Practica Nº1 Fisiologia de La Membrana Semipermea [PDF]

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA PRÁCTICA Nº1 Y 2 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE FISIOLOGIA HUMANA OBTENCION DE MUESTRAS BIOLOGICAS PARA EXPERIMENTACION EN ANIMALES Y SERES HUMANOS. MANEJO DE ANIMALES DE EXPERIMENTACION FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE FRAGILIDAD OSMÓTICA BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE FISIOLOGIA HUMANA INTRODUCCIÓN Bioseguridad: Es el conjunto de normas preventivas para proteger la salud y brindar seguridad al personal que trabaja en salud frente a los diferentes riesgos producidos por agentes: biológicos, físicos, químicos y mecánicos. Agentes de riesgo o causantes de daño: agentes biológicos trasmitidos por ingesta, inhalación, inoculación, y por contacto directo a través de piel y mucosas. Agentes físicos y mecánicos: Temperaturas extremas, radiaciones ionizantes, contacto y conexiones eléctricas, defectuosas, vidrios rotos. Agentes químicos: corrosivos, tóxicos, carcinogénicos, inflamables, explosivos. Riesgo Biológico: es la probabilidad de infectarse con un agente patógeno (agente patógeno se llama a toda aquella noxa que es capaz de producir una enfermedad en la actividad laboral. Exposición: Es un contacto que implica riesgo con un patógeno capaz de trasmitirse por la vía donde se está produciendo la exposición. OBJETIVOS Promover la salud de los trabajadores de salud mediante la vigilancia de las actividades de cada área de trabajo en salud. Prevenir las exposiciones a fluidos con riesgo biológico y vigilancia del cumplimiento de las normas de bioseguridad. Promover, sugerir y establecer políticas que apoyen la educación continua de los trabajadores de salud. PRACTICAS DE SEGURIDAD Todo el personal que trabaja en el laboratorio fisiológico o ingresa a él debe seguir reglas de seguridad. Las normas de seguridad son obligatorias y son esenciales porque consisten en prácticas que otorgan seguridad y protección al personal, alumnos e investigadores que trabajan en los laboratorios bioquímicos, fisiológicos, bacteriológicos, biológicos, químicos, etc. PRACTICAS GENERALES Se prohíbe fumar, comer y aplicarse cosméticos, para evitar la diseminación de agentes infecciosos o productos químicos tóxicos de las mallas hacia la boca. Con el fin de evitar el contacto con agentes infecciosos o diseminarlos, debe utilizarse alguna prenda protectora sobre la

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA ropa, como el guardapolvo, mandil, o la bata de laboratorio. Estas prendas de protección externa no deben usarse fuera del laboratorio. Los zapatos han de ser de punta y talón cerrado. Se recomienda el uso de lentes de protección o protectores para la cara a las personas que usan lentes de contacto, en particular si hay alto riesgo de vapores, aerosoles o salpicaduras. Se prohibe estrictamente pipetear con la boca todo tipo de muestra, reactivo, agua o cualquier otra sustancia biológica deberán usarse pipetas manuales automáticas. DERRAMES Es necesario desarrollar y tener políticas escritas y procedimientos para instruir a los alumnos y a los empleados acerca de la manera de manejar derrames químicos y biológicos. Existen en el comercio estuches con insumos para ambos tipos de derrames. LAVADO DE MANOS El lavado de manos es una de las principales maneras de evitar la diseminación de agentes infecciosos. Aunque se utilicen guantes, el lavado de manos es necesario. Porque es posible que estos tengan huecos microscópicos. Al tratar con pacientes, es necesario lavarse las manos tras atender a cada uno de ellos aunque se utilicen guantes. LIMPIEZA No debe permitirse que la basura, los desperdicios biológicos, infecciosos. y el material de vidrio sucio se acumulen en grandes cantidades en el laboratorio. Los recipientes con muestras de desecho y agentes etiológicos deben taparse cuando no se estén empleando. Es necesario limpiar con frecuencia las superficies de trabajo con algún desinfectante al comenzar y terminar cada turno. ETIQUETAS Y SEÑALES Todos los recipientes que contienen productos químicos deben etiquetarse con claridad, indicando el nombre del producto y cualquier precaución para su manejo. Las áreas en que se almacenan productos inflamables, peligrosos o tóxicos y carcinógenos, o en las cuales se utilizan deben estar marcadas claramente. Las áreas en que se almacenan o analizan sangre o líquidos corporales deben estar marcadas claramente con el signo de riesgo biológico. DESECHO DE DESPERDICIOS AGUJAS Y OBJETOS PUNTIAGUDOS. Todas las agujas desechables y demás objetos punzantes deben colocarse en un recipiente resistente a la perforación y a prueba de fugas, marcado con el símbolo de riesgo biológico. Estos recipientes se descartan, siguiendo las políticas de la institución, cuando están llenos hasta la mitad o las tres cuartas partes. La mayoría de las instituciones incineran los recipientes que contienen objetos punzantes. Inmediatamente después de usada una aguja deberá incinerarse y para ello existen en la actualidad equipos especiales incineradores de agujas llamados destructores de agujas. EXTINTORES Ó EXTINGUIDORES PARA INCENDIOS. CLASES.

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA Los extintores contra incendios contienen diferentes sustancias y están marcados según el tipo de incendio para el que deben emplearse. Los extintores clase A están llenos de agua y nunca deben utilizarse para incendios de tipo eléctrico, ya que el agua puede conducir la electricidad de regreso a la persona que tiene el extintor en las manos. Los extintores clase B contienen productos químicos secos, espuma acuosa que forma una capa (AFFF) o dióxido de carbono. Los extintores clase C están llenos de dióxido de carbono o Halon; los de la clase D de un polvo seco especial que contiene un enlazante termoplástico que permite que el agente forme una corteza sólida al calentarse. Hay extintores que pueden emplearse para Incendios de clases A, B y C. Contienen un polvo seco y pueden utilizarse con eficacia y seguridad para las tres clases de incendios. Generalmente este tipo de extintores es el que se compra para uso en el hogar o en las oficinas. Sin embargo, si se emplea para incendios de equipo eléctrico en el laboratorio, es probable que sea difícil o imposible eliminar posteriormente dicho polvo de los instrumentos. Por tanto, se recomiendan los extintores de dióxido de carbono para incendios de equipo eléctrico. CAUSAS DE INCENDIO Y SU PREVENCIÓN Las causas fundamentales de incendios en el laboratorio son descuido, falta de conocimiento acerca de los productos químicos que se utilizan, permitir que se efectúen procedimientos sin la vigilancia adecuada, sobrecarga de circuitos eléctricos, llamas de gas abiertas. En caso de que se produzca un incendio es necesario ponerse en contacto con el departamento de bomberos y solicitar ayuda antes de intentar extinguirlo, Se pierde tiempo importante cuando se trata de apagar el incendio primero, y después se solicita ayuda. Los pasos que deben seguirse en caso de incendio son: 1. Rescatar a cualquier persona que se encuentre en peligro. 2. Aislar el incendio cerrando alguna puerta. 3. Solicitar ayuda. 4. Intentar extinguido. 5. Evacuar las instalaciones en caso de que no se pueda apagar el fuego SEGURIDAD BIOLOGICA Protección Personal Se sabe que las personas que laboran en los laboratorios médicos en general, fisiológicos, bacteriólogos, biólogos y otros relacionados con la salud en general, conforman un grupo de alto riesgo para infecciones por virus de hepatitis B relacionadas con el trabajo y virus de inmunodeficiencia humana (HIV). Entre las recomendaciones se aconseja que "se tomen precauciones congruentes al manejar sangre y líquidos corporales de todos los pacientes y las muestras que se obtengan". Esto se conoce como precauciones universales. Las recomendaciones incluyen el uso de equipo para protección personal, como guardapolvos, mandiles, batas, guantes descartables y protectores para los ojos al manipular sangre y líquidos corporales en el laboratorio. Se recomienda usar equipo de protección personal para manejar todas las sustancias biológicas y animales. Deben tratarse todas las secreciones y excreciones corporales como potencialmente infecciosas, ya que hay otras enfermedades además de HBV y HIV que se transmiten a través de diversos líquidos del organismo humano y de los animales.

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA La regla final indica que el patrón debe proporcionar equipo de protección personal que no permita que los materiales potencialmente infecciosos entren en contacto con la ropa, la piel, los ojos y la boca del trabajador en condiciones normales de uso. La regla también indica la manera correcta de disponer de objetos punzantes y otros desperdicios con riesgo biológico y señala la necesidad de administrar la vacuna de HBV y el tratamiento tras alguna exposición a todos los empleados que corran este riesgo. Además de describir equipo de protección personal, dicha norma incluye instrucciones para el lavado de manos, transporte de muestras, uso de pipetas, forma de recoger derrames, desechos de desperdicios y descontaminación del equipo. Derrames Es necesario que las personas que limpian algún derrame biológico utilicen guantes descartables y bata de laboratorio. Se colocan toallas desechables sobre el derrame y se vacía desinfectante sobre ellas. Tras dejarlo reposar algunos minutos. Se recoge la sustancia y el desinfectante con material absorbente. A continuación se coloca el material contaminado en un recipiente para riesgos biológicos: bolsas plástico grueso color rojo en el Perú y bolsa de color negro para basura doméstica. Después de absorber la mayor parte de material, el área se limpia con un desinfectante de fuerza intermedia o alta, por ejemplo, dilución de Lejía 1:10. La solución desinfectante se absorbe con material desechable. El área se enjuaga con agua y se seca para evitar que quede resbalosa. SEGURIDAD QUIMICA Información que contiene la hoja de datos de seguridad para cada material o grupo de sustancias relacionadas, de uso en Laboratorio fisiológico y otros Laboratorios biológicos. 1. Identificación del producto químico (nombre químico, y sinónimo y/o nombre vulgar.) 2. Ingredientes peligrosos 3. Datos físicos 4. Datos de incendios y explosiones 5. Información de riesgos para la salud 6. Datos de reactividad 7. Procedimientos para derrames, fugas y desecho 8. Información de protección personal. 9. Precauciones especiales y comentarios MANEJO DE ANIMALES El personal de laboratorio puede recibir de casi todos los animales (conejos. cobayas. ratones), pequeños arañazos cuando el animal trata de escapar; pero raras veces intenta éste lesionar al operador. En el caso de las ratas, las cosas cambian; pueden realizar muchos esfuerzos para escapar y producir mordeduras peligrosas. Es indispensable que aun los pequeños arañazos de animales se traten en forma adecuada; si el animal ha sido inyectado con material patológico la naturaleza de dicho material puede obligar a tomar ciertas medidas para proteger al personal contra las consecuencias de la mordedura.

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA Debe reportarse de inmediato, y tratarse médicamente cualquier lesión. TOMA DE MUESTRAS DE SANGRE La muestra de sangre para las pruebas de laboratorio pueden tomarse en diferentes sitios: capilar o periférica, venosa y ocasionalmente arterial. Esta muestra se utiliza para la valoración de diversos parámetros del medio interno que puede llevarse a cabo en sangre completa o una fracción de la misma, sea plasma o suero. Deben tomarse precauciones en todos los casos por lo que la obtención y manipulación de las muestras se harán con guantes quirúrgicos descartables. SANGRE CAPILAR O PERIFÉRICA La sangre que suele llamarse capilares, al menos parte arteriolar se obtienen por o general de: a). La yema del dedo; b). el borde del lóbulo de la oreja; y c). el talón en los niños pequeños En cualquier de estos sitios el área debe de estar tibia (ni fría ni congestionada) ya que de otra manera la composición de la sangre varia por la éxtasis o la dilución. Sin embargo debe recordarse que aun ejecutando una buena toma, los valores de los parámetros difieren entre la sangre capilar y la venosa. Usar alcohol y lancetas descartables. TECNICA 1. Limpie la piel con una torunda de algodón con alcohol de 70º o con otro desinfectante adecuado y deje secar. 2. Haga una punción profunda (2- 3 mm con una lanceta o aguja estéril desechable. La punción debe efectuarse de un golpe y rápidamente para que resulte casi indolora (sobre todo el borde del lóbulo de la oreja). 3. La primera gota de sangre se elimina porque contiene desechos tisulares. La sangre no debe exprimirse o se obtendrá una muestra diluida; peso sí puede hacerse presión a distancia del sitio de la punción. Tras concluir la toma de la muestra se entrega al paciente una torunda limpia que debe presionar sobre el sitio de lesión. SANGRE VENOSA Por lo general se utiliza una de las venas de las fosas ante cubitales, pero con frecuencia también se puncionan las venas de las manos las muñecas o cualquier vena visible de buen calibre (en los pacientes prematuros es posible punzar las venas del cuero cabelludo o la yugular externa o la femoral) Las venas deben examinarse cuidadosamente; si son profundas y no se palpan con facilidad se descartan. Para facilitar el examen se usa un torniquete de jebe. EQUIPO. Las muestras se toman previa desinfección con alcohol y con jeringas desechables con aguja de calibre 19 o 20 x1 (cuanto más bajo es el número mas es el grosor de la aguja, las de menor grosor pueden hemolizar la muestra y las de mayor grosor se reservan para la obtención de sangre para transfusiones). TECNICA 1. El paciente debe estar acostado o sentado cómodamente y con el brazo apoyado en una mesa o soporte. Algunas pacientes – en especiales los jóvenes – pueden sufrir malestar o incluso desmayarse. Por tanto manténgase alerta ante señales como palidez o piel fría.

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA 2. Coloque el torniquete con un medio lazo para poder retirarlo fácilmente. No efectué demasiada presión ya que puede detener la circulación arterial. 3. Pida al paciente que abra y cierre el puño un par veces para obtener mayor distensión de las venas. Algunas veces las venas no se ven con claridad pero se palpan. 4. Una vez elegido el sitio de punción se procede a limpiar con alcohol y se deje secar. Enseguida se fija la vena sosteniendo el brazo del paciente con la mano mientras se estiran y comprimen con el pulgar y los tejidos blandos situados justo debajo del escogido para punzar. La jeringa se sujeta entre el pulgar y los tres últimos dedos de la otra mano y sus dorsos se apoyan con el brazo del paciente. El dedo índice se coloca sobre el casquillo de la aguja y sirve como guía. El bisel de la aguja debe quedar hacia arriba. 5. Cuando la vena es prominente se punza en forma directa con la aguja colocada horizontal y dirigida en paralelo a la vena. Al perforar la pared se percibe una sensación de crujido. Cuando el acceso a la vena no es tan perceptible, la punción se efectúa en dos tiempos: primero se punza la piel y luego la vena. Para que la sangre entre a la jeringa se hace una tracción ligera sobre el embolo evite realizar una tracción excesiva porque la vena puede contraerse e impedir el paso de la sangre hacia la jeringa. Algunas veces al puncionar se traspasa la vena; entonces debe retirarse ligeramente la aguja al verificar la entrada de la sangre. Esta operación puede producir hematomas; si se advierte señales de extravasación de sangre a los tejidos, retire la aguja de inmediato y aplique presión local. 6. Antes de retirar la aguja, quite el torniquete y pida al paciente que abra el puño. En cuanto se adquiera la destreza necesaria, esta última operación se efectúa cuando la sangre termina de entrar a la jeringa. El paciente debe mantener la presión con una torunda en el sitio de la punción y el brazo flexionado durante unos minutos para evitar hematomas. 7. Tras la obtención de la sangre, se retira la aguja de la jeringa con una pinza de metal y con un movimiento de torsión y con la ayuda de otra pinza se coloca el extremo del embolo sobre la pared interna del tubo. Nunca realizar el reenfundamiento de la aguja sin pinzas. La sangre se vacía suavemente para evitar que se forme espuma y produzca hemólisis. Si la determinación que se va efectuar exige sangre completa o plasma la muestra se coloca con un tubo con anticoagulante y se invierte con suavidad varias veces para mezclar. Si en cambio se desea obtener suero, la sangre se coloca en tubo, de preferencia de 37 ª C para que el coágulo se forme más rápido. La retracción del coágulo puede acelerarse separando de la pared del tubo con un aplicador de madera. Es imperativo usar destructores de agujas en todos los casos. USO DE VACUTAINER En muchos laboratorios se utilizan actualmente los tubos Vacutainer para obtener las muestras de sangre venosa, en lugar de las jeringas. Los tubos están sellados con un tapón de goma y extraen un volumen de sangre predeterminado. La aguja desechable se enrosca en el tubo de manera que el tapón de goma alcancé justo la línea guía. La aguja más corta se mete dentro del tapón de goma, pero no penetra y por lo tanto no rompe el vació. Una vez que se tiene la certeza de que la aguja ha abordado la vena, se empuja el tubo hasta el fondo del sujetador lo que rompe el vacío y la sangre entra al tubo. Cuando el flujo cesa, el tubo se retira y si se desea puede sustituirse por el otro para obtener otra muestra .No debe usarse el Vacutainer para dosaje de gases arteriales. SANGRE ARTERIAL Para la determinación de gases se requiere punción arterial. En esos casos la arteria se ubica localizado el latido por palpación muy cuidadosa. La punción es necesariamente más profunda y se requiere mayor cautela para impedir hematomas. Debe practicarla el médico.

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA ANTICOAGULANTES Los cuatro anticoagulantes más usados son una mezcla de oxalato amoniaco y potasio, citrato trisodico, Sequestrene (EDTA) y heparina. Los tres primeros impiden la coagulación al sustraer el calcio del plasma sanguíneo por precipitación o fijación en forma no ionizada, e inhibe la activación de los factores de la coagulación. El citrato trisodico se utiliza para impedir la coagulación de la sangre destinada a transfusiones. El Sequestrene y la heparina pueden servir para el mismo fin, pero no la mezcla de oxalatos porque es toxica. La mezcla de oxalato de amonio y (6partes) y oxalato potasio (4partes) en la cantidad de 2 mg/ml de sangre no afecta el volumen globular medio y puede usarse para hemoglobina, hematocrito y recuentos globulares. En frotis de sangre su utilidad está limitada a los primeros minutos por que se desarrollan con rapidez formas dentadas en los hematíes, vacuolización en el citoplasma de los granulocitos y artefactos en los núcleos de linfocitos y monocitos y otras deformidades. Asimismo, la sangre tomada con esta mezcla de anticoagulantes no puede emplearse para determinados químicas de nitrógeno ni potasio. El citrato trisódico en solución acuosa al 3.8%, se mezcla a razón de 1/9 con sangre para investigaciones de coagulación. El Sequestrene (EDTA) se emplea en una concentración de 1 a 2 mg/ml de sangre. La sal di sódica o di potásica de Etilendiaminotetracetato es tal vez el anticoagulante que más se emplea para el recuento de las células sanguíneas. Hay que mezclarlo minuciosamente con la sangre. Para el estudio del hematocrito es equiparable al oxalato y para estudios morfológicos lo supera, ya que impide la deformación y artefactos incluso después de un reposo prolongado. Se consiguen frotis aceptables aun cuando hayan pasado 2 o 3 hs y hasta 24 hs si la sangre se refrigera. También es posible realizar el recuento de plaquetas aun después de unas pocas horas. La heparina, a razón de 0.1 a 0,2 mg/ml de sangre, no afecta el tamaño corpuscular ni el hematocrito. Es el mejor anticoagulante para prevenir la hemólisis y para las pruebas de fragilidad osmótica. No resulta satisfactoria para recuentos de leucocitos o cuando han de prepararse frotis (o extensiones de sangre porque en este segundo caso produce un fondo azul en las preparaciones teñidas con el colorante de Wright. CUIDADO, INOCULACIÓN Y SANGRIA DE LOS ANIMALES y DIAGNOSTICO DE SUS ENFERMEDADES FUNDAMENTOS 1. Para determinadas investigaciones de laboratorio fisiológico es indispensable disponer de los animales apropiados. 2. Los animales habrán de ser sanos y seleccionados con cuidado y estar instalados con limpieza y comodidad, así como adecuada y suficientemente alimentados. 3. Pocos métodos de inyección y sangría producen mayor dolor que los similares empleados en los seres humanos, y todos los métodos operatorios de importancia habrán de efectuarse con el animal anestesiado. Por otra parte estos animales habrán de ser tratados con la solicitud que merecen por los servicios que prestan a la humanidad. ALOJAMIENTO DE LOS ANIMALES. Las jaulas para los animales pequeños, como conejos, cobayos, ratones y ratas deben construirse y disponerse de modo que los animales se conserven sanos y cómodos. Se evitara atestar las jaulas con lotes demasiados numerosos.

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA Los animales recién llegados al laboratorio deberán ser examinados cuidadosamente, a fin de comprobar que no están enfermos, antes de colocarlos en las jaulas de los normales. Si se dispone de suficiente espacio será conveniente guardarlos en aislamiento durante una semana a diez días. Las jaulas se construirán de modo que permitan la limpieza y desinfección más completas y posean suficiente luz y ventilación, deben construirse expresamente para fines experimentales fisiológicos. Debe disponerse de compartimientos, y jaulas de aislamiento para los animales inoculados y deberán estar solos, en jaulas aparte, para protegerlos de las molestias o herida que entre ellos pudieren infligirse. Los compartimientos de animales deben estar bien iluminados y ventilados .Se procurara conservar a una temperatura uniforme, día y noche. IDENTIFICACION DE LOS ANIMALES La práctica de rotular las jaulas sirve para la distinción de los lotes numerosos de animales aun cuando para conseguir un registro completo conviene numera a cada animal y anotar los detalles relativos al sexo, descripción, etc. Chapas. Para los conejos y cobayos pueden emplearse unas pequeñas chapas de aluminio que se fijan a una oreja de animal por medio de una grapa o un hilo metálico que perfore estos órganos y atraviese también los orificios de las chapas. Para los animales de mayor tamaño pueden adquirirse identificadores especiales. Descripción. Cuando se use únicamente este método de identificación y haya que alojar juntos en una misma jaula varios animales, deben seleccionarse los que presenten señales o colores diferentes .Para facilitar el registro debe disponerse de sellos de goma con dibujos de ratón, cobayo o conejo. Este método se utiliza junto con el de la chapa metálica a fin de asegurar la identificación si la chapa se perdiera. Asimismo, debe anotarse cuidadosamente cualquier deformidad o seña particular .El sexo debe registrarse en la descripción (macho y hembra). Señales o marcas para identificación de animales Los animales pequeños, como ratones y ratas, pueden marcarse en el cuerpo o en la cola pintándose la piel y el pelo con colorantes. PREVENCION Y TRATAMIENTO DE LOS ACCIDENTES EN LOS LABORATORIOS DE FISIOLOGIA Las personas que trabajan en los laboratorios fisiológicos se hallan rodeadas de múltiples peligros, de modo especial a causa de las infecciones que pueden contraer durante el manejo de los animales de experimentación, o durante el trabajo mismo con ellos como actos quirúrgicos, exposición de órganos, u otros trabajos que así lo demanden los experimentos fisiológicos, o al manipular productos sépticos durante las investigaciones o sufrir quemaduras o la deglución accidental productos biológicos o producirse a heridas consecutivas rotura de cristales ,etc. PREVENCION DE LOS ACCIDENTES

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA Deben emplearse siempre guantes de goma descartables en los experimentos, el investigador ha de tener especial cuidado en no herirse los dedos con las agujas y evitar cortarse con los instrumentos afiliados, como bisturís, sierras, etc. Deben usarse pipetas automáticas manuales de volúmenes regulables con punteras descartables. Las pipetas de vidrio, en caso de ser usadas, aunque no es recomendable hacerlo, habrán de tener la parte bucal tapada con algodón de modo obligatorio y tendrán bulbos de goma para aspiración, y nunca aspirar con la boca. Pueden utilizarse asimismo diversas jeringas. De igual modo, al aspirar ácidos, álcalis y otras soluciones peligrosas por medio de pipetas, deben usarse pipetas con bulbos de goma de aspiración y nunca hacerlo con la boca. Vale la redundancia, el alumno deberá tomar todas estas preocupaciones con el máximo cuidado. Las manos del operador habrán de estar libres de cortes y escoriaciones, particulares en la proximidad de las uñas, debiendo lavarse cuidadosamente con jabón y agua y luego sumergirlas en una solución desinfectante antes y después de haber manipulado productos infecciosos y antes de las comidas. Una vez terminado el experimento deberá lavarse la superficie de las mesas con una solución desinfectante. Las pipetas, tubos de ensayo y demás instrumentos empleados en la experimentación fisiológica también se desinfectarán con una solución lisol o tricresol al 2 por 100, o se esterilizarán inmediatamente por ebullición durante 20 minutos o autoclave que es lo ideal. Los recipientes, láminas portaobjetos u otro material contaminado con orina ò heces ò secreciones biológicas de los animales, ò contaminados con productos biológicos humanos, se someterán a un proceso de desinfección inmediata. Los calentadores y demás aparatos eléctricos se comprobarán con frecuencia para verificar la exactitud de su funcionamiento, reparando sin pérdida de tiempo sus averías a fin de evitar cortos circuitos incendios. El mechero de Bunsen no debe utilizarse nunca en la proximidad de materias inflamables .Siempre se verificará que la llave de mechero quede bien cerrada antes de retirarse del laboratorio, igualmente se asegurará de cerrar la llave del balón contenedor del gas ó la llave general del gas del laboratorio de ser el caso. El éter, el alcohol y similares deben mantenerse alejados de todo posible contacto eléctrico. FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE FRAGILIDAD OSMÓTICA INTRODUCCIÓN Uno de los fenómenos más comunes en el universo es la difusión, que por definición es el flujo de materia o energía de una zona con mayor concentración a una con menor concentración. La difusión al ser un fenómeno natural, puede adoptar varias formas tales como difusión calorífica (energética), osmosis y diálisis (en la materia). Siempre que tengan un gradiente de concentración con relación al medio que les rodea. Las soluciones presentan el fenómeno de la osmosis cuando se separan mediante una membrana semipermeable (que permite el paso del disolvente, pero no así del soluto), y cuyas concentraciones son distintas. En éstas condiciones se observa que el disolvente tiene tendencia a atravesar la membrana en el sentido de la disolución cuya concentración es más elevada, lo que tiene como consecuencia un aumento de la cantidad de disolvente en la parte que contiene la disolución más concentrada y una disminución de la cantidad de éste en el lado en que se encuentra la disolución cuya concentración es menor. De tal forma que cuando el volumen de la

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA solución más diluida disminuye, el volumen de la solución más concentrada aumenta. El efecto continúa hasta que la presión hidrostática consigue equilibrar dicha tendencia. Por lo tanto, se dice que la solución más diluida ejerce una presión a la que se da el nombre de presión osmótica. Este equilibrio entre la presión hidrostática y la presión osmótica permite determinar la magnitud de ésta a partir de la medición de altura que alcanza el disolvente. El proceso osmótico depende de varios factores que determinan su eficacia; los dos principales son la solubilidad del soluto en el disolvente, y la naturaleza de la membrana a utilizar. A su vez, la solubilidad se encuentra determinada por los enlaces químicos que cada componente en la disolución presenta, la entalpía y la entropía de los factores y los cambios estructurales que presenten los iones con que se esté trabajando. Por ello, antes de preparar la disolución deben conocerse la solubilidad del soluto, tener en cuenta que la solubilidad aumenta con la temperatura, que algunas sustancias absorben o desprenden energía en forma de calor al ser disueltas y que cuando se mezcla un soluto con el solvente puede ocurrir una concentración o aumento del volumen. En tanto que las membranas a utilizar, son más permeables con las soluciones que tengan orígenes parecidos, así una membrana animal tendrá preferencia por una solución de lípidos, mientras que una membrana de origen vegetal facilitará la acción de una solución de naturaleza glúcida. Todas las células del organismo están rodeadas de una membrana limitante, a través de la cual obtienen sus alimentos y el oxígeno y excretan sus productos de deshecho y el C02 resultante de su metabolismo. La membrana celular tiene propiedades bien establecidas: Solo deja entrar las sustancias que se necesitan y solo deja salir las secreciones, los productos de desecho y las sustancias no indispensables, en otras palabras, es semipermeable. Estas funciones las realiza a través de diversos mecanismos, que hemos revisado con detalle en las clases teóricas. En la presente práctica trataremos de una de ellas que es la Osmosis. En general la osmosis significa el paso de líquidos a través de una membrana semipermeable. Cuando dos soluciones de diferentes concentraciones están separadas por una membrana semipermeable, el solvente y los solutos atraviesan la membrana siguiendo las leyes que rigen el fenómeno de la ósmosis. El agua es transportada a través de la membrana celular por una fuerza hidrostática llamada presión osmótica, dicho de otro modo, la presión osmótica es la fuerza de atracción que ejercen las partículas sobre el agua atrayéndola. La osmolaridad depende del número de partículas que se encuentran es solución. La Unidades de Osmolaridad son el Osmol /Kg H2O, en medicina usamos el sub múltiplo mili Osmol /Kg H20. MARCO TEÓRICO OSMOSIS La ósmosis es un fenómeno físico relacionado con el movimiento de un solvente a través de una membrana semipermeable. Permite el paso de disolventes, pero no de solutos), desde una disolución más diluida a otra más concentrada. Tal comportamiento supone una difusión simple a través de la membrana, sin gasto de energía. La ósmosis del agua es un fenómeno biológico importante para el metabolismo celular de los seres vivos.

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El agua y la ósmosis El agua es la molécula más abundante en el interior de todos los seres vivos, y mediante la ósmosis es capaz de atravesar membranas celulares que son semipermeables para penetrar en el interior celular o salir de él. Esta capacidad depende de la diferencia de concentración entre los líquidos extracelular e intracelular, determinada por la presencia de sales minerales y moléculas orgánicas disueltas. - Medios acuosos hipertónicos o hipotónicos Los medios acuosos separados por membranas semipermeables pueden tener diferentes concentraciones, y se denominan: + Hipertónicos: elevada concentración de solutos Son hipertónicos, los que tienen una elevada concentración de solutos con respecto a otros en los que la concentración es inferior.

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+ Hipotónicos: baja concentración de solutos Son hipotónicos los que contienen una concentración de solutos baja con respecto a otros que la tienen superior. - Presión osmótica y proceso osmótico Las moléculas de agua en la ósmosis difunden desde los medios hipotónicos hacia los hipertónicos, provocando un aumento de presión sobre la cara de la membrana del compartimento hipotónico, esta presión se denomina presión osmótica. Como consecuencia del proceso osmótico se puede alcanzar el equilibrio, igualándose las concentraciones; entonces, los medios serán isotónicos. + Osmorregulación o regulación de la presión osmótica Todos los seres vivos, sean acuáticos o terrestres, están obligados a la osmorregulación o regulación de la presión osmótica. Muchos de ellos han conseguido sobrevivir en medios hipotónicos o hipertónicos mediante mecanismos físicos o químicos, que evitan los cambios de presión osmótica en su medio interno. - Seres vivos unicelulares Los más primitivos, los procariotas, presentan una pared celular que los protege y evita que estallen cuando el medio exterior es hipotónico; los protozoos carecen de envolturas rígidas. Los que viven en agua dulce (medio hipotónico con respecto a su medio interno) ingresan grandes cantidades de agua. El estallido celular lo evitan mediante vacuolas pulsátiles que continuamente vierten hacia el exterior el exceso de agua acumulado en el interior de la célula. - Vegetales Los organismos vegetales, que habitualmente viven en medios hipotónicos con respecto al medio interno de sus células, absorben agua por las raíces. La entrada de agua en las células provoca un grado de turgencia que facilita el crecimiento de las plantas. En el caso de vivir en medios hipertónicos, los vegetales expulsan agua y se marchitan. La apertura y cierre de los estomas permite regular la eliminación de agua. Las plantas halófitas, que viven en medios hipertónicos con alto contenido en sales, logran sobrevivir absorbiendo gran cantidad de estas sales hasta alcanzar una concentración en su medio interno, ligeramente superior a la del exterior. Es en esas condiciones cuando es posible la absorción de agua, imprescindible para su proceso vital. - Animales pluricelulares Presentan un medio interno que puede considerarse una prolongación del medio externo, con el que sus células han de mantener el equilibrio osmótico. Todos consiguen, mediante diversos mecanismos, mantener en su interior la cantidad de agua suficiente y necesaria para vivir. + Peces de agua dulce Los peces de agua dulce viven en medios hipotónicos y absorben gran cantidad de agua, eliminando una orina muy diluida por la que expulsan el máximo líquido con la mínima pérdida de sales. + Peces marinos

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA Los peces marinos, al vivir en un medio hipertónico, deben contrarrestar la constante entrada de sales minerales; eliminan orina bastante concentrada o hipertónica y, además, expulsan el exceso de sales por las branquias. + Reptiles y aves Los reptiles y las aves logran evitar la desecación disminuyendo la cantidad de agua excretada, eliminando los productos de desecho en forma de ácido úrico. + Mamíferos Los mamíferos mantienen constantemente el equilibrio hídrico a través de diversos mecanismos fisiológicos: . Riñones: los glomérulos renales absorben gran cantidad de agua al filtrar continuamente la sangre, pero a través de los tubos contorneados y del asa del Henle se reabsorbe prácticamente toda el agua y una cantidad variable de sales. La eliminación, tanto de agua como de sales, en la orina depende de las cantidades ingeridas. . Intestino grueso: la absorción de agua y sales a través de la mucosa intestinal origina la formación de heces más sólidas y más salinas a medida que se incrementan las pérdidas de agua. Esto ocurre, por ejemplo en lugares con climas muy cálidos . Piel: a través de la piel se eliminan cantidades variables de agua y sales en forma de sudor. En las zonas desérticas, el sudor es menos concentrado que en las zonas más templadas, y como el volumen excretado para regular la temperatura es muy elevado, es imprescindible el aporte exógeno de agua y sales. HIPÓTESIS El eritrocito al entrar en contacto con la solución hipotónica va sufrir hemolisis. La cantidad de eritrocitos destruidos aumentara mientras más hipotónica sea la solución. OBJETIVO El objetivo principal que se pretende lograr en éste experimento es que el alumno observe el fenómeno de la difusión. Observar el proceso de la osmosis como un proceso en membranas permeables de organismos vivos y de materia inerte. Para ello se introducirá al alumno en el manejo del método científico experimental, determinando para ello las etapas del mismo, y por tanto dando inicio a la aplicación de dicho método, propiciando así la elaboración de pequeños proyectos experimentales. Objetivos específicos Aprenderemos a reconocer el proceso de hemolisis en los eritrocitos. Registraremos el nivel de osmolaridad de los tubos de ensayo. Observaremos 2 tipos de hemolisis: inicial y total. Observar la resistencia globular (fragilidad osmótica) frente a una solución hipotónica. Plasmaremos la osmolaridad correspondiente a cada uno de los tubos expresados en unidades m Osm/ Kg H2O. JUSTIFICACIÓN

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA Este proyecto experimental tiene como finalidad que el alumno aplique los conocimientos adquiridos en la parte teórica del curso, en lo referente a la osmosis. Se tomará en cuenta la etapa de la observación del método científico. Para lo cual se induce al alumno a realizar mediciones que le permitan apreciar o distinguir cambios significativos en un proceso físico. FUNDAMENTO Se llama resistencia globular osmótica a la que presentan los hematíes suspendidos en soluciones salinas hipotónicas. Si empleamos soluciones salinas de 0.76 a 0.9 % y suspendemos dentro de ellas los hematíes veremos que éstos se conservan sin alteración durante varias horas, y que una vez sedimentados (espontáneamente ó por centrifugan), el líquido que sobrenada es claro y transparente como la misma solución salina. Pero si efectuamos suspensiones de hematíes en soluciones de cloruro sódico a concentraciones progresivamente decrecientes observaremos que al llegar a una determinada concentración empiezan a destruirse, liberándose la Hb, lo que confiere al líquido una ligera coloración rojiza que no desaparece por centrifugación. Esto se le llama hemólisis inicial o resistencia mínima, que normalmente se presenta entre las concentraciones de 0.46 y 0.42 %.Esta hemólisis de los hematíes va aumentando en cantidad a medida que la solución de cloruro sódico va siendo más hipotónica hasta presentarse una hemólisis total. Esta hemólisis total se observa entre las concentraciones de 0.34 a 0.30 % Los eritrocitos son células sin núcleo, bicóncavos (esta forma facilita su función de intercambio) y son los encargados de transportar el oxígeno en la sangre. Eleritrocito presenta, entre otros, a la Hemoglobina (Hb) encargada del transporte de oxígeno y de dar la tonalidad rojiza característica de este tipo de células. La célula presenta una membrana semipermeable la cual permite el paso de solventes y solutos de acuerdo a una gradiente (de menor concentración a mayor concentración); a su vez el eritrocito presenta una resistencia globular la cual es una propiedad de los eritrocitos de conservarse sin ningún cambio ante determinadas sustancias, las cuales tienden a destruirlos (hemolisis y crenación). Se usa una solución hipotónica debido a que esta presenta una concentración iónica menor al citoplasma celular por lo cual la célula (eritrocito) tiende a absorber agua de la solución, el paso de agua al interior de la célula esta mediado por unas proteínas llamadas acuaporinas. Debido a que la célula ha absorbido agua esta se hinchara hasta el punto en el que estalla y se produce la Hemolisis, la HB es liberada por los poros de la membrana lo cual le dará una coloración rojiza a la mezcla.

PROYECTO EXPERIMENTAL Observación del efecto del cambio de la concentración de una solución, y/o del efecto del cambio de la superficie de una membrana en el fenómeno de la ósmosis. REACTIVOS Y EQUIPOS NECESARIOS 1. Solución salina al 0.9 % 2.-Pipetas graduadas: 1 ml al 0.01 10 ml al 0.1 5 ml al 0.1 3.- Micropipetas de 0.1 ml

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA 4.- Fiola de 100 ml 6.- Muestra de sangre venosa desfibrinada ó hematíes lavados. 7.- Agua destilada 8.- Tubos de vidrio 13x 100 mm sin reborde MÉTODO 1.- Preparar soluciones seriadas, en tubos de prueba marcados del 1 al 19, según la tabla adjunta, haciendo las diluciones con agua destilada según lo indicado: Marcar 19 tubos de prueba y repartir así:

NOTA: EL NUMERO 19 ES CONTROL DE HEMOLISIS TOTAL (100% HEMOLISIS) 2.- Una vez hecha la distribución anterior, mezclar bien, por inversión cada uno de los tubos. NO OLVIDAR ESTE PASO. 3.- Recién ahora, después de haber mezclado, añadir 0.1 ml de sangre venosa desfibrinada cada uno de los tubos. 4.- Tapar los tubos y mezclar nuevamente por inversión suave. 5.- Dejar en reposo 10 minutos a temperatura ambiente y luego volver a mezclar por inversión suave. 6.- Centrifugar a 2000 rpm. Durante 10 minutos. Examinar por simple inspección visual en cuál de los tubos se inicia la hemólisis (hemólisis leve), generalmente a partir del tubo Nº 8, de 0.425 % NaCl (lo que se manifiesta por el color ligeramente

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA rojizo del líquido) y luego examinar en qué otro tubo la hemólisis es intensa (aproximadamente en 0.36 % NaCl). En el Tubo Nº 19 se producirá hemólisis total y corresponde al 100% de Hemólisis. (Destrucción total de los hematíes y no deja nada de sedimento). Valores Normales: Hemólisis inicial (leve) (empieza Hemólisis): 0.44 % + -- 0.02 Hemólisis Total (Hemólisis completa): 0.32 % + -- 0.02

PROCEDIMIENTOsdasad El experimento se realizó como se describe en la lección 2 de la Guía de Práctica de Fisiología Humana. Se usaron 3 pipetas de distinta medidewrefvdsefa (1ml, 5ml y 10ml), agua destilada, cloruro de sodio, una jeringa, tubos de ensayo y una gradilla para colocar las muestras. Se extrajo sangre de un integrante del grupo y se mezcló con anticoagulante para su posterior uso. Se agregó agua destilada y cloruro de sodio (NaCl) en 3 tubos de ensayo. Se tomaron como guías los tubos nº 5, 9 y 19 (tubo de control o tubo 0). Al tubo nº5 se le agregó primero 1.75 ml de Solución de NaCl al 1% con un porcentaje de solución resultante de 0.35% Luego se agregó 3.25 ml de agua destilada Al tubo nº9 se le agregó primero 2.25 asdsadsadml de Solución de NaCl al 1% con un porcentaje de solución resultante de 0.45% Luego se agregó 2.75 ml de agua destilada Al tubo nº19 se le agregó sólo 10 ml de agua destilada con un porcentaje de Solución de NaCl resultante de 0% Después de terminado estos pasos se procede a mezclar bien los 3 tubos por inversión. Luego se adicionó 0.1ml de sangre más anticoagulante en cada uno de los tubos de ensayo y se dejó reposar por 10 minutos. Se volvió a tapar los tubos y mezclar nuevamente por inversión suave para, posteriormente, llevarlo a la centrifuga a 2000 RPM en un lapso de 10 min. Se observó en el tubo 5 un grado de hemolisis inicial o hemolisis ligera Finalmente se calculó el porcentaje de hemolisis en cada tubo con la fórmula correspondiente y se calculó la Osmolaridad en cada uno de los tubos obteniéndose: En el tubo nº5: 54.89 x 2 = 119.78 En el tubo nº9: 77.04 x 2 = 154.08

RESULTADOS

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA Se observó que cuando la solución es hipotónica el porcentaje de hemolisis en los eritrocitos hallado en los tubos de ensayo se ve aumentado; sucede lo contrario con una solución hipertónica.

DISCUSIÓN Los resultados obtenidos nos indican que la hemolisis está sujeta a la concentración de cloruro de sodio presente en la solución. Cuando el eritrocito se encuentra en una solución hipotónica necesita obtener un solvente para equilibrar el balance intracelular de líquido por lo cual se ve obligado a absorber agua del exterior, en este caso la solución formada con agua destilada y cloruro de sodio (NaCl), por lo cual ocurrirá la hinchazón y posterior destrucción del eritrocito (hemolisis). CONCLUSIONES Encontramos que la hemolisis en los eritrocitos se ve aumentada mientras más hipotónica es la solución empleada. A menor concentración de NaCl, hay menor osmolaridad y se produce mayor hemolisis. A mayor concentración de NaCl, hay mayor osmolaridad y se produce menor hemolisis. El porcentaje de hemolisis fue el más bajo cuando se utilizó una solución resultante 0.45%

de

NaCl al

La hemolisis se incrementó cuando se utilizó una solución resultante de NaCl al 0.35% Y se obtuvo la hemolisis completa cuando no se utilizó la solución resultante de NaCl.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Gerhard Thews, Ernest Mutschler, Peter Vaupel. “Anatomía, fisiología y patofisiología del hombre”. Edición en español 1983. Páginas 127-129 Cecie, Starr, Ralph Taggart. “Biología: la unidad y diversidad de la vida” Página 90-92 Claude A. Ville, Biología, 7ª edición, Editorial Interamericana, México 1985 HernanVeléz, Willian Rojas, Jaime Borrero y Jorge Restrepo. “Hematología”. Edición2004. Página 91 Vázquez, G. F. y Gil F. E. “Concentración de soluciones. Molaridad, normalidad y molalidad”, A. G. T. Editor, México, 1992.

Web Bibliografía http://cienciaexplicada.com/resistencia-globular.html http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003641.htm La Seguridad en los Laboratorios de Prácticas, Universidad de Alcalá, 1995, Comisión de Seguridad y Salud Laboral http://www2.uah.es/edejesus/seguridad.htm

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FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA SEMIPERMEABLE Y FRAGILIDAD OSMÓTICA Ósmosis http://www.unad.edu.co/curso_biologia/osmosis.htm

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