Explorarea de Laborator A LCR Jercaianu Daniela [PDF]

Zitiervorschau

UNIVERSITATEA ”OVIDIUS” DIN CONSTANTA FACULTATEA DE FARMACIE REZIDENȚIAT SPECIALIZAREA: LABORATOR FARMACEUTIC

STAGIUL: Laborator Clinic PROIECT DE CERCETARE: Explorarea de laborator a lichidului cefalo-rahidian

Coordonator Științific: Prof. Univ. Dr. Mihaela Bratu REZIDENT: Farmacist Daniela Jercăianu

2021, CONSTANȚA

Investigarea biochimică a lichidului cefalorahidian (LCR) Strict anatomic, lichidul cefalorahidian este lichidul biologic care se află în ventriculii cerebrali, canalul ependimar şi spaţiul subarahnoidian. Spaţiul subarahnoidian se realizează între cele două membrane ale învelişurilor meningeale ale sistemului nervos: pia mater şi arahnoida. Cantitatea de lichid în toate aceste spaţii este de aproximativ 150 ml la adultul tânăr. Separarea acestui lichid biologic faţă de plasmă şi limfă este realizată de aşanumita barieră hematoencefalică. Lichidul cefalorahidian circulă prin toate spaţiile pe care le umple, ducând la formarea celei de-a treia circulaţii după sânge şi limfă. Primele menţiuni scrise despre membranele şi lichidele creierului apar în papirusul egiptean descoperit la Teba în 1862: papirusul Edwin Smith. Deşi acest papirus a fost scris în secolul al XVII-lea î.Hr., el conţine transcrieri ale unor documente datând între anii 3000-2500 î.Hr. Menţionarea LCR este apoi fă cută în scrierile hi ppocratice, atunci când este descris tratamentul prin trepanaţie al hidrocefaliilor. Interzicerea disecţiilor a determinat stoparea adunării de noi informaţii despre corpul uman. Abia în timpul Renaşterii, când se reiau disecţiile pe cadavre umane, se desenează planşe de către pictori renumiţi ai vremii, ce redau ţesuturi şi organe realist reprezentate. Pentru prima dată, în opera anatomistului italian Niccolo Massa, „Anatomiae Libri Introductorius“, în 1536, este descris lichidul cefalorahidian. În lucrările medicilor şi anatomiştilor secolului al XVIII-lea, Contugno şi Haller, se fac menţiuni despre existenţa circulaţiei lichidului cefalorahidian. Descrierea ştiintifică, în adevăratul sens al cuvântului, este realizată de renumitul profesor de anatomie şi fi ziologie al Facultăţii de Medicină din Paris, François Magendie, în lucrările publicate în 1825. A. Key şi G. Retzius sintetizează în lucrarea „Studien in der Anatomie des Nervensystems und der Bindgewebe“, apărută în 1875, toate cunoştinţele de certă valoare ştiinţifi că acumulate până atunci în ceea ce priveşte lichidul cefalorahidian. Progrese importante în cunoaşterea lor au loc după 1891, an în care Quincke publică tehnica puncţiei lombare, şi în 1908, când savantul român Alexandru Obregia pune la punct tehnica puncţiei suboccipitale. Tehnica a fost folosită de chirurgul şi anatomistul Thoma Ionescu pentru anestezie în variate intervenţii chirurgicale, promovând rahianestezia înaltă prin stovainizare (stricnină-stovaină), utilizabilă şi în intervenţiile chirurgicale pe cap şi gât, metodă ce s-a impus ca „metoda românească“În primele decenii ale secolului XX, şcoala franceză, reprezentată de Sicard, Widal, Ravaut scot în evidenţă utilitatea clinică a cunoaşterii citologiei lichidului cefalorahidian. Tot în această perioadă suntrealizate camere de numărat celule de către Fuchs, Rosenthal şi Nageotte. Proteinorahia, de o importanţă covârşitoare în patologia infecţioasă, începe să fi e măsurată. Prima estimare este făcută de Franz Nissl. Pe acest principiu, în 1913, Kafka realizează tubul de determinare a proteinorahiei care se mai utilizează în unele laboratoare. Pentru uşurinţa şi

indicaţiile importante pe care le aduc, metodele calitative se folosesc pe scară largă în cepând cu anul 1908 – metoda lui None şi Appelt, apoi metoda lui Pandy. De subliniat faptul că pro fesorul maghiar Pandy a fost, pentru o perioadă scurtă, între 1911 şi 1913, directorul Spitalului din Sibiu. Fiziologia lichidului cefalorahidian a fost cercetată în primele decenii ale secolului XX în multe centre universitare. Astfel, în anul 1914, Dandy şi Blackfan demonstrează secreţia exclusivă de catre plexurile coroide a lichidului cefalorahidian. Tot în 1914, Weed sugerează resorbţia lichidului cefalorahi dian la nivelul vililor arahnoidieni. Dar ipoteza secreţiei exclusive a lichidului cefalorahidian de plexurile coroide este infi rmată de cercetările cu izo topi radioactivi efectuate de Sweet în 1950. Studiile efectuate la om de Scarff şi la animalul de experienţă de M. Ilhorat au demonstrat continuarea secreţiei lichidului cefalorahidian în cazul extirpării totale a plexurilor coroide, secreţie realizată de ţesutul nervos. Fiziologia lichidului cefalorahidian a cuprins şi studiul circulaţiei acestuia. Date importante despre aceasta a adunat marele chirurg şi neurolog american William Harvey Cushing în studiile sale interbeliceAsupra citologiei lichidului cefalorahidian s-au aplecat numeroşi medici şi cercetători de-a lungul timpului. Având în vedere fragilitatea celulelor, explorarea lor era mult îngreunată atât cantitativ, cât şi calitativ. În 1935, Wedemeyer publică lucrarea sa în care descrie metoda lui de separare a celulelor lichidului cefalorahidian prin sedimentare spontană, metodă ce va intra în practica de laborator în 1954, în urma lucrărilor publicate de Sayk, care descrie modul de folosire al camerei ce-i poartă numele. Cercetări ample s-au efectuat în prima jumătate a secolului XX în centrele universitare europene şi din Statele Unite şi Canada, rezultatele acestora fi ind cuprinse în lucrările de sinteză ale lui Sayk – 1960, Davson – 1967, Schmidt – 1968, Oehmichen – 1976 şi Kolmel, care publică în 1976 un atlas citologic care a fost un îndreptar important pentru clinicieni. La Spitalul de Neurochirurgie din Bucureşti, sub îndrumarea profesorului C. Arseni, medicul de labo rator Dan Chimion a efectuat un mare număr de explorări ale lichidului cefalorahidian, de la pacienţi cu afecţiuni variate. Statistica biochimică a lui Chimion a fost publicată în reviste de prestigiu. În concluzie, trebuie spus că în istoria anatomiei a existat întotdeauna o fascinaţie pentru umorile corpului, pornind de la sistemul hipocratic şi ajungând la cercetările biochimice de ultimă oră, cercetări ce vizează structura moleculelor, în cele mai mici detalii. În mod special, lichidul adăpostit de creier a constituit o sursă de preocupări constante, pornind de la explicaţii mistice sau fanteziste şi ajungând, după cum s-a văzut mai sus, la abordările sistematice de fi ziologie comparată şi la aplicaţiile clinice imediate.

Formarea LCR Lichidul cefalorahidian ocupă spaţiile din sistemul nervos central, înconjurând creierul şi măduva spinării, fiind un produs al activităţii secretorii a SNC în plexurile coroide ale ventriculilor laterali (65%), chiar dacă aproximativ 30-35% din volumul total se poate produce şi extracoroid, în elementele gliale din peretele ependimar. Din ventriculii laterali, LCR trece, prin intermediul ventriculilor III şi IV, în cisterna magna de unde se scurge în spaţiile subarahnoidiene spinale şi cerebrale. Se formează atât prin ultrafiltrarea plasmei, cât şi ca rezultat al proceselor de reabsorbţie şi de secreţie. LCR este secretat şi reînnoit continuu în ritm de 0,17-0,23 ml/min/g ţesut coroid, în 6-12 ore fiind refăcut integral. La nivelul regiunii lombare rămâne mai mult timp (circa 2-4 zile), astfel că lichidul recoltat de la acest nivel are o compoziţie diferită de a celui din zona cervicală. Fiziologic, se formează un volum diferit în funcţie de vârstă:  la sugar, 40-60 ml;  la copiii de până la 5 ani, 100 ml;  la adultul tânăr, aproximativ 150 ml. Spre deosebire de alte lichide interstiţiale, LCR este separat de plasma sanguină circulantă printr-un sistem morfofuncţional ce împiedică pătrunderea compuşilor macromoleculari în spaţiile lichidiene, permiţând difuzia liberă a apei bariera hematolichidiană. Funcţiile biologice ale LCR 1. Funcţii biomecanice: a. asigură forma structurilor SNC; b. protecţie faţă de efectul şocurilor şi solicitărilor mecanice; c. rol antigravitaţional-diminuarea influenţelor acceleraţiilor de intensitate diferită 2. Funcţii biodinamice: a. rol limfatic: se elimină surplusul de lichid interstiţial din masa tisulară a SNC (nu există sistem limfatic la acest nivel); b. menţinerea homeostaziei mediului intern; c. funcţie de transport neuroendocrin: contribuie la distribuţia hormonilor hipofizari;

d. protecţie faţă de agenţii patogeni - componente cu proprietăţi bactericide şi bacteriostatice. Caracteristicile lichidului cefalorahidian Aspect: limpede, ca “apa de stâncă” Culoare: incolor Volum: 100 – 200 ml Densitate: 1,003 –1,009 g/cm3 pH: 7,3 – 7,35 (sisteme tampon: bicarbonat/acid carbonic, proteine) Unele caracteristici se modifică în stări patologice. Presiunea creşte în meningite, de exemplu în meningita meningococică, edeme cerebrale şi scade în blocaj subarahnoidian, colaps circulator, deshidratare. Culoarea se schimbă dacă LCR conţine pigmenţi biliari (xantocromic, gălbui), hemoglobină (roşiatic) sau methemoglobină (brun). Compoziţia lichidului cefalorahidian LCR are o compoziţie complexă, fiind o soluţie sterilă rezultată prin dizolvarea unor substanţe organice şi anorganice (aproximativ 10%), ce derivă din plasmă sau sunt produse de celulele din SNC, într-un mediu apos (aproximativ 90%). Majoritatea substanţelor din LCR îşi au originea în plasmă, fiind însă componente plasmatice ce lipsesc la acest nivel: fibrinogen, lipide, pigmenţi biliari, insulină, hormoni steroizi. Substanţele anorganice (Na+, K+ , Ca2+, Mg2+, Cl-, fosfaţi, HCO3-) au concentraţie diferită de cea a unui dializat plasmatic. Unele au concentraţie mai mare ca în plasmă (Na+, Mg2+,Cl-) altele aproximativ egală (Ca2+). Ele trec în LCR mai ales prin difuzie. Clorul este principalul anion din LCR. Valoare normală a clororahiei este 115130mEq/L. Valori crescute se înregistrează în hipercloremii, nefrite, tumori cerebrale. Valori scăzute apar în meningite netuberculoase, stază rahidiană. Substanţele organice ajung în LCR pe două căi: pasiv, prin difuziune prin bariera hematoencefalică sau prin transport activ.Proteinele (albumine şi globuline) sunt în cantitate mult mai mică decât în plasmă. Valoarea normală a proteinorahiei este 1545 mg/dL. Concentraţia acestora este în corelaţie cu vârsta (la nou născuţi este mai mare, scade până la adolescenţă, după care începe să crească). Albumina se găseşte în cantitate mai mare, aproximativ 50-60% din total, chiar dacă este în concentraţie de 250 ori mai mică decât în plasmă. Dintre globuline pot să apară IgA, proteina C reactivă, β2-microglobulina, α2-macroglobulina, concentraţia IgG crescând cu vârsta. Creşterea proteinorahiei poate fi determinată de una din următoarele cauze:

1) creşterea permeabilităţii barierei hematoencefalice (cu vârsta sau în stări inflamatorii); 2) producere redusă de LCR datorită blocării parţiale sau totale deasupra zonei de puncţie; 3) răspuns imunitar de tip umoral în interiorul structurilor SNC; 4) patologia distructivă a SNC cu eliberarea proteinelor celulare. Valori crescute apar în meningite, hemoragii meningiene, meningoencefalite purulente, tumori extramedulare, traumatisme cranio-cerebrale. Totdeauna când se obţin valori crescute ale proteinorahiei este necesară caracterizarea acestora prin electroforeză. Obţinerea mai multor benzi IgG (proteine oligoclonale) indică stări inflamatorii, scleroză multiplă, situaţii în care sunt stimulate celulele imunocompetente. Enzimele au activitate redusă, găsindu-se lactat dehidrogenază, LDH (mai ales, LDH1), transaminaza GOT. În cazul unor traumatisme craniocerebrale, LCR poate să conţină creatin kinaza, predominant sub forma CKBB. Aminoacizii sunt prezenţi în cantitate mică, găsindu-se aceeaşi aminoacizi ca şi în sânge (glicocol, alanină). Glucoza este prezentă în LCR în proporţie de 60% din valoarea glicemiei. Se elimină din plasmă prin difuzie facilitată. Valoarea normală a glicorahiei este de 50-80 mg/100 ml. Este recomandat să se determine raportul glicorahie/glicemie care are o valoare normală ~0,6. Hipoglicorahia apare atunci când în LCR apar celule ce consumă glucoza: meningite purulente, meningite bacteriene, fungice, leucemie. Hiperglicorahia apare rar, în afecţiuni hipotalamice, encefalite sau asociată hiperglicemiei. Acidul lactic provine din activitatea metabolică a SNC. Concentraţia creşte în cazul unor tumori, meningite virale, meningite bacteriene tratate necorespunzător, traumatisme cranio-cerebrale, când scade glucoza şi creşte acidul lactic. Valoarea normală este 1,9 –2,2 mg /100 ml LCR. Cataboliţii proteici, uree, creatinină, acid uric, trec prin difuzie liberă. Mediatorii chimici sau produşii de catabolism ai acestora îşi au originea în SNC. Poate să conţină: a. noradrenalina sau 3-metoxi-4-hidroxifenilglicocol, catabolitul acesteia; b. acid 5-hidroxi-indolilacetic, metabolitul serotoninei; c. acid homovanilic, metabolit al dopaminei. În anumite afecţiuni, concentraţia mediatorilor şi a metaboliţilor lor se modifică. De exemplu, noradrenalina creşte în accidente vasculare ischemice, la bolnavii cu hipertensiune arterială, hemoragie cerebrală; acidul homovanilic creşte în meningita bacteriană şi virală, în encefalite (50% din cazuri). Componenta celulară a lichidului cefalorahidian În mod normal, această componentă lichidiană este redusă cantitativ, dar este foarte importantă, celulele având rol în apărarea spaţiilor lichidiene şi a SNC de

agresiunea bacteriană şi virală. În LCR lombar, densitatea elementelor este 5/mm3. La nou-născut, numărul este mai mare. Modificările calitative şi cantitative ce apar în unele stări patologice permit stabilirea unui diagnostic. Creşterea numărului de elemente peste 10/mm3 este patologică. În paralizii sunt 50-500 elemente/mm3, în meningite epidemice 1000 elemente/mm3. Tipurile de celule ce apar sunt diferite. LCR normal conţine în număr redus: a. limfocite mici,monocite, granulocite neutrofile; b. celule ajunse accidental ca urmare a puncţiei: hematii, celule ependimare, celule coroidiene. Celulele prezente în procese patologice pot fi: celule tumorale, celule inflamatorii (limfocite, granulocite polimorfonucleare), microorganisme.Examenul citologic urmăreşte diferenţierea celulelor din LCR. De exemplu, în meningita virală şi în cea tuberculoasă sunt crescute limfocitele, iar în cea meningococică sunt crescute granulocitele. Recoltarea lichidului cefalorahidian Se recoltează 4-5 ml LCR prin puncţie în zona lombară (între vertebrele L3 – L4) cu pacientul şezând sau culcat pe o parte. Mai rar, în cazuri speciale, se practică puncţia suboccipitală sau ventriculară. Explorarea de laborator a LCR Puncţia rahidiană (rahicenteza) este greu de suportat şi traumatizantă pentru bolnav, de aceea se recomandă numai dacă analiza LCR furnizează informaţii absolut importante pentru stabilirea diagnosticului. Examenul LCR este obligatoriu în neuroinfecţii: meningite, meningoencefalite,encefalite, sifilis nervos, dar şi în hemoragii subarahnoidiene acute, traumatisme craniocerebrale, leucemie. Cantitatea de LCR necesară pentru examenul de laborator este, de obicei, 4-5 ml. În cazul explorării electroforetice a proteinelor şi punerii în evidenţă a bacilului Koch sunt necesare cantităţi mai mari. Proba recoltată este divizată pentru etapele investigării LCR în laborator şi este analizată în maxim 1 oră de la recoltare. Explorarea de laborator a LCR constă în: • Examen direct – analiza caracteristicilor, precum transparenţa, culoarea, fluiditatea, prezenţa unor formaţiuni . • Examen biochimic: a. determinarea proteinorahiei; b. determinarea glicorahiei;

c. determinarea clororahiei; d. determinarea acidului lactic; e. posibil, identificarea unor componente patologice (triptofan, acetonă).

• Examen citologic: a. determinarea numărului de celule/mm3; b. determinarea numărului de hematii/mm3. • Examen serologic pentru sifilis • Examen bacteriologic (obligatoriu în meningite): a. coloraţia Gram sau Ziehl-Nielsen a frotiului; b. culturi; c. antibiogramă, • Examen virusologic Examenul bacteriologic trebuie efectuat dacă: a. bolnavul prezintă semne clinice de meningită; b. LCR prezintă un aspect tulbure sau purulent; c. după intervenţii neurochirurgicale dacă bolnavul devine febril. Cuprinde un examen bacterioscopic, izolarea agentului bacterian, studiul sensibilităţii la antibiotice a tulpinei izolate. Examenul direct 1. Transparenţa: normal – limpede ca “apa de stâncă”, patologic – turbiditate. Dacă este uşor opalescent poate să conţină: 200 neutrofile, 400 limfocite, 700-800 hematii. Când LCR este tulbure este necesar examenul bacteriologic. 2. Culoarea se examinează pe un fond alb: normal – incolor, patologic – xantocromic (galben) conţine bilirubină, sanguinolent (roşu) conţine 1000-1200 hematii/mm3 sau hemoglobină. 3. Fluiditatea este asemănătoare cu a apei. Este mai puţin fluid LCR sanguinolent sau purulent, deoarece conţine fibrină, LCR ce conţine factori de coagulare (poate coagula). 4. Prezenţa unor formaţiuni străine: larve de paraziţi, membrane false, “vălul”, peliculă fină de fibrină ce indică prezenţa unor bacili sau virusuri.

Examenul biochimic Se face pe LCR centrifugat.

Determinarea calitativă şi cantitativă a proteinelor Reacţia Pandy Principiu: Soluţia saturată de fenol dă o opalescenţă cu un LCR în care conc. proteinelor este crescută. Mod de lucru: 1 ml LCR se pune într-o eprubetă de hemoliză. Se adaugă cu un tub efilat câteva picături soluţie de fenol. Se observă, pe un fond negru, formarea unui precipitat sau apariţia unei opalescenţe. Interpretare: normal - clar sau uşor opalescent. patologic -: opalescent, reacţia +; tulbure reacţia este + +; lăptos reacţia + + + Reacţia Pandy este pozitivă în meningite, tifos, pneumonie, tumori ale măduvei spinării. Reacţia Nonne-Appelt Principiu: Globulinele din LCR precipită cu o soluţie saturată de sulfat de amoniu. Mod de lucru: Peste 1 ml LCR se adaugă 1 ml soluţie saturată de sulfat de amoniu astfel încât să se formeze două straturi de lichid. Dacă sunt prezente globuline, la limita dintre straturi apare un inel de precipitare. Interpretare: normal - nu apare inel; patologic - opalescenţă slabă - reacţia +; tulburarea lichidului - reacţie + +; precipitare - reacţie + + +. Reacţia Nonne-Appelt este pozitivă în leziuni ale SNC, meningite. Determinarea proteinorahiei

Analizoarele automate utilizează pentru dozarea proteinelor din LCR (proteinorahia), metode colorimetrice (cu un complex colorat pirogalol-acid molibdenic) sau turbidimetrice (după denaturare cu clorură de benzetoniu).

Determinarea glicorahiei Identificarea calitativă se face prin reacţia Fehling. LCR normal reduce reactivul Fehling la oxid cupros, roşu cărămiziu. Reacţia poate fi folosită şi în scopul unei determinări semicantitative. Mod de lucru: Hipoglicorahie. Într-o eprubetă se pipetează 2 ml LCR şi 0,2 ml reactiv Fehling. Se încălzeşte eprubeta pe baie de apă, la fierbere. Dacă lichidul rămâne albastru, concentraţia glucozei este mai mica de 20-30 mg/100 ml LCR. Hiperglicorahie. Într-o eprubetaă se pipetează 0,6 ml LCR, 2 ml apă distilată şi 1 ml reactiv Fehling. Se ţine eprubeta pe baie de apă 1 minut. Dacă soluţia rămâne albastră, glucoza este în cantitate normală sau scăzută. Dacă apare culoarea roşucărămiziu, glucoza este mai mare de 70mg/100 ml. Pentru determinarea cantitativă glucozei în LCR se pot folosi metode colorimetrice (metoda cu o-toluidină) şi, mai ales, metodele enzimatice folosite la dozarea glucozei serice, metode folosite de analizoarele automate. Determinarea clororahiei Principiu: Clorurile din LCR se pot doza prin metoda argentometrică, titrând proba cu o soluţie de azotat de argint, în exces, în prezenţa cromatului de potasiu ca indicator. Mod de lucru: Într-un vas Erlenmayer se pipetează 1 ml LCR, 5 ml apă distilată, 2 picături cromat de potasiu. Se titrează cu azotat de argint n/50 până la apariţia unei coloraţii portocalii. Calcul: mg NaCl/100 ml LCR = n x 1,17 x 100 Valoarea normală: 720 – 750 mg NaCl/100 ml. Valorile sub 500 mg/100 ml indică o meningită netuberculoasă. Valorile cuprinse între 550 – 650 mg/100 ml necesită cunoaşterea formulei leucocitare, deoarece limfocitoza indică meningită tuberculoasă. Pentru determinarea clororahiei se pot folosi şi metode colorimetrice (cu tiocianat de mercur şi clorură ferică) sau cele bazate pe utilizarea de electrozi ionselectivi similare celor folosite pentru dozarea clorului în ser şi urină. Identificarea triptofanului

Se realizează pentru a diferenţia meningita tuberculoasă de meningitele de altă etiologie când nu apare triptofan. Principiu: Triptofanul reacţionează cu oxalat de magneziu, în mediu acid, formând un compus colorat în violet. Mod de lucru: Într-o eprubetă se pipetează 5 ml oxalat de magneziu şi 2 ml LCR. Se agită uşor şi se adaugă 1 ml acid sulfuric concentrat la fundul eprubetei. Dacă LCR conţine triptofan, la limita de separare apare un inel de culoare violet. Reducerea KMnO4 (metoda P. Ferencz) LCR reduce soluţia de permanganat de potasiu 1,5‰ într-un timp determinat (120 secunde). În meningită acută şi în toxicoze la copii, reducerea permanganatului de potasiu este instantanee. Investigarea biochimică a lichidelor patologice de puncţie (lichide de paracenteză sau revărsate seroase) Plămânii, inima şi cavitatea abdominală sunt înconjurate de ”saci” membranari dublu stratificaţi permeabili pentru componentele serice. Fluidul care se formează când serul dializează prin aceste membrane este numit lichid seros. Specific, acestea sunt lichid pleural (la plămâni), pericardial (în jurul inimii) şi peritoneal (abdominal sau lichid de ascită). Lichidele seroase sunt o plasmă ultrafiltrată. Concentraţia compuşilor cu dimensiuni reduse (electroliţi, glucoză) este comparabilă cu cea din plasmă. De exemplu, concentraţia glucozei este aprox. 75 mg/dL. Concentraţia proteinelor este mai mică decât în plasmă, iar proteinele cu masă moleculară mare (de exemplu, fibrinogen, α2-macroglobulină, lipoproteine) nu sunt prezente în condiţii normale. Concentraţia normală a proteinelor este