Nelson Cox - Principi Di Biochimica - Lehninger [PDF]

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"I principi di biochimica di Lehninger" di Nelson e Cox

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Codice genetico e traduzione del RNA messaggero Significato e caratteristiche del codice genetico Il codice genetico Tre grandi scoperte hanno posto le basi per l'attuale conoscenza della biosintesi delle proteine. All'inizio degli anni '50, Paul Zamecnik e i suoi collaboratori hanno eseguito una serie di esperimenti tesi a rispondere alla domanda su quale fosse la localizzazione cellulare della sintesi proteica. Essi iniettarono amminoacidi radioattivi nei ratti; quindi, a differenti intervalli di tempo dopo l'iniezione, il fegato veniva rimosso, omogenizzato e frazionato per centrifugazione. Le frazioni subcellulari venivano poi esaminate al fine di determinare la presenza di proteine radioattive. Se si lasciavano trascorrere ore o addirittura giorni dall'iniezione di amminoacidi marcati, si notava che tutte le frazioni subcellulari conteneano proteine marcate; invece quando il fegato veniva rimosso e frazionato, alcuni minuti dopo l'iniezione degli ammnoacidi marcati, le proteine marcate si trovavano solo in una frazione contenente piccole particelle ribonucleoproteiche. Queste particelle, visibili al microscopio elettronico nei tessuti animali, furono pertanto identificate come il sito dove, a partire dagli amminoacidi, avveniva la sintesi proteica; in seguito vennero chiamate ribosomi. La seconda scoperta fu fatta da Mahlon Hoagland e dallo stesso Zamecnik; essi osservarono che gli amminoacidi venivano “attivati” se erano incubati con ATP e con la frazione citosolica delle cellule epatiche. Gli amminoacidi erano uniti a una forma speciale di RNA solubiIe stabile al calore (scoperti e caratterizzati da Robert Holley) in seguito chiamata RNA transfer (tRNA), e formavano un complesso amminoacil-tRNA. Gli enzimi che catalizano questo processo sono le amminoacil-tRNA sintetasi. La terza importante scoperta ebbe Iuogo in seguito alla domanda che si pose Francis Crick su quale fosse il meccanismo attraverso il quale l'informazione genetica, codificata dal linguaggio a quattro lettere degli acidi nucleici, viene tradotta nel linguaggio a 20 lettere delle proteine. Crick intuì che un piccolo acido nucleico (presumibimente l'RNA) doveva servire da adattatore, con una parte della sua molecola che lega un amminoacido specifico e un'altra parte che riconosce una breve sequenza dell'mRNA che codifica quell'amminoacido. Questa idea venne presto verificata. Il tRNA adattatore "traduce" la sequenza nucleotidica dell'mRNA nella sequenza amminoacidica del polipeptide. Il processo complessivo della sintesi proteica guidata dall'mRNA viene chiamato traduzione. Queste scoperte condussero presto alla conoscenza dei passaggi fondamentali della sintesi proteica e infine alla decifrazione del codice genetico che specifica i singoli amminoacidi Il codice genetico è stato decifrato utilizzando stampi di mRNA artificiali Già negli anni '60 era evidente che erano necessari almeno tre residui nucleotidici di DNA per codificare ciascun amminoacido. Il codice a quattro lettere del DNA (A, T, G e C) a gruppi di due può dare solo 4 2 = 16 combinazioni diverse, non sufficienti a codificare 20 amminoacidi. Gruppi di tre possono però dare 4 3 = 64 diverse combinazioni. Molte delle proprietà chiave del codice genetico erano state stabilite in precedenti studi genetici. Un codone è una tripleta di nucleotidi che codifica uno specifico amminoacido. La traduzione avviene quando queste triplette di nucleotidi vengono lette in successione senza sovrapposizioni. Il primo codone specifico della sequenza determina un quadro di lettura (reading frame), in base al quale ogni tre residui nucleotidici inizia un nuovo codone. Non esiste punteggiatura tra i codoni di due amminoacidi in successione. La sequenza amminoacidica di una proteina è definita dalla sequenza lineare di codoni contigui costituiti da tre nucleotidi. Secondo questo schema, ci sono tre possibili quadri di lettura per ogni singolo filamento di DNA o di mRNA. Ognuno determina tre sequenze diverse di codoni, ma solo uno è in grado di codificare una determinata proteina. Rimaneva però irrisolta una questione molto importante: quali sono le parole del codice a tre lettere che specificano i diversi amminoacidi? Nel 1961 Marshall Nirenberg e Heinrich Matthei resero nota una loro ricerca che aprì il primo varco. Essi avevano incubato il poliribonucleotide sintetico poliuridilato, poli(U), con un estratto di E.coli, GTP, ATP e una miscella dei 20 amminoacidi in 20 provette diverse; ogni provetta conteneva un diverso amminoacido radioattivo. Poichè il poli(U) può essere considerato come un mRNA artificiale contenente molte triplette UUU in successione, dovrebbe promuovere la sintesi di un polipeptide formato da uno solo dei 20 amminoacidi, quello codificato dalla tripletta UUU. Infatti si era formato un polipeptide radioattivo in una sola delle 20 provette, quella contenente fenilalanina radioattiva. Nirenberg e Matthaei conclusero quindi che la tripletta UUU codifica la fenilalanina. Mediante lo stesso tipo di approccio si è scoperto che il poliribonucleotide sintetico policitidilato o poli(C) codifica un polipeptide contenente solo prolina (Poliprolina), e il poliadenilato o poli(A) codifica la polilisina. Il poliguanilato non funziona in questo tipo di esperimento perché forma spontaneamente tetraplette che non possono essere lette dai ribosomi. I polinucleotidi sintetici usati in questi esperimenti erano stati prodotti per mezzo della polinucleotide fosforilasi, che catalizza la formazione di polimeri di RNA a partire da ADP, UDP, CDP e GDP. Questo enzima, scoperto da Severo Ochoa, non ha bisogno di stampo e sintetizza polimeri con una composizione di basi che riflette direttamente la

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concentrazione relativa dei precursori nucleosidi 5' -difosfato presenti nella miscela di reazione. Se la polinucleotide fosforilasi viene incubata con UDP, sintetizza solo poli(U). Se essa viene incubata con una miscela di cinque parti di ADP e una di CDP, sintetizzerà un polimero in cui circa cinque sesti dei residui sono di adenilato e un sesto è di citidilato. Un polimero casuale di questo tipo ha un'elevata probabilità di avere molte triplette AAA e un numero minore di triplette AAC, ACA e CAA, relativamente poche triplette ACC, CCA e CAC, e pochissime triplette CCC. Utilizzando diversi mRNA artificiali sintetizzati dalla polinucleotide fosforilasi a partire da diverse miscele di ADP, GDP, UDP e CDP, è stato possibile identificare la composizione in basi delle triplette che codificano quasi tutti gli amminoacidi. Nonostante questi esperimenti rivelino la composizione delle basi delle triplette, non possono però rivelare la sequenza delle basi. Nel 1964 Nirenberg e Philip Leder fecero un'altra scoperta fondamentale. Osservarono che ribosomi isolati di E. coli si legano a uno specifico amminoacil-tRNA se è presente il corrispondente messaggero sintetico polinucleotidico. Ad esempio, ribosomi incubati con poli(U) e fenilalanil-tRNA Phe (Phe-tRNAPhe) legano entrambi i tipi di RNA, mentre se i ribosomi vengono incubati con poli(U) e qualche altro amminoacil-tRNA, l'amminoacil-tRNA non si lega perché non riconosce le triplette UUU del poli(U). Poiché qualsiasi trinucleotide può promuovere il legame specifico con un tRNA corrispondente, con questa tecnica i ricercatori furono in grado di determinare, utilizzando gli oligonucleotidi sintetizzati chimicamente, quale amminoacil-tRNA si legava a ciascuno di circa 54 codoni dei 64 possibili. Nel caso di alcuni codoni, poi, o non si legava alcun amminoacil-tRNA o se ne legava più di uno. Era necessario un altro metodo per confermare e completare l'intero codice genetico. Quasi contemporaneamente, H. Gobind Khorana fornì un approccio complementare: aveva sviluppato un metodo per sintetizzare poliribonucleotidi con definite sequenze ripetitive di due, tre o quattro basi. I polipeptidi prodotti usando questi RNA come messaggeri avevano uno o alcuni amminoacidi in sequenze ripetitive. Queste sequenze, combinate con l'informazione contenuta nei polimeri casuali utilizzati da Nirenberg e collaboratori, hanno reso possibile l'assegnazione dei codoni senza alcuna ambiguità. Il copolimero (AC)n, per esempio, possiede codoni alternati ACA e CAC, indipendentemente dal quadro di lettura: ACACACACACACACA. Il polipeptide sintetizzato sulla base di questo messaggero era formato da uguali quantità di treonina e di istidina. Poiché il codone per l'istidina ha una A e due C, CAC deve codificare l'istidina e ACA la treonina. Il consolidamento dei risultati ottenuti con questi esperimenti ha permesso di assegnare 61 dei 64 possibili codoni. Gli altri tre sono stati identificati come codoni di terminazione, anche perché interrompevano la sequenza degli amminoacidi quando venivano inclusi nella sequenza di un polimero di RNA sintetico. Con queste strategie le sequenze di basi di tutte le triplette codificanti ciascun amminoacido furono definitivamente chiarite entro il 1966 e verificate in molti modi diversi. La comprensione del codice genetico è ritenuta una delle più importanti scoperte scientifiche del ventesimo secolo. I codoni sono la chiave per la traduzione dell'informazione genetica che dirige la sintesi di specifiche proteine. Il quadro di lettura deve pertanto essere stabilito correttamente all'inizio della traduzione di una molecola di mRNA, e in seguito deve essere mantenuto quando il macchinario sintetico legge sequenzialmente da una tripletta alla successiva. Se il quadro di lettura iniziale è spostato di una o due basi, o se viene accidentalmente saltato un nucIeotide dell'mRNA, tutti i codoni successivi saranno fuori registro e porteranno alla formazione di una proteina non presente in natura con una sequenza di amminoacidi sbagliata. Alcuni codoni hanno funzioni specifici. Il codone di inizio AUG, è il segnale più comune di inizio delle catene amminoacidiche in tutte le cellule, e inoltre codifica la metionina anche se posto all’interno dei polipeptidi. I codoni di terminazione (UAA, UAG, UGA) chiamati anche codoni non consenso, normalmente segnalano la fine della catena polipeptidica e non codificano nessun amminoacido conosciuto. L’inizio della sintesi proteica inizia un processo elaborato che ha bisogno, oltre che di segnali di inizio, anche di altri segnali presenti sull’mRNA. Facendo retrospettivamente gli esperimenti di Nirenberg e Khorana per identificare la funzione dei codoni, essi non avrebbero dovuto funzionare in assenza dei codoni di inizio. Sorprendentemente, le condizioni sperimentali erano tali da permettere l'inizio della sintesi anche in mancanza di questi. La perseveranza combinata con la casualità produsse una scoperta fondamentale, un fatto che si è ripetuto spesso nella storia della biochimica. In una sequenza casuale di nucleotidi, in media un codone ogni 20 in ciascun quadro di lettura sarà un codone di terminazione. In generale, se un quadro di lettura non presenta un codone di terminazione per più di 50 nucleotidi consecutivi, tale regione viene chiamata quadro di lettura aperto (open reading frame, "ORF"). Quadri di lettura aperti che si estendono per lunghi tratti generalmente corrispondono a tratti che codificano proteine. Nell'analisi delle

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sequenze presenti nelle banche dati, sono usati programmi sofisticati per cercare quadri di lettura aperti al fine di trovare geni nella quantità immensa di DNA non genico. Un gene privo di interruzioni che codifica una proteina con una massa molecolare di 60 000 dovrebbe avere un quadro di lettura aperto con 500 o più codoni. Una caratteristica sorprendente del codice genetico è che un amminoacido può essere specificato da più di un codone, in questo senso il codice viene detto degenerato. Questo, però, non significa che il codice è impreciso. Infatti, anche se a un amminoacido corrispondono più codoni, ciascun codone specifica solo un amminoacido. Si noti che la degenerazione del codice non è uniforme. Mentre soltanto la metionina e il triptofano corrispondono a un solo codone, per esempio, tre amminoacidi (Leu, Ser, Arg) hanno ciascuno sei codoni corrispondenti, cinque amminoacidi ne hanno quattro, Ile ne ha tre, e nove amminoacidi ne hanno due. Il codice genetico è praticamente universale, con l'interessante eccezione di poche variazioni nei mitocondri, in alcuni batteri e in alcuni eucarioti unicellulari; i codoni che corrispondono ai 20 amminoacidi sono identici in tutte le specie esaminate finora. Gli esseri umani, E. coli, la pianta del tabacco, gli anfibi e i virus condividono lo stesso codice genetico. Sembra inoltre che tutte le forme viventi abbiano avuto un antenato comune il cui codice genetico si è conservato durante l'evoluzione biologica. Perfino le variazioni rafforzano questo concetto. L"oscillazione" permette ad alcuni tRNA di riconoscere più di un codone Quando diversi codoni specificano un singolo amminoacido, la differenza tra i vari codoni generalmente riguarda la terza base (all'estremità 3'). Ad esempio, l'alanina viene codificata dalle triplette GCU, GCC, GCA e GCG. I codoni per quasi tutti gli amminoacidi possono essere rappresentati simbolicamente da XYAG o XYKUG Le prime due Iettere di ciascun codone sono pertanto i principali determinanti della specificità, una caratteristica che ha alcune interessanti conseguenze. Gli RNA transfer riconoscono i codoni per mezzo dell'appaiamento di basi tra il codone dell'mRNA e la tripletta del tRNA chiamata anticodone. La prima base del codone (che viene letto sempre in direzione 5' 3') si appaia con la terza base dell'anticodone. Se la tripletta anticodone di uno specifico tRNA riconoscesse una sola tripletta codone attraverso il classico appaiamento di basi di Watson-Crick in tutte e tre le posizioni, le cellule dovrebbero avere un tRNA diverso per ciascun codone che specifica un amminoacido. Ma non è così poiché gli anticodoni in alcuni tRNA contengono il nucleotide inosinato (chiamato I), che contiene l'inconsueta base ipoxantina. Modelli molecolari dimostrano che l'inosinato può formare legami idrogeno con tre diversi nucleotidi (U, C e A), ma questi appaiamenti sono piuttosto deboli rispetto ai forti legami idrogeno tra gli appaiamenti di Watson-Click (G≡C e A=U). Nel lievito, ad esempio, un tRNAARG ha l'anticodone (5')ICG, che può riconoscere tre diversi codoni dell'arginina: (5')CGA, (5')CGU c (5')CGC. Le prime due basi di questi codoni sono identiche (CG) e formano solidi appaiamenti di Watson-Crick con le basi corrispondenti degli anticodoni, ma la terza base dei tre codoni (A, U o C) che corrispondono all'arginina forma dei leganti idrogeno piuttosto deboli con il residuo I posto nella prima posizione sull'anticodone. L'esame di questi e di altri appaiamenti codone-anticodone indusse Click a concludere che la terza base della maggior parte dei codoni si appaia in modo piuttosto "libero" con la base corrispondente del proprio anticodone; per usare la sua espressione pittoresca, le terze basi di tali codoni (e le prime basi dei corrispondenti anticodoni) "oscillano" (wobble). Crick elaborò quattro principi che vanno sotto il nome complessivo di ipotesi dell'oscillazione. 1. Le prime due basi di un codone di mRNA formano sempre solidi appaiamenti di Watson-Crick con le basi corrispondenti dell'anticodone del tRNA e conferiscono la maggior parte della specificità di codificazione. 2. La prima base di alcuni anticodoni (leggendo in direzione 5’3’; si ricordi che questa base è appaiata con la terza base del codone) determina il numero di codoni letti da un dato tRNA. Quando la prima base dell'anticodone è C o A, il legame è specifico e quel tRNA legge un solo codone. Quando la prima base è U o G, il legame è meno specifico e possono essere letti due diversi codoni. Quando l'inosinato (I) è il primo nucleotide di un anticodone (o nucleotide oscillante), tre diversi codoni possono venire letti da quel tRNA. Questo è il massimo numero di codoni che può essere riconosciuto da un tRNA. 3. Quando un amminoacido viene specificato da più codoni diversi, i codoni che differiscono in una delle due prime basi necessitano di tRNA diversi. 4. Per la traduzione di tutti i 61 codoni sono necessari come minimo 32 tRNA (31 che codificano gli amminoacidi e 1 per l'inizio). La base oscillante (o terza base) del codone contribuisce alla specificità ma, a causa dell'appaiamento più debole con la base corrispondente sull'anticodone, permette la dissociazione rapida del tRNA dal suo codone durante la sintesi proteica. Se tutte e tre le basi presenti sul codone formassero solidi appaiamenti del tipo Watson-Crick con le tre basi presenti sull'anticodone, il tRNA si dissocierebbe troppo lentamente e ciò limiterebbe gravemente la velocità della

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sintesi proteica. Le interazioni esistenti tra codoni e anticodoni ottimizzano la risposta alle necessità di accuratezza e di velocità. Grazie allo studio del codice genetico conosciamo il processo con cui l'informazione per la sequenza proteica viene conservata negli acidi nucleici, e anche il sistema con cuì questa informazione viene tradotta in una proteina. Occupiamoci ora dei meccanismi molecolari del processo di traduzione. Lo slittamento della sequenza di lettura e l'editing dell'RNA influenzano la lettura del codice Una volta costituitasi la sequenza di lettura durante la sintesi proteica, i codoni vengono tradotti senza sovrapposizioni o punteggiatura fino a che il complesso ribosomiale non incontra il codone di terminazione. Le altre due possibili sequenze di lettura non contengono alcuna informazione genetica utile, tuttavia alcuni geni sono strutturati in modo tale che ad un certo punto del processo di traduzione degli mRNA i ribosomi "avanzano a singhiozzo", cambiando la sequenza di lettura da quel punto in poi. Potrebbe trattarsi di un meccanismo che permette la sintesi di due o più proteine correlate, ma distinte, a partire da un unico trascritto, oppure di un meccanismo di regolazione della sintesi di una proteina. Uno degli esempi meglio documentati di slittamento della sequenza di lettura è quello della traduzione degli mRNA dei geni gag e pol del virus del sarcoma di Rous. La sequenza di lettura per pol è spostata a sinistra di una base (fase di lettura – 1) rispetto alla sequenza di lettura per gag. Il prodotto del gene pol (trascrittasi inversa) viene tradotto, sotto forma di una grossa poliproteina sullo stesso mRNA utilizzato per la sintesi della sola proteina gag. La poliproteina, o poliproteina gag-pol, viene poi tagliata per digestione proteolitica, producendo la trascrittasi inversa matura. La produzione della poliproteina richiede uno slittamento di sequenza nella regione di sovrapposizione per permettere al ribosoma di scavalcare il codone di terminazione UAG alla fine del gene gag. Slittamenti di sequenza si verificano nel 5% delle traduzioni di questo mRNA, e la poliproteina gag-pol (e quindi la trascrittasi inversa) viene sintetizzata con una frequenza di circa un quinto rispetto alla proteina gag, un livello comunque sufficiente per la replicazione del virus. In alcuni retrovirus, un altro slittamento di sequenza permette la traduzione di una poliproteina ancora più grande, che include il prodotto del gene env fuso con i prodotti del gene pol. Un simile meccanismo produce le due subunità τ e γ della DNA polimerasi III di E. coli da un singolo trascritto del gene dnaX. Alcuni mRNA vengono modificati prima della traduzione. L'editing dell'RNA può comportare l'aggiunta, la delezione o l'alterazione dei nucleotidi dell'RNA, in modo tale da influenzare il significato del trascritto quando viene tradotto. L’aggiunta o la delezione di nucleotidi è stata osservata soprattutto negli RNA originati dai genomi mitocondriali e cloroplastici degli eucarioti. Le reazioni richiedono una speciale classe di molecole di RNA, codificate dagli stessi organelli, con sequenze complementari agli mRNA modificati. Questi RNA guida (gRNA) agiscono da stampi per il processo di editing. I trascritti iniziali dei geni che codificano la subunità II della citocromo ossidasi in alcuni mitocondri dei protisti sono un esempio di editing per inserzione. Questi trascritti non corrispondono precisamente alla sequenza necessaria per la terminazione carbossilica del prodotto proteico. Un processo di editing post-trascrizionale inserisce quattro residui di U che spostano la fase di lettura della traduzione del trascritto. Si noti che l'appaiamento delle basi tra il trascritto iniziale e l'RNA guida comporta un certo numero di coppie di basi G≡U, comuni nelle molecole di RNA. L'editing del DNA per alterazione dei nucleoticti spesso comporta la deamminazione enzimatica dei residui di adenosina e di citidina, ccn formazione rispettivamente di inosina e uridina, anche se sono state descritte altre reazioni che alterano le basi. Durante la traduzione, l'inosina viene letta come un residuo G. La deamminazione dell'adenosina è catalizzata da adenosina deamminasi che agisce sull'RNA (ADAR) La deamminazione della citidina è catalizzata da una famiglia di enzimi, che comprende i peptidi catalitici apoB per l'editing dell'mRNA (APOBEC), e le deamminasi indotte dall'attivazione (AID, activation-induced deamminases). Ambedue i gruppi di enzimi possiedono un dominio catalitico omologo, che coordina uno ione zinco. Un esempio ben studiato di editing dell'RNA per deamminazione è quello che interessa il gene per l'apolipoproteina B, un componente delle Iipoproteine a bassa densità dei vertebrati. Una forma di apolipoproteina B, l'apoB-100, (Mr 513 000), viene sintetizzata nel fegato; una seconda forma, l'apoB-48 (Mr 250 000), viene sintetizzata nell'intestino. Ambedue le proteine sono codificate da un mRNA prodotto dal gene per l'apoB-100. Una APOBEC citidina deamminasi presente esclusivamente nell'intestino si lega all'mRNA a livello del codone per il residuo amminoacidico 2153 (CAA = GIn), e converte la C in D, creando la terminazione UAA. L'apoB-48 prodotta nell'intestino dall'mRNA modificato non è che una forma troncata dell'apoB100, priva della metà della posizione amminoterminale. La reazione permette la sintesi tessuto-specifica di due differenti proteine da uno stesso gene.

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La deamminazione dell'A in I, catalizzata dall'ADAR, è particolarmente comune nei trascritti dei geni dei primati, e circa il 90% o più dell'editing avviene in corti elementi sparsi (SINE, shon interspersed elements) chiamati elementi Alu. Nell'uomo sono stati identificati più di un milione di elementi Alu, lunghi 300 bp, che ammontano a circa il 10% del genoma. Sono concentrati soprattutto vicino ai geni che codificano le proteine, spesso negli introni e nelle regioni non tradotte delle terminazioni 3' e 5' dei trascritti. Non appena sintetizzati (prima del processo di maturazione), gli mRNA dell’uomo includono mediamente da 10 a 20 elementi Alu. Gli enzimi ADAR si legano agli mRNA e promuovono l'editing dell'A in I solo in regioni duplex dell'RNA.. I numerosi elementi Alu offrono molte opportunità di formazione di accoppiamenti di basi intramolecolari nei trascritti, formando in tal modo i siti a doppia elica sui quali possono agire gli ADAR. Alcune reazioni di editing alterano la sequenza di basi dei geni. Alcuni difetti degli enzimi ADAR sono stati correlati con vari disordini neurologici, tra cui la sclerosi amiotrofica laterale (ALS), l'epilessia e la depressione. l genomi di tutti i vertebrati sono ricchi di sequenze SINE, ma esistono molti tipi di SINE nella maggior parte di questi organismi. Gli elementi Alu sono presenti soprattutto nei primati. Uno screening accurato dei geni e dei trascritti ha rivelato che l'editing di A in I è da 30 a 40 volte più frequente nell'uomo che nel topo, soprattutto per la presenza di molti elementi Alu. La deamminazione di A in l su larga scala e un più elevato livello di splicing alternativo sono due caratteristiche che distinguono il genoma dei primati da quello degli altri mammiferi. Non è chiaro se queste reazioni sono puramente accidentali o se hanno svolto un ruolo nell'evoluzione dei primati, e quindi dell'uomo.

Sintesi ribosomiale delle proteine (attivazione degli amminoacidi, inizio, allungamento, terminazione)

La sintesi proteica Come abbiamo visto per il DNA e per l'RNA, la sintesi delle biomolecole polimeriche può essere suddivisa negli stadi di inizio, allungamento e terminazione. Questi processi fondamentali sono di norma preceduri seguiti da due stadi aggiuntivi: l'attivazione dei precursori degli amminoacidi prima della sintesi, e le modificazioni post-sintetiche del polimero completato. La sintesi delle proteine avviene nello stesso modo. L'attivazione degli amminoacidi prima della loro incorporazione nei polipeptidi e le modifiche post-traduzionali svolgono un ruolo particolarmente importante nell'assicurare sia la fedeltà della sintesi, sia la funzione appropriata della proteina prodotta. I componenti cellulari necessari alle cellule eucariotiche sono molto simili, sebbene il numero dei componenti sia a volte più grande. Una sintesi di questi stadi può essere utile per quanto diremo in seguito. La sintesi proteica avviene in cinque stadi: Stadio 1: attivazione degli amminoacidi La sintesi di un polipeptide con una sequenza definita necessita di due fondamentali requisiti chimici: (1) il gruppo carbossilico di ciascun amminoacido deve essere attivato per facilitare la formazione del legame peptidico; (2) deve essere stabilita una corrispondenza tra ciascun nuovo amminoacido e l'informazione contenuta nell'mRNA che lo codifica. Entrambi questi requisiti vengono ottenuti tramite l'attacco dell'amminoacido al tRNA nel primo stadio della sintesi proteica. L'attacco dell'amminoacido giusto al tRNA giusto costituisce il punto cruciale. Questo stadio avviene nel citosol, non sui ribosomi. Ciascuno dei 20 amminoacidi viene legato covalentemente a un tRNA specifico, spendendo energia fornita dall'ATP e con l'utilizzo di enzimi attivatori Mg2+-dipendenti chiamati amminoacil-tRNA sintetasi. Quando sono attaccati ai loro amminoacidi (amminoacilati), i tRNA vengono definiti "carichi". Stadio 2: inizio L'mRNA che contiene il codice per il polipeptide da sintetizzare si lega alla subunità minore del ribosoma e all'amminoacil-tRNA di inizio. A questo punto si lega la subunità ribosomiale maggiore e si forma un complesso di inizio. L’amminoacil-tRNA di inizio si appaia al codone AUG dell'mRNA che segnala l'inizio della catena polipeptidica. Questo processo, che richiede GTP, viene promosso da specifiche proteine citosoliche chiamate fattori di inizio. Stadio 3: allungamento La catena polipeptidica nascente si allunga per unione covalente di unità amminoacidiche successive, ciascuna trasportata verso il ribosoma e correttamente posizionata dal rispettivo tRNA, che si appaia al codone corrispondente nell'mRNA. L'allungamento viene coordinato da proteine citosoliche chiamate fattori di allungamento. Il legame di ciascun amminoacil-tRNA e lo scorrimento del ribosoma lungo l'mRNA sono facilitali dall'idrolisi di GTP per ogni residuo aggiunto alla catena nascente. Stadio 4: terminazione e rilascio del ribosoma Il completamento di una catena polipeptidica è segnalato da un codone di terminazione nell'mRNA. La nuova catena polipeptidica è quindi rilasciata dal ribosoma, con l'aiuto di proteine chiamate fattori di rilascio e il ribosoma è utilizzato per un altro ciclo di sintesi. Stadio 5: ripiegamento e modificazioni post-traduzionali Per acquisire la sua forma biologicamente attiva, il nuovo polipeptide deve ripiegarsi nella sua conformazione tridimensionale. Prima o dopo il ripiegamento, il nuovo polipeptide può subire modificazioni ad opera di enzimi, come la rimozione di uno o più amminoacidi, generalmente

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dal l'estremità ammino-terminale; l'aggiunta di gruppi acetile , fosfato, metile, carbossile o altri a determinati residui amminoacidici; la scissione proteolitica della proteina; l'attacco di oligosaccaridi o di gruppi prostetici. Prima di analizzare in dettaglio i cinque stadi, dobbiamo esaminare i due componenti chiave della biosintesi proteica: il ribosoma e il tRNA. Il ribosoma è una complessa macchina sopramolecolare Ogni cellula di E. coli contiene 15000 o più ribosomi, che costituiscono circa un quarto del peso secco della cellula. I ribosomi batterici sono formati per circa il 65% da rRNA e per il restante 35% da proteine; hanno un diametro di circa 18 nm e sono composti da due subunità diseguali con un coefficiente di sedimentazione rispettivamente di 30S e di 50S, mentre quello complessivo è pari a 70S. Entrambe le subunità contengono proteine ribosomiali e almeno una grossa molecola di rRNA. In seguito alla scoperta di Zamecnik che i ribosomi sono i complessi responsabili della sintesi proteica e alla successiva comprensione del codice genetico, lo studio sui ribosomi ha subìto un'accelerazione. Alla fine degli anni '60, Masayasu Nomura e colleghi dimostrarono che entrambe le subunità ribosomiali possono venire suddivise nei loro componenti di RNA e proteine, e successivamente ricostituite in vitro. In condizioni sperimentali appropriate, l'RNA e le proteine si riassemblano spontaneamente per formare le subunità 30S o 50S praticamente identiche per struttura e per attività alle subunità native. Queste nuove acquisizioni hanno alimentato decenni di ricerche sulla struttura e la funzione degli RNA ribosomiali e delle proteine. Contemporaneamente, metodi strutturali sofisticati hanno rivelato sempre maggiori dettagli sulla struttura dei ribosomi. Agli albori del terzo millennio sono state ottenute attraverso tecniche ad alta risoluzione le prime informazioni sulla struttura delle subunità ribosomiali batteriche che sono state fonte di molte sorprese. Per prima cosa l'attenzione che tradizionalmente era rivolta ai componenti proteici dei ribosomi si è spostata. Le subunità ribosomiali sono enormi molecole di RNA. Nella subunità 50S gli rRNA 5S e 23S formano il nucleo della struttura. Le proteine sono elementi secondari nel complesso: non fanno altro che "decorare" la superficie. Secondo, e ancora più importante, non c'è nessuna proteina nei 18Å del sito attivo in cui avviene la formazione del legame peplidico. La struttura ad alta risoluzione conferma così ciò che molti avevano sospettato per più di un decennio: il ribosoma è un ribozima. La conoscenza dettagliata della struttura del ribosoma e delle sue subunità, oltre a far comprendere il meccanismo della sintesi proteica (come spiegato di seguito), ha fornito un nuovo modo di considerare l'evoluzione della vita. Il ribosoma batterico è complesso, ed ha un peso molecolare totale di ~2,7 milioni. Le due subunità ribosomiali dalla forma irregolare unendosi formano una scanalatura attraverso la quale passa l'mRNA, man mano che il ribosoma scorre durante la traduzione. Le 57 proteine nel ribosoma batterico variano enormemente per dimensione e struttura. L'intervallo di pesi molecolari va da circa 6000 a 75 000. La maggior parte delle proteine possiede domini globulari disposti sulla superficie ribosomiale. Alcune possiedono anche estrusioni proteiche serpentiformi che protrudono nel nucleo dell'rRNA del ribosoma, stabilizzandone la struttura. Le funzioni di alcune di queste proteine non sono ancora state chiarite in dettaglio, nonostante per molte di loro risulti evidente un ruolo di tipo strutturale. Attualmente si conoscono le sequenze degli rRNA di molti organismi. Ciascuna delle tre catene singole dell'rRNA di E. coli possiede una specifica conformazione tridimensionale che forma estesi accoppiamenti intercatena. La struttura secondaria prevista degli rRNA è stata ampiamente confermata in modelli ad alta risoluzione, ma non chiarisce l'estesa rete di interazioni terziarie evidenti nella struttura completa. I ribosomi delle cellule eucariotiche (tranne i ribosomi dei mitocondri e dei cloroplasti) sono sostanzialmente più grandi e più complessi dei ribosomi batterici, avendo un diametro di circa 23nm e un coefficiente di sedimentazione di circa 80S. Presentano anche due subunità che variano di dimensione a seconda della specie, ma che hanno coefficienti di sedimentazione medi di 60S e 40S. I ribosomi eucariotici contengono complessivamente più di 80 proteine diverse. l ribosomi dei mitocondri e dei cloroplasti invece sono leggermente più piccoli e più semplici di quelli batterici. Ciò nonostante, la struttura del ribosoma e le sue funzioni sono estremamente simili in tutti gli organismi e in tutti gli organelli. Gli RNA transfer hanno caratteristiche strutturali peculiari Per capire in che modo i tRNA possono funzionare come adattatori nella traduziore del linguaggio degli acidi nucleici nel linguaggio delle proteine, occorre prima esaminare la loro struttura in maniera più dettagliata. I tRNA sono relativamente piccoli e sono costituiti da una singola elica di RNA ripiegata in modo da formare una precisa struttura tridimensionale. Nei batteri e nel citosol degli eucarioti i tRNA hanno da 73 a 93 residui nucleotidici che corrispondono a masse molecolari che vanno da 24 000 a 31000. I mitocondri e i cloroplasti contengono tRNA particolari di dimensioni relativamente ridotte. Le cellule contengono almeno un tipo di tRNA per ciascun amminoacido; sono necessari almeno 32 tRNA per riconoscere tutti i codoni degli amminoacidi (alcuni riconoscono più di un codone), ma alcune cellule ne usano più di 32.

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Il tRNA dall'alanina di lievito (tRNAAla), il primo acido nucleico ad essere stato completamente sequenziato, contiene 76 residui nucleotidici, dieci dei quali con basi modificate. Il confronto tra molti tRNA di varie specie ha evidenziato molti comuni denominatori strutturali. Otto o più residui nucleotidici di tutti i tRNA hanno basi e zuccheri modificati, molti dei quali sono derivati metilati delle basi principali. La maggior parte dei tRNA ha un residuo di guanilato (pG) all'estremità 5' e tutti hanno la sequenza trinucleotidica CCA(3') all'estremità 3'. Se rappresentati nella forma a due dimensioni, i legami idrogeno di tutti i tRNA formano una struttura costituita da tre anse e uno stelo, simile a un trifoglio; i tRNA più lunghi hanno anche una quinta ansa, chiamata braccio extra, più corta. Nella struttura a tre dimensioni, un tRNA ha la forma di una L rovesciata. Due regioni del tRNA sono di importanza fondamentale per la funzione di adattatore. Lo stelo (o braccio) accettore dell'amminoacido trasporta un amminoacido specifico, legato mediante un legame estere tra iI gruppo carbossilico dell'amminoacido e il gruppo ossidriIico 2' o 3' del residuo di adenosina all'estremità 3' del tRNA. L'ansa (o braccio) dell'anticodone contiene l'anticodone. Le altre due regioni principali sono l'ansa D o della diidrouridina, che contiene I’inusuale nucleotide diidrouridina (D), e l'ansa TψC, che contiene ribotimidina (T), di solito assente negli RNA, e pseudouridina (ψ), che possiede un insolito legame carbonio-carbonio tra la base e il ribosio. Le anse D e TψC contribuiscono alle importanti interazioni che influenzano il ripiegamento della molecola di tRNA; inoltre l'ansa TψC interagisce con la subunita maggiore dell'rRNA. Dopo aver esaminato la struttura dei ribosomi e degli RNA transfer, consideriamo in dettaglio i cinque stadi della sintesi delle proteine. Stadio 1: le amminoacil-tRNA sintetasi legano il corretto amminoacido ai tRNA corrispondenti Nella prima fase della sintesi proteica, che ha luogo nel citosol, i 20 diversi amminoacidi vengono legati mediante legame estere alloro tRNA ad opera di amminoacil-tRNA sintetasi. Ciascun enzima è specifico per un amminoacido e per uno o più tRNA corrispondenti. Nella maggior parte degli organismi esiste generalmente una amminoacil-tRNA sintetasi per ciascun amminoacido. Per gli amminoacidi che hanno due o più tRNA corrispondenti, di solito la stessa arnrninoacil-tRNA sintetasi provvede alla amminoacilazione di tutti. Sono oggi note le strutture di tutte le amminoacil-tRNA sintetasi di E. coli. Questi enzimi sono stati suddivisi in due classi basandosi su differenze sostanziali presenti nella struttura primaria e terziaria e su differenze nel meccanismo di reazione. Queste due classi sono presenti in tutti gli organismi e non ci sono prove dell'esistenza di un antenato comune. Le ragioni biologiche, chimiche o evolutive che giustifichino l'esistenza di due classi di enzimi coinvolti in processi identici rimangono oscure. La reazione calalizzata da un'amminoacil-tRNA sintetasi è la seguente:

Questa reazione avviene in due passaggi separati all'interno del sito attivo dell'enzima. Nella tappa (1) si forma un intermedio legato all'enzima, l'amminoacil-adenilato (amminoacil-AMP). Nel secondo passaggio il gruppo amminoacilico viene trasferito dall'amminoacil-AMP legato all'enzima al tRNA specifico corrispondente. Il meccanismo di questo secondo passaggio dipende dalla classe a cui appartiene l'enzima, nelle tappe (2a) e (2b) il risultante legame estere tra l'amminoacido e il tRNA ha un'energia libera standard di idrolisi molto negativa (ΔG’° = -29 kJ/mole). Il pirofosfato liberato nella reazione di attivazione viene idrolizzato a fosfato da parte della pirofosfatasi inorganica. Pertanto, due legami fosfato ad alta energia vengono complessivamente utilizzati per ciascuna molecola di amminoacido attivata, rendendo la reazione complessiva praticamente irreversibile:

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Alcune amminoacil-tRNA sintetasi svolgono anche attività di proofreading L’amminoacilazione del tRNA raggiunge due obiettivi: (1) l'attivazione di un amminoacido per la formazione di un legame peptidico e (2) l'attacco dell'amminoacido a un tRNA adattatore, che lo porta nella giusta posizione nel polipeptide in formazione. L’identità dell'amminoacido legato al tRNA non viene controllata a livello del ribosoma, quindi l'attacco del corretto amminoacido a ciascun tRNA è essenziale per la fedeltà della sintesi proteica. Come si ricorderà, la specificità di un enzima è limitata dall'energia di legame disponibile che può derivare dall'interazione enzima-substrato. La distinzione tra due substrati amminoacidici simili è stata analizzata in dettaglio nel caso della Ile-tRNA sintetasi, che deve distinguere l'isoleucina dalla valina, la quale differisce dall'isoleucina soltanto per un gruppo metilenico (-CH 2-). Per questo enzima l'attivazione dell'isoleucina (per formare Ile-AMP) è favorita di 200 volte rispetto a quella della valina, come c'era da aspettarsi, considerando quanto il gruppo metilenico (dell'Ile) può favorire il legame del substrato. Tuttavia, la valina viene erroneamente incorporata nelle proteine in posizioni normalmente occupate dall'isoleucina con una frequenza di appena 1 volta su 3000. A che cosa è dovuto questo aumento di accuratezza di oltre 10 volte? La Ile-tRNA sintetasi, come le altre amminoacil-tRNA sintetasi, ha una funzione di correzione delle bozze (proofreading). Si ricordi un principio generale emerso durante la discussione sulla correzione delle bozze da parte della DNA polimerasi: se le interazioni disponibili non permettono una sufficiente discriminazione tra due substrati, la necessaria specificità può essere raggiunta attraverso il legame del substrato specifico in due passaggi successivi. L’effetto che si ottiene forzando il sistema attraverso due "filtri" successivi, invece che attraverso uno solo, è sinergico. Nel caso della Ile-tRNA sintetasi, il primo filtro è rappresentato dall'iniziale legame dell'amminoacido all'enzima e dalla sua attivazione ad amminoacil-AMP. II secondo filtro è rappresentato da un sito attivo separato che catalizza la deacilazione degli amminoacil-AMP sbagliati; un substrato che si lega nel secondo sito attivo viene idrolizzato. Poiché il gruppo R della valina è leggermente più piccolo di quello dell'isoleucina, il Val-AMP riesce ad adattarsi al sito idrolitico (di proofreading) della Ile-RNA sintetasi, mentre l'Ile-AMP no. Quindi, il Val-AMP viene idrolizzato a valina e AMP nel sito attivo di proofreading, e il tRNA legato alla sintetasi non viene amminoacilato con l'amminoacido sbagliato. Oltre all'attività di proofreading dopo la formazione dell'intermedio amminoacil-AMP, la maggior parte delle amminoacil-tRNA sintetasi sono anche in grado di idrolizzare il legame estere tra l'amminoacido e il tRNA nell'amminoacil-tRNA. Tale idrolisi è fortemente accelerata nel caso di tRNA che abbiano legati amminoacidi per cui non sono specifici, fornendo così un terzo filtro che aumenta la fedeltà del processo complessivo. Le poche amminoacil-tRNA sintetasi che attivano amminoacidi che non hanno affinità strutturali con altri amminoacidi (per esempio la Cys-tRNA sintetasi) sono praticarnente prive di attività di proofreading. In questi casi il sito attivo per l'amminoacilazione può discriminare con sufficiente accuratezza tra l'amminoacido giusto e ogni altro amminoacido non corretto. La frequenza complessiva di errori della sintesi proteica (circa 1 errore su 10 4 amminoacidi incorporati) non è bassa come quella della replicazione del DNA. Poiché un eventuale errore in una proteina viene eliminato distruggendo la proteina stessa e quindi non viene trasmesso alle generazioni future, ha un significato biologico minore. Questo grado di fedeltà è sufficiente ad assicurare che la maggior parte delle proteine non contenga errori e che la grande quantità di energia necessaria per sintetizzare una proteina non venga sprecata. Una molecola proteica non corretta è normalmente priva di importanza quando sono presenti molte copie corrette della stessa proteina. L’interazione tra un'amminoacil-tRNA sintetasi e un tRNA costituisce un "secondo codice genetico" Un'amminoaciltRNA sintetasi deve essere specifica non solo per un amminoacido, ma anche per un determinato tRNA. La capacità di scegliere fra alcune decine di tRNA è importante per la fedeltà complessiva della biosintesi proteica quanto la capacità di scegliere tra diversi amminoacidi. L'interazione tra le amminoacil-tRNA sintetasi e i tRNA è stata definita "secondo

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codice genetico", per sottolineare l'importanza fondamentale del suo ruolo nell'assicurare la precisione nella sintesi proteica. Le regole di questo "codice" sembrano più complesse di quelle del "primo" codice. Alcuni nucleotidi sono conservati in tutti i tRNA e perciò non possono essere utilizzati come discriminanti. Le posizioni dei nucleotidi utili alle amminoacil-tRNA sintetasi sono state individuate sulla base dell'osservazione che le mutazioni di tali nucleotidi alterano la specificità dell'enzima per il substrato. Queste interazioni sembrano essere concentrate nello stelo dell'amminoacido e nell'ansa dell'anticodone, includendo i nucleotidi dello stesso anticodone, ma si localizzano anche in molti altri punti della molecola. La determinazione della struttura cristallina del complesso costituito da amminoacil-tRNA sintetasi, dal relativo tRNA e dall'ATP è stata un grande passo in avanti verso la conoscenza di queste interazioni. Nel riconoscimento di un tRNA da parte della sua specifica amminoacil-tRNA sintetasi possono essere coinvolti dieci o più nucleotidi specifici. Ma in alcuni casi il meccanismo di riconoscimento risulta semplice. In tutti gli organismi, dai batteri all'uomo, il principale determinante del riconoscimento di un tRNA da parte delle Ala-tRNA sintetasi è un'unica coppia di basi G=U nello stelo accettore dell'amminoacido del tRNA ALA. Un piccolo RNA sintetico, con appena sette coppie di basi disposte in una semplice minielica a forcina, viene efficientemente amminoacilato dall'Ala-tRNA sintetasi, purché l'RNA contenga questo essenziale appaiamento G=U. Questo processo relativamente semplice visto per l’alanina potrebbe essere un residuo dell'evoluzione di un periodo in cui gli oligonucleotidi di RNA, antenati dei tRNA, venivano amminoacilati mediante un sistema primitivo di sintesi proteica. L'interazione delle amminoacil-tRNA sintetasi con i tRNA substrati è essenziale per un'accurata lettura del codice genetico. Ogni espansione del codice che includesse nuovi amminoacidi comporterebbe necessariamente una nuova coppia tRNA sintetasi:tRNA. In realtà, una limitata espansione del codice è stata osservata in natura; una espansione più estesa è stata realizzata in laboratorio. Stadio 2: uno specifico amminoacido dà inizio alla sintesi proteica La sintesi delle proteine inizia dalla terminazione amminica e procede per aggiunta successiva degli amminoacidi alla terminazione carbossilica del peptide in via di crescita, come dimostrato da Howard Dintzis nel 1961. Il codone di inizio AUG specifica il residuo di metionina amminoterminale. Anche se la metionina ha un solo codone, (5')AUG, tutti gli organismi hanno due tRNA per la metionina. Uno viene usato esclusivamente quando (5')ACG è il codone di inizio per la sintesi delle proteine. L'altro viene usato per codificare un residuo di Met in una posizione interna del polipeptide. La distinzione tra il codone (5')AUG di inizio e quello interno è netta. Nei batteri, i due tipi di tRNA specifici per la metionina sono indicati come tRNA Met e tRNAfMet. L'amminoacido incorporato in risposta al codone di inizio (5')AUG è l'N-formilmetionina (fMet). Esso giunge al ribosoma come N-formil-metionil-tRNA fMet (fMet-tRNAfMet) , che si forma attraverso due successive reazioni. Nella prima la metionina si lega al tRNA Met ad opera della Met-tRNA sintetasi (che in E. coli amminoacila sia il tRNA fMet, sia il tRNAMet): Nella seconda una transformilasi trasferisce un gruppo formilico dall’N 10-formiltetraidrofolato al gruppo amminico del residuo Met: La transformilasi è più selettiva della Met-tRNA sintetasi; è specifica per i residui di Met legati al tRNA fMet, probabilmente perché riconosce qualche struttura particolare di quel tRNA. Per contro, il Met-tRNA Met inserisce la metionina nelle parti interne dei polipeptidi.

L’aggiunta del gruppo N-formilico al gruppo amminico della metionina da parte della transformiIasi impedisce che la fMet venga inserita all'interno dei polipeptidi, e allo stesso tempo permette all'fMet-tRNA fMet di legarsi ad uno speciflco sito di inizio ribosomiale, che non accetta né il Met-tRNA Met. né qualunque altro amminoacil-tRNA. Nelle cellule eucariotiche, tutti i polipeptidi sintetizzati dai ribosomi citosolici iniziano con un residuo Mel (invece che fMet) , ma ancora una volta le cellule utilizzano uno speciale tRNA di inizio diverso dal tRNA Met utilizzato dai codoni (5')AUG nelle posizioni interne dell'mRNA. I polipeptidi sintetizzati dai ribosomi dei mitocondri e dei cloroplasti, però,

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iniziano con l'N-formilmetionina. Ciò è in accordo con la teoria che i mitocondri e i cloroplasti derivano da batteri primitivi che vennero incorporati simbioticamente nei precursori delle cellule eucariotiche durante uno stadio iniziale dell'evoluzione. Come può il singolo codone (5')AUG determinare se deve essere inserita una N-formilmetionina (o metionina, negli eucarioti) di inizio o un residuo Met interno? La risposta verrà fornita dall'esame dettagliato del processo di inizio. I tre passaggi dell'inizio della sintesi proteica L’inizio della sintesi proteica nei batteri richiede (1) la subunità ribosomiale 30S, (2) l'mRNA che codifica il polipeptide che deve essere sintetizzato, (3) l'fMet-tRNA fMet di inizio, (4) un gruppo di tre proteine chiamate fattori di inizio (IF-1, IF-2 e IF-3), (5) GTP, (6) la subunità ribosomiale 50S e (7) Mg 2+. La formazione del complesso di inizio avviene in tre passaggi. Nella tappa (1) la subunità ribosomiale 30S si lega ai due fattori di inizio IF-1 e IF-3. Il fattore IF-3 impedisce l'assemblaggio prematuro delle subunità 30S e 50S. A questo punto ha luogo il legame dell'mRNA alla subunità 30S. Il codone di inizio (5')AUG viene diretto verso la sua corretta posizione da un segnale di inizio presente sull'mRNA chiamato sequenza di Shine-Dalgarno (nome derivato dai ricercatori australiani John Shine e Lynn Dalgarno, che l'hanno identificata). Questa sequenza consenso è un segnale di inizio costituito da 4-9 residui purinici situato 8-13 coppie di basi prima del codone di inizio, in direzione 5'. La sequenza di Shine-Dalgarno viene riconosciuta da una sequenza complementare ricca di pirimidine vicino all'estremità 3' dell'rRNA 16S della subunità 30S, con la quale si appaia. Questa interazione mRNA-rRNA immobilizza l'mRNA in modo che (5')AUG sia posizionato correttamente sulla subunità 30S per l'inizio della traduzione. Lo specifico codone (5')AUG al quale si deve legare l'fMet-tRNA fMet viene così individuato rispetto ai codoni delle metionine interne grazie alla sua vicinanza alla sequenza di Shine-Dalgarno sull'mRNA. I ribosomi batterici hanno tre siti che legano i tRNA: il sito amminoacilico o sito A, il sito peptidilico o sito P e il sito di uscita E. l siti A e P legano gli amminoacil-tRNA, mentre il sito E si lega solo ai tRNA scarichi che hanno svolto la loro funzione sul ribosoma. Sia la subunità 30S che la subunità 50S contribuiscono alle caratteristiche dei si ti A e P, mentre il sito E è in gran parte confinato alla subunità 50S. Il codone di inizio (5')AUG si posiziona nel sito P, l'unico sito a cui si lega fMet-tRNAfMet. fMet-tRNAfMet è il solo amminoacil-tRNA che si lega prima al sito P; durante la successiva fase di allungamento, tutti gli altri amminoacil-tRNA entranti (compreso il Met-tRNA Met che si lega ai codoni AUG interni) si legano dapprima al sito A, e solo successivamente ai siti P ed E. il sito E è il sito dal quale escono i tRNA "scarichi" durante l'allungamento. Il fattore IF -1 si lega al sito A e impedisce il legame del tRNA in questo sito durante la fase di inizio. Nella tappa (2) del processo di inizio il complesso costituito dalle subunità 30S, da IF-3 e da mRNA forma ora un complesso ancora più grande legando IF-2, che già è legato al GTP e l' fMet-tRNA fMet di inizio. In questo passaggio l'anticodone di questo tRNA si appaia correttamente al codone di inizio sull'mRNA. Nella tappa (3) questo voluminoso complesso si combina con la subunità ribosomiale 50S; simultaneamente, la molecola di GTP legata a IF-2 viene idrolizzata a GDP e P i che vengono rilasciati dal complesso. A questo punto tutti e tre i fattori di inizio si staccano dal ribosoma. Il completamento dei passaggi produce un ribosoma funzionale 70S chiamato complesso di inizio, che contiene l'mRNA e l'fMet-tRNAfMet di inizio. Il corretto legame dell'fMet-tRNA fMet al sito P del complesso di inizio 70S è assicurato dalla presenza di almeno tre punti di riconoscimento e di attacco: l'interazione codone-anticodone, che interessa l'AUG di inizio fissato nel sito P; l'interazione tra la sequenza di Shine-Dalgarno presente sull'mRNA e l'rRNA 16S; e rinterazione di legame tra il sito P del ribosoma e l'fMet-tRNA fMet. Il complesso di inizio è ora pronto per la fase di allungamento. L'inizio nelle cellule eucariotiche La traduzione negli eucarioti è generalmente simile alla traduzione nelle cellule batterìche; le differenze più significative compaiono nei meccanismi di inizio. Gli mRNA eucariotici sono legati al ribosoma e formano un complesso con un numero di proteine specifiche. Alcune di queste servono ad unire le estremità 5' e 3' della molecola di messaggio. All'estremità 3', l'mRNA è legato da una proteina chiamata proteina che lega poli(A) (PAB). Le cellule eucariotiche hanno almeno nove fattori di inizio. Un complesso chiamato eIF4F, che comprende le proteine eIF4E, eIF4G e eIF4A, si lega al cappuccio 5' tramite elF4E. La proteina elF4G lega sia eIF4E sia PAB, tenendole efficacemente insieme. La proteina eIF4A ha un'attività RNA elicasica. È il complesso eIF4F che si associa con un altro fattore, eIF3, e con la subunità ribosomiale 40S. L’efficienza della traduzione dipende da svariate proprietà dell'mRNA e delle proteine del complesso, nonché dalla lunghezza del tratto 3' del poli(A) (in molti casi una lunghezza maggiore aumenta l'efficienza della traduzione). L'arrangiamento da estremità ad estremità dell'mRNA, eucariotico facilita la regolazione della traduzione dell'espressione genica con un meccanismo che considereremo più avanti.

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Il codone di inizio (5')AUG non è situato nell'mRNA in prossimità della sequenza di Shine-Dalgarno, ma è la prima sequenza AUG che si incontra scorrendo l'mRNA dall'estremità 5', e segnala il punto di inizio del quadro di lettura. Il complesso eIF4F è probabilmente coinvolto nel processo di ricerca, che forse avviene grazie all'attività RNA elicasica di eIF4A che elimina la struttura secondaria nella parte 5' non tradotta dell'mRNA. La scansione è facilitata anche da un'altra proteina, eIF4B. Il meccanismo d'azione dei vari fattori di inizio batterici ed eucariotici rimane un'area di ricerca estremamente importante. Stadio 3: i legami peptidici si formano durante la fase di allungamento Il terzo stadio della sintesi delle proteine è l'allungamento. Ancora una volta, inizieremo la nostra analisi partendo dai batteri. L'allungamento richiede (1) il complesso di inizio descritto sopra, (2) gli amminoacil-tRNA, e (3) un gruppo di tre proteine solubili, localizzate nel citosol, chiamate fattori di allungamento (EF-Tu, EF-Ts ed EF-G nei batteri) e (4) il GTP. L'aggiunta di ogni amminoacido è realizzata mediante tre fasi che vengono ripetute tante volte quanti sono i residui amminoacidici che vengono aggiunti. Fase di allungamento 1: legame dell'amminoacil-tRNA entrante Nella prima fase del ciclo di allungamento, l'appropriato amminoacil-tRNA entrante si lega al complesso EF-Tu che a sua volta lega GTP. Il complesso risultante amminoacil-tRNA-EF-Tu-GTP si lega al sito A del complesso di inizio 70S. Il GTP viene idrolizzato, e un complesso EF-TuGDP viene rilasciato dal ribosoma 70S. Il complesso EF-Tu-GTP si riforma tramite un processo in cui intervengono EF-Ts e il GTP. Fase di allungamento 2: formazione del legame peptidico A questo punto si forma un legame pepticlico tra due amminoacidi legati ai loro tRNA nei siti A e P del ribosoma. Ciò avviene attraverso il trasferimento del residuo di inizio N-formilmetionina dal suo tRNA al gruppo amminico del secondo amminoacido, che ora si trova nel sito A. Il gruppo α-amminico dell'amminoacido nel sito A agisce da nucleofilo, spiazzando il tRNA nel sito P per formare il legame peptidico. Questa reazione forma un dipeptidil-tRNA nel sito A, mentre il tRNAfMet ora "scarico" (deacilato), rimane legato al sito P. I tRNA passano in uno stato di legame "ibrido", con elementi di ciascuno di essi che occupano due siti differenti del ribosoma. L'attività enzimatica che catalizza la formazione del legame peptidico è stata chiamata peptidil trasferasi. A lungo si è creduto che fosse intrinseca a una o più proteine della subunità maggiore del ribosoma; oggi sappiamo che la reazione è catalizzata dall'rRNA 23S. Si tratta dunque di un'attività catalitica da aggiungere al repertorio dei ribozimi. Questa scoperta ha notevoli implicazioni nello studio del processo evolutivo degli esseri viventi. Fase di allungamento 3: traslocazione Nella fase finale del processo di allungamento, la traslocazione, il ribosoma si sposta per una lunghezza pari a un codone verso la terminazione 3' dell'mRNA. Questo movimento a sua volta sposta l'anticodone del dipeptidil-tRNA, che è ancora legato al secondo codone dell'mRNA, dal sito A al sito P, e sposta il tRNA deacilato dal sito P al sito E, da dove il tRNA viene rilasciato nel citosol. Il terzo codone dell'mRNA ora viene a trovarsi nel sito A e il secondo nel sito P. Questo spostamento del ribosoma lungo l'mRNA richiede EF-G (chiamato anche traslocasi) ed energia fornita dall'idrolisi di un'altra molecola di GTP. Una modificazione della conformazione tridimensionale dell'intero ribosoma produce il suo spostamento sull'mRNA. La struttura di EF-G riproduce la struttura del complesso EF-Tu-tRNA, suggerendo che EF-G possa legarsi al sito A e spostare il peptidil-tRNA. Dopo la traslocazione il ribosoma, con il dipeptidil-tRNA e l'mRNA ad esso legati, è ora pronto per un altro ciclo di allungamento che porta al legame del terzo residuo amminoacidico. Questo processo avviene allo stesso modo dell'aggiunta del secondo residuo. Per ciascun amminoacido correttamente aggiunto alla catena, due GTP vengono idrolizzati a GDP e Pi, mentre il ribosoma si muove da un codone all'altro lungo l'mRNA verso l'estremità 3'. La catena polipeptidica resta sempre attaccata al tRNA dell'ultimo amminoacido che è stato inserito. Questa associazione mantiene la connessione funzionale tra l'informazione contenuta nell'mRNA e il polipeptide che ne è la traduzione. Nello stesso tempo, il legame estere tra questo tRNA e il terminale carbossilico del polipeptide in crescita attiva tale gruppo carbossilico per l'attacco nucleofilico da parte dell'amminoacido entrante, e quindi per la formazione del nuovo legame peptidico. Mentre il legame estere tra il polipeptide e il tRNA viene scisso durante la formazione del legame peptidico, il legame tra il polipeptide e l'informazione contenuta sull'mRNA rimane, poiché ciascun amminoacido in arrivo è a sua volta attaccato al suo tRNA. Il ciclo di allungamento negli eucarioti è molto simile a quello dei procarioti. Tre fattori di allungamento eucariotici (chiamati eEF1α, eEF1βγ ed eEF2) hanno funzioni analoghe a quelle dei fattori di allungamento batterici (EF-Tu, EF-Ts ed EF-G: rispettivamente). I ribosomi eucariotici non hanno un sito E. I tRNA scarichi sono espulsi direttamente dal sito P.

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Il proofreading a livello del ribosoma L'attività GTPasica di EF-Tu durante Ia prima fase di allungamento nelle cellule batteriche fornisce un importante contributo alla velocità e alla fedeltà dell'intero processo biosintetico. Entrambi i complessi EF-Tu-GTP ed EF-Tu-GDP permangono solo per alcuni millisecondi prima di dissociarsi. Questi intervalli di tempo vengono utilizzati per verificare le interazioni codone-anticodone, cioè per l'attività di proofreading. Gli amminoacil-tRNA errati normalmente si dissociano dal sito A durante uno di questi periodi. Se invece di GTP viene usato il suo analogo guanosina 5'-O-(3-tiotrifosfato) (GTPγS), l'idrolisi avviene più lentamente, aumentando così la fedeltà (poiché incrementa gli intervalli di tempo dedicati all'attività di proofreading), ma riducendo la velocità della sintesi proteica.

Tale processo (comprese le caratteristiche dell'appaiamento codone-anticodone già descritte) si è via via ottimizzato durante l'evoluzione per arrivare a un compromesso tra velocità e fedeltà. Aumentando la fedeltà, la velocità potrebbe diminuire, mentre un aumento della velocità comprometterebbe probabilmente la fedeltà. Si noti che il meccanismo di proofreading sul ribosoma assicura soltanto che sia avvenuto il corretto appaiamento codoneanticodone. L’identità degli amminoacidi attaccati ai vari tRNA non viene minimamente controllata sul ribosorna. Se un tRNA viene amminoacilato con un amminoacido sbagliato (come si può fare sperimentalmente), questo amminoacido sbagliato è efficientemente incorporato nella proteina in corrispondenza del codone che viene normalmente riconosciuto dal tRNA. Stadio 4: la terminazione della sintesi proteica necessita di un segnale peculiare L'allungamento prosegue finché il ribosoma aggiunge l'ultimo amminoacido codificato dall'mRNA. La terminazione, la quarta fase della sintesi polipeptidica, è segnalata da uno dei tre codoni di terminazione dell'mRNA (UAA, UAG, UGA), che fa immediatamente seguito al codone dell'ultimo amminoacido. Mutazioni presenti sull'anticodone del tRNA che consentono l'inserimento di un amminoacido al posto del codone di terminazione sono generalmente molto dannose per la cellula. Nei batteri, quando un codone di terminazione occupa il sito A sul ribosoma, tre fattori di terminazione o fattori di rilascio, le proteine RF1, RF2 ed RF3, provvedono ad effettuare: (1) l'idrolisi del legame terminale del peptidil-tRNA; (2) il rilascio del polipeptide libero e dell'ultimo tRNA, ora scarico, dal sito P; (3) la dissociazione del ribosoma 70S nelle sue subunità 30S e 50S, rendendo così possibile l'inizio di un nuovo ciclo di sintesi polipeptidica. RF-1 riconosce i codoni di terminazione UAG e UAA, ed RF-2 riconosce UGA ed UAA. RF-1 o RF-2 (a seconda di quale codone è presente) si lega a un codone di terminazione e induce la peptidil trasferasi a trasferire la catena polipeptidica a una molecola d'acqua invece che a un altro amminoacido. Questi fattori di rilascio contengono domini la cui funzione sembra essere quella di riprodurre la struttura del tRNA, come si è visto per il fattore di allungamento EF-G. La funzione specifica di RF-3 non è stata ancora chiarita con certezza, sebbene si pensi che sia coinvolto nel rilascio della subunità ribosomiale. Negli eucarioti, un unico fattore di rilascio chiamato eRF riconosce tutti e tre i codoni di terminazione. Il riciclo del ribosoma porta alla dissociazione dei componenti della traduzione. I fattori di rilascio si dissociano dal complesso post-terminazione (con un tRNA non carico nel sito P) e sono sostituiti da EF-G e da una proteina chiamata fattore del riciclo del ribosoma (RRF; Mr 20300). L'idrolisi di GTP da parte di EF-G porta alla dissociazione della subunità 50S dal complesso tRNA 30S-mRNA. EF-G e RRF sono sostituiti da IF-3, che promuove la dissociazione del tRNA. Viene infine rilasciato mRNA. Il complesso di IF-3 e della subunità 30S è così pronto per iniziare un altro ciclo di sintesi proteica. Il costo energetico della fedeltà della sintesi proteica La sintesi di una proteina che sia la fedele traduzione del messaggio contenuto sull'mRNA richiede molta energia. La formazione enzimatica di ciascun amminoacil-tRNA utilizza due gruppi fosfato ad alto contenuto energetico. Un'altra molecola di ATP viene consumata ogni volta che un amminoacido attivato in modo sbagliato viene idrolizzato dall'attività deacilasica di una amminoacil-tRNA sintetasi come parte della sua attività di proofreading. Una molecola di GTP viene scissa in GDP e P i durante la prima fase dell'allungamento, e un altro GTP viene idrolizzato durante la traslocazione. Pertanto, in media, l'energia derivata dall'idrolisi di più di quattro NTP a NDP è necessaria per la formazione di ciascun legame peptidico. Ciò rappresenta una "spinta" termodinamica straordinariamente forte nella direzione della sintesi: almeno 4 X 30,5 kJ/mole = 122 kJ/mole di energia di legame fosfodiestere sono necessari per produrre un legame peptidico che ha un'energia libera standard di idrolisi di appena -21 kJ/mole. La variaziore netta di energa libera nella sintesi di un

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legame peptidico è perciò di -101 kJ/mole. Le proteine sono polimeri contenenti "informazione". Lo scopo biochimico non è semplicemente la formazione di un legame peptidico, ma la formazione di un legame peptidico tra due amminoacidi specifici. Ciascuno dei legami ad alta energia impiegati in questo processo svolge un ruolo in un passaggio di importanza cruciale per il mantenimento dell'esatto allineamento tra ciascun nuovo codone dell'mRNA e I’amminoacido che esso codifica all'estremità carbossiterminale della catena polipeptidica nascente. Questa energia rende possibile la fedeltà molto alta della traduzione biologica del messaggio genetico dell'mRNA nelIa sequenza amminoacidica delle proteine. Rapida traduzione di un singolo messaggio da parte dei polisomi Grandi raggruppamenti di ribosomi, da 10 a 100, molto attivi nella sintesi proteica possono essere isolati sia dalle cellule eucariotiche sia dai batteri. Nelle fotografie al microscopio elettronico è visibile una struttura formata da una fibrilla che unisce ribosomi adiacenti, chiamata polisoma. La fibra di connessione è una singola catena di mRNA che viene simultaneamente tradotta da numerosi ribosomi ravvicitati, permettendo di utilizzare l'mRNA in modo molto efficiente. Nei batteri esiste uno stretto accoppiamento fra la trascrizione e la traduzore. Gli RNA messaggeri vengono sintetizzati in direzione 5'3' e vengono tradotti nella stessa direzione. I ribosomi iniziano la traduzione dall'estremità 5' dell'mRNA prima che la trascrizione sia stata completata. La situazione è piuttosto diversa negli eucarioti, dove gli mRNA appena trascritti devono essere trasferiti fuori dal nucleo prima che possano essere tradotti. Gli mRNA batterici hanno generalmente una vita media di pochi minuti prima di essere degradati dalle nucleasi. Per mantenere elevate velocità di sintesi proteica, l'mRNA per una determinata proteina (o gruppo di proteine) deve essere sintetizzato continuamente e tradotto. La breve vita degli mRNA dei batteri per la sintesi di una proteina cessi rapidamente quando non è più necessaria alla cellula.

Azione degli antibiotici sulla traduzione La sintesi proteica è inibita da molti antibiotici e tossine La sintesi proteica è una funzione centrale nella fisiologia cellulare e in quanto tale è il principale bersaglio di una grande varietà di antibiotici e tossine presenti in natura. Tranne alcune eccezioni, gli antibiotici inibiscono la sintesi proteica dei batteri. Le differenze tra la sintesi proteica negli eucarioti e nei batteri, sebbene in molti casi siano piccole, sono sufficienti a far sì che la maggior parte dei composti che saranno descritti in seguito sia relativamente innocua per le cellule eucariotiche. La selezione naturale ha favorito l'evoluzione di composi che sfruttano queste piccole differenze allo scopo di infuenzare selettivamente i sistemi batterici; pertanto queste armi biochimiche sono sintetizzate da alcuni microrganismi e sono invece estremamente tossiche per altri. Poiché quasi tutte le fasi della sintesi proteica possono essere specificamente inibite da un particolare antibiotico o da un altro, gli antibiotici sono diventati validi strumenti per lo studio della sintesi proteica. Uno degli antibiotici inibitori meglio studiati è la puromicina, prodotta dalla muffa Streptomyces Alboniger. La puromicina ha una struttura molto simile aIl'estremità 3' dell amminoacil-tRNA, per cui può legarsi al sito ribosomiale A e partecipare alla formazione del legame peptidico, formando la peptidil-puromicina. Tuttavia, poiché la puromicina ricalca solo l'estremità 3' dell’RNA, non va incontro alla traslocazicne e si dissocia dal ribosoma subito dopo essersi legata all'estremità carbossilica del peptide. Ciò provoca la prematura terminazone della sintesi del polipeptide. Le tetracicline inibiscono la sintesi proteica nei batteri bloccando il sito A del ribosoma impedendo in tal modo il legame degli amminoacil-tRNA. Il cloramfenicolo inibisce la sintesi proteica nei ribosomi batterici (e nei mitocondri e nei cloroplasti) bloccando la peptidil trasferasi, ma non interferisce con la sintesi delle proteine citosoliche degli eucarioti. Al contrario, la cicloesimide blocca la peptidil trasferasi dei ribosomi eucariotici 80S, ma non quella dei ribosomi batterici 70S (e dei mitocondri e dei cloroplasti). La streptomicina, un trisaccaride basico, causa l'errata lettura del codice genetico (nei batteri) a concentrazioni relativamente basse e inibisce l'inizio della sintesi proteica a concentrazioni più alte.

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Degni di nota per la loro tossicità per l'uomo e per altri mammiferi sono anche alcuni altri inibitori della sintesi proteica. La tossina difterica (Mr 58330) catalizza l'ADP-ribosilazione di un residuo di diftamide (un'istidina modificata) del fattore di allungamento eEF2, inattivandolo. La ricina (Mr 29895), una proteina estremamente tossica del ricino, inattiva la subunità 60S dei ribosomi eucariotici tramite la depurinazione di un'adenosina specifica sull'rRNA 23S. Diversi antibiotici interferiscono con il processo di traduzione e hanno reso possibile la comprensione dei diversi passaggi della glicosilazione delle proteine; quello meglio caratterizzato è la tunicamicina, la quale imita la struttura dell’UDP-N-acetilglucosammina e blocca il primo passaggio del processo.

Modificazione postsintetiche delle proteine

Nell’ultimo stadio della sintesi proteica la catena polipeptidica in formazione viene ripiegata su se stessa e modificata per essere biologicamente attiva. A un certo punto, durante o dopo la sintesi la catena polipeptidica assume spontaneamente una conformazione nativa che permette la formazione di un corretto numero di legami idrogeno, di interazioni di Van der Waals e di interazioni ioniche e idrofobiche. In questo modo il messaggio genetico lineare o unidimensionale presente nell'mRNA viene convertito nella struttura tridimensionale della proteina. Alcune proteine appena sintetizzate, sia nei procarioti sia negli eucarioti, non raggiungono la loro conformazione biologicamente attiva finché non sono state alterate in una o più reazioni di modificazione chiamate modificazioni post-traduzionali. Modificazioni amminoterminali e modificazioni carbossiterminali Il primo residuo che viene inserito in tutti i polipeptidi è N-formilmetionina (nei batteri) o metionina (negli eucarioti). Tuttavia, il gruppo formilico, il residuo di Met amminoterminale e spesso altri residui amminoterminali (e, in alcuni casi, carbossiterminali) possono essere rimossi enzimaticamente, e pertanto non compaiono nel prodotto proteico finale e funzionale. Nel 50% delle proteine eucariotiche il gruppo amminico del residuo amminoterminale viene N-acetilato dopo la traduzione. Talvolta anche i residui al terminale carbossilico vengono modificati.

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Perdita delle sequenze segnale I primi 15-30 residui amminoterminali di alcune proteine svolgono un ruolo fondamentale nel dirigere la proteina verso la sua destinazione definitiva nella cellula. Tali sequenze segnale vengono rimosse da peptidasi specifiche. Modificazioni di singoli amminoacidi I gruppi ossidrilici di alcuni residui di Ser, Thr e Tyr di alcune proteine sono fosforilati enzimaticamente dall'ATP; i gruppi fosforici aggiungono cariche negative a questi polipeptidi. Il significato funzionale di questa modificazione varia da una proteina all'altra. Per esempio, la proteina del latte caseina possiede numerosi gruppi fosfoserinici che servono a legare Ca 2+. Dato che calcio e fosfato, così come gli amminoacidi, sono necessari ai lattanti, la caseina fornisce tre nutrienti fondamentali. Inoltre, come abbiamo visto in numerosi casi, cicli di fosforilazione e di defosforilazione regolano l'attività di molti enzimi e di proteine regolatrici. Ulteriori gruppi carbossilici possono essere aggiunti a residui di Glu di alcune proteine. Per esempio, la proteina della coagulazione protrombina contiene un certo numero di residui di γ-carbossiglutammato nella sua regione amminoterminale, che vengono introdotti da un enzima che necessita di vitamina K. Questi gruppi carbossilici legano il Ca 2+, indispensabile per dare inizio alle reazioni di coagulazione. Residui di monometil- e dimetillisina sono presenti in alcune proteine del muscolo e nel citocromo c. La calmodulina della maggior parte degli organismi contiene un residuo di trimetillisina in una posizione specifica. In altre proteine i gruppi carbossilici di alcuni residui di Glu vengono metilati, perdendo così la propria carica negativa. Aggiunta di catene laterali di carboidrati Le catene laterali di carboidrati delle glicoproteine vengono legate covalentemente durante o dopo la sintesi della catena polipeptidica. In alcune glicoproteine la catena laterale di carboidrati viene unita enzimaticamente a residui di Asn (oligosaccaridi legati in N), in altre a residui di Ser o di Thr (oligosaccaridi legati in O. Molte proteine che svolgono la loro funzione al di fuori della cellula, come i proteoglicani "lubrificanti" che ricoprono le membrane mucose, contengono catene laterali oligosaccaridiche. Aggiunta di gruppi isoprenilici Un certo numero di proteine eucariotiche viene modificato tramite l'aggiunta di gruppi derivati dall'isoprene (gruppi isoprenilici). Un legame tioetere si forma tra il gruppo isoprenilico e un residuo di Cys della proteina. I gruppi isoprenilici derivano da intermedi pirofosforilati della via biosintetica del colesterolo, come il farnesil pirofosfato. Proteine modificate in questo modo comprendono le proteine Ras, che sono i prodotti degli oncogeni ras e dei protooncogeni, e le proteine G, e inoltre proteine chiamate lamìne che si trovano nella matrice nucleare. Il gruppo isoprenilico serve ad ancorare la proteina alla membrana. L'attività trasformante (cancerogena) dell'oncogene ras si perde quando l'isoprenilazione è bloccata, e ciò ha suscitato un grande interesse, volto a identificare gli inibitori di questa via di modificazione post-traduzionale per un loro possibile impiego nella chemioterapia del cancro. Aggiunta di gruppi prostetici Molte proteine procariotiche ed eucariotiche hanno bisogno di gruppi prostetici legati covalentenente per svolgere la loro attività. Due esempi sono la molecola di biotina legata covalentemente all'acetilCoA carbossilasi, e il gruppo eme dell'emoglobina o del citocromo c. Modificazioni proteolitiche Molte proteine vengono sintetizzate inizialmente come precursori inattivi di dimensioni più grandi. Questi precursori vengono modificati proteoliticamente per produrre le loro forme attive finali più piccole. Esempi ne sono la proinsulina, alcune proteine virali e proteasi come il chimotripsinogeno e il tripsinogeno. Formazione di legami disolfuro Dopo l'avvolgimento nella loro conformazione nativa, alcune proteine formano legami disolfuro intracatena o intercatena tra residui di Cys. Negli eucarioti, i legami disolfuro si trovano comunemente nelle proteine che devono essere esportate fuori dalle cellule. Tali legami contribuiscono a proteggere la conformazione nativa della proteina impedendone la denaturazione nell'ambiente extracellulare, che può essere molto diverso dalle condizioni intracellulari e che generalmente è un ambiente ossidante.

Traffico intracellulare delle proteine

Trasporto a destinazione (targeting) e degradazione delle proteine . La cellula eucariotica è un insieme di numerose strutture, compartimenti e organelli, ciascuno dei quali possiede specifiche funzioni che richiedono gruppi distinti di enzimi e proteine. Queste proteine (con l’eccezione di quelle prodotte nei mitocondri e nei plastidi) sono sintetizzate sui ribosomi nel citosol, per cui si pone il problema di come possano essere indirizzate alla loro destinazione finale. Stiamo iniziando ora a comprendere questo complesso e affascinante processo. Le proteine destinate alla secrezione, all'integrazione nella mernbrara plasmatica o all'inclusione nei Iisosomi hanno generalmente in comune i primi passaggi di una via che inizia nel reticolo endoplasmatico. Le proteine destinate ai mitocondri, ai cloroplasti o al nucleo utilizzano tre meccanismi separati, e le proteine destinate al citosol restano semplicemente dove vengono sintetizzate. L'elemento più importante di tutti questi sistemi di trasporto a destinazione è una breve sequenza amminoacidica chiamata sequenza segnale, la cui funzione fu postulata per la prima volta da Gunter Blobel e colleghi nel 1970. La

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sequena segnale dirige la proteina verso la sua appropriata destinazione nella cellula e per molte proteine, viene rimessa durante il trasporto o dopo che la proteina ha raggiunto la sua destinazione finale. Per le proteine destinate al trasporto nei mitocondri, nei cloroplasti o nel reticolo endoplasmatico, la sequenza segnale è locaIizzata all'estremità amminoterminale del polipeptide neosintetizzato. In molti casi la capacità di indirizzare a destinazione propria di particolari sequenze segnale è stata confermata unendo la sequenza segnale di una proteina a un'altra proteina e dimostrando che il segnale dirige la seconda proteina alla destinazione tipica della prima proteina. Anche la degradazione selettiva di proteine di cui la cellula non ha più bisogno si basa fondamentalmente su segnali molecolari presenti nella struttura di ciascuna proteina. Le modificazioni post-traduzionali di molte proteine eucariotiche cominciano nel reticolo endoplasmatico il sistema di trasporto a destinazione meglio definito ha inizio nel reticolo endoplasmatico (ER). La maggior parte delle proteine Iisosomiali, di membrana o destinate alla secrezione possiede una sequenza segnale amminoterminale che le contraddistingue, permettendo la loro trasporto. Sono state determinate centinaia di proteine segnale di questo gruppo. La glicosilazione svolge un ruolo chiave nel trasporto a destinazione delle proteine Nel lume dell'ER, le proteine neosintetizzate vengono ulteriormente modificate in vari modi. Dopo la rimozione delle sequenze segnale, i polipeptidi vengono correttamente avvolti, si formano i legami disolfuro e molte proteine vengono anche glicosilate. Le proteine glicosilate, o glicoproteine, presentano spesso oligosaccaridi legati a residui di Asn. Questi oligosaccaridi legati in N sono molto diversi tra loro, ma le numerose vie attraverso le quali si formano hanno il primo passaggio in comune.

Le proteine modificate possono dirigersi verso diverse destinazioni intracellulari. Le proteine si spostano dall'ER al complesso di Golgi all'interno di vescicole di trasporto. Nel complesso di Golgi, ad alcune proteine vengono legati oligosaccaridi in O, mentre gli oligosaccaridi legati in N vengono ulteriormente modificati. Attraverso meccanismi chiariti soltanto in parte, le proteine vengono anche smistate e indirizzate alle rispettive destinazioni finali. All'interno del complesso di Golgi i processi che segregano le proteine destinate all'esterno della cellula rispetto a quelle destinate alla membrana plasmatica o ai lisosomi devono distinguere le proteine in base a caratteristiche strutturali diverse dalla sequenza segnale, che è stata rimossa nel lume dell'ER. Questo processo di segregazione è stato meglio definito nel caso delle idrolasi destinate a essere trasportate nei lisosomi. Quando una idrolasi (una glicoproteina) arriva nel complesso di Golgi, una parte non ancora determinata della sua struttura tridimensionale (talvolta chiamata placca segnale) viene riconosciuta da una fosfotrasferasi, che fosforila alcuni residui di mannosio dell'oligosaccaride dell'idrolasi. La presenza di uno o più residui di mannosio 6fosfato nell'oligosaccaride legato in N è il segnale strutturale che indirizza la proteina ai Iisosomi. Un recettore proteico nella membrana del complesso di Golgi riconosce il mannosio 6-fosfato segnale e lega l'idrolasi così contrassegnata. Vescicole che contengono questi complessi recettore-idrolasi gemmano dal lato trans del complesso di Golgi e se ne distaccano. Al loro interno il complesso recettore-idrolasi si dissocia in un processo facilitato dal basso pH e dalla rimozione del fosfato dai residui di mannosio 6-fosfato catalizzata da una fosfatasi. Il recettore viene poi riciclato e torna al complesso di Golgi; vescicole che contengono le idrolasi gemmano dalle vescicole di segregazione e si dirigono ai lisosomi. Nelle cellule trattate con tunicamicina, le idrolasi che dovrebbero essere dirette ai lisosomi vengono invece secrete, confermando che l'oligosaccaride legato in N svolge un ruolo chiave nell'indirizzare questi enzimi ai lisosomi.

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Anche i meccanismi che dirigono le proteine ai mitocondri e ai cloroplasti si basano sulle sequenze segnale amminoterminali. Sebbene i mitocondri e i cloroplasti contengano DNA, le loro proteine vengono in gran parte codificate dal DNA nucleare e da lì devono essere trasportate agli organelli appropriati. A differenza del trasporto delle proteine verso l'ER, il meccanismo di trasporto ai mitocondri e ai cloroplasti inizia solo dopo che una proteina precursore è stata completamente sintetizzata e rilasciata dal ribosoma. I precursori proteici destinati ai mitocondri e ai cloroplasti si legano a proteine chaperone del citosol e vengono rilasciati nei pressi di recettori situati sulla superficie esterna degli organelli a cui sono destinati. Meccanismi specializzati nella traslocazione portano la proteina alla sua destinazione finale negli organelli, dopo che la sequenza segnale è stata rimossa. Le sequenze segnale per il trasporto delle proteine nel nucleo non vengono eliminate La comunicazione molerolare tra il nucleo e il citosol richiede il passaggio di molecole attraverso i pori nucleari. Le molecole di RNA sintetizzate nel nucleo sono esportate nel citosol. Le proteine ribosomiali sintetizzate sui ribosomi citosolici sono traferite nel nucleo e organizzate in subunità ribosomiali 60S e 30S nel nucleolo; il ribosoma completo viene poi trasferito nuovamente nel citosol. Numerose proteine nucleari (RNA e DNA polimerasi, istoni, topoisomerasi, proteine che regolano l'espressione genica, ecc.) vengono sintetizzate nel citosol e trasferite nel nucleo. Questo traffico di proteine è regolato da un complesso sistema di segnali molecolari e di proteine di trasporto ancora in fase di studio. In molti eucarioti multicellulari, l'involucro nucleare si disgrega ad ogni divisione cellulare. Quindi, una volta completata la divisione e una volta riformatosi l'involucro, le proteine nucleari disperse nel citosol devono essere reimportate nel nucleo. Al fine di permettere il frequente passaggio delle proteine nucleari dal citosol al nucleo, la sequenza di localizzazione nucleare, NLS, che dirige la proteina al nucleo, non viene rimossa una volta che la proteina è giunta a destinazione. L'NLS, al contrario di altre sequenze segnale, può essere localizzata quasi dovunque lungo la sequenza primaria della proteina. Le sequenze NLS possono essere molto diverse, ma molte di esse consistono di 4-6 residui amminoacidici che includono diversi residui basici (Arg o Lys). Il trasporto nel nucleo è mediato da alcune proteine che passano dal citosol al nucleo e viceversa, come l'importina α e β e una piccola GTPasi, nota come Ran (Ras-related nuclear protein, proteina nucleare correlata alla Ras). Un eterodimero costituito da importina α e β funziona come un recettore solubile per le proteine indirizzate al nucleo, con la subunità α che lega le proteine NLS nel citosol. Il complesso della proteina NLS e dell'importina si accosta ad un poro nucleare ed è trasportato attraverso il poro mediante un meccanismo dipendente da energia. Nel nucleo l'importina β viene legata da Ran GTPasi che rilascia importina β dalla proteina importata. L’importina α viene legata da Ran e da CAS (proteina cellulare suscettibile all'apoptosi) e separata dalla proteina NLS. Le importine α e β, nei loro complessi con Ran e CAS, sono quindi portate fuori dal nucleo. Nel citosol Ran idrolizza il suo GTP con conseguente rilascio delle importine che tornano quindi libere e pronte per ricominciare un altro ciclo. La proteina Ran stessa viene reimportata nel nucleo tramite un processo che inizia con il legame di Ran-GDP al fattore per il trasporto nucleare 2 (NTF2). Nel nucleo il GDP legato a Ran è scambiato con GTP mediante l'azione del fattore di scambio dei nucleotidi guanosinici (RanGEF). Anche i batteri utilizzano sequenze segnale per trasportare le proteine a destinazione Anche i batteri possono indirizzare alcune loro proteine alle membrane interna ed esterna, allo spazio periplasmatico compreso tra queste membrane o al mezzo extracellulare. Questo trasporto a destinazione utilizza sequenze segnale presenti al terminale amminico delle proteine ed è molto simile a quello delle proteine eucariotiche dirette all'ER, ai mitocondri e ai cloroplasti. Dopo la traduzione, una proteina che deve essere esportata si ripiega molto lentamente, perché la sequenza amminoterminale impedisce l'avvolgimento. La proteina chaperone solubile SecB si lega alla sequenza segnale delle proteine o ad altre caratteristiche della sua struttura ripiegata in modo incompleto. La proteina legata viene quindi ceduta a SecA, una proteina associata alla superficie interna della membrana citoplasmatica. SecA agisce sia da recettore sia da ATPasi di traslocazione. Una volta dissociata da SecB, ma ancora legata a SecA, la proteina passa a un complesso di traslocazione presente sulla membrana, costituito da SecY, E e G, e viene traslocata gradualmente attraverso la membrana al complesso SecYEG, con spostamenti di circa 20 amminoacidi per volta. Ogni fase del processo viene facilitata dall'idrolisi di ATP da parte di SecA. Una proteina esportata viene quindi spinta attraverso la membrana dalla proteina SecA localizzata sulla superficie citoplasmatica, anziché essere trascinata attraverso la membrana da una proteina localizzata sulla superficie periplasmatica. Questa differenza potrebbe semplicemente riflettere la necessità dell'ATPasi di traslocazione di stare dove è presente l’ATP. Il potenziale eletrochimico transmembrana fornisce inoltre energia per la traslocazione di una proteina da esportare con un meccenisno non ancora noto.

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Anche se nei batteri la maggior parte delle proteine viene esportata attraverso questo meccanismo, alcune seguono una via alternativa che utilizza componenti di riconoscimento del segnale e recettori omologhi a SRP e al suo recettore negli eucarioti. Le cellule importano le proteine per endocitosi mediata da recettori Alcune proteine, come la lipoproteina a bassa densità (LDH) la transferrina (una proteina che trasporta il ferro) , gli ormoni peptidici e le proteine circolanti destinate alla degradazione, vengono importate nelle cellule eucariotiche dal materiale circostante. Esistono diverse vie che conducono all'importazione delle proteine nella cellula. In una di esse, le proteine si legano a recettori situati in invaginazioni della membrana dette vescicole (invaginazioni), dove i recettori endocitotici si trovano in concentrazione maggiore rispetto alle altre proteine di membrana. Dal lato citosolico le invaginazione sono rivestite da uno strato formato dalla proteina clatrina, che forma strutture icosaedriche chiuse. Il lattice di clatrina aumenta il numero dei recettori occupati dalle proteine bersaglio, finché una vescicola endocitotica completa circondata da una membrana, si stacca dala membrana plasmatica e penetra nel citoplasma, con l'aiuto di una proteina detta dinamina, dotata di attività GTPasica. La clatrina viene subito rimossa da enzimi specifici, e la vescicola si fonde con un endosoma. L'attività ATPasica della membrana endosomiale riduce il pH all'interno degli endosomi, facilitando la dissociazione dei recettori dalle loro proteine bersaglio. In una via correlata è la caveolina a indurre l'imaginazione di porzioni di membrana che contengono "zattere" (rafts) lipidiche associate a determinati tipi di recettori. Queste vescicole endocitotiche si fondono con i caveosomi, strutture endocellulari contenenti la caveolina, dove le molecole internalizzate sono ordinate per gruppi per essere indirizzate in altre zone della cellula, mentre le caveoline sono reindirizzate sulla membrana cellulare per essere riciclate. Esistono anche vie di endocitosi clatrina- e caveolinaindipendenti; alcune utilizzano la dinamina, altre no. Le proteine importate e i recettori seguono quindi vie separate, e il loro destino varia a seconda del tipo di cellula e di proteina internalizzata. La transferrina e il suo recettore sono infine riciclati. Alcuni ormoni, i fattori di crescita e gli immunocomplessi, dopo aver indotto la risposta appropriata nella cellula, vengono degradati insieme ai loro recettori. Le LDL vengono degradate dopo che il colesterolo ad esse associato è stato appropriatamente distribuito, ma il recettore delle LDL viene riciclato. L'endocitosi mediata dai recettori è sfruttata da alcune tossine e dai virus per penetrare nell cellule. Seguono questa via il virus dell'influenza, la tossina difterica e la tossina del colera.

n) RNA

Struttura e funzione (RNA ribosomiale, transfer e messaggero) Con la sola eccessione dei genomi ad RNA di alcuni virus, tutte le molecole di RNA hanno origineda informazioni permanentemente immagazzinate nel DNA. In un processo chiamato trascrizione, un sistema enzimatico converte l’informazione genetica di un segmento di DNA a doppia elica in una catena di RNA con una sequenza di basi complementare a una delle due catene del DNA. Vengono prodotti tre tipi principali di RNA. L’ RNA messaggero (mRNA) contiene le sequenze che codificano la sequenza degli amminoacidi di uno o più polipeptidi, specificate da un gene o da un insieme di geni. L’ RNA transfer (tRNA) è un adattatore che legge l’informazione codificata nell’mRNA e trasferisce l’appropriato amminoacido alla catena proteica nascente durante la sintesi proteica. Le molecole di RNA ribosomiale (rRNA) fanno parte dei ribosomi, le complesse strutture cellulari dove vengono sintetizzate le proteine. Inoltre, numerosi altri RNA specializzati hanno funzioni regolatrici e catalitiche oppure sono precursori di una delle 3 classi principali appena citate. Oggi si pensa che queste molecole di RNA con funzioni speciali non siano solo secondarie rispetto alle tre categorie su elencate. Nei vertebrati, il numero degli RNA che non rientrano in una di queste categorie sembra essere molto più elevato di quelli che vi rientrano. L'acido ribonucleico (RNA) è un polimero organico, risultante alla polimerizzazione di ribonucleotidi. Chimicamente l'RNA è molto simile al DNA. Anch'esso è una catena polinucleotidica contenente quattro nucleotidi diversi. Le molecole di RNA differiscono da quelle di DNA perché:  contengono lo zucchero ribosio (con un gruppo OH legato al carbonio 2') anziché il deossiribosio (da qui il nome)  una delle basi, la timina (T), è sostituita dall'uracile (U). In questo caso è l'uracile a legarsi all'adenina, mentre la guanina si lega sempre alla citosina;  sono di solito a singolo filamento, anziché a filamento doppio (il DNA possiede una struttura più complessa, chiamata a doppia elica, che consiste nel piegamento della struttura a elica singola su se stessa, secondo i canoni dei livelli di organizzazione proteica, mentre l'RNA possiede una struttura semplice a elica singola). Le molecole di RNA vengono sintetizzate attraverso un processo, conosciuto come trascrizione del DNA, dove un filamento diDNA viene ricopiato nel corrispondente filamento di RNA.

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Vi sono tre tipi di RNA comuni a tutti gli organismi cellulari:  mRNA (RNA messaggero) che contiene l'informazione per la sintesi delle proteine;  rRNA (RNA ribosomiale), che entra nella struttura dei ribosomi;  tRNA (RNA transfer) necessario per la traduzione nei ribosomi. Negli eucarioti abbiamo anche:  hnRNA (RNA eterogeneo nucleare) tipo di molecole di cui fa parte il pre-mRNA;  snRNA (piccolo RNA nucleare) necessario per la maturazione dell'HnRna. La sintesi dell'RNA è molto simile a quella del DNA. La RNA polimerasi non richiede però un innesco. La trascrizione può iniziare solo presso una sequenza detta promotore e termina in presenza di altre sequenze particolari. È stata avanzata l'ipotesi che l'RNA abbia assunto un ruolo chiave negli organismi primitivi prima del DNA. A favore di tale ipotesi c'è la capacità catalitica di alcune molecole di RNA (ribozimi). Sull'mRNA viene trascritta l'informazione genetica che poi verrà utilizzata per svariati usi. Sintesi Questo processo è molto diverso tra eucarioti e procarioti. Negli eucarioti la sintesi avviene nel nucleo attraverso tre diverse molecole dette RNA polimerasi (nei procarioti ce n'è solo una). Sono parzialmente diverse tra loro, infatti hanno alcune subunità in comune e altre uniche per la loro specie. Ciò è anche dovuto al fatto che esse producono tre tipi diversi di RNA.  La RNA polimerasi I produce gli rRNA 5,8 S, 18 S, 28 S nel nucleolo  La RNA polimerasi II produce mRNA e piccoli RNA stabili che servono a formare gli snRNP nel nucleo  La RNA polimerasi III produce piccoli RNA stabili, tRNA e l'RNA 5 S sempre nel nucleo. La RNA polimerasi più conosciuta è la RNA polimerasi II perché produce l'mRNA, che servirà poi ai ribosomi per sintetizzare le proteine. L'rRNA 18 S più 35 proteine compresse andrà a formare la subunità ribosomiale minore. Gli rRNA 5 S, 5,8 S e 28 S più 50 proteine andranno a formare la subunità ribosomiale maggiore. Anomalie dell'RNA Durante il corso degli anni i ricercatori si sono accorti che gran parte dell'RNA sintetizzato dalle polimerasi veniva scartato e solo una piccola parte veniva inviata sotto forma di mRNA per la sintesi proteica. Infatti per una proteina media di circa 400 a.a. (quindi 1200 nucleotidi) venivano sintetizzati anche più del doppio dei nucleotidi realmente necessari. Ciò è dovuto al fatto che nel DNA esistono delle sequenze non più codificanti, che servivano alla cellula quando non era ancora specializzata. Queste sequenze vengono comunque trascritte dalla polimerasi e vengono dette introni, quelle che invece vengono copiate e codificanti esoni. Questo fatto implica che prima della traduzione, esse andranno tagliate; in un processo denominato Splicing L'RNA transfer (o RNA di trasporto), abbreviato in tRNA, è una piccola catena di RNA (di 74-93 nucleotidi) che trasferisce un amminoacido specifico ad una catena polipeptidica in crescita al sito ribosomiale della sintesi proteica durante la traduzione. Il tRNA ha un sito di attacco per l'amminoacido ed una regione con tre basi (nucleotidi), chiamata anticodone, che riconosce il corrispondente codone a tre basi dell'mRNA attraverso l'appaiamento di basi complementari. Ogni tipo di molecola di tRNA può legarsi ad un solo tipo di amminoacido, ma essendo presenti nel DNA tipi diversi di codoni che specificano uno stesso amminoacido, molti tipi di tRNA con anticodoni differenti possono portare lo stesso amminoacido. La molecola di RNA transfer è dunque il dispositivo "adattatore" ipotizzato da Francis Crick, che media il riconoscimento della sequenza del codone nell'mRNA e permette la sua traduzione nell'amminoacido appropriato. Struttura del tRNA Il tRNA ha una struttura primaria (l'ordine dei nucleotidi da 5' a 3'), una struttura secondaria (chiamata comunemente struttura a trifoglio), ed una struttura terziaria (tutti i tRNA hanno una simile struttura 3D a forma di L che permette loro di entrare nei siti P ed A dei ribosomi). La struttura primaria venne descritta nel 1969 da Robert W. Holley. Le strutture secondaria e terziaria derivarono dagli studi con la cristallografia a raggi x effettuati indipendentemente nel 1974 da due gruppi di ricerca, uno americano ed uno britannico, capeggiati rispettivamente da Alexander Rich ed Aaron Klug. Caratteristiche I bracci che caratterizzano la struttura secondaria a trifoglio del tRNA presentano le seguenti strutture e funzioni.  Il braccio accettore (chiamato anche braccio amminoacidico) è composto di 7 paia di basi (i nucleotidi che si appaiano sono quelli 5'- e 3'-terminali). Ilgruppo ossidrile al 3' è utilizzato per l'attacco dell'amminoacido. Al 5' c'è un gruppo fosfato. Il braccio accettore può presentare nucleotidi ed appaiamenti diversi da quelli classici individuati da James Watson e Francis Crick.

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Alla terminazione 3' del braccio, in particolare, è presente un trinucleotide molto conservato dalla sequenza CCA (detta anche coda CCA). Questa sequenza è importante per il riconoscimento dei tRNA durante la traduzione. Nei procarioti la coda CCA è trascritta, mentre negli eucarioti è aggiunta dopo la trascrizione, nel corso del processamento del tRNA.  Il braccio D è una regione contenente un loop che presenta spesso diidrouridina.  Il braccio A (o braccio dell'anticodone) è composto da 7 nucleotidi di cui i 3 centrali formano l'anticodone.  Il braccio T, composto da 7 basi, contiene una sequenza molto conservata TΨC. Esistono numerose basi modificate, solitamente attraverso metilazione. Tali modificazioni sono più frequenti presso i nucleotidi fiancheggianti o componenti l'anticodone. La terza base dell'anticodone, ad esempio, è spesso modificata in inosina (derivata dall'adenina) o in pseudouridina (derivata dall'uracile). L'anticodone Un anticodone è costituito da tre nucleotidi che corrispondono alle tre basi del codone letto dal tRNA. Ogni specifico anticodone di tRNA contiene una sequenza (tripletta) che può appaiarsi ad uno o più codoni per uno stesso amminoacido. Ad esempio, un codone per la lisina è AAA; l'anticodone della lisina deve essere UUU. Il codice genetico però è ridondante, e ad alcuni amminoacidi corrispondono più codoni di mRNA (quindi più anticodoni di tRNA). Questo comporta che codoni diversi possano codificare per lo stesso amminoacido, oppure che l'appaiamento sia accurato per le prime due basi mentre per la terza può esistere una tolleranza agli appaiamenti "sbagliati". Alcuni anticodoni infatti possono appaiarsi a più di un codone, in base ad un fenomeno chiamato wobble pairing (o appaiamento incerto). Nel codice genetico è comune che un singolo amminoacido occupi tutte e quattro le possibilità della terza posizione; ad esempio la glicina è codificata dai codoni GGU, GGC, GGA e GGG. Per permettere una corrispondenza uno a uno tra molecole di tRNA e codoni, ci sarebbe bisogno di 61 molecole di tRNA per cellula. Invece le cellule contengono meno di 61 tipi di tRNA perché la base "incerta" (fenomeno del wobble pairing) è capace di legarsi a molti -non necessariamente tutti- i codoni che specificano un particolare amminoacido. Amminoacilazione L'amminoacilazione è il processo di aggiunta di un gruppo amminoacile ad un composto. Questo produce delle molecole di tRNA con i loro CCA 3' terminali legati covalentemente ad un amminoacido. Ogni tRNA è amminocilato (o caricato) con uno specifico amminoacido dall'amminoacil-tRNA sintetasi. Esiste soltanto una amminoacil-tRNA sintetasi per ogni amminoacido, nonostante il fatto che possa esserci più di un tRNA e più di un anticodone per ogni amminoacido. Il riconoscimento del tRNA appropriato da parte della sintetasi non è mediato soltanto dall'anticodone ed il sito accettore spesso gioca un ruolo importante. Reazione: amminoacido + ATP → amminoacil-AMP + PPi amminoacil-AMP + tRNA → amminoacil-tRNA + AMP Geni che codificano tRNA Gli organismi variano col numero di geni che codificano per il tRNA nel loro genoma. Il verme nematode C. elegans, un organismo utilizzato come modello negli studi di genetica, ha 19000 geni nel suo genoma nucleare, 659 dei quali codificano per il tRNA. Nel genoma umano, che secondo stime attuali ha circa 30000 geni, ci sono circa 2000 geni non codificanti, che includono quelli per la codifica del tRNA. I geni per tRNA citoplasmatico possono essere raggruppati in 49 famiglie secondo le caratteristiche del loro anticodone. Questi geni si trovano su tutti i cromosomi, tranne i cromosomi 22 ed Y. Le molecole di tRNA sono trascritte (nelle cellule eucariote) dalla RNA polimerasi III, diversamente dall'RNA messaggero (mRNA), che è trascritto dalla RNA polimerasi II. L'RNA messaggero (noto con l'abbreviazione di mRNA o con il termine più generico di trascritto) è un tipo di RNA che codifica e porta informazioni durante la trascrizione dal DNA ai siti della sintesi proteica, per essere sottoposto alla traduzione. “Ciclo vitale” dell'mRNA La breve vita di una molecola di mRNA comincia con la trascrizione e termina con la degradazione. Durante la sua vita una molecola di mRNA può anche essere esaminata, modificata e trasportata prima della traduzione. Le molecole di mRNA degli eucarioti spesso richiedono di essere verificate e trasportate, al contrario di quelle dei procarioti. Struttura dell'mRNA La struttura di un mRNA eucariotico maturo. Un mRNA completamente modificato include un cappuccio 5', un 5' UTR, una regione codificante, un 3' UTR ed una coda poli-A. Cappuccio 5' Un cappuccio 5', chiamato anche cappuccio RNA 7-metilguanosina (o RNA7G), è un nucleotide guaninico modificato che viene aggiunto all'estremità frontale (5' terminale) dell'RNA messaggero appena dopo l'inizio della trascrizione. Consiste in un residuo terminale di 7-metilguanosina legato tramite un legame 5'-5'-trifosfato al primo nucleotide trascritto. La sua presenza è importante per il riconoscimento da parte del ribosoma e la protezione dall'RNasi.

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L'aggiunta del cappuccio è contemporanea alla trascrizione. Appena dopo l'inizio della trascrizione, il 5' terminale sintetizzato è legato tramite un complesso per la sintesi del cappuccio associato con l'RNA polimerasi. Questo complesso enzimatico catalizza le reazioni chimiche necessarie. La sintesi procede come una reazione biochimica multi-step: Viene tagliato il trifosfato del 5' terminale dell'RNA appena sintetizzato. L'enzima fosfoidrolasi taglia i legami γ fosfodiesteri lasciando i fosfati in posizione α e β. L'enzima guanililtrasferasi trasferisce una guanina ed il suo α fosfato sul β fosfato del 5' terminale dell'RNA, producendo un legame 5'-5'-trifosfato. La posizione dell'azoto-7 (N-7) viene metilata (guaninmetilazione) dall'enzima mRNA (guanina-N7-)-metiltransferasi. La mRNA (nucleoside-2'-O-)-metiltransferasi metila la posizione 2' dello zucchero ribosio. Questo gruppo metile contribuisce alla stabilità dell'RNA, grazie alla protezione da un taglio reso possibile da un attacco nucleofilo del vicino idrogeno. Dopo che il 5' terminale è stato "incappucciato", viene rilasciato dal complesso di sintesi ed è poi legato da un complesso legante associato alla RNA polimerasi. Regioni codificanti Le regioni codificanti sono composte da codoni che vengono decodificati e tradotti in proteine dai ribosomi. Le regioni codificanti cominciano con un codone di inizio e terminano con tre possibili codoni di stop. In aggiunta alla sintesi proteica, porzioni di regioni codificanti possono agire da sequenze regolatrici come amplificatori dello splicing esonico o inibitori dello splicing esonico. Regioni non codificanti Le regioni non codificanti sono sezioni dell'RNA posizionate prima del codone d'inizio e dopo il codone di stop, che non vengono tradotte e vengono chiamate rispettivamente 5' UTR e 3' UTR (dove UTR sta per untranslated region). Sono stati attribuiti diversi ruoli alle regioni non codificanti nell'espressione genica, inclusa la stabilizzazione dell'mRNA, la localizzazione dell'mRNA e l'efficienza traduzionale. La stabilità dell'mRNA può essere mediata dal 5' UTR e dal 3' UTR, per la mutevole affinità per alcuni enzimi che degradano l'RNA, le ribonucleasi, che possono promuovere o inibire la stabilità della molecola di RNA. Più un mRNA è stabile, più proteine possono essere prodotte da quella trascrizione. Si pensa che la localizzazione citoplasmatica dell'RNA dipenda dal 3' UTR. Le proteine possono essere sintetizzate nella regione cellulare che ne ha bisogno; in tal caso il 3' UTR può contenere delle sequenze che permettono che il trascritto possa essere localizzato in quella regione per la traduzione. L'efficienza traduzionale e l'inibizione della traduzione possono essere mediate dagli UTR. Le proteine che si legano al 3' o al 5' UTR possono danneggiare la traduzione interferendo con l'abilità dei ribosomi di legarsi all'mRNA. Alcuni degli elementi contenuti nelle regioni non codificanti formano una struttura secondaria caratteristica quando vengono trascritti in RNA. Questi elementi strutturali dell'mRNA sono coinvolti nella regolazione dell'mRNA. Alcuni, come gli elementi SECIS, sono bersagli per le proteine da legare. Una classe di elementi dell'mRNA, i "riboswitches", legano direttamente piccole molecole, cambiando il proprio ripiegamento per modificare i livelli di trascrizione o traduzione. In questi casi l'mRNA si regola da sé. mRNA monocistronico L'mRNA si dice monocistronico quando porta l'informazione per un solo gene, ed è una caratteristica tipica degli eucarioti mentre nei procarioti l'mRNA è molto spesso policistronico e cioè che porta l'informazione per più geni (il trascritto di mRNA corrispondente è in grado di tradurre per più catene polipeptidiche diverse, in sequenza). Un cistrone è quindi una sequenza di basi nucleotidiche compresa tra una tripletta di inizio AUG e una di stop. Il termine deriva dal fatto che due mutazioni puntiformi diverse possono complementare (ossia dare un fenotipo normale) solo se sono in cis, ossia nello stesso filamento (per cui l'altro cistrone è selvatico), e non se sono in trans, in quanto entrambi i polipeptidi risultano anormali. La tipica organizzazione policistronica dell'mRNA dei procarioti è dovuta alla caratteristica organizzazione dei geni in operoni, ovvero una serie di geni disposti uno accanto all'altro lungo il cromosoma che codificano enzimi con funzione correlata tra loro (solitamente coinvolti nella stessa pathway) controllati da un unico induttore e che sono trascritti su un'unica molecola di mRNA. Questo risponde anche a necessità funzionali ed evolutive: semplificando, un procariote avrà spesso bisogno di un adattamento immediato all'ambiente circostante, dal momento che non lo controlla (come possono fare invece gli organismi pluricellulari e complessi), e deve attivare quindi una risposta sotto forma di una particolare via metabolica, che include più passaggi, quindi diverse proteine ed enzimi. Un mRNA policistronico consente loro, nello stesso passaggio, di sintetizzare buona parte di quelle catene polipeptidiche. Infatti un mRNA policistronico codifica solitamente proteine della stessa via metabolica.

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Coda poliadenilata La coda di poli(A) consiste in una lunga sequenza di nucleotidi adenina (spesso anche alcune centinaia), aggiunta al 3' del pre-mRNA dall'enzima poliadenilato polimerasi. La coda di poli(A) è aggiunta ai trascritti contenenti una specifica sequenza segnale, composta da AAUAAA. L'importanza del segnale AAUAAA è stata dimostrata dalla mutazione individuata sul gene della α2-globina (una subunità dell'emoglobina), che vede l'originale sequenza AATAAA mutata in AATAAG. Gli individui che presentano questa mutazione hanno deficienza di emoglobina[1]. mRNA Anti-senso Durante la trascrizione, il DNA a doppio filamento produce mRNA a partire dal cosiddetto filamento senso; l'altro filamento, complementare, è detto antisenso. Con il termine mRNA antisenso, si intende un RNA complementare in sequenza con uno o più mRNA. In alcuni organismi, la presenza di un mRNA anti-senso può inibire l'espressione genetica attraverso l'appaiamento con gli specifici mRNA. Nella ricerca biochimica, questo effetto è stato usato per studiare il funzionamento dei geni, semplicemente inibendo il cromosoma studiato aggiungendo il suo mRNA anti-senso. Tali studi sono stati compiuti sul nematode Caenorhabditis elegans ed il batterio Escherichia coli. L'RNA ribosomiale (o RNA ribosomale, abbreviato come rRNA) è la tipologia più abbondante di RNA presente nella cellula. Non codifica direttamente le proteine, ma è il componente essenziale (circa i due terzi) dei ribosomi, macchine catalitiche che provvedono all'assemblaggio delle proteine, presenti in tutte le cellule viventi. Il ribosoma è una struttura che si auto-assembla in due subunitàripiegate (la subunità maggiore e la subunità minore) costituite dall'RNA ribosomiale, in presenza di 70-80 proteine ribosomiali, che si trovano all'esterno oppure nelle cavità presenti all'interno dell'rRNA ripiegato. La funzione dell'rRNA è fornire un meccanismo per la decodifica dell'mRNA in amminoacidi (al centro della subunità minore del ribosoma) ed interagire con il tRNA durante la sintesi proteica, provvedendo all'attività della peptidil trasferasi, che avviene nella subunità maggiore. L'esattezza della traduzione è dovuta al lavoro di entrambe le subunità. Le caratteristiche dell'RNA ribosomiale sono importanti per la medicina e per lo studio dell'evoluzione:  L'rRNA è il bersaglio di molti antibiotici: cloramfenicolo, eritromicina, kasugamicina, micrococcina, paromicina, ricina, sarcina, spectinomicina, streptomicina e tiostreptone;  L'rRNA è il componente più conservato (che ha subito meno variazioni nel corso dell'evoluzione) in tutte le cellule. Per questa ragione, i geni che codificano per l'rRNA vengono sequenziati per identificare il gruppo tassonomico di un organismo, per riconoscere i gruppi correlati e stimare il tasso di divergenza tra le varie specie. Nei Bacteria, negli Archaea, nei mitocondri e nei cloroplasti, la subunità minore contiene l'rRNA 16S, mentre la subunità maggiore ne contiene due specie: il 5S ed il 23S. Nei batteri i geni ribosomiali 16S, 23S e 5S sono tipicamente organizzati in un operone. Possono esserci una o più copie dell'operone disperse nel genoma (Escherichia coli ad esempio ne ha sette). Gli Archaea possono contenere sia un singolo operone di rDNA sia copie multiple dello stesso operone. Al contrario gli Eukaryota hanno generalmente molte copie dei geni dell'rRNA ripetute in serie. Negli esseri umani sono presenti approssimativamente 300-400 ripetizioni di rRNA in cinque gruppi (suicromosomi 13, 14, 15, 21 e 22). Nella maggior parte degli eucarioti la subunità ribosomiale minore contiene l'rRNA 18S, mentre la subunità maggiore ne contiene tre specie diverse: il 5S, il 5,8S ed il 25S/28S. Per i geni dell'rRNA è stata dimostrata la dominanza nucleolare. In alcuni organismi, in particolare le piante, quando due nuclei si combinano in una singola cellula durante l'ibridazione, l'organismo che ne deriva può "scegliere" un set di geni per la trascrizione dell'rRNA. L'altro set viene soppresso e generalmente non viene trascritto, anche se a volte può essere "riattivato". L'hnRNA (RNA eterogeneo nucleare) è un gruppo di molecole di cui fanno parte il pre-mRNA ed di altri trascritti non destinati a divenire mRNA citoplasmatico. Nonostante questa distinzione l'hnRNA è spesso usato come sinonimo di pre-mRNA. L'hnRNA può essere complessato da proteine formando l'hnRNP (particelle ribonucleoproteiche nucleari eterogenee). Per small nuclear RNA (piccolo RNA nucleare, abbreviato come snRNA) si intende una piccola molecola di acido ribonucleico, solitamente molto ricca di uracile, che partecipa alla maturazione dell'mRNA. La localizzazione degli snRNA è tipicamente nel nucleo eucariote. Gli snRNA, trascritti dalla RNA polimerasi II o dalla RNA polimerasi III, sono coinvolti in una serie di importanti processi come lo splicing (la rimozione degli introni dal pre-mRNA), la regolazione deifattori di trascrizione (7SK RNA) o della stessa RNA polimerasi II (B2 RNA) o il mantenimento dei telomeri.

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Le snRNP formano lo spliceosoma, cioè quell'insieme di particelle che contribuiscono allo splicing di un tratto della catena di mRNA. snRNP Gli snRNA sono sempre associati a proteine specifiche, con cui formano complessi noti come small nuclear ribonucleoproteins (piccole ribonucleoproteine nucleari, o snRNP).

Trascrizione (RNA polimerasi, inizio e terminazione)

La trascrizione è catalizzata da RNA polimerasi dipendenti dal DNA, che utilizzano ribonucleosidi 5’ trifosfato per sintetizzare un RNA complementare al filamento stampo del DNA a doppio filamento.la trascrizione avviene in più fasi: legame della FNA polimerasi ad un sitodel DNA chiamato promotore, inizio della sintesi del trascritto, allungamento e terminazione. La RNA polimerasi batterica richiede una specifica subunità per individuare il promotore. Poichè questa è la prima tappa obbligata della trascrizione, il legame della RNA polimerasi al promotore e l’inizio della trascrizione sono strettamente regolati. La trascrizione si ferma a livello di sequenze dette terminatori. Le cellule eucariotiche possiedono tre tipi di RNA polimerasi. Il legame della Pol II al suo promotore richiede una serie di proteine conosciute come fattori di trascrizione. I fattori di allungamento partecipano alla fase di allungamento della trascrizione. La subunità più grande della Pol II possiede un lungo dominio carbossiterminale che viene fosforilato durante le fasi di inizio e allungamento. La trascrizione è regolata a diversi livelli La richiesta cellulare di un determinato prodotto genico può variare molto, a seconda delle condizioni della cellula e dei suoi diversi stadi di sviluppo. La trascrizione di ciascun gene è accuratamente regolata per fornire alla cellula le proteine solo nella quantità necessaria. Il processo di regolazione può avvenire durante ogni fase della trascrizione, inclusi l'allungamento e la terminazione. Tuttavia la regolazione avviene principalmente a livello del legame della polimerasi e della tappa iniziale della trascrizione. Le differenze nelle sequenze dei promotori sono solo uno dei diversi livelli di controllo. Il livello di espressione genica può anche essere influenzato dal legame di proteine a sequenze poste sia vicino sia lontano dal sito del promotore. Tale legame può attivare la trascrizione, facilitando il legame della RNA polimerasi o stimolando tappe successive nel processo di inizio, oppure reprimerla bloccando l'attività della polimerasi. In E. coli, un esempio di proteina che attiva la trascrizione è la proteina recettore per il cAMP (CRP), che aumenta i livelli di trascrizione dei geni che codificano gli enzimi che metabolizzano zuccheri diversi dal glucosio, quando le cellule sono coltivate in assenza di questo zucchero. l repressori sono proteine che bloccano la sintesi di RNA in corrispondenza di geni specifici. Nel caso del repressore Lac, la sintesi per gli enzimi necessari al metabolismo del lattosio è bloccata quando il lattosio non è disponibile. Poiché la trascrizione è il primo passaggio di una complessa serie di reazioni ad alto consumo energetico che porta alla sintesi proteica, la regolazione dei livelli proteici, sia nei batteri che negli eucarioti, avviene a livello della trascrizione. Sequenze specifiche segnalano la fine della sintesi dell'RNA La sintesi dell'RNA è processiva (cioè l'RNA polimerasi ha necessariamente un'alta processività); ciò è fondamentale perché se l'enzima rilasciasse prematuramente un trascritto non potrebbe riprenderne la sintesi da quel punto, ma dovrebbe per forza ricominciare da capo. Tuttavia, quando la RNA polimerasi incontra particolari sequenze sul DNA, effettua una pausa nella sintesi dell'RNA e presso alcune di queste sequenze la sintesi si ferma. Il processo di terminazione non è molto chiaro negli eucarioti e, pertanto, la nostra attenzione si sposterà nuovamente sui batteri. In E. coli esistono almeno due classi di tali segnali di terminazione o terminatori: una classe utilizza un fattore proteico chiamato ρ (rho), mentre l'altra è ρ-indipendente. La maggior parte dei terminatori ρ-indipendenti è contraddistinta da due caratteristiche strutturali. La prima è una regione che produce un trascritto di RNA con sequenze complementari a se stesse, determinando la formazione di una struttura a forcina, centrata da 15 a 20 nucleotidi prima della estremità terminale della catena di RNA. La seconda caratteristica è una ma di tre residui A nella catena stampo che vengono trascritti in U all'estremità 3' della forcina. Quando la polimerasi arriva a un sito di terminazione con questa struttura si ferma. La formazione della struttura a forcina nell'RNA distrugge molte coppie di basi A=U nel segmento ibrido DNA-RNA e potrebbe alterare anche importanti interazioni tra l'RNA e l'RNA polimerasi, facilitando la dissociazione del trascritto. I terminatori ρ-dipendenti non possiedono la sequenza di residui A ripetuti nello stampo, ma di solito hanno una se quenza ricca di C-A detta elemento rut (rho utilization). La proteina ρ si associa all'RNA in corrispondenza di un sito di legame specifico e migra in direzione 5'3’ finché non raggiunge il complesso di trascrizione fermo al terminatore. Qui esso contribuisce al rilascio del trascritto di RNA. La proteina ρ possiede un'attività RNA-DNA elicasica che ne

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promuove la traslocazione lungo l'RNA. L'ATP viene idrolizzato dalla proteina ρ durante il processo di terminazione. Il preciso meccanismo con cui la proteina promuove il rilascio del trascritto non è conosciuto. Le cellule eucariotiche hanno tre tipi di RNA polimerasi nel nucleo L'apparato preposto al processo di trascrizione nel nucleo delle cellule eucariotiche è molto più complesso di quello dei batteri. Gli eucarioti possiedono tre RNA polimerasi, chiamate Pol I, Pol II, e Pol III, che sono complessi proteici distinti, ma con alcune subunità in comune. Ciascuna polimerasi ha una specifica funzione e si lega ad una specifica sequenza dei promotori. L'RNA polimerasi I (Pol I) è responsabile della sintesi di un solo tipo di RNA, un trascritto chiamato RNA preribosomiale (o pre-rRNA), che contiene i precursori dell'RNA 18 S e 5,8 S e dell'rRNA 28 S. l promotori della Pol I hanno sequenze diverse da una specie all'altra. La polimerasi II (poI II) sintetizza invece l'mRNA e alcuni RNA specializzati. L'enzima riconosce migliaia di promotori con sequenze anche molto diverse tra loro. Molti promotori Pol II hanno qualche caratteristica sequenza in comune, tra cui il TATA box (sequenza consenso eucariotica TATAAA) vicina alla coppia di basi -30, e una sequenza lnr (iniziatore) vicina al sito di inizio della sintesi dell'RNA, in posizione +1. L’RNA polimerasi III (Pol III) sintetizza i tRNA, l'rRNA 5S, ed altri piccoli RNA con funzioni specializzate. I promotori riconosciuti dalla Pol III sono stati ben caratterizzati. È interessante notare che alcune delle sequenze necessarie per la regolazione dell'inizio della trascrizione da parte della Pol III sono localizzate all'interno dello stesso gene, mentre altre si trovano in posizioni più convenzionali, cioè a monte del sito di inizio dell'RNA. La RNA polimerasi II richiede molti altri fattori proteici per la sua attività L’RNA polimerasi II ha un ruolo centrale nell'espressione genica degli eucarioti ed è stata studiata in dettaglio. Nonostante questa polimerasi sia molto più complessa del suo corrispettivo batterico, la complessità nasconde una marcata conservazione di struttura, funzione e meccanismo. La polimerasi II è un enzima di grandi dimensioni costituito da 12 subunità. La subunità maggiore (RPB1) mostra un alto grado di omologia con la subunità β' deIl'RNA polimerasi batterica. L'altra subunità (RPB2) è strutturalmente simile alla subunità β batterica e altre due (RPB3 e RPB11) mostrano alcune omologie strutturali con le due subunità α batteriche. La Pol II deve funzionare con genomi molto più complessi e con molecole di DNA impacchettate in maniera molto più elaborata rispetto a quelle dei batteri. La necessità di contatti proteina-proteina con numerosi altri fattori proteici necessari per muoversi in questo labirinto spiega in larga misura l'aumentata complessità della polimerasi eucariotica. La subunità più grande di Pol II possiede anche una caratteristica insolita, cioè una lunga coda carbossiterminale che consiste in molte ripetizioni di una sequenza amminoacidica di sette amminoacidi - YSPTSPS-. Ci sono 27 ripetizioni nell'enzima del lievito (18 esattamente sovrapponibili alla sequenza consenso) e 52 (21 sovrapponibili) negli enzimi murini e umani. Questo dominio carbossiterminale (CTD) è separato dal grosso della proteina enzimatica mediante una sequenza di unione non strutturata. Il CTD ha molti ruoli importanti nella funzione di Pol II, come è sottolineato in seguito. L'RNA polimerasi II richiede un gruppo di tre proteine, chiamate fattori di trascrizione, per poter formare il complesso attivo della trascrizione. I fattori di trascrizione di base richiesti da qualsiasi promotore della RNA polimerasi II (comunemente indicati con TFII e con una lettera di identificazione) sono molto conservati in tutti gli eucarioti. Il processo di trascrizione da parte di Pol II può essere suddiviso in diverse fasi: organizzazione, inizio, allungamento, terminazione, ognuna delle quali è associata alla funzione di proteine caratteristiche. Il meccanismo descritto fase per fase, più avanti, porta all'attivazione in vitro della trascrizione. Nella cellula, molte di queste proteine possono essere presenti in una forma preorganizzata, che semplifica il meccanismo di associazione al promotore. Organizzazione della RNA polimerasi e dei fattori di trascrizione a Iivello del promotore La formazione di un complesso chiuso ha inizio quando la proteina che lega il TATA box (TBP) si lega alla sua sequenza bersaglio. La TBP a sua volta interagisce con il fattore di trascrizione TFIIB, che si lega anche al DNA dall'altro lato della TBP. Il legame del fattore TFIIA, anche se non sempre essenziale, può stabilizzare il complesso TFIIB-TBP sul DNA e può essere importante a livello di promotori non consenso, dove il legame della TBP è relativamente debole. Il complesso TFIIBTBP si lega poi ad un altro complesso formato dalla TFIIF e dalla Pol II. TFIIF indirizza la Pol II ai suoi promotori, sia interagendo con la TFIIF sia impedendo il legame della polimerasi a siti non specifici sul DNA. Infine, si legano TFIIE e TFIIH, per creare un complesso chiuso. Il fattore TFIIH possiede un'attività elicasica, che promuove lo svolgimento del DNA in prossimità del sito di inizio (un processo che richiede l'idrolisi dell'ATP), creando in tal modo un complesso aperto. Contando tutte le subunità dei vali fattori essenziali (TFIIA escluso), il complesso nella sua composizione minima possiede più di 30 polipeptidi. Gli studi strutturali condotti da Roger Kornberg e collaboratori hanno fornito un'immagine dettagliata del nucleo della RNA polimerasi II durante l’allungamento. Inizio della sintesi dell'RNA e abbandono del promotore Il fattore TFIIH ha un'ulteriore funzione durante la fase di inizio della trascrizione. L'attività chinasica di una delle sue subunità fosforila la Pol II in molti siti del dominio

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carbossiterminale CTD. Altre chinasi, inclusa la CDK9 (chinasi ciclina-dipendente 9), che è parte del complesso pTEFb (Positive transcription elongation factor b) fosforilano il CTD, soprattutto a livello dei residui di serina delle sequenze ripetitive del CTD. Questo provoca una variazione conformazionale dell'intero complesso, che dà inizio alla trascrizione. La fosforilazione di CTD è importante anche per la successiva fase di allungamento, lo stato di fosforilazione di CTD cambia man mano che la trascrizione procede. Queste variazioni modificano le interazioni tra il complesso di trascrizione e le altre proteine o enzimi, con il risultato che le proteine che iniziano la trascrizione sono diverse da quelle che partecipano alle fasi successive. Alcune di queste proteine sono coinvolte anche nel processo di maturazione del trascritto. Durante la polimerizzazione dei 60-70 nucleotidi iniziali dell'RNA, viene rilasciato prima il TFIIE, poi il TFIIH e la Pol II entra nella fase di allungamento. Allungamento, terminazione e rilascio Il TFIIF rimane associato alla Pol II durante la fase di allungamento. In questa fase, l'attività della polimerasi aumenta sensibilmente ad opera di alcune proteine, chiamate fattori di allungamento. I fattori di allungamento, alcuni legati al CTD fosforilato, sopprimono le pause durante la trascrizione e coordinano anche l'interazione tra complessi proteici coinvolti nella maturazione post-trascrizionale degli mRNA. Una volta completato il trascritto, il processo ha termine. La Pol II viene defosforilata ed è pronta per dare inizio alla sintesi di un nuovo trascritto. Regolazione dell'attività della RNA polimerasi II La regolazione della trascrizione a livello dei promotori della Pol II è molto complessa e comporta l'interazione di una grande varietà di proteine con il complesso di preinizio. Alcune di queste proteine regolatrici interagiscono con i fattori di trascrizione, altre che con la Pol II stessa. Altre funzioni di TFIIH Negli eucarioti la riparazione del DNA danneggiato è più efficiente all'interno dei geni che vengono attivamente trascritti, piuttosto che a livello di altri siti di DNA danneggiati. La catena di DNA stampo viene riparata con maggior efficienza della catena non stampo. Queste interessanti osservazioni possono essere spiegate tenendo conto dei ruoli alternativi delle subunità di TFIIH. TFIIH non solo partecipa alla formazione del complesso chiuso durante l'organizzazione del complesso di trascrizione sopra descritto, ma alcune delle sue subunità sono anche componenti essenziali del complesso di riparazione per escissione dei nucleotidi.

Maturazione (modificazione chimica, splicing degli introni e RNA catalitico) Gli mRNA eucariotici vengono modificati per aggiunta di un residuo di 7-metilguanosina all’estremità 5’ e tramite un taglio seguito alla poliadenililazione, con formazione di una coda di poli(A), all’estremità 3’. Molti trascritti primari di mRNA contengono introni (regioni non codificati), che vengono rimossi dallo splicing. L’escissione degli introni del gruppo I, che si trovano in alcuni rRNA, richiede come cofattore la guanosina. Alcuni introni dei gruppi I e II sono capaci di autosplicing, senza che sia richiesto l’intervento di enzimi proteici. I precursori dell’mRNA nucleare possiedono una terza classe di introni (la più ampia), che vengono escissi con l’aiuto di complessi di RNA-proteine, chiamati snRNP, organizzati in spliceosomi. Una quarta classe di introni, che si trova in alcuni tRNA, comprende introni che vengono sceissi da enzimi proteici. La funzione di molti mRNA eucariotici è regolata da microRNA (miRNA) complementari. I miRNA stessi derivano da precursori, attraverso una serie di reazioni di modificazione. Gli rRNA e gli tRNA derivano da precursori di maggiori dimensioni, su cui agiscono alcune nucleasi. Alcune basi vengono modificate enzimaticamente durante il processo di maturazione. Alcune modificazioni dei nucleosidi sono guidate dagli snoRNA, all’interno di complessi proteici chiamati snoRNP. Gli introni capaci di autosplicing e la componente di RNA nella Rnasi P (che taglia l’estremità 5’ dei precursori dei tRNA) sono 2 esempi di ribozimi. Questi catalizzatori biologici mostrano le stesse caratteristiche degli enzimi. Generalmente promuovono scissioni idrolitiche e transesterificazioni, utilizzando l’RNA come substrato. Una combinazione di questi tipi di reazione può essere promossa dall’introne isolato del gruppo I dell’rRNA di Tetrahymena, che catalizza una reazione di polimerizzazione dell’RNA. La polinucleotide fosforilasi catalizza una reazione reversibile di formazione di polimeri simili all’RNA a partire da ribonucleosidi-5’-difosfato, aggiungendo o rimuovendo ribonucleotidi a livello dell’estremità ossidrilica 3’ del polimero. In vivo l’enzima degrada l’RNA. Maturazione dell’RNA Molte molecole di RNA batterico e praticamente tutte quelle di RNA eucariotico subiscono modificazioni dopo essere state sintetizzate. Alcuni dei più significativi eventi molecolari del metabolismo dell'RNA avvengono proprio nell'ambito di queste reazioni post-sintetiche. Molto interessante è il fatto che alcuni enzimi che

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catalizzano questi processi sono costituiti da RNA invece che da proteine. La scoperta di questi RNA catalitici, o ribozimi, ha provocato una rivoluzione di pensiero circa la funzione dell'RNA e le origini della vita. Una molecola di RNA appena sintetizzata è chiamata trascritto primario. Forse le modificazioni più radicali dei trascritti primari avvengono a carico degli mRNA eucariotici e dei tRNA batterici ed eucariotici. Vengono modificate anche molecole di RNA che svolgono funzioni speciali. Il trascritto primario degli mRNA degli eucarioti contiene sequenze che comprendono un solo gene, anche se le sequenze che codificano i polipeptidi possono non essere contigue. I tratti non codificanti che interrompono la regione codificante del trascritto vengono chiamati introni e i segmenti codificanti sono chiamati esoni. In un processo chiamato splicing, gli introni vengono rimossi dal trascritto primario e gli esoni vengono uniti formando una sequenza contigua che specifica un polipeptide funzionante. Gli mRNA eucariotici vengono anche modificati a ciascuna estremità: una struttura chiamata cappuccio viene aggiunta all'estrernità 5' e viene detta cap 5'. L'estremità 3' viene tagliata ad essa viene aggiunta una serie da 80 a 250 residui di A, formando una "coda" di poli(A). l complessi proteici talvolta molto elaborati che catalizzano questi tre tipi di processi di modificazione dell'RNA non operano in maniera indipendente. Essi risultano associati l'uno con l'altro e con il CTD fosforilato della Pol II; ogni complesso influenza la funzione degli altri. Nel nucleo l'mRNA è associato ad altre proteine coinvolte nel trasporto dell'mRNA al citoplasma; quindi la maturazione del trascritto è associata al suo trasporto. In effetti, un mRNA eucariotico quando viene sintetizzato è collocato all'interno di un elaborato complesso che coinvolge decine di proteine. La composizione del complesso varia quando il trascritto primario deve essere processato, trasportato al citoplasma e consegnato al ribosoma per la traduzione. Le proteine associate modulano tutti gli aspetti funzionali o il destino dell'mRNA. I trascritti primari dei tRNA dei procarioti e degli eucarioti vengono modificati con la rimozione di sequenze da ciascuna estremità (scissione) e, talvolta, con la rimozione di introni (splicing). Inoltre, vengono modificate molte basi e zuccheri dei tRNA; i tRNA maturi presentano numerose basi insolite assenti in altri acidi nucleici. Molti degli RNA con funzioni speciali vanno incontro a elaborati processi di modificazione che spesso coinvolgono la rimozione di una o entrambe le estremità. Il destino ultimo di qualsiasi RNA è la sua degradazione completa che avviene sotto un rigido controllo. La velocità di turnover degli RNA è cruciale per la determinazione del loro livello omeostatico e della velocità con cui le cellule possono bloccare l'espressione di un gene il cui prodotto non è più necessario. Per esempio, nello sviluppo di organismi multicellulari è importante che certe proteine vengano espresse soltanto in alcuni stadi, e quindi che l'mRNA che codifica tali proteine sia prodotto e degradato nei tempi corretti. Gli mRNA degli eucarioti vengono "incappucciati" all'estremità 5' Molti mRNA degli eucarioti possiedono all'estremità 5' un cappuccio (cap 5'), un residuo di 7-metilguanosina legato al residuo 5' -terminale dell'mRNA attraverso un inconsueto legame 5',5' -trifosfato. Il cap 5' aiuta a proteggere l'mRNA dalle ribonucleasi. Esso si lega anche ad uno specifico complesso proteico di legame del cappuccio, e partecipa al legame dell'mRNA al ribosorna, per avviare la traduzione. Il cap 5' si forma dalla condensazione di una molecola di GTP con il trifosfato dell'estremità 5' del trascritto. La guanina viene successivamente metilata in N-7 ed altri gruppi metilici vengono spesso aggiunti agli ossidrili in 2' del primo e del secondo nucleotide adiacenti al cappuccio. I gruppi metilici sono forniti dalla S-adenosilmetionina. Tutte queste reazioni avvengono molto precocemente durante la trascrizione dopo che sono stati aggiunti i primi 20-30 nucleotidi del trascritto. Tutti e tre gli enzimi di incappucciamento, e attraverso essi l'estremità 5' dello stesso trascritto, sono associati con il CTD dell'RNA polimerasi II finché il cappuccio viene sintetizzato. L'estremità 5' incappucciata abbandona poi gli enzimi, e si lega al complesso di legame del cappuccio. Gli introni e gli esoni vengono trascritti da DNA ad RNA Nei batteri una catena polipeptidica viene generalmente codificata da una sequenza di DNA stampo non interrotta, contenente tutta l'informazione necessaria a specificare il polipeptide, e colineare con la sequenza amminoacidica. Però l'idea che tutti i geni fossero continui fu confutata nel 1977, quando Phillip Sharp e Richard Roberts, indipendentemente, scoprirono che negli eucarioti molti geni di polipeptidi sono interrotti da sequenze non codificanti (introni). La grande maggioranza dei geni dei vertebrati, eccetto quelli che codificano gli istoni, contiene introni. La frequenza degli introni in altri organismi eucariotici non è così costante. Molti geni di Sacchammyces cerevisiae mancano degli introni, anche se in altre specie di lieviti essi sono più comuni. Gli introni sono anche presenti nei geni di alcuni batteri e archea. Essi vengono trascritti dalle RNA polimerasi insieme a tutto il gene. Gli introni dei trascritti primari vengono rimossi (splicing), mentre gli esoni vengono riuniti per formare un unico RNA maturo e funzionale. Negli mRNA eucarioti, la maggior parte degli esoni è lunga meno di 300 nucleotidi; molti sono costituiti da 100 a 200 nucleotidi che codificano sequenze di circa 30-60 amminoacidi all'interno di un polipeptide più grande. Gli introni invece possono

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contenere da 50 a 20 000 nucleotidi. l geni degli eucarioti superiori, compreso l'uomo, hanno più DNA sotto forma di introni che di esoni. Molti geni possiedono introni; alcuni ne contengono decine. L’RNA catalizza la rimozione (splicing) degli introni Gli introni possono essere suddivisi in quattro classi, le prime due, comprendenti gli introni del gruppo I e del gruppo II, differiscono nei dettagli dei loro meccanismi di splicing ma hanno in comune alcune sorprendenti caratteristiche: essi sono in grado di rimuovere gli introni senza l’aiuto di proteine, cioè possono catalizzare un meccanismo di auto-splicing. Gli introni del gruppo l si trovano in alcuni geni nucleari, mitocondriali e dei cloroplasti, che codificano per rRNA, mRNA e tRNA. Gli introni del gruppo II si trovano generalmente nei trascritti primari degli mRNA di mitocondri o cloroplasti presenti in funghi, alghe e piante. Questi due tipi di introni possono essere presenti anche in quei rari casi di batteri contenenti introni. Nessuna delle due classi ha bisogno per lo splicing di un cofattore ad alta energia, come l'ATP. Il meccanismo di splicing in entrambi i gruppi comporta due reazioni di transesterificazione, in cui un ossidrile in 2' o 3' del ribosio porta un attacco nucleofilico ad un atomo di fosforo, formando un nuovo legame fosfodiestere a spese di quello già esistente, senza variazioni nel bilancio energetico. Le reazioni sono molto simili a quelle della rottura e ricongiungimento del DNA, catalizzate dalle topoisomerasi e delle ricombinasi sito specifiche. Le reazioni di splicing del gruppo I richiedono un nucleoside guaninico o altro cofattore nucleotidico, che però non viene utilizzato come fonte di energia. Il gruppo ossidrilico 3' della guanosina viene usato come nucleofilo nella prima tappa del processo di splicing. Il gruppo ossidrilico 3' forma un legame 3',5' -fosfodiestere con l'estremità 5' dell'introne. L'ossidrile in 3' dell'esone che viene liberato in questa fase agisce da nucleofilo in una reazione simile, ed agisce sull'estremità 3' degli esoni. Il risultato è l'esatta rimozione dell'introne e il congiungimento degli esoni. Per gli introni del gruppo II le reazioni sono simili, ma i nucleofilo della prima tappa è in questo caso il gruppo ossidrilico di un residuo di A all'interno dell'introne. Viene così a formarsi come intermedio una struttura ramificata a cappio. Il processo di autosplicing degli introni fu osservato per la prima volta nel 1982 durante gli studi condotti da Thomas Chec e collaboratori sul meccanismo di splicing degli introni del gruppo I negli rRNA del protozoo ciliato Tetrahymena thermophila. Questi ricercatori hanno trascritto in vitro il DNA di Tetrahymena (compresi gli introni), usando una polimerasi batterica purificata. Il risultante RNA andava incontro a splicing in modo accurato, senza l'intervento di alcun enzima di Tetrahymena. La scoperta che gli RNA possono svolgere funzioni catalitiche è stata una pietra miliare della ricerca biologica. La maggioranza degli introni non possiede il meccanismo di autosplicing e questi tipi non vengono classificati in una delle classi già descritte. La terza e più vasta classe di introni include quelli che si trovano nei trascritti nucleici primari di mRNA. Essi vengono chiamati introni spliceosomiali, perché la loro rimozione è catalizzata da un complesso proteico, detto spliceosoma. All'interno di questa struttura, gli introni vanno incontro ad un meccanismo di splicing simile a quello degli introni di gruppo I con la formazione della struttura a cappio. Lo spliceosoma è costituito da complessi RNA-proteine, chiamati pico proteine nucleari (small nuclear ribonucleoproteins, snRNP, spesso pronunciato "snurp"). Ogni snRNP è codificato da un RNA lungo da 100 a 200 nucleotidi, appartenente una classe di RNA eucariotici, che vanno sotto il nome piccoli RNA nucleari (snRNA). Cinque snRNA (U1, U2, U4, U5, e U6), tutti coinvolti nelle reazioni di splicing sono molto rappresentati nel nucleo degli eucarioti. Gli RNA delle proteine snRNP sono altamente conservati negli esoni dai lieviti all'uomo. Gli introni spliceosomiali hanno la sequenza generale dinucleotidica GU all'estremità 5' e AG all'estremità 3’. Queste sequenze segnalano dove deve avvenire lo splicing. L’snRNA U1 contiene una sequenza complementare a quenze vicine al sito di splicing 5' degli introni dell’RNA nucleare, mentre la proteina snRNP lega a questa regione nel trascritto primario. L’azione delle proteine snRNP U2, U4, U5, e U6, porta alla formazione dello spliceosoma. Nel loro insieme, le snRNP forniscono cinque RNA e circa 50 proteine al nucleo dello spliceosoma, un complesso sopramolecolare paragonabile ai ribosomi. È probabile che altre 50 proteine si associno allo spliceosoma durante i vari stadi del processo di splicing e che qualcuna svolga più di una funzione, come nello splicing, nel trasporto dell'mRNA dal nucleo al citoplasma, nella traduzione e nell'eventuale degradazione dell'mRNA. L'organizzazione dello spliceosoma richiede ATP, ma le reazioni di "taglia e cuci" non sembrano richiedere energia. Alcuni introni dell'mRNA subiscono un tipo di splicing che richiede l'intervento di uno spliceosoma meno comune, in cui le proteine snRNP U1 e U2 sono sostituite dalle proteine snRNP U11 e U12. Mentre gli spliceosomi contenenti U1 e U2 rimuovono gli introni con sequenze terminali (5')GU e AG(3'), gli spliceosomi contenenti U11 e U12 rimuovono una rara classe di introni le cui estremità sono segnalate da sequenze (5')AU e AC(3'). Gli spliceosomi nucleari si sono probabilmente evoluti da introni di gruppo il più antichi, in cui le proteine snRNP hanno sostituito i domini catalitici dei progenitori in grado di effettuare l'autosplicing.

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Alcuni dei componenti degli apparati di splicing sembrano essere legati al CTD dell'RNA polimerasi II, suggerendo un'interessante modello per la reazione di splicing. Non appena viene sintetizzata la sequenza della prima giunzione di splicing, questa viene riconosciuta dallo spliceosoma legato alla polimerasi. La seconda giunzione viene poi catturata dallo stesso complesso, facilitando il successivo processo di splicing. L'introne rimosso rimane nel nucleo, e viene degradato. La quarta classe di introni, presente in alcuni tRNA, si differenzia dagli introni dei gruppi l e II in quanto la reazione di splicing richiede l'intervento dell'ATP e di una endonucleasi che scinde il legame fosfodiestere a livello di ambedue le estremità dell'introne. l due esoni vengono riuniti tramite un meccanismo simile a quello della DNA ligasi. Anche se gli introni spliceosomiali sembrano essere esclusivi degli eucarioti, le altre classi di introni sono più generali. Geni con introni dei gruppi I e II sono stati trovati nei batteri e nei batteriofagi. Il batteriofago T4, per esempio, possiede alcuni geni che codificano proteine con introni del gruppo I. Gli introni sembrano essere più frequenti negli archea che nei batteri. Gli mRNA degli eucarioti hanno strutture particolari all'estremità 3' Molti mRNA eucariotici hanno alla loro estremità 3' una sequenza costruita da 80-250 residui di A, che formano la cosiddetta coda di poli(A). Questa struttura serve come sito di legame per una o più proteine specifiche. La coda di poli(A) e le proteine ad essa associate probabilmente aiutano a proteggere l'mRNA dalla degradazione enzimatica. Anche molti mRNA batterici possiedono code di poli(A), ma in questo caso esse stimolano la degradazione dell'mRNA, invece di proteggerlo. L'aggiunta della coda di poli(A) è un processo a più tappe. Il trascritto si estende oltre il sito a cui verrà poi aggiunta la coda. Esso viene scisso dall'attività endonucleasica di un grosso complesso multienzimatico, anch'esso associato al CTD della RNA polimerasi II. Il sito di mRNA dove avviene la scissione è indicato da due elementi di sequenza: la sequenza altamente conservata (5')AAUAAA(3'), situata da 10 a 30 nucleotidi sul lato 5' (a monte) rispetto al sito di scissione, ed una sequenza non ben definita ricca di residui di G e U, da 20 a 40 nucleotidi posta a valle del sito di scissione. La rottura genera un gruppo ossidrilico libero, che definisce la fine dell'mRNA, al quale vengono immediatamente aggiunti i residui di A dalla poliadenilato polimerasi, che catalizza la reazione dove n varia da 80 a 250. L'enzima non richiede uno stampo, ma necessita di una molecola di mRNA già scissa come primer. In qualche caso la regione codificante viene modificata dal meccanismo di "editing" (revisione). L'editing comprende reazioni che aggiungono o eliminano basi nelle regioni codificanti del trascritto primario, o che modificano la sequenza (per esempio, un residuo di C si trasforma in U per deamminazione enzimatica). Un esempio particolarmente significativo è quello del tripanosoma, un protozoo parassita, in cui ampie regioni di un mRNA vengono sintetizzate senza uridilato che è inserito in seguito, mediante un processo di editing. Un gene può dare origine a prodotti diversi a seguito di modificazioni differenti dell'RNA L'evidente complessità degli organismi non sembra corrispondere al numero dei geni che codificano proteine, né alla quantità del DNA genomico. Però, gli studi tradizionali sui geni che codificano le proteine non tengono conto della complessità dei trascrittomi. Man mano che le numerose funzioni dell'RNA diventano sempre più chiare, diventa sempre più evidente la complessità della nuova genomica. Alcuni trascritti di mRNA si modificano in un solo mRNA maturo, e quindi in un solo polipeptide conispondente, altri invece vengono modificati (maturati) in più di un modo e possono produrre differenti mRNA, e quindi differenti polipeptidi. Il trascritto primario contiene segnali molecolari per tutte le vie di maturazione alternative a cui può andare incontro; Ia via favorita in un determinato tipo di cellula è stabilita da alcune proteine dette fattori di maturazione che si legano all'RNA e che promuovono un particolare tipo di maturazione. I trascritti complessi possono avere più di un solo sito di scissione per la successiva poliadenilazione, vie alternative di splicing, oppure entrambi i meccanismi. Nel primo caso, se viene scisso il sito più vicino all'estremità 5', verrà rimossa una parte considerevole della sequenza del trascritto primario. Questo meccanismo, detto "di scelta del sito della poliadenilazione", è alla base della variabilità dei domini delle catene pesanti delle immunoglobuline. Nelle diverse fasi dello sviluppo del moscerino della frutta, vie alternative di splicing producono da un trascritto primario comune tre differenti forme di catene pesanti di miosina. Entrambi i meccanismi entrano in gioco quando un singolo trascritto di RNA viene modificato in modo differente per produrre due ormoni diversi: la calcitonina, che regola i livelli del calcio nella tiroide del ratto, e il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) nel cervello del ratto. Esistono anche altre vie alternative di splicing.

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Molti, se non tutti, i geni dei genomi di mammifero sono soggetti a splicing alternativi che aumentano il numero delle proteine codificate dai geni. Lo stesso processo ha invece poca rilevanza negli eucarioti inferiori, come il lievito, dove solo alcuni geni vanno incontro a splicing alternativi. Anche gli RNA ribosomiali e i tRNA subiscono modificazioni post-trascrizionali Le modificazioni post-trascrizionali non sono limitate all'mRNA. Gli RNA ribosomiali dei batteri, degli archea e delle cellule eucariotiche si formano a partire da precursori più lunghi, chiamati RNA pre-ribosomiali. Anche i tRNA derivano da precursori più lunghi. Questi RNA contengono anche una varietà di nucleosidi modificati. RNA ribosomiali Nei batteri gli rRNA 16S, 23S, e 5S (e alcuni tRNA, anche se la maggioranza dei tRNA è codificata altrove) derivano da una singola molecola di RNA precursore 30S costituito da circa 6500 nucleotidi. L'estremità del precursore 30S e i segmenti tra le unità di rRNA vengono rimossi mediante un processo di maturazione. Gli RNA 16S e 23S contengono anche nucleosidi modificati. In E. coli, gli 11 nucleosidi modificati dell'rRNA 16S comprendono una pseudouridina e altri 10 nucleosidi metilati sulla base o sul gruppo 2'-ossidrilico, oppure su entrambi i siti. L'rRNA 23S ha 10 pseudouridine, 1 diidrouridina e 12 nucleosidi metilati. Nei batteri, ciascuna modificazione è generalmente catalizzata da uno specifico enzima. Le reazioni di metilazione utilizzano l'S-adenolsilmetionina come cofattore, mentre non sono richiesti cofattori per la formazione della pseudouridina. Il genoma di E. coli codifica sette molecole di pre-rRNA. Tutti questi geni hanno essenzialmente regioni identiche codificanti l'rRNA, ma differiscono nei segmenti intercalati. I segmenti tra i geni per il 16S e il 23S generalmente codificano uno o due tRNA differenti, a seconda del tipo di trascritto di pre-rRNA. In alcuni trascritti precursori le sequenze codificanti per i tRNA si trovano sul lato 3' dell'rRNA 5S. La situazione negli eucarioti è più complicata. Un trascritto 45S di pre-rRNA viene sintetizzato dalla RNA polimerasi I e nel nucleolo; da questa molecola derivano gli rRNA 18S, 28S e 5,8 S, caratteristici dei ribosomi degli eucarioti. Come nei batteri, il processo di maturazione include le reazioni di scissione mediate da endo- o esoribonucleasi e reazioni di modificazione dei nucleosidi. Alcuni pre-rRNA contengono introni che devono poi essere eliminati. L’intero processo ha inizio nel nucleolo, in grossi complessi che si organizzano sull'rRNA precursore, man mano che viene sintetizzato dalla Pol I. Esiste una stretta relazione tra trascrizione, maturazione dell'rRNA, e organizzazione dei ribosomi nel nucleolo. Ciascun complesso comprende le ribonucleasi che scindono gli rRNA precursori, gli enzimi che modificano basi particolari, molti piccoli RNA nucleolari, o snoRNA, che guidano la modificazione dei nucleosidi e alcune reazioni di scissione, e proteine ribosomiali. Nel lievito, l'intero processo che agisce sul pre-rRNA coinvolge più di 170 proteine non ribosomiali, snoRNA specifici per ciascuna modificazione dei nucleosidi (Circa 70 in totale, poiché alcuni snoRNA guidano due tipi di modificazione) e 78 proteine ribosomiali. L'uomo possiede un numero ancora più grande di nucleosidi modificati, circa 200, e un numero maggiore di snoRNA associati. La composizione dei complessi può variare man mano che i ribosomi si formano, e molti dei complessi intermedi possono competere quanto a complessità con il ribosorna stesso e con le snRNP. L'rRNA 5S della maggioranza degli eucarioti si forma come trascritto completamente separato, per azione di una polimerasi differente (Pol III). Le più comuni modificazioni dei nucleosidi degli rRNA degli eucarioti sono sempre la conversione dell'uridina in pseudouridina e la metilazione dei nucleosidi adoMet-dipendenti (spesso sui gruppi ossidrilici 2'). Queste reazioni dipendono dai complessi snoRNA-proteine, o snoRNP, ciascuno formato da uno snoRNA e quattro o cinque proteine, tra cui l'enzima che catalizza la modificazione. Esistono due classi di snoRNP caratterizzate da elementi con sequenza conservata, identificati da lettere maiuscole. Le snoRNP indicate come H/ACA sono coinvolte nelle pseudouridililazioni mentre le snoRNP C/D sono implicate nelle reazioni di 2'-O-metilazione. Contrariamente a quanto accade nei batteri, lo stesso enzima può partecipare alla modificazione di molti siti, guidato dagli snoRNA. Gli snoRNA sono lunghi da 60 a 300 nucleotidi. Molti vengono codificati da sequenze che si trovano all'interno degli introni di altri geni e che vengono cotrascritte insieme ai geni. Ogni snoRNA include una sequenza di 10-21 nucleotidi, perfettamente complementare ad un segmento di un rRNA. La restante sequenza conservata dello snoRNA si ripiega in strutture che si legano alle proteine che fanno parte della snoRNP. RNA transfer La maggior parte delle cellule ha da 40 a 50 diversi tRNA e le cellule eucariotiche possiedono copie multiple di molti dei geni per i tRNA. I tRNA derivano da RNA precursori più lunghi, per rimozione enzimatica di nucleotidi dalle estremità 5' e 3'. In alcuni trascritti di tRNA negli eucarioti sono presenti introni che devono essere rimossi. Quando due o più tRNA diversi sono contenuti in un singolo trascritto primario, essi vengono separati per taglio enzimatico. La endonucleasi RNasi P, presente in tutti gli organismi, rimuove l'RNA all'estremità 5' dei tRNA. Questo enzima contiene proteine ed RNA. Il componente RNA è essenziale per l'attività enzimatica e nelle cellule batteriche può catalizzare la reazione di modificazione dell'RNA, anche in assenza della componente proteica. L’RNasi P è quindi un altro esempio di RNA catalitico, la cui funzione verrà descritta in dettaglio in seguito. L'estremità 3' dei tRNA viene modificata da una o più nucleasi, compresa l'esonucleasi RNasi D.

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I precursori dei tRNA possono andare incontro ad altre modificazioni post-trascrizionali. Il trinucleotide terminale CCA(3'), a cui si lega l'amminoacido durante la sintesi proteica, è assente in alcuni precursori dei tRNA batterici, e in tutti i precursori dei tRNA eucariotici. Questa sequenza viene aggiunta durante la maturazione ed è portata avanti dalla tRNA nucleotidiltrasferasi, un enzima insolito, che lega i tre ribonucleosidi trifosfato substrato in siti attivi separati, e catalizza la formazione dei legami fosfodiestere per produrre la sequenza CCA(3'). L'aggiunta di questa sequenza nucleotidica non dipende quindi da un DNA o RNA stampo, ma dalla specificità dei siti di legame dell'enzima. Lo stadio finale del processo di maturazione dei tRNA è costituito da reazioni di metilazione, deamminazione: e riduzione di alcune basi. Nel caso della pseudouridina, la base uracile viene prima rimossa, e poi riattaccata al ribosio in posizione C-5. Alcune di queste basi modificate si trovano in posizioni caratteristiche in tutti i tRNA. Gli RNA con funzioni speciali vanno incontro a diversi tipi di modificazioni Il numero di classi conosciute di RNA dotati di speciali funzioni va espandendosi rapidamente, insieme con il numero delle funzioni trovate normalmente associate a queste molecole. Molti di questi RNA vanno incontro a processi di maturazione. Gli snRNA e gli snoRNA non solo facilitano le reazioni di modificazione degli RNA, ma vengono anch'essi sintetizzati sotto forma di precursori più lunghi e poi modificati. Molti snoRNA vengono codificati all'interno di introni di altri geni. Quando gli introni vengono rimossi dal pre-mRNA le proteine snoRNP si legano alle sequenze dello snoRNA e le ribonucleasi rimuovono RNA non necessari dalle estremità 3' e 5'. Gli snRNA destinati agli spliceosomi vengono sintetizzati come pre-snRNA dalla RNA polimerasi II e le ribonucleasi rimuovono RNA in più da ciascuna delle due estremità. Particolari nucleosidi degli snRNA sono soggetti a 11 tipi di modificazioni, mediante O-metilazione in 2' e la conversione dell'uridina in pseudouridina. I microRNA (miRNA) sono speciali classi di RNA coinvolti nella regolazione genica. Si tratta di RNA non codificanti, lunghi circa 22 nucleotidi, con una sequenza complementare a particolari regioni degli mRNA, che regolano la funzione degli mRNA, tagliandoli, o impedendone la traduzione. I miRNA si trovano negli eucarioti pluricellulari, dai moscerini della frutta, alle piante e ai mammiferi. Fino all'1% del genoma umano codifica miRNA, i quali regolano la funzione di circa un terzo degli mRNA. I miRNA vengono sintetizzati da precursori molto più grandi, in diverse tappe. I trascritti primari dei miRNA (primiRNA) hanno dimensioni molto variabili; alcuni sono codificati negli introni di altri geni e vengono espressi insieme ai geni che li ospitano. Gli RNA con proprietà enzimatiche catalizzano alcune reazioni del metabolismo dell'RNA Lo studio delle modificazioni post-trascrizionali dell'RNA condotto ad una delle più entusiasmanti scoperte della biochimica moderna: l'esistenza di RNA catalitici. I ribozimi meglio caratterizzati sono gli introni appartenenti al gruppo I capaci di autosplicIng, come l'RNasi P ed i ribozimi a testa di martello. La maggioranza delle attività questi ribozimi è basata su due reazioni fondamentali: la transesterificazione e l'idrolisi (rottura) del legame fosfodiestere. Il substrato dei ribozimi è spesso una molecola di RNA, che può far parte dello stesso ribozima. Quando il substrato è l'RNA, l'RNA catalitico può fare l'appaiamento delle basi per allineare il substrato affinché la reazione abbia luogo. La dimensione dei ribozimi è molto varia. Gli introni del gruppo I capaci di autosplicing possono possedere più di 400 nucleotidi. l ribozimi a testa di martello consistono da due filamenti, per un totale di 41 nucleotidi. Come per le proteine enzimatiche, la struttura tridimensionale dei ribozimi è importante per la funzione. I ribozimi vengono inattivati a temperature superiori alla loro temperatura di fusione e per aggiunta di agenti denaturanti o di oligonucleotidi complementari, che rompono i normali legami idrogeno delle coppie di basi. l ribozimi si possono inattivare anche se vengono sostituiti i nucleotidi essenziali. Proprietà enzimatiche degli introni del gruppo I Gli introni del gruppo I capaci di autosplicing, oltre ad accelerare la velocità di reazione, possiedono altre proprietà in comune con gli enzimi, come ad esempio il comportamento cinetico e la specificità. Il legame del cofattore guanosina all'introne del gruppo I di Tetrahymena è saturabile (Km ~ 30μM) e può essere inibito competitivamente dalla deossiguanosina. L'introne catalizza la reazione di escissione in modo assolutamente specifico, in particolare per la presenza di un segmento denominato sequenza guida interna, che può appaiarsi con le sequenze esoniche vicino al sito 5' di splicing. L'appaiamento promuove l'appropriato allineamento dei leganti che devono essere scissi e riuniti. Poiché l'introne viene modificato chimicamente durante la reazione di splicing (le sue estremità vengono scisse), il ribozima sembra mancare di una delle proprietà basilari degli enzimi: la possibilità di catalizzare più volte la stessa reazione. Un esame più approfondito ha dimostrato che, dopo la escissione, l'introne di 414 nucleotidi dell'rRNA di Tetrahymena può comportarsi in vitro come un vero enzima (in vitro però viene rapidamente degradato). Una serie di reazioni di ciclizzazioni intramolecolari e di scissioni a carico dell'introne escisso, porta alla perdita di 19 nucleotidi dalla sua estremità 5'. L'RNA lineare formato dai rimanenti 395 nucleotidi, denominato L-19 IVS, promuove alcune

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reazioni di trasferimento di nucleotidi, in cui alcuni oligonucleotidi vengono allungati a spese di altri. l migliori substrati sono oligonucleotidi come l'oligomero sintetico (C) 5, che può appaiarsi con la sequenza guida interna ricca di guanilaro che mantiene l'esone 5' nel sito di autosplicing. L'attività enzimatica del ribozima L-19 IVS è il risultato d ciclo di transesterificazioni meccanicisticameme simili all’autosplicing. Ciascuna molecola di ribozima può modificare circa 100 molecole di substrato all'ora e non viene alterata durante la reazione; quindi l'RNA agisce in base agli stessi principi usati da un catalizzatore. Il ribozima segue la cinetica di Michaelis-Menten, è specifico per gli oligonucleotidi substrato, e può essere inibito competitivamente. Il rapporto k cat/km (costante di specificità) è di 103 M-1 s-1, più basso di quello di molti enzimi, ma il ribozima accelera la reazione di idrolisi di un fattore di 10 10 rispetto alla reazione non catalizzata. Il suo meccanismo d'azione si basa sull'orientamento del substrato, sulla catalisi covalente e sulla catalisi da ioni metallici, tutte strategie utilizzate anche dagli enzimi proteici. Caratteristiche di altri ribozimi L'RNasi P di E. coli possiede sia una componente ad RNA (l'RNA M1 , di 377 nucleotidi), sia una componente proteica (Mr 17500). Nel 1983 Sidney Altman e Norman Pace e i loro collaboratori scoprirono che in certe condizioni l'RNA M1 è dotato di capacità catalitiche e taglia i precursori del tRNA nella corretta posizione. La componente proteica apparentemente ha la funzione di stabilizzare l'RNA catalitico o di facilitarne la funzione in vivo. Il ribozima RNasi P riconosce la struttura tridimensionale del suo substrato pre-tRNA e la sequenza CCA; è quindi in grado di scindere i nucleotidi all'estremità 5' dei diversi tRNA. Il repertorio delle proprietà catalitiche dei ribozimi continua ad espandersi. Alcuni virusoidi, piccoli RNA associati ai virus a RNA delle piante, contengono una struttura che catalizza una reazione di autosplicing. Il ribozima a testa di martello, appartiene a questa classe di ribozimi. Esso catalizza l'idrolisi di un legame fosfodiestere interno. La reazione di splicing che avviene in uno spliceosoma potrebbe basarsi su un centro catalitico formato dagli snRNA U2, U5, e U6. Ancora più rilevante è il fatto che una componente ad RNA dei ribosami catalizza la sintesi delle proteine. Lo studio degli RNA catalitici ha ampliato l'orizzonte della catalisi in generale e allo stesso tempo ha suggerito importanti implicazioni sull'origine e sulla evoluzione della vita su questo pianeta. Gli mRNA cellulari vengono degradati a velocità diverse L'espressione genica è regolata a diversi livelli. Un fattore cruciale che governa l'espressione di un gene è la concentrazione del suo mRNA. La quantità di ogni tipo di molecola in una cellula dipende da due fattori: la velocità della sua sintesi e la velocità della sua degradazione. Quando sintesi e degradazione di un mRNA sono bilanciate, la sua concentrazione rimane in una condizione di stato stazionario. Una variazione di una delle due velocità condurrà ad un accumulo o ad una mancanza dell'mRNA. Le vie di degradazione assicurano che gli mRNA non si accumulino nella cellula e non dirigano la sintesi di proteine non più necessarie. Le velocità di degradazione variano notevolmente negli mRNA prodotti da differenti geni eucariotici. Quando un prodotto genico è necessario solo per un breve periodo, il tempo di emivita del suo mRNA è di soli pochi minuti o secondi. Invece prodotti genici di cui la cellula ha costantemente bisogno possono avere mRNA stabili per molte generazioni cellulari. Il tempo di emivita medio degli mRNA dei vertebrati è di circa 3 ore e il pool di ciascun tipo di mRNA viene degradato e risintetizzato 10 volte per generazione cellulare. II tempo di emivita degli mRNA batterici è molto più breve (circa 1,5 min), forse per scopi regolatori. L'RNA messaggero viene degradato da ribonucleasi presenti in tutti i tipi di cellule. In E. coli, il processo inizia con uno o più tagli operati da un'endoribonucleasi, seguiti da una degradazione 3'  5' catalizzata da esoribonucleasi. Negli eucarioti inferiori, la via principale di demolizione comprende dapprima l'accorciamento della coda di poli(A), e quindi l'eliminazione del cappuccio all'estremità 5' e la degradazione dell'mRNA nella direzione 5'3'. Esiste anche una degradazione 3'5', che potrebbe essere la via principale negli eucarioti superiori. Tutti gli eucarioti hanno un complesso di circa 10 esoribonucleasi 3' 5' conservate, chiamate exosomi, coinvolte nella modificazione delle estremità 3' degli rRNA, dei tRNA e di alcuni RNA con funzioni speciali (inclusi gli snRNA e gli snoRΝA), come pure nella degradazione degli mRNA. Nei batteri una struttura a forcina con un terminatore ρ indipendente conferisce stabilità all'RNA. Simili strutture a forcina possono rendere più stabili alcuni trascritti primari, contribuendo così alla non uniforme stabilità dei trascritti. Nelle cellule eucariotiche, le code di poli(A) in 3' e i cappucci in 5', sono importanti per stabilizzare molti mRNA. La polinucleotide fosforilasi sintetizza polimeri simili all'RNA a sequenza casuale Nel 1955 Marianne GrunbergManago e Severo Ochoa scoprirono la polinucleotide fosforilasi, un enzima batterico che catalizza la reazione:

La polinucleotide fosforilasi è stato il primo enzima scoperto in grado di sintetizzare un acido nucleico (Arthur Kornberg scoprì la DNA polimerasi subito dopo). La reazione catalizzata dalla polinucleotide fosforilasi differisce

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notevolmente dalle attività della polimerasi discusse finora, in quanto non richiede uno stampo. L'enzima usa come substrato i ribonucleosidi 5'-difosfato, e non accetta i corrispondenti trifosfato, né i deossinucleosidi 5' -difosfato. I polimeri di RNA formati dalla polinucleotide fosforilasi contengono il classico legame 3',5' -fosfodiestere, che può essere idrolizzato dalla ribonucleasi. La reazione è reversibile, e può essere spinta verso la degradazione dei poliribonucleotidi, aumentando la concentrazione del fosfato. La probabile funzione dell'enzima è quella di degradare gli mRNA a nucleosidi difosfato. Perché la polinucleotide foslorilasi non usa uno stampo, i polimeri che forma non anno una specifica sequenza di basi. La reazione procede con qualunque dei quattro nucleosidi difosfato, e la composizione in basi del polimero sintetizzato riflette soltanto le concentrazioni relative dei substrati nel mezzo. La polinucleotide fosforilasi può essere usata in laboratorio, per preparare polimeri di RNA con frequenze di base diverse. I polimeri di RNA sintetizzati con la polinucleotide fosforilasi sono stati essenziali per definire il codice genetico per gli amminoacidi.

Azione degli antibiotici sulla trascrizione L’allungamento delle catene di RNA da parte della RNA polimerasi sia nei batteri sia negli eucarioti viene inibito dall’antibiotico actinomicina D. La porzione planare di questa molecola si inserisce nel DNA a doppia elica tra appaiamenti G≡C consecutivi, deformando il DNA. Questa alterazione locale impedisce il movimento della polimerasi lungo lo stampo. Poichè l’actinomicina D inibisce l’allungamento dell’RNA sia in cellule integre, sia in estratti cellulari, è diventata molto utile per l’identificazione di quei processi cellulari che dipendono dalla sintesi di RNA. L’acridina inibisce la sintesi di RNA in modo analogo. La rifampicina inibisce la sintesi di RNA batterico legandosi specificamente alla subunità β delle RNA polimerasi batteriche e impedendo così la fase di distacco dal promotore della trascrizione. Essa è talvolta usata come antibiotico. Il fungo Amanita Phalloides ha evoluto un meccanismo molto efficace di difesa contro i predatori. Essa produce l’αamanitina che impedisce la formazione di mRNA nelle cellule animali inibendo l’RNA polimerasi II e, a più altre concentrazioni, l’RNA polimerasi III. Nè la Pol I, nè la RNA polimerasi batterica e tando meno l’RNA polimerasi II di A.Phalloides sono sensibili all’α-amanitina.

m) DNA Geni e cromosomi

Elementi cromosomici Il DNA celluIare contiene porzioni geniche e intergeniche, entrambe necessarie per le funzioni vitali della cellula. I genomi più complessi come quelli delle cellule eucariotiche necessitano un maggiore livello di organizzazione, e questo si riflette nelle caratteristiche strutturali dei loro cromosomi. lnizieremo considerando i diversi tipi di sequenze di DNA e gli elementi strutturali all'interno dei cromosomi. I geni sono segmenti di DNA che codificano RNA e catene polipeptidiche La nostra conoscenza dei geni è aumentata sensibilmente nel corso dell'ultimo secolo. Classicamente un gene era definito come la porzione di un cromosoma che determina o influenza la comparsa di un singolo carattere o fenotipo (caratteristica reversibile), come per esempio il colore degli occhi. Una definizione molecolare fu proposta nel 1940. Esponendo le spore del funge neospora crassa ai raggi X e ad altre sostanze note per la loro capacità di danneggiare il DNA e di alterarne la sequenza (mutazioni), erano prodotti diversi ceppi fungini mutanti, ognuno dei quali era privo di un enzima specifico, che causava a volte la scomparsa di un intera via metabolica nel ceppo. La conclusione era che un gene è un segmento di materiale genetico che determina o codifica un enzima: la cosiddetta ipotesi un gene-un enzima. Successivamente questo concetto fu modificato in un gene-un polipeptide, poiché molti geni codificano proteine che non sono enzimi oppure polipeptidi che fanno parte di una proteina multisubunità. La definizione biochimica moderna è ancora più precisa. Un gene è tutto il DNA che codifica la sequenza primaria di alcuni prodotti genici finali: può trattarsi di un polipeptide oppure di RNA con una specifica funzione strutturale o catalitica. Oltre ai geni il DNA contiene anche altri segmenti o sequenze che hanno funzioni regolatrici. Queste sequenze regolatrici sono i segnali che indicano l'inizio o la fine dei geni, che influenzano la trascrizione dei geni, oppure fungono da inizio della replicazione o della ricombinazione. Alcuni geni possono essere espressi in vari modi per generare prodotti genici multipli a partire da un solo segmento di DNA. La dimensione complessiva dei geni che codificano proteine può essere determinata direttamente. Come descritto in dettaglio ciascun amminoacido di una catena polipeptidica è codificato da una sequenza di tre nucleotidi consecutivi presenti su una singola catena di DNA. Questi “codoni” sono disposti in una sequenza che corrisponde alla sequenza

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degli amminoacidi nel polipeptide codificato dal gene. Una catena polipeptidica con 350 residui amminoacidici (una catena di dimensioni medie) corrisponde infatti a 1050 coppie di basi (bp). Ma i geni degli eucarioti e alcuni geni dei procarioti sono per la maggior parte interrotti da sequenze di DNA non codificante, e sono quindi considerevolmente più lunghi rispetto a quanto è possibile prevedere dal semplice calcolo. Quanti sono i geni presenti in un singolo cromosoma? Il cromosoma di Escherichia coli, uno dei genomi di procarioti che è stato completamente sequenziato, una molecola di DNA circolare (nel senso di un avvolgimento senza fine piuttosto che un cerchio perfetto) formato da 4 639 675 bp, Queste coppie di basi contengono circa 4300 geni che codificano proteine e 157 geni che codificano molecole stabili di RNA. Tra gli eucarioti, i circa 3,1 miliardi di coppie di basi contenute nel genoma umano codificano quasi 29 000 geni suddivisi in 24 cromosomi diversi. Le molecole di DNA sono molto più lunghe degli involucri che le contengono: I DNA cromosomici sono spesso più lunghi di molti ordini di grandezza delle cellule o dei virus in cui sono contenuti. Questo è vero per ogni classe di organismi o parassiti virali.

Batteri Una singola cellula di E. coli contiene quasi 100 volte più DNA di una particella di batteriofago λ. Il cromosoma di una cellula di E. coli è costituito da un'unica molecola circolare a doppia catena. Essa è costituita da 4639675 coppie di basi e ha una lunghezza complessiva di circa 1,7 rnm, approssimativamente 850 volte la lunghezza di una cellula di E. coli. Oltre alla molecola di DNA circolare di grandi dimensioni localizzata nel nucleoide, molti batteri contengono una o più piccole molecole di DNA circolare libere nel citosol. Questi elementi extracromosomici sono chiamati plasmidi. La maggior parte dei plasmidi ha una lunghezza di poche migliaia di coppie di basi ma alcuni sono lunghi anche più di 10 000. I plasmidi contengono informazioni genetiche e si replicano per dare origine a plasmidi figli, che vengono trasmessi alle cellule figlie al momento della divisione cellulare. Oltre che nei batteri i plasmidi sono stati ritrovati nei lieviti e nei funghi. In molti casi i plasmidi non conferiscono alcun vantaggio al loro ospite e la loro unica funzione sembra essere l'autopropagazione. Tuttavia, alcuni contengono geni che rendono il batterio ospite resistente ad agenti antibatterici. Ad esempio, alcuni plasmidi che trasportano il gene per Ienzima β-lattamasi conferiscono resistenza ad antibiotici βIattamici come la penicillina, l'ampicillina e l'amoxicillina. Questi plasmidi e altri simili possono anche passare da una cellula antibiotico-resistente a una antibiotico-sensibile della stessa o di un'altra specie batterica, rendendo quindi quest'ultima resistente. L'abbondante uso di antibiotici in alcune popolazioni umane ha determinato una forte pressione selettiva facilitando la diffusione dei plasmidi che conferiscono resistenza agli antibiotici (così come gli elementi trasponibili descritti più avanti che trasportano geni simili) in batteri patogeni, creando ceppi batterici resistenti a molti antibiotici. I medici stanno diventando sempre più riluttanti a prescrivere gli antibiotici, a meno che non sia strettamente necessario. Per ragioni simili, si cerca oggi di limitare l'aggiunta di antibiotici al mangime animale. Eucarioti Una singola cellula di lievito, uno degli eucarioti più semplici, ha una quantità di DNA 2,6 volte superiore rispetto a una cellula di E. coli. Le cellule di Drosophila, il moscerino della frutta usato negli studi genetici classici, ne hanno una quantità 35 volte superiore rispetto alle cellule di E.coli, e ogni cellula di un essere umano e di molti altri mammiferi ha circa 700 volte più DNA. Le cellule di numerose piante e di numerosi anfibi ne hanno quantità ancora maggiori. Il materiale genetico è suddiviso in cromosomi, il cui numero diploide (2n) è tipico di ciascuna specie. Una cellula somatica umana, per esempio, ha 46 cromosomi. Ogni cromosoma di una cellula eucariotica contiene una sola, grande molecola di DNA a doppia catena. Le molecole di DNA dei 24 diversi tipi di cromosomi umani (22 coppie, più i cromosomi sessuali X e Y) hanno una lunghezza che varia fino a 25 volte l'una rispetto all'altra. Ogni diverso cromosoma eucariotico contiene un insieme caratteristico di geni. Il DNA del genoma umano (22 cromosomi più i cromosomi sessuali X e Y) potrebbe estendersi per circa un metro da un'estremità all’altra. La maggior parte delle cellule umane è diploide e ogni cellula contiene circa 2 m di DNA. Un corpo umano adulto contiene approssimativamente 10 14 cellule, e quindi la lunghezza totale del DNA corrisponde a circa 2 x 1011 km. Se si paragona questa lunghezza a quella della circonferenza della Terra (4 x 104 km) o alla distanza

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esistente fra la Terra e il Sole (1,5 x 108km), risulta chiaro che l'organizzazione del DNA nella cellula deve presentare uno straordinario grado di compattamento. Le cellule eucariotiche sono anche provviste di organelli, mitocondri e cloroplasti, che contengono DNA. Il DNA mitocondriale (mtDNA) è una molecola molto piccola, se paragonata ai cromosomi nucleari. Nelle cellule animali, l'mtDNA contiene meno di 20000 coppie di basi (16 569 bp nell'mtDNA umano) ed è presente sotto forma di DNA circolare a doppia elica. Ogni mitocondrio possiede da due a dieci copie di questa molecola di mtDNA e il numero può aumentare a centinaia in alcuni tipi di cellule quando un embrione sta andando incontro al differenziamento cellulare. In pochi organismi (tripanosomi, per esempio) ogni mitocondrio contiene centinaia di copie di mtDNA organizzato in complessi e interconnesso alla matrice; queste strutture sono dette chinetoplasti. L’mtDNA di cellule vegetali è considerevolmente più grande di quello delle cellule animali e contiene da 200 000 a 2500 000 bp. Il DNA dei cloroplasti (cpDNA) è anch'esso presente in forma circolare a doppia elica e le me dimensioni variano da 120 000 a 160000 bp. I geni e i cromosomi degli eucarioti sono molto complessi: Molti batteri contengono soltanto un cromosoma per cellula e in quasi tutti i casi ogni cromosoma contiene una sola copia di ciascun gene. Solo pochissimi geni, per esempio quelli che codificano l' RNA, sono ripetuti diverse volte. Quasi tutto il DNA nei procarioti è costituito da geni e sequenze regolatrici. Inoltre quasi tutti i geni sono colineari con la sequenza amminoacidica (o con la sequenza di RNA) che essi codificano. L'organizzazione dei geni nel DNA degli eucarioti strutturalmente e funzionalmente molto più complessa. Gli studi sui cromosomi eucariotici hanno portato a molte scoperte sorprendenti. Molti, se non la maggior parte, dei geni degli eucarioti hanno caratteristiche strutturali peculiali e complesse: Le loro sequenze nucleotidiche contengono uno o più segmenti di DNA intercalati che non codificano la sequenza amminoacidica della catena polipeptidica finita. Questi inserti non tradotti interrompono la relazione altrimenti colineare tra la sequenza dei nucleoticli del gene e la sequenza amminoacidica del polipeptide. Il centromero è una sequenza di DNA che funziona durante il processo di divisione cellulare come punto d'attacco per le proteine che legano il cromosoma al fuso mitotico. Questo attacco è essenziale per un'eguale e ordinata distribuzione dei cromosomi alle cellule figlie. Sono stati isolati e studiati i centromeri di Saccharomyces cerevisiae. Le sequenze essenziali per la funzione del centromero sono lunghe circa 130 bp e sono molto ricche di coppie A=T. Le sequenze centromeriche di eucarioti più evoluti sono molto più lunghe e, diversamente da quelle di lievito, contengono generalmente DNA a sequenza semplice, ccstituito da migliaia di copie di una o poche brevi sequenze – da 5 a 10 coppie di basi – con lo stesso orientamento. Non è ancora noto il ruolo del DNA a sequenza semplice nel centromero. I telomeri (dal greco telos, "fine") sono sequenze poste all'estremità dei cromosomi eucariotici e aiutano a stabilizzare il cromosoma. I telomeri meglio caratterizzati sono quelli degli eucarioti più semplici. I telomeri di lievito terminano con sequenze ripetute nella forma di

dove x e y variano generalmente da 1 a 4. Il numero delle ripetizioni del telomero, n, varia tra 20 e 100 nei cromosomi della maggior parte degli eucarioti unicellulari e generalmente è superiore a 1500 nei cromosomi dei mammiferi. Le estremità di una molecola lineare di DNA non possono essere normalmente replicate dall'apparato replicativo della cellula (questa può essere la ragione per cui le molecole di DNA batterico sono circolari). Le sequenze telomeriche ripetute sono aggiunte ai cromosomi eucariotici principalmente dall'enzima specifico telomerasi. Sono stati costruiti cromosomi artificiali come strumento per conoscere meglio il significato funzionale di molte caratteristiche strutturali dei cromosomi eucariotici. La creazione di un cromosoma artificiale ragionevolmente stabile richiede solo tre componenti: un centromero, i telomeri ad ogni estremità e le sequenze che permettono l'inizio della replicazione del DNA. I cromosorri artificiali di lievito (YAC) sono stati creati come strumento di ricerca biotecnologica. Analogamente, i cromosomi artificiali umani (HAC) sono stati creati per il trattamento di malattie genetiche mediante la terapia genica.

Struttura, organizzazione e funzione del DNA nei vari organismi (superavvolgimenti, topoisomeri, nucleosomi)

Superavvolgimento del DNA: Dagli esempi forniti in precedenza risulta chiaro che il DNA cellulare deve essere strettamente compattato, il che implica un elevato grado di organizzazione strutturale. Il meccanismo di ripiegamento non deve soltanto impacchettare il DNA, ma deve anche permettere l'accesso all'informazione contenuta nel DNA.

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Prima di considerare come ciò avviene, in processi quali la replicazione e la trascrizione, dobbiamo esaminare l'importante proprietà della struttura del DNA: il superavvolgimento. Il termine superavvolgimento sta ad indicare "avvolgimento di qualcosa già avvolto". Il cordone del telefono, per esempio, è un tipico filo avvolto. La torsione che spesso si verifica in tale filo a partire dalla base dell'apparecchio telefonico al ricevitore generalmente determina un suporavvolgimento. Il DNA è avvolto in forma di una doppia elica nella quale entrambe le catene avvolte ruotano intorno a un asse. Un ulteriore ripiegamento o una torsione di tale asse su se stesso determinano un superavvolgimenro del DNA. Come sarà spipgato in dettaglio in seguito, il superavvolgimento del DNA è in genere la manifestazione di una tensione strutturale. AI contrario, se non vi è alcun ripiegamento dell'asse del DNA su se stesso, si dice che il DNA è in uno stato rilassato. Mentre era possibile prevedere che la compattazione del DNA potesse comportare una qualche forma di superavvolgimento, era più difficile intuire che anche la replicazione e la trascrizione del DNA richiedessero un superavvolgimento. La replicazione e la trascrizione richiedono una temporanea separazione delle eliche di DNA, resa difficile dal fatto che le due catene del DNA sono avvolte l'una sull'altra. È sicuramente ragionevole che il DNA nella sua forma cellulare altamente impacchettata sia superavvolto, e sarebbe addirittura ovvio se non fosse per il fatto che molte molecole di DNA circolare rimangono superavvolte anche dopo che sono state purificate e separate dalle proteine o da altri componenti cellulari. Ciò indica che il superavvolgimento è un importante aspetto intrinseco alla struttura terziaria del DNA. Esso è ubiquitario nel DNA cellulare ed è stret tamente regolato in ogni cellula. Sono state definite alcune proprietà quantificabili del superavvolgimento che hanno fornito molti chiarimenti sulla struttura e sulla funzione del DNA. Questo contributo si è avvalso abbondantemente di concetli derivati da una branca della matematica chiamata topologia, cioè lo studio delle proprietà di un oggetto che non cambiano pur subendo deformazioni continue. Nel caso del DNA, continue deformazioni comprendono modificazioni conformazionali dovute a movimenti termici o a interazioni con proteine o con altre molecole. Deformazioni discontinue richiedono la rottura delle catene del DNA. Per le molecole di DNA circolare, una proprietà topologica è quela che non viene alterata dalla deformazione delle catene del DNA, senza che vi siano rotture. Le proprietà topologiche del DNA possono essere modificate soltanto attraverso la rottura e la rigiunzione di una o di entrambe le catene del DNA. Esaminiamo ora le proprietà fondamentali del superavvolgimento e le origini fisiche di questo fenomeno. La maggior parte del DNA cellulare è parzialmente disavvolto: Per capire la natura del superavvolgimento dobbiamo ora focalizzare la nostra attenzione sulle proprietà dei piccoli DNA circolari, come i plasmidi e i virus a DNA. Quando tali DNA non contengono interruzioni in nessuna delle due catene sono chiamati DNA circolari chiusi. Se il DNA che forma una molecola circolare chiusa corrisponde perfettamente alla struttura B (struttura di Watson-Crick), con un giro della doppia elica ogni 10,5 coppie di basi, il DNA sarà rilassato anziche superavvolto. Il superavvolgimento avviene quando il DNA è sottoposto a una sorta di deformazione strutturale. Tuttavia, quando sono purificati, i DNA circolari chiusi sono raramente rilassati, indipendentemente dalla loro origine biologica. Inoltre, il grado di superavvolgimento è generalmente ben definito e caratteristico di ogni DNA derivato da un determinato tipo cellulare. La struttura del DNA è quindi sottoposta in qualche modo a una tensione regolata dalla cellula, tale da indurre il superavvolgimenlo. In quasi tutti i casi la tensione è il risultato di un disavvolgimento del DNA circolare chiuso a doppia elica. In altre parole, il DNA presenta un numero di giri di elica minore di quanto ci si dovrebbe attendere se il DNA fosse nella struttura B. Un segmento di 84 coppie di basi di un DNA circolare rilassato conterrebbe otto giri di doppia elica, uno per ogni 10,5 coppie di basi. Se uno di questi giri è rimosso, ci saranno (84 bp)/7 = 12,0 coppie di basi per giro, invece delle 10,5 che si trovano nel DNA B. Questa è una deviazione dalla forma di DNA più stabile e, come risultato, la molecola è termodinamicamente più svantaggiata. Generalmenle la deformazione potrebbe essere riequilibrata tramite l'avvolgimento dell'asse del DNA su se stesso per formare un superavvolgimento (parte della tensione in questo segmento di DNA di 84 bp potrebbe essere dispersa nella struttura non avvolta di una molecola di DNA più grande). In linea di principio la deformazione potrebbe essere riequilibrata anche tramite la parziale separazione delle due catene di DNA per una lunghezza corrispondente a circa 10 coppie di basi. Nei segmenti di DNA circolare a doppia elica isolati, la deformazione provocata dal disavvolgimento è generalmente risolta dal superavvolgimento piuttosto che dalla separazione delle catene, in quanto l'avvolgimento dell'asse del DNA di solito richiede meno energia della rottura dei legami idrogeno che contengono unite le due catene. È comunque da notare che il disavvolgimento del DNA in vivo rende più facile separare le catene tra loro, il che consente facile accesso all'informazione contenuta al loro interno.

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Ogni cellula disavvolge attivamente il suo DNA con l'aiuto di processi enzimatici (descritti in seguito) e la deformazione del DNA rappresenta una forma di immagazzinamento di energia. Le cellule mantengono il DNA in uno stato parzialmente disavvolto per facilitarne il compattamento. Inoltre, il parziale disavvolgimento è molto importante per gli enzimi che intervengono nel metabolismo del DNA e che hanno tra le loro funzioni la separazione delle due catene della doppia elica. Lo stato parzialmente disavvolto può essere mantenuto solo se il DNA è in forma circolare chiusa o se è stabillzzato da interazioni con proteine, in modo tale che le catene non siano libere di ruotare su se stesse. Se si verifica un'interruzione in una delle due catene di un DNA circolare non legato a proteine, in quel punto la rotazione libera provocherà un ritorno spontaneo allo stato rilassato del DNA parzialmente disavvolto. In un DNA circolare chiuso, invece, il numero di giri di elica è fisso e non può essere modificato, a meno che una delle catene di DNA non sia interrotta anche in modo transitorio. Il numero dei giri di elica di una molecola di DNA è quantificabile e fornisce perciò una precisa descrizione del superavvolgimento. Il DNA disavvolto è definito topologicamente dal numero di legame: La branca della matematica chiamata topologia fornisce alcune idee utili a questa discussione in particolare sul concetto di numero di legame (linking number, Lk). Il numero di legame è una proprietà topologica in quanto non varia quando il DNA a doppia elica subisce qualunque tipo di torsione o deformazione, a condizione che entrambe le catene di DNA rimangano integre. Cominciamo analizzando la separazione delle due catene di un DNA circolare a doppia elica. Anche se tutti i legami idrogeno e le interazioni tra le basi adiacenti venissero a mancare, in modo tale che le catene non fossero più in contatto fisico, un legame topologico unirebbe ancora le due catene. Si può configurare una delle catene circolari come la delimitazione di una superficie immaginaria (più o meno come il sottile strato di acqua e sapone che si deposita sull'anello circolare prima di soffiare la bolla). Il numero di legame è definito come il numero di volte che la seconda catena penetra in questa superficie. Il numero di legame di un DNA circolare chiuso è sempre un numero intero. Convenzionalmente, per eliche avvolte in senso sinistrorso il numero di legame è negativo (-), mentre per eliche avvolte in senso destrorso è positivo (+). Ad ogni modo i numeri di legame negativi non si incontrano mai nel DNA cellulare. Possiamo ora estendere questi concetti a un DNA circolare chiuso con 2100 coppie di basi. Quando la molecola è in stato rilassato, il numero di legame è semplicemente il numero di coppie di basi diviso per il numero di coppie di basi per giro, che è vicino a 10,5; in questo caso, Lk = 200. Perché una molecola di DNA circolare abbia una proprietà topologica come il numero di legame, è necessario che nessuna delle due catene presenti delle interruzioni. Se una delle due catene è rotta, è possibile in linea di principio disavvolgere le eliche e separarle completamente. In questo caso non esiste più alcun legame topologico e il numero di legame Lk è indefinito. È possibile adesso descrivere il disavvolgimento parziale del DNA in termini di cambiamento del numero di legame. Il numero di legame del DNA rilassato, chiamato Lk 0, è usato come riferimento. Spesso è utile esprimere la variazione di numero di legame sotto forma di una grandezza indipendente dalla lunghezza della molecola di DNA. Questa quantità è chiamata differenza di legame specifica (σ) o densità di superelica, che è la misura del numero di giri eliminati rispetto al numero di quelli presenti nel DNA rilassato:

Il grado di disavvolgimento dei DNA cellulari è generalmente compreso tra il 5% e il 7%; ovvero, σ va da -0,05 a -0,07. Il segno negativo di σ indica che la variazione del numero di legame è il risultato di un parziale disavvolgimento del DNA. Il superavvolgimento causato dal parziale disavvolgimento è pertanto chiamato superavvolgimento negativo. AI contrario, in certe condizioni il DNA può essere avvolto più del normale e il risultante superavvolgimento è chiamato positivo. Si noti che il senso della rotazione dell'asse dell'elica del DNA quando il DNA è parzialmente disavvolto (superavvolgimento negativo) è l'immagine speculare di quello del DNA iperavvolto (superavvolgimento positivo). Il superavvolgimento non è un processo casuale; il senso del superavvolgimento è largamente determinato dalla tensione torsionale a cui sottoposto il DNA in seguito alla riduzione o all'aumento del numero di legame rispetto al DNA B. Il numero di legame può essere variato di ±1 interrompendo una delle due catene di DNA, ruotando una delle estremità di 3600 attorno alla catena intatta e riunendo le estremità interrotte. Questa modificazione on ha effetto sul numero di coppie di basi e sul numero di atomi della molecola di DNA circolare. Due forme di DNA circolare che differiscono solo per una proprietà topologica come il numero di legame sono chiamate topoisomeri.

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Il numero di legame può essere scomposto in due componenti strutturali chiamati avvolgimento (Wr) e torsione (Tw). Questi concetti sono più difficili da descrivere rispetto al numero di legame; l'avvolgimento può essere immaginato come la misura del numero di spire generate dall'asse dell'elica, mentre la torsione definisce un ripiegamento locale o la relazione spaziale tra basi adiacenti, Quando si verifica un cambiamento del numero di legame, parte della tensione risultante è solitamente compensata dall'avvolgimerto (superavvolgimento) e parte da modificazioni della torsione, dando luogo all'equazione Tw e Wr non sono necessariamente numeri interi. Torsione e avvolgimento sono proprietà geometriche e non topologiche, poiché possono essere modificate dalla deformazione di una molecola di DNA circolare chiuso. Oltre a produrre superavvolgimento e a rendere più facile la separazione delle catene, il parziale disavvolgimento del DNA facilita una serie di modificazioni strutturali della molecola. Queste variazioni strutturali sono di importanza fisiologica minore, ma aiutano a illustrare gli effetti del disavvolgimento. Un DNA cruciforme in genere contiene alcune basi spaiate; il parziale disavvolgimento del DNA contribuisce a mantenere la necessaria separazione delle catene. Il parziale disavvolgimento di un'elica destrorsa di DNA facilita la formazione di brevi regioni di DNA Z sinistrorso laddove la sequenza del DNA è in accordo con la formazione di questa organizzazione strutturale. Le topoisomerasi catalizzano le variazioni del numero di legame del DNA: Il superavvolgimento del DNA è un processo altamente regolato che influenza numerosi aspetti del metabolismo del DNA. In ogni cellula vi sono enzimi il cui unico compito è quello di disavvolgere e/o rilassare il DNA. Gli enzimi che determinano l'aumento o la diminuzione del grado di disavvolgimento del DNA sono chiamati topoisomerasi; la proprietà del DNA su cui agiscono è il numero il legame. Questi enzimi svolgono un ruolo importante specialmente in processi quali la replicazione e l'impacchetamento del DNA. Vi sono due classi di topoisomerasi: le topoisomerasi di tipo I agiscono rompendo transitoriamente una delle due catene del DNA, ruotando un'estremità attorno alla catena integra e riunendo le estremità interrotte; esse modificano il valore di Lk aumentandolo di una unità. Le topoisomerasi di tipo II rompono entrambe le catene del DNA e modificano Lk con incrementi pari a due unità. Gli effetti di questi enzimi possono essere identificati usando l'elettroforesi su gel di agarosio. Una popolazione di DNA plasmidici identici con lo stesso numero di legame migrerà come una banda discreta durante l’elettroforesi. Topoisomeri con valori di Lk che differiscono anche soltanto di 1 possono essere separati con questo metodo; si possono così analizzare variazioni nel numero di legame causate dalle topoisomerasi. Vi sono almeno quattro diverse topoisomerasi in E. coli, con assegnate da numeri romani (da I a IV). Le forme appartenenti al tipo I (topoisomerasi l e III) generalmente rilassano il DNA rimuovendo i superavvolgimenti negativi (esse aumentano il valore di Lk). Un enzima batterico di tipo II, chiamato topoisomerasi II o DNA girasi, è in grado di indurre superavvolgimenti negativi (diminuzione di Lk). Per portare a termine il suo compito tale enzima utilizza l'energia dell'ATP. Per alterare il numero di legame, le topoisomerasi di tipo II tagliano entrambe le catene della molecola di DNA e consentono il passaggio di un altro duplex attraverso la rottura. Il grado di superavvolgimento del DNA batterico è mantenuto dalla regolazione dell'attività netta delle topoisomerasi I e II. Anche le cellule eucariotiche possiedono topoisomerasi di tipo I e II. Gli enzimi tipo I sono topoisomerasi I e III; l'unico enzima tipo II è presente nei vertebrati in due isoforme dette IIα e ΙΙβ. Gli enzimi di tipo II, tra cui la DNA girasi degli archea, sono per la maggior parte correlati e definiscono una famiglia chiamata IIA. Gli archea hanno anche un enzima particolare, la topoisomerasi VI, che da sola definisce la famiglia IIB. Le topoisomerasi eucariotiche di tipo II non possono disavvolgere parzialmente il DNA (introducendo superavvolgimenti negativi), ma possono rilassare superavvolgimenti sia negativi, sia positivi. Le topoisomerasi svolgono un ruolo importante in ogni aspetto del metabolismo del DNA. Di conseguenza, esse sono importasti bersagli per il trattamento di infezioni batteriche e del cancro. La compattezza del DNA richiede una speciale forma di superavvolgimento: Le molecole di DNA superavvolto sono uniformi sotto molti punti di vista. I superavvolgimenti sono destrorsi in una molecola di DNA con superavvolgimento negativo; il DNA superavvolto tende anche ad essere lungo e stretto piuttosto che compatto, e spesso possiede ramificazioni multiple. Con le densità di superelica normalmente riscontrabili nelle cellule, la Iunghezza dell'asse del superavvolgimento, comprese le ramificazioni, è circa il 40% della lunghezza del DNA stesso. Questo tipo di superavvolgimento è definito superavvolgimento plectonemico (dal greco pléktos, "ritorto", e néma, "filo"). Questo termine può essere applicato a qualsiasi struttura nella quale le catene siano arrotolate in maniera semplice e regolare, e si adatta bene alla struttura generale del DNA superavvolto in soluzione.

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Anche se il superavvolgimento plectonemico è la forma che si osserva nei DNA isolati in laboratorio, esso non fornisce la compattezza necessaria per l'impacchettamento del DNA nella cellula. Una seconda forma di superavvolgimento, chiamata superavvolgimento a solenoide, può essere assunta da un DNA parzialmente disavvolto. Invece degli ampi superavvolgimenti destrorsi caratteristici della forma plectonemica, il superavvolgimento a solenoide è costituito da rotazioni sinistrorse più strette ed è simile alla struttura assunta da un tubo per innaffiare ben avvolto attorno a un rocchetto. Sebbene le loro strutture siano significativamente differenti, i superavvolgimenti plectonemico e a solenoide rappresentano due forme di superavvolgimento negativo che possono essere assunte dallo stesso segmento di DNA parzialmente disavvolto. Le due forme sono rapidamente interconvertibili. Benché la forma plectonemica sia la più stabile in soluzione, la forma a solenoide può essere stabilizzata dal legame con proteine ed è la forma presente nella cromatina. Essa fornisce un grado molto superiore di compattezza e permette di spiegare come il parziale disavvolgimento contribuisca alla compattezza del DNA. Struttura dei cromosomi: Il termine "cromosoma" indica una molecola di acido nucleico depositaria dell'informazione genetica di un virus, di un batterio, di una cellula eucariotica o di un organello. Questa parola viene usata anche in un altro senso, cioè per indicare le inclusioni densamente colorate all'interno dei nuclei eucariotici che possono essere visualizzate al microscopio ottico dopo che le cellule sono state sottoposte a colorazione. La cromatina è costituita da DNA e proteine: Il ciclo cellulare eucariotico produce notevoli cambiamenti nella struttura dei cromosomi. Nelle cellule eucariotiche non in divisione (in G0) e in quelle in interfase (G1, S e G2) il materiale cromosomico, chiamato cromatina, è amorfo e appare uniformemente disperso all'interno del nucleo. Durante la fase S o I'interfase, il DNA nello stato amorfo viene replicato e ogni cromosoma produce due cromosomi fratelli (chiamati cromatidi fratelli), che rimangono associati l'uno all'altro fino a che la replicazione non è stata completata. I cromosomi diventano molto più condensati durante la profase della mitosi, separandosi in un numero specie-specifico di coppie ben definite di cromatidi fratelli. La cromatina è costituita da fibre che contengono proteine e DNA in quantità approssimativamente uguali, più una piccola parte di RNA. Il DNA della cromatina interagisce molto strettamente con proteine chiamate istoni, che condensano e ordinano il DNA in unità strutturali dette nucleosomi. Nella cromatina si trovano anche molte proteine non istoniche, alcune delle quali regolano l'espressione di specifici geni. Già nei nucleosomi il DNA cromosomico degli eucarioti è disposto in una successione di strutture di ordine superiore che portano il cromosoma addensato ad essere visibile al microscopio ottico. Ora ci occuperemo della descrizione di questa struttura negli eucarioti e la confronteremo con l'organizzazione del DNA nelle cellule batteriche. Gli istoni sono piccole proteine basiche: Gli istoni sono proteine con masse molecolari comprese tra 11000 e 21000 presenti nella cromatina di tutte le cellule eucariotiche. Questi polipeptidi sono molto ricchi degli amminoacidi basici arginina e Iisina (nell'insieme, rappresentano circa un quarto dei residui amminoacidici). In tutte le cellule eucariotiche sono presenti le cinque classi principali di istoni, con massa molecolare e composizione amminoacidica diversa. Gli istoni H3 e H4 hanno una sequenza di amminoacidi pressoché identica in tutti gli eucarioti, il che suggerisce un'elevata conservazione delle loro funzioni. Gli istoni H1, H2A e H2B presentano un grado minore di omologia di sequenza tra le diverse specie eucariotiche. Ciascun istone può avere diverse forme poiché certe catene laterali amminoacidi che sono modificate enzimaticamente da metilazione, acetilazione, ADP-ribosilazione, fosforilazione, glicosilazione, sumoilazione o ubiquitinazione. Queste modificazioni cambiano la carica elettrica netta, la forma e altre proprietà delle molecole di istone e di conseguenza la strutturae le proprietà funzionali della cromatina, giocando un ruolo rilevante nella regolazione della trascrizione. Inoltre, gli eucarioti in genere hanno diverse varianti di istoni: le più importanti sono gli istoni H2A e H3. Queste forme di istoni svolgono ruoli particolari nel metabolismo del DNA.

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I nucleosomi sono le unità organizzative fondamentali della cromatina: Il cromosoma eucariotico rappresenta la forma compatta di una molecola di DNA lunga circa 10 5 μm che si trova all'interno di un nucleo cellulare il cui diametro è compreso tra 5 e 10 μm. Questa compattazione richiede diversi livelli di ripiegamento altamente organizzato. Sottoponendo i cromosomi a trattamenti che li srotolano parzialmente, si evidenzia una struttura in cui il DNA è legato strettamente a granuli di proteine che spesso presentano una spaziatura regolare. I granuli disposti "a collana" sono complessi di istoni e DNA. Il granulo e il tratto di DNA di connessione con il granulo vicino formano il nucleosoma, l'unità fondamentale dell'organizzazione su cui si basa la complessità strutturale di ordine superiore della cromatina. Il granulo di ogni nucleosoma contiene otto molecole di istone: due copie ciascuno degli istoni H2A, H2B, H3 e H4. I nucleosomi costituiscono un'unità ripetitiva formata da circa 200 coppie di basi, di cui 146 sono legate strettamente al nucleo istonico e le rimanenti servono da DNA di collegamento tra i granuli dei nucleosomi. L'istone H1 è legato al DNA di collegamento. Quando la cromatina viene trattata per breve tempo con enzimi che digeriscono il DNA, viene degradato di preferenza il DNA di collegamento, liberando in tal modo particelle istoniche che contengono 146 coppie di basi che sono state protette dalla digestione. I nucleosomi isolati ottenuti in questo modo sono stati cristallizzati e studiati per mezzo della diffrazione dei raggi X. Si è così stabilito che una particella, composta da otto molecole di istone, è circondata da DNA nella conformazione a superelica a solenoide sinistrorsa. Un attento esame di questa struttura può spiegare perché il DNA eucariotico sia parzialmente disavvolto nonostante le cellule eucariotiche non possiedano enzimi che disavvolgono il DNA. Si rammenti che il ripiegamento a solenoide osservato nei nucleosomi è una conformazione assunta dal DNA parzialmente disavvolto (superavvolto negativamente). Lo stretto avvolgimento del DNA attorno agli istoni nelle particelle nucleosomiche richiede la rimozione di circa un giro d'elica dal DNA. Quando il nucleo proteico di un nucleosoma si lega in vitro a un DNA circolare chiuso in forma rilassata, il legame induce un superavvolgimento negativo. Poiché questo processo di legame non rompe il DNA né modifica il numero di legame, la formazione di una superelica a solenoide negativa deve essere accompagnata dalla formazione compensativa di una superelica positiva non legata a un nucleosoma in un altro punto del DNA. Le topoisomerasi eucariotiche,come si è detto, possono determinare il rilassamento di supereliche positive. II rilassamento della superelica positiva non legata lascia intatta la superelica negativa (grazie al legame con il centro istonico del nucleosoma) e determina una riduzione netta del numero di legame. Le topoisomerasi, si sono dimostrate capaci di indurre l'organizzazione della cromatina in vitra, a partire da istoni purificati e DNA circolare chiuso. Un altro fattore importante che controlla il legame del DNA al centro istonico dei nucleosomi è la sequenza stessa del DNA che si lega. Il nucleo istonico non si lega casualmente al DNA, ma i nucleosomi tendono a localizzarsi in determinate posizioni. Il motivo di questa localizzazione non è del tutto chiaro, ma parte della spiegazione sembra risiedere nel fatto che i nucleosomi si formano dove vi sono abbondanti appaiamenti A=T nella parte di DNA in contatto con gli istoni. Lo stretto avvolgimento del DNA intorno ai nucleosomi richiede una compressione della scanalatura minore dell'elica in questi punti, e un gruppo di due o tre coppie di basi A=T facilita tale compressione. I nucleosomi si legano particolarmente bene a livello di sequenze dove dinucleotidi del tipo AA, AT o TT sono separati da intervalli di 10 bp. Queste sequenze si riscontrano nel 50% delle sequenze del DNA legato ai nucleosomi. Per il posizionamento dei nucleosomi sul DNA è richiesto l'intervento di altre proteine. In molti organismi alcune proteine si legano a sequenze specifiche del DNA, facilitando la formazione di un nucleosoma in quella regione. I nucleosomi si formano sul DNA durante la replicazione, o a seguito di processi che richiedono un temporaneo spostamento dei nucleosomi stessi. La formazione di queste strutture sembra avvenire per gradi. Dapprima si lega al DNA un tetramero formato da due istoni H3 e due H4, seguito dal legame di dimeri H2A e H2B. L'incorporaztone dei nucleosomi nella struttura cromosomica dopo la replicazione dei cromosomi è mediata da un complesso proteico detto RCAF (replication-coupling assembly factor, fattore di assemblaggio accoppiato alla replicazione). L'RCAF include gli istoni acetilati H3 e H4, una proteina formata da tre subunità detta fattore 1 di assemblaggio della cromatina (CAF1), e una proteina detta fattore 1 antisilenziante (ASF1). Il meccanismo dell'assemblaggio dei nucleosomi non è noto fin nei dettagli, anche se si sa che parti del complesso RCAF interagiscono direttamente con il meccanismo di replicazione. Quando occorre assemblare i nucleosorni dopo la riparazione del DNA o dopo altri processi, l'RCAF viene sostituito da altre proteine specializzate. Fattori di scambio degli istoni permettono la sostituzione di varianti istoniche con gli istoni già presenti nel nucleo centrale. La sostituzione corretta delle varianti istoniche è importante; infatti è stato dimostrato che topi che mancano di tali varianti istoniche muoiono durante lo sviluppo embrionale. il preciso posizionamento degli istoni nel nucleo centrale ha un ruolo anche nell'espressione di alcuni geni eucariotici.

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I nucleosomi sono compattati in strutture di ordine via via superiore: L’avvolgimento intorno al nucleo dei nucleosomi rende il DNA circa sette volte più compatto. Però la compattazione del DNA nei cromosomi supera le 10000 volte: e ciò di per sé fornisce la prova dell'esistenza di organisazioni strutturali di livello nettamente superiore. Nei cromosomi isolati con metodiche molto delicate, gli stessi nucleosomi appaiono ulteriormente organizzati in modo da formare ciò che si può per semplicità definire una fibra di 30 nm. Il compattamento richiede la presenza di una molecola di istone H1 per nucleosoma. L'organizzazione in fibre di 30nm non si estende per l'intera lungheza del cromosoma, ma è inframmezzata da regioni che interagicono con proteine (proteine non istoniche) che si legano al DNA in modo sequenza-specifico. La struttura di 30nm osservata sembra dipendere anche dall'attività trascrizionale della particolare regione del DNA. Le zone contenenti geni in cui si sta verificando un processo di trascrizione si presentano apparentemente in uno stato meno ordinato che contiene una trascurabile quantità di istone H1. Le fibre di 30 nm, un secondo livello di organizzazione della cromatina, forniscono al DNA una compateza di circa 100 volte. Il livello superiore di ripiegamento non è ancora stato chiarito, ma sembra che alcune regioni deI DNA si associno con un'impalcatura nucleare. Le regioni associate a tale impalcatura sono separate da anse di DNA contenenti probabilmente da 20000 a 100000 coppie di basi. Il DNA di queste anse può contenere un gruppo di geni correlati tra loro. Per esempio, in Drosophila, una famiglia completa di geni che codificano istoni si presenta raggruppata in anse che sono fissate da siti di attacco all'impalcatura. La stessa impalcatura contiene verosimilmente diverse proteine, in particolare grandi quantità di istone H1 (localizzato all'interno della fibra) e topoisomerasi II. La presenza della topoisomerasi II sottolinea ulteriormente l'importarza del rapporto tra il disavvolgimento del DNA e l'assemblaggio della cromatina. La topoisomerasi II è talmente importate nel processo di assemblaggio della cromatina che inibitori specifici di questo enzima possono rapidamente uccidere le cellule in divisione. Molti farmaci utilizzati nella chemioterapia del cancro sono inibitori della topoisomerasi II e consentono all'enzima di produrre la rottura della catena ma non di riparare l'interruzione. Esistono evidenze sperimentali a favore dell'esistenza di ulteriori livelli di organizzazione nei cromosomi eucariotici, ognuno dei quali determina un forte aumento del grado di compattezza. Un modello che esemplifica questo concetto è illustrato nella Figura 24.33. Ulteriori livelli di compattezza nella struttura della cromatina variano probabilmente da cromosoma a cromosoma, da una regione all'altra in un singolo cromosoma e da un istante all'altro nella vita della cellula. Nessun modello è in grado di descrivere adeguatamente questa struttura. Ciò nonostante, il principio è elementare: la compattezza del DNA del cromosoma eucariotico è verosimilmente dovuta ad avvolgimenti successivi che si sovrappongono ad avvolgimenti già presenti. Le strutture condensate dei cromosomi sono mantenute dalle proteine SMC: La terza classe di proteine cromatiniche, oltre agli istoni e alle topoisomerasi, è quella delle proteine SMC (structural maintenance of chromosomes, mantenimento strutturale dei cromosomi). La struttura primaria delle proteine SMC è costituita da cinque domini distinti. I domini globulari ammino- e carbossiterminali, N e C, ciascuno dei quali possiede parte di un sito idrolitico per l'ATP, sono connessi mediante due regioni avvolte ad α elica ulteriormente avvolte l'una sull'altra unite da un dominio a cerniera. Le proteine sono normalmente dimeriche e creano un complesso a forma di V che si genera dall'interazione tra i due domini a cerniera. Un dominio N e uno C si riuniscono per formare un sito idrolitico completo per l'ATP ad ogni estremità della V. Le proteine della famiglia SMC si trovano in tutti i tipi di organismi, dai batteri all'uomo. I due tipi principali negli eucanoti sono le coesine e le condensine; entrambe sono legate a proteine regolatrici ed accessorie. Le coesine giocano un ruolo essenziale nel legare i cromatidi fratelli immediatamente dopo la replicazione e li tengono uniti quando i cromosomi condensano nella metafase. Questo legame è essenziale per segregare opportunamente i cromosomi durante la divisione cellulare. Le coesine, insieme ad una terza proteina, la cleisina, possono formare un anello interno ai cromosomi replicati che li tiene uniti fino a che la divisione cellulare non richiede la loro separazione. L'anello può espandersi e contrarsi in risposta all'idrolisi di ATP. Le condensine sono essenziali per la condensazione dei cromosomi quando le cellule entrano in mitosi, In laboratorio, le condensine si legano al DNA creando superavvolgimenti positivi; la condensina quindi provoca un superavvolgimento del DNA contrario al disavvolgimento indotto dal legame dei nucleosomi. Non è ancora chiaro come ciò aiuti il compattamento della cromatina. L'addensamento del DNA operato dalla condensina può contribuire alla sua condensazione. Le coesine e le condensine sono fondamentali per quelle modificazioni nella struttura del cromosoma che accompagnano il ciclo cellulare degli eucarioti. Anche il DNA batterico è altamente organizzato: Ora ci occuperemo brevemente della struttura dei cromosomi batterici. Il DNA batterico è compattato in una struttura chiamata nucleoide, che occupa un'ampia frazione del volume

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della cellula batterica. Il DNA della cellula batterica appare come attaccato ad uno o più punti sulla superficie interna della membrana plasmatica. La struttura del nucleoide è molto meno nota di quella della cromatina eucariotica, ma anche in questo caso si sta evidenziando una struttura complessa. Nell'E. coli sembra esservi una struttura simile ad una impalcatura, che organizza il cromosoma circolare in una serie di circa 500 domini ad ansa, ciascuna formata in media da circa 10000 bp, come descritto in precedenza per la cromatina. I domini sono sottoposti ad una tensione topologica. Per esempio, se il DNA viene scisso a livello di un dominio, solo il DNA di quel dominio verrà rilassato. I domini non hanno una posizione fissa, ma sono in costante movimento lungo il DNA, in coordinazione con la replicazione del DNA. Il DNA batterico non sembra possedere alcuna struttura con un'organizzazione comparabile a quella dei nucleosomi degli eucarioti. Proteine simili agli istoni sono presenti in abbondanza in E. coli; quella meglio studiata è una proteina con due subunità chiamata HU (Mr 19000). Queste proteine si legano e si dissociano in un arco di tempo di minuti e non è stata mai evidenziata alcuna struttura stabile e regolare. Il cromosoma batterico è una struttura relativamente dinamica che riflette probabilmente la necessità di un accesso più rapido all'informazione genetica in esso contenuta. Il ciclo di divisione della cellula batterica può essere lungo soltanto 15 minuti, mentre una tipica cellula eucariotica può anche non dividersi per ore, o anche per mesi. Inoltre, una frazione molto più grande del DNA procariotico è usata per codificare RNA e/o prodotti proteici. Gli elevati livelli di metabolismo della cellula battetica stanno a significare che una frazione molto maggiore del DNA viene trascritta o replicata in un dato momento rispetto a quanto accade nella maggior parte delle cellule eucariotiche.

Introni ed esoni I segmenti di DNA non tradotto presenti nei geni sono chiamati sequenze intercalate o introni, mentre i segmenti tradotti sono chiamati esoni. Solo pochi geni di procarioti contengono introni. Negli eucanoti in posizione più elevata nella scala evolutiva un gene tipico possìede molte più sequenze introniche che sequenze esoniche. Per esempio, nel gene che codifica la catena polipeptidica della proteina ovoalbumina presente nell'uovo degli uccelli gli introni sono molto più lunghì degli esoni; la somma delle sette sequenze introniche copre l’85% del DNA di questo gene. Nel gene che codifica la subunità β dell'emoglobina, una singola sequenza intronica copre più della metà del DNA del gene. Il gene della proteina muscolare titina contiene più di tutti: ne possiede ben 178. I geni per gli istoni sembra non possiedano introni. In molti casi la funzione degli introni non è chiara. In totale soltanto l’1,5% del DNA umano codifica prodotti proteici o RNA o DNA esonico. Tuttavia, se nel conteggio sono inclusi gli introni più grandi, i geni diventano il 30% del genoma umano. Dato il numero relativamente basso dei geni nel genoma umano, la funzione di un gran parte del DNA resta inspiegata. La maggior parte del DNA non genico è nella forma di tipi diversi di sequenze ripetute. Forse è ancora più sorprendente che il genoma umano sia costituito per circa la metà da sequenze moderatamente ripetitive derivate da elementi trasponibili, segmenti di DNA che vanno da poche centinaia a molte migliaia di coppie di basi di lunghezza, che possono muoversi da un punto ad un altro del genoma. Gli elementi trasponibili (trasposoni) sono una forma di parassiti molecolari, capaci di installarsi con successo all'interno del genoma ospite. Molti possiedono geni che codificano proteine che catalizzano il processo di trasposizione. Alcuni trasposoni nel genoma umano sono attivi, muovendosi a bassa frequenza, ma per la maggior parte sono stati resi inattivi da mutazioni avvenute durante il corso dell'evoluzione. Nonostante questi elementi generalmente non codifichino proteine o RNA utilizzabili nelle cellule umane, essi hanno avuto un ruolo importante nell'evoluzione umana: il movimento dei trasposoni può portare alla ridistribuzione di altre sequenze genomiche. Un altro 3% o quasi del genoma umano è costituito da sequenze altamente ripetitive, definite anche DNA a sequenza semplice o semplici sequenze ripetute (SSR). queste corte sequenze, generalmente formate da meno di 10 coppie di basi, sono talvolta ripetute milioni di volte in ogni cellula. Il DNA a sequenza semplice viene anche chiamato DNA satellite, in quanto la sua inusuale composizione di basi ne provoca la migrazione come bande "satellite" (separate dal resto del DNA) quando campioni frammentati di DNA cellulare vengono sottoposti a centrifugazione in gradiente di densità con cloruro di cesio. Recenti studi suggeriscono che il DNA a sequenza semplice no codifichi proteine o RNA. A differenza degli elementi trasponibili, il DNA altamente ripetitivo può avere un'importanza funzionale identificabile nel metabolismo cellulare umano, poiché gran parte di esso è associato a due strutture caratteristiche dei cromosomi eucariotici: i centromeri i telomeri.

Replicazione (DNA polimerasi, ligasi e telomerasi)

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Molto prima che fosse nota la struttura del DNA, gli scienziati hanno avanzato numerose ipotesi sulla capacità degli organismi di riprodursi e, in tempi più recenti, sulla capacità delle cellule di sintetizzare numerose copie identiche di macromolecole complesse e di grandi dimensioni. Le discussioni vertevano soprattutto sul concetto di stampo, una struttura che doveva permettere alle molecole di allinearsi in un ordine specifico, e di unirsi tra loro per creare una macromolecola con un'unica sequenza e un'unica funzione. Risale agli anni '40 la scoperta che il DNA è la molecola in cui è immagazzinata l'informazione genetica, ma solo dopo che James Watson e Francis Crick ne determinarono la struttura apparve chiaro il modo con cui il DNA agisce come stampo per la replicazione e la trasmissione dell'informazione genetica: ognuna delle due eliche è complementare all'altra. Le rigorose regole che governano l'appaiamento delle basi rendono comprensibile il fatto che l'utilizzo di una catena come stampo determinerà la formazione di un'altra catena con una sequenza complementare prevedibile. Le proprietà fondamentali della replicazione del DNA e i meccanismi utilizzati dagli enzimi che la catalizzano si sono dimostrati essenzialmente identici in tutti gli organismi. Questa identità di funzionamento sarà un tema ricorrente durante la nostra trattazione, che passerà dalle proprietà generali del processo di replicazione agli enzimi replicativi in E. coli e, infine, alla replicazione negli eucarioti. La replicazione del DNA è governata da un insieme di regole fondamentali: Le prime ricerche sulla replicazione del DNA batterico e sugli enzimi coinvolti hanno permesso di stabilire molte delle proprietà di base applicabili alla sintesi del DNA in tutti gli organismi. La replicazione del DNA è semiconservativa Poiché ciascuna delle catene del DNA serve da stampo per la sintesi di una nuova catena, verranno generate due nuove molecole di DNA, ciascuna con una catena neosintetizzata e una parentale. Questo processo è chiamalo replicazione semiconservativa. L'ipotesi della replicazione semiconservativa fu proposta da Watson e Crick subito dopo la pubblicazione del loro lavoro sulla struttura del DNA nel 1953, e la teoria fu in seguito dimostrata da ingegnosi esperimenti progettati da Matthew Meselson e Franklin Stahl nel 1957. Meselson e Stahl coltivarono cellule di E. coli per molte generazioni in un terreno in cui l'unica fonte di azoto (NH 4Cl) conteneva 15N, l'isotopo "pesante" dell'azoto, invece del normale e più frequente isotopo "leggero" 14N. Il DNA isolato da queste cellule aveva una densità maggiore di circa l’1% rispetto al normale [14N]DNA. Sebbene questa sia una differenza molto piccola, una miscela di [ 15N]DNA pesante e di [14N]DNA leggero può essere separata per mezzo della centrifugazione all'equilibrio in un gradiente di densità di cloruro di cesio. Le cellule di E. coli cresciute nel terreno contenente 15N furono trasferite in un nuovo terreno contenente soltanto l'isotopo 14N, in cui furono lasciate crescere fino a raddoppiare il numero delle cellule. Il DNA isolato da questa prima generazione di cellule formava una singola banda nel gradiente di CsCl, indicando che le molecole di DNA a doppia elica delle cellule figlie erano ibridi contenenti una catena 14N nuova e una catena 15N parentale. Questo risultato deponeva contro la replicazione conservativa, un'ipotesi alternativa in cui una molecola di DNA figlia sarebbe formata da due catene neosintetizzate e l'altra conterrebbe le due catene parentali; in questo caso non ci sarebbero state molecole ibride nell'esperimento di Meselson-Stahl. L'ipotesi della replicazione semiconservativa fu ulteriormente rafforzata nella seconda parte dell'esperimento. Le cellule vennero fatte dividere nuovamente in un terreno contenente 14N. Il DNA prodotto durante questo secondo ciclo di replicazione risultò suddiviso mediante un gradiente di densità in due bande, una di densità uguale al DNA leggero e l'altra con la stessa densità del DNA ibrido presente dopo il primo ciclo di divisione cellulare. La replicazione inizia in un sito d'origine e procede in entrambe le direzioni In seguito alla conferma del meccanismo semiconservativo sorsero alcune domande. Le catene di DNA parentale si disavvolgono completamente prima che ciascuna si replichi? La replicazione inizia in un punto qualunque o in un sito ben preciso? Dopo l'inizio in un punto sul DNA, la replicazione procede in una o in entrambe le direzioni? Una prima indicazione che la replicazione è un processo rigidamente coordinato, in cui le catene parentali vengono disavvolte e replicate simultaneamente, venne dagli studi di John Cairns, che utilizzò la tecnica dell'autoradiografia. Egli rese radioattivo il DNA delle cellule di E. coli facendole crescere in un terreno contenente timidina marcata con trizio (3H). Quando il DNA veniva isolato, disperso ed esposto ad una lastra fotografica per alcune settimane, i residui di timidina radioattiva generavano dei "tracciati" di granuli d'argento, riproducendo l'immagine della molecola di DNA. Questi tracciati rivelarono che il cromosoma intatto di E. coli è un unico grande cerchio lungo 1,7 mm. il DNA radioattivo isolato dalle cellule durante la replicazione presentava un'ansa radioattiva in più. Cairns concluse che l'ansa di DNA risultava dalla formazione di due catene figlie radioattive, ciascuna complementare a una delle catene parentali. Una o entrambe le estremità dell'ansa sono punti dinamici, denominati forcelle di replicazione, dove il DNA parentale viene disavvolto e le catene separate vengono rapidamente replicate. L'esperimento di Cairns ha dimostrato che entrambe le catene del DNA vengono replicate simultaneamente, e una variante dello stesso esperimento ha

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indicato che la replicazione dei cromosomi batterici è bidirezionale: entrambe le estremità delle anse hanno forcelle di replicazione. Per determinare se le anse originavano da un punto preciso del DNA erano necessari punti di riferimento nella molecola del DNA. Tali punti di riferimento furono individuati grazie a una tecnica chiamata mappatura della denaturazione, sviluppata da Ross Inman e collaboratori. Usando il cromosoma del batteriofago λ, lungo 48 502 coppie di basi, Inman dimostrò che il DNA poteva essere selettivamente denaturato in corrispondenza di sequenze insolitamente ricche di appaiamenti di basi A=T, generando una serie riproducibile di regioni a singola catena che assomigliano a bolle. Quando DNA isolati, contenenti anse di replicazione, vengono parzialmente denaturati in questo modo, la posizione e l'avanzamento delle forcelle di replicazione possono essere misurati e mappati usando le regioni denaturate come punti di riferimento. Questa tecnica ha rivelato che le anse di replicazione iniziano sempre in un punto preciso, chiamato origine. Inoltre, questo studio ha sottolineato la validità dell'osservazione precedente relativa al fatto che la replicazione è generalmente bidirezionale. Nel caso di un DNA circolare, le due forcelle di replicazione si muovono in verssi opposti e al termine del processo di rincontrano. Poiché le due eliche di DNA sono antiparallele, l'elica usata come stampo viene letta dall'estremità 3' verso l'estremità 5'. Se la sintesi procede sempre in direzione 5'3', come è possibile che le due catene vengano sintetizzate simultaneamente? Se entrambe le catene venissero sintetizzate senza interruzioni nella direzione in cui si muove la forcella di replicazione, si dovrebbe verificare anche una sintesi in senso 3' 5'. Questo problema fu risolto da Reiji Okazaki e collaboratori negli anni '60. Okazaki scoprì che una delle due nuove catene di DNA viene sintetizzata sotto forma di brevi frammenti, chiamati ora frammenti di Okazaki. La conclusione finale di questo lavoro fu che una catena viene sintetizzata in modo continuo e l'altra in modo discontinuo. La catena con crescita continua, catena veloce o leader (detta anche filamento veloce o leader, leading strand) è quella in cui la sintesi nella direzione 5'3' segue il movimento della forcella di replicazione. La catena discontinua, catena lenta o ritardata (detta anche filamento lento o ritardato, lagging strand) è quella in cui la sintesi in senso 5'3' procede in direzione opposta all'avanzamento della forcella di replicazione. l frammenti di Okazaki hanno una lunghezza variabile da alcune centinaia ad alcun migliaia di nucleotidi, a seconda del tipo di cellula. Come vedremo, le sintesi della catena veloce e di quella lenta sono strettamente coordinate. Il DNA è degradato dalle nucleasi: Per spiegare l'enzimologia della replicazione del DNA, analizzeremo prima gli enzimi che lo degradano e poi quelli che lo sintetizzano. Gli enzimi che degradano esclusivamente il DNA sono chiamati nucleasi o DNasi. Ogni cellula contiene diversi tipi di nucleasi, che si possono dividere in due classi: esonucleasi ed endonucleasi. Le esonucleasi degradano il DNA a partire da un'estremìtà della molecola. Alcune possono operare solo in direzione 5' 3', altre in direzione 3'5', rimuovendo rispettivamente i nucleotidi a partire dall'estremità 5' o dall'estremità 3' di una catena di un acido nucleico a doppia elica o di un DNA a catena singola. Le endonucleasi agiscono sulla porzione interna degli acidi nucleici, degradandoli in frammenti sempre più piccoli. Solo poche esonucleasi ed endonucleasi degradano soltanto DNA a catena singola. Esistono anche alcune importanti classi di endonucleasi che effettuano tagli solo in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche (ad esempio le endonucleasi di restrizione, che sono così importanti nelle biotecnologie). Il DNA viene sintetizzato dalle DNA polimerasi: La ricerca di un enzima che fosse in grado di sintetizzare il DNA fu intrapresa da Arthur Komberg e collaboratori intorno al 1955. Questo lavoro culminò con la purificazione e la caratterizzazione della DNA polimerasi di E. coli, un enzima costituito da una singola catena polipeptidica, ora chiamato DNA polimerasi I (Mr 103000), e codificato dal gene polA. In seguito si scoprì che E. coli contiene almeno altre quattro distinte DNA polimerasi, che verranno descritte più avanti. Studi accurati sulla DNA polimerasi I hanno rivelato le caratteristiche del processo di sintesi del DNA che si sono dimostrate comuni a tutte le DNA polimerasi. La reazione fondamentale è il trasferimento di un gruppo fosforico. Il nucleofilo è il gruppo ossidrilico 3' del nucleotide presente all'estremità 3' della catena in fase di crescita. L'attacco nucleofilico avviene sul gruppo fosforico α del deossinucleoside 5' -trifosfato entrante. Nella reazione si libera pirofosfato inorganico. L'equazione generale della reazione è

dove dNMP e dNTP sono rispettivamente il deossinucleoside 5' -monofosfato e 5' -trifosfato. La reazione sembra procedere con soltanto una piccola variazione di energia libera, dato che la formazione di un legame fosfodiestere avviene a spese di un legame fosfoanidride un po' meno stabile. Comunque, le interazioni non covalenti che si instaurano nell'impilamento e nell'appaiamento delle basi aiutano a stabiIizzare maggiormente la catena di DNA che si

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allunga rispetto ai nucleotidi liberi. Inoltre, la formazione dei prodotti è ulteriormente facilitata nella cellula dai 19kJ/mole generati nella successiva idrolisi del pirofosfato per mezzo dell'enzima pirofosfatasi. Gli studi iniziali sulla DNA polimerasi l portarono ben presto alla definizione di due condizioni essenziali per la polimerizzazione del DNA. Innanzitutto, tutte le DNA polimerasi necessitano di uno stampo. La reazione di polimerizzazione viene guidata da una catena stampo di DNA, secondo le regole dell'appaiamento di basi del modello di Watson e Crick: in corrispondenza di una guanina presente nello stampo viene aggiunta una citosina nella nuova catena, e così via. Questa scoperta fu particolarmente importante, non solo perché forniva una base biochimica alla teoria della replicazione semiconservativa del DNA, ma perché rappresentava il primo esempio di utilizzo di uno stampo per dirigere una reazione biosintetica. In secondo luogo è necessaria una molecola d'innesco o primer. Un primer è un segmento di catena, complementare alla catena stampo, con un gruppo ossidrilico 3' libero a cui poter legare i nucleotidi. L’estremità 3' del primer viene chiamata termine del primer. In altre parole, parte della nuova catena deve essere già al suo posto; la polimerasi può soltanto aggiungere nucleotidi a una catena preesistente. I primer sono spesso oligonucleotidi composti da RNA piuttosto che da DNA, sintetizzati da enzimi particolari. Dopo l'aggiunta di un nucleotide alla catena di DNA nascente, la DNA polimerasi deve dissociarsi o muoversi lungo lo stampo e aggiungere un altro nucleotide. L'associazione e la dissociazione della polimerasi possono limitare la velocità complessiva della reazione: la velocità è maggiore se la polimerasi aggiunge nucleotidi uno dopo l'altro senza dissociarsi dallo stampo. Il numero medio di nucleotidi aggiunti prima che la polimerasi si dissoci determina la sua processività. Le DNA polimerasi sono caratterizzate da processività molto variabili: alcune aggiungono soltanto pochi nucleotidi, altre ne aggiungono varie migliaia prima di dissociarsi. Il processo di replicazione è molto accurato: La replicazione deve procedere con un grado elevato di precisione. In E. coli viene commesso un errore ogni 10 9-1010 nucleotidi aggiunti. Nel caso del cromosoma di E. coli, lungo circa 4,6 x 105 coppie di basi, ciò signifIca che viene commesso un errore soltanto una volta ogni 1000-10 000 replicazioni. Durante la polimerizzazione, la distinzione tra nucleotidi corretti e sbagliati avviene non solo in base ai legami idrogeno che dererminano un corretto appaiamento tra basi complementari: ma anche alla geometria delle coppie di basi A=T e G≡C. La DNA polimerasi I ha un sito attivo nel quale entrano solo coppie di basi con questa geometria. Un nucleotide sbagliato potrebbe essere in grado di formare legami idrogeno con un'altra base nello stampo, ma in realtà non può entrare nel sito attivo della DNA polimerasi, e quindi i nucleotidi sbagliati vengono scartati prima ancora che si formi il legame fosfodiestere. Tuttavia, la precisione della reazione di polimerizzazione di per sé non è sufficiente a spiegare l'alto grado di fedeltà della replicazione. Accurate misurazioni effettuate in vitro hanno dimostrato che le DNA polimerasi inseriscono un nudeotide sbagliato ogni 104 -105 nucleotidi inseriti. Tali errori talvolta si verificano in quanto i nucleotidi si presentano per breve tempo in una forma tautomerica insolita, che permette la formazione di legami idrogeno con una base normalmente non complementare. La frequenza di errori viene ulteriormente ridotta in vivo da altri meccanismi enzimatici. Tutte le DNA polimerasi possiedono anche un'attività esonucleasica 3'5' che serve a controllare ogni nucleotide. L'attività esonucleasica 3’5’ rimuove il nucleotide sbagliato e la polimerasi ricomincia la reazione. Questa attività, chiamata correzione delle bozze (proofreading), non è semplicemente il contrario della reazione di polimerizzazione, in quanto non è coinvolto il pirofosfato. Le attività di polimerizzazione e di proofreading di una DNA polimerasi possono essere misurate separatamente. Queste misure hanno dimostrato che il processo di proofreading migliora la precisione della reazione di polimerizzazione di un fattore di 10 2-103. Nella DNA polimerasi I monomerica i siti attivi per la polimerizzazione e per il proofreading sono separati anche se si trovano sullo stesso polipeptide. Quando si combinano i processi di proofreading e di selezione delle basi, una DNA polimerasi commette circa un errore ogni 106-108 coppie di basi. Tuttavia la precisione della replicazione delle cellule di E. coli è ancora maggiore. Un ulteriore sistema enzimatico ripara i rimanenti errori nell'appaiamento delle basi a replicazione avvenuta. La replicazione del DNA richiede numerosi enzimi e fattori proteici: È oggi noto che la replicazione in E. coli non richiede semplicemente un'unica DNA poliMerasi, ma 20 o più tra enzimi e proteine, ognuno dei quali ha un compito specifico. L'intero complesso è stato chiamato sistema della DNA replicasi o replisoma. La complessità del sistema enzimatico che dirige la replicazione riflette le esigenze imposte al processo dalla struttura del DNA e dalla necessità di un'assoluta accuratezza. Prenderemo ora in considerazione le classi principali di enzimi della replicazione in base ai problemi che essi devono affrontare.

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Affinché le due catene di DNA che devono servire da stampo siano accessibili, devono essere separate. Di ciò generalmente si occupano enzimi chiamati elicasi, che si muovono lungo il DNA e separano le catene usando l'energia chimica fornita dall'ATP. La separazione delle catene provoca una tensione topologica nella struttura ad elica del DNA, che viene rimossa dall'azione delle topoisomerasi. Le catene separate vengono stabilizzate da proteine che legano il DNA. Prima dell'inizio della sintesi del DNA devono essere presenti o venire sintetizzati i primer, che sono in genere brevi frammenti di RNA sintetizzati da enzimi chiamati primasi. Infine, i primer di RNA devono essere rimossi e sostituiti da DNA. In E. coli questa è una delle tante funzioni espletate dalla DNA polimerasi I. Dopo la rimozione dei segmenti di RNA e il riempimento della lacuna con DNA, rimangono punti nello scheletro del DNA in cui i legami fosfodiestere sono assenti. Queste interruzioni (nick) devono essere riparate da enzimi denominati DNA ligasi. Tutti questi processi devono essere coordinati e regolati. Le interazioni tra questi e altri enzimi sono state meglio caratterizzate in E. coli. La replicazione del cromosoma di E. coli procede in fasi successive:La sintesi di una molecola di DNA può essere suddivisa in tre fasi, inizio, allungamento e terminazione, distinguibili sia per quanto riguarda le reazioni, sia per gli enzimi che intervengono. Nei prossimi due capitoli vedremo che le sintesi degli altri principali polimeri biologici, gli RNA e le proteine, possono essere suddivise nelle stessi tre fasi, ciascuna con caratteristiche peculiari. I risultati descritti qui di seguito derivano soprattutto da esperimenti in vitro effettuati con proteine purificate da E. coli, ma i principi sono altamente conservati in tutti i sistemi di replicazione. Inizio L'origine della replicazione in E. coli (oriC) consiste di 245 bp e contiene sequenze del DNA altamente conservate nelle origini di replicazioni batteriche. Due tipi di strutture sono particolarmente interessanti: cinque sequenze ripetute di 9 bp (siti R), che fungono da siti di legame per la proteina chiave per l'inizio della replicazione, la DnaA, e una regione ricca di coppie di basi A=T chiamata elemento per il disavvolgimento del DNA (DUE). Vi sono altri tre siti di legame delle DnaA (siti I), e i siti di legame delle proteine IHF (fattori di integrazione dell’ospite) e FIS (fattore di stimolazione dell'inversione). Queste proteine sono componenti necessari essenziali nelle reazioni di ricombinazione, i loro nomi riflettono i loro ruoli. Un'altra proteina che si lega al DNA, l'HU (una proteina batterica simile agli istoni, originariamente denominata fattore U), pur partecipando al processo non sembra avere uno specifico sito di legame. Alla fase di inizio della replicazione partecipano almeno 10 differenti enzimi (o proteine). Essi aprono l'elica del DNA all'origine e formano un complesso preprimer per le successive reazioni. Il componente fondamentale nel processo di inizio è la proteina DnaA, un membro della famiglia AAA + ATPasi (ATPasi associate a diverse attività cellulari). Molte AAA + ATPasi, come la DnaA, formano oligomeri e idrolizzano l'ATP piuttosto lentamente. Questa idrolisi dell'ATP agisce come un interruttore che media l'interconversione della proteina in due stadi. Nel caso della proteina DnaA, la forma legata all'ATP è attiva, mentre la forma legata all'ADP (il prodotto dell'idrolisi) è inattiva. Otto molecole proteiche di DnaA nello stato conformazionale indotto dal legame dell'ATP si uniscono e formano un complesso che comprende i siti R ed I dell'oriC. La DnaA ha una maggiore affinità per i siti R rispetto ai siti I e si lega a questi siti R sia nella conformazione con l'ATP sia in quella con l'ADP. I siti I, che legano solo la DnaA con legato l'ATP, permettono di discriminare tra le forme attive e inattive della DnaA. Lo stretto avvolgimento destrorso del DNA attorno a questo complesso introduce un superavvolgimento positivo. La tensione associata al DNA vicino porta alla denaturazione delle regioni DUE ricche di coppie A=T. Il complesso formatosi all'origine della replicazione comprende anche diverse proteine che legano il DNA, HU, IHF e FIS, che facilitano un ripiegamento del DNA. La proteina DnaC, un'altra AAA + ATPasi, posiziona poi la proteina DnaB sui filamenti separati di DNA nella regione denaturata. Un esamero della DnaC, in cui ciascuna subunità è legata all'ATP, forma un complesso con le DnaB elicasi che ha una forma ad anello. L’interazione DnaC-DnaB apre l'anello della DnaB e il processo è aiutato da un'ulteriore interazione tra la DnaB e la DnaA. Due esameri di DnaB a forma di anello vengono posizionati sulla regione DUE, uno intorno a ciascuna catena di DNA. L’ATP legato alla DnaC viene idrolizzato, rilasciando la DnaC e lasciando la DnaB legata al DNA. Il posizionamento della DnaB elicasi è una tappa fondamentale nel processo di inizio della replicazione. Per la sua azione elicasica, la DnaB migra lungo il DNA a catena singola in direzione 5' 3', disavvolgendo il DNA durante il suo movimento. Le elicasi DnaB posizionate intorno alle due catene di DNA si muovono quindi in direzioni opposte, creando due potenziali forcelle di replicazione. Tutte le altre proteine della forcella di replicazione sono direttamente o indirettamente legate alla DnaB. L'oloenzima DNA polimerasi III si lega attraverso le subunità τ; altre interazioni della DnaB verranno descritte in seguito. Appena comincia la replicazione e le due catene di DNA si separano a livello della forcella, le catene separate sono stabilizzate dal legame di molte molecole di proteine che si uniscono al DNA a singola catena (SSB), mentre la DNA girasi (la DNA topoisomerasi II) rilascia lo stress topologico prodotto davanti alla forcella dalla reazione di disavvolgimento.

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L'inizio è la sola fase della replicazione del DNA ad essere regolata. La regolazione avviene solo una volta in ogni ciclo cellulare. Il meccanismo di regolazione non è stato ancora interamente chiarito, ma studi genetici e biochimici hanno messo in evidenza diversi meccanismi di regolazione. Una volta che la DNA polimerasi III si è posizionata sul DNA, insieme alle subunità β (che segnalano la fine della fase di inizio), la proteina Hda si lega alle subunità β e interagisce con la proteine DnaA, per stimolare l'idrolisi dell'ATP legato. Hda è un'altra AAA + ATPasi, strettamente correlata con la DnaA (il suo nome deriva da homologous to DnaA). L'idrolisi dell'ATP conduce al dissolvimento del complesso DnaA all'origine della replicazione. Il lento rilascio dell'ADP da parte della DnaA e il nuovo legame dell'ATP fa sì che la proteina passi ciclicamente da una forma inattiva (con l'ADP legato) ad una forma attiva (con l'ATP legato), in una scala temporale che va da 20 a 40 minuti. Il timing dell’inizio della replicazione è sotto il controllo della metilazione del DNA e delle interazioni con la membrana plasmatica batterica. Il DNA dell'oriC viene metilato dalla metilasi Dam, che metila l'N 6 dell'adenina che fa parte della sequenza palindroma (5')GATC. (Dam non è il nome di una proteina, ma sta per DNA adenine methylation.) La regione oriC di E. coli è molto ricca di sequenze GATC e ha 11 su 245 bp, quando la frequenza media di GATC nel cromosoma di E. coli è di 1 su 256 bp. Subito dopo la replicazione, il DNA è emimetilato: le catene parentali hanno le sequenze oriC metilate, ma le catene neosintetizzate non sono metilate. Le sequenze oriC emimetilate interagiscono ora con la membrana plasmatica (il meccanismo è ignoto) e legano la proteina SeqA. In seguito l'oriC si stacca dalla membrana plasmatica, SeqA si dissocia, e il DNA deve essere completamente metilato dalla metilasi Dam prima che possa ancora legarsi alla DnaA e iniziare un nuovo ciclo di replicazione. Allungamento La fase di allungamento della replicazione consta di due eventi apparentemente simili, ma ben distinti per quanto riguarda il meccanismo: la sintesi della catena veloce e la sintesi della catena lenta. Vari enzimi presenti alla forcella di replicazione sono importanti per la sintesi di entrambe le catene. Per prima cosa le DNA elicasi disavvolgono il DNA parentale e la tensione topologica indotta dalle elicasi viene rimossa dalle DNA topoisomerasi. Ogni catena separata è poi stabilizzata dalle SSB. Da questo punto in poi, la sintesi delle due catene del DNA è molto differente. La sintesi della catena veloce comincia con la sintesi da parte di una primasi (la proteina DnaG) di un breve primer di RNA (da la a 60 nucleotidi) all'origine della replicazione. La proteina DnaG interagisce con l'elicasi DnaB per catalizzare la reazione, e il primer viene sintetizzato in direzione opposta a quella con cui si sposta la DnaB elicasi. Infatti, la DNA elicasi si muove lungo la catena che diventa la catena lenta nella sintesi del DNA; tuttavia, il primo primer sintetizzato dalla prima interazione DnaG-DnaB serve per innescare la sintesi della catena veloce di DNA nella direzione opposta. l deossiribonucleotidi vengono aggiunti a questo primer da un complesso della DNA polimerasi III legato alla DnaB elicasi legata alla catena opposta di DNA. La sintesi della catena veloce procede in modo continuo, in sincronia con il disavvolgimento del DNA a livello della forcella di replicazione. La sintesi della catena lenta, come abbiamo già visto, procede tramite la formazione dei frammenti di Okazaki. In primo luogo, il primer di RNA è sintetizzato dalla primasi e, come nella sintesi della catena veloce, la DNA polimerasi III si lega al primer di RNA e aggiunge deossiribonucleotidi. A questo livello la sintesi di ognuno dei frammenti di Okazaki sembra semplice, ma in realtà è piuttosto complessa. La difficolta sta nel coordinamento della sintesi della catena veloce e della catena lenta: entrambe le catene sono prodotte da un singolo dimero asimmetrico di DNA polimerasi III, che viene coordinato facendo piegare ad anello il DNA della catena lenta e procedendo insieme nei due diversi percorsi di polimerizzazione La sintesi dei frammenti di Okazaki sulla catena lenta comporta un'elegante coreografia enzimatica. La DnaB clicasi e la DnaG primasi costituiscono un'unità funzionale all'interno del complesso replicativo, chiamata primosoma. La DNA polimerasi III utilizza uno dei dimeri del nucleo per sintetizzare la catena veloce in maniera continuativa; l'altro dimero sintetizza un frammento di Okazaki dopo l'altro sull'anello che si forma sulla catena lenta. L'enzima DnaB elicasi legata vicino alla DNA polimerasi III separa la doppia elica del DNA a livello della forcella di replicazione, e si sposta lungo il filamento stampo lento nella direzione 5' 3'. La DnaG primasi si associa temporaneamente alla DnaB sintetizzando un corto primer di RNA. Una nuova pinza scorrevole contenente una subunità β viene posizionata, vicino al primer dal complesso della DNA polimerasi III. Quando è stata completata la sintesi di un frammento di Okazaki, la replicazione si arresta e le subunità che cstituiscono il nucleo della DNA polimerasi III si dissociano dalla subinità β che è servita da pinza scorrevole (e dal frammento di Okazaki neosintetizzato) e si vanno ad associare con una nuova subunità β. Ciò dà inizio ala sintesi di un nuovo frammento di Okazaki. Come accennato in precedenza, l'intero complesso responsabile della sintesi coordinata del DNA alla forcella di replicazione è un replisoma.

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Anche il complesso della DNA polimerasi IIl per il posizionamento della pinza formato da parti delle due subunità τ insieme con le subunità γ, δ e δ’, è una AAA+ ATPasi. Questo complesso si lega all'ATP e alla nuova pinza scorrevole β. Il legame trasmette una certa tensione alla pinza dimerica, aprendo l'anello in corrispondenza di un interfacia tra Ie due subunità. L'elica lenta col primer passa all'interno dell'anello attraverso l'apertura. Il posizionatore della pinza scorrevole idrolizza l'ATP, rilasciando la pinza scorrevole β, che si chiude intorno aI DNA. Il replisoma consente la rapida sintesi di DNA ad una velocità di circa 1000 nucleotidi al secondo su entrambe le catene (catena lenta e catena veloce). Quando il frammento di Okazaki neosintetizzato è completo: il suo primer di RNA viene rimosso dalla DNA polimerasi I e rimpiazzato da DNA sintetizzato dallo stesso enzima. L'interruzione che rimane viene ricucita dalla DNA ligasi. La DNA ligasi catalizza la formazione di un legame fosfodistere tra l'ossidrile all'estremità 3' di una catena di DNA fosfato all'estremìta 5' di un'altra catena. Il gruppo fosforico deve essere attivato tramite adenililazione. Le DNA ligasi dei virus e degli eucarioti utilizzano a questo scopo l'ATP. Le DNA ligasi dei batteri usano invece NAD + – un cofattore normalmente impiegato nelle reazioni di trasferimento di idruro – quale fonte di gruppi AMP necessari per l'attivazione. La DNA ligasi è un altro enzima del metabolismo del DNA che ha assunto importanza fondamentale come reagente negli esperimenti con il DNA ricombinante. Terminazione Normalmente le due forcelle di replicazione del cromosoma circolare di E. coli si incontrano in una regione terminale contenente copie multiple di una sequenza di 20 coppie di basi chiamata Ter (Ter sta per "termine"). La sequenza Ter è costruita in modo tale da costituire ura sorta di trappola dove la forcella di replicazione può entrare ma non uscire. La sequenza Ter funziona come sito di legame per una proteina chiamata Tus (acronimo per terminus utilization substance). Il complesso Tus-Ter è in grado di arrestare la forcella di replicazione soltanto da una direzione. Solo un complesso Tus-Ter funziona per ogni ciclo di replicazione; si tratta di quello che viene incontrato per primo da una delle due forcelle. Dato che le forcelle di replicazione oppste in genere si fermano quando si incontrano, non sembra che le sequenze Ter svolgano un molo essenziale: ma potrebbero comunque impedire l'ulteriore replicazione da parte di una forcela nel caso che l'altra venisse ritardata o fermata da ostacoli o danneggiamenti del DNA. Così, quando una delle due forcelle di replicazione incontra un complesso funzionale Tus-Ter, si ferma; l'altra forcella si arresta quando incontra la prima forcella già ferma; le poche centinaia di coppie di basi rimaste tra questi due grossi complessi proteici vengono quindi replicate (con un meccanismo ancora ignoto), completando due cromosomi circolari topologicamente interconnessi (concatenati). I DNA circolari legati in questo modo vengono chiamati catenani e in E. coli la loro separazione richiede la presenza dell'enzima topoisomerasi IV (un tipo di topoisomerasi II). l cromosomi separati vengono quindi distribuiti nelle cellule figlie durante il processo di divisione. La fase terminale della replicazione di altri cromosomi circolari, soprattutto virus a DNA degli eucarioti, è molto simile. La replicazione nelle cellule eucariotiche è più complessa: Le molecole di DNA delle cellule eucariotiche sono considerevolmente più grandi di quelle dei batteri e sono organizzate in complesse strutture nucleoproteiche (cromatina). Le caratteristiche essenziali della replicazione del DNA sono le stesse in eucarioti e procarioti, e molti dei complessi proteici sono funzionalmente e strutturalmente conservati. Però la replicazione degli eucarioti è regolata e coordinata in rapporto al ciclo cellulare, il che implica un grado di maggiore complessità. Le origini della replicazione hanno una struttura ben caratterizzata in alcuni eucarioti inferiori, ma sono molto meno definite negli eucarioti superiori. Nei vertebrati, numerose sequenze ricche di coppie A=T possono essere usate per l'inizio della replicazione, ma i siti possono variare da una divisione cellulare alla successiva. Il lievito (Saccharomuces cerevisiae) possiede origini di replicazione chiamate sequenze che si replicano autonomamente (ARS, automomously replicating sequences), o replicatori. I replicatori del lievito si estendono per ~150 bp e contengono diverse sequenze essenziali e conservate. Circa 400 replicatori sono distribuiti tra i 16 cromosomi del genoma aploide del lievito. La regolazione assicura che tutto il DNA cellulare sia replicato una sola volta per ciclo cellulare. Gran parte della regelazione comporta l'intervento di proteine chiamate cicline e di chinasi ciclina-dipendenti (CDK), che si associano tra loro. Le cicline vengono rapidamente distrutte da una proteolisi ubiquitina-dipendente alla fine della fase M (mitosi) e la loro assenza permette la formazione dei complessi prereplicativi (pre-RC) a livello dei siti di inizio della replicazione. Nelle cellule che si moltiplicano rapidamente, i pre-RC si formano alla fine della fase M (mitosi). Invece nelle cellule che si moltiplicano lentamente non si formano fino alla fine della fase G1. La formazione del complesso pre-RC rende le cellule competenti per la replicazione, un evento talvolta chiamato licenza (licensing). Come nei batteri, anche negli eucarioti l'evento chiave dell'inizio della replicazione è il posizionamento dell'elicasi, un complesso eteroesamerico di proteine per il mantenimento del minicromosoma (MCM) (da MCM-2 a MCM-7). L'anello dell'elicasi MCM2-7, il cui funzionamento è simile a quello dell'elicasi batterica DnaB, viene posizionato

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intorno al DNA da un altro complesso di sei proteine, chiamato ORC (complesso di riconoscimento dell'origine). L'ORC ha cinque domini AAA + ATPasici nelle sue subunità ed è funzionalmente analogo alla DnaA batterica. Anche altre due proteine, la CDC6 (cell division cycle) e CDT1 (CDC10 dependent transcript 1), sono necessarie per formare il complesso MCM2-7; la CDC6 del lievito è un'altra AAA+ ATPasi. La replicazione richiede la sintesi e l'attività dei complessi ciclina-CDK della fase S (come il complesso ciclina E-CDK2) e CDC7-DBF4. Entrambi i complessi concorrono ad attivare la replicazione, legandosi e fosforilando alcune proteine del pre-RC. Una volta iniziata la replicazione, altre cicline e CDK inibiscono invece la formazione di più complessi pre-RC. Per esempio, quando i livelli di ciclina E diminuiscono durante la fase S, la CDK2 si lega alla ciclina A, inibendo la CDK2 e prevenendo la formazione di altri complessi pre-RC. La velocità di spostamento della forcella di replicazione negli eucarioti (circa 50 nucleotidi/s) è solo un ventesimo di quella osservata in E. coli. A questa velocità, la replicazione di un cromosoma umano medio che procedesse da un'unica origine impiegherebbe più di 500 ore. In realtà la replicazione dei cromosomi umani procede bidirezionalmente a partire da origini multiple che distano tra loro da 30.000 a 300.000 coppie di basi. Poiché i cromosomi eucariotici sono molto più grandi di quelli batterici, la presenza di molte origini della replicazione lungo ogni cromosoma eucariotico è probabilmente una regola generale. Analogamente ai batteri, le cellule eucariotiche possiedono vari tipi di DNA polimerasi; alcune svolgono funzioni peculiari, come la replicazione del DNA mitocondriale. La replicazione dei cromosomi nucleari è effettuata da un enzima chiamato DNA polimerasi α, in associazione con un'altra polimerasi, chiamata DNA polimerasi δ. La DNA polimerasi α è un enzima multimerico con struttura e proprietà simili in tutte le cellule eucariotiche. Una delle subunità ha attività primasica; la subunità maggiore (Mr -180 000) ha attività polimerasica. Tuttavia, questa polimerasi non può compiere l'attività 3'5' esonucleasica di proofreading ed è quindi poco adatta per la replicazione ad alta fedeltà del DNA. Si pensa che la DNA polimerasi α funzioni solo nella sintesi di corti primer (contenenti RNA o DNA) necessari alla formazione dei frammenti di Okazaki sulla catena lenta. Questi primer vengono in seguito estesi dalla DNA polimerasi δ. Questo enzima è associato ad una proteina chiamata antigene nucleare della cellula proliferante (proliferating cell nuclear antigen, PCNA; Mr 29 000), che si trova in grandi quantità nei nuclei delle cellule in proliferazione. La struttura tridimensionale della proteina PCNA è molto simile a quella della subunità β della DNA polimerasi III di E. coli, sebbene non sia evidente una omologia nella sequenza amminoacidica; anche le funzioni sono analoghe, dato che si forma una sorta di pinza circolare che aumenta notevolmente la processività della polimerasi. La DNA polimerasi δ, che possiede un'attività esonucleasica 3'5' di proofreading, è probabilmente responsabile della sintesi della catena veloce e della catena lenta; infatti agisce sotto forma di un complesso analogo alla DNA polimerasi III dimerica dei batteri. In alcune situazioni, come la riparazione del DNA, un'altra polimerasi, la DNA polimerasi ε, può prendere il posto della DNA polimerasi δ. La DNA polimerasi ε potrebbe operare a livello della forcella di replicazione svolgendo una funzione simile a quella della DNA polimerasi I batterica, rimuovendo i primer dei frammenti di Okazaki dalla catena lenta. Altri due complessi proteici, chiamati RPA (replication protein A) e RFC (replication factor C), intervengono nella replicazione del DNA eucariotico. L’RPA è una proteina che lega il DNA eucariotico a singola elica e la sua funzione è equivalente a quella delle proteine SSB di E. coli. L'RFC è un posizionatore della pinza per PCNA, e quindi facilita l'assemblaggio di complessi di replicazione attivi. Le subunità del complesso RFC hanno analogie di sequenza significative con le subunità del complesso posizionatore della pinza scorrevole (γ) dei batteri. La terminazione della replicazione dei cromosomi lineari eucariotici comporta la sintesi di speciali strutture, dette telomeri, all'estremità di ciascun cromosoma.

Danni, mutazioni e cancerogenesi Le mutazioni sono legate alla cancerogenesi. Non c’è modo migliore di illustrare l’importanza della riparazione el DNA se non considerare gli effetti di un danneggiamento del DNA non riparato (una lesione). La modificazione più grave è una cambiamento nella sequenza di basi del DNA, che se replicato e trasmesso alle future generazioni cellulari, diventa permanente. Questi cambiamenti permanenti nella sequenza nucleotidica del DNA sono chiamati mutazioni. Le mutazioni possono variare dalla sostituzione di una coppia di basi con un’altra (mutazione per sostituzione), all’aggiunta o alla rimozione di una o più coppie di basi (mutazioni per inserzione o per delezione). Se la mutazione interessa DNA non essenziale o se ha un effetto trascurabile sulla funzione di un gene, è chiamata mutazione silente. Raramente una mutazione silente conferisce vantaggi biologici. Molte mutazioni non silenti sono invece neutri o deleterie.

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Nei mammiferi esiste una forte correlazione tra l’accumulo di mutazioni e il cancro. Un semplice test messo a punto da Bruce Ames misura la capacità di un dato composto himico di promuovere certe mutazioni facilmente determinabili in un ceppo batterico specializzato. Solo un numero esiguo di composti chimici in cui ci possiamo imbattere quotidianamente risulta mutageno in questo test; più del 90% dei composti noti per essere cancerogeni in prove su animali è risultato mutageno anche nel test di Ames. A causa dell’importante correlazione tra mutagenesi e cancerogenesi, il test di Ames è ampiamente usato come rapido ed economico sistema di valutazione delle potenziali sostanze cancerogene nell’uomo. Il genoma di una tipica cellula di mammifero accumula molte migliaia di lesioni nell’arco di 24 ore. Tuttavia, grazie alla riparazione del DNA, meno di una lesione su 1000 diventa una mutazione. Il DNA è una molecola relativamente stabile, tuttavia, senza i sistemi di riparazione, gli effetti cumulativi di molte reazioni infrequenti ma dannose renderebbero la sopravvivenza impossibile.

Sistemi di riparazione del DNA Tutte le cellule possiedono sistemi multipli di riparazione del DNA: Il numero e la varietà dei sistemi di riparazione riflettono l'importanza della riparazione del DNA per la sopravvivenza della cellula e le molte cause che possono determinare il danneggiamento del DNA. Alcuni tipi comuni di lesioni, come i dimeri di pirimidine, possono essere riparati da sistemi diversi. Inoltre, molti sistemi di riparazione del DNA sembrano essere eccezionalmente inefficienti dal punto di vista energetico: si tratta di un'eccezione, se si considera che nella grande maggioranza delle vie metaboliche in cui l'ATP interviene è utilizzato in modo ottimale. Ma quando è in gioco l'integrità dell'informazione genetica, la quantità di energia chimica investita nel processo di riparazione sembra essere irrilevante. La riparazione del DNA è possibile essenzialmente perché la molecola del DNA è formata da due catene complementari. II DNA danneggiato in una catena può essere rimosso e accuratamente rimpiazzato, utilizzando la catena complementare non danneggiata come stampo. Prenderemo ora in considerazione i principali sistemi di riparazione, iniziando da quelli che correggono i rari errori di appaiamento dei nucleotidi che vengono commessi durante la replicazione. Riparazione degli errori di appaiamento di basi La correzione dei rari errori di appaiamento rimasti dopo la replicazione in E. coli migliora la precisione complessiva del processo replicativo di un fattore che va da 10 2 a 103. Gli errori di appaiamento vengono corretti quasi sempre in base all'informazione contenuta nella catena stampo, per cui il sistema deve in qualche modo saper distinguere tra lo stampo e la catena neosintetizzata. La cellula effettua questa discriminazione marcando il vecchio DNA (stampo) con gruppi metilici, in modo da distinguerlo da quello appena sintetizzato. Il sistema di riparazione degli appaiamenti sbagliati di E. coli comprende almeno 12 proteine che partecipano alla discriminazione delle catene o al processo di riparazione stesso. Il meccanismo di discriminazione non è stato individuato nella maggioranza dei batteri e degli eucarioti, ma è ben conosciuto quello operante in E. coli e in alcuni batteri strettamente correlati. Nel caso di questi batteri la discriminazione delle catene si basa sull'azione di un enzima chiamato Dam metilasi, che metila il DNA nella posizione l'N6 tutte le adenine presenti nelle sequenze (5')GATC. Immediatamente dopo il passaggio della forcella di replicazione vi è un breve intervallo (pochi secondi o minuti) durante il quale la catena stampo è metilata, ma la catena neosintetizzata non lo è ancora. La mancata metilazione transitoria delle sequenze GATC nella catena neosintetizzata permette la discriminazione delle catene. Gli errori di appaiamento vicini alle sequenze GATC emimetilate vengono allora riparati secondo l'informazione contenuta nella catena parentale metilata (stampo). Test in vitro dimostrano che se entrambe le catene sono metilate in una sequenza GATC, si ha una riparazione non efficace; se nessuna delle due catene è metilata, la riparazione avviene, ma non favorisce nessuna delle due catene in particolare. Questo sistema di riparazione degli errori di appaiamento diretto dai gruppi metilici corregge con precisione errori che distano fino a 1000 coppie di basi da una sequenza GATC emimetilata. Come viene diretto un processo di correzione degli errori da parte di sequenze GATC relativamente distanti? La proteina MutL forma un complesso con la proteina MutS e si lega a tutte le sequenze di basi male appaiate (eccetto C-C). La proteina MutH si lega a MutL e alle sequenze GATC incontrate dal complesso MutL-MutS. Il DNA su entrambi i lati dell'errore di appaiamento viene modificato dal complesso MutL-MutS, creando un'ansa di DNA; il movimento dei filamenti dell'anello sul complesso avviene simultaneamente a quello del complesso sul DNA. La proteina MutH funziona come un'endonucleasi sito-specifica ed è inattiva fino a quando il complesso non incontra una sequenza GATC emimetilata. A questo punto MutH taglia la catena non metilata al 5' della G della sequenza GATC, contraddistinguendo in tal modo la catena da riparare. I successivi passaggi del processo dipendono dalla posizione dell'appaiamento sbagliato rispetto a tale sito di taglio. Quando l'errore è dal lato 5' rispetto al sito di taglio, i dati suggeriscono che la catena non metilata venga disavvolta e degradata in direzione 3' 5' a partire dal sito di scissione verso l'errore stesso e rimpiazzata con nuovo DNA. Questo

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processo richiede l'azione combinata di DNA elicasi II, SSB, esonucleasi I o esonucleasi X (entrambe degradano solo il DNA a singola elica in direzione 3' 5'), DNA polimerasi III e DNA ligasi. Il processo di riparazione degli errori di appaiamento dal lato 3' del sito di taglio è simile, ad eccezione del fatto che l'esonucleasi viene rimpiazzata dall'esonucleasi (che degrada il DNA a singola elica in direzione 5' 3' o 3'5') o dalla nucleasi RecJ (un'esonucleasi che degrada il DNA a singola elica in direzione 5'3'). Dal punto di vista energetico, la riparazione degli errori di appaiamento di basi è un processo particolarmente dispendioso per i batteri. L'errore può essere localizzato a più di 1000 bp di distanza da una sequenza GATC. La degradazione con relativa sostituzione di un segmento di catena di queste dimensioni richiede un enorme investimento di deossinucleotidi attivati per riparare un unico errore. Ciò sottolinea ancora una volta l'importanza dell'integrità del genoma per la cellula. Tutte le cellule eucariotiche possiedono proteine strutturalmente e funzionalmente analoghe alle proteine batteriche MutS e MutL (ma non MutH). Alterazioni nei geni umani che codificano proteine di questo tipo producono alcune delle più comuni sindromi ereditarie di suscettibilità ai tumori, a ulteriore dimostrazione dell'importanza dei sistemi di riparazione del DNA per l'organismo. Tutti gli omologhi di MutS nella maggior parte degli eucarioti, dal lievito all'uomo, sono MSH2 (omologo 2 di MutS) , MSH3 e MSH6. Gli eterodimeri di MSH2 e MSH6 normalmente si legano ad un errore di una singola base, ma riconoscono meno bene le anse leggermente più lunghe generate da un errato appaiamento. In molti organismi gli appaiamenti sbagliati più lunghi (da 2 a 6 coppie di basi) possono invece essere legati da eterodimeri di MSH2 e MSH3, oppure da entrambi i tipi di eterodimeri in fila. Gli omologhi di MUTL, principalmente un eterodimero di MLH1 (MutL homolog 1) e PMS1 (post-meiotic segregation) si legano ai complessi MSH e li stabilizzano. Molti dettagli sugli eventi successivi della riparazione degli errori di appaiamento del DNA negli eucarioti non sono ancora del tutto chiari. In particolare non conosciamo il meccanismo con cui vengono identificate le catene di DNA neosintetizzate, in quanto la ricerca ha rivelato che l'identificazione di questo filamento non coinvolge le sequenze GATC. Riparazione per escissione di basi Ogni cellula possiede una classe di enzimi, chiamati DNA glicosilasi, che riconoscono lesioni particolarmente comuni (come i prodotti di deamminazione di citosina e adenina) e rimuovono la base alterata scindendo il legame N-glicosilico. Ciò crea un sito apurinico o apirimidinico nel DNA, che viene comunemente chiamato sito AP o abasico. Ciascuna DNA glicosilasi è generalmente specifica per un tipo di lesione. Un esempio comune a molte cellule è l'uracil DNA glicosilasi, che rimuove dal DNA l'uracile che si forma dalla deamminazione spontanea della citosina. Nelle cellule mutate che mancano di questo enzima vi è un'elevata percentuale di mutazioni, dove al posto di G≡C troviamo A=T. Questa glicosilasi non rimuove l'uracile dall'RNA, e neppure i residui di timina dal DNA. Come abbiamo visto, la capacità di distinguere la timina dal prodotto di deamminazione della citosina, l'uracile, necessaria per questo meccanismo di riparazione, suggerisce una spiegazione al fatto che il DNA contiene timina invece di uracile. l batteri normalmente possiedono solo un tipo di uracil DNA glicosilasi, mentre l'uomo ne possiede almeno quattro tipi con specificità diversa, un'indicazione dell'importanza della rimozione dell'uracile dal DNA. La più abbondante uracil glicosilasi umana, l'UNG, è associata al replisoma umano, dove rimuove gli occasionali residui di U inseriti al posto di una T durante la replicazione. La deamminazione dei residui C è 100 volte più rapida nel DNA a catena singola che nel DNA a doppia catena e l'uomo possiede l'enzima hSMUG 1, che rimuove tutti i residui U presenti in un DNA a catena singola durante la replicazione o la trascrizione. Due altre DNA glicosilasi umane, TDG e MBD4, rimuovono residui U e T appaiati a G generati dalla deamminazione rispettivamente della citosina o della 5-metilcitosina. Altre DNA glicosilasi riconoscono e rimuovono varie basi danneggiate, tra cui la formamidopirimidina e l'8idrossiguanina (che derivano dall'ossidazione delle purine), l'ipoxantina (che deriva dalla deamminazione dell'adenina) ed eventuali basi alchilate come la 3-metiladenina e la 7-metilguanina. Sono state identificate glicosilasi che riconoscono altre lesioni, come i dimeri di pirimidina. Si ricordi che i siti AP si formano anche dalla lenta, spontanea idrolisi dei legami N-glicosilici del DNA. Una volta che il sito AP è stato generato da una DNA glicosilasi, un altro gruppo di enzimi deve ripararlo. La riparazione non avviene semplicemente con l'inserzione di una nuova base e con la riformazione di un legame N-glicosilico, ma il deossiribosio 5'-fosfato rimasto nel sito deve essere rimosso e sostituito con un nuovo nucleotide. Questo processo viene iniziato da enzimi chiamati endonucleasi AP, che scindono la catena del DNA contenente il sito AP. La posizione del taglio rispetto al sito AP (5' o 3') varia a seconda del tipo di endonucleasi AP. Un segmento di DNA che contiene il sito AP viene in seguito rimosso, il DNA viene sostituito dalla DNA polimerasi I e l'interruzione rimasta viene ricucita dalla DNA Iigasi. Negli eucarioti la sostituzione del nucleotide è catalizzata da polimerasi specializzate, che saranno descritte in seguito.

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Riparazione per escissione di nucleotidi Le lesioni del DNA che causano gravi distorsioni nella struttura a doppia elica vengono generalmente riparate con il sistema della escissione di nucleotidi, un meccanismo di riparazione cruciale negli organismi viventi. Nella riparazione per escissione di nucleotidi, un enzima multimerico idrolizza i due legami fosfodiestere su ciascun lato della lesione. In Escherichia coli e in altri procarioti l'enzima idrolizza il quinto legame fosfodiestere nella direzione 3' e l'ottavo nella direzione 5', generando un frammento di 12 o 13 nucleotidi (a seconda se la lesione coinvolge una o due basi). Nell'uomo e negli altri eucarioti l'enzima idrolizza il sesto legame fosfodiestere nella direzione 3' e il ventiduesimo nella direzione 5' , generando un frammento di 27-29 nucleotidi. Subito dopo la doppia incisione gli oligonucleotidi escissi vengono rilasciati e il frammento mancante viene sintetizzato dalla DNA polimerasi I in E. coli e dalla DNA polimerasi ε nell'uomo. L’interruzione viene poi eliminata dalla DNA ligasi. In E. coli il complesso enzimatico chiave è la nucleasi di escissione ABC, costituita da tre subunità: UvrA (Mr 104 000), UvrB (Mr 78000) e UvrC (Mr 68 000). ll termine "nucleasi di escissione" è utilizzato per descrivere la caratteristica capacità di questo complesso enzimatico di catalizzare due specifici tagli endonucleolitici, a differenza dell'attività di tutte le endonucleasi standard. Un complesso delle proteine UvrA e UvrB (A 2B) fa la scansione del DNA e si lega alla zona lesionata. Il dimero di UvrA si dissocia, lasciando UvrB legata al DNA. Quindi UvrC si associa a UvrB, che produce la rottura del quinto legame fosfodiestere nella direzione 3' rispetto alla lesione. A questo segue la rottura sempre mediata da UvrG sull'ottavo legame fosfodiestere nella direzione 5'. Il frammento risultante di 12 o 13 nucleotidi viene rimosso dalla UvrD elicasi. L’interruzione creatasi viene riempita dalla DNA polimerasi I e unita dalla ligasi. Questo meccanismo è il principale sistema di riparazione di vari tipi di lesione, tra cui i dimeri di ciclobutanopirimidina, i fotoprodotti con legami 6-4 e altri tipi di basi modificate, inclusa la benzo[α]pirene-guanina che si forma nel DNA in seguito all'esposizione al fumo di sigaretta. L'attività nucleolitica della nucleasi di escissione ABG è unica nel suo genere in quanto produce contemporaneamente due tagli nel DNA. Le nucleasi di escissione degli eucarioti funzionano in modo molto simile a quelle batteriche, sebbene necessitino di 16 subunità polipeptidiche del tutto diverse da quelle dell'E. coli per effettuare la doppia rottura. Come vedremo, alcuni dei meccanismi di riparazione per escissione di nucleotidi e per escissione di basi negli eucarioti sono strettamente collegati alla trascrizione. La mancanza del meccanismo di escissione, ereditata geneticamente, ha come conseguenza, nell'uomo, la comparsa di gravi malattie. Riparazione diretta Vari tipi di danno vengono riparati senza la rimozione di una base o di un nucleotide. L’esempio meglio caratterizzato è la fotoriattivazione dei dimeri di ciclobutano-pirimidina, reazione promossa dalle DNA fotoliasi. I dimeri di pirimidina si formano da una reazione indotta dalla luce ultravioletta e le fotoliasi utilizzano l'energia derivata dalla luce assorbita per riparare questo danno. Le fotoliasi contengono generalmente due cofattori che agiscono da composti che assorbono la luce, detti cromofori. Uno dei cromofori è sempre il FADH -. In E. coli e nel lievito l'altro cromoforo è un folato. Il meccanismo di reazione comporta la generazione di radicali liberi. Le DNA fotoliasi non sono presenti nelle cellule dei mammiferi placentali (di cui fa parte l'uomo). Esistono altri esempi di riparazione di nucleotidi con danni da alchilazione. Il nucleotide modificato O 6-metilguanina si forma in presenza di agenti alchilanti ed è una lesione comune e altamente mutagena. Questo nucleotide tende ad appaiarsi con la timina invece che con la citosina durante la replicazione, ed è pertanto responsabile delle mutazioni di G≡C in A=T. La riparazione diretta della O6-metilguanina è effettuata dalla O6-metilguanina-DNA metiltrasferasi, una proteina che catalizza il trasferimento del gruppo metilico della O 6-metilguanina a uno specifico residuo di Cys sulla stessa proteina. Questa metiItrasferasi non è un enzima in senso stretto, poiché il trasferimento di un unico metile inattiva la proteina. Il consumo di un'intera molecola proteica per correggere una singola base danneggiata è un altro esempio significativo dell'importanza del mantenimento dell'integrità del DNA cellulare. Un altro meccanismo diretto, ma molto diverso, viene usato per riparare l'1-metiladenina e la 3-metilcitosina. I gruppi amminici di A e C sono talvolta metilati quando il DNA è a singola catena e la metilazione modifica l'appaiamento delle basi. In E. coli, la demetilazione ossidativa di questi nucleotidi alchilati avviene per mezzo della proteina AlkB, un membro della superfamiglia della diossigenasi α-chetoglutarato-Fe2+-dipendente. Il blocco della forcella di replicazione da DNA danneggiato può essere superato dalla riparazione soggetta ad errori I meccanismi di riparazione fino ad ora considerati intervengono generalmente nelle lesioni del DNA a doppia elica, dove la catena integra fa da stampo per ripristinare la corretta informazione genetica sulla catena danneggiata. Tuttavia ci sono alcuni tipi di lesioni, come per esempio rotture della doppia elica, formazioni di ponti trasversali nella doppia elica o lesioni sulla singola elica di DNA, dove la catena complementare è danneggiata o assente. Generalmente rotture della doppia elica o lesioni del DNA a singola elica si originano quando la forcella di replicazione incontra una lesione del DNA non riparata. Tali lesioni, insieme ai ponti trasversali nel DNA, possono anche originarsi a causa di radiazioni ionizzanti e di reazioni ossidative.

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Se la forcella di replicazione batterica si ferma in presenza di un danno, vi sono due vie alternative di riparazione. In assenza della catena integra che specifichi la sequenza del segmento da riparare, l'informazione richiesta proviene dal cromosoma omologo. Quindi il sistema di riparazione prevede la ricombinazione genetica fra gli omologhi. In alcune condizioni, entra in azione un altro meccanismo di riparazione chiamato riparazione soggetta ad errori (abbreviata con TLS). Quando questo meccanismo è attivo, la riparazione del DNA diventa significativamente meno accurata e si verifica un'elevata frequenza di mutazioni. Nei batteri la riparazione soggetta ad errori è un sistema con cui la cellula risponde allo stress provocato da un intenso danneggiamento del DNA, noto come risposta SOS. Alcune delle proteine della risposta SOS, come le proteine UvrA e UvrB, sono normalmente presenti a livello cellulare, ma vengono significativamente indotte a livelli più alti durante il meccanismo di risposta SOS. Altre proteine SOS partecipano al meccanismo di riparazione soggetta ad errori e sono le proteine UmuC e UmuD ("Umu" deriva da unmutable, non mutabile; la mancanza della funzione del gene umu elimina la riparazione soggetta ad errori). La proteina UmuD viene scissa in un processo regolato da SOS, producendo una forma di UmuD più corta, detta UmuD', che dà luogo a un complesso con UmuC creando una DNA polimerasi specializzata (la DNA polimerasi V) in grado di ricominciare la replicazione al di là delle lesioni che altrimenti bloccherebbero la replicazione. Poiché un preciso appaiamento di basi è spesso impossibile in corrispondenza del sito della lesione, questo tipo di replicazione è soggetto ad errori. Dopo aver insistito nel sottolineare l'importanza dell'integrità genomica in tutto questo capitolo, può sembrare incoerente che esista un sistema capace di aumentare la frequenza delle mutazioni. Tuttavia, possiamo pensare che questa sia una strategia di salvataggio estremo. I geni umuC e umuD sono completamente indotti solo alla fine della risposta SOS e non sono attivati per la sintesi al di là della lesione iniziata dalla rottura effettuata da UmuD, a meno che i livelli del danno al DNA siano particolarmente alti e tutte le forcelle di replicazione siano bloccate. Le mutazioni prodotte dalla replicazione mediata dalla DNA polimerasi V uccidono molte cellule e determinano mutazioni dannose in altre, ma questo è il prezzo biologico che le cellule pagano per superare una barriera altrimenti insuperabile alla replicazione; così, almeno alcune cellule, anche se mutate, possono sopravvivere. Oltre alla polimerasi V, la replicazione translesione richiede la proteina RecA. l filamenti di RecA legati al DNA a singola catena a livello di un sito cromosomico possono attivare i complessi della DNA polimerasi V legati in siti lontani sul cromosoma. Questo meccanismo è stato chiamato “in trans” ed è favorito dalla formazione di un'ansa nel cromosoma, che pone uno accanto all'altro i due siti distanti tra loro. Anche un'altra polimerasi, la DNA polimerasi IV, viene indotta durante la risposta SOS. La replicazione da parte della DNA polimerasi IV, un prodotto del gene dinB, è soggetta ad errori. Le polimerasi batteriche IV e V fanno parte di una famiglia di polimerasi TLS presenti in tutti gli organismi, Questi enzimi mancano dell'attività esonucleasica per la correzione delle bozze, quindi la fedeltà della selezione delle basi durante la replicazione viene ridotta di un fattore pari a 10 2, diminuendo la fedeltà della replicazione ad un errore ogni circa 1000 nucleotidi.

Ormoni

Ormoni e le loro azione biochimica Gli ormoni: strutture diverse per funzioni diverse Praticamente tutti i processi che avvengono negli organismi complessi sono regolati da uno o più ormoni: il mantenimento della pressione sanguigna, del volume del sangue e del bilancio elettrolitico; l'embriogenesi; il differenziamento sessuale, lo sviluppo e la riproduzione; la fame, il comportamento alimentare, la digestione e la distribuzione energetica, solo per nominarne alcuni. Esamineremo ora i metodi per identificare e misurare gli ormoni e le loro interazioni con i recettori, prendendo in considerazione alcuni esempi rappresentativi dei vari tipi eli ormoni. La coordinazione del metabolismo nei diversi organi dei mammiferi avviene mediante il sistema neuroendocrino. Le singole cellule in un tessuto percepiscono le modificazioni nell'ambiente che circonda l'organismo e rispondono secernendo un messaggero chimico extracellulare che passa a un'altra cellula, dove si lega a un recettore specifico e innesca una modificazione delle attività di questa seconda cellula. Nella trasmissione dei segnali neuronali, il messaggero chimico (il neurotrasmettitore acetilcolina, per esempio) può spostarsi solo per spazi piccolissimi, frazioni di micrometro, attraverso lo spazio sinaptico fino a raggiungere l'altra cellula; al contrario, gli ormoni sono trasportati dal sangue raggiungendo organi distanti dalla loro sede di produzione, e possono percorrere metri prima di incontrare la loro cellula bersaglio. A parte questa differenza anatomica, i segnali chimici trasmessi dal sistema nervoso o dal sistema endocrino utilizzano meccanismi simili. L'adrenalina e la noradrenalina, per esempio, funzionano come neurotrasmettitori in alcune sinapsi del cervello e del muscolo liscio, e come ormoni nel controllo del metabolismo energetico del fegato e del muscolo. Nella nostra analisi dei sistemi di trasmissione dei segnali delle cellule porremo l'accento sull'azione degli ormoni e del sistema endocrino in genere, utilizzando nozioni apprese dalle discussioni

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precedenti sul metabolismo energetico. Per la maggior parte i meccanismi di base descritti sono gli stessi dei meccanismi d'azione dei neurotrasmettitori. La scoperta e la purificazione di un ormone richiedono la messa a punto di un sistema di dosaggio Come viene identificato e purificato un ormone? Per prima cosa bisogna scoprire in un tessuto un processo fisiologico che dipenda da un segnale che si è originato in un altro tessuto. L'insulina, per esempio, fu identificata per la prima volta come una sostanza prodotta nel pancreas capace di modificare il volume e la composizione dell'urina eliminata da un cane. Una volta scoperto il possibile effetto fisiologico dell'ormone, bisogna mettere a punto un sistema di dosaggio dell'ormone. Nel caso dell'insulina, il dosaggio consisteva nell'iniettare estratti di pancreas (una fonte grezza di insulina) in animali da laboratorio carenti di insulina, e nel quantificare poi le modificazioni dei livelli di glucosio nel sangue e nell'urina. Per isolare l'ormone gli estratti contenenti la sostanza in questione devono essere frazionati con le stesse tecniche usate per purificare altre biomolecole (frazionamento con solventi, cromatografia, elettroforesi), e in ogni frazione viene dosata l'attività ormonale. Una volta che la sostanza è stata purificata, si possono determinare la sua composizione chimica e la sua struttura. Questo protocollo per la caratterizzazione di un ormone sembra facile, ma non è così. Gli ormoni sono così potenti che vengono prodotti in quantità estremamente piccole. Ottenere una quantità di ormone sufficiente per una caratterizzazione chimica richiede molto spesso quantità enormi di materiale di partenza. Quando Roger Guillemin e Andrew Schally purificarono indipendentemente l'uno dall'altro e caratterizzarono l'ormone che provoca il rilascio della tirotropina (TRH) dall'ipotalamo, il gruppo di Schally utilizzò 20 tonnellate di ipotalami ottenuti da circa 2 milioni di pecore, mentre il gruppo di Guillemin utilizzò l'ipotalamo di circa 1 milione di maiali. Il TRH si dimostrò essere un semplice derivato del tripeptide Glu-Ris-Pro. Una volta stabilita la struttura dell'ormone, fu possibile sintetizzarlo chimicamente in grandi quantità per utilizzarlo in studi fisiologici e biochimici. Gli anticorpi specifici per gli ormoni rappresentano la base del dosaggio radioimmunologico (RIA). L'ormone purificato iniettato in un coniglio induce la produzione di anticorpi che possono legare l'ormone con altissima specificità e affinità. Quando una certa quantità di anticorpo viene incubata con l'ormone marcato con un radioisotopo, una parte dell'ormone radioattivo si lega all'anticorpo. Se oltre all'ormone marcato è presente anche l'ormone non marcato, Quest'ultimo potrà competere con una parte di quello radioattivo spostandolo dai siti di legame sull'anticorpo. Questa competizione può essere valutata creando una curva standard in funzione della quantità di ormone non marcato utilizzato. La quantità di ormone radioattivo che viene spostata dall'anticorpo è una misura della quantità di ormone non marcato presente nel campione di sangue o nell'estratto del tessuto. Usando un ormone contenente grandi quantità di radioisotopo è possibile ottenere sistemi di dosaggio sensibili a picogrammi di ormone. Gli ormoni agiscono attraverso specifici recettori cellulari ad alta affinità Abbiamo visto che tutti gli ormoni agiscono attraverso specifici recettori presenti nelle loro cellule bersaglio; gli ormoni si legano a queste molecole con elevata specificità e affinità. Ogni tipo di cellula ha la sua combinazione di recetori ormonali che definisce la sua capacità di rispondere a segnali extracellulari. Inoltre, due cellule con lo stesso tipo di receuore possono avere bersagli intracellulari diversi dell'azione dell'ormone e possono quindi rispondere allo stesso segnale in modo diverso. La specificità di azione di un ormone deriva dalla complementarità strutturale tra l'ormone e il suo recettore. Questa interazione è estremamente sensibile, consentendo a ormoni strutturalmente simili di avere effetti diversi; l'elevata affinità di questa interazione consente invece alla cellula di rispondere a basse concentrazioni di ormoni. Nella progettazione di farmaci destinati a intervenire sulla regolazione ormonale, è essenziale conoscere la specificità e l'affinità del farmaco rispetto a quella dell'ormone naturale. Si ricordi che l'affinità di un ormone per il suo recettore può essere misurata e determinata con il metodo di Scatchard, che in condizioni favorevoli permette di ottenere un valore quantitativo dell'affinità (la costante di dissociazione del complesso) e anche il numero di siti che legano l'ormone presenti sul recettore. Il sito dove il recettore e l'ormone interagiscono può avere una localizzazione extracellulare, citosolica o nucleare, a seconda del tipo di ormone. Gli effetti intracellulari dell'interazione ormone-recettore possono essere di sei tipi generali: (1) all'interno della cellula si genera un secondo messaggero (come il cAMP o l'inositolo trisfosfato), che agisce da effettore allosterico di uno o più enzimi; (2) un recettore ad attività tirosina chinasica viene attivato dall'ormone extracellulare; (3) un recettore guanilil ciclasico viene attivato, e produce il secondo messaggero cGMP; (4) una variazione del potenziale di membrana provoca l'apertura o la chiusura di un canale ionico controllato dall'ormone; (5) un recettore di adesione sulla superficie cellulare interagisce con molecole della matrice

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extracellulare e trasmette l'informazione al citoscheletro; (6) una molecola steroidea o similsteroidea provoca una variazione del livello di espressione (trascrizione del DNA in mRNA) di uno o più geni, mediata da un recettore ormonale nucleare. Gli ormoni amminici e peptidici solubili in acqua (per esempio adrenalina e insulina) agiscono dall'esterno delle loro cellule bersaglio legandosi ai loro recettori che attraversano la membrana plasmatica. Dopo il legame dell'ormone al suo dominio extracellulare, il recettore va incontro a una modificazione conformazionale analoga a quella prodotta in un enzima allosterico dal legame di una molecola effettrice. La modificazione conformazionale innesca gli altri effetti dell'ormone. Una singola molecola di ormone, formando un complesso ormone-recettore, attiva un catalizzatore che produce molte molecole di un secondo messaggero; quindi il recettore serve sia come trasduttore di segnali sia come amplificatore di segnali. Molti ormoni agiscono mediante una cascata di segnali, cioè una serie di tappe in ognuna delle quali viene attivato un catalizzatore, di conseguenza l'amplificazione del segnale originale è molto elevata. Un esempio di queste cascate è la regolazione della sintesi e della demolizione del glicogeno da patte dell'adrenalina. Per ogni molecola di adrenalina che si lega al suo recettore viene attivata una molecola di adenilil ciclasi, la quale produce molte molecole di cAMP. Questo secondo messaggero a sua volta attiva la proteina chinasi cAMP-dipendente (la proteina chinasi A), che attiva la glicogeno fosforilasi b chinasi, che a sua volta attiva la glicogeno fosforilasi b. Il risultato è un'amplificazione del segnale: una molecola di adrenalina determina quindi la formazione di molte molecole di glucosio 1-fosfato dal glicogeno. Gli ormoni non solubili in acqua (steroidi, retinoidi e ormoni tiroidei) attraversano facilmente la membrana plasmatica delle loro cellule bersaglio e raggiungono i loro recettori nel nucleo. Nel caso di questi ormoni è il complesso ormonerecettore che trasporta il messaggio; esso interagisce con il DNA e altera l'espressione di geni specifici, modificando i componenti enzimatici della cellula e quindi il suo metabolismo. Gli ormoni che agiscono mediante recettori presenti nella membrana plasmatica in genere innescano risposte biochimiche e fisiologiche molto rapide. Solo pochi secondi dopo la secrezione nel sangue dell'adrenalina da parte della midollare surrenale, il muscolo scheletrico risponde accelerando la demolizione del glicogeno. Al contrario, gli ormoni tiroidei e gli ormoni sessuali (steroidei) determinano la risposta massima nei loro tessuti bersaglio soltanto dopo alcune ore o addirittura dopo giorni. Queste differenze nei tempi di risposta corrispondono ai diversi modi d'azione usati dai vari ormoni. In generale gli ormoni ad azione rapida determinano la variazione dell'attività di uno o più enzimi preesistenti nella cellula, mediante meccanismi allosterici o mediante la loro modificazione covalente. Gli ormoni a risposta lenta alterano invece l'espressione genica, incrementando (upregulation) o diminuendo (downregulation) la sintesi delle proteine regolate. Gli ormoni sono chimicamente diversi Vi sono diverse classi di ormoni nei mammiferi, distinguibili in base alle loro strutture chimiche e ai loro meccanismi d'azione. Gli ormoni peptidici, gli ormoni amminici e gli eicosanoidi agiscono dall'esterno della cellula bersazlio attraverso recettori posti sulla superficie cellulare. Gli steroidi, la vitamina D, i retinoidi e gli ormoni tiroidei entrano nella cellula e agiscono mediante recettori nucleari. L'ossido di azoto entra anch'esso nella cellula, ma attiva un enzima citosolico, la guanilil ciclasi. Gli ormoni possono essere classificati anche in base al modo che essi utilizzano per passare dal punto di secrezione al tessuto bersaglio. Gli ormoni endocrini (dal greco éndon, all'interno, e krinein, secernere) sono secreti nel flusso sanguigno e trasportati alle cellule bersaglio attraverso tutto il corpo (l'insulina e il glucagone per esempio). Gli ormoni paracrini sono rilasciati nello spazio extracellulare da una cellula e diffondono verso cellule bersaglio vicine (sono di questo tipo gli ormoni eicosanoidi). Gli ormoni autocrini sono rilasciati da una cellula e producono il loro effetto sulla stessa cellula legandosi a recettori sulla sua superficie. I mammiferi non sono certamente gli unici ad avere sistemi ormonali di segnalazione. Gli insetti e i nematodi hanno sistemi molto sviluppati di regolazione ormonale, i cui meccanismi fondamentali sono simili a quelli dei mammiferi. Anche le piante usano segnali ormonali per coordinare le attività dei loro vari tessuti. Lo studio dell'azione degli ormoni nelle piante non è così avanzato come negli animali ma sappiamo che alcuni meccanismi sono condivisi. Ormoni peptidici Gli ormoni peptidici possono avere da 3 a più di 200 residui amminoacidici. Comprendono gli ormoni pancreatici insulina, glucagone e somatostatina, l'ormone paratiroideo, la calcitonina, e tutti gli ormoni dell'ipotalamo e dell'ipofìsi (descritti in seguito). Questi ormoni sono sintetizzati sui ribosomi sotto forma di precursori proteici più grandi (Proormoni), che vengono concentrati in vescicole di secrezione e trasformati nella forma attiva mediante scissione proteolitica. L'insulina è una piccola proteina (Mr 5800) con due catene polipeptidiche, dette A e B, unite da

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due ponti disolfuro. Viene sintetizzata nel pancreas sotto forma di precursore inattivo a catena singola, la preproinsulina, che ha una "sequenza segnale" amminoterminale che dirige il suo ingresso nelle vescicole di secrezione. La rimozione proteolitica della sequenza segnale e la formazione di tre ponti disolfuro producono la proinsulina, che viene conservata nei granuli di secrezione delle cellule β del pancreas. Quando un'elevata concentrazione di glucosio nel sangue stimola la secrezione di insulina, la proinsulina viene convertita nell'ormone attivo da proteasi specifiche che rompono due legami peptidici e generano la molecola dell'insulina matura e attiva. In alcuni casi le proteine proormonali generano un unico tipo di ormone peptidico attivo, ma spesso dalla molecola di precursore si possono ottenere diversi tipi di ormone attivo. La prooppiomelanocortina (POMC) è un ottimo esempio dei molti ormoni codificati da un unico gene. Il gene della POMC codifica un polipeptide molto grande che viene poi tagliato in almeno nove peptidi biologicamente attivi. I residui terminali degli ormoni peptidici sono spesso modificati, come nel TRH. La concentrazione di ormoni peptidici nei granuli di secrezione è così elevata che queste proteine si vengono a trovare quasi allo stato cristallino; quando il contenuto dei granuli viene rilasciato per esocitosi, una grande quantità di ormone viene liberata pressoché istantaneamente. l capillari che irrorano la ghiandola endocrina sono meno compatti dei capillari normali (e quindi più permeabili ai peptidi), per cui le molecole di ormone secreto passano rapidamente nel flusso sanguigno per essere trasportate alle cellule bersaglio. Come abbiamo già visto, tutti gli ormoni peptidici agiscono dall'esterno delle cellule bersaglio attraverso recettori posti sulla superficie esterna di queste cellule. Essi determinano la produzione di un secondo messaggero nel cìtosol con la conseguente modificazione dell attività di alcuni enzirni intracellulari che va ad alterare il quadro metabolico della cellula. Ormoni catecolamminici Gli ormoni idrosolubili adrenalina (epinefrina) e noradrenalina (norepinefrina) prendono il nome di catecolammine, in quanto sono strutturalmente correlate con il catecolo. Le catecolammine sono sintetizzate a partire dalla tirosina. Le catecolammine prodotte nel cervello e negli altri tessuti nervosi hanno funzioni di neurotrasmettitori, ma l'adrenalina e la noradrenalina sono sintetizzate e secrete anche dalla ghiandola surrenale e si comportano come ormoni. Come gli ormoni peptidici, le catecolammine sono immagazzinate in alte concentrazioni in vescicole di secrezione e sono rilasciate per esocitosi. Esse agiscono attraverso recettori di superficie, producendo secondi messaggeri e mediando varie risposte fisiologiche a stress acuti. Ormoni eicosanoidi Gli ormoni eicosanoidi (prostaglandine, trombossani e leucotrieni) derivano dall'acido arachidonico, un acido grasso poliinsaturo a 20 atomi di carbonio.

A differenza degli ormoni appena descritti, non sono sintetizzati in anticipo e poi conservati, ma sono prodotti solo quando necessari a partire dall'arachidonato, che viene rilasciato dai fosfolipidi di membrana a opera della fosfolipasi A2. Gli enzimi della via metabolica che porta alla formazione di prostagIandine e trombossani sono largamente distribuiti in tutti i tessuti di mammifero: la maggior parte delle cellule può produrre questi segnali, e le cellule di molti tessuti rispondono attraverso recettori specifici localizzati nella membrana plasmatica. Gli ormoni eicosanoidi sono ormoni paracrini, che vengono secreti nel fluido interstiziale all'esterno della cellula (e non nel sangue) e agiscono sulle cellule vicine. Ormoni steroidei Gli ormoni steroidei (gli ormoni della corteccia surrenale e gli ormoni sessuali) sono sintetizzati a partire dal colesterolo in diversi tessuti endocrini e vengono trasportati ai loro tessuti bersaglio attraverso il flusso sanguigno legati a proteine trasportatrici.

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Nella corteccia surrenale sono prodotti più di 50 ormoni corticosteroidei mediante reazioni che rimuovono la catena laterale dall'anello D del colesterolo e inseriscono nella molecola atomi di ossigeno per formare gruppi chetonici oppure ossidrilici. Molte di queste reazioni coinvolgono gli enzimi del complesso del citocromo P-450. In generale gli ormoni steroidei si possono dividere in due classi. I glucocorticoidi (come il cortisolo) agiscono di preferenza sul metabolismo dei carboidrati; i mineralcorticoidi (come I'aldosierone) regolano la concentrazione di elettroliti nel sangue. Gli androgeni (testosterone) e gli estrogeni (come l'estradiolo) sono sintetizzati rispettivamente nei testicoli e nelle ovaie. Alla loro sintesi partecipano gli enzimi del complesso del citocromo P-450, che rimuovono la catena laterale del colesterolo e introducono atomi di ossigeno. Essi controllano lo sviluppo e il comportamento sessuale e una varietà di altre funzioni, legate o meno alla riproduzione. Tutti gli ormoni steroidei agiscono tramite recettori nucleari e modificano l'espressione di specifici geni. Ormoni retinoidi I retinoidi sono ormoni potenti che regolano la crescita delle cellule, la sopravvivenza e il differenziamento mediante l'interazione con recettori nucleari. Il proormone retinolo viene sintetizzato dal β-carotene principalmente nel fegato, e molti tessuti convertono il retinolo nell'ormone acido retinoico (AR).

Ormoni tiroidei Gli ormoni tiroidei T4 (tiroxina) e T3 (triiodotironina) sono sintetizzati nella tiroide a partire dal precursore proteico tiroglobulina (Mr 660000), Più di 20 residui di Tyr della proteina sono iodinati enzimaticamente nella tiroide, in seguito due residui di iodiotirosina condensano per formare il precursore della tiroxina. Un processo proteolitico libera poi la tiroxina ogni volta che viene richiesta. La condensazione di un residuo di monoiodiotirosina con uno di diiodiotirosina forma, invece, l'ormone T 3 che viene rilasciato anch'esso nella forma attiva per proteolisi.

Gli ormoni tirodei stimolano il metabolismo che produce energia, in particolare nel fegato e nel muscolo, attivando, attraverso recettori nucleari, l'espressione di geni che codificano enzimi catabolici chiave. Una gerarchia di segnali ormonali e nervosi regola il rilascio degli ormoni I livelli diversi di specifici ormoni regolano processi cellulari specifici, ma che cosa regola i livelli degli ormoni? Una risposta semplice potrebbe essere che il sistema nervoso centrale riceve segnali da molti sensori interni ed esterni – segnali di pericolo, di rame, sull'assunzione di cibo, sulla composizione e la pressione del sangue, per esempio – e orchestra la produzione di appropriati segnali ormonali da parte dei diversi tessuti endocrini del corpo. Per avere una risposta più completa dobbiamo dare uno sguardo ai principali sistemi di produzione degli ormoni del corpo umano e ad alcune loro interconnessioni. L'ipotalamo, una piccola regione del cervello, è il centro di coordinazione del sistema endocrino; esso riceve e integra messaggi provenienti dal sistema nervoso centrale. In risposta a questi messaggi, l'ipotalamo produce ormoni regolatori (fattori di rilascio) che passano direttamente all'ipofisi anteriore attraverso speciali vasi sanguigni o attraverso i neuroni che uniscono le due ghiandole. L'ipofisi, o ghiandola pituitaria, è costituita da due parti funzionalmente distinte. L'ipofisi posteriore contiene terminazioni assoni che di molti neuroni il cui corpo cellulare è

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nell'ipotalamo. Questi neuroni producono i piccoli ormoni peptidici ossitocina e vasopressina, che si muovono lungo l'assone per raggiungere le terminazioni nervose nell'ipofisi, dove sono conservati in granuli di secrezione in attesa di un segnale per il loro rilascio. L'ipofisi anteriore risponde agli ormoni ipotalamici trasportati dal sangue producendo ormoni tropici o tropine. Questi peptidi relativamente lunghi attivano a loro volta un successivo gruppo di ghiandole endocrine che comprende le ghiandole surrenali, la tiroide, le ovaie e i testicoli. Queste ghiandole sono stimolate a secernere specifici ormoni, che sono poi portati dal sangue ai tessuti bersaglio. Per esempio, l'ormone che rilascia la corticotropina dall'ipotalarno stimola l'ipofisi anteriore a rilasciare ACTH, il quale stimola la zona fascicolata della corteccia surrenale e innesca il rilascio di cortisolo. Il cortisolo, I’ultimo ormone di questa cascata, agisce attraverso i suoi recettori su molti tipi di cellule alterando il loro metabolismo. Negli epatociti una delle azioni del cortisolo è l'aumento della velocità della gluconeogenesi. Le cascate ormonali come quelle responsabili del rilascio di cortisolo e di adrenalina generano una grande amplificazione del segnale iniziale e consentono una regolazione molto fine della secrezione dell'ormone finale. Ad ogni livello della cascata, un piccolo segnale innesca una risposta più grande. Per esempio, il segnale elettrico iniziale all'ipotalamo determina il rilascio di pochi nanogrammi dell'ormone che rilascia la corticotropina, che a sua volta innesca il rilascio di microgrammi di corticotropina. Quest'ultimo ormone agisce sulla corteccia surrenale e determina il rilascio di milligrammi di cortisolo, con un'amplificazione totale di almeno un milione di volte. Ad ogni livello di una cascata ormonale una delle tappe precedenti può andare incontro a inibizione retroattiva; un livello non necessariamente elevato dell'ormone finale o di un ormone intermedio inibisce il rilascio degli ormoni delle tappe precedenti a partire dall'ipotalamo o dall'ipofisi. Questi meccanismi a feedback raggiungono lo stesso fine dei meccanismi allosterici che limitano il flusso delle vie biosintetiche: un prodotto viene sintetizzato (o rilasciato) solo fino a che non viene raggiunta la concentrazione necessaria alla cellula.

Secondi messaggeri (cAMP, cGMP, IP3, Ca2+, NO) I recettori accoppiati alle proteine G e i secondi messaggeri Tre componenti essenziali definiscono la trasduzione del segnale tramite i recettori accoppiati alle proteine G (GPCR): un recettore localizzato sulla membrana plasmatica con sette eliche transmembrana, un enzima effettore, anch'esso localizzato nella membrana plasmatica, che genera un secondo messaggero intracellulare, e una proteina che lega i nucleotidi guanilici (proteina G) che attiva l'enzima effettore. La proteina G, stimolata dal recettore attivato, scambia il GDP col GTP; la proteina GTP si dissocia dal recettore e si lega a una proteina enzimatica localizzata nelle vicinanze, modulandone l'attività. Il genoma umano codifica circa 350 di questi recettori GPCR, che rispondono a ormoni, fattori di crescita ed altri ligandi endogeni. Sono probabilmente 500 i recettori GPCR che fungono da recettori olfattivi e gustativi. Il sistema recettoriale β-adrenergico agisce tramite un secondo messaggero, il cAMP L'adrenalina dà il segnale d'allarme quando, di fronte a un pericolo, l'organismo recluta i propri sistemi che generano energia; segnala la condizione di "combatti o fuggi". La sua azione ha inizio quando si lega ad un recettore proteico della membrana plasmatica di una cellula sensibile all'adrenalina. l recettori adrenergici sono di quattro tipi – α1, α2, β1 e β2 – definiti in base alle differenze di affinità e alle risposte ad un gruppo di agonisti e antagonisti. Gli agonisti sono analoghi strutturali che si legano ai recettori e mimano gli effetti del ligando naturale; gli antagonisti sono analoghi che si legano ai recettori, senza provocare alcun effetto, quindi bloccano l'effetto degli agonisti, ivi inclusi quelli del ligando naturale. In alcuni casi I'affinità dell'agonista sintetico o dell'antagonista per il recettore è più elevata di quella dell'agonista naturale. I quattro tipi di recettori adrenergici si trovano in differenti tessuti bersaglio, e mediano risposte differenti in risposta all'adrenalina. Noi rivolgeremo l'attenzione ai recettori β-adrenergici d l muscolo, del fegato e del tessuto adiposo. Queste risposte provocano variazioni nel metabolismo dei combustibili, ivi inclusa la degradazione del glicogeno e dei grassi. I recettori adrenergici β1 e β2 agiscono con uno stesso meccanismo, quindi col termine "β-adrenergico" ci si riferirà ad ambedue i tipi. Il recettore β-adrenergico è una proteina integrale di membrana, con 7 regioni idrofobiche di 20-28 residui amminoacidici che attraversano sette volte la membrana da un lato all'altro (da cui le seguenti due denominazioni alternative per i recettori GPCR: recettori a serpentina o recettori a sette eliche). II legame dell'adrenalina al sito specifico del recettore, in profondità sulla membrana plasmatica (tappa (1)) promuove una variazione conformazionale nel dominio intracellulare, che si ripercuote sulla interazione con la seconda proteina della via di trasduzione del segnale, la proteina G stimolatoria, o Gs, sul lato citoplamatico della membrana. Alfred Gilman e

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Martin Rodbeli hanno scoperto che la proteina G s attivata stimola la produzione di cAMP (AMP Ciclico) da parte dell'adenilato ciclasi sulla membrana plasmatica. La G s, la proteina prototipo delle proteine G che agiscono nella biosegnalazione, è un eterotrimero, formato da subunità α, β e γ. Quando il sito di legame della Gs (sulla subunità α) è occupato dal GTP, la Gs viene attivata, e a sua volta attiva l'adenilato ciclasi (AC); quando invece è occupato dal GDP, la Gs viene disattivata. Il recettore β-adrenergico attivato interagisce con la Gs, catalizzando lo scambio del GDP col GTP, e convertendo così la Gs nella sua forma attiva (tappa (2)). Le due subunità β e γ della Gs si dissociano dalla subunità α sotto forma di dimero β-γ, e la Gsα, col GTP legato, si sposta sul piano della membrana dal recettore ad una molecola vicina di adenilato ciclasi (tappa (3)). La G sα viene mantenuta legata alla membrana da un gruppo palmitoilico legato covalentemente. L'adenilil ciclasi è una proteina integrale della membrana plasmatica, col sito attivo rivolto verso la faccia citoplasmatica. L'associazione della Gsα con l'adenilil ciclasi attiva la ciclasi, che sintetizza il cAMP dall'ATP (tappa (4)), aumentando così la concentrazione citosolica del cAMP. L'interazione tra la G sα e l'adenilil ciclasi è possibile solo se le regioni "switch" della Gsα vengono esposte a seguito di una variazione conformazionale indotta dal GTP. Lo stimolo da parte della Gsα è limitato nel tempo; la Gsα è anche una GTPasi che inattiva se stessa, convertendo il GTP legato in GDP. La Gsα, ora inattiva, si dissocia dalla adenilil ciclasi, rendendo la ciclasi inattiva. La G sα si riassocia con il dimero βγ (Gsβγ), e la Gs inattiva è di nuovo disponibile per interagire con un recettore legato all'ormone. Una serie di proteine G agiscono in molti processi che coinvolgono la fusione o la scissione di membrana. L’AMP ciclico agisce da secondo messaggero per molte molecole regolatrici L'adrenalina è solo uno dei molti ormoni, fattori di crescita ed altre molecole regolatrici che agiscono variando la [cAMP] intracellulare, e quindi l'attività della PKA. Per esempio, il glucagone si lega ai suoi recettori sulla membrana plasmatica degli adipociti, attivando (tramite la proteina Gs) l'adenilato ciclasi. La PKA, stimolata dal conseguente aumento della [cAMP], fosforila e attiva due proteine coinvolte nella mobilizzazione degli acidi grassi dai depositi di grassi. Analogamente l'ormone peptidico ACTH (ormone adrenocorticotropo, detto anche corticotropina), prodotto dall'ipofisi anteriore, si lega a recettori specifici nella corteccia surrenale, attivando la adenilato ciclasi e promuovendo un aumento della [cAMP] intracellulare. La PKA quindi fosforila e attiva molti enzimi richiesti per la sintesi del cortisolo e di altri ormoni steroidei. In molti tipi cellulari, la subunità catalitica della PKA può anche raggiungere il nucleo, dove fosforila la proteina che lega l'elemento di risposta al cAMP (CREB), una proteina che altera l'espressione di geni specifici regolati dal cAMP. Alcuni ormoni agiscono inibendo l'adenilil ciclasi, quindi abbassando la [cAMP] e sopprimendo la fosforilazione delle proteine. Per esempio, il legame della somatostatina al suo recettore provoca l'attivazione di una proteina G inibitoria, o Gi, strutturalmente omologa alla G s, ma in grado di inibire l'adenilil ciclasi, provocando una diminuzione della [cΑMP]. La somatostatina quindi controbilancia l'effetto del glucagone. Nel tessuto adiposo, la prostaglandina E (PGE1), inibisce l'adenilil ciclasi, e quindi abbassa la [cAMP], rallentando la mobilizzazione delle riserve lipidiche attivata dall'adrenalina e dal glucagone. Ln altri tipi di tessuti la PGE1 stimola la sintesi del cAMP: i suoi recettori sono accoppiati alla adenilil ciclasi tramite proteine G stimolatrici, G s. Nei tessuti con recettori α2-adrenergici, l'adrenalina abbassa la [cAMP]; in questo caso i recettori sono accoppiati ad una adenilil ciclasi tramite una proteina G inibitoria, G, Quindi, un segnale extracellulare come l'adrenalina o la PGE1, può produrre effetti diversi a seconda del tipo di recettore presente nel tessuto, del tipo di proteina G (G s o Gi) con cui il recettore si accoppia, e del corredo di enzimi bersaglio della PKA presenti nella cellula o nel tessuto. Dalla sommatoria dei fattori che tendono ad aumentare o a diminuire la [cAMP], le cellule realizzano quella integrazione dei segnali che, come abbiamo già sottolineato, è uno dei caratteri generali più importanti dei meccanismi di trasduzione del segnale. Un quarto meccanismo, che spiega in che modo tipi diversi di segnale possano essere mediati da un singolo secondo messaggero (cAMP), consiste nel confinamento del processo di biosegnalazione in una specifica regione cellulare da parte delle proteine adattatrici, proteine che non possiedono attività catalitiche, ma che mantengono unite molecole proteiche che devono agire di concerto. Le AKAP (proteine che ancorano la chinasi A) sono proteine adattatrici multivalenti; con una porzione si legano alle subunità R della PKA, mentre con un'altra si legano alina specifica struttura della cellula, in tal modo confinando la chinasi in una determinata localizzazione cellulare. Per esempio, specifiche AKAP si legano ai microtubuli, ai filamenti di actina, ai canali ionici, al nucleo. Differenti tipi di cellule possiedono differenti complementi di AKAP, in modo che il cAMP può stimolare la fosforilazione di proteine mitocondriali in una cellula, oppure di filamenti di actina in un'altra. In certi casi una AKAP connette la PKA con l'enzima che provoca la sua attivazione (l'adenilil ciclasi), oppure con l'enzima che diminuisce la sua attività (come la cAMP fosfodiesterasi o la fosfoproteina fosfatasi). La stretta vicinanza di questi enzimi attivatori e disattivatori presumibilmente comporta una risposta molto breve e localizzata. Vedremo che alcune proteine di segnalazione

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legate alle membrane (compresa l'adenilato ciclasi) sono localizzate in specifiche aree delle membrane dette "zattere" ("rafts") o caveole. È evidente che, per poter comprendere in modo soddisfacente i meccanismi della segnalazione cellulare, i ricercatori necessitano di tecniche idonee a individuare e studiare gli aspetti spazio-temporali dei processi di segnalazione a livello subcellulare e in tempo reale. Negli studi sulla localizzazione intracellulare di questi eventi, la biochimica si incontra con la biologia cellulare. Le tecniche che oltrepassano i confini tra queste due discipline stanno diventando essenziali per comprendere appieno la biosegnalazione. Per esempio, sono oggi ampiamente utilizzate sonde fluorescenti. Marcando proteine funzionali con fluorofori, ad esempio con la proteina fluorescente verde (GFP) , si possono studiare le loro localizzazioni subcellulari. I cambiamenti dello stato di associazione di due proteine (per esempio delle subunità R e C della PKA) possono essere osservati misurando il trasferimento non radioattivo dell'energia tra sonde fluorescenti legate a ciascuna proteina, una tecnica chiamata trasferimento di energia di fluorescenza per risonanza (FRET). Ca2+, IP3, NO Il calcitriolo lavora di concerto con l'ormone paratiroideo nell'omeostasi del calcio, regolando la concentrazione del Ca2+ nel sangue e l'equilibrio della deposizione di calcio e la sua mobilizzazione dalle ossa. Mediante l'interazione con recettori nucleari, il calcitriolo attiva la sintesi di una proteina che lega il calcio nell'intestino, essenziale per il recupero del Ca2+ presente nella dieta. Un apporto inadeguato di vitamina D nella dieta o un difetto nella sintesi di calcitriolo portano a malattie piuttosto serie come il rachitismo, in cui le ossa sono deboli e malformate. Alcune GPCR agiscono tramite la fosfolipasi Cdella membrana plasmatica, che scinde il PIP 2 a diacilglicerolo e IP3, che apre i canali del Ca2+ del reticolo endoplasmatico ed aumenta la [Ca 2+] citoplasmatica. Il diacilglicerolo e il Ca2+ agiscono insieme, per attivare la proteina chinasi C, che fosforila specifiche proteine cellulari modificandone l’attività. La [Ca 2+] regola attraverso la calmodulina molti altri enzimi e proteine coinvolte nella secrezione, nel modellamento del citoscheletro e nella contrazione. L'ossido di azoto (NO) è un radicale libero relativamente stabile sintetizzato a partire dall'ossigeno molecolare e dall'azoto guanidinico dell'arginina in una reazione catalizzata dalla NO sintasi. Questo enzima è presente in molti tessuti e in diversi tipi di cellule: neuroni, macrofagi, epatociti, cellule del muscolo liscio, cellule epiteliali dei vasi sanguigni e cellule epiteliali del rene. L'NO agisce vicino ai suoi punti di sintesi e di rilascio, entrando nelle cellule bersaglio e attivando l'enzima citosolico guanilil ciclasi, che catalizza la formazione del secondo messaggero cGMP.

Il sangue e le interazioni metaboliche tra gli organi

Nei mammiferi vi è una divisione del lavoro metabolico tra organi e tessuti specializzati. Il fegato è deputato alla distribuzione e alla modificazione delle sostanze nutritive. Gli zuccheri e gli amminoacidi prodotti durante la digestione attraversano l’epitelio intestinale ed entrano nel sangue, che li trasporta poi al fegato. Una parte dei triacilgliceroli ingeriti con la dieta arriva al fegato, dove gli acidi grassi presenti in queste molecole lipidiche è utilizzata per processi diversi. Il glucosio 6-fosfato è intermedio fondamentale del metabolismo dei carboidrati. Può essere polimerizzato a glicogeno, defosforilato a glucosio nel sangue oppure convertito in acidi grassi, via acetil-CoA. Ancora, può essere degradato nella glicolisi, nel ciclo dell’acido citrico e nella catena respiratoria per formare ATP, o nella via del pentosio fosfato per prdurre pentosi e NADPH. Gli amminoacidi sono utilizzati per sintetizzare le proteine epatiche e plasmatiche, oppure i loro scheletri carboniosi possono essere convertiti in glucosio e glicogeno nella gluconeogenesi; l’ammoniaca formata dalla loro deamminazione viene trasforamata in urea. Nel fegato gli acidi grassi possono essere convertiti in triacilgliceroli, fosfolipidi o in colesterolo e nei suoi esteri; questi composti sono trasportati dalle lipoproteine plasmatiche al tessuto adiposo dove sono immagazzinati. Gli acidi grassi possono anche essere ossidati per generare ATP o formare corpi chetonici da inviare attraverso il circolo sanguigno agli altri tessuti. Il tessuto adiposo bianco conserva grandi quantità di triacilgliceroli, che poi rilascia nel sangue in risposta all’adrenalina o al glucagone. Il tessuto adiposo bruno è specializzato per la termogenesi che deriva dall’ossidazione degli acidi grassi in mitocondri disaccoppiati.

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Il muscolo scheletrico è specializzato nella produzione di ATP da utilizzare per generare lavoro meccanico. Durante un’attività muscolare intensa, il glicogeno diventa la fonte principale di combustibili metabolici, generando ATP attraverso la fermentazione lattica. Durante la fase di recupero il lattato viene rivonvertito in glicogeno e glucosio nel fegato ad apera della gluconeogenesi. La fosfocreatina è una fonte immediata di ATP durante la contrazione. Il cuore ricava quasi tutto l’ATP di cui ha bisogno dalla fosforilazione ossidativa. I neuroni del cervello utilizzano come combustibili metabolici soltanto il glucosio ed il β-idrossibutirrato; quest’ultimo è importante durante un periodo di digiuno prolungato. Il cervello utilizza la maggior parte della sua energia sotto forma di ATP per il trasporto attivo degli ioni Na + e K+ per mantenere il potenziale elettrico delle membrane neuronali. Il sangue trasporta nutrienti, prodotti di scarto e segnali ormonali a tutti i tessuti e organi. La concentrazione di glucosio nel sangue è regolalta dagli ormoni. Fluttuazioni della concentrazione di glucosio nel sangue (normale ~60-90mg/100ml), dovute all’assunzione di zucchero con la dieta o a un esercizio fisico prolungato sono controbilanciate da variazioni indotte dagli ormoni del metabolismo di alcuni organi. Concentrazioni elevate di glucosio nel sangue determinano la secrezione di insulina, che incrementa la velocità di assunzione del glucosio da parte dei tessuti e favorisce il deposito dei combustibili metabolici sotto forma di glicogeno o di triacilgliceroli, mentre inibisce la mobilizzazione degli acidi grassi nel tessuto adiposo. Una bassa concentrazione di glucosio determina la secrezione di glucagone, che stimola il rilascio di glucosio dal fegato e modifica il metabolismo del fegato e del muscolo scheletrico, che cominciano a utilizzare acidi grassi risparmiando il glucosio per il cervello. Nel digiuno prolungato, i triacilgliceroli diventano la principale sostanza nutritiva; il fegato converte gli acidi grassi in corpi chetonici, che esporta agli altri tessuti, fra quali il cervello. L’adrenalina prepara il corpo ad un aumento dell’attività fisica mobilizzando il glucosio dal glicogeno e da altri precursori e riversandolo nel sangue. Il cortisolo, rilasciato in risposta a vari tipi di stress tra cui anche una bassa concentrazione di glucosio nel sangue, stimola la gluconeogenesi nel fegato a partire da amminoacidi e da glicerolo, generando un aumento della concentrazione di glucosio nel sangue e controbilanciando l’effetto dell’insulina. Nei diabetici l’insulina non viene prodotta o non viene riconosciuta dai tessuti, per cui è compromesso il trasporto del glucosio dal sangue ai tessuti. Quando la concentrazione del glucosio nel sangue è molto alta, lo zucchero viene escretto nelle urine. I tessuti dipendono, quindi, dagli acidi grassi per la produzione di energia (con formazione di corpi chetonici) e degradano le proteine cellulari per produrre glicogeno dagli amminoacidi glicogenici. Il diabete non controllato è caratterizzato da alti livelli di glucosio nel sangue e nelle urine e dalla produzione ed escrezione di corpi chetonici.

) I cicli anfibolici e la fosforilazione ossidativa Struttura e funzione del mitocondrio La scoperta effettuata nel 1948 da Eugene Kennedy e da AIbert Lehninger che negli eucarioti i mitocondri sono il compartimento cellulare in cui avviene la fosforilazione ossidativa rappresenta storicamente l'inizio degli studi più approfonditi sulla trasduzione energetica nei sistemi biologici. l mitocondri, come i batteri gram-negativi, hanno due membrane. La membrana mitocondriale esterna è facilmente permeabile a piccole molecole (Mr C1; Z è il valore assoluto della sua carica elettrica (1 per un protone); Δψ è la differenza di potenziale elettrico transmembrana, misurata in volt. Nel caso dei protoni a 25°C,

e l'Equazione 19.8 si riduce a

Durante un'intensa respirazione mitocondriale, il Δψ è stato valutato tra 0,15 V e 0,2 V e il pH della matrice è di circa 0,75 unità più alcalino rispetto a quello dello spazio intermembrana. Quando i protoni fluiscono spontaneamente secondo il loro gradiente elettrochimico, questa energia viene resa disponibile per produrre lavoro. Nei mitocondri, nei cloroplasti e nei batteri aerobici, l'energia elettrochimica del gradiente protonico porta alla sintesi di ATP da ADP e P i. Ritomeremo nella reazione 19.2 sugli aspetti energetici e sulla stechiometria della sintesi di ATP dovuta al potenziale elettrochimico del gradiente protonico. Durante la fosforilazione ossidativa si generano specie reattive dell' ossigeno: Durante alcune delle tappe del trasferimento degli elettroni fino all'ossigeno sono prodotti radicali liberi fortemente reattivi, che possono danneggiare la cellula. Durante il trasferimento degli elettroni dal QH 2 al Complesso III e dal Complesso I al QH2 si

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forma come intermedio il radicale °Q -. Il °Q- può passare un elettrone all'O2, anche se la probabilità che questo trasferimento possa accadere non è elevata Il radicale libero superossido generato si è estremamente reattivo; la sua formazione porta a sua volta alla formazione di un altro radicale libero, ancora più reattivo, il radicale libero ossidrilico °OH. Queste specie reattive dell'ossigeno così generate sono fortemente distruttive, poiché reagiscono e danneggiano enzimi, Iipidi di membrana e acidi nucleici. Nei mitocondri che respirano attivamente, dallo 0,1 % fino al 4% dell'ossigeno utilizzato nella respirazione forma °O 2-, una quantità più che sufficiente per provocare effetti letali, a meno che il radicale libero non venga inattivato. I fattori che diminuiscono la velocità del flusso attraverso la catena respiratoria aumentano la formazione del superossido, forse prolungando il tempo di emivita dell’°O 2- generato nel ciclo Q. Per prevenire gli effetti dannosi dell’°O 2- le cellule dispongono di diverse forme dell'enzima superossido dismutasi, che catalizza la reazione La detossicazione del perossido di idrogeno (H 2O2) così generato viene effettuata dalla glutatione perossidasi. La glutatione reduttasi ricicla il glutatione ossidato trasformandolo nella sua forma ridotta, utilizzando gli elettroni del NADPH che si formano per azione della nicotinammide nucleotide transidrogenasi (nei mitocondri) o attraverso la via del pentosio fosfato (nel citosol). Il glutatione ridotto ha anche la funzione di mantenere allo stato ridotto i gruppi sulfidrilici delle proteine, prevenendo alcuni degli effetti indesiderati dello stress ossidativo. La nicotinammide nucleotide transidrogenasi ha un ruolo critico in questo processo di detossicazione, in quanto produce il NADPH essenziale per l'attività della glutatione reduttasi. I mitocondri delle piante possiedono meccanismi alternativi per ossidare il NADH: I mitocondri delle piante forniscono ATP durante i periodi di scarsa illuminazione o di buio con meccanismi analoghi a quelli usati dagli organismi non fotosintetici. Alla luce, la principale fonte di NADH mitocondriale è rappresentata da una reazione in cui la glicina prodotta dalla fotorespirazione viene convertita in serina: Per ragioni che esamineremo più avanti, le piante possono effettuare questo processo anche quando non hanno bisogno di NADH per produrre ATP. Per rigenerare NAD + dal NADH che non può essere più utilizzato, i mitocondri delle piante trasferiscono gli elettroni dal NADH all'ubichinone e da questo direttamente all'ossigeno, scavalcando i Complessi III e IV e le loro pompe protoniche. L'energia presente nelle molecole di NADH viene dissipata in calore, che talvolta può essere utile per le piante. Diversamente dalla citocromo ossidasi (Complesso IV), l'alternativa QH 2 ossidasi non viene inibita dal cianuro. L’ossidazione del NADH cianuro-resistente rappresenta quindi la peculiarità di questa via di trasferimento elettronico esclusiva delle piante.

Ciclo di Krebs Come abbiamo già visto, alcune cellule ottengono energia (ATP) tramite la fermentazione, demolendo il glucosio in assenza di ossigeno. Per la maggioranza delle cellule eucariotiche e per molti batteri che vivono in condizioni aerobiche ed ossidano i loro combustibili organici ad anidride carbonica e acqua, la glicolisi è solo la prima fase della completa ossidazione del glucosio. lnvece di essere ridotto a lattato, etanolo o a qualche altro prodotto della fermentazione, il piruvato prodotto dalla glicolisi viene ulteriormente ossidato ad H 2O e CO2. Questa fase aerobica del catabolismo è chiamata respirazione. ln senso più fisiologico il termine respirazione si riferisce ad un'assunzione di O 2 e al rilascio di CO2 da parte degli organismi multicellulari. Però i biochimici e i biologi cellulari usano questo termine per indicare quei processi molecolari attraverso i quali le cellule consumano O 2 per produrre CO2, processi più precisamente denominati respirazione cellulare. La respirazione cellulare si svolge in tre fasi principali. Nella prima, le molecole organiche, come il glucosio, gli acidi grassi e alcuni amminoacidi, vengono ossidate per produrre frammenti a due atomi di carbonio, nella forma del gruppo acetilico inserito nell'acetil-coenzima A (acetil-CoA). Nella seconda fase, i gruppi acetilici entrano nel ciclo di Krebs, che li ossida enzimaticamente a CO 2; l'energia liberata viene conservata come NADH o FADH 2, le forme ridotte di questi trasportatori di elettroni. Nella terza fase della respirazione, i coenzimi ridotti vengono riossidati liberando elettroni (H+) e protoni. Gli elettroni vengono trasferiti all'O2, il loro accettore finale, attraverso una serie di molecole trasportatrici di elettroni, conosciuta come catena respiratoria. Nel corso del trasferimento di elettroni, una parte notevole dell'energia rilasciata viene conservata sotto forma di ATP, tramite un processo chiamato fosforilazione ossidativa. La respirazione è più complessa della glicolisi e si pensa che si sia evoluta molto più tardi, dopo la comparsa

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dei cianobatteri. Le attività metaboliche dei cianobatteri spiegano l'aumento dei livelli di ossigeno nell'atmosfera terrestre, un processo determinante nella storia dell'evoluzione. Consideriamo dapprima la conversione del piruvato in gruppi acetilici e quindi l'entrata di questi nel ciclo dell'acido citrico, detto anche ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA) o ciclo di Krebs. Esamineremo poi le reazioni del ciclo e le proprietà degli enzimi che le catalizzano. Poiché alcuni intermedi del ciclo dell'acido citrico possono abbandonare il ciclo, essendo precursori in altre vie biosintetiche, prenderemo poi in esame alcune delle vie metaboliche che li risintetizzano. Il ciclo dell'acido citrico è un crocevia del metabolismo, su cui convergono vie degradative e da cui partono vie biosintetiche; quindi la sua attività deve essere strettamente coordinata con quella delle altre vie metaboliche. Il capitolo termina con la trattazione del ciclo del gliossilato, una via metabolica che in alcuni organismi utilizza enzimi che catalizzano reazioni del ciclo dell'acido citrico e consente la sintesi netta di glucosio dai triacilgliceroli di riserva. Produzione di acetil-CoA (acetato attivato): Negli organismi aerobici il glucosio e gli altri zuccheri, gli acidi grassi e la maggior parte degli amminoacidi sono ossidati a CO 2 e H2O attraverso il ciclo dell'acido citrico e la catena respiratoria. Prima di poter entrare nel ciclo, lo scheletro carbonioso degli zuccheri e degli acidi grassi deve essere degradato al gruppo acetilico dell'acetil-CoA, la forma con cui il ciclo accetta la maggior parte del combustibile metabolico. Anche gli atomi di carbonio di molti amminoacidi entrano in questo modo nel ciclo; altri amminoacidi sono invece degradati in intermedi del ciclo diversi dall'acetil-CoA. Analizzeremo ora come il piruvato, derivato dal glucosio ad opera della glicolisi, viene ossidato ad acetil-CoA e CO 2 ad opera di un gruppo di tre enzimi organizzati nel complesso della piruvato deidrogenasi (PDH), un insieme di tre enzimi, ciascuno dei quali rappresentato in più copie, localizzato nei mitocondri delle cellule eucariotiche e nel citosol delle cellule procariotiche. Possiamo considerare questo complesso enzimatico sotto diversi aspetti. Il complesso della piruvato deidrogenasi è un classico esempio, molto ben caratterizzato, di un complesso multienzimatico in cui una serie di intermedi chimici rimangono legati alle molecole enzimatiche fino a che il substrato non è stato trasformato nel prodotto finale. Al meccanismo di questa reazione partecipano cinque cofattori, di cui quattro derivati dalle vitamine. La regolazione di questo complesso è un altro esempio di come la combinazione tra modificazione covalente e regolazione allosterica sia in grado di modulare in modo preciso il flusso attraverso una tappa metabolica. Infine, il complesso della piruvato deidrogenasi è il prototipo di altri due complessi enzimatici importanti che incontreremo in seguito: l'α-chetoglutararo deidrogenasi (del ciclo dell'acido citrico) e l'α-chetoacido deidrogenasi dei chetoacidi a catena ramificata, coinvolta nella degradazione ossidativa di alcuni amminoacidi. La notevole somiglianza nella struttura proteica, nella richiesta di cofattori e nel meccanismo di reazione tra questi complessi riflette senza dubbio un'origine evolutiva comune. Il piruvato viene ossidato ad acetil-CoA e CO 2: La reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi è una decarbossilazione ossidativa, un processo di ossidazione irreversibile in cui il gruppo carbossilico viene rimosso dal piruvato sotto forma di una molecola di CO 2, e i due atomi di carbonio che restano diventano il gruppo acetilico legato al coenzima A. Il NADH formato in questa reazione porta uno ione idruro con i suoi due elettroni (:H-) alla catena respiratoria, che li trasporta poi all'ossigeno o, nei microrganismi anaerobici, a un accettore di elettroni alternativo come un nitrato o un solfato. Il trasferimento degli elettroni all'ossigeno produce 2,5 molecole di ATP per coppia di elettroni. L'irreversibilità della reazione della piruvato deidrogenasi è stata dimostrata anche con esperimenti di marcatura isotopica: la CO2 marcata non può riattaccarsi all'acetil-CoA per formare piruvato con il gruppo carbossilico marcato. Il complesso della piruvato deidrogenasi richiede cinque coenzimi distinti: La deidrogenazione e la decarbossilazione combinata del piruvato ad acetil-CoA coinvolgono l'azione sequenziale di tre enzimi diversi e di cinque gruppi prostetici o coenzimi: la tiamina pirofosfato (TPP) , il flavin adenin dinucleotide (FAD), il coenzima A (CoA, talvolta indicato come CoA-SH, per porre in evidenza il ruolo del gruppo -SH) , il nicotinammide adenin dinucleotide (NAD) ed il lipoato. Ben quattro vitamine che devono essere assunte con l'alimentazione sono elementi essenziali di questo sistema: la tiamina (per la TPP), la riboflavina (per il FAD), la macina (per il NAD) e il pantotenato (per il coenzima A). Abbiamo già incontrato ed esaminato le funzioni biologiche del FAD e del NAD come trasportatori di elettroni; abbiamo anche già osservato il ruolo della TPP come coenzima della piruvato decarbossilasi. Il coenzima A ha un gruppo reattivo tiolico (-SH) essenziale per la sua funzione di trasportatore di gruppi acilici in un certo numero di reazioni metaboliche. I gruppi acilici formano legami tioestere, quando si legano covalentemente al gruppo tiolico del coenzima A. Data la loro elevata energia libera di idrolisi, i tioesteri hanno un elevato potenziale di trasferimento del gruppo acilico a una grande varietà di molecole accettrici. Il gruppo acilico legato al coenzima A può quindi essere considerato come una forma "attivata" pronta per il trasferimento del gruppo.

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Il quinto cofattore della reazione della piruvato deidrogenasi, il lipoato, ha due gruppi tiolici che possono essere ossidati in modo reversibile e formare un ponte disolfuro (-S-S-) simile a quello che si genera tra due residui di Cys in una proteina. Data la sua capacità di andare incontro a reazioni di ossidoriduzione, il lipoato, come vedremo, può servire sia come trasportatore di elettroni sia come trasportatore di acili. Il complesso della piruvato deidrogenasi è costituito da tre enzimi distinti: Il complesso della piruvato deidrogenasi (PDH) è costituito da molte copie di tre enzimi: la piruvato deidrogenasi (E1), la diidrolipoil transacetilasi (E2) e la diidrolipoil deidrogenasi (E3). Il numero di copie di ogni subunità, quindi la dimensione del complesso, varia da un organismo all'altro. Il complesso della PDH isolato dai mammiferi ha un diametro di circa 50nm, cinque volte più grande dell'intero ribosoma e quindi osservabile direttamente al microscopio elettronico. Nell'enzima bovino, 60 copie identiche di E2 sono disposte a formare un dodecaedro pentagonale (il nucleo) che ha un diametro di circa 25nm. (Il nucleo dell'enzima di Escherichia coli contiene 24 copie di E 2.) Sull' E2 si lega il gruppo prostetico lipoato tramite un legame ammidico con il gruppo e-amminico di un residuo di Lys. E 2 presenta tre domini funzionali distinti: il dominio lipoitico amminoterminale che contiene uno o più residui di lipoil-lisina; il dominio centrale di legame ad E 1 ed E3; e il dominio interno aciltrasferasico che contiene il sito attivo. Il complesso PDH del lievito ha un solo dominio lipoilico con attaccato un lipoato, mentre nel complesso dei mammiferi ve ne sono due e in E. coli tre. Nell'E 2 i domini sono separati da sequenze di collegamento di 20-30 residui amminoacidici ricche di residui di alanina e prolina e costellate di residui carichi; queste sequenze di collegamento tendono ad assumere la forma allungata tenendo lontani i tre domini l'uno dall'altro. Il sito attivo di E1 contiene la TPP, mentre quello di E3 ha legato a sé il FAD. Fanno parte del complesso anche due proteine regolatrici, una proteina chinasi e una fosfoproteina fosfatasi, di cui parleremo successivamente. Questa struttura di base E1-E2-E3 è stata conservata nel corso dell'evoluzione e utilizzata in numerose reazioni metaboliche simili, compresa l'ossidazione dell'α-chetoglutarato nel ciclo dell'acido citrico (descritta di seguito) e l'ossidazione degli α-chetoacidi prodotti durante il catabolismo degli amminoacidi ramificati valina, isoleucina e leucina. In una data specie, l'E3 del complesso PDH è identico all'E 3 degli altri due complessi enzimatici. Il legame del lipoato all'estremità della catena laterale di un residuo di lisina di E 2 produce un braccio lungo e flessibile che si può spostare dal sito attivo di E1 ai siti attivi di E2 ed E3, una distanza pari a 5 nm o più. Durante l'incanalamento dei substrati, gli intermedi non abbandonano mai la superficie dell'enzima: La tappa (1) è essenzialmente identica alla reazione catalizzata dalla piruvato decarbossilasi; l'atomo C-1 del piruvato viene rilasciato sotto forma di CO2 e l'atomo C-2, che nel piruvato ha lo stato di ossidazione di un'aldeide, viene legato alla TPP come gruppo idrossietilico. Questa prima tappa è la più lenta e quindi è quella che limita la velocità dell'intero processo; essa è anche il punto in cui il complesso PDH esercita la sua specificità di substrato, nella tappa (2) , il gruppo idrossietilico viene ossidato a livello di acido carbossilico (acetato). I due elettroni rimossi nella reazione vanno a ridurre il ponte -S-S- del gruppo lipoilico sull'E 2 formando due gruppi tiolici (-SH). II residuo acetilico in questa reazione di ossidoriduzione viene prima esterificato su uno dei due gruppi -SH del gruppo lipoilico e poi transesterificato al CoA, formando acetil-CoA (tappa (3)). Quindi, l'energia dell'ossidazione guida la formazione di un tioestere ad alta energia dell'acetato. La restante parte della reazione catalizzata dal complesso PDH (da E 3, tappe (4) e (5)) è una serie di trasferimenti elettronici necessari a rigenerare la forma ossidata a disolfuro del gruppo lipoilico dell'E 2 e a preparare il complesso per un altro ciclo di ossidazione. Gli elettroni rimossi dal gruppo idrossietilico derivato dal piruvato passano al NAD+, transitando prima attraverso il FAD. Il punto centrale di questo processo è rappresentato dal braccio mobile lipoil-lisinico dell'E2, che accetta dall'E1 i due elettroni e il gruppo acetile derivati dal piruvato, e quindi passa gli elettroni all'E3. Tutti gli enzimi e i coenzimi sono raggruppati insieme, consentendo agli intermedi di reagire facilmente e senza dover diffondere fuori dalla superficie di questo complesso enzimatico. Gli intermedi della sequenza a molte tappe non si allontanano mai dal complesso e la concentrazione locale d l substrato di E 2 viene mantenuta molto elevata. L'incanalamento evita anche la sottrazione del gruppo acetilico attivato da parte di altri enzimi di cui può essere un substrato. Come vedremo, un simile meccanismo di incanalamento del substrato tra i siti attivi viene usato in altri enzimi che utilizzano cofattori come lipoato, biotina o un'unità simile al CoA. Reazioni del ciclo dell'acido citrico: Siamo ora pronti a esaminare il processo di ossidazione dell'acetil-CoA, ossia il ciclo dell'acido citrico, la prima via metabolica ciclica da noi presa in esame. Per iniziare un giro del ciclo, l'acetil-CoA dona il suo gruppo acetilico all'ossalacetato, un composto a quattro atomi di carbonio, formando il citrato a sei atomi di carbonio. Il citrato viene poi trasformato in isocitrato, anch'esso a sei atomi di carbonio, che viene deidrogenato con perdita di CO2, producendo il composto a cinque atomi di carbonio α-chetoglutarato (detto anche ossoglutarato). Quesl'ultimo perde un'altra molecola di CO 2 per formare il succinato, un composto a quattro atomi di carbonio. Il succinato viene convertito enzimaticamente in tre tappe in ossalacetato, il composto a quattro atomi di carbonio con

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cui era iniziato il ciclo. L'ossalacetato è ora di nuovo pronto a reagire con un'altra molecola di acetil-CoA per iniziare un secondo giro del ciclo. In ogni giro del ciclo entra un gruppo acetilico (due atomi di carbonio) sotto forma di acetil-CoA ed escono due molecole di CO2. In ogni giro viene utilizzata una molecola di ossalacetato per formare il citrato, ma – dopo una serie di reazioni – l'ossalacetato viene rigenerato. Quindi, non vi è un consumo netto di ossalacetato e una molecola di ossalacetato è in teoria sufficiente a ossidare un numero infinito di gruppi acetilici. L’ossalacetato infatti è presente nella cellula in basse concentrazioni. Quattro delle otto tappe di questo processo sono ossidazioni, in cui l'energia dell'ossidazione viene conservata con un alto grado di efficienza mediante la formazione dei coenzimi ridotti NADH e FADH2. Come già detto, anche se il ciclo dell'acido citrico è la via metabolica principale per la produzione di energia, il suo ruolo non si limita alla conservazione dell'energia chimica. Gli intermedi a quattro e a cinque atomi di carbonio del ciclo sono anche precursori biosintetici per vari composti. Per rimpiazzare gli intermedi utilizzati per altri scopi, le cellule si servono di reazioni anaplerotiche (di riempimento), che saranno descritte più avanti. L'intera serie di reazioni del ciclo dell'acido citrico aveva luogo nei mitocondri. I mitocondri isolati contenevano non soltanto tutti gli enzimi e i coenzimi necessari al ciclo dell'acido citrico, ma anche tutti gli enzimi e le proteine necessari alla fase successiva della respirazione cellulare, cioè il trasferimento degli elettroni e la sintesi di ATP tramite la fosforilazione ossidativa. I mitocondri contengono anche gli enzimi che catalizzano l'ossidazione degli acidi grassi ad acetil-CoA e la degradazione ossidativa di alcuni amminoacidi ad acetil-CoA e di altri a ossalacetato, succinil-CoA o αchetoglutarato. Quindi, negli eucarioti non fotosintetici il mitocondrio è la sede in cui avvengono le reazioni di ossidazione che producono energia e in cui si ha la sintesi di ATP accoppiata a queste reazioni. Negli eucarioti fotosintetici i mitocondri sono la sede principale di produzione di ATP al buio, ma alla luce solare i principali produttori di ATP diventano i cloroplasti. La maggior parte dei batteri contengono gli enzimi del ciclo dell'acido citrico nella loro frazione citosolica, e la loro membrana plasmatica ha una funzione analoga a quella della membrana interna del mitocondrio per quanto riguarda la sintesi di ATP. Il ciclo dell'acido citrico comprende otto tappe: Nell'esaminare le otto reazioni che costituiscono il ciclo dell'acido citrico, porremo un accento particolare sulle trasformazioni chimiche a cui va incontro il citrato che si è formato dall'acetil-CoA e dall'ossalacetato, quando viene ossidato per generare CO 2 e l'energia dell'ossidazione viene conservata sotto forma dei coenzimi ridotti NADH e FADH 2. (1) Formazione del citrato La prima reazione del ciclo è la condensazione dell'acetil-CoA con l'ossalacetato per formare citrato, reazione catalizzata dalla citrato sintasi.

In questa reazione l'atomo di carbonio metilico del gruppo acetilico si lega al gruppo carbonilico (C-2) dell'ossalacetato. Il citril-CoA è un intermedio transitorio che si forma sul sito attivo dell'enzima e va incontro a una rapida idrolisi, producendo CoA libero e citrato, che sono poi rilasciati dal sito attivo. L'idrolisi di questo intermedio tioestere ad elevata energia rende la reazione di scissione fortemente esoergonica. La variazione di energia libera standard della reazione catalizzata dalla citrato sintasi è essenziale per il funzionamento del ciclo, perché, come si è detto prima, la concentrazione dell'ossalacetato normalmente è molto bassa. Il CoA liberato in questa reazione viene riciclato e può partecipare alla decarbossilazione ossidativa di un'altra molecola di piruvato da parte del complesso della piruvato deidrogenasi. La citrato sintasi nei mitocondri è stata cristallizzata e la sua struttura analizzata ai raggi X in presenza e in assenza dei suoi substrati e inibitori. Ciascuna subunità dell'enzima omodimerico è costituita da un singolo polipeptide con due domini, uno grande e rigido, l'altro più piccolo e flessibile; il sito attivo si trova tra i due domini. L'ossalacetato, il primo substrato che si lega all'enzima, induce un'estesa modificazione conformazionale nel dominio flessibile, creando un sito di legame per il secondo substrato, l'acetil-CoA. Quando nel sito attivo si è formato il citroil-CoA, un'altra modificazione conformazionale causa l'idrolisi del tioestere e viene rilasciato CoA-SH. Questo adattamento indotto

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dell'enzima, prima al substrato e poi all'intermedio della reazione, diminuisce la probabilità di avere una scissione prematura e non produttiva del legame tioestere dell'acetil-CoA. Gli studi cinetici sull'enzima sono coerenti con questo tipo di meccanismo ordinato a due substrati. La reazione catalizzata dalla citrato sintasi è essenzialmente una condensazione di Claisen che coinvolge un tioestere (l'acetil-CoA) e un chetone (l'ossalacetato). (2) Formazione dell'isocitrato attraverso il cis-aconitato L'enzima aconitasi (più propriamente aconitato idratasi) catalizza la trasformazione reversibile del citrato in isocitrato, mediante la formazione intermedia dell'acido tricarbossilico cis-aconitato, che normalmente non si dissocia dal sito attivo dell'enzima. L’aconitasi può aggiungere una molecola d'acqua al doppio legame dell'intermedio legato all'enzima cis-aconitato, in due modi diversi; una via porta a citrato e l'altra a isocitrato:

Anche se la miscela all'equilibrio a pH 7,4 e a 25°C contiene meno del 10% di isocitrato, nella cellula la reazione viene spinta verso destra dal consumo molto rapido di isocitrato da parte della tappa successiva, che abbassa la sua concentrazione allo stato stazionario. L’aconitasi contiene un centro ferro-zolfo che agisce sia nel legame del substrato al sito attivo sia nell'aggiunta o rimozione catalitica dell'acqua. Nelle cellule in cui la concentrazione del ferro è bassa, l'aconitasi perde il suo centro ferro-zolfo, e si acquisisce un nuovo ruolo nella regolazione dell'omeostasi del ferro. L'aconitasi è uno dei molti enzimi, di cui si conosce un ruolo ulteriore rispetto a quello catalitico.

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Vi sono due differenti forme di isocitrato deidrogenasi: una che richiede NAD + come accettore di elettroni e un'altra che utilizza invece NADP+. La reazione complessiva catalizzata dai due enzimi è ovviamente identica. Nelle cellule eucariotiche l'isozima NAD-dipendente è presente nella matrice mitocondriale e opera all'interno del ciclo dell'acido citrico. L'isozima NADP-dipendente è presente sia nella matrice nlitocondriale sia nel citosol. La sua funzione principale è quella di generare NADPH, coenzima essenziale nelle reazioni anaboliche riduttive. (3) Ossidazione dell'isocitrato ad α-chetoglutarato e CO2 Nella tappa successiva, l'isocitrato deidrogenasi catalizza la decarbossilazione ossidativa dell'isocitrato per formare α-chetoglutarato. Uno ione Mn2+ presente nel sito attivo interagisce con il gruppo carbonilico dell'intermedio ossalosuccinato, che si forma transitoriamente e non lascia il suo sito di legame fino alla sua conversione in α-chetoglutarato mediante decarbossilazione. L'Mn 2+ stabilizza anche l'enolo formato transitoriamente per decarbossilazione. (4) Ossidazione dell'α-chetoglutarato a succinil-CoA e CO2 La tappa successiva è un'altra decarbossilazione ossidativa, in cui l'α-chetoglutarato viene trasformato in succinil-CoA e CO2 dal complesso dell'α-chetoglutarato deidrogenasi; il NAD+ è l'accettore finale degli elettroni e il CoA è il trasportatore del gruppo succinile. L’energia liberata dell'ossidazione dell'α-chetoglutarato è conservata mediante la formazione del legame tioestere del succinil-CoA:

Questa reazione è praticamente identica alla reazione catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi, esaminata in precedenza; il complesso dell'α-chetoglutarato deidrogenasi è molto simile al complesso della piruvato deidrogenasi (PDH) sia come struttura sia come funzione. Anche in questo complesso sono presenti tre enzimi, analoghi a E1, E2 ed E3 del complesso della piruvato deidrogenasi, e cinque coenzimi: TPP legata al primo enzima, lipoato legato al secondo enzima, FAD, NAD e coenzima A. Entrambi i complessi enzimatici sono sicuramente derivati da un gene ancestrale comune. Anche se gli enzimi E 1 dei due complessi sono strutturalmente simili, le loro sequenze amminoacidiche sono diverse e di conseguenza hanno una diversa specificità di legame: E 1 del complesso della piruvato deidrogenasi lega il piruvato, mentre E 1 del complesso dell'α-chetoglutarato deidrogenasi lega l'αchetoglutarato. Anche i componenti E2 sono molto simili; entrambi contengono gruppi lipoilici legati covalentemente. Le unità E3 dei due complessi enzimatici sono identiche. (5) Conversione del succinil-CoA a succinato Il succinil-CoA, come l'acetiI-CoA, ha un legame tiostere con un'energia libera di idrolisi fortemente negativa (ΔG'° ~ -36 kJ/mole). Nella tappa successiva del ciclo dell'acido citrico, l'energia rilasciata dalla rottura del legame tioestere viene usata per favorire la sintesi di un legame fosfoanidride sotto forma di GTP o ATP con un ΔG'° netto di soli -2,9 kJ/mole. Il processo porta alla formazione di succinato:

L'enzima che catalizza questa reazione reversibile viene detto succinil-CoA sintetasi o anche succinico tiochinasi; entrambi i nomi suggeriscono la partecipaziore alla reazione di un nucleoside trifosfato. Questa reazione che conserva energia vi è una fase intermedia in cui la molecola dell'enzima diventa fosforilata a lipoato di un suo residuo di His presente nel sito attivo. Il gruppo fosforico, che ha un elevato potenziale di trasferimento di gruppo, viene quindi trasferito all'ADP (o GDP) per formare ATP (o GTP). Le cellule animali hanno due isozimi, uno specifico per l'ADP e un altro per il GDP. L’enzima succinil-CoA sintetasi ha due subunità: la subunità α (Mr 32000) possiede il residuo di His fosforilato (His 246) e il sito di legame per il CoA; la subunità β (Mr 42000) conferisce la specificità per l'ATP o per il GTP. Il sito attivo è all'interfaccia tra le due subunita. La struttura cristallografica della succinil-CoA sintetasi rivela due "eliche" (una per ogni subunità) poste in modo tale da orientare le cariche positive parziali dei loro dipoli elettrici in stretta vicinanza al residuo di His fosforilato e quindi carico negativamente (P)-His,

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stabilizzando così l'intermedio fosfoenzima. (Si ricordi il comportamento analogo dei dipoli dell'elica nel canale per il K + nello stabilizzare gli ioni K+.) La formazione dell'ATP (o del GTP) a spese dell'energia rilasciata dalla decarbossilazione ossidativa dell'αchetoglutarato è una fosforilazione a livello del substrato, come la sintesi dell'ATP catalizzata dalle reazioni fosfoglicerato chinasica e piruvato chinasica della via glicolitica. Il GTP formato dalla succinil-CoA sintetasi può donare il suo gruppo fosforico terminale all'ADP, per formare ATP, tramite una reazione reversibile, catalizzata dalla nucleoside difosfato chinasi:

Quindi, il risultato netto dell'attività di entrambi gli isozimi della succinil-CoA sintetasi è la conservazione dell'energia sotto forma di ATP. Non vi è variazione di energia libera nella reazione della nucleoside difosfato chinasi; ATP e GTP sono energeticamente equivalenti. (6) Ossidazione del succinato a fumarato Il succinato formato dal succinil-CoA viene ossidato a fumarato da parte della flavoproteina succinato deidrogenasi:

Negli eucarioti la succinato deidrogenasi è legata saldamente alla membrana interna dei mitocondri; nei batteri è associata alla membrana plasmatica. L’enzima contiene tre diversi centri ferro-zolfo e una molecola di FAD legata covalentemente. Gli elettroni estratti dal succinato passano attraverso il FAD e i centri reno-zolfo prima di entrare nella catena di trasporto degli elettroni della membrana mitocondriale interna (o della membrana plasmatica dei batteri). Il flusso di elettroni dal succinato attraverso questi trasportatori fino all'accettore finale, l'ossigeno, è accoppiato alla sintesi di circa 1,5 molecole di ATP per coppia di elettroni (fosforilazione legata alla respirazione). Il malonato, un analogo del succinato normalmente non presente nelle cellule, è un forte inibitore competitivo della succinato deidrogenasi e quindi, se aggiunto nei mitocondri, blocca il ciclo dell'acido citrico.

(7) Idratazione del fumarato a malato L'idratazione reversibile del fumarato a L-malato è catalizzata dalla fumarasi (fumarato idratasi). in questa reazione lo stato di transizione è un carbanione:

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L’enzima è altamente stereospecifico e catalizza l'idratazione del doppio legame trans del fumarato, ma non agisce sul maleato, l'isomero cis del fumarato. Nella direzione inversa (da L-malato a fumarato), la fumarasi è ugualmente stereospecifica: il D-malato non è un substrato dell'enzima.

(8) Ossidazione del malato a ossalacetato Nell'ultima reazione del ciclo dell'acido citrico l'L-malato deidrogenasi NADdipendente catalizza l'ossidazione dell'L-malato a ossalacetato:

Nelle condizioni termodinamiche standard questo equilibrio è molto spostato a sinistra. Nelle cellule, invece, l'ossalacetato viene rimosso continuamente dalla reazione altamente esoergonica della citrato sintasi, contribuendo a mantenere estremamente bassa (