Totalizarea 2 [PDF]

Zitiervorschau

TEMA1: ACȚIUNEA FACTORILOR DE MEDIU AMBIANT ASUPRA MICROBILOR. STERILIZAREA. METABOLISMUL MICROBIAN 1. Acțiunea factorilor fizici asupra microorganismelor (căldura, temperaturi joase, desicare, presiune osmotică, ultrasunet, radiații) Activitatea bacteriilor se realizeaza intr-un complex de factori fizici, chimici si biologici. Rezultatul actiunii acestor factori este in functie de: intensitatea actiunii factorului, timpul de actiune asupra celulei bacteriene, conditiile de mediu nutritiv sau natural, structura celulei (prezenta capsulei, sporilor) si sensibilitatea bacteriei ca specie sau individ. Deci principalii agenti fizici care pot actiona asupra microorganismelor sunt temperatura (caldura sau frigul), uscaciunea (desicarea), pH-ul, presiunea osmotica, radiatiile, ultrasunetele, electricitatea si filtrarea precum am mentionat. 1.Temperatura - Speciile microbiene au, aproape fiecare dintre ele, o temperatura zisa “optima” si anumite limite sub care si peste care dezvoltarea este stanjenita. Astfel, din punct de vedere al temperaturii optime bacteriile se clasifica in: · mezofile – specii patogene sau conditionat patogene adaptate la o temperatura optima de 37-38˚C, temperatura corpului uman, cu limite intre 25-34˚C/ 10-45˚C; · psihrofile (criofile) – care cuprind microorganismele a caror temperatura optima este intre 15-20˚C cu limite intre 0 si 20˚C/ 0-35˚C; · termofile – includ bacteriile de putrefactie a gunoaielor a caror temperatura optima este intre 50-53˚C cu limitele intre 50-80˚C (85˚C- bacteriile din gheizere). Bacteriile suporta relativ usor temperaturile joase.Culturile de microorganisme in stare congelata pot fi conservate in conditii de laborator mai mult de 80 de ani. Temperaturile joase frineaza procesele de putrefactie si de fermentare.Doar unele specii patogene ( meningocoul, gonococul etc . ).sint foarte sensibile la temperaturi joase. Microorganisemele termolabile mor destul de repede chiar si la o refrigerare de scurta durata. La temperaturi joase se produce incetinerea proceselor metabolice, moartea bacteriilor prin imbatrinere si subalimentare, distrugerea celulelor sub influenta sporirii toxicitatii ionilor. O influenta nociva exercita asupra microorganismelor temperatura inalta. Majoritatea bacteriilor asporogene mor la temperatura de 58˚-60˚ C in curs de 30-60 min., la 100˚ C – in timp de 2-3 min. Bacteriile siliciufixatoare isi pastreze viabilitatea chiar dupa o expunere la o temperatura de 160˚ C . Sporii bacililor si clostriidiilor sunt mai rezistenti decit formele vegetative. La baza actiunii bactericide a temperaturilor inalte rezida distrugerea ribozomilor, dezintegrarea structurii tertiare a proteinelor si membranelor celulare, deteriorarea barierei osmotice. Temperaturile inalte provoaca distrugerea destul de rapida a numeroase specii de virusuri. *. Caldura – dincolo de limita superioara este nociva, ducand la dezorganizarea reactiilor metabolice prin coagularea proteinelor (teoria denaturarii si coagularii proteinelor) sau prin acumularea de produsi toxici rezultati in urma proceselor biochimice (teoria intoxicatiei). Exista diferente intre modul de actiune a caldurii uscate si a caldurii umede. Caldura uscata patrunde mai greu prin peretele celulei bacteriene, spre deosebire de caldura umeda. Caldura uscata este mai putin eficienta necesitand temperaturi de 140˚C si un timp de expunere intre 5-15 minte (Clostridiile) si 180˚C si 60 minute (Bacillus anthracis). Caldura umeda patrunde mai usor, datorita inmuierii peretelui celulelor si cresterea permeabilitatii acestuia. Caldura umeda are efect bactericid asupra formelor vegetative expuse la 100˚C timp 2-3’ sau 60˚C timp de 1 ora. Sporii bacterieni sunt distrusi in 15’ la 121˚C, presiunea de autoclavare variind intre 1,5 atm – 2 atm.

In practica medicala, caldura este folosita in procesul de sterilizare a instrumentarului medical si a materialelor folosite in diagnosticul de laborator. Sterilizarea se efectueaza prin caldura uscata (flambare si pupinel) si caldura umeda (fierbere, autoclavare si pasteurizare). 2.Desicarea - Sensibilitatea bacteriilor la deshidratare difera in raport cu specia si chiar tulpina. Microorganismele ca meningococii, gonococii, treponemele, leptospirele sunt foarte sensibile. Bacilii tuberculozei, stafilococii raman viabili perioade indelungate de timp. Temperatura scazuta, mediul proteic si lipsa oxigenului protejeaza considerabil microbii fata de efectele nocive ale deshidratarii. Pe aceste principii se bazeaza liofilizarea (criodesicarea). Metoda consta in congelarea suspensiei microbiene in mediu protector, uscarea in vid si pastrarea in fiole inchise cu gaz inert. Prin liofilizare se conserva vaccinurile si tulpinile microbiene de referinta. Uscarea in aer este insotita de deshidratarea citoplasmei si de denaturarea proteinelor bacteriene.Una din metodele de conservare a produselor alimentare o constituie sublimarea,adica deshidratarea la temperaturi joase in conditii de vid profund,care este insotita de vaporizarea apei,de racirea si congelarea rapida. Desicarea in vid la temperatura joasa nu omoara bacteriile si virsurile.Aceasta metoda de conservare a culturilor e utilizata in producerea vaccinurilor stabile contra pestei,tuberculozei,tularemiei ,etc. 3. Presiunea osmotica -celulele vegetative tinere sunt mai sensibile decat sporii. In medii hipertone se produce fenomenul plasmoliza(lichidul paraseste celula cu retractia acesteia), in medii hipotone are loc fenomenul de turgescenta (marirea diametrului celulei), in mediu izoton bacteriile isi pastreaza forma. Dintre acestea, plasmoliza are efect letal asupra bacteriilor si fungilor. Isi gaseste aplicatii in conservarea alimentelor (saramurare, pregatire dulceturi, siropuri). 4. Ultrasunetul -  sunt vibratii cu frecventa mai mare decat cea a undelor sonore (peste 1000Hz). Sunt bactericide prin procesul cavitatiei. Unda ultrasonica, la trecerea prin apa extra si intracelulara, determina o miscare intensa a protoplastului cu dezagregarea structurilor celulare (spargerea peretelui celular).Mecanismul actiunii bactericide a ultrasunetului consta in faptul ca in citoplasma bacteriilor din mediul acvatic se formeaza o cavitate, care se umple cu vapori. Se utilizeaza la dezinfectia si curatirea instrumentarului stomatologic, chirurgical, la analize chimice determinand separarea enzimelor celulare. 5.Radiatiile - actioneaza asupra bacteriilor prin mecanisme diverse: producerea de peroxizi in mediu cu efect bactericid (radiatiile ionizante: X, α, β, γ) si prin efect direct asupra acizilor nucleici celulari ( radiatiile solare, ultraviolete). Radiatiile ionizante (X, α, β, γ, neutroni) au actiune bactericida puternica, fiind purtatoare ale unor energii mai inalte. Ele produc denaturarea proteinelor si acizilor necleici celulari prin inactivarea ribozomilor, ruperea lanturilor de acizi nucleici, se produce inactivarea actiunii enzimelor datorita formarii de radicali liberi (OH, H) in apa mediului, formarea de peroxizi (R-O-O-R) ce actioneaza ca agenti oxidanti. In doze mici pot produce mutatii bacteriene (radiatii X) cu modificari morfologice si patogenitate. Se utilizeaza pentru sterilizarea instrumentelor medicale, medicamentelor, alimentelor. Radiatiile ultraviolete actioneaza prin absorbtie selectiva la nivelul acizilor nucleici (indeosebi ADN). Activitatea bactericida este maxima la 260nm. Acest proces se produce prin expunere la lumina puternica (lungimea de unda 400nm). Se produce clivarea dimerilor de timidina din molecula de ADN ce favorizeaza reluarea multiplicarii bacteriilor “omorate”. Se utilizeaza la sterilizarea incaperilor, boxelor, materialelor plastice, medicamentelor .6.Electricitatea are actiuni minore asupra bacteriilor, dar poate produce modificari ale mediului (fizicochimice) cu efecte secundare bactericide: cresterea temperaturii, eliberarea clorului din compusi, formarea de ozon.

7. Filtrarea – se realizeaza prin trecerea unui fluid printr-un corp poros (filtru). In functie de diametrul porilor, filtrarea poate fi clarifianta sau sterilizanta. O membrana cu porozitatea de 0,22μm retine toate bacteriile.

2. Mecanismele de actiune a substantelor chimice asupra microorganismelor (fenolul, crezolul, colorantii, oxidantii, sarurile metalelor grele , formaldehida, alcoolii ) In functie de structura fizico- chimica a mediului, de concentratie, de durata contactului, de temperatura substantele chimice exercita o influenta variata asupra microbilor. In doze mici ele se prezinta ca excitanti, pe cind in concentratii bactericide ele paralizeaza activitatea vitala a bacteriilor. Dupa efectele lor asupra bacteriilor agentii chimici bactericizi se impart in: 1. Substantele tensioactive sau detergentii – au proprietatea de a provoca o reducere brutala a tensiunii superficiale avind efect de tulburare a bunei functionari a peretelui celular si membranei citoplasmice. (Ex: acizii grasi, sapunurile,detergenti sinteticiactualmente se folosesc pe larg .) 2. Fenolul, crezolul si derivatii lor – lezeaza peretele celular , apoi proteinele celulei.Unele substante inhiba functia coenzimei care participa la dehidrogenarea glucozei si a.lactic. 3. Colorantii – au capacitatea de a frina cresterea bacteriilor. Au afinitate accentuata pt gruparile fosforice ale nucleoproteidelor. ( Ex: verde de briliant , rivanolul, acriflavina ) 4. Sarurile metalelor grele (plumbului, cuprului,zincului,argintului,mercurului )coaguleaza proteinele celulare si rezulta un albuminat de metal si acid liber.O serie de metale ( Argintul ,aurul , Pl ) au efecte oligodinamice, adica capacitati bactericide.Mecanismul de actiune consta in faptul ca ionii metalelor cu sarcina + sunt adsorbiti de suprafata cu sarcina - a bacteriilor ,modificind permeabiltatea membranei citoplasmice.Ca consecinta se produce dereglarea nutritiei si multiplicarii bacteriilor si virusurilor. 5. Oxidantii – actioneaza asupra grupurilor sulfhidrilice ale proteinelor active. Oxidantii mai puternici au o actiune nociva si asupra altor grupuri( fenolice,aminice, indolice). Spre ex Clorul denatureaza dehidrazele, hidrolazele,amilazele si proteazele bacteriene, ca urmare fiind folosit la dezinfectarea apei, precum si clorura de var, cloramina intrebuintate in scopuri de dezinfectie . Tinctura de iod provoaca denaturarea grupurilor active de proteine din citoplasma bacteriana , utilizat pe larg in medicina . In practica chirurgicala iodul este substituit prin clorhexidina, acesta avind activitate antibacteriana mai inalta asupra bacteriilor G+ si G- . Permanganatul de potasiu de asemenea poseda caractere oxidative ca si peroxidul de Hidrogen si alte substante. 6. Formaldehida – se foloseste sub forma de solutii de 37-40 % numita formalina.Actiunea ei antimicrobiana provoaca denaturarea grupurilor aminice ale proteinelor.Omoara atit formele vegetative cit si sporii.Este folosita pt inactivarea exotoxinelor difteriei si antraxului. 7. Alcoolii -produc o disociere electrolitica, pun in libertate ionii de H + sau actioneaza prin molecula intreaga, efectul bactericid fiind legat de gradul de disociere de ioni H pe unitatea de volum. Fiecare specie se diferentiaza dupa sensibilitatea la actiunea acizilor. Formele vegetative sunt mult mai sensibile decat sporii. Efect bactericid maxim au: acidul clorhidric, acidul sulfuric, acidul azotic, acidul sulfocromic. Se folosesc ca dezinfectanti in concentratii de 5%, iar pentru B. Koch de 10%. Alcoolii au o activitate mai intensa cu cat greutatea moleculara este mai mare. Alcoolul etilic este mai activ decat cel metilic. Alcoolii sunt bactericizi in concentratii de 50 – 70%. Efectul sporocid antifungic este redus. Sunt utilizati pentru aseptizarea tegumentului (dar timpul necesar efectului bactericid este de 5 minute).

3.Notiune de dezinfectie.Substante dezinfectante contemporane utilizate in R. Moldova.Fierberea .Pasteurizarea. Dezinfectia - operatie cu rezultat momentan ,permite eliminarea/distrugerea microorganismelor si inactivarea virusilor, cu exceptia sporilor bacterieni -actioneaza pe medii inerte , prin mijloace fizice/chimic - reducerea incarcaturii microbiene pentru materialele sanitare ≥5logCF - exista dezinfectanti chimici numiti “sterilizanti chimici”, care in 6-10 ore sau doar 30 minute au proprietati sporicide ! Dezinfectant – produs utilizat pentru dezinfectia mediilor inerte ; contin cel putin un principiu activ cu proprietati anti-microbiene - se utilizeaza imperativ dupa o operatie de curatare - se clasifica in: *dezinfectanti de nivel inalt – la o expunere de pana in 30 min. distrug micro- organismele cu exceptia unui numar mare de spori *dezinfectanti de nivel scazut – distrug majoritatea bacteriilor in stare vegetativa majoritatea virusurilor si a fungilor intr-o perioada ≤10 min. *dezinfectanti de nivel intermediar au actiune “cida pentru BK,bacterii vegetative majoritatea virusurilor si a fungilor intr-o perioada ≤10 min CLASE CHIMICE DE SUBSTANTE DEZINFECTANTE  

        

FENOLII -Fenolul si derivatii fenolici (fenoli) HALOGENII - compusii care elibereaza clor, brom sau iod - Substante chimice care elibereaza clor : Dicloroizocianatul de sodiu;  Hipocloritii Cloraminele - Iodul si iodoforii : Iodul; Iodoforii  COMPUSI CUATERNARI DE AMONIU : Clorura de Benzalkonium;  Clorura de Didecildimetilamoniu, Cetrimide  CLORHEXIDINA  HEXACHLOROPHENE  TRICLOSAN  ALCOOLII  ALDEHIDE: Formaldehida, Glutaraldehida, Succindialdehida  PEROXIDUL DE HIDROGEN SI COMPUSII IRUDITI  CHLOROXYLENOL  ALTI COMUSI ANITIMICROBIENI (colorantii)

Fierberea - metoda de dezinfectie fizica (in apa la 100oC sau utilizarea aburului de 100oC) permite distrugerea in 10-20 min a formelor vegetative precum si a formelor sporulate mai putin rezistente la temperaturi ridicate : utilizata pentru alimente, apa potabila, dezinfectia lenjeriei, tacamurilor si veselei rezistente la fierbere; dezinfectia prin caldura umeda cu fierul de calcat (distrugerea formelor vegetative in 5-10 min si formelor sporulate in 50 secunde Pasteurizarea- deasemenea este o metoda de dezinfectie fizica, ce foloseste actiunea combinata a caldurii umede si frigului pentru conservarea lichidelor alimentare. Incalzirea lichdelor alimentare la t intre 62 si 85 grade distruge formele vegetative, dar nu omoara sporii si nici enterovirusurile. Refrigerarea imediata la 4 grade C completeaza, prin soc termic efectul microbiocid al caldurii si impiedica multiplicarea microorg. Spre ex laptele la t de 85 grade – 8-15 sec 71-74 grade -40-45 sec

62-65 grade – 30 min 4. Notiuni de aseptica si antiseptica. Principalele substante antiseptice. Conservarea chimica. Aplicarea practica. Asepsie – ansamblul de metode prin care se previne contaminarea cu microoganisme sau prin care se mentine “sterilitatea “ tesuturilor mediilor de cultura medicamentelor injectabile etc. Antisepsie – inlaturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe substraturii vii – ex. Tegumente, mucosae sau din plagi ; cu ajutorul substantelor antiseptic netoxice pt tegument ex : alcool etilic 70 grade ; tinctura de iod 5 % ; KMnO4 0,1 %; detergent cationici etc . Antiseptic – o substanta care inhiba cresterea si dezvoltarea microorganismelor fara sa le omoare neaparat.Antisepticele se aplica usual pe suprafata corpului. Substante antispetice : Alcool etilic (50-70%);

Clorura de benzalkonium; Clorhexidina;

Iod: solutie 1% in etanol 70% ; Povidone – iodine : 7,5-10% ; Tinctura de iod 5%; Apa oxigenata: 3%. Conservarea chimica  (agenti chimici)

Substanta

Domeniu de utilizare

Concentratia%

Fenol

Seruri immune, Vaccinuri

0.3-0,5 %

Mertiolat de Sodiu

Seruri immune, preparate injectabile

0,004-0,02

Feniol +mertiolat

Seruri immune, Colire

0,2+0,005    ;       0,002+0,01

Benzoat de sodium

Unguente, Emulsii, Alimente 0,2-1

 

 

Aplicarea practica:

 

Substante chimice utilizate la pastrarea  preparatelor.   5. Noţiuni de sterilizare, obiect steril şi nesteril. Sterilizare – distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor, inclusiv a sporilor cu ajutorul metodelor fizice, chimice sau mecanice. În laboratoarele de microbiologie sterilizarea se obţine prin tehnici bazate pe următorii agenţi: 



Căldură uscată: - Încălzirea la roşu - Fierberea - Incinerarea - Aer cald Căldură umedă: - Peste 100oC (autoclavare)



- La sau sub 100oC (tyndalizare) Filtrare

Sterilizarea chimică prin oxid de etilen nu se practică. Obiect steril - obiect care a fost prelucrat special şi au fost distruse sau îndepartate toate microorganismele (inclusiv sporii) de pe el şi la însămînţare prezintă lipsa creşterii. Obiect nesteril - obiect care a intrat în contact cu mediul înconjurator sau cu bolnavul şi care la însămînţare prezintă prezenţa creşterii. 6. Metode fizice de sterilizare prin: ardere, vapori sub presiune, aer cald (căldura uscată). Sterilizarea prin radiaţii şi ultrasunet.  Sterilizare prin ardere - Încălzirea la roşu este indicată pentru firul drept, ansa şi spatula de însămînţare. - Flambarea – înfierbîntarea obiectului de sterilizat prin trecere repetată în flacără timp de cîteva secunde. Indicată pentru capilarul pipetelor Pasteur, gura eprubetelor şi flacoanelor, cotraindictă pentru obiectele mari. - Incinerarea – indicată pentru sterilizarea obiectelor cu unică folosinţă contaminate prin utilizarea în laborator.  Sterilizare prin vapori sub presiune  Sterilizare la peste 100 o - în autoclave care realizează 115oC la 0,5 atmosfere(mediile de glucide timp de 15 min.), 121oC la o atmosferă (timp de 15 min – mediile de cultură uzuale, vesela de laborator cu materialul infectat; şi 134 oC la 2 atmosfere (timp de 40 min. - materialul şi vesela ce conţin bacilii anthraxului, clostridiile botulinice). Autoclava - un cazan cu pereţi rezistenţi , în care după închiderea etanşă cu un capac masiv, presat cu baloane sau cu un sistem cabestan , vaporii de apă se comprimă la presiunea necesaară sterilizării. a. Autoclave cu perete simplu Indicaţii: sterilizarea soluţiilor, materialului contaminat din laborator, sticlăria pentru culturi de celule şi aparatele de filtrare. Vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi pătrund în camera de sterilizare de jos în sus prin suportul de tablă pe care se aşază obiectele de sterilizat. Un manometru controlează presiunea din interiorul cazanului. Are un robinet superior de vapori, un robinet inferior pentru ce permite evacuarea apei, o supapă de siguranţă pentru evacuarea vaporilor cînd presiunea lor depăşeşte limita de siguranţă. Procedura: 1. Se toarnă apă în cazan prin incinta de sterilizare. 2. Se aşază pe support obiectele de sterilizat ăn ambalajele lor (flacoane, eprubete, calojete, cutii). 3. Se închide etanş capacul. 4. Se conectează la sursa de căldură. 5. Se deschide robinetul pentru evacuarea aerului. 6. Se închide robinetul pentru evacuarea aerului. 7. Cînd presiunea ajunge la valoarea aleasă, se reglează sursa de căldură ca să menţină această presiune pe toată durata sterilizării. 8. Se întrerupe sursa de căldură şi se lasă să se răcească pînă cînd manometrul indică zero (presiunea atmosferică) apoi se deschide robinetul de vapori apoi capacul. 9. Se lasă materialele pentru uscare în autoclave deschisă. b. Autoclave cu manta de abur - asigură uscarea rapidă şi perfectă a materialelor sterilizate. Pot fi vertical sau orizontale. Indicaţii: strelizarea materialelor chirurgicale din bumbac, obiectelor şi instrumentelor din cauciuc, instrumentarului metallic, seringelor cu componente metalice etc. pot fi utliyate şi pentru sterilizarea soluţiilor sau a altor matriale din laborator.



Autoclava verticală cu mantade abur. Vaporii de apă provin din rezervorul de apă plasat în partea inferioară a cazanului de presiune şi pătrund în incinta de sterilizare de sus în jos, după ce au trecut prin mantaua de abur şi au încălzit-o. Componente: cele de la autoclave cu perete simplu + o pîlnie de alimentare şi o nivelă pentru controlul apei din sursa de vapori, robinete ce unesc aceste piese su sursa de vapori, un ronet de avacuare a apei şi altul a aburului. Procedura: 1. Se deschid robinetele pîlniei de alimentare cu apă şi ale nivelei. 2. Se toarnă apă în rezervor pînă la marca indicată pe nivelă. 3. Se aşază în incinta de sterilizare materialele în ambalajele lor. 4. Se închide etanş capacul cayanului. 5. Se conectează sursa de căldură. 6. Se deschide robinetul pentru evacuarea aerului şi se închid toate celelalte robinete ale aparatului. Pentru sterilizarea soluţiilor – etapele 5-9 de la autoclava cu perete simplu. Pentru sterilizarea materialelor chirurgicale şi a seringelor (după epuizarea timpului de sterilizare): 7. Se întrerupe sursa e de căldură. 8. Se deschide robinetul de evacuare a aburului. 9. La presiunea =0,5 atm. se deschide robinetul de evacuare a condensului. 10. La presiunea =0 atm. se deschide capacul autoclavei. 11. Se scot casoletele şi se închid orificiile după ce au fost răcite în autoclave.  Autoclava orizontală cu evacuare gravitaţională a aerului poate fi cilindrică sau rectangulară. Componente: regulator de presiune, sistem cabestan, valve termostatice (capcane pentru aer pur), termometru, sistem de vacuum(uscare), sistem de racier (scăderea presiunii). Procedura: 1. Prin admisie de abur, se încălzeşte mantaua pînă la temperature de sterilizare. 2. Se plasează în incinta autoclavei materialele de sterilizat şi se închide uşa etanş. 3. Se dechide accesul vaporilor de apă în incinta de sterilizare cu valve canalului de evacuare a aerului şi condesului deschisă. 4. Se urmăreşte termometrul canalului de evacuare a incintei de sterilizare, cînd atinge to de sterilizare se marcheză timpul de sterilizare. 5. La epuizarea timpului de sterilizare se opreşte eccesul vaporilor în incinta de sterilizare. 6. Scăderea presiunii prin deschidereavalvei de evacuare. Uscarea prin sistemul de vacuum 7. Deschiderea autoclavei.  Tyndalizare (sterilizare fracţionară) – pentru substanţele care degradează şi denaturează uşor la t o de 60 o C (serurile, vitaminele). Evită încălzirea de peste 100 o C. Indicaţii: Sterilizarea unor medii de cultură, a alimentelor. Necesar: Autoclava pentru tyndalizare la 100 o C, în vapori fluenţi, baie de apă sau de nisip pentru tyndalizări sub 100 oC. Procedura: Substanţele de sterilizat, în volume mai mici de un litru, se menţin 30-60 min, 3-8 zile consecutive, la temperature impusă de compoziţia lor. În intervalele dintre încălziri recipientele cu substanţe supuse sterilizării se menţin la temperatura camerei pentru germinarea sporilor.  Sterilizare prin aer cald (căldura uscată) – în etuvă la 160-180o Indicaţii: obiecte de laborator din sticlă (eprubete, flacoane, pipete) sau porţelan( mojare, pistile), seringi Luer dinsticlă, instrumentar chirurgical, substanţe grase, pulberi termostabile. Contraindicaţii: soluţii apoase, obiecte din cauciuc, seringi, ţesături, vată. Etuva este o incintă cilindrică sau paralelipidică cu pereţi dubli, din tablă, termoizolaţi. Componente: rezistenţe electrice, termostat, sistem de ventilaţie, rafturi din sită metalică pentru obiectele de steriliyat. Procedura:



1. Plasarea obictelor de sterilizat ambulate în incintă. 2. Se închide uşa aparatului, se deschid orificiile de ventilaţiile şi se conectează la reţeaua electrică. 3. Se marchează timpul de sterilizaredin momentul în care temometrul indică 160-180 o 4. Se scot obiectele sterilizate numai după răcirea aparatului. Sterilizarea prin radiaţii şi ultrasunet Acţiune bactericidă are radiaţia ionizantă, şi ultrasunetul, care pot fi folosite pentru sterilizarea produselor alimentare, mediilor de cultură, preparatelor biologice (vaccinuri, seruri ş.a.) şi dezinfecţia obiectelor.

7.Metoda mecanică de sterilizare. Tipurile de filtre şi aplicarea practică. Sterilizarea chimică. Filtrare – trecerea unui fluid printr-un corp poros – filtru. Microorganismele fluidului filtrate sunt reţinute mecanic ţi electrostatic în porii filtrului, se face prin asipraţie sau prin presiune pozitivă. Indicaţii: sterilizarea aerului, a unor medii de cultură pentru microbe, a medicamentelor care nu suportă încălziri. Tipuri de filtre: -

Filtre din porţelan Filtre din pămînt de infuzorii Filtre Scholl – sticlă poroasă Filtre Seitz - plăci filtrante din azbest Membrane filtrante din acetat cu porozităţi între 8 şi 0,025 μm – reţine bacteriile.

Sterilizarea chimică – cu gaze (oxidul de etilen, beta-propiolactona, formaldehida). Indicaţii: sterilizarea echipamentelor de plastic termosensibil în lab. de microbiologie, cateterelor şi componentelor termosensibile ale endoscoapelor în serviciile de endoscopie; în chirurgie şi stomatologie. Procedura: În incinte etanşe cu un amestec cu 15% CO2 şi oxid de etilen cu concentraţie de 450-800 mg/l, la 55-60o şi 40% umiditate relativă timp de 2,5-3 ore. 8.Controlul eficienţei sterilizării Se face prin indicatori: -

Fizici (manometru, termometru) Chimici (floare de sulf, acid benzoic, fenacetină, 1,3,5-Tribromfenol, tiouree, sulfametoxipiridazină) Biologici (tuburi cu fire de bumbac impregnate cu spori bacterieni şi uscate). După sterilizare se testează viabilitatea sporilor prin însămînţarea pe medii de cultură.

9.Metabolismul microbian .Particularitati.  Metabolismul bacterian reprezintă ansamblul de reacţii biochimice care au loc în celula vie. -

Catabolism – reacţii chimice de descompunere a substanţelor complexe în elemente simple, însoţită de degajarea energiei (metabolism energetic)

-

Catabolismul reprezintă o succesiune de reacţii biochimice implicate în degradarea nutrienţilor şi eliberarea de energie necesară pentru funcţionarea celorlalte căi metabolice şi altor activităţi fiziologice ale celulei.

-

Faza 1: macromoleculele sunt descompuse enzimatic în unităţi de bază: proteinele →AA, lipidele → acizi graşi şi glicerol, glucidele → monoglucide;

-

- are loc frecvent la exteriorul celulei bacteriene, fiind realizată de exoenzime. Din aceste reacţii se eliberează ~1% din energia totală a macromoleculei, inaccesibilă celulei, fiind eliberată sub formă de căldură.

-

Faza 2: moleculele rezultate în faza precedentă sunt degradate incomplet, eliberand 1/3 din energia totală, cu producerea, în afară de CO2+ H2O, a unui număr mic de produşi de importanţă esenţială în metabolism, numiţi intermediari metabolici ai căilor metabolice centrale (de ex., aminoacizii sunt utilizaţi pe căi diferite şi catabolismul lor conduce la formarea de acetilCoA sau intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici = ciclul Krebs).

-

Faza 3: se derulează diferit, în funcţie de tipul respirator al microorganismului (respiraţie celulară = procesul de degradare a nutrienţilor prin reacţii de oxidoreducere biologică).

-

Anabolism – reacţii chimice de sinteză a substanţelor complexe din elemente simple, necesită energie (metabolism constructiv, de sinteză).

-

Reprezinta totalitatea reactiilor biochimice prin care microorganismele îşi sintetizează din molecule simple constituenţii celulari proprii. Pot fi utilizaţi şi intermediari ai căilor metabolice centrale.

-

Sinteza macromoleculelor este foarte eficientă şi se face sub acţiunea informaţiei genetice codificată în ADN. Celula bacteriană sintetizează mai întâi monomeri (AA, baze azotate) pe care îi aranjează ulterior într-o ordine specifică, dictată genetic, care determină structura primară a macromoleculelor respective.

-

Specificitatea biologică constă în aranjarea diferită a unui număr limitat de monomeri (unităţi de structură: 20 AA, 5 baze azotate) pentru a forma un număr impresionant de macromolecule biologice cu structuri şi funcţii diferite

Particularităţile metabolismului bacterian: 1. Natura şi diversitatea nutrienţilor folosiţi - substanțe anorganice, organice (unele chiar cunoscute ca fiind inhibitori ai creşterii): acizi (formic, oxalic, sulfuric), lignină, chitină, celuloză, antibiotice, fenoli, asfalt, petrol, parafine, materiale plastice. 2. Plasticitatea metabolismului bacterian – se referă la capacitatea bacteriilor de a folosi surse alternative de nutrienţi (bacteriile se adaptează rapid la tipul și cantitatea nutrienților) 3. Diversitatea mecanismelor enzimatice şi a produşilor rezultați – bacteriile nu au o cale metabolică pentru un produs, ci au căi alternative multiple pentru a se adapta condiţiilor de mediu variate. 4. Intensitatea reacțiilor metabolice (viteza reacţiilor este mare). 5. Este un metabolism necompartimentat, toate procesele metabolice se desfăşoară intr-o singură celulă În toate reacţiile metabolice intervin catalizatori proteici specifici – enzimele. 10.Enzimele bacteriene.Clasificarea. Rolul in fiziologia bacteriilor.  Enzimele bacteriene. Caractere generale: -

Substanţe proteice

-

Active în limite largi de temperaturi (0-65°C) şi de pH (2-9)

-

Specificitate de substrat şi de acţiune (reacţionează cu un substrat catalizând un tip de reacţie)

-

Specificitatea este determinată de centrul activ al enzimei, complementar cu receptorul de pe substrat

-

Nu se modifică în cursul reacţiei

Clasificarea enzimelor bacteriene: I.

Constitutive (permanente)

II.

Inductive (adaptive), se sintetizează în prezenţa substratului (ex.: lactaza)

III.

Represive, sinteza lor este inhibată de acumularea în exces a produsului reacţiei catalizate  După locul de acţiune (exoenzime, endoenzime)  După tipul reacţiei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)  După impactul asupra ma/o -

Enzime metabolice

-

Enzime de patogenitate, responsabile de modificări patologice ale ţesuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza, proteaze, etc.

-

Rolul enzimelor in fiziologia bacteriilor

-

Rol în identificarea şi clasificarea bacteriilor (enzimele determină activitatea biochimică specifică a bacteriilor)

-

Unele substanţe chimice, antibiotice se combina cu activitatea unor enzime, inhibând creşterea bacteriilor (tratament)

-

Determinarea mecanismelor patogenezei infecţiilor (unele enzime sunt responsabile de producerea leziunilor în ţesutul gazdei)

-

Aplicarea industrială a enzimelor

11.Nutritia bacteriilor. Tipurile de nutritive si mecanismele transportului nutrientilor in celula bacteriana.  Nutriţia – modalităţile prin care bacteriile asimilează din mediu substanţele necesare pentru metabolism.  Modul (tipul) de nutriţie la bacterii este absorbtiv.  Nutrienţi – substanţe, soluţiile cărora pot traversa MCP pentru a fi antrenate în metabolismul celulei. Se obţin din alimente prin solvire (săruri minerale, CO2, O2) sau după o digestie prealabilă (proteine, polizaharide, lipide).  La bacterii digestia este extracelulară (la bacteriile G- şi în spaţiul periplasmic)  Nutrienţii servesc în calitate de material de construcţie şi sursă de energie pentru sinteza compuşilor şi menţinerea vieţii bacteriei. Transportul transmembranar 1. Difuzie simplă, pasivă (conform gradientului de concentraţie, fără consum de energie): O2, CO2, acizi graşi, nutrienţi liposolubili 2. Difuzie facilitată (conform gradientului de concentraţie) – permite transportul transmembranar al moleculelor mari prin intermediul proteinelor de transport specifice integrate in MCP - permeaze. 3. Transport activ (contra gradientului de concentraţie, necesită energie). Participă permeazele şi alte proteine de transport /fixare specifice. Nutrienţii nu suportă modificări.

4. Translocaţie – substratul este modificat chimic (ex.: fosforilat) în timpul transportului membranar; necesită energie  Substanţele care au pătruns în citoplasmă sunt descompuse de către enzimele bacteriene conform căilor metabolice proprii fiecărei specii bacteriene (ex.: Embden-Meyerhof, EntnerDoudoroff, ciclul pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obţine energie şi precursori care vor fi antrenaţi în biosinteză (anabolism).  Excreţia metaboliţilor – difuzie, proteine de transport, liza bacteriei Necesităţile nutritive ale bacteriilor -

Necesităţi elementare, de bază: C, H, O, N în cantităţi importante; S, P, Fe, Ca, Mg, K în cantităţi mici şi urme de Co, Cu, Zn, Mo. Bacteriile prototrofe sunt capabile a-şi realiza integral sinteza metaboliţilor esenţiali.

- Necesităţi specifice. Bacteriile auxotrofe solicită suplimentar compuşi organici preformaţi (factori de creştere), care nu pot fi sintetizaţi de bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezenţa lor în mediul de cultură este indispensabilă creşterii acestor bacterii. 12. Clasificarea microorganismelor dupa sursele de energie si carbon.Notiune de microorganisme saprofite si parazite. Clasificarea bacteriilor după sursa de carbon  Bacterii autotrofe – utilizează CO2 ca unică sursă de carbon (nepatogene)  Bacterii heterotrofe – utilizează carbonul din compuşii organici (glucide, acizi graşi, alcooli, etc) Notiune de bacterii saprofite si parazite. -

Bacteriile care utilizează materia organică moartă sunt saprofite (reciclarea materiei organice)

-

Bacteriile parazite (obligate, facultative) trăiesc pe contul organismelor vii, aducându-le daune

-

Bacteriile patogene reprezintă parazite care afectează grav gazda, provocând maladie sau moarte.

 Surse de azot -

AA sau acizi nucleici

-

Săruri de amoniu, nitriţi, azot atmosferic

 Surse de substanţe minerale: -

S - din AA, sulfuri, sulfaţi;

-

P - din fosfaţi;

-

K, Mg, Ca, Na - din săruri minerale;

-

Zn, Cu, Mn, Mo – din apă

Clasificarea bacteriilor după sursa de energie  Bacterii fototrofe – utilizează energia solară (fotosinteza)  Bacterii chemotrofe – folosesc energia degajată din reacţiile chimice de oxido-reducere. Ele necesită un substrat donor de hidrogen (e- şi H+) şi un substrat acceptor de hidrogen. În transfer participă transportori intermediari de electroni (lanţul respirator, NAD, NADH, FAD, etc.) -

Bacteriile chemolitotrofe – donorul de H este o substanţă anorganică

-

Bacteriile chemoorganotrofe – donorul de H este o substanţă organică (glucoza, lipide...)

Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe. 13. Metabolismul energetic la bacterii chemoorganotrofe. Oxidarea biologica a substratului. Tipurile oxidarii biologice. Depozitarea si utilizarea energiei. Bacteriile chemoorganotrofe – donorul de H este o substanţă organică (glucoza, lipide...) Mecanismele de obţinere a energiei la chemoorganotrofe în funcţie de acceptorul final de H :  Respiraţie aerobă. Acceptorul final este oxigenul gazos (agent oxidant extern). Implică lanţul respirator de transport al electronilor asociat MCP. Produs final – H2O sau H2O2 .  Respiraţie anaerobă. Acceptori finali – compuşi anorganici (nitrat, sulfat, S). Transportul de electroni prin lanţul respirator. Produse finale – nitritul, amoniacul, sulfura (în prezenţa O2 – H2O2).  Fermentaţie. Substratul organic este metabolizat fără intervenţia unui agent oxidant extern. Constă în procese de ox-red care realizează numai o oxidare parţială a substratului, donorul şi acceptorul de H+ fiind substanţe organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o moleculă mai oxidată (ex.: fermentare lactică, fermentare alcoolică, acidă mixtă, acetoinică, etc). Fermentaţia se poate desfăşura în prezenţa O2, dar fără intervenţia acestuia. Conservarea energiei  O parte din energia eliberată se pierde sub formă de căldură sau poate fi utilizată direct sub formă de energie electro-chimică (fpm-forta proton motrice) la nivelul MCP (ex.: rotaţia flagelilor, transport transmembranar) sau stocată în compuşi chimici macroergici “bogaţi în energie”: ATP (sintetizat prin fosforilare oxidativă sau fosforilare la substrat), fosfoenolpiruvat, acetilfosfat şi acetil-CoA.  În procesele de respiraţie se elimină mai multă energie decât din fermentaţie (în glicoliză dintrun mol de glucoză - 38 moli ATP, prin fermentaţie - 2 moli ATP). În procese de fermentare se formează deşeuri rejetate de către celulă.

TEMA2: PRINCIPIILE DE CULTIVARE A BACTERIILOR. MEDIILE DE CULCTURA 1. Cresterea si multiplicarea bacteriilor. Ciclul celular. Creşterea – mărirea coordonată a masei şi volumului structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor de sinteză Multiplicarea – creşterea numărului de celule pe o unitate de suprafaţă sau de volum - Diviziune binară - Înmugurire (levuri, ciuperci levuriforme) - Autoreproducere (virusuri) - Spori (micete) - Fragmentare (actinomicete) Ciclul celular – procesele care au loc de la formarea celulei pâna la următoarea diviziune 1. Faza C – replicarea ADN 2. Faza G – de latenţă, segregarea cromozomilor 3. Faza D – de diviziune, formarea septului Replicarea ADN depinde de masa critică a celulei, iar separarea cromozomilor şi diviziunea intervin în momentul când celula atinge o lungime - limită  Perioada dintre 2 diviziuni reprezintă timpul (perioada) de generaţie (TG).  Durata TG depinde de specie şi de condiţiile de creştere (condiţii optime – viteză maximă)

Bacteria

TG in vitro (min)

TG in vivo (ore)

Escherichia coli

20-40

5

Staphylococcus aureus

40

3-5

Vibrio cholerae

10

2-3

Mycobacterium tuberculosis

120-240

24-48

2.Cultivarea bacteriilor. Conditiile de cultivare. Creşterea bacteriilor în laborator – cultivare. Se cultivă bacteriile pentru izolarea lor din medii naturale (prelevate patologice, alimente, apă, etc). Izolarea bacteriilor se realizează pentru: 1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic) 2. Testarea sensibilităţii lor faţă de antibiotice 3. Obţinerea unor produşi de biosinteză (antibiotice, AA), bioconversie (hormoni steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor, eubioticelor... Pentru creştere bacteriile au nevoie de nutrienţi şi condiţii fizico-chimice adecvate. Condiţiile (principiile) de cultivare -

Sursă nutritivă adecvată Sursă de energie Apă Temperatura potrivită pH adecvat Concentraţie optimă a oxigenului şi a CO2 Presiune osmotică adecvată

Temperatura de creştere Există temperaturi minime, maxime şi optime de dezvoltare a bacteriilor. În raport cu temperatura optimă deosebim: 1. Bacterii psichrofile – tº optimă 10-20º C. Cresc şi la 0º C. 2. Bacterii mezofile – optimum 30-37º C (limite 15-45º C) 3. Bacterii termofile – optimum 50-60º C (până la 95º C) 4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70–110º C)  1. 2. 3.

pH Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) – pH 6-7,5 Bacterii acidofile – pH 2-6 (Lactobacillus) Bacterii alcalofile – pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)

 Presiunea osmotică 1. Bacterii halotolerante (osmotolerante) – cresc în concentraţii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul intern al gazdei) – mi/o patogene 2. Bacterii halofile – preferă concentraţii mari de NaCl (1-30%) – stafilococi, vibrioni (Vibrio parahaemolyticus)

 Oxigenul 1. Bacterii strict aerobe – cresc doar în prezenţa O2 molecular. Obţin energia prin respiraţie aerobă 2. Bacterii microaerofile – necesită concentraţii reduse de O2 şi 2-10% CO2. Obţin energia prin respiraţie sau fermentaţie (Neisseria, Brucella, Campylobacter) 3. Bacterii strict anaerobe – cresc doar în absenţa O2. Obţin energia prin fermentaţie sau uneori respiraţie anaerobă. Toxicitatea O2 – formarea H2O2,, a radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi O22- pe care anaerobii nu le pot descompune (absenţa catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei) – Clostridium, Bacteroides 4. Bacterii anaerobe aerotolerante – pot creşte în prezenţa O2, obţin energia prin fermentaţie, posedă peroxidază (Lactobacillus, streptococi) 5. Bacterii facultativ anaerobe – cresc în orice condiţii, obţin energia prin respiraţie sau fermentaţie 3.Mediile de cultura p-u bacteriile chemoheterotrofe si cerintele fata de ele. Mediile de cultură – soluţii sau substrate solide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare cultivării bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru cultivarea (izolarea) bacteriilor, testarea sensibilităţii la antibiotice, stocarea sau transportul culturilor bacteriene.  -

Cerinţele faţă de mediile de cultură Să asigure necesităţile nutritive şi energetice ale bacteriilor Umiditate optimală pH optimal (7,2-7,4) şi constant (caracter de tampon) Potenţial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH210) Să fie izotonice (0,5% NaCl) Să fie sterile şi transparente

4. Clsificarea mediilor de cultura După provenienţă 1. Empirice, naturale. Au la bază produse de origine animală sau vegetală (sânge, ser, lapte, ouă, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, peşte, levuri, etc). Compoziţia lor chimică precisă nu poate fi controlată 2. Sintetice – includ ingrediente chimice pure, compoziţia chimică este cunoscută cu exactitate 3. Semisintetice După consistenţă 1. Medii lichide (bulion)– utilizate pentru obţinerea biomasei bacteriene şi a produselor lor (antibiotice, enzime, toxine) 2. Medii solide – conţin 10-15% gelatină sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roşii, t topire 80-100 C, solidificare 42 C). Placa de geloză în cutii Petri este utilizată pentru izolarea culturilor pure, geloza înclinată (în pantă) – pentru acumularea culturilor pure 3. Medii semisolide – 0,2 – 0,5 % agar-agar. Se utilizează pentru studierea activităţii biochimice sau a mobilităţii bacteriilor. După compoziţia chimică (complexitate) şi destinaţie A. Medii uzuale (universale, simple) 1. Apă peptonată (apă+1% peptonă+0,5% NaCl)

2. Bulion peptonat – BP (extract apos din carne + 1% peptonă+0,5% NaCl) 3. Geloza nutritivă (BP + 2-3% agar-agar) 4. Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatină) Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor nepretenţioase la cultivare Sterilizarea prin autoclavare: 120 C, 20 min B. Medii complexe I. Medii elective – formate din medii simple cu adaos de componente care permit creşterea mi/o pretentioase nutritiv (bulion-seric, bulion glucozat, geloză-sânge – streptococi, neisserii; ser coagulat – corinebacterii, etc) II. Medii selective – medii solide cu adaos de componente sau cu condiţii fizico-chimice particulare care stimulează creşterea unor specii şi inhibă creşterea altor specii (geloza salină - stafilococi, geloza alcalină - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc) Mediile de îmbogăţire reprezintă medii selective lichide, utilizate pentru îmbogăţirea florei patogene şi inhibarea florei de asociaţie dintrun prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale). Etapă premergătoare însămânţării pe medii selective. - Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit ) - Mediul Kauffmann (mediul Muller+bilă+verde de briliant) – Salmonella - Bulion cu selenit – Shigella, Salmonella - Apă peptonată alcalină (pH=8) –Vibrio cholera - Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoză+bucăţi de ficat) – pentru anaerobi III. Medii diferenţial-diagnostice (DD) – permit diferenţierea speciilor bacteriene în baza activităţii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere…) Sunt construite după următoarea schemă:

Bază nutritivă+substrat+indicator (la necesitate)

Medii DD pentru izolarea culturii pure Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure şi identificare preliminară Medii DD pentru identificarea finală a culturii pure IV. Medii speciale – pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Loewenstein-Jensen –pentru agenţii tuberculozei, Sabouraud – fungi) V. Medii de transport – destinate transportării sau stocării unui material (prelevat), care va fi examinat ulterior. Menţine în viaţă bacteriile, fără a favoriza multiplicarea lor. - Mediul cu glicerină 30% - Soluţie tampon-fosfat - Soluţie NaCl 3% - Mediul Cary-Blair

- Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) – pentru anaerobi, neisserii, etc

5

Mediile uzuale. Componenta. Tehnica de preparare si sterilizare

Medii uzuale (universale, simple) 1. Apă peptonată (apă+1% peptonă+0,5%NaCl) 2. Bulion peptonat – BP (extract apos din carne+ 1% peptonă+0,5% NaCl) 3. Geloza nutritivă (BP + 2-3% agar-agar) 4. Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatină) Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor nepretenţioase la cultivare Sterilizarea prin autoclavare: 120 C, 20 min Sterilizari prin caldura umeda: Se fac in autoclave prin vapori sub presiune, care realizeaza 115 C la 0,5 atmosfere, 121 C la o atmosfera si 134 C Celsius la 2 atmofere. Important este ca procedura se realizeaza numai intr-o incinta lipsita de aer, aerul comprima sterilizarea. Autoclave este un cazan cu pereti rezistenti, in care , dupa inchiderea etansa cu un capac masiv, preset cu buloane sau cu un sistem cabestan, vaporii de apa se comprima la presiunea necesara sterilizarii. In autoclave la temperature de 120 C Celsius, timp de 15 minute, mediile de cultura uzuale ( geloza, bulionul peptonat), solutia izotonica de natriu clorid , vesela de laborator cu materialul infectat. La aceasta temperature nu se sterilizeaza mediile cu protein native, glucide si alte substante care se modifica usor la incalzire. Mediile cu glucide se sterilizeaza la 110 C Celsius, timp de 5-10 minute. Pentru controlul functionarii sterilizatorului cu vapori intre obiectele ce se sterilizeaza se pune un tub de sticla sudat, care contine o substanta cu punctul de topire cunoscut (benzonaftol)-110 C Celsius, (acid benzoic)- 120 C Celsius, si o cantitate mica de colorant anilinic praf. La topirea acestor substante are loc colorarea lor uniforma. Eficacitatea sterilizarii se controleaza, introducind in autoclave materialul intentionat infectat cu spori de bacterii, strilizarea in autoclave fiind cea mai perfecta pentru ca asigura distrugerea sporilor. Prepararea: Vesela: mediile de cultura se prepara in cratite emailate sau din otel inoxidabil. Mediile de cultura pregatite se repartizeaza in flacoane , eprubete, cutii. Vesela din sticla neutilizata se fierbe in solutie de HCl 1-2 % pentru neutralizarea bazei solubile, apoi se spala minutios cu apa curgatoare si se usuca. Vesela uzata , se sterilizeaza apoi se spala cu sapun sau alti detergent cu ajutorul unei perii, se clateste bine si se usuca. Flacoanele , retortele, eprubetele se inched cu tampoane de vata. Bulionul peptonat: 1. Intr-un litru extras apos de carne se dizolva, incalzind si amestecind, 10g peptona 1%, 5g(0,5%) natriu clorid. Se recomanda de luat 3 parti de clorura de natriu si 2 parti difosfat acid de natriu. Fosfatul acid de natriu, stabilizeaza reactia mediului si serveste ca o sursa suplimentara de fosfor. Se ajusteaza pH al mediului la 7,6-7,8, se fierbe 30-40 minute pina la depunerea sedimentului. 2. Se raceste, se filtreaza prin filtru de hirtie, se adauga apa pina la volumul initial, se controleaza pH.

3. se repartizeaza in eprubete, flacoane si se sterilizeaza 15-20 min in autoclave la 120 C Celsius. Bulionul peptonat concentrat se prepara pe baza unui extras apos din carne special ( 1 kg de carne in 1l de apa). Acest bullion serveste pentru cultivarea anaerobilor si altor microorganisme. Geloza (G): 1 La bulionul peptonat, pentru a-I reda o consistenta solida, se adauga 2-2,5% agar spalat si taiat marunt. 2 Se fierbe amestecind pina la lichefierea complete a agarului. Uneori pentru limpezirea mediului se adauga un albus de ou, amestecat cu o cantitate dubla de apa rece. Mediul se introduce in autoclave pe 45 min la 115 C Celsius. Flacoanele de proteina coagulate absorb particulele suspendate si le sedimenteaza la fund. 3 Se determina reactia mediului. Se mentine un timp pentru sedimentare si se filtreaza prin filtre de tifon si vata in stare fierbinte, folosind o pilnie metalica speciala cu pereti dubli, intre care circula apa fierbinte. 4 Mediul se toarna printr-o pilnie de sticla cu cleme in eprubete si flacoane, se sterilizeaza in autoclave la 120 C Celsius , 15-20 min. 5 Geloza sterile lichefiata se repartizeaza in eprubete pentru pregatirea gelozei inclinate si in coloana ( geloza in stilp). In primul caz eprubetele se aranjeaza in pozitie inclinata, in al doilea- e in stativ. ***Agarul se obtine printr-o prelucrare speciala a algelor de mare. El prezinta o substanta de natura polizaharidica, contine o cantitate neinsemnata de azot si nu prezinta un substrat nutritive. Gelul format de agar se lichefiaza la temperature de 70-100 C Celsius si se solidifica la temperature camerei. Pentru prepararea mediilor nutritive solide se poate folosi materialul sintetic din polimeri.

6. mediile complexe , clasificarea lor, destinatia, component, sterilizarea Medii complexe I. Medii elective – formate din medii simple cu adaos de componente care permit creşterea mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloză-sânge – streptococi, neisserii; ser coagulat – corinebacterii, etc) II. Medii selective – medii solide cu adaos de componente sau cu condiţii fizico-chimice particulare care stimulează creşterea unor specii şi inhibă creşterea altor specii (geloza salină - stafilococi, geloza alcalină - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc) Mediile de îmbogăţire reprezintă medii selective lichide, utilizate pentru îmbogăţirea florei patogene şi inhibarea florei de asociaţie dintrun prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale). Etapă premergătoare însămânţării pe medii selective. - Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit ) - Mediul Kauffmann (mediul Muller+bilă+verde de briliant) – Salmonella - Bulion cu selenit – Shigella, Salmonella - Apă peptonată alcalină (pH=8) –Vibrio cholerae - Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoză+bucăţi de ficat)– pentru anaerobi

III. Medii diferenţial-diagnostice (DD) – permit diferenţierea speciilor bacteriene în baza activităţii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere…) Sunt construite după următoarea schemă:

Bază nutritivă+substrat+indicator (la necesitate)

Medii DD pentru izolarea culturii pure Studierea proprietăţilor zaharolitice Endo (geloză+lactoză+fucsină+hiposulfit de Na) Levin (geloză+lactoză+eozină+albastru metilen) Ploskirev (geloză+lactoză+roşu neutru+săruri de acizi biliari+verde de briliant) Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roşii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin) Studierea proprietăţilor de oxido-reducere Mediul cu sulfit de Bismut – pentru Salmonella (colonii negre – reducerea sulfitului în sulfura de Bi) Mediul Klauberg (geloză-sânge cu telurit de K) –pentru Corynebacterium diphtheria (colonii negre) Studierea proprietăţilor lipolitice Geloza cu gălbenuş de ou – bacteriile cu lecitinază formează un halou opac în jurul coloniei Studierea proprietăţilor hemolitice Geloza-sânge (geloza+5-15% sânge defibrinat) În cazul hemolizei în jurul coloniilor apare o zonă clară Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure şi identificare preliminară Russel –geloză+1% lactoză, 0,1% glucoză, indicator Kligler – identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S) Olkeniţki – identic Kligler+1% zaharoză+uree Indicatorul Andrede – fucsină+NaOH Scindarea glucidelor (acid - A, acid şi gaz - AG) duce la modificarea pH şi virajul culorii mediului din roşu în galben. În pantă se apreciază lactoza/zaharoza (oxidare), în coloană-glucoza (fermentare). Producerea H2S – înnegrirea mediului Medii DD pentru identificarea finală a culturii pure - Şirul pestriţ Hiss (lichid sau semi-solid)– un şir de tuburi ce conţin soluţii 0,5% de diferite glucide şi indicator. Aprecierea – după modificarea culorii (acid - A)şi apariţia bulelor de gaz (acid şi gaz - AG) - Medii cu AA (lizină, arginină, ornitină) şi indicatori. IV. Medii speciale – pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu,Loewenstein-Jensen –pentru agenţii tuberculozei, Sabouraud – fungi)

V. Medii de transport – destinate transportării sau stocării unui material (prelevat), care va fi examinat ulterior. Menţine în viaţă bacteriile, fără a favoriza multiplicarea lor. - Mediul cu glicerină 30% - Soluţie tampon-fosfat - Soluţie NaCl 3% - Mediul Cary-Blair - Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) – pentru anaerobi, neisserii, etc  Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mica de material ce conţine bacterii (inoculum) se întroduce într-un mediu de cultură (însămânţare, inoculare), care ulterior va fi incubat în termostat (pentru asigurarea temperaturii optime).  În timpul incubării (18-24-48 ore…..) bacteriile cresc şi se divid, formând o cultură bacteriană (totalitatea bacteriilor accumulate prin multiplicare intr-un mediu). M.tuberculosis – 3-5 săptămâni V.cholerae – 6-12 ore 7. Manifestarea cresterii si multiplicarii bacteriilor in medii solide si lichide. Coloniile de bacterii, metodele de studiere. Tipurile de colonii si caracteristica lor. Manifestarea creşterii şi multiplicării bacteriilor În mediu lichid - Turbiditate uniformă - Formarea unei pelicule la suprafaţa mediului (vibrioni, yersinia) - Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe pereţi (streptococi, Bacillus anthracis) În mediu solid – formarea coloniilor Colonie – o aglomerare de bacterii care se dezvoltă dintr-o singură celulă sau un grup de celule (UFC – unitate formatoare de colonii) pe suprafaţa unui mediu solid Fiecare specie bacteriană formează colonii specifice (caracter util în identificare) Caracteristica coloniilor Dimensiuni – colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm) Contur (margini) – neted, ondulat, zimţat, lobat,etc Suprafaţă – plată, bombată, convexă, ombilicată,etc Formă – punctiformă, circulară, filamentoasă,neregulată Culoare (pigmentaţie) – albă, galbenă, aurie, etc Densitate – opacă, transparentă, etc

Consistenţă – cremoasă, untoasă, uscată, mucoidăHemoliza- prezenta si tipul ( pe medii de singe) Tipurile de colonii Colonii S (smouth) – rotunde, netede, umede,lucioase. Bacterii cu incarcatura electronegative puternica si hidrofile , proprietati asigurate de structura de invelis, tulbura omogen mediile de cultura lichide, formeaza suspensii stabile. Colonii R (rough) –Bacteriile cu incarcatura electronegativa si hidrofilie mai redusa se autoaglutineaza, cultiva sub forma de Bulgari, lasind mediul supernatant clar si formeaza colonii cu margini neregulate, suprafata uscata, rugoasa. Studierea coloniilor 1.Studierea macroscopica in lumina directa si reflectata: Cutia se intoarce cu fundul spre sine si se studiaza coloniile in lumina directa. Daca sint mai multe tipuri de colonii , ele se numeroteaza si fiecare se descrie aparte. In lumina reflectata coloniile se studiaza din partea capacului fara a-l deschide si in protocol se fixeaza: culoarea, suprafata, pozitia pe mediul nutritiv. 2.Examenul microscopic al coloniilor Cutia se instaleaza cu fundul in sus pe masuta microscopului, se coboara condensatorul si cu obiectivul 8X se studiaza coloniile, fixind in protocol strucyura lor si caracterul marginilor. 8.Notiuni de specie, cultura pura si mixta, tulpina si clona. Specie- unitatea fundamentala a evolutiei. Cultura pura- este o populatie formata din bacterii de aceeasi specie (indispensabila identificarii). Cultura mixta- este o populatie compusa din bacterii de specii diferite. Tulpina-este o populatie microbiana constituita din descendentii unei singure izolari in cultura pura, pe care o manipulam pentru studiu. Clona- populatie care rezulta din multiplicarea unei singure celule.

9. Fazele evolutiei culturilor periodice de bacterii. Dinamica multiplicarii bacteriilor in cultura continua si discontinua. Importanta practica. Exista 2 tipuri principale de culturi bacteriene:  

Culturi discontinue (in mediul de cultura nereinnoit) care pot fi realizate: -asincron -sincron Culturi continue (in medii de cultura reinnoite continuu)

Culturile discontinue- se obtin la cultivarea bacteriilor in volum limitat de mediu Fazele dezvoltarii unei culture discontinue asincrone sunt: 1. Faza de lag- faza de adaptare la conditiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc in dimensiuni, dar nu se divid. Durata este variabila (2-4 ore) si depinde de starea bacteriei, conditiile mediului.

2. Faza logaritmica- bacteriile cresc si se divid cu viteza maximala constanta, curba evolueaza exponential. Bacteriile sunt foarte sensibile la agenti antimicrobieni (culture utile pentru testarea sensibilitatii antibiotice). Durata 8-10 ore. 3. Faza stationara- rata celulelor care se multiplica scade treptat, numarul celulelor vii ramine constant mai multe ore. Cauza- consumarea nutrientilor, acumularea metabolitilor toxici. Morfologia bacteriilor este tipica specie, apar incluziuni, spori (culture utile pentru identificare). Sensibilitatea la agenti antimicrobieni scade. Durata 10-12 ore. 4. Faza de declin (letalitate)-bacteriile mor progresiv. Consecinta acestor actiuni conduce, in final, la sterilizarea mediului si la moartea tutror celulelor, respective la pierderea culturii.   

Culturi discontinue sincrone- culturi in care bacteriile se divid in acelasi timp. Sunt selectionate din culture asincrone si contin organisme foarte asemanatoare deoarece apartin aceleiasi categorii de virsta si/sau de dimensiuni si ca urmare se divid aproape simultan. Procesul de diviziune sincrona dureaza numai 2-3 generatii deoarece diferentele individuale determina procesul de defazare in ritmul de crestere, chiar intre descendentii unei singure celule. Tehnicile de obtinere a culturilor sincrone sunt: -Tehnici bazate pe selectie dupa dimensiuni de virsta -Tehnici bazate pe modificari ale mediului.

Culturi continue- se realizeaza cind mediul de cultura este continuu reinnoit si imbogatit cu oxigen cu evacuarea unei cantitati de cultura. Se realizeaza in chemostate sau turbidostate, cultura aflindu-se permanent in faza exponentiala. Chemsotatele- sunt sisteme de cultivare deschise, in flux continuu, in care mediul proaspat este adaugat in mod continuu, in timp ce o cantitate egala, reprezentind surplusul de microorganism si de mediu este indepartat. În chemostat densitatea populaţiei bacteriene şi rata de creştere pot fi controlate prin intermediul a doi factori de reglare: -rata diluţiei - concentraţia unui nutrient limitant. Chemostatul asigură în mod continuu o cultură care creşte indefinit, cu o viteză constantă, în condiţii constante, furnizând celule cu proprietăţi uniforme şi activităţi fiziologice optime. Culturile continue se folosesc în practica industrială pentru: – obţinerea biomasei microbiene bogate în nutrienţi; – extragerea unor principii active de la diferite specii de microorganisme (vitamine, enzime etc.). 11.CULTIVAREA VIRUSURILOR Virusurile sunt cultivate pentru: -

Stabilirea diagnosticului etiologic

-

Testarea infecţiozităţii virusurilor

-

Testarea preparatelor antivirale

-

Producerea vaccinurilor

SISTEME DE CULTIVARE 1. Culturi de celule 2. Ou embrionat de găină 3. Animale de laborator

TEMA3: EXAMENUL BACTERIOLOGIC IN DIAGNOSTICUL BOLILOR INFECTIOASE 1. Metoda bacteriologica de diagnostic al bolilor infectioase. Esenta. Scopul . Examenul bacteriologic- consta in inocularea (insamintarea) prelevatelor pe medii de cultura pentru izolarea culturilor pure de bacterii care vor fi ulterior: -identificate -testate la sensibilitate fata de antibiotic -conservate Etapele examenului bacteriologic (incepind cu prelevarea probelor biologice pina la remiterea rezultatelor) sunt: Faza pre-analitica (responsabilitatea medicului) 

Prescrierea investigatiei (in functie de datele examenului clinic si paraclinic).

In ordonanta se fixeaza: -identitatea medicului si a pacientului -scopul analizei -manifestarile patologice -locul si data aparitiei si alte date ca: imunospuresie, tratament cu antibiotice, graviditate. 

Prelevarea probelor

-Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicarii sau/ si din caile de eliminare ale agentului patogen) -Momentul prelevarii Recoltare->transport->examen macroscopic->examen microscopic->izolarea culturilor pure>acumularea culturilor pure->identificarea culturii pure->evaluarea rezultatelor, formularea raspunsului

2. Prelevate (biosubstrate) de la pacienti si din mediul ambiant (apa, sol, aer, produse alimentare, lavaje). Regulile de recoltare si ambalare, conditiile de transportare in laborator. Pregatirea probelor pentru investigatii de laborator . Materiale de examinat de la pacienti: -Secretii rino-faringiene, bronsice

-Sputa -Puroi -Exsudate, transudate -Singe -LCR -Urina, secretii genitale

-Mase fecale, bila, suc duodenal -Bioptate, punctate -Material cadaveric Materiale de examinat din mediul extern: -Apa -Alimente -Sol -Aer -Lavaje -Vectori Mod de prelevare (recoltare): -In recipiente sterile -Respectind regulile de autoprotectie -La debutul bolii -Pina la administrarea antibioticelor -Cantitatea suficienta Transportarea -Imediata sau utilizind medii de transport, cu respectarea conditiilor special dupa necessitate -In ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic) -In fisa de insotire sa fie indicate identitatea pacientului, virsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevarii, scopul investigatiei) 3.EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBE -

Prelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) orientare în diagnostic

-

După necesitate, probele sunt supuse pregătirii pentru investigaţie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc)

-

Examinarea microscopică (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Loeffler...) – prezenţa mi/o, forma, cantitatea, G+/-.

I etapă – IZOLAREA CULTURILOR PURE Scopul izolării - de a obţine o cultură pură dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic. O colonie separată constituie o cultură pură. Tehnici utilizate: 1. Prin epuizarea inoculului pe suprafaţa gelozei din cutia Petri (însămânţare în striuri paralele, însămânţare în cadrane, etalarea consecutivă pe trei cutii). 2. Metoda diluţiilor logaritmice a inoculului în geloză topită şi răcită la 50º C (10-1, 10-2,...), apoi turnate în cutii Petri sau eprubete. Incubare în termostat la 37º C, 18-24 h (în funcţie de TG).

II etapă – ACUMULAREA CULTURII PURE -

Examinarea macroscopică a coloniilor crescute (formă, culoare, dimensiuni, etc)

-

Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte, confirmarea purităţii culturii

-

Repicarea coloniilor suspecte pe geloză în pantă (înclinată) pentru acumularea culturii pure

-

Termostat, 37º C, 18-24 ore

III etapă – IDENTIFICAREA CULTURII PURE -

Verificarea purităţii culturii (frotiu Gram)

-

Identificarea culturii pure constă în evidenţierea unor caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include într-o familie, gen, specie, variantă

Se studiază caracterele: -

Morfologice

-

Tinctoriale

-

De cultură

-

Biochimice

-

Antigenice (seroidentificarea)

-

De patogenitate

-

Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)

-

Sensibilitatea la antibiotice

Identificarea rapidă Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spaţiu, material)

Sistemul API – o galerie din plastic formată din numeroase alveole care conţin fiecare un mediu deshidratat diferit (glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacteriană testată şi incubate. Ulterior la necesitate se adaugă reactive pentru detectarea metaboliţilor particulari. Lectura – peste 4-18h conform unui cod de cifre sau computerizat

IV etapă – EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA RĂSPUNSULUI -

Compararea rezultatelor obţinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a găsi asemănări.

-

Exemplu de răspuns: Din proba examinată a fost izolată tulpina de Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibilă la ...., rezistentă la .....

4. Particularitati de izolare in cultura pura a bacteriilor -

A bacteriilor sporulate: încălzirea prealabilă a prelevatului 80º C – 20 min

-

A bacteriilor acido-rezistente: tratarea prealabilă cu acid a prelevatului şi neutralizarea ulterioară cu o bază

-

A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene: îmbogăţirea prealabilă a florei patogene utilizând medii de îmbogăţire

-

A bacteriilor cu virulenţă înaltă şi pretenţioase la cultivare: inocularea la animalele de laborator sensibile

5.Caile si metodele de creare a conditiilor anaerobe,medii de cultura speciale si paratajul utilizat EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene) Condiţia principală – cultivare în absenţa oxigenului 1. Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100º C, 20 min, răcit, acoperit cu vazelină; însămânţarea în geloză în coloană) 2. Crearea condiţiilor de anaerobioză -

Metoda fizică – utilizarea anaerostatului

-

Metoda chimică – în exicator se întroduc substanţe ce fixează oxigenul (pirogalol+bază); utilizarea gas-pachetelor

-

Metoda biologică Fortner – cultivarea concomitentă a aerobilor şi anaerobilor

Fizice 1 camera anaeroba-in care operatiunile de insamintare la observarea culturilor si repicari se fac in absenta oxigenului

2 Siatemul Mac Intosh si Filde-foloseste un borcan etans in care aerul indepartat cu o pompa in vid este inlocuit cu hidrogen sau cu un ameste gazos iar clorura de paladiu inclusa in azbest catalizeaza la cald fixarea hidrogenului pe urmele de oxigen Chimice In cutia petri poate fi creata o incinta etansa din care oxigenul este indepartat prin reactia cu pirogalul in mediu alcalin.Un pachet cu:Pirogalol 0.4g,Carbonat de potasiu:0.4g,Talc:4.0g este suficient pentru a crea anarobioza intro cutie petri de 11 cm Biologice 1 Mediu Kitt-Tarozzi A.bulion peptonat+glucoza 0.15%,agar(ph7,2-7.4) La fundul eprobetei pentru absorbtia oxigenului se introduc bucatele de ficat sau carne intrun strat de 1-1.5 cm si se acopera cu 6-7 ml mediu. Pina la utilizarea mediului se incalzeste la baia ferbinte 10-20 minpentru inlaturarea oxigenului dizolvat in el ,apoi se raceste .Pentru izolarea formelor anaerobe sporogene mediul insamintat din nou se incalzeste la temp de 80 grade(20-30min)pentru inactivarea formelor bacteriene asporulate.

6.Etapele examenului bacteriologic pentru izolarea culturilor de bacterii anaerobe (clostridiene, neclostridiene) Condiţia principală – cultivare în absenţa oxigenului 1. Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100º C, 20 min, răcit, acoperit cu vazelină; însămânţarea în geloză în coloană) 2. Crearea condiţiilor de anaerobioză -

Metoda fizică – utilizarea anaerostatului

-

Metoda chimică – în exicator se întroduc substanţe ce fixează oxigenul (pirogalol+bază); utilizarea gas-pachetelor

-

Metoda biologică Fortner – cultivarea concomitentă a aerobilor şi anaerobilor

-

Recoltarea – cu precauţie, evitând contactul cu aerul (în seringi, utilizând medii speciale)

-

I etapă – ÎMBOGĂŢIREA ANAEROBILOR

-

Însămânţarea prelevatului în 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat

-

Încălzirea unui tub la 80º C, 20 min – distrugerea florei nesporogene

-

Incubarea la 37º C, 24-48 h (va avea loc multiplicarea anaerobilor)

II etapă - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI -

Studierea caracterelor de cultură – tulburarea mediului, descompunerea bucăţilor de ficat, etc

-

Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (însămânţarea a 0,1 ml din mediul K-T pe 3 cutii cu geloză-sânge glucozată consecutiv). Incubarea în anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h

-

Metoda Weinberg – diluţii succesive ale culturii în geloză glucozată lichefiată şi aspirarea în tuburi lungi şi înguste, închise ermetic. Incubarea în termostat, 24 h III etapă - ACUMULAREA CULTURII PURE

-

Studierea macroscopică a coloniilor

-

Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte

-

Repicarea în mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure

-

Incubarea în termostat, 24 h IV etapă - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI

-

Verificarea purităţii culturii pure (frotiu Gram)

-

Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiţiilor de anaerobioză) V etapă - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA ŞI ELIBERAREA RĂSPUNSULUI

7-9.STUDIUL CARACTERELOR DE CULTURA ALE MICROORGANISMELOR ANAEROBE IZOLATE

11.Tehnici semi-,automatizate de identificare a bacteriilor Sistemul API – o galerie din plastic formată din numeroase alveole care conţin fiecare un substrat deshidratat (glucide, AA, etc). Din colonia izolată se prepară o suspensie de o anumită concentrație. Alveolele sunt inoculate cu suspensia bacteriană testată şi incubate. Ulterior la necesitate se adaugă reactive pentru detectarea metaboliţilor particulari. Lectura – peste 4-18h conform unui cod de cifre sau computerizat Sistemul VITEK® 2 Compact are ca obiect de activitate identificarea bacteriilor şi a fungilor şi testarea sensibilităţii bacteriilor cu efecte semnificative din punct de vedere clinic. Sistemul include aparatul VITEK® 2 Compact, un computer (o staţie de lucru) şi o imprimantă.  Este disponibil un sistem Advanced Expert System™ (Utilizare Clinică) pentru asigurarea online a validării sistematice a rezultatelor şi a interpretării fenotipurilor rezistente identificate în cursul testelor de senAparatul VITEK® 2 Compact este un sistem integrat care combină operaţiile de inoculare a cardului de testare, incubare a cardului de testare şi citire a rezultatelor. ETAPELE:  1. Izolarea culturii pure  2. Pregatirea probelor (a suspensiei bacteriene)  3. Introducerea cardurilor de testare şi a eprubetelor cu probe în casetelor corespunzătoare.  Încărcarea casetei în Staţia de umplere (umplerea celulelor cardurilor de testare). MALDI-TOF MS MALDI - abreviere de la "Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization.“ TOF – Time Of Flight MALDI/TOF este utilizat pentru identificarea microorganismelor (bacterii sau fungi). O colonie izolata este etalata direct pe o placa metalizata si acoperita cu matrice (absorbent de energie). Amestecul este ionizat in mod automat cu raze laser. Matricea absoarbe razele laser si le transforma in energie termica, incalzindu-se rapid (nsec) si generand ioni de analit de diferite dimensiuni. Ionii sunt identificati dupa mass-to-charge ratio. Spectromeria de masa generata este analizata cu un anumit soft si apoi comparata cu profilele stocate (biblioteca). Identificarea speciilor este mult mai rapidă, mai exactă și mai ieftină decât alte proceduri bazate pe teste imunologice sau biochimice.

Tema 4 1 . Notiune de biotope si biocenoza. Flora normala a organismului uman. Rolul ei in fiziologia si patologia umana. Relatiile dintre microorganism in biocenoze.

BIOTOP– spaţiu cu condiţii de viaţă particulare (conjunctiva, mucoasa intestinală, orofaringe, vagin, tegument, etc), populat şi transformat de asociaţii de fiinţe vii. MICROBIOCENOZĂ (ecosistem, comunitate microbiană) – asociaţii microbiene ce populează un biotop. Microorganismele prezente într-un biotop particular constituie microflora (microbiota ,microbiomul ) acestui habitat (m/f cutanată, intestinală, etc) Aceasta joacă un rol important în protejarea gazdei faţă de o invazie microbiană ulterioară, actionând prin următoarele mecanisme: • competiţia pentru aceiaşi nutrienţi; • competiţia pentru aceiaşi receptori de pe celulele gazdei; • producţia de bacteriocine; vitamine; • producerea de acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi; • stimularea continuă a sistemului imun; • stimularea producerii unor factori imuni de protecţie (anticorpii naturali).

Între microorganismele unui biotop se pot stabili relaţii: -Indiferente (neutralism) - Favorabile (comensalism/satelitism, simbioză/mutualism, sinergism) - Defavorabile (parazitism, antagonism) Antagonism – o specie inhibă sau omoară altă specie prin mecanisme specifice sau nespecifice

2. Antagonismul microbian. Tipurile. Mecanismele. Metode de studiere. Importanta practica. Antagonism – o specie inhibă sau omoară altă specie prin mecanisme specifice sau nespecifice Mi/o care manifestă activitate inhibitoare – antagonist (A), mi/o care suferă – concurent (C). Tipuri de antagonism: 1. Antagonism nespecific: - Antagonistul este mai activ, utilizând nutrienţii, oxigenul - Antagonistul produce metaboliţi toxici (acizi, indol, H2S, amoniac, peroxid, etc) 2. Antagonism specific – antagonistul produce substanţe cu acţiune specifică asupra unui sau mai multor concurenţi (antibiotice, bacteriocine) Efectul acţiunii unui antagonist asupra concurentului poate fi bacteriostatic sau bactericid (uneori bacteriolitic)

METODELE DE STUDIU AL ANTAGONISMULUI 1. În mediu solid (metoda tranşeei) – antagonistul se însămânţează în centrul cutiei, concurenţii – perpendicular. Termostat 24h. Aprecierea – după dimensiunea zonei de inhibiţie a creşterii culturii concurentului. 2. În mediu semisolid – I strat – antagonistul, II strat – concurentul. Termostat 24h. Aprecierea – zonă clară între straturi. 3. Însămânţarea în mediu lichid (BP) a unui număr egal de A şi C. După 24 h de incubaţie se reînsămânţează 0,1 ml pe placa cu geloză. Se compară numărul coloniilor de A şi C.

Utilizarea practică a antagonismului microbian: 1. Pentru depistarea mi/o – producenţi de antibiotice (micete, actinomicete, bacterii) 2. Pentru obţinerea produselor biologice curative de origine microbiană (probiotice, eubiotice/sinbiotice): Lactobacterina, Colibacterina, Bifidumbacterina, Bificol, etc 3. Crearea biocenozelor favorabile organismulu  Probioticele sunt preparate ce conţin bacterii vii sau substanţe de origine microbiană care, întroduse pe cale naturală, manifestă efecte benefice (fiziologice, biochimice şi imune) pentru organismul-gazdă prin stabilizarea şi optimizarea funcţiilor microflorei normale.  Prebioticele sunt preparate ce conţin un ingredient alimentar nedigerabil care stimulează selectiv creşterea şi activitatea unui număr limitat de bacterii rezidente ale microflorei normale intestinale.  Sinbioticele/eubioticele sunt preparate obţinute în urma combinării raţionale dintre probiotice şi prebiotice. 3. Antibioticele. Notiune. Clasificarea dupa spectrul de actiune si producent. Antibioticele – produse de origine naturală (microbiană, animală sau vegetală), derivaţi semi-sintetici sau produse sintetice care inhibă sau omoară selectiv unele mi/o sau/şi celule tumorale, fără a exercita ca regulă efecte toxice asupra macroorganismului. Clasificarea AB I.

După efectul asupra celulei

-

Bacteriostatice (tetraciclina, cloramfenicol…)

-

Bactericide (streptomicina, polimixina)

-

Bacteriolitice (peniciline, cefalosporine)

II. Dupa spectrul de acţiune - AB cu spectru îngust (limitat) de acţiune (AB anti-G+, anti-G-, anti-tuberculoase, anti-micotice, antitumorale, etc) - AB cu spectru larg de acţiune (G+ şi G-)

III. După producent (origine) 1. De origine fungică (peniciline, cefalosporine,...) 2. Din actinomicete (aminoglicozide, macrolide, cloramfenicol, etc) 3. De origine bacteriană (bacitracina din Bacillus subtilis, gramicidina din Bacillus brevis, polimixina, colistina din Paenibacillus polymyxa) 4. De origine vegetală – (alicina, rafanina) 5. De origine animală (lizozima – din albuşul de ou, ecmolina – din oase de peşte, masă eritrocitară, splenocitina – din splină)

eritrina – din

4. Metode de obtinere a antibioticelor. Cerintele fata de antibiotic. Unitatile de actiune. Antibioticele se obtin prin 3 metode: a. Metoda biologica b. Metoda sintetică c. Metoda semi-sintetică

Etapele metodei biologice: 1. Cultivarea tulpinilor-producente de AB (ex.: Penicillium notatum, Actinomyces griseum, etc) în mediu lichid adecvat 2. Extragerea AB 3. Purificarea şi concentrarea AB 4. Controlul toxicităţii 5. Determinarea activităţii AB

Cerinţele faţă de AB: - Toxicitate selectivă - Efect terapeutic cu doze minime - Activitate de lungă durată - Spectru restrâns de acţiune - Să fie solubile şi absorbite uşor - Să nu provoace efecte secundare

- Să nu se dezvolte rezistenţa contra AB - Să fie ieftine

Unitati de actiune Activitatea AB se măsoară în unităţi de masă (g, mg, µg) sau de acţiune (UA). 1 UA – cantitatea minimală de AB care inhibă creşterea unei tulpini de referinţă în condiţii standarde. Penicilina – 1UA = 0,6 µg de substanţă pură.

5.Grupele principale de antibiotice,utilizate in medicina practica Clase de antibiotice            

3.1Beta-lactame 3.2Glicopeptide 3.3Polipeptide 3.4Aminoglicozide 3.5Chinolone 3.6Tetracicline 3.7Macrolide 3.8Lincosamide 3.9Streptogramine 3.10Rifamicine 3.11Sulfamide 3.12Nitroderivați

6.Mecanismul de acţiune al AB. 1. AB cu acţiune inhibitorie asupra sintezei peretelui celular (dereglarea sintezei peptidoglicanului) - Beta-lactamice (peniciline, cefalosporine). Dereglează procesul de sinteză a PG, inhibând transpeptidazele (ţinta - PFP) - Vancomicina, teicoplanina (blochează transferul pentapeptidului din MCP spre peretele celular) - Bacitracina (blochează reciclarea moleculelor de transport transmembranar - bactoprenol) - Fosfomicina (blochează piruviltransferaza, implicată în sinteza acidului N-acetil muramic) Efectul acestor AB este bactericid/litic, doar celulele metabolic active sunt omorâte. Nu afectează celulele eucariote (lipsa PG) 2. AB cu acţiune asupra ME şi a MCP - AB polipeptidice (polimixina, colistina). Se fixează pe membrane bacteriene (în special pe lipidul A (ME la bacterii G-), provocând dezorganizarea lor. Efect bactericid.

- AB polienice (nistatina, levorina, amfotericina B, etc). Se fixează pe sterolii MCP ale micetelor, perturbând respiraţia şi dezorganizând MCP (permeabilitate excesivă şi moartea celulei). Aceste AB acţionează şi asupra celulelor în repaos. Relativ toxice, în special nefro. 1. AB cu acţiune asupra ribozomilor Se leagă pe receptori specifici de pe subunităţile 30S sau 50S, perturbând sinteza proteică (inhibiţia transpeptidazei, a translocaţiei peptidelor, etc). Rezultă inhibiţia sintezei proteice sau sinteza proteinelor nefuncţionale. Efectul este bacteriostatic (aminosidele – bactericid), doar asupra celulelor active metabolic.

- 30S (aminoside: streptomicina, kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina; tetracicline) - 50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide: eritromicina, oleandomicina; lincosamide: clindamicina, lincomicina). 4. AB cu acţiune asupra acizilor nucleici - Rifampicina – inhibă ARN-polimeraza ADNdependentă. Rezultă stoparea sintezei ARNm - Novobiocina , Chinolonele (acidul nalidixic, ciprofloxacina, ofloxacina) – blochează activitatea topoizomerazelor, intervenind în conformaţia ADN-ului. Efect bactericid. - Sulfamidele şi trimetoprimul perturbă sinteza acidului folic şi folaţilor (cofactori în sinteza AN). Activitate bacteriostatică. 7.Sensibilitatea bacteriilor la antibiotic.Notiuni de bacterii sensibile,rezistente,intermediare Sensibilitatea microbilor la AB În funcţie de rezultatele clinice, bacteriile se divizează în 3 clase: sensibile la AB (S), rezistente (R) şi intermediare (I, moderat sensibile). Tulpinile S – efectul terapeutic este obţinut cu doze terapeutice uzuale Tulpinile R – efectul terapeutic nu poate fi obţinut cu doze terapeutice Tulpinile I – succesul terapeutic este imprevizibil. Ar fi posibil cu doze mari sau la administrarea locală a AB.

8.Determinarea sensibilitatii microbilor la antibiotic.Metoda difuzimetrica (a rondelor) Fiecare tulpină izolată manifestă sensibilitate particulară. Ea poate fi studiată în laborator pentru determinarea profilului de sensibilităţi al acestei tulpini, ceea ce constituie o antibiogramă.  Prin antibiograma se intelege testarea sensibilitatii față de diverse antibiotice a unei tulpini bacteriene izolate dintr-un prelevat. Rezultatele testelor de sensibilitate permit medicului să claseze tulpinile bacteriene după categoriile terapeutice (S, R, I) – tratament corect, monitoring-ul apariţiei şi evoluţiei rezistenţei la acest AB, uneori sunt utile în identificarea tulpinilor.

Testarea sensibilităţii bacteriilor la AB Metoda difuzimetrică (discurilor, rondelelor) Kirby- Bauer. Calitativă, utilizată uzual în infecţii banale. Condiţii: mediu standard, concentraţie standardă de mi/o, rondele/discuri/comprimate cu % standarde de AB, condiţii standarde. Mediul este inoculat cu suspensia bacteriană. După uscare în termostat se aplică rondelele cu pensa sau cu dispenser pentru discuri – 24h, 37°C.  In jurul discurilor se va realiza un gradient de concentratie prin difuziunea locala a antibioticului (in imediata vecinatate a discului realizindu-se o concentratie mai mare de antibiotic care descreste pe masura indepartarii de acesta). Citirea– se măsoară diametrul zonei de inhibiţie a creşterii culturii bacteriene. Interpretarea – Sensibil (S), Rezistent (R), Intermediar (I) în funcție de valorile din tabelele de interpretare. 9.Metoda dilutiilor successive (in medii lichide si solide). Notiune de Concentratie Minima de Inhibitie (CMI), Concentratie Minima Bactericida (CMBC). Corelatia CMI\CT si semnificatia ei in prescrierea antibioticelor.  Metoda diluţiilor (cantitativa) Într-un şir de tuburi cu 1 ml de bulion peptonat se efectuează diluţia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, etc). Se adaugă în fiecare tub (cu excepţia celui martor) 0,1 ml de suspensie bacteriană (concentrație standard). Termostat - 24h. Lectura – cea mai mică doză de AB care inhibă creşterea culturii după 24h de incubare (mediu clar) constituie Concentraţia Minimă de Inhibiţie (CMI) a AB pentru tulpina testată. CMI măsoară efectul bacteriostatic Concentraţia Minimă Bactericidă (CMB) – cantitatea minimă de AB care omoară 99,9% din inoculum după 18h de incubare. Determinarea CMB – din ultimele tuburi fără creştere se repică 0,1 ml de mediu pe placa cu geloză. După 1824h se compară numărul celulelor ce au supravieţuit cu nr iniţial de bacterii (din tubul-martor). Testarea CMI / CMB este indicată în tratamentul infecţiilor grave - meningite, septicemii, endocardite, infecţii cronice sau la persoane cu imunosupresie, testarea bacteriilor cu cultivare lentă. Noțiune de concentrație critică (terapeutică sau concentrație mediu ponderată) Concentrațiile critice sunt stabilite pe baza concentrațiilor serice/tisulare obținute după administrarea unei posologii uzuale și a posologiei maximum tolerate.  concentraţia critică inferioară (c) - concentraţia serică a antibioticului obţinută după administrarea unei posologii uzuale  concentraţia critică superioară (C) - concentraţia serică a antibioticului obţinută după administrarea unei posologii maximum tolerate.  Fiecare AB are propriile concentrații critice (terapeutice)

11.Rezistenta bacteriilor la antibiotic.Tipuile.Mecanismele rezistentei.Combaterea rezistentei dobandite Rezistenţa la antibiotice este capacitatea naturală sau dobândită a unui microorganism de a rezista efectelor unuia sau mai multor antibiotice.  Rezistența naturală (constitutiva):  Caracterizează ansamblul de tulpini ale unei specii sau gen  Purtată de cromozom  Transmisibilă la descendenți (vertical)  Determină fenotipurile “sălbatice” de rezistență la antibiotice Exemplu: - lipsa ţintei – ex.: micoplasme, micete; -

imposibilitatea de a atinge ţinta – ex.: Mycobacterium (ceara, lipidele împiedică pătrunderea AB în citoplasmă);

-

bacteriile nu efectuează procesul inhibat de AB – ex.: acidul folic este preluat din mediu – rezistenţă la sulfamide

 Rezistența dobândită:  Se referă doar la o proporție de tulpini ale unei specii sau gen  Variabilă în timp  Există prin dobândirea unui mecanism (sau mai multor) de rezistență  Frecvent mediată de un element genetic mobil (plasmide, transpozoni)  Transmisibilă orizontal (uneori între specii diferite)  Determină un anumit fenotip de rezistență, diferit de fenotipul “sălbatic” Rezistența dobândită depinde de acţiunea de selecţie exercitată de AB utilizate în tratament, urmată de răspândirea ei (între bacterii, interuman, transmisie de origine animală). Mecanismele rezistenţei dobândite: -

Diminuarea permeabilităţii membranare

-

Modificarea ţintei moleculare

-

Eliminarea rapidă a AB (sisteme de eflux)

-

Inactivarea enzimatică a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinază, cefalosporinază) sau modificat structural (acetilaze, adenilaze, fosforilaze), etc.

Rezistenţa dobândită se poate manifesta fenotipic (bacteriile în faza de repaos, formele “L” de bacterii) sau genetic (genotipic) Rezistenţa genetică poate fi achiziţionată în urma: -

Mutaţiilor (rezistenţă cromozomială) - 10%

Mecanisme: modificarea ţintei moleculare, diminuarea permeabilităţii membranare -

Transferului de material genetic, realizat prin transfer de gene (conjugare prin intermediul plasmidelor R (poate fi rezistenţă multiplă), transducţie – bacteriofagi, transformare)

Mecanisme: inactivarea enzimatică, modificarea ţintei, substituţia sau supraproducţia ţintei, excreţie excesivă a AB. Programul OMS de combatere a rezistenței bacteriilor la antibiotice  Utilizarea prudentă a antibioticelor (de nu utilizat AB când beneficiul este minimal, utilizarea AB cu spectru îngust, respectarea posologiei)  Accent pe prevenirea infecțiilor (vaccinări, măsuri de control al infecțiilor, ameliorarea condițiilor sanitaro-igienice)  Monitorizarea rezistenței bacteriilor la antibiotice  Cercetări pentru obținerea de AB noi Prevenirea rezistenţei 1. Politică strictă de prescriere a AB 2. Respectarea dozelor terapeutice corecte şi a timpului de tratament necesar 3. Asocierea AB cu mecanisme de acţiune diferite 4. Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utilizând inhibitori (acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). Ex.: augmentina – amoxicilina+acid clavulanic 5. Reciclarea AB 6. Producerea AB noi 7. Supravegherea epidemiologică a tulpinilor rezistente

12. Reactiile adverse ale organismului la administrarea de antibiotice. - Efect toxic (streptomicina – surditate, cloramfenicolul – toxică pentru măduva osoasă, polipeptidele – nefrotoxice, etc) - Efect teratogen - Acţiune sensibilizantă (penicilina, etc)

-Disbacterioză - Dereglarea imunogenezei -Selecţia suşelor rezistente

11. Bacteriocinele. Tipurile si importanta. Bacteriocinele – substanţe proteice bactericide produse de numeroase specii bacteriene şi active asupra altor tulpini ale aceeaşi specii sau asupra speciilor înrudite. Producerea bacteriocinelor este determinată plasmidic (plasmide Col). Tipuri de bacteriocine: - colicine (secretate de Escherichia coli), -corinecine (Corynebacterium), -vibriocine (Vibrio), -piocine (Pseudomonas)

Studiul sensibilităţii unei tulpini la bacteriocine (bacteriocinotipia) se utilizează în scopuri epidemiologice