Tehnica ELISA Complet [PDF]

Zitiervorschau

Tehnica ELISA

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbet Assay) reprezintă la ora actuală, una din cele mai des folosite metode, de indentificare şi apreciere cantitativă pentru anticorpi, antigene, hormoni, citokine şi o paletă largă de alte molecule, inclusiv peptide sintetice. Tehnica ELISA a fost inventată de un grup de cercetători de la Universitatea din Stokholm condus de Peter Perlmann şi Eva Engval, aceştia publicând primul articol despre ELISA în 1971. Articolul descria aprecierea cantitativă a IgG în serul de iepure folosind fosfatază alcalină ca enzimă de indentificare. Avantaje de siguranţă crescută şi cele economice, faţă de testarea radioimună(RIA) au făcut din tehnica imunoenzimatica ELISA una indispensabilă pentru domeniul medicinei clinice, biologiei si al biotehnologiei. 1. PRINCIPIUL METODEI Principiul metodei, indiferent de tipul de ELISA ales, este în esenţă acelaşi şi se bazează pe reacţia antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de captură este fixat pe un suport solid după care este pus în contact cu o imunoglobulină, un antigen sau respectiv orice moleculă pentru care are specificitate. O enzimă cuplată fie direct de imunoglobulină sau de un alt anticorp anti-imunoglobulină degradează un substrat cromogen incolor producând un compus colorat ce poate fi detectat spectrofotometric la o lungime de undă corespunzătoare. 2. PUNCTE CRITICE ÎN PROTOCOLUL ELISA În implementarea oricărei tehnici ELISA înţelegerea proceselor de bază şi aplicarea corectă a acestora reprezintă un factor esenţial în atingerea obiectivului propus. Etapele fundamentale ale tehnicii sunt reprezentate de: • Prepararea conjugatului Conjugatul este reprezentat de un antigen sau un anticorp cu specificitate pentru molecula de determinat, cuplat cu o enzimă. Cuplarea enzimei se realizează prin cross-linkare sub acţiunea unor agenţi favorizanţi cum ar fi glutaraldehida, di-iso-cianat toluen, p-benzochinona, etc. Deşi un grup mai mare de enzime au fost utilizate de-a lungul timpului, fosfatază alcalină şi peroxidază din hrean(HRP-/7orserac//s/) peroxidase) rămân cele mai populare datorită randamenului oferit prin prelucrarea rapidă a substratului şi a gamei vaste de tehnici de developare existente. Alte enzime folosite în tehnica ELISA sunt (3-galactozidaza, glucozoxidaza, pirofosfataza, etc. în cazul în care conjugatul folosit este reprezentat de un grup enzimăanticorp, anticorpul respectiv trebuie să fie ales în aşa fel încât să recunoască

alt determinant antigenic al moleculei de determinat cum ar fi fragmentul Fc al imunoglobulinei sau alt epitop al antigenului. Există o multitudine de protocoale pentru prepararea conjugatului disponibile în literatură dar realizarea acestora presupune experienţă în domeniu şi timp consumat în plus. Mai convenabilă este achiziţionarea conjugatului de la firme specializate în domeniu. • Fixarea anticorpului sau antigenului de captură pe placă Pentru pregătirea unei determinări ELISA, pregătirea plăcii de reacţie este foarte importantă. Cu toate că diferite tipuri de plăci gata pregătite pot fi achiziţionate de la producători, acestea pot fi adesea scumpe aşa că prepararea plăcilor în laborator reprezintă încă un punct cheie în tehnica ELISA. În general se folosesc plăci de microtitrare cu 96 de godeuri fabricate din material plastic. Majoritatea proteinelor pot fi adsorbite pe suprafeţe din plastic datorită interacţiunilor hidrofobice între structurile proteice nepolare şi structurile nepolare ale matricei polimerului. Există mai multe protocoale de fixare, dar cele mai des folosite, implică incubarea unei diluţii a anticorpului sau antigenului de captură în godeul plăcii de microtitrare într-un tampon carbonat la pH 9-10. Incubarea poate fi de câteva ore sau peste noapte şi se face la 37°C sau la temperatura camerei. Placa de microtitrare astfel pregătită poate fi păstrată la 4°C până la 6 luni. Deoarece fixarea anticorpilor de placă nu este una specifică este necesară blocarea situsurilor de legare nespecifică pentru a preveni fixarea celorlalţi reactanţi de placă în locul interacţiunii acestora cu anticorpul fixat. Blocarea se realizează de obicei prin incubarea cu un tampon de blocare, format de obicei dintr-o proteină inertă şi un detergent neionic. • Incubarea antigenului sau anticorpului de determinat în placă Adăugarea diluţiei de antigen sau anticorp în placa de reacţie reprezintă prima etapă efectivă a tehnicii ELISA şi nu un pas pregătitor. În această etapă molecula de determinat se ataşează prin legături de hidrogen, ionice, interacţiuni hidrofobice şi forţe de interacţiune van der Waals, de anticorpul/antigenul completentar, de captură. Incubarea se realizează de obicei la temperatura camerei timp de 2 ore. Cu toate că numărul de legări specifice în timp de 2 ore este de obicei suficient pentru a obţine un semnal puternic în reacţia cromogenă, saturarea situsurilor de legare(starea de echilibru) este atinsă în aproximatix 5-10 ore, aşa că o incubare mai lungă poate duce la rezultate mai bune. • îndepărtarea reactanţilor liberi din placă (Spălarea) Un pas foarte important în tehnica ELISA îl reprezintă etapele de spălare. Moleculele nefixate fie în timpul aderării la placă fie în timpul legărilor specifice cu anticorpii de captură trebuiesc eliminate din godeuri pentru a nu inhiba legarea reactanţilor ce urmează a fi adăugaţi ceea ce ar conduce la un rezultat eronat. O etapă de spălare presupune încărcarea godeurilor cu o anumită cantitate de tampon de spălare şi îndepărtarea tamponului de spălare după o perioadă scurtă de timp.

Tamponul de spălare este reprezentat în general de o soluţie de tampon fosfat salin(TFS) la care se poate adaugă 0,05% azidă de sodiu(NaN3). Pentru a asigura o spălare bună a plăcii şi implicit o îndepărtare eficientă a reactanţilor liberi din placă sunt necesare mai multe spălări între etapele determinării. La sfârşitul fiecărei etape de spălare, indiferent de numărul de spălări din respectiva etapă, este bine să se elimine orice urmă de tampon de spălare din godeuri. Pentru aceasta, placa este întoarsă şi scuturată energic pe un prosop de hârtie. Foarte importante rămân spălările după fixarea antigenului pe placă, după prima incubare şi după incubarea cu soluţia de conjugat. Numărul de spălări într-o etapă poate fi cuprins între 2 şi 5 dar atât timp cât spălările nu sunt făcute într-o manieră „brutală" un număr mai mare de spălări nu poate decât să crească calitatea tehnicii. Spălarea se poate face manual folosind o pipetă multichannell sau cu un spălător automat ELISA. La folosirea spălătorului automat trebuie acordată atenţie deosebită folosirii unor plăci recunoscute de aparat şi ajustarea setărilor aparatului la tipul de godeuri - cu fundul plat, conic, rotund. • Incubarea conjugatului în placă în funcţie de tipul de ELISA aplicat, adăugarea conjugatului în reacţie presupune legarea acestuia de anticorpul de determinat sau de antigenul specific. Ca şi în etapa de incubare a anticorpilor sau antigenelor de determinat prelungirea timpului de reacţie poate oferii un semnal mai puternic. După incubare, plăcile sunt spălate şi pot fi păstrate la 4°C câteva luni până la adăugarea substratului cromogen. • Adăugarea substratului cromogen Adăugarea substratului cromogen reprezintă o etapă critică în tehnica ELISA deoarece este etapa în care rezultatul pozitiv sau negativ poate fi apreciat. Este de asemenea prima etapă în care putem semnala dacă vreo etapă în protocol a fost executată greşit sau unul dintre reactivi nu funcţionează. Substratul cromogen este adăugat în godeuri şi placa este incubată la întuneric o anumită perioadă de timp, în funcţie de caracteristicile enzimei şi ale substratului, şi reacţia este oprită prin adăugarea unei soluţii de stopare. Timpul de incubare al substratului cromogen în proba cu conjugatul fixat se determină empiric prin observarea modificării culorii amestecului de reacţie până la o intensitate comparabilă cu cea teoretică a produsului final. Conjugatul poate fi reprezentat de o enzimă cuplată cu straptavidină, o proteină tetramerică obţinută din bacteria Streptomyces avidinii, ce are o afinitate foarte mare pentru biotină(vitamina H). Biotina poate fi cuplată prin diverse procedee la un aticorp şi astfel, pe baza afinităţii streptavidinei pentru biotină, conjugatul se poate cupla la anticorpul biotinilat fără a fi nevoie de un conjugat enzimă-anticorp specific. Această procedură este deosebit de importantă în cazul tehnicilor ELISA sandviş în care se dispune de o cantitate mică de anticorpi monoclonali, folosirea complexului stravidinăbiotină amplificând sensibilitatea analizei de 2-5 ori. Deşi această incursiune presupune adăugarea de paşi la protocolul iniţial, efortul este unul recompensat printr-o imbunătăţire considerabilă a sensibilităţii analizei.

• Interpretarea rezultatelor Constă în aprecierea culorii probei. Intensitatea culorii se apreciază mai întâi vizual, pentru determinarea virării de culoare după adăugarea substratului şi stabilirea timpului de menţinere a lui până la stoparea reacţiei. Densitatea optică a fiecărei probei se apreciază la stectrofotometru, la o lungime de undă corespunzătoare. Aprecierea rezultatelor se face prin două metode : 1. Metoda calitativa de apreciere a pozitivităţii probelor, prin calcularea valorilor prag (cut off) faţă de care se raportează absorbanta fiecărei probe. Această valoare este determinată corform formulei: COX+ 2 DS unde CO este valoarea prag (cutt off), X - media valorilor negative, DS este deviaţia standard. Probele cu valoarea absorbantei sub limita prag sunt considerate negative iar cele peste această valoare sunt considerate pozitive. 2. Metoda cantitativa presupune folosirea unor probe standard, de concentraţii cunoscute, cu ajutorul cărora se trasează o curba standard. Aceasta se realizează prin introducerea concentraţilor probelor standard pe axa X a unui grafic, a valorilor densităţilor optice respective pe axa Y şi stabilirea punctelor de intersecţie. Curba standard se defineşte ca cea mai apropriată ecuaţie liniară care să intersecteze cât mai multe din punctele de pe grafic. Folosindu-ne de valorile cunoscute putem extrapola o funcţie, a relaţiei dintre densitatea optică şi concentraţia probei, prin regresie liniară. Ecuaţia obţinută fiind de forma: DO=C*k + DO0 unde DO este densitatea optică a probei, C - concentraţia probei, k constanta, DO0-valoarea absorbantei la o concentraţie a probei egală cu 0. Valoarea lui DO0 poate fi calculată în orice program de calcul computerizat printr-o funcţie ce returnează valoarea unei curbe în punctul de intersecţie cu axa Y. în Microsoft Excel putem folosi funcţia INTERCEPT având ca parametri pe de-o parte valorile concentraţiilor probelor standard şi pe de altă parte valorile densităţilor optice respective. După calcularea lui DO0 putem afla valoare lui k şi de aici prin rezolvarea ecuaţiei obţinem formula de calcul a concetraţiei probelor în funcţie de valoarea densităţii optice : C = (DO - DO0)/k 3. CLASIFICAREA TEHNICILOR ELISA

Datorită multiplelor aplicaţii ale metodei imunoenzimatice ELISA, au apărut diferite protocoale pentru executarea acesteia în funcţie de particularităţile moleculei de determinat şi de modul în care procesele fundamentale ale metodei ELISA se desfăşoară. O prima clasificare a tehnicilor ELISA se poate face referitor la modul de fixare al anticorpului la antigenul de captura, astfel facandu-se distincţia intre fixare competitiva şi necompetitiva.

O altă clasificare se face în funcţie de modul direct sau indirect în care conjugatul se fixează de antigenul sau anticorpul de captura. O categorie separată de tehnici ELISA o reprezintă tehnicile sandviş, în care un antigen este prins intre 2 sau chiar 3 anticorpi, dintre care primul este cel de captură şi ultimul este cel din conjugat. Tehnica ELISA celulara, denumită de unii autori şi cELISA reprezintă o determinare în care antigenul sau anticopul fie el de determinat sau de captură este o moleculă exprimată la suprafaţa membranei celulare Tehnici ELISA folosite curent ELISA INDIRECTĂ Această tehnică este utilă pentru determinarea concentraţiei anticorpilor serici sau din supernatantul celulelor de tip hibridoma. Metoda se pretează situaţilor în care cantităţi de ordinul miligramelor din antigenul purificat sau semipurificat sunt disponibile. Protocolul presupune fixarea antigenului pe fundul plăcilor de microtitrare şi blocarea situsurilor de legare nespecifică, incubarea soluţiilor de testat şi spălarea anticoprilor necuplati din placă după incubare. Soluţia de conjugat (conjugat enzimă-anticorp anti-anticorpul de determinat) se adaugă în reacţie, se incubează şi o noua etapă de spălare inlatură conjugatul nefixat din placă. Se adaugă substratul cromogen şi după parcurgerea timpului de incubare reacţia este stopata. Cantitate de substrat descompus de enzimă este determinată prin citire la spectrofotometru. Valorile densităţilor optice vor fi direct proporţionale cu cantitatea de anticorpi din soluţia testata. ELISA COMPETITIVA DIRECTA Această tehnică se poate folosii pentru a detectarea calitativa şi cantitativa a antigenelor solubile şi este indeosebi utilă cand atât antigenul cât şi anticorpii specifici sunt disponibil în cantităţi de ordinul miligramelor. Protocolul presupune fixare antigenului de captură pe fundul plăcii şi adăugarea în acelaşi timp a conjugatului enzimă-anticorp specific şi a soluţiei de testat care conţine antigene solubile. Cuplarea conjugatului la antigenul de captură este inhibată de cuplarea la antigenul solubil. După incubarea cu amestecul de conjugat şi antigen solubil inhibitor, reactanţii nefixati sunt indepartaţi prin spălare. Se adaugă subtratul cormogen şi după incubare reacţia este stopata. Cantitatea de antigen din soluţia de testat este direct proporţională cu gradul de inhibare al transformării substratului şi poate fi cuantificat prin intrapolare pe o curba de inhibare generată prin realizarea unor diluţii seriale ale soluţiei standard de antigen. ELISA SANDVIŞ Tehnicile care folosesc principiul anticorpi-sandviş ar putea reprezenta unele din cele mai utile determinări imunoenzimatice pentru determinare antigenelor deoarece frecvent oferă o sensibilitate de 2-5 ori mai mare decât alte tehnici de determinare a antigenulei Protocolul presupune folosirea unor anticorpi specifici de captură fixaţi pe placa de microtitrare peste care se adaugă soluţiile de antigen de testat. După incubare antigenul nelegat este inlaturat prin spălare iar în placă se adaugă soluţia de conjugat(conjugat enzimă-anticorp specific pentru alt epitop al antigenului), etapă căreia ii urmează o noua incubare. Conjugatul nelegat este inlaturat prin spălare. Se adaugă substratul cromogen şi după parcurgerea timpului de incubare reacţia este blocata. Cantitatea de substrat

hidrolizat este direct proporţională cu cantitatea de antigen din soluţia de testat. ELISA DUBLU-SANDVIŞ Tehnică folosită în special pentru detectarea anticorpilor specifici în cazul în care se dispune de o cantitate mică de anticorp specific şi nu se dispune de antigen purificat. Tehnica se poate folosi şi pentru investigarea poziţiei epitopilor diferiţilor anticorpi monoclonali formaţi impotriva unui antigen comun. Suportul solid este acoperit cu anticorpi anti-imunoglobulina (imunoglbulina provenită de la speciile imunizate). Soluţia de anticorpi de testat se incubează în placă şi la sfârşit anticorpii nelegaţi sunt inlaturaţi prin spălare. Se adaugă soluţia de antigen şi se incubează. După incă o etapă de spălare se adaugă conjugat enzimă-antigen specific şi se incubează din nou. Conjugatul nelegat este indepartat prin spălare şi se adaugă substratul cromogen. Probele din godeurile în care apare reacţia de culoare sunt desemnate posibil pozitive adică ar putea să conţină anticorpi specifici. Verificarea rezultatelor fals pozitive sau a probelor cu o pozitivitate incertă se poate face prin retestarea probelor respective. Probele vor fi lucrate în patru exemplare în godeuri în care s-a fixat anticorpul de captura. în doua dintre godeuri se va adaugă antigenul iar în celelalte doua doar un tampon de blocare. în toate cele patru godeuri se continua cu adăugarea conjugatului şi a substratului cromogen. Plăcile vor fi citite după o ora. Acesta procedură va elimina rezultatele fals pozitive obţinute pe fondul reacţiei dintre anticorpii de testat cu anticorpii din conjugat. Pentru a distinge rezultatele pozitive dar cu o concentraţia mică de anticorpi specifici plăcile pot fi citite din nou după câteva ore sau zile de la adăugarea substratului cromogen. ELISA CELULARĂ DIRECTA Tehnica este folosită pentru evaluarea prezenţei antigenelor sau a receptorilor de suprafaţa pe membrana celulelor de testat folosind anticorpi existenţi sau alţi liganzi specifici antigenelor membranare. Protocolul presupune determinarea densităţii optime a suspensiei celulare per godeu prin analiza intersectată a diluţiilor seriale şi obţinerea suspensiei celulare prin centrifugare şi resuspendare în volumul determinat. Un volum fix de suspensie celulară este adăugat în godeurile plăcii de microtitrare, placa este centrifugată şi supernatantul este inlaturat. Etapele următoare presupun desprinderea butolunul celular şi resuspendarea celuleror în conjugatul enzimă-anticorp specific anti-molecule membranare. După incubare plăcile sunt centrifugate şi conjugatul nelegat este inlaturat printr-o spălare blânda. La acest moment se adaugă substratul cromogen. In timpul etapelor de incubare în prezenţa conjugatului sau a substratului cromogen placa va fi agitată uşor la interval de 15 minute pentru a asigură o buna interacţiune intre reactanţi. Nivelul de exprimare antigenică la suprafaţa celulară este direct proporţional cu nivelul de transformare a substratului. Celulele eucariote secretă cantităţi variabile de fosfatază alcalina cea ar putea interfera în tehnica ELISA din această cauză o evaluare a cantităţii de fosfatază alcalina exprimată de celulele de testat va fi efectuată intr-un experiment preliminar. Dacă celulele secretă fosfatază alcalina la un nivel ce

ar putea interfera cu protocolul de analiza, enzimă din conjugat va fi inlocuită cu o alta, cum ar fi (3-galactozidaza. Celulele folosite pot fi fixate inainte de analiză dar numai dacă se poate demonstra că celulele fixate işi păstrează antigenicitatea membranare. Fixarea se poate face prin suspendarea celulelor intr-o soluţie de glutaraldehidă 0,5% timp de 30 de minute şi spălare ulterioare. Această tehnică poate fi la fel de sensibilă ca şi citometria în flux în cuantificarea nivelului de exprimare antigenică al unei populaţii celulare dar spre deosebire de metoda citometrică această metoda nu face distincţia intre populaţiile celulare şi prin urmare nu poate fi aplicată unei populaţii heterogene de celule. ELISA CELULARĂ INDIRECTA Această tehnică este concepută pentru detectarea anticorpilor specifici impotriva antigenelor mebranare. Anticorpii anti-antigene membranare sunt detectaţi prin incubarea celulelor cu o soluţie de anticorpi primari de testat. După centrifugare şi spălare pentru inlaturarea anticorpilor nelegaţi, celulele sunt incubate cu o soluţie de conjugat enzimă-anticorp secundar(anticorp anti-anticorpul primar). Plăcile sunt centrifugate şi conjugatul nelegat este inlaturat prin spălare. Se adaugă substratul cromogen. Cantitatea de anticorpi primari din soluţia de testat este direct proporţională cu cantitatea de substrat transformat. 4. MATERIALE Şl REACTIVI NECESARI în TEHNICA ELISA

Tehnicile ELISA, indiferent de tipul folosit, necesită în general acelaşi set de materiale şi reactivi, exceptând evident soluţiile de testat şi anticorpii, respectiv antigenele, complementare care definesc fiecare protocol în parte. Lista de materiale şi reactivi necesari pentru executarea unei analize ELISA de rutina MATERIALE: - pipete automate de volume diferite(1 -500ul) şi vârfuri corespunzătoare; - pipetă multichannel şi vârfuri corespunzătoare; - placi de microtitrare corespunzătoare modelului experimental; - pisetă de plastic; - spectrofotometru; - cuve plastic pentru pipeta multichannel; REACTIVI: - soluţie agent de developare (conjugat enzimă-anticorp/antigen); - soluţie antigen; - soluţie anticorpi de testat; - TFS (tampon fosfat salin); - apă distilată sau deionizata; substrat cromogen NPP(p-nitrofenil fosfat) sau TMB(tetrametilbenzidina); - tampon de blocare a legărilor nespecifice; - soluţie de stopare (NaOH, H2S04) - tampon de spălare;

- tampon de fixare a anticorpilor/antigenelor pe placă; în cazul tehnicilor ELISA celulare(cELISA) la lista de materiale şi reactivi se adaugă: - soluţie de suspensie celulare; - soluţie de conjugat enzimă-anticorp specific - tampon de spălare, ţinut pe gheaţa; - placi de microtitrare cu fundul rotund sau conic;

5. SURSE DE EROARE Teoretic, orice etapă din protocolul ELISA poate reprezenta o sursa de eroare, dar studiile au demonstrat că numai o parte din proceduri pot fi considerate ca surse semnificative de eroare. Aceste proceduri critice sunt pipetarea soluţiei de testat şi a substratului cromogen şi absorbanta inerentă a plăcilor de microtitrare. Acestea sunt totuşi probleme de fineţe pe care le pot intampina pana şi cei cu experienţa în tehnica ELISA. Urmează o trecere în revistă a condiţiilor de indeplinit şi posibilelor surse de eroare: • Toţi reactivii şi plăcile de microtitrare se aduc la temperatura camerei inainte de utilizare; • Deşi tehnica ELISA nu impune condiţii de sterilitate, sticlăria şi consumabilele (vârfuri, cuve, etc.) trebuiesc să fie cât mai curate şi fară urme de detergenţi; • Concentraţia reactivului ce urmează a fi adsorbit pe suportul solid trebuie determinată pentru fiecare cuplu suport-proteina şi pH-ul soluţiei trebuie să fie unul adecvat. • Blocarea situsurilor de legare nespecifică este o etapă foarte importantă în protocol. Tamponul de blocare asigură atât saturarea suprafeţei godeului, prevenind astfel fixarea anticorpilor de detecţie sau a conjugatului de faza solida, cât şi inhibarea legării anticorpilor specifici la antigenul/anticorpul de captura. • Aranjamentul probelor în placă poate influenţa rezultatul determinării. Pentru un protocol de mare precizie este bine să lăsam marginile placii(randurile A şi H) libere pentru a măsura absorbanta plăcii iar probele de control, pozitiv şi negativ, pot fi distribuite aleatoriu în zone diferite ale plăcii (Caciagli şi Verderio, 2003). • Diluţia probei pozitive cercetate trebuie să corespundă unei valori a absorbantei semnificativ pozitive. • Enzima utilizată în conjugat trebuie să aibe o specificitate ridicată şi un randament ridicat în transformarea substratului. Este de asemenea important ca problele de testat să nu conţină substanţe care ar putea intefera cu stabilitatea sau activitatea enzimei. • Concentraţia conjugatului enzimatic trebuie să corespundă celei mai mici valori care asigură vizualizarea complexului format. • Pentru rezultate mai bune, probele se lucrează în duplicat sau chiar triplicat. Media valorilor absorbantei este folosită pentru determinarea concentraţiei probei.

• Manevrarea bruscă a plăcii sau adăugarea prea rapidă a probelor, tamponului de spălare în placă poate duce la desprinderea moleculei de captură de pe suportul solid. • Dacă folosiţi spălătorul automat, asiguraţi-vă că aparatul este potrivit pentru tipul de placă folosit şi acordaţi atenţie adâncimii la care coboară acul de spălare în placă. Setarea neadecvată a aparatului poate duce la aspirarea anticorpilor de captura, zgarierea fundului plăcii sau chiar la stricarea aparatului. Este de preferat să folosiţi spălătorul automat doar în cazul folosirii unor kituri ELISA cumpărate al căror protocol prevede folosirea unui astfel de aparat. Plăcile pregătire în laborator pot fi mai sensibile la mecanica spălătorului automat şi astfel rezultatul protocolului are de suferit. • In cazul folosirii tehnicii cELISA, etapele de spălare necesită o atenţie deosita. Plăcile vor fi mai intai centrifugate la parametrii specificaţi în protocol şi supertanatul trebuie inlaturat cu grija pentru a nu desprinde butonul celular. Adăugarea tamponului de spălare se va face intr-un mod blând. La finalul unei etape de spălare, placa va fi agitată pentru desprinderea butonulu celular şi celulele vor fi resuspendate în reactivul aferent etapei următoare. Tamponul de spălare trebuie să fie ţinut pe gheata. • Concentraţia soluţiei de captură va fi invers proporţională faţa de concentraţia teoretica a soluţiei de testat pentru a prevenii legarea conjugatului sau anticorpilor secundari la molecula de captura.

BIBLIOGRAFIE 1. Bianchi A.T.J., Moonen-Leusen H.W.M, van der Heijden P.J., Bokhout B.A., The use of a double antibody sandwich ELISA and monoclonal antibodies for the assessment of porcine IgM, IgG and IgA concentrations, Veterinary Immunology and Immunopathology, 44, 309-317, 1995 2. Caciagli P., Verderio A., Experimental layout, data analysis, and thresholds in ELISA testing of maize for aphid-borne viruses, Journal of Virological Methods, Volume 110, Issue 2, Pages 143-152, 30 June 2003 3. Clarck M. F., Lister R.M., Bar-Joseph M., ELISA Techniques, Methods in enzymology, voi 118,742-766, 1986 4. Eva Engval, Enzyme immunoassay ELISA and EMIT, Methods in enzymology, voi 70, p. 419-439, 1980 5. Heck F. C, Williams J. D., Pruett J. Interpretation of Spectrophotometric Absorbance Values to Define Results of Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Apr. 1980, p. 398-401 6. John Wiley and Sons, Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA), Unit 11.2 in Current Protocols in Molecular Biology Supplement 34,1996 7. Kricka L.J., Selected strategies for improving sensitivity and reliability of immunoassays, Clinical Chemistry, 40, 3, 347-357, 1994 8. Kuby J., Goldsby R., Kindt T., Osborne B., Immunology , 5th edition, 2003 9. Le Goff C, Thiaucourt F., A competitive ELISA for the specific diagnosis of contagious bovine pleuropneumonia (CBPP), Veterinary Microbiology, Volume 60, Issues 2-4, Pages 179-191,28 February1998 10. Lequin Rudolf M. , Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Clinical Chemistry 51, No. 12, 2005

11. Michael Steinitz, Lea Baraz, A rapid method for estimating the binding of ligands to ELISA microwells, Journal of Immunological Methods, 238, 143-150, 2000 12. Mire-Sluis A.R., Gaines-Das R., Thorpe R. Journal of Immunological Methods, Volume 186, Issue 2, Pages 157-160, 26 October 1995 13. Olinescu A., Dolganiuc A., Imunologia practica în clinica şi experiment, subcapitolul: Analiza imunoenzimatica ELISA, pg. 153-157, Ed. Viaţa Medicala Romaneasca, Bucureşti, 2001 ' 14. Osuchowski M. F., Remick D. G., The repetitive use of samples to measure multiple cytokines:The sequential ELISA, Methods 38, 304-311, 2006 15. Plebani A., Avanzinia M. A., Massaa M. and Ugazioa A.G., An avidin-biotin ELISA for the measurement of serum and secretory IgD, Journal of Immunological Methods, Volume 71, Issue 2, Pages 133-140, 6 July 1984 16. Qian W., Yao D., et al., Immobilization of Antibodies on Ultraflat Polystyrene Surfaces, Clinical Chemistry 46: 1456-1463, 2000 17. Satoh A., Kojima K., Koyama T., Ogawa H., Matsumoto I., Immobilization of Saccharides and Peptides on 96-Well Microtiter Plates Coated with Methyl Vinyl Ether-Maleic Anhydride Copolymer, Analytical Biochemistry, Volume 260, Issue 1, Pages 96-102, 15 June 1998 18. Sittampalam S., Smith W.C., et al., Application of experimental design techniques to optimize a competitive ELISA, Journal of Immunological Methods, 190, 151-161, 1996 19. Voller A., Bartlett A. and Bidwell D.E., Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques, Journal of Clinical Pathology,31, 507-520, 1978 20. Wilco de Jager, Ger T. Rijkers, Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: A comparison, Methods, Volume 38, Issue 4, Pages 294-303, April 2006 21. Yuzuru Hayashi et al. , An expression of within-plate uncertainty in sandwich ELISA, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 36, 225229, 2004