Curs 12 Metode Fizico Chimice [PDF]

Zitiervorschau

Modulul 5 – Biochimie Curs 12. Metodele de laborator pentru determinarea unor constant biologice ale organismului si compozitiei chimice a probelor biologice de analizat Metodele fizice utilizate in laborator - pH – metrie, spectrofotometrie, cromatografie, electroforeza Spectrofotometria Un spectrofotometru sau un colorimetru utilizeaza transmiterea luminii printr-o solutie pentru determinarea concentratiei unui solut in solutia respectiva. Spectrofotometrul difera de colorimetru prin modul in care lumina este separata in lungimile de unda componente. Spectrofotometrul utilizeaza o prisma pentru separarea luminii, iar colorimetrul utilizeaza filtre. Ambele se bazeaza pe un model simplu de trecere a luminii de lungime de unda cunoscuta printr-o proba si masurarea cantitatii de energie luminoasa care este transmisa. Aceasta se realizeaza prin plasarea unei fotocelule in partea opusa a probei respective. O raza de lumina este formata din fotoni; cand un foton intalneste o molecula de analit, exista sanse ca analitul sa absoarba fotonul. Aceasta absorbtie reduce numarul de fotoni din raza de lumina, astfel reducand intensitatea luminoasa.Toate moleculele absorb energie radianta la anumite lungimi de unda. Cele care absorb energie in spectrul vizibil sunt cunoscute ca pigmenti. Proteinele si acizii nucleici absorb lumina in domeniul ultraviolet. Un spectrofotometru implica o sursa de lumina, o prisma, un suport pentru probe si o fotocelula. Acestea sunt conectate la un sistem electric sau mecanic care controleaza intensitatea luminii, lungimea de unda si conversia energiei primite la nivelul fotocelulei in fluctuatii voltmetrice. Fluctuatiile voltmetrice sunt apoi proiectate pe o scala metrica/digitala si valorile sunt inregistrate intr-un computer. Intensitatea culorii dintr-o proba depinde de cantitatea de solut din proba respectiva. Transmisia luminii nu este o functie liniara, ci mai degraba exponentiala. Transmitanta este procentul relativ de lumina care a trecut prin proba. Transmitanta procentuala este transformata intr-o functie logaritmica inversa cunoscuta ca absorbanta (sau densitate optica). Legea Beer-Lambert: absorbanta este minus log10 din transmitanta (A = - log10T). Aceasta valoare este mai utila decat transmitanta deoarece proiectia absorbantei versus concentratie determina o linie dreapa, absorbanta crescand odata cu cresterea concentratiei (transmitanta scade odata cu cresterea concentratiei de analit). Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesara stabilirea unei serii cunoscute de dilutii a unor cantitati cunoscute de solut. Una din acestea nu contine solut si este cunoscuta ca “blank”. Este utilizata pentru ajustarea instrumentului sa citeasca 100% transmitanta pentru absorbanta 0. O valoare a transmitantei de 0% (absorbanta infinita) este stabilita prin plasarea unei bariere intre sursa de lumina si fotocelula. Toate celelalte masuratori sunt apoi efectuate prin simpla plasare a probelor in calea luminii. Dupa inregistrarea absorbantei pentru o serie de probe standard este efectuata o dreapta absorbanta versus concentratie. Panta dreptei reprezinta coeficientul de extinctie. Aceasta valoare este o constanta si este utilizata pentru conversia oricarei absorbante masurate in concentratia corespunzatoare (C = A/ε). Un spectrofotometru poate utiliza atat lumina vizibila (de obicei avand ca sursa de lumina o lampa cu tugsten/halogen), cat si lumina UV. Singura modificare necesara este inlocuirea tuburilor de sticla cu cuvete de quartz (sticla absoarbe lumina UV si nu este potrivita pentru un spectrofotometru UV).

1

Modulul 5 – Biochimie Majoritatea testelor de chimie clinica efectuate pe analizorul automat sunt teste colorimetrice, distingandu-se urmatoarele tipuri de teste: - teste enzimatice colorimetrice in care substanta de analizat este tratata cu una sau mai multe enzime specifice, in urma reactiei rezultand hidrogen peroxid, care in prezenta unui substrat, sub actiunea peroxidazei duce la formarea unui pigment iminoquinonic care este determinat fotometric, intensitatea culorii formate fiind proportionala cu concentratia analitului respectiv (ex: determinarea acidului uric cu utilizarea uricazei); - teste colorimetrice in care substanta de analizat se cupleaza specific cu reactivul cu formarea unui produs conjugat colorat care este determinat fotometric (ex.: bilirubina se cupleaza cu ionul diazoniu in mediu puternic acid cu formarea azobilirubinei de culoare rosie); in cazul determinarii enzimelor, acestea cliveaza enzimatic un substrat specific, produsul rezultat fiind colorat/ se cupleaza cu un cromogen si formeaza un complex colorat; - teste UV: NADH/NADPH care este fie produs, fie consumat in timpul reactiilor care au loc este determinat fotometric in lumina ultravioleta, concentratia sa fiind direct, respectiv invers proportionala cu concentratia analitului de determinat (ex: determinarea ALT si AST). - teste kinetice: produsul final este determinat kinetic (in timp fix), ceea ce ofera o linearitate mai mare (ex.: test kinetic UV pentru determinarea ureei). Turbidimetria si nefelometria: se bazeaza pe formarea de complexe antigen-anticorp in solutie. Solutiile de antigen si anticorp sunt mixate, fiind necesare cantitati foarte mici de reactiv; formarea de agregate survine rapid. Turbidimetria masoara cantitatea de lumina transmisa nedeviata prin solutie; fotosenzorul este plasat in linie dreapta cu sursa de lumina; o solutie complet limpede va transmite 100% din lumina; cu cat concentratia de particule este mai mare, cu atat mai putina lumina este transmisa. Ca si in colorimetrie se aplica legea Beer-Lambert. Nefelometria masoara cantitatea de lumina dispersata in unghi drept fata de raza de lumina, fotosenzorul fiind plasat la un unghi de 90° fata de sursa de lumina; o solutie complet limpede nu disperseaza lumina. Deoarece masuratorile nefelometrice vizeaza cresterile peste un nivel de baza zero (spre deosebire de turbidimetrie care vizeaza reduceri ale transmisiei sub 100%), nefelometria este mai sensibila la concentratii mici ale analitilor. Nefelometria de rata reprezinta masurarea kinetica a formarii agregatelor. Timpul in care panta curbei “lumina dispersata – timp” este maxima, este proportional cu concentratia de antigen. Aplicatii ale turbidimetriei si nefelometriei: determinarea albuminemiei si microalbuminuriei, a imunoglobulinelor IgA, IgG, IgM si a fractiunilor complementului C3c, C4. pH –metru pH-ul reprezintă logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentrației ionilor din soluție. Prin noțiunea de pH se exprimă cantitativ aciditatea (sau bazicitatea) unei substanțe, pe baza concentrației ionilor numiți hidroniu H3O+. Pentru soluțiile foarte diluate se consideră că pH-ul nu mai este egal cu concentrația hidroniului, ci cu concentrația molară a soluției. Limite pH[modificare | modificare sursă] 0 ≤ pH < 7 => pH acid | soluție acidă pH = 7 => pH neutru | soluție neutră 7 < pH ≤ 14 => pH bazic (alcalin) | soluție bazică (alcalină) Indicatori acido-bazici 2

Modulul 5 – Biochimie 1. indicator | 2. mediu neutru | 3. mediu acid | 4. mediu bazic _________________________________________________________________ 1. fenolftaleina | 2. Incolor | 3. incolor | 4. roșu carmin _________________________________________________________________ 1. metiloranj | 2. oranj | 3. roșu | 4. galben _________________________________________________________________ 1. turnesol | 2. violet | 3. roșu | 4. albastru Măsurare pH-ul poate fi măsurat prin: 





Adăugarea unui indicator de pH în soluția de analizat. Culoarea luată de indicator variază în funcție de pH-ul soluției. Utilizarea indicatorilor pentru determinări calitative trebuie să țină cont de variația de culoare a acestuia, în funcție de pH-ul soluției (de preferat sunt indicatorii care variază pe un interval de pH cât mai mic). Utilizarea unui aparat pH-metru cu electrozi pH selectivi: electrod de sticlă, electrod de hidrogen, electrod de chinhidronă. Determinarea exactă a valorii pH-ului se face totuși prin metode combinate: utilizarea de indicatori împreună cu metode spectrofotometrice, pentru identificarea fiecărui constituent ce influențează pH-ul (culoarea indicatorului).

-

Valori reprezentative ale pH-ului Tipuri de substanțe pH Acid clorhidric - HCl , 1M 0.1 Acid de baterie 0.5 Acidul gastric 1.5 – 2.0 Suc de lămâie 2.4 Cola 2.5 Oțet - CH3COOH 2.9 Suc de portocală sau de măr 3.5 Bere 4.5 Ploaie acidă