Stanica v. Izd [PDF]

Zitiervorschau

UDŽBENICI SVEUČILIŠTA U OSIJEKU, RIJECI, SPLITU I ZAGREBU

STANICA Molekularni pristup   Peto izdanje

MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB BIBLIOTEKA SVEUČILIŠNI UDŽBENICI GEOFFREY M. COOPER i ROBERT E. HAUSMAN / STANICA – Molekularni pristup

Napisali: GEOFFREY M. COOPER ROBERT E. HAUSMAN Stručni urednik hrvatskoga izdanja: prof. dr. sc. GORDAN LAUC

Recenzenti: aka­dem­ki­nja SIBILA JELASKA, Sveu­či­lište u Zag­re­bu aka­de­mik STJEPAN GAMULIN, Sveu­či­li­šte u Zag­re­bu prof. dr. sc. DRAŠKO ŠERMAN, Sveu­či­li­šte u Zag­re­bu prof. dr. sc. MAJA PAVELA­-VRANČIĆ, Sveu­či­li­šte u Spli­tu prof. dr. sc. VERA CESAR, Sveu­či­li­šte J. J. Stros­smaye­ra u Osi­je­ku

CIP zapis dostupan u računalnom katalogu Nacionalne i sveučilišne knjižnice u Zagrebu pod brojem 745010 ISBN 978-953-176-493-3

Korištenje naziva sveučilišni udžbenik odobreno je: Odlukom Senata Sveučilišta J. J. Strossmayera u Osijeku pod brojem 12/04. Klasa: 612-10/04-01/12, ur. br. 2158-60-01/05-02 na sjednici održanoj 19. srpnja 2004. godine, Odlukom Senata Sveučilišta u Rijeci pod brojem: Klasa: 602-09/04-01/13, ur. br. 2170-57-05-04-2 na sjednici održanoj 16. rujna 2004. godine, Odlukom Senata Sveučilišta u Splitu po brojem 01-12/6-6-2004. na sjednici održanoj 19. srpnja 2004. godine (Manualia universitatis studiorum Spalatensis), te Odlukom Senata Sveučilišta u Zagrebu br. 02-3420/3/2003. na sjednici održanoj 12. listopada 2004. godine odobreno je korištenje naziva sveučilišni udžbenik (Manualia universitatis studiorum Zagrabiensis). © Sva prava za hrvatsko izdanje: Medicinska naklada, Zagreb

STANICA

Molekularni pristup Peto izdanje

GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN Boston University GORDAN LAUC

stručni urednik hrvatskoga izdanja

MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB 2010.

Naslovnica

Na slici naslovnice prikazani su receptori na površini stanice, formacija klatrinom obložene jažice, struktura citoskeleta, ribosomi i ostale citoplaz­ matske komponente. Šifra koja identificira pojedine molekule dostupna je na mrežnoj stanici ovog udžbenika: www.sinauer.com/cooper5e

Umjetnik

David S. Goodsell je izvanredni profesor Molekularne biologije na Istra­ži­ vačkom Institutu Scripps (The Scripps Research Institute). Knjige koje je ovaj autor ilustrirao, The machinery of life i Our molecular nature, istražuju biološke molekule i njihove raznolike uloge unutar živih stanica. Njegova nova knjiga Bionanotechnology: Lessons from nature predstavlja poveznicu između biologije i nanotehnologije. Više informacija možete naći na http:// mgl.scripps.edu/people/goodsell

Naslov izvornika: The Cell: A Molecular Approach, Fifth Edition Copyright 2009 by Geoffrey M. Cooper, All rights reserved. This book may not be reproduced in wgole or in part eithout permission.

ASM PRESS

Washington, D. C.

SINAUER ASSOCIATES, INC. Sunderland, Massachusetts

Address editorial correspondence tp ASM Press, c/o The American Society for Microbiology, 1752 N Street NW, Washington, DC, 20036 U.S.A. Address orders and requestes for examination copies to: Sinauer Associates, Inc. P.O. Box 407, 23 Plumtree Road Sunderland, MA 01375 U.S.A. Phone: 413-549-4300 FAX: 413-549-1118 email: [email protected] www.sinauer.com Library of Congress Cataloging-in-Publication Data Cooper, Geoffrey M.   The cell : a molecular approach / Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman.— 5th ed.      p. ; cm. Includes bibliographical references and index. ISBN 978-0-87983-300-6 1. Cytology. 2. Molecular biology. I. Hausman, Robert E., 1947-II. Title. [DNLM: 1. Cells. 2. Cytology. 3. Molecular Biology. QU 300 C776e 2009] QH581.2.C66 2009 571.6—dc22 2003008953 Printed in U.S.A. 5  4  3  2  1

Prevoditelji Stručni urednik

10. poglavlje

Prof. dr. sc. Gordan Lauc

Prof. dr. sc. Floriana Bulić-Jakuš, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

1. poglavlje Prof. dr. sc. Vlatka Zoldoš, Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu Prof. dr. sc. Lukrecija Brečević, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

2. poglavlje Prof. dr. sc. Mirna Flögel, Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

3. poglavlje Prof. dr. sc. Mirna Flögel, Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

4. poglavlje Prof. dr. sc. Gordan Lauc, Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu Prof. dr. sc. Vlatka Zoldoš, Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu

5. poglavlje Prof. dr. sc. Floriana Bulić-Jakuš, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

6. poglavlje Prof. dr. sc. Dragan Primorac, Medicinski fakultet Sveučilišta u Splitu

7. poglavlje Prof. dr. sc. Karmela Barišić, Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

8. poglavlje Prof. dr. sc. Jerka Dumić, Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

9. poglavlje Prof. dr. sc. Maja Vlahović, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

11. poglavlje Prof. dr. sc. Tatijana Zemunik, Medicinski fakultet Sveučilišta u Splitu

12. poglavlje Prof. dr. sc. Goran Šimić, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

13. poglavlje Prof. dr. sc. Marija Heffer-Lauc, Medicinski fakultet Sveučilišta J. J. Strossmayera u Osijeku

14. poglavlje Prof. dr. sc. Gordana Maravić Vlahoviček, Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

15. poglavlje Prof. dr. sc. Dora Višnjić, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

16. poglavlje Prof. dr. sc. Vlatka Zoldoš, Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu Prof dr. sc. Miljenko Kapović, Medicinski fakultet Sveučilišta u Rijeci

17. poglavlje Prof. dr. sc. Gordana Maravić Vlahoviček, Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

18. poglavlje Prof. dr. sc. Igor Aurer Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Pojmovnik Prof. dr. sc. Ana Marušić, Medicinski fakultet Sveučilišta u Splitu

Kratki sadržaj DIO I

Uvod  1

Poglavlje   1

Pregledno o stanicama i istraživanju stanica  3

Poglavlje   2

Stanični sastav  43

Poglavlje   3

Stanični metabolizam  73

Poglavlje   4

Osnove molekularne biologije  103

DIO II

Protok genetičkih informacija  153

Poglavlje   5

Organizacija i redoslijed staničnih genoma  155

Poglavlje   6

Replikacija, održavanje i preslagivanje genomske DNA  201

Poglavlje   7

Sinteza i doradba DNA  251

Poglavlje   8

Sinteza, doradba i regulacija proteina  309

DIO III

Struktura i funkcija stanice  353

Poglavlje   9

Jezgra  355

Poglavlje 10

Razvrstavanje i prijenos proteina   En­dop­laz­mat­ski re­ti­kul, Gol­gi­jev apa­rat i li­zo­so­mi  383

Poglavlje 11

Bioenergetika i metabolizam   Mi­to­hon­dri­ji, klo­rop­las­ti i pe­rok­si­so­mi  433

Poglavlje 12

Citoskelet i stanično kretanje  473

Poglavlje 13

Stanična membrana  529

Poglavlje 14

Stanične stijenke, izvanstanični matriks i međustanične reakcije  571

DIO IV

Stanična regulacija  601

Poglavlje 15

Stanično signaliziranje  603

Poglavlje 16

Stanični ciklus  653

Poglavlje 17

Stanična smrt i stanična obnova  693

Poglavlje 18

Rak  725

Sadržaj Predgovor  XV Predgovor hrvatskom izdanju  XVII Organizacija i obilježja Stanice   XIX

DIO I  UVOD

1

Preg­led­no o sta­ni­cama i is­traživa­nju sta­nica  3

Pod­ri­jet­lo i evo­lu­ci­ja stanica  4 Pr­va sta­ni­ca  4 Evo­lu­ci­ja me­ta­bo­liz­ma  6

Sažetak i ključni pojmovi  39 Pi­ta­nja  41 Li­te­ra­tu­ra  42

2

Stanični sas­tav  43

3

Stanični metabolizam  73

Središnja uloga enzima kao bioloških katalizatora  73 Katalitička aktivnost enzima  73 Mehanizmi enzimske katalize  74

Stanične mo­le­ku­le  43

Koenzimi  76

Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce  8

Ug­lji­ko­hid­ra­ti  44

Regulacija enzimske aktivnosti  79

Po­dri­jetlo eu­ka­rio­ta  9

Li­pi­di  46

Raz­voj višes­ta­ničnih or­ga­ni­za­ma  12

Nuk­lein­ske ki­se­li­ne  49

Da­našnji pro­ka­rio­ti  8

Sta­ni­ce kao eksperimentalni mo­de­li  16

Pro­tei­ni  52

Sta­nič­ne mem­bra­ne  58

Metabolička energija  81 Slobodna energija i ATP  81 Stvaranje ATP iz glukoze  84

Es­che­ric­hia co­li  16

Mem­bran­ski li­pi­di  58

Dobivanje energije iz drugih organskih molekula  89

Kvas­ci  17

Mem­bran­ski pro­tei­ni  60

Fotosinteza  89

Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns  18

Tran­spo­rt kroz sta­nič­ne membrane  63

Biosinteza staničnih sastojaka  91

Dro­sop­hi­la me­la­no­gas­ter  18 Ara­bi­dop­sis tha­lia­na  19 Kra­lježnja­ci  19

Oruđa sta­nične bio­lo­gi­je  21 Svjet­los­na mik­ros­ko­pi­ja  21 Elek­tron­ska mik­ros­ko­pi­ja  28 Frak­cio­ni­ra­nje sta­ni­ce  30 Ra­st živo­tinj­skih sta­ni­ca u kul­tu­ri  33 Kul­tu­ra bilj­nih sta­ni­ca  36 Virusi  37 KLJUČNI POKUS

Kul­tu­ra animalnih sta­ni­ca  34

MOLEKULARNA MEDICINA Vi­ru­si i rak  37

Pro­teo­mi­ka: op­sež­na analiza sta­nič­nih pro­tei­na  64

Ugljikohidrati  92 Lipidi  93

Iden­ti­fi­ka­ci­ja sta­nič­nih pro­tei­na  65

Proteini  94

Sveo­buh­vat­na ana­li­za lo­ka­li­za­ci­je pro­tei­na  67

Nukleinske kiseline  96

Pro­tein­ske in­te­rak­ci­je  68 KLJUČNI POKUS

Smatanje polipeptidnih lanaca  54

KLJUČNI POKUS

Struktura staničnih membrana  60

Sažetak i ključni pojmovi  70 Pi­ta­nja  71 Iz­vor­na i do­dat­na li­te­ra­tu­ra  71

MOLEKULARNA MEDICINA Fenilketonurija  97

KLJUČNI POKUS

Antimetaboliti i kemoterapija  98

Sažetak i ključni pojmovi  99 Pitanja  100 Izvorna i dodatna literatura  101

SADRŽAJ 

4

Ge­nski kod  113

Os­no­ve mo­le­ku­lar­ne biologi­je  103

Nas­lje­đi­va­nje, ge­ni i DNA  103 Ge­ni i kro­mo­so­mi  104 Ge­ni i en­zi­mi  105 Mo­le­ku­la DNA no­si­telj je ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je  107

RNA-vi­ru­si i ob­r­nu­to prepisivanje  115

Re­kom­bi­nan­tna DNA  118 Res­trik­cij­ske en­do­nuk­lea­ze  118

Ge­ne­tič­ke ana­li­ze u kvas­ci­ma  136

Proiz­vod­nja re­kom­bi­nan­tnih molekula DNA  120

Pri­je­nos ge­na u bi­lja­ka i životinja  137

Vek­to­ri za re­kom­bi­nan­tnu DNA  121

Mu­ta­ge­ne­za klo­ni­ra­ne DNA  140

Sek­ven­ci­ra­nje DNA  124

Uno­še­nje mu­ta­ci­ja u sta­nič­ne gene  141

Ek­spre­si­ja klo­ni­ra­nih ge­na  124

Rep­li­ka­ci­ja DNA  109

De­tek­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na i pro­tei­na  127

Ko­li­near­no­st ge­na i pro­tei­na  111 Ulo­ga glas­nič­ke RNA  112

Pro­tu­ti­je­la kao son­de za proteine  133

Fun­kci­ja ge­na u eukariota  136

Struk­tu­ra DNA  108

Ek­spre­si­ja ge­ne­tič­ke informaci­je  110

   IX

Ome­ta­nje gen­ske ek­spre­si­je  143 KLJUČNI POKUS

Pretpostavka DNA provirusa  116

Um­no­ža­va­nje DNA lan­ča­nom reakcijom po­li­me­ra­ze  128

KLJUČNI POKUS

Hib­ri­di­za­ci­ja nuk­lein­skih kiselina  130

Sažetak i ključni pojmovi  149

RNA interferencija  146

Pi­ta­nja  150 Li­te­ra­tu­ra  150

DIO II  PROTOK GENETIČKIH INFORMACIJA

5

Or­ga­ni­za­ci­ja i re­dos­li­jed sta­nič­nih ge­no­ma  155

Slo­že­no­st eu­ka­riot­skih genoma  155

Re­dos­li­jed či­ta­vih genoma  176 Pro­ka­riot­ski ge­no­mi  177 Kvaš­čev ge­nom  178 Ge­no­mi Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns i vinske mu­ši­ce  180

In­tro­ni i eg­zo­ni  157

Bilj­ni ge­no­mi  182

Po­nav­lja­ju­ći (re­pe­ti­tiv­ni) slje­do­vi DNA  161

Ljud­ski ge­nom  184

Dup­li­ka­ci­ja ge­na i pseu­do­ge­ni  164 Sas­tav ge­no­ma vi­ših eu­ka­rio­ta  165

Kro­mo­so­mi i kro­ma­tin  166

Ge­no­mi os­ta­lih kra­ljež­nja­ka  188

Bioin­for­ma­ti­ka i sis­temna biolo­gi­ja  191

Kljućni pokus

Ljudski genom  186

Sažetak i ključni pojmovi  195 Pi­ta­nja  198 Li­te­ra­tu­ra  198

6

Rep­li­ka­ci­ja, od­r­ža­va­nje i pres­la­gi­va­nje ge­nom­ske DNA  201

Rep­li­ka­ci­ja DNA  201 DNA-po­li­me­ra­ze  202 Rep­li­ka­cij­ske raš­lje  203

Kro­ma­tin  166

Sis­te­ma­tič­ni pro­bi­ri gen­ske fun­kci­ je  191

Cen­tro­me­re  170

Re­gu­la­ci­ja gen­ske ek­spre­si­je  192

Is­ho­diš­te i ini­ci­ja­ci­ja rep­li­ka­ci­je  211

Te­lo­me­re  174

Va­ri­ja­ci­je me­đu po­je­din­ci­ma i genom­ska me­di­ci­na  194

Te­lo­me­re i te­lo­me­ra­ze: od­r­ža­va­nje kra­je­va kro­mo­so­ma  214

KLJUČNI POKUS

Otkriće introna  158

Vjer­no­st rep­li­ka­ci­je  210

X    SADRŽAJ

Pop­ra­vak DNA  216 Iz­rav­ni ob­rat oš­te­će­nja DNA  216 Pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem (ek­sci­zij­ski pop­ra­vak)  219 Tran­sle­zij­ska sin­te­za DNA  224 Pop­ra­vak dvo­lan­ča­nih lo­mo­va  226

Re­kom­bi­na­ci­ja iz­među homolognih slje­do­va ­DNA  227 Mo­de­li ho­mo­log­ne rekombinacije  228 En­zi­mi uk­lju­če­ni u ho­mo­log­nu rekom­bi­na­ci­ju  229

Pres­la­gi­va­nje DNA  233 Mjes­nospe­ci­fič­na rekombinacija (engl. si­te-spe­ci­fic recombination)  234 Tran­spo­zi­ci­ja pos­re­do­va­na DNA inter­me­di­ja­ri­ma  240 Tran­spo­zi­ci­ja pos­re­do­va­na RNA interme­di­ja­ri­ma  242 Am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na  245 Molekularna medicina

Kar­ci­nom de­be­log cri­je­va i pop­ra­vak DNA  225

Eu­ka­riot­ske RNA-polimeraze i opći tran­skrip­cij­ski faktori  258 Eu­ka­riot­ske RNA-po­li­me­ra­ze  259 Tran­skrip­cij­ski fak­to­ri i ini­ci­ja­ci­ja transkripcije po­mo­ću RNA-polimera­ze II  259 Tran­skrip­ci­ja po­li­me­ra­zom I i III  262

Re­gu­la­ci­ja tran­skrip­ci­je u euka­rio­ti­ma  265 ci­s-dje­lu­ju­ći re­gu­lacijski slje­do­vi: promo­to­ri i po­ja­či­va­či  265 Vez­na mjes­ta za tran­skrip­cij­ske faktore  269 Pro­tei­ni ko­ji re­gu­li­ra­ju transkripciju  270 Struk­tu­ra i fun­kci­ja tran­skrip­cij­skih ak­ti­va­to­ra  273

8

Sin­te­za, do­ra­dba i regulaci­ja proteina  309

Tran­sla­ci­ja mR­NA  309 Tran­spor­tne RNA  310 Ri­bo­som  311 Or­ga­ni­za­ci­ja mR­NA i ini­ci­ja­ci­ja transla­ci­je  317 Pro­ces tran­sla­ci­je  318 Re­gu­la­ci­ja tran­sla­ci­je  323

Sma­ta­nje i do­ra­dba proteina  329 Ša­pe­ro­ni i sma­ta­nje pro­tei­na  330 En­zi­mi ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju sma­ta­nje protei­na  332 Ki­da­nje pro­tei­na  333

Eu­ka­riot­ski rep­re­so­ri  276

Gli­ko­zi­la­ci­ja  335

Re­gu­la­ci­ja elon­ga­ci­je  278

Ve­za­nje li­pi­da  337

Po­ve­za­no­st kro­ma­tin­ske struk­tu­re i tran­skrip­ci­je  278

Re­gu­la­ci­ja fun­kci­je proteina  340

Re­gu­li­ra­nje tran­skrip­ci­je nekodirajućim RNA  285 Me­ti­li­ra­nje DNA  286

Re­gu­la­ci­ja ma­lim mo­le­ku­la­ma  340 Fos­fo­ri­la­ci­ja pro­tei­na  341 In­te­rak­ci­je pro­tei­n-pro­tein  343

Ključni pokus

Do­ra­dba i pro­met RNA  287

Sažetak i ključni pojmovi  247

Do­ra­dba ri­bo­som­skih i tran­spor­tnih RNA  288

Put ubik­vi­ti­n-pro­tea­som  345

Pitanja  249

Do­ra­dba mR­NA u eu­ka­rio­ti­ma  290

Li­zo­som­ska pro­teo­li­za  348

Li­te­ra­tu­ra  249

Me­ha­ni­zam prek­ra­ja­nja  293

Ključni pokus

Pres­la­gi­va­nje imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na  236

7

Sin­te­za i do­ra­dba DNA  251

Tran­skrip­ci­ja u prokariotima  251 RNA-po­li­me­ra­za i tran­skrip­ci­ja  252

Al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje  298 Ure­đi­va­nje RNA  300 Raz­grad­nja RNA  301 Ključni pokus

Izo­la­ci­ja eu­ka­riot­sko­ga tran­skrip­cij­skog fak­to­ra  272

Ključni pokus

Ot­kri­će snR­NP  294

Sažetak i ključni pojmovi  303

Rep­re­so­ri i ne­ga­tiv­na kon­tro­la transkrip­ci­je  256

Pitanja  305

Po­zi­tiv­na kon­tro­la tran­skrip­ci­je  258

Li­te­ra­tu­ra  306

Raz­grad­nja pro­tei­na  345

Katalitička uloga ribosomske RNA  316

Ključni pokus

Ot­kri­će pro­tei­n-ti­ro­zin-ki­na­za  344

Sažetak i ključni pojmovi  349 Pitanja  351 Literatura  351

SADRŽAJ 

   XI

DIO III  STRUKTURA I FUNKCIJA STANICE

9

Jez­gra  355

Jez­gri­na ovoj­ni­ca i promet između jez­gre i citoplazme  355

10

Razvr­stavanje i prije­nos proteina

En­dop­laz­mat­ski retikul, Golgijev apa­rat i lizosomi  383

Struk­tu­ra jez­gri­ne ovoj­ni­ce  356

En­dop­laz­mat­ski re­ti­kul  383

Kom­ple­ks jez­gri­ne po­re  360

En­dop­laz­mat­ski re­ti­kul i iz­lu­či­va­nje pro­tei­na  384

Se­lek­tiv­ni tran­spo­rt pro­tei­na u jez­gru i iz jez­gre  361 Re­gu­la­ci­ja ulas­ka pro­tei­na u jezgru  367 Tran­spo­rt mo­le­ku­la RNA  368

Unu­tar­nja or­ga­ni­za­ci­ja jezgre  369 Kro­mo­so­mi i struk­tu­ra kro­ma­ti­na na vi­šoj ra­zi­ni  370 Po­do­d­jelj­ci unu­tar jez­gre  372

Jez­gri­ca (nuc­leo­lus) i do­ra­dba rR­NA  374 Ge­ni za ri­bo­som­sku RNA i or­ga­ni­za­ci­ ja jez­gri­ce  375 Tran­skrip­ci­ja i do­ra­dba ri­bo­som­ske RNA  376 Sas­tav­lja­nje ri­bo­so­ma  378 Molekularna medicina Bolesti jezgrinih lamina  358

Ključni pokus

Iden­ti­fi­ka­ci­ja jez­gri­nih lo­ka­li­za­cij­skih signala  362

Sažetak i ključni pojmovi  379 Pi­ta­nja  381 Li­te­ra­tu­ra  381

Us­mje­ra­va­nje pro­tei­na u endoplazmat­ski re­ti­kul  386 Ugradnja pro­tei­na u mem­bra­nu ER  391

ključni pokus

Signalna hipoteza  388

Molekularna medicina Gaucherova bolest  425

Sažetak i ključni pojmovi  429 Pi­ta­nja  431 Li­te­ra­tu­ra  431

11

Bioe­ner­ge­ti­ka i metabolizam

Mi­to­hon­dri­ji, klo­rop­las­ti i perok­si­so­mi  433

Sma­ta­nje i do­ra­dba pro­tei­na u ER  396

Mi­to­hon­dri­ji  433

Kontrola kva­li­te­te u ER  398

Or­ga­ni­za­ci­ja i fun­kci­ja mitohondrija  434

Glat­ki ER i sin­te­za li­pi­da  402 Izlazak pro­tei­na i li­pi­da iz ER  405

Golgijev apa­rat  408 Or­ga­ni­za­ci­ja Gol­gi­je­va apa­ra­ta  408 Gli­ko­zi­la­ci­ja pro­tei­na u Gol­gi­je­vu apa­ra­tu  410 Me­ta­bo­li­zam li­pi­da i po­li­sa­ha­ri­da u Gol­gi­je­vu apa­ra­tu  412 Razvr­sta­va­nje i iz­voz pro­tei­na iz Golgi­je­va apa­ra­ta  413

Me­ha­ni­zam ve­zi­ku­lar­nog tran­spor­ta  416 Ek­spe­ri­men­tal­ni pris­tup razumijevanju vezi­ku­lar­no­ga transpor­ta  416 Odabir te­re­ta, ob­la­žu­ći pro­tei­ni i pupa­nje ve­zi­ku­la  418 Sta­pa­nje ve­zi­ku­la  420

Li­zo­so­mi  423

Genetički sus­tav mi­to­hon­dri­ja  435 Unos pro­tei­na i pos­ta­nak mitohondrija  437

Me­ha­ni­zam ok­si­da­tiv­ne fos­fo­ ri­la­ci­je  445 Tran­spor­tni la­nac elek­tro­na  445 Ke­mios­mo­ts­ko zdru­ži­va­nje  446 Tran­spo­rt me­ta­bo­li­ta kroz unu­tar­nju mem­bra­nu  451

Klo­rop­las­ti i os­ta­li plastidi  452 Struk­tu­ra i fun­kci­ja klo­rop­las­ta  452 Ge­nom klo­rop­las­ta  454 Unos i razvr­sta­va­nje pro­tei­na kloroplas­ta  455 Ostali plas­ti­di  457

Fo­to­sin­te­za  459

Li­zo­som­ske ki­se­le hid­ro­la­ze  424

Pro­tok elek­tro­na kroz fo­to­sus­ta­ve I i II  460

En­do­ci­to­za i nas­ta­nak li­zo­so­ma  426

Kružni tok elektrona  463

Fa­go­ci­to­za i au­to­fa­gi­ja  426

Sin­te­za ATP  463

XII    SADRŽAJ

Pe­rok­si­so­mi  464

Mik­ro­tu­bu­li  504

Funkcije pe­rok­si­so­ma  465

Struk­tu­ra i di­na­mič­ka or­ga­ni­za­ci­ja mik­ro­tu­bu­la  504

Nas­ta­ja­nje pe­rok­si­so­ma  467 Molekularna medicina

Bo­les­ti mi­to­hon­dri­ja: Le­be­ro­va nas­ljed­na op­tič­ka neu­ro­pa­ti­ja  438

Ključni pokus

Kemiosmotička teorija  448

Sažetak i ključni pojmovi  469 Pi­ta­nja  471 Li­te­ra­tu­ra  471

12

Ci­tos­ke­let i sta­nič­no kreta­nje  473

Sas­tav­lja­nje mik­ro­tu­bu­la  507 Us­troj mik­ro­tu­bu­la unu­tar stanica  509

Mik­ro­tu­bu­lar­ni mo­to­ri i kretanja  511 Iden­ti­fi­ka­ci­ja mik­ro­tu­bu­lar­nih motorič­kih pro­tei­na  511

Ak­tiv­ni tran­spo­rt tje­ran ion­skim gradi­jen­tom  555

En­do­ci­to­za  557 Fa­go­ci­to­za  557 En­do­ci­to­za pos­re­do­va­na receptorom  558 Pro­met pro­tei­na u en­do­ci­to­zi  563 Molekularna medicina Cistična fibroza  554

Ključni pokus

Pri­je­nos or­ga­ne­la i unu­tar­sta­nič­na or­ga­ni­za­ci­ja  515

Sažetak i ključni pojmovi  567

Tre­pet­lji­ke i bi­če­vi  516

Pi­ta­nja  568

Reor­ga­ni­za­ci­ja mik­ro­tu­bu­la za vrijeme mi­to­ze  519

Li­te­ra­tu­ra  568

LDL-receptor  560

Ključni pokus

14

Ud­ru­ži­va­nje ak­tin­skih vla­ka­na sa stanič­nom mem­bra­nom  481

Sažetak i ključni pojmovi  522

Bak­te­rij­ska sta­nič­na sti­jen­ka  571

Pi­ta­nja  525

Iz­bo­če­nja sta­nič­ne pov­r­ši­ne  485

Li­te­ra­tu­ra  525

Sta­nič­ne sti­jen­ke eu­ka­riot­skih stanica  572

Struk­tu­ra i or­ga­ni­za­ci­ja aktinskih vla­ka­na  473 Iz­grad­nja i raz­grad­nja ak­tin­skih vlakana  474 Or­ga­ni­za­ci­ja ak­tin­skih vla­ka­na  479

Ak­tin, mio­zin i sta­nič­no kretanje  487 Mi­šić­na kon­trak­ci­ja  487 Kon­trak­til­ne na­ku­pi­ne aktina i miozina u ne­mi­šić­nim stanicama  492 Ne­kon­ven­cio­nal­ni mio­zi­ni  493 Ob­li­ko­va­nje iz­bo­če­nja i kre­ta­nje stani­ca  494

In­ter­me­di­jar­na vlak­na  496 Pro­tei­ni in­ter­me­di­jar­nih vlakana  496 Iz­grad­nja in­ter­me­di­jar­nih vlakana  498 Unu­tar­sta­nič­na or­ga­ni­za­ci­ja intermedi­jar­nih vla­ka­na  499 Fun­kci­je ke­ra­ti­na i neu­ro­filamenata: bolesti ko­že i živ­ča­no­ga sustava  501

Kre­ta­nje kro­mo­so­ma  520 Ključni pokus

Ek­spre­si­ja mu­tan­tno­ga ke­ra­ti­na uz­ro­ku­je ne­nor­ma­lan raz­voj ko­že  502

Izolacija kinezina  512

13

Sta­nič­na membrana  529

Struk­tu­ra sta­nič­ne membrane  529 Fos­fo­li­pid­ni dvos­loj  529 Mem­bran­ski pro­tei­ni  533 Pok­ret­lji­vo­st mem­bran­skih proteina  538 Gli­ko­ka­li­ks  540

Tran­spo­rt ma­lih molekula  540 Pa­siv­na di­fu­zi­ja  541

Sta­nič­ne stijenke, izvanstanični matriks i međustanič­ne interakcije  571

Sta­nič­ne sti­jen­ke  571

Iz­van­sta­nič­ni mat­riks i stanične inte­rak­ci­je s matriksom  577 Struk­tur­ni pro­tei­ni mat­rik­sa  578 Po­li­sa­ha­ri­di mat­rik­sa  581 Ad­he­zij­ski pro­teini mat­rik­sa  582 In­te­rak­ci­je sta­ni­ce i mat­rik­sa  583

Me­đus­ta­nič­ne interakcije  587 Ad­he­zij­ski spo­je­vi  587 Čvr­sti spo­je­vi  590 Ti­jes­ni spoj ili pre­mos­ni­ca  591 Plaz­mo­dez­me  595 Ključni pokus

Karakterizacija integrina  584

Olak­ša­na di­fu­zi­ja i pro­tei­ni nosači  542

Molekularna medicina

Ion­ski ka­na­li  544

Sažetak i ključni pojmovi  596

Ak­tiv­ni tran­spo­rt tje­ran hid­ro­li­zom ATP  551

Pi­ta­nja  598

Bolesti tijesnih spojeva ili premosnica  594

Li­te­ra­tu­ra  598

SADRŽAJ 

   XIII

DIO IV  STANIČNA REGULACIJA

15

Sta­nič­no signaliziranje  603

Sig­nal­ne mo­le­ku­le i nji­ho­vi re­cep­to­ri  603 Ob­li­ci sig­na­li­zi­ra­nja iz­me­đu dvi­ju stani­ca  604 Ste­roid­ni hor­mo­ni i su­per­po­ro­di­ca re­cep­to­ra u jez­gri  605 Du­ši­kov ok­sid i ug­lji­kov monoksid  607 Neu­rot­ran­smi­to­ri  608 Pep­tid­ni hor­mo­ni i fak­to­ri ras­ta  609 Ei­ko­sa­noi­di  610 Bilj­ni hor­mo­ni  612

Pri­je­nos sig­na­la i citoskelet  641 In­teg­ri­ni i pri­je­nos sig­na­la  641 Re­gu­la­ci­ja ak­tin­sko­ga citoskeleta  641

Signalne mre­že  644 Pov­rat­na spre­ga (en­gl. feed­ba­ck) i međusobno ko­mu­ni­ci­ra­nje (en­gl. cros­sta­lk)  644 Mreže sta­nič­nog pri­je­no­sa signala  646 Ključni pokus

Re­cep­to­ri po­ve­za­ni s G-pro­tei­ni­ma i zamjeći­va­nje mi­ri­sa  616

Molekularna medicina

Kar­ci­nom: pri­je­nos sig­na­la i on­ko­ge­ni ras  633

Djelovanje sta­nič­nih površinskih re­cep­to­ra  613

Sažetak i ključni pojmovi  647

Re­cep­to­ri po­ve­za­ni s G-proteinima  613

Li­te­ra­tu­ra  650

Re­cep­tor­ske pro­tei­n-ti­ro­zi­nkinaze  615 Re­cep­to­ri za ci­to­ki­ne i ne­re­cep­tor­ske pro­tei­n-ti­ro­zi­n-ki­na­ze  620 Receptori po­ve­za­ni s drugim enzimskim ak­tiv­nos­ti­ma  620

Pu­te­vi unu­tar­sta­nič­no­ga prije­no­sa sig­na­la  621 cA­MP-put: dru­gi glas­ni­ci i fos­fo­ri­la­ci­ja pro­tei­na  622 Cik­lič­ki GMP  624 Fos­fo­li­pi­di i Ca2+  625 Pu­te­vi PI 3-kinaza/Akt i mTOR  628 Sig­nal­ni put MA­P-ki­na­ze  630 Putevi JAK/STAT i TGF-β/Smad  636 Sig­na­li­zi­ra­nje NF-κB  637 Pu­te­vi Hed­ge­hog, Wnt i Not­ch  638

Pi­ta­nja  650

16

Sta­nični cik­lus  653

Sta­nični cik­lus eu­ka­riot­ske sta­ni­ce  653 Fa­ze sta­nično­ga cik­lu­sa  654 Sta­nični ra­st i iz­van­sta­nični signali u regula­ciji sta­ničnog cik­lusa  655 Kon­trol­ne točke sta­nično­ga ciklusa  657

Fak­to­ri ras­ta i re­gu­la­ci­ja Cdk-ki­na­za u G-1 fa­zi sta­ničnog cik­lu­sa  667 Kon­trol­ne točke oštećenja DNA  670

Do­gađaji u M-fa­zi  672 Fa­ze mi­to­ze  672 Cdk1/ciklin B i nap­re­do­va­nje do meta­fa­ze  675 Kon­trol­na točka sla­ga­nja dio­be­nog vretena i nap­re­do­va­nje pre­ma anafa­zi  678 Ci­to­ki­ne­za  680

Me­jo­za i op­lod­nja  681 Pro­ces me­jo­ze  681 Re­gu­la­ci­ja me­jo­ze oo­ci­ta  684 Oplod­nja  687 Ključni pokus Otkriće MPF  660

Ključni pokus

Otkriće ciklina  663

Sažetak i ključni pojmovi  688 Pi­ta­nja  690 Li­te­ra­tu­ra  691

17

Sta­nič­na smrt i stanič­na obnova  693

Prog­ra­mi­ra­na sta­nič­na smrt  693 Zbi­va­nja ti­je­kom apop­to­ze  694

Og­ra­ničava­nje na sa­mo jed­nu replikaciju DNA ti­je­kom sta­nično­ga cik­lu­sa  659

Kas­pa­ze: iz­vr­ši­te­lji apop­to­ze  697

Re­gu­la­to­ri nap­re­do­vanja kroz stanični cik­lus  659

Sig­nal­ni pu­to­vi ko­ji re­gu­li­ra­ju apopto­zu  701

Pro­tei­n-ki­na­ze i re­gu­la­ci­ja sta­ničnog cik­lu­sa  659 Po­ro­di­ce cik­li­na i ki­na­za ovis­nih o cikli­ni­ma  664

Sre­diš­nji re­gu­la­to­ri apop­to­ze: porodica Bcl-2  699

Al­ter­na­tiv­ni pu­to­vi prog­ra­mi­ra­ne sta­ nič­ne smr­ti  705

XIV    SADRŽAJ

Ma­tič­ne sta­ni­ce i od­r­ža­va­nje od­ras­lih tki­va  705 Pro­li­fe­ra­ci­ja di­fe­ren­ci­ra­nih stanica  706 Ma­tič­ne sta­ni­ce  708

18

Rak  725

Nas­ta­nak i uz­ro­ci ra­ka  725

Tu­mo­r-sup­re­sor­ski ge­ni  752 Ot­kri­će tu­mo­r-sup­re­sor­skih gena  752 Dje­lo­va­nje pro­du­ka­ta tu­mo­rsupresor­skih ge­na  756 Ulo­ge on­ko­ge­na i tu­mo­rsupresorskih gena u nas­tan­ku tu­mo­ra  759

Me­di­cin­ska prim­je­na od­ras­lih matičnih sta­ni­ca  713

Vr­ste ra­ka  725

Em­brio­nal­ne ma­tič­ne stanice i tera­pij­sko klo­ni­ra­nje  714

Uz­ro­ci ra­ka  729

Em­brio­nal­ne ma­tič­ne sta­ni­ce  716

Tran­sfor­ma­ci­ja sta­ni­ca u kul­tu­ri  734

Mo­le­kul­arni pris­tup li­je­če­nju ra­ka  761

Pri­je­nos jez­gre so­mat­ske stanice  718

Tu­mor­ski vi­ru­si  735

Mo­le­ku­lar­na di­jag­nos­ti­ka  762

In­du­ci­ra­ne plu­ri­po­ten­tne ma­tič­ne sta­ni­ce  719

SV40 i po­lio­ma­vi­rus  736

Ključni pokus

Iden­ti­fi­ka­ci­ja ge­na pot­reb­nih za programiranu sta­nič­nu smrt  696

Nas­ta­nak ra­ka  726 Svoj­stva sta­ni­ca ra­ka  730

Vi­ru­si he­pa­ti­ti­sa B i C  735 Pa­pi­lo­ma­vi­ru­si  737 Ade­no­vi­ru­si  737 Her­pes­vi­ru­si  738

Spr­je­ča­va­nje i ra­no ot­kri­va­nje  761 Li­je­če­nje  763 Klučni pokus

Otkriće protoonkogena  742

MOLEKULARNA MEDICINA

Ima­ti­nib: li­jek pro­tiv ra­ka us­mje­ren pro­tiv on­ko­ge­na bcr/abl  766

Ključni pokus

Ret­ro­vi­ru­si  738

Sažetak i ključni pojmovi  720

On­ko­ge­ni  739

Pi­ta­nja  769

Pi­ta­nja  722

Ret­ro­vi­rus­ni on­ko­ge­ni  739

Li­te­ra­tu­ra  770

Li­te­ra­tu­ra  722

Pro­toon­ko­ge­ni  740

Kul­tu­ra em­brio­nal­nih ma­tič­nih sta­ni­ca  715

Sažetak i ključni pojmovi  767

On­ko­ge­ni u ljud­skim tu­mo­ri­ma  743

Odgovori na pitanja  773

Dje­lo­va­nje on­ko­ge­nih pro­tei­na  747

Pojmovnik  783 Kazalo  799

Predgovor Pe­to iz­da­nje knji­ge Sta­ni­ca: mo­le­ku­lar­ni pris­tup zad­r­ža­lo je pris­tup i ci­lje­ve ko­ji su obi­lje­ži­li i ra­ni­ja iz­da­nja, te se stu­den­ti­ma koji će čitati ovu knji­gu po­ku­ša­lo dočarati uz­buđenje znan­stve­nog is­tra­ži­va­nja i ob­jas­ni­ti na ko­ji način te­če razvoj ovo­ga prog­re­siv­no­ga pod­ručja znanosti. Svje­do­ ci smo ve­li­ko­ga nap­ret­ka od tis­ka­nja pos­ljed­njeg iz­da­nja ove knji­ge 2006. go­di­ne i te su no­vi­ne uklju­če­ne u ovaj volumen. Po­go­to­vu je iz­ra­žen na­ pre­dak u raz­vo­ju ge­no­mi­ke – no­ve teh­no­lo­gi­je omo­gućile su br­zo sek­ven­ ci­ra­nje cje­lo­kup­nih po­je­dinačnih ge­no­ma (uk­ljučujući i genom Ja­me­sa Wat­so­na i Crai­ga Ven­te­ra) te iden­ti­fi­ka­ci­ju ge­na od­go­vor­nih za nas­ta­nak razli­čitih uo­bičajenih bo­les­ti u lju­di. Može se očekivati da će daljnji na­ pre­dak omo­gućiti sek­ven­ci­ra­nje in­di­vi­dual­nih ge­noma što će za­ci­je­lo imati ve­li­ke prim­je­ne u in­di­vi­dua­li­zi­ra­noj me­di­ci­ni. Op­sež­ne ge­nom­ske ana­lize već su pridonijele no­vim spoz­na­ja­ma o spek­tru gen­skih prom­je­na od­go­vor­nih za nas­ta­nak mno­gih vr­sta tu­mo­ra, što ima po­ten­ci­jal­nu pri­ mje­nu u raz­vo­ju no­vih ci­lja­nih li­je­ko­va i so­fis­ti­ci­ra­ni­je­ga li­ječenja. Us­po­re­do s no­vim dos­tig­nućima u ge­no­mi­ci svje­do­ci smo i no­vih do­ stig­nuća u epigenetici, uk­ljučujući rasvjetljavanje me­ha­ni­za­ma epi­ge­ne­ti­ čkoga nas­ljeđivanja cen­tro­me­ra u vi­ših eu­ka­rio­ta, ve­li­ke važ­nos­ti kom­ plek­snos­ti his­ton­skih mo­di­fi­ka­ci­ja u re­gu­la­ci­ji gen­ske ek­spre­si­je te ra­zu­mi­je­va­nje inak­ti­va­ci­je X-kro­mo­so­ma po­moću akcije ne­ko­di­ra­jućih RNA-molekula. Pos­ta­li smo svjes­ni i ši­ro­ke ulo­ge ma­lih mo­le­ku­la u post­ tran­skrip­cij­skoj re­gu­la­ci­ji ge­na, ne sa­mo ti­je­kom nor­mal­no­ga staničnoga po­na­ša­nja ne­go i ti­je­kom pa­to­lo­gi­je sta­ni­ce kao što je rak ili srčane bo­le­ sti. Konačno, glav­ni nap­re­dak nap­rav­ljen je pre­ma po­ten­ci­jal­noj kliničkoj prim­je­ni matičnih sta­ni­ca. Oso­bi­to je uz­bud­lji­vo ot­kriće da se odrasle tje­ les­ne sta­ni­ce mo­gu rep­rog­ra­mi­ra­ti ta­ko da se po­na­ša­ju kao plu­ri­po­ten­tne matične sta­ni­ce u kul­tu­ri. Do­dat­na pos­tig­nuća od tiskanja pos­ljed­nje­ga iz­da­nja knji­ge Sta­ni­ca uk­ljučuju nap­re­dak u rje­ša­va­nju du­go­go­diš­njih otvo­re­nih pi­ta­nja u staničnoj i mo­le­ku­lar­noj bio­lo­gi­ji kao što su ulo­ga raz­ličitih eu­ka­riot­skih DNA-po­li­me­ra­za u rep­li­ka­cij­skoj vi­li­ci ili me­ha­ni­ zam tran­spor­ta pro­tei­na kroz Gol­gi­jev apa­rat. Pot­ru­di­li smo se pri­ka­za­ti ne sa­mo in­for­ma­ciju već i uzbuđenje i iza­ zo­ve is­ta­ži­va­nja u staničnoj bio­lo­gi­ji. Is­to­dob­no smo zad­r­žali čitljivost i pris­tupačnost tek­sta knji­ge Sta­ni­ca stu­den­ti­ma pred­dip­lom­ske nas­ta­ve ko­ji se pr­vi pu­ta sus­reću s nastavom iz stanične i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je. Značajke ko­je is­tiču knjigu Sta­ni­ca su od­jelj­ci Mo­le­ku­lar­na me­di­ci­na i Ključni po­ku­si, ko­ji nag­la­ša­va­ju kliničku prim­je­nu i opi­suju ključne znan­ stve­ne ra­do­ve. No­vi Ključni po­ku­si u ovom iz­da­nju knji­ge Sta­ni­ca uk­lju­ čuju ot­kriće RNA-in­ter­fe­ren­ci­je, rad znan­stve­ni­ka An­drewa Fi­rea i Crai­ga Mel­loa, te ot­kriće da recep­to­ri za mi­ris spa­da­ju u ve­li­ku po­ro­di­cu re­cep­ to­ra po­ve­za­nih s G-pro­tei­ni­ma, rad znan­stve­ni­ka Lin­de Bu­ck i Ric­har­da Axe­la. Ovi ključni po­ku­si, za­jed­no s os­ta­lim po­ku­si­ma opi­sa­nim i ob­ja­ šnje­nim u tek­stu knji­ge, da­ju stu­den­tu uvid u ti­jek prog­re­sa ovo­ga znan­

XVI    PREDGOVOR stve­no­ga područja, te dočara­va­ju na ko­ji se način stvara­ju hi­po­te­ze i in­ter­ pre­ti­ra­ju re­zul­ta­ti. Kao i u pret­hod­nim iz­da­nji­ma, sva­ko pog­lav­lje uk­ljučuje i ne­ko­li­ko na­po­me­na ko­je ob­jaš­nja­va­ju područje in­te­re­sa, ili pak značaj otkrića za medi­ci­nu. Da bi se zad­r­žao fo­kus na ek­spe­ri­men­tal­noj ana­li­zi (ka­ko je i kon­ci­pi­ra­na ci­je­la knji­ga) mno­ga od tih pi­ta­nja po­tiču studen­ta da raz­miš­lja o ek­spe­ri­men­tal­nom pris­tu­pu ili in­ter­pre­ta­ci­ji re­zul­ta­ta. U ovom, kao i u pret­hod­nim iz­da­nji­ma knji­ge Sta­ni­ca, naš naj­važ­ni­ji za­da­tak bio je pri­je­nos uz­buđenja i iza­zo­va is­tra­ži­va­nja u suv­re­me­noj staničnoj i mo­le­ku­lar­noj bio­lo­giji na čita­te­lja (stu­den­ta). Mogućnos­ti u ovom području ni­ka­da ni­su bi­le veće i nadamo se da će knjiga Sta­ni­ca sti­mu­li­ra­ ti da­naš­nje stu­den­te da se sus­ret­nu s iza­zo­vi­ma budu­ćih istra­ži­va­nja.

Zah­va­le

Pe­to iz­da­nje knji­ge Sta­ni­ca po­bolj­ša­no je i zah­va­lju­ju­ći komen­ta­ri­ma i su­ges­ti­ja­ma re­cen­ze­na­ta, ko­le­ga te pre­da­vača i stude­na­ta ko­ji su se ko­ris­ti­ li pret­hod­nim iza­nji­ma. Svo­jim sav­je­ti­ma po­mog­li su nam: Dr. Fe­li­pe Kier­ szen­baum, Mic­hi­gan Sta­te Uni­ver­si­ty; Dr. Ka­ren Guz­man, Cam­pbe­ll Uni­ ver­si­ty; Dr. T. Pa­ge Owen, Jr. Con­nec­ti­cut Col­le­ge; Dr. Ju­njun Liu, Ca­li­for­nia Sta­te Uni­ver­si­ty, Po­mo­na; Dr. Floyd Knoop, Creig­hton Uni­ver­ si­ty; Dr. Ja­son Bu­sh, Ca­li­for­nia Sta­te Uni­ver­si­ty, Fres­no; Dr. Ge­ne Set­tle, Uni­ver­si­ty of Ari­zo­na; Dr. Ame­lia Ahe­r­n-Rin­de­ll, Uni­ver­si­ty of Por­tla­nd (plus komentari njezinih studenata); Dr. Cynthia Brad­ham, Bos­ton Uni­ ver­si­ty i Dr. Ul­la Han­sen, Bos­ton Uni­ver­si­ty i na to­me im sves­r­dno zah­va­ lju­je­mo. Još jed­nom zah­va­lju­je­mo na­šim iz­da­vačima i ured­ni­ci­ma na nji­ho­voj kon­ti­nui­ra­noj pot­po­ri. Kao i uvi­jek, bi­lo nam je ugod­no su­rađiva­ti s An­dy Si­nauer i Dean Scud­de­rom, Si­nauer As­so­cia­tes, i s Jef­fom Hol­tmeie­rom, ASM Pre­ss. Cris­top­her Sma­ll i Ja­ni­ce Ho­la­bi­rd nap­ra­vi­li su od­ličan posao u iz­ra­di ove knji­ge. Po­seb­no smo sret­ni po­nov­no zah­va­li­ti Chel­sea Ho­la­ bird na nje­zi­noj bri­zi, str­plji­vos­ti i dob­rom hu­mo­ru ti­je­kom ra­da na ovoj knji­zi. Geof­frey M. Coo­per i Ro­be­rt E. Haus­ma­nn Ve­lja­ča 2009

Predgovor hrvatskom izdanju Knjiga »The Ce­ll – a Mo­le­cu­lar Ap­proa­ch«, au­to­ra G. Coo­pe­ra i R. Haus­ ma­na, je­dan je od naj­po­pu­lar­ni­jih ud­žbe­ni­ka mo­le­ku­lar­ne i stanične bio­ lo­gi­je u svi­je­tu. Svo­ju ve­li­ku po­pu­lar­no­st ste­kao je pog­la­vi­to zbog jed­no­ stav­no­ga i stu­den­tu pri­la­gođenoga pri­ka­zi­va­nja gra­di­va. Ia­ko je pos­ri­je­di vr­lo op­sež­nan ud­žbe­nik, ko­ji do­di­ru­je i naj­suv­re­me­ni­je te­me stanične i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je, nje­go­va or­ga­ni­za­ci­ja i pe­da­goš­ki pris­tup iz­la­ga­nju gra­di­va omo­gućuju stu­den­tu da to inače vrlo slo­že­no gra­di­vo raz­mjer­no la­ko us­vo­ji. Iz­nim­no ve­seli činjenica da na­kon pot­pu­no ras­pro­da­no­ga pri­je­vo­da treće­ga hr­vat­skog izdanja, s ma­nje od go­di­nu da­na zaos­tat­ka od iz­las­ka iz­vor­ni­ka na en­gles­kom je­zi­ku, mo­že­mo pred­sta­vi­ti i hr­vat­ski pri­je­vod pe­ tog iz­da­nja ove knji­ge. Ka­ko je hr­vatska stručna li­te­ra­tura već niz godina op­te­rećena ne­dos­tat­kom te­melj­no­ga ud­žbe­ni­ka mo­le­ku­lar­ne i stanične bio­lo­gi­je, pre­vođenje ove knji­ge bio je do­nek­le i pio­nir­ski po­duh­vat. Za velik broj stručnih na­zi­va na en­gles­kom je­zi­ku ni­su pos­to­ja­li hr­vat­ski na­ zivi, a često je za is­ti po­jam u is­to­dob­noj prim­je­ni bi­lo vi­še hr­vat­skih na­zi­ va. U pre­vođenje knji­ge Sta­ni­ca bi­lo je uk­ljučeno vi­še pre­vo­di­te­lja, ko­ji se raz­li­ku­ju sti­lom pi­sa­nja, a po­neg­dje i načinom pre­vođenja od­ređe­nih stručnih ter­mi­na. Po­ku­ša­li smo naći kompromis iz­među uvo­đenja no­vih hr­vat­skih na­zi­va i us­va­ja­nja uv­ri­je­že­nih an­glo­sak­son­skih. Ia­ko smo ulo­ži­li ve­lik trud u usug­la­ša­va­nje ter­mi­no­lo­gi­je, svjes­ni smo da je to sa­mo ma­li ko­rak, na­da­mo se, u pra­vo­me smje­ru. Ne­kim rje­še­nji­ma, na­ža­lo­st, ni sa­mi nis­mo za­do­volj­ni, no bo­lja nis­mo us­pje­li pro­naći. I pored ve­li­kog ulo­že­nog tru­da, u knji­zi vje­ro­jat­no još uvi­jek ima ne­dos­ljed­nos­ti, a možda čak i ne­ točnosti u pre­vođenju. Uočene pog­r­ješ­ke po­kušat ćemo is­pra­vi­ti u slje­ dećem izdanju. Una­toč određenim ne­dos­tat­ci­ma, ova je knji­ga izvr­stan ud­žbe­nik i na­damo se da će i ovo izdanje stu­den­ti­ma bi­ti vri­je­dan iz­vor zna­nja, a nas­tav­ni­ci­ma va­žan ele­me­nt u nas­ta­vi. Zag­reb, u ruj­nu 2010. Gor­dan Lauc

XVIII    PREDGOVOR

PREDGOVOR 

Organizacija i obilježja knjige

STANICA  mo­le­ku­lar­ni pri­stup

Knji­ga Sta­ni­ca na­pi­sa­na je ta­ko da bu­de pris­tu­pačan i pou­čan tekst koje­ga stu­de­nt mo­že us­vo­ji­ti u cje­li­ni ti­je­kom jed­nog se­mes­tra. Knji­ga pret­pos­tav­lja da je stude­nt već savla­dao os­no­ve bio­lo­gi­je i opću kemi­ju, ali da ni­je slu­šao or­gan­sku ke­mi­ju, bio­ke­mi­ju ili mo­le­ku­lar­nu bio­lo­gi­ju. Or­ga­ ni­za­ci­ja knji­ge i nje­zi­na obi­ljež­ja po­moći će studen­tu da pris­tu­pi gra­di­vu i us­pješ­no ga us­vo­ji.

Organizacija Knji­ga Sta­ni­ca po­di­je­ljena je u četi­ri di­je­la. Di­je­lovi su me­đusob­no neo­ vis­ni ta­ko da je op­seg i re­dos­li­jed te­ma mo­guće prila­go­di­ti raz­ličitim ko­le­ gi­ji­ma. U I. di­je­lu na­la­ze se te­melj­na pog­lav­lja o evo­lu­ci­ji sta­ni­ca, me­to­da­ma za is­pi­ti­va­nje sta­ni­ca, sta­ničnoj kemi­ji i os­no­va­ma suv­re­me­ne mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je. Oni stu­den­ti ko­ji su pred­zna­nje iz ovih pod­ručja stekli ili u op­ šir­nom uvod­nom ko­le­gi­ju bio­lo­gi­je, ili u pret­hod­nom ko­le­gi­ju iz mo­le­ku­ lar­ne bio­lo­gi­je mo­gu pres­kočiti raz­ličite di­je­lo­ve ovih pog­lavlja ili ih pak is­ko­ris­ti­ti kao preg­led­ni tek­st već na­uče­no­ga. U II di­je­lu nag­la­sak je na mo­le­ku­lar­noj bio­lo­gi­ji sta­ni­ce i u nje­mu su sad­r­ža­na pog­lav­lja o or­ga­ni­za­ci­ji ge­no­ma i DNA sek­ven­ci­ja­ma, rep­li­ka­ci­ji, pop­rav­ku i re­kom­bi­na­ci­ji DNA, tran­skrip­ci­ji i do­ra­di RNA, te sin­te­zi, do­ ra­di i re­gu­la­cii pro­tei­na.. Sli­jed pog­lav­lja pra­ti ti­jek ge­ne­tičke infor­ma­ci­je (DNA → RNA → pro­tein) i pru­ža krat­ki, ali suv­re­me­ni preg­led ovih te­ ma. III. dio sad­r­ža­va sre­diš­nja pog­lav­lja o struk­tu­ri i fun­kci­ji sta­ni­ce, uklju­ čujući poglav­lja o jez­gri, ci­top­laz­mat­skim or­ga­ne­li­ma, ci­tos­ke­le­tu i sta­ ničnoj površi­ni. Ovaj dio knji­ge počinje pog­lav­ljem o jez­gri ko­je mo­le­ku­ lar­nu bio­lo­gi­ju iz II di­je­la stav­lja u kon­tek­st eu­ka­riot­ske sta­ni­ce, a za­tim sli­je­de ci­top­laz­mat­ski or­ga­ne­li, ci­tos­ke­let i sta­nična membra­na. Sva su ova pog­lav­lja u ve­li­koj mje­ri neo­vis­na i mo­gu bi­ti pri­ka­za­na drukčijim re­do­sli­ je­dom ako je to po­god­ni­je za po­je­di­ni ko­le­gij. Pos­ljed­nji, IV. dio, pok­ri­va uz­bud­lji­vo i br­zo nap­re­du­juće područje stanične regu­la­ci­je, a uk­ljučuje i te­me kao što su sta­nična signa­li­za­ci­ja, sta­ nični ciklus i prog­ra­mi­ra­na sta­nična smrt. Ovaj dio knjige zav­r­ša­va po­ glav­ljem o ra­ku ko­je pri­ka­zu­je pos­lje­di­ce po­re­mećaja u os­nov­nim me­ha­ niz­mi­ma sta­nične regu­la­ci­je.

Obilježja U knji­gu Sta­ni­ca ugra­đeno je ne­ko­li­ko pe­da­goš­kih obi­ljež­ja ko­ja bi tre­ ba­la po­moći studen­tu da sav­la­da i po­ve­že gra­di­vo. Ta su obi­ljež­ja ov­dje na­ve­de­na kao upu­ta stu­de­ntu za učenje s po­moću ove knjige. Or­ga­ni­za­ci­ja pog­lav­lja. Sva­ko je pog­lav­lje po­di­je­ljeno na četi­ri ili pet glav­nih od­je­lja­ka, ko­ja su za­tim po­di­je­lje­na na sličan broj podod­je­lja­ka.

   XIX

XX    PREDGOVOR Po­pis glav­nih od­je­lja­ka, ko­ji se na­la­zi na početku sva­ko­ga pog­lav­lja, da­je krat­ki preg­led sad­r­ža­ja. Ključni pojmo­vi i Poj­mov­nik. Ključni su pojmo­vi pri­ka­za­ni po­deb­lja­no kad se pr­vi pu­ta po­jav­lju­ju u pog­lav­lju. Ti su ključni pojmo­vi po­nov­lje­ni u sa­žet­ku pog­lav­lja, a nji­ho­va de­fi­ni­ci­ja na­la­zi se u Poj­mov­ni­ku na kra­ju knji­ ge. Ilus­tra­ci­je i mik­ro­fo­tog­ra­fi­je. Ilus­tra­ci­je u ob­li­ku cr­te­ža u bo­ji i mik­ro­ fo­tog­ra­fi­je paž­lji­vo su odab­ra­ne da bi na­do­pu­ni­li i vi­zual­no po­jačali tek­st. Ključni poku­si i Mo­le­ku­lar­na me­di­ci­na. Sva­ko pog­lav­lje sad­r­ža­va ili dva pri­ka­za ključnih poku­sa, ili je­dan pri­kaz ključno­ga poku­sa i je­dan odje­ljak Mo­le­ku­lar­na me­di­ci­na. Svr­ha ovih od­je­lja­ka je­st stu­den­tu da­ti osjećaj za ekspe­ri­men­tal­nu os­no­vu sta­nične i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je i nje­ zi­nu prim­je­nu u suv­re­me­noj me­di­ci­ni. Uočili smo da ova pog­lav­lja mo­gu bi­ti od­lična podlo­ga za stu­den­tske se­mi­na­re ko­ji mo­gu bi­ti i upot­pu­nje­ni pre­gle­dom ori­gi­nal­nih znan­stvenih člana­ka na ko­ji­ma su ute­me­lje­ni pri­ka­ zi ključnih poku­sa. Na­po­me­ne. Sva­ko pog­lav­lje sad­r­ža­va ne­ko­li­ko na­po­me­na ko­ji da­ju kra­ tak opis naj­važ­ni­jih to­ča­ka in­te­re­sa ko­je se od­no­se na gra­di­vo u tek­stu. Na­po­me­ne su do­da­tak tes­kstu i po­laz­na su toč­ka za ras­pra­vu. Sa­žet­ci pog­lav­lja. Sa­žet­ci su or­ga­ni­zi­ra­ni u ob­li­ku krat­kih iz­vo­da iz glav­nih od­je­lja­ka i po­dod­je­lja­ka sva­kog pog­lav­lja. Ovaj od­je­lja­k-po-od­je­ ljak pri­kaz upot­pu­njen je po­pi­som ključnih pojmo­va ko­ji su uve­de­ni u sva­kom pog­lav­lju što da­je krat­ki, ali pot­pu­ni preg­led gra­di­va. Li­te­ra­tu­ra. Op­se­žan po­pis li­te­ra­tu­re na kra­ju sva­kog pog­lav­lja upućuje i na preg­led­ne i odab­ra­ne iz­vor­ne znan­stvene članke. Ka­ko bi stu­den­tu bi­ lo lak­še pro­naći članke ko­ji ga za­ni­ma­ju, li­te­ra­tu­ra je or­ga­ni­zi­ra­na pre­ma od­jelj­ci­ma u tek­stu. Preg­ledni članci obi­lje­že­ni su s [P], a iz­vor­ni znan­ stveni članci s [I]. Pop­rat­ne in­ter­net­ske iko­ne (en­gl. Com­pa­nion web­si­te ico­ns). No­ve iko­ ne na mar­gi­na­ma knji­ge us­mje­ra­va­ju stu­den­te na in­ter­net­ske ani­ma­ci­je, vi­deo-snim­ke, kvi­z-pi­ta­nja, prob­le­me i os­ta­li preg­led­ni ma­te­ri­jal.

DIO

I

Uvod

POGLAVLJE 1

Pregledno o stanicama i istraživanju stanica

POGLAVLJE 2

Stanični sastav

POGLAVLJE 3

Stanični metabolizam

POGLAVLJE 4

Osnove molekularne biologije

1 Podrijetlo i evolucija stanica  4 Sta­nice kao eksperimentalni modeli  16 Oruđa stanične biologije  21 Ključ­ni po­kus Kultura animalnih stanica  34 Molekularna medicina Virusi i rak  37

Preg­led­no o sta­ni­ca­ma i is­traživa­nju sta­ni­ca Ra­zu­mi­je­va­nje mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gije sta­ni­ce je fun­da­men­tal­no za sve bio­loške zna­nos­ti. Osim važnos­ti za fun­da­men­tal­nu zna­no­st, spoz­ na­je pri­kup­lje­ne is­traživa­nji­ma na mo­le­ku­lar­noj ra­zi­ni sve se više prim­je­ nju­ju u me­di­ci­ni, po­ljop­riv­re­di i bio­teh­no­lo­gi­ji. Zav­ršetak sek­ve­ncira­nja ljud­sko­ga ge­no­ma značio je ve­li­ki nap­re­dak za sta­ničnu i mo­le­ku­la­rnu bio­lo­giju i ti­me otvorio no­ve ho­ri­zon­te u me­di­cin­skoj prak­si. Iz­ra­zi­ti prim­je­ri prim­je­ne saz­na­nja iz pod­ručja mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je sta­ni­ce uk­ ljučuju: iden­ti­fi­ka­ci­ju ge­na uk­ljučenih u in­di­vi­dual­nu pri­je­mči­vo­st na raz­ ne bo­les­ti kao što su srčane bo­les­ti, reu­ma­toid­ni ar­tri­tis i di­ja­be­tes; raz­voj no­vih li­je­ko­va ko­ji spr­ječava­ju ra­st tu­mor­skih sta­ni­ca; te po­ten­cijal­na upo­ra­ba ma­tičnih sta­ni­ca u svr­hu zam­je­ne oštećenih tki­va i li­ječenju bo­ les­ni­ka od di­ja­be­tesa, Par­kin­so­no­ve bo­le­sti, Al­zhei­me­rove bo­le­sti, oz­lje­da kra­lježnične moždi­ne i srčanih bo­les­ti. Budući da se po­lje is­traživa­nja sta­nične i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je br­zo širi, važno je ra­zum­je­ti ek­spe­ri­men­tal­nu os­novu mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gije kao i dosa­dašnje spoz­na­je. Pre­ma to­mu, ovo će se pog­lav­lje us­re­do­točiti na načine is­traživa­nja sta­ni­ca te na preg­led­ni pri­kaz ne­kih sta­ničnih os­ nov­nih svoj­sta­va. Za ra­zu­mi­je­va­nje stanične bio­lo­gi­je po­se­bi­ce je važno shva­ti­ti sličnos­ti i raz­li­ke među sta­ni­ca­ma. Pr­vi dio pog­lav­lja ras­prav­lja sto­ga o je­din­stve­nos­ti i raz­ličitos­ti da­našnjih sta­ni­ca uzi­ma­jući u ob­zir nji­ ho­vu evo­lu­ci­ju od za­jed­ničkog pret­ka. S jed­ne stra­ne, sve sta­ni­ce dijele za­jed­ničke os­nov­ne oso­bi­ne ko­je su os­ta­le očuva­ne ti­je­kom evo­lu­ci­je. Prim­je­ri­ce, sve sta­ni­ce upot­reb­lja­va­ju mo­le­ku­lu DNA kao svoj ge­ne­tički ma­te­ri­jal, ok­ružene su mem­bra­na­ma i ko­ris­te is­te te­melj­ne me­ha­niz­me za me­ta­bo­li­zam pot­re­ban pri proiz­vod­nji energi­je. S dru­ge stra­ne, da­našnje su sta­ni­ce raz­vi­le raz­ličite sti­lo­ve živo­ta. Mno­gi or­ga­niz­mi, po­put bak­te­ri­ ja, ame­ba i kva­sa­ca sas­to­je se od jed­ne je­di­ne sta­ni­ce ko­ja je spo­sob­na za sa­mos­tal­no um­nažanje. Složeni­ji or­ga­niz­mi iz­građeni su od sku­pi­na sta­ni­ ca čije je dje­lo­va­nje us­klađeno, a raz­ličite sta­ni­ce spe­ci­ja­li­zi­ra­ne su za iz­ vršava­nje od­ređenih za­da­ta­ka. Prim­je­ri­ce, ljud­sko je ti­je­lo iz­građeno od više od 200 raz­ličitih vr­sta sta­ni­ca od ko­jih je sva­ka spe­ci­ja­li­zi­ra­na za ne­ku od po­seb­nih fun­kci­ja kao što je pa­mćenje, vid, kre­ta­nje ili pro­ba­va. Raz­ no­li­ko­st ko­ju is­ka­zu­ju raz­ličite vr­ste sta­ni­ca zais­ta je doj­mljiva; prim­je­ri­ce, za­mis­li­mo raz­li­ke iz­među sta­ni­ce bak­te­ri­ja i sta­ni­ca ljud­sko­ga moz­ga. Te­melj­ne sličnos­ti iz­među raz­ličitih vr­sta sta­ni­ca pred­stav­lja­ju za­jed­ ničku te­mu sta­nične bio­lo­gi­je ko­ja omo­gućuje da se te­melj­ni prin­ci­pi

4    POGLAVLJE 1 stečeni iz ek­spe­ri­me­na­ta s jed­nom vr­stom sta­ni­ca ek­strapoli­ra­ju i ge­ne­ra­ li­zi­ra­ju na dru­ge ti­po­ve sta­ni­ca. Ne­ko­li­ko vr­sti sta­ni­ca i or­ga­ni­za­ma na ve­li­ko se ko­ris­ti u proučava­nju raz­ličitih as­pe­ka­ta sta­nične i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je; u slje­dećem od­jelj­ku ovo­ga pog­lav­lja ras­prav­lja se o ne­kim svoj­ stvi­ma tih sta­ni­ca ko­ja ih čine oso­bi­to vri­jed­nim ek­spe­ri­men­tal­nim mo­de­ li­ma. Na kra­ju, važno je shva­ti­ti da nap­re­dak sta­nične bio­lo­gi­je po­seb­no ovi­si o ras­po­loživos­ti ek­spe­ri­men­tal­nih oruđa ko­ja znan­stve­ni­ci­ma omo­ gućuju pos­ti­za­nje no­vih opažanja ili pro­vođenje novih ti­po­va ek­spe­ri­me­na­ ta. Pre­ma to­me, uvod­no pog­lav­lje zav­ršava ras­pra­vom o ne­kim ek­spe­ri­ men­tal­nim pris­tu­pi­ma ko­ji se ko­ris­te za is­traživanje sta­ni­ca, te ta­kođer preg­le­dom ne­kih naj­značaj­ni­jih po­vi­jes­nih nap­re­da­ka ko­ji su do­ve­li do sa­ dašnjeg ra­zu­mi­je­va­nja sta­nične struk­tu­re i fun­kci­je.

Pod­ri­jet­lo i evo­lu­ci­ja sta­ni­ca Sta­ni­ce su po­di­je­lje­ne u dvi­je ve­li­ke sku­pi­ne ko­je su de­fi­ni­ra­ne pos­to­ja­ njem od­nos­no ne­pos­to­ja­njem pra­ve jez­gre. Pro­ka­riot­ske sta­ni­ce (bak­te­ri­ je) ne­ma­ju jez­gri­nu ovoj­ni­cu, a eu­ka­riot­ske sta­ni­ce ima­ju jez­gru u ko­joj je ge­ne­tički ma­te­ri­jal od­vo­jen od ci­top­laz­me. Pro­ka­riot­ske sta­ni­ce o­pćeni­to su ma­nje i jed­nos­tav­ni­je od eu­ka­riot­skih; osim što im ne­dos­ta­je jez­gra, nji­ho­vi su ge­no­mi jed­nos­tav­ni­ji i ne sad­ržava­ju ci­top­laz­mat­ske or­ga­ne­le (ta­bl. 1-1). Una­toč ovim raz­li­ka­ma, is­ti os­nov­ni mo­le­ku­lar­ni me­ha­niz­mi up­rav­lja­ju živo­tom ka­ko pro­ka­rio­ta ta­ko i eu­ka­rio­ta, što uka­zu­je da sve da­našnje sta­ni­ce pot­ječu od za­jed­ničko­ga pr­vo­bit­nog pret­ka. Ka­ko se raz­ vi­la ta pr­va sta­ni­ca? A ka­ko se raz­vi­la složeno­st i raz­no­li­ko­st ko­ju pos­je­du­ ju da­našnje sta­ni­ce?

Pr­va sta­ni­ca Čini se da je život nas­tao pri­je naj­ma­nje 3,8 mi­li­jar­di go­di­na, prib­ližno 750 mi­li­ju­na go­di­na na­kon nas­tan­ka Ze­mlje. Ka­ko se život po­ja­vio i ka­ko je nas­ta­la pr­va sta­ni­ca pred­met je čiste spe­ku­la­ci­je, bu­dući da se ti do­gađaji ne mo­gu rep­ro­du­ci­ra­ti u la­bo­ra­to­ri­ju. Una­toč tomu, ne­ko­li­ko raz­ličitih tipo­va ek­spe­ri­me­na­ta pružilo je važne po­dat­ke ko­ji ob­jašnja­va­ju ne­ke ko­ ra­ke u tom pro­ce­su. Dva­de­se­tih go­di­na prošlo­ga sto­ljeća pred­loženo je da se jed­nos­tav­ne or­gan­ske mo­le­ku­le mo­gu spon­ta­no po­li­me­ri­zi­ra­ti u mak­ro­mo­le­ku­le u uv­ je­ti­ma za ko­je se pret­pos­tav­lja da su pos­to­ja­li u pri­mi­tiv­noj Zem­lji­noj at­ mos­fe­ri. U vri­je­me kad se po­ja­vio život, smat­ra se da je Zem­lji­na at­mos­fe­ ra sad­ržava­la ma­lo ili uo­pće ni­je sad­ržava­la slo­bod­ni ki­sik već se sas­to­ja­la ug­lav­nom od CO2 i N2 te od ma­nje ko­ličine pli­no­va kao što su H2, H2S i

Tab­li­ca 1-1. Pro­ka­riot­ske i eu­ka­riot­ske sta­ni­ce Oso­bi­ne

Pro­ka­rio­ti

Eu­ka­rio­ti

jez­gra

ne­dos­ta­je

pri­sut­na

prom­jer ti­pične sta­ni­ce

1 μm

10–100 μm

ci­top­laz­mat­ski or­ga­ne­li

ne­dos­ta­ju

sad­ržaj DNA (pa­ro­vi ba­za)

1 × 10 do 5 × 10

1,5 × 107 do 5 × 109

kro­mo­so­mi

jed­na kružna   mo­le­ku­la DNA

više li­nea­rnih molekula   DNA

6

pri­sut­ni 6

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA  Sli­ka 1-1. Spon­tano for­mi­ra­nje or­gan­skih mo­le­ku­la.  Vo­de­na pa­ra cir­ku­li­ra­la je kroz at­mos­fe­ru ko­ja je sad­ržava­la CH4, NH3, i H2 i u ko­joj je do­la­zi­lo do elek­tričnog pražnje­nja. Ana­li­ze pro­du­ka­ta reak­ci­je ot­kri­le su nas­ta­nak raz­ličitih or­gan­skih mo­le­ku­la, uk­ljučujući ami­no­kiseli­ne ala­nin, as­pa­ra­gin­sku ki­se­li­nu, glu­ta­min­sku ki­se­li­nu i gli­cin.

CO. Tak­va je at­mos­fe­ra mog­la osi­gu­rati re­du­ci­ra­juće uv­je­te u ko­ji­ma se mo­gu spon­ta­no for­mi­ra­ti or­gan­ske mo­le­ku­le, uz iz­vo­re ener­gi­je kao što je Su­nčeva svjet­lo­st ili elek­trično pražnje­nje. Spon­ta­no for­mi­ra­nje or­gan­skih mo­leku­la pr­vi je put ek­spe­ri­men­tal­no do­ka­za­no 1950-ih go­di­na, kada je Stan­ley Mil­ler (ta­da još stu­de­nt) po­ka­zao da iz­bi­ja­nje elek­trične is­kre u mje­šavi­ni H2, CH4 i NH3, u pri­sut­nos­ti vo­de, omo­gućuje for­mi­ra­nje raz­li­ čitih or­gan­skih mo­le­ku­la, uk­ljučujući i nekoli­ko ami­no­ki­se­li­na (sl. 1-1). Ia­ko u Mil­le­ro­vim ek­spe­ri­men­tima ni­su točno rep­ro­du­ci­ra­ni uv­je­ti ko­ji su vla­da­li na pri­mi­tiv­noj Zem­lji, ipak je jas­no po­ka­zana vje­ro­jat­no­st spon­tane sin­teze or­gan­skih mo­le­ku­la kao os­nov­nih ma­te­ri­ja­la iz ko­jih su nas­ta­li prvi živi or­ga­niz­mi. Idući ko­rak u evo­lu­ci­ji bi­lo je for­mi­ra­nje mak­ro­mo­le­ku­la. Do­ka­za­no je da se mo­no­me­ri, os­nov­ne gra­div­ne je­di­ni­ce mak­ro­mo­le­ku­la, mo­gu spon­ta­ no po­li­me­ri­zi­ra­ti u pret­pos­tav­ljenim pre­bio­tičkim uv­je­ti­ma. Zag­ri­ja­va­nje su­he mješavi­ne ami­no­ki­se­li­na, prim­je­ri­ce, re­zul­ti­ra nji­ho­vom po­li­me­ri­za­ci­ jom i for­mi­ra­njem po­li­pep­ti­da. No, kri­tična oso­bi­na mak­ro­mo­le­ku­le iz ko­ je se raz­vio život mo­ra­la je bi­ti nje­zi­na spo­sob­no­st da se sa­morep­li­ci­ra. Je­ di­no mak­ro­mo­le­ku­la ko­ja je spo­sob­na da up­rav­lja sin­te­zom vlas­ti­tih no­vih ko­pi­ja mog­la bi bi­ti spo­sob­na za sa­morep­ro­duk­ci­ju i dalj­nju evo­lu­ci­ju. Od dvi­ju glav­nih kla­sa in­for­ma­cij­skih mak­ro­mo­le­ku­la u da­našnjim sta­ ni­ca­ma (nuk­lein­ske ki­se­li­ne i pro­tei­ni), je­di­no su nuk­lein­ske ki­se­li­ne spo­ sob­ne up­rav­lja­ti vlas­ti­tom rep­li­kacijom. Nuk­lein­ske ki­se­li­ne služe kao ka­ lu­pi za vlas­ti­tu sin­te­zu, što se te­me­lji na spe­ci­fičnom spa­ri­va­nju ba­za iz­među kom­plemen­tar­nih nuk­leo­ti­da (sl. 1-2). Značajan ko­rak u ra­zu­mi­ je­vanju mo­le­ku­lar­ne evo­lu­ci­je pos­tig­nut je ra­nih 80-ih go­di­na prošlo­ga stoljeća, kad je u la­bo­ra­to­ri­ju Si­da Al­tma­na i To­ma Cec­ha ot­kri­ve­no da je RNA spo­sob­na ka­ta­li­zi­ra­ti od­ređeni broj ke­mij­skih reak­ci­ja, uk­ljučujući i po­li­me­ri­za­ci­ju nuk­leo­ti­da. Dalj­nje stu­di­je proširi­le su op­seg poz­na­tih ka­ta­ li­tičkih ak­tiv­nos­ti mo­le­ku­le RNA, u­ključujući mo­le­ku­le RNA ko­je up­rav­ lja­ju sin­te­zom no­vo­ga lan­ca RNA pre­ma RNA ka­lu­pu. Pre­ma to­me, RNA

Sli­ka 1-2. Sa­moum­nožava­nje RNA.  Kom­ple­men­tar­no spa­ri­va­nje iz­među nuk­leo­ti­ da (ade­ni­na [A] s ura­ci­lom [U] i gva­ni­na [G] s ci­to­zi­nom [C]) omo­gućuje jed­nom lan­cu RNA da pos­luži kao ka­lup za sinte­zu no­vo­ga lan­ca s kom­ple­men­tar­nim sli­je­dom.

   5

6    POGLAVLJE 1

Sli­ka 1-3. Og­rađiva­nje sa­moum­nožava­juće RNA fos­fo­li­pid­nom mem­bra­ nom.  Pret­pos­tav­lja se da su se pr­ve sta­ni­ce raz­vi­le og­rađiva­njem sa­moum­nožava­juće RNA i prid­ruženih okol­nih mo­le­ku­la mem­bra­nom građenom od fos­folipi­da. Sva­ka fos­ fo­li­pid­na mo­le­ku­la ima dva du­ga hid­ro­fob­na re­pa ve­za­na za hid­ro­fil­nu sku­pi­nu. Hid­ ro­fob­ni su re­po­vi ug­rađeni u li­pid­ni dvos­loj; hid­ro­fil­ne gla­ve iz­ložene su vo­di s ob­iju stra­na mem­bra­ne.

ima je­din­stve­nu spo­sob­no­st da služi kao ka­lup i da ka­ta­li­zi­ra vlas­ti­tu rep­ li­ka­ci­ju. Sto­ga se o­pćeni­to vje­ru­je da je RNA bi­la ini­ci­jal­ni ge­ne­tički sus­tav, a smatra se da su se rane fa­ze ke­mij­ske evo­lu­ci­je os­ni­va­le na sa­mo­rep­li­ci­ ra­jućim mo­le­ku­la­ma RNA – raz­dob­lje evo­lu­ci­je poz­na­to kao RNA-svi­jet. Sli­je­di­le su broj­ne in­te­rak­ci­je iz­među RNA i ami­no­ki­se­li­na ko­je su evo­lui­ ra­le u da­našnji ge­nski kod, a DNA je ko­načno za­mi­je­ni­la RNA kao ge­ne­ tički ma­te­ri­jal. Pret­pos­tav­lja se da se pr­va sta­ni­ca raz­vi­la ta­ko da se sa­mo­rep­li­ci­ra­juća RNA ok­ružila mem­bra­nom iz­građenom od fos­fo­li­pi­da (sl. 1-3). Fos­fo­li­pi­ di su os­nov­ne kom­po­nen­te svih da­našnjih bio­loških mem­bra­na, uk­ljučujući sta­nične mem­bra­ne ka­ko pro­ka­riot­skih ta­ko i eu­ka­riot­skih sta­ni­ca, o čemu će de­talj­ni­je bi­ti ri­ječi u slje­dećem pog­lav­lju. Ključna oso­bina fos­fo­li­pi­da ko­ji for­mi­ra­ju mem­bra­ne je nji­ho­va am­fi­pa­tičnost, što znači da je je­dan dio mo­le­ku­le top­ljiv u vo­di, a dru­gi ni­je. Fos­fo­li­pi­di ima­ju du­ge, ug­lji­ko­vo­ dične lan­ce ne­top­lji­ve u vo­di (hid­ro­fob­ne), ve­za­ne za u vo­di top­lji­ve (hi­ dro­fil­ne) gla­ve ko­je sad­ržava­ju fos­fat. Kad se uro­ne u vo­du, fos­fo­li­pi­di spon­ta­no stva­ra­ju dvos­loj ta­ko da su fos­fat­ne gla­ve or­ijen­ti­ra­ne prema van u vo­denu sre­dinu, a ug­lji­ko­vo­dični re­po­vi u unut­rašnjo­st, međusob­no se do­di­ru­jući. Ta­kav li­pid­ni dvos­loj ob­li­ku­je sta­bil­nu ba­ri­je­ru iz­među dva­ju vo­de­nih od­je­lja­ka – pa ta­ko, prim­je­ri­ce, od­va­ja unut­rašnjo­st sta­ni­ce od vanj­skog oko­liša. Og­rađiva­nje samo­rep­li­ci­ra­juće RNA i prid­ruženih joj mo­le­ku­la unu­tar fos­fo­li­pid­ne mem­bra­ne mog­lo ih je od­ržati kao je­di­ni­cu, spo­sob­nu za sa­ mo­repro­duk­ci­ju i dalj­nju evo­lu­ci­ju. Moguće je da je, u to vri­je­me, već evo­ lui­ra­la sin­te­za pro­tei­na ovis­na o RNA, pa se u tom slučaju pr­va sta­ni­ca mog­la sas­to­ja­ti od sa­moreplicirajuće RNA i pro­tei­na ko­je je ona ko­di­ra­la.

Evo­lu­ci­ja me­ta­bo­liz­ma Budući da su se sta­ni­ce raz­vi­le u mo­ru or­gan­skih mo­le­ku­la, bi­le su spo­ sob­ne do­bi­va­ti hra­nu i ener­gi­ju iz­rav­no iz svog oko­liša. Ali tak­vo je stanje sa­mo po se­bi og­ra­ničavajuće, pa su sta­ni­ce tre­ba­le raz­vi­ti svo­je vlasti­te me­

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

ha­niz­me za proiz­vod­nju ener­gi­je i sin­te­zu mo­le­ku­la pot­reb­nih za svo­ju re­ pli­ka­ci­ju. Proiz­vod­nja i kon­tro­li­ra­na upo­ra­ba me­ta­bo­ličke ener­gi­je ključna je za sve sta­nične ak­tiv­nos­ti, pa su os­nov­ni me­ta­bo­lički pu­to­vi i do­bi­va­nje energi­je (po­tan­ko opi­sa­no u pog­lav­lju 3) uve­li­ke evo­lu­cij­ski očuva­ni u da­ našnjim sta­ni­ca­ma. Sve sta­ni­ce ko­ris­te ade­no­zi­n-5'-tri­fos­fat (ATP) kao iz­vor me­ta­bo­ličke ener­gi­je za sin­te­zu sta­ničnih di­je­lo­va i iz­vršavanje dru­ gih ak­tiv­nos­ti za ko­je je pot­reb­na ener­gi­ja, po­put kre­ta­nja (prim­je­ri­ce, mišićna kon­trak­ci­ja). Smat­ra se da su se me­ha­niz­mi ko­je sta­ni­ce ko­ris­te za proiz­vod­nju ATP raz­vi­li u tri stup­nja, što od­go­va­ra evo­lu­ci­ji gli­ko­li­ze, fo­ to­sin­te­ze i ok­sida­tiv­no­ga me­ta­bo­liz­ma (sl. 1-4). Raz­voj ovih me­ta­bo­ličkih pu­te­va pro­mi­je­nio je at­mos­fe­ru Zem­lje, čime se pro­mi­je­nio i ti­jek dalj­nje evo­lu­ci­je. Pret­pos­tav­lja se da su prve reak­ci­je stva­ra­nja ener­gi­je u Zem­lji­noj at­ mo­s­fe­ri, ko­ja je u počet­ku bi­la anae­rob­na, uk­ljučiva­le raz­la­ga­nje or­gan­skih mole­ku­la u od­sut­nos­ti ki­si­ka. Te reak­ci­je vje­ro­jat­no pred­stav­lja­ju ob­lik da­ našnje gli­ko­li­ze – anae­rob­ne raz­grad­nje glu­ko­ze u mli­ječnu ki­se­li­nu s čis­ tim do­bit­kom ener­gi­je od dvi­ju mo­le­ku­la ATP. Sve da­nas poz­na­te sta­ni­ce, uz ko­rištenje ATP kao glav­nog iz­vo­ra sta­nične ke­mij­ske ener­gi­je, obav­lja­ju i gli­ko­li­zu što je u skla­du s ide­jom da su se te reak­ci­je po­ja­vi­le vr­lo ra­no ti­je­kom evo­lu­ci­je. Gli­ko­li­za je omo­gućila me­ha­ni­zam ko­jim se ener­gi­ja sad­ržana u već ob­li­ko­va­nim or­gan­skim mo­le­kulama (prim­je­ri­ce, glu­kozi) može pret­vo­ri­ti u ATP ko­ji se ta­da može is­ko­ris­ti­ti kao iz­vor ener­gi­je za pok­re­ta­nje dru­gih me­ta­bo­ličkih reak­ci­ja. Smat­ra se da je raz­voj fo­to­sin­te­ze bio idući ve­li­ki evo­lu­cij­ski ko­rak ko­ji je do­pus­tio da sta­ni­ca is­ko­ris­ti ener­giju Su­nčeve svjet­los­ti čime se pos­tig­la neo­vis­no­st o ko­rište­nju već ob­li­ko­va­nih or­gan­ skih mo­le­ku­la. Pr­va fo­to­sin­te­tička bak­te­ri­ja, ko­ja se raz­vi­la pri­je više od 3 mi­li­jar­de go­di­na, vje­ro­jat­no je ko­ris­ti­la H2S da pret­vo­ri CO2 u or­gan­ske mo­le­ku­le – poz­na­ti oblik fo­to­sin­te­ze ko­ji ne­ke bak­te­ri­je još uvi­jek ko­ris­te. Ko­rište­nje H2O kao do­no­ra elek­tro­na i vo­di­ka za pret­vor­bu CO2 u or­gan­ ske spo­je­ve raz­vi­lo se kas­ni­je, a važna pos­lje­di­ca bi­la je mi­je­nja­nje Zem­lji­ ne at­mos­fe­re. Ko­rište­nje H2O u fo­to­sin­te­tičkim reak­ci­jama stva­ra slo­bod­ni

Sli­ka 1-4. Stva­ra­nje me­ta­bo­ličke ener­gi­je.  Gli­ko­li­za je anae­rob­na raz­grad­nja glu­ ko­ze do mli­ječne ki­se­li­ne. Foto­sin­te­za is­ko­rišta­va ener­gi­ju Su­nčeve svjet­los­ti za sin­te­zu glu­ko­ze iz CO2 i H2O, a pri to­mu se os­lo­bađa O2 kao spo­red­ni pro­du­kt. O2 os­lo­bođen fo­ to­sin­te­zom is­ko­rištava se u ok­si­da­tiv­nom me­ta­bo­liz­mu, u ko­jem se glu­ko­za raz­građuje do CO2 i H2O os­lo­bađajući mno­go više ener­gi­je ne­go što se do­bi­je gli­ko­li­zom.

   7

8    POGLAVLJE 1 O2 kao nus­pro­du­kt, te se smat­ra da je ovaj me­ha­ni­zam bio od­go­vo­ran za stva­ra­nje obil­nih ko­ličina ki­si­ka u Zem­lji­noj at­mos­fe­ri. Os­lo­bađanje O2 kao pos­lje­di­ca fo­to­sin­te­ze pro­mi­je­ni­lo je oko­liš u ko­ jem su se sta­ni­ce raz­vi­ja­le pa se o­pćeni­to smat­ra da je to do­ve­lo do raz­vo­ ja ok­si­da­tiv­no­ga me­ta­bo­liz­ma. S dru­ge stra­ne, mo­guće je da se ok­si­da­tiv­ ni me­ta­bo­li­zam raz­vio pri­je fo­to­sin­te­ze kao re­zul­tat po­ra­sta at­mos­fer­skog O2 što je za pos­lje­di­cu ima­lo ja­ku se­lek­tiv­nu pred­no­st za or­ga­niz­me spo­ sob­ne za ko­rište­nje O2 u reak­ci­ja­ma ko­je proiz­vo­de ener­gi­ju. U sva­kom slučaju, O2 je vi­so­koreak­tiv­na mo­le­ku­la, pa je ok­si­da­tiv­ni me­ta­bo­li­zam, ko­ ris­teći tu reak­tiv­no­st, omo­gućio me­ha­ni­zam za stva­ra­nje ener­gi­je iz or­gan­ skih mo­le­ku­la ko­ji je pu­no efi­kas­ni­ji od anae­robne gli­ko­li­ze. Prim­je­ri­ce, pot­pu­na ok­si­da­tiv­na raz­grad­nja glu­ko­ze na CO2 i H2O stva­ra ener­get­ski ek­vi­va­le­nt od 36 do 38 mo­le­ku­la ATP, za raz­li­ku od 2 mo­le­ku­le ATP ko­je nas­ta­ju anae­rob­nom gli­ko­li­zom (v. sl. 1-4). Uz ne­ko­li­ko iz­ni­ma­ka, da­našnje sta­ni­ce koris­te ok­si­da­tiv­ne reak­ci­je kao svoj glav­ni iz­vor ener­gi­je.

▶▶ Pos­to­ja­nje or­ga­ni­za­ma ko­ji žive u ek­strem­nim uv­je­ti­ma do­ ve­lo je do pos­tav­lja­nja hi­po­te­ze da bi život mo­gao pos­to­ja­ti u sličnom oko­lišu bi­lo gdje u so­ lar­nom sus­ta­vu. Pod­ručje as­tro­ bio­lo­gi­je (ili ek­so­bio­lo­gi­je) traži zna­ko­ve ovak­vog izvanzemalj­ skog živo­ta.

Da­našnji pro­ka­rio­ti Da­našnji pro­ka­rio­ti, u ko­je ub­ra­ja­mo sve raz­ličite ti­po­ve bak­te­ri­ja, po­ di­je­lje­ni su u dvi­je sku­pi­ne – ar­he­bak­te­ri­je i eu­bak­te­ri­je – ko­je su se raz­ dvo­ji­le vr­lo ra­no ti­je­kom evo­lu­ci­je. Ne­ke ar­he­bak­te­ri­je žive u ek­strem­nom oko­lišu ko­ji da­nas ni­je uo­bičajen, ali je vje­ro­jat­no prev­la­da­vao na pri­mi­tiv­ noj Zem­lji. Prim­je­ri­ce, ter­moa­ci­do­fi­li žive u vrućim sum­por­nim vre­li­ma na tem­pe­ra­tu­ra­ma do 80 °C s vr­lo nis­kom pH vri­jed­no­šću (pH = 2). Eu­ bak­te­ri­je, među ko­je spa­da­ju uo­bičaje­ni ob­li­ci da­našnjih bak­te­ri­ja, ve­li­ka su sku­pi­na or­ga­ni­za­ma ko­ja živi u raz­ličitim vr­sta­ma oko­liša kao što su zem­lja, vo­da, i dru­gi or­ga­niz­mi (prim­je­ri­ce, ljud­ski pa­to­ge­ni). Bak­te­rij­ske su sta­ni­ce većinom ok­rug­le, šta­pićaste ili spi­ral­ne, s prom­je­ rom od 1 – 10 µm. Sad­ržaj DNA va­ri­ra od 0,6 mi­lijuna do 5 mi­li­ju­na pa­ ro­va ba­za, što je do­vo­ljno da se ko­di­ra oko 5.000 raz­ličitih pro­tei­na. Najveći i naj­složeni­ji pro­ka­rio­ti su ci­ja­no­bak­te­ri­je – bak­te­ri­je u ko­ji­ma se raz­vi­la fo­to­sin­te­za. Struk­tu­ra ti­pične pro­ka­riot­ske sta­ni­ce ob­jašnje­na je na prim­je­ru bakte­ ri­je Es­che­ric­hia co­li (E. co­li), uo­bičajenog sta­nov­ni­ka lju­dsko­ga pro­bav­nog trak­ta (sl. 1-5). Sta­ni­ca je šta­pićas­ta, prom­je­ra oko 1 µm i du­lji­ne oko 2 µm. Kao i mno­gi dru­gi pro­ka­rio­ti, E. co­li oba­vi­je­na je kru­tom sta­ničnom sti­jen­ kom iz­građenom od po­lisaha­ri­da i pep­ti­da. Is­pod sta­nične sti­jen­ke je sta­ nična mem­bra­na, građena od dvos­lo­ja fos­fo­li­pi­da i prid­ruženih pro­tei­na. Dok je sta­nična sti­jen­ka po­roz­na i la­ko pro­pušta raz­ličite mo­le­ku­le, sta­ nična mem­bra­na osi­gu­ra­va fun­kcio­nal­no od­va­ja­nje iz­među unut­rašnjos­ti sta­ni­ce i vanj­skog oko­liša. Mo­le­ku­la DNA bak­te­ri­je E. co­li je jed­na kružna mo­le­ku­la na­zvana nuk­leoid ko­ji, za raz­li­ku od pra­ve jez­gre (nuk­leu­sa) eu­ ka­rio­ta, ni­je oba­vi­jen mem­bra­nom ko­ja ga od­va­ja od ci­top­laz­me. Ci­top­laz­ ma sad­ržava prib­ližno 30.000 ribo­so­ma (mjesta sin­te­ze pro­tei­na), ko­ji su od­go­vor­ni za nje­zin zr­na­ti iz­gled.

Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce Po­put pro­ka­riot­skih sta­ni­ca, sve eu­ka­riot­ske sta­ni­ce ok­ružene su mem­ bra­na­ma i sad­ržava­ju ri­bo­so­me. Međutim, eu­ka­riot­ske sta­ni­ce mno­go su

Sli­ka 1-5. Elek­tron­sko­mik­ros­kop­ska sli­ka bak­te­ri­je E. co­li.  Sta­ni­ca je oba­vi­je­ na sta­ničnom sti­jen­kom is­pod ko­je se na­la­zi sta­nična mem­bra­na. DNA je smještena u nuk­leoi­du. (Men­ge i Wur­tz/Biozentrum, Uni­ver­si­t y of Ba­sel/Science Pho­to Lib­ra­r y/ Photo Re­sear­ches, Inc.)

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

složeni­je građe i sadržava­ju jez­gru, raz­ličite ci­top­laz­mat­ske orga­ne­le i ci­tos­ ke­let (sl. 1-6). Najveći i najznačaj­ni­ji or­ga­nel eu­ka­riot­skih sta­ni­ca je­st jez­ gra, s prom­je­rom od oko 5 µm. Jez­gra sad­ržava ge­ne­tičku in­for­ma­ci­ju sta­ ni­ce, ko­ja je u eu­ka­rio­ta sad­ržana u li­near­nim, a ne kružnim mo­le­ku­la­ma DNA. Jez­gra je mjes­to gdje se rep­li­ci­ra DNA i sin­te­ti­zi­ra RNA; tran­sla­ci­ja RNA u pro­tei­ne od­vi­ja se na ri­bo­so­mi­ma u ci­top­laz­mi. Uz jez­gru, eu­ka­riot­ska sta­ni­ca sad­ržava u svo­joj ci­top­laz­mi raz­ličite or­ ga­ne­le ok­ružene mem­branom. Ovi organe­li pred­stav­lja­ju od­jelj­ke u ko­ji­ma se od­vi­jaju raz­ličite me­ta­bo­ličke ak­tiv­nos­ti. Eu­ka­riot­ske su sta­ni­ce o­pćeni­to mno­go veće od pro­ka­riot­skih sta­ni­ca, te ima­ju naj­ma­nje ti­suću pu­ta veći sta­nični vo­lu­men. Stva­ra­nje od­je­lja­ka u ob­li­ku ci­top­laz­mat­skih or­ganela osi­gu­ra­va eu­ka­riot­skoj sta­ni­ci efi­kas­ni­je fun­kcio­ni­ra­nje. Dvi­je vr­ste ovih or­ga­ne­la, mi­to­hon­dri­ji i klo­rop­las­ti, ima­ju ključnu ulo­gu u stva­ra­nju me­ ta­bo­ličke ener­gi­je. Mi­to­hon­dri­ji, koje na­lazimo u go­to­vo svim eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, mjes­ta su od­vi­ja­nja ok­si­da­tiv­no­ga me­ta­bo­liz­ma i pre­ma to­mu od­go­vor­ni su za proiz­vod­nju većine mo­le­ku­la ATP do­bi­venih raz­grad­njom or­gan­skih mo­le­ku­la. Klo­rop­las­ti su mjes­ta gdje se od­vi­ja fo­to­sin­te­za i na­ đeni su sa­mo u bilj­nim sta­ni­ca­ma i ze­le­nim al­ga­ma. Li­zo­so­mi i pe­rok­si­so­ mi ta­kođer pred­stav­lja­ju spe­ci­ja­li­zi­ra­ne me­ta­bo­ličke od­jelj­ke – u li­zo­so­mi­ ma se od­vi­ja pro­bava mak­ro­mo­le­ku­la, dok se u pe­rok­si­so­mi­ma od­vi­ja­ju raz­ličite ok­si­da­tiv­ne reak­ci­je. Uz to, mno­ge bilj­ne sta­ni­ce sadržava­ju ve­li­ke va­kuo­le ko­je obav­lja­ju raz­ličite fun­kcije, uk­ljučujući pro­ba­vu mak­ro­mo­le­ ku­la i spre­ma­nje ka­ko ot­pad­nih pro­du­ka­ta ta­ko i hra­nji­vih tva­ri. Zbog ve­ličine i složene građe eu­ka­riot­skih sta­ni­ca, tran­spo­rt pro­tei­na na nji­ho­vo točno od­re­dište unu­tar sta­ni­ce složeni je za­da­tak. Dva ci­top­laz­ mat­ska or­ganela, en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul i Gol­gi­jev apa­rat, ima­ju spe­ci­ fičnu fun­kci­ju u ras­po­ređivanju i tran­spo­rtu pro­tei­na na­mi­je­nje­nih za se­k­ re­ci­ju, ug­rad­nju u sta­ničnu mem­bra­nu i unošenje u li­zo­so­me. En­do­plaz­mat­ski re­ti­ku­l je op­sežna mreža unu­tar­sta­ničnih mem­brana, ko­ja se proteže od jez­gri­ne ovoj­ni­ce kroz čita­vu ci­top­laz­mu. Nje­go­va fun­kci­ja ni­je sa­mo u do­ra­dbi i tran­spor­tu pro­tei­na ne­go ta­kođer u sin­te­zi li­pi­da. Od en­dop­laz­mat­skog re­ti­kula pro­tei­ni se tran­spor­ti­ra­ju unu­tar ma­lih mem­ bran­skih ve­zi­ku­la do Gol­gi­jeva apa­ra­ta, gdje se da­lje do­rađuju i razvr­sta­va­ ju za tran­spo­rt do ko­načnih od­re­dišta. Po­red ulo­ge u tran­spor­tu pro­tei­na, Gol­gi­jev apa­rat pred­stav­lja mjes­to gdje se sin­te­ti­zi­ra­ju li­pi­di, te u bilj­nim sta­ni­ca­ma mjes­to gdje se sin­te­ti­zi­ra­ju ne­ki po­li­sa­ha­ri­di ko­ji iz­građuju sta­ ničnu sti­jen­ku. Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce ima­ju još jed­nu ra­zi­nu unut­rašnje or­ga­ni­za­ci­je: ci­ tos­ke­let, mrežu pro­tein­skih vla­ka­na ko­ja se pros­ti­re kroz ci­top­laz­mu. Ci­ tos­ke­let je struk­tur­na os­no­va sta­ni­ce, od­ređuje sta­nični ob­lik i o­pćeni­tu or­ga­nizaci­ju ci­top­laz­me. Uz to, ci­tos­ke­let je od­go­vo­ran za pok­re­ta­nje ci­je­ lih sta­ni­ca (prim­je­ri­ce, kon­trak­ci­ja mišićnih sta­ni­ca) i za unu­tar­sta­nični tran­spo­rt i po­ložaj or­ga­ne­la i dru­gih struk­tu­ra, uk­ljučujući i kre­ta­nje kro­ mo­so­ma ti­je­kom sta­nične dio­be.

Pod­ri­jetlo eu­ka­rio­ta Stje­ca­nje sta­ničnih or­ga­ne­la ok­ruženih mem­bra­nom bio je ključni ko­ rak u evo­lu­ci­ji eu­ka­riot­skih sta­ni­ca čime je omo­gućen raz­voj složenih ka­ rak­te­ris­ti­ka eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Pret­pos­tav­lja se da su or­ga­ne­li eu­ka­rio­ta nas­ta­li en­do­sim­bio­zom – po­java ka­da jed­na sta­ni­ca živi unu­tar dru­ge. Za­ p­ra­vo, smat­ra se da su se eu­ka­riot­ski or­ga­ne­li raz­vi­li od pro­ka­riot­skih sta­ ni­ca ko­je su ne­ka­da živ­je­le u eu­ka­riot­skom pret­ku. Hi­po­te­za da su eu­ka­riot­ske sta­ni­ce evo­lui­ra­le en­do­sim­biozom dob­ro je pot­kri­jep­lje­na istraživa­nji­ma mi­to­hon­dri­ja i klo­rop­las­ta za ko­je se pret­pos­

   9

10    POGLAVLJE 1

Sli­ka 1-6. Struk­tu­ra živo­tinj­ske i bilj­ ne sta­nice.  Ob­je, i ani­mal­na i bilj­na sta­nica, ok­ružene su mem­bra­nom i sadr­ žava­ju jez­gru, ci­tos­ke­let i mno­ge za­jed­ ni­čke ci­top­lazmat­ske or­ga­ne­le. Bilj­ne su stani­ce još oba­vi­je­ne sta­ničnom sti­jen­ kom i sad­ržava­ju klo­rop­las­te i ve­li­ke va­ kuo­le.

tav­lja da su se raz­vi­li iz eubak­te­ri­ja ko­je su živ­je­le u većim sta­ni­ca­ma. Mito­hon­dri­ji i klo­rop­las­ti slični su bak­te­ri­ja­ma po ve­ličini, a kao i bak­te­ri­ je, um­nažaju se dio­bom. Kao naj­važni­je tre­ba istak­nu­ti da i mi­to­hon­dri­ji i klo­rop­las­ti ima­ju vlas­ti­tu DNA ko­ja ko­di­ra ne­ke nji­ho­ve di­je­lo­ve. DNA mi­to­hon­dri­ja i klo­rop­las­ta rep­li­ci­ra se sva­ki puta kad se or­ga­nel di­je­li, a nje­zi­ni ge­ni pre­pi­su­ju se unu­tar or­ga­ne­la i in­for­ma­ci­ja se pre­vo­di na ri­bo­ so­mi­ma orga­ne­la. Ta­ko mi­to­hon­dri­ji i klo­rop­las­ti ima­ju vlas­ti­te ge­ne­tičke sus­ta­ve, ko­ji se raz­li­ku­ju od ge­no­ma sta­nične jez­gre. Na­da­lje, ri­bo­so­mi i ri­bo­somske mo­le­ku­le RNA ovih or­ga­ne­la srod­ni­ji su bak­te­rij­ski­ma ne­go oni­ma ko­ji su ko­di­ra­ni ge­no­mom jez­gre eu­ka­rio­ta. En­do­sim­bio­tičko pod­ri­jet­lo ovih or­ga­ne­la o­pće je prih­vaćeno, te se smat­ra da su se mi­to­hon­dri­ji raz­vi­li iz ae­rob­nih bak­te­ri­ja, a klo­rop­las­ti iz fo­to­sin­te­tičkih bak­te­ri­ja, kao što su ci­ja­no­bak­te­ri­je. Ud­ruživa­nje s ae­rob­ nom bak­te­ri­jom osi­gu­ra­lo je anae­rob­noj sta­ni­ci pro­vođenje ok­si­da­tiv­nog me­ta­bo­liz­ma. Ud­ruživa­nje s fo­to­sin­te­tičkom bak­te­ri­jom osi­gu­ra­lo je neo­ vis­no­st sta­ni­ce u preh­ram­be­nom pog­le­du, pos­tig­nu­tu spo­sob­no­šću oba­ vlja­nja fo­to­sin­te­ze. Ovak­va en­do­sim­bio­tička ud­ruživa­nja pružila su neo­ bično ve­li­ku predno­st par­tne­ri­ma sim­bio­ze što je omo­gućilo nji­hov evo­lu­cij­ski oda­bir. Vre­me­nom, većina ori­gi­nal­nih ge­na iz ovih bak­te­ri­ja ug­ra­di­la se u ge­nom sta­nične jez­gre, ta­ko da ge­no­mi or­ga­ne­la ko­di­ra­ju još sa­mo neke sas­ta­vne di­je­love sa­mih mi­to­hon­dri­ja i klo­roplas­ta.

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

Pre­ciz­no pod­ri­jet­lo eu­ka­riot­ske sta­ni­ce os­ta­je za sa­da kon­tro­ver­zno i neri­ješeno pi­ta­nje u našem ra­zu­mi­je­va­nju evo­lu­ci­je. Ana­li­ze DNA sek­ven­ ce po­ka­za­le su da su ar­he­bak­te­ri­je i eu­bak­te­ri­je is­to to­li­ko raz­ličite međusob­ no ko­li­ko se raz­li­ku­ju od eu­ka­riota. Sto­ga se čini da su se drev­ne ar­he­bak­ te­ri­je i eu­bak­te­ri­je evo­lu­cij­ski ja­ko ra­no od­vo­ji­le od za­jed­ničkog pret­ka što je re­zul­ti­ra­lo raz­vo­jem da­našnjih ar­he­bak­te­ri­ja i eu­bak­te­ri­ja. Međutim, vr­ lo je teško zak­ljučiti da li su se euk­a­rio­ti raz­vi­li od ar­hebak­te­ri­ja ili eu­bak­ te­ri­ja. Začuđuje činje­ni­ca što su ne­ki eu­ka­riot­ski ge­ni vr­lo slični ge­ni­ma eu­bak­te­ri­ja, dok su ne­ki dru­gi pu­no slični­ji ge­ni­ma ar­he­bak­te­ri­ja. Sto­ga se čini da se ge­nom eu­ka­rio­ta sas­to­ji od ge­na ko­ji pot­ječu i od ar­he­bak­te­ri­ja i od eu­bak­teri­ja, dok je ma­nje vje­ro­jat­no da eu­ka­riot­ski ge­no­mi od­ražava­ ju ge­nom eu­bak­te­rij­skog od­nos­no ar­he­bak­te­rij­skog pret­ka. Iz­ne­nađujuće je to što eu­ka­riot­ski ge­ni ko­ji su uk­ljučeni u in­for­ma­cij­ske pro­ce­se (kao što su rep­li­ka­ci­ja DNA, tran­skrip­ci­ja i sin­te­za protei­na) pot­ječu od ar­he­bak­te­ ri­ja, dok većina eu­ka­riot­skih ge­na uk­ljučenih u o­pće sta­nične pro­ce­se (kao što su gli­ko­li­za i bio­sin­te­za ami­no­ki­se­li­na) pot­ječe od eu­bak­te­ri­ja. Hi­po­te­ze no­vi­jeg da­tu­ma pred­lažu mo­zaičnu pri­ro­du eu­ka­riot­skih ge­ no­ma pre­ma ko­joj bi geno­mi eu­ka­rio­ta bi­li re­zul­tat fu­zi­je ge­no­ma ar­he­ bak­te­ri­ja i ge­no­ma eu­bak­te­ri­ja (sl. 1-7). Pre­ma ovoj hi­po­te­zi, en­do­sim­ bion­tska aso­ci­ja­ci­ja iz­među eu­bak­te­ri­je i ar­he­bak­te­ri­je bi­la je pop­raćena fu­zi­jom dva­ju pro­ka­riot­skih ge­no­ma čime je on­da nas­tao an­ce­stral­ni eu­ka­

   11

▶▶ Ne­ki od da­našnjih mor­skih pro­tis­ta pro­gu­ta­ju al­ge da bi im služili kao en­do­sim­bion­ti ko­ji oba­v­lja­ju fo­to­sin­te­zu za svo­je do­maćine.

12    POGLAVLJE 1

Sli­ka 1-7. Evo­lu­ci­ja sta­ni­ca.  Da­ našnje su se sta­ni­ce raz­vi­le iz za­je­ d­ničko­ga pro­ka­riot­sko­ga pret­ka, ko­ ji je di­ver­gi­rao u dvi­je za­seb­ne li­ni­je po­to­ma­ka iz ko­jih su nas­ta­le da­našnje ar­he­bak­te­rije i eu­bak­te­rije. Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce mog­le su nas­ta­ti en­do­sim­bion­t­ skom aso­ci­ja­ci­jom ae­rob­ne eu­bak­te­ri­je sa ar­he­bak­te­ri­jom, vo­deći ka nas­tan­ku mi­to­hon­dri­ja te for­ma­ci­ji eu­ka­riot­skog geno­ma sas­tav­lje­nog od ge­na ko­ji su pod­ri­jet­lom od eu­bak­te­ri­ja i ar­he­bak­te­ ri­ja. Sli­je­di­la je evo­lu­ci­ja klo­rop­la­sta kao re­zul­tat en­do­sim­bion­tskog ud­ruživa­nja ci­ja­no­bak­te­ri­ja s pred­ci­ma bi­lja­ka. Mo­del nas­tan­ka pr­ve eu­ka­riot­ske sta­ni­ce ba­zi­ ran je na M.C. Ri­vera and J.A. La­ke, 2004, Na­tu­re 431: 152.

riot­ski ge­nom sas­tav­ljen od di­je­lo­va ge­no­ma eu­bak­te­ri­ja i ar­he­bak­te­ri­ja. Naj­jed­nos­tav­ni­ja ver­zi­ja ove hi­po­te­ze kaže da je ini­ci­jal­ni en­do­sim­bion­tski od­nos eu­bak­te­ri­je ko­ja je živ­je­la unu­tar ar­he­bak­te­ri­je do­veo do evo­lu­ci­je mi­to­hon­dri­ja ali i sa­mog ge­no­ma pret­ka eu­ka­riot­ske sta­ni­ce, sto­ga sas­tav­ lje­nog od ge­na ko­ji pot­ječu od oba­ju pro­ka­riot­skih pre­da­ka.

Raz­voj višes­ta­ničnih or­ga­ni­za­ma Mno­gi su eu­ka­rio­ti jed­nos­ta­nični or­ga­niz­mi ko­ji su, po­put bak­te­ri­ja, iz­građeni sa­mo od jed­ne sta­ni­ce spo­sob­ne za samoum­nažanje. Naj­jed­nos­ tav­ni­ji eu­ka­rio­ti su kvas­ci. Kvas­ci su mno­go složeni­ji od bak­te­ri­ja, ali mno­ go ma­nji i jed­nos­tav­ni­ji od sta­ni­ca živo­ti­nja ili bi­lja­ka. Prim­je­ri­ce, na­jče­šće is­traživa­ni kva­sac Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­siae prom­je­ra je oko 6 µm, a nje­go­ va DNA sad­ržava 12 mi­li­ju­na pa­ro­va ba­za (sl. 1-8). Međutim, osta­li jed­ nos­ta­nični eu­ka­rio­ti su mno­go složeni­je sta­ni­ce, a ne­ke sad­ržava­ju jed­na­ko DNA kao i ljud­ske sta­ni­ce. Ne­ki od njih su spe­ci­ja­li­zi­ra­ni za iz­vršava­nje naj­raz­ličiti­jih za­da­ta­ka, uk­ljučujući fotosin­te­zu, pok­re­ta­nje, te hva­ta­nje i gu­ta­nje dru­gih or­ga­ni­za­ma ra­di prehra­ne. Amoe­ba pro­teus, prim­je­ri­ce, ve­ li­ka je sta­ni­ca složene građe. Nje­zin je vo­lu­men više od 100.000 pu­ta veći od jed­nos­ta­nične E. co­li, a du­lji­na pre­mašuje 1 mm kad je sta­nica pot­pu­no is­pružena (sl. 1-9). Ame­ba je iz­nim­no pok­re­tan or­ga­ni­zam ko­ji upot­reb­ lja­va ci­top­laz­mat­ske iz­dan­ke, naz­va­ne pseu­do­po­di­ji, za kre­ta­nje i proždi­ ra­nje hra­ne ko­ju čine dru­gi or­ga­niz­mi po­put bak­te­ri­ja i kva­sa­ca. Dru­gi jed­nos­ta­nični eu­ka­rio­ti (ze­le­ne al­ge) sa­država­ju klo­rop­las­te i spo­sob­ni su obav­lja­ti fo­to­sin­te­zu.

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

   13

Sli­ka 1-8. Sli­ka kvas­ca Sac­c­ha­ro­myces ce­re­vi­siae do­bi­ve­na pret­ražnim elek­tron­ skim mik­ros­kopom.  Fo­tog­ra­f i­ja je um­jet­no obo­je­na. (© Me­di­ca­l-o­n-Li­ne/Alamy)

Višes­tanični or­ga­niz­mi raz­vi­li su se iz jed­nos­ta­ničnih eu­ka­rio­ta pri­je više od bi­li­jun go­di­na. Ne­ki jed­nos­ta­nični eu­ka­rio­ti ob­li­ku­ju višes­ta­nične ag­re­ga­te, pa se smat­ra da pred­stav­lja­ju evo­lu­cij­ski pri­je­laz od jed­ne sta­ni­ce pre­ma višes­ta­ničnim or­ga­niz­mi­ma. Ta­ko se sta­ni­ce mno­gih al­gi (prim­je­ri­ ce, ze­le­ne al­ge Vol­vox) međusob­no ud­ružuju i tvo­re višes­ta­nične ko­lo­ni­je (sl. 1-10), za ko­je se smat­ra da su evo­lu­cij­ske pre­teče da­našnjih bi­lja­ka. Povećanje sta­nične spe­ci­ja­li­za­ci­je ta­da je do­ve­lo do prije­las­ka ko­lo­ni­jal­nih ag­re­ga­ta u pra­ve višes­ta­nične or­ga­niz­me. Nas­tav­lja­nje sta­nične spe­ci­ja­li­za­ ci­je i pod­je­la ra­da među sta­ni­ca­ma jed­nog or­ga­niz­ma do­ve­le su do slo­že­ nos­ti i raz­ličitos­ti ko­je se mo­gu opa­zi­ti pro­mat­ra­njem mno­gih ti­po­va sta­ ni­ca od ko­jih su izgrađeni biljni i životinjski or­ga­niz­mi, te čov­ječji or­ga­ni­zam. Bilj­ke su iz­građene od ma­njeg bro­ja raz­ličitih ti­po­va sta­ni­ca ne­go živo­ ti­nje, ali sva­ka od raz­ličitih bilj­nih sta­ni­ca spe­ci­ja­li­zi­ra­na je za pro­vođenje spe­ci­fičnih za­da­ta­ka pot­re­bnih ci­je­lom or­ga­niz­mu (sl. 1-11). Sta­ni­ce bi­lja­ ka or­ga­ni­zi­ra­ne su u tri glav­na sus­ta­va tki­va: os­nov­no tki­vo, kožno tki­vo i pro­vod­no tki­vo. Os­nov­no tki­vo sad­ržava pa­ren­him­ske sta­ni­ce ko­je iz­vo­de većinu me­ta­bo­ličkih reak­ci­ja bilj­ke, uk­ljučujući i fo­to­sin­te­zu. Os­nov­no tki­ vo ta­kođer sad­ržava dvi­je spe­ci­ja­li­zi­ra­ne vr­ste sta­ni­ca (ko­len­him­ske i skle­ ren­him­ske sta­ni­ce) ko­je ima­ju ka­rak­te­ris­tičnu de­be­lu sta­ničnu sti­jen­ku i

Sli­ka 1-9. Sli­ka vr­ste Amoe­ba pro­teus do­bi­ve­na po­moću svjet­losnog mik­ ros­ko­pa.  (M. I. Wal­ker/Photo Re­sear­ che­rs, Inc.)

Sli­ka 1-10. Ko­lo­ni­je ze­le­nih al­gi.  Po­je­di­načne sta­ni­ce al­ge Vol­vox ob­li­ku­ju ko­lo­ ni­je sas­tav­lje­ne od šupljih lop­ti u ko­ji­ma se na­la­zi sto­ti­ne ili ti­suće sta­ni­ca uk­lop­ lje­no u žela­ti­noz­ni mat­ri­k s. (Ca­bis­co/Visuals Un­li­mi­ted.)

14    POGLAVLJE 1 Sli­ka 1-11. Sli­ke tipičnih bi­ljnih sta­ni­ ca do­bi­ve­ne svjet­lo­snim mik­ros­ko­ pom.  (A) Pa­ren­him­ske sta­ni­ce ko­je su odgo­vor­ne za fo­to­sin­te­zu i dru­ge me­ta­ bo­ličke reak­ci­je. (B) Ko­len­him­ske sta­ni­ce, spe­ci­ja­li­zi­ra­ne su pot­por­ne sta­ni­ce s de­ be­lim sta­ničnim sti­jen­ka­ma. (C) Epi­der­ mal­ne sta­ni­ce na pov­ršini lis­ta. Sićušne po­re (sto­me, puči) ok­ružene su spe­ci­ja­ li­­zi­ra­nim sta­ni­ca­ma ko­je se zo­vu zaštit­ne sta­ni­ce. (D) Pro­vod­ni ele­men­ti i tra­hei­de su iz­dužene sta­ni­ce po­re­da­ne u ni­zu s jed­nog kraja bilj­ke na dru­gi, te obli­ku­ju žile ksi­le­ma. (A, Ja­ck M. Bas­tsa­ck/Visuals Un­li­mi­ted; B, A. J. Kar­po­f f/Vi­sua­ls Un­li­ mi­­ted; C, Al­fred Owczar­zak/Biological Pho­to Ser­vi­ce; D, Biop­ho­to As­so­cia­tes/ Science Sour­ce/Photo Re­sear­che­rs Inc.)

pružaju struk­tur­nu pot­po­ru bilj­ci. Kožno tki­vo pok­ri­va pov­ršinu bilj­ke i iz­građeno je od epi­der­mal­nih sta­ni­ca ko­je ob­li­ku­ju zaštit­ni sloj te omo­ gućuju ap­sor­pci­ju hra­nji­vih tva­ri. Ko­načno, ne­ko­li­ko raz­ličitih ti­po­va iz­ duženih sta­ni­ca gra­di pro­vod­ni sus­tav (ksi­lem i floem), ko­ji je od­go­vo­ran za tran­spo­rt vo­de i hra­nji­vih tva­ri kroz bilj­ku. U živo­ti­nja se na­la­zi mno­go više raz­ličitih sta­ni­ca ne­go u bi­lja­ka. Pri­ mje­ri­ce, ljud­sko je ti­je­lo iz­građeno od više od 200 raz­ličitih ti­po­va sta­ni­ca, za ko­je se o­pćeni­to smat­ra da su sas­tav­ni di­je­lo­vi pet glav­nih tki­va: epi­tel­ no­ga tki­va, ve­ziv­no­ga tki­va, kr­vi, ži­včano­ga tki­va i mišićno­ga tki­va (sl. 1-12). Epi­tel­ne sta­ni­ce tvo­re slo­je­ve ko­ji pok­ri­va­ju pov­ršinu ti­je­la i unu­ tar­njih or­ga­na. Ima mno­go raz­ličitih vr­sta epi­tel­nih sta­ni­ca, a sva­ka je spe­ ci­ja­li­zi­ra­na za od­ređenu fun­kci­ju kao što je zašti­ta (koža), ap­sor­pci­ja (pri­ mje­ri­ce, sta­ni­ce tan­ko­ga crije­va) i sek­re­ci­ja (prim­je­ri­ce, sta­ni­ce žli­jez­da sli­nov­ni­ca). U ve­ziv­no tki­vo ub­ra­ja­mo ko­st, hr­ska­vi­cu i mas­no tki­vo, a sva­ ko od njih tvo­re raz­ličite vr­ste stani­ca (os­teob­las­ti, hon­dro­ci­ti od­nos­no adi­po­ci­ti). Rah­lo ve­ziv­no tki­vo ko­je leži is­pod epi­tel­no­ga slo­ja i po­pu­nja­va pros­to­re iz­među or­ga­na i tki­va u ti­je­lu sačinje­no je od dru­ge vr­ste sta­ni­ca, fib­rob­las­ta. Krv sad­ržava ne­ko­li­ko raz­ličitih vr­sta sta­ni­ca, ko­je ima­ju fun­ kci­ju u tran­spor­tu ki­si­ka (cr­ve­ne kr­vne sta­ni­ce ili erit­ro­ci­ti), upal­nim re­ ak­ci­ja­ma (granu­lo­ci­ti, mo­no­ci­ti i mak­ro­fa­gi) i imu­nood­go­vo­ru (lim­fo­ci­ ti). Ži­včano je tki­vo građeno od ži­včanih sta­ni­ca ili neu­ro­na, ko­je su vi­so­kospe­ci­ja­li­zi­ra­ne za pri­je­nos signa­la kroz ti­je­lo. Raz­ličite su vr­ste os­je­ til­nih sta­ni­ca, kao što su sta­ni­ce u oku ili uhu, još k to­me spe­ci­ja­li­zi­ra­ne za

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

Sli­ka 1-12. Sli­ke ti­pičnih živo­tinj­skih sta­ni­ca do­bi­ve­ne svjet­lo­snim mik­ro­ skopom.  Epi­tel­ne sta­ni­ce usti­ju (de­ be­­li, mno­gos­loj­ni pok­rov), žučovo­da i cri­­je­va. (B) Fib­rob­las­ti su sta­ni­ce ve­ziv­ no­ga tki­va ka­rak­te­ris­tičnog iz­duženog, vre­te­nas­tog ob­li­ka. (C) Erit­ro­ci­ti, gra­nu­ lo­ci­ti, lim­fo­ci­ti i mono­ci­ti u ljud­skoj kr­vi. [(A)i i (A)ii, G. W. Wil­lis/Biological Pho­to Ser­vi­ce; (A)iii, Biop­ho­to As­so­cia­tes/Photo Re­sear­che­rs, Inc.; B, Don W. Fawce­tt/Vi­ suals Un­li­mi­ted; C, G. W. Wil­lis/Biological Pho­to Ser­vi­ce.]

pri­ma­nje sig­na­la iz oko­liša. Ko­načno, ne­ko­li­ko raz­ličitih ti­po­va mišićnih sta­ni­ca od­go­vor­no je za stva­ra­nje si­le i kre­ta­nja. Jas­no je da evo­lu­ci­ja živo­ti­nja uk­ljučuje raz­voj od­go­va­ra­juće raz­no­li­ko­ sti i spe­ci­ja­li­za­ci­je na staničnoj ra­zi­ni. Ra­zu­mi­je­va­nje me­ha­ni­za­ma ko­ji kon­tro­li­ra­ju ra­st i di­fe­ren­ci­ja­ci­ju ta­ko složenog ni­za spe­ci­ja­li­zi­ra­nih sta­ni­ ca, po­la­zeći od jed­ne je­di­ne op­lođene jaj­ne sta­ni­ce, je­dan je od glav­nih iza­zo­va s ko­jim se suočava suv­re­me­na sta­nična i mo­le­ku­lar­na biolo­gi­ja.

   15

16    POGLAVLJE 1

Sta­ni­ce kao ek­spe­ri­men­tal­ni mo­de­li Evo­lu­ci­ja da­našnjih sta­ni­ca iz za­jed­ničko­ga pret­ka ima značajne im­pli­ ka­ci­je za sta­ničnu i mo­le­ku­lar­nu bio­lo­gi­ju kao ek­spe­ri­men­tal­nu zna­no­st. Budući da su os­nov­na svoj­stva svih sta­ni­ca očuva­na ti­je­kom evo­lu­ci­je, te­ melj­ni prin­ci­pi spoz­na­ni iz ek­spe­ri­me­na­ta s jed­nom vr­stom sta­ni­ca, o­pćeni­ to su prim­je­nji­vi na dru­ge vr­ste sta­ni­ca. S dru­ge stra­ne, zbog ve­li­ke raz­no­ li­kos­ti da­našnjih sta­ni­ca, mno­ge vr­ste ek­spe­ri­me­na­ta mo­gu se mno­go la­kše iz­ves­ti s jed­nom vr­stom sta­ni­ca nego s ne­kom dru­gom. Ne­ko­li­ko raz­ličitih vr­sta sta­ni­ca i or­ga­ni­za­ma o­pćeni­to se ko­ris­ti kao ek­spe­ri­men­tal­ne mo­de­le u is­traživa­nju raz­ličitih pod­ručja sta­nične i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je. Kao što je pri­ka­za­no u slje­dećim od­lom­ci­ma svoj­stva od­ređenih sta­ni­ca čine ih po­ seb­no po­god­nim po­kus­nim mo­de­li­ma. U mno­gim slučaje­vi­ma, dos­tup­ nost pot­pu­no sek­ven­ci­ra­nog ge­no­ma još do­dat­no pod­cr­ta­va vri­jed­no­st od­ ređenih or­ga­ni­za­ma kao mo­del­nih sis­te­ma u ra­zu­mi­je­va­nju mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je sta­ni­ce.

Es­che­ric­hia co­li Pro­ka­riot­ske sta­ni­ce (bak­te­ri­je) su, zbog svo­je kom­pa­ra­tiv­ne jed­nos­tav­ nos­ti, ideal­ni mo­de­li za is­traživa­nje te­melj­nih pro­ce­sa u bio­ke­mi­ji i mo­le­ ku­lar­noj bio­lo­gi­ji. Bak­te­rij­ska vrsta ko­ja je naj­te­me­lji­ti­je is­tražena je bak­te­ ri­ja E. co­li, ko­ja je du­go bi­la i na­jo­mi­lje­ni­ji or­ga­ni­zam za is­traživa­nje os­no­v­nih me­ha­ni­za­ma mo­le­ku­lar­ne ge­ne­ti­ke. Većina naših da­našnjih spoz­ na­ja iz mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je – uk­ljučujući naše ra­zu­mi­je­va­nje rep­li­ka­ci­je DNA, ge­nsko­ga ko­da, ek­spre­si­je ge­na i sin­te­ze pro­tei­na – proi­zišle su iz is­traživanja ove skrom­ne bak­te­ri­je. E. co­li izu­zet­no je ko­ris­na mo­le­ku­lar­nim bio­lo­zi­ma zbog svo­je re­la­tiv­ne jed­nos­tav­nos­ti i la­koće ko­jom se može raz­množava­ti i is­traživa­ti u la­bo­ra­ to­ri­ju. Ge­nom E. co­li, prim­je­ri­ce, sas­to­ji se od ot­pri­li­ke 4,6 mi­li­ju­na parova Tab­li­ca 1-2. Sad­ržaj DNA u sta­ni­ca­ma Ko­ličina hap­loid­ne DNA Or­ga­ni­zam Broj gena (mi­li­ju­ni pa­ro­va ba­za) Bak­te­ri­je Mycop­las­ma 0,6 470 E. co­li 4,6 4.300 Jed­nos­ta­nični eu­ka­rio­ti Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­siae (kva­sac) 12 6.000 Dic­tyoste­lium dis­coi­deum 70 nepoznato Eug­le­na 3.000 nepoznato Bilj­ke Ara­bi­dop­sis tha­lia­na 125 26.000 Zea mays (kukuruz) 5.000 nepoznato Živo­ti­nje Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns (ob­lić) 97 19.000 Dro­sop­hi­la me­la­no­gas­ter 180 20–23.000   (vin­ska mušica) pi­le 1.200 20–25.000 zeb­ras­ta ri­ba 1.700 20–25.000 miš 3.000 20–25.000 čov­jek 3.000 20–25.000

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

ba­za i sad­ržava oko 4.300 ge­na. Ljud­ski je ge­nom go­to­vo ti­suću pu­ta veći (prib­ližno 3 mi­li­jar­de pa­ro­va ba­za) i pret­pos­tav­lja se da sad­ržava 20–25.000 ge­na (ta­bl. 1-2). Ma­li ge­nom E. co­li (ko­ji je pot­pu­no sek­ven­ci­ran 1997. go­di­ne) pred­stav­lja očig­led­nu pred­no­st za ge­ne­tičke ana­li­ze. Mo­le­ku­lar­noge­ne­tičke ek­spe­ri­men­te na­da­lje ola­kšava br­zi ra­st E. co­li pod dob­ro de­fi­ni­ra­nim la­bo­ra­to­rij­skim uv­je­ti­ma. U op­ti­mal­nim uv­je­ti­ma kul­tu­re, E. co­li di­je­li se sva­kih 20 mi­nu­ta. Što­više, klo­nal­na po­pu­la­ci­ja E. co­li, u ko­joj su sve sta­ni­ce do­bi­ve­ne dio­ba­ma iz jed­ne is­hod­ne sta­ni­ce, može bi­ti la­ko izo­li­ra­na kao ko­lo­ni­ja ko­ja ras­te u po­lu­te­kućem me­di­ju (sl. 1-13). Budući da se bak­te­rij­ske ko­lo­ni­je ko­je sad­ržava­ju čak 108 sta­ni­ca mo­gu raz­vi­ti pre­ko noći, izolaci­ja od­ređene ge­ne­tičke va­ri­jan­te so­ja E. co­li – prim­je­ri­ce, mu­tan­te re­zis­ten­tne na an­ti­bio­tik kao što je pe­ni­ci­lin – la­ka je i br­za. Lakoća ko­jom tak­vi mu­tan­ti mo­gu bi­ti izo­li­ra­ni i ana­li­zi­ra­ni bi­la je ključni fak­tor za us­pjeh ek­spe­ri­me­na­ta ko­ji su de­fi­ni­ra­li te­melj­na načela mo­le­ku­la­rne ge­ne­ti­ke, što će bi­ti ob­jašnje­no u pog­lav­lju 4. Hra­nji­vi me­dij u ko­jem se E. co­li naj­brže di­je­li sas­to­ji se od glu­ko­ze, so­ li, i raz­ličitih or­gan­skih spo­je­va, po­put ami­no­ki­se­li­na, vi­ta­mi­na i prekur­so­ra nuk­lein­skih ki­se­li­na. Međutim, E. co­li može ta­kođer ras­ti na mno­go jed­nos­ tav­ni­jim me­di­ji­ma ko­ji sad­ržava­ju sa­mo so­li, iz­vor dušika (kao što je amo­ ni­jak) i iz­vor ug­lji­ka i ener­gi­je (kao što je glu­ko­za). U tak­vom me­di­ju, bak­ te­ri­je ras­tu nešto spo­ri­je (vri­je­me dio­be je oko 40 mi­nu­ta) jer mo­ra­ju sa­me sin­te­ti­zi­ra­ti sve ami­no­ki­se­li­ne, nuk­leo­ti­de i dru­ge or­gan­ske spo­je­ve. Spo­ sob­no­st E. co­li da obavlja ove biosin­te­tičke reak­ci­je u jed­nos­tav­nim de­fi­ni­ ra­nim me­di­ji­ma učini­la ih je izu­zet­no po­god­nim za raz­jašnja­va­nje bio­ke­ mij­skih pu­to­va. Dak­le, br­zi ra­st i je­dnos­tav­ni hra­nid­be­ni zah­tje­vi bak­te­ri­je E. co­li uve­li­ke su ola­kšali os­nov­ne ek­spe­ri­men­te u mo­le­ku­lar­noj bio­lo­gi­ji i bio­ke­mi­ji.

   17

Sli­ka 1-13. Bak­te­rij­ske ko­lo­ni­je.  Sli­ ka koloni­ja bak­te­ri­je E. co­li ko­je ras­tu na pov­ršini agaroznog me­di­ja. (A. M. Sie­ gel­man/Visuals Un­li­mi­ted)

Kvas­ci Ia­ko su bak­te­ri­je neo­bično vri­je­dan mo­del za is­traživa­nje mno­gih evo­ lu­cij­ski očuva­nih svoj­sta­va sta­ni­ce, one ipak ni­su po­godne za is­traživa­nje sta­nične struk­tu­re i fun­kci­je je­din­stve­ne za eu­ka­rio­te. Kvas­ci, naj­jed­nos­tav­ ni­ji eu­ka­rio­ti, ima­ju broj­ne ek­spe­ri­men­tal­ne pred­nos­ti slične oni­ma u E. co­li. Sto­ga su kvas­ci pos­ta­li os­nov­ni mo­del za stu­dije mno­gih te­melj­nih pro­ce­sa u sta­ničnoj bio­lo­gi­ji eu­ka­rio­ta. Ge­nom na­jče­šće is­traživa­no­ga kvas­ca, Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­siae, sas­to­ji se od oko 12 mi­li­ju­na pa­ro­va ba­za DNA i sad­rži oko 6.000 ge­na. Prem­da je ge­nom kvas­ca oko tri pu­ta veći ne­go ge­nom E. co­li, ipak ga je pu­no la­kše istraživa­ti nego ge­nome složeni­je građenih eu­ka­rio­ta, kao što su lju­di. Ia­ko pu­no jed­nos­ta­vnija, sta­ni­ca kvas­ca po­ka­zu­je sve ti­pične oso­bi­ne eu­ka­riot­ ske sta­ni­ce (sl. 1-14): kva­ščeva sta­ni­ca ima jez­gru oba­vi­je­nu jez­gri­nom ovoj­ni­com, nje­zi­na je ge­nom­ska DNA or­ga­ni­zi­ra­na u 16 li­near­nih kro­mo­ so­ma, a ci­top­laz­ma sad­ržava ci­tos­ke­let i sta­nične or­ga­ne­le. Kvas­ci se mo­gu la­ko uz­ga­ja­ti u la­bo­ra­to­ri­ju i mo­gu se is­traživa­ti mno­ gim od mo­le­ku­lar­nih pris­tu­pa ko­ji su us­pješni i u is­traživa­nji­ma E. co­li. Prem­da se kvas­ci ne mo­gu raz­množava­ti ta­ko br­zo kao bak­te­ri­je, oni se ipak čes­to di­je­le, sva­ka 2 sa­ta, a mo­gu se i laga­no uz­go­ji­ti ko­lo­ni­je iz jed­ne je­di­ne sta­ni­ce. Pre­ma to­mu, kvas­ci se mo­gu ko­ris­ti­ti za raz­ličite ge­ne­tičke ma­ni­pu­la­ci­je slične oni­ma ko­je se pro­vo­de na bak­te­ri­ja­ma. Ove su oso­bi­ne učini­le sta­ni­cu kvas­ca naj­pris­tu­pačni­jom eu­ka­riot­skom sta­ni­com sa sta­ja­lišta mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je. Mu­tan­ti kvas­ca pos­ta­li su važni za ra­zu­mi­je­va­nje mno­gih os­nov­nih pro­ce­sa u eu­ka­rio­ta, uk­ljučujući rep­li­ka­ci­ju DNA, tran­skrip­ci­ju, do­ra­dbu RNA, raz­vrsta­va­nje pro­tei­na i re­ gu­la­ci­ju sta­nične dio­be, o čemu ćemo ras­prav­lja­ti u slje­dećim pog­lav­lji­ma.

Sli­ka 1-14. Elek­tron­sko­mik­ros­kop­ska snim­ka kvas­ca Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­ siae.  (Da­vid Scha­r f/Peter Ar­no­ld, Inc.)

18    POGLAVLJE 1 Sli­ka 1-15. Cae­nor­hab­di­ti­s e­le­ga­ns.  (Iz: J. E. Sul­ston i H. R. Hor­vi­tz, 1997. Dev. Biol. 56:110.)

Da je mo­le­ku­lar­na bio­lo­gi­ja sta­ni­ce je­din­stve­na pos­ta­lo je očito činje­ni­com da su os­nov­na načela sta­nične struk­tu­re i fun­kci­je, ot­kri­ve­na is­traživa­njima na kvascu, prim­je­nji­va na sve eu­ka­riot­ske sta­ni­ce.

Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns Jed­nos­ta­nični kvas­ci važni su mo­de­li za is­traživa­nje eu­ka­riot­skih sta­ni­ ca, ali za ra­zu­mi­je­va­nje raz­vo­ja višes­ta­ničnih or­ga­ni­za­ma pot­reb­ne su ek­ spe­ri­men­tal­ne ana­li­ze bi­lja­ka i živo­ti­nja, koji pred­stav­lja­ju mno­go složeni­ je or­ga­niz­me. Oblić Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns (sl. 1-15) ima ne­ko­li­ko zna­čaj­nih oso­bi­na ko­je ga čine jed­nim od naj­više rab­lje­nih mo­de­la za pro­ učava­nje raz­vo­ja živo­ti­nja i sta­nične di­fe­ren­ci­ja­ci­je. Prem­da je ge­nom C. ele­ga­ns (oko 100 mi­li­ju­na pa­ro­va ba­za) veći od ge­ ­no­ma jed­nos­ta­ničnih eu­ka­rio­ta, ipak je jed­nos­tav­ni­ji i mno­go po­god­ni­ji za is­traživa­nja od većine ani­mal­nih ge­no­ma. Kom­plet­no sek­ven­ci­ra­ni ge­nom C. ele­ga­ns ot­krio je sad­ržaj od oko 19.000 ge­na – što pred­stav­lja ot­pri­like tri pu­ta više ge­na ne­go što ih ima kvasac i go­to­vo is­ti broj ge­na ko­li­ko ih ima­ ju lju­di. Bio­loški gle­da­no, C. ele­ga­ns je re­la­tiv­no jed­nos­ta­van višes­ta­nični or­ ga­ni­zam: od­ras­le je­din­ke sad­ržava­ju sa­mo 959 so­mat­skih sta­ni­ca i oko 1.000 do 2.000 sta­ni­ca ger­minati­vne li­ni­je. Uz to, C. ele­ga­ns se može la­ko uz­ga­ja­ti u la­bo­ra­to­rij­skim uvje­ti­ma i po­go­dan je za ge­ne­tičke ma­ni­pu­la­cije. Jed­nos­tav­no­st građe C. ele­ga­ns omo­gućila je de­talj­no proučava­nje ti­je­ka nje­go­va raz­vit­ka po­moću mik­ros­ko­pa. Ovak­ve ana­li­ze us­pješno su ot­kri­le em­brio­nal­no pod­ri­je­tlo i lozu od ko­je su po­tek­le sve sta­ni­ce od­ras­le je­din­ ke. Ge­ne­tičke ana­li­ze su ta­kođer ot­kri­le mno­ge mu­ta­ci­je od­go­vor­ne za raz­ voj­ne ab­nor­mal­nos­ti, što je omo­gućilo izo­la­ciju i ka­rak­te­ri­za­ci­ju ključnih ge­na u kon­tro­li raz­vit­ka i di­fe­ren­ci­ja­ci­je ob­lića. Važno ot­kriće je da slični ge­ni ima­ju ana­log­nu fun­kci­ju u složenim živo­ti­nja­ma (uk­ljučujući čov­je­ka), što C. ele­ga­ns čini važnim mo­de­lom za proučava­nje raz­vit­ka živo­ti­nja.

Dro­sop­hi­la me­la­no­gas­ter

Sli­ka 1-16. Dro­sop­hi­la me­la­no­gas­ter.  (Dar­win Da­le/Photo Re­sear­che­rs, Inc.)

Po­put C. ele­ga­ns, vin­ska mušica Drosop­hi­la me­la­no­gas­ter (sl. 1-16) pred­stav­lja važan ani­mal­ni mo­del u raz­voj­noj bio­lo­gi­ji. Ge­nom vin­ske mu­ šice sad­rži 180 mi­li­ju­na pa­ro­va ba­za, znači veći je od ge­no­ma C. ele­gans, ia­ko sad­ržava sa­mo oko 14.000 ge­na. Na­da­lje, vin­ska se mušica može la­ko uz­gaja­ti i od­ržava­ti u la­bo­ra­to­ri­ju, a nje­zin kra­tak rep­ro­duk­cij­ski cik­lus (oko dva tjed­na) čini je vr­lo po­god­nim or­ga­niz­mom za ge­ne­tičke ek­spe­ri­ men­te. Mno­gi os­nov­ni prin­ci­pi ge­ne­ti­ke – kao što je od­nos iz­među ge­na i kro­mo­so­ma – proi­zišli su iz is­traživa­nja prove­de­nih na vin­skoj mušici počet­kom dva­de­se­to­ga sto­ljeća (vi­di pog­lav­lje 4). Iscr­pna ge­ne­tička ana­li­za vin­ske mušice ot­kri­la je mno­ge ge­ne ko­ji kon­ tro­li­ra­ju raz­voj i di­fe­ren­ci­ja­ci­ju, a sa­dašnje me­to­de mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

   19

omo­gućile su de­talj­nu ana­li­zu funkci­je tih ge­na. Kao re­zul­tat to­ga, is­ traživa­nja pro­ve­de­na na vin­skoj mušici do­ve­la su do značaj­no­ga nap­ret­ka u ra­zu­mi­je­va­nju mo­le­ku­lar­nih me­ha­ni­za­ma ko­ji up­rav­lja­ju raz­vo­jem živo­ tinj­skih or­ga­ni­za­ma, oso­bi­to s ob­zi­rom na us­pos­tav­lja­nje pla­na građe ti­je­la složenih višes­ta­ničnih or­ga­ni­za­ma. Ut­vrđeno je da slični ge­ni i me­ha­niz­mi pro­nađeni u vin­skoj mušici (baš kao i u C. ele­ga­ns) pos­to­je i u kra­lježnja­ka što je pot­vr­di­lo upot­reb­lji­vo­st vin­ske mušice kao jed­nog od glav­nih ekspe­ ri­men­ta­lnih mo­de­la u suv­re­me­noj razvoj­noj bio­lo­gi­ji.

Ara­bi­dop­sis tha­lia­na Is­traživa­nje bilj­ne mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je i raz­vo­ja bilj­nog or­ga­niz­ma jest ak­tiv­no i sve op­sežni­je pod­ručje značaj­ne eko­nom­ske važnos­ti kao i in­te­lek­tual­nog in­te­re­sa. Budući da ge­no­mi bi­lja­ka ima­ju ra­zi­nu složenos­ti us­po­re­di­vu sa živo­tinj­skim ge­no­mi­ma (v. ta­bl. 1-2), op­ti­mal­ni mo­del za is­traživa­nje bilj­nog raz­vo­ja tre­bao bi bi­ti re­la­tiv­no jed­nos­ta­van or­ga­ni­zam s ne­kim po­god­nim svoj­stvi­ma slično or­ga­niz­mi­ma C. ele­ga­ns i D. me­la­no­ gas­ter. Ma­le­na cvjet­ni­ca uročnjak ili Ara­bi­dop­sis tha­lia­na (sl. 1-17) is­pu­ nja­va te kri­te­ri­je i zbog to­ga se na­ve­li­ko ko­ris­ti kao mo­del za is­traživa­nje bilj­ne mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je. A. tha­lia­na po­god­na je bilj­ka zbog svo­je­ga ge­no­ma od sve­ga oko 120 mi­li­ju­na pa­ro­va ba­za. Uročnjak sad­rži ukupno 26.000 ge­na, od ko­jih su mno­gi po­nov­lje­ni više pu­ta u ge­no­mu, a sve­ga 15.000 ge­na je uni­kat­no što pred­stav­lja složeno­st sličnu onoj u or­ga­ni­za­ma C. ele­ga­ns i D. me­la­no­gas­ ter. Osim to­ga, A. tha­lia­na re­la­tiv­no se la­ko uz­ga­ja u la­bo­ra­to­ri­ju, te su raz­vi­jene me­to­de ko­je omo­gućava­ju mo­le­ku­la­rnoge­ne­tičke ma­ni­pu­la­cije ovom bilj­kom. Upot­re­ba ovih me­to­da do­ve­la je do iden­ti­fi­ka­ci­je ge­na uk­ lju­čenih u raz­ličite as­pek­te bilj­nog raz­vo­ja, kao što je raz­voj cvi­je­ta. Ana­li­ za ovih ge­na po­ka­zu­je mno­ge sličnos­ti, ali i iz­razite raz­li­ke, iz­među me­ha­ ni­za­ma ko­ji kon­tro­li­ra­ju raz­voj bi­lja­ka i živo­ti­nja.

Kra­lježnja­ci Naj­složeni­je živo­ti­nje je­su kra­lježnja­ci, uk­ljučujući lju­de i dru­ge si­sav­ce. Ljud­ski ge­nom ima ot­pri­li­ke 3 mi­li­jar­de pa­ro­va ba­za – što je oko 30 pu­ta više ne­go što sadrže ge­nomi C. ele­ga­ns, vin­ske mušice ili A. tha­lia­na – i sa­d­rži 20.000–25.000 ge­na. Osim to­ga, ljud­sko se ti­je­lo sas­to­ji od više od 200 raz­ličitih spe­ci­ja­li­zi­ra­nih ti­po­va sta­ni­ca. Ta je složeno­st prob­lem za is­ traživa­nje kra­lježnja­ka sa sta­ja­lišta sta­nične i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je, ali za­ ni­ma­nje bio­loške zna­nos­ti ipak pre­težito iz­vi­re iz želje za ra­zu­mi­je­va­njem ljud­skog or­ga­niz­ma u cje­li­ni. Što­više, od­go­vo­ri na mno­ga pi­ta­nja ne­pos­re­ dne prak­tične vri­je­dnos­ti (prim­je­ri­ce, u me­di­ci­ni) mo­ra­ju se ba­zi­ra­ti na izrav­nim is­traživa­nji­ma ljud­skih ti­po­va sta­ni­ca (ili sta­ni­ca blis­ko srod­nih or­ga­ni­za­ma). Je­dan od važnih pris­tupa u is­traživa­nju ljud­skih sta­ni­ca i sta­ni­ca os­ta­lih si­sa­va­ca je uz­goj izo­li­ra­nih sta­ni­ca u kul­tu­ri, gdje je omo­gućena ma­ni­ pulaci­ja pod kon­tro­li­ranim la­bo­ra­to­rij­skim uv­je­ti­ma. Upot­re­ba sta­ni­ca u kul­tu­ri omo­gućila je is­traživa­nje mno­gih as­pe­ka­ta sta­nične bio­lo­gi­je si­sa­ va­ca, uk­ljučujući ek­spe­ri­men­te ko­ji su raz­jas­ni­li me­ha­niz­me rep­li­ka­ci­je DNA, ek­spre­si­je ge­na, sin­te­ze i do­ra­dbe pro­tei­na i sta­nične diobe. Što­više, mo­gućno­st kul­ti­va­ci­je sta­ni­ca u ke­mij­ski de­fi­ni­ranim me­di­ji­ma omo­gućilo je is­traživa­nja sig­nal­nih me­ha­ni­za­ma ko­ji nor­mal­no kon­tro­li­ra­ju sta­nični ra­st i di­fe­ren­ci­ja­ci­ju unu­tar or­ga­niz­ma kao cje­li­ne. Spe­ci­ja­li­zi­ra­ne oso­bi­ne ne­kih vi­so­kodi­fe­ren­cira­nih ti­po­va sta­ni­ca učini­ le su ih važnim mo­de­li­ma za is­traživa­nja od­ređenih as­pe­ka­ta sta­nične bio­ lo­gi­je. Prim­je­ri­ce, mišićne su sta­ni­ce vi­so­kospe­ci­ja­li­zi­ra­ne za kon­trak­ci­ju, proiz­vo­deći si­lu i pok­ret. Zbog te spe­ci­ja­li­za­ci­je, mišićne su sta­ni­ce ključni

Sli­ka 1-17. Ara­bi­dop­sis tha­lia­na.  (Je­re­ my Bur­ge­ss/Photo Re­sear­che­rs, Inc.)

20    POGLAVLJE 1

Sli­ka 1-18. Ja­ja žabe Xe­no­pus lae­vis.  (Lju­baz­no­šću Michae­la Da­nil­chi­ka i Kim­ ber­ly Ray.)

model za is­traživa­nje sta­nično­ga kre­ta­nja na mo­le­ku­lar­noj ra­zi­ni. Dru­gi prim­jer pru­žaju ži­včane sta­ni­ce (neu­ro­ni) ko­ je su spe­ci­ja­li­zi­ra­ne za pro­vođenje elek­tro­ke­mij­skih sig­na­la na ve­li­ke uda­lje­nos­ti. U lju­di, ak­so­ni ži­včanih sta­ni­ca mo­ gu bi­ti du­lji od je­dnog met­ra, a ne­ki bes­kra­lježnja­ci, po­put lig­nje, ima­ju go­le­me neu­ro­ne s ak­so­ni­ma i do 1 mm u prom­je­ru. Zbog nji­ho­ve vi­so­kospe­ci­ja­li­zi­ra­ne struk­tu­re i fun­kci­je, ovi go­le­mi neu­ro­ni važni su mo­de­li za is­traživa­ nja pri­je­no­sa io­na kroz sta­ničnu mem­bra­nu i ulo­gu ci­tos­ ke­le­ta u pri­je­no­su or­ga­ne­la iz ci­top­laz­me. Žaba Xe­no­pus lae­vis važan je mo­del za is­traživa­nje ra­ nog raz­vo­ja kra­lježnja­ka. Ja­ja X. lae­vis neo­bično su ve­li­ke sta­ni­ce, s promje­rom ot­pri­li­ke 1 mm (sl. 1-18). Budući da se ja­ja žabe raz­vi­ja­ju iz­van maj­ke, svi stup­nje­vi raz­vo­ja od ja­ja do pu­nog­lav­ca mo­gu se la­ko proučava­ti u la­bo­ra­to­ri­ju. Uz to, žabe proiz­vo­de ve­lik broj ja­ja što ola­kšava bio­ke­mij­ sku ana­li­zu. Zbog ovih teh­ničkih pred­nos­ti, in­ten­ziv­na is­ traživa­nja u raz­vo­jnoj bio­lo­giji pro­ve­de­na su up­rav­o na X. lae­vis, te su stečena saz­na­nja omo­gućila ra­zu­mi­je­va­nje mo­le­ku­la­rnih me­ ha­nizama ko­ji kon­tro­li­ra­ju raz­voj, di­fe­ren­ci­ja­ci­ju i dio­bu sta­ni­ca za­met­ka. Zeb­ras­ta ri­bi­ca (sl. 1-19) ima broj­ne pred­nos­ti za ge­ne­tičke stu­di­je raz­vo­ja kra­lježnja­ka. Ove ma­le­ne ribe se br­zo raz­množava­ju i la­ko ih je uz­ga­ja­ti u la­bo­ra­to­ri­ju. Uz to, za­met­ci se raz­vi­ja­ju iz­van majčinog ti­je­la te su pro­zir­ni ta­ko da se ra­ne fa­ze raz­vo­ja mo­gu la­ko pro­mat­ra­ti. Raz­vi­je­ne su moćne me­to­de ko­je su omo­gućile izo­la­ci­ju mu­ta­ci­ja ko­je po­ka­zu­ju ut­je­ caj na nor­mal­ni raz­voj zeb­ras­te ri­be. Da­nas je ot­kri­ve­no čak ne­ko­li­ko ti­ suća tak­vih mu­ta­ci­ja. Budući da je zeb­ras­ta ri­bi­ca kra­lježnjak ko­ji se la­ko proučava, on bi mo­gao pos­lužiti kao spo­na iz­među složenih or­ga­ni­za­ma kao što je čov­ječji i jed­nos­tav­nih bes­kra­lježnjačkih sus­ta­va po­put C. ele­gans i Dro­sop­hi­la. Među si­sav­ci­ma, miš je naj­prik­lad­ni­ji za ge­ne­tičke ana­li­ze, ko­je su k to­me ola­kšane dos­tup­no­šću pot­pu­ne sek­ve­nce mišje­ga ge­no­ma. Ia­ko su teh­ničke po­teškoće u stu­di­ra­nju ge­ne­ti­ke miša go­le­me (u us­po­redbi, pri­ mje­ri­ce, s ge­netikom kva­sa­ca ili vin­ske mušice), ot­kri­ve­ne su mno­ge mu­ ta­ci­je ko­je ima­ju ut­je­caj na nor­mal­ni raz­voj miša. Ne­dav­na dostig­nuća u mo­le­ku­lar­noj bio­lo­gi­ji omo­gućila su stva­ra­nje tran­sge­ničnih miševa, u ko­ji­ma su spe­ci­fični mu­ti­ra­ni ge­ni uve­de­ni u sta­ni­ce ger­mi­na­tiv­ne li­ni­je, doz­vo­lja­va­jući na taj način stu­di­ju fun­kci­je ovih ge­na u kon­tek­stu ci­je­log

Sli­ka 1-19. Zeb­ras­ta ri­bi­ca.  (A) Za­me­tak star 24 sa­ta. (B) Od­ras­la ri­ba. (A, lju­baz­no­šću Char­le­sa Kim­me­la, Uni­ver­si­t y of Ore­gon; B, lju­baz­no­šću S. Kon­ do.)

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

   21

Sli­ka 1-20. Miš kao mo­del za proučava­ nje raz­voja čov­je­ka.  Di­je­te i miš po­ ka­zu­ju slični po­re­mećaj pig­men­ta­ci­je (ša­re­ni­lo) što je re­zul­tat mu­ta­ci­je u ge­ nu od­go­vor­nom za nor­mal­nu mig­ra­ci­ju me­la­no­ci­ta (sta­ni­ce od­go­vor­ne za pig­ men­ta­ci­ju kože) ti­je­kom em­brio­nal­no­ga raz­vit­ka. (Lju­baz­no­šću R.A. Fleis­chman, Mar­key Can­cer Cen­ter, Uni­versi­t y of Ken­ tuc­k y.)

živo­tinj­skog or­ga­niz­ma. Na prik­lad­no­st miša kao mo­de­la za proučava­nje raz­vo­ja ljud­skog or­ga­niz­ma ne uka­zu­je sa­mo sličnost mišje­ga i ljud­sko­ga geno­ma, već i činje­nica da mu­ta­ci­je ho­mo­log­nih ge­na re­zul­ti­ra­ju vr­lo sli­ čnim raz­voj­nim nep­ra­vil­nos­ti­ma u ob­je vr­ste; iz­ra­zi­ti prim­jer je po­re­mećaj pig­men­ta­ci­je u ob­je vr­ste (sl. 1-20).

Oruđa sta­nične bio­lo­gi­je Kao i u bi­lo ko­joj ek­spe­ri­men­ta­lnoj zna­nos­ti, istraživa­nja u sta­ničnoj bio­lo­gi­ji os­la­nja­ju se i ovi­se o la­bo­ra­to­rij­skim me­to­da­ma ko­je su dos­tup­ne za ana­li­ze struk­tu­re i fun­kci­je sta­ni­ce. Broj­ni značaj­ni po­ma­ci u našem ra­ zu­mi­je­va­nju sta­ni­ca iz­rav­na su pos­lje­di­ca raz­vo­ja no­vih me­to­da ko­je su omo­gućile pot­pu­no no­ve pris­tu­pe is­traživa­nji­ma. Sto­ga su ek­speri­men­tal­ ne me­tode, ko­je sto­je na ras­po­la­ga­nju sta­ničnom bio­lo­gu, pre­su­dne ka­ko za ra­zu­mi­je­va­nje sa­dašnjeg sta­nja ta­ko i za bu­duće smjer­ni­ce u dalj­njem raz­voju ovog pro­pul­ziv­nog pod­ručja zna­nos­ti. U tek­stu ko­ji sli­je­di opi­sa­ne su ne­ke od važnih me­to­da sta­nične bio­lo­gi­je. Ne­ki od os­ta­lih ek­spe­ri­men­ tal­nih pris­tu­pa, uk­ljučujući bio­ke­mij­ske me­to­de i me­to­de mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je, bit će opi­sa­ni u idućim pog­lav­lji­ma.

Svjet­los­na mik­ros­ko­pi­ja Zbog činje­ni­ce da je većina sta­ni­ca pre­ma­le­na da bi se vid­je­le go­lim okom, is­traživa­nje sta­ni­ca uve­li­ke je ovi­si­lo o upotre­bi mik­ros­ko­pa. Zap­ra­ vo, ot­kriće same sta­ni­ce zah­va­lju­je se raz­voju mik­ros­ko­pa: Ro­be­rt Hoo­ke pr­vi je uveo na­ziv »sta­ni­ca« 1665. go­di­ne pro­mat­ra­jući ko­ma­dić plu­ta jed­ nos­tav­nim svjet­los­nim mik­ros­ko­pom (sl. 1-21). Koris­teći mik­ros­kop ko­ji je mo­gao po­većati ob­jek­te za čak oko 300 pu­ta, još dav­ne 1670. go­di­ne An­to­ny van Leeuwen­hoek je bio u sta­nju raz­li­ko­va­ti ti­po­ve sta­ni­ca kao što su sper­mi­ji, cr­ve­ne kr­vne stanice i bak­te­ri­je. Mat­thias Schlei­den i Theo­dor Schwa­nn 1838. go­di­ne pred­ložili su sta­ničnu teo­ri­ju, što se može smat­ra­ti rođenjem suv­re­me­ne sta­nične bio­lo­gi­je. Mik­ros­kop­ska is­traživa­nja bilj­nih tki­va, ko­ji­ma se ba­vio Schlei­den, te is­traživa­nja ani­mal­nih tkiva, kojima se

Sli­ka 1-21. Sta­nična struk­tu­ra plu­ta.  Rep­ro­duk­ci­ja ori­gi­nal­nog cr­teža Ro­ber­ ta Hoo­ka ko­ji pred­stav­lja tan­ki rez plu­ta kojeg je pro­mat­rao svjet­los­nim mik­ro­ sko­pom. »Sta­ni­ce« ko­je je Hook pro­ma­ trao zap­ra­vo su pred­stav­lja­le sa­mo sta­ nične stijen­ke preos­ta­le od sta­ni­ca ko­je su dav­no ugi­nu­le.

22    POGLAVLJE 1 ba­vio Schwa­nn, do­ve­la su do is­tog zak­ljučka: svi se or­ga­niz­mi sas­to­je od sta­ni­ca. Ne­du­go na­kon toga ot­krića, pos­ta­lo je jas­no da sta­ni­ce ne nas­ta­ju de no­vo, već dio­bom već pos­to­jećih sta­ni­ca. Pre­poz­na­va­nje sta­ni­ce kao os­ nov­ne je­di­ni­ce svih živih or­ga­ni­za­ma dak­le zah­va­lju­je­mo opažanji­ma po­ moću svjet­los­nog mik­ros­ko­pa. Uz teh­nička po­bo­ljšanja ko­ja do­pušta­ju vi­zua­li­za­ci­ju sve većeg bro­ja po­ je­di­nos­ti sta­nične struk­tu­re, svjet­los­ni mik­ros­kop je i da­lje os­no­vno oru­đe sta­nične bio­lo­gi­je. Da­našnji svjet­los­ni mik­ros­ko­pi mo­gu po­većati ob­jek­te do prib­ližno 1.000 pu­ta više od nji­ho­ve stvar­ne ve­ličine. Ka­ko je prom­jer većine sta­ni­ca iz­među 1 i 100 µm, ci­je­le se sta­ni­ce kao i ne­ki od većih sta­ ničnih or­ga­ne­la (jez­gre, klo­rop­las­ti i mi­to­hon­dri­ji) mo­gu pro­ma­trati svjet­ los­nim mik­ros­ko­pom. Međutim, svjet­los­ni mik­ros­kop ni­je do­volj­no moćan da ot­kri­je fi­ne po­je­di­nos­ti sta­nične struk­tu­re, za što je re­zo­lu­ci­ja ili moć raz­lučiva­nja svjet­los­no­ga mik­ros­ko­pa – spo­sob­no­st mi­kro­s­ko­pa da dva blis­ ka ob­jek­ta raz­li­ku­je kao odvoje­ne struk­tu­re – važni­ja od sa­me spo­sob­no­sti po­većava­nja. Sli­ke mo­gu bi­ti po­većane po želji (na prim­jer, pro­jek­ci­jom na ve­li­ko plat­no), ali na taj način do­bi­ve­na sli­ka ne omo­gućava raspo­z­na­va­nje većeg bro­ja de­ta­lja. Mak­si­mal­na moć raz­lučiva­nja svjet­los­no­ga mik­ros­ko­pa iz­no­si prib­ližno 0,2 µm; dva ob­jek­ta uda­ljena ma­nje od 0,2 µm uočava­ju se kao je­dan ob­ je­kt ili sli­ka te se ne mo­gu međusob­no raz­li­ko­va­ti je­dan od dru­go­ga. Ovak­ va teo­ret­ska gra­ni­ca moći raz­lučiva­nja svjet­los­no­ga mik­ros­ko­pa od­ređena je dva­ma fak­to­ri­ma – val­nom du­lji­nom (λ) vid­lji­ve svjet­los­ti i spo­sob­no­šću leće mik­ros­ko­pa da sa­kup­lja svjet­lo­st (nu­me­rička aper­tu­ra, NA), a iz­ra­ču­ na­va se pre­ma jed­na­džbi: moć razlučivanja = 0,61 λ NA

Val­na du­lji­na vid­lji­ve svjet­los­ti iz­no­si 0,4 do 0,7 µm, pa se uzi­ma da vri­jed­no­st λ za svjet­los­ni mik­ros­kop iz­no­si prib­ližno 0,5 µm. Nu­me­rička aper­tu­ra može se de­fi­ni­ra­ti kao stožas­ti snop svjet­la ko­ji na­kon pro­las­ka kroz bio­loški uzo­rak ulazi u leće mik­ros­ko­pa (sl. 1-22). Nu­me­rička se aper­tu­ra iz­računa­va pre­ma jed­na­džbi: NA = η sin α

Sli­ka 1-22. Nu­me­rička aper­tu­ra.  Svje­ tlo se fo­ku­si­ra na uzo­rak s po­moću leće kon­den­zo­ra, a za­tim ga sa­kup­lja leća objek­ti­va mik­ros­ko­pa. Nu­me­rička aper­ tu­ra od­ređena je ku­tom (α) stožas­to­ga sno­pa svjet­la ko­je ula­zi u leću ob­jek­ti­va i in­dek­som ref­rak­ci­je me­di­ja (obično zrak ili ulje) iz­među leće i bio­loškog uzor­ka.

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA  Sli­ka 1-23. Fotog­ra­fi­ja obo­je­no­ga tki­va do­bi­ve­na mi­ kros­ko­pom svi­jet­log po­lja.  Sek­ci­ja be­nig­nog tu­mo­ra bub­re­ga. (G. W. Wil­lis/Biological Pho­to Ser­vi­ce.)

gdje je η inde­ks lo­ma svjet­los­ti ko­ja pro­la­zi kroz od­ređeni me­dij na pu­tu između uzor­ka i leće. In­ de­ks lo­ma svjet­los­ti za zrak je 1,0, no može se po­ većati do prib­ližno 1,4 uz ko­rište­nje leće pri­la­go­ đene pro­mat­ra­nju uzoraka kroz kap imer­zij­skog ulja (imerzij­ske leće, imer­zij­ski ob­jek­ti­vi). Kut α od­go­va­ra po­lo­vi­ni širi­ne stožas­tog sno­pa svjet­la ko­ji je prošao kroz leću. Mak­si­mal­na vri­jed­no­st za α je 90°, gdje je sin = 1, pa je naj­veća mo­guća vri­ jed­no­st nu­me­ričke aper­tu­re 1,4. Teo­ret­ska mak­si­mal­na moć razlučiva­nja svjet­ los­no­ga mik­ros­ko­pa može se pre­ma to­me iz­ra­ču­ na­ti na slje­deći način: moć razlučivanja = 0,61 × 0,5 = 0,22 μm 1,4

Mik­ros­ko­pi ko­ji su spo­sob­ni do­seg­nu­ti na­ve­de­nu moć raz­lučiva­nja iz­ rađeni su već kra­jem de­vet­naes­to­ga sto­ljeća, te se dalj­nja po­bo­ljšanja svjet­ los­no­ga mik­ros­ko­pa u tom smis­lu ne mo­gu očekiva­ti. Ne­ko­li­ko se ti­po­va svjet­los­nih mik­ros­ko­pa ko­ris­ti ru­tin­ski u is­traživa­ nju raz­ličitih as­pe­ka­ta sta­nične struk­tu­re. Naj­jed­nos­tav­ni­ji je mik­ros­kop svjet­log po­lja ko­ji je kon­strui­ran ta­ko da svjet­lo­st pro­la­zi iz­rav­no kroz sta­ ni­cu, a spo­sob­no­st raz­li­ko­va­nja po­je­di­nih sta­ničnih di­je­lo­va ovi­si o kon­ tras­tu koji se do­bi­va zbog raz­ličite ap­sor­pci­je vid­lji­ve svjet­los­ti u raz­ličitim sta­ničnim kom­po­nenta­ma. Da bi se po­većao kon­tra­st iz­među raz­ličitih di­ je­lo­va sta­ni­ce, sta­ni­ce se čes­to bo­je bo­ja­ma spe­ci­fičnim za pro­teine ili pak nuk­lein­ske ki­se­line. Pri­je sa­mog bo­je­nja, uzor­ci se obično pod­vr­ga­va­ju fik­ sa­ciji (al­ko­ho­lom, oc­te­nom ki­se­li­nom ili for­mal­de­hi­dom) čija je svr­ha sta­ bi­li­za­ci­ja i očuva­nje sta­ničnih struk­tura. Ana­li­za fik­si­ra­nih i obo­je­nih uzo­ ra­ka tki­va svjet­los­nim mik­ros­ko­pom stan­dar­dan je pris­tup u his­tološkim la­bo­ra­to­ri­ji­ma (sl. 1-23). Teh­ni­ke bo­je­nja ubi­ja­ju sta­ni­ce, pa sto­ga ta­kav način prip­re­ma­nja sta­ni­ca za ana­li­zu ni­je prik­la­dan za mno­gob­roj­ne ek­ speri­men­te ko­ji­ma je cilj ana­li­za živih sta­ni­ca. Iz­ra­van pro­la­zak svjet­los­ti kroz neo­bo­ja­ne sta­nične struk­tu­re ne stva­ra kon­tra­st pot­re­ban za raz­li­ko­v a­nje mno­gih unu­tar­sta­ničnih di­je­lo­va, što og­ra­ničava upo­ra­bu mik­ros­kopije svi­jet­log polja. Međutim, kon­tra­st iz­ među va­lo­va svjet­los­ti ko­ji pro­la­ze kroz pod­ručja sta­ni­ce raz­ličitih gus­toća može se po­većati mo­di­fi­ci­ra­njem op­ti­ke svjet­los­no­ga mik­ros­ko­pa. Dva na­ jče­šća načina vi­zua­li­za­ci­je živih sta­ni­ca je­su ana­li­za faz­nokon­tras­tnom i di­fe­ren­ci­jal­nom in­ter­fe­ren­cij­skokon­tras­tnom mik­ros­ko­pi­jom (sl. 1-24). Oba ti­pa mik­ros­ko­pi­je ko­ris­te op­tičke sus­tave ko­ji pret­va­raju raz­li­ke u gus­ toći ili deb­ljini raz­ličitih sta­ničnih di­je­lo­va u raz­li­ke u kon­tras­tu na ko­ načnoj sli­ci. Ka­da se ko­ris­ti mik­ros­kop svi­je­tlog polja, struktu­re kao što je jez­gra su sla­bo kon­tras­tne jer sla­bo ap­sor­bi­ra­ju svjet­lo. Međutim, br­zi­na svjet­los­ti sma­nju­je se prolas­kom kroz te struk­tu­re, pa fa­za svjet­los­ti ko­ja Sli­ka 1-24. Pro­mat­ra­nje živih sta­ni­ca mik­ros­ko­pom.  Mik­roskop­ske fo­tog­ra­f i­je sta­ ni­ca bu­kal­ne sluz­ni­ce do­bi­ve­ne po­moću (A) mik­ros­ko­pa svi­jet­log po­lja, (B) mik­ro­sko­pa s faz­nim kon­tras­tom, i (C) mik­ros­ko­pa s di­fe­ren­ci­ja­lnim in­ter­fe­ren­cij­skim kon­tra­s­tom. (Sus­retlji­vo­šću Mor­ta Ab­ra­mowit­za, Olympus Ame­ri­ca, Inc.)

   23

24    POGLAVLJE 1

Sli­ka 1-25. Vi­deo­ka­me­rom po­jačana in­ter­fe­ren­cij­ska mik­ros­ko­pi­ja.  Elek­ tron­ska ob­ra­dba sli­ke omo­gućuje vi­zua­ li­za­ci­ju po­je­di­nih mik­ro­tu­bu­la. (Sus­ret­lji­ vo­šću E. D. Sal­mon, Uni­ver­si­t y of Nor­th Ca­ro­li­na, Cha­pel Hi­ll.)

pro­la­zi kroz jez­gru zaos­ta­je u us­po­red­bi s fa­zom svje­tlos­ti koja je prošla kroz okol­nu citop­laz­mu. Faz­nokon­tras­tna i in­ter­fe­ren­cij­ska mik­ros­ko­pi­ja pret­va­ra­ju raz­li­ke u fa­zi svjet­los­ti u raz­li­ke u kon­tras­tu, što re­zul­ti­ra pobo­ ljšanom kva­li­te­tom sli­ka živih neo­bo­janih sta­ni­ca. Moć svjet­los­no­ga mik­ros­ko­pa znat­no je po­većana upotre­bom vi­deo­ka­ me­ra i kom­pju­te­ra za ana­li­zu i ob­ra­dbu sli­ka. Tak­vi elek­tro­nički sus­ta­vi za ob­ra­dbu sli­ka mo­gu bit­no po­većati kon­tra­st sli­ke do­bi­ven svjet­los­nim mik­ ros­ko­pom, omo­gućujući vi­zua­li­za­ci­ju ma­lih ob­je­ka­ta ko­ji se inače ne bi mog­li vid­je­ti. Na prim­jer, vi­deo­ka­me­rom unapri­jeđena di­fe­ren­ci­jal­na in­ ter­fe­ren­cij­skokon­tras­tna mik­ros­ko­pi­ja do­pušta vi­zua­li­za­ci­ju po­mi­ca­nja or­ga­ne­la duž mik­ro­tu­bu­la, pro­tein­skih fi­la­me­na­ta ci­tos­keleta prom­je­ra sve­ga 0,025 µm (sl. 1-25). Međutim, to unap­ređenje ne pre­la­zi teo­ret­sku gra­ni­cu moći raz­lučiva­nja svjet­los­no­ga mik­ros­ko­pa ko­ja iz­no­si približno 0,2 µm. Sto­ga, ia­ko ko­rište­nje mik­ros­kopa uz ko­ji je po­veza­na vi­deo­ka­ mera omo­gućava vi­zua­li­za­ci­ju mik­ro­tu­bu­la, oni će na elek­tron­skoj sli­ci bi­ ti neoštri i mut­ni, ba­rem oni ko­ji su prom­je­ra 0,2 µm, te se poje­di­ni mik­ ro­tu­bu­li ne će raz­li­ko­va­ti od sus­jed­nih struk­tu­ra. Svjet­los­na mik­ros­ko­pi­ja do­seg­la je ra­zi­nu mo­le­ku­lar­nih ana­li­za me­to­ da­ma obi­lježava­nja s po­moću spe­ci­fičnih mo­le­ku­la ko­je se unu­tar sta­ni­ca mo­gu vi­zua­li­zi­ra­ti. Spe­ci­fični ge­ni i RNA tran­skrip­ti mo­gu se de­tek­ti­ra­ti hib­ri­di­za­ci­jom sa son­da­ma ko­je su kom­ple­men­ta­rne cilj­nim sli­je­dovima nuk­lein­skih ki­se­li­na, a pro­tei­ni upotre­bom odgo­va­ra­jućih pro­tu­ti­je­la (v. pog­l. 4). Sonde i pro­tu­ti­je­la mo­gu se oz­načiti raz­ličitim bi­lje­zi­ma koji doz­ vo­lja­vaju vi­zua­li­za­ci­ju po­moću svjet­los­nog mik­ros­kopa, čime se može od­ redi­ti po­ložaj spe­ci­fičnih mo­le­ku­la unu­tar po­je­di­načne sta­ni­ce. Fluo­res­cen­tna mik­ros­ko­pi­ja ima ve­li­ku prim­je­nu u is­traživanjima unu­tar­sta­nične ras­pod­je­le mo­le­ku­la zbog izu­ze­tne os­jet­ljivos­ti (sl. 1-26).

Sli­ka 1-26. Fluo­res­cen­tna mik­ros­ko­pi­ja.  (A) Svjet­lo pro­la­zi kroz po­bud­ni (ek­scitacij­ ski) fil­tar ko­ji oda­bi­re svjet­lo od­ređene val­ne du­lji­ne (prim­je­ri­ce, pla­vo svjet­lo), ko­je pak eksci­ti­ra fluo­res­cen­tnu bo­ju. Dik­roično og­le­da­lo tad od­bi­ja ek­sci­ta­cij­sko svjet­lo us­mje­ru­jući ga do­lje na uzo­rak. Fluo­res­cen­tno svjet­lo ko­je emi­ti­ra uzo­rak (prim­je­ri­ce, ze­le­no svjet­lo) ta­da pro­la­zi kroz dikroično og­le­da­lo i dru­gi fil­tar (en­gl. bar­rier fil­ter) ko­ji oda­bi­re svjet­lo val­ne du­lji­ne ko­ju emi­ti­ra fluo­res­cen­tna bo­ja. (B) Fo­tog­ra­f i­ja sta­ni­ce pluća daždev­nja­ka, do­bi­ve­na fluo­res­cen­tnim mik­ros­ko­pom, u ko­joj je DNA obo­je­na pla­vo, a mik­ro­tu­bu­li u ci­top­laz­mi ze­le­no. (Con­ly S. Rie­der/Biological Pho­to Ser­vi­ce.)

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

   25

Sli­ka 1-27. Fluo­res­cen­tna mik­ros­ko­pi­ja pro­tei­na obi­lježenog s GFP-om.­  Mi­ kro­tu­bu­lar­ni pro­tein (en­gl. mic­ro­tu­bu­leas­so­cia­ted pro­tein) fuzio­ni­ran je sa ze­le­ nim fluo­res­cen­tnim pro­tei­nom (GFP) te je une­sen u neu­ro­ne miša u kul­tu­ri, a za­tim je vi­zua­li­zi­ran po­moću fluo­res­cent­nog mik­ros­kopa. Jez­gra je obo­ja­na pla­vo. (Iz: A. Ca­ri­boni, 2004, Na­tu­re Ce­ll Biol. 6:929.)

Određene mo­le­ku­le unu­tar fik­si­ra­nih ili živih sta­ni­ca obi­lježava­ju se fluo­ res­cen­tnim bojama (fluo­rok­romima). Fluo­res­cen­tna bo­ja je mo­le­ku­la ko­ja ap­sor­bi­ra svjet­lo­st jed­ne val­ne du­lji­ne, a emi­ti­ra svjet­lo­st dru­ge val­ne du­ lji­ne. Fluo­res­cen­ci­ja se pos­tiže os­vjet­lji­va­njem uzor­ka svjet­lo­šću val­ne du­ lji­ne ko­ja po­buđuje od­ređenu fluo­res­cen­tnu bo­ju, a upo­ra­bom od­go­va­ra­ jućeg fi­ltra de­tek­ti­ra se spe­ci­fična val­na du­lji­na svjet­los­ti ko­ju po­tom fluo­res­cen­tna bo­ja emi­ti­ra. Fluo­res­cen­tni se mik­ros­kop da­nas koris­ti u is­ traživa­nji­ma raz­ličitih mo­le­ku­la unu­tar sta­ni­ca. Čes­to se upot­reb­lja­va oz­ načava­nje spe­ci­fičnih pro­tu­ti­je­la (za ne­ki pro­tein) fluorok­ro­mi­ma u svr­hu od­ređiva­nja dis­tri­bu­ci­je ne­kog pro­tei­na unu­tar po­je­di­nih sta­ni­ca. U no­vi­je vri­je­me, fluo­res­cen­tna mik­ros­ko­pija je unap­ri­jeđena upot­re­ bom ze­le­no­ga fluo­res­cen­tnog pro­tei­na (GFP – en­gl. green fluo­res­ce­nt protein), izo­li­ra­nog iz me­du­ze, u svr­hu vi­zua­li­za­ci­je pro­tei­na unu­tar živih sta­ni­ca. Stan­dar­dnim me­to­da­ma re­kom­bi­nan­tne DNA, GFP se može ve­za­ti za bi­lo koji odab­ra­ni pro­tein. Pro­tein označen ze­le­nim fluo­res­cen­tnim pro­ tei­nom se za­tim une­se u živu sta­ni­cu i vi­zua­li­zi­ra po­moću fluo­res­ce­ntnog mik­ros­kopa, bez pot­re­be za fik­sa­ci­jom i bo­je­njem sta­ni­ca (što bi bi­lo pot­reb­ no u slučaju de­tek­ci­je pro­tei­na pro­tu­ti­jeli­ma). Zbog svo­je sves­tra­nos­ti, GFP je u sta­ničnoj bio­lo­gi­ji izu­zet­no po­pu­la­ran, a prim­je­nju­je se u praćenju po­ ložaja i kre­ta­nja ve­li­kog bro­ja raz­ličitih pro­teina u živim sta­ni­ca­ma (sl. 1-27). Dalj­nja ek­span­zi­ja ove teh­ni­ke pos­tig­nu­ta je uporabom srod­nih fluo­ res­cen­tnih pro­tei­na pla­vog, žutog ili cr­ve­nog emi­sij­skog spek­tra. Raz­vi­je­ne su raz­ličite me­to­de za praćenje kre­ta­nja i in­te­rak­ci­ja pro­tei­na ve­za­nih za GFP unu­tar živih sta­ni­ca. Na­jče­šće upot­reb­lja­va­na me­to­da za praćenje kre­ta­nja pro­tei­na ve­za­nih za GFP je me­to­da opo­rav­ka fluo­res­cen­ ci­je na­kon fo­toiz­bje­lji­va­nja (en­gl. Fluo­res­cen­ce Re­co­ve­ry Af­ter Pho­to­bleac­ hi­ng ili FRAP) (sl. 1-28). Ovom me­to­dom se pod­ručje in­te­re­sa unu­tar sta­ni­ce ko­ja ek­spri­mi­ra pro­tein ve­zan za GFP izbli­je­di iz­la­ga­njem ja­ko in­ tenziv­nom svjet­lu. Fluo­res­cen­ci­ja se opo­ra­vi na­kon ne­kog vre­me­na za­hva­ ljujući kre­ta­nju neiz­bljed­je­lih mo­le­ku­la ve­za­nih za GFP u pod­ručje ko­je je

▶▶ Po­luvodički na­nok­ris­tali (na­

zva­ni kvan­tne čes­ti­ce, en­gl. quan­tum do­ts) se sve više kori­ ste um­jes­to fluo­res­cen­tnih bo­ja za mno­ge prim­je­ne u fluo­res­ cen­tnoj mik­ros­ko­pi­ji. Kvan­tne čes­ti­ce fluo­res­ci­ra­ju jače i pu­no su sta­bil­ni­je ne­go tra­di­cio­nal­ne fluo­res­cen­tne bo­je.

▶▶ GFP je izo­li­ran iz Pa­ci­fičke

me­du­ze Aequo­ria vic­to­ria. Pro­ tei­ni ko­ji fluo­res­ci­ra­ju u raz­liči­ tim bo­ja­ma izo­li­ra­ni su iz ne­kih dru­gih mor­skih or­ga­ni­za­ma.

26    POGLAVLJE 1 bi­lo iz­loženo svjet­lu, te se na taj način od­re­di ra­zi­na kre­ta­nja cilj­nog pro­ tei­na unu­tar sta­ni­ce. In­te­rak­ci­je između dva­ju pro­tei­na unu­tar sta­ni­ce mo­gu se ana­li­zi­ra­ti po­moću teh­ni­ke naz­va­ne fluo­res­cen­cij­sko re­zo­nan­tni pri­je­nos ener­gi­je (en­gl. Fluo­res­cen­ce Re­so­nan­ce Ener­gy Tran­sfer ili FRET) (sl. 1-29). Ti­je­ kom ove me­to­de, sva­ki od dva cilj­na pro­tei­na ve­za­na su za dva raz­ličita fluo­rok­ro­ma, od­nos­no dvi­je va­ri­jan­te GFP pro­tei­na. Ove va­ri­jan­te GFP-a ap­sor­bi­ra­ju i emi­ti­ra­ju raz­ličitu val­nu du­lji­nu svjet­los­ti, ta­ko da svjet­lo­st emi­ti­ra­na s jed­nom va­ri­jan­tom ek­sci­ti­ra dru­gu va­ri­jan­tu. In­te­rak­ci­ja iz­ među dva cilj­na protei­na se za­tim može od­re­di­ti ta­ko da se sta­ni­ca os­vijet­ li val­nom du­lji­nom svjet­los­ti ko­ja ek­sci­ti­ra pr­vu GFP va­ri­jan­tu te se ana­li­ zi­ra val­na du­lji­na emi­ti­ra­ne svjet­los­ti. Ako su pro­tei­ni, ve­za­ni za ove GFP va­ri­jan­te, u međusob­noj in­te­rak­ci­ji unu­tar sta­nice, fluo­res­cen­tne mo­le­ku­le će se naći bli­zu jed­na dru­goj te će svjet­lo­st ko­ju emi­ti­ra jed­na va­ri­jan­ta ek­sci­ti­ra­ti dru­gu va­ri­jan­tu, re­zul­ti­ra­jući emi­si­jom svjet­los­ti val­ne dulj­ine ka­rakte­ris­tične za dru­gu GFP va­ri­jant­u. Sli­ka do­bi­ve­na po­moću kon­ven­cio­nal­nog fluo­res­cen­tnog mik­ros­ko­pa je ne­jas­na zbog efek­ta ra­sa­pa emi­ti­ra­ne svjet­los­ti s rav­ni­na ko­je ni­su u fo­ku­su. Kva­li­te­ta sli­ke može se znat­no po­bo­ljšati po­moću računal­ne teh­ni­ke za ob­ ra­dbu mik­ros­kop­skih sli­ka ko­ja se na­zi­va de­kon­vo­lu­ci­ja (en­gl. ima­ge de­con­ vo­lu­tion) i ko­ja omo­gućava ana­li­zu sli­ka do­bi­ve­nih iz raz­ličitih rav­ni­na fo­ ku­sa. Kao re­zul­tat ovak­ve računal­ne ob­ra­dbe ne­ko­li­ko sli­ka do­bi­va se jed­na oštri­ja sli­ka us­po­re­di­va s onom ko­ju bismo do­bi­li sa­mo iz jed­ne točke fo­ku­ sa. Slično to­me, kon­fo­ka­lnom mik­ros­ko­pijom mo­guće je do­bi­ti sli­ke pu­no Sli­ka 1-28. Me­to­da opo­rav­ka fluo­ res­cen­ci­je na­kon fo­toiz­bje­lji­va­nja (FRAP).  Pod­ručje oko sta­ni­ce, ko­ja ek­ spri­mi­ra pro­tein oz­načen ze­le­nim fluo­ res­cen­tnim pro­tei­nom, je iz­bije­lje­no po­ moću la­se­ra. Fluo­res­cen­ci­ja se us­pos­tavlja na­kon ne­kog vre­me­na jer neiz­bije­lje­ne mo­le­ku­le pro­tei­na, oz­načenog GFP-i­jem, di­fun­di­ra­ju u iz­bije­lje­no pod­ručje. Br­zi­na opo­rav­ka fluo­res­cen­ci­je pred­stav­lja br­zi­ nu kre­ta­nja tog od­ređenog pro­tei­na unu­ tar sta­ni­ce.

Sli­ka 1-29. Me­to­da fluo­res­cen­cij­sko rezonan­tnog pri­je­no­sa ener­gi­je (FRET).  Dva pro­tei­na su fu­zio­ni­ra­na sa raz­ličitim va­ri­jan­ta­ma ze­le­nog fluo­res­cen­tnog pro­tei­na (GFP1 i GFP2) ko­ji ima­ju raz­ličitu val­nu du­lji­nu ek­sci­ta­ci­je i emi­si­je. Oni su izab­ra­ni ta­ko da val­na du­lji­na svjet­la, ko­je emi­ti­ra GFP1, može po­bu­di­ti GFP2. Sta­ni­ce se za­tim os­vijet­le val­nom du­lji­nom svjet­la ko­ja ek­sci­ti­ra GFP1. Ako pro­tei­ni ni­su u međusob­noj in­te­rak­ci­ji, de­tek­ti­ra­t ćemo svjet­lo ko­je emi­ti­ra GFP1. Međutim, ako su ovi pro­tei­ni u međusob­noj in­te­rak­ci­ji, GFP1 će ek­scitira­ti GFP2, i moći ćemo de­tek­ti­ra­ti svjet­lo ko­je emi­ti­ra GFP2.

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

većeg kon­tras­ta i s pu­no po­je­di­no­sti zah­va­lju­jući ana­li­zi fluo­res­cen­ci­je ko­ ja do­la­zi iz po­je­di­načne točke u uzor­ku. Ma­len snop svjet­la, u pra­vi­lu do­ bi­ven la­se­rom, fo­ku­si­ra se na od­ređenu du­bi­nu uzor­ka. Emi­ti­ra­no fluo­res­ cen­tno svjet­lo po­tom se sa­kup­lja s po­moću de­tek­to­ra (vi­deo­ka­me­re). Pri­je ne­go emi­ti­ra­no svjet­lo do­seg­ne de­tek­tor, ono mo­ra proći kroz sićušnu kon­fo­kal­nu aper­tu­ru. Kon­fo­kal­na aper­tu­ra je smješte­na točno na mjes­tu gdje se svjet­lo, emi­ti­ra­no s odab­ra­ne du­bi­ne uzor­ka, skup­lja u fo­ku­su (sl. 1-30). Pre­ma to­me, sa­mo ono svjet­lo ko­je je emi­ti­ra­no s rav­ni­ne u fo­ku­su može do­seg­nu­ti de­tek­tor. Ske­ni­ra­njem uzor­ka do­bi­va se dvo­di­men­zio­na­ lna slika rav­ni­ne u fo­ku­su ko­ja je pu­no oštri­ja od sli­ke ko­ja se može do­bi­ ti stan­dar­dnim fluores­cen­tnim mik­ros­ko­pom (sl. 1-31). Osim to­ga, se­ri­ja sli­ka do­bi­ve­nih s raz­ličitih du­bi­na (fo­ku­sa) može pos­lužiti za re­kon­struk­ ci­ju tro­di­men­zio­nal­ne struk­tu­re ana­li­zi­ra­nog uzor­ka. Mul­ti­fo­ton­ska ek­sci­ta­cij­ska mik­ros­ko­pi­ja al­ter­na­ti­va je kon­fo­kal­nom mik­rosko­pu u svr­hu ana­li­ze živih sta­ni­ca. Uzo­rak se os­vjet­lja­va val­nom du­lji­nom svjet­la ta­ko da ek­sci­ta­ci­ja fluo­res­cen­tne bo­je zah­ti­je­va is­tov­re­me­ nu ap­sor­pci­ju dva­ju ili više fo­to­na (sl. 1-32). Vje­ro­jat­no­st da dva fo­to­na is­tov­re­me­no po­bu­de fluo­res­cen­tnu bo­ju značaj­na je sa­mo u onoj točki uzor­ka gdje se ulaz­ni la­ser­ski snop svjet­la na­la­zi u fo­ku­su. Ta­ko se pos­tiže emi­si­ja fluo­res­cen­ci­je sa­mo iz rav­ni­ne fo­ku­sa ulaz­nog svjet­la. Ovak­va vr­lo pre­ciz­no lo­ka­li­zi­ra­na ek­sci­ta­ci­ja au­to­mat­ski proiz­vo­di tro­di­men­zio­na­lno ra­zlučiva­nje bez pot­re­be da emi­ti­ra­no svjet­lo pro­la­zi kroz aper­tu­ru (kao u slučaju kon­fo­kal­no­ga mik­rosko­pa). Što­više, pre­ciz­na lo­ka­li­za­ci­ja ek­sci­ta­ci­je mi­nimal­no sma­nju­je oštećenja bio­loškog uzor­ka te na taj način omo­gućava tro­di­me­nzio­nal­nu ana­li­zu živih sta­nica.

Sli­ka 1-31. Fo­tog­rafija sta­ni­ca čov­je­ka do­bi­ve­na kon­fo­ka­lnim mik­rosko­pom.  Mik­ro­tu­bu­li i ak­tin­ska vlak­na obo­je­ni su cr­ve­nom od­nos­no ze­le­nom fluo­res­cen­tnom bo­jom. (K. G. Mur­ti/Visuals Un­li­mi­ted.)

   27

Sli­ka 1-30. Kon­fo­kal­na mik­ros­ko­pi­ ja.  Us­ki snop svjet­la fo­ku­si­ra se na od­ ređenu du­bi­nu uzor­ka, a emi­ti­ra­no fluo­ res­cen­tno svjet­lo sa­kup­lja de­tek­tor. Pri­je ne­go stig­ne do de­tek­to­ra, fluo­res­cen­tno svje­tlo emi­ti­ra­no s uzor­ka mo­ra proći kroz kon­fo­kal­nu aper­tu­ru smještenu na mjes­tu gdje se svjet­lo emi­ti­ra­no iz odab­ ra­ne du­bi­ne uzor­ka na­la­zi u fo­ku­su. Na taj se način de­tek­ti­ra sa­mo fo­ku­si­ra­no svjet­lo emi­ti­ra­no s odab­ra­ne du­bi­ne uzor­ka.

28    POGLAVLJE 1 Sli­ka 1-32. Dvo­fo­ton­ska ek­sci­ta­cij­ ska mik­ros­ko­pi­ja.  Za ek­sci­ta­ci­ju fluo­ res­cen­tne boje pot­reb­na je is­to­dob­na ap­sor­pci­ja dva­ju fo­to­na. To se do­gađa sa­mo u točki uzor­ka na ko­ju je ulaz­no svjet­lo fo­ku­si­ra­no, ta­ko da se fluo­res­ cent­no svjet­lo emi­ti­ra sa­mo s odab­ra­ne du­bi­ne uzor­ka.

Elek­tron­ska mik­ros­ko­pi­ja

Sli­ka 1-33. Po­zi­tiv­no bo­janje.  Trans­ mi­sij­ska e­lek­tron­ska mik­rofo­tog­ra­fi­ja po­zi­tiv­no obo­je­ne bi­je­le kr­vne sta­ni­ce. (Don W. Fawce­tt/Visuals Un­li­mi­ted.)

Zbog og­ra­ničene moći raz­lučiva­nja svjet­los­no­ga mik­ros­ko­pa, ana­li­za po­je­di­nos­ti sta­nične struk­tu­re zah­ti­je­va­la je snažniju mik­ros­kop­sku teh­ni­ku – elek­tron­sku mik­ros­ko­pi­ju (EM), ko­ja je raz­vi­je­na tri­de­se­tih go­di­na 20. sto­ljeća. Albe­rt Clau­de, Kei­th Por­ter i Geor­ge Pa­la­de, četr­de­se­tih i pe­de­se­tih go­di­na 20. sto­ljeća pr­vi su pri­mi­je­ni­li elek­tron­sku mik­ros­ko­pi­ju u ana­li­zi bio­loških uzo­ra­ka. Elek­tron­ski mik­ros­kop može do­seći znat­no veće raz­lu­ čiva­nje od svjet­los­no­ga mik­ros­ko­pa jer je val­na du­lji­na elek­tro­na kraća od val­ne du­lji­ne svjet­los­ti. Val­na du­lji­na elek­tro­na u elek­tron­skom mik­ros­ko­pu može bi­ti i do 0,004 nm, što je 100.000 pu­ta ma­nja vri­jed­no­st od val­ne du­ lji­ne vid­lji­ve svjet­los­ti. Teo­ret­ski bi se tom val­nom du­lji­nom mog­la pos­tići moć raz­lučiva­nja od 0,002 nm. Međutim, to se raz­lučiva­nje u prak­si ne može pos­tići, bu­dući da je raz­lučiva­nje određeno ne sa­mo val­nom du­lji­nom već i nu­me­ričkom aper­tu­rom leća mik­ros­ko­pa. Nu­me­rička je aper­tu­ra ogra­ničava­jući fak­tor u elek­tron­skoj mik­ros­kopi­ji jer značaj­ke elek­tro­mag­ net­nih leća od­ređuju ve­ličinu ku­ta nji­ho­ve aper­tu­re na prib­ližno 0,5°, što od­go­va­ra nu­me­ričkim aper­tu­ra­ma od sve­ga oko 0,01. Za­to je, u op­ti­mal­nim uv­je­ti­ma, moć raz­lučiva­nja elek­tron­sko­ga mik­ros­ko­pa oko 0,2 nm. Na­da­lje, raz­lučivanje ko­je se može pos­tići na bio­loškim uzor­ci­ma og­ra­ničeno je i nji­ma svoj­stve­nom ne­dos­tat­no­šću kon­tras­ta. Za­to, mak­si­mal­na moć raz­lu­ čiva­nja elek­tron­sko­ga mik­ros­ko­pa iz­no­si 1 do 2 nm za bio­loške uzor­ke. Prem­da je stvar­no raz­lučiva­nje znat­no ma­nje od teo­retskog raz­lučiva­nja EM-a, pred­viđenog iz­računa­va­njem val­ne du­lji­ne elek­tro­na, ono je više no sto pu­ta veće od moći raz­lučiva­nja svjet­los­no­ga mik­ros­ko­pa. Dva os­nov­na ti­pa elek­tron­sko­ga mik­ros­ko­pa, tran­smi­sij­ski (TEM) i pre­t­ražni (en­gl. scan­ni­ng, SEM), na ve­liko se prim­je­nju­ju u is­traživa­nji­ma sta­ni­ca. Prin­cip tran­smi­sij­ske elek­tron­ske mik­ros­ko­pi­je sličan je mik­ro­ sko­pi­ji u svi­jet­lom po­lju. Uzor­ci se fik­si­ra­ju i bo­je so­li­ma teških me­ta­la ko­je omo­gućuju stva­ra­nje kon­tras­ta jer ras­pršuju elek­tro­ne. Snop elek­tro­na pro­la­zi kroz uzo­rak i fo­ku­si­ra se na fluo­res­cen­tnom zas­lo­nu gdje se stva­ra sli­ka. Elek­tro­ni ko­ji na­li­jeću na io­ne teških me­ta­la pro­la­zeći kroz uzo­rak skreću i uda­lju­ju se, pa ne pri­do­no­se ko­načnoj sli­ci. Na ko­načnoj sli­ci obo­ je­na pod­ručja uzor­ka tam­ne su boje. Uzor­ci ko­ji se ana­li­zi­ra­ju tran­smi­sij­skim elek­tron­skim mik­ros­ko­pom mo­gu bi­ti prip­rem­lje­ni po­zi­tiv­nim ili ne­ga­tiv­nim bo­je­njem. U slučaju po­ zi­tiv­nog bojanja, uzor­ci tki­va režu se u ul­tra­tan­ke re­zo­ve ko­ji se bo­je so­li­ ma teških me­ta­la (os­mi­jev tet­raok­sid, ura­nov ace­tat, olov­ni cit­rat), ko­je pak rea­gi­ra­ju s li­pi­di­ma, pro­tei­ni­ma i nuk­lein­skim ki­se­li­na­ma. Io­ni teških me­ta­la vežu se na raz­ne sta­nične struk­tu­re, što re­zul­ti­ra tam­nim obo­je­

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

   29

Sli­ka 1-34. Ne­ga­tiv­no bo­je­nje.  Trans­ mi­sij­ska e­lek­tron­ska mik­ro­fo­tog­ra­fi­ja ne­ ga­tiv­no obo­je­nih ak­tin­skih vla­ka­na. (Su­ sret­lji­vo­šću Ro­ge­ra Crai­ga, Uni­ver­si­ty of Mas­sac­hu­set­ts Me­di­cal Cen­ter.)

njem na fi­nal­noj sli­ci (sl. 1-33). Al­ter­na­tiv­ne pro­ce­du­re po­zi­tiv­nog boje­nja ta­kođer se ko­ris­te u iden­ti­fi­ka­ci­ji spe­ci­fičnih mak­ro­mo­le­ku­la u sta­ni­ci. Na prim­jer, pro­tu­ti­je­la oz­načena teškim me­ta­li­ma (čes­ti­ca­ma zla­ta) ko­ris­te se čes­to u svr­hu unu­tar­sta­nične lo­ka­li­za­ci­je spe­ci­fičnih pro­tei­na. Ta je me­to­da slična fluo­res­cen­tnoj mikros­ko­pi­ji kod ko­je se pro­tu­ti­je­la oz­načuju fluo­res­ cen­tnim bo­ja­ma. Tro­di­men­zio­nal­ne sli­ke struk­tu­ra, re­zo­lu­ci­je 2–10 nm, mo­gu se ta­kođer do­bi­ti upot­re­bom teh­ni­ke elek­tron­ske to­mog­ra­fi­je – računa­lne ana­lize ve­li­kog bro­ja dvo­di­men­zio­nal­nih sli­ka snim­lje­nih iz raz­ ličitih smje­ro­va gle­da­nja. Pro­ce­du­ra nega­tiv­nog bo­ja­nja ko­risti se za vi­zua­li­za­ci­ju in­tak­tnih bio­ loških struk­tu­ra po­put bak­te­ri­ja, izo­li­ra­nih staničnih or­ga­ne­la, i mak­ro­mo­ le­ku­la (sl. 1-34). Ti­je­kom ove me­to­de, bio­loški uzo­rak pos­tav­lja se na no­ sač prek­ri­ven tan­kim fil­mom te se na­ne­se me­tal­na bo­ja ko­ja se os­ta­vi da se osuši oko pov­ršine uzor­ka. Neo­bo­je­ni uzo­rak ok­ružit će se fil­mom bo­je, te ćemo po­moću mik­ros­ko­pa vid­je­ti sli­ku u ko­joj uzo­rak iz­gle­da svi­je­tao na­ sup­rot tam­no obo­je­noj po­za­di­ni. Sje­nčanje me­ta­lom još je jed­na teh­ni­ka ko­ja se ko­ris­ti u tran­smi­sij­skoj elek­tron­skoj mik­ros­kopiji za vi­zua­li­za­ci­ju pov­ršine izo­li­ra­nih sta­ničnih struk­tu­ra ili mak­ro­mo­le­ku­la (sl. 1-35). Uzo­rak se prek­rije tan­kim slo­jem me­tal­nih pa­ra (prim­je­ri­ce, pla­ti­ne). Me­talne se pa­re ras­prše po uzor­ku pod od­ređenim ku­tem, pa su pov­ršine bio­loškog uzor­ka, ko­je su iz­rav­no us­mje­ rene pre­ma iz­vo­ru mo­le­ku­la me­tal­nih pa­ra, deb­lje pre­ma­za­ne ne­go­li os­ta­

Sli­ka 1-35. Sje­nčanje me­ta­lom.  Elek­ tron­ska mik­ro­fo­tog­ra­f i­ja ak­tin­skih/mio­ zin­skih vla­ka­na ci­tos­ke­le­ta pre­pa­ri­ra­nih sje­nčanjem me­ta­lom.

30    POGLAVLJE 1

Sli­ka 1-36. Smr­za­va­nje i lom­lje­nje.  (A) Po­s­tu­pak smr­za­va­nja i lom­lje­nja raz­dva­ja dvos­loj li­pi­da, os­ta­vljajući uk­lop­lje­ne mem­ bran­ske pro­tei­ne ve­za­ne s jed­nom od dvi­ ju po­lo­vi­na mem­bra­ne. (B) Mik­ro­­fo­tog­ra­fi­ja smr­za­va­nja i lom­lje­nja sta­ničnih mem­bra­ na dvi­ju sus­jed­nih sta­ni­ca. Pro­tei­ni ko­ji se pro­težu kroz dvos­loj li­pi­da iz­gle­da­ju kao in­tra­mem­bran­ske čes­ti­ce (strjeli­ca). (Don W. Fawce­tt/Phozo Re­sear­che­rs, Inc.)

Sli­ka 1-37. Pret­ražna elek­tron­ska mi­ kro­s­ko­pi­ja.  Pret­ražna elek­tron­ska mi­ kro­­fo­tog­ra­fi­ja mak­ro­fa­ga. (Da­vid Phil­li­ps/ Visuals Un­li­mi­ted.)

1.1. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Sta­nično frak­cio­ni­ra­nje. Na­ kon što se sta­ni­ca po­ci­je­pa so­ni­ka­ci­jom sup­sta­nični di­je­lo­vi se frak­cio­ni­ra­ju ko­rište­njem raz­ličitih ti­po­va cen­tri­fu­gi­ra­nja.

tak uzor­ka. Te raz­li­ke u deb­lji­ni slo­ja me­tal­nih pa­ra stva­ra­ju efe­kt sje­ne, da­jući uzor­ku tro­di­men­zio­nal­ni iz­gled na elek­tron­skoj mik­ro­fo­tog­ra­fi­ji. Pre­pa­ri­ra­nje uzo­ra­ka me­to­dom smr­za­va­nja i lom­lje­nja (en­gl. free­ze frac­tu­re), u kom­bi­na­ci­ji s teh­ni­kom sje­nčanja me­ta­lom, bi­lo je na­po­se važno u is­traživa­nju struk­tu­re mem­bra­ne. Uzor­ci se smrznu u te­kućem dušiku (na –196 °C), a za­tim lo­me oštri­com noža. Taj pro­ces čes­to raz­dvo­ ji dvos­tru­ki li­pid­ni sloj, što omo­gućuje pri­ka­zi­va­nje unut­rašnjih povr­šina sta­nične mem­bra­ne (sl. 1-36). Uzo­rak se za­tim sje­nča pla­ti­nom, a bio­loški se ma­te­ri­jal oto­pi kise­li­nom, čime se stva­ra me­tal­na rep­li­ka pov­ršine bio­ loškog uzor­ka. Ana­li­zom rep­li­ka po­moću elek­tron­skog mik­ros­kopa mo­gu se pri­mi­je­ti­ti broj­na pov­ršin­ska is­pu­pčenja, ko­ja od­go­va­ra­ju pro­tei­ni­ma ko­ji se pro­težu kroz dvos­loj li­pi­da. Va­ri­ja­ci­ja ove teh­ni­ke nazva­na smr­za­ va­nje i jet­ka­nje (en­gl. free­ze et­chi­ng), osim vi­zua­li­za­ci­je unu­tar­njih povr­ šina sta­nične mem­bra­ne omo­gućuje i vi­zua­li­za­ci­ju vanj­skih pov­ršina. Dru­gi tip elek­tron­skog mik­ros­ko­pa, pret­ražni elek­tron­ski mik­ros­kop (en­gl. scan­ni­ng elec­tron mic­ros­cop) ko­ris­ti se za do­bi­va­nje tro­di­men­zio­nal­ ne sli­ke sta­ni­ca (sl. 1-37). Ti­je­kom pret­ražne mik­ros­ko­pi­je snop elek­tro­na ne pro­la­zi kroz bio­loški uzo­rak. Um­jes­to to­ga, pov­ršina sta­ni­ce prek­ri­va se teškim me­ta­lom, a snop elek­tro­na ko­ris­ti se za pret­raživa­nje po uzor­ku. Elek­tro­ni ko­ji se ras­pršuju ili emi­ti­ra­ju s pov­ršine uzor­ka sa­kup­lja­ju se ka­ ko se snop elek­tro­na po­miče po sta­ni­ci ta­ko da u ko­načni­ci stvo­re tro­di­ men­zio­nal­nu sli­ku. Budući da je raz­lučiva­nje pret­ražnog elek­tron­skog mik­ros­ko­pa sa­mo oko 10 nm, nje­gova je prim­je­na ug­lav­nom og­ra­ničena na is­traživa­nje ci­je­lih sta­ni­ca, a ne na is­traživa­nje unu­tar­sta­ničnih or­ga­ne­la ili mak­ro­mo­le­ku­la.

Frak­cio­ni­ra­nje sta­ni­ce Prem­da je elek­tron­ski mik­ros­kop omo­gućio vi­zua­li­za­ci­ju sta­nične struk­tu­re u de­ta­lje, sa­ma mik­ros­ko­pija ne doz­vo­lja­va de­fi­ni­ra­nje fun­kci­je raz­nih kom­po­ne­na­ta eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Ka­ko bi se mog­lo od­go­vo­ri­ti na broj­na pi­ta­nja ve­za­na uz fun­kci­ju sta­ničnih or­ga­ne­la, neop­hod­no je izo­li­ ra­ti or­ga­ne­le eu­ka­riot­skih sta­ni­ca u for­mi ko­ja doz­vo­lja­va bio­ke­mij­ske anali­ze. To se može pos­tići di­fe­ren­ci­jal­nim cen­tri­fu­gi­ra­njem, me­to­dom ko­

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA  Sli­ka 1-38. Frak­cio­ni­ra­nje sta­ni­ce.  Sta­ni­ce se li­zi­ra­ju, a sta­nične se kompo­nen­te od­va­ja­ju se­ri­jom cen­tri­fu­gi­ra­nja pri sve većim br­zi­nama. Na­kon sva­kog cen­tri­fu­gi­ra­nja po­je­di­ni se or­ ga­ne­li, se­di­men­ti­ra­ni na dnu ep­ru­ve­te, mo­gu iz­dvo­ji­ti iz ta­lo­ga. Su­per­na­ta­nt se za­tim po­ nov­no cen­tri­fu­gi­ra na većoj br­zi­ni da bi se se­ di­men­ti­ra­li orga­ne­li ko­ji su slje­deći po ve­ličini.

ju su ve­li­kom većinom raz­vi­li Al­be­rt Clau­de, Chris­tian de Du­ve i nji­ho­vi su­ rad­ni­ci, četr­de­se­tih i pe­de­se­tih go­di­na 20. sto­lje­ća, a ko­jom se sta­nične kom­po­ nen­te me­đusob­no od­va­ja­ju na os­novi svo­je ve­li­čine i gus­toće. Pr­vi ko­rak u sta­ničnom frak­cio­ni­ra­ nju je raz­bi­ja­nje sta­nične mem­bra­ne u uv­je­ti­ma ko­ji omo­gućava­ju očuva­nje in­ tak­tnos­ti os­talih unu­tar­sta­ničnih kom­ po­nenata. Prim­je­nju­je se ne­ko­li­ko me­to­ da, uk­ljučujući so­ni­ka­ci­ju (iz­la­ga­nje uzor­ka vi­so­kim frek­ven­ci­ja­ma zvu­ka), usit­nja­va­nje u me­ha­ničkom ho­mo­ge­ni­ za­to­ru ili tre­ti­ra­nje u mi­ješali­ci ve­li­ke brzi­ne. Svi ti pos­tup­ci do­vo­de do ki­da­nja sta­nične mem­bra­ne i en­dop­laz­mat­skog re­ti­kula na ma­le frag­men­te, dok os­ta­le kom­po­nen­te sta­ni­ce (jez­gra, lizo­so­mi, pe­rok­si­so­mi, mi­to­hon­dri­ji i klo­ro­plas­ti) os­ta­ju neoštećene. Sus­pen­zi­ja raz­bi­je­nih sta­ni­ca (ko­ja se na­zi­va li­zat ili ho­mo­ge­nat) za­tim se frak­ cio­ni­ra u kom­po­nen­te se­ri­jom cen­tri­ fugi­ra­nja u ul­tra­cen­tri­fu­gi, ko­ja ro­ti­ra uzor­ke vr­lo ve­li­kom br­zi­nom (preko 100.000 rpm), pri čemu se stva­ra sila i do 500.000 pu­ta jača od si­le gra­vi­ta­ci­je. Ta si­la uz­ro­ku­je da se sta­nične kom­po­ nen­te kreću pre­ma dnu ep­ru­ve­te stva­ra­ jući se­di­me­nt (pro­ces se na­zi­va se­di­men­ ta­ci­ja) br­zi­nom ko­ja ovi­si o nji­ho­voj ve­ličini i gus­toći, s ti­me da se naj­veće i naj­teže struk­tu­re naj­brže se­di­men­ti­ra­ju (sl. 1-38). Obično se sta­nični ho­mo­ge­ na­ti pr­vo cen­tri­fu­gi­ra­ju na ma­lim br­zi­ na­ma, na ko­ji­ma se se­di­men­ti­raju ne­tak­ nu­te sta­ni­ce i jez­gre ko­je pred­stav­lja­ju naj­veće sta­nične struk­tu­re. Ta­ko se pri­li­ kom nižih br­zi­na cen­tri­fu­gi­ra­nja u ta­lo­ gu može do­bi­ti frak­ci­ja obo­gaćena je­z­ gra­ma, dok os­ta­le sta­nične kom­po­nen­te os­taju u sus­pen­zi­ji su­per­na­tan­ta (te­kućeg di­je­la iz­nad ta­lo­ga). Su­per­na­ta­nt se za­

   31

32    POGLAVLJE 1 tim cen­tri­fu­gi­ra na većim br­zi­na­ma ka­ko bi se se­di­men­tirali mi­to­hon­driji, klo­rop­la­sti, li­zo­somi i pe­rok­si­somi. Po­nov­nim cen­tri­fu­gi­ra­njem su­per­na­ tan­ta na još većim br­zi­na­ma se­di­men­ti­ra­ju se frag­men­ti sta­nične mem­bra­ ne i en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul. Četvr­to uzas­top­no cen­tri­fu­gi­ra­nje na još većoj br­zi­ni do­vo­di do sedi­men­ta­ci­je ri­bo­so­ma, os­tav­lja­jući sa­mo top­ljiv dio ci­ top­laz­me (ci­to­sol) u su­per­na­tan­tu. Raz­ličite frak­ci­je do­bi­ve­ne di­fe­ren­ci­jal­nim cen­tri­fu­gi­ra­njem pred­stav­ lja­ju prip­rav­ke obo­gaćene od­ređenim or­ga­nelima, no ti prip­rav­ci još uvi­jek ni­su pot­pu­no čisti. Veći stu­panj proči­šćava­nja može se pos­tići cen­tri­fu­gi­ ra­njem u gra­di­jen­tu gus­toće, u ko­jem se or­ga­ne­li raz­dva­ja­ju se­di­men­ti­ra­ njem kroz gra­di­je­nt gus­te tva­ri, kao što je prim­je­ri­ce oto­pi­na sa­ha­ro­ze. Ti­je­kom cen­tri­fu­gi­ra­nja ko­je se te­me­lji na br­zi­ni se­di­men­ta­cije počet­ni se ma­te­ri­jal sta­vi iz­nad gra­di­je­nta oto­pi­ne šećera (sl. 1-39). Čes­ti­ce raz­ ličitih ve­ličina se­di­men­ti­ra­ju kroz gra­di­je­nt raz­ličitim br­zi­na­ma, pok­rećući se kao za­seb­ne pru­ge. Na­kon cen­tri­fu­gi­ra­nja pos­tiže se dos­tat­no raz­lučiva­ nje za raz­dva­ja­nje orga­ne­la slične ve­ličine po­put mi­to­hon­dri­ja, li­zo­so­ma i pe­rok­si­so­ma, ko­ji se on­da sa­kup­ljaju kao poje­dine frak­cije gra­di­jen­ta. Rav­no­težno cen­tri­fu­gi­ra­nje u gra­di­jen­tu gus­toće može se upo­ra­bi­ti za raz­dva­ja­nje sta­ničnih kom­po­nen­ti na ba­zi nji­ho­va plu­ta­nja uzroko­va­nog

Sli­ka 1-39. Br­zin­sko cen­tri­fu­gi­ra­nje u gra­di­jen­tu gus­toće.  Uzo­rak se nad­ slo­ji na vrh gra­di­jen­ta sa­ha­ro­ze, a čes­ ti­ce ra­zličitih ve­ličina se­di­men­ti­ra­ju duž gra­di­jen­ta kao od­vo­je­ne pru­ge. Od­vo­je­ ne čes­ti­ce mo­gu se sa­ku­pi­ti u po­je­di­ne frak­ci­je gra­di­jen­ta, što se jed­nos­tav­no pos­tiže pro­ba­da­njem dna ep­ru­ve­te za cen­tri­fu­gi­ra­nje i sa­kup­lja­njem kap­lji­ca.

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

   33

uz­go­nom, a neo­vis­no o nji­ho­voj ve­ličini i ob­li­ku. U tom pos­tup­ku, uzo­rak se cen­tri­fu­gi­ra u gra­di­jen­tu ko­ji sad­ržava vr­lo kon­cen­tri­ra­nu oto­pi­nu sa­ha­ ro­ze ili ce­zi­je­va klo­ri­da. Um­jes­to raz­dvaja­nja na os­no­vi br­zi­ne se­di­men­ta­ ci­je, uzo­rak se cen­tri­fu­gira sve dok čes­ti­ce ne do­seg­nu po­ložaj rav­no­teže u ko­jem je gus­toća čes­ti­ca jed­na­ka gus­toći okol­ne oto­pi­ne sa­ha­ro­ze ili oto­pi­ ne ce­zi­je­va klo­ri­da. Rav­no­težno cen­tri­fu­gi­ra­nje ko­ris­no je za raz­dva­ja­nje raz­ličitih ti­po­va mem­brana, a dovolj­no je os­jet­lji­vo i za raz­dva­ja­nje mak­ro­ mo­le­ku­la ko­je su obi­lježene raz­ličitim izo­to­pi­ma. Kla­sičan prim­jer prim­je­ ne rav­no­težnog cen­tri­fu­gi­ra­nja (opi­san u pog­lav­lju 3) pred­stav­lja ana­li­za rep­li­ka­ci­je DNA gdje se raz­dva­jaju teški i la­ki la­nac (oz­načen teškim i la­ kim izo­to­pi­ma dušika; 15N i 14N) rav­no­težnim cen­tri­fu­gi­ra­njem u gra­di­jen­ tu gus­toće oto­pi­ne ce­zi­je­va klo­ri­da.

Ra­st živo­tinj­skih sta­ni­ca u kul­tu­ri Proučava­nje sta­ni­ca uve­li­ke ovi­si o nji­ho­voj spo­sob­nos­ti ras­ta i mo­ gućnos­ti ma­ni­pu­la­ci­je s nji­ma u la­bo­ra­to­rij­skim uv­je­ti­ma. Iako je pro­ces teh­nički pu­no zah­tjev­ni­ji od kul­ti­vi­ra­nja bak­te­ri­ja ili kvas­ca, ve­lik broj vr­ sta živo­tinj­skih i bilj­nih sta­ni­ca može ras­ti u uv­je­ti­ma in vit­ro te se može s nji­ma mani­pulira­ti u kul­tu­ri. Tak­vi in vit­ro sus­ta­vi sta­ničnih kul­tu­ra omo­ gućili su zna­nstve­ni­ci­ma is­traživa­nje ras­ta i di­fe­ren­ci­ja­ci­je sta­ni­ca, kao i iz­vođenje ge­ne­tičkih ma­ni­pu­la­ci­ja nužnih za ra­zu­mi­je­va­nje struk­tu­re i fun­kci­je ge­na. Kul­tu­re ani­mal­nih sta­ni­ca za­počinju usit­nja­va­njem tki­va ta­ko da se do­ bi­je sus­pen­zi­ja sta­ni­ca ko­ja se za­tim stav­lja u po­su­di­cu za kul­tu­ru s hra­nji­ vim me­di­jem. Većina ti­po­va ani­mal­nih sta­ni­ca (kao što su fib­rob­las­ti i epi­ tel­ne sta­ni­ce), prih­vaćaju se za dno plas­tične pov­ršine po­su­di­ce za sta­ničnu kul­tu­ru i na njoj ras­tu (sl. 1-40). Za­met­ci i tu­mo­ri često se u istraživa­nji­ma ko­ris­te kao počet­ni ma­te­ri­jal jer sad­ržava­ju sta­ni­ce ko­je br­zo ras­tu. Fib­rob­ las­ti em­bri­ja po­seb­no dob­ro ras­tu u kul­tu­ri, pa pri­pa­da­ju među naj­če­šće is­traživa­ne ti­po­ve živo­tinj­skih sta­ni­ca. Međutim, mno­gi spe­ci­ja­li­zi­ra­ni ti­ po­vi sta­ni­ca mo­gu ta­kođer ras­ti u kul­tu­ri u od­go­va­ra­jućim uv­je­ti­ma, čime je omo­gućena ana­li­za nji­ho­ve di­fe­ren­ci­ja­cije u kon­tro­li­ra­nim ek­spe­ri­men­ tal­nim uv­je­ti­ma. Em­brio­nal­ne ma­tične sta­ni­ce pred­stav­lja­ju od­ličan prim­jer za to. Ove sta­ni­ce se uz­ga­ja­ju u kul­tu­ri in vit­ro od fa­ze ranog em­ bri­ja, te zad­ržava­ju spo­sob­no­st di­fe­ren­ci­ja­ci­je u sve ti­po­ve sta­ni­ca ko­je su pri­sut­ne u od­ras­lo­me or­ga­niz­mu. Sto­ga su ove sta­ni­ce ima­le važnu ulo­gu u is­traživa­nju fun­kci­je broj­nih ge­na ti­je­kom (em­brio­nal­nog) raz­vo­ja miša. Osim to­ga, em­brio­nal­ne ma­tične sta­ni­ce ima­ju ve­li­ki po­ten­ci­jal u li­ječenju bo­les­ti čov­je­ka pružajući iz­vor tki­va za tran­splan­ta­cij­sku te­ra­pi­ju. Me­dij (ili hra­nji­va pod­lo­ga) za uz­ga­ja­nje ani­mal­nih sta­ni­ca pu­no je složeni­jeg sas­ta­va od mi­ni­mal­nog me­di­ja pot­reb­nog za ra­st bak­te­ri­ja i kva­ sa­ca. Tije­kom ranih is­traživa­nja sta­ničnih kul­tu­ra ko­ris­ti­li su se me­di­ji ne­ de­fi­ni­ranog sas­ta­va kao što su plaz­ma, se­rum ili ek­stra­kt em­bri­ja. Prek­ret­ ni­ca u ovom pod­ručju učinje­na je 1955. go­di­ne, kad je Har­ry Eag­le opi­sao pr­vi točno de­fi­ni­ran me­dij ko­ji omo­gućuje ra­st ani­mal­nih sta­ni­ca. Uz so­li i glu­ko­zu, me­dij za ra­st ani­mal­nih sta­ni­ca sad­ržava raz­ličite ami­no­ki­se­li­ne i vi­ta­mi­ne ko­je sta­ni­ce ne mo­gu sa­me sin­te­ti­zi­ra­ti. Me­dij za kul­tu­ru većine ani­mal­nih sta­ni­ca ta­kođer sad­ržava i se­rum ko­ji pred­stav­lja izvor po­li­pep­ tid­nih fak­to­ra ras­ta, nužnih za sti­mu­la­ci­ju sta­ničnih dio­ba. Iden­ti­fi­ci­ra­no je ne­ko­li­ko fak­to­ra ras­ta. Oni služe kao ključni re­gu­la­to­ri ras­ta i di­fe­ren­ci­ ja­ci­je stanica u višes­ta­ničnih or­ga­ni­za­ma jer pred­stav­lja­ju sig­na­le ko­ji­ma raz­ličite sta­nice ko­mu­ni­ci­ra­ju međusob­no. Prim­je­ri­ce, jed­na od važnih fun­kci­ja fib­rob­las­ta kože u živo­tinj­skih or­ga­ni­za­ma je­st da pro­li­fe­ri­ra­ju kad je pot­reb­no pop­ra­vi­ti oštećenje uz­ro­ko­va­no posje­ko­ti­nom ili ra­nom. Nji­

Sli­ka 1-40. Ani­mal­ne sta­ni­ce u kul­ tu­ri.  Fotog­ra­f i­ja hu­ma­nih fib­rob­las­ta pri­h­vaćenih za pov­ršinu po­su­di­ce za kul­ tu­ru, do­bi­ve­na pret­ražnim elek­tron­skim mik­ros­ko­pom. (Da­vid M. Phil­li­ps/Visual Un­li­mi­ted.)

34    POGLAVLJE 1

KL JUČNI POKUS

Kultura animalnih stani­ca Nut­ri­tion Nee­ds of Mam­ma­lian Cel­ls in Tis­sue Cul­tu­re Harry Eagle National Institutes of Health, Bethesda, MD Scien­ce, vol. 122, 1955, str. 501–504

Kon­tek­st Naj­ra­ni­je sta­nične kul­ture sas­to­ja­le su se od sta­ni­ca na­ras­lih iz frag­me­na­ta tki­ va ko­ji su se na­sa­di­li na ug­rušak plaz­ me – sus­tav ko­ji je vr­lo nep­rik­la­dan za ek­spe­ri­men­tal­nu ana­li­zu. Kas­nih čet­r­ de­se­tih go­di­na 20. sto­ljeća, glav­ni nap­ re­dak predstav­lja­ju sta­nične li­ni­je nas­ ta­le od izo­li­ra­nih sta­ni­ca ko­je su bi­le u mo­gućnos­ti prih­va­ti­ti se za sti­jen­ku po­ su­di­ce za kul­tu­ru i da­lje ras­ti. Međutim, te su se sta­ni­ce još uvi­jek uz­ga­ja­le u ne­de­fi­ni­ra­nom me­di­ju sas­tav­lje­nom od raz­ličitih kom­bi­na­ci­ja seruma i ek­stra­ ka­ta em­bri­ja. Pri­mjerice, čes­to upot­reb­ lja­va­na tu­mor­ska sta­nična li­ni­ja (He­La sta­ni­ce), pr­vobit­no us­pos­tav­lje­na 1952. go­di­ne, rasla je u me­di­ju ko­ji se sas­to­ jao od pi­leće plaz­me, ek­strak­ta go­ veđeg em­bri­ja i se­ru­ma do­bi­ve­nog iz pup­ko­vi­ne čov­je­ka. Pošto su korišteni ta­ko kom­plek­sni i nep­re­ciz­no de­fi­ni­ra­ni me­di­ji bi­lo je ne­mo­guće ana­li­zi­ra­ti spe­ ci­fične po­trebe ani­mal­nih sta­ni­ca za rast u kul­tu­ri. Har­ry Eag­le pr­vi je ri­ješio taj prob­lem, pro­ve­vši sus­tav­nu ana­li­zu hra­nji­vih sa­sto­ja­ka pot­reb­nih za ra­st ani­mal­nih sta­ni­ca u kul­tu­ri.

Ek­spe­ri­men­ti Eag­le je is­traživao ra­st dvi­ju sta­ničnih li­ni­ja: He­La sta­ni­ca i sta­nične li­ni­je mišjih fib­rob­las­ta naz­va­ne L sta­ni­ce. Uz­ga­jao je te sta­ni­ce u me­di­ju sas­tav­ lje­nom od smje­se so­li, ug­lji­ko­hid­ra­ta, ami­no­ki­se­li­na i vitami­na, uz do­da­tak pro­tei­na se­ru­ma. Sus­tav­nim va­ri­ra­njem kom­po­nen­ti tog me­di­ja, Eag­le je us­pio od­re­di­ti spe­ci­fične hra­nji­ve tva­ri za sta­nični ra­st. Uz sol i glu­ko­zu, te hra­nji­ ve tva­ri uk­ljučiva­le su 13 ami­no­ki­se­li­na i ne­ko­li­ko vi­ta­mi­na. Ma­la je ko­ličina se­ ruma ta­kođer bi­la pot­reb­na. Os­nov­ni me­dij ko­ji je raz­vio Eag­le opi­san je u pri­loženoj tab­li­ci ko­pi­ra­noj iz nje­govog

ori­gi­nal­nog ra­da ob­jav­lje­nog 1955. go­ di­ne.

Harry Eagle

Ut­je­caj Me­dij, ko­ji je de­fi­ni­rao Eag­le, još se uvi­ jek ko­ris­ti kao os­nov­ni me­dij za kul­tu­ru ani­malnih sta­ni­ca. Nje­go­va je upotreba omo­gućila znan­stve­ni­ci­ma da kul­ti­vi­ra­ ju raz­ne sta­ni­ce u de­fi­ni­ra­nim ek­spe­ri­ men­tal­nim uv­je­ti­ma, ko­ji su kri­tični za proučava­nje ras­ta i di­fe­ren­ci­ja­ci­je ani­

mal­nih sta­ni­ca, uk­ljučujući iden­ti­fi­ka­ci­ ju fak­to­ra ras­ta pri­sut­nih u se­ru­mu. Da­ nas se zna da ti fak­to­ri ras­ta uk­ljučuju po­li­pep­ti­de ko­ji kon­tro­li­ra­ju po­našanje po­je­di­nih sta­ni­ca u živo­tinjskim or­ga­ niz­mi­ma.

Tablica 4. Osnovni medij za kultiviranje HeLa stanica i mišjih fibroblasta (10) L-aminokiseline* (mM) arginin cistein glutamin histidin izoleucin leucin lizin metionin fenilalanin treonin triptofan tirozin valin

0,1 0,05 2,0 0,05 0,2 0,2 0,2 0,05 0,1 0,2 0,02 0,1 0,2

(0,02)† (1,0) ¡ (0,02)† (0,1)† (0,1)† (0,05)† (0,1)† (0,01)† (0,1)†

vitamini (mM) biotin kolin folna kiselina nikotinamid pentotenska kisel. piridoksal tiamin riboflavin

+ +

razno 10–3 10–3 10–3 10–3 10–3 10–3 10–3 10–4

Soli§ (mM) NaCl KCl NaH2PO4 ´ H2O NaHCO3 CaCl2 MgCl2

100 5 1 20 1 0,5

glukoza penicilin streptomicin fenolno crvenilo

Za istražživanje stanične prehrane dijalizirani serum konja, 1%† dijalizirani humani serum, 10% Za osnovne kulture konjski serum, 5%† humani serum, 10%

* Prikladno čuvati u hladnjaku kao pojedinačne 20 puta koncentrirane osnovne otopine aminokiselina † Za mi{je fibroblaste ‡ Prikladno čuvati kao pojedinačne 100 ili 1.000 puta koncentrirane osnovne otopine; čuvati osnovne

otopine u smrznutom stanju

§ Prikladno čuvati u hladnjaku kao dvije osnovne otopine; jedna neka sadržava NaCl, KCl, NaH PO , 2 4

NaHCO3, i glukozu u 10 puta koncentriranijoj osnovnoj otopini, a druga neka sadržava CaCl2 i MgCl2 u 20 puta koncentriranijoj otopini

¡ Čuva se kao 100 mM osnovna otopina; čuva se u smrznutom obliku kad nije u uporabi

# Čuva se kao pojedinačna 100 puta koncentrirana osnovna otopina penicilina, streptomicina i

fenolnoga crvenila.

5 mM§ 0,005%# 0,005%# 0,0005%#

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

   35

ho­vu dio­bu po­tak­nu fak­to­ri ras­ta ko­ji se os­lo­bađaju iz trom­bo­ci­ta za vri­je­ me zgrušava­nja kr­vi, te na taj način po­tiču pro­li­fe­ra­ci­ju fib­rob­las­ta oko oštećenog tki­va. Iden­ti­fi­ka­ci­ja po­je­di­nih fak­to­ra ras­ta omo­gućila je us­pos­ ta­vu kul­tu­ra raz­nih sta­ni­ca u me­di­ji­ma bez se­ru­ma (me­di­ji u ko­ji­ma je se­rum za­mi­je­njen spe­ci­fičnim fak­to­ri­ma ras­ta pot­reb­nim za pro­li­fe­ra­ci­ju od­ređenog sta­ničnog ti­pa). Ini­ci­jal­no us­pos­tav­lje­ne sta­nične kul­tu­re zo­vu se pri­mar­ne sta­nične kul­ tu­re (sl. 1-41). Sta­ni­ce u pri­mar­noj kul­tu­ri obično ras­tu dok ne prek­ri­ju pov­ršinu dna po­su­di­ce u ko­joj se na­la­ze. Na­kon to­ga, sta­ni­ce se mo­gu iz­ va­di­ti iz po­su­di­ce i u raz­ri­jeđenoj kon­cen­tra­ci­ji po­nov­no na­sa­di­ti u no­ve po­su­di­ce što pred­stav­lja se­kun­dar­nu kul­tu­ru. Taj pro­ces pre­sađiva­nja može se po­no­vi­ti mno­go pu­ta, no većina nor­mal­nih sta­ni­ca u kul­tu­ri ne može bes­ko­načno ras­ti. Na prim­jer, nor­mal­ni fib­rob­las­ti čovje­ka mo­gu se po­di­ je­li­ti 50 do 100 pu­ta, na­kon čega pres­ta­ju ras­ti i ugi­ba­ju. Na­sup­rot to­mu, em­brio­nal­ne ma­tične sta­ni­ce kao i sta­ni­ce tu­mo­ra ima­ju spo­sob­no­st neog­

Sli­ka 1-41. Kul­ti­vi­ra­nje ani­mal­nih sta­ni­ca.  Sta­ni­ce od­ re­đenog tki­va ras­tu in vit­ro u po­su­di­ca­ma u ko­ji­ma je hra­ nji­vi me­dij.

36    POGLAVLJE 1 ra­ničene pro­li­fe­ra­ci­je u kul­tu­ri i te se kul­tu­re na­zi­va­ju per­ma­nen­tnim ili besmr­tnim sta­ničnim li­ni­ja­ma. Na­da­lje, od­ređeni broj besmr­tnih sta­ničnih li­ni­ja glo­da­va­ca izo­li­ran je iz kul­tu­ra nor­mal­nih fib­rob­las­ta. Um­jes­to da na­kon 50–100 po­pu­la­cij­skih ud­vos­tručenja ugi­nu kao većina os­ta­lih stani­ ca fib­rob­las­ta, ne­ko­li­ko sta­ni­ca u tim kul­tu­ra­ma nas­tav­lja s bes­ko­načnom pro­li­fe­ra­ci­jom, tvo­reći sta­nične li­ni­je na­lik tu­mor­skim sta­ničnim li­ni­ja­ma. Te su per­ma­nen­tne sta­nične li­ni­je oso­bi­to ko­ris­ne u naj­raz­ličiti­jim ti­po­vi­ ma ek­spe­ri­me­na­ta, jer pred­sta­vlja­ju kon­ti­nui­ra­ni i uni­for­mni iz­vor sta­ni­ca za raz­ne ma­ni­pu­la­ci­je, klo­ni­ra­nje i neog­ra­ničeno pro­pa­gi­ra­nje sta­ni­ca u la­bo­ra­to­ri­ju. Čak i u op­ti­mal­nim uv­je­ti­ma, sta­nični cik­lus (vri­je­me jed­ne sta­nične dio­be) ani­mal­nih sta­ni­ca ko­je na­jak­tiv­ni­je ras­tu u kul­turi tra­je oko 20 sa­ti, a to je de­set pu­ta du­lje od vre­me­na pot­reb­nog da se po­di­je­li sta­ni­ca kvas­ca. Za­to su ek­spe­ri­men­ti s kul­tu­ra­ma ani­mal­nih sta­ni­ca mno­go zah­tjev­ni­ji i tra­ju znat­no du­lje od ek­spe­ri­me­na­ta s bak­terija­ma ili kva­scima. Prim­je­ri­ce, po­ra­st vi­dljive ko­lo­ni­je ani­mal­nih sta­ni­ca iz jed­ne je­di­ne sta­ni­ce tra­je tje­ dan da­na ili du­lje, dok se ko­lo­ni­ja E. co­li ili kvas­ca raz­vi­je iz jed­ne sta­ni­ce pre­ko noći. Una­toč to­mu, ge­ne­tičke ma­ni­pu­la­ci­je s ani­mal­nim sta­ni­cama u kul­tu­ri neop­hod­ne su nam za ra­zu­mi­je­vanje struk­tu­re i fun­kci­je sta­ni­ce.

Kul­tu­ra bilj­nih sta­ni­ca Bilj­ne se sta­ni­ce ta­kođer mo­gu kul­ti­vi­ra­ti u hra­nji­vom me­di­ju ko­ji sa­ država od­go­va­ra­juće re­gu­lato­re ras­ta. Na­sup­rot po­li­pep­tid­nim re­gu­la­to­ri­ ma ras­ta ani­mal­nih sta­ni­ca, regula­to­ri ras­ta bilj­nih sta­nica su ma­le mo­ leku­le ko­je mo­gu proći kroz sti­jen­ku bilj­ne sta­ni­ce. U pri­sut­nos­ti od­go­va­ra­juće smje­se tih re­gu­la­to­ra ras­ta, mno­gi ti­po­vi bilj­nih sta­ni­ca pro­ li­fe­ri­ra­ju u kul­tu­ri stva­ra­jući ma­su ne­di­fe­ren­ci­ra­nih sta­ni­ca ko­ja se na­zi­va ka­lus (sl. 1-42). Vri­jedno je spo­me­nu­ti da su mno­ge bilj­ne sta­ni­ce spo­sob­ne stva­ra­ti bi­ lo ko­ji od raz­ličitih ti­po­va sta­ni­ca i tki­va pot­reb­nih za re­ge­ne­ra­ci­ju čita­ve bilj­ke. Sto­ga se od­go­va­ra­jućom ma­ni­pu­la­ci­jom hra­nji­vim sas­toj­ci­ma i re­ gu­la­torima ras­ta, ne­di­fe­ren­ci­ra­ne bilj­ne stanice u kul­tu­ri mo­gu po­tak­nu­ti na di­fe­ren­ci­ja­ci­ju u raz­ličita bilj­na tki­va, uk­ljučujući ko­ri­jen, stab­lji­ku i li­ šće. U mno­gim slučaje­vi­ma, čak se i ci­je­la bilj­ka može re­ge­ne­ri­ra­ti iz jed­ne je­di­ne sta­ni­ce u kul­tu­ri. Osim teo­ret­ske važnos­ti, spo­sob­no­st stva­ranja no­ ve bilj­ke od jed­ne je­di­ne stani­ce ma­ni­pu­la­ci­jom u kul­tu­ri omo­gućava jed­ nos­tav­no unošenje ge­ne­tičkih prom­je­na u bi­ljku, što ot­va­ra broj­ne mo­ gućnos­ti u ag­ri­kul­tur­nom ge­ne­tičkom i­nženjer­stvu.

Sli­ka 1-42. Bilj­ne sta­ni­ce u kul­tu­ri.  Ne­di­fe­ren­ci­ra­na ma­sa bilj­nih sta­ni­ca (ka­lus) ras­te na kru­toj pod­lo­zi. (Jo­hn N. A. Lo­tt/ Biological Pho­to Ser­vi­ce.)

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

   37

MOLEKULARNA MEDICINA

Virusi i rak Bo­le­st Rak je sku­pi­na bo­les­ti ko­ju ka­rak­te­ri­zi­ ra ne­kon­tro­li­ra­na pro­li­fe­ra­ci­ja sta­ni­ca. Rast nor­mal­nih ani­mal­nih sta­ni­ca pažlji­ vo je re­gu­li­ran sa svr­hom za­do­vo­lje­nja pot­re­ba ci­je­log or­ga­niz­ma. Na­sup­rot to­mu, sta­ni­ce ra­ka ras­tu na ne­re­gu­la­ ran način te u ko­načnici me­tas­ta­zi­ra­ju i in­ter­fe­ri­ra­ju s fun­kci­jom nor­mal­nih tki­va i or­ga­na. Rak je, nakon bo­les­ti sr­ ca, dru­gi na­jče­šći uz­rok smr­ti u SA­D-u. Prib­ližno će je­dan od tri Ame­ri­kan­ca obo­li­ti od ra­ka ti­je­kom svo­ga živo­ta, a una­toč ve­li­kom nap­ret­ku u li­ječenju, go­to­vo je­dan od četi­ri­ju Ame­ri­ka­na­ca na kra­ju i umi­re od ove bo­les­ti. Sto­ga je je­dan od glav­nih ci­lje­va is­traživa­nja u me­di­ci­ni ra­zu­mi­je­va­nje uz­ro­ka ra­ka i raz­vi­ja­nje efi­kas­ni­jih me­to­da li­ječenja.

Mo­le­ku­lar­na i sta­nična os­no­va Da­nas je poz­na­to da je rak re­zultat mu­ta­ci­ja ge­na ko­ji nor­mal­no kon­tro­li­ ra­ju pro­li­fe­ra­ci­ju sta­ni­ca. Gla­vne spoz­ na­je koje su do­ve­le i do iden­ti­fi­ka­cije tih ge­na do­bi­ve­ne su iz is­traživa­nja vi­ru­sa ko­ji uz­ro­ku­ju rak u živo­ti­nja, a čiji je pro­to­tip izo­li­rao Peyton Rous 1911. go­di­ne. Rous je ot­krio da se sar­ ko­mi (zloćud­ni tu­mo­ri ve­ziv­nih tki­va) pi­lića mo­gu pre­ni­je­ti vi­ru­som ko­ji je da­nas poz­nat kao Rou­sov sar­koma vi­ rus ili RSV. S ob­zi­rom na to da je RSV ret­ro­vi­rus čiji ge­nom ima sa­mo 10.000 pa­ro­va ba­za, mo­guće ga je pu­no la­ kše proučava­ti na mo­le­ku­lar­noj ra­zi­ ni ne­go­li kom­plek­san ge­nom pi­lića ili ge­nom ne­ke dru­ge ani­mal­ne stanice. Tak­va is­traživa­nja do­ve­la su do iden­ti­fi­ ka­ci­je spe­ci­fičnih vi­rus­nih ge­na ko­ji uz­ ro­ku­ju rak (on­ko­gena) i ot­krića srod­nih ge­na u nor­mal­nim sta­ni­ca­ma svih vr­sta kra­lježnja­ka, uk­ljučujući i čov­je­ka. Da­

nas je poz­na­to da su ne­ki ti­po­vi ra­ka u čov­je­ka uz­ro­kova­ni vi­ru­si­ma; dru­gi su pak re­zul­tat mu­ta­ci­ja nor­mal­nih sta­ ničnih ge­na sličnih on­ko­ge­nu pr­vi put iden­ti­fi­ci­ra­nom u RSV.

Pre­ven­ci­ja i li­ječenje Rak u lju­di, ko­ji je izaz­van vi­ru­si­ma uk­ ljučuje rak cer­vik­sa i dru­ge ano­ge­ni­tal­ ne kar­ci­no­me (pa­piloma vi­rus), karci­no­ me jetara (he­pa­ti­tis B i C vi­ru­si), i ne­ke ti­po­ve lim­fo­ma (Ep­stei­n-Bar­rov vi­rus i hu­ma­ni T-lim­fot­rop­ni vi­rus). Tu­mo­ri in­ du­ci­ra­ni tim vi­ru­si­ma čine ukup­no oko 20% in­ci­den­ci­je ra­ka u svi­je­tu. U prin­ ci­pu, po­ja­va ovih tu­mora mog­la bi se spri­ječiti ci­je­plje­njem pro­tiv od­go­vor­ nih vi­ru­sa. Raz­vo­jem efi­kas­nih cje­pi­ va pro­tiv he­pa­ti­ti­sa B i pa­pi­lo­ma vi­ru­ sa učinjen je pri­ličan nap­re­dak u tom pod­ručju. Os­ta­li tu­mo­ri u lju­di izaz­va­ni su mu­ ta­ci­ja­ma nor­mal­nih ge­na – rjeđe su

Tumor iz kojega je izoliran RSV.

Vi­ru­si Vi­ru­si su unu­tar­sta­nični pa­ra­zi­ti ko­ji se ne mo­gu sa­mi rep­li­ci­ra­ti. Oni se raz­množava­ju in­fek­ci­jom sta­ni­ce do­maćina ko­ris­teći sta­ničnu mašine­ri­ ju do­maćina za proiz­vod­nju veće ko­ličine vi­rus­nih čes­ti­ca. U svo­jem naj­ jed­nos­tav­ni­jem ob­li­ku, vi­ru­si su građeni sa­mo od ge­nom­ske nuk­lein­ske ki­se­li­ne (DNA ili RNA) oba­vijene pro­tein­skim omo­tačem (sl. 1-43). Vi­ru­

tu­mo­ri re­zul­tat nas­ljed­nih mu­ta­ci­ja, a puno če­šće su oni re­zul­tat mu­ta­ci­ja ko­ je se dogode ti­je­kom živo­ta ne­ke oso­ be. Is­traživa­nja vi­ru­sa ko­ji uz­ro­ku­ju rak do­ve­la su do iden­ti­fi­ka­ci­je mno­gih ge­ na od­go­vor­nih za ti­po­ve ra­ka ko­ji ni­su izaz­va­ni vi­ru­si­ma te do ra­zu­mi­je­va­nja mo­le­ku­lar­nih me­ha­ni­za­ma od­govor­nih za raz­voj ra­ka. Glav­ni na­po­ri usmje­re­ni su da­nas ka prim­je­ni spoz­na­ja, do­bi­ ve­nih is­traživa­nji­ma u mo­le­ku­lar­noj i sta­ničnoj bio­lo­gi­ji ra­ka, za raz­voj no­vih pris­tu­pa li­ječenju ra­ka. Pr­vi smišlje­ni li­jek ko­ji se po­ka­zao us­pješnim u li­ ječenju ra­ka u ljudi (ima­ti­nib ili Glee­ vec, opi­san u pog­lav­lju 18) dje­lu­je pro­ tiv ge­na vr­lo sličnog RSV on­ko­ge­nu.

Literatura Rous, P. 1911. A sarcoma of the fowl trans­ missible by an agent separable from the tu­ mor cells. J. Exp. Med. 13: 397–411.

38    POGLAVLJE 1 Sli­ka 1-43. Građa jed­nog ani­mal­nog vi­ru­sa.  (A) Čes­ti­ce vi­ru­sa pa­pi­lo­ma sa­ d­ržava­ju ma­lu pr­ste­nas­tu DNA mo­le­ku­lu oba­vi­je­nu pro­tein­skim omo­tačem (kap­ si­dom). (B) Elek­tronska mik­ro­fo­tog­ra­f i­ja čes­ti­ce hu­ma­nog pa­pi­lo­ma vi­ru­sa obo­je­ na um­jet­nom bo­jom. (B, Lin­da Stan­na­rd/ Science Pho­to Lib­ra­r y/Photo Re­sear­che­ rs, Inc.)

Sli­ka 1-44. Pla­ko­vi bak­te­rio­fa­ga.  Pla­ ko­vi fa­ga T4 vid­lji­vi na bak­te­rij­skoj li­va­di E. co­li. Sva­ki plak nas­tao je rep­li­ka­ci­jom jed­ne je­di­ne vi­rus­ne čes­ti­ce. (E. C. S. Chen/Visuals Un­li­mi­ted.)

si su važni za sta­ničnu i mo­le­ku­lar­nu bio­lo­gi­ju jer pred­stav­lja­ju naj­jed­nos­ tav­ni­ji sus­tav za is­traživa­nje sta­ničnih fun­kci­ja. S ob­zi­rom na to da re­pli­ ka­ci­ja vi­ru­sa ovi­si o me­ta­bo­liz­mu za­ražene sta­ni­ce, is­traživanja na vi­ru­si­ma ot­kri­la su broj­ne fun­da­men­tal­ne as­pek­te sta­nične bio­lo­gi­je. Is­tra­živa­nja bak­te­rij­skih vi­ru­sa znat­no su pri­do­ni­je­la našem ra­zu­mi­je­va­nju os­nov­nih me­ha­ni­za­ma mo­le­ku­lar­ne ge­ne­ti­ke, a ek­spe­ri­men­ti s bilj­nim vi­ru­si­ma (vi­ rus mo­zaične bo­les­ti du­ha­na) pr­vi su de­mon­stri­ra­li ge­ne­tički po­ten­ci­jal RNA. Ani­mal­ni vi­ru­si odig­ra­li su ulo­gu vr­lo os­jet­lji­vih son­di za is­traživa­ nje raz­nih ak­tiv­nos­ti eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Br­zi ra­st i ma­li ge­nom bak­te­ri­ja čini ih od­ličnim ek­spe­ri­men­tal­nim mo­ de­lom mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gije, a bak­te­rij­ski vi­ru­si (bak­te­rio­fa­gi) još su više po­jed­nos­tav­ni­li is­traživa­nja ge­ne­ti­ke bak­te­ri­ja. Je­dan od naj­važni­jih bak­te­ rio­fa­ga je bak­te­rio­fag T4 ko­ji in­fic­ i­ra bak­te­riju E. co­li i um­nožava se unu­tar nje. Infek­ci­ja jed­nom čes­ti­com fa­ga T4 re­zul­ti­ra stva­ranjem oko 200 po­to­ ma­ka vi­rus­nih čes­ti­ca u ro­ku od 20–30 mi­nu­ta. To do­vo­di do li­ze (pr­s­nu­ća) infi­ci­ra­ne sta­ni­ce i os­lo­bađanja vi­rus­nih čes­ti­ca u me­dij u ko­jem će in­fic­ i­ ra­ti no­ve bak­te­rij­ske sta­ni­ce. U kul­tu­ri bak­te­ri­ja ko­je ras­tu na aga­ru, rep­li­ ka­ci­ja faga T4 iza­zi­va stva­ra­nje čis­ti­na ili pla­ko­va – jas­nih pod­ručja li­zi­ra­ nih bak­te­rij­skih sta­ni­ca na bak­te­rijskoj li­va­di (sl. 1-44). Jed­na­ko ta­ko ka­ko je la­ko kul­ti­vi­ra­ti i is­tražiti vi­rus­ne česti­ce, ta­ko je la­ko izo­li­ra­ti i vi­rus­ne mu­tan­te ko­je ras­tu u je­dnom so­ju E. co­li, ali ne ras­tu u dru­gom so­ju is­te vr­ste. Pre­ma to­me, ma­ni­pu­la­ci­ja s fa­gom T4 još je jed­nos­tav­ni­ja od ma­ni­ pu­la­ci­je s E. co­li što ga čini po­god­nim mo­de­lom u is­traživanjima mo­le­ku­ la­rne ge­ne­tike. Na­da­lje, ge­nom fa­ga T4 je 20 pu­ta ma­nji od ge­noma E. co­li (sad­ržava oko 0,2 mi­li­ju­na pa­ro­va ba­za) što do­dat­no ola­kšava ge­ne­tičku ana­li­zu. Ne­ki dru­gi bak­te­rio­fa­gi ima­ju još ma­nje ge­no­me, a naj­jed­no­s­tav­ ni­ji su građeni od mo­le­ku­la RNA sas­tav­lje­nih od sve­ga 3.600 nu­kleo­ti­da. Za­to bak­te­rij­ski vi­ru­si pred­stavlja­ju kraj­nje jed­nos­ta­van ek­s­pe­ri­men­tal­ni sus­tav u mo­le­ku­la­rnoj ge­ne­tici. Is­traživa­nja pro­ve­de­na na bak­te­rio­fa­gi­ma nave­li­ko su pri­do­ni­je­la raz­jašnje­nju broj­nih fun­da­men­tal­nih prin­ci­pa mo­ le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je. Zbog ve­li­ke složenos­ti ge­no­ma ani­mal­nih sta­ni­ca, vi­ru­si su još važniji u is­traživa­nji­ma ani­mal­nih sta­ni­ca ne­go u is­traživa­nji­ma bak­te­ri­ja. Mno­gi ani­ mal­ni vi­ru­si rep­li­ci­ra­ju se unu­tar sta­ni­ca te stva­ra­ju pla­ko­ve u sta­ničnim kul­ tu­ra­ma, baš kao i bakte­rio­fa­gi, što omo­gućava la­ga­nu iden­ti­fi­ka­ci­ju. Što­više, geno­mi ani­mal­nih vi­ru­sa slične su složenos­ti kao i ge­no­mi bak­te­riofa­ga (ve­ ličina ge­no­ma kreće se od 3.000 do 300.000 pa­ro­va ba­za), pa je pu­no la­kše ma­ni­pu­li­ra­ti ani­mal­nim vi­ru­si­ma ne­go nji­ho­vim sta­ni­ca­ma do­maćini­ma.

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

   39

Tab­li­ca 1-3. Prim­je­ri ani­mal­nih vi­ru­sa Po­ro­di­ca vi­ru­sa RNA-ge­nom Pi­kor­na vi­rus To­ga­vi­rus Fla­vi­vi­rus Pa­ra­mik­so­vi­rus Or­ho­mik­so­vi­rus Ret­ro­vi­rus DNA-ge­nom He­pad­na­vi­ru­si Pa­po­va­vi­ru­si Ade­no­vi­ru­si Her­pes­vi­ru­si Pok­svi­ru­si

Rep­re­zen­ta­tiv­ni prim­jer vi­rus po­lio­mi­je­li­ti­sa vi­rus ru­beo­le virus žute groz­ni­ce vi­rus os­pi­ca vi­rus in­fluen­ce HIV he­pa­ti­tis B hu­ma­ni pa­pi­lo­ma vi­rus ade­no­vi­rus her­pes sim­ple­ks vi­rus vak­ci­ni­je

Ve­ličina ge­no­ma (1.000 pa­ro­va ba­za) 7–8 12 10 16–20 14 9 3,2 5–8 36 120–200 130–280

Mno­go je raz­ličitih ani­mal­nih vi­ru­sa, ko­ji sad­rže DNA ili RNA kao ge­ ne­tički ma­te­ri­jal (tab­l. 1-3). Većina vi­ru­sa s RNA-ge­no­mom rep­li­ci­ra se u in­fi­ci­ra­nim sta­ni­ca­ma sin­te­ti­zi­ra­jući no­ve RNA-ko­pi­je svo­ga ge­no­ma s RNA-ka­lu­pa. Međutim, ret­ro­vi­ru­si (jed­na od po­ro­di­ca ani­mal­nih vi­ru­sa) sad­ržava­ju RNA-genom u svo­jim vi­rus­nim čes­ti­ca­ma, ali u za­raženoj sta­ ni­ci sin­te­ti­zi­ra­ju DNA-ko­pi­ju svo­ga ge­no­ma. Ovaj tip vi­rusa uka­zu­je na ve­li­ku važnos­t vi­ru­sa kao ek­spe­ri­men­tal­nih mo­de­la jer su up­ra­vo is­traživa­ nja ret­ro­vi­ru­sa pr­vi put po­ka­za­la mo­gućnost sin­te­ze DNA s RNA-ka­lu­pa, što pred­stav­lja fun­da­men­tal­ni način pri­je­no­sa ge­ne­tičke in­for­ma­ci­je za ko­ ji se da­nas zna da se zbi­va u svim eu­ka­rio­tskim sta­ni­ca­ma. Os­ta­li prim­je­ri ko­ji de­mon­stri­ra­ju važnost vi­rusa kao mo­dela u is­traživanjima nji­ho­vih sta­ni­ca do­maćina uk­ljučuju stu­di­je rep­li­ka­ci­je DNA, tran­skrip­ci­je, do­ra­dbe RNA te pri­je­nosa i sek­re­ci­je pro­tei­na. Po­seb­no je važno is­tak­nu­ti da in­fek­ci­ja ne­kim animalnim vi­ru­si­ma ne ubi­ja sta­ni­ce, već pret­va­ra (tran­sfor­mi­ra) nor­mal­nu sta­ni­cu u tu­mor­sku sta­ni­cu. Is­traživa­nja ovak­vih vi­ru­sa ko­ji uz­ro­ku­ju rak, ko­je je pr­vi opi­sao Peyton Rous još 1911. go­di­ne, ne sa­mo da su stvo­ri­la ba­zu za naše da­na­ šnje ra­zu­mi­je­va­nje ra­ka na mo­le­ku­lar­noj i sta­ničnoj ra­zi­ni, već su omo­gu­ ćila ras­vje­tljavanje mno­gih mo­le­ku­lar­nih me­ha­ni­za­ma ko­ji kon­tro­liraju ra­st i di­fe­ren­ci­ja­ci­ju ani­mal­nih sta­ni­ca.

SAŽETAK

▶▶ Živo­tinj­ski vi­ru­si se čes­to

ko­ris­te u gen­skoj te­rap­iji kao vek­to­ri ge­na ko­je tre­ba uni­je­ti u sta­ni­cu.

KLJUČNI POJMOVI

PRIPADAJUĆI WEB­SI­TE Pos­je­ti­te internet stranice ko­je pra­te knji­gu Sta­ni­ca (www.sinauer.com/cooper5e) gdje mo­žete naći ani­ma­ci­je, vi­deosnim­ke, tes­to­ve, prob­le­me i os­ta­le do­dat­ne ma­te­ri­ja­le.

PODRIJETLO I EVOLUCIJA STANICE Pr­va sta­ni­ca: Sve da­našnje sta­ni­ce, pro­ka­riot­ske i eu­ka­riot­ske, pot­ječu od is­te an­ ces­tral­ne sta­ni­ce. Smat­ra se da se pr­va sta­ni­ca po­ja­vi­la pri­je 3,8 mi­li­jar­di go­di­na kao re­zul­tat ok­ruživa­nja sa­mo­replici­ra­juće RNA s fos­fo­li­pid­nom mem­bra­nom.

pro­ka­riot­ska sta­ni­ca, eu­ka­riot­ska sta­ni­ca, RNA-svi­jet, fosfo­li­pid, am­fi­pa­tičan, hid­ro­fo­ban, hid­ro­fi­lan

40    POGLAVLJE 1

KLJUČNI POJMOVI

SAŽETAK

ade­no­zin-5'-trifosfat (ATP), gli­ko­li­za, fo­to­sin­te­za, ok­si­da­tiv­ni me­ta­bo­li­ zam

Evo­lu­ci­ja me­ta­bo­liz­ma: Naj­ra­ni­je reak­ci­je za stva­ra­nje me­ta­bo­ličke ener­gi­je bi­le su ob­lik anae­rob­ne gli­ko­li­ze. Na­kon to­ga po­ja­vi­la se fo­to­sin­te­za, iza ko­je je sli­je­ dio ok­si­da­tiv­ni me­ta­bo­li­zam.

ar­he­bak­te­ri­je, eu­bak­te­ri­je, ci­ja­no­ bak­te­ri­je, Es­che­ric­hia co­li (E. co­li), sta­nična sti­jen­ka, sta­nična mem­bra­ na, ri­bo­som

Da­našnji pro­ka­rio­ti: Da­našnji se pro­ka­rio­ti di­je­le u sku­pi­nu ar­he­bak­te­ri­ja i sku­ pi­nu eu­bak­te­ri­ja, ko­je su se raz­dvo­ji­le ra­no u evo­lu­ci­ji.

jez­gra, mi­to­hondrij, klo­rop­la­st, li­zo­som, pe­rok­si­som, va­kuo­la, en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul, Gol­gi­jev apa­rat, ci­tos­ke­let

Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce: Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce, ko­je su veće i složeni­je od pro­ka­riot­ skih sta­ni­ca, sad­ržava­ju jez­gru, ci­top­laz­mat­ske or­ga­ne­le i citos­ke­let.

en­do­sim­bio­za

Po­dri­jet­lo eu­ka­rio­ta: Smat­ra se da su eu­ka­riot­ske sta­ni­ce evo­lui­ra­le iz sim­bion­ tskih aso­ci­ja­ci­ja pro­ka­rio­ta. Ge­nom eu­ka­rio­ta mo­gao je nas­ta­ti iz fu­zi­je ge­no­ma eu­bak­te­ri­je i ar­he­bak­te­ri­je.

kva­sac, Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­siae, pseu­do­po­dij, epi­tel­ne sta­ni­ce, fib­rob­la­st, erit­ro­cit, gra­nu­lo­cit, mo­no­cit, mak­ro­fag, lim­fo­cit, neu­ron

Raz­voj višes­ta­ničnih or­ga­ni­za­ma: Naj­jed­nos­tav­ni­ji eu­ka­rioti su jed­nos­ta­nični or­ga­niz­mi kao što su kvas­ci i ame­be. Višes­ta­nični or­ga­niz­mi su evo­lui­ra­li od aso­ci­ja­ci­ja tih jed­nos­ta­ničnih eu­ka­rio­ta, a pod­je­la ra­da do­ve­la je do raz­vo­ja mno­gih vr­sta spe­ci­ja­li­zi­ra­nih sta­ni­ca ko­je čine or­ga­niz­me da­našnjih biljaka i živo­tinja.

Sta­ni­ce kao ek­spe­ri­men­tal­ni mo­de­li E. co­li: Bak­te­ri­je po­put E. co­li po­seb­no su ko­ris­ne u is­traživanjima te­melj­nih pos­tav­ki bio­ke­mi­je i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je zah­va­lju­jući nji­ho­voj ge­ne­tičkoj jed­ nos­tav­nos­ti te la­koći ma­ni­pu­la­ci­je s njima. Kvas­ci: Kao naj­jed­nos­tav­ni­je eu­ka­riot­ske sta­ni­ce, kvasci su važan mo­del za stu­ di­je raz­nih as­pe­ka­ta sta­nične bio­lo­gi­je eu­ka­rio­ta. Cae­norhab­di­tis ele­ga­ns

Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns: Oblić C. ele­ga­ns jed­nos­ta­van je višes­ta­ničan or­ga­ni­zam ko­ji pred­stav­lja važan mo­del u raz­voj­noj bio­lo­gi­ji.

Dro­sop­hi­la me­la­no­gas­ter

Dro­sophi­la me­la­no­gas­ter: Op­sežne ge­ne­tičke ana­li­ze vin­ske mušice re­zul­ti­ra­le su ve­li­kim nap­retkom ra­zu­mi­je­vanja ani­mal­nog raz­vo­ja.

Ara­bi­dop­sis tha­lia­na

Ara­bi­dop­sis tha­lia­na: Ma­la cvjet­ni­ca Ara­bi­dop­sis često se ko­ris­ti kao mo­del u is­traživa­nji­ma mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je i biljnog raz­voja.

Xe­no­pus lae­vis zeb­ras­ta ri­bi­ca

Kra­lježnja­ci: Mno­ge vr­ste sta­ni­ca kra­lježnja­ka mo­gu ras­ti u kul­tu­ri te se mo­gu is­traživa­ti u kon­tro­li­ra­nim la­bo­ra­to­rij­skim uv­je­ti­ma. Spe­ci­ja­li­zi­ra­ni ti­po­vi sta­ni­ ca, kao što su neu­ro­ni i mišićne sta­ni­ce, pred­stav­lja­ju ko­ris­ne mo­de­le za is­pi­ti­va­ nje od­ređenih as­pe­ka­ta sta­nične bio­lo­gi­je. Žaba Xe­no­pus lae­vis i zeb­ras­ta ri­bi­ca važni su mo­de­li za is­pi­ti­va­nje ra­nih sta­di­ja raz­vo­ja kra­lježnja­ka, a miš se ko­ris­ti kao mo­del­ni si­sa­vac za ge­ne­tička is­traživa­nja.

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVANJU STANICA 

SAŽETAK

   41

KLJUČNI POJMOVI

Oruđa sta­nične bio­lo­gi­je Svjet­los­na mik­ros­ko­pi­ja: Bro­jne me­to­de u svjet­lo­snoj mik­ros­kopiji ko­ris­te se za vi­zua­li­za­ci­ju sta­ni­ca i unu­tar­sta­ničnih struk­tu­ra, te za ot­kri­va­nje po­ložaja spe­ci­ fičnih unu­tar­sta­ničnih mo­le­ku­la.

re­zo­lu­ci­ja, mik­ros­ko­pi­ja svijet­log po­lja, faz­nokon­tras­tna mik­ros­ko­pi­ja, di­fe­ren­ci­ja­lna in­ter­fe­ren­cij­skokon­ tras­tna mik­ros­ko­pija, vi­deo­ka­me­rom unap­ri­jeđena di­fe­re­ncijal­na in­ter­fe­ ren­cij­skokon­tras­tna mik­ros­ko­pi­ja, fluo­res­cen­tna mik­ros­ko­pi­ja, ze­le­ni fluo­res­cen­tni pro­tein (GFP), opo­ ravak fluo­res­cen­ci­je na­kon fo­toiz­bje­ lji­va­nja (en­gl. Fluo­res­cen­ce Re­co­ve­ry Af­ter Pho­to­bleac­hi­ng ili FRAP), fluo­res­cen­cij­sko re­zo­nan­tni pri­je­nos ener­gi­je (en­gl. Fluo­res­cen­ce Re­so­ nan­ce Ener­gy Tran­sfer ili FRET), kon­fo­kal­na mik­ros­ko­pi­ja, mul­ti­fo­ton­ ska ek­sci­ta­cij­ska mik­ros­ko­pi­ja

Elek­tron­ska mik­ros­ko­pi­ja: Elek­tron­ska mik­ros­ko­pi­ja, čije je raz­lučiva­nje pri­bli­ žno sto pu­ta veće od raz­lučiva­nja u svjet­lo­snoj mik­ros­kopiji, ko­ris­ti se za ana­li­zu de­taljne sta­nične struk­tu­re.

tran­smi­sij­ski elek­tron­ski mik­ros­kop, elek­tron­ska to­mog­ra­fi­ja, sje­nčanje me­ta­lom, me­toda smr­za­va­nja i lom­lje­nja (en­gl. free­ze frac­tu­re), pret­ražna elek­tron­ska mik­ros­ko­pi­ja

Frak­cio­ni­ra­nje sta­ničnih or­ga­ne­la: Or­ga­ne­li eu­ka­riot­skih sta­ni­ca mo­gu se izo­li­ ra­ti di­fe­ren­ci­jal­nim cen­tri­fu­gi­ra­njem u svr­hu bio­ke­mij­ske ana­lize.

di­fe­ren­ci­jal­no cen­tri­fu­gi­ra­nje, ul­tra­cen­tri­fu­gi­ra­nje, cen­tri­fu­gi­ra­nje u gra­di­jen­tu gus­toće, cen­tri­fu­gi­ra­nje ko­je se te­me­lji na br­zi­ni se­di­men­ta­ ci­je, rav­no­težno cen­tri­fu­gi­ra­nje

Vidi Ani­ma­ci­ju 1-1. na Internetu Ra­st ani­mal­nih sta­ni­ca u kul­tu­ri: Raz­množava­nje ani­mal­nih sta­ni­ca u kul­tu­ri omo­gućilo je is­traživa­nje me­ha­ni­za­ma ko­ji kon­tro­li­ra­ju ra­st i di­fe­ren­ci­ja­ci­ju sta­ ni­ca. Kul­tu­ra bilj­nih sta­ni­ca: Bilj­ne sta­ni­ce u kul­tu­ri in vit­ro mo­gu se di­feren­ci­ra­ti u spe­ci­ja­li­zi­ra­ne sta­nične ti­po­ve, a u ne­kim slučaje­vi­ma mo­gu re­ge­ne­ri­ra­ti čita­vu bilj­ku. Vi­ru­si: Vi­ru­si pred­stav­lja­ju jed­nos­tav­ne mo­de­le za is­traživa­nje sta­nične fun­kci­je.

em­brion­alne ma­tične stani­ce, pri­mar­na kul­tu­ra, sta­nična li­ni­ja ka­lus

bak­te­rio­fag, ret­ro­vi­rus

Pi­ta­nja 1. Što su po­ka­za­li ek­spe­ri­men­ti, koje je ra­ dio Stan­ley Mil­ler, o nas­tan­ku or­gan­skih mo­le­ku­la? 2. Koji tip mak­ro­mo­le­ku­la je spo­so­ban up­ rav­lja­ti svo­jom vlas­ti­tom rep­li­ka­ci­jom? 3. Ras­pra­vite činje­ni­cu da su mi­to­hon­dri­ji i klo­rop­las­ti pod­ri­jet­lom od bak­te­ri­ja ko­je su pro­gu­ta­li pret­hod­ni­ci eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. 4. Zašto se smat­ra da je evo­lu­ci­ja fo­to­sin­ te­ze po­go­do­va­la evo­lu­ci­ji ok­si­da­tiv­nog me­ ta­bo­liz­ma? 5. S ob­zi­rom da di­ja­me­tar bak­te­rij­ske sta­ ni­ce vr­ste S. au­reus iz­no­si 1 µm, a di­ja­me­

tar hu­ma­nog mak­ro­faga 50 µm, ko­li­ko se bak­te­rij­skih sta­ni­ca može smjes­ti­ti unu­tar jed­nog hu­ma­nog makrofa­ga? Pre­tpo­sta­vi da je sta­ni­ca sfe­rična. 6. Koji mo­del­ni or­ga­ni­zam pruža naj­jed­ nos­tav­ni­ji sus­tav za is­traživa­nje euk­ariotske rep­li­ka­ci­je? 7. Is­tražuje­te gen uk­ljučen u raz­voj em­bri­ ja si­sa­va­ca. Ko­ji mo­del­ni or­ga­ni­zam bi bio naj­bo­lji za ta is­traživa­nja? 8. Koli­ko se raz­lučiva­nje može pos­tići sa svjet­los­nim mik­ros­ko­pom ako se uzo­rak pro­mat­ra kroz zrak (su­hi ob­jek­tiv), a ne kroz

ulje (ulj­ni ili imer­zij­ski ob­jek­tiv)? Pret­pos­ta­ vi da je val­na du­lji­na svjet­los­ti 0,5 µm. 9. Želi­te ku­pi­ti mik­ros­kop za svoj la­bo­ra­ to­rij i možete bi­ra­ti iz­među dva raz­ličita objek­ti­va. Je­dan ob­jek­tiv ima po­većanje 100× i nu­me­ričku aper­tu­ru (N.A.) 1,1, dok dru­gi ima N.A. 1,3. Pret­pos­ta­vi­mo li da ci­je­na ni­je eli­mina­tor­ni fak­tor ko­ji od ova dva ob­jek­ti­va bis­te izab­ra­li? 10. Ko­je su prednos­ti ze­le­nog fluo­res­cen­ tnog pro­tei­na u is­traživa­nju po­ložaja i kre­ ta­nja pro­tei­na u sta­ni­ca­ma, u us­po­red­bi s pro­tu­ti­je­li­ma ko­ja su oz­načena fluo­rok­ro­ mi­ma?

42    POGLAVLJE 1 11. Iden­ti­fi­ci­rajte raz­ličite ka­rak­te­ris­ti­ke or­ ga­ne­la ko­ji se ra­zdva­ja­ju cen­tri­fu­gi­ra­njem te­me­lje­nim na brzi­ni u gra­di­jen­tu sa­ha­ro­ze

i rav­no­težnim cen­tri­fu­gi­ra­njem u gra­di­jen­ tu sa­ha­ro­ze.

13. Koja je raz­li­ka iz­među pri­mar­ne sta­ nične kul­tu­re i besmr­tnih sta­ničnih li­ni­ja?

12. Zašto je obično pot­reb­no sta­vi­ti se­rum u me­dij za kul­ti­vi­ra­nje živo­tinj­skih sta­ni­ca?

14. Zašto je važno kul­ti­vi­ra­nje em­brio­nal­ nih ma­tičnih sta­ni­ca?

Li­te­ra­tu­ra Pod­ri­jet­lo i evo­lu­ci­ja sta­ni­ca An­der­sson, S. G. E., A. Zo­mo­ro­di­pour, J. O. Ander­sson, T. Sic­he­ri­tz-Pon­ten, U. C. M. Al­s­ma­rk, R. M. Po­dowski, A. K. Nas­lu­nd, A.-S. Eri­ksson, H. H. Win­kler and C. G. Kurla­nd. 1998. The ge­no­me sequen­ce of Ric­ket­tsia pro­wa­ze­kii and the ori­gin of mito­ c­hon­dria. Na­tu­re 396: 133–140. [P] Ce­ch, T. R. 1986. A mo­del for the RNA-ca­t­ alyzed rep­li­ca­tion of RNA. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 83: 4360–4363. [P] Dar­ne­ll, J. E. and W. F. Doo­lit­tle. 1986. Speculatio­ns on the ear­ly cour­se of evo­lu­ tion. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 83: 1271– 1275. [P] DeDuve, C. 2007. The origin of eukaryotes: a reappraisal. Nature Rev. Genet. 8: 395–403. [R] Dyall, S. D., M. T. Brown and P. J. Johnson. 2004  Ancient invasions; From endosym­ bionts to organelles. Science 304:253-257. [R] Ges­te­la­nd, R. F., T. R. Ce­ch and J. F., At­ki­ns (e­ds.). 1999. The RNA Wor­ld. 2nd ed. Plainvie­w, NY: Co­ld Spri­ng Har­bor La­bo­ra­ to­ry Pre­ss. Joh­nston, W. K., P. J. Un­rau, M. S. Lawren­ce, M. E. Glas­ner and D. P. Bar­tel. 2001. RNAca­ta­lyzed RNA po­lyme­ri­za­tion: Ac­cu­ra­te and ge­ne­ral RNA-tem­pla­ted pri­mer exten­ sion. Scien­ce 292: 1319–1325. [P] Joyce, G. F. 2007. A glimpse of biology's first enzym­e. Science 315: 1507–1508. [R] Kas­ti­ng, J. F. and J. L. Sie­fe­rt. 2002. Li­fe and the evo­lu­tion of Ear­th’s at­mos­phe­re. Scien­ce 296: 1066–1068. [R] Mar­gu­lis, L. 1992. Symbio­sis in Ce­ll Evo­lu­tion. 2nd ed. New Yo­rk: W. H. Free­man. Martin, W. and T. M. Embley. 2004. Early evo­ lution comes full circle. Nature 431: 134–137 [R] Mil­ler, S. L. 1953. A pro­duc­tion of ami­no aci­ds un­der pos­sib­le pri­mi­ti­ve ear­th con­di­tio­ns. Scien­ce 117: 528–529. [P] Rivera, M. C. and J. A. Lake. 2004. The ring of life provides evidence for a genome fusion origin of eukaryotes. Nature 431. 152–155 [P] Szostak, J. W., D. P. Bartel and P. L. Luisi. 2001. Synthesizing life. Nature 409: 387–390. [R]

Sta­ni­ce kao ek­spe­ri­men­tal­ni mode­li Ada­ms, M. D. and 194 ot­he­rs. 2000. The geno­ me  sequen­ce of Dro­sop­hi­la me­la­no­gas­ter. Science 287: 2185–2195. [P] Blat­tner, F. R., G. Plun­ke­tt III., C. A. Blo­ch, N. T. Per­na, V. Bur­la­nd, M. Ri­ley, J. Co­l­ladoVides, J. D. Glas­ner, C. K. Ro­de, G. F. Mayhe­w, J. Gre­gor, N. W. Da­vis, H. A. Kirkpat­ri­ck, M. A. Goe­den, D. J. Ro­se, B. Mau and Y. Shao. 1997. The com­ple­te genom­e sequen­ce of Es­che­ric­hia co­li K-12. Scien­ce 277: 1453–1462. [P] Bot­stein, D., S. A. Cher­vi­tz and J. M. Cher­ry. 1997. Yea­st as a mo­del or­ga­ni­sm. Science 277: 1259–1260. [R] Gof­feau, A. and 15 ot­he­rs. 1996. Li­fe wi­th 6000 ge­nes. Scien­ce 274: 546–567. [P] In­ter­na­tio­nal Hu­man Ge­no­me Sequen­ci­ng Consor­tium. 2004. Finishing the euchro­ matic sequence of the human genome. Natu­re 431: 931–945. [P] Lieschke, G. J. and P. D. Currie. 2007. Animal models of human disease zebrafish swim into view. Nature Rev. Genet. 8: 353–367. [R] Meye­rowi­tz, E. M. 2002. Plan­ts com­pa­red to anima­ls: the broa­de­st com­pa­ra­ti­ve stu­dy of de­ve­lop­me­nt. Scien­ce 295: 1482–1485. [R] Mouse Genome Sequencing Consortium. 2002. Initial sequence and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420: 520–562. [P] The Ara­bi­dop­sis Ge­no­me Ini­tia­ti­ve. 2000. Analysi­s of the ge­nome sequen­ce of the flowe­ri­ng pla­nt Ara­bi­dop­sis tha­lia­na. Na­tu­re 408: 796–815. [P] The C. ele­ga­ns Sequen­ci­ng Con­sor­tium. 1998. Ge­no­me sequen­ce of the ne­ma­to­de C. ele­ gans: A plat­fo­rm for in­ves­ti­ga­ti­ng bio­lo­gy. Scien­ce 282: 2012–2018. [I]

Oruđa sta­nične bio­lo­gi­je Bowe­rs, W. E. 1998. Chris­tian de Du­ve and the dis­co­ve­ry of lyso­so­mes and pe­roxi­so­mes. Tren­ds Ce­ll Biol. 8: 330–333 [P] Cair­ns, J., G. S. Ste­nt and J. D. Wat­son (e­ds.). 2007. Pha­ge and the Ori­gi­ns of Mo­le­cu­lar Bio­l­ogy, The Centennial Edition. Plain­view, NY: Co­ld Spri­ng Har­bor La­bo­ra­to­ry Pre­ss. Chudakov, D. M., S. Lukyanov and K. A. Lukyanov. 2005. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotehnol. 23: 605–613 [R]

Clau­de, A. 1975. The co­mi­ng of age of the ce­ll. Scien­ce 189: 433–435. [P] De Du­ve, C. 1975. Explo­ri­ng cel­ls wi­th a cen­ trifuge. Scien­ce 189: 186–194. [R] Eag­le, H. 1955. Nut­ri­tion nee­ds of mam­ma­lian cel­ls in tis­sue cul­tu­re. Scien­ce 235: 442–447. [P] Fli­nt, S. J., L. W. Enqui­st, V. R. Ra­ca­niel­lo and A.  M. Skal­ka. 2003. Prin­cip­les of Vi­ro­lo­gy: Mo­le­cu­lar Bio­lo­gy, Pat­ho­ge­ne­sis, and Con­trol of Animal Viruses. 2nd ed. Was­hin­gton, DC: ASM Press. Giepmans, B. N. G., S. R. Adams, M. H. Ellisma­n  and R. Y. Tsien. 2006. The fluores­ cent toolbox for assessing protein location and function. Science 312: 217–224. [R] Kam, Z., E. Za­mir and B. Gei­ger. 2001. Pro­bi­ng mo­le­cu­lar pro­ces­ses in li­ve cel­ls by quan­ti­ tati­ve mul­ti­di­men­sio­nal mic­ros­co­py. Tren­ds Ce­ll Biol. 11: 329–334. [R] Koster, A. J. and J. Klumperman. 2003. Electron microscopy in cell biology: Integrating structu­re and function. Nature Rev. Molec. Cell Biol 4: SS6–SS10. [R] Lippincott-Schwartz, J., N. Altan-Bonnet. and G. H. Patterson. 2003. Photobleaching and pho­ toactivation: Folowing protein dinam­ics in living cells: Nature Cell. Biol. 5: S7–S14. [R] McIntosh, R., D. Nicastro and D. Mastronarde. 2005. New view of cells in 3D: An intro­ duction to electron tomography. Trends Cell Biol. 15: 43–51. [R] Miyawaki, A., A. Sawano and T. Kogure. 2003. Lighting up sells: Labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biol. 5: S1–S7. [R] Pa­la­de, G. 1975. In­tra­cel­lu­lar as­pec­ts of the proce­ss of pro­tein synthe­sis. Scien­ce 189: 347–358. [R] Pis­ton, D. W. 1999. Ima­gi­ng li­vi­ng cel­ls and tis­ sues by twop­ho­ton exci­ta­tion mic­ros­co­py. Tren­ds Ce­ll Biol. 9: 66–69 [R] Por­ter, K. R., A. Clau­de and E. F. Ful­lam. 1945. A  stu­dy of tis­sue cul­tu­re cel­ls by elec­tron micros­co­py. J. Exp. Med. 81: 233–246. [P] Rous, P. 1911. A sar­co­ma of the fowl tran­smi­s­ sible by an age­nt se­pa­rab­le from the tu­mor cel­ls. J. Exp. Med. 13: 397–411. [P] Sal­mon, E. D. 1995. VE-DIC lig­ht mic­ros­co­py and the dis­co­ve­ry of ki­ne­sin. Tren­ds Ce­ll Biol. 5: 154–158. [R] Spec­tor, D. L., R. Gol­dman and L. Lei­nwa­nd. 1998. Cel­ls: A La­bo­ra­to­ry Ma­nual. Plain­view, NY: Co­ld Spri­ng Har­bor La­bo­ra­to­ry Pre­ss.

2 Sta­nič­ne mo­le­ku­le  43 Sta­nič­ne mem­bra­ne  58 Pro­teo­mi­ka: op­sež­na ana­ li­za sta­nič­nih pro­tei­ na  64 Ključ­ni po­kus Sma­ta­nje po­li­pep­tid­nih lanaca  54 Ključ­ni po­kus Struk­tu­ra sta­nič­nih membra­na  60

Stanični sas­tav Sta­ni­ce su nev­je­ro­jat­no slo­že­ne i raz­no­li­ke tvo­re­vi­ne. Uz sa­mo­ rep­li­ka­ci­ju, ko­ja je bit ži­vo­ta, spo­sob­ne su obav­lja­ti naj­raz­li­či­ti­je spe­ci­ja­li­ zi­ra­ne za­da­će u vi­šes­ta­nič­nom or­ga­niz­mu. Sta­ni­ce se pri to­me po­ko­ra­va­ ju is­tim ke­mij­skim i fi­zič­kim za­ko­ni­ma ko­ji od­re­đu­ju po­na­ša­nje ne­ži­vih sus­ta­va. Sto­ga mo­der­na sta­nič­na bio­lo­gi­ja nas­to­ji ra­zum­je­ti sta­nič­ne pro­ ce­se u vi­du ke­mij­skih i fi­zič­kih reak­ci­ja. Ovo pog­lav­lje raz­mat­ra te­melj­na na­če­la bio­loš­ke ke­mi­je ko­ja up­rav­lja­ ju ži­vo­tom sta­ni­ca. Ne nam­je­ra­va ras­pra­vi­ti sva pi­ta­nja bio­ke­mi­je ni­ti is­ pi­sa­ti sve me­ta­bo­lič­ke reak­ci­je unu­tar sta­ni­ca. Pog­lav­lje us­mje­ra­va po­zor­ no­st na pet glav­nih te­ma: ti­po­vi sta­nič­nih mo­le­ku­la, sre­diš­nja ulo­ga pro­tei­na kao bio­loš­kih ka­ta­li­za­to­ra, stva­ra­nje i ko­riš­te­nje me­ta­bo­lič­ke ener­gi­je, bio­sin­te­za glav­nih sta­nič­nih sas­to­ja­ka i struk­tu­ra bio­loš­kih mem­bra­na. Poz­na­va­nje ovih ke­mij­skih te­me­lja či­ni os­no­vi­cu za ra­zu­mi­ je­va­nje raz­no­li­kos­ti sta­nič­nih struk­tu­ra i fun­kci­ja, o ko­ji­ma ras­prav­lja os­ ta­tak tek­sta.

Stanične mo­le­ku­le

2.1. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Ob­li­ko­va­nje ve­ze. Po­li­me­ri­zacija kova­len­tnim po­ve­zivanjem šeće­ra, ami­nokiselina i nukleo­ti­da stvara polisaharide, proteine i nuklein­ ske ki­se­li­ne.

Sta­ni­ce su sas­tav­lje­ne od vo­de, anor­gan­skih io­na i (or­gan­skih) mo­le­ ku­la ko­je sad­rž­ e ug­ljik. U sta­ni­ca­ma ima naj­vi­še mo­le­ku­la vo­de. Vo­da či­ni naj­ma­nje 70% ukup­ne sta­nič­ne ma­se. Sto­ga su u bio­loš­koj ke­mi­ji oso­bi­to važ­ne in­te­rak­ci­je iz­me­đu vo­de i dru­gih sta­nič­nih sas­to­ja­ka. Ključ­ no svoj­stvo vo­de u tom smis­lu je­st da je mo­le­ku­la vo­de po­lar­na ta­ko da su vo­di­ko­vi ato­mi bla­go po­zi­tiv­no na­bi­je­ni, dok su ki­si­ko­vi ato­mi bla­go ne­ga­tiv­ni (sl. 2-1). Zbog svo­je po­lar­ne na­ra­vi mo­le­ku­le vo­de mo­gu stva­ ra­ti vo­di­ko­ve ve­ze me­đu­sob­no i s dru­gim po­lar­nim mo­le­ku­la­ma. Ta­ko­ đer mo­gu stu­pi­ti u in­te­rak­ci­ju s po­zi­tiv­no ili ne­ga­tiv­no na­bi­je­nim io­ni­ ma. Pos­lje­di­ca tak­vih in­te­rak­ci­ja je­st da su io­ni i po­lar­ne mo­le­ku­le to­plji­vi u vo­di (hid­ro­fil­ni). Sup­rot­no to­me, ne­po­lar­ne mo­le­ku­le, ko­je ne mo­gu stu­pi­ti u in­te­rak­ci­ju s vo­dom, sla­bo su top­lji­ve u vo­de­nom oko­li­šu (hid­ro­fob­ne). Sto­ga ne­po­lar­ne mo­le­ku­le nas­to­je sma­nji­ti do­dir s vo­dom ta­ko da se me­đu­sob­no što tješ­nje zbli­že. Kas­ni­ja ras­pra­va u pog­lav­lju po­ ka­zat će da tak­ve in­te­rak­ci­je po­lar­nih i ne­po­lar­nih mo­le­ku­la, bi­lo s vo­ dom, bi­lo me­đu­sob­ne, ima­ju ključ­nu ulo­gu u ob­li­ko­va­nju bio­loš­kih struk­tu­ra kao što su sta­nič­ne mem­bra­ne. Anor­gan­ski io­ni či­ne naj­vi­še 1%

44    POGLAVLJE 2 Sli­ka 2-1. Svoj­stva vo­de.  Vo­da je po­lar­na mo­le­ku­la (A), dje­lo­mi­ce ne­ga­tiv­nog na­ bo­ja (δ –) na ki­si­ko­vom ato­mu, a dje­lo­mi­ce po­zi­tiv­nog na­bo­ja (δ+) na vo­di­ko­vim ato­ mi­ma. Zbog svo­je po­lar­nos­ti mo­le­ku­le se vo­de mo­gu po­ve­za­ti vo­di­ko­vim mos­to­vi­ma me­đu­sob­no ili s dru­gim po­lar­nim mo­le­ku­la­ma (B) i da­ka­ko os­tva­ru­ju in­te­rak­ci­je s na­ bi­je­nim io­ni­ma (C).

sta­nič­ne ma­se: nat­ri­jev (Na+), ka­li­jev (K+), mag­ne­zi­jev (Mg2+) i kal­ci­jev (Ca2+) ion te fos­fat (HPO42–), klo­rid (Cl–) i bi­kar­bo­nat (HCO3–). Ti su io­ni uk­lju­če­ni na raz­li­či­te na­či­ne u sta­nič­ni me­ta­bo­li­zam pa su bit­ni za sta­ni­ čnu fun­kci­ju. Da­ka­ko, sta­ni­ci svoj­stve­ne mo­le­ku­le su or­gan­ski spo­je­vi. Ve­ći­na njih pri­pa­da jed­nom od če­ti­ri­ju mo­le­ku­lar­nih ti­po­va: ug­lji­ko­hid­ra­ti, li­pi­di, pro­ tei­ni i nuk­lein­ske ki­se­li­ne. Pro­tei­ni, nuk­lein­ske ki­se­li­ne i ve­ći­na ug­lji­ko­hi­ dra­ta (po­li­sa­ha­ri­di) su mak­ro­mo­le­ku­le ob­li­ko­va­ne po­ve­zi­va­njem sto­ti­na­ ma ili ti­su­ća­ma mo­le­ku­la-pre­te­ča ma­le mo­le­kul­arne ma­se. Mak­ro­mo­le­ku­le či­ne 80 do 90% su­he tva­ri u ve­ći­ni sta­ni­ca. Li­pi­di ta­ko­đer pri­pa­da­ju glav­ nim sas­toj­ci­ma sta­ni­ce. Os­ta­tak sta­nič­ne ma­se sad­r­ži raz­li­či­te ma­le or­gan­ ske mo­le­ku­le uk­lju­ču­ju­ći i mak­ro­mo­le­ku­lar­ne pre­te­če. Pre­ma to­me struk­ tu­ra i fun­kci­ja če­ti­ri­ju glav­nih sku­pi­na or­gan­skih mo­le­ku­la omo­gu­ću­je na­čel­no ra­zu­mi­je­va­nje sta­nič­ne ke­mi­je.

Ug­lji­ko­hid­ra­ti

▶▶ Umjetno sladilo sukraloza

(Splen­da) je sintetički derivat obi­čnog šećera u kojem su neke hi­droksilne skupine zamijenjene klorom.

Ug­lji­ko­hid­ra­ti obuh­va­ća­ju jed­nos­tav­ne še­će­re i po­li­sa­ha­ri­de. Jed­nos­tav­ ni še­će­ri po­put glu­ko­ze glav­na su sta­nič­na hra­na. Kas­ni­je u pog­lav­lju ob­ jas­nit će se da nji­ho­va raz­grad­nja is­tov­re­me­no osi­gu­ra­va sta­nič­nu ener­gi­ju i is­hod­ne tva­ri za sin­te­zu dru­gih sta­nič­nih sas­to­ja­ka. Po­li­sa­ha­ri­di su skla­ diš­ni ob­li­ci še­će­ra ili osi­gu­ra­va­ju struk­tur­nu čvr­sto­ću sta­ni­ce. Uz to po­li­sa­ ha­ri­di i kra­ći še­ćer­ni po­li­me­ri dje­lu­ju kao bi­lje­zi u raz­nim pro­ce­si­ma sta­ nič­nog pre­poz­na­va­nja, uk­lju­ču­ju­ći ad­he­zi­ju sta­ni­ca na sus­je­de i tran­spo­rt pro­tei­na do pred­vi­đe­nog unu­tar­sta­nič­nog od­re­diš­ta. Sli­ka 2-2 pri­ka­zu­je struk­tu­re rep­re­zen­ta­tiv­nih jed­nos­tav­nih še­će­ra (mo­no­sa­ha­ri­da). Os­nov­na for­mu­la tih mo­le­ku­la je (CH2O)n i od nje pot­je­ če na­ziv ug­lji­ko­hid­rat (C = »ug­lji­ko« i H2O = »hid­ra­t«). U sta­ni­ca­ma je oso­bi­to va­žan 6C-atomni še­ćer (n = 6) glu­ko­za, jer je glav­ni iz­vor sta­nič­ne ener­gi­je. Dru­gi jed­nos­tav­ni še­će­ri ima­ju od tri do se­dam ug­lji­ka. Me­đu nji­ma su na­ju­čes­ta­li­ji 3C-atomni i 5C-atomni še­će­ri. Še­će­ri ko­ji sad­r­že pet ili vi­še ug­lji­ko­vih ato­ma mo­gu cik­li­za­ci­jom tvo­ri­ti pr­ste­nas­te struk­tu­re ko­ je su pre­te­ži­ti ob­li­ci tih mo­le­ku­la u sta­ni­ci. Sli­ka 2-2 po­ka­zu­je da cik­lič­ki še­će­ri mo­gu pos­to­ja­ti u dva ob­li­ka (α ili β), ovis­no o kon­fi­gu­ra­ci­ji na ato­ mu C1. Mo­no­sa­ha­ri­di se mo­gu po­ve­za­ti reak­ci­jom de­hid­ra­ci­je, pri ko­joj se od­ va­ja H2O, a še­će­ri se po­ve­zu­ju gli­ko­zid­nom ve­zom iz­me­đu nji­ho­va dva ug­lji­ka (sl. 2-3). Po­ve­žu li se sa­mo ne­ko­li­ko mo­le­ku­la še­će­ra, nas­ta­li oli­go­ mer na­zi­va se oli­go­sa­ha­rid. Kad se po­ve­zu­je mnoš­tvo (sto­ti­ne i ti­su­će) še­ će­ra, nas­ta­li mak­ro­mo­le­ku­lar­ni po­li­me­ri na­zi­va­ju se po­li­sa­ha­ri­di. Po­li­sa­ha­ri­di gli­ko­gen i škrob dva su skla­diš­na ob­li­ka ug­lji­ko­hid­ra­ta, prvi u ži­vo­tinj­skim, a dru­gi u bilj­nim sta­ni­ca­ma. Gli­ko­gen i škrob iz­gra­đe­ ni su is­klju­či­vo od mo­le­ku­la glu­ko­ze u α-kon­fi­gu­ra­ci­ji (sl. 2-4). Glav­na se ve­za stva­ra iz­me­đu C1 jed­ne glu­ko­ze i C4 dru­ge glu­ko­ze. Uz to gli­ko­gen i je­dan ob­lik škro­ba (ami­lo­pek­tin) sad­rž­ e po­neg­dje ve­ze α(1→6) u ko­ji­ma je C1 jed­ne glu­ko­ze po­ve­zan s C6 dru­ge glu­ko­ze. Iz pri­ka­za na sli­ci 2-4 oči­to

STANIČNI SASTAV 

   45

Sli­ka 2-2. Struk­tu­ra jed­nos­tav­nih še­će­ra.  Prikaza­ni su prim­je­ri še­će­ra (trio­za, pen­to­za, hek­so­za) ko­ji sad­r­že tri, pet i še­st C-a­to­ma. Še­će­ri s pet ili vi­še ug­lji­ko­vih ato­ma mo­gu cik­li­ zi­ra­ti. Ob­li­ko­va­ni pr­ste­ni pos­to­je u dva ob­li­ka ovis­no o kon­f i­ gu­ra­ci­ji na pr­vom C-a­to­mu (C1).

je da te ve­ze do­vo­de do gra­na­nja, jer po­ve­zu­ju dva za­seb­na lan­ca iz­gra­đe­na ve­za­ma α(1→4). Raz­gra­na­to­st pos­to­ji sa­ mo u gli­ko­ge­nu i ami­lo­pek­ti­nu, dok dru­gi ob­lik škro­ba (ami­lo­za) ni­je raz­gra­nat. Gli­ko­gen i škrob ima­ju osim na­čel­no slič­ne struk­tu­re i slič­nu fun­kci­ju – da us­kla­diš­te glu­ko­zu. Na­sup­rot to­me fun­kci­ja ce­lu­lo­ze bit­no je raz­li­či­ta. Ce­lu­lo­za je glav­ni grad­ be­ni sas­to­jak sta­nič­nog zi­da u bi­lju. Mož­da iz­ne­na­đu­je da je i ce­lu­lo­za saz­da­na sa­mo od mo­le­ku­la glu­ko­ze. Me­đu­tim, ce­lu­lo­za je ne­raz­gra­na­ti po­li­sa­ha­rid, a glu­koz­ne je­din­ice u ce­lu­lo­zi ni­su α-, ne­go su β-kon­fi­gu­ra­ci­je. Ve­za β(1→4) iz­ me­đu glu­koz­nih je­di­ni­ca, za raz­li­ku od ve­za α(1→4), uv­je­ tu­je stva­ra­nje is­pru­že­nih la­na­ca ce­lu­lo­ze ko­ji se boč­no zdru­žu­ju i ob­li­ku­ju vlak­na ve­li­ke me­ha­nič­ke čvr­sto­će. Po­li­ sa­ha­ri­di i oli­go­sa­ha­ri­di uz ener­get­sku i kon­struk­cij­sku ulo­ gu važ­ni su u broj­nim in­for­ma­cij­skim pro­ce­si­ma. Prim­je­ri­ ce, oli­go­sa­ha­ri­di su čes­to ve­za­ni na pro­tei­ne gdje ima­ju zna­čaj­nu ulo­gu u pro­tein­skom sma­ta­nju te obi­lje­ža­va­nju i us­mje­ri­va­nju pro­tei­na pri tran­spor­tu na pov­r­ši­nu sta­ni­ce ili ug­rad­bu u raz­li­či­te sta­nič­ne or­ga­ne­le. Oli­go­sa­ha­ri­di i po­li­ sa­ha­ri­di ta­ko­đer obi­lje­ža­va­ju sta­nič­nu pov­r­ši­nu pa sto­ga

Sli­ka 2-3. Ob­li­ko­va­nje gli­ko­zid­ne ve­ze.  Dva se jed­ no­s­tav­na še­će­ra po­ve­zu­ju reak­ci­jom de­hid­ra­ci­je (uk­la­ nja­njem mo­le­ku­le vo­de). Prim­jer pri­ka­zu­je po­ve­zi­va­nje dvi­ju mo­le­ku­la glu­ko­ze u α-kon­f i­gu­ra­ci­ji ve­zom iz­me­đu ato­ma C1 i C4, ko­ja se sto­ga na­zi­va α(1→4) gli­ko­zid­na ve­za.

46    POGLAVLJE 2

Sli­ka 2-4. Struk­tu­ra po­li­sa­ha­ri­da.  Po­ li­sa­ha­ri­di su mak­ro­mo­le­ku­le ko­je se sa­ sto­je od sto­ti­na ili ti­su­ća jed­nos­tav­nih še­će­ra. Gli­ko­gen, škrob i ce­lu­lo­za iz­gra­ đe­ni su is­klju­či­vo od glu­ko­za po­ve­za­nih α(1→4) gli­ko­zid­nim ve­za­ma u gli­ko­ge­nu i škro­bu, a β(1→4) ve­za­ma u ce­lu­lo­zi. Gli­ ko­gen i je­dan ob­lik škro­ba (ami­lo­pek­tin) sad­r­že ta­ko­đer po­neg­dje α(1→6) ve­ze, ko­je slu­že kao mjes­ta gra­na­nja pri po­ve­ zi­va­nju dva­ju od­vo­je­nih α(1→4) la­na­ca.

ima­ju važ­nu ulo­gu u sta­nič­nom pre­poz­na­va­nju i sta­ni­čnim in­te­rak­ci­ja­ma u tki­vi­ma mno­gos­ta­nič­nih or­ga­ni­za­ma.

Li­pi­di Li­pi­di ima­ju tri iz­ra­zi­te ulo­ge u sta­ni­ca­ma. 1) Osi­gu­ra­va­ju va­žan ob­lik us­kla­diš­te­ne ener­gi­je, 2) li­pi­di su glav­ni sas­toj­ci sta­nič­nih mem­bra­na, što je oso­bi­to važ­no u sta­nič­noj bio­lo­gi­ji, i 3) li­pi­di su vr­lo važ­ni u sta­nič­noj sig­na­li­za­ci­ji, bi­lo kao ste­roid­ni hor­mo­ni (npr. es­tro­gen i tes­tos­te­ron), bi­lo kao glas­nič­ke mo­le­ku­le ko­je pre­no­se sig­nal od re­cep­to­ra na sta­nič­noj povr­ ši­ni do od­re­diš­ta unu­tar sta­ni­ce. Naj­jed­nos­tav­ni­ji li­pi­di su mas­ne ki­se­li­ne. Sas­to­je se od du­gih ug­lji­ko­ vo­dič­nih la­na­ca, ko­ji na jed­nom kra­ju zav­r­ša­va­ju kar­bok­sil­nom sku­pi­nom (COO–)(sl. 2-5). Ug­lji­ko­vo­dič­ni lan­ci naj­češ­će sad­r­že 16 ili 18 ug­lji­ko­vih ato­ma. Ne­za­si­će­ne mas­ne ki­se­li­ne sad­r­že jed­nu ili vi­še dvos­tru­kih ve­za me­đu ug­lji­ko­vim ato­mi­ma. U za­si­će­nim mas­nim ki­se­li­na­ma svi ato­mi uglji­ka ve­žu mak­si­mal­ni broj vo­di­ko­vih ato­ma. Du­gi ug­lji­ko­vo­dič­ni lan­ci mas­nih ki­se­li­na sad­r­že sa­mo ne­po­lar­ne ve­ze C-H ko­je ne ula­ze u in­te­rak­ ci­ju s vo­dom. Hid­ro­fob­na na­rav mas­no­ki­se­lin­skih la­na­ca od­go­vor­na je za ključ­no po­na­ša­nje kom­plek­snih li­pi­da u stva­ra­nju bio­loš­kih mem­bra­na. Mas­ne se ki­se­li­ne poh­ra­nju­ju u ob­li­ku tria­cil­gli­ce­ro­la, ili mas­ti. Tria­ cil­gli­ce­ro­li sad­r­že tri mas­ne ki­se­li­ne po­ve­za­ne s mo­le­ku­lom gli­ce­ro­la (sl. 2-6). Ne­top­lji­vi su u vo­di pa se u ci­top­laz­mi go­mi­la­ju kao mas­ne na­ku­pi­ne.

STANIČNI SASTAV 

   47

Sli­ka 2-5. Struk­tu­ra mas­nih ki­se­li­ na.  Mas­ne ki­se­li­ne se sas­to­je od du­gih ug­lji­ko­vo­dič­nih la­na­ca ko­ji zav­r­ša­va­ju kar­bok­sil­nom sku­pi­nom (COO –). Pal­mi­tat i stea­rat su za­si­će­ne mas­ne ki­se­li­ne ko­ je sad­r­že 16 od­nos­no 18 C-a­to­ma. Oleat je ne­za­si­će­na mas­na ki­se­li­na s 18 C-a­to­ ma ko­ja ima dvos­tru­ku ve­zu iz­me­đu C9 i C10. Va­lja uo­či­ti da dvos­tru­ka ve­za lo­mi ug­lji­ko­vo­dič­ni la­nac.

Zat­re­ba li, one se ki­da­ju za ko­riš­te­nje u reak­ci­ja­ma ko­je proiz­vo­de ener­gi­ju, o ko­ji­ma će pog­lav­lje ras­prav­lja­ti kas­ni­je. Vri­jed­no je spo­me­na da su ma­sti učin­ko­vi­ti­ji ob­lik za­li­he ener­gi­je od ug­lji­ko­hid­ra­ta, jer da­ju vi­še no dvo­ stru­ko ener­gi­je po ma­si raz­gra­đe­ne tva­ri. Sto­ga mas­ti omo­gu­ću­ju skla­di­ šte­nje ener­gi­je u upo­la ma­nje tje­les­ne te­ži­ne ne­go što bi zah­ti­je­va­li ug­lji­ko­ hid­ra­ti – što je oso­bi­to važ­no kad raz­mat­ra­mo pok­ret­no­st ži­vo­ti­nja. Fos­fo­li­pi­di, glav­ni sas­toj­ci sta­nič­nih mem­bra­na, sas­to­je se od dvi­ju mas­nih ki­se­li­na ve­za­nih na jed­nu po­lar­nu čeo­nu sku­pi­nu (sl. 2-7). U gli­ ce­rol­nim fos­fo­li­pi­di­ma dvi­je su mas­ne ki­se­li­ne ve­za­ne na ug­lji­ko­ve ato­me gli­ce­ro­la, kao u trig­li­ce­ri­di­ma. Me­đu­tim, tre­ći ug­lji­kov atom gli­ce­ro­la ve­ zan je na fos­fat­nu sku­pi­nu ko­ja je pak čes­to pri­po­je­na na ne­ku dru­gu ma­ lu po­lar­nu mo­le­ku­lu, kao što je ko­lin, se­rin, ino­zi­tol ili eta­no­la­min. Sfin­ go­mi­je­lin, je­di­ni neg­li­ce­rol­ni fos­fo­li­pid sta­nič­nih mem­bra­na, sad­rž­ i dva ug­lji­ko­vo­dič­na lan­ca ve­za­na na čeo­nu po­lar­nu sku­pi­nu ko­ju tvo­ri se­rin, a ne gli­ce­rol. Svi fos­fo­li­pi­di ima­ju ne­po­lar­ne »re­po­ve« ko­ji se sas­to­je od dva­ ju ug­lji­ko­vo­dič­nih lana­ca, jed­ne hid­ro­fil­ne čeo­ne sku­pi­ne ko­ja sad­r­ži fos­ fat­nu sku­pi­nu i nje­zi­ne po­lar­ne priv­jes­ke. Sto­ga su fos­fo­li­pi­di am­fi­pa­tič­ne mo­le­ku­le, dje­lo­mi­ce top­lji­ve, a dje­lo­mi­ce ne­top­lji­ve u vo­di. Na tom se svoj­ stvu fos­fo­li­pi­da te­me­lji stva­ra­nje bio­loš­kih mem­bra­na, o če­mu će se ras­ prav­lja­ti kas­ni­je u pog­lav­lju. Uz fos­fo­li­pi­de mno­ge sta­nič­ne mem­bra­ne sad­rž­ e gli­ko­li­pi­de i ko­les­te­ rol. Gli­ko­li­pi­di se sas­to­je od dva­ju ug­lji­ko­vo­dič­nih la­na­ca ve­za­nih na po­ lar­ne čeo­ne sku­pi­ne ko­je sad­r­že ug­lji­ko­hid­ra­te (sl. 2-8). Bu­du­ći da su am­

Sli­ka 2-6. Struk­tu­ra tria­cil­gli­ce­ro­la.  Triacilgliceroli (mas­ti) sad­r­že tri mas­ne ki­seline ve­za­ne na gli­ce­rol. U pri­ka­za­nom prim­je­ru tri mas­ne ki­se­li­ne su pal­mi­tat, ali tria­cil­gli­ ce­ro­li čes­to sad­r­že smje­su raz­li­či­tih mas­nih ki­se­li­na.

48    POGLAVLJE 2

STANIČNI SASTAV 

   49

Sli­ka 2-7. Struk­tu­ra fos­fo­li­pi­da.  Gli­ce­rol­ni fos­fo­li­pi­di sad­r­že dvi­je mas­ne ki­se­li­ne ve­za­ne na gli­ce­rol. Mas­ne se ki­se­li­ne mo­gu raz­li­ko­va­ti pa ih obi­lje­ža­va­mo kao R1 i R2. Treći ug­lji­kov atom gli­ce­ro­la po­ve­zan je s fos­fat­nom sku­pi­nom (ob­li­ku­ju­ći fos­fa­tid­nu ki­se­li­nu). Ta fos­fat­na sku­pi­na za­tim je čes­to po­ve­za­na s ne­kom ma­lom po­lar­nom mo­ le­ku­lom (pri če­mu nas­ta­ju fos­fa­ti­di­le­ta­no­la­min, fos­fa­ti­dil­ko­lin, fos­fa­ti­dil­se­rin ili fos­fa­ ti­di­li­no­zi­tol). U sfin­go­mi­je­li­nu dva ug­lji­ko­vo­dič­na lan­ca ve­za­na su na po­lar­nu čeo­nu sku­pi­nu ko­ja pri­pa­da se­ri­nu um­jes­to gli­ce­ro­lu.

fi­pa­tič­ne mo­le­ku­le us­troj­stvom su na­čel­no slič­ni fos­fo­li­pi­di­ma. Za raz­li­ku od fos­fo­li­pi­da ko­les­te­rol se sas­to­ji od če­ti­ri ug­lji­ko­vo­dič­na pr­ste­na, a ne od li­near­nih ug­lji­ko­vo­dič­nih la­na­ca (sl. 2-9). Ug­lji­ko­vo­dič­ni pr­ste­ni su iz­ra­zi­ to hid­ro­fob­ni, ali je hid­rok­sil­na sku­pi­na (OH), ve­za­na na jed­nom kra­ju ko­les­te­ro­la, sla­bo hid­ro­fil­na pa je i ko­les­te­rol am­fi­pa­ti­čan. Osim ulo­ge u iz­grad­nji sta­nič­nih mem­bra­na, li­pi­di dje­lu­ju kao sig­nal­ne mo­le­ku­le unu­tar i iz­me­đu sta­ni­ca. Ste­roid­ni hor­mo­ni (prim­je­ri­ce es­tro­ gen i tes­tos­te­ron) de­ri­va­ti su ko­les­te­ro­la (v. sl. 2-9). Ti hor­mo­ni či­ne raz­ no­rod­nu sku­pi­nu ke­mij­skih glas­ni­ka. Svi sad­r­že če­ti­ri ug­lji­ko­vo­dič­na pr­ ste­na na ko­je su pri­po­je­ne raz­li­či­te fun­kcio­nal­ne sku­pi­ne. De­ri­va­ti fos­fo­li­pi­da slu­že ta­ko­đer kao glas­nič­ke mo­le­ku­le unu­tar sta­ni­ca pros­lje­đu­ ju­ći sig­na­le od re­cep­to­ra na sta­nič­noj pov­r­ši­ni do unu­tar­sta­nič­nih od­re­diš­ ta ko­ja re­gu­li­ra­ju mno­ge sta­nič­ne pro­ce­se, uk­lju­ču­ju­ći sta­nič­nu pro­li­fe­ra­ci­ ju, kre­ta­nje, pre­živ­lje­nje i di­fe­ren­ci­ja­ci­ju. (v. pog­l. 15)

Nuk­lein­ske ki­se­li­ne Nuk­lein­ske ki­se­li­ne – DNA i RNA – glav­ne su in­for­ma­cij­ske mo­le­ku­le u sta­ni­ca­ma. Deok­si­ri­bo­nuk­lein­ska ki­se­li­na (DNA) ima je­din­ca­tu ulo­gu kao ge­ne­tič­ka tvar ko­ja je u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma smješ­te­na u jez­gru. Raz­li­či­ti ti­po­vi ri­bo­nuk­lein­skih ki­se­li­na (RNA) sud­je­lu­ju u ne­ko­li­ko sta­

Sli­ka 2-8. Struk­tu­ra gli­ko­li­pi­da.  Dva ug­lji­ko­vo­dič­na lan­ca ve­za­na su na po­lar­ nu čeo­nu sku­pi­nu ko­ja pot­je­če od se­ri­na i sad­r­ži ug­lji­ko­hid­ra­te (prim­je­ri­ce glu­ko­ zu).

Sli­ka 2-9. Ko­les­te­rol i ste­roid­ni hor­ mo­ni.  Ko­les­te­rol, važ­ni sas­to­jak sta­ni­ čnih mem­bra­na, am­f i­pa­tič­na je mo­le­ku­la zbog svo­je po­lar­ne hid­rok­sil­ne sku­pi­ne. Ko­les­te­rol je ta­ko­đer pre­te­ča ste­roid­nih hor­mo­na kao što su tes­tos­te­ron i es­tra­ diol (ob­lik es­tro­ge­na). Sli­ka ne pri­ka­zu­ je vo­di­ko­ve ato­me ve­za­ne na ug­lji­ke u prste­nu.

50    POGLAVLJE 2 nič­nih ak­tiv­nos­ti. Glas­nič­ka RNA (mR­NA) no­si in­for­ma­ci­ju od DNA do ri­bo­so­ma, gdje slu­ži kao ka­lup za sin­te­zu pro­tei­na. Dru­ga dva ti­pa RNA (ri­bo­som­ska RNA i tran­sfe­r-R­NA) sud­je­lu­ju u sin­te­zi pro­tei­na. Os­ta­li ti­ po­vi RNA uk­lju­če­ni su u pro­ce­sui­ra­nje i pri­je­nos ri­bo­nuk­lein­skih ki­se­li­na i pro­tei­na. Osim što dje­lu­je kao in­for­ma­cij­ska mo­le­ku­la RNA je ta­ko­đer spo­sob­na ka­ta­li­zi­ra­ti ne­ke ke­mij­ske reak­ci­je. U da­naš­njim sta­ni­ca­ma tak­ve su reak­ci­je uk­lju­če­ne u sin­te­zu pro­tei­na i pro­ce­sui­ra­nje RNA. DNA i RNA su nuk­leo­tid­ni po­li­me­ri ko­ji sad­r­že pu­rin­ske i pi­ri­mi­din­ ske ba­ze ve­za­ne na fos­fo­ri­li­ra­ne še­će­re (sl. 2-10). DNA sad­r­ži dva pu­ri­na (ade­nin i gva­nin) i dva pi­ri­mi­di­na (ci­to­zin i ti­min). Ade­nin, gva­nin i ci­ to­zin ta­ko­đer su pri­sut­ni u RNA, ali RNA sad­rž­ i ura­cil um­jes­to ti­mi­na. Ba­ze se ve­žu na še­će­re (2'-deok­si­ri­bo­zu u DNA, ili ri­bo­zu u RNA) da nas­ ta­nu nuk­leo­zi­di. Nuk­leo­ti­di do­dat­no sad­rž­ e jed­nu ili vi­še fos­fat­nih sku­pi­ na ve­za­nih na 5'-ugljik nuk­leo­zid­nog še­će­ra.

Sli­ka 2-10. Sas­toj­ci nuk­lein­skih ki­se­li­ na.  Nukleinske ki­se­li­ne sad­r­že pu­rin­ske i pi­ri­mi­din­ske ba­ze veza­ne na fos­fo­ri­li­ra­ ne še­će­re. Ba­za nuk­lein­ske ki­se­li­ne ve­za­ na sa­mo na še­ćer je nuk­leo­zid. Nuk­leo­ti­ di do­dat­no sad­r­že jed­nu ili vi­še fos­fat­nih sku­pi­na.

STANIČNI SASTAV 

   51

Sli­ka 2-11. Po­li­me­ri­za­ci­ja nuk­leo­ti­da.  Fos­fo­dies­ter­ska se ve­za ob­li­ku­je iz­me­đu 3'hidroksilne sku­pi­ne jed­nog nuk­leo­ti­da i 5'-fosfatne sku­pi­ne dru­gog. Po­li­nuk­leo­tid­ni la­nac je us­mje­re­na mo­le­ku­la: je­dan kraj zav­rš­ a­va 5'-fosfatnom sku­pi­nom (5' kraj), a dru­gi 3'-hidroksilnom sku­pi­nom (3' kraj).

Po­li­me­ri­za­ci­ja nuk­leo­ti­da ko­jom se ob­li­ku­ju nuk­lein­ske ki­se­li­ne, uk­lju­ ču­je stva­ra­nje fos­fo­dies­ter­skih ve­za iz­me­đu 5'-fosfata jed­nog nuk­leo­ti­da i 3'-hidroksila dru­gog nuk­leo­ti­da (sl. 2-11). Oli­go­nuk­leo­ti­di su oli­go­me­ri ko­ji sad­r­že sa­mo ne­ko­li­ko nuk­leo­ti­da. Ve­li­ki po­li­nuk­leo­ti­di ko­ji či­ne RNA i DNA mo­gu sad­r­ža­va­ti ti­su­će i mi­li­ju­ne nuk­leo­ti­da. Vri­jed­no je is­tak­nu­ti da je po­li­nuk­leo­tid­ni la­nac us­mje­re­na mo­le­ku­la ko­joj je na jed­nom kra­ju 5'-fosfat, a na dru­gom 3'-hidroksilna sku­pi­na. Po­li­nuk­leo­ti­di se uvi­jek sin­ te­ti­zi­ra­ju u smje­ru od 5' pre­ma 3', ta­ko da se slo­bod­ni nuk­leo­tid do­da­je na 3'-OH-skupinu ras­tu­ćeg lan­ca. Do­go­vor­no sli­jed ba­za u DNA i RNA ta­ko­ đer se is­pi­su­je u smje­ru od 5' pre­ma 3'. In­for­ma­ci­ja u DNA i RNA pros­lje­đu­je se sli­je­dom ba­za u po­li­nuk­leo­ti­ du. DNA je dvos­tra­na mo­le­ku­la ko­ja se sas­to­ji od dva po­li­nuk­leo­tid­na sup­ rot­no us­mje­re­na lan­ca (v. pogl. 3). In­for­ma­ci­ja u DNA i RNA priop­ću­je se sli­je­dom ba­za u po­li­nuk­leo­ti­du. DNA je dvos­tru­ka mo­le­ku­la ko­ja se sas­to­ ji od dva sup­rot­no us­mje­re­na po­li­nuk­leo­tid­na lan­ca (v. pogl. 3). Ba­ze su u unut­raš­njos­ti mo­le­ku­le i vo­di­ko­ve ve­ze iz­me­đu kom­ple­men­tar­nih pa­ro­va ba­za po­ve­zu­ju dva lan­ca. Ade­nin se spa­ru­je s ti­mi­nom, a gva­nin s ci­to­zi­ nom (sl. 2-12). Bit­na pos­lje­di­ca tak­vog kom­ple­men­tar­nog po­ve­zi­va­nja ba­ za je­st da je­dan la­nac DNA (ili RNA) mo­že dje­lo­va­ti kao ka­lup ko­ji us­mje­ ru­je sin­te­zu kom­ple­men­tar­nog lan­ca. Nuk­lein­ske ki­se­li­ne ima­ju, dak­le jed­inca­tu spo­sob­no­st sa­mo­rep­li­ka­ci­je i za­to u sta­ni­ci dje­lu­ju kao os­nov­ne in­for­ma­cij­ske mo­le­ku­le. In­for­ma­cij­ski sad­r­žaj u DNA i RNA us­mje­ru­je sin­te­zu spe­ci­fič­nih pro­tei­na ko­ji nad­zi­ru ve­ći­nu sta­nič­nih ak­tiv­nos­ti. Osim što su gra­đev­ne je­di­ni­ce nuk­lein­skih ki­se­li­na, nuk­leo­ti­di ima­ju i dru­ge ključ­ne ulo­ge u sta­nič­nim pro­ce­si­ma. Najis­tak­nu­ti­ji prim­jer je ade­ no­zi­n-5'-tri­fos­fat (ATP), ko­ji je glav­ni ob­lik ke­mij­ske ener­gi­je unu­tar sta­ ni­ca. Slič­no dje­lu­ju i dru­gi nuk­leo­ti­di ko­ji u broj­nim me­ta­bo­lič­kim reak­ci­ ja­ma do­no­se ener­gi­ju ili ak­ti­vi­ra­ne kemij­ske sku­pi­ne. Ne­ki nuk­leo­ti­di (pri­mje­ri­ce cik­lič­ki AMP) važ­ne su sig­nal­ne mo­le­ku­le unu­tar sta­ni­ca (v. pogl. 15).

Sli­ka 2-12. Kom­ple­men­tar­no spa­ri­va­ nje ba­za nuk­lein­skih ki­se­li­na.  Stva­ ranje vo­di­ko­vih ve­za iz­me­đu ba­za sup­rot­no us­mje­re­nih la­na­ca DNA omo­ gu­ću­je spe­ci­f ič­no spa­ri­va­nje gva­ni­na (G) s ci­to­zi­nom (C) i ade­nina (A) s ti­mi­nom (T).

52    POGLAVLJE 2

Pro­tei­ni

Sli­ka 2-13. Struk­tu­ra ami­no­ki­se­li­ na.  Sva­ka se ami­no­ki­se­li­na sas­to­ji od sre­diš­njeg ato­ma ug­lji­ka (α-ug­ljik) veza­ nog na vo­di­kov atom, kar­bok­sil­nu sku­ pi­nu, ami­no-skupinu i spe­ci­f ič­ni boč­ni og­ra­nak (oz­na­čen kao R). Kod fi­zio­loš­kog pH kar­bok­sil­na sku­pi­na i ami­no-sku­pi­na su io­ni­zi­ra­ne ka­ko je pri­ka­za­no.

▶▶ Osim što su gra­div­ne mo­le­

ku­le za pro­tei­ne, ami­no­ki­se­li­ne obav­lja­ju važ­nu fun­kci­ju kao mo­le­ku­le ko­je sta­ni­ca ko­ris­ti­ za ko­mu­ni­ka­ci­ju. Ami­no­ki­se­li­ne gli­cin i glu­ta­mat pov­rh ne­ko­li­ ko ami­no­ki­se­li­na ko­je se na­la­ze u pro­tei­ni­ma dje­lu­ju kao neu­ro­ tran­smi­te­ri (v. pogl. 15).

▶▶ Pro­tei­ni po­ka­zu­ju nev­je­ro­jat­

nu raz­li­či­to­st. Prim­je­ri neo­bič­nih pro­tei­na: •  Ce­men­tni pro­tei­ni ko­ji slu­že ra­či­ći­ma (Cir­ri­pe­dia – Crus­ta­cea) u školj­ka­ma za pričvr­šće­nje na pod­vod­ne pov­r­ši­ne. Znan­stve­ ni­ci po­ku­ša­va­ju proiz­ves­ti tak­ve pro­tei­ne za in­dus­trij­ske pot­re­be u proiz­vod­nji lje­pi­la ili an­ti­ko­ro­ ziv­nih pre­ma­za. •  Svi­la pau­ka Nep­hi­la cla­vi­pes. Ia­ko je ek­strem­no la­ga­na i flek­si­ bil­na čvr­sta je kao »kev­la­r« ko­ji slu­ži za iz­ra­dbu nep­ro­boj­nih pr­ slu­ka.

Dok nuk­lein­ske ki­se­li­ne no­se ge­ne­tič­ku in­for­ma­ci­ju sta­ni­ce, pri­mar­na je duž­no­st pro­tei­na da iz­ve­du za­da­će pre­ma upu­ta­ma te in­for­ma­ci­je. Pro­ tei­ni su naj­raz­no­li­ki­ji od svih mak­ro­mo­le­ku­la. Sva­ka sta­ni­ca sad­r­ži ne­ko­li­ ko ti­su­ća pro­tei­na ko­ji iz­vo­de naj­raz­li­či­ti­je za­da­će. Pro­tei­ni slu­že kao kon­ struk­tiv­ne sas­tav­ni­ce sta­ni­ca i tki­va, pre­no­se i poh­ra­nju­ju ma­le mo­le­ku­le (npr. pri­je­nos ki­si­ka po­mo­ću he­mog­lo­bi­na), pre­no­se i in­for­ma­ci­je iz­me­đu sta­ni­ca (prim­je­ri­ce hor­mo­ni) te osi­gu­ra­va­ju ob­ra­nu od in­fek­ci­je (prim­je­ri­ ce pro­tu­ti­je­la). Me­đu­tim, ključ­na je ulo­ga pro­tei­na da dje­lu­ju kao en­zi­mi ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju sko­ro sve ke­mij­ske reak­ci­je u bio­loš­kim sus­ta­vi­ma, ka­ko će po­ka­za­ti nas­ta­vak pog­lav­lja. Na taj na­čin pro­tei­ni up­rav­lja­ju go­to­vo svim ak­tiv­nos­ti­ma sta­ni­ce. Sre­diš­nju ulo­gu pro­tei­na u bio­loš­koj ke­mi­ji is­ka­za­na je nji­ho­vim na­zi­vom, ko­ji pot­je­če od gr­čke ri­je πρωτειον, što zna­či »pr­vi«, »pr­vo­raz­red­ni«. Pro­tei­ni su po­li­me­ri sas­tav­lje­ni od dva­de­set raz­li­či­tih ami­no­ki­se­li­na. Sva­ka se ami­no­ki­se­li­na sas­to­ji od ug­lji­ko­vog ato­ma (naz­va­nog α-ug­ljik) po­ve­za­nog s kar­bok­sil­nom sku­pi­nom (COO–), ami­no-sku­pi­nom (NH3+), vo­di­ko­vim ato­mom i pre­poz­nat­lji­vim boč­nim og­ran­kom (sl. 2-13). Spe­ci­ fič­na ke­mij­ska svoj­stva ami­no­ki­se­lin­skih boč­nih og­ra­na­ka od­re­đu­ju ulo­ge sva­ke po­je­di­ne ami­no­ki­se­li­ne u pro­tein­skoj struk­tu­ri i fun­kci­ji. Ami­noki­se­li­ne se mo­gu razvr­sta­ti pre­ma svoj­stvi­ma boč­nih og­ra­na­ka u če­ti­ri vr­ste (sl. 2-14). De­set ami­no­ki­se­li­na ima­ju ne­po­lar­ne boč­ne og­ran­ke ko­ji ne stu­pa­ju u in­te­rak­ci­ju s vo­dom. Gli­cin je naj­jed­nos­tav­ni­ja ami­no­ki­ se­li­na – nje­gov boč­ni og­ra­nak sad­r­ži sa­mo vo­di­kov atom. Ala­nin, va­lin, leu­cin i izo­leu­cin ima­ju uglji­ko­vo­dič­ne boč­ne og­ran­ke ko­ji sad­r­že do če­ti­ ri ug­lji­ko­va ato­ma. Boč­ni og­ran­ci tih ami­no­ki­se­li­na su hid­ro­fob­ni i zbog to­ga se nas­to­je smjes­ti­ti u sre­diš­te pro­tei­na da iz­bjeg­nu do­dir s vo­dom. Slič­no i pro­lin sad­r­ži ug­lji­ko­vo­dič­ni boč­ni og­ra­nak, ali pro­lin je je­din­cat po to­me što je nje­gov boč­ni og­ra­nak s jed­ne stra­ne ve­zan na du­ši­kov atom ami­no-sku­pi­ne, a s dru­ge na α-ug­ljik ta­ko da ob­li­ku­je pr­ste­nas­tu struk­tu­ ru. Boč­ni og­ran­ci dvi­ju ami­no­ki­se­li­na, cis­tei­na i me­tio­ni­na, sad­r­že ato­me sum­po­ra. Me­tio­nin je pri­lič­no hid­ro­fo­ban za raz­li­ku od cis­tei­na ko­ji ni­je hid­ro­fo­ban zbog svo­je sul­fhid­ril­ne sku­pi­ne (SH). Cis­tein­ska sul­fhid­ril­na sku­pi­na ima važ­nu ulo­gu u pro­tein­skoj struk­tu­ri, jer do­la­zi do stva­ra­nja di­sul­fid­nih ve­za iz­me­đu boč­nih cis­tein­skih og­ra­na­ka, ali o to­me će se ras­ prav­lja­ti kas­ni­je. Ko­nač­no, dvi­je ne­po­lar­ne ami­no­ki­se­li­ne, fe­ni­la­la­nin i trip­to­fan, sad­r­že u svo­jim boč­nim og­ran­ci­ma iz­ra­zi­to hid­ro­fob­ne aro­mat­ ske pr­ste­ne. Pet ami­no­ki­se­li­na ima­ju po­lar­ne, ali ne­na­bi­jene boč­ne og­ran­ke. To su se­rin, treo­nin i ti­ro­zin, ko­ji pos­je­du­ju hid­rok­sil­nu sku­pi­nu u boč­nom lan­ cu, te as­pa­ra­gin i glu­ta­min, ko­ji sad­r­že po­lar­ne amid­ne sku­pi­ne (O=C– NH2). Bu­du­ći da po­lar­ni boč­ni og­ran­ci mo­gu stva­ra­ti vo­di­ko­ve ve­ze s vo­ dom, ove su ami­no­ki­se­li­ne hid­ro­fil­ne i nas­to­je se smjes­ti­ti na pov­r­ši­ni pro­ tei­na. Ami­no­ki­se­li­ne li­zin, ar­gi­nin i his­ti­din u boč­nom og­ran­ku pos­je­du­ju na­ bi­je­ne ba­zič­ne sku­pi­ne. Li­zin i ar­gi­nin su vr­lo ba­zič­ne ami­no­ki­se­li­ne i u sta­ni­ci nji­ho­vi boč­ni og­ran­ci no­se po­zi­tiv­ni na­boj. Zbog to­ga su vr­lo hid­ ro­fil­ni i smješ­te­ni na pov­r­ši­ni pro­tei­na os­tva­ru­ju do­dir s vo­dom. His­ti­din mo­že bi­ti ne­na­bi­jen ili po­zi­tiv­no na­bi­jen kod fi­zio­loš­kog pH. Čes­to ak­tiv­ no sud­je­lu­je u en­zim­skim reak­ci­ja­ma ko­je uk­lju­ču­ju raz­mje­nu vo­di­ko­vih io­na kao što po­ka­zu­je prim­jer, ko­ji će­mo opi­sa­ti u slje­de­ćem od­jelj­ku. Ko­nač­no, dvi­je ami­no­ki­se­li­ne, as­pa­ra­gin­ska i glu­ta­min­ska ki­se­li­na, po­ sje­du­ju ki­se­le boč­ne og­ran­ke ko­ji zav­r­ša­va­ju kar­bok­sil­nim sku­pi­na­ma. Te su ami­no­ki­se­li­ne ne­ga­tiv­no na­bi­je­ne unu­tar sta­ni­ce i za­to ih se čes­to spo­

STANIČNI SASTAV 

mi­nje kao as­par­tat i glu­ta­mat. Slič­no ba­zič­nim ami­no­ki­se­li­na­ma i ki­se­le ami­ no­ki­se­li­ne su iz­ra­zi­to hid­ro­fil­ne i naj­češ­će smješ­te­ne na pov­r­ši­ni pro­tei­na. Ami­no­ki­se­li­ne su me­đu­sob­no po­ve­za­ne pep­tid­nim ve­za­ma iz­me­đu α-a­mi­no-sku­pi­ne jed­ne ami­no­ki­se­li­ne i α-kar­bok­sil­ne sku­pi­ne dru­ge (sl. 2-15). Po­li­pep­ti­di su du­gi li­near­ni lan­ci ko­ji sad­r­že sto­ti­ne ili ti­su­će ami­ no­ki­se­li­na. Sva­ki po­li­pep­tid­ni la­nac ima dva raz­li­či­ta kra­ja, je­dan ko­ji zavr­ ša­va α-amino-skupinom (ami­no- ili N-kraj ili N-ter­mi­nus) i dru­gi, ko­ji zav­r­ša­va α-kar­bok­sil­nom sku­pi­nom (kar­bok­si- ili C-terminus ili C-kraj). Po­li­pep­ti­di se sin­te­ti­zi­ra­ju ni­za­njem ami­no­ki­se­li­na na C-kra­ju. Sli­jed ami­ no­ki­se­li­na u po­li­pep­ti­du is­pi­su­je se (pre­ma do­go­vo­ru) is­tim re­dom.

   53

Sli­ka 2-14. Ami­no­ki­se­li­ne.  Naz­na­če­ne su tros­lov­na i jed­nos­lov­na kra­ti­ca za sva­ ku ami­no­ki­se­li­nu. Na os­no­vi svoj­sta­va boč­nih og­ra­na­ka ami­no­ki­se­li­ne su razvr­ sta­ne u če­ti­ri ka­te­go­ri­je: ne­po­lar­ne, po­ lar­ne, ba­zič­ne i ki­se­le.

54    POGLAVLJE 2

KL JUČNI POKUS

Smatanje po­li­pep­tid­nih la­na­ca Re­duk­tiv­no ki­da­nje di­sul­fid­nih mos­to­va u ri­bo­nuk­lea­zi Mic­hael Se­la, Fre­de­ri­ck H. Whi­te, Jr. i Chris­tian B. An­fin­sen National Institutes of Health, Bethesda, MD Scien­ce, vol. 125, 1957, str. 691-692

Kontekst Fun­kcio­nal­ni pro­tei­ni su znat­no slo­že­ ni­ji od li­near­nih la­na­ca ami­no­ki­se­li­na. Stva­ra­nje ak­tiv­nih en­zi­ma ili dru­gih pro­tei­na zah­ti­je­va sma­ta­nje po­li­pep­ti­d­ nih la­na­ca u pre­ciz­nu trodi­men­zionalnu kon­for­ma­ci­ju. Ta raz­li­ka iz­me­đu pro­ tei­na i po­li­pep­tid­nih la­na­ca pos­tav­lja ključ­na pi­ta­nja pri ra­zu­mi­je­vanju od­ no­sa pro­tein­ske struk­tu­re i fun­kci­je. Ka­ko je odab­ra­na pra­va kon­for­ma­ci­ja od mno­gih mo­gu­ćih kon­for­ma­ci­ja ko­je bi po­li­pep­tid­ni la­nac mogao pop­ri­mi­ti? Odak­le in­for­ma­ci­ja ko­ja us­mje­ru­je pro­ tein­sko sma­ta­nje? Kla­sič­ni po­kus Chris­tia­na An­fin­se­ na i nje­go­vih su­rad­ni­ka od­go­va­ra na ta pi­ta­nja. Prou­ča­va­ju­ći en­zim ri­bo­ nuk­lea­zu, An­fin­sen i su­rad­ni­ci us­pje­li su po­ka­za­ti da se de­na­tu­ri­ra­ni pro­tei­ ni mo­gu spon­ta­no po­nov­no smo­ta­ti u

Sli­ka 2-15. Stva­ra­nje pep­tid­ne ve­ ze.  Kar­bok­sil­na sku­pi­na jed­ne ami­no­ ki­se­li­ne po­ve­za­na je s ami­no-­skupi­nom dru­ge.

ak­tiv­nu kon­for­ma­ci­ju. Pre­ma to­me pri­ mar­ni ami­no­ki­se­lin­ski sli­jed sad­r­ži svu pot­reb­nu in­for­ma­ci­ju ko­ja od­re­đu­je pra­vil­nu tro­di­men­zionalnu kon­for­ma­ ci­ju pro­tei­na. Niz ek­spe­ri­me­na­ta na­ veo je An­fin­se­na da zak­lju­či da na­tiv­na trodi­men­zionalna struk­tu­ra pro­tei­na od­go­va­ra ter­mo­di­na­mič­ki naj­sta­bil­ni­joj kon­for­ma­ci­ji ko­ju od­re­đu­ju in­te­rak­ci­ je sas­tav­nih ami­no­ki­se­li­na. Ori­gi­nal­na opa­ža­nja ko­ja su do­ve­la do ovog ključ­ nog na­če­la au­to­ri Mic­hael Se­la, Fre­de­ ri­ck H. Whi­te, Jr. i Chris­tian B. An­fin­sen ob­ja­vi­li su u ci­ti­ra­nom ra­du 1957.

Pokusi Se­la, Whi­te i An­fin­sen prou­ča­va­li su go­ve­đu ri­bo­nuk­lea­zu, ma­li pro­tein od 124 ami­no­ki­se­li­ne ko­ji sad­r­ži če­ti­ri di­ sul­fid­ne (S-S) ve­ze iz­me­đu boč­nih og­

Chris­tian B. An­fin­sen

ra­na­ka cis­tei­na. En­zim­ska ak­tiv­no­st od­re­đi­va­na je mje­re­njem spo­sob­nos­ti en­zi­ma da po­ki­da RNA u nuk­leo­ti­de, što je pos­tu­pak za od­re­đi­va­nje fun­kci­je na­tiv­nog pro­tei­na. En­zim­ska je ak­tiv­ no­st pot­pu­no nes­ta­la ako su pos­tup­ kom u en­zi­mu po­ki­da­ne ne­ko­val­entne ve­ze (npr. vodikove veze) i re­du­ci­ra di­ sul­fid­ne ve­ze u sul­fhid­ril­ne (SH) sku­pi­ ne. Denaturirani pro­tein se po­na­ša kao slu­čaj­na neak­tiv­na kon­for­ma­ci­ja.

Ka­rak­te­ris­tič­na svoj­stva pro­tei­na od­re­đe­na su spe­ci­fič­nim ami­no­ki­se­ lin­skim sli­je­dom. 1953. Fre­de­ri­ck San­ger od­re­dio je pr­vi pot­pu­ni sli­jed ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­nu. Bio je to sli­jed u hor­mo­nu in­zu­li­nu. Po­ka­za­lo se da se in­zu­lin sas­to­ji od dva po­li­pep­tid­na lan­ca ko­ji su me­đu­sob­no po­ve­za­ ni di­sul­fid­nim ve­za­ma iz­me­đu cis­tein­skih og­ra­na­ka (sl. 2-16). Naj­važ­ni­ja spoz­na­ja u San­ge­ro­vom ek­spe­ri­men­tu je­st da se sva­ki pro­tein sas­to­ji od svog spe­ci­fič­nog sli­je­da ami­no­ki­se­li­na. Da­nas se slje­do­vi ami­no­ki­se­li­na ne­ kog pro­tei­na od­re­đu­ju de­duk­ci­jom iz sek­ven­ce nuk­leo­ti­da u mR­NA. Do da­nas su poz­na­te pot­pu­ne ami­no­ki­se­lin­ske sek­ven­ce za vi­še od 100.000 pro­tei­na. Sva­ka sad­r­ži je­din­ca­ti ami­no­ki­se­lin­ski sli­jed ko­ji je od­re­đen re­ dos­li­je­dom nuk­leo­ti­da u ge­nu (v. pogl. 4). Ami­no­ki­se­lin­ski sli­jed pro­tei­na tek je pr­vi ele­me­nt pro­tein­ske struk­tu­ re. Pro­tei­ni ni­su iz­du­že­ni lan­ci ami­no­ki­se­li­na. Oni pop­ri­ma­ju svoj­stve­nu tro­di­men­zio­nal­nu kon­for­ma­ci­ju ko­ja je bit­na za nji­ho­vu fun­kci­ju. Tro­di­ men­zio­nal­ne kon­for­ma­ci­je pro­tei­na pos­lje­di­ca su me­đu­sob­ne in­te­rak­ci­je sas­tav­nih ami­no­ki­se­li­na ta­ko da su i pros­tor­ni ob­li­ci pro­tei­na od­re­đe­ni ami­no­ki­se­lin­skim sli­je­dom. Pr­vi je to po­ka­zao Chris­tian An­fin­sen ek­spe­ ri­men­tom u ko­jem je zag­ri­ja­va­njem po­ki­dao tro­di­men­zio­nal­nu pro­tein­sku struk­tu­ru. Po­pu­ca­le su sa­mo ne­ko­va­len­tne ve­ze. Taj pro­ces na­zi­va­mo de­

STANIČNI SASTAV 

   55

KL JUČNI POKUS

Sa­že­tak re­zul­ta­ta re­na­tu­ra­cij­skih po­ku­ sa. En­zim­ska ak­tiv­no­st ri­bo­nuk­lea­ze gra­fič­ki je pri­ka­za­na kao fun­kci­ja broj­nos­ti sul­fhid­ril­nih sku­pi­na pri­sut­nih na­kon raz­li­či­tih pos­tu­pa­ka. Ak­tiv­no­st je iz­ra­že­na kao pos­to­tak ak­tiv­nos­ti na­tiv­nog en­zi­ma.

Oso­bi­to je važ­no da su Se­la, Whi­te i An­fin­sen opa­zi­li da se en­zim­ska ak­tiv­ no­st vra­ća ako se de­na­tu­ri­ra­ni pro­tein in­ku­bi­ra u uv­je­ti­ma ko­ji omo­gu­ću­ju da se po­li­pep­tid­ni la­nac po­nov­no smota i di­sul­fid­ne ve­ze po­nov­no us­pos­ta­ve. U tim po­ku­si­ma uk­lo­nje­no je de­ na­tu­ri­ra­ju­će sred­stvo, a za­tim je inak­ ti­vi­ra­ni en­zim in­ku­bi­ran u fi­zio­loš­kom pu­fe­ru u pri­sut­nos­ti O2. Taj pos­tu­pak

Sli­ka 2-16. Ami­no­ki­se­lin­ski sli­jed in­zu­li­ na.  In­zu­lin se sas­to­ji od dvaju po­li­pep­tid­ nih lanaca, od ko­jih je­dan sad­r­ži 21, a dru­gi 30 ami­no­ki­se­li­na (naz­na­če­nih od­go­va­ra­ju­ ćim jed­nos­lov­nim sim­bo­lom).

do­veo je do ok­si­da­ci­je sulfhid­ril­nih sku­pi­na i po­nov­ne us­pos­ta­ve di­sul­fid­ nih ve­za. Tim pro­ce­som en­zi­mu se vra­ ti­la ka­ta­li­tič­ka ak­tiv­no­st, što do­ka­zu­je da se en­zim po­nov­no smo­tao u na­tiv­ nu kon­for­ma­ci­ju. Bu­du­ći da ni­su bi­le pri­sut­ne dru­ge sta­nič­ne kom­po­nen­te, sva pot­reb­na in­for­ma­ci­ja za pro­tein­sko sma­ta­nje oči­to je pot­je­ca­la od pri­mar­ nog ami­no­ki­se­lin­skog sli­je­da u po­li­ pep­tid­nom lan­cu.

Uči­nak Dalj­nji po­ku­si od­re­di­li su uv­je­te u ko­ji­ ma de­na­tu­ri­ra­na ri­bo­nuk­lea­za pot­pu­no vra­ti svo­ju na­tiv­nu struk­tu­ru i en­zim­ sku ak­tiv­no­st pot­vr­đu­ju­ći »ter­mo­di­na­ mič­ku hi­po­te­zu« pro­tein­skog sma­ta­nja

ko­ja ka­že da na­tiv­na trodi­men­zionalna struk­tu­ra pro­tei­na od­go­va­ra ter­mo­di­ na­mič­ki naj­sta­bil­ni­jem sta­nju u fi­zio­ loš­kim uv­je­ti­ma. Ter­mo­di­na­mič­ku sta­ bil­no­st od­re­đu­ju in­te­rak­ci­je sas­tav­nih ami­no­ki­se­li­na u sli­je­du. Bu­du­ći da re­ dos­li­jed nuk­leo­ti­da u DNA spe­ci­fi­ci­ra sli­jed ami­no­ki­se­li­na u po­li­pep­ti­du, sli­ je­di da nuk­leo­tid­ni sli­jed u ge­nu sad­r­ži svu in­for­ma­ci­ju pot­reb­nu za trodi­men­ zionalnu struk­tu­ru svog pro­tein­skog pro­duk­ta. Prem­da je An­fin­se­nov rad pos­ta­vio ter­mo­di­na­mič­ki te­melj za pro­tein­sko sma­ta­nje, ra­zu­mi­je­va­nje me­ha­niz­ma tog pro­ce­sa još je ak­tiv­no is­tra­ži­vač­ko pod­ruč­je. Pro­tein­sko sma­ta­nje je izu­ zet­no slo­že­no i još uvi­jek je ne­mo­gu­će pred­vid­je­ti trodi­men­zionalnu struk­tu­ ru pro­tei­na iz­rav­no iz amino­ki­se­lin­ske sek­ven­ce. Ta­ko­đer je važ­no na­po­me­ nu­ti da je spon­ta­no sma­ta­nje pro­tei­na in vit­ro mno­go spo­ri­je ne­go pro­tein­sko sma­ta­nje u sta­nici, gdje po­ma­žu en­zi­ mi (v. pog­l. 7). Sma­ta­nje pro­tei­na os­ta­ je sre­diš­nji iza­zov bio­loš­ke ke­mi­je.

56    POGLAVLJE 2

Sli­ka 2-17. De­na­tu­ra­ci­ja i po­nov­no sma­ta­nje pro­tei­na.  Nor­mal­no se pro­tein sma­ ta u svo­ju na­tiv­nu kon­for­ma­ci­ju ko­ja sad­r­ži če­ti­ri di­sul­f id­ne ve­ze (naz­na­če­ne kao spa­ re­ni kru­ži­ći ko­ji pred­stav­lja­ju cis­tei­ne).

Sli­ka 2-18. Trodi­men­zionalna struk­tu­ ra miog­lo­bi­na.  Miog­lo­bin je pro­tein od 153 ami­no­ki­se­li­ne ko­ji sud­je­lu­je u tran­spor­tu ki­si­ka. Po­li­pep­tid­ni la­nac se sma­ta oko he­m-sku­pi­ne ko­ja slu­ži kao vez­no mjes­to za ki­sik.

na­tu­ra­ci­jom (sl. 2-17). Na­kon in­ku­ba­ci­je u bla­gim uv­je­ti­ma na taj na­čin de­na­tu­ri­ra­ni pro­tei­ni čes­to se spon­ta­no vra­ća­ju u na­tiv­nu kon­for­ma­ci­ju, što je po­ka­za­telj da su kon­for­ma­ci­je iz­rav­no od­re­đe­ne ami­no­ki­se­lin­skim sli­je­dom. Tro­di­men­zio­nal­na struk­tu­ra pro­tei­na naj­češ­će se ana­li­zi­ra kris­ta­log­ra­ fi­jom uz X-zra­ke, što je teh­ni­ka vi­so­ke re­zo­lu­ci­je ko­ja ra­zot­kri­va raz­mješ­ taj po­je­di­nač­nih ato­ma unu­tar mo­le­ku­le. Snop X-zra­ka us­mje­ru­je se na kris­tal ana­li­zi­ra­nog pro­tei­na. X-zra­ke ko­je pro­đu kroz pro­tein­ski kris­tal de­tek­ti­ra­ju se fil­mom os­jet­lji­vim na X-zra­ke. Kad X-zra­ke uda­re kris­tal, ras­pr­šu­ju se na ka­rak­te­ris­ti­čan na­čin ko­ji je od­re­đen ras­po­re­dom ato­ma u mo­le­ku­li. Struk­tu­ra mo­le­ku­le može se izvesti na os­no­vi ras­pr­še­nih X-zra­ka (dif­rak­cij­ski uzo­rak). 1958. go­di­ne Jo­hn Ken­drew pr­vi je od­re­dio tro­di­men­zio­nal­nu struk­tu­ ru pro­tei­na miog­lo­bi­na, jed­nos­tav­nog pro­tei­na saz­da­nog od 153 ami­no­ki­ se­li­ne (sl. 2-18). Od ta­da ana­li­zi­ra­ne su ti­su­će pro­tei­na. Ve­ći­na tih pro­tei­ na su glo­bu­lar­ni pro­tei­ni, kao što je i miog­lo­bin. Po­li­pep­tid­ni lan­ci glo­bu­lar­nih pro­tei­na su smo­ta­ni u kom­pak­tne struk­tu­re. Ne­ki pro­tei­ni (prim­je­ri­ce kon­struk­tiv­ni pro­tei­ni ve­ziv­nog tki­va) du­gač­ke su vlak­nas­te struk­tu­re. Ne­mo­gu­će je od­re­di­ti tro­di­men­zio­nal­nu struk­tu­ru pro­tei­na iz­ rav­no iz ami­no­ki­se­lin­skog sli­je­da. Op­će­ni­to se pro­tein­ska struk­tu­ra opi­su­je na če­ti­ri ra­zi­ne. Pri­mar­na struk­tu­ra pro­tei­na je sli­jed ami­no­ki­se­li­na u pro­tein­skom lan­cu. Sekun­dar­ na struk­tu­ra je pra­vil­ni lo­kal­ni ras­po­red ami­no­ki­se­li­na unu­tar od­re­đe­ne re­gi­je po­li­pep­ti­da. 1951. Li­nus Pau­li­ng i Ro­be­rt Co­rey uo­či­li su dva naj­češ­ ća ti­pa se­kun­dar­ne struk­tu­re: α-uz­voj­ni­cu i β-plo­ču. Ob­je te se­kun­dar­ne struk­tu­re učvr­šće­ne su vo­di­ko­vim ve­za­ma iz­me­đu CO i NH sku­pi­na pep­ tid­nih ve­za. α-Uz­voj­ni­ca nas­ta­je kad se dio po­li­pep­tid­nog lan­ca ovi­ja oko svo­je osi, ta­ko da CO sku­pi­na jed­ne pep­tid­ne ve­ze stvo­ri vo­di­ko­vu ve­zu s NH-sku­pi­nom pep­tid­ne ve­ze čet­vr­te ami­no­ki­se­li­ne u ami­no­ki­se­lin­skom

STANIČNI SASTAV 

   57

Sli­ka 2-19. Se­kun­dar­na struk­tu­ra pro­ tei­na.  Naj­češ­ći ob­li­ci se­kun­dar­ne struk­ tu­re su α-uz­voj­ni­ca i β-plo­ča. U α-uz­voj­ ni­ci ob­li­ku­ju se vo­di­ko­ve ve­ze iz­među sku­pi­na CO i NH u pep­tid­nim ve­za­ma uda­lje­nim za če­ti­ri ami­no­ki­se­li­ne. U β-plo­ či vo­di­ko­ve ve­ze po­ve­zu­ju dva pri­leg­nu­ta di­je­la po­li­pep­tid­nog lan­ca. Ni­su pri­ka­za­ni boč­ni og­ran­ci ami­no­ki­se­li­na.

ni­zu po­li­pep­ti­da (sl. 2-19). Na­sup­rot to­me β-plo­ča se ob­li­ku­je kad dva di­ je­la po­li­pep­tid­nog lan­ca le­že je­dan do dru­go­ga po­ve­za­ni vo­di­ko­vim ve­za­ ma. Tak­ve β-plo­če mo­gu se stvo­ri­ti iz­me­đu vi­še di­je­lo­va po­li­pep­ti­da ta­ko da ti di­je­lo­vi po­li­pep­tid­nog lan­ca bu­du us­mje­re­ni pa­ra­lel­no ili an­ti­pa­ra­lel­ no. Ter­ci­jar­na struk­tu­ra je smo­ta­no­st po­li­pep­tid­nog lan­ca ko­ja na­ sta­je kao pos­lje­di­ca in­te­rak­ci­ja iz­me­đu boč­nih og­ra­na­ka ami­ no­ki­se­li­na iz raz­li­či­tih re­gi­ja u pri­mar­nom sli­je­du (sl. 2-20). U ve­ći­ni pro­tei­na α-uz­voj­ni­ce i β-plo­če, po­ve­za­ ne re­gi­ja­ma pet­lji sma­ta­ju se u kom­pak­tne glo­bu­lar­ne struk­tu­re naz­va­ne do­me­na­ma i či­ne os­nov­ne je­di­ ni­ce ter­ci­jar­ne struk­tu­re. Mali pro­tei­ni, kao što su ri­bo­nuk­lea­za ili miog­lo­bin, sad­r­že sa­mo jed­nu do­me­nu; ve­ći pro­tei­ni mo­gu sad­r­ža­va­ti vi­še raz­ li­či­tih do­me­na ko­je su čes­to po­ve­za­ne s raz­li­či­ tim fun­kci­ja­ma. Kri­tič­na od­red­ni­ca ter­ci­jar­ne struk­tu­re je po­lo­žaj hid­ro­fob­nih ami­no­ki­se­li­na u unut­raš­ njos­ti pro­tei­na i hid­ro­fil­nih ami­no­ki­se­li­na na pov­r­ši­ni, gdje mo­gu stu­pi­ti u in­te­rak­ci­ju s vo­ dom. Unut­raš­njo­st smo­ta­nih pro­tei­na sas­to­ji se dak­le pre­te­ži­to od hid­ro­fob­nih ami­no­ki­se­ li­na pos­tro­je­nih u α-uz­voj­ni­ce i β-plo­če. Te se­kun­dar­ne struk­tu­re na­la­ze se u hid­ro­fob­nim jez­gra­ma pro­tei­na jer vo­di­ko­ve ve­ze neut­ra­li­zi­ ra­ju po­lar­ni ka­rak­ter sku­pi­na CO i NH u po­li­ pep­tid­nom kos­tu­ru.

Sli­ka 2-20. Ter­ci­jar­na struk­tu­ra ri­bo­ nuk­lea­ze.  Pod­r­učja se­kun­da­rne struk­ tu­re, α-uz­voj­ni­ce i β-plo­če, po­ve­za­na pod­ruč­ji­ma pet­lji sma­ta­ju se u na­tiv­nu kon­for­ma­ci­ju pro­tei­na. U she­mat­skom pri­ka­zu vr­pčas­tog mo­de­la po­li­pep­tid­ nog lan­ca α-uz­voj­ni­ce su pri­ka­za­ne kao spi­ra­le, a β-plo­če kao ši­ro­ke strje­li­ce.

58    POGLAVLJE 2

Sli­ka 2-21. Kvar­ter­na struk­tu­ra he­ mo­glo­bi­na.  He­mog­lo­bin se sas­to­ji od če­ti­riju po­li­pep­tid­nih lana­ca od ko­jih je sva­ki ve­zan na he­m-sku­pi­nu. Iden­tič­na su dva α-lan­ca i dva β-lan­ca.

Re­gi­je pet­lji ko­je po­ve­zu­ju ele­men­te se­kun­dar­ne struk­tu­re na­la­ze se na pov­r­ši­ni smo­ta­nih pro­tei­na, gdje po­lar­ne kom­po­nen­te pep­tid­nih ve­za us­ pos­tav­lja­ju vo­di­ko­ve ve­ze s vo­dom ili s po­lar­nim boč­nim og­ran­ci­ma hi­ dro­fob­nih ami­no­ki­se­li­na. In­te­rak­ci­je iz­me­đu po­lar­nih boč­nih og­ra­na­ka (vo­di­ko­ve i ion­ske ve­ze) na pro­tein­skoj pov­r­ši­ni su ta­ko­đer važ­ne od­red­ ni­ce u ter­ci­jar­noj struk­tu­ri. Pov­rh to­ga, ko­va­len­tne di­sul­fid­ne ve­ze iz­me­đu sul­fhid­ril­nih sku­pi­na cis­tein­skih og­ra­na­ka sta­bi­li­zi­ra­ju smo­ta­ne struk­tu­re mno­gih sek­re­tor­nih pro­tei­na i pro­tei­na na sta­nič­noj pov­r­ši­ni. Čet­vr­ta ra­zi­na pro­tein­ske struk­tu­re je kvar­ter­na struk­tu­ra. Sas­to­ji se od in­te­rak­ci­ja iz­me­đu raz­li­či­tih po­li­pep­tid­nih la­na­ca u pro­tei­ni­ma ko­ji sa­ dr­že vi­še od jed­nog po­li­pep­ti­da. He­mog­lo­bin je, prim­je­ri­ce, sas­tav­ljen od če­ti­ri po­li­pep­tid­na lan­ca. Ti lan­ci su me­đu­sob­no po­ve­za­ni is­tim vr­sta­ma in­te­rak­ci­ja ko­je od­r­ža­va­ju ter­ci­jar­nu struk­tu­ru (sl. 2-21). Raz­li­či­ta ke­mij­ska svoj­stva dva­de­set raz­li­či­tih ami­no­ki­se­li­na do­vo­de do znat­nih va­ri­ja­ci­ja u tro­di­men­zio­nal­noj kon­for­ma­ci­ji smo­ta­nih pro­tei­na. Sto­ga pro­tei­ni či­ne ek­strem­no slo­že­nu i raz­no­li­ku sku­pi­nu mak­ro­mo­le­ku­ la, prik­lad­nu za mnoš­tvo za­da­ća ko­je pro­tei­ni obav­lja­ju u sta­nič­noj bio­lo­ gi­ji.

Sta­nič­ne mem­bra­ne Struk­tu­ra i fun­kci­ja sta­ni­ca pre­sud­no ovi­si o mem­bra­na­ma ko­je ne sa­ mo da od­va­ja­ju nut­ri­nu sta­ni­ce od nje­zi­ne oko­li­ne ne­go ta­ko­đer od­re­đu­ju in­ter­ne od­jelj­ke eu­ka­riot­skih sta­ni­ca uk­lju­ču­ju­ći jez­gru i ci­top­laz­mat­ske or­ga­ne­le. Ob­li­ko­va­nje bio­loš­kih mem­bra­na te­me­lji se na svoj­stvi­ma li­pi­da. Sve sta­nič­ne mem­bra­ne ima­ju za­jed­nič­ku struk­tur­nu or­ga­ni­za­ci­ju: dvos­loj fos­fo­li­pi­da i prid­ru­že­ne pro­tei­ne. Mem­bran­ski pro­tei­ni obav­lja­ju mno­ge spe­ci­ja­li­zi­ra­ne fun­kci­je. Ne­ki slu­že kao re­cep­to­ri ko­ji omo­gu­ću­ju sta­ni­ci da od­go­va­ra na iz­va­nje sig­na­le, ne­ki su od­go­vor­ni za se­lek­tiv­ni tran­spo­rt mo­ le­ku­la kroz mem­bra­nu, a ne­ki sud­je­lu­ju u tran­spor­tu elek­tro­na i ok­si­da­ tivnoj fos­fo­ri­la­ci­ji. Osim to­ga mem­bran­ski pro­tei­ni nad­zi­ru in­te­rak­ci­je izme­đu sta­ni­ca u mno­gos­ta­nič­nim or­ga­niz­mi­ma. Za­jed­nič­ko struk­tur­no us­troj­stvo mem­bra­na je pod­lo­ga raz­li­či­tim bio­loš­kim pro­ce­si­ma i spe­ci­ja­ li­zi­ra­nim mem­bran­skim fun­kci­ja­ma, o ko­ji­ma će pod­rob­no ras­prav­lja­ti kas­ni­ja pog­lav­lja.

Mem­bran­ski li­pi­di Os­nov­ne gra­đev­ne je­di­ni­ce svih sta­nič­nih mem­bra­na su fos­fo­li­pi­di ko­ ji su am­fi­pa­tič­ne mo­le­ku­le, sas­tav­lje­ne od dva­ju hid­ro­fob­nih mas­noki­se­lin­ skih la­na­ca ve­za­nih na hid­ro­fil­nu čeo­nu sku­pi­nu ko­ja sad­r­ži fos­fat (v. sl. 2-7). Fos­fo­li­pi­di spon­ta­no stva­ra­ju dvos­lo­je u vo­de­nim oto­pi­na­ma zbog sla­be top­lji­vos­ti mas­no­ki­se­lin­skih re­po­va u vo­di. Hid­ro­fob­ni mas­no-ki­se­ lin­ski re­po­vi su skri­ve­ni u unut­raš­njos­ti mem­bra­ne, a nji­ho­ve po­lar­ne čeo­ ne sku­pi­ne su iz­lo­že­ne do­di­ru s vo­dom na ob­je stra­ne (sl. 2-22). Tak­vi fos­fo­li­pid­ni dvos­lo­ji stva­ra­ju sta­bil­nu preg­ra­du iz­me­đu dva vo­de­na od­jelj­ ka i pred­stav­lja­ju os­nov­nu struk­tu­ru svih bio­loš­kih mem­bra­na.

Sli­ka 2-22. Fos­fo­li­pid­ni dvos­loj.  Fos­fo­li­pi­di spon­ta­no ob­li­ku­ju sta­bil­ne dvos­lo­je ta­ ko da su nji­ho­ve po­lar­ne čeo­ne sku­pi­ne iz­lo­že­ne vo­di, a hid­ro­fob­ni re­po­vi usa­đe­ni u unu­traš­njo­st mem­bra­ne.

STANIČNI SASTAV 

   59

Tablica 2-1. Lipidni sastav staničnih membranaa Membrana plazme Lipid fosfatidilkolin fosfatidilserin fosfatidiletanolamin sfingomijelin glikolipidi kolesterol

E. coli 0 0 80 0 0 0

Eritrocit 17 6 16 17 2 45

Grubi endo­ plazmatski retikul

Vanjska mitohondrijska membrana

55 3 16 3 0 6

50 2 23 5 0 0) u staničnim uvjetima. Za odvijanje takvih reakcija potreban je dodatni izvor energije. Razmotrimo primjer reakcije

Pretvorba A u B energijski je nepovoljna pa reakcija teče u suprotnom smjeru umjesto u smjeru stvaranja produkta B. Međutim reakciju u tom smjeru može pokrenuti povezivanje konverzije A u B s energijski povolj­ nom reakcijom kao što je reakcija

Ako se povežu ove dvije reakcije, povezanu ukupnu reakciju možemo prikazati kao

∆G vezane reakcije jednaka je zbroju promjena slobodnih energija po­ jedinačnih sastavnih reakcija pa je ukupna vezana reakcija energijski po­ voljna i teći će kao što je napisana. Tako se energijski nepovoljna konver­ zija A u B pokreće povezivanjem s drugom reakcijom koja se odvija uz veliko smanjenje slobodne energije. Enzimi su zaduženi za provedbu takvih vezanih reakcija na koordinirani način. Stanica rabi ovaj temeljni mehanizam za pokretanje mnogih energijski nepovoljnih reakcija koje su nužne u biološkim sustavima. Adenozin-5'tri­fosfat (ATP) ima središnju ulogu u takvim procesima i djeluje kao spre­ mi­šte slobodne energije unutar stanice (sl. 3-10). Veze između fosfata u ATP znane su kao »visokoenergijske« veze jer njihovu hidrolizu prati re­ lativno veliko smanjenje slobodne energije. Nema ništa posebna u tim ke­ mijskim vezama. Nazivaju ih »visokoenergijskima« samo zbog velike slo­ bodne energije koja se oslobodi prigodom hidrolize unutar stanice. Hi­droliza ATP do ADP i fosfata (Pi) teče uz ∆G°' = 30 kJ/mol. Podsjetimo se, međutim, da se ∆G°' odnosi na »standardne uvjete«, pri kojima su kon­ centracije produkata i reaktanata 1M. Stvarne unutarstanične koncentraci­ je Pi su približno 10–2M, a koncentracije ATP su veće od koncentracija ADP. Te razlike između unutarstaničnih koncentracija i standardnog stanja pogoduju hidrolizi ATP tako da ∆G za hidrolizu ATP unutar stanice izno­ si približno –50 kJ/mol. ATP se alternativno može hidrolizirati do AMP i pirofosfata (PPi). Oslobađa se približno jednaka količina slobodne energije kao pri hidrolizi

STANIČNI METABOLIZAM 

ATP do ADP. Međutim, nastali pirofosfat u toj reakciji sam se brzo hidroli­ zira uz ∆G sličnu hidrolizi ATP. Na taj način ukupna promjena slobodne energije pri hidrolizi ATP do AMP je približno dvostruka od energije do­ bivene hidrolizom ATP do ADP. Radi usporedbe, energija veze između šećerne i fosfatne skupine AMP nije velika i tipična je za kovalentne veze. ∆G°'=-14 kJ/mol. Zbog popratnog smanjenja slobodne energije hidroliza ATP može po­ kretati druge energijski zahtjevne reakcije unutar stanice. Primjerice prva reakcija��������������������������������������������������������������������� glikolize����������������������������������������������������������� �������������������������������������������������������������������� (��������������������������������������������������������� o�������������������������������������������������������� kojoj�������������������������������������������������� ������������������������������������������������������� raspravlja��������������������������������������� ������������������������������������������������� sljede�������������������������������� �������������������������������������� ć������������������������������� e������������������������������ poglavlje�������������������� ����������������������������� ) je���������������� ������������������ konverzija����� ��������������� glu­ ���� koze u glukozu-6-fosfat. Reakciju možemo prikazati kao

Budući da je napisana reakcija energijski nepovoljna (∆G°'=+14 kJ/ mol), mora se povezati s hidrolizom ATP da se pokrene u napisanom smjeru (∆G°'=-30 kJ/mol).

Združenu reakciju možemo napisati kao

Promjena slobodne energije za tu reakciju je zbroj promjena slobodnih energija pojedinačnih reakcija tako da je za združenu reakciju ∆G°'=-16 kJ/mol i potiče stvaranje glukoza-6-fosfata.

   83

Slika 3-10. ATP kao uskladištena slo­ bodna energija.  Veze između fosfatnih skupina ATP nazivaju se visokoenergij­ske veze zbog velikog smanjenja slobo­dne energije nakon njihove hidrolize. Hi­ drolizom ATP može nastati ADP i fos­ fatna skupina (HPO42-) ili AMP i pirofosfat. Nastali pirofosfat se sam brzo hidrolizira oslobađajući dodatnu slobodnu energi­ ju.

84    POGLAVLJE 3 Postoje i druge molekule, uključujući nukleozid-trifosfate (primjerice GTP��������������������������������������������������������������������� ), ������������������������������������������������������������������ koje�������������������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������� posjeduju���������������������������������������������������� ��������������������������������������������������� visokoenergijske����������������������������������� ���������������������������������� veze������������������������������ ����������������������������� pa��������������������������� �������������������������� se������������������������ ����������������������� i���������������������� ��������������������� one������������������ ����������������� koriste���������� ��������� za������� ������ pokre­ tanje energijski zahtjevnih reakcija kao ATP. Međutim za većinu reakcija energiju dostavlja ATP. Zbog toga su u stanici reakcije povezane: one koje oslobađaju energiju sa sintezom ATP, a one koje zahtijevaju energiju s hidrolizom ATP. Stoga visokoenergijske veze ATP imaju središnju ulogu u staničnom metabolizmu i služe kao uporabiv oblik uskladištene slobodne energije.

Stvaranje ATP iz glukoze Razgradnja ugljikohidrata, posebice glukoze, glavni je izvor stanične energije. Potpuna oksidativna razgradnja glukoze do CO2 i H2O može se napisati kao

3.3. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Glikoliza. Glikoliza je početna faza razgradnje glukoze koja proizvodi dvije molekule piruvata i čist dobitak od dvije molekule ATP.

Reakcija proizvodi veliku količinu slobodne energije: ∆G°' = –2867,5 kJ/mol. Da se ova energija prikupi u uporabivom obliku glukoza se u sta­ nici oksidira u nizu koraka koji su povezani sa sintezom ATP. Glikoliza, početna faza razgradnje glukoze, zajednička je praktički svim stanicama���������������������������������������������������������������� . �������������������������������������������������������������� Glikoliza����������������������������������������������������� ���������������������������������������������������� se�������������������������������������������������� ������������������������������������������������� zbiva�������������������������������������������� ������������������������������������������� u������������������������������������������ ����������������������������������������� odsutnosti������������������������������� ������������������������������ kisika������������������������ ����������������������� i���������������������� ��������������������� anaerobnim����������� ���������� organizmi­ ma�������������������������������������������������������������������� mo����������������������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������� ž���������������������������������������������������������������� e��������������������������������������������������������������� osigurati����������������������������������������������������� �������������������������������������������������������������� svu������������������������������������������������� ���������������������������������������������������� potrebnu���������������������������������������� ������������������������������������������������ metaboli������������������������������� ��������������������������������������� č������������������������������ ku���������������������������� energiju������������������� ��������������������������� .U ����������������� aerobnim stani­ cama glikoliza je tek prva faza razgradnje glukoze. Reakcije glikolize razgrađuju glukozu do piruvata uz neto-dobitak od dvi­je molekule ATP (sl. 3-11). Početne reakcije na putu u stvari troše ener­giju rabeći ATP za fosforilaciju glukoze do glukoza-6-fosfata i zatim fruktoze-6-fosfata do fruktoza-1,6-bisfosfata. Enzimi koji kataliziraju ove dvi­je reakcije, heksokinaza i fosfofruktokinaza, su važne regulacijske točke glikolitičkog puta. Ključni nadzor provodi fosfofruktokinaza, koju inhibira visoka razina ATP. Inhibicija fosfofruktokinaze izaziva nagomilavanje glu­ koza-6-fosfata, koji tada inhibira heksokinazu. Na taj je način inhibirana razgradnja glukoze kad stanica ima dovoljno raspoložive metaboličke ener­ gije u obliku ATP. Reakcije koje slijede nakon stvaranja fruktoza-1,6-bisfosfata pripadaju dijelu glikolitičkog puta kojim se proizvodi energija. Raspadom fruktoza1,6-bisfosfata nastaju dvije molekule šećera s tri ugljikova atoma. Gliceral­ dehid-3-fosfat se oksidira u 1,3-bisfosfoglicerat. Fosfatna skupina tog spoja ima vrlo veliku slobodnu energiju hidrolize (∆G°'=48 kJ/mol) pa se koristi u sljedećoj re­akciji glikolize za pokretanje sinteze ATP iz ADP. Produkt te reakcije, 3-fo­sfoglicerat, prevodi se zatim u fosfoenolpiruvat, drugi visoko­ energijski in­termedijar u glikolizi. Hidroliza visokoenergijskog fosfata u fosfoenolpi­ruvatu teče uz ∆G°'=-61 kJ/mol pa se konverzija fosfoenolpiru­ vata u piru­vat povezuje sa sintezom ATP. Svaka molekula gliceraldehid-3fosfata koja se prevede u piruvat povezana je s proizvodnjom dviju moleku­ la ATP. Od ishodne molekule glukoze ukupno se sintetiziraju četiri mo­le­kule ATP. Bu­dući da su dvije molekule ATP bile potrebne za otpo­ činjanje prvih reakci­ja, neto-dobitak od glikolize su dvije molekule ATP. Povrh proizvedenog ATP glikoliza pretvara dvije molekule koenzima NAD+ u NADH. U toj reakciji NAD+ djeluje kao oksidacijsko sredstvo koje prima elektrone od gliceraldehid-3-fosfata. NADH, nastali produkt te re­ akcije, reciklira i služi kao donor elektrona u drugim oksido-redukcijskim reakcijama unutar stanice. Pri konverziji piruvata u laktat ili etanol u anae­ robnim uvjetima reoksidira se NADH nastao glikolizom u NAD+. Među­ tim u aerobnim organizmima NADH služi kao dodatni izvor energije da­

STANIČNI METABOLIZAM 

Slika 3-11. Reakcije glikolize.  Glukoza se raz­građuje do piruvata uz oslobađanje dviju molekula ATP i dviju molekula NADH. U an­ aerobnim uvjetima NADH se reoksidira kon­ verzijom piruvata u etanol ili laktat. U aerob­ nim uvjetima piruvat se dalje metabolizira u ciklusu limunske kiseline. Obratite po­ zornost na činjenicu da od jedne molekule glukoze nastanu dvije molekule 3C-atomna derivata za proizvodnju energije.

   85

86    POGLAVLJE 3 Slika 3-12. Oksidativna dekarboksila­ cija piruvata.  Piruvat se prevodi u CO2 i acetil-CoA. U tom se procesu proizvodi molekula NADH. Koenzim A (CoA-SH) je opći nosač aktiviranih acilnih skupina u različitim reakcijama.

3.4. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Ciklus limunske kiseline. Ciklus limunske kiseline središnji je put oksidativnog metabolizma i okončava oksidaciju glukoze stvaranjem šest molekula ugljikova dioksida.

jući svoje elektrone transportnom lancu elektrona putem kojeg će na kraju poslužiti za redukciju O2 u H2O uz povezano stvaranje dodatnog ATP. U eukariotskim stanicama glikoliza se odvija u citosolu. Piruvat se za­ tim prenosi u mitohondrij, gdje se njegovom potpunom oksidacijom do CO2 i H2O proizvede većina ATP nastalog razgradnjom glukoze. Sljedeći korak u metabolizmu piruvata je njegova oksidativna dekarboksilacija u prisutnosti koenzima A (CoA) koji služi kao nosač acilnih skupina u ra­ zličitim metaboličkim reakcijama (sl. 3-12). Jedan se ugljik piruvata oslo­ bađa kao CO2, a preostala dva ugljika se predaju CoA da nastane acetilCoA. U tom se procesu reducira molekula NAD+ u NADH. Acetil-CoA nastao ovom reakcijom ulazi u ciklus limunske kiseline ili Krebsov ciklus (sl. 3-13) koji je središnji put oksidativnog metabolizma. Dva ugljikova atoma acetilne skupine povezuju se s oksaloacetatom (četiri ugljika) da nastane citrat (šest ugljika). Tijekom osam narednih reakcija dva se citratna ugljika potpuno oksidiraju do CO2 pri čemu se regenerira oksaloacetat. Tijekom ciklusa nastane jedna visokoenergijska fosfatna veza u GTP koja se izravno koristi za pokretanje sinteze molekule ATP. Povrh toga svaki krug ciklusa proizvede tri molekule NADH i molekulu reduci­ ranog flavin-adenin-dinukleotida (FADH2) koji je također nosač elektro­ na u oksido-redukcijskim reakcijama. Ciklus limunske kiseline dovršava oksidaciju glukoze do šest molekula CO2. Četiri molekule ATP izravno su dobivene od svake molekule glukoze – dvije tijekom glikolize i dvije ciklusom limunske kiseline (po jedna od svake molekule piruvata). Osim toga nastaju deset molekula NADH (dvije iz glikolize, dvije konverzijom piruvata u acetil-CoA i šest iz ciklusa li­ munske kiseline) i dvije molekule FADH2. Preostala energija kojoj je izvor razgradnja glukoze dolazi od reoksidacije NADH i FADH2 kad se njihovi elektroni prenesu transportnim lancem elektrona do kisika koji reduciraju u H2O. Tijekom oksidativne fosforilacije povezuju se elektroni NADH i FADH­2 s O2, a oslobođena energija tim procesom pokreće sintezu ATP od ADP. Prijenos elektrona od NADH na O2 oslobodi golemu količinu slo­ bodne energije: ∆G°'= –219,5 kJ za svaki par prenesenih elektrona. Da se ta energija može prikupiti u uporabivom obliku proces se odvija postup­

STANIČNI METABOLIZAM 

nim prolaskom elektrona preko niza nosača koji čine transportni lanac elektrona (sl. 3-14). Sastavnice transportnog lanca elektrona smještene su u unutrašnjoj mitohondrijskoj membrani eukariotskih stanica. O pojedi­ nostima oksidativne fosforilacije razmatrat ćemo u 10. poglavlju u raspravi o mitohondrijima. U aerobnim bakterijama koje rabe usporedivi sustav sastavnice lančanog prijenosa elektrona smještene su u membranu plazme. U svakom slučaju prijenos elektrona od NADH na O2 stvara dovoljno energije za pokretanje sinteze približno triju molekula ATP. Elektroni od FADH­2 ulaze u transportni lanac na nižoj energijskoj razini pa njihov pri­ jenos na O2 donosi manje uporabive energije, za dvije molekule ATP.

   87

Slika 3-13. Ciklus limunske kiseli­ ne.  2C-atomna acetilna skupina se pre­ no­si od ace­til-CoA na oksaloacetat da na­stane citrat. Dva ugljika citrata se oksi­ diraju u CO2 i rege­nerira se oksaloacetat. Svaki krug ciklusa stvara molekulu GTP, tri molekule NADH i mo­lekulu FADH2.

88    POGLAVLJE 3 Slika 3-14. Transportni lanac elektro­ na.  Elektroni se prenose od NADH i FADH2 na O2 preko niza nosača organi­ ziranih u četiri proteinska kompleksa unutar mitohon­drijske membrane. Slo­ bodna energija oslobođena reak­ci­jama elek­tronskog transporta na kompleksi­ ma I, III i IV koristi se za pokretanje sin­ teze ATP.

Sada možemo izračunati ukupni prinos ATP oksidacijom glukoze. Neto­dobitak od glikolize su dvije molekule ATP i dvije molekule NADH. Pretvorba piruvata do acetil-CoA i njegov metabolizam putem ciklusa li­ munske kiseline donosi još dvije molekule ATP, osam molekula NADH i dvije molekule FADH2. Pretpostavimo li da se oksidacijom svakog NADH sintetiziraju tri molekule ATP i po dvije od svakog FADH2, ukupan prinos je 38 molekula ATP po molekuli glukoze. Međutim prinos je nešto niži u nekim stanicama, jer dvije molekule NADH nastale glikolizom u citosolu ne mogu izravno ući u mitohondrij. Elektroni tih molekula NADH preno­ se se u mitohondrij trajektnim sustavom. Ovisno o korištenom sustavu, mo­guće je da ti elektroni uđu u transportni lanac na razini FADH2. U ta­ kvim slučajevima dvije molekule NADH iz glikolize ne omogućuju sintezu triju nego samo dviju molekula ATP smanjujući na taj način ukupno isko­ rištenje od 38 ATP na 36 ATP po molekuli glukoze.

STANIČNI METABOLIZAM  Slika 3-15. Oksidacija masnih kiselina.  Prvo se masna kiselina (primjerice 16C-atomna zasićena masna kiselina palmitat) veže na koenzim A uz utrošak jedne molekule ATP. Oksidacija masne kiseline zatim teče postupnim uklanjanjem po dvije C-atomne jedinice u obliku acetil-CoA uz istovremeno stvaranje po jedne molekule NADH i FADH2.

Dobivanje energije iz drugih organskih molekula Energiju u obliku ATP moguće je dobiti razgradnjom i drugih organ­ skih molekula pri čemu putovi uključeni u razgradnju glukoze imaju sre­ dišnju ulogu. Nukleotidi se primjerice mogu razgraditi do šećera koji tada ulaze u glikolitički put. I aminokiseline se razgrađuju putem ciklusa li­ munske kiseline. Dva osnovna oblika skladištenja energije unutar stanica, polisaharidi i lipidi, također se mogu razgraditi za proizvodnju ATP. Poli­ saharidi se kidaju na slobodne šećere koji se metaboliziraju kako je opi­ sano u prethodnom odlomku. Lipidi su međutim još učinkovitija moleku­ larna skladišta energije. Budući da su lipidi reduciraniji od ugljikohidrata sadržavajući pretežito ugljikovodične lance, njihova oksidacija donosi osjet­no više energije po masi ishodne tvari. Masti (triacilgliceroli) glavni su oblik skladištenja lipida. Prvi korak u njihovom korištenju je razgradnja do glicerola i slobodnih masnih kiselina. Svaka masna kiselina povezuje se s koenzimom A da nastane acil-CoA uz utrošak jedne molekule ATP (sl. 3-15). Masne kiseline se razgrađuju u postupnom oksidativnom procesu od po dva ugljika. Nastaje acetil-CoA i acil-CoA skraćen za dva C-atoma. U svakom krugu oksidacije nastaje mo­ lekula NADH i molekula FADH2. Acetil-CoA ulazi zatim u ciklus limunske kiseline, a ostatak masne kiseline nastavlja se razgrađivati na isti način. Razgradnja masne kiseline s 16 ugljikovih atoma proizvodi sedam mo­ lekula NADH, sedam FADH2 i osam molekula acetil-CoA. Izrazi li se taj rezultat prinosom ATP, dobivamo 21 molekulu ATP od NADH (3 × 7), 14 ATP od FADH2 (2 × 7) i 96 od acetil-CoA (8 × 12). Budući da je jedan ATP potrošen za otpočinjanje procesa neto-dobitak je 130 molekula ATP po molekuli masne kiseline od 16 ugljikovih atoma. Usporedimo taj prinos s dobivenih 38 ATP po molekuli glukoze. Budući da je relativna moleku­ larna masa zasićene masne kiseline s 16 ugljikovih atoma 256, a glukoze 180, do­bivena količina ATP je približno 2,5 puta veća po gramu masne kiseline. Prema tome lipidi su bolje molekularno skladište energije od ugljikohi­drata.

Fotosinteza Stvaranje energije oksidacijom ugljikohidrata i lipida temelji se na raz­ gradnji prethodno oblikovanih organskih spojeva. Potrebna energija za sin­tezu tih spojeva potječe od Sunčeva svjetla. Biljke i fotosintezne bakteri­ je prikupljaju i koriste tu energiju za pokretanje sinteze ugljikohidrata. Pre­ tvorbom Sunčeve energije u uporabivi oblik kemijske energije fotosinteza je izvor praktički svekolike metaboličke energije u biološkim sustavima. Ukupnu jednadžbu fotosinteze može se prikazati kao

Međutim taj proces je mnogo složeniji i odvija se u dvije odvojene faze. U prvoj fazi, nazvanoj svjetlosne reakcije, apsorbirana Sunčeva energija

   89

90    POGLAVLJE 3 Slika 3-16. Struktura klorofila.  Klorofili se sasto­je od struktura porfirinskog prstena vezanih na ugljikovodične lance. Klorofili a i b razlikuju se u jednoj funkcionalnoj skupini u porfirinskom prstenu.

pokreće sintezu ATP i NADPH (koenzim sličan NADH) povezanu s oksi­ dacijom H2O u O2. ATP i NADPH, nastali svjetlosnim reakcijama, pokreću sintezu ugljikohidrata od CO2 i H2O u drugom skupu reakcija, koje su na­ zvane reakcije tame, jer ne zahtijevaju Sunčevo svjetlo. U eukariotskim sta­nicama, odvijaju se svjetlosne reakcije i reakcije tame u kloroplastima. Fotosintezni pigmenti hvataju Sunčevu energiju apsorpcijom fotona. Apsorpcija svjetla tim pigmentima uzrokuje pokretanje elektrona iz nor­ malne molekularne orbitale u orbitalu više energije pretvarajući na taj način Sunčevu energiju u kemijsku energiju. U bilju su najobilniji fotosin­ tezni pigmenti klorofili (sl. 3-16) koji osim zelenog zajedno apsorbiraju vidljivo svjetlo svih valnih duljina. Dodatni pigmenti apsorbiraju svjetlo drugih valnih duljina tako da se načelno uhvati potpuni spektar vidljivog svjetla i iskoristi za fotosintezu. Energija uhvaćena apsorpcijom svjetla troši se na pretvorbu H2O u O2 (sl. 3-17). Elektroni visoke energije, proizvedeni tim procesom, ulaze za­ tim u transportni lanac elektrona, gdje budu prijenosom preko niza nosača povezani sa sintezom ATP. Osim toga elektroni visoke energije reduciraju NADP+ u NADPH. U reakcijama tame ATP i NADPH (proizvedeni svjetlosnim reakcija­ ma) pokreću sintezu ugljikohidrata od CO2 i H2O. Po jedna molekula CO2 ulazi u reakcijski ciklus poznat kao Calvinov ciklus (Melvin Calvin je otkrio taj ciklus) koji dovodi do stvaranja ugljikohidrata (sl. 3-18). Calvi­ nov ciklus utroši ukupno 18 molekula ATP i 12 NADPH za sintezu svake molekule glukoze. Dva su elektrona potrebna za pretvorbu svake molekule NADP+ u NADPH, tako da 24 elektrona moraju proći transportnim lan­

Slika 3-17. Reakcije svjetla u fotosin­ tezi.  Sunčeva se energija koristi da ra­ stavi H2O u O2. Visokoenergijski elektro­ ni iz tog procesa prenose se nizom no­sača i koriste se za prevođenje NADP+ u NADPH. Energija reakcija elektronskog transporta pokreće također sintezu ATP. O pojedinostima ovih reakcija raspravlja 10. poglavlje.

STANIČNI METABOLIZAM 

   91

Slika 3-18. Calvinov ciklus.  Prikaza­na je sinteza molekule glukoze iz šest mo­ lekula CO2. Svaka molekula CO2 dodaje se ribuloza-1,5-bisfosfatu da nastanu dvi­je molekule 3-fosfoglicerata. Tih šest molekula CO2 vode do stvaranja 12 mo­ lekula 3-fosfoglicerata koje se prevode u 12 molekula gliceraldehid-3-fosfata uz utrošak po 12 molekula ATP i NADPH. Zatim se dvije molekule gliceraldehid3-fosfata koriste za sintezu glukoze, a deset molekula nastavljaju u Calvino­ vom ciklusu oblikovati šest molekula ribuloza-5-fosfata. Ciklus je dovršen up­ orabom šest dodatnih molekula ATP za sintezu ribuloza-1,5-bisfosfata.

cem elektrona da stvore dovoljno NADPH za sintezu jedne molekule glukoze. Ti se elektroni dobivaju pretvorbom 12 molekula H2O u 6 mo­ lekula O2 što je u skladu sa stvaranjem šest molekula O2 uz svaku moleku­ lu glukoze. Nije međutim jasno dostaje li prolaz istih 24 elektrona duž transportnog lanca elektrona za proizvodnju 18 ATP koje predviđa Calvi­ nov ciklus. Možda neke od molekula ATP nastaju alternativnim transport­ nim lancima koji koriste Sunčevu energiju za sintezu ATP bez sinteze NADP­H (v. pogl. 10).

Biosinteza staničnih sastojaka Prethodni odlomak predočio je pregled glavnih metaboličkih reakcija putem kojih stanica dobavlja i pohranjuje energiju u obliku ATP. Ta se metabolička energija zatim koristi za obavljanje različitih zadaća uključujući i sintezu makromolekula i drugih staničnih sastojaka. Energija koja se do­ biva razgradnjom organskih molekula (katabolizam) troši se za pokretanje sinteze drugih stanici potrebnih sastojaka. Većina kataboličkih putova uključuje oksidaciju organskih molekula povezanu sa stvaranjem energije

3.5. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Calvinov ciklus. U Calvinovu ciklusu fotosinteze šest molekula ugljikova dioksida koriste se za stvaranje jedne molekule glukoze.

92    POGLAVLJE 3 (ATP) i reduktivnog potencijala (NADH). Nasuprot tome biosintezni pu­ tevi najčešće troše i ATP i reduktivni potencijal (obično u obliku NADPH) za proizvodnju novih organskih spojeva. Jedan od glavnih biosinteznih pu­ tova je sinteza ugljikohidrata od CO2 i H2O tijekom fotosinteznih reakcija u tami, o čemu se je raspravljalo u prethodnom odlomku. O postojećim alternativnim putevima koji dovode do biosinteze glavnih staničnih sasto­ jaka (ugljikohidrata, lipida, proteina i nukleinskih kiselina) raspravljat će naredni odlomci.

Ugljikohidrati Osim što se glukoza dobiva izravno iz hrane ili stvara fotosintezom, moguće je sintetizirati glukozu iz drugih organskih molekula. U animal­ nim stanicama sinteza glukoze (glukoneogeneza) obično počinje laktatom (proizvedenim anaerobnom glikolizom), aminokiselinama (nastalim raz­ gradnjom proteina) ili glicerolom (nastalim razgradnjom lipida). Biljke (ne životinje) sposobne su također sintetizirati glukozu iz masnih kiselina – osobito važan proces tijekom klijanja sjemenki kad se energija pohranje­na u obliku masti mora kon­vertirati u ugljikohidra­te nužne za rast biljke. U animalnim i biljnim sta­nicama jednostavni se še­će­ ri polimeriziraju i po­­hranjuju kao polisaharidi. Glukoneogeneza uključuje pretvorbu piruvata do glukoze – načelno obrnuti proces glikolize (sl. 3-19). Međutim, kako je već ranije bilo rečeno, glikolitička pretvorba glukoze do piruvata je put koji stvara energiju proizvodeći dvije molekule ATP i NADH. Premda su neke reakcije glikolize povratne, preostale teku samo u smjeru razgradnje glukoze, jer su vezane uz golemo smanjenje slo­bodne energije. Tijekom glukoneogeneze zaobilaze se te energijski povolj­ne reakcije glikolize putem drugih reakcija (kataliziranim drugim enzimi­ma) uz koje se troši ATP i NADH da se pokrenu i teku u smjeru sinteze glukoze. Stvaranje glukoze iz dvije molekule piruvata zahtijeva ukupno če­tiri molekule ATP, dvije mo­ lekule GTP i dvije molekule NADH. Taj je pro­ces izrazito skuplji nego povratni proces glikolize (koji bi zahtijevao dvije molekule ATP i dvije mo­ lekule NADH) što pokazuje da je potrebna doda­tna energija za pokretanje puta u smjeru biosinteze. Biljne i animalne stanice skladište glukozu u obliku polisaharida (škro­ ba odnosno glikogena). Sinteza polisaharida, kao svih drugih makromole­ kula, je energijski zahtjevna reakcija. Već je ranije spomenuto da je vezu između dva šećera (glikozidna veza) moguće prikazati kao produkt reakci­ je de­hidracije kojom se uklanja H2O (v. sl. 2-3). Takva je reakcija, među­ tim, energijski nepovoljna pa ne može spontano teći u smjeru nastajanja gliko­zidne veze. Stoga se stvaranje glikozidne veze mora povezati s reakci­ jom koja oslobađa energiju, što se postiže uporabom nukleotidnih šećera kao intermedijara u sintezi polisaharida (sl. 3-20). Reakcijom koju po­ kreće ATP glukoza se prvo fosforilira u glukoza-6-fosfat koji zatim prelazi u glu­koza-1-fosfat. Glukoza-1-fosfat reagira s UTP (uridin-trifosfat), pri čemu nastane UDP-glukoza i pirofosfat, koji se hidrolizira u fosfat uz oslobađa­nje dodatne energije. UDP-glukoza je aktivirani intermedijar koji predaje svoj glukozni dio rastućem lancu polisaharida u energijski povolj­

Slika 3-19. Glukoneogeneza.  Glukoza se sintetizira od dvije molekule piruvata za račun od četiri molekule ATP, dvije molekule GTP i dvije molekule NADH. Energijski zahtjevni koraci glukoneogeneze naznačeni su crvenom strjelicom.

STANIČNI METABOLIZAM  Slika 3-20. Sinteza polisaharida.  Prvo se glukoza prevodi u aktivirani oblik, UDPglukozu uz utrošak po jedne molekule ATP i UTP. Zatim se energijski povoljnom reakcijom glukoza prenosi od UDP-glu­ koze na rastući lanac polisaharida.

noj reakci­ji. Na taj način kemijska energija u obliku ATP i UTP pokreće sintezu po­lisaharida iz jednostavnih šećera.

Lipidi Lipidi su važne molekule za pohranu energije i glavni su sastojak stani­ čnih membrana. Sintetiziraju se iz acetil-CoA, koji nastaje razgradnjom ugljikohidrata u nizu reakcija koje su slične obrnutoj oksidaciji masnih kiselina. Međutim, kao i kod biosinteze ugljikohidrata, reakcije koje dovo­ de do sinteze masnih kiselina razlikuju se od reakcija koje ih razgrađuju, a u biosinteznom ih smjeru pokreće popratni utrošak energije u obliku ATP i reduktivnog potencijala u obliku NADPH. Masne kiseline se sintetiziraju postupnim dodavanjem jedinica od po dva C-atoma na rastući lanac. Sva­ ka od tih 2C-atomnih jedinica, koje donosi acetil-CoA, troši jednu mole­ kulu ATP i dvije molekule NADPH. Biosinteza masnih kiselina odvija se u citosolu. Njezin glavni produkt je palmitat, 16C-atomna masna kiselina. Osnovni sastojci staničnih mem­

   93

94    POGLAVLJE 3 Slika 3-21. Asimilacija dušika u organ­ ske spojeve.  Svi organizmi ugrađuju amo­nijak u organske spojeve. Neke su bakterije sposobne prevesti atmosferski dušik u amonijak, a većina bakterija, glji­ va i biljaka može koristiti nitrat iz tla.

brana (fosfolipidi, sfingomijelin i glikolipidi) sintetiziraju se iz masnih ki­ selina u endoplazmatskom retikulu i Golgijevom aparatu.

Proteini

▶▶ Usporedba katalizatora. Indu­

strijska proizvodnja amonijaka provodi se pomoću željeza kao katalizatora u uvjetima visokog tla­ka i temperature. Enzim nitro­ genaza proizvodi amonijak u fi­ ziološkim uvjetima uz utrošak ATP i reduktivnog potencijala u obliku NADH.

Dok ugljikohidrati i lipidi sadrže samo ugljik, vodik i kisik, proteini (kao i nukleinske kiseline) sadrže osim tih elemenata i dušik. U različitim orga­ nizmima (sl. 3-21) različito je podrijetlo dušika koji se ugrađuje u organske spojeve. Neke bakterije rabe atmosferski dušik. U procesu koji se naziva fik­sacijom dušika N2 se reducira u NH3 uz utrošak energije u obliku ATP. Broj vrsta sposobnih za fiksaciju dušika je relativno mali, međutim većina bak­terija, biljaka i gljiva može koristiti nitrat (NO3–), obični sastojak tla, koji se reducira do NH3 putem elektrona koje daje NADH ili NADPH. Bez ob­ zira na razlike svi su organizmi sposobni ugraditi NH3 u organske spojeve. NH3 se ugrađuje u organske molekule prvenstveno tijekom sinteze ami­ nokiselina glutamata i glutamina iz α-ketoglutarata, intermedijara u ciklu­ su limunske kiseline. Te aminokiseline zatim služe kao donori amino-sku­ pina tijekom sinteze drugih aminokiselina, koje se također izvode iz in­termedi­jara središnjih metaboličkih puteva, glikolize i ciklusa limunske kiseline (sl. 3-22). Sirovine za sintezu aminokiselina se, dakle, dobivaju iz glukoze, a sinteza aminokiselina troši energiju (ATP) i reduktivni potenci­ jal (NADP­H). Mnoge bakterije i biljke mogu sintetizirati svih 20 aminokiseli­

Tablica 3-2. Potrebe aminokiselina u ljudskoj prehrani Esencijalne aminokiseline Neesencijalne aminokiseline Fenilalanin Glutamat Histidin Alanin Izoleucin Arginina Leucin Asparagin Lizin Aspartat Metionin Cistein Treonin Glutamin Triptofan Glicin Valin Prolin Serin Tirozin Esencijalne aminokiseline moraju se dobaviti iz hranidbenih izvora; humane stanice mogu sintetizirati neesencijalne aminokiseline. Premda je arginin razvrstan u skupinu neesencijalnih aminokiselina, djeci u razvoju potreban je dodatni arginin iz hrane. a

STANIČNI METABOLIZAM 

na. Ljudi i drugi sisavci mogu, međutim, sintetizirati samo oko polovicu potrebnih aminokiselina, a ostale moraju pribaviti prehranom (tabl. 3-2). Polimerizacija aminokiselina u proteine također zahtijeva energiju. Sli­ čno sintezi polisaharida, stvaranje peptidne veze može se smatrati reakci­ jom dehidracije koju će u smjeru sinteze pokretati povezivanje s nekim dru­gim izvorom metaboličke energije. U biosintezi polisaharida takvo se po­vezivanje ostvaruje konverzijom šećera u aktivirane intermedijare kao što je UDP-glukoza. Aminokiseline treba također aktivirati prije nego što će biti upotrijebljene za sintezu proteina. Ključna razlika između sinteze proteina i sinteze polisaharida jest činje­ nica da se aminokiseline ugrađuju u proteine jedincatim redoslijedom koji specificira gen. Slijed nukleotida u genu određuje slijed aminokiselina u proteinu putem translacije pri kojoj glasnička RNA (mRNA) služi kao ka­ lup za proteinsku sintezu (v. pogl. 2). Svaka se aminokiselina naj­prije veže za specifičnu molekulu RNA (tRNA) u reakciji koja je povezana s hidroli­ zom ATP (sl. 3-23). Zatim se aminoacil-tRNA privije uz kalup mRNA koji je vezan na ribosom i svaka se aminokiselina doda C-kraju rastućeg poli­ peptidnog lanca putem niza reakcija o kojima podrobno ra­s­pravlja 7. po­ glavlje. Tijekom tog procesa dodatno se hidroliziraju dvije mo­lekule GTP, tako da je ugradba svake aminokiseline u protein povezana s hidrolizom jedne molekule ATP i dviju molekula GTP.

Slika 3-22. Biosinteza aminokiselina.  Ugljikovi kosturi aminokiselina potječu od intermedijara glikolize i ciklusa limunske kiseline.

   95

96    POGLAVLJE 3

Slika 3-23. Oblikovanje peptidne veze.  Aminokiselina se prvo aktivira vezanjem na svoju tRNA u dvostupnoj reakciji koja uključuje hidrolizu ATP do AMP. tRNA služe kao adapteri za nizanje aminokiselina prema kalupu mRNA koji je vezan na ribosomu.

Usporedba katalizatora: Industrijska proizvodnja amonijaka provodi se uz željezni katalizator pri visokom tlaku i visokoj temperaturi. Enzim ni­ trogenaza proizvodi amonijak pri fiziološkim uvjetima uz utrošak ATP i reduktivnog potencijala NADH.

Nukleinske kiseline Preteče nukleinskih kiselina, nukleotidi, sastavljeni su od fosforiliranih 5C-atomnih šećera vezanih na baze nukleinskih kiselina. Nukleotidi se

STANIČNI METABOLIZAM 

   97

MOLEKULARNA MEDICINA

Fenilketonurija Bolest Fenilketonurija (PKU) je urođena po­ grje­ška aminokiselinskog metabolizma s razornim učincima. Pogađa približno jedno od 10.000 novorođenčadi. Ako se ne liječi, izaziva tešku mentalnu re­ tardaciju. Na sreću, razumijevanje pri­ rode defekta koji uzrokuje fenilketo­nu­ riju omogućuje ranu dijagnozu i učin­kovito liječenje.

Molekularna i stanična osnova Fenilketonuriju uzrokuje nedostatak en­zima fenilalanin-hidroksilaze, koji pre­vodi fenilalanin u tirozin. Nedosta­ tak uzrokuje nagomilavanje fenilala­ni­ na do visokih razina, što izaziva dru­ge reakcije, primjerice njegovu kon­verziju u fenilpiruvat. Fenilalanin, fenilpiruvat i drugi abnormalni metaboliti skuplja­ju se u krvi i izlučuju se u visokim koli­či­ nama u urinu (naziv bolesti potječe od visoke koncentracije fenilpiruvata, fenil­ ketona koji se pojavljuje u urinu bole­ sne djece). Premda biokemijski uzrok men­talne retardacije nije precizno po­ znat, za njezinu pojavu ključno je na­

Abnormalni metabolizam fenilalanina kod pacijenata s fenilketonurijom.

gomilavanje abnormalnih metabolita fenilalanina.

Prevencija i liječenje Nedostatak enzima ne stvara probleme dok je fetus u maternici pa su djeca s fenilketonurijom pri rođenju normalna. Međutim, ako se bolest ne liječi, bole­ sna djeca postaju nepovratno i teško zaostala tijekom prve godine života. Sretna je okolnost da se fenilketonurija može odmah prepoznati po povišenoj

mogu sintetizirati iz ugljikohidrata i aminokiselina (sl. 3-24). Moguće ih je također dobiti iz prehrambenih izvora ili ponovnim korištenjem nakon razgradnje nukleinskih kiselina. Polazište u biosintezi nukleotida je fos­ forilirani šećer, riboza-5-fosfat koji se dobiva iz glukoza-6-fosfata. Diver­ gentni putevi vode zatim do sinteze purinskih i pirimidinskih nukleotida koji su izravne preteče za sintezu RNA. Ribonukleotidi se prevode u deok­ siribonukleotide koji su monomerne građevne jedinice DNA. RNA i DNA su polimeri nukleozidnih monofosfata. Kao i za druge ma­ kromolekule, izravna polimerizacija nukleozidnih monofosfata je energij­ ski nepovoljna pa sinteza polinukleotida umjesto njih koristi nukleozidne trifosfate kao aktivirane preteče (sl. 3-25). Nukleozid-5’-trifosfat dodaje se 3’-hidroksilnoj skupini rastućeg polinukleotidnog lanca uz otpuštanje i za­ tim hidrolizu pirofosfata što pokreće reakciju u smjeru sinteze polinukleo­ tida.

Slika 3-24. Biosinteza purinskih i pirimidinskih nukleotida.  Purinski i pirimidin­ ski nukleotidi sintetiziraju se od 5C-atomnih šećera i aminokiselina.

razini fenilalanina u krvi pri rutinskim testovima novorođenčadi. Moguće je spriječiti mentalnu retardaciju prehra­ nom bolesne novorođenčadi sintetič­ kom dijetom koja je siromašna fenilala­ ninom. Takav dijetalni postupak uklanja nagomilavanje toksičnih fenilalaninskih metabolita i učinkovito sprječava per­ manentnu mentalnu retardaciju do koje bi došlo bez terapije. Stoga je ru­ tinska analiza fenilalanina u krvi bitni test za svu novorođenčad.

98    POGLAVLJE 3

KL JUČNI POKUS

Antimetaboliti i kemoterapija Antagonisti derivata nukleinskih kiselina. VI. Purini

Gertrude B. Elion, George H. Hitchings, and Henry Yanderwerff Wellcome Research Laboratories, Tuckahoe, NY, Journal of Biological Chemistry, vol. 192, 1951, str. 505-518

Kontekst Gertrude Elion i George Hitchings su 1944. započeli suradnju koja je traja­ la 20 godina I dovela do razvitka lije­ ko­va koji su se pokazali učinkovitim za liječenje raka, gihta (uloga), virusa i parazitskih infekcija. Načelo njihova pri­stupa razvitku lijeka temeljilo se na antimetabolitnoj teoriji koja inicijalno predlaže da neki lijekovi, aktivni protiv bakterija, djeluju tako da sprječavaju bakterijske stanice u korištenju bitnih nutrijenata (metabolita). Elion i Hitch­ ings su predložili da bi se rast stanica koje se brzo dijele, kao što su stanice raka, mogao inhibirati analozima baza nukleinskih kiselina koji bi interferirali s normalnom sintezom DNA. Nastavili su provjeravati tu pretpostavku tako da su sintetizirali golem broj spojeva srodnih purinima i provjeravali njiho­ ve biološke učinke. Ta su istraživanja do­vela do otkrića da 6-merkaptopurin snažno inhibira bakterijsko korištenje purina, a nakon toga su ubrzo slije­ dila istraživanja koja su pokazala učin­ kovitost tog spoja u liječenju leukemije u djece.

Pokusi Elion i Hitchings su odabrali bakteriju Lactobacillus casei za testiranje potenci­ jalne aktivnosti purinskih analoga na bak­terijski rast. Godine 1948. pokaza­li su da 2,6-diaminopurin inhibira rast L. casei interferirajući s normalnim me­ta­ bolizmom purina. U radu objavlje­nom 1951. proširili su ta opažanja testira­njem učinka stotinu različitih purina uvo­ đenjem amino- i kloro-skupine, hidro­ ksilne, metilne, sulfhidrilne i drugih ke­mijskih skupina supstitucijom na ra­zličitim mjestima purinskog prstena.

Dva spoja, 6-merkaptopurin i 6-tiogva­ nin, gdje je kisik zamijenjen sumporom u položaju 6 kod gvanina i hipoksan­ tina, pokazali su se kao snažni inhibi­ tori bak­terijskog rasta (vidi sliku). Ti su se spojevi pokazali kao aktivni inhibi­ tori rasta različitih tumora u glodavaca, što je dovelo do pokusne primjene u liječenju dječje leukemije. Rezultati tih pokusa bili su spektakularni uspjeh pa je Food and Drug Administration 1953. godine odobrila 6-merkaptopurin za li­ ječenje dječje leukemije. Bilo je to tek nešto više od dvije godine nakon sin­ teze i početnih pokazatelja njegove ak­ tivnosti kao purinskog antimetabolita kod bakterija.

Učinak Uspjeh 6-merkaptopurina u liječenju dje­čje leukemije pružio je uvjerljiv do­ kaz da inhibitori metabolizma nukle­ inskih kiselina mogu biti učinkoviti lije­kovi protiv raka. Ta činjenica vrijedi i danas, a 6-merkaptopurin još je uvijek lijek koji se uspješno koristi za liječenje leukemije. U međuvremenu su nađeni i drugi antimetaboliti, korisni u liječenju raka, koji interferiraju s metabolizmom nukleinskih kiselina. Gertrude Elion i George Hitchings na­sta­vili su svoju suradnju na purin­ skim antimetabolitima do umirovlje­ nja Hitchingsa 1967. godine. Osim 6-merkaptopurina razvili su lijekove ko­ji se koriste za imunosupresiju na­ kon transplantacije tkiva, za liječenje re­umatoidnog artritisa, uloga i za li­ je­čenje zaraza parazitima. Nakon Hitchingsovog umirovljenja Elion je usmjerila svoja istraživanja na liječenje virusnih infekcija i razvila je prvi uči­n­

Gertrude B. Elion

George H. Hitching­s

kovit lijek protiv humane virusne in­ fekcije – analog gvanina »acyclovir« ko­ji je vrlo učinkovit protiv herpes-vi­ rusa, posebice herpes simplexa. Sljedeći us­pjeh u razvitku antimetabolita nukle­ inskih kiselina kao antiviralnih lijekova uključuju timidinski analog AZT koji se naširoko primjenjuje kao HIV-inhibitor u liječenju AIDS-a. Pionirski rad znan­ stvenika Elion i Hitchings otvorio je mnoga nova istraživačka područja i snažno je utjecao na liječenje mnogih bolesti.

Struktura 6-merkaptogvani­ na i 6-merkaptopurina

STANIČNI METABOLIZAM 

   99

Slika 3-25. Sinteza polinukleotida.  Nu­kleozidtrifosfati se vežu na 3' kraj rastućeg polinukleotidnog lanca uz otpuštanje pirofosfata.

SAŽETAK

KLJUČNI POJMOVI

Prateće informacije na internetu www.sinauer.com/cooper5e

Središnja uloga enzima kao bioloških katalizatora Katalitička aktivnost enzima: Enzimi kataliziraju praktički sve kemijske reakci­ je u stanici. (vidi internetsku stranicu, Animacija 3.1) Mehanizmi enzimske katalize: Enzimi ubrzavaju reakcije vezanjem supstrata u odgovarajućem položaju, mijenjajući konformaciju supstrata radi postizanja pri­jelaznog stanja i izravno sudjelujući u kemijskim reakcijama.

enzim, supstrat, produkt, prijelazno stanje, energija aktivacije, aktivno središte model ključ-brava, inducirana prilagodba

(vidi internetsku stranicu, Animacija 3.2) Koenzimi: Koenzimi djeluju u svezi s enzimima prenoseći kemijske skupine iz­ među supstrata.

prostetička skupina, koenzim, nikotinamid-dinukleotid (NAD+)

Regulacija enzimske aktivnosti: Aktivnosti enzima se reguliraju u skladu s fi­zio­ loškim potrebama stanice. Enzimska se aktivnost može nadzirati vezanjem ma­ lih molekula, interakcijom s drugim proteinima i kovalentnim modifikacijama.

inhibicija povratnom spregom, alosterička regulacija, fosforilacija

Metabolička energija Slobodna energija i ATP: ATP služi kao uskladištena slobodna energija koja se ko­risti za pokretanje energijski zahtjevnih reakcija u stanici.

Gibbsova slobodna energija (G), adenozin-5'-trifosfat (ATP), visokoenergijska veza

100    POGLAVLJE 3

KLJUČNI POJMOVI

SAŽETAK

glikoliza, koenzim A (CoA), ciklus limunske kiseline, Krebsov ciklus, flavin-adenin-dinukleotid (FADH2), oksidativna fosforilacija, transportni lanac elektrona

Stvaranje ATP iz glukoze: Razgradnja glukoze predstavlja glavni izvor stanične energije. U aerobnim stanicama potpuna oksidacija glukoze proizvodi 36 do 38 mo­lekula ATP. Većina tog ATP dobiva se transportnim lancem elektrona koji re­duciraju O2 u H2O. (vidi internetsku stranicu, Animacija 3.3) (vidi internetsku stranicu, Animacija 3.4) Dobava energije iz drugih organskih molekula: Moguće je proizvesti ATP razgradnjom organskih molekula druga���������������������������������������� č��������������������������������������� ijih����������������������������������� od�������������������������������� ���������������������������������� glukoze������������������������ ������������������������������� . Budu������������������ ���������������������� ć����������������� i���������������� da������������� ��������������� su���������� ������������ masti���� ��������� re­ ��� duciranije��������������������������������������������������������������������� od������������������������������������������������������������������ �������������������������������������������������������������������� ugljikohidrata��������������������������������������������������� ����������������������������������������������������������������� , predstavljaju������������������������������������ ������������������������������������������������� u���������������������������������� ����������������������������������� č��������������������������������� inkovitiji����������������������� oblik����������������� ���������������������� uskladi��������� ���������������� š�������� tene���� en­ ��� ergije.

reakcije svjetla, reakcije tame, fotosintezni pigmenti, klorofil, Calvinov ciklus

Fotosinteza: Krajnji izvor energije potrebne za sintezu organskih molekula Sunčevo je svjetlo koje prikupljaju biljke i fotosintezne bakterije. U prvoj fazi fotosinteze Sunčeva se energija koristi za pokretanje sinteze ATP i NADPH uz oksidaciju H2O u O2. Na taj način proizvedeni ATP i NADPH zatim se koriste za sintezu glukoze iz CO2 i H2O. (vidi internetsku stranicu, Animacija 3.5)

Biosinteza staničnih sastojaka glukoneogeneza

Ugljikohidrati: Glukozu je moguće sintetizirati iz drugih organskih molekula uporabom energije i reduktivnog potencijala u obliku ATP i NADH. Dodatni ATP je zatim nuždan za pokretanje sinteze polisaharida iz jednostavnih šećera. Lipidi: Lipidi se sintetiziraju iz CoA koji nastaje razgradnjom ugljikohidrata.

fiksacija dušika

Proteini: Aminokiseline se sintetiziraju iz intermedijara glikolize i ciklusa limunske kiseline. Polimerizacija u proteine zahtijeva dodatnu energiju u obliku ATP i GTP. Nukleinske kiseline: Purinski i pirimidinski nukleotidi se sintetiziraju iz uglji­ kohidrata i aminokiselina. Njihovu polimerizaciju u DNA i RNA pokreću nu­ klezidni tri­fosfati koji služe kao aktivirane preteče.

Pitanja 1. Vezni džep tripsina sadrži aspartat. Pret­ postavi kako će na enzimsku aktivnost dje­ lovati zamjena te aminokiseline lizinom. 2. Koje svojstvo histidina omogućuje njego­ vu ulogu u enzimskim reakcijama tijekom kojih dolazi do prijenosa vodikova iona? 3. Prikazani slijed reakcija put je enzimski katalizirane biosinteze molekule D uz en­ zime E1, E2 i E3.

Proučavajući reakciju koju katalizira enzim E1 u odsutnosti drugih enzima opazilo se da se reakcija usporuje dodatkom i po­ve­ća­ njem koncentracije tvari D. Što takvo opa­ žanje govori o regulacijskom mehanizmu enzima E1?

4. U fiziološkim uvjetima mnoge su bio­ ke­mijske reakcije energijski nepovoljne (∆G'°> 0). Kako stanica izvodi te reakcije? 5. Promatrajte reakciju fruktoza-6-fosfat + HPO42-  fruktoza-1,6bisfosfat + H2O ΔG'°= +16,6 kJ/mol. Znajući standardnu promjenu Gibbsove ener­gije za hidrolizu ATP (–30,4 kJ/mol)

STANIČNI METABOLIZAM  izračunajte promjenu standardne slobodne energije za reakciju koju katalizira fosfo­ fruktokinaza. 6. Promatrajte reakciju A  B + C za koju je ΔG'° = +14,6 kJ/mol. Izračunajte ΔG u sta­ničnim uvjetima pri kojima je koncen­ tra­cija tvari A 10–2 M, a pojedinačne kon­ centracije B i C su 10–3 M. U kojem će smje­ru teći reakcija u stanici? (R = 8,28 × 10-3 kJ/mol/stupanj; T=298 K (25 °C); ln(x) = 2,3 log10 (x))

   101

7. Kako bi povećanje staničnog sadržaja ATP utjecalo na glikolizu?

9. Kako anaerobni organizmi regeneriraju NAD+ iz NADH koji nastane glikolizom?

8. Kvasac može rasti u anaerobnim i aerob­ nim uvjetima. Koliko molekula ATP će kva­sac proizvesti za svaku konzumiranu mo­lekulu glukoze, ako raste u anaerobnim uvjetima, a koliko kad raste u aerobnim uvjetima?

10. Zašto su lipidi učinkovitiji od ugljiko­ hi­drata za molekularno skladištenje ener­ gije?

Neurath, H. 1984. Evolution of proteolytic enzym­es. Science 227: 350-357. [R]

Biosinteza staničnih sastojaka

11. Koje su reakcije svjetla i reakcije tame u fotosintezi? 12. Zašto glukoneogeneza nije jednostavan povratni put glikolize?

Izvorna i dodatna literatura Berg, J. M., J. L. Tymoczko and L. Stryer. 2002. Biochemistry. 5th ed. New York: W. H. Freema­n. Mathews, C. K., K. E. van Holde and K. G. Aher­n. 2000. Biochemistry. 3rd ed. Redwood City, CA: Benjamin Cummings. Nelson, D. L. and M. M. Cox, 2005. Lehninger Principles of Biochemistry. 4th ed. New York: W. H. Freeman.

Središnja uloga enzima kao bioloških katalizatora Fersht, A. 1999. Structure and Mechanism in Protei­n Science; A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. New York: W. H. Freema­n Koshland, D. E. 1984. Control of enzyme activ­ity and metabolic pathways. Trends Biochem. Sci. 9: 155–159. [R] Lienhard, G. E. 1973. Enzymatic catalysis and transition-state theory. Science 180: 149-154. [R] Lipscomb, W. N. 1983. Structure and catalysis of  enzymes. Ann. Rev. Biochem. 52:17-34. [R] Monod, J., J. -P. Changeux and F. Jacob. 1963. Allosteric proteins and cellular control sys­ tems. J. Mol. Biol. 6: 306-329. [P] Narlikar, G. J. and D. Herschlag. 1997. Mechanisti­c aspects of enzymatic catalysis: Lessons from comparison of RNA and pro­ tein enzymes. Ann. Rev. Biochem. 66: 19-59. [R]

Petsko, G. A. and D. Ringe. 2003. Protein Structur­e and Function. Sunderland, MA: Sinauer.

Hers, H. G. and L. Hue. 1983. Gluconeogenesis and related aspects of glycolysis. Ann. Rev. Biochem. 52: 617-653. [R]

Schramm. V. L. 1998. Enzymatic transition states  and transition state analog design. Ann. Rev. Biochem. 67: 693-720. [R]

Jones, M. E. 1980. Pyrimidine nucleotide bio­ synthesis in animals: Genes, enzymes, and regulation of UMP biosynthesis. Ann. Rev. Biochem. 49: 253-279. [R]

Metabolička energija

Kornberg, A. and T. A. Baker. 1991. DNA Replicati­on. 2nd ed. New York: W. H. Free­ man.

Beinert, H., R. H. Holm and E. Munck. 1997. Iron-sulfur clusters: Nature's modular, mul­ tipurpose structures. Science 277: 653-659. [R] Bennett, J. 1979. The protein that harvests sun­ light. Trends Biochem. Sci. 4: 268-271. [R] Calvin, M. 1962. The path of carbon in photo­ syntesis. Science 135: 879-889. [R] Deisenhofer, J. and H. Michel. 1991. Structures of bacterial photosynthetic reaction centers. Ann. Rev. Cell Biol. 7: 1-23. [R] Krebs, H. A. 1970. The history of the tricar­ boxylic cycle. Perspect. Biol. Med. 14: 154170. [R] Kuhlbrandt, W. , D. N. Wang and Y. Fujiyoshi 1994. Atomic model of plant light-harvest­ ing complex by electron criystallography. Nature 367: 614-621. [P] Nicholls, D. G. and S. J. Ferguson. 2002. Bio­ energetics. 3rd ed, London: Academic Press. Saraste, M. 1999. Oxidative phosphorylation at the fin de siècle. Science 283: 1488-1493. [R]

Tolbert, N. E. 1981. Metabolic pathways in per­ oxisomes and glyoxysomes. Ann. Rev. Bioche­m. 50: 133-157. [R] Umbarger, H. E. 1978. Amino acid biosynthe­sis and its regulation. Ann. Rev. Bioche­m. 47:533-606. [R] Van den Bosch, H., R. B. H. Schutgens, R. J. A. Wanders and J. M. Tager. 1992. Bi­ochemistry of peroxisomes. Ann. Rev. Biochem. 61: 157197. [R] Wakil, S. J., J. K. Stoops and V. C. Joshi. 1983. Fatty acid synthesis and its regulation. Ann. Rev. Biochem. 52: 537-579. [R]

4 Nasljeđivanje, geni i DNA  103 Ekspresija genetičke informacije  110 Rekombinantna DNA  118 Detekcija nukleinskih kiselina i proteina  127 Funkcija gena u eukariota  136 KLJUČNI POKUS Pretpostavka DNA provirusa  116 Ključ­ni po­kus RNA interferencija  146

Os­no­ve mo­le­ku­lar­ne biologi­je Suv­re­me­na mo­le­ku­lar­na bio­lo­gi­ja te­ži ra­zum­je­ti me­ha­niz­me od­ go­vor­ne za nas­lje­đi­va­nje i ek­spre­si­ju ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je ko­ja od­re­đu­je struk­tu­ru i fun­kci­ju sta­ni­ce. Kao što je pri­ka­za­no u pr­vom pog­lav­lju, sve sta­ni­ce di­je­le od­re­đe­na os­nov­na svoj­stva, a to te­melj­no je­din­stvo sta­nič­ne bio­lo­gi­je po­se­bi­ce je vid­lji­vo na mo­le­ku­lar­noj ra­zi­ni. Pos­to­ja­nje te­melj­no­ ga sta­nič­nog je­din­stva omo­gu­ći­lo je znan­stve­ni­ci­ma da iza­be­ru jed­no­ stav­ni­je or­ga­niz­me, prim­je­ri­ce bak­te­ri­je, kao mo­del za pro­vo­đe­nje mno­ gih fun­da­men­tal­nih ek­spe­ri­me­na­ta u oče­ki­va­nju da će mo­le­ku­lar­ni me­ha­niz­mi i u or­ga­niz­mi­ma me­đu­sob­no raz­li­či­tim po­put čov­je­ka i E. co­ li bi­ti slič­ni. Broj­ni ek­spe­ri­men­ti pot­vr­di­li su toč­no­st te pret­pos­tav­ke i da­nas je jas­no da je mo­le­ku­lar­na bio­lo­gi­ja sta­ni­ce je­din­stve­ni put ra­zu­mi­ je­va­nja raz­no­li­kih ob­li­ka sta­nič­no­ga po­na­ša­nja. Po­čet­ni nap­re­dak u mo­le­ku­lar­noj bio­lo­gi­ji pos­tig­nut je ko­riš­te­njem pred­nos­ti br­zog ras­ta i jed­nos­tav­ne ge­ne­ti­ke bak­te­ri­ja po­put E. co­li i nje­ zi­nih vi­ru­sa. Raz­voj re­kom­bi­nan­tne DNA teh­no­lo­gi­je, ko­ji je us­li­je­dio, omo­gu­ćio je da se os­nov­ni prin­ci­pi i ek­spe­ri­men­tal­ni pris­tu­pi raz­vi­je­ni u pro­ka­rio­ti­ma pro­ši­re i na eu­ka­riot­ske sta­ni­ce. Pos­lje­di­ce raz­vo­ja re­ kom­bi­nan­tne DNA teh­no­lo­gi­je su go­le­me. U ra­nim je fa­za­ma re­kom­bi­ nan­tna DNA teh­no­lo­gi­ja omo­gu­ći­la izo­la­ci­ju i ka­rak­te­ri­za­ci­ju po­je­di­nih ge­na, a od ne­dav­no i od­re­đi­va­nje cje­lo­kup­nih re­dos­li­je­da nuk­leo­ti­da u ge­no­mi­ma slo­že­nih or­ga­niz­ama po­put bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja, uk­lju­ču­ju­ći i čov­je­ka.

Nas­lje­đi­va­nje, ge­ni i DNA Mogućnost rep­ro­duk­ci­je te­melj­no je svoj­stvo svih ži­vih bi­ća. Svi or­ga­ niz­mi ge­ne­tič­ku in­for­ma­ci­ju, ko­ja od­re­đu­je nji­ho­vu struk­tu­ru i fun­kci­ju, nas­lje­đu­ju od svo­jih ro­di­te­lja. Is­to ta­ko, sve sta­ni­ce nas­ta­ju iz pret­hod­no pos­to­je­ćih sta­ni­ca, i nuž­no je da se ge­ne­tič­ki ma­te­ri­jal um­no­ži i po­di­je­li pri sva­koj pod­je­li sta­ni­ce. Na­čin na ko­ji se ge­ne­tič­ka in­for­ma­ci­ja ud­vos­tru­ ču­je i pre­no­si sa sta­ni­ce na sta­ni­cu, ili s or­ga­niz­ma na or­ga­ni­zam, sre­diš­nje je pi­ta­nje bio­lo­gi­je. Pre­poz­na­va­nje mo­le­ku­le DNA kao no­si­te­lja ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je i ot­kri­va­nje me­ha­ni­za­ma nje­zi­na pri­je­no­sa stvo­ri­lo je te­melj na­šem da­naš­njem ra­zu­mi­je­va­nju bio­lo­gi­je na mo­le­ku­lar­noj ra­zi­ni.

104    POGLAVLJE 4 Sli­ka 4-1. Nas­lje­đi­va­nje do­mi­nan­tnih i re­ce­siv­nih ge­na.

Ge­ni i kro­mo­so­mi Temeljne prin­ci­pe ge­ne­ti­ke pos­ta­vio je Gre­gor Men­del 1865. go­di­ne na os­no­vi po­ku­sa kri­ža­nja graš­ka. Is­pi­ti­va­njem nas­lje­đi­va­nja ne­ko­li­ko dob­ro de­fi­ni­ra­nih svoj­sta­va kao što je prim­je­ri­ce bo­ja sje­men­ke, Men­del je us­pio ra­zum­je­ti os­nov­ne prin­ci­pe nji­ho­va pri­je­no­sa. Pret­pos­ta­vio je da je sva­ko svoj­stvo od­re­đe­no pa­rom nas­ljed­nih ele­me­na­ta ko­je da­nas zo­ve­mo ge­ni­ ma, i na taj je na­čin us­pio ob­jas­ni­ti sve re­zul­ta­te do­bi­ve­ne kri­ža­njem. Po jed­na ko­pi­ja ge­na za sva­ko svoj­stvo (na­zi­va­mo je alel) nas­lje­đu­je se od sva­ kog ro­di­te­lja. Prim­je­ri­ce, kri­ža­nje dvi­ju sor­ti graš­ka, jed­ne sa žu­tim, a dru­ ge sa ze­le­nim sje­men­ka­ma, da­je po­tom­stvo pri­ka­za­no na sli­ci 4-1. Sva­ka ro­di­telj­ska sor­ta ima po dvi­je iden­tič­ne ko­pi­je ge­na ko­ji od­re­đu­je žu­tu (Y – en­gl. yel­low) ili ze­le­nu (y) bo­ju sje­men­ke. Bilj­ke nas­ta­le kri­ža­njem su hib­ ri­di ko­ji su nas­li­je­di­li po jed­nu ko­pi­ju ge­na ko­ji od­re­đu­je žu­tu (Y) i jed­nu ko­pi­ju ge­na ko­ji od­re­đu­je ze­le­nu (y) bo­ju sje­men­ke. Sve bilj­ke po­tom­ci pri­ ka­za­no­ga kri­ža­nja (pr­va fi­li­jal­na ili F1 ge­ne­ra­ci­ja) ima­ju žu­te sje­men­ke, sto­ ga ka­že­mo da je gen ko­ji od­re­đu­je žu­tu bo­ju sje­men­ki (Y) do­mi­nan­tan, a gen ko­ji od­re­đu­je ze­le­nu bo­ju sje­men­ki (y) re­ce­si­van. Ge­no­tip (ge­ne­tič­ki us­troj) bi­lja­ka F1 ge­ne­ra­ci­je je sto­ga Yy, a nji­hov fe­no­tip (fi­zič­ki iz­gled) je žu­ta bo­ja sje­men­ki. Kri­ža­mo li me­đu­sob­no dva po­tom­ka F1 ge­ne­ra­ci­je do­ bi­va­mo F2 ge­ne­ra­ci­ju u ko­joj se ale­li za žu­tu i ze­le­nu bo­ju sje­men­ke raz­dva­ ja­ju (seg­re­gi­ra­ju) ta­ko da je om­jer bi­lja­ka F2 ge­ne­ra­ci­je sa žu­tim i ze­le­nim sje­men­ka­ma 3 : 1. Men­de­lo­vo ot­kri­će, ko­je je oči­to bi­lo is­pred svog vre­me­na, ug­lav­nom je za­pos­tav­lja­no do 1900. go­di­ne kad su Men­de­lo­vi za­ko­ni nas­lje­đi­va­nja po­ no­vo ot­kri­ve­ni te je ko­nač­no spoz­na­ta nji­ho­va važ­no­st. Ub­r­zo na­kon to­ga pred­lo­že­no je da su kro­mo­so­mi nositelji ge­na. Uo­če­no je da je ve­ći­na sta­ ni­ca vi­ših bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja dip­loid­na, tj. da ima po dvi­je ko­pi­je sva­ko­ga kro­mo­so­ma. Iz­nim­ka su spol­ne sta­ni­ce (sper­mi­ji i jaj­ne sta­ni­ce) ko­je na­ sta­ju po­seb­nim ti­pom dio­be ko­ji na­zi­va­mo me­jo­za, a u ko­joj se sa­mo po je­dan član kro­mo­som­sko­ga pa­ra pre­no­si na sva­ku no­vo­nas­ta­lu sta­ni­cu (sl. 4-2). Pos­lje­dič­no, sper­mi­ji i jaj­ne sta­ni­ce su hap­loid­ne i ima­ju sa­mo po

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   105

Sli­ka 4-2. Kro­mo­so­mi u me­jo­zi i op­ lod­nja.  Pri­ka­za­na su dva pa­ra kro­mo­ so­ma hi­po­tet­skog or­ga­niz­ma.

jed­nu ko­pi­ju sva­kog kro­mo­so­ma. Sje­di­nje­nje dvi­ju tak­vih hap­loid­nih sta­ ni­ca pri op­lod­nji stva­ra no­vi dip­loid­ni or­ga­ni­zam u ko­jem je­dan kro­mo­ som sva­ko­ga pa­ra pot­je­če od muš­ko­ga, a dru­gi od žen­sko­ga ro­di­te­lja. Po­ na­ša­nje pa­ro­va kro­mo­so­ma ti­je­kom me­jo­ze sto­ga os­li­ka­va po­na­ša­nje ale­la ti­je­kom seg­re­ga­ci­je, što je re­zul­ti­ra­lo pret­pos­tav­kom da su kro­mo­so­mi no­ si­te­lji ge­na. Os­no­ve mu­ta­ci­ja, ge­ne­tič­ke po­ve­za­nos­ti i od­no­sa iz­me­đu ge­na i kro­mo­ so­ma ve­li­kim su di­je­lom raz­jaš­nje­ne po­ku­si­ma pro­ve­de­nim na vin­skoj mu­ ši­ci, Dro­sop­hi­la me­la­no­gas­ter. Vin­sku je mu­ši­cu mo­gu­će jed­nos­tav­no uz­ga­ ja­ti u la­bo­ra­to­rij­skim uv­je­ti­ma na od­go­va­ra­ju­ćim pod­lo­ga­ma, a raz­mno­ža­va se prib­liž­no sva­ka dva tjed­na što je zna­čaj­na pred­no­st za ge­ne­tič­ka is­pi­ti­ va­nja. Zbog tih je svoj­sta­va Dro­sop­hi­la i da­lje vrlo po­pu­la­ran or­ga­ni­zam za ge­ne­tič­ka is­pi­ti­va­nja na ži­vo­ti­nja­ma, po­se­bi­ce u pod­ruč­ju ge­ne­ti­ke raz­vo­ja i di­fe­ren­ci­ja­ci­je. Po­čet­kom 20. sto­lje­ća ot­kri­ven je ve­lik broj ge­ne­tič­kih prom­je­na (mu­ ta­ci­ja) kod vin­ske mu­ši­ce ko­je su ug­lav­nom po­ga­đa­le la­ko uoč­lji­va svoj­ stva po­put bo­je oči­ju i ob­li­ka kri­la. Po­ku­si kri­ža­nja po­ka­za­li su da se ne­ki od ge­na ko­ji od­re­đu­ju ta svoj­stva nas­lje­đu­ju neo­vis­no je­dan o dru­gom što je upu­ći­va­lo na to da se na­la­ze na raz­li­či­tim kro­mo­so­mi­ma ko­ji se neo­vis­ no raz­dva­ja­ju ti­je­kom me­jo­ze (sl. 4-3). U is­to vri­je­me, ne­ki su se dru­gi ge­ni čes­to nas­lje­đi­va­li za­jed­no. U tom slu­ča­ju go­vo­ri­mo o ve­za­nim ge­ni­ma, a po­ve­zu­je ih smješ­taj na is­tom kro­mo­so­mu. Broj sku­pi­na ve­za­nih ge­na jed­nak je bro­ju kro­mo­so­ma ne­kog or­ga­niz­ma (če­ti­ri kod vin­ske mu­ši­ce) što je do­dat­no pod­r­ža­lo pret­pos­tav­ku da su kro­mo­so­mi no­si­te­lji ge­na. Do 1915. go­di­ne go­to­vo je sto­ti­nu ge­na iden­ti­fi­ci­ra­no i kar­ti­ra­no na če­ti­ri kro­ mo­so­ma vin­ske mu­ši­ce što je do­ve­lo do op­ćeg prih­va­ća­nja kro­mo­so­ma kao no­si­te­lja nas­lje­đi­va­nja.

Ge­ni i en­zi­mi Rana ge­ne­tič­ka is­tra­ži­va­nja bi­la su us­mje­re­na na iden­ti­fi­ka­ci­ju i kro­mo­ som­sku lo­ka­li­za­ci­ju ge­na ko­ji od­re­đu­ju la­ko uoč­lji­va svoj­stva po­put bo­je oči­ju vin­ske mu­ši­ce, no na­čin na ko­ji ti ge­ni od­re­đu­ju fe­no­tip ni­je bio po­ znat. Pr­ve spoz­na­je o ve­zi iz­me­đu ge­na i en­zi­ma po­ja­vi­le su se 1909. go­di­ne,

106    POGLAVLJE 4

Sli­ka 4-3. Raz­dva­ja­nje (seg­re­ga­ci­ja) i ve­za­no­st ge­na.  (A) Raz­dva­ja­nje dva­ju hi­po­ tet­skih ge­na za ob­lik (A/a = čet­vr­ta­st/okrugao) i bo­ju (B/b = cr­ve­no/plavo) smješ­te­nih na raz­li­či­tim kro­mo­so­mi­ma. (B) Nas­lje­đi­va­nje ge­na smješ­te­nih na is­tom kro­mo­so­mu (ve­za­ni ge­ni).

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   107

kad je uo­če­no da je nas­ljed­na bo­le­st fe­nil­ke­to­nu­ri­ja (vi­di: Mo­le­ku­lar­na me­ di­ci­na u 2. pog­lav­lju) pos­lje­di­ca ge­ne­tič­ko­ga po­re­me­ća­ja u me­ta­bo­liz­mu ami­no­ki­se­li­ne fe­ni­la­la­ni­na. Pret­pos­tav­lje­no je da je taj po­re­me­ćaj pos­lje­di­ca ne­dos­tat­ka en­zi­ma ko­ji ka­ta­li­zi­ra od­go­va­ra­ju­će me­ta­bo­lič­ke reak­ci­je, što je po­tak­lo for­mu­li­ra­nje ge­ne­ral­ne hi­po­te­ze da ge­ni od­re­đu­ju sin­te­zu en­zi­ma. Jas­ni­ji do­kaz po­ve­za­nos­ti ge­na sa sin­te­zom en­zi­ma proi­zi­šao je iz eks­ pe­ri­men­ta ko­ji su 1941. go­di­ne na glji­vi­ci Neu­ros­po­ra cras­sa pro­ve­li Geor­ ge Bead­le i Ed­wa­rd Ta­tum. U la­bo­ra­to­ri­ju Neu­ros­po­ra mo­že bi­ti uz­ga­ja­na na mi­ni­mal­nim ili bo­ga­tim me­di­ji­ma slič­nim oni­ma opi­sa­nim u 1. pog­lav­ lju za uz­goj E. co­li. Za glji­vi­cu Neu­ros­po­ra cras­sa minimalni se me­dij sa­sto­ ji sa­mo od so­li, glu­ko­ze i bio­ti­na. Bo­ga­ti me­dij obo­ga­ćen je ami­no­ki­se­li­na­ ma, vi­ta­mi­ni­ma, pu­ri­ni­ma i pi­ri­mi­di­ni­ma. Bead­le i Ta­tum izo­li­ra­li su mu­tan­te ove glji­vi­ce ko­je nor­mal­no ras­tu na bo­ga­tom me­di­ju, no ne mo­gu ras­ti na mi­ni­mal­nom me­di­ju. Ot­kri­li su da je sva­koj mu­tan­ti za ra­st pot­re­ ban spe­ci­fi­čan preh­ram­be­ni na­dom­jes­tak, prim­je­ri­ce od­re­đe­na ami­no­ki­se­ li­na. Što­vi­še, pot­re­ba za od­re­đe­nim preh­ram­be­nim na­dom­jes­tkom bi­la je u ko­re­la­ci­ji s ne­mo­guć­noš­ću sin­te­ze te is­te mo­le­ku­le. Na os­no­vi ovih pro­ mat­ra­nja Bead­le i Ta­tum su zak­lju­či­li da sva­ka mu­ta­ci­ja re­zul­ti­ra ne­dos­tat­ kom od­re­đe­no­ga me­ta­bo­lič­ko­ga pu­ta. Ka­ko je bi­lo poz­na­to da me­ta­bo­li­ čkim pu­to­vi­ma up­rav­lja­ju en­zi­mi, iz ek­spe­ri­me­na­ta na glji­vi­ci Neu­ros­po­ra cras­sa proizišao je zak­lju­čak da sva­ki gen od­re­đu­je struk­tu­ru jed­nog en­zi­ ma, tj. hi­po­te­za je­dan gen – je­dan en­zim. Da­nas zna­mo da se mno­gi en­ zi­mi sas­to­je od vi­še po­li­pep­ti­da, pa je tre­nut­no prih­va­ćen ob­lik ove hi­po­ te­ze da sva­ki gen od­re­đu­je struk­tu­ru jed­no­ga po­li­pep­tid­nog lan­ca.

Mo­le­ku­la DNA no­si­telj je ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je Razumijevanje kro­mo­som­ske os­no­ve nas­lje­đi­va­nja i od­no­sa iz­me­đu ge­ na i en­zi­ma ni­je sa­mo po se­bi pru­ži­lo mo­le­ku­lar­no ob­jaš­nje­nje ge­na. Kro­ mo­so­mi sad­r­ža­va­ju i pro­tei­ne i DNA, i pr­vot­no se mis­li­lo da su ge­ni pro­ tei­ni. Pr­vi do­ka­zi ko­ji su vo­di­li pre­ma sup­rot­noj ide­ji da je mo­le­ku­la DNA no­si­telj ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je doš­li su iz ek­spe­ri­me­na­ta pro­ve­de­nih na bak­te­ri­ja­ma. Ti ek­spe­ri­men­ti pred­stav­lja­ju pro­to­tip suv­re­me­nog pris­tu­pa od­re­đi­va­nju ulo­ge ge­na uno­še­njem no­vih mo­le­ku­la DNA u sta­ni­cu, što će bi­ti ob­jaš­nje­no kas­ni­je u ovom pog­lav­lju. Ulo­ga mo­le­ku­le DNA ot­kri­ve­na je iz re­zul­ta­ta ek­spe­ri­me­na­ta pro­ve­de­ nih na bak­te­ri­ji ko­ja uz­ro­ku­je upa­lu plu­ća (Pneu­mo­coc­cus). Vi­ru­len­tni so­ je­vi ove bak­te­ri­je ok­ru­že­ni su kap­su­lom iz­gra­đe­nom od po­li­sa­ha­ri­da ko­ja šti­ti bak­te­ri­je od na­pa­da imu­no­sus­ta­va do­ma­ći­na. Bu­du­ći da kap­su­la bak­ te­rij­skim ko­lo­ni­ja­ma da­je glat­ki iz­gled u kul­tu­ri, soj bak­te­ri­ja ko­ji proiz­vo­ di kap­su­lu oz­na­ču­je­mo sa S (en­gl. smoo­th). Mu­ti­ra­ni so­je­vi ko­ji su iz­gu­bi­ li spo­sob­no­st stva­ra­nja kap­su­le (oz­na­če­ni sa R, en­gl. rou­gh) tvo­re ko­lo­ni­je s hra­pa­vim ru­bom te ni­su le­tal­ni ako nji­ma za­ra­zi­mo mi­ša. Go­di­ne 1928. uo­če­no je da miš in­fi­ci­ran smje­som ži­vu­ćih hra­pa­vih (R) bak­te­ri­ja i top­li­ nom ubi­je­nih glat­kih (S) bak­te­ri­ja raz­vi­ja upa­lu plu­ća i ub­rz­ o umi­re. Bak­ te­ri­je ko­je su za­tim izo­li­ra­ne iz tak­vog mi­ša bi­le su ti­pa S. Kas­ni­ji su ek­spe­ ri­men­ti po­ka­za­li da su ek­strak­ti bak­te­rij­skih kul­tu­ra ti­pa S u ko­ji­ma ni­je bi­lo či­ta­vih bak­te­rij­skih sta­ni­ca ta­ko­đer u sta­nju pre­ves­ti (tran­sfor­mi­ra­ti) bak­te­ri­je ti­pa R u ob­lik S. Zak­lju­če­no je da je ne­ka tvar u ek­strak­tu bak­te­ ri­ja ti­pa S (naz­va­na tran­sfor­mi­ra­ju­ći prin­cip) od­go­vor­na za ge­ne­tič­ku trans­for­ma­ci­ju R ob­li­ka u S ob­lik bak­te­ri­je. Go­di­ne 1944. Oswa­ld Ave­ry, Co­lin Mac­Leod i Mac­lyn McCar­ty izo­li­ra­ li su DNA iz bak­te­rij­skih ek­stra­ka­ta i po­ka­za­li da en­zi­mi ko­ji raz­gra­đu­ju DNA uniš­ta­va­ju spo­sob­no­st tran­sfor­ma­ci­je, dok en­zi­mi ko­ji raz­gra­đu­ju pro­tei­ne ne­ma­ju ta­kav uči­nak (sl. 4-4). Na taj su na­čin do­ka­za­li da je tran­

4.1. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Ave­ry, Mac­Leod & McCar­ty. Kroz se­ri­ju po­ku­sa pro­ve­de­nih 1944. go­di­ne Os­wa­ld Ave­ry, Colin Mac­Leod i Mac­lyn McCar­ty po­ka­za­li su da je »tran­sfor­mi­ra­ju­ći prin­ci­p« (ge­ne­tič­ki ma­te­ri­jal) DNA.

4.2. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Bak­te­rij­ska tran­sfor­ma­ci­ja. Nepa­ to­ge­ni soj bak­te­ri­je Pneu­mo­co­ccus mo­že bi­ti tran­sfor­mi­ran u pa­to­ ge­ni soj uno­še­njem frag­me­ na­ta DNA iz pa­to­ge­nog so­ja i nji­ho­vom ug­rad­ njom u kro­mo­som ne­pa­to­ge­nog so­ja.

108    POGLAVLJE 4 Sli­ka 4-4. Pri­je­nos ge­ne­tič­ke in­for­ma­ ci­je po­mo­ću DNA.  DNA je izo­li­ra­na iz pa­to­ge­nog ti­pa bak­te­ri­je Pneu­mo­coc­cus ko­ji je ok­ru­žen kap­su­lom i tvo­ri glat­ke ko­lo­ni­je (S, en­gl. smoo­th). Do­da­tak DNA, pro­čiš­će­ne iz S ti­pa u kul­tu­ru ne­pa­to­ge­ nih bak­te­ri­ja ko­je ne tvore kap­su­lu (R, en­gl. rou­gh), do­vo­di do stva­ra­nja S ko­ lo­ni­ja. Zak­lju­čak je da pro­čiš­će­na DNA sad­r­ža­va ge­ne­tič­ku in­for­ma­ci­ju od­go­ vor­nu za tran­sfor­ma­ci­ju ti­pa R u tip S bak­te­ri­ja.

sfor­mi­ra­ju­ći prin­cip zap­ra­vo mo­le­ku­la DNA. Ipak, tek će ek­spe­ri­men­ti pro­ve­de­ni ti­je­kom slje­de­ćih ne­ko­li­ko go­di­na na bak­te­rij­skim vi­ru­si­ma re­ zul­ti­ra­ti prih­va­ća­njem DNA kao ge­ne­tič­kog ma­te­ri­ja­la. Nai­me, kad bak­te­ rij­ski vi­rus in­fi­ci­ra sta­ni­cu, DNA vi­ru­sa, a ne nje­go­vi pro­tei­ni, mo­ra ući u sta­ni­cu ka­ko bi omo­gu­ći­la um­na­ža­nje vi­ru­sa. Što­vi­še, DNA ro­di­telj­skog vi­ru­sa (a ne nje­go­vi pro­tei­ni) pre­no­si se na no­vo­nas­ta­le čes­ti­ce vi­ru­sa. Us­ kla­đe­no­st tih re­zul­ta­ta s nas­tav­kom is­pi­ti­va­nja ak­tiv­nos­ti DNA u tran­sfor­ ma­ci­ji bak­te­ri­ja do­ve­la je do ko­nač­nog prih­va­ća­nja ide­je da je DNA ge­ne­ tič­ki ma­te­ri­jal.

Struk­tu­ra DNA

▶▶ Struk­tu­ra DNA ko­ju su opi­sa­li

Wat­son i Cri­ck bi­la je ve­li­ko ot­kri­ će, no ni­je bi­la sav­r­še­na. U svom ori­gi­nal­nom ra­du oni su pret­po­ sta­vi­li da se i A-T i G-C spa­ru­ju s po dvi­je vo­di­ko­ve ve­ze, te su pre­ vid­je­li pos­to­ja­nje tre­će vo­di­ko­ve ve­ze u G-C pa­ro­vi­ma ba­za.

Poznavanje tro­di­men­zio­nal­ne struk­tu­re DNA ko­ju su 1953. go­di­ne ot­ kri­li Ja­mes Wat­son i Fran­cis Cri­ck te­melj je suv­re­me­ne mo­le­ku­lar­ne bio­lo­ gi­je. U vri­je­me kad su Wat­son i Cri­ck ra­di­li na struk­tu­ri DNA bi­lo je poz­ na­to da je DNA po­li­mer ko­ji se sas­to­ji od četiri ti­pa du­ši­ko­vih ba­za, dva pu­ri­na (ade­nin [A] i gva­nin [G]) i dva pi­ri­mi­di­na (ci­to­zin [C] i ti­min [T]), ve­za­nih za fos­fo­ri­li­ra­ne še­će­re. S ob­zi­rom na sre­diš­nju ulo­gu DNA kao ge­ ne­tič­kog ma­te­ri­ja­la, ob­jaš­nje­nje nje­zi­ne tro­di­men­zio­nal­ne struk­tu­re bi­lo je kri­tič­no za ra­zu­mi­je­va­nje nje­zi­ne fun­kci­je. Wat­so­nov i Cric­kov pog­led na taj prob­lem bio je pod zna­čaj­nim ut­je­ca­jem Li­nus Pau­lin­go­va ob­jaš­nje­nja vo­di­ko­ve ve­ze i α-uz­voj­ni­ce, čes­tog ob­li­ka se­kun­dar­ne struk­tu­re pro­tei­na (v. pog­l. 2). Ek­spe­ri­men­tal­ni po­dat­ci o struk­tu­ri DNA proi­ziš­li su iz kris­ ta­log­raf­skih is­pi­ti­va­nja Mau­ri­cea Wil­kin­sa i Ro­sa­li­nd Fran­klin. Ana­li­za tih po­da­ta­ka ot­kri­la je da je mo­le­ku­la DNA uz­voj­ni­ca ko­ja či­ni za­vo­je od 3,4 nm. Po­dat­ci su po­ka­za­li i da je raz­mak iz­me­đu sus­jed­nih ba­za 0,34 nm, sto­ga se je­dan za­voj uz­voj­ni­ce sas­to­ji od 10 pa­ro­va ba­za. Važ­no je ot­kri­će bi­lo da je prom­jer uz­voj­ni­ce prib­liž­no 2 nm, što je upu­ći­va­lo na to da se mo­le­ku­la DNA sas­to­ji od dva­ju, a ne od jed­no­ga lan­ca DNA.

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   109

Sli­ka 4-5. Struk­tu­ra mo­le­ku­le DNA.

Na os­no­vi ovih po­da­ta­ka Wat­son i Cri­ck su iz­gra­di­li svoj mo­del mo­le­ ku­le DNA (sl. 4-5). Os­nov­na svoj­stva mo­de­la je­su da je DNA dvos­tru­ka uz­voj­ni­ca sa še­ćer­no-fos­fat­nom okos­ni­com na vanj­skoj stra­ni mo­le­ku­le. Ba­ze su smješ­te­ne u unut­raš­njos­ti mo­le­ku­le i ori­jen­ti­ra­ne ta­ko da se vo­di­ ko­ve ve­ze stva­ra­ju iz­me­đu na­sup­rot­nih pu­ri­na i pi­ri­mi­di­na. Spa­ri­va­nje ba­ za vr­lo je spe­ci­fič­no: A se uvi­jek spa­ru­je s T, a G s C. Ova spe­ci­fič­no­st ob­jaš­nja­va ra­ni­ji re­zul­tat Erwi­na Char­gaf­fa ko­ji je ana­li­zi­rao sas­tav ba­za u raz­li­či­tim mo­le­ku­la­ma DNA i ut­vr­dio da je ko­li­či­na ade­ni­na uvi­jek jed­na­ ka ko­li­či­ni ti­mi­na, a ko­li­či­na gva­ni­na jed­na­ka ko­li­či­ni ci­to­zi­na. Zbog spe­ ci­fič­nog su spa­ri­va­nja ba­za dva lan­ca mo­le­ku­le DNA kom­ple­men­tar­na i sva­ki la­nac sad­r­ža­va cje­lo­kup­nu in­for­ma­ci­ju pot­reb­nu za od­re­đi­va­nje sli­je­ da ba­za u dru­gom lan­cu.

Rep­li­ka­ci­ja DNA Otkriće kom­ple­men­tar­nog spa­ri­va­nja ba­za iz­me­đu dva­ju la­na­ca u mo­ le­ku­li DNA da­lo je od­go­vor na pi­ta­nje ka­ko ge­ne­tič­ki ma­te­ri­jal mo­že up­ rav­lja­ti svo­jom vlas­ti­tom rep­li­ka­ci­jom, pro­ce­som ko­ji se mo­ra do­go­di­ti pri sva­koj dio­bi sta­ni­ca. Pred­lo­že­no je da se dva lan­ca DNA mo­gu raz­dvo­ji­ti i

110    POGLAVLJE 4 Sli­ka 4-6. Se­mi­kon­zer­va­tiv­na rep­li­ka­ci­ja DNA.  Dva se lan­ca ro­di­telj­ske DNA raz­ dva­ja­ju i sva­ki od njih slu­ži kao ka­lup za sin­te­zu no­vo­ga lan­ca. Na taj na­čin nas­ta­ju dvi­je no­ve, pot­pu­no iden­tič­ne mo­le­ku­le DNA. Sli­jed nuk­leo­ti­da u no­vo­nas­ta­lim lan­ci­ ma DNA od­re­đen je kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem ba­za.

slu­ži­ti kao ka­lup za sin­te­zu no­vo­ga kom­ple­men­tar­nog lan­ca či­ji bi sli­jed bio od­re­đen spe­ci­fič­nim spa­ri­va­njem ba­za (sl. 4-6). Ovaj pro­ces na­zi­va­mo se­mi­kon­zer­va­tiv­nom rep­li­ka­ci­jom jer je u sva­koj no­vo­nas­ta­loj mo­le­ku­li DNA sa­ču­van po je­dan sta­ri la­nac ro­di­telj­ske DNA. Iz­rav­nu pod­r­šku mo­de­lu se­mi­kon­zer­va­tiv­ne rep­li­ka­ci­je DNA pru­žio je ele­gan­tni ek­spe­ri­me­nt ko­ji su 1958. go­di­ne pro­ve­li Mat­thew Mes­sel­son i Fra­nk Sta­hl obi­lje­živ­ši DNA izo­to­pi­ma ko­ji su pro­mi­je­ni­li nje­zi­nu gus­to­ću (sl. 4-7). E. co­li je pr­vo uz­ga­ja­na u me­di­ju ko­ji je sad­r­ža­vao teš­ki izo­top du­ši­ka (15N) um­jes­to nor­mal­no­ga du­ši­ka (14N). DNA tih bak­te­ri­ja um­jes­to nor­mal­no­ga du­ši­ka 14N sad­rž­ a­va­la je teš­ki izo­top 15N, te je sto­ga bi­la guš­ća od DNA bak­te­ri­ja uz­ga­ja­nih u nor­mal­nom me­di­ju. Tak­vu teš­ku DNA (15N) bi­lo je mo­gu­će raz­dvo­ji­ti od nor­mal­ne DNA (14N) rav­no­tež­nim cen­tri­fu­gi­ ra­njem u gra­di­jen­tu CsCl, što je omo­gu­ ći­lo prou­ča­va­nje pro­ce­sa sin­te­ze DNA. E. co­li ko­ja je ras­la u 15N me­di­ju pre­ne­se­na je u nor­mal­ni me­dij te joj je omo­gu­će­no da se po­­di­je­li još jed­nom. DNA bak­te­ri­ja do­bi­ve­nih dio­bom je izo­li­ra­na i ana­li­zi­ra­ na cen­tri­fu­gi­ra­njem u gra­di­jen­tu gus­to­će CsCl. Re­zul­tat ove ana­li­ze po­ka­zao je da je sva teš­ka DNA za­mi­je­nje­na no­vo­sin­te­ ti­zi­ra­nim mo­le­ku­la­ma DNA či­ja je gus­to­ ća iz­me­đu gus­to­će teš­kih (15N) i la­kih (14N) mo­le­ku­la DNA. Ta­kav re­zul­tat ob­jaš­njen je mo­de­lom u ko­jem ti­je­kom rep­li­ ka­ci­je do­la­zi do raz­dva­ja­nja dva­ju teš­kih ro­di­telj­skih la­na­ca DNA od ko­jih sva­ki slu­ži kao ka­lup za sin­te­zu po jed­no­ga no­vog la­ko­ga lan­ca DNA. Re­zul­tat su mo­le­ku­le DNA od ko­ jih sva­ka sa­drža­va po je­dan la­ki i je­dan teš­ki la­nac te je nji­ ho­va gus­to­ća iz­me­đu gus­to­će teš­ke i la­ke mo­le­ku­le DNA. Ovaj ek­spe­ri­me­nt pru­žio je iz­rav­ni do­kaz za se­mi­kon­zer­va­ tiv­nu rep­li­ka­ci­ju DNA i jas­no nag­la­sio važ­no­st kom­ple­men­ tar­nog spa­ri­va­nja ba­za iz­me­đu dva­ju la­na­ca DNA u dvos­tru­koj uz­voj­ni­ci. Spo­sob­no­st DNA da slu­ži kao ka­lup za vlas­ti­tu sin­te­zu do­dat­no je pot­ vr­đe­na kad je ut­vr­đe­no da en­zim izo­li­ran iz E. co­li (DNA-po­li­me­ra­za) mo­že ka­ta­li­zi­ra­ti rep­li­ka­ci­ju DNA in vit­ro. U pri­sut­nos­ti lan­ca DNA ko­ji slu­ži kao ka­lup, DNA-po­li­me­ra­za mog­la je ka­ta­li­zi­ra­ti ug­rad­nju nuk­leo­ti­da u kom­ple­men­tar­ni la­nac DNA.

Ek­spre­si­ja ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je Geni dje­lu­ju ta­ko da od­re­đu­ju struk­tu­ru pro­tei­na ko­ji su od­go­vor­ni za fun­kcio­ni­ra­nje sta­ni­ce na mo­le­ku­lar­noj ra­zi­ni. Iden­ti­fi­ka­ci­ja DNA kao ge­ ne­tič­kog ma­te­ri­ja­la i raz­jaš­nje­nje nje­zi­ne struk­tu­re ot­kri­lo je da ge­ne­tič­ka in­for­ma­ci­ja mo­ra bi­ti od­re­đe­na re­dos­li­je­dom če­ti­ri­ju ba­za (A, C, G i T) ko­je iz­gra­đu­ju mo­le­ku­lu DNA. S dru­ge stra­ne, pro­tei­ni su po­li­me­ri iz­gra­ đe­ni od 20 raz­li­či­tih ami­no­ki­se­li­na či­ji sli­jed od­re­đu­je nji­ho­vu struk­tu­ru i fun­kci­ju. Pr­va iz­rav­na ve­za iz­me­đu mu­ta­ci­je ge­na i prom­je­ne u sli­je­du ami­no­ki­se­li­na po­ka­za­na je 1957. go­di­ne, kad je ut­vr­đe­no da je raz­li­ka iz­

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

Sli­ka 4-7. Ek­spe­ri­men­tal­ni do­kaz se­mi­kon­zer­va­tiv­ne rep­li­ka­ci­je DNA.  Bak­te­ri­ je uz­ga­ja­ne u me­di­ju ko­ji je sad­r­ža­vao nor­mal­ni izo­top du­ši­ka (14N) pre­ne­se­ne su u me­dij ko­ji sad­r­ža­va teš­ki izo­top du­ši­ka (15N) te su tu uz­ga­ja­ne ti­je­kom ne­ko­li­ko ge­ne­ ra­ci­ja. Za­tim su pre­ne­se­ne po­no­vo u me­dij s 14N du­ši­kom i uz­ga­ja­ne ti­je­kom jed­ne do­dat­ne ge­ne­ra­ci­je. DNA izo­li­ra­na iz tih bak­te­ri­ja ana­li­zi­ra­na je rav­no­tež­nim ul­tra­cen­ tri­fu­gi­ra­njem u oto­pi­ni CsCl. Iz­lo­žen ve­li­kom gra­vi­ta­cij­skom po­lju CsCl se­di­men­ti­ra i tvo­ri gra­di­je­nt gus­to­će, a mo­le­ku­le DNA tvo­re vr­pcu na po­lo­ža­ju gdje je nji­ho­va gus­ to­ća jed­na­ka gus­to­ći oto­pi­ne CsCl. DNA bak­te­ri­ja pre­ne­se­nih iz 15N me­di­ja u 14N me­dij ti­je­kom vre­me­na ko­je je omo­gu­ći­lo sa­mo jed­nu do­dat­nu rep­li­ka­ci­ju tvo­ri vr­pcu či­ja je gus­to­ća iz­me­đu gus­to­ća 15N DNA i 14N DNA, što upu­ću­je na to da se ra­di o hib­rid­noj mo­le­ku­li ko­ja se sas­to­ji od jed­no­ga teš­kog i jed­no­ga la­kog lan­ca.

me­đu he­mog­lo­bi­na pa­ci­je­na­ta obo­lje­lih od nas­ljed­ne bo­les­ti sr­pas­te ane­ mi­je i nor­mal­no­ga he­mog­lo­bi­na u sve­ga jed­noj ami­no­ki­se­li­ni, no dub­lje ra­zu­mi­je­va­nje mo­le­ku­lar­nog od­no­sa iz­me­đu DNA i pro­tei­na proi­ziš­lo je iz se­ri­je ek­spe­ri­me­na­ta ko­ji su is­ko­ris­ti­li pred­nos­ti E. co­li i nje­zi­nih vi­ru­sa kao ge­ne­tič­kih mo­de­la.

Ko­li­near­no­st ge­na i pro­tei­na Najjednostavnija pret­pos­tav­ka ko­ja bi ob­jas­ni­la od­nos ge­na i pro­tei­na bi­la je da re­dos­li­jed nuk­leo­ti­da u DNA od­re­đu­je re­dos­li­jed ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­ni­ma. Mu­ta­ci­je u ge­nu od­go­va­ra­le bi prom­je­na­ma u sli­je­du nu­ kleo­ti­da u mo­le­ku­li DNA ko­je bi mog­le nas­ta­ti zbog zam­je­ne jed­nog nu­ kleo­ti­da ne­kim dru­gim, zbog do­da­va­nja (adi­ci­je) ili uk­la­nja­nja (de­le­ci­je) nuk­leo­ti­da. Prom­je­ne u sli­je­du nuk­leo­ti­da u mo­le­ku­li DNA ta­da bi re­zul­ ti­ra­le od­go­va­ra­ju­ćim prom­je­na­ma u sli­je­du ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­nu što ga ko­di­ra mu­ti­ra­ni gen. Ova je pret­pos­tav­ka pred­vid­je­la da bi raz­li­či­te mu­ ta­ci­je u is­tom ge­nu mog­le pro­mi­je­ni­ti raz­li­či­te ami­no­ki­se­li­ne u pro­tei­nu što ga taj gen ko­di­ra, a da bi po­lo­žaj mu­ta­ci­je unu­tar ge­na tre­bao od­go­va­ ra­ti po­lo­ža­ju pro­mi­je­nje­ne ami­no­ki­se­li­ne u pro­tei­nu. Br­zo um­na­ža­nje i jed­nos­tav­no­st ge­ne­tič­ko­ga sus­ta­va E. co­li bili su od ve­li­ke po­mo­ći pri tra­že­nju od­go­vo­ra na ova pi­ta­nja. Bi­lo je mo­gu­će izo­li­ ra­ti raz­li­či­te mu­tan­te bak­te­ri­je E. co­li, uk­lju­ču­ju­ći i nut­ri­tiv­ne mu­tan­te ko­ je (po­put mu­tan­ti glji­vi­ce Neu­ros­po­ra cras­sa prikazanih ra­ni­je) ras­tu sa­mo uz do­da­tak od­re­đe­ne ami­no­ki­se­li­ne. Brz ra­st bak­te­ri­je E. co­li omo­gu­ćio je izo­la­ci­ju i kar­ti­ra­nje vi­še mu­ta­ci­ja unu­tar jed­no­ga ge­na, što je re­zul­ti­ra­lo pr­vim do­ka­zom li­near­nog od­no­sa iz­me­đu ge­na i pro­tei­na. Char­les Ya­nof­ sky i nje­go­vi ko­le­ge kar­ti­ra­li su se­ri­ju mu­ta­ci­ja u ge­nu ko­ji ko­di­ra en­zim

   111

112    POGLAVLJE 4

Sli­ka 4-8. Ko­li­near­no­st ge­na i pro­tei­na.  Se­ri­ja mu­ta­ci­ja (str­je­li­ce) kar­ti­ra­na je u ge­ nu bak­te­ri­je E. co­li koji ko­di­ra trip­to­fa­n-sin­te­ta­zu (gor­nji red). Prom­je­ne ami­no­ki­se­li­na ko­je su proi­zaš­le iz sva­ke od tih mu­ta­ci­ja ut­vr­đe­ne su ana­li­zom sli­je­da ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­ni­ma mu­ti­ra­nih bak­te­ri­ja (do­nji red). Ova is­pi­ti­va­nja po­ka­za­la su da re­dos­li­jed mu­ta­ci­ja u DNA od­go­va­ra re­dos­li­je­du pro­mi­je­nje­nih ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­nu što ga taj gen ko­di­ra.

pot­re­ban za sin­te­zu ami­no­ki­se­li­ne trip­to­fa­na. Ana­li­za en­zi­ma ko­je ko­di­ra­ ju ti mu­ti­ra­ni ge­ni po­ka­za­la je da re­la­tiv­ni po­lo­žaj prom­je­na u ami­no­ki­se­ li­na­ma od­go­va­ra po­lo­ža­ju mu­ta­ci­ja u ge­nu (sl. 4-8). Dak­le, sli­jed ami­no­ki­ se­li­na u pro­tei­nu ko­li­nea­ran je sa sli­je­dom nuk­leo­ti­da u ge­nu, što je u skla­du s pret­pos­tav­kom da re­dos­li­jed nuk­leo­ti­da u mo­le­ku­li DNA od­re­đu­ je re­dos­li­jed ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­nu.

Ulo­ga glas­nič­ke RNA Iako se či­ni­lo da sli­jed nuk­leo­ti­da u DNA od­re­đu­je sli­jed ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­nu, iz to­ga ni­je nuž­no proiz­la­zi­lo da sa­ma mo­le­ku­la DNA up­rav­lja sin­te­zom pro­tei­na. Što­vi­še, u pri­log to­mu ni­je go­vo­ri­la ni či­nje­ni­ca da je DNA smješ­te­na u jez­gri eu­ka­riot­ske sta­ni­ce, dok se sin­te­za pro­tei­na od­vi­ja u ci­top­laz­mi. Či­ni­lo se pu­no vje­ro­jat­ni­jim da ne­ka dru­ga mo­le­ku­la pre­no­ si ge­ne­tič­ku in­for­ma­ci­ju s mo­le­ku­le DNA na mjes­to sin­te­ze pro­tei­na (ri­bo­ so­mi). RNA je dje­lo­va­la kao vje­ro­jat­ni kan­di­dat za tak­vog pos­red­ni­ka jer je slič­no­st nje­zi­ne struk­tu­re sa struk­tu­rom DNA upu­ći­va­la na to da bi RNA mog­la bi­ti sin­te­ti­zi­ra­na na os­no­vi DNA-ka­lu­pa (sl. 4-9). Mo­le­ku­la se RNA raz­li­ku­je od mo­le­ku­le DNA po to­me što je jed­no­lan­ča­na, a ne dvo­lan­ča­na, što je nje­zi­na še­ćer­na kom­po­nen­ta ri­bo­za, a ne deok­si­ri­bo­za, i što sad­r­ža­va pi­ri­mi­din­sku ba­zu ura­cil (U) um­jes­to ti­mi­na (T) (v. sl. 2-10). No ni prom­ je­na še­će­ra, ni­ti zam­je­na ura­ci­la ti­mi­nom ne ut­je­če na spa­ri­va­nje ba­za, sto­ga je sin­te­zom RNA mo­gu­će up­rav­lja­ti ko­ris­te­ći DNA kao ka­lup. Što­vi­ še, ka­ko je RNA smješ­te­na pog­la­vi­to u ci­top­laz­mi, či­ni­lo se da je ona lo­gič­ ni pos­red­nik u pri­je­no­su in­for­ma­ci­je s DNA na ri­bo­so­me. Ova svoj­stva RNA su­ge­ri­ra­la su ti­jek ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je ko­ji pre­poz­na­je­mo kao sre­ diš­nju dog­mu molekularne bio­lo­gi­je: DNA → RNA → protein

Sli­ka 4-9. Sin­te­za mo­le­ku­le RNA iz mo­le­ku­le DNA.  Dva se lan­ca mo­le­ku­ le DNA raz­mo­ta­va­ju, a je­dan od njih se ko­ris­ti kao ka­lup za sin­te­zu kom­ple­men­ tar­no­ga lan­ca mo­le­ku­le RNA.

U skla­du s ovim kon­cep­tom, mo­le­ku­la RNA sin­te­ti­zi­ra se na os­no­vi DNA-ka­lu­pa (pro­ces ko­ji na­zi­va­mo pre­pi­si­va­nje ili tran­skrip­ci­ja), a pro­ tei­ni se sin­te­ti­zi­ra­ju na os­no­vi RNA-ka­lu­pa (pro­ces ko­ji na­zi­va­mo pre­vo­ đe­nje ili tran­sla­ci­ja). Ek­spe­ri­men­tal­ni do­kaz pos­to­ja­nja RNA pos­red­ni­ka ko­ji je pred­vid­je­la sre­diš­nja dog­ma pru­ži­li su Sid­ney Bren­ner, Fran­çois Ja­cob i Mat­thew Me­ sel­son prou­ča­va­njem E. co­li in­fi­ci­ra­ne bak­te­rio­fa­gom T4. Sin­te­za RNA E. co­li pres­ta­je na­kon in­fek­ci­je bak­te­rio­fa­gom T4 i je­di­na no­va RNA ko­ja nas­

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

ta­je u in­fi­ci­ra­nim bak­te­ri­ja­ma pre­pi­sa­na je s DNA bak­te­rio­fa­ga T4. RNA bak­te­rio­fa­ga T4 do­la­zi u kon­ta­kt s bak­te­rij­skim ri­bo­so­mi­ma, te sto­ga pre­ no­si infor­ma­ci­ju s DNA na mjes­to sin­te­ze pro­tei­na. Zbog svo­je ulo­ge u pri­je­no­su ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je mo­le­ku­la RNA ko­ja slu­ži kao ka­lup za sin­ te­zu pro­tei­na naz­va­na je glas­nič­kom RNA (mR­NA, od en­gl. mes­sen­ger). Sin­te­zu RNA na os­no­vi DNA-ka­lu­pa ka­ta­li­zi­ra en­zim naz­van RNA-po­li­ me­ra­za. Osim mR­NA, za sin­te­zu pro­tei­na važ­na su i dva dru­ga ti­pa RNA – ri­ bo­som­ska RNA (rR­NA) ko­ja je sas­tav­ni dio ri­bo­so­ma i tran­spor­tna RNA (tR­NA) ko­ja dje­lu­je kao adap­tor ko­ji do­no­si ami­no­ki­se­li­ne na RNA-ka­lup. Os­no­ve struk­tu­re i fun­kci­je tih mo­le­ku­la opi­sa­ne su u nas­tav­ku ovo­ga pog­ lav­lja, a de­talj­ni­je su pri­ka­za­ne u pog­lav­lji­ma 7 i 8.

Ge­nski kod Na ko­ji se na­čin sli­jed nuk­leo­ti­da u RNA pre­vo­di u sli­jed ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­nu? U ovom ko­ra­ku ek­spre­si­je ge­na ge­ne­tič­ka se in­for­ma­ci­ja pre­ no­si s nuk­lein­skih ki­se­li­na na pro­tei­ne, mo­le­ku­le ko­je su ke­mij­ski ja­ko raz­li­či­te, što ot­va­ra dva no­va prob­le­ma za ra­zu­mi­je­va­nje dje­lo­va­nja ge­na. Bu­du­ći da ami­no­ki­se­li­ne ni­su struk­tur­no srod­ne du­ši­ko­vim ba­za­ma, iz­rav­no kom­ple­men­tar­no spa­ri­va­nje mR­NA i ami­no­ki­se­li­na ti­je­kom ugrad­ nje ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­ne ni­je se či­ni­lo vje­ro­jat­nim. Ka­ko je on­da mo­ gu­će da se ami­no­ki­se­li­ne sla­žu na mR­NA-ka­lup ti­je­kom sin­te­ze pro­tei­na? Ovaj prob­lem ri­je­šen je ot­kri­ćem tR­NA ko­je slu­že kao adap­to­ri iz­me­đu ami­no­ki­se­li­na i mR­NA ti­je­kom pre­vo­đe­nja ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je (sl. 4-10). Pri­je nje­zi­ne upo­ra­be u sin­te­zi pro­tei­na, sva­ka ami­no­ki­se­li­na se s po­mo­ću spe­ci­fič­nog en­zi­ma po­ve­zu­je s od­go­va­ra­ju­ćom tR­NA. U slje­de­ćem ko­ra­ku spa­ri­va­nje ba­za iz­me­đu pre­poz­na­va­ju­ćeg sli­je­da na mo­le­ku­li tR­NA i kom­ple­men­tar­nog sli­je­da na mR­NA us­mje­ra­va ami­no­ki­se­li­nu ve­za­nu na tR­NA na nje­zin to­čan po­lo­žaj na mR­NA-ka­lu­pu. Dru­gi prob­lem u pre­vo­đe­nju sli­je­da nuk­leo­ti­da u sli­jed ami­no­ki­se­li­na bio je od­re­đi­va­nje ge­ns­ko­ga ko­da. Na ko­ji je na­čin mo­gu­će in­for­ma­ci­ju sad­r­ža­nu u sli­je­du če­ti­ri­ju raz­li­či­tih nuk­leo­ti­da pre­ves­ti u sli­jed 20 raz­li­či­ tih ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­ni­ma? Bu­du­ći da je 20 raz­li­či­tih ami­no­ki­se­li­na pot­reb­no od­re­di­ti s po­mo­ću sve­ga če­ti­ri nuk­leo­ti­da, bi­lo je nuž­no da naj­ ma­nje tri nuk­leo­ti­da bu­du uk­lju­če­na u ko­di­ra­nje sva­ke ami­no­ki­se­li­ne. Ko­ riš­te­ni po­je­di­nač­no, če­ti­ri nuk­leo­ti­da mog­li bi ko­di­ra­ti sve­ga če­ti­ri ami­no­ ki­se­li­ne, a ko­riš­te­ni u pa­ro­vi­ma, sve­ga šes­nae­st (42) ami­no­ki­se­li­na. Ko­riš­te­ni u ob­li­ku trip­le­ta če­ti­ri nuk­leo­ti­da mo­gu ko­di­ra­ti 64 (43) raz­li­či­te ami­no­ki­se­li­ne, što je vi­še ne­go do­volj­no za 20 raz­li­či­tih ami­no­ki­se­li­na ko­je dois­ta iz­gra­đu­ju pro­tei­ne. Da je ge­ns­ki kod zais­ta or­ga­ni­zi­ran u trip­le­te pot­vr­đe­no je ek­spe­ri­men­ ti­ma pro­ve­de­nim na bak­te­rio­fa­gu T4 ko­ji je no­sio mu­ta­ci­je u in­ten­ziv­no prou­ča­va­nom ge­nu naz­va­nom rII. Fa­gi s mu­ta­ci­ja­ma u tom ge­nu tvo­re ja­ ko ve­li­ke pla­ko­ve ko­je je vr­lo la­ko raz­li­ko­va­ti od pla­ko­va ko­je tvo­re vi­ru­si div­ljeg ti­pa. Iden­ti­fi­ka­ci­ja i kar­ti­ra­nje mu­ta­ci­ja u ge­nu rII vr­lo je jed­nos­tav­ no pa je nap­rav­lje­na de­talj­na ge­ne­tič­ka kar­ta ovog lo­ku­sa. Is­pi­ti­va­nje re­ kom­bi­na­na­ta iz­me­đu rII mu­ta­na­ta ko­ji su nas­ta­li adi­ci­jom ili de­le­ci­jom nuk­leo­ti­da po­ka­za­lo je da adi­ci­ja ili de­le­ci­ja jed­no­ga ili dva­ju nuk­leo­ti­da Sli­ka 4-10. Fun­kci­ja tran­spor­tne RNA (tR­NA).  tR­NA dje­lu­je kao adap­tor u sin­te­zi pro­tei­na. Sva­ka ami­no­ki­se­li­na (prim­je­ri­ce his­ti­din) ve­že se na 3' kraj spe­ci­f ič­ne tR­NA s po­mo­ću od­go­va­ra­ju­ćeg en­zi­ma (ami­noa­ci­l-tR­NA-sin­te­ta­ze). »Na­bi­je­na« tR­NA ta­da se po­ve­zu­je s mo­le­ku­lom mR­NA ko­ja slu­ži kao ka­lup na os­no­vi kom­ple­men­tar­nog spa­ ri­va­nja ba­za.

   113

4.3. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU »Sre­diš­nja dog­ma«. Sre­diš­nja dog­ ma mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je, ka­ko ju je pr­vo pos­ta­vio Fran­cis Cri­ck, tvr­di da in­for­ma­ ci­ja te­če pr­vo od DNA na RNA, a za­tim od RNA do pro­tei­na.

114    POGLAVLJE 4 Sli­ka 4-11. Ge­ne­tič­ki do­kaz trip­let­no­ ga ko­da.  Se­ri­ja mu­ta­ci­ja ko­je se sas­to­je od adi­ci­je jed­no­ga, dva­ju ili tri­ju nuk­leo­ ti­da is­pi­ti­va­ne su u rII ge­nu bak­te­rio­fa­ga T4. Adi­ci­ja jed­no­ga ili dva­ju nuk­leo­ti­da mi­je­nja ok­vir či­ta­nja os­tat­ka ge­na, te su sto­ga sve slje­de­će ami­no­ki­se­li­ne pog­rje­ š­ne i da­ju ne­fun­kcio­nal­ni pro­tein ko­ji re­ zul­ti­ra mu­ti­ra­nim fe­no­ti­pom fa­ga. S dru­ ge stra­ne, adi­ci­ja tri­ju nuk­leo­ti­da mi­je­nja sa­mo jed­nu ami­no­ki­se­li­nu. Ok­vir či­ta­nja os­tat­ka ge­na je nor­ma­lan pa će i pro­tein što ga ko­di­ra taj gen bi­ti fun­kcio­na­lan, a fag će ima­ti nor­mal­ni fe­no­tip (div­lji tip fa­ga = WT).

4.4. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Mu­ta­ci­je u DNA. Mu­ta­ci­ja u sa­mo jed­nom pa­ru ba­za u ko­di­ra­ju­ćem di­je­lu ge­na mo­že, ovis­no o ti­pu mu­ta­ci­je, re­zul­ti­ra­ti ili pre­ ra­no zav­r­še­nim po­li­pep­ ti­dom, ili po­li­pep­ti­dom u ko­ji je ug­ra­đe­na pog­rješ­na ami­no­ki­ se­li­na.

Sli­ka 4-12. Trip­let UUU ko­di­ra fe­ni­la­la­ nin.  In vit­ro pre­vo­đe­nje sin­te­tič­ke RNA ko­ja se sas­to­ji od po­nav­lja­ju­ćih ura­ci­la (po­li-U ka­lup) re­zul­ti­ra sin­te­zom po­li­pep­ ti­da ko­ji se sas­to­ji sa­mo od fe­ni­la­la­ni­na.

uvi­jek re­zul­ti­ra mu­tan­tnim fe­no­ti­pom. Na­sup­rot to­mu, fa­gi ko­ji su ima­li de­le­ci­ju ili adi­ci­ju triju nuk­leo­ti­da čes­to bi zad­r­ža­li fun­kci­ju div­ljeg ti­pa (sl. 4-11). Ovo ot­kri­će su­ge­ri­ra­lo je da se ge­ni či­ta­ju od ne­ke fik­sne toč­ke u sku­pi­na­ma od po tri nuk­leo­ti­da. Adi­ci­ja ili de­le­ci­ja jed­no­ga ili dva­ju nu­ kleo­ti­da po­re­me­ti­la bi ok­vir či­ta­nja či­ta­vo­ga ge­na, što bi do­ve­lo do ug­rad­ nje pog­r­ješ­nih ami­no­ki­se­li­na či­ta­vom du­ži­nom ko­di­ra­nog pro­tei­na. Na­ sup­rot to­mu, adi­ci­ja ili de­le­ci­ja triju nuk­leo­ti­da re­zul­ti­ra­la bi sa­mo do­dat­kom ili gu­bit­kom jed­ne ami­no­ki­se­li­ne, dok bi os­ta­tak pro­tei­na bio nep­ro­mi­je­njen, a često bi i zad­r­žao pr­vo­bit­nu fun­kci­ju. Slje­de­ći ko­rak u ot­kri­va­nju ge­nsko­ga ko­da bio je prid­ru­ži­ti od­go­va­ra­ju­ ću ami­no­ki­se­li­nu sva­kom trip­le­tu nuk­leo­ti­da. Za rje­ša­va­nje ovog pro­ble­ma pri­mi­je­njen je sus­tav ko­ji je mo­gao sin­te­ti­zi­ra­ti pro­tei­ne in vit­ro (in vit­ro tran­sla­ci­ja). Ta­da je već bi­lo poz­na­to da ek­strak­ti sta­ni­ca, ko­ji sad­r­ža­va­ju ri­bo­so­me, ami­no­ki­se­li­ne, tR­NA i en­zi­me od­go­vor­ne za ve­za­nje ami­no­ki­se­ li­na na pri­pa­da­ju­će tR­NA (ami­noa­ci­l-tR­NA-sin­te­ta­ze), mo­gu ka­ta­li­zi­ra­ti ug­rad­nju ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­ne. Ta­kav na­čin sin­te­ze pro­tei­na ovi­si o pri­sut­nos­ti mR­NA ve­za­ne na ri­bo­so­me, a sa­mu je sin­te­zu mo­gu­će zna­čaj­ no po­ja­ča­ti do­dat­kom pro­čiš­će­ne mR­NA. Bu­du­ći da u tak­vom su­sta­vu do­ da­na stra­na mR­NA up­rav­lja sin­te­zom pro­tei­na, is­pi­ti­va­nje pre­vo­đe­nja sin­ te­tič­kih mR­NA poz­na­to­ga sli­je­da nuk­leo­ti­da omo­gu­ći­lo je de­ko­di­ra­nje ge­nsko­ga ko­da. Pr­vi ek­spe­ri­me­nt to­ga ti­pa pro­ve­li su Mar­sha­ll Ni­ren­be­rg i Hein­ri­ch Mat­thaei ko­ris­te­ći sin­te­tič­ki po­li­mer RNA ko­ji je sad­r­ža­vao sa­mo ura­cil kao ka­lup za in vit­ro sin­te­zu pro­tei­na (sl. 4-12). Ut­vr­di­li su da po­li-U ka­lup od­re­đu­je ug­rad­nju sa­mo jed­ne ami­no­ki­se­li­ne, fe­ni­la­la­ni­na, u po­li­pep­tid ko­ji se sas­to­ji od po­nav­lja­ju­ćih fe­ni­la­la­nin­skih os­ta­ta­ka. Slič­ni ek­spe­ri­men­ ti s RNA-po­li­me­ri­ma ko­ji su sad­r­ža­va­li sa­mo jed­nu vr­stu nuk­leo­ti­da po­ka­ za­li su da AAA ko­di­ra li­zin, a CCC ko­di­ra pro­lin. Os­ta­tak ge­ns­ko­ga ko­da de­ko­di­ran je ko­ris­te­ći po­li­me­re RNA ko­ji su sad­rž­ a­va­li smje­se nuk­leo­ti­da. Na taj na­čin de­šif­ri­ra­na su sva 64 trip­le­ta (ko­do­na) (ta­bl. 4-1). Od 64 ko­ do­na 61 ko­don od­re­đu­je ami­no­ki­se­li­ne, a preos­ta­la tri (UAA, UAG i UGA) pred­stav­lja­ju STOP ko­do­ne ko­ji sig­na­li­zi­ra­ju kraj sin­te­ze pro­tei­na. Ge­ns­ki kod je de­ge­ne­ri­ran što zna­či da su mno­ge ami­no­ki­se­li­ne od­re­đe­ne s vi­še no jed­nim ko­do­nom. Uz ne­ko­li­ko iz­ni­ma­ka (pri­ka­za­nih u 11. pog­lav­lju), svi se or­ga­niz­mi slu­že is­tim ge­nskim ko­dom što je čvr­st do­kaz da su se sve da­naš­nje sta­ni­ce raz­vi­le od is­to­ga za­jed­nič­kog pret­ka.

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE  Tab­li­ca 4-1. Genski kod Prvo mjes­to

U

C

A

G

U Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val

Dru­go mjes­to C Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala

A Tyr Tyr stop stop His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu

G Cys Cys stop Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly

   115

Tre­će mjes­to U C A G U C A G U C A G U C A G

RNA-vi­ru­si i ob­r­nu­to pre­pi­si­va­nje Nakon de­ko­di­ra­nja ge­ns­ko­ga ko­da či­ni­lo se da su te­melj­ni prin­ci­pi mo­ le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je pos­tav­lje­ni. U skla­du sa sre­diš­njom dog­mom, ge­ne­tič­ki ma­te­ri­jal sas­to­ji se od DNA ko­ja ima svoj­stvo sa­mo­rep­li­ka­ci­je i mo­gu­ćno­st pri­je­no­sa in­for­ma­ci­je (pre­pi­si­va­nja) na mo­le­ku­lu mR­NA, ko­ja on­da slu­ži kao ka­lup za sin­te­zu pro­tei­na. Ipak, kao što je već na­ve­de­no u pr­vom po­ glav­lju, mno­gi vi­ru­si kao ge­ne­tič­ki ma­te­ri­jal sad­r­ža­va­ju RNA umje­sto DNA što zah­ti­je­va ne­ki dru­gi ob­lik pri­je­no­sa ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je. RNA-ge­no­mi su is­pr­va ot­kri­ve­ni kod bilj­nih vi­ru­sa od ko­jih se mno­gi sas­to­je sa­mo od mo­le­ku­la RNA i pro­tei­na. Iz­rav­ni do­kaz da RNA obav­lja ulo­gu ge­ne­tič­kog ma­te­ri­ja­la tih vi­ru­sa pru­ži­li su ek­spe­ri­men­ti pro­ve­de­ni sre­di­nom 20. sto­lje­ća ko­ji su po­ka­za­li da pro­čiš­će­na RNA izo­li­ra­na iz vi­ru­ sa mo­zai­ka du­ha­na mo­že in­fi­ci­ra­ti no­ve sta­ni­ce do­ma­ći­na u ko­ji­ma on­da nas­ta­ju no­ve in­fek­tiv­ne vi­rus­ne čes­ti­ce. Na­čin rep­li­ka­ci­je ve­ći­ne vi­rus­nih RNA-ge­no­ma raz­jaš­njen je is­pi­ti­va­njem RNA bak­te­rio­fa­ga bak­te­ri­je E. co­li. Otkriveno je da ti vi­ru­si no­se in­for­ma­ci­ju za spe­ci­fič­ni en­zim ko­ji ka­ta­li­zi­ ra sin­te­zu mo­le­ku­le RNA na os­no­vi RNA-ka­lu­pa (RNA-up­rav­lja­na RNAsin­te­za) prim­je­nju­ju­ći is­ti prin­cip kom­ple­men­tar­nog spa­ri­va­nja ba­za ko­ji se ra­bi pri rep­li­ka­ci­ji DNA ili pre­pi­si­va­nju DNA u RNA. Ia­ko je ut­vr­đe­no da se ve­ći­na ži­vo­tinj­skih RNA-vi­ru­sa (prim­je­ri­ce po­lio vi­rus ili vi­rus in­fluen­ce) um­no­ža­va RNA-up­rav­lja­nom sin­te­zom RNA, ovaj me­ha­ni­zam ni­je mo­gao ob­jas­ni­ti um­no­ža­va­nje jed­ne po­ro­di­ce ži­vo­tinj­skih vi­ru­sa (RNA tu­mor­skih vi­ru­sa) ko­ji su bi­li po­se­bi­ce in­te­re­san­tni zbog svo­ je spo­sob­nos­ti da uz­ro­ku­ju tu­mo­re u in­fi­ci­ra­nih ži­vo­ti­nja. Ia­ko ovi vi­ru­si sad­r­ža­va­ju ge­nom­sku RNA, ek­spe­ri­men­ti ko­je je po­čet­kom 1960-ih go­di­na pro­veo Howa­rd Te­min po­ka­za­li su da za um­no­ža­va­nje vi­rus­nih čes­ti­ca mo­ra do­ći do sin­te­ze DNA u in­fi­ci­ra­nim sta­ni­ca­ma, što je do­ve­lo do pret­ pos­tav­ke da se RNA tu­mor­ski vi­ru­si (da­nas ih na­zi­va­mo ret­ro­vi­ru­si) um­ no­ža­va­ju sin­te­zom DNA-pos­red­ni­ka ko­ji na­zi­va­mo DNA-pro­vi­rus (sl. 4-13). Ova je pret­pos­tav­ka u po­čet­ku nai­la­zi­la na ve­li­ki ot­por znan­stve­ni­

4.5. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Rep­ro­duk­ci­ja HIV vi­ru­sa. U di­je­ lu svog cik­lu­sa rep­ro­duk­ci­je unu­tar sta­ni­ce do­ma­ći­na ret­ro­vi­rus ko­ris­ti en­zim re­ver­znu tran­skrip­ta­zu ka­ko bi svoj RNA-ge­ nom pre­veo u DNA.

116    POGLAVLJE 4

KL JUČNI POKUS

Pretpostavka DNA provirusa Nature of the Provirus of Rous Sarcoma

Howard M. Temin McAr­dle La­bo­ra­to­ry, Uni­ver­si­ty of Wis­con­sin, Ma­di­son, WI Na­tio­nal Can­cer In­sti­tu­te Mo­nog­rap­hs, vol. 17, 1964, str. 557–570

Kon­tek­st Rou­sov sar­kom­ski vi­rus (RSV) pr­vi je opi­sa­ni vi­rus ko­ji mo­že uz­ro­ko­va­ti tu­ mo­re, te je pos­lu­žio kao ek­spe­ri­men­ tal­ni mo­del za is­tra­ži­va­nje mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je tu­mo­ra. Howa­rd Te­min uk­lju­ čio se u is­tra­ži­va­nje ovog pod­ruč­ja kad je kao pos­li­je­dip­lo­ma­nd 1958. go­di­ne raz­vio me­to­du tran­sfor­ma­ci­je nor­mal­ nih sta­ni­ca u kul­tu­ri u tu­mor­ske s po­ mo­­ću in­fek­ci­je Rou­so­vim sar­kom­skim vi­ru­som. Uvo­đe­nje ove kvan­ti­ta­tiv­ne in vit­ro me­to­de omo­gu­ći­lo je dalj­nja is­tra­ži­va­nja tran­sfor­ma­ci­je sta­ni­ca i um­ na­­ža­nja vi­ru­sa. Pro­vo­de­ći spo­me­nu­te ekspe­ri­men­te, Te­min je do­šao do se­ri­je neo­če­ki­va­nih opa­ža­nja ko­ja su upu­ći­ va­la na to da je rep­li­ka­ci­ja RSV vi­ru­sa ba­zič­no raz­li­či­ta od rep­li­ka­ci­je os­ta­lih RNA-vi­ru­sa. Te­min je pret­pos­ta­vio da se RNA vi­ru­sa pre­pi­su­je u DNA u in­fi­ci­ ra­nim sta­ni­ca­ma što se u to vri­je­me iz­ rav­no su­kob­lja­va­lo s op­ćeprih­va­će­nom sre­diš­njom dog­mom mo­le­ku­lar­ne bio­ lo­gi­je (pret­pos­tav­ka DNA-pro­vi­ru­sa).

Ek­spe­ri­men­ti Pret­pos­tav­ka DNA-pro­vi­ru­sa zas­no­va­na je na ne­ko­li­ko raz­li­či­tih ti­po­va ek­spe­

ri­men­tal­nih do­ka­za. Is­pi­ti­va­nja sta­ni­ca in­fi­ci­ra­nih mu­ti­ra­nim RSV po­ka­za­la su da su ne­ka svoj­stva tih sta­ni­ca od­re­ đe­na ge­ne­tič­kom in­for­ma­ci­jom vi­ru­sa. Ova se in­for­ma­ci­ja uvi­jek pre­no­si­la na sta­ni­ce kće­ri na­kon dio­be sta­ni­ca, čak i uko­li­ko ni­je do­la­zi­lo do um­no­ža­va­nja vi­ru­sa. Na os­no­vi to­ga opa­ža­nja Te­min je zak­lju­čio da vi­rus­ni ge­nom pos­to­ ji u sta­ni­ca­ma u sta­bil­nom ob­li­ku ko­ji je mo­gu­će nas­li­je­di­ti, te ga je naz­vao pro­vi­ru­som. Do­ka­zi da je pro­vi­rus zais­ta DNA iz­ve­ de­ni su iz ek­spe­ri­me­na­ta ko­ji su ko­ris­ti­ li me­ta­bo­lič­ke in­hi­bi­to­re. Pro­na­đe­no je da ak­ti­no­mi­cin D, ko­ji in­hi­bi­ra sin­te­zu RNA na os­no­vi DNA-ka­lu­pa, one­mo­ gu­­ću­je proiz­vod­nju vi­ru­sa u sta­ni­ca­ ma in­fi­ci­ra­nim RSV (vi­di sli­ku). S dru­ge stra­ne, in­hi­bi­to­ri sin­te­ze DNA blo­ki­ra­li su ra­ne sta­di­je in­fek­ci­je sta­ni­ce vi­ru­ som. Či­ni­lo se da je u ra­nim sta­di­ji­ma in­fek­ci­je pot­reb­na sin­te­za DNA, a da je DNA-up­rav­lja­na sin­te­za RNA pot­re­bna u kas­ni­jim sta­di­ji­ma za proiz­vod­nju no­vih vi­rus­nih čes­ti­ca. Na te­me­lju ovih opa­ža­nja pret­pos­ta­vi­lo se da je pro­vi­ rus DNA-ko­pi­ja vi­ral­no­ga RNA-ge­no­ma.

Howard M. Temin

Te­min je po­ku­šao do­dat­no do­ka­za­ti ovu pret­pos­tav­ku ko­ris­te­ći hib­ri­di­za­ci­ju nuk­lein­skih ki­se­li­na za de­tek­ci­ju vi­rus­ nih sli­je­do­va u DNA in­fi­ci­ra­nih sta­ni­ca. Ipak, os­jet­lji­vo­st teh­ni­ka ko­je su mu bi­ le na ras­po­la­ga­nju ni­je bi­la dos­tat­na i re­zul­ta­ti ni­su bi­li uv­jer­lji­vi.

Ut­je­caj Te­mi­no­va pret­pos­tav­ka da se RSV umno­ža­va pri­je­no­som in­for­ma­ci­je s RNA na DNA u os­no­vi je pred­lo­že­na na te­me­lju ge­ne­tič­kih ek­spe­ri­me­na­ ta i uči­na­ka me­ta­bo­lič­kih in­hi­bi­to­ra, a ko­si­la se s op­ćep­rih­va­će­nom sre­diš­ njom dog­mom mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je. U tom kon­tek­stu, ne sa­mo da ni­je bi­ la pri­hva­će­na u znan­stve­noj za­jed­ni­ci, već je bi­la iz­lo­že­na op­ćem od­bi­ja­nju, go­to­vo pod­smi­je­hu. Te­min je ipak us­ tra­jao i ti­je­kom 1960-ih nas­ta­vio pri­ kup­lja­ti eks­pe­ri­men­tal­ne do­ka­ze ko­ji bi pot­kri­je­pi­li nje­go­vu pret­pos­tav­ku. Ti su na­po­ri kul­mi­ni­ra­li 1970. go­di­ne kad su Te­min i Sa­tos­hi Mi­zu­ta­ni (u is­to vri­

ka jer je uk­lju­či­va­la RNA-up­rav­lja­nu sin­te­zu DNA što se pro­ti­vi­lo sre­diš­ njoj dog­mi. Go­di­ne 1970. su Howa­rd Te­min i Da­vid Bal­ti­mo­re neo­vis­no je­dan o dru­go­me ot­kri­li da ret­ro­vi­ru­si sad­rž­ a­va­ju do­sad ne­poz­na­ti en­zim ko­ji ka­ta­li­zi­ra sin­te­zu DNA na os­no­vi RNA-ka­lu­pa, a do­bi­ve­ni su i jas­ni do­ka­zi pri­sut­nos­ti vi­rus­ne DNA u in­fi­ci­ra­nim sta­ni­ca­ma. S ovim je ot­kri­ ći­ma sin­te­za DNA na os­no­vi RNA-ka­lu­pa, ko­ju da­nas na­zi­va­mo ob­r­nu­to pre­pi­si­va­nje (reverzna tran­skrip­ci­ja) prih­va­će­na kao ob­lik pri­je­no­sa ge­ne­ tič­ke in­for­ma­ci­je u bio­loš­kim sus­ta­vi­ma. Ob­r­nu­to pre­pi­si­va­nje je važ­no ne sa­mo kao me­ha­ni­zam um­no­ža­va­nja ret­ro­vi­ru­sa, već i u još naj­ma­nje dva dru­ga ši­ro­ka pod­ruč­ja mo­le­ku­lar­ne i sta­nič­ne bio­lo­gi­je. Ob­r­nu­to pre­pi­si­va­nje ni­je og­ra­ni­če­no sa­mo na ret­ro­vi­ ru­se. Od­vi­ja se i u sta­ni­ca­ma i kao što je pri­ka­za­no u pog­lav­lji­ma 5 i 6, čes­to je od­go­vor­no za prem­ješ­ta­nje (tran­spo­zi­ci­ju) sli­je­da nuk­leo­ti­da s jed­

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   117

KL JUČNI POKUS je­me kad i Da­vid Bal­ti­mo­re) ot­kri­li vi­rus­ni en­zim, da­nas poz­nat kao re­ ver­zna tran­skrip­ta­za, ko­ji sin­te­ti­zi­ra DNA na os­no­vi RNA-ka­lu­pa. To je bio ned­voj­be­ni bio­ke­mij­ski do­kaz da je ti­jek ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je mo­gu­će i ob­r­nu­ti i da sre­diš­nju dog­mu tre­ba mo­di­fi­ci­ra­ti. U svom ra­du ob­jav­lje­nom 1970. go­ di­ne Te­min je zak­lju­čio da nje­go­vi

Učinak aktinomicina D na replikaciju RSV. Stanice inficirane RSV uzgajane su u kulturi u prisutnosti navedenih koncentraci­ ja aktinomicina tijekom 8 sati nakon čega je aktinomicin D uklonjen te je analizirana količina nastalog virusa.

re­zul­ta­ti »pred­stav­lja­ju sna­žan do­kaz da je pret­pos­tav­ka DNA-pro­vi­ru­sa toč­ na i da RNA tu­mor­ski vi­ru­si ima­ju DNAge­nom kad su u sta­ni­ca­ma, a RNA-ge­ nom kad su u vi­rus­nim čes­ti­ca­ma. Ovaj re­zul­tat imao bi zna­čaj­ne im­pli­ka­ci­je na teo­ri­ju vi­rus­ne kan­ce­ro­ge­ne­ze, a mož­da i na teo­ri­je pri­je­no­sa in­for­ma­ ci­je u dru­gim bio­loš­kim sus­ta­vi­ma«. Kao što je Te­min i pred­vi­dio, ot­kri­će RNA-up­rav­lja­ne sin­te­ze DNA do­ve­lo je do zna­čaj­no­ga nap­ret­ka na­šeg ra­zu­mi­ je­va­nja tu­mo­ra, hu­ma­nih ret­ro­vi­ru­sa i preu­re­đi­va­nja ge­na. En­zim re­ver­zna tran­skrip­ta­za omo­gu­ćio je klo­ni­ra­nje cDNA, te je sto­ga imao uči­nak na prak­ tič­no sva pod­ruč­ja suv­re­me­ne sta­nič­ne i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je.

no­ga na ne­ko dru­go mjes­to u DNA nji­ho­vih kro­mo­so­ma. Što­vi­še, sek­ven­ ci­ra­nje ge­no­ma čov­je­ka po­ka­za­lo je da je prib­liž­no 40% ge­nom­ske DNA čov­je­ka nas­ta­lo ob­r­nu­tim pre­pi­si­va­njem. S dru­ge stra­ne, en­zi­mi ko­ji ka­ta­ li­zi­ra­ju RNA-up­rav­lja­nu sin­te­zu DNA (re­ver­zne tran­skrip­ta­ze) mo­gu bi­ti upo­rab­lje­ni za sin­te­zu DNA-ko­pi­ja bi­lo ko­je mo­le­ku­le RNA u ek­spe­ri­men­ tal­nim sus­ta­vi­ma. Prim­je­na re­ver­zne tran­skrip­ta­ze omo­gu­ći­la je is­pi­ti­va­nje eu­ka­riot­ske mR­NA me­to­da­ma ko­je se ko­ris­te za ma­ni­pu­li­ra­nje mo­le­ku­la­ ma DNA, a ko­je su opi­sa­ne u nas­tav­ku ovog pog­lav­lja.

Sli­ka 4-13. Ob­r­nu­to pre­pi­si­va­nje i re­ p­li­ka­ci­ja ret­ro­vi­ru­sa.  Ret­ro­vi­ru­si sa­ drža­va­ju RNA-ge­no­me u svo­jim vi­rus­nim čes­ti­ca­ma. Ti­je­kom in­fek­ci­je sta­ni­ce do­ ma­ći­na ret­ro­vi­rus sin­te­ti­zi­ra DNA-ko­pi­ju svo­ga RNA-ge­no­ma s po­mo­ću en­zi­ma re­ver­zne tran­skrip­ta­ze. Vi­rus­na DNA ta­ da se ug­ra­đu­je u kro­mo­som­sku DNA do­ ma­ći­na i tvo­ri DNA-pro­vi­rus ko­ji se pre­ pi­su­je ka­ko bi stvo­rio RNA pot­reb­nu za nas­ta­nak no­vih vi­rus­nih čes­ti­ca.

118    POGLAVLJE 4

Re­kom­bi­nan­tna DNA Klasični ek­spe­ri­men­ti u mo­le­ku­lar­noj bio­lo­gi­ji zna­čaj­no su unap­ri­je­di­li na­še te­melj­no ra­zu­mi­je­va­nje pri­ro­de i ek­spre­si­je ge­na. Bu­du­ći da su ta is­ tra­ži­va­nja bi­la zas­no­va­na pog­la­vi­to na ge­ne­tič­kim ana­li­za­ma, nji­hov je us­ pjeh u zna­čaj­noj mje­ri ovi­sio o ko­riš­te­nju jed­nos­tav­nih or­ga­ni­za­ma ko­ji se br­zo raz­mno­ža­va­ju (kao što su prim­je­ri­ce bak­te­ri­je i vi­ru­si). Ka­ko su ge­no­ mi ve­ći­ne eu­ka­rio­ta (prim­je­ri­ce ge­nom čov­je­ka) i do ti­su­ću pu­ta slo­že­ni­ji od ge­no­ma bak­te­ri­je E. co­li, ni­je bi­lo jas­no ka­ko bi se ti te­melj­ni prin­ci­pi pri­mi­je­ni­li i na vi­še or­ga­niz­me. Po­čet­kom 1970-ih mo­guć­no­st is­tra­ži­va­nja slo­že­nih ge­no­ma na mo­le­ku­lar­noj ra­zi­ni ni­je dje­lo­va­la obe­ća­va­ju­će. Po­se­ bi­ce se či­ni­lo da ne­ma na­či­na na ko­ji bi bi­lo mo­gu­će izo­li­ra­ti i is­pi­ti­va­ti po­je­di­nač­ne ge­ne. Ovu prep­re­ku nap­ret­ku mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je sav­la­dao je raz­voj teh­no­ lo­gi­je re­kom­bi­nan­tne DNA ko­ja je znan­stve­ni­ci­ma pru­ži­la mo­guć­no­st da izo­li­ra­ju, sek­ven­ci­ra­ju i ma­ni­pu­li­ra­ju ge­ni­ma izo­li­ra­nim iz bi­lo ko­jeg ti­pa sta­ni­ca, pa i onih slo­že­nih or­ga­ni­za­ma. Prim­je­na teh­no­lo­gi­je re­kom­bi­nan­ tne DNA omo­gu­ći­la je de­talj­na mo­le­ku­lar­na is­pi­ti­va­nja struk­tu­re i fun­kci­ je eu­ka­riot­skih ge­na i ge­no­ma te je na taj na­čin pro­du­bi­la na­še ra­zu­mi­je­ va­nje sta­nič­ne bio­lo­gi­je.

Res­trik­cij­ske en­do­nuk­lea­ze 4.6. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Res­trik­cij­ske en­do­nuk­lea­ze. Res­ trik­cij­ske en­do­nuk­lea­ze ki­ da­ju DNA na spe­ci­fič­nim mjes­ti­ma os­tav­lja­ju­ći ljep­lji­ve ili tu­pe kra­ je­ve na po­ki­da­nim frag­men­ti­ma DNA.

▶▶ Zaš­to bak­te­ri­je res­trik­cij­skim en­do­nuk­lea­za­ma ne raz­gra­đu­ju vla­s­ti­tu DNA? Res­trik­cij­ske en­ do­­nukleaze ne dje­lu­ju sa­me u bak­te­ri­ja­ma, već su po­ve­za­ne s en­zi­mi­ma ko­ji DNA mo­di­fi­ci­ra­ju na na­čin da je res­trik­cij­ske en­ do­nuk­lea­ze vi­še ne pre­poz­na­ju. Ovaj sus­tav res­trik­ci­je i mo­di­fi­ ka­ci­je osi­gu­ra­va da sa­mo ne­mo­ di­fic­ i­ra­na stra­na DNA (prim­je­ri­ce vi­rus­na DNA) bu­de raz­gra­đe­na re­s­trik­cij­skim en­do­nuk­lea­za­ma ko­je ima ne­ka od­re­đe­na vr­sta bak­te­ri­ja.

Prvi ko­rak u raz­vo­ju teh­no­lo­gi­je re­kom­bi­nan­tne DNA bi­la je ka­rak­te­ri­ za­ci­ja res­trik­cij­ski­h en­do­nuk­lea­za, en­zi­ma ko­ji ki­da­ju DNA na spe­ci­fi­ čnim re­dos­li­je­di­ma. Ovi en­zi­mi ot­kri­ve­ni su u bak­te­ri­ja gdje vje­ro­jat­no slu­že kao ob­ram­be­ni me­ha­ni­zam pro­tiv ulas­ka stra­ne DNA (prim­je­ri­ce vi­ rus­ne) u sta­ni­cu. Bak­te­ri­je ima­ju ve­lik broj raz­li­či­tih res­trik­cij­ski­h en­do­ nuk­lea­za ko­je ki­da­ju DNA na vi­še od sto­ti­nu spe­ci­fič­nih mjes­ta pre­poz­na­ va­nja, a sva­ko od tih mjes­ta sas­to­ji se od spe­ci­fič­nog sli­je­da od če­ti­ri do osam pa­ro­va ba­za (prim­je­ri su na­ve­de­ni u tab­l. 4-2). Bu­du­ći da res­trik­cij­ske en­do­nuk­lea­ze raz­gra­đu­ju DNA u spe­ci­fič­nim re­dos­li­je­di­ma, mo­gu­će ih je pri­mi­je­ni­ti za ki­da­nje mo­le­ku­le DNA na je­din­ stve­nim mjes­ti­ma. Prim­je­ri­ce res­trik­cij­ska en­do­nuk­lea­za EcoRI pre­poz­na­je sli­jed od še­st pa­ro­va ba­za GAATTC. Ova­kav sli­jed nuk­leo­ti­da pri­su­tan je Tab­li­ca 4-2. Mjes­ta pre­poz­na­va­nja ne­kih res­trik­cij­ski­h en­do­nuk­lea­za Enzimia Iz­vor Mjes­to pre­poz­na­va­njab BamHI Ba­cil­lus amylo­lique­fa­cie­ns H GGATCC EcoRI Es­che­ric­hia co­li RY13 GAATTC HaeIII Hae­mop­hi­lus ae­gyptius GGCC HindIII Hae­mop­hi­lus in­f luen­zae Rd AAGCTT HpaI Hae­mop­hi­lus pa­rain­f luen­zae GTTAAC HpaII Hae­mop­hi­lus pa­rain­f luen­zae CCGG MboI Mo­raxel­la bo­vis GATC NotI No­car­dia oti­ti­di­s-ca­via­rum GCGGCCGC SfiI Strep­to­myces fim­bria­tus GGCCNNNNNGGCC TaqI Ther­mus aqua­ti­cus TCGA Ime­na res­trik­cij­skih en­zi­ma iz­vo­de se iz ime­na or­ga­niz­ma iz ko­jih su izo­li­ra­ni i red­no­ga bro­ja ko­ji omo­gu­ću­je raz­li­ko­va­nje raz­li­či­tih en­zi­ma izo­li­ra­nih iz is­tog or­ga­niz­ma (prim­je­ri­ce HpaI i HpaII – dva­ju raz­li­či­tih en­zi­ma izo­li­ra­nih iz bak­te­ri­je Hae­mop­hi­lus pa­rain­f luen­zae). b Mjes­ta pre­poz­na­va­nja pri­ka­za­na su sa­mo kao sli­jed nuk­leo­ti­da jed­no­ga lan­ca dvo­lan­ča­ne DNA. »N« pred­stav­lja bi­lo ko­ju ba­zu. a

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   119

Sli­ka 4-14. Raz­grad­nja DNA en­zi­mom EcoRI i ge­l-e­lek­tro­fo­re­za.  Enzim EcoRI ki­da DNA na pet mjes­ta (str­je­li­ce) či­me nas­ta­je še­st frag­me­na­ta. Ti se frag­men­ti raz­dva­ja­ju elek­tro­fo­re­zom u aga­roz­nom ge­lu. Frag­men­ti DNA pu­tu­ju pre­ma po­ zi­tiv­noj elek­tro­di s tim da se ma­nji frag­ men­ti kre­ću br­že, a ve­ći spo­ri­je. Na­kon elek­tro­fo­re­ze, DNA se bo­ji fluo­res­cen­ tnom bo­jom i fo­tog­ra­f i­ra. Pri­ka­za­na je ve­ li­či­na frag­me­na­ta DNA.

na pet mjes­ta u DNA bak­te­rio­fa­ga, te sto­ga EcoRI raz­gra­đu­je DNA u še­st frag­me­na­ta du­lji­ne od 3,6 do 21,2 ki­lo­ba­ze (1 kb = 1.000 pa­ro­va ba­za) (sl. 4-14). Ti frag­men­ti mo­gu bi­ti raz­ dvo­je­ni pre­ma ve­li­či­ni ge­l-e­lek­tro­fo­re­zom, me­to­dom ko­ja raz­dva­ja mo­le­ku­le na os­no­vi raz­li­ka u br­zi­ni ko­jom pu­tu­ju u elek­trič­nom po­lju. Gel, ko­ji je naj­češ­će na­či­njen od aga­ro­ze ili po­liak­ri­la­mi­da, smješ­ta se iz­me­đu dva­ju re­zer­voa­ra s pu­fe­ rom u ko­ji­ma se na­la­ze elek­tro­de. Za­tim se uzo­rak (prim­je­ri­ ce smje­sa frag­me­na­ta DNA ko­je tre­ba ana­li­zi­ra­ti) pi­pe­tom uno­si u pret­hod­no nap­rav­lje­ne bu­na­ri­će u ge­lu i uk­lju­ču­je se elek­trič­no po­lje. Nuk­lein­ske ki­se­li­ne su ne­ga­tiv­no na­bi­je­ne (zbog fos­fa­ta u nji­ho­vim okos­ni­ca­ma) te sto­ga pu­tu­ju pre­ma po­zi­tiv­noj elek­tro­di (ano­di). Gel dje­lu­je kao si­to ko­je se­lek­ tiv­no us­po­ra­va ve­će mo­le­ku­le. Ma­nje mo­le­ku­le se sto­ga kroz gel kre­ću br­že što omo­gu­ću­je da se mo­le­ku­le u smje­si raz­ dvo­je na os­no­vi raz­li­ka u ve­li­či­ni. Raz­li­či­tim me­to­da­ma mo­gu­će je ut­vr­di­ti re­dos­li­jed res­ trik­cij­skih frag­me­na­ta i do­bi­ti (prim­je­ri­ce) kar­tu EcoRI res­ trik­cij­skih mjes­ta u DNA fa­ga. Ut­vr­đe­ni po­lo­ža­ji res­trik­cij­ skih mjes­ta za broj­ne raz­li­či­te res­trik­cij­ske en­do­nuk­lea­ze mo­gu se is­ko­ris­ti­ti za stva­ra­nje de­talj­nih res­trik­cij­skih ka­ra­ta molekula DNA kao što su prim­je­ri­ce ge­no­mi vi­ru­sa (sl. 4-15). Osim to­ga, na­kon elek­tro­fo­re­ze mo­gu­će je izo­li­ra­ti po­je­di­ne frag­men­te nas­ta­le raz­grad­njom res­trik­cij­ski­m en­do­nuk­lea­za­ma što omo­gu­ću­je nji­ho­vo de­talj­no is­pi­ti­va­nje, prim­je­ri­ce od­re­đi­va­nje sli­je­da nuk­leo­ti­da u mo­le­ku­li DNA. Na taj je na­čin ka­rak­te­ri­zi­ra­na DNA broj­nih vi­ru­sa. Sa­ma raz­grad­nja res­trik­cij­ski­m en­do­nuk­lea­za­ma me­đu­tim ne­ma do­ volj­no raz­lu­či­va­nje za ana­li­zu ve­ćih mo­le­ku­la DNA, kao što su prim­je­ri­ce sta­nič­ni ge­no­mi. Res­trik­cij­ska en­do­nuk­lea­za s mjes­tom pre­poz­na­va­nja od še­st pa­ro­va ba­za (kao što je prim­je­ri­ce EcoRI) sta­tis­tič­ki će gle­da­no pre­ poz­na­ti jed­no mjes­to sva­kih 4.096 pa­ro­va ba­za (1/46). Sto­ga se mo­že oče­ ki­va­ti da će raz­grad­njom mo­le­ku­le ve­li­či­ne DNA (48,5 kb) nas­ta­ti oko de­ set EcoRI frag­me­na­ta što je u skla­du s re­zul­ta­tom pri­ka­za­nim na sli­ci 4-14.

Sli­ka 4-15. Res­trik­cij­ske kar­te DNA bak­ te­rio­fa­ga i ade­no­vi­ru­sa.  Po­lo­žaj mje­s­ta ki­da­nja DNA bak­te­rio­fa­ga E. co­li (48,5 kb) i hu­ma­nog ade­no­vi­ru­sa 2 (35,9 kb) en­zi­mi­ ma BamHI, EcoRI i Hi­ndIII.

120    POGLAVLJE 4 Me­đu­tim raz­grad­nja ve­ćih ge­no­ma res­trik­cij­ski­m en­do­nuk­lea­za­ma da­je zna­čaj­no dru­ga­či­je re­zul­ta­te. Prim­je­ri­ce ge­nom čov­je­ka sas­to­ji se od pri­ bliž­no 3 × 106 kb i sto­ga se mo­že oče­ki­va­ti da će­mo res­trik­cij­skom raz­grad­ njom do­bi­ti vi­še od 500.000 EcoRI frag­me­na­ta. Ta­ko ve­lik broj frag­me­na­ta ni­je mo­gu­će raz­dvo­ji­ti, te aga­roz­na ge­l-e­lek­tro­fo­re­za ge­no­ma čov­je­ka raz­ gra­đe­nog res­trik­cij­skom en­do­nuk­lea­zom EcoRI um­jes­to raz­dvo­je­nih frag­ me­na­ta da­je sa­mo kon­ti­nui­ra­ni raz­maz DNA. Ka­ko ni­je mo­gu­će izo­li­ra­ti po­je­di­ne res­trik­cij­ske frag­men­te iz tak­ve smje­se, sa­ma raz­grad­nja res­trik­ cij­skim nuk­lea­za­ma ni­je od­go­va­ra­ju­ća me­to­da za prip­ra­vu ho­mo­ge­nog uzor­ka DNA za dalj­nju ana­li­zu. Ve­li­ku ko­li­či­nu pro­čiš­će­nih frag­me­na­ta DNA mo­gu­će je prip­ra­vi­ti mo­le­ku­lar­nim klo­ni­ra­njem. 4.7. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Re­kom­bi­nan­tne mo­le­ku­le DNA. Os­nov­na stra­te­gi­ja mo­le­kul­arnog klo­ni­ra­nja je ug­ra­di­ti frag­me­nt DNA ko­ji nas za­ni­ma u mo­ le­ku­lu DNA (na­zi­va­mo je vek­tor) ko­ja se mo­že sa­mos­tal­no rep­li­ci­ra­ti u sta­ni­ci do­ma­ći­nu.

Proiz­vod­nja re­kom­bi­nan­tnih mo­le­ku­la DNA

Temeljna je stra­te­gi­ja mo­le­ku­lar­no­ga klo­ni­ra­nja uni­je­ti frag­me­nt DNA ko­ji nas za­ni­ma (prim­je­ri­ce ko­ma­dić DNA čov­je­ka) u ne­ku dru­gu mo­le­ku­ lu DNA (zo­ve­mo je vek­tor) ko­ja se mo­že sa­mos­tal­no um­na­ža­ti u sta­ni­ci do­ma­ći­nu. Ta­ko nas­ta­la hib­rid­na (re­kom­bi­nan­tna) mo­le­ku­la ili mo­le­ku­ lar­ni klon sas­to­ji se od ug­ra­đe­no­ga že­lje­nog frag­men­ta DNA po­ve­za­no­ga s DNA vek­to­ra. Omo­gu­ći­mo li tak­vom vek­to­ru da se um­no­ži u od­go­va­ra­ ju­ćem do­ma­ći­nu do­bit će­mo ve­lik broj ko­pi­ja ug­ra­đe­no­ga frag­men­ta DNA. Prim­je­ri­ce frag­me­nt DNA čov­je­ka mo­gu­će je ug­ra­di­ti u vek­tor (sl. 4-16). Tak­ve re­kom­bi­nan­tne mo­le­ku­le ta­da je mo­gu­će uni­je­ti u bak­te­ri­ju E. co­li gdje se one učin­ko­vi­to raz­mno­ža­va­ju, a mi­li­ju­ni no­vih bak­te­rio­fa­ga sad­r­ ža­vat će mi­li­ju­ne ko­pi­ja ug­ra­đe­no­ga že­lje­nog frag­men­ta hu­ma­ne DNA. Dok naš že­lje­ni frag­me­nt pred­stav­lja mož­da jed­nu sto­ti­su­ćin­ku ge­no­ma čov­je­ka, na­kon ug­rad­nje u vek­tor on či­ni prib­liž­no jed­nu de­se­ti­nu DNA vek­to­ra. Taj je frag­me­nt sa­da la­ko raz­dvo­ji­ti od os­tat­ka DNA vek­to­ra raz­ grad­njom res­trik­cij­skim en­do­nuk­lea­za­ma i ge­l-e­lek­tro­fo­re­zom. Re­zul­tat je ve­lik broj ko­pi­ja ho­mo­ge­no­ga pro­čiš­će­nog frag­men­ta hu­ma­ne DNA ko­ji mo­že­mo ana­li­zi­ra­ti i nji­me da­lje ru­ko­va­ti. Frag­men­te DNA ko­ji­ma se ko­ris­ti­mo za stva­ra­nje re­kom­bi­nan­tnih mo­ le­ku­la obič­no prip­rav­lja­mo raz­grad­njom res­trik­cij­skim en­do­nuk­lea­za­ma. Mno­gi od tih en­zi­ma ki­da­ju u mjes­tu pre­poz­na­va­nja ta­ko da os­tav­lja­ju na­ zub­lje­ne (ljep­lji­ve) kra­je­ve jed­no­lan­ča­ne DNA ko­ji se me­đu­sob­no mo­gu po­ve­za­ti kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem ba­za (sl. 4-17). Ve­zu iz­me­đu tih kra­je­va po­ve­za­nih kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem ba­za mo­gu­će je učvr­sti­ ti tret­ma­nom s DNA-li­ga­zom, en­zi­mom ko­ji zat­va­ra pre­ki­de u lan­ci­ma DNA (v. pog­l. 6). Na taj je na­čin mo­gu­će u re­kom­bi­nan­tnu mo­le­ku­lu DNA po­ve­za­ti dva raz­li­či­ta frag­men­ta DNA (prim­je­ri­ce frag­me­nt DNA čov­je­ka i DNA vek­to­ra) prip­rav­lje­na raz­grad­njom s po­mo­ću is­te res­trik­cij­ske en­ do­nuk­lea­ze. Frag­men­ti DNA ko­je mo­že­mo klo­ni­ra­ti ne mo­ra­ju nuž­no zav­r­ša­va­ti od­go­va­ra­ju­ćim sli­je­dom nuk­leo­ti­da ko­ji pre­poz­na­ju res­trik­cij­ske en­do­nuk­ lea­ze. Nai­me, na tu­pe kra­je­ve bi­lo ko­jeg frag­men­ta DNA mo­gu­će je do­da­ ti sin­te­tič­ke DNA-spoj­ni­ce ko­je sad­r­ža­va­ju mjes­ta pre­poz­na­va­nja za ve­lik broj raz­li­či­tih res­trik­cij­skih en­do­nuk­lea­za. Te su spoj­ni­ce krat­ki oli­go­nuk­ leo­ti­di ko­je je la­ko prip­ra­vi­ti ke­mij­skom sin­te­zom, a omo­gu­ću­ju da se prak­tič­no bi­lo ko­ji frag­me­nt DNA prip­re­mi za ug­rad­nju u vek­tor.

Sli­ka 4-16. Proiz­vod­nja re­kom­bi­nan­tnih mo­le­ku­la DNA.  Frag­me­nt hu­ma­ne DNA ug­ra­đen je u DNA vek­to­ra. Tak­va re­kom­bi­nan­tna mo­le­ku­la za­tim se uno­si u E. coli gdje se um­no­ža­va i stva­ra re­kom­bi­nan­tno po­tom­stvo bak­te­rio­fa­ga ko­je sad­r­ža­va umet­nu­ti frag­me­nt hu­ma­ne DNA.

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   121

Sli­ka 4-17. Po­ve­zi­va­nje mo­le­ku­la DNA.  Vek­tor i frag­me­nt DNA ko­ji tre­ba ug­ra­ di­ti raz­gra­đu­ju se is­tom res­trik­cij­sko­m en­do­nuk­lea­zom (prim­je­ri­ce EcoRI) ko­ja ki­da DNA os­tav­lja­ju­ći pro­du­že­ne jed­no­ lan­ča­ne ljep­lji­ve kra­je­ve. DNA vek­to­ra i frag­men­ta ko­ji se ug­ra­đu­je pr­vo se po­ ve­zu­ju kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem ba­za, a za­tim dje­lo­va­njem DNA-li­ga­ze nas­ta­ju ko­va­len­tne ve­ze ko­je sta­bi­li­zi­ra­ju re­kom­bi­nan­tnu mo­le­ku­lu.

Osim mo­le­ku­la DNA mo­gu­će je klo­ni­ra­ti i mo­le­ku­le RNA (sl. 4-18). Pr­vi je ko­rak u tom pro­ce­su prip­ra­vi­ti DNA-ko­pi­ju mo­le­ku­le RNA ko­ris­ te­ći en­zim re­ver­znu tran­skrip­ta­zu. Ta­ko proiz­ve­de­nu mo­le­ku­lu DNA (na­ zi­va­mo je cDNA jer je kom­ple­men­tar­na mo­le­ku­li RNA ko­ju smo ko­ris­ti­li kao ka­lup) mo­gu­će je ug­ra­di­ti u vek­tor na već opi­sa­ni na­čin. Bu­du­ći da su eu­ka­riot­ski ge­ni naj­češ­će is­pre­ki­da­ni ne­ko­di­ra­ju­ćim re­dos­li­je­di­ma (in­tro­ ni­ma, v. pog­l. 5) ko­ji se prek­ra­ja­njem (en­gl. spli­ci­ng) uk­la­nja­ju iz mR­NA, mo­guć­no­st klo­ni­ra­nja i cDNA i ge­nom­ske DNA bi­la je ključ­na za ra­zu­mi­ je­va­nje struk­tu­re i fun­kci­je ge­na

Vek­to­ri za re­kom­bi­nan­tnu DNA Ovisno o ve­li­či­ni frag­men­ta DNA ko­ji že­li­mo ug­ra­di­ti i svr­si ek­spe­ri­ men­ta ko­ji pla­ni­ra­mo, za prip­ra­vu re­kom­bi­nan­tnih mo­le­ku­la na ras­po­la­ga­ nju nam je ve­lik broj raz­li­či­tih vr­sta vek­to­ra za klo­ni­ra­nje. Os­nov­ni vek­tor­ ski sus­ta­vi ko­ji se ko­ris­te za izo­la­ci­ju i um­na­ža­nje klo­ni­ra­ne DNA pri­ka­za­ni su ov­dje. Os­ta­li vek­to­ri raz­vi­je­ni za ek­spre­si­ju klo­ni­ra­ne DNA i uvo­đe­nje re­kom­bi­nan­tnih mo­le­ku­la u eu­ka­riot­ske sta­ni­ce ras­prav­lje­ni su u slje­de­ćim pog­lav­lji­ma. Plaz­mi­di se čes­to ko­ris­te za klo­ni­ra­nje ge­nom­skih ili cDNA frag­me­na­ta ve­li­či­ne do ne­ko­li­ko ti­su­ća pa­ro­va ba­za. Plaz­mid­ni vek­to­ri se obič­no sas­to­

Sli­ka 4-18. Klo­ni­ra­nje cDNA.

122    POGLAVLJE 4 je od 2 do 4 kb DNA ko­ja uk­lju­ču­je is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je – sli­jed DNA ko­ ji upu­ću­je DNA-po­li­me­ra­zu sta­ni­ce do­ma­ći­na da rep­li­ci­ra tu mo­le­ku­lu DNA. Plaz­mid­ni vek­to­ri sad­r­že i ge­ne ko­ji omo­gu­ću­ju ot­por­no­st (re­zis­ten­ ci­ju) na an­ti­bio­ti­ke (prim­je­ri­ce ot­por­no­st na am­pi­ci­lin) te ta­ko omo­gu­ću­ju se­lek­ci­ju bak­te­ri­ja ko­je sad­r­že te plaz­mi­de. Prim­jer izo­la­ci­je hu­ma­ne DNA i klo­ni­ra­nja u plaz­mid­ni vek­tor pri­ka­zan je na sli­ci 4-19. Skup cDNA frag­ me­na­ta po­ve­zu­je se (li­gi­ra) s plaz­mid­nom DNA raz­gra­đe­nom res­trik­cij­ skim en­do­nuk­lea­za­ma. Do­bi­ve­nim re­kom­bi­nan­tnim mo­le­ku­la­ma DNA se tran­sfor­mi­ra bak­te­ri­ja E. co­li. Za­tim se oda­bi­ru ko­lo­ni­je ko­je su re­zis­ten­tne na an­ti­bio­tik, jer one sad­r­ža­va­ju plaz­mid­nu DNA. Ka­ko sva­ki po­je­di­ni re­ kom­bi­nan­tni plaz­mid da­je jed­nu ko­lo­ni­ju ot­por­nu na an­ti­bio­ti­ke, sve bak­ te­ri­je u ne­koj ko­lo­ni­ji sad­rž­ a­vat će je­din­stven ug­ra­đe­ni frag­me­nt cDNA. Bak­te­ri­je u ko­ji­ma se na­la­ze plaz­mi­di mo­gu­će je sad um­no­ži­ti u že­lje­nim ko­li­či­na­ma i iz njih izo­li­ra­ti DNA. Ma­le kruž­ne mo­le­ku­le plaz­mid­ne DNA, ko­jih čes­to ima vi­še sto­ti­na u sva­koj sta­ni­ci, mo­gu­će je raz­dvo­ji­ti od kro­ mo­som­ske DNA bak­te­ri­ja. Re­zul­tat je pro­čiš­će­na plaz­mid­na DNA ko­ja je prik­lad­na za dalj­nju ana­li­zu ug­ra­đe­no­ga frag­men­ta DNA. Vek­to­ri iz­ve­de­ni iz bak­te­rio­fa­ga λ ta­ko­đer se ko­ris­te za izo­la­ci­ju ge­nom­ ske DNA ili cDNA iz eu­ka­riot­skih sta­ni­ca, a omo­gu­ću­ju ug­rad­nju ve­ćih frag­me­na­ta no plaz­mid­ni vek­to­ri. Iz λ vek­to­ra uk­lo­nje­ni su di­je­lo­vi ge­no­ma bak­te­rio­fa­ga ko­ji ni­su nuž­ni za um­na­ža­nje vi­ru­sa, a za­mi­je­nje­ni su s je­din­ stve­nim res­trik­cij­skim mjes­ti­ma za ug­rad­nju klo­ni­ra­ne DNA. Ve­li­či­na frag­ men­ta DNA ko­ji je mo­gu­će ug­ra­di­ti u tak­ve vek­to­re og­ra­ni­če­na je na pri­ bliž­no 15 kb zbog nuž­nos­ti pa­ki­ra­nja tak­vog re­kom­bi­nan­tno­ga ge­no­ma u čes­ti­ce fa­ga. S tak­vim čes­ti­ca­ma fa­ga za­tim in­fi­ci­ra­mo kul­tu­re E. co­li u ko­ji­ ma nas­ta­ju mi­li­ju­ni po­to­ma­ka fa­ga ko­ji sad­r­že tu ug­ra­đe­nu mo­le­ku­lu DNA. Bu­du­ći da sva­ka čes­ti­ca fa­ga stva­ra od­vo­je­ni plak, mo­gu­će je izo­li­ra­ti re­kom­ bi­nan­tne mo­le­ku­le ko­je sad­r­ža­va­ju sa­mo je­dan spe­ci­fič­ni frag­me­nt DNA. Broj­ne ana­li­ze ge­nom­ske DNA zah­ti­je­va­ju klo­ni­ra­nje frag­me­na­ta DNA ve­ćih no što ih mo­gu prih­va­ti­ti plaz­mid­ni ili λ vek­to­ri. Za tu se nam­je­nu ko­ris­te pet glav­nih ti­po­va vek­to­ra (tab­l. 4-3). Koz­mid­ni vek­to­ri mo­gu prih­va­ti­ti umet­ke ve­li­či­ne oko 45 kb. Ovi vek­to­ri sad­rž­ a­va­ju DNA bak­te­ rio­fa­ga ko­ja omo­gu­ću­je učin­ko­vi­tu ug­rad­nju klo­ni­ra­ne DNA u čes­ti­ce fa­ ga. Koz­mid­ni vek­to­ri sad­r­ža­va­ju i is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je i ge­ne za re­zis­ten­ci­ ju na an­ti­bio­ti­ke svoj­stve­ne plaz­mi­di­ma, pa se mo­gu rep­li­ci­ra­ti kao plaz­mi­di u bak­te­rij­skim sta­ni­ca­ma. Dru­ga dva ti­pa vek­to­ra iz­ve­de­na su pak iz bak­te­rio­fa­ga P1 i mo­gu prih­va­ti­ti frag­men­te DNA ve­li­či­ne od 70 do 100 kb. Sad­r­ža­va­ju slje­do­ve nuk­leo­ti­da ko­ji omo­gu­ću­ju in vit­ro ug­rad­nju re­kom­bi­nan­tne DNA u čes­ti­ce P1 fa­ga, a u bak­te­ri­ji E. co­li se mo­gu neo­ vis­no rep­li­ci­ra­ti po­put plaz­mi­da. Takozvani P1 um­jet­ni kro­mo­so­mi (PAC – en­gl. P1 ar­ti­fi­cial chro­mo­so­me) ta­ko­đer sad­rž­ a­va­ju slje­do­ve bak­te­rio­fa­ga P1, ali se u bak­te­ri­ju E. co­li uno­se iz­rav­no kao plaz­mi­di, a prih­va­ća­ju frag­ men­te DNA ve­li­či­ne od 130 do 150 kb. Tab­li­ca 4-3. Vektori za klo­ni­ra­nje ve­li­kih frag­me­na­ta DNA Ve­li­či­na frag­men­ta Vektor (kb) Kozmidi 30–45 Bakteriofag P1 70–100 P1 um­jet­ni kro­mo­so­mi (PAC) 130–150 Bakterijski um­jet­ni kro­mo­so­mi (BAC) 120–300 Kvaščev um­jet­ni kro­mo­som (YAC) 250–400

Sta­ni­ca domaćin E. co­li E. co­li E. co­li E. co­li kva­sac

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

Slika 4-19. Klo­ni­ra­nje u plaz­mid­ne vek­ to­re.  Vektor je ma­la kruž­na mo­le­ku­la ko­ja ima is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je (ori), gen ko­ji no­si re­zis­ten­ci­ju na am­pi­ci­lin (Ampr) i res­ trik­cij­sko mjes­to (prim­je­ri­ce EcoRI) u ko­je je mo­gu­će ug­ra­di­ti stra­nu DNA. Frag­me­nt stra­ne DNA ug­ra­đu­je se u vek­tor i re­kom­ bi­nan­tnim se plaz­mi­di­ma tran­sfor­mi­ra bak­te­ri­ja E. co­li. Bak­te­ri­je se na­sa­đu­ju na me­dij ko­ji sad­r­ža­va am­pi­ci­lin na ko­jem ko­lo­ni­je stva­ra­ju sa­mo one bak­te­ri­je ko­je sad­r­ža­va­ju plaz­mid­nu DNA zbog ko­je su pos­ta­le re­zis­ten­tne na am­pi­ci­lin. Klo­no­ve bak­te­ri­ja ko­ji sad­r­ža­va­ju po­je­di­ne plaz­ mi­de mo­gu­će je izo­li­ra­ti i um­no­ži­ti u ve­ li­koj ko­li­či­ni ra­di izo­la­ci­je re­kom­bi­nan­tnih plaz­mi­da.

Bak­te­rij­ski um­jet­ni kro­mo­so­mi (BAC – en­gl. bac­te­rial ar­ti­fi­cial chro­ mo­so­me) su vek­to­ri iz­ve­de­ni iz pri­rod­nog plaz­mi­da ko­ji na­la­zi­mo u E. co­li (na­zi­va­mo ga F-fak­tor). Is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je i os­ta­li re­dos­li­je­di F-fak­to­ra omo­gu­ću­ju da se BAC rep­li­ci­ra kao sta­bil­ni plaz­mid čak i uz umet­ke od 120 do 300 kb. Još ve­će frag­men­te DNA (250–400 kb) mo­gu­će je klo­ni­ra­ti u vek­to­ru ko­ji na­zi­va­mo kvaš­čev um­jet­ni kro­mo­som (YAC – en­gl. yea­st ar­ ti­fi­cial chro­mo­so­me). Ti vek­to­ri sad­r­ža­va­ju is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je kvas­ca i ne­ ke dru­ge ele­men­te (cen­tro­me­re i te­lo­me­re, vi­di 5. pog­lav­lje) ko­ji im omo­

   123

124    POGLAVLJE 4 gu­ću­ju da se rep­li­ci­ra­ju u sta­ni­ca­ma kvas­ca kao li­near­ne mo­le­ku­le sli­čne kro­mo­so­mi­ma.

Sek­ven­ci­ra­nje DNA Molekularno klo­ni­ra­nje omo­gu­ću­je izo­la­ci­ju po­je­di­nač­nih frag­me­na­ta DNA u ko­li­či­na­ma ko­je su prik­lad­ne za de­talj­nu ka­rak­te­ri­za­ci­ju i od­re­đi­ va­nje sli­je­da nuk­leo­ti­da. Od­re­đi­va­nje sli­je­da nuk­leo­ti­da broj­nih ge­na ot­ kri­lo je struk­tu­re nji­ho­vih pro­tein­skih pro­du­ka­ta, a raz­jas­ni­lo je i svoj­stva slje­do­va DNA ko­ji re­gu­li­ra­ju nji­ho­vu ek­spre­si­ju. Što­vi­še, sli­jed nuk­leo­ti­da u ko­di­ra­ju­ćim re­gi­ja­ma no­vih ge­na čes­to je sro­dan sli­je­du nuk­leo­ti­da u ne­kim već ot­pri­je poz­na­tim ge­ni­ma pa je fun­kci­ju no­voot­kri­ve­nih ge­na čes­to mo­gu­će pre­poz­na­ti na os­no­vi slič­nos­ti u slje­do­vi­ma nuk­leo­ti­da. Sek­ven­ci­ra­nje DNA obič­no se pro­vo­di au­to­ma­ti­zi­ra­nim sus­ta­vi­ma ko­ji su br­zi i pre­ciz­ni pa je da­nas od­re­đi­va­nje sli­je­da nuk­leo­ti­da DNA od ne­ko­ li­ko ki­lo­ba­za raz­mjer­no jed­nos­ta­van za­da­tak. Sto­ga je neus­po­re­di­vo jed­no­ stav­ni­je klo­ni­ra­ti i sek­ven­ci­ra­ti DNA ne­go što je od­re­di­ti sli­jed ami­no­ki­se­ li­na u pro­tei­nu što ga taj gen ko­di­ra. Bu­du­ći da sli­jed nuk­leo­ti­da u ge­nu mo­že­mo iz­rav­no pre­ves­ti u sli­jed ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­nu, naj­lak­ši na­čin od­re­đi­va­nja pri­mar­ne struk­tu­re pro­tei­na je sek­ven­ci­ra­nje klo­ni­ra­no­ga ge­ na ili cDNA. Naj­češ­ća me­to­da za sek­ven­ci­ra­nje DNA zas­ni­va se na preu­ra­nje­nom pres­tan­ku sin­te­ze DNA zbog ug­rad­nje di­deok­si­nuk­leo­ti­da (ko­ji ne­ma­ju 3' OH sku­pi­nu na deok­si­ri­bo­zi) ko­ji pre­ki­da­ju sin­te­zu DNA lan­ca DNA-po­ li­me­ra­zom (sl. 4-20). Sin­te­za DNA za­po­či­nje na spe­ci­fič­nom mjes­tu ko­je­ ga od­re­đu­je spe­ci­fič­na sin­te­tič­ka po­čet­ni­ca. Reak­ci­ja za sek­ven­ci­ra­nje DNA osim nor­mal­nih deok­si­nuk­leo­ti­da sad­r­ža­va i sva če­ti­ri di­deok­si­nuk­leo­ti­da (A, C, G i T). Sva­ki od če­ti­ri di­deok­si­nuk­leo­ti­da obi­lje­žen je dru­gom fluo­ res­cen­tnom bo­jom ko­ja omo­gu­ća­va de­tek­ci­ju nje­go­ve ug­rad­nje u DNA. Ug­rad­nja di­deok­si­nuk­leo­ti­da zaus­tav­lja sin­te­zu DNA jer je 3' OH sku­pi­na nuž­na za ve­za­nje slje­de­ćeg nuk­leo­ti­da. Na taj na­čin nas­ta­je se­ri­ja obi­lje­že­ nih mo­le­ku­la DNA ko­je sve zav­r­ša­va­ju jed­nim od če­ti­ri fluo­res­cen­tno o­bi­ lje­že­na di­deok­si­nuk­leo­ti­da. Ti se frag­men­ti DNA za­tim raz­dva­ja­ju pre­ma ve­li­či­ni ge­l-e­lek­tro­fo­re­zom. Ka­ko no­vo­sin­te­ti­zi­ra­ni lan­ci DNA iz­la­ze iz ge­ la za elek­tro­fo­re­zu oni pro­la­ze kroz la­ser­sku zra­ku ko­ja po­bu­đu­je fluo­res­ cen­tni bi­ljeg. Emi­ti­ra­nu svjet­lo­st oči­ta­va fo­to­mul­tip­li­ka­tor, a ra­ču­na­lo pri­ kup­lja i ana­li­zi­ra po­dat­ke. Ve­li­či­na sva­kog frag­men­ta od­re­đe­na je po­lo­ža­jem na ko­ji se ug­ra­dio (jed­nom od če­ti­ri fluo­res­cen­tne bo­je) obi­lje­že­ni di­deok­ si­nuk­leo­tid, sto­ga je sli­jed nuk­leo­ti­da u DNA mo­gu­će pro­či­ta­ti iz re­dos­li­ je­da fluo­res­cen­tno obi­lje­že­nih frag­me­na­ta DNA ko­ji iz­la­ze iz ge­la za elek­ tro­fo­re­zu. Vi­so­kop­ro­toč­no au­to­ma­ti­zi­ra­no sek­ven­ci­ra­nje DNA ovog ti­pa omo­gu­ći­lo je ma­sov­no od­re­đi­va­nje sli­je­da nuk­leo­ti­da ko­je je bi­lo pot­reb­no za sek­ven­ci­ra­nje či­ta­vih ge­no­ma, uk­lju­ču­ju­ći i ge­no­ma čov­je­ka.

Ek­spre­si­ja klo­ni­ra­nih ge­na Osim od­re­đi­va­nja sli­je­da nuk­leo­ti­da po­je­di­no­ga ge­na, te sto­ga i sli­je­da ami­no­ki­se­li­na u nje­go­vom pro­tein­skom pro­duk­tu, mo­le­ku­lar­no klo­ni­ra­nje je omo­gu­ći­lo prip­ra­vu ve­li­kih ko­li­či­na pro­tei­na za struk­tur­na i fun­kcio­nal­ na is­pi­ti­va­nja. Ve­ći­na pro­tei­na pri­sut­na je u vr­lo ma­lim ko­li­či­na­ma u eu­ ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, sto­ga je kon­ven­cio­nal­nim bio­ke­mij­skim me­to­da­ma ne­mo­gu­će prip­ra­vi­ti ve­će ko­li­či­ne tih pro­tei­na. Me­đu­tim, kad jed­nom ima­ mo klo­ni­ra­ni gen, taj prob­lem mo­že­mo ri­je­ši­ti ko­ris­te­ći po­seb­no di­zaj­ni­ra­ ne vek­to­re ko­ji omo­gu­ću­ju snaž­nu ek­spre­si­ju klo­ni­ra­no­ga ge­na u bak­te­rij­ skim ili eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Da bis­mo ek­spri­mi­ra­li eu­ka­riot­ski gen u E. co­li, že­lje­nu cDNA klo­ni­ra­ mo u plaz­mid­ni ili fag­ni vek­tor (na­zi­va­mo ga ek­spre­sij­ski vek­tor). Vek­tor

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

Sli­ka 4-20. Sek­ven­ci­ra­nje DNA.  Dideoksinukleotidi ko­ji­ma ne­dos­ta­je OH sku­pi­na i na 3' i na 2' po­lo­ža­ju deok­si­ri­bo­ze ko­ris­te se za pre­ki­da­nja sin­te­ze DNA na spe­ci­f ič­ nim ba­za­ma. Te se mo­le­ku­le nor­mal­no ug­ra­đu­ju u ras­tu­će lan­ce DNA. Bu­du­ći da im ne­dos­ta­je 3' OH sku­pi­na, na njih ni­je mo­gu­će po­ve­za­ti slje­de­ći nuk­leo­tid pa na tom mjes­tu pres­ta­je dalj­nja sin­te­za DNA. Sin­te­za DNA za­po­či­nje na spe­ci­f ič­nom mjes­tu uz ko­riš­te­nje spe­ci­f ič­ne sin­te­tič­ke po­čet­ni­ce. Reak­ci­ja sad­r­ži, osim če­ti­ri nor­mal­na deok­si­ nuk­leo­ti­da, i če­ti­ri di­deok­si­nuk­leo­ti­da od ko­jih je sva­ki obi­lje­žen raz­li­či­tom fluo­res­cen­ tnom bo­jom. Ka­da se di­deok­si­nuk­leo­tid in­kor­po­ri­ra u DNA, nje­zi­na sin­te­za se zaus­tav­ lja, pa reak­ci­jom do­bi­va­mo se­ri­ju pro­du­ka­ta ko­ji za­po­či­nju po­čet­ni­com, a zav­r­ša­va­ju di­deok­si­nuk­leo­ti­dom obi­lje­že­nim fluo­res­cen­tnom bo­jom. Pro­duk­ti reak­ci­je se za­tim raz­dvo­je ge­l-e­lek­tro­fo­re­zom. Ka­ko se frag­men­ti DNA pok­re­ću kroz gel u jed­nom će tre­nut­ku pro­ći kroz la­ser­sku zra­ku, ko­ja po­bu­đu­je fluo­res­cen­tne bi­lje­ge ve­za­ne za di­ deok­si­nuk­leo­ti­de. Emi­ti­ra­nu svjet­lo­st oči­ta­va fo­to­mul­tip­li­ka­tor po­ve­zan s ra­ču­na­lom ko­je sa­kup­lja i ana­li­zi­ra po­dat­ke pot­reb­ne za od­re­đi­va­nje sli­je­da nuk­leo­ti­da.

sad­r­ža­va slje­do­ve ko­je po­ti­ču pre­pi­si­va­nje i pre­vo­đe­nje umet­nu­to­ga ge­na u bak­te­rij­skim sta­ni­ca­ma (sl. 4-21). Klo­ni­ra­ni gen čes­to mo­že bi­ti ta­ko ja­ko ek­spri­mi­ran da nje­gov pro­tein­ski pro­du­kt pred­stav­lja i do 10% ukup­nih pro­tei­na bak­te­ri­je. Na­kon to­ga je pro­čiš­ća­va­nje pro­tei­na ko­di­ra­no­ga klo­ni­

   125

4.8. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Sek­ven­ci­ra­nje lan­ca DNA. Je­dan od na­či­na od­re­đi­va­nja sli­je­da nuk­leo­ti­da u mo­le­ku­li DNA uk­lju­ču­je mo­di­fi­ci­ra­ nu reak­ci­ju sin­te­ze DNA uz ko­riš­te­ nje nuk­leo­ti­da ko­ji pre­ki­da­ju sin­te­zu DNA i fluo­res­cen­ tnih po­čet­ni­ca ko­je mo­ gu bi­ti iden­ti­fi­ci­ra­ne au­to­mat­skim sus­ta­vi­ ma za de­tek­ci­ju.

126    POGLAVLJE 4 ra­nim ge­nom u ko­li­či­na­ma pot­reb­nim za de­talj­na bio­ke­mij­ska ili struk­tur­ na is­pi­ti­va­nja jed­nos­ta­van za­da­tak. Čes­to je pot­reb­no klo­ni­ra­ni gen ek­spri­mi­ra­ti u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma um­jes­to u bak­te­ri­ja­ma. Taj ob­lik ek­spre­si­je va­žan je da bis­mo, prim­je­ri­ce, osi­gu­ra­li nor­mal­no od­vi­ja­nje pos­ttran­sla­cij­skih mo­di­fi­ka­ci­ja pro­tei­na (kao što su do­da­tak ug­lji­ko­hid­ra­ta ili li­pi­da). Sin­te­za stra­nih pro­tei­na u eu­ka­ riot­skim sta­ni­ca­ma pos­ti­že se (ana­log­no pos­tup­ku s E. co­li) ug­rad­njom klo­ni­ra­no­ga ge­na u vek­tor (obič­no iz­ve­den od vi­ru­sa) ko­ji omo­gu­ću­je vi­ so­ku ra­zi­nu ek­spre­si­je to­ga ge­na. Sus­tav ko­ji se čes­to ko­ris­ti za proiz­vod­nju re­kom­bi­nan­tnih pro­tei­na u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma je in­fek­ci­ja sta­ni­ca in­ se­ka­ta ba­ku­lo­vi­rus­nim vek­to­ri­ma ko­ji omo­gu­ću­ju vi­so­ku ra­zi­nu ek­spre­si­je ge­na umet­nu­tih na mjes­to ge­na za struk­tur­ne pro­tei­ne vi­ru­sa. Vi­so­ku ra­ zi­nu ek­spre­si­je klo­ni­ra­nih ge­na mo­gu­će je pos­ti­ći i u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca po­mo­ću od­go­va­ra­ju­ćih vek­to­ra. Od po­seb­ne je ko­ris­ti klo­ni­ra­ni gen ek­spri­mi­ra­ti u kvas­cu zbog mo­guć­ nos­ti prim­je­ne jed­nos­tav­nih me­to­da ge­ne­ti­ke kvas­ca u is­pi­ti­va­nju in­te­rak­

Sli­ka 4-21. Ek­spre­si­ja klo­ni­ra­nih ge­na u bak­te­ri­ ja­ma.  Ekspresijski vek­to­ri sad­r­ža­va­ju pro­mo­to­re (pro) ko­ji po­ti­ču pre­vo­đe­nje umet­nu­tog frag­men­ta DNA, te re­dos­lje­de pot­reb­ne za ve­za­nje mR­NA na bak­te­rij­ske ri­bo­so­me (Shi­ne-Del­gar­nov [SD] sli­jed, dis­ku­ti­ra­no u pog­l. 8). Eu­ka­riot­ska cDNA umet­nu­ta pok­raj tih slje­do­va učin­ko­vi­to se ek­spri­mi­ra u E. co­ li što re­zul­ti­ra proiz­vod­njom eu­ka­riot­skih pro­tei­na u tran­sfor­mi­ra­nim bak­te­ri­ja­ma.

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   127

Sli­ka 4-22. Kvaš­čev dvo­hib­rid­ni sus­ tav.  cDNA dva hu­ma­na pro­tei­na klo­ ni­ra­ne su kao fu­zi­je s dvi­je do­me­ne (obi­lje­že­ne s 1 i 2) kvašče­vog pro­tei­na što po­ti­če pre­pi­si­va­nje cilj­no­ga ge­na. Te dvi­je re­kom­bi­nan­tne cDNA uvo­de se u sta­ni­cu kvas­ca. Ako dva hu­ma­na pro­ tei­na stu­pa­ju u me­đu­sob­nu in­te­rak­ci­ju, oni prib­li­ža­va­ju dvi­je do­me­ne kvaš­če­vog pro­tei­na. Do­me­na 1 ve­že DNA uz­vod­ no od mjes­ta cilj­no­ga ge­na, a do­me­na 2 po­ti­če nje­go­vo pre­pi­si­va­nje. Na taj je na­čin mo­gu­će in­te­rak­ci­ju dva hu­ma­na pro­tei­na de­tek­ti­ra­ti ek­spre­si­jom cilj­no­ga ge­na u tran­sfor­mi­ra­no­me kvas­cu.

ci­ja iz­me­đu raz­li­či­tih pro­tei­na. U ovom ti­pu ana­li­ze, ko­ji se još na­zi­va sus­ tav dvaju hib­ri­da u kvas­ca (en­gl. yea­st two-hybrid system), dvi­je raz­li­či­te cDNA (prim­je­ri­ce pod­ri­jet­lom iz sta­ni­ca čov­je­ka) spo­je­ne su na dvi­je raz­ li­či­te do­me­ne pro­tei­na ko­ji sti­mu­li­ra ek­spre­si­ju cilj­nog kvaš­če­vog ge­na (sl. 4-22). Kva­sac se za­tim tran­sfor­mi­ra s hib­rid­nim cDNA klo­no­vi­ma ka­ko bi se tes­ti­ra­le in­te­rak­ci­je iz­me­đu dva pro­tei­na. Ako su dva hu­ma­na pro­tei­na u me­đu­sob­noj in­te­rak­ci­ji, oni će dvi­je do­me­ne kvaš­če­vog pro­tei­na do­ves­ ti u blis­ku ve­zu, što će re­zul­ti­ra­ti sti­mu­la­ci­jom ek­spre­si­je cilj­nog ge­na u tran­sfor­mi­ra­nom kvas­cu. Ek­spre­si­ja cilj­nog ge­na mo­že se la­ga­no ut­vr­di­ti ras­tom kva­sa­ca na se­lek­tiv­nom me­di­ju ili pla­vo-bi­je­lom se­lek­ci­jom (pla­va bo­ja ko­lo­ni­ja kva­sa­ca nas­ta­je kao pro­du­kt dje­lo­va­nja po­seb­nog en­zi­ma pri­ sut­nog u sta­ni­ca­ma kvas­ca), ta­ko da sus­tav dvaju hib­ri­da u kvas­ca pred­ stav­lja jed­nos­tav­nu me­to­du tes­ti­ra­nja in­te­rak­ci­ja iz­me­đu raz­li­či­tih pro­tei­ na. Što­vi­še, preg­le­da­va­nje ve­li­kog bro­ja in­te­rak­ci­ja pa­ro­va pro­tei­na u ma­lom vre­me­nu omo­gu­ći­lo je kon­struk­ci­ju in­te­rak­cij­skih ka­ra­ta na ve­li­ko. Dru­gim ri­je­či­ma, ovom je me­to­dom ana­li­zi­ra­no na ti­su­će pro­tei­na u eu­ka­ riot­skoj sta­ni­ci (v. sl. 2-33).

De­tek­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na i pro­tei­na Raz­voj mo­le­ku­lar­nog klo­ni­ra­nja omo­gu­ćio je izo­la­ci­ju i ana­li­zu po­je­di­ nač­nih ge­na eu­ka­riot­skog ge­no­ma. Ipak, ra­zu­mi­je­va­nje ulo­ge ge­na unu­tar eu­ka­riot­ske sta­ni­ce zah­ti­je­va ana­li­zu unu­tar­sta­nič­ne or­ga­ni­za­ci­je i ek­spre­ si­je po­je­di­nač­nih ge­na i pro­tei­na ko­je oni ko­di­ra­ju. U ovom će­mo pog­lav­lju ob­jas­ni­ti os­nov­ne me­to­de ko­je se ko­ris­te za ot­kri­va­nje spe­ci­fič­nih nuk­lein­ skih ki­se­li­na i pro­tei­na. Ovi me­to­do­loš­ki pris­tu­pi važ­ni su za raz­li­či­ta is­tra­

128    POGLAVLJE 4 ži­va­nja kao što su prim­je­ri­ce kar­ti­ra­nje ge­na na kro­mo­so­mi­ma, ana­li­ze eks­ pre­si­je ge­na i od­re­đi­va­nje po­lo­ža­ja pro­tei­na unu­tar sta­nič­nih or­ga­ne­la.

Um­no­ža­va­nje DNA lan­ča­nom reak­ci­jom po­li­me­ra­ze 4.9. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Lan­ča­na reak­ci­ja po­li­me­ra­ze. Lančana reak­ci­ja po­li­me­ra­ze omo­gu­ća­va proiz­vod­nju mi­li­ju­na ko­pi­ja frag­me­ na­ta DNA iz sa­mo jed­ ne po­čet­ne mo­le­ku­le DNA.

▶▶ PCR je pos­tao izu­zet­no važ­na i moć­na fo­ren­zič­ka me­to­da. Am­ pli­fi­ka­ci­ja lan­ča­nom reak­ci­jom po­li­me­ra­ze omo­gu­ća­va is­tra­ži­va­ ču da do­bi­je pro­fil DNA iz ma­log uzor­ka DNA s mjes­ta zlo­či­na.

Mo­le­ku­lar­no klo­ni­ra­nje omo­gu­ću­je prip­ra­vu ve­li­kih ko­li­či­na spe­ci­fič­ nih frag­me­na­ta DNA um­no­ža­va­njem i izo­la­ci­jom iz bak­te­ri­ja. Al­ter­na­tiv­ni pris­tup za prip­ra­vu ve­li­ke ko­li­či­ne ne­ke mo­le­ku­le DNA je lan­ča­na reak­ci­ ja po­li­me­ra­ze (PCR – en­gl. po­lyme­ra­se chain reac­tion), ko­ju je 1988. go­di­ ne raz­vio Ka­ry Mul­lis. Ako je poz­nat dio sli­je­da nuk­leo­ti­da u ne­koj mo­le­ ku­li DNA, lan­ča­nom reak­ci­jom po­li­me­ra­ze mo­gu­će je u pot­pu­nos­ti in vit­ro prip­ra­vi­ti go­le­me ko­li­či­ne te mo­le­ku­le. Os­no­va me­to­de je ope­to­va­no umna­ža­nje od­re­đe­nog seg­men­ta DNA s po­mo­ću DNA-po­li­me­ra­ze. Broj mo­le­ku­la DNA dvos­tru­ko je ve­ći na­kon sva­ko­ga kru­ga um­na­ža­nja i po­ve­ ća­va se ek­spo­nen­ci­jal­no, te je iz ma­lo­ga bro­ja ko­pi­ja mo­le­ku­la ka­lu­pa ko­je su pri­sut­ne na po­čet­ku reak­ci­je mo­gu­će prip­ra­vi­ti ve­li­ku ko­li­či­nu DNA. Pri­mje­ri­ce, iz jed­ne će mo­le­ku­le DNA na­kon 30 cik­lu­sa um­na­ža­nja teo­rij­ ski nas­ta­ti 230 (prib­liž­no mi­li­jar­du) iden­tič­nih ko­pi­ja. To zna­či da je jed­nu je­di­nu mo­le­ku­lu DNA mo­gu­će um­no­ži­ti do ko­li­či­ne ko­ja je pot­reb­na za mo­le­ku­lar­no klo­ni­ra­nje, ana­li­zu raz­grad­njom res­trik­cij­ski­m en­do­nuk­lea­ za­ma, ili od­re­đi­va­nje sli­je­da nuk­leo­ti­da. Os­no­va me­to­de za um­na­ža­nje DNA lan­ča­nom reak­ci­jom po­li­me­ra­ze pri­ka­za­na je na sli­ci 4-23. Po­čet­ni ma­te­ri­jal mo­že bi­ti klo­ni­ra­ni frag­me­nt DNA ili pak smje­sa raz­li­či­tih mo­le­ku­la DNA, prim­je­ri­ce ukup­ni ek­stra­kt DNA sta­ni­ca čov­je­ka. Da bis­mo mog­li um­no­ži­ti že­lje­ni seg­me­nt DNA mo­ ra­mo poz­na­va­ti sli­jed nuk­leo­ti­da ko­ji ga ok­ru­žu­ju ka­ko bis­mo mog­li krei­ ra­ti spe­ci­fič­ne po­čet­ni­ce ko­je će za­po­če­ti sin­te­zu DNA na že­lje­nim mjes­ti­ ma. Te po­čet­ni­ce su naj­češ­će ke­mij­ski sin­te­ti­zi­ra­ne mo­le­ku­le DNA du­lji­ne od 15 do 20 nuk­leo­ti­da. Ko­ris­te se dvi­je po­čet­ni­ce ko­je će za­po­če­ti sin­te­zu u sup­rot­nim smje­ro­vi­ma na dva kom­ple­men­tar­na lan­ca DNA. Reak­ci­ja za­ po­či­nje zag­ri­ja­va­njem ka­lu­pa na vi­so­ku tem­pe­ra­tu­ru (prim­je­ri­ce 95 °C) da bi se raz­dvo­ji­la dva lan­ca DNA. Tem­pe­ra­tu­ra se ta­da sni­zu­je ka­ko bi se omo­gu­ći­lo po­čet­ni­ca­ma da se spe­ci­fič­no po­ve­žu s kom­ple­men­tar­nim slje­ do­vi­ma na lan­ci­ma ka­lu­pa. DNA-po­li­me­ra­za ta­da sin­te­ti­zi­ra la­nac DNA kom­ple­men­ta­ran ka­lu­pu po­čev­ši od spe­ci­fič­no po­ve­za­nih po­čet­ni­ca. U jed­nom cik­lu­su um­no­ža­va­nja iz sva­ke mo­le­ku­le ka­lu­pa nas­ta­ju po dvi­je no­ve iden­tič­ne mo­le­ku­le DNA. Ovaj je pro­ces mo­gu­će po­no­vi­ti ve­lik broj pu­ta, a u sva­kom će se cik­lu­su broj mo­le­ku­la DNA ud­vos­tru­či­ti. Vi­šes­tru­ki uzas­top­ni cik­lu­si gri­ja­nja i hla­đe­nja, ko­ji su sas­tav­ni dio lan­ ča­ne reak­ci­je po­li­me­ra­ze, pro­vo­de se u po­seb­nim ter­mob­lo­ko­vi­ma ko­je je mo­gu­će prog­ra­mi­ra­ti, a na­zi­va­mo ih ter­mo­cik­le­ri. En­zi­mi ko­je ko­ris­ti­mo u lan­ča­noj reak­ci­ji po­li­me­ra­ze su sta­bil­ni i na vi­so­kim tem­pe­ra­tu­ra­ma ko­ ji­ma raz­dva­ja­mo lan­ce mo­le­ku­le DNA. Nai­me, ovi su ter­mos­ta­bil­ni en­zi­mi izo­li­ra­ni iz bak­te­ri­ja po­put Ther­mus aqua­ti­cus ko­je ži­ve u ter­mal­nim iz­vo­ ri­ma na tem­pe­ra­tu­ra­ma od prib­liž­no 75 °C. Tak­ve su po­li­me­ra­ze sta­bil­ne i na vi­so­kim tem­pe­ra­tu­ra­ma ko­ji­ma raz­dva­ja­mo lan­ce dvo­lan­ča­ne DNA, pa je um­na­ža­nje DNA lan­ča­nom reak­ci­jom po­li­me­ra­ze mo­gu­će jed­nos­tav­no pro­ves­ti. Na ovaj je na­čin ta­ko­đer mo­gu­će um­no­ži­ti mo­le­ku­le RNA ako pri­je lan­ča­ne reak­ci­je po­li­me­ra­ze nap­ra­vi­mo cDNA ko­pi­ju mo­le­ku­le RNA re­ver­znom tran­skrip­ta­zom. Ako je sli­jed nuk­leo­ti­da ne­ko­ga ge­na poz­nat u do­volj­noj mje­ri da mo­ že­mo prip­re­mi­ti od­go­va­ra­ju­će po­čet­ni­ce, lan­ča­na reak­ci­ja po­li­me­ra­ze iz­ nim­no je moć­na me­to­da za prip­ra­vu ve­li­kih ko­li­či­na DNA iz po­čet­nog ma­te­ri­ja­la ko­ji mo­že sad­r­ža­va­ti sve­ga ne­ko­li­ko tra­že­nih mo­le­ku­la DNA u smje­si ve­li­kog bro­ja raz­li­či­tih dru­gih mo­le­ku­la DNA. Je­di­ne mo­le­ku­le DNA ko­je će se um­no­ži­ti me­to­dom PCR bi­t će one ko­je sad­r­že nuk­leo­tid­

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

ni sli­jed kom­ple­men­ta­ran po­čet­ni­ca­ma ko­riš­te­nim u reak­ci­ji. Ova­kav me­ to­do­loš­ki pris­tup omo­gu­ća­va se­lek­tiv­no um­na­ža­nje spe­ci­fič­nog ka­lu­pa unu­tar kom­plek­sne smje­se kao što je prim­je­ri­ce ukup­na sta­nič­na DNA ili RNA. Zah­va­lju­ju­ći vi­so­koj os­jet­lji­vos­ti PCR je pos­tao važ­na me­to­da za raz­ li­či­te prim­je­ne uk­lju­ču­ju­ći ana­li­ze ek­spre­si­je ge­na u sta­ni­ca­ma dos­tup­nim u vr­lo ma­lim ko­li­či­na­ma. Frag­men­ti DNA um­no­že­ni po­mo­ću me­to­de PCR mo­gu se di­rek­tno sek­ven­ci­ra­ti ili se mo­gu ug­ra­di­ti u vek­to­re i pro­pa­gi­ra­ti kao mo­le­ku­lar­ni klo­no­vi. Sto­ga, me­to­da PCR omo­gu­ća­va am­pli­fi­ka­ci­ju i klo­ni­ra­nje bi­lo ko­ jeg di­je­la DNA za ko­ji je mo­gu­će proiz­ves­ti spe­ci­fič­ne po­čet­ni­ce. Lan­ča­na reak­ci­ja po­li­me­ra­ze zna­čaj­no pri­do­no­si re­per­toa­ru me­to­da re­kom­bi­nan­tne DNA. Prim­je­ri­ce, za mno­ge or­ga­niz­me či­ji ge­nom još uvi­jek ni­je pot­pu­no sek­ven­ci­ran, PCR mo­že pos­lu­ži­ti za um­na­ža­nje i klo­ni­ra­nje og­rom­nog bro­ja že­lje­nih frag­me­na­ta DNA.

   129

Sli­ka 4-23. Um­na­ža­nje DNA lan­ča­nom reak­ci­jom po­li­me­ra­ze.  Dio DNA ko­ji tre­ba um­no­ži­ti ome­đen je s dva sli­je­da nu­k­leo­ti­da s ko­ji­ma za­po­či­nje sin­te­za. Po­ čet­nu dvo­lan­ča­nu DNA zag­ri­ja­va­mo da bis­mo raz­dvo­ji­li lan­ce, a za­tim je hla­di­mo ka­ko bi se po­čet­ni­ce (naj­češ­će oli­go­nuk­ leo­ti­di od 15 do 20 ba­za) ve­za­le na sva­ki od tih la­na­ca. Po­čev­ši od po­čet­ni­ca, DNApo­li­me­ra­za izo­li­ra­na iz bak­te­ri­je Ther­mus aqua­ti­cus (Taq-polimeraza) sin­te­ti­zi­ra no­ ve lan­ce DNA što do­vo­di do stva­ra­nja dvi­ju no­vih dvo­lan­ča­nih mo­le­ku­la DNA. Ovaj je pro­ces mo­gu­će vi­šes­tru­ko po­nav­ lja­ti što re­zul­ti­ra ud­vo­stru­če­njem bro­ja mo­le­ku­la DNA na­kon sva­ko­ga cik­lu­sa.

130    POGLAVLJE 4 4.10. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU

Hib­ri­di­za­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na

Os­no­va de­tek­ci­je spe­ci­fič­nih sl­je­do­va nuk­leo­ti­da nuk­lein­skih ki­se­li­na je spa­ri­va­nje ba­za iz­me­đu kom­ple­men­tar­nih la­na­ca DNA ili RNA. Pri vi­so­ kim se tem­pe­ra­tu­ra­ma (90–100 °C) kom­ple­men­tar­ni lan­ci DNA raz­dva­ja­ju i nas­ta­ju jed­no­lan­ča­ne mo­le­ku­le. Ka­že­mo da se DNA de­na­tu­ri­ra­la. Ako tak­ve de­na­tu­ri­ra­ne mo­le­ku­le DNA in­ku­bi­ra­mo na od­go­va­ra­ju­ćoj tem­pe­ra­ tu­ri (prim­je­ri­ce 65 °C), re­na­tu­ri­rat će se u dvo­lan­ča­ne mo­le­ku­le na os­no­vi kom­ple­men­tar­nog spa­ri­va­nja ba­za. Taj pro­ces po­nov­nog us­pos­tav­lja­nja dvo­lan­ča­ne struk­tu­re na­zi­va­mo hib­ri­di­za­ci­jom nuk­lein­skih ki­se­li­na. Hib­ rid­ne nuk­lein­ske ki­se­li­ne mo­gu stvo­ri­ti dva lan­ca DNA, dva lan­ca RNA ili je­dan la­nac DNA i je­dan la­nac RNA. Hib­ri­di­za­ci­ja iz­me­đu po­čet­ni­ce i ka­lu­pa DNA osi­gu­ra­va spe­ci­fič­no­st am­ pli­fi­ka­ci­je me­to­dom PCR. Ta­ko­đer, mno­ge dru­ge me­to­de ko­ris­te prin­cip hi­ b­ridi­za­ci­je nuk­lein­skih ki­se­li­na u svr­hu de­tek­ci­je DNA ili RNA sek­ven­ci kom­ple­men­tar­nih bi­lo ko­joj izo­li­ra­noj nuk­lein­skoj ki­se­li­ni kao što je prim­ je­ri­ce ne­ki od­re­đe­ni klo­ni­ra­ni nuk­leo­tid­ni sli­jed (sl. 4-24). Klo­ni­ra­na DNA je obi­lje­že­na ug­rad­njom ra­dioak­tiv­nih nuk­leo­ti­da ili mo­di­fic­ i­ra­nih nuk­leo­ ti­da ko­ji se de­tek­ti­ra­ju uz po­moć fluo­res­cen­ci­je ili ke­mo­lu­mi­nis­cen­ci­je. Ta­ko oz­na­če­na DNA se ta­da ko­ris­ti kao son­da za hib­ri­di­za­ci­ju s kom­ple­men­tar­ nim slje­do­vi­ma DNA ili RNA, ko­je on­da de­tek­ti­ra­mo na te­me­lju ra­dioak­tiv­ nos­ti, fluo­res­cen­ci­je ili lu­mi­nis­cen­ci­je re­zul­ti­ra­ju­ćih dvo­lan­ča­nih hib­ri­da. Hib­ri­di­za­ci­ja po Sout­he­r­nu ili Sout­he­rn blot (tehnika ko­ju je raz­vio E. M. Sout­he­rn, en­gl. Sout­he­rn blot­ti­ng) je ši­ro­ko ras­pros­tra­nje­na me­to­da za de­tek­ci­ju spe­ci­fič­nih ge­na u sta­nič­noj DNA (sl. 4-25). DNA ko­ju že­li­mo ana­li­zi­ra­ti pr­vo će­mo raz­gra­di­ti res­trik­cij­ski­m en­do­nuk­lea­za­ma te nas­ta­le frag­men­te DNA raz­dvo­ji­ti ge­l-e­lek­tro­fo­re­zom. Na gel se ta­da stav­lja nit­ro­ ce­lu­loz­ni fil­tar ili naj­lon­ska mem­bra­na na ko­ju se pre­no­se (en­gl. blot­ti­ng) frag­men­ti DNA da bi se do­bi­la rep­li­ka ge­la. Fil­tar ili mem­bra­na se za­tim in­ku­bi­ra­ju s obi­lje­že­nom son­dom ko­ja će hib­ri­di­zi­ra­ti s onim di­je­lo­vi­ma DNA gdje će pro­na­ći kom­ple­men­tar­ni slijed nuk­leo­ti­da. Na­kon hib­ri­di­za­ ci­je son­de i frag­me­na­ta DNA mo­gu­će je od­re­di­ti po­lo­žaj tih frag­me­na­ta unu­tar sta­nič­ne DNA. Kad um­jes­to mo­le­ku­la DNA že­li­mo de­tek­ti­ra­ti mo­le­ku­le RNA ko­ris­ti­ mo va­ri­ja­ci­ju me­to­de Sout­he­rn blot ko­ju na­zi­va­mo Nor­the­rn blot (ime me­to­de izab­ra­no je pre­ma ana­lo­gi­ji s en­gles­kim zna­če­njem ri­je­či sou­th – jug; nor­th – sje­ver, op. prev.). U ovoj se me­to­di ukup­na sta­nič­na RNA izo­ li­ra i raz­dvo­ji pre­ma ve­li­či­ni ge­l-e­lek­tro­fo­re­zom. Kao i u me­to­di hib­ri­di­za­ ci­je po Sout­he­r­nu, RNA se pre­no­si na fil­tar i de­tek­ti­ra hib­ri­di­za­ci­jom s klo­ni­ra­nom son­dom. Nor­the­rn blot se često ko­ris­ti za ana­li­zu ek­spre­si­je ge­na, prim­je­ri­ce ka­da že­li­mo ut­vr­di­ti je li spe­ci­fič­na mR­NA pri­sut­na u raz­li­či­tim ti­po­vi­ma sta­ni­ca. Sli­ka 4-24. De­tek­ci­ja mo­le­ku­la DNA hib­ri­di­za­ci­jom Hib­ri­di­za­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na mo­že se pri­mi­je­ni­ti i u nuk­lein­skih ki­se­li­na.  Spe­ci­f ič­ne slje­do­ve nuk­leo­ti­da svr­hu pro­na­la­že­nja mo­le­ku­lar­nih klo­no­va ko­ji sad­r­že spe­ci­ u ukup­noj sta­nič­noj DNA mo­gu­će je de­tek­ti­ra­ti hib­ri­ fič­ne sta­nič­ne DNA in­ser­te. Naj­češ­će je pr­vi ko­rak u izo­la­ci­ di­za­ci­jom s ra­dioak­tiv­no obi­lje­že­nom DNA-son­dom ili ji bi­lo ge­nom­ske DNA bi­lo cDNA klo­no­va prip­rav­lja­nje DNA-son­dom u ko­ju su in­kor­po­ri­ra­ni ke­mij­ski ili fluo­res­ rekom­bi­nan­tnih DNA-bib­lio­te­ka. DNA-bib­lio­te­ka zap­ra­vo cen­tno mo­di­f i­ci­ra­ni nuk­leo­ti­di. DNA se de­na­tu­ri­ra za­gri­ pred­stav­lja zbir­ku klo­no­va ko­ji sad­r­že sve ge­nom­ske ili ja­va­njem na 95 °C či­me do­bi­va­mo jed­no­lan­ča­ne mo­le­ mRNA sek­ven­ce od­re­đe­nog sta­nič­nog ti­pa (sl. 4-26). Ge­ ku­le. Na­kon de­na­tu­ra­ci­je, mo­le­ku­la­ma DNA se do­da­je obi­lje­že­na son­da te se tak­va smje­sa mo­le­ku­la in­ku­bi­ra nom­ska bib­lio­te­ka ukup­ne DNA čov­je­ka, prim­je­ri­ce, mo­že na 65 °C. Ti­me se omo­gu­ću­je da se spe­ci­f ič­ni slje­do­vi se prip­re­mi­ti ta­ko da se u λ vek­tor klo­ni­ra­ju na­su­mični frag­ ba­za u de­na­tu­ri­ra­nim mo­le­ku­la­ma DNA spo­je sa slje­do­ men­ti DNA ve­li­či­ne 15 kb. Poš­to ge­nom čov­je­ka sad­r­ži oko vi­ma ba­za u DNA-son­di (hib­ri­di­za­ci­ja mo­le­ku­la DNA) na 3 mi­liju­na kb, kom­plet­ni ge­nom bi­t će pred­stav­ljen zbir­kom te­me­lju kom­ple­men­tar­nos­ti. De­tek­ci­jom mjes­ta hi­bri­ od oko 500.000 tak­vih klo­no­va. Bi­lo ko­ji gen za ko­ji pos­to­ji di­za­ci­je obi­lje­že­ne son­de s mo­le­ku­lom DNA de­tek­ti­ra­li spe­ci­fič­na son­da mo­že se on­da izo­li­ra­ti iz re­kom­bi­nan­tne smo spe­ci­f ič­ni sli­jed DNA u cje­lo­kup­noj sta­nič­noj DNA. Hib­ri­di­za­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na. Komplementarni slje­do­vi nuk­leo­ti­da se raz­dva­ja­ju na vi­so­kim tem­pe­ra­tu­ ra­ma, a ka­da se tem­pe­ra­tu­ra sni­zi po­no­vo se for­mi­ra­ju dvo­lan­ča­ni frag­men­ti DNA pre­ma prin­ci­pu kom­ple­men­tar­nos­ti spa­ri­va­nja ba­za.

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   131

Sli­ka 4-25. Hib­ri­di­za­ci­ja po Sout­he­r­nu.  Frag­men­ti DNA nas­ta­li raz­grad­njom res­trik­ cij­skim en­do­nuk­lea­za­ma raz­dvo­je se gele­lek­tro­fo­re­zom, a spe­ci­f ič­ni se frag­men­ti DNA iden­ti­f i­ci­ra­ju hib­ri­di­za­ci­jom s od­go­va­ ra­ju­ćom son­dom.

bib­lio­te­ke. Bak­te­ri­je E. co­li tran­sfor­mi­ra­ju se re­kom­bi­nan­tnim fa­gi­ma, od ko­jih će se sva­ki unu­tar svo­je bak­te­rij­ske sta­ni­ce um­na­ža­ti da bi u ko­nač­ ni­ci proiz­veo čis­ti­nu ili plak (od en­gl. plaque) na bak­te­rij­skoj li­va­di. Pla­ko­ vi se za­tim pre­ne­su na fil­tre, pro­ce­som slič­nim pri­je­no­su DNA s ge­la na fil­tar ti­je­kom hib­ri­di­za­ci­je po Sout­her­nu, ko­ji se za­tim hib­ri­di­zi­ra­ju s oz­na­ če­nom son­dom ka­ko bi se iden­ti­fi­ci­ra­li pla­ko­vi fa­ga ko­ji sad­rž­ e željeni gen. Raz­li­či­te pro­be ko­ris­te se za ovak­ve ek­spe­ri­men­te. Prim­je­ri­ce, cDNA klon mo­že se upot­ri­je­bi­ti kao son­da ka­ko bi se izo­li­rao od­go­va­ra­ju­ći ge­nom­ski klon ili se pak gen klo­ni­ran iz jed­ne vr­ste (npr. mi­ša) mo­že upo­tri­je­bi­ti da bi se izo­li­rao srod­ni gen u dru­goj vr­sti (npr. čov­jek). Od­go­va­ra­ju­ći plak je za­tim mo­gu­će izo­li­ra­ti iz ori­gi­nal­ne aga­roz­ne plo­če, na ko­joj se na­la­ze li­ va­de bak­te­ri­ja, da bi se pro­pa­gi­ra­li re­kom­bi­nan­tni fa­gi ko­ji no­se že­lje­ni sta­nič­ni in­se­rt DNA. Slič­na pro­ce­du­ra mo­že se pri­mi­je­ni­ti u svr­hu pret­ra­ ži­va­nja bak­te­rij­skih ko­lo­ni­ja ko­je no­se plaz­mid­ne DNA klo­no­ve. Spe­ci­fič­ni se klon iden­ti­fi­ci­ra i izo­li­ra uz po­moć hib­ri­di­za­ci­je bi­lo iz plaz­mid­ne bib­ lio­te­ke bi­lo iz bib­lio­te­ke fa­ga. Um­jes­to ana­li­ze jed­nog po jed­nog ge­na, kao u slu­ča­ju me­to­de Sout­he­rn i Nor­the­rn blo­ta, hib­ri­di­za­ci­ja s DNA-mik­ro­či­po­vi­ma omo­gu­ću­je is­tov­re­ me­nu ana­li­zu de­se­ti­na ti­su­ća ge­na. Ka­ko u ba­zi po­da­ta­ka pos­to­ji sve vi­še eu­ka­riot­skih ge­no­ma ko­ji su pot­pu­no sek­ven­ci­ra­ni, hib­ri­di­za­ci­ja s DNA-

4.11. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Hib­ri­di­za­ci­ja po Sout­her­nu. Fragmenti DNA se od­vo­je pre­ma ve­li­či­ni elek­tro­fo­re­zom na ge­lu te se in­ku­bi­ra­ju s ra­dioak­tiv­nom son­dom ka­ko bi se iden­ti­fi­ci­ra­li spe­ci­fič­ni frag­men­ti DNA.

132    POGLAVLJE 4 Sli­ka 4-26. Pret­ra­ži­va­nje re­kom­bi­nan­ t­ne knjiž­ni­ce hib­ri­di­za­ci­jom.  Frag­ men­ti sta­nič­ne DNA klo­ni­ra­ni su u bak­ te­rio­fag­ni vek­tor λ i ug­rađeni u čes­ti­ce fa­ga. Ta­ko nas­ta­lom zbir­kom re­kom­bi­ nan­tnih fa­ga, ko­ji sad­r­ža­va­ju raz­li­či­te umet­ke sta­nič­ne DNA, in­f i­ci­ra­ju se bak­ te­ri­je i kul­tu­ra se prek­ri­va mem­bra­nom. Ne­ki od fa­ga iz sva­ko­ga pla­ka pre­no­si se na mem­bra­nu ko­ja se za­tim hib­ri­di­zi­ra s obi­lje­že­nom son­dom ka­ko bi se iden­ti­f i­ ci­rao plak u ko­jem se na­la­ze oni fa­gi ko­ji no­se že­lje­ni gen. Te je fa­ge ta­da mo­gu­će izo­li­ra­ti iz ori­gi­nal­ne plo­či­ce s bak­te­rij­ skom kul­tu­rom.

4.12. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Hib­ri­di­za­ci­ja ko­lo­ni­ja. Bakterije mo­gu sad­r­ža­va­ti re­kom­bi­nan­tne DNA-bib­lio­te­ke. Spe­ci­fič­ne re­kom­ bi­nan­tne DNA mo­le­ku­le unu­tar bib­ lio­te­ka mo­gu se iden­ti­fi­ci­ra­ti hib­ri­di­za­ci­jom ko­lo­ni­ja. Ova pro­ce­du­ra pod­ra­zu­mi­je­va in­ku­ba­ci­ju DNA sa spe­ ci­fič­nom ra­dioak­tiv­ nom DNA-son­dom.

mik­ro­či­po­vi­ma pru­ža znan­stve­ni­ci­ma pri­li­ku za glo­bal­nu ana­li­zu slje­do­va pri­sut­nih u uzor­ci­ma sta­nič­ne RNA ili DNA. DNA-mik­ro­čip sas­to­ji se od pred­met­nog sta­kal­ca ili mem­bra­ne na ko­ju su, uz po­moć ro­bo­ti­zi­ra­nih sus­ta­va, frag­men­ti cDNA utis­nu­ti u ve­li­kom bro­ju ma­lih to­ča­ka vi­so­ke gus­to­će (sl. 4-27). U sva­koj se toč­ki na mik­ro­či­pu na­la­zi je­dan oli­go­nu­ kleo­tid ili cDNA. Na kla­sič­no pred­met­no mik­ros­kop­sko sta­kal­ce mo­gu­će je utis­nu­ti vi­še od 100.000 je­din­stve­nih sek­ven­ci DNA, što omo­gu­ću­je pri­ p­ra­vu DNA-mik­ro­či­po­va ko­ji pok­ri­va­ju cje­lo­kup­ne ge­no­me. Kao što je pri­ka­za­no na sli­ci 4-27, DNA-mik­ro­či­po­ve mo­gu­će je pri­mi­je­ni­ti za ana­li­ zu ek­spre­si­je ge­na, prim­je­ri­ce za us­po­re­đi­va­nje ge­na ko­je ek­spri­mi­ra­ju dva raz­li­či­ta ti­pa sta­ni­ca. U ek­spe­ri­men­ti­ma ovog ti­pa sin­te­ti­zi­ra­ju se cDNA pro­be od ukup­ne mR­NA ko­ja je ek­spri­mi­ra­na u dva ti­pa sta­ni­ca (prim­je­ ri­ce tu­mor­skim i nor­mal­nim sta­ni­ca­ma). Te dvi­je sku­pi­ne cDNA obi­lje­že se raz­li­či­tim fluo­res­cen­tnim bo­ja­ma (obič­no cr­ve­nom i ze­le­nom), po­mi­je­ ša­ju i hib­ri­di­zi­ra­ju s mik­ro­či­po­vi­ma na ko­ji­ma se na­la­zi 10.000 ili vi­še hu­ ma­nih ge­na pred­stav­lje­nih kao po­je­di­nač­ne toč­ki­ce. DNA-mik­ro­čip se ta­ da ana­li­zi­ra la­ser­skim či­ta­čem vi­so­ke re­zo­lu­ci­je, a re­la­tiv­ni om­je­ri

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE  Sli­ka 4-27. DNA-mik­ro­či­po­vi.  (A) Prim­jer us­po­red­ne ana­li­ze ek­spre­si­je ge­na u tu­ mor­skim i nor­mal­nim sta­ni­ca­ma. mR­NA izo­li­ra­na iz nor­mal­nih i tu­mor­skih sta­ni­ca ko­ ris­ti se kao ka­lup za sin­te­zu cDNA-son­di ko­je se za­tim obi­lje­ža­va­ju raz­li­či­tim fluo­res­ cen­tnim bo­ja­ma (prim­je­ri­ce cr­ve­ni fluo­res­cen­tni bi­ljeg za tu­mor­ske sta­ni­ce i ze­le­ni za nor­mal­ne sta­ni­ce). Po­mi­je­ša­ne dvi­je raz­li­či­te cDNA hib­ri­di­zi­ra­ju s DNA-mik­ro­či­pom. Na mi­kro­či­pu se na­la­ze toč­ki­ce s oli­go­nuk­leo­ti­di­ma ko­je pred­stav­lja­ju 10.000 ili vi­še hu­ ma­nih ge­na. Re­la­tiv­na ek­spre­si­ja sva­ko­ga ge­na u tu­mor­skoj sta­ni­ci u od­no­su na nje­go­ vu ek­spre­si­ju u nor­mal­noj sta­ni­ci os­li­ka­na je om­je­rom cr­ve­ne i ze­le­ne fluo­res­cen­ci­je na od­go­va­ra­ju­ćim po­lo­ža­ji­ma na DNA-mik­ro­či­pu. (B) Fo­tog­ra­fi­ja di­je­la DNA-mik­ro­či­pa.

trans­krip­ci­je od­re­đe­nog ge­na u tu­mor­skim od­nos­no nor­mal­nim sta­ni­ca­ ma od­go­va­ra­ju om­je­ru cr­ve­ne i ze­le­ne fluo­res­cen­ci­je u od­go­va­ra­ju­ćim toč­ ki­ca­ma na DNA-mik­ro­či­pu. Hib­ri­di­za­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na mo­že se pri­mi­je­ni­ti za de­tek­ci­ju ho­ mo­log­nih slje­do­va DNA ili RNA ne sa­mo u ek­strak­ti­ma sta­ni­ca već i na kro­mo­so­mi­ma ili in­tak­tnim sta­ni­ca­ma. Me­to­du na­zi­va­mo hib­ri­di­za­ci­ja in si­tu (sl. 4-28). Fluo­res­cen­tno obi­lje­že­nu son­du hib­ri­di­zi­ra­nu na spe­ci­fič­ne sta­nič­ne ili sup­sta­nič­ne struk­tu­re de­tek­ti­ra­mo uz po­moć mik­ros­ko­pa. Pri­ mje­ri­ce, obi­lje­že­ne je son­de mo­gu­će hib­ri­di­zi­ra­ti s in­tak­tnim kro­mo­so­mi­ ma ka­ko bis­mo od­re­di­li gdje se na kro­mo­so­mi­ma na­la­ze ge­ni ko­ji nas in­ te­re­si­ra­ju. Ta­ko­đer, hib­ri­di­za­ci­jom in si­tu na in­tak­tnom tki­vu mo­že­mo de­tek­ti­ra­ti spe­ci­fič­ne mR­NA u raz­li­či­tim ti­po­vi­ma sta­ni­ca.

Pro­tu­ti­je­la kao son­de za pro­tei­ne Is­tra­ži­va­nja ek­spre­si­je i fun­kci­je ge­na zah­ti­je­va de­tek­ci­ju, ne sa­mo DNA i RNA, već i spe­ci­fič­nih pro­tei­na. U ovim ana­li­za­ma pro­tu­ti­je­la preu­zi­ma­ ju ulo­gu son­di ko­je, u ovom slu­ča­ju, se­lek­tiv­no rea­gi­ra­ju s je­din­stve­nim pro­tein­skim mo­le­ku­la­ma. Pro­tu­ti­je­la su pro­tei­ni, proiz­ve­de­ni od stra­ne sta­ni­ca imu­nosus­ta­va (B-lim­fo­ci­ta), ko­ji rea­gi­ra­ju s mo­le­ku­la­ma ko­je or­ga­ ni­zam do­ma­ći­na pre­poz­na­je kao stra­ne mo­le­ku­le (an­ti­ge­ni, prim­je­ri­ce pro­tein­ski omo­tač vi­ru­sa). Imu­no­sus­tav kra­ljež­nja­ka spo­so­ban je stvo­ri­ti mi­li­ju­ne raz­li­či­tih pro­tu­ti­je­la od ko­jih sva­ko pre­poz­na­je je­din­stve­ni an­ti­ gen (pro­tein, ug­lji­ko­hid­rat ili ne­ku dru­gu mo­le­ku­lu ko­ja ni­je pri­rod­nog pod­ri­jet­la). Je­dan lim­fo­cit proiz­vo­di sa­mo je­dan tip pro­tu­ti­je­la, no zbog prog­ra­mi­ra­nog preu­re­đi­va­nja ge­na ti­je­kom raz­vo­ja imu­no­sus­ta­va, raz­li­či­ti lim­fo­ci­ti sad­r­že raz­li­či­te ge­ne ko­ji ko­di­ra­ju proiz­vod­nju raz­li­či­tih pro­tu­ti­ je­la (v. pog­l. 6). Ove va­ri­ja­ci­je re­zul­ti­ra­ju ve­li­kim bro­jem raz­li­či­tih pro­tu­ti­ je­la ko­ja proiz­vo­de raz­li­či­ti lim­fo­ci­ti prog­ra­mi­ra­ni da od­go­vo­re na raz­li­či­te an­ti­ge­ne. Proiz­vod­nju pro­tu­ti­je­la mo­gu­će je po­tak­nu­ti imu­ni­za­ci­jom ži­vo­ti­nje ne­kim stra­nim pro­tei­nom. Prim­je­ri­ce, pro­tu­ti­je­la ko­ja pre­poz­na­ju pro­ tei­ne čov­je­ka čes­to se proiz­vo­de u ku­ni­ću. U se­ru­mi­ma tak­vih ži­vo­ti­nja na­la­ze se smje­se pro­tu­ti­je­la (proiz­ve­de­nih u raz­li­či­tim lim­fo­ci­ti­ma) ko­ja rea­gi­ra­ju s raz­li­či­tim di­je­lo­vi­ma mo­le­ku­le an­ti­ge­na ko­jim je ži­vo­ti­nja imu­ni­zi­ra­na. Po­je­di­nač­na pro­tu­ti­je­la (mo­nok­lon­ska pro­tu­ti­je­la) mo­gu­ će je proiz­ves­ti uz­ga­ja­ju­ći u kul­tu­ri klo­nal­ne li­ni­je B-lim­fo­ci­ta izo­li­ra­nih iz imu­ni­zi­ra­nih ži­vo­ti­nja (naj­češ­će mi­ša). Ka­ko je sva­ki lim­fo­cit prog­ra­ mi­ran da proiz­vo­di sa­mo jed­no pro­tu­ti­je­lo, klo­nal­ne li­ni­je lim­fo­ci­ta proiz­vo­de mo­nok­lon­ska pro­tu­ti­je­la ko­ja sva pre­poz­na­ju is­tu an­ti­ge­nsku de­ter­mi­nan­tu, te sto­ga pred­stav­lja­ju vr­lo spe­ci­fič­ni imu­no­loš­ki rea­ge­ns. Sli­ka 4-28. Fluo­res­cen­tna hib­ri­di­za­ci­ja in si­tu.  Hib­ri­di­za­ci­ja in si­tu fluo­res­cen­ tno obi­lje­že­nih son­di na kro­mo­so­me čov­je­ka. Sva­ki od 24 kro­mo­so­ma obi­lje­žen je raz­li­či­tom bo­jom jer za sva­ki hu­ma­ni kro­mo­som pos­to­ji spe­ci­fič­na son­da. (Lju­baz­ noš­ću Tho­ma­sa Rei­da i He­se­da Pa­dil­la-Nas­ha, Na­tio­nal Can­cer In­sti­tu­te, SAD.)

   133

134    POGLAVLJE 4 Sli­ka 4-29. Wes­te­rn blot.  Proteini se raz­dva­ja­ju pre­ma ve­li­či­ni SDS-po­liak­ri­la­mid­ nom ge­l-e­lek­tro­fo­re­zom (SDS-PAGE) i pre­no­se s ge­la na mem­bra­nu. Mem­bra­na se in­ku­bi­ra s pro­tu­ti­je­li­ma ko­ja pre­poz­na­ju pro­tein od in­te­re­sa, a ve­za­na pro­tu­ti­je­la mo­ gu­će je de­tek­ti­ra­ti reak­ci­jom na raz­li­či­te rea­gen­se, prim­je­ri­ce ke­molu­mi­nis­cen­tnom son­dom ko­ja se ve­že na pro­tu­ti­je­lo.

Ia­ko se naj­češ­će proiz­vo­de pro­tu­ti­je­la ko­ja pre­poz­na­ju pro­tei­ne pro­čiš­ će­ne iz sta­ni­ca, mo­gu­ći su i ne­ki dru­gi ob­li­ci imu­ni­za­ci­je. Prim­je­ri­ce, ži­vo­ ti­nje je mo­gu­će imu­ni­zi­ra­ti in­tak­tnim sta­ni­ca­ma ka­ko bi proiz­ve­le pro­tu­ti­ je­la na ne­poz­na­te pro­tei­ne ko­ji su ek­spri­mi­ra­ni u od­re­đe­nim vr­sta­ma sta­ni­ca (prim­je­ri­ce tu­mor­skim). Tak­va je pro­tu­ti­je­la on­da mo­gu­će is­ko­ris­ ti­ti za iden­ti­fi­ka­ci­ju pro­tei­na ko­ji su spe­ci­fič­ni za vr­stu sta­ni­ca ko­ja je ko­ riš­te­na za imu­ni­za­ci­ju. Pro­tu­ti­je­la se čes­to proiz­vo­de i na re­kom­bi­nan­tne pro­tei­ne ek­spri­mi­ra­ne u bak­te­ri­ja­ma. Na ovaj na­čin mo­le­ku­lar­no klo­ni­ra­ nje omo­gu­ću­je proiz­vod­nju pro­tu­ti­je­la na pro­tei­ne ko­je je go­to­vo ne­mo­gu­ će u dos­tat­nim ko­li­či­na­ma pro­čis­ti­ti iz eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Osim na cje­ lo­vi­te pro­tei­ne, pro­tu­ti­je­la je mo­gu­će raz­vi­ti i na sin­te­tič­ke pep­ti­de od sve­ga 10 do 15 ami­no­ki­se­li­na. Ako je poz­nat sli­jed nuk­leo­ti­da u ne­kom ge­nu, mo­gu­će je raz­vi­ti pro­tu­ti­je­la na sin­te­tič­ke pep­ti­de či­ji je sli­jed ami­ no­ki­se­li­na iz­ve­den iz di­je­la sli­je­da to­ga ge­na. Bu­du­ći da tak­va pro­tu­ti­je­la proiz­ve­de­na na sin­te­tič­ke pep­ti­de čes­to pre­poz­na­ju i cje­lo­vi­ti pro­tein, za us­pješ­nu nam je proiz­vod­nju pro­tu­ti­je­la na ne­ki pro­tein do­volj­no poz­na­ va­ti sli­jed nuk­leo­ti­da klo­ni­ra­no­ga ge­na. Pro­tu­ti­je­la mo­že­mo na raz­ne na­či­ne pri­mi­je­ni­ti za de­tek­ci­ju pro­tei­na u sta­nič­nim ek­strak­ti­ma. Dvi­je uo­bi­ča­je­ne me­to­de su imu­nob­lot (poz­nat i kao Wes­te­rn blot) i imu­nop­re­ci­pi­ta­ci­ja. Wes­te­rn blot (sl. 4-29) je još jed­ na va­ri­ja­ci­ja Sout­he­rn blot me­to­de. Pro­tei­ni u ek­strak­ti­ma sta­ni­ca pr­vo se raz­dvo­je pre­ma ve­li­či­ni ge­l-e­lek­tro­fo­re­zom, no ka­ko su pro­tei­ni raz­li­či­ti ob­li­kom i na­bo­jem, ovaj je pro­ces neš­to dru­ga­či­ji od elek­tro­fo­re­ze nuk­lein­ skih ki­se­li­na. Pro­tei­ne raz­dva­ja­mo me­to­dom ko­ju na­zi­va­mo SDS-po­liak­ ri­la­mid­na ge­l-e­lek­tro­fo­re­za (SDS-PAGE) u ko­joj su pro­tei­ni otop­lje­ni u oto­pi­ni ko­ja sad­r­ža­va ne­ga­tiv­no na­bi­je­ni de­ter­ge­nt nat­ri­j-do­de­cil­sul­fat (SDS). Na sva­ki se pro­tein ve­že ve­lik broj mo­le­ku­la de­ter­gen­ta ko­je ga de­ na­tu­ri­ra­ju i da­ju mu ukup­ni ne­ga­tiv­ni na­boj. Pod tim uv­je­ti­ma svi pro­tei­ni pu­tu­ju pre­ma po­zi­tiv­noj elek­tro­di, a br­zi­na pu­to­va­nja (kao i kod nuk­lein­ skih ki­se­li­na) od­re­đe­na je sa­mo nji­ho­vom ve­li­či­nom. Na­kon elek­tro­fo­re­ze pro­tei­ni se pre­no­se na mem­bra­nu i za­tim in­ku­bi­ra­ju s pro­tu­ti­je­li­ma ko­ja pre­poz­na­ju že­lje­ni pro­tein. Pro­tu­ti­je­la ve­za­na na mem­bra­nu mo­gu­će je de­ tek­ti­ra­ti raz­li­či­tim me­to­da­ma (prim­je­ri­ce ke­mo­lu­mi­nis­cen­cij­ski), či­me se ot­kri­va i pro­tein na ko­ji su se ta pro­tu­ti­je­la ve­za­la. Imu­nop­re­ci­pi­ta­ci­ju ko­ris­ti­mo ka­ko bis­mo izo­li­ra­li pro­tei­ne ko­je pre­ poz­na­ju spe­ci­fič­na pro­tu­ti­je­la (sl. 4-30). Sta­ni­ce se naj­češ­će uz­ga­ja­ju u pri­ sut­nos­ti ra­dioak­tiv­no obi­lje­že­ne ami­no­ki­se­li­ne ka­ko bis­mo do­bi­li ra­dioak­ tiv­no obi­lje­že­ne pro­tei­ne. Tak­vi ra­dioak­tiv­ni ek­strak­ti sta­ni­ca in­ku­bi­ra­ju se s pro­tu­ti­je­li­ma ko­ja se ve­žu na cilj­ne pro­tei­ne (an­ti­ge­ne) pro­tiv ko­jih su raz­vi­je­na. Nas­ta­li kom­plek­si an­ti­ge­n-pro­tu­ti­je­lo izo­li­ra­ju se i ana­li­zi­ra­ju elek­tro­fo­re­zom što omo­gu­ću­je de­tek­ci­ju ra­dioak­tiv­no obi­lje­že­nog an­ti­ge­na au­to­ra­diog­ra­fi­jom. Imu­nop­re­ci­pi­ta­ci­jom se ta­ko­đer mo­gu de­tek­ti­ra­ti in­te­rak­ci­je iz­me­đu raz­li­či­tih pro­tei­na unu­tar sta­ni­ce na taj na­čin što dva pro­tei­na u in­te­rak­ci­ ji koi­mu­nop­re­ci­pi­ti­ra­ju. Kao što je već dis­ku­ti­ra­no u 2. pog­lav­lju, je­dan od na­či­na na ko­ji se mo­gu iden­ti­fi­ci­ra­ti pro­tein­ski kom­plek­si je imu­nop­re­ci­ pi­ta­ci­ja sta­nič­nog pro­tei­na u sla­bim uvje­ti­ma ta­ko da os­ta­ne po­ve­zan s pro­tei­nom s ko­jim je nor­mal­no u in­te­rak­ci­ji unu­tar sta­ni­ce. Imu­nop­re­ci­pi­ ti­ra­ni pro­tein­ski kom­ple­ks se ta­da ana­li­zi­ra, prim­je­ri­ce gel elek­tro­fo­re­zom

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

Sli­ka 4-30. Imu­nop­re­ci­pi­ta­ci­ja.  Radio­ aktivno obi­lje­že­ni pro­tei­ni in­ku­bi­ra­ju se sa spe­ci­fič­nim pro­tu­ti­je­li­ma ko­ja su uz­ga­ja­na za pro­tein od in­te­re­sa (an­ti­gen). Ta­kav kom­ ple­ks ra­dioak­tiv­nog pro­tei­na i pro­tu­ti­je­la ve­že se spe­ci­fič­no s an­ti­ge­nom. Kom­plek­si obi­lje­že­no pro­tu­ti­je­lo-an­ti­gen pri­kup­lja­ju se na zr­nci­ma ko­ja ve­žu pro­tu­ti­je­la. Zr­nca se za­tim za­ku­ha­ju ka­ko bi se kom­ple­ks pro­tu­ ti­je­lo-an­ti­gen raz­dvo­jio, a os­lo­bo­đe­ni pro­ tei­ni ana­li­zi­ra­ju se SDS-po­liak­ri­la­mid­nom ge­l-e­lek­tro­fo­re­zom. Ra­dioak­tiv­no obi­lje­že­ ne pro­tei­ne ko­ji su imu­nop­re­ci­pi­ti­ra­li de­tek­ ti­ra­mo au­to­ra­diog­ra­fi­jom.

   135

4.13. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU

ili ma­se­nom spek­tro­met­ri­jom, da bi se iden­ti­fi­ci­rao ne sa­mo pro­tein ko­jeg pre­poz­na­je spe­ci­fič­no protu­ti­je­lo već i os­ta­li pro­tei­ni s ko­ji­ma je u in­te­rak­ ci­ji taj pro­tein u sta­nič­nom ek­strak­tu. Kao što je već pri­ka­za­no u 1. pog­lav­lju, pro­tu­ti­je­li­ma mo­že­mo vi­zua­li­ zi­ra­ti pro­tei­ne unu­tar sta­ni­ca ali i u li­za­ti­ma sta­ni­ca. Prim­je­ri­ce, pro­tu­ti­je­la mo­že­mo obi­lje­ži­ti fluo­res­cen­tnim bo­ja­ma te od­re­di­ti po­lo­žaj pro­tei­na, za ko­ja su se ve­za­la obi­lje­že­na protu­ti­je­la, unu­tar sta­ni­ce uz po­moć fluo­res­ centnog mik­ros­ko­pa ko­ji će de­tek­ti­ra­ti fluo­res­cen­tnu bo­ju ve­za­nu za pro­ tu­ti­je­lo (v. sl. 1-28). Pro­tu­ti­je­la je mo­gu­će obi­lje­ži­ti i bi­lje­zi­ma ko­ji su vid­ lji­vi pri­li­kom ana­li­ze elek­tron­skim mik­ros­ko­pom, prim­je­ri­ce teš­kim me­ta­li­ma, što omo­gu­ću­je is­pi­ti­va­nja i na ul­tras­truk­tur­noj ra­zi­ni.

Mo­nok­lo­nska protu­ti­je­la. Monoklonska protuti­je­la mo­gu se prip­ra­vi­ti ino­ku­la­ci­jom ne­ke ži­vo­ ti­nje (prim­je­ri­ce, mi­ša) od­re­đe­nim an­ti­ge­nom. Ži­vo­ti­nja će na­kon ne­kog vre­me­na raz­vi­ti imu­nosni od­go­vor na­kon če­ga se sa­ku­pe B-sta­ni­ce iz kr­vi ži­vo­ti­nje. B-sta­ni­ce se za­tim fu­zio­ni­ra­ju s du­go­ži­vu­ćim sta­ni­ca­ma mi­je­lo­ma, pri če­mu nas­ta­ju hib­rid­ ne mo­le­ku­le ko­je se mo­gu upot­ri­je­bi­ti za proiz­vod­nju ko­ris­ nih pro­tu­ti­je­la.

Sli­ka 4-31. Imu­nof­luo­res­cen­ci­ja.  Humane sta­ni­ce u kul­tu­ri obo­ja­ne su imu­nof­luo­res­ cen­tnim pro­tu­ti­je­li­ma ko­ja pre­poz­na­ju ak­tin (pla­vo) i tu­bu­lin (žu­to). Jez­gre su obo­ja­ne cr­ ve­nom fluo­res­cen­tnom bo­jom. (Dr. Tor­sten Wit­tma­nn / Pho­to Re­sear­che­rs, Inc.)

136    POGLAVLJE 4

Fun­kci­ja ge­na u eu­ka­rio­ta Po­ja­va re­kom­bi­nan­tne DNA teh­no­lo­gi­je, o ko­joj je bi­lo ri­je­či u pret­ hod­nom pog­lav­lju, omo­gu­ći­la je moć­ni pris­tup pri izo­la­ci­ji i de­talj­noj ana­ li­zi ge­na eu­ka­riot­ske sta­ni­ce. Za ra­zu­mi­je­va­nje fun­kci­je ge­na ni­je do­volj­na ana­li­za jed­nos­tav­nih mo­le­ku­lar­nih klo­no­va iz bak­te­ri­ja, već je pot­reb­na ana­li­za ge­na unu­tar sta­ni­ca ili in­tak­tnih or­ga­ni­za­ma. Pris­tu­pom kla­sič­ne ge­ne­ti­ke, fun­kci­ja ge­na se op­će­ni­to ot­kri­va­la pro­mat­ra­njem pro­mi­je­nje­nog fe­no­ti­pa mu­ti­ra­nog or­ga­niz­ma. Do­la­zak re­kom­bi­nan­tne DNA pru­žio je no­vu di­men­zi­ju stu­di­ja­ma fun­kci­je ge­na. Pos­ta­lo je mo­gu­će is­tra­ži­va­ti fun­ kci­ju klo­ni­ra­nog ge­na di­rek­tno, po­nov­nim uvo­đe­njem klo­ni­ra­ne DNA u eu­ka­riot­sku sta­ni­cu. U jed­nos­tav­ni­jih eu­ka­rio­ta, prim­je­ri­ce kvas­ca, re­kom­ bi­nan­tna DNA omo­gu­ći­la je izo­la­ci­ju mo­le­ku­lar­nih klo­no­va ko­ji od­go­va­ ra­ju vir­tual­no bi­lo ko­jem mu­ti­ra­nom ge­nu. Pov­rh to­ga, pos­to­ji ne­ko­li­ko me­to­da uz po­moć ko­jih se klo­ni­ra­ni gen mo­že uves­ti u ku­l­tu­ru ani­mal­nih i bilj­nih sta­ni­ca, a ta­ko­đer i u intak­tne or­ga­niz­me, u svr­hu fun­kcio­nal­nih is­tra­ži­va­nja. Na­ve­de­ni pris­tu­pi, ud­ru­že­ni s mo­guć­noš­ću da se mu­ta­ci­je uve­du u klo­ni­ra­nu DNA in vit­ro, pro­ši­ru­ju moć re­kom­bi­nan­tne DNA u is­tra­ži­va­nji­ma fun­kci­je ge­na pu­no slo­že­ni­jih eu­ka­rio­ta.

Ge­ne­tič­ke ana­li­ze u kvas­ci­ma Kvasci su po­se­bi­ce po­god­ni or­ga­niz­mi u is­tra­ži­va­nji­ma mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je eu­ka­rio­ta (v. pog­l. 1). Ge­nom kvas­ca Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­siae sas­to­ji se od prib­liž­no 1,2 × 107 pa­ro­va ba­za i 200 je pu­ta ma­nji od ge­no­ma čov­je­ka. Kvas­ce je la­ga­no uz­ga­ja­ti u kul­tu­ri gdje se ud­vos­tru­ču­ju prib­liž­no sva­ka 2 sa­ta, te nam sto­ga kvas­ci pru­ža­ju ne­ke od te­melj­nih pred­nos­ti ko­je pru­ža­ju i bak­te­ri­je (ma­li ge­nom i br­zo raz­mno­ža­va­nje). Mu­ta­ci­je je u kvas­ci­ma jed­na­ko la­ko ot­kri­ti kao i u E. co­li. Prim­je­ri­ce, la­ko je izo­li­ra­ti mu­tan­te kva­sa­ca ko­je zah­ti­je­va­ju od­re­đe­nu ami­no­ki­se­li­nu ili ne­ki dru­gi hra­nid­be­ni na­dom­jes­tak u pod­lo­zi na ko­joj ras­tu. Osim to­ga, kvas­ce s pog­rješ­ka­ma u ge­ni­ma pot­reb­nim za te­melj­ne sta­nič­ne pro­ce­se (za raz­li­ku od me­ta­bo­lič­kih pog­rje­ša­ka) mo­gu­će je izo­li­ra­ti kao mu­tan­te os­jet­ lji­ve na tem­pe­ra­tu­ru. Tak­ve mu­tan­te kva­sa­ca ko­di­ra­ju pro­tei­ne ko­ji su fun­ kcio­nal­ni na jed­noj tem­pe­ra­tu­ri (per­mi­siv­na tem­pe­ra­tu­ra), ali ne i na ne­koj dru­goj tem­pe­ra­tu­ri (ne­per­mi­siv­na tem­pe­ra­tu­ra), dok nor­mal­ni kvas­ci proiz­ vo­de nor­mal­ne pro­tei­ne ko­ji su fun­kcio­nal­ni i na jed­noj i na dru­goj tem­pe­ ra­tu­ri. Kva­sac s mu­ta­ci­jom os­jet­lji­vom na tem­pe­ra­tu­ru u ne­kom ključ­nom ge­nu mo­gu­će je ot­kri­ti zah­va­lju­ju­ći se­lek­tiv­nom ras­tu na od­re­đe­noj tem­pe­ ra­tu­ri. Spo­sob­no­st izo­la­ci­je mu­ti­ra­nih kva­sa­ca os­jet­lji­vih na tem­pe­ra­tu­ru omo­gu­ći­la je ot­kri­va­nje kvaš­če­vih ge­na ko­ji kon­tro­li­ra­ju broj­ne te­melj­ne sta­nič­ne pro­ce­se, kao što je prim­je­ri­ce sin­te­za i do­ra­dba RNA, nap­re­do­va­nje kroz sta­nič­ni cik­lus ili tran­spo­rt pro­tei­na iz­me­đu sta­nič­nih od­je­lja­ka. Raz­mjer­no jed­nos­tav­na ge­ne­ti­ka kvas­ca omo­gu­ći­la je klo­ni­ra­nje ge­na ko­ji od­go­va­ra bi­lo ko­joj mu­ta­ci­ji na os­no­vi nje­zi­ne fun­kcio­nal­ne ak­tiv­nos­ti (sl. 4-32). U pr­vom se ko­ra­ku prip­rav­lja ge­nom­ska knjiž­ni­ca nor­mal­ne DNA kvas­ca u vek­to­ri­ma ko­ji se um­na­ža­ju kao plaz­mi­di i u kvas­cu i u E. co­li. Zbog raz­mjer­no ma­lo­ga ge­no­ma kvas­ca cje­lo­kup­na se knjiž­ni­ca sas­to­ji od sve­ga ne­ko­li­ko ti­su­ća plaz­mi­da. Mu­tan­te kvas­ca os­jet­lji­ve na tem­pe­ra­tu­ru za­tim se tran­sfor­mi­ra­ju smje­som tak­vih plaz­mi­da i iza­bi­ru se trans­for­mi­ra­ni kvas­ci ko­ji su stek­li spo­sob­no­st ras­ta na ne­per­mi­siv­noj tem­pe­ra­tu­ri. Trans­ for­mi­ra­ni kvas­ci sad­r­ža­va­ju nor­mal­nu ko­pi­ju tra­že­no­ga ge­na na plaz­mid­noj DNA ko­ju je za­tim jed­nos­tav­no izo­li­ra­ti u svr­hu dalj­nje ka­rak­te­ri­za­ci­je. Na ovaj su na­čin izo­li­ra­ni ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju raz­ne ključ­ne pro­tei­ne kva­ sa­ca. U mno­gim su slu­ča­je­vi­ma ta­ko izo­li­ra­ni ge­ni kvas­ca omo­gu­ći­li iden­ ti­fi­ka­ci­ju i klo­ni­ra­nje srod­nih ge­na iz sta­ni­ca si­sa­va­ca. Dak­le, osim što je

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

Sli­ka 4-32. Klo­ni­ra­nje ge­na kvas­ca.  (A) Kvaš­čev vek­tor. Vek­tor sad­r­ža­va bak­te­rij­sko is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je (ori) i gen za re­zis­ten­ci­ju na am­pi­ci­lin (Ampr) pot­reb­ne za nje­go­vu pro­ pa­ga­ci­ju u bak­te­ri­ji E. co­li. Osim to­ga, vek­tor sad­r­ža­va kvaš­če­vo is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je i gen bi­ljeg (LEU2) ko­ji omo­gu­ću­je se­lek­ci­ju tran­ sfor­mi­ra­nih kva­sa­ca. Gen LEU2 ko­di­ra en­zim pot­re­ban za sin­te­zu ami­no­ki­se­li­ne leu­ci­na te je tran­sfor­man­te so­ja kvas­ca, ko­je­mu ne­dos­ ta­je ovaj gen, mo­gu­će izab­ra­ti na os­no­vi stje­ca­nja spo­sob­nos­ti ras­ta na pod­lo­zi u ko­joj ne­dos­ta­je leu­cin. (B) Izo­la­ci­ja ge­na kvas­ca. Tra­že­ni gen pro­na­đen je na te­me­lju mu­ta­ci­je ko­ja kvas­cu do­no­si os­jet­lji­vo­st na tem­pe­ra­tu­ru (kva­sac mo­že ras­ti na 25 °C ali ne i na 37 °C). Ra­di izo­la­ci­je klo­na že­lje­no­ga ge­na, kvas­ci os­jet­lji­vi na tem­pe­ra­tu­ru tran­sfor­mi­ra­ni su knjiž­ni­com plaz­mi­da ko­ja sad­r­ža­va ge­ne cje­lo­kup­nog kvaš­če­va ge­no­ma. Svi kvas­ci tran­sfor­mi­ra­ni plaz­mid­nom DNA ras­tu na me­di­ju ko­jem ne­dos­ta­je leu­cin na tem­pe­ra­tu­ri od 25 °C, no sa­mo oni kvas­ci tran­sfor­mi­ra­ni plaz­mi­dom ko­ji no­si nor­mal­nu ko­pi­ju tra­že­ no­ga ge­na ima­ju spo­sob­no­st ras­ta na tem­pe­ra­tu­ri od 37 °C. Že­lje­ni plaz­mid mo­gu­će je izo­li­ra­ti iz kva­sa­ca ko­ji tvo­re ko­lo­ni­je na ne­per­mi­siv­noj tem­pe­ra­tu­ri.

pru­ži­la va­žan mo­del­ni sus­tav za is­pi­ti­va­nje eu­ka­riot­skih sta­ni­ca, jed­nos­tav­ na ge­ne­ti­ka kvas­ca omo­gu­ći­la je i klo­ni­ra­nje srod­nih ge­na slo­že­ni­jih eu­ka­ rio­ta.

Pri­je­nos ge­na u bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja Za raz­li­ku od sta­ni­ca kvas­ca, sta­ni­ca­ma vi­ših eu­ka­rio­ta ni­je mo­gu­će ge­ ne­tič­ki ma­ni­pu­li­ra­ti na jed­nos­ta­van na­čin, no i u nji­ma je mo­gu­će is­pi­ti­va­ ti fun­kci­je ge­na uno­še­njem klo­ni­ra­ne DNA u bilj­ne i ži­vo­tinj­ske sta­ni­ce. Tak­vi su se ek­spe­ri­men­ti (op­će­ni­to ih na­zi­va­mo pri­je­no­som ge­na) po­ka­za­ li ključ­nim za is­pi­ti­va­nje broj­nih važ­nih pro­ce­sa, kao što su prim­je­ri­ce me­ ha­niz­mi ko­ji re­gu­li­ra­ju ek­spre­si­ju ge­na ili do­ra­dbu pro­tei­na. Kao što će bi­ti pri­ka­za­no kas­ni­je u ovoj knji­zi, pri­je­nos ge­na omo­gu­ćio je ot­kri­va­nje i ka­ rak­te­ri­za­ci­ju ge­na ko­ji kon­tro­li­ra­ju ra­st i di­fe­ren­ci­ja­ci­ju ži­vo­tinj­skih sta­ni­ca, uk­lju­ču­ju­ći broj­ne ge­ne od­go­vor­ne za ne­nor­mal­ni ra­st tu­mor­skih sta­ni­ca. Me­to­do­lo­gi­ja uno­sa DNA u ži­vo­tinj­ske sta­ni­ce pr­vo je raz­vi­je­na za unos in­fek­tiv­ne vi­rus­ne DNA i sto­ga se čes­to na­zi­va tran­sfek­ci­ja (riječ iz­ ve­de­na iz poj­mo­va tra­nsformacija + infek­ci­ja) (sl. 4-33). DNA je u ži­vo­ tinj­sku sta­ni­cu u kul­tu­ri mo­gu­će uni­je­ti na vi­še na­či­na. Prim­je­ri­ce, iz­rav­ nim mik­roi­njek­ti­ra­njem u jez­gru sta­ni­ce, kop­re­ci­pi­ta­ci­jom DNA s kal­ci­je­vim fos­fa­tom u sit­ne čes­ti­ce ko­je spon­ta­no ula­ze u sta­ni­ce, ug­rad­

   137

138    POGLAVLJE 4

Sli­ka 4-33. Uno­še­nje DNA u ži­vo­tinj­ske sta­ni­ce.  Eukariotski gen klo­ni­ra se u plaz­ mid ko­ji mo­ra ima­ti i od­go­va­ra­ju­ći gen za se­lek­ci­ju. Ta­kav gen no­si re­zis­ten­ci­ju na od­ re­đe­ni in­hi­bi­tor ras­ta što omo­gu­ću­je se­lek­ci­ju ži­vo­tinj­skih sta­ni­ca u kul­tu­ri. Plaz­mid­na DNA uno­si se i ek­spri­mi­ra ne­ko­li­ko da­na u ve­li­kom bro­ju sta­ni­ca (pro­laz­na ek­spre­si­ja). Sta­bil­no tran­sfor­mi­ra­ne sta­ni­ce, kod ko­jih je plaz­mid­na DNA ug­ra­đe­na u kro­mo­som­ sku DNA, mo­gu­će je iz­dvo­ji­ti na os­no­vi spo­sob­nos­ti ras­ta u me­di­ju ko­ji sad­r­ža­va in­ hi­bi­tor ras­ta.

njom DNA u li­pid­ne ve­zi­ku­le (li­po­so­me) ko­ji se spa­ja­ju sa sta­nič­nom mem­bra­nom, ili iz­la­ga­njem sta­ni­ca krat­kim elek­trič­nim pul­se­vi­ma ko­ji priv­re­me­no ot­va­ra­ju po­re u sta­nič­noj mem­bra­ni (elek­tro­po­ra­ci­ja). Stra­na DNA se na taj na­čin mo­že uni­je­ti u ve­lik broj sta­ni­ca i pre­ni­je­ti u jez­gru gdje će se pre­pi­si­va­ti ti­je­kom slje­de­ćih ne­ko­li­ko da­na – fe­no­men ko­ji na­zi­ va­mo pro­laz­na ek­spre­si­ja. U ma­njem bro­ju sta­ni­ca (obič­no 1% ili ma­nje) stra­na DNA se sta­bil­no ug­ra­đu­je u sta­nič­ni ge­nom i pri dio­bi sta­ni­ca pre­ no­si se na sta­ni­ce-kće­ri baš kao i bi­lo ko­ji dru­gi sta­nič­ni gen. Sta­bil­no tran­sfor­mi­ra­ne sta­ni­ce mo­gu­će je odab­ra­ti ako tran­sfek­ti­ra­na DNA sad­r­ ža­va bi­ljeg za se­lek­ci­ju, prim­je­ri­ce gen za re­zis­ten­ci­ju na in­hi­bi­tor ras­ta nor­mal­nih sta­ni­ca. Za­jed­no s ge­nom za re­zis­ten­ci­ju na in­hi­bi­tor, u sta­ni­ce je mo­gu­će uni­je­ti bi­lo ko­ji klo­ni­ra­ni gen te ana­li­zi­ra­ti nje­gov uči­nak na po­na­ša­nje sta­ni­ca, prim­je­ri­ce na ra­st ili di­fe­ren­ci­ja­ci­ju. Kao vek­to­re za unos klo­ni­ra­ne DNA u sta­ni­ce mo­gu­će je ko­ris­ti­ti i ži­ vo­tinj­ske vi­ru­se. Po­se­bi­ce su po­god­ni ret­ro­vi­ru­si jer nji­hov nor­mal­ni ži­vot­ ni cik­lus uk­lju­ču­je sta­bil­nu in­teg­ra­ci­ju vi­rus­no­ga ge­no­ma u ge­nom in­fi­ci­ ra­nih sta­ni­ca (sl. 4-34). Ret­ro­vi­ru­si se mo­gu ko­ris­ti­ti za učin­ko­vit unos klo­ni­ra­nih ge­na u raz­li­či­te ti­po­ve sta­ni­ca, što ih či­ni zna­čaj­nim vek­to­rom sa ši­ro­kim ras­po­nom prim­je­ne.

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE  Sli­ka 4-34. Ret­ro­vi­rus­ni vek­to­ri.  Vektor se sas­to­ji od ret­ro­vi­rus­nih slje­do­va klo­ni­ ra­nih u plaz­mid ko­ji se mo­že um­na­ža­ti u E. co­li. Stra­ne DNA ume­ću se unu­tar vi­rus­nih slje­do­va te se tak­vi re­kom­bi­nan­tni plaz­mi­di izo­li­ra­ju u bak­te­ri­ja­ma. Re­kom­bi­nan­tnom DNA tran­sfek­ti­ra­ju se ži­vo­tinj­ske sta­ni­ce u kul­tu­ri. Sa­mo u ma­li broj tran­sfek­ti­ra­nih sta­ni­ca ući će re­kom­bi­nan­tna DNA i proiz­ves­ti re­kom­bi­nan­tne ret­ro­vi­rus­ne čes­ti­ce. Tak­vim se re­kom­bi­nan­tnim vi­ru­si­ma mo­gu učin­ko­vi­to tran­sfek­ti­ra­ti no­ve sta­ni­ce u ko­ ji­ma će se vi­rus­ni ge­nom, no­si­telj že­lje­nih ge­na, ug­ra­di­ti u kro­mo­som­sku DNA kao pro­vi­rus.

Klo­ni­ra­ne je ge­ne mo­gu­će uni­je­ti i u ma­tič­ne li­ni­je vi­šes­ta­nič­nih or­ga­ ni­za­ma što omo­gu­ću­je nji­ho­vo is­pi­ti­va­nje in vi­vo, a ne sa­mo u kul­tu­ri sta­ ni­ca. Jed­na od me­to­da je iz­rav­no mik­roi­njek­ti­ra­nje klo­ni­ra­ne DNA u pro­ nuk­leus op­lo­đe­ne jaj­ne sta­ni­ce, a ko­ris­ti se za stva­ra­nje mi­še­va ko­ji no­se stra­ne ge­ne (tran­sge­nič­nih mi­še­va) (sl. 4-35). Jaj­na sta­ni­ca u ko­ju se ubriz­ga­va DNA pre­no­si se u su­ro­gat-maj­ku gdje se raz­vi­ja sve do oko­ta. U oko 10% oko­će­nih mi­še­va stra­na će se DNA ug­ra­di­ti u ge­nom op­lo­đe­ne jaj­ne sta­ni­ce i sto­ga će bi­ti pri­sut­na u svim sta­ni­ca­ma u or­ga­niz­mu. Bu­du­ ći da je stra­na DNA pri­sut­na i u spol­nim sta­ni­ca­ma tih ži­vo­ti­nja, dalj­njim raz­mno­ža­va­njem pre­ni­jet će se na po­tom­stvo baš kao i sva­ki dru­gi gen. Ka­rak­te­ris­ti­ke em­brio­nal­nih ma­tič­nih (EM) sta­ni­ca omo­gu­ću­ju al­ter­ na­tiv­ni pris­tup uno­še­nja klo­ni­ra­nih ge­na u mi­ša (sl. 4-36). EM sta­ni­ce mo­gu­će je uves­ti u kul­tu­ru iz ra­nih miš­jih em­bri­ja, a za­tim ih po­no­vo vra­ ti­ti u ra­ni miš­ji em­brio gdje će nor­mal­no sud­je­lo­va­ti u raz­vo­ju i di­fe­ren­ci­ ra­ti se u sta­ni­ce bi­lo ko­jeg tki­va mi­ša, uk­lju­ču­ju­ći i spol­ne sta­ni­ce. Ovaj pris­tup omo­gu­ću­je da u EM sta­ni­ce u kul­tu­ri une­se­mo klo­ni­ra­nu DNA, te iza­be­re­mo one sta­ni­ce ko­je su se sta­bil­no tran­sfor­mi­ra­le i une­se­mo ih u miš­je em­bri­je. Tak­vi em­bri­ji raz­vit će se u ki­mer­ne ži­vo­ti­nje u ko­ji­ma će neke sta­ni­ce pot­je­ca­ti od nor­mal­nih em­brio­nal­nih sta­ni­ca, a ne­ke od tran­ sfek­ti­ra­nih EM sta­ni­ca. U ne­kim od tih mi­še­va tran­sfek­ti­ra­ne EM sta­ni­ce raz­vit će se u spol­ne sta­ni­ce, pa će se nji­ho­vim dalj­njim raz­mno­ža­va­njem tran­sfek­ti­ra­ni gen iz­rav­no pre­no­si­ti na po­tom­stvo. Klo­ni­ra­nu DNA mo­gu­će je uni­je­ti i u bilj­ne sta­ni­ce na raz­li­či­te na­či­ne. Je­dan pris­tup je bom­bar­di­ra­nje sta­ni­ca mik­rop­ro­jek­ti­li­ma oko ko­jih je omo­ta­na DNA, prim­je­ri­ce ma­lim čes­ti­ca­ma tun­gste­na. Bilj­ne sta­ni­ce su di­rek­tno bom­bar­di­ra­ne tak­vim mik­rop­ro­jek­ti­li­ma ta­ko da ne­ke od njih umi­ru, no ne­ke od njih će pre­živ­je­ti i pos­ta­ti sta­bil­no tran­sfor­mi­ra­ne. Plaz­

Sli­ka 4-35. Proiz­vod­nja tran­sge­nič­nih mi­še­va.  Strana se DNA mik­roub­riz­ga­va u pro­nuk­leus op­lo­đe­ne miš­je jaj­ne sta­ni­ce (op­lo­đe­na jaj­na sta­ni­ca sad­r­ža­va dva pro­ nuk­leu­sa; je­dan iz jaj­ne sta­ni­ce i je­dan iz sper­mi­ja). Tak­va se jaj­na sta­ni­ca za­tim pre­no­ si u su­ro­gat-maj­ke gdje se raz­vi­ja. Dio po­tom­stva imat će stra­nu DNA ug­ra­đe­nu u svoj ge­nom (tran­sge­nič­no po­tom­stvo).

   139

140    POGLAVLJE 4 Sli­ka 4-36. Uno­še­nje ge­na u mi­ša pu­tem em­brio­nal­ nih ma­tič­nih sta­ni­ca.  Embrionalne ma­tič­ne (EM) sta­ ni­ce su sta­ni­ce u kul­tu­ri iz­ve­de­ne iz ra­nih miš­jih em­bri­ ja (blas­to­cis­ta). U kul­tu­ri in vit­ro, u EM sta­ni­ce mo­gu­će je uni­je­ti stra­nu DNA i izo­li­ra­ti sta­bil­no tran­sfek­ti­ra­ne sta­ni­ce. Tak­ve tran­sfor­mi­ra­ne EM sta­ni­ce se za­tim ub­ riz­ga­va­ju u blas­to­cis­tu pri­ma­te­lja gdje sud­je­lu­ju u nor­ mal­nom raz­vo­ju em­bri­ja. Ne­ki od mi­še­va ko­ji će se raz­ vi­ti na­kon pri­je­no­sa em­bri­ja, ko­ji­ma su ub­riz­ga­ne EM sta­ni­ce, u su­ro­gat-maj­ke sad­r­ža­vat će osim nor­mal­nih sta­ni­ca i sta­ni­ce ko­je su se raz­vi­le iz tran­sfor­mi­ra­nih EM sta­ni­ca. Ka­ko su ti mi­še­vi mje­ša­vi­na dva­ju raz­li­či­ tih ti­po­va sta­ni­ca, ka­že­mo da su ki­mer­ni. Kri­ža­njem ki­ mer­nih mi­še­va, u ko­ji­ma su tran­sfor­mi­ra­ne EM sta­ni­ce ugra­đe­ne u spol­ne sta­ni­ce, nas­tat će po­tom­stvo ko­je no­si tran­sfek­ti­ra­ne ge­ne.

mid iz bak­te­ri­je Ag­ro­bac­te­rium tu­me­fa­cie­ns (Ti-plaz­mid) pred­stav­lja no­vi vek­tor za učin­ko­vit unos re­kom­bi­nan­tne DNA u mno­ge bilj­ne vr­ste (sl. 4-37). U pri­ro­di se Ag­ro­bac­ te­rium pričvr­šću­je za liš­će bi­lja­ka, a Ti-plaz­mid se pre­no­si u bilj­ne sta­ni­ce gdje se ug­ra­đu­je u kro­mo­som­sku DNA, što vek­to­re iz­ve­de­ne iz Ti-plaz­mi­da či­ni ja­ko učin­ko­vi­tim za uno­še­nje re­kom­bi­nan­tne DNA u os­jet­lji­ve bilj­ne sta­ni­ce. Ka­ ko je mno­ge bilj­ke mo­gu­će re­ge­ne­ri­ra­ti iz po­je­di­nač­nih sta­ ni­ca u kul­tu­ri bilj­nog tki­va (v. pog­l. 1), tran­sge­nič­ne je bilj­ke mo­gu­će iz­rav­no raz­vi­ti iz sta­ni­ca u ko­je je re­kom­bi­nan­tna DNA une­se­na u kul­tu­ri što je da­le­ko jed­nos­tav­ni­je od proiz­ vod­nje tran­sge­nič­nih ži­vo­ti­nja. Zap­ra­vo, mno­ge eko­nom­ski važ­ne bilj­ke, prim­je­ri­ce ku­ku­ruz, raj­či­ca, so­ja i krum­pir, su tran­sge­nič­ne va­ri­jan­te.

Mu­ta­ge­ne­za klo­ni­ra­ne DNA U kla­sič­nim je ge­ne­tič­kim is­pi­ti­va­nji­ma, ko­ja ko­ris­te bak­ te­ri­je ili kvas­ce kao mo­de­le, pro­mat­ra­nje pro­mi­je­nje­nog fe­ no­ti­pa mu­ti­ra­nih or­ga­ni­za­ma ključ za ot­kri­va­nje ge­na i ra­zu­ mi­je­va­nje nji­ho­ve ulo­ge. Nai­me, mu­ti­ra­ni ge­n mo­gu­će je ot­kri­ti jer za pos­lje­di­cu ima vid­lji­vu prom­je­nu fe­no­ti­pa or­ga­ niz­ma, prim­je­ri­ce ra­st os­jet­ljiv na tem­pe­ra­tu­ru ili od­re­đe­ne hra­nid­be­ne pot­re­be. Mo­guć­no­st izo­la­ci­je ge­na teh­no­lo­gi­jom re­kom­bi­nan­tne DNA ot­vo­ri­la je no­vi pris­tup mu­ta­ge­ne­zi. Da­nas je mo­gu­će uni­je­ti bi­lo ko­ju prom­je­nu u klo­ni­ra­ni gen i is­pi­ta­ti učin­ke te mu­ta­ci­je na fun­kci­ju ge­na. Ta­kav je pos­tu­ pak naz­van ob­r­nu­tom ge­ne­ti­kom jer se pr­vo od­re­đe­na mu­ ta­ci­ja uno­si u gen, a za­tim se pro­mat­ra­ju prom­je­ne fe­no­ti­pa. Mo­guć­no­st uno­še­nja spe­ci­fič­nih mu­ta­ci­ja u klo­ni­ra­nu DNA (in vit­ro mu­ta­ge­ne­za) po­ka­za­la se zna­čaj­nim oru­đem za is­ pi­ti­va­nje ek­spre­si­je i fun­kci­je eu­ka­riot­skih ge­na. Klo­ni­ra­ne ge­ne mo­gu­će je pro­mi­je­ni­ti raz­li­či­tim pos­tup­ ci­ma in vit­ro mu­ta­ge­ne­ze, a re­zul­tat su de­le­ci­je, in­ser­ci­je ili zam­je­ne po­je­di­nih nuk­leo­ti­da. Uo­bi­ča­je­na me­to­da mu­ta­ge­ ne­ze je ko­riš­te­nje sin­te­tič­kih oli­go­nuk­leo­ti­da za uvo­đe­nje prom­je­na u mo­le­ku­lu DNA (sl. 4-38). U ovoj se me­to­di sin­ te­tič­ki oli­go­nuk­leo­ti­di ko­ji no­se mu­ti­ra­nu ba­zu ko­ris­te kao

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   141

Sli­ka 4-37. Uno­še­nje ge­na u bilj­ne sta­ni­ce s po­mo­ću Ti-plaz­mi­da.  Ti-plazmid sad­r­ža­va T-re­gi­ju na mo­le­ku­li DNA, ko­ja se pre­no­si u in­f i­ci­ra­ne bilj­ne sta­ni­ce, te ge­ne vi­ru­len­ci­je (vir) ko­ji sud­je­lu­ju u pri­je­no­su T DNA. U Ti-plaz­mid­nim vek­to­ri­ma stra­na se DNA ume­će u T-re­gi­ju. Re­kom­bi­nan­tni se plaz­mid za­tim uno­si u bak­te­ri­ju Ag­ro­bac­ te­rium tu­me­fa­cie­ns ko­jom se in­f i­ci­ra­ju sta­ni­ce u kul­tu­ri. T-re­gi­ja plaz­mi­da (ko­ja no­si umet­nu­tu stra­nu DNA) pre­no­si se u bilj­ne sta­ni­ce i ug­ra­đu­je u kro­mo­som­sku DNA. Na taj na­čin iz tran­sfor­mi­ra­nih sta­ni­ca mo­že­mo uz­go­ji­ti tran­sge­nič­nu bilj­ku.

po­čet­ni­ce za sin­te­zu DNA. No­vo­sin­te­ti­zi­ra­nu DNA ko­ja sad­r­ža­va mu­ta­ci­ju mo­gu­će je za­tim izo­li­ra­ti i da­lje ana­li­zi­ra­ti. Prim­je­ri­ce, mo­gu­će je pro­mi­je­ ni­ti po­je­di­ne ami­no­ki­se­li­ne u pro­tei­nu ka­ko bi se is­pi­ta­la nji­ho­va ulo­ga u fun­kci­ji pro­tei­na. S po­mo­ću opi­sa­ne me­to­de i nje­zi­nih va­ri­ja­ci­ja, te zah­va­lju­ju­ći teh­no­lo­ gi­ji re­kom­bi­nan­tne DNA mo­gu­će je uni­je­ti prak­tič­no bi­lo kak­vu prom­je­nu u klo­ni­ra­ni gen. Učin­ke mu­ta­ci­ja na ek­spre­si­ju i fun­kci­ju ge­na mo­gu­će je za­tim ana­li­zi­ra­ti uno­še­njem pro­mi­je­nje­no­ga ge­na u od­go­va­ra­ju­će sta­ni­ce. In vit­ro mu­ta­ge­ne­za omo­gu­ći­la je de­talj­no is­pi­ti­va­nje fun­kci­je pod­ruč­ja ge­na ko­ja kod­ira­ju sa­mi pro­tein ali i re­gu­la­cijskih pod­ruč­ja klo­ni­ra­nih ge­ na.

Uno­še­nje mu­ta­ci­ja u sta­nič­ne ge­ne Ia­ko je pri­je­nos klo­ni­ra­nih ge­na u sta­ni­ce (po­se­bi­ce u kom­bi­na­ci­ji s in vit­ro mu­ta­ge­ne­zom) moć­no oru­đe za is­pi­ti­va­nje struk­tu­re i fun­kci­je ge­na, tak­vim ek­spe­ri­men­tal­nim pris­tu­pom ni­je mo­gu­će od­re­di­ti ulo­gu ne­poz­na­ to­ga gena u sta­ni­ci ili od­re­đe­nom or­ga­niz­mu. Sta­ni­ca u ko­ju se uno­si klo­ ni­ra­ni gen naj­češ­će još uvi­jek sad­r­ža­va i nor­mal­nu ko­pi­ju to­ga ge­na u svo­ joj kro­mo­som­skoj DNA, ko­ja nas­tav­lja obav­lja­ti svo­ju nor­mal­nu ulo­gu u sta­ni­ci. Zbog to­ga je pot­reb­no pr­vo uk­lo­ni­ti ak­tiv­no­st nor­mal­ne sta­nič­ne ko­pi­je od­re­đe­no­ga ge­na da bis­mo shva­ti­li bio­loš­ku ulo­gu klo­ni­ra­no­ga ge­ na. Ne­ko­li­ko je mo­gu­ćih pris­tu­pa u svr­hu inak­ti­va­ci­je kro­mo­som­ske ko­pi­ je klo­ni­ra­no­ga ge­na ili one­mo­gu­ća­va­nja nje­go­ve nor­mal­ne fun­kci­je ka­ko u ži­vo­tinj­skim sta­ni­ca­ma u kul­tu­ri ta­ko i u tran­sge­nič­nim mi­še­vi­ma. Uno­še­nje mu­ta­ci­ja u ge­ne te­me­lji se na mo­guć­nos­ti klo­ni­ra­no­ga ge­na, ko­ji smo uni­je­li u sta­ni­cu, da se za­mi­je­ni s nor­mal­nom kro­mo­som­skom ko­pi­jom me­ha­niz­mom ho­mo­log­ne re­kom­bi­na­ci­je (sl. 4-39). Na taj se na­ čin klo­ni­ra­ni gen, u ko­ji smo in vit­ro uni­je­li od­re­đe­nu mu­ta­ci­ju, ug­ra­đu­je u kro­mo­som na mjes­to nor­mal­nog ale­la te pos­ta­je dio nor­mal­ne kro­mo­ som­ske ko­pi­je ge­na. Naj­jed­nos­tav­ni­je re­če­no, klo­ni­ra­ni gen inak­ti­vi­ra­mo mu­ta­ci­jom ta­ko da one­mo­gu­ći­mo nje­go­vu nor­mal­nu fun­kci­ju, te ga uno­ si­mo na mjes­to nor­mal­no­ga ge­na u kro­mo­so­mu ka­ko bis­mo ut­vr­di­li nje­ go­vu ulo­gu u sta­nič­nim pro­ce­si­ma. Re­kom­bi­na­ci­ja iz­me­đu stra­ne DNA i ho­mo­log­no­ga kro­mo­som­sko­ga ge­na do­ga­đa se čes­to u kvaš­če­vim sta­ni­ca­ma no vr­lo je ri­je­dak do­ga­đaj u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca, pa je inak­ti­va­ci­ju ge­na u si­sa­va­ca ovim pris­tu­pom teh­ ni­čki vr­lo teš­ko iz­ves­ti. U si­sa­va­ca, ve­ći­na tran­sfek­ti­ra­ne DNA ug­ra­di se u ge­nom sta­ni­ca pri­ma­te­lji­ca na­su­mič­nom re­kom­bi­na­ci­jom s nes­rod­nim slje­do­vi­ma. Ovaj se prob­lem jav­lja vje­ro­jat­no zbog to­ga što su ge­no­mi si­sa­va­ca da­le­ko ve­ći od ge­no­ma ▶▶ Oko po­lo­vi­ce od 250 mi­liju­na ju­ta­ra zem­lje na ci­je­lo­ kvas­ca. Da­nas su raz­vi­je­ne raz­li­či­te me­to­de ko­je me svi­je­tu za­sa­đe­ne s ge­ne­tič­ki mo­di­fi­ci­ra­nim kul­tu­ra­ po­ve­ća­va­ju učes­ta­lo­st ho­mo­log­ne re­kom­bi­na­ci­je u ma na­la­zi se u SA­D. Raj­či­ca »Fla­vr Sav­r«, ko­ja se od­li­ku­je ge­no­mi­ma si­sa­va­ca, te us­pješ­no­st se­lek­ci­je i izo­la­ od­go­đe­nim saz­ri­je­va­njem, pr­va je ge­ne­tič­ki mo­di­fi­ci­ra­ ci­je sta­ni­ca u ko­ji­ma je doš­lo do ho­mo­log­ne re­ na bilj­ka ko­ju je FDA odob­ri­la u preh­ram­be­ne svr­he. kom­bi­na­ci­je, ta­ko da je mo­gu­će inak­ti­vi­ra­ti bi­lo

142    POGLAVLJE 4

Sli­ka 4-38. Mu­ta­ge­ne­za po­mo­ću sin­ te­tič­kih oli­go­nuk­leo­ti­da.  Oligonukle­ otid ko­ji sad­r­ža­va že­lje­nu prom­je­nu ba­ ze ko­ris­ti se za sin­te­zu plaz­mid­ne DNA, a no­vo­sin­te­ti­zi­ra­na mo­le­ku­la cir­ku­la­ri­ zi­ra se s po­mo­ću DNA-li­ga­ze. Ovim po­ stup­­kom nas­ta­je plaz­mid ko­ji u jed­nom lan­cu sad­r­ža­va nor­mal­nu, a u dru­gom mu­ti­ra­nu ba­zu. Rep­li­ka­ci­jom plaz­mid­ne DNA unu­tar tran­sfor­mi­ra­nih bak­te­ri­ja E. co­li nas­ta­je smje­sa nor­mal­no­ga i mu­ti­ra­ no­ga plaz­mi­da.

ko­ji že­lje­ni gen. Od izu­zet­ne je važ­nos­ti da se ge­ni, inak­ti­vi­ra­ni u li­ni­ja­ma em­brio­nal­nih ma­tič­nih sta­ni­ca u kul­tu­ri, mo­gu upot­ri­je­bi­ti za proiz­vod­nju tran­sge­nič­nih mi­še­va (sl. 4-40). Tak­vi se tran­sge­nič­ni mi­še­vi da­lje mo­gu raz­mno­ža­va­ti da da­ju po­tom­stvo ko­je no­si mu­ti­ra­nu ko­pi­ju cilj­nog ge­na na oba ho­mo­log­na kro­mo­so­ma, pa se u tom slu­ča­ju uči­nak inak­ti­va­ci­je ge­na is­pi­tu­je u kon­tek­stu or­ga­niz­ma, a ne sa­mo po­je­di­nač­nih sta­ni­ca. Na taj je na­čin is­pi­ta­na bio­loš­ka ak­tiv­no­st oko 4.000 miš­jih ge­na što je po­se­bi­ce bi­ lo zna­čaj­no za ra­zu­mi­je­va­nje ulo­ge spe­ci­fič­nih ge­na ti­je­kom raz­vo­ja mi­ša. Ho­mo­log­na re­kom­bi­na­ci­ja upot­rijeb­lje­na je za sis­te­mat­sku inak­ti­va­ci­ju (en­gl. knoc­kout) sva­kog po­je­di­nač­nog ge­na u ge­no­mu kvas­ca, ta­ko da je

Sli­ka 4-39. Inak­ti­va­ci­ja ge­na ho­mo­log­nom re­kom­bi­na­ci­ jom.  Mutirana ko­pi­ja klo­ni­ra­no­ga ge­na uno­si se u ži­vo­tinj­sku sta­ni­cu u kul­tu­ri in vit­ro. Nor­mal­na ko­pi­ja ge­na ta­da se mo­že za­mi­je­ni­ti mu­ti­ra­nom ko­pi­jom me­ha­niz­mom ho­mo­log­ne re­ kom­bi­na­ci­je či­me nas­ta­je sta­ni­ca ko­ja no­si že­lje­nu mu­ta­ci­ju u kro­mo­som­skoj DNA.

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   143

Sli­ka 4-40. Proiz­vod­nja mu­ti­ra­nih mi­še­va ho­mo­log­nom re­ kom­bi­na­ci­jom u em­brion­alnim ma­tič­nim sta­ni­ca­ma.  Homo­ logna re­kom­bi­na­ci­ja ko­ris­ti se da bi se za­mi­je­nio nor­mal­ni gen s mu­ti­ra­nom inak­tiv­nom ko­pi­jom u em­brionalnim ma­tič­nim (EM) sta­ni­ca­ma. Na taj se na­čin mo­že do­bi­ti EM sta­ni­ca ko­ja no­si jed­nu nor­mal­nu i jed­nu mu­ti­ra­nu inak­tiv­nu ko­pi­ju ge­na na ho­mo­log­ nim kro­mo­so­mi­ma. Ovak­ve EM sta­ni­ce se mo­gu uba­ci­ti u blas­to­ cis­tu ko­ja se upot­ri­je­bi da se do­bi­je miš na na­čin ilus­tri­ran sli­kom 4-36. Miš, ko­ji no­si jed­nu nor­mal­nu i jed­nu mu­ti­ra­nu ko­pi­ju ge­na, mo­že se da­lje nor­mal­no raz­mno­ža­va­ti te da­ti po­tom­stvo ko­je no­ si mu­ti­ra­nu ko­pi­ju ge­na na oba kro­mo­so­ma.

da­nas znan­stve­ni­ci­ma dos­tup­na ko­lek­ci­ja kvaš­če­vih mu­ta­na­ta u svr­hu ana­ li­ze fun­kci­je bi­lo ko­jeg že­lje­nog ge­na. Do da­nas je oko 20% miš­jih ge­na sis­te­mat­ski inak­ti­vi­ra­no ho­mo­log­nom re­kom­bi­na­ci­jom. Me­đu­tim, ve­li­ki me­đu­na­rod­ni pro­jek­ti ima­ju za cilj sis­te­mat­sku inak­ti­va­ci­ju svih ge­na miš­ jeg ge­no­ma, što bi stvo­ri­lo ge­nom­sku ko­lek­ci­ju mu­ta­na­ta mi­ša. Ovak­va bib­lio­te­ka mu­ta­ci­ja bi pred­stav­lja­la glav­ni iz­vor in­for­ma­ci­ja za znan­stve­ni­ ke ko­ji se ba­ve is­tra­ži­va­nji­ma raz­vo­ja si­sa­va­ca i sta­nič­ne fun­kci­je. Raz­vi­je­ ne su i meto­de za uvjet­nu inak­ti­va­ci­ju (con­di­tio­nal­ly knoc­kout ge­nes) ge­na u spe­ci­fič­nim tki­vi­ma mi­ša ko­ja doz­vo­lja­va is­tra­ži­va­nje fun­kci­je ge­na u od­re­đe­nom sta­nič­nom ti­pu (prim­je­ri­ce u sta­ni­ca­ma živ­ča­nog sus­ta­va) um­ jes­to ana­li­zu fun­kci­je to­ga ge­na unu­tar svih sta­ni­ca or­ga­niz­ma.

Ome­ta­nje gen­ske ek­spre­si­je Osim ho­mo­log­ne re­kom­bi­na­ci­je, raz­li­či­ti dru­gi al­ter­na­tiv­ni pris­tu­pi se mo­gu pri­mi­je­ni­ti za spe­ci­fič­no ome­ta­nje ek­spre­si­je ili fun­kci­je ge­na. Jed­na od me­to­da za in­hi­bi­ci­ju ek­spre­si­je cilj­no­ga ge­na je uvo­đe­nje pro­tus­mis­le­ nih (en­gl. anti­sen­se) nuk­lein­skih ki­se­li­na u stanice u kul­tu­ri in vit­ro (sl. 4-41). Mo­le­ku­la RNA ili jed­no­lan­ča­na DNA kom­ple­men­tar­na mo­le­ku­li mR­NA ge­na ko­ji nas za­ni­ma (pro­tus­mis­le­na DNA/RNA mo­le­ku­la) hib­ri­ di­zi­ra s mR­NA i blo­ki­ra nje­zi­no pre­vo­đe­nje u pro­tei­ne. Što­vi­še, RNA-DNA hib­ri­di ko­ji nas­ta­ju zbog uno­še­nja pro­tus­mis­le­ne mo­le­ku­le DNA naj­češ­će se br­zo raz­gra­đu­ju u sta­ni­ci. Pro­tus­mis­le­ne RNA mo­gu se iz­rav­no uni­je­ti u sta­ni­cu ili sa­me sta­ni­ce mo­gu bi­ti tran­sfek­ti­ra­ne s vek­to­rom ko­ji je kon­ strui­ran ta­ko da ek­spri­mi­ra pro­tus­mis­le­nu RNA. Pro­tus­mis­le­na DNA obi­

144    POGLAVLJE 4

Sli­ka 4-41. In­hi­bi­ci­ja gen­ske ek­spre­si­je pro­tus­mis­le­nom RNA ili DNA.  Pro­tu­ smis­le­na RNA ili jed­no­lan­ča­na DNA kom­ple­men­tar­na je s mo­le­ku­lom mR­NA ge­na ko­ji nas za­ni­ma. Pro­tus­mis­le­na RNA for­mi­ra hib­rid­nu mo­le­ku­lu s cilj­nom mR­NA, te na taj na­čin blo­ki­ra pre­pi­si­va­nje mR­NA u pro­tein i vo­di ka raz­grad­nji mR­NA.

▶▶ Pro­tus­mis­le­ni

oli­go­nuk­leo­ ti­dni slje­do­vi i siR­NA mo­le­ku­le ana­li­zi­ra­ne su ka­ko bi se is­pi­tao nji­hov po­ten­ci­jal­ni te­ra­pij­ski uči­ nak. Pro­tus­mis­le­ni oli­go­nuk­leo­ tid­ni sli­jed fo­mi­ver­sen odob­ren je od stra­ne FDA za tret­ma­ne in­fek­ci­ja oka uz­ro­ko­va­nih vi­ru­ som her­pe­sa. siR­NA mo­le­ku­le se tre­nut­no kli­nič­ki is­pi­tu­ju za ko­ riš­te­nje u tret­ma­ni­ma ma­ku­lar­ne de­ge­ne­ra­ci­je po­ve­za­ne sa sta­re­ njem.

čno je u ob­li­ku krat­kih oli­go­nuk­leo­ti­da (du­lji­ne oko 20 ba­za) s ko­ji­ma se on­da tran­sfek­ti­ra­ju sta­ni­ce ili vr­lo čes­to sta­ni­ce u kul­tu­ri in vit­ro direktno pri­ma­ju oli­go­nuk­leo­ti­de iz sta­nič­nog me­di­ja. U zad­njih ne­ko­li­ko go­di­na, RNA in­ter­fe­ren­ci­ja (RNAi) je pos­ta­la jed­ na od izu­zet­no učin­ko­vi­tih i ši­ro­ko prim­je­nji­vih me­to­da za ome­ta­nje eks­ pre­si­je ge­na na ra­zi­ni mR­NA. RNA in­ter­fe­ren­ci­ja je pr­vo ot­kri­ve­na u ob­li­ ću Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns 1998. go­di­ne, ka­da su is­tra­ži­va­či An­drew Fi­re, Craig Mel­lo i njiho­vi su­rad­ni­ci ot­kri­li da injek­ti­ra­na dvo­lan­ča­na RNA in­ hi­bi­ra ek­spre­si­ju ge­na s kom­ple­men­tar­nim sli­je­dom mR­NA. Ovo neo­če­ki­ va­no ot­kri­će upu­ti­lo je na nep­red­vi­đe­nu ulo­gu dvo­lan­ča­ne RNA u re­gu­la­ ci­ji ge­na, te je omo­gu­ći­lo raz­voj moć­nog ek­spe­ri­men­tal­nog oru­đa za in­hi­bi­ci­ju ek­spre­si­je cilj­nih ge­na. Ka­da uđe u sta­ni­cu, dvos­tru­ku RNA po­ ci­je­pa en­zim zvan Di­cer na krat­ke dvo­lan­ča­ne mo­le­ku­le od oko 21 do 23 oli­go­nuk­leo­ti­da (sl. 4-42). Ove krat­ke dvo­lan­ča­ne mo­le­ku­le, zva­ne krat­ke ome­ta­ju­će (in­ter­fe­ri­ra­ju­će) mo­le­ku­le RNA (siR­NAs od en­gl. sho­rt in­ter­fe­ ri­ng RNAs), ve­žu se on­da s kom­plek­som pro­tei­na poz­na­tim kao uti­ša­va­ju­ ći kom­ple­ks in­du­ci­ran mo­le­ku­lom RNA (en­gl. RNA-in­du­ced si­len­ci­ng com­ plex ili RISC). Ka­da pos­ta­nu dio RISC-kom­plek­sa, dva lan­ca siR­NA mo­le­ku­le se raz­dvo­je i la­nac kom­ple­men­ta­ran s mR­NA (pro­tus­mis­le­ni la­ nac), na os­no­vi kom­ple­men­tar­nog spa­ri­va­nja ba­za us­mje­ri kom­ple­ks do cilj­ne mR­NA. Mo­le­ku­lu mR­NA ta­da ci­je­pa je­dan od en­zi­ma RISC-kom­ plek­sa. Na­kon deg­ra­da­ci­je mR­NA, RISC-siRNA-kom­ple­ks se ras­for­mi­ra te nas­tav­lja sud­je­lo­va­ti u vi­šes­tru­kim cik­lu­si­ma ci­je­pa­nja mR­NA, do­vo­de­ći na taj na­čin do efi­kas­ne des­truk­ci­je cilj­ne mR­NA mo­le­ku­le. Me­to­da RNAi ute­me­lje­na je kao po­ten­ci­jal­na me­to­da za ome­ta­nje gen­ ske ek­spre­si­je u or­ga­niz­mi­ma C. ele­ga­ns, Dro­sop­hi­la, Ara­bi­dop­sis, te si­sav­ ci­ma, a pru­ža re­la­tiv­no iz­ra­van pris­tup u is­tra­ži­va­nju fun­kci­je bi­lo ko­jeg ge­na či­ja je sek­ven­ca poz­na­ta. Osim to­ga, bib­lio­te­ke dvo­lan­ča­ne RNA ili siR­NA, ko­je pok­ri­va­ju ve­li­ke frak­ci­je ge­na u ge­no­mu C. ele­ga­ns, Dro­sop­hi­la i čov­je­ka, po­mog­le su u ot­kri­va­nju no­vih ge­na uk­lju­če­nih u spe­ci­fič­ne bio­ loš­ke fun­kci­je kao što je ra­st i pre­živ­lja­va­nje sta­ni­ca. Na kra­ju, RNAi ni­je sa­mo ek­spe­ri­men­tal­no oru­đe – kao što će­mo dis­ku­ti­ra­ti unu­tar pog­lav­lja 7 i 8, RNA in­ter­fe­ren­ci­ja ta­ko­đer pred­stav­lja sta­nič­ni re­gu­la­cijski me­ha­ni­zam za kon­tro­lu ek­spre­si­je ge­na na tran­skrip­cij­skoj i tran­sla­cij­skoj ra­zi­ni. Osim inak­ti­vi­ra­nja ge­na ili po­ti­ca­nja raz­grad­nje mR­NA, po­ne­kad je mo­gu­će iz­rav­no ome­ta­ti fun­kci­ju pro­tei­na u sta­ni­ca­ma (sl. 4-43). Je­dan od

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   145

Sli­ka 4-42. RNA in­ter­fe­ren­ci­ja.  Dvo­ lan­ča­nu RNA mo­le­ku­lu po­ci­je­pa en­zim Di­cer u krat­ke in­ter­fe­ren­cij­ske RNA mo­ le­ku­le (siR­NA). siR­NA mo­le­ku­le ve­žu se s RNA in­du­ci­ra­nim uti­ša­va­ju­ćim kom­plek­ som (RISC) što re­zu­lti­ra nji­ho­vim raz­ma­ ta­njem. Pro­tus­mis­le­ni la­nac siR­NA mo­ le­ku­le on­da us­mje­ra­va RISC-kom­pleks pre­ma ho­mo­log­noj mR­NA mo­le­ku­li ko­ ju po­ci­je­pa je­dan od en­zi­ma tog kom­ pleksa. RISC-siRNA-kom­ple­k s se za­tim ras­for­mi­ra i sud­je­lu­je u slje­de­ćem ci­k­lu­ su deg­ra­da­ci­je mR­NA.

na­či­na je mik­roub­riz­ga­va­nje pro­tu­ti­je­la ko­ja spe­ci­fič­no blo­ki­ra­ju ak­tiv­no­st od­re­đe­nog pro­tei­na. Al­ter­na­tiv­no, od­re­đe­ni mu­ti­ra­ni pro­tei­ni mo­gu ome­ ta­ti fun­kci­ju nor­mal­nih ko­pi­ja uko­li­ko su ek­spri­mi­ra­ni u is­toj sta­ni­ci, prim­je­ri­ce kom­pe­ti­ci­jom s nor­mal­nim pro­tei­nom za ve­za­nje na cilj­nu mo­ le­ku­lu. Klo­ni­ra­nu DNA, ko­ja ko­di­ra tak­ve mu­ti­ra­ne pro­tei­ne (na­zi­va­mo ih do­mi­nan­tni in­hi­bi­ra­ju­ći mu­tan­ti), mo­gu­će je uni­je­ti u sta­ni­ce pri­je­no­ som ge­na u svr­hu is­pi­ti­va­nja učin­ka blo­ki­ra­nja fun­kci­je nor­mal­no­ga ge­ na.

146    POGLAVLJE 4

Sli­ka 4-43. Iz­rav­na in­hi­bi­ci­ja fun­kci­je pro­tei­na.  Protutijela mik­roub­riz­ga­na u sta­ ni­ce ve­žu se na pro­tei­ne i in­hi­bi­ra­ju nji­ho­vu nor­mal­nu fun­kci­ju. Osim to­ga, ne­ki mu­ ti­ra­ni pro­tei­ni ome­ta­ju fun­kci­ju nor­mal­nih ko­pi­ja pro­tei­na, prim­je­ri­ce, kom­pe­ti­ra­ju­ći s nji­ma za ve­za­nje na cilj­ne mo­le­ku­le.

KL JUČNI POKUS

RNA interferencija Po­ten­t and Spe­ci­fic Ge­ne­tic In­ter­fe­ren­ce by Double-Stranded RNA in Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns

Andrew Fi­re, SiQuin Xu, Ma­ry K. Mon­tgo­me­ry, Ste­ven A. Kos­tas, Samuel E. Dri­ver, and Craig C. Mel­lo Car­ne­gie In­sti­tu­te of Was­hin­gton, Bal­ti­mo­re, MD, and Uni­ver­si­ty of Mas­sac­ hu­set­ts, Wor­ces­ter, MA Na­tu­re, vol. 391, 1998, str. 806-811 Andrew Fire

Kon­tek­st Pro­tus­mis­le­na RNA je pr­vi pu­t upot­ri­ jeb­lje­na 1984. go­di­ne i na­kon to­ga je pri­mi­je­nje­na kao ek­spe­ri­men­tal­na me­ to­da za in­hi­bi­ci­ju gen­ske ek­spre­si­je u raz­li­či­tim ži­vo­tinj­skim mo­de­li­ma, prim­ je­ri­ce u C. ele­ga­ns. Ta­da se smat­ra­lo da pro­tus­mis­le­na RNA in­hi­bi­ra ek­spre­si­ju ge­na na taj na­čin što hib­ri­di­zi­ra s cilj­

nom (smis­le­nom, en­gl. sen­se) mR­NA i blo­ki­ra nje­zi­nu tran­sla­ci­ju. Me­đu­tim, re­zul­ta­ti ne­kih kon­trol­nih ek­spe­ri­me­na­ ta bi­li su kon­tra­dik­tor­ni pred­lo­že­nom me­ha­niz­mu dje­lo­va­nja pro­tus­mis­le­nih RNA. An­drew Fi­re i nje­go­vi su­rad­ni­ci su 1991. go­di­ne pri­mi­je­ti­li da plaz­mi­di ko­ ji ek­spri­mi­ra­ju smis­le­ne i pro­tus­mis­le­ne

Craig Mello

RNA mo­le­ku­le ome­ta­ju ek­spre­si­ju ge­na u mi­šić­nim sta­ni­ca­ma C. ele­ga­ns (De­ ve­lop­me­nt 113:503). Go­di­ne 1995. Su Guo i Ken­ne­th Kem­phues ta­ko­đer su pri­mi­je­ti­li da i smis­le­ne i pro­tus­mis­le­ ne RNA mo­le­ku­le, ka­da su injek­ti­ra­ne u sta­ni­ce ra­nog em­bri­ja C. ele­ga­ns, ome­ ta­ju fun­kci­ju ge­na pot­reb­nih za nje­gov

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

   147

KL JUČNI POKUS

raz­voj (Ce­ll 81:611). Ovi re­zul­ta­ti su bi­li neo­če­ki­va­ni i iz­ne­na­đu­ju­ći jer se ni­je oče­ki­va­lo da će smis­le­na RNA mo­le­ku­ la hib­ri­di­zi­ra­ti s cilj­nom mR­NA. An­drew Fi­re, Craig Mel­lo i nji­ho­vi su­rad­ni­ci od­ lu­či­li su is­tra­ži­ti raz­lo­ge za ovu po­ja­vu i go­di­ne 1998. ob­ja­vi­li su znan­stve­ni rad ko­ji ot­kri­va fe­no­men RNA in­ter­fe­ren­ci­ je pos­re­do­va­ne dvo­lan­ča­nom RNA.

Ek­spe­ri­men­ti Plaz­mi­di kon­strui­ra­ni da proiz­ve­du smis­le­nu od­nos­no pro­tus­mis­le­nu mo­ le­ku­lu RNA mo­ra­li bi proiz­ves­ti i ma­lu ko­li­či­nu sup­rot­no­ga lan­ca, pa su Fi­re, Mel­lo i nji­ho­vi su­rad­ni­ci zak­lju­či­li da će ma­la ko­li­či­na dvos­tru­ke RNA bi­ ti pri­sut­na u oba prip­rav­ka (smis­le­ne i pro­tus­mis­le­ne mo­le­ku­le RNA). Sto­ga su pret­pos­ta­vi­li mo­guć­no­st da dvo­ lan­ča­na RNA mo­že pri­do­ni­je­ti in­hi­bi­ci­ji gen­ske ek­spre­si­je. Ka­ko bi tes­ti­ra­li ovu pret­pos­tav­ku us­po­re­di­li su ak­tiv­nost dvo­lan­ča­nih RNA-hib­ri­da s oba ti­pa mo­le­ku­la – smis­le­nim i pro­tus­mis­le­ nim jed­no­la­nča­nim mo­le­ku­la­ma RNA ko­je su upot­rijeb­lje­ne za in­hi­bi­ci­ju ne­ ko­li­ko ge­na C. ele­ga­ns. U oba slu­ča­ja, dvos­tru­ka mo­le­ku­la RNA po­ka­za­la se kao pu­no snaž­ni­ji in­hi­bi­tor ek­spre­si­je ge­na od pro­tus­mis­le­ne jed­no­lan­ča­ne RNA. Osim to­ga, dok je injek­ti­ra­na dvo­ lan­ča­na RNA re­zul­ti­ra­la ek­sten­ziv­nom raz­grad­njom cilj­ne mR­NA, jed­no­la­nča­ ne pro­tus­mis­le­ne RNA su ima­le tek mi­ni­mal­ni efe­kt (vi­di sli­ku). Kao pos­lje­ di­ca ovih iz­ne­na­đu­ju­ćih re­zul­ta­ta kon­ trol­nih ek­spe­ri­me­na­ta izaš­lo je ot­kri­će

dvo­lan­ča­ne RNA kao po­ten­ci­jal­nog i spe­ci­fič­nog oru­đa za blo­ki­ra­nje gen­ske ek­spre­si­je.

Ut­je­caj Ot­kri­će RNA in­ter­fe­ren­ci­je ni­je sa­mo do­ve­lo do raz­vo­ja no­vih i vrlo učin­ ko­vitih ek­spe­ri­men­tal­nih me­to­da za blo­ki­ra­nje ek­spre­si­je ge­na, ne­go i do fun­da­men­tal­ne prom­je­ne u na­šem ra­ zu­mi­je­va­nj­ u me­ha­ni­za­ma ko­ji re­gu­ li­ra­ju ek­spre­si­ju ge­na u eu­ka­riot­skoj

sta­ni­ci. Dvo­lan­ča­na RNA je, zap­ra­vo, vr­lo moć­no ek­spe­ri­men­tal­no oru­đe i da­nas se ko­ris­ti za ome­ta­nje ek­spre­si­je ge­na u ve­li­kom bro­ju raz­li­či­tih ek­spe­ ri­men­tal­nih sis­te­ma, uk­lju­ču­ju­ći sta­ni­ ce si­sa­va­ca u kul­tu­ri. Još doj­mlji­vi­ja su sve broj­ni­ja ot­kri­ća raz­li­či­tih ulo­ga ko­je dvo­lan­ča­ne RNA nor­mal­no imaju unu­ tar eu­ka­riot­ske sta­ni­ce. U znan­stve­nom ra­du pub­li­ci­ra­nom još 1998. go­di­ne, u ko­jem su Fi­re i Mel­lo ob­ja­vi­li ot­kri­će in­ter­fe­ren­cij­ske ulo­ge dvos­tru­ke RNA, ovi au­to­ri pred­vid­je­li su da »in­ter­fe­ren­ ci­ja RNA dje­lu­je pre­ma me­ha­niz­mu ko­ ji vje­ro­jat­no ima bio­loš­ku ulo­gu«. Oni ta­mo na­da­lje ka­žu: »Ge­ne­tič­ku in­ter­fe­ ren­ci­ju po­mo­ću dvo­lan­ča­ne DNA or­ga­ niz­mi mo­gu ko­ris­ti­ti u svr­hu fi­zio­loš­kog uti­ša­va­nja ge­na.« Re­zul­ta­ti mno­gob­roj­ nih is­tra­ži­va­nja od 1998. go­di­ne na­ da­lje pot­vr­di­li su ovu pret­pos­tav­ku te je dvo­lan­ča­na RNA da­nas pre­poz­na­ta kao glav­ni re­gu­la­tor gen­ske ek­spre­si­je u eu­ka­rio­ta. Ne­ko­li­ko sto­ti­na ne­ko­di­ra­ ju­ćih re­gu­lacijskih mo­le­ku­la RNA (naz­ va­nih mik­roR­NA mo­le­ku­le) ot­kri­ve­no je u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca, te je po­kaz­ano da re­gu­la­ci­ja po­mo­ću mik­roR­NA ig­ra važ­nu ulo­gu u ve­li­kom bro­ju raz­li­či­tih sta­nič­nih pro­ce­sa kao što su sta­nič­na sig­na­li­za­ci­ja, sta­nič­no pre­živ­lja­va­nje, raz­voj sr­ca i moz­ga te raz­voj ra­ka. Sva­ ka mik­roR­NA ima pu­no cilj­nih mR­NA i proc­ije­nje­no je da je oko 5.000 hu­ ma­nih ge­na re­gu­li­ra­no po­mo­ću mik­ roRNA. Sto­ga je ot­kri­će RNA in­ter­fe­ ren­ci­je, ko­je se ba­zi­ra na neo­če­ki­va­nim re­zul­ta­ti­ma kon­trol­nih ek­spe­ri­me­na­ta, re­vo­lu­cio­na­li­zi­ra­lo na­še ra­zu­mi­je­va­nje re­gu­la­ci­je ge­na.

148    POGLAVLJE 4

KLJUČNI POJMOVI

SAŽETAK PRATEĆE INFORMACIJE NA INTERNETU Pos­je­ti­te web stra­ni­ce ko­je pra­te pog­lav­lja ud­žbe­ni­ka Sta­ni­ca www.sinauer.com/ cooper5e da bis­te mog­li vid­je­ti ani­ma­ci­je, vi­deourat­ke, prob­le­me i os­ta­li ma­te­ri­ jal.

Nas­lje­đi­va­nje, ge­ni i DNA gen, alel, do­mi­nan­tan, re­ce­si­van, ge­no­tip, fe­no­tip, kro­mo­som, dip­loid, me­jo­za, ha­p­loid, mu­ta­ci­ja

Ge­ni i kro­mo­so­mi: Kro­mo­so­mi su no­si­te­lji ge­na.

hi­po­te­za »je­dan gen – je­dan en­zi­m«

Ge­ni i en­zi­mi: Gen od­re­đu­je sli­jed ami­no­ki­se­li­na u po­li­pep­tid­nom lan­cu. Iden­ti­fi­ka­ci­ja DNA kao ge­ne­tič­kog ma­te­ri­ja­la: DNA je iden­ti­fi­ci­ra­na kao ge­ne­ tič­ki ma­te­ri­jal ek­spe­ri­men­ti­ma s tran­sfor­ma­ci­jom bak­te­ri­ja. Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-1. Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-2. Struk­tu­ra DNA: DNA je dvos­tru­ka uz­voj­ni­ca u ko­joj se stva­ra­ju vo­di­ko­ve ve­ze iz­me­đu pu­ri­na i pi­ri­mi­di­na u na­sup­rot­nim lan­ci­ma. Zbog spe­ci­fič­nog spa­ri­va­ nja ba­za (A – T, G – C) dva su lan­ca mo­le­ku­le DNA kom­ple­men­tar­na u sli­je­du nuk­leo­ti­da.

tran­sfor­ma­ci­ja se­mi­kon­zer­va­tiv­na rep­li­ka­ci­ja, DNA-po­li­me­ra­za

Rep­li­ka­ci­ja DNA: DNA se ud­vos­tru­ču­je se­mi­kon­zer­va­tiv­nom rep­li­ka­ci­jom u ko­joj se dva lan­ca raz­dva­ja­ju i sva­ki slu­ži kao ka­lup za sin­te­zu no­vo­ga lan­ca.

Ek­spre­si­ja ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je Ko­li­near­no­st ge­na i pro­tei­na: Sli­je­dom nuk­leo­ti­da u DNA od­re­đen je sli­jed ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­nu. cen­tral­na dog­ma, tran­skrip­ci­ja, tran­sla­ci­ja, glas­nič­ka RNA mo­le­ku­la (mR­NA), RNA-po­li­me­ra­za, ri­bo­som­ ska RNA mo­le­ku­la (rR­NA), tran­spor­ tna RNA mo­le­ku­la (tR­NA)

Ulo­ga glas­nič­ke RNA: Glas­nič­ka RNA dje­lu­je kao pos­red­nik ko­ji pre­no­si in­for­ ma­ci­ju s DNA na ri­bo­so­me gdje slu­ži kao ka­lup za sin­te­zu pro­tei­na.

ge­ns­ki kod, tran­sla­ci­ja in vit­ro, ko­don

Ge­nski kod: Tran­spor­tna RNA slu­ži kao adap­tor iz­me­đu ami­no­ki­se­li­na i mR­NA ti­je­kom pre­vo­đe­nja. Sva­ka je ami­no­ki­se­li­na od­re­đe­na ko­do­nom ko­ji se sas­to­ji od tri nuk­leo­ti­da.

Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-3.

Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-4. ret­ro­vi­rus, re­ver­zna tran­skrip­ci­ja, re­ver­zna tran­skrip­ta­za

RNA vi­ru­si i ob­r­nu­to pre­pi­si­va­nje: DNA je mo­gu­će sin­te­ti­zi­ra­ti na os­no­vi RNAka­lu­pa što je pr­vo ot­kri­ve­no kod ret­ro­vi­ru­sa. Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-5.

Re­kom­bi­nan­tna DNA res­trik­cij­ska en­do­nuk­lea­za, gel-elek­ tro­fo­re­za, res­trik­cij­ska kar­ta

Res­trik­cij­ske en­do­nuk­lea­ze: Res­trik­cij­ske en­do­nuk­lea­ze ki­da­ju DNA na od­re­ đe­nim slje­do­vi­ma či­me nas­ta­ju frag­men­ti DNA de­fi­ni­ra­ne ve­li­či­ne. Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-6.

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE 

SAŽETAK Proiz­vod­nja re­kom­bi­nan­tnih mo­le­ku­la DNA: Re­kom­bi­nan­tna mo­le­ku­la DNA sas­to­ji se od že­lje­no­ga frag­men­ta DNA ug­ra­đe­nog u vek­tor ko­ji se mo­že neo­vis­ no um­na­ža­ti u od­go­va­ra­ju­ćoj sta­ni­ci do­ma­ći­nu.

   149

KLJUČNI POJMOVI mo­le­ku­lar­no klo­ni­ra­nje, vek­tor, re­kom­bi­nan­tna mo­le­ku­la, mo­le­ku­ lar­ni klon, plaz­mid, DNA-li­ga­za, cDNA

Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-7. Vek­to­ri za re­kom­bi­nan­tnu DNA: Za klo­ni­ra­nje frag­me­na­ta DNA raz­li­či­te ve­li­ či­ne ko­ris­te se raz­li­či­ti vek­to­ri.

iz­vo­riš­te rep­li­ka­ci­je, koz­mid, um­jet­ni kro­mo­som P1 (PAC), bak­te­rij­ski um­jet­ni kro­mo­som (BAC), kvaš­čev um­jet­ni kro­mo­som (YAC)

Sek­ven­ci­ra­nje DNA: U klo­ni­ra­nom frag­men­tu DNA mo­gu­će je od­re­di­ti sli­jed nuk­leo­ti­da.

di­deok­si­nuk­leo­tid

Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-8. Ek­spre­si­ja klo­ni­ra­nih ge­na: Pro­tei­ne ko­je ko­di­ra­ju klo­ni­ra­ni ge­ni mo­gu­će je sin­te­ti­zi­ra­ti u ve­li­kim ko­li­či­na­ma u bak­te­ri­ja­ma ili eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma.

ek­spre­sij­ski vek­tor, sus­tav dvaju hib­ ri­da u kvas­ca

De­tek­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na i pro­tei­na Um­no­ža­va­nje DNA lan­ča­nom reak­ci­jom po­li­me­ra­ze: PCR omo­gu­ća­va in vit­ro um­na­ža­nje i izo­la­ci­ju spe­ci­fič­nih frag­me­na­ta DNA, i zbog to­ga pred­stav­lja vr­lo os­jet­lji­vu me­to­du za de­tek­ci­ju ma­lih ko­li­či­na spe­ci­fič­nih mo­le­ku­la DNA ili RNA.

lan­ča­na reak­ci­ja po­li­me­ra­ze (PCR)

Vi­di mrežnu stranicu Ani­ma­ci­ja 4-9. Hib­ri­di­za­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na: Hib­ri­di­za­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na omo­gu­ ću­je de­tek­ci­ju spe­ci­fič­nih sek­ven­ci DNA ili RNA na prin­ci­pu kom­ple­men­tar­nog spa­ri­va­nja ba­za iz­me­đu od­vo­je­nih la­na­ca DNA ili RNA. Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-10.

hib­ri­di­za­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na, hib­ri­di­za­ci­ja po Sout­he­r­nu (Southern blot), Nort­he­rn blot, bib­lio­te­ka re­kom­bi­nan­tnih DNA, mik­ro­či­po­vi DNA, hib­ri­di­za­ci­ja in si­tu

Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-11. Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-12. Pro­tu­ti­je­la kao son­de za pro­tei­ne: Pro­tu­ti­je­la ko­ris­ti­mo za de­tek­ci­ju spe­ci­fič­nih pro­tei­na u sta­ni­ca­ma ili sta­nič­nim ek­strak­ti­ma. Vi­di Web­si­te ani­ma­ci­ju 4-13.

pro­tu­ti­je­lo, an­ti­gen, mo­nok­lon­sko pro­tu­ti­je­lo, imu­nob­lot, Wes­te­rn blot, imu­nop­re­ci­pi­ta­ci­ja, SDS-po­liak­ri­la­ mid­na gel-elek­tro­fo­re­za (SDS-PAGE)

Fun­kci­ja eu­ka­riot­skih ge­na Ge­ne­tič­ke ana­li­ze u kvas­ci­ma: Jed­nos­tav­na ge­ne­ti­ka i br­zo raz­mno­ža­va­nje kvas­ca omo­gu­ću­ju mo­le­ku­lar­no klo­ni­ra­nje ge­na ko­ji od­go­va­ra­ju bi­lo ko­joj mu­ ta­ci­ji u kvas­cu.

tem­pe­ra­tur­no os­jet­lji­vi mu­tan­ti

Pri­je­nos ge­na u bilj­ke i ži­vo­ti­nje: Klo­ni­ra­ne ge­ne mo­gu­će je uni­je­ti u sta­ni­ce vi­ ših eu­ka­rio­ta i vi­šes­ta­nič­ne or­ga­niz­me ra­di fun­kcio­nal­ne ana­li­ze.

pri­je­nos ge­na, tran­sfek­ci­ja, li­po­som, elek­tro­po­ra­ci­ja, pro­laz­na ek­spre­si­ja, tran­sge­nič­ni miš, em­brion­alne ma­tič­ne (EM) sta­ni­ce, Ti-plaz­mid

Mu­ta­ge­ne­za klo­ni­ra­ne DNA: In vit­ro mu­ta­ge­ne­zu klo­ni­ra­ne DNA ko­ris­ti­mo za is­pi­ti­va­nje učin­ka od­re­đe­nih mu­ta­ci­ja na fun­kci­ju ge­na.

re­ver­zna ge­ne­ti­ka, mu­ta­ge­ne­za in vit­ro

150    POGLAVLJE 4

KLJUČNI POJMOVI

SAŽETAK

homologna re­kom­bi­na­ci­ja, no­kaut

Uno­še­nje mu­ta­ci­ja u sta­nič­ne ge­ne: Mu­ta­ci­je je mo­gu­će uni­je­ti u kro­mo­som­ske ge­ne ho­mo­log­nom re­kom­bi­na­ci­jom s klo­ni­ra­nom DNA.

pro­tus­mis­le­ne nuk­lein­ske ki­se­li­ne, RNA in­ter­fe­ren­ci­ja (RNAi), do­mi­na­n­ t­ni in­hi­bi­ra­ju­ći mu­tan­ti

Ome­ta­nje ek­spre­si­je sta­nič­nih ge­na: Ekspresiju ili fun­kci­ju spe­ci­fič­nih gen­skih pro­du­ka­ta mo­gu­će je blo­ki­ra­ti pro­tus­mis­le­nim nuk­lein­skim ki­se­li­na­ma, RNA in­ter­fe­ren­ci­jom ili do­mi­nan­tnim in­hi­bi­rajućim mu­tan­ti­ma.

Pi­ta­nja 1. Ka­ko bis­te od­re­di­li da li su dva raz­li­či­ta ge­na u vin­ske mu­ši­ce me­đu­sob­no ve­za­na? 2. Uz­ga­ja­li ste E. co­li na me­di­ju ko­ji sad­r­ ži 15N kroz ne­ko­li­ko ge­ne­ra­ci­ja. Sta­ni­ce ste za­tim pre­m­jes­ti­li u me­dij ko­ji sad­r­ži 14N te ste doz­vo­li­li ra­st kroz još dvi­je ge­ne­ra­ci­je. Ko­ji će udio izo­li­ra­nih DNA iz uz­go­je­nih sta­ni­ca sad­r­ža­va­ti mo­le­ku­le teš­ke, la­ga­ne ili sred­nje gus­to­će? 3. Ob­jas­ni­te zaš­to adi­ci­ja ili de­le­ci­ja jed­no­ ga ili dva­ju nuk­leo­ti­da u ko­di­ra­ju­ćem di­je­lu ge­na re­zul­ti­ra ne­fun­kcio­nal­nim pro­tei­nom, a adi­ci­ja ili de­le­ci­ja tri­ju nuk­leo­ti­da čes­to re­zul­ti­ra pro­tei­nom ko­ji zad­r­ža­va nor­mal­ nu fun­kci­ju. 4. Na­ve­di­te oso­bi­ne ko­je kvaš­čev um­jet­ni kro­mo­som mo­ra ima­ti ka­ko bi se u nje­ga mog­la uk­lo­ni­ra­ti DNA čov­je­ka po­ci­je­pa­na s en­zi­mom EcoRI.

5. Is­pi­tu­je­te en­zim u ko­jem je cis­tein u ak­tiv­nom mjes­tu ko­di­ran trip­le­tom UGU. Ka­kav će ut­je­caj na en­zim­sku ak­tiv­no­st ima­ti mu­ta­ci­ja tre­će ba­ze u C, a ka­kav mu­ ta­ci­ja is­te te ba­ze u A? 6. Raz­grad­nja mo­le­ku­le DNA ve­li­ke 4 kb s EcoRI da­je dva frag­men­ta; je­dan od 1 kb i je­dan od 3 kb. Raz­grad­nja is­te mo­le­ku­le s Hi­ndIII da­je frag­men­te od 1,5 i 2,5 kb. Raz­ grad­nja s kom­bi­na­ci­jom en­zi­ma EcoRI i Hi­ndIII da­je frag­men­te od 0,5 kb, 1 kb i 2,5 kb. Nac­r­taj­te res­trik­cij­sku kar­tu to­ga frag­ men­ta (mo­le­ku­le DNA) i une­si­te po­lo­ža­je mjes­ta pre­poz­na­va­nja za EcoRI i Hi­ndIII. 7. Ko­li­ko će ko­pi­ja ne­ko­ga ge­na nas­ta­ti na­ kon 10 i 30 cik­lu­sa um­no­ža­va­nja lan­ča­nom reak­ci­jom po­li­me­ra­ze ako reak­ci­ju za­poč­ ne­mo s mo­le­ku­lom DNA iz jed­nog je­di­nog sper­mi­ja?

8. Klo­ni­ra­li ste frag­me­nt ge­nom­ske DNA čov­je­ka u koz­mid­ni vek­tor. Ko­li­ko pu­ta ot­ pri­li­ke oče­ku­je­te da će in­se­rt bi­ti po­ci­je­pan s res­trik­cij­skom en­do­nuk­lea­zom BamHI? 9. Ko­li­ko je mi­ni­mal­no BAC klo­no­va pot­ reb­no da bi se nap­ra­vi­la bib­lio­te­ka ge­nom­ ske DNA čov­je­ka? 10. Na ko­ji na­čin će ak­ti­no­mi­cin D ut­je­ca­ti na rep­li­ka­ci­ju vi­ru­sa gri­pe? 11. Ko­ja je ključ­na oso­bi­na vek­to­ra za klo­ ni­ra­nje ko­ja vam omo­gu­ća­va da izo­li­ra­te sta­bil­no tran­sfek­ti­ra­ne sta­ni­ce si­sa­va­ca? 12. Nuk­lein­ske ki­se­li­ne ima­ju ne­ga­tiv­ni na­boj i mo­gu se pre­ma ve­li­či­ni raz­dvo­ji­ti po­mo­ću gel-elek­tro­fo­re­ze. Sup­rot­no to­me, raz­li­či­ti pro­tei­ni ima­ju raz­li­či­ti na­boj. Ka­ko bis­te on­da po­mo­ću elek­tro­fo­re­ze raz­dvo­ji­li pro­tei­ne s ob­zi­rom na nji­ho­vu ve­li­či­nu?

Li­te­ra­tu­ra Nas­lje­đi­va­nje, ge­ni i DNA Ave­ry, O. T., C. M. Mac­Leod and M. McCar­ty. 1944. Stu­dies on the che­mi­cal na­tu­re of the sub­stan­ce in­du­ci­ng tran­sfor­ma­tion of pneu­ mo­coc­cal types. J. Exp. Med. 79: 137–158. [P] Fran­klin, R. E. and R. G. Gos­li­ng. 1953. Molecula­r con­fi­gu­ra­tion in so­dium thy­ monuc­lea­te. Na­tu­re 171: 740–741. [P] Kor­nbe­rg, A. 1960. Bio­lo­gic synthe­sis of deoxyri­ bo­nuc­leic acid. Scien­ce 131: 1503–1508. [P] Kres­ge, N., R. D. Si­mo­ni and R. L. Hi­ll. 2005. Laun­chi­ng the age of bioc­he­mi­cal ge­ne­ti­cs, wi­th Neu­ros­po­ra: The wo­rk of Geor­ge Wel­ls Bead­le. J. Biol. Chem. 280: e9-e11. [R] Leh­man, I. R. 2003. Dis­co­ve­ry of DNA po­lyme­ ra­se. J. Biol. Chem. 278: 34733-34738. [R] Me­sel­son, M. and F. W. Sta­hl. 1958. The rep­li­ca­ tion of DNA in Es­che­ric­hia co­li. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 44: 671–682. [P]

Wat­son, J.D. and F. H. C. Cri­ck. 1953. Ge­ne­ti­cal im­pli­ca­tio­ns of the struc­tu­re of deoxyri­ bonuc­leic acid. Na­tu­re 171: 964–967. [P] Wat­son, J.D. and F. H. C. Cri­ck. 1953. Molecula­r  struc­tu­re of nuc­leic aci­ds: A struc­tu­re for deoxyri­bo­se nuc­leic acid. Natur­e 171: 737–738. [P] Wil­ki­ns, M. H. F., A. R. Sto­kes and H. R. Wilso­n.  1953. Mo­le­cu­lar struc­tu­re of deoxypen­to­se nuc­leic aci­ds. Na­tu­re 171: 738–740. [P]

Ek­spre­si­ja ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je Bal­ti­mo­re, D. 1970. RNA-de­pen­de­nt DNA polyme­ra­se in vi­rio­ns of RNA tu­mour viruse­s. Na­tu­re 226: 1209–1211. [P] Bren­ner, S., F. Ja­cob and M. Me­sel­son. 1961. An un­stab­le in­ter­me­dia­te car­ryi­ng in­for­ma­tion from ge­nes to ri­bo­so­mes for pro­tein synthe­ sis. Na­tu­re 190: 576–581. [P]

Cri­ck, F. H. C., L. Bar­ne­tt, S. Bren­ner and R. J. Wat­ts-To­bin. 1961. Ge­ne­ral na­tu­re of the  gene­tic co­de for pro­tei­ns. Na­tu­re 192: 1227–1232. [P] In­gram, V. M. 1957. Ge­ne mu­ta­tio­ns in hu­man he­mog­lo­bin: The che­mi­cal dif­fe­ren­ce betwee­n nor­mal and sic­kle ce­ll he­mog­lo­bin. Na­tu­re 180: 326–328. [P] Ni­ren­be­rg, M. 2004. His­to­ri­cal re­view: Decipherin­g the ge­ne­tic co­de – a per­so­nal ac­cou­nt. Tren­ds Bioc­hem. Sci. 29: 46-54. [R] Ni­ren­be­rg, M. and P. Le­der. 1964. RNA code­ wor­ds and pro­tein synthe­sis. Scien­ce 145: 1399–1407. [P] Ni­ren­be­rg, M. W. and J. H. Mat­thaei. 1961. The de­pen­den­ce of ce­ll-free pro­tein synthe­sis in E. co­li upon na­tu­ral­ly oc­cur­ri­ng or synthe­tic po­lyri­bo­nuc­leo­ti­des. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 47: 1588–1602. [P]

OSNOVE MOLEKULARNE BIOLOGIJE  Te­min, H. M. and S. Mi­zu­ta­ni. 1970. RNAdepen­de­nt DNA po­lyme­ra­se in vi­rio­ns of Rous sar­co­ma vi­rus. Na­tu­re 226: 1211–1213. [P] Ya­nof­sky, C. 2007. Es­tab­lis­hi­ng the trip­let nature­ of the ge­ne­tic co­de. Ce­ll 128: 815-818. [R] Ya­nof­sky, C., B. C. Car­lton, J. R. Gue­st, D. R. Helin­ski and U. Hen­ni­ng. 1964. On the co­l­ i­nea­ri­ty of ge­ne struc­tu­re and pro­tein struc­ tu­re. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 51: 266–272. [P]

Re­kom­bi­nan­tna DNA Au­su­bel, F. M., R. Bre­nt, R. E. Kin­gston, D. D. Moo­re, J. G. Seid­man, J. A. Smi­th and K. Stru­hl. eds. 1989. Cur­re­nt Pro­to­co­ls in Molecu­lar Bio­lo­gy. New Yo­rk: Gree­ne Publishi­ng and Wi­ley In­ter­scien­ce.

Molecu­lar Bio­lo­gy. New Yo­rk: Gree­ne Publishi­ng and Wi­ley In­ter­scien­ce. Brown, P. O. and D. Bot­stein. 1999. Explo­ri­ng the new wor­ld of the ge­no­me wi­th DNA mic­roar­rays. Na­tu­re Ge­ne­ti­cs 21: 33-37. [R] Ca­rut­he­rs, M. H. 1985. Ge­ne synthe­sis machine­s:  DNA che­mis­try and its uses. Scien­ce 230: 281–285. [R] Ger­ho­ld, D., T. Rus­hmo­re and C. T. Cas­key. 1999. DNA chi­ps: pro­mi­si­ng toys ha­ve becom­e power­ful too­ls. Tren­ds Bioc­hem. Sci. 24: 168–173. [R] Grun­stein, M. and D. S. Hog­ne­ss. 1975. Co­lo­ny hybri­di­za­tion: A met­hod for the iso­la­tion of clo­ned DNAs that con­tain a spe­ci­fic ge­ne. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 72: 3961–3965. [P] Har­low, E. and D. La­ne. 1999. Usi­ng An­ti­bo­dies: A La­bo­ra­to­ry Ma­nual. Co­ld Spri­ng Har­bor, N.Y.: Co­ld Spri­ng Har­bor La­bo­ra­to­ry Pre­ss.

Bur­ke, D. T., G. F. Car­le and M. V. Ol­son. 1987. Clo­ni­ng of lar­ge seg­men­ts of exo­ge­nous DNA in­to yea­st by mea­ns of ar­ti­fi­cial chro­ mo­so­me vec­to­rs. Scien­ce 236: 806–812. [P]

Koh­ler, G. and C. Mil­stein. 1975. Con­ti­nuous cul­tu­res of fu­sed cel­ls sec­re­ti­ng an­ti­bo­dy of pre­de­fi­ned spe­ci­fi­ci­ty. Na­tu­re 256: 495–497. [P]

Co­hen, S. N., A. C. Y. Cha­ng, H. W. Boyer and R. B. Hel­li­ng. 1973. Con­struc­tion of bio­lo­g­ ical­ly fun­ctio­nal bac­te­rial plas­mi­ds in vit­ro. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 70: 3240–3244. [P]

Sam­brook, J., and D. Rus­se­ll. 2001. Mo­le­cu­lar Clo­ni­ng: A La­bo­ra­to­ry Ma­nual. 3rd ed. Plain­view, N.Y.: Co­ld Spri­ng Har­bor Laborato­ry Pre­ss.

Nat­ha­ns, D. and H. O. Smi­th. 1975. Res­tric­tion en­do­nuc­lea­ses in the ana­lysis and res­truc­ turi­ng of DNA mo­le­cu­les. Ann. Rev. Bioche­m. 44: 273–293. [R]

Sout­he­rn, E. M. 1975. De­tec­tion of spe­ci­fic sequen­ces amo­ng DNA frag­men­ts se­pa­ rated by gel elec­trop­ho­re­sis. J. Mol. Biol. 98: 503–517. [P]

Sai­ki, R. K., D. H. Gel­fa­nd, S. Stof­fel, S. J. Scharf, R. Hi­guc­hi, G. T. Ho­rn, K. B. Mul­lis and H. A. Er­li­ch. 1988. Pri­me­r-di­rec­ted enzyma­tic am­pli­fi­ca­tion of DNA wi­th a ther­mos­tab­le DNA po­lyme­ra­se. Scien­ce 239: 487–491. [P] Sam­brook, J., and D. Rus­se­ll. 2001. Mo­le­cu­lar Clo­ni­ng: A La­bo­ra­to­ry Ma­nual. 3rd ed. Plain­view, N.Y.: Co­ld Spri­ng Har­bor Laborato­ry Pre­ss. San­ger, F., S. Nic­klen and A. R. Coul­son. 1977. DNA sequen­ci­ng wi­th chai­n-ter­mi­na­ti­ng in­hi­bi­to­rs. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467. [P]

De­tek­ci­ja nuk­lein­skih ki­se­li­na i pro­tei­na Au­su­bel, F. M., R. Bre­nt, R. E. Kin­gston, D. D. Moo­re, J. G. Seid­man, J. A. Smi­th and K. Stru­hl. eds. 1989. Cur­re­nt Pro­to­co­ls in

Fun­kci­ja eu­ka­riot­skih ge­na Bout­ros, M., A. A. Ki­ger, S. Ar­mknec­ht, K: Ke­rr, M. Hi­ld, B. Ko­ch, S. A. Haas, Hei­del­be­rg Fly Ar­ray Con­sor­tium, R. Pa­ro and N. Perri­ mon. 2004. Ge­no­me-wi­de RNAi ana­lysis of growth and via­bi­li­ty in Dro­sop­hi­la cel­ls. Scien­ce 303: 832-835. [P] Bran­da, C. S. and S. M. Dymec­ki. 2004. Tal­ki­ng about a re­vo­lu­tion: The im­pa­ct of si­te-spe­ cific re­com­bi­na­ses on ge­ne­tic ana­lysis in mi­ce. De­vel. Ce­ll 6: 7-28. [P] Bron­son, S. K. and O. Smit­hies. 1994. Al­te­ri­ng mi­ce by ho­mo­lo­gous re­com­bi­na­tion usi­ng em­bryo­nic stem cel­ls. J. Biol. Chem. 269: 27155–27158. [R] Ca­pec­chi, M. R. 1989. Al­te­ri­ng the ge­no­me by ho­mo­lo­gous re­com­bi­na­tion. Scien­ce 244: 1288–1292. [R]

   151

Car­pen­ter, A. E. and D. M. Sa­ba­ti­ni. 2004. Systema­tic ge­no­me-wi­de scree­ns of ge­ne fun­ction. Na­tu­re Rev. Ge­net. 5:11-22. [R] Downwa­rd, J. 2004. Use of RNA in­ter­fe­ren­ce libra­ries to in­ves­ti­ga­te on­co­ge­nic sig­na­li­ng in mam­ma­lian cel­ls. On­co­ge­ne 23: 83768383. [R] Fi­re, A., S. Xu, M. K. Mon­tgo­me­ry, S. A. Kos­tas, S. E. Dri­ver and C. C. Mel­lo. 1998. Po­te­nt and spe­ci­fic ge­ne­tic in­ter­fe­ren­ce by doub­lestran­ded RNA in Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns. Na­tu­re 391: 806-811. [P] Gel­vin, S. B. 2003. Ag­ro­bac­te­riu­m-me­dia­ted plant tran­sfor­ma­tion: The bio­lo­gy be­hi­nd the »ge­ne-joc­keyin­g« tool. Mic­ro­biol. Mo­lec. Biol. Rev. 67: 16-37. [R] Her­skowi­tz, I. 1987. Fun­ctio­nal inac­ti­va­tion of ge­nes by do­mi­na­nt ne­ga­ti­ve mu­ta­tio­ns. Natu­re 329: 219–222. [P] Iza­nt, J. G. and H. Wein­traub. 1984. In­hi­bi­tion of thymi­di­ne ki­na­se ge­ne expres­sion by an­ tisen­se RNA: A mo­le­cu­lar ap­proa­ch to gene­tic ana­lysis. Ce­ll 36: 1007–1015. [P] Ku­hn, R., F. Schwe­nk, M. Aguet and K. Rajew­ sky. 1995. In­du­cib­le ge­ne tar­ge­ti­ng in mi­ce. Scien­ce 269: 1427–1429. [P] Mel­lo, C. C. and D. Con­te Jr. 2004. Re­vea­li­ng the wor­ld of RNA in­ter­fe­ren­ce. Na­tu­re 431: 338342. [R] Nilsen, T. W. 2007. Mechanisms of microRNAmediated gene regulation in animal cells. Trends Genet. 23:243-249. [R] Novina, C. D. and P. A. Sharp. 2004. The RNAi revolution. Nature 430: 161-164. [R] Pal­mi­ter, R. D. and R. L. Brin­ster. 1986. Ge­r­mline tran­sfor­ma­tion of mi­ce. Ann. Rev. Genet. 20: 465–499. [R] Smi­th, M. 1985. In vit­ro mu­ta­ge­ne­sis. Ann. Rev. Ge­net. 19: 423–462. [R] Stru­hl, K. 1983. The new yea­st ge­ne­ti­cs. Na­tu­re 305: 391–397. [R] The In­ter­na­tio­nal Knoc­kout Mou­se Con­sor­ tium. 2007. A mou­se for all rea­so­ns. Ce­ll 128: 9-13.

DIO

II

Protok genetičkih informacija

POGLAVLJE 5

Organizacija i redoslijed staničnih genoma

POGLAVLJE 6

Replikacija, održavanje i preslagivanje genomske DNA

POGLAVLJE 7

Sinteza i doradba DNA

POGLAVLJE 8

Sinteza, doradba i regulacija proteina

5 Složenost eukariotskih genoma  155 Kromosomi i kromatin  166 Re­dos­li­jed či­ta­vih genoma  176 Bioin­for­matika i sistemna biologija  191 Ključ­ni po­kus Otkriće introna  158 Ključ­ni po­kus Ljudski genom  186

Or­ga­ni­za­ci­ja i re­dos­li­jed sta­nič­nih ge­no­ma Kao ge­ne­tič­ki ma­te­ri­jal, DNA da­je nac­rt za us­mje­ra­va­nje svih sta­ni­ čnih ak­tiv­nos­ti kao i za od­re­đi­va­nje pla­na raz­vo­ja vi­šes­ta­nič­nih or­ga­ni­za­ ma. Pre­ma to­me, ra­zu­mi­je­va­nje struk­tu­re i fun­kci­je ge­na je od fun­da­ men­tal­ne važ­nos­ti za ra­zu­mi­je­va­nje mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je sta­ni­ce. Raz­voj me­to­da klo­ni­ra­nja ge­na pred­stav­ljao je naj­važ­ni­ji ko­rak pre­ma ovom ci­lju jer je omo­gu­ćio znan­stve­ni­ci­ma se­ci­ra­nje slo­že­nih eu­ka­riot­skih ge­no­ma kao i prou­ča­va­nje fun­kci­je eu­ka­riot­skih ge­na. Kon­ti­nui­ra­no nap­re­do­va­nje teh­no­lo­gi­je re­kom­bi­nan­tne DNA up­ra­vo nas je do­ve­lo do uz­bud­lji­vog tre­nut­ka od­re­đi­va­nja sek­ven­ci či­ta­vih ge­no­ma što omo­gu­ću­je no­vi pri­ stup de­šif­ri­ra­nju ge­ne­tič­ke os­no­ve po­na­ša­nja sta­ni­ce. Kao što je iz­lo­že­no u 4. pog­lav­lju, po­čet­na prim­je­na teh­no­lo­gi­je re­ kom­bi­nan­tne DNA bi­la je us­mje­re­na na izo­la­ci­ju i ana­li­zu po­je­di­nih ge­ na. Ne­dav­no su op­sež­ni (en­gl. lar­ge-sca­le) pro­jek­ti sek­ven­ci­ra­nja či­ta­vih ge­no­ma do­ve­li do sek­ven­ci­ra­nja kom­plet­nih ge­nom­skih slje­do­va (en­gl. sequen­ces) sto­ti­na bak­te­ri­ja, kvas­ca, mno­gih bilj­nih i ži­vo­tinj­skih vr­sta uk­lju­ču­ju­ći i čov­je­ka. Pot­pu­ne sek­ven­ce sta­nič­nih ge­no­ma da­ju bo­ga­tu žet­vu in­for­ma­ci­ja omo­gu­ća­va­ju­ći iden­ti­fi­ka­ci­ju mno­gih do sa­da ne­poz­na­ tih ge­na i re­gu­lacijskih slje­do­va. Od re­zul­ta­ta pro­je­ka­ta sek­ven­ci­ra­nja ge­ no­ma oče­ku­je se da će či­tav niz go­di­na sti­mu­li­ra­ti bu­du­ća is­tra­ži­va­nja u mo­le­ku­lar­noj i sta­nič­noj bio­lo­gi­ji te da će ima­ti zna­ča­jan ut­je­caj na na­še ra­zu­mi­je­va­nje i te­ra­pi­ju bo­les­ti u čov­je­ka.

Slo­že­no­st eu­ka­riot­skih ge­no­ma Ge­no­mi ve­ći­ne eu­ka­rio­ta ve­ći su i slo­že­ni­ji od pro­ka­riot­skih (sl. 5-1). Ve­li­či­na eu­ka­riot­skih ge­no­ma ni­je sa­ma po se­bi iz­ne­na­đu­ju­ća, bu­du­ći da bi se i oče­ki­va­lo da će se u slo­že­ni­jim or­ga­niz­mi­ma pro­na­ći vi­še ge­na. Ipak, iz­gle­da da ve­li­či­na ge­no­ma ni­je u raz­mje­ru sa ge­ne­tič­kom slo­že­noš­ ću. Prim­je­ri­ce, ge­no­mi daž­dev­nja­ka i lji­lja­na sad­rž­ a­va­ju vi­še od de­set pu­ ta ve­ću ko­li­či­nu DNA od ljud­sko­ga ge­no­ma, pa ipak, pos­ve je jas­no da ovi or­ga­niz­mi ni­su de­set pu­ta slo­že­ni­ji od ljud­skog. Ovaj pri­vid­ni pa­ra­do­ks tu­ma­či se ot­kri­ćem da ge­no­mi ve­ći­ne eu­ka­ riot­skih sta­ni­ca ne sad­r­ža­va­ju sa­mo fun­kcio­nal­ne ge­ne već i ve­li­ke ko­li­či­ ne DNA slje­do­va ko­ji ne ko­di­ra­ju pro­tei­ne. Raz­li­ka u ve­li­či­ni iz­me­đu ge­ no­ma daž­dev­nja­ka i čov­je­ka dak­le vi­še od­ra­ža­va raz­li­ku u ve­ćoj ko­li­či­ni

156    POGLAVLJE 5 Sli­ka 5-1. Ve­li­či­na ge­no­ma.  Ras­pon ve­li­či­ne ge­no­ma rep­re­zen­ta­tiv­nih sku­pi­ na or­ga­ni­za­ma pri­ka­zan je na lo­ga­ri­tam­ skoj ska­li.

ne­ko­di­ra­ju­ćih slje­do­va ne­go­li u ve­ćem bro­ju ge­na u daž­dev­nja­ka. Pri­sut­ no­st ve­li­ke ko­li­či­ne ne­ko­di­ra­ju­ćih slje­do­va je­st op­će svoj­stvo ge­no­ma slo­ že­nih eu­ka­rio­ta. Iz to­ga sli­je­di da ti­su­ću pu­ta ve­ća du­lji­na ljud­sko­ga ge­no­ ma u us­po­red­bi s onim u E. co­li ni­je uz­ro­ko­va­na sa­mo ve­ćim bro­jem

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   157

ljud­skih ge­na. Za ljud­ski ge­nom se pret­pos­tav­lja da sad­rž­ i 20.000 do 25.000 ge­na što je sa­mo 5 pu­ta vi­še ne­go­li onaj E. co­li. Pre­ma to­me, slo­že­no­st eu­ ka­riot­skih ge­no­ma ve­ći­nom je re­zul­tat ve­li­ke ko­li­či­ne ne­ko­li­ci­ne raz­li­či­tih ti­po­va ne­ko­di­ra­ju­ćih slje­do­va ko­ji či­ne pre­tež­ni dio DNA u sta­ni­ca­ma vi­ših eu­ka­rio­ta.

In­tro­ni i eg­zo­ni

Pre­ma mo­le­ku­lar­noj ter­mi­no­lo­gi­ji gen se mo­že de­fi­ni­ra­ti kao dio DNA ko­ji se ek­spri­mi­ra u obliku fun­kcio­nal­nog pro­duk­ta i to bi­lo u ob­li­ku RNA (prim­je­ri­ce ri­bo­som­ske i tran­spor­tne RNA) bi­lo u ob­li­ku po­li­pep­ti­da. Ne­ ke od ne­ko­di­ra­ju­ćih DNA u eu­ka­rio­ta ub­ra­ja­ju se u du­ge DNA-slje­do­ve ko­ji le­že u pros­to­ri­ma iz­me­đu ge­na (raz­dvoj­ni slje­do­vi, en­gl. spa­cer se­ quen­ces). Me­đu­tim, unu­tar ve­ći­ne eu­ka­riot­skih ge­na ta­ko­đer se na­la­ze ve­ li­ke ko­li­či­ne ne­ko­di­ra­ju­će DNA. Tak­vi ge­ni ima­ju po­di­je­lje­nu struk­tu­ru u ko­ji­ma su seg­men­ti ko­di­ra­ju­ćih slje­do­va (eg­zo­ni) raz­dvo­je­ni s po­mo­ću ne­ ko­di­ra­ju­ćih slje­do­va (in­ter­ve­ni­ra­ju­će sek­ven­ce ili in­tro­ni) (sl. 5-2). Pre­pi­ si­va­njem či­ta­vog ge­na nas­ta­je du­gač­ka mo­le­ku­la RNA (pre-mR­NA, op. prev.), a on­da se in­tro­ni uk­la­nja­ju pro­ce­som prek­ra­ja­nja (en­gl. spli­ci­ng) ta­ko da u mo­le­ku­li RNA os­ta­ju sa­mo eg­zo­ni. In­tro­ni su pr­vi put neo­vis­no ot­kri­ve­ni 1977. go­di­ne u la­bo­ra­to­ri­ji­ma Phil­li­pa Shar­pa i Ric­har­da Ro­ber­tsa pri­li­kom is­tra­ži­va­nja rep­li­ka­ci­je ade­ no­vi­ru­sa u kul­ti­vi­ra­nim hu­ma­nim sta­ni­ca­ma. Ade­no­vi­rus pred­stav­lja ko­ ris­tan mo­del za prou­ča­va­nje gen­ske ek­spre­si­je za­to što ge­nom ovog vi­ru­sa sad­r­ža­va sa­mo oko 3,5 × 104 pa­ro­va ba­za kao i za­to što se u za­ra­že­nim sta­ ni­ca­ma proiz­vo­de ve­li­ke ko­li­či­ne mR­NA ade­no­vi­ru­sa. Je­dan od pris­tu­pa ko­riš­te­nih za ka­rak­te­ri­za­ci­ju ade­no­vi­rus­ne mR­NA išao je pre­ko od­re­đi­va­ nja smješ­ta­ja od­go­va­ra­ju­ćih vi­rus­nih ge­na pro­mat­ra­njem RNA-DNA hi­bri­ da elek­tron­skim mik­ros­ko­pom. Bu­du­ći da se RNA-DNA hib­ri­di mo­gu raz­ li­ko­va­ti od jed­no­lan­ča­ne DNA, mo­gu se od­re­di­ti po­lo­ža­ji RNA pri­je­pi­sa na mo­le­ku­li DNA. Za­ču­do, ovak­vi ek­spe­ri­men­ti ot­kri­li su da se ade­no­vi­rus­ne mR­NA ne hib­ri­di­zi­ra­ju sa­mo s jed­nim pod­ruč­jem vi­rus­ne DNA (sl. 5-3). Um­jes­to to­ga, po­je­di­na mo­le­ku­la mR­NA hib­ri­di­zi­ra se s ne­ko­li­ko od­vo­je­ nih pod­ruč­ja vi­rus­no­ga ge­no­ma. Iz to­ga sli­je­di da ade­no­vi­rus­na mR­NA ne od­go­va­ra nep­re­kid­nom pri­je­pi­su DNA-ka­lu­pa; zap­ra­vo, mR­NA se skla­pa iz ne­ko­li­ci­ne raz­li­či­tih blo­ko­va slje­do­va ko­ji pot­je­ču iz raz­li­či­tih di­je­lo­va vi­rus­ne DNA. Kas­ni­je se po­ka­za­lo da se to od­vi­ja uz po­moć prek­ra­ja­nja RNA (en­gl. RNA spli­ci­ng) što će­mo de­talj­no pri­ka­za­ti u 7. pog­lav­lju. Ub­r­zo na­kon ot­kri­ća in­tro­na u ade­no­vi­ru­sa, pri­mi­je­će­na je slič­na po­ja­ va u klo­ni­ra­nim ge­ni­ma eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Prim­je­ri­ce, elek­tron­sko­mik­ ros­kop­ska ana­li­za RNA-DNA hib­ri­da i nak­nad­no sek­ven­ci­ra­nje klo­ni­ra­nih ge­nom­skih DNA i cDNA po­ka­za­li su da je ko­di­ra­ju­ća re­gi­ja miš­jeg β-glo­

Sli­ka 5-2. Struk­tu­ra eu­ka­riot­skih ge­ na.  Ve­ći­na eu­ka­riot­skih ge­na sad­r­ža­va seg­men­te ko­di­ra­ju­ćih slje­do­va (eg­zo­ni) ko­ji su is­pre­ki­da­ni ne­ko­di­ra­ju­ćim slje­do­ vi­ma (in­tro­ni). In­tro­ni i eg­zo­ni za­jed­no se pre­pi­su­ju u du­gač­ki pri­mar­ni tran­skript RNA. Na­kon to­ga se pri­li­kom for­mi­ra­nja zre­le mR­NA prek­ra­ja­njem uk­la­nja­ju in­ tro­ni.

158    POGLAVLJE 5

KL JUČNI POKUS

Otkriće introna Spli­ced Seg­men­ts at the 5' Ter­mi­nus of Ade­no­vi­rus 2 La­te mR­NA Su­san M. Ber­get, Clai­re Moo­re, and Phil­lip A. Sha­rp Mas­sac­hu­set­ts In­sti­tu­te of Tec­hno­lo­gy, Cam­brid­ge, Mas­sac­hu­set­ts Pro­cee­din­gs of the Na­tio­nal Aca­de­my of Scien­ces USA, vol. 74, 1977, str. 3171–3175

Kon­tek­st Pri­je ne­go­li se raz­vi­lo mo­le­ku­lar­no klo­ ni­ra­nje ma­lo se zna­lo o sin­te­zi mR­NA u eu­ka­riot­skoj sta­ni­ci. Ipak, bi­lo je jas­ no da je ovaj pro­ces pu­no slo­že­ni­ji u eu­ka­rio­ta ne­go u bak­te­ri­ja. Iz­gle­da­lo je da sin­te­za eu­ka­riot­skih mR­NA tre­ ba osim tran­skrip­ci­je ta­ko­đer i reak­ci­ je do­ra­dbe ko­je mo­di­fi­ci­ra­ju struk­tu­ru pri­mar­nih tran­skri­pa­ta. Ono što je tu bi­lo naj­zna­čaj­ni­je je­st da se či­ni­lo kao da se eu­ka­riot­ske mR­NA sin­te­ti­zi­ra­ju u ob­li­ku du­gač­kih pri­mar­nih tran­skri­pa­ta u jez­gri, a on­da ki­da­ju da se stvo­re pu­ no kra­će mo­le­ku­le mR­NA ko­je pre­la­ze u ci­top­laz­mu. Op­će­ni­to se smat­ra­lo da stup­nje­vi ova­ kve do­ra­dbe uk­lju­ču­ju ukla­nja­nje slje­ do­va s 5' i 3' kra­je­va pri­mar­no­ga tran­ skrip­ta. Pre­ma ovo­me mo­de­lu, mR­NA uk­lop­lje­ne u du­gač­ke pri­mar­ne trans­ krip­te bi­le bi ko­di­ra­ne nep­re­ki­nu­tim slje­do­vi­ma DNA. Ova­kav pog­led na eu­­ka­riot­sku mR­NA ra­di­kal­no je pro­mi­ je­ni­lo ot­kri­će prek­ra­ja­nja do če­ga su ne­ovis­no doš­li Ber­get, Moo­re i Sha­rp te Loui­se Chow, Ric­ha­rd Ge­li­nas, Tom Bro­ker i Ric­ha­rd Ro­ber­ts (An ama­zi­ng sequen­ce ar­ran­ge­me­nt at the 5' en­ds of ade­no­vi­rus 2 mes­sen­ger RNA, Ce­ll 12: 1-8, 1977).

su svoj po­kus na mR­NA ko­ja se stva­ra u ve­li­koj ko­li­či­ni, a ko­di­ra vi­rus­ni struk­ tur­ni po­li­pep­tid poz­nat pod ime­nom heg­zon (en­gl. hexon). U svr­hu kar­ti­ra­nja heg­zon­ske mR­NA u vi­rus­nom ge­no­mu, pro­čiš­će­na mRNA hib­ri­di­zi­ra­na je s ade­no­vi­rus­nom DNA, a hib­rid­ne su mo­le­ku­le preg­le­da­ne elek­tron­skom mik­ros­ko­pi­jom. Kao što se i oče­ki­va­lo glav­ni dio heg­zon­ske mR­NA stva­rao je hib­ri­de s res­trik­cij­skim frag­men­ti­ma ade­no­vi­rus­ne DNA za ko­ je se pret­hod­no saz­na­lo da sad­r­ža­va­ju heg­zon­ski gen. Ipak, na op­će iz­ne­na­ đe­nje, slje­do­vi na 5' kra­ju hegzon­ske mRNA ni­su se hib­ri­di­zi­ra­li sa slje­do­ vi­ma DNA u bli­zi­ni onih ko­ji ko­di­ra­ju glav­ni dio po­ru­ke, što je upo­zo­ri­lo na to da 5' kraj mR­NA mo­le­ku­le pot­je­če od slje­do­va ko­ji su smješ­te­ni na ne­kom dru­gom mjes­tu vi­rus­no­ga ge­no­ma. Ova mo­guć­no­st prov­je­re­na je hib­ri­di­za­ ci­jom heg­zon­ske mR­NA s res­trik­cij­skim frag­men­tom ko­ji se pro­te­že uz­vod­no od heg­zon­sko­ga ge­na. Hib­ri­di iz­me­đu mR­NA i DNA ko­ji su se stva­ra­li u ovom

Phillip Sharp

Richard Roberts

po­ku­su po­ka­za­li su slo­že­nu struk­tu­ru u ob­li­ku pet­lji (vi­di sli­ku). Glav­ni­na mR­NA stvo­ri­la je du­gač­ku hib­rid­nu re­gi­ju s pret­hod­no iden­ti­fi­ci­ra­nim heg­zon­skim slje­do­vi­ma DNA. Iz­ne­na­đu­ju­će je bi­lo da se 5' kraj heg­zon­ske mR­NA hib­ri­di­ zi­rao s tri krat­ke uz­vod­ne re­gi­je DNA ko­je su bi­le od­vo­je­ne jed­na od dru­ge i od glav­ni­ne tran­skrip­ta ve­li­kim jed­ no­lan­ča­nim pet­lja­ma DNA. Po­ka­za­lo se da se slje­do­vi na 5' kra­ju heg­zon­ske mR­NA pre­pi­su­ju iz tri­ju od­vo­je­nih re­ gi­ja vi­rus­no­ga ge­no­ma ko­je su se pre­ kra­ja­njem po­ve­za­le s glav­nim di­je­lom mR­NA za vri­je­me do­ra­dbe du­gač­kog pri­mar­nog tran­skrip­ta.

Ut­je­caj Na­kon ot­kri­ća prek­ra­ja­nja ade­no­vi­rus­ ne mR­NA, br­zo su us­li­je­di­li slič­ni po­ku­

Ek­spe­ri­men­ti Ob­je is­tra­ži­vač­ke sku­pi­ne ko­je su ot­kri­ le prek­ra­ja­nje ko­ris­ti­le su ade­no­vi­rus 2 za is­tra­ži­va­nje sin­te­ze mR­NA u ljud­skim sta­ni­ca­ma. Naj­ve­ća pred­no­st vi­ru­sa je­st u to­me da pred­stav­lja mo­del ko­ji je pu­ no jed­nos­tav­ni­ji od sta­ni­ce do­ma­ći­na. Vi­rus­na DNA mo­že se iz­rav­no izo­li­ra­ti iz vi­rus­nih čes­ti­ca, a mo­le­ku­le mR­NA ko­je ko­di­ra­ju vi­rus­ne struk­tur­ne pro­tei­ ne pri­sut­ne su u ta­ko ve­li­koj ko­li­či­ni da se mo­gu iz­rav­no pro­čis­ti­ti iz za­ra­že­nih sta­ni­ca. Ber­get, Moo­re i Sha­rp us­mje­ri­li

Elek­tron­skomik­ros­kop­ska sli­ka i pra­će­nje heg­zon­ske mR­NA hib­ri­di­zi­ra­ne na ade­no­vi­rus­nu DNA. Jednolan­ča­ne pet­lje oz­na­če­ne s A, B i C od­go­va­ra­ju in­tro­ni­ma.

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   159

KL JUČNI POKUS si sa sta­nič­nim mR­NA mo­le­ku­la­ma ko­ji su po­ka­za­li da eu­ka­riot­ski ge­ni ima­ju pret­hod­no pos­ve nep­red­vi­đe­nu struk­ tu­ru. Nji­ho­vi ko­di­ra­ju­ći slje­do­vi ni­su bi­li kon­ti­nui­ra­ni ne­go su ih pre­ki­da­li in­tro­ni ko­ji su se od­stra­nji­va­li prek­ra­ja­ njem pri­mar­no­ga pri­je­pi­sa. Za in­tro­ne se da­nas zna­de da či­ne ve­li­ki dio DNA eu­ka­riot­skih ge­no­ma, a ulo­ga in­tro­na

u evo­lu­ci­ji i re­gu­la­ci­ji gen­ske ek­spre­si­ je pred­stav­lja pod­ruč­je ko­je se i da­lje ak­tiv­no prou­ča­va. Ot­kri­će prek­ra­ja­nja ta­ko­đer je po­tak­lo ve­li­ko za­ni­ma­nje za me­ha­ni­zam ove neo­če­ki­va­ne reak­ci­je do­ra­dbe mR­NA. Kao što je pri­ka­za­no u 7. pog­lav­lju, ove stu­di­je ni­su sa­mo ras­vi­jet­li­le no­ve me­ha­niz­me re­gu­la­ci­je gen­ske ek­spre­si­je; one su ta­ko­đer ot­

kri­le no­ve ka­ta­li­tič­ke ak­tiv­nos­ti RNA i po­das­tr­le važ­ne po­dat­ke ko­ji po­du­pi­ ru hi­po­te­zu po ko­joj je ra­na evo­lu­ci­ ja bi­la ba­zi­ra­na na sa­moum­na­ža­ju­ćim RNA mo­le­ku­la­ma. Ta­ko je neo­če­ki­va­na struk­tu­ra ade­no­vi­rus­ne mR­NA os­tva­ri­la go­lem ut­je­caj na raz­li­či­ta pod­ruč­ja sta­ nič­ne i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je.

binskoga ge­na (ko­ji ko­di­ra β-pod­je­di­ni­cu he­mog­lo­bi­na) pre­ki­nu­ta dva­ma in­tro­ni­ma ko­ji se iz mR­NA uk­la­nja­ju prek­ra­ja­njem (sl. 5-4). In­tron­sko-eg­ zon­ska struk­tu­ra mno­gih eu­ka­riot­skih ge­na pri­lič­no je kom­pli­ci­ra­na, a ko­ li­či­na DNA u in­tron­skim slje­do­vi­ma čes­to je ve­ća od one u eg­zo­ni­ma. Na prim­jer, pros­ječ­ni hu­ma­ni gen sad­r­ža­va ot­pri­li­ke 9 eg­zo­na, is­pre­ki­dan je s 8 in­tro­na i ras­po­re­đen na oko 30.000 pa­ro­va ba­za (30 ki­lo­ba­za ili kb) ge­ nom­ske DNA (tab­l. 5-1). Eg­zo­ni op­će­ni­to iz­no­se sa­mo oko 2,5 kb za­jed­no s pod­ruč­ji­ma na oba, 5’ i 3’ kra­ja mR­NA ko­ji se ne pre­vo­de u pro­tein (engl. 5’ i 3’ un­tran­sla­ted re­gio­ns, UT­Rs). Pre­ma to­me, vi­še od 90% pros­ječ­nog hu­ma­no­ga ge­na či­ne in­tro­ni. In­tro­ni su pri­sut­ni u ve­ći­ni ge­na slo­že­nih eu­ Sli­ka 5-3. Iden­ti­fi­ka­ci­ja in­tro­na u ade­ no­vi­rus­noj mR­NA.  (A) Gen za ko­di­ ra­nje ade­no­vi­rus­no­ga heg­zo­na (glav­ni struk­tur­ni pro­tein vi­rus­ne čes­ti­ce) sas­to­ji se od če­ti­ri­ju eg­zo­na ko­ji su is­pre­ki­da­ni tri­ma in­tro­ni­ma. (B) Pri­kaz elek­tron­sko mi­kros­kop­ske fo­tog­ra­f i­je hi­po­te­tič­ko­ga hi­bri­da iz­me­đu heg­zon­ske mR­NA i di­je­ la ade­no­vi­rus­ne DNA. Eg­zo­ni su pri­ka­za­ ni kao pod­ruč­ja RNA-DNA hib­ri­da ko­ja su raz­dvo­je­na jed­no­lan­ča­nim pet­lja­ma DNA ko­je od­go­va­ra­ju in­tro­ni­ma.

160    POGLAVLJE 5 Sli­ka 5-4. Miš­ji β-glo­bin­ski gen.  Ovaj gen sad­r­ži dva in­tro­na ko­ji di­je­le ko­di­ra­ ju­ću re­gi­ju na tri eg­zo­na. Eg­zon 1 ko­di­ra ami­no­ki­se­li­ne 1 do 30, eg­zon 2 ko­di­ra ami­no­ki­se­li­ne 31 do 104, a eg­zon 3 ko­ di­ra ami­no­ki­se­li­ne 105 do 146. Eg­zo­ni 1 i 3 ta­ko­đer sad­r­ža­va­ju re­gi­je ko­je se ne pre­vo­de (UTR), pr­vi na 5', a dru­gi na 3' kra­ju mR­NA.

ka­rio­ta, ia­ko ne pred­stav­lja­ju uni­ver­zal­nu po­ja­vu. Prim­je­ri­ce, in­tro­ni ne­ dos­ta­ju u go­to­vo svim his­ton­skim ge­ni­ma, pa je pre­ma to­me jas­no da in­ tro­ni ni­su pot­reb­ni za fun­kcio­ni­ra­nje ge­na u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Ta­ ko­đer tre­ba do­da­ti da in­tro­ni ni­su na­đe­ni ni u ve­ći­ni ge­na jed­nos­tav­nih eu­ka­rio­ta kao što su kvas­ci. Na­sup­rot to­me, in­tro­ni je­su pri­sut­ni u ne­kim ri­jet­kim ge­ni­ma pro­ka­rio­ta. Pre­ma to­me, pri­sut­no­st ili od­sut­no­st in­tro­na ne pred­stav­lja ap­so­lut­nu raz­li­ku iz­me­đu pro­ka­riot­skih i eu­ka­riot­skih ge­na iako su in­tro­ni da­le­ko češ­ći u vi­ših eu­ka­rio­ta (i bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja) gdje na njih ot­pa­da zna­tan dio cje­lo­kup­ne ge­nom­ske DNA. Mno­gi in­tro­ni su kon­ zer­vi­ra­ni u ge­ni­ma i bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja što uka­zu­je na to da su se po­ja­vi­li ra­no u evo­lu­ci­ji, pri­je bilj­no-ži­vo­tinj­ske di­ver­gen­ci­je. Ia­ko ve­ći­na in­tro­na ne od­re­đu­je sin­te­zu pro­tein­skog proiz­vo­da, oni ima­ju ne­ke dru­ge važ­ne sta­nič­ne ak­tiv­nos­ti. Mno­gi in­tro­ni ko­di­ra­ju fun­ kcio­nal­ne RNA, uk­lju­ču­ju­ći ma­le nuk­leo­lar­ne RNA ko­je ra­de na ob­ra­dbi ri­bo­som­ske RNA (v. pog­l. 9) i mik­roR­NA ko­je pred­stav­lja­ju zna­čaj­ne re­gu­ la­to­re gen­ske ek­spre­si­je u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma (v. pog­l. 7 i 8). In­tro­ni sad­r­že regu­la­cijske slje­do­ve ko­ji kon­tro­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju i ob­ra­dbu mRNA. Osim to­ga, pri­sut­no­st in­tro­na omo­gu­ću­je eg­zo­ni­ma jed­nog ge­na spa­ja­nje u raz­li­či­tim kom­bi­na­ci­ja­ma što re­zul­ti­ra sin­te­zom raz­li­či­tih pro­ tei­na na te­me­lju jed­nog te is­tog ge­na. Ovaj pro­ces pod ime­nom al­ter­na­tiv­ no prek­ra­ja­nje (en­gl. al­ter­na­ti­ve spli­ci­ng) (sl. 5-5) zbi­va se čes­to u ge­ni­ma slo­že­nih eu­ka­rio­ta. Na prim­jer, mis­li se da ve­ći­na hu­ma­nih ge­na al­ter­na­ tiv­nim prek­ra­ja­njem mo­že po pri­li­ci da­ti pros­ječ­no pet raz­li­či­tih mR­NA, pa al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje zna­čaj­no po­ve­ća­va fun­kcio­nal­ni re­per­toar 20.000 do 25.000 ge­na hu­ma­nog ge­no­ma. Za in­tro­ne se ta­ko­đer smat­ra da su odig­ra­li važ­nu ulo­gu u evo­lu­ci­ji olak­ša­va­ju­ći re­kom­bi­na­ci­ju iz­me­đu re­gi­ja za ko­di­ra­nje pro­tei­na (eg­zo­na) raz­li­či­tih ge­na pro­ce­som ko­ji je poz­nat pod ime­nom mi­je­ša­nje eg­zo­na (engl. exon shuf ­fl i­ng). Eg­zo­ni čes­to ko­di­ra­ju fun­kcio­nal­no raz­li­či­te pro­tein­ ske do­me­ne, pa bi re­kom­bi­na­ci­ja me­đu in­tro­ni­ma raz­li­či­tih ge­na re­zul­ti­ra­ Tab­li­ca 5-1. Ka­rak­te­ris­ti­ke pros­ječ­nog ljud­skog ge­na Broj eg­zo­na Broj in­tro­na Eg­zon­ske sek­ven­ce: 5’ nep­re­ve­de­na re­gi­ja Ko­di­ra­ju­ća sek­ven­ca 3’ nep­re­ve­de­na re­gi­ja UKUPNO In­tron­ske sek­ven­ce:

9 8 300 pa­ro­va ba­za 1.400 pa­ro­va ba­za 800 pa­ro­va ba­za 2.500 pa­ro­va ba­za 27.000 pa­ro­va ba­za

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

la no­vim ge­ni­ma ko­ji sad­r­ža­va­ju no­ve kom­bi­na­ci­je slje­do­va za ko­di­ra­nje pro­tei­na. U skla­du s ovom hi­po­te­zom, prou­ča­va­nja pos­ve­će­na sek­ven­ci­ra­ nju po­ka­za­la su da su ne­ki ge­ni eg­zon­ske ki­me­re iz­ve­de­ne od ne­ko­li­ci­ne ge­na, a to pred­stav­lja di­rek­tni do­kaz da no­vi ge­ni mo­gu nas­ta­ti re­kom­bi­ na­ci­jom iz­me­đu in­tron­skih slje­do­va.

Po­nav­lja­ju­ći (re­pe­ti­tiv­ni) slje­do­vi DNA In­tro­ni zna­čaj­no dop­ri­no­se ve­ćoj ve­li­či­ni ge­no­ma vi­ših eu­ka­rio­ta. U lju­ di, prim­je­ri­ce, in­tro­ni iz­no­se ot­pri­li­ke 20% ukup­ne ge­nom­ske DNA. Ipak, je­dan još ve­ći dio slo­že­nih eu­ka­riot­skih ge­no­ma sas­to­ji se od vi­so­kopo­nav­ ljajućih ne­ko­di­ra­ju­ćih slje­do­va DNA. Ove slje­do­ve, ko­ji su po­ne­kad zas­tup­ lje­ni sto­ti­na­ma ti­su­ća ko­pi­ja po ge­no­mu, pr­vi su pro­naš­li Roy Brit­ten i Da­ vid Koh­ne za vri­je­me prou­ča­va­nja br­zi­ne rea­so­ci­ja­ci­je de­na­tu­ri­ra­nih frag­me­na­ta sta­nič­ne DNA (sl. 5-6). De­na­tu­ri­ra­ni lan­ci DNA hib­ri­di­zi­ra­ju se je­dan s dru­gim (rea­so­ci­ra­ju) po­nov­no stva­ra­ju­ći dvos­tru­ku uz­voj­ni­cu (v.

   161

Sli­ka 5-5. Al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­ nje.  Gen pri­ka­zan na sli­ci sad­r­ža­va še­st eg­zo­na ko­ji su raz­dvo­je­ni s po­mo­ću pet in­tro­na. Al­ter­na­tiv­no iz­re­zi­va­nje omo­ gu­ću­je ovim eg­zo­ni­ma da se po­ve­žu na raz­li­či­te na­či­ne, pa se stva­ra­ju tri raz­li­či­te mR­NA mo­le­ku­le i tri raz­li­či­ta pro­tei­na iz jed­no­ga pri­mar­no­ga tran­skrip­ta.

Sli­ka 5-6. Iden­ti­fi­ka­ci­ja re­pe­ti­tiv­nih slje­do­va po­mo­ću rea­so­ci­ja­ci­je DNA.  Ki­ne­ti­ka rea­so­ci­ja­ci­je frag­me­na­ta DNA E. co­li i go­ve­da pri­ka­za­na je kao fun­kci­ja C0t što pred­stav­lja po­čet­nu kon­cen­tra­ci­ju DNA pom­no­že­nu s vre­me­nom in­ku­ ba­ci­je. DNA E. co­li rea­so­ci­ra se jed­no­li­ko što je u skla­du s či­nje­ni­com da je sva­ki frag­me­nt DNA pri­su­tan sa sa­mo jed­ nom ko­pi­jom u ge­no­mu od 4,6 × 106 pa­ro­va ba­za. Za raz­ li­ku od to­ga frag­men­ti DNA go­ve­da po­ka­zu­ju dva raz­li­či­ta na­či­na rea­so­ci­ja­ci­je. Oko 60% frag­me­na­ta DNA (ne­po­nav­ lja­jući slje­do­vi) rea­so­ci­ra­ju se spo­ri­je ne­go DNA E. co­li kao što se i oče­ku­je za slje­do­ve ko­ji su pri­sut­ni u jed­noj ko­pi­ji u ve­ćem ge­no­mu go­ve­da (3 × 109 pa­ro­va ba­za). Ipak, os­ta­lih 40% frag­me­na­ta DNA go­ve­da (po­navljajući slje­do­vi) rea­so­ ci­ra­ju se br­že od DNA E. co­li što upu­ću­je na to da pos­to­je vi­šes­tru­ke ko­pi­je po­je­di­nih slje­do­va.

162    POGLAVLJE 5 Tab­li­ca 5-2. Re­pe­ti­tiv­ni slje­do­vi u hu­ma­nom ge­nu Vr­sta sli­je­da Broj ko­pi­ja a Po­nav­lja­nje jed­nos­tav­nih slje­do­va >1,000.000 Ret­rot­ran­spo­zo­ni   LINE 850.000   SINE 1,500.000   ret­ro­vi­ru­su slič­ni ele­men­ti 450.000 DNA tran­spo­zo­ni 300.000

Dio ge­no­ma oko 10% 21% 13% 8% 3%

Ko­li­či­na po­nav­lja­nja jed­nos­tav­nih slje­do­va pro­ci­je­nje­na je pre­ma ud­je­lu he­te­rok­ro­ma­ti­na u ljud­ skom ge­no­mu. a

Sli­ka 5-7. Sa­te­lit­na DNA.  Rav­no­tež­ nim cen­tri­fu­gi­ra­njem DNA vin­ske mu­ši­ ce u gra­di­jen­tu gus­to­će CsCl raz­dva­ja se sa­te­lit­na DNA (oz­na­če­na bro­je­vi­ma I do IV) s gus­to­ća­ma od 1,672, 1,687 i 1,705 g/cm3, od glav­ne pru­ge ge­nom­ske DNA či­ja je gus­to­ća 1,701 g/cm3.

sl. 4-24). Bu­du­ći da je rea­so­ci­ja­ci­ja uz­voj­ni­ce DNA bi­mo­le­ku­lar­na reak­ci­ja (dva raz­dvo­je­na lan­ca mo­ra­ju se su­da­ri­ti je­dan s dru­gim ne bi li se hib­ri­di­ zi­ra­li), br­zi­na rea­so­ci­ja­ci­je ovi­si o kon­cen­tra­ci­ji la­na­ca DNA. Kad se pus­ti­ lo de­na­tu­ri­ra­ne frag­men­te DNA E. co­li da se me­đu­sob­no hib­ri­di­zi­ra­ju, sva DNA jed­no­li­ko se rea­so­ci­ra­la kao što bi se i oče­ki­va­lo da je u ge­no­mu sva­ ki sli­jed DNA pri­su­tan sa­mo jed­nom. Me­đu­tim, rea­so­ci­ja­ci­ja frag­me­na­ta DNA iz­dvo­je­nih iz sta­ni­ca si­sa­va­ca po­ka­za­la je pos­ve dru­ga­či­ju sli­ku. Ot­ pri­li­ke 50% frag­me­na­ta DNA rea­so­ci­ra­lo se br­zi­nom pred­vi­đe­nom za slje­ do­ve ko­ji su pri­sut­ni sa­mo jed­nom u ge­no­mu, a os­ta­tak se rea­so­ci­rao pu­no br­že ne­go što bi se oče­ki­va­lo. Ovi re­zul­ta­ti pro­tu­ma­če­ni su ti­me da ne­ki slje­do­vi pos­to­je u vi­še ko­pi­ja pa se zbog to­ga rea­so­ci­ra­ju pu­no br­že od slje­ do­va ko­ji su pri­sut­ni sa­mo jed­nom. Ovi su po­ku­si po­seb­no upu­ti­li na to da se prib­liž­no 50% DNA si­sa­va­ca sas­to­ji od vi­so­ko­re­pe­ti­tiv­nih slje­do­va, od ko­jih su ne­ki po­nov­lje­ni čak 105 do 106 pu­ta. Dalj­nje ana­li­ze, ko­je su svoj vr­hu­nac do­živ­je­le sek­ven­ci­ra­njem či­ta­vih ge­no­ma, iden­ti­fi­ci­ra­le su ne­ko­li­ko vr­sta ovak­vih vi­so­kopo­navljajućih slje­ do­va (tab­l. 5-2). Jed­na od tih vr­sta naz­va­na po­nav­lja­nja jed­nos­tav­nih slje­do­va (en­gl. sim­ple-sequen­ce re­pea­ts), sas­to­ji se od uzas­top­no po­nav­lja­ jućih ni­zo­va do ne­ko­li­ko ti­su­ća ko­pi­ja krat­kih slje­do­va du­lji­ne od 1 do 500 nuk­leo­ti­da. Prim­je­ri­ce, je­dan tip po­nav­lja­nja jed­nos­tav­nih slje­do­va u vin­ ske mu­ši­ce sas­to­ji se od uzas­top­nih po­nav­lja­nja je­di­ni­ce od se­dam nuk­leo­ ti­da ACAAACT. Zbog nji­ho­va je­din­stve­nog sas­ta­va, mno­ge po­nov­lje­ne jed­no­stav­ne DNA mo­gu se iz­dvo­ji­ti iz os­tat­ka ge­nom­ske DNA rav­no­tež­ nim cen­tri­fu­gi­ra­njem u gra­di­jen­ti­ma gus­to­će CsCl. Gus­to­ća DNA od­re­đe­ na je sas­ta­vom ba­za, pa slje­do­vi bo­ga­ti AT-ba­za­ma pos­je­du­ju ma­nju gus­ to­ću ne­go­li slje­do­vi bo­ga­ti GC-ba­za­ma. Zbog to­ga, jed­nos­tav­ni sli­jed bo­gat AT-ba­za­ma smješ­ta se u gra­di­jen­ti­ma CsCl u pod­ruč­ju ma­nje gus­to­će od ve­li­ke ve­ći­ne ge­nom­ske DNA vin­ske mu­ši­ce (sl. 5-7). Bu­du­ći da ovak­vi po­navljajući slje­do­vi či­ne pru­gu u ob­li­ku »sa­te­li­ta« od­vo­je­nih od glav­ne pru­ge DNA, čes­to se o nji­ma go­vo­ri kao o sa­te­lit­nim DNA. Ovi slje­do­vi po­nav­lja­ju se na mi­li­ju­ne pu­ta u ge­no­mu pa či­ne oko 10% DNA u ve­ći­ne vi­ših eu­ka­rio­ta. Po­nav­lja­nja jed­nos­tav­nih slje­do­va ne pre­pi­su­ju se i ne pre­ no­se fun­kcio­nal­nu ge­ne­tič­ku in­for­ma­ci­ju. Ne­ka ipak ig­ra­ju važ­nu ulo­gu u struk­tu­ri­ra­nju kro­mo­so­ma, o če­mu će­mo ras­prav­lja­ti u slje­de­ćem od­lom­ ku ovo­ga pog­lav­lja. Os­ta­li po­nav­ljajući slje­do­vi DNA pri­je su raš­tr­ka­ni po ge­no­mu ne­go­li na­kup­lje­ni u ob­li­ku uzas­top­nih po­nav­lja­nja. Ovi raz­ba­ca­ni po­nav­ljajući ele­men­ti naj­vi­še pri­do­no­se ve­li­či­ni ge­no­ma či­ne­ći ot­pri­li­ke 45% ljud­ske ge­nom­ske DNA. Dvi­je naj­češ­će vr­ste tak­vih slje­do­va zo­vu se SINE (en­gl. sho­rt in­ter­sper­sed ele­men­ts) tj. krat­ki raz­ba­ca­ni ele­men­ti i LINE (en­gl. lo­ng in­ter­sper­sed ele­men­ts) tj. du­gi ras­pr­še­ni ele­men­ti. SINE sad­r­ža­va­ju 100 do

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   163

Sli­ka 5-8. Pok­re­ta­nje ret­rot­ran­spozo­­ na.  Ret­rot­ran­spo­zon smješ­ten na jed­ nom mjes­tu u kro­mo­som­skoj DNA pre­ pi­su­je se u RNA, a za­tim se pret­va­ra u DNA uz po­moć re­ver­zne tran­skrip­ta­ze. Ret­rot­ran­spo­zon­ska DNA ta­da se mo­ že ug­ra­di­ti u ne­ko dru­go kro­mo­som­sko mjes­to.

300 pa­ro­va ba­za. Oko 1,5 mi­li­ju­na ovak­vih slje­do­va pro­ši­re­no je po ge­no­ mu, te či­ne ot­pri­li­ke 13% ukup­ne ljud­ske DNA. Ia­ko se SINE pre­pi­su­ju u RNA, ne ko­di­ra­ju pro­tei­ne i ne­poz­na­te su fun­kci­je. Naj­ve­ći ljud­ski LINE su du­lji­ne 4 do 6 kb ia­ko su mno­gi po­nov­lje­ni slje­do­vi iz­ve­de­ni iz LINE kra­ći, s pros­ječ­nom ve­li­či­nom od oko 1 kb. U ge­no­mu pos­to­ji oko 850.000 LINE po­nav­lja­nja što či­ni oko 21% ljud­ske DNA. LINE se pre­pi­su­ju i ba­ rem ne­ki ko­di­ra­ju pro­tei­ne, ali kao i za SINE ne­poz­na­te su ulo­ge u sta­nič­ noj fi­zio­lo­gi­ji. I SINE i LINE su prim­je­ri pok­ret­nih ele­me­na­ta ko­ji se mo­gu po­mi­ca­ti na raz­li­či­ta mjes­ta u ge­nom­skoj DNA. Kao što se de­talj­no ras­prav­lja u 6. pog­lav­lju, i SINE i LINE su ret­rot­ran­spo­zo­ni, pa se nji­ho­va tran­spo­zi­ci­ja od­vi­ja pre­ko re­ver­zne tran­skrip­ci­je (sl. 5-8). RNA-ko­pi­ja SINE ili LINE u sta­ni­ci se pret­va­ra u DNA uz po­moć re­ver­zne tran­skrip­ta­ze, pa se ug­ra­đu­ je na dru­gom mjes­tu u ge­no­mu. Raz­ba­ca­ni re­pe­ti­tiv­ni slje­do­vi tre­će vr­ste ta­ko­đer se po­mi­ču unu­tar ge­no­ma uz po­moć re­ver­zne tran­skrip­ta­ze, ja­ko su na­lik na ret­ro­vi­ru­se, pa se sto­ga i zo­vu ret­ro­vi­ru­su slič­ni ele­men­ti (engl. ret­ro­vi­ru­s-li­ke ele­men­ts). Hu­ma­ni ret­ro­vi­ru­su slič­ni ele­men­ti ima­ju ras­pon du­lji­ne od ot­pri­li­ke 2 do 10 kb. U ljud­skom ge­no­mu pri­sut­no je oko 450.000 ret­ro­vi­ru­su slič­nih ele­me­na­ta što iz­no­si oko 8% ljud­ske DNA. Za raz­li­ku od to­ga, raz­ba­ca­ni re­pe­ti­tiv­ni ele­men­ti čet­vr­te vr­ste (DNA-tran­s­po­zo­ni) po­ mi­ču se kroz ge­nom ko­pi­ra­njem i po­nov­nom ugrad­njom u ob­li­ku slje­do­va DNA ra­di­je ne­go­li pok­re­ta­njem uz po­moć re­ver­zne tran­skrip­ci­je. U ljud­ skom ge­no­mu pri­sut­no je oko 300.000 ko­pi­ja DNA-tran­spo­zo­na ve­li­či­ne od 80 do 3.000 pa­ro­va ba­za, a či­ne oko 3% ljud­ske DNA. Pre­ma to­me, bli­zu po­lo­vi­ce ljud­sko­ga ge­no­ma sas­to­ji se od raz­ba­ca­nih re­pe­ti­tiv­nih ele­me­na­ta ko­ji su se rep­li­ci­ra­li i pu­to­va­li kroz ge­nom bi­lo pre­ ko RNA ili pre­ko DNA pos­red­ni­ka. Tre­ba za­pa­zi­ti da se ve­li­ka ve­ći­na ovih ele­me­na­ta tran­spo­ni­ra pre­ko in­ter­me­di­je­ra RNA, pa je ta­ko re­ver­zna trans­ krip­ci­ja odgo­vor­na za ob­li­ko­va­nje pre­ko 40% hu­ma­no­ga ge­no­ma. Ne­ki od ovih slje­do­va mo­gu re­gu­li­ra­ti gen­sku ek­spre­si­ju, ali ve­ći­na po­nav­ljajućih slje­do­va, po sve­mu su­de­ći, ne da­je ni­ka­kav ko­ris­ni dop­ri­nos sta­ni­ci. Umje­ s­to to­ga, one su iz­gle­da, pred­stav­ni­ci »se­bič­nih DNA ele­me­na­ta« ko­ji su se­lek­cio­ni­ra­ni zbog vlas­ti­te spo­sob­nos­ti da se um­na­ža­ju u ge­no­mu, a ne zbog ne­ke se­lek­tiv­ne pred­nos­ti važ­ne za nji­ho­vog do­ma­ći­na. Me­đu­tim, pok­ret­ni su ele­men­ti odig­ra­li važ­nu ulo­gu po­ti­ca­njem preg­rad­nje ge­na što je pri­do­nije­lo ge­ne­ri­ra­nju ge­ne­tič­ke raz­no­li­kos­ti.

164    POGLAVLJE 5

Dup­li­ka­ci­ja ge­na i pseu­do­ge­ni Slje­de­ći fak­tor ko­ji pri­do­no­si ve­li­či­ni eu­ka­riot­skih ge­no­ma je­st či­nje­ni­ ca da mno­gi ge­ni pos­to­je u vi­še ko­pi­ja od ko­jih su ne­ke čes­to ne­fun­kcio­ nal­ne. Po­ne­kad vi­šes­tru­ke ko­pi­je ne­kih ge­na tre­ba­ju za slu­čaj proiz­vod­nje RNA ili pro­tei­na pot­reb­nih u ve­li­kim ko­li­či­na­ma po­put ri­bo­som­skih RNA ili his­to­na. S dru­ge stra­ne, od­re­đe­ni čla­no­vi sku­pi­ne srod­nih ge­na (po­ro­ di­ce ge­na) mo­gu se pre­pi­si­va­ti u raz­li­či­tim tki­vi­ma ili u raz­li­či­tim sta­di­ji­ ma raz­vo­ja. Prim­je­ri­ce, α- i β-pod­je­di­ni­ce he­mog­lo­bi­na u hu­ma­nom su ge­no­mu ko­di­ra­ne dvje­ma po­ro­di­ca­ma ge­na, a raz­li­či­ti čla­no­vi ovih po­ro­ di­ca ek­spri­mi­ra­ju se u em­brio­nal­nim, fe­tal­nim ili od­ras­lim tki­vi­ma (sl. 5-9). Čla­no­vi mno­gih gen­skih po­ro­di­ca (npr. glo­bin­ski ge­ni) sa­kup­lje­ni su u jed­nom pod­ruč­ju DNA; čla­no­vi os­ta­lih gen­skih po­ro­di­ca raz­ba­ca­ni su po raz­li­či­tim kro­mo­so­mi­ma. Smat­ra se da su po­ro­di­ce ge­na nas­ta­le dup­li­ka­ci­jom jed­nog iz­vor­no­ga pret­ka, a raz­li­či­ti čla­no­vi po­ro­di­ce za­tim su se od­va­ja­li kao pos­lje­di­ca mu­ ta­ci­ja nas­ta­lih ti­je­kom evo­lu­ci­je. Ovak­va di­ver­gen­ci­ja mo­že vo­di­ti evo­lu­ci­ ji srod­nih pro­tei­na ko­ji op­ti­mal­no fun­kcio­ni­ra­ju u raz­li­či­tim tki­vi­ma ili u raz­li­či­tim fa­za­ma raz­vo­ja. Prim­je­ri­ce, fe­tal­ni glo­bi­ni pos­je­du­ju vi­ši afi­ni­tet za O2 ne­go­li glo­bi­ni od­ras­log što je raz­li­ka ko­ja omo­gu­ću­je fe­tu­su da do­bi­ je O2 iz maj­čin­ske cir­ku­la­ci­je. Kao što bi se i mog­lo oče­ki­va­ti, sve mu­ta­ci­je ipak ne po­bolj­ša­va­ju fun­ kci­ju ge­na. Ne­ke ko­pi­je ge­na um­jes­to to­ga ima­ju od­r­ža­ne mu­ta­ci­je ko­je re­zul­ti­ra­ju gu­bit­kom spo­sob­nos­ti za proiz­vod­nju fun­kcio­nal­no­ga gen­skog pro­duk­ta. Prim­je­ri­ce, sva­ka od ljud­skih α- i β-glo­bin­skih gen­skih po­ro­di­ca sad­r­ža­va dva ge­na ko­ji su bi­li inak­ti­vi­ra­ni mu­ta­ci­jom. Ovak­ve ne­fun­kcio­ nal­ne ko­pi­je ge­na (zva­ne pseu­do­ge­ni) pred­stav­lja­ju evo­lu­cij­ske re­lik­te ko­ji po­ve­ća­va­ju ve­li­či­nu eu­ka­riot­skih ge­no­ma, a ne da­ju ni­ka­kav fun­kcio­nal­ni ge­ne­tič­ki dop­ri­nos. Ne­dav­no je iden­ti­fi­ci­ra­no vi­še od 20.000 pseu­do­ge­na u hu­ma­nom ge­no­mu. Bu­du­ći da se op­će­ni­to pret­pos­tav­lja da je to pre­nis­ka proc­je­na, vje­ro­jat­no je da naš ge­nom pos­je­du­je pu­no vi­še pseu­do­ge­na ne­ go­li fun­kcio­nal­nih ge­na. Dup­li­ka­ci­je ge­na mo­gu nas­ta­ti pre­ko dva­ju raz­li­či­tih me­ha­ni­za­ma. Pr­vi pred­stav­lja dup­li­ka­ci­ju di­je­la DNA ko­ja mo­že re­zul­ti­ra­ti pri­je­no­som blo­ka slje­do­va DNA na no­vu lo­ka­ci­ju u ge­no­mu. Za ovak­ve dup­li­ka­ci­je DNA‑seg­ me­na­ta du­lji­ne od 1 kb do vi­še od 50 kb proc­je­nju­je se da iz­no­se oko 5% ljud­sko­ga geno­ma. Za raz­li­ku od to­ga, ge­ni se mo­gu dup­li­ci­ra­ti ob­r­nu­tim pre­pi­si­va­njem mR­NA, na­kon če­ga sli­je­di ug­rad­nja cDNA-ko­pi­je na ne­ko

Sli­ka 5-9. Po­ro­di­ce glo­bin­skih ge­na.  Čla­no­vi ljud­skih α- i β-globinskih gen­skih po­ ro­di­ca gru­pi­ra­ni su na kro­mo­so­mi­ma 16 i 11. Sva­ka po­ro­di­ca sad­r­ži ge­ne ko­ji se spe­ci­f ič­no ek­spri­mi­ra­ju ili u tki­vi­ma em­bri­ja, fe­tu­sa ili od­ras­lo­ga or­ga­niz­ma, kao i ne­ fun­kcio­nal­ne ko­pi­je ge­na (pseu­do­ge­ne).

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   165

Sli­ka 5-10. For­mi­ra­nje do­ra­đe­no­ga pseu­do­ge­na.   Gen se pre­pi­še i pre­ kro­ji da bi se stvo­ri­la mR­NA iz ko­je su od­stra­nje­ni in­tro­ni. Ta­da se mR­NA ko­pi­ ra s po­mo­ću re­ver­zne tran­skrip­ta­ze, pa na­s­ta­je cDNA bez in­tro­na. In­teg­ra­ci­ja u kro­mo­som­sku DNA re­zul­ti­ra for­mi­ra­ njem do­ra­đe­no­ga pseu­do­ge­na.

no­vo kro­mo­som­sko mjes­to (sl. 5-10). Ovaj na­čin dup­li­ka­ci­je ge­na, ana­lo­ gan tran­spo­zi­ci­ji po­nav­ljajućih ele­me­na­ta ko­ji se pok­re­ću pre­ko RNA pos­ red­ni­ka, re­zul­ti­ra stva­ra­njem gen­skih ko­pi­ja ko­ji­ma ne­dos­ta­ju in­tro­ni, a ne­ma­ju ni nor­mal­ne kro­mo­som­ske slje­do­ve ko­ji po­ti­ču pre­pi­si­va­nje ge­na u mR­NA. Kao re­zul­tat to­ga, dup­li­ka­ci­ja ge­na re­ver­znom tran­skrip­ci­jom obič­no proiz­vo­di jed­nu inak­tiv­nu ko­pi­ju ge­na ko­ja se zo­ve do­ra­đe­ni pseu­ do­gen. Do­ra­đe­ni pseu­do­ge­ni od­go­va­ra­ju ot­pri­li­ke dvje­ma tre­ći­na­ma pseu­ do­ge­na od onih ot­kri­ve­nih u hu­ma­nom ge­no­mu.

Sas­tav ge­no­ma vi­ših eu­ka­rio­ta Bu­du­ći da se ras­prav­lja­lo o ne­ko­li­ko vr­sta ne­ko­di­ra­ju­ćih DNA ko­je pri­ do­no­se ge­nom­skoj slo­že­nos­ti u vi­ših eu­ka­rio­ta, za­nim­lji­vo bi bi­lo da­ti preg­led sas­ta­va sta­nič­nih ge­no­ma. U bak­te­rij­skih ge­no­ma, ve­ći­na DNA ko­ di­ra pro­tei­ne. Prim­je­ri­ce, ge­nom E. co­li dug je oko 4,6 × 106 pa­ro­va ba­za i sad­r­ža­va oko 4.000 ge­na, a bli­zu 90% DNA ko­ris­ti se za ko­di­ra­nje pro­tei­na. Ge­nom kvas­ca ko­ji se sas­to­ji od 12 × 106 pa­ro­va ba­za, ot­pri­li­ke je 2,5 pu­ta ve­ći od ge­no­ma E. co­li, ali je još uvi­jek iz­van­red­no kom­pak­tan. Sa­mo 4% ge­na Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­siae sad­r­ža­va in­tro­ne, a oni on­da obič­no ima­ju sa­mo je­dan ma­li in­tron bli­zu star­ta ko­di­ra­ju­će­ga sli­je­da. Ot­pri­li­ke 70% kvaš­če­va ge­no­ma ko­ris­ti se za ko­di­ra­nje pro­tei­na, što ukup­no od­re­đu­je oko 6.000 pro­tei­na. Re­la­tiv­no jed­nos­tav­ni ži­vo­tinj­ski ge­no­mi C. ele­ga­ns i vin­ske mu­ši­ce oko de­set pu­ta su ve­ći od kvaš­če­va ge­no­ma, ali sad­r­ža­va­ju sa­mo dva do tri pu­ ta vi­še ge­na. Um­jes­to to­ga, ovi jed­nos­tav­ni ži­vo­tinj­ski ge­no­mi ima­ju vi­še in­tro­na i vi­še po­nav­ljajućih slje­do­va ta­ko da slje­do­vi za ko­di­ra­nje pro­tei­na pred­stav­lja­ju sa­mo ot­pri­li­ke 25% ge­no­ma C. ele­ga­ns i oko 13% ge­no­ma vin­ske mu­ši­ce. Ge­nom bilj­no­ga mo­de­la Ara­bi­dop­sis sad­r­ži sli­čan broj ge­na, a ot­pri­li­ke 26% ge­no­ma pred­stav­lja slje­do­ve za ko­di­ra­nje pro­tei­na. Ge­no­mi vi­ših ži­vo­ti­nja (kao lju­di) ot­pri­li­ke su 20 do 30 pu­ta ve­ći od onih C. ele­ga­ns i vin­ske mu­ši­ce. Ipak, naj­ve­će iz­ne­na­đe­nje na­kon de­šif­ri­ra­ nja sli­je­da hu­ma­no­ga ge­no­ma bi­lo je ot­kri­će da ljud­ski ge­nom ima sa­mo oko 20.000–25.000 ge­na. Iz­gle­da da sa­mo 1,2% hu­ma­nog ge­no­ma sad­rž­ a­va slje­do­ve ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne. Ot­pri­li­ke 20% ge­no­ma sas­to­ji se od in­tro­ na, a vi­še od 60% sas­tav­lje­no je od raz­li­či­tih ti­po­va re­pe­ti­tiv­nih i dup­li­ci­ ra­nih slje­do­va, dok os­ta­tak od­go­va­ra pseu­do­ge­ni­ma, ne­po­nav­ljajućim raz­ dvoj­nim slje­do­vi­ma (en­gl. spa­cer sequen­ces) i eg­zon­skim slje­do­vi­ma ko­ji su pri­sut­ni na 5' i 3' kra­ju mR­NA, ali se ne pre­vo­de u pro­tein. Pre­ma to­me, po­ve­ća­nje ge­no­ma vi­ših eu­ka­rio­ta da­le­ko je vi­še pos­lje­di­ca pri­sut­nos­ti ve­ li­kih ko­li­či­na po­nav­ljajućih slje­do­va i in­tro­na ne­go­li po­ve­ća­no­ga bro­ja gena.

166    POGLAVLJE 5

Kro­mo­so­mi i kro­ma­tin Ne sa­mo da su ge­no­mi ve­ći­ne eu­ka­rio­ta da­le­ko slo­že­ni­ji od onih u pro­ ka­rio­ta, ne­go je ta­ko­đer DNA eu­ka­riot­skih sta­ni­ca or­ga­ni­zi­ra­na dru­ga­či­je od pro­ka­riot­skih. Ge­nom pro­ka­rio­ta sad­r­žan je u jed­nom kro­mo­so­mu ko­ ji je obič­no kruž­na mo­le­ku­la DNA. Za raz­li­ku od to­ga, ge­nom eu­ka­rio­ta sas­tav­ljen je od vi­še kro­mo­so­ma od ko­jih sva­ki sad­r­ža­va li­near­nu mo­le­ku­ lu DNA. Ia­ko broj i ve­li­či­na kro­mo­so­ma zna­čaj­no va­ri­ra­ju me­đu vr­sta­ma (tab­l. 5-3), os­nov­na im je struk­tu­ra jed­na­ka u svih eu­ka­rio­ta. DNA eu­ka­ riot­skih sta­ni­ca čvr­sto je ve­za­na na ma­le ba­zič­ne pro­tei­ne (his­to­ne) ko­ji u sta­nič­noj jez­gri pra­vil­no pa­ki­ra­ju DNA. To je pop­ri­lič­na za­da­ća s ob­zi­rom na ko­li­či­nu DNA ve­ći­ne eu­ka­rio­ta. Prim­je­ri­ce, ukup­na du­lji­na ras­teg­nu­te DNA u ljud­skoj sta­ni­ci iz­no­si sko­ro 2 m, a mo­ra se uk­lo­pi­ti u jez­gru či­ji je prom­jer sve­ga 5 do 10 μm.

Kro­ma­tin

5.1. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Kro­ma­tin i kro­mo­so­mi. U eu­ka­riot­ skim sta­ni­ca­ma DNA je čvr­sto omo­ta­ na oko his­ton­skih pro­tei­na (for­mi­ra­ ju­ći kro­ma­tin), a ka­da se sta­ni­ca prip­re­ma za mi­to­zu kro­ma­ tin se na­mo­ta­va sam oko se­be ne­ko­li­ko pu­ta da se for­mi­ra kom­pak­tni kro­mo­som.

Kom­ple­ks iz­me­đu eu­ka­riot­ske DNA i pro­tei­na zo­ve se kro­ma­tin, a ti­ pič­no sad­r­ža­va dvos­tru­ko vi­še pro­tei­na ne­go DNA. Glav­ni pro­tei­ni kro­ma­ ti­na su his­to­ni, ma­li pro­tei­ni ko­ji sad­r­ža­va­ju ve­li­ku ko­li­či­nu ba­zič­nih ami­ no­ki­se­li­na (ar­gi­nin i li­zin) ko­je olak­ša­va­ju ve­za­nje na ne­ga­tiv­no na­bi­je­nu mo­le­ku­lu DNA. Pos­to­ji pet ve­li­kih ti­po­va his­to­na ko­ji se zo­vu H1, H2A, H2B, H3 i H4, a vr­lo su slič­ni u raz­li­či­tih eu­ka­riot­skih vr­sta (tab­l. 5-4). His­to­na ima neo­bič­no mno­go u eu­ka­riot­skoj sta­ni­ci; nji­ho­va za­jed­nič­ka ukup­na ma­sa ot­pri­li­ke je jed­na­ka ma­si sta­nič­ne DNA. Osim to­ga, kro­ma­ tin sad­r­ži prib­liž­no jed­na­ku ma­su ve­li­kog bro­ja raz­li­či­tih ne­his­ton­skih kro­ mo­som­skih pro­tei­na. Ima vi­še od ti­su­ću raz­li­či­tih ti­po­va ovih pro­tei­na ko­ ji su uk­lju­če­ni u ci­je­li niz ak­tiv­nos­ti uk­lju­čiv­ši rep­li­ka­ci­ju DNA i gen­sku ek­spre­si­ju.

Tab­li­ca 5-3. Broj kro­mo­so­ma u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma Or­ga­ni­zam

Ve­li­či­na ge­no­ma (Mb)a

Broj kromosomaa

Kva­sac (Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­siae)

12

16

Slu­za­va pli­je­san (Dic­tyos­te­lium)

70

7

125

5

5.000

10

Ara­bi­dop­sis tha­lia­na Ku­ku­ruz Cr­ve­ni luk

15.000

8

Lji­ljan

50.000

12

97

6

180

4

3.000

18

Ne­ma­to­da (Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns) Vin­ska mu­ši­ca (Dro­sop­hi­la) Ža­ba (Xe­no­pus lae­vis) Slat­ko­vod­na ri­ba dvo­di­ha­li­ca

50.000

17

Pi­le

1.200

39

Miš

3.000

20

Kra­va

3.000

30

Pas

3.000

39

Čov­jek

3.000

23

a

Ve­li­či­na ge­no­ma kao i broj kro­mo­so­ma od­no­se se na hap­loid­ne sta­ni­ce. Mb = mi­li­jun pa­ro­va ba­za.

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   167

Tab­li­ca 5-4. Glav­ni his­ton­ski pro­tei­ni Mole­ku­lar­na teži­na

Broj aminokiselina

Pos­to­tak li­zi­na + ar­gi­ni­na

H1

22.500

244

30,8

H2A

13.960

129

20,2

H2B

13.774

125

22,4

H3

15.273

135

22,9

H4

11.236

102

24,5

His­ton

Os­nov­nu struk­tur­nu je­di­ni­cu kro­ma­ti­na, nuk­leo­som, opi­sao je 1974. go­di­ne Ro­ger Kor­nbe­rg (sl. 5-11). Dva ti­pa po­ku­sa do­ve­la su Kor­nber­ga do pred­la­ga­nja nuk­leo­som­skog mo­de­la. Pr­vo, dje­lo­mič­na raz­grad­nja kro­ ma­ti­na s po­mo­ću mik­ro­ko­kal­ne nuk­lea­ze (en­zim ko­ji raz­gra­đu­je DNA) proiz­ve­la je frag­men­te DNA du­ge oko 200 pa­ro­va ba­za. Za raz­li­ku od to­ga, slič­na raz­grad­nja go­le DNA (ko­ja ni­je bi­la ve­za­na s pro­tei­ni­ma) da­la je jed­no­lič­ni raz­maz slu­čaj­no raz­gra­đe­nih frag­me­na­ta raz­li­či­tih ve­li­či­na. Ovi re­zul­ta­ti da­li su nas­lu­ti­ti da ve­za­nje pro­tei­na na DNA šti­ti od­re­đe­na pod­ ruč­ja DNA od raz­grad­nje nuk­lea­zom ta­ko da en­zi­mi mo­gu na­pas­ti DNA sa­mo na mjes­ti­ma ko­ja su uda­lje­na oko 200 pa­ro­va ba­za. U skla­du s ti­me, elek­tron­ska mik­ros­ko­pi­ja ot­kri­la je da kro­ma­tin­ska vlak­na na­li­ku­ju na ogr­ li­cu či­je su per­le smješ­te­ne u raz­ma­ci­ma od ot­pri­li­ke 200 pa­ro­va ba­za. Ta­ ko su ob­je me­to­de, raz­grad­nja nuk­lea­zom i elek­tron­ska mik­ros­ko­pi­ja do­

Sli­ka 5-11. Or­ga­ni­za­ci­ja kro­ma­ti­na u nu­k­leo­so­mi­ma.   (A) DNA se omo­ta oko his­to­na u čes­ti­ca­ma nuk­leo­som­ske sr­ži i za­pe­ča­ti H1 his­to­nom. Ne­his­ton­ski pro­tei­ni ve­žu se na vez­nu nit DNA ko­ja po­ve­zu­je čes­ti­ce nuk­leo­som­ske sr­ži. (B) Ge­l-e­lek­tro­fo­re­za DNA frag­me­na­ta do­bi­ ve­na dje­lo­mič­nom raz­grad­njom kro­ma­ ti­na mik­ro­ko­kal­nom nuk­lea­zom. Vez­na DNA iz­me­đu čes­ti­ca nuk­leo­som­ske sr­ži po­ka­zu­je po­seb­nu os­jet­lji­vo­st, ta­ko da og­ra­ni­če­na raz­grad­nja kro­ma­ti­na da­je frag­men­te ko­ji od­go­va­ra­ju vi­šes­tru­kim um­noš­ci­ma je­di­ni­ce od 200 pa­ro­va ba­ za. (C) Elek­tron­sko­mik­ros­kop­ska sli­ka iz­du­že­no­ga kro­ma­tin­sko­ga vlak­na ko­ja pri­ka­zu­je nje­gov izgled zr­na­te og­r­li­ce. (B, lju­baz­noš­ću Ro­ge­ra Kor­nber­ga, Uni­ ver­zi­tet Stan­fo­rd; C, lju­baz­noš­ću Ade L. Oli­ns i Do­nal­da E. Oli­nsa, Na­cio­nal­ni la­ bo­ra­to­rij Oak Rid­ge.)

168    POGLAVLJE 5 Sli­ka 5-12. Struk­tu­ra kro­ma­to­so­ma.  (A) Čes­ti­ca nuk­leo­som­ske sr­ži sas­to­ji se od 147 pa­ro­va ba­za DNA omo­ta­nih 1,67 pu­ta oko his­ton­ske sr­ži, ok­ta­me­ra ko­ji sad­r­ža­va po dvi­je mo­le­ku­le H2A, H2B, H3 i H4. Kro­ma­to­som sad­r­ža­va dva pu­na ok­re­ta DNA (166 pa­ro­va ba­za) ko­je dr­ži na mjes­tu jed­na mo­le­ku­la H1. (B) Mo­del čes­ti­ce nuk­leo­ som­ske sr­ži. DNA osi pri­ka­za­ne su sme­đom i tir­kiz­nom bo­jom. His­to­ni su pri­ka­za­ni mod­rom (H3), ze­le­nom (H4), žu­tom (H2A) i cr­ve­nom (H2B) bo­jom. (B, iz K. Lu­ger i sur., 1997. Na­tu­re 389:251.)

ve­le do pret­pos­tav­ke da je kro­ma­tin sas­tav­ljen od po­nav­lja­ju­ćih je­di­ni­ca ve­li­či­ne 200 pa­ro­va ba­za ko­je su naz­va­ne nuk­leo­so­mi­ma. Po­ka­za­lo se da snaž­ni­ja raz­grad­nja kro­ma­ti­na mik­ro­ko­kal­nom nuk­lea­ zom da­je čes­ti­ce (naz­va­ne česticama nuk­leo­som­ske sr­ži) ko­je od­go­va­ra­ju zr­nci­ma vid­lji­vi­ma pod elek­tron­skim mik­ros­ko­pom. De­talj­nom ana­li­zom ovih čes­ti­ca po­ka­za­lo se da one sad­r­ža­va­ju 147 pa­ro­va ba­za DNA omo­ta­ nih 1,67 pu­ta oko his­ton­ske sr­ži ko­ja se sas­to­ji od po dvi­ju mo­le­ku­la H2A, H2B, H3 i H4 (his­to­ni sr­ži, en­gl. co­re his­to­nes) (sl. 5-12). Po jed­na mo­le­ ku­la pe­to­ga his­to­na H1 ula­zi u sva­ku česticu his­ton­ske sr­ži ve­žu­ći se na DNA. Ovo či­ni kro­ma­tin­sku pod­je­di­ni­cu poz­na­tu kao kro­ma­to­som ko­ja se sas­to­ji od 166 pa­ro­va ba­za DNA omo­ta­nih oko his­ton­ske sr­ži ko­je za­ jed­no dr­ži H1 (vez­ni his­to­n, en­gl. lin­ker his­to­ne). Pa­ki­ra­nje DNA po­mo­ću his­to­na da­je kro­ma­tin­sko vlak­no prom­je­ra oko 10 nm, a ko­je je sas­tav­lje­no od kro­ma­to­so­ma od­vo­je­nih vez­nom (en­gl. lin­ ker) DNA ko­ja je du­ga oko 50 pa­ro­va ba­za (sl. 5-13). Pod elek­tron­skim mik­ros­ko­pom ovo vlak­no deb­lji­ne 10 nm ima iz­gled zr­na­te og­r­li­ce što je i upo­zo­ri­lo na nuk­leo­som­ski mo­del. Pa­ki­ra­nje DNA u ovak­va kro­ma­tin­ska vlak­na deb­lji­ne 10 nm skra­ću­je nje­go­vu du­lji­nu za oko še­st pu­ta. Kro­ma­tin se da­lje mo­že zgus­nu­ti na­ma­ta­njem u vlak­na deb­lji­ne 30 nm što re­zul­ti­ra ukup­nom kon­den­za­ci­jom od pe­de­se­tak pu­ta. Iz­gle­da da u tom sta­di­ju

Sli­ka 5-13. Kro­ma­tin­ska vlak­na.  Pa­ki­ra­nje DNA u nuk­leo­so­me da­je kro­ma­tin­sko vlak­no prom­je­ra ot­pri­li­ke 10 nm. Kro­ma­tin se da­lje kon­den­zi­ra na­mo­ta­va­njem u vlak­ no deb­lji­ne 30 nm ko­je sad­r­ža­va oko še­st nuk­leo­so­ma po na­vo­ju. (Fo­tog­ra­f i­je lju­baz­ noš­ću Ade L. Oli­ns i Do­nal­da E. Olin­sa, Na­cio­nal­ni la­bo­ra­to­rij Oak Rid­ge.)

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   169

Sli­ka 5-14. In­ter­faz­ni kro­ma­tin.  Elek­ tron­sko­mik­ros­kop­ska sli­ka in­ter­faz­ne jez­gre. Euk­ro­ma­tin je ras­pros­tra­njen po či­ta­voj jez­gri. He­te­rok­ro­ma­tin je oz­ na­čen vr­ho­vi­ma str­je­li­ca, a nuk­leo­lus str­je­li­com. (Lju­baz­noš­ću Ade. L. Oli­ns i Do­nal­da E. Olin­sa, Na­cio­nal­ni la­bo­ra­to­ rij Oak Rid­ge.)

kon­den­za­ci­je kro­ma­ti­na važ­nu ulo­gu ig­ra­ju in­te­rak­ci­je iz­me­đu mo­le­ku­la H1 his­to­na, a to je od pre­sud­ne važ­nos­ti za pris­tu­pač­no­st kro­mo­som­ske DNA pro­ce­si­ma kao što su rep­li­ka­ci­ja DNA i tran­skrip­ci­ja. Sa­vi­ja­nje 30nm vla­ka­na oko sa­mih se­be mo­že vo­di­ti dalj­njoj kon­den­za­ci­ji kro­ma­ti­na unu­tar sta­ni­ce. Uspr­kos nje­ne važ­nos­ti, toč­na struk­tu­ra 30-nm vlak­na još ni­je pos­ve us­ta­nov­lje­na. Stu­panj kon­den­za­ci­je kro­ma­ti­na mi­je­nja se ti­je­kom ži­vot­nog cik­lu­sa sta­ni­ce te ig­ra zna­čaj­nu ulo­gu u re­gu­la­ci­ji gen­ske ek­spre­si­je o če­mu će se ras­prav­lja­ti u pog­lav­lju 7. U in­ter­faz­nim sta­ni­ca­ma (sta­ni­ca­ma ko­je se ne di­je­le) ve­ći­na kro­ma­ti­na (naz­va­nog euk­ro­ma­tin) re­la­tiv­no je de­kon­den­zi­ ra­na i pro­ši­re­na kroz ci­je­lu jez­gru (sl. 5-14). Ti­je­kom ove fa­ze sta­nič­no­ga cik­lu­sa ge­ni se pre­pi­su­ju, a DNA se ud­vos­tru­ču­je u sklo­pu prip­re­me za dio­bu sta­ni­ce. Ve­ći­na kro­ma­ti­na in­ter­faz­ne jez­gre pri­sut­na je, iz­gle­da, u ob­li­ku vla­ka­na deb­lji­ne 30 nm ili u neš­to kon­den­zi­ra­ni­jem kro­ma­tin­skom vlak­nu od 60 do 130 nm. Geni ko­ji se ak­tiv­no pre­pi­su­ju de­kon­den­zi­ra­ni­ji su, što či­ni mo­le­ku­lu DNA pris­tu­pač­ni­jom tran­skrip­cij­skoj ma­ši­ne­ri­ji. Za raz­li­ku od euk­ro­ma­ti­na, ot­pri­li­ke 10% in­ter­faz­nog kro­ma­ti­na (naz­va­nog he­te­rok­ro­ma­tin) na­la­zi se u vr­lo kon­den­zi­ra­nom sta­nju na­lik na ono u ko­jem se na­la­zi kro­ma­tin ti­je­kom mi­to­ze sta­ni­ce. He­te­rok­ro­ma­tin je tran­ skrip­cij­ski neak­ti­van i sad­r­ža­va vi­so­kopo­nav­ljajuće slje­do­ve DNA po­put onih ko­ji su pri­sut­ni u cen­tro­me­ra­ma i te­lo­me­ra­ma (opis sli­je­di u slje­de­ ćem od­jelj­ku). Ka­ko sta­ni­ca ula­zi u mi­to­zu, nje­zi­ni kro­mo­so­mi pos­ta­ju vi­so­kokon­den­ zi­ra­ni ka­ko bi se mog­li pre­no­si­ti u sta­ni­ce-kće­ri. Smat­ra se da se pet­lje kro­ma­tin­skog vlak­na deb­lji­ne 30 nm da­lje pre­sa­vi­ja­ju ka­ko bi ob­li­ko­va­le zgus­nu­te me­ta­faz­ne kro­mo­so­me mi­to­tič­kih sta­ni­ca u ko­ji­ma se DNA kon­ den­zi­ra sko­ro 10.000 pu­ta (sl. 5-15). Ova­ko zgus­nu­ti kro­ma­tin vi­še ne mo­že pos­lu­ži­ti kao ka­lup za sin­te­zu RNA, pa tran­skrip­ci­ja pres­ta­je za vri­

Sli­ka 5-15. Kon­den­za­ci­ja kro­ma­ti­na za vri­je­me mi­to­ze.  Pret­raž­na elek­tron­ sko­mik­ros­kop­ska sli­ka me­ta­faz­nog kro­ mo­so­ma. Do­da­no je um­jet­no obo­je­nje. (Biop­ho­to As­so­cia­tes/Photo Re­sear­ches Inc.)

170    POGLAVLJE 5 Sli­ka 5-16. Struk­tu­ra me­ta­faz­nih kro­mo­so­ma.  Elek­tron­sko­mik­ros­kop­ska sli­ka om­ či DNA ko­je se hva­ta­ju na pro­tein­ski kos­tur me­ta­faz­nih kro­mo­so­ma iz ko­jih su uk­lo­ nje­ni his­to­ni. (Iz: J. R. Paul­son i U. K. Lem­mli, 1977. Ce­ll 12:817.)

je­me mi­to­ze. Elek­tron­sko­mik­ros­kop­ske sli­ke upu­ću­ju na to da je DNA me­ ta­faz­nih kro­mo­so­ma or­ga­ni­zi­ra­na u ve­li­ke om­če ko­je su pričvr­šće­ne za pro­tein­ski kos­tur (sl. 5-16), ali tre­nu­tač­no ne ra­zu­mi­je­mo ni de­talj­nu struk­tu­ru ovak­vog vi­so­kokon­den­zi­ra­nog kro­ma­ti­na, ni­ti me­ha­ni­zam kon­ den­za­ci­je kro­ma­ti­na. Me­ta­faz­ni kro­mo­so­mi su to­li­ko vi­so­kokon­den­zi­ra­ni da se nji­ho­va struk­ tu­ra mo­že prou­ča­va­ti svjet­los­nom mik­ros­ko­pi­jom (sl. 5-17). Ne­ko­li­ko teh­ni­ka bo­je­nja da­je ka­rak­te­ris­tič­ne ob­ras­ce naiz­mje­nič­nih svi­jet­lih i tam­ nih kro­mo­som­skih pru­ga, a re­zul­tat su raz­li­ke u ve­za­nju obič­nih ili fluo­ res­cen­tnih bo­ja na slje­do­ve DNA bo­ga­ti­je AT ili GC-ba­za­ma. Ove su pru­ge spe­ci­fič­ne za sva­ki kro­mo­som i pred­stav­lja­ju, iz­gle­da, od­re­đe­ne kro­mo­ som­ske re­gi­je. Ge­ni se mo­gu lo­ka­li­zi­ra­ti unu­tar spe­ci­fič­nih kro­mo­som­skih pru­ga hib­ri­di­za­ci­jom in si­tu što upu­ću­je na to da je pa­ki­ra­nje DNA u kro­ mo­so­me ja­ko ure­dan i rep­ro­du­ci­bi­lan pro­ces.

Cen­tro­me­re

Cen­tro­me­ra je spe­ci­ja­li­zi­ra­na re­gi­ja kro­mo­so­ma ko­ja ig­ra glav­nu ulo­gu u osi­gu­ra­nju pra­vil­ne ras­pod­je­le ud­vos­tru­če­nih kro­mo­so­ma sta­ni­ca­ ma‑kće­ri­ma ti­je­kom mi­to­ze (sl. 5-18). Sta­nič­na DNA rep­li­ci­ra se za vri­je­ me in­ter­fa­ze što re­zul­ti­ra stva­ra­njem dvi­ju ko­pi­ja sva­kog kro­mo­so­ma pri­je po­čet­ka mi­to­ze. Kad sta­ni­ca uđe u mi­to­zu, kon­den­za­ci­jom kro­ma­ti­na stva­ ra­ju se me­ta­faz­ni kro­mo­so­mi ko­ji se sas­to­je od dvi­ju iden­tič­nih ses­trin­skih kro­ma­ti­da. Te ses­trin­ske kro­ma­ti­de dr­že se za­jed­no na cen­tro­me­ri ko­ja ima ob­lik kon­strik­ci­je na kro­mo­so­mu. Ka­ko mi­to­za nap­re­du­je, mik­ro­tu­bu­ li mi­to­tič­ko­ga vre­te­na prih­va­ća­ju se na cen­tro­me­re, a za­tim se dvi­je ses­ trin­ske kro­ma­ti­de raz­dvo­je i kre­ću na sup­rot­ne po­lo­ve vre­te­na. Na kra­ju

Sli­ka 5-17. Ljud­ski me­ta­faz­ni kro­mo­ so­mi.  Mik­ros­kop­ska sli­ka ljud­skih kro­ mo­so­ma do­bi­ve­nih iz me­ta­faz­ne sta­ni­ce. (Leo­na­rd Les­sin/Peter Ar­no­ld, Inc.)

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

Sli­ka 5-18. Kro­mo­so­mi za vri­je­me mi­to­ze.  Bu­du­ći da se DNA rep­li­ci­ra ti­je­kom in­ ter­fa­ze, sta­ni­ca sad­r­ža­va dvi­je jed­na­ke ud­vos­tru­če­ne ko­pi­je sva­ko­ga kro­mo­so­ma pri­je ne­go uđe u mi­to­zu.

mi­to­ze jez­gri­na ovoj­ni­ca se po­no­vo for­mi­ra, kro­mo­so­mi se de­kon­den­zi­ra­ ju, a kao re­zul­tat to­ga stva­ra­ju se dvi­je jez­gre-kće­ri od ko­jih sva­ka sad­rž­ a­va po jed­nu ko­pi­ju ro­di­telj­sko­ga kro­mo­so­ma. Cen­tro­me­re zap­ra­vo ima­ju dvos­tru­ku ulo­gu, pr­vo kao mjes­ta ud­ru­ži­va­ nja ses­trin­skih kro­ma­ti­da i dru­go kao mjes­ta na ko­ja se prih­va­ća­ju mik­ro­ tu­bu­li dio­be­no­ga vre­te­na. Sas­to­je se od spe­ci­fič­nih slje­do­va DNA na ko­je se ve­že od­re­đe­ni broj cen­tro­me­ri prid­ru­že­nih pro­tei­na ko­ji for­mi­ra­ju spe­ ci­ja­li­zi­ra­nu struk­tu­ru ko­ja se zo­ve ki­ne­to­ho­ra (sl. 5-19). Ve­za­nje mik­ro­tu­ bu­la na ki­ne­to­hor­ne pro­tei­ne pos­re­du­je ve­za­nju kro­mo­so­ma na mi­to­tič­ko vre­te­no. Pro­tei­ni ve­za­ni na ki­ne­to­ho­re ta­da dje­lu­ju kao »mo­le­ku­lar­ni mo­ to­ri« ko­ji up­rav­lja­ju kre­ta­njem kro­mo­so­ma duž vla­ka­na vre­te­na raz­dva­ja­ ju­ći ta­ko kro­mo­so­me u jez­gre-kće­ri. Cen­tro­mer­ni slje­do­vi DNA pr­vo su de­fi­ni­ra­ni u kvas­ca gdje se nji­ho­va fun­kci­ja mo­že prou­ča­va­ti pra­će­njem seg­re­ga­ci­je plaz­mi­da u mi­to­zi (sl. 5-20). Plaz­mi­di ko­ji sad­r­že fun­kcio­nal­ne cen­tro­me­re raz­dva­ja­ju se na is­ti Sli­ka 5-19. Cen­tro­me­ra me­ta­faz­no­ga kro­mo­so­ma.  Cen­tro­me­ra je pod­ruč­je na ko­je­mu su dvi­je ses­trin­ske kro­ma­ti­de spo­je­ne za vri­je­me me­ta­fa­ze. Na cen­tro­mer­nu DNA ve­žu se spe­ci­f ič­ni pro­tei­ni te tvo­re ki­ne­to­ho­ru ko­ja slu­ži kao mjes­to ve­za­nja ni­ti dio­be­no­ga vre­te­na.

   171

172    POGLAVLJE 5

Sli­ka 5-20. Cen­tro­mer­ni te­st u kvas­cu.  Oba pri­ka­za­na plaz­mi­da sad­r­ža­va­ju se­ lek­tiv­ni bi­ljeg (LEU2) i slje­do­ve DNA ko­ji slu­že kvas­cu kao iz­vo­ri rep­li­ka­ci­je (ARS, au­ to­nom­ni rep­li­ka­cij­ski sli­jed). Bu­du­ći da plaz­mi­du I ne­dos­ta­je cen­tro­me­ra (CEN) čes­to se gu­bi iz sta­ni­ce za vri­je­me mi­to­ze zbog nep­ra­vil­ne seg­re­ga­ci­je. Za raz­li­ku od to­ga, pri­sut­no­st cen­tro­me­re (CEN) u plaz­mi­du II osi­gu­ra­va nje­gov re­do­vi­ti pri­je­nos u sta­ni­ ce-kće­ri.

na­čin kao i kro­mo­so­mi i jed­no­li­ko se ras­po­re­đu­ju u sta­ni­ce-kće­ri na­kon mi­to­ze. U od­sut­nos­ti fun­kcio­nal­ne cen­tro­me­re plaz­mid se ne ras­po­re­đu­je pra­vil­no, pa mno­ge sta­ni­ce-kće­ri ne nas­li­je­de plaz­mid­nu DNA. Prou­ča­va­ nja ovog ti­pa omo­gu­ći­la su da se od­re­de slje­do­vi pot­reb­ni za fun­kci­ju cen­ tro­me­re. Ovak­vi po­ku­si pr­vo su po­ka­za­li da su cen­tro­mer­ni slje­do­vi dob­ro poz­na­tog kvas­ca Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­siae sad­r­ža­ni u ot­pri­li­ke 125 pa­ro­va ba­za ko­ji se sas­to­je od tri­ju ele­me­na­ta: dva krat­ka sli­je­da od 8 i 25 pa­ro­va ba­za od­vo­je­na me­đu­sob­no sa 78 do 86 pa­ro­va ba­za DNA ko­ja je ja­ko bo­ ga­ta AT-ba­za­ma (sl. 5-21A). Iz­gle­da da krat­ki cen­tro­mer­ni slje­do­vi de­fi­ni­ra­ni u S. ce­re­vi­siae ipak ne od­ra­ža­va­ju si­tua­ci­ju u dru­gih eu­ka­rio­ta, uk­lju­ču­ju­ći ci­je­pa­ju­ći kvas­ac Schi­ zo­sac­cha­ro­myces pom­be. Ia­ko su i S. ce­re­vi­siae i S. pom­be kvas­ci, iz­gle­da da su me­đu­sob­no uda­lje­ni pod­jed­na­ko kao što je sva­ki od njih uda­ljen od čov­je­ka, pa su mno­ge zna­čaj­ke nji­ho­ve sta­nič­ne bio­lo­gi­je pri­lič­no raz­li­či­te. Ta­ko ove dvi­je vr­ste kvas­ca či­ne kom­ple­men­tar­ne mo­de­le za jed­nos­tav­no i

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

Sli­ka 5-21. Cen­tro­mer­ni DNA slje­do­vi.  (A) Cen­tro­mer­ni slje­do­vi S. ce­re­vi­siae (CEN) sas­to­je se od dva­ju krat­kih kon­zer­vi­ra­nih slje­do­va (CDE I i CDE III) ko­ji su raz­dvo­je­ni s po­mo­ću slje­do­va DNA bo­ga­tih AT-ba­za­ma (CDE II) dulji­ne od 78 do 86 pa­ro­va ba­za (pb). Pri­ka­za­ni slje­do­vi su kon­sen­zus slje­do­vi iz­ve­de­ni ana­li­zom cen­tro­mer­nih slje­do­va po­je­di­nih kvaš­če­vih kro­mo­so­ma. Pu = A ili G; x = A ili T; y = bi­lo ko­ja ba­za. (B) Pri­ka­ zan je us­troj cen­tro­mer­nih slje­do­va kro­mo­so­ma II S. pom­be. Cen­tro­me­ra se sas­to­ji od cen­tral­ne sr­ži (CC – en­gl. cen­tral co­re) je­din­stve­nog sli­je­da DNA, na či­jem se bo­ku na­ la­ze po­navljajući slje­do­vi tri­ju re­pe­ti­tiv­nih ele­me­na­ta (B, K i L). (C) Cen­tro­me­ra vin­ske mu­ši­ce sas­to­ji se od dva­ju sa­te­lit­nih slje­do­va, tran­spo­ni­ra­ju­ćih ele­me­na­ta i ne­po­nav­ ljajuće DNA pro­te­žu­ći se pre­ko sto­ti­na ki­lo­ba­za (kb). (D) Ljud­ske cen­tro­me­re sas­to­je se od uzas­top­nih po­nav­lja­nja α-sa­te­lit­nih DNA s mno­go AT-ba­za, du­lji­ne 171 pa­ra ba­za ko­je se pro­težu pre­ko jed­nog do pet mi­li­ju­na pa­ro­va ba­za (Mb).

la­ga­no prou­ča­va­nje eu­ka­riot­ske sta­ni­ce. Cen­tro­me­re S. pom­be pro­te­žu se na 40 do 100 kb DNA; one su prib­liž­no ti­su­ću pu­ta du­že od onih S. ce­re­ vi­siae. Sas­to­je se od cen­tral­ne sr­ži od 4 do 7 kb jed­ne ko­pi­je DNA ko­joj se na bo­ko­vi­ma na­la­ze po­navljajući slje­do­vi (sl. 5-21B). Ne sa­mo cen­tral­na srž ne­go ta­ko­đer i boč­ni po­nov­lje­ni slje­do­vi pot­reb­ni su za fun­kci­ju cen­ tro­me­re, pa iz­gle­da da su cen­tro­me­re S. pom­be da­le­ko slo­že­ni­je ne­go one S. ce­re­vi­siae. Prou­ča­va­njem kro­mo­so­ma vin­ske mu­ši­ce nap­rav­lje­na je pr­va ka­rak­te­ ri­za­ci­ja cen­tro­me­ra u vi­ših eu­ka­rio­ta (sl. 5-21C). Cen­tro­me­re vin­ske mu­ ši­ce pro­te­žu se na pre­ko 420 kb od ko­jih se ve­ći­na (vi­še od 85%) sas­to­ji od dvi­ju vi­so­kopo­nav­ljajućih sa­te­lit­nih DNA sa sli­je­dom AATAT i AAGAG. Os­ta­tak cen­tro­me­ra sas­to­ji se od ras­pr­še­nih tran­spo­ni­ra­ju­ćih ele­me­na­ta, ko­ji se ta­ko­đer na­la­ze i na dru­gim mjes­ti­ma ge­no­ma vin­ske mu­ši­ce, kao do­da­tak ne­po­navljajućoj re­gi­ji DNA bo­ga­toj AT-ba­za­ma.

   173

174    POGLAVLJE 5 Cen­tro­me­re bi­lja­ka i si­sa­va­ca ka­rak­te­ri­zi­ra­ne su he­te­rok­ro­ma­ti­nom ko­ ji se sas­to­ji od du­gač­kih ni­zo­va vi­so­kopo­nav­ljajućih sa­te­lit­nih slje­do­va DNA. U bilj­ke Ara­bi­dop­sis cen­tro­me­re se sas­to­je od 3 mi­li­ju­na pa­ro­va ba­ za sa­te­lit­ne DNA od 178 pa­ro­va ba­za s mno­go AT. U lju­di i os­ta­lih pri­ma­ ta glav­ni cen­tro­mer­ni sli­jed je­st α-sa­te­lit­na DNA od 171 po­nav­lja­ju­ćeg pa­ ra ba­za s mno­go AT ko­ja se pro­te­že na 1 do 5 mi­li­ju­na pa­ro­va ba­za (sl. 5-21D). Us­pr­kos ve­li­kim na­po­ri­ma, ni­je se mog­lo iden­ti­fi­ci­ra­ti spe­ci­fič­ne sek­ ven­ce DNA ko­je pos­re­du­ju cen­tro­mer­nu fun­kci­ju u eu­ka­rio­ta osim u S. cerevisiae. S dru­ge stra­ne, po­ka­za­lo se da kro­ma­tin na cen­tro­me­ra­ma ima je­din­stve­nu struk­tu­ru. U cen­tro­mer­nom kro­ma­ti­nu his­ton H3 za­mi­je­njen je H3-slič­nom va­ri­jan­tom ko­ja se zo­ve cen­tro­mer­ni H3 (CenH3) ili CENP-A. U svih prou­če­nih or­ga­ni­za­ma uvi­jek se u cen­tro­me­ra­ma na­šao CenH3, a nuk­leo­so­mi ko­ji sad­r­že Cen­H3 pot­reb­ni su za sas­tav­lja­nje os­ta­ lih ki­ne­to­hor­nih pro­tei­na pot­reb­nih za fun­kci­ju cen­tro­me­ra. Ta­ko iz­gle­da da je pri­je struk­tu­ra kro­ma­ti­na ne­go­li spe­ci­fič­an slijed DNA pri­mar­na de­ ter­mi­nan­ta iden­ti­te­ta i fun­kci­je cen­tro­me­ra. Važ­no je da pri­sut­no­st je­din­stve­ne kro­ma­tin­ske struk­tu­re doz­vo­lja­va cen­tro­me­ra­ma da se sta­bil­no od­r­ža­va­ju ti­je­kom sta­nič­ne dio­be čak i u od­ sut­nos­ti spe­ci­fič­nog centro­mer­nog sli­je­da DNA. To je je­dan od prim­je­ra epi­ge­net­ičkog nas­lje­đi­va­nja tj. pri­je­no­sa po­ru­ke sa ro­di­te­lja na po­tom­stvo ko­ja ni­je zas­no­va­na na sli­je­du DNA. U ovom i mno­gim dru­gim ti­po­vi­ma epi­ge­net­ičkog nas­lje­đi­va­nja (ras­prav­lje­no u 7. pog­lav­lju) in­for­ma­ci­ju no­se his­to­ni (sl. 5-22). Ka­da se kro­mo­som­ska DNA ud­vos­tru­ču­je, ro­di­telj­ski nuk­leo­so­mi se ras­po­re­đu­ju na dva no­vo­nas­ta­la lan­ca, ta­ko da je Cen­H3 pri­su­tan u nuk­leo­so­mi­ma cen­tro­me­ra oba no­vos­tvo­re­na kro­mo­so­ma. Ovi nuk­leo­so­mi ko­ji sad­r­že Cen­H3 up­rav­lja­ju sa­kup­lja­nje no­vih nuk­leo­so­ma sa Cen­H3 u kro­ma­tin ta­ko da se kro­ma­tin­ska struk­tu­ra cen­tro­me­ra zad­r­ ža­va ti­je­kom dio­be sta­ni­ca.

Te­lo­me­re

Tab­li­ca 5-5. Te­lo­mer­na DNA Or­ga­ni­zam

Te­lo­mer­ni ponavlja­ jući sli­jed

Kvas­ci   Sac­cha­ro­myces    cerevi­siae

TG1–3

  Schi­zo­sac­cha­ro­myces    pom­be

TTACG2–5

Pro­to­zoa   Tet­ra­hyme­na

TTGGGG

  Dic­tyos­te­lium

AG1–8

Bilj­ka   Ara­bi­dop­sis

AGGGTTT

Si­sa­vac   Čov­jek

AGGGTT

Slje­do­vi na kra­je­vi­ma eu­ka­riot­skih kro­mo­so­ma, ko­ji se zo­vu te­lo­me­re, ig­ra­ju zna­čaj­nu ulo­gu u rep­li­ka­ci­ji i od­rž­ a­nju kro­mo­so­ma. Te­lo­me­re su ra­ no pre­poz­na­te kao po­seb­ne struk­tu­re jer su u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma kro­ mo­so­mi na­kon lom­lje­nja vr­lo nes­ta­bil­ni, pa se pret­pos­ta­vi­lo da su na nor­ mal­nim kra­je­vi­ma kro­mo­so­ma pot­reb­ni ne­ki spe­ci­fič­ni slje­do­vi. Ovo je za­tim do­ka­za­no po­ku­si­ma u ko­ji­ma su te­lo­me­re pra­ži­vo­ti­nje Tet­ra­hyme­na do­da­ne kra­je­vi­ma li­near­nih mo­le­ku­la DNA plaz­mi­da kvas­ca. Do­da­tak ovih te­lo­mer­nih slje­do­va DNA omo­gu­ći­li su tim plaz­mi­di­ma da se rep­li­ci­ ra­ju u kvas­cu kao li­near­ne mo­le­ku­le na­lik na kro­mo­so­me, pa je to bio iz­ ra­van do­kaz da su te­lo­me­re pot­reb­ne za rep­li­ka­ci­ju li­near­nih mo­le­ku­la DNA. Te­lo­mer­ni slje­do­vi DNA raz­li­či­tih eu­ka­rio­ta slič­ni su i sad­rž­ a­va­ju po­ nav­ljajuće jed­nos­tav­ne slje­do­ve DNA s na­ku­pi­na­ma G-os­ta­ta­ka u jed­nom lan­cu (tab­l. 5-5). Prim­je­ri­ce, sli­jed te­lo­mer­nih po­nav­lja­nja u čov­je­ka i os­ ta­lih si­sa­va­ca je TTAGGG, a te­lo­mer­no po­nav­lja­nje u Tet­ra­hyme­ni je TTGGGG. Ovi su slje­do­vi po­nov­lje­ni sto­ti­na­ma ili ti­su­ća­ma pu­ta i zav­r­ša­ va­ju s jed­nim jed­no­lan­ča­nim re­pom DNA. Po­navljajući slje­do­vi te­lo­mer­ne DNA ne­kih or­ga­ni­za­ma (uk­lju­ču­ju­ći čov­je­ka) či­ne om­če na kra­je­vi­ma kro­ mo­so­ma te ve­žu pro­tein­ski kom­ple­ks ko­ji ču­va kro­mo­som­ske kra­je­ve od raz­grad­nje (sl. 5-23). Te­lo­me­re ig­ra­ju glav­nu ulo­gu u rep­li­ka­ci­ji kra­je­va li­near­ne DNA mo­le­ ku­le (v. pogl. 6). DNA-po­li­me­ra­za mo­že pro­du­ži­ti ras­tu­ći DNA la­nac, ali ne mo­že za­po­če­ti sin­te­zu no­vo­ga lan­ca na kra­ju li­near­ne DNA mo­le­ku­le.

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   175

Sli­ka 5-22. Epi­ge­net­ičko nas­lje­đi­va­ nje cen­tro­mer­nog H3.   Nuk­leo­so­mi u cen­tro­me­ra­ma sad­r­že Cen­H3. Kad se DNA rep­li­ci­ra, roditeljski nuk­leo­so­mi sa Cen­H3 ras­po­re­đu­ju se na oba no­vo­nas­ ta­la lan­ca. Ovak­vi nuk­leo­so­mi sa Cen­H3 us­mje­ra­va­ju ug­rad­nju no­vih nuk­leo­so­ ma sa Cen­H3, od­r­ža­va­ju­ći kro­ma­tin­sku struk­tu­ru cen­tro­me­ra.

▶▶ Sta­ni­ce ra­ka ima­ju vi­so­ku ra­

Pre­ma to­me, kra­je­vi li­near­nih kro­mo­so­ma ne mo­gu se rep­li­ci­ra­ti nor­mal­ nom ak­ci­jom DNA-po­li­me­ra­ze. Taj prob­lem ri­je­šen je evo­lu­ci­jom po­seb­ nog en­zi­ma te­lo­me­ra­ze ko­ji ima ak­tiv­no­st re­ver­zne tran­skrip­ta­ze za rep­li­ ka­ci­ju te­lo­mer­nih slje­do­va DNA. Od­r­ža­nje te­lo­me­ra je, iz­gle­da, va­žan fak­tor u od­re­đi­va­nju tra­ja­nja ži­vo­ta i rep­ro­duk­tiv­ne spo­sob­nos­ti sta­ni­ce, pa prou­ča­va­nje te­lo­me­ra i te­lo­me­ra­ze obe­ća­va no­ve uvi­de u pro­ce­se sta­re­ nja i nas­tan­ka ra­ka.

zi­nu te­lo­me­ra­ze što im omo­gu­ ća­va od­r­ža­nje kra­je­va nji­ho­vih kro­mo­so­ma ti­je­kom bes­ko­nač­ nih dio­ba. Bu­du­ći da nor­mal­ne so­mat­ske sta­ni­ce ne­ma­ju te­lo­ me­raz­nu ak­tiv­no­st i ne di­je­le se bes­ko­nač­no, agen­si ko­ji in­hi­bi­ ra­ju te­lo­me­ra­zu raz­vi­ja­ju se u li­ je­ko­ve pro­tiv ra­ka.

176    POGLAVLJE 5 Sli­ka 5-23. Struk­tu­ra te­lo­me­re.  Te­lo­mer­na DNA iz­bo­či se i vra­ća sa­ma na se­be pa se ta­ko stvo­ri kruž­na struk­tu­ra na ko­ju se ve­že pro­ tein­ski kom­ple­k s (shel­te­rin) ko­ji ču­va kra­je­ve kro­mo­so­ma.

Re­dos­li­jed či­ta­vih ge­no­ma Ne­ka od na­juz­bud­lji­vi­jih no­vih ot­kri­ća u mo­le­ku­lar­noj bio­lo­gi­ji po­ve­ za­na su uz re­zul­ta­te ana­li­ze kom­plet­nog nuk­leo­tid­nog sli­je­da hu­ma­no­ga ge­no­ma i ge­no­ma ne­ko­li­ci­ne mo­del­nih or­ga­ni­za­ma me­đu ko­ji­ma su E. co­ li, Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­siae, Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns, Dro­sop­hi­la, Ara­bi­dop­ sis i miš (tab­l. 5-6). Re­zul­ta­ti sek­ven­ci­ra­nja či­ta­vih ge­no­ma od­ve­li su nas da­lje od ka­rak­te­ri­za­ci­je po­je­di­nih ge­na sve do glo­bal­nog pog­le­da na or­ga­

Tab­li­ca 5-6. Pred­stav­ni­ci sek­ven­ci­ra­nih ge­no­ma Ve­li­či­na Or­ga­ni­zam Broj ge­na geno­ma (Mb)a Bak­te­ri­je   H. in­f luen­zae 1,8 1.743   E. co­li 4,6 4.288 Kvas­ci   S. ce­re­vi­siae 12 6.000   S. pom­be 12 4.800 Bes­kra­ljež­nja­ci   C. ele­ga­ns 97 19.000   Dro­sop­hi­la 180 13.600 Bilj­ke   Ara­bi­dop­sis tha­lia­na 125 26.000 Ri­ža 390 37.000 Ri­be   Fu­gus rub­ri­pes 370 20.000-23.000 Pti­ce Pi­le 1.000 20.000-23.000 Si­sav­ci Čov­jek 3.200 30.000-40.000 Mb = mi­li­ju­ni pa­ro­va ba­za

a

Slje­do­vi ko­ji kodi­ra­ju pro­tei­ne 89% 88% 70% 60% 25% 13% 25% 12% 10% 3% 1,2%

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   177

ni­za­ci­ju i gen­ski sad­r­žaj či­ta­vih ge­no­ma. Us­tva­ri, ova­kav pris­tup po­ten­ci­ jal­no vo­di do iden­ti­fi­ka­ci­je svih ge­na ne­kog or­ga­niz­ma ko­ji ta­da pos­ta­ju pris­tu­pač­ni is­tra­ži­va­nju nji­ho­ve struk­tu­re i fun­kci­je. Što­vi­še, dos­tup­no­st kom­plet­nih ge­nom­skih re­dos­lje­do­va ot­va­ra uz­bud­lji­vu mo­guć­no­st iden­ti­ fi­ka­ci­je slje­do­va ko­ji re­gu­li­ra­ju gen­sku ek­spre­si­ju ko­ris­te­ći ana­li­zu ši­rom či­ta­vog ge­no­ma. Ia­ko još mno­go to­ga tre­ba ot­kri­ti, dos­tup­ni ge­nom­ski re­ dos­lje­do­vi da­li su znan­stve­ni­ci­ma je­din­stve­nu ba­zu po­da­ta­ka ko­ja se sa­sto­ ji od nuk­leo­tid­nih slje­do­va kom­plet­ne gen­ske gar­ni­tu­re i nje­nih re­gu­lacij­ skih slje­do­va što će stvo­ri­ti os­no­vu za mno­ga bu­du­ća is­tra­ži­va­nja u sta­nič­noj bio­lo­gi­ji.

Pro­ka­riot­ski ge­no­mi Pr­vi pot­pu­ni re­dos­li­jed sta­nič­no­ga ge­no­ma ob­ja­vi­la je, 1995. go­di­ne, sku­pi­na is­tra­ži­va­ča pod vod­stvom Crai­ga Ven­te­ra, a ra­di­lo se o bak­te­ri­ji Hae­mop­hi­lus in­fluen­zae ko­ja je čes­ti sta­nov­nik diš­no­ga sus­ta­va. Ge­nom H. in­fluen­zae sad­r­ža­va oko 1,8 × 106 pa­ro­va ba­za (1,8 me­ga­ba­za ili Mb) što je ma­lo ma­nje od po­lo­vi­ce ve­li­či­ne ge­no­ma E. co­li. Pot­pu­ni nuk­leo­tid­ni sli­jed po­ka­zao je da je ge­nom H. in­fluen­zae kruž­na mo­le­ku­la ko­ja sad­r­ža­va 1,830.137 pa­ro­va ba­za DNA. Sli­jed je ta­da ana­li­zi­ran na ge­ne ko­ji ko­di­ra­ju rR­NA, tR­NA i pro­tei­ne. Po­ten­ci­jal­na pod­ruč­ja za ko­di­ra­nje pro­tei­na iden­ ti­fi­ci­ra­na su kom­pju­tor­skom ana­li­zom slje­do­va DNA ka­ko bi se ot­kri­li otvo­re­ni ok­vi­ri či­ta­nja (en­gl. ope­n-rea­di­ng fra­mes), du­gi ni­zo­vi nuk­leo­ti­da ko­ji mo­gu ko­di­ra­ti po­li­pep­ti­de jer ne sad­r­ža­va­ju ni­ti je­dan od tri­ju stop ko­ do­na (UAA, UAG i UGA). Bu­du­ći da se ovi ko­do­ni ko­ji zaus­tav­lja­ju pre­vo­ đe­nje po­li­pep­tid­nog lan­ca na­sum­ce po­jav­lju­ju jed­nom na sva­ki 21 ko­don (3 stop ko­do­na od ukup­no 64 ko­do­na), ot­vo­re­ni ok­vi­ri či­ta­nja ko­ji se pro­te­žu na vi­še od sto­ti­nu ko­do­na obič­no pred­stav­lja­ju fun­kcio­nal­ne ge­ne. Ovak­vom ana­li­zom u ge­no­mu H. in­fluen­zae ot­kri­ve­no je še­st kopi­ja ge­na za rR­NA, 54 raz­li­či­tih tR­NA ge­na i 1.743 po­ten­ci­jal­nih re­gi­ja za ko­ di­ra­nje pro­tei­na (sl. 5-24). Na te­me­lju po­du­dar­nos­ti s poz­na­tim pro­tein­ skim slje­do­vi­ma na vi­še od ti­su­ću ovih re­gi­ja pri­do­da­na je od­re­đe­na bio­

Sli­ka 5-24. Ge­nom Hae­mop­hi­lu­sa in­ fluen­zae.  Pred­vi­đe­ne re­gi­je za ko­di­ ra­nje pro­tei­na oz­na­če­ne su obo­je­nim cr­ta­ma. Bro­je­vi oz­na­ču­ju pa­ro­ve ba­za u DNA. (Iz Fleis­chma­nn et al., 1995. Scien­ce 269: 496.)

178    POGLAVLJE 5 loš­ka ulo­ga (npr. en­zi­mu cik­lu­sa li­mun­ske ki­se­li­ne), ali os­ta­le re­gi­je pred­stav­lja­ju ge­ne ne­poz­na­te fun­kci­je. Pret­pos­tav­lje­ni ko­di­ra­ju­ći slje­do­vi ima­ju pros­ječ­nu ve­li­či­nu od oko 900 pa­ro­va ba­za, pa pok­ri­va­ju oko 1,6 Mb DNA što či­ni bli­zu 90% ge­no­ma H. in­fluen­zae. Sa­da poz­na­mo či­ta­ve ge­nom­ske re­dos­lje­do­ve vi­še od pet sto­ti­na raz­li­či­ tih bak­te­ri­ja uk­lju­ču­ju­ći i eu­bak­te­ri­je i ar­he­bak­te­ri­je. Ne­ki od ge­nom­skih re­dos­lje­do­va ovih pro­ka­rio­ta da­li su ključ­ne po­dat­ke ob­zi­rom na evo­lu­ci­ju eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Na prim­jer, od­re­đi­va­nje ge­nom­skog re­dos­li­je­da Ric­ ket­tsia prowa­ze­kii ko­ji se po­ka­zao vr­lo blis­kim ge­no­mu da­naš­njih mi­to­ hon­dri­ja, snaž­no je pot­kri­je­pi­lo pret­pos­tav­ku o en­do­sim­biot­skom pod­ri­ jet­lu mi­to­hon­dri­ja (v. pog­l. 1). Is­to ta­ko, re­dos­lje­do­vi ar­he­bak­te­ri­ja po­ka­za­li su da su eu­ka­riot­ski ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne uk­lju­če­ne u udvo­ stru­ča­va­nje, pre­pi­si­va­nje i pre­vo­đe­nje DNA pri­je iz­ve­de­ni iz ar­he­bak­te­ri­ja ne­go­li eu­bak­te­ri­ja (v. sl. 1-7). Ia­ko su re­la­tiv­na jed­nos­tav­no­st i la­ko­ća ge­ne­ti­ke E. co­li od nje nap­ra­vi­ li omi­lje­ni or­ga­ni­zam mo­le­ku­lar­nih bio­lo­ga, ge­nom E. co­li od 4,6 Mb ni­je bio pot­pu­no sek­ven­ci­ran sve do 1997. go­di­ne. Ana­li­za re­dos­li­je­da nuk­leo­ ti­da E. co­li ot­kri­la je ukup­no 4.288 ge­na, pri če­mu slje­do­vi za ko­di­ra­nje pro­tei­na či­ne 88% nje­zi­na ge­no­ma. Od 4.288 ge­na ot­kri­ve­nih sek­ven­ci­ra­ njem, 1.835 ge­na bi­lo je već pret­hod­no iden­ti­fi­ci­ra­no, a fun­kci­ja do­dat­nih 821 mog­la se iz­vu­ći iz us­po­red­bi sa slje­do­vi­ma ge­na ka­rak­te­ri­zi­ra­nih u dru­gim or­ga­niz­mi­ma. Ipak, fun­kci­ja vi­še od tre­ći­ne ge­na E. co­li (oko 40% ge­no­ma) ni­je se mog­la od­re­di­ti. Prou­ča­va­nje ovih ge­na je još u ti­je­ku, što uka­zu­je na to da, čak i za ta­ko iscr­pno is­tra­ži­van or­ga­ni­zam po­put E. co­li, preos­ta­je da se doz­na još mno­go to­ga o pro­ka­riot­skoj sta­nič­noj bio­lo­gi­ji.

Kvaš­čev ge­nom Kao što je već spo­me­nu­to, naj­jed­nos­tav­ni­ji eu­ka­riot­ski ge­nom (1,2 × 107 pa­ro­va ba­za DNA) pro­na­đen je u kvas­ca Sac­cha­ro­myces ce­re­vi­siae. Što­ vi­še, kvas­ci ras­tu br­zo i mo­gu se podvr­gnu­ti jed­nos­tav­nim ge­ne­tič­kim ma­ ni­pu­la­ci­ja­ma. Zbog to­ga kvas­ci na vi­še na­či­na pred­stav­lja­ju mo­del eu­ka­ riot­skih sta­ni­ca ko­ji se mo­že pu­no lak­še prou­ča­va­ti ne­go­li sta­ni­ce si­sa­va­ca i os­ta­lih vi­ših eu­ka­rio­ta. U skla­du s ti­me, pot­pu­no sek­ven­ci­ra­nje jed­no­ga ci­je­lo­ga kvaš­če­vo­ga kro­mo­so­ma, 1992. go­di­ne, (sl. 5-25) te za­tim od­re­đi­ va­nje re­dos­li­je­da ci­je­lo­ga kvaš­če­va ge­no­ma 1996. go­di­ne, pred­stav­lja­lo je naj­važ­ni­je ko­ra­ke u ra­zu­mi­je­va­nju mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je eu­ka­riot­skih sta­ ni­ca. Ge­nom S. ce­re­vi­siae sad­rž­ i oko 6.000 ge­na, me­đu ko­ji­ma se, ka­ko se pred­vi­đa, na­la­zi 5.885 slje­do­va za ko­di­ra­nje pro­tei­na, 140 ge­na za ri­bo­som­ sku RNA, 275 ge­na za tran­spor­tnu RNA i 40 ge­na ko­ji ko­di­ra­ju ma­le jez­ gri­ne RNA uk­lju­če­ne u do­ra­dbu RNA (v. pogl. 7). Pre­ma to­me, kvas­ci ima­ ju ve­li­ku gus­to­ću slje­do­va ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne što je slič­no bak­te­rij­skim ge­no­mi­ma, a ti slje­do­vi či­ne oko 70% ukup­ne kvaš­če­ve DNA. U skla­du s ti­me, sa­mo 4% kvaš­če­vih ge­na sad­r­ža­va in­tro­ne. Što­vi­še, ge­ni S. ce­re­vi­siae ko­ji sad­r­ža­va­ju in­tro­ne obič­no ima­ju sa­mo je­dan ma­li in­tron bli­zu po­čet­ka ge­na. Redoslijed ge­no­ma S. ce­re­vi­siae ne­dav­no je sli­je­dio re­dos­li­jed ge­no­ma ki­da­ju­ćeg kvas­ca S. pom­be kao i ge­no­ma ne­ko­li­ci­ne os­ta­lih kva­sa­ca i glji­va. Pre­ma pret­hod­noj ras­pra­vi u ovom pog­lav­lju, S. ce­re­vi­siae i S. pom­be pri­ lič­no su di­ver­gen­tni i nji­ho­va se bio­lo­gi­ja raz­li­ku­je po mno­go če­mu, uk­lju­ ču­ju­ći i struk­tu­ru cen­tro­me­ra (v. sl. 5-21). Za­nim­lji­vo je da i nji­ho­vi ge­no­ mi po­ka­zu­ju pri­lič­ne raz­li­ke. Ia­ko i S. ce­re­vi­siae i S. pom­be pos­je­du­ju ot­pri­li­ke is­tu ko­li­či­nu je­din­stve­nih slje­do­va DNA (12,5 Mb), iz­gle­da da S. pom­be sadrži sa­mo oko 4.800 ge­na. In­tro­na ima mno­go vi­še u S. pom­be

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

Sli­ka 5-25. Kvaš­čev kro­mo­som III.  Gor­nje pla­ve li­ni­je oz­na­ču­ju klo­no­ve ko­riš­te­ne pri­li­kom sek­ven­ci­ra­nja DNA. Ot­vo­re­ni ok­vi­ri či­ta­nja oz­na­če­ni su str­je­li­ca­ma. (Iz S.G. Oli­ver i sur., 1992. Na­tu­re 357:38.)

ne­go­li u S. ce­re­vi­siae. Ot­pri­li­ke 43% ge­na S. pom­be sad­r­ža­va in­tro­ne, a in­ tro­ni S. pom­be ve­ći su od onih u S. ce­re­vi­siae, pa slje­do­vi za ko­di­ra­nje pro­ tei­na či­ne sa­mo oko 60% ge­no­ma S. pom­be. Ve­ći­na ge­na S. pom­be ima ho­mo­lo­ge u ge­no­mu S. ce­re­vi­siae, ali oko 700 ge­na je­din­stve­no je za S. pom­be. Kom­pju­tor­skom ana­li­zom te­me­lje­nom na slič­nos­ti­ma sa slje­do­vi­ma poz­na­tih ge­na pred­vi­đe­ne su u S. ce­re­vi­siae fun­kci­je za prib­liž­no po­la slje­ do­va za ko­di­ra­nje pro­tei­na. Ipak, fun­kci­je mno­gih ge­na su pri­je bi­le opi­sa­ ne sa­mo op­ćim ter­mi­ni­ma (kao »tran­skrip­cij­ski fak­to­r«) ne­go­li s pu­nim ra­zu­mi­je­va­njem nji­ho­ve ulo­ge u sta­ni­ci. Što­vi­še, bu­du­ći da po­lo­vi­ca pro­tei­ na ko­di­ra­nih kvaš­če­vim ge­no­mom ni­je bi­la u ni­kak­voj ve­zi s pret­hod­no opi­sa­nim ge­ni­ma, preos­ta­lo je da se fun­kci­ja do­dat­nih 3.000 ne­poz­na­tih pro­tei­na ras­vi­jet­li. Na svu sre­ću, kvas­ci su na­ro­či­to pris­tu­pač­ni fun­kcio­nal­ noj ana­li­zi ne­poz­na­tih ge­na zbog la­ko­će s ko­jom se nor­mal­ni kro­mo­som­ ski lo­ku­si mo­gu inak­ti­vi­ra­ti ho­mo­log­nom re­kom­bi­na­ci­jom sa klo­ni­ra­nim sek­ven­ca­ma (ras­prav­lje­no u 4. poglavlju). Zbog to­ga je na­kon sek­ven­ci­ra­ nja ge­no­ma us­li­je­di­lo stva­ra­nje so­je­va u ko­ji­ma je sva­ki od 6.000 poz­na­tih

   179

180    POGLAVLJE 5 ge­na inak­ti­vi­ran ho­mo­log­nom re­kom­bi­na­ci­jom. Sus­tav­na ana­li­za ove zbir­ ke mu­tan­ti ši­rom ge­no­ma sa­da je ra­zot­kri­la fun­kci­ju po­ve­za­nu s pre­ko 5.000 ge­na što pred­stav­lja zna­ča­jan nap­re­dak u ra­zu­mi­je­va­nju bio­lo­gi­je ove jed­nos­tav­ne eu­ka­riot­ske sta­ni­ce.

Ge­no­mi Cae­nor­hab­di­tis ele­ga­ns i vin­ske mu­ši­ce Ge­no­mi C. ele­ga­ns i vin­ske mu­ši­ce re­la­tiv­no su jed­nos­tav­ni ani­mal­ni ge­no­mi, a po ve­li­či­ni i slo­že­nos­ti do­la­ze iz­me­đu kvaš­če­va i ljud­sko­ga ge­no­ ma. Po­seb­ne ka­rak­te­ris­ti­ke sva­kog od ovih or­ga­ni­za­ma či­ne ih važ­nim mo­ de­li­ma za ana­li­zu ge­no­ma: C. ele­ga­ns na ve­li­ko se ko­ris­ti za prou­ča­va­nje ani­mal­nog raz­vo­ja, a vin­ska je mu­ši­ca po­seb­no dob­ro is­tra­že­na što se ti­če ge­ne­ti­ke. Ge­no­mi su ovih or­ga­ni­za­ma, ipak, oko de­set pu­ta ve­ći od onih kvaš­če­vih što pred­stav­lja fak­tor ko­ji uno­si no­vi red ve­li­či­ne u te­ži­nu kar­ti­ ra­nja i sek­ven­ci­ra­nja ge­no­ma. Pre­ma to­me, sek­ven­ci­ra­nje C. ele­ga­ns, 1998. go­di­ne, pred­stav­lja­lo je va­žan pu­to­kaz za ana­li­zu ge­no­ma jer je pro­ši­ri­lo sek­ven­ci­ra­nje ge­no­ma s jed­nos­ta­nič­nih or­ga­ni­za­ma (bak­te­ri­ja i kva­sa­ca) na vi­šes­ta­nič­ne or­ga­niz­me ko­ji su prih­va­će­ni kao va­žan mo­del ani­mal­nog raz­vo­ja. U po­čet­noj fa­zi ana­li­ze ge­no­ma C. ele­ga­ns ko­ris­ti­li su se ulom­ci DNA klo­ni­ra­ni u koz­mi­di­ma ko­ji mo­gu prih­va­ti­ti umet­ke DNA od oko 30 do 45 kb (v. tabl. 4-3). Ovim se pris­tu­pom, ipak, ni­je mo­gao pok­ri­ti či­ta­vi ge­nom, pa je to pos­tig­nu­to klo­ni­ra­njem pu­no ve­ćih ko­ma­da DNA u kvaš­če­vim um­jet­nim kro­mo­so­mi­ma (YAC – en­gl. yea­st ar­ti­fi­cial chro­mo­so­me) kao vek­to­ri­ma. Kao što je na­po­me­nu­to u 4. pog­lav­lju, je­din­stve­no svoj­stvo YA­ C-o­va je­st da sad­r­ža­va­ju cen­tro­me­re i te­lo­me­re što im omo­gu­ću­je re­pli­ka­ ci­ju u kvas­cu u ob­li­ku li­near­nih mo­le­ku­la na­lik na kro­mo­so­me. Pre­ma to­mu, mo­gu se ko­ris­ti­ti za klo­ni­ra­nje frag­me­na­ta DNA ve­li­či­ne kvaš­če­ve kro­mo­som­ske DNA, sve do ti­su­ća ki­lo­ba­za du­lji­ne. Ve­li­ki umet­ci DNA ko­ji se mo­gu klo­ni­ra­ti s YA­C-o­vi­ma i os­ta­lim vek­to­ri­ma ve­li­kog ka­pa­ci­te­ta od pre­sud­ne su važ­nos­ti za ana­li­zu slo­že­nih ge­no­ma. Ge­nom C. ele­ga­ns dug je 97 × 106 pa­ro­va ba­za, a pre­ma pred­vi­đa­nji­ma sad­r­ža­va oko 19.000 slje­do­va ko­di­ra­ju­ćih za pro­tei­ne što je po pri­li­ci tri pu­ta ve­ći broj od bro­ja ge­na u kvas­ca (sl. 5-26). Za raz­li­ku od kom­pak­tne or­ga­ni­za­ci­je ge­no­ma u kvas­ca, ge­ni C. ele­ga­ns pro­te­žu se na oko 5 kb i sa­ dr­ža­vaju pros­ječ­no pet in­tro­na. Slje­do­vi za ko­di­ra­nje pro­tei­na ta­ko iz­no­se sa­mo oko 25% ge­no­ma C. ele­ga­ns u us­po­red­bi sa 60 do 70% u S. pom­be i S. ce­re­vi­siae te bli­zu 90% iz­no­sa bak­te­rij­skog ge­no­ma. Ot­pri­li­ke 40% pro­tei­na pred­vi­đe­nih u C. ele­ga­ns po­ka­za­lo je zna­čaj­nu slič­no­st s poz­na­tim pro­tei­ni­ma dru­gih or­ga­ni­za­ma. Kao što se i oče­ki­va­lo, pos­to­je zna­čaj­no ve­će slič­nos­ti iz­me­đu pro­tei­na C. ele­ga­ns i čov­je­ka ne­go iz­me­đu pro­tei­na C. ele­ga­ns i bi­lo ko­jeg od kva­sa­ca ili bak­te­ri­ja. Pro­tei­ni ko­ji su za­jed­nič­ki C. ele­ga­ns i kvas­cu mož­da dje­lu­ju u os­nov­nim sta­nič­nim pro­ce­si­ma ko­je ti or­ga­niz­mi di­je­le po­put me­ta­bo­liz­ma, ud­vos­tru­či­va­nja DNA, pre­pi­si­va­nja, pre­vo­đe­nja i razvr­sta­va­nja pro­tei­na. Iz­gle­da da se ovi os­nov­ni bio­loš­ki pro­ce­si od­vi­ja­ju s po­mo­ću slič­nog bro­ja ge­na u oba or­ga­ niz­ma, a mo­gu­će je da ove ge­ne di­je­le sve eu­ka­riot­ske sta­ni­ce. Za raz­li­ku od to­ga, ve­ći­na ge­na C. ele­ga­ns ni­je pro­na­đe­na u kvas­ca, pa mož­da dje­lu­je u sup­til­ni­jim re­gu­la­cijskim ak­tiv­nos­ti­ma ko­je su pot­reb­ne za raz­voj vi­še­ sta­nič­nih or­ga­ni­za­ma. Vje­ro­jat­no je da će ras­vjet­lji­va­nje dje­lo­va­nja ovih ge­na bi­ti po­seb­no uz­bud­lji­vo s ob­zi­rom na ra­zu­mi­je­va­nje ani­mal­nog raz­ vo­ja. Ia­ko od­ras­la C. ele­ga­ns sad­r­ža­va sa­mo 959 so­mat­skih sta­ni­ca u či­ta­ vom svom ti­je­lu, ona pos­je­du­je sve spe­ci­ja­li­zi­ra­ne sta­nič­ne ti­po­ve kao i slo­že­ni­je ži­vo­ti­nje. Što­vi­še, opi­san je kom­plet­ni uzo­rak od­vi­ja­nja sta­nič­nih dio­ba pri raz­vo­ju C. ele­ga­ns kao i ana­li­za us­pos­tav­lja­nja ve­za svih 302 neu­

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   181

Sli­ka 5-26. Ge­nom C. ele­ga­ns.  Cr­ve­ nim li­ni­ja­ma oz­na­če­na je po­zi­ci­ja pred­ vi­đe­nih ge­na na sva­kom po­je­di­nom kro­mo­so­mu C. ele­ga­ns. Oni ko­ji su slič­ni kvaš­če­vim ge­ni­ma oz­na­če­ni su lju­bi­čas­ to. (Iz Kon­zor­ci­ja za sek­ven­ci­ra­nje C. ele­ ga­ns, 1998. Scien­ce 282:2012.)

ro­na u od­ras­loj ži­vo­ti­nji. Već se pro­naš­lo da su mno­gi od ovih ge­na uk­lju­ če­nih u raz­voj i di­fe­ren­ci­ja­ci­ju C. ele­ga­ns srod­ni ge­ni­ma ko­ji su uk­lju­če­ni u kon­tro­lu pro­li­fe­ra­ci­je i di­fe­ren­ci­ja­ci­je sta­ni­ca si­sa­va­ca što da­je pra­vi do­ kaz vri­jed­nos­ti C. ele­ga­ns kao mo­de­la za slo­že­ni­je ži­vo­ti­nje. Dro­sop­hi­la (vin­ska mu­ši­ca) pred­stav­lja dru­gi ključ­ni mo­del ani­mal­nog raz­vo­ja ko­ji je oso­bi­to dob­ro ge­ne­tič­ki oka­rak­te­ri­zi­ran. Pred­nos­ti vin­ske mu­ši­ce za ge­ne­tič­ku ana­li­zu uk­lju­ču­ju nje­zin re­la­tiv­no jed­nos­ta­van ge­nom kao i či­nje­ni­cu da se mo­že la­ko uz­ga­ja­ti i kri­ža­ti u la­bo­ra­to­ri­ju. Uz to u vin­skoj mu­ši­ci pos­to­ji po­seb­no oru­đe za ge­ne­tič­ku ana­li­zu: go­ros­tas­ni po­ li­te­ni kro­mo­so­mi ko­ji se na­la­ze u ne­kim tki­vi­ma po­put žli­jez­da sli­nov­ni­ca lar­ve. Ovi kro­mo­so­mi nas­ta­ju u sta­ni­ca­ma ko­je se ne di­je­le kao pos­lje­di­ca po­nov­lje­nih rep­li­ka­ci­ja la­na­ca DNA što se ne od­va­ja­ju je­dan od dru­go­ga. Ta­ko sva­ki od po­li­te­nih kro­mo­so­ma sad­r­ža­va na sto­ti­ne iden­ti­čnih pa­ra­lel­ nih mo­le­ku­la DNA. Zbog svo­je ve­li­či­ne po­li­te­ni kro­mo­so­mi vid­lji­vi su pod svjet­los­nim mik­ros­ko­pom, a od­re­đe­nim bo­je­njem ot­kri­va­ju se po­seb­ni uzor­ci pru­ga­nja što pred­stav­lja fi­zič­ku kar­tu ge­no­ma Dro­sop­hi­le vi­so­ke re­ zo­lu­ci­je (s dale­ko ve­ćim stu­pnjem re­zo­lu­ci­je od ono­ga ko­ji se pos­ti­že u me­ta­faz­nim kro­mo­so­mi­ma, op. prev.). Gen­ske de­le­ci­je se čes­to mo­gu ko­re­ li­ra­ti s gu­bit­kom od­re­đe­ne kro­mo­som­ske pru­ge či­me se de­fi­ni­ra fi­zič­ki smješ­taj ge­na na kro­mo­so­mu. Osim to­ga, klo­ni­ra­ne DNA se mo­gu kar­ti­ra­ ti po­mo­ću hib­ri­di­za­ci­je in si­tu na po­li­te­ne kro­mo­so­me, čes­to s dos­tat­nom re­zo­lu­ci­jom da se lo­ka­li­zi­ra­ju klo­ni­ra­ni ge­ni u spe­ci­fič­nim pru­ga­ma (sl. 5-27). Na taj na­čin mo­gu se na kar­ti la­ko od­re­di­ti po­zi­ci­je koz­mid­nih ili YAC-klo­no­va (ko­ji se pro­te­žu pre­ko vi­še pru­ga) pa se dobi­je os­no­va za ana­li­zu ge­nom­sko­ga re­dos­li­je­da. Zbog raz­vi­je­ne ge­ne­ti­ke vin­ske mu­ši­ce, sek­ven­ci­ra­nje nje­zi­nog ge­no­ma, po­čet­kom 2000. go­di­ne, pred­stav­lja­lo je va­žan nap­re­dak za ge­nom­sku ana­ li­zu. Ge­nom vin­ske mu­ši­ce sas­to­ji se od ot­pri­li­ke 180 × 106 pa­ro­va ba­za, a od to­ga je po pri­li­ci jed­na tre­ći­na u ob­li­ku he­te­rok­ro­ma­ti­na. He­te­rok­ro­ma­

Sli­ka 5-27. In si­tu hib­ri­di­za­ci­ja na po­li­te­nom kro­mo­so­mu Dro­sop­hi­lae.  Pri­ka­za­na je hib­ri­di­za­ci­ja YAC-klo­na na po­li­te­ni kro­mo­som. Pod­ruč­je hib­ri­di­za­ci­je oz­na­če­no je str­je­li­com. (Lju­baz­noš­ću Da­nie­la L. Har­tla, Uni­ver­zi­tet Har­va­rd.)

182    POGLAVLJE 5 tin se sas­to­ji ug­lav­nom od jed­nos­tav­nih po­nov­lje­nih sa­te­lit­nih slje­do­va te raz­ba­ca­nih tran­spo­ni­ra­ju­ćih ele­me­na­ta što sve ni­je bi­lo uk­lju­če­no u ge­ nom­ski sli­jed. Os­ta­tak od 120 × 106 pa­ro­va ba­za euk­ro­ma­ti­na sek­ven­ci­ra­no je upo­ra­bom kom­bi­na­ci­je klo­no­va bak­te­rij­skog um­jet­nog kro­mo­so­ma (BAC – en­gl. bac­te­rial ar­ti­fi­cial chro­mo­so­me) ko­ji no­se ve­li­ke umet­ke DNA (v. tabl. 4-3) te me­to­dom »sač­ma­ri­ce« (en­gl. shot­-gun) u ko­joj su ma­li frag­ men­ti DNA na­su­mič­no klo­ni­ra­ni i sek­ven­ci­ra­ni u plaz­mid­nim vek­to­ri­ma. Slje­do­vi ovak­vih ma­lih frag­me­na­ta DNA za­tim su sas­tav­lje­ni u ve­li­ke kon­ ti­nui­ra­ne slje­do­ve od­re­đi­va­njem prek­la­pa­nja me­đu tim frag­men­ti­ma te su im od­re­đe­ni smje­ro­vi s po­mo­ću BAC-klo­no­va ka­ko bi se do­bio pot­pu­ni sli­jed euk­ro­ma­tin­skog di­je­la ge­no­ma vin­ske mu­ši­ce. Ge­nom vin­ske mu­ši­ce sad­r­ža­va oko 14.000 ge­na. Kao i u C. ele­ga­ns i u vin­ske mu­ši­ce ge­ni sad­r­ža­va­ju pros­ječ­no 4 in­tro­na, a ukup­na ko­li­či­na in­ tron­skih slje­do­va slič­na je ko­li­či­ni eg­zon­skih slje­do­va. Ukup­no 13% ge­no­ ma vin­ske mu­ši­ce sas­to­ji se od slje­do­va za ko­di­ra­nje pro­tei­na. Iz­ne­na­đu­ju­ći je bio na­laz da je broj ge­na u Dro­sop­hi­le zna­čaj­no ma­nji ne­go­li broj ge­na u C. ele­ga­ns ia­ko je vin­ska mu­ši­ca slo­že­ni­ji or­ga­ni­zam. Ono što na­ro­či­to upa­da u oči je­st da slo­že­na ži­vo­ti­nja po­put vin­ske mu­ši­ce pos­je­du­je sa­mo dvos­tru­ko ve­ći broj je­din­stve­nih ge­na ne­go kva­sac. Ova za­pa­ža­nja oči­to nag­la­ša­va­ju či­nje­ni­cu da slo­že­no­st vi­šes­ta­nič­nih or­ga­ni­za­ ma ni­je na jed­nos­ta­van na­čin po­ve­za­na s ve­ćim bro­jem ge­na u ge­no­mu. Dio ve­će bio­loš­ke slo­že­nos­ti vin­ske mu­ši­ce i C. ele­ga­ns mož­da proiz­la­zi iz či­nje­ni­ce da su nji­ho­vi pro­tei­ni op­će­ni­to ve­ći te sad­r­ža­va­ju vi­še fun­kcio­nal­ nih do­me­na ne­go­li pro­tei­ni kvas­ca. Dalj­nja fun­kcio­nal­na ana­li­za ge­no­ma vin­ske mu­ši­ce i C. ele­ga­ns bez sva­ke će sum­nje ig­ra­ti od­luč­nu ulo­gu u ra­ zu­mi­je­van­ju na­či­na na ko­ji ovi ge­ni up­rav­lja­ju slo­že­nim pro­ce­som ani­mal­ nog raz­vo­ja. Na­kon sek­ven­ci­ra­nja ge­no­ma C. ele­ga­ns i Dro­sop­hi­le me­la­no­gas­ter od­ re­đe­ni su i ge­nom­ski re­dos­lje­do­vi ne­ko­li­ci­ne do­dat­nih bes­kra­ljež­nja­ka. Me­đu nji­ma su ge­no­mi ne­ma­to­de Cae­nor­hab­di­tis brig­gsae (blis­ki srod­nik C. ele­ga­ns) i ge­no­mi je­da­nae­st do­dat­nih vr­sta Dro­sop­hi­la što pred­stav­lja zna­ča­jan re­su­rs za us­po­red­nu ana­li­zu or­ga­ni­za­ma u blis­kom srod­stvu. U ove do­dat­no sek­ven­ci­ra­ne ge­no­me ku­ka­ca spa­da ge­nom ko­mar­ca, du­do­ vog svil­ca i pče­le. Ge­nom­ski re­dos­lje­do­vi je­žin­ca i mor­ske ane­mo­ne (sme­ đa vla­su­lja) ta­ko­đer su od­re­đe­ni te je pro­ci­je­nje­no da pr­vi sad­r­ži ot­pri­li­ke 23.000, a dru­gi 18.000 ge­na što do­dat­no nag­la­ša­va či­nje­ni­cu ne­raz­mje­ra iz­me­đu bro­ja ge­na i kom­plek­snos­ti or­ga­niz­ma.

Bilj­ni ge­no­mi Zav­r­še­tak sek­ven­ci­ra­nja ge­no­ma Ara­bi­dop­sis tha­lia­na, 2000. go­di­ne, pro­ši­rio je sek­ven­ci­ra­nje ge­no­ma sa ži­vo­ti­nja na bilj­ke, pa je ta­ko doš­lo do naj­važ­ni­jeg do­ga­đa­ja u bilj­noj bio­lo­gi­ji. Ara­bi­dop­sis tha­lia­na je jed­nos­tav­na cvjet­ni­ca ko­ja je na ve­li­ko ko­riš­te­na kao mo­del za prou­ča­va­nje mo­le­ku­lar­ ne bio­lo­gi­je i raz­vo­ja bilj­ke. Ovaj or­ga­ni­zam ima tu pred­no­st da kao mo­del za prou­ča­va­nje mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je i ge­ne­ti­ke ima re­la­tiv­no ma­li ge­nom od ot­pri­li­ke 125 × 106 pa­ro­va ba­za, što je po ve­li­či­ni slič­no ge­no­mi­ma C. ele­ga­ns i vin­ske mu­ši­ce. Kao i ge­nom vin­ske mu­ši­ce, i ge­nom Ara­bi­dop­si­sa ug­lav­nom je sek­ven­ci­ran ko­riš­te­njem BAC-vek­to­ra za prih­vat ve­li­kih frag­ me­na­ta DNA. Pos­ve neo­če­ki­va­no ana­li­za ge­no­ma Ara­bi­dop­si­sa po­ka­za­la je da on sa­ dr­ži prib­liž­no 26.000 ge­na za ko­di­ra­nje pro­tei­na što je zna­čaj­no vi­še ge­na ne­go što je pro­na­đe­no bi­lo u C. ele­ga­ns bi­lo u vin­ske mu­ši­ce. Ve­li­ki broj ge­na u Ara­bi­dop­si­sa je u naj­ma­nju ru­ku di­je­lom re­zul­tat dup­li­ka­ci­ja ve­li­kih di­je­lo­va ge­no­ma Ara­bi­dop­si­sa. Te dup­li­ka­ci­je uk­lju­ču­ju ot­pri­li­ke 60% ge­

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   183

no­ma, pa je pro­ci­je­nje­no da je broj raz­li­či­tih ge­na ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne oko 16.000. Gus­to­ća ge­na u Ara­bi­dop­si­sa slič­na je onoj u C. ele­ga­ns, pa slje­do­vi ko­ ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne či­ne oko 25% ge­no­ma. U pros­je­ku, ge­ni Ara­bi­dop­si­sa ima­ju oko 4 in­tro­na, a ukup­na du­lji­na in­tron­skih slje­do­va prib­liž­no je jed­ na­ka ukup­noj du­lji­ni eg­zon­skih slje­do­va. Pok­ret­ni ele­men­ti sud­je­lu­ju s oko 10% u ge­no­mu Ara­bi­dop­si­sa. Kao i u vin­skoj mu­ši­ci, po­nav­lja­ju­ći pok­ret­ni ele­men­ti na­kup­lje­ni su na cen­tro­me­ra­ma za­jed­no sa sa­te­lit­nim po­nav­lja­ju­ ćim slje­do­vi­ma. Kom­pa­ra­tiv­na ana­li­za fun­kci­je ge­na Ara­bi­dop­si­sa otkri­la je za­nim­lji­ve slič­nos­ti kao i raz­li­ke iz­me­đu ge­na bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja. Ge­ni ko­ji su uk­lju­če­ ni u os­nov­ne sta­nič­ne pro­ce­se kao što su ud­vos­tru­či­va­nje DNA, pop­ra­vak, pre­pi­si­va­nje, pre­vo­đe­nje i pro­met pro­tei­na slič­ni su oni­ma u kvas­ca, C. ele­ ga­ns i vin­ske mu­ši­ce što od­ra­ža­va za­jed­nič­ko evo­lu­cij­sko pod­ri­jet­lo svih eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Za raz­li­ku od to­ga ge­ni Ara­bi­dop­si­sa ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne uk­lju­če­ne u pro­ce­se po­put sta­nič­ne sig­na­li­za­ci­je i mem­bran­skog tran­spor­ta pri­lič­no su raz­li­či­ti od onih u ži­vo­ti­nja što je u skla­du s ve­li­kim raz­li­ka­ma u fi­zio­lo­gi­ji i raz­vo­ju iz­me­đu bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja. Oko tre­ći­ne svih ge­na Ara­bi­dop­si­sa iz­gle­da da su je­din­stve­ni za bilj­ke, bu­du­ći da ih ne­ma ni u kvaš­če­vim, ni­ti u ži­vo­tinj­skim ge­no­mi­ma. Naj­ve­ća fun­kcio­nal­na sku­pi­na ge­na, ko­ja zau­zi­ma 22% ge­no­ma, ko­di­ra pro­tei­ne uk­lju­če­ne u me­ta­bo­li­zam i fo­to­sin­te­zu (sl. 5-28). Dru­ga ve­li­ka sku­pi­na ge­na (12% ge­no­ma) ko­di­ra pro­tei­ne uk­lju­če­ne u ob­ra­nu bilj­ke. Ta­ko­đer je važ­no za­pa­zi­ti da ge­nom Ara­bi­dop­si­sa kodi­ra vi­še od 3.000 pro­tei­na ko­ji re­gu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju (što iz­no­si oko 17% ge­no­ma). Broj pro­tei­na ko­ji re­gu­li­ra­ju gen­sku ak­tiv­no­st (tran­skrip­cij­ski fak­to­ri) dva pu­ta je ve­ći od ono­ga ko­ji je pro­na­đen u vin­ ske mu­ši­ce ili tri pu­ta ve­ći od ono­ga ko­ji je pro­na­đen u C. ele­ga­ns. Mno­gi od tran­skrip­cij­skih fak­to­ra Ara­bi­dop­si­sa je­din­stve­ni su za bilj­ke, što je vje­ ro­jat­no od­raz po­seb­nih ob­li­ka gen­ske ek­spre­si­je ti­je­kom raz­vo­ja bilj­ke te od­go­vo­ra bilj­ke na oko­liš.

Sli­ka 5-28. Fun­kci­ja ge­na pred­vi­đe­nih u Ara­bi­dop­sis tha­lia­na.  Ilus­tra­ci­ja pri­ ka­zu­je pro­por­ci­ju ge­na Ara­bi­dop­sis tha­ lia­na u raz­li­či­tim fun­kcio­nal­nim ka­te­go­ ri­ja­ma. (Iz Ara­bi­dop­sis Ge­no­me Ini­tia­ti­ve, 2000. Na­tu­re 408: 796.)

184    POGLAVLJE 5 Na­kon sli­je­da nuk­leo­ti­da Ara­bi­dop­si­sa, us­li­je­di­lo je ob­jav­lji­va­nje dvi­ju ski­ca re­dos­lje­do­va ri­ži­na ge­no­ma 2002. go­di­ne, te za­tim vi­so­kok­va­li­tet­nog pot­pu­nog re­dos­li­je­da 2005. godine. Ri­žin ge­nom sas­to­ji se od oko 390 × 106 pa­ro­va ba­za DNA, pa je sko­ro tri pu­ta ve­ći od ge­no­ma Ara­bi­dop­si­sa. Ot­pri­li­ke 35% ri­ži­na ge­no­ma sas­to­ji se od pok­ret­nih ele­me­na­ta ko­ji dop­ri­ no­se nje­go­voj znat­ni­joj ve­li­či­ni. Osim to­ga, ri­ža sad­r­ži iz­ne­na­đu­ju­će ve­lik broj ge­na ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne, što je pro­ci­je­nje­no na oko 41.000. Tre­ći bilj­ni ge­nom ko­ji se sek­ven­ci­ra, onaj cr­ne ka­nad­ske to­po­le, ta­ko­đer sad­r­ži ve­li­ki broj ge­na pro­ci­je­njen na vi­še od 45.000. Pre­ma to­me, pos­ve neo­če­ki­va­no, iz­gle­da da je broj ge­na u bi­lja­ka zna­ čaj­no ve­ći od ono­ga u ži­vo­ti­nja. Kao i ge­nom Ara­bi­dop­sisa, ta­ko i ge­no­mi ri­že i ka­nad­ske to­po­le sad­r­že mno­ge dup­li­ci­ra­ne ge­ne ko­ji su se po­ja­vi­li kao re­zul­tat dup­li­ka­ci­je ve­li­kih seg­me­na­ta ge­no­ma i dop­ri­no­se ovak­vim ve­li­kim bro­je­vi­ma ge­na. Osim to­ga, ve­li­ki bro­je­vi ge­na u bi­lja­ka mož­da su od­raz dru­gih as­pe­ka­ta bilj­ne bio­lo­gi­je što će se mož­da ras­vi­jet­li­ti dalj­njim ge­nom­skim ana­li­za­ma.

Ljud­ski ge­nom Za mno­ge znan­stve­ni­ke kraj­nji cilj ana­li­ze ge­no­ma bi­lo je od­re­đi­va­nje pot­pu­nog sli­je­da nuk­leo­ti­da ljud­sko­ga ge­no­ma: ot­pri­li­ke 3 × 109 pa­ro­va ba­za DNA. Da bi se ra­zum­je­la ve­li­či­na ovog po­th­va­ta, tre­ba se pod­sje­ti­ti da je ljud­ski ge­nom vi­še od de­set pu­ta ve­ći od ono­ga u vin­ske mu­ši­ce; da je naj­ma­nji kro­mo­som čov­je­ka ne­ko­li­ko pu­ta ve­ći od či­ta­va kvaš­če­va ge­no­ ma; te da je ras­teg­nu­ta DNA ko­ja či­ni ljud­ski ge­nom du­ga vi­še od 1 m. Iz tak­ve per­spek­ti­ve, od­re­đi­va­nje re­dos­li­je­da hu­ma­no­ga ge­no­ma pred­stav­lja fe­no­me­na­lan pot­hvat, pa je pub­li­ci­ra­nje nje­go­ve ski­ce 2001. go­di­ne bi­lo na­jav­lje­no kao znan­stve­no dos­tig­nu­će od po­vi­jes­nog zna­če­nja. Ljud­ski ge­nom po­di­je­ljen je na 24 kro­mo­so­ma (22 au­to­so­ma i 2 spol­na kro­mo­so­ma), od ko­jih sva­ki sad­rž­ a­va iz­me­đu 45 i 280 Mb DNA (sl. 5-29). Pri­je ne­go­li se od­re­dio re­dos­li­jed ge­no­ma, ne­ko­li­ko ti­su­ća hu­ma­nih ge­na iden­ti­fi­ci­ra­no je i kar­ti­ra­no na hu­ma­ne kro­mo­so­me. Me­to­da ko­ja se obi­ čno ko­ris­ti za lo­ka­li­za­ci­ju ge­na je­st in si­tu hib­ri­di­za­ci­ja son­di obi­lje­že­nih fluo­res­cen­tnim bo­ja­ma s kro­mo­so­mi­ma – me­to­da ko­ja se op­će­ni­to spo­mi­ nje kao fluo­res­cen­tna in si­tu hib­ri­di­za­ci­ja ili FISH (sl. 5-30). Hib­ri­di­za­ ci­ja in si­tu s me­ta­faz­nim kro­mo­so­mi­ma omo­gu­ću­je kar­ti­ra­nje klo­ni­ra­no­ga ge­na na lo­kus de­fi­ni­ran kro­mo­som­skom pru­gom. Bu­du­ći da sva­ka pru­ga ljud­sko­ga me­ta­faz­no­ga kro­mo­so­ma sad­rž­ a­va na ti­su­će ki­lo­ba­za DNA, hi­ bri­di­za­ci­ja in si­tu s ljud­skim me­ta­faz­nim kro­mo­so­mi­ma ne da­je ta­ko de­ talj­nu in­for­ma­ci­ju za kar­ti­ra­nje kao što se do­bi­va hib­ri­di­za­ci­jom s po­li­te­ nim kro­mo­so­mi­ma vin­ske mu­ši­ce ko­ja omo­gu­ću­je lo­ka­li­za­ci­ju ge­na na pru­ga­ma in­ter­faz­nih kro­mo­so­ma ko­je sad­rž­ a­va­ju sa­mo 10 do 20 kb DNA. Ipak, bo­lja re­zo­lu­ci­ja mo­že se do­bi­ti hib­ri­di­za­ci­jom s de­kon­den­zi­ra­ni­jim ljud­skim kro­mo­so­mi­ma iz sta­ni­ca u pro­me­ta­fa­zi ili in­ter­fa­zi gdje se fluo­ res­cen­tnom in si­tu hib­ri­di­za­ci­jom mo­gu kar­ti­ra­ti klo­ni­ra­ni ge­ni u re­gi­ja­ma od ot­pri­li­ke 100 kb. Uz FISH, ge­ne­tič­ka ana­li­za ve­za­nos­ti i fi­zič­ko kar­ti­ra­ nje klo­ni­ra­nih slje­do­va ge­nom­ske kao i cDNA ko­riš­te­no je da se iz­ra­de fi­zič­ka kar­ta (en­gl. physi­cal map) i kar­ta ve­za­nih ge­na (en­gl. ge­ne­tic map) ljud­sko­ga ge­no­ma, što je stvo­ri­lo po­za­di­nu za sek­ven­ci­ra­nje ge­no­ma. Ski­ce re­dos­lje­do­va hu­ma­no­ga ge­no­ma ob­jav­lje­ne 2001. go­di­ne proiz­ve­ le su dvi­je ne­za­vis­ne is­tra­ži­vač­ke sku­pi­ne ko­je su se ko­ris­ti­le raz­li­či­tim pris­tu­pi­ma. Jed­na od njih, In­ter­na­cio­nal­ni kon­zor­cij za sek­ven­ci­ra­nje hu­ ma­no­ga ge­no­ma (In­ter­na­tio­nal Hu­man Ge­no­me Sequen­ci­ng Con­sor­tium) ko­ris­ti­la je kao pod­lo­gu za sek­ven­ci­ra­nje BAC-klo­no­ve ko­ji su kar­ti­ra­ni na kro­mo­som­ska mjes­ta. Dru­ga sku­pi­na, pod vod­stvom Crai­ga Ven­te­ra iz Ce­

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

Sli­ka 5-29. Ljud­ski kro­mo­so­mi.  She­mat­ski pri­kaz pru­ga­nja me­ta­faz­nih kro­mo­so­ma na­kon ci­to­ge­ne­tič­ko­ga bo­je­nja.

   185

186    POGLAVLJE 5

KL JUČNI POKUS

Ljudski genom Ini­tial Sequen­ci­ng and Ana­lysis of the Hu­man Ge­no­me In­ter­na­tio­nal Hu­man Ge­no­me Sequen­ci­ng Con­sor­tium Na­tu­re, vol. 409, 2001, str. 860–921

The Sequen­ce of the Hu­man Ge­no­me J. Craig Ven­ter and 273 ot­he­rs Scien­ce, vol. 291, 2001, str. 1304–1351

Kon­tek­st Ide­ja o sek­ven­ci­ra­nju ci­je­lo­ga ljud­sko­ ga ge­no­ma za­če­ta je pr­vi put sre­di­nom osam­de­se­tih go­di­na proš­lo­ga sto­lje­ća. U po­čet­ku je me­đu bio­lo­zi­ma do­če­ka­na s ve­li­kom skep­som jer je ve­ći­na sma­ tra­la da je to jed­nos­tav­no neos­tva­riv pot­hvat. U to vri­je­me, naj­ve­ći ge­nom ko­ji je u pot­pu­nos­ti sek­ven­ci­ran bio je ge­nom Ep­stei­n-Bar­ro­va vi­ru­sa ko­ji je imao ukup­no oko 180.000 pa­ro­va ba­za DNA. Iz te per­spek­ti­ve mno­gi­ma je bi­ lo ne­za­mis­li­vo sek­ven­ci­ra­nje ljud­sko­ga ge­no­ma ko­ji je oko 20.000 pu­ta ve­ći. Ipak ide­ja o tak­vom go­le­mom pro­jek­ tu za bio­lo­gi­ju oča­ra­la je ne­ke po­je­din­ ce, me­đu ko­ji­ma je bio i Char­les De­Li­si ko­ji je ta­da vo­dio Ured za is­tra­ži­va­nje zdrav­lja i oko­li­ša u Od­je­lu za ener­ge­ti­ ku (Of­fi­ce of Heal­th and En­vi­ron­men­tal Re­sear­ch, De­par­tme­nt of Ener­gy). Go­di­ ne 1986., De­Li­si je us­pio lan­si­ra­ti Ini­ci­ ja­ti­vu za ljud­ski ge­nom (Hu­man Ge­no­ me Ini­tia­ti­ve) kao pro­je­kt unu­tar Od­je­la za ener­ge­ti­ku. Pro­je­kt je do­bio ši­ru pod­rš­ ku 1988. go­ di­ne, ka­da ga je po­dup­ro od­bor Na­cio­ nal­no­ga sav­je­ta za is­tra­ži­va­nja. Taj je od­bor pre­po­ru­čio pro­ši­re­nje nas­to­ja­nja na tom pod­ruč­ju, uk­lju­čiv­ši sek­ven­ci­ra­ nje ge­no­ma ne­ko­li­ko mo­del­nih or­ga­ni­ za­ma i us­po­red­ni raz­voj de­talj­ne kar­te ve­za­nih ge­na i fi­zič­ke kar­te ljud­skih kro­mo­so­ma. Pro­je­kt je bio ob­je­di­njen u Na­cio­nal­nim in­sti­tu­ti­ma za zdrav­lje (Na­tio­nal In­sti­tu­tes of Heal­th), a u po­ čet­ku ga je vo­dio Ja­mes Wat­son (suot­ kri­vač struk­tu­re DNA) ko­je­ga je kas­ni­je nas­li­je­dio Fran­ces Col­li­ns. Pr­vo pot­pu­no sek­ven­ci­ra­nje ge­no­ma pro­ve­de­no je u bak­te­ri­ji Hae­mop­hi­lus in­fluen­zae, a ob­ja­vio ga je Craig Ven­ter sa su­rad­ni­ci­ma, 1995. go­di­ne. Ven­ter

Eric Lander je sud­je­lo­vao u nas­to­ja­nji­ma sek­ven­ci­ ra­nja ge­no­ma u Na­cio­nal­nim in­sti­tu­ti­ ma za zdrav­lje, ali je taj po­sao na­pus­ tio 1991. go­di­ne da bi pos­tao di­rek­tor nep­ro­fit­ne or­ga­ni­za­ci­je, In­sti­tu­ta za ge­nom­ska is­tra­ži­va­nja. U me­đuv­re­me­ nu, zna­ča­jan je napredak pos­tig­nut u kar­ti­ra­nju ljud­sko­ga ge­no­ma, a iza po­ čet­nog sli­je­da H. in­fluen­zae us­li­je­di­li su 1998. go­di­ne, slje­do­vi dru­gih bak­te­ri­ja, kvas­ca i C. ele­ga­ns. Go­di­ne 1998. Ven­ter je os­no­vao no­vu kom­pa­ni­ju, Ce­le­ra Ge­no­mi­cs, i ob­ja­vio plan prim­je­ne nap­red­nih teh­no­lo­gi­ ja sek­ven­ci­ra­nja ko­ji će mu omo­gu­ći­ ti iz­ra­dbu cje­lo­vi­tog sli­je­da ljud­sko­ga ge­no­ma u ro­ku od 3 go­di­ne. Col­li­ns i

Craig Venter

os­ta­li vo­di­te­lji jav­no fi­nan­ci­ra­nog pro­ jek­ta ge­no­ma od­go­vo­ri­li su na taj iza­ zov ub­r­za­njem svo­jih nas­to­ja­nja, pa je to re­zul­ti­ra­lo ut­r­kom ko­ja je na­po­kon do­ve­la do ob­jav­lji­va­nja dvi­ju ski­ca ljud­ sko­ga ge­no­ma u ve­lja­či 2001. go­di­ne.

Ek­spe­ri­men­ti Dvi­je su sku­pi­ne znan­stve­ni­ka ko­ris­ti­le raz­li­či­te pris­tu­pe u iz­ra­dbi re­dos­li­je­da ljud­sko­ga ge­no­ma. Jav­no fi­nan­ci­ra­na gru­pa In­ter­na­cio­nal­ni kon­zor­cij za sek­ ven­ci­ra­nje hu­ma­no­ga ge­no­ma, pod vod­stvom Eri­ca Lan­de­ra, sek­ven­ci­ra­la je frag­men­te DNA iz­ve­de­ne iz BAC‑

Strategija sekvenciranja genoma u kojoj se koriste BAC-klonovi koji se organiziraju u preklapajuće skupine i kartiraju na humane kromosome.

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   187

KL JUČNI POKUS klo­no­va ko­ji su pret­hod­no kar­ti­ra­ni na hu­ma­ne kro­mo­so­me što je bi­lo slič­no pris­tu­pu ko­ji je ko­riš­ten za od­re­đi­va­nje sli­je­da ge­no­ma kvas­ca i C. ele­ga­ns (vi­ di sli­ku). Za raz­li­ku od to­ga, sku­pi­na iz Cele­ra ge­no­mi­cs ko­ris­ti­la je za sek­ven­ ci­ra­nje na či­ta­vom ge­no­mu me­to­du »sač­ma­ri­ce« ko­ju su Ven­ter i su­rad­ni­ci pr­vi put upot­ri­je­bi­li za sek­ven­ci­ra­nje ge­no­ma H. in­fluen­zae. U ovom pris­tu­pu, frag­men­ti DNA su na­sum­ce sek­ven­ci­ra­ ni, a prek­la­pa­nja me­đu frag­men­ti­ma ta­da su ko­riš­te­na za po­nov­no sas­tav­ lja­nje sli­je­da či­ta­vo­ga ge­no­ma. Oba re­ dos­li­je­da pok­ri­va­la su sa­mo eu­kro­ma­ tin­ski dio hu­ma­no­ga ge­no­ma, ot­pri­li­ke 2.900 Mb DNA, a he­te­rok­ro­ma­tin­ski dio ge­no­ma bo­gat po­nav­lja­ju­ćim slje­do­vi­ ma os­tao je ne­sek­ven­ci­ran. Ob­je od ovih dvi­ju pr­vih ob­jav­lje­nih ver­zi­ja pred­stav­lja­le su sa­mo ski­ce, a ne pot­pu­ne re­dos­lje­do­ve. Dalj­njim na­

po­ri­ma upot­pu­njen je redos­li­jed, što je 2004. go­di­ne do­ve­lo do ob­jav­lji­va­nja vr­lo pre­ciz­ne sek­ven­ce hu­ma­nog ge­ no­ma.

Ut­je­caj Ne­ko­li­ko važ­nih zak­lju­ča­ka od­mah je proi­ziš­lo iz re­dos­li­je­da ljud­sko­ga ge­ no­ma. Pr­vo, broj ljud­skih ge­na je iz­ne­ na­đu­ju­će ma­len te iz­gle­da da se kre­će iz­me­đu 20.000 i 25.000 u upot­pu­nje­ nom re­dos­li­je­du. Ipak, za­nim­lji­vo je da je al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje po svoj pri­ li­ci uo­bi­ča­je­no u ljud­skom ge­no­mu, pa sva­ki gen mo­že ko­di­ra­ti vi­še od jed­nog pro­tei­na. In­tro­ni čine oko 20% hu­ma­ no­ga ge­no­ma, a re­pe­ti­tiv­ne sek­ven­ce oko 60%. Važ­no je pri­mi­je­ti­ti da je vi­še od 40% ljud­ske DNA slo­že­no od slje­ do­va ko­ji su iz­ve­de­ni re­ver­znom trans­ krip­ci­jom što stav­lja nag­la­sak na važ­

no­st ovog na­či­na pri­je­no­sa in­for­ma­ci­ja u ob­li­ko­va­nju na­še­ga ge­no­ma. Osim ovih ne­pos­red­nih zak­lju­ča­ka, re­ dos­li­jed ljud­sko­ga ge­no­ma, za­jed­no s re­dos­lje­do­vi­ma dru­gih or­ga­ni­za­ma, dat će no­ve te­me­lje bio­lo­gi­ji i me­di­ci­ ni u nas­tu­pa­ju­ćem raz­dob­lju. Ut­je­caj ge­nom­sko­ga re­dos­li­je­da os­je­tit će se pri­li­kom ot­kri­va­nja no­vih ge­na i nji­ ho­ve fun­kci­je, u ra­zu­mi­je­va­nju gen­ske re­gu­la­ci­je, ras­vjet­lja­va­nju os­no­ve ljud­ skih bo­les­ti i u raz­vo­ju no­vih stra­te­gi­ja u pre­ven­ci­ji i li­je­če­nju zas­no­va­nom na gen­skom us­tro­ju po­je­din­ca. Poz­na­va­ nje ljud­sko­ga ge­no­ma mo­že u ko­nač­ni­ ci pri­do­ni­je­ti ot­kri­va­nju ono­ga, o če­mu Ven­ter i su­rad­ni­ci ka­žu »Pra­vi iza­zov hu­ma­ne bio­lo­gi­je je­st … ob­jas­ni­ti ka­ko je naš um us­pio ta­ko dob­ro or­ga­ni­zi­ra­ ti svo­je mis­li da se mo­gao pos­ve­ti­ti is­ tra­ži­va­nju svo­ga vlas­ti­tog pos­to­ja­nja.«.

le­ra Ge­no­mi­cs ko­ris­ti­la je me­to­du »sač­ma­ri­ce« u ko­joj su ma­li frag­men­ti klo­ni­ra­ni i sek­ven­ci­ra­ni, a on­da su za sas­tav­lja­nje ge­no­ma ko­riš­te­na prek­ la­pa­nja u slje­do­vi­ma me­đu tim frag­men­ti­ma. Oba ova re­dos­li­je­da bi­la su u po­čet­ku ne­kom­plet­ne ski­ce u ko­ji­ma je po pri­li­ci 90% euk­ro­ma­tin­skog di­ je­la ge­no­ma bi­lo sek­ven­ci­ra­no i sas­tav­lje­no. Kon­ti­nu­ira­nim na­po­ri­ma zat­ vo­re­ne su pu­ko­ti­ne u re­dos­li­je­du i po­bolj­ša­na je pre­ciz­no­st ski­ca pa je to 2004. go­di­ne do­ve­lo do kom­ple­ti­ra­nja vi­so­kok­va­li­tet­no­ga re­dos­li­je­da hu­ ma­no­ga ge­no­ma. Sek­ven­ci­ra­ni euk­ro­ma­tin­ski dio ge­no­ma obuh­va­ća ot­pri­li­ke 3,2 × 106 kb (sl. 5-31), a os­ta­tak od 10% ge­no­ma ot­pa­da na vi­so­kopo­navljajuće slje­do­

Sli­ka 5-30. Fluo­res­cen­tna in si­tu hib­ri­di­za­ci­ja.  Fluo­ res­cen­tna son­da za gen ko­ji ko­di­ra la­min­ski B re­cep­tor hib­ri­di­zi­ra­na je s obo­je­nim ljud­skim me­ta­faz­nim kro­mo­ so­mom (pla­vo). Hib­ri­di­za­cij­ski sig­na­li na po­je­di­nač­nim ge­ ni­ma de­tek­ti­ra­ju se s po­mo­ću cr­ve­ne fluo­res­cen­ci­je. (Lju­ baz­noš­ću L. L. Wydne­ra i J. B. Lawren­ce, Me­di­cin­ski cen­tar Uni­ver­zi­te­ta Mas­sac­hu­set­ts.)

188    POGLAVLJE 5

Sli­ka 5-31. Re­dos­li­jed ljud­sko­ga kro­mo­so­ma 1.  Pri­ka­za­ne su po­zi­ci­je ge­na iden­ ti­f i­ci­ra­nih u ski­ci sek­ven­ce ljud­sko­ga kro­mo­so­ma 1. (Iz: In­ter­na­tio­nal Hu­man Ge­no­me Sequen­ci­ng Con­sor­tium, 2001. Na­tu­re 409: 860.)

▶▶ Ti­je­kom mno­gih go­di­na,

znan­stve­ni­ci su op­će­ni­to pri­ hva­ća­li proc­je­nu da hu­ma­ni ge­nom ima oko 100.000 ge­na. Na­kon ob­jav­lji­va­nja ski­ce hu­ ma­nog ge­no­ma 2001. go­di­ ne, broj je dras­tič­no sma­njen na 30.000 do 40.000. Sa­daš­nje proc­je­ne, zas­no­va­ne na vi­so­ kok­va­li­tet­noj sek­ven­ci ob­jav­lje­ noj 2004. go­di­ne, uz ko­riš­te­nje po­bolj­ša­nih ra­ču­nalnih oru­đa za iden­ti­fi­ka­ci­ju ge­na, još vi­še re­du­ci­ra­ju broj hu­ma­nih ge­na na oko 20.000 do 25.000.

ve he­te­rok­ro­ma­ti­na. Pre­ma pret­hod­noj ras­pra­vi u ovom pog­lav­lju, raz­ba­ ca­ni po­navljajući slje­do­vi, či­ja su ve­ći­na pok­ret­ni ele­men­ti ko­ji su se kre­ta­ li po ge­no­mu s po­mo­ću re­ver­zne tran­skrip­ci­je RNA pos­red­ni­ka, či­ne oko 45% sli­je­da ljud­skog euk­ro­ma­ti­na. Os­ta­lih 5% ge­no­ma sas­to­ji se od dup­li­ ci­ra­nih di­je­lo­va DNA, pa se oko 60% ljud­sko­ga ge­no­ma sas­to­ji od po­nav­ ljajućih slje­do­va DNA. Naj­ve­će iz­ne­na­đe­nje proi­zaš­lo iz ge­nom­ske sek­ven­ce bio je neo­če­ki­va­ no ma­li broj ljud­skih ge­na. Ljud­ski ge­nom, či­ni se, ima sa­mo 20.000 do 25.000 ge­na što ni­je pu­no vi­še od bro­ja ge­na u jed­nos­tav­ni­jih ži­vo­ti­nja kao što je C. ele­ga­ns i Dro­sop­hi­la, a ma­nje je od bro­ja ge­na u bi­lja­ka. S dru­ge stra­ne, či­ni se, pos­to­ji ve­li­ka ko­li­či­na al­ter­na­tiv­nog prek­ra­ja­nja u ljud­skim ge­ni­ma, što omo­gu­ću­je jed­nom ge­nu da od­re­di vi­še od jed­no­ga pro­tei­na (v. sl. 5-5). Ia­ko još uvi­jek ni­je jas­no ko­li­ki je do­seg al­ter­na­tiv­nog prek­ra­ja­ nja u lju­di, on mo­že zna­čaj­no po­ve­ća­ti broj pro­tei­na ko­di­ra­nih hu­ma­nim ge­no­mom. Ljud­ski ge­ni pro­ši­re­ni su pre­ko pu­no ve­ćih uda­lje­nos­ti i sad­r­ža­va­ju vi­še in­tron­skih slje­do­va ne­go ge­ni vin­ske mu­ši­ce ili C. ele­ga­ns. Pros­je­čan sli­jed za ko­di­ra­nje pro­tei­na u hu­ma­nim ge­ni­ma iz­no­si oko 1.400 pa­ro­va ba­za što je slič­no ono­me u C. ele­ga­ns i vin­ske mu­ši­ce. Ipak, pros­ječ­ni ljud­ski gen zau­zi­ma 30 kb DNA pri če­mu vi­še od 90% ge­na od­go­va­ra in­tro­ni­ma. Pre­ ma to­me, oko 20% ge­no­ma sas­to­ji se od in­tro­na, a sa­mo 1,2% ljud­sko­ga ge­no­ma od­go­va­ra slje­do­vi­ma ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne. Pre­ko 40% pret­pos­tav­lje­nih ljud­skih pro­tei­na srod­no je pro­tei­ni­ma u os­ta­lim sek­ven­ci­ra­nim or­ga­niz­mi­ma uk­lju­ču­ju­ći vin­sku mu­ši­cu i C. ele­ga­ ns. Mno­gi od ovih kon­zer­vi­ra­nih pro­tei­na dje­lu­ju u os­nov­nim sta­nič­nim pro­ce­si­ma kao što je me­ta­bo­li­zam, ud­vos­tru­či­va­nje i pop­ra­vak DNA, pre­ pi­si­va­nje, pre­vo­đe­nje i pro­me­to­va­nje pro­tei­na. Ve­ći­na pro­tei­na je­din­stve­ nih u čov­je­ka nap­rav­lje­na je od pro­tein­skih do­me­na pro­na­đe­nih i u os­ta­ lim or­ga­niz­mi­ma, ali te is­te do­me­ne su pos­tav­lje­ne u no­ve od­no­se ka­ko bi da­le pro­tei­ne spe­ci­fič­ne za čov­je­ka. U us­po­red­bi s vin­skom mu­ši­com i C. ele­ga­ns ljud­ski ge­nom sad­r­ža­va po­ve­ća­ni broj ge­na uk­lju­če­nih u fun­kci­je po­ve­za­ne s ve­ćom slo­že­noš­ću kra­ljež­nja­ka kao što je imu­nosni od­go­vor, živ­ča­ni sus­tav i zgru­ša­va­nje kr­vi, kao i po­ve­ća­ni broj ge­na uk­lju­če­nih u raz­voj, sta­nič­nu sig­na­li­za­ci­ju i re­gu­la­ci­ju tran­skrip­ci­je.

Ge­no­mi os­ta­lih kra­ljež­nja­ka Uz humani genom sekvenciran je veliki broj genoma kralježnjaka, a taj broj je još uvijek u porastu. Tu spa­da­ju ge­no­mi ri­ba, pi­le­ta, glo­da­va­ca, pa­

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

sa i pri­ma­ta (sl. 5-32). Ovi re­dos­lje­do­vi omo­gu­ću­ju za­nim­lji­ve us­po­red­be s hu­ma­nim ge­no­mom i po­ka­zu­ju se od ko­ris­ti za iden­ti­fi­ka­ci­ju mnoš­tva raz­li­či­tih ti­po­va fun­kcio­nal­nih sek­ven­ci uk­lju­ču­ju­ći i re­gu­lacijske ele­men­te ko­ji kon­tro­li­ra­ju gen­sku ek­spre­si­ju. Ge­nom ri­be Fu­gus rub­ri­pes odab­ran je za sek­ven­ci­ra­nje za­to jer je neo­ bi­čn ­ o kom­pak­tan za ge­nom kra­ljež­nja­ka. Bu­du­ći da se sas­to­ji sa­mo od 3,7 × 108 pa­ro­va ba­za DNA, ge­nom ove ri­be je ot­pri­li­ke ve­li­či­ne sa­mo jed­ ne os­mi­ne hu­ma­nog ge­no­ma. Ia­ko ge­nom ove ri­be i ljud­ski ge­nom pos­je­ du­ju sli­čan broj ge­na, ri­ba ima pu­no ma­nje po­nav­lja­ju­ćih slje­do­va i kra­će in­tro­ne. U stva­ri, po­nav­lja­ju­će sek­ven­ce či­ne sa­mo oko 15% ge­no­ma ove ri­be (što iz­no­si ot­pri­li­ke 50 mi­li­ju­na pa­ro­va ba­za DNA) u kom­pa­ra­ci­ji s oko 60% ge­no­ma čov­je­ka (oko 2 mi­li­jar­de pa­ro­va ba­za). Zbog sma­nje­ne ko­li­či­ne po­nav­lja­ju­ćih slje­do­va u ove ri­be, ge­ni su pu­no guš­će pa­ki­ra­ni i zau­zi­ma­ju oko jed­ne tre­ći­ne ge­no­ma. Fu­gus rub­ri­pes i ljud­ski ge­ni sad­rž­ e sli­čan broj in­tro­na, ali in­tro­ni su kra­ći u ri­be, pa slje­do­vi koji kodiraju pro­

   189

▶▶ Ri­ba Fu­gus rub­ri­pes u ne­kim

tki­vi­ma sad­r­ži snaž­ni neu­ro­tok­ sin pod na­zi­vom tet­ro­do­tok­sin. U Ja­pa­nu ovu ri­bu smat­ra­ju po­ slas­ti­com ko­ju spre­ma­ju po­seb­ no uv­jež­ba­ni ku­ha­ri u res­to­ra­ni­ ma sa po­seb­nom doz­vo­lom.

Sli­ka 5-32. Evo­lu­ci­ja sek­ven­ci­ra­nih kra­ljež­nja­ka.  Vre­men­ska proc­je­na tre­ nut­ka (pri­je mi­li­ju­na go­di­na) ka­da su vr­ ste di­ver­gi­ra­le pri­ka­za­ne su toč­ka­ma gra­ na­nja na di­jag­ra­mu.

190    POGLAVLJE 5 tei­ne od­go­va­ra­ju prib­liž­no jed­noj tre­ći­ni pros­ječ­nog ge­na ili oko 10% rib­ ljeg ge­no­ma (u us­po­red­bi sa 1,2% ge­no­ma čov­je­ka). Fu­gus rub­ri­pes sto­ga pred­stav­lja kom­pak­tni mo­del kra­ljež­njač­kog ge­no­ma u ko­je­mu su ge­ni i kri­tič­ne re­gu­la­cijske sek­ven­ce vi­so­kokon­cen­tri­ra­ne te ta­ko olak­ša­va­ju na­ po­re u fo­ku­si­ra­nju kon­ti­nui­ra­nih stu­di­ja na fun­kcio­nal­ne ge­nom­ske ele­ men­te. Pi­le je u sre­di­ni iz­me­đu Fu­gus rub­ri­pes i si­sa­va­ca što se ti­če evo­lu­cij­ske di­ver­gen­ci­je i ve­li­či­ne ge­no­ma. Pi­le­ći ge­nom se sas­to­ji od ot­pri­li­ke 109 pa­ ro­va ba­za pa po ve­li­či­ni od­go­va­ra tre­ći­ni ljud­skog ge­no­ma. Ipak, proc­je­ nju­je se da sad­r­ži 20.000 do 30.000 ge­na, što je slič­no kao u čov­je­ka. Ma­nja ve­li­či­na pi­le­ćeg ge­no­ma ve­ći­nom se jav­lja kao re­zul­tat po­za­maš­ne re­duk­ci­ je u ko­li­či­ni po­nav­lja­ju­ćih slje­do­va i pseu­do­ge­na u us­po­red­bi s ge­no­mi­ma si­sa­va­ca. Sek­ven­ci­ra­ni ge­no­mi si­sa­va­ca, uz hu­ma­ni ge­nom, uk­lju­ču­ju ge­no­me čud­no­va­tog klju­na­ša, opo­su­ma, mi­ša, šta­ko­ra, psa, re­zus ma­ka­ko maj­mu­ na i čim­pan­ze. Svi ovi ge­no­mi su po ve­li­či­ni slič­ni ljud­skom, a sad­r­že i sli­čan broj ge­na. Ipak, sva­ki od njih je na svoj po­se­ban na­čin od ko­ris­ti za dalj­nji nap­re­dak ra­zu­mi­je­va­nja gen­ske re­gu­la­ci­je i fun­kci­je. Kao što je re­ če­no u pret­hod­nim pog­lav­lji­ma, miš kao sus­tav pred­stav­lja ključ­ni mo­del za ek­spe­ri­men­tal­ne stu­di­je ge­ne­ti­ke i raz­vo­ja si­sa­va­ca, pa dos­tup­no­st miš­je ge­nom­ske sek­ven­ce pred­stav­lja bit­nu ba­zu po­da­ta­ka za is­tra­ži­va­nje na tim po­lji­ma. Is­to ta­ko, štakor pred­stav­lja va­žan mo­del za ljud­sku fi­zio­lo­gi­ju i me­di­ci­nu pa će i te stu­di­je bi­ti olak­ša­ne dos­tup­noš­ću šta­kor­skog ge­no­ma. Mi­še­vi, šta­ko­ri i lju­di pos­je­du­ju 90% za­jed­nič­kih ge­na što pred­stav­lja ne­ pri­je­por­ne ge­ne­tič­ke te­me­lje za upora­bu mi­ša i šta­ko­ra kao mo­de­la za is­ tra­ži­va­nje raz­vo­ja i bo­les­ti čov­je­ka. Ve­li­ki broj po­seb­nih pas­mi­na pa­sa kuć­nih lju­bi­ma­ca či­ni re­dos­li­jed pse­ćeg ge­no­ma na­ro­či­to važ­nim za ra­zu­mi­je­va­nje ge­ne­tič­ke pod­lo­ge mor­ fo­lo­gi­je, po­na­ša­nja i raz­li­či­tih slo­že­nih bo­les­ti ko­je na­pa­da­ju i pse i lju­de. Pos­to­ji oko 300 pas­mi­na pa­sa ko­je se raz­li­ku­ju po svo­jim fi­zič­kim ka­rak­te­ ris­ti­ka­ma, po­na­ša­nju kao i u pod­lož­nos­ti pre­ma raz­li­či­tim bo­les­ti­ma uk­lju­ ču­ju­ći ne­ko­li­ko vr­sta ra­ka, slje­po­ću, glu­ho­ću i me­ta­bo­lič­ke po­re­me­ća­je. Ove ka­rak­te­ris­ti­ke su vi­so­kospe­ci­fič­ne za po­seb­ne pas­mi­ne, što uve­li­ke olak­ša­va iden­ti­fi­ka­ci­ju za njih od­go­vor­nih ge­na. Na prim­jer, ne­dav­nim ana­li­za­ma pse­ćih ge­no­ma iden­ti­fi­ci­ra­ni su ge­ni od­go­vor­ni za bi­je­lu bo­ju kr­zna te za ve­li­či­nu ti­je­la ma­lih pas­mi­na. Sli­čan tip ge­ne­tič­ke ana­li­ze se up­ra­vo pro­vo­di u svr­hu ra­zu­mi­je­va­nja ge­ne­tič­ke pod­lo­ge raz­nih bo­les­ti uk­lju­ču­ju­ći ne­ko­li­ko ti­po­va ra­ka ko­ji su uo­bi­ča­je­ni za ne­ke pas­mi­ne. Bu­ du­ći da mno­ge od tih bo­les­ti po­ga­đa­ju i pse i lju­de, za re­zul­ta­te ovih stu­ di­ja mo­že se pret­pos­ta­vi­ti da će ut­je­ca­ti na ljud­sko zdrav­lje i ve­te­ri­nar­sku me­di­ci­nu. U bu­duć­nos­ti ta­ko­đer mo­že­mo oče­ki­va­ti ge­ne­tič­ke ana­li­ze po­ na­ša­nja u pa­sa. Bu­du­ći da su mno­gi ob­li­ci po­na­ša­nja u pasa, kao strah od od­va­ja­nja, uo­bi­ča­je­ni i u lju­di, psi­ho­lo­zi će vje­ro­jat­no ima­ti što za nau­či­ti od vr­ste ko­ja nam je bi­la naj­bli­ži pra­ti­lac ti­su­ća­ma go­di­na. Od re­dos­li­je­da ge­no­ma čim­pan­ze, na­šeg naj­bli­žeg evo­lu­cij­skog srod­ni­ ka, oče­ku­je se da po­mog­ne u pre­ciz­nom od­re­đi­va­nju je­din­stve­nih ob­li­ka na­šeg ge­no­ma ko­ji raz­li­ku­ju lju­de od os­ta­lih pri­ma­ta. Za­nim­lji­vo je da us­ po­red­ba ge­nom­skih slje­do­va čim­pan­ze i čov­je­ka ipak ne su­ge­ri­ra la­ga­ni od­go­vor na pi­ta­nje o to­me što nas či­ni lju­di­ma. Nuk­leo­tid­ni slje­do­vi čim­ pan­ze i čov­je­ka su sko­ro 99% iden­tič­ni. Raz­li­ka iz­me­đu slje­do­va ovih blis­ ko srod­nih vr­sta (prib­liž­no 1 nuk­leo­tid od 100) je ot­pri­li­ke de­set pu­ta ve­ća od raz­li­ke me­đu ge­no­mi­ma po­je­di­nih lju­di (prib­liž­no 1 nuk­leo­tid od 1.000). Mož­da je iz­ne­na­đu­ju­će to da raz­li­ke u slje­do­vi­ma iz­me­đu čov­je­ka i čim­pan­ze ni­su og­ra­ni­če­ne na ne­ko­di­ra­ju­će slje­do­ve. Um­jes­to to­ga, one

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

čes­to mi­je­nja­ju ko­di­ra­ju­će slje­do­ve ge­na što vo­di raz­li­ci ami­no­ki­se­lin­skih slje­do­va ve­ći­ne pro­tei­na ko­di­ra­nih ge­no­mom čim­pan­ze i ge­no­mom čov­je­ ka. Ia­ko mno­ge od ovih ami­no­ki­se­lin­skih prom­je­na ne mi­je­nja­ju fun­kci­ju pro­tei­na, iz­gle­da da se iz­me­đu čim­pan­ze i čov­je­ka ra­di o prom­je­na­ma struk­tu­re ali i ek­spre­si­je ti­su­ća ge­na, pa pre­poz­na­ti ove raz­li­ke ko­je su ključ­ne za pos­ta­nak čov­je­ka ne ­će pred­stav­lja­ti jed­nos­ta­van po­sao.

Bioin­for­ma­ti­ka i sis­tem­na bio­lo­gi­ja Sek­ven­ca hu­ma­nog ge­no­ma, za­jed­no sa sek­ven­ca­ma os­ta­lih ge­no­ma, pred­stav­lja či­ta­vo bo­gat­stvo in­for­ma­ci­ja ko­je slu­že for­mi­ra­nju no­vog ok­vi­ ra za prou­ča­va­nje sta­nič­ne i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je te ot­va­ra no­ve mo­guć­ nos­ti za me­di­cin­sku prak­su. Osim to­ga, pro­jek­ti sek­ven­ci­ra­nja ge­no­ma zna­čaj­no su pro­mi­je­ni­li pris­tup rje­ša­va­nju mno­gih bio­loš­kih prob­le­ma. Tra­di­cio­nal­nim pris­tu­pom su mo­le­ku­lar­ni bio­lo­zi is­tov­re­me­no prou­ča­va­li ili sa­mo je­dan ili sa­mo ne­ko­li­ko ge­na (ili pro­tei­na). Ovo se pro­mi­je­ni­lo uvo­đe­njem pro­je­ka­ta sek­ven­ci­ra­nja ge­no­ma ko­ji su, iz­njed­riv­ši op­sež­ne (en­gl. lar­ge-sca­le) ek­spe­ri­men­tal­ne pris­tu­pe, ge­ne­ri­ra­li og­rom­nu ko­li­či­nu po­da­ta­ka. Sav­la­da­va­nje og­rom­nih ko­li­či­na po­da­ta­ka ge­ne­ri­ra­nih sek­ven­ci­ ra­njem či­ta­vih ge­no­ma zah­ti­je­va­lo je so­fis­ti­ci­ra­ne ra­ču­nalne ana­li­ze, pa se do­ti­ca­jem bio­lo­gi­je i ra­ču­nal­ne zna­nos­ti stvo­ri­lo no­vo po­lje bioin­for­ma­ti­ ke fo­ku­si­ra­no na raz­voj ra­ču­nal­nih me­to­da pot­reb­nih za ana­li­zu i iz­dva­ja­ nje ko­ris­nih bio­loš­kih in­for­ma­ci­ja iz sek­ven­ci mi­li­jar­di ba­za DNA. Raz­voj ovak­vih ra­ču­nal­nih me­to­da do­veo je opet do no­vih vr­sta op­sež­nih bio­loš­ kih ek­spe­ri­me­na­ta me­đu ko­ji­ma do si­mul­ta­ne ana­li­ze ek­spre­si­je ti­su­ća mR­NA ili pro­tei­na i raz­vo­ja sveo­buh­vat­nih (en­gl. hi­gh-throug­hput) me­to­da za od­re­đi­va­nje gen­ske fun­kci­je ko­riš­te­njem RNA in­ter­fe­ren­ci­je. Ovak­vi op­sež­ni ek­spe­ri­men­tal­ni pris­tu­pi či­ne os­no­vu no­vog po­lja sis­temne bio­lo­ gi­je ko­je te­ži kvan­ti­ta­tiv­nom ra­zu­mi­je­va­nju in­teg­ri­ra­nih di­na­mič­kih po­na­ ša­nja slo­že­nih bio­loš­kih sus­ta­va i pro­ce­sa. Sis­tem­na bio­lo­gi­ja ta­ko udru­žu­ je op­sež­ne bio­loš­ke po­ku­se s kvan­ti­ta­tiv­nom ana­li­zom i raz­vo­jem ob­jek­tiv­nih mo­de­la za slo­že­ne bio­loš­ke pro­ce­se. Glo­bal­na ana­li­za sta­nič­nih pro­tei­na (pro­teo­mi­ka), o ko­joj se ras­prav­lja u 2. pog­lav­lju, prim­jer je ovak­ vih no­vih op­sež­nih ek­spe­ri­men­tal­no-ra­ču­nal­nih pris­tu­pa. Sli­je­di ras­pra­va o ne­ko­li­ci­ni do­dat­nih pod­ruč­ja is­tra­ži­va­nja u ko­ji­ma se prim­je­nju­ju op­sež­ ni ek­spe­ri­men­ti, bioin­for­ma­ti­ka i sis­temna bio­lo­gi­ja.

Sis­te­ma­tič­ni pro­bi­ri gen­ske fun­kci­je Identifikacija svi­h ge­na ne­kog or­ga­niz­ma ot­va­ra mo­guć­no­st za op­sež­nu sis­te­ma­tič­nu ana­li­zu gen­ske fun­kci­je. To­me se mo­že pris­tu­pi­ti ta­ko da se sus­tav­no inak­ti­vi­ra (ili no­kau­ti­ra) sva­ki po­je­di­ni gen ge­no­ma ho­mo­log­ nom re­kom­bi­na­ci­jom s inak­tiv­nim mu­ti­ra­nim ale­lom (v. sl. 4-39). Kao što je na­po­me­nu­to u 4. pog­lav­lju, ovo je pro­ve­de­no na kvas­cu u svr­hu proiz­ vod­nje zbir­ke kvaš­če­vih so­je­va s mu­ta­ci­ja­ma svih poz­na­tih ge­na, što se opet mo­že ana­li­zi­ra­ti da bi se ot­kri­lo ko­ji su ge­ni uk­lju­če­ni u bi­lo ko­ju bio­ loš­ku fun­kci­ju od in­te­re­sa. Up­ra­vo je u ti­je­ku i op­sež­ni in­ter­na­cio­nal­ni pro­je­kt sus­tav­ne inak­ti­va­ci­je svih miš­jih ge­na. Kao al­ter­na­ti­va, op­sež­ni pro­bi­ri ba­zi­ra­ni na RNA in­ter­fe­ren­ci­ji (RNAi) ko­ris­te se za sus­tav­nu ana­ li­zu gen­ske fun­kci­je u raz­li­či­tih or­ga­ni­za­ma kao što su Dro­sop­hi­la, C. elegans te kul­ti­vi­ra­ne sta­ni­ce si­sa­va­ca. U RNAi pro­bi­ri­ma ko­ris­te se dvo­lan­ča­ne DNA za in­duk­ci­ju deg­ra­da­ci­ je ho­mo­log­nih mR­NA u sta­ni­ci (v. sl. 4-42). Dos­tup­no­st kom­plet­nih ge­ nom­skih sek­ven­ci omo­gu­ća­va di­zaj­ni­ra­nje knjiž­ni­ca dvo­lan­ča­nih RNA i

   191

192    POGLAVLJE 5

Sli­ka 5-33. RNAi pro­bir ši­rom ge­no­ma na sta­nič­ni ra­st i pre­živ­lje­nje.  Sva­ki mik­ ro­bu­na­rić sad­r­ži RNAi ko­ja od­go­va­ra po­je­di­nom ge­nu. Sta­ni­ce iz kul­tu­re tki­va do­da­ne su sva­kom bu­na­ri­ću i in­ku­bi­ra­ne da im se omo­gu­ći ra­st. U bu­na­ri­ći­ma u ko­ji­ma sta­ni­ ce ne ras­tu pro­na­đe­ni su ge­ni neop­hod­ni za sta­nič­ni ra­st ili pre­živ­lje­nje.

nji­ho­vu upora­bu u pro­bi­ri­ma či­ta­vih ge­no­ma ka­ko bi se iden­ti­fi­ci­ra­li svi ge­ni uk­lju­če­ni u bi­lo ko­ji bio­loš­ki pro­ces ko­ji se mo­že is­tra­ži­ti sveo­bu­hvat­ nim pris­tu­pom. Na prim­jer, RNAi ana­li­za či­ta­vog ge­no­ma mo­že se upot­ri­ je­bi­ti za iden­ti­fi­ka­ci­ju ge­na pot­reb­nih za ra­st i pre­živ­lje­nje sta­ni­ca Dro­sop­ hi­le ili si­sa­va­ca u kul­tu­ri (sl. 5-33). Po­je­di­ne dvo­lan­ča­ne RNA iz či­ta­ve ge­nom­ske knjiž­ni­ce tes­ti­ra­ju se u mik­ro­bu­na­ri­ći­ma sveo­buh­vat­nim for­ma­ tom ka­ko bi se pro­naš­le one ko­je in­ter­fe­ri­ra­ju s ras­tom ili pre­živ­lje­njem u od­re­đe­nim uv­je­ti­ma. Slič­ni RNAi pro­bi­ri ko­ris­ti­li su se u iden­ti­fi­ka­ci­ji ge­ na uk­lju­če­nih u raz­li­či­te bio­loš­ke pro­ce­se uk­lju­ču­ju­ći pu­te­ve sta­ni­č­ne sig­ na­li­za­ci­je, pro­tein­ske deg­ra­da­ci­je, i pri­je­no­sa na si­nap­sa­ma živ­ča­nog sus­ta­ va.

Re­gu­la­ci­ja gen­ske ek­spre­si­je Genomske sek­ven­ce mo­gu, u stva­ri, osim slje­do­va za ko­di­ra­nje pro­tei­ na, ot­kri­ti i re­gu­lacijske ele­men­te ko­ji kon­tro­li­ra­ju gen­sku ek­spre­si­ju. Kao što će se ras­prav­lja­ti u sl­je­de­ćim pog­lav­lji­ma, re­gu­la­ci­ja gen­ske ek­spre­si­je je ključ­na za mno­ge oblike sta­nič­ne fun­kci­je uk­lju­ču­ju­ći i raz­voj slo­že­nog vi­šes­ta­nič­nog or­ga­niz­ma. Pre­ma to­me, ra­zu­mi­je­va­nje me­ha­ni­za­ma ko­ji kon­tro­li­ra­ju gen­sku ek­spre­si­ju, uk­lju­ču­ju­ći tran­skrip­ci­ju i al­ter­na­tiv­no pre­ kra­ja­nje, pred­stav­lja sre­diš­nji pot­hvat suv­re­me­ne sta­nič­ne i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je pa se oče­ku­je da će pris­tu­pač­no­st ge­nom­skih sek­ven­ci zna­čaj­no dop­ri­ni­je­ti toj za­da­ći. Na ža­lo­st, da­le­ko te­že je pro­na­ći re­gu­la­cijske slje­do­ve ge­na ne­goli slje­do­ve za ko­di­ra­nje pro­tei­na. Ve­ći­na re­gu­lacijskih ele­me­na­ta su krat­ke sek­ven­ce DNA ko­je ti­pič­no sad­rž­ a­va­ju sa­mo de­se­tak pa­ro­va ba­ za. Pre­ma to­me, na­su­mič­na po­ja­va slje­do­va ko­ji pod­sje­ća­ju na re­gu­lacijske ele­men­te čes­ta je u ge­nom­skoj DNA pa se fi­zio­loš­ki zna­čaj­ni ele­men­ti ne mo­gu iden­ti­fi­ci­ra­ti sa­mo iz sli­je­da DNA. Sto­ga iden­ti­fi­ka­ci­ja fun­kcio­nal­nih re­gu­la­cijskih ele­me­na­ta kao i ras­vjet­lja­va­nje sig­nal­nih mre­ža za kon­tro­lu gen­ske ek­spre­si­je pred­stav­lja­ju naj­ve­će iza­zo­ve za bioin­for­ma­ti­ku i sis­tem­ nu bio­lo­gi­ju.

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   193

Pristupačnost ge­nom­skih re­dos­lje­do­va omo­gu­ći­la je znan­stve­ni­ci­ma glo­bal­ne stu­di­je gen­ske ek­spre­si­je u ko­ji­ma se si­mul­ta­no ana­li­zi­ra­ju ek­s­ pre­sij­ske ra­zi­ne svih ge­na jed­ne sta­ni­ce. Ovi ek­spe­ri­men­ti ko­ris­te DNA mik­ro­pos­tro­je u ko­ji­ma je sva­ki gen pred­stav­ljen jed­nim oli­go­nuk­leo­ti­dom u obliku sit­ne toč­ki­ce na sta­kal­cu (v. sl. 4-27). Hib­ri­di­za­ci­ja fluo­res­cen­tno obi­lje­že­nih cDNA-ko­pi­ja sta­nič­nih mR­NA na ova­kav mik­ro­pos­troj omo­ gu­ća­va is­to­dob­nu de­ter­mi­na­ci­ju ra­zi­ne mR­NA svih sta­nič­nih ge­na. Ova­ kav pris­tup po­ka­zao se od po­seb­ne ko­ris­ti za ot­kri­va­nje glo­bal­nih prom­je­ na u gen­skoj re­gu­la­ci­ji po­ve­za­noj s od­re­đe­nim sta­nič­nim po­na­ša­njem kao što je sta­nič­na di­fe­ren­ci­ja­ci­ja ili od­go­vor sta­ni­ca na od­re­đe­ni hor­mon ili fak­tor ras­ta. Bu­du­ći da ge­ni ko­ji se koor­di­ni­ra­no re­gu­li­ra­ju unu­tar sta­ni­ce mo­gu bi­ti pod kon­tro­lom slič­nih me­ha­ni­za­ma, ana­li­za pro­m­je­ne ek­spre­si­ je mul­tip­lih ge­na mo­že po­mo­ći u pre­ciz­nom od­re­đi­va­nju za­jed­nič­kih re­ gu­la­cijskih ele­me­na­ta. Je­dan pris­tup ide pre­ko us­po­red­ne ana­li­ze ge­nom­ skih sek­ven­ci srod­nih or­ga­ni­za­ma. On se ba­zi­ra na pret­pos­tav­ci da su fun­kcio­nal­no važ­ne sek­ven­ce evo­lu­cij­ski kon­zer­vi­ra­ne, dok ne­fun­kcio­nal­ ni seg­men­ti DNA pu­no br­že di­ver­gi­ra­ju. Oko 5% ge­nom­ske se­kven­ce je kon­zer­vi­ra­no u si­sa­va­ca: bu­du­ći da prib­liž­no 1,2% ge­no­ma od­go­va­ra slje­ do­vi­ma ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne, os­ta­lih 4% mož­da pred­stav­lja fun­kcio­nal­no važ­ne re­gu­lacijske slje­do­ve. Na prim­jer, ra­ču­nal­na ana­li­za pri­li­kom iden­ti­ fi­ka­ci­je ne­ko­di­ra­ju­ćih slje­do­va kon­zer­vi­ra­nih u miš­jem, šta­kor­skom, pse­ ćem i ljud­skom ge­no­mu po­ka­za­la se ko­ris­nom za opis slje­do­va ko­ji kon­tro­ li­ra­ju gen­sku tran­skrip­ci­ju (sl. 5-34). Osim to­ga, fun­kcio­nal­ni re­gu­lacijski ele­men­ti čes­to se po­jav­lju­ju u na­ku­pi­na­ma što pred­stav­lja od­raz či­nje­ni­ce da su ge­ni op­će­ni­to re­gu­li­ra­ni me­đud­je­lo­va­njem ne­ko­li­ci­ne tran­skrip­cij­ skih fak­to­ra (v. pogl. 7). Ra­ču­nal­ni al­go­rit­mi di­zaj­ni­ra­ni za ot­kri­va­nje na­ ku­pi­na vez­nih mjes­ta za tran­skrip­cij­ske fak­to­re u ge­nom­skoj DNA su se ta­ko­đer po­ka­za­li ko­ris­ni­ma u iden­ti­fi­ka­ci­ji slje­do­va ko­ji re­gu­li­ra­ju gen­sku ek­spre­si­ju. Kao što će se ras­prav­lja­ti da­lje u 7. pog­lav­lju, raz­vi­je­ni su op­sež­ni ek­ spe­ri­men­tal­ni pris­tu­pi za ana­li­zu vez­nih mjes­ta re­gu­lacijskih pro­tei­na ši­ rom ge­no­ma (en­gl. ge­no­me-wi­de ana­lysis). Kom­bi­na­ci­ja ovak­vih glo­bal­nih ek­spe­ri­men­tal­nih me­to­da s ra­ču­nal­nom ana­li­zom do sa­da je us­pje­la ba­rem ne­ka­ko po­čet­no uka­za­ti na tran­skrip­cij­ske re­gu­lacijske ele­men­te ko­ji up­ rav­lja­ju gen­skom ek­spre­si­jom u kvas­ca. Ipak, pro­ši­re­nje ovak­vih pris­tu­pa na pu­no slo­že­ni­ji ge­nom čov­je­ka i os­ta­lih si­sa­va­ca os­ta­je naj­ve­ćim iza­zo­ vom te­ku­ćih is­tra­ži­va­nja.

Sli­ka 5-34. Konzervacija fun­kcio­nal­nih re­gu­la­cijskih ele­me­ na­ta ge­na.  Ljud­ski, miš­ji, šta­kor­ski i pse­ći slje­do­vi u bli­zi­ni mje­s­ta star­ta tran­skrip­ci­je ge­na sad­r­že fun­kcio­nal­ni re­gu­lacijski ele­me­nt ko­ji ve­že tran­skrip­cij­ski re­gu­la­cijski pro­tein E­r­r-α. Ove sek­ven­ce (oz­nače­ne žu­tom bo­jom) su kon­zer­vi­ra­ne u sva če­ti­ri ge­no­ma za raz­li­ku od slje­do­va ko­ji ih ok­ru­žu­ju. (Iz X. Xie i sur., 2005. Na­tu­re 434: 338.)

194    POGLAVLJE 5

Va­ri­ja­ci­je me­đu po­je­din­ci­ma i ge­nom­ska me­di­ci­na

▶▶ Up­ra­vo se ula­žu po­seb­ni na­

po­ri u raz­voj teh­no­lo­gi­ja ko­je će omo­gu­ći­ti sek­ven­ci­ra­nje ge­ no­ma po­je­di­na­ca po vr­lo nis­ koj ci­je­ni. Ovak­vi ci­je­nom pris­ tu­pač­ni „per­so­nal­ni ge­nom­ski pro­jek­ti“ mog­li bi dop­ri­nije­ti bo­ljoj zdrav­stve­noj skr­bi skro­ je­noj po mje­ri po­je­di­nih pa­ci­je­ na­ta.

Usporedbe ge­nom­skih slje­do­va srod­nih vr­sta po­ma­žu u ra­zu­mi­je­va­nju os­no­ve za raz­li­ku me­đu vr­sta­ma, a ta­ko­đer i u pro­na­la­že­nju ge­na i re­gu­la­ cijskih slje­do­va ko­ji su os­ta­li kon­zer­vi­ra­ni ti­je­kom evo­lu­ci­je. Dru­ga­či­ja vrsta in­for­ma­ci­je mo­že se do­bi­ti us­po­red­bom ge­nom­skih re­dos­lje­do­va raz­ li­či­tih po­je­di­na­ca. Va­ri­ja­ci­je iz­me­đu in­di­vi­dual­nih ge­no­ma te­melj su fi­zič­ kih i psi­hič­kih ka­rak­te­ris­ti­ka uk­lju­ču­ju­ći i pod­lož­no­st pre­ma mnoš­tvu bo­ les­ti. Jed­na od naj­važ­ni­jih prim­je­na sek­ven­ce hu­ma­nog ge­no­ma bi­t će od po­mo­ći pri ot­kri­va­nju no­vih ge­na uk­lju­če­nih u mno­ge bo­les­ti ko­je po­ga­ đa­ju čov­je­čan­stvo kao što su rak, sr­ča­na bo­le­st, i de­ge­ne­ra­tiv­ne bo­les­ti živ­ ča­nog sus­ta­va po­put Par­kin­so­no­ve i Al­zhei­me­ro­ve bo­les­ti. Osim to­ga, ra­ zu­mi­je­va­nje je­din­stve­nog ge­net­skog us­tro­ja (en­gl. ge­ne­tic ma­keup) sva­kog po­je­din­ca tre­ba­lo bi do­ves­ti do no­vih stra­te­gi­ja za pre­ven­ci­ju i li­je­če­nje bo­les­ti iz­ra­đe­nih po mje­ri tog po­je­din­ca. Sekvence či­ta­vih ge­no­ma ne­ko­li­ci­ne po­je­di­na­ca, me­đu ko­ji­ma i Crai­ga Ven­te­ra i Ja­me­sa Wat­so­na, ne­dav­no su od­re­đe­ne, pa se mo­že pred­vid­je­ti da će per­so­nal­no sek­ven­ci­ra­nje ge­no­ma pos­ta­ti dio bu­duć­nos­ti me­di­cin­ske prak­se. Tre­ba nag­la­si­ti da je Wat­so­nov ge­nom sek­ven­ci­ran po­mo­ću no­vih teh­no­lo­gi­ja ko­je su da­le­ko br­že i pu­no jef­ti­ni­je ne­go tra­di­cio­nal­ne me­to­de sek­ven­ci­ra­nja DNA pa se oče­ku­je da će stal­ni teh­no­loš­ki nap­re­dak na kra­ ju omo­gu­ći­ti od­re­đi­va­nje sli­je­da in­di­vi­dual­nog ge­no­ma po ra­zum­noj ci­ jeni. Zajedno s pot­pu­nim sek­ven­ci­ra­njem in­di­vi­dual­nih ge­no­ma, op­sež­ne me­to­de ge­nom­ske ana­li­ze omo­gu­ći­le su iden­ti­fi­ka­ci­ju ge­na po­ve­za­nih s pod­lož­noš­ću ne­ko­li­ci­ni čes­tih bo­les­ti. Ge­no­mi dvo­je nes­rod­nih lju­di raz­li­ ku­ju se po pri­li­ci u jed­noj od ti­su­ću ba­za. Ve­ći­na ovih va­ri­ja­ci­ja od­no­si se na prom­je­ne u jed­noj ba­zi što je poz­na­to pod ime­nom po­li­mor­fiz­mi jed­ nog nuk­leo­ti­da (en­gl. sin­gle nuc­leo­ti­de po­lymorp­hysms – SNPs) a oni se na­la­ze na oko 10 mi­li­ju­na po­zi­ci­ja u ge­no­mu. Pre­ko mi­li­ju­n učes­ta­lih SNPo­va kar­ti­ra­no je u hu­ma­nom ge­no­mu. Ovak­vi SNP-o­vi dis­tri­bui­ra­ni su s re­la­tiv­nom uni­for­mnoš­ću u ge­nom­skoj DNA, pa zbog to­ga osi­gu­ra­va­ju bi­ lje­ge kroz ge­nom na raz­ma­ku od po pri­li­ci 5 kb. Aso­ci­ja­cij­ski pro­bi­ri ši­ rom ge­no­ma (engl. ge­no­me-wi­de as­so­cia­tion sca­ns) koriste SNP-o­ve za iden­ti­fi­ka­ci­ju ge­na po­ve­za­nih s nas­ljed­nim raz­li­ka­ma u pod­lož­nos­ti ne­ko­ li­ci­ni čes­tih bo­les­ti uk­lju­ču­ju­ći reu­ma­toid­ni ar­tri­tis, hi­per­ten­zi­ju, upal­nu bo­le­st cri­je­va, ma­nič­no-dep­re­siv­ni po­re­me­ćaj, bo­le­st ko­ro­nar­nih ar­te­ri­ja, di­ja­be­tes, as­tmu te rak pros­ta­te i doj­ke. U ovak­vim stu­di­ja­ma mo­le­ku­le DNA ti­su­ća pa­ci­je­na­ta i nor­mal­nih kon­tro­la hib­ri­di­zi­ra­ju se na mik­ro­pos­ tro­je ko­ji sad­r­že oba ale­la do 500.000 čes­tih SNP-o­va (sl. 5-35). Ako je gen pri­do­dan pod­lož­nos­ti za bo­le­st ve­zan na od­re­đe­ni SNP, ta­da će se je­dan alel to­ga SNP-a po­jav­lji­va­ti s ve­ćom učes­ta­los­ti u mo­le­ku­la­ma DNA pa­ci­ je­na­ta ne­go­li u mo­le­ku­la­ma DNA nor­mal­nih kon­tro­la. Bu­du­ći da je lo­ka­ li­za­ci­ja SNP-o­va poz­na­ta, ovi re­zul­ta­ti uka­zu­ju na po­ve­za­no­st spe­ci­fič­ne ge­nom­ske re­gi­je, zap­ra­vo ge­na, s po­ve­ća­nim ri­zi­kom obo­li­je­va­nja. Re­zul­ta­ ti ovak­vih aso­ci­ja­cij­skih pro­bi­ra ši­rom ge­no­ma omo­gu­ću­ju da se spe­ci­fič­ni ge­ni po­ve­žu s pod­lož­noš­ću pre­ma raz­li­či­tim bo­les­ti­ma, ali će ta­ko­đer omo­ gu­ći­ti li­ječ­ni­ci­ma da po mje­ri ge­net­skog us­tro­ja po­je­di­nog pa­ci­jen­ta pro­ve­ du stra­te­gi­ju za pre­ven­ci­ju bo­les­ti i li­je­če­nje. Slič­ne us­po­red­be iz­me­đu ge­ no­ma ne­kih dru­gih gru­pa po­je­di­na­ca ta­ko­đer će bi­ti od po­mo­ći u ras­vjet­lja­va­nju kon­tri­bu­ci­je na­ših ge­na os­ta­lim je­din­stve­nim ka­rak­te­ris­ti­ ka­ma kao što su at­let­ska spo­sob­no­st ili in­te­li­gen­ci­ja te bo­ljem ra­zu­mi­je­va­ nju in­te­rak­ci­ja iz­me­đu ge­na i oko­li­ne ko­je uz­ro­ku­ju raz­li­či­te aspekte slo­že­ nog ljud­skog po­na­ša­nja.

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

   195

Sli­ka 5-35. Asocijacijski probiri širom genoma.  Uzorci DNA nekoliko tisuća pacije­na­ta i zdra­vih kon­tro­la ana­li­zi­ra­no je hib­ri­di­za­ci­jom na mik­ro­pos­tro­je ko­ji sad­r­že dva ale­la (oz­na­če­na kao a i b) do 500.000 SNP-o­va (oz­na­če­nih kao SNP1, SNP2, itd.). U pri­ka­za­nom prim­je­ru, alel a SNP5 je po­ve­zan s pod­lož­no­šću pre­ ma bo­les­ti (pri­ka­za­no cr­ve­nom bo­jom). I pa­ci­jen­to­ve i kon­trol­ne DNA hi­b­ri­di­zi­ra­ju se sa slič­nom frek­ven­ci­jom na dva ale­ la os­ta­lih SNP-o­va (npr. SNP1). Mo­le­ku­le DNA zdra­vih kon­tro­la ta­ko­đer se hib­ri­ di­zi­ra­ju sa slič­nom frek­ven­ci­jom na oba ale­la SNP5, ali za raz­li­ku od to­ga, DNA pa­ci­jen­ta hib­ri­di­zi­ra­ju se češ­će s ale­lom a SNP5, što uka­zu­je na nje­go­vu po­ve­za­ no­st s bo­les­ti. (Mo­di­f i­ci­ra­no pre­ma A.M. Bowco­ck, 2007. Na­tu­re 447: 654.)

SAŽETAK

KLJUČNI POJMOVI

PRA­TE­ĆA WEB STRA­NI­CA Pos­je­ti­te web stra­ni­cu ko­ja pra­ti Sta­ni­cu www.sinauer.com/cooper5e na ko­joj se na­la­ze ani­ma­ci­je, vi­deoma­te­ri­jal, tes­to­vi, prob­le­mi i os­ta­li preg­led­ni ma­te­ri­jal.

Slo­že­no­st eu­ka­riot­skih ge­no­ma In­tro­ni i eg­zo­ni: Ve­ći­na eu­ka­riot­skih ge­no­ma ima ras­ci­jep­lje­nu struk­tu­ru u ko­ joj su di­je­lo­vi ko­di­ra­ju­ćih slje­do­va (eg­zo­ni) pre­ki­nu­ti ne­ko­di­ra­ju­ćim slje­do­vi­ma (in­tro­ni). U slo­že­nih eu­ka­rio­ta in­tro­ni zau­zi­ma­ju vi­še od de­set pu­ta to­li­ko DNA ko­li­ko zau­zi­ma­ju eg­zo­ni.

gen, raz­dvoj­ni slje­do­vi, eg­zon, in­tron, prek­ra­ja­nje RNA, ki­lo­ba­za (kb), al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje

Po­nav­lja­ju­ći (re­pe­ti­tiv­ni) slje­do­vi DNA: Vi­še od 50% DNA si­sa­va­ca sas­to­ji se od vi­so­kopo­nav­lja­ju­ćih slje­do­va DNA od ko­jih su ne­ki pri­sut­ni u 105 do 106 ko­ pi­ja po ge­no­mu. Me­đu tim slje­do­vi­ma su po­nav­lja­nja jed­nos­tav­nih slje­do­va kao i po­nav­ljajući ele­men­ti ko­ji su se kre­ta­li ge­no­mom, bi­lo pre­ko RNA bi­lo pre­ko DNA pos­red­ni­ka.

po­nav­lja­nje jed­nos­tav­no­ga sli­je­da, sa­te­lit­na DNA, SINE, LINE, ret­rot­ran­ spo­zon, ret­ro­vi­ru­su sli­čan ele­me­nt, DNA-tran­spo­zon

196    POGLAVLJE 5

KLJUČNI POJMOVI po­ro­di­ca ge­na, pseu­do­ge­ni, do­ra­đe­ni pseu­do­ge­ni

SAŽETAK Dup­li­ka­ci­je ge­na i pseu­do­ge­ni: Mno­gi eu­ka­riot­ski ge­ni pri­sut­ni su u vi­šes­tru­ kim ko­pi­ja­ma ko­je se zo­vu po­ro­di­ce ge­na, a nas­ta­le su dup­li­ka­ci­jom pre­da­ka tih ge­na. Ne­ki čla­no­vi gen­ske po­ro­di­ce dje­lu­ju u raz­li­či­tim tki­vi­ma ili raz­li­či­tim sta­ di­ji­ma raz­vo­ja. Os­ta­li čla­no­vi gen­skih po­ro­di­ca (pseu­do­ge­ni) inak­ti­vi­ra­ni su mu­ta­ci­ja­ma pa vi­še ne pred­stav­lja­ju fun­kcio­nal­ne ge­ne. Dup­li­ka­ci­je ge­na mo­gu nas­ta­ti bi­lo dup­li­ka­ci­jom seg­men­ta DNA bi­lo re­ver­znom tran­skrip­ci­jom mR­NA ko­jom nas­ta­je do­ra­đe­ni pseu­do­gen. Oko 5% ljud­sko­ga ge­no­ma sas­to­ji se od dup­li­ci­ra­nih seg­me­na­ta DNA. Osim to­ga u ljud­skom ge­no­mu ima vi­še od 10.000 do­ra­đe­nih pseu­do­ge­na. Sas­tav ge­no­ma vi­ših eu­ka­rio­ta: Sa­mo ma­li dio ge­no­ma slo­že­nih eu­ka­rio­ta od­ go­va­ra slje­do­vi­ma ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne. Proc­je­nju­je se da ljud­ski ge­nom sad­r­ ža­va 20.000 do 25.000 ge­na, a slje­do­vi ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne pred­stav­lja­ju sa­mo 1,2% DNA. Oko 20% ljud­sko­ga ge­no­ma sas­to­ji se od in­tro­na, a vi­še od 60% sas­ tav­lje­no je od re­pe­ti­tiv­nih i dup­li­ci­ra­nih slje­do­va DNA.

Kro­mo­so­mi i kro­ma­tin kro­ma­tin, his­ton, nuk­leo­som, čes­ti­ca nuk­leo­som­ske sr­ži, kro­ma­to­som, euk­ro­ma­tin, he­te­rok­ro­ma­tin

Kro­ma­tin: DNA eu­ka­riot­skih sta­ni­ca omo­ta­na je oko his­to­na te se ta­ko for­mi­ra­ ju nuk­leo­so­mi. Kro­ma­tin se da­lje mo­že zgus­nu­ti na­ma­ta­njem nuk­leo­so­ma u struk­tu­re vi­še­ga re­da me­đu ko­je spa­da­ju i vi­so­kokon­den­zi­ra­ni me­ta­faz­ni kro­ mo­so­mi sta­ni­ca ko­ji pro­la­ze kroz mi­to­zu. Vi­di web por­tal Ani­ma­ci­ja 5-1.

cen­tro­me­re, ki­ne­to­ho­re, centromerni H3 (Cen­H3), CENP-A, epi­ge­net­sko nas­lje­đi­va­nje

Cen­tro­me­ra: Cen­tro­me­re su spe­ci­ja­li­zi­ra­ne re­gi­je eu­ka­riot­skih kro­mo­so­ma ko­je slu­že kao mjes­ta po­ve­zi­va­nja dvi­ju ses­trin­skih kro­ma­ti­da i mjes­ta prih­va­ća­nja ni­ti dio­be­no­ga vre­te­na za vri­je­me mi­to­ze. Fun­kci­ja cen­tro­me­ra je od­re­đe­na va­ ri­jan­tom H3 his­to­na ko­ja se epi­ge­net­ski od­r­ža­va ti­je­kom mi­to­ze. Te­lo­me­ra: Te­lo­me­re su spe­ci­ja­li­zi­ra­ni slje­do­vi pot­reb­ni za od­r­ža­va­nje kra­je­va eu­ka­riot­skih kro­mo­so­ma.

Re­dos­li­jed či­ta­vih ge­no­ma te­lo­me­re, te­lo­me­ra­za bioin­for­ma­ti­ka

Pro­ka­riot­ski ge­no­mi: Pot­pu­no su sek­ven­ci­ra­ni ge­no­mi vi­še od pet­sto raz­li­či­tih bak­te­ri­ja uk­lju­ču­ju­ći E. co­li. Ge­nom E. co­li sad­r­ža­va 4.288 ge­na, a slje­do­vi ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne zau­zi­ma­ju bli­zu 90% DNA.

me­ga­ba­ze (Mb), ot­vo­re­ni ok­vir či­ta­nja

Kvaš­čev ge­nom: Pr­vi sek­ven­ci­ra­ni eu­ka­riot­ski ge­nom bio je onaj kvas­ca S. ce­re­ vi­siae. Ge­nom S. ce­re­vi­siae sad­r­ža­va oko 6.000 ge­na, a slje­do­vi ko­ji ko­di­ra­ju pro­ tei­ne zau­zi­ma­ju oko 70% ge­no­ma. Ge­nom ki­da­ju­ćeg kvas­ca S. pom­be sad­r­ža­va ma­nje ge­na (oko 5.000) i vi­še in­tro­na ne­go S. ce­re­vi­siae, a slje­do­vi ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne zau­zi­ma­ju oko 60% ge­no­ma S. pom­be.

kvaš­čev um­jet­ni kro­mo­som (YAC), po­li­te­ni kro­mo­som, bak­te­rij­ski um­jet­ni kro­mo­som (BAC)

Ge­no­mi C. ele­ga­ns, Dro­sop­hi­le me­la­no­gas­ter i os­ta­lih bes­kra­ljež­nja­ka: Ge­ nom C. ele­ga­ns bio je pr­vi sek­ven­ci­ra­ni ge­nom ne­kog vi­šes­ta­nič­nog or­ga­niz­ma. Ge­nom C. ele­ga­ns sad­r­ža­va oko 19.000 slje­do­va za ko­di­ra­nje pro­tei­na ko­ji zau­zi­ ma­ju sa­mo oko 25% ge­no­ma. Ge­nom vin­ske mu­ši­ce sad­r­ža­va ot­pri­li­ke 14.000 ge­na, a slje­do­vi ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne zau­zi­ma­ju oko 13% ge­no­ma. Do­dat­ni ge­ no­mi bes­kra­ljež­nja­ka ko­ji su sek­ven­ci­ra­ni uk­lju­ču­ju ge­no­me os­ta­lih vr­sta ne­ma­

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA 

SAŽETAK

   197

KLJUČNI POJMOVI

to­da i Dro­sop­hi­le, ne­kih ku­ka­ca, je­žin­ca i mor­ske ane­mo­ne (sme­đe vla­su­lje). Broj ge­na u tih vr­sta uka­zu­je na to da broj ge­na ni­je u jed­nos­tav­noj ko­re­la­ci­ji s bio­loš­kom slo­že­noš­ću ne­kog or­ga­niz­ma. Bilj­ni ge­no­mi: Ge­nom ma­le cvjet­ni­ce Ara­bi­dop­sis tha­lia­na sad­r­ža­va oko 26.000 ge­na, neo­če­ki­va­no ve­ći broj od ono­ga pro­na­đe­nog bi­lo u vin­ske mu­ši­ce, bi­lo u C. ele­ga­ns. Mno­gi od tih ge­na je­din­stve­ni su za bilj­ke, a tu se na­la­ze ge­ni uk­lju­ če­ni u bilj­nu fi­zio­lo­gi­ju, raz­voj i ob­ra­nu. Sli­jed ri­ži­na ge­no­ma i cr­ne ka­nad­ske to­po­le ta­ko­đer su od­re­đe­ni, a iz­gle­da da sad­r­že vi­še od 40.000 ge­na. Ve­li­ki broj ge­na u ovih bilj­ki dje­lo­mič­no od­ra­ža­va dup­li­ci­ra­no­st ve­li­kih re­gi­ja nji­ho­vih ge­ no­ma. Ljud­ski ge­nom: Ljud­ski ge­nom, či­ni se, sad­r­ža­va 20.000 do 25.000 ge­na, što ni­je pu­no vi­še od bro­ja ge­na pro­na­đe­nog u jed­nos­tav­nih ži­vo­ti­nja po­put vin­ske mu­ ši­ce i C. ele­ga­ns. Vi­še od 40% pred­vi­đe­nih ljud­skih pro­tei­na srod­no je pro­tei­ni­ ma ko­ji su pro­na­đe­ni u os­ta­lim sek­ven­ci­ra­nim or­ga­niz­mi­ma me­đu ko­ji­ma su i vin­ska mu­ši­ca i C. ele­ga­ns. Osim to­ga, ljud­ski ge­nom sad­r­ža­va po­ve­ća­ni broj ge­ na uk­lju­če­nih u živ­ča­ni sus­tav, imu­nos­ni sus­tav, zgru­ša­va­nje kr­vi, raz­voj, sta­nič­ nu sig­na­li­za­ci­ju i re­gu­la­ci­ju gen­ske ek­spre­si­je.

fluo­res­cen­tna in si­tu hib­ri­di­za­ci­ja (FISH)

Ge­no­mi os­ta­lih kra­ljež­nja­ka: Ge­no­mi ri­be, pi­le­ta, mi­ša, šta­ko­ra, psa, re­zus ma­ ka­ko maj­mu­na i čim­pan­ze pred­stav­lja­ju važ­ne us­po­red­be pre­ma hu­ma­nom ge­ no­mu. Svi ovi ver­teb­ra­ti sad­rž­ e sli­čan broj ge­na ali po­ne­kad se bit­no raz­li­ku­ju u sad­r­ža­ju svo­jih re­pe­ti­tiv­nih slje­do­va.

Bioin­for­ma­ti­ka i sis­tem­Na bio­lo­gi­ja Sis­te­mat­ski pro­bi­ri gen­ske fun­kci­je: Pro­jek­ti sek­ven­ci­ra­nja ge­no­ma uve­li su opsež­ne (en­gl. lar­ge-sca­le) ek­spe­ri­men­tal­ne i ra­ču­nal­ne pris­tu­pe u is­tra­ži­va­nje sta­nič­ne i mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je. Pro­bi­ri ši­rom ge­no­ma (en­gl. geno­me-wi­de scree­ns) ko­ji ko­ris­te RNA in­ter­fe­ren­ci­ju mo­gu sis­te­mat­ski iden­ti­fi­ci­ra­ti sve ge­ne jed­nog or­ga­niz­ma ko­ji su uk­lju­če­ni u bi­lo ko­ji pro­ces ko­ji se mo­že ana­li­zi­ra­ti sveo­buh­vat­nim (en­gl. hi­gh-throug­hput) for­ma­tom.

bioin­for­ma­ti­ka, sis­tem­na bio­lo­gi­ja

Re­gu­la­ci­ja gen­ske ek­spre­si­je: Iden­ti­fi­ka­ci­ja slje­do­va ko­ji re­gu­li­ra­ju gen­sku ek­ spre­si­ju kao i ras­vjet­lja­va­nje sig­nal­nih mre­ža ko­je kon­tro­li­ra­ju gen­sku ek­spre­si­ju su naj­ve­ći iza­zo­vi za bioin­for­ma­ti­ku i sis­temnu bio­lo­gi­ju. Ovim prob­le­mi­ma pris­tu­pa se pu­tem stu­di­ja gen­ske ek­spre­si­je ši­rom ge­no­ma u kom­bi­na­ci­ji s pris­ tu­pi­ma za iden­ti­fi­ka­ci­ju fun­kcio­nal­nih re­gu­la­cijskih ele­me­na­ta. In­di­vi­dual­ne va­ri­ja­ci­je i ge­nom­ska me­di­ci­na: Va­ri­ja­ci­je u na­šim ge­no­mi­ma od­ go­vor­ne su za ka­rak­te­ris­ti­ke po­je­di­nih lju­di uk­lju­ču­ju­ći pod­lož­no­st mno­gim bo­ les­ti­ma. Asocijacijski pro­bi­ri ši­rom ge­no­ma (engl. ge­no­me-wi­de as­so­cia­tion sca­ ns) koriste se za ot­kri­va­nje ge­na po­ve­za­nih s pod­lož­noš­ću pre­ma ne­kim čes­tim bo­les­ti­ma. Iden­ti­fi­ka­ci­ja ovih ge­na na kra­ju će do­ves­ti do raz­vo­ja no­vih stra­te­gi­ ja u pre­ven­ci­ji i li­je­če­nju bo­les­ti, a u skla­du s ge­net­skim us­tro­jem sva­kog po­je­ din­ca.

aso­ci­ja­cij­ski pro­bir ši­rom ge­no­ma

198    POGLAVLJE 5

Pi­ta­nja 1. Mno­gi eu­ka­riot­ski ge­no­mi mno­go su ve­ ći ne­go što bi se pret­pos­ta­vi­lo s ob­zi­rom na nji­ho­vu slo­že­no­st. Ob­jas­nite ovaj pa­ra­do­ks. 2. Na ko­ji su na­čin ot­kri­ve­ni in­tro­ni za vri­ je­me prou­ča­va­nja ade­no­vi­rus­nih mR­NA? 3. Na ko­ji na­čin in­tron­ski slje­do­vi u hu­ma­ nom ge­no­mu po­ve­ća­va­ju raz­no­li­ko­st pro­ tei­na ko­ji se ek­spri­mi­ra­ju iz og­ra­ni­če­nog bro­ja od 20.000 do 25.000 ge­na? 4. Ka­ko se mo­že iz­dvo­ji­ti DNA s po­nav­lja­ nji­ma jed­nos­tav­nih slje­do­va iz ukup­ne jez­ gri­ne DNA? 5. Kvaš­če­ve (S. ce­re­vi­siae) cen­tro­me­re for­ mi­ra­ju ki­ne­to­ho­ru ko­ja se hva­ta na je­dan je­di­ni mik­ro­tu­bul dok se vi­še mik­ro­tu­bu­la hva­ta na ki­ne­to­ho­re ve­ći­ne ži­vo­tinj­skih sta­ ni­ca. Ka­ko struk­tu­ra cen­tro­me­re S. ce­re­vi­ siae od­ra­ža­va ovu raz­li­ku?

6. Ka­da se kruž­ni plaz­mi­di opskr­be cen­ tro­mer­nim sl­je­do­vi­ma i une­su u sta­ni­ce kvas­ca, oni se nor­mal­no um­no­ža­va­ju i seg­ re­gi­ra­ju pri sva­koj sta­nič­noj dio­bi. Ipak, ako se plaz­mid iz­re­že na od­re­đe­nom mje­ stu po­mo­ću res­trik­cij­ske en­do­nuk­lea­ze da se stvo­ri li­near­ni kro­mo­som, plaz­mid­ni se ge­ni br­zo iz­gu­be iz kvas­ca. Ob­jas­ni­te. Ko­ji bis­te do­dat­ni po­kus nap­ra­vi­li da pot­vr­di­te svo­ju hi­po­te­zu? 7. Ko­ja je pros­ječ­na uda­lje­no­st iz­me­đu ge­ na ljud­skog ge­no­ma? 8. Ko­li­ko je, ot­pri­li­ke, mo­le­ku­la his­to­na H1 ve­za­no na kvaš­če­vu ge­nom­sku DNA?

10. Nap­ra­vi­li ste knjiž­ni­cu u plaz­mid­nom vek­to­ru ko­ja sad­r­ži kom­plet­nu ljud­sku cDNA. Ko­ja je oče­ki­va­na pros­ječ­na ve­li­či­ na jed­nog umet­ka? 11. U če­mu se raz­li­ko­vao pris­tup ko­ji je ko­ris­ti­o Ce­le­ra Ge­no­mi­cs pri­li­kom sek­ven­ ci­ra­nja ljud­skog ge­no­ma od pri­stu­pa ko­ji je ko­ris­tio Kon­zor­cij za sek­ven­ci­ra­nje hu­ma­ nog ge­no­ma? 12. Zaš­to je te­že iden­ti­fi­ci­ra­ti re­gu­la­cijske slje­do­ve ne­go­li slje­do­ve ko­ji ko­di­ra­ju pro­ tei­ne? Ko­ji se raz­li­či­ti pris­tu­pi ko­ris­te za iden­ti­fi­ka­ci­ju fun­kcio­nal­nih re­gu­lacijskih slje­do­va?

9. Ko­ja je pros­ječ­na du­ži­na jed­nog in­tro­na u hu­ma­nom ge­nu?

13. Što je to SNP? Ko­ji se re­zul­ta­ti oče­ku­ju od prou­ča­va­nja SNP-o­va?

Roy, S. W. and W. Gilbert. 2006. The evolution of  spliceosomal introns patterns puzzles and progress. Nature Rev. Genet. 7: 211–221. [R]

Gilson, E. and V. Geli. 2007. How telomere are replicated. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8: 825–838. [R]

Li­te­ra­tu­ra Složenost eukariotskih genoma Ben-Dov, C., B. Hartmann, J. Lundgren and J. Valcarel. 2008. Genome wide analysis of alternati­ve pre-RNA splicing J. Biol. Chem. 283: 1220-1233. [R] Berget, S. M., C. Moore and P. A. Sharp. 1977. Spliced segments at the 5' terminus of ade­ novirus 2 late mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 3171–3175. [P] Biencowe, B. J. 2006. Alternative splicing new insights from global analysis. Cell 126: 37–47. [R] Britten, R. J. and D. E. Kohne. 1968. Repeated sequences in DNA. Science 161: 529–540. [R] Chow, L. T., R. E. Gelinas, T. R. Broker and R. J.  Roberts. 1977. An amazing sequence arrange­ment at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA. Cell 12: 1–8. [P] International Human Genome Sequencing Consorti­um. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921. [P] International Human Genome Sequencing Consorti­um. 2004. Finishing the euchro­ matic seguence of the human genome. Natu­re 431: 931–945. [P] Jeffares, D. C., T. Mourier and D. Penny. 2006. The biology of intron gain and loss. Trends Genet. 22: 16–22 [R] Kazazian, H. H., Jr. 2004. Mobile elements: Driver­s of genome evolution. Science 303: 1626-1632. [R] Maniatis, T. and B. Tasic. 2002. Alternative premRNA splicing and proteome expansion in matazoans. Nature 418: 236–243. [R]

Schmid, C. W. and W. R. Jelinek. 2007. The ori­ gins of polypeptide domains. BioEssays 29: 262–270. [R] Tilghman, S. M., P. J. Curtis, D. C. Tiemeier, P. Leder and C. Weissmann. 1978. The in­ tervening sequence of a mouse β-globin gene is transcribed within the 15S β-globin mRNA precursor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1309–1313. [P] Venter, J. C. and 273 others. 2001. The se­quence of the human genome. Science 291: 1304–1351. [P] Zhang, Z. and M. Gerstein. 2004. Large-scale analysis of pseudogenes in the human ge­ nome. Curr. Opin. Geneet. Dev. 14: 328–335. [R]

Kromosomi i kromatin Black, B. F. and E. A. Bassett. 2008. The histone variant CENP-A and centromere specifica­ tion. Curr. Opin. Cell Biol. 20: 91–100. [R] Blackburn, E. H. 2005. Telomeres and telom­ erase. Their mechanisms of action and the effects of altering their functions. FEBS Letter­s 529: 859–862. [R] Blasco, M. A. 2007. Telomere lenght, stems cells and aging, Nature Chem. Biol. 3: 640–649. [R] Ferreira, M. G., K. M. Miller and J. P. Cooper. 2004. Indecent exposure: When telomeres become uncapped. Mol. Cell 13: 7–18. [R]

Henikoff, S. and Y. Dalal. 2005. Centromeric chromatin. What makes him unique? Curr. Opin. Genet. Dev. 15: 177–184. [R] Kornberg, R. D. 1974. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science 184: 868–871. [P] Luger, K., A. W. Mader, R. K. Richmond, D. F. Sargent and T. J. Richmond. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature 389: 251–260. [P] Morris C. A. and D. Moazed. 2007. Centromere assembly and propagation. Cell 127: 647–650. [R] Paulson, J. R. and U. K. Laemmli. 1977. The structure of histone-depleted metaphase chromosomes. Cell 12: 817–828. [P] Schueler, M. G., A. W. Higgins, M. Katharine Rudd, K. Gustashaw and H. F. Willard. 2001. Genomic and genetic definition of a functional human centromere. Science 294: 109–115. [P] Sun, X., J. Wahlstrom and G. Karpen. 1997. Molecu­lar structure of a functional Drosophi­la centromere. Cell 91: 1007–1019. [P] Tremethick, D. J. 2007. Higher-order structures of chromatin: the elusive 30 nm fiber. Cell 128: 651–654. [R] Van Holde, K. and J. Zlatanova. 2007. Chromatin fiber structure: where is the problem now? Sem. Cell Dev. Biol. 18: 651–658. [R]

ORGANIZACIJA I REDOSLIJED STANIČNIH GENOMA  Verdun, R. E. and J. Karlseder. 2007. Repli­cation and protection of telomeres. Nature 447: 924–931. [R] Woodcock, C. L. 2006. Chromatin architecture. Curr. Opin. Struc. Biol. 16: 213–220. [R]

Sljedovi čitavih genoma Adams, M. D. and 194 others. 2000. The ge­ nome sequence of Drosophila melano­gaster. Scienc­e 287: 2185–2195. [R] Andersson, S. G. E., A. Zomorodipour, J. O. Anderss­on, T. Sicheritz-Ponten, U. C. M. Alsmark, R. M. Prodowski, A. K. Naslund, A, -S. Eriksson, H. H. Winkler and C. G. Kurland. 1998. The genome sequence of Rickettsia prowazekii and the origin of mito­ chondria. Nature 396: 133–140. [R] Aparicio, S. and 40 others. 2002. Whole-ge­ nome shotgun assembly and analysis of the genom­e of Fugu rubripes. Science 297: 1301– 1310. [P] Ashburner, M. and C. M. Bergman. 2005. Drosophi­la melanogaster: a case ctudy of a model genomic sequence and its conse­ quences. Genome Res. 15: 1661–1667. [R] Baltimore, D. 2001. Our genome unveiled. Natur­e 409: 814-816. [R]

analysis of the human genome. Nature 409: 860–921. [P] International Human Genome Sequencing Consorti­um. 2004. Finishing the euchro­ matic sequence of the human genome. Natu­re 431: 931–945. [P] International Rice Genome Sequencing Project. 2005. The map-based sequence of the rice genome. Nature 436: 793–800. [P] Karksson, E. K. and 19 others. 2007. Efficient mapping of mendelian traits in dogs trough  genome-wide association. Nature Genet. 39: 1321–1328. [P] Kirkness, R. F., V. Bafna, A. L. Halpern, S. Levy, K. Remington, D. B. Rusch, A. L. Delcher, M. Pop, W. Wang, C. M. Frase amd J. C. Venter. 2003. The dog genome: Survey sequen­cing and comparative analysis. Science 301: 1898–1903. [P] Lindblad-Toh, K. and 46 others. 2005. Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic dog. Nature 438: 803–819. [P] Martienssen, R. and W. R. McCombie. 2001. The  first plant genome. Cell 105: 571–574. [R]

Blattner, F. R. and 16 others. 1997. The com­ plete  genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277: 1453–1462. [P]

Mikkelsen, T. S. and 63 others. 2007. Genome of the marsupial Monodelphis domestica re­ veals inovation in non-coding sequences. Nature 447: 167–178. [P]

Bult, C. J. and 39 others. 1996. Complete genom­e sequence of the methanogenic Archae­on, Methanococcus jannaschii. Science 273: 1058–1073. [P]

Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002. Initial sequence and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420: 520–562. [P]

Chervitz, S. A., L. Aravind, G. Sherlock, C. A. Ball, E. V. Koonin, S. S. Dwight, M. A. Har­ ris, K. Dolinski, S. Mohr, T. Smith, S. Weng, J. M. Cherry and D. Botstein. 1998. Com­ parison of the complete protein sets of worm and yeast: Orthology and divergence. Sci­ence 282: 2022–2028. [R]

Oliver, S. G. and 146 others. 1992. The complete DNA sequence of yeast chromosome III. Nature 357: 38–46. [P]

Fleischmann, R. D., and 39 others. 1995. Wholegenome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Sci­ence 269: 496–512. [P]

Rat Genome Sequencing Project Consortium. 2004. Genome sequence of the Brown Norwa­y rat yields insights into mammalian evolution. Nature 428: 493–521. [P]

Goff, S. A. and 54 others. 2002. A draft se­quence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. Japonica). Science 296: 92–100. [P]

Rhesus Macaque Genome Sequencing and Analysi­s Consortium. 2007. Evolutionary and biomedical insights from the rhesus ma­ caque genome. Science 316: 222–234. [P]

Goffeau, A. and 15 others. 1996. Life with 6000 genes. Science 274: 546–567. [P] Goldstein, D. B. and G. I. Cavalleri. 2005. Understan­ding human diversity Nature 437: 1241–1242. [R] Hillier, I., W. A. Coulson, J. I. Murray. Z. Bao, J. E. Sulston and R. H. Waterston. 2005. Ge­no­ mics in C. elegans; So many genes, such a little worm. Genome Res. 15: 1651–1660. [R] International Chicken Genome Sequencing Consortium. 2004. Sequence and compara­ tive analysis of the chicken genome provide unique perspectives on vertebrate evolution. Nature 432: 695–715. [R] International Human Genome Sequencing Consorti­um. 2001. Initial sequencing and

Putnam, N. H. and 18 others. 2007. Sea anemone genome reveals ancestral eumeta­ zoan gene repertoire and genomic organi­ zation. Science 317: 86–94. [P]

Rubin, G. M. 2001. The draft sequences: com­ paring species. Nature 409: 820–821. [P] Scherens, B. and A. Goffeau. 2004. The uses of genome-wide yeast mutant collections. Geno­me Biol. 5: 229. [R] Sea Urchin Genome Sequencing Consortium. 2006. The genome of the sea urchin Strongylocentro­tus purpuratus. Science 314: 941–952. [P] Sterck, L., S. Rombauts, K. Vandepoele, P. Rouze and Y. Van den Peer. 2007. How many genes are there in plants (… and why are they there)? Curr. Opin. Plan Biol. 10: 199–203. [P]

   199

Sutter, N. B. and 20 others. 2007. A single IGF1 allele in amjor determinant of small size in dogs. Science 316: 112–115. [P] The Arabidopsis Genome Initiative. 2000. Analysi­s of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408: 796–815. [P] The C. elegans Sequencing Consortium. 1998. Genome sequence of the nematode C. el­e­ gans: A platform for investigating biology. Science 282: 2012–2018. [P] The Chimpanzee Sequencing and Analysis Con­ sortium. 2005. Initial sequence of the chim­ panzee genome and comparison with the human genome. Nature 437: 69–87. [P] The Honeybee Genome Sequencing Consor­ tium. 2006. Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera. Nature 443:931–949. [P] The International Chimpanzee Chromosome 22 Consortium. 2004. DNA sequence and comparative analysis of chimpanzee chro­ mosome 22. Nature 429: 382–388. [P] Tuskan, G. A. and 109 others. 2006. The ge­nome of black cottonwood, Populus tri­cho­carpa (Torr & Grey) Science 313: 1596–1604. [P] Venter, J. C. and 273 others. 2001. The se­quence of the human genome. Science 291: 1304– 1351. [P] Walbot, V. 2000. A green chapter in the book of life. Nature 408: 794–795. [P] Warren, W. C. and 105 others. 2008. Genome ana­lysis of the platypus reveals unique signa­ tures of evolution. Nature 453: 175–184. [P] Wayne, R. K. and E. A. Ostrander. 2007. Lessons learned from the dog genome. Trends Genet. 23: 557–567 [R]. Wood, V. and 132 others. 2002. The genome se­ quence of Schizosaccharomyces pombe. Nature 415: 871–880. [P] Yu, J. and 99 others. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. Indica). Science 296: 79–92. [P]

Bioin­for­ma­ti­ka i sis­temna biologija Aldridge, B. B., J. M. Burke, D. A. Lauffen­ berger  and P. K. Sorger. 2006. Physicochemic­al modeling of cell signaling path­ ways. Nature Cell Biol. 8: 1195–1203. [P] Bowcock, A. M. 2007. Guilt by association. Nature 447: 645–646. [R] Ehrenberg, M., J. Elf, E. Aurell. R. Sandberg and J. Tegner. 2003. Systems biology is taking off. Genome Res. 13: 2377–2380. [R] Elnitsky, L., V. X. Jin, P. J. Farnham and S. J. M. Jones. 2006. Locating mammalian transcrip­ tion factor binding sites: a survey of com­ putational and experimental techniques. Genome Res. 16: 1455–1464. [R] Friedman, A. and N. Perrimon. 2004. Genome­ wide high-throughput screens in functional genomics. Surr. Opin. Genet. Dev. 14: 470– 476. [R]

200    POGLAVLJE 5 Ge, H., A. J. M. Walhout and M. Vidal. 2003. Integrating 'omic' information: A bridge betwe­en genomics and systems biology. Trends Genet. 19: 551–559. [R] Harbison, C. T. and 19 others. 2004. Trans­ criptional regulatory code of a eukaryotic genome. Nature 431: 99–104. [P] Hinds, D. A., L. L. Stuve, G. B. Nilsen, E. Halperi­n, E, Eskin, D. G. Ballinger, K. A. Frazer and D. R. Cox. 2005. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science 307: 1072–1079. [P] Holt, R. A. and S. J. M. Jones. 2008. The new paradigm of flow cell sequencing. Genome Res. 18: 839–846. [R] Kirchner, M. W. 2005. The meaning of systems biology. Cell 121: 503–504. [R]

Kitano, H. 2002. Systems biology: A brief overvie­w. Science 205: 1662–1664. [R] Komili, S. and P. Silver. 2008. Coupling and coordinati­on in gene expression processes a systems biology view. Nature Rev. Genet. 9: 38–48. [R] Levy, S. and 30 others. 2007. The diploid ge­ nome  sequence of an individual human. PLoS Biology 5:e254. [P] Mathew, C. G. 2008. New links to the patho­ genesis of Crohn desease provided by ge­ nome-wide association scans, Nature Rev. Genet. 9: 9–14. [R] McCarthy, M. I., G. R. Abecasis, L. R. Cardon, D. B. Goldstein, J. Little, J. P. A. Ioannidis and J. N. Hirschhorn. 2008. Genome-wide asso­ ciation studies for complex traits: consen­ sus, uncertainty and challenges. Nature Rev. Genet. 9: 356–369. [R]

Wasserman, W. W. and A. Sandelin. 2004. Ap­ plied bioinformatics for the identification of regulatory elements. Nature Rev. Genet. 5: 279–287. [R] Wheeler, D. A. and 26 others. 2008. The com­ plete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing. Nature 452: 872–877. [P] Xie, X., J. Lu, E. J. Kulbokas, T. R. Golub, V. Mootha, K. Lindblad-Toh, E. S. Lander and M. Kellis. 2005. Systematic discovery of reg­ ulatory motifs in human promoters and 3' UTRs by comparison of several mammals. Nature 434: 338–345. [P] Zhu, X., M. Gerstein and M. Snyder. 2007. Gettin­g connected: analysis and principles of biological networks. Genes Dev. 21: 1010–1024. [R]

6 Replikacija DNA  201 Popravak DNA  216 Re­kom­bi­na­ci­ja iz­me­đu homolognih slje­do­va ­DNA  227 Preslagivanje DNA  233 MOLEKULARNA MEDICINA Kar­ci­nom de­be­log cri­je­va i pop­ra­vak DNA  225 Ključ­ni po­kus Pres­la­gi­va­nje imu­no­ globu­lin­skih ge­na  236

Rep­li­ka­ci­ja, od­r­ža­va­nje i pres­la­gi­va­nje ge­nom­ske DNA Os­nov­ni bio­loš­ki pro­ces raz­mno­ža­va­nja zah­ti­je­va vjer­ni pri­je­nos ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je s ro­di­te­lja na po­tom­stvo. Zbog to­ga je toč­na rep­li­ ka­ci­ja ge­nom­ske DNA ključ­na za ži­vot svih sta­ni­ca i or­ga­ni­za­ma. Sva­ki pu­t kad se sta­ni­ca di­je­li, nje­zin cje­lo­kup­ni ge­nom mo­ra bi­ti ud­vos­tru­čen, pri če­mu je za ko­pi­ra­nje ve­li­kih mo­le­ku­la DNA ko­je iz­gra­đu­ju pro­ka­riot­ ske i eu­ka­riot­ske kro­mo­so­me pot­reb­na pri­sut­no­st ci­je­log ni­za en­zi­ma. Uz to, sta­ni­ce su raz­vi­le me­ha­niz­me za pop­rav­lja­nje pog­r­je­ša­ka ko­je se po­ne­ kad do­ga­đa­ju za vri­je­me um­na­ža­nja DNA te za pop­ra­vak oš­te­će­nja ko­ja nas­ta­ju kao re­zul­tat dje­lo­va­nja čim­be­ni­ka oko­li­ša kao što je zra­če­nje. Ne­ pra­vil­nos­ti u ovim pro­ce­si­ma re­zul­ti­ra­ju ne­mo­guć­noš­ću toč­ne rep­li­ka­ci­je i od­r­ža­va­nja ge­nom­ske DNA – pog­r­ješ­kom ko­ja mo­že ima­ti ka­tas­tro­fal­ne pos­lje­di­ce kao što je raz­voj kar­ci­no­ma. Una­toč važ­nos­ti pre­ciz­ne rep­li­ka­ci­je i od­r­ža­va­nja DNA, sta­nič­ni ge­no­ mi su ipak pod­lož­ni prom­je­na­ma. Da bi se vr­ste evo­lu­cij­ski raz­vi­ja­le, po­ treb­na je pri­sut­no­st mu­ta­ci­ja i pres­la­gi­va­nja ge­na ka­ko bi se od­r­ža­la ge­ne­ tič­ka va­ri­ja­bil­no­st iz­me­đu je­din­ki. Re­kom­bi­na­ci­ja ho­mo­log­nih kro­mo­so­ma za vri­je­me me­jo­ze ig­ra važ­nu ulo­gu u ovom pro­ce­su omo­gu­ću­ju­ći ro­di­ telj­skim ge­ni­ma da pres­la­gi­va­njem (rea­ran­žma­nom) stva­ra­ju no­ve kom­ bi­na­ci­je u bu­du­ćim ge­ne­ra­ci­ja­ma. Smat­ra se da pres­la­gi­va­nje slje­do­va DNA unu­tar ge­no­ma stva­ra­njem no­vih kom­bi­na­ci­ja ge­ne­tič­kih in­for­ma­ ci­ja ta­ko­đer pri­do­no­si evo­lu­cij­skom nap­ret­ku. Uz to su ne­ki ob­li­ci pres­la­ gi­va­nja DNA prog­ra­mi­ra­ni za re­gu­la­ci­ju ek­spre­si­je ge­na ti­je­kom di­fe­ren­ ci­ja­ci­je i raz­vo­ja in­di­vi­dual­nih sta­ni­ca i or­ga­ni­za­ma. Ka­rak­te­ris­ti­čan pri­m­jer to­ga pro­ce­sa u lju­di pred­stav­lja pres­la­gi­va­nje imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na ti­je­kom raz­vo­ja imu­no­loš­kog sus­ta­va. Sto­ga je za raz­voj po­je­di­nač­ nih or­ga­ni­za­ma kao i za evo­lu­ci­ju vr­sta pot­reb­na sup­til­na rav­no­te­ža iz­me­ đu od­r­ža­va­nja i va­ri­ja­bil­nos­ti nas­ljed­nih in­for­ma­ci­ja.

Rep­li­ka­ci­ja DNA Kao što je na­ve­de­no u čet­vr­tom pog­lav­lju, rep­li­ka­ci­ja DNA je se­mi­ kon­zer­va­ti­van pro­ces u ko­jem sva­ki ro­di­telj­ski la­nac slu­ži kao ka­lup za sin­te­zu no­vih, kom­ple­men­tar­nih la­na­ca-kće­ri. Glav­ni en­zim uk­lju­čen u ovaj pro­ces je DNA-po­li­me­ra­za ko­ja ka­ta­li­zi­ra spa­ja­nje deok­si­ri­bo­nuk­leo­ zi­d-5'-tri­fos­fa­ta (dNTP) ras­tu­ćeg lan­ca DNA. Ipak, rep­li­ka­ci­ja DNA znat­ no je kom­plek­sni­ja i zah­ti­je­va vi­še od jed­ne en­zim­ske reak­ci­je. U cje­lo­ku­

202    POGLAVLJE 6 pan pro­ces uk­lju­če­ni su broj­ni dru­gi pro­tei­ni, a nuž­na je i pri­sut­no­st ko­ri­gi­ra­ju­ćih me­ha­ni­za­ma ka­ko bi se osi­gu­ra­lo da toč­no­st rep­li­ka­ci­je bu­de kom­pa­ti­bil­na s ma­lom učes­ta­loš­ću pog­r­je­ša­ka što je pot­reb­no za nor­mal­no od­vi­ja­nje sta­nič­ne rep­ro­duk­ci­je. Do­dat­ni pro­tei­ni, kao i spe­ci­fič­ni slje­do­vi DNA, pot­reb­ni su i za ini­ci­ja­ci­ju rep­li­ka­ci­je i ko­pi­ra­nje kra­je­va eu­ka­riot­ skih kro­mo­so­ma.

DNA-po­li­me­ra­ze DNA-po­li­me­ra­zu pr­vi je ot­krio Ar­thur Kor­nbe­rg, 1956. go­di­ne u li­za­ ti­ma bak­te­ri­je E. co­li. Spo­sob­no­st ovog en­zi­ma da toč­no ko­pi­ra DNA-ka­lup pru­ži­la je bio­ke­mij­sku pod­lo­gu za mo­del rep­li­ka­ci­je mo­le­ku­le DNA ko­ji su pr­vot­no pred­lo­ži­li Wat­son i Cri­ck, ta­ko da nje­zi­na izo­la­ci­ja pred­stav­lja jed­ no od te­melj­nih ot­kri­ća mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je. Iro­nič­no, pr­va iden­ti­fi­ci­ra­ na DNA-po­li­me­ra­za (da­nas je zo­ve­mo DNA-po­li­me­ra­za I) ni­je glav­ni en­ zim od­go­vo­ran za rep­li­ka­ci­ju DNA E. co­li. Um­jes­to to­ga poli­me­ra­za I je pr­ven­stve­no uk­lju­če­na u pop­ra­vak oš­te­će­ne DNA; da­nas zna­mo da i pro­ ka­riot­ske i eu­ka­riot­ske sta­ni­ce sad­rž­ a­va­ju ne­ko­li­ko DNA-po­li­me­ra­za ko­je ima­ju raz­li­či­te ulo­ge u rep­li­ka­ci­ji i pop­rav­ku DNA. Kod pro­ka­riot­skih sta­ ni­ca po­li­me­ra­za III je glav­na po­li­me­ra­za od­go­vor­na za rep­li­ka­ci­ju DNA. Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce ima­ju tri DNA-po­li­me­ra­ze (α, δ, ε) ko­je sud­je­lu­ju u rep­li­ka­ci­ji jez­gri­ne DNA. U mi­to­hon­dri­ju se na­la­zi za­seb­na DNA-po­li­me­ ra­za (γ) ko­ja je od­go­vor­na za rep­li­ka­ci­ju mi­to­hon­drij­ske DNA. Sve poz­na­te DNA-po­li­me­ra­ze di­je­le dva os­nov­na svoj­stva ko­ja su od pre­sud­ne važ­nos­ti za rep­li­ka­ci­ju DNA (sl. 6-1). Pr­vo, sve po­li­me­ra­ze sin­ te­ti­zi­ra­ju DNA sa­mo u 5' → 3' smje­ru do­da­ju­ći dNTP na 3' hid­rok­sil­nu

Sli­ka 6-1. En­zim­ska reak­ci­ja ka­ta­li­zi­ ra­na DNA-po­li­me­ra­zom.  Sve poz­na­te DNA-po­li­me­ra­ze do­da­ju deok­si­ri­bo­nu­ kleo­ti­d-5'-tri­fos­fat na 3' hid­rok­sil­nu sku­ pi­nu ras­tu­će­ga lan­ca DNA (la­nac po­čet­ ni­ce).

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   203

sku­pi­nu ras­tu­ćeg lan­ca. Dru­go, DNA-po­li­me­ra­ze mo­gu do­da­ti no­ve dNTP sa­mo na pret­hod­no for­mi­ra­ni la­nac po­čet­ni­ce ko­ji je vo­di­ko­vim ve­za­ma spo­jen s ka­lu­pom; one ni­su u mo­guć­nos­ti za­po­če­ti sin­te­zu DNA de no­vo ka­ta­li­zi­ra­ju­ći po­li­me­ri­za­ci­ju slo­bod­nih dNTP. Po to­me se DNA-po­li­me­ra­ze raz­li­ku­ju od RNA-po­li­me­ra­za ko­je mo­gu za­po­če­ti sin­te­zu no­vog lan­ca RNA u od­sut­nos­ti po­čet­ni­ce. Kao što je opi­sa­no da­lje u ovom pog­lav­lju, na­ve­de­ne ka­rak­te­ris­ti­ke DNA-po­li­me­ra­za či­ne se ključ­ni­ma za od­rž­ a­va­nje vi­so­ke vjer­nos­ti rep­li­ka­ci­je DNA pot­reb­ne za um­no­ža­va­nje sta­ni­ca.

Rep­li­ka­cij­ske raš­lje Mo­le­ku­le DNA u pro­ce­su rep­li­ka­ci­je pr­vi je ana­li­zi­rao Jo­hn Cair­ns u ek­spe­ri­men­ti­ma u ko­ji­ma je E. co­li uz­ga­ja­na u pri­sut­nos­ti ra­dioak­tiv­nog ti­mi­di­na što je omo­gu­ći­lo nak­nad­nu vi­zua­li­za­ci­ju no­vo­rep­li­ci­ra­ne DNA au­to­ra­diog­ra­fi­jom (sl. 6-2). U ne­kim slu­ča­je­vi­ma mog­le su se opa­zi­ti kom­ plet­ne kruž­ne mo­le­ku­le u pro­ce­su rep­li­ka­ci­je. Ove mo­le­ku­le DNA sad­rž­ a­ va­le su dvo­je rep­li­ka­cij­ske raš­lje ko­je pred­stav­lja­ju pod­ruč­ja sin­te­ze DNA. U sva­kim raš­ljama ro­di­telj­ski lan­ci mo­le­ku­le DNA su se raz­dvo­ji­li i sin­te­ ti­zi­ra­la su se dva no­va lan­ca-kće­ri. Pro­ces sin­te­ze no­vih la­na­ca DNA kom­ple­men­tar­nih lan­ci­ma ro­di­telj­ske mo­le­ku­le DNA pos­ta­vio je važ­no pi­ta­nje za ra­zu­mi­je­va­nje bio­ke­mij­skih pro­ce­sa uk­lju­če­nih u rep­li­ka­ci­ju DNA. Bu­du­ći da lan­ci dvo­lan­ča­ne DNA uz­voj­ni­ce te­ku u sup­rot­nim (an­ti­pa­ra­lel­nim) smje­ro­vi­ma, kon­ti­nui­ra­na sin­te­za dva­ju no­vih la­na­ca u rep­li­ka­cij­skim raš­lja­ma zah­ti­je­va­la bi da je­dan la­nac bu­de sin­te­ti­zi­ran u 5' → 3' smje­ru, dok se dru­gi sin­te­ti­zi­ra u sup­rot­ nom (3' → 5') smje­ru. No, DNA-po­li­me­ra­za ka­ta­li­zi­ra po­li­me­ri­za­ci­ju dNTP sa­mo u 5' → 3' smje­ru. Ka­ko se on­da vr­ši sin­te­za dru­gog lan­ca DNA? Ova enig­ma ri­je­še­na je ek­spe­ri­men­ti­ma ko­ji su po­ka­za­li da se sa­mo je­ dan la­nac mo­le­ku­le DNA sin­te­ti­zi­ra kon­ti­nui­ra­no u smje­ru sveu­kup­ne rep­li­ka­ci­je DNA dok se dru­gi for­mi­ra iz krat­kih dis­kon­ti­nui­ra­nih frag­me­ na­ta DNA (1–3 kb) ko­ji se sin­te­ti­zi­ra­ju unat­rag u od­no­su na smjer kre­ta­nja rep­li­ka­cij­skih raš­lji (sl. 6-3). Ovi ma­li frag­men­ti no­vo­sin­te­ti­zi­ra­ne DNA (naz­va­ni Oka­za­ki­je­vi frag­men­ti, pre­ma ja­pan­skom bio­ke­mi­ča­ru Rei­ji Oka­za­ki­ju ko­ji ih je ot­krio) spa­ja­ju se dje­lo­va­njem DNA-li­ga­ze stva­ra­ju­ći cje­lo­vi­ti no­vi la­nac DNA. Kon­ti­nui­ra­no sin­te­ti­zi­ra­ni la­nac na­zi­va se vo­de­

Sli­ka 6-2. Rep­li­ka­ci­ja DNA E. co­li.­  (A) Au­to­ra­diog­ra­f i­ja s pri­ka­zom bak­te­ri­ja ko­ je su uz­ga­ja­ne u 3H ti­mi­di­nu kroz dvi­je ge­ne­ra­ci­je ka­ko bi se obi­lje­ži­la DNA, ko­ ja je za­tim izo­li­ra­na i vi­zua­li­zi­ra­na ek­spo­ zi­ci­jom fo­tog­raf­skog fil­ma. (B) Ovaj she­ mat­ski pri­kaz ilus­tri­ra dvi­je rep­li­ka­cij­ske raš­lje pri­ka­za­ne pod (A). (Iz J. Cair­ns, 1963., Co­ld Spri­ng Har­bor Symp.Quant. Biol. 28:43.)

204    POGLAVLJE 6

Sli­ka 6-3. Sin­te­za vo­de­će­ga i tro­mo­ga lan­ca DNA.  Vo­de­ći la­nac sin­te­ti­zi­ra se kon­ ti­nui­ra­no u smje­ru kre­ta­nja rep­li­ka­cij­skih raš­lji. Zaos­ta­ju­ći la­nac sin­te­ti­zi­ra se u krat­kim ulom­ci­ma (Oka­za­ki­je­vi frag­men­ti), unat­rag u od­no­su na sveu­kup­ni smjer rep­li­ka­ci­je. Oka­za­ki­je­vi frag­men­ti se na­kon to­ga spa­ja­ju dje­lo­va­njem DNA-li­ga­ze.

Sli­ka 6-4. Ini­ci­ja­ci­ja Oka­za­ki­je­va frag­ men­ta RNA-po­čet­ni­ca­ma.  Krat­ki frag­ men­ti RNA slu­že kao po­čet­ni­ce ko­je se mo­gu pro­du­lji­ti dje­lo­va­njem DNA-po­li­ me­ra­ze.

ći la­nac jer nje­go­vo pro­du­lje­nje u smje­ru kre­ta­nja rep­li­ka­cij­ske raš­lje iz­la­že ka­lup ko­ji se ko­ris­ti za sin­te­zu Oka­za­ki­je­vih frag­me­na­ta (zaos­ta­ju­ći ili tro­ mi la­nac). Ia­ko je ot­kri­će dis­kon­ti­nui­ra­ne sin­te­ze tro­mo­ga lan­ca ob­jas­ni­lo me­ha­ ni­zam pro­du­lje­nja oba lan­ca DNA u rep­li­ka­cij­skim raš­ljama, is­tov­re­me­no je pos­ta­vi­lo još jed­no pi­ta­nje: ka­ko DNA-po­li­me­ra­za, ko­ja zah­ti­je­va po­čet­ ni­cu i ne mo­že za­po­če­ti sin­te­zu de no­vo, za­po­či­nje sin­te­zu Oka­za­ki­je­vih frag­me­na­ta? Od­go­vor je da krat­ki frag­men­ti RNA slu­že kao po­čet­ni­ce za

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   205

rep­li­ka­ci­ju DNA (sl. 6-4). Za raz­li­ku od sin­te­ze DNA, sin­te­za RNA mo­že za­po­če­ti de no­vo, a en­zim naz­van pri­ma­za sin­te­ti­zi­ra krat­ke frag­men­te RNA (prim­je­ri­ce du­gač­ke 3–10 nuk­leo­ti­da) kom­ple­men­tar­ne ka­lu­pu tro­ mo­ga lan­ca u rep­li­ka­cij­skim raš­ljama. Oka­za­ki­je­vi se frag­men­ti za­tim sin­te­ ti­zi­ra­ju pro­du­lje­njem ovih RNA-po­čet­ni­ca dje­lo­va­njem DNA-po­li­me­ra­ze. Ot­kri­će RNA-DNA spo­je­va u no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nim Oka­za­ki­je­vim frag­men­ti­ ma pru­ži­lo je ključ­ni do­kaz za ulo­gu RNA-po­čet­ni­ca u rep­li­ka­ci­ji DNA. Da bi se for­mi­rao kon­ti­nui­ra­ni zaos­ta­ju­ći (tro­mi) la­nac DNA, RNA-po­ čet­ni­ce mo­ra­ju se na kra­ju uk­lo­ni­ti iz Oka­za­ki­je­vih frag­me­na­ta i za­mi­je­ni­ ti slje­do­vi­ma DNA (sl. 6-5). Kod pro­ka­rio­ta, RNA-po­čet­ni­ce se uk­la­nja­ju dje­lo­va­njem po­li­me­ra­za I. Uz tu nje­nu DNA-po­li­me­raz­nu ak­tiv­no­st, DNA‑ po­li­me­ra­za dje­lu­je kao eg­zo­nuk­lea­za ko­ja mo­že hid­ro­li­zi­ra­ti DNA (ili RNA) bi­lo u 3' → 5' ili u 5' → 3' smje­ru. 5' → 3' eg­zo­nuk­leaz­na ak­tiv­no­st po­li­me­ra­ze I uk­la­nja ri­bo­nuk­leo­ti­de s 5' kra­je­va Oka­za­ki­je­vih frag­me­na­ta te se oni zam­je­nju­ju deok­si­ri­bo­nuk­leo­ti­di­ma ka­ko bi se stvo­ri­li frag­men­ti u pot­pu­nos­ti gra­đe­ni od slje­do­va DNA. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma RNA‑ po­čet­ni­ce se uk­la­nja­ju kom­bi­ni­ra­nim dje­lo­va­njem RNa­ze H, en­zi­ma ko­ji deg­ra­di­ra RNA la­nac RNA-DNA hib­ri­da, i 5' → 3' eg­zo­nuk­lea­za. Pu­ko­ti­ne ko­je pri tom nas­ta­ju po­pu­nja­va­ju se za­tim po­li­me­ra­zom δ te se frag­men­ti DNA spa­ja­ju DNA-li­ga­zom stva­ra­ju­ći in­tak­tni tro­mi la­nac. Kao što je ra­ni­je spo­me­nu­to, raz­li­či­te DNA-po­li­me­ra­ze ima­ju raz­li­či­te ulo­ge u rep­li­ka­cij­skim raš­ljama i kod pro­ka­riot­skih i kod eu­ka­riot­skih sta­ ni­ca (sl. 6-6). Glav­na rep­li­ka­cijska po­li­me­ra­za u E. co­li je po­li­me­ra­za III ko­ja sin­te­ti­zi­ra i vo­de­ći la­nac DNA i Oka­za­ki­je­ve frag­me­nte pro­du­lji­va­ njem RNA-po­čet­ni­ca. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, u rep­li­ka­ci­ju jez­gri­ne DNA uklju­če­ne su tri raz­li­či­te DNA-po­li­me­ra­ze (α, δ i ε). Ulo­ge ovih DNA‑ po­li­me­ra­za prou­ča­va­ne su pu­tem dva ti­pa ek­spe­ri­me­na­ta. Pr­vo, rep­li­ka­ci­ja DNA ne­kih ži­vo­tinj­skih vi­ru­sa po­put SV40 mo­že se prou­ča­va­ti u be­sta­nič­

Sli­ka 6-5. Uk­la­nja­nje RNA-po­čet­ni­ca i spa­ja­nje Oka­za­ki­je­vih frag­me­na­ta.  RNA-po­čet­ni­ce se uk­la­njaju i DNA-po­li­ me­ra­za po­pu­nja­va pu­ko­ti­ne iz­me­đu Oka­za­ki­je­vih frag­me­na­ta s DNA. Nas­ta­li frag­men­ti DNA mo­gu se za­tim spo­ji­ti DNA-li­ga­zom.

206    POGLAVLJE 6

Sli­ka 6-6. Ulo­ge DNA-po­li­me­ra­za u E. co­li i sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca.  Vo­de­ći la­nac sin­ te­ti­zi­ra se u E. co­li dje­lo­va­njem po­li­me­ra­ze III (pol III) i dje­lo­va­njem po­li­me­ra­ze δ (pol δ) u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca. U E. co­li sin­te­za tro­mo­ga lan­ca ini­ci­ra se pri­ma­zom, a RNApo­čet­ni­ce se pro­du­lju­ju dje­lo­va­njem po­li­me­ra­ze III. U sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca ini­ci­ja­ci­ja sin­te­ze tro­mo­ga lan­ca od­vi­ja se s po­mo­ću kom­plek­sa pri­ma­ze i po­li­me­ra­ze (pol α). Krat­ki RNA-DNA frag­men­ti sin­te­ti­zi­ra­ni ovim kom­plek­som pro­du­lju­ju se za­tim po­li­me­ ra­zom ε.

nim (en­gl. ce­ll-free) ek­strak­ti­ma omo­gu­ća­va­ju­ći di­rek­tnu bio­ke­mij­sku ana­ li­zu dje­lo­va­nja ra­z­li­či­tih DNA-po­li­me­ra­za kao i dru­gih pro­tei­na uk­lju­če­nih u rep­li­ka­ci­ju DNA. Dru­go, po­li­me­ra­ze α, δ i ε na­đe­ne su u kvas­ci­ma kao i u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca što je omo­gu­ći­lo is­pi­ti­va­nje nji­ho­vih bio­loš­kih ulo­ga prim­je­nom raz­li­či­tih pris­tu­pa u stu­di­ja­ma ge­ne­ti­ke kvas­ca (v. po­gl. 4). Bio­ ke­mij­ske ana­li­ze ut­vr­di­le su da se po­li­me­ra­za α na­la­zi u kom­plek­su s pri­ ma­zom i da za­jed­no s njom dje­lu­je u sin­te­zi krat­kih RNA-DNA frag­me­na­ ta ti­je­kom sin­te­ze tro­mog lan­ca i u is­ho­diš­ti­ma rep­li­ka­ci­je (v. sl. 6-12). Po­li­me­ra­ze δ i ε za­tim dje­lu­ju kao glav­ne rep­li­kacijske po­li­me­ra­ze i smat­ra se da su od­go­vor­ne za sin­te­zu i vo­de­će­ga i tro­mo­ga lan­ca. Uz po­li­me­ra­ze i pri­ma­ze, u rep­li­ka­cij­skim raš­ljama je ak­ti­van či­tav niz dru­gih pro­tei­na. Ti do­dat­ni pro­tei­ni iden­ti­fi­ci­ra­ni su ana­li­zom E. co­li i mu­ ta­na­ta kvas­ca de­fek­tnih za rep­li­ka­ci­ju DNA te pro­čiš­ća­va­njem pro­tei­na si­ sa­va­ca pot­reb­nih za in vit­ro rep­li­ka­ci­ju DNA SV40. Jed­na sku­pi­na pro­tei­na pot­reb­nih za rep­li­ka­ci­ju ve­že se za DNA-po­li­me­ra­ze po­ve­ća­va­ju­ći ta­ko nji­ ho­vu ak­tiv­no­st i zad­rž­ a­va­ju ih ve­za­ni­ma uz DNA-ka­lup ka­ko bi nas­ta­vi­le sin­te­zu no­vo­ga lan­ca DNA. I po­li­me­ra­za III E. co­li i eu­ka­riot­ske po­li­me­ra­ ze δ i ε zdru­že­ne su s pro­tei­ni­ma kli­za­ju­će ste­zalj­ke (en­gl. sli­di­ng-cla­mp pro­tei­ns) (kod eu­ka­rio­ta je to jez­gre­ni an­ti­gen za pro­li­fera­ci­ju sta­ni­ca, PCNA – en­gl. pro­li­fe­ra­ti­ng ce­ll nuc­lear an­ti­gen). Ti pro­tei­ni pos­tav­lja­ju po­ li­me­ra­zu na po­čet­ni­cu i od­r­ža­va­ju nje­zi­nu sta­bil­nu po­ve­za­no­st s ka­lu­pom (sl. 6-7). Po­mo­ću pro­tei­na za stav­lja­nje ste­zalj­ke (en­gl. cla­mp-loa­di­ng pro­ tei­ns) (kod eu­ka­rio­ta je to rep­li­ka­cij­ski fak­tor C, RFC – engl. rep­li­ca­tion fac­tor C) pro­tei­ni kli­za­ju­će ste­zalj­ke se pos­tav­lja­ju na DNA na mjes­tu spa­ ja­nja po­čet­ni­ce i ka­lu­pa. Za ot­va­ra­nje kli­za­ju­će ste­zalj­ke pro­tei­ni za stav­lja­ nje ste­zalj­ke ko­ris­te ener­gi­ju ko­ja pot­je­če od hid­ro­li­ze A­TP. Pro­tei­ni za stav­lja­nje ste­zalj­ke za­tim ot­puš­ta­ju pro­tein kli­za­ju­će ste­zalj­ke či­me se stva­ ra pr­sten oko DNA-ka­lu­pa. Pro­tein kli­za­ju­će ste­zalj­ke smješ­ta za­tim DNApo­li­me­ra­zu na DNA na mjes­to spa­ja­nja po­čet­ni­ce i ka­lu­pa. Pr­sten stvo­ren kli­za­ju­ćom ste­zalj­kom od­r­ža­va zdru­že­no­st po­li­me­ra­ze s nje­zi­nim ka­lu­pom ti­je­kom pro­ce­sa rep­li­ka­ci­je i ta­ko omo­gu­ću­je neo­me­ta­nu ug­rad­nju vi­še ti­ su­ća DNA nuk­leo­ti­da.

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   207

Sli­ka 6-7. Po­moć­ni pro­tei­ni po­li­me­ra­ze.  (A) Kom­ple­k s pro­tei­na za sta­ v­lja­nje i kli­za­nje ste­zalj­ke (RFC i PCNA u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca) ve­že se za DNA na mjes­tu spa­ja­nja po­čet­ni­ce i ka­lu­pa. RFC se za­tim ot­puš­ta, a PCNA stav­lja na DNA. DNA-po­li­me­ra­za se za­tim ve­že na DNA. (B) Mo­del PCNA ve­za­nog za DNA. (B, iz T. S. Kris­hna, X. P. Ko­ng, S. Ga­r y, P. M. Bur­ge­rs i J. Ku­riyan, 1994. Ce­ll 79: 1233.)

Dru­gi pro­tei­ni raz­mo­ta­va­ju DNA-ka­lup i sta­bi­li­zi­ra­ju jed­no­lan­ča­na pod­ruč­ja (sl. 6-8). He­li­ka­ze su en­zi­mi ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju raz­mo­ta­va­nje ro­di­ telj­ske DNA is­pred rep­li­ka­cij­skih raš­lji što je po­ve­za­no s hid­ro­li­zom ATP. Pro­tei­ni ko­ji ve­žu jed­no­lan­ča­nu DNA (en­gl. sin­gle stran­ded DNA-bin­di­ng pro­tei­ns, prim­je­ri­ce eu­ka­riot­ski rep­li­ka­cij­ski fak­tor A, RFA) na­kon to­ga sta­bi­li­zi­ra­ju raz­mo­ta­ni DNA-ka­lup od­r­ža­va­ju­ći ga u is­pru­že­nom jed­no­lan­ ča­nom sta­nju ka­ko bi se mo­gao ko­pi­ra­ti dje­lo­va­njem po­li­me­ra­ze. Dok se lan­ci ro­di­telj­ske DNA raz­ma­ta­ju, DNA is­pred rep­li­ka­cij­skih raš­ lji pri­si­lje­na je na ro­ta­ci­ju. Ne­kon­tro­li­ra­na ro­ta­ci­ja do­ve­la bi do to­ga da se kruž­ne mo­le­ku­le DNA (kao što je DNA SV40 ili kro­mo­so­mi E. coli) omo­ ta­ju sa­me oko se­be što bi na kra­ju blo­ki­ra­lo pro­ces rep­li­ka­ci­je (sl. 6-9). Ovaj prob­lem ri­je­šen je dje­lo­va­njem to­poi­zo­me­ra­za, en­zi­ma ko­ji ka­ta­li­zi­ ra­ju re­ver­zi­bil­no ki­da­nje i po­nov­no spa­ja­nje la­na­ca DNA. Pos­to­je dvi­je vr­

208    POGLAVLJE 6 Sli­ka 6-8. Dje­lo­va­nje he­li­ka­za i pro­tei­na ko­ji ve­žu jed­no­lan­ča­nu DNA.  He­li­ka­ze od­mo­ta­va­ju dva lan­ca ro­di­telj­ske DNA is­pred rep­li­ka­cij­skih raš­lji. Od­mo­ta­ni lan­ci DNA sta­bi­li­zi­ra­ju se pro­tei­ni­ma ko­ji ve­žu jed­no­lan­ča­nu DNA ka­ko bi mog­li slu­ži­ti kao ka­lu­pi za sin­te­zu no­ve DNA.

▶▶ Inhibitor topoizomeraze II,

lijek nazvan etopozid, primje­ njuje se kao kemoterapeutik u liječenju nekoliko vrsta raka.

ste ovih en­zi­ma: to­poi­zo­me­ra­ze ti­pa I ki­da­ju sa­mo je­dan la­nac DNA, dok to­poi­zo­me­ra­ze ti­pa II is­tov­re­me­no ki­da­ju oba lan­ca. Pre­ki­di nas­ta­li dje­lo­va­njem to­poi­zo­me­ra­za slu­že kao osi ko­je omo­gu­ću­ju da se dva la­nca DNA-ka­lu­pa slo­bod­no ro­ti­ra­ju je­dan oko dru­go­ga ta­ko da se rep­li­ka­ci­ja mo­že nas­ta­vi­ti bez uvi­ja­nja DNA is­pred rep­li­ka­cij­ skih raš­lji (v. sl. 6-9). Prem­da su eu­ka­riot­ski kro­mo­so­mi gra­đe­ni od li­near­nih, a ne kruž­nih mo­le­ku­la DNA, nji­ho­va rep­li­ka­ci­ja ta­ko­đer zah­ti­je­va dje­lo­va­nje to­poi­zo­me­ra­za jer bi se u sup­rot­nom kom­plet­ni kro­ mo­so­mi mo­ra­li kon­ti­nui­ra­no ro­ti­ra­ti za vri­je­me sin­te­ze DNA. To­poi­zo­me­ra­za ti­pa II pot­reb­na je ne sa­mo za raz­mo­ta­va­nje DNA već i za raz­mo­ta­va­nje no­vo­rep­li­ci­ra­nih kruž­nih mo­le­ku­la DNA ko­je su pos­ta­le me­đu­sob­no is­prep­le­te­ne. Či­ni se da je to­poi­zo­me­ra­za ti­pa II u eu­ka­riot­ skim sta­ni­ca­ma ta­ko­đer uk­lju­če­na u kon­den­za­ci­ju mi­to­tič­kih kro­mo­so­ma. Is­pi­ti­va­nja mu­ta­na­ta kva­sa­ca, kao i ek­spe­ri­men­ti na vin­skoj mu­ši­ci te sta­ ni­ca­ma si­sa­va­ca, po­ka­za­li su da je to­poi­zo­me­ra­za II pot­reb­na za raz­dva­ja­ nje kro­ma­ti­da-kće­ri u mi­to­zi su­ge­ri­ra­ju­ći nje­zi­nu ulo­gu u raz­mo­ta­va­nju no­vo­rep­li­ci­ra­nih pet­lji DNA eu­ka­riot­skih kro­mo­so­ma. En­zi­mi uk­lju­če­ni u rep­li­ka­ci­ju DNA dje­lu­ju na koor­di­ni­ran na­čin sin­ te­ti­zi­ra­ju­ći is­tov­re­me­no vo­de­ći i zaos­ta­ju­ći la­nac DNA u rep­li­ka­cij­skim raš­ljama (sl. 6-10). Ovaj za­da­tak pos­ti­že se zdru­ži­va­njem dvi­ju rep­li­ka­cij­ skih DNA-po­li­me­ra­za s pod­je­di­ni­ca­ma pro­tei­na za stav­lja­nje ste­zalj­ke ko­ji je ta­ko­đer ve­zan i s he­li­ka­zom u rep­li­ka­cij­skim raš­ljama. Jed­na mo­le­ku­la

Sli­ka 6-9. Dje­lo­va­nje to­poi­zo­me­ra­za za vri­je­me rep­li­ka­ci­je DNA.  (A) Dok se dva lan­ca ro­di­telj­ske DNA od­mo­ta­va­ju, DNA is­pred rep­li­ka­cij­skih raš­lji pri­si­lje­na je na ro­ ta­ci­ju u sup­rot­nom smje­ru uz­ro­ku­ju­ći me­đu­sob­no uvi­ja­nje kruž­nih mo­le­ku­la. (B) Ovaj prob­lem ri­je­šen je dje­lo­va­njem to­poi­zo­me­ra­za ko­je ka­ta­li­zi­ra­ju re­ver­zi­bil­no ki­da­nje i spa­ja­nje la­na­ca DNA. Priv­re­me­ni pre­ki­di nas­ta­li dje­lo­va­njem ovih en­zi­ma slu­že kao osi ko­je omo­gu­ću­ju da se dva la­nca DNA slo­bod­no ro­ti­ra­ju je­dan oko dru­go­ga.

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   209

Sli­ka 6-10. Mo­del rep­li­ka­cij­skih raš­lji E. co­li.  He­li­ka­za, pri­ma­za i dvi­je mo­le­ ku­le DNA-po­li­me­ra­ze III pro­vo­de koor­ di­ni­ra­nu sin­te­zu vo­de­ćeg i zaos­ta­ju­ćeg lan­ca DNA. Ob­je mo­le­ku­le DNA-po­li­me­ ra­ze zdru­že­ne su s pro­tei­nom za stav­lja­ nje ste­zalj­ke ko­ji je u rep­li­ka­cij­skim raš­ ljama ve­zan za he­li­ka­zu. Ka­lup tro­mo­ga lan­ca je pre­sa­vi­jen ta­ko da se po­li­me­ra­ za od­go­vor­na za sin­te­zu tro­mo­ga lan­ca kre­će u is­tom smje­ru kao i sveu­kup­no kre­ta­nje rep­li­ka­cij­skih raš­lji. To­poi­zo­me­ ra­za dje­lu­je kao os ok­re­ta­nja is­pred rep­ li­ka­cij­skih raš­lji, dok se iza rep­li­ka­cij­skih raš­lji RNA-po­čet­ni­ce uk­la­nja­ju DNA-po­li­ me­ra­zom I, a Oka­za­ki­je­vi frag­men­ti spa­ ja­ju li­ga­zom.

po­li­me­ra­ze ta­da sin­te­ti­zi­ra vo­de­ći la­nac dok dru­ga dje­lu­je u sin­te­zi tro­mo­ ga lan­ca. Zaos­ta­ju­ći la­nac stva­ra pet­lju u rep­li­ka­cij­skim raš­ljama ta­ko da se pod­je­di­ni­ca po­li­me­ra­ze uk­lju­če­na u sin­te­zu tro­mo­ga lan­ca kre­će u is­tom sveu­kup­nom smje­ru kao dru­ga pod­je­di­ni­ca ko­ja sin­te­ti­zi­ra vo­de­ći la­nac. Po­li­me­ra­za zaos­ta­ju­ćeg lan­ca di­so­ci­ra sa DNA ka­da do­seg­ne kraj jed­nog Oka­za­ki­je­vog frag­men­ta. Ka­ko je ve­za­na na pro­tein za stav­lja­nje ste­zalj­ke, efi­kas­no se mo­že po­nov­no pos­ta­vi­ti na no­vu kli­za­ju­ću ste­zalj­ku na mjes­tu spa­ja­nja po­čet­ni­ce i ka­lu­pa ka­ko bi za­po­če­la sin­te­zu sl­je­de­ćeg Oka­za­ki­je­ vog frag­men­ta. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma ti­je­kom rep­li­ka­ci­je DNA po­re­me­ti se ta­ko­ đer i or­ga­ni­za­ci­ja nuk­leo­so­ma. Nuk­leo­so­mi ro­di­telj­skog kro­ma­ti­na po­di­je­ lje­ni su iz­me­đu dva DNA lan­ca-kće­ri i ta­da se do­da­ju no­vi his­to­ni ka­ko bi se uz po­moć do­dat­nih pro­tei­na (fak­to­ri za iz­grad­nju kro­ma­ti­na) ko­ji pu­tu­ ju duž rep­li­ka­cij­skih raš­lji nu­kleo­so­mi po­nov­no sklo­pi­li.

6.1. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Rep­li­ka­cij­ske rašlje DNA. He­li­ka­za, pri­ma­za i dvi­je mo­le­ku­le DNApo­li­me­ra­ze III u rep­li­ka­cij­ skim rašljama obav­lja­ju us­kla­đe­nu sin­te­zu vo­ de­ćeg i tro­mog lan­ca DNA.

210    POGLAVLJE 6

Vjer­no­st rep­li­ka­ci­je

Sli­ka 6-11. Ko­rek­tiv­na ak­tiv­no­st DNApo­li­me­ra­ze.  G je ug­ra­đen um­jes­to A kao re­zul­tat pog­r­ješ­nog spa­ri­va­nja s T na lan­cu ka­lu­pa. Zbog to­ga što je po­ gr­je­š­no spa­ren G na 3' kra­ju no­vo­sin­te­ ti­zi­ra­no­ga lan­ca ni­je ve­zan vo­di­ko­vom ve­zom s lan­cem ka­lu­pa. Ovo pog­r­je­šno spa­ri­va­nje na 3' kra­ju ras­tu­ćeg lan­ca pre­poz­na­to je i iz­re­za­no 3'→5' eg­zo­nu­ kleaz­nom ak­tiv­noš­ću DNA-po­li­me­ra­ze ko­ja, da bi nas­ta­vi­la sin­te­zu, zah­ti­je­va po­čet­ni­cu spo­je­nu vo­di­ko­vim ve­za­ma s lan­cem ka­lu­pa. Na­kon iz­re­zi­va­nja po­ g­r­ješ­no spa­re­nog G, sin­te­za DNA mo­že se nas­ta­vi­ti ug­rad­njom od­go­va­ra­ju­će­ga nuk­leo­ti­da (A).

Pre­ciz­no­st um­na­ža­nja DNA kri­tič­na je za sta­nič­no raz­mno­ža­va­nje, a pro­c­je­na mu­ta­cij­skih sto­pa za raz­li­či­te ge­ne po­ka­zu­je da učes­ta­lo­st pog­r­je­ ša­ka ti­je­kom rep­li­ka­ci­je od­go­va­ra sa­mo jed­noj pog­r­ješ­no ug­ra­đe­noj ba­zi na sva­kih 109 do 1010 ug­ra­đe­nih nuk­leo­ti­da. Ova učes­ta­lo­st pog­r­je­ša­ka znat­no je ma­nja od one ko­ja bi se mog­la pred­vid­je­ti sa­mo na os­no­vi kom­ ple­men­tar­nos­ti spa­ri­va­nja ba­za. Kon­kret­no, raz­li­ka u slo­bod­noj ener­gi­ji ko­ja prois­tje­če iz prom­je­na u spa­ri­va­nju vo­di­ko­vim ve­za­ma iz­me­đu ko­rek­ tno i ne­ko­rek­tno spa­re­nih ba­za je tek to­li­ka da fa­vo­ri­zi­ra stva­ra­nje kom­ple­ men­tar­no­ga baz­nog pa­ra za sve­ga ti­su­ću pu­ta. Zbog to­ga bi iz­bor ba­za re­gu­li­ran sa­mo spa­ri­va­njem vo­di­ko­vim ve­za­ma na te­me­lju kom­ple­men­tar­ nos­ti re­zul­ti­rao učes­ta­loš­ću pog­r­je­ša­ka ko­ja od­go­va­ra ug­rad­nji jed­ne po­ grješ­ne ba­ze na ot­pri­li­ke sva­kih 100 nuk­leo­ti­da no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nog lan­ca DNA. Mno­go ve­ći stu­panj vjer­nos­ti rep­li­ka­ci­je ko­ji se u stva­ri pos­ti­že prois­tje­če ug­lav­nom iz ak­tiv­nos­ti DNA-po­li­me­ra­ze. Je­dan od me­ha­ni­za­ma ko­jim DNA-po­li­me­ra­za po­ve­ća­va vjer­no­st rep­li­ ka­ci­je je­st taj da po­ma­že u iz­bo­ru od­go­va­ra­ju­će ba­ze za ug­rad­nju u no­vo­ sin­te­ti­zi­ra­ni la­nac. Po­li­me­ra­za ne ka­ta­li­zi­ra ug­rad­nju bi­lo ko­jeg nuk­leo­ti­da ko­ji je vo­di­ko­vim ve­za­ma po­ve­zan s lan­cem ka­lu­pa već se pri­la­go­đa­va kon­ for­ma­ci­ji kom­ple­men­tar­no­ga baz­nog pa­ra i na taj na­čin ak­tiv­no one­mo­gu­ ću­je ug­rad­nju pog­r­ješ­ne ba­ze. Ne­dav­na is­pi­ti­va­nja struk­tu­re ne­ko­li­ko DNA-po­li­me­ra­za upu­ću­ju na to da ve­za­nje ko­rek­tno spa­re­nih dNTP stva­ra kon­for­ma­cij­ske prom­je­ne u DNA-po­li­me­ra­zi ko­je do­vo­de do ug­rad­nje nuk­leo­ti­da u DNA. Ova spo­sob­no­st DNA-po­li­me­ra­ze da oda­be­re od­go­va­ ra­ju­će nuk­leo­ti­de za ug­rad­nju po­ve­ća­va pre­ciz­no­st rep­li­ka­ci­je za oko ti­su­ću pu­ta sma­nju­ju­ći ti­me oče­ki­va­nu učes­ta­lo­st pog­r­je­ša­ka na oko 10–5. Dru­gi glav­ni me­ha­ni­zam od­go­vo­ran za pre­ciz­no­st rep­li­ka­ci­je DNA je ko­rek­tiv­na (en­gl. proof­rea­di­ng) ak­tiv­no­st DNA-po­li­me­ra­ze. Rep­li­ka­cijske po­li­me­ra­ze (eu­ka­riot­ske poli­me­ra­ze δ i ε te po­li­me­ra­za III E. co­li) pos­je­du­ je eg­zo­nuk­leaz­nu ak­tiv­no­st ko­ja hid­ro­li­zi­ra DNA u 3'→5' smje­ru. Ova 3'→5' egzo­nuk­lea­za dje­lu­je u sup­rot­nom smje­ru od smje­ra sin­te­ze DNA i sud­je­lu­je u prov­je­ra­va­nju toč­nos­ti no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nog lan­ca DNA (sl. 6-11). Ko­rek­tiv­no od­či­ta­va­nje je dje­lot­vor­no jer DNA-po­li­me­ra­za zah­ti­je­va po­čet­ni­cu i ne mo­že za­po­če­ti sin­te­zu de novo. Pre­fe­ri­ra­ju se po­čet­ni­ce ko­ je su vo­di­ko­vim ve­za­ma ve­za­ne za ka­lup ta­ko da ka­da do­đe do ug­rad­nje pog­r­ješ­ne ba­ze vr­lo je vje­ro­jat­no da se ona ne će is­ko­ris­ti­ti za nas­ta­vak sin­ te­ze, već će se uk­lo­ni­ti 3'→5' eg­zo­nuk­leaz­nom ak­tiv­noš­ću DNA-po­li­me­ra­ ze. 3'→5' eg­zo­nuk­lea­ze rep­li­kacijskih DNA-po­li­me­ra­za se­lek­ti­vno uk­la­nja­ ju nep­ra­vil­no spa­re­ne ba­ze ug­ra­đe­ne na kraj ras­tu­ćeg lan­ca DNA i ti­me po­ve­ća­va­ju vjer­no­st rep­li­ka­ci­je za sto do ti­su­ću pu­ta. Važ­no­st ko­rek­tiv­nog od­či­ta­va­nja no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nog lan­ca mog­la bi obja­s­ni­ti zaš­to DNA-po­li­me­ra­ze zah­ti­je­va­ju pri­sut­no­st po­čet­ni­ca i ka­ta­li­zi­ ra­ju sin­te­zu la­na­ca DNA sa­mo u 5'→3' smje­ru. Kad se DNA sin­te­ti­zi­ra u 5'→3' smje­ru ener­gi­ja pot­reb­na za po­li­me­ri­za­ci­ju prois­tje­če iz hid­ro­li­ze 5' tri­fos­fat­ne sku­pi­ne slo­bod­nog dNTP do ko­je do­la­zi kad se is­ti do­da­je na 3' hid­rok­sil­nu sku­pi­nu ras­tu­će­ga lan­ca (v. sl. 6-1). Kad bi se DNA pro­du­lji­va­ la u 3'→5' smje­ru, ener­gi­ja po­li­me­ri­za­ci­je mo­ra­la bi pot­je­ca­ti iz hid­ro­li­ze 5' tri­fos­fat­ne sku­pi­ne ter­mi­nal­nih nuk­leo­ti­da već ug­ra­đe­nih u DNA. To bi one­mo­gu­ći­lo ko­rek­tiv­no od­či­ta­va­nje zbog to­ga što bi pri tak­voj sin­te­zi uk­ la­nja­nje nep­ra­vil­no spa­re­no­ga ter­mi­nal­nog nuk­leo­ti­da is­tov­re­me­no uk­lo­ ni­lo 5' tri­fos­fat­nu sku­pi­nu pot­reb­nu kao iz­vor ener­gi­je za dalj­nje pro­du­lje­ nje lan­ca. Pre­ma to­me, ia­ko spo­sob­no­st DNA-po­li­me­ra­ze da pro­dulju­je

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

po­čet­ni­ce sa­mo u 5'→3' smje­ru či­ni rep­li­ka­ci­ju na iz­gled kom­pli­ci­ra­nom, ona je nuž­na da bi osi­gu­ra­la pre­ciz­no um­na­ža­nje ge­ne­tič­kog ma­te­ri­ja­la. Uz spo­sob­no­st da raz­li­ku­je ug­rad­nju pog­r­ješ­no spa­re­ne ba­ze, ko­rek­tiv­ na ak­tiv­no­st DNA-po­li­me­ra­ze do­volj­na je da sma­nji učes­ta­lo­st pog­r­je­ša­ka pri rep­li­ka­ci­ji na ot­pri­li­ke jed­nu pog­r­ješ­no spa­re­nu ba­zu na sva­kih 107–108 ug­ra­đe­nih nuk­leo­ti­da. Ka­ko bi se uk­lo­ni­le pog­r­ješ­no spa­re­ne ba­ze ug­ra­đe­ ne u no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nu DNA, dje­lu­ju do­dat­ni me­ha­niz­mi (pri­ka­za­ni u od­ jelj­ku Pop­ra­vak DNA) ko­ji sma­nju­ju sto­pu pog­r­ješ­ke na ma­nje od 10-9.

Is­ho­diš­te i ini­ci­ja­ci­ja rep­li­ka­ci­je Um­na­ža­nje pro­ka­riot­skih i eu­ka­riot­skih DNA za­po­či­nje na je­din­stve­ nom mjes­tu zva­nom is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je ko­je slu­ži kao spe­ci­fič­no vez­no mjes­to za pro­tei­ne ko­ji ini­ci­ra­ju pro­ces rep­li­ka­ci­je. Pr­vo is­ho­diš­te rep­li­ka­ ci­je opi­sa­no je u E. co­li kod ko­je um­na­ža­nje uvi­jek za­po­či­nje na je­din­stve­ nom mjes­tu bak­te­rij­skog kro­mo­so­ma. De­talj­ni­je ana­li­ze su po­ka­za­le da je is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je gra­đe­no od 245 pa­ro­va ba­za či­ji di­je­lo­vi slu­že kao vez­ na mjes­ta za pro­tei­ne pot­reb­ne za ini­ci­ja­ci­ju rep­li­ka­ci­je DNA (sl. 6-12). Ključ­ni ko­rak je ve­za­nje ini­ci­ja­cij­skog pro­tei­na za spe­ci­fič­ni sli­jed nuk­leo­ ti­da unu­tar is­ho­diš­ta či­me za­po­či­nje raz­ma­ta­nje dvos­tru­ke uz­voj­ni­ce. Osim to­ga, ini­ci­ja­cij­ski pro­tein reg­ru­ti­ra i dru­ge pro­tei­ne uk­lju­če­ne u sin­te­zu DNA. Na­kon to­ga he­li­ka­za i pro­tei­ni ko­ji ve­žu jed­no­lan­ča­nu DNA dje­lu­ju u dalj­njem raz­mo­ta­va­nju DNA-ka­lu­pa, a pri­ma­za za­po­či­nje sin­te­zu vo­de­ ćih la­na­ca. For­mi­ra­ju se dvi­je rep­li­ka­cij­ske raš­lje u ko­ji­ma sin­te­za te­če u sup­rot­nim smje­ro­vi­ma uz­duž kruž­no­ga kro­mo­so­ma E. co­li. Prou­ča­va­nje is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je ne­ko­li­ko ani­mal­nih vi­ru­sa kao što je SV40 pos­lu­ži­lo je kao mo­del za is­tra­ži­va­nje za­po­či­nja­nja sin­te­ze DNA u eu­ka­rio­ta. SV40 pos­je­du­je jed­no is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je (gra­đe­no od 64 pa­ro­ va ba­za) ko­je fun­kcio­ni­ra i u in­fi­ci­ra­nim sta­ni­ca­ma i u be­sta­nič­nim sus­ta­ vi­ma. Rep­li­ka­ci­ju za­po­či­nje pro­tein ko­di­ran vi­rus­nim ge­no­mom (T-an­ti­ gen) ko­ji se ve­že za is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je i is­to­dob­no dje­lu­je kao he­li­ka­za. Za sta­bi­li­za­ci­ju raz­mo­ta­no­ga ka­lu­pa pot­reb­na je pri­sut­no­st pro­tei­na ko­ji se ve­že za jed­no­lan­ča­nu DNA, a za­tim kom­ple­ks DNA-po­li­me­ra­ze i α-pri­ma­ ze za­po­či­nje sin­te­zu DNA. Prem­da su jed­nos­tru­ka is­ho­diš­ta do­volj­na za rep­li­ka­ci­ju bak­te­rij­skih i vi­rus­nih ge­no­ma, za rep­li­ka­ci­ju mno­go ve­ćih ge­no­ma eu­ka­riot­skih sta­ni­ca

Sli­ka 6-12. Is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je E. co­li.  Rep­li­ka­ci­ja za­po­či­nje u je­din­stve­nom is­ho­ diš­tu na kro­mo­so­mu E. co­li oz­na­če­nom s ori (en­gl. ori­gin). Pr­vi ko­rak je ve­za­nje ini­ci­ja­ cij­skog pro­tei­na za ori sli­jed u mo­le­ku­li DNA što do­vo­di do dje­lo­mič­nog od­mo­ta­va­nja ka­lup­ne DNA. Od­mo­ta­va­nje DNA se nas­tav­lja dje­lo­va­njem he­li­ka­ze i pro­tei­na ko­ji ve­žu jed­no­lan­ča­nu DNA, a pri­ma­za sin­te­ti­zi­ra RNA-po­čet­ni­ce. Dvi­je rep­li­ka­cij­ske raš­lje stvo­ re­ne u is­ho­diš­tu kre­ću se za­tim u sup­rot­nim smje­ro­vi­ma uz­duž kruž­ne mo­le­ku­le DNA.

   211

212    POGLAVLJE 6

Sli­ka 6-13. Is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je u eu­ka­riot­skim kro­mo­so­mi­ma.  Rep­li­ka­ci­ja za­po­ či­nje u vi­šes­tru­kim is­ho­diš­ti­ma (ori) od ko­jih sva­ko stva­ra dvo­je rep­li­ka­cij­ske raš­lje.

unu­tar prih­vat­lji­vog vre­men­skog pe­rio­da pot­reb­na je pri­sut­no­st vi­šes­tru­ kih is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je. Ta­ko se prim­je­ri­ce sveu­kup­ni ge­nom E. co­li (4 × 106 pa­ro­va ba­za) rep­li­ci­ra iz jed­nos­tru­kog is­ho­diš­ta za ot­pri­li­ke 30 mi­nu­ta. Kad bi se ge­nom si­sa­va­ca (3 × 109 pa­ro­va ba­za) rep­li­ci­rao is­tom br­zi­nom iz jed­nog is­ho­diš­ta za rep­li­ka­ci­ju DNA bi­lo bi pot­reb­no oko 3 tjed­na (30.000 mi­nu­ta). Ta­ko­đer je poz­na­to da je br­zi­na rep­li­ka­ci­je DNA u sta­ni­ ca­ma si­sa­va­ca u stva­ri oko de­set pu­ta ma­nja ne­go u E. co­li, vje­ro­jat­no ra­di pa­ki­ra­nja eu­ka­riot­ske DNA u kro­ma­tin. Una­toč to­mu, ge­no­mi sta­ni­ca si­ sa­va­ca ug­lav­nom se rep­li­ci­ra­ju unu­tar ne­ko­li­ko sa­ti, što zah­ti­je­va ko­riš­te­nje vi­še ti­su­ća is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je. Pri­sut­no­st vi­šes­tru­kih is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma pr­vi je put po­ka­za­na iz­la­ga­njem kul­tu­re sta­ni­ca si­sa­va­ca ra­dioak­tiv­nom ti­mi­di­nu unu­tar raz­li­či­tih vre­men­skih in­ter­va­la što je pra­će­no au­to­ra­dio­ gra­fi­jom ka­ko bi se de­tek­ti­ra­la no­vo­sin­te­ti­zi­ra­na DNA. Re­zul­ta­ti tak­vih is­ pi­ti­va­nja po­ka­za­li su da sin­te­za DNA za­po­či­nje na vi­še mjes­ta iz ko­jih se za­tim nas­tav­lja u oba smje­ra uz­duž kro­mo­so­ma (sl. 6-13). Is­ho­diš­ta re­pli­ ka­ci­je u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca me­đu­sob­no su uda­lje­na za ot­pri­li­ke 50 do 300 kb – pre­ma to­me hu­ma­ni ge­nom ima oko 30.000 is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je. Ge­ no­mi jed­nos­tav­ni­jih eu­ka­rio­ta ta­ko­đer pos­je­du­ju vi­šes­tru­ka is­ho­diš­ta; ta­ko prim­je­ri­ce rep­li­ka­ci­ja u kvas­ci­ma za­po­či­nje u is­ho­diš­ti­ma me­đu­sob­no uda­ lje­nim oko 40 kb. Is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je eu­ka­riot­skih kro­mo­so­ma pr­vi put su prou­ča­va­na u kvas­cu S. ce­re­vi­siae u ko­jem su iden­ti­fi­ci­ra­ni kao slje­do­vi ko­ji po­du­pi­ru rep­li­ka­ci­ju plaz­mi­da u tran­sfor­mi­ra­nim sta­ni­ca­ma (sl. 6-14). To je ujed­no bio fun­kcio­nal­ni te­st za ove slje­do­ve i do sa­da je izo­li­ra­no ne­ko­li­ko tak­vih ele­me­na­ta (naz­va­ni auto­nom­no rep­li­ci­ra­ju­ći slje­do­vi ili AR­Ss – engl. au­ to­no­mous­ly rep­li­ca­ti­ng sequen­ces). Nji­ho­va ulo­ga kao is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je pot­vr­đe­na je iz­rav­nom bio­ke­mij­skom ana­li­zom, ne sa­mo u plaz­mi­di­ma već i u kro­mo­som­skoj DNA kva­sa­ca. Fun­kcio­nal­ni ARS ele­men­ti obuh­va­ća­ju oko 100 pa­ro­va ba­za, uk­lju­ču­ ju­ći sli­jed dug 11 pa­ro­va ba­za ko­ji je pri­su­tan u mno­gim raz­li­či­tim ARS ele­men­ti­ma (sl. 6-15). Ovaj sre­diš­nji sli­jed nu­ždan je za fun­kci­ju ARS ele­ me­na­ta te pred­stav­lja vez­no mjes­to za pro­tein­ski kom­ple­ks od še­st pod­je­ di­ni­ca (naz­van kom­ple­ks is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je ili ORC – en­gl. ori­gin rep­ li­ca­tion com­plex) ko­ji je pot­re­ban za za­po­či­nja­nje rep­li­ka­ci­je DNA u is­ho­diš­ti­ma S. ce­re­vi­siae. ORC-kom­ple­ks reg­ru­ti­ra dru­ge pro­tei­ne (uk­lju­

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

Sli­ka 6-14. Iden­ti­fi­ka­ci­ja is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je u kvas­cu.  Oba plaz­mi­da, plaz­mid I i plaz­mid II, sad­r­ža­va­ju se­lek­tiv­ni bi­ljeg, gen (LEU2) ko­ji tran­sfor­mi­ra­nim sta­ni­ca­ma omo­gu­ću­je ra­st u me­di­ju bez leu­ci­na. Ipak, sa­mo plaz­mid II sad­r­ža­va is­ho­diš­te rep­ li­ka­ci­je (ARS). Tran­sfor­ma­ci­ja sta­ni­ca kvas­ca s plaz­mi­dom I da­je sa­mo ri­jet­ke tran­sfor­ man­te u ko­ji­ma je plaz­mid in­teg­ri­ran u kro­mo­som­sku DNA. Plaz­mid II je, me­đu­tim, spo­so­ban rep­li­ci­ra­ti se bez in­teg­ra­ci­je u kro­mo­so­m kvas­ca (au­to­nom­na rep­li­ka­ci­ja) ta­ko da nje­gov unos u sta­ni­ce kvas­ca re­zul­ti­ra znat­no ve­ćim bro­jem tran­sfor­mi­ra­nih sta­ni­ca.

ču­ju­ći MCM DNA-he­li­ka­zu) pre­ma is­ho­diš­tu što do­vo­di do za­po­či­nja­nja rep­li­ka­ci­je. Sto­ga se či­ni da je me­ha­ni­zam za­po­či­nja­nja rep­li­ka­ci­je DNA u S. ce­re­vi­siae sli­čan ono­me u pro­ka­riot­skim i eu­ka­riot­skim vi­ru­si­ma – ini­ ci­ja­cij­ski pro­tein se ve­že za spe­ci­fič­ni sli­jed DNA u is­ho­diš­tu rep­li­ka­ci­je. Dalj­nja is­pi­ti­va­nja po­ka­za­la su da je ulo­ga ORC-pro­tei­na kao ini­ci­ja­to­ra rep­li­ka­ci­je kon­zer­vi­ra­na u svim eu­ka­rio­ti­ma od kva­sa­ca do si­sa­va­ca. Ipak, is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je dru­gih eu­ka­rio­ta ni­su ta­ko dob­ro de­fi­ni­ra­na kao ARS ele­me­nti kvas­ca S. ce­re­vi­siae. Is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je u ge­no­mu kvas­ca S. pom­be ras­po­re­đe­na su od 0,5 do 1 kb DNA. Ona ne­ma­ju jas­no de­fi­ni­ra­no

   213

214    POGLAVLJE 6 Sli­ka 6-15. ARS ele­me­nt kvas­ca.  ARS ele­me­nt kvas­ca S. ce­re­vi­siae sad­r­ža­va 11 pa­ro­va ba­za dug ARS kon­sen­zus sli­jed (ACS – en­gl. ARS con­sen­sus sequen­ce) i tri do­dat­na ele­men­ta (B1, B2 i B3) ko­ji za­jed­no pri­do­no­se fun­kci­ji ARS ele­men­ ta. Kom­ple­k s is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je (ORC) ve­že se za ACS i B1. ORC za­tim reg­ru­ti­ ra do­dat­ne pro­tei­ne, uk­lju­ču­ju­ći MCM DNA‑he­li­ka­zu, pre­ma is­ho­diš­tu rep­li­ka­ ci­je.

vez­no mjes­to za ORC kao što su ARS ele­men­ti S. ce­re­vi­siae, ali sad­rž­ a­va­ju po­nav­lja­ju­će slje­do­ve bo­ga­te AT-ba­za­ma ko­ji slu­že kao vez­no mjes­to za ORC-kom­ple­ks. Kod vin­ske mu­ši­ce i sta­ni­ca si­sa­va­ca ORC-pro­tei­ni ne pre­poz­na­ju spe­ci­fič­ne sl­je­do­ve DNA. Um­jes­to to­ga mo­gu­će je da mjes­ta ve­za­nja ORC i za­po­či­nja­nje rep­li­ka­ci­je DNA kod vi­ših eu­ka­rio­ta mogu biti od­re­đe­na izgle­dom struk­tu­re kro­ma­ti­na što tek preos­ta­je za raz­jas­ni­ti ti­je­ kom bu­du­ćih is­tra­ži­va­nja.

Te­lo­me­re i te­lo­me­ra­ze: od­r­ža­va­nje kra­je­va kro­mo­so­ma Bu­du­ći da DNA-po­li­me­ra­ze pro­du­lju­ju po­čet­ni­ce sa­mo u 5'→3' smje­ru, one ne mo­gu ko­pi­ra­ti kraj­nje 5' di­je­lo­ve li­near­nih mo­le­ku­la DNA. Zbog to­ga su za rep­li­ka­ci­ju kraj­njih slje­do­va li­near­nih eu­ka­riot­skih kro­mo­so­ma pot­reb­ni po­seb­ni me­ha­niz­mi. Kraj­nji slje­do­vi kro­mo­so­ma (te­lo­me­re) sas­ to­je se od uzas­top­nih po­nav­lja­nja jed­nos­tav­nih slje­do­va DNA (v. pog­l. 5). Te­lo­me­re se od­rž­ a­va­ju dje­lo­va­njem po­seb­nog en­zi­ma, naz­va­nog te­lo­me­ra­ za, ko­ji je spo­so­ban ka­ta­li­zi­ra­ti sin­te­zu te­lo­me­ra u od­sut­nos­ti DNA-ka­lu­ pa. Te­lo­me­ra­za je re­ver­zna tran­skrip­ta­za, tip DNA-po­li­me­ra­ze ko­ji sin­te­ ti­zi­ra DNA na os­no­vi RNA-ka­lu­pa, a pr­vi je put ot­kri­ve­na u ret­ro­vi­ru­si­ma (v. pog­l. 4). Važ­no je na­po­me­nu­ti da je te­lo­me­ra­za en­zim­ski kom­ple­ks ko­ ji sad­r­ža­va svoj vlas­ti­ti RNA-ka­lup kom­ple­men­ta­ran s po­nav­lja­ju­ćim te­lo­ mer­nim slje­do­vi­ma kro­mo­so­ma. Ko­riš­te­nje RNA-ka­lu­pa omo­gu­ću­je te­lo­ me­ra­zi da stvo­ri vi­šes­tru­ke ko­pi­je po­nav­lja­ju­ćih slje­do­va te­lo­me­ra od­r­ža­ va­ju­ći ih na taj na­čin i u od­sut­nos­ti kon­ven­cio­nal­no­ga DNA-ka­lu­pa. Me­ha­ni­zam ak­tiv­nos­ti te­lo­me­ra­ze ob­jas­ni­li su Ca­rol Grei­der i Eli­za­be­th Blac­kbu­rn 1985. go­di­ne prou­ča­va­ju­ći praživotinju Tet­ra­hyme­na (sl. 6-16). Te­lo­me­ra­za Tet­ra­hyme­ne na­la­zi se u kom­plek­su sa 159 nuk­leo­ti­da du­gom RNA ko­ja sad­r­ža­va sli­jed 3'-AACCCCAAC-5'. Ovaj je sli­jed kom­ple­men­ ta­ran s te­lo­mer­nim po­nav­lja­njem Tet­ra­hyme­ne (5'-TTGGGG-3') i slu­ži kao ka­lup za sin­te­zu te­lo­mer­ne DNA. Ko­riš­te­nje ove RNA kao ka­lu­pa omo­gu­

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   215

Sli­ka 6-16. Dje­lo­va­nje te­lo­me­ra­ze.  Te­lo­mer­na DNA je je­dno­stav­ni po­nav­lja­ ju­ći sli­jed s jed­no­lan­ča­nim 3' kra­jem na no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nom vo­de­ćem lan­cu. Te­ lo­me­ra­za, kao dio en­zim­skog kom­plek­ sa, sad­r­ža­va svo­ju vlas­ti­tu mo­le­ku­lu RNA kom­ple­men­tar­nu te­lo­mer­noj DNA. Jed­ no­­lan­ča­ni 3' kraj te­lo­mer­ne DNA ve­že se za RNA te­lo­me­ra­ze ko­ja za­tim slu­ži kao ka­lup za pro­du­lje­nje vo­de­će­ga lan­ca za jed­nu po­nav­lja­ju­ću je­di­ni­cu. Zaos­ta­ju­ći la­nac te­lo­mer­ne DNA mo­že se na­kon to­ ga sin­te­ti­zi­ra­ti po­mo­ću kon­ven­cio­nal­ne RNA-po­čet­ni­ce dje­lo­va­njem DNA-po­li­ me­ra­ze.

ću­je te­lo­me­ra­zi da pro­du­lji 3' kraj kro­mo­som­ske DNA za jed­nu po­nav­lja­ ju­ću je­di­ni­cu vi­še od ori­gi­nal­ne du­lji­ne. Kom­ple­men­tar­ni la­nac se ta­da mo­že sin­te­ti­zi­ra­ti dje­lo­va­njem kom­plek­sa po­li­me­ra­ze i α-pri­ma­ze ko­riš­te­ njem kon­ven­cio­nal­ne RNA-po­čet­ni­ce. Uk­la­nja­nje RNA-po­čet­ni­ce os­tav­lja jed­no­lan­ča­ni 3' kraj kro­mo­som­ske DNA ko­ji mo­že stva­ra­ti pet­lje na kra­ju eu­ka­riot­skih kro­mo­so­ma (v. sl. 5-23).

216    POGLAVLJE 6 Te­lo­me­ra­ze su ot­kri­ve­ne u raz­li­či­tim eu­ka­rio­ti­ma, a ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju te­lo­me­raz­ne RNA klo­ni­ra­ni su iz Tet­ra­hyme­ne, kva­sa­ca, mi­ša i čov­je­ka. U svim slu­ča­je­vi­ma te­lo­me­raz­na RNA sad­rž­ i slje­do­ve kom­ple­men­tar­ne s po­ nav­lja­ju­ćim sli­je­dom te­lo­me­re or­ga­niz­ma iz ko­je­ga je izo­li­ra­na (v. tab­l. 5-5). Ulo­ga te­lo­me­ra­ze u od­rž­ a­va­nju kra­je­va eu­ka­riot­skih kro­mo­so­ma do­ ka­za­na je i uno­še­njem mu­ti­ra­nih ge­na za te­lo­me­raz­nu RNA u kvas­ce što je re­zul­ti­ra­lo od­go­va­ra­ju­ćim prom­je­na­ma po­nav­lja­ju­ćih slje­do­va na kra­je­vi­ ma kro­mo­so­ma. De­fek­ti te­lo­me­ra­ze i nor­mal­nog od­r­ža­va­nje te­lo­me­ra po­ve­za­ni su s ne­ ko­li­ko bo­les­ti u lju­di. Ak­tiv­no­st te­lo­me­ra­ze re­gu­li­ra­na je kod dio­be sta­ni­ca ka­ko bi od­r­ža­va­la nor­mal­nu du­lji­nu te­lo­me­ra. U lju­di, prim­je­ri­ce, te­lo­me­ re obuh­va­ća­ju oko 10 kb na 3' jed­no­lan­ča­nom kra­ju du­gom 150–200 ba­za. Ia­ko se ova du­lji­na od­r­ža­va u ger­mi­na­tiv­nim sta­ni­ca­ma, ve­ći­na so­mat­skih sta­ni­ca ne­ma do­volj­no vi­so­ke ni­voe te­lo­me­ra­ze za od­rž­ ava­nje nji­ho­vih te­ lo­me­ra za neog­ra­ni­čen broj sta­nič­nih dio­ba. Sto­ga se te­lo­me­re pos­tup­no skra­ću­ju ka­ko sta­ni­ca sta­ri, a to skra­ći­va­nje s vre­me­nom vo­di do sta­nič­ne smr­ti ili sta­ros­ti. Za­nim­lji­vo je spo­me­nu­ti da je ne­ko­li­ko sin­dro­ma pri­jev­ re­me­nog sta­re­nja ka­rak­te­ri­zi­ra­no neuo­bi­ča­je­no br­zim gu­bit­kom te­lo­me­re. Ne­ke od tih bo­les­ti uz­ro­ko­va­ne su di­rek­tno mu­ta­ci­ja­ma u te­lo­me­ra­zi. Sup­ rot­no to­me, sta­ni­ce kar­ci­no­ma ima­ju neuo­bi­ča­je­no vi­sok ni­vo te­lo­me­ra­ze omo­gu­ću­ju­ći im da nas­ta­ve neog­ra­ni­če­nu dio­bu.

Pop­ra­vak DNA

▶▶ Pr­vak u pop­rav­ku DNA:

bak­te­ri­ja Dei­no­coc­cus ra­dio­du­ rans izo­li­ra­na je 1956. go­di­ne iz li­men­ki s me­som za ko­je se smat­ra­lo da su ste­ri­li­zi­ra­ne zra­ če­njem. Bak­te­ri­je su pre­živ­je­le zbog nji­ho­ve iz­nim­ne ot­por­no­ s­ti na zra­če­nje. D. ra­dio­du­ra­ns je oko sto­ti­nu pu­ta ot­por­ni­ja na io­ni­zi­ra­ju­će zra­če­nje ne­go E. coli.

Kao i sva­ka dru­ga mo­le­ku­la i DNA mo­že bi­ti iz­lo­že­na raz­li­či­tim ke­mij­ skim reak­ci­ja­ma. Bu­du­ći da DNA slu­ži kao je­din­stve­na, traj­na ko­pi­ja sta­ nič­no­ga ge­no­ma, prom­je­ne nje­zi­ne struk­tu­re ima­ju znat­no ve­će pos­lje­di­ce ne­go prom­je­ne dru­gih sta­nič­nih kom­po­nen­ti, po­put RNA, ili pro­tei­na. Mu­ ta­ci­je mo­gu proi­za­ći iz ug­rad­nje pog­r­ješ­ne ba­ze za vri­je­me um­na­ža­nja DNA. Uz to, u mo­le­ku­li DNA do­ga­đa­ju se raz­li­či­te ke­mij­ske prom­je­ne, bi­lo spon­ta­no (sl. 6-17) bi­lo kao pos­lje­di­ca iz­lo­že­nos­ti ke­mi­ka­li­ja­ma ili zra­če­ nju (sl. 6-18). Tak­va oš­te­će­nja DNA mo­gu blo­ki­ra­ti rep­li­ka­ci­ju ili tran­ skrip­ci­ju, a mo­gu i re­zul­ti­ra­ti vi­so­kom učes­ta­loš­ću mu­ta­ci­ja či­je su po­slje­ di­ce nep­rih­vat­lji­ve s gle­diš­ta sta­nič­ne rep­ro­duk­ci­je. Da bi od­rž­ a­le in­teg­ri­tet svo­je­ga ge­no­ma sta­ni­ce su mo­ra­le raz­vi­ti me­ha­niz­me za pop­ra­vak oš­te­će­ne DNA. Me­ha­niz­mi pop­rav­ka DNA mo­gu se po­di­je­li­ti u dvi­je op­će sku­pi­ne: 1) iz­rav­ni ob­rat ke­mij­ske reak­ci­je od­go­vor­ne za oš­te­će­nje DNA i 2) uk­la­ nja­nje oš­te­će­nih ba­za na­kon čega sli­je­di nji­ho­va zam­je­na s no­vo­sin­te­ti­zi­ra­ nom DNA. U slu­ča­je­vi­ma kad za­ta­je oba me­ha­niz­ma pop­rav­ka DNA, evo­ lu­ci­ja je raz­vi­la do­dat­ne me­ha­niz­me ko­ji sta­ni­ci po­ma­žu da se no­si s oš­te­će­nji­ma.

Iz­rav­ni ob­rat oš­te­će­nja DNA Ve­ći­na oš­te­će­nja DNA pop­rav­lja se uk­la­nja­njem oš­te­će­ne ba­ze na­kon če­ga sli­je­di po­nov­na sin­te­za uk­lo­nje­nog pod­ruč­ja. Ne­ka se oš­te­će­nja ipak mo­gu pop­ra­vi­ti iz­rav­nim ob­ra­tom oš­te­će­nja što mo­že bi­ti znat­no učin­ko­ vi­ti­ji na­čin bor­be sa spe­ci­fič­nim ti­po­vi­ma oš­te­će­nja DNA ko­ji se učes­ta­lo do­ga­đa­ju. Sa­mo ne­ko­li­ko ti­po­va oš­te­će­nja DNA pop­rav­lja se na ovaj na­čin – pi­ri­mi­din­ski di­me­ri nas­ta­li kao re­zul­tat iz­la­ga­nja ul­tra­lju­bi­čas­tom (UV) svjet­lu i al­ki­li­ra­ni gva­nin­ski os­tat­ci, mo­di­fi­ci­ra­ni do­dat­kom me­til­ne ili etil­ ne sku­pi­ne na O6 po­zi­ci­ju pu­rin­skog pr­ste­na. UV-svjet­lo jed­no je od glav­nih iz­vo­ra oš­te­će­nja DNA, a ta­ko­đer je naj­ vi­še prou­če­ni tip oš­te­će­nja u smis­lu me­ha­ni­za­ma pop­rav­ka. Na nje­go­vu važ­no­st upu­ću­je či­nje­ni­ca da iz­la­ga­nje Sun­če­vu UV-zra­če­nju pred­stav­lja

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   217

Sli­ka 6-17. Spon­ta­no oš­te­će­nje DNA.  Dvi­je su glav­ne vr­ste spon­ta­nih oš­te­će­nja DNA: (A) dea­mi­na­ci­ja ade­ni­na, ci­to­zi­na i gva­ ni­na i (B) de­pu­ri­na­ci­ja (gu­bi­tak pu­rin­ske ba­ze) ko­ja nas­ta­je zbog ki­da­nja ve­ze iz­me­đu pu­rin­ske ba­ze i deok­si­ri­bo­ze, os­tav­lja­ju­ći apu­ rin­sko (AP) mjes­to u DNA. dGMP = deok­sig­va­no­zi­n-mo­no­fos­fat.

uz­rok go­to­vo svih kar­ci­no­ma ko­že u lju­di. Glav­ni tip oš­te­će­nja in­du­ci­ran UV-svjet­lom je­st for­mi­ra­nje pi­ri­mi­din­skih di­me­ra u ko­jima su sus­jed­ni pi­ri­mi­di­ni na is­tom lan­cu DNA spo­je­ni cik­lo­bu­tan­skim pr­ste­nom nas­ta­lim za­si­će­njem dvos­tru­ke ve­ze iz­me­đu pe­to­ga i šes­to­ga ato­ma ug­lji­ka (v. sl. 6-18A). Stva­ra­nje ovak­vih di­me­ra na­ru­ša­va struk­tu­ru DNA i blo­ki­ra tran­ skrip­ci­ju ili rep­li­ka­ci­ju niz­vod­no od mjes­ta oš­te­će­nja pa je nji­hov pop­ra­vak us­ko po­ve­zan sa spo­sob­noš­ću sta­ni­ca da pre­ži­ve UV-zra­če­nje. Je­dan od me­ha­ni­za­ma za pop­rav­lja­nje piri­mi­din­skih di­me­ra in­du­ci­ra­nih UV-svjet­ lom je iz­rav­ni ob­rat di­me­ri­za­cij­ske reak­ci­je. Pro­ces se na­zi­va fo­to­reak­ti­va­ ci­ja jer se za ki­da­nje struk­tu­re cik­lo­bu­tan­skog pr­ste­na ko­ris­ti ener­gi­ja vid­ lji­ve svjet­los­ti (sl. 6-19). Fo­to­reak­ti­va­ci­jom se iz­vor­ne pi­ri­mi­din­ske ba­ze vra­ća­ju u nor­mal­no sta­nje i os­ta­ju u mo­le­ku­li DNA. Ka­ko je Sun­če­vo UVzra­če­nje glav­ni iz­vor oš­te­će­nja mo­le­ku­le DNA u raz­li­či­tim ti­po­vi­ma sta­ni­ ca, lo­gič­no je oče­ki­va­ti da je pop­ra­vak pi­ri­mi­din­skih di­me­ra fo­to­reak­ti­va­ ci­jom za­jed­nič­ko raz­li­či­tim pro­ka­riot­skim i eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, uk­lju­ču­ju­ći E. co­li, kvas­ce i ne­ke vr­ste bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja. Za­nim­lji­vo je, ipak, da fo­to­reak­ti­va­ci­ja ni­je uni­ver­zal­na; pla­cen­tal­ni si­sav­ci (uk­lju­ču­ju­ći čov­je­ka) ne­ma­ju ovaj me­ha­ni­zam pop­rav­ka DNA.

218    POGLAVLJE 6

Sli­ka 6-18. Prim­je­ri oš­te­će­nja DNA in­du­ci­ra­nih zra­če­njem i ke­mij­skim čim­be­ni­ ci­ma.  (A) UV-svjet­lo in­du­ci­ra nas­ta­ja­nje pi­ri­mi­din­skih di­me­ra u ko­ji­ma su dva su­ sje­d­na pi­ri­mi­di­na (prim­je­ri­ce ti­mi­na) spo­je­na struk­tu­rom cik­lo­bu­tan­skog pr­ste­na. (B) Al­ki­li­ra­nje je do­da­va­nje me­til­ne ili etil­ne sku­pi­ne na raz­li­či­te po­lo­ža­je ba­za DNA. U ovom prim­je­ru al­ki­li­ra­nje O6 po­lo­ža­ja gva­ni­na re­zul­ti­ra stva­ra­njem O6-me­til­gva­ni­na. (C) Mno­gi kar­ci­no­ge­ni (prim­je­ri­ce ben­zo[a]pi­ren) rea­gi­ra­ju s ba­za­ma u DNA što re­zul­ ti­ra do­da­va­njem ve­li­kih ke­mij­skih sku­pi­na na mo­le­ku­lu DNA.

Dru­gi ob­lik di­rek­tnog pop­rav­ka od­no­si se na oš­te­će­nja proi­zaš­la iz reak­ci­je iz­me­đu al­ki­li­ra­ju­ćih čim­be­ni­ka i DNA. Al­ki­li­ra­ju­ći čim­be­ni­ci su reak­tiv­ne kom­po­nen­te ko­je mo­gu pre­ni­je­ti me­til­nu ili etil­nu sku­pi­nu na ba­zu DNA i ti­me je ke­mij­ski mo­di­fi­ci­ra­ti (v. sl. 6-18B). Oso­bi­to va­žan tip oš­te­će­nja je me­ti­la­ci­ja O6 po­zi­ci­je gva­ni­na sto­ga što nas­ta­li pro­du­kt, O6-

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   219

Sli­ka 6-19. Iz­rav­ni pop­ra­vak ti­min­skih di­me­ra.  Ti­min­ski di­me­ri in­du­ci­ra­ni UVsvjet­lom mo­gu se pop­ra­vi­ti fo­to­reak­ti­va­ci­jom, pri če­mu ener­gi­ja vid­lji­ve svjet­los­ti slu­ ži za ki­da­nje ve­za ko­je tvo­re cik­lo­bu­tan­ski pr­sten.

me­til­gva­nin, stva­ra kom­ple­men­tar­ne baz­ne pa­ro­ve s ti­mi­nom um­jes­to s ci­to­zi­nom. Ova le­zi­ja mo­že bi­ti pop­rav­lje­na dje­lo­va­njem en­zi­ma naz­va­nog O6-me­til­gva­ni­n-me­til­tran­sfe­ra­za, ko­ji pre­no­si me­til­nu sku­pi­nu s O6-me­til­ gva­ni­na na cis­tein­ski os­ta­tak u svom ak­tiv­nom mjes­tu (sl. 6-20). Ti­me je uk­lo­nje­na po­ten­ci­jal­na mu­ta­ge­na ke­mij­ska mo­di­fi­ka­ci­ja i res­tau­ri­ran iz­ vor­ni gva­nin. En­zi­mi ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju ovu di­rek­tnu reak­ci­ju pop­rav­ka zas­ tup­lje­ni su u znat­nom bro­ju pro­ka­riot­skih i eu­ka­riot­skih or­ga­ni­za­ma, uk­ lju­ču­ju­ći i čov­je­ka.

Pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem (ek­sci­zij­ski pop­ra­vak) Prem­da je iz­rav­ni pop­ra­vak učin­ko­vit za od­re­đe­ni tip oš­te­će­nja DNA, pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem je op­će­ni­ti­ji na­čin pop­rav­ka ši­ro­ke sku­pi­ne ke­mij­ skih prom­je­na mo­le­ku­le DNA. Pre­ma to­me, raz­li­či­ti ti­po­vi pop­rav­ka iz­re­ zi­va­njem pred­stav­lja­ju naj­važ­ni­je me­ha­niz­me pop­rav­ka DNA ka­ko u pro­ ka­riot­skim ta­ko i u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. U pop­rav­ku iz­re­zi­va­njem, oš­te­će­na DNA bi­va pre­poz­na­ta i uk­lo­nje­na bi­lo u ob­li­ku slo­bod­nih ba­za ili nuk­leo­ti­da. Nas­ta­la pu­ko­ti­na se za­tim po­pu­nja­va sin­te­zom no­vog lan­ca DNA ko­riš­te­njem neoš­te­će­no­ga kom­ple­men­tar­nog lan­ca kao ka­lu­pa. Tri ti­pa pop­rav­ka iz­re­zi­va­njem – iz­re­zi­va­nje ba­za, iz­re­zi­va­nje nuk­leo­ti­da i po­

Sli­ka 6-20. Pop­ra­vak O6 -me­til­gva­ni­ na.­  O 6 -me­t il­g va­n i­n -me­t il­t ran­s fe­r a­z a pre­no­si me­til­nu sku­pi­nu s O6-metilgva­ nina na cis­tein­ski os­ta­tak u ak­tiv­nom mjes­tu en­zi­ma.

220    POGLAVLJE 6 Sli­ka 6-21. Pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem ba­za.  U ovom je prim­je­ru ura­cil (U) stvo­ren de­a­ mi­na­ci­jom ci­to­zi­na (C) i zbog to­ga se na­la­zi na­sup­rot gva­ni­nu (G) u kom­ple­men­tar­nom lan­cu DNA. Ve­za iz­me­đu ura­ci­la i deok­si­ri­bo­ze pre­ki­nu­ta je dje­lo­va­njem DNA-gli­ko­zi­ la­ze os­tav­lja­ju­ći u DNA še­ćer bez prid­ru­že­ne ba­ze (AP mjes­to). Ovo mjes­to pre­poz­na­je AP-en­do­nuk­lea­za ko­ja ki­da la­nac DNA. Preos­ta­la deok­si­ri­bo­za uk­la­nja se dje­lo­va­njem deok­si­ri­bo­za-fos­fo­dies­te­ra­ze. Nas­ta­la pu­ko­ti­na po­pu­nja­va se na­kon to­ga DNA-po­li­me­ ra­zom i li­ga­zom što do­vo­di do ug­rad­nje od­go­va­ra­ju­će ba­ze (C) na­sup­rot G.

p­ra­vak pog­reš­no spa­re­nih ba­za (en­gl. mis­mat­ch re­pair) – omo­gu­ću­ju sta­ ni­ca­ma da se bo­re sa ši­ro­kim spek­trom raz­li­či­tih oš­te­će­nja DNA. Pop­ra­vak mo­le­ku­le DNA ko­ja sad­r­ža­va ura­cil pred­stav­lja do­bar prim­jer pop­rav­ka iz­re­zi­va­njem ba­za, u ko­jem jed­na oš­te­će­na ba­za bi­va pre­poz­na­ na i uk­lo­nje­na iz mo­le­ku­le DNA (sl. 6-21). Ura­cil se mo­že po­ja­vi­ti u DNA na dva na­či­na: 1) Ura­cil (kao dU­TP – deok­siu­ri­di­n-tri­fos­fat) pov­re­me­no se ug­ra­đu­je na mjes­tu ti­mi­na za vri­je­me sin­te­ze DNA; i 2) ura­cil se mo­že po­ja­vi­ti u DNA dea­mi­na­ci­jom ci­to­zi­na (v. sl. 6-17A). Dru­gi me­ha­ni­zam ima mno­go ve­ći bio­loš­ki zna­čaj bu­du­ći da mi­je­nja nor­mal­ni ob­ra­zac kom­ ple­men­tar­nog spa­ri­va­nja ba­za i ti­me pred­stav­lja mu­ta­ge­ni do­ga­đaj. Iz­re­zi­ va­nje ura­ci­la ka­ta­li­zi­ra­no je dje­lo­va­njem DNA-gli­ko­zi­la­ze, en­zi­ma ko­ji ki­da ve­zu iz­me­đu ba­ze (ura­ci­la) i deok­si­ri­bo­ze u okos­ni­ci DNA. Ova reak­ ci­ja stva­ra slo­bod­ni ura­cil i api­ri­mi­din­sko mjes­to – še­ćer bez prid­ru­že­ne ba­ze. DNA-gli­ko­zi­la­ze ta­ko­đer pre­poz­na­ju i uk­la­nja­ju dru­ge nep­ra­vil­ne ba­ze uk­lju­ču­ju­ći hi­pok­san­tin stvo­ren dea­mi­na­ci­jom ade­ni­na, al­ki­li­ra­ne pu­ ri­ne (osim O6-al­kilgva­ni­na) i ba­ze oš­te­će­ne ok­si­da­ci­jom ili io­ni­zi­ra­ju­ćim zra­če­njem. Re­zul­tat ak­tiv­nos­ti DNA-gli­ko­zi­la­ze je­st for­mi­ra­nje api­ri­mi­din­skog ili apu­rin­skog mjes­ta (uo­bi­ča­je­no zva­nim AP mjes­tom) u DNA. Slič­na AP mjes­ta nas­ta­ju kao re­zul­tat spon­ta­no­ga gu­bit­ka pu­rin­skih ba­za (v. sl. 6-17B), što se do­ga­đa sa zna­čaj­nom učes­ta­loš­ću u nor­mal­nim sta­nič­nim uv­je­ti­ma. Proc­je­nju­je se da na taj na­čin sva­ka sta­ni­ca u ljud­skom ti­je­lu dnev­no gu­bi ne­ko­li­ko ti­su­ća pu­rin­skih ba­za. Ta se mjes­ta pop­rav­lja­ju dje­ lo­va­njem AP-en­do­nuk­lea­ze ko­ja ki­da la­nac DNA uz AP mjes­to (v. sl. 6-21). Preos­ta­li se deok­si­ri­boz­ni os­ta­tak za­tim uk­lo­ni, a nas­ta­la pu­ko­ti­na od jed­ne ba­ze po­pu­nja­va se dje­lo­va­njem DNA-po­li­me­ra­ze i li­ga­ze. Dok DNA-gli­ko­zi­la­ze pre­poz­na­ju sa­mo spe­ci­fič­ne ob­li­ke oš­te­će­nih ba­ za, dru­gi sus­ta­vi pop­rav­ka iz­re­zi­va­njem pre­poz­na­ju ši­ro­ku sku­pi­nu oš­te­će­ nih ba­za ko­je na­ru­ša­va­ju struk­tu­ru mo­le­ku­le DNA, uk­lju­ču­ju­ći pi­ri­mi­din­ ske di­me­re in­du­ci­ra­ne UV-zra­če­njem i ve­li­ke sku­pi­ne do­da­ne ba­za­ma DNA kao re­zul­tat in­te­rak­ci­je raz­li­či­tih kar­ci­no­ge­na s DNA (v. sl. 6-18C). Ovaj ši­ro­ko ras­pros­tra­nje­ni ob­lik pop­rav­ka DNA poz­nat je kao pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da jer se oš­te­će­ne ba­ze (prim­je­ri­ce di­me­ri ti­mi­na) uk­la­nja­ju kao dio oli­go­nuk­leo­ti­da u ko­jem je doš­lo do oš­te­će­nja (sl. 6-22). Kod E. co­li pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da ka­ta­li­zi­ran je dje­lo­va­njem pro­du­ka­ta tri­ju ge­na (uv­rA, uv­rB i uv­rC) ko­ji su ot­kri­ve­ni zah­va­lju­ju­ći či­ nje­ni­ci da mu­ta­ci­je ovih lo­ku­sa re­zul­ti­ra­ju ek­strem­nom os­jet­lji­voš­ću na UV-svjet­lo. Pro­tein UvrA pre­poz­na­je oš­te­će­nu DNA i reg­ru­ti­ra UvrB i UvrC pre­ma mjes­tu le­zi­je. UvrB i UvrC za­tim cije­pa­ju la­nac na 3' i 5' stra­ ni oš­te­će­nog mjes­ta iz­re­zu­ju­ći oli­go­nuk­leo­tid gra­đen od 12 ili 13 ba­za. Kom­ple­ks UvrABC se čes­to na­zi­va eksci­nuk­lea­za, ime­nom ko­je od­ra­ža­va nje­go­vu spo­sob­no­st da iz­rav­no iz­re­zu­je (en­gl. exci­se) od­re­đe­ni oli­go­nuk­ leo­tid. Na­kon to­ga je pot­reb­na ak­tiv­no­st he­li­ka­ze ka­ko bi se iz dvo­lan­ča­ne mo­le­ku­le DNA uk­lo­nio oli­go­nuk­leo­tid u ko­jem se na­la­zi oš­te­će­nje, a nas­ ta­la pu­ko­ti­na po­pu­nja­va se dje­lo­va­njem DNA-po­li­me­ra­ze i li­ga­ze.

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   221

Sli­ka 6-22. Pop­ra­vak ti­min­skih di­me­ ra iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da.  Oš­te­će­na DNA pre­poz­na­na je i po­ki­da­na na oba kra­ja ti­min­skog di­me­ra dje­lo­va­njem 3' i 5'-nukleaza. Od­mo­ta­va­nje he­li­ka­zom re­ zul­ti­ra iz­re­zi­va­njem oli­go­nuk­leo­ti­da ko­ji sad­r­ža­va oš­te­će­ne ba­ze. Nas­ta­la pu­ko­ti­ na po­pu­nja­va se dje­lo­va­njem DNA-po­li­ me­ra­ze i zat­va­ra li­ga­zom.

Sus­tav pop­rav­ka iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da ta­ko­đer je in­ten­ziv­no prou­ča­ van u eu­ka­riot­skim or­ga­niz­mi­ma, uk­lju­ču­ju­ći kvas­ce, glo­dav­ce i čov­je­ka. U kvas­ci­ma, kao i u E. co­li, ot­kri­ve­no je ne­ko­li­ko ge­na uk­lju­če­nih u po­pra­ vak DNA (naz­va­nih ge­ni RAD – en­gl. ra­dia­tion sen­si­ti­vi­ty) izo­la­ci­jom mu­ ta­na­ta s po­ve­ća­nom os­jet­lji­voš­ću na UV-svjet­lo. U čov­je­ka su ge­ni pop­rav­ ka DNA ot­kri­ve­ni ug­lav­nom prou­ča­va­njem oso­ba ko­je pa­te od nas­ljed­nih bo­les­ti uz­ro­ko­va­nih ne­mo­guć­noš­ću pop­rav­ka oš­te­će­nja DNA. Na­jin­ten­ziv­ ni­je prou­ča­va­na od ovih bo­les­ti je Xe­ro­der­ma pig­men­to­sum (XP), ri­je­dak ge­ne­tič­ki po­re­me­ćaj ko­ji po­ga­đa ot­pri­li­ke jed­nu od 250.000 oso­ba. Po­je­ din­ci s ovom bo­leš­ću ek­strem­no su os­jet­lji­vi na UV-zra­če­nje i raz­vi­ja­ju vi­šes­tru­ke kar­ci­no­me ko­že na pod­ruč­ji­ma ti­je­la iz­lo­že­ni­ma Sun­če­vu svjet­ lu. Ja­mes Clea­ver je 1968. go­di­ne do­šao do ključ­nog ot­kri­ća da kul­ti­vi­ra­ne sta­ni­ce izo­li­ra­ne iz bo­les­ni­ka ko­ji pa­te od Xe­ro­der­ma pig­men­to­sum ne mo­ gu pro­vo­di­ti pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da. Ovo opa­ža­nje ne sa­mo da je pru­ži­lo pr­vu ve­zu iz­me­đu pop­rav­ka DNA i kar­ci­no­ma, već je ta­ko­đer pred­lo­ži­lo ko­riš­te­nje XP sta­ni­ca kao ek­spe­ri­men­tal­nih sus­ta­va za iden­ti­fi­ ka­ci­ju ljud­skih ge­na uk­lju­če­nih u pop­ra­vak DNA. Ljud­ski ge­ni uk­lju­če­ni u pop­ra­vak DNA ot­kri­ve­ni su osim to­ga i prou­ča­va­njem dru­ge dvi­je bo­les­ti

222    POGLAVLJE 6 Sli­ka 6-23. Pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca.  XPC pre­ po­z­na­je oš­te­će­nje DNA (prim­je­ri­ce ti­min­ski di­mer), a na­kon to­ga se ve­žu XPB, RPA i TFIIH, ko­ji sad­r­ža­va XPB i XPD he­li­ka­ze. Na­kon od­mo­ta­va­nja DNA dje­lo­va­njem XPB i XPD, reg­ru­ti­ra­ju se XPG i XPF/ERCC1 en­do­nuk­lea­ze koje ki­da­ju DNA i uk­la­nja­ju oš­ te­će­ni oli­go­nuk­leo­tid. Nas­ta­la pu­ko­ti­na po­pu­nja­va se dje­lo­va­njem DNA-po­li­me­ra­ze i zat­va­ra li­ga­zom.

lju­di ko­je nas­ta­ju kao pos­lje­di­ca de­fe­ka­ta u pop­rav­ku DNA (Coc­kayneov sin­drom i tri­ho­tio­dis­tro­fi­ja) te prou­ča­va­njem sta­nič­nih li­ni­ja os­jet­lji­vih na UV-zra­če­nje. Vra­ta ek­spe­ri­men­tal­ne ana­li­ze pop­rav­ka iz­re­zi­va­njem nu­ kleo­ti­da u sus­ta­vi­ma si­sa­va­ca ot­vo­ri­lo je klo­ni­ra­nje ge­na za­du­že­nih za pop­ ra­vak oš­te­će­nja DNA. To­me su pri­do­ni­je­li ek­spe­ri­men­ti pri­je­no­sa ge­na pro­ve­de­ni u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca s de­fek­ti­ma u pop­rav­ku DNA, a ko­ji se zas­ni­va­ju na spo­sob­nos­ti ale­la div­ljeg ti­pa da os­jet­lji­vo­st mu­ti­ra­nih sta­ni­ca na UV-zra­če­nje vra­te na nor­mal­nu ra­zi­nu. Mo­le­ku­lar­nim klo­ni­ra­njem ot­kri­ve­no je se­dam raz­li­či­tih ge­na pop­rav­ka (oz­na­če­nih XPA do XPG) ko­ji su mu­ti­ra­ni u oso­ba obo­lje­lih od Xe­ro­der­ma pig­men­to­sum, a ot­kri­ve­ni su i ge­ni mu­ti­ra­ni u oso­ba ko­je pa­te od Coc­ kayneo­va sin­dro­ma i tri­ho­tio­dis­tro­fi­je te u mu­tan­ti­ma sta­ni­ca glo­da­va­ca os­jet­lji­vim na UV-zra­če­nje. Pro­tei­ni ko­di­ra­ni ovim ge­ni­ma pop­rav­ka oš­te­ će­nja DNA u si­sa­va­ca us­ko su srod­ni pro­tein­skim pro­duk­ti­ma ge­na RAD kva­sa­ca, što uka­zu­je na vi­so­ku kon­zer­vi­ra­no­st me­ha­niz­ma pop­rav­ka iz­re­ zi­va­njem nuk­leo­ti­da u eu­ka­riot­skim or­ga­niz­mi­ma. Ka­da su klo­ni­ra­ni ge­ni pop­rav­ka u kva­sa­ca i si­sa­va­ca bi­lo je mo­gu­će do­bi­ti i pro­tei­ne ko­je oni ko­ di­ra­ju u čis­tom ob­li­ku te raz­vi­ti in vit­ro sus­ta­ve za is­pi­ti­va­nje nji­ho­ve ulo­ge u me­ha­niz­mi­ma pop­rav­ka (sl. 6-23). Po­čet­ni ko­rak pop­rav­ka iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca uk­lju­ču­je pre­poz­na­va­nje pog­r­ješ­no spa­re­ nih ba­za s po­mo­ću XPC pro­tei­na na­kon ko­jeg sli­je­di koo­pe­ra­tiv­no ve­za­nje XPA, pro­tei­na ko­ji se ve­že za jed­no­lan­ča­nu DNA i rep­li­ka­cij­ski pro­tein A (RPA) o ko­je­mu je bi­lo ri­je­či ra­ni­je u ovom pog­lav­lju (v. sl. 6-8) te tran­ skrip­cij­skog fak­to­ra TFIIH ko­ji se sas­to­ji od vi­še pod­je­di­ni­ca i ko­ji je pot­ re­ban za po­če­tak tran­skrip­ci­je eu­ka­riot­skih ge­na (v. pog­l. 7). U ne­kim slu­ ča­je­vi­ma, XPE mo­že ta­ko­đer ima­ti ulo­gu u pre­poz­na­va­nju oš­te­će­nja. XPB i XPD pro­tei­ni su dvi­je pod­je­di­ni­ce TFIIH, a dje­lu­ju kao he­li­ka­ze ko­je od­ mo­ta­va­ju oko 25 pa­ro­va ba­za DNA oko mjes­ta oš­te­će­nja. Za­tim se do tog kom­plek­sa reg­ru­ti­ra pro­tein XPG, a od­mah za­tim i XPF kao he­te­ro­di­mer sa ER­CC1 (pro­tein pop­rav­ka iden­ti­fi­ci­ran u sta­nič­nim li­ni­ja­ma glo­da­va­ca os­jet­lji­vim na UV-zra­če­nje). XPF/ER­CC1 i XPG su en­do­nuk­lea­ze ko­je ki­ da­ju DNA na 5' i 3' kra­je­vi­ma oš­te­će­nog mjes­ta. Tim se ki­da­njem iz­re­zu­je oli­go­nuk­leo­tid du­lji­ne od ot­pri­li­ke 30 ba­za. Nas­ta­la pu­ko­ti­na po­pu­nja­va se dje­lo­va­njem DNA-po­li­me­ra­ze δ ili (uz su­rad­nju RFC i PCNA) i li­ga­ze. Ia­ko oš­te­će­nja DNA mo­gu bi­ti pre­poz­na­ta bi­lo gdje u ge­no­mu, al­ter­na­ tiv­ni ob­lik pop­rav­ka iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da, zvan pop­ra­vak ud­ru­žen s tran­skrip­ci­jom, spe­ci­fi­čan je za pop­ra­vak oš­te­će­nja unu­tar ge­na ko­ji se pre­pi­su­ju (sl. 6-24). Ve­za iz­me­đu tran­skrip­ci­je i pop­rav­ka ge­na pr­vi pu­t je do­ka­za­na ek­spe­ri­men­ti­ma ko­ji su po­ka­za­li da se la­nac DNA ko­ji se pre­pi­ su­je pop­rav­lja znat­no br­že od lan­ca ko­ji se ne pre­pi­su­je, ka­ko u E. co­li ta­ko i u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca. Bu­du­ći da oš­te­će­nje DNA blo­ki­ra tran­skrip­ci­ju, sta­ ni­ca fa­vo­ri­zi­ra pop­ra­vak za vri­je­me tran­skrip­ci­je jer joj omo­gu­ću­je da pog­ la­vi­to pop­ra­vi oš­te­će­nja onih ge­na ko­ji su ak­tiv­no ek­spri­mi­ra­ni. I kod E. co­li i kod sta­ni­ca si­sa­va­ca me­ha­ni­zam po­ve­za­nos­ti tran­skrip­ci­je i pop­rav­ka uk­lju­ču­je pre­poz­na­va­nje RNA-po­li­me­ra­ze za­ko­če­ne pri oš­te­će­nju lan­ca DNA ko­ji se pre­pi­su­je. Za­ko­če­nu RNA-po­li­me­ra­zu pre­poz­na­je pro­tein, naz­van fak­tor po­ve­zan s tran­skrip­cij­skim pop­rav­kom, ko­ji uk­la­nja RNA-

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   223

Sli­ka 6-24. Pop­ra­vak po­ve­zan s tran­skrip­ci­jom u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca.  RNA-po­ li­me­ra­za zaus­tav­lje­na je na mjes­tu oš­te­će­nja (npr. ti­min­ski di­mer) u lan­cu DNA ko­ji se pre­pi­su­je. Zaus­tav­lje­na RNA-po­li­me­ra­za reg­ru­ti­ra CSA i CSB do mjes­ta oš­te­će­nja, a CSA i CSB za­tim reg­ru­ti­ra­ju XPA, RPA i TFIIH i pop­rav­ak iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da od­vi­ja se ka­ko je opi­sa­no na sli­ci 6-23.

po­li­me­ra­zu i us­mje­ru­je UvrABC ek­sci­nuk­lea­zu pre­ma mjes­tu oš­te­će­nja. U sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca, pop­ra­vak ud­ru­žen s tran­skrip­ci­jom uk­lju­ču­je pre­poz­ na­va­nje za­ko­če­ne RNA-po­li­me­ra­ze dje­lo­va­njem pro­tei­na CSA i CSB ko­ji su ko­di­ra­ni ge­ni­ma od­go­vor­nim za Coc­kayneov sin­drom. Za raz­li­ku od bo­les­ni­ka ko­ji pa­te od Xe­ro­der­ma pig­men­to­sum, bo­les­ni­ci s Coc­kayneo­vim sin­dro­mom po­ka­zu­ju spe­ci­fi­čan de­fe­kt pop­rav­ka po­ve­za­nog s tran­skrip­ci­ jom što je u skla­du s ulo­gom pro­tei­na CSA i CSB kao fak­to­ra po­ve­za­nih s tran­skrip­cij­skim pop­rav­kom. Na­kon pre­poz­na­va­nja za­ko­če­ne RNA-po­li­ me­ra­ze, CSA i CSB reg­ru­ti­ra­ju XPA, RPA i TFIIH do mjes­ta oš­te­će­nja DNA, a na­kon to­ga se nas­tav­lja pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da kao što je is­tak­nu­to na sli­ci 6-23. Tre­ći me­ha­ni­zam pop­rav­ka iz­re­zi­va­njem pre­poz­na­je pog­r­ješ­no spa­re­ne ba­ze ug­ra­đe­ne za vri­je­me rep­li­ka­ci­je DNA. Mno­ge od tih pog­r­ješ­no spa­re­ nih ba­za uk­la­nja­ju se ko­rek­tiv­nom ak­tiv­noš­ću DNA-po­li­me­ra­ze. Preos­ta­le pog­rješ­no spa­re­ne ba­ze ob­je­kt su kas­ni­jeg ko­rek­tiv­nog me­ha­niz­ma zva­nog pop­ra­vak pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za (en­gl. mis­mat­ch re­pair system) ko­ji pro­v­je­ra­va no­vo­rep­li­ci­ra­nu DNA. Me­ha­niz­mi ovog pop­rav­ka spo­sob­ni su ot­kri­ti i spe­ci­fič­no iz­re­za­ti pog­r­ješ­no spa­re­nu ba­zu iz no­vo­sin­te­ti­zi­ra­no­ga lan­ca DNA omo­gu­ćiv­ši ti­me pop­ra­vak pog­r­ješ­ke i po­nov­no us­pos­tav­lja­nje iz­vor­no­ga sli­je­da nuk­leo­ti­da. Kod E. co­li, spo­sob­no­st sus­ta­va pop­rav­ka pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za da raz­li­ku­je ro­di­telj­ski od no­vo­sin­te­ti­zi­ra­no­ga lan­ca DNA zas­ni­va se na či­nje­ ni­ci da je DNA ove bak­te­ri­je mo­di­fi­ci­ra­na me­ti­la­ci­jom ade­nin­skih os­ta­ta­ka unu­tar sli­je­da GATC či­me se ade­nin pret­va­ra u 6-metiladenozin (sl. 6-25). Ka­ko se me­ti­la­ci­ja od­vi­ja na­kon rep­li­ka­ci­je, no­vo­sin­te­ti­zi­ra­ni lan­ci DNA ni­su me­ti­li­ra­ni i mo­gu se spe­ci­fič­no pre­poz­na­ti en­zi­mi­ma pop­rav­ka pog­r­

Sli­ka 6-25. Pop­ra­vak pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za u E. co­li.  Sus­tav pop­rav­ka po­ g­r­ješ­no spa­re­nih ba­za ot­kri­va i uk­la­nja pog­r­ješ­no spa­re­ne ba­ze u no­vo­rep­li­ci­ra­ noj DNA ko­ja se raz­li­ku­je od ro­di­telj­skog lan­ca jer još ni­je me­ti­li­ra­na. MutS se ve­že za pog­r­ješ­no spa­re­nu ba­zu na­kon če­ga se ve­že i MutL. Ve­za­nje MutL ak­ti­ vi­ra MutH ko­ji ki­da ne­mo­di­f i­ci­ra­ni la­nac na­sup­rot mjes­tu me­ti­la­ci­je. MutS i MutL za­jed­no s he­li­ka­zom i eg­zo­nuk­lea­zom na­kon to­ga iz­re­zu­ju dio ne­mo­di­f i­ci­ra­nog lan­ca ko­ji sad­r­ža­va pog­r­ješ­no spa­re­nu ba­zu. Pu­ko­ti­na se po­pu­nja­va dje­lo­va­njem DNA-po­li­me­ra­ze i zat­va­ra li­ga­zom.

224    POGLAVLJE 6 ješ­no spa­re­nih ba­za. Pop­ra­vak po­g­r­ješ­no spa­re­nih ba­za za­po­či­nje dje­lo­va­njem pro­tei­na MutS ko­ji pre­poz­na­je pog­r­ješ­no spa­re­ne ba­ze te tvo­ri kom­ple­ks s dva dru­ga pro­tei­na zva­na MutL i MutH. Mu­tH-en­do­nuk­lea­za za­ tim ki­da ne­me­ti­li­ra­ni la­nac DNA unu­tar sli­je­da GATC. MutL i MutS dje­lu­ju na­kon to­ga za­jed­no s eg­zo­nuk­lea­ zom i he­li­ka­zom isi­je­ca­ju­ći DNA iz­me­đu pre­ki­da lan­ca i pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za, a nas­ta­la pu­ko­ti­na po­pu­nja­ va se dje­lo­va­njem DNA-po­li­me­ra­ze i li­ga­ze. Eu­ka­rio­ti ima­ju sli­čan sus­tav pop­rav­ka pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za prem­da se me­ha­ni­zam ko­jim eu­ka­riot­ ske sta­ni­ce pre­poz­na­ju no­vo­rep­li­ci­ra­nu DNA raz­li­ku­je od onog ko­riš­te­nog u E. co­li, (sl. 6-26). Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce ne­ma­ju ho­mo­lo­ga MutH i spe­ci­fič­no­st pog­r­ješ­ no spa­re­ne ba­ze u no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nom lan­cu ni­je od­re­ đe­na me­ti­la­ci­jom DNA. Um­jes­to to­ga, pri­sut­no­st jed­ no­lan­ča­nog lo­ma od­re­đu­je la­nac kojeg je pot­reb­no pop­ra­vi­ti. Eu­ka­riot­ski ho­mo­lo­zi pro­tei­na MutS i MutL ve­žu se za po­g­r­ješ­no spa­re­nu ba­zu i up­rav­lja­ju isi­je­ca­ njem DNA iz­me­đu pre­ki­da u lan­cu i pog­r­ješ­no spa­re­ nih ba­za, kao i u slu­ča­ju E. co­li. Važ­no­st ovog me­ha­niz­ ma pop­rav­ka dra­ma­tič­no je ilus­tri­ra­na či­nje­ni­com da su mu­ta­ci­je ljud­skih ho­mo­lo­ga mu­tS i mu­tL ge­na od­ go­vor­ne za uo­bi­ča­je­ni tip nas­ljed­nog kar­ci­no­ma de­be­ lo­ga cri­je­va (nas­ljed­ni ne­po­li­poz­ni ko­lo­rek­tal­ni kar­ci­ nom ili HNPCC – engl. he­re­di­ta­ry non­po­lypo­sis co­lo­rec­tal can­cer). HNPCC pred­stav­lja jed­no od na­juo­bi­ča­ je­ni­jih nas­ljed­nih obo­lje­nja s učes­ta­loš­ću od jed­ne na 200 oso­ba, a od­go­vo­ran je za 15% svih ko­lo­rek­tal­nih kar­ci­no­ma u SA­D. Po­ve­za­no­st iz­me­đu HNPCC i po­re­ me­ća­ja u po­p­rav­ku pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za ot­kri­ve­na je 1993. go­di­ne kad su dvi­je sku­pi­ne znan­stve­ni­ka klo­ ni­ra­le ljud­ski ho­mo­log mu­tS ge­na i pro­naš­le da je mu­ ta­ci­ja u ovom ge­nu od­go­vor­na za ot­pri­li­ke po­lo­vi­cu svih slu­ča­je­va HNPCC. Nak­nad­na is­pi­ti­va­nja po­ka­za­la su da je ve­ći­na preos­ta­lih slu­ča­je­va HNPCC re­zul­tat mu­ta­ci­je jed­nog od tri ljud­ska ge­na ko­ji su ho­mo­lo­zi ge­na mu­tL. Či­ni se da de­fek­ti ovih ge­na re­zul­ti­ra­ju vi­ so­kom učes­ta­loš­ću mu­ta­ci­ja dru­gih sta­nič­nih ge­na s od­go­va­ra­ju­ćom vi­so­kom vje­ro­jat­noš­ću da će ne­ke od njih na kra­ju do­ves­ti do raz­vo­ja kar­ci­no­ma.

Tran­sle­zij­ska sin­te­za DNA

Sli­ka 6-26. Pop­ra­vak pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca.  Eu­ka­riot­ski homolo­zi MutS i MutL (MSH i M­LH) ve­žu se na pog­r­ješ­no spa­re­nu ba­zu i up­rav­lja­ju iz­re­zi­va­njem DNA iz­ me­đu pog­r­ješ­no spa­re­ne ba­ze i pre­ki­da u lan­cu DNA. Pre­ki­di u no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nom tro­mom lan­cu pri­sut­ni su na oba kra­ja Oka­ za­ki­je­vih frag­me­na­ta dok je pre­kid u vo­de­ćem lan­cu pri­su­tan na nje­go­vom ras­tu­ćem 3' kra­ju.

Me­ha­niz­mi iz­rav­nog ob­ra­ta oš­te­će­nja DNA i pop­ rav­ka iz­re­zi­va­njem pop­rav­lja­ju oš­te­će­nje DNA pri­je rep­li­ka­ci­je ta­ko da se DNA mo­že sin­te­ti­zi­ra­ti ko­riš­te­ njem neoš­te­će­nog lan­ca DNA kao ka­lu­pa. U slu­ča­ju da ovi me­ha­niz­mi za­ka­žu, sta­ni­ca ipak ima al­ter­na­tiv­ne me­ha­niz­me za pop­ra­vak oš­te­će­nja DNA u rep­li­ka­cij­ skim raš­ljama. Pi­ri­mi­din­ski di­me­ri i mno­gi dru­gi ti­po­ vi le­zi­ja ne mo­gu se ko­pi­ra­ti nor­mal­nom ak­tiv­noš­ću DNA-po­li­me­ra­za pa je rep­li­ka­ci­ja na mjes­ti­ma tih oš­ te­će­nja blo­ki­ra­na. No, sta­ni­ce ta­ko­đer pos­je­du­ju ne­ko­ li­ko spe­ci­ja­li­zi­ra­nih DNA-po­li­me­ra­za ko­je su u sta­nju

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   225

MOLEKULARNA MEDICINA

Kar­ci­nom de­be­log cri­je­va i pop­ra­vak DNA Bo­le­st Kar­ci­no­mi ko­lo­na i rek­tu­ma (ko­lo­rek­ tal­ni kar­ci­no­mi) ne­ki su od­ naj­češ­ćih kar­ci­no­ma u za­pad­nom svi­je­tu, bro­ je­ći oko 150.000 slu­ča­je­va kar­ci­no­ma ko­ji su go­diš­nje za­bi­lje­že­ni u SA­D (ot­ pri­li­ke oko 10% sveu­kup­nih slu­ča­je­va kar­ci­no­ma). Ve­ći­na kar­ci­no­ma de­be­log cri­je­va (kao i dru­gih vr­sta kar­ci­no­ma) ni­su nas­ljed­ne bo­les­ti što zna­či da se ne pre­no­se iz­rav­no s ro­di­te­lja na po­ tom­stvo. No ipak, opi­sa­na su dva na­ slje­d­na ob­li­ka ovog kar­ci­no­ma. U oba slu­ča­ja nas­lje­đi­va­nje ge­na za pre­dis­po­ zi­ci­ju po­ja­ve kar­ci­no­ma re­zul­ti­ra vr­lo ve­li­kom vje­ro­jat­noš­ću raz­vo­ja bo­les­ti. Je­dan od ob­li­ka nas­ljed­nog kar­ci­no­ma de­be­lo­ga cri­je­va (fa­mi­li­jar­na ade­no­ ma­toz­na po­li­po­za) iz­nim­no je ri­je­dak i či­ni ma­nje od 1% slu­ča­je­va kar­ci­no­ma de­be­lo­ga cri­je­va. Dru­gi nas­ljed­ni ob­lik kar­ci­no­ma de­be­lo­ga cri­je­va (nas­ljed­ni ne­po­li­poz­ni ko­lo­rek­tal­ni kar­ci­nom ili HNPCC – en­gl. he­re­di­ta­ry non­po­lypo­sis co­lo­rec­tal can­cer) znat­no je učes­ta­li­ji i či­ni do 15% svih slu­ča­je­va kar­ci­no­ma de­be­lo­ga cri­je­va. HNPCC je uis­ti­nu jed­ na od na­ju­čes­ta­li­jih nas­ljed­nih bo­les­ti i po­ga­đa prib­liž­no jed­nu od sva­kih 200 oso­ba. Prem­da su kar­ci­no­mi de­be­lo­ ga cri­je­va naj­češ­ća ma­ni­fes­ta­ci­ja ovog obo­lje­nja, po­go­đe­ne oso­be ta­ko­đer pa­te od po­ve­ća­ne po­ja­ve dru­gih ti­po­ va kar­ci­no­ma, uk­lju­ču­ju­ći kar­ci­nom jaj­ ni­ka i en­do­met­ri­ja.

Mo­le­ku­lar­na i sta­nič­na os­no­va Po­put dru­gih kar­ci­no­ma, ko­lo­rek­tal­ni kar­ci­nom re­zul­tat je mu­ta­ci­ja ge­na ko­ji re­gu­li­ra­ju sta­nič­nu pro­li­fe­ra­ci­ju što do­ vo­di do ne­kon­tro­li­ra­no­ga ras­ta sta­ni­ca kar­ci­no­ma. U ve­ći­ni slu­ča­je­va te mu­ ta­ci­je nas­ta­ju spo­ra­dič­no u so­mat­skim sta­ni­ca­ma. Za raz­li­ku od to­ga, kod na­

s­ljed­nih kar­ci­no­ma mu­ta­ci­je u sta­ni­ca­ ma ger­mi­na­tiv­ne li­ni­je (spol­nim sta­ni­ ca­ma) pre­dod­re­đu­ju raz­voj bo­les­ti kod po­je­din­ca. Zna­ča­jan nap­re­dak u is­tra­ži­va­nju ove vr­ste kar­ci­no­ma do­go­dio se 1993. go­ di­ne ka­da je ot­kri­ve­no da gen od­go­vo­ ran za oko 50% HNPCC slu­ča­je­va ko­di­ra en­zim uk­lju­čen u pop­ra­vak pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za – ovaj gen u čov­je­ka ho­ mo­log je ge­na MutS u E. co­li. Nak­nad­na is­tra­ži­va­nja po­ka­za­la su da su još tri ge­ na, od­go­vor­na za ve­ći­nu preos­ta­lih slu­ ča­je­va HNPCC, ho­mo­lo­zi ge­na MutL te su ta­ko­đer uk­lju­če­ni u pop­ra­vak pog­r­ ješ­no spa­re­nih ba­za. Oš­te­će­nja u ovim ge­ni­ma re­zul­ti­ra­ju vi­so­kom uče­sta­loš­ću mu­ta­ci­ja dru­gih sta­nič­nih ge­na. Ve­li­ka je vje­ro­jat­no­st da će ne­ke od tih mu­ ta­ci­ja na kra­ju do­ves­ti do raz­vo­ja kar­ ci­no­ma u slu­ča­ju da po­go­de ge­ne ko­ji re­gu­li­ra­ju pro­li­fe­ra­ci­ju sta­ni­ca.

Pre­ven­ci­ja i li­je­če­nje Kao i kod dru­gih nas­ljed­nih bo­les­ti, ot­ kri­će ge­na od­go­vor­nih za HNPCC omo­ gu­ću­je da se ge­ne­tič­kim tes­ti­ra­njem iden­ti­fi­ci­ra­ju oso­be iz­lo­že­ne ri­zi­ku za raz­voj ovog ob­li­ka nas­ljed­nog kar­ci­ no­ma. Na­da­lje, pre­na­tal­na ge­ne­tič­ka di­jag­no­za mo­že bi­ti veo­ma važ­na no­ sio­ci­ma HNPCC mu­ta­ci­ja u pla­ni­ra­nju obi­te­lji. Po­ten­ci­jal­ne po­god­nos­ti ot­kri­ va­nja ovih mu­ta­ci­ja ni­su og­ra­ni­če­ne sa­mo na pre­ven­ci­ju pre­no­še­nja mu­ti­ ra­no­ga ge­na na slje­de­ću ge­ne­ra­ci­ju – nji­ho­vo ot­kri­će mo­že ta­ko­đer pri­do­ni­ je­ti pre­ven­ci­ji raz­vo­ja bo­les­ti u no­sio­ca mu­ta­ci­ja. Ključ­na zna­čaj­ka kar­ci­no­ma de­be­lo­ ga cri­je­va je­st nje­gov pos­tup­ni raz­voj u raz­dob­lju od ne­ko­li­ko go­di­na. Ra­ no di­jag­nos­ti­ci­ra­nje obo­lje­nja znat­no

iz­vr­ši­ti rep­li­ka­ci­ju i pre­ko mjes­ta s oš­te­će­njem DNA. Rep­li­ka­ci­ja oš­te­će­ne DNA dje­lo­va­njem tak­vih spe­ci­ja­li­zi­ra­nih po­li­me­ra­za, naz­va­na tran­sle­zij­ ska sin­te­za DNA, me­ha­ni­zam je ko­jim sta­ni­ca mo­že nad­vla­da­ti oš­te­će­nje DNA u rep­li­ka­cij­skim rašljama ko­je se za­tim mo­že pop­ra­vi­ti na­kon zav­r­ šet­ka rep­li­ka­ci­je.

Polip debeloga crijeva vizualiziran kolo­no­ skopijom. (David M. Martin, M.D./SPL/Photo Researches, Inc.)

­ o­ve­ća­va šan­se pre­živ­lje­nja bo­les­ni­ka. p Po­čet­ni sta­dij kar­ci­no­ma de­be­lo­ga cri­ je­va pred­stav­lja ra­st ma­lih be­nig­nih po­li­pa ko­ji s vre­me­nom pos­ta­ju ma­ lig­ni i na­pa­da­ju okol­no ve­ziv­no tki­vo. Pri­je ma­lig­ne tran­sfor­ma­ci­je po­li­pe je mo­gu­će la­ko uk­lo­ni­ti ki­rur­škim pu­tem što je vr­lo efi­kas­no u pre­ven­ci­ji raz­vo­ ja ma­lig­nog tu­mo­ra. Po­li­pi i ra­ni sta­di­ji kar­ci­no­ma de­be­lo­ga cri­je­va mo­gu se ot­kri­ti preg­le­dom de­be­lo­ga cri­je­va s tan­kom os­vi­jet­lje­nom son­dom (ko­lo­ nos­ko­pom), ta­ko da učes­ta­le ko­lo­no­ sko­pi­je bo­les­ni­ka s HNPCC mo­gu omo­ gu­ći­ti uk­la­nja­nje po­li­pa pri­je raz­vo­ja kar­ci­no­ma. Osim to­ga, ot­kri­ve­no je ne­ ko­li­ko li­je­ko­va po­ten­ci­jal­nih in­hi­bi­to­ra raz­vo­ja kar­ci­no­ma de­be­lo­ga cri­je­va ko­ ji mo­gu do­ni­je­ti znat­nu ko­ri­st bo­le­sni­ ci­ma s HNPCC. Pra­vo­dob­na prim­je­na pre­ven­tiv­nih mje­ra, u smis­lu ot­kri­va­nja mu­ta­ci­ja od­go­vor­nih za HNPCC, mo­ že znat­no pri­do­ni­je­ti sma­nje­nju bro­ja obo­lje­lih od ove zlo­ćud­ne bo­les­ti.

226    POGLAVLJE 6 Sli­ka 6-27. Tran­sle­zij­ska sin­te­za DNA.  Nor­mal­na rep­li­ka­ci­ja blo­ki­ra­na je ti­min­skim di­me­rom, ali spe­ci­ja­li­zi­ra­na DNA-po­li­me­ra­za, kao što je prim­je­ri­ce po­li­me­ra­za V (pol V), pre­poz­na­je i nas­tav­lja sin­te­zu DNA i pre­ko oš­te­će­nog mjes­ta. Rep­li­ka­ci­ja se ta­da mo­že nas­ta­vi­ti re­gu­lar­nom rep­li­ka­cij­skom DNA-po­li­me­ra­zom, a ti­min­ski di­mer se na kra­ju uk­la­nja pop­rav­kom ek­sci­zi­jom nuk­leo­ti­da.

Pr­va spe­ci­ja­li­zi­ra­na DNA-po­li­me­ra­za od­go­vor­na za tran­sle­zij­sku sin­te­ zu DNA ot­kri­ve­na je 1999. go­di­ne u E. co­li. Ovaj en­zim, naz­van po­li­me­ra­ za V, in­du­ci­ran je u od­go­vo­ru na ek­sten­ziv­no UV-zra­če­nje i mo­že sin­te­ti­ zi­ra­ti no­vi la­nac mo­le­ku­le DNA pre­ko mjes­ta s ti­min­skim di­me­ri­ma (sl. 6-27). Dru­ge dvi­je DNA-po­li­me­ra­ze u E. co­li, po­li­me­ra­za II i IV, na sli­čan su na­čin in­du­ci­ra­ne oš­te­će­njem DNA i dje­lu­ju u tran­sle­zij­skoj sin­te­zi. Eu­ ka­riot­ske sta­ni­ce ta­ko­đer sad­r­ža­va­ju vi­še spe­ci­ja­li­zi­ra­nih DNA-po­li­me­ra­za, a za pet tak­vih en­zi­ma po­ka­za­lo se da sud­je­lu­ju u tran­sle­zij­skoj sin­te­zi u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca. Ove spe­ci­ja­li­zi­ra­ne po­li­me­ra­ze zam­je­nju­ju nor­mal­ne po­li­me­ra­ze ko­je su zaus­tav­lje­ne na mjes­tu oš­te­će­nja DNA. Sve spe­ci­ja­li­zi­ra­ne DNA-po­li­me­ra­ze is­ka­zu­ju ma­lu vjer­no­st pre­pi­si­va­ nja neoš­te­će­nog lan­ca DNA i ne­dos­ta­je im 3' → 5' ko­rek­tiv­na ak­tiv­no­st (v. sl. 6-11) ta­ko da su nji­ho­ve sto­pe pog­r­je­ša­ka od 100 do 10.000 pu­ta ve­će no što su sto­pe pog­r­je­ša­ka nor­mal­nih rep­li­ka­cij­skih DNA-po­li­me­ra­za (prim­je­ri­ce po­li­me­ra­ze III u E. co­li ili po­li­me­ra­ze δ i ε u eu­ka­rio­ta). Ipak, one po­ka­zu­ju od­go­va­ra­ju­ću se­lek­tiv­no­st pri ug­rad­nji toč­ne ba­ze smje­šte­ne na­sup­rot od­re­đe­nih le­zi­ja, kao što su pi­ri­mi­din­ski di­me­ri, u ošte­će­noj DNA. Sto­ga su spe­ci­ja­li­zi­ra­ne po­li­me­ra­ze spo­sob­ne ug­ra­di­ti od­go­va­ra­ju­će ba­ze smješ­te­ne na­sup­rot ne­kim ob­li­ci­ma oš­te­će­nja DNA, prem­da su sklo­ne pog­r­ješ­ka­ma u ug­ra­đi­va­nju ba­za smješ­te­nih na­sup­rot dru­gih ob­li­ka oš­te­ će­ne DNA ili u sin­te­zi DNA ko­riš­te­njem nor­mal­no­ga neoš­te­će­nog ka­lu­ pa.

Pop­ra­vak dvo­lan­ča­nih lo­mo­va Dvo­lan­ča­ni lo­mo­vi su iz­nim­no opa­san ob­lik oš­te­će­nja DNA jer je kon­ ti­nui­tet mo­le­ku­la DNA na­ru­šen pre­ki­di­ma u oba lan­ca (sl. 6-28). Tak­vi dvo­lan­ča­ni lo­mo­vi uo­bi­ča­je­no se do­ga­đa­ju ti­je­kom rep­li­ka­ci­je DNA, prim­ je­ri­ce kad DNA-po­li­me­ra­za u rep­li­ka­cij­skim rašljama nai­đe na urez u lan­ cu ka­lup­ne DNA. Dvo­lan­ča­ni lo­mo­vi su uz to in­du­ci­ra­ni i io­ni­zi­ra­ju­ćim zra­če­njem (kao što su X-zra­ke) te ne­kim ke­mi­ka­li­ja­ma ko­je oš­te­ću­ju DNA uvo­đe­njem lo­mo­va u na­sup­rot­nim lan­ci­ma. Ob­zi­rom da dvo­lan­ča­ni lo­mo­vi dje­lu­ju na oba lan­ca DNA, oni se ne mo­gu pop­ra­vi­ti me­ha­niz­mi­ma ko­ji zah­ti­je­va­ju sin­te­zu DNA pre­ko oš­te­će­ nog mjes­ta. Um­jes­to to­ga, dvo­lan­ča­ni lo­mo­vi pop­rav­lja­ju se za­seb­nim me­ ha­niz­mom, re­kom­bi­na­cij­skim pop­rav­kom, ko­ji po­nov­no spa­ja po­ci­je­pa­ ne lan­ce. Sta­ni­ce ko­ris­te dva os­nov­na pu­ta re­kom­bi­na­cij­skog pop­rav­ka (v. sl. 6-28). Re­kom­bi­na­ci­ja s ho­mo­log­nim sl­je­do­vi­ma DNA na neoš­te­će­nom kro­mo­so­mu (de­talj­ni­je opi­sa­no u sl­je­de­ćem od­jelj­ku ovog po­glav­lja) me­ ha­ni­zam je za pop­ra­vak tak­vih oš­te­će­nja i ob­nav­lja­nje nor­mal­nog sli­je­da DNA. Kod eu­ka­riot­skih sta­ni­ca ovaj me­ha­ni­zam pop­rav­ka ope­ra­ti­van je je­di­no na­kon rep­li­ka­ci­je DNA ka­da no­vos­tvo­re­ne ses­trin­ske kro­ma­ti­de os­ ta­ju zdru­že­ne jed­na s dru­gom (v. sl. 5-18). Al­ter­na­tiv­no, dvo­lan­ča­ni lo­mo­ vi se mo­gu pop­ra­vi­ti po­nov­nim spa­ja­njem po­ci­je­pa­nih kra­je­va jed­ne mo­ le­ku­le DNA no to do­vo­di do vr­lo učes­ta­lih pog­r­je­ša­ka ko­je su re­zul­tat de­le­ci­je ba­za oko mjes­ta oš­te­će­nja. Važ­no je spo­me­nu­ti da je­dan od ge­na od­go­vor­nih za nas­ljed­ni kar­ci­nom doj­ke (BR­CA2) ko­di­ra pro­tein ko­ji je

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

Sli­ka 6-28. Pop­ra­vak dvo­lan­ča­nih lo­mo­va.  Io­ni­zi­ra­ju­će zra­če­nje i ne­ke ke­mi­ka­li­je in­du­ci­ra­ju dvo­lan­ča­ne lo­mo­ve u DNA. Ovi lo­mo­vi se mo­gu pop­ra­vi­ti ho­mo­log­nom re­ kom­bi­na­ci­jom s nor­mal­nim kro­mo­so­mom do­vo­de­ći do ob­nav­lja­nja iz­vor­no­ga sli­je­da DNA. Al­ter­na­tiv­no, kra­je­vi dvo­lan­ča­nih lo­mo­va mo­gu se po­nov­no spo­ji­ti ne­ho­mo­log­ nim spa­ja­njem, uz učes­ta­li gu­bi­tak ba­za uz mjes­to oš­te­će­nja.

uk­lju­čen u pop­ra­vak dvo­lan­ča­nih lo­mo­va pos­red­stvom ho­mo­log­ne re­kom­ bi­na­ci­je, što su­ge­ri­ra da oš­te­će­nja ovog ti­pa pop­rav­ka DNA mo­gu ima­ti za pos­lje­di­cu nas­ta­nak jed­nog od na­ju­čes­ta­li­jih kar­ci­no­ma u že­na.

Re­kom­bi­na­ci­ja iz­me­đu homolognih slje­do­va ­DNA Pre­ciz­na rep­li­ka­ci­ja DNA i pop­ra­vak oš­te­će­nja DNA nuž­ni su za od­r­ža­ nje ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je i osi­gu­ra­nje nje­zi­na toč­nog pri­je­no­sa s ro­di­te­lja na po­tom­stvo. Kao što je spo­me­nu­to u pret­hod­nom tek­stu, re­kom­bi­na­ci­ja je va­žan me­ha­ni­zam za pop­ra­vak oš­te­će­ne DNA. Uz to, re­kom­bi­na­ci­ja je ključ­na za stva­ra­nje ge­ne­tič­ke raz­no­li­kos­ti, oso­bi­to važ­ne s evo­lu­cij­skog gle­diš­ta. Ge­ne­tič­ke raz­li­či­tos­ti me­đu je­din­ka­ma pru­ža­ju os­nov­ni star­tni ma­te­ri­jal pri­rod­ne se­lek­ci­je ko­ji omo­gu­ću­je vr­sta­ma da evo­lui­ra­ju i pri­la­ go­de se prom­je­nji­vim uv­je­ti­ma oko­li­ša. Re­kom­bi­na­ci­ja ima sre­diš­nju ulo­ gu u tom pro­ce­su jer omo­gu­ću­je ge­ni­ma da se pres­lo­že u raz­li­či­te kom­bi­ na­ci­je. Ta­ko prim­je­ri­ce re­kom­bi­na­ci­ja re­zul­ti­ra iz­mje­nom ge­na u spa­re­nim ho­mo­log­nim kro­mo­so­mi­ma za vri­je­me me­jo­ze i kri­tič­na je za raz­dva­ja­nje kro­mo­so­ma ti­je­kom me­jo­ze I (o to­me će biti ri­je­či u 16. pog­lav­lju). Uz to, re­kom­bi­na­ci­ja je uk­lju­če­na u pres­la­gi­va­nje spe­ci­fič­nih slje­do­va DNA ko­ji mi­je­nja­ju ek­spre­si­ju i fun­kci­ju ne­kih ge­na ti­je­kom raz­vo­ja i di­fe­ren­ci­ja­ci­je. Sto­ga, re­kom­bi­na­ci­ja ig­ra važ­nu ulo­gu u ži­vo­tu po­je­di­nač­nih sta­ni­ca i or­ ga­ni­za­ma, a is­tov­re­me­no pri­do­no­si ge­ne­tič­koj raz­no­li­kos­ti vr­sta.

   227

228    POGLAVLJE 6 U ovom di­je­lu pog­lav­lja pri­ka­za­ni su me­ha­niz­mi ho­mo­log­ne re­kom­bi­ na­ci­je ko­ja uk­lju­ču­je iz­mje­nu in­for­ma­ci­ja iz­me­đu mo­le­ku­la DNA ko­je di­ je­le ho­mo­lo­gi­ju sli­je­da u pre­ko sto­ti­nu ba­za. Prim­je­ri uk­lju­ču­ju ho­mo­log­ nu re­kom­bi­na­ci­ju za vri­je­me pop­rav­ka DNA kao i re­kom­bi­na­ci­ju iz­me­đu spa­re­nih eu­ka­riot­skih kro­mo­so­ma ti­je­kom me­jo­ze kao i ho­mo­log­nu re­ kom­bi­na­ci­ju ti­je­kom pop­rav­ka DNA. Bu­du­ći da ovaj tip re­kom­bi­na­ci­je pod­ra­zu­mi­je­va iz­mje­nu ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je iz­me­đu dvi­ju ho­mo­log­nih mo­le­ku­la DNA, on ne do­vo­di do prom­je­ne u sveu­kup­nom us­tro­ju ge­na na kro­mo­so­mu. Dru­gi ti­po­vi re­kom­bi­na­ci­je ne zah­ti­je­va­ju iz­ra­zi­tu ho­mo­lo­gi­ ju slje­do­va DNA i sto­ga se mo­gu od­vi­ja­ti i iz­me­đu nes­rod­nih mo­le­ku­la DNA. Re­kom­bi­na­cij­ski do­ga­đa­ji to­ga ti­pa do­vo­de do pres­la­gi­va­nja ge­na o če­mu će bi­ti go­vo­ra kas­ni­je u ovom pog­lav­lju.

Mo­de­li ho­mo­log­ne re­kom­bi­na­ci­je 6.2. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Ho­mo­log­na re­kom­bi­na­ci­ja. U Hol­ li­daye­vom mo­de­lu re­kom­bi­na­ci­je iz­me­đu dvi­ju ho­mo­log­nih dvo­lan­ča­ nih mo­le­ku­la DNA pro­ces po­či­nje za­ re­zi­va­njem jed­nog lan­ca sva­ke dvo­lan­ča­ne mo­le­ku­le na­kon če­ga sli­je­di iz­mje­na la­na­ ca i spa­ja­nje za­re­za­nih la­na­ca na na­sup­rot­ nim mo­le­ku­la­ma.

Re­kom­bi­na­ci­ja je re­zul­tat ci­je­pa­nja i po­nov­nog spa­ja­nja dvi­ju ro­di­telj­ skih mo­le­ku­la DNA što do­vo­di do pre­ras­pod­je­le ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je dva­ju ro­di­telj­skih kro­mo­so­ma. Ti­je­kom ho­mo­log­ne re­kom­bi­na­ci­je to se do­ga­đa bez ne­ke dru­ge prom­je­ne ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je. Sto­ga, ključ­no pi­ ta­nje je: ka­ko dvi­je ro­di­telj­ske mo­le­ku­le DNA mo­gu bi­ti pre­ki­nu­te toč­no na is­tom mjes­tu ta­ko da se mo­gu po­no­vo spo­ji­ti, a da pri to­me ne nas­ta­nu mu­ta­ci­je zbog de­le­ci­ja od­nos­no adi­ci­ja nuk­leo­ti­da u mjes­tu lo­ma? Za vri­ je­me re­kom­bi­na­ci­je iz­me­đu ho­mo­log­nih mo­le­ku­la DNA tak­vo po­rav­na­va­ nje omo­gu­će­no je spa­ri­va­njem ba­za kom­ple­men­tar­nih la­na­ca DNA (sl. 6-29). Prek­la­pa­ju­ći jed­no­lan­ča­ni kra­je­vi iz­mje­nju­ju se iz­me­đu ho­mo­log­ nih mo­le­ku­la DNA do­vo­de­ći do stva­ra­nja he­te­ro­dup­lek­sa u ko­jem dva lan­ ca re­kom­bi­nan­tne dvo­lan­ča­ne uz­voj­ni­ce pot­je­ču od raz­li­či­tih ro­di­te­lja. Kad se mo­le­ku­le DNA he­te­ro­dup­lek­sa ge­ne­tič­ki raz­li­ku­ju, mo­le­ku­la DNA ko­ja nas­ta­je sad­r­ža­va dva raz­li­či­ta ge­ne­tič­ka bi­lje­ga. U ne­kim slu­ča­je­vi­ma po­ grješ­no spa­re­ne ba­ze u he­te­ro­dup­lek­su mo­gu bi­ti pre­poz­na­te i is­prav­lje­ne me­ha­niz­mom pop­rav­ka pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za na na­čin ko­ji je opi­san ra­ni­je u ovom pog­lav­lju. Ge­ne­tič­ki do­kaz za stva­ra­nje i pop­ra­vak tak­vih he­te­ro­dup­lek­snih pod­ruč­ja, do­bi­ven prou­ča­va­njem re­kom­bi­na­ci­je kod glji­va i bak­te­ri­ja, do­veo je 1964. go­di­ne do raz­vo­ja mo­le­ku­lar­nog mo­de­la re­kom­bi­na­ci­je. Prem­da mo­di­fi­ci­ran stje­ca­njem no­vih spoz­na­ja, ovaj mo­ del, poz­nat kao Hol­li­dayev mo­del (naz­van pre­ma is­tra­ži­va­ču Ro­bi­nu Hol­ li­dayu), nas­ta­vio je pru­ža­ti os­no­vu za da­naš­nje poi­ma­nje me­ha­ni­za­ma re­ kom­bi­na­ci­je. Iz­vor­na ver­zi­ja Hol­li­daye­va mo­de­la pred­la­že da re­kom­bi­na­ci­ja za­po­či­ nje uvo­đe­njem ure­za (en­gl. ni­ck) u is­tom mjes­tu obi­ju ro­di­telj­skih mo­le­ku­ la (sl. 6-30). Za­re­za­ni lan­ci DNA dje­lo­mič­no se raz­mo­ta­ju i sva­ki za­la­zi u dru­gu mo­le­ku­lu na taj na­čin da se spa­ri s kom­ple­men­tar­nim nep­re­ki­nu­tim lan­cem. Spa­ja­nje pre­ki­nu­tih la­na­ca stva­ra za­tim uk­ri­že­nje poz­na­to kao Hol­li­daye­va ve­za ko­ja pred­stav­lja glav­ni me­đup­ro­du­kt u re­kom­bi­na­ci­ji. Iz­rav­ni pri­kaz Hol­li­daye­ve ve­ze do­bi­ven elek­tron­skim mik­ros­ko­pom dao je jas­nu pot­po­ru za ovaj mo­del re­kom­bi­na­ci­je (sl. 6-31). Jed­nom stvo­re­na Hol­li­daye­va ve­za mo­že bi­ti raz­ri­je­še­na ki­da­njem i po­ nov­nim spa­ja­njem uk­ri­že­nih la­na­ca što do­vo­di do stva­ra­nja re­kom­bi­nan­

Sli­ka 6-29. Ho­mo­log­na re­kom­bi­na­ci­ja kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem ba­za.  Ro­­di­telj­ske mo­le­ku­le DNA po­ki­da­ne su u mjes­ti­ma sa ste­pe­nas­to prek­la­pa­ju­ćim kra­ je­vi­ma ko­ji su iz­mi­je­nje­ni pu­tem spa­ri­va­nja ba­za s ho­mo­log­nim sl­je­do­vi­ma. Re­zul­tat to­ga je he­te­ro­dup­lek­sno pod­ruč­je u ko­jem dva lan­ca DNA pot­je­ču iz raz­li­či­tih ro­di­telj­ skih mo­le­ku­la.

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   229

Sli­ka 6-30. Hol­li­dayev mo­del ho­mo­log­ne re­kom­bi­na­ci­je.  Jed­no­lan­ča­ni ure­zi uve­ de­ni su u is­tim mjes­ti­ma obi­ju ro­di­telj­skih mo­le­ku­la. Na­kon to­ga do­la­zi do iz­mje­ne za­re­za­nih la­na­ca kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem ba­za, a li­ga­ci­ja stva­ra uk­ri­že­ni me­ đup­ro­du­k t zvan Hol­li­daye­va ve­za.

tne mo­le­ku­le (sl. 6-32). To se mo­že do­go­di­ti na dva raz­li­či­ta na­či­na ovis­no o ori­jen­ta­ci­ji Hol­li­daye­ve ve­ze ko­ja la­ko stva­ra dva raz­li­či­ta izo­me­ra. U izo­me­ru ko­ji nas­ta­je iz po­čet­ne iz­mje­ne la­na­ca uk­ri­že­ni su oni lan­ci ko­ji su za­re­za­ni na po­čet­ku re­kom­bi­na­cij­skog pro­ce­sa. No, jed­nos­tav­na ro­ta­ci­ja ove struk­tu­re da­je dru­ga­či­ji izo­mer u ko­jem su uk­ri­že­ni nep­re­ki­nu­ti ro­di­ telj­ski lan­ci. Raz­r­je­še­nje ovih raz­li­či­tih izo­me­ra ima raz­li­či­te ge­ne­tič­ke po­ slje­di­ce. U pr­vom slu­ča­ju nas­ta­le mo­le­ku­le ima­ju he­te­ro­dup­lek­sna pod­ruč­ ja, ali ni­su re­kom­bi­nan­tne za DNA ko­ja ome­đu­je ta pod­ruč­ja. Ako do­đe do izo­me­ri­za­ci­je, ki­da­nje i po­nov­no spa­ja­nje uk­ri­že­nih la­na­ca re­zul­ti­rat će mo­le­ku­la­ma ko­je su re­kom­bi­nan­tne za pod­ruč­ja ko­ja ome­đu­ju he­te­ro­du­ ple­ks. Stva­ra­nje re­kom­bi­nan­tnih i ne­re­kom­bi­nan­tnih he­te­ro­dup­lek­sa od­re­ đe­no je up­ra­vo Hol­li­daye­vom ve­zom što je u skla­du s ge­ne­tič­kim po­dat­ci­ ma na ko­ji­ma je zas­no­van Hol­li­dayev mo­del. Ini­ci­jal­no pred­lo­žen Hol­li­dayev mo­del ni­je us­pio ob­jas­ni­ti ka­ko do­la­zi do po­čet­ka re­kom­bi­na­ci­je is­tov­re­me­nim za­re­zi­va­njem obi­ju ro­di­telj­skih mo­le­ku­la na is­tov­jet­nom po­lo­ža­ju. Sa­da se či­ni da re­kom­bi­na­ci­ja op­će­ni­to po­či­nje dvo­lan­ča­nim lo­mom ka­ko za vri­je­me pop­rav­ka DNA ta­ko i za vri­ je­me re­kom­bi­na­ci­je iz­me­đu ho­mo­log­nih kro­mo­so­ma ti­je­kom me­jo­ze (sl. 6-33). Oba lan­ca DNA na mjes­tu dvo­lan­ča­nog lo­ma pr­vo se raz­gra­de dje­ lo­va­njem nuk­lea­ze ko­ja raz­gra­đu­je DNA u 5'→3' smje­ru stva­ra­ju­ći jed­no­ lan­ča­ne kra­je­ve. Ti jed­no­lan­ča­ni kra­je­vi za­la­ze u dru­gu ro­di­telj­sku mo­ leku­lu pri če­mu se spa­re kom­ple­men­tar­ne ba­ze. Pu­ko­ti­ne se za­tim po­pu­nja­va­ju sin­te­zom, a lan­ci spa­ja­ju li­ga­ci­jom stva­ra­ju­ći mo­le­ku­lu s dvos­ tru­kom Hol­li­daye­vom ve­zom ko­ja se mo­že raz­ri­je­ši­ti ta­ko da daje ili re­ kom­bi­nan­tne ili ne­re­kom­bi­nan­tne he­te­ro­dup­lek­sne mo­le­ku­le kao što je to ra­ni­je opi­sa­no.

En­zi­mi uk­lju­če­ni u ho­mo­log­nu re­kom­bi­na­ci­ju Ve­ći­na en­zi­ma za ko­je se da­nas zna da su uk­lju­če­ni u re­kom­bi­na­ci­ju pr­vot­no je iden­ti­fi­ci­ra­na ana­li­zom re­kom­bi­na­cij­ski de­fek­tnih mu­ta­na­ta E. co­li. Tak­ve ge­ne­tič­ke ana­li­ze ut­vr­di­le su da re­kom­bi­na­ci­ja zah­ti­je­va spe­ci­ fič­ne en­zi­me, za­jed­no s pro­tei­ni­ma (kao što su DNA-po­li­me­ra­za, li­ga­za i pro­tei­ni ko­ji ve­žu jed­no­lan­ča­nu DNA) ko­ji ima­ju vi­šes­tru­ke ulo­ge u me­ta­

Sli­ka 6-31. Iden­ti­fi­ka­ci­ja Hol­li­daye­ve ve­ze po­mo­ću elek­tron­ske mik­ros­ko­pi­je.  Elek­tron­sko­mik­ros­kop­ska fo­tog­ra­f i­ja Hol­li­daye­ve ve­ze ot­kri­ve­ne za vri­je­me re­kom­ bi­na­ci­je plaz­mid­nih mo­le­ku­la DNA u E. co­li. U do­njem di­je­lu sli­ke pri­ka­zan je in­ter­ pre­ta­cij­ski cr­tež struk­tu­re. Pri­ka­za­na mo­le­ku­la ilus­tri­ra Hol­li­daye­vu ve­zu ot­vo­re­ne kon­f i­gu­ra­ci­je ko­ja je re­zul­tat ro­ta­ci­je me­đup­ro­duk­ta s uk­ri­že­nim lan­ci­ma (v. sl. 6-32). (Lju­baz­noš­ću Hun­tin­gtona Pot­tera, Uni­ver­si­t y of Sou­th Flo­ri­da i Da­vida Dres­slera, Uni­ver­si­t y of Oxfo­rd.)

230    POGLAVLJE 6

Sli­ka 6-32. Izo­me­ri­za­ci­ja i raz­r­je­ša­va­nje Hol­li­daye­ve ve­ze.  Hol­li­daye­ve ve­ze raz­ r­je­šu­ju se ki­da­njem i pres­pa­ja­njem uk­ri­že­nih la­na­ca. Ako se Hol­li­daye­va ve­za stvo­ re­na ini­ci­jal­nom iz­mje­nom la­na­ca raz­ri­je­ši nas­ta­ju he­te­ro­dup­lek­sni po­tom­ci ko­ji ni­su re­kom­bi­nan­tni za gen­ske bi­lje­ge iz­van he­te­ro­dup­lek­snog pod­ruč­ja. Ipak, dvi­je ro­ta­ci­ je mo­le­ku­le s uk­ri­že­nim lan­ci­ma stva­ra­ju izo­mer u ko­jem su uk­ri­že­ni nep­re­ki­nu­ti ro­ di­telj­ski lan­ci, a ne ini­ci­jal­no za­re­za­ni lan­ci. Ki­da­nje i pres­pa­ja­nje uk­ri­že­nih la­na­ca tih izo­me­ra da­je po­tom­ke ko­ji su re­kom­bi­nan­tni he­te­ro­dup­lek­si.

bo­liz­mu DNA. Ot­kri­će ge­na pot­reb­nih za učin­ko­vi­tu re­kom­bi­na­ci­ju u E. co­li omo­gu­ći­lo je izo­la­ci­ju i ka­rak­te­ri­za­ci­ju pro­tei­na ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju stva­ ra­nje i raz­r­je­še­nje Hol­li­daye­vih struk­tu­ra. Ključ­ni pro­tein uk­lju­čen u glav­ne ko­ra­ke ho­mo­log­ne re­kom­bi­na­ci­je u E. coli je RecA ko­ji pro­mi­če iz­mje­nu la­na­ca iz­me­đu ho­mo­log­nih mo­le­ku­la DNA što re­zul­ti­ra stva­ra­njem he­te­ro­dup­lek­sa (sl. 6-34). Ak­tiv­no­st pro­tei­ na RecA mo­že se opi­sa­ti u tri ko­ra­ka. RecA pro­tein se pr­vo ve­že za jed­no­ lan­ča­nu DNA, oba­vi­ja je ka­ko bi se stvo­ri­la nit sa­či­nje­na od pro­tei­na i DNA. Bu­du­ći da sad­r­ža­va tri raz­li­či­ta vez­na mjes­ta za DNA, pro­tein RecA ve­zan za jed­no­lan­ča­nu DNA mo­že ve­za­ti i dru­gu, dvo­lan­ča­nu mo­le­ku­lu DNA, stva­ra­ju­ći ta­ko kom­ple­ks iz­me­đu dvi­je mo­le­ku­le DNA. Ovo nes­pe­ ci­fič­no po­ve­zi­va­nje, pos­re­do­va­no pro­tei­nom RecA, pop­ra­će­no je spe­ci­fi­ čnim spa­ri­va­njem ba­za iz­me­đu jed­no­lan­ča­ne DNA i nje­nog kom­ple­men­ta. RecA za­tim ka­ta­li­zi­ra iz­mje­nu la­na­ca pri če­mu jed­no­lan­ča­ni kraj mo­le­ku­le

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

Sli­ka 6-33. Ini­ci­ja­ci­ja re­kom­bi­na­ci­je dvo­lan­ča­nim lo­mom.  Oba lan­ca DNA na mjes­tu dvo­lan­ča­nog lo­ma raz­gra­đe­na su nuk­lea­zom u 5'→3' smje­ru. Jed­no­lan­ča­ni kra­je­vi za­tim za­la­ze u dru­gu ro­di­telj­sku mo­le­ku­lu s po­mo­ću ho­mo­log­no­ga spa­ri­va­nja ba­za. Pu­ko­ti­ne se na­kon to­ga po­pu­nja­va­ju sin­te­zom DNA i zat­va­ra­ju li­ga­ci­jom stva­ra­ ju­ći dvos­tru­ku Hol­li­daye­vu ve­zu.

DNA, oba­vi­jen pro­tei­nom RecA, po­mi­če svoj ho­mo­log­ni la­nac ka­ko bi se stvo­rio he­te­ro­dup­le­ks. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, dva us­ko po­ve­za­na pro­tei­na, Ra­d51 i Dmc1 dje­lu­ju slič­no kao RecA. Ra­d51 je stal­no ek­spri­mi­ran dok je Dmc1 ek­s­ primi­ran sa­mo ti­je­kom me­jo­ze. Ra­d51 i Dmc1 se ve­žu za jed­no­lan­ča­nu DNA i stva­ra­ju ni­ti sa­či­nje­ne od pro­tei­na i DNA slič­ne oni­ma ko­je stva­ra Re­cA (sl. 6-35) i na sli­čan na­čin mo­gu ka­ta­li­zi­ra­ti reak­ci­je iz­mje­ne la­na­ca in vit­ro. Kod E. co­li, Hol­li­daye­ve ve­ze raz­r­je­ša­va­ju se kom­plek­som ko­ji je sas­tav­ ljen od tri pro­tei­na, RuvA, RuvB i RuvC (sl. 6-36). RuvA pre­poz­na­je Hol­ li­daye­vu ve­zu i reg­ru­ti­ra RuvB. RuvA i RuvB dje­lu­ju kao mo­tor ko­ji upra­ vlja mig­ra­ci­jom mjes­ta u ko­jem su uk­ri­že­ni lan­ci DNA mi­je­nja­ju­ći na taj na­čin ve­li­či­nu he­te­ro­dup­lek­sa i po­lo­žaj na ko­jem će uk­ri­že­ni lan­ci bi­ti po­ ki­da­ni i po­nov­no spo­je­ni. RuvC raz­r­je­šu­je Hol­li­daye­vu ve­zu ki­da­ju­ći uk­ri­ že­ne lan­ce DNA. Pro­ces zav­r­ša­va po­nov­nim spa­ja­njem pre­ki­nu­tih la­na­ca li­ga­ci­jom na taj na­čin da se stvo­re dvi­je re­kom­bi­nan­tne mo­le­ku­le. Eu­ka­

   231

232    POGLAVLJE 6

Sli­ka 6-34. Fun­kci­ja pro­tei­na RecA.  RecA se ini­ci­jal­no ve­že za jed­no­lan­ča­nu DNA stva­ra­ju­ći nit ko­ja se sas­to­ji od pro­tei­na i DNA. Pro­tein RecA ko­ji oba­vi­ja jed­no­lan­ča­nu DNA se za­tim ve­že za dru­gu, dvo­lan­ča­nu mo­le­ku­lu DNA stva­ra­ju­ći kom­ple­k s u ko­jem ne do­la­zi do spa­ri­va­nja ba­za. Na­kon to­ga sli­je­di kom­ple­men­tar­no spa­ri­va­nje ba­za i iz­mje­na la­na­ca pri če­mu nas­ta­ju he­te­ro­dup­lek­sna pod­ruč­ja.

riot­ske sta­ni­ce ne pos­je­du­ju ho­mo­lo­ge pro­tei­na RuvA, RuvB i RuvC ko­je na­la­zi­mo u E. co­li. Um­jes­to to­ga, raz­r­je­ša­va­nje Hol­li­daye­ve ve­ze u eu­ka­ riot­skim sta­ni­ca­ma pos­re­do­va­no je ne­kim dru­gim pro­tei­ni­ma ko­ji još ni­su u pot­pu­nos­ti ka­rak­te­ri­zi­ra­ni. En­do­nuk­leaz­ni kom­ple­ks naz­van Mu­s81-E­ me1 iden­ti­fi­ci­ran je kao mo­gu­ća re­zol­va­za Hol­li­daye­ve ve­ze u eu­ka­riot­ skim sta­ni­ca­ma no nje­go­vu fun­kci­ju u pot­pu­nos­ti tek tre­ba spoz­na­ti.

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

Sli­ka 6-35. RecA i Ra­d51 ni­ti gra­đe­ne od pro­tei­na i DNA.  Elek­tron­sko­mik­ro­skop­ ska fo­tog­ra­f i­ja ni­ti stvo­re­nih ve­za­njem pro­tei­na RecA E. coli i ljud­skog pro­tei­na Rad51 za DNA. (Iz S.C. We­st, 2003. Natu­re Rev.Mol.Cell.Biol. 4:1. Lju­baz­noš­ću A. Sta­siaka i S. Westa)

Pres­la­gi­va­nje DNA Ho­mo­log­na re­kom­bi­na­ci­ja re­zul­ti­ra pre­ras­pod­je­lom ge­na iz­me­đu ho­ mo­log­nih kro­mo­so­ma pri če­mu se ne mi­je­nja sad­rž­ aj ge­no­ma. Na­sup­rot to­mu, dru­ge vr­ste re­kom­bi­na­cij­skih do­ga­đa­ja do­vo­de do pres­la­gi­va­nja ge­ nom­ske DNA. Ne­ki od tih pres­la­gi­va­nja DNA važ­ni su u kon­tro­li ek­spre­ si­je ge­na u spe­ci­fič­nim ti­po­vi­ma sta­ni­ca, dok dru­gi pri­do­no­se ge­ne­tič­koj raz­no­li­kos­ti pri če­mu mo­gu bi­ti važ­ni za evo­lu­ci­ju. Ot­kri­će da se ge­ni mo­gu prem­ješ­ta­ti na raz­li­či­ta mjes­ta u kro­mo­so­mi­ ma pot­je­če iz is­tra­ži­va­nja ku­ku­ru­za ko­je je čet­r­de­se­tih go­di­na proš­lo­ga sto­ lje­ća pro­ve­la Bar­ba­ra McClin­to­ck. Ona je sa­mo na os­no­vi ge­ne­tič­ke ana­li­ ze opi­sa­la no­ve ge­ne­tič­ke ele­men­te ko­ji se mo­gu po­mi­ca­ti na raz­li­či­ta pod­ruč­ja u ge­no­mu ku­ku­ru­za te mi­je­nja­ti ek­spre­si­ju sus­jed­nih ge­na. No, proš­lo je sko­ro tri de­set­lje­ća pri­je no što je fi­zič­ka os­no­va nje­zi­na za­pa­ža­nja ras­vi­jet­lje­na ot­kri­ćem pok­ret­nih ele­me­na­ta u bak­te­ri­ja­ma či­me je ide­ja o pok­ret­nim ge­ne­tič­kim ele­men­ti­ma pos­ta­la ši­ro­ko prih­va­će­na od stra­ne znan­stve­ne jav­nos­ti. Da­nas je poz­na­to ne­ko­li­ko ti­po­va pres­la­gi­va­nja DNA ko­ji se zbi­va­ju u eu­ka­riot­skim i pro­ka­riot­skim ge­no­mi­ma, uk­lju­ču­ju­ći i prem­ješ­ta­nje ele­me­na­ta ko­je je pr­va opi­sa­la Bar­ba­ra McClin­to­ck. Na­da­lje, da­nas zna­mo da pok­ret­ni ge­ne­tič­ki ele­men­ti či­ne ve­li­ki dio ge­no­ma bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja, uk­lju­ču­ju­ći i ljud­ski ge­nom gdje je nji­hov udio go­to­vo 50%.

Sli­ka 6-36. Mig­ra­ci­ja uk­ri­že­nja i raz­r­je­še­nje Hol­li­daye­ve ve­ze.  RuvA pre­poz­na­je Hol­li­daye­vu ve­zu i mo­bi­li­zi­ra RuvB ko­ji ka­ta­li­zi­ra po­mi­ca­nje mjes­ta u ko­jem su lan­ ci uk­ri­že­ni (mig­ra­ci­ja uk­ri­že­nja). RuvC raz­r­je­ša­va Hol­li­daye­vu ve­zu cije­pa­ju­ći uk­ri­že­ne lan­ce ko­ji se za­tim spa­ja­ju dje­lo­va­njem li­ga­ze.

   233

234    POGLAVLJE 6

Mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ci­ja (en­gl. si­te-spe­ci­fic re­com­bi­na­tion)

Sli­ka 6-37. Struk­tu­ra imu­nog­lo­bu­li­ na.  Imu­nog­lo­bu­li­ni su gra­đe­ni od dva­ ju teš­kih i dva­ju la­kih la­na­ca spo­je­nih di­sul­f id­nim ve­za­ma. I teš­ki i la­ki lan­ci ima­ju va­ri­ja­bil­na i kon­stan­tna pod­ruč­ja.

6.3. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Ge­ni za la­ki la­nac. Ti­je­kom raz­vo­ja B-sta­ni­ca mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­ bi­na­ci­ja spa­ja pod­ruč­ja ge­na za la­ki la­nac imu­nog­lo­bu­li­ na što vo­di do stva­ra­nja je­din­stve­nih la­kih la­na­ ca imu­nog­lo­bu­li­na.

6.4. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Ge­ni za teš­ki la­nac. Ti­je­kom raz­vo­ja B-sta­ni­ca mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­ bi­na­ci­ja spa­ja pod­ruč­ja ge­na za teš­ki la­nac imu­nog­lo­bu­ li­na što vo­di do stva­ra­ nja je­din­stve­nih teš­kih la­na­ca imu­nog­lo­bu­ li­na.

Za raz­li­ku od uo­bi­ča­je­ne ho­mo­log­ne re­kom­bi­na­ci­je, ko­ja se do­ga­đa na sva­kom ve­ćem pod­ruč­ju ho­mo­lo­gi­je nuk­leo­tid­nih slje­do­va, mjes­nospe­ci­ fič­na re­kom­bi­na­ci­ja od­vi­ja se iz­me­đu spe­ci­fič­nih slje­do­va u pod­ruč­ji­ma DNA ma­nje ho­mo­log­nos­ti. Glav­na in­te­rak­ci­ja u ovom pro­ce­su ni­je pos­re­ do­va­na kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem ba­za već ak­tiv­noš­ću pro­tei­na ko­ji pre­poz­na­ju spe­ci­fič­ni cilj­ni sli­jed nuk­leo­ti­da. Mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ ci­ja sto­ga vo­di do prog­ra­mi­ra­nih pres­la­gi­va­nja DNA ko­ja ig­ra­ju važ­ne ulo­ ge u raz­vo­ju i re­gu­la­ci­ji ek­spre­si­je ge­na. Raz­voj imu­no­loš­kog sus­ta­va kra­lješ­nja­ka, ko­ji pre­poz­na­je stra­ne sup­ stan­ce (an­ti­ge­ne) i pru­ža zaš­ti­tu pro­tiv in­fek­tiv­nih agen­sa, pr­vi je prim­jer mjes­nospe­ci­fič­ne re­kom­bi­na­ci­je kod vi­ših eu­ka­rio­ta. Dvi­je su glav­ne sku­ pi­ne imu­nood­go­vo­ra pos­re­do­va­ne B i T-lim­fo­ci­ti­ma. B-lim­fo­ci­ti iz­lu­ču­ju pro­tu­ti­je­la (imu­nog­lo­bu­li­ni) ko­ja rea­gi­ra­ju s top­lji­vim an­ti­ge­ni­ma dok T‑lim­fo­ci­ti iz­lu­ču­ju pro­tei­ne sta­nič­ne pov­r­ši­ne (re­cep­to­ri T-sta­ni­ca) ko­ji rea­gi­ra­ju s an­ti­ge­ni­ma pri­sut­nim na pov­r­ši­ni dru­gih sta­ni­ca. Ključ­na oso­ bi­na imu­nog­lo­bu­li­na i re­cep­to­ra T-sta­ni­ca je­st nji­ho­va iz­nim­no ve­li­ka raz­ no­li­ko­st ko­ja omo­gu­ću­je pre­poz­na­va­nje ši­ro­ko­ga spek­tra stra­nih an­ti­ge­na. Ta­ko je prim­je­ri­ce sva­ka oso­ba spo­sob­na stvo­ri­ti vi­še od 1011 raz­li­či­tih pro­ tu­ti­je­la, što je znat­no vi­še od ukup­nog bro­ja ge­na u ge­no­mi­ma si­sa­va­ca (20.000–25.000). Ta raz­li­či­ta imu­nog­lo­bu­lin­ska pro­tu­ti­je­la (kao i re­cep­to­ri T-sta­ni­ca) ni­su ko­di­ra­na ge­ni­ma ger­mi­na­tiv­nih sta­ni­ca, već je­din­stve­nim lim­fo­cit­nim ge­ni­ma ko­ji nas­ta­ju ti­je­kom raz­vo­ja imu­no­loš­kog sus­ta­va kao re­zul­tat mjes­nospe­ci­fič­ne re­kom­bi­na­ci­je iz­me­đu raz­li­či­tih seg­me­na­ta imu­ nog­lo­bu­li­na i ge­na za re­cep­to­re T-sta­ni­ca. Ulo­gu mjes­nospe­ci­fič­ne re­kom­bi­na­ci­je u stva­ra­nju imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na pr­vi je put, 1976. go­di­ne, pri­ka­zao Su­su­mu To­ne­gawa. Imu­nog­lo­bu­ li­ni su gra­đe­ni od dva­ju iden­tič­nih pa­ro­va teš­kog i la­kog po­li­pep­tid­nog lan­ca (sl. 6-37). Oba lan­ca sad­rž­ a­va­ju kon­stan­tno pod­ruč­je na C-kra­ju te va­ri­ja­bil­na pod­ru­čja na N-kra­ju. Va­ri­ja­bil­na pod­ruč­ja, ko­ja ima­ju raz­li­čit sli­jed ami­no­ki­se­li­na u raz­li­či­tim imu­nog­lo­bu­lin­skim mo­le­ku­la­ma, od­go­ vor­na su za ve­za­nje an­ti­ge­na i up­ra­vo ta raz­no­li­ko­st ami­no­ki­se­lin­sko­ga sli­je­da va­ri­ja­bil­nog pod­ruč­ja omo­gu­ću­je raz­li­či­tim pro­tu­ti­je­li­ma da pre­ poz­na­ju spe­ci­fič­ne an­ti­ge­ne. Prem­da je sva­ka oso­ba u sta­nju stvo­ri­ti ši­rok spek­tar raz­li­či­tih pro­tu­ti­je­la, sva­ki B-lim­fo­cit stva­ra sa­mo je­dan tip pro­tu­ ti­je­la. S. To­ne­gawa ot­krio je da je sva­ko pro­tu­ti­je­lo ko­di­ra­no je­din­stve­nim ge­nom stvo­re­nim mjes­nospe­ci­fič­nom re­kom­bi­na­ci­jom ti­je­kom raz­vo­ja B‑lim­fo­ci­ta. Pres­la­gi­va­nje ge­na stva­ra raz­li­či­te imu­nog­lo­bu­lin­ske ge­ne u raz­li­či­tim B-lim­fo­ci­ti­ma ta­ko da je po­pu­la­ci­ja od ot­pri­li­ke 1012 B-lim­fo­ci­ta čov­ječ­je­ga ti­je­la spo­sob­na stvo­ri­ti pro­tu­ti­je­la pro­tiv ši­ro­kog spek­tra stra­nih an­ti­ge­na. Ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju la­ke lan­ce imu­nog­lo­bu­li­na gra­đe­ni su od tri pod­ruč­ ja: V-pod­ruč­ja ko­je ko­di­ra 95–96 N-ter­mi­nal­nih ami­no­ki­se­li­na va­ri­ja­bil­ nog pod­ruč­ja po­li­pep­ti­da, J-pod­ruč­ja (en­gl. joi­ni­ng re­gion) ko­je ko­di­ra 12–14 C-ter­mi­nal­nih ami­no­ki­se­li­na va­ri­ja­bil­nog pod­ruč­ja pro­tei­na i C‑pod­ruč­ja ko­je ko­di­ra kon­stan­tnu regi­ju po­li­pep­ti­da (sl. 6-38). Glav­na sku­pi­na ge­na la­ko­ga lan­ca u mi­še­va for­mi­ra se kom­bi­na­ci­jom ot­pri­li­ke 150 V-pod­ruč­ja i 4 J-pod­ruč­ja s jed­nim C-pod­ruč­jem. Ti­je­kom raz­vo­ja lim­fo­ ci­ta mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ci­ja do­vo­di do pres­la­gi­va­nja ge­na – jed­no V-pod­ruč­je re­kom­bi­ni­ra s jed­nim J-pod­ruč­jem stva­ra­ju­ći fun­kcio­nal­ni gen la­ko­ga lan­ca. Raz­li­či­ta V i J-pod­ruč­ja re­kom­bi­ni­ra­ju u raz­li­či­tim B-lim­fo­ ci­ti­ma ta­ko da mo­gu­će kom­bi­ni­ra­nje 150 V-pod­ruč­ja s 4 J-pod­ruč­ja mo­že stvo­ri­ti ot­pri­li­ke 600 (4 × 150) je­din­stve­nih la­kih la­na­ca.

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

Ge­ni teš­ko­ga lan­ca sad­r­ža­va­ju čet­vr­to pod­ruč­je poz­na­to kao D-pod­ruč­ je (en­gl. di­ver­si­ty) ko­je ko­di­ra ami­no­ki­se­li­ne smješ­te­ne iz­me­đu V i J-pod­ ruč­ja (sl. 6-39). Stva­ra­nje fun­kcio­nal­no­ga ge­na teš­ko­ga lan­ca zah­ti­je­va dva re­kom­bi­na­cij­ska do­ga­đa­ja. D-pod­ruč­je se pr­vo re­kom­bi­ni­ra s J-pod­ruč­ jem, a za­tim se V-pod­ruč­je re­kom­bi­ni­ra s pres­lo­že­nim DJ-pod­ruč­jem. Kod mi­še­va pos­to­ji oko 150 V-pod­ruč­ja teš­kih la­na­ca, 12 D-pod­ruč­ja i 4 J-pod­ ru­č­ja, ta­ko da ukup­ni broj teš­kih la­na­ca ko­ji mo­že bi­ti stvo­ren re­kom­bi­na­ cij­skim do­ga­đa­ji­ma iz­no­si 7.200 (150 × 12 × 4). Kom­bi­ni­ra­nje ot­pri­li­ke 600 raz­li­či­tih la­kih la­na­ca i 7.000 teš­kih la­na­ca stvo­re­nih mjes­nospe­ci­fič­nom re­kom­bi­na­ci­jom mo­že proiz­ves­ti oko 4 × 106 raz­li­či­tih imu­nog­lo­bu­lin­skih mo­le­ku­la. Raz­no­li­ko­st je na­da­lje po­ve­ća­na

   235

Sli­ka 6-38. Pres­la­gi­va­nje imu­nog­lo­bu­ lin­skih ge­na za la­ke lan­ce.  Sva­ki gen za la­ki la­nac (pri­ka­za­n je miš­ji κ la­ki la­ nac) sas­to­ji se od kon­stan­tno­ga pod­ruč­ja (C), spa­ja­ju­će­ga pod­ruč­ja (J) i va­ri­ja­bil­no­ ga pod­ruč­ja (V). Pos­to­ji ot­pri­li­ke 250 raz­ li­či­tih va­ri­ja­bil­nih pod­ruč­ja ko­ja su u ger­ mi­na­tiv­nim sta­ni­ca­ma od­vo­je­na od J i C sa ot­pri­li­ke 20 kb. Ti­je­kom raz­vo­ja B‑lim­ fo­ci­ta mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ci­ja spa­ja jed­no od V-pod­ruč­ja s jed­nim od če­ti­ri J-pod­ruč­ja. Ovo pres­la­gi­va­nje ak­ti­ vi­ra tran­skrip­ci­ju što re­zul­ti­ra stva­ra­njem pri­mar­nog tran­skrip­ta ko­ji sa­dr­ža­va pre­ slo­že­no VJ-pod­ruč­je za­jed­no s preos­ta­lim J-pod­ruč­ji­ma i C-pod­ruč­jem. Preos­ta­la neu­po­rab­lje­na J-pod­ruč­ja i in­tro­ni iz­me­ đu J i C se na­kon to­ga uk­la­nja­ju prek­ra­ja­ njem stva­ra­ju­ći fun­kcio­nal­nu mR­NA.

Sli­ka 6-39. Pres­la­gi­va­nje ge­na za teš­ke lan­ce imu­nog­lo­bu­li­ na.  Ge­ni teš­kih la­na­ca uz V, J i C sad­r­ža­va­ju i D-pod­ruč­ja. Pr­vo se spa­ja­ju D i J-pod­ruč­je. Za­tim se V-pod­ruč­je spa­ja s pres­lo­že­ nim DJ-seg­men­tom. In­tro­ni iz­ me­đu J i C uk­la­nja­ju se prek­ra­ ja­njem i nas­ta­je mR­NA teš­ko­ga lan­ca.

236    POGLAVLJE 6

KL JUČNI POKUS

Pres­la­gi­va­nje imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na Evi­den­ce for So­ma­tic Rear­ran­ge­me­nt of Im­mu­nog­lo­bu­lin Ge­nes Co­di­ng for Va­riab­le and Con­sta­nt Re­gio­ns No­bu­mic­hi Ho­zu­mi and Su­su­mu To­ne­gawa Ba­sel In­sti­tu­te for Im­mu­no­lo­gy, Ba­sel, Swit­zer­la­nd Pro­cee­din­gs of the Na­tio­nal Aca­de­my of Scien­ces, USA, vol. 73, 1976, str. 3628–3632

Kon­tek­st Spo­sob­no­st imu­no­loš­kog sus­ta­va kra­ ljež­nja­ka da pre­poz­na­ju bes­ko­nač­no mnoš­tvo stra­nih mo­le­ku­la (an­ti­ge­na) upu­ću­je na to da lim­fo­ci­ti mo­gu stvo­ ri­ti od­go­va­ra­ju­ći ši­ro­ki spek­tar pro­tu­ ti­je­la. Ka­ko je raz­no­li­ko­st pro­tu­ti­je­la os­no­va imu­no­loš­kog pre­poz­na­va­nja, ra­zu­mi­je­va­nje me­ha­niz­ma s po­mo­ću ko­je­ga je na iz­gled neog­ra­ni­čen broj imu­nog­lo­bu­li­na ko­di­ran ge­nom­skom DNA pred­stav­lja sre­diš­nju te­mu imu­ no­lo­gi­je. Pri­je ek­spe­ri­me­na­ta ko­je su pro­ve­li Ho­ zu­mi i To­ne­gawa, od­re­đi­va­nje ami­no­ki­ se­lin­skog sli­je­da ve­li­kog bro­ja imu­no­ glo­bu­lin­skih mo­le­ku­la po­ka­za­lo je da su la­ki i teš­ki la­nac gra­đe­ni od za­seb­nih va­ri­ja­bil­nih i kon­stan­tnih pod­ruč­ja. Ge­ ne­tič­ka su is­pi­ti­va­nja na­da­lje po­ka­za­la da mi­še­vi nas­lje­đu­ju sa­mo jed­nu ko­pi­ ju ge­na za kon­stan­tno pod­ruč­je. Ovo je opa­ža­nje su­ge­ri­ra­lo da su imu­nog­ lo­bu­li­ni ko­di­ra­ni vi­šes­tru­kim ge­ni­ma za va­ri­ja­bil­no pod­ruč­je ko­ji se mo­gu zdru­ ži­ti s jed­nim ge­nom kon­stan­tnog pod­ ruč­ja. Ho­zu­mi­je­vo i To­ne­gawi­no ot­kri­će pres­la­gi­va­nja imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na pru­ži­lo je pr­vu iz­rav­nu ek­spe­ri­men­ tal­nu pot­po­ru ove hi­po­te­ze i po­lo­ži­lo te­me­lje za ra­zu­mi­je­va­nje mo­le­ku­lar­ne os­no­ve raz­li­či­tos­ti pro­tu­ti­je­la.

te­me­lju uzor­ka ki­da­nja DNA s res­trik­cij­ skim en­do­nuk­lea­za­ma. DNA em­bri­ja i plaz­mo­ci­to­ma raz­gra­đe­ne su res­trik­cij­ skom en­do­nuk­lea­zom BamHI, a ulom­ ci DNA raz­li­či­tih ve­li­či­na raz­dvo­je­ni su elek­tro­fo­re­zom u aga­roz­nom ge­lu. Za­tim su iz ge­la iz­re­za­na pod­ruč­ja s od­go­va­ra­ju­ćim frag­men­ti­ma, a iz njih izo­li­ra­na DNA hib­ri­di­zi­ra­na je s ra­dioak­ tiv­no obi­lje­že­nim son­da­ma ko­je su do­

Susumu Tonegawa bi­ve­ne iz imu­nog­lo­bu­lin­skih mo­le­ku­la mR­NA izo­li­ra­nih iz sta­ni­ca plaz­mo­ci­to­ ma. Upo­rab­lje­ne su dvi­je son­de ko­je od­go­va­ra­ju kom­plet­noj imu­no­glo­bu­ lin­skoj mo­le­ku­li mR­NA ili 3' kra­ju mR­ NA gra­đe­nom sa­mo od sli­je­da za kon­ stan­tno pod­ruč­je.

Ek­spe­ri­men­ti Ho­zu­mi i To­ne­gawa ek­spe­ri­men­tal­no su is­pi­ta­li mo­guć­no­st da se ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju va­ri­ja­bil­no i kon­stan­tno pod­ ruč­je imu­nog­lo­bu­li­na spa­ja­ju na ra­zi­ni DNA ti­je­kom raz­vo­ja lim­fo­ci­ta. Us­po­re­ di­li su or­ga­ni­za­ci­ju slje­do­va va­ri­ja­bil­nih i kon­stan­tnih pod­ruč­ja u DNA izo­li­ra­ noj iz miš­jih em­bri­ja i sta­ni­ca miš­jeg plaz­mo­ci­to­ma (tu­mor B-lim­fo­ci­ta ko­ji stva­ra jed­nu vr­stu imu­nog­lo­bu­li­na) na

Gel-elektroforeza DNA izolirane iz embrija i plazmocitoma te razgrađene s BamHI i hibridizirane sa sondama koje odgovaraju ili cijeloj ili 3' području plazmocitomske mRNA. Podatci su prikazani kao radioaktivnost detektirana u hibridnim molekulama s DNA izoliranom iz izrezanih područja gela s odgovarajućim fragmentima.

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   237

KL JUČNI POKUS Zna­ča­jan re­zul­tat bi­lo je ot­kri­će u pot­ pu­nos­ti raz­li­či­tih ob­ra­za­ca za slje­do­ve va­ri­ja­bil­nog i kon­stan­tnog pod­ruč­ja iz­me­đu DNA em­bri­ja i DNA izo­li­ra­ne iz plaz­mo­ci­to­ma (vi­di sli­ku). U DNA em­ bri­ja kom­plet­na son­da hib­ri­di­zi­ra s dva BamHI ulom­ka od 8,6 i 5,6 kb. Sa­mo 8,6 kb ulo­mak hib­ri­di­zi­ra s 3' son­dom, što su­ge­ri­ra da taj ulo­mak sad­r­ža­va sli­jed kon­stan­tnog pod­ruč­ja, a da ulo­ mak od 5,6 kb sad­r­ža­va sli­jed va­ri­ja­bil­ nog pod­ruč­ja. U pot­pu­nos­ti sup­rot­no to­mu, ob­je son­de hib­ri­di­zi­ra­le su sa sa­ mo jed­nim 3,4 kb du­gim frag­men­tom DNA plaz­mo­ci­to­ma. In­ter­pre­ta­ci­ja ovih re­zul­ta­ta bi­la je da su se slje­do­vi va­ri­ ja­bil­nog i kon­stan­tnog pod­ruč­ja ko­ji su u DNA em­bri­ja od­vo­je­ni pres­lo­ži­li

ti­je­kom raz­vo­ja lim­fo­ci­ta da­ju­ći je­dan imu­nog­lo­bu­lin­ski gen.

Ut­je­caj Re­zul­ta­ti ko­je su do­bi­li Ho­zu­mi i To­ ne­gawa, zas­no­va­ni na re­la­tiv­no in­di­ rek­tnom pris­tu­pu ma­pi­ra­nja res­trik­cij­ skim en­do­nuk­lea­za­ma pot­vr­đe­ni su i pro­ši­re­ni mo­le­ku­lar­nim klo­ni­ra­njem i sek­ven­ci­ra­njem imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­ na. Tak­va is­tra­ži­va­nja su da­nas ned­vos­ mis­le­no ut­vr­di­la da se ovi ge­ni stva­ra­ju mjes­nospe­ci­fič­nom re­kom­bi­na­ci­jom za­seb­nih slje­do­va DNA B-lim­fo­ci­ta. Slič­no pres­la­gi­va­nje DNA u T-lim­fo­ci­ti­ ma od­go­vor­no je za stva­ra­nje ge­na ko­ ji ko­di­ra­ju re­cep­to­re T-sta­ni­ca. Sto­ga su mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ci­ja i prog­

sto­ga što spa­ja­nje seg­me­na­ta imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na čes­to uk­lju­ču­je gu­ bi­tak ili do­da­tak od jed­no­ga do ne­ko­li­ko nuk­leo­ti­da. Mu­ta­ci­je proi­zaš­le zbog tih de­le­ci­ja i in­ser­ci­ja po­ve­ća­va­ju raz­no­li­ko­st va­ri­ja­bil­nih pod­ruč­ja imu­nog­lo­bu­li­na za oko 100 pu­ta, što od­go­va­ra for­mi­ra­nju ot­pri­li­ke 105 raz­li­či­tih la­kih la­na­ca i 106 teš­kih la­na­ca ko­ji se za­tim mo­gu kom­bi­ni­ra­ti stva­ra­ju­ći vi­še od 1011 raz­li­či­tih pro­tu­ti­je­la. Slič­no su gra­đe­ni re­cep­to­ri T-lim­fo­ci­ta ko­ji ima­ju dva lan­ca (naz­va­na α i β), a sva­ki od njih sad­r­ža­va va­ri­ja­bil­na i kon­stan­tna pod­ruč­ja (sl. 6-40). Ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju ove po­li­pep­ti­de stva­ra­ju se re­kom­bi­na­ci­jom iz­me­đu V i J-pod­ruč­ja (α-la­nac) ili iz­me­đu V, D i J-pod­ruč­ja (β-la­nac), ana­log­no stva­ ra­nju imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na. Mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ci­ja iz­me­đu tih raz­li­či­tih pod­ruč­ja DNA, a ta­ko­đer i mu­ta­ci­je ko­je su se do­go­di­le ti­je­ kom re­kom­bi­na­ci­je, stva­ra­ju stu­panj raz­no­li­kos­ti re­cep­to­ra T-sta­ni­ca sli­čan ono­me imu­nog­lo­bu­li­na. V(D)J re­kom­bi­na­ci­ja pos­re­do­va­na je kom­plek­som ko­ji či­ne dva pro­tei­ na, RA­G1 i RA­G2, ko­ji su spe­ci­fič­no ek­spri­mi­ra­ni u lim­fo­ci­ti­ma. RAG pro­ tei­ni pre­poz­na­ju ta­koz­va­ne slje­do­ve re­kom­bi­na­cij­skog sig­na­la (RS) smješ­ te­ne uz ko­di­ra­ju­će slje­do­ve sva­ko­ga gen­skog pod­ruč­ja i po­ti­ču pres­la­gi­va­nje DNA uvo­đe­njem dvo­lan­ča­nog lo­ma iz­me­đu RS-sli­je­da i ko­di­ra­ju­ćeg sli­je­ da (sl. 6-41). Ko­di­ra­ju­ći kra­je­vi gen­skih pod­ruč­ja za­tim se spa­ja­ju stva­ra­ ju­ći pres­lo­že­ne imu­nog­lo­bu­li­ne ili ge­ne za re­cep­to­re T-sta­ni­ca. Ka­ko se ovi dvo­lan­ča­ni lo­mo­vi spa­ja­ju pos­tup­kom ne­homolog­nog spa­ja­nja kra­je­va (v. sl. 6-28), ti­je­kom reak­ci­ja spa­ja­nja se vr­lo čes­to do­ga­đa gu­bi­tak nuk­leo­ti­da. Uz to, lim­fo­ci­ti ima­ju spe­ci­ja­li­zi­ra­ni en­zim (ter­mi­nal­na deok­si­nuk­leo­ti­

Sli­ka 6-40. Struk­tu­ra re­cep­to­ra T-sta­ni­ca.  Re­cep­to­ri T-sta­ni­ca gra­đe­ni su od dva­ju po­li­pep­tid­nih la­na­ca (α i β) ko­ji se pro­te­žu kroz sta­nič­nu mem­bra­nu, a me­đu­sob­no su spo­je­ni di­sul­f id­nim ve­za­ma. I α- i β-lan­ci gra­đe­ni su od va­ri­ja­bil­nih i kon­stan­tnih pod­ruč­ja.

ra­mi­ra­no pres­la­gi­va­nje ge­na os­no­va za raz­voj imu­no­loš­kog sus­ta­va. Dalj­nja is­tra­ži­va­nja po­ka­za­la su da va­ ri­ja­bil­na pod­ruč­ja imu­nog­lo­bu­li­na i re­cep­to­ra T-sta­ni­ca nas­ta­ju pres­la­gi­va­ njem dva­ju od tri raz­li­či­ta seg­men­ta DNA. Spo­sob­no­st re­kom­bi­na­ci­je ovih seg­me­na­ta, za­jed­no s vi­so­kom učes­ ta­loš­ću mu­ta­ci­ja na mjes­tu re­kom­bi­ na­ci­je, ve­ćim su di­je­lom od­go­vor­ni za raz­li­či­to­st imu­nog­lo­bu­li­na i re­cep­to­ra T-sta­ni­ca. Ot­kri­će pres­la­gi­va­nja imu­nog­lo­bu­lin­ skih ge­na zbog to­ga pred­stav­lja os­ no­vu za ra­zu­mi­je­va­nje na ko­ji na­čin imu­no­loš­ki sus­tav mo­že pre­poz­na­ti i od­go­vo­ri­ti na dos­lov­no neog­ra­ni­čen ras­pon stra­nih sup­stan­ci.

238    POGLAVLJE 6 Sli­ka 6-41. V(D)J re­kom­bi­na­ci­ja.  Ko­ di­ra­ju­ći di­je­lo­vi imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na i ge­na za re­cep­to­re T-sta­ni­ca (prim­je­ri­ ce V i D-pod­ruč­je) ome­đe­ni su krat­kim slje­do­vi­ma re­kom­bi­na­cij­skih sig­na­la (RS) ko­ji se na­la­ze u sup­rot­nim ori­jen­ta­ci­ja­ ma na 5' i 3' kra­je­vi­ma ko­di­ra­ju­ćih slje­ do­va. RS‑slje­do­ve pre­poz­na­je kom­ple­k s re­kom­bi­na­cij­skih pro­tei­na spe­ci­f ič­nih za lim­fo­ci­te, RA­G1 i RA­G2, ko­ji ki­da­ju DNA iz­me­đu ko­di­ra­ju­ćih i RS-slje­do­va. Pre­ki­ nu­ti ko­di­ra­ju­ći lan­ci se za­tim po­nov­no spa­ja­ju i tvo­re pres­lo­že­ni seg­me­nt ge­na. Mu­ta­ci­je su re­zul­tat gu­bit­ka ba­za na kra­ je­vi­ma ti­je­kom spa­ja­nja ne­ho­mo­log­nih kra­je­va kao i zbog do­da­va­nja ba­za ter­ mi­nal­nom deok­si­nuk­leo­ti­dil-tran­sfe­ra­ zom.

▶▶ Mutacije u ge­ni­ma RA­G1 i

RA­G2 mo­gu do­ves­ti do teš­ke kom­bi­ni­ra­ne imu­no­de­fic­ i­jen­ci­je (SCID – engl. se­ve­re com­bi­ned im­mu­no­de­fi­cien­cy). Obo­lje­li se ra­đa­ju bez fun­kcio­nal­nog imu­ no­loš­kog sus­ta­va i raz­vi­ja­ju smr­to­nos­ne in­fek­ci­je uko­li­ko se ne li­je­če. Li­je­če­nje uk­lju­ču­je ži­ vot u oko­li­šu bez ba­ci­la (u plas­ tič­nim »ba­lo­ni­ma«), tran­splan­ ta­ci­ju ma­ti­č­nih sta­ni­ca ko­je će stvo­ri­ti fun­kcio­nal­ni imu­no­loš­ki sus­tav te gen­sku te­ra­pi­ju.

dil‑tran­sfe­ra­za) ko­ji na­sum­ce do­da­je nuk­leo­ti­de na kra­je­ve mo­le­ku­la DNA. Sto­ga tije­kom reak­ci­je spa­ja­nja, kao re­zul­tat gu­bit­ka ili do­da­va­nja nuk­leo­ ti­da, nas­ta­ju mu­ta­ci­je. Kao što je spo­me­nu­to, ove mu­ta­ci­je znat­no pri­do­ no­se raz­no­li­kos­ti imu­nog­lo­buli­na i re­cep­to­ra T-sta­ni­ca. Do­dat­na raz­nov­r­sno­st pro­tu­ti­je­la stva­ra se na­kon ­stva­ra­nja pres­lo­že­nih imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na kroz dva pro­ce­sa ko­ja se od­vi­ja­ju­ sa­mo u B-lim­ fo­ci­ti­ma: re­kom­bi­na­ci­ja prom­je­ne kla­se i so­mat­ska hi­per­mu­ta­ci­ja. Rekom­ bi­na­ci­ja prom­je­ne kla­se re­zul­ti­ra zdru­ži­va­njem pres­lo­že­nih pod­ruč­ja s raz­li­či­tim kon­stan­tnim pod­ruč­ji­ma teš­kog lan­ca. To vo­di do stva­ra­nja pro­ tu­ti­je­la s raz­li­či­tim fun­kcio­nal­nim ulo­ga­ma u imu­no­loš­kom od­go­vo­ru. Si­ sav­ci stva­ra­ju če­ti­ri raz­li­či­te kla­se imu­nog­lo­bu­li­na – IgM, IgG, IgE i IgA – s teš­kim lan­ci­ma ko­ji su ko­di­ra­ni va­ri­ja­bil­nim pod­ruč­jem zdru­že­nim s kon­ stan­tnim re­gi­ja­ma Cµ, Cγ, Cε i Cα. Uz to, pos­to­ji ne­ko­li­ko pot­kla­sa IgG ko­je su ko­di­ra­ne raz­li­či­tim Cγ pod­ruč­ji­ma. Raz­li­či­te kla­se imu­nog­lo­bu­li­na

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   239

spe­ci­ja­li­zi­ra­ne su da uk­la­nja­ju antigene na raz­li­či­te na­či­ne. IgM ak­ti­vi­ra kom­ple­me­nt (sku­pi­na se­rum­skih pro­tei­na ko­ji uniš­ta­va­ju sta­ni­ce ko­je na­ pa­da­ju ili vi­ru­se, ta­ko da su pro­tu­ti­je­la IgM efek­tna pr­va li­ni­ja obra­ne pro­ tiv bak­te­rij­skih ili vi­rus­nih in­fek­ci­ja. Pro­tu­ti­je­la IgG, naj­broj­ni­ji imu­nog­lo­ bu­li­ni u se­ru­mu, ne sa­mo da ak­ti­vi­ra­ju kom­ple­me­nt već ta­ko­đer ve­žu re­cep­to­re na fa­go­ci­tič­nim sta­ni­ca­ma. Uz to, pro­tu­ti­je­la IgG iz maj­či­ne cir­ ku­la­ci­je mo­gu pro­ći kroz pla­cen­tu i ta­ko fe­tu­su pru­ži­ti imu­no­loš­ku zaš­ti­tu. Pro­tu­ti­je­la IgA se iz­lu­ču­ju u raz­li­či­te tje­les­ne te­ku­ći­ne kao što su sluz iz no­sa i sli­na gdje se mo­gu ve­za­ti i uk­lo­ni­ti bak­te­ri­je i vi­ru­se ka­ko bi spri­je­ či­li in­fek­ci­ju. Pro­tu­ti­je­la IgA se ta­ko­đer iz­lu­ču­ju u mli­je­ko maj­ki ko­je do­je pa ta­ko pru­ža­ju imu­no­loš­ku zaš­ti­tu no­vo­ro­đen­ča­di. Pro­tu­ti­je­la IgE su učin­ ko­vi­ta u zaš­ti­ti pro­tiv pa­ra­zit­skih in­fek­ci­ja te su ta­ko­đer kla­sa pro­tu­ti­je­la od­go­vor­nih za aler­gi­je. Po­čet­no pres­la­gi­va­nje V(D)J stva­ra prom­je­nji­va pod­ruč­ja zdru­že­na s Cµ što re­zul­ti­ra stva­ra­njem IgM pro­tu­ti­je­la. Re­kom­bi­na­ci­ja prom­je­ne kla­se za­tim pre­no­si pres­lo­že­na va­ri­ja­bil­na pod­ruč­ja niz­vod­no do no­vog kon­ stan­tnog pod­ruč­ja pri čemu se de­le­ti­ra pos­red­nič­ka DNA (sl. 6-42). Re­ kom­bi­na­ci­ja se do­ga­đa iz­me­đu vi­so­ko­po­nav­lja­ju­ćih sl­je­do­va u pod­ruč­ji­ma prom­je­ne (S) (e­ngl. swit­ch re­gio­ns) koja su smješ­te­na od­mah uz­vod­no od sva­kog C-pod­ruč­ja. Pod­ruč­ja pro­mjene su du­ga 2–10 kb i re­kom­bi­na­ci­ja se mo­že do­ga­đa­ti bi­lo gdje unu­tar tih pod­ruč­ja ta­ko da je prom­je­na kla­se re­kom­bi­na­cij­ski do­ga­đaj ko­ji se vi­še od­no­si na spe­ci­fič­no pod­ruč­je ne­go na spe­ci­fič­no mjes­to. Ob­zi­rom da su pod­ruč­ja prom­je­ne unu­tar in­tro­na, pre­ciz­no mjes­to na ko­jem se do­ga­đa re­kom­bi­na­ci­ja prom­je­ne ne ut­je­če na slje­do­ve ko­ji ko­di­ra­ju za imu­nog­lo­bu­li­ne. So­mat­ska hi­per­mu­ta­ci­ja po­ve­ća­va raz­no­li­ko­st imu­nog­lo­bu­li­na ta­ko što stva­ra vi­šes­tru­ke mu­ta­ci­je unu­tar pres­lo­že­nih va­ri­ja­bil­nih pod­ruč­ja teš­kih i la­kih la­na­ca. Ove mu­ta­ci­je, u prin­ci­pu su to zam­je­ne jed­ne ba­ze, do­ga­đa­ ju se frek­ven­ci­jom od 10-3, oko mi­li­jun pu­ta vi­še od uo­bi­ča­je­ne br­zi­ne ko­ jom se do­ga­đa­ju spon­ta­ne mu­ta­ci­je. Te mu­ta­ci­je do­vo­de do stva­ra­nja imu­ nog­lo­bu­li­na sa znat­no po­ve­ća­nim afi­ni­te­tom za antigene i sto­ga su bit­ne za učin­ko­vi­ti imu­no­loš­ki od­go­vor. Re­kom­bi­na­ci­ja prom­je­ne kla­se i so­mat­ska hi­per­mu­ta­ci­ja su no­vi ti­po­vi prog­ra­mi­ra­nih ge­net­skih prom­je­na, a mo­le­ku­lar­ni me­ha­niz­mi ko­ji su u to uk­lju­če­ni vr­lo su ak­tiv­na pod­ruč­ja is­tra­ži­va­nja. Ključ­nu ulo­gu u oba pro­ ce­sa ima en­zim ak­ti­va­ci­jom in­du­ci­ra­na dea­mi­na­za (AID – engl. ac­ti­va­ tio­n-in­du­ced dea­mi­na­se) ko­ji je 1999. go­di­ne ot­krio Ta­su­ku Ho­njo i nje­go­ vi su­rad­ni­ci. AID je ek­spri­mi­ra­na sa­mo u B-lim­fo­ci­ti­ma i pot­reb­na je i za re­kom­bi­na­ci­ju prom­je­ne kla­se i so­mat­sku hi­per­mu­ta­ci­ju. AID ka­ta­li­zi­ra

Sli­ka 6-42. Re­kom­bi­na­ci­ja prom­je­ne kla­se.  Prom­je­na kla­se do­ga­đa se re­kom­ bi­na­ci­jom iz­me­đu po­nav­lja­ju­ćeg pod­ruč­ja prom­je­ne (S) uz­vod­no od ni­za kon­stant­ nih pod­ru­č­ja (C) u lo­ku­su za teš­ki la­nac (pri­ka­zan je lo­kus kod mi­ša). U pri­ka­za­ nom prim­je­ru, V(D)J-pod­ruč­je pre­no­si se sa Cµ do Cγ1 re­kom­bi­na­ci­jom iz­me­đu Sµ i Sγ1 pod­ruč­ja prom­je­ne. Pos­red­nič­ka DNA iz­re­zu­je se kao kruž­na mo­le­ku­la.

240    POGLAVLJE 6 Sli­ka 6-43. Mo­del za ulo­gu ak­ti­va­ci­jom in­du­ci­ra­ne dea­mi­na­ze (AID) u so­mat­skoj hi­per­mu­ta­ci­ji i re­kom­bi­na­ci­ji prom­je­ne kla­se.  AID dea­ mi­ni­ra C u U u DNA. Uk­la­nja­nje U po­p­ra­v­kom iz­re­zi­va­njem ba­ze (v. sl. 6-21) os­tav­lja jed­no­lan­ča­nu pu­ko­ti­nu u DNA. U va­ri­ja­bil­nim pod­ruč­ji­ma (V), gr­ješ­ke ti­je­kom pop­rav­ka mo­gu do­ves­ti do so­mat­ske hi­per­mu­ta­ci­je što je naj­vje­ro­jat­ni­je re­zul­tat dje­lo­va­nja spe­ci­ja­li­zi­ra­ne grješ­ka­ma sklo­ne DNA‑po­li­me­ra­ze (v. sl. 6-27). U pod­ruč­ji­ma prom­je­ne (S), iz­re­zi­va­nje ba­za na­sup­rot­nih la­na­ca mo­že re­zul­ti­ra­ti dvo­lan­ča­nim lo­mo­vi­ma što sti­mu­li­ra re­kom­bi­na­ci­ju prom­je­ne ba­za.

dea­mi­na­ci­ju ci­to­zi­na u DNA u ura­cil (sl. 6-43). Nje­no dje­lo­va­ nje re­zul­ti­ra prom­je­nom C→U u va­ri­ja­bil­nim pod­ruč­ji­ma i pod­ru­č­ji­ma prom­je­ne ge­na za imu­nog­lo­bu­li­ne, a to do­vo­di do re­kom­bi­na­ci­je prom­je­ne kla­sa i so­mat­ske hi­per­mu­ta­ci­je. Me­ha­ niz­mi ko­ji­ma mu­ta­ci­je C→U po­ti­ču ove pro­ce­se ni­su u pot­pu­ nos­ti jas­ni, no či­ni se da je va­žan ko­rak uk­la­nja­nje U pop­rav­ kom iz­re­zi­va­njem ba­ze (v. sl. 6-21). U pod­ruč­ji­ma prom­je­ne (ko­ja ima­ju ve­li­ki sad­r­žaj GC-pa­ro­va ba­za) dvo­lan­ča­ni lo­mo­vi se stva­ra­ju iz­re­zi­va­njem ura­ci­la na na­sup­rot­nim lan­ci­ma. Re­ kom­bi­na­ci­ja pro­m­je­ne kla­se re­zul­tat je po­nov­nog spa­ja­nja ovih po­ci­je­pa­nih di­je­lo­va u raz­li­či­tim re­gi­ja­ma prom­je­ne ne­ho­mo­ log­nim spa­ja­njem kra­je­va (v. sl. 6-28). Smat­ra se da je u va­ri­ja­ bil­nim pod­ruč­ji­ma so­mat­ska hi­per­mu­ta­ci­ja re­zul­tat ve­li­ke učes­ ta­los­ti pog­r­je­ša­ka ti­je­kom pop­rav­ka mu­ta­ci­ja C→U do ko­jeg vje­ro­jat­no do­la­zi zbog pop­rav­ka spe­ci­ja­li­zi­ra­nim DNA-po­li­me­ra­za­ma ko­je su sk­lo­ne gr­ješ­ka­ma (v. sl. 6-27). Ia­ko de­ta­lje ovih pro­ce­sa tek tre­ba ras­vi­ jet­li­ti, jas­no je da je AID iz­nim­no za­nim­ljiv en­zim s no­vom ulo­gom uvo­ đe­nja mu­ta­ci­ja u DNA u spe­ci­fič­noj fa­zi raz­vo­ja.

Tran­spo­zi­ci­ja pos­re­do­va­na DNA in­ter­me­di­ja­ri­ma Mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ci­ja od­vi­ja se iz­me­đu dva spe­ci­fič­na sli­je­da ko­ji pos­je­du­ju ba­rem ma­lo ho­mo­lo­gi­je. Za raz­li­ku od to­ga, tran­spo­zi­ci­ja uk­lju­ču­je prem­ješ­ta­nje slje­do­va unu­tar ge­no­ma i ne zah­ti­je­va ho­mo­lo­gi­ju nuk­leo­tid­nih slje­do­va. Ele­men­ti ko­ji se prem­ješ­ta­ju tran­spo­zi­ci­jom, po­put onih ko­je je pr­va opi­sa­la McClin­to­ck, zo­vu se pok­ret­ni ele­men­ti (en­gl. tran­spo­sab­le ele­men­ts) ili tran­spo­zo­ni. Oni se di­je­le u dvi­je op­će sku­pi­ne ovis­no o to­me prem­ješ­ta­ju li se pu­tem DNA ili RNA in­ter­me­di­ja­ra. Pr­vi de­talj­no opi­sa­ni tran­spo­zo­ni ko­ji se prem­ješ­ta­ju pu­tem DNA in­ter­ me­di­ja­ra na­đe­ni su u bak­te­ri­ja­ma (sl. 6-44). Naj­jed­nos­tav­ni­ji od tih ele­ me­na­ta su in­ser­cij­ski slje­do­vi či­ja se ve­li­či­na kre­će u ras­po­nu od oko 800 do 2.000 nuk­leo­ti­da. In­ser­cij­ski slje­do­vi ko­di­ra­ju gen za en­zim uk­lju­čen u tran­spo­zi­ci­ju (tran­spo­za­za) ome­đen krat­kim ob­r­nu­tim po­nav­lja­nji­ma ko­ja su mjes­ta dje­lo­va­nja tran­spo­za­ze. In­ser­cij­ski slje­do­vi prem­ješ­ta­ju se s jed­nog na dru­go mjes­to na kro­mo­ so­mu, a da se pri to­me ne rep­li­ci­ra­ju. Tran­spo­za­za uvo­di ste­pe­nas­ti lom u cilj­nu DNA i ci­je­pa na kra­je­vi­ma ob­r­nu­tih po­nav­lja­ju­ćih slje­do­va tran­spo­ zo­na. Dok tran­spo­za­za dje­lu­je spe­ci­fič­no na ob­r­nu­tim po­nav­lja­nji­ma tran­ spo­zo­na, nje­zi­na spe­ci­fič­no­st za slje­do­ve cilj­ne DNA pu­no je ma­nja ta­ko da ka­ta­li­zi­ra prem­ješ­ta­nje tran­spo­zo­na unu­tar cje­lo­kup­no­ga ge­no­ma. Na­ kon ci­je­pa­nja tran­spo­zo­na i cilj­nih DNA, tran­spo­za­za spa­ja jed­no­lan­ča­ne kra­je­ve cilj­ne DNA s pok­ret­nim ele­men­tom. Pu­ko­ti­na ko­ja nas­ta­je u cilj­noj DNA pop­rav­lja se sin­te­zom DNA na­kon če­ga sli­je­di li­ga­ci­ja s dru­gim lan­

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   241

Sli­ka 6-44. Bak­te­rij­ski tran­spo­zo­ni.  In­ser­cij­ski slje­do­vi (IS) du­gi su od 800 do 2.000 nuk­leo­ti­da i sad­r­ža­va­ju ge­ne za tran­spo­za­zu ome­đe­nu ob­r­nu­tim po­ nav­lja­nji­ma (IR) du­gim oko 20 nuk­leo­ ti­da. Tran­spo­za­za ci­je­pa na oba kra­ja tran­spo­zo­na i uvo­di ste­pe­nas­te re­zo­ve s jed­no­lan­ča­nim kra­je­vi­ma u cilj­nu DNA. Jed­no­lan­ča­ni kra­je­vi cilj­ne DNA se za­ tim spa­ja­ju s tran­spo­zo­nom, a pu­ko­ti­ne u cilj­noj DNA nas­ta­le dje­lo­va­njem tran­ spo­za­ze se pop­rav­lja­ju. Re­zul­tat to­ga je stva­ra­nje krat­kih iz­rav­nih po­nav­lja­nja cilj­nog mjes­ta zah­va­će­ne DNA (du­gih 5 do 10 nuk­leo­ti­da) ko­ja ome­đu­ju ug­ra­đe­ ni tran­spo­zon.

cem tran­spo­zo­na. Re­zul­tat ovog pro­ce­sa je krat­ko iz­rav­no po­na­vlja­nje cilj­ no­ga sli­je­da DNA s obi­ju stra­na pok­ret­nog ele­men­ta što je obi­ljež­je ug­rad­ nje tran­spo­zo­na. Ovaj me­ha­ni­zam do­vo­di do prem­ješ­ta­nja tran­spo­zo­na s jed­nog na dru­ go mjes­to kro­mo­so­ma. Dru­gi ti­po­vi tran­spo­zo­na prem­ješ­ta­ju se znat­no slo­že­ni­jim me­ha­niz­mi­ma ko­ji­ma se is­to­dob­no s prem­ješ­ta­njem na no­vo mjes­to unu­tar ge­no­ma i rep­li­ci­ra­ju. Kao re­zul­tat tak­vo­ga prem­ješ­ta­nja je­ dna ko­pi­ja tran­spo­zo­na bit će ug­ra­đe­na na no­vo mjes­to u ge­no­mu, dok će dru­ga ko­pi­ja os­ta­ti na svom iz­vor­nom po­lo­ža­ju. Tran­spo­zo­ni ko­ji se prem­ješ­ta­ju pu­tem DNA in­ter­me­di­ja­ra pri­sut­ni su i u eu­ka­rio­ti­ma i bak­te­ri­ja­ma. Ta­ko prim­je­ri­ce ljud­ski ge­nom sad­r­ža­va ot­ pri­li­ke 300.000 DNA tran­spo­zo­na ko­ji či­ne oko 3% ukup­ne ljud­ske DNA. Pok­ret­ni ele­men­ti ko­je je McClin­to­ck opi­sa­la u ku­ku­ru­zu prem­ješ­ta­ju se ne­rep­li­ka­tiv­nim me­ha­niz­mom kao što to či­ni ve­ći­na pok­ret­nih ele­me­na­ta u dru­gim bilj­ka­ma i ži­vo­ti­nja­ma. Po­put bak­te­rij­skih tran­spo­zo­na, ovi se ele­men­ti prem­ješ­ta­ju na raz­li­či­ta cilj­na mjes­ta uz­duž ge­no­ma. Tak­vo pre­ mješ­ta­nje na nes­pe­ci­fič­na mjes­ta u ge­no­mu naj­vje­ro­jat­ni­je ni­je ko­ris­no za sta­ni­ce u ko­ji­ma se od­vi­ja, ali zbog pres­la­gi­va­nja DNA si­gur­no ig­ra ve­li­ku ulo­gu u evo­lu­ci­ji. Na­sup­rot to­mu, kod kva­sa­ca i pro­to­zoa tran­spo­zi­ci­ja rep­li­ka­tiv­nim me­ ha­niz­mom od­go­vor­na je za prog­ra­mi­ra­na pres­la­gi­va­nja DNA ko­ja re­gu­li­ ra­ju ek­spre­si­ju ge­na. U tom slu­ča­ju tran­spo­zi­ci­ja za­po­či­nje dje­lo­va­njem nuk­lea­ze ko­ja ki­da spe­ci­fič­no cilj­no mjes­to u ko­je se za­tim ug­ra­đu­je ko­pi­ ja pok­ret­nog ele­men­ta. Pre­ma to­me, pok­ret­ni se ele­men­ti ne prem­ješ­ta­ju

242    POGLAVLJE 6 sa­mo na nes­pe­ci­fič­na mjes­ta uz­duž ge­no­ma, već mo­gu sud­je­lo­va­ti i u spe­ ci­fič­nim pres­la­gi­va­nji­ma ge­na ko­ja re­zul­ti­ra­ju prog­ra­mi­ra­nom prom­je­nom ek­spre­si­je ge­na.

Tran­spo­zi­ci­ja pos­re­do­va­na RNA in­ter­me­di­ja­ri­ma

Ve­ći­na pok­ret­nih ele­me­na­ta u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma su ret­rot­ran­s­ po­zo­ni ko­ji se prem­ješ­ta­ju re­ver­znom tran­skrip­ci­jom RNA in­ter­me­di­ja­ra. U čov­je­ka pos­to­ji go­to­vo 3 mi­li­ju­na ko­pi­ja ret­rot­ran­spo­zo­na ko­ji či­ne vi­še od 40% ukup­no­ga ge­no­ma (v. tab­l. 5-2). Me­ha­ni­zam tran­spo­zi­ci­je ovih ele­me­na­ta sli­čan je rep­li­ka­ci­ji ret­ro­vi­ru­sa ko­ja je pos­lu­ži­la kao pro­to­tip za prou­ča­va­nje ove sku­pi­ne pok­ret­nih slje­do­va DNA. Ret­ro­vi­ru­si sad­r­ža­va­ju RNA-ge­no­me u svo­jim vi­rus­nim čes­ti­ca­ma, ali se rep­li­ci­ra­ju sin­te­zom DNA-pro­vi­ru­sa ko­ji se ug­ra­đu­je u kro­mo­som­sku DNA in­fi­ci­ra­nih sta­ni­ca (v. sl. 4-13). DNA-ko­pi­ja vi­rus­ne RNA sin­te­ti­zi­ra se vi­rus­nim en­zi­mom zva­nim re­ver­zna tran­skrip­ta­za. Me­ha­ni­zam ko­jim se to do­ga­đa re­zul­ti­ra sin­te­zom mo­le­ku­le DNA ko­ja ima di­rek­tna po­nav­lja­ nja od ne­ko­li­ko sto­ti­na nuk­leo­ti­da na oba svo­ja kra­ja (sl. 6-45). Ovi po­ nav­lja­ju­ći slje­do­vi, naz­va­ni du­ga ter­mi­nal­na po­nav­lja­nja (en­gl. long ter­mi­ nal re­pea­ts) ili LTR nas­ta­ju dup­li­ka­ci­jom onih mjes­ta vi­rus­ne RNA za ko­ja se ve­žu po­čet­ni­ce da bi zapo­če­le sin­te­zu DNA. DNA vi­ru­sa ug­ra­đu­je se u kro­mo­som sta­ni­ce do­ma­ći­na pro­ce­som slič­nim ug­rad­nji pok­ret­nih ele­me­ na­ta DNA. Ug­rad­nja je ka­ta­li­zi­ra­na in­teg­ra­zom vi­ru­sa i do­ga­đa se na mno­ gim raz­li­či­tim cilj­nim slje­do­vi­ma sta­nič­ne DNA. In­te­gra­za ci­je­pa dvi­je ba­ze na kra­ju vi­rus­ne DNA i uvo­di ste­pe­nas­ti rez s jed­no­lan­ča­nim kra­jem u cilj­ no mjes­to sta­nič­ne DNA. Jed­no­lan­ča­ni kra­je­vi sta­nič­ne DNA se za­tim spa­ ja­ju s kra­je­vi­ma vi­rus­ne DNA, a pu­ko­ti­na se po­pu­nja­va sin­te­zom DNA. Ug­ra­đe­ni pro­vi­rus je sto­ga ome­đen iz­rav­nim po­nav­lja­njem sta­ni­čnog sli­je­ da, slič­nom po­nav­lja­nju ko­je ome­đu­je DNA tran­spo­zo­ne. Ži­vot­ni cik­lus vi­ru­sa nas­tav­lja se tran­skrip­ci­jom ug­ra­đe­nih pro­vi­ru­sa či­me se stva­ra vi­rus­na ge­nom­ska RNA te mo­le­ku­la mR­NA ko­je us­mje­ra­ va­ju sin­te­zu vi­rus­nih pro­tei­na (uk­lju­ču­ju­ći re­ver­znu tran­skrip­ta­zu i in­te­ gra­zu). Ge­nom­ska RNA se za­tim pa­ki­ra u vi­rus­ne čes­ti­ce ko­je se os­lo­ba­đa­ ju iz sta­ni­ce do­ma­ći­na. Ta­ko nas­ta­le vi­rus­ne čes­ti­ce mo­gu in­fi­ci­ra­ti no­vu sta­ni­cu za­po­či­nju­ći no­vi krug sin­te­ze DNA i ug­rad­nje. Sveu­kup­ni uči­nak mo­že se pro­mat­ra­ti kao prem­ješ­ta­nje pro­vi­ru­sa s jed­no­ga na dru­go mjes­to u kro­mo­so­mu pu­tem sin­te­ze i re­ver­zne tran­skrip­ci­je RNA in­ter­me­di­ja­ra. Ne­ki ret­rot­ran­spo­zo­ni (naz­va­ni ret­ro­vi­ru­su slič­ni ele­men­ti) struk­tur­no su slič­ni ret­ro­vi­ru­si­ma. Oni ima­ju LTR-slje­do­ve na oba kra­ja; ko­di­ra­ju re­

Sli­ka 6-45. Rep­li­ka­ci­ja ret­ro­vi­ru­sa.  DNA-kopi­ja vi­rus­ne RNA sin­te­ti­zi­ra se re­ver­znom tran­skrip­ta­zom. Ti­je­kom re­ ver­zne tran­skrip­ci­je, slje­do­vi oba kra­ja RNA se dup­li­ci­ra­ju kako bi stvo­ri­li du­ga­ čka ter­mi­nal­na po­nav­lja­nja (LTR) ko­ja su di­rek­tna po­nav­lja­nja od ne­ko­li­ko sto­ti­na nuk­leo­ti­da. Ge­ni vi­ru­sa, uk­lju­ču­ju­ći ge­ ne za re­ver­znu tran­skrip­ta­zu, in­teg­ra­zu i struk­tur­ne pro­tei­ne vi­rus­nih čes­ti­ca, smješ­te­ni su iz­me­đu LTR. Ug­ra­đe­ni pro­ vi­rus ome­đen je krat­kim di­rek­tnim po­ nav­lja­nji­ma DNA do­ma­ći­na.

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

Sli­ka 6-46. Struk­tu­ra ljud­skih LINE-ele­me­na­ta.  LINE-ele­men­ti ne­ma­ju LTR-slje­do­ ve, ali ko­di­ra­ju re­ver­znu tran­skrip­ta­zu i en­do­nuk­lea­zu. Oni sad­r­ža­va­ju slje­do­ve bo­ga­te s A (oz­na­če­ni s An) na svo­jim 3' kra­je­vi­ma, za ko­je se smat­ra da nas­ta­ju re­ver­znom trans­krip­ci­jom po­li-A re­po­va do­da­nih na 3' kraj mR­NA mo­le­ku­la. Po­put dru­gih pok­ ret­nih ele­me­na­ta, LINE-ele­men­ti su ome­đe­ni krat­kim di­rek­tnim po­nav­lja­nji­ma cilj­ne DNA.

ver­znu tran­skrip­ta­zu i in­teg­ra­zu i prem­ješ­ta­ju se (po­put ret­ro­vi­ru­sa) trans­ krip­ci­jom u mo­le­ku­lu RNA, sin­te­zom no­ve ko­pi­je DNA dje­lo­va­njem re­ ver­zne tran­skrip­ta­ze na­kon ko­je sli­je­di ug­rad­nja u sta­nič­nu DNA. Re­t­ro­vi­ru­su slič­ni ele­men­ti raz­li­ku­ju se od ret­ro­vi­ru­sa po to­me što se ne pa­ki­ra­ju u in­fek­tiv­ne čes­ti­ce i sto­ga se ne mo­gu ši­ri­ti s jed­ne na dru­gu sta­ ni­cu. No, ovi ret­rot­ran­spo­zo­ni se mo­gu prem­ješ­ta­ti na no­va mjes­ta kro­mo­ so­ma unu­tar is­te sta­ni­ce me­ha­niz­mi­ma slič­ni­ma oni­ma uk­lju­če­nim u rep­ li­ka­ci­ju ret­ro­vi­ru­sa. Ret­rot­ran­spo­zo­ni ovo­ga ti­pa či­ne oko 8% ljud­skog ge­no­ma. Dru­gi tip ret­rot­ran­spo­zo­na su ret­rot­ran­spo­zo­ni bez LTR-slje­do­va, a od ret­ro­vi­ru­sa se raz­li­ku­ju po to­me što ne­ma­ju LTR-slje­do­ve ia­ko ko­di­ra­ju za svo­ju re­ver­znu tran­skrip­ta­zu i en­do­nuk­lea­zu uk­lju­če­nu u pro­ces prem­ješ­ ta­nja. Glav­nu sku­pi­nu ovih ret­rot­ran­spo­zo­na u si­sa­va­ca či­ne vi­so­ko­po­nav­ lja­ju­ći du­gi ras­pr­še­ni ele­men­ti (en­gl. hig­hly re­pe­ti­ti­ve lo­ng in­ter­sper­sed ele­ men­ts – LI­NE) ko­ji se u ge­no­mu po­nav­lja­ju oko 850.000 pu­ta i či­ne oko 21% ge­nom­ske DNA (v. tab­l. 5-2). Ci­je­li LINE-ele­me­nt dug je oko 6 kb, ia­ko je ve­ći­na čla­no­va ove obi­te­lji skra­će­na na svom 5' kra­ju (sl. 6-46). Na svojim 3' kra­je­vi­ma LINE ima­ju slje­do­ve bo­ga­te ade­ni­nom za ko­ji se smat­ ra da je nas­tao re­ver­znom tran­skrip­ci­jom po­li-A re­po­va ko­ji su do­da­ni mo­le­ku­la­ma mR­NA na­kon tran­skrip­ci­je (v. pog­l. 7). Kao i dru­gi pok­ret­ni ele­men­ti, LINE su ome­đe­ni krat­kim di­rek­tnim po­nav­lja­nji­ma cilj­nih mjes­ ta DNA, što uka­zu­je da in­teg­ra­ci­ja uk­lju­ču­je stva­ra­nje ste­pe­nas­tih jed­no­ lan­ča­nih kra­je­va i pop­ra­vak sin­te­zom. Ka­ko LINE ne sad­r­ža­va­ju LTR-slje­do­ve, me­ha­ni­zam nji­ho­ve re­ver­zne tran­skrip­ci­je i ugrad­nje u kro­mo­som­sku DNA raz­li­ku­je se od onog ko­ji ko­ris­te ret­ro­vi­ru­si i ret­rot­ran­spo­zo­ni ko­ji sad­rž­ a­va­ju LTR-slje­do­ve. Kon­ kret­no, re­ver­zna tran­skrip­ci­ja kao po­čet­ni­cu ko­ris­ti pre­ki­nu­te kra­je­ve kro­ mo­som­ske DNA na cilj­nim mjes­ti­ma za ug­rad­nju ret­rot­ran­spo­zo­na, a ko­ji su re­zul­tat ci­je­pa­nja nuk­lea­zom ko­ju je ko­di­rao ret­rot­ran­spo­zon (sl. 6-47). Re­ver­zna tran­skrip­ci­ja ta­da za­po­či­nje unu­tar po­li-A sli­je­da na 3' kra­ju tran­spo­zon­ske RNA i nas­tav­lja se duž mo­le­ku­le. Sup­rot­ni la­nac DNA sin­ te­ti­zi­ra se ko­riš­te­njem dru­go­ga pre­ki­nu­tog kra­ja cilj­ne DNA kao po­čet­ni­ ce, što re­zul­ti­ra is­tov­re­me­nom sin­te­zom i ug­rad­njom ret­rot­ran­spo­zon­ske DNA. Dru­gi slje­do­vi ko­ji ne ko­di­ra­ju svo­je vlas­ti­te re­ver­zne tran­skrip­ta­ze ta­ ko­đer se prem­ješ­ta­ju pu­tem RNA in­ter­me­di­ja­ra. Ovi ele­men­ti uk­lju­ču­ju vi­so­ko­po­nav­lja­ju­će krat­ke ras­pr­še­ne ele­men­te (en­gl. sho­rt in­ter­sper­sed ele­ men­ts – SINE) ko­ji do­la­ze u ot­pri­li­ke 1,5 mi­li­ju­na ko­pi­ja u ge­no­mi­ma si­ sa­va­ca (v. tab­l. 5-2). Glav­na po­ro­di­ca ovih ele­me­na­ta kod lju­di sas­tav­lje­na je od Alu slje­do­va du­gih ot­pri­li­ke 300 ba­za. Ovi su slje­do­vi na svom 3' kra­ ju bo­ga­ti ade­ni­nom i ome­đe­ni su krat­kim dup­li­ka­ci­ja­ma nuk­leo­tid­nog sli­

   243

244    POGLAVLJE 6 Sli­ka 6-47. Mo­del re­ver­zne tran­skrip­ci­ je i ug­rad­nje LINE-ele­me­na­ta.  Cilj­na DNA po­ki­da­na je nuk­lea­zom ko­di­ra­nom ret­rot­ran­spo­zo­nom. Re­ver­zna tran­skrip­ ci­ja, ko­riš­te­njem pre­ki­nu­tih kra­je­va cilj­ne DNA kao po­čet­ni­ca, za­po­či­nje s po­li-A re­pom na 3' kra­ju RNA ret­rot­ran­spo­zo­na. Sin­te­za sup­rot­nog lan­ca DNA ret­rot­ran­ spo­zo­na ta­ko­đer kao po­čet­ni­cu ko­ris­ti dru­gi la­nac DNA cilj­nog mjes­ta.

je­da cilj­ne DNA, struk­tur­no slič­no ret­rot­ran­spo­zo­ni­ma bez LTR-slje­do­va (prim­je­ri­ce LINE). SINE nas­ta­ju re­ver­znom tran­skrip­ci­jom ma­lih mo­le­ku­ la RNA uk­lju­ču­ju­ći mo­le­ku­le tR­NA i ma­le ci­top­laz­mat­ske mo­le­ku­le RNA uk­lju­če­ne u tran­spo­rt pro­tei­na. Ka­ko SINE-ele­men­ti vi­še ne ko­di­ra­ju fun­ kcio­nal­ne pro­duk­te RNA oni pred­stav­lja­ju pseu­do­ge­ne ko­ji nas­ta­ju RNA‑po­s­re­do­va­nom tran­spo­zi­ci­jom. Pseu­do­ge­ni mno­gih ge­na ko­ji ko­di­ ra­ju pro­tei­ne (naz­va­ni do­ra­đe­ni pseu­do­ge­ni) ta­ko­đer nas­ta­ju na sli­čan na­ čin re­ver­znom tran­skrip­ci­jom glas­nič­kih mo­le­ku­la RNA (sl. 6-48). Tak­vi do­ra­đe­ni pseu­do­ge­ni la­ko se pre­poz­na­ju ne sa­mo zbog to­ga što zav­r­ša­va­ju sli­je­dom nuk­leo­ti­da bo­ga­tim ade­ni­nom, već i sto­ga što su in­tro­ni pri­sut­ni u nji­ho­vim fun­kcio­nal­no od­go­va­ra­ju­ćim ge­ni­ma ov­dje uk­lo­nje­ni ti­je­kom pro­ce­si­ra­nja glas­nič­kih mo­le­ku­la RNA. Smat­ra se da se tran­spo­zi­ci­ja SINE‑ele­me­na­ta i dru­gih do­ra­đe­nih pseu­do­ge­na od­vi­ja slič­no tran­spo­zi­ci­ ji LINE-ele­me­na­ta. No, ka­ko ovi ele­men­ti ne pos­je­du­ju ge­ne za re­ver­znu tran­skrip­ta­zu ili nuk­lea­zu, nji­ho­vo prem­ješ­ta­nje vje­ro­jat­no uk­lju­ču­je dje­lo­ va­nje re­ver­zne tran­skrip­ta­ze i nuk­lea­ze ko­di­ra­nih ge­ni­ma ko­ji se na­la­ze neg­dje drug­dje u ge­no­mu – naj­vje­ro­jat­ni­je u dru­gim ret­rot­ran­spo­zo­ni­ma kao što su LINE-ele­men­ti. Prem­da vi­so­ko­po­nav­lja­ju­ći SINE i LINE-ele­men­ti či­ne zna­ča­jan udio ge­nom­ske DNA, nji­ho­va tran­spo­zi­ci­ja na na­su­mič­na mjes­ta u ge­no­mu po sve­mu su­de­ći ni­je od ko­ris­ti za sta­ni­cu u ko­joj su smješ­te­ni. Kad se ug­ra­de na no­va cilj­na mjes­ta ovi tran­spo­zo­ni in­du­ci­ra­ju mu­ta­ci­je ko­je su i po­put onih izaz­va­nih dru­gim čim­be­ni­ci­ma naj­vje­ro­jat­ni­je štet­ne za sta­ni­cu. Pri­ mje­ri­ce, mu­ta­ci­je nas­ta­le tran­spo­zi­ci­jom i LINE i SINE-ele­me­na­ta do­ve­de­ ne su u ve­zu s ne­kim slu­ča­je­vi­ma he­mo­fi­li­je, mi­šić­ne dis­tro­fi­je, kar­ci­no­ma doj­ke i kar­ci­no­ma de­be­lo­ga cri­je­va. S dru­ge stra­ne, ne­ke mu­ta­ci­je nas­ta­le

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   245

Sli­ka 6-48. Stva­ra­nje do­ra­đe­no­ga pseu­do­ge­na.  Pri­ka­za­ni gen ima tri eg­zo­na raz­dvo­je­na s dva in­tro­na. In­tro­ ni su prek­ra­ja­njem uk­lo­nje­ni iz pri­mar­ nog tran­skrip­ta i na 3' kraj mR­NA je do­ dan po­li-A rep. Re­ver­zna tran­skrip­ci­ja i ugra­d­nja na­kon to­ga stva­ra­ju do­ra­đe­ni pseu­do­gen ko­ji nema in­tro­ne i ima sli­jed bo­gat ade­ni­nom na svom 3' kra­ju. Do­ra­ đe­ni pseu­do­gen je ome­đen krat­kim di­ rek­tnim po­nav­lja­nji­ma cilj­ne DNA stvo­ re­nim ti­je­kom ug­rad­nje.

prem­ješ­ta­njem pok­ret­nih ele­me­na­ta mo­gu bi­ti ko­ris­ne na taj na­čin što pri­ do­no­se evo­lu­cij­skom raz­vo­ju vr­ste. Ta­ko se prim­je­ri­ce pro­naš­lo da ne­ki ret­rot­ran­spo­zo­ni u ge­no­mu si­sa­va­ca sad­r­ža­va­ju re­gu­la­cijske slje­do­ve ko­ji kon­tro­li­ra­ju ek­spre­si­ju sus­jed­nih ge­na. Osim što ima­ju mu­ta­ge­ni uči­nak, ret­rot­ran­spo­zo­ni su odig­ra­li ve­li­ku ulo­gu u ob­li­ko­va­nju ge­no­ma sti­mu­li­ra­njem pres­la­gi­va­nja DNA. Ta­ko pri­ mje­ri­ce pres­la­gi­va­nje kro­mo­som­ske DNA mo­že nas­ta­ti zbog re­kom­bi­na­ci­ ja LINE-ele­me­na­ta ug­ra­đe­nih na raz­li­či­ta mjes­ta u ge­no­mu. Na­da­lje, slje­ do­vi sta­nič­ne DNA sus­jed­nih LINE-ele­me­na­ta učes­ta­lo se pre­no­se ti­je­kom tran­spo­zi­ci­je što ima za pos­lje­di­cu nji­ho­vo prem­ješ­ta­nje na no­va mjes­ta u ge­no­mu. Ka­ko se LINE-ele­men­ti mo­gu ug­ra­di­ti u ak­tiv­ne ge­ne, s nji­ma po­ve­za­na tran­spo­zi­ci­ja sta­nič­nih slje­do­va DNA mo­že do­ves­ti do stva­ra­nja no­vih re­gu­lacijskih i/ili ko­di­ra­ju­ćih slje­do­va i di­rek­tno pri­do­ni­je­ti evo­lu­cij­ skom raz­vo­ju no­vih ge­na. Ve­li­ka ve­ći­na pok­ret­nih ele­me­na­ta u ljud­skom ge­no­mu ni­je ak­tiv­na i sve­ga je oko 100 ko­pi­ja LINE-ele­me­na­ta ko­ji još uvi­jek sad­rž­ a­va­ju slje­do­ve ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne pot­reb­ne za nji­ho­vo prem­ješ­ta­nje. Osim to­ga, pro­ cje­nju­je se da se ljud­ski LINE-ele­men­ti prem­ješ­ta­ju učes­ta­loš­ću od je­dan na sva­kih 100 po­ro­da. Dru­ge vr­ste, uk­lju­ču­ju­ći mi­še­ve, ima­ju mno­go ve­ću ra­zi­nu pos­to­je­će tran­spo­zon­ske ak­tiv­nos­ti. Kod mi­še­va je prim­je­ri­ce pro­ ci­je­nje­no da oko 10% svih mu­ta­ci­ja u ge­no­mu mi­ša nas­ta­je ak­tiv­noš­ću tran­spo­zo­na u us­po­red­bi sa sa­mo oko 0,3% u lju­di.

Am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na Pres­la­gi­va­nja DNA o ko­ji­ma se do sa­da go­vo­ri­lo mi­je­nja­ju po­lo­žaj sli­ je­da DNA unu­tar ge­no­ma. Am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na mo­že se pro­mat­ra­ti kao dru­ga­či­ji tip iz­mje­na struk­tu­re ge­no­ma – ona, nai­me, po­ve­ća­va broj ko­pi­ja ge­na unu­tar sta­ni­ce. Am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na pod­ra­zu­mi­je­va ope­to­va­nu rep­li­ka­ ci­ju DNA či­me se proiz­vo­de vi­šes­tru­ke ko­pi­je od­re­đe­nih pod­ruč­ja (sl. 6-49). Um­no­že­ni slje­do­vi DNA mo­gu se na­ći ili kao slo­bod­ne ek­strak­ro­ mo­som­ske mo­le­ku­le ili kao niz uzas­top­no po­nav­lja­ju­ćih slje­do­va unu­tar kro­mo­so­ma. U oba slu­ča­ja do­la­zi do po­ve­ća­ne ek­spre­si­je am­pli­fi­ci­ra­no­ga ge­na zah­va­lju­ju­ći jed­nos­tav­noj či­nje­ni­ci da je pri­sut­no vi­še ko­pi­ja dos­tup­ nih za tran­skrip­ci­ju. U ne­kim slu­ča­je­vi­ma am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na od­go­vor­na je za raz­voj­no prog­ ra­mi­ra­na po­ve­ća­nja ek­spre­si­je ge­na. Ti­pi­čan je prim­jer am­pli­fi­ka­ci­ja ri­bo­

246    POGLAVLJE 6

Sli­ka 6-49. Am­pli­fi­ka­ci­ja DNA.  Po­nav­lja­ju­ći ko­ra­ci rep­li­ka­ci­je DNA stva­ra­ju vi­še­ stru­­ke ko­pi­je od­re­đe­ne re­gi­je kro­mo­so­ma.

som­skih RNA (rR­NA) ge­na u oo­ci­ta­ma vo­do­ze­ma­ca. Oo­ci­te su iz­nim­no ve­li­ke sta­ni­ce ko­je zah­ti­je­va­ju po­ve­ća­nu sin­te­zu pro­tei­na. S ob­zi­rom na vo­ lu­men, oo­ci­te vo­do­ze­ma­ca su oko mi­li­jun pu­ta ve­će od ti­pič­nih so­mat­skih sta­ni­ca pa mo­ra­ju ima­ti ve­li­ke ko­li­či­ne pro­tei­na ti­je­kom ra­nog raz­vo­ja. To zah­ti­je­va po­ve­ća­nu sin­te­zu mo­le­ku­la rR­NA što se jed­nim di­je­lom pos­ti­že am­pli­fi­ka­ci­jom rR­NA ge­na. Kao što je spo­me­nu­to u 5. pog­lav­lju, u so­mat­ skim sta­ni­ca­ma rR­NA ge­ni do­la­ze u ne­ko­li­ko sto­ti­na ko­pi­ja što je pot­reb­no za sin­te­zu do­volj­ne ko­li­či­ne mo­le­ku­la rR­NA nuž­nih da se za­do­vo­lje pot­re­ be sta­ni­ca. U oo­ci­ta­ma vo­do­ze­ma­ca ovi su ge­ni am­pli­fi­ci­ra­ni do­dat­nih 2.000 pu­ta na ot­pri­li­ke 1 mi­li­jun ko­pi­ja po oo­ci­ti. Dru­gi prim­jer prog­ra­mi­ ra­ne gen­ske am­pli­fi­ka­ci­je od­vi­ja se u ge­no­mu vin­ske mu­ši­ce. Nai­me, ge­ni u sta­ni­ca­ma jaj­ni­ka žen­ki vin­ske mu­ši­ce, ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne jaj­ne ovoj­ ni­ce (ko­rion­ski ge­ni), am­pli­fi­ci­ra­ni su za­to da bi se za­do­vo­lji­la pot­re­ba za ve­li­kom ko­li­či­nom ovih pro­tei­na. Po­put dru­gih prog­ra­mi­ra­nih pres­la­gi­va­ nja ge­na i am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na re­la­tiv­no je ri­je­dak do­ga­đaj ko­ji se od­vi­ja u vi­so­kospe­ci­ja­li­zi­ra­nim ti­po­vi­ma sta­ni­ca i ne mo­že se smat­ra­ti uo­bi­ča­je­nim me­ha­niz­mom re­gu­la­ci­je ge­na. Am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na od­vi­ja se i kao ne­nor­mal­ni pro­ces u zlo­ćud­nim tu­ mor­skim sta­ni­ca­ma što re­zul­ti­ra po­vi­še­nom ek­spre­si­jom ge­na za sta­nič­nu pro­li­fe­ra­ci­ju (on­ko­ge­ni) što do­vo­di do ne­kon­tro­li­ra­nog ras­ta sta­ni­ca i raz­ vo­ja tu­mo­ra (v. pog­l. 18). Pre­ma to­me, kao i kod dru­gih ti­po­va pres­la­gi­va­ nja DNA, pos­lje­di­ce am­pli­fi­ka­ci­je ge­na mo­gu bi­ti dje­lot­vor­ne, ali i štet­ne za sta­ni­cu ili or­ga­ni­zam u ko­je­mu se do­ga­đa­ju.

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

SAŽETAK

   247

KLJUČNI POJMOVI

Pra­te­ća mrež­na stra­ni­ca Za ani­ma­ci­je, vi­deokli­po­ve, tes­to­ve, za­dat­ke i dru­ge preg­led­ne ma­te­ri­ja­le pos­je­ ti­te mrež­nu stra­ni­cu ko­ja pra­ti The Ce­ll (www.sinauer.com/cooper5e).

Rep­li­ka­ci­ja DNA DNA-po­li­me­ra­ze: Raz­li­či­te DNA-po­li­me­ra­ze ima­ju spe­ci­fič­ne ulo­ge u rep­li­ka­ci­ ji i pop­rav­ku DNA ka­ko u pro­ka­riot­skim ta­ko i u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Sve poz­na­te DNA-po­li­me­ra­ze sin­te­ti­zi­ra­ju DNA sa­mo u 5'→3' smje­ru do­da­ju­ći dNTP na pret­hod­no sin­te­ti­zi­ra­ne po­čet­ni­ce DNA.

DNA-po­li­me­ra­za

Rep­li­ka­cij­ske raš­lje: Ro­di­telj­ski lan­ci mo­le­ku­le DNA se raz­dvo­je i slu­že kao ka­ lu­pi za sin­te­zu dva­ju no­vih la­na­ca u rep­li­ka­cij­skim raš­ljama. Je­dan no­vo­sin­te­ti­ zi­ra­ni la­nac (vo­de­ći la­nac) sin­te­ti­zi­ra se kon­ti­nui­ra­no dok se dru­gi la­nac (zaos­ ta­ju­ći la­nac) for­mi­ra spa­ja­njem krat­kih ulo­ma­ka DNA ko­ji se sin­te­ti­zi­ra­ju u ob­r­nu­tom smje­ru u od­no­su na sveu­kup­ni smjer rep­li­ka­ci­je. DNA-po­li­me­ra­ze i raz­li­či­ti dru­gi pro­tei­ni dje­lu­ju koor­di­ni­ra­no sin­te­ti­zi­ra­ju­ći i vo­de­će i zaos­ta­ju­će lan­ce DNA.

rep­li­ka­cij­ske raš­lje, Oka­za­ki­je­vi frag­men­ti, DNA-li­ga­za, vo­de­ći la­nac, zaos­ta­ju­ći la­nac, pri­ma­za, RNa­za H, eg­zo­nuk­lea­za, he­li­ka­za, pro­tei­ni ko­ji ve­žu jed­no­lan­ča­nu DNA, to­poi­zo­me­ ra­za

Vi­di ani­ma­ci­ju 6.1 na mrež­noj stra­ni­ci Vjer­no­st rep­li­ka­ci­je: DNA-po­li­me­ra­ze po­ve­ća­va­ju toč­no­st rep­li­ka­ci­je oda­bi­rom od­go­va­ra­ju­će ba­ze za unos u no­vo­sin­te­ti­zi­ra­ni la­nac i ko­ri­gi­ra­njem no­vo­sin­te­ti­ zi­ra­ne DNA na taj na­čin da eli­mi­ni­ra­ju pog­r­ješ­no spa­re­ne ba­ze.

ko­rek­tiv­na spo­sob­no­st DNA-po­li­me­ ra­ze

Is­ho­diš­te i ini­ci­ja­ci­ja rep­li­ka­ci­je: Rep­li­ka­ci­ja DNA za­po­či­nje u spe­ci­fič­nom is­ ho­diš­tu rep­li­ka­ci­je ko­je sad­r­ža­va vez­na mjes­ta za pro­tei­ne zas­luž­ne za po­če­tak pro­ce­sa rep­li­ka­ci­je. Kod vi­ših eu­ka­rio­ta, mjes­ta is­ho­diš­ta mo­gu pri­je bi­ti od­re­ đe­na struk­tu­rom kro­ma­ti­na ne­go sli­je­dom DNA.

is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je, au­to­nom­no rep­li­ci­ra­ju­ći slje­do­vi (ARS), kom­ple­ks is­ho­diš­ta rep­li­ka­ci­je (ORC)

Te­lo­me­re i te­lo­me­ra­ze – od­rž­ a­va­nje kra­je­va kro­mo­so­ma: Po­nav­lja­ju­ći slje­do­vi nuk­leo­ti­da na kra­je­vi­ma kro­mo­so­ma (te­lo­me­re) od­r­ža­va­ju se dje­lo­va­njem re­ ver­zne tran­skrip­ta­ze (te­lo­me­ra­ze) ko­ja sad­rž­ a­va svoj vlas­ti­ti RNA-ka­lup.

te­lo­me­re, te­lo­me­ra­za, re­ver­zna tran­skrip­ta­za

Pop­ra­vak DNA Iz­rav­ni ob­rat oš­te­će­nja DNA: Ne­ko­li­ko ti­po­va čes­tih oš­te­će­nja DNA, po­put pi­ ri­mi­din­skih di­me­ra i al­ki­li­ra­nih gva­nin­skih os­ta­ta­ka, pop­rav­lja­ju se iz­rav­nim ob­ra­tom oš­te­će­nja.

pi­ri­mi­din­ski di­me­ri, fo­to­reak­ti­va­ci­ja

Pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem: Ve­ći­na oš­te­će­nja DNA pop­rav­lja se iz­re­zi­va­njem oš­te­ će­ne DNA. Nas­ta­le pu­ko­ti­ne po­pu­nja­va­ju se no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nom DNA ko­riš­te­ njem neoš­te­će­no­ga kom­ple­men­tar­nog lan­ca kao ka­lu­pa. U pop­rav­ku iz­re­zi­va­ njem ba­za spe­ci­fič­ni ti­po­vi po­je­di­nač­nih oš­te­će­nih ba­za uk­la­nja­ju se iz mo­le­ku­le DNA. Na­sup­rot to­mu, pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da pre­poz­na­je ši­rok spek­ tar le­zi­ja ko­je na­ru­ša­va­ju struk­tu­ru DNA i uk­la­nja oš­te­će­ne ba­ze kao dio oli­go­ nuk­leo­ti­da. Tre­ći me­ha­ni­zam pop­rav­ka iz­re­zi­va­njem spe­ci­fič­no uk­la­nja pog­r­ ješ­no spa­re­ne ba­ze iz no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nih la­na­ca DNA.

pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem ba­za, DNA-gli­ko­zi­la­za, AP-en­do­nuk­lea­za, pop­ra­vak iz­re­zi­va­njem nuk­leo­ti­da, ek­sci­nuk­lea­za, pop­ra­vak ud­ru­žen s tran­skrip­ci­jom, pop­ra­vak pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za

248    POGLAVLJE 6

KLJUČNI POJMOVI

SAŽETAK

tran­sle­zij­ska sin­te­za DNA

Tran­sle­zij­ska sin­te­za DNA: Spe­ci­ja­li­zi­ra­ne DNA-po­li­me­ra­ze spo­sob­ne su rep­li­ ci­ra­ti DNA uz­duž mjes­ta oš­te­će­nja, prem­da ak­tiv­no­st ovih po­li­me­ra­za mo­že re­ zul­ti­ra­ti vi­so­kom učes­ta­loš­ću ug­rad­nje pog­r­ješ­nih ba­za.

dvo­lan­ča­ni lom, re­kom­bi­na­cij­ski pop­ra­vak

Pop­ra­vak dvo­lan­ča­nih lo­mo­va: Dvo­lan­ča­ni lo­mo­vi pop­rav­lja­ju se re­kom­bi­na­ci­ jom ka­ko bi se oš­te­će­ni lan­ci po­nov­no spo­ji­li. Re­kom­bi­na­cij­ski pop­ra­vak mo­že se od­vi­ja­ti ili ho­mo­log­nom re­kom­bi­na­ci­jom s neoš­te­će­nim kro­mo­so­mom ili ne­ ho­mo­log­no po­nov­nim spa­ja­njem po­ci­je­pa­nih kra­je­va jed­ne mo­le­ku­le DNA.

Re­kom­bi­na­ci­ja iz­me­đu ho­mo­log­nih DNA slje­do­va ho­mo­log­na re­kom­bi­na­ci­ja, Hol­li­ dayev mo­del, Hol­li­daye­va struk­tu­ra

Mo­de­li ho­mo­log­ne re­kom­bi­na­ci­je: Re­kom­bi­na­ci­ja uk­lju­ču­je ci­je­pa­nje i po­nov­ no spa­ja­nje ro­di­telj­skih mo­le­ku­la DNA. Po­rav­na­va­nje ho­mo­log­nih mo­le­ku­la DNA omo­gu­će­no je kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem ba­za. Za­re­za­ni lan­ci ro­di­ telj­ske DNA za­la­ze u dru­gu ro­di­telj­sku mo­le­ku­lu da­ju­ći me­đup­ro­du­kt s uk­ri­že­ nim lan­ci­ma poz­nat kao Hol­li­daye­va ve­za. Re­kom­bi­nan­tne mo­le­ku­le se na­kon to­ga for­mi­ra­ju ci­je­pa­njem i po­nov­nim spa­ja­njem uk­ri­že­nih la­na­ca. Vi­di ani­ma­ci­ju 6.2 na mrež­noj stra­ni­ci

RecA

En­zi­mi uk­lju­če­ni u ho­mo­log­nu re­kom­bi­na­ci­ju: Sre­diš­nji en­zim ho­mo­log­ne re­ kom­bi­na­ci­je je RecA ko­ji ka­ta­li­zi­ra iz­mje­nu la­na­ca ho­mo­log­nih mo­le­ku­la DNA. Dru­gi en­zi­mi za­re­zu­ju i raz­mo­ta­va­ju ro­di­telj­ske mo­le­ku­le DNA te raz­r­je­ša­va­ju Hol­li­daye­vu struk­tu­ru.

Pres­la­gi­va­nje DNA mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ci­ja, an­ti­gen, imu­nog­lo­bu­lin, re­cep­tor T-sta­ni­ca, re­kom­bi­na­ci­ja prom­je­ne kla­se, so­mat­ska hi­per­mu­ta­ci­ja, ak­ti­va­ci­jom in­du­ci­ra­na dea­mi­na­za (AID)

Mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ci­ja: Mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ci­ja se od­vi­ja iz­ me­đu spe­ci­fič­nih slje­do­va DNA ko­je pre­poz­na­ju pro­tei­ni uk­lju­če­ni u ovaj pro­ ces. Kod kra­ljež­nja­ka mjes­nospe­ci­fič­na re­kom­bi­na­ci­ja ig­ra vr­lo ključ­nu ulo­gu u stva­ra­nju imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na i ge­na re­cep­to­ra T-sta­ni­ca ti­je­kom raz­vo­ja imu­no­loš­kog sus­ta­va. Do­dat­nu raz­nov­r­sno­st omo­gu­ću­ju ge­ni za imu­nog­lo­bu­li­ ne so­mat­skom hi­per­mu­ta­ci­jom i re­kom­bi­na­ci­jom prom­je­ne kla­se. Vi­di ani­ma­ci­ju 6.3 na mrež­noj stra­ni­ci Vi­di ani­ma­ci­ju 6.4 na mrež­noj stra­ni­ci

pok­ret­ni ele­me­nt, tran­spo­zon

Tran­spo­zi­ci­ja pos­re­do­va­na DNA in­ter­me­di­ja­ri­ma: Ve­ći­na DNA tran­spo­zo­na prem­ješ­ta se uz­duž ge­no­ma bez pot­re­be za spe­ci­fič­nim sli­je­dom DNA na mjes­tu nji­ho­va ug­ra­đi­va­nja. Ipak, u pro­to­zoa i kva­sa­ca tran­spo­zi­ci­ja ne­kih slje­do­va DNA u spe­ci­fič­na cilj­na mjes­ta re­zul­ti­ra prog­ra­mi­ra­nim pres­la­gi­va­nji­ma DNA ko­ja re­gu­li­ra­ju ek­spre­si­ju ge­na.

ret­rot­ran­spo­zon, ret­ro­vi­rus, re­ver­zna tran­skrip­ta­za, du­ga ter­mi­nal­na po­nav­lja­nja (LTR), LINE, SINE, do­ra­đe­ni pseu­do­ge­ni

Tran­spo­zi­ci­ja pos­re­do­va­na RNA in­ter­me­di­ja­ri­ma: Ve­ći­na tran­spo­zo­na u eu­ka­ riot­skim sta­ni­ca­ma prem­ješ­ta se re­ver­znom tran­skrip­ci­jom RNA in­ter­me­di­ja­ra, slič­no rep­li­ka­ci­ji ret­ro­vi­ru­sa. Ovi ret­rot­ran­spo­zo­ni uk­lju­ču­ju vi­so­ko­po­nav­lja­ju­ će LINE i SINE-slje­do­ve ge­no­ma si­sa­va­ca.

am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na

Am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na: Am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na re­zul­tat je uzas­top­nih rep­li­ka­ci­ja od­re­ đe­no­ga kro­mo­som­skog pod­ruč­ja. U ne­kim slu­ča­je­vi­ma am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na zap­ ra­vo je me­ha­ni­zam za po­ve­ća­nje ek­spre­si­je to­ga ge­na ti­je­kom raz­vo­ja or­ga­niz­ ma. Am­pli­fi­ka­ci­ja ge­na ta­ko­đer se učes­ta­lo do­ga­đa u sta­ni­ca­ma kar­ci­no­ma gdje mo­že re­zul­ti­ra­ti po­ve­ća­nom ek­spre­si­jom ge­na ko­ji pri­do­no­se ne­kon­tro­li­ra­noj pro­li­fe­ra­ci­ji sta­ni­ca.

REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 

   249

Pitanja 1. Izo­li­ra­li ste soj E. coli s mu­ta­ci­jom u DNA-po­li­me­ra­zi i os­jet­ljiv na tem­pe­ra­tu­ru. Ako pos­to­je, ko­ja bi oš­te­će­nja pos­to­ja­la u bak­te­ri­ji s ovak­vom mu­ta­ci­jom? 2. Us­po­re­dite dje­lo­va­nje to­poi­zo­me­ra­za I i II. 3. Ko­ji je prib­li­žan broj Oka­za­ki­je­vih frag­ me­na­ta ko­ji se sin­te­ti­zi­ra ti­je­kom rep­li­ka­ci­ je ge­no­ma kvas­ca? 4. Zaš­to sin­te­za Oka­za­ki­je­vih frag­me­na­ta za­po­či­nje pri­ma­zom um­jes­to DNA-po­li­ me­ra­zom? 5. Ko­ja je ulo­ga 3'→5' eg­zo­nuk­leaz­ne ak­ tiv­nos­ti kod DNA-po­li­me­ra­ze? Ko­ja bi bi­la pos­lje­di­ca mu­ta­ci­je ove ak­tiv­nos­ti DNA‑po­li­me­ra­ze III na vjer­no­st rep­li­ka­ci­je DNA E. coli?

6. Ka­ko bis­te prov­je­ri­li sli­jed DNA u sta­ni­ci kvas­ca da bis­te ut­vr­di­li sad­r­ži li is­ho­diš­te rep­li­ka­ci­je? 7. Sta­ni­ca­ma kvas­ca nuž­na je te­lo­me­ra­za za pot­pu­nu rep­li­ka­ci­ju nji­ho­vih ge­no­ma dok E. co­li ne tre­ba ovaj po­seb­ni en­zim. Zaš­to? 8. Ko­ji me­ha­ni­zam sta­ni­ca ko­ris­ti za pop­ ra­vak dvo­lan­ča­nih lo­mo­va u svo­jim mo­le­ ku­la­ma DNA? Ka­ko se to raz­li­ku­je od pop­ rav­ka u jed­nom lan­cu? 9. Obo­lje­li od bo­les­ti Xe­ro­der­ma pig­men­to­ sum ima­ju iz­nim­no vi­so­ku in­ci­den­ci­ju kar­ ci­no­ma ko­že, ali ni­je na­đe­no da ima­ju od­ go­va­ra­ju­će vi­so­ku in­ci­den­ci­ju kar­ci­no­ma unut­ar­njih or­ga­na (prim­je­ri­ce kar­ci­nom

de­be­lo­ga cri­je­va). Što nam ova či­nje­ni­ca mo­že su­ge­ri­ra­ti o vr­sta­ma oš­te­će­nja DNA od­go­vor­nih za ve­ći­nu unu­tar­njih kar­ci­no­ ma? 10. Mno­gi od li­je­ko­va ko­ji se u kli­nič­koj upo­ra­bi ko­ris­te u li­je­če­nju AI­DS-a in­hi­bi­ to­ri su re­ver­zne tran­skrip­ta­ze HI­V-a. Na ko­je dru­ge sta­nič­ne pro­ce­se mo­gu dje­lo­va­ti ovi in­hi­bi­to­ri? 11. Pop­ra­vak pog­r­ješ­no spa­re­nih ba­za u lju­di uk­lju­ču­je ho­mo­lo­ge E. coli - MutS i MutL, ali ne i MutH. Zaš­to? 12. Ka­kav fe­no­tip bis­te pred­vid­je­li za mu­ tan­tnog mi­ša ko­je­mu ne­dos­ta­je je­dan od ge­na nuž­nih za mjes­nospe­ci­fič­nu re­kom­bi­ na­ci­ju u lim­fo­ci­ti­ma?

Li­te­ra­tu­ra Rep­li­ka­ci­ja DNA An­nun­zia­to, A.T. 2005. Split de­ci­sion: What hap­pe­ns to nuc­leo­so­mes du­ri­ng DNA rep­li­ ca­tion? J. Biol. Chem. 280: 12065–12068 [R] Be­ll, S. P. and A. Dut­ta. 2002. DNA rep­li­ca­tion in eu­ka­ryo­tic cel­ls. Ann. Rev. Bioc­hem. 71: 333–374. [R] Blac­kbu­rn, E. H. 2005. Te­lo­me­res and te­lo­m­ erase: their mec­ha­nis­ms of ac­tion and the ef­fec­ts of al­te­ri­ng their fun­ctio­ns. FEBS Le­tt. 579: 859-862. [R] Blas­co, M.A. 2007. Te­lo­me­re len­gth, stem cel­ls and agi­ng. Na­tu­re Rev. Chem. Biol. 3: 640– 649. [R] Cham­poux, J. J. 2001. DNA to­poi­so­me­ra­ses: Struc­tu­re, fun­ction, and mec­ha­ni­sm. Ann. Rev. Bioc­hem. 70: 369–413. [R] Coz­za­rel­li, N. R., G. J. Co­st, M. Nöllma­nn, T. Viar­d and J. E. Stray. Gia­nt pro­tei­ns that mo­ve DNA: bul­lies of the ge­no­mic play­ ground. Na­tu­re Mol. Ce­ll Biol. 7: 580-588. [R] Cve­tic C. and Wal­ter J. C. 2005. Eu­ka­ryo­tic origi­ns of DNA rep­li­ca­tion: Cou­ld you please be mo­re spe­ci­fic? Sem. Ce­ll Dev. Biol. 16: 343-53. [R] Fri­ck, D. N. and C. C. Ric­har­dson. 2001. DNA pri­ma­ses. Ann. Rev. Bioc­hem. 70: 39–80. [R] Gil­be­rt, D. M. 2004. In sear­ch of the ho­ly rep­li­ ca­tor. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 5: 1-8 [R] Gil­son E. and V. Ge­li. 2007. How te­lo­me­res are rep­li­ca­ted. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 8: 825838. [R] Grei­der C. W. and E. H. Blac­kbu­rn. 1985. Identifica­tion of a spe­ci­fic te­lo­me­re ter­mi­ nal tran­sfe­ra­se ac­ti­vi­ty in Tet­ra­hyme­na extrac­ts. Ce­ll 43: 405-413. [R]

Hu­ber­man, J. A. and A. D. Rig­gs. 1968. On the mec­ha­ni­sm of DNA rep­li­ca­tion in mam­ma­ lian chro­mo­so­mes. J. Mol. Biol. 32: 327–341. [P]

Ver­dun R.E. and J. Kar­lse­der. 2007. Rep­li­ca­tion and pro­tec­tion of te­lo­me­res. Na­tu­re; 447: 924-931. [R]

Joh­nson A. and M. O'Don­ne­ll. 2005. Cel­lu­lar DNA rep­li­ca­ses: com­po­nen­ts and dyna­mi­cs at the rep­li­ca­tion fo­rk. Ann. Rev. Bioc­hem. 74:283-315 [R]

Pop­ra­vak DNA

Kor­nbe­rg, A., I. R. Leh­man, M. J. Bes­sman and E. S. Sim­ms. 1956. En­zymic synthe­sis of de­ oxy­ri­bo­nuc­leic acid. Bioc­him. Biop­hys. Ac­ta 21: 197–198. [P]

Da­vid S. S., V. L. O'Shea and S. Kun­du. 2007. Ba­se-exci­sion re­pair of oxi­da­ti­ve DNA da­ ma­ge. Na­tu­re 447: 941-950. [R]

Mac­hi­da Y.J., J.L. Ham­lin and A. Dut­ta. 2005. Rig­ht pla­ce, rig­ht ti­me, and on­ly on­ce: repli­ ca­tion ini­tia­tion in me­ta­zoa­ns. Ce­ll 123: 1324. [R] McCul­lo­ch, S.D. and T.A. Kun­kel. 2008. The fide­li­ty of DNA synthe­sis by eu­ka­ryo­tic repli­ca­ti­ve and tran­sle­sion synthe­sis po­ly­ me­ra­ses. Ce­ll Res. 18: 148-161. [R] Mol­do­van, G. L., B. Pfan­der, and S. Jentsch. 2007. PCNA, the maes­tro of the rep­li­ca­tion fo­rk. Ce­ll 129:665-679. [R] Pur­se­ll, Z. F., I. Isoz, E. B. Lundstrom, E. Johansso­n, and T. A. Kun­kel. 2007. Yea­st DNA po­lyme­ra­se ε par­ti­ci­pa­tes in lea­di­ngstra­nd DNA rep­li­ca­tion. Scien­ce 317: 127– 130. [P] Ro­bin­son N. P. and S. D. Be­ll. 2005. Ori­gi­ns of DNA rep­li­ca­tion in the three do­mai­ns of life. FEBS J. 272: 3757-3766. [R] Stil­lman B. 2008. DNA po­lyme­ra­ses at the replica­tion fo­rk in eu­ka­ryo­tes. Mol. Ce­ll. 30: 259-260. [R] Stin­thco­mb, D. T., K. Stru­hl and R. W. Da­vis. 1979. Iso­la­tion and cha­rac­te­ri­za­tion of a yea­st chro­mo­so­mal rep­li­ca­tor. Na­tu­re 282: 39–43. [P]

Clea­ver, J. E. 1968. De­fec­ti­ve re­pair rep­li­ca­tion of DNA in xe­ro­der­ma pig­men­to­sum. Na­tu­re 218: 652–656. [P]

Es­sen L. O. and T. Klar. 2006. Lig­ht-dri­ven DNA re­pair by pho­to­lya­ses. Ce­ll Mol. Li­fe Sci. 63: 1266-1277. [R] Fis­hel, R., M. K. Les­coe, M. R. S. Rao, N. G. Co­ pe­la­nd, N. A. Jen­ki­ns, J. Gar­ber, M. Ka­ne and R. Ko­lod­ner. 1993. The hu­man mu­ta­tor ge­ne ho­mo­log MSH2 and its as­so­cia­tion with he­re­di­ta­ry non­po­lypo­sis co­lon can­cer. Ce­ll 75: 1027–1038. [P] Fous­te­ri M. and L.H. Mul­len­de­rs. 2008. Trans­ crip­tio­n-coup­led nuc­leo­ti­de exci­sion re­pair in mam­ma­lian cel­ls: mo­le­cu­lar mec­ha­nis­ms and bio­lo­gi­cal ef­fec­ts. Ce­ll Res.18: 73-84. [R] Fried­be­rg E. C., A. R. Leh­ma­nn and R. P. P. Fuchs. 2005. Tra­di­ng pla­ces: How do DNA po­lyme­ra­ses swit­ch du­ri­ng tran­sle­sion DNA synthe­sis? Mol. Ce­ll 18: 499-505. [R] Fried­be­rg, E. C., G. C. Wal­ker, W. Sie­de, R. D. Wood, R. A. Schultz and F. Ellenberger, 2005. DNA Re­pair and Mu­ta­ge­ne­sis. Washingto­n, D.C.: ASM Pre­ss. Heg­de, M. L., T. K. Haz­ra and S. Mit­ra. 2008. Ear­ly ste­ps in the DNA ba­se exci­sion/singlestrand in­ter­rup­tion re­pair pat­hway in mam­ ma­lian cel­ls. Ce­ll Res. 18: 27-47. [R]

250    POGLAVLJE 6 Hoeij­ma­ke­rs, J. H. J. 2001. Ge­no­me main­te­nan­ce mec­ha­nis­ms for pre­ven­ti­ng can­cer. Na­tu­re 411: 366–374. [R] Ji­ric­ny J. 2006. The mul­ti­fa­ce­ted mis­mat­chrepair system. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 7: 335-46. [R] Lea­ch, F. S. and 34 ot­he­rs. 1993. Mu­ta­tio­ns of a mu­tS ho­mo­log in he­re­di­ta­ry non­po­lypo­sis co­lo­rec­tal can­cer. Ce­ll 75: 1215–1225. [P] Leh­ma­nn A. R., A. Nii­mi, T. Ogi, S. Brown, S. Sab­bio­ne­da, J. F. Wi­ng, P. L. Kan­nouc­he and C. M. Green. 2007. Tran­sle­sion synthe­sis: Y-fa­mi­ly po­lyme­ra­ses and the po­lyme­ra­se swit­ch. DNA Re­pair 6: 891-899. [R] Li G. M. 2008. Mec­ha­nis­ms and fun­ctio­ns of DNA mis­mat­ch re­pair. Ce­ll Res. 18: 85-98. [R] Lieber, M. R. 2008. The mechanisms of human nonhomologous DNA end joining. J. Biol. Chem, 283: 1-5. [R] Mod­ri­ch, P. 2006. Mec­ha­nis­ms in eu­ka­ryo­tic mis­mat­ch re­pair. J. Biol. Chem. 281: 3030530309. [R] San­car A., L. A. Lin­dsey-Bol­tz, K. Un­sa­l-Kac­maz and S. Li­nn. 2004. Mo­le­cu­lar mec­ha­nis­ms of mam­ma­lian DNA re­pair and the DNA dama­ge chec­kpoin­ts. Ann. Rev. Bioc­hem. 73: 39–85. [R] Sa­ve­ry N. J. 2007. The mo­le­cu­lar mec­ha­ni­sm of tran­scrip­tio­n-coup­led DNA re­pair. Tren­ds Mic­ro­biol. 15(7): 326-33. [R]

Das­Gup­ta, C., A. M. Wu, R. Ka­hn, R. P. Cun­nin­ gham and C. M. Rad­di­ng. 1981. Con­cer­ted stra­nd exchan­ge and for­ma­tion of Hol­li­day struc­tu­res by E. co­li RecA pro­tein. Ce­ll 25: 507–516. [R] Hol­li­day, R. 1964. A mec­ha­ni­sm for ge­ne con­ver­ sion in fun­gi. Ge­net. Res. 5: 282–304. [P] Kro­gh B. O. and L.S. Symin­gton. 2004. Re­com­bi­ na­tion pro­tei­ns in yea­st. Ann. Rev. Ge­net.; 38: 233-271. [R] Liu Y. and S. C. We­st. 2004. Hap­py Hol­li­days: 40th an­ni­ver­sa­ry of the Hol­li­day jun­ction. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll 5: 937-946. [R] Nea­le M.J. and S. Kee­ney. 2006. Cla­ri­fyi­ng the mec­ha­ni­cs of DNA stra­nd exchan­ge in mei­ otic re­com­bi­na­tion. Na­tu­re 442: 153-158 [R] Pot­ter, H. and D. Dres­sler. 1976. On the mec­ha­ ni­sm of ge­ne­tic re­com­bi­na­tion: Elec­tron mic­ros­co­pic ob­ser­va­tion of re­com­bi­na­tion in­ter­me­dia­tes. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 73: 3000–3004. [P] San Fi­lip­po J., P. Su­ng and H. Klein. 2008. Mecha­ni­sm of eu­ka­ryo­tic ho­mo­lo­gous recom­bi­na­tion. Ann. Rev. Bioc­hem. 77: 9.19.29. [R] Szos­tak, J. W., T. L. O­r­r-Wea­ver, R. J. Rot­hstein and F. W. Sta­hl. 1983. The doub­le-stra­ndbreak re­pair mo­del for re­com­bi­na­tion. Ce­ll 33: 25–35. [P]

Pres­la­gi­va­nje DNA

Sed­gwi­ck B., P. A. Ba­tes, J. Paik, S. C. Ja­co­bs and  T. Lin­da­hl. 2007. Re­pair of al­kyla­ted DNA: re­ce­nt ad­van­ces. DNA Re­pair 6: 429– 442. [R]

Be­lan­cio V. P., D. Hed­ges and P. Dei­nin­ger. 2008. Mam­ma­lian no­n-LTR ret­rot­ran­spo­so­ns: For bet­ter or wor­se, in sic­kne­ss and in heal­th. Re­view. Ge­no­me Res. 18(3):343-358. [R]

Shu­ck S. C., E. A. Sho­rt and J. J. Tur­chi. 2008. Eu­ka­ryo­tic nuc­leo­ti­de exci­sion re­pair: from un­der­stan­di­ng mec­ha­nis­ms to in­fluen­ci­ng bio­lo­gy. Ce­ll Res. 18: 64-72. [R]

Chaud­hu­ri J. and F. W. Alt. 2004. Cla­ss-swit­ch re­com­bi­na­tion: In­ter­play of tran­scrip­tion, DNA dea­mi­na­tion and DNA re­pair. Na­tu­re Rev. Im­mu­nol. 4: 541-552. [R]

Thorlu­nd T. and S. C. We­st. 2007. BR­CA2: a univer­sal re­com­bi­na­se re­gu­la­tor. On­co­ge­ne 26: 7720-7730. [R]

Clayco­mb J.M. and T. L. O­r­r-Wea­ver. 2005. De­ ve­lop­men­tal ge­ne am­pli­fi­ca­tion: in­sig­hts into DNA rep­li­ca­tion and ge­ne expres­sion. Tren­ds Ge­net. 21: 149-162. [R]

Re­kom­bi­na­ci­ja iz­me­đu homolognih slje­do­va DNA Cox M. M. 2007. Mo­to­ri­ng alo­ng wi­th the bac­ terial RecA pro­tein. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 8: 127-138. [R]

Di Noia J. M. and M. S. Neu­ber­ger. 2007. Mo­ lecu­lar mec­ha­nis­ms of an­ti­bo­dy so­ma­tic hyper­mu­ta­tion. Ann. Rev. Bioc­hem. 76:1-22. [R]

Fe­do­ro­ff, N. and D. Bot­stein. 1992. The Dyna­mic Ge­no­me: Bar­ba­ra McClin­to­ck’s Ideas in the Cen­tu­ry of Ge­ne­ti­cs. Plain­view, N.Y.: Co­ld Spri­ng Har­bor La­bo­ra­to­ry Pre­ss. Han J. S. and J. D. Boe­ke. 2005. LI­NE-1 ret­ro­ tran­spo­so­ns: mo­du­la­to­rs of quan­ti­ty and qua­li­ty of mam­ma­lian ge­ne expres­sion? BioEs­says 27:775-784. [R] Ho­njo T., H. Na­gao­ka, R. Shin­ku­ra and M. Mura­mat­su. 2005. AID to over­co­me the li­ mi­ta­tio­ns of ge­no­mic in­for­ma­tion. Na­tu­re Im­mu­nol. 6: 655-661. [R] Ho­zu­mi, N. and S. To­ne­gawa. 1976. Evi­den­ce for so­ma­tic rear­ran­ge­me­nt of im­mu­nog­lo­bu­lin ge­nes co­di­ng for va­riab­le and con­sta­nt regio­ns. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 73: 3628–3632. [P] Ju­ng, D. and F. W. Alt. 2006. Mec­ha­ni­sm and con­trol of V(D)J re­com­bi­na­tion at the immu­nog­lo­bu­lin hea­vy chain lo­cus. Ann. Rev. Im­mu­nol. 24: 541-570. [R] Ka­za­zian H. H. Jr. 2004. Mo­bi­le ele­men­ts: Driver­s of ge­no­me evo­lu­tion. Scien­ce 303: 1626-1632. [R] Lon­ge­ri­ch S., U. Ba­su, F. Alt and U. Sto­rb. 2006. AID in so­ma­tic hyper­mu­ta­tion and cla­ss swit­ch re­com­bi­na­tion. Cu­rr. Opin. Im­mu­nol. 18: 164-74. [R] Mai­ze­ls N. 2005. Im­mu­nog­lo­bu­lin ge­ne di­ver­ sifi­ca­tion. Ann. Rev. Ge­net. 39:23-46. [R] McClin­to­ck, B. 1956. Con­trol­li­ng ele­men­ts and the ge­ne. Co­ld Spri­ng Har­bor Symp. Qua­nt. Biol. 21: 197–216. [P] Mil­ls R. E., E. A. Ben­ne­tt R. C., Is­kow and S. E. De­vi­ne. 2007. Whi­ch tran­spo­sab­le ele­men­ts are ac­ti­ve in the hu­man ge­no­me? Tren­ds Genet. 23: 183–191. [R] Te­ng G. and F. N. Pa­pa­va­si­liou. 2007. Im­mu­no­ glo­bu­lin so­ma­tic hyper­mu­ta­tion. Ann. Rev. Ge­net. 41:107-120. [R] Tower J. 2004. De­ve­lop­men­tal ge­ne am­pli­fi­ca­ tion and ori­gin re­gu­la­tion. Ann. Rev. Ge­net. 38: 273–304. [R]

7 Tran­skrip­ci­ja u prokariotima  251 Eu­ka­riot­ske RNApoli­meraze i opći transkrip­cij­ski faktori  258 Re­gu­la­ci­ja tran­skrip­ci­je u eu­ka­rio­ti­ma  265 Doradba i promet RNA  287 Ključ­ni po­kus Izolacija eukariotskoga transkripcijskog faktora  272 Ključ­ni po­kus Otkriće snRNA  294

Sin­te­za i do­ra­dba DNA U 5. i 6. pog­lav­lju raz­mat­ra­na je or­ga­ni­za­ci­ja i od­r­ža­va­nje ge­ nom­ske DNA, ko­ja bi se mog­la pro­mat­ra­ti kao skup ge­ne­tič­kih in­struk­ ci­ja ko­je up­rav­lja­ju svim sta­nič­nim ak­tiv­nos­ti­ma. In­struk­ci­je se pro­vo­de pu­tem sin­te­ze RNA i pro­tei­na. Važ­no je na­po­me­nu­ti da po­na­ša­nje sta­ni­ce ni­je od­re­đe­no is­klju­či­vo nas­li­je­đe­nim ge­ni­ma ne­go i ti­me ko­ji je od tih ge­na iz­ra­žen u ne­ko od­re­đe­no vri­je­me. Re­gu­la­ci­ja gen­ske ek­spre­si­je omo­ gu­ću­je sta­ni­ca­ma pri­la­god­bu na prom­je­ne nji­ho­va oko­li­ša, a od­go­vor­na je i za spe­ci­fič­ne ak­tiv­nos­ti broj­nih di­fe­ren­ci­ra­nih sta­nič­nih vr­sta ko­je iz­ gra­đu­ju vi­še bilj­ke i ži­vo­ti­nje. Mi­šić­ne i jet­re­ne sta­ni­ce, prim­je­ri­ce, sad­r­ ža­va­ju is­te ge­ne; fun­kci­je tih sta­ni­ca ni­su od­re­đe­ne raz­li­ka­ma u nji­ho­vim ge­no­mi­ma, ne­go re­gu­li­ra­nim ob­ras­ci­ma gen­ske ek­spre­si­je ko­ji up­rav­lja­ju raz­vo­jem i di­fe­ren­ci­ja­ci­jom. Pr­vi ko­rak u ek­spre­si­ji ge­na, tran­skrip­ci­ja DNA u RNA, pri­mar­na je ra­zi­na na ko­joj se re­gu­li­ra gen­ska ek­spre­si­ja i u pro­ka­riot­skim i u eu­ka­ riot­skim sta­ni­ca­ma. Mo­le­ku­le RNA u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma nak­nad­no se mi­je­nja­ju na raz­li­či­te na­či­ne − prim­je­ri­ce, in­tro­ni se uk­la­nja­ju prek­ra­ ja­njem či­me se pri­mar­ni pri­je­pis pre­vo­di u svoj fun­kcio­nal­ni ob­lik. Raz­ li­či­te vr­ste RNA ima­ju raz­li­či­te ulo­ge u sta­ni­ca­ma. Glas­nič­ke RNA (mRNA) slu­že kao ka­lu­pi za sin­te­zu pro­tei­na, a ri­bo­som­ske RNA (rR­NA) i tran­spor­tne RNA (tR­NA) dje­lat­ne su u pro­ce­su tran­sla­ci­je mR­NA. Dru­ ge ma­le mo­le­ku­le RNA slu­že re­gu­la­ci­ji ge­na, prek­ra­ja­nju mR­NA, do­ra­đi­ va­nju tR­NA te razvr­sta­va­nju pro­tei­na u eu­ka­rio­ti­ma. Ne­ki od na­juz­bud­ lji­vi­jih nap­re­da­ka pos­ljed­njih go­di­na od­no­se se na ulo­gu ne­ko­di­ra­ju­ćih RNA (mik­roR­NA) u re­gu­la­ci­ji gen­ske ek­spre­si­je u eu­ka­rio­ti­ma. U ovom pog­lav­lju raz­mat­ra­mo tran­skrip­ci­ju i do­ra­dbu (en­gl. pro­ces­si­ng) RNA. Kraj­nji ko­rak u ek­spre­si­ji ge­na, pre­vo­đe­nje glas­nič­ke RNA u pro­tein, bit će raz­mat­ran u 8. pog­lav­lju.

Tran­skrip­ci­ja u pro­ka­rio­ti­ma Kao u ve­ći­ni pod­ruč­ja mo­le­ku­lar­ne bio­lo­gi­je, is­tra­ži­va­nja na E. co­li osi­gu­ra­la su mo­del za kas­ni­ja is­tra­ži­va­nja tran­skrip­ci­je u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Ka­ko je re­če­no u 4. pog­lav­lju, mR­NA je pr­vot­no ot­kri­ve­na u E. co­li. Ta­ko­đer, E. co­li je pr­vi or­ga­ni­zam iz ko­je­ga je izo­li­ra­na i prou­ča­ va­na RNA-po­li­me­ra­za. Os­nov­ni me­ha­niz­mi po­mo­ću ko­jih je tran­skrip­ci­

252    POGLAVLJE 7 ja re­gu­li­ra­na ras­vi­jet­lje­ni su ta­ko­đer pio­nir­skim po­ku­si­ma na E. co­li. Ti su po­ku­si po­ka­za­li da re­gu­li­ra­na gen­ska ek­spre­si­ja omo­gu­ću­je sta­nič­ni od­go­ vor na prom­je­ne u oko­li­ni, prim­je­ri­ce na prom­je­ne u dos­tup­nos­ti hra­nji­vih sas­to­ja­ka. Ra­zu­mi­je­va­nje tran­skrip­ci­je u E. co­li omo­gu­ći­lo je prou­ča­va­nje mno­go slo­že­ni­jih me­ha­ni­za­ma ko­ji re­gu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma.

RNA-po­li­me­ra­za i tran­skrip­ci­ja Sli­ka 7-1. RNA-po­li­me­ra­za iz E. coli.  En­zim se sas­to­ji iz 6 pod­je­di­ni­ca: dvi­je α, jed­ne β, jed­ne β', jed­ne ω i jed­ne σ. Pod­je­di­ni­ca σ re­la­tiv­no je sla­bo ve­za­na i mo­že di­so­ci­ra­ti od os­ta­lih pet pod­je­di­ni­ ca ko­je či­ne srž po­li­me­ra­ze.

En­zim od­go­vo­ran za sin­te­zu RNA je­st RNA-po­li­me­ra­za ko­ja ka­ta­li­zi­ra po­li­me­ri­za­ci­ju ri­bo­nuk­leo­zi­d-5'-tri­fos­fa­ta (NTP) us­mje­re­nu ka­lu­pom DNA. Sin­te­za RNA je slič­na sin­te­zi DNA; slič­no DNA-po­li­me­ra­zi, RNApo­li­me­ra­za ka­ta­li­zi­ra ra­st lan­ca RNA uvi­jek u smje­ru 5' pre­ma 3'. Me­đu­ tim, za raz­li­ku od DNA-po­li­me­ra­ze, RNA-po­li­me­ra­za ne tre­ba prip­rem­lje­ nu kli­cu za za­po­či­nja­nje (ini­ci­ja­ci­ju) sin­te­ze RNA. Um­jes­to to­ga, trans­krip­ci­ja za­po­či­nje de no­vo na spe­ci­fič­nim mjes­ti­ma na po­čet­ku ge­na. Pro­ces za­po­či­nja­nja po­se­bi­ce je va­žan jer je to zna­čaj­na ra­zi­na na ko­joj se re­gu­li­ra tran­skrip­ci­ja. RNA-po­li­me­ra­za, slič­no kao i DNA-po­li­me­ra­za, slo­žen je en­zim ko­ji se sas­to­ji od vi­še po­li­pep­tid­nih la­na­ca. Bak­te­rij­ski en­zim sas­tav­ljen je iz pet raz­li­či­tih pod­je­di­ni­ca, naz­va­nih α, β, β', ω i σ (sl. 7-1). Pod­je­di­ni­ca σ je re­la­tiv­no sla­bo ve­za­na i mo­že se raz­dvo­ji­ti od os­ta­lih pod­je­di­ni­ca da­ju­ći srž en­zi­ma na­či­nje­nu od dvi­je α, jed­ne β, jed­ne β' i jed­ne ω pod­je­di­ni­ce. Srž po­li­me­ra­ze pot­pu­no je spo­sob­na ka­ta­li­zi­ra­ti po­li­me­ri­za­ci­ju NTP u RNA, što upu­ću­je na to da σ pod­je­di­ni­ca ni­je pot­reb­na za os­nov­nu ka­ta­li­ tič­ku ak­tiv­no­st en­zi­ma. Me­đu­tim, srž en­zi­ma ne mo­že se spe­ci­fič­no ve­za­ti na slje­do­ve DNA ko­ji sig­na­li­zi­ra­ju nor­mal­nu ini­ci­ja­ci­ju tran­skrip­ci­je, sto­ga je σ pod­je­di­ni­ca pot­reb­na za ut­vr­đi­va­nje is­prav­nih mjes­ta za za­po­či­nja­nje tran­skrip­ci­je. Iz­bor tih mjes­ta kri­tič­ni je dio tran­skrip­ci­je jer sin­te­za fun­ kcio­nal­ne RNA mo­ra za­po­če­ti na po­čet­ku ge­na. Ve­ći­na bak­te­ri­ja, uk­lju­ču­ ju­ći E. co­li, pos­je­du­je ne­ko­li­ko raz­li­či­tih σ pod­je­di­ni­ca ko­je upuću­ju RNA‑po­li­me­ra­zu na raz­li­či­te vr­ste ini­ci­ja­cij­skih mjes­ta za tran­skrip­ci­ju u raz­li­či­tim uv­je­ti­ma, prim­je­ri­ce u uv­je­ti­ma gla­do­va­nja na­sup­rot uv­je­ti­ma dob­re opskr­be hra­nom. Sli­jed DNA na ko­ji se ve­že RNA-po­li­me­ra­za ka­ko bi za­po­če­la tran­skrip­ ci­ju ge­na na­zi­va se pro­mo­tor. Slje­do­vi DNA uk­lju­če­ni u pro­mo­tor­sku fun­ kci­ju naj­pri­je su ut­vr­đe­ni us­po­red­bom nuk­leo­tid­nih slje­do­va ni­za raz­li­či­tih ge­na izo­li­ra­nih iz E. co­li. Us­po­red­be su po­ka­za­le da pod­ruč­ja uz­vod­no od mjes­ta za­po­či­nja­nja tran­skrip­ci­je sad­r­ža­va­ju dvi­je sku­pi­ne slje­do­va ko­je su slič­ne u mno­gim ge­ni­ma. Sva­ki od tih za­jed­nič­kih slje­do­va sas­to­ji se od še­st nuk­leo­ti­da i smješ­ten je oko 10 i 35 baz­nih pa­ro­va uz­vod­no od po­čet­ nog tran­skrip­cij­skog mjes­ta (sl. 7-2). Oni se na­zi­va­ju –10 i –35 ele­men­ti, oz­na­ču­ju­ći nji­ho­vu po­zi­ci­ju u od­no­su na po­čet­no tran­skrip­cij­sko mjes­to ko­je je de­fi­ni­ra­no kao +1. Slje­do­vi na –10 i –35 po­zi­ci­ji u raz­li­či­tim pro­

Sli­ka 7-2. Pro­mo­tor­ski slje­do­vi E. co­li.  Zna­čaj­ku pro­mo­to­ra E. co­li pred­stav­lja­ju dva ni­za slje­do­va smješ­te­nih 10 i 35 pa­ro­va ba­za uz­vod­no od po­čet­nog mjes­ta za tran­skrip­ci­ju (+1). Usug­la­še­ni slje­do­vi po­ka­zu­ju da su u skla­du s naj­češ­će na­đe­nim ba­ za­ma u raz­li­či­tim pro­mo­to­ri­ma.

SINTEZA I DORADBA DNA 

   253

mo­to­ri­ma ni­su jed­na­ki, ali su svi do­volj­no slič­ni da se pos­ta­ve usug­la­še­ni slje­do­vi − ba­ze naj­češ­će pri­sut­ne na sva­koj po­zi­ci­ji. Ne­ko­li­ko vr­sta ek­spe­ri­men­tal­nih do­ka­za pot­vr­đu­ju fun­kcio­nal­nu važ­ no­st –10 i –35 pro­mo­tor­skih ele­me­na­ta. Pr­vo, ge­ni s pro­mo­to­ri­ma ko­ji se raz­li­ku­ju od usug­la­še­nih slje­do­va pre­pi­su­ju se ma­nje učin­ko­vi­to od ge­na či­ji se pro­mo­to­ri mno­go bo­lje po­du­da­ra­ju s usug­la­še­nim slje­do­vi­ma. Dru­ go, mu­ta­ci­je uve­de­ne bi­lo u –35 bi­lo u –10 usug­la­še­ne slje­do­ve utje­ču na pro­mo­tor­sku fun­kci­ju. Tre­će, mjes­ta na ko­ji­ma se RNA-po­li­me­ra­za ve­že na pro­mo­to­re iz­rav­no su ut­vr­đe­na po­ku­si­ma DNA otis­ka sto­pa­la (en­gl. DNA foot­pri­nt), ko­ji se uo­bi­ča­je­no ko­ris­te za ut­vr­đi­va­nje mjes­ta na ko­ja se pro­ tei­ni ve­žu na DNA (sl. 7-3). U po­ku­si­ma te vr­ste ulo­mak DNA ra­dioak­tiv­ no je ili fluo­res­cen­tno oz­na­čen na jed­nom kra­ju. Oz­na­če­na DNA in­ku­bi­ra

Sli­ka 7-3. DNA oti­sak sto­pa­la.  Uzo­rak ko­ji sad­r­ža­va frag­men­te DNA ra­dioak­tiv­ no oz­na­če­ne na jed­nom kra­ju po­di­je­ljen je u dva di­je­la, a jed­na po­lo­vi­ca uzor­ka in­ku­bi­ra­na je s pro­tei­ni­ma ko­ji se ve­žu na spe­ci­f ič­ne slje­do­ve unu­tar frag­men­ta DNA. Oba se uzor­ka po­tom raz­gra­đu­ju DNa­zom pod tak­vim uv­je­ti­ma da DNa­ za uvo­di pros­ječ­no je­dan rez po mo­le­ ku­li. Dio DNA ve­zan na pro­tein zaš­ti­ćen je od raz­grad­nje DNa­zom. Kom­plek­si DNA-pro­tein se de­na­tu­ri­ra­ju, a ve­li­či­na ra­dioak­tiv­no oz­na­če­nih frag­me­na­ta na­ sta­lih dje­lo­va­njem DNa­ze ana­li­zi­ra­na je elek­tro­fo­re­zom. Frag­men­ti DNA nas­ta­li ki­da­njem DNa­zom unu­tar pod­ruč­ja zaš­ ti­će­nog ve­za­njem pro­tei­na na DNA ne­ dos­ta­ju u uzor­ku DNA ko­ji je in­ku­bi­ran s pro­tei­nom.

254    POGLAVLJE 7

Sli­ka 7-4. Tran­skrip­ci­ja po­li­me­ra­zom iz E. co­li.  U po­čet­ku se po­li­me­ra­za ve­ že nes­pe­ci­f ič­no na DNA i kre­će po mo­le­ ku­li sve dok se σ pod­je­di­ni­ca ne ve­že na −35 i −10 pro­mo­tor­ske ele­men­te, stva­ ra­ju­ći zat­vo­re­ni pro­mo­tor­ski kom­ple­k s. Po­li­me­ra­za po­tom raz­ma­ta DNA oko ini­ci­ja­cij­skog mjes­ta, a tran­skrip­ci­ja za­ po­či­nje po­li­me­ri­za­ci­jom slo­bod­nih NTP. σ pod­je­di­ni­ca po­tom di­so­ci­ra od sr­ži po­ li­me­ra­ze, ko­ja se kre­će duž DNA i pro­du­ lju­je ras­tu­ći la­nac RNA.

se s pro­tei­ni­ma ko­ji se is­pi­tu­ju (prim­je­ri­ce RNA-po­li­me­ra­za) i nak­nad­no dje­lo­mič­no raz­gra­đu­je DNa­zom. Na­če­lo je me­to­de da su pod­ruč­ja DNA na ko­ja se ve­zao pro­tein zaš­ti­će­na od raz­grad­nje DNa­zom. Sto­ga se ta pod­ ruč­ja mo­gu ut­vr­di­ti us­po­red­bom raz­grad­nih pro­du­ka­ta DNA na ko­ju su se ve­za­li pro­tei­ni, s iden­tič­nim pa­ra­lel­nim uzor­kom DNA ko­ja ni­je bi­la in­ku­ bi­ra­na s pro­tei­ni­ma. Va­ri­ja­ci­je ove os­nov­ne me­to­de, ko­ja ko­ris­ti ke­mij­ske rea­gen­se za mo­di­fi­ka­ci­ju i raz­grad­nju DNA na od­re­đe­nim nuk­leo­ti­di­ma, mo­gu se ko­ris­ti­ti za ut­vr­đi­va­nje spe­ci­fič­nih ba­za na DNA ko­je su u kon­

SINTEZA I DORADBA DNA 

tak­tu s pro­tei­nom. Ana­li­za otis­ka sto­pa­la po­ka­za­la je da se RNA-po­li­me­ra­ za op­će­ni­to ve­že na pro­mo­to­re u pod­ruč­ju oko 60 pa­ro­va ba­za ko­ji se pro­ te­žu od –40 do +20 (od 40 nuk­leo­ti­da uz­vod­no do 20 nuk­leo­ti­da niz­vod­no od po­čet­no­ga tran­skrip­cij­sko­ga mjes­ta). σ pod­je­di­ni­ca spe­ci­fič­no se ve­že na slje­do­ve u oba, –35 i –10 pro­mo­tor­ska pod­ruč­ja, pot­kr­jep­lju­ju­ći važ­nost tih slje­do­va u pro­mo­tor­skoj fun­kci­ji. Osim to­ga, ne­ki pro­mo­to­ri E. co­li ima­ju tre­ći sli­jed smješ­ten uz­vod­no od –35 pod­ruč­ja ko­ji slu­ži kao spe­ci­ fič­no vez­no mjes­to za α pod­je­di­ni­cu RNA-po­li­me­ra­ze. U od­sut­nos­ti σ pod­je­di­ni­ce, RNA-po­li­me­ra­za ve­že se nes­pe­ci­fič­no i s nis­kim afi­ni­te­tom na DNA. Ulo­ga σ pod­je­di­ni­ce sas­to­ji se u us­mje­ra­va­nju po­li­me­ra­ze k pro­mo­to­ri­ma spe­ci­fič­nim ve­zi­va­njem na oba sli­je­da, –35 i -10, do­vo­de­ći do za­po­či­nja­nja tran­skrip­ci­je na po­čet­ci­ma ge­na (sl. 7-4). Po­čet­no ve­zi­va­nje iz­me­đu po­li­me­ra­ze i pro­mo­to­ra naz­va­no je zat­vo­re­nim pro­mo­tor­skim kom­plek­som bu­du­ći da DNA ni­je od­mo­ta­na. Po­li­me­ra­za po­tom od­mo­ta­va 12–14 ba­za DNA, od –12 do +2, stva­ra­ju­ći ot­vo­re­ni pro­ mo­tor­ski kom­ple­ks u ko­je­mu jed­no­lan­ča­na DNA slu­ži kao ka­lup za tran­ skrip­ci­ju. Tran­skrip­ci­ja za­po­či­nje po­ve­zi­va­njem dva­ju slo­bod­nih NTP. Na­ kon ug­rad­nje pr­vih de­set nuk­leo­ti­da, σ pod­je­di­ni­ca os­lo­ba­đa se s po­li­me­ra­ze ko­ja os­tav­lja pro­mo­tor i kre­će se duž ka­lu­pa DNA da bi nas­ta­ vi­la pro­du­lje­nje (elon­ga­ci­ju) ras­tu­će­ga lan­ca RNA. Ti­je­kom pro­du­lje­nja, po­li­me­ra­za os­ta­je zdru­že­na s ka­lu­pom nas­tav­lja­ ju­ći sin­te­zu mR­NA. Kre­ću­ći se duž ka­lu­pa po­li­me­ra­za od­mo­ta­va ka­lup is­ pred se­be, a smo­ta­va ga iza se­be, od­r­ža­va­ju­ći od­mo­ta­no pod­ruč­je du­lji­ne oko 15 pa­ro­va ba­za u di­je­lu ko­ji se pre­pi­su­je. Unu­tar od­mo­ta­nog di­je­la DNA, 8-9 ba­za ras­tu­ćeg lan­ca RNA kom­ple­men­tar­no je ve­za­no za ka­lup DNA. Vi­so­koraz­lu­ču­ju­ća struk­tur­na ana­li­za bak­te­rij­ske RNA-po­li­me­ra­ze uka­zu­je da β i β' pod­je­di­ni­ce tvo­re struk­tu­ru slič­nu ra­ko­vim šti­palj­ka­ma ko­ja čvr­sto dr­ži ka­lup DNA (sl. 7-5). Unu­tar­nji žli­jeb iz­me­đu β i β' pod­je­ di­ni­ca mo­že pri­mi­ti 20 pa­ro­va ba­za DNA i sad­r­ža­va ak­tiv­no mjes­to po­li­ me­ra­ze. Sin­te­za RNA nas­tav­lja se sve dok po­li­me­ra­za ne nai­đe na ter­mi­na­cij­ski znak; na tom se mjes­tu zaus­tav­lja tran­skrip­ci­ja, RNA se os­lo­ba­đa, a en­zim di­so­ci­ra s ka­lu­pa DNA. Pos­to­je dva me­ha­niz­ma za ter­mi­na­ci­ju tran­skrip­ ci­je u E. co­li. Naj­jed­nos­tav­ni­ji i naj­češ­ći ter­mi­na­cij­ski sig­nal u E. co­li sas­to­ ji se od si­met­rič­no­ga ob­r­nu­tog po­nav­lja­nja sli­je­da bo­ga­tog GC-ba­za­ma iza ko­je­ga sli­je­di oko se­dam A-ba­za (sl. 7-6). Tran­skrip­ci­ja GC-bo­ga­tog ob­r­

   255

7.1. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Tran­skrip­ci­ja. Tran­skrip­ci­ja je sin­te­za RNA ko­jom up­ rav­lja DNA, a ka­ta­li­zi­ra je RNA-po­li­me­ra­za.

Sli­ka 7-5. Struk­tu­ra bak­te­rij­ske RNA-po­li­me­ra­ze.  α pod­je­di­ni­ce po­li­me­ra­ze obo­je­ne su tam­no­ze­le­no i svi­jet­lo­ze­le­no, β pla­vo, β' ru­ži­ čas­to i ω žu­to. (Lju­baz­noš­ću Set­ha Dar­sta, Sveu­či­liš­te Roc­ke­fel­ler.)

256    POGLAVLJE 7 Sli­ka 7-6. Ter­mi­na­ci­ja tran­skrip­ci­je.  Ter­mi­na­ci­ja tran­skrip­ci­je sig­na­li­zi­ra­na je ob­r­nu­tim po­nav­lja­nji­ma bo­ga­tim GC iza ko­jih sli­je­di se­dam A-os­ta­ta­ka. Ob­r­nu­ta po­nav­lja­nja stva­ra­ju sta­bil­ne pe­telj­kaom­ča struk­tu­re u RNA, uz­ro­ku­ju­ći di­so­ ci­ja­ci­ju RNA s ka­lu­pa DNA.

nu­tosi­met­rič­nog po­nav­lja­nja do­vo­di do stva­ra­nja seg­men­ta RNA ko­ji mo­ že tvo­ri­ti sta­bil­ne struk­tu­re pe­telj­ka-om­ča kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem ba­za. Nas­ta­nak tak­vih struk­tu­ra u RNA, ko­je su sa­me se­bi kom­ple­men­tar­ ne, ras­ki­da aso­ci­ja­ci­ju RNA s DNA-ka­lu­pom i zaus­tav­lja tran­skrip­ci­ju. S ob­zi­rom na to da su vo­di­ko­vi mos­to­vi iz­me­đu A i U sla­bi­ji ne­go iz­me­đu G i C, pri­sut­no­st A-ba­za niz­vod­no od ob­r­nu­topo­nav­lja­ju­će­ga sli­je­da po­ti­če di­so­ci­ja­ci­ju RNA s DNA-ka­lu­pa. Al­ter­na­tiv­no, tran­skrip­ci­ja ne­kih ge­na se zaus­tav­lja spe­ci­fič­nim ter­mi­na­cij­skim pro­tei­nom (Rho-pro­tein) ko­ji se ve­ že na str­še­ći, jed­no­lan­ča­ni dio (vi­še od 60 nuk­leo­ti­da) RNA. S ob­zi­rom da je bak­te­rij­ska mR­NA zdru­že­na s ri­bo­so­mi­ma te da se nje­na tran­skrip­ci­ja od­vi­ja is­tov­re­me­no s tran­sla­ci­jom, str­še­ća jed­no­lan­ča­na pod­ruč­ja RNA iz­ lo­že­na su sa­mo na kra­ju ne­ke mR­NA.

Rep­re­so­ri i ne­ga­tiv­na kon­tro­la tran­skrip­ci­je Tran­skrip­ci­ja se mo­že re­gu­li­ra­ti na oba stup­nja, ini­ci­ja­ci­ji ili elon­ga­ci­ji, ali ve­ći­na tran­skrip­cij­ske re­gu­la­ci­je u bak­te­ri­ja­ma obuh­va­ća re­gu­la­ci­ju na ni­vou ini­ci­ja­ci­je. Pe­de­se­tih go­di­na proš­lo­ga sto­lje­ća Fra­nçois Ja­cob i Ja­ cques Mo­nod iz­ve­li su pio­nir­ska is­tra­ži­va­nja re­gu­la­ci­je ge­na u E. co­li. Ovi is­tra­ži­va­či za­jed­no sa svo­jim su­rad­ni­ci­ma ana­li­zi­ra­li su ek­spre­si­ju en­zi­ma dje­lat­nih u me­ta­bo­liz­mu lak­to­ze či­ji se raz­grad­ni pro­duk­ti, glu­ko­za i ga­lak­ to­za, mo­gu ko­ris­ti­ti kao iz­vor ug­lji­ka i ener­gi­je (sl. 7-7). En­zim ko­ji ka­ta­ li­zi­ra raz­grad­nju lak­to­ze (β-galaktozidaza) kao i os­ta­li en­zi­mi dje­lat­ni u me­ta­bo­liz­mu lak­to­ze, ek­spri­mi­ra­ni su sa­mo ako je lak­to­za na ras­po­la­ga­nju bak­te­ri­ja­ma. Ina­če, sta­ni­ca je spo­sob­na ra­cio­nal­no gos­po­da­ri­ti ne ula­žu­ći ener­gi­ju u sin­te­zu RNA i pro­tei­na ko­ji joj ni­su pot­reb­ni. Ta­ko lak­to­za in­ du­ci­ra sin­te­zu en­zi­ma ko­ji sud­je­lu­ju u nje­zi­nom vlas­ti­tom me­ta­bo­liz­mu. Osim β-ga­lak­to­zi­da­ze, za me­ta­bo­li­zam lak­to­ze pot­reb­ni su pro­duk­ti dva­ju dru­gih ge­na ko­ji su us­ko po­ve­za­ni: lak­to­za-per­mea­za ko­ja tran­spor­ti­ra lak­ to­zu u sta­ni­cu te tran­sa­ce­ti­la­za či­ja je za­da­ća inak­ti­vi­ra­ti tok­sič­ne tio­ga­

SINTEZA I DORADBA DNA 

lakto­zi­de ko­ji se sku­pa s lak­to­zom tran­spor­ti­ra­ju u sta­ni­cu s po­mo­ću per­ mea­ze. Na os­no­vi čis­to ge­ne­tič­kih po­ku­sa, Ja­cob i Mo­nod de­du­ci­ra­li su me­ha­ ni­zam ko­jim je re­gu­li­ra­na ek­spre­si­ja ovih ge­na, pos­tav­lja­ju­ći model fun­da­ men­ta­lan za ra­zu­mi­je­va­nje re­gu­la­ci­je tran­skrip­ci­je. Ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju β-ga­lak­to­zi­da­zu, per­mea­zu i tran­sa­ce­ti­la­zu ek­spri­mi­ra­ju se kao jed­na je­di­ ni­ca naz­va­na ope­ron (sl. 7-8). Is­tra­ži­va­nje mu­tan­tnih bak­te­ri­ja de­fek­tnih u re­gu­la­ci­ji na­ve­de­nih ge­na iden­ti­fi­ci­ra­lo je dva raz­li­či­ta lo­ku­sa, naz­va­na o i i, ko­ji kon­tro­li­ra­ju ek­spre­si­ju ope­ro­na. Tran­skrip­ci­ja ope­ro­na je kon­tro­li­ ra­na ope­ra­to­rom (o) smješ­te­nim u sus­jed­stvu mjes­ta za ini­ci­ja­ci­ju tran­s­ krip­cije. Gen i, fi­zič­ki odi­je­ljen od ope­ro­na, ko­di­ra pro­tein ko­ji re­gu­li­ra tran­skrip­ci­ju ve­za­njem na ope­ra­tor­sku DNA. Mu­tan­te ko­je ne mo­gu stva­ ra­ti fun­kcio­nal­ni pro­du­kt i ge­na kon­sti­tu­tiv­no ekspri­mi­ra­ju ope­ron čak i u od­sus­tvu lak­to­ze. To zna­či da je pro­du­kt i ge­na rep­re­sor ko­ji blo­ki­ra trans­ krip­ci­ju uko­li­ko je ve­zan na o. Do­da­tak la­kto­ze in­du­ci­ra ope­ron jer se lak­ to­za ve­že za rep­re­sor sprje­ča­va­ju­ći ta­ko nje­go­vo ve­za­nje na ope­ra­tor­sko mje­s­to na DNA. Mno­gi po­ku­si pot­vr­di­li su ovaj te­melj­ni mo­del, uk­lju­ču­ju­ći i po­ku­se izo­la­ci­je lac rep­re­so­ra i ana­li­ze nje­go­va ve­za­nja na ope­ra­tor­sku DNA, ko­je je pro­veo Wal­ter Gil­be­rt šez­de­se­tih go­di­na proš­lo­ga sto­lje­ća. Mo­le­ku­lar­ nom ana­li­zom de­fi­ni­ra­na je ope­ra­tor­ska DNA kao dva­de­se­tak pa­ro­va ba­za smješ­te­nih ne­ko­li­ko ba­za is­pred ini­ci­ja­cij­sko­ga mjes­ta tran­skrip­ci­je. Ana­li­ zom otis­ka sto­pa­la to je pod­ruč­je iden­ti­fi­ci­ra­no kao mjes­to na ko­je se rep­

   257

Sli­ka 7-7. Me­ta­bo­li­zam lak­to­ze.  β-ga­ lak­to­zi­da­za ka­ta­li­zi­ra hid­ro­li­zu lak­to­ze na glu­ko­zu i ga­lak­to­zu.

Sli­ka 7-8. Ne­ga­tiv­na kon­tro­la lac ope­ro­na.  Gen i ko­di­ra rep­re­sor ko­ji se, u od­sut­nos­ti lak­to­ze (vrh), ve­že na ope­ra­tor (o) i in­ter­fe­ri­ra s ve­zi­va­njem RNA-po­li­me­ra­ze na pro­mo­tor, blo­ki­ra­ju­ći tran­skrip­ci­ju tri struk­tur­na ge­na (z, β-ga­lak­to­zi­da­ze; y, per­mea­ze; a, tran­sa­ce­ti­ la­ze). Lak­to­za in­du­ci­ra ek­spre­si­ju ope­ro­na ve­zi­va­njem na rep­re­sor (dno sli­ke) što spr­je­ča­ va rep­re­sor da se ve­že na ope­ra­tor. P – pro­mo­tor; Pol – po­li­me­ra­za.

258    POGLAVLJE 7 re­sor ve­že i one­mo­gu­ću­je ve­za­nje RNA-po­li­me­ra­ze na pro­mo­tor či­me spr­ je­ča­va tran­skrip­ci­ju. Kao što je pred­vi­đe­no, lak­to­za se ve­že na rep­re­sor ko­ji se ta­da vi­še ne mo­že ve­za­ti na ope­ra­tor­sku DNA. Sre­diš­nji je prin­cip re­gu­la­ci­je ge­na, pro­tu­ma­čen na prim­je­ru lak­to­za ope­ro­na, da je kon­tro­la tran­skrip­ci­je pos­re­do­va­na in­te­rak­ci­jom re­gu­lacijskih pro­tei­na sa spe­ci­fi­ čnim slje­do­vi­ma DNA. Ovaj op­ći na­čin re­gu­la­ci­je ši­ro­ko je prim­je­njiv i kod pro­ka­riot­skih i kod eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Re­gu­la­cijski slje­do­vi po­put ope­ra­to­ra na­zi­va­ju se cis-dje­lu­ju­ći kon­trol­ni ele­men­ti sto­ga što ut­je­ču na ek­spre­si­ju sa­mo onih ge­na ko­ji su ve­za­ni na is­tu mo­le­ku­lu DNA. S dru­ge stra­ne, pro­tei­ni po­put rep­re­so­ra, na­zi­va­ju se tra­ns-dje­lu­ju­ći fak­to­ri jer mo­ gu ut­je­ca­ti na ek­spre­si­ju ge­na smješ­te­nih na dru­gim kro­mo­so­mi­ma u sta­ ni­ci. Lac ope­ron prim­jer je ne­ga­tiv­ne kon­tro­le jer ve­za­nje rep­re­so­ra spr­je­ ča­va tran­skrip­ci­ju. Me­đu­tim, to ni­je uvi­jek slu­čaj; mno­gi tra­ns-dje­lu­ju­ći fak­to­ri pri­je su ak­ti­va­to­ri ne­go in­hi­bi­to­ri tran­skrip­ci­je.

Po­zi­tiv­na kon­tro­la tran­skrip­ci­je

Sli­ka 7-9. Po­zi­tiv­na kon­tro­la lac ope­ ro­na glu­ko­zom.  Sni­že­na ra­zi­na glu­ ko­ze ak­ti­vi­ra ade­ni­l-cik­la­zu ko­ja pre­vo­di ATP u cik­lič­ki AMP (cA­MP). Cik­lič­ki AMP ve­že se po­tom na ka­ta­bo­lič­ki ak­ti­va­tor­ ski pro­tein (CAP) či­me sti­mu­li­ra nje­go­vo ve­za­nje na re­gu­lacijske slje­do­ve mno­gih ope­ro­na po­ve­za­nih s me­ta­bo­liz­mom al­ ter­na­tiv­nih še­će­ra, kao što je lak­to­za. CAP stu­pa u in­te­rak­ci­ju s pod­je­di­ni­com RNA-po­li­me­ra­ze olak­ša­va­ju­ći ta­ko ve­za­ nje po­li­me­ra­ze za pro­mo­tor.

Naj­bo­lje is­tra­žen prim­jer po­zi­tiv­ne kon­tro­le u E. co­li je­st ut­je­caj glu­ko­ ze na ek­spre­si­ju ge­na ko­ji ko­di­ra­ju en­zi­me dje­lat­ne u raz­grad­nji (ka­ta­bo­ liz­mu) dru­gih še­će­ra (uk­lju­ču­ju­ći lak­to­zu), ko­ji pred­stav­lja­ju al­ter­na­tiv­ni iz­vor ug­lji­ka i ener­gi­je. Prio­ri­tet­no se ko­ris­ti glu­ko­za, ta­ko da dok je glu­ ko­za na ras­po­la­ga­nju, en­zi­mi dje­lat­ni u ka­ta­bo­liz­mu al­ter­na­tiv­nih iz­vo­ra ener­gi­je ni­su ek­spri­mi­ra­ni. Prim­je­ri­ce, ako E. co­li ras­te u me­di­ju ko­ji sa­ drža­va i glu­ko­zu i lak­to­zu, lac ope­ron se ne in­du­ci­ra, a bak­te­ri­je ko­ris­te sa­mo glu­ko­zu. Ta­ko glu­ko­za gu­ši lac ope­ron čak i u pri­sut­nos­ti nor­mal­nog in­duk­to­ra (lak­to­ze). Da­nas je poz­na­to da je rep­re­si­ja glu­ko­zom (op­će­ni­to naz­va­no rep­re­si­ja ka­ta­bo­li­tom) pos­re­do­va­na po­zi­tiv­nim kon­trol­nim sus­ta­vom, ko­ji je po­ve­ zan s ra­zi­nom cik­lič­kog AMP (cA­MP) (sl. 7-9). En­zim ade­ni­l-cik­la­za, ko­ ji pre­vo­di ATP u cA­MP, u bak­te­ri­ja­ma je re­gu­li­ran ta­ko da pad ra­zi­ne glu­ko­ze iza­zi­va po­ra­st cA­MP. Po­tom se cA­MP ve­že na pro­tein ko­ji re­gu­li­ra tran­skrip­ci­ju, naz­van ka­ta­bo­lič­ki ak­ti­va­tor­ski pro­tein (CAP). Ve­zi­va­nje cAMP sti­mu­li­ra ve­zi­va­nje CAP na cilj­ni sli­jed DNA u lac ope­ro­nu smje­ šten oko 60 ba­za uz­vod­no od po­čet­nog mjes­ta tran­skrip­ci­je. CAP za­tim stu­pa u in­te­rak­ci­ju s pod­je­di­ni­com RNA-po­li­me­ra­ze, pro­mi­ču­ći ve­zi­va­nje po­li­me­ra­ze na pro­mo­tor i ak­ti­vi­ra­ju­ći tran­skrip­ci­ju.

Eu­ka­riot­ske RNA-po­li­me­raze i opći tran­skrip­cij­ski fak­to­ri Ia­ko se tran­skrip­ci­ja u svim sta­ni­ca­ma od­vi­ja po is­tom te­melj­nom me­ ha­niz­mu, u eu­ka­riot­skim je sta­ni­ca­ma taj pro­ces znat­no slo­že­ni­ji ne­go u bak­te­ri­ja­ma. Tri su bit­ne raz­li­ke iz­me­đu pro­ka­riot­skog i eu­ka­riot­sko­ga su­ sta­va. Pr­vo, dok se u bak­te­ri­ja­ma svi ge­ni pre­pi­su­ju po­mo­ću jed­ne RNApo­li­me­ra­ze, eu­ka­riot­ske sta­ni­ce ima­ju ne­ko­li­ko raz­li­či­tih RNA-po­li­me­ra­za ko­je pre­pi­su­ju od­re­đe­ne sku­pi­ne ge­na. Dru­go, eu­ka­riot­ske se RNA-po­li­me­ ra­ze ne ve­žu iz­rav­no na pro­mo­tor­ske slje­do­ve ne­go zah­ti­je­va­ju in­te­rak­ci­ju s ni­zom do­dat­nih pro­tei­na da bi spe­ci­fič­no za­po­če­le i re­gu­li­ra­le tran­skrip­ ci­ju. Ko­nač­no, tran­skrip­ci­ja se kod eu­ka­rio­ta do­ga­đa pri­je na kro­ma­ti­nu ne­go na slo­bod­noj DNA, ta­ko da je re­gu­la­ci­ja kro­ma­tin­ske struk­tu­re va­žan čim­be­nik u tran­skrip­cij­skoj ak­tiv­nos­ti eu­ka­riot­skih ge­na. Po­ve­ća­na slo­že­ no­st euka­riot­ske tran­skrip­ci­je, omo­gu­ća­va so­fis­ti­ci­ra­nu re­gu­la­ci­ju gen­ske

SINTEZA I DORADBA DNA 

ek­spre­si­je pot­reb­ne za up­rav­lja­nje ak­tiv­nos­ti­ma ve­li­ko­ga bro­ja raz­li­či­tih sta­ni­ca u vi­šes­ta­nič­nom or­ga­niz­mu.

Eu­ka­riot­ske RNA-po­li­me­ra­ze Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce ima­ju tri raz­li­či­te RNA-po­li­me­ra­ze, smješ­te­ne u jez­gri, ko­je pre­pi­su­ju raz­li­či­te sku­pi­ne ge­na (tab­l. 7-1). Ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne pre­pi­su­ju se po­mo­ću RNA-po­li­me­ra­ze II da­ju­ći mR­NA, a ri­bo­ som­ske (rR­NA) i tran­spor­tne RNA (tR­NA) pre­pi­su­ju se RNA-po­li­me­ra­za­ ma I i III. RNA-po­li­me­ra­za I spe­ci­fič­no je od­re­đe­na za tran­skrip­ci­ju tri­ju naj­ve­ćih vr­sta rR­NA oz­na­če­nih kao 28S, 18S i 5,8S, u skla­du s br­zi­nom nji­ho­ve se­di­men­ta­ci­je u cen­tri­fu­gal­nom po­lju. RNA-po­li­me­ra­za III pre­pi­ su­je ge­ne za tR­NA i za naj­ma­nju ri­bo­som­sku RNA (5S rR­NA). Ne­ke od ma­lih RNA dje­lat­nih u pro­ce­su prek­ra­ja­nja RNA i pri­je­no­su pro­tei­na (snRN­A i scR­NA) ta­ko­đer se pre­pi­su­ju po­mo­ću RNA-po­li­me­ra­ze III, dok su os­ta­li tran­skrip­ti nas­ta­li dje­lo­va­njem RNA-po­li­me­ra­ze II. Uz to, po­se­ bne RNA-po­li­me­ra­ze (slič­ne bak­te­rij­skim RNA-po­li­me­ra­za­ma) na­la­ze se u klo­rop­las­ti­ma i mi­to­hon­dri­ji­ma, gdje spe­ci­fič­no pre­pi­su­ju DNA tih or­ga­ ne­la. Sve su tri jez­gri­ne RNA-po­li­me­ra­ze slo­že­ni en­zi­mi ko­ji se sas­to­je od 12 do 17 raz­li­či­tih pod­je­di­ni­ca. Prem­da pre­poz­na­ju raz­li­či­te pro­mo­to­re i pre­ pi­su­ju raz­li­či­te sku­pi­ne ge­na, po ne­kim su svoj­stvi­ma me­đu­sob­no slič­ne pa čak i s bak­te­rij­skom RNA-po­li­me­ra­zom. Sve tri eu­ka­riot­ske RNA-po­li­me­ ra­ze sad­r­ža­va­ju de­vet kon­zer­vi­ra­nih pod­je­di­ni­ca, od ko­jih su pet slič­ne α, β, β' i ω pod­je­di­ni­ca­ma bak­te­rij­ske RNA-po­li­me­ra­ze. Struk­tu­ra kvaš­če­ve RNA-po­li­me­ra­ze II je vr­lo slič­na bak­te­rij­skom en­zi­mu (sl. 7-10), što go­vo­ ri u pri­log to­me da sve RNA-po­li­me­ra­ze ko­ris­te te­melj­ni kon­zer­vi­ra­ni me­ ha­ni­zam za tran­skrip­ci­ju DNA.

   259

Tab­li­ca 7-1. Sku­pi­ne ge­na pre­pi­ sa­nih eu­ka­riot­skim RNA-po­li­me­ ra­za­ma Vr­sta RNAsin­te­ti­zi­ra­ne RNA po­li­me­ra­za nuk­lear­ni ge­ni mR­NA II tR­NA III rR­NA 5,8S, 18S, 28S I 5S III snR­NA i scR­NA II i IIIa mi­to­hon­drij­ski mi­to­hon­drij­skab ge­ni klo­rop­las­tni ge­ni klo­rop­las­tnab

Ne­ke ma­le nuk­lear­ne (sn) i ma­le ci­top­laz­mat­ ske (sc) RNA pre­pi­su­ju se po­li­me­ra­zom II, a dru­ge po­li­me­ra­zom III. b Mi­to­hon­drij­ske i klo­rop­las­tne RNA-po­li­me­ ra­ze slič­ne su bak­te­rij­skim en­zi­mi­ma.

a

Tran­skrip­cij­ski fak­to­ri i ini­ci­ja­ci­ja transkripcije po­mo­ću RNA-po­li­me­ra­ze II U ža­riš­tu ve­ći­ne is­tra­ži­va­nja tran­skrip­ci­je u eu­ka­rio­ti­ma nala­zi se RNApo­li­me­ra­za II s ob­zi­rom na to da je od­go­vor­na za sin­te­zu mR­NA ge­na ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ne. Ra­ni po­ku­ša­ji prou­ča­va­nja tog en­zi­ma po­ka­za­li su

Sli­ka 7-10. Struk­tu­ra kvaš­če­ve RNA-po­li­me­ra­ze II.  Pod­ je­di­ni­ce su pri­ka­za­ne u raz­li­či­tim bo­ja­ma. (Od P. D. Kra­mer i sur., 2001. Scien­ce 292: 1863.)

260    POGLAVLJE 7 da je nje­go­va ak­tiv­no­st raz­li­či­ta od pro­ka­riot­ske RNA-po­li­me­ra­ze. Toč­no pre­pi­si­va­nje bak­te­rij­skih ge­na, što se mo­že iz­ves­ti in vit­ro jed­nos­tav­nim do­dat­kom pro­čiš­će­ne RNA-po­li­me­ra­ze mo­le­ku­li DNA ko­ja sad­rž­ a­va pro­ mo­tor, ni­je mo­gu­će u eu­ka­riot­skom sus­ta­vu. Temeljna raz­li­či­to­st ut­vr­đe­na je 1979. go­di­ne ka­da je Ro­be­rt Roe­der sa su­rad­ni­ci­ma ot­krio da je RNApo­li­me­ra­za spo­sob­na za­po­če­ti tran­skrip­ci­ju sa­mo ako su u reak­ci­ji pri­sut­ni do­dat­ni pro­tei­ni. Ta­ko se či­ni ka­ko su za tran­skrip­ci­ju u eu­ka­riot­skom sus­ ta­vu pot­reb­ni raz­li­či­ti ini­ci­ja­cij­ski fak­to­ri, ko­ji (za raz­li­ku od bak­te­rij­skih σ fak­to­ra) ni­su zdru­že­ni s po­li­me­ra­zom. Bio­ke­mij­skim frak­cio­ni­ra­njem jez­gri­nog ek­strak­ta iden­ti­fi­ci­ra­ni su spe­ ci­fič­ni pro­tei­ni (naz­va­ni tran­skrip­cij­ski fak­to­ri) ko­ji su pot­reb­ni RNA-po­ li­me­ra­zi II za za­po­či­nja­nje tran­skrip­ci­je. Op­ći tran­skrip­cij­ski fak­to­ri dje­ lat­ni su u tran­skrip­ci­ji svih pro­mo­to­ra po­li­me­ra­ze II i či­ne dio baz­ne tran­skrip­cij­ske ma­ši­ne­ri­je. Tran­skrip­cij­ski fak­to­ri spe­ci­fič­ni za ge­ne (raz­ mat­ra­ni da­lje u ovom pog­lav­lju) ve­žu se na slje­do­ve DNA ko­ji kon­tro­li­ra­ju ek­spre­si­ju in­di­vi­dual­nih ge­na pa su ta­ko od­go­vor­ni za re­gu­la­ci­ju gen­ske ek­spre­si­je. Pro­ci­je­nje­no je da oko 10% ge­na ljud­sko­ga ge­no­ma ko­di­ra tran­ skrip­cij­ske fak­to­re či­me je nag­la­še­na važ­no­st tih pro­tei­na. Pro­mo­to­ri mno­gih ge­na ko­ji se pre­pi­su­ju RNA-po­li­me­ra­zom II sad­r­že ne­ko­li­ko raz­li­či­tih slje­do­va oko tran­skrip­cij­skog mjes­ta (sl. 7-11). Pr­vi iden­ti­fi­ci­ra­ni sli­jed je sli­jed sli­čan TATAA smješ­ten 25 do 30 nuk­leo­ti­da uz­vod­no od mjes­ta za po­če­tak tran­skrip­ci­je. Taj sli­jed (naz­van TA­TA-slog) na­li­ku­je -10 sli­je­du u bak­te­rij­skim pro­mo­to­ri­ma i pr­vot­no je smat­ran op­ ćim svoj­stvom pro­mo­to­ra onih ge­na ko­ji se tran­skri­bi­ra­ju RNA-po­li­me­ra­ zom II. Me­đu­tim, suv­re­me­na is­tra­ži­va­nja ge­no­ma po­ka­za­la su da je TA­ TA-slog pri­su­tan sa­mo u 10-20% pro­mo­to­ra za RNA-po­li­me­ra­zu II. Os­ta­li sljed­ni ele­men­ti u pro­mo­to­ri­ma ge­na tran­skri­bi­ra­nih RNA-po­li­me­ ra­zom II obuh­va­ća­ju ini­ci­ja­cij­ske (I­nr) ele­men­te, ko­ji ovi­ja­ju mjes­ta za po­ če­tak trans­krip­ci­je, TFIIB ras­poz­na­va­ju­će ele­men­te (BRE), smješ­te­ne uz­ vod­no od po­čet­ka tran­skrip­ci­je, te ne­ko­li­ko pro­mo­tor­skih ele­me­na­ta smje­šte­nih niz­vod­no od po­čet­nog mjes­ta za tran­skrip­ci­ju (DPE, DCE i MTE). Pro­mo­to­ri raz­li­či­tih ge­na sad­r­že raz­li­či­te kom­bi­na­ci­je tih sr­žnih pro­mo­tor­skih ele­me­na­ta ko­ji za­jed­no dje­lu­ju u ve­zi­va­nju op­ćih tran­skrip­ cij­skih fak­to­ra. Naj­ma­nje je pet op­ćih tran­skrip­cij­skih fak­to­ra pot­reb­no za ini­ci­ja­ci­ju tran­skrip­ci­je RNA-po­li­me­ra­zom II u in vit­ro sus­ta­vu (v. sl. 7-11). Prvi ko­ rak u nas­ta­ja­nju tran­skrip­cij­skog kom­plek­sa je ve­za­nje op­ćeg tran­skrip­cij­ skog fak­to­ra naz­va­nog TFIID na pro­mo­tor (TF zna­či tran­skrip­cij­ski fak­tor, II oz­na­ča­va po­li­me­ra­zu II). TFIID se sas­to­ji iz vi­še pod­je­di­ni­ca uk­lju­ču­ju­ ći TA­TA-vez­ni pro­tein (TBP) te 14 dru­gih po­li­pep­ti­da naz­va­nih TBPzdru­že­ni fak­to­ri (TAF). TBP se spe­ci­fič­no ve­že na TA­TA-slog dok se dru­ ge pod­je­di­ni­ce TFIID (TAF) ve­žu na Inr, DPE, DPC i MTE slje­do­ve. Na­kon ve­za­nja TFIID sli­je­di prid­ru­ži­va­nje dru­gog op­ćeg tran­skrip­cij­skog fa­ktora (TFIIB) ko­ji se ve­že na TBP i BRE slje­do­ve. TFIIB slu­ži kao mo­st za RNApo­li­me­ra­zu II ko­ja se ve­že na kom­ple­ks TBP-TFIIB zdru­žen s tre­ćim fak­ to­rom, TFIIF. Sli­je­de­ći prid­ru­ži­va­nje RNA-po­li­me­ra­ze II na pro­mo­tor ve­za­nje dva do­ dat­na fak­to­ra (TFIIE i TFIIH) dov­r­ša­va nas­ta­nak prei­ni­ci­ja­cij­skog kom­ plek­sa či­ji je mo­le­ku­lar­ni mo­del pri­ka­zan na slici 7-12. TFIIH se sas­to­ji iz vi­še pod­je­di­ni­ca, a ima naj­ma­nje dvi­je važ­ne ulo­ge. Pr­vo, dvi­je su pod­je­di­ ni­ce TFIIH he­li­ka­ze ko­je od­mo­ta­va­ju DNA oko ini­ci­ja­cij­skog mjes­ta. (Te pod­je­di­ni­ce TFIIH je­su pro­tei­ni XPB i XPD, pot­reb­ni za pop­ra­vak iz­re­zi­ va­njem nuk­leo­ti­da, ko­ji je opi­san u 6. pog­lav­lju.) Dru­ga je pod­je­di­ni­ca TFIIH pro­tei­n-ki­na­za ko­ja fos­fo­ri­li­ra po­nav­lja­juće slje­do­ve pri­sut­ne u pod­

SINTEZA I DORADBA DNA 

   261

Sli­ka 7-11. Stva­ra­nje prei­ni­ci­ja­cij­ skog kom­plek­sa po­li­me­ra­ze II in vit­ ro.  Pro­mo­to­ri za po­li­me­ra­zu II sad­r­že TA­TA-slog (usug­la­še­ni sli­jed TATAA) 25 do 30 nu­kleo­ti­da uz­vod­no od po­čet­no­ ga mjes­ta za tran­skrip­ci­ju, TFIIB mjes­to pre­poz­na­va­nja (BRE) oko 35 nuk­leo­ti­da uz­vod­no od mjes­ta gdje za­po­či­nje tran­ skrip­ci­ja, ini­ci­ja­cij­ski ele­me­nt (I­nr) ko­ji sad­r­ži mje­sto za­po­či­nja­nja tran­skrip­ci­ je te ne­ko­li­ko ele­me­na­ta niz­vod­no od po­čet­ka trans­krip­ci­je (DCE, MTE i DPE). Nas­ta­ja­nje trans­krip­cij­skog kom­plek­ sa za­po­či­nje ve­za­njem tran­skrip­cij­skog fak­to­ra TFIID. Jed­na se pod­je­di­ni­ca tog tran­skrip­cij­skog fak­to­ra TFIID ve­že na TA­TA-slog, pro­tein ko­ji se ve­že na TA­ TA-slog ili TBP, a dru­ge se pod­je­di­ni­ce (fak­to­ri zdru­že­ni s TBP ili TAF) ve­žu na Inr i ele­men­te smješ­te­ne niz­vod­no od pro­mo­to­ra. TFIIB (B) se po­tom ve­že na TBP i na BRE slje­do­ve. Na­kon to­ga sli­je­ di ve­za­nje po­li­me­ra­ze ko­ja je zdru­že­na s TFIIF (F). Na kra­ju se nas­ta­lom kom­plek­ su prid­ru­žu­ju TFIIE (E) i TFIIH (H).

262    POGLAVLJE 7

Sli­ka 7-12. Mo­del prei­ni­ci­ja­cij­skog kom­plek­sa po­li­me­ra­ze II.  Mo­le­ku­lar­ni mo­del zdru­ži­va­nja RNA-po­li­me­ra­ze II (si­vo), TBP (ze­le­no), TFIIB (žu­to), TFIIE (lju­bi­čas­to), TFIIF (pla­vo) i TFIIH (bež) na pro­mo­to­ru. Ori­jen­ta­ci­ja ini­ci­ja­cij­skog kom­plek­sa na DNA pri­ka­ za­nog na ovoj sli­ci ob­r­nu­ta je is­toj pri­ka­za­noj na sli­ci 7-11. (Preu­ze­to od D. A. Bus­hne­ll et al., 2004. Scien­ce 303: 983.)

ruč­ju C-kra­ja naj­ve­će pod­je­di­ni­ce RNA-po­li­me­ra­ze II. C-ter­mi­nal­ni dio po­li­me­ra­ze II (ili CTD) sas­to­ji se iz uzas­top­nih po­nav­lja­nja (27 po­nav­lja­nja u kvas­ca, a 52 u čov­je­ka) od 7 ami­no­ki­se­li­na s usug­la­še­nim sli­je­dom TyrSe­r-Pro-Thr-Se­r-Pro-Ser. Fos­fo­ri­la­ci­ja seri­na-5 (pe­ta ami­no­ki­se­li­na) u tim CTD po­nav­lja­nji­ma TFIIH pro­tein-ki­na­zom os­lo­ba­đa po­li­me­ra­zu iz aso­ci­ ja­ci­je s prei­ni­ci­ja­cij­skim kom­plek­som i vo­di u ini­ci­ja­ci­ju tran­skrip­ci­je. Prid­ru­ži­va­nje pet op­ćih tran­skrip­cij­skih fak­to­ra i RNA-po­li­me­ra­ze II pred­stav­lja mi­ni­mal­ni sus­tav pot­re­ban za tran­skrip­ci­ju in vit­ro, a za sti­mu­ la­ci­ju tran­skrip­ci­je u sta­ni­ci su pot­reb­ni do­dat­ni fak­to­ri. Oni obuh­va­ća­ju ve­li­ki pro­tein­ski kom­ple­ks naz­van pos­red­nik (en­gl. me­dia­tor) ko­ji se sas­ to­ji iz vi­še od 20 pod­je­di­ni­ca i stu­pa u in­te­rak­ci­je i s op­ćim tran­skrip­cij­ skim fak­to­ri­ma i s RNA-po­li­me­ra­zom (sl. 7-13). Kom­ple­ks pos­red­ni­ka po­ti­če ba­zal­nu tran­skrip­ci­ju, ali je zna­ča­jan i za po­ve­zi­va­nje op­ćih tran­s­ krip­cij­skih fak­to­ra s tran­skrip­cij­skim fa­kto­ri­ma spe­ci­fič­nim za po­je­di­ne ge­ne ko­ji re­gu­li­ra­ju nji­ho­vu gen­sku ek­spre­si­ju. Pos­red­nič­ki pro­tei­ni se ot­ puš­ta­ju od po­li­me­ra­ze na­kon zdru­ži­va­nja prei­ni­ci­ja­cij­skog kom­plek­sa i fos­fo­ri­la­ci­je po­li­me­raz­ne C-ter­mi­nal­ne do­me­ne. Fos­fo­ri­li­ra­na CTD ve­že dru­ge pro­tei­ne ko­ji omo­gu­ća­va­ju tran­skrip­cij­sku elon­ga­ci­ju te sud­je­lu­ju u do­ra­dbi mR­NA, o če­mu će bi­ti go­vo­ra kas­ni­je u ovom pog­lav­lju.

Tran­skrip­ci­ja po­li­me­ra­zom I i III Ka­ko je pret­hod­no ka­za­no, raz­li­či­te RNA-po­li­me­ra­ze od­go­vor­ne su za tran­skrip­ci­ju ge­na ko­ji ko­di­ra­ju ri­bo­som­ske, tran­spor­tne RNA i ne­ke ma­le ne­ko­di­ra­ju­će RNA u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Me­đu­tim, sve tri RNA-po­li­

SINTEZA I DORADBA DNA 

Sli­ka 7-13. Kom­ple­k s RNA-po­li­me­ra­za II/posrednički pro­tei­ni i za­po­či­nja­nje tran­ skrip­ci­je.  RNA-po­li­me­ra­za II zdru­že­na je s pos­red­nič­kim pro­tei­ni­ma, kao i s op­ćim tran­skrip­cij­skim fak­to­ri­ma na pro­mo­to­ru. Pos­red­nič­ki se kom­ple­k s ve­že na ne­fos­fo­ri­ li­ra­ni CTD po­li­me­ra­ze II, a os­lo­ba­đa se na­kon fos­fo­ri­li­ra­nja CTD kad je za­po­če­ta tran­ skrip­ci­ja. Fos­fo­ri­li­ra­ni CTD po­tom ve­že elon­ga­cij­ske i do­rad­be­ne fak­to­re ko­ji olak­ša­va­ ju sin­te­zu i do­ra­dbu mR­NA.

me­ra­ze tre­ba­ju do­dat­ne tran­skrip­cij­ske fak­to­re za zdru­ži­va­nje s od­go­va­ra­ ju­ćim pro­mo­tor­skim slje­do­vi­ma. RNA-po­li­me­ra­za I pos­ve­će­na je is­klju­či­vo tran­skrip­ci­ji ge­na za ri­bo­ som­ske RNA, pri­sut­nih u uzas­top­nim po­nav­lja­nji­ma. Tran­skrip­ci­jom tih ge­na nas­ta­je ve­li­ka 45S pre-r­R­NA iz ko­je do­ra­dbom nas­ta­ju 28S, 18S i 5,8S rR­NA (sl. 7-14). Pro­mo­to­ri ge­na za ri­bo­som­ske RNA obuh­va­ća­ju oko 150 pa­ro­va ba­za ne­pos­red­no uz­vod­no od ini­ci­ja­cij­sko­ga mjes­ta tran­skrip­ci­je. Te pro­mo­tor­ske slje­do­ve pre­poz­na­ju dva tran­skrip­cij­ska fak­to­ra, UBF (fak­ tor ko­ji se ve­že uz­vod­no, en­gl. up­stream bin­di­ng fac­tor) i SL1 (fak­tor se­lek­ ci­je 1, en­gl. se­lec­ti­vi­ty fac­tor 1), ko­ji se koo­pe­ra­tiv­no ve­žu na pro­mo­tor, a po­tom im se prid­ru­žu­je po­li­me­ra­za I te ti­me nas­ta­je ini­ci­ja­cij­ski kom­ple­ks (sl. 7-15). SL1 tran­skrip­cij­ski fak­tor sas­to­ji se od če­ti­ri pod­je­di­ni­ce, a jed­ na od njih je TBP. S ob­zi­rom na to da pro­mo­to­ri za ri­bo­som­ske RNA ge­ne

   263

264    POGLAVLJE 7

Sli­ka 7-14. Ge­ni za ri­bo­som­sku RNA.  Ri­bo­som­ska se DNA (rDNA) pre­pi­su­je da­ju­ći ve­li­ke mo­le­ku­le RNA (45S pre-r­R­NA ko­je se nak­nad­no ki­da­ju na 28S, 18S i 5,8S rR­NA.

ne sad­r­že TA­TA-slog, TBP se ne ve­že na spe­ci­fič­ni pro­mo­tor­ski sli­jed. Umjes­to to­ga, zdru­že­nje TBP s ge­ni­ma za ri­bo­som­ske RNA pos­re­do­va­no je ve­za­njem dru­gih pro­tei­na iz SL1 kom­plek­sa na pro­mo­tor. Ge­ni za tR­NA, 5S rR­NA i ne­ke ma­le mo­le­ku­le RNA dje­lat­ne u prek­ra­ ja­nju RNA i pri­je­no­su pro­tei­na pre­pi­su­ju se po­li­me­ra­zom III. Ti se ge­ni pre­pi­su­ju od tri raz­li­či­te sku­pi­ne pro­mo­to­ra, od ko­jih su dva smješ­te­na unu­tar, a ne uz­vod­no od sli­je­da ko­ji se pre­pi­su­je (sl. 7-16). Naj­vi­še prou­ ča­va­ni ge­ni od svih ko­ji se pre­pi­su­ju po­li­me­ra­zom III je­su žab­lji (Xe­no­pus) ge­ni za 5S rR­NA. TFIIIA (pr­vi pro­čiš­će­ni tran­skrip­cij­ski fak­tor) pok­re­će zdru­ži­va­nje tran­skrip­cij­sko­ga kom­plek­sa ve­za­njem na spe­ci­fič­ne slje­do­ve DNA u 5S rR­NA pro­mo­to­ru. To je ve­za­nje pra­će­no sek­ven­cij­skim ve­za­ njem TFIIIC, TFIIIB i po­li­me­ra­ze. Pro­mo­to­ri ge­na za tR­NA raz­li­ku­ju se od 5S rR­NA pro­mo­to­ra ti­me što ne pos­je­du­ju sli­jed DNA ko­ji pre­poz­na­je TFIIIA. Um­jes­to to­ga TFIIIC se iz­rav­no ve­že na pro­mo­to­re ge­na za tR­NA, što uz­ro­ku­je prid­ru­ži­va­nje TFIIIB i po­li­me­ra­ze te nas­ta­nak tran­skrip­cij­ sko­ga kom­plek­sa. Pro­mo­to­ri tre­će sku­pi­ne ge­na pre­pi­si­va­nih po­li­me­ra­zom III, uk­lju­ču­ju­ći i ge­ne za ma­le jez­gri­ne RNA dje­lat­ne u prek­ra­ja­nju RNA, smješ­te­ni su uz­vod­no od po­čet­no­ga tran­skrip­cij­skog mjes­ta. Ti pro­mo­to­ri ima­ju TA­TA-slog (slič­no pro­mo­to­ri­ma za po­li­me­ra­zu II) kao i vez­na mjes­ ta za dru­ge fak­to­re naz­va­ne SNAP. SNAP i TFIIIB ve­žu se koo­pe­ra­tiv­no na pro­mo­to­re, s tim da se TFIIIB iz­rav­no ve­že na TA­TA-slog. Ve­za­nje je pos­ re­do­va­no pro­tei­nom ko­ji se ve­že na TA­TA-slog, TBP, koji je zap­ra­vo jed­na pod­je­di­ni­ca TFIIIB. Kao i u slu­ča­ju pro­mo­to­ra za os­ta­le ge­ne pre­pi­si­va­ne

Sli­ka 7-15. Ini­ci­ja­ci­ja tran­skrip­ci­je rDNA.  Dva tran­skrip­cij­ska fak­to­ra, UBF i SL1, ko­ ope­ra­tiv­no se ve­žu na pro­mo­to­re rDNA i prid­ru­žu­ju RNA-po­li­me­ra­zu I stva­ra­ju­ći ta­ko ini­ci­ja­cij­ski kom­ple­k s. Jed­na pod­je­di­ni­ca SL1 je TBP, pro­tein ko­ji se ve­že na TA­TA-slog.

SINTEZA I DORADBA DNA 

   265

Sli­ka 7-16. Tran­skrip­ci­ja ge­na RNApo­li­me­ra­zom III.  Ge­ni ko­je pre­pi­su­je po­li­me­ra­za III ek­spri­mi­ra­ju se s po­mo­ću dvi­je vr­ste pro­mo­to­ra. Pro­mo­to­ri ge­na za 5S rR­NA i tR­NA na­la­ze se niz­vod­no od mjes­ta ini­ci­ja­ci­je tran­skrip­ci­je. Trans­ krip­ci­ja ge­na za 5S rR­NA je ini­ci­ra­na ve­ za­njem TFIIIA na­kon če­ga sli­je­di ve­za­nje TFIIIC, TFIIIB i po­li­me­ra­ze. Pro­mo­to­ri za tR­NA ne sad­r­ža­va­ju vez­no mjes­to za TFIIIA, a on ni­je ni pot­re­ban za nji­ho­vu tran­skrip­ci­ju. Um­jes­to to­ga, TFIIIC po­ti­ če za­po­či­nja­nje tran­skrip­ci­je tR­NA ge­ na ve­za­njem na pro­mo­tor­ski sli­jed, a po­tom se zdru­žu­ju TFIIIB i po­li­me­ra­za. Pro­mo­tor ge­na za U6 snR­NA je uz­vod­ no od po­čet­nog mjes­ta za tran­skrip­ci­ju i sad­r­ža­va TA­TA-slog. Pod­je­di­ni­ca fak­to­ra TFIIIB (pro­tein ko­ji se ve­že na TA­TA-slog ili TBP), pre­poz­na­je TA­TA-slog za­jed­no s jed­nim dru­gim fak­to­rom ko­ji se na­zi­va SNAP.

po­li­me­ra­zom III, TFIIIB po­tom priv­la­či po­li­me­ra­zu u tran­skrip­cij­ski kom­ ple­ks.

Re­gu­la­ci­ja tran­skrip­ci­je u eu­ka­rio­ti­ma Kon­tro­la gen­ske ek­spre­si­je je pu­no slo­že­ni­ja u eu­ka­rio­ti­ma ne­go u bak­ te­ri­ja­ma, ia­ko vri­je­de is­ti te­melj­ni prin­ci­pi. Kao i kod bak­te­ri­ja, tran­skrip­ ci­ja u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma kon­tro­li­ra­na je pro­tei­ni­ma ko­ji se spe­ci­fič­no ve­žu na re­gu­la­cijske slje­do­ve i mo­du­li­ra­ju ak­tiv­no­st RNA-po­li­me­ra­ze. Me­ đu­tim, važ­na raz­li­ka iz­me­đu re­gu­la­ci­je tran­skrip­ci­je u pro­ka­riot­skim i eu­ ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, re­zul­tat je pa­ki­ra­nja eu­ka­riot­ske DNA u kro­ma­tin ko­ji og­ra­ni­ča­va ras­po­lo­ži­vo­st DNA kao ka­lu­pa za tran­skrip­ci­ju. Sto­ga mo­ di­fi­ka­ci­ja kro­ma­tin­ske struk­tu­re ig­ra ključ­nu ulo­gu u kon­tro­li tran­skrip­ci­je u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Za­nim­lji­vo i ak­tual­no is­tra­ži­vač­ko pod­ruč­je te­ me­lji se na ot­kri­ću da ne­ko­di­ra­ju­će RNA i ne­ki pro­tei­ni mo­di­fi­ci­ra­ju­ći kro­ ma­tin­sku struk­tu­ru re­gu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma.

ci­s-dje­lu­ju­ći re­gu­lacijski slje­do­vi: pro­mo­to­ri i po­ja­či­va­či Ka­ko je up­ra­vo ob­raz­lo­že­no, tran­skrip­ci­ja je u bak­te­ri­ja­ma re­gu­li­ra­na ve­za­njem pro­tei­na na cis-dje­lu­ju­će slje­do­ve (prim­je­ri­ce lac ope­ra­tor) ko­ji

266    POGLAVLJE 7 Sli­ka 7-17. Iden­ti­fi­ci­ra­nje eu­ka­riot­skih re­gu­lacijskih slje­do­va.  Re­gu­lacijski sli­jed klo­ni­ra­no­ga eu­ka­riot­sko­ga ge­na spo­jen je s re­por­ter­skim ge­nom. Re­por­ter­ski gen ko­ di­ra en­zim či­ju je ak­tiv­no­st la­ko de­tek­ti­ra­ti. Nas­ta­li plaz­mid po­tom se uvo­di u kul­tu­ru sta­ni­ca pri­ma­te­lja tran­sfek­ci­jom. Ak­tiv­ni re­gu­la­cijski sli­jed up­rav­lja tran­skrip­ci­jom re­ por­ter­sko­ga ge­na, a nje­go­va se ek­spre­si­ja de­tek­ti­ra u tran­sfi­ci­ra­nim sta­ni­ca­ma.

kon­tro­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju sus­jed­nih ge­na. Slič­ni cis-dje­lu­ju­ći slje­do­vi re­gu­ li­ra­ju ek­spre­si­ju eu­ka­riot­skih ge­na. Ti su slje­do­vi iden­ti­fi­ci­ra­ni u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca prim­je­nom tes­ta pri­je­no­sa ge­na za is­pi­ti­va­nje vje­ro­jat­nih re­gu­la­ cijskih pod­ruč­ja klo­ni­ra­nih ge­na (sl. 7-17). Eu­ka­riot­ski re­gu­lacijski slje­do­ vi obič­no su ve­za­ni na re­por­ter­ski gen ko­ji ko­di­ra en­zim jed­nos­ta­van za de­tek­ci­ju, prim­je­ri­ce lu­ci­fe­ra­za kri­jes­ni­ca (en­zim od­go­vo­ran za bio­lu­mi­ nis­cen­ci­ju). Ek­spre­si­ja re­por­ter­skog ge­na na­kon pri­je­no­sa u kul­ti­vi­ra­ne sta­ni­ce omo­gu­ću­je os­jet­lji­vo is­pi­ti­va­nje spo­sob­nos­ti klo­ni­ra­nih re­gu­la­cij­ skih slje­do­va da up­rav­lja­ju tran­skrip­ci­jom. Na ovaj se na­čin mo­gu ut­vr­di­ti re­gu­lacijska pod­ruč­ja ko­ja su bio­loš­ki ak­tiv­na, a mu­ta­ge­ne­za in vi­vo mo­že se upot­ri­je­bi­ti za ut­vr­đi­va­nje ulo­ge spe­ci­fič­nih slje­do­va unu­tar ut­vr­đe­nog, bio­loš­ki ak­tiv­nog re­gu­la­cijskog pod­ruč­ja. Ge­ni ko­ji se pre­pi­su­ju RNA-po­li­me­ra­zom II ima­ju sr­žne pro­mo­tor­ske ele­men­te u ko­je spa­da­ju TA­TA-slog i Inr-sli­jed. To su spe­ci­fič­na vez­na mje­ sta za op­će tran­skrip­cij­ske fak­to­re. Dru­gi cis-dje­lu­ju­ći slje­do­vi slu­že kao vez­na mjes­ta za ši­ro­ku le­pe­zu re­gu­lacijskih fak­to­ra ko­ji kon­tro­li­ra­ju eks­pre­ si­ju in­di­vi­dual­nih ge­na. Ti ci­s-dje­lu­ju­ći re­gu­lacijski slje­do­vi su čes­to, ali ne uvi­jek, smješ­te­ni uz­vod­no od ini­ci­ja­cij­skog tran­skrip­cij­skog mjes­ta. Prim­je­ ri­ce, dva re­gu­lacijska sli­je­da, na­đe­na u mno­gim eu­ka­riot­skim ge­ni­ma, iden­ ti­fi­ci­ra­na su is­tra­ži­va­njem pro­mo­to­ra ge­na ko­ji ko­di­ra ti­mi­di­n-ki­na­zu u vi­ ru­su Her­pes sim­plex (sl. 7-18). Oba sli­je­da smješ­te­na su unu­tar 100 pa­ro­va ba­za uz­vod­no od po­čet­nog mjes­ta za tran­skrip­ci­ju: usug­la­še­ni su nji­ho­vi slje­do­vi CCAAT i GGGCGG (naz­van GC-slog). Ta­ko­đer su iden­ti­fi­ci­ra­ni spe­ci­fič­ni pro­tei­ni ko­ji se ve­žu na te slje­do­ve i sti­mu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju. Na­sup­rot re­la­tiv­no jed­nos­tav­noj or­ga­ni­za­ci­ji CCAAT i GC-slo­go­va u pro­mo­to­ru ge­na za ti­mi­di­n-ki­na­zu kod her­pe­s-vi­ru­sa, mno­ge ge­ne u sta­ ni­ca­ma si­sa­va­ca kon­tro­li­ra­ju re­gu­lacijski slje­do­vi smješ­te­ni vr­lo da­le­ko (po­ne­kad vi­še od 50 ki­lo­ba­za) od po­čet­no­ga tran­skrip­cij­skog mjes­ta. Ti slje­do­vi, naz­va­ni po­ja­či­va­či (en­gl. en­han­cer), pr­vot­no su iden­ti­fi­ci­ra­ni ti­je­ kom is­tra­ži­va­nja pro­mo­to­ra jed­no­ga dru­gog vi­ru­sa, SV40 (sl. 7-19). Za učin­ko­vi­tu tran­skrip­ci­ju kon­tro­li­ra­nu tim pro­mo­to­rom, osim TA­TA-slo­ga pot­reb­no je i še­st GC-slo­go­va te dva po­nav­lja­nja od 72 pa­ra ba­za smješ­te­na da­lje uz­vod­no. Ut­vr­đe­no je da ti slje­do­vi sti­mu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju od dru­ gih pro­mo­to­ra kao i od SV40 te da, iz­ne­na­đu­ju­će, nji­ho­va ak­tiv­no­st ne ovi­si ni o uda­lje­nos­ti ni o ori­jen­ta­ci­ji u od­no­su na mjes­to za­po­či­nja­nja tran­skrip­ci­je (sl. 7-20). Oni mo­gu sti­mu­li­ra­ti tran­skrip­ci­ju bez ob­zi­ra na to je­su li smješ­te­ni uz­vod­no ili niz­vod­no od pro­mo­to­ra, ili u ori­jen­ta­ci­ji nap­ri­jed ili na­zad.

Sli­ka 7-18. Eu­ka­riot­ski pro­mo­tor.  Pro­mo­tor ge­na za ti­mi­di­n-ki­na­zu vi­ru­sa Her­pes sim­plex sad­r­ži tri sljed­na ele­men­ta uz­vod­no od TA­TA-slo­ga ko­ji su pot­reb­ni za učin­ko­ vi­tu tran­skrip­ci­ju: CCAA­T-slog i dva GC-slo­ga (usug­la­še­ni sli­jed GGGCGG).

SINTEZA I DORADBA DNA 

   267

Sli­ka 7-19. SV40 po­ja­či­vač.  SV40 pro­mo­tor za ra­nu ek­spre­si­ju ge­na sad­r­ža­va TA­TAslog i še­st GC-slo­go­va aran­ži­ra­nih u tri ni­za po­nav­lja­ju­ćih slje­do­va. Osim to­ga, za učin­ ko­vi­tu tran­skrip­ci­ju, pot­re­ban je uz­vod­ni po­ja­či­vač ko­ji se sas­to­ji od dva po­nav­lja­nja od po 72 pa­ra ba­za (pb).

Spo­sob­no­st po­ja­či­va­ča da dje­lu­ju i kad su vr­lo uda­lje­ni od ini­ci­ja­cij­skog mjes­ta za tran­skrip­ci­ju su­ge­ri­ra­la je u pr­vi mah da oni fun­kcio­ni­ra­ju po dru­gom prin­ci­pu od pro­mo­to­ra. Me­đu­tim, ta je pret­pos­tav­ka od­ba­če­na: po­ja­či­va­či, slič­no pro­mo­to­ri­ma, fun­kcio­ni­ra­ju ve­za­njem tran­skrip­cij­skih fak­to­ra ko­ji po­tom mo­gu re­gu­li­ra­ti RNA-po­li­me­ra­zu. To je mo­gu­će s ob­ zi­rom na pos­to­ja­nje om­či DNA što omo­gu­ću­je tran­skrip­cij­skim fak­to­ri­ma

▶▶ Po­ja­či­va­či mo­gu dje­lo­va­ti na

ve­li­ku uda­lje­no­st, kat­kad s raz­ li­či­tih kro­mo­so­ma. Taj se pro­ces na­zi­va tran­svek­ci­ja, a naj­bo­lje je prou­čen u voć­noj mu­ši­ci gdje obuh­va­ća tra­ns-dje­lu­ju­će po­ja­ či­va­če jed­nog ge­na ko­ji re­gu­li­ ra­ju ek­spre­si­ju nje­go­vog ho­mo­ lo­ga na dru­gom kro­mo­so­mu.

Sli­ka 7-20. Dje­lo­va­nje po­ja­či­va­ ča.  Bez po­ja­či­va­ča gen se pre­pi­su­je na nis­koj os­nov­noj ra­zi­ni (A). Do­dat­kom po­ja­či­va­ča E, prim­je­ri­ce, SV40 72 pb po­ nav­lja­nja, sti­mu­li­ra tran­skrip­ci­ju. Po­ja­či­ vač je ak­ti­van ne sa­mo kad je smješ­ten ne­pos­red­no uz­vod­no od pro­mo­to­ra (B), ne­go i kad je uba­čen ne­ko­li­ko ki­lo­ba­za uz­vod­no ili niz­vod­no od star­tno­ga tran­ skrip­cij­sko­ga mjes­ta (C i D). Osim to­ga, po­ja­či­vač je ak­ti­van u ob­je ori­jen­ta­ci­je, nap­ri­jed i na­zad (E).

268    POGLAVLJE 7 Sli­ka 7-21. Stva­ra­nje om­če DNA.  Trans­ krip­cij­ski fak­to­ri ve­za­ni na uda­lje­ne po­ ja­či­va­če mo­gu stu­pa­ti u in­te­rak­ci­ju s kom­plek­som RNA-po­li­me­ra­za/posrednik na pro­mo­to­ru zah­va­lju­ju­ći spo­sob­no­sti DNA da stva­ra om­če. Ne­ma te­melj­ne raz­li­ke iz­me­đu dje­lo­va­nja tran­skrip­cij­skih fak­to­ra ve­za­nih na DNA ne­pos­re­dno uz­ vod­no od pro­mo­to­ra i uda­lje­nog po­ja­či­ va­ča.

Sli­ka 7-22. Imu­nog­lo­bu­lin­ski po­ja­či­ vač.  Po­ja­či­vač imu­nog­lo­bu­lin­sko­ga teš­kog lan­ca pre­moš­ću­je oko 200 ba­za i sa­dr­ža­va de­vet fun­kcio­nal­nih sljed­nih ele­me­na­ta (E, µE1-5, π, µB i OCT), ko­ji za­ jed­no sti­mu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju u B-lim­fo­ ci­ti­ma.

ve­za­nim na uda­lje­ne po­ja­či­va­če da stu­pa­ju u in­te­rak­ci­ju s pro­tei­ni­ma zdru­ že­nim s kom­plek­som RNA-po­li­me­ra­za/posrednik na pro­mo­to­ru (sl. 7-21). Ta­ko tran­skrip­cij­ski fak­to­ri ve­za­ni na uda­lje­ne po­ja­či­va­če dje­lu­ju na is­ti na­čin kao i oni ve­za­ni na sus­jed­ne pro­mo­to­re, što zna­či da ne­ma bit­ne raz­ li­ke iz­me­đu dje­lo­va­nja po­ja­či­va­ča i cis-dje­lu­ju­ćih re­gu­lacijskih slje­do­va u sus­jed­stvu po­čet­nog mjes­ta za tran­skrip­ci­ju. Za­nim­lji­vo je da su po­ja­či­va­či pr­vo iden­ti­fi­ci­ra­ni u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca, a po­tom na­đe­ni i u bak­te­ri­ja­ma − je­dan neo­bi­čan slu­čaj da is­tra­ži­va­nja eu­ka­rio­ta slu­že kao mo­del za jed­ nos­tav­ni­je, pro­ka­riot­ske sus­ta­ve. Ve­za­nje spe­ci­fič­nih tran­skrip­cij­skih re­gu­la­cijskih pro­tei­na na po­ja­či­va­ če od­go­vor­no je za kon­tro­lu ek­spre­si­je ge­na ti­je­kom raz­vo­ja i di­fe­ren­ci­ja­ ci­je, kao i za od­go­vor sta­ni­ca na hor­mo­ne i fak­to­re ras­ta. Je­dan dob­ro is­ tra­že­ni prim­jer je po­ja­či­vač ko­ji kon­tro­li­ra tran­skrip­ci­ju imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na u B-lim­fo­ci­ti­ma. Po­ku­si­ma pri­je­no­sa ge­na ut­vr­đe­no je da je imu­no­ glo­bu­lin­ski po­ja­či­vač ak­ti­van sa­mo u lim­fo­ci­ti­ma, a ne i u dru­gim vr­sta­ma sta­ni­ca. Ta­ko je ovaj re­gu­la­cijski sli­jed dje­lo­mič­no od­go­vo­ran za spe­ci­fič­nu tkiv­nu ek­spre­si­ju imu­nog­lo­bu­lin­skih ge­na u od­go­va­ra­ju­će di­fe­ren­ci­ra­nim vr­sta­ma sta­ni­ca. Va­žan je as­pe­kt po­ja­či­va­ča to što oni sad­r­ža­va­ju vi­še fun­kcio­nal­nih ele­ me­na­ta ko­ji ve­žu raz­li­či­te re­gu­lacijske pro­tei­ne. Ka­da dje­lu­ju za­jed­no, ti pro­tei­ni re­gu­li­ra­ju ek­spre­si­ju ge­na. Po­ja­či­vač teš­ko­ga lan­ca imu­nog­lo­bu­li­ na, prim­je­ri­ce, obuh­va­ća oko 200 baz­nih pa­ro­va i sad­r­ža­va naj­ma­nje de­vet raz­li­či­tih sljed­nih ele­me­na­ta ko­ji slu­že kao vez­na mjes­ta za pro­tei­ne (sl. 7-22). Mu­ta­ci­ja bi­lo ko­jeg od slje­do­va sma­nju­je, ali ne uniš­ta­va poja­či­va­ čku ak­tiv­no­st, upu­ću­ju­ći na to da svi vez­ni pro­tei­ni ni­su nuž­no pot­reb­ni za dje­lo­va­nje po­ja­či­va­ča. Mno­gi od po­je­di­nač­nih slje­do­va imu­nog­lo­bu­lin­skog po­ja­či­va­ča sa­mi po se­bi sti­mu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju u ne­lim­foid­nim sta­ni­ca­ ma. Sto­ga og­ra­ni­če­na ak­tiv­no­st ci­je­log po­ja­či­va­ča u B-lim­fo­ci­ti­ma ni­je re­

SINTEZA I DORADBA DNA 

zul­tat spe­ci­fič­ne tkiv­ne fun­kci­je sva­ke od nje­go­vih kom­po­nen­ti. Um­jes­to to­ga, spe­ci­fič­na tkiv­na ek­spre­si­ja pos­lje­di­ca je kom­bi­na­ci­je in­di­vi­dual­nih sljed­nih ele­me­na­ta ko­ji upot­pu­nju­ju ci­je­li po­ja­či­vač. Ti ele­men­ti obuh­va­ća­ ju ne­ke cis-dje­lu­ju­će re­gu­la­cijske slje­do­ve ko­ji ve­žu tran­skrip­cij­ske ak­ti­va­ to­re, spe­ci­fič­no ek­spri­mi­ra­ne u B-lim­fo­ci­ti­ma, kao i dru­ge re­gu­lacijske sljedo­ve ko­ji ve­žu rep­re­so­re u ne­lim­foid­nim sta­ni­ca­ma. Pre­ma to­me, imu­ nog­lo­bu­lin­ski po­ja­či­vač ima ne­ga­tiv­ne re­gu­lacijske ele­men­te ko­ji in­hi­bi­ra­ ju tran­skrip­ci­ju u neod­go­va­ra­ju­ćoj vr­sti sta­ni­ca, ali i po­zi­tiv­ne re­gu­la­cijske ele­men­te ko­ji ak­ti­vi­ra­ju tran­skrip­ci­ju u B-lim­fo­ci­ti­ma. Ukup­na ak­tiv­no­st po­ja­či­va­ča ve­ća je od zbro­ja po­je­di­nač­nih ak­tiv­nos­ti, od­ra­ža­va­ju­ći kom­bi­ ni­ra­no dje­lo­va­nje pro­tei­na zdru­že­nih sa sva­kim in­di­vi­dual­nim sli­je­dom. Prem­da stva­ra­nje om­či u mo­le­ku­li DNA omo­gu­ću­je po­ja­či­va­či­ma da dje­lu­ju sa znat­ne uda­lje­nos­ti od pro­mo­to­ra, ak­tiv­no­st bi­lo ko­jeg po­ja­či­va­ča spe­ci­fič­na je za pro­mo­tor od­re­đe­no­ga ci­lja­no­ga ge­na. Ta se spe­ci­fič­no­st od­rž­ a­va po­mo­ću izo­la­to­ra ili gra­nič­nih ele­me­na­ta ko­ji di­je­le kro­mo­so­me u neo­vis­na pod­ruč­ja i spr­je­ča­va­ju po­ja­či­va­če da dje­lu­ju na pro­mo­to­re smješ­te­ne u sus­jed­nom pod­ruč­ju. Izo­la­to­ri ta­ko­đer spr­je­ča­va­ju ši­re­nje kro­ ma­tin­ske struk­tu­re jed­ne do­me­ne na sus­jed­stvo, či­me od­rž­ a­va­ju neo­vis­no re­gu­li­ra­na pod­ruč­ja ge­no­ma. Smat­ra se da izo­la­to­ri dje­lu­ju na na­čin da or­ga­ni­zi­ra­ju neo­vis­ne do­me­ne kro­ma­ti­na u jez­gri, ali me­ha­ni­zam nji­ho­vog dje­lo­va­nja ras­vi­jet­lit će bu­du­ća is­tra­ži­va­nja.

   269

▶▶ Naj­ve­ći prob­lem za gen­sku

te­ra­pi­ju je da su uve­de­ni ge­ni nep­ri­rod­no re­gu­li­ra­ni ili inak­ti­ vi­ra­ni zbog struk­tu­re ob­liž­njeg kro­ma­ti­na. Do­da­tak izo­lacij­skih ele­me­na­ta je jed­na mo­guć­no­st rje­ša­va­nja tog prob­le­ma.

Vez­na mjes­ta za tran­skrip­cij­ske fak­to­re Vez­na mjes­ta za pro­tei­ne ko­ji re­gu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju u pro­mo­tor­skim ili po­ja­či­vač­kim slje­do­vi­ma ut­vr­đe­na su uz po­moć dvi­ju vr­sta po­ku­sa. Pr­ vu sku­pi­nu pred­stav­lja DNA oti­sak sto­pa­la, po­kus pret­hod­no opi­san u od­ jelj­ku ko­ji go­vo­ri o ve­za­nju RNA-po­li­me­ra­ze na pro­ka­riot­ske pro­mo­to­re (v. sl. 7-3). Dru­gi pos­tu­pak je test po­ma­ka u elek­tro­fo­re­ts­koj pok­ret­lji­vos­ti u ko­jem se ra­dioak­tiv­no oz­na­če­ni frag­me­nt DNA in­ku­bi­ra s pro­tei­ni­ma, a po­tom podvr­gne elek­tro­fo­re­ts­kom raz­dva­ja­nju na ne­de­na­tu­ri­ra­jućem ge­lu (sl. 7-23). Veza­nje pro­tei­na de­tek­ti­ra se kao sma­nje­nje elek­tro­fo­re­ts­ke pok­ret­lji­vos­ti frag­men­ta DNA, s ob­zi­rom na to da je nje­go­vo kre­ta­nje kroz

Sli­ka 7-23. Te­st po­ma­ka u elek­tro­fo­ re­ts­koj pok­ret­lji­vos­ti.  Uzo­rak ko­ji sa­ d­r­ža­va ra­dioak­tiv­no oz­na­če­ni frag­me­nt DNA po­di­je­li se u dva di­je­la te se jed­na po­lo­vi­ca in­ku­bi­ra s pro­tei­nom ko­ji se ve­ že na spe­ci­f ič­ni sli­jed DNA. Uzor­ci se po­ tom ana­li­zi­ra­ju elek­tro­fo­re­zom u ne­de­ na­tu­ri­ra­ju­ćem ge­lu (pro­tein os­ta­je ve­zan na DNA). Ve­za­nje pro­tei­na ut­vr­đu­je se us­po­red­bom us­po­re­ne mig­ra­ci­je kom­ plek­sa DNA-pro­tein u od­no­su na slo­ bod­nu DNA. Sa­mo je dio DNA u uzor­ku ve­zan na pro­tein pa se mo­gu de­tek­ti­ra­ti i kom­ple­k s DNA-pro­tein i slo­bod­na DNA u uzor­ku in­ku­bi­ra­nom s pro­tei­nom.

270    POGLAVLJE 7 Sli­ka 7-24. Vez­na mjes­ta za tran­skrip­cij­ske fak­to­re.  Vez­na mjes­ta za tri tran­skrip­cij­ska fak­to­ra si­sa­va­ca (AP1, Myc i SRF) su pri­ka­za­na kao pik­tog­ra­mi u ko­ji­ma je uče­sta­lo­st sva­kog od nuk­leo­ti­da pred­stav­lje­na vi­si­nom od­go­va­ra­ju­ćeg slo­va na sva­koj po­zi­ci­ji u pod­ruč­ju vez­nog mjes­ta.

gel us­po­re­no ve­za­nim pro­tei­nom. Kom­bi­ni­ra­na prim­je­na otis­ka sto­ pa­la i po­ma­ka u elek­tro­fo­re­ts­koj pok­ret­lji­vos­ti omo­gu­ći­la je us­po­red­ bu vez­nih mjes­ta za pro­tei­ne s re­gu­lacijskim ele­men­ti­ma po­ja­či­va­ča i pro­mo­to­ra te po­ka­za­la da ti slje­do­vi pred­stav­lja­ju mjes­ta pre­poz­na­va­ nja spe­ci­fič­nih pro­tei­na ko­ji se ve­žu na DNA. Vez­na mjes­ta ve­ći­ne tran­skrip­cij­skih fak­to­ra sas­to­je se od krat­kih slje­do­va DNA, uo­bi­ča­je­no obuh­va­ća­ju 6–10 baz­nih pa­ro­va. U ve­ći­ni slu­ča­je­va ta su vez­na mjes­ta de­ge­ne­ri­ra­na što zna­či da se tran­skrip­cij­ ski fak­tor ne ve­že sa­mo za usug­la­še­ni sli­jed ne­go i za slje­do­ve ko­ji se od usug­la­še­nog raz­li­ku­ju u jed­nom ili vi­še nuk­leo­ti­da. Ta­ko je uo­bi­ ča­je­no pred­stav­lja­nje vez­nih mjes­ta za tran­skrip­cij­ski fak­tor kao pik­ tog­ra­me ko­ji sad­r­že frek­ven­ci­je svih ba­za na svim po­lo­ža­ji­ma vez­nog mjes­ta za od­re­đe­ni fak­tor (sl. 7-24). Zbog krat­ko­će i de­ge­ne­ra­ci­je slje­do­vi ko­ji od­go­va­ra­ju vez­nim mjes­ti­ma za tran­skrip­cij­ske fak­to­re čes­to se po­jav­lju­ju u ge­nom­skoj DNA. Sto­ga, ana­li­za sli­je­da DNA ni­je do­volj­na za ut­vr­đi­va­nje fi­zio­loš­ki zna­čaj­nih re­gu­la­cijskih slje­do­va. Utvr­đi­va­nje fi­zio­loš­ki funkcio­nal­nih re­gu­lacijskih slje­do­va u ge­nom­ skoj DNA va­žan je iza­zov za bioin­for­ma­ti­ku i sis­tem­nu bio­lo­gi­ju o če­mu je bi­lo go­vo­ra u 5. pog­lav­lju. Va­žan ek­spe­ri­men­tal­ni pris­tup za ut­vr­đi­va­nje pod­ruč­ja DNA ko­ja ve­žu tran­skrip­cij­ski fak­tor u sta­ni­ci pred­stav­lja imu­nop­re­ci­pi­ta­ci­ja kro­ma­ti­na (sl. 7-25). Sta­ni­ce se naj­pri­je ob­ra­đu­ju for­mal­de­hi­dom ko­ ji um­re­ža­va pro­tei­ne s DNA. Kao re­zul­tat to­ga tran­skrip­cij­ski fak­to­ri su ko­va­len­tno ve­za­ni na slje­do­ve DNA za ko­je su bi­li ve­za­ni u ži­vim sta­ni­ca­ma. Na­kon to­ga se izo­li­ra kro­ma­tin te po­ki­da u frag­men­te ve­ li­či­ne oko 500 baz­nih pa­ro­va. Frag­men­ti DNA ve­za­ni na tran­skrip­cij­ ski fak­tor mogu se izo­li­ra­ti imu­nop­re­ci­pi­ta­ci­jom pro­tu­ti­je­li­ma nas­ pram tran­skrip­cij­skog fak­to­ra (v. sl. 4-30). Nak­nad­no se po­ki­da­ju ve­ze um­re­že­ne for­mal­de­hi­dom te se imu­nop­re­ci­pi­ti­ra­ni frag­men­ti DNA mo­gu izo­li­ra­ti i ana­li­zi­ra­ti s ci­ljem ut­vr­đi­va­nja mjes­ta na ko­ja su se ve­za­li spe­ci­fič­ni tran­skrip­cij­ski fak­to­ri u sta­ni­ci. Osim ana­li­ze kro­ma­tin­skih imu­ nop­re­ci­pi­ta­ta za is­pi­ti­va­nje ve­za­nja tran­skrip­cij­skog fak­to­ra na re­gu­la­cijski sli­jed mo­že se upot­ri­je­bi­ti ana­li­za imu­nop­re­ci­pi­ti­ra­nih frag­me­na­ta DNA u ci­je­lom ge­no­mu. Ta se ana­li­za iz­vo­di po­mo­ću sek­ven­ci­ra­nja ili hib­ri­di­za­ci­ je na mik­ro­či­pu i slu­ži za ut­vr­đi­va­nje svih vez­nih mjes­ta za tran­skrip­cij­ski fak­tor u sta­ni­ci.

Pro­tei­ni ko­ji re­gu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju Izo­li­ra­ni su broj­ni pro­tei­ni ko­ji re­gu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju te­me­ljem ve­za­ nja na spe­ci­fič­ne slje­do­ve DNA. Ro­be­rt Tjian i su­rad­ni­ci pr­vi su iden­ti­fi­ci­ ra­li je­dan od pro­to­ti­po­va eu­ka­riot­sko­ga tran­skrip­cij­skog fak­to­ra is­tra­žu­ju­ ći tran­skrip­ci­ju SV40 DNA. Ut­vr­đe­no je da taj fak­tor (naz­van Sp1, od en­gl. spe­ci­fi­ci­ty pro­tein 1) sti­mu­li­ra tran­skrip­ci­ju ve­za­njem na GC-slo­go­ve u SV40 pro­mo­to­ru. Spe­ci­fič­no ve­za­nje Sp1 na GC-slog ne pred­stav­lja sa­mo dje­lo­va­nje Sp1 kao tran­skrip­cij­sko­ga fak­to­ra, ne­go i op­ći pris­tup pro­čiš­ća­ va­nju tran­skrip­cij­skih fak­to­ra. Izo­la­ci­ja tih pro­tei­na pr­vot­no je bi­la ve­li­ki

SINTEZA I DORADBA DNA 

Sli­ka 7-25. Imu­nop­re­ci­pi­ta­ci­ja kro­ma­ti­na.  Sta­ni­ce se iz­la­žu dje­lo­va­nju for­mal­de­hi­ da da bi se um­re­ži­li DNA i pro­tei­ni na nju ve­za­ni, a na­kon to­ga iz­lo­že ul­traz­vuč­nim va­ lo­vi­ma što iza­zi­va frag­men­ta­ci­ju kro­ma­ti­na. Frag­men­ti kro­ma­ti­na se in­ku­bi­ra­ju s pro­ tu­ti­je­li­ma nas­pram spe­ci­f ič­nih tran­skrip­cij­skih fak­to­ra. Kro­ma­tin­ski frag­men­ti na ko­je su ve­za­na pro­tu­ti­je­la skup­lja­ju se ka­ko je opi­sa­no u sli­ci 4-30. Um­re­že­nja se nak­nad­no po­niš­ta­va­ju, DNA pro­čiš­ća­va i ta­ko se do­bi­va­ju frag­men­ti DNA ko­ji sad­r­že vez­na mje­ sta za spe­ci­f ič­ne tran­skrip­cij­ske fak­to­re.

iza­zov s ob­zi­rom na to da su pri­sut­ni u vr­lo ma­lim ko­li­či­na­ma (prim­je­ri­ce sve­ga 0,001% ukup­nih sta­nič­nih pro­tei­na) ko­je je teš­ko pro­čis­ti­ti kon­ven­ cio­nal­nim bio­ke­mij­skim teh­ni­ka­ma. Prob­lem je ot­klo­njen pro­čiš­ća­va­njem Sp1 DNA-a­fin ­ i­tet­nom kro­ma­tog­ra­fi­jom (sl. 7-26). Mno­gob­roj­ne ko­pi­je

   271

272    POGLAVLJE 7

KL JUČNI POKUS

Izo­la­ci­ja eu­ka­riot­sko­ga tran­skrip­cij­skog fak­to­ra Af­fi­ni­ty pu­ri­fi­ca­tion of Sequen­ce-Spe­ci­fic DNA-Bin­di­ng Pro­tei­ns Ja­mes T. Ka­do­na­ga and Ro­be­rt Tjian Uni­ver­si­ty of Ca­li­for­nia at Ber­ke­ley, Ber­ke­ley, CA Pro­cee­din­gs of the Na­tio­nal Aca­de­my of Scien­ces, USA, 1986, vol. 83, str. 5889–5893

Kon­tek­st Is­tra­ži­va­nja lac ope­ro­na Ja­co­ba i Mo­no­ da raz­jas­ni­la su re­gu­la­ci­ju tran­skrip­ci­je pro­tei­ni­ma ko­ji se ve­žu na spe­ci­fi­čne slje­do­ve DNA. Je­dan od pro­to­tip­nih sus­ta­va za is­tra­ži­va­nje gen­ske ek­spre­si­ je u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma je­st maj­ mun­ski vi­rus SV40, u ko­jem je iden­ti­fi­ ci­ra­no ne­ko­li­ko re­gu­la­cijskih slje­do­va DNA još ra­nih 80-ih go­di­na proš­log sto­lje­ća. 1983. Wil­liam Dynan i Ro­be­rt Tjian su pr­vi put po­ka­za­li da je je­dan

od tih sljed­nih ele­me­na­ta (GC-slog) spe­ci­fič­no vez­no mjes­to za pro­tein ko­ji se na­la­zi u ek­strak­tu jez­gre ljud­skih sta­ ni­ca. Taj pro­tein, naz­van Sp1 (spe­ci­fič­ni pro­tein 1; en­gl. spe­ci­fi­ci­ty pro­tein 1) ne ve­že se sa­mo na GC-slog ne­go i po­ti­če trans­krip­ci­ju in vit­ro, po­ka­zu­ju­ći da je tran­skrip­cij­ski ak­ti­va­tor. Za prou­ča­va­nje me­ha­niz­ma dje­lo­va­nja Sp1, bi­lo je pot­reb­no ima­ti tran­skrip­cij­ ski fak­tor u čis­tom ob­li­ku i even­tual­no klo­ni­ra­ti Sp1 gen. Izo­la­ci­ja čis­tog Sp1 bi­la je nuž­na, ali is­to­dob­no je to bio zas­tra­šu­ju­ći teh­nič­ki iza­zov. Sp1 i dru­gi tran­skrip­cij­ski fak­to­ri pred­ stav­lja­ju sa­mo oko 0,001% ukup­nih sta­nič­nih pro­tei­na, ta­ko da se oni ne mo­gu pro­čis­ti­ti kon­ven­cio­nal­nim bio­ ke­mij­skim teh­ni­ka­ma. Ja­mes Ka­do­na­ga i Ro­be­rt Tjian ri­je­ši­li su taj prob­lem raz­ vit­kom me­to­de DNA-a­fi­ni­tet­ne kro­ma­ tog­ra­fi­je, me­to­de ko­jom su pro­čiš­će­ni Sp1 i mno­gi dru­gi eu­ka­riot­ski tran­s­ krip­cij­ski fak­to­ri, ot­va­ra­ju­ći ta­ko vra­ta za mo­le­ku­lar­nu ana­li­zu re­gu­la­ci­je trans­ krip­ci­je u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma.

Ek­spe­ri­me­nt

Pročišćavanje Sp1. Gel-elektroforeza proteina početno prisutnih u grubom nuklearnom ek­ straktu (kolona 1) i proteina dobivenih nakon jednoga (kolona 2) ili dva ciklusa DNA-afinitet­ ne kromatografije (kolona 3). Veličina proteina markera (u kilodaltonima) označena je na li­ jevoj strani gela, a Sp1 polipeptida strjelicama.

Me­to­da DNA-a­fi­ni­tet­ne kro­ma­tog­ra­fi­je Ka­do­na­ge i Tjia­na ko­ris­ti­la je spe­ci­fič­ no vi­so­koa­fi­ni­tet­no ve­za­nje Sp1 na GCslog, GGGCGG. Sin­te­tič­ki oli­go­nuk­leo­ti­ di ko­ji sad­r­ža­va­ju mno­gob­roj­ne ko­pi­je tog sli­je­da ve­za­ni su na čvr­ste kug­li­ce, a gru­bi nuk­lear­ni ek­stra­kt pro­la­zio je kroz ko­lo­nu ko­ja je sad­r­ža­va­la kug­li­ce na ko­ji­ma je ve­zan GC-slog. Kug­li­ce su po­tom op­ra­ne da bi se is­pra­li pro­tei­ni ko­ji se ni­su spe­ci­fič­no ve­za­li na oli­go­ nuk­leo­ti­de. Ko­nač­no su kug­li­ce op­ra­ne u pu­fe­ru vi­so­ke kon­cen­tra­ci­je so­li (0,5 M KCl) što ras­ki­da ve­zu Sp1 i DNA, os­ lo­ba­đa­ju­ći ta­ko Sp1 s ko­lo­ne.

Robert Tjian Ge­l-e­lek­tro­fo­re­za po­ka­za­la je da je gru­ bi nuk­lear­ni ek­stra­kt do­dan na po­čet­ku na ko­lo­nu slo­že­na mje­ša­vi­na pro­tei­na (vi­di sli­ku). Sup­rot­no to­me, oko 90% pro­tei­na po­nov­no do­bi­ve­nih na­kon dva­ju cik­lu­sa DNA-a­fi­ni­tet­ne kro­ma­ tog­ra­fi­je pred­stav­lja­ju dva po­li­pep­ti­da, ko­ji su iden­ti­fi­ci­ra­ni kao Sp1 na os­no­vi ve­za­nja na DNA i dje­lo­va­nja na tran­ skrip­ci­ju u in vit­ro tes­to­vi­ma. Ta­ko je Sp1 us­pješ­no pro­čiš­ćen DNA-a­fi­ni­tet­ nom kro­ma­tog­ra­fi­jom.

Ut­je­caj U član­ku iz 1986. go­di­ne, Ka­do­na­ga i Tjian tvr­di­li su ka­ko se teh­ni­ka DNA-a­fi­ ni­tet­ne kro­ma­tog­ra­fi­je »mo­že op­će­ni­to pri­mi­je­ni­ti u pro­čiš­ća­va­nju dru­gih pro­ tei­na ko­ji se spe­ci­fič­no ve­žu na slje­do­ ve DNA.« Pret­pos­tav­ka je pot­vr­đe­na pro­čiš­ća­va­njem broj­nih eu­ka­riot­skih tran­skrip­cij­skih fak­to­ra up­ra­vo tom me­ to­dom. Ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju dru­ge tran­ skrip­cij­ske fak­to­re izo­li­ra­ni su al­ter­na­ tiv­nim pos­tup­kom (neo­vis­no raz­vi­je­nim 1988. go­di­ne u la­bo­ra­to­ri­ju Phil­li­pa Shar­pa i Ste­ve­na McKnig­hta) u ko­jem se cDNA ek­spre­sij­ska knjiž­ni­ca pro­si­ja­ va s oli­go­nuk­leo­tid­nom son­dom da bi se de­tek­ti­ra­li pro­tei­ni ko­ji se spe­ci­fič­no ve­žu na od­re­đe­ne slje­do­ve. Mo­guć­no­st izo­la­ci­je pro­tei­na ko­ji se spe­ci­fič­no ve­ žu na od­re­đe­ne slje­do­ve DNA ovim me­to­da­ma do­ve­lo je do de­talj­nog ras­ vjet­lja­va­nja struk­tu­re i fun­kci­je ve­li­kog bro­ja tran­skrip­cij­skih re­gu­lacijskih pro­ tei­na, osi­gu­ra­va­ju­ći te­melj za na­še da­ naš­nje ra­zu­mi­je­va­nje gen­ske ek­spre­si­je u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma.

SINTEZA I DORADBA DNA 

Sli­ka 7-26. Pro­čiš­ća­va­nje Sp1 s po­mo­ću DNA-a­fi­ni­tet­ne kro­ma­tog­ra­fi­je.  Dvo­lan­ ča­ni oli­go­nuk­leo­tid ko­ji sad­r­ža­va po­nav­lja­ne GC-slo­go­ve ve­že se na aga­roz­ne kug­li­ce smješ­te­ne u ko­lo­nu. Smje­sa sta­nič­nih pro­tei­na, ko­ja sad­r­ža­va Sp1, na­ne­se se na ko­ lo­nu; s ob­zi­rom na spe­ci­f ič­no ve­za­nje Sp1 na GC-slog oli­go­nuk­leo­ti­da, Sp1 zad­r­ža­va se na ko­lo­ni dok dru­gi pro­tei­ni pro­la­ze kroz nju. Is­pi­ra­nje ko­lo­ne pu­fe­rom s vi­so­kom kon­cen­tra­ci­jom so­li iza­zi­va di­so­ci­ja­ci­ju Sp1 od GC-slo­ga DNA, da­ju­ći pro­čiš­će­ni Sp1.

oli­go­nuk­leo­ti­da, ko­ji od­go­va­ra­ju sli­je­du GC-slo­ga, ve­za­ne su na čvr­sti no­ sač, a sta­nič­ni ek­stra­kt pro­la­zi kroz oli­go­nuk­leo­tid­nu ko­lo­nu. Bu­du­ći da je Sp1 ve­zan na GC-slog ja­kim afi­ni­te­tom, spe­ci­fič­no se zad­rž­ a­va na ko­lo­ni, dok os­ta­li pro­tei­ni ne. Na taj je na­čin pro­čiš­ćen Sp1 ko­ji se mo­gao is­ko­ris­ ti­ti za dalj­nja is­tra­ži­va­nja. Op­će­ni­to, me­to­da DNA-a­fi­ni­tet­ne kro­ma­tog­ra­fi­je, pr­vot­no op­ti­mi­ra­na za pro­čiš­ća­va­nje Sp1, us­pješ­no je ko­riš­te­na za izo­la­ci­ju ve­li­kog bro­ja pro­ tei­na ko­ji se ve­žu na spe­ci­fič­ne slje­do­ve DNA iz eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju dru­ge tran­skrip­cij­ske fak­to­re izo­li­ra­ni su pret­ra­ži­va­njem cDNA ek­spre­sij­skih knjiž­ni­ca na re­kom­bi­nan­tni pro­tein ko­ji se ve­že na spe­ci­fič­ne slje­do­ve. Klo­ni­ra­nje i sek­ven­ci­ra­nje cDNA za tran­skrip­cij­ske fak­to­re omo­gu­ći­lo je broj­ne in­for­ma­ci­je o struk­tu­ri i fun­kci­ji ovih važ­nih re­gu­lacijskih pro­tei­na.

Struk­tu­ra i fun­kci­ja tran­skrip­cij­skih ak­ti­va­to­ra S ob­zi­rom na to da tran­skrip­cij­ski fak­to­ri ima­ju sre­diš­nju ulo­gu u re­gu­ la­ci­ji ek­spre­si­je ge­na, u ra­zu­mi­je­va­nje me­ha­ni­za­ma nji­ho­va dje­lo­va­nja ulo­

   273

274    POGLAVLJE 7

Sli­ka 7-27. Struk­tu­ra tran­skrip­cij­skih ak­ti­va­to­ra.  Tran­skrip­cij­ski ak­ti­va­to­ri sas­to­je se od dvi­ju neo­vis­nih do­me­na. Do­me­na ko­ja se ve­že na DNA pre­poz­na­je spe­ci­f ič­ni sli­jed DNA, a ak­ti­va­cij­ska do­me­na stu­pa u in­te­rak­ci­ju s pos­red­nič­kim pro­tei­ni­ma ili dru­gim čim­be­ni­ci­ma tran­skrip­cij­sko­ga sus­ta­va.

▶▶ Raz­vi­je­ni su um­jet­ni tran­s­

krip­cij­ski fak­to­ri s do­me­na­ma cin­ko­vog pr­sta di­zaj­ni­ra­ni da bi se ve­za­li na spe­ci­fič­ne slje­do­ve u ge­no­mu. Po­ve­zi­va­njem raz­li­ či­tih efek­tor­skih do­me­na na do­ me­nu od­go­vor­nu za ve­za­nje na DNA, cilj­ni gen se mo­že ak­ti­vi­ra­ ti ili po­tis­nu­ti. Ta teh­no­lo­gi­ja bi se mog­la pri­mi­je­ni­ti u gen­skoj te­ra­pi­ji i raz­vo­ju tran­sge­nič­nih bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja.

že­ni su znat­ni is­tra­ži­vač­ki na­po­ri. Naj­vi­še su is­tra­že­ni tran­skrip­cij­ski ak­ ti­va­to­ri, ko­ji se, slič­no Sp1, ve­žu na re­gu­lacijske slje­do­ve DNA i sti­mu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju. Op­će­ni­to, ti se fak­to­ri sas­to­je od dvi­ju do­me­na: jed­na se do­me­na spe­ci­fič­no ve­že na DNA, a dru­ga sti­mu­li­ra tran­skrip­ci­ju stu­pa­njem u in­te­rak­ci­ju s dru­gim pro­tei­ni­ma, uk­lju­ču­ju­ći pos­red­nič­ki pro­ tein ili dru­ge sas­tav­ni­ce tran­skrip­cij­skog sus­ta­va (sl. 7-27). Te­melj­na fun­ kci­ja pod­ruč­ja ko­je se ve­že na DNA je sid­re­nje tran­skrip­cij­skog fak­to­ra na od­go­va­ra­ju­će mjes­to na DNA, a akti­va­cij­ska do­me­na po­tom neo­vis­no sti­ mu­li­ra tran­skrip­ci­ju in­te­rak­ci­jom pro­tein-pro­tein. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma ut­vr­đe­ni su broj­ni tran­skrip­cij­ski fak­to­ri, prim­je­ri­ce oko 2.000 u ljud­skom ge­no­mu. Oni sad­rž­ e raz­li­či­te vr­ste do­me­ na ko­je se ve­žu na DNA, ne­ke od njih pri­ka­za­ne su na slici 7-28. Naj­češ­ća je do­me­na cin­ko­vog pr­sta. Ona sad­r­ži po­nav­lja­nja cis­tein­skih i his­ti­din­ skih os­ta­ta­ka na ko­je se ve­žu cin­ko­vi io­ni. Do­me­na je nab­ra­na u om­če (»pr­sti«) ko­ji­ma se ve­že na DNA. Prvot­no su te do­me­ne iden­ti­fi­ci­ra­ne u tran­skrip­cij­skom fak­to­ru po­li­me­ra­ze III, TFIIIA, ali su pri­sut­ne i u tran­ skrip­cij­skim fak­to­ri­ma ko­ji re­gu­li­ra­ju pro­mo­to­re po­li­me­ra­ze II, kao i Sph1. Dru­gi prim­je­ri tran­skrip­cij­skih fak­to­ra što sad­r­ža­va­ju do­me­nu cin­ko­va prst­a je­su re­cep­to­ri za ste­roid­ne hor­mo­ne ko­ji re­gu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju ge­ na ti­je­kom od­go­vo­ra na hor­mo­ne kao što su es­tro­gen i tes­tos­te­ron. Uz­voj­ni­ca-ok­re­t-uz­voj­ni­ca (en­gl. he­lix-tu­r­n-he­lix) mo­tiv pr­vi je put pre­poz­nat kod pro­ka­riot­skih pro­tei­na ko­ji se ve­žu na DNA, kao što je pro­ tein ak­ti­va­tor ka­ta­bo­liz­ma (CAP) u E. co­li. U tih pro­tei­na jed­na uz­voj­ni­ca os­tva­ru­je ve­ći­nu do­di­ra s DNA, dok dru­ga uz­voj­ni­ca pre­moš­ću­je kom­pleks da bi sta­bi­li­zi­ra­la in­te­rak­ci­ju. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma pro­tei­ni uz­voj­ni­ ca-ok­re­t-uz­voj­ni­ca uk­lju­ču­ju ho­meo­do­men­ske pro­tei­ne ko­ji su važ­ni u re­ gu­la­ci­ji ek­spre­si­je ge­na ti­je­kom em­brio­nal­no­ga raz­vo­ja. Ge­ni ko­ji ko­di­ra­ju te pro­tei­ne naj­pri­je su ot­kri­ve­ni u raz­voj­nim mu­tan­ta­ma voć­ne mu­ši­ce. Ne­ke od naj­ra­ni­je pre­poz­na­nih mu­tan­ti voć­ne mu­ši­ce (naz­va­ne, 1984. go­ di­ne, ho­meot­skim mu­tan­ta­ma) do­vo­de do raz­vo­ja mu­ši­ca kod ko­jih je je­ dan dio ti­je­la tran­sfor­mi­ran u dru­gi. Prim­je­ri­ce, u ho­meot­skoj mu­tan­ti

SINTEZA I DORADBA DNA 

Sli­ka 7-28. Prim­je­ri do­me­na ko­je se ve­žu na DNA.  (A) Do­me­na cin­ko­va pr­sta sas­ to­ji se od ne­ko­li­ko om­či u ko­ji­ma jed­na uz­voj­ni­ca i β-nab­ra­na plo­ča koor­di­na­tiv­no ve­žu cin­kov ion. (B) Uz­voj­ni­ca-ok­re­t-uz­voj­ni­ca do­me­ne sas­to­je se iz tri­ju (ili u ne­kim slu­ča­je­vi­ma če­ti­ri­ju) uz­vo­ji­tih pod­ruč­ja. Jed­na uz­voj­ni­ca (uz­voj­ni­ca 3) os­tva­ru­je ve­ći­nu kon­ta­ka­ta s DNA, dok uz­voj­ni­ce 1 i 2 le­že na vr­hu i sta­bi­li­zi­ra­ju in­te­rak­ci­ju. (C) Do­ me­ne pro­tei­na s leu­cin­skim zat­va­ra­čem ko­je se ve­žu na DNA nas­ta­ju iz dva­ju uda­lje­ nih po­li­pep­tid­nih la­na­ca. In­te­rak­ci­je iz­me­đu hid­ro­fob­nih pos­tra­nič­nih la­na­ca leu­cin­ skih os­ta­ta­ka ko­ji su iz­lo­že­ni na jed­noj stra­ni uz­vo­ji­tog pod­ruč­ja (leu­cin­ski zat­va­rač) od­go­vor­ne su za di­me­ri­za­ci­ju. Od­mah na­kon pod­ruč­ja leu­cin­sko­ga zat­va­ra­ča sli­je­di uz­voj­ni­ca ko­ja ve­že DNA, a bo­ga­ta je ba­zič­nim ami­no­ki­se­li­na­ma. (D) Uz­voj­ni­ca-om­ ča-uz­voj­ni­ca do­me­ne slič­ne su leu­cin­skom zat­va­ra­ču, osim što se sva­ka di­me­ri­za­cij­ska do­me­na tih pro­tei­na sas­to­ji od dva­ju uz­vo­ji­tih pod­ruč­ja raz­dvo­je­nih om­čom.

naz­va­noj An­ten­na­pe­dia, no­ge, a ne an­te­ne, ras­tu iz gla­ve mu­ši­ce (sl. 7-29). Mno­go ho­meo­do­men­skih pro­tei­na na­đe­no je u glji­va­ma, bilj­ka­ma i ži­vo­ti­ nja­ma uk­lju­ču­ju­ći i čov­je­ka. Dru­ge dvi­je obi­te­lji pro­tei­na ko­ji se ve­žu na DNA, pro­tei­ni s leu­cin­ skim zat­va­ra­čem i pro­tei­ni uz­voj­ni­ca-om­ča-uz­voj­ni­ca, ima­ju vez­ne do­ me­ne za DNA nas­ta­le di­me­ri­za­ci­jom dva­ju po­li­pep­tid­nih la­na­ca. Leu­cin­ski zat­va­rač sad­r­ža­va četiri ili pet leu­cin­skih os­ta­ta­ka raz­mak­nu­tih u in­ter­va­ li­ma od po se­dam ami­no­ki­se­li­na, či­me su nji­ho­vi hid­ro­fob­ni pos­tra­nič­ni lan­ci iz­lo­že­ni na jed­noj stra­ni uz­voj­ni­ce. Taj dio uz­voj­ni­ce slu­ži kao di­me­ ri­za­cij­ska do­me­na za dvi­je pro­tein­ske pod­je­di­ni­ce ko­je se dr­že za­jed­no hid­ro­fob­nim in­te­rak­ci­ja­ma pos­tra­nič­nih la­na­ca leu­ci­na. Od­mah na­kon do­ me­ne s leu­cin­skim zat­va­ra­čem na­la­zi se do­me­na bo­ga­ta po­zi­tiv­no na­bi­je­ nim ami­no­ki­se­li­na­ma (li­zin i ar­gi­nin) ko­ja se ve­že na DNA. Pro­tei­ni uz­

   275

276    POGLAVLJE 7 Sli­ka 7-29. Mu­ta­ci­ja An­ten­na­pe­dia.  An­ ten­na­pe­dia mu­tan­tne mu­ši­ce ima­ju no­ge ko­je ras­tu iz nji­ho­vih gla­va na mjes­tu an­ te­ne. (A) Gla­va nor­mal­ne mu­ši­ce. (B) Gla­ va An­ten­na­pe­dia mu­tan­te. (Lju­baz­noš­ću F. Ru­dol­fa Tur­ne­ra, In­dia­na Uni­ver­si­t y.)

voj­ni­ca-om­ča-uz­voj­ni­ca slič­ne su struk­tu­re, osim što je sva­ka nji­ho­va di­me­ri­za­cij­ska do­me­na iz­gra­đe­na iz dvi­ju uz­voj­ni­ca raz­dvo­je­nih om­čom. Važ­no je svoj­stvo tran­skrip­cij­skih fak­to­ra iz sku­pi­ne leu­cin­skih zat­va­ra­ča ili uz­voj­ni­ca-om­ča-uz­voj­ni­ca da ima­ju spo­sob­no­st stva­ra­nja di­me­ra. Ta­ko kom­bi­na­ci­ja raz­li­či­tih pro­tein­skih pod­je­di­ni­ca mo­že stva­ra­ti ve­li­ki broj fak­to­ra ko­ji se raz­li­ku­ju, ka­ko u pre­poz­na­va­nju sli­je­da DNA na ko­ji se ve­ žu, ta­ko i u sti­mu­la­ci­ji tran­skrip­ci­je. Pro­tei­ni s leu­cin­skim zat­va­ra­čem i pro­tei­ni uz­voj­ni­ca-om­ča-uz­voj­ni­ca važ­ni su u re­gu­la­ci­ji spe­ci­fič­ne tkiv­ne i in­du­ci­bil­ne gen­ske ek­spre­si­je, a nas­ta­nak di­me­ra iz­me­đu raz­li­či­tih čla­no­va tih po­ro­di­ca va­žan je as­pe­kt kon­tro­le nji­ho­ve fun­kci­je. Ak­ti­vi­ra­ju­ća do­me­na ni­je ta­ko dob­ro ka­rak­te­ri­zi­ra­na kao vez­na do­me­ na. Ne­ke, naz­va­ne ki­se­lim ak­ti­vi­ra­ju­ćim do­me­na­ma, bo­ga­te su ne­ga­tiv­no na­bi­je­nim os­tat­ci­ma (as­par­tat i glu­ta­mat), dru­ge su pak bo­ga­te pro­li­ni­ma i glu­ta­mi­ni­ma. Ak­ti­vi­ra­ju­će do­me­ne eu­ka­riot­skih tran­skrip­cij­skih fak­to­ra sti­mu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju na dva raz­li­či­ta na­či­na (sl. 7-30). Pre­ma pr­vom me­ha­niz­mu, one rea­gi­ra­ju s pos­red­nič­kim pro­tei­ni­ma i op­ćim tran­skrip­ cij­skim fak­to­ri­ma, kao što su TFIIB ili TFIID, da bi prid­ru­ži­li RNA-po­li­ me­ra­zu i olak­ša­li zdru­ži­va­nje tran­skrip­cij­sko­ga kom­plek­sa na pro­mo­to­ru, slič­no tran­skrip­cij­skim ak­ti­va­to­ri­ma u bak­te­ri­ja­ma (v. sl. 7-9). Na­da­lje, eu­ ka­riot­ski tran­skrip­cij­ski fak­to­ri stu­pa­ju u in­te­rak­ci­ju s mno­gim koak­ti­va­to­ri­ma ko­ji sti­mu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju mo­di­fi­ci­ra­njem struk­tu­re kro­ma­ti­na, ka­ko će bi­ti pri­ka­za­no da­lje u ovom pog­lav­ lju. Važ­no je pri­mi­je­ti­ti da ak­ti­va­to­ri ne re­gu­li­ra­ju sa­mo ini­ci­ja­ci­ju tran­skrip­ci­je: elon­ga­ci­ja i do­ra­dba RNA ta­ko­đer su re­gu­li­ra­ni, bi­lo iz­rav­nim mo­du­li­ra­njem ak­tiv­nos­ti RNA-po­li­me­ra­ze ili dje­lo­va­ njem na kro­ma­tin­sku struk­tu­ru.

Eu­ka­riot­ski rep­re­so­ri Ek­spre­si­ja ge­na u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma re­gu­li­ra­na je, ka­ko rep­re­so­ri­ma, ta­ko i tran­skrip­cij­skim ak­ti­va­to­ri­ma. Slič­no pro­ka­ riot­skim rep­re­so­ri­ma i eu­ka­riot­ski se rep­re­so­ri ve­žu na spe­ci­fi­čan sli­jed DNA i in­hi­bi­ra­ju tran­skrip­ci­ju. U ne­kim slu­ča­je­vi­ma eu­ka­ riot­ski rep­re­so­ri jed­nos­tav­no in­ter­fe­ri­ra­ju s ve­za­njem dru­gih tran­ Sli­ka 7-30. Dje­lo­va­nje tran­skrip­cij­skih ak­ti­va­to­ra.  Eu­ka­riot­ski ak­ti­va­to­ri po­ti­ču tran­skrip­ci­ju na dva na­či­na: 1) stu­pa­ju u in­te­rak­ci­ju s pos­red­nič­kim pro­tei­ni­ma i op­ćim tran­skrip­cij­skim fak­to­ri­ma olak­ša­va­ju­ći zdru­ži­va­nje tran­ skrip­cij­sko­ga kom­plek­sa či­me po­ti­ču tran­skrip­ci­ju, te 2) stu­pa­ju u in­te­rak­ci­ ju s koak­ti­va­to­ri­ma ko­ji olak­ša­va­ju tran­skrip­ci­ju mo­di­f i­ci­ra­ju­ći kro­ma­tin­sku struk­tu­ru.

SINTEZA I DORADBA DNA 

   277

Sli­ka 7-31. Dje­lo­va­nje eu­ka­riot­skih re­ pre­so­ra.  (A) Ne­ki rep­re­so­ri spr­je­ča­va­ju ve­za­nje ak­ti­va­to­ra na re­gu­la­cijske slje­do­ ve. (B) Dru­gi rep­re­so­ri pos­je­du­ju rep­re­ sij­ske do­me­ne ko­je in­hi­bi­ra­ju tran­skrip­ci­ ju svo­jom in­te­rak­ci­jom ili s pos­red­nič­kim pro­tei­ni­ma ili s op­ćim tran­skrip­cij­skim fak­to­ri­ma, ili, pak, s ko­rep­re­so­ri­ma ko­ji mo­di­f i­ci­ra­ju kro­ma­tin­sku struk­tu­ru.

skrip­cij­skih fak­to­ra na DNA (sl. 7-31A). Prim­je­ri­ce, ve­za­nje rep­re­so­ra u bli­zi­ni po­čet­no­ga mjes­ta za tran­skrip­ci­ju mo­že spri­je­či­ti in­te­rak­ci­ju RNApo­li­me­ra­ze ili op­ćih tran­skrip­cij­skih fak­to­ra s pro­mo­to­rom, što je slič­no dje­lo­va­nju rep­re­so­ra u bak­te­ri­ja­ma. Dru­gi se rep­re­so­ri nat­je­ču s ak­ti­va­to­ri­ ma za ve­za­nje na spe­ci­fi­čan re­gu­la­cijski sli­jed. Ta­ko ne­ki rep­re­so­ri sad­rž­ a­ va­ju is­tu do­me­nu za ve­za­nje na DNA kao i ak­ti­va­to­ri, ali ne­ma­ju nji­ho­vu ak­ti­va­cij­sku do­me­nu. Pos­lje­di­ca je to­ga da nji­ho­vo ve­za­nje na pro­mo­tor ili po­ja­či­vač spr­je­ča­va ve­za­nje ak­ti­va­to­ra na to mjes­to či­me se po­tis­ku­je trans­ krip­ci­ja. Osim rep­re­so­ra ko­ji jed­nos­tav­no in­ter­fe­ri­ra­ju s ve­za­njem ak­ti­va­to­ra, pos­to­je i rep­re­so­ri (naz­va­ni ak­tiv­nim rep­re­so­ri­ma) koji po­tis­ku­ju tran­ skrip­ci­ju na na­čin da svo­jim spe­ci­fič­nim fun­kcio­nal­nim do­me­na­ma in­hi­ bi­ra­ju pro­tei­n-pro­tein in­te­rak­ci­ju (sl. 7-31B). Pr­vi ta­kav ak­tiv­ni rep­re­sor opi­san je 1990. go­di­ne pri is­tra­ži­va­nju ge­na naz­va­nog Krüppel, dje­lat­nog u em­brio­nal­nom raz­vo­ju voć­ne mu­ši­ce. Mo­le­ku­lar­na ana­li­za Krüppelova pro­tei­na po­ka­za­la je da on sad­r­ža­va od­vo­je­nu rep­re­sij­sku do­me­nu po­ve­za­ nu s do­me­nom cin­ko­va pr­sta ko­ja se ve­že na DNA što spr­je­ča­va tran­skrip­ ci­ju in­te­rak­ci­jom pro­tei­n-pro­tein. Ut­vr­đe­no je da mno­gi ak­tiv­ni rep­re­so­ri ima­ju ključ­nu ulo­gu u re­gu­la­ ci­ji tran­skrip­ci­je u ži­vo­tinj­skim sta­ni­ca­ma, u mno­gim slu­ča­je­vi­ma oni su kri­tič­ni re­gu­la­to­ri sta­nič­no­ga ras­ta i di­fe­ren­ci­ja­ci­je. Kao i kod tran­skrip­cij­ skih ak­ti­va­to­ra, iden­ti­fi­ci­ra­no je ne­ko­li­ko raz­li­či­tih vr­sta rep­re­sij­skih do­ me­na. Prim­je­ri­ce, rep­re­sij­ska do­me­na Krüppe­lo­va pro­tei­na bo­ga­ta je ala­ nin­skim os­tat­ci­ma, dok su dru­ge rep­re­sij­ske do­me­ne bo­ga­te pro­li­nom ili ki­se­lim os­tat­ci­ma. Fun­kcio­nal­ni su ci­lje­vi rep­re­so­ra ta­ko­đer raz­li­či­ti: rep­

278    POGLAVLJE 7 re­so­ri mo­gu in­hi­bi­ra­ti tran­skrip­ci­ju in­te­rak­ci­jom sa spe­ci­fič­nim ak­ti­va­tor­ skim ili pos­red­nič­kim pro­tei­ni­ma ili s op­ćim tran­skrip­cij­skim fak­to­ri­ma ili pak, s ko­rep­re­so­ri­ma ko­ji mo­di­fi­ci­ra­ju kro­ma­tin­sku struk­tu­ru. Re­gu­la­ci­ja tran­skrip­ci­je rep­re­so­ri­ma, kao i ak­ti­va­to­ri­ma, zna­čaj­no ši­ri niz me­ha­ni­za­ma ko­ji kon­tro­li­ra­ju ek­spre­si­ju eu­ka­riot­skih ge­na. Zna­čaj­na ulo­ga rep­re­so­ra mog­la bi bi­ti in­hi­bi­ci­ja ek­spre­si­je ge­na u od­re­đe­nim tki­vi­ ma. Prim­je­ri­ce, ka­ko je na­po­me­nu­to ra­ni­je, mjes­to za ve­za­nje rep­re­so­ra u imu­nog­lo­bu­lin­skom po­ja­či­va­ču pri­do­no­si spe­ci­fič­noj tkiv­noj ek­spre­si­ji, spr­je­ča­va­ju­ći tran­skrip­ci­ju u ne­lim­foid­nim sta­ni­ca­ma. Dru­gi rep­re­so­ri igra­ju ključ­ne ulo­ge u kon­tro­li pro­li­fe­ra­ci­je i di­fe­ren­ci­ja­ci­je sta­ni­ca iz­lo­že­ nih dje­lo­va­nju hor­mo­na i fak­to­ra ras­ta.

Re­gu­la­ci­ja elon­ga­ci­je Tran­skrip­ci­ja broj­nih ge­na je re­gu­li­ra­na na ni­vou stva­ra­nja prei­ni­ci­ja­ cij­skog kom­plek­sa i ini­ci­ja­ci­je tran­skrip­ci­je (v. sl. 7-11 i 7-13). Me­đu­tim, tran­skrip­ci­ja se mo­že re­gu­li­ra­ti i na elon­ga­cij­skoj ra­zi­ni. Važ­no­st kon­tro­le elon­ga­ci­je nag­la­ša­va­ju naj­no­vi­ja is­tra­ži­va­nja. Ona su po­ka­za­la da pos­to­ji zna­ča­jan broj ge­na, ka­ko kod voć­ne mu­ši­ce ta­ko i kod čov­je­ka, či­ja se tran­ skrip­ci­ja, na­kon što je za­po­če­la uz mo­le­ku­le RNA-po­li­me­ra­ze zaus­tav­lja ne­pos­red­no niz­vod­no od pro­mo­to­ra. Te su RNA-po­li­me­ra­ze neod­luč­ne u nas­tav­lja­nju tran­skrip­ci­je. Za­nim­lji­vo, broj­ni ge­ni na ko­ji­ma je na­đe­na zaus­tav­lje­na po­li­me­ra­za re­gu­li­ra­ni su iz­van­sta­nič­nim sig­na­li­ma ili su ak­ tiv­ni u raz­vo­ju što uka­zu­je na važ­no­st kon­tro­le elon­ga­ci­je za vri­je­me raz­ vo­ja i di­fe­ren­ci­ja­ci­je. Tran­skrip­ci­ja RNA-po­li­me­ra­zom II za­po­či­nje na­kon fos­fo­ri­li­ra­nja T­FIIH pro­tein­-ki­na­zom se­ri­na-5 u CTD (sl. 7-32). Na­kon ini­ci­ja­ci­je, po­ li­me­ra­za sin­te­ti­zi­ra krat­ko pod­ruč­je RNA na­kon če­ga se zaus­tav­lja na po­ čet­ku ge­na, obič­no unu­tar pr­vih 50 nuk­leo­ti­da. Zaus­tav­lja­nje po­li­me­ra­ze na tom mjes­tu pos­lje­di­ca je zdru­ži­va­nja ne­ga­tiv­nih re­gu­la­cijskih fak­to­ra uk­lju­ču­ju­ći NELF (en­gl. ne­ga­ti­ve elon­ga­tion fac­tor) i DSIF ko­ji spr­je­ča­va­ju dalj­nju tran­skrip­ci­ju. Nas­ta­vak tran­skrip­ci­je ovi­si o dje­lo­va­nju jed­nog dru­ gog fak­to­ra naz­va­nog P-TE­Fb (en­gl. po­si­ti­ve tran­scrip­tio­n-e­lon­ga­tion fac­to­ r-b). P-TE­Fb sad­r­ži pro­tein­-ki­na­zu ko­ja fos­fo­ri­li­ra NELF i DSIF kao i se­ri­ n-2 u CTD RNA-po­li­me­ra­ze. To vo­di do ini­ci­ja­ci­je pro­duk­tiv­ne elon­ga­ci­je i zdru­ži­va­nja os­ta­lih elon­ga­cij­skih i pro­ce­si­ra­ju­ćih fak­to­ra s CTD. Priv­la­če­nje P-TE­Fb se smat­ra glav­nim re­gu­la­cij­skim ko­ra­kom u kon­ tro­li elon­ga­ci­je te se či­ni da su ne­ki tran­skrip­cij­ski ak­ti­va­to­ri zdru­že­ni s P-TE­Fb i priv­la­če ga pro­mo­to­ru. Me­đu­tim, ra­zu­mi­je­va­nje me­ha­ni­za­ma ko­ji kon­tro­li­ra­ju elon­ga­ci­ju je no­vo i neis­tra­že­no pod­ruč­je tran­skrip­cij­ske re­gu­la­ci­je.

Po­ve­za­no­st kro­ma­tin­ske struk­tu­re i tran­skrip­ci­je Ka­ko je na­po­me­nu­to u pret­hod­nom od­jelj­ku, ak­ti­va­to­ri i rep­re­so­ri re­ gu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju u eu­ka­rio­ti­ma, ne sa­mo in­te­rak­ci­jom s pos­red­ni­kom i dru­gim čim­be­ni­ci­ma tran­skrip­cij­skog sus­ta­va, ne­go i iza­zi­va­njem prom­ je­na u kro­ma­tin­skoj struk­tu­ri. DNA svih eu­ka­riot­skih sta­ni­ca ve­za­na je na his­to­ne. Os­nov­na struk­tur­na je­di­ni­ca kro­ma­ti­na je­st nuk­leo­som ko­ji se sas­to­ji od 147 pa­ro­va ba­za DNA omo­ta­nih oko dvi­ju mo­le­ku­la sva­ko­ga his­ton­skog pro­tei­na H2A, H2B, H3 i H4, te jed­ne mo­le­ku­le his­to­na H1 ve­za­no­ga na DNA pri ulas­ku u srž nuk­leo­som­ske čes­ti­ce (v. sl. 5-12). Kro­ ma­tin je po­tom kon­den­zi­ran smo­ta­va­njem u ob­li­ku spi­ra­le u struk­tu­ru vi­še­ga re­da or­ga­ni­zi­ra­nu u ve­li­ke om­če DNA. Ovak­vo pa­ki­ra­nje eu­ka­riot­ ske DNA u kro­ma­tin si­gur­no ima važ­ne pos­lje­di­ce na ras­po­lo­ži­vo­st DNA kao ka­lu­pa za tran­skrip­ci­ju. Ta­ko kro­ma­tin­ska struk­tu­ra pred­stav­lja kri­ti­ čan aspe­kt gen­ske ek­spre­si­je u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma.

SINTEZA I DORADBA DNA 

Sli­ka 7-32. Re­gu­la­ci­ja tran­skrip­cij­ske elon­ga­ci­je.  Trans­ krip­ci­ja za­po­či­nje na­kon fos­fo­ri­li­ra­nja C-ter­mi­nal­ne do­me­ ne (CTD) RNA-po­li­me­ra­ze II na se­rin­skom os­tat­ku 5 po­mo­ću TFIIH. Fak­to­ri uk­lju­če­ni u po­čet­ne stup­nje­ve do­ra­dbe mR­NA zdru­žu­ju se s fos­fo­ri­li­ra­nim CTD. Osim to­ga, ne­ga­ti­vni re­gu­lacijski fak­to­ri (NELF i DSIF) zdru­žu­ju se s po­li­me­ra­zom i ta­ko uz­ro­ku­ju nje­no zaus­tav­lja­nje unu­tar oko 50 nuk­leo­ti­da na­kon po­čet­nog tran­skrip­cij­skog mjes­ta. Nas­tav­lja­njem tran­skrip­ci­je (učin­ko­vi­tom elon­ga­ci­jom) do­la­zi do fos­fo­ri­ li­ra­nja NELF, DSIF i se­ri­na-2 u CTD-po­li­me­ra­ze po­mo­ću P-TE­Fb. Fos­fo­ri­li­ra­ni NELF di­so­ci­ra iz kom­plek­sa, a do­dat­ni fak­to­ri ko­ji su pot­reb­ni za elon­ga­ci­ju i do­ra­dbu zdru­žu­ju se s po­li­me­ra­zom.

   279

280    POGLAVLJE 7 Ge­ni ko­ji se ak­tiv­no pre­pi­su­ju smješ­te­ni su u re­la­tiv­no de­kon­den­zi­ra­ nom kro­ma­ti­nu, ko­ji se vje­ro­jat­no po­du­da­ra s 30-nm kro­ma­tin­skim vlak­ nom raz­mat­ra­nim u 5. pog­lav­lju (v. sl. 5-13). Prim­je­ri­ce, mik­ros­kop­ska vi­zua­li­za­ci­ja po­li­ten­skih kro­mo­so­ma voć­ne mu­ši­ce po­ka­zu­je da se pod­ruč­ ja ge­no­ma ko­ja ak­tiv­no sin­te­ti­zi­ra­ju RNA po­du­da­ra­ju s de­kon­den­zi­ra­nim kro­mo­som­skim di­je­lom (sl. 7-33). Una­toč to­mu, ak­tiv­no pre­pi­si­va­ni ge­ni os­ta­ju ve­za­ni na his­to­ne i pa­ki­ra­ni u nuk­leo­so­me ta­ko da se trans­krip­cij­ski fak­to­ri i RNA-po­li­me­ra­za i da­lje sus­re­ću s prob­le­mom in­te­rak­ci­je s kro­ma­ ti­nom, a ne s go­lom DNA. Gus­to na­mo­ta­na DNA oko sr­ži nuk­leo­som­ske čes­ti­ce naj­ve­ća je prep­re­ka tran­skrip­ci­ji, što ut­je­če ka­ko na spo­sob­no­st tran­skrip­cij­skih fak­to­ra da se ve­žu na DNA, ta­ko i na spo­sob­no­st RNA-po­ li­me­ra­ze da pre­pi­su­je kroz kro­ma­tin­ski ka­lup. Struk­tu­ra kro­ma­ti­na mo­di­fi­ci­ra se na ne­ko­li­ko na­či­na uk­lju­ču­ju­ći in­te­ rak­ci­ju s HMG (vr­lo pok­ret­lji­va sku­pi­na, en­gl. hi­gh mo­bil­ity group), mo­di­ fi­ka­ci­je his­to­na i preu­re­đe­nje nuk­leo­so­ma. HMG-pro­tei­ni su pro­tein­ska su­pe­ro­bi­telj ko­ja ut­je­če na ar­hi­tek­tu­ru kro­ma­tin­skih ni­ti. Pos­to­je tri obi­te­ lji na­ve­de­nih pro­tei­na: HMGA, HMGB i HMGN. HMGA i HMGB pro­tei­ ni sa­vi­ja­ju DNA i omo­gu­ća­va­ju ve­za­nje re­gu­lacijskih fak­to­ra na kro­ma­tin. HGMN-pro­tei­ni se spe­ci­fič­no ve­žu na nuk­leo­so­me na mjes­ti­ma ko­ja pre­ kri­va­ju vez­na mjes­ta za his­to­ne H1 i ta­ko mo­gu po­ti­ca­ti ot­va­ra­nje kro­ma­ ti­na te sti­mu­li­ra­ti tran­skrip­ci­ju od­rž­ a­va­njem ne­kon­den­zi­ra­ne kro­ma­tin­ske struk­tu­re. Pr­va opi­sa­na vr­sta mo­di­fi­ka­ci­je his­to­na nji­ho­vo je ace­ti­li­ra­nje, ko­je se po­ve­zu­je s tran­skrip­cij­ski ak­tiv­nim kro­ma­ti­nom u vr­lo ve­li­kom bro­ju sta­ nič­nih vr­sta (sl. 7-34). Sr­žni his­to­ni (H2A, H2B, H3 i H4) ima­ju dvi­je do­me­ne: do­me­na his­ton­skog na­ma­ta­nja, uk­lju­če­na u in­te­rak­ci­je s dru­gim his­to­ni­ma i smo­ta­va­nje DNA oko sr­ži nuk­leo­som­ske čes­ti­ce te do­me­na re­pa na ami­no-kra­ju ko­ja se pru­ža iz­van nuk­leo­so­ma. Rep­na do­me­na na

Sli­ka 7-33. De­kon­den­zi­ra­na pod­ruč­ja u kro­mo­so­mu voć­ne mu­ši­ce.  Svjet­los­na mik­rog­ra­f i­ja pri­ka­zu­je de­kon­den­zi­ra­na pod­ruč­ja po­li­ten­skih kro­mo­so­ma (strje­li­ce) ko­ji su ak­tiv­ni u sin­te­zi RNA. (Lju­baz­noš­ću Jo­sep­ha Gal­la, Car­ne­gie In­sti­tu­tion.)

SINTEZA I DORADBA DNA 

Sli­ka 7-34. Ace­ti­li­ra­nje his­to­na.  (A) His­to­ni sr­ži ima­ju do­me­nu sma­ta­nja his­to­na. Ona str­ši iz­van nuk­leo­so­ma, a u in­te­rak­ci­ji je s dru­gim his­to­ni­ma i DNA. Re­po­vi na N-kra­ju his­to­na sr­ži (npr. H3) mo­di­f i­ci­ra­ju se do­dat­kom ace­til­nih sku­pi­na (Ac) na po­ stra­nič­ni la­nac li­zin­skih os­ta­ta­ka. (B) Tran­skrip­cij­ski ak­ti­va­to­ri i rep­re­so­ri zdru­že­ni su s koak­ti­va­to­ri­ma i ko­rep­re­so­ri­ma, ko­ji su zap­ra­vo his­ton­ske ace­ti­l-tran­sfe­ra­ze (HAT) i dea­ce­ti­la­ze (HDAC). Ace­ti­li­ra­nje his­to­na svoj­stvo je ak­tiv­no pre­pi­si­va­no­ga kro­ma­ti­na.

ami­no-kra­ju bo­ga­ta je li­zi­nom i mo­že se mo­di­fi­ci­ra­ti ace­ti­li­ra­njem na spe­ ci­fič­nim li­zin­skim os­tat­ci­ma. Is­tra­ži­va­nja dvi­ju sku­pi­na znan­stve­ni­ka 1996. go­di­ne pru­ži­la su do­ka­ze o iz­rav­noj ve­zi iz­me­đu ace­ti­li­ra­nja his­to­na i re­gu­li­ra­nja tran­skrip­ci­je te po­ ka­za­la da su tran­skrip­cij­ski ak­ti­va­to­ri i rep­re­so­ri zdru­že­ni s ace­ti­l-tran­sfe­ ra­zom i dea­ce­ti­la­zom. Ta je po­ve­za­no­st pr­vi put ot­kri­ve­na pri klo­ni­ra­nju ge­na ko­ji ko­di­ra his­ton­sku ace­ti­l-tran­sfe­ra­zu u pra­ži­vo­ti­nji Tet­ra­hyme­na. Neo­če­ki­va­no, sli­jed ami­no­ki­se­li­na his­ton­ske ace­ti­l-tran­sfe­ra­ze u blis­koj je sve­zi s pret­hod­no poz­na­tim tran­skrip­cij­skim koak­ti­va­to­rom u kvas­ci­ma, naz­va­nim Gcn5p. Kas­ni­jim je is­tra­ži­va­nji­ma ot­kri­ve­no da sam Gcn5p dje­ lu­je kao ace­ti­l-tran­sfe­ra­za, su­ge­ri­ra­ju­ći da je ak­ti­vi­ra­nje tran­skrip­ci­je iz­rav­ na pos­lje­di­ca ace­ti­li­ra­nja his­to­na. Re­zul­ta­ti su pro­ši­re­ni spoz­na­ja­ma o tome

   281

282    POGLAVLJE 7 Sli­ka 7-35. Ob­ras­ci his­ton­skih mo­di­fi­ ka­ci­ja.  Me­ti­li­ra­nje i fos­fo­ri­li­ra­nje spe­ ci­f ič­nih ami­no­ki­se­lin­skih os­ta­ta­ka u his­ ton­skom re­pu, kao i ace­ti­li­ra­nje, ut­je­ču na tran­skrip­cij­sku ak­tiv­no­st kro­ma­ti­na. Za­seb­ni ob­ras­ci his­ton­ske mo­di­f i­ka­ci­je svoj­stve­ni su tran­skrip­cij­ski ak­tiv­nom ili inak­tiv­nom kro­ma­ti­nu.

da je ace­ti­l-tran­sfe­ra­za zdru­že­na s broj­nim tran­skrip­cij­skim ko­ak­ti­va­to­ri­ ma si­sa­va­ca, kao i s op­ćim tran­skrip­cij­skim fak­to­rom TFIID. Na­p­ro­tiv, mno­gi tran­skrip­cij­ski ko­rep­re­so­ri, ka­ko u sta­ni­ca­ma kvas­ca ta­ko i u sta­ni­ ca­ma si­sa­va­ca dje­lu­ju kao his­ton­ske dea­ce­ti­la­ze, uk­la­nja­ju­ći ace­til­nu sku­pi­ nu s his­ton­skog re­pa. Ace­ti­li­ra­nje his­to­na ta­ko je iz­rav­na me­ta i tran­skrip­ cij­skih ak­ti­va­to­ra i rep­re­so­ra, po­ka­zu­ju­ći da ace­ti­li­ra­nje ima ključ­nu ulo­gu u re­gu­la­ci­ji gen­ske ek­spre­si­je u eu­ka­rio­ti­ma. His­to­ni se ne mo­di­fi­ci­ra­ju sa­mo ace­ti­li­ra­njem, ne­go i na niz dru­gih na­ či­na ko­ji obuh­va­ća­ju me­ti­li­ra­nje li­zin­skih i ar­gi­nin­skih os­ta­ta­ka, fos­fo­ri­li­ ra­nje se­rin­skih os­ta­ta­ka te do­da­va­nje pep­ti­da (ubik­vi­ti­na i SUMO, o nji­ma će bi­ti go­vo­ra u 8. pog­lav­lju) na li­zin­ske os­tat­ke. Slič­no ace­ti­li­ra­nju, ove se mo­di­fi­ka­ci­je do­ga­đa­ju na spe­ci­fič­nim ami­no­ki­se­lin­skim os­tat­ci­ma u his­ ton­skom re­pu, a po­ve­za­ne su s prom­je­na­ma tran­skrip­cij­ske ak­tiv­nos­ti (sl. 7-35). Či­ni se da his­ton­ske mo­di­fi­ka­ci­je ut­je­ču na gen­sku ek­spre­si­ju na dva na­či­na: mi­je­nja­njem svoj­sta­va kro­ma­ti­na te pris­kr­bom vez­nih mjes­ta za dru­ge pro­tei­ne ko­ji dje­lu­ju kao ak­ti­va­to­ri ili rep­re­so­ri tran­skrip­ci­je. Prim­je­ri­ce, tran­skrip­cij­ski ak­tiv­ni kro­ma­tin zdru­žen je s ne­ko­li­ko spe­ci­fi­ čnih mo­di­fi­ka­ci­ja his­to­na H3 ko­je obuh­va­ća­ju me­ti­li­ra­nje li­zi­na-4, fos­fo­ri­ la­ci­ju se­ri­na-10, ace­ti­li­ra­nje li­zi­na 9, 14, 18 i 23 te me­ti­li­ra­nje ar­gi­ni­na 17 i 26. Ace­ti­la­ci­ja neut­ra­li­zi­ra po­zi­tiv­ni na­boj li­zin­skih os­ta­ta­ka što pri­do­no­si tran­skrip­cij­skoj ak­tiv­nos­ti re­lak­sa­ci­jom kro­ma­tin­ske struk­tu­re. Uz to, ace­ ti­li­ra­nje li­zi­na slu­ži kao vez­no mjes­to za broj­ne pro­tei­ne ko­ji po­ti­ču tran­ skrip­ci­ju. Dru­gi se pro­tei­ni po­ve­za­ni s tran­skrip­cij­skom ak­tiv­noš­ću ve­žu na me­ti­li­ra­ne li­zin­ske (li­zi­n-4) os­tat­ke. Sup­rot­no to­me, me­ti­li­ra­nje li­zi­na 9 i 27 po­ve­za­no je s rep­re­si­jom tran­skrip­ci­je i kon­den­za­ci­jom kro­ma­ti­na. Ko­rep­re­so­ri priv­la­če en­zi­me ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju me­ti­li­ra­nje na­ve­de­nih li­zin­ skih os­ta­ta­ka na cilj­ne ge­ne. Me­ti­li­ra­ni li­zin­ski os­tat­ci 9 i 27 u H3 slu­že kao vez­na mjes­ta za pro­tei­ne ko­ji po­ti­ču kon­den­za­ci­ju kro­ma­ti­na, po­ve­zu­ju­ći ta­ko iz­rav­no mo­di­fi­ka­ci­ju his­to­na s rep­re­si­jom tran­skrip­ci­je i nas­tan­kom he­te­rok­ro­ma­ti­na. Tre­ba ima­ti na umu da mo­di­fi­ka­ci­je his­ton­skog re­pa re­gu­li­ra­ju jed­na dru­gu te ta­ko tvo­re raz­li­či­te ob­ras­ce his­ton­skih mo­di­fi­ka­ci­ja ko­je ko­re­li­ra­ ju s tran­skrip­cij­skom ak­tiv­noš­ću. Prim­je­ri­ce, fos­fo­ri­li­ra­nje H3 se­ri­na-10 (po­ve­za­no s ak­ti­vi­ra­njem tran­skrip­ci­je) pro­mo­vi­ra ace­ti­li­ra­nje li­zi­na-14 (ta­ko­đer po­ve­za­no s ak­ti­vi­ra­njem tran­skrip­ci­je), ali in­hi­bi­ra me­ti­li­ra­nje li­ zi­na-9 (po­ve­za­no s rep­re­si­jom tran­skrip­ci­je), Ta­ko, fos­fo­ri­li­ra­nje H3 se­ri­ na-10 po­ti­če dru­ge mo­di­fi­ka­ci­je ko­je su svoj­stve­ne ak­tiv­nom kro­ma­ti­nu. Na­sup­rot to­me, pro­tein ko­ji se ve­že na me­ti­li­ra­ne li­zin­ske os­tat­ke (li­zi­n-9) zdru­žen je s ak­tiv­noš­ću his­ton­ske dea­ce­ti­la­ze ko­ja pri­do­no­si kon­den­za­ci­ji kro­ma­ti­na i rep­re­si­ji tran­skrip­ci­je.

SINTEZA I DORADBA DNA 

   283

Sli­ka 7-36. Epi­ge­net­sko nas­lje­đi­va­nje his­ton­skih mo­di­fi­ka­ci­ja.  Ro­di­telj­ski nu­k­leo­so­mi koji sad­r­ža­va­ju mo­di­f i­ci­ra­ ne his­to­ne, ras­pod­je­lju­ju se na oba lan­ca DNA ti­je­kom nje­ne rep­li­ka­ci­je. Na taj na­ čin ro­di­telj­ski mo­di­f i­ci­ra­ni his­to­ni mo­gu up­rav­lja­ti slič­nim mo­di­f i­ka­ci­ja­ma no­vo­ sin­te­ti­zi­ra­nih his­to­na ko­ji se ug­ra­đu­ju u kro­mo­so­me po­to­ma­ka.

S ob­zi­rom da mo­di­fi­ci­ra­ni his­to­ni slu­že kao vez­na mjes­ta za pro­tei­ne ko­ji i sa­mi ka­ta­li­zi­ra­ju mo­di­fi­ci­ra­nje his­to­na, mo­di­fi­ka­ci­ja his­to­na pred­ stav­lja me­ha­ni­zam za epi­ge­net­sko nas­lje­đi­va­nje − pri­je­nos in­for­ma­ci­je ko­ je ni­su sad­r­ža­ne u sli­je­du DNA kod sta­nič­ne dio­be (sl. 7-36). Kao što je raz­mat­ra­no u 5. pog­lav­lju ro­di­telj­ski nuk­leo­so­mi se ras­pod­je­lju­ju na dva nas­ljed­na lan­ca-po­tom­ka ti­je­kom rep­li­ka­ci­je kro­mo­som­ske DNA. Suk­lad­ no to­me i mo­di­fi­ci­ra­ni se his­to­ni pre­no­se s ro­di­telj­skog kro­mo­so­ma na kro­mo­so­me po­to­ma­ka. Ti mo­di­fi­ci­ra­ni his­to­ni mo­gu up­rav­lja­ti slič­nim mo­di­fi­ka­ci­ja­ma no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nih his­to­na od­rž­ a­va­ju­ći ob­ra­zac his­ton­ske mo­di­fi­ka­ci­je svoj­stven ili ak­tiv­nom ili neak­tiv­nom kro­ma­ti­nu.

284    POGLAVLJE 7 Sli­ka 7-37. Fak­to­ri ko­ji re­mo­de­li­ra­ju kro­ma­tin.  Fak­ to­ri ko­ji re­mo­de­li­ra­ju kro­ma­tin mi­je­nja­ju aran­žman ili struk­tu­ru nuk­leo­so­ma. Prim­je­ri­ce, fak­tor ko­ji re­mo­de­li­ra kro­ma­tin zdru­žen s tran­skrip­cij­skim ak­ti­va­to­rom mo­že olak­ša­ti ve­za­nje op­ćih tran­skrip­cij­skih fak­to­ra i RNA-po­ li­me­ra­ze na kro­ma­tin re­po­zi­cio­ni­ra­njem nuk­leo­so­ma od pro­mo­tor­skog sli­je­da.

Na­sup­rot en­zi­mi­ma ko­ji re­gu­li­ra­ju kro­ma­tin­sku struk­tu­ru mo­di­fi­ci­ra­ njem his­to­na, kro­ma­tin­ski re­mo­de­li­ra­ju­ći fak­to­ri je­su pro­tein­ski kom­ plek­si ko­ji ko­ris­te ener­gi­ju nas­ta­lu hid­ro­li­zom A­TP-a za mi­je­nja­nje kon­ta­ ka­ta iz­me­đu DNA i his­to­na (sl. 7-37). Je­dan me­ha­ni­zam ko­jim dje­lu­ju kro­ma­tin­ski re­mo­de­li­ra­ju­ći fak­to­ri je­st taj da ka­ta­li­zi­ra­ju po­mi­ca­nje his­ ton­skih ok­ta­me­ra duž DNA. Ta­ko se re­po­zi­cio­ni­ra­ju nuk­leo­so­mi da bi se pro­mi­je­ni­la iz­lo­že­no­st spe­ci­fič­nog sli­je­da DNA tran­skrip­cij­skim fak­to­ri­ma. Osim to­ga, nuk­leo­som­ski re­mo­de­li­ra­ju­ći fak­to­ri mo­gu dje­lo­va­ti i ta­ko da iza­zi­va­ju prom­je­ne u kon­for­ma­ci­ji nuk­leo­so­ma, što opet ut­je­če na spo­sob­ no­st spe­ci­fič­nih slje­do­va DNA da stu­pa­ju u in­te­rak­ci­ju s re­gu­lacijskim tran­skrip­cij­skim pro­tei­ni­ma. Ko­nač­no, kro­ma­tin­ski re­mo­de­li­ra­ju­ći fak­to­ri mo­gu od­ba­ci­ti his­to­ne iz DNA os­tav­lja­ju­ći pod­ruč­ja ko­ja ne sad­r­že nu­ kleo­so­me. Slič­no en­zi­mi­ma ko­ji mo­di­fi­ci­ra­ju his­to­ne, kro­ma­tin­ski re­mo­ de­li­ra­ju­ći fak­to­ri mo­gu se prid­ru­ži­ti DNA sku­pa s dru­gim tran­skrip­cij­skim ak­ti­va­to­ri­ma ili rep­re­so­ri­ma te pro­mi­je­ni­ti aran­žman nuk­leo­so­ma ta­ko da po­ti­če ili in­hi­bi­ra tran­skrip­ci­ju. Prid­ru­ži­va­nje en­zi­ma ko­ji mo­di­fi­ci­ra­ju his­to­ne i kro­ma­tin­skih re­mo­de­ li­ra­ju­ćih fak­to­ra dje­lo­va­njem tran­skrip­cij­skih ak­ti­va­to­ra sti­mu­li­ra za­po­ činja­nje tran­skrip­ci­je mi­je­nja­njem kro­ma­tin­ske struk­tu­re u pod­ruč­ji­ma po­ja­či­va­ča ili pro­mo­to­ra. Me­đu­tim, na­kon za­po­či­nja­nja tran­skrip­ci­je, RNA-po­li­me­ra­za i da­lje je suo­če­na s prob­le­mom elon­ga­ci­je kro­ma­tin­sko­ga ka­lu­pa. Elon­ga­ci­ju omo­gu­ća­va­ju elon­ga­cij­ski fak­to­ri ko­ji su zdru­že­ni s fos­ fo­ri­li­ra­nim C-kra­jem RNA-po­li­me­ra­ze II u tre­nut­ku kad je za­po­če­la pro­ duk­tiv­na elon­ga­ci­ja (v. sl. 7-32). Ti elon­ga­cij­ski fak­to­ri obuh­va­ća­ju ka­ko en­zi­me ko­ji mo­di­fi­ci­ra­ju his­to­ne (ace­til-­tran­sfe­ra­ze i me­til­-tran­sfe­ra­ze) ta­ ko i kro­ma­tin­ske re­mo­de­li­ra­ju­će fak­to­re ko­ji pro­laz­no po­mi­ču nuk­leo­so­me ti­je­kom tran­skrip­ci­je.

SINTEZA I DORADBA DNA 

   285

Re­gu­li­ra­nje tran­skrip­ci­je ne­ko­di­ra­ju­ćim RNA Naj­no­vi­je spoz­na­je upu­ću­ju na to da se ek­spre­si­ja ge­na mo­že re­gu­li­ra­ti, osim tran­skrip­cij­skim re­gu­lacijskim pro­tei­ni­ma, o ko­ji­ma je već bi­lo go­vo­ ra, i ne­ko­di­ra­ju­ćim re­gu­lacijskim mo­le­ku­la­ma RNA uk­lju­ču­ju­ći ma­le in­ ter­fe­ri­ra­ju­će RNA (siR­NA) i mik­roR­NA. Op­će­ni­to, te krat­ke dvo­lan­ča­ne RNA in­hi­bi­ra­ju tran­sla­ci­ju ili po­ti­ču raz­grad­nju ho­mo­log­nih mR­NA pu­ tem RNA in­ter­fe­ren­ci­je (v. sl. 4-42). Gen­ska re­gu­la­ci­ja na pos­ttran­skrip­cij­ skoj ra­zi­ni te­ma je pog­lav­lja 8. Ne­ko­di­ra­ju­će RNA mo­gu, ta­ko­đer, po­tis­nu­ ti tran­skrip­ci­ju po­ti­ca­njem his­ton­skih mo­di­fi­ka­ci­ja ko­je vo­de ka kon­den­za­ci­ji kro­ma­ti­na i nas­tan­ku he­te­rok­ro­ma­ti­na. Po­tis­ki­va­nje tran­ skrip­ci­je po­mo­ću siR­NA naj­bo­lje je opi­sa­no kod ci­je­pa­ju­ćeg kvas­ca S. pom­be gdje siR­NA up­rav­lja nas­tan­kom he­te­rok­ro­ma­ti­na u pod­ruč­ju cen­ tro­me­ra (sl. 7-38). siR­NA se zdru­žu­je s kom­plek­som naz­va­nim kom­plek­ som RNA po­ti­ca­nog tran­skrip­cij­skog uti­ša­va­nja (RITS). Raz­dvo­je­ni siR­NA lan­ci po­tom na­vo­de RITS-kom­ple­ks na ho­mo­log­ni gen spa­ri­va­njem s mRNA tran­skrip­tom. RITS-kom­ple­ks po­ti­če pro­tei­ne na iza­zi­va­nje kon­ den­za­ci­je kro­ma­ti­na i me­ti­la­ci­ju li­zi­na-9 u his­to­nu H3 što do­vo­di do nas­ tan­ka he­te­rok­ro­ma­ti­na. Tran­skrip­cij­sko uti­ša­va­nje po­mo­ću siR­NA ta­ko­đer

Sli­ka 7-38. Re­gu­la­ci­ja tran­skrip­ci­je po­mo­ću siRNA.  Po­tis­ki­va­nje tran­skrip­ci­je je pos­re­do­va­no zdru­ži­va­njem siR­NA s RITS-kom­plek­som. siR­NA po­tom vo­di RITS do ho­mo­log­nog cilj­nog ge­na naj­vje­ro­jat­ni­je spa­ri­va­njem s mR­NA tran­skrip­tom zdru­že­nim s RNA-po­li­me­ra­zom II. RITS obuh­va­ća his­ton­ske me­til­-tran­sfe­ra­ze ko­je me­ti­li­ ra­ju li­zi­n-9 his­to­na H3 iza­zi­va­ju­ći nas­ta­nak he­te­rok­ro­ ma­ti­na i po­tis­ki­va­nje tran­skrip­ci­je.

286    POGLAVLJE 7

Sli­ka 7-39. Inak­ti­va­ci­ja X-kro­mo­so­ ma.  Inak­ti­vi­ra­ni X-kro­mo­so­m (pla­vo) ob­lo­žen je s Xi­st RNA (cr­ve­no). (Preu­ze­ to od B. Pan­ni­ng i R. Jae­nis­ch, 1988. Ce­ll 93: 305.)

je opi­sa­no u bilj­ka­ma, C. ele­ga­ns, voć­noj mu­ši­ci i sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca prem­ da meha­ni­zam uti­ša­va­nja u tim sta­ni­ca­ma ni­je pot­pu­no ras­vi­jet­ljen. Fe­no­men inak­ti­vi­ra­nja X-kro­mo­so­ma prim­jer je ulo­ge ne­ko­di­ra­ju­ćih RNA u re­gu­la­ci­ji gen­ske ek­spre­si­je u si­sa­va­ca. U mno­gih ži­vo­ti­nja (kao i u čov­je­ka) žen­ke ima­ju dva X-kro­mo­so­ma, a muž­ja­ci je­dan X- i je­dan Y-kro­ mo­som. X-kro­mo­som sad­rž­ a­va oko 1.000 ge­na ko­ji ni­su pri­sut­ni na mno­ go ma­njem Y-kro­mo­so­mu (v. sl. 5-29). Ta­ko žen­ke ima­ju dva­put vi­še ko­ pi­ja ve­ći­ne ge­na smješ­te­nih na X-kro­mo­so­mu u od­no­su na muž­ja­ke. Una­toč toj raz­li­ci i muž­ja­ci i žen­ke ima­ju is­tu ko­li­či­nu pro­tei­na ko­di­ra­nih ve­ći­nom ge­na na X-kro­mo­so­mu. Re­zul­tat je to kom­pen­za­cij­sko­ga me­ha­ niz­ma za do­zi­ra­nje ko­jim se ve­ći­na ge­na s jed­nog od dva X-kro­mo­so­ma u sta­ni­ca­ma žen­ke ra­no u raz­vo­ju inak­ti­vi­ra kon­ver­zi­jom u he­te­rok­ro­ma­tin. Sli­je­dom to­ga, sa­mo jed­na ko­pi­ja ve­ći­ne ge­na smješ­te­nih na X-kro­mo­so­ mu na ras­po­la­ga­nju je za tran­skrip­ci­ju u sta­ni­ca­ma ka­ko žen­ki, ta­ko i muž­ja­ka. Prem­da me­ha­ni­zam inak­ti­va­ci­je X-kro­mo­so­ma ni­je pot­pu­no raz­jaš­ njen, či­ni se da je ključ­ni ele­me­nt ne­ko­di­ra­ju­ća RNA nas­ta­la tran­skrip­ci­ jom re­gu­lacijsko­ga ge­na, naz­va­nog Xi­st, ko­ji se na­la­zi na inak­tiv­nom X-kro­mo­so­mu. Xi­st RNA os­ta­je na inak­tiv­nom X-kro­mo­so­mu, ve­že se na nje­ga i prek­ri­va ga (sl. 7-39). Po­tom sli­je­di priv­la­če­nje pro­tein­skog kom­ plek­sa ko­ji po­ti­če me­ti­la­ci­ju his­to­na H3 na li­zi­nu-27 i li­zi­nu-9 što da­lje iza­zi­va kon­den­za­ci­ju kro­ma­ti­na i kon­ver­zi­ju inak­tiv­nog X u he­te­rok­ro­ma­ tin. Naj­no­vi­ja is­tra­ži­va­nja uka­zu­ju na či­nje­ni­cu da inak­ti­va­ci­ja X obuh­va­ća nas­ta­nak dvos­tru­kog lan­ca RNA iz­me­đu Xi­st i nje­mu kom­ple­men­tar­nog lan­ca. Dvo­lan­ča­na struk­tu­ra Xi­st RNA se pro­ce­si­ra u siR­NA ko­ja pos­re­du­ je sa­mu inak­ti­va­ci­ju X.

Me­ti­li­ra­nje DNA

Sli­ka 7-40. Me­ti­li­ra­nje DNA.  Me­til­na sku­pi­na do­da­je se na C-5 u ci­to­zin­skom pr­ste­nu u DNA.

Me­ti­li­ra­nje DNA slje­de­ći je op­ći me­ha­ni­zam ko­ji kon­tro­li­ra tran­skrip­ ci­ju u eu­ka­rio­ti­ma. Ci­to­zin­ski os­tat­ci u DNA glji­va, bi­lja­ka i ži­vo­ti­nja mo­ gu se mo­di­fi­ci­ra­ti do­dat­kom me­til­nih sku­pi­na na ug­lji­kov atom u po­lo­ža­ju 5 (sl. 7-40). DNA se spe­ci­fič­no me­ti­li­ra na ci­to­zi­ni­ma (C) ko­ji pret­ho­de gva­ni­ni­ma (G) u lan­cu DNA (CpG di­nuk­leo­ti­di). Me­ti­li­ra­nje je po­ve­za­no s po­tis­ki­va­njem tran­skrip­ci­je. Me­ti­li­ra­nje se čes­to do­ga­đa u tran­spo­zon­ skim ele­men­ti­ma i či­ni se da ig­ra važ­nu ulo­gu u spr­je­ča­va­nju kre­ta­nja tran­spo­zo­na kroz ge­nom. Osim to­ga, me­ti­li­ra­nje je po­ve­za­no i s po­tis­ki­va­ njem tran­skrip­ci­je ne­kih ge­na za­jed­no s prom­je­na­ma u kro­ma­tin­skoj struk­tu­ri. U bilj­ka­ma, siR­NA up­rav­lja­ju me­ti­li­ra­njem DNA i kro­ma­tin­skim mo­di­fi­ka­ci­ja­ma po­tis­nu­tih ge­na. Ni­je raz­jaš­nje­no do­ga­đa li se sli­čan pro­ces i u životinjama. Me­đu­tim, ge­ni inak­ti­vi­ra­nog X-kro­mo­so­ma u si­sav­ci­ma bi­va­ju me­ti­li­ra­ni na­kon tran­skrip­cij­skog po­tis­ki­va­nja izaz­va­nog Xi­st RNA što zna­či da oba pro­ce­sa, me­ti­li­ra­nje DNA i mo­di­fi­ka­ci­je his­to­na, ima­ju svo­je zna­čaj­no mjes­to u inak­ti­va­ci­ji X-kro­mo­so­ma. Me­ti­li­ra­njem DNA naj­bo­lje je raz­jaš­njen me­ha­ni­zam epi­ge­net­skog nas­ lje­đi­va­nja. Ob­ra­zac me­ti­li­ra­nja DNA sta­bil­no se od­r­ža­va na­kon rep­li­ka­ci­je DNA en­zi­mi­ma ko­ji spe­ci­fič­no me­ti­li­ra­ju CpG slje­do­ve la­na­ca-kće­ri ko­ji su vo­di­ko­vim ve­za­ma ve­za­ni na me­ti­li­ra­ni ro­di­telj­ski la­nac (sl. 7-41). Ta­ko ge­ni ko­ji su me­ti­li­ra­ni i po­tis­nu­ti u ro­di­telj­skoj sta­ni­ci os­ta­ju me­ti­li­ra­ni i po­tis­nu­ti u sta­ni­ca­ma po­to­ma­ka. Važ­na re­gu­lacijska ulo­ga me­ti­li­ra­nja DNA pred­stav­lje­na je po­ja­vom zna­nom kao ge­nom­ski uti­sak (en­gl. ge­no­mic im­prin­ti­ng), ko­ja kon­tro­li­ra ek­spre­si­ju ne­kih ge­na dje­lat­nih u em­brio­nal­nom raz­vo­ju si­sa­va­ca. U ve­ći­ni slu­ča­je­va, oba ale­la, i maj­čin i očev, bi­va­ju ek­spri­mi­ra­ni u dip­loid­nim sta­ ni­ca­ma. Me­đu­tim, pos­to­ji ma­li broj utis­nu­tih ge­na (oko 70 je opi­sa­no u

SINTEZA I DORADBA DNA 

Sli­ka 7-41. Od­r­ža­va­nje ob­ras­ca me­ti­li­ra­nja.  U ro­di­telj­skoj DNA oba se lan­ca me­ti­ li­ra­ju na kom­ple­men­tar­nim CpG slje­do­vi­ma. Na­kon rep­li­ka­ci­je, sa­mo je ro­di­telj­ski la­ nac sva­ke mo­le­ku­le-kće­ri me­ti­li­ran. No­vo­sin­te­ti­zi­ra­ni lan­ci po­tom se me­ti­li­ra­ju spe­ci­ fič­nim en­zi­mom ko­ji pre­poz­na­je CpG slje­do­ve na­sup­rot mjes­tu me­ti­li­ra­nja.

mi­ša i čov­je­ka) či­ja ek­spre­si­ja ovi­si o to­me je­su li nas­li­je­đe­ni od maj­ke ili od oca. U ne­kim je slu­ča­je­vi­ma ek­spri­mi­ran sa­mo očev alel utis­nu­tog ge­na, a maj­čin je alel tran­skrip­cij­ski inak­ti­van. Za dru­ge utis­nu­te ge­ne maj­čin je alel ak­ti­van, a očev inak­ti­van. Či­ni se da me­ti­li­ra­nje DNA ig­ra ključ­nu ulo­gu u raz­li­ko­va­nju maj­či­nih i oče­vih ale­la za utis­nu­te ge­ne. Do­bar je prim­jer gen H19, ko­ji se pre­pi­su­je sa­mo s maj­či­ne ko­pi­je (sl. 7-42). Gen H19 spe­ci­ fič­no je me­ti­li­ran ti­je­kom raz­vo­ja muš­kih, ali ne i žen­skih spol­nih sta­ni­ca. Spa­ja­nje sper­ma­to­zoi­da s jaj­nom sta­ni­com u tre­nut­ku oplod­nje da­je em­brij ko­ji sad­r­ža­va me­ti­li­ra­ne oče­ve i ne­me­ti­li­ra­ne maj­či­ne ale­le to­ga ge­na. Očev alel H19 sto­ga os­ta­je me­ti­li­ran i tran­skrip­cij­ski inak­ti­van u em­brio­nal­nim sta­ni­ca­ma i so­mat­skim tki­vi­ma. Me­đu­tim, očev alel H19 de­me­ti­li­ra se u za­met­noj li­ni­ji, omo­gu­ću­ju­ći us­pos­ta­vu no­vog uzor­ka me­ti­la­ci­je u slje­de­ćoj ge­ne­ ra­ci­ji.

Do­ra­dba i pro­met RNA Prem­da je tran­skrip­ci­ja pr­vi i vr­lo ure­đe­ni ko­rak u gen­skoj eks­ pre­si­ji, obič­no pred­stav­lja po­če­tak ni­za do­ga­đa­nja pot­reb­nih za nas­ta­nak fun­kcio­nal­ne RNA. Ve­ći­na no­vo­sin­te­ti­zi­ra­nih RNA mo­ra

Sli­ka 7-42. Ge­nom­ski uti­sak.  Gen H19 spe­ci­fič­no se me­ti­li­ra ti­je­kom raz­ vo­ja muš­kih spol­nih sta­ni­ca. Sto­ga, sper­mi­ji ima­ju me­ti­li­ra­ni alel H19, a jaj­ ne sta­ni­ce ne­me­ti­li­ra­ni alel. Na­kon op­lod­nje, me­ti­li­ra­ni ro­di­telj­ski alel os­ta­je tran­skrip­cij­ski inak­ti­van, a ne­me­ti­li­ra­ni alel maj­ke ek­spri­mi­ra se u em­bri­ju.

   287

288    POGLAVLJE 7 se mo­di­fi­ci­ra­ti na raz­li­či­te na­či­ne da bi bi­la pre­ve­de­na u fun­kcio­nal­ni ob­ lik. Bak­te­rij­ske su mR­NA iz­nim­ke; one se od­mah ko­ris­te kao ka­lu­pi za sin­te­zu pro­tei­na, dok se još pre­pi­su­ju. Me­đu­tim, pri­mar­ni tran­skrip­ti rRNA i tR­NA mo­ra­ju pro­ći niz ko­ra­ka do­ra­dbe (en­gl. pro­ces­si­ng), ka­ko u pro­ka­ riot­skim, ta­ko i u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Slič­no, pri­mar­ni tran­skrip­ti eu­ ka­riot­skih mR­NA pro­la­ze in­ten­ziv­ne mo­di­fi­ka­ci­je, kao uk­la­nja­nje in­tro­na prek­ra­ja­njem, pri­je ne­go se tran­spor­ti­ra­ju iz jez­gre u ci­top­laz­mu, gdje slu­ že kao ka­lup za sin­te­zu pro­tei­na. Re­gu­la­ci­ja ko­ra­ka do­ra­dbe osi­gu­ra­va do­ dat­ni stu­panj kon­tro­le gen­ske ek­spre­si­je, kao i re­gu­la­ci­ja br­zi­ne ko­jom raz­ li­či­te mR­NA bi­va­ju raz­gra­đe­ne u sta­ni­ci.

Do­ra­dba ri­bo­som­skih i tran­spor­tnih RNA Os­nov­na do­ra­dba ri­bo­som­skih i tran­spor­tnih RNA slič­na je u pro­ka­ riot­skim i u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, što se mog­lo i oče­ki­va­ti s ob­zi­rom na fun­da­men­tal­nu ulo­gu tih RNA u sin­te­zi pro­tei­na. Ka­ko je već re­če­no eu­ ka­rio­ti ima­ju če­ti­ri vr­ste ri­bo­som­ske RNA (v. tab­l. 7-1), tri su od njih (28S, 18S i 5,8 rR­NA) de­ri­va­ti ki­da­nja jed­no­ga du­gog pre­kur­sor­skog tran­skrip­ta, naz­va­no­ga pre-r­RN ­ A (sl. 7-43). Pro­ka­rio­ti ima­ju tri ri­bo­som­ske RNA (23S, 16S i 5S), ek­vi­va­len­tne 28S, 18S i 5S rR­NA eu­ka­riot­skih sta­ni­ca i ta­ ko­đer su nas­ta­le do­ra­dbom jed­nog pre-r­R­NA tran­skrip­ta. Je­di­na rR­NA ko­ja se ne do­ra­đu­je sveo­buh­vat­no je­st 5S rR­NA u eu­ka­rio­ti­ma, ko­ja se pre­ pi­su­je s od­vo­je­no­ga ge­na. Pro­ka­riot­ske i eu­ka­riot­ske pre-r­R­NA do­ra­đu­ju se u ne­ko­li­ko ko­ra­ka. Ini­ci­jal­no ki­da­nje bak­te­rij­ske pre-r­R­NA da­je od­vo­je­ne pre­kur­so­re za tri in­di­vi­dual­ne rR­NA; one se da­lje do­ra­đu­ju se­kun­dar­nim ki­da­njem u ko­

Sli­ka 7-43. Pro­ces do­ra­dbe ri­bo­som­skih RNA.  Pro­ka­riot­ske sta­ni­ce sad­r­ža­va­ju tri rR­NA (16S, 23S i 5S) ko­je nas­ta­ju ki­da­njem pre-r­R­NA tran­skrip­ta. Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce (prim­je­ri­ce hu­ma­ne sta­ni­ce) sad­r­ža­va­ju če­ti­ri rR­NA. Jed­na od njih (5S rR­NA) pre­pi­su­je se od­vo­je­no, dok su os­ta­le tri (18S, 28S i 5,8S) de­ri­va­ti za­jed­nič­ke pre-r­R­NA. Na­kon ki­ da­nja, 5,8S rR­NA (je­din­stve­na u eu­ka­rio­ta) ve­že se vo­di­ko­vim ve­za­ma na 28S rR­NA.

SINTEZA I DORADBA DNA 

nač­ne pro­duk­te. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, pre-r­RN ­ A pr­vo se ki­da na mjes­tu ko­je je u bli­zi­ni 5,8S rR­NA na nje­noj 5' stra­ni, da­ju­ći dva od­vo­je­na pre­kur­so­ra ko­ji sad­r­ža­va­ju 18S i 28S + 5,8S rR­NA. Dalj­nje ki­da­nje pre­vo­di ih u ko­nač­ne pro­duk­te, s ti­me da je 5,8S rR­NA ve­za­na vo­di­ko­vim ve­za­ma na 28S mo­le­ku­lu. Osim ovih ki­da­nja, do­ra­dba rR­NA uk­lju­ču­je do­da­tak me­til­ne sku­pi­ne na ba­zu i še­ćer­ni dio spe­ci­fič­nih nuk­leo­ti­da. Do­ra­dba rRNA do­ga­đa se u jez­gri­ci eu­ka­riot­skih sta­ni­ca, o če­mu će bi­ti go­vo­ra u 9. po­glav­lju. Slič­no rR­NA, tR­NA u bak­te­ri­ja­ma i eu­ka­rio­ti­ma sin­te­ti­zi­ra­ju se kao du­ ge pre­kur­sor­ske mo­le­ku­le (pre-tR­NA), od ko­jih ne­ke sad­r­ža­va­ju ne­ko­li­ko in­di­vi­dual­nih slje­do­va tR­NA (sl. 7-44). U bak­te­ri­ja­ma se ne­ke tR­NA na­la­ ze u pre-r­R­NA tran­skrip­ti­ma. Do­ra­dba 5' kra­ja pre-tR­NA uk­lju­ču­je ki­da­ nje en­zi­mom naz­va­nim RNa­za P, ko­je je po­seb­no za­nim­lji­vo s ob­zi­rom na to da pred­stav­lja pro­to­tip­ni mo­del reak­ci­je ka­ta­li­zi­ra­ne RNA-en­zi­mom. RNa­za P sas­to­ji se od RNA i pro­tein­ske mo­le­ku­le, a ob­je su pot­reb­ne za mak­si­mal­nu ak­tiv­no­st. Go­di­ne 1983. Sid­ney Al­tman i su­rad­ni­ci po­ka­za­li su da je izo­li­ra­na RNA kom­po­nen­ta RNa­ze P spo­sob­na ka­ta­li­zi­ra­ti ki­da­nje pre-tR­NA. Pre­ma tim je po­ku­si­ma RNa­za P ri­bo­zim enzim u ko­jem je RNA, a ne pro­tein od­go­vo­ran za ka­ta­li­tič­ku ak­tiv­no­st. 3' kraj tR­NA nas­ta­je dje­lo­va­njem kon­ven­cio­nal­no­ga pro­tei­na RNa­ze, ali do­ra­dba to­ga kra­ja tR­NA mo­le­ku­le ta­ko­đer uk­lju­ču­je neo­bič­nu ak­tiv­no­st: do­da­tak CCA. Sve tR­NA ima­ju CCA sli­jed na 3' kra­je­vi­ma. Taj je sli­jed

Sli­ka 7-44. Pro­ces do­ra­dbe tran­spor­tnih RNA.  (A) Tran­spor­tne RNA de­ri­va­ti su pre-tR­NA, od ko­jih ne­ke sad­r­ža­va­ju ne­ko­li­ko in­di­vi­dual­nih mo­le­ku­la tR­NA. Ki­da­nje na 5'-kraju tR­NA ka­ta­li­zi­ra­no je ri­bo­zi­mom RNa­za P, a ki­da­nje na 3'-kraju ka­ta­li­zi­ra­no je kon­ven­cio­nal­nim pro­tei­nom RNa­zom. CCA kraj se po­tom do­da­je na 3'-kraj mno­gih tR­NA u pro­ce­su pos­ttran­skrip­cij­ske do­ra­dbe. Ko­nač­no, ne­ke se ba­ze mo­di­f i­ci­ra­ju na ka­rak­te­ris­tič­nim po­zi­ci­ja­ma u tR­NA mo­le­ku­li. U ovom prim­je­ru, mo­di­f i­ci­ra­ni nuk­leo­ zi­di obuh­va­ća­ju di­hid­rou­ri­din (DHU), me­til­gva­no­zin (mG), ino­zin (I), ri­bo­ti­mi­din (T) i pseu­dou­ri­din (ψ). (B) Struk­tu­ra mo­di­f i­ci­ra­nih ba­za. Ri­bo­ti­mi­din, di­hid­rou­ri­din i pseu­ dou­ri­din nas­ta­ju mo­di­f i­ci­ra­njem uri­di­na u tR­NA. Ino­zin i me­til­gva­no­zin nas­ta­ju mo­di­ fi­ci­ra­njem gva­no­zi­na.

   289

290    POGLAVLJE 7 mjes­to ve­zi­va­nja ami­no­ki­se­li­ne, pot­reb­no za fun­kci­ju tR­NA ti­je­kom sin­te­ ze pro­tei­na. CCA kraj ne­kih tR­NA ko­di­ran je sli­je­dom DNA, ali kod dru­ gih ni­je, sto­ga se do­da­je kao ko­rak do­ra­dbe RNA en­zi­mom ko­ji pre­poz­na­ je i do­da­je CCA na 3' kraj svih tR­NA ko­je ne­ma­ju taj sli­jed. Dru­gi je neo­bi­čan as­pe­kt do­ra­dbe tR­NA sveo­buh­vat­na mo­di­fi­ka­ci­ja ba­ za u mo­le­ku­li tR­NA. Oko 10% svih ba­za u mo­le­ku­li tR­NA pro­mi­je­nje­no je i da­je ta­ko raz­li­či­te mo­di­fi­ci­ra­ne nuk­leo­ti­de na spe­ci­fič­nim po­lo­ža­ji­ma u mo­le­ku­la­ma tRNA (v. sl. 7-44). Fun­kci­je su ve­ći­ne tih mo­di­fi­ci­ra­nih ba­za ne­poz­na­te, ali ne­ke su važ­ne u sin­te­zi pro­tei­na jer mi­je­nja­ju svoj­stva tR­NA, s ob­zi­rom na spa­ri­va­nje kom­ple­men­tar­nih ba­za (v. pog­l. 8). Ne­ke pre-tR­NA, kao i pre-r­RN ­ A u ma­lom bro­ju or­ga­ni­za­ma, sad­r­ža­va­ ju in­tro­ne ko­ji se uk­la­nja­ju prek­ra­ja­njem. Prek­ra­ja­nje tR­NA pos­re­do­va­no je kon­ven­cio­nal­nim pro­tein­skim en­zi­mi­ma što ni­je slu­čaj u dru­gim reak­ ci­ja­ma prek­ra­ja­nja u ko­ji­ma sud­je­lu­ju ka­ta­li­tič­ke RNA. En­do­nuk­lea­za ki­da pre-tR­NA na mjes­tu prek­ra­ja­nja da bi iz­re­za­la in­tron, na­kon če­ga sli­je­di spa­ja­nje eg­zo­na i nas­ta­nak zre­le mo­le­ku­le tR­NA.

Do­ra­dba mR­NA u eu­ka­rio­ti­ma Na­sup­rot do­ra­dbi ri­bo­som­skih i tran­spor­tnih RNA, do­ra­dba glas­nič­kih RNA pred­stav­lja naj­ve­ću raz­li­ku iz­me­đu pro­ka­riot­skih i eu­ka­riot­skih sta­ ni­ca. U bak­te­ri­ja­ma, ri­bo­so­mi ima­ju iz­ra­van pris­tup mo­le­ku­li mR­NA u nas­ta­ja­nju i tran­sla­ci­ja zap­ra­vo za­po­či­nje na nas­ta­ju­ćem lan­cu mR­NA dok

Sli­ka 7-45. Pro­ces do­ra­dbe eu­ka­riot­skih glas­nič­kih RNA.  Pro­ces do­ra­dbe mR­NA obuh­va­ća mo­di­f i­ci­ra­nje 5'-kraja do­da­va­njem ka­pe s 7-metilgvanozinom (m7G), mo­di­f i­ ci­ra­nje 3'-kraja po­lia­de­ni­la­ci­jom i uk­la­nja­nje in­tro­na prek­ra­ja­njem. 5'-kapa nas­ta­je do­ dat­kom GTP u ob­r­nu­toj ori­jen­ta­ci­ji nas­pram 5'-kraja mR­NA, stva­ra­ju­ći 5'-5' ve­zu. Do­ da­ni G po­tom se me­ti­li­ra na po­lo­ža­ju N-7, a me­til­ne se sku­pi­ne do­da­ju i na ri­bo­ze ko­je pri­pa­da­ju pr­vom ili pr­vim dvama nuk­leo­ti­dima u mR­NA.

SINTEZA I DORADBA DNA 

još tra­je tran­skrip­ci­ja. U eu­ka­rio­ti­ma, mR­NA sin­te­ti­zi­ra­na u jez­gri mo­ra se pr­vo tran­spor­ti­ra­ti u ci­top­laz­mu, pri­je ne­go što se mo­že upo­ra­bi­ti kao ka­ lup za sin­te­zu pro­tei­na. Što­vi­še, po­čet­ni pro­duk­ti tran­skrip­ci­je u eu­ka­riot­ skim sta­ni­ca­ma (pre-mR­NA) sveo­buh­vat­no se mo­di­fi­ci­ra­ju pri­je iz­las­ka iz jez­gre. Do­ra­dba mR­NA obuh­va­ća mo­di­fi­ka­ci­ju oba­ju kra­je­va pri­mar­no­ga tran­skrip­ta, kao i uk­la­nja­nje in­tro­na (sl. 7-45). Reak­ci­je do­ra­dbe pri­je su po­ve­za­ne s tran­skrip­ci­jom, ne­go što su neo­vis­ni do­ga­đa­ji ko­ji sli­je­de na­kon sin­te­ze pre-mR­NA. Ta­ko su sin­te­za mR­NA i nje­zi­na do­ra­dba ti­jes­no koor­ di­ni­ra­ni ko­ra­ci u ek­spre­si­ji ge­na. Do­me­na na C-kra­ju (CTD) RNA-po­li­me­ ra­ze II ig­ra ključ­nu ulo­gu u koor­di­ni­ra­nju tih pro­ce­sa, slu­že­ći kao vez­no mjes­to za en­zim­ske kom­plek­se uk­lju­če­ne u do­ra­dbu mR­NA. Zdru­ži­va­nje tih en­zi­ma za do­ra­dbu RNA s CTD po­li­me­ra­ze II pri­do­no­se nji­ho­voj spe­ ci­fič­nos­ti u pro­ce­su do­ra­dbe mR­NA; po­li­me­ra­ze I i III ne­ma­ju CTD, ta­ko da se nji­ho­vi tran­skrip­ti ne do­ra­đu­ju is­tim en­zim­skim kom­plek­si­ma. Pr­vi je ko­rak u pro­ce­su do­ra­dbe mR­NA mo­di­fi­ci­ra­nje 5' kra­ja tran­ skrip­ta do­da­va­njem struk­tu­re naz­va­ne 7-metilgvanozinska ka­pa. En­zi­mi od­go­vor­ni za do­da­va­nje ka­pe prid­ru­žu­ju se fos­fo­ri­li­ra­noj CTD, sli­je­de­ći za­po­či­nja­nje tran­skrip­ci­je, a ka­pa se do­da­je na­kon tran­skrip­ci­je pr­vih 20 do 30 nuk­leo­ti­da RNA. Do­da­va­nje ka­pe za­po­či­nje na­kon do­dat­ka GTP u obr­nu­toj ori­jen­ta­ci­ji na 5' kraj­nji nuk­leo­tid RNA. Na­kon to­ga do­da­je se me­til­na sku­pi­na na G ba­zu i na ri­bo­zu jed­no­ga ili dva nuk­leo­ti­da na 5' kra­ju RNA lan­ca. 5' ka­pa sta­bi­li­zi­ra RNA i po­rav­na­va eu­ka­riot­ske mR­NA s ri­bo­so­mi­ma ti­je­kom tran­sla­ci­je (v. pog­l. 8). 3' kraj ve­ći­ne eu­ka­riot­skih mR­NA ni­je de­fi­ni­ran zaus­tav­lja­njem tran­ skrip­ci­je, ne­go ki­da­njem pri­mar­nog tran­skrip­ta i do­da­va­njem po­li-A re­pa reak­ci­jom do­ra­dbe naz­va­nom po­lia­de­ni­la­ci­ja (sl. 7-46). Sig­na­li za po­lia­ de­ni­la­ci­ju obuh­va­ća­ju vi­so­kokon­zer­vi­ra­ne hek­sa­nuk­leo­ti­de (AAUAAA u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca), smješ­te­ne 10 do 30 nuk­leo­ti­da uz­vod­no od mjes­ta po­ lia­de­ni­la­ci­je, i GU-bo­ga­ti niz­vod­ni sljed­ni ele­me­nt. Osim to­ga, ne­ki ge­ni ima­ju U-bo­ga­te sljed­ne ele­men­te uz­vod­no od AAUAAA. Te slje­do­ve pre­ poz­na­je pro­tein­ski kom­ple­ks ko­ji obuh­va­ća en­do­nuk­lea­ze što ki­da­ju la­nac RNA i od­vo­je­nu po­li-A-po­li­me­ra­zu ko­ja do­da­je po­li-A rep du­lji­ne oko 200 nuk­leo­ti­da na tran­skri­pt. En­zi­mi dje­lat­ni u pro­ce­su do­ra­dbe po­ve­za­ni su s fos­fo­ri­li­ra­nom CTD RNA-po­li­me­ra­ze II i mo­gu pu­to­va­ti s po­li­me­ra­zom po­čev­ši od mjes­ta za­po­či­nja­nja tran­skrip­ci­je. Na­kon ki­da­nja i po­lia­de­ni­la­ ci­je do­la­zi do raz­grad­nje RNA niz­vod­no od mjes­ta za po­lia­de­ni­la­ci­ju što do­vo­di do zaus­tav­lja­nja tran­skrip­ci­je.

   291

7.2. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Do­ra­dba RNA. Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce mo­ra­ju do­ra­di­ti tran­skrip­cij­ske RNA pro­ duk­te do ob­li­ka zre­le glas­nič­ke RNA ko­ja se mo­že tran­sla­ti­ra­ti.

Sli­ka 7-46. Nas­ta­nak 3'-kra­je­va na eu­ka­riot­skim mR­NA.  Po­lia­de­ni­la­ cij­ski sig­na­li u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca sas­ to­je se od še­st nuk­leo­ti­da AAUAAA uz uz­vod­ne i niz­vod­ne ele­men­te (bo­ga­te GU). En­do­nuk­lea­za ki­da pre-mR­NA 10 do 30 nuk­leo­ti­da niz­vod­no od AAUA­ AA, obič­no na CA sli­je­du. Po­li-A-po­li­ me­ra­za na­kon to­ga do­da­je po­li-A rep ko­ji se sas­to­ji od prib­liž­no 200 A na 3'-kraju RNA.

292    POGLAVLJE 7 Goto­vo su sve mR­NA u eu­ka­rio­ti­ma po­lia­de­ni­li­ra­ne, a po­li-A rep, po­ ka­za­no je, re­gu­li­ra i tran­sla­ci­ju i sta­bil­no­st mR­NA. Osim to­ga, po­lia­de­ni­ la­ci­ja ig­ra važ­nu re­gu­la­cijsku ulo­gu u ra­nom raz­vo­ju, gdje prom­je­ne du­lji­ ne po­li-A re­po­va kon­tro­li­ra­ju tran­sla­ci­ju mR­NA. Prim­je­ri­ce, mno­ge mR­NA us­kla­diš­te­ne su u neop­lo­đe­nim ja­ji­ma u ob­li­ku nep­rim­je­re­nom za tran­sla­ ci­ju s krat­kim po­li-A re­po­vi­ma (obič­no 30 do 50 nuk­leo­ti­da du­gom). Oplod­nja sti­mu­li­ra pro­du­lji­va­nje po­li-A re­po­va us­kla­diš­te­nih mR­NA, što po­tom ak­ti­vi­ra nji­ho­vu tran­sla­ci­ju i sin­te­zu pro­tei­na pot­reb­nih za ra­ni em­ brio­nal­ni raz­voj. Naj­doj­mlji­vi­ja je mo­di­fi­ka­ci­ja pre-mR­NA uk­la­nja­nje in­tro­na prek­ra­ja­ njem. Kao što je već pri­ka­za­no u 5. pog­lav­lju, ko­di­ra­ju­ći su slje­do­vi ve­ći­ne eu­ka­riot­skih ge­na is­pre­ki­da­ni ne­ko­di­ra­ju­ćim slje­do­vi­ma (in­tro­ni­ma) ko­ji se pre­ciz­no iz­re­zu­ju iz zre­le mR­NA. U si­sa­va­ca, ve­ći­na ge­na sad­rž­ a­va vi­ šes­tru­ke in­tro­ne, ko­ji pri­do­no­se ve­li­či­ni pre-mR­NA oko de­set pu­ta ve­ćoj ne­go kad bi sad­r­ža­va­la sa­mo eg­zo­ne. Neo­če­ki­va­no ot­kri­će in­tro­na 1977. go­di­ne us­mje­ri­lo je is­tra­ži­vač­ke na­po­re u smje­ru ra­zu­mi­je­va­nja me­ha­niz­ ma prek­ra­ja­nja, vr­lo spe­ci­fič­nog za stva­ra­nje fun­kcio­nal­ne mR­NA. Dalj­nja is­tra­ži­va­nja prek­ra­ja­nja ni­su sa­mo ras­vi­jet­li­la no­ve me­ha­niz­me re­gu­la­ci­je ge­na, ne­go su ra­zot­kri­la neo­bič­ne ka­ta­li­tič­ke ak­tiv­nos­ti mo­le­ku­la RNA.

Sli­ka 7-47. In vit­ro prek­ra­ja­nje.  Gen ko­ji sad­r­ža­va in­tron klo­ni­ran je niz­vod­no od pro­mo­to­ra (P) ko­ji pre­poz­na­je bak­ te­rio­fag­na RNA-po­li­me­ra­za. Plaz­mid je raz­gra­đen res­trik­cij­ skim en­zi­mom ko­ji ki­da na 3'-kraju klo­ni­ra­no­ga ge­na da­ju­ći li­near­nu mo­le­ku­lu DNA. Ta se DNA pre­pi­su­je in vit­ro bak­ te­rio­fag­nom po­li­me­ra­zom da­ju­ći RNA. Reak­ci­je prek­ra­ja­nja mo­gu se is­pi­ti­va­ti in vit­ro do­dat­kom nas­ta­lih pre-mR­NA nuk­lear­nom ek­strak­tu sta­ni­ca si­sa­va­ca.

SINTEZA I DORADBA DNA 

   293

Me­ha­ni­zam prek­ra­ja­nja Ključ je ra­zu­mi­je­va­nja prek­ra­ja­nja pre-mR­NA raz­voj in vit­ro sus­ta­va ko­ji efi­kas­no iz­vo­di reak­ci­ju prek­ra­ja­nja (sl. 7-47). Pre-mRNA sin­te­ti­zi­ra­ju se in vit­ro klo­ni­ra­njem struk­tur­nih ge­na (s nji­ho­vim in­tro­ni­ma) u bli­zi­nu pro­mo­to­ra za bak­te­rio­fag­ne RNA-po­li­me­ra­ze ko­je se mo­gu izo­li­ra­ti u ve­li­ kim ko­li­či­na­ma. Tran­skrip­ci­ja tih plaz­mi­da mo­že se po­tom ko­ris­ti­ti za prip­ra­vu ve­li­kih ko­li­či­na mR­NA, ko­je, kad se do­da­ju nuk­lear­nom ek­strak­ tu sta­ni­ca si­sa­va­ca, bi­va­ju ko­rek­tno prek­ro­je­ne. Kao kod tran­skrip­ci­je, prim­je­na ovak­vih in vit­ro sus­ta­va omo­gu­ću­je de­talj­ni­je is­tra­ži­va­nje prek­ra­ ja­nja ne­go bi to bi­lo mo­gu­će u cje­lo­vi­tim sta­ni­ca­ma. Ana­li­za reak­cij­skih pro­du­ka­ta i in­ter­me­di­ja­ra nas­ta­lih in vit­ro ra­zot­kri­ la je da se prek­ra­ja­nje mR­NA od­vi­ja u dva ko­ra­ka (sl. 7-48). Pr­vo, mR­NA se ki­da na 5' mjes­tu za prek­ra­ja­nje, i 5' kraj in­tro­na spa­ja se s ade­nin­skim nuk­leo­ti­dom unu­tar in­tro­na (bli­zu 3' kra­ja). U ovom ko­ra­ku nas­ta­je neo­ bič­na ve­za iz­me­đu 5' kra­ja in­tro­na i 2' hid­rok­sil­ne sku­pi­ne ade­nin­sko­ga nuk­leo­ti­da. Nas­ta­li in­ter­me­di­jar sli­čan je la­su u ko­jem in­tron pra­vi om­ču. Dru­gi ko­rak u prek­ra­ja­nju od­vi­ja se is­to­dob­nim ki­da­njem na 3' mjes­tu za prek­ra­ja­nje i sljep­lji­va­njem (li­ga­ci­jom) dva­ju eg­zo­na. In­tron je ta­ko is­je­čen u ob­li­ku la­sa, bi­va po­tom li­nea­ri­zi­ran i raz­gra­đen u jez­gri cje­lo­vi­te sta­ni­ ce. Ove reak­ci­je de­fi­ni­ra­ju tri kri­tič­na sljed­na ele­men­ta u mR­NA: sli­jed na 5' mjes­tu za prek­ra­ja­nje, sli­jed na 3' mjes­tu za prek­ra­ja­nje i sli­jed unu­tar in­tro­na na toč­ki gra­na­nja (mjes­to gdje se 5' kraj in­tro­na po­ve­zu­je da bi nas­ta­la struk­tu­ra slič­na la­su) (v. sl. 7-48). Pre-mRNA sad­rž­ a­va slič­ne usug­ la­še­ne slje­do­ve na sva­koj od na­ve­de­nih po­zi­ci­ja, omo­gu­ću­ju­ći sus­ta­vu za prek­ra­ja­nje da pre­poz­na pre-mR­NA i iz­ve­de reak­ci­je ki­da­nja i sljep­lji­va­nja obuh­va­će­ne pro­ce­som prek­ra­ja­nja. Bio­ke­mij­ska ana­li­za nuk­lear­nih ek­stra­ka­ta ot­kri­la je da se prek­ra­ja­nje od­vi­ja u ve­li­kim kom­plek­si­ma naz­va­nim tje­leš­ca za prek­ra­ja­nje (en­gl. spli­ceo­so­mes) ko­ji se sas­to­je od pro­tei­na i RNA. RNA kom­po­nen­te tje­le­ša­ca za prek­ra­ja­nje svr­sta­ne su u pet sku­pi­na ma­lih nuk­lear­nih RNA (snR­NA) naz­va­nih U1, U2, U4, U5 i U6. Te snR­NA, ve­li­či­ne oko 50 do 200 nuk­leo­

Sli­ka 7-48. Prek­ra­ja­nje pre-mR­NA.  Reak­ci­ja prek­ra­ja­nja od­vi­ja se u dva ko­ ra­ka. Pr­vi ko­rak obuh­va­ća ki­da­nje na 5'mjestu prek­ra­ja­nja (en­gl. spli­ce si­te, SS) i spa­ja­nje 5'-kraja in­tro­na na A unu­tar in­tro­na (en­gl. bran­ch poi­nt, toč­ka gra­na­ nja). Tom reak­ci­jom nas­ta­je po­lup­roiz­ vod sli­čan la­su (en­gl. la­ria­t-li­ke). Dru­gi je ko­rak ki­da­nje i si­mul­ta­no spa­ja­nje eg­zo­ na, či­me do­la­zi do iz­re­zi­va­nja struk­tu­re in­tro­na slič­ne la­su.

294    POGLAVLJE 7

KL JUČNI POKUS

Ot­kri­će snR­NP An­ti­bo­dies to sma­ll nuc­lear RNAs com­plexed wi­th pro­tei­ns are pro­du­ced by pa­tien­ts wi­th syste­mic lu­pus erythe­ma­to­sus Mic­hael R. Ler­ner and Joan A. Stei­tz Ya­le Uni­ver­si­ty, New Ha­ven, Con­nec­ti­cut Pro­cee­din­gs of the Na­tio­nal Aca­de­my of Scien­ces, USA, 1979, vol. 76, str. 5495-5499

Kon­tek­st Ot­kri­će in­tro­na 1977. go­di­ne da­lo je na­slu­ti­ti da su pot­pu­no nep­red­vi­đe­ne reak­ci­je do­ra­dbe pot­reb­ne da bi na­ sta­la mR­NA u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. In­tro­ni se mo­ra­ju pre­ciz­no iz­re­za­ti iz pre-mR­NA na­kon če­ga sli­je­di spa­ja­ nje eg­zo­na i nas­ta­nak zre­le mo­le­ku­le mRNA. Neo­če­ki­va­na pri­ro­da prek­ra­ja­ nja pre-mR­NA i nje­zi­no ra­zu­mi­je­va­nje zao­ku­pi­lo je paž­nju mno­gih mo­le­ku­lar­ nih bio­lo­ga. Je­dan od naj­važ­ni­jih ko­ra­ka u ra­zu­mi­ je­va­nju me­ha­niz­ma prek­ra­ja­nja bi­lo je ot­kri­će snR­NP i nji­ho­va dje­lo­va­nja u prek­ra­ja­nju. Ma­le jez­gri­ne RNA iden­ti­fi­ci­ra­ne su pr­ vi put u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma kas­nih 60-ih go­di­na proš­lo­ga sto­lje­ća. Me­đu­ tim, fun­kci­ja snR­NA bi­la je ne­poz­na­ta. U član­ku ob­jav­lje­nom 1979. go­di­ne Mic­hael Ler­ner i Joan Stei­tz po­ka­za­li su ka­ko je ve­ći­na snR­NA pri­sut­na kao kom­ple­ks RNA i pro­tei­na naz­van snRNP. Osim to­ga, oni su pr­vi pred­lo­ži­li da bi ti kom­plek­si RNA i pro­tei­na mog­li bi­ti ak­tiv­ni u prek­ra­ja­nju pre-mR­NA. Na­kon iden­ti­fi­ka­ci­je snR­NP us­li­je­di­li su raz­li­či­ ti po­ku­si ko­ji su ut­vr­di­li nji­ho­vu ulo­gu i ras­vi­jet­li­li me­ha­ni­zam ko­jim se od­vi­ja prek­ra­ja­nje pre-mR­NA.

nas­to­ja­li oka­rak­te­ri­zi­ra­ti dva an­ti­ge­na, naz­va­na ri­bo­nuk­lein­ski pro­tein (RNP) i Sm, ko­ji su bi­li pre­poz­na­ti pro­tu­ti­je­li­ma do­bi­ve­nim od bo­les­ni­ka s eri­te­ma­toz­ nim lu­pu­som. Neiz­rav­ni su po­dat­ci su­ ge­ri­ra­li da se RNP sas­to­ji i iz pro­tei­na i iz RNA, na što upu­ću­je sa­mo ime, ali ni jed­no ni dru­go ni­je bi­lo ut­vr­đe­no na mo­le­ku­lar­noj ra­zi­ni. Da bi iden­ti­fi­ci­ra­li mo­gu­će fak­to­re RNP i Sm an­ti­ge­na, jez­gri­ne RNA izo­li­ra­ne iz miš­jih sta­ni­ca ra­dioak­tiv­no su oz­na­

Ek­spe­ri­me­nt Iden­ti­fi­ka­ci­ja snR­NP te­me­lji­la se na upo­ ra­bi an­ti­se­ru­ma do­bi­ve­nih od bo­les­ni­ka obo­lje­lih od sis­tem­nog eri­te­ma­toz­nog lu­pu­sa, au­toi­mu­nosne bo­les­ti kod ko­je bo­les­ni­ci stva­ra­ju pro­tu­ti­je­la nas­pram vlas­ti­tih, nor­mal­nih sta­nič­nih sas­to­ja­ka. Mno­ga pro­tu­ti­je­la kod eri­te­ma­toz­no­ga lu­pu­sa stvo­re­na su nas­pram kom­po­ nen­ti jez­gre, obuh­va­ća­ju­ći DNA, RNA i his­to­ne. Ot­kri­će snR­NP prois­tek­lo je iz is­tra­ži­va­nja ko­ji­ma su Ler­ner i Stei­tz

Imunoprecipitacija snRNA antiserumima bole­ snika oboljelih od eritematoznoga lupusa. Kolona 1, anti-Sm; kolona 2, normalni kon­ trolni serum; kolona 3, antiserum koji primarno prepoznaje RNP antigen; kolona 4, anti-RNP. Obratite pažnju na to da je nespecifična RNA označena s X prisutna u svim imunoprecipita­ tima uključujući i kontrolu.

Joan Steitz

če­ne s 32P i po­tom imu­nop­re­ci­pi­ti­ra­ne an­ti­se­ru­mi­ma bo­les­ni­ka obo­lje­lih od raz­li­či­tih ob­li­ka eri­te­ma­toz­no­ga lu­pu­sa (vi­di sli­ku 4-30). Pro­na­đe­no je še­st raz­ li­či­tih vr­sta snR­NA ko­je su se­lek­tiv­no imu­nop­re­ci­pi­ti­ra­ne an­ti­se­ru­mi­ma od ra­zli­či­tih bo­les­ni­ka, ali ne i se­ru­mom zdra­ve, kon­trol­ne oso­be (vi­di sli­ku). An­ti-Sm se­rum imu­nop­re­ci­pi­ti­rao je svih tih še­st snR­NA ko­je su oz­na­če­ne U1a, U1b, U2, U4, U5 i U6. Anti-RNP se­rum imu­nop­re­ci­pi­ti­rao je sa­mo U1a i U1b, a se­rum tre­će­ga bo­les­ni­ka (ko­ ji je oka­rak­te­ri­zi­ran kao ve­ći­nom an­ ti-RNP) imu­nop­re­ci­pi­ti­rao je U1a, U1b i U6. Imu­nop­re­ci­pi­ti­ra­ne snR­NA nak­ na­dno su oka­rak­te­ri­zi­ra­ne sek­ven­ci­ra­ njem, ko­je je po­ka­za­lo da su U1a, U1b i U2 iden­tič­ni naj­češ­ćim snR­NA već po­ zna­tim u jez­gra­ma si­sa­va­ca i da U1a i U1b pred­stav­lja­ju ina­či­ce is­te vr­ste U1 snR­NA pri­sut­ne u hu­ma­nim sta­ni­ca­ma. Na­sup­rot to­mu, U4, U5 i U6 snR­NA je­ su no­voot­kri­ve­ne snR­NA u ovom po­ku­ su Mic­hae­la Ler­ne­ra i Joane Steit­z. Važ­no je is­tak­nu­ti ka­ko imu­nop­re­ci­ pi­ta­ci­ja ovih snR­NA po­ka­zu­je da su one bi­le kom­po­nen­te kom­plek­sa RNA i pro­tei­na. An­ti-Sm se­rum, ko­ji je imu­ nop­re­ci­pi­ti­rao svih še­st snR­NA, pre­ poz­na­je pro­tein­ski an­ti­gen. Slič­no to­ mu, ot­pri­je je poz­na­to da je pro­tein pot­re­ban za pre­poz­na­va­nje an­ti­ge­na an­ti-R­NP se­ru­mom. Što­vi­še, Ler­ner i Stei­tz po­ka­za­li su da se ni­jed­na snR­NA ne bi mog­la imu­nop­re­ci­pi­tira­ti ako se pr­vo uk­lo­ni pro­tein ek­strak­ci­jom RNA fe­no­lom. Dalj­nja ana­li­za sta­ni­ca u ko­

SINTEZA I DORADBA DNA 

   295

KL JUČNI POKUS ji­ma su pro­tei­ni ra­dioak­tiv­no oz­na­če­ni 35 S-me­tio­ni­nom iden­ti­fi­ci­ra­la je se­dam zna­čaj­nih nuk­lear­nih pro­tei­na ko­ji su imu­nop­re­ci­pi­ti­ra­ni sku­pa sa snR­NA s po­mo­ću an­ti-Sm i an­ti-R­NP se­ru­ma. Ti po­dat­ci sto­ga po­ka­zu­ju da je sva­ka od še­st snR­NA pri­sut­na u snR­NP kom­plek­ su sa spe­ci­fič­nim nuk­lear­nim pro­tei­ni­ ma.

Ut­je­caj Ot­kri­će da su snR­NA kom­po­nen­te snR­NP ot­vo­ri­lo je no­vi pris­tup u is­tra­ ži­va­nju fun­kci­je snR­NA. Ler­ner i Stei­tz

za­mi­je­ti­li su da bi na­jin­tri­gan­tni­ja mo­ gu­ća ulo­ga snR­NA bi­la u prek­ra­ja­nju pre-mR­NA te su nag­la­si­li da su slje­do­ vi u bli­zi­ni 5' kra­ja U1 snR­NA kom­ple­ men­tar­ni mjes­tu prek­ra­ja­nja. Stei­tz i nje­zi­ni su­rad­ni­ci iš­li su da­lje s ni­zom po­ku­sa ko­ji­ma su po­ka­za­li ka­ ko su snR­NP kri­tič­ni fak­to­ri u prek­ra­ ja­nju. Ta su is­tra­ži­va­nja obuh­va­ti­la i da­le­ko­sež­ni­ju ana­li­zu sli­je­da od one ko­ja je upo­zo­ri­la na kom­ple­men­tar­ nost 5' kon­zer­vi­ra­nih slje­do­va U1 snR­ NA s usug­la­še­nim slje­do­vi­ma na mjes­ ti­ma prek­ra­ja­nja, su­ge­ri­ra­ju­ći da U1

ti­da, na­la­ze se u kom­plek­su sa še­st do de­set pro­tein­skih mo­le­ku­la tvo­re­ći ma­le nuk­lear­ne ri­bo­nuk­leop­ro­tein­ske čes­ti­ce (snR­NP) ko­je ig­ra­ju sre­ diš­nju ulo­gu u pro­ce­su prek­ra­ja­nja. U1, U2 i U5 snR­NP sva­ka sad­rž­ a­va jed­nu mo­le­ku­lu snR­NA, dok su U4 i U6 snR­NA me­đu­sob­no zdru­že­ne u jed­nu snR­NP. Pr­vi je ko­rak u zdru­ži­va­nju tje­leš­ca za prek­ra­ja­nje ve­za­nje U1 snR­NP na 5' mjes­to za prek­ra­ja­nje pre-mR­NA (sl. 7-49). Pre­poz­na­va­nje 5' mjes­ta za prek­ra­ja­nje obuh­va­ća spa­ri­va­nje ba­za iz­me­đu 5' usug­la­še­nog sli­je­da za prek­ra­ja­nje i kom­ple­men­tar­nog sli­je­da na 5’ kra­ju U1 snR­NA (sl. 7-50). Po­tom se U2 snR­NP ve­že na toč­ku gra­na­nja slič­nim kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem iz­me­đu U2 snR­NA i sli­je­da toč­ke gra­na­nja. Već nas­ta­li kom­ ple­ks sas­tav­ljen od U4/U6 i U5 snR­NP ug­ra­đu­je se u tje­leš­ce za prek­ra­ja­ nje, ve­za­njem U5 na sli­jed uz­vod­no od 5' mjes­ta za prek­ra­ja­nje. Reak­ci­ja prek­ra­ja­nja po­ve­za­na je s pres­la­gi­va­njem snR­NA. U1 i U4 snR­NP di­so­ci­ ra­ju iz kom­plek­sa te U6 zam­je­nju­je U1 na 5' mjes­tu za prek­ra­ja­nje. U6 po­tom stva­ra kom­ple­ks s U2 što prib­li­ža­va toč­ku gra­na­nja i 5' mjes­to pre­ kra­ja­nja za pr­vi ko­rak u reak­ci­ji prek­ra­ja­nja (nas­ta­nak in­ter­me­di­ja­ra struk­ tur­no slič­no­ga la­su, v. sl. 7-48). U5 se na­kon to­ga ve­že na slje­do­ve na 3' mjes­tu za prek­ra­ja­nje od­r­ža­va­ju­ći ori­jen­ta­ci­ju iz­me­đu 5' i 3' eg­zo­na ta­ko da se mo­gu spo­ji­ti na­kon iz­re­zi­va­nja in­tro­na. snR­NA ne sa­mo da pre­poz­na­ju usug­la­še­ne slje­do­ve na toč­ki gra­na­nja i mjes­ti­ma prek­ra­ja­nja, one ta­ko­đer iz­rav­no ka­ta­li­zi­ra­ju reak­ci­ju prek­ra­ja­nja. Ka­ta­li­tič­ka ulo­ga RNA u pro­ce­su prek­ra­ja­nja po­ka­za­na je ot­kri­ćem ne­kih RNA spo­sob­nih za sa­mop­rek­ra­ja­nje; one mo­gu ka­ta­li­zi­ra­ti uk­la­nja­nje vlas­ti­tih in­tro­na u od­sut­nos­ti dru­gih pro­tei­na ili RNA fak­to­ra. Sa­mop­re­ kra­ja­nje pr­vi put je opi­sao Tom Ce­ch i su­rad­ni­ci prou­ča­va­ju­ći 28S rR­NA u pra­ži­vo­ti­nji Tet­ra­hyme­na. Ta RNA sad­r­ža­va in­tron ve­li­či­ne oko 400 ba­za ko­ji se pre­ciz­no uk­la­nja na­kon in­ku­ba­ci­je pre-r­R­NA u od­sut­nos­ti do­da­nih pro­tei­na. Dalj­nja su is­tra­ži­va­nja ob­je­lo­da­ni­la da je prek­ra­ja­nje ka­ta­li­zi­ra­no in­tro­nom, ko­ji dje­lu­je kao ri­bo­zim up­rav­lja­ju­ći iz­re­zi­va­njem sa­mo­ga se­be iz pre-r­R­NA. Ot­kri­će sa­mop­rek­ra­ja­ju­ćih rR­NA pra­ži­vo­ti­nje Tet­ra­hyme­na za­ jed­no s is­pi­ti­va­njem RNa­ze P, o če­mu je bi­lo ri­je­či, pr­vi je put po­ka­za­lo ka­ta­li­tič­ku ak­tiv­no­st RNA.

ima ulo­gu u pre­poz­na­va­nju 5' mjes­ta za pre­kra­ja­nje. Osim to­ga, an­ti­se­ru­mi nas­pram snR­NP upot­ri­jeb­lje­ni su za po­ka­zi­va­nje da je U1 pot­reb­na za premR­NA pre­kra­ja­nje ka­ko u izo­li­ra­nim jez­gra­ma ta­ko i u in vit­ro ek­strak­ti­ma. Dalj­nja su is­tra­ži­va­nja uka­za­la na važ­ no­st snR­NA, ne sa­mo u iden­ti­fi­ci­ra­nju mjes­ta za prek­ra­ja­nje, ne­go i kao ka­ ta­li­za­to­ra reak­ci­je prek­ra­ja­nja. Ot­kri­će da su snR­NA čim­be­ni­ci snR­NP, te da ih mo­gu pre­poz­na­ti spe­ci­fič­ni an­ti­se­ru­mi, omo­gu­ći­lo je ra­zu­mi­je­va­nje me­ha­niz­ ma prek­ra­ja­nja pre-mR­NA.

296    POGLAVLJE 7 Sli­ka 7-49. Nas­ta­nak tje­leš­ca za pre­ kra­ja­nje.  Pr­vi je ko­rak u nas­tan­ku tje­ leš­ca za prek­ra­ja­nje ve­za­nje U1 snR­NP na 5' mjesto za prek­ra­ja­nje (SS), na­kon če­ga sli­je­di ve­za­nje U2 snR­NP na toč­ku gra­na­nja. Pret­hod­no nas­ta­li kom­ple­k s sas­tav­ljen od U4/U6 i U5 snR­NP ula­zi u tje­leš­ce za prek­ra­ja­nje. U5 se ve­že na slje­do­ve uz­vod­no od 5' mjesta za pre­ kra­ja­nje, a U6 di­so­ci­ra od U4 i po­mi­če U1. U4 i U1 di­so­ci­ra­ju s tje­leš­ca za pre­ kra­ja­nje, a U6 stva­ra kom­ple­k s s U2 vo­ de­ći ka nas­tan­ku po­lup­roiz­vo­da u ob­li­ ku la­sa. U5 se po­tom ve­že na 3' mjesto za prek­ra­ja­nje od­r­ža­va­ju­ći zdru­že­nje 5' i 3' eg­zo­na ta­ko da se oni mo­gu po­ve­za­ti na­kon iz­re­zi­va­nja in­tro­na.

SINTEZA I DORADBA DNA 

Sli­ka 7-50. Ve­za­nje U1 snR­NA na 5' mjesto za prek­ra­ja­nje.  5' kraj U1 snR­NA ve­že se na usug­la­še­ne slje­do­ve na 5' mjestu za prek­ra­ja­nje kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem.

Dalj­njim is­pi­ti­va­nji­ma ot­kri­ve­ne su sa­mop­rek­ra­ja­ju­će RNA u mi­to­hon­ dri­ji­ma, klo­rop­las­ti­ma i bak­te­ri­ja­ma. Sa­mop­rek­ra­ja­ju­će RNA svr­sta­ne su u dvi­je sku­pi­ne na os­no­vi reak­cij­skog me­ha­niz­ma sa­mop­rek­ra­ja­nja (sl. 7-51). Pr­vi ko­rak u prek­ra­ja­nju sku­pi­ne I in­tro­na (prim­je­ri­ce, Tet­ra­hyme­na prer­R­NA) ki­da­nje je na 5' mjes­tu za prek­ra­ja­nje pos­re­do­va­no gva­no­zin­skim ko­fak­to­rom. 3' kraj slo­bod­nog eg­zo­na po­tom rea­gi­ra s 3' mjes­tom za pre­ kra­ja­nje da bi se iz­re­zao in­tron kao li­near­na RNA. Na­sup­rot to­me, sa­mo­ prek­ra­ja­ju­će reak­ci­je sku­pi­ne II in­tro­na (prim­je­ri­ce, ne­ke mi­to­hon­drij­ske pre-mR­NA) ja­ko na­li­ku­ju nuk­lear­nom prek­ra­ja­nju mR­NA kod če­ga do ki­ da­nja 5' mjes­ta za prek­ra­ja­nje do­la­zi zbog na­pa­da ade­no­zin­skog nuk­leo­ti­da u in­tro­nu. Kao i kod pre-mR­NA prek­ra­ja­nja nas­ta­je po­lup­roiz­vod sli­čan la­su ko­ji se iz­re­zu­je. Slič­no­st iz­me­đu prek­ra­ja­nja pre-mR­NA pos­re­do­va­nog tje­leš­ci­ma za pre­kra­ja­nje i sa­mop­rek­ra­ja­nja sku­pi­ne II in­tro­na su­ge­ri­ra da su ak­tiv­ne ka­ ta­li­tič­ke kom­po­nen­te tje­leš­ca za prek­ra­ja­nje pri­je RNA ne­go pro­tei­ni. Pre­ ciz­no, slič­nos­ti po­ka­zu­ju da je prek­ra­ja­nje pre-mR­NA ka­ta­li­zi­ra­no snR­NA u tje­leš­cu za prek­ra­ja­nje. Nas­ta­vak is­tra­ži­va­nja prek­ra­ja­nja pre-mR­NA pot­ kri­je­pi­o je taj stav ti­me što je po­ka­za­no da U2 i U6 snR­NA u od­sut­nos­ti pro­tei­na mo­gu ka­ta­li­zi­ra­ti pr­vi ko­rak u prek­ra­ja­nju pre-mR­NA. Smat­ra se da pro­ces prek­ra­ja­nja pre-mR­NA je­st reak­ci­ja ute­me­lje­na na RNA; snR­NA u tje­leš­cu za prek­ra­ja­nje dje­lu­je ana­log­no sku­pi­ni II sa­mop­rek­ra­ja­ju­ćih in­ tro­na. Unu­tar sta­ni­ce, pro­tein­ske kom­po­nen­te snR­NP ta­ko­đer su pot­reb­ne i par­ti­ci­pi­ra­ju, ka­ko u zdru­ži­va­nju tje­leš­ca za prek­ra­ja­nje, ta­ko i u sa­moj reak­ci­ji prek­ra­ja­nja.

   297

298    POGLAVLJE 7

Sli­ka 7-51. Sa­mop­rek­ra­ja­ju­ći in­tro­ ni.  Sku­pi­na I i sku­pi­na II sa­mop­rek­ra­ja­ ju­ćih in­tro­na raz­li­ku­je se po reak­cij­skim me­ha­niz­mi­ma prek­ra­ja­nja. U sku­pi­ni I in­ tro­na, pr­vi ko­rak u prek­ra­ja­nju je­st ki­da­ nje 5' mjesta za prek­ra­ja­nje reak­ci­jom s gva­no­zin­skim ko­fak­to­rom. Ta­ko nas­ta­je li­near­ni po­lup­roiz­vod s G do­da­nim na 5' kraj in­tro­na. U sku­pi­ni II in­tro­na (kao kod pre-mR­NA prek­ra­ja­nja) pr­vi je ko­rak ki­ da­nje 5' mjesta za prek­ra­ja­nje reak­ci­jom s A unu­tar in­tro­na, stva­ra­ju­ći po­lup­roiz­ vod u ob­li­ku la­sa. U oba slu­ča­ja, dru­gi je ko­rak si­mul­ta­no ki­da­nje 3' mjesta za prek­ra­ja­nje i spa­ja­nje eg­zo­na.

Broj­ni pro­tein­ski fak­to­ri prek­ra­ja­nja, ko­ji ni­su snR­NP, ta­ko­đer ig­ra­ju važ­nu ulo­gu u zdru­ži­va­nju tje­le­ša­ca za prek­ra­ja­nje, po­se­bi­ce u iden­ti­fi­ka­ci­ji ko­rek­tnog mjes­ta za prek­ra­ja­nje u pre-mR­NA. Pre-mRNA si­sa­va­ca uo­bi­ča­ je­no sad­r­ža­va krat­ke eg­zo­ne (pros­ječ­no oko 150 nuk­leo­ti­da u lju­di) raz­dvo­ je­ne mno­go ve­ćim in­tro­ni­ma (pros­ječ­no 3.500 nuk­leo­ti­da). In­tro­ni čes­to sad­r­ža­va­ju vi­še slje­do­va ko­ji od­go­va­ra­ju mjes­tu prek­ra­ja­nja, ta­ko da sus­tav za prek­ra­ja­nje mo­ra bi­ti spo­so­ban iden­ti­fi­ci­ra­ti od­go­va­ra­ju­ća 5’ i 3’ prek­ra­ ja­ju­ća mjes­ta u gra­nič­nom pod­ruč­ju in­tro­na/egzona da bi nas­ta­le fun­kcio­ nal­ne mR­NA. Prek­ra­ja­ju­ći fak­to­ri slu­že za us­mje­ra­va­nje tje­leš­ca za prek­ra­ ja­nje na ko­rek­tno mjes­to prek­ra­ja­nja ve­za­njem na spe­ci­fič­ne RNA slje­do­ve unu­tar eg­zo­na, prid­ru­žu­ju­ći po­tom U1 i U2 snR­NP na od­go­va­ra­ju­ća mjes­ ta na pre-mR­NA in­te­rak­ci­ja­ma pro­tei­n-pro­tein. Prim­je­ri­ce, SR‑fak­to­ri pre­ k­ra­ja­nja ve­žu spe­ci­fič­ne slje­do­ve unu­tar eg­zo­na i dje­lu­ju ta­ko da priv­la­če U1 snR­NP do 5’ mjes­ta prek­ra­ja­nja (sl. 7-52). SR-pro­tei­ni stu­pa­ju ta­ko­đer u in­te­rak­ci­ju s dru­gim fak­to­ri­ma prek­ra­ja­nja (U2AF) ko­ji se ve­žu na slje­do­ve bo­ga­te pi­ri­mi­di­ni­ma priv­la­če­ći kom­po­nen­te tje­leš­ca za prek­ra­ja­nje na mRNA. Fak­to­ri prek­ra­ja­nja po­ve­zu­ju prek­ra­ja­nje s tran­skrip­ci­jom zdru­ži­va­ njem s fos­fo­ri­li­ra­nom CTD RNA-po­li­me­ra­ze II. Sid­re­nje sus­ta­va za prek­ra­ ja­nje na RNA-po­li­me­ra­zu smat­ra se važ­nim za osi­gu­ra­va­nje da se eg­zo­ni po­ve­zu­ju u is­prav­nom po­ret­ku u skla­du sa sin­te­zom pre-mR­NA.

Al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje

▶▶ Proc­je­nju­je se da je oko 15%

nas­lije­đe­nih bo­les­ti uz­ro­ko­va­no neis­prav­nim prek­ra­ja­njem. U na­ve­de­ne bo­les­ti spa­da­ju bo­ les­ti po­put β-ta­la­se­mi­ja i ne­kih vr­sta ra­ka.

Sre­diš­nja ulo­ga prek­ra­ja­nja u pro­ce­su do­ra­dbe pre-mR­NA ot­va­ra mo­ guć­nos­ti re­gu­la­ci­je gen­ske ek­spre­si­je kon­tro­lom sus­ta­va za prek­ra­ja­nje. Bu­ du­ći da ve­ći­na pre-mR­NA sad­r­ža­va broj­ne in­tro­ne, raz­li­či­te mR­NA mo­gu nas­ta­ti iz is­to­ga ge­na raz­li­či­tim kom­bi­na­ci­ja­ma 5' i 3' mjes­ta za prek­ra­ja­nje. Mo­guć­no­st da se eg­zo­ni spo­je me­đu­sob­no u raz­nim kom­bi­na­ci­ja­ma ba­ca no­vo svjet­lo na kon­tro­lu gen­ske ek­spre­si­je jer se broj­ne mR­NA (i sto­ga broj­ni pro­tei­ni) mo­gu ge­ne­ri­ra­ti iz is­te pre-mR­NA. Taj pro­ces, naz­van al­ ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje, do­ga­đa se čes­to u ge­ni­ma slo­že­nih eu­ka­rio­ta. Prim­je­ri­ce, pro­ci­je­nje­no je da vi­še od 50% ljud­skih ge­na stva­ra­ju tran­skrip­ te ko­ji se al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­ju i ta­ko po­ve­ća­va­ju raz­li­či­to­st pro­tei­na ko­

SINTEZA I DORADBA DNA 

   299

Sli­ka 7-52. Ulo­ga fak­to­ra za prek­ra­ ja­nje u zdru­ži­va­nju tje­leš­ca za prek­ ra­ja­nje.  SR-fak­to­ri za prek­ra­ja­nje ve­žu se na spe­ci­f ič­ne slje­do­ve unu­tar eg­zo­ na. SR-pro­tei­ni prid­ru­žu­ju U1 snR­NP na 5' mjesto za prek­ra­ja­nje, a do­dat­ni fak­ tor za prek­ra­ja­nje (U2AF) na 3' mjesto za prek­ra­ja­nje. U2AF po­tom prid­ru­žu­je U2 snR­NP na toč­ku gra­na­nja.

di­ra­nih s oko 20.000 do 25.000 ge­na u ge­no­mu si­sa­va­ca. Zah­va­lju­ju­ći to­me što je ob­ra­zac al­ter­na­tiv­nog prek­ra­ja­nja raz­li­čit u raz­li­či­tim tki­vi­ma kao i prom­je­njiv u skla­du s od­go­vo­rom na iz­van­sta­nič­ne sig­na­le, al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje osi­gu­ra­va va­žan me­ha­ni­zam za tkiv­nospe­ci­fič­nu i raz­voj­no re­ gu­li­ra­nu gen­sku ek­spre­si­ju. Dob­ro is­tra­žen prim­jer al­ter­na­tiv­no­ga, tkiv­no spe­ci­fič­nog, prek­ra­ja­nja pred­stav­lja od­re­đi­va­nje spo­la u vinske mu­ši­ce (Drosophila), gdje al­ter­na­tiv­ no prek­ra­ja­nje is­te pre-mR­NA od­re­đu­je je li mu­ši­ca žen­ka ili muž­jak (sl. 7-53). Al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje pre-mR­NA ge­na naz­va­nog tran­sfor­mi­ra­ ju­ći gen (en­gl. tran­sfor­mer) kon­tro­li­ra­no je pro­tei­nom (SXL) ko­ji je ek­spri­ mi­ran sa­mo u žen­ka­ma. Tran­sfor­mi­ra­ju­ća pre-mR­NA ima tri eg­zo­na, ali je raz­li­či­ti dru­gi eg­zon ug­ra­đen u pre-mR­NA kao re­zul­tat upot­re­be al­ter­na­tiv­ nog 3' mjes­ta za prek­ra­ja­nje u dva raz­li­či­ta spo­la. U muž­ja­ka eg­zon 1 spa­ja se uz­vod­no od 3' mjes­ta, odab­ra­nog ve­za­njem U2AF fak­to­ra prek­ra­ja­nja. U žen­ka­ma se SXL pro­tein ve­že na to 3' mjes­to prek­ra­ja­nja spr­je­ča­va­ju­ći ve­za­ nje U2AF. Dos­ljed­no to­me, uz­vod­no 3' mjes­to prek­ra­ja­nja pres­ko­če­no je u žen­ka­ma, a eg­zon 1 se um­jes­to to­ga spa­ja na al­ter­na­tiv­no mje­s­to prek­ra­ja­ nja da­lje niz­vod­no. Slje­do­vi u eg­zo­nu 2 u muž­ja­ka sad­r­ža­va­ju ko­don za ter­mi­na­ci­ju tran­sla­ci­je, ta­ko da ne nas­ta­je pro­tein. Ter­mi­na­cij­ski ko­don ne na­la­zi se u mR­NA žen­ki, ta­ko da žen­ke ek­spri­mi­ra­ju fun­kcio­nal­ni tran­sfor­ mi­ra­ju­ći pro­tein, ko­ji dje­lu­je kao ključ­ni re­gu­la­tor spol­nog od­re­đi­va­nja. Al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje tran­sfor­mi­ra­ju­će­ga ge­na ilus­tri­ra dje­lo­va­nje rep­re­so­ra (SXL pro­tein) ko­ji dje­lu­je spr­je­ča­va­ju­ći ve­za­nje fak­to­ra prek­ra­ja­ nja (U2A­F) i ve­li­ke sku­pi­ne pro­tei­na ko­ja slič­no re­gu­li­ra al­ter­na­tiv­no pre­ kra­ja­nje ve­za­njem na uti­ša­va­ju­ći sli­jed u pre-mR­NA. U dru­gim slu­ča­je­ vima, al­ter­na­tiv­no se prek­ra­ja­nje kon­tro­li­ra ak­ti­va­to­ri­ma. Ak­ti­va­to­ri pri­d­ru­žu­ju fak­to­re prek­ra­ja­nja mjes­tu prek­ra­ja­nja, ko­je na dru­gi na­čin ne

▶▶ Uho si­sa­va­ca ima sta­ni­ce s dla­či­cama ko­je su ta­ko ugo­đe­ne da od­go­va­ra­ju na zvu­ko­ve raz­ li­či­tih frek­ven­ci­ja. Ugo­đa­va­nje sta­ni­ca s dla­či­cama dje­lo­mič­no je pos­re­do­va­no al­ter­na­tiv­nim pre­k­ra­­ja­njem ge­na ko­ji ko­di­ra je­dan ka­nal­ni pro­tein.

Sli­ka 7-53. Al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje u od­re­đi­va­nju spo­la u voć­ne mu­ši­ ce.  Al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje tran­sfor­ mi­ra­ju­će (en­gl. tran­sfor­mer, tra) mR­NA re­gu­li­ra­no je SXL pro­tei­nom, ek­spri­mi­ra­ nim sa­mo u žen­skim mu­ši­ca­ma. U muš­ kih mu­ši­ca pr­vi eg­zon tra mR­NA spa­ja se na 3' mjesto za prek­ra­ja­nje tvo­re­ći dru­gi eg­zon ko­ji sad­r­ža­va ko­don za ter­ mi­na­ci­ju tran­sla­ci­je (UAG), ta­ko da tra pro­tein ne nas­ta­je. U žen­ka­ma ve­za­nje SXL pro­tei­na spr­je­ča­va ve­za­nje U2AF na 3' mjesto za prek­ra­ja­nje, što do­vo­di do upo­ra­be al­ter­na­tiv­nog mjes­ta da­lje niz­ vod­no u eg­zo­nu 2. To je al­ter­na­tiv­no 3' mjesto za prek­ra­ja­nje niz­vod­no od ter­ mi­na­cij­sko­ga ko­do­na ta­ko da mR­NA ek­ spri­mi­ra­na u žen­ka­ma up­rav­lja sin­te­zom fun­kcio­nal­no­ga tra pro­tei­na.

300    POGLAVLJE 7

Sli­ka 7-54. Al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje Dscam.  Dscam gen sad­r­ži če­ti­ri sku­pi­ ne al­ter­na­tiv­nih eg­zo­na: 12 za eg­zon 4, 48 za eg­zon 6, 33 za eg­zon 9 i 2 za eg­ zon 17. Sva­ki po­je­di­nač­ni eg­zon iz sva­ke sku­pi­ne mo­že bi­ti ug­ra­đen u zre­lu mRNA ta­ko da al­ter­na­tiv­nim prek­ra­ja­njem mo­ že nas­ta­ti ukup­no 38.016 raz­li­či­tih mR­NA (12 × 48 × 33 × 2 = 38.016).

bi bi­lo pre­poz­na­to. Dob­ro is­tra­že­ni ak­ti­va­to­ri prek­ra­ja­nja čla­no­vi su obi­te­ lji SR pro­tei­na (v. sl. 7-52) ko­ji se ve­žu na spe­ci­fič­ne po­ja­či­vač­ke slje­do­ve. Broj­ni me­ha­niz­mi mo­gu ta­ko re­gu­li­ra­ti al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje, a va­ri­ ja­ci­je u al­ter­na­tiv­nom prek­ra­ja­nju naj­vi­še pri­do­no­se raz­no­li­kos­ti pro­tei­na ek­spri­mi­ra­nih ti­je­kom raz­vo­ja i di­fe­ren­ci­ja­ci­je. Je­dan ta­kav upe­čat­ljiv prim­ jer al­ter­na­tiv­nog prek­ra­ja­nja je sta­nič­ni pov­r­šin­ski pro­tein u voć­ne mu­ši­ce (naz­van Dscam) uk­lju­čen u od­go­va­ra­ju­će po­vez­ni­ce iz­me­đu neu­ro­na. Dsca­m gen sad­rž­ i 4 sku­pi­ne al­ter­na­tiv­nih eg­zo­na od ko­jih sa­mo je­dan eg­ zon bi­va ug­ra­đen u mR­NA ko­ja se prek­ra­ja (sl. 7-54). Eg­zo­ni se po­ve­zu­ju u bi­lo ko­joj kom­bi­na­ci­ji, ta­ko da al­ter­na­tiv­nim prek­ra­ja­njem mo­že nas­ta­ti 38.016 raz­li­či­tih mR­NA i pro­tei­na od jed­nog je­di­nog ge­na, što pred­stav­lja vi­še od dvos­tru­kog bro­ja ukup­nog bro­ja ge­na u ge­no­mu voć­ne mu­ši­ce. Naj­no­vi­ja is­tra­ži­va­nja uka­zu­ju na to da al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­ni ob­li­ci Dsca­m priskr­blju­ju sva­kom neu­ro­nu iden­ti­fi­ka­cij­ski kod ko­ji je bi­tan za us­pos­ta­vu po­vez­ni­ca iz­me­đu neu­ro­na, a one su pot­reb­ne za raz­voj moz­ga mu­ši­ce.

Ure­đi­va­nje RNA

Ure­đi­va­nje RNA od­no­si se na do­ga­đa­je u pro­ce­su do­ra­dbe RNA (ko­ji ni­su prek­ra­ja­nje) što mi­je­nja­ju ko­di­ra­ju­će slje­do­ve ne­kih mR­NA. Taj neo­ če­ki­va­ni ob­lik pro­ce­sa do­ra­dbe RNA ot­kri­ven je u mi­to­hon­drij­skim mRNA pra­ži­vo­ti­nje ro­da Trypa­no­so­ma, gdje se U os­tat­ci do­da­ju i bri­šu na vi­še mjes­ta u mo­le­ku­li pre-mR­NA s ci­ljem nas­tan­ka mR­NA. Mno­go kas­ni­je opi­sa­no je ure­đi­va­nje mi­to­hon­drij­skih mR­NA dru­gih or­ga­ni­za­ma, mR­NA iz klo­rop­las­ta vi­ših bi­lja­ka te nuk­lear­nih mR­NA ne­kih ge­na si­sa­va­ca. Ure­đi­va­nje nuk­lear­nih mR­NA si­sa­va­ca, kao i mi­to­hon­drij­skih i klo­ro­ plas­tnih RNA vi­ših bi­lja­ka, obuh­va­ća prom­je­ne jed­ne ba­ze kao pos­lje­di­ce mo­di­fi­ka­cij­skih reak­ci­ja, slič­nih oni­ma dje­lat­nim u pro­ce­su do­ra­dbe tRNA. U sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca reak­ci­je ure­đi­va­nja RNA obuh­va­ća­ju dea­mi­ni­ra­nje ci­to­zi­na u uri­din i ade­no­zi­na u ino­zin. Je­dan od naj­bo­lje is­tra­že­nih prim­ je­ra je­st ure­đi­va­nje mR­NA za apo­li­pop­ro­tein B, li­pop­ro­tein ko­ji sud­je­lu­je u tran­spor­tu li­pi­da u kr­vi. U tom slu­ča­ju, ure­đi­va­nje RNA spe­ci­fič­no za od­re­đe­no tki­vo ima za pos­lje­di­cu dva ob­li­ka apo­li­pop­ro­tei­na B (sl. 7-55). U lju­di, Apo-B100 (4.536 ami­no­ki­se­li­na) sin­te­ti­zi­ra se u jet­rima tran­sla­ci­ jom neu­re­đe­ne mR­NA. Me­đu­tim, kra­ći pro­tein (Apo-B48, 2.152 ami­no­ki­ se­li­ne) nas­ta­je sin­te­zom u cri­je­vi­ma kao re­zul­tat tran­sla­ci­je ure­đe­ne mRNA u ko­joj je C pro­mi­je­njen u U dea­mi­ni­ra­njem. Te al­ter­na­tiv­ne prom­je­ne ko­do­na za glu­ta­min (CAA) u neu­re­đe­noj mR­NA u ko­don za ter­mi­na­ci­ju tran­sla­ci­je (UAA) u ure­đe­noj mR­NA ima­ju za pos­lje­di­cu sin­te­zu kra­ćeg Apo-B pro­tei­na. Ek­spre­si­ja struk­tur­no i fun­kcio­nal­no raz­li­či­tih pro­tei­na u jet­rima i cri­je­vi­ma proiz­la­zi iz tkiv­no spe­ci­fič­nog ure­đi­va­nja Apo-B mR­ NA. Pro­tein pu­ne du­lji­ne, Apo-B100 nas­tao u jet­rima, tran­spor­ti­ra li­pi­de u cir­ku­la­ci­ji; Apo-B48 ak­ti­van je u ap­sor­pci­ji li­pi­da iz hra­ne u cri­je­vu. Ure­đi­va­nje RNA dea­mi­ni­ra­njem ade­no­zi­na u ino­zin na­juo­bi­ča­je­ni­ji je ob­lik ure­đi­va­nja nuk­lear­ne RNA u si­sa­va­ca. Taj ob­lik ure­đi­va­nja ig­ra važ­

SINTEZA I DORADBA DNA 

Sli­ka 7-55. Ure­đi­va­nje mR­NA za apo­li­pop­ro­tein B.  U ljud­skim se jet­rima, neu­re­ đe­na mR­NA pre­vo­di da­ju­ći pro­tein od 4.536 aminokiselinskih os­ta­ta­ka naz­van ApoB100. Me­đu­tim, u ljud­skim cri­je­vi­ma mR­NA se ure­đu­je mo­di­f i­ci­ra­njem ba­za što mi­je­ nja spe­ci­f ič­ni C u U. Ta mo­di­f i­ka­ci­ja mi­je­nja ko­don za glu­ta­min (CAA) u ter­mi­na­cij­ski ko­don (UAA), što ima za pos­lje­di­cu sin­te­zu kra­će­ga pro­tei­na (Apo-B48, sas­to­ji se iz 2.152 ami­no­ki­se­li­ne).

nu ulo­gu u živ­ča­nom sus­ta­vu, gdje ure­đi­va­nje A u I ima za pos­lje­di­cu iz­ mje­ne jed­ne ami­no­ki­se­li­ne u ion­skim ka­na­li­ma i re­cep­to­ri­ma na pov­r­ši­ni neu­ro­na. Prim­je­ri­ce, mRNA ko­je ko­di­ra­ju re­cep­to­re za neu­rot­ran­smi­ter se­ro­to­nin mo­že se ure­di­ti na pet mjes­ta či­me mogu nas­ta­ti 24 raz­li­či­ta ob­ li­ka re­cep­to­ra za raz­li­či­te sig­nal­ne ak­tiv­nos­ti. Važ­no­st ure­đi­va­nja A u I u živ­ča­nom sus­ta­vu pot­kri­jep­lje­na je na­la­zom da C. ele­ga­ns, voć­na mu­ši­ca i miš­ji mu­tan­ti ko­ji­ma ne­dos­ta­ju en­zi­mi za ure­đi­va­nje pa­te od raz­li­či­tih neu­ro­loš­kih ne­dos­ta­ta­ka.

Raz­grad­nja RNA Iz ko­ra­ka u pro­ce­su do­ra­dbe pri­ka­za­nih u pret­hod­nom od­jelj­ku, proiz­ la­ze zre­le mR­NA ko­je se pre­no­se u ci­top­laz­mu da bi up­rav­lja­le sin­te­zom pro­tei­na. No ve­ći­na se slje­do­va pre­pi­sa­nih u mR­NA raz­gra­đu­je u jez­gri. Vi­še od 90% pre-mR­NA pred­stav­lja­ju in­tron­ski slje­do­vi ko­ji se raz­gra­đu­ju u jez­gri, na­kon iz­re­zi­va­nja u pro­ce­su prek­ra­ja­nja. Raz­grad­nju pro­vo­di en­ zim ko­ji pre­poz­na­je je­din­stve­nu 2'-5' ve­zu ko­ja nas­ta­je u toč­ki gra­na­nja, kao i en­zim ko­ji pre­poz­na­je ili 5' ili 3' kra­je­ve mo­le­ku­la RNA i ka­ta­li­zi­ra deg­ra­da­ci­ju RNA u oba smje­ra. 5' i 3' kra­je­vi mR­NA zaš­ti­će­ni su od dje­lo­ va­nja deg­ra­da­cij­skog sus­ta­va 5' ka­pom i po­li-A re­pom, dok ne­zaš­ti­će­ni kra­je­vi in­tro­na bi­va­ju pre­poz­na­ni i raz­gra­đe­ni. Osim za raz­grad­nju in­tro­na, sta­ni­ce ima­ju i sus­tav za kon­tro­lu kva­li­te­te ko­ji de­tek­ti­ra i raz­gra­đu­je nep­ri­rod­ne mR­NA nas­ta­le kao re­zul­tat pog­rješ­ ke ti­je­kom tran­skrip­ci­je. Naj­bo­lje je opi­san me­ha­ni­zam kon­tro­le kva­li­te­te na­z­van raz­grad­nja nes­mis­le­ne mR­NA (engl. non­sen­se-me­dia­ted mR­NA de­cay) ko­ji vo­di u raz­grad­nju mR­NA bez cje­lo­vi­tog ok­vi­ra či­ta­nja. To eli­ mi­ni­ra de­fek­tne mR­NA mo­le­ku­le i spr­je­ča­va sin­te­zu ne­nor­mal­no skra­će­ nih pro­tei­na. Tak­va se raz­grad­nja pok­re­će u tre­nut­ku kad ri­bo­so­mi nai­đu na pre­ra­ni ter­mi­na­cij­ski ko­don što iza­zi­va zaus­tav­lja­nje tran­sla­ci­je te raz­ grad­nju ne­fun­kcio­nal­ne mR­NA. Kraj­nji as­pe­kt pro­ce­sa do­ra­dbe RNA mo­le­ku­le je­st nje­zi­na even­tual­na deg­ra­da­ci­ja u ci­top­laz­mi. S ob­zi­rom na to da je unu­tar­sta­nič­na ra­zi­na bi­lo ko­je RNA od­re­đe­na rav­no­te­žom iz­me­đu sin­te­ze i raz­grad­nje, br­zi­na ko­jom se in­di­vi­dual­ne RNA raz­gra­đu­ju je­st dru­ga ra­zi­na na ko­joj se mo­že kon­

   301

302    POGLAVLJE 7

Sli­ka 7-56. Raz­grad­nja mR­NA.  Raz­grad­nja mR­NA uo­bi­ča­je­no bi­va po­tak­nu­ta skra­ ći­va­njem po­li-A re­pa (dea­de­ni­la­ci­jom). Na­kon to­ga sli­je­di ili uk­la­nja­nje 5' ka­pe i raz­ grad­nja od 5' kra­ja (deg­ra­da­ci­ja u smje­ru 5' pre­ma 3') ili raz­grad­nja od 3' kra­ja (raz­ grad­nja u smje­ru 3' pre­ma 5').

tro­li­ra­ti ek­spre­si­ja ge­na. Ri­bo­som­ska i tran­spor­tna RNA su sta­bil­ne, a ta sta­bil­no­st uve­li­ke ob­jaš­nja­va vi­so­ku ra­zi­nu tih RNA (vi­še od 90% svih RNA) i u pro­ka­riot­skim i u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Sup­rot­no to­me, bak­ te­rij­ske se mR­NA br­zo raz­gra­đu­ju i obič­no ima­ju po­lu­vi­jek od 2 do 3 mi­ nu­te. Taj br­zi pro­met bak­te­rij­skih mR­NA omo­gu­ću­je sta­ni­ci da br­zo od­go­ vo­ri na prom­je­ne u oko­li­šu, kao što su prim­je­ri­ce prom­je­ne u hra­nji­vim tva­ri­ma pot­reb­ni­ma za ra­st. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, me­đu­tim, raz­li­či­te mR­NA raz­gra­đu­ju se raz­li­či­tim br­zi­na­ma, što pred­stav­lja do­dat­ni čim­be­nik u re­gu­la­ci­ji ek­spre­ si­je ge­na u eu­ka­rio­ti­ma. Po­lu­ži­vot mR­NA u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca iz­no­si od naj­ma­nje 30 mi­nu­ta do oko 20 sa­ti. Nes­ta­bil­ne mR­NA čes­to ko­di­ra­ju re­gu­ lacijske pro­tei­ne po­put tran­skrip­cij­skih fak­to­ra či­je se ra­zi­ne mi­je­nja­ju u sta­ni­ci u skla­du s oko­liš­nim sig­na­li­ma. Na­sup­rot to­me, mR­NA ko­je ko­di­ ra­ju struk­tur­ne pro­tei­ne ili sre­diš­nje me­ta­bo­lič­ke en­zi­me, ima­ju op­će­ni­to dug po­lu­ži­vot. Ci­top­laz­mat­ska raz­grad­nja ve­ći­ne eu­ka­riot­skih mR­NA za­po­či­nje skra­ ći­va­njem nji­ho­vih po­li-A re­po­va (sl. 7-56). mR­NA ko­ji­ma je uk­lo­njen po­ li-A rep raz­gra­đu­ju se po­tom po­mo­ću nuk­lea­za ko­je dje­lu­ju od 3' kra­ja ili uk­la­nja­njem ka­pe na 5' kra­ju i raz­grad­njom RNA po­mo­ću nuk­lea­za ko­je dje­lu­ju od 5' kra­ja. Krat­ko­ži­vu­će mR­NA obič­no sad­rž­ e spe­ci­fič­ne AU-bo­ ga­te slje­do­ve u bli­zi­ni svo­jih 3' kra­je­va ko­ji slu­že kao vez­na mjes­ta za pro­ tei­ne ko­ji tak­ve mR­NA ili mo­gu sta­bi­li­zi­ra­ti ili upu­ti­ti u raz­grad­nju. Dje­lo­ va­nje tih pro­tei­na ko­ji se ve­žu na RNA re­gu­li­ra­no je iz­van­sta­nič­nim sig­na­li­ma po­put fa­kto­ra ras­ta i hor­mo­na što omo­gu­ću­je sta­ni­ci da kon­tro­ li­ra br­zi­nu raz­grad­nje spe­ci­fič­nih mR­NA u skla­du sa svo­jim oko­li­šem. Osim to­ga, raz­grad­nja ne­kih mR­NA je re­gu­li­ra­na po­mo­ću siR­NA (v. sl. 4-42) i mik­roR­NA ko­je ut­je­ču ka­ko na sta­bil­no­st mR­NA ta­ko i na nji­ho­vu tran­sla­ci­ju (raz­mat­ra se u 8. pog­lav­lju). Zak­ljuč­no, prem­da je tran­skrip­ci­ja pr­ven­stve­no re­gu­li­ra­na na ni­vou gen­ske ek­spre­si­je, raz­li­či­tos­ti u br­zi­ni raz­ grad­nje mR­NA ta­ko­đer pred­stav­lja­ju va­žan čim­be­nik u kon­tro­li ni­voa mR­ NA u sta­ni­ca­ma u us­ta­lje­nom sta­nju.

SINTEZA I DORADBA DNA 

SAŽETAK

   303

KLJUČNI POJMOVI

MREŽ­NA STRA­NI­CA IZ­DA­VA­ČA ORI­GI­NA­LA Pos­je­ti­te mrež­nu stra­ni­cu The Ce­ll www.sinauer.com/cooper5e gdje se na­la­ze ani­ma­ci­je, vi­deosnim­ke, kvi­zo­vi, prob­le­mi i dru­gi re­vi­jal­ni ma­te­ri­jal.

Tran­skrip­ci­ja u pro­ka­rio­ta RNA-po­li­me­ra­za i tran­skrip­ci­ja: RNA-po­li­me­ra­za E. co­li sas­to­ji se od α, β, β', ω i σ pod­je­di­ni­ca. Tran­skrip­ci­ja za­po­či­nje ve­za­njem na pro­mo­tor­ski sli­jed. Na­kon sin­te­ze pr­vih 10-tak nuk­leo­ti­da RNA, srž en­zi­ma di­so­ci­ra od σ i pu­tu­je duž ka­ lu­pa DNA ka­ko pro­du­lju­je no­vo­sin­te­ti­zi­ra­ni la­nac RNA. Tran­skrip­ci­ja se nas­ tav­lja dok ne nai­đe na ter­mi­na­cij­ski sig­nal.

RNA-po­li­me­ra­za, pro­mo­tor, oti­sak sto­pa­la

Pog­le­daj­te ani­ma­ci­ju 7.1 na mrež­noj stra­ni­ci Rep­re­so­ri i ne­ga­tiv­na kon­tro­la tran­skrip­ci­je: Pro­to­tip­ni je mo­del za gen­sku re­ gu­la­ci­ju u bak­te­ri­ja­ma lac ope­ron, re­gu­li­ran ve­za­njem rep­re­so­ra na spe­ci­fič­ni sli­jed na DNA unu­tar pro­mo­to­ra.

ope­ron, ope­ra­tor, rep­re­sor, ci­s-dje­lu­ ju­ći kon­trol­ni ele­men­ti, tra­ns-dje­lu­ ju­ći fak­to­ri

Po­zi­tiv­na kon­tro­la tran­skrip­ci­je: Ne­ki bak­te­rij­ski ge­ni re­gu­li­ra­ni su pri­je trans­ krip­cij­skim ak­ti­va­to­ri­ma ne­go rep­re­so­ri­ma.

EUKARIOTSKE RNA-POLIMERAZE I TRANSKRIPCIJSKI FAKTORI Eu­ka­riot­ske RNA-po­li­me­ra­ze: Eu­ka­riot­ske sta­ni­ce sad­r­ža­va­ju tri raz­li­či­te nu­ klear­ne RNA-po­li­me­ra­ze što pre­pi­su­ju ge­ne ko­ji ko­di­ra­ju mR­NA (po­li­me­ra­za II), rR­NA (po­li­me­ra­za I i III) te tR­NA (po­li­me­ra­za III). Op­ći tran­skrip­cij­ski fak­to­ri i za­po­či­nja­nje tran­skrip­ci­je RNA-po­li­me­ra­zom II: Eu­ka­riot­ske RNA-po­li­me­ra­ze ne ve­žu se iz­rav­no za pro­mo­tor­ske slje­do­ve; one tre­ba­ju do­dat­ne pro­tei­ne (op­će tran­skrip­cij­ske fak­to­re) za za­po­či­nja­nje trans­ krip­ci­je. Pro­mo­tor­ske slje­do­ve mno­gih ge­na koje pre­pi­su­je po­li­me­ra­za II pre­ poz­na­ju pro­tei­ni ko­ji se ve­žu na TA­TA-slog, oni prid­ru­žu­ju do­dat­ne tran­skrip­ cij­ske fak­to­re i RNA-po­li­me­ra­zu do pro­mo­to­ra.

tran­skrip­cij­ski fak­to­ri, op­ći tran­ skrip­cij­ski fak­to­ri, TA­TA-slog, TA­TA-ve­zu­ju­ći pro­tein (TBP), TBP-zdru­že­ni fak­tor (TAF), pos­red­nik

Tran­skrip­ci­ja RNA-po­li­me­ra­zom I i III: RNA-po­li­me­ra­ze I i III ta­ko­đer tre­ba­ju do­dat­ne tran­skrip­cij­ske fak­to­re da bi se ve­za­le na pro­mo­to­re ge­na ko­ji ko­di­ra­ju rR­NA, tR­NA i ne­ke snR­NA.

Re­gu­la­ci­ja tran­skrip­ci­je u eu­ka­rio­ta ci­s-dje­lu­ju­ći re­gu­lacijski slje­do­vi: pro­mo­to­ri i po­ja­či­va­či: Tran­skrip­ci­ja eu­ka­ riot­skih ge­na kon­tro­li­ra­na je pro­tei­ni­ma ko­ji se ve­žu na re­gu­la­cijske slje­do­ve uda­lje­ne do ne­ko­li­ko ki­lo­ba­za od mjes­ta za­po­či­nja­nja tran­skrip­ci­je. Po­ja­či­va­či ti­pič­no sad­r­že vez­na mjes­ta za vi­še pro­tei­na ko­ji za­jed­nič­kim dje­lo­va­njem re­gu­ li­ra­ju gen­sku ek­spre­si­ju.

po­ja­či­va­či, izo­la­to­ri, gra­nič­ni ele­men­ti

Vez­na mjes­ta za tran­skrip­cij­ske fa­kto­re: Eu­ka­riot­ski se tran­skrip­cij­ski fak­to­ri ve­žu na krat­ke slje­do­ve, uo­bi­ča­je­no du­lji­ne 6-10 baz­nih pa­ro­va, u pro­mo­to­ri­ma ili po­ja­či­va­či­ma.

te­st po­ma­ka elek­tro­fo­re­tske pok­ret­lji­vos­ti, imu­nop­re­ci­pi­ta­ci­ja kro­ma­ti­na

304    POGLAVLJE 7

KLJUČNI POJMOVI

SAŽETAK

DNA-a­fi­ni­tet­na kro­ma­tog­ra­fi­ja

Pro­tei­ni ko­ji re­gu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju: Mno­gi eu­ka­riot­ski tran­skrip­cij­ski fak­to­ri izo­li­ra­ni su na te­me­lju ve­za­nja na spe­ci­fič­ne slje­do­ve DNA.

tran­skrip­cij­ski ak­ti­va­tor, do­me­na cin­ko­va pr­sta, re­cep­tor za ste­roid­ni hor­mon, uz­voj­ni­ca-ok­re­t-uz­voj­ni­ca, ho­meo­do­me­na, leu­cin­ski zat­va­rač, uz­voj­ni­ca-om­ča-uz­voj­ni­ca, koak­ti­va­ tor

Struk­tu­ra i fun­kci­ja tran­skrip­cij­skih ak­ti­va­to­ra: Tran­skrip­cij­ski su ak­ti­va­to­ri mo­du­lar­ni pro­tei­ni ko­ji se sas­to­je iz raz­li­či­tih do­me­na, jed­ne se ve­žu na DNA, a dru­ge su ak­ti­va­cij­ske do­me­ne. Do­me­ne ko­je se ve­žu na DNA pos­re­du­ju zdru­ži­ va­nje sa spe­ci­fič­nim re­gu­lacijskim slje­do­vi­ma; ak­ti­va­cij­ske do­me­ne sti­mu­li­ra­ju tran­skrip­ci­ju stu­pa­ju­ći u in­te­rak­ci­ju s pos­red­nič­kim pro­tei­ni­ma i op­ćim tran­s­ krip­cij­skim fak­to­ri­ma, kao i koak­ti­va­to­ri­ma ko­ji mo­di­fi­ci­ra­ju kro­ma­tin­sku struk­tu­ru.

ko­rep­re­sor

Eu­ka­riot­ski rep­re­so­ri: Gen­ska ekspre­si­ja u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma re­gu­li­ra­na je ka­ko rep­re­so­ri­ma ta­ko i ak­ti­va­to­ri­ma. Ne­ki rep­re­so­ri in­ter­fe­ri­ra­ju s ve­za­njem ak­ti­va­to­ra ili op­ćih tran­skrip­cij­skih fak­to­ra na DNA. Dru­gi pak rep­re­so­ri sad­r­že dis­kret­ne rep­re­sij­ske do­me­ne ko­je in­hi­bi­ra­ju tran­skrip­ci­ju stu­pa­ju­ći u in­te­rak­ci­ ju s pos­red­nič­kim pro­tei­ni­ma, op­ćim tran­skrip­cij­skim fak­to­ri­ma, tran­skrip­cij­ skim ak­ti­va­to­ri­ma ili ko­rep­re­so­ri­ma ko­ji dje­lu­ju na kro­ma­tin­sku struk­tu­ru. Re­gu­la­ci­ja elon­ga­ci­je: Tran­skrip­ci­ja je ta­ko­đer re­gu­li­ra­na i na ni­vou elon­ga­ci­je. Kod broj­nih ge­na mo­le­ku­le RNA-po­li­me­ra­ze II ko­je su za­po­če­le s tran­skrip­ci­ jom zaus­tav­lja­ju se od­mah niz­vod­no od pro­mo­to­ra. Ta­ko zaus­tav­lje­ne po­li­me­ ra­ze nas­ta­vit će tran­skrip­ci­ju u skla­du s od­go­va­ra­ju­ćim iz­van­sta­nič­nim sig­na­li­ ma.

HMG-pro­tei­ni, ace­ti­li­ra­nje his­to­na, epi­ge­net­sko nas­lje­đi­va­nje, fak­to­ri ko­ji re­mo­de­li­ra­ju kro­ma­tin, elon­ga­ cij­ski fak­to­ri

Ve­za kro­ma­tin­ske struk­tu­re s tran­skrip­ci­jom: Pa­ki­ra­nje DNA u nuk­leo­so­me pred­stav­lja prep­re­ku za tran­skrip­ci­ju u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Mo­di­fi­ci­ra­nje his­to­na ace­ti­li­ra­njem us­ko je veza­no s re­gu­la­ci­jom tran­skrip­ci­je, a en­zi­mi ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju ace­ti­li­ra­nje his­to­na zdru­že­ni su s tran­skrip­cij­skim ak­ti­va­to­ri­ma, dok su his­ton­ske dea­ce­ti­la­ze zdru­že­ne s rep­re­so­ri­ma. His­to­ni se ta­ko­đer mo­di­fi­ci­ra­ ju fos­fo­ri­li­ra­njem i me­ti­li­ra­njem, a spe­ci­fič­ne mo­di­fi­ka­ci­je his­to­na dje­lu­ju na gen­sku ek­spre­si­ju, slu­že­ći kao vez­na mjes­ta za dru­ge re­gu­la­cijske pro­tei­ne. Osim to­ga, fak­to­ri ko­ji re­mo­de­li­ra­ju kro­ma­tin olak­ša­va­ju ve­za­nje tran­skrip­cij­skih fak­ to­ra na DNA mi­je­nja­njem aran­žma­na ili struk­tu­re nuk­leo­so­ma.

inak­ti­va­ci­ja X-kro­mo­so­ma

Re­gu­la­ci­ja tran­skrip­ci­je ne­ko­di­ra­ju­ćim RNA: Tran­skrip­ci­ja mo­že bi­ti re­gu­li­ra­ na ne­ko­di­ra­ju­ćim RNA kao i re­gu­lacijskim pro­tei­ni­ma. siR­NA po­tis­ku­ju tran­s­ krip­ci­ju ho­mo­log­nih ge­na zdru­ži­va­njem s pro­tein­skim kom­plek­som (RITS) ko­ji po­ti­če mo­di­fi­ka­ci­je his­to­na ko­je vo­de ka nas­tan­ku he­te­rok­ro­ma­ti­na. Inak­ti­va­ci­ ja X-kro­mo­so­ma u si­sav­ci­ma pos­re­do­va­na je ta­ko­đer ne­ko­di­ra­ju­ćim RNA.

ge­nom­ski uti­sak

Me­ti­li­ra­nje DNA: Me­ti­li­ra­nje ci­to­zin­skih os­ta­ta­ka mo­že spri­je­či­ti tran­skrip­ci­ju euka­riot­skih ge­na. Ta­ko­đer va­žan je pro­ces u uti­ša­va­nju pok­ret­nih ele­me­na­ta. Re­gu­la­ci­ja gen­ske ek­spre­si­je me­ti­li­ra­njem ig­ra važ­nu ulo­gu u ge­nom­skom utis­ ku ko­ji kon­tro­li­ra tran­skrip­ci­ju ne­kih ge­na dje­lat­nih u raz­vo­ju si­sa­va­ca.

Do­ra­dBa i pro­met RNA pre-r­R­NA, pre-tR­NA, RNa­za P, ri­bo­zim

Do­ra­dba ri­bo­som­ske i tran­spor­tne RNA: Ri­bo­somske i tran­spor­tne RNA de­ri­ va­ti su ki­da­nja du­gih pri­mar­nih tran­skri­pa­ta i u pro­ka­riot­skim i u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Me­til­ne se sku­pi­ne do­da­ju na rR­NA, a raz­li­či­te se ba­ze mo­di­fi­ci­ra­ju u tR­NA.

SINTEZA I DORADBA DNA 

SAŽETAK Do­ra­dba mR­NA u eu­ka­rio­ti­ma: Eu­ka­riot­ske pre-mR­NA se, osim uk­la­nja­nja in­ tro­na prek­ra­ja­njem, mo­di­fi­ci­ra­ju do­da­va­njem 7-metilgvanozinske ka­pe i 3' po­ li-A re­pa.

   305

KLJUČNI POJMOVI pre-mR­NA, 7-metilgvanozinska ka­pa, po­li-A rep, po­lia­de­ni­la­ci­ja

Pog­le­daj­te ani­ma­ci­ju 7.2 na mrež­noj stra­ni­ci Me­ha­ni­zam prek­ra­ja­nja: Prek­ra­ja­nje nuk­lear­nih pre-mR­NA do­ga­đa se u ve­li­ kim kom­plek­si­ma, naz­va­nim tje­leš­ca za prek­ra­ja­nje, sas­tav­lje­nim od pro­tei­na i ma­lih nuk­lear­nih RNA (snR­NA). snR­NA pre­poz­na­ju slje­do­ve na mjes­ti­ma za prek­ra­ja­nje u pre-mR­NA i ka­ta­li­zi­ra­ju sa­mu reak­ci­ju. Ne­ke mi­to­hon­drij­ske, klo­ rop­las­tne i bak­te­rij­ske RNA pro­la­ze sa­moprek­ra­ja­nje u ko­me je reak­ci­ja prek­ra­ ja­nja ka­ta­li­zi­ra­na in­tron­skim sli­je­dom.

tje­leš­ce za prek­ra­ja­nje, ma­le nuk­lear­ne RNA (snR­NA), ma­le nuk­lear­ne ri­bo­nuk­leop­ro­tein­ske čes­ti­ce (snR­NP), sa­moprek­ra­ja­nje

Al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje: Eg­zo­ni se mo­gu po­ve­za­ti u raz­li­či­tim kom­bi­na­ci­ja­ma kao pos­lje­di­ca al­ter­na­tiv­nog prek­ra­ja­nja ko­je pred­stav­lja va­žan me­ha­ni­zam za kon­tro­lu gen­ske ek­spre­si­je spe­ci­fič­nu za od­re­đe­no tki­vo u slo­že­nim eu­ka­rio­ti­ma.

al­ter­na­tiv­no prek­ra­ja­nje

Ure­đi­va­nje RNA: Ne­ke se mR­NA mo­di­fi­ci­ra­ju u pro­ce­su do­ra­dbe ta­ko da se mi­je­nja sli­jed ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­nu ko­ji je nji­ma ko­di­ran. Ure­đi­va­nje mi­to­ hon­drij­skih mR­NA u ne­kim pra­ži­vo­ti­nja­ma obuh­va­ća do­da­va­nje i bri­sa­nje uri­ din­skih os­ta­ta­ka na vi­še mjes­ta u mo­le­ku­li. Dru­gi ob­li­ci ure­đi­va­nja mR­NA u bilj­ka­ma i sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca obuh­va­ća­ju mo­di­fi­ka­ci­je spe­ci­fič­ne ba­ze.

ure­đi­va­nje RNA

Raz­grad­nja RNA: In­tro­ni se raz­gra­đu­ju u jez­gri, a ne­nor­mal­ne mR­NA, ko­ji­ma ne­dos­ta­je pot­pun ot­vo­re­ni ok­vir či­ta­nja, eli­mi­ni­ra­ju se ras­pa­dom pos­re­dov­anim nes­mis­le­nim mR­NA. Fun­kcio­nal­ne mR­NA u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma raz­gra­đu­ ju se na vi­še na­či­na, osi­gu­ra­va­ju­ći ta­ko do­dat­ne me­ha­niz­me za kon­tro­lu gen­ske ek­spre­si­je. U ne­kim slu­ča­je­vi­ma, br­zi­na raz­grad­nje mR­NA re­gu­li­ra­na je sig­na­li­ ma iz­van sta­ni­ce.

raz­grad­nja mR­NA pos­re­do­va­na nes­mis­le­nim sli­je­dom

Pitanja 1. Ka­ko se me­to­dom otis­ka sto­pa­la mo­gu ut­vr­di­ti vez­na mjes­ta za pro­tei­ne na DNA? 2. Ko­ja je ulo­ga sig­ma (σ) fak­to­ra u sin­te­zi RNA u bak­te­ri­ja­ma? 3. Na­ve­di­te glav­ni me­ha­ni­zam ter­mi­na­ci­je mR­NA u E. co­li. 4. Ka­ko lac rep­re­sor ut­je­če na tran­skrip­ci­ju lac ope­ro­na? 5. Us­po­re­đu­je­te što je pot­reb­no za in vit­ ro ba­zal­nu tran­skrip­ci­ju dva­ju ge­na ko­ji se pre­pi­su­ju po­li­me­ra­zom II, od ko­jih je­dan sad­r­ža­va TA­TA-slog, a dru­gi sad­r­ža­va sa­ mo Inr sli­jed. Je­su li za tran­skrip­ci­ju od tih pro­mo­to­ra pot­reb­ni TBP ili TFIID? 6. Ka­ko se po­ja­či­va­či, kao cis-dje­lu­ju­ći re­ gu­la­cijski slje­do­vi, raz­li­ku­ju od pro­mo­to­ra u eu­ka­rio­ti­ma?

7. Is­tra­žu­je­te po­ja­či­vač ge­na ko­ji se nor­ mal­no ek­spri­mi­ra sa­mo u neu­ro­ni­ma. Kon­stru­kt u ko­je­mu je taj po­ja­či­vač po­ ve­zan na re­por­ter­ski gen ek­spri­mi­ran je u neu­ro­ni­ma, ali ne u fib­rob­las­ti­ma. Me­đu­ tim, ako mu­ti­ra­te spe­ci­fič­ni ele­me­nt sli­je­da unu­tar po­ja­či­va­ča, do­bit će­te ek­spre­si­ju i u fib­rob­las­ti­ma i u neu­ro­ni­ma. Ko­ja bi se vr­sta re­gu­lacijskog pro­tei­na pre­ma Va­šem oče­ki­va­nju ve­za­la na po­ja­či­vač­ki ele­me­nt? 8. Ko­ja je fun­kci­ja izo­la­to­ra? 9. Ob­jas­ni­te me­ha­ni­zam inak­ti­va­ci­je X-kro­ mo­so­ma u že­na. 10. Ko­ja se svoj­stva Sp1 ko­ris­te za nje­go­ vo pro­čiš­ća­va­nje po­mo­ću DNA-afi­ni­tet­ne kro­ma­tog­ra­fi­je? Ka­ko bis­te prov­je­ri­li da je pro­čiš­će­ni pro­tein dois­ta Sp1?

11. Raz­vi­li ste reak­ci­ju prek­ra­ja­nja in vit­ro u ko­joj se pre-mR­NA do­ra­đu­je u zre­lu mR­ NA. Ka­kav re­zul­tat oče­ku­je­te ako u reak­ci­ ju do­da­te an­ti­se­rum nas­pram Sm? 12. Ka­ko ne­ko­di­ra­ju­će RNA re­gu­li­ra­ju kon­cen­tra­ci­ju spe­ci­fič­nih mR­NA u sta­ni­ci? 13. Ko­ja je ulo­ga fak­to­ra prek­ra­ja­nja ko­ji ni­su kom­po­nen­te snR­NP? 14. Ka­ko se sin­te­ti­zi­ra­ju dva struk­tur­no i fun­kcio­nal­no raz­li­či­ta ob­li­ka apo­li­pop­ro­ tei­na B u ljud­skim jet­rima i cri­je­vi­ma? 15. Što je pro­ces raz­grad­nje nes­mis­le­ne RNA i ka­kav je nje­gov zna­čaj u sta­ni­ci?

306    POGLAVLJE 7

Li­te­ra­tu­ra Tran­skrip­ci­ja u pro­ka­rio­ti­ma Bo­ruk­hov, S., J. Lee and O. Lap­ten­ko. 2005. Bacte­rial tran­scrip­tion elon­ga­tion fac­to­rs: new in­sig­hts in­to mo­le­cu­lar mec­ha­ni­sm of ac­tion. Mo­lec. Mic­ro­biol. 55: 1315−1324. [R] Bo­ruk­hov, S. and E. Nud­ler. 2003. RNA poly­ mera­se ho­loen­zyme: Struc­tu­re, fun­ction and bio­lo­gi­cal im­pli­ca­tio­ns. Cu­rr. Opin. Mic­ro­ biol. 6: 93−100. [R] Gil­be­rt, W. and B. Mul­le­r-Hi­ll. 1966. Iso­la­tion of the lac rep­res­sor. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 56: 1891–1899. [P] Grei­ve, S. J. and P. H. von Hip­pel. 2005. Thinkin­g  quan­ti­ta­ti­ve­ly about tran­scrip­ tional re­gu­la­tion. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 6: 221−232. [R] Ja­cob, F. and J. Mo­nod. 1961. Ge­ne­tic and re­gu­ la­to­ry mec­ha­nis­ms in the synthe­sis of pro­ tei­ns. J. Mol. Biol. 3: 318–356. [P] Lawson, C. L., D. Swi­gon, K. S. Mu­ra­ka­mi, S. A. Dar­st, H. M. Ber­man and R. H. Eb­rig­ht. 2004. Ca­ta­bo­li­te ac­ti­va­tor pro­tein: DNA bin­di­ng and tran­scrip­tion ac­ti­va­tion. Cu­rr. Opin. Struc. Biol. 14: 10−20. [R] Mat­hew, R. and D. Chet­ter­ji. 2006. The evol­v­ ing sto­ry of the ω su­bu­nit of bac­te­rial RNA po­lyme­ra­se. Tren­ds Mic­ro­biol. 14: 450−455. [R]

Moo­ney, R. A., S. A. Dar­st and R. Lan­di­ck. 2005. Sig­ma and RNA po­lyme­ra­se: an on-a­gain, o­ff-a­gain re­la­tion­ship? Mol. Ce­ll 20: 335−345. [R] Mu­ra­ka­mi, K. S. and S. A. Dar­st. 2003. Bac­te­rial RNA po­lyme­ra­ses: The who­le sto­ry. Cu­rr. Opin. Struc. Biol. 13: 31−39. [R] Mu­ra­ka­mi, K. S., S. Ma­su­da and S. A. Dar­st. 2002. Struc­tu­ral ba­sis of tran­scrip­tion ini­ti­ ation: RNA po­lyme­ra­se ho­loen­zyme at 4 Å re­so­lu­tion. Scien­ce 296: 1280–1284. [P] Ptas­hne, M. and A. Ga­nn. 2002. Ge­nes and Signa­ls. Co­ld Spri­ng Har­bor, NY: Co­ld Spri­ ng Har­bor La­bo­ra­to­ry Pre­ss. Ric­har­dson, J. P. 2003. Loa­di­ng Rho to ter­mi­na­te tran­scrip­tion. Ce­ll 114: 157−159. [R] Vas­sylyev, D. G., S. Se­ki­ne, O. Lap­ten­ko, J. Lee, M. N. Vas­sylye­va, S. Bo­ruk­hov and S. Yokoya­ma. 2002. Crystal struc­tu­re of a bac­ te­rial RNA po­lyme­ra­se holoen­zyme at 2.6 Å re­so­lu­tion. Na­tu­re 417: 712–719. [P] Wil­son, C. J., H. Zhan, L. Swi­nt-Kru­se and K. S. Mat­thews. 2007. The lac­to­se rep­res­sor sys­ tem: pa­ra­dig­ms for re­gu­la­tion, al­los­te­ric be­ ha­vior and pro­tein fol­di­ng. Ce­ll. Mol. Li­fe. Sci. 64: 3−16. [R] Zha­ng, G., E. A. Cam­pbe­ll, E. A., L. Mi­nak­hin, C. Ric­hter, K. Se­ve­ri­nov and S. A. Dar­st. 1999. Crystal struc­tu­re of Ther­mus aquaticus co­re RNA po­lyme­ra­se at 3.3 Å re­so­lu­tion. Ce­ll 98: 811–824. [P]

Eu­ka­riot­ske RNA-po­li­me­ra­ze i op­ći tran­skrip­cij­ski fak­to­ri Ama­ral, P. P., M. E. Din­ger, T. R. Mer­cer and J. S. Mat­ti­ck. 2008. The eu­ka­ryo­tic ge­no­me as an RNA mac­hi­ne. Scien­ce 319: 1787−1789. [R] Bus­hne­ll, D. A., K. D. Wes­to­ver, R. E. Da­vis and R. D. Kor­nbe­rg. 2004. Struc­tu­ral ba­sis of tran­scrip­tion: An RNA po­lyme­ra­se II-TFIIB coc­rystal at 4.5 Angstro­ms. Scien­ce 303: 983−988. [P] Co­naway, J. W., L. Flo­re­ns, S. Sa­to, C.TomomoriSa­to, T. J. Par­me­ly, T. Yao, S. K. Swan­son, C. A. S. Ban­ks, M. P. Was­hbu­rn and R. C. Co­ naway. 2005. The mam­ma­lian Me­dia­tor com­plex. FEBS Le­tt. 579: 904−908. [R] Cra­mer, P., D. A. Bus­hne­ll and R. D. Kor­nbe­rg. 2001. Struc­tu­ral ba­sis of tran­scrip­tion: RNA po­lyme­ra­se II at 2,8 Å re­so­lu­tion. Scien­ce 292: 1863–1876. [P]

San­de­lin, A., P. Car­nin­ci, B. Len­ha­rd, J. Po­nja­vic, Y. Hayas­hi­za­ki and D. A. Hume. 2007. Mam­ma­lian RNA po­lyme­ra­se II co­re pro­ mo­te­rs: in­sig­hts from ge­no­me-wi­de stu­dies. Na­tu­re Rev. Ge­net. 8: 424−436. [R] Schra­mm, L. and N. Her­nan­dez. 2002. Rec­ruit­ me­nt of RNA po­lyme­ra­se III to its tar­get pro­mo­te­rs. Genes Dev. 16: 2593–2620. [R] Weil, P. A., D. S. Lu­se, J. Se­ga­ll and R. G. Roe­der. 1979. Se­lec­ti­ve and ac­cu­ra­te ini­tia­tion of tran­scrip­tion at the Ad2 ma­jor la­te pro­mo­ ter in a so­lub­le system de­pen­de­nt on pu­ri­ fied RNA po­lyme­ra­se II and DNA. Ce­ll 18: 469−484. [R]

Re­gu­la­ci­ja tran­skrip­ci­je u eukarioti­ma Bayne, E. H. and R. C. Al­lshi­re. 2005. RNA-di­ rec­ted tran­scrip­tio­nal ge­ne si­len­ci­ng in mam­ma­ls. Tren­ds Ge­net. 21: 370−373. [R]

Eb­rig­ht, R. H. 2000. RNA po­lyme­ra­se: struc­tu­ral si­mi­la­ri­ties be­tween bac­te­rial RNA po­lyme­ ra­se and eu­ka­ryo­tic RNA po­lyme­ra­se II. J. Mol. Biol. 304: 687–698. [R]

Belotserkovskaya R. and D. Rein­be­rg. 2004. Facts about FACT and tran­scri­pt elon­ga­tion throu­gh chro­ma­tin. Cu­rr. Opin. Ge­net. Dev. 14: 139−146. [R]

Ju­ve­n-Ger­shon, T., J.-Y. Hsu, J. W. M. Thei­sen and J. T. Ka­do­na­ga. 2008. The RNA po­ lymera­se II co­re pro­mo­ter−the ga­teway to tran­scrip­tion. Cu­rr. Opin. Ce­ll Biol. 20: 253−259. [R]

Ber­ger, S. L. 2007. The com­plex lan­gua­ge of chro­ma­tin re­gu­la­tion du­ri­ng tran­scrip­tion. Na­tu­re 447: 407-412. [R]

Kim, Y.-J. and J. T. Lis. 2005. In­te­rac­tio­ns betwee­n su­bu­ni­ts of Dro­sop­hi­la Me­dia­tor and ac­ti­va­tor pro­tei­ns. Tren­ds Bioc­hem. Sci. 30: 245−249. [R] Kor­nbe­rg, R. D. 2005. Me­dia­tor and the mec­ha­ ni­sm of tran­scrip­tio­nal ac­ti­va­tion. Tren­ds Bioc­hem. Sci. 30: 235-239. [R] Kor­nbe­rg, R. D. 2007. The mo­le­cu­lar ba­sis of euka­ryo­tic tran­scrip­tion. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 104: 12955-12961. [R] Ma­lik, S. and R. G. Roe­der. 2005. Dyna­mic re­gu­ la­tion of pol II tran­scrip­tion by the mam­ ma­lian Me­dia­tor com­plex. Tren­ds Bioc­hem. Sci. 30: 256−263. [R] Mat­sui, T., J. Se­ga­ll, P. A. Weil and R. G. Roe­der. 1980. Mul­tip­le fac­to­rs are requi­red for ac­cu­ ra­te ini­tia­tion of tran­scrip­tion by pu­ri­fied RNA po­lyme­ra­se II. J. Biol. Chem. 255: 11992–11996. [P]

Browne­ll, J. E., J. Zhou, T. Ra­nal­li, R. Ko­bayas­hi, D. G. Ed­mon­dson, S. Y. Ro­th and C. D. Al­ lis. 1996. Tet­ra­hyme­na his­to­ne ace­tyltran­sfe­ ra­se A: A ho­mo­log to yea­st Gcn5p lin­ki­ng his­to­ne ace­tyla­tion to ge­ne ac­ti­va­tion. Ce­ll 84: 843–851. [P] Buh­ler, M. and D. Moa­zed. 2007. Tran­scrip­tion and RNAi in he­te­roc­hro­ma­tic ge­ne si­len­ cing. Na­tu­re Struc. Mol. Biol. 14: 1041−1048. [R] Cou­rey, A. J. and S. Jia. 2001. Tran­scrip­tio­nal rep­res­sion: the lo­ng and the sho­rt of it. Gene­s Dev. 15: 2786–2796. [R] Dynan, W. S. and R. Tjian. 1983. The pro­mo­te­rspe­ci­fic tran­scrip­tion fac­tor Sp1 bin­ds to up­stream sequen­ces in the SV40 ear­ly pro­ mo­ter. Ce­ll 35: 79–87. [P] Gas­zner, M. and G. Fel­sen­fe­ld. 2006. In­su­la­to­rs: exploi­ti­ng tran­scrip­tio­nal and epi­ge­ne­tic mec­ha­nis­ms. Na­tu­re Rev. Ge­net. 7: 703−713. [R]

Mul­ler, F., M. A. De­me­ny and L. To­ra. 2007. New prob­le­ms in RNA po­lyme­ra­se II tran­ scrip­tion ini­tia­tion: mat­chi­ng the di­ver­si­ty of co­re pro­mo­te­rs wi­th a va­rie­ty of pro­ moter re­cog­ni­tion fac­to­rs. J. Biol. Chem. 282: 14685−14689. [R]

Gol­dbe­rg, A. D., C. D. Al­lis and E. Ber­nstein. 2007. Epi­ge­ne­ti­cs: a lan­dsca­pe ta­kes sha­pe. Ce­ll 128: 635-638. [R]

Or­pha­ni­des, G. and D. Rein­be­rg. 2002. A uni­ fied theo­ry of ge­ne expres­sion. Ce­ll 108: 439–451. [R]

Good­ri­ch, J. A. and J. F. Ku­gel. 2006. Non­coding-RNA re­gu­la­to­rs of RNA po­lyme­ra­se II tran­scrip­tion. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 7: 612−616. [R]

Rus­se­ll, J. and J. C. B. M. Zo­mer­di­jk. 2005. RNA po­lyme­ra­se I-di­rec­ted rDNA tran­scrip­tion, li­fe and wor­ks. Tren­ds Bioc­hem. Sci. 30: 87−96. [R]

Go­ll, M. G. and T. H. Bes­tor. 2005. Eu­ka­ryo­tic cyto­si­ne met­hyltran­sfe­ra­ses. Ann. Rev. Bio­ che­m. 74: 481-514. [R]

Grewal, S. I. S. and S. C. R. El­gin. 2007. Transcrip­tion and RNA in­ter­fe­ren­ce in the

SINTEZA I DORADBA DNA  for­ma­tion of he­te­roc­hro­ma­tin. Na­tu­re 447: 399−406. [R] Hea­rd, E. and C. M. Dis­tec­he. 2006. Do­sa­ge com­pen­sa­tion in mam­ma­ls: fi­ne-tu­ni­ng the expres­sion of the X chro­mo­so­me. Ge­nes Dev. 20: 1848−1867. [R] He­ni­ko­ff, S. 2008. Nuc­leo­so­me des­ta­bi­li­za­tion in the epi­ge­ne­tic re­gu­la­tion of ge­ne expres­sion. Na­tu­re Rev. Ge­net. 9: 15−26. [R] Ho­ck, R., T. Fu­ru­sawa, T. Ue­da and M. Bus­tin. 2007. HMG chro­mo­so­mal pro­tei­ns in de­ve­ lop­me­nt and di­sea­se. Tren­ds Ce­ll Biol. 17: 72−79. [R] Je­nuwein, T. and C. D. Al­lis. 2001. Tran­sla­ti­ng the his­to­ne co­de. Scien­ce 293: 1074–1080. [R] Ka­do­na­ga, J. T. 2004. Re­gu­la­tion of RNA poly­ me­ra­se II tran­scrip­tion by sequen­ce-spe­ci­fic DNA bin­di­ng fac­to­rs. Ce­ll 116: 247–257. [R] Ka­do­na­ga, J. T. and R. Tjian. 1986. Af­fi­ni­ty pu­ri­ fi­ca­tion of sequen­ce-spe­ci­fic DNA bin­di­ng pro­tei­ns. Proc. Na­tl. Acad. Sci. USA 83: 5889–5893. [P] Kim, T. H. and B. Ren. 2006. Ge­no­me-wi­de ana­ lysis of pro­tei­n-DNA in­te­rac­tio­ns. Ann. Rev. Ge­no­mi­cs Hum. Ge­net. 7: 81−102. [R] Kou­za­ri­des, T. 2007. Chro­ma­tin mo­di­fi­ca­tio­ns and their fun­ction. Ce­ll 128: 693−705. [R] Li, B., M. Ca­rey and J. L. Wor­kman. 2007. The ro­le of chro­ma­tin du­ri­ng tran­scrip­tion. Ce­ll 128: 707-719. [R] Lo­na­rd, D. M. and B. W. O'Mal­ley. 2005. Expan­ di­ng fun­ctio­nal di­ver­si­ty of the coac­ti­va­to­rs. Tren­ds Bioc­hem. Sci. 30: 126−132. [R] Mas­ton, G. A., S. K. Eva­ns and M. R. Green. 2006. Tran­scrip­tio­nal re­gu­la­to­ry ele­men­ts in the hu­man ge­no­me. Ann. Rev. Ge­no­mi­cs Hum. Ge­net. 7: 29−59. [R] Meis­ter, G. and T. Tus­chl. 2004. Mec­ha­nis­ms of ge­ne si­len­ci­ng by doub­le-stran­ded RNA. Na­tu­re 431: 343-349. [R] Ogawa, Y., B. K. Sun and J. T. Lee. 2008. Intersectio­n of the RNA in­ter­fe­ren­ce and X-i­nac­ti­va­tion pat­hways. Scien­ce 320: 1336−1341. [R] Pri­ce, D. H. 2008. Poi­sed po­lyme­ra­se: on your mar­k…get se­t…go! Mol. Ce­ll 30: 7−10. [R] Roe­der, R. G. 2005. Tran­scrip­tio­nal re­gu­la­tion and the ro­le of di­ver­se coac­ti­va­to­rs in ani­ mal cel­ls. FEBS Le­tt. 579: 909−915. [R] Rut­hen­bu­rg, A. J., H. Li, D. J. Pa­tel and C. D. Al­lis. 2007. Mul­ti­va­le­nt en­ga­ge­me­nt of chro­ ma­tin mo­di­fi­ca­tio­ns by lin­ked bin­di­ng modu­les. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 8: 983−994. [R] Sa­ha, A., J. Wit­tmeyer and B. R. Cair­ns. 2006. Chro­ma­tin re­mo­de­li­ng: the in­dus­trial re­vo­ lu­tion of DNA arou­nd his­to­nes. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 7: 437−447. [R] Saun­de­rs, A., L. J. Co­re and J. T. Lis. 2006. Breaki­ng bar­rie­rs to tran­scrip­tion elon­ga­ tion. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 7: 557−567. [R]

Si­ms, R. J. III, R. Belotserkovskaya and D. Rein­ be­rg. 2004. Elon­ga­tion by RNA po­lyme­ra­se II: The sho­rt and lo­ng of it. Ge­nes Dev. 18: 2437−2468. [R] Stau­dt, L. M. and M. J. Leo­nar­do. 1991. Im­ munog­lo­bu­lin ge­ne tran­scrip­tion. Ann. Rev. Im­mu­nol. 9: 373-398. [R] Taun­ton, J., C. A. Has­sig and S. L. Schrei­ber. 1996. A mam­ma­lian his­to­ne dea­ce­tyla­se rela­ted to the yea­st tran­scrip­tio­nal re­gu­la­tor Rpd3p. Scien­ce 272: 408–411. [P] Teixei­ra da Roc­ha, S. and A. C. Fer­gu­so­n-Smi­th. 2004. Ge­no­mic im­prin­ti­ng. Cu­rr. Biol. 14: R646-649. [R] Wor­kman, J. L. 2006. Nuc­leo­so­me dis­pla­ce­ment in tran­scrip­tion. Ge­nes Dev. 20: 2009−2017. [R]

Do­ra­dba i pro­met RNA Abel­son, J., C. R. Trot­ta and H. Li. 1998. tR­NA spli­ci­ng. J. Biol. Chem. 273:12685–12688. [R] Be­n-Dov, C., B. Har­tma­nn, J. Lun­dgren and J. Val­car­cel. 2008. Ge­no­me-wi­de ana­lysis of al­ter­na­ti­ve pre-mR­NA spli­ci­ng. J. Biol. Chem. 283: 1229−1233. [R] Bla­ck, D. L. 2003. Mec­ha­nis­ms of al­ter­na­ti­ve pre-mes­sen­ger RNA spli­ci­ng. Ann. Rev. Bioc­hem. 72: 291-336. [R] Bla­nc, V. and N. O. Da­vid­son. 2003. C-to-U RNA edi­ti­ng: mec­ha­nis­ms lea­di­ng to genetic di­ ver­si­ty. J. Biol. Chem. 278: 1395–1398. [R] Eva­ns, D., S. M. Ma­rquez and N. R. Pa­ce. 2006. RNa­se P: in­ter­fa­ce of the RNA and pro­tein wor­lds. Tren­ds Bioc­hem. Sci. 31: 333−341. [R]

   307

Kru­ger, K., P. J. Gra­bowski, A. Zaug, A. J. San­ds, D. E. Gottschli­ng and T. R. Ce­ch. 1982. Se­lfspli­ci­ng RNA: Au­toexci­sion and au­to­ cyclization of the ri­bo­so­mal RNA in­ter­ve­n­ ing sequen­ce of Tet­ra­hyme­na. Ce­ll 31: 147–157. [P] Maas, S., A. Ri­ch and K. Nis­hi­ku­ra. 2003. A-to-I RNA edi­ti­ng: re­ce­nt news and re­si­dual myste­ ries. J. Biol. Chem. 278: 1391–1394. [R] Mat­lin, A. J., F. Cla­rk and C. W. J. Smi­th. 2005. Un­der­stan­di­ng al­ter­na­ti­ve spli­ci­ng: Towar­ds a cel­lu­lar co­de. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 6: 386−398. [R] Mayda­no­vych, O. and P. A. Beal. 2006. Brea­ki­ng the cen­tral dog­ma by RNA edi­ti­ng. Chem. Rev. 106: 3397-3411. [R] Pad­ge­tt, R. A., M. M. Ko­nar­ska, P. J. Gra­bowski, S. F. Har­dy and P. A. Sha­rp. 1984. La­riat RNAs as in­ter­me­dia­tes and pro­duc­ts in the spli­ci­ng of mes­sen­ger RNA pre­cur­so­rs. Scien­ce 225: 898–903. [P] Pad­ge­tt, R. A., S. M. Mou­nt, J. A. Stei­tz and P. A. Sha­rp. 1983. Spli­ci­ng of mes­sen­ger RNA pre­cur­so­rs is in­hi­bi­ted by an­ti­se­ra to sma­ll nuc­lear ri­bo­nuc­leop­ro­tein. Ce­ll 35: 101–107. [P] Phat­na­ni, H. P. and A. L. Green­leaf. 2006. Phos­ pho­ryla­tion and fun­ctio­ns of the RNA po­ lyme­ra­se II CTD. Ge­nes Dev. 20: 2922−2936. [R] Proud­foot, N. J. 2004. New per­spec­ti­ves on connec­ti­ng mes­sen­ger RNA 3' end for­ma­ tion to tran­scrip­tion. Cu­rr. Opin. Ce­ll Biol. 16: 272−278. [R]

Gar­neau, N. L., J. Wi­lu­sz and C. J. Wi­lu­sz. 2007. The hig­hways and byways of mR­NA de­cay. Na­tu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 8: 113−126. [R]

Schmuc­ker, D. 2007. Mo­le­cu­lar di­ver­si­ty od Dsca­m: re­cog­ni­tion of mo­le­cu­lar iden­ti­ty in neu­ro­nal wi­ri­ng. Na­tu­re Rev. Neu­ros­ci. 8: 915−920. [R]

Guer­rie­r-Ta­ka­da, C., K. Gar­di­ner, T. Mar­sh, N. Pa­ce and S. Al­tmen. 1983. The RNA moie­ty of ri­bo­nuc­lea­se P is the ca­ta­lytic su­bu­nit of the en­zyme. Ce­ll 35: 849−857. [P]

See­bu­rg, P. H. and J. Har­tner. 2003. Re­gu­la­tion of ion chan­nel / neu­rot­ran­smit­ter re­cep­tor fun­ction by RNA edi­ti­ng. Cu­rr. Opin. Neu­ ro­biol. 13: 279−283. [R]

Hau­gen, P., D. M. Si­mon and D. Bhat­tac­ha­rya. 2005. The na­tu­ral his­to­ry of group I in­tro­ns. Tren­ds Ge­net. 21: 111−119. [R]

Shin, C. and J. L. Man­ley. 2004. Ce­ll sig­na­li­ng and the con­trol of pre-mR­NA spli­ci­ng. Natu­re Rev. Mol. Ce­ll Biol. 5: 727−738. [R]

Hi­ro­se, Y. and Y. Oh­ku­ma. 2007. Phos­ phorylation  of the C-ter­mi­nal do­main of RNA po­lyme­ra­se II plays cen­tral ro­les in the in­teg­ra­ted even­ts of eu­ka­ryo­tic ge­ne expres­ sion. J. Bioc­hem. 141: 601−608. [R]

Ste­te­fe­ld, J. and M. A. Rue­gg. 2005. Struc­tu­ral and fun­ctio­nal di­ver­si­ty ge­ne­ra­ted by al­ter­ na­ti­ve mR­NA spli­ci­ng. Tren­ds Bioc­hem. Sci. 30: 515−521. [R]

Hop­per, A. K. and E. M. Phi­zic­ky. 2003. tR­NA tran­sfe­rs to the li­me­lig­ht. Ge­nes Dev. 17: 162–180. [R]

Stua­rt, K. D., A. Schnau­fer, N. L. Er­nst and A. K. Pa­nig­ra­hi. 2005. Com­plex ma­na­ge­me­nt: RNA edi­ti­ng in trypa­no­so­mes. Tren­ds Bioc­ hem. Sci. 30: 97−105. [R]

Hou­se, A. E. and K. W. Lynch. 2008. Re­gu­la­tion of al­ter­na­ti­ve spli­ci­ng: mo­re than ju­st AB­Cs. J. Biol. Chem. 283: 1217−1221. [R]

Va­lad­khan, S. 2007. The sli­ceo­so­me: a ri­bo­zyme at hea­rt? Biol. Chem. 368: 693−697. [R]

Is­ken, O. and L. E. Maquat. 2007. Qua­li­ty con­ trol of eu­ka­ryo­tic mR­NA: sa­fe­guar­di­ng cel­ls from ab­nor­mal mR­NA fun­ction. Ge­nes Dev. 21: 1833−1856. [R]

Wei­ner, A. M. 2004. tR­NA ma­tu­ra­tion: RNA polyme­ri­za­tion wit­hout a nuc­lei acid tem­ pla­te. Cu­rr. Biol. 14: R883−R885. [R]

Kor­nblih­tt, A. R., M. de la Ma­ta, J. P. Fe­de­da, M. J. Mu­noz and G. No­gues. 2004. Mul­tip­le links be­tween tran­scrip­tion and spli­ci­ng. RNA 10: 1489−1498. [R]

8 Translacija mRNA  309 Smatanje i doradba proteina  329 Regulacija funkcije proteina  340 Razgradnja proteina  345 MOLEKULARNA MEDICINA Katalitička uloga ribosomske RNA  316 Ključ­ni po­kus Ot­kri­će pro­tei­n-ti­ro­zin-ki­ na­za  344

Sin­te­za, do­ra­dba i regulaci­ja pro­tei­na Na­kon tran­skrip­ci­je i do­ra­dbe RNA sli­je­di tran­sla­ci­ja od­nos­no sin­te­za pro­tei­na ko­ja se od­vi­ja pre­ma ka­lu­pu mR­NA. Pro­tei­ni su ak­tiv­ni su­dio­ni­ci ve­ći­ne sta­nič­nih pro­ce­sa jer obav­lja­ju mno­gob­roj­ne za­da­će, od­ re­đe­ne in­for­ma­ci­ja­ma poh­ra­nje­nim u ge­nom­skoj DNA. Sin­te­zu pro­tei­na sto­ga je mo­gu­će smat­ra­ti kraj­njim ko­ra­kom gen­ske ek­spre­si­je. Tran­sla­ci­ ja, od­nos­no pre­vo­đe­nje mR­NA, ipak je tek pr­vi ko­rak nas­tan­ka fun­kcio­ nal­nog pro­tei­na, s ob­zi­ro­m na to da se na­kon sin­te­ze, po­li­pep­tid­ni la­nac mo­ra smo­ta­ti u od­go­va­ra­ju­ću tro­di­men­zio­nal­nu kon­for­ma­ci­ju, a uz to, čes­to pod­li­je­že raz­li­či­tim ob­li­ci­ma do­ra­dbe pri­je no što pop­ri­mi svoj ak­ tiv­ni ob­lik. Do­ra­dba (en­gl. pro­ces­si­ng) pro­tei­na, po­se­bi­ce kod eu­ka­rio­ta, us­ko je po­ve­za­na s razvr­sta­va­njem i tran­spor­tom pro­tei­na do nji­ho­vih od­go­va­ra­ju­ćih od­re­diš­ta unu­tar sta­ni­ce. Gen­ska ek­spre­si­ja ni­je re­gu­li­ra­na sa­mo na ra­zi­ni tran­skrip­ci­je (v. pog­l. 7), već i na ra­zi­ni tran­sla­ci­je, što je va­žan čim­be­nik gen­ske re­gu­la­ci­je i u pro­ka­riot­skim i u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Uz to, još ši­ru zna­čaj­no­st ima­ ju meha­niz­mi ko­ji kon­tro­li­ra­ju ak­tiv­nos­ti pro­tei­na u sta­ni­ci. Jed­nom sin­ te­ti­zi­ra­ni, mno­gi pro­tei­ni u od­go­vo­ru na iz­van­sta­nič­ne sig­na­le mo­gu bi­ti re­gu­li­ra­ni ka­ko ko­va­len­tnim mo­di­fi­ka­ci­ja­ma ta­ko i po­ve­zi­va­njem s dru­ gim mo­le­ku­la­ma. Na­da­lje, ra­zi­ne pro­tei­na u sta­ni­ci mo­gu bi­ti re­gu­li­ra­ne raz­li­či­tom br­zi­nom raz­grad­nje pro­tei­na. Ove vi­šes­tru­ke kon­tro­le ko­li­či­ne i ak­tiv­nos­ti unu­tar­sta­nič­nih pro­tei­na, u ko­nač­ni­ci, re­gu­li­ra­ju sve as­pek­te po­na­ša­nja sta­ni­ce.

Tran­sla­ci­ja mR­NA Sin­te­za pro­tei­na od­vi­ja se pre­ma ka­lu­pu mR­NA pro­ce­som ko­ji je ti­je­ kom evo­lu­ci­je os­tao vi­so­koo­ču­van (preg­led u 4. pog­lav­lju). Sve se mR­NA či­ta­ju u smje­ru 5' pre­ma 3', a po­li­pep­tid­ni se la­nac sin­te­ti­zi­ra od ami­nokra­ja pre­ma kar­bok­si-kra­ju. Sva­ka ami­no­ki­se­li­na od­re­đe­na je s tri ba­ze (ko­don) u mR­NA, pre­ma go­to­vo uni­ver­zal­nom ge­nskom ko­du. Te­melj­ni me­ha­ni­zam pro­tein­ske sin­te­ze je ta­kođer is­tov­je­tan u svim sta­ni­ca­ma: tran­sla­ci­ja se od­vi­ja na ri­bo­so­mi­ma, uz tran­spor­tne RNA (tR­NA) ko­je slu­že kao adap­te­ri iz­me­đu ka­lu­pa mR­NA i ami­no­ki­se­li­na ko­je se ugra­đu­ ju u pro­tein. Sin­te­za pro­tei­na ti­me uk­lju­ču­je in­te­rak­ci­je iz­me­đu tri ti­pa mo­le­ku­la RNA (ka­lup mR­NA, tR­NA i rR­NA) kao i raz­li­či­te pro­tei­ne ko­ji su nuž­ni za tran­sla­ci­ju.

310    POGLAVLJE 8

Tran­spor­tne RNA

Sli­ka 8-1. Struk­tu­ra tR­NA.  Struk­tu­ra kvaš­če­ve fe­ni­la­la­ni­l-tR­NA pri­ka­za­na je u ot­vo­re­noj for­mi lis­ta dje­te­li­ne (A) ka­ko bi kom­ple­men­tar­no spa­ri­va­nje ba­za bi­ lo vid­lji­vo. Mo­di­f i­ci­ra­ne ba­ze obi­lje­že­ne su kao mG – me­til­gva­nin; mC – me­til­ci­ to­zin; DHU – dihid­rou­ra­cil; T – ri­bo­ti­min; Y – mo­di­f i­ci­ra­ni pu­rin (naj­češ­će ade­ni­n); ψ – pseu­dou­ra­cil. Smo­ta­na for­ma mo­ le­ku­le pri­ka­za­na je pod (B), a pros­tor­ni mo­del pod (C). (C, sus­ret­lji­voš­ću Da­na Ric­har­dso­na.)

Ti­je­kom tran­sla­ci­je, sva­ka od 20 ami­no­ki­se­li­na mo­ra bi­ti prid­ru­že­na od­go­va­ra­ju­ćim ko­do­ni­ma u ka­lu­pu mR­NA. Sve sta­ni­ce sad­r­ža­va­ju raz­no­li­ ke tR­NA ko­je slu­že kao adap­te­ri ovog pro­ce­sa. Kao što se mo­že oče­ki­va­ti, zbog is­tov­jet­ne fun­kci­je u pro­ce­su sin­te­ze pro­tei­na, raz­li­či­te tR­NA ima­ju za­jed­nič­ke struk­tur­ne oso­bi­ne. Ipak, pos­je­du­ju je­din­stve­ne iden­ti­fi­ka­cij­ske slje­do­ve ko­ji omo­gu­ću­ju ve­za­nje od­go­va­ra­ju­će ami­no­ki­se­li­ne i nje­zi­no prid­ru­ži­va­nje svom pri­pa­da­ju­ćem ko­do­nu u mR­NA. Tran­spor­tne RNA iz­gra­đe­ne su od prib­liž­no 70 do 80 nuk­leo­ti­da i ima­ ju ka­rak­te­ris­tič­nu struk­tu­ru »lis­ta dje­te­li­ne« ko­ja je pos­lje­di­ca spa­ri­va­nja kom­ple­men­tar­nih ba­za iz raz­li­či­tih re­gi­ja mo­le­ku­le (sl. 8-1). Kris­ta­log­raf­ ske ana­li­ze X-zra­ka­ma do­dat­no su pot­vr­di­le da se sve tR­NA sma­ta­ju u slič­ne kom­pak­tne L-ob­li­ke ko­ji su nuž­ni za uk­la­pa­nje tR­NA u ri­bo­so­me za vri­je­me pro­ce­sa tran­sla­ci­je. Pos­red­nič­ka fun­kci­ja tR­NA te­me­lji se na dvi­je od­vo­je­ne re­gi­je mo­le­ku­le. Sve tR­NA na 3' kra­ju sad­rž­ a­va­ju sli­jed CCA, a ami­no­ki­se­li­ne se ko­va­len­tno ve­žu na ri­bo­zu kraj­njeg ade­no­zi­na iz to­ga sli­ je­da. An­ti­ko­don­ska pet­lja, smješ­te­na na dru­gom kra­ju smo­ta­ne tR­NA, pu­ tem kom­ple­men­tar­nog spa­ri­va­nja ba­za pre­poz­na­je i ve­že od­go­va­ra­ju­ći ko­ don u ka­lu­pu mR­NA. Ug­rad­nja pra­vil­no ko­di­ra­nih ami­no­ki­se­li­na u pro­tei­ne ovi­si o po­ve­zi­va­ nju sva­ke po­je­di­ne ami­no­ki­se­li­ne s od­go­va­ra­ju­ćom tR­NA kao i o spe­ci­fi­ čnom spa­ri­va­nju ba­za ko­do­na i an­ti­ko­do­na. Reak­ci­je u ko­ji­ma se ami­no­ ki­se­li­ne po­ve­zu­ju sa spe­ci­fič­nim tR­NA kata­li­zi­ra­ne su en­zi­mi­ma, naz­va­nim ami­noa­ci­l-tR­NA-sin­te­ta­ze, ko­je su 1957. go­di­ne ot­kri­li Paul Za­mec­nik i Mah­lon Hoag­la­nd. Sva­ki od tih 20 enzi­ma pre­poz­na­je jed­nu ami­no­ki­se­li­ nu i od­go­va­ra­ju­ću tR­NA (ili vi­še njih) za ko­ju ami­no­ki­se­li­na tre­ba bi­ti ve­za­na. Reak­ci­ja se od­vi­ja u dva ko­ra­ka (sl. 8-2). Ami­no­ki­se­li­na se pr­vo ak­ti­vi­ra reak­ci­jom s ATP ka­ko bi nas­tao ami­noa­ci­l-A­MP-sin­te­taz­ni me­ đup­ro­du­kt. Ak­ti­vi­ra­na se ami­no­ki­se­li­na za­tim po­ve­zu­je s 3' kra­jem tR­NA. Ami­noa­ci­l-tR­NA-sin­te­ta­ze mo­ra­ju bi­ti vi­so­kose­lek­tiv­ni en­zi­mi ko­ji pre­ poz­na­ju i po­je­di­nač­ne ami­no­ki­se­li­ne i spe­ci­fič­ne slje­do­ve ba­za ko­ji su svoj­ stve­ni od­go­va­ra­ju­ćoj ak­cep­tor­skoj tR­NA. U ne­kim slu­ča­je­vi­ma vi­so­ka po­ uz­da­no­st pre­poz­na­va­nja ami­no­ki­se­li­na pot­je­če di­je­lom i od pro­ce­sa pro­vje­re či­ta­nja (ko­rek­tiv­ne fun­kci­je), u ko­jem se neis­prav­ni ami­noa­ci­l-

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA  Sli­ka 8-2. Ve­za­nje ami­no­ki­se­li­ne na tR­NA.  U pr­vom reak­cij­skom ko­ra­ku ami­no­ ki­se­li­ni se prid­ru­žu­je AMP, či­me nas­ta­je me­đup­ro­du­k t ami­noa­ci­l-A­MP. U dru­gom se ko­ra­ku ami­no­ki­se­li­na pre­no­si na 3' CCA kraj ak­cep­tor­ske tR­NA, a AMP se ot­puš­ta. Oba reak­cij­ska ko­ra­ka ka­ta­li­zi­ra­ju ami­noa­ci­l-tR­NA-sin­te­ta­ze.

AMP kom­plek­si hid­ro­li­zi­ra­ju, um­jes­to da bu­du prid­ru­že­ni tran­spor­tnim RNA ti­je­kom dru­go­ga ko­ra­ka reak­ci­je. Pre­poz­na­va­nje is­prav­ne tR­NA od stra­ne ami­noa­ci­l-tR­NA-sin­te­ta­ze ta­ko­đer je vi­so­kose­lek­tiv­no: sin­te­ta­za pre­poz­na­je spe­ci­fi­čan nuk­leo­tid­ni sli­jed (ko­ji u ve­ći­ni slu­ča­je­va obuh­va­ća i an­ti­ko­don) ko­ji je­din­stve­no iden­ti­fi­ci­ra sva­ku po­je­di­nu vr­stu tR­NA. Na­kon što se ami­no­ki­se­li­na po­ve­za­la s tR­NA, nas­ta­li se kom­ple­ks smješ­ ta na ka­lup mR­NA, što je pos­re­do­va­no kom­ple­men­tar­nim spa­ri­va­njem ba­ za ko­do­na u mR­NA i an­ti­ko­do­na tR­NA. Spa­ri­va­nje ba­za iz ko­do­na i an­ti­ ko­do­na neš­to je ma­nje stro­go od stan­dar­dnog spa­ri­va­nja ba­za A-U i G-C o ko­jem je bi­lo go­vo­ra u pret­hod­nim pog­lav­lji­ma. Zna­če­nje ovog neuo­bi­ ča­je­nog spa­ri­va­nja ba­za u pre­poz­na­va­nju ko­do­n-an­ti­ko­don po­ve­za­no je s re­dun­dan­ci­jom ge­ns­kog ko­da. Od 64 mo­gu­ća ko­do­na, tri su sto­p-ko­do­ni ko­ji sig­na­li­zi­ra­ju zav­r­še­tak tran­sla­ci­je, dok os­ta­lih 61 ko­di­ra­ju ami­no­ki­se­ li­ne (v. tab­l. 4-1). Suk­lad­no to­mu, ve­ći­na ami­no­ki­se­li­na od­re­đe­na je i vi­še ne­go jed­nim ko­do­nom. Ova re­dun­dan­ci­ja di­je­lom proiz­la­zi iz činjenice da se mno­ge ami­no­ki­se­li­ne mo­gu ve­za­ti s ne­ko­li­ko vr­sta tR­NA. E. co­li, prim­ je­ri­ce, pos­je­du­je oko 40 raz­li­či­tih tR­NA ko­je slu­že kao ak­cep­to­ri za 20 raz­ li­či­tih ami­no­ki­se­li­na. Uz to, ne­ke tR­NA mo­gu pre­poz­na­ti vi­še od jed­nog ko­do­na u mR­NA, što je pos­lje­di­ca nes­tan­dar­dnog spa­ri­va­nja ba­za (naz­va­ nog ko­le­ba­nje) iz­me­đu an­ti­ko­do­na tR­NA i ba­ze na tre­ćem po­lo­ža­ju ne­kih kom­ple­men­tar­nih ko­do­na (sl. 8-3). Slo­bod­ni­je spa­ri­va­nje ba­za na tom po­ lo­ža­ju di­je­lom pot­je­če od stva­ra­nja pa­ro­va ba­za G-U, a di­je­lom od mo­di­fi­ ka­ci­je gva­ni­na u ino­zin u an­ti­ko­do­ni­ma ne­ko­li­ci­ne tR­NA ti­je­kom do­ra­dbe (v. sl. 7-44). Ino­zin se mo­že spa­ri­ti s ba­za­ma C, U ili A na tre­ćem po­lo­ža­ju, ta­ko da pri­sut­no­st ove ba­ze u an­ti­ko­do­nu omo­gu­ću­je jed­noj tR­NA pre­poz­ na­va­nje tri­ju raz­li­či­tih ko­do­na u ka­lu­pu mR­NA.

Ri­bo­som Ri­bo­so­mi su mjes­ta na ko­ji­ma se od­vi­ja sin­te­za pro­tei­na, ka­ko u pro­ka­ riot­skim ta­ko i u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Pr­vot­no su opi­sa­ni kao čes­ti­ce de­tek­ti­ra­ne ul­tra­cen­tri­fu­gi­ra­njem sta­nič­nog li­za­ta, pa ih se sto­ga, čes­to ime­nu­je na te­me­lju nji­ho­ve br­zi­ne se­di­men­ta­ci­je: oz­na­ka 70S ko­ris­ti se za bak­te­rij­ske ri­bo­so­me, a oz­na­ka 80S za neš­to ve­će ri­bo­so­me eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Ri­bo­so­mi i pro­ka­riot­skih i eu­ka­riot­skih sta­ni­ca iz­gra­đe­ni su od dvi­je raz­li­či­te pod­je­di­ni­ce, ko­je ob­je sad­rž­ e ka­rak­te­ris­tič­ne pro­tei­ne i mo­ le­ku­le rR­NA. Či­nje­ni­ca da sta­ni­ce uo­bi­ča­je­no sad­r­ža­va­ju mno­go ri­bo­so­ma od­ra­ža­va sre­diš­nju važ­no­st sin­te­ze pro­tei­na u sta­nič­nom me­ta­bo­liz­mu. E. co­li, prim­je­ri­ce, sad­r­ža­va oko 20.000 ri­bo­so­ma, što pred­stav­lja prib­liž­no 25% su­he ma­se sta­ni­ce, dok br­zo­ras­tu­će sta­ni­ce si­sa­va­ca sad­rž­ a­va­ju oko 10 mi­li­ju­na ri­bo­so­ma. Prem­da se u ne­kim de­ta­lji­ma raz­li­ku­ju, os­nov­na je struk­tu­ra pro­ka­riot­ skih i eu­ka­riot­skih ri­bo­so­ma slič­na (sl. 8-4). Ma­la pod­je­di­ni­ca (obi­lje­že­na kao 30S) ri­bo­so­ma E. co­li, sas­to­ji se od 16S rR­NA i 21 pro­tei­na, a ve­li­ka je pod­je­di­ni­ca (50S) iz­gra­đe­na od 23S i 5S rR­NA i 34 pro­tei­na. Sva­ki ri­bo­som sad­r­ža­va jed­nu ko­pi­ju rR­NA i jed­nu ko­pi­ju sva­kog ri­bo­som­skog pro­tei­na, uz jed­nu iz­nim­ku: je­dan pro­tein 50S pod­je­di­ni­ce pri­su­tan je u če­ti­ri ko­pi­je. Pod­je­di­ni­ce eu­ka­riot­skih ri­bo­so­ma su ve­će i sad­r­ža­va­ju vi­še pro­tei­na u od­ no­su na od­go­va­ra­ju­će pod­je­di­ni­ce pro­ka­riot­skih ri­bo­so­ma. Ma­la je pod­je­ di­ni­ca (40S) eu­ka­riot­skih ri­bo­so­ma iz­gra­đe­na od 18S rR­NA i prib­liž­no 30

   311

312    POGLAVLJE 8 Sli­ka 8-3. Nes­tan­dar­dno spa­ri­va­nje ba­ za ko­do­n-an­ti­ko­don.  Spa­ri­va­nje ba­ze na tre­ćem po­lo­ža­ju ko­do­na ni­je stro­go, či­me je gva­ni­nu (G) omo­gu­će­no spa­ri­va­ nje s ura­ci­lom (U), a ino­zi­nu (I) iz an­ti­ko­ do­na spa­ri­va­nje s ura­ci­lom (U), ci­to­zi­nom (C) i ade­ni­nom (A). Pri­ka­za­na su dva prim­ je­ra neuo­bi­ča­je­no­ga spa­ri­va­nja, na te­me­ lju ko­jeg je fe­ni­la­la­nil (Phe) tR­NA omo­gu­ će­no pre­poz­na­va­nje ko­do­na UUC i UUU te ala­nil (Ala) tR­NA pre­poz­na­va­nje ko­do­ na GCU, GCC i GCA.

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   313

Sli­ka 8-4. Struk­tu­ra ri­bo­so­ma.  (A) Kom­po­nen­te pro­ ka­riot­skih i eu­ka­riot­skih ri­bo­so­ma. Na te­me­lju br­zi­ne se­ di­men­ta­ci­je pri­li­kom ul­tra­cen­tri­fu­gi­ra­nja, in­tak­tni se pro­ ka­riot­ski ri­bo­so­mi oz­na­ču­ju oz­na­kom 70S, a eu­ka­riot­ski oz­na­kom 80S. Iz­gra­đe­ni su od ve­li­ke i ma­le pod­je­di­ni­ce ko­je sad­r­ža­va­ju i ri­bo­som­ske pro­tei­ne i rR­NA. (B-C) Vi­ so­ko­re­zo­lu­cij­ska kris­tal­na struk­tu­ra (do­bi­ve­na X-zra­ka­ ma) ri­bo­som­ske pod­je­di­ni­ce 30S (B) i 50S (C). (B, iz B. T. Wim­ber­ly, D. E. Bro­der­sen, W. M. Cle­mo­ns, R. J. Mor­ga­ n-War­r­ner, A. P. Car­ter, C. Von­r­hein, T. Har­tr­sch and V. Ra­mak­ris­hnan, 2000. Na­tu­re 407:327. C, iz N. Ban, P. Nis­ sen, J. Han­sen, P. B. Moo­re and T. A. Stei­tz, 2000. Scien­ce 289:905.)

pro­tei­na, dok ve­li­ka pod­je­di­ni­ca (60S) sad­rž­ a­va 28S, 5,8S i 5S rR­NA te oko 45 pro­tei­na. Zbog svo­je ve­li­či­ne i kom­plek­snos­ti, vi­so­kore­zo­lu­cij­ska struk­ tur­na ana­li­za ri­bo­so­ma X-zra­ka­ma ni­je us­pješ­no iz­ve­de­na sve do 2000. go­ di­ne kad je pr­vi put ob­jav­lje­na struk­tu­ra i pod­je­di­ni­ce 50S i 30S. Kao što će u dalj­njem tek­stu bi­ti do­dat­no ras­prav­lja­no, ras­vjet­lja­va­nje struk­tu­re ri­bo­ so­ma na atom­skoj ra­zi­ni bi­lo je ključ­no za ra­zu­mi­je­va­nje nji­ho­ve fun­kci­je. Važ­no je svoj­stvo ri­bo­so­ma da se mo­gu for­mi­ra­ti in vit­ro, sa­moud­ru­ži­ va­njem od­go­va­ra­ju­ćih RNA i pro­tei­na. Kao što je Ma­saya­su No­mu­ra pr­ vot­no opi­sao 1968. go­di­ne, pro­čiš­će­ni će ri­bo­som­ski pro­tei­ni i mo­le­ku­le rR­NA kad se po­mi­je­ša­ju za­jed­no, pod od­go­va­ra­ju­ćim uv­je­ti­ma, po­no­vo stvo­ri­ti fun­kcio­nal­ne ri­bo­so­me. Prem­da je ud­ru­ži­va­nje ri­bo­so­ma in vi­vo (po­se­bi­ce u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma) znat­no slo­že­ni­je, spo­sob­no­st ri­bo­so­ ma da se sa­moud­ru­žu­ju in vit­ro, osi­gu­ra­la je va­žan ek­spe­ri­men­tal­ni pris­ tup, omo­gu­ćiv­ši na taj na­čin is­pi­ti­va­nje ulo­ge sva­kog po­je­di­nog pro­tei­na i mo­le­ku­le rR­NA.

314    POGLAVLJE 8 ▶▶ Prem­da je sli­jed nuk­leo­ti­da

u ri­bo­som­skim RNA vi­so­ko­oču­ van, ti­je­kom evo­lu­ci­je su se do­ go­di­le zam­je­ne. Up­ra­vo je sto­ ga, us­po­red­ba slje­do­va rRNA snaž­na alat­ka u od­re­đi­va­nju evo­lu­cij­skih od­no­sa iz­me­đu raz­ li­či­tih vr­sta.

Sli­ka 8-5. Struk­tu­ra 16S RNA.  Kom­ ple­men­tar­no spa­ri­va­nje ba­za re­zul­ti­ra stva­ra­njem spe­ci­f ič­ne se­kun­dar­ne struk­ tu­re. (Iz M. M. Yu­su­pov, G. Z. Yu­su­po­va, A. Bau­com, K. Lie­ber­man, T. N. H. Ear­ ne­st, J. H. D. Ca­te and H. F. Nol­ler. 2001. Scien­ce 292:883.)

Kao i tran­spor­tne RNA, i ri­bo­som­ske RNA pu­tem kom­ple­men­tar­nog spa­ri­va­nja ba­za stva­ra­ju ka­rak­te­ris­tič­ne se­kun­dar­ne struk­tu­re (sl. 8-5). Po­ ve­zu­ju­ći se s ri­bo­som­skim pro­tei­ni­ma ri­bo­som­ske RNA do­dat­no se sma­ta­ ju u po­seb­ne tro­di­men­zio­nal­ne struk­tu­re. Pr­vot­no se smat­ra­lo da ri­bo­ som­ske RNA ima­ju struk­tur­nu ulo­gu, od­nos­no da osi­gu­ra­va­ju kos­tur ko­ji sje­di­nju­je ri­bo­som­ske pro­tei­ne. Ot­kri­ćem ka­ta­li­tič­kih oso­bi­na dru­gih vr­sta RNA, prim­je­ri­ce, RNa­ze P i sa­mop­rek­ra­ja­ju­ćih in­tro­na o ko­ji­ma je bi­lo go­vo­ra u 7. pog­lav­lju, uve­li­ke se po­če­la raz­mat­ra­ti mo­gu­ća ka­ta­li­tič­ka ulo­ ga rR­NA. U skla­du s tom pret­pos­tav­kom, ut­vr­đe­no je da je rR­NA nuž­na za ud­ru­ži­va­nje fun­kcio­nal­nih ri­bo­so­ma in vit­ro. S dru­ge stra­ne, izos­tav­lja­ nje mno­gih ri­bo­som­skih pro­tei­na re­zul­ti­ra­lo je sma­nje­njem, ali ne i pot­pu­ nim gu­bit­kom ri­bo­som­ske aktiv­nos­ti. Pr­vi iz­rav­ni do­kaz o ka­ta­li­tič­koj ak­tiv­nos­ti rR­NA proi­za­šao je iz ek­spe­ ri­me­na­ta Har­ry Nol­le­ra i nje­go­vih su­rad­ni­ka 1992. go­di­ne. Ovi su znan­ stve­ni­ci po­ka­za­li da ve­li­ka ri­bo­som­ska pod­je­di­ni­ca mo­že ka­ta­li­zi­ra­ti nas­ta­ ja­nje pep­tid­ne ve­ze (reak­ci­ja pep­ti­di­l-tran­sfe­ra­ze) čak i kad je 90%

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   315

ri­bo­som­skih pro­tei­na uk­lo­nje­no stan­dar­dnim pos­tup­ci­ma ek­strak­ci­je pro­ tei­na. Sup­rot­no to­mu, na­kon prim­je­ne RNa­ze, stva­ra­nje pep­tid­ne ve­ze u pot­pu­nos­ti je do­ki­nu­to, či­me je snaž­no po­dup­r­ta hi­po­te­za da ovu reak­ci­ju ka­ta­li­zi­ra RNA. No, ka­ko je pri­sut­no­st ne­kih ri­bo­som­skih pro­tei­na bi­la nuž­na za od­r­ža­va­nje in­tak­tnos­ti RNA, još uvi­jek ni­je bi­lo mo­gu­će u pot­pu­ nos­ti is­klju­či­ti mo­guć­no­st da stva­ra­nje pep­tid­ne ve­ze ka­ta­li­zi­ra­ju pro­tei­ni. Ned­voj­be­ni do­kaz o to­me da rR­NA ka­ta­li­zi­ra reak­ci­ju stva­ra­nja pep­tid­ ne ve­ze proi­zi­šao je iz pr­vih struk­tur­nih ana­li­za vis­o­ke raz­lu­či­vos­ti 50S ri­bo­som­ske pod­je­di­ni­ce, ko­je su 2000. go­di­ne ob­ja­vi­li Pe­ter Moo­re, Tho­ mas Sei­tz i nji­ho­vi su­rad­ni­ci (sl. 8-6). Uvid u struk­tu­ru ri­bo­so­ma na atom­ skoj ra­zi­ni ot­krio je da ri­bo­som­ski pro­tei­ni ni­su pri­sut­ni na mjes­tu u ko­ jem se od­vi­ja reak­ci­ja pep­ti­di­l-tran­sfe­ra­ze, či­me je pot­vr­đe­no da rR­NA ka­ta­li­zi­ra reak­ci­ju stva­ra­nja pep­tid­ne ve­ze. Dalj­nje su stu­di­je ras­vi­jet­li­le me­ha­ni­zam ko­jim rR­NA ka­ta­li­zi­ra pep­ti­dil-tran­sfe­raz­nu reak­ci­ju i po­ka­za­ le da ve­li­ka ri­bo­som­ska pod­je­di­ni­ca dje­lu­je kao ri­bo­zim. Prem­da su smat­ ra­ni pri­mar­nim ka­ta­li­tič­kim di­je­lo­vi­ma ri­bo­so­ma, da­nas se smat­ra da ribo­ som­ski pro­tei­ni ima­ju ug­lav­nom struk­tur­nu ulo­gu. Iz­rav­na uk­lju­če­no­st rR­NA u reak­ci­ju pep­ti­di­l-tran­sfe­ra­ze ima važ­ne po­ s­lje­di­ce i za evo­lu­ci­ju. Smat­ra se da su RNA pr­ve sa­mo­rep­li­ci­ra­ju­će ma­kro­ mo­le­ku­le (v. pog­l. 1). Ovu pret­pos­tav­ku snaž­no po­du­pi­re či­nje­ni­ca da ri­ bo­zi­mi, kao što su RNa­za P i sa­mop­rek­ra­ja­ju­ći in­tro­ni, mo­gu ka­ta­li­zi­ra­ti reak­ci­je u ko­ji­ma su sup­stra­ti RNA. Ulo­ga rR­NA u stva­ra­nju pep­tid­ne ve­ze pro­ši­ru­je ka­ta­li­tič­ku ak­tiv­no­st RNA od sa­mo­rep­li­ka­ci­je sve do iz­rav­ne uk­ lju­če­nos­ti u sin­te­zu pro­tei­na. Do­dat­ne su stu­di­je po­ka­za­le da ri­bo­zim­ska rR­NA iz pra­ži­vo­ti­nje Tet­ra­hyme­na mo­že ka­ta­li­zi­ra­ti ve­za­nje ami­no­ki­se­li­na na RNA i ti­me ot­vo­ri­le mo­guć­no­st da su iz­vor­ne ami­noa­ci­l-tR­NA-sin­te­ta­ ze vje­ro­jat­no bi­le ri­bo­nuk­lein­ske ki­se­li­ne, a ne pro­tei­ni. Či­nje­ni­ca da mo­ le­ku­le RNA mo­gu ka­ta­li­zi­ra­ti reak­ci­je nuž­ne za sin­te­zu pro­tei­na kao i reak­ ci­je sa­mo­rep­li­ka­ci­je, mo­že pred­stav­lja­ti važ­nu spo­nu za ra­zu­mi­je­va­nje ra­ne evo­lu­ci­je sta­ni­ca.

Sli­ka 8-6. Struk­tu­ra 50S ri­bo­som­ske pod­je­di­ni­ ce.  Vi­so­ko­re­zo­lu­cij­ski mo­del ri­bo­som­ske pod­je­ di­ni­ce 50S s tri mo­le­ku­le tR­NA ve­za­ne na mjes­ta A, P i E na ri­bo­so­mu (v. sl. 8-12). Ri­bo­som­ski su pro­tei­ni pri­ka­za­ni ru­ži­čas­tom, a rR­NA pla­vom bo­ jom. (Iz P. Nis­sen, J. Han­sen, N. Ban, P. B. Moo­re and T. A. Stei­tz. 2000. Scien­ce 289:920.)

316    POGLAVLJE 8

KL JUČNI POKUS

Katalitička uloga ribosomske RNA Unu­sual Re­sis­tan­ce of Pep­ti­dyl Tran­sfe­ra­se to Pro­tein Extraction Pro­ce­du­res Har­ry F. Nol­ler, Ver­ni­ta Hof­far­th, and Lu­dwi­ka Zim­niak Uni­ver­si­ty of Ca­li­for­nia at San­ta Cruz Scien­ce, vol. 256, 1992, str. 1416–1419

Kon­tek­st Ulo­ga ri­bo­so­ma u sin­te­zi pro­tei­na ras­ vije­tlje­na je šez­de­se­tih go­di­na 20. sto­ lje­ća. U tom su raz­dob­lju ri­bo­so­mi opi­ si­va­ni kao čes­ti­ce ko­je se sas­to­je od pro­tei­na i RNA te je us­pješ­no obav­ljen ek­spe­ri­me­nt us­pos­tav­lja­nja fun­kcio­nal­ nih ri­bo­so­ma iz pro­čiš­će­nih gra­div­nih kom­po­nen­ti. Ta­da se smat­ra­lo da stva­ ra­nje pep­tid­ne ve­ze (reak­ci­ju pep­ti­di­ltran­sfe­ra­ze) ka­ta­li­zi­ra­ju ribo­som­ski pro­ tei­ni, a da rR­NA ug­lav­nom pri­do­no­si od­r­ža­nju struk­tu­re ri­bo­so­ma. U ra­nim se­dam­de­se­ti­ma, do­ka­zi su ipak po­če­li su­ge­ri­ra­ti da bi mo­le­ku­le ri­bo­som­ske RNA mog­le iz­rav­ni­je sud­je­lo­va­ti u pro­ tein­skoj sin­te­zi. Prim­je­ri­ce, ut­vr­đe­no je da mno­gi ri­bo­som­ski pro­tei­ni ni­su esen­ci­jal­ni za fun­kci­ju ri­bo­so­ma. Su­ prot­no to­mu, po­ka­za­no je da su slje­ do­vi ne­kih di­je­lo­va rR­NA dob­ro oču­ va­ni ti­je­kom evo­lu­ci­je, što je upu­ći­va­lo na ključ­nu fun­kcio­nal­nu ulo­gu ovih di­ je­lo­va mo­le­ku­le rR­NA. U ra­nim osam­de­se­ti­ma, na te­me­lju stu­di­ja To­ma Cec­ha pro­ve­de­nih na ri­ bo­zi­mu iz pra­ži­vo­ti­nje Tet­ra­hyme­na i stu­di­ja Sid­neya Al­tma­na pro­ve­de­nih na RNa­zi P, ut­vr­đe­na je ka­ta­li­tič­ka ak­ tiv­no­st mo­le­ku­la RNA. Ova su ot­kri­ća stvo­ri­la te­me­lje za pret­pos­tav­ku da je rR­NA iz­rav­no uk­lju­če­na u ka­ta­li­zu stva­ ra­nja pep­tid­ne ve­ze. Ne­po­bit­ni do­kaz, ko­ji je pot­vr­dio pred­lo­že­nu ulo­gu rR­NA pru­ži­li su u svom član­ku Har­ry Nol­ler i nje­go­vi su­rad­ni­ci, 1992. go­di­ne.

Ek­spe­ri­men­ti U stu­di­ja­ma ka­ta­li­tič­ke ak­tiv­nos­ti rR­NA, Nol­ler i su­rad­ni­ci ko­ris­ti­li su po­jed­no­ stav­nje­nu mo­del­nu reak­ci­ju za od­re­đi­ va­nje pep­ti­di­l-tran­sfe­raz­ne ak­tiv­nos­ti. U reak­ci­ji je mje­ren pri­je­nos ra­dioak­ tiv­no obi­lje­že­nog N-for­mil­me­tio­ni­na s frag­men­ta tR­NA na ami­no-sku­pi­nu

pu­ro­mi­ci­na, an­ti­bio­ti­ka ko­ji sli­či ami­no­ a­ci­l-tR­NA i mo­že stvo­ri­ti pep­tid­nu ve­zu s ras­tu­ćim po­li­pep­tid­nim lan­cem. Pred­ no­st ove mo­del­ne reak­ci­je pep­ti­diltran­sfe­ra­ze je­st da se mo­že pro­ves­ti s izo­li­ra­nom ri­bo­somskom pod­je­di­ni­com 50S; ma­la ri­bo­som­ska pod­je­di­ni­ca, dru­ gi pro­tein­ski fak­to­ri, kao ni mR­NA ni­su pot­reb­ni za od­vi­ja­nje ove reak­ci­je. Is­tra­ži­va­či su za­tim is­pi­ta­li ulo­gu rR­NA mje­re­njem pep­ti­di­l-tran­sfe­raz­ne ak­tiv­ no­s­ti pod­je­di­ni­ce 50S iz ko­je su ri­bo­ som­ski pro­tei­ni uk­lo­nje­ni stan­dar­dnim pos­tup­ci­ma ek­strak­ci­je pro­tei­na. Va­žan de­talj ovih po­ku­sa bi­la je upo­ra­ba ri­bo­ so­ma iz bak­te­ri­je Ther­mus aqua­ti­cus. S ob­zi­rom na to da ove bak­te­ri­je ži­ve pri vi­so­kim tem­pe­ra­tu­ra­ma, smat­ra­lo se da je struk­tu­ra nji­ho­ve rRNA sta­bil­ni­ja od struk­tu­re rR­NA iz E. co­li. Klju­čan je bio re­zul­tat da je pep­ti­di­l-tran­sfe­raz­na ak­ tiv­no­st ri­bo­so­ma iz T. aqua­ti­cus bi­la u pot­pu­nos­ti ot­por­na na snaž­ne ek­strak­ cij­ske pos­tup­ke, prim­je­nu de­ter­ge­na­ta, pro­tea­za i fe­no­la (vi­di sli­ku). Što je još zna­čaj­ni­je, pep­ti­di­l-tran­sfe­raz­na ak­tiv­ no­st bi­la je u pot­pu­nos­ti oču­va­na čak i na­kon po­nov­lje­nih ek­strak­ci­ja, ko­ji­ma je uk­lo­nje­no 90% ri­bo­som­skih pro­tei­na. Sup­rot­no to­mu, pep­ti­di­l-tran­sfe­raz­na je ak­tiv­no­st, bi­lo in­tak­tnih, bi­lo ek­stra­hi­ra­ nih ri­bo­so­ma bi­la iz­nim­no os­jet­lji­va čak i na krat­ko iz­la­ga­nje dje­lo­va­nju RNa­ze. Prem­da na te­me­lju ovih po­ku­sa ni­je bi­ lo mo­gu­će is­klju­či­ti po­ten­ci­jal­nu ulo­gu ri­bo­som­skih pro­tei­na zaos­ta­lih na­kon ek­strak­ci­je, do­bi­ve­ni su re­zul­ta­ti pru­ži­li snaž­nu pot­po­ru pret­pos­tav­ci o iz­rav­ nom sud­je­lo­va­nju ri­bo­somske RNA 23S u pep­ti­dil-tran­sfe­raz­noj reak­ci­ji.

Ut­je­caj Re­zul­ta­ti Nol­le­ro­vih po­ku­sa ko­nač­no su pot­vr­đe­ni ana­li­zom 50S ri­bo­som­

Harry F. Noller

ske pod­je­di­ni­ce pri vi­so­kom raz­lu­či­va­ nju ko­ju su 2000. go­di­ne ob­ja­vi­li Pe­ter Moo­re, Tho­mas Stei­tz i nji­ho­vi su­rad­ ni­ci. Po­ka­za­no je da mjes­to na ri­bo­ so­mu u ko­jem se od­vi­ja pep­ti­di­l-tran­ sfe­raz­na reak­ci­ja sad­r­ža­va sa­mo rR­NA, a da ri­bo­som­ski pro­tei­ni ni­su pri­sut­ni. Ovi su re­zul­ta­ti uk­lo­ni­li sva­ku sum­nju o ka­ta­li­tič­koj ulo­zi rR­NA u ovoj reak­ci­ ji te su po­ka­za­li da te­melj­nu reak­ci­ju sin­te­ze pro­tei­na ka­ta­li­zi­ra ri­bo­som­ska RNA. Ova ot­kri­ća ne sa­mo da su ima­la sna­žan ut­je­caj na ra­zu­mi­je­va­nje fun­ kci­je ri­bo­so­ma, već su uve­li­ke pro­ši­ri­la spoz­na­je o pret­hod­no opi­sa­nim ka­ta­ li­tič­kim ak­tiv­nos­ti­ma mo­le­ku­la RNA te

Peptidil-transferazna aktivnost mjerena je pra­ ćenjem nastalog radioaktivnog N-formil me­ tionin-puromicina (f-Met-puro), primjenom elek­troforeze i autoradiografije. Ribosomi iz T. aquaticus izloženi su ekstrakciji proteina ili djelovanju RNaze, kao što je pokazano na slici.

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   317

KL JUČNI POKUS su osi­gu­ra­la no­ve vri­jed­ne do­ka­ze ko­ji go­vo­re u pri­log hi­po­te­zi pre­ma ko­joj je ra­ni pe­riod evo­lu­ci­je bio svi­jet RNA na­ pu­čen sa­mo­rep­li­ci­ra­ju­ćim mo­le­ku­la­ma RNA. Ova je hi­po­te­za pret­hod­no te­me­

lje­na na spo­sob­nos­ti mo­le­ku­la RNA da ka­ta­li­zi­ra­ju reak­ci­je pot­reb­ne za nji­ho­ vu vlas­ti­tu rep­li­ka­ci­ju. Ot­kri­će da RNA mo­že ka­ta­li­zi­ra­ti reak­ci­je ko­je sud­je­lu­ju u sin­te­zi pro­tei­na, pru­ži­lo je do­kaz o iz­

rav­noj ve­zi iz­me­đu svi­je­ta RNA i pro­to­ ka ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je u da­naš­njim sta­ni­ca­ma, u ko­ji­ma rR­NA sud­je­lu­je u ključ­nim reak­ci­ja­ma stva­ra­nja pep­tid­ ne ve­ze.

Or­ga­ni­za­ci­ja mR­NA i ini­ci­ja­ci­ja tran­sla­ci­je Prem­da su me­ha­niz­mi sin­te­ze pro­tei­na u pro­ka­riot­skim i eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma slič­ni, pos­to­je i ne­ke raz­li­ke, po­se­bi­ce u sig­na­li­ma ko­ji od­re­đu­ju mjes­to po­čet­ka sin­te­ze pro­tei­na na ka­lu­pu mR­NA (sl. 8-7). Tran­sla­ci­ja ne za­po­či­nje na 5' kra­ju mR­NA, već na spe­ci­fič­nom ini­ci­ja­cij­skom mjes­tu. Sto­ga su i kod pro­ka­riot­skih i kod eu­ka­riot­skih mR­NA di­je­lo­vi na 5' kra­ju ne­ko­di­ra­ju­ći slje­do­vi, naz­va­ni 5' net­ran­sla­ti­ra­na (nep­re­ve­de­na) pod­ruč­ja (en­gl. un­tran­sla­ted re­gion, UTR). Eu­ka­riot­ska mR­NA ug­lav­nom ko­di­ra sa­ mo je­dan po­li­pep­tid­ni la­nac, ali mno­ge pro­ka­riot­ske mR­NA ko­di­ra­ju vi­še po­li­pep­ti­da ko­ji se sin­te­ti­zi­ra­ju neo­vis­no, s tim da sin­te­za za­po­či­nje na za­ seb­nim ini­ci­ja­cij­skim mjes­ti­ma. Prim­je­ri­ce, lac ope­ron iz E. co­li sad­rž­ a­va tri ge­na ko­ji se pre­vo­de s is­te mR­NA (v. sl. 7-8). Glas­nič­ke RNA ko­je ko­ di­ra­ju vi­še po­li­pep­ti­da naz­va­ne su po­li­cis­tron­ske, dok mo­no­cis­tron­ske mR­NA ko­di­ra­ju je­dan po­li­pep­tid­ni la­nac. Ko­nač­no, i pro­ka­riot­ske i eu­ka­ri­ ot­ske mR­NA zav­r­ša­va­ju 3' net­ran­sla­ti­ra­nim (nep­re­ve­de­nim) pod­ruč­ji­ma. I u pro­ka­riot­skim i u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, tran­sla­ci­ja uvi­jek za­po­či­ nje ami­no­ki­se­li­nom me­tio­ninom, ko­ja je naj­češ­će ko­di­ra­na ko­do­nom AUG. Al­ter­na­tiv­ni se ini­ci­ja­cij­ski ko­do­ni, kao što je prim­je­ri­ce ko­don GUG, ko­ ris­te pov­re­me­no, ali kad se na­đu na mjes­tu po­čet­ka po­li­pep­tid­nog lan­ca ovi ko­do­ni od­re­đu­ju ug­rad­nju me­tio­ni­na, a ne ami­no­ki­se­li­ne ko­ju uo­bi­ča­je­no ko­di­ra­ju (GUG je ko­don za va­lin). Kod ve­ći­ne bak­te­ri­ja, sin­te­za pro­tei­na za­po­či­nje mo­di­fi­ci­ra­nim me­tio­nin­skim os­tat­kom (N-for­mil­me­tio­ni­nom), dok kod eu­ka­rio­ta sin­te­za za­po­či­nje ne­mo­di­fi­ci­ra­nim me­tio­ni­nom (osim u mi­to­hon­dri­ji­ma i klo­rop­las­ti­ma, čiji ri­bo­so­mi sli­če bak­te­rij­ski­ma).

Sli­ka 8-7. Pro­ka­riot­ske i eu­ka­riot­ske mR­NA.  I pro­ka­riot­ske i eu­ka­riot­ske mR­NA sad­r­že net­ran­sla­ti­ra­na pod­ruč­ ja (UTR) na svo­jim 5' i 3' kra­je­vi­ma. Eu­ ka­riot­ske mR­NA sad­r­ža­va­ju ta­ko­đer 5' 7-metilgvanozinske (m7G) ka­pe i 3' po­ li-A re­po­ve. Pro­ka­riot­ske su mR­NA čes­to po­li­cis­tron­ske: ko­di­ra­ju vi­še pro­tei­na, od ko­jih se sva­ki pre­vo­di s neo­vis­nog mjes­ ta po­čet­ka tran­sla­ci­je. Eu­ka­riot­ske mR­NA naj­češ­će su mo­no­cis­tron­ske, od­nos­no, ko­di­ra­ju sa­mo je­dan pro­tein.

318    POGLAVLJE 8 Sli­ka 8-8. Sig­na­li za ini­ci­ja­ci­ju trans­ la­ci­je.  Ini­ci­ja­cij­ska mjes­ta na pro­ka­ ri­ot­skim mR­NA obi­lje­že­na su sli­je­dom Shi­ne-Del­gar­no ko­ji pret­ho­di ini­ci­ja­cij­ skom ko­do­nu AUG. Spa­ri­va­nje ba­za iz sli­je­da Shi­ne-Del­gar­no i kom­ple­men­tar­ nog sli­je­da bli­zu 3' kra­ja 16S rR­NA smješ­ ta mR­NA na ri­bo­som. Sup­rot­no to­mu, eu­ka­riot­ske su mR­NA na ri­bo­som­sku pod­je­di­ni­cu 40S ve­za­ne pre­ko svo­jih 5' 7-metilgvanozinskih ka­pa. Ri­bo­som za­ tim pret­ra­žu­je uz­duž mR­NA sve dok ne nai­đe na ini­ci­ja­cij­ski ko­don AUG.

Sig­na­li ko­ji od­re­đu­ju ini­ci­ja­cij­ske ko­do­ne raz­li­či­ti su kod pro­ka­riot­skih i eu­ka­riot­skih sta­ni­ca, što je u sug­las­ju s raz­li­či­tim fun­kci­ja­ma po­li­cis­tron­ skih i mo­no­cis­tron­skih mR­NA (sl. 8-8). Ini­ci­ja­cij­skim ko­do­ni­ma u bak­te­ rij­skim mR­NA pret­ho­di spe­ci­fi­čan sli­jed (naz­van sli­jed Shi­ne-Del­gar­no, pre­ma nje­go­vim ot­kri­va­či­ma, Jo­hn Shi­ne i Lynn Del­gar­no) ko­ji smješ­ta mR­NA na ri­bo­som za tran­sla­ci­ju ta­ko što se spa­ru­je s ba­za­ma kom­ple­men­ tar­nog sli­je­da bli­zu 3' kra­ju 16S rR­NA. Ovo spa­ri­va­nje ba­za omo­gu­ću­je bak­te­rij­skim ri­bo­so­mi­ma za­po­či­nja­nje tran­sla­ci­je ne sa­mo na 5' kra­ju mR­ NA već i na unu­tar­njim ini­ci­ja­cij­skim mjes­ti­ma po­li­cis­tron­ske mR­NA. Sup­rot­no to­mu, kod eu­ka­rio­ta ri­bo­so­mi ve­ći­nu mR­NA pre­poz­na­ju ve­za­ njem na 7-metilgvanozinsku ka­pu smješ­te­nu na 5' kra­ju mR­NA (v. sl. 7-45). Ri­bo­so­mi, za­tim, pret­ra­žu­ju mR­NA niz­vod­no od 5' kra­ja sve dok ne nai­đu na ini­ci­ja­cij­ski ko­don (naj­češ­će AUG). Slje­do­vi ko­ji ok­ru­žu­ju ko­don AUG ut­je­ču na učin­ko­vi­to­st ini­ci­ja­ci­je, pa se u ne­kim slu­ča­je­vi­ma do­ga­đa da pr­vi ko­don AUG u mR­NA bu­de pres­ko­čen te da tran­sla­ci­ja za­poč­ne na slje­de­ćem ko­do­nu AUG ko­ji se na­la­zi niz­vod­no. Ta­ko­đer tre­ba spo­me­nu­ti da ne­ko­li­ko vi­rus­nih i sta­nič­nih mR­NA ima­ ju unu­tar­nja mjes­ta ulas­ka ri­bo­so­ma, pa na nji­ma tran­sla­ci­ja mo­že za­po­če­ ti ve­za­njem ri­bo­so­ma na unu­tar­nji po­lo­žaj na mR­NA. Či­ni se da taj al­ter­ na­tiv­ni me­ha­ni­zam za­po­či­nja­nja sin­te­ze fun­kcio­ni­ra u uv­je­ti­ma sta­nič­nog stre­sa ka­ko bi omo­gu­ćio se­lek­tiv­nu tran­sla­ci­ju ne­kih mR­NA ka­da je nor­ ma­lan na­čin ini­ci­ja­ci­je na 5' ka­pi in­hi­bi­ran, o če­mu će bi­ti ras­prav­lja­no kas­ni­je u ovom pog­lav­lju. Ovaj mo­le­ku­lar­ni me­ha­ni­zam ko­jim tran­sla­ci­ja za­po­či­nje na unu­tar­njim mjes­ti­ma ulas­ka ri­bo­so­ma ni­je u pot­pu­nos­ti raz­ jaš­njen te je još uvi­jek pod­ruč­je in­ten­ziv­nih is­tra­ži­va­nja. 8.1. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Tran­sla­ci­ja. Tran­sla­ci­ja je sin­te­za po­li­pep­ti­da na te­me­lju in­for­ma­ci­ja iz RNA.

Pro­ces tran­sla­ci­je Pro­ces tran­sla­ci­je ili pre­vo­đe­nja mo­gu­će je op­će­ni­to po­di­je­li­ti u tri ko­ ra­ka: ini­ci­ja­ci­ju, elon­ga­ci­ju i ter­mi­na­ci­ju (sl. 8-9). I kod pro­ka­rio­ta i kod eu­ka­rio­ta pr­vi je ko­rak ini­ci­ja­cij­skog stup­nja ve­za­nje spe­ci­fič­ne ini­ci­ja­tor­ Tab­li­ca 8-1. Tran­sla­cij­ski fak­to­ri Ulo­ga Pro­ka­rio­ti Ini­ci­ja­ci­ja IF1, IF2, IF3 Elon­ga­ci­ja Ter­mi­na­ci­ja

EF-Tu, EF-Ts, EF-G RF1, RF2, RF3

Eu­ka­rio­ti eIF1, eI­F1A, eI­F2, eI­F2B, eI­F3, eIF4A,   eI­F4B, eI­F4E, eI­F4G, eI­F5 eE­F1α, eEFβγ, eE­F2 eR­F1, eR­F3

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   319

Sli­ka 8-9. Preg­led tran­sla­ci­je.

ske me­tio­ni­l-tR­NA i mR­NA za ma­lu ri­bo­som­sku pod­je­di­ni­cu. Za­tim se ovom kom­plek­su prid­ru­žu­je ve­li­ka ri­bo­som­ska pod­je­di­ni­ca, či­me se stva­ra fun­kcio­nal­ni ri­bo­som na ko­jem se da­lje nas­tav­lja pro­ces elon­ga­ci­je po­li­ pep­tid­nog lan­ca. Za od­vi­ja­nje po­je­di­nih stup­nje­va pro­ce­sa tran­sla­ci­je nuž­ na je pri­sut­no­st broj­nih spe­ci­fič­nih ne­ri­bo­som­skih pro­tei­na (tab­l. 8-1).

Sli­ka 8-10. Ini­ci­ja­ci­ja tran­sla­ci­je kod bak­te­ri­ja.  Pr­vo se tri ini­ci­ja­cij­ska fak­to­ ra (IF1, IF2, IF3) ve­žu za ri­bo­som­sku pod­ je­di­ni­cu 30S. Za­tim se ovom kom­plek­su prid­ru­žu­ju mR­NA i ini­ci­ja­tor­ska N-formilmetionin (fMet) tR­NA, ko­ju pre­poz­na­je fak­tor IF2, ve­zan s GTP. IF1 i IF3 se za­tim ot­puš­ta­ju, a pod­je­di­ni­ca 50S se ve­že za kom­ple­k s po­ti­ču­ći hid­ro­li­zu GTP i ot­puš­ ta­nje IF2, na ko­ji je sa­da ve­zan GDP.

320    POGLAVLJE 8 Sli­ka 8-11. Ini­ci­ja­ci­ja tran­sla­ci­je kod eu­ka­riot­skih sta­ni­ca.  Ini­ci­ja­cij­ski fak­ to­ri eI­F3, eI­F1A i eI­F5 ve­žu se na ri­bo­ som­sku pod­je­di­ni­cu 40S. Ini­ci­ja­tor­ska me­tio­ni­l-tR­NA je ve­za­na s eI­F2 (ko­ji je u kom­plek­su s GTP) i stva­ra kom­ple­k s s pod­je­di­ni­com 40S. mR­NA na pod­je­di­ni­ cu do­no­se fak­to­ri eI­F4E (ko­ji se ve­že na 5' ka­pu), eI­F4G (ko­ji se ve­že i na eI­F4E na 5' ka­pi i na PABP na 3' po­li-A re­pu), eI­F4A i eI­F4B. Ri­bo­som za­tim niz­vod­no pret­ra­žu­je mR­NA sve dok ne na­đe pr­vi ini­ci­ja­cij­ski ko­don AUG. Za pret­ra­ži­va­nje je pot­reb­na ener­gi­ja, pa se ovaj pro­ces sto­ga od­vi­ja uz hid­ro­li­zu ATP. Kad je ini­ ci­ja­cij­ski ko­don AUG ot­kri­ven, fak­tor eI­F5 po­ti­če hid­ro­li­zu GTP ve­za­nog na eI­F2 što iza­zi­va ot­puš­ta­nje eI­F2 (sa­da u kom­plek­ su s GDP), kao i ot­puš­ta­nje os­ta­lih fak­ to­ra ini­ci­ja­ci­je. Za­tim se 40S kom­plek­su prid­ru­žu­je ri­bo­som­ska pod­je­di­ni­ca 60S, što olak­ša­va eI­F5B.

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

Ini­ci­ja­ci­ja kod bak­te­ri­ja za­po­či­nje ve­za­njem ri­bo­som­ske pod­je­di­ni­ce 30S s dva ini­ci­ja­cij­ska fak­to­ra IF1 i IF3 (sl. 8-10). Tre­ći ini­ci­ja­cij­ski fak­tor (IF2, ko­ji je ve­zan na GTP), mR­NA i ini­ci­ja­tor­ska N-for­mi­l-me­tio­nil-tR­NA se za­tim prid­ru­žu­ju kom­plek­su, s tim da IF2 spe­ci­fič­no in­te­rrea­gi­ra s ini­ci­ja­ tor­skom tR­NA. tR­NA se za­tim ve­že na ini­ci­ja­cij­ski ko­don na mR­NA, a IF1 i IF3 se ot­puš­ta­ju. Po­tom se kom­plek­su prid­ru­žu­je ri­bo­som­ska pod­je­di­ni­ca 50S, što po­ti­če hid­ro­li­zu GTP ve­za­nog na IF2 i ot­puš­ta­nje IF2 (ve­za­nog na GDP) iz kom­plek­sa. To re­zul­ti­ra stva­ra­njem ini­ci­ja­cij­skog kom­plek­sa 70S (s mR­NA i ini­ci­ja­tor­skom tR­NA ve­za­nim za ri­bo­som) ko­ji je spre­man za stva­ ra­nje pep­tid­ne ve­ze ti­je­kom elon­ga­cij­skog ko­ra­ka tran­sla­ci­je. Ini­ci­ja­ci­ja je kod eu­ka­rio­ta mno­go slo­že­ni­ja i zah­ti­je­va ba­rem je­da­nae­st pro­tei­na (od ko­jih se sva­ki sas­to­ji od vi­še po­li­pep­tid­nih la­na­ca), naz­va­nih eIF (euka­riot­ski ini­ci­ja­cij­ski fakto­ri; v. tab­l. 8-1). Fak­to­ri eI­F1, eI­F1A, eI­F3 i eI­F5 ve­žu se za ri­bo­som­sku pod­je­di­ni­cu 40S, a eI­F2 (ko­ji je pri­su­tan u kom­plek­su s GTP) ve­že se na ini­ci­ja­tor­sku me­tio­ni­l-tR­NA (sl. 8-11). Prei­ ni­ci­ja­cij­ski kom­ple­ks za­tim nas­ta­je po­ve­zi­va­njem pod­je­di­ni­ce 40S i in­ici­ja­ tor­ske tR­NA. Glas­nič­ku RNA pre­poz­na­ju i na ri­bo­som do­no­se fak­to­ri sku­ pi­ne eI­F4. Elon­ga­cij­ski fak­tor eI­F4E ko­ji stva­ra kom­ple­ks s eF4A i eF4G pre­poz­na­je 5' ka­pu glas­nič­ke RNA. eIF4G se ta­kođer ve­že na pro­tein ko­ji ve­že po­li-A (en­gl. po­ly-A pro­tein, PABP), ko­ji je po­ve­zan s po­li-A re­pom na 3' kra­ju mR­NA. Na taj na­čin, eu­ka­riot­ski ini­ci­ja­cij­ski fak­to­ri pre­poz­na­ ju i 5' i 3' kraj mR­NA, što ob­jaš­nja­va sti­mu­lacijski uči­nak po­lia­de­ni­la­ci­je na tran­sla­ci­ju. Ini­ci­ja­cij­ski fak­to­ri eI­F4E i eI­F4G, za­jed­no s fak­to­ri­ma eI­ F4A i eI­F4B za­tim do­no­se mR­NA na ri­bo­som­sku pod­je­di­ni­cu 40S, pri če­ mu fak­tor eI­F4G stu­pa u in­te­rak­ci­ju s fak­to­rom eI­F3. Ri­bo­som­ska pod­je­ di­ni­ca 40S za­jed­no s ve­za­nom me­tio­ni­l-tR­NA i elon­ga­cij­skim fak­to­ri­ma pret­ra­žu­je mR­NA ka­ko bi ot­kri­la ini­ci­ja­cij­ski ko­don AUG. Kad je ko­don AUG pro­na­đen, fak­tor eI­F5 po­ti­če hid­ro­li­zu GTP ve­za­nog na fak­tor eI­F2. Ini­ci­ja­cij­ski se fak­to­ri (uk­lju­ču­ju­ći eI­F2 na ko­ji je sa­da ve­zan GDP) za­tim ot­puš­ta­ju, a eI­F5B olak­ša­va ve­za­nje pod­je­di­ni­ce 60S u ci­lju stva­ra­nja ini­ci­ ja­cij­skog kom­plek­sa 80S eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Na­kon što je nas­tao in­ici­ja­cij­ski kom­ple­ks tran­sla­ci­ja se nas­tav­lja elon­ ga­ci­jom po­li­pep­tid­nog lan­ca. Me­ha­ni­zam elon­ga­ci­je kod pro­ka­riot­skih i eu­ka­riot­skih sta­ni­ca je vr­lo sli­čan (sl. 8-12). Na ri­bo­so­mu pos­to­je tri mjes­ta za ve­za­nje tR­NA, naz­va­na mjes­to P (pep­ti­dil), mjes­to A (ami­noa­cil) i mjes­to E (iz­laz­no, en­gl. exit). Ini­ci­ja­tor­ska me­tio­nil-tR­NA ve­za­na je na mjes­to P. Pr­vi je ko­rak elon­ga­ci­je ve­za­nje slje­de­će ami­noa­ci­l-tR­NA na mjes­to A, što se od­vi­ja na te­me­lju spa­ri­va­nja ba­za an­ti­ko­do­na s ba­za­ma dru­gog ko­do­na na mR­NA. Aminoacil-tRNA do ri­bo­so­ma pra­ti elon­ga­cij­ ski fak­tor (EF-Tu kod pro­ka­rio­ta, eEFα kod eu­ka­rio­ta) ko­ji se na­la­zi u kom­plek­su s GTP. Oda­bir is­prav­ne ami­noa­ci­l-tR­NA za ug­rad­nju ami­no­ki­ Sli­ka 8-12. Elon­ga­cij­ski stu­panj tran­sla­ci­je.  Na ri­bo­so­mu pos­to­je tri mjes­ta ve­za­ nja tR­NA, oz­na­če­na kao mjes­to P (pep­ti­dil), mjes­to A (ami­noa­cil) i mjesto E (iz­laz­no, en­gl. exit). Ini­ci­ja­torska N-for­mil­-me­tio­ni­n-tR­NA smješ­ta se u mjes­to P, dok je mjes­ to A praz­no. Dru­gu ami­noa­ci­l-tR­NA (prim­je­ri­ce, ala­ni­l-tR­NA) u mjes­to A do­no­si fak­tor eE­F1α, (u kom­plek­su s GTP). Na­kon hid­ro­li­ze GTP, fak­tor EF1α (sa­da ve­zan s GDP) na­ puš­ta ri­bo­som, u či­jem je mjes­tu A sa­da smješ­te­na ala­ni­l-tR­NA. Po­tom se stva­ra pep­ tid­na ve­za, pri če­mu se me­tio­nin pre­no­si na ami­noa­ci­l-tR­NA ko­ja se na­la­zi u mjes­tu A. Ri­bo­som se po­tom po­mi­če za tri nuk­leo­ti­da uz­duž mR­NA. Ovim se po­ma­kom pep­ ti­di­l-(Me­t-A­la)-tR­NA prem­ješ­ta u mjes­to P, a ne­na­bi­je­na tR­NA u mjes­to E, os­tav­lja­ju­ći praz­no mjes­to A sprem­no za prih­vat slje­de­će ami­noa­ci­l-tR­NA. Tran­slo­ka­ci­ja je pos­re­ do­va­na fak­to­rom eE­F2, a pra­će­na je hid­ro­li­zom GTP. Na sli­ci je she­mat­ski pri­ka­za­no od­vi­ja­nje ovog pro­ce­sa kod eu­ka­rio­ta, ko­ji je i kod pro­ka­rio­ta veo­ma sli­čan. (U tab­li­ci 8-1 na­ve­de­na su ime­na pro­ka­riot­skih elon­ga­cij­skih fak­to­ra.)

   321

322    POGLAVLJE 8

▶▶ U ne­kim se slu­ča­je­vi­ma, na

stop-ko­don ug­ra­đu­je se­le­no­ cis­tein, ko­ji je naz­van 21. ami­ no­ki­se­li­nom. Se­le­no­cis­tein je ami­no­ki­se­li­na ko­ja sad­r­ži se­len, a pro­na­đen je kod raz­li­či­tih or­ ga­ni­za­ma, uk­lju­ču­ju­ći čov­je­ka. Dru­ge mo­di­fi­ci­ra­ne ami­no­kise­ li­ne, prim­je­ri­ce pi­ro­li­zin, ta­ ko­đer mo­gu bi­ti ug­ra­đe­ne na stop-ko­do­ne. Pi­ro­li­zin je mo­di­ fi­ci­ra­ni li­zin na­đen u pro­tei­ni­ma ne­kih ar­he­bak­te­ri­ja i va­žan je za proiz­vod­nju me­ta­na.

se­li­ne u ras­tu­ći po­li­pep­tid­ni la­nac klju­čan je ko­rak ko­ji od­re­đu­je toč­no­st sin­te­ze pro­tei­na. Prem­da se ovaj oda­bir te­me­lji na spa­ri­va­nju ba­za ko­do­na mR­NA i ba­za an­ti­ko­do­na na tR­NA, sa­mo spa­ri­va­nje ba­za ni­je do­volj­no da bi se osi­gu­ra­la toč­no­st sin­te­ze pro­tei­na ko­joj je učes­ta­lo­st pog­rješ­ke ma­nja od 103. Ova­ko ve­li­ku toč­no­st osi­gu­ra­va »de­ko­di­ra­ju­ći cen­ta­r« u ma­loj ri­ bo­som­skoj pod­je­di­ni­ci, ko­ji pre­poz­na­je pra­vil­no spo­je­ne pa­ro­ve ba­za ko­ do­na i an­ti­ko­do­na, od­nos­no raz­li­ku­je ih od nep­ra­vil­no spo­je­nih. Smješ­ta­ nje is­prav­ne ami­noa­ci­l-tR­NA u mjes­to A po­ti­če kon­for­ma­cij­sku prom­je­nu ko­ja in­du­ci­ra hid­ro­li­zu GTP ve­za­nog na eE­F1α te ot­puš­ta­nje ovog elon­ga­ cij­skog fak­to­ra sa­da ve­za­nog na GDP. Ne­dav­ne struk­tur­ne stu­di­je ri­bo­so­ ma po­lu­či­le su zna­ča­jan re­zul­tat pre­ma ko­jem se pre­poz­na­va­nje pra­vil­nog pa­ra ko­do­n-an­ti­ko­don u de­ko­di­ra­ju­ćem cen­tru, kao i pep­ti­di­l-tran­sfe­raz­na ak­tiv­no­st, te­me­lji pog­la­vi­to na ak­tiv­nos­ti ri­bo­som­ske RNA, a ne pro­tei­na. Jed­nom kad je eE­F-1α na­pus­tio ri­bo­som, iz­me­đu ini­ci­ja­tor­ske me­tio­ nil-tR­NA smješ­te­ne u mjes­tu P i dru­ge ami­noa­ci­l-tR­NA smješ­te­ne u mjes­ tu A, mo­že nas­ta­ti pep­tid­na ve­za. U ovoj reak­ci­ji, ko­ju ka­ta­li­zi­ra ve­li­ka ri­ bo­som­ska pod­je­di­ni­ca, ključ­nu ulo­gu ima RNA (kao što je pret­hod­no ob­ja­šnje­no). Re­zul­tat je pri­je­nos me­tio­ni­na na ami­noa­ci­l-tR­NA, smješ­te­nu u mjes­tu A ri­bo­so­ma, pri če­mu na tom mjes­tu nas­ta­je pep­ti­di­l-tR­NA, a ne­na­bi­je­na ini­ci­ja­tor­ska tR­NA na­puš­ta mjes­to P. Slje­de­ći ko­rak elon­ga­ci­je je tran­slo­ka­ci­ja, za ko­ju je pot­re­ban dru­gi elon­ga­cij­ski fak­tor (EF-G kod pro­ka­rio­ta, a eE­F2 kod eu­ka­rio­ta). Ovaj je ko­rak, kao i pret­hod­ni, pra­ćen hi­dro­li­zom GTP. Za vri­je­me tran­slo­ka­ci­je, ri­bo­som se po­mi­če za tri nuk­ leo­ti­da uz­duž mR­NA, smješ­ta­ju­ći slje­de­ći ko­don u praz­no mjes­to A. Ovim se ko­ra­kom pep­ti­di­l-tR­NA iz mjes­ta A prem­ješ­ta u mjes­to P, a ne­na­bi­je­na tR­NA iz mjes­ta P u mjes­to E. Ti­me ri­bo­som os­ta­je s pep­ti­di­l-tR­NA smješ­ te­nom u mjes­tu P i praz­nim mjes­tom A. Ve­za­nje no­ve ami­noa­ci­l-tR­NA u mjes­to A po­ti­če ot­puš­ta­nje ne­na­bi­je­ne tR­NA iz mjes­ta E, či­me je ri­bo­som spre­man za ug­rad­nju no­ve ami­no­ki­se­li­ne u ras­tu­ći po­li­pep­tid­ni la­nac. Ka­ko se elon­ga­ci­ja nas­tav­lja, eE­F1α (ili eE­F-Tu) ko­ji je s ri­bo­so­ma ot­ puš­ten u kom­plek­su s GDP mo­ra bi­ti pre­ve­den u svoj GTP ob­lik (sl. 8-13). Za ovu pret­vor­bu pot­re­ban je tre­ći elon­ga­cij­ski fak­tor, eE­F-1βγ (EF-Ts kod pro­ka­rio­ta) ko­ji se ve­že na kom­ple­ks EF1α/GDP i po­ti­če zam­je­nu ve­za­nog GDP s GTP. Re­zul­tat ove iz­mje­ne je ob­nav­lja­nje kom­plek­sa EF1α/GTP, ko­ ji je sa­da spre­man za pra­će­nje no­ve ami­noa­ci­l-tR­NA u mjes­to A na ri­bo­ so­mu, či­me za­po­či­nje no­vi cik­lus elon­ga­ci­je. Re­gu­la­ci­ja EF1α ve­za­njem i hid­ro­li­zom GTP ti­pi­čan je prim­jer re­gu­la­ci­je pro­tein­ske ak­tiv­nos­ti. Slič­ni me­ha­niz­mi kon­tro­li­ra­ju ak­tiv­nos­ti mnoš­tva pro­tei­na uk­lju­če­nih u re­gu­la­ ci­ju sta­nič­nog ras­ta i re­gu­la­ci­je, kao i tran­spor­ta i sek­re­ci­je pro­tei­na, što će bi­ti ras­prav­lja­no u slje­de­ćim pog­lav­lji­ma. Elon­ga­ci­ja po­li­pep­tid­nog lan­ca nas­tav­lja se sve dok u mjes­to A na ri­bo­ so­mu ne do­đe stop-ko­don (UAA, UAG ili UGA). Sta­ni­ce ne sad­r­ža­va­ju tran­spor­tne RNA s an­ti­ko­do­ni­ma ko­ji su kom­ple­men­tar­ni ovim ter­mi­na­ cij­skim sig­na­li­ma; um­jes­to to­ga pos­to­je fak­to­ri ot­puš­ta­nja ko­ji pre­poz­na­ ju ove sig­na­le i zav­r­ša­va­ju sin­te­zu pro­tei­na (sl. 8-14). Pro­ka­riot­ske sta­ni­ce sad­r­ža­va­ju dva fak­to­ra ot­puš­ta­nja ko­ji pre­poz­na­ju ter­mi­na­cij­ske ko­do­ne: fak­tor RF1 pre­poz­na­je UAA ili UAG, a fak­tor RF2 pre­poz­na­je UAA ili UGA (v. tab­l. 8-1). U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma pri­su­tan je sa­mo je­dan fak­ tor ot­puš­ta­nja (eR­F1) ko­ji pre­poz­na­je sva tri ter­mi­na­cij­ska ko­do­na. I pro­ ka­riot­ske i eu­ka­riot­ske sta­ni­ce sad­r­ža­va­ju ta­ko­đer i tre­ći fak­tor ot­puš­ta­nja (RF-3 kod pro­ka­rio­ta, a eR­F3 kod eu­ka­rio­ta) ko­ji ne pre­poz­na­je spe­ci­fič­ni ter­mi­na­cij­ski ko­don, već dje­lu­je za­jed­no s RF1 (ili eR­F1) i RF2. Fak­to­ri ot­puš­ta­nja ve­žu se na ter­mi­na­cij­ski ko­don u mjes­tu A i po­ti­ču hi­dro­li­zu ve­ze iz­me­đu tR­NA i po­li­pep­tid­nog lan­ca u mjes­tu P, što re­zul­ti­ra ot­puš­ta­

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

Sli­ka 8-13. Ob­nav­lja­nje kom­plek­sa EF1α/GTP.  Fak­tor EF1α u kom­plek­su s GTP pra­ti ami­noa­ci­l-tR­NA do ri­bo­so­ma. Kad je is­prav­na tR­NA smješ­te­na na ri­bo­som, GTP se hid­ro­li­zi­ra, a fak­tor EF1α, sa­da u kom­plek­su s GTP, ot­puš­ta. Kom­ple­k s EF1α/GDP je inak­ti­van i kao ta­kav ne mo­že ve­za­ti no­vu tR­NA. Ka­ko bi se tran­sla­ci­ja mog­la nas­ta­vi­ ti, ovaj se kom­ple­k s mo­ra ob­no­vi­ti, od­nos­no pre­ves­ti u ak­ti­van ob­lik ET1α/GTP što je pos­re­do­va­no dru­gim fak­to­rom eE­F1βγ, ko­ji po­ti­če iz­mje­nu GDP sa slo­bod­nim GTP.

njem dov­r­še­nog po­li­pep­ti­da s ri­bo­so­ma. Za­tim se ot­puš­ta tR­NA, a ri­bo­ som­ske pod­je­di­ni­ce i ka­lup mR­NA di­so­ci­ra­ju. I kod pro­ka­rio­ta i kod eu­ka­rio­ta sin­te­za pro­tei­na na te­me­lju glas­nič­ke RNA mo­že se od­vi­ja­ti is­tov­re­me­no na ne­ko­li­ko ri­bo­so­ma. Jed­nom, kad se ri­bo­som mak­ne s ini­ci­ja­cij­skog mjes­ta, dru­gi se ri­bo­som mo­že ve­za­ti na mR­NA i za­po­če­ti sin­te­zu no­vog po­li­pep­tid­nog lan­ca, ta­ko da se mR­NA ug­lav­nom pre­vo­de se­ri­jom ri­bo­so­ma ko­ji su me­đu­sob­no uda­lje­ni 100–200 nuk­leo­ti­da (sl. 8-15). Sku­pi­na ri­bo­so­ma ve­za­na na jed­nu mo­le­ku­lu RNA na­zi­va se po­li­ri­bo­som ili po­li­som. Sva­ki ri­bo­som unu­tar sku­pi­ne fun­kcio­ ni­ra neo­vis­no, što re­zul­ti­ra nas­ta­ja­njem za­seb­nih po­li­pep­tid­nih la­na­ca.

Re­gu­la­ci­ja tran­sla­ci­je Prem­da je tran­skrip­ci­ja pri­mar­na ra­zi­na na ko­joj se od­vi­ja kon­tro­la ek­ spre­si­je ge­na, re­gu­la­ci­ja tran­sla­ci­je mR­NA ta­ko­đer ig­ra važ­nu ulo­gu u mo­ du­la­ci­ji gen­ske ek­spre­si­je. Tran­sla­ci­ja ne­kih mR­NA mo­že bi­ti re­gu­li­ra­na ka­ko pro­tei­ni­ma rep­re­so­ri­ma tran­sla­ci­je ta­ko i ne­ko­di­ra­ju­ćim mik­roR­NA, ko­je su pre­poz­na­te kao sre­diš­nji re­gu­la­to­ri gen­ske ek­spre­si­je u eu­ka­riot­ skim sta­ni­ca­ma. Uz to, ukup­na tran­sla­cij­ska ak­tiv­no­st sta­ni­ce uv­je­to­va­na je

Sli­ka 8-14. Ter­mi­na­ci­ja tran­sla­ci­je.  Ter­mi­na­cij­ski ko­don (prim­je­ri­ce UAA) pre­po­ zna­je fak­tor ot­puš­ta­nja, a ne spe­ci­f ič­na tR­NA. Pos­lje­di­ca pre­poz­na­va­nja stop-ko­do­na je ot­puš­ta­nje dov­r­še­no­ga po­li­pep­tid­no­ga lan­ca, na­kon če­ga tR­NA i mR­NA di­so­ci­ra­ju sa ri­bo­so­ma.

   323

324    POGLAVLJE 8

Sli­ka 8-15. Po­li­so­mi.  Tran­sla­ci­ja se is­to­dob­no od­vi­ja na mnoš­tvu ri­bo­so­ma na­ni­ za­nih uz­duž mR­NA (po­li­som). (A) Elek­tron­ska mik­rog­ra­f i­ja eu­ka­riot­skog po­li­so­ma. (B) Uop­će­ni she­mat­ski pri­kaz po­li­so­ma. Uo­či­te da su na ri­bo­so­mi­ma ko­ji su bli­že 3’ kra­ju mR­NA, po­li­pep­tid­ni la­n­ci du­ži. (A, iz M. Boub­lik et al. 1990. The Ri­bo­so­me, str. 117., sus­ ret­lji­voš­ću Ame­rič­ko­ga druš­tva za mik­ro­bio­lo­gi­ju.)

odgo­vo­rom sta­ni­ce na sta­nič­ni stres, dos­tup­no­st hra­nji­vih tva­ri te sti­mu­la­ ci­ju fak­to­ri­ma ras­ta. Je­dan od na­či­na re­gu­la­ci­je tran­sla­ci­je je­st ve­za­nje rep­re­sor­skih pro­tei­na (ko­ji spr­je­ča­va­ju tran­sla­ci­ju) na spe­ci­fič­ne slje­do­ve mRNA. Dob­ro prou­čen prim­jer ovog me­ha­niz­ma kod eu­ka­riot­skih sta­ni­ca je­st re­gu­la­ci­ja sin­te­ze fe­ri­ti­na, pro­tei­na ko­ji poh­ra­nju­je že­lje­zo unu­tar sta­ni­ce (sl. 8-16). Tran­sla­ ci­ju fe­ri­ti­na re­gu­li­ra dos­tup­no­st že­lje­za: vi­še se fe­ri­ti­na sin­te­ti­zi­ra kad je že­lje­zo pri­sut­no. Ova je re­gu­la­ci­ja pos­re­do­va­na pro­tei­nom ko­ji se (ka­da že­lje­zo ni­je pri­sut­no) ve­že za sli­jed (ele­me­nt od­go­vo­ra na že­lje­zo; en­gl. the iron res­pon­se ele­me­nt, IRE) u 5' net­ran­sla­ti­ra­nom pod­ruč­ju glas­nič­ke RNA

Sli­ka 8-16. Re­gu­la­ci­ja tran­sla­ci­je fe­ri­ti­na.  Glas­nič­ka RNA za fe­ri­tin bli­zu svo­je 5’ ka­pe sad­r­ža­va ele­me­nt od­go­vo­ra na že­lje­zo (IRE). Kad je že­lje­zo pri­sut­no u do­volj­ nim ko­li­či­na­ma, tran­sla­ci­ja mR­NA za fe­ri­tin od­vi­ja se nor­mal­no. Ako že­lje­zo ne­do­ sta­je, pro­tein (naz­van pro­tei­nom ko­ji ve­že ele­me­nt od­go­vo­ra na že­lje­zo ili IRE-BP) se ve­že na IRE i ti­me spr­je­ča­va tran­sla­ci­ju mR­NA in­ter­fe­ri­ra­ju­ći s ve­za­njem mR­NA na ri­bo­som­sku pod­je­di­ni­cu 40S.

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   325

Sli­ka 8-17. Ve­za­nje rep­re­so­ra tran­sla­ci­je na 3' net­ran­sla­ti­ra­na pod­ruč­ja.  Rep­re­ sor tran­sla­ci­je se mo­že ve­za­ti na re­gu­lacijske slje­do­ve u 3' net­ran­sla­ti­ra­nom pod­ruč­ ju (UTR) i in­hi­bi­ra­ti tran­sla­ci­ju ve­za­njem na ini­ci­ja­cij­ski fak­tor eI­F4, ko­ji je po­ve­zan s 5' ka­pom. To spr­je­ča­va tran­sla­ci­ju jer je ve­za­nje eI­F4E i eI­F4G u nor­mal­ni ini­cij­acij­ski kom­ple­k s one­mo­gu­će­no (v. sl. 8-11).

za fe­ri­tin te na taj na­čin blo­ki­ra tran­sla­ci­ju fe­ri­ti­na. U pri­sut­nos­ti že­lje­za, že­lje­zom re­gu­li­ra­ni pro­tei­ni se vi­še ne ve­žu na IRE, pa se tran­sla­ci­ja fe­ri­ti­ na mo­že da­lje od­vi­ja­ti. IRE je smješ­ten unu­tar 40 nuk­leo­ti­da na 5' ka­pi, i či­ni se da že­lje­zom re­gu­li­ra­ni pro­tei­ni sup­ri­mi­ra­ju tran­sla­ci­ju ta­ko što in­ ter­fe­ri­ra­ju s ve­za­njem ri­bo­som­ske pod­je­di­ni­ce 40S na mR­NA. Tran­sla­ci­ja ta­ko­đer mo­že bi­ti re­gu­li­ra­na pro­tei­ni­ma ko­ji se ve­žu na spe­ ci­fič­ne slje­do­ve u 3' net­ran­sla­ti­ra­nim pod­ruč­ji­ma ne­kih mR­NA. U ne­kim slu­ča­je­vi­ma ovi tran­sla­cij­ski rep­re­so­ri dje­lu­ju ta­ko što se ve­žu na ini­ci­ja­cij­ ski fak­tor eI­F4E, spr­je­ča­va­ju­ći ti­me in­te­rak­ci­ju eI­F4E i eI­F4G što re­zul­ti­ra in­hi­bi­ci­jom ini­ci­ja­ci­je tran­sla­ci­je (sl. 8-17). Pro­tei­ni ko­ji se ve­žu na 3' ne­ tran­sla­ti­ra­na pod­ruč­ja mR­NA su ta­ko­đer od­go­vor­ni za smješ­taj glas­nič­kih RNA u spe­ci­fič­na pod­ruč­ja u sta­ni­ci, osi­gu­ra­va­ju­ći na taj na­čin sin­te­zu pro­tei­na na spe­ci­fič­nim mjes­ti­ma unu­tar sta­ni­ce. Smješ­taj mo­le­ku­la mRNA va­žan je dio re­gu­la­ci­je tran­sla­ci­je u mno­gim sta­ni­ca­ma uk­lju­ču­ju­ći ja­jaš­ca, em­bri­je, živ­ča­ne sta­ni­ce te pok­ret­ne fib­rob­las­te. Ta­ko prim­je­ri­ce, smješ­taj mo­le­ku­la mR­NA u spe­ci­fič­no pod­ruč­je ja­jaš­ca ili em­bri­ja ima važ­nu ulo­gu u raz­vo­ju ti­me što osi­gu­ra­va od­vi­ja­nje sin­te­ze pro­tei­na na od­go­va­ra­ju­ćim mjes­ti­ma em­bri­ja u raz­vo­ju (sl. 8-18). Smješ­taj mo­le­ku­la mR­NA us­ko je po­ve­zan s re­gu­la­ci­jom nji­ho­ve tran­sla­ci­je, ta­ko da se pro­tei­ni ko­je te mRNA ko­di­ra­ju, sin­te­ti­zi­ra­ju tek ka­da se, u od­go­va­ra­ju­ćem raz­voj­nom sta­di­ju, mR­NA pra­vil­no smjes­ti. Re­gu­la­ci­ja tran­sla­ci­je po­se­bi­ce je važ­na ti­je­kom ra­nog raz­vo­ja or­ga­niz­ ma. Kao što je bi­lo go­vo­ra u 7. pog­lav­lju u oo­ci­ta­ma je mnoš­tvo mR­NA poh­ra­nje­no u ob­li­ku ko­ji se ne pre­vo­di; tran­sla­ci­ja ovih poh­ra­nje­nih mRNA ak­ti­vi­ra se fer­ti­li­za­ci­jom ili u kas­ni­jim fa­za­ma raz­vo­ja. Je­dan od me­ha­ni­za­ ma ovak­ve re­gu­la­ci­je tran­sla­ci­je je­st kon­tro­li­ra­na po­lia­de­ni­la­ci­ja oo­cit­nih mR­NA. Mnoš­tvo net­ran­sla­ti­ra­nih mR­NA poh­ra­nje­no je u oo­ci­ta­ma s krat­ kim po­li-A re­po­vi­ma (prib­liž­no 30-50 nuk­leo­ti­da). Ove poh­ra­nje­ne mR­ NA po­čet­no su sin­te­ti­zi­ra­ne s du­gim po­li-A re­po­vi­ma iz­gra­đe­nim od pri­ bliž­no 200 nuk­leo­ti­da, kao i dru­ge mR­NA (v. sl. 7-46), no po­tom ih

Sli­ka 8-18. Smješ­taj mR­NA u oo­ci­ta­ ma vr­ste Xe­no­pus.  Hib­ri­di­za­ci­jom in si­tu pri­ka­zan je smješ­taj mR­NA za Xle­rk u ve­ge­ta­tiv­noj ko­ri oo­ci­ta vr­ste Xe­no­pus. (Sus­ret­lji­voš­ću Ja­me­sa Des­hle­ra, Sveu­či­ liš­te u Bos­to­nu.)

▶▶ Spe­ci­fič­ne mR­NA su smje­ šte­ne u si­nap­sa­ma iz­među neu­ ro­na. Či­ni se da je re­gu­la­ci­ja tran­sla­ci­je ovih mR­NA nuž­na za stva­ra­nje i od­r­ža­va­nje si­nap­si te da ima ulo­gu u pro­ce­su uče­nja i pam­će­nja.

326    POGLAVLJE 8 pre­poz­na­je pro­tein rep­re­sor tran­sla­ci­je ko­ji se ve­že na nji­ho­ve 3' net­ran­sla­ ti­ra­ne re­gi­je i do­vo­di do uk­lanj­anja ve­ći­ne po­li-A re­pa. U od­go­va­ra­ju­ćem sta­di­ju raz­vo­ja po­li-A re­po­vi poh­ra­nje­nih mo­le­ku­la mR­NA se pro­du­lju­ju do ne­ko­li­ko sto­ti­na nuk­leo­ti­da, či­me one pos­ta­ju sprem­ne za tran­sla­ci­ju. Na taj je na­čin omo­gu­će­no ve­za­nje pro­tei­na ko­ji ve­že po­li-A (PABP) ko­ji sti­mu­li­ra tran­sla­ci­ju in­te­rrea­gi­ra­ju­ći s eI­F4G (v. sl. 8-11). Jed­no od na­juz­bud­lji­vi­jih ot­kri­ća pos­ljed­njih go­di­na bilo je ras­vjet­lja­va­ nje ulo­ge ne­ko­di­ra­ju­ćih mo­le­ku­la RNA u re­gu­la­ci­ji gen­ske ek­spre­si­je. Od nje­zi­nog ot­kri­ća 1998. go­di­ne, in­ter­fe­ren­ci­ja RNA (RNAi), ko­ja je pos­re­ do­va­na krat­kim dvos­tru­kim mo­le­ku­la­ma RNA, pos­ta­la je iz­nim­no koriš­te­ na ek­spe­ri­men­tal­na alat­ka za in­hi­bi­ci­ju gen­ske ek­spre­si­je na ra­zi­ni tran­sla­ ci­je (v. sl. 4-42). Prem­da se pu­tem in­ter­fe­ren­ci­je RNA mo­že in­hi­bi­ra­ti i tran­skrip­ci­ja, us­li­jed če­ga do­la­zi do stva­ra­nja he­te­rok­ro­ma­ti­na (v. sl. 7-38), nje­zin je pri­mar­ni na­čin dje­lo­va­nja po­se­bi­ce u ani­mal­nim sta­ni­ca­ma, in­hi­ bi­ci­ja tran­sla­ci­je i/ili po­ti­ca­nje raz­grad­nje cilj­ne mR­NA. Dvi­je os­nov­ne vr­ ste ma­lih mo­le­ku­la RNA ko­je pos­re­du­ju in­ter­fe­ren­ci­ju RNA je­su ma­le in­ ter­fe­ri­ra­ju­će RNA (e­ng. sma­ll in­ter­fe­ri­ng RNA, siR­NA) i mik­roR­NA (miR­NA), ob­je iz­gra­đe­ne od prib­liž­no 22 nuk­leo­ti­da, ali raz­li­či­te po po­dri­ jet­lu. siR­NA nas­ta­ju ki­da­njem du­žih dvo­lan­ča­nih mo­le­ku­la RNA po­mo­ću nuk­lea­ze Di­cer (v. sl. 4-42). Du­že dvo­lan­ča­ne mo­le­ku­le ko­je su pre­kur­so­ri siR­NA mo­gu se u sta­ni­cu uni­je­ti ek­spe­ri­men­tal­no ili nas­ta­ju unu­tar sta­ni­ ce od prek­la­pa­ju­ćih tran­skri­pa­ta. Sup­rot­no to­mu, pre­kur­so­ri miR­NA se pre­pi­su­ju po­mo­ću RNA-po­li­me­ra­ze II kao pri­mar­ni tran­skrip­ti iz­gra­đe­ni od prib­liž­no 70 nuk­leo­ti­da, ko­ji se za­tim pos­tup­no ki­da­ju po­mo­ću nuk­lea­ ze Dor­sha ili Di­cer či­me nas­ta­ju dvo­lan­ča­ne mo­le­ku­le RNA ve­li­či­ne 22 nuk­leo­ti­da (sl. 8-19). Je­dan la­nac i miRN­A i siR­NA je ug­ra­đen u R­NA-in­ du­ci­ran uti­ša­vač­ki kom­ple­ks ­(en­gl. RNA-in­du­ced si­len­ci­ng com­plex, RISC), ko­ji na kom­ple­men­tar­ne mo­le­ku­le mR­NA us­mje­ra­va­ju up­ra­vo siR­NA ili miR­NA. U ne­kim slu­ča­je­vi­ma, siRN­A ili miR­NA po­ti­ču ki­da­nje cilj­ne mRNA po­mo­ću sas­tav­ni­ca RISC, o če­mu je ras­prav­lja­no u pog­lav­lju 4. Ovo se op­će­ni­to do­ga­đa kod mo­le­ku­la siR­NA ili miR­NA ko­je se sav­r­še­no spa­ru­ju sa svo­jim cilj­nim mR­NA. Ve­ći­na mo­le­ku­la miR­NA sa svo­jim cilj­ nim mR­NA ipak stva­ra kri­vo spa­re­ne (en­gl. mis­matc­hed) dup­lek­se. U ne­ kim slu­ča­je­vi­ma, kom­ple­ks miR­NA/RISC in­hi­bi­ra tran­sla­ci­ju bez da in­du­ ci­ra ki­da­nje mo­le­ku­la mR­NA, prem­da kri­vo spa­re­ne mo­le­ku­le miR­NA ta­ko­đer us­mje­ra­va­ju mo­le­ku­le mR­NA ti­me što po­ti­ču dea­de­ni­la­ci­ju (v. sl. 7-56). Me­ha­ni­zam rep­re­si­je tran­sla­ci­je po­mo­ću miR­NA još uvi­jek ni­je u pot­pu­nos­ti raz­jaš­njen te se smat­ra da mo­že uk­lju­či­va­ti in­hi­bi­ci­ju i ini­ci­ja­ ci­je i elon­ga­ci­je. Važ­no­st miR­NA za gen­sku re­gu­la­ci­ju je go­le­ma. Proc­je­nju­je se da je naj­ma­nje 1.000 mo­le­ku­la miR­NA ko­di­ra­no u ge­no­mu si­sa­va­ca. Na­da­lje, či­ni se da sva­ka miR­NA mo­že dje­lo­va­ti na sto­ti­njak raz­li­či­tih mo­le­ku­la mR­NA, pa se proc­je­nju­je da je naj­ma­nje tre­ći­na ge­na ko­ji ko­di­ra­ju pro­tei­ ne pod­lož­na re­gu­la­ci­ji pu­tem miR­NA. Prem­da se nji­ho­va bio­loš­ka ulo­ga tek po­či­nje vrjed­no­va­ti, ut­vr­đe­no je da dje­lu­ju u raz­li­či­tim raz­voj­nim pro­ ce­si­ma, uk­lju­ču­ju­ći ra­ni em­brio­nal­ni raz­voj, raz­voj živ­ča­nog sus­ta­va, mi­ši­ ća, sr­ca, plu­ća te imu­nosus­ta­va. Po­ka­za­no je ta­ko­đer da miR­NA re­gu­li­ra­ju sta­nič­nu pro­li­fe­ra­ci­ju i pre­živ­lja­va­nje, a ut­vr­đe­no je i da ne­nor­mal­na ek­ spre­si­ja miR­NA pri­do­no­si raz­vo­ju bo­les­ti sr­ca te ne­ko­li­ko vr­sta ra­ka. Up­ ra­vo je zbog to­ga, ra­zu­mi­je­va­nje ka­ko me­ha­niz­ma dje­lo­va­nja miR­NA ta­ko i svih nji­ho­vih bio­loš­kih ulo­ga od iz­nim­nog znan­stve­nog in­te­re­sa. Dru­gi me­ha­ni­zam re­gu­la­ci­je tran­sla­ci­je u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, ko­ji re­zul­ti­ra sveo­buh­vat­nim učin­kom na cje­lo­kup­nu tran­sla­cij­sku ak­tiv­no­st vi­ še ne­go na tran­sla­ci­ju spe­ci­fič­nih mR­NA, uk­lju­ču­je mo­du­la­ci­ju ak­tiv­nos­ti

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

Sli­ka 8-19. Re­gu­la­ci­ja tran­sla­ci­je pos­re­do­va­na miR­NA.  Pre­kur­so­ri miR­NA (primiR­NA) pos­tup­no se ki­da­ju dje­lo­va­njem nuk­lea­za Dros­ha i Di­cer na dvo­lan­ča­ne RNA ve­li­či­ne oko 22 nuk­leo­ti­da. miR­NA se po­ve­zu­ju s RISC-kom­plek­som u ko­jem se dva lan­ca miR­NA raz­ma­ta­ju. miR­NA za­tim us­mje­ra­va RISC na ho­mo­log­nu mR­NA, što do­ vo­di do ki­da­nja mR­NA (uko­li­ko je miR­NA u pot­pu­nos­ti kom­ple­men­tar­na s mR­NA) ili spr­je­ča­va­nja tran­sla­ci­je (uko­li­ko je miR­NA dje­lo­mič­no kom­ple­men­tar­na s mR­NA).

   327

328    POGLAVLJE 8 Sli­ka 8-20. Re­gu­la­ci­ja tran­sla­ci­je po­ sre­do­va­na fos­fo­ri­la­ci­jom fak­to­ra eI­F2 i eI­F2B.  (A) Ak­tiv­ni ob­lik eI­F2 (u kom­ plek­su s GTP) pra­ti ini­ci­jatorsku me­tio­niltR­NA do ri­bo­so­ma (v. sl. 8-11). S ri­bo­so­ ma se eI­F2 ot­puš­ta kao inak­tiv­ni ob­lik, u kom­plek­su s GDP. Ka­ko bi se tran­sla­ci­ja nas­ta­vi­la, fak­tor eI­F2 mo­ra bi­ti reak­ti­vi­ ran po­mo­ću eIF2B, ko­ji po­ti­če iz­mje­nu ve­za­nog GDP za GTP. (B) Tran­sla­ci­ja se mo­že in­hi­bi­ra­ti (prim­je­ri­ce, ako sta­ni­ ci ne­dos­ta­ju fak­to­ri ras­ta) re­gu­la­cijskim pro­tei­n-ki­na­za­ma ko­je u tom slu­ča­ju fos­fo­ri­li­ra­ju ili eI­F2 ili eI­F2B. Fos­fo­ri­la­ci­ja ovih fak­to­ra spr­je­ča­va zam­je­nu GDP za GTP, ta­ko da se kom­ple­k s eI­F2/GTP ne mo­že re­ge­ne­ri­ra­ti.

ini­ci­ja­cij­skih fak­to­ra, po­se­bi­ce fak­to­ra eI­F2 i eI­F4E. Kao što je već ob­jaš­ nje­no, fak­tor eI­F2 se (u kom­plek­su s GTP) ve­že s ini­ci­ja­tor­skom me­tio­ni­ltR­NA i do­no­si je na ri­bo­som. Za­tim sli­je­di ot­puš­ta­nje fak­to­ra eI­F2, što je pra­će­no hid­ro­li­zom GTP, a či­me eI­F2, sa­da u kom­plek­su s GDP, pos­ta­je neak­ti­van. Ka­ko bi sud­je­lo­vao u slje­de­ćem cik­lu­su ini­ci­ja­ci­je, kom­ple­ks eI­ F2/GTP mo­ra se re­ge­ne­ri­ra­ti iz­mje­nom ve­za­nog GDP za GTP (sl. 8-20). Ova je iz­mje­na pos­re­do­va­na fak­to­rom eI­F2B. Kon­tro­la ak­tiv­nos­ti eI­F2 pu­ tem ve­za­nja i hid­ro­li­ze GTP slič­na je sto­ga kon­tro­li ak­tiv­nos­ti fak­to­ra eE­ F1α (v. sl. 8-13). Na taj na­čin, re­gu­la­ci­ja ak­tiv­nos­ti fak­to­ra eI­F2 osi­gu­ra­va ključ­nu kon­trol­nu toč­ku u mno­gim eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Što­vi­še, fak­ to­ri eI­F2 i eI­F2B mo­gu bi­ti fos­fo­ri­li­ra­ni re­gu­lacijskim pro­tei­n-ki­na­za­ma. Ove fos­fo­ri­la­ci­je in­hi­bi­ra­ju iz­mje­nu ve­za­nog GDP s GTP te na taj na­čin in­hi­bi­ra­ju ini­ci­ja­ci­ju tran­sla­ci­je. Prim­je­ri­ce, ako sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca ne­dos­ ta­ju fak­to­ri ras­ta, pro­tei­n-ki­na­ze ko­je fos­fo­ri­li­ra­ju fak­tor eI­F2B pos­ta­ju ak­ tiv­ne, in­hi­bi­ra­ju­ći na­da­lje sin­te­zu pro­tei­na. Re­gu­la­ci­ja ak­tiv­nos­ti fak­to­ra eI­F4E, ko­ji se ve­že na 5' ka­pu mo­le­ku­la mR­NA, dru­ga je ključ­na kon­trol­na toč­ka u ko­joj fak­to­ri ras­ta kon­tro­li­ra­ju pro­tein­sku sin­te­zu (sl. 8-21). Prim­je­ri­ce, fak­to­ri ras­ta ko­ji po­ti­ču sin­te­zu

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   329

Sli­ka 8-21. Re­gu­la­ci­ja ini­ci­ja­cij­skog fak­to­ra eI­F4E.  Ka­da fak­to­ri ras­ta ni­su pri­sut­ni, tran­sla­ci­ja je in­hi­bi­ra­na pro­tei­nom ko­ji ve­že eI­F4E (4E-BP) i spr­je­ča­va nje­go­vu in­te­rak­ci­ju s eI­F4G. Sti­mu­la­ci­ja fak­to­ri­ma ras­ta do­vo­di do fos­fo­ri­la­ci­je 4E-BP, ko­ji se za­tim ot­puš­ta s eI­F4E, što omo­gu­ća­va nas­ta­vak tran­sla­ci­je.

pro­tei­na u sta­ni­ca­ma si­sa­va­ca ak­ti­vi­ra­ju pro­tei­n-ki­na­ze ko­je fos­fo­ri­li­ra­ju re­gu­lacijske pro­tei­ne (naz­va­ni pro­tei­ni ko­ji ve­žu eI­F4E, 4E-BP) ko­ji ve­žu fak­tor eI­F4E. U od­sut­nos­ti od­go­va­ra­ju­ćih fak­to­ra ras­ta, ne­fos­fo­ri­li­ra­ni 4EBP ve­žu fak­tor eI­F4E te in­hi­bi­ra­ju tran­sla­ci­ju ti­me što ome­ta­ju in­te­rak­ci­ju fak­to­ra eI­F4E i fak­to­ra eI­F4G. Kad su fak­to­ri ras­ta pri­sut­ni u do­volj­noj ko­ li­či­ni, fos­fo­ri­la­ci­ja fak­to­ra 4E-BP spr­je­ča­va nji­ho­vu in­te­rak­ci­ju s fak­to­rom eI­F4E, što do­vo­di do po­ja­ča­ne ini­ci­ja­ci­je tran­sla­ci­je. Zna­čaj­no je is­tak­nu­ti da cje­lo­kup­na in­hi­bi­ci­ja tran­sla­ci­je mo­že us­tva­ri po­tak­nu­ti se­lek­tiv­nu tran­sla­ci­ju ne­kih mo­le­ku­la mR­NA. Prim­je­ri­ce, mo­le­ ku­le mR­NA ko­je sad­r­že unu­tar­nja mjes­ta ulas­ka ri­bo­so­ma mo­gu bi­ti se­lek­ tiv­no tran­sla­ti­ra­ne pod uv­je­ti­ma ko­ji in­hi­bi­ra­ju eI­F4E i ti­me do­ves­ti do in­hi­bi­ci­je ini­ci­ja­ci­je ovis­ne o ka­pi. Tak­va se­lek­tiv­na tran­sla­ci­ja podvr­ste mR­NA mo­že po­mo­ći sta­ni­ci u bor­bi s uv­je­ti­ma sta­nič­nog stre­sa, kao što je gla­do­va­nje, ne­dos­ta­tak fak­to­ra ra­sta ili oš­te­će­nja DNA.

Sma­ta­nje i do­ra­dba pro­tei­na Tran­sla­ci­jom je zav­r­šen pro­tok ge­ne­tič­ke in­for­ma­ci­je unu­tar sta­ni­ce. Sli­jed nuk­leo­ti­da u DNA sa­da je pre­ve­den u sli­jed ami­no­ki­se­li­na u po­li­ pep­tid­nom lan­cu. Sin­te­za po­li­pep­ti­da, ipak, ne od­go­va­ra u pot­pu­nos­ti stva­ra­nju fun­kcio­nal­nog pro­tei­na. Ka­ko bi bio upo­rab­ljiv, po­li­pep­tid se mo­ra smo­ta­ti u spe­ci­fič­nu tro­di­men­zio­nal­nu kon­for­ma­ci­ju, a u mno­go slu­ča­je­va vi­še se po­li­pep­tid­nih la­na­ca mo­ra ud­ru­ži­ti u fun­kcio­nal­ni kom­

330    POGLAVLJE 8 ple­ks. Uz to, mno­gi pro­tei­ni pod­li­je­žu dalj­njim mo­di­fi­ka­ci­ja­ma, iz­me­đu os­ta­log ki­da­nju te ko­va­len­tnom ve­za­nju ug­lji­ko­hid­ra­ta i li­pi­da, što je klju­ čno za nji­ho­vu fun­kci­ju i pra­vi­lan smješ­taj unu­tar sta­ni­ce.

Ša­pe­ro­ni i sma­ta­nje pro­tei­na

▶▶ Pog­rješ­no sma­ta­nje pro­tei­na

mo­že ima­ti ja­ko lo­še pos­lje­di­ce za sta­ni­cu. Ne­ki se pog­rješ­no smo­ta­ni pro­tei­ni mo­gu ag­re­gi­ ra­ti i stva­ra­ti ne­top­lji­va vlak­na, naz­va­na ami­loid­nim vlak­ni­ma, ko­ja se aku­mu­li­ra­ju u iz­van­sta­ nič­nom pros­to­ru i unu­tar sta­ni­ ce. Ami­loid­na vlak­na su glav­no obi­ljež­je ne­ko­li­ko bo­les­ti u čov­ je­ka, kao što su Al­zhei­me­ro­va i Par­kin­so­no­va bo­le­st.

Tro­di­men­zio­nal­na kon­for­ma­ci­ja pro­tei­na pos­lje­di­ca je in­te­rak­ci­ja iz­ me­đu boč­nih og­ra­na­ka ami­no­ki­se­li­na ko­je ih iz­gra­đu­ju, kao što je ob­ja­ šnje­no u 2. pog­lav­lju. Pre­ma kla­sič­noj pos­tav­ci o sma­ta­nju pro­tei­na, sve in­for­ma­ci­je pot­reb­ne da bi pro­tein zau­zeo pra­vil­nu tro­di­men­zio­nal­nu kon­ for­ma­ci­ju sad­r­ža­ne su u nje­go­vom ami­no­ki­se­lin­skom sli­je­du. Ta pos­tav­ka pot­je­če od ek­spe­ri­me­na­ta Chris­tia­na An­fin­se­na ko­ji su po­ka­za­li da se u uv­je­ti­ma in vit­ro de­na­tu­ri­ra­na RNa­za po­no­vo spon­ta­no sma­ta u svo­ju ak­ tiv­nu kon­for­ma­ci­ju (v. sl. 2-17). Na te­me­lju tih po­da­ta­ka či­ni­lo se da je sma­ta­nje pro­tei­na sa­moud­ru­žu­ju­ći pro­ces za ko­ji ni­su pot­reb­ni do­dat­ni sta­nič­ni čimbenici. No, no­vi­je su stu­di­je po­ka­za­le da ovaj opis ne od­go­va­ra u pot­pu­nos­ti sma­ta­nju pro­tei­na unu­tar sta­ni­ce. Pra­vil­no sma­ta­nje pro­tei­na unu­tar sta­ni­ce pos­re­do­va­no je ak­ti­va­ci­jom dru­gih pro­tei­na. Pro­tei­ni ko­ji olak­ša­va­ju sma­ta­nje dru­gih pro­tei­na naz­va­ni su mo­le­ku­ lar­nim ša­pe­ro­ni­ma. Po­jam cha­pe­ron pr­vi su upot­ri­je­bi­li Ron Las­key i su­ rad­ni­ci ka­ko bi opi­sa­li pro­tein (nuk­leop­laz­min) ko­ji je bio pot­re­ban za stva­ra­nje nuk­leo­so­ma iz his­to­na i DNA. Nuk­leop­laz­min se ve­že na his­to­ne i pos­re­du­je nji­ho­vo ud­ru­ži­va­nje u nuk­leo­so­me, ali se sam nuk­leop­laz­min ne ug­ra­đu­je u ko­nač­nu struk­tu­ru nuk­leo­so­ma. Ša­pe­ro­ni na taj na­čin dje­ lu­ju kao ka­ta­li­za­to­ri ko­ji olak­ša­va­ju ud­ru­ži­va­nje, a da se pri to­me ne ug­ra­ đu­ju u kom­ple­ks. Stu­di­je ko­je su sli­je­di­le pro­ši­ri­le su kon­ce­pt, pa se da­nas tim ime­nom na­zi­va­ju pro­tei­ni ko­ji pos­re­du­ju u mno­gim dru­gim pro­ce­si­ ma ud­ru­ži­va­nja, po­se­bi­ce u sma­ta­nju pro­tei­na. Važ­no je uo­či­ti da ša­pe­ro­ni ne pre­no­se do­dat­ne in­for­ma­ci­je pot­reb­ne za sma­ta­nje po­li­pep­ti­da u nji­ho­ve pra­vil­ne tro­di­men­zio­nal­ne kon­for­ma­ci­je već da je kraj­nja kon­for­ma­ci­ja pro­tei­na od­re­đe­na is­klju­či­vo sli­je­dom ami­ no­ki­se­li­na. Ipak, ša­pe­ro­ni ka­ta­li­zi­ra­ju sma­ta­nje pro­tei­na po­ma­žu­ći u pro­ ce­su sa­mos­kla­pa­nja. Oni dje­lu­ju ta­ko da ve­žu i sta­bi­li­zi­ra­ju nes­mo­ta­ne ili dje­lo­mič­no smo­ta­ne po­li­pep­ti­de ko­ji su me­đup­ro­duk­ti pro­ce­sa ko­ji vo­di do ko­nač­nog pra­vil­no smo­ta­nog ob­li­ka. U od­sut­nos­ti ša­pe­ro­na, nes­mo­ta­ni ili dje­lo­mič­no smo­ta­ni po­li­pep­tid­ni lan­ci bi­li bi nes­ta­bil­ni unu­tar sta­ni­ce, pa bi se sma­ta­li nep­ra­vil­no ili bi se ag­re­gi­ra­li u ne­top­lji­ve kom­plek­se. Ve­ za­nje ša­pe­ro­na sta­bi­li­zi­ra ove nes­mo­ta­ne po­li­pep­ti­de či­me se spr­je­ča­va nep­ra­vil­no sma­ta­nje i ag­re­ga­ci­ja te na taj na­čin omo­gu­ću­je sma­ta­nje po­li­ pep­tid­nog lan­ca u nje­go­vu pra­vil­nu kon­for­ma­ci­ju. Do­bar su prim­jer ša­pe­ro­ni ko­ji se ve­žu na po­li­pep­tid­ni la­nac u nas­ta­ja­ nju, ko­ji se još uvi­jek pre­vo­di na ri­bo­so­mu te na taj na­čin spr­je­ča­va­ju ne­ pra­vil­no sma­ta­nje ili ag­re­ga­ci­ju ami­no-ter­mi­nal­nog di­je­la po­li­pep­ti­da pri­je ne­go što je sin­te­za ci­je­log lan­ca zav­r­še­na (sl. 8-22). Pro­tei­ni se sma­ta­ju u do­me­ne ko­je se sas­to­je od 100 do 300 ami­no­ki­se­lin­skih os­ta­ta­ka, pa je nuž­no da se la­nac u nas­ta­ja­nju zaš­ti­ti od nep­ra­vil­nog sma­ta­nja ili ag­re­ga­ ci­je s dru­gim pro­tei­ni­ma sve dok sin­te­za či­ta­ve do­me­ne ni­je zav­r­še­na i pro­tein mo­že bi­ti smo­tan u svo­ju pra­vil­nu kon­for­ma­ci­ju. Ve­za­nje ša­pe­ro­na sta­bi­li­zi­ra ami­no-ter­mi­nal­ni dio u nes­mo­ta­noj kon­for­ma­ci­ji sve dok preos­ ta­li dio po­li­pep­tid­nog lan­ca ne bu­de sin­te­ti­zi­ran, od­nos­no dok se dov­r­še­ni pro­tein ne bu­de mo­gao smo­ta­ti u svo­ju pra­vil­nu kon­for­ma­ci­ju. Ša­pe­ro­ni ta­ko­đer sta­bi­li­zi­ra­ju nes­mo­ta­ne po­li­pep­tid­ne lan­ce za vri­je­me nji­ho­vog tran­spor­ta u sta­nič­ne or­ga­ne­le – prim­je­ri­ce, za vri­je­me tran­spor­ta pro­tei­na iz ci­to­so­la u mi­to­hon­dri­je (sl. 8-23). Pro­tei­ni se kroz mi­to­hon­drij­sku mem­bra­nu pre­no­se u dje­lo­mič­no smo­ta­noj kon­for­ma­ci­ji ko­ja je sta­bi­li­zi­

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   331

Sli­ka 8-22. Dje­lo­va­nje ša­pe­ro­na za vri­je­me tran­sla­ci­je.  Ša­pe­ro­ni se ve­žu na ami­no (N) ter­mi­nal­ni dio po­li­pep­tid­nog lan­ca u nas­ta­ja­nju te ga sta­bi­li­zi­ra­ju u nje­go­vom nes­mo­ta­nom ob­li­ku sve dok sin­te­za lan­ca ni­je u pot­pu­nos­ti zav­r­še­na. Dov­r­še­ni se pro­tein za­tim ot­puš­ta s ri­bo­so­ma, te se mo­že smo­ta­ti u svo­ju pra­vil­nu tro­di­men­zio­nal­nu kon­for­ma­ci­ju.

ra­na ša­pe­ro­ni­ma iz ci­to­so­la. Za­tim ša­pe­ro­ni unu­tar mi­to­hon­dri­ja olak­ša­va­ ju pri­je­nos po­li­pep­tid­nog lan­ca kroz mem­bra­nu te nje­go­vo sma­ta­nje unu­ tar or­ga­ne­la. Uz to, ša­pe­ro­ni sud­je­lu­ju i u ud­ru­ži­va­nju pro­tei­na ko­ji su iz­gra­đe­ni od vi­še po­li­pep­tid­nih la­na­ca te nji­ho­vom ud­ru­ži­va­nju u mak­ro­ mo­le­ku­lar­ne struk­tu­re (prim­je­ri­ce, nuk­leop­laz­min). Mno­gi pro­tei­ni za ko­je je da­nas poz­na­to da dje­lu­ju kao mo­le­ku­lar­ni ša­pe­ro­ni pr­vot­no su ot­kri­ve­ni kao pro­tei­ni top­lin­sko­ga šo­ka, sku­pi­na pro­tei­na ko­ja se ek­spri­mi­ra u sta­ni­ca­ma ko­je su bi­le iz­lo­že­ne po­vi­še­nim tem­pe­ra­tu­ra­ma. Smat­ra­lo se da pro­tei­ni top­lin­sko­ga šo­ka (Hsp, od en­gl. hea­t-sho­ck pro­tein), sta­bi­li­zi­ra­ju i olak­ša­va­ju po­nov­no sma­ta­nje pro­tei­na

Sli­ka 8-23. Dje­lo­va­nje ša­pe­ro­na za vri­je­me pri­je­no­sa pro­tei­na.  Dje­lo­mi­ č­no smo­ta­ni po­li­pep­tid pre­no­si se iz ci­ to­so­la u mi­to­hon­drij. Ci­to­sol­ni ša­pe­ro­ni sta­bi­li­zi­ra­ju nes­mo­ta­nu kon­f i­gu­ra­ci­ju. Mi­to­hon­drij­ski ša­pe­ro­ni olak­ša­va­ju pri­je­ nos i sma­ta­nje po­li­pep­tid­nog lan­ca unu­ tar or­ga­ne­la.

332    POGLAVLJE 8

Sli­ka 8-24. Sek­ven­cij­sko dje­lo­va­nje ša­pe­ro­na.  Za vri­je­me tran­sla­ci­je nes­mo­ta­ne po­li­pep­tid­ne lan­ce ve­žu i sta­bi­li­zi­ra­ju ša­pe­ro­ni po­ro­di­ce Hsp70. Nes­mo­ta­ni se pro­tei­ni za­tim pre­no­se na čla­no­ve po­ro­di­ce ša­pe­ro­ni­na, unu­tar ko­jih se od­vi­ja sma­ta­nje. Za ot­puš­ta­nje nes­mo­ta­nih po­li­pep­tid­nih la­na­ca sa Hsp70, kao i za nji­ho­vo sma­ta­nje unu­ tar ša­pe­ro­ni­na nuž­na je hid­ro­li­za ATP.

ko­ji su bi­li dje­lo­mič­no de­na­tu­rira­ni zbog iz­la­ga­nja po­vi­še­noj tem­pe­ra­tu­ri. Dvi­je po­ro­di­ce pro­tei­na top­lin­sko­ga šo­ka Hsp70 i ša­pe­ro­ni­ni sud­je­lu­ju u cje­lo­kup­nom pro­cesu sma­ta­nja pro­tei­na u pro­ka­riot­skim i eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma. Čla­no­vi po­ro­di­ce Hsp70 sta­bi­li­zi­ra­ju nes­mo­ta­ne po­li­pep­tid­ne lan­ce ti­je­kom tran­sla­ci­je (vi­di za prim­jer sli­ku 8-22) kao i za vri­je­me tran­ spor­ta po­li­pep­ti­da u raz­li­či­te unu­tar­sta­nič­ne od­jelj­ke, kao što su mi­to­hon­ dri­ji i en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul. Ovi se pro­tei­ni ve­žu za krat­ke hid­ro­fob­ne di­je­lo­ve (od prib­liž­no se­dam ami­no­ki­se­lin­skih os­ta­ta­ka) nes­mo­ta­nog po­li­ pep­ti­da, zad­r­ža­va­ju­ći po­li­pep­tid­ni la­nac u nje­go­voj nes­mo­ta­noj kon­for­ma­ ci­ji i sprje­ča­va­ju­ći ag­re­ga­ci­ju. Nes­mo­ta­ni po­li­pep­tid­ni la­nac se za­tim pre­no­si sa ša­pe­ro­na Hsp70 na ša­pe­ro­nin, unu­tar ko­jeg se od­vi­ja sma­ta­nje pro­tei­na, či­me nas­ta­je pro­tein pra­vil­no smo­tan u svo­ju tro­di­men­zion­alnu kon­for­ma­ci­ju. Ša­pe­ro­ni­ni se sa­sto­je od vi­še pro­tein­skih pod­je­di­ni­ca ure­đe­nih u dva nad­slo­že­na pr­ste­na, či­me stva­ra­ju struk­tu­ru s dvi­je šup­lji­ne. Nes­mo­ta­ni po­li­pep­tid­ni lan­ci za­ šti­će­ni su od ci­to­so­la ta­ko što se ve­žu unu­tar sre­diš­nje šup­lji­ne ša­pe­ro­nin­ skog ci­lin­dra. U ovom izo­li­ra­nom ok­ru­že­nju sma­ta­nje pro­tei­na mo­že se nas­ta­vi­ti, dok je ag­re­ga­ci­ja nes­mo­ta­nih di­je­lo­va po­li­pep­tid­nog lan­ca spri­je­ če­na nji­ho­vim ve­za­njem za ša­pe­ro­nin. I bak­te­rij­ske i eu­ka­riot­ske sta­ni­ce ta­ko­đer sad­rž­ e i dru­ge po­ro­di­ce ša­pe­ro­na, a broj ša­pe­ro­na je zna­čaj­no ve­ći kod eu­ka­rio­ta. Prim­je­ri­ce, al­ter­na­tiv­ni put sma­ta­nja ne­kih pro­tei­na u ci­to­ so­lu i en­dop­laz­mat­skom re­ti­ku­lu uk­lju­ču­je dje­lo­va­nje čla­no­va po­ro­di­ca Hsp70 i Hsp90. Ve­ći­na sup­stra­ta za sma­ta­nje uz Hsp90 su pro­tei­ni ko­ji sud­je­lu­ju u pri­je­no­su sig­na­la, uk­lju­ču­ju­ći re­cep­to­re ste­roid­nih hor­mo­na i raz­li­či­te pro­tein­-ki­na­ze.

En­zi­mi ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju sma­ta­nje pro­tei­na Osim ša­pe­ro­na, ko­ji olak­ša­va­ju sma­ta­nje pro­tei­na ve­za­njem i sta­bi­li­za­ ci­jom dje­lo­mič­no smo­ta­nih me­đup­ro­du­ka­ta, sta­ni­ce sad­r­ža­va­ju naj­ma­nje dvi­je vr­ste en­zi­ma ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju sma­ta­nje pro­tei­na. Stva­ra­nje di­sul­fid­nih ve­za iz­me­đu cis­tein­skih os­ta­ta­ka važ­no je za sta­bi­li­za­ci­ju smo­ta­nih struk­ tu­ra mno­gih pro­tei­na (v. sl. 2-16). Pro­tei­n-di­sul­fi­d-i­zo­me­ra­ze (PDI), ko­je je 1963. go­di­ne ot­krio Chris­tian An­fin­sen, ka­ta­li­zi­ra­ju stva­ra­nje di­sul­fid­

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   333

Sli­ka 8-25. Dje­lo­va­nje en­zi­ma pro­ tein-di­s ul­f i­d -i­z o­m e­ra­z e.  Pro­tei­n -di­ sul­f i­d-i­zo­me­ra­za (PDI) ka­ta­li­zi­ra stva­ra­nje di­sul­f id­nih ve­za, ka­ta­li­zi­ra­ju­ći ok­si­do­ re­duk­cij­sku reak­ci­ju iz­me­đu sup­stra­ta i svo­jih fun­kcio­nal­nih sku­pi­na.

nih ve­za (sl. 8-25). Za pro­tei­ne ko­ji sad­r­ža­va­ju vi­še cis­tein­skih os­ta­ta­ka, PDI ta­ko­đer ima­ju važ­nu ulo­gu u po­ti­ca­nju br­ze iz­mje­ne iz­me­đu spa­re­nih di­sul­fi­da, omo­gu­ću­ju­ći ti­me pro­tei­nu zad­r­ža­va­nje ob­ras­ca di­sul­fid­nih ve­za ko­ji je kom­pa­ti­bi­lan s nje­go­vom sta­bil­no smo­ta­nom kon­for­ma­ci­jom. Di­ sul­fid­ne su ve­ze ug­lav­nom pri­sut­ne kod sek­re­tor­nih pro­tei­na i ne­kih mem­ bran­skih pro­tei­na jer ci­to­sol sad­r­ža­va re­du­ci­ra­ju­će agen­se ko­ji od­r­ža­va­ju cis­tein­ske os­tat­ke u re­du­ci­ra­nom (–SH) ob­li­ku, spr­je­ča­va­ju­ći na taj na­čin stva­ra­nje di­sul­fid­ne (S–S) ve­ze. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma di­sul­fid­ne ve­ze nas­ta­ju u en­dop­laz­mat­skom re­ti­ku­lu, u ko­jem se od­rž­ a­va­ju ok­si­da­tiv­ni uvje­ti. PDI je klju­čan ša­pe­ron i ka­ta­li­za­tor sma­ta­nja pro­tei­na u en­dop­laz­ mat­skom re­ti­ku­lu i je­dan je od naj­zas­tup­lje­ni­jih pro­tei­na u tom or­ga­ne­lu. Dru­gi en­zim ko­ji sud­je­lu­je u pro­ce­su sma­ta­nja pro­tei­na ka­ta­li­zi­ra izo­ me­ri­za­ci­ju pep­tid­nih ve­za u ko­ji­ma sud­je­lu­je pro­lin (sl. 8-26). Pro­lin je ami­no­ki­se­li­na neo­bič­na po to­me što je u rav­no­te­ži iz­me­đu cis i tra­ns kon­ fi­gu­ra­ci­je pep­tid­nih ve­za ko­je pret­ho­de pro­lin­skom os­tat­ku, tra­ns ob­lik tek bla­go fa­vo­ri­zi­ran. Sup­rot­no to­mu, pep­tid­ne ve­ze iz­me­đu dru­gih ami­no­ki­ se­li­na go­to­vo su uvi­jek u tra­ns ob­li­ku. Izo­me­ri­za­ci­ja iz­me­đu cis i tra­ns kon­ fi­gu­ra­ci­ja pep­tid­nih ve­za ko­je pret­ho­de pro­lin­skom os­tat­ku, ko­ja u pro­tiv­ nom mo­že pred­stav­lja­ti og­ra­ni­ča­va­ju­ći ko­rak u pro­tein­skom sma­ta­nju, ka­ta­li­zi­ra­na je en­zi­mom pep­ti­di­l-pro­li­l-i­zo­me­ra­zom. Ovaj en­zim ši­ro­ko je ras­pros­tra­njen i kod pro­ka­riot­skih i kod eu­ka­riot­skih sta­ni­ca i ig­ra važ­ nu ulo­gu u sma­ta­nju ne­kih pro­tei­na.

Ki­da­nje pro­tei­na

Ki­da­nje po­li­pep­tid­no­ga lan­ca (pro­teo­li­za) va­žan je ko­rak u saz­ri­je­va­nju ne­kih pro­tei­na. Jed­nos­ta­van je prim­jer uk­la­nja­nje ini­ci­ja­tor­skog me­tio­ni­na s ami­no-kra­ja mno­gih po­li­pep­ti­da, ko­ji se od­vi­ja ne­pos­red­no na­kon što je ami­no-kraj ras­tu­ćeg po­li­pep­tid­nog lan­ca iz­ro­nio iz ri­bo­so­ma. Do­dat­ne ke­ mij­ske sku­pi­ne, kao što su ace­tat­na sku­pi­na ili lan­ci mas­nih ki­se­li­na (o če­mu će se us­ko­ro ras­prav­lja­ti) čes­to se do­da­ju na ami­no-ter­mi­nal­ni os­ta­ tak. Pro­teo­li­tič­ke mo­di­fi­ka­ci­je ami­no-kra­ja važ­ne su ta­ko­đer i za pri­je­nos mno­gih pro­tei­na kroz mem­bra­ne, uk­lju­ču­ju­ći sek­re­tor­ne pro­tei­ne kod bak­te­ri­ja i eu­ka­rio­ta, kao i pro­tei­na pre­dod­re­đe­nih za ug­rad­nju u sta­nič­nu mem­bra­nu, li­zo­so­me, mi­to­hon­dri­je i klo­rop­las­te eu­ka­riot­skih sta­ni­ca. Ovi su pro­tei­ni us­mje­re­ni za pri­je­nos do svo­jih od­re­diš­ta pu­tem ami­no-ter­mi­ nal­nog sli­je­da ko­ji se uk­la­nja pro­teo­li­tič­kim ki­da­njem kad pro­tein pro­đe

Sli­ka 8-26. Dje­lo­va­nje pep­ti­di­l-pro­li­l-i­zo­me­ra­ze.  Pep­ti­di­l-pro­li­l-i­zo­me­ra­za ka­ta­li­ zi­ra izo­me­ri­za­ci­ju cis i tra­ns kon­for­ma­ci­je pep­tid­ne ve­ze u ko­joj sud­je­lu­je pro­lin.

334    POGLAVLJE 8

Sli­ka 8-27. Ulo­ga sig­nal­no­ga sli­je­da u pri­je­no­su pro­tei­na kroz mem­bra­ne.  Sig­nal­ni sli­jed us­mje­ra­va pri­je­nos po­li­ pep­tid­nog lan­ca kroz sta­nič­nu mem­bra­ nu bak­te­ri­ja ili u en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul eu­ka­riot­skih sta­ni­ca (što je pri­ka­za­no na sli­ci). Sig­nal­ni sli­jed, niz hid­ro­fob­nih ami­ no­ki­se­li­na ko­ji se na­la­zi na ami­no-kra­ju po­li­pep­tid­nog lan­ca, ura­nja po­li­pep­tid­ni la­nac u mem­bran­ski ka­nal čim la­nac iz­ ro­ni iz ri­bo­so­ma. Za­tim se os­ta­tak lan­ca pre­no­si kroz ka­nal, a sig­nal­ni sli­jed ot­ki­ nut dje­lo­va­njem sig­nal­nih pep­ti­da­za, ot­ puš­ta sa zre­lo­ga pre­ne­se­no­ga pro­tei­na.

kroz mem­bra­nu. Prim­je­ri­ce, ami­no-ter­mi­nal­ni sig­nal­ni sli­jed, dug naj­češ­ će dva­de­se­tak ami­no­ki­se­li­na, us­mje­ra­va mno­ge sek­re­tor­ne pro­tei­ne u sta­ nič­nu mem­bra­nu bak­te­ri­ja ili u en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul eu­ka­riot­skih sta­ni­ ca dok je tran­sla­ci­ja još uvi­jek u ti­je­ku (sl. 8-27). Sig­nal­ni sli­jed, ko­ji se ug­lav­nom sas­to­ji od hid­ro­fob­nih ami­no­ki­se­li­na, ura­nja u mem­bran­ski ka­ nal ne­pos­red­no na­kon što iz­ro­ni iz ri­bo­so­ma. Ka­ko se tran­sla­ci­ja od­vi­ja, os­ta­tak po­li­pep­tid­no­ga lan­ca pro­la­zi kroz ka­nal u mem­bra­ni. Za­tim se sig­ nal­ni sli­jed uk­la­nja ki­da­njem s po­mo­ću spe­ci­fič­nih mem­bran­skih pro­tea­za (sig­nal­ne pep­ti­da­ze), a zre­li se pro­tein ot­puš­ta. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, tran­slo­ka­ci­ja ras­tu­ćeg po­li­pep­tid­nog lan­ca u en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul pred­ stav­lja pr­vi ko­rak u us­mje­ra­va­nju pro­tei­na za sek­re­ci­ju, ug­rad­nju u sta­nič­ nu mem­bra­nu ili ug­rad­nju u li­zo­so­me. O me­ha­niz­mi­ma ko­ji us­mje­ra­va­ju tran­spo­rt pro­tei­na na ova od­re­diš­ta, kao i o ulo­zi dru­gih us­mje­ra­va­ju­ćih slje­do­va u pri­je­no­su pro­tei­na u mi­to­hon­dri­je i klo­rop­las­te bit će vi­še go­vo­ ra u pog­lav­lji­ma 10 i 11. Dru­gi va­žan ob­lik pro­teo­li­tič­ke do­ra­dbe je­st stva­ra­nje ak­tiv­nih en­zi­ma ili hor­mo­na, ki­da­njem ve­ćih pre­te­ča. Do­bar je prim­jer in­zu­lin, ko­ji se sin­ te­ti­zi­ra kao du­gi pre­kur­sor­ski po­li­pep­tid, a ko­nač­ni ob­lik nas­ta­je dvos­tru­ kim ki­da­njem. Po­čet­ni pre­kur­sor (prep­roin­zu­lin) sad­rž­ a­va ami­no-ter­mi­ nal­ni sli­jed ko­ji us­mje­ra­va po­li­pep­tid­ni la­nac u en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul (sl. 8-28). Uk­la­nja­njem sig­nal­nog sli­je­da ti­je­kom pri­je­no­sa u en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul nas­ta­je dru­gi pre­kur­sor, naz­van proin­zu­lin. Ovaj se pre­kur­sor za­tim pre­vo­di u in­zu­lin (ko­ji se sas­to­ji od dva­ju la­na­ca po­ve­za­nih di­sul­fid­nim ve­za­ma) pro­teo­li­tič­kim uk­la­nja­njem unut­raš­njeg di­je­la pep­ti­da. Dru­gi pro­ tei­ni ak­ti­vi­ra­ni slič­nim pro­ce­si­ma ki­da­nja je­su pro­bav­ni pro­tei­ni i pro­tei­ni uk­lju­če­ni u zgru­ša­va­nje kr­vi te kas­ka­da pro­tea­za ko­je re­gu­li­ra­ju prog­ra­mi­ ra­nu smrt kod ži­vo­ti­nja. Za­nim­lji­vo je uo­či­ti da pro­tei­ni mno­gih ži­vo­tinj­skih vi­ru­sa nas­ta­ju ki­ da­njem ve­ćih pre­kur­so­ra. Je­dan iz­nim­no va­žan prim­jer ulo­ge pro­teo­li­ze u rep­li­ka­ci­ji vi­ru­sa na­đen je u HIV. Ti­je­kom rep­li­ka­ci­je HIV, pro­tea­za ko­ja je ko­di­ra­na u vi­ru­su ki­da po­li­pep­tid­ni pre­kur­sor pri če­mu nas­ta­je vi­rus­ni struk­tur­ni pro­tein. Zbog sre­diš­nje ulo­ge u rep­li­ka­ci­ji vi­ru­sa, pro­tea­ze iz HIV (uz re­ver­znu tran­skrip­ta­zu) važ­na su me­ta za raz­voj li­je­ko­va za te­ra­ pi­ju AIDS. Da­nas su, uis­ti­nu, in­hi­bi­to­ri pro­tea­za me­đu na­ju­čin­ko­vi­ti­jim agen­si­ma dos­tup­nim za bor­bu pro­tiv ove bo­les­ti.

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   335

Sli­ka 8-28. Pro­teo­li­tič­ka do­ra­dba in­ zu­li­na.  Zre­la mo­le­ku­la in­zu­li­na iz­gra­ đe­na je od dva­ju po­li­pep­tid­nih la­na­ca (A i B) ko­ji su me­đu­sob­no po­ve­za­ni di­sul­ fid­nim ve­za­ma. In­zu­lin se sin­te­ti­zi­ra kao pre­kur­sor­ski po­li­pep­tid – prep­roin­zu­lin. Ami­no-ter­mi­nal­ni sig­nal­ni sli­jed ot­ki­da se ti­je­kom pri­je­no­sa ras­tu­ćeg po­li­pep­ tid­nog lan­ca u en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul či­me nas­ta­je slje­de­ći pre­kur­sor (proin­ zu­lin). Dalj­njom pro­teo­li­zom, ko­jom se uk­la­nja unu­tar­nji po­ve­zu­ju­ći po­li­pep­tid, proin­zu­lin se pre­vo­di u in­zu­lin.

Gli­ko­zi­la­ci­ja Mno­gi pro­tei­ni, po­se­bi­ce u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma, mo­di­fi­ci­ra­ni su do­dat­kom ug­lji­ko­hid­ra­ta, u pro­ce­su naz­va­nom gli­ko­zi­la­ci­ja. Pro­tei­ni na ko­je je ve­zan ug­lji­ko­hid­rat­ni la­nac (naz­va­ni gli­kop­ro­tei­ni) ug­lav­nom se iz­lu­ču­ju ili su smješ­te­ni na sta­nič­noj pov­r­ši­ni, prem­da su mno­gi jez­gre­ni i ci­to­sol­ni pro­tei­ni ta­ko­đer gli­ko­zi­li­ra­ni. Ug­lji­ko­hid­rat­ni di­je­lo­vi gli­kop­ro­ tei­na ima­ju važ­nu ulo­gu u sma­ta­nju pro­tei­na u en­dop­laz­mat­skom re­ti­ku­lu, u us­mje­ra­va­nju pro­tei­na u od­go­va­ra­ju­će sta­nič­ne od­jelj­ke te kao mjes­ta pre­poz­na­va­nja u me­đus­ta­nič­nim in­te­rak­ci­ja­ma. Ovis­no o mjes­tu ve­za­nja ug­lji­ko­hid­rat­nog boč­nog lan­ca, gli­kop­ro­tei­ni su po­di­je­lje­ni na N-ve­za­ne ili O-ve­za­ne (sl. 8-29). Kod N-ve­za­nih gli­ko­ pro­tei­na, ug­lji­ko­hid­rat je ve­zan na du­ši­kov atom boč­nog og­ran­ka as­pa­ra­ gi­na. Kod O-ve­za­nih gli­kop­ro­tei­na, mjes­to ve­za­nja ug­lji­ko­hid­ra­ta je ki­si­ kov atom boč­nog og­ran­ka se­ri­na ili treo­ni­na. Še­će­ri iz­rav­no ve­za­ni na te po­lo­ža­je su N-a­ce­til­glu­ko­za­min kod N-ve­za­nih še­će­ra i N-a­ce­til­ga­lak­to­za­ min kod O-ve­za­nih še­će­ra. Ve­ći­na gli­kop­ro­tei­na u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma pre­dod­re­đe­na je za sek­ re­ci­ju ili ug­rad­nju u sta­nič­nu mem­bra­nu. Ovi se pro­tei­ni naj­češ­će pre­no­se u en­dop­laz­mat­ski re­ti­kul dok nji­ho­va tran­sla­ci­ja još uvi­jek tra­je. Gli­ko­zi­la­ ci­ja, ta­ko­đer, za­po­či­nje u en­dop­laz­mat­skom re­ti­ku­lu pri­je ne­go što je tran­ sla­ci­ja u pot­pu­nos­ti zav­r­še­na. Pr­vi je ko­rak pri­je­nos os­nov­nog oli­go­sa­ha­ri­ da iz­gra­đe­nog od 14 še­ćer­nih os­ta­ta­ka (2 N-a­ce­til­glu­ko­za­mi­na, 3 glu­ko­ze i 9 ma­no­za) na as­pa­ra­gin ras­tu­ćeg po­li­pep­tid­nog lan­ca (sl. 8-30). Oli­go­sa­ ha­rid je s en­dop­laz­mat­skim re­ti­ku­lom po­ve­zan pu­tem li­pid­nog no­sa­ča

Sli­ka 8-29. Ti­po­vi ve­za ko­ji­ma su ug­lji­ko­hid­rat­ni lan­ci po­ve­za­ni s pro­teini­ma u gli­kop­ro­tei­ni­ma.  N-ve­za­ni gli­ka­ni po­ve­za­ni su s pro­tei­nom pre­ko as­pa­ra­gi­na, dok su O-ve­za­ni gli­ka­ni po­ve­za­ni ili pre­ko se­ri­na (što je pri­ka­za­no na sli­ci) ili treo­ni­na. Še­ će­ri pre­ko ko­jih su ug­lji­ko­hid­rat­ni lan­ci po­ve­za­ni s pro­tei­nom je­su N-a­cet­ilglu­ko­za­min kod N-ve­za­nih gli­kop­ro­tei­na, od­nos­no N-a­ce­til­ga­lak­to­za­min kod O-ve­za­nih gli­kop­ro­ tei­na.

336    POGLAVLJE 8

Sli­ka 8-30. Sin­te­za N-ve­za­nih gli­kop­ro­tei­na.  Pr­vi ko­rak gli­ko­zi­la­ci­je, ko­ji se od­vi­ ja u en­dop­laz­mat­skom re­ti­ku­lu, je­st ve­za­nje oli­go­sa­ha­ri­da iz­gra­đe­nog od 14 še­ćer­nih os­ta­ta­ka na po­li­pep­tid u nas­ta­ja­nju. Oli­go­sa­ha­rid (iz­gra­đen od dva N-a­ce­til­glu­ko­za­mi­ na, de­vet ma­no­za i tri glu­ko­ze) ve­zan je na li­pid­ni no­sač (do­li­ko­l-fos­fat) ko­ji je uro­njen u mem­bra­nu ER. Oli­go­sa­ha­rid se za­tim u ci­je­los­ti pre­no­si na ak­cep­tor­ski as­pa­ra­gin­ski os­ta­tak po­li­pep­ti­da.

(doli­ko­l-fos­fa­ta). Oli­go­sa­ha­rid se za­tim pre­no­si na in­tak­tnu je­di­ni­cu ak­ cep­tor­skog as­pa­ra­gi­na (A­sn) smješ­te­nog unu­tar sli­je­da A­sn-X-Ser ili A­snX-Thr (gdje je X bi­lo ko­ja ami­no­ki­se­li­na osim pro­li­na). Ti­je­kom dalj­nje do­ra­dbe os­nov­ni se N-ve­za­ni oli­go­sa­ha­rid mo­di­fi­ci­ra (sl. 8-31). Dok se gli­kop­ro­tein na­la­zi u en­dop­laz­mat­skom re­ti­ku­lu, uk­la­ nja­ju se tri glu­koz­na os­tat­ka, što je ključ­no za sma­ta­nje pro­tei­na (v. po­gl. 10). Oli­go­sa­ha­rid se do­dat­no mo­di­fi­ci­ra u Gol­gi­je­vu apa­ra­tu u ko­ji se gli­ kop­ro­tei­ni pre­no­se iz en­dop­laz­mat­skog re­ti­ku­la. Ove mo­di­fi­ka­ci­je obu­h­va­ ća­ju i uk­la­nja­nje i do­da­va­nje ug­lji­ko­hid­rat­nih os­ta­ta­ka ka­ko gli­kop­ro­tein pro­la­zi kroz od­jelj­ke Gol­gi­je­va apa­ra­ta. N-ve­za­ni oli­go­sa­ha­ri­di raz­li­či­tih gli­kop­ro­tei­na do­ra­đu­ju se u raz­li­či­toj mje­ri, ovis­no o en­zi­mi­ma ko­ji su pri­ sut­ni u raz­li­či­tim sta­ni­ca­ma kao i o dos­tup­nos­ti oli­go­sa­ha­ri­da en­zi­mi­ma ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju ove mo­di­fi­ka­ci­je. Gli­kop­ro­tei­ni s ne­dos­tup­nim oli­go­sa­ha­ ri­di­ma ne do­bi­va­ju no­ve še­će­re u Gol­gi­je­vu apa­ra­tu. Sup­rot­no to­mu, gli­ kop­ro­tei­ni s dos­tup­nim oli­go­sa­ha­ri­di­ma in­ten­ziv­no se pro­ce­si­ra­ju što re­ zul­ti­ra stva­ra­njem raz­no­li­kih kom­plek­snih oli­go­sa­ha­ri­da. O-ve­za­ni oli­go­sa­ha­ri­di se na po­li­pep­ti­de ta­ko­đer do­da­ju u Gol­gi­je­vu apa­ra­tu. Sup­rot­no N-ve­za­nim oli­go­sa­ha­ri­di­ma, O-ve­za­ni oli­go­sa­ha­ri­di na­

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA  Sli­ka 8-31. Pro­ce­si­ra­nje N-ve­za­nih oli­go­sa­ha­ri­da.  Raz­li­či­ti oli­go­sa­ha­ri­di nas­ta­ju dalj­njim mo­di­f i­ka­ci­ja­ma os­nov­nog oli­go­sa­ha­ri­da, iz­gra­đe­nog od 14 še­ćer­nih je­di­ni­ca, ko­ji je do­dan na pro­tein u en­dop­laz­mat­skom re­ti­ku­lu. Tri glu­koz­na os­tat­ka uk­la­nja­ju se u en­dop­laz­mat­skom re­ti­ku­lu. Gli­kop­ro­tein se za­tim pre­mješ­ta u Gol­gi­je­v apa­rat u ko­jem se uk­la­nja­ju ma­noz­ni os­tat­ci te se do­da­ju dru­gi še­će­ri. Pri­ka­za­na struk­tu­ra je rep­re­zen­ta­tiv­ni prim­jer.

s­ta­ju do­da­va­njem jed­nog po jed­nog še­će­ra i naj­češ­će se sas­to­je od sa­mo ne­ko­li­ko os­ta­ta­ka (sl. 8-32). Mno­gi ci­top­laz­mat­ski i jez­gre­ni pro­tei­ni, uklju­ču­ju­ći mno­ge tran­skrip­cij­ske fak­to­re, mo­di­fi­ci­ra­ni su do­dat­kom jed­ nog O-vezanog N-a­ce­til­glu­ko­za­min­skog os­tat­ka, što je ka­ta­li­zi­ra­no dru­gim en­zim­skim sus­ta­vom. Smat­ra se da gli­ko­zi­la­ci­ja ci­top­laz­mat­skih i jez­gre­nih pro­tei­na re­gu­li­ra nji­ho­vu ak­tiv­no­st, prem­da pos­lje­di­ce O-gli­ko­zi­la­ci­je još uvi­jek ni­su u pot­pu­nos­ti raz­jaš­nje­ne.

Ve­za­nje li­pi­da Ne­ki pro­tei­ni eu­ka­riot­skih sta­ni­ca mo­di­fi­ci­ra­ni su ve­za­njem li­pi­da na po­li­pep­tid­ni la­nac. Ove mo­di­fi­ka­ci­je naj­češ­će slu­že za us­mje­ra­va­nje i si­ dre­nje pro­tei­na u sta­nič­nu mem­bra­nu, u ko­ju se hid­ro­fob­ni li­pid mo­že uklo­pi­ti (v. sl. 2-25). Uo­bi­ča­je­na su tri ti­pa li­pid­nih mo­di­fi­ka­ci­ja – N-mi­ ris­ti­la­ci­ja, pre­ni­la­ci­ja i pal­mi­ta­ci­ja, i to na eu­ka­riot­skim pro­tei­ni­ma ko­ji su po­ve­za­ni s ci­to­sol­nom stra­nom sta­nič­ne mem­bra­ne. Čet­vr­ti tip mo­di­fi­ka­ ci­je, do­da­tak gli­ko­li­pi­da, ima važ­nu ulo­gu u sid­re­nju ne­kih pov­r­šin­skih pro­tei­na u vanj­sku stra­nu sta­nič­ne mem­bra­ne. Na ne­ke se pro­tei­ne mas­na ki­se­li­na ve­že na ami­no-kraj ras­tu­ćeg po­li­ pep­tid­nog lan­ca ti­je­kom tran­sla­ci­je. U tom pro­ce­su, naz­va­nom N-mi­ris­ti­ la­ci­ja, mi­ris­tin­ska ki­se­li­na (mas­na ki­se­li­na iz­gra­đe­na od 14 ug­lji­ko­vih ato­ ma) ve­že se na N-ter­mi­nal­ni gli­cin (sl. 8-33). Gli­cin je čes­to dru­ga po re­du ami­no­ki­se­li­na ug­ra­đe­na u po­li­pep­tid­ni la­nac, a ini­ci­ja­tor­ski se me­tio­nin uk­la­nja pro­teo­li­zom pri­je do­dat­ka mas­ne ki­se­li­ne. Mno­gi pro­tei­ni ko­ji su mo­di­fi­ci­ra­ni N-miristilacijom po­ve­za­ni su s unut­raš­njom stra­nom sta­ni­ čne mem­bra­ne. Ulo­gu mas­ne ki­se­li­ne u tom po­ve­zi­va­nju jas­no su po­ka­za­ le ana­li­ze mu­ti­ra­nih pro­tei­na kod ko­jih je N-ter­mi­nal­ni gli­cin za­mi­je­njen

Sli­ka 8-32. Prim­je­ri O-ve­za­nih oli­go­sa­ha­ ri­da.  O-ve­za­ni oli­go­sa­ha­ri­di naj­češ­će se sa­ sto­je od tek ne­ko­li­ko ug­lji­ko­hid­rat­nih os­ta­ta­ ka, ko­ji se do­da­ju je­dan po je­dan.

   337

338    POGLAVLJE 8 Sli­ka 8-33. Do­da­tak mas­nih ki­se­li­na N-mi­ris­ti­la­ci­jom.  Uk­la­nja­njem po­če­ tnog me­tio­ni­na, na N-kra­ju po­li­pep­tid­ nog lan­ca os­ta­je gli­cin. Za­tim se do­da­ je mi­ris­tin­ska ki­se­li­na (mas­na ki­se­li­na iz­gra­đe­na od 14 ug­lji­ko­vih ato­ma).

ala­ni­nom. Ovom je zam­je­nom spri­je­če­na mi­ris­ti­la­ci­ja te je blo­ki­ra­na fun­ kci­ja mu­ti­ra­nih pro­tei­na ti­me što je one­mo­gu­će­no nji­ho­vo po­ve­zi­va­nje s mem­bra­nom. Li­pi­di na pro­tein mo­gu bi­ti ve­za­ni i pre­ko boč­nih og­ra­na­ka cis­tei­na, se­ri­na ili treo­ni­na. Va­žan prim­jer ovog ti­pa mo­di­fi­ka­ci­je je pre­ni­la­ci­ja, u ko­joj su spe­ci­fič­ni ti­po­vi li­pi­da (pre­nil­ne sku­pi­ne) ve­za­ni na sum­por­ne ato­ me boč­nih og­ra­na­ka cis­tei­na smješ­te­nih na C-kra­ju po­li­pep­tid­nog lan­ca (sl. 8-34). Mno­gi pro­tei­ni ve­za­ni na sta­nič­nu mem­bra­nu ko­ji sud­je­lu­ju u kon­tro­li sta­nič­nog ras­ta i di­fe­ren­ci­ja­ci­je mo­di­fi­ci­ra­ni su na ovaj na­čin, prim­je­ri­ce on­ko­ge­ni pro­tei­ni Ras ko­ji su od­go­vor­ni za ne­kon­tro­li­ran ra­st mno­gih tu­mo­ra u čov­je­ka (v. pog­l. 18). Pre­ni­la­ci­ja se kod ovih pro­tei­na od­vi­ja u tri ko­ra­ka. Pr­vo se pre­nil­na sku­pi­na do­da­je na cis­tein ko­ji je od kar­bok­sil­nog kra­ja po­li­pep­tid­nog lan­ca uda­ljen tri ami­no­ki­se­li­ne. Pre­nil­ne sku­pi­ne ko­je se do­da­ju u ovoj reak­ci­ji je­su ili far­ne­zil (15 uglji­ko­vih ato­ma,

Sli­ka 8-34. Pre­ni­la­ci­ja C-ter­mi­nal­no­ga cis­tein­skog os­tat­ka.  Ovaj tip pre­ni­la­ci­je dje­lu­je na pro­tei­ne Ras i pro­tei­ne jez­gri­ne ovoj­ni­ce (jez­gre­ni la­mi­ni). Ovi pro­ tei­ni na C-kra­ju zav­r­ša­va­ju cis­tein­skim os­tat­kom (Cys) iza ko­jeg sli­je­de dvi­je ali­fat­ske ami­no­ki­se­li­ne (A) i jed­ na, bi­lo ko­ja ami­no­ki­se­li­na (X). Pr­vi ko­rak mo­di­f i­ka­ci­je je­st do­da­tak far­ne­zil­ne sku­pi­ne iz­gra­đe­ne od 15 ug­lji­ ko­vih ato­ma na boč­ni og­ra­nak cis­tei­na (far­ne­zi­la­ci­ja). Za­tim sli­je­di pro­teo­li­tič­ko uk­la­nja­nje tri C-ter­mi­nal­ne ami­no­ki­se­li­ne te me­ti­la­ci­ja cis­tei­na, ko­ji se sa­da na­la­zi na C-kra­ju.

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   339

Sli­ka 8-35. Pal­mi­ta­ci­ja.  Pal­mi­tat (mas­na ki­se­li­na iz­gra­đe­na od 16 ug­lji­ko­vih ato­ma) do­da­je se na boč­ne og­ran­ke cis­tei­na ko­ji su smješ­te­ni u unut­raš­njem di­ je­lu po­li­pep­tid­no­ga lan­ca.

pri­ka­zan na sl. 8-34) ili ge­ra­ni­l-ge­ra­nil (20 ug­lji­ko­vih ato­ma). Za­tim se ami­no­ki­se­li­ne iza cis­tein­skog os­tat­ka uk­la­nja­ju, či­me cis­tein os­ta­je pos­ljed­ nji na kar­bok­sil­nom kra­ju. Ko­nač­no se na kar­bok­sil­nu sku­pi­nu C-ter­mi­ nal­nog cis­tei­na do­da­je me­til­na sku­pi­na. Tre­ći tip mo­di­fi­ka­ci­je pro­tei­na mas­nim ki­se­li­na­ma je pal­mi­ta­ci­ja. Pal­ mi­tin­ska se ki­se­li­na (mas­na ki­se­li­na sa 16 ug­lji­ko­vih ato­ma) do­da­je na sum­por boč­nih og­ra­na­ka cis­tei­na smješ­te­nih u unut­raš­njem di­je­lu po­li­ pep­tid­nog lan­ca (sl. 8-35). Kao i mi­ris­ti­la­ci­ja i pre­ni­la­ci­ja, pal­mi­ta­ci­ja ig­ra važ­nu ulo­gu u po­ve­zi­va­nju ne­kih pro­tei­na s ci­to­sol­nom stra­nom sta­nič­ne mem­bra­ne. Ko­nač­no, li­pi­di ve­za­ni na oli­go­sa­ha­ri­de (gli­ko­li­pi­di) do­da­ni na C-ter­ mi­nal­ne kar­bok­sil­ne sku­pi­ne ne­kih pro­tei­na, slu­že kao sid­ra za ve­za­nje pro­tei­na na vanj­sku stra­nu sta­nič­ne mem­bra­ne. S ob­zi­rom na to da gli­ko­ li­pi­di ve­za­ni na ove pro­tei­ne sad­r­ža­va­ju fos­fa­ti­di­l-i­no­zi­tol, čes­to se na­zi­va­ ju gli­ko­zil­fos­fa­ti­di­l-i­no­zi­tol ili GPI-sid­ra (sl. 8-36). Oli­go­sa­ha­rid­ni di­je­ lo­vi GPI-si­da­ra ve­za­ni su na kraj­nju kar­bok­sil­nu sku­pi­nu po­li­pep­tid­nih la­na­ca. Ino­zi­tol­na je sku­pi­na fos­fa­ti­di­l-i­no­zi­to­la ve­za­na na oli­go­sa­ha­rid ta­ ko da ug­lji­ko­hid­rat slu­ži kao po­vez­ni­ca iz­me­đu pro­tei­na i mas­ne ki­se­li­ne fos­fo­li­pi­da. GPI-sid­ra se sin­te­ti­zi­ra­ju te kao već us­tro­je­ne struk­tu­re pre­no­ se na pro­tei­ne unu­tar en­dop­laz­mat­skog re­ti­ku­la. Nji­ho­vo do­da­va­nje pra­će­ no je uk­la­nja­njem po­li­pep­ti­da ve­li­či­ne 20 ami­no­ki­se­li­na s C-kra­ja po­li­pep­ tid­nog lan­ca. Mo­di­fi­ci­ra­ni se pro­tein za­tim pre­no­si na pov­r­ši­nu sta­ni­ce, pri če­mu lan­ci mas­nih ki­se­li­na GPI-sid­ra pos­re­du­ju u po­ve­zi­va­nju pro­tei­na sa sta­nič­nom mem­bra­nom.

Sli­ka 8-36. Struk­tu­ra GPI-sid­ra.  GPI-sid­ro, ve­za­no na C-kraj po­li­pep­tid­nog lan­ ca, usid­ru­je pro­tei­ne u sta­nič­nu mem­bra­nu. Sid­ro je C-ter­mi­nal­nom ami­no­ki­se­li­nom po­ve­za­no pre­ko eta­no­la­mi­na, ko­ji je ve­zan za oli­go­sa­ha­rid iz­gra­đen od ma­noz­nih, N-ace­til­ga­lak­to­za­min­skih i glu­ko­za­min­skih os­ta­ta­ka. Oli­go­sa­ha­rid je na­da­lje po­ve­zan s ino­zi­tol­nom sku­pi­nom fos­fa­ti­di­l-i­no­zi­to­la. Dva lan­ca mas­nih ki­se­li­na iz li­pid­no­ga di­je­la uro­nje­na su u sta­nič­nu mem­bra­nu. Na sli­ci je pri­ka­za­no GPI-sid­ro šta­kor­sko­ga pro­tei­ na, Thy-1.

340    POGLAVLJE 8

Re­gu­la­ci­ja fun­kci­je pro­tei­na Ključ­na fun­kci­ja pro­tei­na nji­ho­vo je en­zim­sko dje­lo­va­nje, pot­reb­no za ka­ta­li­zu go­to­vo svih bio­loš­kih reak­ci­ja. Re­gu­la­ci­ja en­zim­ske ak­tiv­nos­ti ti­ me ig­ra ključ­nu ulo­gu u up­rav­lja­nju sta­nič­nim po­na­ša­njem. To se jed­nim di­je­lom pos­ti­že na ra­zi­ni ek­spre­si­je ge­na, ko­ja od­re­đu­je ko­li­či­nu ne­kog en­ zi­ma (pro­tei­na) ko­ju sta­ni­ca sin­te­ti­zi­ra. Dru­ga ra­zi­na kon­tro­le pos­ti­že se re­gu­la­ci­jom fun­kci­je pro­tei­na, ko­ja omo­gu­ću­je sta­ni­ci da re­gu­li­ra ne sa­mo ko­li­či­nu, već i ak­tiv­no­st svo­jih pro­tein­skih kom­po­nen­ti. O re­gu­la­ci­ji ak­tiv­ nos­ti ne­kih pro­tei­na na ra­zi­ni tran­skrip­ci­je i tran­sla­ci­je već je bi­lo go­vo­ra u ovom i pret­hod­nom pog­lav­lju, dok će mno­gi do­dat­ni prim­je­ri re­gu­la­ci­je pro­tein­ske fun­kci­je u kon­tro­li i sta­nič­nom po­na­ša­nju bi­ti ob­jaš­nje­ni u ostat­ku ove knji­ge. U ovom će od­jelj­ku bi­ti go­vo­ra o tri os­nov­na me­ha­ni­ zma ko­ji­ma se re­gu­li­ra ak­tiv­no­st sta­nič­nih pro­tei­na.

Re­gu­la­ci­ja ma­lim mo­le­ku­la­ma

Sli­ka 8-37. In­hi­bi­ci­ja pov­rat­nom spre­ gom.  Kraj­nji pro­du­k t bio­ke­mij­skog pu­ ta dje­lu­je kao alos­te­rič­ki in­hi­bi­tor en­zi­ma ko­ji ka­ta­li­zi­ra pr­vi ko­rak nje­go­ve sin­te­ze.

Dje­lo­va­nje ve­ći­ne en­zi­ma kon­tro­li­ra­no je prom­je­nom nji­ho­ve kon­for­ ma­ci­je, či­me se mi­je­nja i nji­ho­va ka­ta­li­tič­ka ak­tiv­no­st. U mno­gim su slu­ ča­je­vi­ma kon­for­ma­cij­ske prom­je­ne pos­lje­di­ca ve­za­nja ma­lih mo­le­ku­la, kao što su ami­no­ki­se­li­ne ili nuk­leo­ti­di, či­me se re­gu­li­ra i en­zim­ska ak­tiv­no­st. Ovaj tip re­gu­la­ci­je čes­to je od­go­vo­ran za kon­tro­lu me­ta­bo­lič­kih pu­te­va pu­ tem pov­rat­ne spre­ge. Prim­je­ri­ce, ko­nač­ni pro­duk­ti mno­gih pu­te­va bio­sin­ te­ze (prim­je­ri­ce ami­no­ki­se­li­ne) in­hi­bi­ra­ju en­zi­me ko­ji ka­ta­li­zi­ra­ju pr­vi ko­ rak nji­ho­ve sin­te­ze, osi­gu­ra­va­ju­ći na taj na­čin od­go­va­ra­ju­će snab­di­je­va­nje pro­duk­tom, ali i spr­je­ča­va­ju­ći sin­te­zu pre­ve­li­kih ko­li­či­na is­tog (sl. 8-37). In­hi­bi­ci­ja pov­rat­nom spre­gom prim­jer je alos­te­rič­ke re­gu­la­ci­je, u ko­joj se re­gu­lacijska mo­le­ku­la ve­že na mjes­to na en­zi­mu ko­je je raz­li­či­to od ka­ta­li­ tič­kog mjes­ta (allo = dru­gi, steric = mjes­to). Ve­za­nje tak­ve re­gu­lacijske mo­le­ku­le mi­je­nja kon­for­ma­ci­ju pro­tei­na, a ti­me se mi­je­nja i ob­lik ka­ta­li­tič­ kog mjes­ta što dje­lu­je i na ka­ta­li­tič­ku ak­tiv­no­st (v. sl. 3-8). Mno­gi tran­ skrip­cij­ski fak­to­ri (o ko­ji­ma je bi­lo go­vo­ra u 7. pog­lav­lju) ta­ko­đer su re­gu­ li­ra­ni ve­za­njem ma­lih mo­le­ku­la. Prim­je­ri­ce, ve­za­nje lak­to­ze na la­c-rep­re­sor u E. co­li in­du­ci­ra kon­for­ma­cij­sku prom­je­nu ko­ja spr­je­ča­va ve­za­nje rep­re­ so­ra na DNA (v. sl. 7-8). U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma ste­roid­ni hor­mo­ni na sli­čan na­čin kon­tro­li­ra­ju gen­sku ek­spre­si­ju ve­žu­ći se na tran­skrip­cij­ske re­ gu­la­cijske pro­tei­ne. Re­gu­la­ci­ja tran­skrip­cij­skih fak­to­ra kao što je re­gu­la­ci­ja eE­F1α ve­za­njem GTP (v. sl. 8-13) ilus­tri­ra dru­gi uo­bi­ča­je­ni me­ha­ni­zam ko­jim se kon­tro­li­ra ak­tiv­no­st unu­tar­sta­nič­nih pro­tei­na. U ovom slu­ča­ju, ob­lik pro­tei­na s ve­za­ nim GTP ak­tiv­na je kon­for­ma­ci­ja, dok je ob­lik s ve­za­nim GDP neak­ti­van. Mno­gi sta­nič­ni pro­tei­ni re­gu­li­ra­ni su na sli­čan na­čin, ve­za­njem GTP ili GDP. U ovu sku­pi­nu ub­ra­ja­mo on­ko­ge­ne pro­tei­ne Ras, ko­ji su in­ten­ziv­no prou­ča­va­ni zbog nji­ho­ve ulo­ge u kon­tro­li sta­nič­ne pro­li­fe­ra­ci­je i tu­mo­ra u čov­je­ka. Po­se­bi­ce za­nim­lji­vi po­dat­ci do­bi­ve­ni kris­ta­log­raf­skom ana­li­zom X-zra­ka­ma ovih pro­tei­na, ot­kri­li su ma­le, ali iz­nim­no zna­čaj­ne kon­for­ma­ cij­ske raz­li­ke iz­me­đu neak­tiv­nog ob­li­ka pro­tei­na s ve­za­nim GDP i ak­tiv­ nog ob­li­ka s ve­za­nim GTP (sl. 8-38). Ove fi­ne raz­li­ke u pro­tein­skoj kon­ for­ma­ci­ji od­re­đu­ju mo­že li Ras (u ak­tiv­nom ob­li­ku s ve­za­nim GTP) rea­gi­ra­ti sa svo­jom cilj­nom mo­le­ku­lom, što je sig­nal za sta­nič­nu dio­bu. Važ­no­st ovih fi­nih raz­li­ka u pro­tein­skoj kon­for­ma­ci­ji ilus­tri­ra činjenica da mu­ta­ci­je u ras ge­nu pri­do­no­se raz­vo­ju oko 20% tu­mo­ra u čov­je­ka. Na taj na­čin mu­ta­ci­je mi­je­nja­ju struk­tu­ru pro­tei­na Ras ta­ko da su oni za­rob­lje­ni u svo­joj ak­tiv­noj kon­for­ma­ci­ji s ve­za­nim GTP i kon­ti­nui­ra­no sig­na­li­zi­ra­ju sta­nič­nu dio­bu, što do­vo­di do ne­kon­tro­li­ra­nog ras­ta tu­mor­skih sta­ni­ca.

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   341

Sli­ka 8-38. Kon­for­ma­cij­ske raz­li­ke iz­me­đu ak­tiv­nog i inak­tiv­nog ob­li­ka pro­tei­ na Ras.  Pro­tei­ni Ras se iz­mje­nju­ju iz­me­đu svo­jih ak­tiv­nih, GTP-ve­za­nih i inak­tiv­nih, GDP-ve­za­nih ob­li­ka. Glav­ni uči­nak ve­za­nja GTP u od­no­su na ve­za­nje GDP je pro­mje­ na kon­for­ma­ci­je dva­ju pod­ruč­ja mo­le­ku­le, naz­va­nih re­gi­je pre­ki­da­ča I i II. Na sli­ci je kos­tur GTP-kom­plek­sa pri­ka­zan bi­je­lom bo­jom; kos­tur re­gi­ja pre­ki­da­ča I GDP-kom­ plek­sa pla­vom bo­jom, a kos­tur re­gi­ja pre­ki­da­ča II GDP-kom­plek­sa žu­tom bo­jom. Gva­ nin­ski je nuk­leo­tid pri­ka­zan cr­ve­nom bo­jom, a io­ni Mg2+ žu­tom bo­jom. (Sus­ret­lji­voš­ću Sung-Hou Ki­ma, Sveu­či­liš­te u Ka­li­for­ni­ji, Ber­ke­ley.)

Sup­rot­no to­mu, nor­mal­ni pro­tei­ni Ras ba­lan­si­ra­ju iz­me­đu GTP- ili GDPkon­for­ma­ci­ja, ti­me što pos­ta­ju ak­tiv­ni tek na­kon sti­mu­la­ci­je hor­mo­ni­ma ili fak­to­ri­ma ras­ta ko­ji nor­mal­no kon­tro­li­ra­ju sta­nič­nu pro­li­fe­ra­ci­ju u vi­ šes­ta­nič­nim or­ga­niz­mi­ma.

Fos­fo­ri­la­ci­ja pro­tei­na Prim­je­ri o ko­ji­ma je bi­lo go­vo­ra u pret­hod­nom od­jelj­ku od­no­se se na ne­ko­va­len­tno po­ve­zi­va­nje pro­tei­na s ma­lim mo­le­ku­la­ma – in­hi­bi­to­ri­ma ili ak­ti­va­to­ri­ma. S ob­zi­rom na to da se ne stva­ra­ju ko­va­len­tne ve­ze, ve­za­nje ovih re­gu­lacijskih mo­le­ku­la na pro­tein je re­ver­zi­bil­no, što sta­ni­ci omo­gu­ ću­je brz od­go­vor na prom­je­ne u oko­li­ni. Me­đu­tim, ak­tiv­no­st mno­gih pro­ tei­na re­gu­li­ra­na je ko­va­len­tnim mo­di­fi­ka­ci­ja­ma. Je­dan od prim­je­ra ovog ti­pa re­gu­la­ci­je je ak­ti­va­ci­ja en­zi­ma pro­teo­li­tič­kim ki­da­njem neak­tiv­nih pre­te­ča. Kao što je pret­hod­no spo­me­nu­to u ovom pog­lav­lju, pro­bav­ni en­ zi­mi i pro­tei­ni ko­ji sud­je­lu­ju u zgru­ša­va­nju kr­vi te prog­ra­mi­ra­noj sta­nič­noj smr­ti regu­li­ra­ni su ovim me­ha­niz­mom. S ob­zi­rom na to da je pro­teo­li­za ire­ver­zi­bi­lan pro­ces, ona je pog­la­vi­to ob­lik kon­tro­le ak­ti­va­ci­je en­zi­ma, a ne uk­lju­či­va­nja i is­klju­či­va­nja en­zi­ma u od­go­vo­ru na prom­je­ne u oko­li­ni. Sup­rot­no to­mu, dru­ge su ko­va­len­tne mo­di­fi­ka­ci­je – po­se­bi­ce fos­fo­ri­la­ci­ja, re­ver­zi­bil­ni pro­ce­si unu­tar sta­ni­ce i dje­lu­ju, kao prim­je­ri­ce i alos­te­rič­ka re­gu­la­ci­ja, ta­ko da re­ver­zi­bil­no ak­ti­vi­ra­ju ili in­hi­bi­ra­ju mnoš­tvo raz­li­či­tih sta­nič­nih pro­tei­na u od­go­vo­ru na sig­na­le iz oko­li­ne. Fos­fo­ri­la­ci­ju pro­tei­na ka­ta­li­zi­ra­ju pro­tei­n-ki­na­ze, od ko­jih ve­ći­na pre­ no­si fos­fat­nu sku­pi­nu s ATP na hid­rok­sil­ne sku­pi­ne boč­nih og­ra­na­ka se­ri­ na, treo­ni­na ili ti­ro­zi­na (sl. 8-39). Pro­tei­n-ki­na­ze či­ne jed­nu od naj­ve­ćih pro­tein­skih po­ro­di­ca kod eu­ka­rio­ta, a pri­pa­da im i prib­liž­no 2% svih eu­ ka­riot­skih ge­na. Ve­ći­na pro­tei­n-ki­na­za fos­fo­ri­li­ra ili se­rin­ski i treo­nin­ski os­ta­tak ili ti­ro­zin­ski os­ta­tak, pa se suk­lad­no to­me na­zi­va­ju pro­tei­n-se­rin/ treonin-kinaze ili pro­tei­n-ti­ro­zi­n-ki­na­ze. Reak­ci­ju re­ver­znu fos­fo­ri­la­ci­ji, hid­ro­li­zu fos­fo­ri­li­ra­nog ami­no­ki­se­lin­skog os­tat­ka ka­ta­li­zi­ra­ju pro­tei­n-fos­ fa­ta­ze. Kao i pro­tei­n-ki­na­ze, pro­tei­n-fos­fa­ta­ze su spe­ci­fič­ne za se­rin­ske ili treo­nin­ske os­tat­ke, ili ti­ro­zin­ske os­tat­ke, prem­da ne­ke od njih pre­poz­na­ju sve tri fos­foa­mi­no­ki­se­li­ne. Za­jed­nič­ko dje­lo­va­nje pro­tei­n-ki­na­za i pro­tei­n-fos­fa­ta­za pos­re­du­je u re­ver­zi­bil­noj fos­fo­ri­la­ci­ji mno­gih sta­nič­nih pro­tei­na. Pro­tei­n-ki­na­ze čes­to

342    POGLAVLJE 8 Sli­ka 8-39. Pro­tei­n-ki­na­ze i fos­fa­ta­ ze.  Pro­tei­n-ki­na­ze ka­ta­li­zi­ra­ju pri­je­nos fos­fat­ne sku­pi­ne s ATP na boč­ni og­ra­nak se­ri­na ili treo­ni­na (pro­tei­n-se­rin/treoninkinaze) ili na ti­ro­zin (pro­tei­n-ti­ro­zi­n-ki­na­ ze). Pro­tei­n-fos­fa­ta­ze ka­ta­li­zi­ra­ju uk­la­nja­ nje fos­fat­ne sku­pi­ne s is­tih ami­no­ki­se­li­na hid­ro­li­zom.

dje­lu­ju kao kom­po­nen­te pu­te­va pri­je­no­sa sig­na­la u ko­ji­ma jed­na ki­na­za ak­ti­vi­ra slje­de­ću ki­na­zu, ko­ja za­tim mo­že dje­lo­va­ti na slje­de­ću ki­na­zu u ni­zu. Kon­se­ku­tiv­no dje­lo­va­nje se­ri­je pro­tei­n-ki­na­za mo­že pre­ni­je­ti sig­nal prim­ljen na sta­nič­noj pov­r­ši­ni do cilj­nog pro­tei­na unu­tar sta­ni­ce, što re­ zul­ti­ra prom­je­na­ma sta­nič­nog po­na­ša­nja u od­go­vo­ru na po­ti­ca­je iz oko­li­ ne. Pro­to­tip dje­lo­va­nja pro­tei­n-ki­na­za proi­zi­šao je iz stu­di­ja me­ta­bo­liz­ma gli­ko­ge­na, au­to­ra Eda Fis­he­ra i Eda Kreb­sa, iz 1955. go­di­ne. U mi­šić­nim sta­ni­ca­ma hor­mon ad­re­na­lin po­ti­če raz­grad­nju gli­ko­ge­na do glu­ko­za-1fos­fa­ta, či­me se osi­gu­ra­va iz­vor ener­gi­je za po­ja­ča­nu mi­šić­nu ak­tiv­no­st. Raz­grad­nju gli­ko­ge­na ka­ta­li­zi­ra en­zim gli­ko­ge­n-fos­fo­ri­la­za, ko­ju re­gu­li­ra pro­tei­n-ki­na­za (sl. 8-40). Epi­nef­rin (ad­re­na­lin) se ve­že na re­cep­tor na pov­r­ši­ni sta­ni­ce i po­ti­če pret­vor­bu ATP u cik­lič­ki AMP (cA­MP), ko­ji za­tim ve­že i ak­ti­vi­ra pro­tei­n-ki­na­zu, naz­va­nu pro­tei­n-ki­na­za ovis­na o cA­MP. Ova ki­na­za fos­fo­ri­li­ra te ti­me ak­ti­vi­ra slje­de­ću pro­tei­n-ki­na­zu, naz­va­nu fos­fo­ri­la­za-ki­na­za. Fos­fo­ri­la­za-ki­na­za za­tim fos­fo­ri­li­ra i ak­ti­vi­ra gli­ko­ge­nfos­fo­ri­la­zu što u ko­nač­ni­ci do­vo­di do stva­ra­nja glu­ko­ze. Ak­ti­va­ci­ja fos­fo­ rila­za-ki­na­ze i gli­ko­ge­n-fos­fo­ri­la­ze fos­fo­ri­la­ci­jom je priv­re­me­na, što ka­ talizi­ra­ju spe­ci­fič­ne fos­fa­ta­ze, ta­ko da uk­la­nja­nje po­čet­nog sti­mu­lan­sa (ad­re­na­li­na) in­hi­bi­ra dalj­nju raz­grad­nju gli­ko­ge­na. Sig­nal­ni put ko­ji do­vo­di do ak­ti­va­ci­je gli­ko­ge­n-fos­fo­ri­la­ze za­po­či­nje alos­te­rič­kom kon­for­ma­ci­jom izaz­va­nom ve­za­njem ma­lih mo­le­ku­la na cilj­ ne mo­le­ku­le – ve­za­njem epi­nef­ri­na na nje­gov pov­r­šin­ski recep­tor i ve­za­ njem cA­MP na pro­tei­n-ki­na­zu ovis­nu o cA­MP. Sig­nal se za­tim pre­no­si na unu­tar­sta­nič­ni cilj uzas­top­nim dje­lo­va­njem pro­tei­n-ki­na­za. Slič­ni sig­nal­ni pu­te­vi, u ko­ji­ma pro­tei­n-ki­na­ze i fos­fa­ta­ze ig­ra­ju sre­diš­nju ulo­gu, sud­je­lu­ju u re­gu­la­ci­ji go­to­vo svih ob­li­ka po­na­ša­nja eu­ka­riot­skih sta­ni­ca (v. pog­l. 15

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA  Sli­ka 8-40. Re­gu­la­ci­ja raz­grad­nje gli­ko­ge­na fos­fo­ri­la­ci­jom pro­tei­na.  Ve­za­nje ad­re­na­li­na na re­cep­tor na sta­nič­noj pov­r­ši­ni po­ti­če stva­ra­nje cik­lič­kog AMP (cA­MP), ko­ji ak­ti­vi­ra pro­tei­n-ki­na­zu ovis­nu o cA­MP. Pro­tei­n-ki­na­za ovis­na o cA­MP fos­fo­ri­li­ra i ak­ti­vi­ra fos­fo­ri­la­za-ki­na­zu, ko­ja na­da­lje fos­fo­ri­li­ra i ak­ti­vi­ra gli­ko­ge­n-fos­fo­ri­la­zu. Gli­ko­ ge­n-fos­fo­ri­la­za za­tim ka­ta­li­zi­ra raz­grad­nju gli­ko­ge­na do glu­ko­za-1-fos­fa­ta.

i 16). Od­stu­pa­nja u ovim pu­te­vi­ma, pri če­mu su čes­to pro­mi­je­nje­ne i ak­ tiv­nos­ti pro­tei­n-ti­ro­zi­n-ki­na­za, ta­ko­đer su odgo­vor­na za raz­voj mno­gih bo­les­ti po­vez­anih s nep­ra­vil­nom re­gu­la­ci­jom sta­nič­nog ras­ta i di­fe­ren­ci­ja­ ci­je, uk­lju­ču­ju­ći i raz­voj tu­mo­ra. Pr­va pro­tei­n-ti­ro­zi­n-ki­na­za ot­kri­ve­na je 1980. go­di­ne ti­je­kom is­tra­ži­va­nja on­ko­ge­nih pro­tei­na tu­mor­skih vi­ru­sa kod ži­vo­ti­nja, toč­ni­je Rou­sov sar­kom­ski vi­rus ko­je su pro­ve­li To­ny Hun­ter i Bar­to­lo­mew Sef­ton. Dalj­nje su stu­di­je im­pli­ci­ra­le uk­lju­če­no­st po­re­me­ća­ja pro­tei­n-ti­ro­zi­n-ki­na­za u raz­voj mno­gih vr­sta raka u čov­je­ka, dok su ma­le mo­le­ku­le ko­je in­hi­bi­ra­ju ove en­zi­me tre­nut­no jed­ne od naj­per­spek­tiv­ni­jih li­je­ko­va ko­ji su raz­vi­je­ni u ci­lju no­vih te­ra­pij­skih pris­tu­pa u li­je­če­nju ra­ ka. Prem­da je fos­fo­ri­la­ci­ja naj­češ­ći i naj­bo­lje prou­če­ni ob­lik ko­va­len­tnih mo­di­fi­ka­ci­ja ko­je re­gu­li­ra­ju ak­tiv­no­st pro­tei­na, i ne­ke dru­ge pro­tein­ske mo­di­fi­ka­ci­je ta­ko­đer ima­ju važ­ne ulo­ge. To su me­ti­la­ci­ja i ace­ti­la­ci­ja li­zin­ skih os­ta­ta­ka (o čemu je bi­lo go­vo­ra u 7. pog­lav­lju), kao i nit­ro­zi­la­ci­ja do­da­tak NO sku­pi­ne na boč­ne og­ran­ke cis­tein­skih os­ta­ta­ka (sl. 8-41). Kao što je na­ve­de­no ra­ni­je u ovom pog­lav­lju, O-gli­ko­zi­lac­ija jez­gre­nih i ci­top­ laz­mat­skih pro­tei­na ta­ko­đer mo­že ima­ti re­gu­lacijsku ulo­gu. Uz to, ne­ki su pro­tei­ni re­gu­li­ra­ni ko­va­len­tnim po­ve­zi­va­njem ma­lih po­li­pep­ti­da, kao što su ubik­vi­tin i SUMO, o če­mu će go­vo­ra bi­ti u slje­de­ćem od­jelj­ku ovog pog­ lav­lja.

In­te­rak­ci­je pro­tei­n-pro­tein Mno­gi se pro­tei­ni sas­to­je od vi­še pod­je­di­ni­ca, od ko­jih je sva­ka neo­vi­ san po­li­pep­tid­ni la­nac. Kod ne­kih su pro­tei­na pod­je­di­ni­ce is­tov­r­sne, dok su dru­gi iz­gra­đe­ni od dva­ju ili vi­še raz­li­či­tih po­li­pep­ti­da. U oba su slu­ča­ja in­te­rak­ci­je iz­me­đu po­li­pep­tid­nih la­na­ca važ­ne za re­gu­la­ci­ju pro­tein­ske ak­ tiv­nos­ti. Važ­no­st ovih in­te­rak­ci­ja vid­lji­va je kod alos­te­rič­kih en­zi­ma, kod ko­jih ve­za­nje re­gu­lacijske mo­le­ku­le mi­je­nja kon­for­ma­ci­ju pro­tei­na prom­ je­nom in­te­rak­ci­ja iz­me­đu pod­je­di­ni­ca. Mno­gi dru­gi en­zi­mi re­gu­li­ra­ni su na sli­čan na­čin, pu­tem in­te­rak­ci­ja pro­tei­n-pro­tein. Do­bar je prim­jer pro­tei­n-ki­na­za ovis­na o cA­MP, ko­ja se

Sli­ka 8-41. Nit­ro­zi­la­ci­ja.  Du­ši­kov ok­ sid (NO) mo­že rea­gi­rati s boč­nim og­ran­ kom cis­tei­na.

   343

344    POGLAVLJE 8

KL JUČNI POKUS

Ot­kri­će pro­tei­n-ti­ro­zin-ki­na­za Tran­sfor­mi­ng Ge­ne Pro­du­ct of Rous Sar­co­ma Vi­rus Phos­phoryla­tes Tyro­si­ne To­ny Hun­ter and Bar­tho­lo­mew M. Sef­ton The Sa­lk In­sti­tu­te, San Die­go, CA Pro­cee­din­gs of the Na­tio­nal Aca­de­my of Scien­ce, USA, 1980 vol. 77, str. 1311-1315

Kon­tek­st Na­kon što je izo­li­ran 1911. go­di­ne, Rou­sov sar­kom­ski vi­rus (RSV) pos­tao je pr­vi vi­rus za ko­jeg je bi­lo op­će­ni­to prih­va­će­no da uz­ro­ku­je rak kod ži­vo­ ti­nja (vi­di ok­vir »Mo­le­ku­lar­na me­di­ci­ na« u 1. pog­lav­lju). Ne­ko­li­ko oso­bi­na uči­ni­lo je RSV za­nim­lji­vim mo­de­lom za is­tra­ži­va­nja raz­vo­ja ra­ka. Pri­je sve­ga ma­la ve­li­či­na ge­no­ma RSV po­bu­di­la je na­du da bi se mog­li iden­ti­fi­ci­ra­ti spe­ ci­fič­ni vi­rus­ni ge­ni od­go­vor­ni za po­ti­ ca­nje ne­nor­mal­ne pro­li­fe­ra­ci­je ko­ja je ka­rak­te­ris­tič­na za sta­ni­ce ra­ka. Taj je cilj pos­tig­nut se­dam­de­se­tih go­di­na proš­ log sto­lje­ća ka­da je ut­vr­đe­no da je sa­ mo je­dan gen RSV (naz­van src pre­ma sar­kom) pot­re­ban za in­duk­ci­ju tu­mo­ra. Važ­no je nag­la­si­ti da je gen vr­lo sli­ čan ge­nu src ko­ji je ta­ko­đer na­đen kao dio nor­mal­nog ge­ne­tič­kog ma­te­ri­ja­la mno­gih kra­ljež­nja­ka, uk­lju­ču­ju­ći čov­je­ ka. S ob­zi­ro­m na to da je pro­tein Src od­go­vo­ran za up­rav­lja­nje ne­kon­tro­li­ra­ nom pro­li­fe­ra­ci­jom sta­ni­ca ra­ka, či­ni­lo se da bi ra­zu­mi­je­va­nje fun­kci­je Src bi­lo ključ­no za uvid u mo­le­ku­lar­ne os­no­ve in­duk­ci­je ra­ka kao i re­gu­la­ci­ju nor­mal­ ne sta­nič­ne pro­li­fe­ra­ci­je. Go­di­ne 1977. Ray Erik­son i su­rad­ni­ci ot­kri­li su pro­tein Src imu­nop­re­ci­pi­ta­ci­ jom ko­ris­te­ći an­ti­se­rum do­bi­ven od ži­ vo­ti­nja ko­je su ima­le tu­mo­re izaz­va­ne RSV. Ne­du­go za­tim, ot­kri­ve­no je da in­ ku­ba­ci­ja imu­nop­re­ci­pi­ta­ta pro­tei­na Src s ra­dioak­tiv­nim ATP re­zul­ti­ra fos­fo­ri­la­ci­ jom mo­le­ku­la imu­nog­lo­bu­li­na. Ti­me je ut­vr­đe­no da je Src protein-ki­na­za, što je im­pli­ci­ra­lo važ­no­st fos­fo­ri­la­ci­je pro­ tei­na u kon­tro­li sta­nič­ne pro­li­fe­ra­ci­je. Sve pret­hod­no is­tra­ži­va­ne pro­tein-ki­ na­ze ka­ta­li­zi­ra­le su fos­fo­ri­la­ci­ju se­ri­na ili treo­ni­na, ko­je su ta­ko­đer do ta­da bi­

le je­di­ne fos­foa­mi­no­ki­se­li­ne ot­kri­ve­ne u ži­vo­tinj­skim sta­ni­ca­ma. No, 1979. go­ di­ne Wal­ter Ec­khar­dt i To­ny Hun­ter su uo­či­li da je on­ko­ge­ni pro­tein dru­gog ži­vo­tinj­skog tu­mor­skog vi­ru­sa (po­lio­ ma­vi­rus) fos­fo­ri­li­ran na ti­ro­zin­skom os­ tat­ku. Hun­ter i Sef­ton su sto­ga is­pi­ta­li mo­guć­no­st da pro­tein Src fos­fo­ri­li­ra ti­ro­zin­ske, a ne se­rin­ske/treoninske os­ tat­ke u svo­jim sup­stra­ti­ma. Ovi su po­ ku­si po­ka­za­li da pro­tein Src uis­ti­nu dje­ lu­je kao pro­tei­n-ti­ro­zin­-ki­na­za, či­ja je ak­tiv­no­st da­nas pre­poz­na­ta kao ključ­ na za pu­te­ve sta­nič­ne sig­na­li­za­cije.

Ek­spe­ri­men­ti Hun­ter i Sef­ton ot­kri­li su ami­no­ki­se­li­nu fos­fo­ri­li­ra­nu pro­tei­nom Src ta­ko što su in­ku­bi­ra­li imu­nop­re­ci­pi­tat Src s ATP ko­ji je bio obi­lje­žen ra­dioak­tiv­nim fos­fo­rom (32P). Ti­me je ami­no­ki­se­li­na fos­fo­ri­li­ra­na pro­tei­nom Src u pro­tei­nu-sup­stra­tu (u ovom slu­ča­ju imu­nog­lo­bu­lin) pos­ta­la ra­dioak­tiv­no obi­lje­že­na. Za­tim je imu­ nog­lo­bu­lin izo­li­ran te hid­ro­li­zi­ran či­me su do­bi­ve­ne po­je­di­nač­ne ami­no­ki­se­ li­ne, ko­je su po­tom ana­li­zi­ra­ne elek­ tro­fo­retskim i kro­ma­tog­raf­skim me­to­ da­ma što je re­zul­ti­ra­lo raz­dva­ja­njem fos­fo­ti­ro­zi­na, fos­fo­se­ri­na i fos­fot­reo­ni­ na (vi­di sli­ku). Ra­dioak­tiv­na ami­no­ki­se­ li­na de­tek­ti­ra­na ovim ek­spe­ri­men­ti­ma bi­la je fosfo­ti­ro­zin, što je upu­ći­va­lo na zak­lju­čak da pro­tein Src spe­ci­fič­no fos­ fo­ri­li­ra ti­ro­zin­ske os­tat­ke. Dalj­nja su is­tra­ži­va­nja po­ka­za­la da nor­ mal­ni sta­nič­ni pro­tein Src, kao i vi­rus­ ni, dje­lu­je kao pro­tei­n-ti­ro­zin-ki­na­za. Uz to, Hun­ter i Sef­ton su pro­ši­ri­li ove in vit­ro ek­spe­ri­men­te i po­ka­za­li pri­sut­ no­st fos­fo­ti­ro­zi­na u pro­tei­ni­ma ek­stra­ hi­ra­nim iz ci­je­lih sta­ni­ca. U nor­mal­nim sta­ni­ca­ma, fos­fo­ti­ro­zin či­ni 0,03% svih

Tony Hunter

Bartholomew Sefton

fos­foa­mi­no­ki­se­li­na (dok os­ta­tak či­ne fos­fo­se­rin i fos­fot­reo­nin), što ob­jaš­nja­ va zaš­to je nje­go­va de­tek­ci­ja pret­hod­ no pro­mak­la. Ipak, fos­fo­ti­ro­zin je de­set pu­ta zas­tup­lje­ni­ji u sta­ni­ca­ma ko­je su in­fek­ti­ra­ne Rou­so­vim sar­kom­skim vi­ru­ som, što upu­ću­je da je po­ja­ča­na pro­ tei­n-ti­ro­zin-ki­na­zna ak­tiv­no­st vi­rus­nog pro­tei­na Src od­go­vor­na za nje­go­vu spo­sob­no­st da in­du­ci­ra ne­nor­mal­nu sta­nič­nu pro­li­fe­ra­ci­ju.

Iden­ti­fi­ka­ci­ja fos­fo­ti­ro­zi­na u imu­nog­lo­bu­ li­nu fos­fo­ri­li­ra­nom pro­tei­nom Src. Imu­no­ pre­ci­pi­tat ko­ji je sad­r­ža­vao pro­tein Src iz RSV je in­ku­bi­ran s [32P]-A­TP. Imu­nog­lo­bu­lin je za­tim izo­li­ran i hid­ro­li­zi­ran. Ami­no­ki­se­li­ne iz hid­ro­li­ za­ta su raz­dvo­je­ne elek­tro­fo­re­zom i kro­ma­to­ gra­fi­jom na tan­kim plo­ča­ma ce­lu­lo­ze. Po­lo­žaj ami­no­ki­se­li­na obi­lje­že­nih ra­dioak­tiv­nim fos­ fo­rom je od­re­đen iz­la­ga­njem ce­lu­loz­nih plo­ča ra­diog­raf­skom fil­mu. Is­pre­k i­da­nim li­ni­ja­ma oz­na­čen je po­lo­žaj neo­bi­lje­že­nih fos­foa­mi­no­ ki­se­li­na ko­je su ko­rište­ne kao bi­lje­zi. Uo­či­te da je ami­no­ki­se­li­na obi­lje­že­na ra­dioak­tiv­nim fos­ fo­rom fos­fo­ti­ro­zin.

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   345

KL JUČNI POKUS Utjecaj Otkriće da je Src protein-tirozin-kinaza istovremeno je identificiralo novi oblik pro­tein-kinazne aktivnosti i pokazalo da je ta aktivnost povezana s kontro­ lom stanične proliferacije. Na rezultate Huntera i Seftona nastavili su se pokusi koji su pokazali da mnogi drugi protei­ ni tumorskih virusa također djeluju kao protein-tirozin-kinaze, što je uputilo na

općenitu povezanost fosforilacije tiro­ zina u proteinima i nenormalne pro­li­ feracije tumorskih stanica. Daljnja istra­ živanja su identificirala brojne protein-­ti­rozin-kinaze koje sudjeluju u raz­li­čitim signalnim putovima u normalnim stanicama. Ispitivanje mehanizma ko­ jim virusi uzrokuju rak kod kokoši ot­ krilo je do tada nepoznatu enzimsku

sas­to­ji od dvi­je re­gu­lacijske i dvi­je ka­ta­li­tič­ke pod­je­di­ni­ce (sl. 8-42). U ovom sta­nju, en­zim je neak­ti­van; re­gu­lacijske pod­je­di­ni­ce in­hi­bi­ra­ju en­ zim­sko dje­lo­va­nje ka­ta­li­tič­kih pod­je­di­ni­ca. En­zim se ak­ti­vi­ra s po­mo­ću cA­MP, ko­ji se ve­že na re­gu­lacijske pod­je­di­ni­ce i po­ti­če kon­for­ma­cij­sku prom­je­nu ko­ja uz­ro­ku­je di­so­ci­ja­ci­ju kom­plek­sa us­li­jed če­ga se ka­ta­li­tič­ke pod­je­di­ni­ce os­lo­ba­đa­ju i pos­ta­ju en­zim­ski ak­tiv­ne pro­tei­n-ki­na­ze. Na taj na­čin cik­lič­ki AMP dje­lu­je kao alos­te­rič­ki re­gu­la­tor dje­lu­ju­ći na in­te­rak­ci­ je pro­tei­n-pro­tein. Kao što će bi­ti go­vo­ra u slje­de­ćim pog­lav­lji­ma, slič­ne in­te­rak­ci­je pro­tei­n-pro­tein, ko­je mo­gu bi­ti re­gu­li­ra­ne ve­za­njem ma­lih mo­ le­ku­la ili fos­fo­ri­la­ci­jom, ig­ra­ju ključ­nu ulo­gu u kon­tro­li broj­nih raz­li­či­tih ob­li­ka sta­nič­nog po­na­ša­nja.

Raz­grad­nja pro­tei­na Ra­zi­ne pro­tei­na u sta­ni­ci od­re­đe­ne su, osim in­ten­zi­te­tom sin­te­ze, i ud­ je­lom nji­ho­ve raz­grad­nje. Po­luv­re­me­na ži­vo­ta pro­tei­na u sta­ni­ci ja­ko su raz­li­či­ta, od ne­ko­li­ko mi­nu­ta do ne­ko­li­ko da­na, pa su raz­li­či­te br­zi­ne pro­ tein­ske raz­grad­nje va­žan čim­be­nik sta­nič­ne re­gu­la­ci­je. Mno­gi pro­tei­ni ko­ ji se br­zo raz­gra­đu­ju dje­lu­ju kao re­gu­lacijske mo­le­ku­le, prim­je­ri­ce tran­ skrip­cij­ski fak­to­ri. Brz ob­r­taj ovih pro­tei­na pot­re­ban je ka­ko bi nji­ho­voj ra­zi­ni omo­gu­ćio br­zu prom­je­nu u od­go­vo­ru na sig­na­le iz oko­li­ne. Dru­gi se pro­tei­ni u od­go­vo­ru na spe­ci­fič­ne sig­na­le br­zo raz­gra­đu­ju, omo­gu­ću­ju­ći dru­ga­či­ji me­ha­ni­zam za re­gu­la­ci­ju unu­tar­sta­nič­ne en­zim­ske ak­tiv­nos­ti. Uz to, ne­fun­kcio­nal­ni ili oš­te­će­ni pro­tei­ni bi­va­ju pre­poz­na­ti i br­zo raz­gra­đe­ni unu­tar sta­ni­ce, či­me se uk­la­nja­ju pos­lje­di­ce pog­rješ­ki ko­je su nas­ta­le ti­je­ kom sin­te­ze pro­tei­na. U eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma pos­to­je dva glav­na pu­ta raz­grad­nje pro­tei­na – put ubik­vi­ti­n-pro­tea­som i li­zo­so­mska pro­teo­li­za.

Put ubik­vi­ti­n-pro­tea­som Glav­ni put se­lek­tiv­ne raz­grad­nje pro­tei­na u eu­ka­riot­skim sta­ni­ca­ma kao bi­ljeg za us­mje­ra­va­nje ci­to­sol­nih i jez­gre­nih pro­tei­na na br­zu pro­teo­ li­zu ko­ris­ti ubik­vi­tin (sl. 8-43). Ubik­vi­tin je po­li­pep­tid iz­gra­đen od 76

Sli­ka 8-42. Re­gu­la­ci­ja pro­tei­n-ki­na­ze ovis­ne o cA­MP.  U inak­tiv­nom sta­nju, en­zim se sas­to­ji od dvi­je re­gu­la­cijske (R) i dvi­je ka­ta­li­tič­ke (C) pod­je­di­ni­ce. Cik­lič­ki se AMP ve­že na re­gu­lacijske pod­je­di­ni­ce što po­ti­če kon­for­ma­cij­sku prom­je­nu ko­ja do­vo­di do nji­ho­ve di­so­ci­ja­ci­je od ka­ta­li­tič­kih pod­je­di­ni­ca. Ti­me, slo­bod­ne ka­ta­li­tič­ke je­di­ni­ce pos­ta­ju en­zim­ski ak­tiv­ne.

aktivnost koja ima ključnu ulogu u sig­ nalnim putovima koji reguliraju rast životinjskih stanica. Nadalje, kao što je prikazano u poglavlju 18, protein-tiro­ zin-kinaze kodirane onkogenima poka­ zale su se kao najperspektivnije mete za razvoj specifičnih lijekova protiv tu­ morskih stanica.

346    POGLAVLJE 8 Sli­ka 8-43. Put ubik­vi­ti­n-pro­tea­ som.  Pro­tei­ni se za br­zu raz­grad­nju obi­lje­ža­va­ju ko­va­len­tnim ve­za­njem ne­ ko­li­ko mo­le­ku­la ubik­vi­ti­na. Pr­vo en­zim E1 ak­ti­vi­ra ubik­vi­tin, a za­tim se ak­ti­vi­ra­ni ubik­vi­tin pre­no­si na je­dan od ne­ko­li­ko raz­li­či­tih en­zi­ma ko­ji ko­nju­gi­ra­ju ubik­vi­ tin (E2). Ubik­vi­ti­n-li­ga­za (E3) se za­tim po­ ve­zu­je s E2 i us­mje­ra­va pri­je­nos ubik­vi­ti­ na na spe­ci­f ič­ni cilj­ni pro­tein. Do­da­je se ne­ko­li­ko ubik­vi­ti­na, a po­liu­bik­vi­ti­ni­li­ra­ni pro­tein za­tim raz­gra­đu­je pro­teaz­ni kom­ ple­k s (pro­tea­som).

8.2. Ani­ma­ci­ja na in­ter­ne­tU Put ubik­vi­ti­n-pro­tea­so­m. Ve­ za­njem lan­ca ubik­vi­tin­ske mo­le­ku­le na pro­tein, eu­ka­ riot­ske sta­ni­ce obi­lje­ža­ va­ju pro­tein za br­zu raz­grad­nju pro­teaz­ nim kom­plek­som.

▶▶ Put ubik­vi­ti­n-pro­tea­som je

od­go­vo­ran za raz­grad­nju ne­ ko­li­ko važ­nih re­gu­lacijskih pro­ tei­na, uk­lju­ču­ju­ći pro­tei­ne ko­ji kon­tro­li­ra­ju sta­nič­nu pro­li­fe­ra­ ci­ju i pre­živ­lja­va­nje. S ob­zi­rom na to da ra­st tu­mor­skih sta­ni­ca ovi­si o raz­grad­nji tih pro­tei­na, pro­tea­som je pos­tao cilj­na mo­ le­ku­la za an­titu­mor­ske li­je­ko­ ve. Bor­te­zo­mib je pr­vi in­hi­bi­tor pro­tea­so­ma odob­ren za li­je­če­ nje ra­ka u lju­di – mul­tip­log mi­ je­lo­ma.

ami­no­ki­se­li­na, ko­ji je vi­so­koo­ču­van kod svih eu­ka­rio­ta (kva­sa­ca, ži­vo­ti­nja i bi­lja­ka). Ve­za­njem ubik­vi­ti­na na ami­no-sku­pi­nu boč­nog og­ran­ka li­zi­na pro­tei­ni pos­ta­ju obi­lje­že­ni za raz­grad­nju. Dalj­njim na­do­da­va­njem ubik­vi­ ti­na nas­ta­je mul­tiu­bik­vi­tin­ski la­nac. Tak­ve po­liu­bik­vi­ti­ni­li­ra­ne pro­tei­ne pre­poz­na­je i raz­gra­đu­je ve­li­ki, vi­še­pod­je­di­nič­ni pro­teaz­ni kom­ple­ks, naz­ van pro­tea­som. Ubik­vi­tin se ot­puš­ta u tom pro­ce­su, pa se mo­že ko­ris­ti­ti i u slje­de­ćem cik­lu­su. I za ve­za­nje ubik­vi­ti­na, kao i za raz­grad­nju obi­lje­že­nih pro­tei­na pot­reb­na je ener­gi­ja ko­ja se do­bi­va iz ATP. Ka­ko je ve­za­nje ubik­vi­ti­na bi­ljeg za br­zu raz­grad­nju, sta­bil­no­st broj­nih pro­tei­na ovi­si o to­me ho­će li bi­ti ubik­vi­ti­ni­li­ra­ni. Ubik­vi­ti­ni­la­ci­ja se od­vi­ja u vi­še ko­ra­ka. Pr­vo se ubik­vi­tin ak­ti­vi­ra ve­za­njem za en­zim ko­ji ak­ti­vi­ra ubik­vi­tin, E1. Ubik­vi­tin se za­tim pre­no­si na dru­gi en­zim, naz­van en­zi­mom ko­ji ko­nju­gi­ra ubik­vi­tin (E2), a po­tom na cilj­ni pro­tein što je pos­re­do­va­no tre­ćim en­zi­mom, naz­va­nim ubik­vi­tin-li­ga­za ili E3, ko­ji je od­go­vo­ran za se­lek­tiv­no pre­poz­na­va­nje od­go­va­ra­ju­ćeg sup­strat­nog pro­tei­na. Ve­ći­na sta­ ni­ca pos­je­du­je sa­mo jed­nu vr­stu E1, ali ne­ko­li­ko vr­sta E2 i ve­lik broj en­zi­

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   347

ma E3. Raz­li­či­ti en­zi­mi E3 pre­poz­na­ju raz­li­či­te sup­strat­ne pro­tei­ne, pa se se­lek­tiv­no us­mje­ra­va­nje sta­nič­nih pro­tei­na na raz­grad­nju ubik­vi­ti­n-pro­ teaz­nim pu­tem te­me­lji up­ra­vo na spe­ci­fič­nom dje­lo­va­nju ovih en­zi­ma. Mno­gi pro­tei­ni ko­ji kon­tro­li­ra­ju te­melj­ne pro­ce­se u sta­ni­ci, kao što su ek­spre­si­ja pro­tei­na i sta­nič­na pro­li­fe­ra­ci­ja, ci­lje­vi su dje­lo­va­nja za re­gu­li­ra­ nu ubik­vi­ti­ni­la­ci­ju i pro­teo­li­zu. Za­nim­ljiv prim­jer tak­ve kon­tro­li­ra­ne raz­ grad­nje pru­ža­ju cik­li­ni, pro­tei­ni ko­ji re­gu­li­ra­ju sta­nič­ni ra­st kon­tro­li­ra­ju­ći dio­be­ni cik­lus eu­ka­riot­skih sta­ni­ca (sl. 8-44). Ula­zak u mi­to­zu kod eu­ka­ riot­skih sta­ni­ca kon­tro­li­ran je di­je­lom cik­li­nom B, ko­ji je re­gu­la­cijska pod­ je­di­ni­ca pro­tei­n-ki­na­ze, naz­va­ne Cdk1 (v. pog­l. 16). Po­ve­zi­va­nje cik­li­na B s Cdk1 nuž­no je za ak­ti­va­ci­ju ki­na­ze Cdk1, ko­ja za­po­či­nje pro­ce­se mi­to­ze (što obuh­va­ća kon­den­za­ci­ju kro­ma­ti­na i raz­grad­nju jez­gri­ne ovoj­ni­ce) ti­ me što fos­fo­ri­li­ra raz­li­či­te sta­nič­ne pro­tei­ne. Cdk1 ta­ko­đer ak­ti­vi­ra ubik­vi­ ti­n-li­ga­zu što us­mje­ra­va cik­lin B na raz­grad­nju, što vo­di pre­ma kra­ju mi­ to­ze. Raz­grad­nja cik­li­na B inak­ti­vi­ra Cdk1, omo­gu­ću­ju­ći sta­ni­ci iz­la­zak iz mi­to­ze i nas­ta­vak pre­ma in­ter­fa­zi slje­de­ćeg sta­nič­nog cik­lu­sa. Ubik­vi­ti­ni­la­ ci­ja cik­li­na B je vi­so­kospe­ci­fič­na reak­ci­ja, ko­ju od­re­đu­je sli­jed od 9 ami­no­

Sli­ka 8-44. Raz­grad­nja cik­li­na ti­je­kom sta­nič­no­ga cik­lu­sa.  Nap­re­do­va­nje eu­ ka­riot­skih sta­ni­ca kroz dio­be­ni cik­lus kon­tro­li­ra­no je di­je­lom sin­te­zom i raz­ grad­njom cik­li­na B, ko­ji je re­gu­lacijska pod­je­di­ni­ca pro­tei­n-ki­na­ze Cdk1. Sin­te­za cik­li­na B za vri­je­me in­ter­fa­ze do­vo­di do stva­ra­nja ak­tiv­nog kom­plek­sa cik­lin B-pro­tei­n-ki­na­za Cdk1, ko­ji po­ti­če ula­zak u mi­to­zu. Br­za raz­grad­nja cik­li­na B za­tim do­vo­di do inak­ti­va­ci­je pro­tei­n-ki­na­ze Cdk1, omo­gu­ću­ju­ći sta­ni­ci iz­la­zak iz mi­ to­ze i ula­zak u in­ter­fa­zu slje­de­će­ga sta­ nič­nog cik­lu­sa.

348    POGLAVLJE 8 ki­se­li­na u cik­li­nu B, naz­van des­truk­cij­ska ku­ti­ja. Mu­ta­ci­je u ovom sli­je­du spr­je­ča­va­ju pro­teo­li­zu cik­li­na B što uz­ro­ku­je zas­toj dio­be sta­ni­ce u mi­to­zi. Ovaj prim­jer po­ka­zu­je važ­no­st re­gu­la­ci­je raz­grad­nje pro­tei­na u kon­tro­li te­melj­nih pro­ce­sa sta­nič­ne dio­be. Prem­da ubik­vi­ti­ni­la­ci­ja uo­bi­ča­je­no us­mje­ra­va pro­tei­ne na raz­grad­nju, ve­za­nje ubik­vi­ti­na na ne­ke pro­tei­ne mo­že ima­ti i dru­ge fun­kci­je. Prim­je­ri­ ce, doda­tak sa­mo jed­ne mo­le­ku­le ubik­vi­ti­na na ne­ke pro­tei­ne sud­je­lu­je u re­gu­la­ci­ji pop­rav­ka DNA, tran­skrip­ci­ji i en­do­ci­to­zi. Uz to, pro­tei­ni mo­gu bi­ti mo­di­fi­ci­ra­ni ve­za­njem dru­gih po­li­pep­ti­da slič­nih ubik­vi­ti­nu, kao što je SUMO (ma­li ubik­vi­ti­nu sli­čan mo­di­fi­ka­tor; en­gl. sma­ll ubiqui­ti­n-re­la­ted mo­di­fier). SUMO i dru­gi pro­tei­ni slič­ni ubik­vi­ti­nu ne us­mje­ra­va­ju pro­tei­ne na raz­grad­nju, već slu­že kao bi­ljeg za lo­ka­li­za­ci­ju i kao re­gu­la­to­ri ak­tiv­nos­ ti pro­tei­na. Mno­gi pro­tei­ni mo­di­fi­ci­ra­ni pro­tei­nom SUMO su tran­skrip­cij­ ski fak­to­ri i dru­gi jez­gre­ni pro­tei­ni ko­ji sud­je­lu­ju u od­r­ža­va­nju kro­ma­tin­ ske struk­tu­re i pop­rav­ku DNA.

Li­zo­som­ska pro­teo­li­za Dru­gi glav­ni put raz­grad­nje pro­tei­na je­st raz­grad­nja pro­tei­na pu­tem li­zo­so­ma. Li­zo­so­mi su mem­bra­nom ok­ru­že­ni or­ga­ne­li ko­ji sad­r­ža­va­ju broj­ne raz­grad­ne en­zi­me, me­đu ko­ji­ma i ne­ko­li­ko pro­tea­za (v. po­gl. 10). Ima­ju ne­ko­li­ko ulo­ga u sta­nič­nom me­ta­bo­liz­mu, iz­me­đu os­ta­log sud­je­lu­ju u raz­grad­nji iz­van­sta­nič­nih pro­tei­na une­se­nih en­do­ci­to­zom kao i u pret­ vor­bi ci­top­laz­mat­skih or­ga­ne­la i ci­to­sol­nih pro­tei­na. Zad­r­ža­va­nje pro­tea­za i dru­gih raz­grad­nih en­zi­ma unu­tar li­zo­so­ma sprje­ča­va ne­kon­tro­li­ra­nu raz­grad­nju sta­nič­nog sad­r­ža­ja. Sto­ga, da bi bi­li raz­gra­đe­ni li­zo­so­mskom pro­teo­li­zom, sta­nič­ni pro­tei­ni pr­vo mo­ra­ju bi­ti une­se­ni u li­zo­som. Te­melj­ni prin­cip uno­sa pro­tei­na au­to­fa­gi­ja, uk­lju­ču­je stva­ra­nje ve­zi­ku­la (au­to­fa­go­so­ma) pri če­mu se ma­la pod­ruč­ja ci­top­laz­me ili ci­top­laz­mat­skih or­ga­ne­la oba­vi­ja­ju cito­sol­nom mem­bra­nom (sl. 8-45). Ove se ve­zi­ku­le za­tim sta­pa­ju s li­zo­so­mi­ma te raz­grad­ni li­zo­so­mski en­zi­mi pre­ra­đu­ju nji­hov sad­r­žaj. Či­ni se da je unos pro­tei­na u au­to­fa­go­som ne­se­ lek­ti­van pro­ces, ta­ko da u ko­nač­ni­ci re­zul­ti­ra spo­rom raz­grad­njom du­go­ ži­vu­ćih ci­top­laz­mat­skih pro­tei­na. Ne­ki or­ga­ne­li, ipak, kao prim­je­ri­ce oš­te­

Sli­ka 8-45. Au­to­fa­gi­ja.  Li­zo­so­mi sad­ r­ža­va­ju raz­li­či­te raz­grad­ne en­zi­me, uk­ lju­ču­ju­ći i pro­tea­ze. Li­zo­so­mi preu­zi­ma­ju sta­nič­ne pro­tei­ne sta­pa­njem s au­to­fa­go­ so­mi­ma, ko­ji nas­ta­ju oba­vi­ja­njem od­re­ đe­nog pod­ruč­ja ci­top­laz­me ili or­ga­ne­la (prim­je­ri­ce, mi­to­hon­dri­ja) cito­sol­nom mem­bra­nom. Tim sta­pa­njem nas­ta­je fa­ go­li­zo­som, ko­ji raz­gra­đu­je sad­r­žaj au­to­ fa­go­so­ma.

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   349

će­ni mi­to­hon­dri­ji, mo­gu bi­ti se­lek­tiv­no us­mje­re­ni na deg­ra­da­ci­ju au­to­fa­gi­jom. Au­to­fa­gi­ja je re­gu­li­ra­na dos­tup­noš­ću hra­nji­vih tva­ri, ali i ti­je­kom raz­vo­ ja vi­šes­ta­nič­nih or­ga­ni­za­ma. Ovaj se pro­ces op­će­ni­to ak­ti­vi­ra u uv­je­ti­ma ne­dos­tat­ka hra­nji­vih tva­ri, či­me je sta­ni­ci omo­gu­će­na raz­grad­nja nee­sen­ci­ jal­nih pro­tei­na i or­ga­ne­la te na taj na­čin po­no­vo is­ko­riš­ta­va­nje vlas­ti­tih kom­po­nen­ti. Uz to, au­to­fa­gi­ja ima važ­nu ulo­gu u mno­gim raz­voj­nim pro­ ce­si­ma, kao što je prim­je­ri­ce me­ta­mor­fo­za in­se­ka­ta, ko­ji obuh­va­ća­ju in­ten­ ziv­no re­mo­de­li­ra­nje tki­va i raz­grad­nju sta­nič­nih kom­po­nen­ti. Kao što će bi­ti ras­prav­lja­no u 17. pog­lav­lju, au­to­fa­gi­ja mo­že ta­ko­đer ima­ti važ­nu ulo­gu u prog­ra­mi­ra­noj sta­nič­noj smr­ti, dok su po­re­me­ća­ji au­to­fa­gi­je po­ve­za­ni s ne­ko­li­ko bo­les­ti u čov­je­ka, uk­lju­ču­ju­ći neu­ro­de­ge­ne­ra­tiv­ne bo­les­ti i rak.

SAŽETAK

KLJUČNI POJMOVI

Pop­rat­na in­ter­net­ska stra­ni­c a Pos­je­ti­te in­ter­net­sku stra­ni­cu ko­ja je do­da­tak ovom ud­žbe­ni­ku www.sinauer. com/cooper5e na ko­joj će­te na­ći ani­ma­ci­je, fil­mo­ve, kvi­ze­ve, prob­lem­ske za­dat­ ke te os­ta­li pop­rat­ni ma­te­ri­jal.

TRANSLACIJA mRNA Tran­spor­tna RNA: Tran­spor­tna RNA slu­ži kao pos­red­nik ko­ji smješ­ta ami­no­ki­ se­li­ne na ka­lup mR­NA. Ami­noa­ci­l-tR­NA-sin­te­ta­ze ve­žu ami­no­ki­se­li­ne na od­go­ va­ra­ju­će tR­NA, ko­je se za­tim pu­tem kom­ple­men­tar­nog spa­ri­va­nja ba­za ve­žu na ko­do­ne mR­NA.

tR­NA, an­ti­ko­don, ami­noa­ci­l-tR­NAsin­te­ta­za

Ri­bo­som: Ri­bo­so­mi se sas­to­je od dvi­ju pod­je­di­ni­ca, ko­je su iz­gra­đe­ne od pro­tei­ na i ri­bo­som­skih RNA. Stva­ra­nje pep­tid­ne ve­ze pri­mar­no je ka­ta­li­zi­ra­no ri­bo­ som­nom 23S RNA.

ri­bo­som, rR­NA

Us­troj­stvo mR­NA i ini­ci­ja­ci­ja tran­sla­ci­je: Tran­sla­ci­ja pro­ka­riot­skih i eu­ka­riot­ skih mR­NA za­po­či­nje me­tio­nin­skim os­tat­kom. Kod bak­te­ri­ja, ini­ci­ja­cij­skom ko­do­nu pret­ho­di sli­jed ko­ji smješ­ta mR­NA na ri­bo­som pu­tem spa­ri­va­nja ba­za sa 16S rR­NA. Kod eu­ka­rio­ta, ini­ci­ja­cij­ski ko­don se pro­na­la­zi pret­ra­ži­va­njem mR­NA s 5' kra­ja, a pre­poz­na­je se na te­me­lju nje­go­ve 7-metilgvanozinske ka­pe.

5' net­ran­sla­ti­ra­no pod­ruč­je (UTR), po­li­cis­tron­ska mRNA, mo­no­cis­tron­ ska mRNA, 3' net­ran­sla­ti­ra­no pod­ruč­je, sli­jed Shi­ne-Del­gar­no

Pro­ces tran­sla­ci­je: Tran­sla­ci­ja za­po­či­nje ve­za­njem me­tio­ni­l-tR­NA i mR­NA na ma­lu ri­bo­som­sku pod­je­di­ni­cu. Za­tim se kom­plek­su prid­ru­žu­je ve­li­ka ri­bo­som­ ska pod­je­di­ni­ca te se po­li­pep­tid­ni la­nac pro­du­žu­je sve dok ri­bo­som ne stig­ne do ter­mi­na­cij­skog ko­do­na na mR­NA. Za od­vi­ja­nje ini­ci­ja­ci­je, elon­ga­ci­je i ter­mi­na­ ci­je tran­sla­ci­je i kod pro­ka­rio­ta i kod eu­ka­rio­ta nuž­na je pri­sut­no­st raz­li­či­tih neri­bo­som­skih fak­to­ra.

ini­ci­ja­cij­ski fak­tor, elon­ga­cij­ski fak­tor, ot­puš­ta­ju­ći fak­tor, po­li­som

Vi­di ani­ma­ci­ju 8.1 na in­ter­net­skoj stra­ni­ci. Re­gu­la­ci­ja tran­sla­ci­je: Tran­sla­ci­ja spe­ci­fič­nih mR­NA mo­že bi­ti re­gu­li­ra­na ve­za­ njem rep­re­sor­skih pro­tei­na i ne­ko­di­ra­ju­ćim mik­roR­NA. Kon­tro­li­ra­na po­lia­de­ ni­la­ci­ja mR­NA ta­ko­đer je va­žan me­ha­ni­zam re­gu­la­ci­je tran­sla­ci­je ti­je­kom ra­ne fa­ze raz­vo­ja. Uz to, sveop­ća tran­sla­cij­ska ak­tiv­no­st u sta­ni­ci mo­že bi­ti re­gu­li­ra­na mo­di­fi­ka­ci­jom ini­ci­ja­cij­skih fak­to­ra.

in­ter­fe­ren­ci­ja RNA (RNAi), ma­la in­ter­fe­ri­ra­ju­ća RNA (siR­NA), mik­ro RNA (miR­NA)

350    POGLAVLJE 8

KLJUČNI POJMOVI

SAŽETAK Sma­ta­nje i do­ra­dBa pro­tei­na

ša­pe­ron

Ša­pe­ro­ni i sma­ta­nje pro­tei­na: Mo­le­ku­lar­ni ša­pe­ro­ni olak­ša­va­ju sma­ta­nje pro­ tei­na ve­za­njem i sta­bi­li­za­ci­jom nes­mo­ta­nih ili dje­lo­mič­no smo­ta­nih po­li­pep­tid­ nih la­na­ca.

pro­tein-di­sul­fi­d-i­zo­me­ra­ze (PDI), pep­ti­di­l-pro­li­l-i­zo­me­ra­ze

En­zi­mi i sma­ta­nje pro­tei­na: Ba­rem dvi­je vr­ste en­zi­ma, pro­tein-di­sul­fi­d-i­zo­me­ ra­ze i pep­ti­di­l-pro­lil-izo­me­ra­ze, ka­ta­li­zi­ra­ju sma­ta­nje pro­tei­na.

pro­teo­li­za, sig­nal­ni sli­jed, sig­nal­ne pep­ti­da­ze

Ki­da­nje pro­tei­na: Pro­teo­li­za je va­žan ko­rak u do­ra­dbi mno­gih pro­tei­na: prim­je­ ri­ce, sek­re­tor­ni pro­tei­ni i pro­tei­ni ko­ji se ug­ra­đu­ju u ve­ći­nu eu­ka­riot­skih or­ga­ ne­la us­mje­ra­va­ju se do svo­jih od­re­diš­ta s po­mo­ću ami­no­ki­se­lin­skog sli­je­da ko­ji se na­kon pro­las­ka pro­tei­na kroz mem­bra­nu uk­la­nja pro­teo­li­tič­kim ki­da­njem.

gli­ko­zi­la­ci­ja, gli­kop­ro­tein, dolikol‑fosfat

Gli­ko­zi­la­ci­ja: Mno­gi su eu­ka­riot­ski pro­tei­ni, po­se­bi­ce sek­re­tor­ni i pro­tei­ni sta­ nič­ne mem­bra­ne, mo­di­fi­ci­ra­ni do­dat­kom ug­lji­ko­hid­ra­ta u en­dop­laz­mat­skom re­ti­ku­lu i Gol­gi­je­vu apa­ra­tu.

N-mi­ris­ti­la­ci­ja, pre­ni­la­ci­ja, pal­mi­ta­ci­ ja, gli­ko­li­pid, gli­ko­zi­l-fos­fa­ti­di­l-i­no­zi­ tol­no (GPI) sid­ro

Ve­za­nje li­pi­da: Ko­va­len­tno ve­za­ni li­pi­di čes­to us­mje­ra­va­ju i usid­ru­ju pro­tei­ne u sta­nič­nu mem­bra­nu.

Re­gu­la­ci­ja fun­kci­je pro­tei­na alos­te­rič­ka re­gu­la­ci­ja

Re­gu­la­ci­ja ma­lim mo­le­ku­la­ma: Mno­gi su pro­tei­ni re­gu­li­ra­ni ve­za­njem ma­lih mo­le­ku­la, kao što su ami­no­ki­se­li­ne i nuk­leo­ti­di, ko­ji po­ti­ču prom­je­ne kon­for­ ma­ci­je i ak­tiv­nos­ti pro­tei­na.

pro­tei­n-ki­na­ze, pro­tei­n-se­rin/ treonin-kinaze, pro­tein-tirozinkinaze, pro­tei­n-fos­fa­ta­ze, nitrozilacija

Fos­fo­ri­la­ci­ja pro­tei­na: Re­ver­zi­bil­na fos­fo­ri­la­ci­ja, ko­ja kon­tro­li­ra ak­tiv­no­st mnoš­tva raz­li­či­tih sta­nič­nih pro­tei­na, pos­lje­di­ca je dje­lo­va­nja pro­tei­n-ki­na­za i fos­fa­ta­za. Dru­ge mo­di­fi­ka­ci­je, kao što je nit­ro­zi­la­ci­ja, ta­ko­đer re­gu­li­ra­ju ak­tiv­ no­st ne­kih pro­tei­na. In­te­rak­ci­je pro­tei­n-pro­tein: In­te­rak­ci­je iz­me­đu po­li­pep­tid­nih la­na­ca važ­ne su za re­gu­la­ci­ju alos­te­rič­kih en­zi­ma i dru­gih sta­nič­nih pro­tei­na.

Raz­grad­nja pro­tei­na ubik­vi­tin, pro­tea­som

Put ubik­vi­ti­n-pro­tea­som: Glav­ni put se­lek­tiv­ne raz­grad­nje pro­tei­na u eu­ka­riot­ skim sta­ni­ca­ma ko­ris­ti ubik­vi­tin kao bi­ljeg ko­ji us­mje­ra­va pro­tei­ne na br­zu pro­ teo­li­zu s po­mo­ću pro­tea­so­ma. Vi­di ani­ma­ci­ju 8.1 na in­ter­net­skoj stra­ni­ci.

li­zo­som, au­to­fa­gi­ja

Li­zo­som­ska pro­teo­li­za: Li­zo­som­ske pro­tea­ze raz­gra­đu­ju iz­van­sta­nič­ne pro­tei­ne une­se­ne en­do­ci­to­zom, a od­go­vor­ne su i za raz­grad­nju ci­top­laz­mat­skih or­ga­ne­la i du­go­ži­vu­ćih ci­to­sol­nih pro­tei­na au­to­fa­gi­jom. Au­to­fa­gi­ja se ak­ti­vi­ra kao od­go­ vor na sta­nič­no gla­do­va­nje i ig­ra važ­nu ulo­gu u raz­vo­ju i prog­ra­mi­ra­noj sta­nič­ noj smr­ti.

SINTEZA, DORADBA I REGULACIJA PROTEINA 

   351

Pitanja 1. E. co­li sad­r­ža­va 64 raz­li­či­ta ko­do­na u svo­jim mR­NA, od ko­jih 61 za ami­no­ki­se­ li­ne. Ka­ko mo­gu sin­te­ti­zi­ra