Tugas 1 - TPA [PDF]

Zitiervorschau

Definisi

Tissue Plasminogen Aktivator (disingkat tPA atau PLAT) merupakan protein yang bertanggung jawab pada pemecahan bekuan darah. Protein ini merupakan serine protease (EC 3.4.21.68) yang terdapat dalam sel endotel, sel yang mengelilingi pembuluh darah. Sebagai sebuah enzim, tPA mengkatalisis perubahan plasminogen menjadi plasmin, enzimyang memecah bekuan darah. Karena enzim ini bekerja pada sistem pembekuan darah, sehingga sering digunakan dalam pengobatan stroke trombogenik atau embolik, tetapi dikontraindikasikan pada stroke hemoragik. (http://id.wikipedia.org/) TPA adalah obat pemecahan bekuan darah. Hal ini disebut sebagai agen trombolitik atau lebih sering disebut sebagai "clot buster." t-PA merupakan obat intravena atau pengobatan IV biasanya diberikan dengan cara dimasukkan ke dalam vena di lengan. (Giveme5forstroke.com) Tissue Plasminogen Activator (t-PA) merupakan molekul biopolimer, hasil translasi gena PLAT pada kromosom 8, terdiri dari 562 asam amino dengan berat molekul 62.91 kDa. Molekul ini berperan penghancur gumpalan fibrin pada bekuan darah (Blood Clothing) sebagai trombus, digunakan pada terapi thrombosis pembuluh darah, terutama pada penyakit Cardio-Vascular. (http://prillian09.student.ipb.ac.id/) Fungsi tPA berfungsi untuk mengkatalis perubahan plasminogen menjadi plasmin. Tissue plasminogen aktivator juga berperan pada migrasi sel dan perubahan jaringan. kemudian tPA digunakan pada pengobatan penyakit-penyakit yang terdapat penggumpalan darah, seperti emboli paru, infark myocard, dan

stroke.

Mekanisme Kerja Mekanismenya dengan cara injeksi intravena pada 3 jam pertama setelah muncul gejala. t-PA tsb memecah satu rantai plasminogen menjadi dua rantai yang dihubungkan oleh ikatan disulfida dan menghasilkan senyawa yang disebut plasmin.

Proses Pembuatan Analisis data menggunakan BioEditor menunjukkan nilai sebagai berikut. DNA molecule: CCDS Human PLAT Length = 1689 base pairs Molecular Weight = 514775.00 Daltons, single stranded Molecular Weight = 1029185.00 Daltons, double stranded G+C content = 58.38% A+T content = 41.62% Nucleotide Number Mol% A

378

22.38

C

481

28.48

G

505

29.90

T 325 19.24 Dengan menggunakan data sekuens DNA CCDS Human TPA ini dilakukan konstruksi pada vector plasmid pBR 322 kemudian di lakukan konstruksi kloning pada sistem operon bakteria E.coli. Konstruksi susunan sekuens DNA ini diperlukan pada awal rencana penelitian eksperimen rekombinan DNA pada vector plasmid pBR322 pada sistem operon untuk produksi rekombinan t-PA manusia (Human PLAT). Tulisan ini bertujuan untuk mempersiapkan rencana kerja dalam penelitian rekayasa genetik pada bakteri E.coli untuk menghasilkan subtansi alamiah tubuh t-PA, yang diperlukan dalam pengobatan atherothrombosis. Bagian Pertama membahas mengenai konstruksi sekuens DNA rekombinan CCDS Human PLAT pada Vector Plasmid pBR322 dan insersi pada sistem operon bakteria Escherichia coli K-12 MG1655 Refseq NC 000913 dari KEGG. Bagian kedua, membahas konsep upaya implementasi eksperimen ini, agar berhasil dan memberi manfaat bagi khalayak, khsususnya bagi penderita atherothrombosis. Konstruksi Sekuens DNA Rekombinan Human PLAT-pBR322 Vector Pengkajian kontruksi sekuens DNA pada gena target yakni Human PLAT gene yang menghasilkan t-PA mutlak untuk diketahui. Bertujuan untuk menentukan konstruksi primer upaya mengisolasi conserve region DNA sequence Human PLAT gene pada kromosom 8 limfosit pada sampel darah. Isolat DNA dari CCDS Human PLAT sebagai bahan dasar untuk membuat cetakan atau template DNA yang akan bertranslasi menjadi molekul biopolimer “Tissue-Plasminogen Activator (t-PA)”, yang akan diproduksi melalui mesin biologis bakteri E.coli K12.MG1655. NC000913. Melalui sistem operon. Konstruksi CCDS Human PLAT pada gambar (gb-1) sebagai berikut. Gb 1: Konstruksi Conserve Region Gena Human t-PA pada Kromosom 8, dengan singkatan CCDS HumanPLAT dipublikasi NCBI pada Bulan Desember

2005. Warna kuning adalah primer oligonukleotida untuk mengisolasi sekuens DNA ini dengan besaran 1690 bp. Isolasi DNA Gena CCDS Human PLAT Isolasi DNA Total dari Limfosit sampel darah dengan kemurnian absorban 260 nm= 1.8, untuk keperluan eksperimen diperlukan sebanyak-banyaknya. Isolasi Gena Human PLAT dengan menggunakan primer dan mesin PCR . Primer t-PA F: ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTC ( 24 nt, tm= 61oC, 50% GC, posisi 1..24), dan Primer t-PA R: GATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (25 nt, tm=63oC, 52%, posisi 1665..1689). PCR product 1689 bp. Kemudian dilakukan pemrogram mesin PCR , isolat gena Human PLAT kemudian dimurnikan pada panjang gelombang 260 nm= 1.8. Sebagai bahan untuk diinsersi kedalam vector plasmid pBR322 E.coli dapat diperoleh dari Promega cat: D1511, size 10mg, Concentration 1mg/ml, kondisi penyimpanan (storage condition) –20oC, properti DNA 4.326 bp di dalamnya terdapat gena resisten Tetracyclin dan gena resisten Ampiciline. Secara ilustratif diperlihatkan pada Gb.2 . Isolate DNA CCDS Human PLAT kemudian diinsersi pada vector plasmide pBR 322 E.coli, terlebih dulu dilakukan pemotongan ikatan fosfodiester nukleotida, menggunakan enzim restriksi AluI pada posisi 32, persis pada promoter GATAA. Dengan demikian telah terjadi rekombinan DNA antara Human PLAT gene dengan pBR 322 vector sebagai chimeria , pBR322 E.coli Recombinant tPA, sebagaimana Gb2 dibawah ini. Tabel : 1.1 Enzim Endonuklease Restriksi AluI pada lokus promoter gataa pBR 322 Vectror E.coli Size(bp) SiteKeterangan-1 Site-2 Mass% 1 62

AluI 30 InsersiGena HTPA

End

92

68

15

AluI 15

AluI 30

16

14 Start 1 AluI 15 15 Tabel : 1.2 Enzim Endonuklease Restriksi AluI pada pBR 322 Vectror E.coli Keterangan-1 Keterangan- Mass Size site1 site2 2 % 908 AluI 1089 Gena Tet-R

AluI 1997

21

659 AluI 3717 Gena Amp-R

AluI 15

15

656 AluI 30

Promoter/Insersi AluI 686 Gena Tet-R 15

521 AluI 3033 ColE1

AluI 3554 Gena Amp- 12 R

403 AluI 686 Gena Tet-R

AluI 1089 Gena Tet-R 9

281 AluI 2133

AluI 2414 ColE1

6

257 AluI 2776

AluI 3033 ColE1

6

226 AluI 2414 ColE1

AluI 2640 ColE1

5

100 AluI 3554 Gena Amp-R

AluI 3654 Gena Amp- 2 R

90 AluI 2640 ColE1

AluI 2730 ColE1

2

63 AluI 3654

AluI 3717

1

57 AluI 1997

AluI 2054

1

49 AluI 2065

AluI 2114

1

46 AluI 2730

AluI 2776 ColE1

1

19 AluI 2114

AluI 2133

0

15 AluI 15

AluI 30

11 AluI 2054

AluI 2065

111 PvuI 5422 Gena Amp-R

InsersiGena 0 HTPA 0

ScaI 5533 Gena Amp- 2 R Dalam proses pembuatan rekombinan DNA ini harus dipastikan mengenai sekuens DNA Human PLAT gene yang sesuai dengan rancangan, data informasi diperoleh dari hasil band gel elektroforesis dengan Ladder 1689 bp, sekuensing menggunakan automated analysing yang dapat menjangkau 1689 bp. Persoalan yang barangkali muncul ialah apabila laporan hasil sekuensing gena Hum-PLAT tidak sesuai dengan sekuens CCDS NCBI, dengan perbedaan alignment > 25%, apakah dapat digunakan? Apabila digunakan sebatas apa? Apakah memenuhi syarat untuk keperluan mendapatkan biomolekul t-PA yang cocok dengan manusia Indonesia? Dari Tabel 1.2 dan Tabel 1.2 dapat dilihat mengenai posisi enzim endonuklease restriksi AluI pada rekombinan pBR322HTPA, yang dapat mengeliminasi gena Amp-R yang berjumlah sekitar 756 bp. Dan insersi HTPA pada posisi 30 pBR322 vector sebagai GATAA (Promoter), dengan menggunaan T4 Ligase. Namun untuk non-aktifkan gena Amp-R dapat digunakan PuuI . Posisi pemutusan ikatan fosfodiester plasmide kemudian diperbaiki dengan T4 DNA Ligase.. Maka didapat rekombinan DNA pBR322HTPA minus gena Amp-R, yang akan disisipkan dalam sistem lac-operon bakteri E.coli. . Gb 3: Rekombinan DNA Plasmid pBR322 vector-HTPA dengan Amp-R tidak aktif sebagai bahan kloning pada sistem lacoperon E.coli. Rekombinasi Dengan Plasmid Lac-operon E.coli

Tahap berikutnya ialah membuat kombinasi plasmid pBR322 vector-HTPA dengan plasmid Lac-operon dalam sistem E.coli. Penetapan konstruksi kloning dengan menggunakan data informasi Lacoperon E.coli sebagai berikut. ID ECLAC standard; genomic DNA; PRO; 7477 BP. XX AC J01636; J01637; K01483; K01793; XX SV J01636.1 XX DT 30-NOV-1990 (Rel. 26, Created) DT 09-SEP-2004 (Rel. 81, Last updated, Version 8) XX DE E.coli lactose operon with lacI, lacZ, lacY and lacA genes. XX KW acetyltransferase; beta-D-galactosidase; galactosidase; lac operon; KW lac repressor protein; lacA gene; lacI gene; lactose permease; lacY gene; KW lacZ gene; mutagenesis; palindrome; promoter region; KW thiogalactoside acetyltransferase. XX OS Escherichia coli OC Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; OC Enterobacteriaceae; Escherichia. XX RN [1] RP 1243-1266 RX PUBMED; 4587255. RA Gilbert W., Maxam A.; RT “The nucleotide sequence of the lac operator”; RL Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70(12):3581-3584(1973) Langkah pertama memotong secara terbatas rekombinan pBR322-HTPA dengan endonuklease restriksi dan penyambungan dengan T4 DNA ligase. Konstruksinya adalah sebagai berikut. Pertama dipotong dengan aluI untuk mendapat ujung 5′ pada posisi 15, kemudian disambung dengan T4 DNA ligase, kedua dipotong dengan TaqI untuk mendapat ujung 5′ pada posisi pada posisi 24, konstruksi ini siap untuk diklon pada sistem gena Lac-operon E.coli. Secara sekuensial kontruksi DNA digambarkan sebagai berikut. Tuesday, January 16, 2007 7:52:13 AM Recom.pBR322-HTPA-in AmpR 20 30 40 50 * | * | * | * | * 24 TaqI 49 SduI 15 AluI 23 ClaI 36 HpyCH4V 49 BanII | || | |

15 AGCTTATCATCGATAAATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTG 59 S L S S I N G C N E E R A L L A Y H R * M D A M K R G L C L I I D K W M Q * R E G S A TCGAATAGTAGCTATTTACCTACGTTACTTCTCTCCCGAGACGAC > Promoter >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> PCR Product t-PA Lokus Pemotongan AluI pada Recom.pBR322-HTPA-in AmpR Size site1 site2 Mass % 908 AluI 2778 AluI 3686 15 656 AluI 1719 AluI 2375 11 548 AluI 5406 AluI 15

9

521 AluI 4722 AluI 5243 9 447 AluI 625 AluI 1072 8 415 AluI 15

AluI 430 7

403 AluI 2375 AluI 2778 7 281 AluI 3822 AluI 4103 5 260 AluI 1364 AluI 1624 4 257 AluI 4465 AluI 4722 4 226 AluI 4103 AluI 4329 4 195 AluI 430 AluI 625 3 190 AluI 1072 AluI 1262 3 100 AluI 5243 AluI 5343 2 95

AluI 1624 AluI 1719 2

90

AluI 4329 AluI 4419 2

78

AluI 1262 AluI 1340 1

63

AluI 5343 AluI 5406 1

57

AluI 3686 AluI 3743 1

49

AluI 3754 AluI 3803 1

46

AluI 4419 AluI 4465 1

24

AluI 1340 AluI 1364 0

19

AluI 3803 AluI 3822 0

11 AluI 3743 AluI 3754 0 Pemotongan pada tahap kedua ialah dengan TaqI pada ujung 5′ posisi 24, hal ini dilakukan agar tidak terjadicodon bias pada pembacaan translasi gena recombinan pBR322-HTPA. Pemotongan ini beresiko pada munculnya sejumlah fragmen sekuens DNA yang harus disambung kembali dengan menggunakan T4 DNA ligase, hasilnya ujung 5′ mengkode asam amino arginine (R ). Recom.pBR322-HTPA-in AmpR 30 40 50 60 * | * | * | * | 49 SduI 24 TaqI 36 HpyCH4V 49 BanII | | | 24 TCGATAAATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTG 63 S I N G C N E E R A L L C R * M D A M K R G L C C V D K W M Q * R E G S A V AGCTATTTACCTACGTTACTTCTCTCCCGAGACGACACAC > Promoter >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> PCR Product t-PA >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> Primer CCDS t-PA F Lokus Pemotongan TaqI pada Recom.pBR322-HTPA-in AmpR Size site1 site2 Mass % 1333 TaqI 4262 TaqI 5595 22 1305 TaqI 2957 TaqI 4262 22 1172 TaqI 24

TaqI 1196 20

805 TaqI 1223 TaqI 2028 14 616 TaqI 2341 TaqI 2957 10 368 TaqI 5595 TaqI 24

6

313 TaqI 2028 TaqI 2341 5 27

TaqI 1196 TaqI 1223 0

Plasmide recombinan ini kemudian diklon pada plasmide lac-operon E.coli, sebagai vector yang akan ditransfeksi pada bakteri E.coli K12. Konstruksi ini sebagai rancangan untuk mesin produksi Human Tissue Plasminogen Activator, secara bioteknologis dengan metoda genetic engineering. Adapun proses kloning adalah sebagai berikut. Pertama plasmide Lac-operon dipotong dengan VspI pada ujung 5′ posisi 1172 sebagai pintu insersi kloning lokus Lac1 Represor , hasil digesi VspI kemudian diligasi dengan T4 DNA ligase, untuk menyambung fragmen DNA yang terpotong. Peta sekuens lokus insersi ini adalah sebagai berikut. Tuesday, January 16, 2007 10:52:00 AM Ecoli lac operon.str Text Map 1170 1180 1190 1200 1210 1220 1230 * | * | * | * | * | * | * | 1172 VspI | 1162 gcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggc 1230 A Q R N * C E L A H S L G T P G F T L Y A S G cgcgttgcgttaattacactcaatcgagtgagtaatccgtggggtccgaaatgtgaaatacgaaggccg >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> >>>>>>>>>>>> LacI Represor mRNA >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> Cap protein binding site Pada sekuens fragmen DNA diatas menunjukkan posisi caat sebagai translasi region pada lokus LacI Represor mRNA pada sistem operon , tempat insersi rekombinan pBR322-HTPA, sebagai wahana kloning dalam bakteri E.coli K12. Dalam insersi ini akan ditampakan peta ekspresi gena CCDS-HTPA dalam sistem operon yang akan dijelaskan berikut ini. Pertama, gambaran digesti VspI secara utuh pada plasmid Lac-operon E.coli. Sebagai bahan pertimbangan untuk mendapatkan fragmen sekuens plasmid DNA yang murni untuk diadaptasi dalam bakteri E.coli. Adaptasi plasmid menjadi sangat penting, karena menyangkut keberadaan gena HTPA yang akan mengekspresi biopolimer molekul “Tissue Plasminogen Activator”. Kegagalan dalam adaptasi, plasmid rekombinan akan hilang atau gagal dalam ekspresi disebabkan adanya enzimenzim penangkal plasmid, atau kesalahan dalam codon bias. Tuesday, January 16, 2007 11:08:54 AM Ecoli lac operon.str Size site1 site2 Mass % 4084 VspI 1172 VspI 5256 55

2428 VspI 6162 VspI 1113 32 906 VspI 5256 VspI 6162 12 59 VspI 1113 VspI 1172 1 Pembukaan plasmid Lac-operon yang terfragmentasi dalam sekuens DNA kemudian disambung kembali dengan T4 DNA ligase dan kemungkinan penambahan polylinker yang diperlukan. Konstruksi kloning adalah sebagai berikut. Insersi pada posisi 1172 Cap protein Binding Site pada plasmid Lac-operon, tampalak rekombinan pBR322-HTPA berekspresi pada frame 3 dengan sekuens *AQRNKMMDAMKRGLLCCVLLLCGAV, sebagai fragmen sekuens biopolimer molekul t-PA. Dengan demikian konstruksi ini dapat menduga dalam proses kloning pembuatan molekul “Tissue Plasminogen Activator”. Persoalan kemudian, bagaimana konstruksi ini dapat diimplemetasi dalam kerja laboratorium Biomolekuler? Menerupakan persoalan manajemen peneltian dan sokongan sarana dan dana untuk membiayai riset ini. Diskripsi peta plasmid rekombinan sistem lac-operon dengan pBR322-HTPA dilukiskan dalam gambar berikut ini. Peta translasi di atas menunjukan biopolimer t-PA terikat pada lima peptida AQRNKM pada Cap Protein Binding Site, sebagai produksi proses fermentasi E.coli dalam Biofermentor. Namun yang paling mendasar ialah plasmid rekombinan lac-operan ini harus mmampu beradaptasi dalam sistem bakteri E.coli, yang mana plasmid terserap dan berekspresi, selanjutnya identifikasi molekul protein harus dilakukan dengan menggunakan analisis struktural dan fungsional, sebelum diujicoba pada hewan coba atherothrombosis.