Report of Biochemistry [PDF]

Zitiervorschau

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO CHẤT LƯỢNG CAO BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ****************

BÁO CÁO THỰC HÀNH THÍ NGHIỆM HÓA SINH THỰC PHẨM GVHD: ThS. Phạm Thanh Tùng Lớp thứ 3: 27/08 – 10/09 Nhóm 4: 1. Trương Tiểu My

17116095

2. Trương Thị Nga

17116097

3. Ngô Trọng Nhân

17110197

4. Trần Lê Quế Thanh

17116124

TP.HỒ CHÍ MINH, THÁNG 9 NĂM 2019

MỤC LỤC BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1 ..........................................................................................................................3 1.1.

Tổng quan...................................................................................................................................3

1.2.

Mục tiêu bài thí nghiệm ............................................................................................................4

1.3.

Nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu ..................................................................................4

1.3.1.

Nguyên tắc ..........................................................................................................................4

1.3.2.

Nguyên liệu và dụng cụ .....................................................................................................5

1.3.3.

Sơ đồ thí nghiệm ................................................................................................................5

1.4.

Kết quả........................................................................................................................................7

1.4.1.

Kết quả thí nghiệm ............................................................................................................7

1.4.2.

Tính toán kết quả: .............................................................................................................7

1.4.3.

Bàn luận ..............................................................................................................................8

1.5.

Tài liệu tham khảo:....................................................................................................................9

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 2 ....................................................................................................................... 11 1.1.

Tổng quan................................................................................................................................ 11

1.2.

Mục tiêu bài thí nghiệm ......................................................................................................... 12

1.3.

Nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 12

1.3.1.

Nguyên tắc ....................................................................................................................... 12

1.3.2.

Nguyên liệu và dụng cụ .................................................................................................. 13

1.3.3.

Sơ đồ thí nghiệm ............................................................................................................. 13

1.4.

Kết quả..................................................................................................................................... 15

1.4.1.

Kết quả thí nghiệm ......................................................................................................... 15

1.4.2.

Tính kết quả: ................................................................................................................... 15

1.4.3.

Bàn luận: ......................................................................................................................... 15

1.5.

Tài liệu tham khảo:................................................................................................................. 16

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 3 ....................................................................................................................... 18 1.1.

Tổng quan................................................................................................................................ 18

1.2.

Mục tiêu bài thí nghiệm: ........................................................................................................ 19

1.3.

Nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu: .............................................................................. 19

1.3.1.

Nguyên tắc ....................................................................................................................... 19

1.3.2.

Nguyên liệu và dụng cụ .................................................................................................. 20

1.3.3.

Sơ đồ thí nghiệm: ............................................................................................................ 20

1.4.

Kết quả..................................................................................................................................... 22

1.4.1.

Kết quả thí nghiệm ......................................................................................................... 22 1

1.4.2.

Tính toán kết quả ............................................................................................................ 23

1.4.3.

Bàn luận ........................................................................................................................... 23

1.5.

Tài liệu tham khảo:................................................................................................................. 24

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4 ....................................................................................................................... 26 1.1.

Tổng quan................................................................................................................................ 26

1.2.

Mục đích bài thí nghiệm......................................................................................................... 27

1.3.

Nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 28

1.3.1.

Nguyên tắc ....................................................................................................................... 28

1.3.2.

Nguyên liệu và dụng cụ .................................................................................................. 28

1.3.3.

Sơ đồ thí nghiệm ............................................................................................................. 29

1.4.

Kết quả: ................................................................................................................................... 33

1.4.1.

Thí nghiệm 1.................................................................................................................... 33

1.4.1.1.

Kết quả thí nghiệm khảo sát động học của enzyme ................................................. 33

1.4.1.2.

Tính toán kết quả ........................................................................................................ 33

1.4.2.

Thí nghiệm 2.................................................................................................................... 36

1.4.2.1.

Kết quả thí nghiệm Xác định hoạt độ ....................................................................... 37

1.4.2.2.

Tính toán kết quả ........................................................................................................ 37

1.4.3. 1.5.

Bàn luận ........................................................................................................................... 37

Tài liệu tham khảo:................................................................................................................. 38

2

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH 1.1.

Tổng quan

α-Amylase còn gọi là α-amylaza là một enzyme loại protein thủy phân liên kết alpha của các

polysaccharide

chứa

liên

kết

alpha

như tinh

bột và glycogen,

tạo

ra glucose và maltose. Đây là dạng chủ yếu của amylase được tìm thấy ở người và các động vật có vú khác. Nó cũng có mặt trong các loại hạt giống sử dụng tinh bột như một loại năng lượng dự trữ, và trong chất tiết của nhiều loại nấm.

Enzyme ߙ െ ‫݁ݏ݈ܽݕ݉ܣ‬

Trong sinh lý con người: mặc dù tìm thấy nhiều trong các mô,nhưng amylase chủ yếu có trong dịch tụy và nước bọt, trong đó có dạng riêng của α-amylase người. Chúng có sự khác nhau về sự tập trung đẳng điện, và cũng có thể được tách ra trong thử nghiệm bằng cách sử dụng các kháng thể đơn dòng đặc biệt. Ở con người, tất cả các đồng dạng amylase liên kết với nhiễm sắc thể 1p21. ߙ െAmylase là một enzyme có khả năng thủy phân ngẫu nhiên liên kết α -1,4 glycosidic

trong tinh bột để tạo thành các đoạn dextrin ngắn (Van Oort, 2010). ߙ െAmylase có

3

nhiều trong các loại hạt nói chung và đại mạch nói riêng. Thông thường, những hạt đại mạch chưa nảy mầm không có hoặc có rất ít hoạt độ amylase. Tuy nhiên, trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, hoạt độ amylase tăng lên đáng kể. Enzyme này có tác dụng xúc tác quá trình thủy phân của tinh bột có trong hạt thành các đoạn dextrin ngắn, cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho việc nảy mầm. Amylases nói chung và alpha amylase nói riêng có vai trò rất quan trọng trong công nghiệp, nhất là công nghiệp thực phẩm. Chúng được sử dụng nhiều nhất trong các ngành công nghiệp sản xuất bia rượu, mạch nha và bánh mì. Sự thủy phân tinh bột của alpha amylase có thể được tóm lược thông qua phương trình phản ứng sau: Tinh bột

α-amylase

Dextrin phân tử lượng thấp

Điều kiện hoạt động tối ưu cho ߙ െ ‫ ݁ݏ݈ܽݕ݉ܣ‬ở pH từ 4,2 đến 5,7; các anion và các chất

hoạt hóa gồm: Chloride và bromide (hiệu quả nhất), iodine (ít hiệu quả hơn), sulfate và phosphate (kém hiệu quả nhất). Các thử nghiệm đối với amylase được thực hiện dễ dàng hơn đối với lipase, làm cho các kiểm tra chủ yếu được sử dụng để phát hiện và theo dõi viêm tụy. Các phòng thí nghiệm thường sẽ đo amylase tụy hoặc amylase tổng số. Nếu chỉ đo amylase tụy có tăng sẽ không thể phân biệt với quai bị hoặc chấn thương tuyến nước bọt khác. Tuy nhiên, bởi vì nó có số lượng nhỏ,nên thời gian là rất quan trọng khi lấy mẫu máu để đo chất này. Lấy máu nên được thực hiện ngay sau một cơn đau viêm tụy, nếu không nó sẽ được đào thải nhanh chóng qua thận. ߙ െamylase nước bọt đã được sử dụng như là một biomarker cho căng thẳng mà không cần lấy máu. 1.2.

Mục tiêu bài thí nghiệm

Biết được cách tính toán khối lượng, thể tích pha chế các hóa chất trong bài thí nghiệm. Xác định được hoạt độ ߙ െamylase theo phương pháp Wohlgemuth để biết được nồng

độ enzyme thấp nhất để có thể thủy phân tinh bột thành dextrin.

Tìm hiểu thêm được một số ứng dụng của enzyme trong đời sống thực tiễn. 1.3.

Nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu

1.3.1. Nguyên tắc

4

Phương pháp Wohlgemuth dựa vào nguyên tắc tìm nồng độ enzyme thấp nhất để có thể thủy phân tinh bột thành dextrin. Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1 mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút ở 37ºC có ion Cl- làm chất hoạt hóa. Dùng iodine 0,3% để kiểm tra sự có mặt của tinh bột, nếu trong mẫu thí nghiệm vẫn còn xuất hiện phức chất màu tím xanh chứng tỏ enzyme alpha amylase vẫn chưa thủy phân hết lượng tinh bột có trong mẫu. 1.3.2. Nguyên liệu và dụng cụ -

11 ống nghiệm

-

Pipet 1 ml (4 cái)

-

Tủ ấm

-

Giấy lọc

-

NaCl 0,5%: cân 0,5g NaCl, cho vào 99,5 ml nước cất, ta có được 100 ml dung dịch NaCl 0,5%.

-

Tinh bột 0,5%: cân 0,5g tinh bột, cho vào 99,5 ml nước cất, ta có được 100 ml dung dịch tinh bột 0,5% sau đó đun cách thủy đến khi hòa tan hết.

-

H2SO4 10%: lấy 10 ml H2SO4 cho vào 90 ml nước cất, ta được 100 ml dung dịch.

-

Iodine 0,3% trong KI 3%: cân 0,15g iodine cho vào 49,85 ml nước cất. Cân 1,5g KI cho vào 48,5 ml nước cất. Sau đó trộn iodine vào KI ta được dung dịch cần pha.

1.3.3. Sơ đồ thí nghiệm Chuẩn bị dịch chiết

Cân 10g malt

Cho vào bình định mức đến 100ml

Lọc 2 lần

Tiến hành khảo sát enzyme amylase Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự

Cho 1ml NaCl 0,5% vào mỗi ống nghiệm

5

1ml amylase vào ống 1

Cho 1ml hồ tinh bột 0,5% vào mỗi ống nghiệm Lắc Để vào tủ 37C Sau 30 phút thêm 1ml H2SO4 10% vào mỗi ống 2 giọt KI vào mỗi ống và lắc đều Xem màu trong mỗi ống nghiệm

6

Ống để so màu 3ml nước cất vào ống 11 Cho 2 giọt iod vào So sánh màu với 10 ống nghiệm

Xác định nồng độ enzyme thấp nhất

1.4.

Kết quả

1.4.1. Kết quả thí nghiệm Kết quả được thể hiện trong bảng: có đánh dấu xanh (x), đỏ (đ), nâu (n), vàng (v). Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Độ pha

2

4

8

16

32

64

128

256

512

1024

n/2

n/4

n/8

V

v

v

loãng Nồng độ

n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024

enzyme Màu

đ

đ

n

x

x

x

x

1.4.2. Tính toán kết quả: Lượng enzyme cho vào ống nghiệm:

Trong đó:

݊ൌ݉ൈ

ͳ ܸଵ ൌ ͳͲ ൈ ൌ Ͳǡͳ ܸଶ ͳͲͲ

V1 – thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1 ml) 7

V2 – thể tích dịch chiết enzyme (100 ml) m – lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (mg) Một đơn vị Wohlgemuth (W):

Trong đó:

ܹൌ

݊ Ͳǡͳ ൌ ൌ ͲǡͲͲͷ ‫ܨ‬ൈͷ Ͷൈͷ

F – độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11) Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzyme (ܰ௪ ): 1.4.3. Bàn luận

ܰ௪ ൌ

݊ Ͳǡͳ ൌ ൌ ʹͲ ܸଵ ൈ ܹ ͳ ൈ ͲǡͲͲͷ

Dịch enzyme trong đại mạch được pha loãng đến 10 lần (qua 10 ống nghiệm) thì đến ống nghiệm 6 lượng enzyme rất ít nên thủy phân được một nửa, còn các ống có màu xanh (7, 8, 9, 10) do lượng enzyme không còn nên không thể thủy phân được tinh bột. Khi cho NaCl vào tạo thành ion ‫ ି ݈ܥ‬là chất hoạt hóa cho Enzyme, nếu như không có

NaCl tốc độ phản ứng sẽ xảy ra chậm hơn.

Một số nguyên nhân gây sai sót: thao tác của sinh viên lúc pha hóa chất; yếu tố chủ quan khi sử dụng dụng cụ thí nghiệm (ống nghiệm, pipet,...); thời gian ủ hoặc nhiệt độ ủ 8

không chính xác; sai sót trong quá trình pha hóa chất (cân thiếu hoặc thừa nhiều, không đun nóng làm tan hồ tinh bột). Enzyme ߙ െ ‫݁ݏ݈ܽݕ݉ܣ‬hoạt động ở pH tối ưu là 6,77 và hoạt động tốt ở ở pH từ 4,2 đến 5,7.

Hồ tinh bột làm chất chỉ thị ‫ܪ‬ଶ ܱܵସ ức chế enzyme, kết thúc quá trình thủy phân, một phần trung hòa pH do phản ứng giữa hồ tinh bột và iodine xảy ra tốt nhất trong môi trường trung tính.

Một số ứng dụng của enzyme ‫ ן‬െ‫ ݁ݏ݈ܽݕ݉ܣ‬trong công nghệ thực phẩm:

Trong công nghiệp nướng bánh: Mục tiêu là xác định được hoạt độ lipase trong đậu nành. Biết cách pha các hóa chất cần thiết cho thí nghiệm. Trong công nghiệp sản xuất nước giải khát: thủy phân tinh bột thành glucose. Trong công nghiệp sản xuất bột ngọt. Trong sản xất bánh mì làm cho bánh nở xốp thơm ngon hơn bởi enzyme làm giảm độ dính, tăng độ đàn hồi của bột nhào, tăng mùi thơm, làm tăng nhanh thể tích bánh và rút ngắn thời gian nhào. Trong sản xuất tương, mạch nha, mật, đường glucose. Trong công nghệ sản xuất bánh kẹo: làm tăng hàm lượng amino acid tự do và tăng lượng đường khử trong bánh qui; đường khử và các amino acid tự do sẽ tăng lên làm cho các phản ứng oxy hóa khử tăng theo. Ứng dụng trong sản xuất cồn: được sử dụng ở giai đoạn đường hóa  Chuyển hóa tinh bột bằng ߙ െ ‫݁ݏ݈ܽݕ݉ܣ‬để tạo dextrin

 Chuyển hóa dextrin bằng ߚ െ ‫ ݁ݏ݈ܽݕ݉ܣ‬để tạo ra đường có khả năng lên men.

Ngoài ra còn ứng dụng trong một số lĩnh vực khác như tẩy trắng giấy, trong công nghiệp dệt, trong ngành dược phẩm, chế biến thức ăn gia súc. 1.5.

Tài liệu tham khảo:

Giáo trình thí nghiệm hóa sinh thực phẩm Đại học sư phạm kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh.

9

Rosenblum, JL, Irwin, CI, Alpers, DH. Starch and glucose oligosaccharides protect salivary-type amylase activity at acid pH. American Journal of Physiology 254 (Gastrointestinal and Liver Physiology 17):G775-780 (1988). Hóa sinh học – Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. Hóa học thực phẩm – Hoàng Kim Anh. Nhà xuất bản khoa học – kỹ thuật, 2007 Maureen Barlow Pugh biên tập (2000). Stedman's Medical Dictionary (ấn bản 27). Baltimore, Maryland, USA: Lippincott Williams & Wilkins. tr. 65.

Chaudhary, S., Sagar, S., Kumar, M., Sengar, R.S. and Tomar, A. (2015). The use of enzymes in food processing. South Asian Journal of Food Technology and Environment, 1(3&4): 190-210.

10

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 2 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE 1.1.

Tổng quan

Lipase (EC 3.1.1.3) (phiên âm kiểu cũ: Lipaza) là một loại enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân chất béo (lipid). Lipases là một phân hộ của các enzyme thủy phân este.

Lipase đóng vai trò thiết yếu trong quá trình tiêu hóa, vận chuyển và xử lý các chất béo trong chế độ ăn uống (ví dụ: triglyceride, mỡ, dầu) trong hầu hết, nếu không phải là tất cả, các sinh vật sống. Gen mã hóa cho lipase thậm chí còn hiện diện trong một số loại virus. Hầu hết lipase hoạt động ở một vị trí cụ thể trên "mạch xương sống" glycerol của cơ chất lipid (A1, A2 hoặc A3) (trong ruột non). Ví dụ, lipase tuyến tụy của con người (HPL), là enzyme chính phân hủy chất béo trong hệ tiêu hóa của con người, chuyển hóa triglyceride được tìm thấy trong dầu ăn thành monoglyceride và hai acid béo.

11

Một

số

loại

hoạt

động lipase khác

tồn

tại

trong

tự

nhiên,

chẳng

hạn

như phospholipase, và sphingomyelinase, tuy nhiên chúng thường được tách riêng biệt so với lipase "thông thường" mà ta đang xét. Một số lipase được biểu hiện và tiết ra bởi các sinh vật gây bệnh trong khi bị nhiễm trùng. Đặc biệt, loại nấm gây bệnh Candida albicans có nhiều loại lipase khác nhau, có thể phản ánh phổ hoạt động phân giải chất béo rộng, có thể góp phần vào tính bền vững và độc lực của C. albicans trong mô người. Lipase còn được gọi là triacylglycerol lipase.Trong thực vật, lipase hoạt động trong các mô lưu trữ lipid trong hạt trong quá trình nảy mầm. Các lipase này xúc tác quá trình thủy phân triacylglycerol lưu trữ thành acid béo, được chuyển thành đường, acid amin và chuỗi carbon cần thiết để hỗ trợ sự phát triển của phôi.

Là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein: được sản xuất bởi tế bào sống (vi sinh vật, thực vật, động vật); xúc tác cho các phản ứng sinh học; có khả năng xúc tác bên trong lẫn bên ngoài tế bào; cường độ xúc tác mạnh; điều kiện cúc tác ôn hòa; phản ứng có sự góp mặt của enzmye có khả năng điều khiển được. Tùy vào điều kiện hoạt nhiệt độ mà enzyme có hoạt tính mạnh ở pH khác nhau. Lipase hoạt động không cần cofactor tuy nhiên với sự có mặt của một số cation như ‫ܽܥ‬ଶା ǡ ܰܽା

sẽ làm tăng hoạt tính của lipase và ngược lại với sự có mặt của ‫݃ܪ‬ଶା ǡ ܰ݅ ଶା ǡ ܵ݊ଶା enzyme sẽ bất hoạt còn với ܼ݊ଶା và EDTA sẽ bị kiềm hãm nhẹ. 1.2.

Mục tiêu bài thí nghiệm

Mục tiêu là xác định được hoạt độ lipase trong đậu nành. Biết cách tính toán cân đo pha các hóa chất cần thiết cho thí nghiệm. Tìm hiểu thêm một số ứng dụng khác của lipase trong lĩnh vực đời sống. 1.3.

Nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu

1.3.1. Nguyên tắc 12

Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo. Hàm lượng acid được chuẩn độ bằng kiềm. Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để trung hòa aicd mới được hình thành. Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng một đối tượng enzyme. 1.3.2. Nguyên liệu và dụng cụ -

Cối chày sứ

-

Erlen 10 ml

-

Pippet 1 ml, 10 ml

-

Ống đong

-

Burret

-

Cốc 100 ml, 250 ml

-

Tủ ấm

-

Đệm acetate pH = 4,7 (trộn CH3COOH 0,1N và CH3COONa 0,1N tỉ lệ 1:1): cân 0,82g CH3COONa cho vào 100 ml nước cất. Dùng công thức C1V1 = C2V2 để tính lượng thể tích CH3COOH nguyên chất cần lấy, tính toán theo công thức thì lượng thể tích cần lấy là 0,574 ml cho vào 99,426 ml nước cất. Trộn 2 dung dịch lại theo tỉ lệ 1:1 ta được dung dịch đệm pH = 4,7.

-

Cồn 96º

-

Ether ethylic

-

NaOH 0,1N: cân 0,8g NaOH cho vào 200 ml nước cất ta được 200 ml NaOH 0,1N.

-

Phenolphthalein 1%: 1g phenolphthalein được pha với 50 ml ethanol và 50 ml nước cất.

-

Dầu đậu nành nguyên chất. 1.3.3. Sơ đồ thí nghiệm

13

5g đậu nành

Nghiền mịn

10ml nước cất

Erlen

Lắc đều trong 15’ ở ͵Ͳι‫ܥ‬

1ml dầu đậu nành

Hỗn hợp

5ml đệm acetate Vài giọt toluen

Lắc đều trong 24h ở ͵Ͳι‫ܥ‬ 25ml cồn 96ι

Hỗn hợp

15ml erther

Lắc đều và để yên trong 2’ sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N với phenolphthalein 1% làm chỉ thị

14

Làm tương tự với bình kiểm chứng, tuy nhiên đem đun cách thủy 10 phút trước khi thêm cơ chất. 1.4.

Kết quả

1.4.1. Kết quả thí nghiệm Hoạt độ của lipase (X) được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lượng acid tự do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân trong 24 giờ: X = (a – b) x 10 x k/m Trong đó: a: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm b: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng k: hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,1N m: khối lượng hạt sử dụng 1.4.2. Tính kết quả: Lần 1: X = (9,6 – 9,4) x 10 x (0,815/0,8)/5 = 0,4075 Lần 2: X = (9.5 – 9,4) x 10 x (0,815/0,8)/5 = 0,2038 Lần 3: X = (9,6 – 9,5) x 10 x (0,815/0,8)/5 = 0,2038 1.4.3. Bàn luận: Lượng NaOH dùng để định phân ở bình thí nghiệm sẽ nhiều hơn bình kiểm chứng vì enzyme trong bình kiểm chứng đã được làm bất hoạt tính bởi nhiệt độ nên hoạt độ của enzym ở bình kiểm chứng thấy nên lượng sản phẩm thủy phân ít dẫn đến lượng NaOH dùng định phân ít. Dung dịch đệm acetate: dùng trung hòa pH, tạo môi trường thuận lợi để Enzyme hoạt hóa. Cồn và ether: giảm bớt tốc độ phản ứng của enzyme. Toluen: hòa tan chất béo (do đây là dung môi không phân cực). NaOH trung hòa môi trường Một số nguyên nhân gây sai số trong quá trình thí nghiệm: nghiền đậu không nhuyễn, lắc không đều trong hai giai đoạn; khi cho cồn và ether nếu thao tác chậm sẽ khiến chúng bay hơi; khi pha chỉ thị có vấy NaOH cũng dẫn đến sai số; khi chuẩn độ với 15

NaOH không nhận thấy chính xác sự đổi màu; ngoài ra còn những yếu tố chủ quan cả sinh viên trong quá trình thực hiện khi cân – pha hóa chất cũng như với dụng cụ còn bẩn hoặc vấy nước. Một số ứng dụng của enzyme lipase: Trong công nghệ thực phẩm: đối với các sản phẩm từ sữa lipase thủy phân chất béo, làm chín phomat; cải thiện mùi thơm trong các loại bánh; tăng cường hương vị cả các sản phẩm thịt cá loại bỏ chất béo; cải thiện mùi hương trong nước giải khát,... Trong ngành dược: chuyển đổi sự ester hóa, thủy phân các lipid đặc trưng, các chất trợ tiêu hóa đối với dược phẩm. Trong mỹ phẩm: tổng hợp hệ nhũ tương. Trong chất tẩy rửa: Lipase kiềm chịu nhiệt đã được áp dụng trong công nghệ tẩy rửa để loại bỏ các vết triglyceride từ người và các loại thức ăn nhanh, trước kia, việc loại bỏ các chất này trong điều kiện giặt ủi bình thường rất khó khăn. Các lipase sử dụng trong công nghiệp tẩy rửa ở Việt Nam có một ý nghĩa quan trọng, có hiệu quả kinh tế cao, thị trường tiêu thụ rộng lớn. Ngoài ra còn ứng dụng trong công nghệ môi trường, công nghệ hóa học, công nghệ sản xuất giấy,... 1.5.

Tài liệu tham khảo:

Giáo trình thí nghiệm hóa sinh thực phẩm Đại học sư phạm kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh. Rohit Shama et.al, Production, purification, characterization and applications of lipase, Biotechnology adavances 19 (2001) 627-662. Hóa sinh học – Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. Hóa học thực phẩm – Hoàng Kim Anh. Nhà xuất bản khoa học – kỹ thuật, 2007 Svendsen A (2000). Lipase protein engineering. Biochim Biophys Acta 1543 (2): 223– 228. Jars, 1992; Jäeger và cs., 1994; Kottwitz và cs., 1994; Kirk và cs., 2002; Vanhanen và cs., 2000; Prazeres và cs., 2006 16

Winkler FK; D'Arcy A; W Hunziker (1990). “Structure of human pancreatic lipase”. Nature 343 (6260): 771–774.

17

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 3 KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASE 1.1.

Tổng quan

Invertase có nguồn gốc từ thực vật, động vật và vi sinh vật, hiện nay được sản xuất chủ yếu nhờ nấm men saccharomyces cerevisiae, được thu dưới 2 dạng: invertase nội bào có trọng lượng phân tử 135000 Daltons, ngoại bào có trọng lượng phân tử 270000 Daltons. Invertase tồn tại nhiều dạng khác nhau trong tế bào: dạng hòa tan (dịch tế bào), dạng liên kết với màng, dạng độc lập (hạt).

Enzyme invertase Tên thay thế của invertase là EC 3.2.1.26, sacchatase, glucosucrase, ߚ-h-fructosidase, ߚfructosidase, invertin, sucrose, maxinvert l 1000, fructosylinvertase. Tên hệ thống ߚfructofuranosidase.

Invertase là một enzyme dùng để thủy phân saccharose thành glucose và fructose. Trong thực vật, invertase tách sucrose thành glucose và fructose tương ứng để cung cấp cho tế bào, làm nhiên liệu cho hô hấp, là nguồn cung cấp carbon và năng lượng. Sự thủy phân sucrose ảnh hưởng tới áp lực thẩm thấu của tế bào và do đó giúp cho tế bào phát triển về chiều dài và do đó làm thực vật tăng trưởng về chiều cao. Hoạt độ acid cao của invertase (ví dụ trong trái cây) cũng có thể liên quan với sự tích tụ của đường hexose. Do đó, invertase hòa tan cũng có chứng năng như một chất điều chỉnh thành phần đường trong sản phẩm sau thu hoạch. 18

Đường nghịch đảo thu được từ quá trình thủy phân sucrose ngọt hơn fructose và khó bị kết tinh do đó invertase chủ yếu được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm (bánh kẹo) vì có đặc tính hút ẩm khả năng giữ cho sản phẩm tươi và mềm trong thời gian dài. Đồ uống có cồn, acid lactic, glycerol được sản xuất bằng cách lên men sucrose có sử dụng invertase. Invertase hòa tan được sử dụng trong ngành công nghiệp đồ ngọt để sản xuất mật ong nhân tạo. Invertase (ߚ െ ݂‫ ;݁ݏܽ݀݅ݏ݋݊ܽݎݑ݂݋ݐܿݑݎ‬EC3.2.1.26) là một enzyme dùng để thủy phân

saccharose thành glucose và fructose.

Invertase có vùng pH rộng từ 3.5 – 5.5, pH tối ưu là 4.5 Nhiệt độ tối ưu của invertase là 60oC, nhiệt độ trên 80oC bị bất hoạt hoàn toàn Bị ức chế bởi các kim loại nặng như Cu, Pb,… do dễ phá vỡ liên kết disulfide làm enzyme mất hoạt tính. Ure hoạt động như một chất ức chế không cạnh tranh của invertase, bằng cách phá vỡ các liên kết hydro nội phân tử góp phần vào cấu trúc bậc ba của enzyme. Invertase thuộc nhóm enzyme xúc tác Hydrolase phản ứng thủy phân có sự tham gia của H2O. 1.2.

Mục tiêu bài thí nghiệm:

Khảo sát được hoạt độ enzyme Invertase trong men bánh mì. Biết cách tính toán khối lượng, thể tích để pha chế các hóa chất cần thiết cho thí nghiệm. Tìm hiểu thêm một số ứng dụng khác về enzyme trong đời sống thực tiễn. 1.3.

Nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu:

1.3.1. Nguyên tắc Dựa vào tính chất. Iodine trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để định lượng glucose sinh ra bằng cách định phân Iodine dư với dung dịch Na2S2O3. 19

I2 + 2NaOH  NaIO + NaI + H2O NaIO + CH2OH-(CHOH)4-CHO  NaI + CH2OH-(CHOH)4-COOH 2NaIO + 2NaI + 2H2SO4  I2 + 2Na2SO4 + 2H2O I2 + 2Na2S2O3  2NaI + Na2S4O3. 1.3.2. Nguyên liệu và dụng cụ -

Cốc thủy tinh 100ml-250ml

-

Bình tam giác 250ml

-

Pipette 2ml-10ml

-

Buret 25ml

-

Phễu thủy tinh

-

Giấy lọc

-

Saccharose 10%: Cân 10g saccharose hòa tan vào 90ml nước cất ta được 100ml dung dịch saccharose 10%.

-

NaOH 0,1N: Hòa tan 0,8g NaOH vào 200ml nước cất ta được 200ml dung dịch NaOH 0,1N.

-

HCl 37%: Hút 37ml HCl nguyên chất cho vào 63ml nước cất ta được 100ml dung dịch HCl 37%.

-

Iodine 0,1N: Cân 40g KI và hòa tan với 100ml nước cất trong bình cầu 1000ml. Cân 12,7g I2 cho vào bình cầu trên và lắc cho đến khi tan hoàn toàn. Nhỏ 3 giọt HCl 37%. Định mức cho đủ 1000ml bằng nước cất.

-

H2SO4 1N: Hòa tan 27,7ml H2SO4 96% cho đủ 1000ml bằng nước cất.

-

Hồ tinh bột 1%: 1g hồ tinh bột hòa tan trong 100ml. Đun cách thủy trong 15 phút.

-

Dung dịch Na2S2O3 0,05N: Cân 12.5g Na2S2O3.5H2O trong nước cất cho đủ 1000ml.

1.3.3. Sơ đồ thí nghiệm:

20

1g men bánh mì Cho nước vào đến vạch

Bình định mức 100ml Lắc 5 phút và lọc dịch Chuẩn bị ống nghiệm Để 3 ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó đem cách thủy 10 phút

10ml dung dịch Iodine

Hút 5ml hỗn hợp trên cho vào erlen 250ml

15ml NaOH

Sau đó để trong bóng tối 20 phút

Thêm 2ml H2SO4 1N vào và cho vài giọt hồ tinh bột 1%

Định phân với Na2S2O3

Xác định được lượng glucose và lặp lại thí nghiệm 3 lần

21

Điều chế dung dịch invertase: cân 1g men bánh mì, hòa tan vào 50ml nước cất, cho vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch, lắc đều trong 5 phút. Để lắng lọc lấy dịch lọc. Lấy 1/3 dịch lọc đem đun cách thủy 10 phút. Thực hiện 3 ống nghiệm như sau: Số ống

1

2

3

Dung dịch saccharose 10% (ml)

0

10

10

Nước cất (ml)

10

0

0

Dịch enzyme (ml)

10

10

0

Dịch enzyme đã đun cách thủy 10 phút (ml)

0

0

10

Để 3 ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong chính xác 30 phút sau đó đem đun cách thủy trong 10 phút. Ở từng ống nghiệm, hút ra 5ml hỗn hợp dung dịch cho vào một bình tam giác 250ml để xác định hàm lượng glucose. Để xác định glucose: thêm vào mỗi bình tam giác 10ml dung dịch iodine 0,1N và 15ml NaOH 0,1N. Chú ý nhỏ chậm từng giọt NaOH vào sao cho thời gian nhỏ kéo dài khoảng 2 phút. Để yên trong bóng tối khoảng 20 phút. Lấy ra, thêm vào 2ml H2SO4 1N. Định phân lượng iodine thêm thừa bằng Na2S2O3 0,05N với hồ tinh bột 1% làm chất chỉ thị. Lặp lại thí nghiệm 2-3 lần. 1.4.

Kết quả

1.4.1. Kết quả thí nghiệm Ống 1

Ống 2

Ống 3

Lần 1

15.7

1.05

13.45

Lần 2

15.4

0.75

13.2

Lần 3

15.2

1.25

13.2 V(ml)

Hoạt độ của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose bị thủy phân bởi lượng enzyme có trong 1g men bánh mì trong một phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.

Trong đó:

ሺܸଵ െ ܸଶ ሻ ൈ

‫ܣ‬ൈ‫ܤ‬ ͳͲͲͲ ൈ ʹͲ ൈ ʹ ൈ ܽ ൈ ܾ ൈ ‫ ݐ‬ൈ ݉

ܸଵ ǣsố ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1

22

ܸଶ : số ml dùng để định phân dung dịch ở ông nghiệm 2

A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm (ml)

B: tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m (g) men bánh mì (ml) a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (ml) b: thể tích dung dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (ml) t: thời gian thủy phân (phút) 1.4.2. Tính toán kết quả Lần 1: ሺܸଵ െ ܸଶ ሻ ൈ ‫ ܣ‬ൈ

஻

ଵ଴଴଴ൈଶ଴ൈଶൈ௔ൈ௕ൈ௧ൈ௠

ൌ ሺͳͷǡ͹ െ ͳǡͲͷሻ ൈ ʹͲ ൈ

ͳͲͲ ൌ Ͷǡͺͺ ൈ ͳͲିସ ͳͲͲͲ ൈ ʹͲ ൈ ʹ ൈ ͷ ൈ ͳͲ ൈ ͵Ͳ ൈ ͳ

ൌ ሺͳͷǡͶ െ Ͳǡ͹ͷሻ ൈ ʹͲ ൈ

ͳͲͲ ൌ Ͷǡͺͺ ൈ ͳͲିସ ͳͲͲͲ ൈ ʹͲ ൈ ʹ ൈ ͷ ൈ ͳͲ ൈ ͵Ͳ ൈ ͳ

ൌ ሺͳͷǡʹ െ ͳǡʹͷሻ ൈ ʹͲ ൈ

ͳͲͲ ൌ Ͷǡ͸ͷ ൈ ͳͲିସ ͳͲͲͲ ൈ ʹͲ ൈ ʹ ൈ ͷ ൈ ͳͲ ൈ ͵Ͳ ൈ ͳ

Lần2: ሺܸଵ െ ܸଶ ሻ ൈ ‫ ܣ‬ൈ

ଵ଴଴଴ൈଶ଴ൈଶൈ௔ൈ௕ൈ௧ൈ௠

Lần 3: ሺܸଵ െ ܸଶ ሻ ൈ ‫ ܣ‬ൈ 1.4.3. Bàn luận

஻

஻

ଵ଴଴଴ൈଶ଴ൈଶൈ௔ൈ௕ൈ௧ൈ௠

Hoạt độ enzyme ở ống 2 mạnh nhất vì lượng đường sinh ra nhiều thì lượng NaIO tham gia phản ứng với đường nhiều sinh ra nhiều NaI và lượng NaIO còn lại để phản ứng với NaI ít nên sinh ra lượng I2 ít dẫn tới lượng Na2S2O3 định phân ít. Ống 1 có lượng Na2S2O3 định phân nhiều vì không có đường enzyme không thủy phân nên lượng NaIO sinh ra không phản ứng với đường dẫn đến NaOI phản ứng với NaI nhiều, I2 sinh ra nhiều nên cần lượng Na2S2O3 nhiều. Còn ống 3 có đường nhưng enzyme bị bất hoạt một phần bởi nhiệt độ nên lượng Na2S2O3 để định phân ít hơn ống một nhiều hơn ống 2. Saccharose là cơ chất ‫ܪ‬ଶ ܱܵସ tái tạo lại iodine trong dung dịch

Một số lỗi thường gặp dẫn đến sai kết quả thí nghiệm: do hóa chất để lâu ngày hoặc bị lẫn tạp chất; do tính chủ quan cẩu thả của sinh viên trong quá trình thực hiện; không lau

rửa dụng cụ sau mỗi lần sử dụng; trong lúc lọc không cẩn thận; để ống nghiệm ở khoảng nhiệt độ và thời gian không chính xác; trong quá trình đun bị lẫn nước vào;. 23

Một số ứng dụng của enzyme: Việc sản xuất syrup đường không kết tình từ sucrose là một trong những ứng dụng của enzyme invertase. Syrup từ đường nghịch đảo có đặc tính hút ẩm trong lĩnh vực sản xuất kẹo mềm. Đồ uống có cồn, acid lactic, glycerol,... được sản xuất bằng cách lên men từ dung dịch có chứa sucrose. Ngoài ra còn ứng dụng trong ngành mỹ phẩm sử dụng như chất làm dẻo. Invertase còn là chất chống các tác nhân vi khuẩn mạnh mẽ và là chất hỗ trợ chống oxy hóa chống nhiễm trùng và lên men ruột từ quá trình oxy hóa. 1.5.

Tài liệu tham khảo:

Hóa sinh học – Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. Hóa học thực phẩm – Hoàng Kim Anh. Nhà xuất bản khoa học – kỹ thuật, 2007. Giáo trình thí nghiệm hóa sinh thực phẩm Đại học sư phạm kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh. Myrbäck K (1960). "Invertases". In Boyer PD, Lardy H, Myrbäck K (eds.). The Enzymes. 4(2nd ed.). New York: Academic Press. pp. 379–396. LaBau E. "What is Invertase?". About.com. Retrieved 10 April 2015. Neumann NP, Lampen JO (February 1967). "Purification and properties of yeast invertase". Biochemistry. 6 (2): 468–75. Uma C, Gomathi D, Multhulakshmi C, Gopalkrishana VK. Production, purification and characterization of invertase by Aspergillus flavus using fruit peel waste as substrate. Advan Biol Res. 2010;4(1):31e36.

Young Linda, Cauvain Stanley P. Technology of Bread MakingIn: The Scientific Name for Baker’s Yeast Is Saccharomyces Cerevisiae. Berlin: Springer; 2007, ISBN 0-387-38563-0; 2007:79. MAXINVERT. Invertase for food processing. 24

Kotwal

SM,

Shankar

V.

Immobilized

invertase.

Biotechnol

Adv.

2009;27:311e322. Friedrich Micscher Institute, Switzerland. Invertases, primary structure, function and roles in plant development and sucrose partitioning. Plant Physiol. September, 1999;121

25

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4 KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME UREASE. 1.1.

Tổng quan

Urease nếu xét về chức năng thì thuộc vè siêu họ các amidohydrolase và phosphotriesterase. Urease được tìm thấy trong rất nhiều vi khuẩn, nấm, tảo, thực vật và một số động vật không sương sống, thậm chí còn còn có thể tồn tại trong đất. Urease là các metalloenzyme chứa niken và có trọng lượng phân tử cao. Urease thuộc nhóm enzyme hydrolase.

Enzym urease Trọng lượng phân tử tương đối của nó là 12 000 ~ 13 000. Hoạt động cao nhất khi độ pH từ 6.0 đến 8.0, độ pH tối ưu là 7,4. Nhiệt độ tối ưu là 60°C, nhiệt độ khử hoạt tính là 70°C. Urease là một enzyme thủy phân ure thành ammoniac và carbondioxide. Trong thực vật, urease đóng vai trò quan trọng trong việt xúc tác quá trình thủy phân urea nhằm cung cấp nguồn ni-tơ thiết yếu cho cây. Urease có ứng dụng thực tiễn trong nhiều lĩnh vực. Trong công nghiệp thực phẩm, urease được ứng dụng trong việc loại bỏ urea còn tồn dư trong rượu vang, đảm bảo độ an toàn và chất lượng cảm quan cho sản phẩm. Phản ứng thủy phân urea dưới xúc tác urease được biểu diễn theo phương trình: ሺܰ‫ܪ‬ଶ ሻ‫ ܱܥ‬൅  ‫ܪ‬ଶ ܱ

ܰ‫ܪ‬ଷ ൅  ‫ܱܥ‬ଶ

26

Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamathylane tetramine và giải phóng acid carbonic: ʹሺܰ‫ܪ‬ସ ሻଶ ‫ ܱܥ‬൅ ͸‫ ܱܪܥܪ‬՜  ሺ‫ܪܥ‬ଶ ሻ଺ ܰସ ൅  ʹ‫ܪ‬ଶ ‫ܱܥ‬ଷ ൅  ͸‫ܪ‬ଶ ܱ

Hoạt động của urease làm tăng độ pH của môi trường vì nó tạo ra amoniac. Urease là enzyme đầu tiên được kết tinh. Urease từ những nguồn khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau và ngay cả trong cùng một nguồn là đậu nành, có tới 2 loại urease. Hai loại urease này khác nhau về thành phần apoenzyme nhưng bản chất của coenzyme vẫn không thay đổi. Các apoenzyme là những chuỗi polypeptide được hình thành từ nhiều acid amin. Thành phần acid amin này không giống nhau ở những nguồn gốc khác nhau. Trung tâm hoạt động của urease có chứa 2 nguyên tử Ni. Mỗi nguyên tử Ni này được nối với 2 nguyên tử N trong vòng imidazole và 1 nhóm carboxylate, 1 phân tử nước và chính 2 nguyên tử Ni này đóng vai trò quan trọng trong việc xúc tác phản ứng của urease. Đo cũng chính là lí do mà urease còn được gọi là “Nikel dependent enzyme”. Tuy nhiên urease có các nguồn gốc khác nhau như urease từ vi khuẩn như Bacillus pasteurii trong trung tâm hoạt động có chứa ion kim loại Zn2+ còn ở Klebsiella aerogenes có cofactor là Cu2+. Các tác nhân ảnh hưởng đến urease: Có nhiều loại thuốc ức chế urease khác nhau và cơ chế hoạt động của chúng đối với urease cũng khác nhau. Nó được chia thành hai cách: Thứ nhất, các chất ức chế urease thay đổi cấu trúc urease và làm bất hoạt urease. Các chất ức chế này bao gồm muối kim loại nặng và Paraformaldehyd; thứ hai là chất ức chế urease kết hợp với trung tâm hoạt động của urease để làm bất hoạt nó, để kiểm soát sự giải phóng khí amoniac, các chất này bao gồm các hợp chất acid ectopic và saponin chiết xuất yucca

1.2.

Mục đích bài thí nghiệm

Khảo sát được động học của enzyme urease và xác định được hoạt độ enzyme urease trong đậu nành. Biết cách tính toán pha chế hóa chất cho bài thí nhiệm. 27

Biết được các kĩ năng vẽ đồ thị Lineweaver-Burk; tính toán các thông số. Tìm hiểu được ứng dụng của urease trong thực tiễn. 1.3.

Nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu

1.3.1. Nguyên tắc Dùng dung dịch kiềm chuẩn định phân lương acid tạo thành sẽ tính được lượng urea bị thủy phân. 1.3.2. Nguyên liệu và dụng cụ -

Becher 100ml, 250ml

-

Erlen 100ml

-

Ống đong 50ml

-

Pipette 5ml, 10ml

-

Ống nghiệm

-

Bình định mức 100ml

-

Cối chày sứ

-

Tủ ấm

-

Bể ổn định nhiệt

-

NaOH 0,2N: Cân 4g NaOH cho vào 500ml nước cất ta được 500ml dung dịch NaOH 0,2N.

-

NaOH 0,05N: Cân 1g NaOH cho vào 500ml nước cất ta được dung dịch NaOH 0,05N.

-

Ure 2%: Cân 2g ure hòa tan vào 98ml nước cất ta được 100ml dung dịch ure 2%

-

Ure 1/3M: Cân 10,01g ure hòa tan vào 500ml nước cất ta được 500ml dung dịch ure 1/3M.

-

Formol trung tính: cho 10ml dung dịch 10% formol vào erlen, bổ sung 2ml 0,5% phenolphtalein. Nhỏ từng giọt 0,2N NaOH vào erlen cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt của phenolphtalein. Ghi nhận lượng 0,2N NaOH đã sử dụng (Vml).Căn cứ tỉ lệ dung dịch 10% formol và 0,2N NaOH đã sử dụng, tiến hành điều chế 100ml 10% formol trung hòa (không được sử dụng phenolphtalein).

-

Phenolphtalein 1%: cho 1g phenolphtalein vào 50ml ethanol và 50ml nước cất. 28

1.3.3. Sơ đồ thí nghiệm Thí nghiệm 1:

29

10g đậu nành xay

Cho nước vào tới vạch

Bình định mức 150ml Lọc Chuẩn bị ống nghiệm Cho Ure 1/3M vào ống 16 theo thể tích lần lượt là 0,1,2,3,4,5(ml) Dãy 2

Dãy 1

Cho vào tủ ấm 30oC trong 20 phút

Cho vào bể ổng định nhiệt ở 40oC trong 20 phút Chuyển mỗi ống nghiệm vào erlen 100ml

Lắc đều 2 phút và cho vài giọt phenolphtalein 1%

Định phân với NaOH 0,05N

Tính kết quả và lặp lại thí nghiệm 3 lần 30

Thí nghiệm 2: 5ml urease 2%

5ml dd urease 5ml nước cất

Ống 1

Ống 2

Ống 3

Dd urease đã cách thủy

Đặt ở 40oC Sau 20 phút cho vào mỗi ống 5ml formol trung tính

Vài giọt phenolphtalein 1%

Lắc đều 2 phút và đổ ra erlen 100ml

Định phân với NaOH 0,05N

Tính kết quả và lặp lại thí nghiệm 3 lần

31

32

1.4.

Kết quả:

1.4.1. Thí nghiệm 1 1.4.1.1.

Kết quả thí nghiệm khảo sát động học của enzyme

Ở mỗi dãy ống nghiệm tính toán kết quả theo bảng sau: Lần 1 ở 30oC Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

NaOH dùng chuẩn

-

1,4

1,9

2,3

2.8

3,4

-

3,5.10-5

4,75.10-5

5,75.10-5

7.10-5

8,5.10-5

-

1/3

2/3

1

4/3

5/3

Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

NaOH dùng chuẩn

-

1.5

1,8

2,4

2,9

3,5

-

3,75.10-5

4,5.10-5

6.10-5

7,25.10-5

8,75.10-5

-

1/3

2/3

1

4/3

5/3

độ (ml) Y= số mol ure bị thủy phân (mol) [S]= số mol ure ban đầu

Lần 2 ở 30oC

độ (ml) Y= số mol ure bị thủy phân (mol) [S]= số mol ure ban đầu 1.4.1.2.

Tính toán kết quả

Bảng số liệu Ống 1

1/s

1/v

-

-

-

33

Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Ống 6

3

571428,57

3

533333,33

3/2

421052,63

3/2

444444,44

1

347826,09

1

333333,33

3/4

285714,29

3/4

275862,07

3/5

235294.12

3/5

228571,43

Lần 1 ở 40oC Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

NaOH dùng chuẩn

-

1,6

2,1

2,6

3,1

4

-

4.10-5

5,25.10-5

6,5.10-5

7,75.10-5

1.10-4

-

1/3

2/3

1

4/3

5/3

độ (ml) Y= số mol ure bị thủy phân (mol) [S]= số mol ure ban đầu Lần 2 ở 40oC Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

NaOH dùng chuẩn độ

-

1,7

2,3

2,8

3,4

4,1 34

(ml) Y= số mol ure bị thủy

-

4,25.10-5

5,75.10-5

7.10-5

8,5.10-5

1,025.10-4

-

1/3

2/3

1

4/3

5/3

phân (mol) [S]= số mol ure ban đầu Bảng số liệu Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Ống 6

1/s

1/v

-

-

-

-

3

500000

3

470588.24

3/2

380952.38

3/2

347826.09

1

307692.31

1

285714.29

3/4

258064.52

3/4

235294.12

3/5

200000

3/5

195121.95

Trên cùng một hệ trục tọa độ vẽ 2 đường cong biểu diễn lượng cơ chất bị thủy phân theo nồng độ cơ chất ban đầu ở 2 nhiệt độ (Y1 và Y2 theo [S]) Vẽ đường thẳng biểu diễn sự biến thiên của 1/V theo 1/[S] ở 2 nhiệt độ thủy phân. Trong đó: v = d(S)/dt = Y/20 (v là vận tốc phản ứng thủy phân). Động học của phản ứng enzyme được tính toán dựa theo đồ thị Lineweaver-Burk: Với: Vmax: vận tốc thủy phân cực đại [S]: nồng độ cơ chất 35

Km: hằng số Michaelis-Menten Các đường thẳng này sẽ cắt trục hoành và trục tung tại các giá trị nghịch đảo của Km và Vmax. Kết quả khảo sát động học được biểu diễn Lần 1 và lần 2 ở 30Ԩ

700000.00 y = 126174x + 194828 R² = 0.9186

600000.00 500000.00 400000.00 300000.00 200000.00 100000.00 -3

-2

0.00 -1 0 -100000.00

1

2

3

4

3

4

-200000.00

Từ đồ thị ta có giá trị của Km là 2/3 và của Vmax là 5.10-6 Lần 1 và lần 2 ở 40oC

600000.00 y = 111815x + 164938 R² = 0.9299

500000.00 400000.00 300000.00 200000.00 100000.00 -3

-2

0.00 -1 0 -100000.00

1

2

-200000.00

Từ đồ thị ta có giá trị Km là 2/3 và của Vmax là 6,25.10-6 1.4.2. Thí nghiệm 2 36

1.4.2.1.

Kết quả thí nghiệm Xác định hoạt độ Ống 1

Ống 2

Ống 3

Lần 1

0.35

3.25

0.5

Lần 2

0.35

4.9

0.4

Lần3

0.35

5.3

0.5

1.4.2.2.

Tính toán kết quả

Hoạt độ urease được biểu diễn bằng số mol ure bị thủy phân bởi lượng enzyme urease có trong 1g bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 40oC.

Trong đó:

ሺܸଵ െ ܸଶ ሻ ൈ

‫ܣ‬ൈ݇ ʹͲ ൈ ͳͲଷ ൈ ʹ ൈ ‫ ݐ‬ൈ ܽ ൈ ݉

ܸଵ ǡ ܸଶ : số ml NaOH 0,05N dùng định phân dung dịch trong ống nghiệm 1 và 2 a: thể tích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm

A: tổng thể tích enzyme có được từ m(g) bột đậu nành t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu cân k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,05N =1,035/1 Lần 1: ሺ͵ǡʹͷ െ Ͳǡ͵ͷሻ ൈ ʹͲͲ ൈ Lần 2: ሺͶǡͻ െ Ͳǡ͵ͷሻ ൈ ʹͲͲ ൈ

Lần 3: ሺͷǡ͵ െ Ͳǡ͵ͷሻ ൈ ʹͲͲ ൈ 1.4.3. Bàn luận

ଵǡ଴ଷହ

ଶ଴ൈଵ଴య ൈଶൈଶ଴ൈହൈଵ଴ ଵǡ଴ଷହ

ଶ଴ൈଵ଴య ൈଶൈଶ଴ൈହൈଵ଴ ଵǡ଴ଷହ

ଶ଴ൈଵ଴య ൈଶൈଶ଴ൈହൈଵ଴

ൌ ͳǡͷͲ ൈ ͳͲିହ

ൌ ʹǡ͵ͷ ൈ ͳͲିହ ൌ ʹǡͷ͸ ൈ ͳͲିହ

Ở ống nghiệm 1 có ezyme nhưng không có cơ chất nên lượng NaOH dùng định phân ít nhất, ở ống nghiệm 2 có cơ chất và enzyme không bị bất hoạt nên lượng NaOH dùng định phân là nhiều nhất, còn ở ống nghiệm 3 tuy có cơ chất nhưng ezyme đã bị bất hoạt một phần do nhiệt độ nên lương NaOH dùng định phân sẽ ít hơn ống số 2 nhưng sẽ nhiều hơn ống số 1. Cho ure 1/3M và 2% vào để làm cơ chất cho enzyme urease thủy phân. Cho formol trung tính vào môi trường để tạo thành hexamethylene tetramine và giải phóng ra acid carbonic. 37

Cho phenolphtalein 1% vào để làm chất chỉ thị. Dùng NaOH 0.05N để chuẩn độ lượng acid carbonic sinh ra từ đó có thể tính toán được lượng ure đã được thủy phân. Một số lỗi thường gặp dẫn đến sai số trong quá trình làm thí nghiệm là: cân hóa chất không đúng lượng cần pha và pha hóa chất có nồng độ chênh lệch so với nồng độ lí thuyết, lỗi do người thực hiện thao tác như hút hóa chất không đủ hoặc thừa lượng cần dùng, hóa chất bị lẫn tạp chất hoặc có lẫn hóa chất khác do dụng cụ đựng chưa được vệ sinh sạch sẽ. Một số ứng dụng của enzyme: loại bớt nồng độ cồn còn tồn tại trong các sản phẩm bia rượu, được ứng dụng trong phân tích là điện cực urease không tan dùng để xác định tự động ure trên dòng liên tục enzyme urease, ứng dụng trong y học là phân hủy ure trong bộ phận lọc của thận nhân tạo. 1.5.

Tài liệu tham khảo:

PDB : 2KAU ; Jabri E, Carr MB, Hausinger RP, Karplus PA (tháng 5 năm 1995). "Cấu trúc tinh thể của urease từ Klebsiella aerogenes". Khoa học . 268 (5213): 998 bóng1004. doi : 10.1126 / khoa học.7754395 . PMID 7754395 Ciurli S, Benini S, Rypniewski WR, Wilson KS, Miletti S, Mangani S (1999). "Tính chất cấu trúc của các ion niken trong urease: những hiểu biết mới về cơ chế xúc tác và ức chế". Phối hợp Hóa học Nhận xét . 190 Chân192: 331 Từ355. doi : 10.1016 / S00108545 (99) 00093-4 . https://vi.mricc.com/urease-properties.html Hóa sinh học – Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. Hóa học thực phẩm – Hoàng Kim Anh. Nhà xuất bản khoa học – kỹ thuật, 2007. Giáo trình thí nghiệm hóa sinh thực phẩm Đại học sư phạm kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh.

38