Total Iz 2 Micro Usmf [PDF]

Zitiervorschau

TEMA 1 1. INFECŢIA – totalitatea proceselor biologice care se produc în ma/o în urma penetrării mi/o patogene sau potenţial patogene (PP). PROCESUL INFECŢIOS – interacţiunea dintre mi/o şi ma/o în diverse condiţii ale mediului ambiant. Manifestarea lui poate fi inaparentă / asimptomatică (stare de portaj sănătos, eliminarea rapidă a mi/o) sau simptomatică. MALADIA INFECŢIOASĂ – manifestarea supremă a procesului infecţios diferite simptome efectele metaboliţilor microbieni (toxine, enzime, etc) sau de reacţia imună a gazdei la prezenţa bacteriei. Particularităţile bolii infecţioase provocata de agenţi patogeni Contagiozitate (capacitatea de a se transmite de la o sursă la o persoană receptivă) Specificitate (un agent provoacă o infecţie, ex.: Clostridium tetani este agentul tetanosului, etc.) Evoluţie clinică stadială; Imunitate la reinfecţie (durată variabilă) Apariţia maladiei depinde de multipli factori, în special de capacitatea agentului cauzal de a provoca maladia şi de gradul de rezistenţă al gazdei la această invazie 2. ROLUL MICROORGANISMULUI ÎN PROCESUL INFECŢIOS. PATOGENITATEA ŞI VIRULENŢA Relaţiile dintre mi/o şi ma/o gazdă: Comensalism (flora bucală, intestinală, etc); Parazitism (prezenţa mi/o este nocivă pentru ma/o). Orice mi/o “parazit” capabil să provoace o infecţie (condiţii adecvate) este considerat patogen. Există 2 tipuri de mi/o patogene: Obligat (cert) patogene, care infectează persoane imunocompetente cu doze mici Potenţial patogene (oportuniste), care pot cauza infecţie numai cu doze mari sau la persoane imunocompromise (deseori fac parte din flora normală a organismului) Mi/o patogene pot fi găzduite uneori fără a provoca maladia, astfel de persoane sunt numite purtători sănătoşi de germeni. Microorganismele patogene se caracterizează prin: Patogenitate – capacitatea unei bacterii de a declanşa infecţia. Este un caracter de specie determinat genetic ( cromozom, plasmide, bacteriofagi). În cadrul unei specii patogene pot exista tulpini cu manifestare variată a patogenităţii – de la absenţa totală până la foarte înaltă. Virulenţă – gradul de patogenitate al unei tulpini (măsură cantitativă a patogenităţii). Se apreciază prin infectarea animalelor de laborator cu cantităţi diferite de mi/o. Unităţile de virulenţă: DLM – numărul de bacterii necesar pentru a ucide 80% din animalele infectate DL50 – 50% letalitate DCL – 100% letalitate DI50/DI – provoacă boala la 50% / 80% animale Modificarea virulenţei: Amplificarea prin transfer şi recombinare genetică, condiţii optime pentru creştere Reducerea (atenuarea) prin menţinerea bacteriilor în condiţii nefavorabile (t, factori chimici, etc), mutaţii

3. Bacteria patogenă trebuie: Să fie capabilă de a se transmite între gazde Să penetreze în organismul-gazdă Să se răspândească prin organism Să se multiplice şi să persiste (evitând sau distrugând sistemul imun al gazdei) Să producă leziuni Aceste capacităţi sunt asigurate de factorii de patogenitate. Factorii de patogenitate ai bacteriilor Factori structurali (somatici) Adezine - fimbriile, glicocalixul, proteine de adeziune ale peretelui celular. Asigură aderarea bacteriilor la receptorii de pe suprafaţa celulelorţintă sau la proteine matriciale extracelulare (colagen, fibronectină, laminină, elastină, etc) Proteine ale sistemelor de secreţie (tipuri I-IV) Capsula – antifagocitar, anti-complement Ag K Antigenul O - antifagocitar Peptidoglicanul (adeziune, agresie tisulară) Acizii teichoici/lipoteichoici (adeziune, toxicitate) Proteina A la stafilococi (acţiune antifagocitară prin fixarea Fc a IgG) Proteina M la streptococi (adeziune, antifagocitar) Enzime de patogenitate (responsabile de persistenţă, diseminare şi producerea leziunilor) Plasmocoagulaza (formarea trombilor septici-efect antifagocitar, propagare în organism) Fibrinolizina (eliberarea bacteriilor din trombi)

Hialuronidaza (diseminare, leziuni tisulare) Colagenaza (identic) Neuraminidaza (lichefierea mucusului) Proteaze (ex.: distrugerea Ig A secretorii) Dezaminaze Decarboxilaze Fosfataze, etc Toxine bacteriene (responsabile de leziuni): Exotoxine ( proteice, secretate în mediul extracelular); Endotoxine (LPZ, legate de celula bacteriană) Moduline şi invazine: Injectate la suprafaţa sau direct în interiorul celulei-ţintă; Induc penetrarea (internalizarea) şi propagarea bacteriană. Se întâlnesc la Yersinia, Shigella, Salmonella, Escherichia Alţi factori ce asigură persistenţa mi/o: Variaţii antigenice; Mimicria antigenică Caracteristica exotoxinelor: Proteine produse de bacterii G+/GPot fi secretate în mediul extern, eliberate în spaţiul periplasmic sau fixate pe suprafaţa celulei Termolabile (excepţie – enterotoxina stafilococică şi TS (toxina termostabilă) a E. coli) Hidrosolubile şi acţionează la distanţă Efectul se instalează după o perioadă de incubaţie Manifestă tropism (specificitate de acţiune) Toxicitate înaltă (DLM de ordinul ng/kg) Exotoxinele sunt imunogene (induc sinteza anticorpilor - antitoxine) Antitoxinele neutralizează activitatea exotoxinei (faza de fixare pe receptorii celulari) Exotoxinele tratate cu formol 0,4% şi menţinute la 39-40°C timp de 3-4 săptămâni se transformă în anatoxine. Ele sunt lipsite de toxicitate dar păstrează imunogenitatea (utilizate în calitate de vaccin). Suportul genetic al exotoxinelor: cromozom (dizenterică), plasmide (toxina antraxului, toxina tetanică), profagi (toxina difterică, botulinică). Tipurile de exotoxine: Toxine citolitice. Dereglează membranele celulare prin acţiune enzimatică (fosfolipaza /lecitinaza, sfingomielinaza) sau prin formarea porilor (streptolizina O, α-toxina/hemolizina S.aureus, leucocidina) Toxine citotoxice, de tip A-B (acţionează în interiorul celulei). Ex.: toxina difterică, botulinică, tetanică, holerică, etc Au structură bipartită: fracţia polipeptidică B (cell binding) este responsabilă de legarea de receptorii specifici din membrana celulei-ţintă, fracţia polipeptidică A (active) pătrunde în celulă (prin endocitoză sau translocare) şi determină activitatea toxică. Fiecare citotoxină acţionează strict specific: toxina difterică – inhibă sinteza proteinelor, toxina botulinică şi tetanică – neurotoxine, inhibă eliberarea neurotransmiţătorilor, toxina holerică şi pertusică – activează adenilat-ciclaza membranară, etc Obţinerea exotoxinelor bacteriene Cultivarea tulpinii toxigene în mediu lichid Filtrarea culturii pentru separarea toxinei Purificarea toxinei Concentrarea toxinei Determinarea activităţii toxinei (se măsoară in unităţi de floculare – Lf ) Caracteristica endotoxinelor: Complexe LPZ din peretele celular G- (cel mai toxic component este lipidul A). Este eliberată în urma lizei bacteriilor (sub influenţa sistemului imun al gazdei sau a unor AB). Termostabilă Ne-imunogenă Nu poate fi transformată în anatoxină DLM de ordinul mg/kg Efectul se manifestă imediat Determină efecte generale, indiferent de provenienţă Mecanismul de acţiune al endotoxinei : LPZ induce secreţia unor substanţe biologic active (citokine pro-inflamatoare: IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa) de către macrofage şi alte celule. Iniţial LPZ se leagă de o proteină serică (LPS-binding protein)  acest complex interacţionează cu CD 14 de pe membrana macrofagului. Există şi molecule solubile de CD 14, astfel endotoxina poate să acţioneze asupra altor celule, d e ex.: celulele epiteliale. Un alt receptor macrofagic poate interacţiona cu LPZ – receptorul toll-like (TLR4). În doze mari citokinele pot provoca şocul endotoxinic (septic), comun pentru toate bacteriile G-: Febră (eliberarea pirogenilor IL-1, TNF de către celulele care au captat endotoxina) Leucopenie, urmată de leucocitoză Tulburări de coagulare (activarea factorului XII – formarea fibrinei şi obstrucţia capilarelor sanguine – coagulare intravenoasă diseminată) Hemoragii (consumarea factorilor de coagulare) în diverse organe (rinichi, suprarenale, plămâni, creier) Vazodilatare, urmată de colaps vascular (sechestrarea periferică a sângelui, hipovolemie, acidoză metabolică, scăderea bruscă a presiunii sanguine) În consecinţă au loc leziuni hemoragice şi necroză în diverse organe (rinichi, suprarenale, plămâni, creier...). Pronosticul este foarte sever.

5. Dinamica evoluţiei bolii infecţioase Perioada de incubaţie (de la penetrarea mi/o până la apariţia primelor simptome). Durata – variabilă (ore – ani). Microbul se adaptează, se multiplică, produce toxine, enzime, etc. Perioada de invazie (prodromală, de debut). Apar primele semne clinice, nespecifice (febră, frison, inapetenţă, astenie, etc). Durata – 2-3 zile. Perioada de stare (a manifestărilor clinice specifice). Durata variabilă. Perioada terminală (convalescenţă şi vindecare, sau cronicizare, sau stare de portaj, sau deces) 6. Criteriile de apreciere a rolului etiologic al agentului cauzal în survenirea infecţiilor specifice (postulatele lui Koch) Bacteria trebuie să fie prezentă la toate persoanele bolnave. Bacteria trebuie să fie izolată de la bolnav şi menţinută în cultură pură. Cultura pură inoculată la un voluntar sau la un animal experimental trebuie să reproducă simptomele bolii. Aceeaşi bacterie trebuie să fie reizolată de la voluntarul sau animalul infectat. Actualmente se insistă pe genomul bacterian (prezenţa genelor de patogenitate). Rolul mediului ambiant şi social în infecţie (condiţiile economice, condiţiile de viaţă, catastrofe ecologice sau naturale, progresul în igiena publică, etc). Maladii sociale: tuberculoza, pediculoza (tifosul exantematic), sifilisul, etc TEMA 2 1. Rezistenta nespecifica a macroorganismului. Notiune. Factorii care asigura rezistenta nespecifica. Rolul factorilor tisulari (de bariera). Rolul macroorganismului în procesul infecţios. Rezistenţa nespecifică a ma/o. Pentru menţinerea coerenţei celulelor şi ţesuturilor şi păstrarea integrităţii sale ma/o pune în joc 2 categorii de procese apărute succesiv în cursul evoluţiei: Rezistenţa nespecifică, înnăscută – dezvoltată filogenetic, asigurată de factori constituţionali. Răspuns maxim imediat, nespecific, antigen-independent. Imunitatea (rezistenţa specifică) – s-a dezvoltat ontogenetic, Ag-dependentă şi Ag-specifică, răspuns maxim peste câteva zile de la agresie, se caracterizează prin memorie imunologică. Rezistenţa nespecifică: Rezistenţa nespecifică este asigurată de factori tisulari (de barieră), factori celulari şi umorali. Factori tisulari (de barieră) Tegumentul (barieră mecanică - integritatea, descuamarea stratului cornos; barieră biologică -flora normală, chimică - pH acid al tegumentului) Mucoasele (barieră mecanică - integritatea, mişcarea cililor, scurgerea secretelor; chimică -secreţiile digestive, pH acid al urinei; biologică -flora normală; barieră enzimatică – enzimele din secreţiile mucoaselor, ex.: lizozimul, lactoferina) Dacă barierele au fost depăşite, atunci organismul dispune de alţi factori de rezistenţă nespecifică: factori celulari şi umorali.

2. Factori umorali de rezistenţă nespecifică Reactivi de fază acută – organismul supus unei agresiuni reacţionează prin sinteza şi secreţia crescută a unor proteine plasmatice: inhibitori de proteaze proteine ale sistemului complement şi ale coagulării proteina C reactivă protrombina, fibrinogenul, etc. Acestea măresc rezistenţa gazdei, limitează leziunile tisulare si favorizează vindecarea. Complementul – reprezintă un sistem complex de proteine termolabile solubile şi membranare. Se întâlnesc în plasma sangvină, limfă şi exsudate. Nu se detectează în salivă, lacrimi, urină, transsudate. Există peste 30 de fracţii ale C. C1-C9 sunt solubile, celelalte au rol de receptori membranari. Fracţiile C1-C9 circulă în ser sub formă inactivă, care în procesul activării capătă proprietăţi enzimatice. Activitatea biologică a complementului: Opsonizarea bacteriilor Acţiune citolitică Activitate anafilactică – stimulare chimiotaxis  activare neutrofilele, degranularea mastocitelor,bazofilelor Activarea limfocitelor B Properdina – proteine serice care participă la activarea complementului pe cale alternativă. β-lizinele – proteine serice termostabile (63 grade) cu activitate antimicrobiană asupra bacteriilor G+ în special X – lizina, proteină serică termostabilă (70-100 grade), produce liza bacteriilor G –

Lizozimul – prezent în lacrimi, salivă, ser sanguin, favorizează liza bacteriilor Anticorpii normali Interferonii (glicoproteine cu acţiune antivirală, antiproliferativă şi imunomodulatoare) 4. Factori celulari de rezistenţă nespecifică: Reacţia inflamatoare. Împiedică multiplicarea şi răspândirea microbilor şi asigură distrugerea lor. Fagocitoza (component al reacţiei inflamatoare). Asigură captarea şi distrugerea substanţelor străine, inclusiv a mi/o, celulelor infectate, celulelor tumorale. Celulele fagocitare (fagocitele) Leucocitele PMN Macrofagele (monocite – în sânge, macrofage fixe – cel. Kupffer, macrofage alveolare, osteoclaste, microglia, macrofage din splină şi ganglioni limfatici). Pentru a interveni, fagocitele trebuie să recunoască bacteriile ca particule străine. Există molecule solubile şi membranare care pot recunoaşte componente bacteriene: Solubile – lectinele care se pot lega de manoza din PC; proteine plasmatice ce leagă LPZ bacterian Membranare – pe macrofage există receptori de manoză, receptorul CD 14 pentru LPZ, receptori Toll-like (TLR). TLR pot recunoaşte diferite molecule bacteriene: LPZ, PG, lipoproteine, acizi lipoteichoici, flagelina. Alţi receptori: receptori pentru Fc al IgG, pentru complement (CR1, CR3, CR4), pentru interferon, limfokine, lectine, fibronectină, ş.a. FAZELE FAGOCITOZEI Chemotaxisul (atractanţi – proteine bacteriene, fragmente de PC, capsule, LPZ, chemokine, etc) Adeziunea mi/o la fagocit (fagocitul recunoaşte molecule străine de pe suprafaţa bacteriilor – monomeri de PG, acizi teichoici, LPZ, acid micolic, ADN bacterian, ARNd.c. viral, manoza, glicani din fungi, etc ) Inhibitori – capsula, Ag O, prot. M, prot. A, plasmo-coagulaza, etc. Bacteriile patogene care nu pot fi fagocitate se numesc extracelulare. Stimulatori – cationi de Ca2+, prot. C - reactivă, opsonine (fracţii de complement (C3b), fibronectina, unii Ac). Datorită receptorilor opsoninele acoperă suprafaţa bacteriilor (opsonizare). Fagocitele de asemenea posedă receptori pentru opsonine şi astfel facilitează adeziunea şi ingestia mi/o. Ingestia (înglobarea) şi formarea fagosomei. Distrugerea (digestia) intracitoplasmatică. Fagosoma fuzionează cu Lz  fagolizosom  mi/o va fi omorât sub acţiunea E, anionilor superoxizi, H2O2, pH acid, apoi digerat de E hidrolitice. Produsele degradate pot fi eliminate din celulă (PMN, macrofagele) sau după o selecţie şi pregătire prealabilă (processing) unele peptide vor fi expuse pe membrana macrofagelor în asociaţie cu molecule ale CMH. Ele vor contribui la stimularea imunităţii prin interacţiunea cu receptorul pentru Ag de pe limfocitele T. Aceasta este fagocitoza completă. Fagocitoza incompletă – agentul persistă şi se multiplică în fagocit (micobacterii, gonococi). Cauze: inhibiţia formării fagolizosomei, eliminarea bacteriei din fagosomă înainte de fuziunea cu lizosoma, etc). Aceştia sunt patogeni facultativ intracelulari. Aprecierea stării funcţionale a fagocitelor: Procentul fagocitelor active (N - 30-60%) – ponderea fagocitelor care au înglobat cel puţin un mi/o. Numărul fagocitar (N - 4 - 24) – nr de mi/o înglobate în mediu de un fagocit Alte celule cu activitate nespecifică: celulele K şi NK 5. IMUNITATE – nereceptivitatea organismului la orice agenţi străini din punct de vedere genetic, inclusiv la mi/o şi toxinele lor. IMUNITATE – capacitatea de apărare specifică a organismului faţă de agresori externi (virusuri, bacterii, fungi, protozoare, toxine) cât şi faţă de propriile molecule şi unele celule degradate sau modificate. Sarcina fundamentală a imunităţii – distincţia dintre moleculele şi celulele proprii (self) şi cele străine (non-self) TIPURILE DE IMUNITATE Ereditară (naturală, de specie). Poate fi absolută (lipsa ţintei) sau relativă. Dobândită (achizitionata, adaptativa) Activă - Naturală (postinfecţioasă); Artificială (în urma vaccinării) Pasivă - Naturală (transplacentară, prin laptele matern); Artificială (administrarea Ac/seruri imune sau a limfocitelor) Imunitatea dobândită se caracterizează prin: Dezvoltare lenta si manifestare tardiva (câteva zile, săptămâni dupa contactul cu un Ag) Specificitate faţă de Ag (capacitatea de a recunoaste si raspunde specific la numeroase substante straine, inclusiv agenti infectiosi) Memorie imunologică (capacitatea de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si eficace la intalniri repetate cu un Ag) Imunitatea dobândită poate fi: Imunitate antibacteriană, antivirală, antimicotică, antitoxică, antitumorală, etc. În funcţie de mecanismele reacţiilor imune: Imunitate umorală, exercitată prin intermediul unor proteine numite anticorpi (Ac, Ig)  limf. B. Fiind secretate in sange si lichide biologice neutralizeaza si elimina microbii extracelulari si toxinele lor. Imunitate celulară, eficienta in eliminarea parazitilor intracelulari sau a celulelor tumorale. Este exercitată prin intermediul limf. T (citotoxicitate directa, activarea macrofagelor, celulelor NK, secreţia citokinelor). În dependenţă de persistenţa mi/o: Imunitate sterilă – se manifestă după eliminarea agenţilor patogeni din organism (ex.: rujeolă) Imunitate nesterilă – nereceptivitatea se păstrează doar în perioada aflării mi/o în organism (tbc, sifilis).

6. Sistemul Imun reprezinta un ansamblu de celule, molecule şi tesuturi (organe) distribuite în tot organismul, care participa la instaurarea imunitatii.

Functiile Sistemului Imun: Aparare contra infectiilor; Recunoasterea tesuturilor si proteinelor straine si raspunsul la ele; Protectie contra tumorilor Organele centrale (primare) ale SI – măduva osoasă şi timusul la vertebrate (ficatul în perioada embrionară), bursa Fabricius la păsări. Apar primele în timpul vieţii embrionare. Rolul – sursa celulelor-stem, “instruirea”, maturizarea şi selectia celulelor imunocompetente (limfocitele T şi B). În măduva osoasă se află celulele-stem, precursori ai T şi B-limfocitelor. Pre-T limfocitele migrează ulterior în timus, unde va avea loc instruirea şi maturizarea lor, devenind celule imunocompetente, capabile să recunoască specific un singur Ag (prin achiziţionarea unor receptori specifici). Instruirea si maturizarea B-limfocitelor are loc în măduva osoasă. Aceste procese sunt independente de orice stimulare antigenică a organismului. După părăsirea organelor centrale limfocitele nu mai revin aici, ele se stabilesc în organele limfoide secundare, recirculând prin sânge, limfă. Organele periferice (secundare) ale SI. În ele se realizează contactul dintre Ag, celulele prezentatoare de antigen ( CPA) şi celulele imuno-competente, cu inducerea unui raspuns imun. Ganglionii limfatici (raspuns imun contra Ag transportate cu limfa). Splina (raspuns imun contra Ag transportate cu sangele). Formaţiunile limfoide ale mucoaselor digestive şi respiratorii (amigdale, plăci Peyer, apendice), ţesutul limfoid asociat tegumentului (raspuns imun contra Ag ce penetreaza prin epitelii) Ariile timo-dependente (populate de limfocite T) sunt: zona paracorticala a ganglionilor limfatici (paracortex), manşonul limfoid periarteriolar al pulpei albe a splinei şi zonele interfoliculare ale plãcilor Peyer. Celule imunocompetente. Limfocitele (celule imunocompetente, recunoasterea Ag) Celulele efectoare (eliminarea microbilor) Celulele prezentatoare de Ag (CPA) (captarea si prezentarea Ag microbiene ) LIMFOCITELE Toate limfocitele provin din celule-stem ale maduvei osoase, cu o etapa ulterioara de maturizare si selectie. Limfocitele T si B sunt unicele celule ce poarta receptori specifici de Ag (celule imuno-competente), fiind mediatorii principali ai imunitatii adaptative Maturizarea limf. B are loc în măduva osoasă prin intermediul interacţiunii directe cu celulele stromei, iar în stadiile tardive sub acţiunea citokinelor secretate de celulele stromale (în special IL-7). Limf. B sunt supuse unei selectii pozitive in favoarea expresiei de receptori intacti si unei selectii negative contra recunoasterii puternice a antigenelor proprii. In organelor limfoide secundare limf. B se localizeaza in foliculii cortexului extern din ganglionii limfatici, foliculii din plãcile Peyer şi foliculii zonei periferice din pulpa albã a splinei (arii timo-independente). Limfocitele B şi T naive sunt celulele care inca nu s-au întâlnit cu un Ag. După interacţiunea cu Ag urmeaza activarea lor, proliferarea şi diferenţierea în celule efectoare (LB – în plasmocite, LT în Th, Tc), care vor elimina microbii sau neutraliza toxinele lor prin diferite mecanisme. LBreprezintă 10-15% din populaţia limfocitară, cu o durată de viaţă scurtă, de 3-5 zile, iar LT constituie 70% cu o durată de viaţă lungă (luni, ani). Alte celule limfocitare (nule, neimuno-competente) – 15% Celule NK, capabile să distrugă spontan celule canceroase şi celule infectate cu virus. Celule K, posedă pe membrana lor receptori pentru fragmentul Fc al Ig. Distrug celulele-ţintă acoperite cu Ac (Ig) – fenomen de citotoxicitate Ac-dependentă. COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE Moleculele CMH reprezintă un ansamblu unic de glicoproteine exprimate pe suprafaţa celulelor organismului, care sunt veritabili markeri/Ag de identitate ai fiecărui individ. Rolul moleculelor CMH: Participă la prezentarea Ag peptidice TL. Responsabilitate în respingerea grefelor. CMH este transmis genetic. Genele CMH sunt situate pe cromozomul 6 la om, locus numit HLA (Human Leukocyte Antigen). Moleculele CMH sunt formate din 2 catene polipeptidice, constituite din domenii extracelulare, un fragment transmembranar şi o regiune intracitoplasmatică. Structura tridimensională a moleculei duce la formarea unei cavităţi, la fundul căreia se află R care vor interacţiona cu peptide antigenice proprii sau străine. Alţi receptori ai CMH interacţionează cu moleculele CD4 sau CD8 de pe TL. Se disting molecule (antigene) CMH de clasa I şi de clasa II. Moleculele CMH I sunt exprimate pe toate celulele nucleate ale organismului. CMH I recunoaste si interacţionează cu receptorul CD8 de pe TL. CMH I participă la prezentarea peptidelor antigenice scurte (9 AA) obţinute în cursul degradării in citoplasma (de către proteasome) a Ag endogene (molecule proprii sau proteine virale sintetizate de CPA). Complexul peptid/CMH I de pe suprafaţa CPA (macrofage, celule dendritice) poate fi recunoscut de complexul TCR/CD8 complementar de pe TCD8 naive  activarea limfocitelor, diferenţierea lor în limf. Tc - iniţierea răspunsului imun celular) Complexul peptid /CMH I de pe suprafaţa celulelor infectate sau a celulelor tumorale poate fi recunoscut de complexul TCR/CD8 complementar de pe limfocitele efectoare Tc  distrugerea celulelor ce conţin Ag endogen. Moleculele CMH de clasa II sunt exprimate pe celulele specializate în prezentarea Ag pt TCD4: limf. B, celule dendritice, monocite, macrofage. Ele pot prezenta peptide din 12-30 AA derivate din degradarea în fagolizosome a Ag exogene (bacterii, protozoare, fungi, virioni liberi). Complexul peptid/CMH II de pe celulele prezentatoare de Ag interacţionează cu complexul TCR/CD4 de pe limfocitele CD4 naive sau efectoare (Th1, Th2). Astfel moleculele CMH II sunt implicate în ambele tipuri de imunitate: umorală şi celulară.

TEMA 3

1. ANTIGENELE – substanţe străine (non-self) de natură endo-/exo-genă capabile să declanşeze un răspuns imun (umoral, celular, toleranţă imunologică, memorie imunologică, paralizie imunologică). Proprietăţile de bază ale Ag: Imunogenitatea – capacitatea Ag de a fi recunoscut ca străin şi de a induce răspuns imun specific Antigenitatea (specificitatea) – capacitatea Ag de a interacţiona specific cu Ac sau cu receptorul pentru Ag complementar al limfocitelor sensibilizate Antigenele care posedă ambele caractere sunt Ag complete. Cerinţele faţă de Ag complete: Să fie substanţe străine Să fie formate din gruparea carrier (purtător) şi epitopi (determinante antigenice) Să aibă o greutate moleculară de peste 10 kDa Să aibă structură chimică complexă (proteine, PZ, LPZ, etc) Să aibă o conformaţie spaţială stabilă Antigenele incomplete (haptenele) posedă antigenitate dar sunt lipsite de imunogenitate. Cerinte fata de Ag incomplete (haptenele): Au masă moleculară mică Pot deveni imunogene combinându-se cu macromolecule purtătoare (proteine sau polizaharide) Exemple de haptene: săruri ale metalelor grele (Cr, Ni), substanţe de origine vegetală, medicamente, coloranţi, oligonucleotide. SuperAg – molecule proteice particulare (enterotoxinele stafilococice, toxina şocului toxic stafilococic, toxina exfoliativă a stafilococilor, nucleocapsida virusului rabic), capabile să stimuleze un număr mare de limfocite T (10-40%). N – 0.01%. SuperAg provoacă reacţii imunopatologice. Se disting arbitrar: Ag solubile: proteine plasmatice, toxine, enzime, hormoni, etc Ag figurate (celulare, corpusculare): celule, bacterii, paraziţi, etc. În funcţie de provenienţă se deosebesc: Ag heterofile – Ag comune mai multor specii animale. Ex.: Ag polizaharidice Forssman, prezente în hematiile de cal, câine, oaie, cobai; sistemul Rh al eritrocitelor se întâlneşte la om şi maimuţele Macaccus rhesus, etc Ag heterologe (xeno-Ag, hetero-Ag) – Ag provenite din organismul altei specii Izo-Ag (alo-Ag) – Ag de grup în cadrul unei specii (sistemul ABO şi Rh, clasele de Ig) Idioantigene – antigenele specifice unui individ. Corespund moleculelor CMH Autoantigene – Ag proprii unui organism, devenite imunogene în anumite condiţii (spermatozoizii, tiroglobulina, insulina, cristalinul, ţesutul nervos, etc) Exoantigene (provenite din compartimentul extracelular - bacterii, fungi, protozoare fagocitate) Endoantigene (provenite din citoplasma celulelor, reprezintă proteine proprii modificate sau proteine virale sintetizate de celulele macroorganismului) CELULELE PREZENTATOARE DE ANTIGEN (CPA) BL recunosc direct prin intermediul BCR epitopi antigenici conformaţionali solubili sau fixaţi pe membrane celulare. TL pot recunoaşte numai epitopi proteici liniari asociaţi cu molecule ale CMH expuşi pe suprafaţa unor celule specializate – CPA (restricţie CMH). CPA “profesioniste” includ celulele dendritice foliculare şi tisulare, monocitele / macrofagele şi limfocitele B Funcţiile CPA Captarea, fragmentarea (processing-ul) Ag proteice, selectia şi expunerea pe suprafaţa sa a peptidelor antigenice (epitopi liniari) asociate cu moleculele CMH. Transportarea acestor complexe spre tesutul limfoid periferic, unde complexul CMH-peptid va fi prezentat LT naiv cu TCR specific, declanşand activarea lui. CPA care exprima peptide asociate cu CMH I vor interactiona cu limfocite TCD8, iar CPA care exprima peptide in asocoatie cu CMH II – cu TCD4. Producerea semnalelor secundare de activare a LT (secreţia unor citokine).

2. Structura antigenică a celulei bacteriene Ag structurale (Ag O/R – somatice, LPZ, termostabile; Ag H – flagelar, proteic, termolabil; Ag K – capsular, termovariabil; Ag F – fimbrial)

Ag solubile (enzime de patogenitate, exotoxine) Antigene virale: proteine/GP de invelis, nucleoproteine, enzime Determinantele antigenice (epitopii). Imunogenitatea este o caracteristică a întregii macromolecule Ag. Antigenitatea (specificitatea) este determinată de anumite secvenţe ale Ag. Suprafeţe limitate din macromolecula Ag apte să se combine cu Ac specifici sau cu receptorii de pe limfocitele sensibilizate se numesc determinante antigenice sau epitopi. La glucide epitopul este format din 4-6 monozaharide. Polizaharidele sunt formate dintr-un epitop repetat sau dintr-un număr redus de epitopi diferiţi. Polizaharidele sunt Ag T-independente, pot induce sinteza Ac fără intervenţia TL. Epitopul proteic este constituit din câţiva aminoacizi (AA). Epitopii liniari (secvenţiali) sunt determinaţi de structura primară a AA (8-30 AA) Epitopii conformaţionali sunt determinaţi de structura secundară sau terţiară a moleculei proteice (juxtapoziţia în spaţiu a AA situaţi la distanţă). Se modifică la denaturarea proteinei. Fiecare moleculă proteică reprezintă un mozaic de epitopi, fie diferiţi, fie identici. Proteinele sunt Ag T-dependente, deoarece ele induc sinteza Ac doar prin cooperarea dintre T şi B limfocite. Numărul de epitopi de pe o moleculă imunogenă reprezintă valenţa Ag. 3. IMUNOGLOBULINELE (ANTICORPII) = glicoproteine din fracţia γ -globulinelor. Se disting Ig membranare (BCR) şi Ig solubile (secretate) – Ac ca atare. Ac = molecule glicoproteice produse de plasmocitele derivate din limf. B activate de Ag. Ac circulă în sânge şi pătrund în ţesuturi. Sunt eficienţi contra bacteriilor, toxinelor microbiene şi virusurilor în poziţie extracelulară. STRUCTURA ŞI PROPRIETĂŢILE Ig UNITATEA DE STRUCTURĂ a Ig (monomerul) este constituită din 2 lanţuri glicoproteice (catene) identice uşoare L (Light) şi 2 catene grele H (Heavy), legate între ele prin punţi disulfidice. Există 2 tipuri de catene L – κ şi λ, identice într-o moleculă de Ig. Se disting 5 clase de lanţuri H: γ, α, µ, δ, ε, ce corespund celor 5 clase (izotipuri) de Ig: Ig G, Ig A, Ig M, Ig D, Ig E. În componenţa lanţurilor se disting regiuni variabile (aminoterminale) şi regiuni constante (carboxilterminale). Regiunile variabile ale catenelor L şi H formează o cavitate tridimensională - centrul activ (paratopul) al moleculei de Ig, care va reacţiona specific cu determinanta antigenică (epitopul) Ag corespunzător, constituit din 5-7 AA sau 3-4 reziduuri glucidice. Regiunea variabilă constituie fragmentul Fab (antigen binding) al moleculei de Ig. Regiunea constantă corespunde fragmentului Fc (constant, cristalizabil). Este purtător de receptori şi responsabil de activitatea biologică a Ig: Transportul transplacentar al unor Ig (Ig G) Fixarea pe diferite celule (mastocite, bazofile, fagocite, limfocite, etc.) Capacitatea de a fixa complementul Capacitatea de fixare a prot. A a stafilococilor Defineşte clasele şi subclasele de Ig (specificitatea antigenică a catenei H) Monomerul de Ig este constituit din 2 fragmente Fab şi unul Fc. Între ele se află zona balama, responsabilă de flexibilitatea moleculei de Ig. Numărul paratopilor determină valenţa Ig. Ac cu 2 sau mai mulţi paratopi se numesc Ac compleţi, cei cu un singur paratop – Ac incompleţi. Ig G, Ig D şi Ig E sunt monomeri, Ig A din ser – monomeri, din secretele mucoaselor – dimeri, Ig M sunt pentameri. Proprietăţile claselor de Ig Ig G (4 subclase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) – 75% din ansamblul Ig serice. CS = 7S, GM = 150kDa. Sunt unicele Ig capabile să traverseze bariera placentară. Fc al IgG are centre de fixare a complementului (activarea C pe cale clasică), a macrofagelor şi neutrofilelor (rol în opsonizare), a prot. A a stafilococilor. Perioada de semi-viaţă 21 zile. Manifestă activitate opsonizantă, antibacteriană, antitoxică, antivirală. Ig M – 5-6% din totalul Ig. Pentamer. CS = 19S, GM = 900kDa. Se distrug sub acţiunea mercapto-etanolului sau cisteinei. Semi-viaţa – 5 zile. Fixează si activează complementul pe cale clasică. Nu traversează placenta, prezenţa Ig M la nou-născut denotă infecţie intrauterină. Sunt primele care apar după un stimul antigenic primar şi indică un proces infecţios acut. Monomeri de IgM constituie BCR pe B-limfocite. Ig A – 15% din totalul Ig. CS = 7S, GM = 160 kDa. Bogate în glucide. Se disting 2 subclase: IgA1 (93%) şi IgA2 (7%). Semiviaţa – 6 zile, nu traversează placenta, nu activează complementul pe cale clasică. Ig A serice (monomeri) – 6% din totalul Ig serice. Agregate de IgA pot activa complementul pe cale alternativă. Ig A secretoare (sIg A) – salivă, lacrimi, colostrum, lapte, secreţii gastro-intestinale, nazale, bronhice. Dimer. Asigură protecţia mucoaselor, blocând ataşarea bacteriilor şi virusurilor de receptorii mucoaselor. Ig D – 0,2% din totalul Ig. CS – 6,5S, GM – 170 kDa. Semi-viaţa – 3 zile. Rolul – receptor pentru Ag (BCR) pe LB; posibil participă la eliminarea limfocitelor B care produc autoAc (Ac autoreactivi). Ig E – 0,002 - 0,01%, CS – 7,9S, GM – 185 kDa. Semiviaţa – 2-3 zile. Nu traversează placenta, nu fixează complementul. Termolabile (inactivate la 56°C în 30 min). Se pot fixa pe suprafaţa mastocitelor şi bazofilelor, determinând degranularea lor cu eliberarea unor amine vazo-active (şoc anafilactic, dereglări alergice). Eficiente în afecţiuni parazitare (opsonizarea helminţilor şi artropodelor) .

4.. RI = proces complex, indus de pătrunderea unui Ag. Are loc în organele limfoide secundare şi prevede implicarea mai multor celule (CPA, limfocite T, B, ş.a.) şi substanţe solubile (citokine). Consecinţele unui răspuns imun: Imunitate (umorală, celulară); Hipersensibilitate (imediată, tardivă); Memorie imunologică; Toleranţă imunologică; Paralizie imunologică Ac sunt efectorii principali ai imunităţii umorale, iar limfocitele Tc şi macrofagele activate – ale imunităţii celulare. Imunitatea umorală este eficace contra bacteriilor non-invazive (extracelulare), virusurilor libere şi contra toxinelor. Imunitatea celulară intervine în special contra paraziţilor intracelulari (bacterii, virusuri) şi celulelor proprii modificate (tumorale)

Etapele unui răspuns imun Întâlnirea Ag cu CPA, T-, B-limfocite. Are loc în organele limfoide secundare. Recunoaşterea specifică a Ag, asigurată de limfocitele B şi T naïve prin receptorii pentru Ag (BCR, TCR). BL pot recunoaşte epitopi superficiali conformationali ale moleculelor de Ag native. TL recunosc doar epitopi lineari din Ag proteice prezentate de CPA in asociatie cu moleculele CMH. Activarea, proliferarea şi diferenţierea T sau B limfocitelor în celule efectoare şi celule B sau T-memorie. Coordonarea acestor procese este asigurată de contacte celulare directe şi de citokine, eliberate de diverse celule. Realizarea efectului (neutralizare, opsonizare, liză, etc). RIU = formă a imunităţii achiziţionate asigurată de Ac. Are funcţia de a neutraliza şi elimina microbii extracelulari şi toxinele microbiene. In acest proces participă Ag, CPA, limf T4, limf B. Fazele răspunsului imun umoral: 1. Intalnirea Ag cu limfocitele B 2. Recunoaşterea epitopilor unui Ag de către receptorul specific (BCR) de pe suprafaţa B limfocitelor naive (selecţia clonala) şi activarea lor. 3. Proliferarea limfocitelor B activate si diferentierea lor 4. Efectul interacţiunii dintre Ag şi Ac in vivo Răspunsul umoral primar – la primul contact cu Ag I fază – de latenţă – durează 4-7 zile, până la apariţia primilor Ac. In acest timp are loc recunoaşterea, degradarea Ag, diferenţierea T,B limfocitelor. II fază – logaritmică – Titrul Ac creşte, atingând max în a 10-15 zi. Iniţial are loc producerea Ig M, peste 4-5 zile - IgG sau alte izotipuri de Ig (prin comutatie de clasa sub influenta citokinelor produse de Th). III fază – de producere maximă a Ac – Durata variază în funcţie de Ag. IV fază – de diminuare a titrului de Ac (declin)– În cazul Ag proteice dureaza săptămâni, Ag polizaharidice – luni, Ag virale – ani). Răspunsul umoral secundar (la un contact repetat cu acelaşi Ag).  Este asigurat de LB-memorie  Perioadă de latenţă scurtă (ore)  Ascensiune rapidă a titrului Ac  Titru maxim de Ac menţinut o durată mai mare  Afinitate crescută a Ac faţă de Ag  Producerea anticorpilor Ig G Serul sangvin obţinut de la un organism imunizat cu un Ag conţine o mare varietate de molecule de Ac, produşi de diferite clone de LB. Aceştia sunt Ac policlonali. Ac monoclonali sunt absolut identici. Se obţin prin fuzionarea LB cu o celulă tumorală. Hibridomul obţinut se multiplică ca o celulă tumorală şi secretă Ac omogeni, identici cu BCR. Servesc la detectarea receptorilor de pe suprafaţa celulelor, tratament etc. Rolul RIC = a elimina microbii care pot supravieţui în vacuole fagocitare sau în citoplasma celulelor infectate. Acest tip de imunitate este asigurat de limfocitele T. Principalii efectori ai RIC sunt limfocitele Tcitotoxice (Tc) derivate din limf TCD8 (T8), care au capacitatea de a distruge celulele infectate cu virus sau tumorale şi de a liza macrofagele infectate cu bacterii facultativ intracelulare. Ambele tipuri de limfocite (TCD8 naive si Tc) poseda TCR si molecule CD8. Macrofagele activate reprezintă alţi efectori ai RIC. Ele sunt atrase în focarul infecţios, apoi activate, devenind capabile să distrugă bacteriile intracelulare. Celulele K şi NK participă de asemenea la realizarea citotoxicităţii (nu sunt angajate imun). Limfocitele TCD4+ participa indirect la dezvoltarea raspunsului imun celular, deoarece în urma recunoaşterii Ag vor produce un număr mare de citokine care vor acţiona asupra diferitor celule: monocite, limfocite TCD8, TCD4, celule NK, etc 5. Memorie imunologica – Capacitatea sistemului imun de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si mai eficace la intalniri repetate cu acelasi Ag. Toleranta – absenta raspunsului imun la antigene proprii (self). Este determinata de inactivarea si eliminarea limfocitelor autoreactive in procesul de maturizare a limfocitelor T si B. Paralizie imunologica – are loc un acces excesiv de Ag iar organismul nu manifesta raspuns imun.

T EM A 4 1.

Studiul şi aprecierea imunităţii poate fi efectuată prin intermediul diferitor teste realizate in vitro sau in vivo (reacţii imunologice). Pentru aprecierea răspunsului imun umoral se studiază interacţiunea dintre Ag şi Ac, iar pentru aprecierea imunităţii celulare se determină numărul total de limfocite, subclasele limfocitelor T, se evaluează citokinele, etc. REACŢIILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACŢIILE SEROLOGICE) Reacţia Ag-Ac este determinată de interacţiunea specifică dintre epitopii Antigenului şi paratopii Anticorpilor. În acest proces intervin patru tipuri de legături: legături de hidrogen, legături electrostatice, forţele Van der Waals şi legături hidrofobe. Legătura Ag-Ac are trei caracteristici: este exotermică, specifică şi reversibilă.

Afinitatea unui Ac pentru un Ag specific caracterizează intensitatea forţelor de legătură a complexului Ag-Ac. Ea depinde de complementaritatea sterică dintre paratop şi epitop. Aviditatea unui Ac pentru un Ag specific reprezintă rapiditatea apariţiei manifestării reacţiei Ag-Ac (precipitare, aglutinare, etc.). Ea depinde de constanta de asociere, de valenţa Ac, de numărul de epitopi, de temperatură, de pH, de forţa ionică a mediului. Un paratop se poate combina cu un singur epitop, numit “specific”. Astfel, dacă este cunoscut unul din elementele reacţiei - Ag sau Ac, poate fi identificat celălalt. Reacţiile Ac-Ac (reacţiile serologice) au două direcţii de aplicare practică: Seroidentificare: Detectarea şi dozarea Ag (element necunoscut - tulpini microbiene izolate din diferite prelevate) cu ajutorul Ac specifici cunoscuţi. Pot fi utilizate două surse de Ac: Ac monoclonali, absolut omogeni, dar care recunosc doar un singur epitop şi Ac policlonali, ce se conţin în seruri imune (antiseruri), care permit legături de aviditate înaltă cu Ag. Serurile imune se obţin prin injectarea la un animal de laborator a antigenelor cunoscute. După o perioadă de timp, serul animalului va conţine anticorpi contra acestor antigene. Dar natura exactă a Ac din acest ser nu poate fi cunoscută cu exactitate (Ac policlonali). Specificitatea serului trebuie să fie permanent controlată şi Ac nedoriţi trebuie să fie eliminaţi prin adsorbţie. Serodiagnostic: Detectarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor (component necunoscut) faţă de un Ag specific cunoscut (conţinut în diagnosticuri). Unele reacţii Ag-Ac se manifestă direct şi pot fi observate de experimentator: de exemplu precipitarea sau aglutinarea complexelor Ag-Ac, liza unor celule purtătoare de Ag pe membrana lor (hemoliză, bacterioliză, etc). Alte reacţii Ag-Ac nu se vizualizează “spontan” in vitro. În acest caz se va recurge la nişte artificii experimentale, cum ar fi utilizarea Ac “marcaţi”: Ac marcaţi cu un fluorocrom: imunofluorescenţa. Ac marcaţi cu un izotop radioactiv: analiza radio-imună. Ac marcaţi cu o enzimă: analiza imunoenzimatică. INTERACŢIUNEA ANTIGEN-ANTICORP Faza specifică: are loc interacţiunea dintre Ag şi Ac specific corespunzător. Este un fenomen rapid, invizibil, comun pentru toate reacţiile Ag-Ac. Decurge la temperatura de 37 C, în prezenţa unui electrolit (sol. fiziologică). Faza nespecifică, vizibilă a uniunii Ag-Ac, se manifestă prin precipitare, aglutinare, liză, etc - fenomene determinate de anumite condiţii (valenţa Ac, dimensiunile Ag, etc). 2. REACŢIA DE AGLUTINARE Din latină – agglutinatio - încleiere Reacţia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinare atunci când determinantele antigenice sunt purtate de particule figurate (Ag insolubile, corpusculare), iar Ac specifici sunt compleţi (cel puţin bivalenţi). Aglutinarea este determinată de formarea unei reţele între Ag şi Ac, ce permite apropierea unui număr suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10 epitopi potenţiali aglutinează mai activ decât Ac IgG. Clasificarea reacţiilor de aglutinare Aglutinare “activă” sau “directă”, în care particula figurată (Ag corpuscular) este el însuşi purtător de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi, bacterii) Aglutinare “pasivă” sau “indirectă”, în care particula serveşte doar de suport pentru un determinant antigenic solubil fixat artificial pe suprafaţa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol. Reactii de aglutinare activa (directa) Aspect calitativ. Reactia poate fi efectuata pe lama de sticla sau in tuburi. 3.

4.

Reacţia de aglutinare pe lamelă: pe lamela degresată se aplică cu pipeta Pasteur cîteva picături de ser în diluţii mici (1:10 – 1:20) şi o pic de sol izotonică de clorid de natriu pentru control. În fiecare picătură de ser, înclusiv în cea de control se introduce o ansă de cultură vie de microorganisme de 24 ore de pe suprafaţa mediului solid sau se adaugă cu pipeta Pasteur cîte o pic de suspensie de microorganisme omorîte (diagnosticum). Cultura aplicată se amestecă minuţios pentru a obţine o suspensie tulbure omogenă. Reacţia decurge la temperatura camerei. Rezultatul ei se citeşte cu ochiul liber peste 5-10 min, uneori este folosită lupa. Dacă lamele se introduc în camera umedă închisă, pentru a evita uscarea picăturilor rezultatul reacţiei se citeşte şi peste 30-40 min. La reacţia pozitivă în picătura de ser apar flocoane (mari sau mici), uşor vizibile la clătinarea lamei. La reacţia negativă lichidul rămîne tulbure omogen. Dacă cantitatea de microorganisme este mică şi citirea rezultatului reacţiei este dificilă, picătura de ser cu amestecul de cultură se usucă, preparatul se fixeazăse colorează cu fuxină Pfaiffer si se examinează la microscop. La reacţia pozitivă toate cîmpurile de vedere sunt libere. Aceasta este reacţia de microaglutinare. Reacţia de aglutinare în tuburi se foloseşte pentru determinarea serogrupului şi serovarului microorganismelor. Toate ingredientele se repartizează succesiv în eprubete. Serul este diluat în proporţiile 1:100, 1:200, 1:400 etc. În fiecare tub cu serul diluat se adaugă 1-2 picături de antigen (suspensie de 1-2mlrd de microorganisme la 1ml), se agită energic şi se incubează în termostat la 37°C-2 ore, apoi se citesc rezultatele prealabile ale reacţiei, începînd cu cele de control(al serului şi antigenului). Absenţa aglutinării în tuburile de control şi prezenţa de flocoane suspendate în tuburile de experienţă se apreciază ca reacţie pozitivă. Tuburile se menţin la temperatura camerei 18-20 de ore şi după aceea se constată rezultatul definitiv al reacţiei. Intensitatea reacţiei se exprimă prin semne de plus. La aglutinarea completă (++++) lichidul este absolut transparent, iar la fundul tubului se depune sediment din flocoane de microorganisme aglutinate. Cu cît mai puţine microorganisme sînt aglutinate, cu atît este mai tulbure lichidul şi cu atît mai puţin sediment floconos se înregistrează la fundul eprubetei (+++, ++, +). La reacţia negativă (-) sedimentul lipseşte, suspensia rămîne uniform tulbure şi după aspect nu diferă de conţinutul de control al antigenului. RA se

utilizează pentru diagnosticul serologic al bolilor infecţioase – febrelor tifo-paratifoide (reacţia Widal), brucelozei (reacţia Wright, Huddleson), tularemiei şi altor boli. Aprecierea: cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin 3 “+” (+++) se numeste titrul anticorpilor aglutinanti (titrul serului aglutinant).Aglutinarea directa este utilizata pentru determinarea grupelor sangvine sau in diagnosticul unor maladii infectioase (seroidentificarea Ag sau depistarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor) . 5. Reactile de aglutinare pasiva (indirecta) Aglutinarea pasiva consta in fixarea unui Ag solubil (sau al unui Ac) pe un suport corpuscular inert, care nu intervine in reactia AgAc. In calitate de suport inert pot servi hematiile, particule de latex, cristale de colesterol. Suspensia de particule sensibilizate cu Ag sau Ac este pusa in contact cu serul imun (respectiv cu Ag), ca si in cazul aglutinarii directe. Avantajele reactiilor indirecte: facilitatea lecturii si sensibilitatea inalta. Reactia de hemaglutinare indirecta (pasiva) – RHAI / RHAP. Unele antigene de origine polizaharidica se fixeaza practic spontan, dupa o scurta incubatie, pe suprafata hematiilor. Antigenele proteice se fixeaza doar dupa o pregatire prealabila a hematiilor (de ex.: tratarea cu tanina, formol). RHAI se efectuează in godeurile unei placi din polistiren. Reactia pozitiva se manifesta prin aglutinarea eritrocitelor sensibilizate (umbrela inversata de culoare bruna la fundul godeurilor). Uneori Ag folosite în reacţia de aglutinare sunt atît de microdispersate că complexul aglutinogen-aglutinină nu se observă cu ochiul liber. Pentru ca această reacţie să poată fi văzută s-au propus diferite căi de absorbire a acestor Ag pe particule mai mari cu aglutinarea lor ulterioară cu Ac specifici. Ca adsorbanţi se folosesc diferite specii de bacterii, corpuscule de talc, dermatol, colodii, coalină, carmină, latex ş.a. Această reacţie a căpătat denumirea de reacţie de aglutinare indirectă sau pozitivă. O capacitate mai pronunţată de adsorbţie au eritrocitele. Reacţia în care se folosesc eritrocitele se numeşte hemaglutinare indirectă sau pasivă (RHAI sau RHAP). Pentru efectuarea RHAI se folosesc eritrocite de berbec, cal, iepure, găină, şoarece, om ş.a. care în prealabil sunt prelucrate cu formalină sau glutaraldehidă. Capacitatea de adsorbţie a eritrocitelor creşte la prelucrarea lor cu soluţie de tanină sau clorid de crom. În RHAI ca antigene pot servi Ag polizaharidice, extractele vaccinurilor bacteriene, Ag virusurilor şi rickettsiilor şi alte substanţe de natură proteică.Eritrocitele sensibilizate cu antigene se numesc diagnosticumuri eritrocitare. Pentru prepararea diagnosticumurilor eritrocitare se folosesc frecvent eritrocite de berbec, care au o capacitate mare de adsorbţie. Cu ajutorul la RHAI poate fi determinat Ag necunoscut, dacă pe suprafaţa eritrocitelor vom adsorbi anticorpii deja cunoscuţi. 6. Reacţia de latex-aglutinare este utilizata in identificarea factorului reumatoid la bolnavi suspecti de poliartrita reumatoida, in bacteriologie pentru identificarea rapidă a mi/o sau Ag lor în prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infecţii. Reacţia de Co-aglutinare. La baza acestei reacţii se află proprietatea unei bacterii – Staphylococcus aureus (tulpina Cowan) - ce are în componenţa peretelui celular proteina A - să fixeze Ig G prin intermediul fragmentului Fc. Astfel se formează diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificare Ag respective necunoscute. Reacţia se efectuează pe lamă. Reacţia în care se folosesc eritrocitele se numeşte hemaglutinare indirectă sau pasivă (RHAI sau RHAP). Reacţia de latex-aglutinare este utilizata in identificarea factorului reumatoid la bolnavi suspecti de poliartrita reumatoida, in bacteriologie pentru identificarea rapidă a mi/o sau Ag lor în prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infecţii. Reacţia de Co-aglutinare. La baza acestei reacţii se află proprietatea unei bacterii – Staphylococcus aureus (tulpina Cowan) - ce are în componenţa peretelui celular proteina A - să fixeze Ig G prin intermediul fragmentului Fc. Astfel se formează diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificare Ag respective necunoscute. Reacţia se efectuează pe lamă. 7. Reacţie de precipitare (R.P.) se numeşte sedimentarea antigenului (pretipitinogenului) din soluţie la acţiunea serului imun (precipitinei) şi a electrolitului asupra lui. Cu ajutorul reacţiei de precipitare antigenul poate fi evidenţiat în aşa cantităţi minime, care nu se determină pe cale chimică. In reacţia de precipitare se folosesc antigene lichide şi transparente, care prezintă corpuscule ultramicroscopice ale soluţiei coloidale de proteină, polizaharide etc.În calitate de antigene se folosesc extracte din celulele microbiene, organe şi ţesuturi, produsele dezintegrării celulelor rnicrobiene - lizate, filtrate ş. a. Rezistenţa precipitinogenelor la temperaturi înalte se foloseşte la obţinerea antigenelor din agenţii cauzali ai antraxului, pestei ş. a. (metoda de fierbere). Serurile precipitante se pregătesc centralizat prin hiperimunizarea animalelor (iepurilor) cu suspensie de bacterii, filtrat al culturilor bulionice, autolizate, extracte saline ale microorganismelor, proteine serice etc. Titrul serului precipitant, spre deosebire de titrul altor seruri diagnostice, se determină prin diluţia maximă a antigenului care se precipită cu serul dat. Aceasta se explică prin faptul, că antigenul care participă în R.P. are dimensiune ultramicroscopică şi se conţine într-o unitate de volum în cantităţi mai mari decît anticorpi în acelaşi volum de ser. Serurile precipitante se elaborează cu titru nu mai mic de 1:100000. Metodica. Intr-o eprubetă îngustă (d. 0,5 cm) se toarnă 0,3-0,5 ml de ser precipitant nediluat. Cu pipeta Pasteur antigenul lent se prelinge pe peretele eprubetei (în poziţie înclinată) în acelaşi volum. Apoi evitind amestecul lichidelor, eprubeta se aranjează vertical. La suprapunerea corectă a antigenului pe ser se observă clar hotarul dintre cele două straturi de lichide. R.P. este însoţită obligatoriu de controlurile serului şi ale antigenului. Rezultatele reacţiei se citesc, în dependenţa de tipul antigenului şi anticorpilor, peste 5-10 min, 12 ore sau 20-24 ore. în cazul reacţiei pozitive în tubul de experienţă la hotarul serului şi al extractului de examinat apare un precipitat sub formă de inel de culoare albă. Reacţia de precipitate se foloseşte pe larg în practica de laborator pentru diagnosticul bolilor infecţioase bacteriene (antrax, pestă, tularmie ş. a.) şi de natură virotică (variolă, infecţia respiratorie acută ş. a.), In medicina judiciară R.P. se foloseşte pentru determinarea apartenenţei de specie a proteinei (pete de sînge, spermă etc.).

Cu ajutorul R.P. se va determina atît specificitatea de specie, cît şi de grup a proteinei. Prin intermediul ei s-a determinat, de exemplu, gradul de înrudire a diverselor specii de animale şi plante. Aplicarea R.F. în controlul sanitaro-igienic al produselor alimentare permite de a depista falsificarea fabricatelor de carne, peşte, făinoase, adaosurile îa lapte ş. a. Dezavantaje ale R.P. sînt instabilitatea precipitatului (inelar), care dispare ia o agitare uşoară, precum şi imposibilitatea de a evidenţia cantitatea diferitor antigene ce iau parte la formarea precipitatului. Aceste neajunsuri nu le are reacţia de precipitare în gel. 8. Reacţia de precipitare inelară. In eprubeta de precipitare, cu ajutorul pipetei Pasteur, se toarnă 0,2—0,3 ml (5— 6 picături) de ser (serul nu trebuie să nimerească pe peretele eprubetei). Pe peretele eprubetei, în ser, foarte atent, cu ajutorul pipetei subţiri Pasteur, se adaugă acelaşi volum de antigen. In acest timp eprubeta se ţine în poziţie înclinată. La stratificarea corectă între ser şi antigen se distinge o limită clară. Atent, pentru a evita amestecarea straturilor, eprubeta se trece în stativ, în caz de reacţie pozitivă, la hotarul dintre antigen şi anticorp se formează un inel tulbure, care reprezintă precipitatul Reacţia este însoţită de un şir de controale.Un rol deosebit de important aparţine consecutivităţii introducerii ingredienţilor reacţiei în eprubeta. Nu se admite stratificarea serului pe suprafaţa antigenului (în control — pe soluţia izotonică), deoarece densitatea serului este mai mare decît cea a antigenului şi el se va aşeza la fundul eprubetei, iar hotarul dintre antigen şi anticorp nu se for-ează. Evidenţa rezultatelor se efectuează peste 5—30 min, iar în unele cazuri peste o oră, întotdeauna începînd cu controlul. «Inelul» din eprubeta a doua inidică capacitatea serului imun de a intra în reacţia specifică cu antigenul corespunzător, în eprubetele nr. 3—5 nu trebuie să apară «inele» de precipitare, deoarece lipsesc anticorpii şi antigenii omologi. Prezenţa «inelului» în eprubeta nr. l indică rezultatul pozitiv al reacţiei şi faptul că antigenul cercetat corespunde serului imun folosit în reacţie. Lipsa «inelului» («inelul» e prezent doar în eprubeta nr. 2) indică necorespunderea antigenului cu anticorpul, deci a fost obţinut rezultatul negativ al reacţiei. 9. Ag şi Ac difuzează unul spre altul prin geloză ţi în zona de concentraţie optimă a acestora două reactive se produce precipitarea sub formă de linii albe-cenuşii. Dacă există mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizat în analiza calitativă a unui amestec de Ag într-o soluţie. componentele: gelul agaros, Ag, Ac. ptr control se folosesc test-sistemul compus din Ac şi Ag cunoscute omoloage. Clasificare: imunodifuzia radială simplă (tehnica Mancini); imunodifuzia dublă radială (tehnica Ouchterlony); test Eleck; imunoelectroforeza; contraimunoelectroforeza imunodifuzia dublă radială (Tehnica Ouchterlony ). Ag şi Ac difuzază radial di godeuri practicate la distanţă convenabilă în statul de gel.După cca 24 ore de incubare, în zona dintre godeuri, unde reactivii corespondenţi în difuziune au realizat proporţii echivalente, apare o linie de precipitare. Tehnica Ouchterlony este utilizate ptr caracterizarea Ag în amestec. testul Eleck: se poate demonstra toxigeneza bacilului difteric. Într-o placă Petri cu mediu de cultură adecvat se aplică în lungul diametrului o bandă din hîrtie de filtru cu antitoxina difterică. Perpendicular pe direcţia benzii de hîrtie se însămânţează, în striu, tulpina de cercetat şi cîte o tulpină toxigenă şi netoxigenă de bacilul difteric (respectiv martorul pozitiv şi cel negativ). Plăcile se încurbează la 37C. După 24 şi 48 ore se urmăreşte apariţia în unghiul dintre striul de cultură şi depozitul de antitoxină a unei linii de precipitare, care continuă de precipitare toxină-antitoxină a martorului pozitiv. Aplicare practică: 1)ptr diagnosticul bolilor, cauzate de virusuri, rickettsi şi bacterii ce elimină exotoxine. 2)ptr determinarea toxigenezei corinebacteriilor difterice. PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL) În aceste reacţii Ag şi Ac difuzează unul spre altul prin geloză şi în zona de concentraţie optimă a acestor două reactive se produce precipitarea sub formă de linii albe-cenuşii. Dacă există mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizată în analiza calitativă a unui amestec de Ag într-o soluţie. Imunodifuzia simplă radială (tehnica Mancini) Se efectuează pe o placă acoperită cu geloză, în care sunt încorporaţi Ac specifici. Ag este depus în godeurile din stratul de geloză. Ag difuzează radial în geloză pe parcursul a 48 ore. Dacă Ag corespunde Ac, atunci are loc formarea de discuri de precipitare, cu suprafaţa proporţională concentraţiei Ag din godeu. Se utilizeză pentru depistarea şi cuantificarea Ig, hormonilor, enzimelor, etc. Imunodifuzie dublă (tehnicile Ouchterlony şi Elek) Se acoperă cu geloză o placă de sticlă sau se toarnă geloza în cutia Petri. În tehnica Ouchterlony Ag şi Ac difuzează din godeurile situate la o distanţă de 15 mm unul de altul. În tehnica Elek cele 2 reactive difuzează din benzile de hârtie plasate pe suprafaţa gelozei. Moleculele difuzează în gel în funcţie de greutatea lor şi formează linii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-Ac ce corespund în zona lor de echivalenţă. Dacă două Ag sunt identice, liniile lor se unesc, dacă sunt diferite – se intersectează. Utilizarea – determinarea toxinelor (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice

10. Contraimunoelectroforeza (CIEF) Este utilă la examinarea amestecurilor antigenice complexe. Lectura este posibila peste 90 minute. Geloza este turnată pe o placă de sticlă, Ag şi Ac sunt dispuşi în rezervoare circulare de 2 mm diametru, la o distanţă de 10 mm. În timpul electroforezei Ag, încărcat negativ, migrează spre polul pozitiv, întâlnind Ac care migrează spre catod. La interacţiunea Ag şi Ac omologi are loc formarea liniei de precipitare. CIEF serveşte la examinarea componentelor Ag din lichide biologice: LCR, urină, lichid pleural, ascită, etc.

TEMA 5 1, 2, 3 REACŢII DE CITOLIZĂ IMUNĂ (cu participarea complementului) Activarea fracţiilor complementului (C) duce la liza particulei purtătoare de Ag (hematii, bacterii, diverse celule...) Activarea complementului: Calea clasică; Calea alternativă; Calea lectinică Activarea C pe cale clasică Activatorul îl constituie complexe Ag-Ac (IgG, IgM) Consecutivitatea activării C: Ag-Ac fixează fracţia C1qrs, care capătă ulterior activitate esterazică (în prezenţa obligatorie a Ca++). C1 activează C4, cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2 (AgAcC1C4bC2a), complexul C4bC2a devenind convertază ce acţionează asupra C3. Urmează clivarea C3 în C3a (anafilotoxină) şi C3b, care se uneşte de complex (AgAcC1C4bC2aC3b), formând C5convertaza, care clivează C5 în C5a şi C5b. C5b se leagă de membrana celulei-ţintă. Urmează fixarea simultană a C,6,7. La final se fixează C8, apoi C9, formând “complexul de atac membranar”. Fixarea lor produce leziuni ireversibile – liza celulei. Calea alternativă de activare a C Activatori: endotoxine, celule infectate cu virus, levuri, paraziţi, venin de cobră, agregate de IgA sau IgE. C1,4 şi 2 nu intervin şi reacţia începe cu C3. Properdina, factorul B şi ionii de Mg++ sunt obligatorii în procesul de activare pe cale alternativă. Calea lectinică de activare a C este determinată de legarea unor lectine pe unele grupări de manoză, carbohidrat prezent în componenţa multor mi/o şi absentă la ma/o. Lectina este echivalentă fracţiei C1q. Alte 2 molecule se asociază, formând o enzimă similară C1, ceea ce duce la formarea complexului C4bC2a (C3-convertaza) Componentele reacţiilor de liză: Ag (celule bacteriene, hematii, etc). Ac (lizine - IgG şi IgM); Complement– ser proaspăt de cobai sau ser de cobai liofilizat Reacţia de bacterioliză (RBL). Ag – suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...); Ac – serul imun sau serul bolnavului; Complement RBL in vitro: Se efectuează diluţia succesivă a serului; Se adaogă suspensie microbiană vie; Se adaogă complement (martor: Ag+ser fiziologic+C); Incubare 2 h la 37°C; Reînsămânţare pe cutii cu geloză câte 0,1 ml din fiecare diluţie (24h – 37° C). Lectura – se compară nr coloniilor crescute din martor şi probele studiate. Titrul – cea mai mare diluţie a serului în care au fost lizate cel puţin 50% din celule RBL in vivo: Amestecul dintre Ag şi Ac se inoculează intra-peritoneal la animale de laborator (ex.: şoareci albi); Peste fiecare 10 min, timp de o oră, se extrage lichidul peritoneal, se pregăteşte un preparat nativ şi se examinează pe fond negru sau cu contrast de fază. Rezultat pozitiv – numărul bacteriilor scade treptat până la dispariţie. Utilizarea RBL – diagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL) Reacţia de hemoliză (RHL): Ag – hematii de berbec, suspensie de 3%; Ac – ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic) Complement: Principiul reacţiei: complexele Ag-Ac formate fixează C şi-l activează pe cale clasică, provocând hemoliza. Intensitatea hemolizei se apreciază vizual (++++) sau prin măsurarea densităţii optice a hemoglobinei eliberate. Utilizarea practică a RHL: pentru dozarea C, precum şi în montarea reacţiei de fixare a complementului. REACŢIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC). Este o reacţie complexă, constituită din 2 sisteme Ag-Ac şi cu participarea C. În RFC participă Ig capabile să fixeze C – IgM şi IgG. RFC se utilizează în diagnosticul virozelor, infecţiilor bacteriene, etc . componentele: ptr sistemul de bază: antigen (de regulă lizat), extract, haptenă, mai rar suspensia de microorganisme, anticorp: serul bolnavului, complement: serul cobaiului. ptr sistemul hemolitic: antigen: eritrocite de berbec; anticorp: hemolizina faţă de eritrocitele berbecului; soluţie izotonică.T Toate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate în prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru. Reacţia este însoţită de martori ai tuturor componenţilor Reacţia se efectuează în 2 etape utilizând 2 sisteme. I etapă – Sistemul de bază este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) şi complement în doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37° C sau menţinut 16-18 ore la 4° C. Dacă Ac se combină cu Ag omolog va avea loc şi fixarea C (efect frecvent invizibil). II etapă – la sistemul de bază se adaogă sistemul indicator (hemolitic), constituit din hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici (Ac2). Peste 1h incubare la 37° C reacţia este terminată. Evaluarea rezultatelor – dacă complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se observă (rezultat pozitiv). Dacă Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul rămâne disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocând hemoliza (rezultat negativ)Complement Fixation. 4. Titrarea complementului. Anterior de efectuarea experienţei de bază soluţia iniţială a complementului (1:10) este repartizată în tuburi de la 0,05 ml pînă la 0,5 ml şi în fiecare tub volumul se completează cu soluţie izotonică NaCl pînă la 1,5 ml. Eprubetele se includ în termostat la temperatura 37°C pentru 45 min, apoi în tuburi se adaugă sistemul hemolitic şi din nou se menţine în termostat 30 min, după ce se apreciază titrul complementului. Titrul complementului reprezintă cea mai mică cantitate a acestuia, la adăugarea căreia în sistemul hemolititc, se înregistrează hemoliza completă în decurs de 1 oră, la 37C. In reacţie se foloseşte doza de lucru a complementului, care se ia următoarea mai mare după titru deoarece în experienţă activitatea complementului poate săs cadă pe contul adsorbţiei nespecifice a acestuia de către alţi componenţi ai reacţiei. 6. Marcanţii utilizaţi uzual: fluorocromi(rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumină roşu-oranj sau verde-galbenă la tratarea lor cu raze UV. Reacţia de imunofluorescenta directă este folosită numai în scop de seroidentificare. Din materialul ce conţine Ag (material nativ, cultura pură, biopsie tisulară) se prepară un frotiu, peste care se aplică serul imun specific cu Ac marcaţi cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare într-o cameră umedă, preparatul este studiat la microscopul luminescent. În caz de reacţie pozitivă se observă luminiscenţă locală. Inconvinient:necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice ptr fiecare Ag. Are la bază folosirea fluorocromilor, chimic conjugaţi cu anticorpii. Anticorpii marcaţi îşi păstrează specificitatea imunologică si reacţionează strict cu anumite antigene. Complexele antigenelor cu anticorpii marcaţi se evidenţiază uşor după intensitatea de luminiscenţă galben-verzuie la studierea frotiului în microscopul luminiscent. R.I.F. directă prevede folosirea serurilor imunofluorescente faţă de fiecare antigen examinat.

R.I.F. poate fi aplicată pentru examinarea diferitor antigene: culturi de bacterii, ciuperci, protozoare; frotiuri din materialul bolnavului; celulelor infectate, secţiuni de ţesut ş. a. Materialul de examinat se aplică pe lamă şi se fixează (deseori în acetonă (10 min) la temperatura camerei), apoi ss usucă 20 min la temperatura de 37°C. Prelucrarea preparatelor în continuare depinde de varianta R.I.F. folosite. Preparatul în R.i.F. directă se colorează cu antiser specific marcat în cameră umedă 30 min la temperatura 25°C, apoi se spală cu soluţie tampon (pH 7,2) 10 min îa temperatura de 25°C. Pentru a evita rezultate fals-pozitive reacţia este însoţită de un şir de controluri, printre care un rol deosebit îi revine controlului cu antigen eterogen (de exemplu, cu cultura bacteriană ce nu corespunde anti-genic antiserului folosit). La studierea culturilor celulare infectate se foloseşte obligatoriu controlul cu cultura normală neinfectată (pentru excluderea autofluorescenţei şi fixarea nespecifică a anticorpilor marcaţi de suprafaţa celulelor). Pentru a frîna autofluorescenţa preparatelor poate fi folosită albumina bovină, marcată cu sulfarodamină. Reacţia de imunofluorescenţa, păstrînd specificitatea reacţiilor imunologice, se caracterizează prin simplitatea şi rapiditatea executării. Totodată R.I.F. nu poate fi calificată ca reacţie extrem de sensibilă. Deasemenea, nu se exclude posibilitatea de adsorbţie nespecifică a anticorpilor marcaţi pe preparat cu apariţia rezultatelor pseudopozitive. Tehnici serologice cu utilizarea Ac marcaţi În unele cazuri este imposibil de a detecta o reacţie Ag-Ac: unii Ac nu precipitează, alţii nici nu precipitează, nici nu aglutinează, există complexe Ag-Ac care nu fixează C. În aceste cazuri pot fi utilizaţi Ac marcaţi pentru a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac cu marcanţi nu afectează proprietăţile lor imunologice. Aceste reacţii se montează pe suport solid (lamă, plăci din plastic) Marcanţii utilizaţi uzual: Fluorocromi (rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumină roşu-oranj sau verde-galbenă la tratarea lor cu raze UV (Reacţia de Imuno-Fluorescenţă) Enzime (fosfataza alcalină, peroxidaza), capabile să modifice culoarea unui substrat (Reacţia Imuno-enzimatică) Radio-izotopi (125J sau 3H), care emit respectiv raze gamma şi beta (Analiza Radio-Imună) Reacţia de imunofluorescenţă (RIF, reacţia COONS) Metoda directă (numai în scop de seroidentificare). Din materialul ce conţine Ag (material nativ, cultură pură, biopsie tisulară) se prepară un frotiu, peste care se aplică serul imun specific cu Ac marcaţi cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare într-o cameră umedă preparatul este studiat la microscopul luminiscent. În caz de reacţie pozitivă se observă luminiscenţă locală. Inconvenient – necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice pentru fiecare Ag. Metoda indirectă. Poate fi utilizată pentru sero-identificare şi sero-diagnostic. Pe frotiul ce conţine Ag se aplică Ac corespunzători nemarcaţi. Peste 20 min se spală minuţios preparatul, apoi se adaogă anti-Ig fluorescentă, care se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat în numeroase reacţii. Anti-Ig se obţine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Ig. Tehnica fondată pe fixarea C: Markerul fluorescent este un ser anti-complement care se va lega de complementul fixat pe complexul Ag-Ac. RIF se utilizează pentru identificarea rapidă a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic. 7. 1. Reactia imunoenzimatica (RIE, ELISA) directa (tehnica “sandwich”). Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica. RIE reprezintă o interacţiune a Ag cu Ac care este asociat cu o enzimă. Complexul format capătă o activitate enzimatică şi scindează substratul respectiv, exteriorizînd efectul de coloraţie pregnantă. RIE directă aprecizează prezenţa Ag prin intermediul Ac. cantitatea de enzimă fixată de substrat corespunde cantităţii de Ag. componentele: Ag, Ac, enzima (peroxidaza de hrean sau fosfataza bazică) RIE directă (metoda sandwich) este utilizată doar în sero-identificarea Ag. În godeurile din placa de polistiren în care sunt fixaţi Ac cunoscuţi se toarnă soluţia de Ag necunoscuţi. se incurbeaza pe 1 oră. după spălare minuţioasă a godeurilor se adaugă Ac marcaţi cu enzime, care se fixează pe epitopii liberi ai Ag polivalent. După incurbare de 30 min.-1 oră se spală iarăşi godeurile. Prezenţa complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depistează cu ajutorul substratului cromogen (substanţă iniţial incolorp,dar care se colorează sub acţiunea enzimei,ex. apa oxigenată şi orthofenilendiamina). rezultatele reacţiei se aăreciază vizual sau instrumental. la citirea vizuală se determină diluţia maximă a materialului de examinat, în care intensitatea coloraţiei este mai pronunţată faţă de cea de control (albumina serică bovină).la citirea rezultatelor cu spectrofotometrul ca pozitivă se consideră diluţia maximă a materialului examinat, unde nivelul extincţiei prevalează cel puţin de 2 ori nivelul extincţiei din diluţia respectivă a componentului eterolog al reacţiei. Aplicarea practică: pot fi detectaţi Ag în diferite afecţiuni umane. RIE indirectă este utilizată în serodiagnostic. Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac(serul testat) se introduce în godeu, după 1h se spală totul şi se adaugă ligandul marcat cu enzimă(anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzimă). Acest ligand se fixează pe Ac testaţi. se adaugă apoi substanţa cromogen. Cantitatea de Ac se măsoară după densitatea optică a lichidului din godeuri. Metoda indirectă detectează anticorpul. Antigenul de referinţă, fixat pe suprafaţa de polistiren, este incubat cu serul testat, apoi cu anticorpi antiimunoglobulină marcaţi cu enzimă. După fiecare etapă, reactivii necuplaţi sunt îndepărtaţi prin spălarea suportului, în final se adaugă substratul cromogen, iar culoarea dezvoltată in interval de 30 minute este măsurată (figura 10.12, a). • Metoda competitivă detectează de asemenea anticorpi. Anticorpul din serul testat şi anticorpul omolog monoclonal marcat cu peroxidaza din hrean, pipetaţi în ordinea enunţată, intră în competiţie pentru antigenul fixat pe suprafaţa de polistiren. Anticorpii necuplaţi sunt îndepărtaţi prin spălare, apoi este adăugat substratul cromogen pentru testarea enzimei restante pe suprafaţa de reacţie. Intensitatea culorii, măsurată după stoparea reacţiei la 30 minute, deci activitatea enzimei de marcaj este invers proporţională cu concentraţia anticorpului din serul pacientului testat. 8. Tehnica imunoblot (western blot) permite identificarea Ag dintr-un amestec.

I etapă – electroforeza în gel a probei de Ag II etapă – transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloză III etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv Ac dirijaţi contra Ag, apoi conjugatul marcat cu enzimă, care permite depistarea Ac fixaţi. După o spălare se adaogă substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formează zone colorate distincte. Utilizare: depistarea Ac anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali... Proteinele sunt separate electroforetic în gel poliacrilamid. Sub acţiunea câmpului electric are loc difuzia proteinelor conform greutăţii moleculare, aranjându-se în zone liniare subţiri diferite: mai aproape de start se aranjează proteinele cu masă moleculară mare (120-150 kDa), la final se aranjează proteinele cu masă moleculară mică (5-10kDa). Apoi lamela de gel este transferată pe o foaie de nitroceluloză amplasată între electrozii unei surse de curent continuu. Sub acţiunea câmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloză, unde se fixează foarte bine pe hârtie. Proteinele fixate sunt marcate cu o enzimă (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase) incoloră. Procedura ulterioară de montare a reacţiei este similară tehnicii ELISA. Analiza radioimună (ARI). Principiul este identic cu cel al RIE. Ag se fixează la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaogă Ac testaţi care se vor combina cu Ag omolog. După spălarea godeurilor, se adaugă un ligand radiomarcat (anti-Ig). După eliminarea excesului de izotopi prin spălare, se măsoară radio-activitatea: ea este proporţională cu concentraţia Ac dozaţi. T EM A 6 2. Hipersensibilitate – raspunsuri imune excesive sau anormale, capabile sa provoace leziuni tisulare si maladii. Aceste reacţii se pot dezvolta în cadrul mecanismelor de apărare faţă de un microb patogen. În acelaşi timp, reacţii similare pot fi dirijate contra substanţelor de origine ne-infectioasa. Particularităţile RHS:  RHS sunt specifice de Ag/alergen.  RHS sunt induse de un contact primar cu Ag/alergenul care provoacă răspunsul imun specific (umoral, celular).  RHS sunt declanşate la contacte ulterioare repetate cu acelaşi Ag/alergen. Clasificarea RHS după mecanismele imunologice efectuate (Gell, Coombs) Hipersensibilitatea de tipul I (reacţii imediate, anafilactice) Hipersensibilitatea de tipul II (citolitic-citotoxică) Hipersensibilitatea de tipul III (prin complexe imune) Hipersensibilitatea de tipul IV (tardivă) Hipersensibilitatea de tipul V (prin autoAc) Reactiile de hipersensibilitate de tip I (imediate, anafilactice). Factorii implicati, alergenii. Anafilaxia locala si generala, mecanismul reactiilor. Depistarea RHS de tipul I. Combaterea reactiilor anafilactice. RHS imediate mai sunt numite “alergie” sau “atopie”. Persoanele predispuse la astfel de reactii sunt numite “atopice”. Antigenele care declanseaza o hipersensibilitate imediata sunt calificate ca “alergeni”. Manifestările patologice survin timp de 15-30 min după reîntroducerea alergenului în organismul sensibilizat. În reacţiile anafilactice participă Ig E. la persoanele predispuse la alergii intalnirea cu unele Ag determina activarea limf Th2 si producerea Ac Ig E. Fiind sintetizate în timpul primului contact cu alergenul, IgE se fixează pe receptori ai mastocitelor (în special din ţesutul conjunctiv sau din mucoase), persistând mai multe luni. La pătrunderea repetată (percutan, prin mucoase, intravenos) antigenul omolog leagă încrucişat fragmentele Fab ale Ig E vecine de pe mastocite. Aceasta duce la eliberarea din celule a unor mediatori, substanţe biologic active (histamină, serotonină, Factorul de Necroză al Tumorilor, prostaglandine, leucotriene). Ele se fixează pe receptorii terminaţiilor nervoase inducând contracţia musculaturii netede (bronşice, intestinale, uterine), vasodilataţie, creşterea permeabilităţii vasculare cu edem, reacţie urticariană în tegument şi hipersecreţie de mucus la nivelul bronşic. Aceste reactii survin la cateva minute de la reintroducerea Ag. Alti mediatori ai mastocitelor – citokinele – recruteaza, pe parcursul al catorva ore, neutrofile si eozinofile la nivelul localizarii reactiei. Acest proces inflamator al RHS imediate reprezinta faza tardiva a reactiei. Este responsabila de leziunile tisulare provocate de catre atacurile repetate de hipersensibilitate imediata. Anafilaxia generală (şocul anafilactic) Este cea mai brutală şi gravă reacţie declanşată de un Ag/alergen. Se manifestă în câteva secunde după administrarea parenterală a dozelor mari de Ag/alergen cu semne clinice sistemice: urticarie, asfixie, colaps circulator şi şoc. Poate duce la deces subit. Ag responsabile de şocul anafilactic: medicamente (analgezice, anestetice, AB, seruri sangvine de animale, enzime), venin de viespi, de albine, alimente. Anafilaxia locală (alergenul administrat în doză foarte mică sau depus pe o mucoasă) La nivelul mucoaselor: conjunctivita alergică, rinita, astmul şi traheita spasmodică (alergeni: polenuri, dejecte de acarieni din praful de casă) Forme cutanate: dermatita atopică şi urticaria Alergia alimentară: manifestări extradigestive (urticarie, edem Quincke, astm, anafilaxie) şi digestive (diaree, vome) Depistarea RHS tipul I: Teste cutanate prin aplicarea cutanată sau administrarea intradermică a alergenilor. Reacţie pozitivă – peste 15 min local apare o reacţie eritemo-papuloasă. Teste de provocare – se efectuează la astmatici, prin administrarea alergenului în aerozol (pe cale nazală, oculară, orală) şi măsurând modificările imediate şi tardive a volumului expirat maxim. Dozarea imunoenzimatică sau radioimună a Ig E Principii de tratament: Evitarea alergenului; Desensibilizarea prin administrarea repetata a dozelor mici de Ag, care induce sinteza Ac Ig G; Tratament simptomatic (inhibitori ai degranulării mastocitelor, anti-histaminice, etc) Reactiile de hipersensibilitate de tip II (citolitic-citotoxice). Factorii implicati, consecintele. Diagnosticul si combaterea RHS de tipul II.

Implică Ac (Ig G sau Ig M) dirijaţi contra unui Ag natural sau exogen fixat pe suprafaţa unei celule sau a unui ţesut. Se dezvoltă în câteva minute sau ore. Afectează în special celulele sângelui, provocând citoliza prin activarea complementului sau prin opsonizare şi fagocitoză de către macrofage. Celulele K de asemenea pot distruge celulele opsonizate. Aceste mecanisme cauzează citopenie. Reacţii transfuzionale (prezenţa Ac anti-hematii în timpul unei transfuzii sanguine poate induce hemoliză intravasculară prin activarea C pe cale clasică). Maladia hemolitică perinatală prin incompatibilitate Rhesus. Mama Rh- se imunizează în cursul primei gravidităţi contra fătului Rh+ la trecerea hematiilor fetale în sângele matern (la naştere, în timpul unui avort). La o graviditate ulterioară, mama preimunizată contra factorului Rh+ poate sintetiza Ig G anti-Rh+, dacă fătul este iarăşi Rh+. Aceşti Ac pot traversa bariera placentară şi liza hematiile fătului la finele gravidităţii, provocând o hemoliză gravă. Prevenirea: administrarea Ac anti-Rh+ tuturor femeilor Rh- în primele 48 ore de la naşterea unui copil Rh+ sau a unui avort. Aceşti Ac opsonizează hematiile fetale din sângele matern şi provoacă eliminarea lor rapidă. Hemoliza imună de origine medicamentoasă (medicamentul se depune pe membrana eritrocitară şi Ac anti-medicament distrug eritrocitele acoperite de acest medicament). 4. Trombocitopenii şi granulocitopenii. Diagnostic: Depistarea Ac contra celulelor (ţesuturilor) implicare; Prezenţa Ac şi C în leziuni, depistaţi prin RIF Reactiile de hipersensibilitate de tip III (mediate de complexe imune solubile). Factorii implicati. Mecanismul, manifestarile patologice. Depistarea RHS de tipul III. RHS de tipul III (mediate de complexe imune Ag-Ac solubile) În mod normal CI sunt eliminate repede din organism. În unele circumstanţe CI persistă perioade îndelungate. Cauze: Infecţii cronice: angine streptococice, endocardite bacteriene, hepatite virale, parazitoze, etc Ţesuturi proprii devenite auto-reactive în urma unor procese distructive (ex.: colagenoze) Introducerea albuminei serice în cantităţi mari (tratament cu seruri imune) Mecanismul: Complexele Ag-Ac solubile activează C şi determină leziuni în locul formării sau depunerii lor în ţesuturi sau pe endoteliul vascular. Fenomene patologice locale: reacţia Arthus, glomerulonefrita, artrită, poliatrerite. Se produc în exces de Ac după 3-10 ore de la contactul cu Ag. Fenomene patologice generale: boala serului (în exces de Ag). Depistarea RHS de tipul III: Evidenţierea CI în biopsii tisulare. Se efectuează utilizând RIF, RIE sau ARI; Titrarea Complementului seric (diminuarea titrului) Reactiile de hipersensibilitate de tip IV (mediate celular, tardive). Tipurile. Factorii implicati, alergenii. Depistarea RHS de tipul IV. RHS de tipul IV (mediate celular, tardive, întârziate) Sunt determinate de limfocite T CD8 (Tc) sau TCD4 (Th1) activate la contactul secundar cu Ag sensibilizant. Sunt cunoscute 3 modele de hipersensibilitate tardivă: Hipersensibilitatea tuberculinică; Reacţia granulomatoasă; Dermatitele de contact Hipersensibilitatea tuberculinică este indusă de infecţii bacteriene, virale, fungice sau parazitare, prin vaccinare cu vaccinuri vii atenuate sau cu proteine fixate pe un adjuvant complet. Pătrunderea repetată a Ag activează limdocitele Th1 specifice de acest Ag, ducând la activarea Tc şi eliberarea unor citokine, responsabile de acumularea locală a celulelor mononucleate cu apariţia eritemului şi formarea unui infiltrat, în unele cazuri chiar şi necroză. Leziunea apare peste 48 ore şi dispare în 3-5 zile. Hipersensibilitatea granulomatoasă apare în cursul sensibilizării cu substanţe insolubile sau greu digerabile (constituienţii unor paraziţi, compuşi lipoidici ai micobacteriilor, brucelelor, etc). În aceste cazuri RHS se prelungeşte şi se manifestă prin formarea, în câteva săptămâni sau luni, a unui granulom. În componenţa granulomului se disting 3 zone: centrală, din celule epitelioide, intermediară – din limfocite şi fibroblaste şi periferică – din leucocite PMN, limfocite B şi plasmocite. Granulomul poate fi supus fibrozei şi calcifierii, persistând mai mulţi ani. Hipersensibilitatea de contact este determinată de haptene (metale grele - Ni, Cr, substanţe chimice – cauciuc, clei, pesticide, vopsele, produse cosmetice, medicamente). Aplicate percutan se combină cu proteinele membranare, în special ale celulelor Langerhans din epidermă. Aceasta duce la expansiunea clonală a limfocitelor TCD8+. La contacte repetate cu aceeaşi haptenă, citokinele eliberate de limfocitele activate determină infiltrarea celulară a glandelor sudoripare, sebacee, a foliculilor piloşi, a epidermei. Peste 48-72 ore local se observă eritem, edem şi formarea veziculelor. Explorarea hipersensibilităţii tardive: T e s t e c u t a n a t e (in vivo) Dermatitele de contact se depistează prin aplicarea cutanată a haptenelor şi examinarea eritemului, infiltratului cutanat şi a veziculelor apărute peste 48 ore. Hipersensibilitatea tuberculinică se explorează prin introducerea intradermică a alergenilor microbieni: tuberculina (derivat proteic al unei culturi de Mycobacterium tuberculosis), brucelina, tularina, antraxina, dizenterina, etc. Peste 48 ore se măsoară diametrul eritemului şi induraţiei. Reacţia pozitivă denotă că organismul a fost în contact cu alergenul (infecţie anterioară sau actuală, vaccinare) şi că acesta persistă în macrofagele organismului. Pentru confirmarea maladiei sunt necesare investigaţii suplimentare. Teste in vitro Testul de transformare limfoblastică (limfocitele unei persoane cu hipersensibilitate tardivă cultivate in vitro în prezenţa Ag /alergenului suportă o transformare blastică cu proliferare ulterioară). Testul de inhibiţie a migrării leucocitelor (activarea limfocitelor T de către Ag specifice duce la secreţia citokinelor care inhibă migrarea leucocitelor) 4.

IMUNITATE – nereceptivitatea organismului la orice agenţi străini din punct de vedere genetic, inclusiv la mi/o şi toxinele lor. IMUNITATE – capacitatea de apărare specifică a organismului faţă de agresori externi (virusuri, bacterii, fungi, protozoare, toxine) cât şi faţă de propriile molecule şi unele celule degradate sau modificate. Sarcina fundamentală a imunităţii – distincţia dintre moleculele şi celulele proprii (self) şi cele străine (non-self) TIPURILE DE IMUNITATE Ereditară (naturală, de specie). Poate fi absolută (lipsa ţintei) sau relativă. Dobândită (achizitionata, adaptativa) Activă - Naturală (postinfecţioasă); Artificială (în urma vaccinării) Pasivă - Naturală (transplacentară, prin laptele matern); Artificială (administrarea Ac/seruri imune sau a limfocitelor) Imunitatea dobândită se caracterizează prin: 1. Dezvoltare lenta si manifestare tardiva (câteva zile, săptămâni dupa contactul cu un Ag) 2. Specificitate faţă de Ag (capacitatea de a recunoaste si raspunde specific la numeroase substante straine, inclusiv agenti infectiosi) 3. Memorie imunologică (capacitatea de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si eficace la intalniri repetate cu un Ag) Imunitatea dobândită poate fi: Imunitate antibacteriană, antivirală, antimicotică, antitoxică, antitumorală, etc. În funcţie de mecanismele reacţiilor imune:  Imunitate umorală, exercitată prin intermediul unor proteine numite anticorpi (Ac, Ig)  limf. B. Fiind secretate in sange si lichide biologice neutralizeaza si elimina microbii extracelulari si toxinele lor.  Imunitate celulară, eficienta in eliminarea parazitilor intracelulari sau a celulelor tumorale. Este exercitată prin intermediul limf. T (citotoxicitate directa, activarea macrofagelor, celulelor NK, secreţia citokinelor). În dependenţă de persistenţa mi/o:  Imunitate sterilă – se manifestă după eliminarea agenţilor patogeni din organism (ex.: rujeolă)  Imunitate nesterilă – nereceptivitatea se păstrează doar în perioada aflării mi/o în organism (tbc, sifilis). 5. Vaccinurile sunt produse biologice cu proprietăţi de imunogen, constituite din microorganisme vii sau omorâte, din componentele lor sau din toxine modificate. Fiind administrate la om sau animale induc o imunitate artificială activă – IAA - (umorală, celulară, mixtă) fără să provoace efecte nocive. Imunitatea postvaccinală (IAA) se instaurează relativ lent, la 15-20 zile de la ultima inoculare, şi durează timp variabil (luni-ani-toată viaţa). Vaccinarea primară (de bază) conferă organismului memorie imunologică. Vaccinările de rapel (revaccinarea) se utilizează pentru stimularea unui răspuns imun secundar, mai rapid si mai intens Calităţile unui vaccin ideal: Imunogenitate înaltă; Lipsit de efecte secundare; Uşor disponibil; Stabil ; Ieftin; Simplu la administrare şi eficace (să creeze imunitate stabilă de lungă durată) Eficienţa vaccinării depinde de: Calităţile imunogene ale vaccinului; Durata persistenţei vaccinului în organism; Capacitatea organismului vaccinat de a elabora răspuns imun eficient. Clasificarea vaccinurilor: T R A D I Ţ I O N A L E (clasice) - Corpusculare (vii atenuate, inactivate), Subunitare (vaccinuri chimice, anatoxinele). D E P E R S P E C T I V Ă – Sintetice, Ribosomale, Anti-adezive, Recombinante, Vaccinuri hibride, Vaccinuri nucleotidice 6. Vaccinurile vii atenuate. Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor vii. Exemple. Vaccinurile vii atenuate reprezintă tulpini de bacterii sau virusuri vii cu virulenţa redusă, dar cu capacitate imunogenă păstrată. Căile de obţinere: A. Selecţia tulpinilor naturale cu virulenţa redusă - Vaccinul E (contra tifosului exantematic); Vaccinul EV (antipestos); Vaccinul Brucella N19 (antibrucelos). B. Utilizarea mi/o înrudite genetic, avirulente pentru specia umană - (ex.: virusul vacciniei utilizat în profilaxia variolei) C. Atenuarea dirijată a virulenţei prin: Factori fizici (cultivarea la t° neadecvate – vaccinul anti-antrax (42° C), vaccinul anti-pestos (16° C)) Cultivarea în prezenţa unor compuşi chimici nefavorabili (ex.: BCG – obţinut de Calmette şi Guerin prin cultivarea tulpinii de Mycobacterium bovis timp de 13 ani pe medii cu bilă) Prin factori biologici – pasaje multiple pe animale sau pe culturi celulare (Pasteur a efectuat 133 pasaje a suspensiei de creier de la câine turbat intracerebral iepurilor, obţinând un virus atenuat) - Prin inginerie genetica (inactivarea genelor de patogenitate - mutaţii la nivelul genelor de patogenitate) Alte vaccinuri vii atenuate: anti-tularemic, anti-poliomielitic, anti-gripal, anti-rujeolos, anti-rubeolic, anti-parotidită epidemică, etc. Avantajele vaccinurilor vii: Imunogenitate înaltă, o inoculare unică induce imunitate solidă şi de lungă durată; Se administrează pe cale naturală (intranazal, per os, percutan, etc); Induce imunitate locală şi generală Dezavantaje: Pot provoca complicaţii postvaccinale (accidente alergice, efect teratogen); Revenirea la forma virulentă cu riscul bolii infecţioase induse (ex.: poliomielită paralitică, etc); Pericol de inducere a maladiei la persoane cu imunodeficienţe (BCG-ita, etc); Multiple contraindicaţii; Durată de păstrare limitată. Vaccinurile inactivate (omorate). Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor inactivate. Exemple. Autovaccinul, utilizarea practica. Vaccinurile inactivate (omorâte) constau din culturi bacteriene sau virale înalt virulente inactivate prin căldură (60° C – 1 oră), prin agenţi chimici (formaldehidă, fenol, acetonă), radiaţii, ultrasunet, etc. Exemple de vaccinuri inactivate: anti-tifoidic, anti-dizenteric, anticholeric, anti-pertusic, anti-stafilococic, anti-gripal, anti-poliomielitic, etc. Autovaccinul este un vaccin inactivat preparat din tulpina microbiană izolată de la un bolnav şi inoculat aceluiaşi bolnav pentru stimularea imunităţii specifice. Autovaccinul este indicat pacienţilor care suferă de procese cronice: stafilodermii, streptodermii, candidoze, dizenterie cronica, etc.

Avantajele vaccinurilor inactivate: Exclud riscul infecţiei post-vaccinale; Stabile la păstrare. Dezavantaje: Imunogenitate redusă (sunt necesare inoculări repetate); Durată limitată a imunităţii 6 – 12 luni; Eficacitate variabilă; Necesitatea unei concentraţii mari de Ag; Administrarea prin injecţii (stimulează slab sau deloc imunitatea locală). Obtinere: 1. Se izoleaza din prelevatul d ela bolnav bacteria cu semnificatie clinica 2. Se obtine cultura pura si se identifica bacteria izolata 3. Se replica abundant cultura pe geloza nutritive si geloza sange si peste noapte la 37 grade. 4. Se extrage cu pipeta Pasteur in solutie salina izotona fara a include impuritatile, Se ajusteaza densitate. 5. Se inactiveaza suspensia in baie de apa 60 grade o ora. 6. Se controleaza sterilitatea prin replicare in bulion 4 zile 37 grade, apoi se insamanteaza pe placa. 7. Se adauga fenol pt conservative. Si se elibereaza strict aseptic cu numele pacientului varsta etc. Vaccinurile subunitare (fragmentate, chimice) si anatoxinele. Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor subunitare. Notiune de adjuvant. Vaccinurile adsorbite. Vaccinurile subunitare (acelulare, chimice) constau din componente antigenice majore, capabile să inducă un răspuns imun protector, extrase prin diferite metode din celulele bacteriene (digestie enzimatică, hidroliză cu acidul tricloracetic, etc). Ex.: vaccinul anti-pneumococic, anti-meningococic, anti-hemofilus (conţin polizaharide capsulare), etc. Anatoxinele sunt vaccinuri subunitare obţinute din exotoxine bacteriene. Etapele de obţinere a anatoxinelor: 1. Cultivarea tulpinii toxigene în mediu lichid 2. Separarea exotoxinei prin filtrare 3. Tratarea cu formol 0,3-0,4 % timp de 3-4 săptămâni la 39-40° C. Toxinele pierd toxicitatea, dar îşi păstrează capacitatea imunogenă 4. Purificarea anatoxinei (salinizare cu săruri de amoniu, precipitare cu alcool...) 5. Concentrarea 6. Determinarea puterii anatoxinei în RN (floculare) cu seruri antitoxice specifice 7. Anatoxinele se utilizează în profilaxia specifică a infecţiilor cauzate de mi/o toxigene stimulând producerea antitoxinelor. Exemple de anatoxine: difterică, tetanică, gangrenoasă, botulinică, holerică, stafilococică, etc. Avantajele vaccinurilor subunitare: sunt lipsite de efecte secundare; stabilitate la păstrare Dezavantaje: imunogenitate redusă, necesitatea inoculărilor repetate Pentru sporirea imunogenităţii vaccinurilor inactivate şi subunitare se utilizează substanţe speciale - adjuvanţi. I. Adjuvanţii minerali (hidroxidul de Al, fosfatul de Ca, emulsii uleioase) generează o reacţie inflamatoare care reţine eliminarea Ag şi favorizează prezentarea lui limfocitelor T II. Adjuvanţii biologici (unele bacterii: Bordetella pertussis, Corynebacterium parvum, Mycobacterium tuberculosis, sau componente bacteriene – ex. ribosomi bacterieni ) induc expresia moleculelor de co-stimulare pe suprafata CPA, stimuland aceste celule sa secrete citokine care vor activa limfocitele T. Vaccinuri adsorbite (deponente, conjugate) – au Ag fixate pe adjuvanţi (AD, ADT, ADTP, etc) 9, 10,11 Imunizarea artificială pasivă se realizează cu preparate biologice ce conţin Ac (seruri imune, Ig, gamma-globuline, etc), utilizate cu scop de seroterapie sau seroprofilaxie. Imunitatea artificială pasivă se instalează imediat după administrarea preparatului, fiind limitată în timp (max. 3 săptămâni). Din momentul în care Ac exogeni sunt eliminaţi, organismul redevine receptiv la infecţie. Serurile imune sunt preparate biologice ce conţin Ac specifici faţă de diferiţi agenţi patogeni şi produse ale acestora.  După provenienţă există: 1. Seruri imune omologe - De la convalescenţi; De la voluntari imunizaţi activ (seruri hiperimune, specifice); Din sângele donatorilor şi sânge placentar (seruri standarde, normale) 2. Seruri imune heterologe, obţinute prin hiperimunizarea animalelor (cai, cămile, lame) După modul de acţiune se disting: 1. Seruri antibacteriene (anti-meningococic, anti-antrax), ridică sensibilitatea bacteriilor la acţiunea fagocitelor şi complementului. Se dozează în ml (seruri netitrate) 2. Seruri antivirale (ex.: ser anti-rabic). Neutralizează infecţiozitatea virusurilor. 3.Seruri antitoxice (anti-difteric, anti-tetanic, anti-botulinic, etc). Neutralizează exotoxinele bacteriene (blochează fixarea de receptorii celulari). Activitatea lor este apreciată prin titrare şi măsurată în UA (UI). 4. Seruri mixte (ex.: antigangrenos) Serurile imune native conţin pe lângă Ig şi alte proteine ale sângelui (albumine) responsabile de reacţii alergice. Serurile imune purificate şi concentrate sunt lipsite de albumine, care sunt eliminate prin procedee speciale (precipitare cu sulfat de amoniu, prin digestie enzimatică, electroforeză) Imunoglobulinele (gamma-globulinele). Se obţin din seruri omologe rafinate prin procedee care extrag numai gamma-globulinele şi realizează o concentraţie a Ig de 15-20 ori faţă de serul nativ. Ig normale sunt extrase din amestecuri de plasmă de la sute-mii de donatori sau sânge placentar. Se utilizează în seroprofilaxia rujeolei, hepatitei A şi în terapia pacienţilor cu deficit umoral primar. Ig hiperimune (specifice) se obţin din seruri de convalescenţi sau ale persoanelor imunizate (Ig anti-antrax, Ig anti-leptospirozică) Cerinţele faţă de preparatele biologice ce conţin Ac: Sterilitate; Inofensivitate; Apirogenitate ; Aviditate înaltă; Activitate de lungă durată.