Exercices de Chromatographie [PDF]

Zitiervorschau

Exercices

de

chromatographie

:

Exercice 1 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 ml / min) : MM

tr (min)

Aldolase

145000

10,4

Lactate déshydrogénase

135000

11,4

Phosphatase alcaline

80000

18,4

Ovalbumine

45000

26,2

Lactoglobuline

37100

28,6

1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve Que remarquez-vous ? 2 - Pour la glucokinase, tr = 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du graphique précédent. Existe t'il une autre méthode pour déterminer la MM ?

Correction exercice 1 :

1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appelée : tamisage moléculaire, gel filtration, perméation de gel). La connaissance du débit de la colonne (5 ml / min) et des différents temps de rétention nous permet de calculer le volume d'élution pour chaque composé (voir tableau), selon la relation : Ve (volume d'élution) = d (débit) x tr (temps de rétention) La représentation graphique du log de la masse moléculaire (log MM) qu'il faut calculer préalablement (voir tableau) en fonction du volume d'élution (Ve) nous donne une droite : MM

Log MM

tr (min)

Ve (ml)

Aldolase

145000

5,16

10,4

52

Lactate déshydrogénase

135000

5,13

11,4

57

Phosphatase alcaline

80000

4,9

18,4

92

Ovalbumine

45000

4,65

26,2

131

Lactoglobuline

37100

4,57

28,6

143

Le

fait

de

visualiser

une

droite

signifie

qu'aucune

protéine

n'est

exclue

du

gel.

2 - La glucokinase, avec un temps de rétention de 21 min, est éluée à un volume d'élution de 5 x 21 = 105 ml. Il suffit de se reporter au graphe pour déterminer un log de MM = 4,82 environ, soit une masse moléculaire de 66070 Da (ou 66070 g/mol ou 66,07 kDa), environ. Ici, on a tracé le logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution : log MM = f (V e). L'autre représentation serait de porter le logarithme de la masse moléculaire en fonction du KAV, le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f (KAV). KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm) Mais pour cela, il faudrait connaître le volume mort (Vm) et le volume total de la colonne (Vt).

Exercice 2 : On veut séparer 3 acides-aminés : l'acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3 ). Les pH isoélectriques de l'acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, à 25 °C . On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en amenant progressivement le pH à 7.

Question :

1 - Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interactions acide aminé-résine sont uniquement d'ordre électrostatiques). Correction

exercice

2

:

1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie échangeuse d'ions. Une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3 ) est chargée négativement et est donc une résine échangeuse de cations. Lorsque le pH est supérieur au pHi (pH > pHi), l'acide aminé est chargé négativement (forme anionique). Lorsque le pH est inférieur au pHi (pH < pHi), l'acide aminé est chargé positivement (forme cationique). Le tableau ci-dessous donne les charges des 3 acids aminés, à pH = 2 et à pH = 7. acide aminé :

pHi charge : à pH =charge 2: à pH = 7 :

Acide L-Glutamique (Glu) 3,22 L-Leucine (Leu) 5,98 L-Lysine (Lys) 9,74

+ + +

+

Ainsi, à pH = 2, les trois acides aminés sont chargés positivement, et seront retenus lors du passage sur la colonne. A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargés négativement, seront élués. Lys reste fixé à la colonne. Glu est élué en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98). Exercice 3 : La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxyméthyls (-CH2-COOH). Questions

:

1 - Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76). 2 - Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose à pH 7 ? (On considérera que les interactions protéine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre électrostatiques).

Correction

exercice

3

:

1 - Proportion des groupements carboxyméthyls (pKa = 4,76) chargés négativement aux pH : 1, 4,76, 7 et 9. Le pH est donné par la relation suivante :

À pH = 1 :

= pH - pKa = 1 - 4,76 = -3,76

-4

donc :

-4

= 1,74 10

-4

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 1,74 10 .(A),

on en déduit que (A) + 1,74 10 .(A) = 100

(A)

=

est

mis

en

facteur

:

(A)

100

/(1

+

1,74

-4

10 )

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,98 % et (B) = 0,02 %

À pH = 4,76 :

= pH - pKa = 4,76 - 4,76 = 0

donc :

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), (A)

est

mis

en

facteur

=1

on en déduit que (A) + (A) = 100 :

(A)

=

100

/(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %

À pH = 7 :

= pH - pKa = 7 - 4,76 = 2,24

donc :

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), (A)

est

mis

en

facteur

:

= 173,78

on en déduit que (A) + 173,78(A) = 100 (A)

=

100

/(174,78)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) = 99,425 %

À pH = 9 :

= pH - pKa = 9 - 4,76 = 4,24

donc :

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), (A)

est

mis

en

facteur

:

= 13378

on en déduit que (A) + 13378(A) = 100 (A)

=

100

/(13379)

-3

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 5,73 10 % et (B) = 99,994 %

Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-CH2-COOH). À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme basique (-CH2-COO )

2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,425 % sous forme basique, chargée négativement (-CH2-COO ). Protéine :

pHi :

Charge à ph = 7 :

Ovalbumine Cytochrome c Lysozyme

4,6 10,65 11

négative positive positive

Ainsi, seule l'ovalbumine, qui à pH = 7 est chargée négativement, ne sera pas retenue sur la colonne. Le cytochrome c et le lysozyme seront retenus.

Exercice 4 : La diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d'anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements diéthylaminoéthyls : CH2-CH3 / -CH2-CH2- NH+ \ CH2-CH3

Questions

:

1 - Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargés positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considérera que le pK de l'amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4). 2 - Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (pHi = 4,9), Uréase (pHi = 5), Chymotrypsinogène (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAEcellulose ? (On considérera que les interactions protéine-DEAE-cellulose sont uniquement de type électrostatiques).

Correction

exercice

4

:

1 - Proportion des groupements diéthylaminoéthyls (DEAE : pKa = 9,4) chargés négativement aux pH : 2, 7, 9,4 et 12. Le pH est donné par la relation suivante :

À pH = 2 :

= pH - pKa = 2 - 9,4 = -7,4

-6

donc : -6

= 3,98 10

-6

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 .(A),

on en déduit que (A) + 3,98 10 .(A) = 100

(A)

=

est

mis

en

facteur

:

(A)

100

/(1

+

3,98

-6

10 )

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = environ 100 % et (B) = 0 %

À pH = 7 :

= pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4

-3

donc : -3

= 3,98 10

-3

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 .(A),

on en déduit que (A) + 3,98 10 .(A) = 100

(A)

=

est

mis

en

facteur

:

(A)

100

/(1

+

3,98

-3

10 )

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,996 % et (B) = 0,004 %

À pH = 9,4 :

= pH - pKa = 9,4 - 9,4 = 0

donc :

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), (A)

est

mis

en

facteur

=1

on en déduit que (A) + (A) = 100 :

(A)

=

100

/(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %

À pH = 12 :

= pH - pKa = 12 - 9,4 = 2,6

donc :

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 398,1(A), (A)

est

mis

en

facteur

:

(A)

= 398,1

on en déduit que (A) + 398,1(A) = 100 =

100

/(1

+

398,1)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,25 % et (B) = 99,75 %

Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements + diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-NH ). À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme basique (-N)

2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,996 % sous forme acide, chargée positivement.

Protéine :

pHi :

Charge à ph = 7 :

Sérumalbumine Uréase Chymotrypsinogène

4,9 5 9,5

négative négative positive

Ainsi, à pH = 7 la sérumalbumine et l'uréase sont chargées négativement, et seront donc retenues sur la colone. Le chymotrypsinogène ne sera pas retenus. Exercice 5 : Le coefficient de partage de l'iode (I2) entre les deux solvants non-miscibles : tétrachlorométhane et eau, est égal à 100 à 25 °C. À 10 ml de solution aqueuse d'iode à 10 g/l, on ajoute 10 ml de tétrachlorométhane (CCl4). Donnée

: I2 est

plus

soluble

dans

le

tétrachlorométhane

que

dans

l'eau.

Question : Déterminer la concentration en iode dans le tétrachlorométhane et dans l'eau, après agitation et décantation.

Exercice 6 : On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d'une protéine p par chromatographie d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM. L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les volumes d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant : MM (Da)

Ve (ml)

Dextran

2000000

45

Fibrinogène

340000

60

Catalase

230000

75

Lactoglobuline

19000

132

Questions : 1

- Rappeler

à

quoi

correspond

le

Dalton.

2 - La protéine p montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM. Correction

exercice

6 -27

1 - Le Dalton est une unité de masse atomique et correspond à 1,66 . 10 kg. La masse moléculaire d'u composé s'exprimera soit en dalton (Da), soit en grammes par mole (g/mol). Noter que l'abréviation de dalto s'écrit avec un Dmajuscule : Da et que le kilodalton s'écrit kDa

2 - Afin de déterminer la masse moléculaire (MM) de la protéine p (Ve = 113 ml), il faut au préalable tracer représentation du log (masse moléculaire) = f(Ve). Le schéma ci-dessous représente le tracé de log (MM) f(Ve) pour les composés suivants : Dextran, Fibrinogène, Catalase et Lactoglobuline.

Une colonne a été rajoutée dans le tableau pour le calcul du log de la masse moléculaire

MM (Da)

Ve (ml)

log MM

Dextran

2000000

45

6,3

Fibrinogène

340000

60

5,53

Catalase

230000

75

5,36

Lactoglobuline

19000

132

4,28

Il suffit de reporter sur le tracé : log (MM) = f(Ve), le volume de 113 ml pour en déduire un log MM = 4,93, so une masse moléculaire de 85114 Da ou 85114 g/mol pour la protéine p

Il

est

très

important

de

noter

que

- 45 ml représente le volume mort de la colonne, c'est à dire le volume d'élution des substances exclues (ici, dextran). -

132

ml

représente

le

volume

d'exclusion

des

protéines

totalement

incluse

- la droite a été traçée en ne tenant compte que des points correspondants au fibrinogène et à la catalase, ca le dextran est un composé totalement exclu, alors que la lactoglobuline est une protéine totalement inclus dans le gel. Ainsi, il aurait été totalement faux de tracer une droite à partir des points correspondant à catalase et la lactoglobuline (qui sont les protéines dont les volumes d'élution encadrent celui de la protéin

p).

Exercice 7 : Une enzyme a été purifiée en trois étapes, en partant de 1000 g d'un extrait brut contenant au tot 20000 unités de cette enzyme Questions 1 - Compléter le tableau ci-dessous : protéine (g) :

activité (UE) :

Extrait brut

1000

20000

Chromato. d'exclusion

200

14000

Chromato. d'échange d'ions

15

4500

Chromato. d'affinité

0,5

3500

taux de purification :

rendement :

2 - Quelles conclusions peut on tirer de cette étude ? Correction Afin

de

exercice remplir

le

tableau,

7

il

faut

connaître

:

quelques

définitions

:

- L'activité spécifique (AS) représente un nombre d'unités enzymatiques (UE) par gramme de protéines (g) : AS = (UE / g)

- Le taux de purification d'une enzyme est le rapport de l'AS mesurée après une étape de purification, sur l'AS mesurée à l'étape précédente : Taux de purification = AS après une étape / AS avant cette même étape

- Le rendement correspond à un nombre d'UE mesuré après une étape de purification, sur un nombre d'UE mesuré à l'étape précédente : Rendement = UE après une étape / UE avant cette même étape

Connaissant ces définitions, on peut remplir le tableau. Il faudra rajouter une colonne supplémentaire "AS" qui nous permettra de calculer le taux de purification :

protéine (g) :

activité (UE) :

AS :

taux de purification :

rendement :

Extrait brut

1000

20000

20

-

-

Chromato. d'exclusion

200

14000

70

3,5 fois

70 %

Chromato. d'échange d'ions

15

4500

300

4,28 fois

32 %

Chromato. d'affinité

0,5

3500

7000

23,3 fois

77,7 %

On

pourra

utilement

calculer

:

- Le taux global de purification, qui est égal à l'AS mesurée à la fin de toutes les étapes, divisée par

celle

de

- Le

départ.

Ici,

rendement

le

taux

global

global qui

est

de

purification

égal

à

est

3500

égal /

à

7000

20000

/ =

20

=

350.

17,5

%,

Conclusion : Suite aux différentes étapes de purification, on a pu récupérer 3500 unités, sur les 20000 que l'on avait au départ, soit 17,5 %. L'enzyme a été purifiée 350 fois. Exercice 8 : Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6. Question

:

1 - Dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ?

Correction exercice 8 : Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6.

Question

:

dans

quel

ordre

peut-on

prévoir

la

sortie

de

ces

acides

aminés

?

Si les trois acides aminés ont été retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a été réalisée à un pH inférieur au plus petit des pHi, soit un pH inférieur à 2,87, afin que les acides aminés se présentent sous une forme chargée positivement et qu'ils puissent être retenus sar la résine échangeuse de cations, chargée négativement.

Acide aminé :

pHi

Charge à pH < 2,87

Charge à pH 6

Asp

2,87

+

-

Leu

6

+

neutre (50%/50%)

Arg

10,76

+

+

À un pH de 6, Asp est chargé négativement; il est donc élué de la colonne. La leucine est ensuite éluée. L'Arginine, toujours chargée positivement à pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas éluée. Exercice 9 : Un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM = 67000 Da) est déposé sur colonne de séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da). Rappel

:

MM

=

masse

moléculaire.

Question : 1 - Tracer un diagramme d'élution vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le volume mort. Correction exercice 9 : Voici un diagramme d'élution vraisemblable pour une chromatographie d'exclusion séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da), sur laquelle on aurait déposé un un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM = 67000 Da).

Ici on a représenté la mesure de la densité optique (DO) de l'éluat en fonction du volume d'élution (Ve).:

Les IgG présentent une masse moléculaire supérieure à la valeur de la limite d'exclusion de la colonne (100000 Da). Elles seront donc éluées en premier, et donneront la valeur du volume mort de la colonne (Vm = Ve IgG) L'albumine de masse moléculaire 67000 g/mol, sera incluse dans le gel et éluée plus tard, avec un Ve albumine qui est égal à Vm + Ve' albumine.

Exercice 10 : On veut réaliser la séparation de 5 acides aminés (Glu, Met, Tyr, Lys, Ser). On utilise pour cela 5 de résine sèche de polystyrène sulfoné que l'on dispose dans une colonne ouverte. La résine est lavée pa une solution d'HCl (1 M) en excès. Après ce traitement, la résine est lavée à l'eau distillée. On fait alors passe une solution de NaCl (2 M) en excès. Le filtrat correspondant est recueillit dans sa totalité et est dosé par 11 ml de NaOH (1 M Questions

1 - Commenter les opérations effectuées (écrire sommairement les équations mises en jeu) et en déduire capacité de rétention de la résine

2 - Les 5 acides aminés à séparer sont solubilisés dans un tampon à pH = 3,8. A ce pH, quels sont le composés qui seront retenus sur la résine

3 - Après avoir chargé la colonne par les 5 acides aminés préalablement solubilisés dans le tampon à pH 3, l'élution est réalisée en gradient de pH, en augmentant le pH. Dans quel ordre les acides aminés vont-ils êtr élués On se servira des données ci-après : acide aminé :

pK - COOH

pK - NH2

pK -R

Glu

2,19

9,67

4,25

Met

2,28

9,21

-

Tyr

2,20

9,11

10,07

Lys

2,18

8,95

10,53

Ser

2,21

9,15

-

Exercice 11 : Soit un mélange de 2 polypeptides A et B, et d'un octapeptide C. La composition globale e acides aminés, pour chacun de ces peptides, est la suivante : Nombre de résidus : pKa

peptide A

peptide B

peptide C

12

8

12

2

Lys

10

12

16

1

Glu + Asp

4,5

13

10

-

6

2

8

-

Arg

His Cys

8

2

1

1

- NH2

7,8

2

1

1

- COOH

3,8

2

1

1

Questions 1 2

- Que -A

pH

peut =

4,5,

quelles

on sont

dire les

charges

du globales

peptide de

A,

A B

et

C

3 - On veut séparer ces trois composés par chromatographie échangeuse d'ions. Quel type de résine alle vous choisir

4 - A pH = 4,5, ces composés sont-ils fixés sur la résine ? Comment éluer les produits fixés ? Quel sera l'ordr d'élution des composés retenus ? A quel pH élue t'on le peptide C ? Conclusions ? Exercice 12 : Le chromatogramme suivant représente le profil d'élution de trois acides aminé (1, 2 et 3) :

Questions 1

- Quel

est

le

type

de

chromatographie

utilisé

?

Exposer

son

principe

(une

demi-page

2 - En vous aidant du tableau ci-dessous, déterminer quels peuvent être les acides aminés élués. Amino-acide :

pHi :

Amino-acide :

pHi :

Glycine

5,97

Asparagine

5,41

Alanine

6,02

Acide glutamique

3,22

Valine

5,97

Glutamine

5,65

Leucine

5,98

Lysine

9,74

Isoleucine

6,02

Arginine

10,76

Sérine

5,68

Histidine

7,58

Thréonine

6,53

Phénylalanine

5,98

Cystéine

5,02

Tyrosine

5,65

Méthionine

5,75

Tryptophane

5,88

Acide aspartique

2,87

Proline

6,10

3 - Quelle technique chromatographique peut-on utiliser pour séparer deux acides aminés de même pHi ?

Exercice

13

: Séparation

des

esters

méthyliques

d'acides

gra

L'estérification des acides gras d'un corps gras naturel (un mélange de triglycérides) peut être réalisée e incubant le corps gras avec du trifluorure de bore (catalyseur de la réaction) dans le méthanol (CH 3-OH donneur des groupements méthyls), à 100°C durant 15 mi

Le chromatogramme ci-dessous représente le profil d'élution d'esters méthyliques d'acides gras saturés insaturés repris dans l'hexane après injection en chromatographie en phase gazeuse. Le temps de rétentio (tr) est indiqué en minutes, au-dessus de chaque pic :

tr :

aire (%) :

8.98

30.783

17.16

15.976

19.00

29.293

22.90

14.636

29.32

8.761

Questions

1 - Quel est le principe de la chromatographie utilisée ? Il existe deux techniques pour une tel chromatographie. Donnez en les principes en quelques lignes

2 - Le standard interne est ici l'acide stéarique (C18:0) qui présente un temps de rétention de 17,16 minutes. l'aide du tableau ci-dessous, déterminer la nature des autres acides gras élués. Que représente le premier p (tr : 1,7 min) ? Selon quel(s) critère(s) les acides gras sont-ils élués ? acide gras :

rapport tr / tr C18:0 :

ac. laurique (C12:0)

0,12

ac. myristique (C14:0)

0,25

ac. palmitique (C16:0)

0,53

ac. stéarique (C18:0)

1

ac. oléique (C18:1 ; 9)

1,11

ac. linoléique (C18:2 ; 9, 12)

1,33

ac. linolénique (C18:3 ; 9, 12, 15)

1,71

ac. arachidique (C20:0)

1,88

ac. arachidonique (C20:4 ; 5, 8, 11, 14)

3,24

3 - Calculer la masse des différents produits dans l'échantillon, sachant que l'on a injecté 132 microgramme d'esters méthyliques d'acides gras saturés et insaturés.

Exercice 14 : Un corps gras naturel constitué d'un mélange de triglycérides (TG), est soumis à l'action de lipase pancréatique. Cette enzyme permet l'hydrolyse des acides gras en position 1 et 3 des TG, ce qui mène des acides gras libres (AGL) et des 2-monoglycérides (2-MG), lorsque la réaction est totale. Les AGL ont é purifiés à partir du lipolysat par chromatographie échangeuse d'anions. Cette chromatographie permet, outr la fraction AGL, de purifier une seconde fraction constituée de glycérides neutres (GN). Différents échantillon ont été analysés en chromatographie sur couche mince (gel de silice). Le mélange de solvant utilisé, d polarités différentes, étant : éther de pétrole / éther diéthylique.

Les 1

dépôts :

effectués Témoin

sont Triglycérides

(T

2 3 4 5 6 7

:

Témoin : : :

: :

Echantillon Echantillon

Fraction Fraction

1,

2-Diglycérides Témoin Témoin

Echantillon Glycérides Neutres Acides Gras Libres

et

1, Monoglycérides Acides

milieu (GN) provenant de (AGL) provenant de

la la

3-Diglycérides

de chromatographie chromatographie

échangeuse échangeuse

(D (M Gra lipoly d'anio d'anio

Questions

1 - Donner en quelques lignes le principe de la chromatographie sur couche mince utilisée. En fonction d quel(s) critère(s) les différents composés vont-ils être séparés 2

- Ecrire

la

réaction

mettant

en

jeu

les

TG

et

la

lipase

pancréatique

3 - Analyser le chromatogramme ci-dessus. Est-ce que la réaction de lipolyse est totale ?

Exercice 15 : Un corps gras naturel, constitué d'un mélange de triglycérides (TG) est analysé e chromatographie sur couche mince. La plaque de gel de silice est uniformément imprégnée de nitrate d'argen (AgNO3) puis mise à sécher 1 heure, avant d'effectuer les dépôts à analyser. Les sels d'argent sont en eff capables de former une liaison non covalente et réversibles avec les chaînes carbonée insaturées (présentan des doubles liaisons)

1

: Témoin

tri-stéarin

2 3

: Témoin : Echantillon

du

di-oléo-stéarin gra

corps

La plaque est ensuite placée dans une cuve de chromatographie. Le solvant de migration est le chlorure d méthylène. On

rappelle

ac. ac. ac. ac. ac.

laurique myristique palmitique stéarique oléique

:

(C12: (C14: (C16: (C18:

: : : :

(C18:1

;

Questions 1

- Donner

brièvement

le

principe

de

la

chromatographie

utilisée

2 - Analyser le chromatogramme ci-dessus. Donner la composition des TG du corps gras analysé.

ic

Exercice 6 :

Nous désirons étudier les protéines plasmatiques. Dans un premier temps, nous réalisons une électrophorèse sur gel d’agarose à pH = 9 afin de séparer les différentes protéines.

1/ Sachant que les protéines plasmatiques ont un pH isoélectrique inférieur à 8,8, quelle est leur charge ?

2/ En déduire le sens de migration des protéines.

3/ Dans ces conditions, l’albumine a la plus grande mobilité. Qu’en déduire sur la migration de l’albumine par rapport aux autres protéines ?

4/ Une électrophorèse en veine liquide a permis de déterminer que dans ces mêmes conditions la mobilité de l’albumine est de 10.10-7 m².s1.V-1 en valeur absolue. L’albumine sera supposée sphérique et de rayon R = 10-10 m. Calculer la charge de l’albumine.

5/ Quelle sera la distance de migration observée en 1 minute ?

6/ Nous désirons déterminer la masse molaire de l’albumine. Pour cela, nous réalisons une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. Les résultats sont donnés dans le tableau ci-après.

Tableau 1 : Distances de migration de protéines de masse molaire connue. Anhydrase carbonique Ovalbumine Malate deshydrogénase Phosphorylase b

Masse molaire (g.mol-1) 30 000 43 000 60 000 94 000

Distance de migration (mm) 85,2 70,5 51,7 19,4

6-1/ Pourquoi effectuer cette électrophorèse en présence de SDS ?

6-2/ Tracer la droite d’étalonnage.

6-3/ Déterminer la masse molaire de l’albumine sachant que sa distance de migration est de 40,8 mm. Données :

η = 10-3 Pa.s U = - 120 V L = 15 cm.

Exercice 7 : Nous réalisons une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. L’électrophorèse est réalisée en présence de témoins de masse moléculaire traités, comme l’échantillon protéique à analyser, par un mélange urée 8 M / SDS 1% / tampon pH = 8,6. 1/ Rappeler le principe général de l’électrophorèse. 2/ Donner les caractéristiques du support utilisé. 3/ Quelle est la charge probable de la majorité des protéines à pH = 8,6 ? 4/ Donner la formule développée du dodécyl sulfate de sodium. 5/ Expliquer le mode d’action du SDS sur les protéines. 6/ Quelle est l’action de l’urée ? Le résultat de l’expérience est donné par la figure n°1 ci-dessous. Figure 1 : Electrophorégramme des protéines dans les conditions urée 8 M / SDS 1% / tampon pH = 8,6.

7/ Situer l’anode et la cathode sur un schéma (rapide) de l’électrophorégramme. 8/ En déduire un encadrement de la masse molaire de l’échantillon. Exercice 8 : On considère une installation d’électrophorèse capillaire comportant un capillaire de verre de silice non-traitée, à « paroi négative », de longueur totale L = 1 m et de longueur utile l = 90 cm (jusqu’au détecteur). La ddp appliquée aux bornes du capillaire est de 20 kV. Le détecteur est situé vers l’extrémité cathodique du capillaire. L’électrolyte est un milieu tampon de pH 5. Un composé présent dans l’échantillon a un temps de migration tm = 10 min. 1) Peut-on en déduire si la charge nette portée par ce composé est positive ou négative ? 2) Calculer la mobilité électrophorétique apparente app de ce composé.

3) Sachant qu’un marqueur neutre a un temps de migration t mn de 5 min, en déduire la valeur du flux électro-osmotique EOS. 4) Calculer la mobilité électrophorétique EP du composé. En déduire le signe de sa charge nette. 5) Que se passerait-il si on utilisait un capillaire à paroi traitée pour la rendre neutre ? 6) En supposant que le pHi du composé soit de 4, quel sera le signe de sa charge nette si on abaisse le pH de l’électrolyte à 3 ?

XERCICE 1 L'isolement et les analyses préliminaire d'une enzyme E ont révélés sa présence sous deux formes E1 et E2 possédant respectivement les pHi 6,25 et 6,35. Les deux formes sont constituées chacune de 4 monomères appelés A1, B1, C1 et D1 pour la forme E1 et A2, B2, C2 et D2 pour la forme E2 Les masses moléculaires des monomères de types A, B, C et D sont 60000, 30000, 20000 et 10000, respectivement. Seuls les monomères de types B et C sont reliés par des ponts dissulfures. Les valeurs des pHi de chaque monomère sont données dans le tableau suivant : Forme E1

Forme E2

Monomère

pHi

Monomère

pHi

A1 B1 C1 D1

6,3 6,3 6,1 6,3

A2 B2 C2 D2

6,5 6,3 6,1 6,3

L'association des deux monomères de types B et C possède un pHi de 6,2 Trois électrophorèses bidimensionnelles (E2D) ont été réalisées sur l'enzyme E : E2D N°1: Première dimension : isoélectrofocalisation non dénaturante Deuxième dimension : Electrophorèse en présence de SDS et de ßmercaptoéthanol E2D N°2 : Première dimension : isoélectrofocalisation en présence d'urée 9M Deuxième dimension : Electrophorèse en présence de SDS et de ß-mercaptoéthanol E2D N°3 : Première dimension : isoélectrofocalisation en présence d'urée 9M et de ß-mercaptoéthanol Deuxième dimension : Electrophorèse en présence de SDS et de ßmercaptoéthanol Etablir les électrophorégrammes correspondant pour chacune des 3 éléctrophorèses bidimensionnelles. Annoter les polarités et les composants de

chaque bande ou tache. Justifier vos réponses

EXERCICE 2 QUESTION 1: L'étude biochimique approfondie d'une protéine a permis d'élucider sa structure oligomérique comme étant une composition de deux chaînes A (PM : 20 Kd chacune) et deux Chaînes B (PM : 40 Kd chacune) liées par des liaisons faibles et des ponts dissulfure suivant le schéma ci-dessous :

Avant d'analyser la protéine par électrophorèse sur gel de polyacylamide en présence de SDS, trois traitements différents ont été réalisés : Traitement 1 : incubation de la protéine en présence de SDS 1% (p/v) et urée 8 M. Traitement 2 : incubation de la protéine en présence de SDS 1% (p/v), urée 8 M et Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v). Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v) Traitement 3 : incubation de la protéine en présence du Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v), uniquement. 1. Rappeler le rôle des composés : SDS, DTT et urée. 2. Schématiser les profils électrophorétiques correspondant à chaque traitement de la protéine. Justifier votre réponse. QUESTION 2: Afin d'étudier par voie de la protéomique les changements affectant des cellules cancéreuses chez l'Homme, des auteurs ont procédé à la préparation d'échantillons protéiques à partir de cellules saines et de cellules malades. Le tampon de lyse utilisé dans cette étude est constitué d'une solution contenant, entre autres, CHAPS (détergent non ionique) 4% (p/v) et Tris-HCl (pH 7,8) 40 mM. L'électrophorèse en première dimension est une isoélectrofocalisation sur un gradient de pH 4,7-5,9 effectuée dans un tampon composé de l'urée 8 M, CHAPS 2% (p/v), Ampholyte 0,2% (p/v), Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v) et le bleu de Bomophénol 0,001% (p/v) Avant la réalisation de l'électrophorèse SDS-PAGE (deuxième dimension), les gels de la première électrophorèse ont subit l'équilibration dans deux tampons

de compositions suivante : 1er tampon d'équilibration (pH 7,0): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5 M, SDS 2% (p/v) et DTT 130 mM. 2ième tampon d'équilibration (pH 7,8): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5 M, SDS 2% (p/v) et iodoacétamide 135 mM. L'électrophorèse en SDS-PAGE a été réalisée sur un gradient 4-20% en polyacrylamide dans un tampon de pH 8,3 contenant Tris 25 mM, Glycine 192 mM et SDS 0,1% (p/v). Après coloration, trois protéines ; P1, P2 et P3 d'intensité variable selon l'état des cellules (normales ou cancéreuses) apparaissent sur les gels de la deuxième dimension. Elles sont identifiées par leurs coordonnées de points isoélectriques (PI) et de poids moléculaires (PM) qui sont (4,8, 20), (5,3, 40) et (5,8, 80) pour P1, P2 et P3. La figure suivante représente une zone du protéinogramme couvrant les PI de 4,7 à 5,9 et les PM de 20 Kd à 80 Kd. Les 3 protéines d'intérêt sont indiquées par une flèche.

Les protéinogrammes de la deuxième dimension ont été comparés à ceux de la base de données SWISS-2-DPAGE (http://expasy.org/ch2d). Après leur élution des gels, les protéines d'intérêt ont été soumises à une digestion par la trypsine dans un mélange constitué de bicarbonate d'ammonium 25 mM et de la trypsine 0,02% (p/v). Les peptides résultant de l'action de la trypsine sont identifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les empreintes peptidiques obtenues sont comparées à la base de données Suiss-Prot ave le moteur de recherche MASCOT. 1/ Préciser les quantités ou les volumes des réactifs nécessaires pour la

préparation de : - 70 ml du deuxième tampon d'équilibration - 150 ml de tampon d'électrophorèse SDS-PAGE. On donne les PM suivants : urée : 60,06, Tris : 121,14, iodoacétamide : 184,96, Glycine : 75,07 2/ Rappeler le rôle du CHAPS et de l'iodoacétamide 3/ Rappeler le mode d'action de la trypsine 4/ Rappeler la signification d'une empreinte peptidique générée par spectromètrie de masse MALDI-TOF. 5/ Préciser sur l'électrophorégramme les protéines P1, P2 et P3. Justifier vos réponses