BG PTVS - Chuong 6 [PDF]

Zitiervorschau

Chương 6 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG

6.1. Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí 6.1.1. Tổng quan về tổng số vi sinh vật hiếu khí Vi sinh vật trên đĩa thạch còn được gọi là tổng số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm trên đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa chuẩn. Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxi phân tử. Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu phản ánh vệ sinh chế biến, độ tươi mới hay nguy cơ hư hỏng của thực phẩm. Tổng số vi sinh vật hiếu khí còn có thể chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực phẩm. Các nghiên cứu đã chỉ rõ tổng số vi sinh vật hiếu khí có tác dụng nhất trong việc đánh giá chất lượng vệ sinh của các loại thực phẩm không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển như thực phẩm khô hay thực phẩm đông lạnh. Với các loại thực phẩm này, tổng số vi sinh vật hiếu khí được sử dụng để đánh giá vệ sinh trong quá trình sản xuất, vận chuyển và bảo quản thực phẩm. Đối với các thực phẩm tươi sống, ngoài các giá trị như trên, tổng số vi sinh vật hiếu khí còn được dùng làm tiêu chuẩn hướng dẫn thời gian bảo quản. Tổng số vi sinh vật hiếu khí chỉ ra rằng có thể tồn tại những vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tươi sống. Số lượng vi sinh vậthiếu khí thấp thường không đi đôi với thực phẩm an toàn. Do đó, chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh hơn là độ an toàn của thực phẩm.Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng, từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trong một đơn vị khối lượng hay thể tích thực phẩm và có một số tên gọi khác nhau như: -

Số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count _ APC)

-

Tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count _ TPC)

-

Tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count _ TVC)

- Số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count _ SPC) Các bộ tiêu chuẩn về thực phẩm, nước uống luôn có mức giới hạn cho tiêu chuẩn này, chi tiết xem ở phần phụ lục 1. 6.1.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4884 : 2005 (ISO 4833 : 2003) được áp dụng để đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí ở 30 0C trong 72 giờ cho tất cả các loại thực phẩm.

6.1.3. Nguyên tắc Cấy lên môi trường cấy qui định, sử dụng hai đĩa, dùng một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc với một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu sản phẩm ở dạng khác. Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu vào hai đĩa cho mỗi dung dịch pha loãng. Các đĩa này được ủ trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 300C trong 72 ± 6 giờ. Tính số lượng vi sinh vật trên 1g hoặc 1ml mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu được trên đĩa đã chọn. 6.1.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.1. Môi trường và hóa chất Môi trường – Hóa chất

Mục đích

Saline Pepton Water (SPW)

Pha loãng mẫu

Plate count agar (PCA)

Nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí

HCl 10%

Chỉnh pH

NaOH 10%

6.1.5. Quy trình phân tích

10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone Water Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60 giây Dịch mẫu 10-1

Pha loãng

Dịch mẫu 10-2

PCA 02 đĩa

02 đĩa (PCA đã đun chảy và làm nguội đến 470C)

Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 300C trong 72h ± 6h

Đọc kết quả Chọn các đĩa mọc ≤ 300 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả Hình 6.1. Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí

6.1.6. Các bước tiến hành Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện, với sai số cho phép ± 5% cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác). Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5%) vô trùng vào bao PE (hoặc bình tam giác) chứa mẫu. Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng SPW trong 2-3 phút. Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng. Bước 2. Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn 1 cm.Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng. Trộn đều bằng máy vortex trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi đạt được nồng độ pha loãng thích hợp. Lưu ý: Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi chất cấy tiếp xúc với môi trường không được vượt quá 45 phút và thời gian kể từ khi chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo không được vượt quá 30 phút. Bước 3. Cấy và ủ mẫu - Nếu mẫu ở dạng lỏng: dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml. - Nếu mẫu ở dạng rắn: dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml dịch huyền phù ban đầu. - Lặp lại như trên với các độ pha loãng tiếp theo (sử dụng pipet vô trùng khác đối với mỗi dung dịch pha loãng tiếp theo, nếu cần) - Chỉ chọn các bước pha loãng tới hạn (ít nhất hai dung dịch pha loãng liên tiếp) để cấy các đĩa Petri thu khoảng từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên mỗi đĩa petri (hình 2.3). Trên đĩa thạch có số khuẩn lạc > 300 (hình 2.4) thì loại bỏ và cấy vào các đĩa petri ở các độ pha loãng kế tiếp. - Rót vào mỗi đĩa petri khoảng từ 12-15 ml môi trường PCA ở 440C đến 470C.

- Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay đều đĩa petri để cho hỗn hợp đông đặc. - Sử dụng 1 đĩa petri đối chứng để kiểm soát bằng cách lấy 1ml dung dịch pha loãng cho vào đĩa Petri, thêm 12-15 ml môi trường PCA và nuôi ủ cùng điều kiện. - Lật ngược các đĩa đã cấy và đặt vào tủ ấm ở 30 ± 1 0C trong 72 ± 3 giờ. Lưu ý: không xếp quá sáu đĩa và các đĩa cần được tách khỏi nhau, cách xa thành, nóc tủ. Bước 4. Đếm khuẩn lạc - Sau giai đoạn ủ qui định, đếm các khuẩn lạc trên các đĩa. Sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc (nếu cần). Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu, điều quan trọng là các khuẩn lạc chính phải được đếm và tránh đếm nhầm với các hạt không hòa tan hoặc các chất kết tủa trên đĩa. Kiểm tra cẩn thận các khuẩn lạc nghi ngờ, khi cần nên dùng kính lúp có độ khuyếch đại lớn hơn để phân biệt các khuẩn lạc với tạp chất lạ. - Các khuẩn lạc mọc lan rộng được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu ít hơn ¼ đĩa mọc dày lan rộng, thì đếm các khuẩn lạc trên đĩa phần còn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa. Nếu quá ¼ đĩa bị mọc dày lan rộng thì loại bỏ đĩa đó và không đếm (hình 2.5)

Hình 6.2. Khuẩn lạc vi sinh Hình 6.3. Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí trên môi vật hiếu khí trên môi trường PCA từ 15-300 KL trường PCA > 300 KL 6.1.7. Kết quả

Hình 6.4. Khuẩn lạc mọc loang trên môi trường PCA

6.1.7.1. Tính kết quả - Tính số lượng khuẩn lạcvi sinh vật có mặt trong mẫu thử theo trung bình từ hai độ pha loãng liên tiếp

C N=

(CFU/g hay CFU/ml)

V x [n1 + (0,1 x n2)] x d

Trong đó N: là số khuẩn lạc trên 1ml (1g) mẫu C: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2 độ pha loãng liên tiếp và trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 khuẩn lạc.

V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại d: Độ pha loãng đầu tiên được giữ lại - Trường hợp có hai đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc

C N=

(CFU/g hay CFU/ml)

Vxnxd

Trong đó N: Số khuẩn lạc trên 1ml (1g) mẫu C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa; V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit n: Số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n=2). d: Độ pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc của độ pha loãng thứ nhất đã được cấy hoặc được giữ lại [d=1 khi sản phẩm dạng lỏng]. 6.1.7.2. Biểu thị kết quả - Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa Sau khi tính kết quả, nếu chữ số thứ 3 nhỏ hơn 5 thì không thay đổi chữ số đứng trước nó; nếu chữ số thứ 3 lớn hơn hoặc bằng 5 thì tăng chữ số đứng trước lên 1 đơn vị tương ứng của 10, hoặc làm tròn số với 2 chữ số có nghĩa. Lấy kết quả là số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10 x, trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10, hoặc làm tròn số với 2 chữ số có nghĩa. Ví dụ cách tính kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí: Độ pha loãng Số khuẩn lạc

10-3

10-4

168

19

173

15

Số khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí đếm được trên hai độ pha loãng liên tiếp là: - ở độ pha loãng d=10-3: đếm được 168 khuẩn lạc và 173 khuẩn lạc - ở độ pha loãng d=10-4: đếm được 19 khuẩn lạc và 15 khuẩn lạc, ta có N=

C V x [n1 + (0,1 x n2)] x d

=

168 + 173 + 15 + 19

1 x [2+ (0,1 x 2)] x 10-3 Làm tròn kết quả là 1,7 x 105CFU/g (hoặc CFU/ml).

= 170454

6.2. Định lượng tổng nấm men-nấm mốc 6.2.1. Tổng quan về nấm men và nấm mốc Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 400,000 loài nấm nen và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế

bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài, vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Ta có thể phân biệt nấm men và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau: - Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ chằng chịt phát triển rất nhanh gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm. - Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, phát triển thành các khuẩn lạc tròn, lồi viền đều, bóng hoặc mờ trên bề mặt môi trường thạch nấmTrong thực phẩm nếu có thể sinh trưởng và phát triển của nấm men, nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc của thực phẩm, một số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng nấm men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải hộp và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran 18% Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC). Môi trường DRBC được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn 0,95 như thịt, trứng, sản phẩm sữa (trừ sữa bột), rau, quả, các loại pate tươi...Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95 như quả khô, bánh ngọt, mứt, thịt khô, cá muối, ngũ cốc, đậu đỗ và sản phẩm đậu đỗ, bột mì, quả hạch, gia vị... Trong thực phẩm, khi có sự hiện diện của mốc và men, chúng phát triển làm thay đối màu của thực phẩm, gây mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm. Một số loài có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. 6.2.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 8275-1,2:2010 (ISO 21527-1,2:2008) dùng để định lượng nấm men và nấm mốc trong các sản phẩm thực phẩm hoặc trong thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn 0,95% và hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95%. 6.2.3. Nguyên tắc Xác định số lượng nấm mốc hay nấm men trong mẫu bằng kỹ thuật pha loãng và đổ đĩa, một khối lượng mẫu xác định được cấy trang trên môi trường DG 18 (Dichloran Glycerol Agar) hay DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar). Sau khi ủ 25oC trong 5 – 7 ngày, đếm số khuẩn lạc nấm men và nấm mốc. 6.2.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.2. Môi trường và hóa chất Môi trường – Hóa chất

Mục đích

Saline Pepton Water (SPW)

Pha loãng mẫu

DG18

Nuôi cấy nấm men-nấm mốc

DRBC HCl 10%

Chỉnh pH

NaOH 10%

6.2.5. Thực hành Cân 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc hút 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone Water Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 60 giây Dịch mẫu [10-1]

0,1 ml

DRBC hoặc DG18

Pha loãng

Dịch mẫu [10-2]

0,1 ml

0,1 ml

DRBC hoặc DG18

DRBC hoặc DG18

0,1 ml

DRBC hoặc DG18

Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi khô bề mặt thạch.Ủ 250C/3-5 ngày.

Đọc kết quả Chọn các đĩa mọc ≤ 150 khuẩn lạc/mầm/chồi ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả Hình 6.5. Qui trình định lượng tổng nấm men-nấm mốc

6.2.6. Các bước tiến hành Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Cân chính xác 10 g/25 g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml/25ml đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác). Cho dung dịch pha loãng SPW 90 ml/225 ml (sai số cho phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu. Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2÷3 phút. Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng. Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp. Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh các phần tử có vi sinh vật lắng xuống. Bước 2. Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng lấy 1 ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp. Bước 3. Cấy và ủ mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào đĩa thạch DRBC hoặc DG18. Dùng pipet vô trùng mới để chuyển 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10 ) (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10 -2 (sản phẩm ở dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC hoặc DG18 thứ hai. -1

Để thuận tiện cho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, lấy các lượng đến 0,3ml dung dịch pha loãng 10 -1 của mẫu hoặc của mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên ba đĩa.

Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vô trùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng. Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi dịch lỏng hấp thu hết vào môi trường. Có thể sử dụng kỹ thuật cấy bằng phương pháp đổ đĩa nhưng trong trường hợp này sự tương đương của các kết quả phải được đánh giá bằng cách so sánh với kết quả được cấy trên bề mặt đĩa. Phương pháp cấy bề mặt có thể cho kết quả định lượng cao hơn. Kỹ thuật dàn đĩa tạo điều kiện cho các tế bào tiếp xúc tối đa với oxi của không khí và tránh mọi nguy cơ bị bất hoạt do nhiệt của chồi nấm. Các kết quả có thể phụ thuộc vào từng loại nấm. Ủ các đĩa đã chuẩn bị trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thế thẳng đứng trong tủ ấm ở 25 ±10C trong 3÷5 ngày. Khuyến cáo ủ các đĩa trong túi chất dẻo để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trong trường hợp nấm mốc lan ra ngoài đĩa. Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa trong khoảng thời gian ủ từ 3÷5 ngày. Chọn các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc và đếm chúng. Nếu trên các đĩa có nấm mốc mọc quá nhanh thì có thể đếm các khuẩn lạc sau khi ủ 2 ngày và đếm lại sau khi ủ 5 ngày. Tiến hành kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt giữa các tế bào nấm men hoặc nấm mốc và vi khuẩn từ các khuẩn lạc, nếu cần. Đếm các khuẩn lạc nấm men và nấm mốc riêng rẽ, nếu cần. Để nhận biết nấm men và nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thích hợp. 6.2.7. Kết quả 6.2.7.1. Tính toán kết quả Tổng số nấm men hoặc nấm mốc trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức C (CFU/g hay CFU/ml) X= V x (n1+ 0,1x n2) x d C: Tổng số khuẩn lạc nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp. V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại d: Độ pha loãng đầu tiên được giữ lại Làm tròn số kết quả có được tới 2 số có nghĩa (chẳng hạn 2864 làm tròn là 2900) và biểu thị theo công thức:

a x 10n a: số thập phân tương ứng có giá trị từ 1,0 đến 9,9 n: số mũ phù hợp của 10 6.2.7.2 Biểu thị kết quả Ví dụ cách tính tổng nấm men, nấm mốc: Độ pha loãng

10-2

10-3

Số khuẩn lạc

89

13

97

8

Số khuẩn lạc nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên hai độ pha loãng liên tiếp là: - ở độ pha loãng d=10-2: đếm được 83 khuẩn lạc và 97 khuẩn lạc - ở độ pha loãng d=10-3: đếm được 13 khuẩn lạc và 8 khuẩn lạc, ta có C 89 + 97 X= = = 93000 V x n1 x d 0,1 x 2 x 10-2 Làm tròn kết quả là 9,3 x 104CFU/g hoặc CFU/ml. 6.3. Định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp đếm đĩa 6.3.1. Định lượng Coliforms 6.3.1.1. Tổng quan về Coliforms Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức an toàn về vi sinh trong thực phẩm. Sự hiện diện một lượng lớn Coliforms và E. coli trong thực phẩm là điều không mong muốn, tuy nhiên rõ ràng không thể loại bỏ chúng hoàn toàn khỏi nhiều thực phẩm đông lạnh hoặc tươi sống. Vấn đề ở chỗ số lượng chúng đến mức nào có thể coi là không an toàn cho thực phẩm. Coliforms là nhóm những trực khuẩn đường ruột gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37 oC trong vòng 24-48 giờ. Nhóm Coliforms gồm 4 giống: - Escherichia (với 1 loài duy nhất là E. coli) - Citrobacter - Klebsiella - Enterobacter 6.3.1.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 6848:2007 được áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm để xác định Coliforms tổng số.

6.3.1.3. Nguyên tắc Số lượng Coliforms được xác định bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào một môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch Violet Red Bile) có chứa lactose và một chất chỉ thị pH. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau khi ủ môi trường ở 37 oC trong 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc điển hình và khẳng định lại trong môi trường canh Brilliant Green Bile Salt Lactose (BGBL), coliforms sẽ sinh khí trong môi trường này ở 37 oC trong 24 giờ. Kết quả được biểu thị bằng số coliforms trên 1g mẫu chưa pha loãng. 6.3.1.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.3. Môi trường và hóa chất Môi trường – Hóa chất

Mục đích

Saline Pepton Water (SPW)

Pha loãng mẫu

VRBA

Nuôi cấy coliforms

BGBL

Khẳng định coliforms

HCl 10%

Chỉnh pH

NaOH 10% 6.3.1.5 Quy trình phân tích

10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone Water Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60 giây Dịch mẫu 10-1

Pha loãng

Dịch mẫu 10-2

VRB 02 đĩa

02 đĩa (VRB đã đun chảy và làm nguội đến 470C)

Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 370C trong 24 giờ

Cấy 5 khuẩn lạc nghi ngờ vào các ống nghiệm chứa BGBL, ủ ở tủ ấm 370C trong 24 giờ

Tính và biểu thị kết quả

6.3.1.6. Các bước tiến hành Bước 1. thử và huyền

Hình 6.6. Quy trình định lượng tổng Coliforms

Chuẩn bị mẫu phù ban đầu

Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml/25ml đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác). Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml (sai số cho phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu. Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2÷3 phút. Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng. Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp. Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh các phần tử có vi sinh vật lắng xuống. Bước 2. Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp. Bước 3. Cấy và ủ mẫu

Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri. Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri . Rót vào mỗi đĩa khoảng 15ml môi trường VRB. Lắc tròn đĩa xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5-10 lần. Sau khi môi trường đông hoàn toàn rót thêm khoảng 4ml môi trường VRB tráng kín bề mặt đĩa và để đông đặc như trên. Lật úp đĩa và ủ ở 37oC trong 24 giờ. Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc coliforms đặc trưng trên môi trường VRB có màu đỏ tía, đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ do tủa. Đếm các khuẩn lạc coliforms đặc trưng trên những đĩa có số đếm phù hợp. Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng để qui về số coliforms trong 1g mẫu. Trong trường hợp có những khuẩn lạc nghi ngờ, cấy riêng ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ của mỗi loại vào các ống nghiệm chứa môi trường lỏng BGBL, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. 6.3.1.7. Kết quả Tổng số coliforms trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức: X=

(C1xR1)+(C2xR2)+(C3xR3)+(C4xR4) V x (n1+ 0,1 x n2) x d

(CFU/g hay CFU/ml)

C1,2,3,4: Số khuẩn lạc Coliforms đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp được giữ lại. V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại d: Độ pha loãng thứ nhất được giữ lại R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp được giữ lại. 6.3.2. Định lượng E. coli 6.3.2.1. Tổng quan về E. coli Escherichia coli là một trong những vi sinh vật thường gặp trong môi trường. Nhiều người không coi E. coli là vi sinh vật gây bệnh do thực phẩm song những nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng của chúng thực sự có khả năng gây bệnh lây lan qua thực phẩm rất nghiêm trọng. E. coli là dạng trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ biến trong tự nhiên và đặc biệt trong đường tiêu hóa của người người và động vật. Chúng

thuộc loại glucose và lactose dương tính, indol và methyl red dương tính song có phản ứng VP và citrate âm tính. 6.3.2.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này được tham chiếu theo ISO 16649-2:2001 được áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm 6.3.2.3. Nguyên tắc Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch TBX) có chứa lactose và một chất chỉ thị pH. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau khi ủ môi trường ở 44oC trong 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc E. coli điển hình trên môi trường TBX. Kết quả được biểu thị bằng số E. coli trên 1g mẫu chưa pha loãng. 6.3.2.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.4. Môi trường và hóa chất Môi trường – Hóa chất

Mục đích

Saline Pepton Water (SPW)

Pha loãng mẫu

TBX

Nuôi cấy E. coli

HCl 10%

Chỉnh pH

NaOH 10% 6.3.2.5. Quy trình phân tích

6.3.2.6. Cácmẫu bướcrắn tiếnhoặc hành 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 10g/25g đối với Bước 1. Chuẩn bị90/225ml mẫu thử và huyềnPeptone phù banWater đầu Saline Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml/25ml đối Đồng bằng trong với mẫu lỏng của phầnnhất mẫu mẫu thử đại diệnStomacher với sai số cho phép60± giây 5%, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác).

mẫu 10 SPWPha Dịch mẫuphép 10 ± 5% ) vô trùng vào túi loãng (sai Cho dung Dịch dịch pha loãng 90ml/225ml số cho nhựa (bình tam giác) chứa mẫu. -1

-2

Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2÷3 phút. Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng. Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy với TBX một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp. 02 đĩa

02 đĩa

Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịchchảy pha và loãng bằng máy vortex để tránh các (TBX đã đun phần tử có vi sinh vật lắng xuống. 0 Bước 2. Pha loãng mẫu

làm nguội đến 47 C)

Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.

Xoay nhẹbằng trộnmáy đềuvortex mẫu, trong ở nhiệt hỗn hợp đặc,loãng 10 -2 Trộn kỹ 5 - độ 10 phòng, giây để chờ thu được dungđông dịch pha 0 và ủ chất ở tủthì ấmthu 44được C trong (đối với các loại lật mẫungược làm từđĩa nguyên dung 24 dịchgiờ pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp. Bước 3. Cấy và ủ mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển Đọc 1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầu kết quả đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri. Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên Chọn 150vào khuẩn ở 2 độ 15ml pha loãng liên tiếp tiếp, mỗi nồngcác độ đĩa 2 đĩamọc petri.≤ Rót mỗi lạc đĩa khoảng môi trường TBX. Lật úp đĩa o và ủ ở 44 C trong 24 giờ. Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa có số khuẩn Tínhlạc vàdưới biểu150 thị sau kết 24 quảgiờ nuôi cấy. Khuẩn lạc E. coli đặc trưng trên môi trường TBX có màu xanh. Đếm các khuẩn lạc E. coli đặc trưng trên những đĩa có số đếm phù hợp. Tính giá trị trung Hình 6.7. Quy trình định lượng E. coli bình từ các độ pha loãng để qui về số E. coli trong 1g mẫu. 6.3.2.7 Kết quả Tổng số E. coli trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức:

X=

C

(CFU/g hay CFU/ml)

V x (n1+ 0,1x n2) x d

C: Tổng số khuẩn lạc E. coli đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp. V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại 6.4. Định lượng Staphylococcus aureus 6.4.1. Tổng quan về vi khuẩn S. aureus S. aureus là loài cầu khuẩn gram dương, không sinh bào tử, không di động, thường tụ thành chum nho, có khả năng lên men và sinh sucrose, mannitol và sinh sắc tố vàng, chịu mặn (có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl), có khả năng đông tụ huyết tương (phản ứng coagulase (+)). Nhiệt độ thích hợp 35÷37 oC; độ pH 6÷7 và hoạt độ nước tối ưu 0,83÷0,9. S. aureus phân bố khắp mọi nơi như: da, mũi, tóc và lông của các động vật máu nóng...S. aureus sinh độc tố đường ruột enterotoxin, đây là loại độc tố bền nhiệt và không bị phân huỷ ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4÷6 giờ người bị ngộ độc có các triệu chứng như: tiêu chảy nôn mửa kéo dài 6÷8 giờ. Ngoài ra, S. aureus còn gây nổi mụn nhọt, làm đông huyết tương, từ đó gây nên các bệnh như viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận, viêm tủy xương ở người. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp và các loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp, xúc xích, lạp xưởng… S. aureus cũng phát triển tốt trong môi trường có nồng độ đường cao (50÷60%). Chúng lên men và phân giải đường nhưng lại không tạo mùi vị khó chịu cho sản phẩm. 6.4.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này tham chiếu theoTCVN 4830 -1: 2005 (ISO 6888-1:1999) dùng để định lượng S. aureus cho tất cả các loại thực phẩm. 6.4.3. Nguyên tắc - Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc một lượng mẫu qui định (sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù). - Ủ các đĩa trong kiện hiếu khí ở 370C và kiểm tra sau 24h hoặc 48h. - Tính số lượng S. aureus trong một mililit hoặc một gram mẫu từ những khuẩn lạc điển hình và không điển hình trên các đĩa ở độ pha loãng khác nhau và khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính. 6.4.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.5. Môi trường và hóa chất

Môi trường và hóa chất

Mục đích

Dung dịch Saline Peptone Water (SPW)

Pha loãng mẫu

Môi trường Baird-Parker Agar (BPA)

Nuôi cấy S. aureus

Egg yolk tellurite emulsion Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA)

Phục hồi

Brain heart broth (BHI) Huyết tương thỏ đông khô

Khẳng định S. aureus

HCl và NaOH 10%

Chỉnh pH môi trường

6.4.5. Quy trình phân tích

Hình 6.8. Quy trình định lượng S. aureus

6.4.6. Các bước tiến hành Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong 10ml/25ml thể tích đối với mẫu lỏng (sai số cho phép ± 5%), cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác). Cho dung dịch pha loãng SPW 90 ml/225 ml (sai số cho phép ± 5%) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu. Dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác trong 2÷3 phút. Bước 2. Pha loãng mẫu (Theo TCVN 6507-1 : 2005) Dùng pipet vô trùng hút 1ml huyền phù ban đầu (sai số ± 5%) cho vào một ống nghiệm chứa 9ml SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Trộn đều bằng máy vortex trong 5÷10 giây để thu được dịch pha loãng 10 -2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp. Bước 3. Phân lập trên môi trường chọn lọc Hút 0,1 ml dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng vào giữa đĩa môi trường BPA đã được chuẩn bị trước, mỗi nồng độ cấy lặp lại 2 đĩa, dùng que trang trải đều dịch mẫu trên mặt thạch. Lật ngược các đĩa đã cấy và ủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 3h hoặc 48 ± 4h. Bước 4. Quan sát và đếm số khuẩn lạc Sau 24 ± 3h, tiến hành đếm số khuẩn lạc S. aureus điển hình và không điển hình trên môi trường thạch BPA. Khuẩn lạc S. aureus điển hình có đường kính 1÷1,5mm, màu đen sáng, lồi. Mỗi khuẩn lạc có vầng sáng rộng 1÷2mm bao quanh. Những khuẩn lạc điển hình được đánh dấu trên mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24h nữa. Sau 48 ± 4h, khuẩn lạc S. aureus dương tính có đường kính 1,5÷2,0mm, màu đen, sáng và lồi, quanh khuẩn lạc có một vùng đục mờ hẹp, tiếp đó là vùng sáng, trong rộng 2÷4 mm. Còn những khuẩn lạc không điển hình thì không tạo vầng sáng bao quanh và cũng không tạo vùng đục bao quanh khuẩn lạc. Những khuẩn lạc không điển hình này cũng được đánh dấu ở mặt sau của đĩa. Bước 5. Phục hồi Cấy 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc không điển hình từ BPA sang các ống nghiệm tương ứng chứa 5 ml môi trường BHI. Ủ 37 ± 10C trong 24 ± 3h. Bước 6. Khẳng định bằng phản ứng đông tụ huyết tương Nguyên tắc: thử nghiệm khả năng của một số sinh vật làm đông tụ huyết tương bởi hoạt động của enzyme coagulase. Coagulase được Staphylococcus aureus tiết ra bên ngoài tế bào và chúng cũng dễ dàng bất hoạt bởi các protease.

Coagulase là enzyme đóng vai trò đông tụ huyết tương, chúng kết hợp các cấu tử trong huyết tương thành từng khối hay từng cục.

Cách tiến hành: Hút 0,1ml dịch nuôi cấy BHI vào ống nghiệm có kích thước 10mm x 75mm đã chứa 0,3ml huyết tương thỏ (hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất), ủ ở 37 ± 10C. Kiểm tra sự đông tụ của huyết tương sau 4, 6, 8, 24h. Phản ứng được coi là dương tính khi thể tích đông tụ chiếm ¾ . 6.4.7. Báo cáo kết quả 6.4.7.1 Tính kết quả - Tính tỉ lệ giữa số khuẩn lạc điển hình cho thử nghiệm phản ứng coagulase dương tính (+) trên tổng số khuẩn lạc điển hình (H t) và tỉ lệ giữa khuẩn lạc không điển hình cho thử nghiệm coagulase dương tính (+) trên tổng số khuẩn lạc không điển hình (Ha) - Tính mật độ S. aureus trung bình trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu: 10 x (NtHt + NaHa) (CFU/g hay CFU/ml) X= F1 + F2 Trong đó: - F1 và F2: 2 độ pha loãng liên tiếp - Nt: tổng số khuẩn lạc điển hình trên một đĩa ở các độ pha loãng F1, F2 - Na: tổng số khuẩn lạc không điển hình trên một đĩa ở các độ pha loãng F1, F2 - Ht: tỉ lệ giữa số khuẩn lạc điển hình cho thử nghiệm phản ứng coagulase dương tính (+) trên tổng số khuẩn lạc điển hình được thử nghiệm. - Ha: tỉ lệ giữa số khuẩn lạc không điển hình cho thử nghiệm phản ứng coagulase dương tính (+) trên tổng số khuẩn lạc không điển hình được thử nghiệm. Chú ý: Thực hiện song song với một mẫu đối chứng (gồm có chứng âm và chứng dương với S. aureus). Mẫu được kết luận là có S. aureus khi thử nghiệm coagulase có hiện tượng đông tụ giống như chứng dương trong khi đó mẫu đối chứng âm không xuất hiện khối đông tụ. 6.4.7.2 Biểu thị kết quả Ví dụ: Bảng 6.6. Ví dụ về biểu thị cách tính kết quả S. aureus Độ pha loãng

Số khuẩn Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc thử Số phản ứng lạc điển không điển nghiệm phản coagulase (+) hình (Nt) hình (Na) ứng coagulase

Ht

Ha

10-2

30 47 5

5

5

5

2

5

5

5

1

5/5 2/5 5/5

-3

10

8

X=

10 x (NtHt + NaHa) F1 + F2

=

10 x (30x5/5 + 47x2/5 + 5x5/5 + 8x1/5) 10 + 10 -2

-3

1/5

= 5 x 104 (CFU/g hay CFU/ml)

6.5. Phát hiện Salmonella 6.5.1. Tổng quan về vi khuẩn Salmonella Salmonella là trực khuẩn gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có khả năng di động (trừ S. gallinarum và S. pullorum ), sinh acid từ glucose và mannitol nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indol và không phân giải ure. Hầu hết các chủng đều sinh H2S (trừ S. typhi). Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm. Có ba dạng bệnh do Salmonella gây ra. Sốt thương hàn do S. typhy, nhiễm trùng máu do S. cholera-sius, rối loạn tiêu hóa do S. typhymurium và S. enteritidis. Hầu hết các tiêu chuẩn vi sinh về an toàn thực phẩm đều không cho phép có sự hiện diện của Salmonella trong 25g/25ml mẫu. Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập, phục hồi và khẳng định. Vi khuẩn Salmonella kém chịu nhiệt, dễ dàng bị tiêu diệt khi thức ăn được đun nấu phù hợp. Việc làm lạnh, cấp đông, đảm bảo vệ sinh có tác dụng quan trọng làm giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh. 6.5.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4829:2005 dùng để phát hiện Salmonella trong tất cả các loại thực phẩm. 6.5.3. Nguyên tắc Phương pháp này chỉ dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện Salmonella trên lượng mẫu đã lấy. Quy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải qua năm giai đoạn và phải sử dụng chủng đối chứng trong toàn bộ quá trình phân tích. Tiền tăng sinh: mẫu được tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ ở 370C trong khoảng 18h.

Tăng sinh chọn lọc: Sau giai đoạn tiền tăng sinh, dịch mẫu được chuyển qua môi trường tăng sinh chọn lọc RVS ủ ở 41,50C và MKTTn ủ ở 370C trong khoảng 24h. Phân lập: cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang hai môi trường rắn chọn lọc (XLD và HE), ủ ở 370C trong khoảng 24h. Phục hồi: Cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella trên các môi trường phân lập sang môi trường dinh dưỡng. Khẳng định: Cấy chuyển sinh khối trên môi trường dinh dưỡng sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng huyết thanh học. 6.5.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.7. Môi trường và hóa chất Môi trường và hóa chất

Mục đích

Dung dịch Buffered Peptone Water Tăng sinh sơ bộ (BPW) Canh Rappaport-Vassiliadis Pepton (RVS)

Soya Tăng sinh chọn lọc

Selenit xystin / Tetrathionat (TT) Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)

Phân lập

Hektoen Entric Agar (HE) Tryptone Soy Agar (TSA)

Phục hồi

Lysine Decacboxylase broth (LDC)

Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Salmonella

Voges-Proskauer (VP) Ure Broth Tryptone Water Kligler Iron Agar(KIA)/TSI Đĩa giấy ONPG Dung dịch creatine Kháng huyết thanh

Thuốc thử các phản ứng sinh hóa

Dung dịch - naphtol KOH 40% Thuốc thử Kovac’s HCl và NaOH 10%

Chỉnh pH

Cân 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng Thêm 225ml BPW 6.5.5. Quy trình phân tích

Bao PE vô trùng chứa 25g/25ml mẫu thử Dập mẫu trong 1 phút Ủ ở (37 ± 1)0C/ (18 ± 2)h

0,1ml

1ml

10ml môi trường RVS broth Ủ ở (41,5±1) 0C / (24±3) h

10ml môi trường MKTTn broth. Ủ ở (37±1) 0C/ (24±3) h

Cấy lên HE agar Ủ ở 350C/ (18-24)h

Cấy lên XLD agar Ủ ở (37±1)0C/ (24±3) h

Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ, cấy lên NA/TSA Ủ ở (37±1)0C/(24±3) h

Không có khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi môi trường phân lập

Ủ ở (37±1)0C/(24±3)h Không phát hiện Salmonella trong 25g/25ml mẫu thử

Tryptone broth

VP

ONPG

LDC

Ure agar

TSI

Thử một khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ

Thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu

Thử kháng huyết thanh

Dương tính

Báo cáo kết quả (24±3) h

Âm tính

Hình 6.9 Quy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm

6.5.6. Các bước tiến hành Cân một lượng 25g mẫu rắn hoặc đong một thể tích 25ml mẫu lỏng với sai số cho phép ± 5% của phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác), bổ sung 225ml môi trường BPW và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) trong 60 giây. Bước 1. Tiền tăng sinh (tăng sinh sơ bộ) Mẫu được tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ ở 370C ± 3h trong khoảng 18h ± 3h. Bước 2. Tăng sinh chọn lọc Trộn đều dịch tiền tăng sinh, chuyển 0,1ml vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS, ủ ở 41,5 ± 1 0C trong 24 ± 3h; đồng thời chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 3h. Cẩn thận không được để vượt quá nhiệt độ ủ tối đa (42,50C). Bước 3. Phân lập Dùng que cấy vòng cấy phân lập từ mỗi canh thang tăng sinh chọn lọc RVS và MKTTn lên mỗi đĩa thạch chứa môi trường chọn lọc XLD và HE. Sau khi cấy, lật ngược các đĩa sao cho đáy hướng lên trên và ủ ở 370C± 10C trong 24 ± 3h. Sau khi ủ 24 ± 3h, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình và các khuẩn lạc không điển hình mà có thể nghi ngờ là Salmonella. Trên môi trường XLD (hình 1.3) khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu hồng trong suốt, có hoặc không có tâm màu đen. Trên môi trường HE (hình 1.3) khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu xanh lam, có hoặc không có tâm đen. Đánh dấu vị trí các khuẩn lạc này trên đáy đĩa. Bước 4. Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi đĩa trên môi trường phân lập XLD và HE. Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên NA/TSA. Ủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 3h. - Trường hợp 1: từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Salmonella trong mẫu. - Trường hợp 2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa không phù hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu, một trong bốn khuẩn lạc này cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Salmonella trong mẫu và ngược lại thì kết luận không phát hiện Salmonella trong mẫu. Bước 5. Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môi trường sau:

 Thạch TSI Nguyên tắc: xác định khả năng sử dụng nguồn carbohydrate cụ thể kết hợp với môi trường tăng trưởng căn bản, có hoặc không có sinh hơi và hydrogen sulfide (H2S). Cách cấy mẫu: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống đáy. Ủ ở 37± 10C trong 24h ± 3h. Diễn giải những thay đổi trong môi trường như sau: Cấy đâm sâu - Màu vàng glucose dương tính (sử dụng glucose). - Màu đỏ hoặc không đổi màu glucose âm tính (không sử dụng glucose). - Màu đen sinh hydro sunfua. Bọt hoặc vết rạn sinh khí từ glucose. Cấy bề mặt nghiêng của thạch - Màu vàng lactose và/hoặc sucrose dương tính (sử dụng lactose và/hoặc sucrose). - Màu đỏ hoặc không đổi màu lactose và sucrose âm tính (không sử dụng lactose cũng như không sử dụng sucrose). Các khuẩn lạc Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng của thạch và khi cấy đâm sâu mang tính acid (màu vàng) có sinh khí (bọt khí) và (với khoảng 90% trường hợp) sinh hydrosunfua (thạch bị đen).  Lysine decarboxylase Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện vi khuẩn sinh các enzyme decarboxylase, các enzyme này tương tác với các amino acid có gốc carboxyl (-COOH) ở cuối, tạo thành amine hay diamine và carbon dioxide (CO2). Cách cấy mẫu: cấy ngay phía dưới của bề mặt môi trường lỏng, phủ một lớp paraffin hay dầu khoáng lên trên bề mặt môi trường. Ủ ở 37 ± 1 0C trong 24 ± 3h. Salmonella có phản ứng lysine decarboxylase dương tính nên sau khi nuôi cấy, môi trường vẫn giữ nguyên màu tím. Phản ứng âm tính khi môi trường có màu vàng.  Thạch Ure Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt ure thành amoniac do hoạt tính của enzyme urease từ VSV và kết quả là môi trường bị kiềm hóa do NH3 được tạo ra. Cách cấy mẫu: cấy cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch. Ủ ở 37 ± 1 0C trong 24 ± 3h. Nếu phản ứng là dương tính, môi trường từ màu đỏ chuyển thành màu hồng và sau đó chuyển thành màu đỏ hồng. Ngược lại, nếu phản ứng là âm tính thì môi trường không đổi màu (vàng cam).  Môi trường phản ứng Indol Nguyên tắc: phát hiện khả năng oxi hóa tryptophan thành các dạng của indol:Indol, Skatol (methyl indol) và indol-acetate.

Cách cấy mẫu: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường tryptone water. Ủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 3h. Sau khi ủ, thêm 1 ml thuốc thử kovac’s, nếu phản ứng dương tính thì trên bề mặt môi trường xuất hiện một vòng màu đỏ chứng tỏ phản ứng dương tính, xuất hiện màu khác là phản ứng âm tính.  Phát hiện β-galactosidase Nguyên tắc: xác định khả năng lên men lactose của vi sinh vật Cách cấy mẫu: cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào trong ống vô trùng có chứa 0,25ml dung dịch muối sinh lý. Thêm một giọt toluen và lắc ống. Đặt ống này vào trong nồi cách thủy ở 370C và để trong vài phút (khoảng 5 phút). Thêm 0,25ml thuốc thử để phát hiện β-galactosidase và lắc đều. Đặt lại ống vào nồi cách thủy để ở 37 0C và để trong 24 ± 3h, kiểm tra ống thường xuyên. Màu vàng cho thấy phản ứng dương tính. Phản ứng thường xuất hiện sau 20 phút. Nếu sử dụng đĩa giấy bán sẵn, thì theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất.  Voges – Proskauer Nguyên tắc: xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong quá trình lên men glucose của một số vi sinh vật Cách cấy mẫu: cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào trong ống vô trùng có chứa 3 ml môi trường VP. Ủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 3h. Sau khi ủ, thêm 2 giọt dung dịch creatine, 3 giọt dung dịch α-naphthol và sau đó thêm 2 giọt dung dịch kali hydroxyde (KOH), lắc đều sau mỗi lần thêm từng loại thuốc thử. Khi xuất hiện màu hồng đến màu đỏ sáng trong 15 phút chứng tỏ phản ứng dương tính, còn phản ứng âm tính khi dịch vi khuẩn vẫn không đổi màu.  Thử phản ứng kháng huyết thanh: + Loại trừ chủng tự ngưng kết: nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính thủy tinh đã được làm sạch một cách cẩn thận, dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch với khuẩn lạc cần thử, để thu được huyền phù đục và đồng nhất. Lắc nhẹ phiến kính từ 30÷60 giây. Quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp. Nếu có sự vón cục, không rời nhau (ít hoặc nhiều) của vi khuẩn, thì chủng xem như tự ngưng kết, không cần thử phản ứng huyết thanh tiếp theo. Nếu không có sự vón cục và vi khuẩn rời nhau, thì chủng xem như không tự ngưng kết, cần phải tiếp tục thử phản ứng huyết thanh. + Kiểm tra O, H, ... Nhỏ một giọt anti-O hoặc H lên một lam kính sạch, dùng que cấy lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ môi trường Nutrient Agar để phân tán vào giọt huyết thanh, chờ 30÷60 giây, quan sát trên nền đen. Phản ứng dương tính khi có hiện tượng ngưng kết xảy ra. Đôi khi cần quan sát hiện tượng ngưng kết bằng kính lúp hay kính hiển vi với độ phóng đại thấp. Ngược lại, nếu vi khuẩn phân bố đều trong huyết thanh, làm cho giọt dung dịch đục đều được xem là kết quả âm tính.

Mẫu được kết luận dương tính với salmonella khi có khuẩn lạc đặc trưng trên các môi trường phân lập và cho những những kết quả sinh hóa sau: TSI/KIA: đỏ/vàng, có/không có H2S và sinh hơi; Ure (-); Indol (-); VP (-); ONPG (-); LDC (+). 6.5.7. Kết quả Phát hiện (hay không phát hiện) Salmonella trong 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng.

6.6. Định lượng Bacillus cereus giả định (B. cereus) 6.6.1. Tổng quan về B. cereus B. cereus là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng tối ưu ở 35-40oC, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc vi khuẩn này tạo khuẩn lạc rất to, mọc lan, rìa nhăn. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, sản phẩm khô,...), chúng có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B. cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không giữ được trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng. 6.6.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) dùng để định lượng B. cereus giả định có khả năng mọc được trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30oC. Phương pháp này có thể áp dụng cho các sản phẩm dùng cho người và thức ăn chăn nuôi và các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm. 6.6.3. Nguyên tắc - Cấy một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phảm ở dạng khác, lên bề mặt môi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa petri. - Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu. - Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30oC trong khoảng 18-48 giờ. - Tính số lượng B.cereus trong 1ml hoặc trong 1g mẫu từ số lượng khuẩn lạc khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và được khẳng định theo pháp thử qui định. 6.6.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.8. Môi trường và hóa chất Môi trường và hóa chất

Mục đích

SPW (Saline Peptone Water) MYP agar base (Mannitol -Egg Yolk- Nuôi cấy B.cereus Polymixin) Polymixin B Egg Yolk Blood agar base

Khẳng định B.cereus giả định

Sheep blood HCl và NaOH 10%

Chỉnh pH

6.6.5. Quy trình phân tích Cân 10g đối với mẫu rắn hoặc hút 10ml đối với mẫu lỏng + 90ml Saline Peptone Water Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 60 giây Pha loãng

Dịch mẫu [10-1]

0,1 ml

MYP

Dịch mẫu [10-2]

0,1 ml

0,1 ml

MYP

0,1 ml

MYP

MYP

Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi khô bề mặt thạch. Ủ 300C/24 giờ Đếm khuẩn lạc Khẳng định B.cereus giả định trên MT thạch máu cừu bằng phản ứng Haemolysin, Ủ 300C/24 giờ

Tính và biểu thị kết quả Hình 6.10 Qui trình định lượng B.cereus giả định

6.6.6. Các bước tiến hành Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác). Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu. Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2÷3 phút. Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng. Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp. Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh các phần tử có vi sinh vật lắng xuống. Bước 2. Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp. Bước 3. Cấy và ủ mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri. Lặp lại qui trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần. Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri. Dùng que cấy trải trải đều dịch mẫu lên khắp bề mặt đĩa petri, sử dụng một que trải vô trùng cho mỗi đĩa. Để các đĩa khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng để chất cấy bám vào thạch. Lật úp đĩa và ủ ở 30oC trong 24 giờ. Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc B. cereus giả định là các khuẩn lạc lớn, màu hồng, được bao quanh bởi một vòng kết tủa. Đếm các khuẩn lạc B. cereus giả định trên những đĩa có số đếm phù hợp.

Lấy 5 khuẩn lạc giả định, nếu trên đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc thì lấy tất cả các khuẩn lạc giả định có mặt. Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọn lên mặt thạch máu cừu, ủ ở 30oC trong 24 giờ. Đọc kết quả. 6.6.7. Kết quả B. cereus giả định trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo công thức: X=

(C1xR1)+(C2xR2)+(C3xR3)+(C4xR4)

(CFU/g hay CFU/ml)

V x (n1+ 0,1 x n2) x d

C1,2,3,4: Số khuẩn lạc B. cereus giả định đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp được giữ lại. V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trong 4 đĩa petri được giữ lại ở hai độ pha loãng liên tiếp 6.7. Phát hiện Shigella spp. 6.7.1. Tổng quan về Shigella spp. Shigella spp. là trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, Shigella spp. không sinh bào tử và thường hay bị nhằm lẫn với Salmonella trong quá trình kiểm tra vi sinh. Shigella spp. không di động và không sinh bào tử, có phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, lactose âm tính, H2S âm tính, một vài chủng không sinh hơi khi lên men đường glucose. Giống Shigella gồm 4 loài: Shigella dysenteriae (kháng huyết thanh nhóm A), Shigella flexneri (kháng huyết thanh nhóm B, với 6 serovar và một ít serovar phụ), Shigella boydii (kháng huyết thanh nhóm C, với 15 serovar phụ), Shigella sonei (kháng huyết thanh nhóm D). 6.7.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này được tham chiếu theo ISO 21567:2004 được áp dụng để phát hiện Shigella trong tất cả các loại thực phẩm 6.7.3. Nguyên tắc Cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng chọn lọc. Từ môi trường này cấy phân lập lên môi trường rắn chọn lọc, sau thời gian ủ, những khuẩn lạc nghi ngờ sẽ được kiểm tra khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. 6.7.4. Môi trường và hóa chất

Bảng 6.9. Môi trường và hóa chất Môi trường và hóa chất

Mục đích

Shigella Broth

Tăng sinh chọn lọc

MacConkey

Phân lập

XLD Hektoen Enteric Agar Nutrient Agar (NA)

Phục hồi

TSI

Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Shigella

Urea LDC HCl và NaOH 10%

Chỉnh pH

6.7.5. Quy trình phân tích

X g hoặc X ml mẫu thử + 9.Xml canh thang Shigella chứa novobioxin 0,5 µg/ml Đồng hóa và chỉnh pH đến 7,0 nếu cần/ủ kỵ khí 41,50C/16-20h MacConkey agar

XLD agar Hektoen enteric agar 0 ủ 37 C/20 -24h

Chọn 5 khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch dinh dưỡng/ủ 370C, 20-24h

Khẳng định sinh hóa

Hình 6.11. Quy trình định tính Shigella spp.

6.7.6. Các bước tiến hành Bước 1. Tăng sinh chọn lọc Cân một lượng 25g mẫu rắn hoặc đong một thể tích 25 ml mẫu lỏng với sai số cho phép ± 5% của phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác), bổ sung 225ml môi trường tăng sinh chọn lọc Shigella và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) trong 60 giây, ủ ở 370C ± 3h trong khoảng 18h ± 3h. Bước 2. Phân lập Dùng que cấy vòng cấy phân lập từ canh thang tăng sinh chọn lọc Shigella lên mỗi đĩa thạch chứa môi trường chọn lọc MacConkey, XLD và HE. Sau khi cấy, lật ngược các đĩa sao cho đáy hướng lên trên và ủ ở 370C± 10C trong 24 ± 3h. Sau khi ủ 24 ± 3h, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình và các khuẩn lạc không điển hình mà có thể nghi ngờ là Shigella. Trên môi trường XLD khuẩn lạc Shigella điển hình có màu hồng trong suốt, có hoặc không có tâm màu đen. Trên môi trường HE khuẩn lạc Shigella điển hình có màu xanh lam, có hoặc không có tâm đen. Trên môi trường MacConkey khuẩn lạc Shigella điển hình có màu đỏ nhạt (môi trường có màu đỏ cam, hơi đục). Đánh dấu vị trí các khuẩn lạc này trên đáy đĩa. Bước 3. Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi đĩa trên môi trường phân lập MacConkey, XLD và HE. Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên NA/TSA. Ủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 3h. - Trường hợp 1: từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Shigella trong mẫu. - Trường hợp 2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa không phù hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu, một trong bốn khuẩn lạc này cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Shigella trong mẫu và ngược lại thì kết luận không phát hiện Shigella trong mẫu. Bước 5. Khẳng định sinh hóa Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môi trường sau: - Thạch TSI, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Shigella cho phản ứng kiềm trên mặt nghiêng và acid ở phần sâu, không sinh hơi và không sinh H2S trong môi trường. - Môi trường LDC, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Shigella cho phản ứng LDC âm tính. - Môi trường urea agar (urea lỏng), ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Shigella cho phản ứng urea âm tính. 6.7.7. Kết quả

Phát hiện (hay không phát hiện) Shigella trong 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng. 6.8. Định lượng Clostridium perfringenes (C. Perfringenes) 6.8.1. Tổng quan về C. perfringenes C. perfringenes là một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm trong giống Clostridia, chúng chiếm một vị trí khá đặc biệt bởi đồng thời là tác nhân gây bệnh do thực phẩm và cũng là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm. C. perfringenes là dạng trực khuẩn kỵ khí gram dương sinh bào tử, nhiệt độ sống tối ưu nằm trong khoảng 37-45oC. So với C. botulinum các chủng C. perfringenes gặp phổ biến hơn trong đường tiêu hóa của người nên thường được dùng làm vi sinh vật chỉ thị về khả năng nhiễm phân. Bào tử của chúng có mặt ở khắp mọi nơi trong thiên nhiên và dễ dàng nhiễm vào thực phẩm. Nhờ bào tử C. perfringenes có khả năng cạnh tranh cao hơn nhiều vi sinh vật khác nên khi mọi tế bào sinh dưỡng bị chết đi (chẳng hạn do nhiệt độ cao), bào tử của chúng vẫn sống sót, sinh trưởng và phát triển. 6.8.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 4991:2005 (ISO 7937:2004) dùng để định lượng C. perfringenes có khả năng mọc trên đĩa thạch. Phương pháp này có thể áp dụng cho các sản phẩm dùng cho con người, thức ăn cho động vật và các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm. 6.8.3. Nguyên tắc - Cấy một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phảm ở dạng khác, lên bề mặt môi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa petri. - Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu. - Rót môi trường chọn lọc (kỹ thuật rót đĩa) và sau đó phủ lên trên bằng chính môi trường này. - Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 37oC trong khoảng 24 giờ. - Định lượng các khuẩn lạc điển hình - Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng C. Perfringenes trong 1ml hoặc trong 1g mẫu. 6.8.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.10. Môi trường và hóa chất Môi trường và hóa chất

Mục đích

SPW (Saline Peptone Water)

Pha loãng mẫu

TSC agar base

Nuôi cấy C. Perfringenes

D-xycloserin Thioglycolat lỏng LS (lactose sunfit)

Khẳng định C. Perfringenes

Nitrat (thử di động) Lactose-gelatin HCl và NaOH 10%

Chỉnh pH

6.8.5. Quy trình phân tích

Sản phẩm dạng khác

Sản phẩm dạng lỏng

10g mẫu + 90mL SPW

Dịch mẫu [10-1]

Dịch mẫu [10-1]

Dịch mẫu [10-2]

02 đĩa petri

02 đĩa petri

02 đĩa petri

TSC

02 đĩa petri

TSC 15 – 20mL

15 – 20mL 15 – 20mL

15 – 20mL

Sau khi đông đặc thêm 10mL TSC mỗi đĩa, chờ đông đặc, lật ngược đĩa ủ kỵ khí ở 370C trong 20 ± 2 giờ Thioglycolate broth, ủ kỵ khí 370C, 18 – 24 giờ

Lactose sunfit hoặc Nitrat, Lactose-gelatin ủ hiếu khí 460C/18–24h

Đọc kết quả Clostridium perfringens: Hình 6.12. Quy trình định lượng C. perfringenes

6.8.6. Các bước tiến hành Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác). Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu. Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2÷3 phút. Bước 2. Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp. Bước 3. Cấy và ủ mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri. Lặp lại qui trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần. Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường TSC, trộn đều bằng cách xoay nhẹ từng đĩa. Khi môi trường đã đông đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10ml của cùng loại môi trường TSC. Để cho đông đặc lại. Lật úp đĩa và ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37 oC trong 24 giờ. Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc C. perfringenes điển hình có màu đen trên môi trường TSC. Đếm các khuẩn lạc C. perfringenes trên những đĩa có số đếm phù hợp. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình và chọn một trong hai kỹ thuật thử khẳng định sau:

- Kỹ thuật 1: kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường LS Cấy từng khuẩn lạc đã chọn vào môi trường thioglycolat lỏng, ủ ở 37oC trong 24 giờ trong điều kiện kỵ khí. Sau khi ủ, dùng pipet vô trùng chuyển ngay 5 giọt dịch cấy trong môi trường thioglycolat sang môi trường LS, ủ ở 46 oC trong 24 giờ trong điều kiện hiếu khí. Kiểm tra các ống nghiệm chứa môi trường LS về sự sinh khí và có xuất hiện kết tủa màu đen được coi là dương tính. - Kỹ thuật 2: kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường nitrat để thử tính di động và môi trường lactose-gelatin Cấy đâm sâu từng khuẩn lạc chọn lọc sang môi trường nitrat để thử tính di động, ủ 37 C trong 24 giờ trong điều kiện kỵ khí. Kiểm tra ống môi trường nitrat để thử tính di động đối với loại mọc dọc theo đường cấy đâm sâu. Tính di động là bằng chứng phát triển lan rộng vào môi trường cách xa đường cấy đâm sâu. Tiếp theo kiểm tra sự có mặt của nitrit bằng cách thêm 0,2-0,5ml thuốc thử phát hiện nitrit vào từng ống môi trường nitrit để kiểm tra sự có mặt của nitrit. o

Tương tự cấy từng khuẩn lạc chọn lọc đã chọn ở trên sang môi trường lactosegelatin, ủ ở 37oC trong 24 giờ trong điều kiện kỵ khí. Kiểm tra các ống nghiệm về việc sinh khí và có xuất hiện màu vàng cho thấy sự lên men lactoza. Làm lạnh các ống 1 giờ ở 5oC để kiểm tra sự hóa lỏng gelatin, nếu môi trường đông đặc thì ủ lại thêm 24 giờ và kiểm tra lại sự hóa lỏng gelatin. 6.8.7. Kết quả Đối với kỹ thuật 1: vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch TSC và được khẳng định dương tính với môi trường LS được coi là C. perfringenes. Trong các trường hợp khác, các ống được coi là âm tính. Đối với kỹ thuật 2: các vi khuẩn sinh ra các khuẩn lạc màu đen trong môi trường TSC mà không di động, thường khử nitrat thành nitrit, sinh acid và sinh khí từ lactoza và hóa lỏng gelatin được coi là C. perfringenes. C. perfringenes trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo công thức: X=

(C1xR1)+(C2xR2)+(C3xR3)+(C4xR4)

(CFU/g hay CFU/ml)

V x (n1+ 0,1 x n2) x d

C1,2,3,4: Số khuẩn lạc C. perfringenes đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp. V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại

R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp. 6.9. Phát hiện Vibrio cholerae (V. Cholerae) và Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) 6.9.1. Tổng quan về V. cholerae và V. parahaemolyticus Vibrio là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo hình hình dấu phẩy, di động, sống kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S. V. cholerae có phản ứng oxidase (+), ADH(-), LDC(+), lên men được sucrose, có thể tăng trưởng được trong môi trường chứa 0-3% naCl, không phát triển được trong các môi trường chứa 6, 8, 10% muối. V. parahaemolyticus có phản ứng oxidase (+), ADH (-), LDC (+), không lên men sucrose, sử dụng được một số nguồn carbohydrate khác để lên men nhưng không sinh hơi, không tăng trưởng được trong môi trường không có muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong môi trường chứa 10% muối. 6.9.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 7905-1:2008 (ISO 21872-1:2007) dùng để phát hiện V. cholerae và V. parahaemolyticus trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. 6.9.3. Nguyên tắc Phát hiện V. cholerae và V. parahaemolyticus trong thực phẩm được thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu xác định và nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. Từ đây dịch khuẩn được cấy chuyển sang môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc giống V. cholerae và V. parahaemolyticus sẽ được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa. 6.9.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.11. Môi trường và hóa chất Môi trường và hóa chất

Mục đích

APW (Alkaline Phosphat Water)

Tăng sinh chọn lọc

TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose)

Phân lập

NA/TSA

Phục hồi

TSI/KIA

Khẳng định sơ bộ

Đĩa giấy Oxidase Dung dịch NaCl

KOH 3%

Thử String test để khẳng định sơ bộ

Arginine dehydrolase

Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định

Ornithine decarboxylase Lysine decarboxylase TW (Tryptone Water) ONPG Kowac’s

Thuốc thử Indol

HCl và NaOH (KOH) 10%

Chỉnh pH

6.9.5. Các bước tiến hành Bước 1. Tăng sinh Cân 25g mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, thêm 225ml APW, dập mẫu 60 giây, ủ ở 37 C trong 6 giờ và 16-24 giờ. o

Bước 2. Phân lập Từ môi trường tăng sinh, cấy ria lên môi trường thạch TCBS, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Trên môi trường thạch TCBS khuẩn lạc V. cholerae tròn, lớn có màu vàng, khuẩn lạc V. parahaemolyticus tròn, lớn có màu xanh dương. Bước 3. Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ đĩa trên môi trường phân lập TCBS. Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên NA/TSA có bổ sung 1,5% NaCl. Ủ ở 37 ± 10C trong 24 giờ. - Trường hợp 1: từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện. - Trường hợp 2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa không phù hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu, một trong bốn khuẩn lạc này cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện và ngược lại thì kết luận không phát hiện. Bước 4. Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh

Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môi trường thử nghiệm sau: Bước 4.1. Các phép thử nhận dạng giả định Phản ứng tiêu biểu của Phản ứng tiêu biểu của V. parahaemolyticus V. cholerae

Phép thử Tính di động

+

+

Oxidase

+

+

Phép thử

Bước 4.2. Thử nghiệm khẳng định Phản ứng tiêu biểu của Phản ứng tiêu biểu của V. parahaemolyticus V. cholerae

ADH

-

-

ODC

+

+

LDC

+

+

ONPG

+

TSI

Đỏ/vàng, không H2S và khí

Vàng/vàng, không H2S và khí

Indol

+

+

- 0% NaCl

-

+

- 2%

+

+

- 6%

+

-

- 8%

+

-

- 10%

-

-

Thử nghiệm khả năng chịu mặn

Thử nghiệm kiểu huyết thanh Nhóm O (đa giá): O1 và non O1; Kiểu O1 gồm: Inaba, Ogawa, Hikojima; Kiểu non-O1: O139. 6.9.6. Kết quả Phát hiện (hay không phát hiện) V. cholerae hay V. parahaemolyticus trong 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng. 6.10. Định lượng Enterobacteriaceae 6.10.1. Tổng quan về Enterobacteriaceae

Enterobacteriaceae hay họ Vi khuẩn đường ruột là họ vi khuẩn bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện; có thể mọc được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, không có men oxidase; lên men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không; khử nitrat thành nitrit; có thể di động hoặc không, nhưng nếu di động thì có nhiều lông ở xung quanh thân; không sinh nha bào. Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột gồm các loài vi khuẩn vô hại, các loài gây bệnh như Salmonella, Escherichia coli, Yersinia pestis, Klebsiella và Shigella. Các loài gây bệnh thường đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy. Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan khác như tiết niệu, hô hấp, thần kinh… ở bất kỳ loại bệnh phẩm nào cũng có thế gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột. 6.10.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 5518-2:2007 dùng để định lượng Enterobacteriaceae trong các sản phẩm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm. 6.10.3. Nguyên tắc Vi sinh vật hình thành các khuẩn lạc đặc trưng trên thạch glucoza mật đỏ tím và lên men glucoza và cho phản ứng oxidase âm tính. 6.10.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.12. Môi trường và hóa chất Môi trường và hóa chất

Mục đích

SPW (Saline Peptine Water)

Pha loãng mẫu

VRBG (Violet Red Bile Glucose)

Nuôi cấy Enterobacteriaceae

NA/TSA

Phục hồi

Thạch glucoza

Khẳng định Enterobacteriaceae

Thuốc thử oxidase 6.10.5. Quy trình phân tích

           

10g đối với mẫu rắn hoặc 10ml đối với mẫu lỏng + 90ml Saline Peptone Water Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60 giây Dịch mẫu 10-1

Pha loãng

Dịch mẫu 10-2

VRBG 02 đĩa

02 đĩa (VRBG đã đun chảy và làm nguội đến 470C)

Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 370C trong 24 giờ

Đọc kết quả Chọn các đĩa mọc ≤ 150 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp Khẳng định sinh hóa: thạch glucoza và oxidase Tính và biểu thị kết quả Hình 6. 14. Quy trình định lượng Enterobacteriaceae

6.10.6. Các bước tiến hành Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác). Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu. Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2÷3 phút. Bước 2. Pha loãng mẫu

Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp. Bước 3. Cấy và ủ mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri. Lặp lại qui trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần. Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường VRBG, trộn đều bằng cách xoay nhẹ từng đĩa. Khi môi trường đã đông đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10ml của cùng loại môi trường VRBG. Để cho đông đặc lại. Lật úp đĩa và ủ ở 37oC trong 24 giờ. Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy. Các khuẩn lạc đặc trưng có màu hồng đến màu đỏ hoặc đỏ tía (có hoặc không có quầng tủa) trên môi trường VRBG. Đếm các khuẩn lạc Enterobacteriaceae trên những đĩa có số đếm phù hợp. Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy ria lên môi trường dinh dưỡng để thử khẳng định, ủ các đĩa này ở 37oC trong 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy thực hiện các phép thử khẳng định sau: - Phản ứng oxidase: dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh, lấy một phần sinh khối trên môi trường dinh dưỡng và cấy ria lên giấy lọc đã được tẩm thuốc thử oxidase hoặc lên các đĩa bán sẵn. Không dùng que cấy bằng niken/crom. Phép thử được coi là âm tính khi màu của giấy lọc không chuyển sang màu sẫm trong vòng 10s. Cần theo hướng dẫn của nhà sản xuất khi sử dụng đĩa có bán sẵn. - Lên men glucoza: dùng que cấy lấy cùng một loại sinh khối đã được chọn trong phép thử oxidase, cấy đâm sâu vào các ống chứa thạch glucoza, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Nếu màu vàng lan rộng khắp ống thạch thì phản ứng được coi là dương tính. 6.10.7. Kết quả Các khuẩn lạc cho kết quả âm tính oxidase và dương tính glucoza được khẳng định là Enterobacteriaceae. Enterobacteriaceae trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo công thức: X=

(C1xR1)+(C2xR2)+(C3xR3)+(C4xR4) V x (n1+ 0,1 x n2) x d

(CFU/g hay CFU/ml)

C1,2,3,4: Số khuẩn lạc Enterobacteriaceae đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp

V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp. 6.11. Định lượng Coliforms trong thực phẩm bằng phương pháp MPN 6.11.1. Tổng quan về Coliforms Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức an toàn về vi sinh trong thực phẩm, được áp dụng đầu tiên ở Mỹ từ năm 1920. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Sự hiện diện một lượng lớn Coliforms trong thực phẩm là điều không mong muốn, tuy nhiên rõ ràng không thể loại bỏ chúng hoàn toàn khỏi nhiều thực phẩm đông lạnh hoặc tươi sống. Nhóm Coliforms gồm bốn giống là: Escherichia với một loài duy nhất là E.coli; Citrobacter; Klebsiella và Enterobacter. Các bộ tiêu chuẩn về thực phẩm, nước uống luôn có mức giới hạn cho tiêu chuẩn này. 6.11.2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4882 : 2007 (ISO 4831 : 2006) dùng để phát hiện và định lượng Coliforms trong thực phẩm. 6.11.3. Nguyên tắc Cấy vào bộ 3 ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ kép một lượng mẫu thử xác định (nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng) hoặc với một lượng huyền phù ban đầu xác định (nếu các sản phẩm ở dạng khác). Cấy vào bộ 3 hoặc 5 ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ đơn một lượng mẫu thử xác định (nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng) hoặc với một lượng huyền phù ban đầu xác định (nếu các sản phẩm ở dạng khác). Sau đó, trong cùng điều kiện, cấy các ống tiếp theo chứa môi trường với các dịch pha loãng thập phân của phần mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu. Ủ ấm ở 300C hoặc 370C các ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép trong 24 giờ và các ống chứa môi trường nồng độ đơn 24 hoặc 48h và sau đó kiểm tra sự sinh khí hoặc sự mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí trong các ống này. Từ các ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép và các ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn có sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc sinh khí, cấy các dịch cấy vào một loạt các ống chứa môi trường khẳng định.

Ủ ấm các ống ở trên ở 300C hoặc 370C trong 24h hoặc 48h, và sau đó kiểm tra các loạt ống này về sự sinh khí. Tính số có xác suất lớn nhất của Coliforms có trong 1 mililit hoặc trong 1 gam mẫu (tức là số MPN) từ số ống có sinh khí trong loạt ống thử mới. Dùng bảng để xác định số có xác suất lớn nhất. 6.11.4. Môi trường và hóa chất Bảng 6.13. Môi trường và hóa chất Môi trường và hóa chất

Mục đích

SPW (Saline Peptine Water)

Pha loãng mẫu

Lauryl Sulfate Tryptone Broth Nuôi cấy Coliforms (LSB) Brilliant Green Lactose Bile Salt Khẳng định (BGBL) HCl 10% NaOH 10%

6.11.5. Quy trình phân tích

Chỉnh pH

Hình 6.15. Quy trình định lượng Coliforms

6.11.6. Các bước tiến hành Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong với thể tích 10ml/25ml đối với mẫu lỏng của phần mẫu đại diện với sai số cho phép ± 5% cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác). Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml (sai số cho phép ± 5%) vô trùng vào bao PE (hoặc bình tam giác) chứa mẫu. Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác trong 23 phút. Bước 2. Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn 1cm. Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng. Trộn đều bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi thu được độ pha loãng thích hợp.

... Hình 6.16. Kỹ thuật pha loãng mẫu

Bước 3. Cấy và ủ mẫu Lấy 3 ống môi trường tăng sinh nồng độ kép LSB. Dùng pipet vô trùng chuyển 10ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 10ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác vào từng ống trên.

Lấy 3 ống môi trường tăng sinh nồng độ đơn LSB. Dùng pipet vô trùng khác chuyển 1ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở dạng khác vào từng ống nói trên. Lấy 3 ống môi trường tăng sinh nồng độ đơn LSB còn lại. Dùng pipet vô trùng khác chuyển 1ml dịch pha loãng tiếp theo vào từng ống nghiệm nói trên. Trộn đều dịch cấy với môi trường. Đặt các ống môi trường nồng độ kép và đơn LSB vào tủ ấm 37 0C trong 24 ± 2h. Nếu ở giai đoạn này các ống môi trường nồng độ đơn LSB không thấy sinh khí hoặc mờ đục thì ủ tiếp 24 ± 2h. Bước 4. Thử nghiệm khẳng định Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy từ các ống môi trường nồng độ kép và đơn LSB có biểu hiện mờ đục và sinh khí sang các ống môi trường thử khẳng định BGBL. Đặt vào tủ ấm ở 370C trong 24 ± 2h, nếu không sinh khí ở giai đoạn này thì ủ tiếp 24 ± 2h. 6.11.7. Kết quả Đối với mỗi độ pha loãng, đếm tổng số các ống quan sát thấy có sinh khí ở phép thử khẳng định trên BGBL (các ống dương tính) sau 24 ± 2h và sau 48 ± 2h (nếu có). Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng. Tra bảng MPN, suy ra số lượng vi khuẩn Coliforms trên g hoặc ml sản phẩm. Ví dụ 1: Độ pha loãng

N/chất

10-1

10-2

Số ống (+) trên LSB

3

2

1

Số ống (+) trên BGBL

2

2

0

Chỉ số dương tính trên môi trường BGBL là 220, dựa vào bảng 4.2 tra được số vi khuẩn Coliformstrong 1 ml (g) mẫu là 2MPN /ml (g). Ví dụ 2: Trong trường hợp pha loãng nhiều lần thì kết quả tra bảng sẽ nhân với số nghịch của số pha loãng ban đầu. Độ pha loãng

10-3

10-4

10-5

Số ống (+) trên LSB

3

2

1

Số ống (+) trên BGBL

2

2

0

Chỉ số dương tính trên môi trường BGBL là 220, dựa vào bảng 4.2 có kết quả là 2. Vậy ta có số vi khuẩn Coliformstrong 1 ml (g) mẫu là 2 x 103vi khuẩn /ml (g).