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Zitiervorschau

TD 04 : Acides aminés

Exercice 1 Soient les acides aminés suivants : glycine, sérine, leucine glutamine, arginine et aspartate. 1. Ecrire les équilibres acido-basiques de ces acides aminés. 2. calculer le pHi de chaque acide aminé. Exercice 2 :

Gly Ser Gln Arg Asp

pK1 2,34 2,13 2,17 2,17 2,09

pK2 9,60 9,15 9,13 9,04 9,82

pKR 12,48 3,86

Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide de pH tampons croissants jusqu’a = 6. Dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ?  pK1 pK2 Lys 2,18 8,95 Glu 2,19 9,67 Soit une solution qui contient les trois acides aminés suivants en Val 2,32 9,62 quantité équivalente : lysine, glutamate et valine. On dépose un volume de ce mélange sur un support d’électrophorèse adapté (papier Whatman, le pH du tampon est égal à 6,3). Après migration électrophorétique puis révélation des acides aminés, on obtient le résultat suivant :  Exercice 3

Questions : 1- Rappeler la nature des trois acides aminés du mélange. 2- Calculer le pHi de ces trois acides aminés. Justifier les calculs. 3- Identifier l’anode et la cathode sur l’électrophorégramme. 4- Indiquer pourquoi il est nécessaire d’utiliser une technique de révélation des acides aminés après migration. 5- Indiquer le nom d’une technique de révélation des acides aminés ayant pu être utilisée ici. 6- Identifier les trois spots obtenus après révélation. Justifier la réponse.   

pKR 10,53 4,25 -

Corrigé type du TD 04 de biochimie Exercice 1 1) Charge nette des acides aminés.

2) Calcule des pHi des acides aminés pHi Gly

(pK1+pK2)/ 2 = 5,97

Ser

(pK1+pK2)/ 2 = 5,68

Gln

(pK1+pK2)/ 2 = 5,65

Arg

(pK2+pKR)/2 = 10,76

Asp

(pK1+ pKR) /2 = 2,77

Exercice 2 Si les trois acides aminés ont été retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a été réalisée à un pH inférieur au plus petit des pHi, soit un pH inférieur à 2,87, afin que les acides aminés se présentent sous une forme chargée positivement et qu'ils puissent être retenus sar la résine échangeuse de cations, chargée négativement

Acide aminé :

pHi

Ordre d’élution

Asp

2,87

1 er élué

Leu

6

Le deuxième

Arg

10,76

Reste fixé

En augmentant le pH tampon (jusqu’à 6), Asp. avec un pHi de 2.87 est le premier élué de la colonne. La leucine est ensuite éluée (charge nulle). L'Arginine (pHi: 9.74), toujours chargée positivement par rapport au pH tampon (6) reste fixé sur la résine de la colonne et n'est donc pas éluée

Exercice 3 Réponse Q1 : La lysine est un acide aminé (AA) « basique », car elle présente une fonction amine dans sa chaîne latérale R (de pKR = 10,53). Le glutamate est un AA « acide » car il comporte une fonction acide carboxylique dans R (de pKR = 4,25). La valine est un AA aliphatique, sans fonction acido-basique dans R (pas de pKaR).   Réponse Q2 : (il est recommandé de faire les équilibres acido-basiques pour illustrer la réponse) Pour la valine, pHi = ½ *(pK1+pK2). Soit pHi = ½*(2,32+9,62) = 5,97.   Pour la lysine, il faut appliquer la formule suivante pHi = ½ *(pK 2+pKR) car la forme zwitterion de cet AA se trouve entre les deux valeurs de pKa citées. Soit pHi = ½*(8,95+10,53) = 9,74. Cette valeur est supérieure à 7 : c’est en effet un AA « basique ».   Pour le glutamate, il faut appliquer la formule suivante pHi = ½ *(pK 1+pKR) car la forme zwitterion de cet AA se trouve entre les deux valeurs de pKa citées. Soit pHi = ½*(2,19+4,25) = 3,22. Cette valeur est inférieure à 7 : c’est en effet un AA « acide ».  Réponse Q3 : Dans une électrophorèse l’anode est le pôle positif (qui attire les anions) et la cathode est le pôle négatif (qui attire les cations).

Réponse Q4 : Les acides aminés ne sont pas des substances naturellement colorées et ils sont donc invisibles après migration sur le papier. Il faut donc réaliser une révélation chimique pour matérialiser leur emplacement sur le papier.   Réponse Q5 : Pour révéler les AA, on utilise communément la ninhydrine à chaud (on applique le réactif au pinceau sur le papier puis on place à 90°C quelques minutes typiquement). Les spots d’AA apparaissent en violet alors (sauf la proline et l’hydroxyproline, en jaune).   Réponse Q6 : Pour identifier les trois spots, il faut d’abord se poser la question de leur charge au pH du tampon utilisé (pH 6,3). Si le pH du tampon est inférieur au pHi, l’AA est chargé +. Si le pH du tampon est égal au pHi, l’AA a une charge nette nulle. Si le pH du tampon est supérieur au pHi, l’AA est chargé -. Ce qu’on peut résumer avec le petit schéma suivant :  

Lors de la migration, un AA chargé migre vers le pôle de charge opposée. Ainsi : Pour la lysine, pH tampon = 6,3 > pHi Glu = 3,22 : le glutamate est chargé – et migre vers le pôle + (l’anode). Ces deux migrations sont franches car la différence entre pHi et pH du tampon est importante (la charge de l’AA est donc franche). Pour la valine, pH tampon = 6,3 > pHi Val = 5,97 : la valine est donc peu chargée (présence d’une faible charge d-) et migre très peu vers le pôle +.  Au final, l’identification est la suivante : Spot 1 = Glutamate Spot 2 = Valine Spot 3 = Lysine