Nguyên Lý Sắc Ký Ion Và Sắc Ký Lọc Gel [PDF]

Zitiervorschau

Nguyên lý sắc ký ion và sắc ký lọc gel 1.Sắc ký ion Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange, sắc ký viết tắt là IEC) là đại lý trao đổi ion như giai đoạn văn phòng phẩm, các thành phần pha động dựa trên trao đổi ion với các đại lý trao đổi ion cân bằng sự khác biệt có hiệu lực ràng buộc hồi giữa kích thước và tách một loại sắc ký Phát triển Năm 1848, Thompson và những người khác trong việc nghiên cứu các chất kiềm đất được tìm thấy trong việc trao đổi các hiện tượng trao đổi ion. Những năm 1940, sự xuất hiện của một đặc điểm giá ổn định các loại nhựa trao đổi ion polystyrene. Năm 1950, trao đổi ion sắc ký vào lĩnh vực phân tích sinh hóa của các axit amin được sử dụng. Hiện nay phương pháp sắc ký trao đổi ion vẫn thường được sử dụng trong lĩnh vực hóa sinh như một phương pháp sắc ký, sử dụng rộng rãi trong các chất sinh hóa khác nhau như axit amin, protein, đường, nucleotide và tách và tinh chế khác. Trao đổi ion được sử dụng là: trao đổi ion cellulose, dextran trao đổi ion và trao đổi ion nhựa. Thông tin cơ bản Sắc ký trao đổi ion, ma trận được thực hiện với một khoản phí hoặc một loại nhựa cellulose. Gọi là một tích điện dương nhựa trao đổi cation, trong khi gọi là một loại nhựa anion mang điện tích âm. Sắc ký trao đổi ion cũng có thể được sử dụng để tách protein và tinh chế. Kể từ protein có điểm đẳng điện khi độ pH của protein trong các điều kiện khác nhau, điều kiện sạc cũng khác nhau. Ma trận trao đổi anion với một điện tích âm của protein, do đó loại protein còn lại trong cột, và sau đó bằng cách tăng nồng độ muối trong các biện pháp rửa giải với protein hấp phụ trên cột đã được tách rửa. Protein yếu ràng buộc được tách rửa đầu tiên. Ngược lại ma trận trao đổi cation có điện tích dương của protein, protein ràng buộc bởi tăng dần nồng độ muối trong rửa giải hoặc tăng độ pH của rửa giải tách rửa. Hoạt động cụ thể Tiền xử lý và đóng gói cột Việc sử dụng ngoại tệ nước ion để rửa sạch một lượng nhỏ cellulose nghiền nát dễ dàng kết tủa các hạt để đảm bảo sự đồng nhất hơn, cho các sản phẩm tốt không bị sưng bước này. Trao đổi sưng đại lý trước khi sử dụng axit loãng hoặc điều trị kiềm, làm cho nó H trao đổi, OH-ban nhạc của các hình thức. Trao đổi anion sử dụng "kiềm - axit - kiềm" quá trình, để cuối cùng biến-OH-loại hoặc muối kiểu

trao đổi, trao đổi cation được sử dụng cho "axit - kiềm - axit" quá trình, do đó, trận chung kết lượt H loại trao đổi. Rửa cellulose trước khi sử dụng cân bằng với độ pH mong muốn và sức mạnh ion. Có một đại lý đổi cân bằng ngay cả trước khi đóng gói bong bóng cột loại bỏ dưới áp suất giảm. Để tránh kích thước hạt khi đại lý đổi trong việc phân tầng lún tự nhiên, cột đóng gói áp lực thích hợp, trong khi cột giường nén chặt, giảm khối lượng chết, có lợi cho độ phân giải được cải thiện. Trụ cột cài đặt và sau đó giải hấp với bộ đệm bắt đầu cho đến khi nó đạt đến sự cân bằng đầy đủ trước khi sử dụng. Pipetting và rửa giải Pipette: Sắc ký mẫu nên được sử dụng trong những khởi đầu pH dung dịch đệm cùng và sức mạnh ion, giá trị pH được lựa chọn nên rơi trao đổi và là một sự kết hợp của phạm vi phụ trách đối diện, trong khi sự chú ý nên được sức mạnh ion thấp, có thể lọc máu , lọc gel hoặc phương pháp pha loãng để đạt được mục đích này. Các chất không hoà tan trong mẫu sẽ có trước khi lọc máu hoặc lọc gel để loại bỏ bằng cách ly tâm. Để đạt được tách đạt yêu cầu, khối lượng mẫu phải phù hợp, không vượt quá sức chịu tải của cột. Khả năng chịu tải cột có thể được sử dụng để tính toán khả năng trao đổi, thường là trên các đại lý để đổi lấy việc trao đổi khối lượng mẫu của 1% -5% tổng số. Rửa giải: Đã được kết hợp với các mẫu trước khi trao đổi ion, bằng cách thay đổi pH hoặc thay đổi cường độ ion của liên hợp tách rửa, cũng có thể thay đổi độ pH và sức mạnh ion. Để các thành phần hoàn toàn tách biệt của các phức tạp, thường cần phải dần dần thay đổi độ pH hay sức mạnh ion, phương pháp đơn giản nhất là giai đoạn phương pháp rửa giải, sẽ được phân loại và sức mạnh ion ở pH khác nhau đã được thêm vào, để các thành phần khác nhau dần dần tách rửa. Kể từ khi rửa giải này của pH và thay đổi sức mạnh ion, số lượng các thành phần của khối lượng rửa giải cùng một lúc một rửa giải độ tinh khiết kém tương tự, phù hợp để tách tốt. Cách tốt nhất là một gradient bộ máy rửa giải rửa giải liên tục thể hiện trong hình 16-6. Hai thùng đặt ở cùng một mức độ, các container đầu tiên chứa đầy một chất đệm pH, một container thứ hai có chứa một nồng độ muối cao hoặc bộ đệm pH khác nhau, hai bình thông nhau, cột đầu tiên được kết nối với container và, khi dòng chảy dung dịch vào cột từ container đầu tiên, container thứ hai sẽ tự động giải pháp bổ sung, bằng cách trộn một giải pháp của container đầu tiên với dòng chảy hỗn hợp vào cột để khả năng phục vụ gradient đệm rửa giải. Tập trung đầu tiên của các container có sẵn tại bất kỳ thời gian được tính theo công thức sau:

C = C2-(C2-C1) (1-V) A2/A1 Trong đó A1, A2 đại diện cho khu vực mặt cắt ngang của hai container: C1, C2, tương ứng, nồng độ của dung dịch trong thùng chứa; V là tỷ lệ lưu lượng tổng khối lượng. Khi A1 = A2 khi một màu, khi A1> A2 khi lõm gradient, A1> A2 khi lồi gradient. Rửa giải phải đáp ứng các yêu cầu sau: ① tích rửa giải là đủ lớn, thường nhiều lần khối lượng giường, để tách các đỉnh núi sẽ không quá đông đúc. ② độ dốc tối đa là đủ cao để cho phép các vật liệu hấp phụ chặt chẽ có thể được tách. ③ gradient không tăng quá nhanh, chỉ làm cho bạn muốn di chuyển vùng đến phần cuối của cột trong trạng thái giải hấp tới. Giải hấp của hợp chất đích sớm, gây ra vùng khuếch tán, trong khi các sản phẩm mong muốn là quá muộn để làm cho giải hấp đỉnh hình quá rộng. Phân tích các phần phân đoạn tách rửa với số lượng (5-10ml / ống) thu thập rửa giải được đo bằng ống để có được một sắc đồ. Theo mục đích thử nghiệm khác nhau, có thể là một phương pháp phát hiện phù hợp (xác định hoạt tính sinh học, xét nghiệm miễn dịch, vv) để xác định mô hình vị trí trong các sản phẩm mong muốn, và phục hồi các sản phẩm mong muốn. Tái sinh các bộ trao đổi ion trao đổi ion và bảo quản các cột có thể được tái sinh. Chẳng hạn như trao đổi ion cellulose có sẵn 2mol /: NaCl cột rửa giải, nếu có 0.1mol/LNaOH adsorbate mạnh rửa cột, nếu chất tan trong chất béo có sẵn không ion chất tẩy rửa tái sinh cột, cũng có thể được rửa sạch bằng ethanol , theo thứ tự: 0.5mol/LNaOH- nước - ethanol - nước -20% NaOH nước. Tiết kiệm đại lý trao đổi ion để thêm chất bảo quản. Trên các trao đổi anion được ưa thích 0,002% chlorhexidine (chlorhexidine), ethyl trao đổi cation sử dụng chất thimerosal (0,005%). Một số sản phẩm được tạo ra với 0,02% natri azit.

2.Sắc ký lọc gel Sắc ký lọc gel (sắc ký lọc gel) phương pháp, phương pháp sắc ký loại trừ cũng được biết đến hoặc phương pháp sàng phân tử chủ yếu dựa vào kích thước và hình dạng của các protein, chất lượng của các protein được cách ly và tinh khiết. Cột của chất độn trong các cấu trúc xốp của một số chất, polysaccharides chủ yếu là liên kết ngang (như dextran hoặc agarose) chất, các chất trong hỗn hợp protein bằng cách tách kích thước phân tử khác nhau. Còn được gọi là phương pháp sắc ký loại trừ phân tử (sắc ký phân tử loại trừ). Một sử dụng các hạt gel đục như một chất nền, ngăn cách theo các protein kích thước phân tử hoặc phân tử khác trong một

hỗn hợp của kỹ thuật sắc ký. Thường chảy ra đại phân tử đầu tiên, các phân tử nhỏ chảy ra ngoài. Cơ bản Còn được gọi là phân tử sàng sắc ký, sắc ký lọc gel, sắc ký rây kích thước. Có một cấu trúc mạng là việc sử dụng các phân tử tác dụng gel sàng, theo chất phân tử được tách ra để phân tách các kích cỡ khác nhau. Cột của chất độn trong các cấu trúc xốp của một số chất, polysaccharides chủ yếu là liên kết ngang (như dextran hoặc agarose) chất, các phân tử nhỏ có thể nhập vào bên trong, khoảng cách dòng chảy dài, các đại phân tử đã được loại trừ từ bên ngoài, xuống một khoảng cách ngắn, khi một giải pháp hỗn hợp thông qua một cột lọc gel, các giải pháp của chất này được mở ra bởi sàng lọc có trọng lượng phân tử khác nhau. Lợi thế Lợi thế của nó là việc sử dụng các phương pháp sắc ký gel trên một tàu sân trơ được nguyên hiện trạng, hấp phụ yếu, điều kiện hoạt động tương đối nhẹ, trong phạm vi tương đối rộng của nhiệt độ, không dung môi hữu cơ, và các tính chất vật lý và hóa học của các thành phần tách vẫn còn độc đáo. Của vật liệu polyme có tác dụng tách tốt. Sử dụng ⒈ Gel lựa chọn theo mục đích của thí nghiệm lựa chọn khác nhau cho các loại gel. Nếu mục đích của thí nghiệm là các đại phân tử trong mẫu và tách các phân tử nhỏ, do hệ số phân bố của chúng trong một sự khác biệt đáng kể, sự tách biệt này còn được gọi là nhóm tách biệt, và có thể được sử dụng SephadexG-25 và G-50, các peptide nhỏ và các chất trọng lượng phân tử thấp (1000-5000) có thể được sử dụng để khử muối SephadexG-10, G-15 và Bio-Gel-p-2 hoặc 4, nếu mục đích của thử nghiệm là để lấy mẫu một số trọng lượng phân tử là hơn giống như một tách chất, chẳng hạn tách gọi là phân đoạn. Lớn hơn một chút so với giới hạn loại trừ thường được sử dụng trong các chất trọng lượng phân tử cao nhất trong gel mẫu, quy trình sắc ký có thể là mức độ khác nhau của các chất sâu vào gel bên trong, như KD khác nhau, cuối cùng được tách ra. 2. Đường kính và chiều dài của cột theo kinh nghiệm, nhóm tách, họ sử dụng một cột dài 2-30cm, phân đoạn, thường đòi hỏi về cột dài 100cm, 1-5cm, đường kính trong khoảng ít hơn 1cm tạo hiệu ứng tường, lớn hơn 5cm sau đó pha loãng nghiêm trọng. Chiều dài L và đường kính D tỷ lệ L / D nói chung nên được giữa 710, nhưng phong trào chậm của vật liệu nên được giữa 30 và 40. 3. Gel chuẩn bị mô hình cột gel được chọn, các hạt keo lơ lửng trong nước cất hoặc 5-10 lần số lượng chất rửa giải sưng đầy đủ, sưng của các hạt nhỏ tốt sau khi đổ ra

ngoài. Tự nhiên sưng một thời gian dài, nhiệt độ có thể tăng tốc sưng, nghĩa là trong một cốc nước sôi khoảng bùn gel ướt dần dần nóng đến gần sôi, 1-2 giờ để đạt được một sự mở rộng đầy đủ gel hòa tan. Nóng phương pháp, đạt được thời gian và khử trùng. Gel loading: cột dọc cố định mặt đất trên một kệ, ổ cắm dưới cùng với một clip kẹp thủ đô có thể cài đặt một container lớn được trang bị một máy khuấy, cột đầy GEL eluant bùn tương đối mỏng đầu tiên chứa chất lỏng đầy trên đầu cột, sau đó gel được khuấy nhẹ chìm trong cột, do đó, gel hạt mức tăng, lên đến chiều cao mong muốn, loại bỏ phần trên của bộ máy cột, với các bộ lọc thích hợp mảnh nhẹ bao gồm các bề mặt của lớp gel. Một nơi ít một thời gian, và sau đó bắt đầu chảy cân bằng, tốc độ dòng chảy nên được thấp hơn so với tốc độ dòng chảy cần thiết cho sắc ký. Tăng dần trong sắc ký lưu trạng thái cân bằng, không vượt quá tốc độ dòng chảy thức. Cân bằng giường gel qua đêm trước khi sử dụng để kiểm tra giường sắc ký là thống nhất, cho dù "dòng" hoặc bong bóng, hoặc thêm một số tài liệu màu để quan sát sự chuyển động của các băng, chẳng hạn như với một, mịn đồng nhất hiệu suất tốt cột sắc ký hẹp mô tả, băng xuất hiện méo mó, phân tán, cột rộng lớn hơn phải được cài đặt lại. 4. Gel, nạp và tách rửa qua lớp cân bằng, để lại ở đầu số giường của giường gel bão hòa ml rửa giải, và sau đó thêm giọt mẫu. Nói chung tổng khối lượng mẫu là không lớn hơn khối lượng giường gel 5% -10%. Độc lập với nồng độ mẫu và hệ số phân phối, nồng độ mẫu có thể được tăng lên, nhưng các vật liệu trọng lượng phân tử lớn hơn, độ nhớt của dung dịch làm tăng sự tập trung, sự chuyển động phân tử còn hạn chế, độ nhớt tương đối của các mẫu và dung môi không quá 1,5- (2) mẫu sau khi gia nhập dòng ổ cắm mở, để các mẫu thâm nhập vào giường gel, chỉ khi bề mặt mẫu với chiếc giường bề mặt gel bình thường, và sau đó thêm một vài ml rửa giải rửa tường để làm cho nó vào chiếc giường gel sau khi tất cả giường sắc ký với dung dịch rửa giải chai và thu kết nối với tốc độ dòng chảy được thiết kế sẵn, và sau đó phân khúc rửa giải, và mỗi phần để xác định tính và định lượng. 5. Gel cột tái sử dụng, tái chế và bảo quản gel sau khi một cột đóng gói có thể được sử dụng nhiều lần, mà không cần điều trị đặc biệt, không ảnh hưởng đến hiệu ứng tách. Để ngăn chặn ô nhiễm gel, sắc ký có thể được thêm vào sau khi 0.02% sodium azide đầu tiên, trước khi các đại lý khuẩn sắc ký tiếp theo sẽ được loại bỏ để tránh nhiễu với việc xác định dung môi. Phương pháp phục hồi Nếu bạn không còn sử dụng có thể được tái chế, cách tiếp cận chung là rửa gel được ráo nước, rửa sạch với 70%, 90%, 95% ethanol mất nước cân bằng hơn 90%

ethanol, để ráo nước, rửa sạch với ether ethanol, để ráo nước, nơi khô ráo. Ướt phương pháp bảo quản nhà nước của bùn gel đã được thêm vào các tác nhân kháng khuẩn hoặc rửa một nước nồi hấp kín trung lưu.