Bai Giang Dai Cuong Saponin [PDF]

Zitiervorschau

Saponin & Dược liệu chứa Saponin

1

1.

Trình bày được định nghĩa và phân loại các saponin

2.

Ứng dụng được cc tính chất (lý, hóa) chính của saponin

để định tính và định lượng saponin trong dược liệu 3.

Trình bày và lựa chọn được các phương pháp chiết xuất, phân lập saponin

4.

Nêu được các dụng & Công dụng chính của các saponin

5.

Nêu được thành phần hóa học chính và công dụng của các dược liệu chứa saponin quan trọng

2

Phần 1: Đại cương về Saponin 1. Khái niệm - Định nghĩa

6. Chiết xuất

2. Cấu trúc - Phân loại

7. Phân lập - Tinh chế

3. Lý tính

8. Định tính

4. Hóa tính

9. Định lượng

5. Phân bố / tự nhiên

10. Tác dụng - Công dụng

Phần 2: Các dược liệu chứa Saponin 1. Các loài thuộc chi Panax 2. Rau má 3. Cam thảo 4. Đinh lăng … 3

SAPONIN là gì?

4

Rau má (Centella asiatica)

Có bọt

Saponin? 5

Bồ kết (Gleditsia fera)

Có bọt

Saponin?

6

Soap bark (Quillaja saponaria)

Soapnut (Bồ hòn, Sapindus saponaria)

7

Diêm mạch (Chenopodium quinoa)

Quinoa foam

8

Phần I. Đại cương về saponin

9

Phần I. Đại cương về saponin “Sapo” = soap, savon Chi Saponaria hay loài Quillaja saponaria.

- Soapbark: Quillaja saponaria họ Quillajaceae. - Soapwort: Saponaria officinalis họ Caryophyllaceae. - Soapberry: Sapindus saponaria họ Sapindaceae. - Soapnut: Sapindus mukurossi họ Sapindaceae. - Soaproot: Chlorogalum pomeridianum Họ Asparagaceae. 10

Phần I. Đại cương về saponin Độc với cá (Fish poison)

Cotus sp.

fish take in saponins directly into their bloodstream through their gills. The toxin acts on the respiratory organs of the fish without affecting their edibility. 11

https://www.primitiveways.com/fish_poison.html

Phần I. Đại cương về saponin

• Ph.ứng màu (Salkowski, 1872; Liebermann, 1885; Burchard, 1889). • Phản ứng tạo phức Digitonin + Cholesterol (Windaus, 1909). • Phân loại saponin theo tính acid-kiềm

(Robert, 1917).

• Chiết saponin với n-BuOH bão hòa nước (M.E. Wall, 1952).

• “Die Saponine” Ludwig Kofler (1927) •Thuật ngữ saponin: Gmelin (1819): đa số tài liệu Grothus (1815) (theo Kichter, 1939) P.A. Bucholz (1811) (theo Bernard, 1949). 12

Phần I. Đại cương về saponin 1.1. Quan niệm truyền thống: Saponin còn gọi là các saponoside là các glycosid tự nhiên, gặp chủ yếu trong thực vật, một số từ động vật (cá sao, hải sâm) có tính: ✓ Tạo bọt nhiều (bền khi lắc với nước); Làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch ✓ Phá huyết (làm vỡ hồng cầu) ở nồng độ rất thấp. ✓ Độc đối với cá & các loài thân mềm (giun, sán, ốc…)

✓ Kích ứng niêm mạc (gây hắt hơi, đỏ mắt…) ✓ Tạo phức với cholesterol & các Δ’ 3-OH-steroid. Tuy nhiên, nhiều saponin kinh điển (Đậu nành, Cam thảo, Nhân sâm, Tam thất…) lại ko thể hiện đầy đủ các tính chất này; nhất là tính phá huyết & tính tạo phức với cholesterol… 13

Sarsaparilloside (từ chi Smilax) không có tính phá huyết/ tạo phức với cholesterol.

Phần I. Đại cương về saponin

Bernard (1949)

Rosenthaler (1939)

Saponin là các heterosid, có bản chất keo (colloidal), tan trong nước và có tính tạo bọt trong nước. Chúng có mùi hăng nồng, vị đắng, gây hắt hơi, gây phá huyết.

Saponin là các chất có tính tạo bọt bền trong dung dịch nước, có cấu tạo glucosid (hay Δ’ glucuronid) của polyterpen hay của cholan (tức sterol).

Kurt Hostettmann (1995): Saponin là các glycosid có KLPT lớn của triterpenoid hay steroid. Lưu ý: • Các glycosid trợ tim cũng thuộc nhóm saponin. 14

• Các sapogenin, vẫn được xếp vào “nhóm saponin”

15

Phần I. Đại cương về saponin

Steroid alkaloid skeleton

Saponin là các glycosid có KLPT lớn của triterpenoid hay steroid. (K. Hostettmann and A Marston,Saponins, 1995).

16

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin ❑

Robert, 1917: saponin acid, trung tính.

❑

1995 →nay: phân loại theo khung của aglycon = [sapo]genin.

17

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

18

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

19

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin Phần mạch đường trong saponin ❖ Ví trí gắn đường: C-3, C-6, C-20, C-28… ❖ Nối đường: O-glycosid (thường gặp ở 3β-OH → ose). ψ-glycosid (thường gặp ở 28β-COOH → ose). ❖ Loại đường: * hexose: * pentose:

D-Glc (và Δ’ GlcA)

D-Fuc (6-desoxy)

D-Gal (và Δ’ GalA)

L-Rha (6-desoxy)

D-Xyl (f, p)

L-Ara (fura/pyranose)

❖ Mạch đường: 1-3 mạch đường, thẳng/ phân nhánh. Mỗi mạch có thể có 1-5 đường, có khi hàng chục đường 20

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

21

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

❖ Thường từ tên khoa học (tên Chi, tên loài) của mẫu.

❖ Aglycon (genin): diosgenin... (= EU, USA). ❖ Glycosid thường có vĩ ngữ “osid”: ginsenosid... (EU, USA: oside).

Ví dụ: Genin: Smilagenin, Diosgenin, Hederagenin, Gypsogenin…

Glycosid: Panaxosid, Ginsenosid, Asiaticosid, Polysciacosid, Senegin, Mollugocin, Glycyrrhizin, Cucurbitacin…

22

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin Triterpenoid (30 C)

Triterpen 4 vòng (all: trans) Tetracyclic triterpenoid

23

a. Phân nhóm Dammaran * (Me: 10 + 8) b. Phân nhóm Lanostan (Me: 10 + 13) c. Phân nhóm Cucurbitan (Me: 9 + 13) d. Phân nhóm Tirucallan (Me: 10 + 13)

Triterpen 5 vòng (C/D:cis) a. Phân nhóm Oleanan ** b. Phân nhóm Ursan * c. Phân nhóm Lupan d. Phân nhóm Hopan

e. Ph. nhóm taraxasteran f. Phân nhóm khác

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin Triterpenoid (30 C)

Triterpen 4 vòng (all: trans) Tetracyclic triterpenoid

24

a. Phân nhóm Dammaran * (Me: 10 + 8) b. Phân nhóm Lanostan (Me: 10 + 13) c. Phân nhóm Cucurbitan (Me: 9 + 13) d. Phân nhóm Tirucallan (Me: 10 + 13)

Triterpen 5 vòng (C/D:cis) a. Phân nhóm Oleanan ** b. Phân nhóm Ursan * c. Phân nhóm Lupan d. Phân nhóm Hopan

e. Ph. nhóm taraxasteran f. Phân nhóm khác

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

Gồm 6 đơn vị isopren (C5H8); nối chủ yếu theo kiểu “đầu → đuôi”

isopren (C5H8)

Sap triterpene 5 vòng : chỉ có nối vòng C/D là cis.

Sap triterpene 4 vòng : cả 3 nối vòng (A/B, B/C, C/D) đều là trans. 25

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.1 Triterpen 5 vòng (8 nhóm methyl)

❖ 5 vòng 6 cạnh: Oleanan, Ursan, Taraxasteran ❖ 4 vòng 6 cạnh + 1 vòng 5 cạnh: Lupan, Hopan 26

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.1. Saponin triterpenoid 5 vòng 29 30



 12

12

28

28

HO

3

Oleanan → β-amyrin

27

HO

3

Ursan → -amyrin

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.1. Saponin triterpene 5 vòng – khung Oleanan 12

28

3

HO

Rất phổ biến trong thiên nhiên, thường là dẫn xuất của -amyrin 30 29 (3-hydroxy olean-12-en) 19 12 25 1

Acid oleanolic

Có cấu trúc 12-en-28-oic acid

13

20 18

22

17

26 15

21

COOH

16

28

27

3

HO 24

CH2OH 23

Hederagenin (Hedera helix/ Ivy)

28

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.1. Saponin triterpenoid 5 vòng – Khung ursane

Acid quinovic 29

30

30



12

12

25 1

13

29

19

20

18

22

17

26 15

28

21

COOH

16

28

27

3

HO

HO

3

24

Ursan → -amyrin

23

→ acid ursolic

Khá phổ biến là dẫn xuất của α-amyrin (3-hydroxy ursan-12-en). Trong tự nhiên có đi kèm nhóm olean.

29

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.1. Saponin triterpenoid 5 vòng - Lupane 29

30



20

E C

D

R

28

29 30

20

12 11 1

25

4

23

5 24

6

21

18

13

22

17 14

8

10

3

19

26 9

2

A

27

28 16

15

7

Khung Lupan

HO

B

3

R = H:

Lupeol

R = CH2OH: Betulin R = COOH: acid Betulinic

Lupeol/ hạt Lipinus luteus

Thường là dẫn chất của 3-hydroxy lupan 20(29)-en. Ít gặp trong tự nhiên 30

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.1. Saponin triterpenoid 5 vòng - Hopane

 19 12 11 25

4

23

28

5 24

6

30

21 17

8

10

3

13

9

2

18

26

1

20

16

15 27

22 29

Diplopten (Hopene) Hopane xuất phát từ chi Hopea (Sao), Dipterocarpaceae (a source of the resin/John Hope)

7

Khung Hopan

Thường là dẫn chất của 3-hydroxy hop-22(29) Ít phổ biến trong tự nhiên, thường gặp trong bacteria/primitive organism. 31

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.1. Saponin triterpenoid 5 vòng

• Trong 5 vòng A, B, C, D, E: vòng E có thể là 6 cạnh hay 5 cạnh.

• 4 vòng A-D: có 6 nhóm Me (lưu ý: gem-dimethyl ở vòng A). • E 6 cạnh: thêm 2 nhóm Me (geminal: Oleanan, vicinal: Ursan). • E 5 cạnh: thêm 2 nhóm Me / isopropyl (: Lupan; : Hopan). • Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me; ≠ sap. steroid). 29

30

29

30

29

20

20

E

30

E

20 19

21

E

19

20

E 22

21

29

22

30

Oleanan

Ursan

Lupan

Hopan

( 2 singlet x 3H)

(2 doublet x 3H)

(1 doublet x 6H)

(1 doublet x 6H)

32

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng (8 nhóm methyl)

8C

(17 + 5) C

33

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng – Khung dammaran

Tiêu biểu là các sapogenin thật protopanaxadiol và protopanaxatriol trong Nhân sâm thu được khi thủy phân các glycoside bằng enzyme (crude hesperidinase)

34

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng – Khung dammaran

Protopanaxadiol (PPD)

Protopanaxatriol (PPT)

OH

21

OH

20

26

24

22

1

14

8

3

6

HO

17

18

OH 16

27

26

24

22

12

1

30 7

6

28 29

14

8

3

28

17

18

19

15

O-glycosid: C-3, C-20 Ví dụ: các ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd…

20

11

HO 29

OH

21

12 11 19

Ocotillol (OCT)

16

27

15

30 7

OH

O-glycosid: C-3, C6, C-20 Ví dụ: các ginsenoside Rg1, Rg2, Re, Rf…

O-glycoside: C-6 Ví dụ: các majonoside R1, R2…

35

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng – Khung dammaran

Panaxadiol (PD) H+ (HCl) Protopanaxadiol/ protopanaxatriol (PDD/PPT)

Panaxadiol (PT) Nếu thủy phân các ginsenosid bằng acid sẽ cho các genin giả như PD/PT 36

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng – Khung Lanostan (10-Me) 21

20

22

18 12 11 9 2

A/B; B/C; C/D: trans

3 28

5- lanostan

5

23

25

16

27

15 8

10 4

26

17 13

19

24

6

30 7

29

5- lanostan

37

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng – Khung Lanostan (10-Me) 21

20

22

18 12 11 9 2 4

28

5

23

HO

25

16

O

O

O R

27

15 8

10

3

26

17 13

19

24

6

30 7

29

Hải sâm (sea cucumber)

Oses

O

các Holothurin (R = H hay OH)

Nấm lỗ (Polyporaceae)

Họ nấm lỗ: > 30 hợp chất saponin thuộc cấu trúc lanostan. Phá huyết mạnh.

38

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng – Khung Lanostan (10-Me) Major holothurins from black sea cucumber Holothuria atra

Mar. Drugs 2019, 17(2), 86

39

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng – Khung Cucurbitan (9-Me) 22

21 18

20

27

26 16 9

2 19

3

25

23

11

H

24

30

5 28

29

Cucurbitacin A Đây là saponin ít phổ biến, chỉ được tìm thấy trong chi Cucumis (Cucurbitaceae)

Cucurbitacin B Có trong hầu hết các loài thuộc họ Cucurbitaceae. Cucurbitacin B glucosid được phân lập từ rễ của Picrorhiza kurrooa (Scrophulariaceae) 40

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng – Khung Cucurbitan (9-Me)

thiếu nhóm acetyl ở 25-OH

Cucurbitacin C Hoạt chất này rất hiếm trong tự nhiên, chỉ được tìm thấy trong loài Cucumis sativus (Cucurbitaceae).

Cucurbitacin D Được phân lập trong một số họ: Cucurbitaceae, Elaeocarpaneae, Datiscaceae

Ngoài ra còn có cucurbitacin E, F, G, H, O, P , Q, R, S, T và các cucurbitacin không phổ biến khác.

41

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng – Khung Tirucalan (10-Me)

Bioorganic Chemistry, Volume 84, March 2019, Pages 309-318

42

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.2. Saponin triterpenoid 4 vòng – Khung Cycloartane

Cấu trúc 9,19-cyclo(9)lanostan: các astragaloside trong Astragalus

43

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

• Trong 4 vòng A, B, C, D: chỉ vòng D là 5 cạnh

(Σ → 17 C).

• Khung có sẵn 5 nhóm Me; có gem-dimethyl / vòng A (→ 22 C).

• Vòng D thêm nhánh 8 C; trong đó có 3 nhóm Me nữa (→ 30 C). • Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me; khác hẳn sap. steroid). • Từ Lanostan → các phân nhóm khác nhau về vị trí gắn nhóm Me.

44

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin Robert, 1917: saponin acid, trung tính. 1995 →nay: phân loại theo khung của aglycon = [sapo]genin. Saponin Glycon

Sapogenin = Aglycon Steroid

Triterpenoid (acid saponin)

Triterpen 4 vòng

45

Dammaran Cucurbitan Lanostan Tirucallan

Triterpen 5 vòng

Steroid đơn giản

Olean, Ursan Hopan, Lupan Taraxasteran

Spirostan Furostan

(Neutral)

Steroid alkaloid Spirosolan Amino-furostan Solanidan

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.1. Saponin triterpenoid 5 vòng

• Trong 5 vòng A, B, C, D, E: vòng E có thể là 6 cạnh hay 5 cạnh.

• 4 vòng A-D: có 6 nhóm Me (lưu ý: gem-dimethyl ở vòng A). • E 6 cạnh: thêm 2 nhóm Me (geminal: Oleanan, vicinal: Ursan). • E 5 cạnh: thêm 2 nhóm Me / isopropyl (: Lupan; : Hopan). • Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me; ≠ sap. steroid). 30

29

29 30

30 29

20

20

E

E

20 19

21

E

19

20

E 22

21

29

22

30

Oleanan

Ursan

Lupan

Hopan

(46 2 singlet x 3H)

(2 doublet x 3H)

(1 doublet x 6H)

(1 doublet x 6H)

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin Triterpenoid (30 C)

Triterpen 4 vòng (all: trans) a. Phân nhóm Dammaran *

a. Phân nhóm Oleanan **

(Me: 10 + 8)

b. Phân nhóm Ursan *

b. Phân nhóm Lanostan (Me: 10 + 13)

c. Phân nhóm Cucurbitan

c. Phân nhóm Lupan d. Phân nhóm Hopan

(Me: 9 + 13)

e. Ph. nhóm taraxasteran

d. Phân nhóm Tirucallan

f. Phân nhóm khác

(Me: 10 + 13) 47

Triterpen 5 vòng (C/D:cis)

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

• Trong 4 vòng A, B, C, D: chỉ vòng D là 5 cạnh

(Σ → 17 C).

• Khung có sẵn 5 nhóm Me; có gem-dimethyl / vòng A (→ 22 C).

• Vòng D thêm nhánh 8 C; trong đó có 3 nhóm Me nữa (→ 30 C). • Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me; khác hẳn sap. steroid). • Từ Lanostan → các phân nhóm khác nhau về vị trí gắn nhóm Me.

48

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

2.3. Saponin steroid (khung 27 C) 2.3.1. Phân nhóm Spirostan/ Furostan :

Spirosolan: tương tự Spirostan, vòng (F): O → NH. 2.3.2. Phân nhóm Solanidan 2.3.3. Phân nhóm amino-furostan: Tương tự Furostan, 3-OH → 3-NH2 2.3.4. Phân nhóm Polypodo-saponin 2.3.5. Phân nhóm Osladin

2.3.6. Phân nhóm -Spinasteroid 49

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

2.3.1. Saponin steroid (khung 27 C) – khung spirostan

E

F

Cấu tạo giống cholestane nhưng mạch nhánh từ C-20 đến C-27 tạo thành 2 dị vòng chứa O là vòng E, và vòng F, nối nhau qua cầu nối C 22, tạo thành mạch spiroacetal 50

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

2.3.1. Saponin steroid (khung 27 C) – khung spirostan

Cis/trans 25S/25R

Nhóm spirostan: có nhiều C*, hưng do chướng ngại lập thể nên số đồng phân giảm nhiều. Có 2 đồng phân chính – cis/trans (do 2 vòng A/B) – đồng phân cấu hình tuyệt đối ở vị trí C25 51

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

2.3.1. Saponin steroid (khung 27 C) – khung spirostan 27

O

21

22 20

25

26

H 23

24

O

HO

Smilax

Một vài saponin steroid gặp trong tự nhiên

Digitalis 52

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.3.1. Saponin steroid (khung 27 C) – khung spirostan (4 nhóm Me) O 21 18

25

26

22

27 23

20

24

21

O

8C

20 18

22

O 17

19

19

12

25

26

O

17

23

27 24

O

(17 + 2) C HO

5

6

Diosgenin/ Dioscorea

HO

Hecogenin/ Agave

Các saponin thuộc nhóm spirostan thường được dùng làm nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid. Khi chiết xuất, nhóm Me-27 dễ chuyển thành Me-27 (và hecogenin, tigogenin, gitogenin → neohecogenin...) 53

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.3.1. Saponin steroid (khung 27 C) – khung furostan c ~110 ppm OH

21 22 20

23

27

27

HO 26

25

O

21

H

22 20

24

O



Sarsaparilloside

H 23

24

O

 HO

25

26

c ~100 ppm

 HO



Parillin

Ít gặp hơn Spirostan. Furostan dễ đóng vòng thành Spirostan Dưới tác dụng của enzyme, phần đường mạch nhánh sẽ bị cắt đứt Và sẽ bị đóng vòng, để tạo vòng F 6 cạnh như spirostan. Lợi dụng tính chất này để làm giàu nguyên liệu khi chiết xuất saponin spirostan. 54 Ví dụ: chiết xuất saponin sarsaparilloside trong Smilax

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.3.1. Saponin steroid (khung 27 C) – khung furostan Trường hợp vòng F có 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy.

Avenacoside

Isonuatigenin

Hợp chất avenacoside trong yến mạch có 2 mạch đường, khi thủy phân cắt đường glucose ở C-26 thì chuyển thành sprirostan. 55

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.3. Saponin steroid (khung 27 C) Nhận xét chung về khung của saponin steroid đơn giản

Vòng (A): không có gem-dimethyl ở C-4 (≠ sap. triterpenoid). - các khung sap. steroid chỉ có # 4 nhóm methyl. - khung sap. triterpenoid có tới # 8 nhóm methyl. Rất dễ phân biệt bằng các phổ 13C-NMR (CPD, DEPT). • Saponin steroid đa số chỉ có 1 mạch đường (monodesmosid); còn sap. triterpenoid có thể đến 3 mạch đường (tridesmosid).

56

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

2.3. Saponin steroid - Spirosolane Nguyên tử oxy trên vòng F của sprisostan được thay thế bằng nhóm NH.

Solasonin

57

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

2.3. Saponin steroid - Spirosolane

58

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

2.3. Saponin steroid - Spirosolane

59

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin 2.3.2. Saponin alkaloid steroid - Spirosolane 

21

20

22

18

O

NH 26 23

25

27

H

19

3

24



25

26

Solasonin/Cà lá xẻ

HO

5

H

All = 4 nhóm methyl

60

NH

14

5

HO

22

18

14 3

20

O 24

19

23

21

Tomatin/Cà chua xanh

27

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

2.3.2. Saponin alkaloid steroid - Solanidan Vòng E&F có chung 1 C và 1 N 21 20

22

18

19

10 3

Oses

Solanin

Lethal dose: 3-6 mg/kg 61

O

5

13

17

23

N 26

24

25

(MW lẻ!)

27

62

Cà chua xanh: 500 mg/kg Cà chua chín: < 5 mg/kg

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin

2.3. Saponin steroid - Aminofurostan

/Solanum paniculatum

63

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin Saponin steroid - Tính chất tương tự cấu trúc saponin triterpene - Phân bố ít hơn so với saponin triterpene trong tự nhiên - Phân bố: Dioscoreaceace; Liliaceace; Agavaceae,.. - Khung sapogenin có 27C - Tất cả đều có C25 stereoisomerisation - Đường gắn C-3 & C26 (ít hơn) - Cấu trúc ít đường hơn - Càng nhiều đường, hoạt tính phá huyết (haemolytic effect) càng tăng - Là nguyên liệu bán tổng hợp nên các hormone steroid như: Diosgenin -> progesterone

- Các nguyên liệu thô khác: sitosterol; stigmasterol. 64

Phần I. Đại cương về Saponin 2. Cấu trúc – Phân loại saponin Triterpene 4 vòng

Triterpene 5 vòng

Saponin steroid ✓Vòng (A): không có ✓ Trong 4 vòng A, B, C, D: ✓Vòng E có thể là 6 cạnh gem-dimethyl ở C-4 chỉ vòng D là 5 cạnh (Σ → hay 5 cạnh. 17 C). ✓Chỉ có # 4 nhóm ✓ 4 vòng A-D: có 6 nhóm ✓ Khung có sẵn 5 nhóm Me; Me (lưu ý: gem-dimethyl ở methyl. có gem-dimethyl/ vòng A ✓Phân biệt bằng các phổ vòng A). 13C-NMR (CPD, DEPT). (→ 22 C). ✓ Vòng E 6 cạnh: thêm 2 ✓Đa số chỉ có 1 mạch ✓ Vòng D thêm nhánh 8 C; nhóm Me (geminal: trong đó có 3 nhóm Me Oleanan, vicinal:Ursan). E đường (monodesmosid) nữa (→ 30 C).

✓ Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me) ✓ Từ Lanostan → các phân nhóm khác nhau về vị trí gắn nhóm Me. 65

5 cạnh: thêm 2 nhóm Me/ isopropyl (: Lupan; : Hopan).

✓ Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me; ≠ sap. steroid).

Phần 1: Đại cương về Saponin 1. Khái niệm - Định nghĩa

6. Chiết xuất

2. Cấu trúc - Phân loại

7. Phân lập - Tinh chế

3. Lý tính

8. Định tính

4. Hóa tính

9. Định lượng

5. Phân bố / tự nhiên

10. Tác dụng - Công dụng

Phần 2: Các dược liệu chứa Saponin

1. Các loài thuộc chi Panax 2. Rau má 3. Cam thảo 4. Đinh lăng … 66

1. Trình bày được các tính chất vật lý, hóa học chính của

saponin 2. Áp dụng được các tính chất vật lý và hóa học trong

việc định tính các dược liệu chứa saponin

67

3. Tính chất vật lý

Phần I. Đại cương về Saponin

3.1. Cảm quan

• Saponosid: o Trạng thái bột vô định hình o Không màu o Mùi hăng, đa số có vị đắng nhẫn đến đắng • Các sapogenin (aglycon) có thể ở dạng tinh thể (thường là hình kim).

68

Momordica charantia / Cucurbitaceae

Momordicine I

Phần I. Đại cương về Saponin

3. Tính chất vật lý 3.2. Độ phân cực và tính tan

• Độ phân cực tăng theo độ dài & số lượng mạch đường . • Aglycon (sapogenin): dễ tan / dung môi phân cực kém → phân cực trung bình (CHCl3, DCM, EtOAc…). • Các saponosid: thường kém tan/ d. môi (rất) kém phân cực hydrophobic

Lựa chọn dung môi chiết xuất/ phân lập hydrophilic 69

3. Tính chất vật lý

Phần I. Đại cương về Saponin

3.3. Tính tạo bọt (bền trong môi trường nước)

•

Tính lưỡng cực → làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch → tạo bọt nhiều và bền khi được lắc mạnh. (Sapo = soap: xà phòng)

•

Mạch đường càng nhiều & dài, tính tạo bọt càng rõ rệt.

fat soluble saponin

70

Asiaticoside/madecasoside

Water soluble Carbohydrate chain

3. Tính chất vật lý

Phần I. Đại cương về Saponin

3.3. Tính tạo bọt (bền trong môi trường nước) Ứng dụng: ➢ Tẩy rửa, làm thuốc long đàm. ➢ Định tính saponin bằng phương pháp tạo bọt

Thực hiện định tính:

0,5 g mẫu + 10 ml cồn 70%, đun trong 5 phút, Lọc nóng qua bông, cô đến hết cồn (thu dịch nước). Pha với 10 ml nước, lắc 30 lần / đúng 60 giây, Đánh giá: bọt bền 15’ (+); bền 30’ (++); bền 60’ (+++). 71

Phần I. Đại cương về Saponin

3. Tính chất vật lý 3.3. Tính tạo bọt (Chỉ số bọt)

• Chỉ số bọt (CSB) “Là độ pha loãng cần thiết của 1 gam dược liệu để tạo được một lớp bọt cao 1 cm sau khi ngưng lắc 15 phút, tiến hành trong điều kiện quy định.” n ml dịch A + nước vừa đủ 10 ml (độ pha loãng = 1/C = 1000/n)

1‰

1000

2‰

500

3‰

333

4‰

250

5‰

200

6‰

167

7‰

143

8‰

125

9‰

111

• Ứng dụng: Kiểm tra chất lượng dược liệu chứa saponin.

10‰

100

72

3. Tính chất vật lý

Phần I. Đại cương về Saponin

3.4. Tính phá huyết (hemolysis) (cả khi ở nồng độ rất thấp)

➢ Saponin làm vỡ Hồng cầu (có thể do chúng kết hợp cholesterol màng hồng cầu -> tạo phức, giảm tính đàn hồi, kém bền -> vỡ)

➢ Không có mối tương quan rõ rệt giữa tính phá huyết và tạo phức với cholesterol. ➢ Hồng cầu của mỗi động vật nhạy khác nhau. ➢ Nhiều saponin có tính phá huyết rất mạnh (làm vỡ hồng cầu → không được đưa saponin vào mạch máu, nguy cơ gây tan máu).

Ứng dụng: định tính saponin/ đánh giá nguyên liệu chứa saponin 73

3. Tính chất vật lý

Phần I. Đại cương về Saponin

3.4. Tính phá huyết (hemolysis): Chỉ số phá huyết

• Chỉ số phá huyết (CSPH) Là số mililit dung dịch đệm cần thiết để hòa tan các saponin có trong 1 gam dược liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một loại máu đã chọn, tiến hành trong điều kiện quy định. 74

3. Tính chất vật lý

Phần I. Đại cương về Saponin

3.5. Tính kích ứng niêm mạc - Nhiều saponin có tính kích ứng niêm mạc

(làm đỏ mắt, chảy nước mắt; gây hắt hơi mạnh; vd. bột Bồ kết…)

3.6. Độc với cá và động vật thân mềm Tăng tính thấm biểu mô hô hấp -> mất điện giải.

Một số dược liệu được dùng để thuốc cá.

75

3. Tính chất vật lý

Phần I. Đại cương về Saponin

3.7. Phổ UV của saponin

Các saponosid & genin thường không cho phổ hấp thu UV-Vis Cực đại hấp thu của chúng thường 500 loài / 100 họ thực vật. Phân nhóm Lanostan hay gặp trong hải sinh vật (Sao biển, Hải sâm…) Riêng trong chi Panax có hơn 300 saponin cấu trúc khác nhau. (2014) • Saponin steroid Đã gặp trong > 85 loài thuộc 59 chi thực vật (SM. Hassan, 2008). Các chi hay gặp saponin steroid là Agave, Dioscorea, Yucca.

• Sap steroid alkaloid: thường gặp / chi Solanum (họ Solanaceae). Hai nhóm saponin được khai thác thương mại nhiều nhất là từ cây Yucca schidigera và Quillaja saponaria (đều thuộc Châu Mỹ). 97

Phần I. Đại cương về Saponin 5. Phân bố saponin Saponin thường chứa trong các không bào và có thể tìm thấy trong các bộ phận của cây - Rễ: Nhân sâm, Tam thất…(cũng có trong lá)

- Thân: Ngũ gia bì chân chim - Lá: rau má - Quả: bồ hòn, bồ kết

- Hạt: táo Hàm lượng saponin trong dược liệu thường rất cao, có thể từ 5-20% (sâm), 10% (bồ kết), 8-10% (cam thảo)

98

Phần I. Đại cương về Saponin 5. Phân bố saponin Tính đến 2013, đã phân lập được > 20.000 triterpen ở

dạng sapogenin hoặc saponosid (Q. Michaudel, 2013).

99

Phần I. Đại cương về Saponin 6. Chiết xuất saponin Chiết xuất saponin thô: Dung môi: ▪ Chiết xuất dược liệu với MeOH, EtOH, nước hoặc hỗn hợp MeOH-H2O, EtOH-H2O. ▪ Loại tạp béo, kém phân cực thông thường bằng petroleum ether, quá trình này có thể được tiến hành trước hoặc sau khi chiết cao toàn phần. ▪ Dịch chiết sau khi loại tạp được hòa trong nước và chiết phân bố với n-BuOH bão hòa nước. ▪ Kết tủa saponin bằng diethyl ether hoặc aceton.

Phương pháp chiết: ▪ PP chiết thông dụng: ngâm, ngấm kiệt, chiết nóng ▪ PP hiện đại khác: chiết lỏng siêu tới hạn, vi sóng, PLE, SPE…. 100

Phần I. Đại cương về Saponin 6. Chiết xuất saponin Sap. / Dược liệu a. Chiết bằng ROH.H2O

b. Cô thu hồi ROH

(Sap. + tạp) / H2O

1

2

3

4

Kết tủa / dmhcơ

Kết tủa / acid

Lắc với n-BuOH.H2O

SKC / Diaion HP-20

Saponin có % lớn

Saponin acid

Saponin “ít ose”

Sap + tạp phân cực

(Bồ kết…)

(Cam thảo...)

(Nhân sâm…)

(rất nhiều…)

101

• Các saponin có hàm lượng cao (Bồ hòn, Bồ kết, Cam thảo…) → Kết tủa trong n6, EP, Et2O, Cf, DCM, aceton • Các saponin có tính acid (Glycyrrhizin, Glycuronid…) → Kết tủa trong dung dịch acid loãng (HCl…)

• Các saponin có ít ose (1-2 mạch x 1-2 ose; như ginsenosid) → Lắc với “n-BuOH b. hòa nước” hay “i-ProOH b. hòa nước” • Các saponin có MW khác nhau rõ rệt (và MW < 4000). → Dùng SKC rây phân tử (Sephadex G hay LH-20.) • Các sapogenin & saponosid có độ phân cực khác nhau → SKC phân bố với Si gel RP-8 hay RP-18. → SKC phân bố với Diaion HP-20 (Mitsubishi). 102

1 Bột quả Bồ kết Đun hồi lưu

với cồn 96%

Dịch chiết cồn 96% Cô thu hồi cồn đến cắn khô

Hòa tan trong MeOH (min)

Dịch MeOH đậm đặc Rót dịch MeOH vào Et2O

(hoặc aceton). Khuấy đều

Kết tủa màu nâu đen

103

2

Bột rễ Cam thảo (1 kg) Ngấm kiệt nguội

với cồn 70%

Dịch chiết cồn (V ~ 6 lít) Cô thu hồi cồn, còn 1 lít

Pha loãng với 5 lít nước

Dịch chiết loãng (6 lít) Rót HCl 10% vào đến pH 2

Khuấy mạnh trong 5 phút

Kết tủa dẻo, màu nâu đỏ (rất giàu Glycyrrhizin) 104

3 Mẫu / H2O được lắc với “n-BuOH bão hòa nước”.

(ko phải n-BuOH nguyên chất, neat)

Lớp n-BuOH

(1-2 mạch) x (1-2 ose) • các saponin “ít” ose • các glycosid “ít” ose • các saponin “nhiều” ose

Lớp nước

• các glycosid “nhiều” ose • các polysaccharid, tannin • đường tự do, muối…

Đôi khi thay “n-BuOH bão hòa nước” bằng “isopropanol bão hòa nước” 105

Bột Tam thất (TT) 1

CHCl3 (hồi lưu > 2 h)

(bỏ dịch CHCl3)

Bột TT đã loại tạp kpc 2

MeOH 70% (hồi lưu)

(x 3 lần; lọc bông)

Dịch chiết MeOH 3

cô thu hồi MeOH Lắc 3 lần

rồi thêm nước. với n-BuOH bh nước

Lớp n-BuOH (trên) 4

cô quay đến khô,

hòa trong MeOH

Saponin Σ / MeOH 106

Để chấm sắc ký

4 Mẫu / H2O được nạp lên cột chứa Diaion HP-20. Khai triển bằng (H2O – MeOH) với MeOH % tăng dần: độ phân cực giảm dần (chất phân cực nhất sẽ ra đầu tiên)

1

2

3

4

5

6

7

8

Muối vô cơ, đường.

Các glycosid

Các glycosid

Các hợp chất

Polysaccharid, Tannin

phân cực mạnh

ph. cực trung bình

phân cực kém

107

Các saponosid

108

Phần I. Đại cương về Saponin 7. Phân lập saponin A. Nguyên tắc chung • Phân lập (isolation) là kỹ thuật tách riêng từng hợp chất tinh khiết ra khỏi 1 hỗn hợp phức tạp bằng nhiều cách khác nhau.

• Độ tinh khiết của các sản phẩm này phải cao (ví dụ, có thể đem đo phổ NMR để xác định cấu trúc được). Muốn vậy, cần phải trả lời được các vấn đề sau • Tên chính xác (khoa học) của mẫu nghiên cứu. • Thành phần hóa học (sơ bộ) của mẫu nghiên cứu. • Đối tượng nghiên cứu cụ thể: cấu trúc chung, độ bền, tính tan… - Glycosid: số & độ dài mạch ose. Glycosid hay glycuronid - Aglycon: độ phân cực tương đối.

109

Phần I. Đại cương về Saponin 7. Phân lập saponin B. Trình tự tiến hành (đề nghị) B1. Chiết xuất (→ cao chứa hầu hết các thành phần chính) • Chọn quy cách dược liệu (cỡ bột thô, vừa, mịn…) • Chọn dung môi chiết - cho glycosid: MeOH-nước hay EtOH-nước (25; 50; 70%...) - cho genin: cồn cao độ

- cho các cấu trúc có tính acid: dùng [cồn + kiềm]… • Chọn kỹ thuật chiết (ngấm kiệt ngược dòng, đun hồi lưu…) • Chọn nhiệt độ chiết (thường, nóng)

• Cách kiểm tra việc chiết được, hoặc chiết đã xong. 110

• Cách cô dịch chiết (thường, cách thủy, giảm áp…)

Phần I. Đại cương về Saponin 7. Phân lập saponin B2. Loại tạp, làm giàu dịch chiết (→ cao Σ chứa ít tạp hơn) Xác định nhóm tạp (tinh bột, diệp lục, chất béo, polyphenol…)

• Chọn cách loại bỏ tạp - tinh bột: chọn d. môi chiết chứa ít nước; để lắng lạnh. - diệp lục, sắc tố: nước lạnh, than hoạt, chì acetat. - chất béo & kém ph.cực: lắc phân bố với các dmhc kém ph.cực. - polyphenol (tannin…): chì acetat*, Celite, cột Silica gel, … • Chọn dung môi chiết “chuyên biệt” (lắc phân bố với dd. nước) - với ginsenosid (et als): chiết với “n-BuOH bão hòa nước” - với sapogenin: chiết với CHCl3, EtOAc, “EtOAc bão hòa nước”

• Kiểm tra hiệu quả loại tạp (SKLM cao trước & sau khi loại tạp).

111

Phần I. Đại cương về Saponin 7. Phân lập saponin B3. Phân lập Chọn cách phân lập sơ bộ (→ các phân đoạn đơn giản hơn) - VLC với Silica gel NP, SKC với Diaion HP-20… - Cách theo dõi thành phần các ph. đoạn (hệ SKLM & th’ thử…) • Chọn cách phân lập chính - qui mô nhỏ (< hàng chục mg): p-TLC, p-HPLC - qui mô lớn hơn: SKC (h’. phụ, ph. bố, rây ph. tử…), p-HPLC…

- cách theo dõi quá trình phân lập (hệ SKLM với th’ thử…) • Chọn cách tinh chế sản phẩm - Kết tinh phân đoạn, kết tinh lại hay tinh chế qua SPE, cột mini…

- Tinh chế bằng các kỹ thuật khác 112

• Kiểm tinh khiết: SKLM, HPLC, so sánh dữ liệu phổ UV, IR…

7b4. Dùng bột hấp phụ Khi các saponin bị lẫn nhiều tạp phân cực (nhất là tannin) thì có thể tinh chế saponin theo cách sau • Hòa tan mẫu [sap + tannin] vào 1 lượng tối thiểu* nước nóng. • Tẩm dịch nước đậm đặc này vào 1 lượng vừa đủ* bột hấp phụ (bột Kieselgur = Celite; bột polyamid hay bột Mg oxyt).

• Chiết saponin ra khỏi matrix này bằng EtOH 70-80% nóng. Lọc dịch chiết rồi cô thu hồi cồn thu cắn saponin (sạch hơn).

• Do phân cực hơn saponin nên tannin không bị giải hấp ra khỏi matrix này bởi EtOH 70-90% nóng.

113

7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký A. Dùng cột hấp phụ (ví dụ VLC qua Si-gel NP) Thường dùng cột VLC (d lớn, h < 20 cm) Pha tĩnh: Si-gel NP (cỡ hạt vừa = 40-63 hoặc thô = 63-200 μm) Mẫu thử: Dạng bột khô / Si-gel, P mẫu # 1/10 P Si-gel.

Hệ dung môi sử dụng: có độ phân cực tăng dần ***. Thể tích mỗi phân đoạn: nhiều [V (ml) # P Si-gel (gam)] Các phân đoạn đầu sẽ chứa các tạp kém phân cực (bỏ). Các phân đoạn giữa sẽ chứa các sapogenin rồi saponosid (thu). Các phân đoạn cuối (hoặc phần bị giữ lại trong cột) sẽ chứa các

tạp rất phân cực (tannin, polysaccharid, muối, đường tự do…). Kiểm tra vết: SKLM / UV 254 và th’ thử AS, VS hay H2SO4 10%. 114

7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký B. Dùng cột rây phân tử (Sephadex LH-20* hoặc G-25). Dùng để loại bỏ các tạp chất có MW khác xa* MW của sap. Thường dùng cột có d hẹp (1-3-5 cm); h dài (~ 100 cm) Pha tĩnh: Sephadex LH-20* (dạng hỗn dịch / MeOH).

Mẫu thử được hòa trong MeOH (V mẫu # 1/20 V Sephadex). Khai triển với MeOH* (thông dụng nhất) hay (H2O + MeOH). Các hợp chất có MW lớn hơn sẽ ra trước, MW nhỏ hơn sẽ ra sau. Kiểm tra vết bằng SKLM / UV 254 và th’ thử VS, AS, H2SO4 10%

Sephadex LH-20 rất đắt tiền (> 30 triệu VNĐ / 100 gam) 115

7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký C. Dùng cột phân bố đảo (Diaion HP-20*) Mục đích: Chọn phân đoạn (hỗn hợp) có độ ph. cực thích hợp. Thường dùng cột có d khá lớn (~ 5 cm), h tr. bình (50-60 cm). Pha tĩnh: Diaion HP-20* (Mitsubishi), hỗn dịch / nước or MeOH.

Mẫu thử: hòa tan (hay hỗn dịch) / nước hoặc MeOH-nước. Khai triển bằng [H2O – MeOH] (MeOH% tăng dần). Các hợp chất rất ph. cực (ose, muối, PS, tannin) sẽ ra trước. Các glycosid ph. cực → glycosid ít ph. cực → genin sẽ ra sau. Các hợp chất kém ph. cực sẽ ra sau cùng (hoặc bị giữ lại cột).

Kiểm tra vết: SKLM / UV 254 hay th’ thử AS, VS, H2SO4 10%. 116

7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký D. Dùng SKLM chế hóa (SK lớp dày / Silica gel NP) Lớp Si-gel có diện tích lớn; bề dày 1 – vài mm; Mẫu (chỉ vài chục mg) hòa / MeOH, chấm thành băng liên tục

Khai triển với hệ dung môi thích hợp* Phát hiện vết: UV 254*, đôi khi bằng th’ thử (chú ý kỹ thuật). Cạo các vết trên bản si-gel, chiết lại bằng MeOH (hay MeOH-Cf) Lọc loại bỏ phần Si-gel (không tan), thu dịch lọc hòa tan vết. Bay hơi dung môi, thu cắn/tủa…

117

Phần I. Đại cương về Saponin 8. Định tính saponin 8.1. Định tính tạo bọt (trong ống nghiệm) Xác định chỉ số bọt (CSB) 8.2. Định tính phá huyết (lam, thạch máu, ống nghiệm) Xác định chỉ số phá huyết.

8.3. Định tính tạo phức với cholesterol. 8.4. Định tính bằng các phản ứng màu trong ống nghiệm (Salkowski, Liebermann-Burchard) trên bản mỏng (thuốc thử AS, VS, VP hay H2SO4...) 8.5. Định tính bằng SKLM/HPLC

118

A. Nguyên tắc chung

• Vì protein, polysaccharid cũng có thể tạo bọt như saponin → chiết bằng cồn 70% (không chiết bằng nước, tránh pos. giả). • Vì cồn có thể phá bọt → cần loại bỏ cồn trong dịch thử nghiệm

(tránh neg. giả). B. Thực hiện (thống nhất theo 1 quy định chung, xem thực tập) • 0,5 g mẫu + 10 ml cồn 70%, đun cách thủy trong 5 phút.

• Lọc nóng qua bông, cô đến hết cồn (thu dịch nước). • Cho 0,5 ml dịch cô này vào 1 tube (size 16) có sẵn 10 ml nước. • Nút tube, lắc mạnh dọc tube (đúng 30 lần / đúng 60 giây).

• Đánh giá: bọt bền 15’ (+); bền 30’ (++); bền 60’ (+++). 119

(–)

120

(+)

(+)

(+)

Chỉ số bọt (CSB) là số ml nước để hòa tan saponin có trong 1 gam nguyên liệu (= độ pha loãng*), cho cột bọt cao 1 cm sau khi lắc *. Tiến hành thực nghiệm trong các điều kiện quy định.

• cỡ bột nguyên liệu: 0,5 mm.

• 10 tube (1.6 x 16) cm.

• + 100 ml nước sôi *

• chứa 1 → 10 ml dịch A.

• đun sôi nhẹ 1 lần = 30 phút.

• thêm nước vừa đủ 10 ml.

• Lọc nóng (giấy, bông), để nguội.

• Lắc dọc 15 sec = 30 lần *.

• + nước vừa đủ 100 ml (dịch A).

• Đo h (cm) cột bọt sau 15’.

121

n ml dịch A + nước vừa đủ 10 ml

(độ pha loãng = 1/C = 1000/n)

1‰

2‰

3‰

4‰

5‰

6‰

7‰

8‰

9‰

10‰

1000

500

333

250

200

167

143

125

111

100

122

cột bọt ở ống số 4 = 0,8 cm cột bọt ở ống số 5 = 1,3 cm

cột bọt ở ống số 4,4 = 1,0 cm

Trên lý thuyết: Thực hiện lại 10 ống từ 4.1 đến 5.0. Thực tế: Nội suy.

·

1.3 cm 1.0 cm

0.8 cm

· 0.5 cm

ống số 4.0 123

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

A. Nguyên tắc chung • Khi mẫu thử không có tính phá huyết hoàn toàn thì trong dung dịch đẳng trương, vẫn còn (một số) hồng cầu ở nguyên trạng,

và sẽ lắng xuống đáy tube (cặn màu đỏ) sau 1 thời gian nhất định.

• Khi mẫu thử có tính phá huyết hoàn toàn, tất cả hồng cầu bị

phá hủy màng, hemoglobin thoát ra và nhuộm hồng dung dịch đẳng trương (không có hồng cầu lắng xuống đáy tube). 124

A. Nguyên tắc chung (tt) • Để tránh nhầm lẫn khi nhận định kết quả (do fibrin lắng xuống đáy tube), máu thử nghiệm cần phải loại bỏ hết fibrin. • Môi trường thử nghiệm phải là môi trường đẳng trương (thường dùng dung dịch muối sinh lý trong suốt thử nghiệm). • Máu thử nghiệm được quy định tùy tài liệu, nhưng nên chọn máu động vật mà màng hồng cầu dễ bị phá hủy (nhạy).

Thường chọn máu cừu, đôi khi của thỏ, bò & động vật có sừng. Sau khi loại bỏ fibrin, pha máu thành dịch treo 2%, bảo quản mát. (có thể thêm chất chống đông…) 125

B. Các kỹ thuật chung Có thể thử nghiệm tính phá huyết bằng cách quan sát

- Quá trình phá huyết trên lame (qua kính hiển vi). - Sự khuếch tán hemoglobin + hồng cầu lắng đọng (tube) - Vòng phá huyết trên dĩa thạch máu (pétri). Căn cứ vào đường kính vòng phá huyết (dĩa thạch máu); hoặc nồng độ tối thiểu của dịch thử gây nên sự phá huyết hoàn toàn* (/ tube) → khái niệm định lượng về tính phá huyết của (saponin trong) dịch thử nghiệm.

* ống phá huyết “đầu tiên và hoàn toàn” 126

C. Tiến hành (xem phần thực hành, lưu ý sự khác biệt) • Chỉ số bọt (CSB)

Là độ pha loãng cần thiết của 1 gam dược liệu để tạo được một lớp bọt cao 1 cm sau khi ngưng lắc 15 phút, tiến hành trong điều kiện quy định. • Chỉ số phá huyết (CSPH) Là số mililit dung dịch đệm cần thiết để hòa tan các saponin có trong 1 gam dược liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một loại máu đã chọn, tiến hành trong điều kiện quy định. CSB:

dịch thử + dung môi.

CSPH: dịch thử + dung môi + dịch máu 127

sau n. giờ

các vòng phá huyết (d, dd. thử 1 dd. thử 2 dd. chứng

không phá huyết hoàn toàn

phá huyết hoàn toàn

khác “phá huyết không hoàn toàn”

dung dịch trong veo!

128

(thực hiện trong dãy ống nghiệm nhỏ) [C] thấp nhất

→ [C] tăng dần →

→ [C] tăng dần → →

(3 ống phá huyết) còn hồng cầu lắng đọng

ống phá huyết đầu tiên và hoàn toàn

[C] thấp nhất / các ống phá huyết 129

• Phản ứng Salkowski (1872) • Phản ứng Liebermann-Burchard (1889) *** • Phản ứng Carr-Price (1926); Rosenthaler (1905) • Với các thuốc thử (trên SKLM) *

130

Mẫu/CHCl3 + vài giọt H2SO4 đđ.

nâu đỏ, tím, tím sậm

Ban đầu, phản ứng này chỉ dùng để định tính cholesterol. Với saponin nói chung, màu của sản phẩm phản ứng thì không thực sự rõ ràng (ngay cả khi thực hiện với kỹ thuật dùng nhiều acid, nhỏ dọc thành tube… và ngay cả khi thực hiện trên mẫu là cholesterol tinh khiết).

Hiện nay, phản ứng Liebermann-Burchard (L-B) thì thông dụng và hữu hiệu hơn (xem phần sau). 131

Ban đầu, cũng chỉ dùng để định tính cholesterol (Є steroid) • Phản ứng Liebermann (1885, chưa dùng CHCl3): (Steroid / Ac2O) + H2SO4 đđ → màu xanh / đỏ. • Phản ứng L-B (1889; dùng CHCl3 + Ac2O): (Steroid / CHCl3.Ac2O) + H2SO4 đđ → dd. màu xanh. Ac2O dùng để làm khan môi trường và để pha loãng H2SO4. Có thể thay Ac2O bằng AcOH glacial, EtOAc, hay BuOH (khan).

Cơ chế phản ứng: có nhiều đề nghị, nhưng chưa rõ ràng (2007). Kỹ thuật thực hiện: dùng ít/nhiều H2SO4; xem slides phía sau. 132

# 1 ml H2SO4 đđ (pipet thẳng đứng!)

ng nghiệm nghiêng

Lớp dd. mẫu, có màu (xanh lá, đỏ nâu, đỏ…)

vòng nhẫn mỏng, màu sậm (hồng tím, tím, tím than…)

Lớp acid (d ~ 1,84) ko màu; cao > 1 cm

• Hệ thống phải thật khô. Khi thực hiện: cấm cầm trên tay.

• Cho dư Ac2O + Lắc kỹ. Nhỏ acid trôi xuôi theo thành tube. • Rất chú ý khi rửa ống nghiệm này (Coi chừng phỏng mắt)!

133

Một nhận định tham khảo Các phản ứng Salkowski và L-B được nghiên cứu khá nhiều. Theo Schoenheimer & Sperry (1934); Brieskorn & Capuano (1953): Cơ chế của các phản ứng này thì như nhau. Màu của sản phẩm sẽ thay đổi theo tỉ lệ k = [H2SO4 / Ac2O]

• Khi k lớn (ít Ac2O) → red-purple color (phản ứng Salkowski). • Khi k bé (nhiều Ac2O) → a green color (phản ứng L-B). Ac2O có vai trò làm khan môi trường, pha loãng H2SO4 và có thể thay thế bằng các dung môi khan khác như AcOH, EtOAc, n-BuOH.

134

• Khi các phương pháp phổ (NMR…) còn sơ khai, thì các phản ứng màu của saponin (và HCTN) còn có nhiều ứng dụng trong định tính, định danh tuy tính chuyên biệt không thực sự thuyết phục. • Hiện nay, các phản ứng màu của saponin (& HCTN) chỉ có vai trò khiêm tốn trong việc nhận định & phân biệt sơ bộ mà thôi. • Để định tính, định danh mẫu; hiện nay, các ph. pháp phân tích dụng cụ (HPLC-RI, LC-ELSD, LC-MS…) cùng các ph. pháp phổ học (MS, NMR) được ứng dụng nhiều với sự chính xác rất cao.

135

8.4a. SKLM (TLC) và SKLM hiệu năng cao (HP-TLC) Rất thường được sử dụng nhằm nhiều mục đích • So sánh các mẫu đa thành phần (dược liệu thử // dl chuẩn…). • So sánh các hợp chất tinh khiết riêng biệt (đồng nhất Y/N) • Xác định sự có mặt Y/N của 1 chất trong 1 hỗn hợp. • Theo dõi quá trình phản ứng (tổng hợp, thủy phân,…)

• Theo dõi quá trình khai triển SKC • Sơ bộ kiểm tinh khiết. Có thể bán định lượng. • Định danh nhóm của từng vết (nhở th’ thử chuyên biệt…) • Thử nghiệm sinh học (sàng lọc ngay trên vết của sắc ký đồ) 136

8.4.a Sắc ký lớp mỏng saponin Saponin (genin + glycosid) là nhóm hợp chất rất lớn & đa dạng.

SKLM saponin là 1 nghệ thuật. Cần chú ý các điểm sau: • Bản mỏng: thông dụng nhất là silica gel F 254 pha thuận (NP). • Mẫu thử: càng sạch càng tốt; hòa trong [CHCl3 – MeOH; x : y]. nên chấm thành vạch dài 6-10 mm (phân giải tốt hơn điểm). • Dung môi: cùng “tính chất” với đối tượng nghiên cứu - sapogenin dùng d. môi kém ph. cực hơn saponosid. - mẫu có tính acid: d. môi nên có acid (AcOH, TFA, ForOH)

• Phát hiện vết: UV 254 và/hay thuốc thử AS, VS, VP, H2SO4 10%. • Để có sắc đồ đẹp: tham khảo tài liệu với keywords tương ứng (Ginsenosid, Gypenosid, Cardenolid, Madecassoid, Glinus, …)

• Kỹ thuật cụ thể: Tham khảo và ghi chú trong phần thực tập. 137

Phần I. Đại cương về Saponin 8.4.a. Sắc ký lớp mỏng saponin Chú ý kỹ thuật thực hiện

Ghi chú, mục đích

1. Chấm mẫu thành băng # 6 -10 mm

Tăng khả năng phân giải của bản mỏng

2. Để thật khô dung môi hòa mẫu

Tránh làm Rf bị thay đổi do dm còn sót

3. Khai triển bản mỏng

Tránh di chuyển khi đang khai triển

4. Để thật khô dung môi sắc ký

Tránh thuốc thử loang lổ không đều

5. Nhúng thuốc thử (VS, AS…)

Nhúng nhanh, tránh làm loang vết

6. Để thật khô dung môi của thuốc thử

Tránh làm rộp bản mỏng khi sấy nóng

7. Sấy nhẹ kỹ, rồi mới sấy nóng vừa đủ

Tránh làm sậm màu nền bản mỏng

138

Tham khảo kỹ thuật chấm mẫu thử thành băng 1 cm.

139

Mẫu thử: dịch chiết MeOH của các mẫu Panax Bản Si gel F 254 (Merck). Hiện màu vết = thuốc thử VS.

Tham khảo kỹ thuật chấm mẫu thử thành băng 1 cm.

Mẫu thử: dịch chiết MeOH của các mẫu Panax 140

Bản Si gel F 254 (Merck). Hiện màu vết = thuốc thử VS.

P-F11 G-Rf

P. vietnamensis

P. ginseng

P. notoginseng P. quinquefolius

G-Rg1

M-R2 N-R1 + GG-Rd

G-Rb1

G-Rb2/G-Rb1