Désintégration Cellulaire [PDF]

Zitiervorschau

Melle. AOUACHRIA S.

Désintégration cellulaire

1. Désintégration cellulaire La désintégration de la cellule ou la lyse est une étape initiale de la préparation de l'échantillon à analyser. La Lyse vise à rompre la membrane plasmique ou la paroi pour la cellule végétale et fongique en libérant les substances ou structures désirées. Pour se faire, le matériel biologique est mis dans un tampon de pH et force ionique connus. Les composantes cellulaires se retrouvent donc libérées dans le tampon. Le mélange résultant du matériel biologique ainsi brisé et du tampon est appelé homogénat.

2. Techniques désintégration cellulaire Il existe plusieurs méthodes de lysats cellules qui se divisent en méthodes mécaniques, chimiques et enzymatiques.

2.1. Les techniques mécaniques 2.1.1. Broyeurs mécaniques Une des approches qui a été développée la première est celle du broyage mécanique, essentiellement dérivé des mortiers et des pilons utilisés en chimie ou en pharmacie. Cependant, sauf pour certaines applications spécifiques où le matériel est sous forme solide, sèche ou congelée, cette approche se prête mal au matériel biologique, particulièrement si on doit homogénéiser en milieu liquide. Des appareils répondant mieux aux besoins des biologistes ont donc été conçus. Il existe plusieurs variantes de ces appareils :  Homogénéisateur de type Dounce Cet appareil (fig. 1) ressemble à une éprouvette (aux parois épaisses) dans laquelle s’enfonce un piston serré. Le passage des cellules dans l’espace extrêmement exigu entre le piston et la paroi interne du tube cause leur éclatement. En faisant tourner et descendre rapidement le piston dans le bol, on force les cellules à passer dans l'espace libre entre le piston et la paroi du bol. Par cisaillement, les membranes cellulaires s'ouvrent et libèrent les organites. Suivant la taille des cellules, on utilise des Dounce de "clearance" différentes. La "clearance" est l'espace compris entre le piston et la paroi du bol.

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Fig.1. L’homogénéisateur de type Dounce.  L’homogénéisateur de type Potter‐Elvehjem Il

ressemble à un Dounce

motorisé; son piston a souvent une tête de téflon et tourne dans le

cylindre contenant les cellules resuspendues (fig. 2).

Fig.2. L’homogénéisateur de type Potter‐Elvehjem.

En faisant tourner et descendre rapidement le piston dans le bol, on force les cellules à passer dans l'espace libre entre le piston et la paroi du bol (clearance). Les membranes cellulaires s'ouvrent et libèrent les organites (fig. 3).

Fig. 3. Action des broyeurs mécaniques. 2

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2.1.2. La presse Aminco-French Cet appareil (fig. 4) n’est pas français, il a été mis au point par un certain Dr. French (un nom d’inventeur plus facile à porter). L’appareil vise à forcer les cellules à passer dans un espace plus petit qu’elles, ce qui déchire leur membrane (et réduit la plupart de leurs structures). Il consiste en un cyclindre creux en métal, cylindre dans lequel s’enfonce un piston de métal nanti de plusieurs o-rings d’un caoutchouc très solide. À la base du cylindre, une petite valve est installée; celle-ci peut être obstruée par une petite bille en téflon.

Fig. 4. La presse Aminco-French. La suspension de cellules est versée dans le cylindre. Le piston est installé, obstruant le trou, et une puissante vis sans fin commence à l’enfoncer dans le cylindre. Comme il n’y a que peu d’air dans le cylindre et qu’un liquide est à toute fin pratique incompressible, l’enfoncement du piston fait très rapidement grimper la pression sur les parois du cylindre. Quand on ouvre légèrement la valve, la suspension de cellules est éjectée et les cellules sont déchiquetées. Plus la pression est haute dans le cylindre, plus totale est la lyse (fig. 5).

Fig. 5. Mécanisme d’action de la presse Aminco-French. 3

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2.1.3. Homogénéisateurs à gaz ou la bombe à disruption Homogénéisateur à gaz ou la bombe à disruption (fig. 6) consiste en une chambre pressurisée dans laquelle les cellules sont traitées avec de l'azote à haute pression (la pression peut atteindre 350 bars). La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides. On libère alors la pression tout d'un coup; l'azote en solution reprend son état gazeux, forme des bulles à l'intérieur des cellules et les fait éclater. Les cellules sont enfermées dans une chambre métallique que l'on pressurise à l'aide d'un gaz inerte (azote ou argon). Une brusque décompression disloque les structures cellulaires. En effet, lors du passage de 350 atm à 1 atm, les cellules éclatent à cause de la formation de bulles de gaz. A pression élevée, le milieu liquide dissout mieux les gaz et un dégazage important se produit en revenant à la pression atmosphérique.

Fig. 6. Homogénéisateur à gaz ou la bombe à disruption. L'intérêt de la technique est le fait que l'on travaille sous une atmosphère inerte ce qui élimine les risques de réactions d'oxydation, on ne provoque pas d'échauffement et les organites cytoplasmiques sont préservés. 2.1.4. Les billes de verre L’appareil utilisé pour cette technique ressemble à un blender à ceci près qu’il est beaucoup plus petit et ne contient pas de lames. Son contenant amovible est rempli de petites billes de verre sur lesquelles on verse la suspension de cellules (fig. 7). La suspension se répartit entre les billes. Il est important de remplir complètement le contenant et de ne pas y laisser d’air pour éviter de faire de la mousse et d’oxyder les protéines. Le tout est alors scellé et on lance la machine, qui

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fait furieusement tourbilloner les billes de verre dont l’action abrasive a tôt fait de réduire les cellules en charpie. Séparer les billes du lysat est très facile parce que les billes coulent au fond dès que l'agitation cesse. On doit prendre soin de garder le tout au frais; en fait le contenant est souvent nanti d’une chambre où on installe de la glace. Le mouvement des billes génère en effet beaucoup de chaleur.

Fig. 7. Billes de verre. 2.1.5. Sonication Elle consiste en la destruction des cellules par les ultrasons. Ici, une tige de métal le "sonicateur" ou à l’extrémité très fine. La sonotrode est introduite dans la suspension de cellules et induite à vibrer violemment, émettant un bruit fort déplaisant même pour l’utilisateur portant ses cacheoreilles obligatoires (fig. 8).

Fig. 8. Sonicateur. Quand un sonicateur fait vibrer les molécules d’eau. Les vibrations ultrasoniques réussissent à briser les ponts hydrogènes qui assurent l'état liquide de l'eau, ce qui les convertit en gaz. Il s'agit en quelques sortes d'une ébullition à froid, effectuée en agitant les molécules d'eau. Mais comment maintenir de l'eau à l'état gazeux dans un liquide froid? Assurément cela ne peut pas 5

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durer bien longtemps et le gaz se condense. Or voilà: le gaz qui se condense perd du volume et laisse derrière lui un espace vide (une cavité, d'où le nom de "cavitation"). L'eau liquide se précipite dans l'espace vide pour le remplir, et les molécules d'eau liquides entrent en collision au cœur de la cavité (fig. 10). Le problème avec le sonicateur est qu'il génère beaucoup de chaleur dans le matériel biologique. L'utilisateur a tout intérêt à garder le tube dans lequel a lieu la sonication dans un bac à glace.

Fig. 9. Schéma du dispositif du sonicateur. On soumet les cellules à une source d'ultrasons. Les ultrasons sont générés par un "transducteur" en céramique, c'est un organe qui transforme l'énergie électrique domestique (50 à 60 Hz) en énergie ultrasonique (20 kHz). 2.1.6. Congélation –décongélation On peut aussi faire subir au matériel biologique des cycles de congélations et de décongélations qui briseront les membranes. Des températures de -20°C sont souvent suffisantes. En général, ces méthodes ne permettent pas de préserver l'intégrité des structures membranaires et beaucoup d'organites sont endommagées. Dans certains cas, un refroidissement très rapide et très profond est requis, particulièrement pour inactiver toute activité enzymatique ou une décomposition de produits particulièrement labiles. L'azote liquide peut alors être employé. Le matériel peut par la suite être réduit en poudre. Le clampage à froid est une variante de cette approche. Cette technique consiste à comprimer des tissus entre les plaques de pinces refroidies à l'azote liquide.

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2.2. Techniques chimique et enzymatiques 2.2.1. Lyse ou choc osmotique En créant par dilution une hypotonicité du milieu, on provoque l'éclatement des cellules. Mais il y a le risque, dans cette opération, de faire éclater les organites. Le choc osmotique permet de briser certaines cellules fragiles avec un minimum de dommages. Les cellules sont incubées dans une solution hypo-osmotique. Cherchant à rétablir l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par causer une rupture de la membrane plasmique. On peut donner un coup de pouce à la technique avec un peu de détergent (NP-40, LDAO, triton X-100) et avec un soutien mécanique (quelques coups de piston dans un homogénéisateur de type Dounce). Une telle approche permet de récupérer des noyaux presque intacts une fois séparés des débris de la membrane plasmique. Il est possible de lyser les membranes plasmiques sans briser les noyaux. La lyse cellulaire doit être suivie par de fréquentes visites aux microscope. La lyse des noyaux, si elle arrive accidentellement, se traduira par une soudaine augmentation de la viscosité de la solution: c'est la chromatine qui est libérée qui en est la responsable. 2.2.2. Lyse enzymatique Avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir compte de la paroi cellulaire qui protège la membrane plasmique. Si on n’opte pas pour une méthode mécanique et violente d’extraction, il faudra d’abord détruire cette paroi avant de s’en prendre au reste de la cellule. Différents enzymes comme le lysozyme (du blanc d'oeuf de poule, par exemple) ou la lyticase de S.aureus sont disponibles pour s’occuper de cette tâche; il suffit de choisir le plus approprié. 2.2.3. Modification de la force ionique, du pH On modifie la force ionique du milieu en ajoutant des ions ou en modifiant le pH. Pour certains types de cellules, on peut par ce traitement rendre les membranes plus perméables aux constituants du milieu et modifier ainsi la tonicité du cytoplasme. Ceci entraînera une rupture de la membrane plasmique. 2.2.4. Utilisation de détergents Les détergents sont capables de désorganiser les lipides membranaires. Ils affaiblissent de ce fait les interactions entre les différents constituants de la membrane. Le résultat est une rupture de la 7

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membrane. L'action des détergents est difficile à contrôler. La technique demande donc une mise au point précise qui peut être fastidieuse. On peut utiliser un détergent doux (Triton, Tween, etc., quelquefois déoxycholate) pour libérer les composés de l’intérieur des compartiments en dissolvant les membranes de ces compartiment.

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