Cromatografie Gaze Lichide [PDF]

Zitiervorschau

II. CROMATOGRAFIA Analiza cromatografica include mai multe metode de separare si totodata de analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie între doua faze. Una dintre faze este imobila si poarta denumirea de faza stationara (aflata de regula într-un tub numit coloana) iar cealalta -faza mobila, denumită și eluent , se deplaseaza prin golurile primei faze. Separarea speciilor chimice dintr-un amestec se petrece în coloana cromatografica, piesa cheie a întregii metode. Faza mobila,– se scurge continuu, cu viteza constanta, prin interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, provoacă migrarea, cu viteze diferite, a celor n componenti ai amestecului de separat dea lungul coloanei. Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la începutul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa la gazcromatografie și pompă de înaltă presiune la comatografia de lichide de tip HPLC), si se afla initial fixat într-o zona îngusta de la începutul coloanei. Spalati de eluent, o parte din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (nu orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retenție si aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza în grupuri, în fiecare grup existând doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila sesizarea pe rând a componentilor, la parasirea coloanei cromatografice de catre un detector care este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (în mod ideal la oricare) dintre speciile moleculare ce traversează coloana ceomatografică. Detectorul dă un semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component în faza mobila. Intr-o exprimare plastică se poate spune că detectorul "marcheaza" trecerea fiecareia din substantele ce compun initial amestecul analizat în mod similar cu un sistem Video care înregistreaza trecerea liniei de sosire de către concurenti în atletism.

Fig. II.1. Elementele unei cromatograme Dacă se inregistrează semnalele date de detector in funcție de timp se obține o cromatogramă. Pe cromatograma se disting o serie de maxime, numite peak-uri (peak engl. = vârf), care se produc deasupra liniei de baza sau a portiunii orizontale a curbei, paralela cu axa timpului. In cazul ideal, oricare peak are forma distributiei normale Gauss. In cazul introducerii unui singur component intr-un eluent inert se obține cea mai simplă cromatogramă posibilă de tipul celei din figura II.1. Pe axa absciselor fiind reprezentat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului – exprimat în unitati arbitrare. In cazul unei cromatograme distingem urmatoarele elemente de bază: 1. Peak- urile cromatografice. În cazul prezentat în fig. 1, cele doua semnale sau vârfuri sunt denumite peak-uri care sint valorificate în toate metodele cromatografice în scopul analizei calitative si cantitative a speciilor prezente in amestecul analizat. In acest sens inălțimea peak-ului sau suprafa ța lui reprezintă o măsură a concentrației speciei chimice și timpul de sosire la detector ( denumit timp de retenție) reprezintă o caracteristică a naturii speciei. In sens pur grafic o cromatogramă este asemănătoare cu o spectrogramă. Diferențele intervin la faptul că la o spectrogramă identificarea speciilor dintr-un amestec se face prin lungimea de undă care este o constantă fizică, iar la o cromatogramă identificarea speciilor se face prin timpul de retenție care este o mărime caracteristică numai in conditii date de temperatură, presiune, uzura coloanei etc. La analiza amestecurilor complexe cromatografia este superioară spectrometriei. La analiza spectrometrică a unor amestecuri complexe, cu lungimi de undă

1

specifice apropiate pentru unele specii chimice, se poate ajunge la identificări greșite. Asemenea erori sînt excluse la cromatografie deoarece componentele amestecurilor analizate trec la timpi diferiți prin dreptul detectoarelor specifice fiind astfel exclusă atît confuzia acestora cît și posibilitatea ca acestia să părăsească coloana neidentificați . Primul peak din cromatogramă, de înălțime mai redusă, corespunde unui component inert ( gazul purtător în cromatografia de gaze sau diluantul lichid in cromatografia de lichide ) - care este retinut în foarte mică măsură de coloana cromatografică. Cel de-al doilea peak , notat cu C, corespunde speciei (unice în cazul de fata) analizate. Sosirea intirziată a grupului de molecule a acestei specii față de eluent se datorează staționarii mai îndelungate în coloana cromatografică ca urmare afinității mai mari a acestei specii față de materialul coloanei. Gradul de afinitate este exprimat prin numărul absorbțiilor și desorbțiilor repetate de pe umplutura sau pereții coloanei și este o caracteritrică a naturii speciilor analizate. Cu cît numărul absorbțiilor și desorbțiilor este mai mare pe traseul parcurgrerii coloanei de către o specie chimică cu atît mai tîrziu va sosi aceasta la detector la. In cazul unor amestecuri complexe timpii de sosire se vor distribui pe un anumit interval Timpul mort, tM - este timpul în care un component, complet neretinut de catre faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pâna la detector. Acesta nu poate fi zero. În cazul gazcromatografiei (GC) timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retentie al aerului: t M = tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul scurs de la injectarea (introducerea) probei în coloana si aparitia maximului de concentratie în detector, pentru componentul neretinut. Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component al amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si aparitia maximului de concentratie în detector. De exemplu, în cazul prezentat anterior în fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (începutul cromatogramei) pâna la verticala prin vârful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur sau în amestec. Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de retentie (legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Qe): VR = tR·Qe Timpul de retentie ajustat, tR'- introdus în cromatografie pentru a se putea compara timpii masurati pe coloane diferite, în cazul aceluiași component - este dat de diferenta: tR' = tR - tM Volum de retentie ajustat are expresia : VR' = VR - VM unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei, Fe, prin produsul: VM = tM·Fe si reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la coloana la detector. II.1. CLASIFICAREA TEHNICILOR CROMATOGRAFICE S-au realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele în primul rând prin natura fazei mobile, dar si a celei stationare. Astfel se distinge: a. cromatografia de gaze (GC) când faza mobila este un gaz; b. cromatografia de lichide (LC) când faza mobila este un lichid c. cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobila este un lichid aflat peste temperatura critica. In cadrul cromatografiei de gaze (GC) se disting urmatoarele tehnici: 1. Cromatografia gaz-lichid (cromatografie de repartiţie), faza stationara este un lichid nevolatil imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, de tip silicagelul sau alumina, situat într-o coloană, la asa-numita cromatografie conventională sau suportul poate fi chiar peretele coloanei, confectionată la dimensiuni capilare, la așa numita cromatografie pe coloana capilara.

2

2. Cromatografia gaz-solid (cromatografie de absorbţie), faza stationara o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv “sitele moleculare” (niste silicati naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de importanta pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.) II.2. CROMATOGRAFIA DE GAZE Prin cromatografie de gaze pot fi anlizate toate amestecurile de lichide gaze sau solide care pot fi trecute sau există în stare gazoasă şi care nu se descompun la încălzire în alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiză este acela în care amestecurile supuse analizei sînt în stare lichidă din care sînt aduse în stare gazoasă prin evaporare .Singura restrictie pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este la substanţele la care temperatura de vaporizare este mai mare decît temperatura de descompunere a substantelor de analizat rezultind alţi compuşi decît cei supuşi analizei. In aceste cazuri Înainte de introducerea probei în cromatograf se pot realiza niste derivati (compusi noi), volatili, utilizând anumite reactii chimice specifice, procedeu denumit derivatizare. Uşurinta cu care se pune la punct o analiza noua, sensibilitatea sa, posibilitatea de automatizare precum si largile posibilitati de aplicare sunt avantajele principale ale acestei metode. Printre domeniile în care GC si-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia, industria farmaceutica, protectia mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistica. La cromatografia cu gaze proba este evaporată la intrarea în coloana cromatografică fie direct la capătul acestei fie într-un dispozitiv special plasat tot la intrarea în coloană. Separarea de-a lungul coloanei (eluţia) are loc cu ajutorul unui gaz purtător care spre deosebire de cromatografia de lichide nu interacţionează cu faza mobilă , singurul lui scop fiind acela de agent de transport a speciilor chimice din amestec prin coloană. Începuturile Cromatografiei de gaze sînt legate de coloane cu umplutură în care se transfera amestecul de substanţe gazoase după ce în prealabil erau evaporate spontan într-un injector încălzit. La ora actuală este folosită în exclusivitate numai cromatografia de gaze cu coloane fără umplutură cu cele dou[ tipuri : - cromatografia de gaze pe faze staţionare solide (cromatografie de absorbţie) - cromatografia de gaze pe faze staţionare lichide (cromatografie de repartiţie) La cromatografia de gaze pe faze staţionare solide retenţia speciilor de analizat din amestec este realizată pe bază de absorbţie fizică pe peretele interior al coloanelor cromatografice ce au diametre interioare de zecimi de milimetrii şi lungimi apreciabile de ordinul zecilor de metrii. Din cauza unor absorbţii ireversibile, care duc la rîndul lor reproductibilităţi slabe, această tehnică este folosită rar şi numai la substanţe cu puţine molecule în structură. Cromatografia de gaze pe faze staţionare lichide se bazează pe repartiţia substanţei de analizat între faza mobilă gazoasă şi o faza lichidă imobilizată pe peretele interior al coloanei cromatografice. Acest tip de cromatografie de gaze este folosită la ora actuală la scara cea mai larga. Relaţiile matematice care o descriu sînt valabile cu mici modificări şi la cromatografia de lichide, aceste modificări sînt dictate de faptul că gazele sînt compresibile şi ca atare proprietăţile şi comportarea reologică sînt influenţate de presiune şi de temperatură. Din acest motiv la cromatografia de gaze este folosit în locul timpului de retenţie tr volumul de retenţie Vr care ţine cont de debitul mediu Q al fazei mobile exprimată în ml/min, debit ce depinde de presiune şi de temperatură : Vr = t r . Q Spre deosebire de cromatografia de lichide viteza fazei mobile are o influenţă mare asupra lăţirii de bandă ( vezi şi cap. – Cromatografia de lichide) influenţa difuziei longitudinale fiind importantă dtorită coeficientului de difuzie mai ridicat cu 3-4 ordine de mărime la gaze faţă de cel al lichidelor. II.2.1. Aparate folosite în gazcromatografia de gaze Un gazcromatograf respectă schema bloc din figura avînd particularităţi specifice pentru analiza unei faze gazoase schema lui de principiu arată ca în figura II.2.

3

Fig.II.2. Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1-butelie de gaz purtător, 2-reductor de presiune, 3 manometru de înaltă presiune, 3- manometru de joasă presiune, 5- regulator de presiune şi debit, 6seringă de injecţie pentru substanţe de analizat în stare iniţială lichidă, 7-dispozitiv de evaporare rapidă , 8-cuptor termostatat de încălzire, 9- coloană cromatografică tubulară, 10- detector, 11amplificator electronic, 12- sistem electronic de achiziţie prelucrare şi afişare date, 13 – calculator, 14- imprimantă II.2.1.1. Alimentarea cu gaz purtător Gazul purtător trebuie să fie inert din punct de vedere chimic. Din acest punct de vedere intră în discuţie gazele inerte, hidrogenul, azotul şi bioxidul de carbon. Natura gazului utilizat depinde de tipul de detector folosit , iar acesta depinde la rîndul lui de mai mulţi factori dar în principal de clasa de substanţe analizate. Gazele purtătoare de înaltă puritate sînt preluate de regulă din butelii speciale de înaltă presiune prevăzute cu reductoare de presiune ce asigură presiuni de intrare cuprinse între 1,5 şi 3 ata, dar pot fi produse şi pe loc cu generatoare speciale ( hidrogen, azot). Pe traseul gazului purtător se găseşte un debitmetru electronic precum şi o sită moleculară pentru reţinerea vaporilor de apă şi a eventualelor impurităţi solide de dimensiuni mici. II.2.1.2. Sistemul de injecţie Caracteristicile sistemului de injecţie asigură în mare parte responsabile de lăţirea de bandă a peak-urilor. Un sistem

calitatea

analizelor cromatografice, fiind

Fig.II.3. Fazele de injecţie ale amestecului lichid de analizat performant de injecţie trebuie să asigure injecţia în timp scurt a unor cantităţi extrem de mici de subsatanţă de analizat numai aşa sînt asigurate peak-uri înguste la bază. Extragerea probei se face dintr-un minirecpient cilindric de sticlă aşezat pe suportul mobil a autosamplerului prin intermediul unei

4

microseringi speciale acţionată automat. Acul seringii perforează un dop de cauciuc siliconic sau şi absoarbe o cantitate bine definită de probă, figura II.3. , după care se ridică automat , se deplasează şi injectează proba printr-un “semptum” prevăzut cu un dop de cauciuc siliconic într-un dispozitiv de evaporare rapidă situat la intrarea în coloană. Este foarte important ca evaporarea să se producă practic instantaneu astfel încît amestecul fazei purtătoare cu substanţa de analizat să se producă chiar la baza coloanei cromatografice. Volumul unei probe analizate pentru coloane analitice normale variază de la cîţiva μl la cca 30 μl, la coloane capilare volumul probei este mult mai mic de cîtiva nl fiind necesară folosirea unui sistem de splitare ( divizare), figura II.4., a volumului probei , sistem care asigură preluarea pentru analiză numai a unui volum extrem de mic restul fiind purjat în mediu. Aceste sisteme de splitare sînt în principiu divizări de debit cu tuburi de tip “T”, existente atît pe traseul gazului purtător cît şi pe cel al amestecului gazos, pe ale cărori ramuri se crează rezistenţe hidraulice bine controlate astfel încît să poată fi purjată cea mai mare parte din substanţa de analizat, pe coloană ajungînd numai o parte infimă de amestec şi gaz purtător aşa cum de altfel este necesar. Manipularea a unor cantităţi

Fig. II.4. Două procedee de splitatare a volumului probei la cromatograful de gaze a. tub de evaporare cu dop de vata de sticlă sau de cuarţ , 4 corpul dispozitivului de injecţie , 5- ventil cu 3 căi, 6- ventil cu ace cu debit reglabil mici de probă, aşa cum este cazul la gazcromatografie, pe cale manuală duce la erori importante motiv pentru care pentru dozare şi injecţie sînt recomandate dispozitive de tip autosampler. II.2.1.3. Coloane cromatografice Termenul de coloană cromatografică este oarecum impropriu pentru cromatografia de gaze, el provine incă din timpul în care se foloseau coloane cu umplutură de lungimi rezonabile care încăpeau în gazcromatograf sau care erau montate în poziţie verticală lîngă aparat avînd o termostatare concentrică. Diametrul interior al coloanelor cu umplutură pentru gazcromatografie este de 4,6 mm, 3,18 mm sau la aşa numitele coloane “micro”