TD Microbiologie de L'eau 2018 [PDF]

Zitiervorschau

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU

INTRODUCTION Les eaux sont divisées principalement en deux catégories: . Les eaux destinées à la consommation humaine (boisson, préparation d’aliments…) . Les eaux de baignade Les origines des eaux sont diverses: . Eaux souterraines . Eaux de surface Par conséquence, la flore microbienne qui y est présente est très variée. La présence de micro-organismes pathogènes dans les eaux provoquent de sérieux problèmes de santé pour l’homme (déséquilibres intestinaux, maladies cutanées, respiratoires,…).

De ce fait, les eaux font l’objet de contrôles bactériologiques périodiques, entrant dans le cadre d’une politique de prévention et de surveillance des maladies à transmission hydrique. On estime actuellement qu’il existe dans les pays en voie de développement environ 500 millions de personnes qui souffrent chaque année de maladies transmises par des microorganismes pathogènes présents dans les eaux.

ECHANTILLONNAGE  Un examen bactériologique ne peut être valablement interprété que s’il est effectué sur un échantillon correctement prélevé (respectant les règles d’asepsie, homogène et représentatif), selon un mode opératoire précis évitant toute contamination accidentelle. Correctement transporté au laboratoire et analysé sans délai ou après une courte durée de conservation dans des conditions satisfaisantes.

Matériels • Récipients De préférence des flacons en verre de 500 ml borosilicatés Flacon en plastique à usage unique stérilisés par le fabriquant. Ces deux dispositifs doivent être stérilisés au préalable à l’autoclave. materiel : • - Désinfectant (éthanol). • - Désinfectant pour les mains + papier essuie-mains. • - Chalumeau à gaz avec recharges. • - Briquet. • - Marqueurs, stylos, étiquettes. • - Clés à molette. • - Glacière avec blocs réfrigérants. • - Thermomètre. • - Porte flacon lesté (perche). • - Flacons stériles avec thiosulfate de sodium.

Appareillage Canne de prélèvement : Constituée de : • Segments métalliques : d’environ 50 cm s’ajustant les uns au bout des autres. • Une pince de laboratoire : soudée au dernier segment permettant le maintient du flacon de prélèvement.

Plongeur : Il s’agit d’un appareil auquel est fixé le flacon de prélèvement et qui permet d’entrainer celui-ci au dessus de la surface de l’eau, suspendu à une corde, cet appareil peut être descendu au fond d’un puits (du bord de la margelle), dans un cours d’eau (d’un pont) en profondeur dans un lac (d’un bateau).

Prélèvement de l’eau de robinet . Enlever les brises-jets et tuyaux de caoutchouc adaptés au robinet choisi, débarrasser le calcaire qui s’est déposé; · Se laver très soigneusement les mains et avant-bras, les rincer à l’alcool, laisser sécher; · Flamber le robinet pendant au moins 1 minute; · Ouvrir le robinet et laisser couler 3 à 5 minutes avant de faire le prélèvement; · Travailler devant une flamme; · Flamber rapidement le bord du goulot, remplir presque entièrement le flacon, flamber à nouveau rapidement le bord du goulot et remettre le bouchon.

Prélèvement dans un puits à l’aide d’un plongeur · Utiliser un plongeur stérile enveloppé de son papier protecteur et d’une corde, de longueur adaptée à la profondeur du puits; · Poser le plongeur sur le sol; · Enlever le coton obturant le goulot, soulever l’appareil, le dégager totalement du papier protecteur et le descendre lentement dans le puits, en évitant de toucher les parois de celui-ci; · Prélever à 0.5 mètres de la surface; · Lorsque le flacon est plein, remonté l’appareil, dégager le flacon en le prenant par la base du goulot; · Vider un peu d’eau; · Flamber le bord du goulot et l’obturer avec le bouchon dégagé de son paquet;

•Ce même procédé est utilisé pour le prélèvement des eaux de rivière, de lac, de citerne ou de réservoir. •Il est possible d’utiliser des appareils spéciaux ne s’ouvrant qu’une fois la profondeur désirée atteinte et qui autorisent une meilleure précision.

TRANSPORT L’échantillon est transporté au laboratoire et analysé sans délai ou après une courte durée de conservation dans des conditions satisfaisantes.

Les différentes eaux et les micro-organismes recherchés Les eaux

Les germes

Eau du robinet (T)

Eaux de puits/baches forages/sondes (NT)

Eau de piscine

Eaux à usage pharmaceutique/ cosmétique

Coliformes totaux

Coliformes fécaux Streptocoques fécaux Germes anaérobies sulfitoréducteurs Salmonella Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

Germes aérobies mésophiles totaux Vibrio cholerae

(tester la qualité marchande du produit)

Eau de source minérale

Eau de mer

Critères microbiologiques d’une eau potable

Exemple: Qualité requise pour les eaux de baignade (eaux de mer) Paramètres microbiologiques

Unités

Valeurs guides

Valeurs limites

Coliformes totaux

/100 mL

500

10000

Coliformes fécaux

/100 mL

100

2000

Streptocoques fécaux

/100 mL

100

-

Salmonelles

/1 mL

-

0

Vibrion cholérique

/450 mL

-

0

Les concentrations ≤ aux valeurs guides: eau de bonne qualité. Les concentrations comprises entre les valeurs guides et les valeurs limites: eau de qualité acceptable. Les concentrations ˃ aux valeurs limites: eau de mauvaise qualité. Pour les Salmonelles et le vibrion cholérique, le seuil est de zéro ie qu’aucun germe n’est toléré dans le volume d’eau à analyser.

En milieu solide Méthode par incorporation Méthode par étalement Méthode par filtration

En milieu liquide

Méthode de détermination du nombre le plus probable (NPP)

Technique de dénombrement en milieu liquide Principe général Les prise d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses dilutions sont incorporées dans un milieu liquide conçu pour permettre la croissance d’un micro-organisme ou de groupe de microorganismes. la croissance se traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et, éventuellement, une modification visible ( virage d’un indicateur de pH coloré).

Mode opératoire • On ensemence des dilutions successives de l’eau à analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution. • On notera le nombre de tubes inoculés présentant une culture positive. • Les tables, en fonction du nombre caractéristique (nombre de tubes positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et son intervalle de confiance).

Recherche et numérotation par filtration

Principe La filtration sur membrane consiste à faire passer un certain volume d’échantillon au travers une membrane filtrante (type membrane millipore quadrillée de 47 nm de diamètre et d’une porosité de 0,45 µm) sur laquelle sont retenus les micro-organismes recherchés. Le filtre est ensuite posé sur la surface d’un milieu gélosé spécifique du germe à rechercher, face portant les germes vers le haut. Après incubation, on compte les colonies formées à la surface du filtre.

Technique • Stériliser la plaque poreuse et l’entonnoir de l’appareil (les flamber avec le bec Bunsen); • Mettre en marche la pompe à vide et ouvrir le robinet du support puis refroidir le dispositif avec l’eau à analyser; • Fermer par la suite le robinet du support; • Déposer le filtre stérile avec une pince stérile sur la plaque poreuse; • Placer l’entonnoir au dessus du filtre; • Verser l’eau à analyser, après l’avoir agiter, dans l’entonnoir (la quantité d’eau est variable selon le type d’analyse à effectuer); • Ouvrir le robinet du support pour laisser l’eau s’écouler lentement sous l’action du vide.

Evaluation du nombre de bactéries par mL

Nombre de colonies compté dilution de l’échantillon

n N = —————— x d V UFC.cm-3 Volume de l’inoculum cm3

Dénombrement des micro-organismes revivifiables

Définition On entend par microorganismes : bactéries, levures, moisissures  Qui se développent à 20°C favorisant ainsi les germes spécifiques de l’eau.  Et celles qui se développent à 37°C favorisant ainsi les germes issus de l’homme et des animaux à sang chaud. Le dénombrement s’effectue après ensemencement en masse en milieu PCA (Plat Count Agar) ou TGEA (Tryptone Glucose Extract Agar).

Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux Définitions Les coliformes totaux : bacilles aérobie et anaérobie facultatifs, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de d’acide et de gaz en 48h à une température de 35- 37°C. Ils se répartissent en fait en deux catégories : Les germes d’origine fécale stricte : Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, serratia.  Les germes provenant d’autre sources environnementales (aquatique et tellurique) : Enterobacter intermedium, Amnigenus et klebsiella terrigena. Le milieu TTC tergitol est un milieu sélectif, utilisé pour la recherche et le dénombrement des coliformes.

Intérêts la recherche et le dénombrement des coliformes totaux à 37°C: intéressant pour juger de l’efficacité de la désinfection d’une eau est d’un intérêt moindre pour déceler une contamination fécale sure. coliformes thermotolérants ou fécaux à 44°C : la présence signe l’existence quasi certaine d’une contamination fécale récente.

La recherche et le dénombrement des seules Escherichia coli ou présumés : parmi les coliformes thermotolérants, Escherichia coli est l’espèce la plus représentée dans la flore intestinale de l’homme et des animaux.

Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux ou entérocoque Définition bactéries Gram positif, sphériques ou ovoïdes, formant des chainettes, non sporulées, catalase négative, possédant l’antigène D, cultivant en anaérobiose à 44°C, et à pH 9.6, et capables d’hydrolyser l’esculine en présence de bile. Le milieu Slanetz et Bartley est utilisé pour la recherche et le dénombrement des streptocoques. les colonies representatives apparaissent roses à marrons.

Intérêts  les entéroques sont plus résistant que les coliformes dans les eaux naturelles ; leur présence serait donc le signe d’une contamination fécale de l’eau plus ancienne.  La résistance des entérocoques aux agents désinfectant est également plus importante, probablement du fait de leur mode groupement en chainettes, et est comparable à celle des entérovirus. cette propriété pourrait permettre aux entérocoques de mieux représenter la contamination virale d’une eau.  Par contre une partie des espèces est peu spécifiques des contaminations fécales. On retrouve par exemple Streptococcus feacalis var liquefaciens dans l’environnement, sur les végétaux ou sur des sols non contaminés.

Recherche et dénombrement des spores de clostridium sulfito-réducteurs Les Spores : formes de résistance de micro-organismes. Elles se développent en anaérobiose à 37°C ± 1 en 24h et ou 48h en gélose viande foie et donnant des colonies typiques réduisant le sulfite de sodium. Forme végétative: bacilles Gram positif.

Intérêts  Ils ne sont pas tous des indicateurs de contamination fécale. Clostridium perfringens bien qu’effectivement présent dans les matières fécales, est un germe assez ubiquiste.  L’intérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans la propriété qu'ils sporuler, ce qui les rend particulièrement résistant aux traitements de désinfection.  Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs de l’efficacité des traitements vis-à-vis des parasites et en particulier de Cryptosporidium.

Méthode de recherche et Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale analyse

technique

Volume de l’échantillon

µ-organisme revivifiables

Incorporation en milieu liquide

1 ml

Coliformes totaux

filtration

Coliformes fécaux

Milieu utilisé

T° d’incubation

confirmation

Gélose à l’extrait de levure

37° ou 20° C

Colonies blanches

100 ml

Gélose lactosée au TTC

37° C

Colonies typiques oranges

filtration

100 ml

Gélose lactosée au TTC

44° C

Colonies typiques oranges

Streptocoque Du Gr D

filtration

100 ml

Gélose Slanetz et bartley

37° C

Colonies typiques roses à marrons

Clostridium sulfitoréducteurs

Incorporation en milieu solide

20 ml

Gélose Viande - foie

37 ° C

Colomies typiques noires

Colonies de Coliformes sur TTC tergitol

Colonies de Streptocoques sur Slanetz et Bartley

Recherche des bactéries pathogènes

Recherche de salmonella Définition  Des bacille Gram négatifs  Se multipliant 37°C en 24 à 48 h, sur milieu Hektoen, formant de petites colonies, lisses à contours réguliers, pigmentées en vert ou en bleu vert à centre noir. Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les typhoidiques (Hautement pathogènes) et les non typhoidiques.

Méthode de recherche

Pré-enrichissement

Enrichissement primaire

Enrichissement secondaire

Lecture et interprétation  Repérer les colonies caractéristiques.  Faire une identification biochimique basée essentiellement sur ONPG, TSI, Urée -Indole, LDC,…  Si nécessaire faire une identification antigénique basée essentiellement sur l’agglutination à l’aide des sérums de groupe OMA et OMB ou bien s’adresser au laboratoire de référence.

Recherche de vibrion cholérique Définition  Bacille Gram négatif droits ou incurvés,  Très mobiles,  Oxydase (+),  Aéro-anaéribies facultatifs,  Fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S,  Hautement pathogènes. Isolées sur milieu G.N.A.B, les colonies apparaissent grisâtres et transparentes.

Méthode de recherche

Recherche de Staphylocoques à coagulase positive Définition . Cocci à Gram (+) . Isolées ou en grappes de raisin, . Catalase (+) et coagulase (+) . Se multipliant en 24 à 48 h à 37 °C sur un milieu sélectif Chapman au mannitol. L’espèce type du genre est Staphylococcus aureus. Elle est pathogène et très redoutée.

Méthode de recherche

Recherche de Pseudomonas aéruginosa Définition . Un bacille Gram négatif, . Oxydase (+), . Capable de produire de l’ammoniac à partir de l’acétamide. Pseudomonas aeruginosa, est également une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques.

Méthode de recherche

Lecture et interprétation Après la période d’incubation spécifiée : •les colonies pigmentées en bleu vert donc productrices de pyocyanine sont considérées d’emblée comme des colonies de Pseudomonas aeruginosa : Compter le nombre de colonies. •Les colonies qui présentent une fluorescence sous UV, nécessitent une confirmation biochimique basée essentiellement sur un repiquage sur bouillon à l’acétamide qui sera incubé à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures. Après incubation, la production d’ammoniac à partir du bouillon à l’acétamide, est révélée avec une à deux gouttes du réactif de Nessler. Une décoloration du jaune au rouge brique, est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : Compter le nombre de colonies. •Les colonies présentant une pigmentation brun rougeâtre sans fluorescence, nécessitent également une confirmation biochimique basée d’abord sur le test à l’oxydase : •Les colonies oxydase positives seront ensuite repiquées d’une part, sur bouillon à l’acétamide qui sera incubé à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures et d’autre part, sur milieu King B. Après incubation : •La production d’ammoniac à partir du bouillon à l’acétamide, révélée avec une à deux gouttes du réactif de Nessler : décoloration du jaune au rouge brique, et est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : Compter le nombre de colonies. •L’apparition d’une fluorescence sur milieu King B exposé aux UV (360 nm) est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : À compter.