TP Phytopathologie PDF [PDF]

Zitiervorschau

TP n°1 : Préparation des milieux de cultures et des colorants d’observation microscopique des champignons Les champignons sont des végétaux sans chlorophylle. Le thalle, appareil végétatif, est souvent constitué de très fins filaments ramifiés (hyphes). L'ensemble de ces hyphes forme le mycélium. Il est parfois suffisamment dense pour se voir c'est le "blanc de champignon" en fait du blanc au brun presque noir. Chez les Myxomycètes (les plus inférieurs) le thalle est amiboïde c'est à dire qu'il peut se déplacer. Du fait qu'ils n'ont pas de chlorophylle les champignons sont obligés de se procurer le carbone dont ils ont besoin dans des substances organiques mortes (saprophytes) ou vivantes (parasites). Seules les formes parasitaires nous intéressent ici. Il existe aussi des champignons symbiotiques qui forment des lichens avec des algues et des mycorhizes avec des plantes supérieures. Les maladies cryptogamiques (à champignon) sont visibles par les réactions et transformations de la plantes mais on ne voit pas le champignon lui-même sauf au microscope ou s'il fructifie à l'extérieur des organes atteints. 1-Les milieux de cultures : La préparation des milieux de culture varie à l’infini. On peut diviser ces milieux en deux catégories : *Les milieux dits complexes : sans composition bien définie (PDA, MEA, YSA, MYEA, SGA…). *Les milieux synthétiques de composition déterminée (CDA…)
PDA (Potatoes Dextrose Agar) -

Pomme de terre

200 g

-

Eau distillée

700 ml

Laver, couper en morceaux les pommes de terre, les faire cuir, ensuite filtrer et ajouter les ingrédients suivants : -

Succrose

20 g

-

Agar

15 g

Puis ajuster la quantité d’eau à 1000 ml par l’eau distillée. Autoclaver pendant 20 min à 120°C et conserver pour l’emploi ultérieurement.

* PDAa (Potatoes Dextrose Agar acidifié): Au moment d’ensemencement on ajoute à 200 ml de PDA, 1,5 ml d’acide lactique (25%) afin d’inhiber la croissance des Bactéries en acidifiant le milieu. On peut remplacer l’acide lactique par des antibiotiques, ou par Rose Bengal.
AGW (Agar Water) : -

Agar

15 g

-

Eau distillée

1000 ml

Autoclaver pendant 20 min à 120°C et conserver pour l’emploi ultérieurement.
SGA (Soil Glucose Agar) -

Sol

500 g

-

Eau ditillée

1000 ml

Bouillir 30 mn et filtration, filtrat + -

Glucose

10 g

-

Agar

15 g

Puis ajuster la quantité d’eau à 1000 ml par l’eau distillée. Autoclaver pendant 20 min à 120°C et conserver pour l’emploi ultérieurement. Nb : De préférence utilisée le sol du même nature du sol échantillons (sol étudié).
CDA (Czapek Dextrose Agar) -

NaNO3

3g

-

MgSO4

0,5 g

-

KH2PO4

1,5 g

-

FeSO4

0,05 g

-

KCl

0,5 g

-

Succrose

30 g

-

Agar

15 g

Puis ajuster la quantité d’eau à 1000 ml par l’eau distillée. Autoclaver pendant 20 min à 120°C

et conserver pour l’emploi ultérieurement.

2-Préparation des colorants : les colorants sont utilisés pour l’observation microscopique des champignons. Le colorant à posséder obligatoirement est le bleu coton. Ce colorant, on peut le trouver sous deux formes * Bleu coton au lactophenol : Utilisé pour les préparations conservées.

* Bleu lactique : Il permet de visualiser la structure mycélienne des champignons, sans conserver la préparation. Composition du bleu lactique : Bleu de méthyle (=bleu coton)

0.1 g

Eau distillée

20 ml

Acide lactique

20ml

TP n°2 : Isolement des Champignons Phytopathogène 1-Diagnostic des maladies dues aux champignons : Le postulat de Koch : Robert Koch énonça en 1881 un postulat qui précise les étapes successives auxquelles il doit être satisfait pour pouvoir établir une relation causale entre une maladie et un microorganisme. Bien que ce postulat ait été formulé pour des maladies des végétaux causées par des parasites cultivables in vitro. L’application stricte du postulat sera réservée aux cas complexes. Les étapes du postulat de Koch appliqué à la physiopathologie s’énoncent comme suit : 1- L’agent doit être présent chez les plantes malades et absent chez les plantes saines ; 2- L’agent doit pouvoir être isolé de plantes malades et multiplié en culture axénique ; 3- Lorsque l’agent en culture pure est inoculé à une plante saine, il doit induire les symptômes caractéristiques de la maladie ; 4- On doit pouvoir réisoler l’agent initial à partir des plantes infectées expérimentalement 2- Examen direct : Prendre un échantillon (Feuille, Tige, Fruit, Racine et Sol), vous observez à l’aide d’une loupe binoculaire et vous notez toute changement d’aspect entre les échantillons malades et sains. 3- Isolement : a- Ensemencement : Prendre un échantillon (Feuille, Tige, Fruit ou Racine) d’une plante malade et sain, vous les lavez fréquemment avec d’eau distillée stérile deux fois, ensuite vous les désinfectez par de l’alcool à 70%, vous les laissez deux minute, puis vous les rincez avec d’eaux distillée stérile et les séchez avec papier buvard stérile, ensuite vous les coupez en morceaux avec une lame ou un couteau stérile. Vous déposer les morceaux des échantillons (Feuille, Tige et Fruit) dans des boites de Pétri contenant trois rondelles de papier Buvard Stérile et humidifié par l’eau distillée stérile. Vous incubez ensuite les boites à 22°C. Concernant les morceaux de racine vous les déposez sur milieu d’Agar. Vous les incubez à 28°C.

Après trois jours d’incubation vous coulez les milieux de culture (PDAac et CDA) dans des boites de Petri ensuite, après solidification de ces milieux, vous transférez les morceaux des (Feuilles, Tiges, Fruits et Racine). Vous incubez les boites pendant 3 à 5 jours en 28° C. Concernant le sol, récupérez-le sol adhérent aux racines, Séchez-le à 30° C dans des fonds de boite de Petri et Broyez le dans un mortier stérile. Dispersez une quantité de terre (5 à 15 mg) dans des boites de Petri stériles, ensuite ajoutez 1 à 2 gouttes d’eau distillée stérile, par la suite vous coulez les milieux de culture (PDAac, CDA et SGA). Vous agitez les boites de Petri doucement avant solidification et incubez-les à 28° C pendant 5 Jours.

TP n°3 : Purification et Identification des champignons phytopathogène b- Purification : Après incubation, vous observez le développement des champignons de différentes couleurs. Vous prélevez avec une anse de platine stérile quelques spores ou mycélium, et vous les repiquez sur un milieu de culture (PDAac) coulé en boite de Petri. L’incubation se fait à 28° C pendant 5 jours. c- Identification : L’identification est une étude corrélative entre les caractères macroscopiques et microscopiques des champignons. •

Les caractères macroscopiques : Avant purification, vous notez les types de champignons, leur nombre, texture et couleur du thalle, couleur du revers de la boite de Petri, présence d’un pigment diffusible et odeur.

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Les caractères microscopiques : Ils sont observés grâce à la méthode de microculture. Vous coulez des boites de Petri avec PDAac, après solidification du milieu, vous coupez le milieu en petit carré avec un couteau stérile, ensuite vous transférez chaque carré tout seul sur une lame stérile, vous ensemencez chaque type de champignons seul sur un carré en déposant les spores sur les limites périphériques du milieu. Ensuite vous déposez des lamelles stériles sur le milieu à l’aide d’une pince stérile. Vous conditionnez l’ensemble dans une chambre stérile et humide puis incubé à 28° C pendant 3 jours.

TP n°4 : Observation Microscopique Identification microscopique : * La microculture : Après incubation vous transférez les lamelles sur d’autres lames stériles contenant quelques gouttes du bleu coton. * La méthode de scotch : vous écrasez un morceau de scotch sur une colonie fongique pure et ensuite vous le transférez sur une lame stérile contenant quelques gouttes du bleu coton * Observation microscopique : Vous observez au microscope grossissement × 10, × 40 et × 100. Vous comparez les observations par celles décrites par Barnett (1972).