Ejercicios Sesion 4.1 PDF [PDF]

Zitiervorschau

Facultad de Ingeniería Carrea de Ingeniería en Biotecnología IBIO2424 – BIOQUÍMICA III Clase de resolución de ejercicios – Semana 4 1. Un microgramo de una enzima pura (PM= 92000) catalizó una reacción a la velocidad de 0,5 µmoles/min en condiciones óptimas. Calcular (a) la actividad específica de la enzima expresada en U/mg de proteína y en U/mol, (b) el índice de recambio y (c) ¿cuánto tiempo dura un ciclo catalítico? Definiciones útiles: U: unidad de actividad enzimática, corresponde a los μmoles de sustrato consumidos en 1min, o bien a los μmoles de producto formado en 1min. U=μmol S/min = μmol P/min Actividad enzimática: la velocidad con que transcurre una reacción catalizada por una enzima. Se expresa en unidades de velocidad (concentración/tiempo). U/mL Actividad específica: la actividad por unidad de masa de proteína en la preparación enzimática. 𝑈 Actividad enzimática (U/mL) 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 ( ) = 𝑚𝑔 concentración de proteínas totales (mg/mL) Datos:  

1 ug de proteína = 10-3 mg de proteína V = 0.5 umol/min = U 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 =

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 = 500

0.5 𝑢𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛 𝑈 = 500 10−3 𝑚𝑔 𝑚𝑔 (𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎)

𝑈 1000 𝑚𝑔 92000 𝑔 𝑢𝑚𝑜𝑙 𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜/𝑚𝑖𝑛 × × = 4.6 ∗ 1010 𝑚𝑔 1𝑔 1 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 (𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎)

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 = 4.6 ∗ 1010

𝑈 𝑚𝑜𝑙 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 (𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎)

Kcat (constante para cada enzima): Número de recambio. Número de moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones saturantes del sustrato. Se le conoce como número de recambio, porque indica el número máximo de ciclos catalíticos por sitio activo y por unidad de tiempo. Tiene unidades de tiempo-1.

𝑣𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑐𝑎𝑡 ∙ [𝐸]𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑘𝑐𝑎𝑡 =

𝑣𝑚𝑎𝑥 [𝐸]𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙

𝑘𝑐𝑎𝑡 = [𝐸]𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 =

𝑣𝑚𝑎𝑥 [𝐸]𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙

1 𝑢𝑔 = 1.087 ∗ 10−5 𝑢𝑚𝑜𝑙 92000 𝑢𝑔/𝑢𝑚𝑜𝑙 𝑣𝑚𝑎𝑥 = 0.5 𝑢𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛

𝑘𝑐𝑎𝑡 =

𝐶𝑖𝑐𝑙𝑜 𝑐𝑎𝑡𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑜 =

0.5 𝑢𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛 = 46000 𝑚𝑖𝑛−1 1.087 ∗ 10−5 𝑢𝑚𝑜𝑙

1 𝑘𝑐𝑎𝑡

=

1 = 2.17 ∗ 10−5 𝑚𝑖𝑛 = 1.3 ∗ 10−3 𝑠 46000 𝑚𝑖𝑛−1

2. Relación entre la velocidad y la concentración del sustrato. Uso de la ecuación de Michaelis-Menten. a) A que concentración de sustrato una enzima cuyo kcat es de 30 s-1 y el valor de Km es de 0.0050 M, opera a una velocidad equivalente a un cuarto de su velocidad máxima. b) Determine la fracción de Vmax que se obtendría para las siguientes concentraciones de sustrato. [S]= 2Km y 10Km. 𝑣𝑜 =

𝑣𝑚𝑎𝑥 ∙ [𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆]

Datos: 𝑣𝑜 = 0.25 ∗ 𝑣𝑚𝑎𝑥 Km = 0.005 M 0.25 ∗ 𝑣𝑚𝑎𝑥 =

0.25 =

𝑣𝑚𝑎𝑥 ∙ [𝑆] 0.005 + [𝑆]

[𝑆] 0.005 + [𝑆]

[S] = 1.67*10-3 M Concentración a la cual la velocidad es un cuarto de la velocidad máxima. b.1) [S]= 2*Km 𝑣𝑜 =

𝑣𝑚𝑎𝑥 ∙ 2 ∗ 𝐾𝑚 𝑣𝑚𝑎𝑥 ∙ 2 ∗ 𝐾𝑚 2 = = 𝑣𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑚 + 2 ∗ 𝐾𝑚 3 ∗ 𝐾𝑚 3

b.2) [S]= 10*Km 𝑣𝑜 =

𝑣𝑚𝑎𝑥 ∙ 10 ∗ 𝐾𝑚 𝑣𝑚𝑎𝑥 ∙ 10 ∗ 𝐾𝑚 10 = = 𝑣 𝐾𝑚 + 10 ∗ 𝐾𝑚 11 ∗ 𝐾𝑚 11 𝑚𝑎𝑥

3. La enzima Invertasa cataliza la hidrólisis de Sacarosa a fructosa y glucosa. Esta enzima tiene un Km = 0.5 mM para sacarosa y una constante catalítica (Kcat) igual a 175 min-1. Se mide su actividad en presencia de 0.25 mM de sacarosa con 25 x 10-6 µmol de enzima. Datos: [S] = 0.25 Mm [E] = 25*10-6 umol enzima Km = 0.5 Mm KCAT = 175 min-1 a) ¿Qué velocidad de catálisis se observará (Vo) en estas condiciones? 𝑣𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑐𝑎𝑡 ∙ [𝐸]𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 175 ∗ 25 ∗ 10−6 = 0.00438 𝑢𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛

𝑣𝑜 =

𝑣𝑜 =

𝑣𝑚𝑎𝑥 ∙ [𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆]

0.00438 ∙ 0.25 = 0.00146 𝑢𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛 0.5 + 0.25

b) ¿Qué fracción representa esto de la Vmáx? 0.00146 ∗ 100 = 33% 0.00438 c) ¿Cuánto sustrato habría que añadir para que la velocidad observada alcance 95% de la Vmáx? 0.95 ∗ 0.00438 =

0.00438 ∙ [𝑆] 0.5 + [𝑆]

[s] = 9.5 Mm d) ¿Qué importancia podría tener esto para la posible aplicación industrial de la enzima? - Explique sus respuestas.