Naturalne związki organiczne [PDF]

Zitiervorschau

SPIS TREŚCI 1. AMINOKWASY 1.1.

II

Podział a m i n o k w a s ó w

u

1.1.1. Aminokwasy białkowe

12

1.2.

Nomenklatura

21

1.3.

Właściwości aminokwasów

22

1.3.1. 1.3.2. 1.3.3. 1.3.4.

22 24 25 27

1.4.

Właśeiwości kwasowo-zasadowe Rozpuszczalność i temperatura topnienia Właściwości fizjologiczne aminokwasów kodowanych Metabolizm aminokwasów

Aminokwasy niezbędne (egzogenne)

29

1.5.

Naturalne aminokwasy niebiałkowe

31

1.6.

Zastosowanie aminokwasów

35

1.7.

Otrzymywanie aminokwasów

39

1.7.1. Syntezy chemiczne — wybrane przykłady 1.7.2. Otrzymywanie ehiralnyeh aminokwasów 1.7.3. Przykłady ehiralnyeh syntez aminokwasów

39 48 49

R o z d z i e l a n i e a m i n o k w a s ó w r a c e m i c z n y c h na e n a n c j o m e r y

57

1.8.1. 1.8.2. 1.8.3. 1.8.4. 1.8.5. 1.8.6.

57 58 59 60 62 74

1.8.

1.9.

Tworzenie soli diastereoizomerycznych i ich krystalizacja Pochodne diastereoizomeryczne Krystalizaeja spontaniezna Zastosowanie enzymów do rozdzielania racemicznyeh aminokwasów Metody chromatograficzne Elektroforeza

Fizykochemiczne metody badania aminokwasów

76

1.9.1. Polarymetria 1.9.2. Spektrometria mas

76 79

1.10. Literatura źródłowa i uzupełniająca

2. PEPTYDY

80

82

2.1.

Nazewnictwo peptydów

82

2.2.

Synteza peptydów

85

2.2.1. Peptydowe osłony grup funkcyjnych — grupy ochronne 2.2.2. Metody tworzenia wiązania peptydowego

90 99

2.3.

2.4.

Wybrane peptydy biologicznie czynne

124

2.3.1. Glutation (GSH) 2.3.2. Tyreoliberyna 2.3.3. Adrenokortykotropina (ACTH, kortykotropina) 2.3.4. Proopiomclanokortyna 2.3.5. Melanotropina (MSH) 2.3.6. Lipotropina 2.3.7. Peptydy opioidowc 2.3.8. Somatotropina (STH) 2.3.9. Oksytocyna (OT) i wazopresyna (VP) 2.3.10. Libcryny i statyny 2.3.11. Insulina ludzka (HI — ang. human insulinę) 2.3.12. Glukagon 2.3.13. Hormony tkankowe (żołądkowo-jelitowe) 2.3.14. Angiotensyna 2.3.15. Substancja P (SP) 2.3.16. Bradykinina 2.3.17. Peptydy wyizolowane ze skór płazów 2.3.18. Tuftsyna 2.3.19. Proktolina, przedstawiciel neuropeptydów owadzich 2.3.20. Naskórkowy czynnik wzrostu 2.3.21. Antybiotyki peptydowc 2.3.22. Toksyny peptydowe 2.3.23. Alkaloidy peptydowe 2.3.24. Muramylopeptydy

124 125 125 126 127 127 128 136 138 143 145 148 149 151 151 152 152 153 154 156 156 163 168 168

Literatura źródłowa i uzupełniająca

172

3 . BIAŁKA - PROTEINY 3.1.

174

Budowa białek

176

3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.4. 3.1.5.

176 183 189 192 192

Struktura pierwszorzędowa Struktura drugorzędowa Struktura trzeciorzędowa Struktura czwartorzędowa Sposoby badania konformacji cząsteczek białka

3.2.

Denaturacja białek

193

3.3.

Izolacja, rozdzielanie, oczyszczanie i identyfikacja białek

196

3.4.

Klasyfikacja czyli podział białek

197

3.4.1. 3.4.2. 3.4.3. 3.4.4. 3.4.5. 3.4.6.

198 198 199 199 199 199

3.5.

3.6.

Podział Podział Podział Podział Podział Podział

białek białek białek białek białek białek

według według według według według według

kształtu składu funkcji pochodzenia występowania wartos'ci odżywczej

Przykłady białek

200

3.5.1. 3.5.2. 3.5.3. 3.5.4. 3.5.5. 3.5.6.

200 208 221 227 227 228

Białka proste Białka złożone Białka enzymatyczne i ciała czynne Białka słodkie Enzymy niebiałkowc Białka toksyczne

Literatura źródłowa i uzupełniająca

228

4 . CUKRY (SACHARYDY, WĘGLOWODANY)

229

4.1.

Podział c u k r ó w

4.2.

Stereochemia cukrów

232

4.3.

Nomenklatura cukrów

233

4.4.

4.5.

4.6.

4.7.

Monocukry

234

4.4.1. Właściwości fizyczne

234

Właściwości chemiczne

241

4.5.1. 4.5.2. 4.5.3. 4.5.4. 4.5.5. 4.5.6.

241 245 250 253 255 257

Estryfikacja cukrów Eleryfikacja Utlenianie cukrów Redukcja Pochodne cukrów Wzajemne przekształcanie cukrów

Ważniejsze monocukry naturalne

260

4.6.1. Triozy 4.6.2. Tetrozy 4.6.3. Penlozy 4.6.4. Heksozy 4.6.5. Heptozy 4.6.6. Deoksycukry 4.6.7. Aminocukry 4.6.8. Oligosacharydy 4.6.9. Polisacharydy 4.6.10. Serologiczne grupy krwi 4.6. ł ł . Glikozydy naturalne

260 261 261 262 265 265 265 267 278 289 291

Literatura źródłowa i uzupełniająca

295

5 . LIPIDY 5.1. 5.2.

232

296

Podział lipidów

297

K w a s y t ł u s z c z o w e — p r z e d s t a w i c i e l e p o c h o d n y c h lipidów

297

5.2.1. 5.2.2. 5.2.3. 5.2.4. 5.2.5. 5.2.6. 5.2.7. 5.2.8.

300 302 3łl 313 314 317 320 322

Nasycone kwasy tłuszczowe Nienasycone kwasy tłuszczowe Niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe (NNKT, EFA) Znaczenie kwasów tłuszczowych w diecie Aspekty biosyntezy kwasów tłuszczowych Otrzymywanie kwasów karboksyłowych na drodze syntezy chemicznej i ich zastosowanie . . . Otrzymywanie kwasów karboksyłowych w procesach biochemicznych Redukcja kwasów tłuszczowych

5.3. Prostaglandyny — prostanoidy (ejkozanoidy) 5.4. Tłuszcze 5.4.1. 5.4.2. 5.4.3. 5.4.4. 5.4.5. 5.4.6.

Mono- i diacyłogłiccrołe (niepełne acyłogłicerołe) Stereochemia tłuszczów Hydroliza tłuszczów Skład acyłowy tłuszczów Fizjologiczna rola tłuszczów Tłuszcze jadalne

5.5. Oleochemia, przemysł oleochemiczny 5.5.1. Uwodornianie (utwardzanie) tłuszczów 5.5.2. Transestryfikacja (przeestryfikowanie) tłuszczów 5.5.3. Substytuty tłuszczów

323 326 327 328 329 331 332 333 336 337 338 340

5.6.

Fosfolipidy i inne d i a c y l o w e p o c h o d n e glicerolu z a w i e r a j ą c e resztę f o s f o r a n o w ą

342

5.6.1. 5.6.2. 5.6.3. 5.6.4. 5.6.5.

342 346 349 350 352

Glicerofosfolipidy Lipidowa warstwa podwójna (bimolekularna) Liposomy Inne lipidy błon komórkowych Kwasy mykolinowe

5.7.

Kwasy mykolinowe

352

5.8.

Woski

354

5.9.

Alkohole lipidowe

355

5.10. Węglowodory lipidowe

355

5 . 1 1 . P s y c h o a k t y w n e s u b s t a n c j e konopi

356

5.12. Juwenoidy

358

5.13. Kelina

358

5.14. Literatura źródłowa i uzupełniająca

359

6. ALKALOIDY

300

6.1.

Występowanie

361

6.2.

Rola fizjologiczna

361

6.3.

Biosynteza

362

6.4.

Otrzymywanie

364

6.5.

Podział alkaloidów

365

6.5.1. Główne grupy alkaloidów

365

6.6.

6.7.

Przykłady alkaloidów

366

6.6.1. Alkaloidy nic zawierające układów heterocyklicznych 6.6.2. Alkaloidy zawierające piers'cień pirolidynowy 6.6.3. Alkaloidy pochodne pipcrydyny 6.6.4. Alkaloidy pochodne pirydyny 6.6.5. Alkaloidy zawierające nicskondensowane pierścienie pięcio- i sześcioczłonowe 6.6.6. Alkaloidy ze skondensowanym pierścieniem pirolidynowym i piperydynowym 6.6.7. Alkaloidy zawierające picrs'cień chinolinowy łub izochinolinowy 6.6.8. Alkaloidy opium 6.6.9. Alkaloidy zawierające układ indolowy 6.6.10. Kurara 6.6.11. Alkaloidy purynowe 6.6.12. Alkaloidy terpenoidowc 6.6.13. Alkaloidy steroidowe 6.6.14. Epibatydyna

366 375 375 379 379 382 390 392 408 418 420 423 424 425

Literatura źródłowa i uzupełniająca

426

7 . STEROIDY

427

7.1.

Stereochemia sterydów

428

7.2.

Podział i nomenklatura sterydów

429

7.3.

7.4.

N a j w a ż n i e j s z e steroidy

430

7.3.1. Sterole 7.3.2. Witamina D

430 437

Kwasy żółciowe

439

7.5.

7.6.

Hormony płciowe

441

7.5.1. 7.5.2. 7.5.3. 7.5.4. 7.5.5. 7.5.6. 7.5.7. 7.5.8.

441 445 460 460 463 465 468 471

Androgeny Anaboliki Antyandrogeny Estrogeny Hormony ciążowe — progesteny Środki przeciwciążowe (antykoncepcyjne) Wpływ hormonów płciowych na psychikę Hormonalna determinacja płci

Kortykosterydy (kortykosteroidy)

477

7.6.1. Mineralokortykoidy 7.6.2. Glikokortykosteroidy 7.6.3. Kliniczne zastosowanie kortykosterydów i ich analogów

479 479 480

7.7.

Ekdysteroidy

482

7.8.

Glikozydy n a s e r c o w e

483

7.8.1. Glikozydy kardenolidowe

485

7.8.2. Glikozydy bufadienolidowe

487

Saponiny

488

7.9.

7.10. Literatura źródłowa i uzupełniająca

8 . TERPENOIDY (IZOPRENOIDY) 8.1.

489

490

Izopren

491

8.2.

Biosynteza terpenów

492

8.3.

Olejki e t e r y c z n e

492

8.4.

Pozyskiwanie terpenów

503

8.5.

Monoterpeny i monoterpenoidy

504

8.5.1. Monoterpeny i monoterpenoidy niecykliczne 8.5.2. Monoterpenoidy monocykliczne 8.5.3. Bicykliczne monoterpeny i monoterpenoidy

504 506 513

8.6.

Seskwiterpeny i seskwiterpenoidy 8.6.1. 8.6.2. 8.6.3. 8.6.4.

8.7.

8.8.

8.9.

Seskwiterpeny Seskwiterpeny Seskwiterpeny Seskwiterpeny

niecykliczne monocykliczne bicykliczne tricykliczne

518 518 519 520 520

D i t e r p e n y (C 2 0 H 3 2 ) i d i t e r p e n o i d y

521

8.7.1. 8.7.2. 8.7.3. 8.7.4.

521 522 522 523

Kwasy żywiczne Fitol Labdany Jatrofon i cembrenen

Triterpeny i triterpenoidy

523

8.8.1. Skwalen 8.8.2. Lanosterol i cykloartenol 8.8.3. Amiryny

523 524 525

Tetraterpeny i tetraterpenoidy

525

8.9.1. 8.9.2. 8.9.3. 8.9.4.

525 527 530 532

Karoten i karotenole Witamina A Witamina E Witamina K

8.10. Literatura źródłowa i uzupełniająca

533

9 . ZWIĄZKI SYGNAŁOWE (FEROMONY)

534

9.1.

Podział feromonów

537

9.2.

Skład feromonów

538

9.3.

Identyfikacja feromonów

540

9.4.

Wytwarzanie feromonów

542

9.5.

Oddziaływanie feromonów

543

9.6.

Rozprzestrzenianie feromonów

545

9.7.

Selektywność feromonów

546

9.8.

Rola chiralności

546

9.9.

Najważniejsze grupy feromonów

550

9.9.1. 9.9.2. 9.9.3. 9.9.4. 9.9.5. 9.9.6. 9.9.7.

550 553 554 554 554 556 557

Feromony Feromony Feromony Feromony Feromony Feromony Feromony

płciowe ścieżkowe znaczące terytorium alarmowe agregacyjne i rozpraszające dyskryminujące obronne i jady

9.10. Rola feromonów w życiu ssaków

558

9.11. Feromony organizmów morskich

561

9.12. Feromony węży

565

9.13. Antyatraktanty

566

9.14. Zastosowanie feromonów

566

9.15. Literatura źródłowa i uzupełniająca

568

WYKAZ SKRÓTÓW I SYMBOLI

571

SKOROWIDZ

576

1 AMINOKWASY

Aminokwasy — elementarne składniki białek, enzymów, hormonów peptydowych, glikopeptydów, wielu toksyn, antybiotyków peptydowych, alkaloidów peptydowych i szeregu innych produktów naturalnych — są związkami organicznymi zawierającymi co najmniej po jednej grupie aminowej i karboksylowej. W skład ich cząsteczek mogą wchodzić ponadto i inne grupy, np. reszty alifatyczne, aromatyczne, heterocykliczne, grupa hydroksylowa, tiolowa, guanidynowa czy dodatkowa grupa karboksylową lub aminowa. Wśród wielu aminokwasów na wyróżnienie zasługują aminokwasy, z których zbudowane są białka, tzw. aminokwasy białkowe. W przyrodzie oprócz aminokwasów białkowych znaleziono kilkaset innych aminokwasów o bardzo zróżnicowanej budowie. Tym aminokwasom, łącznie z aminokwasami białkowymi, przysługuje nazwa aminokwasów naturalnych. Jeszcze więcej aminokwasów otrzymano na drodze syntezy chemicznej; nazywa się je aminokwasami syntetycznymi lub niewłaściwie — nienaturalnymi czy sztucznymi.

1.1. Podziaf aminokwasów AMINOKWASY

NATURALNE

BIAŁKOWE (L)

pierwszorzędowe (kodowane) endogenne

(D,L)

NIEBIAŁKOWE (D,L)

drugorzędowe

egzogenne

SYNTETYCZNE

trzeciorzędowe

(DL,L,D)

Biorąc pod uwagę chemiczną budowę aminokwasów, można wśród nich wyróżnić aminokwasy y... w zależności od wzajemnego położenia obu głównych grup funkcyjnych: RCH — (CH2)v — COOH

A- = 0, 1, 2, 3...

NH2

a,/s,y,d...

Funkcja aminowa może być grupą aminową pierwszorzędową (—NH 2 ), drugorzędową (—NHR), trzeciorzędową (—NR 2 ) lub czwartorzędową amoniową (—NR 3 + ); aminokwasy zawierające czwartorzędową grupę amoniową noszą nazwę betain.

1.1.1. Aminokwasy biatkowe Aminokwasami białkowymi nazywane są aminokwasy wchodzące w skład białek. Jest ich kilkadziesiąt (tab. 1.1) i dzielą się na aminokwasy pierwszorzędowe, drugorzędowe i trzeciorzędowe. Podział ten nie jest związany z rzędowością grup aminowych, lecz z procesem biosyntezy białka. Stosowane do niedawna równorzędne nazywanie aminokwasów białkowych aminokwasami naturalnymi jest niewłaściwe, ponieważ w przyrodzie, a więc w naturze, występuje znacznie więcej aminokwasów, nie tylko te, które są składnikami białek. Wszystkie aminokwasy znalezione w przyrodzie zaliczane są do aminokwasów naturalnych. Dla poszczególnych aminokwasów białkowych z reguły stosuje się nazwy zwyczajowe. Przykładowo: powszechnie używa się nazwy glicyna, a nie kwas aminooctowy lub aminoetanowy, dalej alanina, a nie kwas aminopropionowy lub aminopropanowy, itp. Wszystkie aminokwasy białkowe należą do grupy aminokwasów a, co oznacza, że obie główne grupy funkcyjne, tj. aminowa i karboksylową, związane są z tym samym atomem węgla, oznaczanym w skrócie Ca. Aminokwasy białkowe, z wyjątkiem glicyny, należą zgodnie z projekcją Fischera do szeregu konfiguracyjnego L, który wywodzi się od aldehydu L-glicerynowego. Natomiast zgodnie z zasadami konfiguracji absolutnej, okreś-

T a b e l a 1 . 1 . Ważniejsze aminokwasy białkowe Nazwa aminokwasu Aminokwasy

Symbole 3 - i 1 —1 — i terowe

Masa molowa

Odkrywca i rok odkrycia

Źródło i zawartość w % (średnia zawartość w białkach)

alifatyczne

Glicyna

Gly, G

75,1

H. Braconnot; z żelatyny; 1820

fibroina jedwabiu, 4 4 żelatyna, 26 (7,8)

Alanina

Ala, A

89,1

T. Weyl; z fibroiny jedwabiu; 1888

fibroina jedwabiu, 30 (8,9)

Walina

Val, V

117,2

E. Gorup-Besanez; z trzustki; 1856

elastyna aorty wołu, 18 (6,8)

Leucyna

Leu, L

131,2

J. Proust; z twarogu; 1819

zeina kukurydzy, 19 albumina surowicy, 13 (7,4)

Tabela 1.1 cd. Izolcucyna

Ile, I

131,2

F. Ehrlich; z buraka cukrowego; 1904

globulina owsa, 4 albumina surowicy, 3 (4,6)

Pro li na

Pro, P

115,1

E. Fischer; z kazeiny; 1901

żelatyna, 16 kazeina, 11; salmina, 7 (4,6)

105,1

E. Cramcr; z jedwabiu; 1865

trypsynogen, 17 fibroina jedwabiu, 16(7,1)

Hydroksyaminokwasy Seryna

alifatyczne Ser, S

Treonina

Thr, T

119,1

W. Rose i wsp.; z włóknika; 1935

awidyna, 10 keratyna włosów, 8 (6,0)

Hydroksyprolina

Hyp

131,2

E. Fischer; z żelatyny; 1902

żelatyna, 14 kolagen, 13

Aminokwasy

siarkowe

Cysteina

Cys, C

121,2

keratyna włosów, 18; wełny, 12; piór, 8 (2,8)

Cystyna

Cys,

240,3

W. Wollaston; z kamieni moczowych; 1910

Metionina

Met, M

149,2

J. Mueller; z kazeiny; 1921

owoalbumina, 5 y-kazeina, 4

Aminokwasy

keratyna włosów, 18; wełny, 12; piór, 8 (1,7)

zasadowe

Lizyna

Lys, K

146,2

E. Drechsel; z kazeiny; 1886

mioglobina, 15 albumina surowicy, 13 (6,9)

Hydroksylizyna

Hly

162,3

D. van Slykc; z żelatyny; 1938

żelatyna, 2 kolagen, 1

Arginina

Arg, R

174,2

E. Schultze; z siewek łubinu; 1886

salmina, 86 histony, 16; żelatyna, 8 (4,7)

Histydyna

His, H

155,2

A. Kossel; ze spermy; 1896

hemoglobina, 7 (2,0)

Aminokwasy

kwasowe

i ich amidy

Kwas asparaginowy

Asp, D

133,1

H. Ritthausen; z grochu; 1868

globulina jęczmienia, 10 (5,5)

Asparagina

Asn, N

132,1

L. Vauquelin; z soku asparagusa; 1806

(4,3)

Kwas glutaminowy

Glu, E

147,1

H. Ritthausen; z glutenu pszenicy; 1866

gliadyna zbóż, 38 zeina kukurydzy, 23 (6,1)

Glutamina

Gin, Q

146,1

E. Schultze; z soku buraków; 1877

(3,9)

Aminokwasy

aromatyczne

Fenyloalanina

Phe, F

165,2

E. Schultze; z siewek łubinu; 1879

albumina surowicy, 8 y-globulina, 5 (3,5)

Tyrozyna

Tyr, Y

181,2

J. Liebig; z kazeiny; 1846

fibroina jedwabiu, 13 (3,5)

Tryptofan

Trp, W

204,2

F. Hopkins i S. Cole; z kazeiny; 1901

lizozym jaja kurzego, 11; a-laktoalbumina, 7 (1,1)

14

coo H,N — C — H CH,

L-alanina

ęoo(~)

H,C

.H

H o o c

.H

CH,

H — C — NH3 CH,

D-alanina

w projekcji Fischera

NH,

NH,

5-alanina

ft-alanina w projekcji Newmana

Rys. 1 . 1 . Konfiguracja aminokwasów na przykładzie alaniny

lanej na podstawie projekcji Newmana, wchodzą w skład szeregu S (z wyjątkiem cysteiny należącej do szeregu R). W celu przypisania konfiguracji związkom chiralnym na podstawie projekcji Fischera należy cząsteczkę przedstawić w postaci rzutu na płaszczyznę w ten sposób, żeby łańcuch węglowy ułożony był wzdłuż pionowej linii, a atom węgla o najwyższym stopniu utlenienia (dla aminokwasów jest to karboksylowy atom węgla — C O O H ) zajmował górną pozycję. Jeżeli na tak przedstawionym rzucie grupa aminowa znajduje się po lewej stronie łańcucha węglowego — aminokwas należy do szeregu L. Konsekwentnie jego enancjomer z grupą aminową po prawej stronie będzie miał konfigurację D (rys. 1.1). Literki D i L zapisywane są mniejszą czcionką niż nazwa aminokwasu. Dla konfiguracji nieznanej używa się symbolu (grecka litera czytaj ksi). Nazwy aminokwasów często przedstawia się za pomocą trój- lub jednoliterowych symboli. Przy symbolach aminokwasów białkowych zazwyczaj pomija się przedrostek L, jako że wszystkie one, z wyjątkiem glicyny, mają konfigurację L, natomiast przy pisaniu pełnej nazwy aminokwasu umieszcza się przedrostek oznaczający konfigurację, piszemy więc L-alanina, L-walina itd. Zarówno przed symbolami, jak i pełnymi nazwami aminokwasów o konfiguracji D lub mieszanin racemicznych umieszcza się odpowiednio przedrostki D lub DL. Przykład: Val oznacza L-walinę, a D-Val lub DL-Val odpowiednio D-wahnę lub DL-walinę. Litery D i L określające konfigurację aminokwasu zgodnie z projekcją Fischera mogą być pominięte również w pełnej nazwie aminokwasu, kiedy z treści wynika, że konfiguracja nie ma znaczenia, np. gdy mówimy ogólnie o danym aminokwasie lub aminokwasach. Litery DL zapisane razem, bez przecinka, oznaczają równomolową mieszaninę izomerów D i L, czyli mieszaninę racemiczną. Zamiast przedrostka DL można stosować przedrostek rac, np. rac-Leu. W celu określenia konfiguracji związku organicznego na podstawie projekcji Newmana, tj. wg. zasady Cahna, Ingolda i Preloga, należy spojrzeć na cząsteczkę wzdłuż wiązania Ca — H (rys. 1.1) i oznaczyć ważność (na podstawie liczby masowej) trzech podstawników wokół chiralnego atomu węgla — im większa liczba masowa, tym podstawnik ważniejszy (otrzymuje niższy numer w skali od 1 do 3, tzn. najważniejszy podstawnik otrzymuje nr 1). W przypadku tej samej liczby masowej dwóch lub nawet trzech atomów połączonych bezpośrednio z atomem chiralnym należy wziąć pod uwagę liczby

masowe atomów kolejnych, tak samo oddalonych od atomu centralnego. Przykład: w przypadku alaniny najważniejszym podstawnikiem jest grupa NH 2 i jej przypisujemy nr 1, dwie pozostałe grupy przyłączone są do atomu chiralnego poprzez atomy C, jednak drugą w kolejności ważności jest grupa — C O O H (nr 2), a trzecią — C H 3 (nr 3). Taka kolejność wynika z tego, że w grupie — C O O H atom węgla połączony jest z atomami tlenu, w grupie — C H 3 zaś z lżejszymi atomami wodoru. Podobnie grupa — C H O jest ważniejsza od grupy —CH 2 OH. Przyjmuje się formalnie, że wiązanie podwójne jest równoznaczne z dwoma pojedynczymi wiązaniami z tym samym atomem: C = O jest tożsame z układem — O — C — O — . Po oznaczeniu ważności podstawników przy atomie chiralnym określa się ich wzajemne ułożenie: jeżeli układ podstawników 1 - 2 - 3, tj. od najważniejszego do najmniej ważnego, jest zgodny z kierunkiem ruchu wskazówek zegara, to mamy do czynienia z enancjomerem R, a w przypadku układu przeciwnego konfiguracja oznaczanego atomu zaliczana jest do szeregu S. W nazwach aminokwasów zawierających dwa centra chiralne stosuje się przedrostek allo. Przedrostek ten oznaczający inny, odpowiada izomerowi o konfiguracji innej niż naturalna lub konfiguracji innej niż konfiguracja aminokwasu poznanego w pierwszej kolejności. Znane są np. a/Zo-izoleucyna czy c/Z/o-treonina. Przedrostek allo w nazwie L-cz//o-treonina oznacza, że zarówno grupa aminowa, jak i grupa hydroksylowa znajdują się przy atomach węgla o konfiguracji L, ponieważ w naturalnej L-treoninie atom węgla (i ma konfigurację D. 1.1.1.1. Pierwszorzędowe aminokwasy białkowe Pierwszorzędowymi aminokwasami białkowymi (tab. 1.2) nazywane są aminokwasy stanowiące substraty w rybosomalnej syntezie białka. Jest ich 20 (lub 21, ponieważ niektórzy autorzy zaliczają do nich również selenocysteinę). Różnią się między sobą budową łańcucha bocznego. Są wśród nich alifatyczne aminokwasy białkowe (Gly, Ala, Val, Ile, Leu i Pro), czyli homologi glicyny, w której miejsce jednego wodoru zajęły takie reszty alifatyczne, jak Me—, i-Pr—, 2-metylopropyl— lub 1-metylopropyl—; aminokwasy siarkowe (Cys i Met) — zawierające ugrupowania — S H lub —SCH 3 ; aminokwasy aromatyczne (Phe, Tyr i Trp), w których skład wchodzi reszta fenylowa, /?-hydroksyfenylowa lub 3-indolilometylenowa; aminokwasy zasadowe (Arg, Lys i His), zawierające dodatkowo grupę guanidynową, aminową lub pierścień imidazolowy; aminokwasy kwasowe i ich amidy (Asp, Glu, Asn i Gin), w których znajduje się dodatkowa grupa karboksylową lub amidowa oraz hydroksyaminokwasy (Ser i Thr). Pierwsze zostały odkryte Gly i Leu (1820 r.), a ostatnim wyizolowanym aminokwasem białkowym była Thr, odkryta i zdefiniowana ponad 100 lat później, tj. w 1935 r., oraz wspomniana już selenocysteina opisana w 1989 r. Aminokwasy pierwszorzędowe nazywane są również aminokwasami kodowanymi, ponieważ tylko one rozpoznawalne są przez kod genetyczny sterujący syntezą białek. Aminokwasy kodowane, z wyjątkiem proliny, zawierają wyłącznie pierwszorzędowe grupy aminowe. Biosynteza białka zachodzi w rybosomach według bardzo precyzyjnego mechanizmu, na podstawie informacji zawartej w sekwencji zasad nukleotydowych makrocząsteczek DNA i RNA, fragmentarycznie przekazywanej w procesie transkrypcji przez informacyjny RNA (ang. messenger-RNA, m-RNA). W samym etapie przyłączania poszczę-

T a b e l a 1.2. Aminokwasy kodowane (białkowe pierwszorzędowe)

Alifatyczne CH 2 COOH, glicyna, NH 2

CH 3 CHCOOH, alanina,

Gly, G

NH 2

(CH 3 ) 2 CHCH 2 CHCOOH, leucyna, NH 2

(CH 3 ) 2 CHCHCOOH, walina,

Ala, A

NH2

Val, V

CH 3 CH 2 CHCHCOOH, izoleucyna,

Leu, L

H 3 C NH 2

^ — C O O H , prolina, N H

Ile, I

Pro, P

Aromatyczne

a

/ C H , C H C O O H , tryptofan,

CH 2 CHCOOH, fenyloalanina, I NH 2 Phe.F H 0

N\

\\

^

~1 NH 2

\

Trp, W

V c H 2 C H C O O H , tyrozyna, NH 2

Tyr, Y

Hydroksyaminokwasy CH-,CHCOOH, seryna, I "I HO N H 2 Ser, S

Aminokwasy

H , C - C H - CHCOOH, treonina, I I HO NH 2 Thr, T

kwasowe i ich amidy

HOOCCH 2 CHCOOH, kwas asparaginowy, NH 2

H 2 NOCCH 2 CHCOOH, asparagina,

Asp, D

NH2

HOOCCH 2 CH 2 CHCOOH, kwas glutaminowy, NH2

Aminokwasy

NH2

zasadowe

NH 2

HN(CH 2 ) 3 CHCOOH, arginina,

Lys, K

r

H 2 NC = NH NH 2

Arg, R

y — C H 2 C H C O O H , histydyna, N

Aminokwasy

H 2 NOCCH 2 CH 2 CHCOOH, glutamina,

Glu, E

CH 2 (CH 2 ) 3 CHCOOH, lizyna, NH 2

Asn, N

NH2

His, H

siarkowe

CHoCHCOOH, cysteina, I I Cys, C SH NH 2

CH 2 CH 2 CHCOOH, metionina, I I SCH 3 NH 2 Met, M

Gin, Q

gólnych aminokwasów do rosnącego łańcucha makropeptydowego istotną rolę odgrywa transportujący RNA (ang. transfer-RNA, t-RNA), mający za zadanie wybór właściwego aminokwasu, uaktywnienie go i przyłączenie w postaci aminoacylo-f-RNA do kompleksu rybosomu z m-RNA. Za wybór tego właściwego, jedynego aminokwasu odpowiedzialne jest współdziałanie kodonu i antykodonu, złożonych z kombinacji 3 przylegających do siebie nukleotydów. Podmiana aminokwasów podczas tego procesu jest wyjątkowa. Istotne znaczenie w precyzyjnym doborze aminokwasów ma sekwencja zasacl, czyli zestaw trzech zasad azotowych w trzech przylegających do siebie nukleotydach, tzw. tryplet nukleotydowy, rozpoznający aminokwasy podczas syntezy białek. Niektórym aminokwasom odpowiada tylko jeden kodon, a części dwa lub więcej, maksymalnie sześć. Skład kodonów nieprzypadkowo dobrany jest do poszczególnych aminokwasów. Obserwuje się duże podobieństwo kodonów kodujących ten sam aminokwas. Również aminokwasy o zbliżonej budowie kodowane są przez podobne zestawy zasad, różniące się najczęściej jedynie trzecią z nich, porównaj kodony Asp i Glu. Stwierdzono, że istnieje relacja między składem zasad kodonu, a strukturą kodowanego aminokwasu. Poznano liczne regularności w składzie kodonów poszczególnych aminokwasów. Już w latach pięćdziesiątych XX w. sformułowano pewne zależności sekwencji zasad w kodonach z budową i właściwościami rozpoznawanych aminokwasów. Dość szybko na podstawie analizy modelowej wykazano steryczną komplementarność współdziałających z sobą aminokwasów i zasad (tab. 1.3). Kolejno brano pod uwagę i inne właściwości aminokwasów, w tym masę cząsteczkową, pojemność cząsteczkową, hydrofobowość, parametry Chartona, przesunięcia chemiczne NMR, refrakcję molową czy stałe dysocjacji, próbując stworzyć mapę kodowanych aminokwasów, pogrupowanych w zbiory o wyT a b e l a 1 . 3 . Kod genetyczny i kodowane aminokwasy Zasada druga Zasada pierwsza

U

C

A

G

Zasada trzecia

TT

Phe Phe Leu Leu

Ser Ser Ser Ser

Tyr Tyr End End

Cys Cys End Trp

C A G

c

Leu Leu Leu Leu

Pro Pro Pro Pro

His His Gin Gin

Arg Arg Arg Arg

U c

A A

Ile Ile Ile Met

Thr Thr Thr Thr

Asn Asn Lys Lys

Ser Ser Arg Arg

U c

n

Val Val Val Val

Ala Ala Ala Ala

Asp Asp Glu Glu

Gly Gly Gly Gly

A: adenina, C: cytozyna, G: guanina, U: uracyl

U

A G

A G

U c A G

18 raźnych regulamościach, zależnych od sekwencji zasad w kodonach. Później zwrócono uwagę na rolę reaktywności aminokwasów we współdziałaniu z kodonami i za pomocą macierzy prawdopodobieństwa ułożono szeregi/pierścienie, w których aminokwasy zgrupowano w zbiory wykazujące wyraźne powiązania ze składem kodonów, a w szczególności ze środkową zasadą. Stwierdzono, że zmiany w obrębie budowy kodonów zachodzą okresowo i systematycznie: w pierwszej kolejności zmianom ulegają zasady zajmujące pozycję trzecią, co odpowiada najmniejszym różnicom wartości energii aktywacji aminokwasów. Po wyczerpaniu się możliwych podstawień w pozycji 3 kodonu zachodzą zmiany w pozycji 1, a jako ostatnie wymianie ulegają zasady środkowe. Reguła ta potwierdza obserwacje, że pozycja środkowa jest najbardziej konserwatywna, co podczas jakiejkolwiek mutacji punktowej zapewnia maksymalne zachowanie najbardziej zbliżonych fizykochemicznych właściwości rozpoznawanego aminokwasu. Selenocysteina jest kodowana przez kodon zawierający następujące zasady: UGA. 1.1.1.2. Drugorzędowe aminokwasy białkowe Drugorzędowymi aminokwasami białkowymi nazywa się aminokwasy powstające w wyniku postrybosomalnej modyfikacji, tzn. pod wpływem reakcji zachodzących na resztach aminokwasów pierwszorzędowych wchodzących w skład peptydowego łańcucha nowo utworzonego białka. Do najważniejszych postrybosomalnych modyfikacji reszt aminokwasów tworzących białko należą takie reakcje, jak Af-metylowanie, C-hydroksylowanie i C-chlorowcowanie. Najczęściej spotykanymi aminokwasami tej grupy są: - //-metylowe pochodne aminokwasów kodowanych, np. N-metylolizyna, N-metylometionina, czy N,N,N-trimetylocilanina (występują głównie w histonach); - pochodne hydroksylowe, np. 3-hydroksyprolina, 4-hydroksyprolina, 3-hydroksylizyna (występują najczęściej w białkach skóry); - halogenoaminokwasy, głównie pochodne tyrozyny, np. 3-chlorotyrozyna, 5-bromo-3-chlorotyrozyna, 3-jodotyrozyna czy 3,5-dijodotyrozyna. Hydroksylowanie proliny i lizyny następuje w wytworzonym łańcuchu białkowym za pomocą kwasu a-oksoglutarowego, przy współudziale hydroksylazy prolinowej lub lizy nowej (rys. 1.2).

COOH

\ N — C H/ / H2C

\ N — C H/

\ CH2

reszta proliny

0

/ H2C \

COOH

HO

C=

kwas a-oksoglutarowy

/

COOH

COAW +

CH2

\ ,CH2 /

+

co2

CH

reszta 4-hydroksyproliny

Rys. 1 . 2 . Reakcja hydroksylowania reszty proliny w łańcuchu białkowym

COOH

kwas bursztynowy

Do typowych drugorzędowych aminokwasów białkowych należą również powstające z Arg: ornityna (Om), NH 2 (CH 2 ) 3 CH(NH 2 )COOH, i cytruliiui, _i 4 y

(S)-Ph° °

R y s . 1 . 2 7 . Otrzymywanie chiralnej fenyloglicyny za pomocą redukcji elektrolitycznej w obecnos'ci strychniny jako czynnika chiralnego

1.7.2.5. Redukcja borowodorem zawierającym chiralne podstawniki Wprowadzenie do cząsteczki borowodoru ehiralnyeh ugrupowań umożliwia zastosowanie go do otrzymywania ehiralnyeh produktów w reakcjach uwodornienia prochiralnych alkenów. Produkty addycji borowodoru zawierającego chiralne ugrupowania w reakcji z nadtlenkiem wodoru zostają utlenione do ehiralnyeh alkoholi, a pod wpływem kwasu amidosulfonowego ulegają przekształceniu do ehiralnyeh amin, w tym aminokwasów, jeżeli zostały użyte odpowiednie substraty. Częstym elementem chiralnym wprowadzanym do cząsteczki borowodoru jest a-pinen (rys. 1.28).

2. H 2 O 2 HO'

3

Ł

(€O>

BH 2. N H 2 S 0 2 0 H

Z

H

R y s . 1 . 2 8 . Zastosowanie a-pinenu do otrzymywania ehiralnyeh alkoholi lub amin za pomocą borowodorowania; w chemii terpenów kreska w e wzorach oznacza grupę CH,

1.7.2.6. Metody mikrobiologiczne W przemysłowej produkcji chiralnych aminokwasów dużą rolę odgrywają procesy wykorzystujące mikroorganizmy lub wyizolowane enzymy. Corynebacteńum glutamicum zostały z powodzeniem zastosowane do produkcji kwasu L-glutaminowego z amoniaku i glukozy, czyli hydrolizatu skrobiowego. Natomiast z kwasu fumarowego i amoniaku, przy współudziale Pseuclomonas trifolii, wytwarza się kwas L-asparaginowy. ITVHDAI T7AT ci/DADT Corynebacterinm glutamicum HYDROLIZAT SKROBI (GLUKOZA)

j^j

35oC 40h

3

^Glu

'

100 kg

50kg Asp

KWAS FUMAROWY

Znane są bakterie wykorzystujące ropę naftową i sole amonowe do wytwarzania aminokwasów. ROPA NAFTOWA

^

^

•

Glu, Ala, Asp

1.7.2.7. Metody enzymatyczne Przykładem wykorzystania enzymów do otrzymywania chiralnych aminokwasów jest synteza kwasu L-asparaginowego z kwasu fumarowego i amoniaku w obecności amoniakolazy asparaginianowej. W reakcji następuje stereo specyficzne przyłączenie amoniaku do a,/^-nienasyconego kwasu. HOOCCH = CHCOOH

+

NH,

^

^

• Asp

Duże zapotrzebowanie na L-lizynę występuje w przemyśle spożywczym. Jej dodatek do potraw mącznych znacznie zwiększa ich wartość odżywczą i dlatego w niektórych krajach dodaje się ją do mąki stosowanej do wypieku chleba. L-Lizynę otrzymuje się z łatwo dostępnego surowca, jakim jest a-aminokaprolaktam, który poddaje się enzymatycznej hydrolizie za pomocą hydrolazy L-aminokaprolaktamowej (rys. 1.29). Substratem enzymu jest jedynie izomer L, wobec czego nie zmieniony D-a-aminokaprolaktam po racemizacji za pomocą racemazy a-aminokaprolaktamowej zawracany jest do syntezy jako surowiec wyjściowy.

hydrol a za — | L-aminokaprolaktamowa

CH 2 (CH 2 )3CH(NH 2 )CO

|

L-Lys + D-a-aminokaprolaktam

NH

racemaza a-aiiiiiiokaprolaktaiiwwci Rys. 1 . 2 9 . Zastosowanie enzymów do otrzymywania L-lizyny z kaprolaktamu

1.8. Rozdzielanie aminokwasów racemicznych na enancjomery Kiedy nie udaje się znaleźć korzystnej procedury umożliwiającej syntezę chiralnie czystych aminokwasów lub potrzebne są oba enancjomery, wówczas trzeba się posłużyć jednym z wielu sposobów rozdzielania mieszaniny racemicznej na składniki. Do najczęściej stosowanych technik prowadzących do otrzymywania enancjomerów z racemicznych aminokwasów należą: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Tworzenie soli diastereoizomerycznych i ich krystalizacja Tworzenie i rozdzielanie pochodnych diastereoizomerycznych Krystalizacja spontaniczna Metody enzymatyczne Chromatografia Elektroforeza

1.8.1. Tworzenie soli diastereoizomerycznych i ich krystalizacja Wolne aminokwasy, jako sole wewnętrzne, mogą tworzyć sole jedynie z silnymi kwasami lub z silnymi zasadami. Aminokwasy, w których jedna grupa funkcyjna (aminowa lub karboksylową) jest chroniona, tworzą sole nawet ze słabymi zasadami (np. amoniakiem czy aminami) lub kwasami (np. kwasami karboksylowymi), ponieważ aminokwasy yV-chronione są kwasami, a C-chronione są zasadami. Jeżeli w reakcjach z racemicznymi aminokwasami lub ich pochodnymi zostaną użyte chiralne kwasy lub zasady, to utworzone przez nie sole są diastereoizomerami, a więc związkami różniącymi się właściwościami fizycznymi, i dzięki temu można je rozdzielać, najczęściej poprzez krystalizację. J (/?,S)-RCH(NH 2 )COOH + (/?)-B

0?)-RCH(NH 2 )COO(-) • 0?)-BH(+)

^ ^

^ (S)-RCH(NH 2 )COO(-) • (/?)-BH(+) (/?)-RCH(NH 3 ( + ))COOH • (S)-A(-)

, (/?,S)-RCH(NH 2 )COOH + (S)-AH ^

-

( S ) - R C H ( N H 3 ( + ) ) C O O H • (S)-A(-)

B — zasada chiralna; do szeroko stosowanych ehiralnyeh zasad należą: ( - ) brucyna, (-) chinina, (+) chinidyna, (-) cynchonidyna, (+) cynchonina, (+) i (-) efedryna, (+) i (-) 1-fenyloetyloamina, Ph—CH(NH 2 )CH 3 , (+) i (-) l(>-nitrofenylo)etyloamina, (+) i (-) l-(«-naftylo)etyloamina, (+) i (-) l-(j3-naftylo)etyloamina czy (-) strychnina. AH — kwas chiralny; najczęściej stosowanymi chiralny mi kwasami są: (+) i (-) asparaginowy, (+) i (-) dibenzoilowinowy, (+) i (-) glutaminowy, (+) i (-) jabłkowy, (+) i (-) migdałowy, (+) i (-) winowy, (+) i (-) kamforo- 10-sulfonowy, (+) i (-) a-metoksy-a-(trifluorometylo)fenylooctowy, (+) i (-) a-metoksyfenylooctowy, również N-podstawione aminokwasy.

58 Spośród aminokwasów wolnych szczególnie łatwo rozdzielają się na enancjomery aminokwasy kwasowe i zasadowe. Na przykład kwas glutaminowy daje się rozdzielić za pomocą chininy, a histydyna tworzy łatwo krystalizujące sole z kwasem winowym. Stosując kwas winowy, można również rozdzielić racemiczną tyrozynę. W przypadku wielu aminokwasów obojętnych dobre wyniki rozdzielenia uzyskano za pomocą kwasu D-kamforo-10-sulfonowego, łatwo dostępnego odczynnika handlowego. Znacznie częściej do rozdzielania stosowane są N- lub C-pochodne aminokwasów, przy czym chętniej używa się pochodnych N-acylowych, ponieważ aminoestry zazwyczaj są nietrwałe i wymagają zachowania szczególnej ostrożności, aby nie dopuścić do ich autokondensacji (cyklizacji do dioksopiperazyn). Estry r-butylowe nie ulegają cyklizacji, ale za to są podatne na acydolizę. Do rozdzielania na enancjomery stosuje się następujące Af-pochodne racemicznych aminokwasów: benzoilowe, acetylowe, chloroacetylowe, formylowe i benzyloksykarbonylowe. Z uwagi na duże zapotrzebowanie na chiralnie czyste aminokwasy opracowano szczegółowe procedury otrzymywania ich czystych enancjomerów. Sukces w rozdzielaniu w dużym stopniu zależy od doboru rozpuszczalnika i odpowiedniej chiralnej aminy lub kwasu. Najczęściej na jeden mol rozdzielanego racemicznego //-chronionego aminokwasu zużywa się 0,5 mola chiralnej aminy, tak aby krystalizowała wyłącznie trudniej rozpuszczalna sól, a w roztworze pozostawał drugi enancjomer. Taka procedura zalecana jest z uwagi na konieczność regeneracji chiralnych amin ze względu na ich zwykle wysoki koszt oraz silne właściwości toksyczne, np. brucyna czy strychnina to jedne z najsilniejszych trucizn. Enancjomer krystalizujący w postaci soli zazwyczaj wykazuje wyższy stopień czystości niż enancjomer pozostający w roztworze. Ten drugi wymaga zwykle dodatkowego oczyszczania, najlepiej poprzez utworzenie i krystalizację soli z chiralną aminą lub kwasem o przeciwnej konfiguracji. Czasami po oddzieleniu łatwiej krystalizującej soli diastereoizomerycznej, sól z drugim enancjomerem zaczyna krystalizować po zatężeniu przesączu, na przykład w wyniku wolnego odparowywania rozpuszczalnika z otwartego naczynia. Jako przykład może posłużyć rozdzielanie racemicznej formylofenyloalaniny za pomocą brucyny. Z roztworu w metanolu po zmieszaniu równomolowych ilości CHO-DL-Phe i brucyny krystalizuje trudniej rozpuszczalna sól izomeru D, a po zatężeniu roztworu przez powolne odparowywanie metanolu z otwartego naczynia wypada sól izomeru L (rys. 1.30). CHO-D-Phe • B R U C Y N A |

4 8 h w otwartym naczyniu R y s . 1 . 3 0 . Rozdzielanie soli diastereoizomerycznych przez krystalizację

1.8.2. Pochodne diastereoizomeryczne Wolne lub chronione racemiczne aminokwasy można przeprowadzić w pochodne diastereoizomeryczne w wyniku utworzenia nowego wiązania kowalencyjnego z odczynnikami

chiralnymi. Pochodne te następnie rozdziela się różnymi sposobami, w tym poprzez krystalizację, chromatografię gazową, chromatografię cieczową, elektroforezę czy też technikę przeciwprądową. Do tworzenia ehiralnyeh diastereoizomerycznych pochodnych aminokwasów stosuje się między innymi: 2-butanol, chlorek karbomentyloksyacetylowy, chlorek kwasu kamforo- 10-sulfonowego, 1-fenyloetyloaminę, mentol czy 2-oktanol. W analitycznej chromatografii cieczowej, na przykład do oznaczania składu enancjomerycznego, często używa się pochodnych uzyskanych w reakcji racemicznych aminokwasów z odczynnikiem Marfeya, czyli amidem N a -(2,4-dinitro-5-fluorofenylo)-L-alaniny. Racemiczny aminokwas można również rozdzielić poprzez przeprowadzenie go w diastereoizomeryczne dipeptydy w reakcji z pochodną chiralnego aminokwasu. Taka droga postępowania jest uzasadniona szczególnie wtedy, kiedy przynajmniej jeden z rozdzielonych dipeptydów zostaje wykorzystany w dalszych etapach jakiejś większej syntezy. W poniżej podanym przykładzie oba diastereoizomeryczne dipeptydy znalazły zastosowanie w procesie otrzymywania niesymetrycznie podstawionego kwasu diaminopimelinowego, kluczowego substratu w syntezie fragmentów ściany komórkowej bakterii. ner

CHO-DL-NH — CH — COOH + D-AlaONBzl

H0Bt

(CH2)3Br

- CHO-D-ó-Br-Ape-D-AlaONBzl + CHO-L-ó-Br-Ape-D-AlaONBzl

kwas N-formylo-DL-ó-bromo-2-aminowalerianowy

Ape = kwas 2-aminowalerianowy (dawniej norwalina)

Diastereoizomeryczne, chronione dipeptydy kwasu 2-aminowalerianowego i alaniny zostały preparatywnie rozdzielone zarówno na drodze krystalizacji frakcjonowanej, TLC, jak i chromatografii kolumnowej. Były to pierwsze diastereoizomeryczne dipeptydy rozdzielone za pomocą technik TLC i chromatografii kolumnowej (1974 r.).

1.8.3. Krystalizacja spontaniczna Krystalizacja spontaniczna polega na wprowadzeniu do przesyconego roztworu racemicznego aminokwasu lub jego pochodnej kryształów czystego enancjomeru w ilości około 25% masy rozdzielanego racematu. W odpowiednio dobranych warunkach, tj. przede wszystkim we właściwym rozpuszczalniku i odpowiedniej temperaturze, zaczyna krystalizować ten enancjomer, którego zarodki krystalizacji zostały wprowadzone do przesyconego roztworu. Zwykle masa wykrystalizowanego materiału przewyższa trzykrotnie masę dodanego enancjomeru. Po wprowadzeniu zarodków krystalizacji przesycony roztwór należy wolno mieszać i wolno ochładzać, najlepiej utrzymując stałą temperaturę przez kilka pierwszych godzin. Szczególnie podatne na krystalizację spontaniczną okazały się sole aminokwasów z kwasami arenosulfonowymi PhS0 3 H • DL-PheOH

^'H

3

'™h -

PhS0 3 H • L-PheOH J

Wydajność krystalizacji spontanicznej jednego enancjomeru można zwiększyć poprzez racemizację pozostałości po krystalizacji. Taka procedura jest uzasadniona w przypadku zapotrzebowania tylko na jeden enancjomer. Gdy potrzebne są oba enancjomery, wów-

czas przesącz po pierwszej krystalizacji „zaszczepia" się kryształkami enancjomeru o konfiguracji przeciwnej niż w pierwszym etapie krystalizacji. Najlepszym sposobem przeprowadzenia racemizacji jest ogrzewanie w temperaturze wrzenia roztworu aminokwasu w kwasie octowym. Kwas glutaminowy i asparaginowy są aminokwasami, które nawet w wolnej postaci wykazują szczególną tendencję do krystalizacji spontanicznej. Enancjomery niektórych aminokwasów krystalizują na kryształkach enancjomeru innego aminokwasu, na przykład z nasyconego roztworu kwasu DL-glutaminowego krystalizuje D-Glu po dodaniu kryształków kwasu L-asparaginowego, a D-tryptofan krystalizuje z roztworu DL-Trp po dodaniu do niego kryształków kwasu L-glutaminowego. Oczywiście produkty takiej krystalizacji zawierają domieszki innego aminokwasu. Znane są również przypadki krystalizacji jednego izomeru z roztworu racemicznego aminokwasu w zetknięciu z kryształami kwarcu. Zjawisko to zostało przez niektórych autorów wykorzystane do wytłumaczenia możliwości zagęszczania L-aminokwasów w erze prebiotycznej, tj. przed etapem powstawania życia. Według tych autorów, tak zagęszczone L-aminokwasy mogły być pierwszym etapem w długotrwałym procesie tworzenia się życia na Ziemi.

1.8.4.

Zastosowanie enzymów do rozdzielania racemicznych aminokwasów

Różne enzymy, np. acylazy, proteazy, syntetazy czy też oksydazy, są szeroko stosowane do rozdzielania racemicznych aminokwasów lub wyodrębniania jednego enancjomeru z mieszaniny. Działają one według różnego mechanizmu, na przykład deprotekcji osłony grupy aminowej lub karboksylowej w aminokwasach o konfiguracji L, tworzenia pochodnych aminokwasu L lub też rozkładu aminokwasu o określonej konfiguracji. Poniżej zostały przedstawione sposoby rozdzielania racemicznych aminokwasów za pomocą wybranych enzymów. 1.8.4.1. Acylazy Amidohydrolaza N-acyloaminokwasowa (EC 3.5.1.14) popularnie zwana, z uwagi na źródło jej pochodzenia, wieprzową acylazą nerkową, jest enzymem najczęściej stosowanym do rozdzielania racemicznych N-acyloaminokwasów poprzez selektywną hydrolizę grupy acylowej na centrum L. Do tego rozdzielania używa się przede wszystkim pochodnych acetylowych, chloroacetylowych lub benzoilowych. Reakcję hydrolizy enzymatycznej prowadzi się w wodnym lub w wodno-organicznym buforze o określonym pH, w temperaturze zbliżonej do temperatury fizjologicznej, tj. około 37°C. Po zakończeniu reakcji hydrolizy, która najczęściej zachodzi ze 100-procentową chemiczną wydajnością i 100-procentową stereoselektywnością, enzym oddziela się, a nie zmieniony acylo-D-aminokwas ekstrahuje z zakwaszonego środowiska organicznym rozpuszczalnikiem. Z roztworu po ekstrakcji wydobywa się wolny L-aminokwas za pomocą jonitów lub przez krystalizację po doprowadzeniu roztworu do punktu izoelektrycznego. W ulepszonym sposobie stosowania acylazy do rozdzielania racemicznych N-acyloaminokwasów przepuszcza się roz-

twór tych pochodnych przez kolumnę wypełnioną złożem zawierającym enzym osadzony na polimerze, tzw. enzym immobilizowany. U dołu kolumny odbiera się roztwór N-acylo-D-aminokwasu i wolnego L-aminokwasu. Zaletą tego sposobu jest: - możliwość prowadzenia procesu w sposób ciągły, - łatwość oddzielenia produktu od enzymu, - zwiększona wydajność rozdzielania w przeliczeniu na jednostkę enzymu, - możliwość przerwania procesu bez konieczności dezaktywacji enzymu, - możliwość wielokrotnego użycia enzymu. Oprócz nerkowej acylazy wieprzowej stosowane są acylazy bakteryjne. Przykładem takiego enzymu jest acylaza izolowana ze szczepu Aspergillus melleus. 1.8.4.2. Proteazy Wśród wielu proteaz (Katalog Sigmy wymienia ponad 30 ich typów) większość jest pochodzenia bakteryjnego, a kilka grzybowego. Do enzymów najczęściej stosowanych do rozdzielania aminokwasów należy proteaza typu VIII, otrzymywana ze szczepu Bacillus licheniformis. Jest sprzedawana w postaci liofilizowanej lub krystalicznej; ta druga, o zwiększonej trwałości, może być przechowywana w lodówce ponad rok bez utraty aktywności. Stosowana jest między innymi do hydrolizy grupy estrowej przy centrum L, co zostało wykorzystane do rozróżnienia centrów ehiralnyeh aminokwasów wielofunkcyjnych (rys. 1.31). W sprzedaży są również proteazy immobilizowane, czyli osadzone na nośnikach. COOMe

COONa

I L-CHNHZ

L-CHNHZ

I (CH 2 ) 3 I D-CHNHZ COOMe

proteaza

typu VIII (CH 2 ) 3

N a H C 0 3 , DMF/H9O D-CHNHZ COOMe

Rys. 1 . 3 1 . Zastosowanie proteazy typu VIII do różnicowania grup funkcyjnych wielofunkcyjnego aminokwasu — kwasu diaminopimelinowego

W podanym powyżej przykładzie enzym proteaza został użyty do hydrolizy wiązania estrowego przy centrum L, natomiast grupa estrowa związana z centrum D tej samej cząsteczki została zachowana. W ten sposób równocenne chemicznie grupy karboksylowe zostały zróżnicowane, co umożliwiło przeprowadzenie dalszych reakcji w celu otrzymania niesymetrycznych pochodnych kwasu diaminopimelinowego, w tym oligopeptydowych fragmentów ściany komórkowej niektórych bakterii. Papaina, zwana również papainazą (EC 3.4.22.2), jest enzymem należącym także do proteaz. Otrzymuje się ją z lateksu drzewa papaya. Jest dostępna w postaci liofilizowanej lub oczyszczonej przez krystalizację. Papaina krystaliczna jest zwykle dziesięciokrotnie

aktywniejsza od papainy liofilizowanej. Rozdzielanie enancjomerów pod wpływem papainy następuje w wyniku katalizowania przez nią reakcji otrzymywania L-anilidów z racemicznych //-chronionych aminokwasów. Nierozpuszczalny w wodzie chroniony anilid enancjomeru L wytrąca się i można go odsączyć, a nie zmieniony N-acetylo-D-aminokwas izoluje się z przesączu za pomocą rozpuszczalnika nie mieszającego się z wodą lub zasadowych jonitów. Ac-DL-Ser + PhNH 2

J T s Z h • Ac-L-Ser-NHPhj + Ac-D-Ser 100%, e.e. = 100%

1.8.5. Metody chromatograficzne W chemii aminokwasów i peptydów były i są szeroko stosowane wszystkie znane odmiany chromatografii, a więc bibułowa, cienkowarstwowa, gazowa, a od kilkunastu lat przede wszystkim cieczowa. Ostatnio coraz większego znaczenia nabiera również elektroforeza kapilarna, a także chromatografia w stanie nadkrytycznym. Jeszcze dwadzieścia kilka lat temu chromatografia bibułowa była powszechnie wykorzystywana nie tylko do jakościowego i ilościowego oznaczania wolnych aminokwasów oraz peptydów, ale także do ich preparatywnego oczyszczania i wyodrębniania. Obecnie jej znaczenie w chemii peptydów jest znikome. Została wyparta przez chromatografię cienkowarstwową i cieczową. Zastosowana została po raz pierwszy w 1944 roku jako typowa chromatografia podziałowa, ponieważ fazę stacjonarną stanowi woda zaadsorbowana na włóknach celulozy (nawet wysuszona bibuła zawiera znaczne ilości wody), a w fazie ruchomej oprócz wody znajduje się rozpuszczalnik mniej polarny, niemieszający się z wodą. O rozdzielaniu analizowanych substancji decyduje wartość współczynnika podziału substancji pomiędzy wodę a mniej polarną fazę ruchomą. Po naniesieniu badanej próbki, zawierającej substancje analizowane, zwane analitami, miejsce naniesienia suszy się i koniec bibuły zanurza się w naczyniu zawierającym fazę ruchomą. Faza ruchoma zwilża bibułę i na zasadzie naczyń włosowatych (chromatografia wstępująca) lub sił grawitacyjnych (chromatografia zstępująca), zwilżając bibułę, przesuwa się do jej drugiego końca. Jest to tzw. rozwijanie chromatogramu. Po osiągnięciu przez fazę ruchomą miejsca naniesienia próbki (startu), anality zostają w niej rozpuszczone i zaczynają się również przesuwać wraz z fazą ruchomą z szybkością zależną od wartości współczynnika podziału między wodę zaadsorbowaną na bibule a mniej polarną fazę ruchomą. Anality polarne przesuwają się wolniej (dłużej przebywają w środowisku wodnym związanym z bibułą), a składniki mniej polarne wędrują szybciej; w granicznym przypadku — razem z czołem fazy ruchomej. Po osiągnięciu przez czoło określonego poziomu w pobliżu drugiego końca paska bibułę wyjmuje się z pojemnika, przerywając tym samym dalsze rozwijanie, po czym się ją suszy i wywołuje badane substancje, tzn. traktuje się je odczynnikami, pod których wpływem anality stają się widoczne w postaci plamek, często kolorowych. Do wywoływania aminokwasów i wolnych peptydów najczęściej używa się ninhydryny, któ-

1.8. Rozdzielanie aminokwasów racemicznych na enancjomery ra tworzy z nimi barwne produkty, zwykle niebieskie lub fioletowe. Tego typu barwne produkty powstają w reakcji ninhydryny z aminokwasami lub innymi związkami zawierającymi wolną, pierwszorzędową grupę aminową (rys. 1.32). Prolina, w której znajduje się drugorzędowa grupa aminowa, tworzy produkt o żółtawym zabarwieniu, znacznie mniej intensywnym niż związki zawierające pierwszorzędowe grupy aminowe. Również aminoestry dają z ninhydryną żółte plamki, intensywniejsze jednak niż prolina. o

O II

II +H 2 0

U -

U - X

-H2O

OH OH

ninhydryną

X

RCH(NH2)COOH +

OH

-CO,

-2H20

y = N — CHRCOOH

OH

C O o II /

c

CH—N=CHR

+H2O ^ -RCHO

UL

CHNH,

II o -H70,HH

II o

C — N =

C

O

substancja barwna R y s . 1 . 3 2 . Reakcja ninhydryny z aminokwasami zawierającymi pierwszorzędową grupę aminową

Na chromatogramie substancje różniące się współczynnikami podziału, mimo że były naniesione razem w miejscu zwanym punktem startowym (startem), po rozwinięciu i wywołaniu znajdują się w różnych miejscach (rys. 1.33). Substancje bardziej polarne — lepiej rozpuszczalne w wodzie, wędrują wolniej, a łatwiej rozpuszczalne w rozpuszczalniku niemieszającym się z wodą wędrują szybciej i po rozwinięciu chromatogramu są bardziej oddalone od miejsca startowego. Stosunek drogi plamki, tj. odległości między startem a środkiem plamki, do drogi rozpuszczalnika od startu do czoła, nosi nazwę współczynnika R{.

64 czoło

Rf =

start Rys. 1 . 3 3 . Chromatogram bibułowy lub cienkowarstwowy

Chromatografia bibułowa, głównie z uwagi na długi czas rozwijania (nawet do kilkudziesięciu godzin) i duże rozmiary wywoływanych plamek (rozmycie pod wpływem długo działającej dyfuzji), została w latach siedemdziesiątych wyparta przez chromatografię cienkowarstwową. Bibuła ma jednak przewagę nad innymi nośnikami chromatograficznymi, ponieważ celuloza — główny składnik bibuły, jest czynnikiem chiralnym, zdolnym do rozdzielania enancjomerów. Jako przykład może służyć rozdzielenie na bibule trzech chiralnych izomerów: D,D, L,L, i mezo kwasu 2,6-diaminoheptano-l,7-dikarboksylowego (diaminopimelinowego). Chiralne właściwości bibuły są wykorzystywane w chromatografii cienkowarstwowej dzięki złożom opartym na sproszkowanej celulozie lub jej chemicznie zmodyfikowanych pochodnych, np. karboksy- czy acetylocelulozie. 1.8.5.2. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC — ang. łhin layer

ęhromatography)

Różni się ona od chromatografii bibułowej głównie podłożem, na którym przeprowadza się rozdzielanie analitu. Najczęściej stosowanym złożem w TLC jest żel krzemionkowy, rzadziej tlenek glinu, ziemia okrzemkowa czy sproszkowana celuloza. Ostatnio coraz większe znaczenie zyskują złoża poliamidowe i chemicznie modyfikowane żele krzemionkowe. Procedura rozdzielania analitów na płytkach TLC jest podobna do chromatografii bibułowej. Na jednym końcu płytki szklanej, plastikowej lub z folii aluminiowej, pokrytej złożem (nośnikiem, czyli fazą stacjonarną), w pewnym oddaleniu od dolnego brzegu płytki, na przykład 1 cm, nanosi się niewielkie próbki, rzędu 1 JLX1 roztworów badanych substancji. Następnie rozpuszczalnik użyty do naniesienia próbki odparowuje się, na przykład umieszczając płytki w suszarce lub przedmuchując okolice startu strumieniem powietrza, po czym płytkę zanurza się w fazie ruchomej tak, żeby punkty startowe znajdowały się nad powierzchnią fazy ruchomej. Rozwijanie chromatogramu prowadzi się w szczelnie zamkniętym naczyniu, co zabezpiecza przed odparowywaniem rozpuszczalników, a tym samym przed zmianą składu fazy ruchomej. Faza ruchoma, nasączając nośnik, podnosi się do góry, zabierając z sobą substancje ze startu. Po zbliżeniu się czoła rozpuszczalnika (fazy ruchomej) do górnego brzegu płytkę wyjmuje się, suszy i wywołuje substancje analizowane. Substancje chromatografowane wędrują wraz z rozpuszczalnikiem wolniej lub szybciej w zależności od różnicy powinowactwa cząsteczek analitu i rozpuszczalnika do miejsc aktywnych, znajdujących się na powierzchni fazy stacjonarnej. Cząsteczki analitu

zaadsorbowane w miejscu aktywnym fazy stacjonarnej wypierane są przez cząsteczki rozpuszczalnika, wobec czego przesuwają się wyżej, po czym ponownie adsorbują się na najbliższych napotkanych miejscach aktywnych. Taki proces w miarę przesuwania się fazy ruchomej odbywa się wielokrotnie. Cząsteczki rozpuszczalnika są w stanie wyprzeć cząsteczki analitu wówczas, gdy ich powinowactwo do złoża jest zbliżone lub większe od powinowactwa cząsteczek analitu. Powinowactwo cząsteczek analitu i rozpuszczalnika do złoża polarnego, jakim jest żel krzemionkowy, wzrasta wraz ze wzrostem ich polarności. Wobec tego, im polarność cząsteczek fazy ruchomej jest większa od polarności cząsteczek analitu, tym łatwiej te drugie są wypierane z miejsc aktywnych przez rozpuszczalnik i tym szybciej przesuwają się wraz z rozpuszczalnikiem w górę płytki. Szybkość migracji cząsteczek analitu można regulować polarnością fazy ruchomej. Stosując mniej lub bardziej polarne rozpuszczalniki lub zmieniając ich udział w fazie ruchomej, można zmieniać szybkość przesuwania się cząsteczek analitu na płytce, a tym samym wartość R{. W granicznych przypadkach, gdy faza ruchoma jest znacznie mniej polarna od analitu, cząsteczki analizowanej substancji pozostają na starcie, natomiast gdy faza ruchoma jest dużo polarniejsza od analitu, cząsteczki analitu wędrują z czołem fazy ruchomej. Tak otrzymane chromatogramy nie mają wartości analitycznej. Dlatego w chromatografii cienkowarstwowej niezwykle istotne znaczenie ma dobór warunków procesu, głównie składu fazy ruchomej, tak żeby wartość R { mieściła się w granicach 0,3-0,7. Jest wiele sposobów wizualizacji analitów na rozwiniętym chromatogramie cienkowarstwowym. W handlu dostępne są płytki pokryte żelem zawierającym substancje oddziałujące ze światłem UV. Na płytkach pokrytych takim żelem niektóre substancje stają się widoczne pod lampą UV w postaci ciemnych lub świecących plamek. Innym sposobem wizualizacji rozdzielanych substancji jest umieszczanie wysuszonych chromatogramów w komorze zawierającej jod. Jod adsorbuje się na wielu substancjach organicznych, powodując ich brunatnienie. Płytki można też spryskać roztworami jodu w takich rozpuszczalnikach, jak etanol czy chloroform. Do uniwersalnych wywoływaczy (reagujących na wiele substancji organicznych) należy 60-procentowy kwas siarkowy. Płytki pokryte żelem krzemionkowym lub innym złożem odpornym na kwas siarkowy spryskuje się po rozwinięciu roztworem kwasu siarkowego i ogrzewa w temperaturze 150-200°C. W tych warunkach większość substancji organicznych ulega rozkładowi — zwęgleniu, co objawia się pojawieniem plamek o różnym odcieniu szarości, aż do czarnego. Znanych jest wiele wywoływaczy specyficznych, reagujących jedynie na określone grupy związków chemicznych. Kwasy karboksylowe można zlokalizować za pomocą niektórych wskaźników. Etanolowy 0,2-0,5-procentowy roztwór ninhydryny służy do wykrywania pierwszorzędowych amin, a więc i aminokwasów. Płytki spryskane takim roztworem po lekkim podgrzaniu zabarwiają się na niebiesko lub fioletowo w miejscach, w których występują aminy pierwszorzędowe. Prolina, inne aminy drugorzędowe i aminoestry zabarwiają się pod wpływem ninhydryny na żółto. Podobnie jak w chromatografii bibułowej, oznaczenie jakościowe analizowanych substancji przeprowadza się przez porównanie wartości R f analitu i wzorca, opierając się na zasadzie, że ta sama substancja, w jednakowych warunkach, przebywa na płytce TLC jednakową drogę w stosunku do drogi fazy ruchomej, a więc jej wartość R{ jest stała. Na-

leży zdawać sobie sprawę, że w chromatografii jednakowa wartość współczynnika R{ nie jest dowodem na identyczność porównywanych substancji, ponieważ dwie lub więcej różnych substancji może mieć takie same lub bardzo zbliżone wartości Rf. W celu zwiększenia prawdopodobieństwa identyczności porównywanych substancji należy powtórzyć oznaczenie, zmieniając warunki chromatograficzne, najczęściej stosując inną fazę ruchomą. Natomiast, na prawidłowo zrobionym chromatogramie, brak plamki w spodziewanym miejscu daje pewność braku danej substancji w oznaczanej próbce. Chromatografia cienkowarstwowa, zarówno w wersji jakościowej, jak i preparatywnej, jest nadal szeroko stosowana do identyfikacji związków organicznych, monitorowania reakcji, oczyszczania lub rozdzielania skomplikowanych mieszanin, a także do przeprowadzania analiz ilościowych. Obecnie najczęściej używa się płytek gotowych do użycia, tj. z naniesionym już złożem. Płytki takie są standaryzowane; szklane najczęściej mają długość 20 cm, a szerokość 5, 10 lub 20 cm. Płytki na foliach Al lub plastikowych, o wymiarach 20 x 20 cm można nożyczkami przyciąć do dowolnych rozmiarów, przy czym należy pamiętać, że droga rozpuszczalnika musi mieć długość co najmniej 10 cm, aby obliczone wartości były wiarygodne, tzn. miały wartość analityczną. Na krótkich chromatogramach błąd pomiaru jest duży. Faza ruchoma powinna być często wymieniana, ponieważ jej składniki zużywają się nierównomiernie, a ponadto jej skład może się zmieniać w wyniku odparowywania bardziej lotnych rozpuszczalników lub reakcji chemicznych pomiędzy składnikami, przez co uzyskiwane wyniki stają się nierzetelne. Chromatografia cienkowarstwowa umożliwia oznaczanie ilościowe rozdzielanych analitów. Specjalne przyrządy mierzące absorbancję wywołanych plamek określają stężenie analitów, oczywiście na podstawie uprzednio wyznaczonych krzywych wzorcowych. 1.8.5.3. Filtracja żelowa Substancje o masie rzędu 1000 Da i więcej, różniące się masą cząsteczkową, a często jedynie rozmiarami lub kształtem cząsteczek, można rozdzielić na porowatych polimerach — żelach o zdefiniowanych rozmiarach kanalików. Podczas przechodzenia roztworów analitów przez takie złoża cząsteczki o rozmiarach mniejszych od średnicy kanalików wnikają w nie przejściowo, przez co ich czas przebywania w kolumnie chromatograficznej wydłuża się. Cząsteczki o rozmiarach większych niż średnica kanalików wędrują przez kolumnę bez przeszkód wraz z fazą ruchomą. Jest to powszechnie stosowana technika rozdzielania cząsteczek o masie molowej powyżej 1000 Da, szczególnie polimerów, a więc ma duże zastosowanie w chemii peptydów i białek. 1.8.5.4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa Metoda ta, w skrócie zwana HPLC, od angielskiej nazwy high performance liąuid chromatography (dawniej high pres sure licjuid chromatography), jest obecnie najczęściej stosowaną techniką chromatograficzną w chemii aminokwasów i peptydów. Jest to stosunkowo nowa technika analityczna, wprowadzona do praktyki w latach sześćdziesiątych ubiegłego stulecia, z tym, że w chemii aminokwasów i peptydów szersze zastosowanie znalazła dopiero w latach osiemdziesiątych. Obecnie trudno sobie wyobrazić prowadzenie badań w tej dziedzinie chemii bez możliwości stosowania HPLC. Podstawowymi elemen-

nastrzyk próbki

Rys. 1 . 3 4 . Schemat ideowy chromatografu HPLC

tami chromatografu cieczowego są: kolumna, urządzenie do nastrzyku, pompa, detektor i rejestrator (rys. 1.34). Dodatkowymi urządzeniami ułatwiającymi obsługę chromatografu lub zwiększającymi jego możliwości są automatyczny podajnik, integrator, termostat, dodatkowa pompa lub mikroprocesory do wytwarzania gradientu czy też komputer sterujący pracą zestawu. HPLC różni się od grawitacyjnej chromatografii cieczowej przede wszystkim rozmiarami ziaren złoża wypełniającego kolumny. W kolumnach HPLC ziarna te mają mniejsze rozmiary, o średnicy poniżej 80 jam, najczęściej jednak 5 - 1 0 |am. Tak małe ziarna stwarzają większe opory fazie ruchomej, przez co trzeba stosować zwiększone ciśnienie wymuszające jej przepływ przez kolumnę. Uzyskuje się w zamian lepszą sprawność rozdziału, widoczną jako bardziej zwarte wymywane warstwy (wąskie piki). W chemii aminokwasów i peptydów chromatografy cieczowe wykorzystywane są zarówno do prac analitycznych, jak i preparatywnych. Technika ta daje nieocenione usługi w jakościowym i ilościowym oznaczaniu zarówno wolnych, jak i chronionych aminokwasów w mieszaninie (np. w hydrolizacie białek), w oznaczaniu czystości aminokwasów (w tym czystości chiralnej), służy także do monitorowania i oceny metod syntezy peptydów, czy wreszcie do badania mechanizmów reakcji tworzenia wiązania peptydowego. W początkowym okresie rozwoju HPLC technika ta nie znajdowała uznania wśród chemików pracujących w dziedzinie aminokwasów i peptydów, ponieważ rozdzielanie tą techniką wolnych aminokwasów, peptydów i białek sprawiało poważne trudności. W owym czasie jedynym stosowanym w praktyce wypełnieniem kolumn był polarny żel krzemionkowy, który polarne anality zbyt mocno adsorbuje i przez to opuszczają one kolumnę szerokim pasmem, wobec czego rejestrowane sygnały (piki) są szerokie, rozmyte i obarczone charakterystycznymi „ogonami". Taki chromatogram jest nieprzydatny zarówno do jakościowej, jak i ilościowej interpretacji. Na żelu krzemionkowym obserwuje się również trwałą adsorpcję polarnych analitów. Dopiero zastosowanie słabo polarnych wypełnień, umożliwiło pokonanie trudności w chromatograficznym rozdzielaniu mieszaniny związków silnie polarnych, a wśród nich wolnych aminokwasów i peptydów. Takimi słabo polarnymi fazami mogą być polimery, ale najczęściej są to chemicznie modyfikowane żele krzemionkowe. Modyfikacja ta polega na kowalencyjnym przyłączeniu do powierzchniowych grup —Si—OH różnych reszt organicznych, często reszt alifatycznych, np. oktadecylowych czy oktylowych, lub ugrupowań zawierających charakterystyczne grupy funkcyjne, np. aminopropylową, dihydroksypropylową, cyjanopropylową

czy fenylową. Tego typu wypełnienia powodują odwrócenie wzajemnego układu polarności fazy stacjonarnej w stosunku do fazy ruchomej. W układach normalnych (czyli takich, jakie stosowano w początkowym okresie rozwoju chromatografii) faza stacjonarna była bardziej polarna od fazy ruchomej, np. żel krzemowy-heksan/izopropanol. W chromatografii w odwróconym układzie faz, RP-HPLC (RP — ang. reverse pjiase) faza stacjonarna jest mniej polarna od fazy ruchomej, na przykład żel krzemionkowy modyfikowany resztami oktadecylowymi (ODS), jako faza stacjonarna, jest znacznie mniej polarny niż najczęściej stosowana w tym układzie faza ruchoma, jaką jest woda lub woda z dodatkiem organicznego modyfikatora, najczęściej metanolu, izopropanolu czy acetonitrylu. Modyfikator organiczny zwiększa siłę elucji fazy ruchomej, tzn. skraca czas retencji w chromatografii z odwróconym układem faz. 1.8.5.4.1. Analizatory aminokwasów. HPLC oddaje duże usługi w oznaczaniu składu aminokwasowego peptydów i białek. Hydrolizat białkowy, będący mieszaniną aminokwasów, może być analizowany jakościowo i ilościowo metodami chromatograficznymi, w tym za pomocą chromatografii bibułowej, cienkowarstwowej lub gazowej. Obecnie najczęściej stosuje się chromatografię cieczową. W 1954 roku S. Moor i W. Stein przedstawili zasady działania analizatora aminokwasowego, po czym urządzenie takie zostało skonstruowane dopiero w 1958 roku. Za konstrukcję analizatora aminokwasów Stein i Moor otrzymali w 1972 roku Nagrodę Nobla. Rozdzielenie poszczególnych aminokwasów w klasycznym analizatorze aminokwasów według Steina i Moora następuje na dwóch szeregowo połączonych kolumnach wypełnionych jonitami. Na jednej z nich rozdzielane są aminokwasy kwasowe, a więc kwas glutaminowy i asparaginowy, na drugiej zaś aminokwasy pozostałe, tj. obojętne, zasadowe i amoniak, powstający w wyniku hydrolizy glutaminy i asparaginy. Eluat po opuszczeniu drugiej kolumny jest mieszany z roztworem ninhydryny, w wyniku czego tworzą się barwne produkty. Produkty te, odpowiadające poszczególnym aminokwasom opuszczają kolumnę w różnym czasie i są wykrywane przez detektor UV. Analiza jakościowa opiera się na porównywaniu czasu retencji składników oznaczanej próbki z wzorcami. Absorbancja zmierzona jako pole lub wysokość poszczególnych pików stanowi podstawę oznaczeń ilościowych. Wadą tego typu analizatorów był długi czas analizy, wynoszący kilka godzin, niezbyt duża dokładność i wysoki próg wykrywalności, a w przypadku proliny i hydroksyproliny bardzo słaby sygnał. Ponadto w czasie kwasowej hydrolizy białka niektóre aminokwasy ulegają rozkładowi: tryptofan i seryna rozkładają się częściowo, glutamina i asparagina są hydrolizowane odpowiednio do kwasu glutaminowego i asparaginowego, a cysteina całkowicie przekształcona zanika. Cysteinę można oznaczyć w oddzielnej procedurze po utlenieniu jej do kwasu cysteinowego. Wynik analizy podaje się w postaci stosunków molowych poszczególnych aminokwasów, co jest odzwierciedleniem ich udziału w cząsteczce białka lub peptydu. Ze względu na stosunkowo duży błąd oznaczeń liczby wyrażające stosunki molowe aminokwasów rzadko bywają liczbami całkowitymi, dlatego poszczególne wartości trzeba zaokrąglać do najbliższych liczb całkowitych, np. otrzymany wynik analizy Ala:Glu:Leu:Phe:Pro:Val = = 1,1:0,9:1,2:3,4:1,6:2,1 odpowiada ich udziałowi w cząsteczce peptydu w stosunku 1:1:1:3:2:2.

Udoskonalenie wypełnień kolumn chromatograficznych bardzo usprawniło procedurę oznaczania składu aminokwasowego hydrolizatów białkowych. Obecnie w analizatorach aminokwasów stosuje się jedną kolumnę, czas analizy wynosi kilkadziesiąt minut, a próg wykrywalności został tak obniżony, że do oznaczenia składu aminokwasowego białka wystarcza próbka rzędu ułamka (.ig. Zamiast ninhydryny wykorzystuje się często inne odczynniki przekształcające aminokwasy w pochodne barwne lub silnie absorbujące w zakresie nadfioletu; wśród nich duże znaczenie zyskały aldehyd o-ftalowy i chlorek dansylu. Umożliwiają one stosowanie detektora fluorescencyjnego, co zwiększa czułość metody o kilka rzędów. Rysunek 1.35 pokazuje porównanie wyników uzyskanych za pomocą klasycznego analizatora aminokwasów z wynikami otrzymanymi za pomocą nowoczesnego aparatu HPLC. Zwraca uwagę nie tylko skrócenie czasu analizy, ale i dwustukrotne obniżenie progu wykrywalności. Met Asp

y Met Tyi Phe, 5 • 10" 1 0 mol • dni" 3 HPLC

Asp

10

1 • 10~ 7 mol • d m - 3 Beckman Unichrom AAA

120 157 czas, min — *

75

G1

NHi

I Phe

Gly

40

Lys

Tyr

20

30 czas, min •

Rys. 1 . 3 5 . Porównanie wyników analizy składu aminokwasowego uzyskanych za pomocą klasycznego analizatora aminokwasów i HPLC

1.8.5.4.2. Chiralna chromatografia cieczowa. Kolejny rysunek 1.36 ilustruje, na przykładzie racemicznej seryny, możliwości rozdziału enancjomerów i oznaczania czystości enancjomerycznej aminokwasów za pomocą chromatografu cieczowego wyposażonego w kolumnę z wypełnieniem chiralnym, w której jako różnicujący czynnik chiralny zastosowano pochodną proliny osadzoną na żelu krzemionkowym. W tego typu chromatografii stosuje się fazę ruchomą zawierającą jony miedzi, umożliwiające przejściowe tworzenie kompleksów aminokwasów z proliną wchodzącą w skład wypełnienia. Zarówno prolina, jak i rozdzielany aminokwas są ligandowymi składnikami kompleksu, przy czym konfiguracja rozdzielanego aminokwasu decyduje o trwałości powstającego kompleksu, a tym

70

OH HOOC I P: 3 - 0 - S i - ( C H 2 ) 3 - 0 - C H 2 - C H - C H 2 - N CH

Ser

CH 2

CH 2 CH 2

10 (im C: 4,6 x 250 mm MP: K H 2 P 0 4 0,04 mol • dur"3, pH = 4,6 S: 10ng~

4

3 czas, mm

Rys. 1 . 3 6 . Rozdział enancjomerów seryny na chiralnym wypełnieniu techniką HPLEC; C — kolumna, MP faza ruchoma, S — wielkość próbki

D Ser

Ala -CH-CH2-

P:

NH-, C H 2 - N - C H 2 - * C H - CH 3

CH.

7,5 (im C: l x 100 mm MP: AcONa 0,25 mol • dm~ 3 (AcO) 2 Cu 0,0015 mol • dm~ 3 J

I

40

I

L

0

czas, min Rys. 1 . 3 7 . Równoczesny rozdział enancjomerów kilku wolnych aminokwasów za pomocą HPLEC

samym o czasie jego przebywania w kolumnie. Enancjomer rozdzielanego aminokwasu tworzący mniej trwały kompleks jest szybciej eluowany. Ponieważ te kompleksy są w stanie równowagi dynamicznej i ich aminokwasowe składowe ulegają stałej wymianie, tego typu chromatografia nazywa się wysokosprawną chromatografią wymiany ligandów — HPLEC (ang. high performance ligand exchange chromatography). Kolejny rysunek 1.37 pokazuje możliwości rozdziału enancjomerów aminokwasów na kolumnie z wypełnieniem polimerycznym zawierającym chiralną aminę. Kolumna taka jest w zasadzie chiralnym wymieniaczem jonowym. Można na niej równocześnie rozdzielić kilka aminokwasów racemicznych na ich enancjomery. Biorąc pod uwagę szerokość pików enancjomerów leucyny, można stwierdzić, że sprawność zastosowanej kolumny nie była wysoka. Podobne techniki stosowano do oznaczania czystości handlowych aminokwasów ehiralnyeh i niektórych pochodnych z nich otrzymanych. Z tabeli 1.8 wynika, że czystość T a b e l a 1 . 8 . Czystość chiralna wybranych aminokwasów handlowych

Aminokwas

Zawartość drugiego enancjomeru [%]

Aminokwas lub pochodna

Zawartość drugiego enancjomeru [%]

L-Ala

0,03

L-Phe

0,01

D-Ala

0,07

D-Phe

0,01

L-Asp

0,02

L-Ser (A)

1,93

D-Asp

0,20

L-Ser(B)

1,24

L-Asn

0,04

D-Ser

1,31

D-Asn

0,04

L-Ser(Bzl)

0,09

1

L-Arg

0,04

L-Ser

D-Arg

0,10

L-Trp

0,01

L-G1U

0,03

D-Trp

0,01

D-GIu

1,08

L-Tyr

0,02

L-Gln

0,09

D-Tyr

0,02

D-GIn

0,11

L-Val

0,03

L-His

0,01

D-Val

0,03

D-His

0,04

Boc-D-Val

0,01

L-Leu

0,02

Boc-D-Ala

0,03

D-Leu

0,97

Boc-D-Gln

0,02

L-Lys

0,07

Boc-D-Leu

0,11

D-Lys

0,06

Boc-D-Met

0,03

L-Met

0,02

Boc-D-Arg(Tos)

0,04

D-Met

0,18

A i B — próbki od różnych d o s t a w c ó w , ' otrzymana z L-Ser(Bzl) przez katalityczne uwodornienie.

0,06

72 chiralna większości analizowanych aminokwasów jest zadowalająca. Są jednak aminokwasy, głównie z serii D, takie jak kwas asparaginowy, arginina, kwas glutaminowy, glutamina, leucyna, metionina, czy seryna, w których zawartość enancjomeru L przekracza 0,1%, a nawet 1 % , co dla substratów służących do otrzymywania preparatów biologicznie czynnych, w tym leków, jest nie do przyjęcia. Te zanieczyszczenia wynikają prawdopodobnie z niezbyt dobrego rozdzielenia mieszanin racemicznych, z których zwykle otrzymuje się aminokwasy D. Wystarczy jednak przeprowadzić je w pochodne i przekrystalizować, żeby otrzymać preparaty o znacznie wyższej czystości, o czym świadczą przykładowo podane czystości Boc-aminokwasów. Aminokwasy L są znacznie czystsze, ponieważ otrzymuje się je zazwyczaj z hydrolizatów białkowych. W trakcie hydrolizy następuje częściowa racemizacja, ale jej zasięg w większości przypadków jest niewielki. Spośród prezentowanych w tabeli aminokwasów L jedynie L-seryna wykazuje znaczną zawartość drugiego enancjomeru jako zanieczyszczenia. Można ją jednak łatwo oczyścić poprzez krystalizację O-benzylowej pochodnej. Innym sposobem rozdzielania racemicznych aminokwasów jest chromatografia ich diastereoizomerycznych pochodnych. Przeprowadzanie aminokwasów w takie związki jest zazwyczaj procesem pracochłonnym, ale pochodne takie udaje się często rozdzielić na znacznie tańszych kolumnach z wypełnieniem niechiralnym. Rozdzielenie mieszaniny Ile p Leu Phe P: M i c r o P a k - N H 2 10 |im C: 2,2 x 2 5 0 mm MP: A izooktan/CHoClo /-PrOH: l 2 *-l 2 I-' (75 : 15 : 15) B izooktan/CH 2 Cl 2 : (90 : 10) D: U V - 2 5 4 nm

Ala

Glu

Trp

R y s . 1 . 3 8 . Chromatogram rozdzielenia mieszaniny estrów p - n i t r o b e n z y l o w y c h 7 V - ( + ) - 1 0 - k a m f o r o s u l f o n y l o — DL-aminokwasów

diastereoizomerycznych pochodnych aminokwasów osiąga się zarówno za pomocą TLC, GC, HPLC, jak i elektroforezy kapilarnej. Przedstawiony na rysunku 1.38 chromatogram ilustruje rozdzielenie kilku diastereoizomerycznych pochodnych aminokwasów za pomocą HPLC, na kolumnie wypełnionej złożem aminopropylowym. Niezwykle cenna jest możliwość uzyskania równoczesnego rozdzielenia enancjomerów wszystkich aminokwasów kodowanych. Rysunek 1.39 przedstawia chromatogram, na którym widoczne są rozdzielone enancjomery 17 aminokwasów. Jest to niezwykle cenne osiągnięcie, ponieważ pozwala ono nie tylko na określenie składu aminokwasowego nieznanego peptydu, ale na jednoczesne określenie konfiguracji reszt aminokwasowych tworzących ten peptyd. Takie wymaganie nie dotyczy analizy białek, gdyż składają się one wyłącznie z L-aminokwasów, a podczas ich hydrolizy zasięg racemizacji jest nieznaczny, jednak wiele naturalnych peptydów, w tym antybiotyków czy toksyn, zawiera w swym składzie D-aminokwasy. Również peptydy otrzymywane syntetycznie mogą zawierać reszty zracemizowanych aminokwasów, wobec czego potrzebny jest sposób ich jakościowego i ilościowego oznaczania. Ponadto wiele syntetycznych analogów natural-

29 24 21

20

8

12

19

13

22

16

10

4 56

26 28 30 25 21

32

33 17

23

31 34

35

1415

U

U T—i—i—i—i—i—r 10 20

—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—r t — i — i — r 30 40 50 60

VJUv n—i—i—r 70

czas, min Rys. 1 . 3 9 . Rozdzielenie techniką HPLC wzorców DL-aminokwasów: 1 — Asp, 2 — D-Asp, 3 — Glu, 4 — Asn, 5 — D-Glu, 6 — Ser, 7 — D-Asn, 8 — D-Ser, 9 — Gin, 10 — D-Gln, 11 — Thr, 12 — Gly, 13 — D-Thr, 14 — His, 15 — D-His, 16 — Ala, 17 — Arg, 18 — D-Ala, 19 — D-Arg, 20 — Tyr, 21 — D-Tyr, 22 — Val, 23 — Met, 24 — Tip, 25 — D-Met, 26 — D-Val, 27 — Phe, 28 — Tle, 29 — D-Trp, 30 — D-Phe, 31 — Leu, 32 — D-Ile, 33 — D-Leu, 34 — Lys, 35 — D-Lys

nych peptydów, np. analogów wazopresyny czy enkefalin, z założenia zawiera D-aminokwasy. I w tym przypadku technika umożliwiająca rozróżnianie konfiguracji aminokwasów wchodzących w skład takich peptydów jest bardzo przydatna. Za pomocą metod chromatograficznych można oznaczać również czystość chiralną peptydów, przy czym nie trzeba do tego stosować złóż chiralnych, ponieważ peptyd stanowiący zanieczyszczenie głównego produktu jest jego diastereoizomerem różnicowalnym zwykle chromatograficznie na achiralnym wypełnieniu. Rysunek 1.40 przedstawia chromatogram, na którym widoczne jest zanieczyszczenie chronionego dipeptydu Z-Phe-Phe-OMe śladową ilością (około 0,1%) diastereoizomeru D-L.

P: LiChrosorb - 60,5 |iim C: 4 x 250 mm MP: /'-PrOH//?-heksan: 2,5%

0,1% L-D

L-D /

Rys. 1 . 4 0 . Chromatogram HPLC Z-Phe-Phe-OMe; widoczne śladowe zanieczyszczenie izomerem L-D

1.8.6. Elektroforeza Do rozdzielania mieszanin związków organicznych techniką elektroforezy wykorzystuje się różnice w szybkości poruszania się naładowanych elektrycznie cząstek w polu elektrycznym. Cząstki naładowane dodatnio dążą do katody, a naładowane ujemnie — do anody. Szybkość poruszania się jonów zależy nie tylko od wielkości ładunku elektrycznego i masy cząstek, ale również od ich kształtu. Nośnikami, na których następuje rozdział jonów, zwykle są zwilżone elektrolitem: bibuła, syntetyczne polimery, żel agarowy czy skrobia. Na powierzchnię nośnika nakłada się roztwór rozdzielanych aminokwasów, peptydów, białek lub innych związków, po czym do końców paska bibuły lub płytki pokrytej nośnikiem przykłada się napięcie do 200 V, w elektroforezie niskonapięciowej, i do 10 000 V, w elektroforezie wysokonapięciowej. W zależności od znaku ładunku, cząsteczki wędrują do katody lub anody, a ich położenie można oznaczyć po wywołaniu (wi-

1.8, Rozdzielanie aminokwasów racemicznych na enancjomery zualizacji) specjalnymi odczynnikami, np. ninhydryną. Elektroforeza pozwala również na rozdzielanie niezjonizowanych cząstek pod warunkiem, że ulegają one polaryzacji w polu elektrycznym. Ulepszoną odmianą elektroforezy klasycznej jest elektroforeza cienkowarstwowa, w której wykorzystuje się płytki podobnie jak w TLC. Zapewnia ona nie tylko wyższą sprawność niż elektroforeza klasyczna (np. bibułowa), ale również umożliwia przeprowadzenie analizy w znacznie krótszym czasie. Mniejsze są również wymiary aparatury. Najwyższą sprawność zapewnia jednak elektroforeza kapilarna, która skupia w sobie zalety dwóch technik — wysokosprawnej chromatografii cieczowej i elektroforezy. Rozdzielanie substancji obdarzonych ładunkiem za pomocą elektroforezy kapilarnej jest zazwyczaj znacznie efektywniejsze (obserwuje się wyższą sprawność) niż techniką HPLC i elektroforezy z osobna. Procedura takiego rozdzielania polega na tym, że do kapilary wypełnionej nośnikiem podobnym do stosowanego w HPLC przykłada się napięcie i tłoczy roztwór analitów. Na uwagę zasługuje zastosowanie elektroforezy do preparatywnego rozdzielania aminokwasów. Procedura rozpoczyna się od doprowadzania w sposób ciągły roztworu mieszaniny aminokwasów na płytkę pokrytą właściwym złożem. Po przyłożeniu napięcia, jak pokazuje rysunek 1.41, poszczególne składniki rozdzielają się w stopniu zróżnicowanym zależnym od jonizacji, wielkości oraz kształtu cząstek i, przesuwając się wraz z rozpuszczalnikiem, ulegają stopniowemu odchyleniu od osi płytki, tak że roztwory czystych aminokwasów mogą być odbierane w określonych miejscach.

mieszanina aminokwasów kierunek przepływu

roztworu buforowego

J.

aminokwasy kwasowe

obojętne

zasadowe

Rys. 1 . 4 1 . Zasada działania ciągłej elektroforezy preparatywnej

1.9. Fizykochemiczne metody badania aminokwasów 1.9.1. Polarymetria Wszystkie aminokwasy białkowe, z wyjątkiem glicyny, a także większość innych aminokwasów naturalnych i rozdzielone na stereoizomery aminokwasy syntetyczne są związkami optycznie czynnymi, tzn. zdolnymi do skręcania płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego. Mierzony za pomocą polarymetru kąt skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego, a, jest przy określonej długości fali światła, temperaturze, rozpuszczalniku i stężeniu wielkością charakterystyczną dla danej substancji. Wartość kąta skręcenia tej płaszczyzny przedstawia się najczęściej w postaci skręcalności właściwej [a]: 100 a [«]i=-

lc

gdzie c oznacza stężenie substancji w g/100 ml roztworu, / — długość rurki polarymetrycznej w dm (odpowiada ona długości drogi, jaką promień przebywa w środowisku chiralnym), a a wartość kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego w stopniach. Indeks X oznacza długość fali światła monochromatycznego, przy której został dokonany pomiar. Często jest to światło linii D sodu, o długości fali równej 589,3 nm. Wartość skręcalności właściwej przy określonej długości fali jest zależna od temperatury, dlatego liczba t nad literą A oznacza temperaturę, w jakiej były robione pomiary. Należy również podawać rozpuszczalnik użyty do sporządzania roztworu oraz jego stężenie, gdyż wartość [a] zależy również od obu tych parametrów. Stężenie c w g/100 ml oraz użyty rozpuszczalnik podaje się w nawiasie okrągłym po wartości skręcalności właściwej, np. [a]5° = 19° (c = 1, MeOH).

Wartości skręcalności właściwej [«] D w wodzie wielu aminokwasów, szczególnie alifatycznych, są niewielkie, na przykład dla Ala wartość ta wynosi 1,8°, dla Val 5,6°, a dla Ser -7,9°. Wartości [«] D cyklicznych i aromatycznych aminokwasów są zwykle znacznie wyższe: - 8 6 ° dla Pro, - 3 4 ° dla Phe, - 3 4 ° dla Tip i - 3 8 ° dla His. Zakwaszenie wodnych roztworów aminokwasów z reguły zwiększa wartość [«] D (staje się bardziej dodatnia), na przykład wartość [a) D L-alaniny wzrasta z 1,8° do 15° odpowiednio w wodzie i w 1-molowym kwasie solnym, podobnie L-tryptofanu z - 3 4 ° do -2,8°, L-proliny z - 8 6 ° do -60°, a L-seryny z -7,5° do 15,1°. Również aminokwasy rozpuszczone w kwasie octowym wykazują skręcalność właściwą bardziej dodatnią niż ich roztwory wodne (tabela 1.9). Podobne tendencje zmian [a] D L-aminokwasów obserwuje się przy zmianie odczynu roztworów od obojętnego do zasadowego. Często skręcalność podawana jest w formie molowej skręcalności optycznej [M]: r..lt l M h

=

M m

Ma t [ a h =

przy czym M oznacza masę molową danej substancji.

~

T a b e l a 1 . 9 . Skręcalność właściwa i molowa wybranych aminokwasów białkowych i ich zmiany przy zmianie pH środowiska (t = 25°C, c = 1 - 2 )

[«]D

MD w H20

w H20

w 5 mol/dm 3 HC1

w AcOH

Ala

+ 1,6

+ 1,8

+ 15

+33

Arg

+22

+12

+28

+29

Asn

-7,4

-5,6

-5,6

+29

Asp

+6,7

+5,0

+25

Cys

-20

-16

+6,5

(Cys),

-509'

-212

-232

Gin

+9,2

+6,3

+31'

Glu

+ 18

+ 13

+32

His

-60

-38

+12

+7,5

Ile

+ 16

+12

+39

+49

Leu

-14

-11

+ 16

+22

Lys

+20

+13

+26

Met

-15

-10

+23

+20

Phe

-57

-34

-4,5

-7,5

Pro

-99

-86

-60

-80

Ser

-7,9

-7,5

+ 15,1

Thr

-34

-28

-15

-30

Trp

-69

-34

-2,8

-34

Aminokwas

Tyr Val

+ 13

-10 +6,6

+5,6

+28

+62

'w 1 nHCl.

Oznaczenie skręcalności danego związku polega na sporządzeniu roztworu oznaczanej substancji w odpowiednim rozpuszczalniku, o stężeniu od poniżej 1 do kilku g/100 ml, w zależności od rozpuszczalności i spodziewanej wartości [a]. Objętość roztworu zależy od wielkości badanej próbki i jakości polarymetru używanego do oznaczeń. Popularne rurki polarymetryczne o długości 10 cm mają średnicę 8 mm, a więc pojemność poniżej 10 ml, tak żeby roztwór przyrządzony w kolbie miarowej o pojemności 10 ml wystarczył do jej napełnienia. Do przyrządzenia takiej objętości roztworu należy dysponować próbką o masie co najmniej 0,lg, jeżeli chce się przyrządzić roztwór o stężeniu c = 1. W przypadku gdy spodziewana wartość [a] jest mała (w granicach kilku stopni), należy przyrządzić roztwór bardziej stężony, a gdy substancja jest słabo rozpuszczalna, można użyć dłuższej rurki polarymetrycznej. W praktyce nie stosuje się rurek dłuższych niż 20 cm, ponieważ

absorpcja światła jest bardzo zależna od długości drogi i w zbyt długich rurkach małe natężenie światła wychodzącego z rurki utrudnia, a często wręcz uniemożliwia przeprowadzenie wiarygodnych odczytów. Są natomiast używane rurki polarymetryczne krótsze, np. 5 cm, a także o mniejszej średnicy, przez co wystarczy przyrządzić roztwór o mniejszej objętości, np. 2, a nawet 1 ml. Używane są one do oznaczania skręcalności właściwej substancji, gdy wielkość próbki jest rzędu kilku mg lub nawet poniżej 1 mg. Odczytanie kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego w rurkach polarymetrycznych o małej średnicy jest bardzo trudne. Znacznie wygodniejsze jest posługiwanie się polarymetrami fotoelektrycznymi o odczycie automatycznym. Polarymetry takie, chociaż drogie, umożliwiają jednak pomiar skręcalności próbek o małej masie, z czym mamy do czynienia szczególnie podczas badania trudno dostępnych próbek naturalnych. Jeżeli wartość [a] D jest mała, tak że precyzyjne jej oznaczenie jest utrudnione, można spóbować przeprowadzić oznaczenie [a] przy innej niż 589,3 nm długości fali światła monochromatycznego, ponieważ wartość skręcalności właściwej jest bardzo zależna od długości fali świetlnej. Zwykle w przypadku związków pozbawionych chromoforów wartość bezwględna [ a \ rośnie wraz ze spadkiem długości fali światła. Spektropolarymetry umożliwiające odczyt [a\ przy wielu różnych wartościach długości fali, na przykład wykonanie pomiaru skręcalności właściwej w zakresie od 185 do 650 nm, pozwalają na wykreślenie krzywej dyspersji skręcalności optycznej, zwanej krzywą ORD (ang. optical rotatory dispersion curve). Krzywa ta dla różnych związków może przybierać zróżnicowany kształt. W przypadku związków zawierających chromofory [a\ w zależności od wartości długości fali A może przyjmować wartość ujemną, dodatnią lub równą 0, a także osiągać ekstremum (efekt Cottona). Krzywe ORD pary enancjomerów są symetryczne względem osi X(A). Wiele związków pokrewnych ma podobne krzywe ORD i na podstawie ich przebiegu można wnioskować o konfiguracji danego związku przez porównanie z krzywą ORD związku pokrewnego o znanej konfiguracji. Oznaczanie skręcalności właściwej rzadko służy do jakościowej analizy aminokwasów i peptydów, ponieważ wiele aminokwasów i peptydów może mieć zbliżone wartości tego parametru. Wartość skręcalności właściwej powinna być jednak podawana jako charakterystyczna wielkość wszystkich związków chiralnych. Skręcalność właściwa jest przede wszystkim miarą czystości prezentowanej substancji, chociaż często może wprowadzać w błąd. Jeżeli zanieczyszczenie jest substancją optycznie obojętną, to zmniejszenie wartości [«] D następuje proporcjonalnie do jego udziału w próbce. Natomiast wpływ zanieczyszczeń optycznie czynnych na wartość [a] D oznaczanej substancji zależy nie tylko od stężenia zanieczyszczenia w próbce, ale również, a często przede wszystkim, od wartości i znaku skręcalności zanieczyszczenia. Przy dużych wartościach [a] D zanieczyszczenia, a małych — oznaczanej substancji, na przykład jeżeli alanina ([a] D = 1,8°) jest zanieczyszczona cystyną ([a] D = -212°), niewielka zawartość zanieczyszczenia wywiera dramatyczny wpływ na wartość oznaczeń. Już 1% L-cystyny w L-alaninie (jest to wartość zanieczyszczeń dopuszczalna w odczynnikach czystych) powoduje zmianę znaku [a] D oznaczanej próbki. Dlatego wartość [a] D jako ocena czystości ma sens jedynie w przypadku występowania w próbce zanieczyszczeń optycznie nieczynnych. Wszystkie zanieczyszczenia optycznie czynne powinny być usunięte przed pomiarem skręcalności.

Zazwyczaj usuwanie jednych zanieczyszczeń, np. za pomocą krystalizacji lub chromatografii, powoduje usunięcie i pozostałych, dając w rezultacie czystą próbkę. Pomiar [a\ umożliwia oznaczanie stopnia racemizacji czy też epimeryzacji badanego związku, oczywiście przy tych samych zastrzeżeniach co powyżej. Znacznie pewniejsze wyniki daje oznaczanie czystości chiralnej za pomocą metod chromatograficznych, przy czym do rozróżnienia enancjomerów potrzebny jest jakiś chiralny selektor, np. chiralne złoże czy chiralny dodatek do fazy ruchomej. Od kilku lat w chromatografii cieczowej wykorzystuje się detektory polarymetryczne. Pozwalają one, bez rozdzielenia enancjomerów, oznaczać ich zawartość w mieszaninie. Detektor taki współpracuje z połączonym szeregowo detektorem UV, za pomocą którego oznacza się stężenie sumaryczne obu enancjomerów na podstawie ich współczynnika absorpcji, natomiast detektor polarymetryczny, odpowiednio wyskalowany, pokazuje stężenie enancjomeru będącego w nadmiarze (e.e.). W ten sposób, za pomocą achiralnej HPLC, można oznaczyć udział enancjomerów w mieszaninie bez ich rozdzielenia. Jest to niezwykle atrakcyjna metoda oznaczania składu enancjomerycznego mieszaniny, ponieważ preparatywne, a nawet analityczne rozdzielenie enancjomerów niejednokrotnie jest bardzo trudne, a czasami wręcz niemożliwe do przeprowadzenia, nawet za pomocą HPLC na ehiralnyeh wypełnieniach lub też przy współudziale innych czynników ehiralnyeh (np. rozpuszczalnika czy specjalnych dodatków).

1.9.2. Spektrometria mas Spektrometria mas jest wykorzystywana z powodzeniem do identyfikacji zarówno wolnych, jak i chronionych aminokwasów, a szczególnie duże usługi daje w analizie peptydów. Jej zasada opiera się na tym, że wszystkie związki organiczne pod wpływem oddziaływania (bombardowania) strumieniem elektronów, fotonów lub jonów ulegają rozpadowi na charakterystyczne fragmenty, przy czym wiele z nich zostaje obdarzonych ładunkiem. Fragmenty powstające w wyniku rozpadu związku wyjściowego służą do jego identyfikacji, ponieważ w określonych warunkach zarówno fragmenty, jak i ich wzajemny stosunek masowy (względna intensywność sygnałów) są charakterystyczne dla danego związku. Identyfikację związków przeprowadza się na podstawie otrzymywanego widma, na którym zarejestrowane są sygnały poszczególnych jonów oraz ich abundancja (wysokość sygnałów) zależna od stężenia jonów. W granicznym przypadku z danego związku można otrzymać jego jon molekularny, tj. jon o masie równej masie cząsteczkowej badanego związku. Jon molekularny tworzy się wówczas, gdy energia cząstek jonizujących jest wystarczająca do wywołania jonizacji związku, ale za niska, żeby spowodować rozerwanie wiązań kowalencyjnych. W takich przypadkach otrzymywany na widmie sygnał określa, z bardzo dużą dokładnością (do 10 -7 Da), masę cząsteczkową wyjściowego związku. Ta wartość wystarcza do obliczenia przez komputer wzoru sumarycznego badanego związku, ponieważ tylko określone atomy występujące w określonym stosunku mogą tworzyć cząsteczkę o konkretnej, zmierzonej z dużą dokładnością, masie cząsteczkowej.

M+ + 2 e~,

M + e-

M+ — masa jonu molekularnego (macierzystego), M = masa cząsteczkowa, e" = elektron Położenie sygnału w widmie mas zależy od ładunku oraz masy jonu, czyli jest funkcją wartości ilorazu m/z, gdzie m oznacza masę jonu wyrażoną w jednostkach atomowych (Da), a z — wartość ładunku. Najczęściej z = 1 i wówczas m odpowiada masie fragmentu lub całej cząsteczki. Sygnał o największej intensywności w danym widmie określany jest jako pik podstawowy, a jego intensywność przyjmuje się równą 100. Intensywność pozostałych sygnałów opisuje się przez porównanie ich wysokości z wysokością piku podstawowego. Wykres wszystkich sygnałów otrzymanych w wyniku analizy metodą spektrometrii mas i przedstawiony na wykresie abundancja/masa nazywa się widmem mas. Na podstawie takiego widma, przez porównanie go ze znanym widmem mas lub z wykorzystaniem zasady fragmentacji, można przypisać konstytucję oznaczanego związku. Detektory mas stosowane w chromatografii gazowej, w układzie GC-MS, służą do szybkiej i precyzyjnej identyfikacji analizowanych związków, poprzez porównywanie uzyskanych widm z danymi zawartymi w bibliotece (pamięci) systemu. Fragmentacja związków organicznych zachodzi zgodnie z określonymi prawidłowościami, na przykład według reguł uprzywilejowanego tworzenia się karbokationów, ich trwałości, rozrywania najsłabszych wiązań czy eliminacji małych, trwałych fragmentów, takich jak cząsteczka H 2 0 , CO czy NH 3 . W wypadku a-aminokwasów znane są dwie charakterystyczne fragmentacje. Pierwsza z nich zaczyna się od rozpadu cząsteczki na trwały rodnik: ' C O O H o masie 45 i resztę M - 45, będącą stabilizowanym mezomerycznie jonem, który może ulegać dalszemu rozpadowi. Drugą typową fragmentacją jest odszczepienie rodnika łańcucha bocznego 'R o masie M - 74 i utworzenie mezomerycznie stabilizowanego jonu H 2 N + = CH—COOH o masie 74. Struktura łańcucha bocznego R ma również duży wpływ na konstytucję tworzących się fragmentów.

1.10. Literatura źródtowa i uzupełniająca G.C. Barrett (red.), Chemistiy and Biochemistry of Amino Acids, Chapman and Hall Ltd, N Y 1985. G.C. Barrett, D.T. Elmore, Amino Acids and Peptides, Cambridge University Press, 1998. M. Bodanszky, Peptide Cheinistry, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo 1988. M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Second Edition, Springer-Verlag, Heidelberg 1993. G. M. Coppola, H.F. Schuster, Asymmetric Synthesis: Construction of Chiral Molecules ley, New York 1987. J. Davies (red.), Amino Acids and Peptides, Chapman and Hall Ltd, N Y 1985. H. Dugas, Bioorganic

Chemistiy,

a Chemical Appioach

using Amino Acids, Wi-

to Enzyme Action, Springer, New York, Berlin, Heidel-

berg 1996. J.P. Greenstein, M. Winitz, Chemistiy of the Amino Acids, J. Wiley, NY-London 1961. H. Jakubke, H. Jeschkeit, Aminokwasy, peptydy, białka, PWN, Warszawa 1989. P. Jolles, D-Amino Acids in Sequences of Peptides turelle, Paris 1998.

of Multicellulai

Organisms,

Museum National d'Histoire Na-

A. Kołodziejczyk, Naturalne związki organiczne, Warszawa 2004 ISBN 83-01-14316-9, © by WN PWN 2003

1.10. Literatura

81

P. Kafarski, B. Lejczak, Chemia bioorganiczna,

PWN, Warszawa 1994.

A. Kołodziejczyk, Zastosowanie HPLC w chemii aminokwasów i peptydów, w Chemia i biologia

peptydów,

WSP Opole, Opole 1984, ss. 21^16. P. Kubikowski, W. Kostowski (red.), Farmakologia, podstawy farmakoterapii, PZWL, Warszawa 1979. P. Lloyd-Williams, Chemical Approaches to the Synthesis ofPeptides and Proteins, CRS Press, Boca Raton, N Y 1997. R.K. Murray, D.K. Granner, P.A. Mayes, V.W. Rodwell, Biochemia C. Nenitescu, Chemia organiczna, PWN, Warszawa 1969. G. Palyi, C. Zucchi, L. Caglioti (red.), Advances in BioChirality, G.L. Patrick, Chemia medyczjia, WNT, Warszawa 2003.

Harpera,

PZWL, Warszawa 1998.

Elsevier 1999.

E. Pawelczyk (red.), Chemia leków, PZWL, Warszawa 1996. C. Ratledge. B. Kristiansen (red.), Basic Biotechnolog)-, Cambridge Univ. Press, 2001. J. Rawn, Biochemistiy, Beil Patterson Pub., North Carolina 1989. B. Smith, Methods of Non-a-Amino Acid Synthesis, Dekker, New York 1995. W. Steglich, B. Fugmann, S. Lang-Fugmann (red.), Natural Products Rompp Encyklopedia, lag, Stuttgard, New York 2000. L. Stryer, Biochemia, W N PWN, Warszawa 2003. B. Weinstein, Chemistiy and Biochemistiy od Amino Acids, Peptides 1971-1978.

and Proteines,

Georg Thieme Ver-

Marcel Dekker Inc., N Y

R. M. Williams, Synthesis of Optically Active a-Amino Acids, Pergamon Press, Oxford 1989. A. Zejc, M. Gorczyca (red.). Chemia leków, PZWL, Warszawa 1998. S. Zito (red.), Pharmaceutic

Biotechnology,

Technomic Publishing Co. Inc., Lancaster-Basel 1997.

PEPTYDY

Peptydy są związkami organicznymi zbudowanymi z reszt aminokwasowych, które połączone są wiązaniami amidowymi, utworzonymi pomiędzy grupą karboksylową jednego aminokwasu a grupą aminową drugiego aminokwasu. Peptyd pod względem chemicznym jest N-acyloaminokwasem, a wiązanie amidowe — C O — N H — między resztami aminokwasowymi nosi nazwę wiązania peptydowego. Typowym wiązaniem peptydowym jest wiązanie cr-peptydowe, tzn. wiązanie utworzone pomiędzy grapą cr-aminową i cc-karboksylową. Istnieją również wiązania peptydowe fi, y i inne, które często nazywane są wiązaniami izopeptydowymi (rys. 2.1).

H,N—CH—CO—NH—CH—COOH CH,OH NH, I I I " I " CH3 CH, — CO— NH— CH,— CO — NH— CH — CO— NH— CH, — CH2 — CH, — CH— COOH

wiązanie a-peptydowe

wiązanie /3-karboksylopeptydowe

wiązanie ó -ami nopeptydowe

Rys. 2 . 1 . Typy wiązań peptydowych

2.1. Nazewnictwo peptydów Nazwę peptydy dla produktów hydrolizy białek zaproponował Emil Fischer, niemiecki chemik, laureat Nagrody Nobla z 1902 roku, pionier w syntezie peptydów na drodze chemicznej. Skompilował on ją, biorąc pierwsze cztery litery ze słowa peptony (tak ówcześnie nazywano produkty enzymatycznej hydrolizy białek przy udziale pepsyny, które faktycznie były peptydami) i dodając końcówkę -vdv ze słowa polisacharydy — stosunkowo dobrze wówczas znane organiczne polimery. Jego zamiarem było stosowanie tej samej końcówki w przypadku biopolimerów. Dzięki użyciu liczebników w funkcji przedrostków słowo peptyd może być różnorodnie modyfikowane. W zależności od liczby reszt

2.1. Nazewnictwo peptydów aminokwasowych wchodzących w skład peptydu nazywa się je, dodając jako przedrostek właściwy liczebnik grecki: di-, tri-, tetra-, pentapeptyd itd. Zamiast przedrostków greckich można używać odpowiednich liczb, np. 10-peptyd, 15-peptyd itd., co ułatwia wymowę nazw szczególnie dużych peptydów, ponieważ liczebniki są czytane po polsku — dziesięciopeptyd, piętnastopeptyd itd. Peptydy zawierające poniżej 10 reszt aminokwasowych noszą nazwę oligopeptydów. Peptydy większe, do 100 reszt, nazywane sąpolipeptydami, a jeszcze większe — białkami, rzadziej — makropeptydarni. W zależności od budowy peptydy mogą być liniowe, rozgałęzione lub cykliczne. Cykliczny dipeptyd nosi nazwę 3,6-dialkilo-2,5-dioksopiperaz.yny (dawniej diketopiperazyna) (rys. 2.2). O RCH

NH

o Rys. 2 . 2 . 2,5-Dioksopiperazyna, cykliczny dipeptyd

Ze względu na dużą różnorodność peptydów, wynikającą z nieograniczonej praktycznie kombinacji (sekwencji) reszt aminokwasowych tworzących łańcuchy o różnej długości, szczególnego znaczenia nabiera nazewnictwo i zapis wzorów poszczególnych peptydów. W zapisie poziomym wzorów peptydowych przyjęto zasadę, zgodnie z którą reszta aminokwasu acylującego, tj. tego, którego grupa karboksylową bierze udział w tworzeniu wiązania peptydowego, znajduje się po lewej stronie łańcucha peptydowego, a reszta aminokwasu acylowanego, tzn. tego, którego grupa aminowa tworzy wiązanie peptydowe, znajduje się po prawej stronie wzoru. W tripeptydzie złożonym w kolejności z alaniny-leucyny-fenyloalaniny, zapisanym w skrócie jako Ala-Leu-Phe, alanina jest aminokwasem acylującym leucynę, leucyna jest acylowana przez alaninę, ale acyluje fenyloalaninę, a fenyloalanina jest aminokwasem acylowanym przez leucynę. W zapisie poziomym peptydu wyrażonym w postaci wzorów strukturalnych reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi grupy a - a m i n o w e , a - k a r b o ksylowe, wiązania peptydowe oraz atomy węgla a umieszcza się w jednej linii jako główny łańcuch peptydowy, reszty boczne zaś i inne grupy funkcyjne zapisuje się nad lub pod łańcuchem, bądź też w nawiasach na tym samym poziomie co łańcuch główny. Dla uproszczenia, zamiast wypisywania wszystkich atomów wchodzących w skład peptydu częściej używa się trójliterowych lub jednoliterowych symboli oznaczających reszty aminokwasowe, pamiętając, że po lewej stronie znajduje się aminokwas początkowy, tj. pierwszy acylujący, zwany N-terminalnym (z wolną grupą aminową), a na prawym końcu umieszczony jest ostatni aminokwas acylowany, zawierający wolną grupę karboksylową, czyli C-terminalny. Zapis taki czyta się od N-końca pamiętając, że peptyd jest acylowanym aminokwasem, tzn. każdy aminokwas poprzedzający oznacza acyl, np. alanina czytana jest alanylo, a walina — waliło itd., a ostatni zachowuje zwykłą nazwę aminokwasu. Poniższa nazwa oktapeptydu: walilo-alanylo-cysteinylo-glicylo-y-glutamylo-bf-lizylo-seiylo-glicyna

ilustruje tę zasadę. Odpowiada ona peptydowi, którego wzór przedstawiony jest na rysunku 2.3.

CH3 NH2CHCO—NHCHCO — NHCHCO—HNCH2CO—NHCHCOOH I I I CH(CH3)2 CH2SH (CH2)2 CO—NH(CH2)4CH(NH2)CO—NHCHCO—NHCH2COOH CH2OH Rys. 2 . 3 . Przykładowy oktapeptyd

Zapis tego oktapeptydu za pomocą trójliterowych symboli zajmuje znacznie mniej miejsca i wygląda następująco: 1 2

3

4

5

6

7

8

Val-Ala-Cys-Gly-y-Glu-£-Lys-Ser-Gly

Reszty aminokwasów w łańcuchu peptydowym często są numerowane, przy czym numerację rozpoczyna się od AMcońca, tak jak powyżej. W kodzie jednoliterowym zapis peptydów jest jeszcze krótszy, dla przykładowego oktapeptydu wygląda następująco: VACG-y-E-£-KSG

Kod jednoliterowy jest szczególnie chętnie używany przez biochemików do przedstawiania sekwencji polipeptydów i białek. Pozwala on na zapisanie w zwartej formie składu i sekwencji aminokwasowej białek złożonych nawet z kilkuset reszt aminokwasowych. Czasami do trójliterowych symboli końcowych reszt aminokwasów dodaje się symbol atomu wodoru — H i grupy hydroksylowej — OH odpowiednio do N- i C-końca, co odpowiada atomowi wodoru związanemu z atomem azotu wolnej grupy aminowej i grupie hydroksylowej wchodzącej w skład wolnej grupy karboksylowej, chociaż i bez tego jest oczywiste, że grupy te znajdują się w tych miejscach. Poniżej przedstawione są trzy równocenne wersje zapisu tego samego tripeptydu: HTyr-Val-PheOH = TyrValPhe = YVF

Zgodnie z zasadami nomenklatury IUPAC brak oznaczenia konfiguracji D, L lub DL przed symbolem reszty aminokwasowej, w tym również we wzorze peptydu, oznacza dla konkretnej reszty aminokwasu białkowego konfigurację białkową, czyli L. Reszty aminokwasów 0 konfiguracji D muszą przed symbolem aminokwasu zawierać literkę D, na przykład zapis Ala-D-Leu-Val oznacza, że alanina i walina mają konfigurację L, a leucyna D. Zwykle oznaczające konfiguracje litery D, L i DL zapisywane są mniejszą czcionką niż pozostałe litery tekstu. Dla aminokwasów białkowych o konfiguracji D stosuje się również zapis za pomocą małych liter zarówno w symbolice trój-, jak i jednoliterowej: oznaczenia „ala" 1 „a" są równoważne symbolowi D-Ala. We wzorach peptydów zawierających jedną lub więcej reszt aminokwasowych o konfiguracji mieszanej D i L (o udziale różnym od 1:1)

nie powinno się używać symbolu DL, ponieważ zarezerwowany jest on dla racematu lub mieszaniny racemicznej. W takim przypadku zalecane jest stosowanie przedrostka (prefiksu) ambo. Tak więc nierównomolowa mieszanina peptydów L-Ala-D-Val-Gly i L-Ala-L-Val-Gly powinna być zapisana Ala-ara£>oVal-Gly. Resztę aminokwasu o nieznanej konfiguracji poprzedza się przedrostkiem £ (ksi), np. £-Ala-Leu. Cyklopeptydy można zapisywać za pomocą trój- lub jednoliterowych symboli, zaznaczając kreskami układ cykliczny: -Pro-Phe-Phe-Val-Pro-A1 a-Phe-Prolub -Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Ala-Phe-Pro-

albo przez dodanie słowa cyklo napisanego kursywą przed nawiasem, w którym umieszczone są symbole określające sekwencję peptydu: cy/:/o(-Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe-Phe-Pro-)

Peptydy cykliczne można również zapisywać w dwóch lub więcej linijkach. W takich przypadkach należy zaznaczyć strzałką kierunek acylowania (wiązania peptydowego) —> dla — C O — N H — lub < - dla wiązania — H N — C O — (rys. 2.4). r-^ Pro

Phe

Phe

— Pro-*— Phe-*— Phe -

Val

Pro —

Ala -

Pro —

Rys. 2 . 4 . Zapis cyklicznego peptydu

Przedstawiony powyżej cyklopeptyd — antanamid, jest związkiem naturalnym występującym w bardzo małych stężeniach w muchomorze sromotnikowym. Jest on odtrutką na niektóre toksyny tego niebezpiecznego grzyba.

2.2. Synteza peptydów Od momentu wyizolowania peptydów z organizmów żywych, poznania ich roli oraz stwierdzenia, że białka — podstawowe składniki świata zwierząt i większości mikroorganizmów — są makropeptydarni, rozpoczęto prace zmierzające do otrzymywania syntetycznych peptydów na drodze chemicznej (przełom XIX i XX wieku). Początkowo były to próby bardzo nieudolne, a powstające produkty stanowiły niejednorodne, amorficzne kopolimery, będące trudnymi do zdefiniowania mieszaninami związków o różnej długości łańcuchów i nieokreślonym składzie. Dopiero po kilkudziesięciu latach intensywnych prac, po wprowadzeniu nowych i udoskonaleniu znanych procedur, a przede wszystkim po zastosowaniu selektywnego osłaniania na czas reakcji tych grup funkcyjnych, które nie biorą udziału w tworzeniu wiązania peptydowego (1932 r., M. Bergmann i L. Zervas), synteza peptydów o zdefiniowanym składzie i wielkości stała się czynnością rutynową, chociaż nadal, przez następne kilkadziesiąt lat, trudnym i skomplikowanym przedsięwzię-

ciem, możliwym do wykonania jedynie w specjalistycznych laboratoriach. Pierwsze syntetyczne peptydy (oksytocyna i wazopresyna, V. duVigneaud), które okazały się identyczne z substancjami wyizolowanymi z naturalnych próbek, tzn. wykazywały taką samą aktywność biologiczną, otrzymano dopiero w latach pięćdziesiątych dwudziestego wieku. Obecnie kilkadziesiąt peptydów produkuje się na skalę przemysłową, ponieważ znajdują ważne zastosowanie praktyczne. Duża skala w przypadku peptydów zwykle oznacza porcje kilogramowe, co w porównaniu z masową produkcją wielu związków organicznych, np. polistyrenu, jest skalą małą, jednak pod względem wartości często zbliżoną. Wiele katalogów oferuje setki standardowo wykorzystywanych peptydów (w katalogu Bachem z 2000 r. znajduje się oferta ponad 1500 takich peptydów), a syntezę innych wykonują na zamówienie firmy specjalizujące się w produkcji peptydów. O skali światowego zapotrzebowania na gotowe peptydy świadczy szybki wzrost ich komercyjnej wartości, szacowanej w 1987 roku na 4,5 • 109 USD, a która już w 1990 roku wzrosła o 35%, by w 1995 roku osiągnąć wartość 40 • 109 USD, przy czym 50% peptydów wytwarzano w tym czasie w USA, 30% w Europie Zachodniej i 20% w Japonii. Peptydem, którego produkuje się najwięcej (pod względem masy), jest aspartam — słodzik stosowany głównie do słodzenia niskokalorycznych napoi, a także służący jako namiastka cukru zalecana dla diabetyków i osób odchudzających się. Zapotrzebowanie na ten dipeptyd (ester metylowy L-aspartylo-L-fenyloalaniny) przekracza 4000 ton rocznie. W praktyce peptydy najczęściej wykorzystywane są do: - leczenia — zarówno ludzi, jak i zwierząt, - produkcji szczepionek, w których pełnią funkcję adiuwantów, czyli składników wzmacniających reakcję immunologiczną organizmu, - diagnostyki medycznej, - hodowli (hormony wzrostu wołowe, wieprzowe, łososiowe, tuńczykowe itp.), - studiów modelowych i porównawczych w różnorodnych badaniach chemicznych, biochemicznych, biologicznych i medycznych, - izolowania receptorów hormonów i innych związków czynnych. Peptydy można otrzymywać różnymi sposobami. Historycznie pierwszym sposobem ich otrzymywania była izolacja ze źródeł naturalnych. Przykładem może być insulina, którą do dziś na wielką skalę izoluje się z trzustki zwierząt rzeźnych. Tą samą drogą z drożdży otrzymuje się glutation. Później duże znaczenie zyskała chemiczna synteza peptydów i nadal odgrywa istotną rolę chociażby w produkcji oligopeptydów, np. wazopresyny, oksytocyny oraz ich analogów. Z czasem w produkcji peptydów coraz większe znaczenie zyskiwały procedury biotechnologiczne lub kombinowane, wykorzystujące zarówno procesy chemiczne, jak i biologiczne, a ostatnio zawrotną karierę robi inżynieria genetyczna, nazywana często techniką rekombinacyjną. Technika oparta na rekombinacji DNA polega na programowaniu i przekształcaniu żyjących organizmów, tak żeby stały się zdolne do produkowania potrzebnych substancji, w tym peptydów o określonym składzie. Początkowo do tego celu wykorzystywano mikroorganizmy lub izolowane komórki np. owadów. Obecnie stosuje się również inne organizmy, w tym nawet transgeniczne ssaki.

Technika samej syntezy chemicznej jest bardzo zróżnicowana; wyróżnia się syntezę klasyczną w roztworze i na nośniku stałym. Wybór sposobu otrzymywania peptydu zależy od wielu czynników, a do tych najważniejszych należy wielkość peptydu, skala syntezy, a także przewidywana częstotliwość powtarzania syntezy tego samego peptydu lub jego analogów. Chociaż przy podejmowaniu decyzji o wyborze sposobu otrzymywania peptydów dużą rolę odgrywają doświadczenie i preferencje eksperymentatora, przyjęto pewne uogólnienia, a nawet reguły. Syntezę klasyczną w roztworze wykorzystuje się najczęściej do otrzymywania krótkich peptydów (2-15 reszt AA), do syntez jednorazowych, a także do otrzymywania peptydów nietypowych. Procedura syntezy chemicznej na fazie stałej zalecana jest do produkcji peptydów średniej wielkości (1CM-5 reszt aminokwasowych) i do otrzymywania dużej liczby analogów. Technologię rekombinacji DNA stosuje się w produkcji długich peptydów (powyżej 30 reszt AA), szczególnie wówczas, gdy na określony produkt przewidywane jest wieloletnie, duże zapotrzebowanie. Pierwszym peptydem otrzymanym techniką rekombinacji DNA była ludzka insulina (HI, 1981r.). Na skalę przemysłową jej produkcja z wykorzystaniem inżynierii genetycznej rozpoczęła się już w 1982 roku. Obecnie koszty produkcji HI tym sposobem są porównywalne z kosztami izolacji insuliny wołowej czy wieprzowej. Przewiduje się, że w niedalekiej przyszłości insulina pochodzenia zwierzęcego zostanie całkowicie wyparta przez HI otrzymywaną za pomocą technologii rekombinacyjnej. Będzie to korzystne dla pacjentów, gdyż zarówno insulina wieprzowa, jak i wołowa, chociaż wykazują podobną aktywność, wywołują poważne reakcje alergiczne. Ludzki hormon wzrostu (somatotropina — ST) znalazł szerokie zastosowanie w terapii (nie tylko do leczenia karłowatości) wyłącznie dlatego, że jego produkcja stała się możliwa dzięki wykorzystaniu bakterii E. coli zawierających rekombinowane DNA. Metodą inżynierii genetycznej produkuje się wolową somatotropinę (bST). Została ona w niektórych krajach, w tym w USA, dopuszczona jako legalny środek zwiększający o 25% ilość wydzielanego mleka krowiego. Chociaż, jak stwierdzono, jej stosowanie jest bezpieczne dla krów oraz konsumentów, budzi ona protesty nie tylko wielu właścicieli farm mlecznych, ale i ośrodków ekologicznych. Kalcytonina, 32-peptyd, produkowana jest obecnie na skalę przemysłową klasyczną metodą chemiczną w roztworze. Jest to procedura złożona z setek takich etapów, jak zakładanie osłon, acylowanie, deprotekcje i oczyszczanie produktów pośrednich. Przypuszcza się, że zastosowanie inżynierii genetycznej do otrzymywania kalcytoniny pozwoli na 20-krotne obniżenie kosztów jej produkcji. Przygotowanie procedury wykorzystującej inżynierię genetyczną jest bardzo kosztowne i czasochłonne, jednak po jej dopracowaniu uzyskuje się wydajną i ekonomicznie korzystną metodę. Potwierdza to przykład produkcji wołowego lub wieprzowego hormonu wzrostu. Z jednego litra brzeczki fermentacyjnej otrzymuje się porcję około 20 g tych preparatów, przy czym koszt produkcji 1 g nie przekracza 1 USD. W tabeli 2.1 zostały wyszczególnione peptydy produkowane na skalę przemysłową za pomocą rekombinacji genów. Podana została równocześnie data rozpoczęcia produkcji i dane firm produkujących. Największymi osiągnięciami w zastosowaniu inżynierii genetycznej do produkcji peptydów na skalę przemysłową mogą pochwalić się przedsiębiorstwa amerykańskie. Synteza peptydów, zwana także reakcją tworzenia wiązania peptydowego, polega na utworzeniu wiązania amidowego pomiędzy grupą a-karboksylową jednego aminokwasu

T a b e l a 2 . 1 . Produkty farmaceutyczne produkowane przemysłowo za pomocą rekombinacji genów Rok rozpoczęcia produkcji

Nazwa produktu

Nazwa i siedziba producenta

1982

insulina ludzka

Lilly — Indianapolis; Genentech — San Francisco. USA

1985

ludzka somatotropina

Genentech — San Francisco, U S A

1986

interferon-«-2a

Hoffman-La Roche — Nutley, USA

interferon-a-2b

Schering-Plough — Madison; Biogen — Massachusetts, U S A

immunoglobina I g G ^ (muromonab CD3)

Ortho — Raritan, U S A

szczepionka przeciw Hepatatis

Merck — Darmstadt, RFN

B

1987

alteplaza (tkankowy aktywator plazminogenu)

Genentech — San Francisco, USA

1989

epoetyna (erytropoietin)

Amgen — Thousand Oaks, USA

intcrferon-3-n3

The Purduc Frcderic Co. — Norwalk, U S A

szczepionka przeciw Hepatitis 1990

B

SmithKline Beecham — Philadelphia, U S A

PEG-adenozyna

Enzon — Piscataway, U S A

interferon-y-lb

Genentech — San Francisco, USA

filgrastym G-CSF (czynnik stymulujący kolonie granulocytów)

Amgen — Thousand Oaks, USA

/5-glukoccrcbrozydaza

Cambridge, U S A

sargramostim (GM-CSF)

Hoechst Roussel — Kansas City; Immunex — Bothell, U S A

globulina przeciwhemofilowa (factor VIII)

Genetics Institute Inc. — Andover; Baxter — Round Lake, U S A

interleukina-2

Chiron — Emeryville, U S A

deoksyrybonukleaza (DNase)

Genentech — San Francisco, USA

globulina przeciwhemofilowa (factor VIII)

Gcnentcch — San Francisco; Miles — West Havcn, USA

1994

PEG-L-asparaginaza

Enzon — Piscataway, U S A

1996

interferon-/?-la

Biogen — Cambridge, USA

czynnik koagulacyjny IX

Genetics Institute Inc. — Andover, U S A

1991

1992

1993

a grupą a-aminową drugiego aminokwasu. Wiązanie amidowe może powstać w wyniku odwodnienia soli kwasu karboksylowego z aminą, na przykład acetamid powstaje z octanu amonu w trakcie termicznej dehydratacji: CH3C00H + NH3 — -

CH3C00" N H ;

>100°C

—CH3CONH

2

+ H2O

Metody tej nie można zastosować do syntezy peptydów, ponieważ w wysokiej temperaturze zarówno substraty, jak i produkt ulegają niepożądanym przemianom, w tym rozkładowi i racemizaeji. Syntezę peptydów trzeba konieczne prowadzić w łagodniejszych warunkach. Acetamid też można otrzymać w znacznie łagodniejszych warunkach, na przykład w reakcji octanu etylu z amoniakiem AcOEt + NH,

tcm P k

J

' ° » AcNH, + EtOH

tydzień

Wadą takiego sposobu otrzymywania amidów jest mała szybkość reakcji. Chociaż w reakcjach acylowania amoniaku lub amin ester alkilowy jest znacznie silniejszym odczynnikiem acylującym niż wolny kwas karboksylowy, nadal szybkość takiej reakcji w temperaturze pokojowej jest nie do przyjęcia. W celu jej przyspieszenia należy silniej zaktywować grupę karboksylową. Jednym ze sposobów aktywacji grupy karboksylowej jest przekształcenie jej w tak zwane estry aktywne, czyli pochodne karboksylowe zawierające grupę elektronoakceptorową, np. fenyloksylową, /?-nitrofenyloksylową czy pentachlorofenyloksylową. Jeszcze bardziej aktywne są bezwodniki. Natomiast znacznie silniejsza aktywacja, na przykład poprzez utworzenie chlorków kwasowych, jest w przypadku aminokwasów niekorzystna, ponieważ wywołuje ona szereg niepożądanych reakcji ubocznych. AcOPh + NH 3 AcOAc + NH 3

AcNH 2 + PhOH °tCh - AcNH 2 + AcOH

Dodatkową trudnością, jaką napotyka chemik podczas reakcji tworzenia wiązania amidowego pomiędzy cząsteczkami dwóch wolnych aminokwasów w celu otrzymania określonego dipeptydu, jest obecność w każdym z substratów co najmniej po jednej grupie aminowej i karboksylowej — w sumie w reakcji mogą brać udział co najmniej cztery grupy funkcyjne. Obie grupy aminowe mogą być acylowane przez obie grupy karboksylowe, a powstałe dipeptydy też mogą acylować i być acylowane, wobec czego produkt reakcji stanowi skomplikowaną mieszaninę. H 2 N — CHR' — CO — NH — CHR' — COOH + H 2 N — CHR — CO — NH — CHR' — COOH H 2 N — CHR — COOH + H 2 N — C H R ' — COOH

+ H 2 N — CHR' — CO — NH — CHR — COOH + H 2 N — CHR — CO — NH — CHR — COOH +

+ cyklo( HN — CHR — CO — NH — CHR — CO) + cyklo{ HN — CHR' — CO — NH — CHR — CO) + ....

Z powyższych równań wynika, że zamiast oczekiwanego dipeptydu, np. Gly-Ala, który powinien utworzyć się w reakcji glicyny z alaniną, powstają cztery dipeptydy: Gly-Gly, Gly-Ala, Ala-Ala oraz Ala-Gly, przy czym każdy z nich w reakcji z substratami daje osiem tripeptydów, a w reakcji między dipeptydami tworzą się tetrapeptydy, a potem dalsze pochodne, w rezultacie czego powstaje skomplikowana mieszania liniowych i cyklicznych oligopeptydów:

Gly + Ala

Ala-Ala + Gly-Ala + Ala-Gly + Gly-Gly + Gly-Gly-Ala + Gly-Ala-Gly + + Gly-Gly-Ala-Gly + cyklo(- Ala-Ala-) + cyklo(-G ly-Ala-) +

W celu wymuszenia reakcji w kierunku pożądanych produktów należy ochronić na czas reakcji te grupy funkcyjne, które nie powinny brać udziału w tworzeniu wiązania peptydowego, tzn. na czas reakcji należy osłonić grupę aminową aminokwasu acylującego i grupę karboksylową aminokwasu acylowanego X-NH-CHR-COOH + H 2 N-CHR'-COOY

aktywacja

» X-NH-CHR-CO-NH-CHR'-COOY

przy czym X oznacza osłonę grupy aminowej, a Y — osłonę grupy karboksylowej. W przypadku syntezy dipeptydu Gly-Ala schemat reakcji wygląda następująco: X-Gly + Ala-Y

aktywacja

> X-Gly-Ala-Y

Po reakcji obie osłony trzeba usunąć, jeżeli celem syntezy był wolny peptyd: X-Gly-Ala-Y

»

Gly-Ala

lub tylko jedną z nich, jeżeli otrzymany peptyd był tylko produktem pośrednim i będzie poddawany dalszym reakcjom, na przykład przyłączeniu kolejnego aminokwasu X-Gly-Ala-Y

~X

•» G l y - A l a - Y

X-Gly-Ala-Y

_y

- X-Gly-Ala

Aminokwasy z chronioną grupą aminową czy też karboksylową tracą charakter soli wewnętrznej, a przez to zdecydowanie zmieniają właściwości fizykochemiczne i chemiczne. Aminokwas z chronioną grupą aminową staje się kwasem, a z chronioną grupą karboksylową, jako amina, wykazuje właściwości zasadowe. Pochodne takie najczęściej tracą właściwości hydrofilowe, a przy tym pogarsza się ich rozpuszczalność w wodzie, natomiast zwykle stają się dobrze rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych. Planując syntezę dowolnego peptydu, należy brać pod uwagę konieczność osłaniania nie tylko nie biorących udziału w reakcjach funkcji aminowych i karboksylowych, ale również bocznych grup funkcyjnych. Pamiętając o tym, syntezę peptydu można prowadzić według zasady minimum lub maksimum osłon. Zasada minimum osłon zakłada ochranianie jedynie najbardziej reaktywnych grup funkcyjnych, tj. grapy aminowej, karboksylowej, a także tiolowej i guanidynowej. Inne grapy funkcyjne mogą być nieosłonięte, mimo że istnieje prawdopodobieństwo ograniczonych reakcji z nimi, a przez to tworzenia się produktów ubocznych. Zasada maksimum osłon zakłada osłanianie wszystkich grap funkcyjnych. Takie postępowanie ma na celu wyeliminowanie wszelkich możliwości niepożądanych reakcji ubocznych.

2.2.1. Peptydowe osłony grup funkcyjnych — grupy ochronne Nie każda osłona grap funkcyjnych jest przydatna w syntezie peptydów. Osłona stosowana w syntezie peptydów powinna spełniać następujące warunki: - procedury jej wprowadzania i usuwania muszą być łatwe, wydajne i selektywne;

2.2. Synteza peptydów - w trakcie jej wprowadzania i usuwania nie mogą zachodzić reakcje uboczne, w tym racemizacja, a także rozrywanie wiązania peptydowego; - zapewniać możliwość kompletnego jej usunięcia w dowolnym etapie syntezy, również w końcowym preparacie, ponieważ niecałkowite usunięcie osłon nie tylko obniża czystość chemiczną związku, ale istotnie wpływa na aktywność biologiczną końcowego produktu (najczęściej dezaktywująco); - zapewniać stabilność osłon grup bocznych w przypadku wielokrotnie powtarzających się etapów tworzenia wiązania peptydowego i deprotekcji, co jest szczególnie istotne przy syntezie dłuższych peptydów; - zapewniać dobrą rozpuszczalność chronionego aminokwasu i peptydu; - wpływać na podwyższanie aktywności komponenta acylującego i nukleofilowości składnika acylowanego; - w przypadku występowania w aminokwasie lub peptydzie dwóch lub więcej takich samych grup funkcyjnych powinna istnieć możliwość ich selektywnej ochrony i deprotekcji; - powinna istnieć możliwość selektywnego lub równoczesnego usuwania wszystkich osłon w końcowym, chronionym peptydzie. Jak istotne są podane wyżej warunki świadczy przykład drastycznego obniżenia aktywności biologicznej końcowego peptydu w wyniku jego niekompletnej deprotekcji. Syntetyczna rybonukleaza A (białko złożone ze 124 reszt aminokwasowych), z której w wyniku trudności w przeprowadzeniu całkowitej deprotekcji usunięto jedynie 93% osłon, wykazywała zaledwie 70% aktywności biologicznej białka natywnego. Przedstawione powyżej wymagania dotyczące osłon peptydowych są niezwykle trudne do spełnienia, czasami wręcz wzajemnie wykluczające się, dlatego mimo że opisano setki różnych osłon peptydowych, tylko kilkanaście z nich znalazło powszechne zastosowanie i nadal trwają poszukiwania nowych, lepszych ugrupowań ochronnych. Dotychczas zaproponowano ponad 200 osłon grupy aminowej, około 70 osłon grupy tiolowej i znacznie mniej, bo po kilkanaście osłon grup karboksylowej, hydroksylowej, guanidynowej i imidazolowej.

2.2.1.1. Przykłady peptydowych osłon grup funkcyjnych aminokwasów a) grupy aminowej (rys. 2.5) b) grupy karboksylowej: metyl (OMe): —O—CH 3

etyl (O-Et): —O—CH 2 CH 3

ten-butyl (O—f-Bu): —O—C(CH 3 ) 3

benzyl (O-Bzl): —O—CH 2 —Ph

/>nitrobenzyl (ONBzl): 0 2 N — C 6 H 4 — C H 2 0 — c) grupy hydroksylowej: benzyl (Bzl); r-butyl (/-Bu); acetyl (Ac); trimetylosilil: (CH 3 ) 3 Si— d) grupy tiolowej: benzyl (Bzl—); acetamidometyl: AcNH—CH 2 —; r-butyl (?-Bu)

92

ch3

O -CH2-0-C-

.0

o HC.

H3C-C-0-C-

benzyloksykarbonyl, Z (Cbo, Cbz)

\

C^ II O

CH3 r-butyloksykarbonyl, Boc

ftalil, Pht

formyl, CHO

H3CO H3c-4

^ S 0

2

O

-

CH9-O-CH2C-O-CII o

H3CO

fluorenylo-9-metoksykarbonyl, Fmoc

/>toluenosulfonyl

(tosyl), Tos

3,5-dimetoksybenzyloksykarbonyl, Z(OMe)

Rys. 2.5. Wybrane osłony grupy aminowej

e) grupy imidazolowej: benzyl (Bzl); r-butyloksykarbonyl (Boc); formy 1 (CHO); benzyloksymetyl (Bom); p-toluenosulfonyl (Tos); 9-fluorenylometoksykarbonyl (Fmoc) f) grupy guanidynowej: grupa nitrowa ( N 0 2 ) ; p-toluenosulfonyl (Tos); 2,2,5,7,8-pentametylochromiano-6-sulfonyl (Pmc); benzyloksykarbonyl (Z, Cbz); /7-metoksybenzenosulfonyl (Mbs); 4-metoksy-2,3,6-trimetylobenzenosulfonyl (Mtr). 2.2.1.2. Ostony grupy aminowej 2.2.1.2.1. Osłona benzyloksykarbonylowa — Z (Cbo, Cbz) odegrała niezwykle istotną rolę w rozwoju chemii peptydów i nadal obok ugrupowań Boc i Fmoc, również należących do osłon typu uretanowego, zaliczana jest do najważniejszych i najczęściej stosowanych osłon peptydowych. Zastosowanie jej w 1932 roku do syntezy peptydów umożliwiło po raz pierwszy otrzymywanie syntetycznych peptydów w łagodnych warunkach. Grupę tę nazwano w skrócie Z na cześć jej odkrywcy — Zervasa. Przełomowe znaczenie osłony Z w chemii peptydów polegało na możliwości usuwania jej z otrzymanego peptydu na drodze wodorolizy, a więc w bardzo łagodnych warunkach, zachowawczych dla wiązania peptydowego. Osłonę Z wprowadza się na grupę aminową najczęściej w znanej reakcji Schottena-Baumanna polegającej na reakcji aminokwasu z chloromrówczanem benzylu w środowisku zasadowym H+

NaOH

BzlOCOCl + H 2 NCHRCOOH

hqh

- Z-NHCHROONa

• Z-NHCHRCOOH

Chloromrówczan benzylu, często oznaczany symbolem ZC1, otrzymuje się w reakcji alkoholu benzylowego z fosgenem. Do wprowadzania osłony Z zamiast chloromrówczanu benzylowego można stosować tzw. estry aktywne, np. węglan benzylowo-p-nitrofenylowy — BzlOCO — O — p-N02C6H4.

Grupę Z można odszczepić przez: - katalityczną wodorolizę: Z-NHR — H ł / P d - H 2 NR + C 0 2 + toluen

- redukcję sodem w ciekłym amoniaku: Z

-

N H R

NH^lic,

'

H 2 NR+(Bzl) 2

- acydolizę bromowodorem w kwasie octowym: Z-NHR

HBr/Ac

° H » [H3N+R]Br~ + Bzl Br + C 0 2

- działanie ciekłego fluorowodoru. Najbardziej zachowawczym sposobem usuwania grupy Z jest katalityczna wodoroliza. Oprócz podatności na usuwanie w łagodnych warunkach osłona ta wykazuje wiele innych pożądanych cech. W większości przypadków zabezpiecza aminokwasy acylujące przed racemizacją w trakcie aktywacji grupy karboksylowej. Osłona Z jest umiarkowanie odporna na działanie środowiska zasadowego. Produkowane na dużą skalę Z-chronione aminokwasy są powszechnie dostępne w handlu. Znanych jest szereg osłon zbliżonych budową do grupy Z. Różnią się one od klasycznej osłony Z obecnością w pierścieniu aromatycznym takich podstawników jak Cl—, Br—, M e O — czy N 0 2 — . Modyfikacje te mają na celu zmianę właściwości chemicznych i fizycznych, w tym przede wszystkim zwiększenie tendencji pochodnych do krystalizacji, a także zwiększenie lub zmniejszenie podatności na acydolizę. 2.2.1.2.2. Osłona t-butyloksykarbonylowa — Boc, obok takich osłon jak Fmoc i Z, jest najczęściej stosowaną grupą ochronną w syntezie peptydów. Obecnie Boc-pochodne popularnych aminokwasów są komercyjnie dostępne i należą do półproduktów wytwarzanych na dużą skalę z przeznaczeniem do otrzymywania peptydów, szczególnie w syntezie na nośniku stałym. Najpopularniejszym odczynnikiem stosowanym do wprowadzenia osłony Boc jest pirowęglan di-f-butylowy. NaOH

(CH3)3COCOOCOOC(CH3)3 + H 2 N-CHRCOOH - j j o ^ Boc-NH-CHRCOONa + (CH)3COH + C 0 2

Do otrzymywania Boc-aminokwasów można również stosować azydek f-butyloksykarbonylowy, jednak odczynnik ten ma już raczej historyczne znaczenie z uwagi na wydzielanie się toksycznego kwasu azotowodorowego w trakcie jego reakcji z aminokwasami. Opisano również przypadki groźnych wybuchów w czasie destylacji tego odczynnika. Do wprowadzania osłony Boc używa się także fluorku f-butoksykarbonylowego i tiowęglanu r-butylo-5'-2(4,6-dimetylopirymidylowego). Osłona Boc jest trwała w środowisku zasadowym, łatwo natomiast ulega odszczepieniu w warunkach acydolitycznych. Do najczęściej używanych odczynników odszczepiających grupę Boc należą: - kwas trifluorooctowy (Tfa), - roztwór chlorowodoru w kwasie octowym, dioksanie, eterze lub w innych rozpuszczalnikach organicznych,

- roztwór bezwodnego kwasu p-toluensulfonowego w rozpuszczalnikach organicznych, na przykład w octanie etylu. W latach 90. XX w. opracowano selektywną procedurę usuwania osłony Boc w obecności estrów f-butylowych, które są podobnie wrażliwe na warunki acydolityczne. Pod wpływem bezwodnego chlorowodoru w octanie etylu osłona Boc ulega odszczepieniu w ciągu 10 minut, a ester r-butylowy jest w tych warunkach trwały godzinami. W trakcie usuwania grupy Boc z peptydów zawierających His, Trp lub Met może dochodzić do r-butylowania ich bocznych grup funkcyjnych. W celu zabezpieczenia się przed tą niepożądaną reakcją uboczną należy podatne na nią aminokwasy zabezpieczyć odpowiednimi osłonami lub stosować odczynniki odszczepiające takie jak eterat trifluorku boru, 98-procentowy kwas mrówkowy czy kwas 2-sulfanyloetanosulfonowy. Skutecznym zabezpieczeniem przed f-butylowaniem wrażliwych aminokwasów jest dodatek do środowiska reakcji nadmiaru odczynników wiążących karbokation £-butylowy, tzw. wymiataczy (ang. sccwengers), do których należą przede wszystkim tiole, ulegające łatwo reakcji z karbokationami. 2.2.1.2.3. Osłona fluorenylometoksykarbonylowa. Duże znaczenie jako osłona peptydowa zyskała — Fmoc, należąca również, jak dwie poprzednie, grupa fluorenylometoksykarbonylowa do osłon typu uretanowego. Grupa Fmoc różni się jednak zdecydowanie właściwościami od Boc i Z, ponieważ jest znacznie odporniejsza na acydolityczne odszczepienie, natomiast jest nietrwała w środowisku zasadowym. Osłonę Fmoc usuwa się za pomocą drugorzędowych amin, przy czym najczęściej do tego celu stosuje się piperydynę lub dimetyloaminę. Ugrupowanie Fmoc, podobnie jak Z, jest wrażliwe na katalityczną redukcję. Odczynnikami stosowanymi do wprowadzania tej osłony jest chloromrówczan fluorenylometylowy — Fmoc-Cl, lub węglan 9-fluorenylometylowo-Af-sukcynoimidylowy. Pochodne Fmoc znajdują duże zastosowanie w syntezie peptydów na nośnikach stałych. 2.2.1.2.4. Osłona ftalilowa. Zaletą osłony ftalilowej — Pht, jest brak atomu w o d o m przy chronionej grupie aminowej, przez co osłona ta dodatkowo zabezpiecza funkcję aminową przed reakcjami ubocznymi z udziałem wodoru. Pht różni się od innych osłon peptydowych jeszcze tym, że jest szczególnie podatna na hydrazynolizę i właśnie w ten sposób jest najczęściej usuwana. Niewątpliwą wadą grupy Pht jest znaczna podatność A^-ftaliloaminokwasów na racemizację. Pochodne ftalilowe otrzymuje się przez stapianie aminokwasów z bezwodnikiem ftalowym lub w warunkach łagodniejszych, w wyniku reakcji aminokwasów z karboetoksyftalimidem, tzw. odczynnikiem Nefkensa. W praktyce odczynnik ten nie zawsze jest skuteczny. 2.2.1.2.5. Osłona tosylowa — Tos, jest niezwykle odporna na hydrolizę, zarówno kwasową, jak i zasadową. Stosuje się ją między innymi do ochrony grupy guanidynowej argininy. Osłonę Tos wprowadza się za pomocą chlorku /?-toluenosulfonowego — TosCl (chlorku tosylu), a usuwa przez działanie ciekłego fluorowodoru lub kwasu trifluorometanosulfonowego w obecności fenolu, a także przez redukcję sodem w ciekłym amoniaku.

2.2.1.2.6. Osłona formylowa. Spośród wielu typowych grup acylowych na uwagę zasługuje formyl — C H O , ponieważ znajduje zastosowanie, chociaż ograniczone, w syntezie peptydów. Grupa acetylowa — Ac i benzoilowa — Bz, mimo że są stosowane w chemii peptydów, nie są zaliczane do osłon peptydowych, ponieważ ich usuwanie powoduje hydrolizę wiązania peptydowego, a na dodatek aminokwasy chronione tymi grupami są bardzo podatne na racemizację. Osłonę formylową wprowadza się za pomocą kwasu mrówkowego, a usuwa w warunkach alkoholizy, na przykład działając roztworem chlorowodoru lub kwasu /?-toluenosulfonowego w etanolu. Gdy w peptydzie, z którego usuwamy osłonę formylową, znajdują się ugrupowania estrowe, wówczas jako rozpuszczalnika kwasu należy użyć alkoholu identycznego z resztą tworzącą ester. W przeciwnym przypadku istnieje niebezpieczeństwo transestryfikacji. CHO-Asn-OEt

HCl

F.nH

- HCl • Asn-OEt;

CHO-Phe-OBzl

TosOH

.

- TosOH • PheOBzl

2.2.1.2.7. Osłona fenyloacetylowa. Na specjalną uwagę zasługuje osłona fenyloacetylowa PhAc (C 6 H 5 CH 2 CO—), która chociaż jest typową osłoną acylową, ma zastosowanie w chemii peptydów ze względu na możliwość usuwania jej w łagodnych warunkach za pomocą enzymu zwanego acyłazą penicylinową. Ta cecha PhAc pozwala na jej selektywne odszczepienie w obecności wielu innych osłon, chroniących zarówno grupę aminową, np. Z, Boc, Fmoc czy CHO, jak i karboksylową, typu Me, Et, Bzl, f-Bu. Można również selektywnie usuwać te osłony w obecności reszty PhAc. Przykłady: PhAc-Thr-Ala-O-fBu

acylaza

^

H-Thr-Ala-O-r-Bu

75%

penicylinowa

PhAc-Phe-Leu-OBzl

H, / P d - C MeOH — P h A c - P h e - L e u - O H

99%

Podobnie jak w przypadku innych acylowych osłon grupy aminowej, reakcjom syntezy peptydów z udziałem składowej acylującej chronionej grupą fenyloacetylową towarzyszy kilkuprocentowa racemizacja. Racemizację taką obserwuje się nawet w obecności dodatków antyracemizacyjnych. Trzeba sobie zdawać z tego sprawę, ponieważ produkty takich reakcji, szczególnie przeznaczone do celów farmakologicznych lub nawet do badań biologicznych, nie mogą zawierać żadnych domieszek, w tym stereoizomerów. Muszą być starannie oczyszczone. Zanieczyszczenie diastereoizomerem zostaje często usunięte w wyniku krystalizacji. 2.2.1.2.8. Osłona 3,5-dimetoksybenzyłoksykarbonyłowa. Duże znaczenie, z uwagi na możliwość usuwania za pomocą fotolizy ma osłona 3,5-dimetoksybenzyłoksykarbonyłowa — Z(OMe) i jej analogi. Tego typu osłony w warunkach bardzo łagodnych, tj. pod wpływem światła, zostają selektywnie usunięte wobec wielu innych osłon. 2.2.1.3. Ostony grupy karboksylowej 2.2.1.3.1. Ester benzylowy. Jedną z najważniejszych osłon grupy karboksylowej jest reszta benzyłowa — Bzl. Jej uprzywilejowana pod tym względem pozycja wynika zarówno

z prostych metod otrzymywania estrów benzylowych, jak i z zachowawczych sposobów jej usuwania, tj. za pomocą: - hydrogenolizy katalitycznej, - hydrolizy zasadowej, - acydolizy, na przykład za pomocą bromowodoru w kwasie octowym, - działania fluorowodoru, - działanie sodem w ciekłym amoniaku. Acydoliza estra benzylowego zachodzi oporniej niż grupy Z. Elektroujemna grupa w pierścieniu aromatycznym w położeniu orto lub para, np. nitrowa, zwiększa trwałość osłony benzylowej na acydolizę, a elektrododatnia, na przykład metoksylowa, ułatwia jej usuwanie tą drogą. Najczęściej stosowana procedura otrzymywania estrów benzylowych polega na ogrzewaniu aminokwasu z alkoholem benzylowym w obecności kwasu p-toluenosulfonowego z równoczesnym azeotropowym usuwaniem wody TosOH

Ala + BzlOH

- H O H , benzen"

TosOH • AlaOBzl

86%

W podobny sposób, stosując alkohol p-nitrobenzylowy, można otrzymać sole estrów p-nitrobenzylowych (NBzI). Wydajności tych reakcji wahają się w granicach 80-90%. Często otrzymywane w ten sposób estry są w znacznym stopniu zanieczyszczone trudnymi do usunięcia przez krystalizację tosylanami wolnych aminokwasów. Najlepszy sposób ich oddzielenia polega na rozpuszczeniu produktu w wodzie, doprowadzeniu pH roztworu do wartości 9 za pomocą wodorowęglanu potasu i wyekstrahowaniu wolnych estrów do niemieszającego się z wodą rozpuszczalnika organicznego, np. chloroformu czy octanu etylu. Po osuszeniu roztworu i odparowaniu rozpuszczalnika aminoestry są wystarczająco czyste, żeby je użyć do otrzymywania peptydów. Estry benzylowe i p-nitrobenzylowe N-chronionych aminokwasów można również otrzymać w reakcji tych ostatnich z odpowiednimi halogenkami w obecności III-rzędowych amin, np. trietyloaminy Boc-Val + 0 2 NC 6 H 4 CH 2 Br

^

- Boc-Val-ONBzl + Et 3 N • HBr

90%

Wygodną procedurą otrzymywania estrów aminokwasów, w tym estrów benzylowych, jest alkilowanie grupy karboksylowej aminokwasu, którego grupa aminowa została na czas reakcji ochroniona za pomocą acetylooctanu etylu (Eaa). Po otrzymywaniu estru grupę aminową uwalnia się w łagodnych warunkach, na przykład poprzez dodanie do roztworu stechiomerycznej ilości kwasu p-toluenosulfonowego. Pierwszy etap reakcji, tj. chronienie grupy aminowej, prowadzony techniką PTC (ang. phase transpher catalysis) biegnie niezmiernie szybko i ilościowo. Powstający produkt w odróżnieniu od wolnych aminokwasów jest łatwo rozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych, a jego grupa karboksylową staje się bardziej podatna na alkilowanie, które przeprowadza się bez wcześniejszego wyodrębniania N-chronionego aminokwasu. KOH / K , C O , , A, 15 min

CH3COCH2COOC2H5 + Leu

bcn7;n/pMS0

1. BzlBr. 50" C, 15 min

» Eaa—LeuOH2

TosOH 20min

» TosOH• LeuOBzl 81%

2.2.1.3.2. Ester t-butylowy (t-Bu), obok benzylowych, należy do najważniejszych peptydowych osłon grupy karboksylowej aminokwasów. Obie te osłony różnią się tak bardzo właściwościami, że idealnie nadają się do selektywnej ochrony grup karboksyłowych. W odróżnieniu od osłony benzylowej, estry r-butylowe nie ulegają hydrogenolizie i są bardzo stabilne w środowisku zasadowym, natomiast ulegają łatwo odszczepieniu pod wpływem kwasów, nawet średniej mocy. Najczęściej stosowanymi odczynnikami do usuwania grupy f-butylowej są, podobnie jak w przypadku eliminacji grupy Boc, kwas trifluorooctowy (Tfa) lub jego roztwory w rozpuszczalnikach organicznych oraz roztwór chlorowodoru w kwasie octowym, eterze czy chloroformie. Oczywiście ugrupowanie estrowe t-Bu, podobnie jak Boc, jest usuwane także pod wpływem HBr/AcOH, HF i roztworów TosOH. Zarówno estry f-butylowe, jak i osłona Boc są odporne na hydrogenolizę, aminolizę i hydrazynolizę. Osłonę Boc można usunąć selektywnie wobec estrów r-bu tyłowych poprzez działanie chlorowodorem w octanie etylu. Estry r-butylowe otrzymuje się najczęściej w reakcji wolnych aminokwasów z izobutylenem w obecności kwasu siarkowego Leu + CH 2 = C(CH3)2

H,SO, c h c,2

- H 2 S0 4 • LeuO-/-Bu

65 %

Bardzo wygodnym sposobem otrzymywania estrów f-butylowych aminokwasów jest reakcja wolnego aminokwasu z octanem r-butylu w obecności kwasu nadchlorowego, w czasie której zachodzi transestryfikacja, czyli przeniesienie reszty r-butylowej z octanu na grupę karboksylową aminokwasu. Octan r-butylu bierze udział w tej reakcji nie tylko jako odczynnik, ale pełni również funkcję rozpuszczalnika, ponieważ w celu uzyskania dobrych wydajności musi być używany w nadmiarze. Ten sposób otrzymywania estrów r-butylowych stosuje się w przypadku tylko tych aminokwasów, których nadchlorany są trudno rozpuszczalne w octanie r-butylu i krystalizują w trakcie reakcji. Phe + AcO-/-Bu

HCIO, A c 0 _,_ B u »

HC104• PheO-/-Bu

95%

Na uwagę zasługuje fakt wprowadzenia osłony r-butylowej do chemii peptydów przez grupę chemików Politechniki Gdańskiej kierowaną przez Emila Taschnera — ojca polskich chemików peptydowych i jednego ze światowych twórców tej dziedziny chemii. 2.2.1.3.3. Estry metylowy (-Me) i etylowy (-Et) są również stosowane do osłony grupy karboksylowej w syntezach peptydów. Otrzymuje się je najczęściej w reakcji bezpośredniej estryfikacji aminokwasów odpowiednim alkoholem w obecności kwasowego katalizatora, np. chlorowodoru. Zamiast gazowego chlorowodoru można użyć chlorku tionylu, ponieważ w wyniku jego reakcji z alkoholem wytwarza się chlorowodór. Większość aminokwasów jest nierozpuszczalna w alkoholach, ale w obecności silnego kwasu mieszana zawiesina aminokwasu w alkoholu stopniowo ulega przemianie na przykład w rozpuszczalny chlorowodorek jeszcze przed utworzeniem estru. Często obserwuje się ponowne wytrącanie osadu, tym razem produktu, ponieważ chlorowodorki wielu estrów metylowych są trudno rozpuszczalne w metanolu. Leu + MeOH

SOCl,

' » HCl • LeuOMe

85 %

Estry metylowe i etylowe aminokwasów można również łatwo otrzymać, podobnie jak estry benzylowe, poprzez alkilowanie aminokwasu czasowo Af-chronionego, na przykład osłoną Boc lub ugrupowaniem powstającym w wyniku reakcji z acetylooctanem etylu (Eaa). Wydajności tej procedury są rzędu 70-80%. Na uwagę zasługuje otrzymywanie monoestrów kwasu glutaminowego lub asparaginowego. a>-Estry tych aminokwasów powstają w typowej procedurze estryfikacji alkoholem etylowym lub metylowym w obecności chlorowodoru lub chlorku tionylu. Protonowane w tych warunkach grupy aminowe utrudniają estryfikację grup a-karboksylowych. Natomiast a-estry tych aminokwasów najłatwiej otrzymuje się w wyniku alkilowania moT a b e l a 2 . 2 . Zasady usuwania grup ochronnych Osłony grupy N H 2 Odczynnik

Warunki reakcji

CHO

Pht

Z

Boc

Osłony grupy COOH Fmoc

+!

-

+!

+

a

+

-

-

+

+

-

a

-

-

+!

-

-

+!

-

-

+!

-

-

H 2 /Pd

RT, ROH lub AcOH; H-,0/HCl

a

HBr

w AcOH; MeNO, 10-20 min, RT

a

HC1 IM

ROH, 24 h, RT lub 1 h, BP

+!

-

HC1 10M

H 2 0/aceton; H.,0/dioksan, 1 h, BP

+

Tfa

50-100%, 20 min, 0°C

TosOH IM

ROH, 24 h, 0°C lub 3 h RT

KOH lub NaOH IM

ROH lub aceton, 2 h, 0°C

NH2NH2 IM

-

+

OMe

-

O-t-Bu

-

OBzl +!

Wiązanie ONBzl peptydowe +!

-

-

+

a

a

+

r.u.

r.u.

+

+

+

+

a

+!

-

-

-

a

-

-

-

-

r.u.

-

-

r.u.

+!

-

+

+

-

ROH, 2h, BP lub 1 - 2 dni, RT

a

+!

-

-

r.u.

a

-

a

a

-

Sód

ciekły NH 3

-

r.u.

+

-

+

r.u.

-

+

+

-

Me 2 NH,

15 min, 50% w CH 2 C1 9 , RT

+!

-

-

-

-

-

piperydyna Ciekły H 2 F 2

15 min, RT

+

-

+

+

+

-

H

-

-

-

-

-

-

+

+

osłona zostaje usunięta; +! — zalecany sposób usuwania osłony;

osłona zostaje zachowana; a — osłona na ogól zostaje zachowana, jednak

istnieje możliwość c z ę ś c i o w e g o odszezepienia lub reakcji ubocznej; r.u. — reakcja uboczna; RT — temperatura pokojowa: BP — temperatura wrzenia; ROH — alkohol

nosoli //-chronionego aminokwasu. W takim układzie //-chroniona grupa aminowa czyni grupę a-karboksylową podatniejszą na alkilowanie — zwiększa elektrofilowość karbonylowego atomu węgla. HOOCCH 2 CH 2 CHCOOH + MeOH

HC1

» MeOOCCH 2 CH 2 CHCOOH

I

I +

NH 2 Et N

Boc-Asp + EtBr

^

» Boc-Asp-O-Et —

Tfa

NH3Cr

• Tfa • Asp-O-Et

Stosowanie estrów metylowych i etylowych aminokwasów w syntezie peptydów jest ograniczone z uwagi na problemy z ich usuwaniem. Jedynym praktycznym sposobem deprotekcji nie naruszającym wiązania peptydowego jest alkaliczna hydroliza, która stwarza jednak duże niebezpieczeństwo reakcji ubocznych, w tym racemizacji. O ile taką operację, prowadzoną ostrożnie w obniżonej temperaturze, można wykonać bez wyraźnej racemizacji w przypadku krótkich peptydów, o tyle w przypadku peptydów dłuższych taka hydroliza staje się bardzo ryzykowana. W tabeli 2.2 zestawiono sposoby usuwania najpopularniejszych osłon peptydowych. Znajomość warunków usuwania poszczególnych grup ochronnych ułatwia ich dobór na etapie przygotowywania substratów, dzięki czemu zarówno w trakcie syntezy, jak i po jej zakończeniu możemy grupy ochronne usuwać w zależności od potrzeb.

2.2.2. Metody tworzenia wiązania peptydowego 2.2.2.1. Metoda karbodiimidowa (DCC) Zaproponowana w 1955 roku przez Sheehana i Hessa synteza peptydów za pomocą dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) (rys. 2.6) szybko zyskała uznanie ze względu na to, że jest nieskomplikowana. Niebagatelne znaczenie ma też niski koszt DCC. Standardowa synteza peptydów z użyciem DCC polega na rozpuszczeniu substratów, tj. N-chronionego aminokwasu, C-chronionego aminokwasu oraz aminy w przypadku użycia aminoestru w postaci soli, a następnie dodaniu DDC. W trakcie reakcji obserwuje się wypadanie z roztworu trudno rozpuszczalnego produktu towarzyszącego, jakim jest dicykloheksylomocznik (DCU). Wadą tej metody jest tworzenie się produktu ubocznego — //-acylomocznika (w poniższym przykładzie jest to Ac-Phe-DCU), którego wydajność w zależności od warunków reakcji i budowy substratów może sięgać do kilkudziesięciu procent, oraz racemizacja (wyrażana na przykład w postaci stopnia epimeryzacji E) komponentu acylującego, która w przypadku chronienia aminokwasów osłonami acylowymi może stanowić poważny problem. Ac-Phe + Leu-OMe Y:

PCC

* Ac-Phe-Leu-OMe + Ac-D-Phe-Leu-OMe + Ac-Phe-DCU + DCU 54% 7% 17% £=11%

Y = wydajność E (stopień epimeryzacji) =

Y

—

100

O NH-C-NH

N=C=N

dicykloheksylokarbodiimid (DCC)

dicykloheksylomocznik (DCU)

Ph — CH 9 I ~ AcNH-CH-C=0 O NH-C-N

jV-acylomocznik (acetylofenyloalanylomocznik) Rys. 2 . 6 . Otrzymywanie dipeptydu metodą DCC z uwzględnieniem produktów ubocznych: epimerycznego dipeptydu i acylomocznika

W reakcjach syntezy peptydów zamiast wolnych aminoestrów można stosować ich sole, dodając do środowiska reakcji zasady, np. III-rzędowej aminy. Procedura taka jest wygodniejsza, omija się bowiem etap uwalniania aminoestm z soli, ale powoduje jednak znaczny wzrost stopnia epimeryzacji. Aminami najczęściej stosowanymi do uwalniania aminoestrów z ich soli są trietyloamina i N-metylomorfolina. Ac-Phe + HC1 • Leu-OMe Y:

pcc Et3

'

^ Ac-Phe-Leu-OMe + Ac-D-Phe-Leu-OMe + Ac-Phe-DCU

61%

23%

E

8%

= 27%

Najpopularniejszymi rozpuszczalnikami używanymi w syntezie peptydów metodą DCC są: CH 2 C1 2 , CHC13, dioksan, CH 2 C1 2 /DMF i DMF. Najmniej reakcji ubocznych obserwuje się w reakcjach prowadzonych w CH2C12, jednakże nie wszystkie substraty rozpuszczają się w nim. Dlatego w przypadku pracy z trudniej rozpuszczalnymi substratami, np. Boc-Arg(Tos), należy stosować mieszaninę chlorku metylenu z DMF, a w ostatecznym przypadku sam DMF. Przy pracy z DCC należy zachować daleko posuniętą ostrożność z uwagi na często obserwowane uczulenie na ten odczynnik. W wyniku kontaktu skóry z DCC pojawiają się plamy uczuleniowe przypominające poparzenia. 2.2.2.2. Metoda karbodiimidowa z dodatkami obniżającymi stopień epimeryzacji (racemizacji) Wady DCC, jako odczynnika stosowanego w syntezie peptydów, a więc przede wszystkim wywoływanie silnej racemizacji i tworzenie N-acylomocznika — niepożądanego produktu ubocznego, można w znacznym stopniu wyeliminować dzięki specjalnym substancjom, zwanym dodatkami antyracemizacyjnymi. Są one w stanie nie tylko znacznie ograniczyć zasięg racemizacji, ale i zmniejszyć ilość powstającego N-acylomocznika.

Ac-Phe + HCl • LeuOMe

DCC, Et,N HQBt

» Ac-Phe-Leu-OMe + Ac-D-Phe-Leu-OMe + Ac-Phe-DCU

Y:

87,6%

1,4%

1,4%

E= 1,6% Do najczęściej stosowanych dodatków antyracemizacyjnych należą N-hydroksybenzotriazol (HOBt) i N-hydroksysukcynoimid (HOSu) (rys. 2.7). O N^ /

N

N—OH

N OH HOBt

O HOSu

Rys. 2 . 7 . Przykłady dodatków antyracemizacyjnych

2.2.2.3. Metoda mieszanych bezwodników N-Chroniony aminokwas w temperaturze -20°C i w obecności aminy III-rzędowej w reakcji z chloromrówczanem alkilu, korzystnie z chloromrówczanem sec-butylu, w ciągu od kilku do kilkunastu minut tworzy mieszany bezwodnik, którego bez izolacji używa się do acylowania aminokomponentu, tj. aminoestru lub nawet soli aminokwasu. Jest to metoda bardzo „czysta", ponieważ produktami towarzyszącymi są łatwe do usunięcia związki: C 0 2 i sec-BuOH. Wydajności są dobre, na ogól przewyższające 80%. Wydajności rzędu 60% w przypadku acylowania soli aminokwasu (PheONa), czyli aminokomponentu, bez typowej osłony grupy karboksylowej należy także uznać za zadowalające. Z-Ala + ClCOO-^c-Bu

- Z-Ala-O-CO-O-sgc-Bu

Phe0Na

- Z-Ala-PheONa

65%

mieszany bezwodnik 2.2.2.4. Metoda aktywnych estrów Estry zawierające w części alkoholowej elektroujemne reszty, np. fenyl, lub jeszcze lepiej pierścień aromatyczny dodatkowo podstawiony grupami elektroujemnymi, np. /?-nitrofenyl (ONp), pentafluorofenyl (OPfp) czy pentachlorofenyl (OPcp), są świetnymi odczynnikami acylującymi. Podobnymi właściwościami odznaczają się karboksylowe pochodne otrzymywane w reakcji z takimi związkami, jak hydroksybenzotriazol (OBt) czy hydroksysukcynoimid (HOSu). Wszystkie tego typu reagenty z uwagi na silne właściwości acylujące nazywane są często estrami aktywnymi, chociaż z punktu widzenia klasyfikacji związków organicznych te ostatnie nie są estrami (rys. 2.8). Estry aktywne otrzymuje się najczęściej w wyniku reakcji N-chronionych aminokwasów z odpowiednimi pochodnymi hydroksylowymi, przy udziale DCC. Bardziej popularne estry aktywne są dostępne w handlu. Użycie ich w syntezie peptydów jest wygodne, gdyż miesza się je bezpośrednio z komponentem acylowanym w rozpuszczalniku, w którym prowadzona jest reakcja. Można je również otrzymywać bezpośrednio przed

p-nitrofenyl

pentafluorofenyl

hydroksybenzotriazyl

hydroksysukcynoimidyl

Rys. 2 . 8 . Przykłady reszt tworzących estry aktywne z grupą karboksylową aminokwasu

syntezą peptydu i używać in situ bez izolacji. Podobnie jak w przypadku mieszanych bezwodników można nimi acylować sole aminokwasów. W procedurze estrów aktywnych zasięg racemizacji zwykle nie jest duży. Z-Pro-Pro-OBt + HC1 • Ala-CM-Bu

Z-Pro-OSu + Gly-ONa

Mc0H/H0H

Z-Pro-Pro-Ala-CM-Bu + HOBt

»

Z-Pro-Gly-ONa + HOSu

94%

78%

Metoda estrów aktywnych nadaje się doskonale do procedury stosującej nadmiar odczynnika acylującego. Zastosowanie nadmiaru jednego z reagentów pozwala nie tylko na skrócenie czasu reakcji, ale dodatkowo zwiększa wydajność produktu (liczoną w stosunku do komponentu będącego w niedomiarze, np. acylowanego), a także zmniejsza zasięg racemizacji z uwagi na skrócony czas reakcji. Niedogodnością takiego sposobu prowadzenia syntezy peptydów jest stosowanie nadmiaru aminokwasu acylującego, którego zwykle się nie odzyskuje, jednak z ekonomicznego punktu widzenia takie postępowanie jest uzasadnione w przypadku trudnej dostępności lub wysokiej ceny komponentu aminowego. 2.2.2.5. Metoda EEDQ EEDQ (2-etoksy-Af-etoksykarbonylo-l,2-dihydrochinolina) (rys. 2.9) jest dogodnym odczynnikiem kondensującym stosowanym w syntezie peptydów. Aktywacja grupy karboksylowej za pomocą tego reagentu polega na tworzeniu in situ mieszanego bezwodnika (X-NHCHRCOCOOEt) złożonego z reszty aminokwasu acylującego i etoksykarbonylu. Zasięg racemizacji w reakcjach z użyciem EEDQ jest zazwyczaj mniejszy niż w typowych procedurach bezwodnikowych, ponieważ tworzący się in situ bezwodnik jest prawie natychmiast zużywany. EEDO

CHO-Phe + TosOH • Phe-ONBzl — E

* • CHO-Phe-Phe-ONBzl

OEt

OEt Rys. 2 . 9 . 2-Etoksy-/V-etoksykarbonylo-1,2-dihydrochinolina (EEDQ)

88%

2.2. Synteza peptydów 2.2.2.6. Metoda azydkowa Przez wiele lat metoda azydkowa była uważana za jedyną bezracemizacyjną procedurę aktywacji acylowanych aminokwasów. Stosowana była najczęściej do łączenia fragmentów peptydowych z udziałem podatnej na racemizację składowej acylującej. Tworzący się z hydrazydu i kwasu azotawego azydek jest dobrym odczynnikiem acylującym i faktycznie racemizacja w takich reakcjach jest nieznaczna. Przeprowadzone nowoczesnymi metodami dokładne pomiary wykazały jednak, że w trakcie takiego postępowania też dochodzi do racemizacji, ale jej zasięg nie przekracza kilku procent nawet dla substratów podatnych na nią. Jednak z uwagi na szereg towarzyszących reakcji ubocznych wydajności w tej metodzie nie są wysokie. Obecnie jest rzadko stosowana. Boc-Val-NH-NH 2 + HNO z —^ Boc-Val-N 3

Aia-o-/-Bufc

B oc-Val-Ala-0-/-Bu

55%

2.2.2.7. Metoda BOP Odczynnik B O P (rys. 2.10) jest niezwykle skutecznym środkiem kondensującym pochodne aminokwasowe w reakcjach syntezy peptydów. Na uwagę zasługuje duża szybkość tworzenia wiązania peptydowego, wysokie wydajności i słaba racemizacja.

Rys. 2 . 1 0 . Odczynnik BOP, czyli heksafluorofosforan tris(dimetyloarnino)-l-benzotriazoliloksyfosfoniowy

Z-Gly-Phe + Yal-OMe

BOP HOBt

Z-Gly-Phe-Yal-OMe

92%;

£=1,2%

Mimo że odczynnik BOP ma tak doskonałe właściwości kondensujące i pod koniec lat osiemdziesiątych ubiegłego wieku był szeroko i z dużym powodzeniem stosowany za-

heksafluorofosforan tris(pirolidynylo)- J -benzotri azoliloksyfosfoniowy (PyBOP)

heksafluorofosforan bromo-tris(pirolidynylo)fosfoniowy (PyBrOP)

tetrafluoroboran [2-(l-benzotriazolilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy (TBTU)

Rys. 2 . 1 1 . Efektywne odczynniki kondensujące stosowane w syntezie peptydów

równo w reakcjach syntezy w roztworach, jak i na nośniku stałym, jego użycie spotkało się z ostrzeżeniem, ponieważ jednym z produktów ubocznych jest silnie kancerogenny tris(dimetylo)fosforotriamid. Castro, odkrywca odczynnika BOP, zaproponował stosowanie w miejsce BOP innych równie skutecznych, jednocześnie nieszkodliwych odczynników kondensujących (rys. 2.11). Do nich należą odczynniki znane głównie pod postacią skrótów: PyBOP i PyBrOP. Podobne działanie wykazuje TBTU, a także cieszący się powodzeniem HBTU (heksafluorofosforan 2-(l-benzotriazololilo)-l,l,3,3- tetrametylouroniowy). 2.2.2.8. Synteza na nośniku stałym Syntezę peptydów w roztworze, inaczej zwaną metodą klasyczną, można prowadzić według dwóch procedur. Pierwsza polega na przyłączaniu, najczęściej od C-końca, kolejno po jednym aminokwasie. Procedura taka nazywana jest krok po kroku (ang. step by step). Drugim sposobem jest łączenie fragmentów złożonych z kilku lub kilkunastu reszt aminokwasowych. Procedura krok po kroku jest bardzo pracochłonna i czasochłonna, ponieważ do zsyntezowania 20-peptydu trzeba 19 razy przeprowadzić reakcję tworzenia wiązania peptydowego, 19 razy usunąć osłonę grupy aminowej, a ponadto każdy otrzymany produkt pośredni, od dipeptydu do 20-peptydu, powinien być oczyszczony i scharakteryzowany. Zwykle najtrudniejszym i najbardziej czasochłonnym elementem każdego etapu syntezy jest proces oczyszczania kolejnych fragmentów rosnącego peptydu. Proces ten, chociaż polega głównie na usuwaniu nadmiaru odczynników i reagentów, jest dodatkowo utrudniony występowaniem produktów ubocznych, których właściwości są często bardzo zbliżone do właściwości produktów głównych, a więc są trudne do oddzielenia. Trudności w oczyszczaniu produktów pośrednich, czyli różnej długości peptydów, związane są głównie z doprowadzeniem krótkich peptydów do postaci krystalicznej i ze słabą rozpuszczalnością dłuższych peptydów. W procedurze łączenia fragmentów peptydowych czas syntezy może być znacznie skrócony. Tak więc 20-peptyd można zsyntezować z trzech fragmentów (np. 6 + 8 + 6), w dwóch następujących po sobie etapach deprotekcji, kondensacji i oczyszczania. Fragmenty te trzeba oczywiście uprzednio otrzymać, ale ich synteza może być prowadzona równolegle przez kilka zespołów, co skraca czas syntezy, chociaż nie zmniejsza sumarycznej pracochłonności. Trudno się więc dziwić, że do lat 60., a nawet i w latach 70. XX w. synteza każdego większego, a nawet średniego peptydu była wielkim wydarzeniem w skali światowej, dokonywanym jedynie w nielicznych ośrodkach przez bardzo doświadczone zespoły. Za syntezę dwóch pierwszych biologicznie czynnych peptydów — oksytocyny i wazopresyny, du Vigneaud otrzymał w 1954 roku Nagrodę Nobla. Tak przedstawiał się problem syntezy peptydów do czasu, kiedy w 1963 roku Merrifield dokonał rewolucyjnego przełomu w tej dziedzinie. Istotą jego odkrycia było zastosowanie polimeru, tj .fazy stałej, do osłony funkcji karboksylowej pierwszego aminokwasu. Następnie, do tak chronionego aminokwasu dołączane były po kolei inne aminokwasy aż do otrzymania peptydu o żądanej długości, po czym gotowy peptyd był odłączany od polimeru. Schematycznie syntezę na fazie stałej przedstawiono na rysunku 2.12.

2.2. Synteza peptydów

DMF

|

80°

obsadzanie polimeru pierwszym

aminokwasem

Boc — NHCHRCO — O — C H 2 C 6 H 4 — polimer

HCI/AcOH

1 lub Tfa

usuwanie osłony — deprotekcja

C l - H 3 N + C H R C O — O — C H 2 C 6 H 4 — polimer

NEt 3 /DCM

|

neutralizacja

N H 2 C H R C O — O — C H 2 C 6 H 4 — polimer

Boc-NHCHR'COOH 1 DCC/DCM

acyłowanie

drugim

aminokwasem

B o c — NHCHR'CO — NHCHRCO — O — C H 2 C 6 H 4 — polimer itd. aż do otrzymania peptydu o założonym składzie i długości, po czym następuje odłączenie go do polimeru

Rys. 2 . 1 2 . Przyłączenie pierwszego i drugiego aminokwasu do polimeru Merrifielda w procedurze syntezy peptydów na fazie stałej

Poszczególne etapy syntezy peptydów na nośniku stałym, zwanej w skrócie SPPS (ang. solid pliase peptide synthesis), są takie same jak w syntezie klasycznej, lecz dzięki temu, że wszystkie prowadzone są w jednym, tym samym naczyniu, unika się strat czysto mechanicznych. Ponadto rosnący peptydylopolimer (syntezowany peptyd z grupą karboksylową chronioną polimerem) zachowuje zbliżone właściwości fizykochemiczne w trakcie całej syntezy, a przede wszystkim cały czas jest nierozpuszczalny w środowisku reakcji, natomiast nadmiar substratów, odczynników i produktów ubocznych, które są zwykle rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, jest łatwy do oddzielenia od peptydylopolimeru przez zwykłe przemywanie i odsączanie. W ten sposób najtrudniejsze etapy syntezy, tzn. oczyszczanie peptydu po przyłączaniu każdego nowego aminokwasu, zostały zredukowane do prostych i szybkich czynności. W najogólniejszym zarysie synteza peptydów na nośniku stałym polega na dodawaniu roztworów odczynników do naczynia, w którym prowadzi się syntezę, mieszaniu peptydylopolimeru z tymi roztworami, sączeniu i przemywaniu. Czynności te powtarza się periodycznie dla każdego cyklu. Cykl przyłączenia jednej reszty aminokwasu został przedstawiony na schemacie 2.1. Niektóre czynności, takie jak acylowanie, deprotekcja czy zobojętnianie, wykonywane są dwukrotnie, a przemywanie każdym rozpuszczalnikiem — trzykrotnie. Gwałtowna zamiana rozpuszczalników stosowanych do przemywania lub prowadzenia reakcji może spowodować uszkodzenie polimeru. Zabezpieczenie przed taką destrukcją polega na jednokrotnym przemyciu polimeru mieszaniną obu rozpuszczalników (1:1), a w przypadku, kiedy rozpuszczalniki bardzo różnią się właściwościami, trzeba stosować dodatkowo rozpuszczalnik o właściwościach pośrednich; na przykład kiedy po prowadzonym w chlorku metyle-

S c h e m a t 2 . 1 . Operacje jednostkowe cyklu przyłączenia reszty jednego aminokwasu w syntezie peptydów na nośniku stałym, według procedury B. Merrifielda, zmodyfikowanej w laboratorium M. Manninga

Operacja jednostkowa

Liczba operacji

Czas operacji [min]

A. Przemywanie, przygotowanie do testu Kaisera 1. DCM 2. DCM/EtOH, 1:1 3. Et OH B. Test Kaisera, sprawdzenie stopnia acylowania C. Przemywanie — przygotowanie do deprotekcji 4. EtOH/AcOH, 1:1 5. AcOH D.

Deprotekcja 6. Wytrząsanie z 1 M HCl/AcOH 7. Wytrząsanie z 1 M HCl/AcOH

E.

Przemywanie — przygotowanie do neutralizacji

F.

8. AcOH 9. AcOH/EtOH, 1:1 10. EtOH 11. EtOH/DCM, 1:1 12.DCM Neutralizacja

5

20

13. NEtj/DCM 14. NEt 3 /DCM G. Przemywanie — przygotowanie do acylowania 15. DCM H. Acylowanie (ang.

coupling)

16. Boc-AA (3 eq), DCC, DCM 17. Przemywanie DCM 18. Boc-AA, DCC, DCM

120 3

60

nu przyłączeniu kolejnego aminokwasu trzeba przejść do deprotekcji wykonywanej w kwasie octowym, polimer przemywa się kolejno chlorkiem metylenu, mieszaniną chlorku metylenu z etanolem, samym etanolem, mieszaniną etanolu z kwasem octowym, a dopiero potem samym kwasem octowym. Jakościowej oceny stopnia acylowania w poszczególnych etapach syntezy można dokonać za pomocą ninhydrynowego testu Kaisera. Zmiana zabarwienia ziarenek na kolor fioletowy świadczy o obecności wolnych grup aminowych, czyli o niecałkowitym acylowaniu. W takim przypadku acylowanie należy powtórzyć. Ilościowy sposób oceny wydajności acylowania, czyli stopnia przyłączenia kolejnego aminokwasu, polega na przeprowadzeniu analizy składu aminokwasowego peptydylopolimeru. W wielu automatycznych syntezatorach peptydów oznaczanie składu aminokwasowego jest standardem wykonywanym po każdym acylowaniu i na podstawie założonego w projekcie syntezy wymagania, na przykład że stopień acylowania nie może być niższy niż 99,9%, stacja robocza kierująca syntezą decyduje o powtórzeniu acylowania lub uruchomieniu następnego etapu syntezy.

Według powyższej procedury w ciągu 1 dnia pracy można przyłączyć reszty dwóch aminokwasów. Zastosowanie bardziej reaktywnych odczynników kondensujących, np. HBTU, daje możliwość znacznego zwiększenia szybkości syntezy peptydów tą metodą. Użycie do deprotekcji droższego odczynnika, jakim jest roztwór Tfa w DCM, znacznie skraca i upraszcza każdy cykl syntezy, ponieważ eliminuje etapy 4, 5, 9 i 10. Niepotrzebne staje się bowiem przemywanie kwasem octowym, ponieważ deprotekcję za pomocą Tfa prowadzi się w chlorku metylenu. Merrifield, biorąc pod uwagę ciąg powtarzających się prostych czynności i prowadzenie reakcji w jednym naczyniu, już w swojej pierwszej publikacji dotyczącej syntezy peptydów na nośniku stałym sugerował możliwość automatyzacji całego procesu. Faktycznie, w dwa lata później Merrifield wraz z zespołem zaprezentował automatyczny syntezator peptydów. Obecnie urządzenia takie są szeroko wykorzystywane w laboratoriach do otrzymywania peptydów. Automatyczny syntezator peptydów jest to zestaw butli z rozpuszczalnikami, butelek z roztworami reagentów i aminokwasów, układ węży i rurek z zaworami, urządzenie sterujące i małe naczynie reakcyjne. Praca operatora sprowadza się do zaprogramowania syntezy za pomocą komputera, kontroli pracy aparatu oraz uzupełniania zapasu roztworów reagentów i rozpuszczalników. Wraz z zakończeniem syntezy kończą się ułatwienia w pracy oferowane przez to urządzenie. Natomiast chemik przejmuje trud związany z odszczepieniem peptydu z żywicy, usunięciem osłon, oczyszczaniem produktu końcowego i innymi operacjami, np. przeprowadzeniem cyklizacji, utworzeniem pochodnych na grupach funkcyjnych itp. Oczywiście wiele z tych czynności może być i często bywa zautomatyzowane, ale tylko w produkcji rutynowej, gdyż prawie każdy nowo otrzymywany peptyd musi być traktowany indywidualnie, ze względu na swoje specyficzne właściwości. Merrifield wypróbował różne polimery pod względem przydatności zastosowania ich jako nośników do syntezy na fazie stałej, w tym celulozę, poli(alkohol winylowy), polimetakrylan metylu), ale najbardziej przydatny okazał się kopolimer styrenu i diwinylobenzenu. I ten właśnie polistyren, usieciowany diwinylobenzenem (1-2%), był przez wiele lat najczęściej stosowanym nośnikiem w syntezie peptydów na fazie stałej, mimo że później wprowadzono szereg innych polimerów, w tym poliamidowych. Zasady ich stosowania są podobne. Używane są zwykle w postaci drobnych kuleczek o średnicy 20-100 jam, przypominających wyglądem drobnoziarniste żywice jonowymienne. Kuleczki nośnika są porowate, z miejscami aktywnymi przede wszystkim we wnętrzu kanalików. Aby miejsca te były dostępne dla swobodnej penetracji roztworów reagentów i były w stanie zmieścić rosnący peptyd, kanaliki muszą mieć odpowiednio duże średnice, co zapewnia się przez właściwie prowadzoną polimeryzację. Istotne znaczenie ma dobór rozpuszczalnika odpowiedniego do prowadzenia reakcji. Powinien on powodować znaczne pęcznienie ziaren nośnika; na przykład żywica Merrifielda pęcznieje w chlorku metylenu, zwiększając kilkakrotnie swoją objętość. Zwykle obsadzenie nośnika pierwszym aminokwasem, a więc w konsekwencji i peptydem, waha się w granicach 0,2-0,7 mmola reszty aminokwasu/g żywicy. Przy obsadzeniu rzędu 0,3 mmola/g w ziarnku nośnika o średnicy 50 p.m znajduje się około 10 12 łańcuchów peptydowych.

Dotychczas opisano wiele różnych polimerów do syntezy peptydów na nośniku stałym. Znane są również polimery rozpuszczalne. Na wyróżnienie zasługują kulki lub pręty szklane albo teflonowe pokryte chlorometylowanym polistyrenem w ten sposób, że jego łańcuchy tworzą rodzaj miękkich szczotek (pędzli) na szklanej czy teflonowej powierzchni. Na tak utworzonych nośnikach synteza zachodzi wyłącznie nad powierzchnią kulek (prętów), a nie w trudno dostępnych kanalikach. Takie ułożenie rosnących łańcuchów peptydowych ułatwia dostęp odczynników i reagentów do miejsc reaktywnych. Jednak najistotniejszą modyfikację żywic stosowanych w syntezie peptydów na nośniku wprowadził Sheppard. Zdołał on wyjaśnić przyczynę jednej z poważnych niedoskonałości żywicy Merrifielda, polegającą na tym, że wraz ze wzrostem długości łańcucha peptydowego maleje udział części polistyrenowej nośnika, a przez to traci on swój węglowodorowy charakter i inaczej oddziałuje ze stosowanym rozpuszczalnikiem. Po przyłączeniu kilkunastu reszt aminokwasowych przeszło połowę masy polimeru stanowi peptyd i to on decyduje o właściwościach fazy stałej. Część węglowodorowa ziaren nośnika różni się istotnie właściwościami od części polipeptydowej, między innymi polarnością i podatnością na pęcznienie w rozpuszczalniku. W rozpuszczalnikach słabo polarnych, a w takich żywica Merrifielda najlepiej pęcznieje, następuje zwijanie się łańcuchów peptydowych w taki sposób, że części polarne, w tym grupa aminowa, zajmują wnętrze zwoju, a węglowodorowe łańcuchy boczne eksponowane na zewnątrz utrudniają reagentom dostęp do centrów reakcji. Wydajność reakcji w takich warunkach drastycznie spada. Natomiast w rozpuszczalnikach polarnych, w których łańcuch peptydowy jest bardziej rozwinięty i centra aktywne zajmują jego zewnętrzną część, polimer Merrifielda pęcznieje nieznacznie, co z kolei utrudnia transport reagentów do kanalików, w których znajdują się łańcuchy peptydowe. Biorąc pod uwagę te zależności, Sheppard zaproponował nośniki poliamidowe, a nawet polipeptydowe, których właściwości są prawie identyczne jak syntezowanego peptydu, i w wielu przypadkach uzyskał lepsze wydajności syntezy peptydów w porównaniu z syntezą na żywicy Merrifielda. Pośród wprowadzonych przez Shepparda żywic do syntezy peptydów na fazie stałej największą popularność zdobył usieciowany poli(dimetyloakryloamid), zawierający ester metylowy sarkozyny jako łańcuch boczny, do którego poprzez łącznik na przykład etylenodiaminowy dołączony zostaje C-końcowy aminokwas syntezowanego peptydu. Poliamidowa żywica pęcznieje dobrze nie tylko w rozpuszczalnikach polarnych, takich jak DMF (dziesięciokrotnie) czy woda (jeszcze więcej), ale również w rozpuszczalnikach niepolarnych, w tym w chlorku metylenu. Sheppard zaproponował również zmianę procedury syntezy (sch. 2.2). Zamiast aminokwasów chronionych osłoną Boc zastosował substraty chronione ugrupowaniem Fmoc, co umożliwiło deprotekcję w łagodnie zasadowych warunkach, a po zakończeniu syntezy odszczepienie peptydu od żywicy za pomocą acydolizy słabymi kwasami. Ta procedura okazała się nie tylko prostsza i mniej czasochłonna od klasycznej procedury Merrifielda, ale i bardziej wydajna, ponieważ wyeliminowanie acydolitycznej deprotekcji wpłynęło na zwiększenie wydajności końcowej. Przeprowadzanie deprotekcji, na przykład za pomocą chloro wodom w kwasie octowym, powoduje około 1-procentową acydolizę estrowego wiązania peptydu z żywicą i w tym samym stopniu utratę peptydu na każdym etapie syntezy. W syntezie dłuższych peptydów jest to poważny problem, ponieważ utrata 1%

S c h e m a t 2 . 2 . Przykładowy protokół jednego cyklu syntezy peptydu na nośniku Shepparda, przy użyciu preaktywowanych Fmoc aminokwasów, np. w postaci symetrycznych bezwodników lub aktywnych estrów Operacja jednostkowa

Liczba operacji

Czas operacji [ruin]

10

1

1 1

3 7

5

1

1

30

A. Przemywanie — przygotowanie do deprotekcji 1. D M F B. Deprotekcja 2. Piperydyna/DMF, 20% 3. Piperydyna/DMF, 20% C. Przemywanie — przygotowanie do acylowania 4. DMF D. Acylowanie 5. Bezwodnik symetryczny, ( F m o c - A A ) 2 0 E. Test sprawdzający stopień acylowania

15

F. W przypadku niecałkowitego acylowania operacja poprzednia jest powtarzana aż do uzyskania zadowalającego wyniku

produktu po przyłączeniu każdego aminokwasu w istotny sposób zmniejsza wydajność końcową. Nowy sposób syntezy peptydów, oparty na nośniku stałym, zaproponowany przez Merrifielda wywołał znaczne emocje w środowisku chemików peptydowych. Peptydowcy podzielili się na dwie grupy: gorących zwolenników i zdecydowanych przeciwników syntezy na nośniku stałym. Z czasem przeciwników metody Merrifielda ubywało. Główną przyczyną kontrowersji były problemy związane z otrzymywaniem czystych produktów końcowych. Zasadniczą zaletą syntezy Merrifielda jest ułatwione oczyszczanie produktu od nadmiaru substratów, odczynników i zwykle powstających niskocząsteczkowych produktów ubocznych. Mimo to, w początkowym etapie rozwoju syntezy na nośniku stałym duże trudności stwarzał problem powstawania, obok właściwego produktu, peptydów zawierających błędną lub niepełną sekwencję. Produkt końcowy w syntezie Merrifielda wymagał żmudnego oczyszczania, ponieważ towarzyszyły mu peptydy krótsze o jedną, dwie czy też więcej reszt aminokwasów. Te peptydy z defektami powstają w wyniku niższej niż 100% wydajności reakcji przyłączenia aminokwasów lub deprotekcji na poszczególnych etapach. Jeżeli na przykład przyłączenie reszty trzeciego aminokwasu zostało dokonane z wydajnością 99%, to 1% wyjściowego dipeptydu nie uległ zmianie. Na następnym etapie znaczna część tego dipeptydu zostaje przekształcona w tripeptyd, podczas gdy zdecydowana większość produktu staje się już tetrapeptydem, ale z kolei nieznaczna ilość tripeptydu pozostaje nie przedłużona i pojawia się następny łańcuch z defektem. Każda niekompletna reakcja przyłączenia reszty kolejnego aminokwasu czy też niecałkowita deprotekcja staje się źródłem łańcucha peptydowego z defektem. Wydajność każdego etapu przyłączenia oraz długość peptydu decydują o ostatecznej wydajności i czystości końcowego produktu. Wpływ tych dwóch czynników na wynik syntezy pokazuje tabela 2.3. Problem niskiej czystości peptydu końcowego, wynikający z niecałkowitego acylowania na poszczególnych etapach syntezy, rozwiązano stosunkowo łatwo — przez zasto-

T a b e l a 2 . 3 . Skład produktów końcowych w syntezie peptydów metodą SPPS Średnia wydajność poszczególnych etapów syntezy [%] Produkt (frakcja)

90

98

99

99,5

99,9

udział danej frakcji w produktach syntezy 9-peptydu (oksytocyny) 9-peptyd

43

85

92

96

99

8-peptydy

38

14

8

4

1

7-peptydy

15

1

0,3

0

0

124—peptydu (rybonukleazy A) 124—peptyd

8

29

54

88

123-peptydy

21

36

33

11

122-peptydy

26

22

10

1

sowanie nadmiaru aminokwasu acylującego, czasami nawet trzykrotnego. Wydajność acylowania na każdym etapie jest sprawdzana i jeżeli zachodzi potrzeba, powtarza się acylowanie aż do uzyskania założonej wydajności, np. 99,9%. Dzięki tym ulepszeniom chronione peptydy — końcowe produkty syntezy na nośniku stałym, otrzymuje się z dużą wydajnością i bardzo czyste. Oczywiście nadal, w specyficznych układach, występują trudności z uzyskiwaniem dobrych wydajności oczekiwanych produktów. Pomijając syntezę długich peptydów (patrz: synteza 124-peptydu), kiedy nawet przy 99,9% wydajności każdego etapu powstaje dużo peptydów niepełnych (12%), pojawiają się często problemy natury konformacyjnej. Zdarza się, że przy określonej długości (najczęściej w peptydzie zawierającym 8 - 1 6 reszt aminokwasowych) i odpowiedniej sekwencji łańcuch syntezowanego peptydu przybiera konformację, w której jego N-koniec zostaje osłonięty przez hydrofobowe grupy boczne i staje się trudno dostępny dla reagentów. Sekwencję określonych aminokwasów wywołujących te problemy określa się jako trudną sekwencję. W takim przypadku nawet wielokrotne acylowanie nie prowadzi do uzyskania wysokiej wydajności. Ta uwaga dotyczy także deprotekcji. Wówczas zaleca się zmianę rozpuszczalnika, w którym prowadzi się acylowanie, np. z DCM na DMF, trifluorometanol czy heksafluoroizopropanol. Polepszenie wydajności można również uzyskać przez zastosowanie innego odczynnika kondensującego. Najlepsze jednak efekty otrzymuje się przez wprowadzenie do środowiska reakcji specjalnych dodatków zmieniających, a właściwie zaburzających konformację łańcucha peptydowego. Są to tzw. czynniki chaotropogenne. Najczęściej funkcję taką spełniają sole nieorganiczne (np. KCNS, NaC10 4 ), które poprzez rozrywanie wiązań wodorowych i osłabianie wiązań jonowych przeciwdziałają zwijaniu się łańcuchów peptydowych, a przez to ułatwiają odczynnikom dostęp do miejsc reaktywnych. Stosowane są również różnego rodzaju detergenty, roztwory trzecio- i czwartorzędowych soli amoniowych, a także roztwory polietylenowych eterów (Tritony).

Jak wielkie peptydy otrzymano metodą Merrifielda? Największym peptydem, a właściwie białkiem, jakie dotychczas zsyntezowano, jest ludzki hormon wzrostu (somatotropina), zawierający 191 reszt aminokwasowych. Zespół Merrifielda zsyntezował rybonukleazę A zawierającą 124 reszty aminokwasowe, a także ludzki leukocytarny interferon zawierający 166 reszt aminokwasowych. Jednak synteza dużych peptydów i białek tą metodą jest nadal trudna, kosztowna, a wydajności końcowe są bardzo niskie. Natomiast synteza średnich peptydów na nośniku stałym zyskała powszechne uznanie i pozwala produkować je seryjnie. Wielu chemików peptydowych wyraża opinię, że pomysł Merrifielda był w ostatnich latach najbardziej płodnym osiągnięciem w naukach przyrodniczych. Wynalazek ten stał się inspiracją dla innych badaczy z różnych dziedzin nauki. Obecnie zdecydowaną większość peptydów otrzymuje się tą metodą. Pomysł Merrifielda zmobilizował chemików do ulepszenia tradycyjnych metod syntezy peptydów i dzięki temu kilka lat po wynalezieniu SPPS zaproponowano procedury syntezy peptydów w roztworze z zastosowaniem nadmiarów komponentów acylujących, np. symetrycznego bezwodnika, aktywnego estru czy azydku. Biegną one równie szybko jak synteza w fazie stałej, ale metoda Merrifielda nadal przewyższa je swoją prostotą, szczególnie pod względem łatwości usuwania produktów ubocznych, towarzyszących i odczynników użytych w nadmiarze. Wynalazek Merrifielda zastosowano lub zaadaptowano także w innych dziedzinach chemii i w biochemii. Tą metodą syntezuje się, między innymi, kwasy nukleinowe. Wykorzystuje się ją także do oznaczania sekwencji peptydów za pomocą automatycznych sekwenatorów. Wiele reakcji enzymatycznych prowadzi się sposobem Merrifielda, tzn. za pomocą umieszczonych w kolumnie enzymów immobilizowanych na polimerze. Znane są również inne reagenty i odczynniki osadzone na polimerze, stosowane zarówno w chemii analitycznej, jak i syntetycznej, np. w procesach utleniania czy redukcji. Odczynniki takie można regenerować w prosty sposób. W ostatnich kilku latach nastąpił dalszy, niewyobrażalny wprost, postęp w szybkości syntezy peptydów. Zostały skonstruowane automatyczne syntezatory peptydów pozwalające na otrzymywanie równocześnie kilkudziesięciu, a nawet kilkuset peptydów o różnym składzie. Dokonuje się tego, między innymi, na prętach na przykład polietylenowych, których powierzchnie zostały pokryte związkami zawierającymi grupy chemiczne zdolne do przyłączenia pierwszego aminokwasu, pokryte na przykład poli(glikolem etylenowym). Pręty takie osadza się w gniazdach bloku, a do każdego gniazda przez odpowiednie przewody i otwory można doprowadzać, a także odprowadzać rozpuszczalniki oraz roztwory reagentów. Roztwory aminokwasów są doprowadzane indywidualnie i selektywnie do każdego gniazda tak, że na poszczególnych prętach mogą być w tym samym cyklu przyłączane różne aminokwasy. Pracą reaktora steruje komputer. Oczywiście w ten sposób otrzymuje się bardzo małe ilości peptydów, rzędu |amoli lub nawet pmoli. Ilości te wystarczają jednak do przeprowadzenia badań aktywności biologicznej. Inna technika, pozwalająca na równoczesną syntezę wielu różnych, ale ściśle zdefiniowanych peptydów, polega na umieszczeniu żywicy do syntezy peptydów w przepuszczalnych woreczkach, typu tea bags. Woreczki te, zaopatrzone w metryczki, można selektywnie wprowadzać do reaktora w celu przeprowadzenia przyłączenia określonego aminokwasu i wyjmować w zależności od potrzeby. Na uwagę zasługuje synteza peptydów na celulozowych krąż-

kach. Krążki te o średnicy 1,55 cm umieszcza się na pręcie (do 100 na jednym pręcie). Można je opisywać zwykłym ołówkiem, a nawet wycinać z nich fragmenty, żeby w takim fragmencie przyłączyć inny aminokwas niż w pozostałej części krążka. Na każdym etapie przyłączenia kolejnego aminokwasu dowolny krążek można usunąć z pręta w celu przyłączenia innego aminokwasu lub zaniechania przyłączenia. Natomiast deprotekcję, neutralizację i kolejne przemywania przeprowadza się równocześnie na jednym pręcie. Taki tok postępowania umożliwia jednoczesną syntezę 100, a nawet więcej peptydów o zadanej sekwencji.

2.2.2.9. Biblioteki peptydów — synteza kombinatoryczna Zapotrzebowanie na syntetyczne peptydy jest niezwykle duże i uprzednio przedstawione sposoby ich otrzymywania nie były w stanie zaspokoić rosnącego popytu. Tak duży popyt na wiele nowych peptydów wynika między innymi z poszukiwania aktywniejszych, bardziej selektywnych i dłużej działających analogów peptydów występujących w naturze, z wykorzystywania oligopeptydów do badania wpływu sekwencji określonego fragmentu na strukturę cząsteczki białek, identyfikacji aktywnych fragmentów dużych peptydów i białek, w tym epitopów (fragmentów białek odpowiedzialnych za aktywność antygenową) czy zastosowania peptydów do produkcji szczepionek nowej generacji, w których pełnią funkcję antygenów. Otrzymywanie pojedynczych peptydów od dawna nie zaspokajało potrzeb badaczy zajmujących się wyżej wymienionymi zagadnieniami. W zależności od długości łańcucha i stopnia skomplikowania reakcji czas potrzebny do otrzymania pojedynczego peptydu, łącznie z jego oczyszczeniem, wynosi od kilku dni do szeregu tygodni. Liczba możliwych kombinacji wynikających z możliwości zmian w sekwencji dekapeptydu złożonego z 20 aminokwasów sięga miliardów. Czas potrzebny na zsyntezowanie tak dużej liczby związków otrzymywanych pojedynczo lub nawet w zestawach po 100 bardzo limitował postęp w badaniach, do których przeprowadzenia potrzeba było milionów peptydów. Z tej przyczyny dużo wysiłku włożono w intensyfikację procesu syntezy peptydów. Osiągnięciem ostatnich lat jest tzw. synteza kombinatoryczna, polegająca na równoczesnym tworzeniu dużej liczby peptydów — zbioru, zwanego biblioteką lub inaczej księgarnią peptydów. Liczba składników w jednym zbiorze może przekraczać dziesiątki milionów peptydów {książek). Zbiór taki otrzymuje się przez acylowanie na określonym etapie syntezy nie pojedynczym aminokwasem, ale grupą aminokwasów. Jeżeli C-chroniony aminokwas lub peptyd z wolną grupą aminową zostanie zacylowany 20 aminokwasami, to otrzymany produkt będzie mieszaniną 20 różnych dipeptydów. Po ich ponownym acylowaniu dwudziestoma aminokwasami powstaje 400 różnych tripeptydów. Postępując dalej w ten sposób, można wyprodukować mieszaninę peptydów złożoną z niewiarygodnie dużej liczby składników. Mieszaninę taką wykorzystuje się do testów na określoną aktywność biologiczną i w przypadku pozytywnego wyniku poszukuje się aktywnych składników przez badanie otrzymanej osobno mieszaniny o zredukowanej liczbie składników. Redukując stopniowo liczbę składników mieszaniny, można zidentyfikować peptyd lub peptydy wykazujące aktywność w stosowanych testach. Redukcja liczby testowanych składników mieszaniny, czyli zmniejszanie liczby książek w bibliotece (ang.

library deconvolution), polega na syntezie zestawu mniej zróżnicowanych peptydów (tworzenie subbiblioteki). Podczas syntezy subbiblioteki określone pozycje acyluje się nie mieszaniną aminokwasów, ale pojedynczym, a najwyżej dwoma aminokwasami. W przypadku biblioteki tetrapeptydu, utworzonej z 20 aminokwasów, będą to subbiblioteki zawierające analogi o następującej budowie: Gly A A 1 "20AA1 " 20 AA 1 "20, AlaAA 1 "20A A 1 "^AA 1 "20, Leu- A A ^ A A 1 "^AA 1 " 20 itd. Takie zmiany dokonuje się kolejno w pozycjach 2, 3 i 4. Peptydy poszczególnych subbibliotek poddaje się testom biologicznym i w razie potrzeby liczbę składników zestawu aktywnego poddaje się dalszej redukcji według podobnej procedury. Znane są również inne sposoby określania aktywnych składników biblioteki. Biblioteka związków chemicznych jest przydatna jedynie wówczas, gdy dysponuje się niezwykle czułymi i selektywnymi testami pozwalającymi ocenić, czy w badanej mieszaninie znajduje się aktywny składnik. Testy stosowane do badania aktywnych peptydów w wieloskładnikowej mieszaninie oparte są głównie na wykorzystywaniu zjawiska fluorescencji, promieniowania radioaktywnego źródła wprowadzonego za pomocą radioligandów, a przede wszystkim reakcji z wysokospecyficznymi przeciwciałami. Takie testy nie tylko pozwalają na stwierdzenie obecności aktywnego składnika w skomplikowanej mieszaninie, ale są możliwe do wykonania na śladowych ilościach badanych substancji, nawet na poziomie subpikomolowym. Powodzenie reakcji syntezy biblioteki peptydów wymaga stosowania określonych reguł, różnych od obowiązujących w syntezie klasycznej, ponieważ komponenty aminowe z różną szykością ulegają acylowaniu //-pochodnymi poszczególnych aminokwasów, //-chronione aminokwasy rozgałęzione, np. walina czy izoleucyna, są znacznie wolniejszymi czynnikami acylującymi niż te same pochodne aminokwasów słabo rozgałęzionych typu glicyny, alaniny czy kwasu glutaminowego. Syntezę biblioteki peptydów prowadzi się z reguły na fazie stałej, a więc stosuje się nadmiary odczynników acylujących. Zastosowanie jednakowego nadmiaru pochodnych poszczególnych aminokwasów w mieszaninie acylującej prowadzi do mieszaniny peptydów z dominacją reszt aminokwasów bardziej reaktywnych w procesie acylowania. Dlatego w procedurze tworzenia bibliotek peptydów do acylowania stosuje się mieszaninę pochodnych aminokwasów, w której nadmiar składników jest zróżnicowany proporcjonalnie do reaktywności pochodnych poszczególnych aminokwasów. Podobny efekt można osiągnąć przez dwukrotne lub nawet wielokrotne acylowanie równomolową mieszaniną //-chronionych aminokwasów użytą w niedomiarze, np. 0,8 równoważnika w stosunku do komponentu acylowanego podczas pierwszego acylowania i znacznie mniej podczas drugiego etapu tej reakcji. Oczywiście ta procedura jest znacznie bardziej czasochłonna, ponieważ reakcje należy prowadzić tak długo, żeby najwolniej acylujący aminokwas miał wystarczająco dużo czasu na reakcję. Ponadto szybkość reakcji prowadzonej w ten sposób jest mniejsza z uwagi na mniejsze stężenie reagentów acylujących; w typowej syntezie na fazie stałej nadmiar jednego z odczynników znacznie zwiększa szybkość reakcji. Otrzymywanie biblioteki peptydów poprzez acylowanie zestawem aminokwasów prowadzi do powstawania mieszaniny dużej liczby peptydów. Tak więc w procesie otrzymywania biblioteki heksapeptydów, do której syntezy użyto na każdym etapie zestawu aminokwasów kodowanych (których, jak wiemy, jest 20), powstaje mieszanina zawie-

rająca 64 000 000 składników (20 6 ). Często jednak do tego typu reakcji nie włącza się cysteiny ze względu na możliwość spontanicznego tworzenia się mostków disulfidowych, co zarówno zwiększałoby liczbę składników w mieszaninie, jak i utrudniałoby ich identyfikację. Czasami w procedurach otrzymywania biblioteki peptydów rezygnuje się również z tryptofanu, który jest powodem wielu niepożądanych reakcji ubocznych. Używa się natomiast często aminokwasów niekodowanych, a nawet niebiałkowych, np. D-aminokwasów, N-metylowanych aminokwasów czy /^-aminokwasów, co znacznie zwiększa liczbę możliwych permutacji. Taka wieloskładnikowa mieszanina peptydów znajduje się w każdym ziarenku peptydylopolimeru. Można jednak syntezę przeprowadzić w taki sposób, żeby w pojedynczym ziarnie nośnika były cząsteczki tylko jednego peptydu i to o ściśle określonej sekwencji. Tego typu postępowanie nosi nazwę proceduiy dziel-i-łącz — SAC (ang. split-and-combine) lub jedno-ziamo/jeden-peptyd (ang. one-bead/one-peptide). Nadaje się ona jedynie do otrzymywania krótkich peptydów (praktycznie do heksapeptydów włącznie). Schemat 2.3 wyjaśnia zasadę procedury SAC. Przygotowany do wprowadzenia S c h e m a t 2 . 3 . Zasada otrzymywania biblioteki peptydów według procedury dzielenia-i-łączenia, uzyskanie produktu, w którym poszczególne ziania żywicy są obsadzone jednym peptydem ©

F-©

L-©

® — polimeryczny nośnik

V-(P)

łączenie, mieszanie i dzielenie na 3 porcje

FT

Lv

vi

FF-®

LF-©

VF

FL-®

LL-®

VL

FY-®

LY-©

W

-CF 3 + LeuNH 2 1

J

Ł

CT-O-PEG-OMe 20h, 20 C, 0,5% HOH t -AmOH / C 6 H 6 1:1

^

z

_phe_LeuNH

Ł

96%

+

Z-Phe-OH

4%

CT — a-chymotrypsyna; H O - P E G - O M e — monometylowy eter poli (glikolu etylenowego); C T - O - P E G - O M e — chymotrypsyna kowalencyjnie związana z monometylowym eterem poli(glikolu etylenowego), Cam — karboksyamidometyl.

T a b e l a 2 . 4 . Wybrane przykłady użycia C T - O - P E G - O M e do syntezy peptydów

Lp.

Składnik acylujący

Nukleofil Leu-Y' LeuNH 2

Stopień hydrolizy [%]

Czas reakcji [h]

Wydajność peptydu [%]

96

40

8

1

Z-Phe-OEt

2

Z-Phe-OEt

36

78

22

3

Z-Phe-0CH2CF3

36

90

10

4

Z-Phe-0CH2CF3

Leu-OMe

96

8

15

5

Z-Phe-0CH2CF3

D-Leu-OMe

48

63

14

6

Boc-D-Phe-Tyr-Cam

LeuNH 2

96

15

4

7

Boc-Tyr-Gly-Gly-Phe-NHCH3

LeuNH 2

48

70

17

Wyniki prezentowane w tabeli 2.4 wskazują, jak wielkie znaczenie ma reszta estrowa składowej acylującej i rodzaj ochrony grupy karboksylowej komponenta acylowanego. Najlepsze wyniki (największe szybkości i wydajności reakcji) uzyskano w przypadku estrów karboksyamidometylowych (Cam, —CH 2 CONH 2 ), estru cyjanometylowego i trifluoroetylowego; ester etylowy był znacznie mniej korzystny. W składowej acylowanej amidowa osłona grapy karboksylowej zapewniała o wiele lepsze wyniki niż ester metylowy. Zaskakuje stereoselektywność reakcji. Chociaż aktywacja enzymatyczna nie powoduje racemizacji składowej acylującej, to reakcja biegnie również w przypadku aminokwasu acylującego o konfiguracji D, ale szybkość takiej reakcji jest znacznie mniejsza. Akceptowalnym substratem okazał się także amid D-leucyny. Próba syntezy dłuższego peptydu powiodła się z wydajnością 70%, a otrzymany peptyd nie zawierał produktu z błędami. Znane są doniesienia literaturowe opisujące enzymatyczne reakcje syntezy dipeptydów z wydajnością 99%, chociaż średnie wydajności wahają się w granicach 90%. Szybkość reakcji w rozpuszczalnikach organicznych jest zwykle mniejsza niż w środowisku wodnym. Enzymy często stosuje się w postaci immobilizowanej, na przykład poprzez osadzenie na węglu aktywnym, szkle porowatym lub poliamidzie. W takiej procedurze roztwór reagentów przepływa przez kolumnę wypełnioną złożem zawierającym związany chemicznie lub tylko zaadsorbowany enzym. 2.2.2.10.1. Synteza LH-RH. Interesującym przykładem zastosowania enzymów do syntezy peptydów jest synteza dekapeptydu L H - R H (ang. luteinizing hormon releasing hormon — hormon uwalniający hormon lutei ni żujący) (schemat 2.5). W mieszanej procedurze chemiczno-enzymatycznej otrzymano dwa pentapeptydy, które połączono za pomocą chymotrypsyny z bardzo dobrą, 95-procentową wydajnością. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 = pEHWSYGLRPGNH 2 CT, 2 uM I

11

+

pH = 8,5,40%DMF

»

L

H-RH

95%

0,1 OM 0,12M

Schemat 2 . 5 . Synteza metylowego estru jV-terminalnego pentapeptydu, I pE

H

W T: trypsyna

OH DCC

H-

OMe CT: OMe

T

NH2

P: papaina CPD-Y: karboksypeptydaza Y PPSE: specyficzna endoproteaza postprolinowa

OH

CLP:

NH2 OMe

BF3 MeOH

chymotrypsyna

NH2

CT

OEt CPD-Y

NH2

CI'D-Y

/i/--; MeOH

OMe

klostrypaina

2.2. Synteza peptydów S c h e m a t 2 . 5 Cd. Synteza amidu C-terminalnego pcntapeptydu, I I R OH

-OEt

DCC

-OEt

H-OEt

cr OEt

OBzl

CLP

•OBzl

-f"NH2

CPD-Y

•NH2 lub PPSE

' -NH2

2.2.2.10.2. Synteza aspartamu — słodkiego peptydu termolizyna

Z-Asp-OH + 2Phe-OMe

pH =

o 4 o x P h Z-Asp-Phe-OMe • Phe-OMe

HCOONH 4 , Pd / C

^Asp-Phe-OMe + PheOMe

Słodki peptyd jest 200 razy słodszy od eukrozy (sacharozy), przez co efekt odczuwania słodkości wywołuje znacznie mniejsza dawka słodzika. Jego słodki smak dla wielu ludzi nie różni się od smaku cukru. Po spożyciu środków spożywczych zawierających aspartam nie wyczuwa się gorzkiego smaku, charakterystycznego dla niektórych innych surogatów cukru. W przewodzie pokarmowym rozkłada się do Phe i Asp. Również podwyższona temperatura przyspiesza jego hydrolizę, dlatego produktów żywnościowych zawierających aspartam nie należy poddawać obróbce termicznej, a także nie należy ich długo przechowywać. Jedna tabletka zawierająca 0,02 g aspartamu jest źródłem 0,36 kcal (1,51 kJ), pod względem słodkości zastępuje 1 łyżeczkę cukru. Maksymalna dawka dzienna aspartamu wynosi 0,04 g/kg ciała. W 1996 roku światowa produkcja aspartamu przekraczała 4 000 ton rocznie. Aspartam stosowany jest powszechnie do produkcji napojów o niskiej kaloryczności, np. Diet Pepsi, Diet 7Up, Diet Coca Cola i innych. Osoby dotknięte fenyloketonurią nie mogą przyjmować pokarmów słodzonych tym peptydem. Aspartam jest także składnikiem preparatów farmaceutycznych zalecanych w diecie cukrzycowej i niskokalorycznej. Do nich należą Diaspam, Peptis i Sucram, produkowane w postaci tabletek lub proszku. Przez wiele lat funkcję niskokalorycznego słodzika spełniała sacharyna. Znane są i stosowane inne substytuty cukru. Słodki smak wykazuje y-lakton kwasu glukorunowego, który jest dodawany do proszków do pieczenia, niektórych produktów mleczarskich oraz do kiełbas. Do innych najbardziej znanych i stosowanych do słodzenia lub potencjalnych środków słodzących należą monełina i taumatyna (białka), hernandułcyna i peńlartyna (terpenoidy), glicyrhizyna i stewiozyd (glikozydy). Hernandułcyna była stosowana już przez Azteków.

2.3. Wybrane peptydy biologicznie czynne Peptydy, substancje powszechnie spotykane w naturze, pełnią niezmiernie istotne funkcje w organizmach żywych. Są, między innymi, hormonami, regulatorami, substancjami sygnałowymi, decydują także o uwalnianiu lub zahamowaniu wydzielania innych hormonów. Ich brak, niedostatek lub nadmiar wywołuje poważne dysfunkcje, prowadzące często do poważnych dolegliwości, a nawet do śmierci; wpływają również na nasze zachowanie i samopoczucie. W żywych organizmach występują na bardzo różnym poziomie stężeń. Niektóre z nich można izolować z materiału biologicznego na skalę przemysłową, np. glutation czy insulinę, a obecność innych można stwierdzić jedynie niezwykle czułymi metodami analitycznymi, na przykład za pomocą znakowania izotopowego czy przeciwciał monoklonalnych. Peptydy naturalne są bardzo zróżnicowane pod względem wielkości i budowy. Jedne są prostymi oligopeptydami, inne — większe, charakteryzują się skomplikowaną budową przestrzenną. Znane są również peptydy złożone, czyli połączenia peptydów z innymi grupami związków, np. glikopeptycly czy lipopeptydy. Poniżej zostały omówione przykładowe peptydy, wybrane spośród tych, które odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu organizmów żywych.

2.3.1. Glutation (GSH) Glutation jest jednym z najprostszych hormonów peptydowych. W jego skład wchodzą zaledwie trzy reszty aminokwasowe — Glu, Cys i Gly: H 2 NCHCH 2 CH 2 CO — NHCHCO — NHCH 2 COOH COOH

y-Glu — Cys — Gly

CH 2 SH

Glutation jest bardzo rozpowszechniony w przyrodzie, znajduje się bowiem we wszystkich komórkach zwierząt wyższych, a także w wielu mikroorganizmach. Wyizolowano kilka naturalnych analogów glutationu, w których kwas glutaminowy jest zastąpiony kwasem piroglutaminowym lub asparaginowym. Mimo prostej budowy, łatwiej jest go pozyskiwać ze źródeł naturalnych, np. z drożdży, niż otrzymywać syntetycznie. Jego biosynteza katalizowana jest przez enzymy przy współudziale ATP, czym różni się od zachodzącej w rybosomach syntezy białek. Glu + Cys J

ATP enzym

Gly, ATP

y-Glu-Cys —enzym 1 •>

GSH

GSH pełni różnorakie funkcje biologiczne, głównie aktywatora wielu enzymów, występuje także jako koenzym hydrolazy acyloglutationowej, dehydrogenazy formaldehydowej, tautomerazy indolilopirogronowej i wielu innych. Glutation ponadto, dzięki obecności grupy tiolowej SH, działa jako przeciwutleniacz (antyoksydant) oraz reduktor w wielu biologicznie ważnych reakcjach redoks:

2GSH -

[OL

[H] *

GSSG

Jest ważnym czynnikiem usuwającym szkodliwe nadtlenki, w tym wodom i nadtlenki organiczne: 2GSH + ROOH

GSSG + H 2 0 + ROH

Prosta budowa glutationu — j e d n e g o z najkrótszych hormonów peptydowych, zachęcała chemików do podejmowania syntezy jego analogów, ale chociaż zsyntezowano już ich kilkadziesiąt, żaden z nich pod względem aktywności biologicznej nie dorównuje hormonowi natywnemu. Z uwagi na nietypowe wiązanie peptydowe — y-amidowe pomiędzy Glu i Cys i potrzebę chronienia grupy tiolowej, jego synteza nie należy do łatwych, przez co stał się modelem do testowania nowych metod syntezy peptydów i nowych osłon ochronnych, szczególnie grupy SH.

2.3.2. Tyreoliberyna Tyreoliberyna, zwana w skrócie T R F (ang. thyreotropin releasing fcictor), występuje w podwzgórzu, a jej zadaniem jest uwalnianie innego hormonu, znanego pod nazwą tyreotropina (tyrotropina). Sekwencja TRF, która podobnie jak glutation jest tripeptydem, wygląda następująco: pGlu-His-Pro-NH 2 . Jak w przypadku glutationu zsyntezowano wiele analogów TRF, jednak tym razem wysiłek nie poszedł na marne. Jeden z nich, [3-Me-His 2 ]TRF okazał się znacznie aktywniejszy od hormonu natywnego. Symbol reszty aminokwasu zapisanego w nawiasie kwadratowym, wraz z liczbą podaną jako indeks górny, oznacza modyfikację i jej miejsce. Tyreotropina, której wydzielanie stymuluje TRF, jest glikoproteinowym hormonem przedniego płata przysadki, zwiększającym aktywność wydzielniczą tarczycy, w tym wychwyt przez nią jodu, a także pobudzającym syntezę hormonów tego gruczołu. TRF i jego aktywny analog są stosowane w diagnostyce i leczeniu tarczycy.

2.3.3. Adrenokortykotropina (ACTH, kortykotropina) Adrenokortykotropina, hormon produkowany i wydzielany przez przedni płat przysadki mózgowej, działa w nadnerczach, gdzie stymuluje syntezę kortykosteiydów — sterydowych hormonów, zwanych również hormonami kory nadnercza. Te niezbędne do życia substancje są odpowiedzialne za metabolizm sacharydów i równowagę elektrolityczną organizmu. ACTH należy do grupy hormonów zwanych neurohormonami. Nazwa ta jest związana z miejscem ich powstawania, czyli mózgiem. Oprócz neurohormonów wyróżnia się hormony gruczołowe i tkankowe. Wydzielanie ACTH w przednim płacie przysadki następuje w wyniku oddziaływania innego hormonu peptydowego — kortykoliberyny (CRF), tworzącej się pod wpływem bodźców stresowych lub obniżenia poziomu hormonów kory nadnercza we krwi. Kortykotropina po wydzieleniu jest transportowana z mózgu wraz z krwią do kory nadnercza, w której pobudza wytwarzanie kortykosterydów.

Wzrost poziomu korty kostery dó w hamuje wydzielanie ACTH, a w dalszej kolejności samych kortykosterydów. ACTH ponadto bierze czynny udział w przekształcaniu cholesterolu w pregnenolon, podstawowy prekursor wszystkich hormonów steroidowych. W ten sposób kortykotropina nie tylko jest odpowiedzialna za biosyntezę kortykosterydów, ale wpływa także na wytwarzanie hormonów płciowych. Hormon ACTH jest peptydem zawierającym 39 reszt aminokwasowych. Został odkryty już w latach pięćdziesiątych ubiegłego wieku, a jego syntezę przeprowadzono w 1963 roku. Sekwencja a h - A C T H ludzkiego wygląda następująco: 10

20

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-PrQ-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Ai"g-Pra-Val30

39

-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe

ACTH człowieka, wołu i owcy różni się nieznacznie składem aminokwasowym. Od dawna wielu specjalistów próbowało na przykładzie tego peptydu poznać mechanizm działania hormonów peptydowych. Stwierdzono między innymi, że jego N-końcowy fragment 1 - 2 4 wykazuje pełną aktywność biologiczną, a we fragmencie 5 - 1 0 zlokalizowane są miejsca aktywne, natomiast reszty 11-18 stanowią miejsca wiążące z receptorem, a ponadto zawierają informacje przeznaczone dla kory nadnercza i komórek tłuszczowych. W sekwencji 11-24 zawarty jest adres, czyli miejsce przeznaczenia hormonu, a ponadto fragment ten wykazuje działanie antagonistyczne. W sekwencji C-końcowej 25-39 zakodowana jest informacja na temat specyficzności gatunkowej (w tym regionie występują gatunkowe różnice w składzie aminokwasowym). Późniejsze badania wykazały, że samo ACTH, pewne jego fragmenty pozbawione aktywności hormonalnej (np. ACTH 4-9) oraz ich niektóre analogi mają wyraźnie stymulujący wpływ na sprawność umysłową zwierząt doświadczalnych, w tym zdolność zapamiętywania, uczenia się, a także kreowania odpowiedniego zachowywania się (wywołują określone reakcje behawioralne). ACTH, a przede wszystkim jego syntetyczne analogi synacthen i cortrosyn (1-24) mają szerokie zastosowanie kliniczne, głównie w przewlekłej kortykoterapii, do leczenia alergii, zapalenia stawów i innych stanów zapalnych, a także do stymulowania pracy przysadki w pewnych przypadkach jej niewydolności, w przypadku zaniku kory nadnercza spowodowanym długotrwałym podawaniem kortyzonu lub jego analogów oraz w ostrych rzutach stwardnienia rozsianego. Używa się ich w onkologii i hematologii do leczenia białaczek i chłoniaków. Stosuje się je również w reumatologii, w dermatologii do leczenia łuszczycy, a także w endokrynologii, pneumologii i wielu innych, podając zwykle domięśniowo lub we wlewie. ACTH i jego analogów nie zaleca się podawać kobietom w ciąży. Przemysłowa produkcja synacthenu została uruchomiona w 1967 roku.

2.3.4. Proopiomelanokortyna Prekursorem ACTH jest glikoproteina zwana proopiomelanokortyną. Z nazwy tego białka wynika, że jest ono prekursorem nie tylko adrenokortykotropiny, ale również wielu innych biologicznie czynnych peptydów, w tym lipotropin (LPH) i melanotropin (MSH), a także peptydów opiatowych — endorfin i enkefalin (rys. 2.17).

-131

-1

ACTH 1 - 3 9

ACTH 1 - 3 9

?

/?-MSH

?

?

a - M S H CLIP 1-13

/3-LPH 4 2 - 1 3 4

/J-LPH ( 1 - 9 3 wół, 1-91 owca, świnia)

y-LPH 1 - 5 8

0-endorfina 6 1 - 9 1

18-39 ?

/J-MSH 42-58

proopiomelanokortyna Rys. 2 . 1 7 . Fragmentacja proopiomelanokortyny; CLIP — fragment hormonu adrenokortykotropowego (ACTH 18-39); inne skróty wyjas'nione w teks'cie

2.3.5. Melanotropina (MSH) Melanotropina, peptyd wytwarzany przez przysadkę mózgową, występuje w trzech odmianach: Of-MSH, /3-MSH i y-MSH. Prekursorem melanotropin jest wspominana wyżej proopiomelanokortyna. Melanotropiny są to kilkunastopeptydy (a-13AA, / M 8 A A i y-12AA), nieznacznie zróżnicowane gatunkowo u różnych zwierząt pod względem składu i długości łańcucha. Stymulują syntezę melaniny i regulują rozprzestrzenianie się tego barwnika w skórze, przez co wpływają na jej zabarwienie. U zwierząt zimnokrwistych melanotropina jest odpowiedzialna za zmianę zabarwienia skóry prowadzącą do przyjmowania przez zwierzę barw ochronnych na wzór otoczenia. Poziom stężenia melanotropin jest regulowany przez dwa inne hormony peptydowe — melanoliberynę i melanostatynę, które są również uwalniane w przysadce. Przypuszcza się, że peptydy melanotropowe pełnią również funkcję neuromodulatorów i przekaźników bodźców nerwowych.

2.3.6. Lipotropina Nazwa peptydu lipotropina (LPH, ponad 90 AA) jest związana z rolą, jaką odgrywa on w procesie uruchamiania metabolizmu tłuszczów zarówno z izolowanych komórek tłuszczowych, jak i z zapasowej tkanki tłuszczowej, które w normalnych warunkach życiowych są nienaruszalne. Takie działanie LPH wykazały badania przeprowadzone na królikach. U innych zwierząt, podobnie jak i u człowieka, nie stwierdzono oddziaływania lipotropiny na metabolizm tłuszczów; jest ona raczej prohormonem, z którego powstają endorfiny i melanotropiny. Tabela 2.5 podaje możliwą fragmentację /Mipotropiny.

T a b e l a 2 . 5 . Fragmentacja/Mipotropiny ( 1 - 9 2 ) Fragment /Mipotropiny 1-58

Produkt fragmentacji y-lipotropina

42-58

yS-MSH

61-91

/?-endorfina

61-76

a-endorfina

61-77

y-endorfina

61-79

ó-endorfina

61-65

Met-enkefalina

2.3.7. Peptydy opioidowe Odkrycie w 1975 roku przez Kosterlitza i współpracowników występującej w mózgu ssaków enkefaliny (gr. enkephalos — mózg), endogennego pentapeptydu o właściwościach podobnych do morfiny, wzbudziło zrozumiałe zainteresowanie chemików peptydowców, a także biochemików, biologów, lekarzy i farmaceutów. Później poznano ponad 20 innych peptydów o podobnych właściwościach, a wśród nich endorfiny (1976), dynorfiny (1979), delt orfiny, oksorfiny (1979), kcizomorfiny (1979) czy dermorfuiy (1981). Pierwszy z nich — enkefalina, okazała się mieszaniną dwóch peptydów różniących się na C-końcu — Leu-enkefalina zawiera leucynę — Tyr-Gły-Gły-Phe-Leu, a Met-enkefalina — metioninę. Inne peptydy o właściwościach opioidowych, np. endorfiny, najczęściej również występują jako mieszaniny analogów opisywanych za pomocą greckich liter a,/3,y czy ó. Powstają one z kilku różnych prekursorów białkowych, w tym z proopiomelanokortyny, proenkefaliny A i proenkefaliny B (prodynorfiny). Mimo że w /3-endorfinie również znajduje się sekwencja enkefaliny, nie z niej ona powstaje. Prekursorem enkefaliny ludzkiej jest wymienione powyżej białko — proenkefalina A, zawierająca 271 reszt aminokwasowych. W białku tym znajduje się 6 sekwencji Met-enkefaliny (fragmenty 100-104, 107-111, 146-150, 189-193, 210-214 i 261-265) oraz jedna sekwencja Leu-enkefaliny (230-234). Peptydy opioidowe wyizolowano również ze skóry żab (dermorfiny), a także z produktów enzymatycznego trawienia kazeiny (^-kazomorfiny). Peptydy te i ich syntetyczne analogi nazwano peptydami opioidowymi z uwagi na ich aktywność biologiczną zbliżoną do narkotyków otrzymywanych z maku, tj. klasycznych opiatów makowych. Obie te grupy związków mają podobne zarówno zalety, jak i wady. W wielu ośrodkach badawczych postanowiono, wykorzystując enkefaliny, zaprojektować i zsyntezować lek podobny do morfiny, o silnym działaniu przeciwbólowym, poprawiający zarazem samopoczucie, ale pozbawiony jej niepożądanych cech związanych z uzależnieniem i innymi przykrymi efektami ubocznymi. Ponadto wysiłki badawcze starano się tak ukierunkować, żeby otrzymać lek, który mógłby być przyjmowany doustnie. Spełnienie tego warunku, jak wiadomo, jest w przypadku peptydów niezmiernie trudne, ponieważ są one nie tylko

podatne na hydrolizę enzymatyczną, ale i trudno pokonują barierę rdzeniowo-mózgową, co dla silnych środków przeciwbólowych jest konieczne. Do dzisiaj nie udało się otrzymać takiego leku, chociaż zsyntezowano wiele analogów enkefalin znacznie silniejszych od morfiny pod względem aktywności przeciwbólowej (analgetycznej). 2.3.7.1. Właściwości biologiczne opioidów; receptory opioidowe Aktywność biologiczna opioidów charakteryzuje się szerokim spektrum oddziaływania. Do najbardziej znanych właściwości należą: rdzeniowe i suprardzeniowe uśmierzanie bólu, działanie uspokajające, wywoływanie euforii, dysforii, halucynacji, a także narkotycznego uzależnienia. Ponadto opioidy utrudniają oddychanie, powodują problemy żołądkowe, stymulują uwalnianie lub hamują wydzielanie niektórych hormonów czy neurotransmiterów, wpływają na temperaturę ciała, są przyczyną wielorakich efektów kardiowaskularnych, oddziałują na wzrost nowotworów oraz wywierają wpływ na układ immunologiczny. Enkefaliny i ^-endorfiny zwiększają aktywność komórek NK i innych ciał odpornościowych, w tym komórek T i B. Receptory opioidowe występują licznie w regionach szczególnie istotnych dla centralnego układu nerwowego i kardiowaskularnego na przykład w mózgu czy szpiku, co może świadczyć o silnym oddziaływaniu opioidów na te ośrodki. Stwierdzono również wpływ enkefalin na ciśnienie kiwi i akcję serca, w tym wywoływanie jego arytmii. Biorąc pod uwagę tę ostatnią cechę, poszukiwano antagonistycznych analogów enkefalin, licząc na znalezienie leków pomagających chorym dotkniętym arytmią serca. Na zasadach podobnych do otrzymania prototypu, jakim był nalokson (antagonista morfiny), otrzymano antyarytmiczne leki typu Helokamy i propranololu. Podobny efekt działania naltreksonu, leku stosowanego do leczenia uzależnienia od środków odurzających, przypisywany jest blokowaniu przez niego receptorów opioidowych K. Stwierdzono, że niektóre typy arytmii są osłabiane po domózgowym podaniu Met-enkefaliny. Dotychczas opisano istnienie co najmniej kilku typów receptorów opioidowych: ju, ó, k, £ i ó. Niektórzy autorzy sugerują ponadto istnienie szeregu podtypów takich j a k / / ] 5 ju2, /c la , /c,b, k 2 i /c3. Tworzą one wspólny system receptorów opioidowych zarówno dla opioidów makowych, jak i peptydów opioidowych. Dotychczas jednak nie udało się ustalić zależności związanych ze specyficznym oddziaływaniem opioidów a powinowactwem receptorowym, tzn. nadal dokładnie nie wiadomo, które receptory są odpowiedzialne za niepożądane efekty uboczne, a które przenoszą oddziaływania analgetyczne czy też poprawiające samopoczucie. Pewne doniesienia sugerują jednak, że receptory/* są odpowiedzialne zarówno za efekt przeciwbólowy, jak i uzależnienie narkotyczne, a także za zaburzenia oddychania po wpływem opioidów. Endogenne peptydy opioidowe, podobnie jak klasyczne opiaty na czele z morfiną, nie wykazują wyraźnej specyficzności w stosunku do receptorów. Co prawda enkefaliny preferują receptor ó, ale wyraźnie wiążą się też z receptorem ju. Dynorfiny z kolei wykazują większe powinowactwo do receptorów K, ale współdziałają też z receptorami ju i ó, a ponadto wiążą się ze swoim specyficznym receptorem s. Dermorfiny wykazują silną, chociaż niespecyficzną/(-selektywność. Jedynymi dotychczas poznanymi, receptorowo specyficznymi, naturalnymi peptydami opioidowy-

mi, są deltorfiny wykazujące powinowactwo do receptora 3000

>2

33

325

10

> 50 0 0 0

> 50 0 0 0

~1

Dermorfina

3

29

9

Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2

1

3

3

Dynorfina A ( 1 - 1 3 )

231

162

[Ala']-dynorfina A ( 1 - 1 3 )

750

25 5 0 0

/3-endorfina /3-AIa-Tyr-GIy-GIy-Phe-Met /V-Met-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-NH2 Tyr-Ala-Gly-NHCH(CH3)CH2CH(CH3)2

0,08 34

tkanki mózgowe szczura lub świnki morskiej, w których udział poszczególnych receptorów jest dokładnie zdefiniowany. W mózgu szczura znajduje się 46% receptorów typu /i, 42% ó i tylko 12% typu k, natomiast w mózgu świnki morskiej przeważają receptory typu k — 44%, a receptorów ó i fx jest odpowiednio 24% i 32%. Tak dokładne oznaczenie udziałów poszczególnych receptorów w odpowiednich tkankach było możliwe dzięki wykorzystaniu bardzo selektywnych radioligandów, tj. radioaktywnych związków łączących się wyłącznie z jednym, określonym receptorem. Selektywność opioidów (tab. 2.6) przedstawia się za pomocą wartości IC 50 albo ilorazu stałych dysocjacji K, dla poszczególnych receptorów, przy czym wartość IC 50 oznacza dawkę związku potrzebną do zahamowania skurczów badanych tkanek o 50%. Stosowanych dawniej testów in vivo, takich jak test gorącej płytki czy też test cofania ogona szczurzego, obecnie zaniechano z uwagi na ochronę zwierząt przed cierpieniem. Badanie aktywności przeciwbólowej in vivo opiera się na znanym opóźnianiu przez analgetyki reakcji na bodźce bólowe. Test gorącej płytki polega na umieszczeniu szczura lub myszy na elektrycznej płytce ogrzanej do temperatury 56°C, po uprzednim podaniu im środka przeciwbólowego. Po pewnym czasie, zależnym od dawki i aktywności preparatu przeciwbólowego, zwierzę doświadczalne objawia przeciwbólowe odruchy obronne, takie jak lizanie łap, podskoki i wreszcie zeskok z płytki. W teście tym mierzy się czas reakcji zwierzęcia na bodziec bólowy, jakim jest podwyższona temperatura. Natomiast w teście cofania ogona mierzy się czas reakcji obronnej, czyli cofnięcie ogona pod wpływem jego punktowego ogrzewania lub ucisku.

2.3.7.3. Enkefaliny Enkefaliny są najmniejszymi endogennymi peptydami opioidowymi. Zostały wyizolowane z mózgu i innych ośrodków nerwowych wielu kręgowców. Nie stwierdzono ich obecności w układzie nerwowym bezkręgowców. Znane są dwie naturalne enkefaliny — Met-enkefalina i Leu-enkefalina, różniące się jedynie jedną resztą aminokwasową w pozycji C-terminalnej: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met,

Met-enkefalina

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu,

Leu-enkefalina

Największe stężenie enkefalin obserwuje się w takich rejonach mózgu jak: prążkowie — 750 pmol/g Met-enkefaliny i 180 pmol/g Leu-enkefaliny oraz podwzgórze odpowiednio 450 pmol/g i 54 pmol/g. Poza mózgiem szczególnie duże stężenie enkefalin stwierdzono w komórkach kory nadnerczy. Enkefaliny ulegają szybko enzymatycznej biodegradacji przez takie enzymy, jak enkefalinaza, karboksypeptyclazy czy aminopeptydazy• Z tego powodu przeciwbólowe działanie egzogennych enkefalin objawia się jedynie po ich dokomorowej iniekcji do centralnego układu nerwowego. Nawet po takim podaniu ich działanie jest nie tylko słabsze niż morfiny, ale i wyjątkowo krótkotrwałe — rzędu 2 minut. Częste podawanie enkefalin zwierzętom doświadczalnym wywołuje u nich tolerancje i uzależnienie. Stwierdzono, po-

132 dobnie jak i dla innych opioidów, bezpośredni wpływ enkefalin na funkcje układu nerwowego oraz na aktywność wydzielniczą hormonów przysadki. Istotną rolę w oddziaływaniu enkefalin z receptorami odgrywa tyrozyna zajmująca pozycję 1. Usunięcie jej łub zastąpienie tak podobnymi aminokwasami, jak fenyłoalanina czy D-tyrozyna, prowadzi do całkowitej utraty aktywności. Porównując budowę enkefalin z budową morfiny, można zauważyć wspólny fragment, odpowiadający ugrupowaniu tyraminy. Właśnie temu ugrupowaniu przypisuje się kluczową rolę w oddziaływaniu enkefalin z receptorami opioidowymi. Tyramina, pochodna tyrozyny, występująca między innymi w sporyszu, jest substancją bardzo toksyczną, o silnym działaniu fizjologicznym. Podobieństwo opiatów klasycznych do peptydów opioidowych i ich zbliżone właściwości biologiczne wynikają z powinowactwa do tych samych receptorów. Są również i różnice we właściwościach tych dwóch grup związków, widoczne przede wszystkim w zmianach pod wpływem pewnych modyfikacji cząsteczek. Allilowanie grupy aminowej morfiny prowadzi do związku o diametralnie innych właściwościach biologicznych — do naloksonu, silnego antagonisty morfiny (rys. 2.18). W wyniku podobnych modyfikacji cząsteczek enkefalin nie udało się otrzymać analogów o właściwościach antagonistycznych. Oczywiście w kształtowaniu aktywności biologicznej enkefalin, oprócz ugrupowania tyraminowego, duże znaczenie ma determinowana składem aminokwasowym konformacja całej cząsteczki. Glicyna w pozycji 3 i reszta aminokwasu aromatycznego w pozycji 4 mają istotne znaczenie dla zachowania wysokiej aktywności enkefalin. Obecność piątego aminokwasu nie jest konieczna do utrzymania aktywności biologicznej peptydów, ale jego brak zmienia względne powinowactwo wobec receptorów pi i