BTH Curs [PDF]

Zitiervorschau

Biotehnologii medicale Distrugerea celulelor microbiene Prof. Univ. Dr. Anca Galaction [email protected]

Alegerea tehnicii de separare Criterii: • • • • • •

localizarea produsului: intracelular sau extracelular; concentrația finală a produsului ȋn lichid; caracteristicile fizico-chimice ale produsului; utilizarea produsului, respectiv condițiile de puritate impuse; natura impurităților din mediul de cultură; costul etapei de separare.

Localizarea produsului Dacă produsul este intracelular și nu poate difuza prin membrana celulară, este necesară distrugerea acesteia, prin metode adecvate, pentru eliberarea produsului, care apoi se separă din soluția rezultată prin diferite tehnici: extracție, schimb ionic, cromatografie, precipitare, distilare, tehnici membranare. In anumite cazuri, atât pentru facilitarea eliberării conținutului intracelular, cât și pentru ușurarea separării ulterioare a produsului util, se pot aplica o serie de metode: • efectuarea unui tratament chimic (modificarea pH-ului, utilizarea unor agenți de floculare, a unor electroliți etc.) sau fizic (utilizarea căldurii) pentru a se favoriza distrugerea membranelor celulare; • utilizarea unor enzime specifice pentru a se distruge pereții celulari; • utilizarea ȋn procesul de fermentație a unor mutanți capabili fie să reducă sau să elimine formarea unor compuși secundari care ar putea influența negativ performanța separării, fie să blocheze formarea membranelor celulare, facilitând astfel difuzia produsului util ȋn mediul de fermentație; • modificarea condițiilor de fermentație, pentru obținerea aceluiași efect menționat mai sus.

Tehnicile de distrugere a membranelor celulelor microbiene Sunt determinate de: • forma și dimensiunea celulelor • structura pereților celulari • compoziția lichidului intracelular. Forma și rezistența membranelor celulelor microbiene depind de: • natura componenților macromoleculari din care sunt alcătuite • de gradul de realizare a unor legături dintre aceștia și alți componenți ai peretelui.

Distrugerea celulelor microbiene a. Metode mecanice

b. Metode nemecanice:

- ȋn fază lichidă • cu ultrasunete • prin agitare mecanică • la presiuni ridicate - ȋn fază solidă • prin măcinare • prin presare

- uscare • uscare cu aer • uscare sub vid • liofilizare • uscare cu solvenți - liză fizică • șoc osmotic • ȋnghețare/dezghețare • șocuri de presiune - liză chimică • cu substanțe tensioactive • cu antibiotice • cu acizi, baze, săruri, esteri etc. • enzimatică : cu lizozime.

a. Distrugerea mecanică a membranelor celulelor microbiene Metodele mecanice de distrugere a biomasei sunt cele mai utilizate, deoarece oferă posibilitatea prelucrării rapide a unor cantități mari de biomasă, cu eficiență sporită. - Principiul general: supunerea celulelor la tensiuni de forfecare ridicate, create de o presiune ridicată, de o agitare mecanică intensă sau cu ajutorul ultrasunetelor. - Caracteristica acestor metode: necesitatea răcirii amestecului prelucrat, pentru preluarea căldurii excesive generate de disiparea unei părți din energia mecanică introdusă ȋn sistem. 1. Cu ultrasunete 2. Tehnica presiunilor ȋnalte 3. Agitarea mecanică

1. Cu ultrasunete - una dintre cele mai utilizate metode la nivel de laborator și pilot - frecvențe de 15-25 kHz. Distrugerea celulelor microbiene este cauzată de tensiunile de forfecare dezvoltate de vârtejurile (turbioanele) create de unda de șoc. In timpul procesului, suspensia de biomasă este răcită cu gheață sau cu un alt agent de răcire care circulă prin mantaua vasului respectiv. Deși metoda poate fi utilizată ȋn regim continuu, nu poate fi aplicată la scară industrială, datorită consumurilor energetice ridicate și a posibilelor denaturări ale biopolimerilor (proteine, enzime) pe care le produc ultrasunetele.

2. Tehnica presiunilor ȋnalte Suspensia de biomasă, conținută ȋntr-un cilindru de oțel, este trecută, sub o presiune de circa 50 - 200 MPa, creată cu ajutorul unui piston, printr-o valvă cu un orificiu ȋngust (1) (figura 1.1). Valva este prevăzută cu un dispozitiv alcătuit dintr-un piston (2) și un resort (3) care menține constantă presiunea cu care suspensia este ȋmpinsă prin orificiu.

biomasa

Figura 1.1. Dispozitiv de distrugere a celulelor microbiene la presiune ridicată

Gradul de distrugere este influențat, ȋn principal, de temperatură, concentrația drojdiei și presiune In funcție de tipul celulelor microbiene și de condițiile de operare (presiuni extrem de ridicate), este posibilă distrugerea aproape completă a biomasei la o singură trecere a suspensiei prin aparat. Astfel, gradul de distrugere pentru Saccharomyces cerevisiae a fost 100% pentru P = 175 MPa. Influența presiunii asupra distrugerii microorganismelor este mai pronunțată ȋn domeniul valorilor sub 70 MPa, peste acest nivel eficiența procesului crescând lent cu presiunea. • Există posibilitatea ca același microorganism să elibereze diferite enzime și proteine la treceri succesive prin dispozitivul de distrugere. Acest fenomen a fost observat la Saccharomyces cerevisiae, care a eliberat 6 enzime diferite, ceea ce indică o poziționare distinctă a acestora ȋn celulă. Preluarea căldurii degajate ȋn timpul operației de distrugere a celulelor, care ar putea determina denaturarea moleculelor proteice, se poate realiza prin diferite procedee: • injectare de dioxid de carbon ȋn interiorul valvei; • utilizarea azotului răcit ȋn prealabil, combinat cu recircularea biomasei. O variantă a metodei de distrugere la presiuni ȋnalte o reprezintă trecerea printr-o valvă ȋngustă a unor suspensii ȋnghețate de celule microbiene, sub o presiune de 550 MPa. In acest mod, la acțiunea forțelor de forfecare ridicate se adaugă efectul abraziv al cristalelor de gheață, modificarea dimensiunii cristalelor de gheață, comportarea reologică puternic nenewtoniană (vâscoplastică) la curgerea suspensiei prin orificiu, rezultatul fiind o distrugere avansată a celulelor. Alte avantaje ale acestui procedeu mai sunt: • posibilitatea utilizării pentru un domeniu larg de microorganisme; • conservarea calităților biologice ale produselor intracelulare. Insă, procedeul nu este recomandat componenților celulari sensibili la temperaturi scăzute.

Agitarea mecanică • Agitarea mecanică a suspensiilor de celule ȋn amestec cu bile confecționate din materiale diferite constituie = o metodă cu aplicații industriale. • Procedeul constă ȋn amestecarea la turații ridicate a suspensiei de biomasă cu astfel de bile, distrugerea celulelor fiind cauzată atât de forțele de forfecare mari, cât și de coliziunea cu corpurile solide din amestec. manta

suspensie de celule

sita

agitator

agent de racire

Bilele

Bilele pot fi confecționate din diferite materiale: • sticlă, • ceramică, • oțel, cu mențiunea că există restricții ȋn folosirea anumitor materiale ȋn cazul prelucrării biomasei ȋn cadrul industriei farmaceutice sau alimentare (ex.: nu este admisă utilizarea sticlei cu conținut de plumb).

Agitatoarele

• Agitatoarele utilizate sunt de tip disc. Pentru reținerea bilelor ȋn utilaj pot fi utilizate trei tipuri de dispozitive: • site • site vibratorii • disc care se rotește ȋn imediata vecinătate a unui taler prevăzut cu un orificiu central.

Factori pentru eficiența distrugerii celulelor • • • • 1.

2.

3.

natura și concentrația microorganismului, condițiile de operare, dimensiunea și concentrația bilelor, configurația sistemului de agitare etc. Din studiile ȋntreprinse, s-a constatat că pentru fiecare microorganism există un interval caracteristic al diametrului bilelor pentru care distrugerea decurge cu randamente maxime (diametru optim). Practic, dimensiunea optimă este dictată de rezistența microorganismului și de localizarea produsului urmărit ȋn celulă (pentru distrugerea celulelor de fungi rezultate bune se obțin cu bile avȋnd diametrul > 1 mm, iar pentru celulele vegetale și animale și drojdii pentru diametre < 1 mm). In același timp, dimensiunea celulelor trebuie corelată cu mărimea și concentrația celulelor microbiene. In general, diametrul bilelor utilizate frecvent variază ȋntre 0,1 și 3 mm. Fracția volumică ocupată de bile influențează atât gradul de distrugere, cât și puterea necesară amestecării. Astfel, distrugerea celulelor este intensificată odată cu creșterea fracției volumice, ȋnsă, peste anumite valori (80 - 88%) nu se mai observă nici un efect. Totuși, trebuie luat ȋn considerație faptul că, pentru o anumită turație a agitatorului, creșterea concentrației bilelor generează creșterea semnificativă a temperaturii dezvoltate ȋn timpul operației. Un alt factor important ȋl reprezintă energia cinetică a bilelor, EC, calculată cu expresia:

Ec =

1 2  m  vb 2

unde: m - masa totală a bilelor din utilaj • •

vb - viteza bilelor.

Deoarece gradul de distrugere depinde direct proporțional de energia cinetică, se observă că o densitate sporită a bilelor și o viteză de rotație ridicată a agitatorului determină creșterea eficienței distrugerii a biomasei. Deși, ȋn general, procesul de distrugere este accentuat cu intensificarea amestecării, la turații ridicate s-a observat atingerea unui nivel constant al gradului de distrugere sau chiar o reducere a acestuia. Acest fenomen este rezultatul apariției unei curgeri inverse a suspensiei odată cu creșterea puternică a turației.

4.dispunereașiconfigurația agitatorului

Majoritatea agitatoarelor au discurile montate perpendicular pe ax, ȋnsă au fost experimentate și agitatoare cu o așezare oblică a discurilor. Aceste agitatoare oferă performanțe superioare, ȋn special la turații reduse, dar necesită consumuri energetice mai mari, iar efectul termic este apreciabil.

Configurația elicoidală a agitatoarelor cu discuri.

Tipuri constructive de agitatoare disc

Combinată cu conformația agitatorului, poziția camerei de mărunțire poate afecta semnificativ eficiența distrugerii biomasei. S-a demonstrat experimental că utilajele orizontale conduc la obținerea unui grad de distrugere mai avansat și, ȋn plus, elimină o serie din dezavantajele celor verticale, cum ar fi: astuparea racordului de evacuare, imposibilitatea etanșării perfecte a utilajului, tendința de fluidizare a bilelor etc.

5.Temperatura, ȋntre limitele ȋn care se operează curent (5 - 40oC), are o influența mai redusă. In schimb, o importanță deosebită o are creșterea temperaturii ȋn camera de mărunțire, ȋn timpul operației. Din acest motiv, un criteriu important de transpunere la scară superioară ȋl constituie preluarea căldurii dezvoltate. 6.Deși concentrația biomasei nu reprezintă un parametru important, se observă, ȋn general, o creștere a gradului de distrugere a celulelor microbiene odată cu creșterea concentrației acestora ȋn suspensia prelucrată. Acest fenomen este atribuit modificării comportării reologice a suspensiei cu concentrația biomasei, ȋnsă trebuie corelat cu turația agitatorului. Pentru unele agitatoare, viteza de distrugere a biomasei este independentă de concentrația acesteia. 6. Pe lângă acești factori, o influență deosebită este atribuită naturii celulelor microbiene și condițiilor de creștere, similar celor prezentate ȋn cadrul procedeului anterior de distrugere a biomasei. In acest tip de utilaj, datorită dimensiunii inferioare, bacteriile sunt distruse mai greu decât drojdiile.

Distrugerea nemecanică a membranelor celulelor microbiene • • • •

Liza enzimatică Liza chimică Metodele fizice Uscarea

a. Liza enzimatică • folosește enzime capabile să atace membrana celulară (lizozime). Utilizarea acestei metode presupune parcurgerea a două etape preliminare: • selectarea unei enzime, sau sistem enzimatic, care să corespundă microorganismului respectiv; • stabilirea condițiilor unei lize eficiente. Unele microorganisme sunt accesibile atacului enzimatic numai ȋn anumite etape ale dezvoltării acestora sau numai atunci când creșterea se desfășoară ȋn anumite condiții. De asemenea, microorganismele pot fi destul de rezistente la liza enzimatică, caz ȋn care facilitarea procesului se realizează prin: • iradiere; • adăugarea unor săruri ȋn concentrație ridicată; • utilizarea unor factori biologici pentru mărirea activității lizozimelor; • utilizarea unor sisteme enzimatice combinate.

Avantaje

• specificitatea ridicată a acțiunii lizozimelor.

Dezavantaje • costuri ridicate, ȋn prezent fiind ei aplicarea la nivel neeconomică industrial; • separarea dificilă a produșilor intracelulari eliberați de lizozime, mai ales atunci când aceștia sunt tot enzime (acest dezavantaj poate fi ȋnlăturat prin imobilizarea lizozimelor pe un suport macromolecular

- Autoliza • O variantă a acestui procedeu o reprezintă autoliza, microorganismul producȋnd el ȋnsuși lizozimele. Numeroase microorganisme sȋnt capabile să producă enzime autolitice care să realizeze distrugerea stucturii polimerice a peretelui celular, proces favorizat de modificarea condițiilor de creștere a microorganismelor respective. Autoliza depinde de o serie de parametri, dintre care pot fi amintiți: • temperatura (autoliza drojdiilor necesită 12-24h la 45-50oC); • valoarea pH-ului; • componența și concentrația mediului de cultură (cantități reduse de NaCl, acetat de etil, sau cloroform pot accelera procesul autolitic); • stadiul de dezvoltare a microorganismului. In general, autoliza necesită durate ȋndelungate, ȋntre 2 și 20 h, eficiența sa fiind destul de redusă. In plus, ȋn timpul acestui proces este posibilă denaturarea moleculelor proteice eliberate din lichidul intracelular.

- Utilizare de microorganisme mutante • Recent au fost experimentate microorganisme mutante, cărora li s-a inhibat capacitatea de a-și sintetiza peretele celular sau ȋn al căror mediu au fost adăugați unii componenți meniți să blocheze sinteza membranei celulare (unele antibiotice, cum ar fi penicilina, adăugate către sfârșitul etapei de creștere). • O condiție a atingerii unor eficiențe sporite a procesului este aceea ca biosinteza produselor utile să decurgă și după adăugarea inhibitorului, astfel ȋncât celulele care realizează diviziunea să aibă membrana distrusă.

b. Liza chimică ….folosită fie pentru distrugerea pereților celulari, fie pentru extracția unor componenți intracelulari. Acest procedeu, destul de răspândit, utilizează agenți chimici incluși ȋn următoarele categorii: • - compuși tensioactivi: detergenți ionici (dodecilsulfat de sodiu) sau neionici. Detergenții ionici sunt mai eficienți, produc liza membranei celulare, sau extrag unii componenți din lichidul citoplasmatic, ȋnsă pot determina și o denaturare a moleculelor proteice eliberate. De asemenea, efectul compusului tensioactiv trebuie corelat cu cel indus de temperatură, ȋn acest caz atingerea unei eficiențe sporite fiind posibilă numai la temperaturi scăzute. • - săruri, zaharuri, esteri acetici: sȋnt compuși care induc plasmoliza, extrăgând materialul intracelular, ȋn general fără denaturarea acestuia. I De ex. separarea invertazei din drojdii. • - acizi: realizează cel mai rapid hidroliza componenților care alcătuiesc peretele celular, necesitând ȋntre 6 și 12 h. De exemplu, suspensii concentrate de drojdii au fost acidulate și refluxate ȋntr-un evaporator pelicular, suspensia rezultată după hidroliză fiind neutralizată, filtrată, decolorată și concentrată. Insă, cu toate că randamentele hidrolizei acide sȋnt ridicate, se produc pierderi ȋn proteine, vitamine și compuși aromatici. • - baze: solubilizează o gamă largă de compuși intracelulari, fără să producă distrugerea peretelui celular. • - antibiotice: pot distruge membrana celulară.

• - butanol, uree etc.: pot crea probleme referitoare la separarea produselor eliberate și la toxicitate.

c. Metodele fizice Utilizate mai rar, ȋn principal datorită eficienței reduse, chiar după un număr mare de cicluri. • șocul osmotic: este indus de modificarea rapidă a concentrației sărurilor din mediu, fiind aplicat, ȋn general, la distrugerea celulelor animale și a celulelor sanguine, majoritatea microorganismelor fiind mai puțin afectate de modificarea bruscă a presiunii osmotice. Mecanismul distrugerii celulelor are la bază capacitatea celulelor de a echilibra rapid concentrația din interiorul lor cu cea din mediul exterior, prin osmoză. Astfel, atunci când celulele sunt suspendate ȋntr-o soluție cu o presiune osmotică ridicată (ca de exemplu, o soluție de 1 M zahăr) și apoi se diluează repede soluția, pătrunderea rapidă a apei ȋn celulă crează o presiune hidrostatică care produce liza celulară. Socul osmotic poate fi o metodă de intensificare a procesului de autoliză. • - ȋnghețare-dezghețare: cu o desfășurare ciclică, ȋnsă cu randamente scăzute. In plus, unii componenți intracelulari sunt sensibili la aceste tratamente. Efectele sunt similare cu ale șocului osmotic.

d. Uscarea • prin ȋncălzire • cu solvenți Dezavantaj: • poate cauza denaturarea unor molecule proteice sau a altor componenți intracelulari utili. Modalitatea de realizare a uscării determină performanțele procesului. Astfel, uscarea masei celulare ȋn uscătoare tip tambur oferă o eficiență sporită ȋn ceea ce privește eliberarea proteinelor, comparativ cu uscarea prin liofilizare sau atomizare.

Analiza gradului de distrugere a membranelor celulelor microbiene Metodele directe • stabilesc numărul sau masa celulelor rămase intacte Se bazează pe numărarea celulelor rămase intacte cu ajutorul unui microscop sau al unui numărător electronic de particule. Uneori compușii obținuți prin distrugerea celulelor pot afecta negativ precizia metodei. Ușurarea numărătorii se poate realiza prin colorarea celulelor, astfel ȋncȋt să poată fi diferențiate mai bine celulele ȋntregi de cele distruse. Metoda necesită un timp mai lung și nu poate fi aplicată cu destulă precizie bacteriilor

Metodele indirecte

• determină componenții celulari eliberați Constau ȋn dozarea concentrației componenților citoplasmatici eliberați ȋn mediu sau ȋn măsurarea unor parametri care depind ȋn mod direct de concentrația acestora (conductivitate electrică, activitate) și compararea cu valorile standard corespunzătoare unui grad de distrugere de 100%.

Biotehnologii medicale FILTRAREA LICHIDELOR DE FERMENTATIE Prof. Univ. Dr. Anca Galaction [email protected]

1. Filtrarea biomaselor fibroase • Filtrarea lichidelor de fermentaţie care conţin masă celulară cu caracter fibros (culturi de fungi din clasele Aspergillus şi Penicillium) este o operaţie relativ uşoară, deoarece miceliul nu colmatează materialul filtrant şi se desprinde uşor de pe acesta. Pentru aceste lichide, la nivel industrial sunt recomandate filtrele rotative cu vid. • Filtrele oferă o suprafaţă mare de filtrare, posibilitatea spălării miceliului pe filtru pentru recuperarea avansată a produselor utile şi nu necesită operaţii manuale.

Filtrul rotativ cu vid = filtru celular Oliver 1 - tambur 2- capul distribuitorului 3 - cuţit răzuitor 4 - material filtrant 5- cuvă pentru suspensie 6 - duză apă pentru spălare 7 - celule filtrante 8 - biomasă depusă 9 - roată dinţată de acţionare

I.- zona de filtrare II.şi IV - zonele de uscare III - zona de spălare V - zona de ȋndepărtare a stratului depus

Descrierea Filtrului rotativ cu vid Poate fi construit din oţel carbon, oţel inoxidabil, oţel căptuşit cu cauciuc sau teflon, din diferite aliaje. Alegerea materialului de construcţie este determinată de caracterul agresiv al lichidelor supuse filtrării. Filtrul constă dintr-un tambur rotativ, cu lungimea de 1 - 4,5 m şi diametru de 1,75 - 3 m, construit din doi cilindri orizontali coaxiali. Cilindrul exterior este perforat şi acoperit cu material filtrant, iar spaţiul dintre cei doi cilindri este ȋmpărţit ȋn 10 - 12 celule etanşe, care funcţionează succesiv şi independent ca un filtru nuce. Legătura dintre aceste celule şi conductele de vid sau aer comprimat se realizează prin intermediul capului de distribuţie. Suprafaţa tamburului este ȋmpărţită ȋn mai multe zone corespunzătoare operaţiilor de filtrare, uscare, spălare şi ȋndepărtare a stratului de miceliu depus. In timpul unei rotaţii a tamburului, fiecare celulă trece prin toate aceste zone.

Tamburul filtrului rotativ cu vid are un grad diferit de scufundare ȋn lichidul de fermentaţie supus filtrării. Stabilirea adȃncimii de scufundare se face ȋn funcţie de caracterul stratului filtrant şi a necesităţilor de spălare şi uscare. Exemplu: ȋn obţinerea antibioticelor se utilizează filtre a căror adȃncime de scufundare a tamburului este de pȃnă la 50%. Dacă produsul util este localizat numai ȋn lichid, spălarea masei celulare după filtrare nu este o operaţie dificilă. Pentru prevenirea pierderilor de produs care se pot ȋnregistra ȋn această etapă, trebuie alese cu grijă debitul apei de spălare şi amplasarea jeturilor de apă, evitȃndu-se diluarea excesivă a filtratului. Indepărtarea miceliului depus pe materialul filtrant se realizează cu ajutorul unui cuţit răzuitor fix. Materialele filtrante se aleg ȋn funcţie de natura chimică a mediului, temperatură, presiune şi sunt confecţionate din ţesături de bumbac, lȃnă, fibre sintetice etc.

Situatii particulare: filtratul iniţial este uşor opalescent Solutie:

- este returnat ȋn rezervorul filtrului. Filtratul rezultat din ultima parte a ciclului de filtrare este limpede, datorită efectului favorabil asupra filtrării creat de stratul de miceliu depus.

Prevenire:

- utilizarea unui vid mai redus ȋn prima parte a filtrării, urmȃnd ca apoi să se lucreze la valoarea prestabilită a vidului.

Viteza de filtrare a lichidelor de fermentaţie a Penicillium chrysogenum In funcţie de viteza de filtrare se determină turaţia optimă a tamburului pentru diferite valori ale rezistenţei precipitatului depus şi grade de scufundare a filtrului ȋn suspensie. In tabel este prezentată dependenţa dintre viteza de filtrare şi parametrii menţionaţi pentru filtrarea lichidelor de fermentaţie ale P. chrysogenum (biosinteza penicilinelor G şi V). rP, m/kg

1 rot/min

2 rot/min

3 rot/min

4 rot/min

5 rot/min

2.1011

1140

740

617

530

407

3.1011

875

615

500

342

390

5.1011

606

432

356

306

375

Viteza medie de filtrare, l/m2.h

rp - rezistenţa precipitatului depus pe filtru, m/kg Concluzie: viteza optimă de filtrare a biomaselor fibroase se atinge la o turaţie a tamburului de 0,8 - 1 rot/min

2. Filtrarea biomaselor greu filtrabile Separarea masei celulare din lichidele de fermentaţie ale bacteriilor, actinomicetelor, a hidrolizatelor celulare se face mult mai dificil decȃt ȋn cazul biomaselor fibroase. Aceasta se explică prin caracterul mucilaginos al masei celulare care astupă rapid porii materialelor filtrante. In acelaşi timp, trebuie remarcat dezavantajul creat de nestandardizarea mediilor de cultură, manifestat prin inconstanţa de la o şarjă la alta a principalilor parametri care determină filtrabilitatea: - conţinutul de suspensii, - vȃscozitate, - caracteristicile biomasei, - conţinutul de proteine

Mărirea vitezei de filtrare • Pentru mărirea vitezei de filtrare, lichidele de fermentaţie se supun unor tratamente preliminare termice, acide sau cu alţi agenţi chimici, ȋn scopul coagulării moleculelor proteice şi a agregării biomasei, cu sau fără adăugarea suplimentară a unor materiale cu rol de strat adjuvant (materiale poroase obţinute din diferite roci vulcanice: perlit, supercel, dicalit etc.).

• Alegerea metodei de prelucrare preliminară este determinată de caracteristicile lichidului de fermentaţie, de natura produsului biosintetizat (stabilitate chimică şi termică), precum şi de caracteristicile precipitatelor formate.

Procedee de tratare preliminară a lichidelor de fermentaţie • lichidele de fermentaţie ale Penicillium chrysogenum (obţinerea penicilinelor G şi V), deşi sunt relativ uşor filtrabile, se tratează ȋnaintea filtrării cu cetazol pentru coagularea albuminelor (ȋn plus, proteinele pot precipita ȋn timpul extracţiei cu solvenţi, ȋngreunȃnd separarea antibioticelor din filtrat) • după terminarea fermentaţiei Streptomyces griseus (obţinerea streptomicinei), lichidul se tratează cu formol, pentru precipitarea albuminelor, şi cu acid oxalic pȃnă la pH = 2,8 – 3,2, pentru agregarea biomasei. Apoi lichidul se ȋncălzeşte direct cu abur la 70 – 80oC, sub agitare, timp de 30 minute, pentru perfectarea coagulării, i se adaugă perlit şi se filtrează pe filtre rotative cu strat adjuvant • ȋn cazul obţinerii tetraciclinelor, lichidele de fermentaţie ale Streptomyces aureofaciens se acidulează cu H2SO4 pȃnă la pH = 1,5 – 2 şi se filtrează pe filtrepresă • lichidul de fermentaţie al Ashbya gossypii (obţinerea vitaminei B2) se acidulează după terminarea fermentaţiei, şi se ȋncălzeşte la 60 – 70oC, după care se filtrează pe filtre-presă sau se centrifughează • culturile de Corynebacterium glutamicum, utilizate pentru obţinerea acidului glutamic, se acidulează cu H2SO4 pȃnă la pH = 6,5, li se adaugă cărbune activ şi un adjuvant şi se ȋncălzesc la 70 – 75oC, pentru precipitarea proteinelor. Se filtrează pe filtre rotative cu strat adjuvant sau pe filtre-presă.

Factori fizico-chimici şi hidrodinamici 1. 2. 3. 4.

influenţa cantităţii de coagulant Influenţa pH-ului Intensitatea amestecării lichidelor Turaţia tamburului

1. Influenţa cantităţii de coagulant • o anumită cantitate de coagulant conduce la atingerea unor viteze maxime de filtrare

2500 2000 1500 1000 500

h

Vitezamedie de filtrare, l/m

2

.

3000

0

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

Cantitate relativa de coagulant

Influenţa cantităţii de coagulant asupra vitezei de filtrare a diferitelor lichide de fermentaţie.

2. Influenţa pH-ului • o anumită valoare a pH-ului conduce la atingerea unor viteze maxime de filtrare

Durata filtr\ rii, min

30 20 10 0

1

2

3

4

pH

Influenţa pH-ului asupra vitezei de filtrare a lichidelor de fermentaţie.

3. Influenţa amestecării lichidelor • Intensificarea amestecării lichidelor ȋn timpul coagulării proteinelor conduce la scăderea vitezei de filtrare, datorită distrugerii particulelor formate prin coagularea proteinelor sau a agregatelor celulare. Viteza relativa de filtrare, m/s

1 0.8 0.6 0.4

0.2 0

0

8

16

24

32

40

Turatie, rpm

Influenţa intensităţii amestecării ȋn timpul tratamentelor de coagulare asupra vitezei de filtrare a lichidelor de fermentaţie

4. Turaţia tamburului • O dublare a turaţiei de la 0,5 rpm la 1 rpm induce aproape o dublare a vitezei de filtrare (figura 2.9). Cea mai importantă creştere a vitezei de filtrare pentru biomasele bacteriene şi actinomicetice se produce ȋn intervalul de turaţie 0,5 - 0,66 rpm 1

1

300

0.8

2

240

0.6 180

2

120

1

0.4

Adaos adjuvant, %

Viteza de filtrare, l/m2.h

360

0.2

60

0

0 0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

Turatie, rpm

Influenţa turaţiei tamburului asupra vitezei de filtrare ( ) şi a consumului de adjuvant ( _ _ _ _ _ ) la filtrarea lichidelor de fermentaţie ale: 1 = Actinomyces rimosus (oxytetracycline) 2 = Streptomyces kanamyceticus (kanamicina)

Reducerea rezistenţelor la filtrare, prin prelucrarea lichidelor de fermentaţie, a permis utilizarea filtrelor cu funcţionare continuă de tipul filtrelor rotative cu vid şi cu strat adjuvant, a căror viteză de filtrare este de 100 - 300 l/m2.h. Dintre filtrele rotative cu vid şi cu strat adjuvant, cel mai utilizat ȋn industria de biosinteză este filtrul cu reȋnnoirea suprafeţei de filtrare. Deosebirea principală dintre acest filtru şi filtrul Oliver constă ȋn utilizarea unui cuţit special cu avansare micrometrică, care ȋn timpul funcţionării se deplasează ȋndepărtând biomasa depusă ȋmpreună cu stratul superficial de adjuvant.

Filtrul rotativ cu vid şi cu strat adjuvant 1 - tambur 2 - capul distribuitorului 3 - cuţit micrometric: viteza de ȋnaintare corespunde unei deplasări de 0,15 – 0,45 mm ȋn timpul unei rotaţii complete a tamburului 4 – material filtrant 5- cuvă pentru suspensie 6 - duză apă pentru spălare 7 - celule de filtrare 8 - strat depus 9 - strat adjuvant;

Biotehnologii medicale SEPARAREA PRIN EXTRACTIE Prof. Univ. Dr. Anca Galaction [email protected]

SEPARAREA PRIN EXTRACTIE Operatia de separare a componentilor unui amestec lichid sau solid pe baza diferentei de solubilitate a acestora intr-unul sau mai multi solventi • extractie lichid - lichid - amestecul supus separarii este lichid, • extractie solid - lichid - amestecul supus separarii este solid.

• extractia este fizica, - extractia se realizeaza numai prin intermediul fenomenelor fizice de solubilizare si difuziune, • extractia este reactiva - in timpul procesului intervin si reactii chimice intre solut si agentul (agentii) de extractie

Clasificarea procedeelor de extractie lichid-lichid • extractia reactiva presupune utilizarea unor agenti de extractie (extractanti, agenti purtatori) solubili fie in solvent, fie in faza apoasa, insa este esential ca produsul format in urma reactiei cu solutul sa fie puternic hidrofob.

Extractie fizica Solutia supusa separarii Extractie reactiva

Solvent

Solvent + Extractant Extractant

Extractia fizica a produselor de biosinteza • Produsele de biosinteza se gasesc in lichidul final de fermentatie in concentratii reduse (0,5 – 8%) • Sunt, in general, compusi labili chimic si termic. • In lichidele de fermentatie se gasesc numerosi compusi secundari, unii cu caracteristici fizico-chimice asemanatoare cu ale produselor utile. Din aceste motive, separarea si purificarea produselor de biosinteza sunt operatii dificile, care necesita etape laborioase.

Etape 1. Contactarea solutiei initiale cu solventul (amestecarea) 2. Solubilizarea si difuzia solutului in faza solventului (transferul de masa al solutului) 3. Separarea celor doua faze rezultate • extractul - faza solventului care contine solutul • rafinatul - solutia initiala epuizata 4. Recuperarea solventului, atât din extract, cât si din rafinat.

Solventi pentru extractie • Pentru extractia produselor de biosinteza polare: alcooli, esteri, cetone. Principala problema o reprezinta solubilitatea lor relativ ridicata in mediul apos. Cresterea masei moleculare a acestor compusi reduce solubilitatea in mediul apos, dar mareste tendinta de formare a unor emulsii stabile cu acesta.

• Pentru extractia produselor de biosinteza nepolare: eter de petrol, diclormetan, dicloretan etc.

Selectarea solventilor • Solventii sau agentii de extractie pot fi compusi chimici puri sau amestecuri. Selectarea unui anumit solvent impune: • cunoasterea caracteristicilor fizico-chimice ale acestuia si pe cele ale compusului care se doreste a fi extras. • cunoasterea echilibrului dintre faze • cunoasterea altor proprietati fizice ale amestecului, proprietati care depind de interactiunile dintre componentii sistemului de extractie.

Separarea antibioticelor -lactamice Extractia fizica reprezinta, deocamdata, singurul procedeu de separare aplicat industrial. • Concentratia finala a penicilinelor G si V in lichidele de fermentatie este cuprinsa intre 3 si 6%, in functie de tulpina utilizata.

Dilutie foarte mare concentrarea solutiei prin extractie si reextractie Penicilinele pot fi extrase: • din solutia apoasa rezultata in urma filtrarii biomasei • direct din lichidul de fermentatie. Pentru extractia penicilinelor G si V au fost studiati o serie de solventi organici, la diferite valori ale pH-ului fazei apoase si ale temperaturii

Extractia penicilinelor • Extractia penicilinelor in acetat de butil decurge cu randamente maxime numai in conditiile in care aceste antibiotice se vor gasi in solutia apoasa supusa extractiei in forma nedisociata. • Solventii nepolari sau cu polaritate redusa (categorie in care intra si acetatul de butil) pot solubiliza numai compusii nepolari.

Extractia penicilinelor cu acetat de butil

Din analiza procesului de extractie fizica a penicilinelor G si V cu acetat de butil s-a constatat ca : • in solvent sunt extrase numai moleculele de penicilina nedisociate • intre moleculele de penicilina, in conditiile in care se realizeaza extractia, nu are loc formarea unor asociatii • in acetatul de butil, penicilinele nu disociaza. Deoarece contin o grupare carboxilica, penicilinele vor disocia in faza apoasa, conform echilibrului: P-COOH(aq) pka = 2,75 pentru penicilina G

P-COO-(aq) + H+(aq) pka = 2,70 pentru penicilina V

• In aceste conditii, penicilinele G si V vor exista intr-o forma neutra numai la un pH al fazei apoase mai mic decat 2,70 - 2,75. Influenta valorii pH-ului asupra randamentului de extractie a unor peniciline Grad de extrac]ie, %

100 80 60 40 20 0 2

3

4

5

6

7

8

9

pH

Influenta valorii pH-ului fazei apoase asupra randamentului extractiei fizice a penicilinelor G si V cu acetat de butil.

Biotehnologii medicale

SEPARAREA CU SCHIMBATORI DE IONI Prof. Univ. Dr. Anca Galaction [email protected]

SEPARAREA CU AJUTORUL SCHIMBATORILOR DE IONI

R-H+ + M+XR+OH - + M+X-

R - M+ R+X- +

+ H+XM+OH-

ionii din soluţie sunt preluaţi de schimbătorii de ioni, aceştia cedând soluţiei ioni de acelaşi semn

Prof. Dr. Anca Galaction

• Reacţii de schimb ionic = Reacţii de dublu schimb • Pot avea loc in sisteme eterogene • Pot avea loc in sisteme omogene

Clasificareaschimbatorilorde ioni (compusinaturalisausintetici, denaturaanorganicasauorganica)

Starea de agregare • Solizi • Geluri • Lichizi Structura chimica • Anorganici • Organici • Rasini schimbatoare de ioni Structura chimica a gruparii active • cationiti carboxilici, sulfonici, aminici Caracterul acido - bazic: • cationiti slab sau puternic acizi • anioniti slab sau puternic bazici

Prof. Dr. Anca Galaction

Specia ionica schimbata • Cationiti (R-H+) sau schimbători de cationi • Anioniti (R+OH -) sau schimbători de anioni

Elutia Regenerarea schimbătorilor de ioni, cu refacerea structurii iniţiale a acestora şi retrecerea ionilor reţinuţi în soluţie, se realizează diferenţiat, în funcţie de tipul ionitului:

cationiţii se tratează cu soluţii acide (HCl, H2SO4) RM

+

HCl

RH

+ MCl

• anioniţii se tratează cu soluţii alcaline RX

+

MOH

ROH

+

MX

Există situaţii în care reacţiile de schimb ionic nu sunt reversibile, şi anume atunci când din proces rezultă apă: RH

ROH

+

+

MOH

RM

HX

RX

+

+

H2O

H2O

Si în aceste cazuri, regenerarea schimbătorilor de ioni se face prin tratare cu agenţii de regenerare menţionaţi anterior

Prof. Dr. Anca Galaction

•

Utilizari 1.dedurizarea si demineralizarea apelor industriale (reţinerea cationilor Ca2+, Mg2+, a anionilor HCO3-, SO42-, SiO32) = alimentarea cazanelor, a circuitelor primare ale reactoarelor nucleare, ca ape tehnologice pentru industria chimică, textilă, a hârtiei şi celulozei. 2.separarea şi recuperarea unor ioni din soluţiile diluate de electroliţi, aplicată la recuperarea unor metale, a unor metale rare sau radioactive (germaniu, uraniu), la regenerarea soluţiilor utilizate în galvanotehnică (soluţii de nichelare, cromare, decapare), la izolarea şi recuperarea compuşilor toxici din apele reziduale, la decontaminarea apelor reziduale din industria combustibilor nucleari.

4. industria farmaceutica: separarea antibioticelor, acizilor carboxilici, aminoacizilor, vitaminelor, alcaloizilor, hormonilor, purificarea solutiilor. 5. industria alimentara: - industria zaharului (purificarea melasei, a solutiilor de zahar, recuperarea zaharului) - purificarea solutiilor de glucoza, glicerinei, fenolilor, gelatinelor - separarea acizilor carboxilici (acid lactic, citric, tartric), aminoacizilor, vitaminelor - innobilarea vinurilor si a sucurilor de fructe. 6. tehnica de laborator: analize calitative si cantitative, separari analitice ale izotopilor, aminoacizilor, metalelor etc., purificarea solutiilor, prepararea reactivilor puri. 7. determinari biologice: dozari si purificari de componenti ai sangelui, ai plasmei si ai altor lichide biologice. 8. practica terapeutica: tratamentul hiperaciditatii, ameliorarea regimului alimentar fara sare, mentinerea calitatii sangelui utilizat in transfuzii, sterilizare, efectuarea unor analize etc.

Prof. Dr. Anca Galaction

3. industria chimica: -purificarea avansata a reactivilor anorganici si organici, a solventilor, prepararea acizilor si bazelor libere din sarurile lor - procese catalitice: alchilari, esterificari,hidratarea olefinelor, suporturi pentru catalizatori

Rasini schimbatoare de ioni

Prof. Dr. Anca Galaction

• Rășinile schimbătoare de ioni sunt compuși macromoleculari sintetici care conțin grupări polare ionizabile ce favorizează schimbul ionic. • Datorită structurii tridimensionale, aceste materiale permit difuzia internă a ionilor din soluția unui electrolit, proces facilitat de caracterul hidrofil al acestor ioniți (la contactul cu apa, apare fenomenul de umflare al rășinii). Pătrunderea apei accelerează difuzia ionilor ȋn interiorul particulei de rășină. • Rășinile sintetice au forma unor granule cu dimensiuni cuprinse ȋntre 0,2 - 1,5 mm, fiind obținute prin policondensarea sau polimerizarea și grefarea pe structura matriceală a polimerului de bază a grupărilor funcționale. Capacitatea de schimb ionic este mărită prin creșterea numărului de grupări polare, ȋnsă aceasta poate cauza accentuarea tendinței de dizolvare a rășinii ȋn apă. • Rășinile sub formă de gel nu posedă o porozitate reală, ionii difuzând prin structura gelului către centrii de schimb ionic. Pentru aceste rășini se definește o porozitate aparentă, determinată de distanțele intermoleculare și care nu depășește 40 Å.

1 Ångström = 10−10 m

Tipuri de schimbatori de ioni •cationiți slab acizi (Amberlit IRC-50, KB-4, KB-4P-2): conțin grupări carboxilice, obținȋndu-se prin copolimerizarea acidului metacrilic cu divinil-benzenul

CS-3 se obține prin copolimerizarea stirenului cu divinil-benzenul, urmată de sulfonare cu acid clorsulfonic La modul general, cationiții se utilizează ȋn procesele de separare și purificare ale unor produse de biosinteză, cum ar fi: antibiotice (streptomicina, tetracicilină, clortetraciclină, oxitetracicilină, albomicinei), aminoacizi (l-lizină), vitamine (vitamina B12 ), alcaloizi etc, precum și la demineralizarea unor soluții. •anioniți slab bazici (AN-2F, Amberlit IR-2V, EDE-10): conțin ȋn moleculă grupări aminice primare, secundare, sau terțiare și se obțin prin condensarea aminelor aromatice cu aldehidă formică, sau prin interacțiunea polietilen-poliamidelor cu epiclorhidrina •anioniți puternic bazici (PEK, Amberlit IRA-400, IRA-410): conțin grupări cuaternare de amoniu, obținȋndu-se prin clorometilarea copolimerului stirendivinil-benzen și introducerea grupei aminice terțiare, care se transformă ȋn grupare cuaternară de amoniu ȋn prezența unui anion

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

•cationiți puternic acizi (CS-3, Amberlit IR-124, Dowex 50): conțin grupări sulfonice.

Adsorbtie

Rasina schimbatoare de ioni

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

Rasina schimbatoare de ioni

Schimb ionic

Separarea prin schimb ionic este o operaţie care constă într-o succesiune de 4 - 6 etape: • reţinerea ionilor din soluţia supusă separării • eluţia ionilor reţinuţi, pentru retrecerea lor în soluţie • spălarea schimbătorului de ioni, pentru îndepărtarea eluentului reţinut fizic • regenerarea schimbătorului de ioni • spălarea schimbătorului de ioni regenerat • afânarea stratului de schimbător de ioni (pentru răşini depuse în strat fix).

Prof. Dr. Anca Galaction

Etapele procesului de separare prin schimb ionic

•

Elutia reprezinta eliberarea ionilor retinuti si retrecerea lor in solutie, si se realizeaza cu reactivi specifici ionilor eluati sau schimbatorilor de ioni folositi. Cationitii se trateaza cu solutii acide de concentratie 2 - 8% (HCl, H2SO4), iar anionitii cu solutii alcaline de concentratie 2 - 5% (NaOH, mai rar Na2CO3 sau NH4OH). In anumite situatii, in functie de structura chimica a gruparii active (de exemplu, cationit in forma acida H sau sodica Na), prin elutie se obtine si regenerarea schimbatorului de ioni.

•

Regenerare - ionitul este readus in forma sa activa. Aceasta etapa se realizeaza cu reactivi specifici tipului de rasina utilizata si a ionului care va fi retinut. Astfel, pentru cationiti sub forma acida H, prin elutie cu o solutie acida se produce si regenerarea. Daca se utilizeaza sub forma Na, dupa elutie cu o solutie acida, cationitul se trateaza cu o solutie 4% NaCl sau NaOH. Anionitii se trateaza pentru elutie cu o solutie 2 - 5% NaOH si, apoi, cu o solutie 5 - 7% HCl, daca anionitul este sub forma Cl.

•

In anumite procese de separare, dupa elutia ionului principal retinut, se poate proceda si la elutia altor specii ionice similare, inainte de regenerare. De exemplu, in cazul separarii streptomicinei pe cationiti, elutia antibioticului se face cu o solutie 3 - 4% H2SO4. Ionii de Ca, Mg, Fe, retinuti de rasina din filtratul supus prelucrarii, se indeparteaza de pe cationit cu o solutie 5 - 7% HCl, dupa care rasina se regenereaza (cationitul se utilizeaza sub forma Na). Regenerarea se poate face fara spalarea prealabila a ionitului sau concomitent cu elutia, iar etapa de afinare poate fi eliminata. In schimb, in special in cazul produselor care impun restrictii privind sterilitatea, se realizeaza si sterilizarea schimbatorului de ioni (de exemplu, cu o solutie 1% formol) inaintea retinerii ionilor. • In coloanele cu schimbatori de ioni dispusi in straturi fixe, inaintea unui nou ciclu de sorbtie, se procedeaza la afinare. Operatia are rolul de a indeparta impuritatile mecanice si bulele de aer din stratul de rasina, in scopul reasezarii particulelor de schimbatori de ioni pentru o distribuire uniforma si o circulatie corespunzatoare a solutiei de prelucrat prin stratul de rasina. Afinarea se realizeaza introducind apa distilata sau demineralizata de jos in sus prin coloana cu rasina. Operatia se opreste atunci cind apa care paraseste coloana pe la partea superioara devine limpede (durata poate fi de pina la 2 ore). In timpul afinarii, volumul stratului de ionit se poate mari considerabil, de aceea se impune existenta unui spatiu gol la partea superioara a coloanei.

Prof. Dr. Anca Galaction

Sorbtia se considera incheiata, respectiv schimbatorul de ioni saturat, atunci cind la iesire solutia are o anumita valoarea concentratieispecieichimicecaresedorestea fiseparata,decirca80%dinconcentratiasainsolutiainitiala (in general, se constata o crestere brusca a concentratiei acesteia in efluent, fenomen care poarta denumirea de strapungere).

Mecanismul separarii prin sorbtie pe schimbatori de ioni Mecanismul procesului de schimb ionic consta in trecerea ionilor din solutie in rasina si a ionilor corespondenti din rasina in solutie.

• difuzia ionilor prin filmul de lichid de la suprafata particulei de schimbator de ioni • difuzia ionilor prin particula de schimbator de ioni • reactia chimica de schimb ionic Matrice: a) Neporoase b) Microporoase c) macroporoase

Prof. Dr. Anca Galaction

Viteza procesului global poate fi controlata de trei tipuri de rezistente (etape limitative):

Etapele retinerii speciilor ionice pe schimbatorii de ioni

specie ionica

granula de schimbator de ioni

1 2

3

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

solutie

Natura etapei limitative In functie de efectul conditiilor hidrodinamice asupra sorbtiei, se poate determina daca difuzia prin filmul de lichid constituie rezistenta principala. Daca viteza de sorbtie ramâne constanta cu modificarea intensitatii amestecarii fazelor, se aplica testul intreruperii, pentru a se stabili daca difuzia interna, sau reactia chimica, controleaza procesul. Testul intreruperii consta in scoaterea rasinii din solutie si reintroducerea ei, dupa un anumit timp. Daca viteza de sorbtie inregistreaza un salt, atunci difuzia interna in particula de schimbator reprezinta etapa determinanta (in perioada cât rasina a fost scoasa din solutie, difuzia in particula a continuat.

6

regim static

3 regim dinamic

0 0

20

30

40

50

Timp, min

60

b

9 6

Concentra]ie, g/l

a

9

regim static [ i dinamic

3

Prof. Dr. Anca Galaction

12

12

Concentra]ie, g/l

Concentra]ie, g/l

12

c

9 6 3 0

0

0

20

30

40

50

Timp, min

60

0

20

30

40

50

Timp, min

Stabilirea naturii etapei limitative a unui proces de separare prin sorbtie pe schimbatori de ioni a - difuzia prin filmul de lichid este etapa limitativa b - difuzia prin filmul de lichid nu este etapa limitativa c - difuzia interna este etapa limitativa.

60

Stabilirea naturii etapei limitative a unui proces de separare prin sorbţie pe schimbători de ioni - difuzia internă este etapa limitativă.

9

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

Concentra]ie, g/l

12

6

3

0 0

20

30

40

50

Timp, min

60

• • • • • • • •

valoarea concentratiei solutiei regimul hidrodinamic dimensiunea particulei de rasina porozitatea si dimensiunea porilor particulei coeficientii de difuzie in rasina etc. valoarea coeficientului de difuzie in particula difuzie interna caracteristicile ionilor participanti la procesul de schimb • structura rasinii - se obtin viteze ridicate de difuzie in cazul ionilor putin voluminosi si rasini cu porozitate ridicata. • difuzia in particula, daca valoarea concentratiei solutiei este de peste 0,1M, pentru concentratii sub 0,01M fiind controlat de difuzia prin filmul de lichid.

Prof. Dr. Anca Galaction

Mecanismul schimbului ionic este determinat de:

• In 1943, S.A.Waksman (premiul Nobel ȋn 1952) a descoperit și izolat din sol de grădină și, ulterior, din gâtul unui pui de găină 2 tulpini de Streptomyces griseus. Pentru această descoperire a studiat peste 5000 de tulpini de actinomicete din sol, deși avea ȋn dulapul său de culturi o tulpină de S. griseus neproductivă. • In 1948, streptomicina a fost obținută industrial și devine al doilea antibiotic ca importanță terapeutică și tonaj fabricat (după benzilpenicilină). • Streptomicina a fost utilizată cu succes atât pentru tratamentul tuberculozei, cât și ciumei, fiind introdusă ȋn terapeutică chiar din 1944. Intre anii 1944 - 1949 au fost scrise peste 1800 de articole referitoare la streptomicină.

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

STREPTOMICINA

Formulă chimică NH2

HN

HN H2N HN

HO

C

HN

O

CH

OH HO

CH

CH

O

O

O=CH

C CH

CH3

OH O

HO

HC

NHCH3

HC

OH

CH CH CH2OH

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

C

Studiulmecanismuluirețineriistreptomicineipeschimbătoride ioni–

Str-NH2 + H2O R-COO-Na+ + Str-NH3+HO-

Str-NH3+HOR-COO-H3N+-Str + NaOH

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

• Reținerea antibioticului este posibilă datorită disocierii sale ȋn soluția apoasă, mecanismul procesului de separare prin schimb ionic fiind descris de reacțiile:

Sisteme de operarela separareaprin retinerepe

• sisteme discontinue si continue, rasina fiind dispusa, in general, in utilaje de tip coloana. Contactarea solutiei supusa prelucrarii cu rasina consta din trecerea solutiei peste stratul fix de rasina, fluidizarea rasinii sau circulatia in contracurent a celor doua faze. Instalatia de separare poate fi alcatuita dintr-o singura coloana cu schimbatori de ioni sau dintr-o baterie de astfel de coloane legate in serie. Utilizarea bateriei ofera posibilitatea unei separari avansate a produsului util si desfasurarea simultana a operatiilor de sorbtie, elutie, regenerare, ceea ce conduce la cresterea productivitatii etapei de separare.

Prof. Dr. Anca Galaction

schimbatori de ioni

Studiulseparăriistreptomicineiȋn coloanecu stratfixde schimbători de ioni

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

• Analiza comparativă a eficienței separării streptomicinei (sorbție și eluție) ȋn coloane cu cationiți carboxilici, respectivi sulfonici, dispuși ȋn strat fix.

Instalațiade separareși purificare a streptomicinei cu ajutorul schimbătorilor de ioni Sorbția se realizează ȋntr-o baterie de coloane cu schimbători de cationi ȋn strat fix (IRC-50, KB-4-P2), ȋn utilajele (1) - (3), la un pH = 7 - 7,5, debitul filtratului fiind de 800 - 1200 l/h filtrat

2

1

3

4

5

6

eluat condi]ionare ape spalare

Prima coloană din baterie se consideră saturată atunci cȋnd concentrația antibioticului la ieșire este de circa 80% din concentrația sa din filtrat. Coloana se izolează de baterie, iar rășina se supune eluției și regenerării.

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

sol. H2SO4

Eluția • Eluția streptomicinei se realizează cu o soluție de 3 - 4% H2SO4 și decurge conform mecanismului Str-NH2.3/2H2SO4 + R-COOH

Debitul soluției de H2SO4 este de 60 - 70 l/h, eluatul reprezentând o soluție acidă de sulfat de streptomicină cu pH = 4 - 4,5. Indepărtarea H2SO4 din eluat se face prin sorbție pe anionitul slab bazic, ȋn coloana (4), iar impuritățile organice (histamină, compuși pirogeni etc.) și minerale (ioni Ca2+, Mg2+, Fe2+, metale grele) prin reținere pe cationitul sulfonic din coloana (5). Coloana (6) conține straturi succesive de anioniți și cationiți și este utilizată pentru demineralizarea soluției de sulfat de streptomicină.

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

R-COO-H3N+-Str + 3/2 H2SO4

Regenerarea

• Rășinile cationice ȋn forma Na (coloanele (1) - (3)) se tratează, apoi, cu o soluție 4% NaOH, iar pentru asigurarea sterilității, se spală cu apă, până la pH = 8 - 8,5, și cu o soluție 1% formol. • Anioniții se regenerează prin tratare cu o soluție 5 - 7% HCl, spălare cu apă demineralizată, tratare cu o soluție 5% Na2CO3 și spălare cu apă până la un pH = 7 - 7,5 al efluentului.

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

• Regenerarea cationiților se face cu o soluție 5 - 7% HCl, care eluează ionii metalici reținuți, urmată de spălare cu apă demineralizată, până la un pH al efluentului de 3 - 4.

Avantajele unei amestecari intense, respectiv o suprafata de contact ridicata si accelerarea transferului de masa. In plus, in cazul produselor de biosinteza, acest sistem permite retinerea componentului util fara filtrarea prealabila a biomasei. • Comparativ cu stratul fix, dimensiunile particulelor de rasina pot fi mai reduse (0,2 mm), deoarece nu apar probleme create de rezistenta hidraulica a fazei solide. Dezavantaje: • antrenarea particulelor de rasina de dimensiuni reduse • distrugerea mecanica a particulelor de rasina • aparitia rezistentei hidraulice ridicate pentru straturile inalte de rasina. • timp de contact redus intre solutie si rasina. Pentru evitarea unora dintre deficientele mentionate, se poate proceda astfel: • crearea unor regiuni cu sectiune mai mare in utilajul de sorbtie pe schimbatori de ioni, care va diminua antrenarea particulelor de rasina • marirea eficientei sorbtiei se face fie prin utilizarea unui raport dintre inaltimea coloanei si diametrul ei apropiat de 6, fie prin circulatia in contracurent a fazelor • utilajele cu mai multe sectiuni permit marirea timpului de contact dintre faze.

Prof. Dr. Anca Galaction

Operarea cu rasina in strat fluidizat

a. regimul de functionare: - discontinue - continue b. forma: - cilindrice - conice - prismatice c. sistemul de distributie a agentului de fluidizare: - aparate fara site: - cu difuzori - cu insertii conice - aparate cu site: - pulsatoare - vibratoare - mobile - cu dispozitiv de prea-plin

Prof. Dr. Anca Galaction

Clasificareautilajelorfolositeinoperareainstratfluidizat

Aparateconice,farasite,incaredistributiaagentuluidefluidizareserealizeazaprin

• Folosirea acestor aparate conice conduce la o fluidizare mai uniforma, la o erodare mai redusa a particulelor de Solutie rasina (datorita unei amestecari mai Solutie de epuizata putin intense, comparativ cu utilajele prelucrat tip coloana), la diminuarea fenomenului de antrenare a granulelor de ionit. Agent de • Absenta sitelor permite prelucrarea fluidizare lichidelor de fermentatie nefiltrate sau opalescente (fara indepartarea Rasina prealabila a proteinelor din lichidul de fermentatie). Aparat conic cu rasina in strat fluidizat.

Prof. Dr. Anca Galaction

difuzoarede constructiespeciala

• consta in circulatia continua in contracurent a solutiei de prelucrat si a rasinii, sistem care se aplica atat elutiei, cat si regenerarii schimbatorilor de ioni. • Aceasta modalitate de operare este intalnita frecvent in industria chimica, fiind mai putin raspandita in industria de biosinteza, procedeul putand fi utilizat pentru prelucrarea lichidelor de fermentatie nefiltrate. Utilajele folosite sunt orizontale, transportul rasinii realizandu-se cu ajutorul unui transportor cu palete.

Prof. Dr. Anca Galaction

Operarea in contracurent

Bioseparari

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction [email protected]

1. Medicamente generice / originale (inovative, de marca) Asemanari:

Deosebiri:

• Acelasi compus biologic activ • Aceeasi formula chimica • Supuse acelorasi aprobari FDA (Food and Drug Administration) • Respecta standardele internationale GMP/GLP (Good manufacturing practices si Good Laboratory Practice).

• pret - cu 20-90% mai ieftine decat originalul • denumire • ambalaj • aspect

Medicamentul generic este certificat sa functioneze similar cu cel original

Teste: - de eliberare in vitro și echivalență terapeutică - testări in vivo și cercetare de bioechivalență

Studiile clinice extinse - faza de pre-înregistrare a medicamentului (faza III) - faza de cercetare post-înregistrare (faza IV).

Situatii raportate: - diferențele între ingredientele inactive (de exemplu, un pacient poate fi alergic la un ingredient inactiv utilizat într-o formulă generică). - diferențele privind de cantitatea de ingredient activ din cele două versiuni.

Bioechivalenta • egalitatea unui parametru farmaceutic specific formei farmaceutice. • Substituirea unui medicament eficace clinic cu un produs cu o compozitie identica sau echivalentul lui generic nu poate fi facuta numai pe baza echivalentei chimice sau farmaceutice, ci trebuie demonstrata echivalenta farmacologica, constatata prin echivalenta efectelor clinice.

Farmacovigilenta • monitorizarea sigurantei medicamentelor

• OMS - activitatile desfasurate pentru depistarea, evaluarea, intelegerea si prevenirea aparitiei de efecte adverse sau a oricaror altor situatii aflate in legatura cu medicamentele

Cazurile de Farmacovigilenta Reprezinta orice reactii/evenimente adverse si neintentionate a medicamentelor - orice reactie adversa/eveniment advers specificat sau nu in prospect - orice eveniment advers in legatura cu retragerea unui medicament - orice suspiciune de transmitere a unui agent infectios prin intermediul unui medicament - orice supradoza (accidentala sau intentionala), abuz sau utilizare gresita - orice eroare de medicatie, interactiune medicamentoasa - orice scadere a actiunii farmacologice preconizate (lipsa de eficacitate) - expunerea in timpul sarcinii sau alaptarii - date despre utilizarea medicamentelor la copii - defecte de calitate (medicamente falsificate/contrafacute)

Concluzii • Un medicament generic este echivalentul unui medicament original (inovativ) din punct de vedere al dozei, concentratiei, caii de administrare, sigurantei, eficacitatii si al indicatiilor terapeutice • Medicamentele generice conțin aceleași substanțe active ca și produsele inovative • Medicamentele generice sunt disponibile în aceleași concentrații și aceleași forme farmaceutice ca și medicamentele inovative. • Un medicament generic trebuie să acționeze în același mod în organism și să producă același efect ca cel al tratamentului cu medicamentul inovativ.

2. A.N.M.D.M. • activitatea de autorizare de punere pe piata si activitatile conexe (aprobarea variatiilor, aprobarea studiilor clinice, aprobarea materialelor publicitare pentru produse OTC, farmacovigilenta, comunicarile directe catre profesionistii din domeniul sanatatii privind medicamentele); • activitatea de control a calitatii medicamentului; • activitatea de inspectie farmaceutica; • activitatea de reglementare sub coordonarea MS; • activitatea referitoare la Farmacopee; • activitatea de management al calitatii.

Biotehnologii medicale Metaboliti secundari Prof. Univ. Dr. Anca Galaction [email protected]

Definitie • Metabolitul reprezinta un compus organic ce intervine in faza initiala, pe parcurs sau la sfarsitul procesului de metabolism.

• Metabolitul este o substanta strict necesara proceselor biochimice de crestere, mentinere in activitate si inmultire a celulelor vii. • Metabolitii sunt preluati din mediul inconjurator sau pot fi biosintetizati chiar de celule.

Istoric Au fost caracterizate: • substantele care pot fi gasite in practic toate organismele si care sunt constituenti functionali (ex. din regnul vegetal: clorofila, lipidele) • o varietate de substante care pot fi obtinute numai din anumite specii ale unor plante si carora nu le pot fi atribuite functiuni generale (camfor, tanin).

Diferenta: Metabolitii primari

• un model chimic general sau o structura organica ce poate suferi modificari relativ minore

Metabolitii secundari

• nu se formeaza in toate circumstantele, au structuri specifice si nu au o functie metabolica evidenta. • Provin din surse limitate.

Metabolitii secundari • sunt substante produse de un organism pentru alte scopuri decat cele care reprezinta functiile fiziologice primare (respiratia, definirea si transcrierea genetica, transferul si depozitarea de energie si alte procese esentiale vietii). • nu au functii evidente pentru cresterea si dezvoltarea celulei, fiind sintetizati pe o perioada limitata de catre celule care sufera, pe moment, o crestere echilibrata. • Fata de metabolitii primari care intretin viata, fiind suficienti pentru existenta, metabolitii secundari joaca rol in calitatea si cantitatea vietii.

Localizare Circumstantele in care se formeaza metabolitii secundari nu sunt aceleasi pentru toate organismele vii, ci sunt limitate la cateva grupe taxonomice. • Regnul animal - cei mai prolifici producatori: artropode, recifuri, alte nevertebrate marine (arici de mare, stele de mare). • Regnul vegetal - metabolitii secundari au fost izolati din abundenta. • Microorganisme - (ex. bacterii, fungi) s-au dovedit a fi la baza elaborarii unei diversitati de astfel de compusi.

Conversie • Metabolitii secundari nu sunt direct asociati cu dezvoltarea microorganismelor • implica formarea unei diversitati de molecule complexe cu masa moleculara relativ redusa, in majoritatea cazurilor prin transformarea acelorasi surse si intermediari ca in cazul metabolismului primar

Metaboliti primari si secundari formati din aceleasi surse si intermediari Metaboliti secundari

Metaboliti primari Surse comune

Acizi grasi

Acetil-CoA

Steroli

Poliketide

Sesquiterpene Mevalonat

Steroizi

Diterpene

Enzime

Dicetopiperazine

Polipeptide Hormoni Proteine structurale

Aminoacizi

Ciclopeptide Beta-lactame

Provenienta unor metaboliti secundari Intermediari cu greutate moleculara joasa

Metaboliti primari

Metaboliti secundari

Aminoacizi

Proteine

Peniciline, alcaloizi

Acid shikimic

Acizi aromatici

Taninuri

Poliglucide

Antibiotice aminoglicozidice

(cyclohexanecarboxylic acid)

Zaharuri (glucide)

Lipide

Antrachinone, Compusi policetonici

Steroizi

Gibereline

Acetil CoA

Genetica - posibilitatea obtinerii unor productii ridicate Prin mutatii s-a reusit: •

• •

obtinerea unei proportii convenabile intre metabolitii secundari elaborati intr-un proces de fermentatie elucidarea mecanismului de biosinteza a metabolitilor secundari obtinerea unor compusi noi.

Exemple: • inhiba germinarea semintelor • stimulatori ai hranirii • proprietati farmacologice • coloranti, substante odorante si aromatizante, alcaloizi, folositi ca agenti farmacologici si produse cosmetice.

Caracteristici ale Metabolitilor secundari (M.S.) • fiecare M.S. este sintetizat de un numar mic de microorganisme • nu pare a fi esential pentru crestere si inmultire • formarea M.S. este dependenta de conditiile de crestere, in special compozitia mediului • M.S. sintetizat de microorganisme se prezinta sub forma unui amestec de substante cu structura chimica inrudita • poate apare o supraproductie de M.S. desi M.P. nu sunt sintetizati in cantitate mare

Clasificare generala a metabolitilor secundari • hormoni si agenti de semnalizare: cu rol in reglarea cresterii si in diferentiere, in activarea unor raspunsuri ale organismelor (apararea, dobindirea rezistentei, declansarea biosintezei unor compusi etc. (terpenoidele, derivatii fenolici etc.) • feromoni • agenti mediatori ai interactiunilor cu mediul

Clasificare a metabolitilor secundari, dupa functia lor • Antibiotice (produse, in special, de catre bacterii si fungi) • Hormoni de crestere ai plantelor (derivati ai acidului giberelinic) • Toxine, antidaunatori, pesticide • Substante cu proprietati odorante si aromatizante • Substante cu proprietati tinctoriale (coloranti si pigmenti) • Atractanti de sex

Antibiotice – scurt istoric • sec.XIX – Louis Pasteur (fenom. de antibioza) • sec.XX (1909)– Paul Ehrlich (Salvarsan) • ’20 – Sir Alexander Fleming (Lizozim) • 1928 – Penicilina • 1939 – Howard Florey si Ernst Chain-Purif.Penicilinei (1945-Pr.Nobel)

• 1939 – René Dubois (Tirotricina) • 1944 – Selman Waksman (Streptomicina) • Venezuela – Cloramfenicol • Filipine - Eritromicina

Antibiotice Definitie - medicamente chimioterapice produse de microorganisme cu proprietatea de a incetini multiplicarea unor organisme patogene, implicate etiologic in diferite boli / sindroame infectioase si de a le distruge.

◼

Agentii patogeni = micro (sau macro) organisme in diferite stadii ale evolutiei biologice (ex. virusuri, bacterii) care determina un proces infectios.

Provenienta • diferite mucegaiuri (fungi) din sol. Penicilinele si cefalosporinele provin din ascomicete, in general fungi de tipul Penicillium, Antibioticele aminoglicozidice, macrolidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, lincomicinele sint extrase din actinomicete din genul Streptomyces. Exista si antibiotice de origine microbiana (cu toxicitate mare) ca polimixinele si bacitracina.

Clasificarea antibioticelor - grupul de agenti patogeni asupra carora sint active antibiotice • Antibiotice antibacteriene (medicatia antibacteriana): Gramicidina, Bacitracina, Polimixinele. • Antibiotice antifungice (medicatia antimicotica): Penicilinele, Grizeofulvina. • Antibiotice antituberculoase: Streptomicina. • Antibiotice antivirale: Aciclovir, Amantadina, Vidarabina, Lopinavir/Ritonavir* (Kaletra) • Antibiotice cu actiune impotriva protozoarelor si metazoarelor (medicatia antiparazitara): antimalarice, antihelmintice. • Antibiotice cu actiune antitumorala.

- dupa mecanismul de actiune 1.

Actiune asupra peretelui celular (prin inhibarea biosintezei acestuia), cu efect bactericid (de distrugere a bacteriilor), numai in faza de multiplicare a bacteriilor: Penicilinele G si V, Oxacilina, Ampicilina, Carbenicilina, Cefalosporinele.

2. Actiune asupra membranei citoplasmatice (prin lezarea acesteia), cu efect bactericid: Polimixina B, Colistina, Amfotericina B. 3. Actiune de inhibare a sintezei proteinelor, prin actiune la nivelul ribozomilor, modificand formarea lanturilor peptidice, cu efect bactericid, in faza de multiplicare si in faza de repaus a bacteriilor si bacteriostatic (oprirea multiplicarii bacteriene): Streptomicina, Gentamicina, Tobramicina, Kanamicina, Neomicina, Tetraciclinele, Cloramfenicol, Eritromicina, Lincomicina. 4. Actiune de inhibare a sintezei acizilor nucleici, cu efect bacteriostatic si bactericid: Novobiocina, Rifampicina, Griseofulvina, Acidul nalidixic si alte chinolone. 5. Pentru o clasificare completa, dupa modul de actiune, trebuie mentionata si actiunea competitiva prin substituire de metaboliti analogi, in aceasta grupa incadrandu-se sulfamidele care, desi nu sint antibiotice, au efect bacteriostatic si bactericid.

- dupa structura chimica: • Beta-lactamice (Peniciline, Cefalosporine) • Aminoglicozidice (Streptomicina, Kanamicina, Gentamicina, Amikacina). • Polipeptide ciclice (Colistina, Polimixina) • Tetracicline (Doxiciclina). • Macrolide (Eritromicina).

- dupa tipul spectrului antimicrobian • antibiotice cu spectru ingust, de tip penicilinic • antibiotice cu spectru ingust, de tip streptomicinic (aminoglicozide, polipeptide), • antibiotice cu spectru larg si foarte larg de actiune (Tetracicline, Cloramfenicol, cefalosporine din generatia a IIa si a III-a), • antibiotice de inlocuire (in cazul aparitiei fenomenului de rezistenta, macrolidele, lincosamidele, rifampicina), • antibiotice de rezerva (toxice, ca Vancomicina, sau care produc rezistenta, ca Rifampicina), • antibiotice de exceptie (active pe germeni “de spital”, Fosfomicina). spectrul antimicrobian

Tipuri de spectru antimicrobian (antibiotice uzuale) Bacili grampozitiv Coci grampozitiv Coci gramnegativ

Bacili gramnegativ

Spectru de tip penicilinic

Spectru de tip streptomicinic

Spectru larg de actiune

Analiza Gram - colorație compusă folosită în microbiologie pentru examenul microscopic al bacteriilor, care a permis clasificarea acestora în funcție de afinitatea tinctorială a peretelui bacterian (Hans Christian Gram, 1884). Principiu: Colorantul bazic (violet de gențiană) patrunde in celula bacteriană fixată in prealabil și reacționeaza cu componenții acizi din citoplasmă care, dupa tratarea cu soluția Lugol (iodură de potasiu), formează un complex stabil intracelular. Acest complex insolubil este specific bacteriilor Gram pozitiv ce nu se decolorează cu alcool acetonă. Bacteriile Gram negativ în care nu se formeaza acest complex stabil se decoloreaza și trebuie recolorate cu alt colorant de contrast (fuxina).

Sensibilitatea unui antibiotic • Concentratia minima inhibitoare (CMI) = cea mai joasa

concentratie, exprimata in mg/l, care, in conditii in vitro definite, previne cresterea bacteriilor intr-o perioada definita de timp. • Concentratia minima bactericida (CMB) = cea mai mica

concentratie de antibiotic, exprimata in mg/l, care in conditii definite in vitro reduce cu 99,9% numarul de microorganisme dintr-un mediu continand un numar definit de microorganisme, intr-un interval definit de timp

Biodisponibilitatea unui antibiotic (fracţia din doza administrată oral care ajunge în circulaţia generală) • timpul, dupa administrare, si concentratia in care medicamentul ajunge in focarul in care germenul patogen sa localizat, dezvoltand un proces infectios, in forma activa, pentru a-si exercita efectul antibacterian dorit.

Bd =

C po Cpi.v.

100

Timpul de injumatatire T 50 • termenul scurs de la administrarea unei doze de antibiotic (deci existenta unei concentratii maxime) pana la injumatatirea acestui nivel in urma metabolizarii si eliminarii acestuia • doza, tratament

Conditii ale eficacitatii • • • •

concentratia activa accesul substantei gradul de legare pH-ul

Cuplare scazuta 5-25%

Cuplare medie 25-75%

Cuplare peste 80%

Ampiciline, Cefalosporine, Aminoglicozide, Polimixine

Penicilina G, Eritromicina, Linomicine, Tetracicline, Cloramfenicol

Oxacilina

Influenta pH-ului Antibiotic

pH

Ampiciline

5,5 – 6

Cloramfenicol

2–9

Eritromicina

8 – 8,5

Gentamicina

7,8

Kanamicina

7,6 – 8

Neomicina

7,6 – 8

Penicilina

6 – 6,5

Streptomicina

7,5 – 8

Tetraciclina

5,5 – 7,3

Metabolismul si eliminarea • • • •

bila (cloramfenicolul) intestinul gros (eritromicina, tetracicline) saliva (rifampicina) urina (40-80% din doza administrata)

ANTIBIOTICE BETA-LACTAMICE PENICILINE DE BIOSINTEZA R

CO

NH

CH

CH

CO

N

S

C CH

CH3 CH3

COOH

pentil metil

CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-

CH3-

Dihidropenicilina F Metilpenicilina

p-aminobenzil

H2N-C6H4-CH2-

Penicilina T

p-hidroxibenzil

HO-C6H4-CH2-

Penicilina X (sau III)

2-pentenil

CH3-CH=CH2-CH-CH2-

Penicilina F (sau I)

benzil

C6H5-CH2-

Penicilina G (sau II)

heptil

CH3-(CH2)5-CH2-

Penicilina K (sau IV)

L-4-amino-4-carboxi-butil

CH3-CH2-CH2-CH(NH2)(COOH)-

Penicilina M

D-4-amino-4-carboxi-butil

CH3-CH2-CH2-CH(NH2)(COOH)-

Penicilina N

alil-mercapto-metil

CH2=CH-CH2-S-CH2-

Penicilina O

3-clor-2-butenil-tiometil

CH3-CCl=CH-CH2-S-CH2-

Penicilina S

fenoximetil

C6H5-O-CH2-

Penicilina V(sau cinci)

Inhibitori de -lactamaze • Agentii patogeni secreta enzime care ataca structura penicilinelor, in scopul de a se apara. (tulpinile producatoare de peniciline sunt mai rezistente la lactamaze in prezenta acestor inhibitori). • In scopul evitarii distrugerii ciclului -lactamic al penicilinelor si scaderii, in acest fel, a eficacitatii antibioticului, aceste medicamente se asociaza cu substante numite Inhibitori de -lactamaze. Rol: inhiba dezvoltarea penicilinazelor si sunt utilizate in urmatoarele conditii: 1.rezistenta la penicilina respectiva sa fie cauzata de existenta enzimei lactamaza; 2. substanta utilizata ca inhibitor trebuie sa fie rezistenta la tipul respectiv de -lactamaza; 3. afinitatea inhibitorului pentru -lactamaza sa fie mai mare decat a penicilinei respective; 4. substanta utilizata ca inhibitor nu trebuie sa aiba actiune antibacteriana.

Acidul clavulanic • izolat in 1977 de catre Reading si Cole din S.clavuligerus. • Acidul clavulanic este utilizat sub forma de sare de sodiu sau potasiu, in infectiile cu tulpini producatoare de -lactamaza (S.auriu, gonococ, H.influenzae, colibacili, bacil tific, Proteus mirabilis).

Mecanismul de actiune se bazeaza pe fixarea ireversibila a enzimei; inelul lactamic al clavulanatului este desfacut si enzima ramane in forma acetilata inactiva. Eliminarea se realizeaza in cea mai mare parte prin urina si in proportii mai mici se excreta prin bila, prin intestinul gros si prin bila. Traverseaza placenta realizand niveluri terapeutice eficace in lichidul amniotic si in sangele ombilical

Clavulanatul de K se asociaza cu • amoxicilina (Augmentin, Amoksiklav); aceasta asociere este activa pe stafilococul auriu rezistent la penicilina, pe tulpinile rezistente la amoxicilina a unor specii de bacili gramnegativi si pe gonococ. • ticarcilina, comercializat sub denumirea Claventin sau Timentin prin spectrul sau larg poate fi utilizat in infectii severe ale pielii si tesuturilor moi, infectii ale oaselor si articulatiilor, infectii urinare, intra-abdominale si ginecologice; in unele cazuri (sistemul imunitar slabit sau infectii cu Pseudomonas) se asociaza cu o aminoglicozida. • benzilpenicilina si ureidopenicilinele Nu toate tipurile de enzime care ataca ciclul -lactamic sunt sensibile la acidul clavulanic. Exista si germeni rezistenti la aceasta asociere: Pseudomonas aeruginosa (piocianic), unele specii de enterobacter, de proteus.

Sulbactamul (sulfona acidului desamino-penicilanic) • Se asociaza cu ampicilina sub denumirea de Unasyn, sau pentru administrare orala Sultamicilin, acesta din urma fiind un ester dublu al ampicilinei cu sulbactamul, care se desface in doua componente in cursul procesului de absorbtie. • Este activa in infectii cu H.influenzae, B.cataahalis, stafilococi, streptococi, infectii grave ale pielii si tesuturilor moi, intraabdominale si ginecologice. Nu e activa fata de Pseudomonas, E.coli si alti bacili gramnegativ. O

O S N O

CH3 CH3 COONa