Microbiologie Alimentara Veterinara [PDF]

Zitiervorschau

Microbiologie Alimentară An VI Sem I

Cuprins Lp-uri L.p. I- II CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL ALIMENTELOR..................................3 L.p. III Determinarea prezenței și numărului de bacterii coliforme (coliformi totali) și a speciei Escherichia coli...........................................................................................................40 L.p. IV Determinarea prezenței bacterii lor din genul Salmonella......................................52 L.p. V Determinarea prezenței și a numărului de clostridii sulfito reducătoare................67 L.p. VI Determinarea prezenței și identificarea bacteriei Listeria monocytogenes............78 L.p. VII Determinarea prezenței și numărului de stafilococi coagulază pozitivi...............89 L.p. VIII Determinarea prezenței și a numărului de bacterii din specia Bacillus cereus..96

Cursuri Curs I Microbiologie alimentară.........................................................................................104 Curs II Toxiinfecțiile alimentare generalități.....................................................................114 Curs III Toxiinfecții alimentare produse de Escherichia coli............................................117 Curs IV Toxiinfecții alimentare produse de Staphylococcus aureus................................126 Curs V Toxiinfecții alimentare produse de Salmonella......................................................130 Curs VI Toxiinfecții alimentare produse de Listeria monocytogenes................................141 Curs VII Toxiinfecții alimentare produse de Bacillus cereus............................................149 Curs VIII Toxiinfecții alimentare produse de Clostridium Botulinum.............................154 Curs IX Toxiinfecții alimentare produse de Campylobacter spp.......................................162 Curs X Paraziții din alimente................................................................................................168 Curs XI Toxiinfecții alimentare produse de virusuri.........................................................173 Curs XII Micotoxinele în lanțul alimentar.........................................................................180 Curs XIII Controlul microorganismelor în alimente.........................................................192

1

Tabele cu Criterii microbiologice pentru produsele alimentare......................................200

2

L.p.

I

MICROBIOLOGIE

ALIMENTARĂ

CONTROLUL

MICROBIOLOGIC AL ALIMENTELOR Norme de biosecuritate în laboratorul de microbiologie alimentară Eșantionarea, recoltarea, transportul și recepția probelor

Microbiologia alimentară Permite realizarea diferitelor analize și a controalelor indispensabile pentru: 1. determinarea calității / siguranței produselor; 2. verificarea igienei; -mediului de producție; -rețelei de distribuție.

Domeniul de interes al microbiologiei alimentare Controlul calității microbiologice - a alimentelor, limitat la controlul produsului finit prin raport are la o normă de calitate microbiologică (igienică). 1. activități ce urmăresc controlul materiilor prime brute, în curs de transformare sau a alimentului finit. 2. al respectării normelor de fabricație prin identificarea principalelor puncte critice ale sistemului de producție/distribuție, (activitatea HACCP - controlul procesului tehnologic de producție trebuie să permită determinarea punctelor critice).

3

rapide fiabile

Metode de analiză reproductibile simple( să implice costuri scăzute)

Metodele de analiză și exprimarea rezultatelor sunt unitare și sunt prezentate în standarde naționale (STAS SR ISO) și standarde europene (SR EN ISO). Absența sau prezența în cazul celor patogeni sau responsabili de boli infecțioase, numărul germenilor cu risc mai scăzut, contaminanți sau din flora normală a materiilor prime din compoziție. Trebuie garantată securitatea consumatorului prin detecția microorganismelor periculoase sau a eventualilor metaboliți toxici sau a toxinelor bacteriene și asigurarea unui produs de bună calitate ( inclusiv printr-o bună conservare). Planul sanitar cuprinde lista bacteriilor ,, periculoase” responsabile de îmbolnăviri după consumul alimentelor contaminate, ce are tendința de a se mări: ➢ Salmonella ➢ Shigella ➢ Staphylococcus aureus enterotoxigenic ➢ Clostridium perfringens la care s-au adăugat Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus ➢ Escherichia coli (enteropatogenică)

4

➢ alte bacterii din genurile Streptococcus, Listeria, Campylobacter, Yersinia, Brucella etc.

RISCURILE ÎN LABORATOARELE DE MICROBIOLOGIE Riscul manipulării microorganismelor a căror identitate și patogenitate sunt necunoscute. Tehnicianul trebuie să cunoască: •

germenii manipulați sau cercetați;

•

căile de acces ale acestui germen în organism;

•

cele mai bune metode de manipulare pentru diminuarea acestui risc. Microorganismele sunt clasificate în 4 grupe după riscul potențial pe care îl

exprimă:

1. Grupa 1 cuprinde microorganisme puțin periculoase pentru microbiolog și mediul de lucru. 2. Grupa 2 corespunde germenilor cu riscuri moderate pentru manipulator și limitate la spațiul de lucru. 3. Grupa 3 este constituită de microorganisme cu înalt risc pentru manipulator și risc moderat pentru spațiul de lucru. 4. Grupa 4 corespunde microorganismelor foarte periculoase pentru manipulator și mediul acestuia. Căile de pătrundere a germenilor sunt: 1. bucală( ingestie) pipetare, apropierea de gură a degetelor sau a obiectelor contaminate ( țigări, stilou, alimente etc.,) - manipulare aseptică incorectă. 2. pe cale respiratorie (trahee,pulmoni) de către aerosoli (particule lichide sau nu în suspensie în aer) - aceștia pot fi generați de omogenizare, centrifugare, etc. 3. prin contact cutanat (Brucella, Staphylococcus sau Pseudomonas) sau la nivelul mucoaselor sau organelor precum ochii. 4. prin penetrare subcutanata accidentală (prin înțepătură sau existența unei plăgi).

5

LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE SE REALIZEAZĂ ANALIZELE DE RUTINĂ (controlul calitativ conform unei norme, evaluarea calității materiilor prime) dar care să permită evaluarea operațiunilor de transformare sau de preparare. Cercetarea și depistarea eventualelor puncte critice (HACCP), evaluarea eficacității tratamentelor antimicrobiene de conservare, ambalaj și igienă, etc. Microorganismele regăsite aparțin în majoritate grupelor 1, 2 și 3. Laboratorul trebuie să fie compus din 3 părți principale: 1. laboratorul propriu0zis sau unde se vor realiza analizele. 2. sala de preparare a mediilor de cultură. 3. sala cu mașina de spălat materialele din sticlă și plastic utilizate pentru analize și unde se depozitează materialul curat și steril. Această încăpere poate constitui o singură cameră împreună cu cea de preparare a mediilor.

6

Dotările laboratoarelor de analize: - un spațiu suficient cu o circulație limitată, cu două sau trei încăperi; - pereții, plafonul și podeaua uniforme dar fără pericol de alunecare, să nu rețină umezeala, ușor de curățat și dezinfectat; - să fie luminate natural sau lumină artificială de bună calitate. Ferestrele culisate cu montură din aluminium echipate cu draperii rulante; - mese de lucru netede și rezistente; - lămpi U.V. dispuse pe plafon și echipate cu temporizator în sala de lucru. A se reține că buna funcționare a laboratorului necesită, în special la nivelul manipulărilor, un personal calificat! • Regulile de igienă strictă și bună creștere trebuie să fie respectate!

7

MATERIALE

ȘI

ECHIPAMENTE

DIN

LABORATORUL

DE

MICROBIOLOGIE Frecvența și diversitatea studiilor cantitative și calitative necesită: 1. Sisteme de sterilizare/ dezinfectare și zone sterile: a) Autoclavul vertical sau orizontal pentru sterilizarea cu vapori a mediilor de cultură, a deșeurilor și a materialelor contaminate. Sterilizarea se realizează în general la 115 sau 121 C 0 timp de 10-30 de minute. b) Etuva Pasteur permite sterilizarea uscată a materialului din sticlă sau din metal și trebuie să atingă o temperatură de 170-1800 C. c) Sistemele de micro sau ultrafiltrare prin membrane se utilizează pentru medii de cultură, lichide ce nu se pot autoclava sau pentru analiza lichidelor (ex. apa). d) Lămpi U.V. prevăzute cu temporizator, instalate în încăperi precum și în hote. Personalul trebuie să se protejeze! e) Recipiente cu hipoclorit de sodiu. Mediul contaminat, după citire, se depozitează în saci speciali care se autoclavează. f) zonele de lucru sunt situate în apropiata protecție a becurilor Bunsen sau în hota cu flux laminar care după funcționare protejează fie produsul, fie operatorul, fie ambii. Hotele cu flux laminar sunt clasate în 3 categorii după funcționare.

8

Materiale folosite pentru incubare și prepararea mediilor de cultură •

Termostate ce pot fi reglate la temperaturi între 25 și 55 º C;

•

Pahare anaerobe și echipament necesar pentru controlul atmosferei (catalizator, generator de hidrogen sau de dioxid de carbon, indicator albastru de metilen) pentru studiul germenilor strict anaerobi.

•

Bains-marie pentru reconstituirea mediului de cultură (100 º C) și menținerea în stare lichidă (45-47o C);

•

Un cuptor cu microunde pentru reducerea tratamentelor termice a mediilor;

•

Balanțe de la 1-2 kg la 1/10 g și de la 200 g la 1/10 mg) indispensabile pentru prepararea mediilor și a eșantioanelor;

•

Eprubete de sticlă de 16 x 160 sau 18 x 180 mm, tuburi de hemoliză de unică folosință și de recipiente cu volume variabile ce pot fi sterilizate (flacoane Erlenmeyer);

•

Pipete sterile de unică folosință și sisteme de pipetaj automatic;

9

•

Magneți pentru agitarea mediului la încălzire și un repartitor volumetric pentru prepararea și distribuirea mediului de cultură.

D . 4 . Microscopie Echipamente de microscopie: •

microscopul cu accesoriile sale;

•

lame și lamele;

•

coloranți și reactivi diverși;

•

Ocularele x10 sunt cele mai comune iar microscopul să dispună de obiective x10, x40 și x100 la imersie;

•

microscopul adaptat cu epifluorescență- tehnicile de imuno-microbiologie,

•

Reactivii coloranți cei mai utilizați sunt cei folosiți pentru colorația GRAM (violet de gențiană, lügol , etanol,fucsină) sau pentru colorații simple (albastru de metilen).

10

Eșantionarea, recoltarea, transportul și recepția probelor REGULAMENTUL (CE) NR 2073/2005 AL COMISIEI din 15 noiembrie 2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare. Prelevarea de probe din mediul de producție și prelucrare poate constitui bun instrument util pentru identificarea și prevenirea prezenței microorganismelor patogene în produsele alimentare. Operatorii din sectorul alimentar trebuie să decidă ei înșiși frecvențele pentru prelevările de probe și controalele necesare în cadrul procedurilor lor bazate pe principiile HACCP și pe alte proceduri de control al igienei. Probele se prelevează din zonele de prelucrare și din echipamentul utilizat la producția produselor alimentare, în cazul în care astfel de prelevări de probe sunt necesare pentru asigurarea respectării criteriilor. Pentru aceste prelevări de probe, standardul ISO 18593 se folosește ca metodă de referință.

Definiții •

Microorganisme = înseamnă bacterii, virusuri, drojdii, mucegai, alge, protozoare parazite, viermi intestinali, paraziți microscopici, precum și toxinele și metaboliții acestora.

•

Criteriu microbiologic = înseamnă un criteriu care definește gradul de acceptabilitate al unui produs, al unui lot de produse alimentare sau al unui proces, pe baza absenței, prezenței sau numărului de microorganisme, și/sau a cantității toxinelor/metaboliților acestora, pe unitate(unități) de masă, volum, suprafață sau lot.

•

Criteriul siguranței alimentare = înseamnă un criteriu care definește gradul de acceptabilitate al unui produs sau a unui lot de produse alimentare, aplicabil produselor introduse pe piață.

11

•

Criteriul igienei procesului = înseamnă un criteriu care indică gradul de acceptabilitate al funcționării procesului de producție. Un astfel de criteriu nu se aplică produselor introduse pe piață. Acesta stabilește o valoare de referință a contaminării, la depășirea căreia se impun măsuri corective destinate să mențină igiena procesului în conformitate cu legislația în domeniul alimentar.

•

Lot = înseamnă un grup sau o serie de produse identificabile obținute în urma unui anumit proces în condiții practic identice și produse într-un anumit loc în cadrul unei perioade de producție determinate.

•

Probă = înseamnă un set compus din una sau mai multe unități sau dintr-o porțiune a unei materii, selectate prin diferite mijloace dintr-o populație sau dintr-o cantitate importantă de materie și având ca scop furnizarea de informații cu privire la o anume caracteristică a populației sau a materiei studiate și oferirea unei baze pentru o decizie cu privire la populația în cauză sau la materia în cauză sau cu privire la procesul din care a rezultat.

•

Probă reprezentativă = înseamnă o probă în care se păstrează caracteristicile lotului din care a fost prelevată. Acesta este cazul în special atunci când oricare dintre articolele sau prelevările elementare din lot este caracterizat de același grad de probabilitate de a face parte din probă.

Prelevarea probelor În absența unor norme mai speciale privind prelevarea de probe și pregătirea probelor pentru teste, se folosesc ca metode de referință standardele relevante ale ISO (Organizația Internațională de Standardizare) și orientările din Codex Alimentariu. Eșantioanele sunt separate în 5 probe de 100 g prelevate steril și identificate. Din alimentele solide se recoltează de pe suprafață și din profunzime, iar din lichide după omogenizare. În cazurile de TIA, microbiologul va identifica germenii de risc ( toxigeni) și toxinele acestora la suprafața produsului.

12

Eșantionarea se face reprezentativ pentru a identifica prezența germenilor patogeni sau a toxinelor distribuite omogen în aliment sau atunci când comercializarea produsului depinde de calitatea microbiologică în relație cu normele impuse de legislație. Principiul

metodelor

de

eșantionare

după

International

Commission

on

Microbiological Specifications for Foods: un eșantion are rezultate nesatisfăcătoare dacă conține microorganisme periculoase sau germeni în număr superior unei limite, de unde pot deveni cu potențial de risc. În metodă simbolul ,, m” reprezintă ce permite repartizarea eșantioanelor în 2 grupe: cele acceptabile (valori ≤ m) și inacceptabile (valori ≥ m). Pentru unele microorganisme periculoase ,,m” poate fi egal cu 0. Când un microorganism dat este tolerat într-un aliment 3 categorii de eșantioane sunt definite: •

Categoria 1 (acceptabilă fără rezerve)

•

Categoria 2 (acceptabilă dar cu restricții)

•

Categoria 3 (innaceptabilă)

TEHNICI GENERALE Calitatea produsului alimentar depinde de controlul florei prezente prin mijloace: •

fizice: temperatură, pH, Wa (water activity),

•

chimice: aditivi cu efecte antimicrobiene;

•

regulile de bună fabricație (ghiduri de microbiologie GLP ” good laboratory practice”): igiena aparatelor și a personalului lucrător, calitatea și prospețimea materiilor prime, respectarea normelor și specificațiilor microbiologice, Calitatea, dpdv igienic, depinde în special de natura și cantitatea microbiotei

bacteriene din produs! 1. Studiul cantitativ al microbiotei bacteriene - determinarea proprietăților comune: bacteriile aerobe mezofile ce cresc pe mediu geloză nutritivă, determinarea levurilor și a fungilor filamentoși și a anaerobilor sulfito reducători. •

Determinarea bacteriilor de origine fecaloidă sau telurică;

13

•

Identificarea unui grup de bacterii ce corespunde unei contaminări determinate: coliformi termotoleranți și/sau enterococi, stafilococi ce evidențiază contaminarea de origine cutanată etc.

2. Cercetarea

orientată

pe

identificarea

bacteriilor

patogene:

Salmonella,

Staphylococcus, Shigella , Mycobacterium , Listeria , Brucella , Campylobacter , Yersinia , etc. Metoda necesită utilizarea metodelor specifice de selectivitate

Analizele realizate în mod normal sunt determinarea coliformilor sau a microbiotei totale. Microbiologul trebuie să facă diferența între noțiunea cantitativă și calitativă a microbiotei normale a produsului sau a materiilor prime ( microoganisme obișnuite) și o microbiotă contaminantă definită prin riscul pe care îl presupune unei anumite categorii de consumatori.

Germenii sunt clasați în funcție de riscul pe care îl exercită asupra consumatorului:

➢ Germeni cu risc sever ( Clostridium botulinum , Salmonella typhi , S. paratyphi Shigella dysenteriae , Vibrio parahaemolyticus , Brucella melitensis , Listeria monocytogenes , Clostridium perfringens type C, virusul hepatitei A). ➢ Germeni cu risc scăzut, dar cu putere mare de difuzare (Staphylococul enterotoxinogen Salmonella typhimurium și alte serotipuri, Shigella spp ., Vibrio parahaemolyticus , Escherichia coli enteropatogenică , Streptococul beta hemolitic). ➢ Germeni cu risc scăzut, dar fără putere de difuzare Bacillus cereus , Brucella abortus Clostridium perfringens ,Salmonella arizonae , Francisella tularensis Yersinia enterocolitica , Pseudomonas aeruginosa , Campylobacter jejuni ,etc...).

14

Prelevarea produselor lichide • Tehnica variază în funcție de produs, volumul și forma conținutului. • Se omogenizează bine înainte de prelevarea cu pipeta a volumului necesar de analiză Prelevarea produselor solide • În funcție de produs, prelevarea se face cu cuțitul, cu sonda în cazul brânzeturilor sau cu pipeta. Se îndepărtează coaja/membrana și se asigura că proba este reprezentativă pentru produs.

Conservele trebuie să îndeplinească condițiile la probele de verificare a stabilității / sterilității: •

Se incubează 5 eșantioane la 370 C timp de 7 zile (sau la 300 C timp de 10 zile) și la 550 C timp de 7 zile. Dacă după expirarea timpului se observă bombarea sau deteriorarea, se va face frotiu pH ul nu trebuie să depășească 0,5 între probele incubate și cele martor.

•

Prin microscopie (după etalarea unui volum de 1 0 μl de produ s fixat și colorat cu albastru de metilen) se observă în 20 de câmpuri , plecând de la cutia incubată (n) și la cea martor (n1), n / n1 trebuie sa fie inferior la 100 .

Metoda de eșantionare pentru identificarea unui număr scăzut de microorganisme

Se poate determina numărul eșantioanelor de analizat dintr-un lot în funcție de gradul de siguranță cercetată:

15

Frecvența eșantionării • Probele trebuie repartizate în timp și în funcție de nivelul de producție și riscurile de contaminare.

Condițiile de prelevare •

Probele trebuie prelevate respectând condițiile de sterilitate;

•

probele se aduc în condițiile inițiale fără contaminare aditivă;

•

din lichide se prelevă proba de la diferite nivele, după omogenizare

•

se utilizează instrumentar steril;

•

flacoanele din sticlă, metal sau plastic, sterilizate, trebuie adaptate la dimensiunile probei și se închid cu capac ermetic;

16

Transferul eșantioanelor în laborator

Prepararea eșantioanelor • Din prelevatul solid sau lichid se prepară o suspensie din care se vor face analizele microbiologice. • Proba se omogenizează sau se obține broiajul într-un volum de diluant - prima diluție

17

PREPARAREA

EȘANTIOANELOR

ȘI

A

CULTURILOR

MICROBIENE Eșantioanele sunt aduse în ambalajul de origine (produsele finite), în flacoane sau recipiente sterile (produse la vrac sau prelevate); •

flacoane, sticle, cutii tetrapack sau instrumente de prelevare a alimentelor solide (tampoane, exsudat faringian, pipete harpon etc).

Prima etapă de tratament al eșantioanelor, după prelevare:

•

distribuirea în părți egale în recipiente;

•

omogenizare (punerea în suspensie omogenă a microorganismelor)- mojar cu pistil, stomacher;

•

centrifugare în tuburi cu capac la 3 până la 4000 g (va permite decantarea microorganismelor din lichide în scurt timp)

•

Vortex-area permite omogenizarea suspensiei bacteriene în momentul diluțiilor seriate.

Materiale consumabile: -

plăci Petri de policarbonat de diametru 90 mm;

-

tuburi de hemoliză;

-

pipete sterile gradate (1 și 10 ml) sau de pipete automate (de 0,1 sau 1 ml) pentru vârfuri de polipropilen;

-

pipete Pasteur;

-

pahare de sticlă;

-

anse din platină etc.

-

un aparat pentru numărătoarea coloniilor;

-

echipament de filtrare

18

19

Soluțiile folosite pentru diluții seriate •Se folosesc soluții care să nu inhibe sau să altereze microorganismele.

20

Reanimarea microorganismelor Pe parcursul proceselor tehnologice microorganismele suferă modificări ale proprietăților fiziologice (deshidratare, căldură, frig etc). • Se impune o etapă de reanimare înainte de trecerea pe medii selective care conțin diverși inhibitori.

Reanimarea în mediu lichid •Se poate realiza în prima etapă de analiză, când probei i se adaugă soluția de diluție. • Dacă perioada de reanimare este mai mare decât cea de latență, se va produce o multiplicare a germenilor nealterați ce va determina, în funcție de tehnica de numărare, la o supraevaluare a numărului de germeni. • Se folosesc medii lichide neselective, în diferite diluții apoi se însămânțează în medii selective.

Reanimarea pe mediu solid • Când numărătoarea se face pe mediu solid, reanimarea poate fi obținută printr o precultură pe un mediu agar neutru favorabil cu un timp de incubare superior timpului de latență, dar fără formarea coloniilor macroscopice vizibile. După reanimare, se toarnă al doilea strat de agar selectiv.

21

Tehnici de diluție • eprubete/tuburi cu cel puțin 9 ml de soluție sterilă

22

L.p.

II

MICROBIOLOGIE

ALIMENTARĂ

CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL ALIMENTELOR

Examenul microbiologic cantitativ ✓ Determinarea NTGMA ✓ Determinarea numărului total de drojdii și mucegaiuri

Tehnicile principale utilizate pentru numărătoare În microbiologia alimentară primează

interesul

studierii

microbiotei prezente într-un aliment din punct de vedere cantitativ și calitativ. Deși

sunt

disponibile

numeroase tehnici de numărătoare , la ora actuală nu există tehnica perfectă. Anumite tehnici: ✓ nu

permit

diferențierea

germenilor morți de cei viabili; ✓ altele sunt incapabile să deosebească anumite celule microbiene,

care

asociate prezente

pot

fi

microbiotei în

aliment

(Staphylococcus, Enterococcus , etc..) și permit evaluarea unităților formatoare de colonii ( UFC).

23

Principalele tehnici de numărare Metodele generale directe

1) Numărătoarea directă • Se realizează la microscop cu ajutorul microcamerelor gradate de volum cunoscut (celulele Thoma, Malassez, Nageotte, Salimbéni Cloup etc...) după o diluție în ser fiziologic pentru germenii morți sau în apă formolizată 10% în cazul celor vii. • Se mai poate estima la microscop numărul de microorganisme dintr-un produs anume după etalarea și colorarea unei cantități cunoscute de produs (microlitri) pe o lamă . O numărătoare directă se poate realiza după filtrarea prin membrane sau diluțiile produsului, colorarea membranelor și observarea la microscop. Această tehnică permite evaluarea după colorarea cu acridină orange și observarea la epifluorescență a microorganismelor moarte sau vii. • Acest colorant este intercalant al acizilor nucleici formând cu aceștia complexe

fluorescente verzi (ADN) sau orange (ARN). 2) Determinarea materiei/greutății uscate, sau dozajul proteinelor microbiene, dozajul acizilor nucleici (de exemplu după sonicație și / sau extracție în mediu alcalin) 3) Nefelometrie Turbiditatea unui mediu reprezintă, în anumite condiții, proporția numărului de microorganisme prezente în mediul respectiv . Astfel absorbanța unei suspensii microbiene la o lungime de undă superioară sau egală cu 540 nm variază liniar până

24

la valori inferioare sau egale cu 0,8 număr de germeni. Este posibilă compararea vizuală a turbidității unui mediu cu o gamă etalon de albumină (metoda Mestrezat : opacitatea unei suspensii de 5. 109 stafilococi per mL este identică cu cea a unei suspensii de albumină de 0,5 g per litru). 4) Sistemul luciferină luciferază Această metodă permite numărătoarea microorganismelor vii prin dozajul ATP-ului intracelular , conținutul în ATP intracelular fiind constant pentru un microorganism dat; acest conținut este egal cu 0 dacă microorganismul este mort. După liza celulei, ATP-ul este dozat pe cale enzimatică. Numărul de fotoni emiși la 562 nm determinați prin numărătoare prin scintilație, este proporțional cantității de ATP, aceasta fiind în funcție de numărul de celule vii.

Metodele generale indirecte

1) Dozajul unui metabolit primar sintetizat, sau dozajul unei cantități de substrat consumat. Aceste metode se aplică doar în condiții bine definite ex: faza exponențială de multiplicare, temperatură, mediu, etc). 2) Reducerea unui colorant •Anumite microorganisme modifică potențialul oxido-reducător al mediului în care se află ; viteza la care are loc această modificare este în funcție de numărul de microorganisme, de activitatea lor metabolică (reducătoare rapide) și alți parametri precum natura mediului, microorganismul, temperatura, etc • Printre indicatorii disponibili, cei mai utilizați sunt albastrul de metilen și resazurina . Modificarea culorii intervine Eh = Eo 0,05 V. • Când se folosește resazurina , reducerea este urmată de variații de culoare de la albastru la lila, apoi mov, roz și incolor la final. 3) Diluția și cultura Această metodă permite în principiu numărătoarea germenilor vii. Cultura se realizează fie în mediu lichid (1 microorganism sau un grup de

25

microorganisme determină după inoculare și incubare, apariția unei culturi) fie în mediu solid (1 microorganism sau un grup de microorganisme dau naștere unei colonii În acest caz, pe mediu solid, însămânțarea se poate face prin încorporarea în masa gelozei sau pe suprafață.

Numărătoarea pe un mediu solid: UFC Această metodă se realizează în plăci Petri. Se bazează pe principiul că toate bacteriile vii introduse în masa sau pe suprafața unui mediu cu geloză dau naștere după incubare la o colonie macroscopică. Numărul total de colonii corespund așadar numărului de UFC prezent într-un inocul.

Dezavantajele metodei: •

Bacteriile strict aerobe se dezvoltă greu în masa gelozei, contrar bacteriilor strict anaerobe care se dezvoltă doar în condiții de incubare corespunzătoare (cilindru pentru anaerobioză).

•

Pot exista anumiți antagoniști bacterieni ( bacteriocine etc...).

•

Dacă temperatura amestecului mediului cu inoculul este superioară de 45-47°C, se poate produce inactivarea microorganismelor.

•

Această metodă de obținere a culturii prin încorporare necesită o dispersie omogenă în geloză, deci o distribuție omogenă a coloniilor.

•

Numărătoarea în cazul etalării este realizabilă doar pe suprafața mediului perfect uscat. Operațiunea de etalare pe suprafață trebuie controlată (adsorbția germenilor pe ansa de însămânțare) și volumul de inocul care nu trebuie să depășească 0,5 mL pe plăcile de 9 cm diametru (volumele superioare nu sunt absorbite de mediu și împiedică numărătoarea).

26

Numărătoarea pe un mediu solid: UFC MEDII DE CULTIVARE: • Medii neselective pentru bacterii : Plate count agar, TSYE, Muller Hinton • Medii neselective pentru fungi : Suportă creșterea majorității speciilor fungice și bacteriene contaminante și patogene : DG 18, Sabouraud Dextrose Agar; Potato Dextrose agar; Brain Heart Infusion agar; Cornmeal agar.

Numărătoarea pe un mediu solid: UFC Tehnica de numărătoare prin încorporare în mediul geloză

o Mediul geloză este topit la bain marie și apoi menținut la o temperatură constantă de 45 ±1°C. o Se pipetează 1 ml din eprubeta cu diluție cunoscută în centrul plăcii Petri, în condiții sterile. Se notează fiecare placă Petri, menționându se originea analizei, mediul utilizat, și diluția corespunzătoare. Se procedează similar pentru fiecare diluție în parte și este recomandat să se realizeze duplicate. o Se adaugă agarul la temperatura de 45°C ±1°C peste inocul. Temperatura crescută a gelozei poate distruge germenii, iar o temperatură scăzută determină solidificarea iregulară și distribuția incorectă a suspensiei bacteriene. Se amestecă prin mișcări circulare și orizontale.

27

o Pentru evitarea formării coloniilor de dimensiuni mari pe suprafață se poate aplica tehnica stratului dublu.

28

29

30

Numărătoarea în mediu lichid: UFC Această metodă prezintă avantajul că se poate studia caracterul biochimic al microorganismului , dificil de evidențiat pe mediu geloză, precum producerea de gaz, sau se poate efectua numărătoarea cu o fază de reanimare inițială. Această metodă se bazează pe principiul că un inocul conține minimum un microorganism care, după însămânțarea într un mediul lichid, va determina o cultură. Tehnica presupune o bună disponibilitate a nutrienților pentru microorganisme.

Divizarea volumelor mari de lichide Pentru evitarea acumulării produșilor de degradare cu posibilă activitate inhibitoare, se însămânțează 1 mL de inocul în 100 mL mediu de cultură. Acesta va fi repartizat în 10 eprubete, cu 10 ml per eprubetă și incubate. Presupunând o distribuție omogenă a microorganismelor, se poate concluziona prezența de 1 la 10 microorganisme în inoculul inițial de 1 ml. •

Dacă toate 10 eprubete prezintă cultură............. peste 10 germeni /ml.

•

Dacă 9 eprubete prezintă cultură........................ peste 9 germeni /ml.

•

Dacă 1 eprubetă prezintă cultură ....................... peste un microorganism/ml.

Metoda M c Grady tehnica numărului probabil NPP) • McGRADY , MH. (1918) Tables for rapid interpretation of fermentation test results. Public Health J., Toronto, 9, 201-210. Această metodă permite revelarea celui mai mic conținut de microorganisme spre diferență de majoritatea metodelor de numărătoare pe mediu solid. Se bazează pe o analiză statistică și determină prin calcul numărul cel mai probabil (NPP). Există numeroase variante ale metodei în funcție de încărcătura microbiană de evaluat. Principiul metodei constă în faptul presupunerii că microorganismul este distribuit în mod normal în mediu și ca un același volum din eșantion conține aproximativ același număr de microorganisme (în realitate sunt mai multe sau mai puține); numărul cel mai probabil corespunde valorii medii . Ex ..: un produs lichid conține 100 microorganisme / 100 ml.

31

• Eșantioanele de 10 mL vor avea în medie 10 germeni per conținut (mai multe de 10 tuburi) și puțini germeni la 1 tub . Eșantioanele de 1 ml conțin în medie 1 germene la eprubete mai numeroase de 1 și eprubete negative.

Numărătoarea prin filtrare Metoda constă în trecerea unui volum din eșantion sau diluțiile acestuia printr-o membrană filtrantă (ex. o membrană Millipore sau Sartorius sau de …47 mm diametru a cărui porozitate medie este de 0 ,45 mm la 0,22 μm) pe care sunt reținute microorganismele de cercetat. După filtrare se spală pâlnia superioară cu apă distilată autoclavată sau cu o soluție tamponată sterilă pentru recuperarea tuturor germenilor și pentru eliminarea de pe filtru a eventualilor agenți cu efect ” cid ”. Filtrul se pune pe suprafața unui mediu de numărat sau pe un mediu geloză specific microorganismului de cercetat, cu fața de portaj a microorganismelor orientată în sus. După incubare se numără coloniile formate la suprafața filtrului.

32

Avantajele metodei: • timpul de incubare este mai scurt (18 h în loc de 24 h); • volumul eșantionului de analizat poate fi mai mare (câțiva litri), ce va permite numărătoarea germenilor în lichide cu conținut scăzut de microorganisme precum apa; • nu există interferențe între microorganisme (separați la suprafața filtrului și crescuți pe mediul de cultură prin traversul porilor) și agenții microbiocizi asociați produsului (clor, antibiotice, conservanți), care sunt eliminați; • Diferențele apărute între rezultatele numărătoarei specifice unui microorganism dat, au cel mai probabil, ca origine natura mediului de cultură ales decât metoda utilizată, temperatura și durata incubării, luându se în calcul variațiile legate de modul de aplicarea tehnicii.

Interpretarea numărătorilor Calculul încărcăturii microbiene a produsului • Plecând de la numărul de unități formatoare de colonii sau de la NPP determinate pentru o diluție dată, acestea se raportează la produsul analizat. • În cazul produselor lichide, acestea nu prezintă dificultate deoarece este suficient să se multiplice numărul de NPP regăsit la o diluție dată, prin inversarea acesteia.

33

Ex: s-au numărat 256 de colonii într o eprubetă însămânțată plecând de la 0,1 mL la diluția 10-3 de produs, numărul de UFC pe mL este egal cu: • 256 x 1 / 0,1 x 1 / 10-3 fiind egal cu 256. 10-4 UFC / ml.

34

35

Numărătoarea în mediu solid

Valoarea densității microbiene din aliment este obținută prin multiplicarea numărului de colonii observate (prin numărătoare manuală sau automată) cu un factor luând în considerare volumul însămânțat și al diluției. Exemplu : • pentru lapte (lichid ) 150 de colonii numărate într o placă Petri însămânțată cu 1 mL dintr- o diluție de 10-3 densitatea microbiană va fi de 150. 10-3 UFC per ml de lapte. • pentru un aliment solid se ține cont de apa pe care o conține sau realizarea primei diluții plecând de la „ x” g de produs și adăugarea diluantului în cantitate suficientă pentru ,,y” mL.

36

Determinarea numărului de germeni mezofili aerobi (NTGMA) din produsele alimentare Metoda orizontală pentru enumerarea microorganismelor- tehnica de numărare a coloniilor la 30°C • SR EN ISO 4833 •EN ISO 4833:2003 Cu referire la : •

ISO 6887 1:2002 (Pregătirea probei pentru analiză, suspensiei inițiale și diluțiilor decimale pentru examen microbiologic)

•

ISO 7218:1996 (Reguli generale pentru examen microbiologic)

•

ISO 8261:2002 (Lapte și produse lactate. Ghid general pentru pregătirea probei pt analiză, suspensiei inițiale și diluțiilor decimale pt examen microbiologic)

•

ISO 11133 1:2002 (Microbiologia produselor alimentare și nutrețurilor. Ghid pt prepararea mediilor de cultură)

Principiul metodei: •

Prepararea a două plăci turnate prin folosirea unui mediu de cultură specific și a unei cantități specifice de probă, dacă produsul inițial este lichid sau a unei cantități specficate de suspensie inițială în cazul altor produse.

•

Prepararea, în aceleași condiții, a altei perechi de plăci turnate, folosind diluțiile decimale ale probei sau ale suspensiei inițiale.

•

Incubarea plăcilor în condiții de aerobioză timp de 72 h la 30°C.

•

Calcularea numărului de microorganisme pe mililitru sau gram de probă din numărul de colonii obținute pe plăcile selectate.

•

Mediu de cultură PCA (Digest enzimatic de cazeină, Extract de drojdie, Glucoză anhidră, Agar, apă)

•

Tehnica diluțiilor decimale

•

Metodă de însămânțare tehnica înglobării în mediul de cultură

•

Incubare

37

Pentru calcul: plăcile ce conțin mai mult de 15 colonii și mai puțin de 300 de colonii NTG= Σ NxD/n, În care, N-numărul de colonii luat în calcul D-inversul diluției însămânțate în placa Petri (ex.10, 100, 1000... (factorul de diluție) n-numărul de plăci luate în calcul.

Buletin de analiză: •

Toate informațiile necesare pentru identificarea completă a probei;

•

Metoda de eșantionare folosită;

•

Metoda de aaliză folosită, cu referire la standardul internațional;

•

Toate condițiile de operare nespecificate în standard (opționale);

•

Rezultatele obținute în analiză.

Determinarea numărului total de drojdii și mucegaiuri Metodă orizontală pentru numărarea drojdiilor și mucegaiurilor SR ISO 21527 2:2008 •

ISO 6887 1:2002 (Pregătirea probei pentru analiză, suspensiei inițiale și diluțiilor decimale pentru examen microbiologic)

•

ISO 7218:1996 (Reguli generale pentru examen microbiologic)

•

ISO 8261:2002 (Lapte și produse lactate. Ghid general pentru pregătirea probei pt analiză, suspensiei inițiale și diluțiilor decimale pt examen microbiologic)

•

ISO 11133 1:2002 (Microbiologia produselor alimentare și nutrețurilor. Ghid pt prepararea mediilor de cultură)

38

Principiul metodei: o Prepararea a două plăci turnate prin folosirea unui mediu de cultură specific și a unei cantități specifice de probă, dacă produsul inițial este lichid sau a unei cantități specficate de suspensie inițială în cazul altor produse. o Prepararea, în aceleași condiții, a altei perechi de plăci turnate, folosind diluțiile decimale ale probei sau ale suspensiei inițiale. o Incubarea plăcilor în condiții de aerobioză timp de 5-7 zile la 25°C o Calcularea numărului de microorganisme pe mililitru sau gram de probă din numărul de colonii obținute pe plăcile selectate. o Mediu de cultură Dichloran 18% glycerol agar DG 18 o Tehnica diluțiilor decimale o Metodă de însămânțare tehnica inundării pe mediu de cultură o Incubare

Pentru calcul: plăcile ce conțin mai puțin de 150 de colonii Numărarea coloniilor se face după 2 zile de incubare, apoi în zilele 5-7 de incubare. NTG= Σ NxD/n, În care, N-numărul de colonii luat în calcul D-inversul diluției însămânțate în placa Petri (ex.10, 100, 1000... (factorul de diluție) n-numărul de plăci luate în calcul.

Buletin de analiză: •

Toate informațiile necesare pentru identificarea completă a probei;

•

Metoda de eșantionare folosită;

•

Metoda de aaliză folosită, cu referire la standardul internațional;

•

Toate condițiile de operare nespecificate în standard (opționale);

•

Rezultatele obținute în analiză.

39

L.p. III Determinarea prezenței și numărului de bacterii coliforme (coliformi totali) și a speciei Escherichia coli

•STAS ISO 4832

Bacteriile coliforme = bacili Gram -, aerobi, facultativi anaerobi, oxidazo pozitivi și care în cel mult 48 h de incubare la 30-37 ºC, fermentează lactoza cu producere de acid și gaz. Escherichia coli = bacterie coliformă, la 44 ºC fermentează lactoza, cu producere de gaz și formează indol din triptofan. Sunt bacterii mobile, nesporogene și au formă de bastonaș. Identificarea E. coli se face pe baza aspectului cultural caracteristic pe agar Levine. E. coli reprezintă indicatorul contaminării fecale!

40

Determinarea prezenței și numărului de bacterii coliforme și E. coli în medii lichide (cu îmbogățire) 1. Prezența bacteriilor coliforme și a E coli la o anumită cantitate de produs 1 g sau 0 1 g, etc se determină prin: -

însămânțarea a 1 mL din produs omogenizat și din fiecare diluție în eprubete care conțin 10 mL bulion lauril sulfat de sodiu și tub colector de gaz (Durham). 1 mL proba/ ș i 1 mL diluții la 10 mL bulion lauril sulfat.

-

la produse solide, la 1 g produs din prima diluție 10 ˉ¹ se însămânțează 10 mL într-o eprubetă cu 10 mL bulion lauril sulfat de sodiu dublu concentrat. 10 ml din diluția 10 ˉ¹ la 10 mL bulion lauril sulfat dublu concentrat.

Se incubează la 30-37 º C timp de 24-48 de ore și se notează eprubetele unde au apărut gaze în tubul colector Se confirmă prin colorație Gram și trecerea cu o ansă din cultură pe mediul Levine (incubare la 30-37 º C, 24 h).

41

În funcție de diluțiile pozitive se raportează prezența sau absența la o anumită cantitate de produs.

42

43

2. Prezența cantitativă a bacteriilor coliforme și a E. coli folosind tehnica numărului cel mai probabil: -

Constă în însămânțarea a 3 diluții succesive folosind 3 tuburi pentru fiecare diluție. În fiecare tub cu mediu lichid se însămânțează 1 mL omogenat sau 10 mL diluție 10 ˉ¹ din proba solidă sau semisolidă.

-

Se incubează la 30-37 º C timp de 24-48 de ore, în funcție de numărul de tuburi din fiecare diluție (confirmate prin ex. bacterioscopic sau Levine) se citește numărul corespunzător combinației de 3 cifre obținute, din tabelul Mac Grady.

Nr. probabil

cel de

mai

bacterii

coliforme/ g (ml): Nr. din tabel x factorul de diluție (prima diluție din cele 3 folosite).

Tabelul Mac Grady

44

Pentru confirmarea E. coli se însămânțează colonii caracteristice de pe Levine într-o eprubetă cu BBLV (bulion bilă lactoză verde briliant) sau BLS (bulion lauril sulfat ) cu tub de fermentare și o eprubetă cu apă peptonată pentru prezența indolului) , preîncălzite la 44º C, 24 h.. Confirmarea E. coli în diluția de 10 ˉ¹ (când se lucrează cu un tub de diluție), se raportează că E coli este prezentă pe 0 1 g produs (absentă la 0,01 g). Evidențierea E. coli enteropatogenă se face prin reacția de aglutinare rapidă pe lamă cu ser anti E. coli (serotipuri patogene pentru om) polivalent. Dacă are loc aglutinarea se confirmă E. coli enteropatogenă.

45

Determinarea numărului de bacterii coliforme și E. coli direct înmedii solide

Pentru produsele alimentare lichide la care se presupune o încărcătură de germeni mai mare de 30 /ml sau de 300 /g, pentru produsele solide sau semisolide, determinarea cantitativă a coliformilor se face prin tehnica încorporării inoculului într un mediu selectiv (VRBLG cristal violet-roșu neutru bilă-lactoză ), cu un strat de 4 ml mediu pe suprafață și incubare la 32-.37 ºC, 24-48 h . după incubare se aplică formula pentru aflarea NTG coliformi pe ml sau g probă.

46

47

Confirmarea tulpinilor de E. coli:

Pentru numărul de E. coli se aleg 5 colonii caracteristice și se striază pe geloză Levine , în plăci Petri. Este un examen prezumtiv de identificare. Numărul de E. coli / g (ml) probă se stabilește în funcție de numărul de colonii confirmate din cele 5 colonii striate și de numărul total de bacterii coliforme/ g (ml) probă. Exemplu: dacă din 5 colonii striate s-au confirmat 2, iar numărul total de bacterii coliforme / g a fost de 250, E. coli / g va fi 100.

48

Izolarea și identificarea E. coli O157: H7 Metodă orizontală pentru detectarea E.coli O 157 SR EN ISO 16654 Determinarea se bazează pe incapacitatea E. coli O 157 : H 7 de a fermenta sorbitolul , celobioza și de a produce beta-galactozidază cât și pe structura antigenică specifică. 1. Din produsul omogenizat și din fiecare diluție se însămânțează câte 1 ml în tuburi cu câte 10 ml bulion Ec cu novobiocină și tub de fermentare . Tuburile însămânțate se termostatează la 37 º C timp de 24 h. 2. Din tuburile în care se constată multiplicare bacteriană și gaz în tubul Durham se striază o ansă de cultură pe suprafața gelozei Mac Conkey cu sorbitol . Plăcile identificate se incubează la 42 º C, 24 h. 3. Se aleg 5 colonii incolore ( sorbitol negative) și fiecare va fi testată pentru confirmare pe: -

Un tub cu bulion nutritiv- identificarea indolului cu reactiv Kovacs(+)

-

Un tub cu geloză înclinată

-

-Un tub cu Ec novobiocină și tub de fermentare- cultură cu producere de gaz(+)

-

Geloză Levine repartizată în plăci Petri- se dezvoltă colonii violet închis cu luciu metalic(+)

4. ) Confirmarea de E.coli O 157 : H 7 se face cu ajutorul testelor biochimice și de a reacției de seroaglutinare.

Medii selective de identificare a tulpinilor de E. coli

49

50

Teste biochimice de identificare: Api 20E (BioMerieux ,Franța)

51

L.p. IV Determinarea prezenței bacterii lor din genul Salmonella - SR ISO 6579:2002 Salmonelele au form ă bacilară sau cocobacilară dimensiunile de 2-3/0,6 μ m, Gram facultativ anaerobe asporogene acapsulogene mobile (cu excepția S. galinarum/pulorum) Salmonella face parte din familia Enterobacteriaceae.

52

Determinarea prezenței și bacteriilor din genul Salmonella : sursele de bacterii

53

Determinarea prezenței și bacteriilor din genul Salmonella

Salmonelele fermentează glucoza cu producere de gaze, produc hidrogen sulfurat, folosesc citratul ca unică sursă de carbon, nu fermentează lactoza și zaharoza și NU produc INDOL și UREAZĂ. Reacția roșului metil este în general pozitivă, reacția Voges Proskauer este negativă, testul ureazei este negativ, reducerea nitraților este pozitivă.

54

Decelarea salmonelelor din alimente se face în 4 etape succesive: 1. Preîmbogățirea într-un mediu de cultură lichid neselectiv. 2. Îmbogățirea folosind mediu lichid selectiv. 3. Izolarea prin treceri pe două medii solide selective și diferențiale. 4. Identificarea coloniilor suspecte de Salmonella dezvoltate pe mediile selective, prin determinarea poprietăților biochimice și serologice. În raport de produsul de analizat și de norma de calitate se ia în lucru o cantitate de 2550 g probă , pentru a determina prezența sau absența salmonelelor. Bacteriile din genul Salmonella pot fi prezente în număr mic și sunt adesea însoțite de un număr considerabil de mare de alte Enterobacterii sau bacterii din alte familii.

55

1. Preîmbogățirea se face pentru produsele congelate, deshidratate termic sau chimic Din alimentele cu consistență solidă se taie fragmente de 0 5 cm și apoi se cântăresc 25 g. Produsele semisolide se folosesc ca atare. Proba cântărită se amestecă cu un volum de 225 ml (1/10 diluție) mediu de preîmbogățire (bulion-manită, bulion-lactoză, apă peptonată tamponată) într-un balon cu perle de sticlă sterilizate. 25 g produs.... 225 ml apă peptonată tamponată/ bulion-manită/ bulionlactoză. Manita este metabolizată de salmonele, rezultând produși acizi care scad pH-ul mediului, devenind nefavorabil florei concurente. Flacoanele însămânțate se termostatează la 37 º C 24 h. 2. Îmbogățirea selectivă se aplică ca primă fază de lucru pentru alimentele proaspete, refrigerate, tocate, lapte crud și ouă proaspete.

- Bulion selenit acid de sodiu; - Bulion Rappaport Vassiliadis cu soia (RVS) - Bulion Müller Kauffmann tetraionat novobiocină MKTTn (cu săruri biliare și verde briliant) 0,1 ml cultură (apă peptonată )….........10 ml bulion Rappaport Vassiliadis cu soia (RVS). 1 ml cultură (apă peptonată )…...10 ml bulion Müller Kauffmann tetraionat novobiocină MKTTn. Bulionul RVS se incubează la 41,5 º C ±1 º C timp de 24 h și bulionul MKTTn la 37 º C ±1 º C timp de 24 h. 3. Izolare selectivă și identificare Din cele două medii de îmbogățire se striază cu ansa pe suprafața a două medii solide selective de izolare recomandate:

56

mediu selectiv XLD(agar xiloză-lizină dezoxicolat Bulion MKTTn mediu selectiv Rambach

mediu selectiv XLD (agar xiloză-lizină dezoxicolat ) Bulion RVS mediu selectiv Rambach

Plăcile Petri cu mediul de izolare însămânțat se incubează 24 h la 37 º C. Medii selective recomandate: -

Agar Istrati Meitert (agar bilă, verde briliant)

-

agar Wilson Blair

-

geloză verde briliant roșu fenol (GVB)

-

mediul ADCL (agar dezoxicolat-citrat-lactoză)

-

Agar Rambach

57

58

4. Confirmarea Se pot folosi chituri de identificare pentru examinarea biochimică a Salmonellei. Recunoașterea coloniilor de Salmonella este în mare măsură o problemă de experiență și aspectul lui poate varia, nu numai de la serovar la serovar , ci de asemenea de la lot la lot de mediu de cultură selectiv folosit. Pentru confirmare, se iau din fiecare placă cu fiecare mediu selectiv cel puțin o colonie considerată a fi tipică sau suspectă și alte patru colonii dacă prima se dovedește a fi negativă. Pentru confirmarea biochimică și serologică se folosesc culturi pure pe plăci cu agar nutritiv.

59

60

Confirmarea biochimică 1. Agar TSI (triple sugar iron ), 37 º C, 24 h : ▪

Masa mediului:

-

galbenă- glucozo pozitivă,

-

roșie sau neschimbată- glucozo negativă,

-

neagră- formare de hidrogen sulfurat,

-

bule sau fisuri- formare de gaz din glucoză.

▪

suprafața înclinată a mediului: -

galbenă- lactozo- și sau/zaharozo pozitivă

-

roșie sau neschimbată- lactozo- și sau zaharozo-negativă.

Culturile tipice de Salmonella prezintă suprafața înclinată a mediului alcalină (roșie) și masa mediului acidă (galbenă), cu formare de gaze (bule) și (în circa 90% din cazuri) formare de hidrogen sulfurat ( înegrirea agarului).

61

2. Agar MIU (mobilitate, indol, uree), 37 º C, 24 h, în cazul salmonelelor se observă : -

Masa mediului: este opacifiată (turbiditate difuză) în jurul liniei de însămânțare (mobilitate +)

-

Culoarea benzii de hârtie neschimbată ( indol -)

-

Suprafața înclinată a mediului de culoare neschimbată ( ureazo-negativă)

3. Agar uree (37 º C, 24 h): dacă reacția este pozitivă, ruperea moleculei de uree pune în libertate amoniac (care alcalinizează mediul), care virează culoarea roșului fenol în roz închis și mai târziu în roșu închis. Reacția este adesea aparentă după 2 h până la 4 h. 4. Mediul de decarboxilarea L-lizinei.

62

5. Punerea în evidență a beta galactozidazei 6. Mediu pentru reacția Voges Proskauer (VP) Se suspendă din cultură într-o eprubetă cu 3 ml mediu VP. Se incubează la 37 º C, 24 h. După incubare se adaugă 2 picături de sol. de creatină, 3 picături sol. etanolică de 1 naftol și apoi 2 pic. de sol. KOH și se agită. Formarea unei colorații roz până la roșu strălucitor în interval de 15 min., indică reacție pozitivă.

7. Mediul MILF (mobilitate, indol, lizindecarboxilază , fenilalanindezaminază ) 37 º C, 24 h, în cazul salmonelelor se observă : -

Mobilitatea se apreciază prin apariția turbidității în toată coloana mediului.

-

Reacția indolului este pozitivă dacă culoarea benzii de hârtie este roșu roz ( indol -)

-

Testarea producerii de fenilalanindezaminază se face prin introducerea câtorva picături dintr o soluție apoasă 10% de clorură ferică acidifiată prin introducerea de ac. clorhidric sol. 10% în proporție de 5%. Dacă testul este pozitiv, inelul format de reactiv se colorează în verde , datorită reacției între sărurile ferice și ac. fenilpiruvic ce apare sub acțiunea fenildezaminazei produse de bacterie.

-

Testul lizindecarboxilazei este pozitiv dacă are loc alcalinizarea mediului , vizibilă prin colorarea în violet datorită trecerii lizinei în cadaverină . Negativ, mediul are culoare galbenă.

8. Mediu pentru reacția indolului: Se inoculează o eprubetă ce conține 5 ml cu mediu triptonă/triptofan cu colonia suspectă, se incubează la 37º C, 24 h. După incubare se adaugă 1 ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel roșu indică o reacție pozitivă, iar un inel galben brun indică o reacție negativă.

63

.

Confirmarea pe baza caracterelor antigenice: La Salmonella se disting 3 tipuri de antigene: a) Ag somatice “O” delimitează grupări antigenice, b) Ag flagelare “H” (faza 1 și faza 2) c) Ag de suprafață Vi. • Serurile “O” si “H” se folosesc pentru aglutinarea pe lama și aglutinarea în tuburi. • Nu se folosește cultura de pe mediile selective pentru determinări antigenice; se aglutinează cultura izolată pe geloza lactozată sau TSI (medii neinhibitorii), Aglutinarea pe lamă: - ser polivalent I anti Salmonella (componente monovalente: AO, BO, DO, EO, LO) și ser polivalent II (CO, FO, GO, HO), - titrul serului aglutinant se prepară conform indicațiilor producătorului, în ser fiziologic fenolat 2‰, - se depune pe o lamă degresată o picătura de ser aglutinant în care se omogenizează o ansa de cultura bacteriană/ suspensia antigenică,

64

- în 1-2 minute, la temperatura camerei, apare aglutinare cu grunji vizibili, - suspensia antigenică se poate inactiva cu alcool 900; astfel se îndepărtează riscul contaminării personalului, se asigură denaturarea antigenelor flagelare și se îndepărtează riscul unor aglutinări încrucișate,

Decelarea salmonelelor din alimente: Simptomatologie în TIA

65

66

L.p. V Determinarea prezenței și a numărului de clostridii sulfito-reducătoare •

SR ISO 15213:2003(E) Clostridii sulfito-reducătoare: Cl. perfringens, Cl. sporogenes, Cl. acetobutylicum,

Cl. roseum și Cl. botulinum. În alimente Cl. perfringens formează peste 90 % dintre clostridiile sulfito-reducătoare și indică o contaminare veche. Clostridiile sulfito-reducătoare sunt bacili Gram +, sporulați, strict anaerobi, din familia Clostridiaceae.

Determinarea prezenței și a numărului de clostridii sulfito-reducătoare Principiul metodei • SR EN ISO 15213:2003 •

Plăcile Petri (duplicate) sunt inoculate cu o cantitate specifică din proba de testat dacă produsul este lichid, sau cu o cantitate specifică din suspensia inițială (10 ˉ¹ ) pentru alte produse.

•

Se inoculează plăci Petri, în aceleași condiții, utilizând diluțiile decimale ale probei de testat sau ale suspensiei inițiale.

•

Se adaugă 10-15 ml de mediu selectiv SC ( sulfit-cicloserină ) (tehnica prin înglobare), se lasă să se solidifice și apoi se mai toarnă încă un strat de mediu pe suprafață (10ml).

•

Plăcile se incubează în condiții de anaerobioză la 37 º C timp de 24-48 ±2 ore.

•

Se numără coloniile caracteristice (din plăci cu un număr mai mic de 150 de colonii), din acestea se confirmă 5 colonii caracteristice și apoi se calculează numărul de Cl. perfringens ml (g) de probă.

67

Ex : la diluția 10 ˉ¹ s au găsit 7 și respectiv 9 colonii. Nr. de microorganisme/g produs este 80. Din 5 colonii testate pe mediile speciale, se confirmă 3 de Cl. perfringens : /g produs sunt 48 de bacterii din specia Cl. perfringens. •

Pentru punerea lor în evidență se folosesc medii care conțin substanțe cu sulf ( cistină, cisteină, sulfit de sodiu) și indicatori pentru decelarea hidrogenului sulfurat (săruri de fier).

•

În urma dezvoltării, aceste microorganisme metabolizează substanțele care conțin sulf, pun în libert at e hidrogen sulfurat, iar acesta intră în reacție cu ionii de fier din mediu, formează sulfura feroasă de culoare neagră.

•

Este indicat ca pentru decelarea și numărarea clostridiilor sulfito reducătoare să se folosească medii care conțin substanțe inhibitoare pentru flora asociată (agar cu sulfit de sodiu, polimixină B și neomicină).

Medii de cultură: ➢ Agar sulfit cicloserină (SC) ➢ Agar

cu

mercaptoacetat

(tioglicolat lichid) ➢ Mediu lactoză-sulfit ➢ Mediu nitrați (mobilitate) ➢ Reagent pentru detecția nitritului ➢ Zinc pulbere ➢ Mediu lactoză gelatină

68

Confirmarea biochimică Tehnica de confirmare utilizând mediu LS (lactoză-sulfit): -

Fiecare colonie selectată pentru confirmare se inoculează pe mediu lichid cu tioglicolat și se incubează în condiții de anaerobioză la 37 º C timp de 18 până la 24 de ore.

-

După expirarea timpului de incubație, se transferă rapid cu o pipetă sterilă 5 picături din cultura de tioglicolat în mediu LS se incubează anaerob la 46 º C în baia de apă timp de 18-24 de ore.

Se examinează tuburile cu mediul LS pentru producerea de gaz și apariția culorii negre (formarea de sulfură feroasă) Se consideră pozitivă proba dacă tuburile Durham sunt pline de gaz mai bine de ¼ și prezintă un precipitat negru.

69

Determinarea numărului cel mai probabil de spori de clostridii sulfitoreducătoare Proba lichidă sau diluția 10 ˉ¹ din probele solide sau semisolide se inactivează în baie de apă la 80 º C timp de 15 min După inactivarea formelor vegetative se fac diluții decimale succesive. Din fiecare diluție se ia cu pipeta 3 ml și se însămânțează în câte trei tuburi

(1 ml/tub) de 18-180 mm. Se însămânțează trei diluții succesive.

În fiecare tub cu inocul se toarnă agar cu sulfit de sodiu polimixină B și neomicină, topit și răcit la 45-50 º C. Mediul trebuie să ocupe ¾ din înălțimea tuburilor. Se omogenizează inoculul și tuburile se introduc în poziție verticală într un vas cu apă rece. După răcire se mai toarnă deasupra coloanei 2 ml de agar nutritiv și se introduc din nou în apă pentru a realiza condiții de anaerobioză. Se incubează 48 de ore la 3037 º C se consideră pozitive tuburile în care a avut loc creștere de colonii negre sau mediul s a înnegrit. Se poate prelungi timpul de incubare la 5-7 zile. Din tuburile pozitive se repică o colonie de culoare neagră și se trece pe mediu selectiv. Se iau 5 colonii și se practică examenul bacterioscopic și testele biochimice.

Clostridium perfringens . Clostridium perfringens cunoscut ca (Cl . welchii ) este un bacil scurt si gros (1-1.3/3-9μ), cu extremitățile ușor rotunjite,Gram pozitiv imobil, anaerob, capsulogen ,sporogen . Sporul este dispus central sau subterminal cu deformarea celulei vegetative. Sinteza capsulei are loc numai când bacteria ajunge in organismul animalelor receptive. Capsula nu poate fi evidențiata prin metode de colorare speciale pentru capsulă, pentru evidențierea ei folosindu-se metoda Casares Gill.

70

C. perfringens este larg răspândit în natură și poate fi identificat în vegetația în putrefacție, sedimente marine, în intestinul omului și alte vertebrate, insecte și în sol. C. perfringens reprezintă a 3 a cea mai întâlnită cauză a TIA în Marea Britanie și SUA deși poate fi consumat fără manifestări clinice. Infecțiile cu C. perfringens pot produce necroză tisulară, bacteriemie

,

emfizematoasă

,

colecistită și

cangrenă

gazoasă , care este cunoscută ca mionecroză clostridială . Toxina care produce cangrena gazoasă este cunoscută ca α toxină și se inseră în membrana plasmatică a celulei producând întreruperi în structura membranei determinând funcționare anormală celulară. După diseminarea locală rapidă și destructivă (care poate avea loc în câteva ore), infecția sistemică bacteriană și toxinele pot cauza moartea. C. perfringens poate participa la infecția anaerobă polimicrobiană . Clostridium perfringens este întâlnit în infecții ca făcând parte din flora normală. În acest caz, rolul acestuia în boală este minor. C. perfringens se dezvoltă pe plăci cu agar sânge în condiții de anaerobioză și produce o zonă dublă de beta-hemoliză.

71

Confirmare C. perfringens se poate confirma cu mediul de identificare Nagler , unde microorganismul suspect se însămânțează pe mediu cu emulsie de gălbenuș de ou, în anaerostat sau folosind amestecul reducător. Reacția Nagler : în colonii se produce lecitinază , care difuzează în jurul coloniilor și descompune lecito vitelina din ou cu formarea unui precipitat și opacifierea mediului. Dacă ½ din suprafața mediului Nagler turnat în placa Petri și uscat se acoperă cu 0,1-0,5 ml ser

antiperfringens

(anti-toxină-alfa ) ce se întinde cu o baghetă și se lasă să se usuce, iar însămânțarea s a făcut în striuri perpendiculare pe linia de demarcație, reacția Nagler apare numai în jumătatea fără ser ( indicând activitatea lecitinazei).

Clostridium botulinum Clostridium botulinum este o bacterie strict anaerobă bacil Gram pozitiv, sporogenă ,larg răspândita în natură,unde se găsește sub formă de spori (sol,apă,sedimente marine,resturi vegetale în descompunere etc iar prin intermediul prafului,fragmentelor de pământ, ale apei, și resturile vegetale poate ajunge ușor în tubul digestiv al omului și animalelor sau în furaje și alimente,unde se poate multiplica.

Agar Veillon- formează colonii mari globuloase,laxe,cu aspect de puf de păpădie

72

În bacteria

cursul

multiplicării

elaborează

o

sale,

exotoxină

responsabilă de apariția botulismului Pe baza structurii antigenice au fost descrise până în prezent 7 tipuri de toxine botulinice, desemnate cu litere mari ale alfabetului latin, de la A la G. Intoxicația botulinică a fost descrisă la om și la numeroase specii de mamifere și pasări (cabaline,bovine,păsări sălbatice și domestice), precum și la unele specii de pești. La om , botulismul este determinat în mod obișnuit de toxinele A,B,E și în mod excepțional de toxinele C și F , în timp ce la celelalte specii de animale se realizează prin intervenția toxinelor C și D, și rareori sub acțiunea toxinelor A,B,E. În condiții naturale, botulismul apare la om fie in urma (i) consumului de produse alimentare în care bacteria s-a multiplicat și a sintetizat toxina , fie în urma (ii) multiplicării bacteriei la nivelul tubului digestiv cu producerea “in situ ” a toxinei botulinice sau ( iii ) a contaminării plăgilor cu spori de Clostridium botulinum care după terminare dau naștere la forme vegetative care vor sintetiza toxina botulinică. Clostridium botulinum mai este utilizat pentru prepararea următoarelor medicamente Botox, Dysport , Xeomin , și Neurobloc utilizate pentru a paraliza selectiv mușchii cu scopul de a împiedica temporar funcționalitatea acestora. Toxina botulinică produsă de C. botulinum se consideră adesea a fi o potențială armă biologică, potența acesteia fiind suficient de mare ca la aproximativ 75 ng să ucidă o persoană (DL50 de 1 ng /kg, la o greutate medie pe persoană de 75 kg); 1 kg ar fi suficient să ucidă întreaga populație umană. Sporii de Clostridium botulinum pot supraviețui în majoritatea mediilor și sunt foarte greu de distrus. Aceștia pot supraviețui la temperatura de fierbere a apei, la presiuni scăzute.

73

Bacteria poate fi distrusă în mediu cu aciditate mare, o cantitate mare de zahăr, nivel crescut de oxigen, nivel scăzut de umiditate sau depozitare la temperaturi sub 30 C (380 F)

pentru toxina de tip A.

Ex: în mediu slab acid, legume conservate precum păstăile, care nu sunt suficient de încălzite pentru a distruge sporii (sub presiune) pot conferi un mediu fără oxigen permițând sporilor să crească și să producă toxina.

74

Determinarea prezenței și a numărului de clostridii sulfito-reducătoare

Toxina botulinică este una dintre cele mai toxice substanțe cunoscute omului. Toxina produce paralizia musculară prin blocajul sinapsei neuro musculare. Dacă toxina ajunge în circulația sistemică, poate cauza moarte prin insuficiență respiratorie (paralizia diafragmului și m. intercostali). Copii între 3 săptămâni și 6 luni de viață, pot fi expuși toxinei din produse alimentare precum conservele de legume pregătite în casă sau mierea de albine.

75

76

77

L.p. VI Determinarea prezenței și identificarea bacteriei Listeria monocytogenes - SR ISO 11290 1:1998 - SR ISO 11290 2:1998

L. monocytogenes este o bacterie Gram+, cu formă de bastonaș scurt, nesporogenă cu mobilitate prin răsucire la 25 º C, facultativ anaerobă, beta hemolitică și care dă testul CAMP pozitiv pentru S. aureus pe agarul cu sânge de oaie. L. monocytogenes face parte din familia Listeriaceae numită după Joseph Lister.

Determinarea prezenței și identificarea bacteri ei Listeria monocytogenes

L. monocytogenes este catalază pozitivă , oxidază negativă, reacțiile RM și VP pozitive, bilă esculină pozitivă , fermentează glucoza, nu reduce nitratul, fermentează ramnoza , nu fermentează xiloza și manita, nu hidrolizează urea , nu produce hidrogen sulfurat în mediul TSI și are o creștere caracteristică sub formă de umbrelă în geloza moale.

78

Catalază pozitivă

79

Determinarea prezenței și identificarea bacteriei Listeria monocytogenes Genul Listeria include 7 specii diferite: L. monocytogenes , L. ivanovii , L. innocua , L. welshimeri , L. seeligeri , L. grayi , și L. murrayi . Atât L. ivanovii precum și L. monocytogenes sunt patogene pentru șoareci, doar L. monocytogenes fiind asociată constant cu îmbolnăviri la om. Există 13 serotipuri de L. monocytogenes care pot cauza boală, dar peste 90 % din izolatele umane aparțin la doar 3 serotipuri: 1/2a, 1/2b, și 4b. Tulpinile de L. monocytogenes serotipul 4b sunt responsabile de 33 până la 50 % de cazurile sporadice de la om din întreaga lume și de toate cazurile majore de TIA din Europa și America de Nord începând cu 1980. Reprezintă unul dintre patogenii cei mai virulenți dintre cei ce determină TIA , determinând moartea la 20-30% dintre infecțiile clinice. Responsabilă de aproximativ 2500 de îmbolnăviri și 500 de morți în SUA anual, listerioza este principala cauză a mortalității față de ceilalți germeni patogeni ce determină TIA, cu rate de fatalitate depășind pe cele ale Salmonellei și Clostridium botulinum.

80

81

Studiile sugerează că până la 10% din tractul gastrointestinal uman poate fi colonizat cu L. monocytogenes Bolile clinice determinate de L. monocytogenes sunt mai frecvent depistate de medicii veterinari: ex. meningoencefalita la rumegătoare. Datorită patogenității frecvente, cauzând meningită la nou născuți (infectați transvaginal ), femeile însărcinate sunt sfătuite să nu consume brânză de tipul: Brie, Camembert, feta, queso blanco fresco , care pot fi contaminate și permit dezvoltarea L. monocytogenes .Reprezintă a-3-a cea mai comună cauză a meningitei la nou născuți.

82

1a) Resuscitarea 25 ml (g) probă + 225 ml apă peptonată tamponată . Incubare 1-2 ore la 20 ºC.

1b) Preîmbogățirea primară în mediu de cultură lichid LEB-1 25 ml (g) probă + 225 ml LEB 1 ( Demi-Fraser). Incubare 24 ore la 30 º C.

2 . Îmbogățirea selectivă folosind mediu lichid selectiv: 1 ml apă peptonată cultivată + 100 ml LEB-2 ( Fraser ). Incubare 24 h la 30 º C 1 ml LEB 1 ( Demi-Fraser ) + 100 ml LEB-2 ( Fraser ). Incubare 24 h la 30 ºC

3. Izolare selectivă Din cele 2 medii de resuscitare și preîmbogățire și respectiv din mediul de îmbogățire selectivă se striază cu ansa pe suprafața unui mediu solid selectiv de izolare recomandat:

83

4. Izolarea coloniilor caracteristice 5 colonii cu aspect caracteristic se pasează pe suprafața agarului TSYEA sau agar nutritiv. Incubare 18-24 de ore la 35-37 º C.

5. Identificare-confirmare: Pentru genul Listeria:

Pentru specia L. monocytogenes:

- colorație Gram

- Testul hemolizei - producerea de acid din: ramnoză și xiloză

- reacția catalazei - testul mobilității

-testul CAMP

84

85

Testul CAMP de confirmare a identificării

86

Rhamnose test

87

88

RAPID' L.mono : 24h îmbogățire + 24h detecție + 6h confirmare

L.p. VII Determinarea prezenței și numărului de stafilococi coagulază pozitivi SR EN ISO 6888 1 • Genul Staphylococcus face parte din familia Micrococaceae (34 de specii)

.

•Acestea elaborează toxine și enzime ca hemolizinele, coagulaza liberă și legată, termonucleaza, hialuronidaza, leucocidina, fibrinolizina, proteaze, toxina sindromului de șoc, toxine exfoliative, enzime și toxine responsabile de necroza țesuturilor, enterotoxine.

Determinarea prezenței și numărului de stafilococi coagulază pozitivi

Pentru microbiologia alimentară prezintă interes speciile de stafilococi care produc coagulază S. aureus elaborează permanent coagulază în timp ce S. hycus și S. intermedius o produc numai uneori. Coagulaza are proprietatea de a coagula plasma citratată. Tulpinile care coagulează plasma în timp de 1-3 ore sunt considerate coagulazo-pozitive enzima decelată la tulpini izolate din alimente este considerată test pentru enterotoxigeneză. Enterotoxinele stafilococice determină toxiinfecții alimentare de tipul toxic la om și au acțiune nocivă asupra maimuței și pisicii.

89

• În alimentele contaminate cu stafilococi enterotoxici elaborarea enterotoxinei se face în timp scurt. • Temperatura coborâtă și pH ul scăzut oprește elaborarea enterotoxinei stafilococice. • Enterotoxina stafilococică este cea mai rezistentă dintre toate toxinele elaborate de microorganisme, rezistând la fierbere și la pasteurizare. • Staphylococcus aureus poate fi rezistent la antibiotice, MRSA( Methicillin Resistant S. aureus )fiind una dintre cele mai greu de tratat bacterii. Sursele de infecție: personalul bolnav, care prezintă leziuni deschise cutanate (panariții, abcese,piodermite), otite, conjunctivite, rinite, etc…Altă sursă: animalele producătoare de lapte având mastite stafilococice. •Stafilococii se localizează la nivelul nazo-faringelui, iar prin tuse, strănut, pot contamina alimentele

Alimentele care pot cauza toxiinfecții alimentare sunt produsele de cofetărie, produsele lactate (brânzeturi sărate), preparate din carne. În produsele lactate stafilococii enterotoxicigăsesc un mediu favorabil de multiplicare și de secreție a enterotoxinei.

90

Semnele toxiinfecției alimentare determinate de stafilococi, sunt de natură gastrointestinală. Acestea includ: greață, vomă, crampe abdominale și diaree. Episoadele de vărsături pot dura până la 24 de ore, iar vindecarea durează până la 2 zile, saumai mult. Febra În unele cazuri, o stare subfebrilă se poate asocia cu toxiinfecția alimentară stafilococică, dar în general apar toate simptomele. Cazurile severe În cazurile severe, indivizii cu toxiinfecție alimentară stafilococică pot manifesta dureri de cap și crampe musculare, modificări de presiune sanguină sau de puls. Stafilococii sunt bacterii Gram pozitive de formă cocoidă dispuși în ciorchine, facultativ aerob anaerob, imobili, neciliați se dezvoltă în prezența unor concentrații mari de clorură de sodiu (7,5-15%) și a unor substanțe inhibitoare ( telurit,piruvat, glicocol) pentru flora concurentă. • Fermentează glucoza, lactoza, zaharoza, manitolul și glicerolul. Nu fermentează rafinoza, salicilina și inulina reduc nitrații și produc catalază.

Medii de îmbogățire: bulion hipersalin cu manită și indicator, bulion hipersalin dublu concentrat cu lactoză, bulion cu telurit-piruvat-glicocol-manităși bulion cu triptonă soia și 10% clorură de sodiu.

91

•Medii selective de izolare și identificare: mediile Chapman, Baird Parker, Vogel-Johnson și geloză-sânge

Determinarea prezenței și numărul de stafilococi coagulazăpozitivi prin îmbogățirea inoculului 1. Prezența stafilococilor la o anumită cantitate de produs (1 g sau 0,1 g, etc..) se determină prin: -însămânțarea a 1 mL din produs omogenizat și din fiecare diluție în eprubete care conțin 10 mL din mediile de îmbogățire. 1 mL proba/și1mL diluții……….în 10 mL mediu de îmbogățire -la produse solide, la 1 g produs din prima diluție (10ˉ¹), se însămânțează 10 mL într-o eprubetă cu 10 mL bulion hipercloruratdublu concentrat și câte 1 mL din fiecare diluție în tuburi cu același mediu simplu concentrat. 10 ml din diluția (10ˉ¹) …………. ..în 10 mL bulion hipercloruratdublu concentrat 1mL diluții………………………….în 10 mL bulion hipercloruratsimplu concentrat

92

Se incubează la 30 -37º C timp de 24-48 de ore și se notează eprubetele unde a apărut turbiditate. Se confirmă prin colorație Gram și trecerea cu o ansă din cultură pe mediul selectiv hiperclorurat Chapman sau Baird Parker(incubare la 30 -37º C, 24 h –48 h). În funcție de diluțiile pozitive se raportează prezența sau absența la o anumită cantitate de produs.

Determinarea prezenței și numărul de stafilococi coagulază pozitivi prin îmbogățirea inoculului

Diferențierea între stafilococii coagulază pozitivi și cei coagulază negativi se face pe mediul Baird Parker cu telurit de potasiu și gălbenuș de ou. Reducerea teluritului de potasiu este caracteristică stafilococilor coagulază pozitivi coloniile având culoarea neagră cu o margine albicioasă înconjurată de o zonă transparentă (United States Pharmacopeial Convention, 2007 ).

93

Confirmarea O colonie caracteristică se însămânțează în 0,5 ml BHB (bulion creier-cord) și se incubează 24 h la 37 º C. • Identificarea Staphylococcus aureus, coagulază pozitiv, se recurge la testul de coagulare a plasmei citratate cu plasmă umană (diluție 1:4 în S. F.) • Principiul metodei cuplarea fibrinogenului cu coagulază legată (proteina A din peretele S aureus), având ca expresie macroscopică aglutinarea amestecului

Determinarea cantitativă de stafilococi coagulază-pozitivi folosind tehnica numărului cel mai probabil: -Constă în însămânțarea din produsul omogenizat și a 3 diluții succesive folosind 3 tuburi pentru fiecare diluție. În fiecare tub cu mediu lichid se însămânțează 1 mL din probă sau diluția acesteia.

94

Se incubează la 30 -37º C timp de 24-48 de ore, în funcție de numărul de tuburi din fiecare diluție (confirmate prin ex. bacterioscopicsau medii selective) se citește numărul corespunzător combinației de 3 cifre obținute, din tabelul Mac Grady. Nr. cel mai probabil de stafilococi coagulază-pozitivi/ g (ml): Nr. din tabel x factorul de diluție (prima diluție din cele 3 folosite)..

Determinarea prezenței și numărului de stafilococi coagulazăpozitivi prin numărătoarea coloniilor (direct în medii solide fără îmbogățire) Pentru produsele alimentare lichide la care se presupune o încărcătură de germeni mai mare de 300 UFC /ml sau de 3000 /g,pentru produsele solide sau semisolide, determinarea cantitativă a stafilococilor coagulază-pozitivi se face prin tehnica etalării a 0,1 ml inoculdin diluțiile probei de analizat pe mediu selectiv (Chapman sau Baird Parker) și incubare la 30-37ºC, 24-48 h. •După incubare se aplică formula pentru aflarea NTG stafilococi pentru plăcile unde s-au dezvoltat între10-100 colonii pe ml sau g probă. Se face confirmarea prin microscopie și testul de coagulază. •Numărul de stafilococi coagulazăpozitivi /g (ml) produs se determină în funcție de numărul prezumtiv de stafilococi / g (ml) produs și în raport de numărul de colonii confirmate ca fiind stafilococi coagulazăpozitivi: •Ex: 98 colonii de stafilococi/ ml produs, iar prin verificarea a 10 colonii, 6 au fost coagulază-pozitive, se determină că produsul conține (98x6):10 stafilococi coagulazăpozitivi / ml produs.

95

L.p. VIII Determinarea prezenței și a numărului de bacterii din specia Bacillus cereus • ISO 21871:2006(E) • SR EN ISO 7932:2004 • B. cereus este o bacterie Gram + cu formă bacilară, bacili mari, drepți sau ușor încurbați cu capetele drepte, dispuși în lanțuri scurte sau lungi încâlcite, sporulată (sporul este dispus central și nu deformează celula), mobilă, necapsulată, cu creștere aerobă sau facultativ anaerobă, beta hemolitică și lecitino litică. • B. cereus face parte din genul Bacillus, familia Bacillaceae.

Determinarea prezenței și a numărului de bacterii din specia Bacilluscereus •B. cereus nu este sensibil la polimixină, nu fermentează manita și xiloza, fermentează în condiții de anaerobioză glucoza și lichefiază gelatina. Tulpinile lecitinolitice pot declanșa toxiinfecții alimentare.

96

Toxiinfecție alimentară •Infecție alimentară –Ingestia microbilor, urmată de multiplicarea acestora, invazia tisulară și/sau eliberare de toxine •Intoxicație alimentară –Ingestia toxinelor din alimentele în care s-au multiplicat microbii –include intoxicația staphilococică, botulismul, intoxicația cu Clostridium perfringens, și intoxicația cu Bacillus cereus. •Alimentele incriminate în episoadele de toxiinfecții alimentare includ: -carne și legume gătite, -orez fiert sau prăjit, -sos de vanilie, -supe, -legume crude. •Două tipuri de manifestări au fost atribuite consumului de alimente contaminate cu B. cereus:

97

-Prima: caracterizată prin dureri abdominale și diaree fără hemoragie (enterotoxina); are perioada de incubație de 4-16 ore după ingerare cu simptome ce durează 12-24 de ore. -A doua: caracterizată prin manifestarea acută a vomei și nauseei(toxina emetică), are loc la 1-5 ore după consumul alimentelor contaminate, diareea nu este caracteristică acestui tip de toxiinfecție.

1. Metoda cu îmbogățirea inoculului: •Determinarea numărului probabil de B. cereus: -50 ml (g) probă + 450 ml apă peptonatătamponată. După obținerea primei diluții se fac diluții decimale până la 10ˉ6. -Se însămânțează din suspensia omogenizată și din fiecare diluție decimală succesivă câte 1 ml în 3 tuburi cu bulion nutritiv cu emulsie de gălbenuș de ou și polimixină B.

98

(tuburi cu bulion nutritiv cu emulsie de gălbenuș de ou și polimixină B)

-Se incubează la 37º C timp de 24-48 de ore. Din tuburile pozitive (gălbenușul precipitat) se iau 0,1 ml și se etalează pe suprafața mediilor de izolare, repartizate în plăci /MYP ((MannitolEgg Yolk PolymyxinAgar)și agar cu sânge. -Folosind tabelele Mac Grady se stabilește numărul probabil de B. cereus/ g (ml) probă. Coloniile care produc lecitinazăse trec pe agar-sângeși se incubează la 44ºC timp de 24 de ore pentru a se face diferențierea între B. cereus, B. anthracis și B. mycoides.

99

Coloniile de Bacillus cereusîn stânga; coloniilede Bacillus anthracisîn dreapta.Coloniile de B. cereus sunt mai mari, mai mucoide, iar această tulpină exprimă o zonă slabă de hemoliză pe agarul cu sânge. •Dacă pe mediul MYP se evidențiază colonii mari, de culoare roz-închis (manitonegative), cu contur neregulat, rugoase, uscate, înconjurate de o zonă de precipitat alb (prezența lecitinazei), se confirmă prezența B. cereus. •pe agar sânge defibrinat de oaie 5% se evidențiază colonii mari, neregulate, plate, cu aspect cerat, înconjurate de zona de beta-hemoliză intensă.

Oxoid Chromogenic Bacillus cereus Agar (CM1036 & SR0230) conține substartul cromogenic5-Bromo-4-cloro-3-indolil-βglucopiranozid, care este hidrolizat de enzima β-glucozidază a B. cereus rezultând formarea coloniilor de culoare bleu.

100

MYP agar vs BACARA agar pentru identificarea B. cereus

101

Biosith: BCM® Bacillus cereus Group Plating Medium

102

B. determinarea cantitativă a B. cereus prin însămânțări pe medii selective: Pentru a determina numai formele sporulate, prima diluție se inactivează la 80ºC timp de 15 min. Proba inactivată se răcește brusc și din aceasta se fac diluții decimale succesive. Din fiecare diluție se ia cu pipeta 0,1 ml și se însămânțează prin etalare pe câte două plăci Petri, una cu mediul MYP și alta cu agar sânge. Se incubează 24-48 de ore la 30-37º C, apoi se numără coloniile caracteristice. Din fiecare placă în care s-au dezvoltat 15-150 de colonii caracteristice pentru B. cereus se iau 5 colonii și se practică testele biochimice.

Identificarea bacteriilor din specia Bacilluscereus Teste biochimice

103

Curs I Microbiologie alimentară

Ce sunt microorganismele ? •

Organisme microscopice, cu diferite grade de complexitate structurală, ubicuitare, extrem de adaptabile

•

Cele mai vechi forme de viață de pe Terra

•

Majoritatea nu sunt dăunătoare omului și animalelor

•

Implicate în digestie și menținerea echilibrului în diferite ecosisteme

•

Microbiomul

Clasificarea microorganismelor Formele de viață pot fi clasificate în procariote, respectiv eucariote, pe baza caracteristicilor structurale și fiziologice

Procariote •

Nucleu absent

•

Membrană nucleară absentă

•

ADN inclus într-un singur cromozom circular

•

Fără proteine în cromozom

•

Absența organitelor celulare

•

Ribozomi mai mici

•

Reproducere fără mitoze

104

Eucariote •

Nucleu prezent

•

Membrană nucleară prezentă

•

ADN inclus în mai mulți cromozomi

•

Proteine în cromozomi

•

Prezența organitelor celulare

•

Ribozomi mai mari

•

Reproducerea presupune mitoze

Microorganismele pot fi grupate în virusuri (forme acelulare), bacterii, levuri (drojdii), fungi filamentoși (mucegaiuri), alge, protozoare,paraziți (±), pe baza diferitelorcaracteristici morfologice,fiziologice/culturale.

105

Virusuri •

20-200 nm (ME necesar pentru vizualizare)

•

Forme acelulare de viață (nici procariote, nici eucariote

•

Conțin un genom format din AND sau ARN, înglobat într-un înveliș proteic numit capsidă (împreună formează nucleocapsida); unele posedă o membrană suplimentară – pericapsida sau anvelopa

•

Se multiplică numai în celulele gazdă; virusul distruge de obicei celula în timpul procesului de multiplicare

Unele virusuri prezente în alimente pot cauza boli ale aparatului digestiv la consumatori (HVA, HVE, norovirus). Bacteriofagii prezenți în alimente pot transmite prin transducție, material genetic între două sușe bacteriene. De asemenea, bacteriofagii pot infecta și distruge culturile starter utilizate la fabricarea produselor lactate acide (au fost descriși bacteriofagi cu electivitate pentru bacterii din genurile Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus și Leuconostoc.

106

Bacterii •

0,5-1 µm diametru, până la 20 µm lungime (MO necesar pentru vizualizare)

•

Unicelulare, au perete, citoplasmă, dar nucleul nu este bine conturat (procariote)

•

Formă variată datorată rigidității peretului

•

Pot fi mobile sau imobile

•

Se multiplică prin fisiune binară

•

Unele sporulează

•

Forme inactive metabolic “viabile dar necultivabile”

•

Gram negative aerobe (Campylobacter, Pseudomonas, Xanthomonas, Acetobacter,

Acinetobacter,

Gluconobacter,

Morexella,

Alteromonas,

Flavobacterium, Alcaligenes, Brucella, Psychrobacter) •

Gram negative facultativ anaerobe (Citrobacter, Escherichia, Enterobacter, Edwardsiella, Erwinia, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Salmonella, Shigella, Serratia, Yersinia, Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas)

•

Rickettsii (Coxiella)

•

Coci

Gram

pozitivi

(Micrococcus,

Staphylococcus,

Enterococcus,

Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Sarcina ) •

Bacili Gram pozitivi sporulați (Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium )

•

Bacili Gram negativi sporulați (Desulfotomaculum)

107

•

Bacili

Gram

pozitivi

nesporulați

(Lactobacillus,

Carnobacterium,

Brochothrix, Listeria, Corynebacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium) •

Noi genuri descrise (Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella, Oenococcus, Kocuria, Shewanella, Alicyclobacillus)

Fungi - Levuri •

Organisme unicelulare, eucariote, imobile

•

Dimensiuni: 1-5 x 5-30 µm

•

Formă variată datorită peretelui celular rigid (ovoidală, elongată, sferică)

•

Se multiplică prin burjeonare

•

Unele specii sunt pigmentate Unele specii implicate în bioprocesarea alimentelor și băuturilor (fermentație). Alte specii sunt capabile să producă substanțe folosite ca aditivi alimentari. Majoritatea speciilor implicate în degradarea alimentelor (spolierea substanțelor

nutritive cu modificarea însușirilor organoleptice, fizice și chimice). Cele mai întâlnite în alimente: genurile Saccharomyces, Pichia, Rhodotorula, Torulopsis, Candida, Zygosaccharomyces.

Fungi - Mucegaiuri •

Organisme pluricelulare, filamentoase

•

Talul format din hife septate sau neseptate și corpi fructificanți unde se formează sporii

•

Se înmulțesc asexuat (toate speciile) și sexuat (unele)

•

Unele specii sunt pigmentate

•

Se pot dezvolta în alimente, chiar în condiții care sunt nefavorabile bacteriilor (pH scăzut, aw redusă, osmolaritate ridicată)

•

Implicate în degradarea alimentelor și producerea de toxine (micotoxine)

•

Unele specii implicate în bioprocesarea alimentelor

•

Specii frecvent întâlnite: Aspergillus, Alternaria, Fusarium, Geotrichum, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Aureobasidium.

108

Biofilme •

Forma obișnuită de existență a microorganismelor în mediu

•

Structuri mixte, complex organizate, formate din celule microbiene solidarizate într-o matrice exopolizaharidică autogenerată, aderente la diverse suprafețe animate sau inerte

•

Comunică prin molecule semnal – quorum sensing

•

Rezistență crescută la factori fizici și chimici (inclusiv la dezinfectanți și antibiotice)

Aderare inițială (reversibilă) • Aderare ireversibilă • Maturare timpurie (microcolonii) • Maturare tardivă (biofilm matur) • Destructurare

Alge •

Organisme autotrofe, uni- sau pluricelulare

•

Eucariote

•

Se înmulțesc asexuat și sexuat

•

Unele specii sunt patogene pentru organismele imunocompromise

109

Protozoare •

Organisme unicelulare, eucariote, motile

•

Dimensiune 10-50 um

•

Ciclul vital este o alternanță a stadiilor proliferative (trofozoiții) cu cele latente metabolic (chiștii)

Clasificarea microorganismelor (temperatura de creștere)

•

Mezofile: min. 5-15°C, optim 35-37°C, max. 40-45°C

•

Termofile: min. 40-45°C, optim 55-75°C, max. 60-90°C

•

Psichrofile: min. -5-5°C, optim 12-15°C, max. 15-20°C

•

Psichrotrope: min. -5-5°C, optim 25-30°C, max. 30-35°C

Clasificarea microorganismelor (activitatea apei – aw) Fiecare microorganism are cerințe diferite față de conținutul de apă al mediului in care trăiește !

Se consideră că activitatea apei reprezintă apa la dispoziția microorganismelor. Activitatea apei (aw) dă indicații asupra cantitații de apă liberă care determină presiunea de vapori de apa deasupra produsului. Valorile numerice ale activitatii apei variaza intre 0 (la produse complet deshidratate) si 1 (la apa pura), toate produsele alimentare incadrandu-se in acest interval • Viteza reactiilor enzimatice in produsele alimentare depinde de activitatea apei: la activitati mari ale apei reactiile enzimatice se declanseaza si au loc cu viteze mari, in timp ce la activitati mici ale apei reactiile enzimatice sunt mult incetinite sau inexistente • Implicații privind conservarea produselor prin deshidratare.

110

Factori ce influențează dezvoltarea microorgansimelor în alimente ➢ Compoziția alimentului (conținutul de apă, zaharuri, proteine, săruri, lipide, pH, conservanți – tradiționali/naturali sau artificiali) (carne, lapte, ouă, pește) ➢ Interacțiunile microbiene (microbiota alimentului, producția de bacteriocine, prezența bacteriofagilor, enzime) ➢ Procesul tehnologic (tratamentul termic, igienizarea / sanitația, presiunea, afumarea) ➢ Condițiile de stocare și transport (temperatura, umiditatea, compoziția gazelor, permeabilitatea ambalajului etc.)

Alimentul – Definiție ➢ Produs, în principal de origine animală sau vegetală, care conține sau constă în nutrienți esențiali organismului – carbohidrați, lipide, proteine, vitamine sau minerale, și care este ingerat / asimilat de către organism pentru a produce energie, a stimula creșterea și a menține viața. ➢ Datorită compoziției complexe, alimentul permite și dezvoltarea unei mari varietăți de microorganisme.

111

1. Good – microorganisme importante pentru obținerea alimentelor, implicate în producerea unei texturi și a unui gust specific 2. Bad – cauzează toxiinfecții alimentare (microorganisme patogene ce se multiplică în alimente, toxine ale acestora) 3. Ugly – microorganisme degradative, spoliază alimentele de substanțe nutritive și le induc modificări organoleptice, fizico-chimice, făcându-le improprii consumului

Metabolizarea glucidelor – fermentația ▪

Utilizată pe scară industrială în industria produselor lactate și alcoolice

▪

Produsă de anumite specii bacteriene și levurice, în mediu anaerob sau microaerofil

▪

Fermentația lactică transformă lactoza în piruvat, apoi în lactat

▪

Fermentația alcoolica transformă glucidele în piruvat, apoi în alcool etilic (acetaldehida si dioxid de carbon – produși intermediari)

Metabolizarea proteinelor (mediu aerob) • Unele bacterii aerobe sau facultativ anaerobe pot degrada proteinele prin oxidarea aminoacizilor (dezaminare oxidativa) cu obținere de ceto-acizi.

112

Metabolizarea proteinelor (mediu anaerob) – putrefacția • Unele bacterii anaerobe sau facultativ anaerobe pot degrada proteinele prin decarboxilarea, dezaminarea sau hidroliza aminoacizilor cu obținere de compuși urât mirositori (amine biogene).

Metabolizarea lipidelor •

Diversitatea surselor lipidice în alimente: mono-, di- și trigliceride, acizi grași saturați și nesaturați, steroli, fosfolipide, ceruri

•

Hidrofobicitatea le face greu degradabile de către microorganisme (în masă compactă)

•

Sunt mai ușor atacate în emulsii, la interfața apălipide

•

Lipazele determină eliberarea de acizi grași și glicerol, apoi AG se transformă prin intervenția oxidazelor în aldehide și cetone (peroxidare – râncezire)

113

Curs II Toxiinfecțiile alimentare Toxiinfecțiile alimentare (foodborne diseases) •

Apar la om în urma consumului alimentelor contaminate cu bacterii patogene viabile sau a celor conținând toxine bacteriene/fungice

•

Evoluează sub formă de episoade (două sau mai multe persoane se îmbolnăvesc având aceeași simptomatologie în urma consumului acelorași alimente din aceeași sursă (investigațiile epidemiologice desemnează, direct sau indirect, drept cauză a îmbolnăvirilor același aliment, provenit din aceeași sursă (în cazul botulismului – letalitate ridicată, sau altor intoxicații - micotoxine, chiar și un caz singular se consideră episod)

•

Epidemiologic, se înregistrează nr. de episoade/an și nr. cazuri/episod, pentru a evalua morbiditatea, și nr. decese/episod pentru a evalua mortalitatea.

•

În funcție de patogenie, au fost împărțite arbitrar în intoxicații, infecții și toxiinfecții. Intoxicațiile – Îmbolnăvirile apar ca o consecință a ingerării toxinelor bacteriene sau fungice preformate în aliment în timpul multiplicării microorganismelor respective. Toxina trebuie să fie prezentă în aliment, fără a fi obligatorie și prezența microorganismelor toxigene viabile în momentul ingerării acestuia (de ex. toxina stafilococică). Infecțiile – Îmbolnăvirile apar ca rezultat al consumului de alimente contaminate cu bacterii sau virusuri enteropatogene. Este necesar ca acestea să fie viabile în momentul consumului. Aceste microorganisme, chiar dacă sunt prezente în număr redus în aliment, au capacitatea de a se înmulți în tubul digestiv al consumatorului și de a produce îmbolnăvirea (de ex. Salmonella și virusul hepatitic A) Toxiinfecțiile – Îmbolnăvirile apar datorită ingerării unui mare. număr de bacterii patogene viabile prin intermediul alimentelor contaminate. În general, bacteriile, fie sporulează, fie mor și eliberează toxinele ce produc simptomatologia (de ex. gastroenterita produsă de Clostridium perfringens).

114

Toxiinfecțiile alimentare (patogenii bacterieni, virali și parazitari predominanți) •

Bacillus cereus

•

Campylobacter jejuni

•

Clostridium botulinum

•

Clostridium perfringens

•

Escherichia coli

•

Salmonella spp.

•

Shigella spp.

•

Staphylococcus aureus

•

Listeria monocytogenes

•

Vibrio cholerae

•

Vibrio parahaemolyticus

•

Vibrio vulnificus

•

Yersinia enterocolitica

•

Streptococcus

•

Virusul hepatitic A

115

•

Rotavirus

•

Norwalk-like virus

•

Cyclospora cayetanensis

•

Cryptosporidium parvum

•

Giardia lamblia

•

Toxoplasma gondii

•

Trichinella spiralis

Toxiinfecțiile alimentare (epidemiologie) Surse extrem de diverse •

1995-2000 (SUA): numeroase episoade de cyclosporioză prin consum de zmeură importată din Guatemala contaminată cu oochiști; participanții la conferința ASA – California 1997)

•

2011 (Germania): episodul de toxiinfecție cu EHEC soldat cu 18 decese, prin consumul mugurilor de fasole “organici” proveniți din ferme ecologice (scandalul castraveților din Spania)

Factori favorizanți •

Temperatură improprie de stocare

•

Igienă deficitară a personalului

•

Gătire insuficientă

•

Echipament contaminat

•

Alimente din surse nesigure

Incidența •

(date FoodNet - SUA, 2010): nr. total al îmbolnăvirilor cauzate de ingestia de alimente a atins 48 milioane, cu 375.000 pacienți spitalizați și 3000 decese (cca. 75% dintre acestea fiind cauzate de Salmonella, Listeria și Toxoplasma); costuri totale: 78 mld. $

•

European Food Safety Authority (2009): 5550 episoade au fost raportate in Uniunea Europeană, 48.964 cazuri, 4356 spitalizări și 46 decese.

116

Curs III Toxiinfecții alimentare produse de Escherichia coli Escherichia coli ▪

Principala bacterie ce populează tubul digestiv al omului și animalelor homeoterme.

▪

Considerată cel mai important marker sanitar al poluării fecaloide a alimentelor și apei (E. coli generică – biotipul 1).

▪

Tulpinile patogene produc tulburări digestive în special la copii, dar și la viței, purcei, miei sau pui de găină; toxiinfecțiile produse de aceste tulpini sunt frecvente în țările în curs de dezvoltare, în condiții precare de igienă generală și alimentară.

▪

Există serotipuri particulare, cu capacitate toxigenă (O157:H7, O104:H4), a căror importanță pentru sănătatea publică este deosebită datorită consecințelor –enterocolită hemoragică, sindrom hemolitic și uremic, purpură trombocitopenică, uneori deces.

▪

Izolată și descrisă prima dată în 1885, de pediatrul german Theodor Escherich, în tubul digestiv al copiilor sănătoși.

▪

Denumită E. coli (1919) de către Castelani și Chalmers.

▪

Este specia-tip a genului Escherichia (genul cuprinde 5 specii: coli, blattae, fergusoni, hermani și vulneris).

▪

Cocobacil Gram negativ, aerob sau facultativ anaerob, polimorf, colorat frecvent bipolar, dimensiuni 2-6 x 1,1- 1,5 μm, nesporulat, mobil (datorită cililor dispuși peritrich) sau imobil; unele tulpini prezintă fimbrii pe suprafață.

▪

Se dezvoltă bine pe medii uzuale la 370C, coloniile sunt opace, nepigmentate, ușor bombate, de tip S, 2-6 mm diametru.

▪

Majoritatea tulpinilor se dezvoltă și la temperaturi de 44-450 C, excepție făcând tulpinile toxigene (42-430 C).

▪

Fermentează glucoza, lactoza, trehaloza și manitolul.

▪

Produce lizindecarboxilază (excepție fac tulpinile enteroinvazive care sunt lactozo- și lizindecarboxilază negative).

▪

Fermentează sorbitolul și produc β-galactozidază (excepție O157:H7).

117

▪

Marea majoritate a serotipurilor sunt indol +, dau reacția roșului de metil + (producerea de acizi din fermentarea glucozei), Voges-Proskauer negative (nu produc acetoin din metabolizarea glucozei), nu pot folosi citratul ca unică sursă de carbon

▪

(IMViC + + - - )

95% dintre tulpini răspund la testul IMViC după modelul + + - - , sunt β- galactozidază și β-glucuronidază pozitive (biotipul 1). Restul răspund după modelul - + - - , nu elaborează una sau ambele enzime și au fost incluse in biotipul 2. Agarul TBX conține triptonă, săruri biliare și 5-bromo-4-chloro-3-indolylbeta- Dglucuronide (X-glucuronide); depistează tulpinile β-glucuronidază pozitive in 4 ore. Structura antigenică: antigenele lipopoliglucidice somatice O (171), antigenele poliglucidice capsulare K (A, B, L - 80) și antigenele proteice flagelare H (56) sunt principalele antigene prezente la Escherichia coli; unele tulpini posedă și antigene proteice fimbriale F (5). Antigenele fimbriale sunt controlate de gene plasmidice, pe când celelalte, de gene cromozomale.

118

Pe baza structurii antigenice, tulpinile de E. coli au fost împărțite în grupe (cea mai importantă fiind “O”) și serotipuri (obținute prin combinarea antigenelor somatice O cu cele flagelare H). În funcție de mecanismele moleculare de patogenitate, serotipurile de E. coli izolate de la om și animale au fost grupate în 4 categorii (cele notate cu “like” sunt de origine animală, celelalte sunt izolate de la om): ▪

•Enteropatogene (EPEC și EPEC-like)

▪

•Enterotoxigene (ETEC și ETEC-like)

▪

•Enteroinvazive (EIEC și EIEC-like)

▪

•Enterohemoragice (EHEC și EHEC-like)

119

Tulpinile enteropatogene: ▪

Nu produc enterotoxine termostabile sau termolabile

▪

Nu pezintă invazivitate de tip “Shigella”

▪

Au capacitatea de atașare la microvilozitățile intestinale și de distrugere a acestora

▪

Nu produc sau produc cantități reduse de verotoxină (toxină Shiga-like)

▪

O26:B6, O55:B5, O86:B7, O111:B4, O119:B14, O124:B77.

Tulpinile enterotoxigene: ▪

Aderă la enterocite prin intermediul fimbriilor

▪

Produc enterotoxine termostabile și/sau termolabile

▪

O6:H16, O8:H9, O15:H11, O25:H42, O78:H12, O120:H7.

Tulpinile enteroinvazive: ▪

Posedă plasmidă de virulență (se transmite altor bacterii)

▪

Invadează și se multiplică în celulele epiteliale intestinale și în culturile celulare

▪

Sunt de regulă imobile, lactozo-negative, lizindecarboxilază negative

▪

Serogrupe: O28, O112, O124, O136, O143, O173.

Tulpinile enterohemoragice: ▪

Produc cantități mari de toxină Shiga-like (toxină similară celei produse de Shigella dysenteriae)

▪

Se atașează de microvilozitățile intestinale și le distrug

▪

Posedă plasmidă de virulență

▪

O157:H7, O26:H11, O103:H2, O104:H4

▪

Principalul rezervor este reprezentat de bovine – portaj intestinal Purtătorii umani simptomatici și asimptomatici reprezintă principalul rezervor pentru

tulpinile EPEC, EIEC și ETEC patogene pentru om. Purtătorii cu igienă personală precară pot contamina alimentele în timp ce le prelucrează sau manipulează. Apele reziduale (de canal, fecaloid-menajere) contaminate folosite la irigarea sau fertilizarea culturilor reprezintă o sursă importantă de bacterii.

120

Toxiinfecții alimentare produse de EPEC •

Boala diareică a copiilor (sub 3 ani) – imunitate la adulți.

•

Diareea turiștilor.

•

Episoade cu caracter epidemic în sezonul cald.

•

Îmbolnăviri frecvente în Europa și SUA în anii 1950-1970, episoade sporadice în prezent.

•

Cauză importantă a diareelor infantile în țările în curs de dezvoltare din America de Sud, Africa și Asia, aflate în zona tropicală și unde condițiile de igienă sunt precare

•

Sursa o reprezintă alimentele contaminate de cei care le prepară și manipulează sau apa potabilă contaminată prin ape uzate.

•

Îmbolnăviri similare au fost diagnosticate și la tineretul animalelor.

•

•Tulpinile EPEC produc leziunea “attachment-effacement” la nivelul vilozităților intestinale, în urma atașării lor la enterocite.

•

Interacțiunea bacterie-celulă gazdă se realizează în două faze: o atașare superficială mediată uneori de fimbrii, urmată de o atașare strânsă a bacteriei de membrana celulei – mediată de actină, soldată cu distrugerea vilozităților și formarea unui “piedestal” sau “cupe” în care se inseră bacteria.

•

Semnele clinice apar după 17-72 ore (cu o medie de 36 ore) de la infectare.

•

Sindromul diareic apare cu precădere la copii și este de obicei mai sever decât cel cu alte etiologii.

•

Diareea (apoasă, fecale bogate în mucus) este însoțită deseori de febră, cefalee, vomismente, dureri abdominale, deshidratare – dacă nu se tratează corespunzător, uneori exitus.

•

Durata bolii: 6 ore-3 zile (în medie 24 h).

•

În cele mai multe cazuri se remite spontan.

•

Diagnosticul de laborator presupune izolarea tulpinilor de E. coli pe medii solide selective și diferențiale (MacConkey sau Levine), apoi depistarea serotipului prin reacția de ser-aglutinare rapidă pe lamă folosind antiseruri polivalente EPEC.

121

Toxiinfecții alimentare produse de ETEC •

Tulpinile ETEC sunt agenți majori ai bolii diareice la copiii din țările în curs de dezvoltare.

•

Boala evoluează cu deshidratare accentuată.

•

Este întâlnită cu precădere în India și Bangladesh, atât la copii, cât și la adulți (2-3 infecții/an în primii 3 ani de viață).

•

Rară în țările dezvoltate; cauza pricipală a diareei turiștilor care provin din țări cu climat temperat și standarde ridicate de igienă și călătoresc în țări tropicale, cu standarde precare de igienă.

•

La animale, tulpinile ETEC sunt responsabile de diareea perinatală (în prima săptămână de viață), cu evoluție gravă, fatală, ce afectează vițeii, purceii, miei tulpinile întâlnite la animale nu sunt patogene pentru om (alimentele pot conține E.coli ETEC fără să determine îmbolnăviri la consumator).

•

Tulpinile ETEC produc una sau ambele enterotoxine (LT – termolabilă, ST – termostabilă), posedă pe suprafața membranei adezine fimbriale care permit colonizarea (mediază atașarea celulei bacteriene de vilozitățile intestinale).

•

După ingerare și pasajul gastric, bacteriile colonizează părțile anterioare ale intestinului subțire prin aderarea la mucoasă, secretă toxine care schimbă fluxul apei și ionilor între enterocite și lumenul intestinal.

•

Condițiile necesare ca ETEC să producă îmbolnăviri la om: bacteria să exprime factorii de adezivitate la mucoasa intestinală, să posede plasmida care codează sinteza enterotoxinelor diareagene, pacientul să ingere un număr suficient de mare de bacterii.

•

Semnele clinice apar după 8-44 ore (26 ore în medie) de la ingerarea apei sau alimentelor contaminate

•

Diaree apoasă (cu mucus, fără sânge) însoțită de febră ușoară, crampe abdominale, vertij, nausee, stare de rău

•

În formele grave, simptomatologia se aseamană cu cea din holeră (diaree severă, deshidratare rapidă), mai ales la adulți, la care gradul de deshidratare este mai mare ca la copii; cazurile mortale la adulți sunt rare (prezența unor factori agravanți)

•

Pentru a se declanșa semnele clinice, un adult trebuie să ingere 10^8-10^10 bacterii ETEC.

122

•

La sugari, boala poate dura mai multe săptămâni, cu scaune apoase numeroase, ducând la deshidratare și malnutriție; netratată, duce la deces.

Toxiinfecții alimentare produse de EIEC •

Patogenitate similară cu a tulpinilor de Shigella.

•

Nu s-au descris cazuri de infecție naturală la animale, portajul este nul.

•

Tulpinile EIEC sunt imobile, lactozo-negative, lizindecarboxilază negative, posedă plasmidă de virulență, invadează și se multiplică în celulele epiteliului intestinal (colon).

•

Bacteria pătrunde în celula prin zona latero-bazală a enterocitului, nu prin cea apicală.

•

Determină prin multiplicare moartea celulelor invadate, degenerescența epiteliului și colită inflamatorie acută.

•

Ulcerația mucoasei explică prezența sângelui în fecale și infiltrațiile cu polimorfonucleare în peretele colonului.

•

Infecțiile cu tulpini EIEC sunt rare, se confundă cu shigeloza.

•

Cauza principală – lipsa măsurilor de igienă (omul este purtător al serotipurilor EIEC)

•

Perioadă scurtă de incubație (8-24 ore, în medie 11 ore).

•

Simptomele sunt tipice: febră, frisoane, cefalee, mialgii, crampe abdominale, diaree profuză sau disenterie (rar semne neurologice).

•

Scaunele diareice sunt frecvente, dar în cantități reduse, spre deosebire de diareea apoasă din infecțiile cu ETEC.

•

Colonoscopia relevă o mucoasă roșie, friabilă, cu numeroase puncte hemoragice.

123

Toxiinfecții alimentare produse de EHEC •

Produse în principal de serotipul O157:H7.

•

Identificată prima oară în 1975 (SUA) la un individ ce prezenta crampe intestinale și diaree hemoragică gravă.

•

Un nou serotip descris în Germania (2011) O104:H4 (“scandalul castraveților”)

•

Episoadele sunt descrise mai ales în țările dezvoltate (SUA - hamburgheri, Japonia, Europa); se izolează rar în țările tropicale.

•

Rezervorul principal reprezentat de tubul digestiv al bovinelor.

•

Evoluția poate fi foarte gravă (insuficiență renală).

•

Un nou serotip descris în Germania (2011) O104:H4 (“scandalul castraveților”); 1150 îmbolnăviri – 16 decese.

•

Un nou serotip descris în România (2016) O26 (“scandalul Brădet”).

•

•Serotipul O157:H7 nu fermentează sorbitolul, nu produce β-galactozidază și βglucuronidază, se dezvoltă pe medii obișnuite la temperaturi între 30-420 C; nu se dezvoltă la 44-450 C.

•

Se poate multiplica la pH 4,5 (rezistă la pH mai mic – 3,8).

•

De asemenea, se poate multiplica în sucul de mere nefermentat la 80 C și în salată la 12o C, rezistă la 6,5% NaCl.

•

Supraviețuiește câteva săptămâni la temperatura de refrigerare.

•

Produce cantități mari de verotoxină (toxină Shiga-like).

•

Implicată în distrugerea celulelor epiteliale intestinale și a celor endoteliale din vasele mici (tractul digestiv, rinichi, pulmoni etc.

•

Perioada de incubație cca. 3-9 zile (medie 4 zile).

•

•Doza infectantă redusă < 1000 ufc.

•

Enterocolita hemoragică (apariție bruscă a crampelor abdominale, urmate în decurs de 24 ore de diaree apoasă, apoi hemoragică, până la eliminarea de sânge exclusiv).

•

La 10% dintre pacienți, boala se complică cu sindromul uremic hemoragic (care este de obicei letal) sau cu purpura trombocitopenică.

•

Sindromul uremic hemoragic se caracterizează printr-o triadă de manifestări grave: 1) anemie hemolitică microangiopatică (eritrocitele sunt lezate mecanic prin comprimarea lor de către vasele cu lumenul micșorat); 2) trombocitopenia; 3) nefropatie acută cu insuficiență renală ceea ce necesită internare de urgență, dializă și transfuzii.

124

E. Coli – agent zoonotic

125

Curs IV Toxiinfecții alimentare produse de Staphylococcus aureus Principala bacterie patogenă a genului •

Primele episoade de toxiinfecție alimentară au fost semnalate în Belgia (Denys, 1894), intuindu-se implicarea unor enterotoxine produse de S. aureus.

•

Manifestările clinice apar rapid după consumul alimentului contaminat (câteva ore) și sunt reprezentate în principal de vomismente, adeseori severe.

•

Prima descriere a genului: Friedrich Rosenbach (1884).

•

Flugge a separat genul Staphylococcus de genul Micrococcus.

•

S. aureus este principala specie patogenă pentru om (diferențierea prin testul coagulării plasmei – von Daranyi, 1925).

•

Coci Gram pozitivi, aerobi sau facultativ anaerobi, nesporulați, dimensiune 0,5-1,5 μm, dispuși izolat, în perechi, tetrade, lanțuri scurte și mai des sub formă de ciorchine.

•

Pigmentul este de natură carotenoidică, nedifuzibil în mediu.

•

Pigmentogeneza și toxinogeneza sunt favorizate de concentrații ale CO2 mai mari decât în aerul atmosferic.

•

S. aureus, S. pseudintermedius și S. hyicus (o parte dintre tulpini) produc coagulază și termonuclează, sunt implicate în episoade de toxiinfecție alimentară.

•

S. epidermidis și S. saprophyticus nu produc coagulază sau termonuclează, nu sunt implicate în apariția toxiinfecțiilor alimentare.

Factorii de patogenitate •

Enzime cu rol în inițierea infecțiilor, facilitând pătrunderea stafilococilor în țesuturi și neutralizarea mecanismelor defensive ale organismului (nu au semnificație patogenică în toxiinfecțiile alimentare).

•

Hialuronidaza, coagulaza liberă și legată, hemolizinele, dezoxiribonucleaza termostabilă sau termonucleaza.

•

Între producerea de coagulază, termonuclează și enterotoxină există o strânsă legatură, de aceea detecția primelor (ieftină , expeditivă) dă informații importante asupra capacității toxigene a tulpinilor stafilococice.

•

(SE) Enterotoxinele stafilococice (A, B, C, D) sunt produse la o temperatură optimă de 370 C (toxiinfecții ce apar după stocare necorespunzătoare, la temperaturi crescute, vara).

126

•

Nu sunt produse la 150 C nici după 8 zile de incubare.

•

Sinteza lor necesită prezența oxigenului, deși SEB poate fi elaborată în condiții de anaerobioză parțială, la 22-300 C (salamuri, hamburgheri conservați în N2).

•

SE sunt proteine simple, cu greutate moleculară mică (25000-29000 Da)

•

Rezistente la acțiunea enzimelor proteolitice ca pepsina, tripsina, chimotripsina și papaina.

•

Cele mai termorezistente toxine bacteriene (D100 este 1-2 ore, D120 este 1040 minute).

•

Căldura devine mai activă asupra SE la pH46􀀁C, mai ales la pH redus.

•

Adăugarea de 8% NaCl mărește termorezistența stafilococilor (în carne de exemplu).

•

Afumarea cărnii sărate sau crenwurstilor nu asigură distrugerea stafilococilor în 48 ore la 490 C, dar temperatura de 530 C îi distruge.

127

Epidemiologie •

Incidența reală nu este cunoscută (în multe țări sunt boli nedeclarabile, au durată scurtă de evoluție)

•

Majoritatea sunt cazuri familiale.

•

Studii epidemiologice în SUA (1993): 1513000 cazuri cu 1210 decese

•

Toxiinfecțiile alimentare apar la persoane care consumă alimente cu SE

•

Sursa de contaminare – oamenii sănătoși purtători (30-50%), purtători persistenți (1535%).

SE apare în alimente în următoarele condiții: •

Alimentul să fie un mediu bun pentru dezvoltarea stafilococilor (carnea, preparatele din carne, laptele, cremele cu ou, unele brânzeturi)

•

Alimentul să fie contaminat cu stafilococi enterotoxigeni (sursa cea mai frecventă: oamenii bolnavi sau purtători)

•

Existența unor condiții favorabile pentru multiplicarea stafilococilor și producerea de enterotoxină (un timp suficient la 30-40o C).

Manifestări clinice •

Perioadă scurtă de incubație: 30 min-6 h (uzual 3-4 h).

•

Doza minimă toxică: cca. 1microgram SE.

•

Boala debutează cu grețuri, crampe abdominale, urmate rapid de vomismente severe, care se repetă la interval de 5-20 minute și care durează cca. 5-8 ore.

•

Vomismentele apar în majoritatea cazurilor și uneori pot avea striuri de sânge (13% dintre pacienți).

•

Diareea este prezentă în cca. 90% din cazuri, dar are un caracter grav la cca. 60% din cazuri; lipsește la cazurile ușoare, deși voma este prezentă.

•

Mai pot surveni tahicardie, leucocitoză, chiar stare de șoc (mimează intoxicațiile cu diverse substanțe chimice).

•

Decesul survine mai rar, la copii sub 4 ani și la bătrâni.

128

Diagnosticul de laborator •

Urmărește izolarea, numărarea și caracterizarea S. aureus, precum și a enterotoxinelor stafilococice.

•

Medii selective și diferențiale (Agar Baird-Parker, Chapman).

•

Testul coagulării plasmei, testul termonucleazei.

•

Detecția enterotoxinei prin metode imunocromatografice și imunoenzimatice (ELISA).

Leucocidina Panton-Valentine •

Factor de virulență prezent la tulpinile comunitare de MRSA (exotoxină).

•

Responsabil de leziuni necrotice cutaneo-mucoase și pneumonia necrozantă (hemoragică).

•

Transmis de bacteriofagi.

129

Curs V Toxiinfecții alimentare produse de Salmonella Salmonella •

Enterobacteriaceae

•

Gram-negative

•

Facultativ anaerobe

•

Glucozo-fermentative

•

Lactozo-negative

•

H2S pozitive

•

Bacil drept

•

Taxonomie: gen, specie, subspecie, serovarserotip.

•

Bacili 2-4 x 0,6-1 μm, de obicei mobili (excepție S. gallinarum), cu cili dispuși peritrich

•

Majoritatea serotipurilor de S. enterica prezintă fimbrii de tip 1 – manozosenzitive, cu rol în adezivitatea la enterocite.

•

S. gallinarum prezintă fimbrii de tip 2, neadezive, ceea ce explică lipsa de patogenitate pentru om.

•

Salmonelele se dezvoltă într-un interval larg de temperaturi, cuprins între 2-54o C (temp. de refrigerare nu oprește proliferarea)

•

Se dezvoltă în alimentele sărate (3-4% sare)

130

Salmonella - Taxonomie •

Genul Salmonella cuprinde două specii, S. enterica și S. bongori

•

Peste 2000 serotipuri sunt grupate în S. enterica. Această specie este divizată în șase subgrupe, pe baza specificității de gazdă și imunoreactivității la 3 antigene de suprafață: O (somatice), H (flagelare) și Vi (de înveliș).

•

Salmonella enterica cuprinde : enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica

•

Toate tulpinile patogene pentru om sunt cuprinse în specia S. enterica, subgrupul 1 (de asemenea numită enterica) – 90% din izolările de la om

•

De exemplu, denumirea taxonomică corectă a unui microorganism care cauzează febră tifoidă este Salmonella enterica ssp. enterica, serovar typhi. Versiunea simplificată: Salmonella typhi.

•

Peste 2500 serotipuri; majoritatea diferitelor episoade de îmbolnăvire sunt cauzate în principal de cca. 1400 serotipuri.

•

Denumirea “Salmonella” derivă de la Dr. Salmon, un medic veterinar american, care a izolat Salmonella enterica / choleraesuis dintr-un intestin de porc în 1885.

•

Bacterile patogene sunt ingerate împreună cu alimentele sau apa contaminată.

•

‘’Salmoneloză’’: Orice infecție cauzată de specii de Salmonella, indiferent de gravitatea lor.

•

Două entități nosologice la om: febra enterică (tifoidă și paratifoidă) și gastroenterita (non-tifoidă).

•

Principalul habitat al salmonelelor este tractul intestinal al oamenilor și a unei largi varietăți de animale (broaștele țestoase de agrement sunt purtătoare în proporție de până la 90%, limfonodurile superficiale la bovine).

OMS grupează Salmonella în 3 tipuri: •

Typhoidal (enteric) Salmonella (tulpini enterice sau tifoide – strict adaptate la gazdele umane și primatele superioare) -

(exemplu: S. typhi) cauzează febră tifoidă și paratifoidă, creștere restricționată la gazdele umane și habitatul principal – tractul intestinal (purtători)

•

Nontyphoidal Salmonella – tulpini netifoide (exemplu: S. enteritidis, S. typhimurium) -

prevalente în tractul gastro-intestinal al unei largi varietăți de animale, incluzând mamifere, reptile, păsări și insecte.

131

-

cauzează îmbolnăviri caracterizate prin gastro-enterită la animale și oameni (evoluează ca toxiinfectii alimentare) de obicei transferate de la animale la om prin intermediul unor produse alimentare: carne proaspătă, ouă și lapte, dar și fructe, legume, fructe de mare.

-

animalele de companie pot îmbolnăvi omul prin contact cu fecalele contaminate ale acestora.

Salmonella mostly restricted to certain animals (tulpini caracteristice unor specii de animale) – bovine, porcine (la care produc salmoneloză); foarte rar întâlnite la om, adesori invazive, prognostic vital defavorabil.

Salmonella - istoric • Câteva personaje istorice au decedat în urma unor infecții cu Salmonella: • Alexandru cel Mare moare misterios în 323 î. H se pare în urma unui episod de salmoneloză (concluzia unei echipe de specialiști de la University of Maryland - 2001, pe baza analizei simptomatologiei descrise de autorul Arrian din Nicomidia) • Prințul Albert, consortul reginei Victoria, moare în urma unei infecții cu Salmonella în 1861 (în perioada victoriană, incidența salmonelozei atingea 50000 cazuri/an în Anglia) Epidemia de febră tifoidă în timpul Războiului Americano-Spaniol (1898) - 20738 recruți au contractat boala (82% din nr. total de soldați), 1590 morți (7.7%). • Între 1904-1914, a devenit disponibil un vaccin antisalmonelic • Vaccinul a fost folosit cu succes în timpul Primului Război Mondial pentru reducerea mortalității de febră tifoidă la soldați (S. typhi). ‘Typhoid Mary’ Mallon primul caz ce a făcut “carieră” în lumea medicală și presa americană (primul caz de febră tifoidă în America). Unii indivizi au imunitate naturală față de Salmonella și devin ‘purtători cronici’. Aceste cazuri servesc ca rezervor natural al bolii. Aproximativ 3% dintre persoanele infectate cu S. typhi și 0.1% dintre cele infectate cu salmonele non-tifoide devin purtători cronici pentru perioade de la câteva săptămâni la câțiva ani sau toată viața.

132

Un astfel de caz a fost Mary Mallon, o irlandeză ce a emigrat în SUA unde a lucrat ca bucătăreasă la diverse familii din zona New York la începutul secolului trecut. Mary Mallon a cauzat numeroase episoade de febră tifoidă mutându-se de la o familie la alta înainte ca îmbolnavirile să se poată corela cu prezența ei. În total, a lucrat pentru 7 familii, a determinat îmbolnăvirea a 53 persoane și a cauzat 3 decese. Autoritățile au izolat-o forțat în 1907 într-un centru special din North Brother Island, NY - unde a rămas până în 1910 când a fost eliberată cu angajamentul de a nu mai presta nicio activitate ce ar presupune un contact cu alimentele Dar a fost din nou depistată lucrând cabucătăreasă și provocând episoade de febră tifoidă. A fost din nou izolată la centrul din North Brother Island, până a murit în 1938. Oregon (SUA): Contaminarea intenționată a salatelor din restaurante Septembrie 1984, 10 restaurante din Dalles (Oregon), implicate într-un episod de infecție cu S. typhimurium (membrii unui cult budist au contaminat dressing-ul pt salate). •Peste 700 îmbolnăviri •Primul atac terorist de anvergură, pe teritoriul SUA

Epidemiologie Cele mai comune serotipuri: - S. typhi - S. enteritidis și S. typhimurium Top 20 serotipuri responsabile de 80% dintre cazurile diagnosticate în SUA

133

S. typhi (Samonella tifoidă) - Cauzează febră enterică (tifoidă) - Nu se cunosc alte gazde decât omul. - Transmiterea prin contact strâns cu persoanele infectate sau cu purtătorii cronici. Apa sau alimentele contaminate pot reprezenta de asemenea sursă de infecție. - Actualmente, boala este rară în țările dezvoltate Febra tifoidă este încă o problemă de sănătate publică în tările în curs de dezvoltare.. OMS estimează numărul de cazuri la 16 milioane anual, cu 600.000 morți.

Salmonella typhi în tările în curs de dezvoltare Apa contaminată este sursa principală de răspândire a febrei tifoide. În timpul anotimpului ploios, apele de suprafață contaminează mai intens sursele de apă potabilă. Severitatea îmbolnăvirilor, morbiditatea și complicațiile survin

134

mai frecvent în Africa decât în Europa sau America de Nord, datorită accesului limitat la antibiotice și metode de potabilizare a apei.

S. enteriditis și typhimurium (salmonele nontifoidice): - reprezintă serotipurile de top în SUA și Europa după anii ’80 - cauzează gastroenterită după ingestia bacteriilor aflate în/pe alimente sau pe degete și alte obiecte. - cauzează majoritatea cazurilor de salmoneloză zoonotică în majoritatea tărilor.

Salmonella enteritidis Transmisă la om prin intermediul alimentelor de origine animală, predominant prin ouă (ouăle crude sau incomplet preparate). CDC, 2002: In N-E SUA, aproximativ 1 din 10000 ouă pot fi contaminate intern; unul din 50 consumatori poate fi expus anual unui astfel de ou contaminat.

135

Aspecte clinice Cum putem dobândi Salmonella? Toxiinfecții alimentare Transmise prin alimente anterior contaminate, impropriu gătite, sau apă contaminată - Carne: pasăre, porc, bovine (burgeri) - ouă, lactate - alimente vegetale Broaște țestoase și șopârle (pets) Forme clinice -

Gastroenterită (S. typhimurium)

-

Septicemie (S. choleraesuis)

-

Febră enterică (S. typhi – febra tifoidă)

Cine poate fi infectat ? -

Potențial, oricine

-

Receptivitate crescută: bătrâni, copii, pacienți imunocompromiși

Factori ce cresc sensibilitatea

136

Salmoneloza non-tifoidă - Incubație: 6 ore-10 zile; Durată: 2-7 zile - Doza infectantă = uzual, milioane sau miliarde de bacterii - Transmitere – prin alimentele sau apa contaminate - Rezervor: a) numeroase specii de animale b) în principal păsările și ouăle (80% dintre cazuri au drept cauză ouăle) c) animalele exotice de companie (> 90% dintre dejecțiile reptilelor conțin Salmonella) - Cauzată de S. typhimurium și S. enteritidis - Sezonul ploios în zona tropicală; sezonul cald în zona temperată (incidență crescută) -

Boală prevalentă în țările în curs de dezvoltare

-

Rezistența la antibiotice este importantă (multi-drug resistant S. typhimurium)

Salmoneloza non-tifoidă: Gastroenterita - Simptomatologie: diaree cu febră, crampe abdominale, nausee, uneori vomă - Limitată la tractul gastro-intestinal - Rareori diaree hemoragică, pseudoapendicită - Coprocultura rămâne pozitivă pentru salmonelle timp de 4-5 săptămâni - < 1% dintre pacienți rămân purtători.

Bacteriemie și infecții endovasculare - l 5% dintre cazuri dezvoltă septicemie; 5-10% dintre pacienții septicemici dezvoltă și infecții localizate - Endocardită: Salmonella infectează deseori situsuri endovasculare; bolile valvulare preexistente reprezintă factori de risc - Arterită: pacienți în vârstă (febră prelungită, dureri toracice, abdominale – consecutive unui episod de gastroenterită) - Ambele manifestări sunt rare, dar pot determina complicații cauzatoare de moarte.

137

Septicemia Serotipul S. choleraesius cauzează septicemie: - febră prelungită, frisoane, anorexie, anemie - leziuni în alte țesuturi - șoc septic, deces.

Infecții localizate Infecții intraabdominale: - Rare, de obicei manifestate sub formă de abcese hepatice și splenice - Factori de risc: anomalii hepato-biliare, abdominale, anemie falciformă - Tratament: chirurgical pt. drenarea abceselor Infecții ale SNC: - Meningită (la nou-născuți, evoluează cu simptome severe – crize convulsive, hidrocefalie, retard mental, paralizii) sau abcese cerebrale. Infecții pulmonare: - Uzual, pneumonie lobară - Factori de risc: anomalii pulmonare preexistente, anemie falciformă, utilizarea glucocorticoizilor.

Febra tifoidă - Incubație: 7-14 zile după ingestie; Durată: câteva zile-câteva săptămâni - Doza infectantă = 105 bacterii Simptome: a. 1 săptămână: febră, cefalee, indispoziție, bronșită b. a 2-a săptămână: apatie, anorexie, confuzie, inconștiență c. a 3-a săptămână: erupție cutanată (rozeole tifice: 1-2 mm diametru) ce durează 2-5 zile, simptomatologie gastro-intestinală variabilă – durere abdominală (2040% dintre cazuri) și diaree; spleno-/hepatomegalie, rinoragii, bradicardie - Simptomatologie neuro-psihică: delir și confuzie - Afectare pe termen lung: artrită

138

- Complicațiile tardive includ perforația intestinală și hemoragia digestivă - Alte complicații rare includ pancreatita, afectări miocardice testiculare, hepatice, meningeale, renale, articulare, osoase, splenice. -

Majoritatea salmonelelor dispar din fecale în 8 săptămâni; totuși, 1-5% dintre pacienți devin purtători cronici asimptomatici: sursa primară de salmonele fiind vezicula biliară.

Tratament ➢ Cefalosporine de generația a 3-a sau fluoroquinolone, 10- 14 zile ➢ Tulpini MDR de S. typhi: fluoroquinolonele sunt singurele antibiotice active ➢ Episoadele severe (stare de conștiență alterată, șoc septic): dexametazonă ➢ Purtătorii cronici: 6 săptămâni administrare orală de amoxicilină, ciprofloxacin sau norfloxacin.

Prevenție Febra tifoidă: ➢ în general, tratabilă cu antibiotice ➢ vaccin disponibil; se recomandă vaccinarea persoanelor care călătoresc în țările în curs de dezvoltare ➢ Identificarea tuturor purtătorilor și a surselor de contaminare a apei ➢ evitați consumul de alimente și băuturi “riscante”: folosiți apă îmbuteliată sau fierbeți apa cel puțin un minut; ➢ evitați consumul de fructe și legume crude (apa de spălare !) ➢ Igienizarea mâinilor prin spălare cu apă și săpun. Salmoneloze non-tifoide ➢ pasteurizarea produselor lactate; ouăle din ferme contaminate se pasteurizează (omogenizat sau praf de ouă) ➢ Carnea de bovine (burgerii) – Salmonella se găsește în limfonodurile superficiale ➢ Implementarea unor programe de asigurarea calității, trasabilitatea, regulamente privind refrigerarea, activități educaționale privind manipularea și gătirea ouălor în colectivități ➢ Evitarea contaminării încrucișate: alimentele negătite trebuie separate de cele gătite, gata de consum.

139

Clasificarea CDC ➢ Agent categoria B: microorganisme cu diseminare moderat ușoară, morbiditate moderată și mortalitate redusă, dar care reclamă o supraveghere epidemiologică susținută ➢ Nivel de biosecuritate: 2 (agent asociat cu îmbolnăviri la om, preponderent neletale, care beneficiază de măsuri profilactice. l 9 specii: Salmonella arizonae, cholerasuis, enteritidis, gallinarum-pullorum, meleagridis, paratyphi (Type A,B,C), spp., typhi, și typhimurium ➢ Salmonella typhi are un potențial crescut de diseminare prin intermediul aerosolilor;

Prima utilizare a salmonelelor în bioterorism ➢ Între 1932-1945, Japonia a efectuat experimente in Manchuria. ➢ În Unitatea 731, special destinată studierii agenților biologici, prizonierii au fost infectați și cu Salmonella typhi alături de alți agenți. ➢ Un mare număr de orașe din China au fost atacate, japonezii contaminând sursele de apă și unele alimente cu Salmonella. Culturi de Salmonella au fost de asemenea aruncate în casele chinezilor sau au fost spray-ate din avion. ➢ Datorită manipulării incorecte și lipsei de echipament corespunzător, campania Chekiang din 1942 a condus la 10000 îmbolnăviri cu 1700 morți în rândul trupelor japoneze.

Distribuția alimentelor: Un aliment contaminat produs într-o țară, poate cauza îmbolnăviri în alta ➢ Trasabilitatea ➢ Rezistența la antimicrobiene: numeroase tulpini de Salmonella sunt de tip MDR ➢ Contaminarea unităților de procesare ➢ Unele atacuri teroriste sunt puse în practică pt a induce panică: consecințe economice impredictibile ➢ Atacurile teroriste cu Salmonella sunt usor de pus în practică (anual, apar episoade naturale de salmoneloză, deci pt un terorist nu este dificil să reproducă astfel de episoade).

140

Curs VI Toxiinfecții alimentare produse de Listeria monocytogenes Genul Listeria Gram (+), bacili nesporulați, facultativ anaerobi, necapsulați, mobili (10-250 C) ➢ Șase specii identificate L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii și L. grayi ➢ Specie primar patogenă pt om (bacterie intracelulară) L. monocytogenes (L. ivanovii patogenă pt rumegătoare) Semnificația L. monocytogenes ➢ Microorganisme ubicuitare ➢ Patogen alimentar care cauzează listerioză 2500 cazuri/an în SUA ➢ Rata mortalității până la 30% (cea mai gravă TIA ➢ Principala cauză de spitalizare dintre toate TIA ➢ Gravidele reprezintă până la 27% dintre cazuri, persoanele imunodeficiente până la 70% ➢ Subiecții HIV+ prezintă risc de 280 ori > de a contracta listerioză.

Distribuția L. monocytogenes Mediul ambiant ➢ sol, apă, dejecțiile animalelor, ape reziduale, vegetație în descompunere (5% purtători intestinali sănătoși) Alimente ➢ Produse alimentare proaspete de origine animală și vegetală (inclusiv lapte nepasteurizat, brânzeturi maturate cu pastă moale, salate și alte produse “ready-to-eat”, care nu necesită tratare termică) ➢ Prevalență în peștele semi-preparat și crud (75%) ➢ Tonsilele faringiene la porci.

141

Circulația L. monocytogenes

Factori care afectează creșterea și supraviețuirea Temperatura ➢ 0,4 - 45ºC, optim 30-35ºC pH ➢ pH 4,4-9,4, optim pH 6,5-7,5 ➢ Condițiile de anaerobioză cresc toleranța la pH scăzut (3,0) ➢ Toleranța la pH este dependentă de temperatură și acidul folosit Activitatea antimicrobiană ➢ Acid acetic > acid lactic > acid citric > acid malic > HCl Activitatea apei ➢ L. monocytogenes este singurul patogen din alimente (alături de stafilococ) capabil să se dezvolte la aw10^5 cfu/g) dintr-un serotip toxigen de B. cereus trebuie izolat din alimentul incriminat, fecalele sau voma pacienților Sau ➢ Un număr semnificativ de bacterii (>10^5 cfu/g) B. cereus trebuie izolate din alimentul incriminat, împreună cu detectarea microorganismului în fecalele și/sau voma pacienților

Izolarea și numărarea B. cereus – medii de cultură ➢ Agarul Mannitol egg yolk polymyxin (MYP) este recomandat pentru izolarea și cuantificarea B. cereus din alimente ➢ Polymyxina este agentul selectiv, gălbenușul de ou și manitolul sunt agenții de diferențiere ➢ Colonii de tip “R”, roz-roșii, înconjurate de o zonă de precipitare albicioasă.

151

Serotipuri și factori de virulență B. cereus ➢ Serotipurile H.1, 3, 4, 5, 8 și 12 sunt obișnuit asociate cu toxiinfecțiile alimentare ➢ Serotipurile H.17, 18, 19, 21, 22 sunt rara sau deloc implicate în apariția îmbolnăvirilor ➢ Factori de virulență: hemolizine, metaloproteaze, fosfolipaze.

Toxiinfecții alimentare produse de B. cereus Două forme de îmbolnăvire ➢ Emetică --- toxina emetizantă preformată în aliment (intoxicație alimentară) - Peptidă circulară, 1.2 kDa - cereulida - Stimulează nervul vag, cu apariția răspunsului vomitiv ➢ Diareică --- enterotoxină (infecție alimentară) - Cel puțin 3 enterotoxine descrise: Hbl, Nhe, CytK

Forma diareică vs. forma emetică Aspectul urmărit

Diareică

Emetică

Doza infecțioasă

105 – 107 celule

105 – 108 per g

Toxina produsă:

In intestinul

Preformată în

subțire

aliment

Enterotoxine

Peptidă ciclică

proteice

(cereulida)

8-16 ore

30 min-5 ore

1 sau mai multe

6-24 ore

Tipul toxinei Perioadă incubație Durată

zile

152

Forma diareică vs. forma emetică Aspectul urmărit

Diareică

Emetică

Simptome

Durere

Nausee, vomă,

abdominală,

uneori și diaree

diaree apoasă, nausee, rar vomă Alimente mai des

Carne, supe,

Orez fiert sau

incriminate

legume, budinci,

prăjit, paste și

sosuri, lapte,

tăiței, produse de

lactate

patiserie

Măsuri de control • Inactivarea sporilor de B. cereus în timpul răcirii după o expunere de 10 min la 900 C are loc în două faze: o fază în timpul răcirii de la 90 la 800 C; a 2-a în timpul răcirii de la 46 to 380 C. Inactivarea nu apare dacă sporii sunt răciți până la 800 C. • Scăderea valorilor pH si cresterea concentratiei de NaCl reduce rata de crestere si măreste faza de lag la B. cereus.

153

Curs VIII Toxiinfecții alimentare produse de Clostridium Botulinum Clostridium botulinum −Gram pozitiv −Bacil obligatoriu anaerob −Sporulat § Ubicuitar Rezistent la căldură, lumină, uscăciune și radiații Condiții specifice pentru germinare (ideale în conserve) • Anaerobioză • Temperatură (10-500 C) • Ușoară alcalinitate Clostridiile botulinogene sunt larg răspândite în natură datorită abilității lor de a forma endospori. • Au fost izolate cu precădere din două habitate principale: • solul, inclusiv sedimentele din lacuri și oceane • tractul intestinal al animalelor • (dar nu de la oameni sănătoși) Clostridium botulinum −Rezistența sporilor •

Căldură: rezistă 3-4 ore la 1000 C, 100 min la 1059 C; distrus în 30 min de autoclavare la 1210 C

•

Condiții de uscăciune: rezistă peste 30 ani

•

Rezistenți la alcooli, compuși fenolici, dar inactivați rapid de substanțele clorigene

•

Rezistenți la UV și relativ rezistenți la iradiere (radiații ionizante)

154

Neurotoxina • Cea mai periculoasă toxină cunoscută • Șapte tipuri diferite (toxinotipuri): A-G −Diferite tipuri afectează diferite specii −Toate cauzează paralizie flască −Doar câteva nanograme pot cauza îmbolnăvire (DL50: 1,3-2,1 ng/kg iv sau im la om) −Acționează la nivelul plăcii motorii (sinapsele neuro-musculare) • Toxina: inactivată prin fierbere

Neurotoxina A Om Cabaline Ovine Bovine Caine Pasari Nurci,Dihori

B X X

C X X X

X

D

E

F X

X X X X X X

G X

X X X X

Toxinotipul E este întâlnit în pește, fructe de mare și mamifere marine. Toxinotipul G a fost izolat in principal din sol.

Istoric • 1793, Justinius Kerner −“Wurstgift” (intoxicație cu cârnați) • “Botulus” = “cârnat” (latină) • 1895, Emile von Ermengem −Izolează microorganismul într-un episod de îmbolnăvire în Belgia • episoade legate de consumul alimentelor la conservă (în sec. XX) – reguli stricte pentru procesarea alimentelor. Transmitere • Ingestie

155

−Spori −Neurotoxine • Contaminarea plăgilor • Inhalare (toxina – bioterorism)

Epidemiologie • Cea mai mare prevalență a botulismului - Europa de Est (Ungaria, Georgia, Polonia, Rusia) • Cele mai multe cazuri de botulism infantil – Statele Unite, Argentina, Australia, Canada, Japonia In SUA, cca. 110 cazuri/an −Aprox. 25% legate de consumul de alimente (adulți) −Aprox. 72% intoxicații la sugari −Restul sunt cazuri produse prin contaminarea plăgilor • Mortalitate −5-10% • Doza toxică - câteva nanograme In România: 0,18 cazuri/100000 locuitori (2007); 18x față de SUA −Consumul produselor din carne preparate în gospodării (cârnați proaspeți, carne afumată) −99% toxinotipul B • Mortalitate: 12,2 ±8,5%

Botulismul la om • Trei forme −Alimentar −Contaminarea plăgilor −infantil • Toate formele pot fi fatale și constituie o urgență medicală • Perioada de incubație: 12-36 ore (limite 6 ore – 2 săpt) • Toxine implicate: A, B, E, mai rar F și H

156

Botulismul alimentar • Ingerarea toxinei preformate în alimentul contaminat • Sursa: conservele “homemade”:( legume, peste etc.), produsele din carne (cârnați proaspeți, produse afumate)

Botulismul infantil • Cea mai comună formă în SUA (2 cazuri/100000 nou-născuți) • Contaminare prin ingestia sporilor −Germinare și elaborarea neurotoxinelor în intestin • sugari (< 1 an) − 94% < 6 luni • Spori din surse variate: −Miere de albine, alimente, praf, sirop de porumb

Botulismul cu sursă cutanată de contaminare • Sporii contaminează plăgile −Germinează și se multiplică în condiții de anaerobioză −Sursa: praf, pietriș −Nici sporii, nici toxina nu penetrează pielea intactă −Asociat cu injectarea de heroină contaminată

Simptomatologie - adult • Semnele gastro-intestinale apar de regulă primele (nausee, vomă, diaree) • Urmează semnele neurologice (deficite bilaterale de nervi cranieni) • Diplopie (vedere dublă) • Dificultate în vorbire sau înghițire (dislexie, disfagie) • Slăbiciune musculară descendentă până la paralizie flască simetrică • Paralizia musculaturii respiratorii

Simptomatologie • Formele cele mai severe și de durată • Sunt date de toxina AA • Gravitatea descrește:A > B > F > E

157

• In botulismul infantil, boala este dată de tipurile A și B, mai rar F

Paralizie flască în botulism

Atentie la AVC

Simptomatologie - sugari • Constipație • Letargie • Inapetență • Plâns redus, slab • Pareză bulbară (IX-XII) • Stoparea luării în greutate • Poate cauza “sudden infant death syndrome-SIDS”.

158

Mecanismul de acțiune al neurotoxinei • Inhibarea eliberării de acetilcolină (principalul neurotrasmițător în placa motorie)

159

Diagnostic • Semnele clinice • Detectarea neurotoxinei în ser, fecale, aspirat gastric sau alimentul suspectat • Coprocultura sau cultura aspiratului gastric durează 5-7 zile • Electromiografia – valoare de diagnostic

Tratament • Terapie intensivă • Ventilație mecanică pt compensarea insuficienței respiratorii • Antitoxină botulinică (heptavalentă) • Imunoglobuline specifice −Botulismul infantil (toxinotipurile A și G)

Botulismul la animale • Bovine și ovine • Cabaline • Păsări • Nurci și dihori • Rar la câini și porci • Nu s-au descris cazuri naturale la pisici • Sursa: ingestia toxinei, rar contaminarea cu spori a plăgilor (cai)

Prevenție • Administrarea mierii de albine la copii sub 1 an este INTERZISĂ • Metode corecte de conservare a alimentelor (800 C timp de 30 min sau 1000 C timp de minim 10 min) • Refrigerarea rapidă a alimentelor preparate • Fierberea > 10 minute (pt inactivarea toxinei) • Decontaminarea ustensilelor în contact cu alimente suspecte − Fierbere sau decontaminare cu substante

160

Bioterorism • Toxină puternică și letală • Ușor de produs și transportat • Ușor de aerosolizat (poate ucide 10% din persoanele prezente pe o rază de 0,5 km) • Secta Aum Shinriky – atentate cu toxină aerosolizată în Tokyo (1990-1995)

Toxina botulinică în medicină • Blefarospasm • Distonie cervicală • Migrenă cronică • Diaforeză rebelă la tratamentul cu antiperspirante uzuale • Strabism Toxina botulinică în cosmetică

161

Curs IX Toxiinfecții alimentare produse de Campylobacter spp •

Familia Campylobacteriaceae - Gram negativ, microaerofilic - Termofil (42-43 grd. C) - Bacili curbați sau spiralați

•

•

Flagelat - mobil -

Cauzează enterite

-

Campylobacter jejuni

-

Campylobacter coli

Speciile de Campylobacter nu tolerează uscăciunea sau căldura, dar supraviețuiesc bine în medii umede

•

C. jejuni poate supraviețui între câteva săptămâni și câteva luni la 4􀀁C, în condiții de umiditate și concentrație scăzută a oxigenului, dar la temperatura camerei rezistă doar câteva zile

•

Unele tulpini tolerează –200 C

•

Campylobacter rămâne viabil până la 9 zile în fecale, 3 în lapte și între 2 – 5 zile în apă.

•

Atât C. jejuni cât și C. coli pot rămâne viabili în dejecțiile umede de pasăre perioade îndelungate.

Istoric 1886 •

Escherich descrie pt prima oară o bacterie spiralată în colonul copiilor decedați de “Cholera infantum”

1968 •

Campylobacter izolat din fecale la om

Anii 1970 •

Este recunoscut ca patogen uman de sine stătător

Surse de contaminare

162

•

Incidență ridicată la păsări: Campylobacter izolat în 100% din cecumurile puilor de curcă, 83% în fecalele puilor de găină, 88% în cele de rață.

•

Carnea de pui broiler - Europa

•

Contaminarea cu C. jejuni - 30% din probele de carne de pui și 5% dintre probele de carne roșie.

•

Specii de Campylobacter izolate de la 50% porumbei din orașe, 35% din păsările migratoare și 20-70% dintre pescăruși

163

Epidemiologie •

Infecțiile cu C. jejuni și C. coli se întâlnesc pe tot Globul

•

C. jejuni – una dintre cauzele comune de diaree bacteriană în SUA (cca. 20 cazuri / 100000 locuitori pe an)

•

Campylobacterioza este răspunzătoare pt 5-14% dintre toate cazurile de boală diareică din lume

•

Infectiile sunt comune la copiii de vârstă mică în țările în curs de dezvoltare (40-60% dintre copiii M.

— acceptabile, în cazul în care media logaritmică zilnică se situează între m și M;

— satisfăcătoare, în cazul în care media logaritmică zilnică este ≤ m;

Enterobacteriaceae și numărul de colonii aerobe în carcasele de bovine, ovine, caprine, cabaline și porcine:

Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a procesului testat.

Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată, cu excepția carcaselor pentru care limitele se referă la probele grupate.

Interpretarea rezultatelor testului

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 22

▼M1

5

E. coli (5)

Stafilococi coagulazo-pozitivi

Stafilococi coagulazo-pozitivi

Stafilococi coagulazo-pozitivi

2.2.2. Brânzeturi din lapte sau zer care a fost supus unui tratament termic

2.2.3. Brânzeturi din lapte crud

2.2.4. Brânzeturi din lapte care a fost supus unui tratament termic mai slab decât pasteurizarea (7) și brânzeturi maturate din lapte sau zer care a fost supus pasteurizării sau unui tratament termic mai puternic decât pasteurizarea (7)

2.2.5. Brânzeturi nematurate sub formă de pastă moale (brânzeturi proaspete) din lapte sau zer care a fost supus pasteurizării sau unui tratament termic mai puternic decât pasteurizarea (7) 5

5

5

5

n

Enterobacteriaceae

Microorganisme

2.2.1. Lapte pasteurizat și alte produse lactate lichide pasteurizate (4)

Categoria de produse alimentare

2

2

2

2

2

c

Plan de prelevare de probe (1)

10 ufc/g

100 ufc/g

1 000 ufc/g

105 ufc/g

104 ufc/g

100 ufc/g

1 000 ufc/g

5/ml

M

100 ufc/g

< 1/ml

m

Limite (2)

EN/ISO 6888-1 sau 2

EN/ISO 6888-1 sau 2

EN/ISO 6888-2

ISO 16649-1 sau 2

ISO 21528-1

Metodă analitică de referință (3)

2.2. Lapte și produse lactate

procesului

de

Sfârșitul fabricație

procesului

de

În timpul procesului de fabricație, când se preconizează că numărul de stafilococi este cel mai ridicat

În timpul procesului de fabricație, când se preconizează că numărul de E. coli este cel mai ridicat (6)

Sfârșitul fabricație

Etapă căreia i se aplică criteriul

Ameliorarea igienei producției. În cazul în care se detectează valori > 105 ufc/g, lotul de brânzeturi trebuie testat pentru enterotoxine stafilococice

Ameliorarea igienei producției și a selecției materiilor prime. În cazul în care se detectează valori > 105 ufc/g, lotul de brânzeturi trebuie testat pentru enterotoxine stafilococice

Ameliorarea igienei producției și a selecției materiilor prime

Controlul eficienței tratamentului termic și prevenirea recontaminării, precum și controlul calității materiilor prime

Acțiune în cazul rezultatelor nesatisfăcătoare

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 23

▼M1

Enterobacteriaceae

Enterobacteriaceae

2.2.9. Formule de început deshidratate și produse alimentare dietetice pentru scopuri medicale speciale destinate sugarilor sub șase luni

2.2.10.Formule de deshidratate

continuare

Enterobacteriaceae

5

10

5

5

Stafilococi coagulazo-pozitivi

2.2.8. Înghețată (8) și deserturi lactate congelate

5

Enterobacteriaceae

2.2.7. Lapte praf și zer praf (4)

5

n

E. coli (5)

Microorganisme

2.2.6. Unt și smântână fabricate din lapte crud sau din lapte care a fost supus unui tratament termic inferior celui de pasteurizare

Categoria de produse alimentare

0

0

2

2

0

2

c

Plan de prelevare de probe (1)

100 ufc/g

100 ufc/g

Absența în 10 g

Absența în 10 g

10 ufc/g

10 ufc/g

M

100 ufc/g

10 ufc/g

10 ufc/g

m

Limite (2)

ISO 21528-1

ISO 21528-1

ISO 21528-2

EN/ISO 6888-1 sau 2

ISO 21528-2

ISO 16649-1 sau 2

Metodă analitică de referință (3)

Sfârșitul fabricație

Sfârșitul fabricație

Sfârșitul fabricație

Sfârșitul fabricație

Sfârșitul fabricație

Sfârșitul fabricație

procesului

procesului

procesului

procesului

procesului

procesului

de

de

de

de

de

de

Etapă căreia i se aplică criteriul

Ameliorarea igienei producției pentru a reduce contaminarea

Ameliorarea igienei producției pentru a reduce contaminarea ( 9)

Ameliorarea igienei producției

Ameliorarea igienei producției. În cazul în care se detectează valori > 105 ufc/g, lotul de brânzeturi trebuie testat pentru enterotoxine stafilococice

Controlul eficienței tratamentului termic și prevenirea recontaminării

Ameliorarea igienei producției și a selecției materiilor prime

Acțiune în cazul rezultatelor nesatisfăcătoare

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 24

▼M1

(10)

(7) (8) (9)

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

Bacillus prezumtiv

cereus

Microorganisme

5

n

1

c

50 ufc/g

m

M

500 ufc/g

Limite (2)

EN/ISO 7932 (10)

Metodă analitică de referință (3)

Sfârșitul fabricație

procesului

de

Etapă căreia i se aplică criteriul

Ameliorarea igienei producției. Prevenirea contaminării. Selectarea materiei prime

Acțiune în cazul rezultatelor nesatisfăcătoare

n = numărul de unități care constituie proba; c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M. Pentru punctele 2.2.7, 2.2.9 și 2.2.10, m = M. Se folosește ediția cea mai recentă a standardului. Acest criteriu nu se aplică produselor destinate unei prelucrări ulterioare în sectorul alimentar. E. coli este folosit aici ca indicator al nivelului de igienă. Pentru brânzeturile care nu permit dezvoltarea de E. coli, numărul de E. coli este în general cel mai ridicat la începutul perioadei de maturare, iar pentru brânzeturile care permit dezvoltarea de E. coli, acesta este de obicei cel mai ridicat la sfârșitul perioadei de maturare. Cu excepția brânzeturilor pentru care producătorul poate demonstra, spre satisfacția autorităților competente, că produsul nu prezintă niciun risc de contaminare cu enterotoxine stafilococice. Numai înghețata cu ingrediente pe bază de lapte. Trebuie efectuată testarea paralelă pentru Enterobacteriaceae și E. sakazakii, cu excepția cazului în care s-a stabilit o corelație între aceste microorganisme la nivel de plantă individuală. În cazul în care se detectează Enterobacteriaceae într-unul dintre eșantioanele de produse testate la o plantă, lotul trebuie testat pentru E. sakazakii. Este responsabilitatea producătorului de a demonstra, spre satisfacția autorității competente, dacă există o astfel de corelație între Enterobacteriaceae și E. sakazakii. 1 ml de inoculum este aplicat pe o cutie Petri cu diametrul de 140 mm sau pe trei cutii Petri cu diametrul de 90 mm.

2.2.11.Formule de început deshidratate și produse alimentare dietetice pentru scopuri medicale speciale destinate sugarilor sub șase luni

Categoria de produse alimentare

Plan de prelevare de probe (1)

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 25

▼M1

— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.

— acceptabile, în cazul în care un punct maxim al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;

— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;

Bacillus cereus prezumtiv în formule de început deshidratate și produse alimentare dietetice pentru scopuri medicale speciale destinate sugarilor sub șase luni:

— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.

— acceptabile, în cazul în care un maximum al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;

— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;

E. coli, Enterobacteriaceae (alte categorii de produse alimentare) și stafilococi coagulazo-pozitivi:

— nesatisfăcătoare, în cazul în care prezența bacteriei este detectată în oricare dintre unitățile de probă.

— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absența bacteriei;

Enterobacteriaceae în formule de început deshidratate și produse alimentare dietetice pentru scopuri medicale speciale destinate sugarilor sub șase luni și formule de continuare deshidratate:

Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a procesului testat.

Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată.

Interpretarea rezultatelor testului

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 26

▼M1

5

n

2

c

10 ufc/g sau ml

m

M

100 ufc/g sau ml

Limite

ISO 21528-2

Metodă analitică de referință (2)

Sfârșitul fabricație

procesului

de

Etapă căreia i se aplică criteriul

— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.

— acceptabile, în cazul în care un punct maxim al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;

— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;

Enterobacteriaceae în produse din ouă:

Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a procesului testat.

Interpretarea rezultatelor testului

n = numărul de unități care constituie proba; c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M. Se folosește ediția cea mai recentă a standardului.

Enterobacteriaceae

Microorganisme

Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată.

(1) (2)

2.3.1. Produse din ouă

Categoria de produse alimentare

Plan de prelevare de probe (1)

2.3. Produse din ouă

Controale ale eficienței tratamentului termic și prevenirea recontaminării

Acțiune în cazul rezultatelor nesatisfăcătoare

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 27

▼M1

5

Stafilococi coagulazo-pozitivi

2

2

c

100 ufc/g

1/g

m

10/g

M

1 000 ufc/g

Limite

E. coli în produsele decorticate și fără cochilie din crustacee și moluște preparate:

Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a procesului testat.

Sfârșitul fabricație

Sfârșitul fabricație

— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.

— acceptabile, în cazul în care un maximum al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;

— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;

Stafilococi coagulazo-pozitivi în produsele decorticate și fără cochilie din crustacee și moluște preparate:

— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.

procesului

procesului de

de

Etapă căreia i se aplică criteriul

— acceptabile, în cazul în care un punct maxim al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;

— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;

EN/ISO 6888-1 sau 2

ISO TS 16649-3

Metodă analitică de referință (2)

Interpretarea rezultatelor testului

n = numărul de unități care constituie proba; c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M. Se folosește ediția cea mai recentă a standardului.

5

n

E. coli

Microorganisme

Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată.

(1) (2)

2.4.1. Produse decorticate și fără cochilie din crustacee și moluște preparate

Categoria de produse alimentare

Plan de prelevare de probe (1)

2.4. Produse pescărești

Ameliorarea igienei producției

Ameliorarea igienei producției

Acțiune în cazul rezultatelor nesatisfăcătoare

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 28

▼M1

5

5

n

2

2

c

100 ufc/g

100 ufc/g

m

M

1 000 ufc/g

1 000 ufc/g

Limite

Procesul de fabricație

Procesul de fabricație

Etapă căreia i se aplică criteriul

— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.

— acceptabile, în cazul în care un punct maxim al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;

— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;

E. coli în legumele și fructele tăiate anterior (gata pentru consum) și în sucurile de fructe și legume nepasteurizate (gata pentru consum):

Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a procesului testat.

Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată.

ISO 16649-1 sau 2

ISO 16649-1 sau 2

Metodă analitică de referință (2)

Interpretarea rezultatelor testului

n = numărul de unități care constituie proba; c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M. Se folosește ediția cea mai recentă a standardului.

E. coli

2.5.2. Sucuri de fructe și legume nepasteurizate (gata pentru consum)

(1) (2)

E. coli

Microorganisme

2.5.1. Fructe și legume tăiate anterior (gata pentru consum)

Categoria de produse alimentare

Plan de prelevare de probe (1)

2.5. Legume, fructe și produse din legume și fructe

Ameliorarea igienei producției și a selecției materiilor prime

Ameliorarea igienei producției și a selecției materiilor prime

Acțiune în cazul rezultatelor nesatisfăcătoare

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 29

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 30 ▼M1 Capitolul 3. Norme pentru prelevarea de probe și pregătirea probelor pentru teste 3.1. Norme generale pentru prelevarea de probe și pregătirea probelor pentru teste În absența unor norme mai speciale privind prelevarea de probe și pregătirea probelor pentru teste, se folosesc ca metode de referință standardele relevante ale ISO (Organizația Internațională de Standardizare) și orientările din Codex Alimentarius. 3.2. Prelevarea de probe bacteorologice în abatoarele și unitățile de producție a cărnii și a preparatelor din carne Norme de prelevare a probelor pentru carcasele de porcine, ovine, caprine și cabaline Metodele destructive și nedestructive de prelevare de probe, selectarea zonelor pentru prelevarea de probe și normele pentru depozitarea și transportul probelor sunt descrise în standardul ISO 17604. La fiecare sesiune de prelevare de probe, acestea se prelevează aleatoriu din cinci carcase. Zonele pentru prelevarea de probe se selectează ținându-se seama de tehnologia de abatorizare utilizată în fiecare unitate. Prelevarea de probe pentru analizele referitoare la Enterobacteriaceae și numărul de colonii aerobe se efectuează din patru zone ale fiecărei carcase. Patru probe de țesut reprezentând o suprafață totală de 20 cm2 se prelevează prin metoda destructivă. În cazul în care se folosește metoda nedestructivă în acest scop, suprafața de prelevare este de minimum 100 cm2 (50 cm2 pentru carcasele de rumegătoare mici) pentru fiecare zonă de prelevare. Prelevarea de probe pentru analizele referitoare la Salmonella se efectuează cu ajutorul metodei buretelui abraziv. Trebuie selectate suprafețele cel mai probabil contaminate. Suprafața totală de prelevare este de minimum 400 cm2. În cazul în care probele sunt prelevate din diferite zone de prelevare ale carcasei, acestea sunt grupate înaintea examinării. Norme de prelevare a probelor pentru carcasele de păsări Pentru analizele referitoare la Salmonella se prelevează, în mod aleatoriu, probe de la minimum 15 carcase pentru fiecare sesiune de prelevare de probe și după refrigerare. Se prelevează de la fiecare carcasă o bucată de piele de pe gât de aproximativ 10 g. De fiecare dată, probele de piele de pe gât de la trei carcase se grupează înaintea examinării pentru a forma cinci probe finale de câte 25 g. Orientări pentru prelevarea de probe Orientări mai detaliate privind prelevarea de probe de la carcase, în special în ceea ce privește zonele de prelevare a probelor, pot fi incluse în ghidurile de bună practică menționate la articolul 7 din Regulamentul (CE) nr. 852/2004. Frecvențele prelevării de probe pentru carcase, carne tocată, preparate din carne și carne separată mecanic Operatorii din sectorul alimentar ai abatoarelor sau unităților care produc carne tocată, preparate din carne sau carne separată mecanic prelevează probe pentru analizele microbiologice cel puțin o dată pe săptămână. Ziua prelevării de probe se modifică în fiecare săptămână, astfel încât să se preleveze probe în fiecare zi a săptămânii. În cazul prelevării de probe din carne tocată și preparate din carne pentru analizele referitoare la E. coli și la numărul de colonii aerobe și al prelevării de probe din carcase pentru analizele referitoare la Enterobacteriaceae și la numărul de colonii aerobe, frecvența poate fi redusă la o dată la două săptămâni, în cazul în care se obțin rezultate satisfăcătoare timp de șase săptămâni consecutive. Pentru prelevarea de probe din carne tocată, preparate din carne și carcase pentru analizele referitoare la Salmonella, frecvența poate fi redusă la o dată la două săptămâni, în cazul în care se obțin rezultate satisfăcătoare timp de 30 de săptămâni consecutive. Frecvența prelevării de probe pentru salmonela poate fi redusă și în cazul în care există un program național sau regional de control al salmonelei, iar respectivul program cuprinde teste care înlocuiesc prelevarea de probe descrisă anterior. Această frecvență poate fi redusă și mai mult în cazul în care programul național sau regional de control al salmonelei demonstrează că prevalența salmonelei este scăzută la animalele cumpărate de abator.

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 31 ▼M1 Cu toate acestea, în cazul în care acest lucru se justifică în urma unei analize a riscului și este autorizat în consecință de autoritatea competentă, abatoarele și unitățile mici care produc carne tocată și preparate din carne în cantități mici pot fi exonerate de obligația de a respecta aceste frecvențe de prelevare de probe.

2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 32 ▼B ANEXA II Studiile menționate la articolul 3 alineatul (2) includ: — specificațiile pentru caracteristicile fizico-chimie ale produsului, cum ar fi pHul, aw, conținutul de sare, concentrația conservanților și sistemul de ambalare, ținând seama de condițiile de depozitare și prelucrare, de posibilitățile de contaminare și de perioada de conservare prevăzută, precum și — consultarea literaturii științifice disponibile și rezultatele cercetărilor privind caracteristicile dezvoltării și supraviețuirii microorganismelor în cauză. Atunci când este necesar, operatorul din sectorul alimentar, pe baza studiilor menționate anterior, realizează studii suplimentare care pot include: — elaborarea de modele matematice predictive pentru produsele alimentare în cauză, utilizând factori critici de dezvoltare sau supraviețuire pentru microorganismele în cauză din produs; — teste care analizează capacitatea microorganismului în cauză, inoculat în mod adecvat, de a se dezvolta sau supraviețui în produs în diferite condiții de depozitare care pot fi prevăzute în mod rezonabil; — studii de evaluare a dezvoltării și supraviețuirii microorganismelor în cauză care pot fi prezente în produs în perioada de conservare în condiții de distribuție, depozitare și utilizare care pot fi prevăzute în mod rezonabil. Studiile menționate anterior țin seama de variabilitatea inerentă a produsului, a microorganismelor în cauză și a condițiilor de prelucrare și depozitare.