Licenta [PDF]

Zitiervorschau

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREŞTI FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL VETERINARE

LUCRARE DE LICENŢĂ

Coordonator ştiinţific, Şef lucrări dr. POPA Gabriela Student, PĂUN Alexandra Andreea

Bucureşti 2014

1

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREŞTI FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL VETERINARE

EMBRIOCULTURA IN VITRO LA CIREŞ

Coordonator ştiinţific, Şef lucrări dr. POPA Gabriela

Student, PĂUN Alexandra Andreea

Bucureşti 2014 2

Rezumatul lucrării

CUPRINS I. STUDIU DOCUMENTAR CAP. 1. INTRODUCERE............................................... CAP. 2. EMBROGENEZA SOMATICA- ASPECTE GENERALE........................................ 2.1. 2.2.................................. 2.3...................................................... 2.3.1..................................................................................................... 2.3.2......................................................................................................... 2.4.........

CAP. 3. CULTURA DE EMBRIONI LA POMII FRUCTIFERIREALIZĂRI CURENTE............................................................................................ 3.1........................................................................ II. PARTE EXPERIMENTALĂ CAP. 4. MATERIAL SI METODE 4.1. Materialul biologic utilizat 4.2. Metode de lucru CAP.5. REZULTATE ŞI DISCUŢII 5.1. Materiale şi metode.................................................................................................................. 5.2. Rezultate şi discuţii.................................................................................................................. CAP.6. CONCLUZII.................................................................................................................... CAP.7.BIBLIOGRAFIE..............................................................................................................

3

I. STUDIU DOCUMENTAR

CAPITOLUL 1 INTRODUCERE

CAPITOLUL 2 EMBROGENEZA SOMATICA- ASPECTE GENERALE 2.1.

INTRODUCERE

4

Embriogeneza somatică (ES) este procesul de avansare în tehnologia de propagare vegetativă pentru plante, care are un impact major asupra reproducerilor pomilor şi culturilor horticole de mare valoare. În cadrul acestui proces se descrie multiplicarea în masă a unor varietăţi noi, de elită, într-un timp scurt şi cu resurse limitate, fiind necesară producerea de plante adevărate, cu trăsături noi, de dorit, rezistente la stresurile biotice şi abiotice pe care le presupun trierea in vitro şi sporirile genetice comparativ cu cele transgenice. Viteza de multiplicare prin metodele de reproducere tradiţionale este scăzută şi depinde de natură, în vreme ce embriogeneza somatică ar putea ajuta la multiplicarea în masă rapidă a plantelor de cultură începute recent şi îmbunătăţite. Globalizarea agriculturii impune din ce în ce mai mult eficienţă sporită şi concurenţă în cazul sistemelor de producţie existente. Îmbunătăţirea pomilor fructiferi prin tehnici de reproducere clasice a devenit limitată din cauza unor probleme inerente, cum ar fi durata lungă de viaţă cu perioadă juvenilă extinsă, morfologia florală, bariera existentă în calea hibridizărilor, sterilitatea, apomixiile şi diminuarea vitalităţii organismelor, care apare ca rezultat al încrucişării intraspecifice. Încă există metode de răspândire tradiţionale, de genul altoiri, marcotări, butăşiri etc. pentru îmbunătăţirea multor pomi fructiferi, însă prelungirea perioadei lor juvenile a făcut ca aceste tehnici să dureze prea mult şi să devină greoaie. Încercarea lui Haberlandt de a institui sisteme de cultivare de ţesuturi de plante a ajutat la o mai bună înţelegere a totipotenţei celulelor vegetale. Cultura de ţesuturi de plante oferă o soluţie eficientă la problemele de tipul răspândirii recoltelor de fructe. Ameliorarea acestora prin mai multe demersuri biotehnologice şi printr-o regenerare deosebit de eficientă este o condiţie prealabilă (Litz şi Gray, 1995). Embriogeneza somatică în cazul recoltelor de fructe devine o anexă atrăgătoare şi uneori indispensabilă la reproducerea de plante clasică. Este un sistem ideal de investigare a întregului proces de diferenţiere a plantelor, precum şi un mecanism de exprimare a totipotenţei celulelor vegetale. Ea are mai multe avantaje distincte comparativ cu răspândirea convenţională (Litz şi Gray, 1992). În cazul metodelor embriogenetice, ameliorarea rapidă poate duce la aplicaţii practice şi comerciale ample, îndeosebi pentru micropropagarea clonală in vitro. Aplicarea embriogenezei somatice la îmbunătăţirea recoltelor fructifere a fost restrânsă din cauza germinării sărace a embrionilor somatici şi a frecvenţei scăzute de recuperare a răsadurilor somatice. Cu toate acestea, în calitate de sistem pentru producţiile la scară largă în bioreactoare prin inducere repetitivă, embriogeneza somatică a atras atenţia reproducătorilor de fructe şi a 5

pomologiştilor pentru ameliorarea pomilor fructiferi. Printre trăsăturile de dorit ale îmbunătăţirii pomilor fructiferi se numără coacerea întârziată, rezistenţa la dăunători, la boli, la secetă şi frig, calitatea fructelor, capacitatea rădăcinilor de a avea ţesuturi mature, juvenilitatea redusă, obiceiul de a face fruct regulat, precum şi modificarea formei şi arhitecturii pomilor – spre ex. capacitatea de a deveni pitici şi semi-pitici. Strategiile care s-au creat pentru îmbunătăţirea pomilor fructiferi de cultură s-au bazat pe ipoteza că e posibil să se aibă în vedere celule cu abilităţi embriogenice şi să se modifice subtil genotipul, pentru a se ajunge la una sau mai multe trăsături horticole specifice (Litz şi alţii, 1992). Regenerarea pomilor fructiferi prin embriogeneză somatică, mai ales la banane, guava, mango, papaya etc. prezintă o importanţă comercială deosebită pentru industrie. 2.2.

TIPURI DE CULTURI IN VITRO DEFINIȚIE

În sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale, încondiţii de asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe, părţi deorgane, ţesuturi sau celule vegetale. Reuşita culturii depinde de o multitudine de factori şi estevizibilă în momentul în care explantul creşte. Explantul, numit şi inocul, este porţiunea de plantă (organ, ţesut, celulă) care sedesprinde de pe planta donor (planta mamă), şi se inoculează în condiţii sterile pe un mediuartificial de cultură. Evoluţia explantului este dirijată de operator în funcţie de scopul urmărit.Acesta poate evolua formând o nouă plantă (sau mai multe plante - neoplantule), prinstimularea dezvoltării organelor aeriene (tulpina şi frunzele) şi a rădăcinii, sau poate formacalus, prin stimularea înmulţirii nediferenţiate a celulelor. Explantul constituie unitatea vie ce conţine în celule întreaga informaţie genetică a plantei mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a regenera una sau mai multe planteidentice cu planta donor. Totipotenţa, este însuşirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce şi de aforma o plantă identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celulă vie este totipotentă, însă în practică s-a observat că nu toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest caracter, datorită pe de o parte diferenţierii celulare şi îmbătrânirii, iar pe de altă parte gradului mare despecializare al acelor celule.

6

Astfel, s-a demonstrat practic că, într-o plantă matură, celulele specializate careconstituie ţesuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la carelipseşte citoplasma şi nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptulcă întreaga informaţie genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu. La plantele cormofite, odată cu înaintarea în vârstă, o parte din celule îşi pierdcapacitatea de totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. Rămân, însă, anumite zone în careactivitatea celulelor este intensă, având loc diviziunea şi formarea aproape continuă de noicelule. Aceste celule sunt mici în dimensiuni, poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolămică şi nucleu mare dispus central şi prezintă o membrană celulozică, formând ţesutul cudenumirea de meristem. Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi grosimea plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini. CARACTERISTICILE CULTURILOT IN VITRO Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau porţiunimari de plantă (marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, deordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplaşti), explante care în condiţiinormale de cultură nu ar reuşi să crească opunând rezistenţă agenţilor patogeni şisintetizându-şi singure substanţele nutritive necesare. Din acest motiv, pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer respectate următoarele condiţii: -prepararea unui mediu de creştere care să asigure o bună nutriţie heterotrofă a explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic uşor accesibil explantelor; -asigurarea şi controlarea factorilor de mediu (temperatură, lumină, umiditate) în limiteleoptime pentru fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie de cerinţele acestora şi scopulurmărit; -stimulare creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii organelor prin utilizareacorespunzătoare a substanţelor stimulatoare de creştere; -asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor

in vitro, prin

dezinfecţiamaterialului vegetal, sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură, precum şi efectuarea tuturor operaţiilor în hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare.

7

DOMENII DE APLICARE A CULTURILO IN VITRO Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au răspuns afirmativ, suntutilizate în prezent în agricultură, silvicultură, farmacie, industria alimentară, industria uşoară,etc. În agricultură, în general şi în horticultură în special, culturile de ţesuturi şi celule suntfolosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorareaspeciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obţinerea de metaboliţisecundari. Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim: -asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornindde la cantităţi mici de material vegetal. Teoretic, se asigură o multiplicare exponenţială, princare în circa 6 luni se pot obţine 1 milion de plante; -se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme, material mai viguros, precoce şi productiv; -necesită spaţii mici de cultură şi se valorifică bine spaţiul din laborator prin cultura peverticală pe 3-5 nivele suprapuse; -obţinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de ţesuturigenerative (cu n cromozomi); -dă posibilitatea obţinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi careîn condiţii normale sunt imposibil de obţinut; -selecţia de plante rezistente la stres, boli şi dăunători;-se evită efectul sezonier de pepinieră;se pot obţine seminţe artificiale; -se pot obţine plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire; -asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii normalede cultură; -asigură păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor comenziferme de multiplicare. Cu toate aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultura in vitro şi care,deocamdată rămân să fie înmulţite tradiţional. Există însă şi câteva impedimente în utilizarea acestei metode pentru înmulţirea în masă a plantelor, cum ar fi: -necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalaţii şi aparate indispensabile activităţilor de micropropagare, care sunt costisitoare; -necesitatea unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea in vitro ;-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor unităţilor de producţie; 8

-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu răspundla metodele cunoscute de multiplicare; -există riscul apariţiei şi multiplicării mutaţiilor recesive, cu afectarea autenticităţii soiurilor; 2.2.1.ETAPE ALE EMBRIOGENEZEI SOMATICE La culturile cu ţesuturi vegetale, din perspectiva totipotenţei unei celule de plantă vie se ştie bine că nucleul fiecărei celule somatice vii conţine informaţiile genetice necesare pentru ghidarea dezvoltării plantei complete. De când Steward şi alţii (1958) şi Reinert (1958) au atras prima dată atenţia asupra formării embrionului somatic în suspensiile celulare de Daucus carota, potenţialul pentru embriogeneza somatică a fost demonstrat într-o gamă largă de specii de plante. Embriogeneza somatică (ES) este un proces în care dintr-o celulă nezigotică fără legături vasculare cu ţesutul originar se dezvoltă structuri bipolare care seamănă cu un embrion zigotic. Embrionii somatici se folosesc la studierea reglării dezvoltării embrionare, însă embriogeneza este un proces de regenerare în mai multe etape, care începe cu formarea de mase proembriogenice, urmată de formarea embrionului somatic, de maturizare, deshidratare şi regenerarea plantei (Arnold şi alţii, 2002). Este un sistem important, în cadrul căruia multiplicările se pot face în proporţie enormă. Embriogeneza somatică implică producerea de structuri care seamănă cu embrionii, din celule somatice fără fuzionarea gameţilor. De-a lungul dezvoltării lor, embrionii somatici trec prin stadii asemănătoare celor observate la embriogeneza zigotică şi se impune ţinerea sub control a 3 faze consecutive : (i) inducerea unor linii embriogenice din materialul vegetal de bază, (ii) menţinerea şi multiplicarea liniilor embriogenice, (iii) maturizarea embrionilor somatici şi convertirea în plăntuţe viabile. În cazul embrionilor somatici se induce dezvoltarea de celule somatice, pentru a se forma embrioni compleţi, asemănători cu cei ai embrionilor zigotici (Sharp şi alţii, 1980, Wang şi alţii, 1990), după cum se arată în Fig. 1. În esenţă, ambii embrioni trec prin aceleaşi stadii de dezvoltare, adică cel globular, în formă de inimă, torpedou, cotiledonar şi matur. Ele apar în mod natural la anumite specii, în cadrul unui proces cunoscut sub denumirea de embriogeneză somatică directă (Williams şi Maheswaran, 1986). În schimb, embrionii somatici se dezvoltă din celule cultivate in vitro, în cadrul unui proces numit embriogeneză somatică indirectă.

9

Embrionii somatici se pot diferenţia fie direct din materialul vegetal de bază fără o fază în care să intervină calus, fie indirect, după o fază cu calus (Williams şi Maheswaran, 1986). Embriogeneza somatică indirectă este metoda cea mai frecventă de generare de embrioni somatici pentru întrebuinţări practice şi s-a descris la sute de specii. Un tip special de embriogeneză somatică indirectă este embriogeneza somatică secundară sau embriogeneza repetitivă, care constă în producerea de embrioni somatici prin folosirea de embrioni somatici drept materiale vegetale de bază iniţiale. Embriogeneza somatică secundară s-a descris în cazul a aproape o sută de specii (Raemarkers şi alţii, 1995). Deşi în cazul embrionilor secundari se înregistrează frecvent rate scăzute de convertire în plante, şi ei se pot folosi la aplicaţii practice. Multe au fost studiile care au tratat problemele de controlare şi gestionare a instituirii iniţiale de linii embriogenice şi cele legate de etapa de convertire ulterioară (Sharp şi alţii, 1980 ; Tisserat şi alţii, 1979). Faza de multiplicare a fost analizată comparativ mai puţin, deşi contribuie direct la producţia plantei finale şi influenţează capacitatea embrionilor rezultaţi de a germina şi de a deveni răsaduri.

10

Fig. 2.2.1. Descrierea embriogenezei somatice la guava. A-inducerea calusului; B-inducerea embriogenezei somatice; C- regenerarea si maturarea embrionilor; D-proliferarea plantulelor; Einradacinarea; F- aclimatizarea; G- plantarea in sol la ghiveci; H-stabilirea culturii (dupa Kamle si colab., 2011)

2.2.2. FACTORI CARE INFLUENTEAZA EMBRIOGENEZA SOMATICA http://www.scribd.com/doc/53021791/somatic-embryogenesis de la 346 pana la 348

2.3.IMPORTANTA EMBRIOGENEZEI SOMATICE În ultimii ani dezvoltarea celulelor vegetale şi tehnica de cultivare a ţesuturilor au dovedit că au potenţial considerabil pentru îmbunătăţirea mai multor pomi fructiferi. Embriogeneza somatică este un proces de dezvoltare de celule somatice, care din punct de vedere morfologic seamănă cu embriogeneza zigotică şi reprezintă o cale importanta pentru regenerarea plantelor din sisteme de cultivare de celule, dar şi o metodă folosită în mod obişnuit la producerea pe scară largă de plante şi seminţe sintetice. În majoritatea recoltelor fructifere importante, cultura tisulară este bine instituită pentru regenerarea plantelor prin intermediul embriogenezei somatice. Mulţi au fost cei care au accentuat că embriogeneza somatică este metoda preferată pentru amleiorările genetice şi multiplicarea de germoplasme preţioase în cazul unei serii întregi de plante lemnoase perene (Gupta şi Durzan, 1987 ; Raj Bhansali, 1990). Dat fiind că adesea culturile embrionare somatice derivă dintr-o singură celulă, acesta este un sistem ideal de inducere de mutaţii, deoarece ajută la prevenirea mutanţilor. Procentajul de germinare embrionară somatică este foarte slab, ceea ce a devenit un obstacol important în multiplicarea vegetală pe scară largă a mutanţilor doriţi induşi în mod voit. Multiplicarea de plante adevărate prin embriogeneză somatică va ajuta la propagarea de genotipuri noi, de elită, pe perioade scurte de timp. Ca la embriogeneza somatică, nu este nevoie de inducere separată de rădăcini, astfel ca plăntuţa se poate multiplica şi aclimatiza repede. Acest lucru a atras atenţia biotehnologilor, deoarece asigură sisteme utile de producere de plante transgenice, precum şi material pentru producerea de seminţe artificiale.

11

Procesul de embriogeneză somatică nu este important numai pentru producerea de plante şi produse secundare, ci şi pentru plantele transgenice şi genetica celulelor somatice. El joacă un rol important în propagarea clonală. Atunci când se include în programe de reproducere şi tehnici moleculare şi biologice clasice axate pe celule, embriogeneza somatică reprezintă un instrument preţios pentru sporirea ritmului de îmbunătăţire genetică a speciilor pentru recolte comerciale (Stasolla şi Yeung, 2003). Însă embriogeneza somatică are şi alte aplicaţii practice pentru ameliorarea recoltelor (trierea celulelor, transformarea genetică, producerea de hibrizi somatici şi plante poliploide), păstrarea germoplasmelor, eliminerea virusurilor, producerea de metaboliţi in vitro şi iniţierea de micorize in vitro. La majoritatea organismelor embrionul reprezintă o entitate distinctă, care funcționează ca un stadiu intermediar al tranzacției de la ciclul biologic gametofic la cel sporofitic:

La plantele superioare embrionii se dezvoltă de regula de la zigotul rezultat dupa fuziunea gametilor, și se numesc embrioni zigotici. Cu toate acestea, si embriogeneza asexuată sau adventive care presupune dezvoltarea embrionilor din celule ce nu rezultă prin fuziunea gametilor, reprezintă un fenomen natural bine cunoscut. Astfel de specii ale genului Citrus sau la unii reprezentanti ai familiei Rutaceae, pe langă embrionul zigotic se dezvoltă adesea embrioni adventivi din celulele nucleare, ale integumentului sau din celulele endospermului. Ciar și celulele sacului embrionar ca sinergidele sau antipodele pot evolua in embrioni care posedă

12

numarul cromozomal gametic, iar proembrionul, embrionul sau suspensorul acestuia pot da nastere la embrioni multiplii. În timp ce incidența embriogenezei asexuate natural se limitează de ragulă la țesutul intraovular al unor specii, in condiții “in vitro” există posibilitatea inducerii embriogenezei asexuate atât din țesut micelar cat și din țesuturi gametice nefertilizate sau din diferite celule somatice. Descrisă mai intai in 1958 de catre F. C. Steward si J. Reinert in culturile inițiale din tesutul radicular de la Daucus carota, embriogeneza non-zigotică sau somatică a fost deja indusa la destule specii pentru a se putea afirma ca acest fenomen nu este limitat numai la unii taxoni, daca celulele cultivate se afla sub influenta unor stimuli pozitivi, principalele conditii fiind: -prezența unei auxine este critică pentru initierea embriogenezei, iar eliminarea acesteia din ediul de cultura stimulează maturarea embrionilor somatici. -prezența azotului sub formă de amoniu este necesară atât pentru inducerea cat si pentru maturarea embrionilor somatici. În consecință, pentru inducerea embriogenezei somatice se recomandă ca regulă generală utilizarea unui mediu de cultura primar, inductiv, care trebuie sa contină o sursă auxinică și un mediu secundar, lipsit de reglatori ai cresterii, dar care să conțină un supliment substanțial de azot sub forma de amoniu. Printre auxine 2, 4, D s-a dovedit a fi deosebit de eficace, fiind utilizat in peste 50% din experimente in care embriogeneza a fost realizată cu succes la diferite specii. In general insă, atât tipul de auxină cât si concentrația optimă pentru inducerea dezvoltarii embriogenice in cazul unui genotip particular, trebuie stabilite empiric. Embriogeneza somatica este directă, atunci când embrionii se dezvoltă direct de la celulele explantului si indirectă, atunci cand intervine faza intermediară din calus. Cele doua tipuri ale dezvoltarii embriogenezei “in vitro” directă și indirectă, pot fi deci caracterizate in funcție de momentele relative ale determinării si diferențierii lor in celulele embriogenice. În timp ce embriogeneza directă derivă de la celule pro-embriogenice determinată, cea indirectă necesită diferențierea celulelor cu funcții specializate, proliferarea calusului și inducerea determinarii embriogenice la unele celule. Fenomenul embriogenezei indirecte explica redeterminarea celulelor diferențiale spre direcția embriogenică de dezvoltare sub acțiunea unor factori chimici,fizici si biologici; ca: genotipul, caracteristicile explantului inițial, reglatorii creșterii, condițiile de incubare, etc. 2.3.1.SELECTIA IN VITRO

13

Liniile celulare pentru cultivarea ţesuturilor se pot tria in vitro cu scopul de a li se testa rezistenţa la diverse stresuri. Tehnicile de cultivare tisulară s-au folosit mult în scop reproductiv, mai ales la trierile pentru toleranţa la stres. Selectarea se face prin inducerea unui agent stresant în culturile de ţesut ce conţin celule care se divid. O metodă eficace de obţinere de plante cu caracteristicile dorite este adăugarea unui agent selectiv care să omoare majoritatea celulelor (cu excepţia celor rezistente) dintr-o cultură tisulară. Această procedură se numeşte triere in vitro (Chawla şi Wenzel, 1987). Având în vedere că unitatea de selectare in vitro poate fi o singură celulă, presiunea pentru triere se poate exercita uniform şi de manieră reproductibilă. De asemenea, trierea in vitro este în principiu mai eficientă decât selectarea întregii plante. Este o sursă de variabilitate genetică, care prin modificări genetice de-a lungul procesului de cultivare in vitro îi dă naştere unui fenomen numit variere somaclonală. Selectarea in vitro oferă un potenţial imens pentru generarea rapidă şi exhaustivă de somaclone utile sau de mutanţi care să reziste la diverşi factori biotici şi abiotici. Această metodă a fost eficientă în special la selectarea plantelor tolerante la ierbicide şi rezistente la boli. În practică, aplicarea tehnicilor de triere in vitro în cadrul programelor de îmbunătăţire a recoltelor este foarte limitată. Din majoritatea semnalărilor reiese o corelare negativă între răspunsurile in vitro şi in vivo la rezistenţă. 2.3.2. TRANSFORMAREA GENETICA Transformarea genetică oferă ocazia de a se manevra genetic plante la nivel celular şi asigură mijloacele de modificare a trăsăturilor horticole separate fără a afecta mult alte aspecte ale fenotipului (Singh şi alţii, 2004). Principalul obiectiv al tehnicilor de transfer genetic este de a crea varietăţi îmbunătăţite prin încorporarea de gene importante în plantele de cultură existente (Singh şi alţii, 2004). Însă prin tehnicile de transformare a plantelor nu se transformă toate celulele, iar plantele regenerate din ţesuturi transformate prin organogeneză sunt adesea mutanţi. Embrionii somatici se nasc din celule singulare, astfel că regenerarea prin embriogeneză somatică reduce formarea de mutanţi. Totuşi, se pare că prin embriogeneză somatică variaţiile somaclonale sunt mai mici comparativ cu organogeneza. Pomii fructiferi sunt consideraţi material recalcitrant la studiile de transformare genetică, principalul impediment la aceasta din urmă fiind regenerarea plăntuţelor transformate. Alegerea materialelor vegetale de bază capabile să se transforme şi să se regenereze este un factor crucial, astfel că tehnicile de cultivare eficientă de ţesuturi devin baza pentru studiile de transformare

14

genetică (Giri şi alţii, 2004). Regenerare cu succes a unor plante transformate genetic s-a reuşit la mai multe specii de pomi fructiferi tropicali (Gomez-Lim şi Litz, 2004). Aplicaţiile tehnologiei de transformare genetică au un potenţial mai mare în cazul pomilor fructiferi sau al plantelor perene decât chiar şi în cel al plantelor ierbacee, deoarece la câştiguri în materie de ameliorări genetice se poate ajunge într-un răstimp destul de scurt raportat la tehnicile de hibridizare, triere şi mutageneză folosite în mod obişnuit, care necesită zeci de ani. În prezent aria de cercetare depinde de cel puţin trei factori, care trebuie îngemănaţi pentru fiecare specie sau genotip care necesită îmbunătăţire : (1) disponibilitatea genelor şi promotorilor specifici de a fi transferaţi şi exprimaţi ; (2) punerea în practică de tehnici fiabile pentru transferarea genelor care vizează celulele şi selectarea celulelor transformate ; şi (3) regenerarea celulelor transformate în plante întregi care se pot răspândi în masă, preferabil prin mijloace asexuale. Pentru transferarea la plante importante din punct de vedere agricol se caracterizează şi se clonează actualmente o întreagă varietate de gene posibil utile, multe dintre acestea urmând a fi de folos la ameliorarea recoltelor de fructe. În mod asemănător, s-au realizat o serie întreagă de metode diferite de transformare genetică a plantelor, unele dintre acestea manifestându-şi aplicabilitatea şi la plantele lemnoase perene. Transferul stabil, integrarea şi exprimarea unei gene-model (cum sunt fototransferaza neomicinică sau β-glucuronidaza) s-au demonstrat doar la puţine specii de fructe şi gene care reglează metabolismul celular sau aspectele fiziologice ale creşterii şi dezvoltării. 2.3.3. VARIATIA SOMACLONALA Scopul culturii tisulare poate fi păstrarea fidelităţii genetice a stocurilor. Cultura tisulară pe termen lung se mai poate folosi şi la intensificarea varierii genetice utile. Variabilitatea genetică în cazul materialului provenit din cultura tisulară, numită variaţie somaclonală (Larkin şi Scowcroft, 1981) prevalează mai ales dacă materialul se păstrează într-o stare nediferenţiată, în care diviziunea are loc cu repeziciune (calusul sau suspensia celulară), o perioadă mai lungă de timp. În fond, frecvenţa variaţiei somaclonale poate fi de 10.000 ori mai mare decât vitezele de mutaţie spontană la plantele întregi (Larkin şi Scowcroft, 1981). S-a sugerat că variaţia genotipică în rândul plantelor regenerate atât din culturile de celule somatice, cât şi gametice (adică variaţiile somaclonale şi gametoclonale) este o sursă utilă de germoplasmă posibil valoroasă pentru reproducerea plantelor.

15

În pofida multor solicitări de posibile întrebuinţări ale variaţiei somaclonale, până în prezent nu s-a înregistrat nici un singur exemplu de varietate nouă ameliorată considerabil pentru vreo specie importantă dezvoltată ca urmare a variaţiei somaclonale şi care să se cultive în scop comercial. 2.3.4. MARKERI MOLECULARI Markerii moleculari sunt avantajoşi în special pentru îmbunătăţirea trăsăturilor agronomice la culturile de fructe perene, ameliorare care altfel ar presupune mult timp ; în plus, ar fi greu să se marcheze genele care conferă rezistenţă împotriva agenţilor patogeni, insectelor, nematodelor, toleranţă la stresurile abiotice, parametri calitativi şi cantitate. Căutarea de markeri aferenţi embriogenezei vegetale este un aspect important al reproducerii moderne de plante (Schell şi alţii, 1994). Apelând la trierea cu ajutorul markerilor, reproducătorul ar putea alege markerii moleculari ai genotipurilor rezistente care sunt strâns legaţi de genele rezistente. În cazul utilizării comerciale a procesului de propagare in vitro a pomilor fructiferi este ultraimportant să se estimeze fidelitatea genetică a componentelor regenerante, mai cu seamă înainte de transplantarea lor pe câmp. Până acum s-au folosit mai multe strategii pentru aprecierea acestei fidelităţi a plantelor crescute in vitro, însă şi ele au propriile lor limitări. În schimb, markerii moleculari facilitează cu mai mare precizie examinarea plantelor crescute in vitro, astfel că aceşti markeri rămân neafectaţi de factorii de mediu şi dau naştere la rezultate mai fiabile şi mai repetitive. S-au înregistrat mai mulţi markeri fiziologici, biochimici şi moleculari legaţi de competenţa embriogenică a celulelor, cum ar fi izozimele şi markerii moleculari. Modelele izozimice ajută mult la o înţelegere mai bună a mecanismelor de bază ale diferenţierii celulare şi promovează dezvoltarea plantelor. Pe lângă studiile clasice, în care izozimele erau folosite ca markeri pentru evenimente în fazele mai târzii ale plantei care creşte (de ex. organogeneza sau germinarea seminţelor), în ultimii douăzeci de ani s-a demonstrat utilitatea lor ca markeri în primele stadii de dezvoltare a plantei (cu alte cuvinte embriogeneza timpurie). Tehnicile de cultură tisulară şi în special embriogeneza somatică au permis aplicarea analizei izozomice în cazul procesului embriogenic, deoarece datorită lor s-au admis cantităţi destul de mari de material vegetal în stadiul de dezvoltare dorit. Deja s-a publicat o trecere în revistă amplă cu privire la folosirea izozimelor drept markeri biochimici în cadrul embriogenezei somatice (Schell şi alţii, 1994). 16

Există mai multe gene candidate care s-ar putea folosi pe post de markeri moleculari ai celulelor competente separate. Una din aceste gene, cea kinazică de tip receptor pentru embriogeneza somatică, s-a constatat că evidenţiază celulele de suspensie Daucus şi Dactylis separate care sunt capabile să formeze embrioni somatici (Somleva şi alţii, 2000). 2.3.5. APLICATII 1)

Producţia pe scară largă : Embrionii somatici au un mare avantaj comparativ cu

reproducerea tradiţională prin propagare, dat fiind că dintr-un singur material vegetal de bază se poate produce o cantitate extraordinară de embrioni. 2)

Multiplicarea rapidă : multiplicarea rapidă prin embriogeneză somatică la culturile de

celule şi folosirea de bioreactoare pentru tehnologia de dezvoltare 3)

Scurtarea ciclului de reproducere : Acest proces scurtează ciclul de reproducere a

speciilor de pomi, sporind astfel germinarea embrionilor hibrizi. 4)

Transgenicitatea : Dezvoltarea embriogenezei somatice ar putea duce la exploatarea

transgenităţii din perspectiva diverselor surse de stres biotic şi abiotic. 5)

Aplicaţiile moleculare şi biochimice : Acestea asigră o sursă importantă de analizare a

evenimentelor moleculare şi biochimice care se petrec în timpul inducerii şi maturizării embrionilor. CONCLUZII Embriogeneza somatică este o metodă promiţătoare pentru stabilirea protocoalelor de multiplicare rapidă a genotipurilor noi, de elită, pentru producerea de seminţe sintetice, pentru demersurile de triere in vitro în cazul solicitărilor de ordin biotic şi abiotic, precum şi pentru studiile de manipulare genetică. Transferarea genelor în celulele plantelor embriogenice reprezintă deja o concurenţă pentru reproducerea tradiţională a plantelor şi a devenit un instrument indispensabil pentru ameliorarea recoltelor. Una din cele mai importante condiţii preliminare pentru manipularea genetică a plantelor in vitro este abilitatea de a creşte celule somatice în mediu steril şi de a regenera plante viabile din aceste culturi. De aceea embriogeneza somatică reprezintă un cadru mai eficient pentru studiile care implică producerea de plante transformate genetic.

17

CAPITOLUL 3 CULTURA DE EMBRIONI LA POMII FRUCTIFERI-REALIZĂRI CURENTE 3.1. APLICAŢII Embriocultura este una din formele cele mai timpurii de cultură in vitro folosite în cazul problemelor practice şi este, probabil, tehnica de cultură tisulară care s-a dovedit a fi cea mai valoroasă pentru reproducători, aplicaţia sa de bază la reproducerea plantelor fiind pentru hibridizarea interspecifică. Avortul embrionar timpuriu apare în principal din cauză că endospermul nu se dezvoltă cum trebuie. La încrucişările interspecifice, cele intergenerice şi cele dintre diploide şi tetraploide, endospermul se dezvoltă adesea ori puţin, ori deloc, însă această problemă se poate rezolva punând aseptic embrionul într-un mediu de cultură cu substanţe nutritive. Embrionii din unii hibrizi neviabili şi-ar putea iniţia dezvoltarea evitând barierele ostzigotice din planta-mamă. Până acum s-au înregistrat mai multe cazuri reuşite de embrioni născuţi din hibrizi interspecifici şi hibrizi intergenerici. Cultura embrionară se poate folosi cu succes ca instrument în cadrul programului de reproducere la cais şi cireş, în scopul ajungerii la un procentaj mai mare de răsaduri din hibridizarea planificată sau pentru a nu ne mai confrunta cu lipsa germinării sâmburilor. Embriocultura poate scurta ciclul de reproducere prin eliminarea latenţei la seminţe, care este cauzată de inhibatorii endogenici, de cerinţele în materie de lumină şi de depozitare la uscat, de temperaturile scăzute şi de imaturitatea embrionilor. Factorii care induc latenţa la seminţe acţionează asupra căptuşelii seminţelor/sâmbu-rilor, asupra endospermului sau asupra ambelor. Prin scoaterea embrionilor din raza de influenţă a acestor factori ei vor putea germina şi creşte repede, astfel că se va scurta ciclul de reproducere. Şi embrionii izolaţi se pot iaroviza, timpul de germinare putându-se uneori diminua cu 40 de zile. Germinarea seminţelor mature în cazul cireşului de cultură care se coace de timpuriu Silej-Delamarka este de 0 % prin metodele tradiţionale de cultivare a seminţelor ; în schimb, embriocultura a sporit cu succes germinarea până la 30 şi 60 la sută în cazul mostrelor de embrioni, la 21 şi, respectiv, 28 de zile de la înflorirea completă. Pe lângă utilizările embrioculturii, această procedură este de ajutor şi la studiile de bază. Creşterea de embrioni în afara ovulului (ex ovulo) este un mod minunat de studiere a nutriţei şi 18

metabolismului embrionilor în diferitele stadii de dezvoltare. Tehnica se mai poate folosi şi la examinarea condiţiilor de creştere pentru embrioni, a efectelor fitohormonilor, a condiţiilor de mediu pentru embriogeneza zigotică şi a posibilităţilor de regenerare a embrionilor întregi şi a segmentelor acestora. Embriocultura se poate întrebuinţa şi la detectarea locurilor în care se află promotorii şi inhibatorii de germinare, la studiile embriogenetice şi la păstrarea criogenică. Germinarea caisului care se coace de timpuriu s-a îmbunătăţit prin folosirea unui mediu cu amestec de alge şi sucroză. De asemenea, cultura embrionară se mai poate folosi şi la propagarea plantelor pe cale vegetativă. Embrionii din grupurile de specii înrudite îndeaproape care au trăsături şi juvenile, dar şi adulte se folosesc drept material de început pentru propagarea vegetativă, embrionii fiind receptivi, deoarece sunt tineri. Embriocultura se poate folosi la studierea germinării precoce, adică a germinării embrionilor înainte de încheierea dezvoltării embrionare obişnuite. De regulă germinarea precoce duce la formarea de răsaduri slabe. Pentru a înţelege factorii care reglează dezvoltarea ordonată a embrionilor în natură, aceştia se pot pune în medii de cultură în condiţii variate, pentru a se vedea cum anume se simulează dezvoltarea embriologică. Germinarea precoce se întâmplă din cauză că inhibatorii se pierd în momentul scoaterii capsulei seminţei/sâmburelui sau potenţialul osmotic negativ este mai mare in vivo. Germinarea precoce s-a preîntâmpinat la Prunus prin cultura ovulară, unde integumentul a acţionat ca un inhibator natural. Embriocultura a fost foarte utilă la stabilirea viabilităţii seminţelor, întrebuinţare care a reieşit din constatările de început că există o corelare bună între creşterea embrionilor excizaţi ai sâmburilor de piersic necopţi ulterior [Prunus persica (L.) Batsch.] şi germinarea sâmburilor copţi

ulterior.

Prin

cultura

embrionară

se

poate

testa

cu

rapiditate

viabilitatea

seminţelor/sâmburilor atunci când se poate evita latenţa lor. 3.1.1.TEHNICILE În majoritatea situaţiilor embrionii se aşează în mediul steril al ovulului, astfel încât nu mai e nevoie să se sterilizeze suprafaţa acestora. În schimb, suprafaţa ovulelor întregi sau a ovarelor se sterilizează, după care embrionii se scot aseptic din ţesuturile din jur. Dat fiind că embrionul este adesea protejat bine de aceste ţesuturi, pentru dezinfectarea suprafeţelor se pot utiliza proceduri un pic mai dure. Astfel, culturile axenice de embrioni se realizează adesea cu uşurinţă. Embrionii necesită dezinfectare directă dacă învelişurile seminţelor / sâmburilor sunt crăpate sau dacă înăuntrul 19

acestora există patogeni endofitici. Disecarea embrionilor poate conduce la probleme. Embrionii mari nu sunt greu de excizat, însă pentru cei mici trebuie folosite instrumente de micro-disecare, pentru a nu-i răni. Embrionii se deteriorează uşor atunci când li se taie învelişul ; în plus, este important ca embrionul excizat să nu se usuce în timpul ţinerii în mediul de cultură. Procesul de excizare a embrionilor imaturi variază de la o specie la alta, însă de multe ori se poate face o incizie la capătul micropilar al ovulului tânăr, capătul celălalt apăsându-se pentru a forţa embrionul să iasă prin deschizătură. Dacă embrionul este înconjurat de endosperm lichid, presiunea pe care o exercită acesta ar putea dăuna ţesutului embrionic fragil dacă nu se va avea grijă. În momentul în care se excizează embrioni tineri sau aflaţi în stadiul de mijloc este important să se păstreze intacţi suspensorii.

3.1.2.CERINŢE PENTRU REUŞITĂ Reuşita dezvoltării unui embrion depinde de mulţi factori. Ca în cazul majorităţii celorlalte procese, succesul este influenţat foarte mult de genotipul plantei. Embrionii unora dintre specii sunt mai uşor de crescut în cultură decât alţii, între plantele de cultură înrudite strâns apărând uneori diferenţe. După cum s-a arătat mai sus, embrionii mici sunt greu de crescut in vitro, însă se pot folosi tehnici specializate pentru îmbunătăţire. Utilizarea endospermului-“doică” presupune introducerea unui embrion hibrid într-un endosperm disecat dintr-un ovul autopolenizat care se dezvoltă în mod normal, ovul provenit de la unul dintre părinţi sau de la o terţă specie, embrionul şi endospermul transferându-se împreună la suprafaţa mediului de cultură. La alte specii s-au adaptat variante modificate ale endospermului-doică, cum ar fi implantarea sau transplantarea de embrioni. Prin salvarea de embrioni se poate atinge o rată de succes de 30-40 % graţie încrucişărilor intergenerice, comparativ cu procentajul de 1 % al situaţiilor în care nu se fac transplanturi de embrion - endosperm-doică. Embrionii mici sau tineri care se avortează în primele stadii de dezvoltare sunt adesea greu de izolat. Embrionii de cais de 5-9 mm au germinat şi au ajuns plante într-un procent considerabil mai mare decât în celelalte două stadii mai mature. Cerinţele nutritive ale embrionilor tineri variază foarte mult, iar riscul de deteriorare a lor este foarte mare. În astfel de situaţii embrionii s-ar putea salva prin metode de cultivare ovariană sau ovulară. Ovarele se excizează după polenizare şi li se scot caliciul, corola şi staminele. 20

Suprafaţa ovarului se sterilizează şi se introduce cu capătul tăiat al pedicelului în mediul de cultură cu substanţe nutritive. Dacă totul decurge bine, ovarul va da naştere unui fruct cu seminţele dezvoltate complet. În cazul culturii cu ovule, ovarul sterilizat se deschide, iar ovulele fertilizate se scot afară şi se transferă pe suprafaţa mediului de cultură. Motivele pentru recuperarea cu succes a hibrizilor mai degrabă din cultura ovariană sau ovulară decât din cea embrionară sunt legate probabil de anumiţi factori nutriţionali şi fizici, dar şi de protejarea embrionului prin ţesuturile materne ori sporofitice. Lumina şi temperatura sunt doi factori de mediu extrem de importanţi pentru embriocultură. Uneori embrionii cresc mai bine dacă se ţin pe întuneric în primele 1-2 săptămâni de cultură, iar apoi se duc la lumină pentru a se forma clorofila. Embrionii izolaţi germinează adesea într-o gamă de temperaturi mai amplă decât seminţele intacte. Unii embrioni necesită o tratare la rece, la 4 °C, pentru a se învinge latenţa. Cultivarea de embrioni de cireş imaturi şi maturi a fost reuşită atunci când aceştia s-au tratat la rece (la 4 °C) timp de 40 de zile şi, respectiv, 60 de zile. Balla şi Brozik au stratificat embrioni de cireş la 4 °C timp de 120 de zile. Temperatura optimă pentru creşterea embrionilor depinde de specia plantelor, însă în mod normal se foloseşte o gamă cuprinsă între 25-30 °C. La cultura embrionară se iau în considerare şi condiţiile de creştere ale plantei-mamă. Endospermul şi cotiledoanele se vor dezvolta mai mult dacă planta-mamă se va cultiva în condiţii bine ţinute sub control ; prin urmare, se va promova creşterea embrionară. 3.1.3.MEDIILE Mulţi oameni de ştiinţă sunt de părere că cel mai important aspect al embrioculturii este alegerea mediului. Pentru cultura embrionară s-au folosit mai multe formule de săruri minerale, fără a se face prea multe aprecieri cu privire la rolul elementelor luate separat. Mediul B5 al lui Murashige şi Skoog şi cel al lui Gamborg, cu anumite modificări, sunt mediile de bază cele mai folosite la embrioculturi. Rizzo şi alţii (1998) au folosit trei medii [MS, Knopp şi cel pentru plantele lemnoase (PL)] la cultura embrionară pentru piersic, embrionii aşezaţi în mediul PL cu sucroză în proporţie de 3 % germinând mai bine. Cerinţele nutriţionale exacte depind de stadiul de dezvoltare a embrionului. Raghavan a identificat două faze de dezvoltare embrionară. În cea heterotrofică, embrionul tânăr depinde de endosperm şi de ţesuturile materne înconjurătoare şi are nevoie de un mediu mai complex şi de o presiune osmotică mai mare decât embrionii mai în vârstă.

21

Dezvoltarea continuă a embrionilor tineri necesită medii complexe, suplimentate cu combinaţii de vitamine, aminoacizi, hormoni de creştere şi, în anumite cazuri, extracte naturale, de genul suc de tomate şi lapte de cocos, care să susţină dezvoltarea. În faza autotrofică – al doilea stadiu de creştere embrionară – embrionul este capabil, din punct de vedere metabolic, să sintetizeze din săruri şi zahăr substanţele necesare creşterii sale. În această fază embrionii pot să germineze şi să crească într-un mediu anorganic simplu, suplimentat cu o sursă de carbon, cum e sucroza. Nitratul de amoniu şi nitratul de potasiu sunt cele mai frecvente surse de N anorganic în embrioculturi. Amoniul din mediu este esenţial sau preferenţial pentru creşterea corespunzătoare şi diferenţierea embrionilor imaturi. De regulă amoniul se combină cu un acid organic, îndeosebi cu anionii de malat sau de citrat. Dintre diverşii aminoacizi, glutamina şi asparagina sunt cei mai eficienţi. Hidrolizatul din caseină este un amestec complex de aminoacizi şi se foloseşte de regulă în mediile de embriocultură pentru a stimula creşterea. De obicei se adaugă şi vitamine – biotină, tiamină, acid pantotenic, acid nicotinic, acid ascorbic, inositol şi piroxidină – însă nu sau dovedit a fi esenţiale. Adăugarea de aminoacizi la mediul de cultură e de natură să stimuleze creşterea embrionilor. De pildă, glutamina este cel mai eficient aminoacid pentru creşterea embrionilor dezvoltaţi în culturi. Şi asparagina poate spori creşterea embrionară, însă poate fi şi inhibatoare. Hidrolizatul din caseină este un amestec complex de 18 aminoacizi, care s-a folosit foarte mult drept aditiv la mediile de cultivare a embrionilor. Atunci când se adaugă singuri la un mediu, nici unul dintre aminoacizi nu egalează efectul benefic al hidrolizatului din caseină, însă în urma inducerii şi maturării embrionilor somatici s-a demonstrat că aminoacizii de genul prolină, serină şi glutamină pot înlocui hidrolizatul din caseină. Lucrarea de referinţă a lui van Overbeek şi alţii a arătat că embrionii de dinainte de stadiul post-torpedic se pot cultiva în mediul de cultură dacă aici se adaugă endosperm lichid de cocos. Modificarea mediului în sensul mimării endospermului care înconjoară embrionii imaturi din ovul a dus la reuşită, ceea ce înainte nu fusese posibil. Prin folosirea de lapte de cocos în mediile pentru embrionii tineri se poate evita germinarea precoce. Ca substitut pentru laptele de cocos se pot folosi alte substanţe naturale – lapte degresat, drojdie de bere uscată (extract de malţ), hidrolizat din caseină şi produse difuzate din seminţele mai multor specii de plante, în funcţie de speciile care se analizează. Deşi se folosesc medii sintetice, aceste extracte naturale din plante se pretează la surse aminoacide pentru creşterea de embrioni imaturi în medii de cultură. Sucroza este cea mai folosită sursă de energie C pentru embrioculturi, deoarece ea este în principal o sursă de energie, cu toate că joacă şi un rol important în menţinerea potenţialului osmotic adecvat al mediilor nutritive. Embrionii maturi se cresc de obicei în medii cu sucroză în proporţie de 2-3 % ; în schimb, cei imaturi cresc mai bine la 8-12 %, unde se mimează potenţialul osmotic ridicat din 22

cadrul sacului embrionar tânăr. În general, cu cât e mai tânăr embrionul excizat, cu atât mai mare trebuie să fie osmolaritatea mediului. Raghavan este de părere că această osmolaritate ridicată previne germinarea precoce şi împiedică celulele care se află în stadiul de diviziune să se alungească. Amestecul de alge este agentul cel mai des folosit pentru solidificarea mediilor de cultură, la embrioculturi utilizându-se de regulă concentraţii de 0,5-1,5 %. Concentraţiile mari de amestec de alge pot inhiba creşterea din cauza calităţii acestuia, a sărurilor contaminatoare sau a faptului că nu este suficientă apă. În loc de amestecul de alge, cu ajutorul sistemului de sprijinire cu silicat de mică pentru embrionii mici ai piersicului de cultură în stadiul incipient de maturitate s-a ajuns la culturi reuşite şi la folosirea de părinţi materni în cadrul programelor de reproducere. Reglatorii de creştere a plantelor joacă în general un rol minor în cultura embrionară. De auxine exogene se pare că nu este nevoie pentru creşterea in vitro a embrionilor plantelor, iar expunerea de faţă vine în sprijinul cazurilor observate în care inducerea somatică de embrioni este inhibată de concentraţii mari de auxină exogenă în mediu, dar este stimulată de concentraţii scăzute sau în absenţa ei. Atunci când se folosesc pe post de hormon singur, citokinele sunt ineficiente sau ajută într-o măsură foarte mică la creşterea embrionilor tineri. Cu toate acestea, ele încurajează creşterea şi diferenţierea embrionilor atunci când sunt combinate cu anumite auxine. Monnier sugerează că la mediile de cultură embrionară n-ar trebui adăugaţi hormoni, deoarece duc la anormalităţi structurale. Auxinele şi citokinele nu se folosesc în general la embrioculturi decât dacă e nevoie de inducere de calus. Giberelinele stimulează uneori germinarea precoce sau se folosesc la eliminarea latenţei.

3.2.SALVAREA EMBRIONILOR INTRODUCERE Termenul de “salvare embrionară” se referă la o serie de tehnici in vitro care au scopul de a promova dezvoltarea unui embrion imatur sau slab care să ajungă plantă viabilă. Salvarea embrionilor s-a folosit foarte mult la producerea de plante din hibridizările la care nedezvoltarea cum trebuie a endospermului a provocat avortarea embrionilor. În cadrul procedurilor de salvare emrbionară mediul artficial cu substanţe nutritive serveşte drept înlocuitor al endospermului, permiţându-i astfel embrionului să-şi continue dezvoltarea. Tehnicile de salvare embrionară sunt printre cele mai vechi şi mai reuşite proceduri in vitro.

23

Una din întrebuinţările de bază ale salvării embrionare a fost producerea de hibrizi interspecifici şi intergenerici. La incompatibilitate interspecifică se poate ajunge dintr-o serie întreagă de motive, una dintre cauzele obişnuite fiind avortarea embrionară. Producerea de seminţe mici şi restrânse în urma hibridizării ample arată încrucişarea în care s-a făcut fertilizare, însă dezvoltarea seminţelor a fost întreruptă. Procedurile de salvare a embrionilor s-au dovedit a fi foarte reuşite pentru depăşirea acestei bariere din calea hibridizării extinse în cazul unei game vaste de materiale vegetale (Collins şi Grosser, 1984). În plus, salvarea embrionară s-a folosit şi la recuperarea haploidelor materne care s-au dezvoltat ca rezultat al eliminării cromozomiale în urma hibridizării interspecifice. Tehnicile de salvare a embrionilor s-au folosit şi la obţinerea de descendenţi prin hibridizări intra-specifice care în mod normal nu produc seminţe viabile. De exemplu, din încrucişări dintre membri diplozi şi tetraploizi din aceeaşi specie s-au recuperat triploide, iar descendenţi s-au obţinut din încrucişări în care pe post de părinţi materni s-au folosit genotipuri de fructe stenospermacarpice fără seminţe/sâmburi, care se coc de timpuriu. Tehnicile de salvare embrionară s-au utilizat şi în situaţii în care nu există pericol de avortare embrionară, adică pentru depăşirea latenţei seminţelor şi studierea dezvoltării şi germinării acestora. Aplicaţiile diverse ale salvării embrionare în cercetările asupra plantelor au fost trecute în revistă de Bridgen (1994), Collins şi Grosser (1984), Ramming (1990) şi Sharma şi alţii (1996). În funcţie de organul crescut în mediul de cultură, salvarea embrionară se referă la cultura de embrioni, de ovule sau de ovare. Procesele de dezinfestare şi de excizare a explantelor sunt diferite în cazul acestor trei tehnici, însă factorii care contribuie la recuperarea cu succes a plantelor viabile sunt aceiaşi. 3.3.FACTORII IMPLICAŢI ÎN SALVAREA EMBRIONARĂ MEDIILE Mediile B-5 ale lui Murashige şi Skoog (MS) (Murashige şi Skoog, 1962) şi ale lui Gamborg (Gam-borg şi alţii, 1968) sunt mediile de bază cele mai folosite la studiile privitoare la salvarea embrionară (Bridgen, 1994). Tipurile şi concentraţiile de suplimente necesare pentru medii depind foarte mult de stadiul de dezvol-tare a embrionului. Raghavan (1976) a identificat două faze ale dezvoltării embrionilor. În cea heterotrofică embrionul tânăr, care este adesea numit proembrion, este dependent de endosperm. Embrionii porniţi în această fază necesită un mediu complex. Aminoacizii, mai ales glutamina şi aspargina, se adaugă frecvent la mediu. Acolo se mai pot introduce şi diverse vitamine. Extractele naturale, 24

cum e laptele de cocos şi hidrolizatul de caseină, s-au folosit uneori în loc de aminoacizi specifici. Embrionii tineri au nevoie de un mediu cu potenţial osmotic mare. Sucroza serveşte adesea atât drept sursă de carbon, cât şi drept osmoticum. Concentraţia osmotică mare din mediu previne germinarea precoce şi sprijină dezvoltarea normală a embrionilor. În cazul celor heterotropici se foloseşte de regulă sucroză de 232-352 mM (8-12 %). În locul acesteia sau pe lângă ea s-au folosit cu succes şi alte zaharuri, însă sucroza este pe departe cea mai folosită substanţă dulce pentru salvarea embrionilor. Cea de-a doua etapă a dezvoltării embrionare este cea autotrofică, care de regulă începe la sfârşitul fazei de mijloc, în care se formează embrionul (Raghavan, 1976). În acest moment embrionul este capabil să sintetizeze din săruri şi zaharuri substanţele necesare creşterii sale. Germinarea va avea loc de obicei într-un mediu anorganic simplu, suplimentat cu sucroză de 5888 mM (2-3 %). La studiile despre salvarea embrionară, mai cu seamă în cazul embrionilor heterotropici, s-au folosit foarte mult reglatori de creştere, însă efectele lor nu au fost deloc conforme. În general, concentraţiile scăzute de auxine au impulsionat creşterea normală, iar acidul giberelic a dus la lărgirea embrionilor ; în schimb, citokinele au inhibat creşterea (Sharma, 1996). Pe lângă adăugarea de vitamine şi aminoacizi în mediu, reglatori de creştere mai pot fi şi anumite extracte naturale. După cum s-a menţionat anterior, cerinţele pentru medii diferă în funcţie de stadiul de dezvoltare a embrionilor. În cazul culturilor începute cu embrioni foarte tineri e posibil să fie nevoie de cel puţin o formulă de mediu. De pildă, embrionii hibrizilor interspecifici Trifolium sau pus prima dată într-un mediu de cultură cu concentraţie mare de sucroză, cu un nivel de auxină moderat şi un nivel de citokinină scăzut. După 1-2 săptămâni de stat în acest mediu embrionii s-au oprit din creştere. Aceasta s-a reluat după ce au fost transferaţi într-un mediu cu o concentraţie mai mică de sucroză, cu un nivel de auxină scăzut şi unul moderat de citokinină (Collins şi Grosser, 1984). În cazul hibrizilor interspecifici ar fi util să se dezvolte medii în care să se cultive embrioni dintr-una sau ambele specii parentale. Cu toate că nevoile nutritive ale hibridului pot fi diferite de ale părinţilor, formulele mediilor parentale vor servi drept punct de plecare bun pentru hibrid. TEMPERATURA ŞI LUMINA Cerinţele în materie de temperatură şi lumină variază de la specie la specie. Potrivit lui Sharma (1996), necesităţile embrionilor pentru creştere sunt adesea aceleaşi cu ale părinţilor lor, 25

embrionii pentru culturile din anotimpurile mai reci având nevoie de temperaturi mai joase decât cei pentru culturile din anotimpurile calde. Culturile se incubează frecvent la 25-30 °C, deşi în cazul anumitor specii e nevoie de temperaturi simţitor mai scăzute. La speciile care de regulă înregistrează latenţă a seminţelor e posibil să fie necesară tratare la rece. Culturile se încep de obicei la întuneric, pentru a se preîntâmpina germinarea precoce, după care se mută într-un mediu cu lumină, pentru a se putea dezvolta clorofila după 1-2 săptămâni de stat în întuneric. MOMENTUL INIŢIERII CULTURII Atunci când se încearcă să se salveze embrioni proveniţi din încrucişări incompatibile este crucial ca respectivele culturi să se înceapă înainte de avortarea embrionilor. Însă de vreme ce este mai greu să se crească embrioni tineri decât cei care au ajuns în faza autotrofică de dezvoltare, şansele de reuşită sunt maximalizate prin lăsarea embrionului să se dezvolte cât mai mult in vivo. Pentru stabilirea momentului cedării endo-spermului şi al avortării embrionilor se pot face examinări histologice, însă astfel de evaluări pot fi foarte laborioase. Culturile de obicei se încep la intervale diferite după polenizare, pentru a spori şansele de salvare a plantelor viabile. Din moment ce se preconizează o interacţiune între medii şi momentul iniţierii culturii, este important ca în momente de cultură diferite să se testeze o gamă întreagă de medii : de la cele complexe, cu concentraţie mare de sucroză, până la cele simple, cu sucroză scăzută.

3.4.PROCEDURILE GENERALE DE SALVARE A EMBRIONILOR CULTURA EMBRIONARĂ Procedura de salvare a embrionilor care se foloseşte cel mai mult este embriocultura, unde embrionii se excizează şi se aşează direct în mediul de cultură. Fructul rezultat din polenizarea controlată a plantelor de seră sau crescute pe câmp se culege înainte de momentul în care se consideră că ar avea loc avortul embrionar. De vreme ce embrionii se află într-un mediu steril, nu este nevoie să se dezinfesteze şi embrionul în sine. În unele cazuri se sterilizează întreaga suprafaţă a ovarului ; în alte cazuri se scot ovulele din ovar în condiţii nonaseptice, iar apoi se dezinfestează. În oricare dintre situaţii, în mod normal se poate face o dezinfestare mai dură, dat fiind că embrionul este protejat de ţesutul înconjurător.

26

Excizarea cu grijă a embrionului este extrem de importantă pentru reuşita culturii embrionare. De regulă este nevoie de un stereomicroscop, care trebuie amplasat în învelitoarea pentru curgerea laminară în aşa fel încât să nu împiedice circulaţia aerului. Cel mai potrivit punct de incizare a ovulului diferă de la specie la specie. În anumite cazuri embrionii se pot extrage prin tăierea capătului micropilar al ovulului şi apoi prin apăsarea uşor a capătului opus al ovulului, pentru ca embrionul să fie împins afară prin deschizătură. Este crucial ca embrionul să se aşeze direct în mediul de cultură după excizare, pentru a nu se usca. În cazul embrionilor mai tineri şi în formă de inimă embrionul va trebui excizat cu suspensorul intact (Hu şi Wang, 1986). Dat fiind că este extrem de important şi adesea foarte greu să nu se excizeze embrioni fără a-i afecta, ar fi util să se creeze şi să pună în parctică o tehnică de excizare în condiţii nonaseptice. Cultura embrionară este uneori precedată de cea ovulară sau ovariană. Unul din avantajele acestei tehnici (numite câteodată cultură ovulo-embrionară sau ovaro-embrionară) este ca excizarea embrionului să se amâne până când acesta devine îndeajuns de mare ca să se poată scoate fără a se strica. De asemenea, s-a constatat că prezenţa intetegumentului în timpul culturii ovulare sau ovariene reduce riscul de germinare precoce (Ramming, 1990). Odată excizat, embrionul poate intra în contact direct cu mediul. În plus, în cazul speciilor afectate de latenţă scoaterea embrionului ar putea elimina eventualele efecte inhibatoare induse de ţesuturile ovulare din jur. La salvarea de embrioni s-au folosit culturi de răsaduri (William şi alţii, 1982). Această tehnică presupune inserarea embrionului dintr-o încrucişare incompatibilă în endospermul scos dintr-o încrucişare compatibilă înrudită. Spre exemplu, embrionul unui hibrid interspecific se poate introduce în endospermul dintr-o încrucişare intraspecifică în care este implicată una din speciile parentale, după care embrionul şi endospermul se aşează împreună în cultură. CULTURA OVULARĂ Embronii sunt greu de excizat atunci când sunt foarte tineri sau provin de la specii cu seminţe mărun-te. Pentru a nu-i afecta în timpul procesului de excizare, uneori ei se pun la crescut în mediul de cultură de când se află încă în interiorul ovulului. Această tehnică se numeşte ovulo-cultură sau embriocultură in ovolo. Ca la cultura embrionară, ovarele se strâng înainte de momentul în care se presupune că ar putea interveni avortul. Se sterilizeză suprafaţa ovarului, iar ovulele se scot şi se aşează în cultură. Această fază poate fi de la extrem de uşor de realizat – în cazul speciilor cu seminţe/sâmburi mari, în care este prezent numai un singur ovul – până la greu de făcut sau foarte îndelungată – în cazul speciilor poliovulate cu seminţe/sâmburi mici. Pentru excizarea ovulelor e posibil să fie nevoie de 27

stereomicroscop. În plus, s-a constatat că introducerea de ţesut placentar în culturile ovulare este benefică la anumite specii (Rangan, 1984). Recent s-au operat modificări la tehnica standard de ovulo-cultură pentru utilizarea la piersic (Prunus persica [L.] Batsch) (Pinto şi alţii, 1994). Una dintre tehnici – perforarea ovulului – presupune realizarea de găurele în fiecare ovul chiar înainte de aşezarea acestuia în mediul de cultură. Aceste perforări, care trebuie făcute cu grijă pentru a nu se afecta embrionii, sporesc absorbţia de apă şi de substanţe nutritive. S-au creat două tipuri de sisteme de sprijinire a ovulelor : cel cu hârtie de filtru presupune creşterea de ovule în partea de sus a hârtiei de filtru aşezate deasupra mediului lichid, în vreme ce tehnica cu silicat de mică implică aşezarea ovulelor cu partea micropilară în jos, într-un amestec de mediu steril lichid cu silicat de mică (sprijinul cu silicat de mică). Sistemul de perforare ovulară şi cel cu silicat de mică e posibil să nu se poată pune în practică la speciile cu seminţe mici, însă mărimea ovulelor n-ar trebui să limiteze testarea sistemului de sprijin cu hârtie de filtru la alte specii decât piersicul.

CULTURA OVARIANĂ În cazul culturii ovariene sau al celei cu pastăi, în cultură se aşează ovarul întreg. Se adună ovarele şi se iau jos eventualele părţi rămase din flori. Prin protocoalele de dezinfestare va trebui să se cureţe suprafaţa de substanţele contaminante fără a se afecta ovarul, după care ovarul se aşează în cultură cu capătul tăiat al pedicelului în mediu. La sfârşitul experimentului se scot seminţele din fructul care se dezvoltă în cultură. La salvarea embrionilor de hibrizi interspecifici de Tulipa s-a folosit o tehnică numită “cultura cu felii de ovar” (Van Creij şi alţii, 1999) : ovarele s-au tăiat pe transversală în secţiuni, iar capătul tăiat de la bază s-a aşezat în mediul de cultură. La Tulipa cultura ovulară şi cea cu felii de ovare a dus la procente de germinare asemănătoare, însă procedura referitoare la cultura cu felii de ovare s-a considerat superioară celor două tehnici, deoarece nu a presupus atât de mult timp.

28

http://www.biology.gatech.edu/people/index.php?id=jerry-pullman

29

II. PARTEA EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL 4 4.1. MATERIALE ŞI METODE 4.1.1. 4.1.2.

CAPITOLUL 5

REZULTATE ŞI DISCUŢII

30

5.1. CAPITOLUL 6

CONCLUZII CAPITOLUL 7

Bibliografie EXEMPLU Burnette, F.S., 1977. Peroxidase and its relationship to food and quality. A review. J. Food Sci, 42: 1-5. Chow, I., Watts, B.M., 1966. Origin of off-odors in frozen green beans.Food Technol., 23: 113114. Hartzler, E.R., Guerrant, N.B., 1952. Effect of blanching and of frozen storage of vegetables on ascorbic acid retention and the concomitant activity of certain enzymes. Food Res., 17: 15-29.

31