Metabolismo de Aminoácidos [PDF]

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PRACTICA No 9 DEGRADACIÓN DE AMINOÁCIDOS: TRANSAMINACIÓN RELACION DE EXPERIMENTOS 1. Transaminación utilizando un extracto enzimático de hígado de paloma INTRODUCCION La transaminación es el proceso que consiste en la transferencia reversible del grupo amino desde un aminoácido hasta un cetoácido, dando como resultado conversión del primero en un cetoácido y el segundo en un nuevo aminoácido. Esta reacción es de gran importancia en el metabolismo de los aminoácidos y es catalizada por enzimas llamadas TRANSAMINASAS o Aminotransferasas, presentes en la mayoría de tejidos animales. El cofactor de estas enzimas es el piridoxal fosfato y para casi todas las transaminasas el alfacetoglutarato es el aceptor del grupo amino, formándose por tanto ácido glutámico.

R-CH-COO-

OOC- CH2-CH2- C- COO-

C=O Enzima

NH3

R-C-COOH

Enzima

L-aminoácido + alfa-cetoglutarato

O

OOC-CH2- CH2-CH-COO-

H-C-NH3 O

alfa-cetoácido + L-glutámico

El interés clínico está centrado especialmente en dos transaminasas: L-alanina: alfaH NH3 cetoglutarato aminotransferasa (ALT o Transaminasa glutámico Pirúvica TGP) y Laspartato: alfa-cetoglutarato aminotransferasa (AST o Transaminasa Glutámico Oxalacética TGO). Estas enzimas tienen una acción eminentemente intracelular, por lo que la actividad sérica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de actividad será evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran de los cuales resultan particularmente importantes corazón e hígado.

Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad de TGO, debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta enzima tan abundante en el miocardio. En este caso no existirá aumento en la actividad sérica de TGP o será mínimo. En hepatitis vírales u otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de tejido, habrá también un incremento considerable de la actividad sérica de transaminasas, incluso antes de la aparición de síntomas clínicos como la ictericia. En este caso TGP será la enzima predominante debido a su gran concentración en el tejido hepático. Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse también en otras condiciones como: traumas accidentales o quirúrgicos, pancreatitis aguda, distrofias musculares, etc. TRANSAMINACION EN PRESENCIA DE UN PREPARADO DE HIGADO DE PALOMA Objetivo: Aplicación de la técnica de cromatografía en capa fina para estudiar la transaminación en presencia de un preparado de hígado de paloma como fuente enzimática, utilizando alanina y aspartato como substratos. Procedimientos: Preparación de la fuente enzimática (Polvos acetónicos): Los hígados recientemente extraídos de 4 pichones son homogeneizados en 10 volúmenes de acetona fría durante un minuto, luego de filtrar y lavar varias veces, el residuo obtenido es secado a temperatura ambiente obteniéndose así polvos secos, fáciles de conservar. El día de la práctica se muelen en un mortero 700 mg de polvos acetónicos con 7 ml de agua destilada y luego se centrifuga el preparado a 2000 r.p.m. por 10 minutos. Se decanta el sobrenadante y se completa el volumen a 35 ml con agua destilada.

La acetona por su acción deshidratante facilita la extracción de enzimas de los tejidos. En

ésta forma, la acetona reduce la desnaturalización de las (enzimas) proteínas y

concomitantemente produce la desintegración de las estructuras celulares y la disrupción de los enlaces lipoproteicos. Preparación del experimento de la transaminación.  En cuatro tubos de prueba (13 x 100 mm), previamente lavados con HNO3 concentrado, medir lo siguiente: REACTIVOS Alanina 0.05 M Glutamato 0.05 M Aspartato 0.05 M alfa-cetoglutarato 0.1 M Piruvato 0.1 M Extracto enzimático Extracto enzimático hervido

I 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml -

SISTEMAS II III 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml -

0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml -

IV 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

Mezclar el contenido de cada sistema y luego incubar en baño maría a 37 oC durante una hora Identificación de los productos de la reacción por cromatografía en capa fina : Cada grupo dispondrá de una placa de aluminio con Silica Gel, de 100 x 100 mm, en la que se han marcado los puntos de origen a 15 mm del borde inferior, con una distancia entre ellos de 25 mm y en el siguiente orden: Uno para cada uno de los cuatro tubos de experimento y tres para los tres estándares de : Alanina, Glutamato y Aspartato. Estos sistemas estándares deberán ser preparados de la siguiente manera: Medir 0.2 ml del Aminoácido (Alanina, Glutamato o Aspartato) que previamente se encuentra a concentración 0.05 M y agregar 0.8 ml de agua.

Muesta o

PUNTOS DE ORIGEN Estandar Estandar

Estándar

Sistema No Rf x 100

1

2

3

4

Alanina

Glutámic. Aspártico

Aplicar utilizando tubos capilares de vidrio y en el punto de origen que les corresponde, 10 ul de cada sistema incubado y 2 ul de las soluciones estándar de aminoácidos en alícuotas de no más de 1 ul cada vez, dejando secar cada área después de cada aplicación. Al final, colocar la placa en la cámara cromatográfica, conteniendo como solvente 75 volúmenes de fenol y 25 de agua. El agua constituye la fase estacionaria y el fenol la fase móvil. La cromatografía termina cuando el solvente alcanza la línea marcada a 10 cm de los puntos de origen. Entonces sacar la placa, secarla en la estufa a 110 ºC por 3 minutos, y revelar el cromatograma rociando una solución de ninhidrina al 0.1% en n-butanol saturado con agua y luego dejarla secar. La representación esquemática de los resultados obtenidos luego de revelar el cromatograma se muestra en la página siguiente. Expresión de Resultados: Calcular los Rf x 100 de cada mancha, completar la tabla anterior e interpretar el cromatograma con los resultados obtenidos. Haga un comentario de cada uno de los sistemas preparados: Rf

Rf

Mancha Nº 1

................

Mancha Nº 5

................

Mancha Nº 2

................

Mancha Nº 6

................

Mancha Nº 3

................

Mancha Nº 7

................

Mancha Nº 4

................

Haga la identificación de cada una de las manchas señalando a qué aminoácido corresponde en base a sus valores de Rf. Tenga en cuenta que los valores de Rf para los aminoácidos: Alanina, ac. glutámico y ac. Aspártico son de 58, 26 y 11.2 respectivamente, para los solventes usados en la presente cromatografía. Aminoácido Mancha Nº 1

................

Aminoácido Mancha Nº 5

................

Mancha Nº 2

................

Mancha Nº 6

................

Mancha Nº 3

................

Mancha Nº 7

................

Mancha Nº 4

................

INTERROGANTES BIOQUIMICAS Que es Rf

Frente del solvente Interpretación de los resultados Obtenidos. Sistema1 ___________________________

2

____________________________ ____________________________ _________________________

4

Sistema 2 ____________________________ ____________________________ ____________________________ ________________________ 1

Sistema 3 3

6

5

I

II

III

____________________________ ____________________________ ____________________________ ________________________ 7

IV

Sistema 4 ____________________________ ____________________________ ____________________________ ________________________

Figura Nº 6.1.- Cromatograma de la transaminación 1. ¿Cuáles son las reacciones catalizadas por TGO y TGP?

2. ¿Qué papel desempeña el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminación? ¿Cuál es el grupo funcional del cofactor?. Explique su mecanismo 3. ¿Cuál es el objeto del sistema 2? 4. ¿Cuál es el objeto del sistema 4? 5. Explique el mecanismo que permite la separación de sustancias por cromatografía en capa fina 6. ¿Por qué en la cromatografía sube más la alanina y menos el aspartato? 7. ¿Se desprende amoniaco libre en el medio durante una reacción de transaminación?. Fundamente su respuesta 8. Pronostique el efecto de una deficiencia de vitamina B6 sobre la degradación de los aminoácidos. ¿La degradación de los 20 aminoácidos sería afectada? 9. Si en el experimento de transaminación que Ud. realiza colocará ácido pirúvico uniformemente marcado con C14, ¿Qué aminoácidos espera encontrar marcados preferentemente?. Fundamente. EXPERIMENTO 2 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ASPARTATO AMINOTRANSFERASA TGO (AST) Objetivos  Estudio de la transaminación en suero sanguíneo normal y patológico 

Aplicación del método enzimático espectrofotométrico para la determinación de la actividad de la TGO sérica.

Método La determinación de AST se realiza acoplando su acción transaminasa a la acción de la enzima malato deshidrogenasa (MDH) en presencia de NADH. El método se basa en el método de Henry et al., siguiendo las recomendaciones de IFCC.

Procedimiento: 1. PREPARACIÓN del Reactivo de trabajo (RT): a) Mezclar: 0.5 ml. de (R2) Substrato + 2 ml. (R1) Tampón. b) Pipetear en un tubo, mezclar, incubar 1 minuto. Evaluaremos 2 muestras de suero sanguíneo: Reactivos

Sistemas

1

2

RT (mL)

1,0

1,0

1 Muestra (μL)

100

---

2 Muestra (μL)

----

100

2. Condiciones del ensayo: a) Longitud de onda: . . . . . . . . . .. 340 nm Cubeta:. .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . 1 cm paso de luz Temperatura constante . . . . . . ...37ºC Colocar en una cubeta las soluciones preparadas y llevar al espectrofotómetro Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronometro y leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos. Expresión de Resultados: Absorbancias 1 Muestra

0.368

0.345

0.330

2 Muestra

0.365

0.328

0.308

Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (ΔA/min) ΔA/min x 1750 = U/L de AST Unidades: Una Unidad de actividad enzimática (UI) es la cantidad de enzima que convierte 1 μmol de substrato por minuto, en condiciones estándar. La concentración se expresa en unidades por litro (U/L).

Interrogantes Bioquímicas.

1. Cuál es la distribución celular de la TGO y TGP ? 2. Se hace referencia de que en el hepatocito TGP es una enzima, exclusivamente citosólica. ¿Está Ud. de acuerdo con esta afirmación? ¿Cuál sería la distribución intracelular de la TGO? Fundamente su respuesta. 3. Si se administra glucosa con C14 a un animal, los carbonos marcados se incorporaran en una proteína. Señale algunas secuencias de reacciones que permitan explicar este fenómeno. 4. ¿Participan las reacciones de transaminación en la biosíntesis de aminoácidos? 5. ¿Qué pensaría de un ensayo en el cual una muestra biológica como el suero, se mezcla

con

alanina,

alfa-cetoglutarato,

NADH

deshidrogenasa?

TALLER (2) HIPERAMONEMIA

y un

exceso

de

lactato

Caso Clínico Un niño nacido luego de un embarazo normal y parto vaginal espontáneo, se mostró bien en las primeras 36 horas de vida hasta que empezó a mostrar letargia e irritabilidad. Se le tomó una muestra de sangre para cultivo a fin de descartar la sospecha de un proceso infeccioso (sepsis). En esta misma muestra se encontraron los electrolitos normales, excepto una ligera disminución del bicarbonato sérico. El nitrógeno ureico en sangre resultó de 2 mg % (V.N. de urea en sangre de 15 a 45 mg%). Se tomó una radiografía del tórax en vista de que el recién nacido tenía hiperventilación y se informó como normal. Luego de las 24 horas siguientes la letargia progresó a estupor y finalmente entró en coma, requiriendo respiración mecánica. Tres días después fue transferido a una unidad de cuidados intensivos para RN. A los 5 días de nacido se le determinó los valores de amonio plasmático encontrándose un valor de 1800 M (V.N. menos de 35 M). Mientras se esperaba el resultado del análisis de aminoácidos plasmáticos y el de ácido orótico urinario, se le practicó hemodiálisis, con lo que se consiguió disminuir el amonio plasmático hasta 160 M. A pesar de la reducción del amonio plasmático el RN siguió en su estado comatoso sin ninguna evidencia de respiración espontanea ni función neurológica. En estas condiciones y previa consulta con sus padres, en sistema ventilatorio que lo mantenía vivo fue retirado y el niño falleció a los 7 días de edad. Cuando llegaron los análisis de aminoácidos plasmáticos se demostró una glutamina de 1500 M (V.N. 200-300 M) y no se detectó citrulina (V:N: 10-30 M). El ácido orótico urinario resultó estar muy elevado (100 veces más de lo normal). El análisis post-morten de la actividad de la Ornitina Carbamil Transferasa (OCT) hepática reveló sólo un 2 % del valor normal. Un mejor estudio de sus antecedentes reveló que dos hermanos de la madre habían muerto en estado de coma dentro de la primera semana de vida y se le atribuyó en ese entonces a una encefalitis como causa de sus muertes.

BASES MOLECULARES.

El amonio que deriva de la pérdida del grupo alfa amino de los aminoácidos en el curso de su metabolismo, se encuentra en la sangre en pequeñas cantidades, en vista que mayoritariamente el hígado se encarga de su conversión en urea, que es una sustancia que se elimina fácilmente por la orina. El amonio también es unido al glutamato para constituir glutamina, una reacción catalizada por la glutamina sinteasa. La vía a través de la cual el amonio se convierte en urea se denomina Ciclo de la urea, Ciclo de Krebs-Henseleit o también Ciclo de la Ornitina y la urea formada se constituye en el componente nitrogenado más abundante de la orina (80 %) bajo condiciones de una ingesta normal de proteínas. Uno de los dos nitrógenos de la urea procede del amonio que viene de los aminoácidos; en tanto que el otro deriva del aspartato. Es importante recordar que la síntesis de cada molécula de urea requiere del aporte energético de 4 enlaces fosfato de alta energía. El bloqueo de alguna de las reacciones propias de la vía de síntesis de la urea (ver figura 1), es muy probable que sea incompatible con la vida ya que no se tiene conocimiento de otra vía alternativa para la eliminación del amonio en la magnitud que lo hace esta vía. Como el amonio se acumula en estas situaciones, resulta tóxico de manera especial para el sistema nervioso central. El pK de amoniaco es alto (9.28), por esta razón al pH de la sangre (7.4) se le encuentra bajo la forma de amonio. Normalmente tenemos amonio en el organismo pero en concentraciones relativamente bajas. En la sangre su concentración es de 80 a 110 mg %; pero cuando esta concentración aumenta (hiperamonemia), aunque sea por periodos cortos, determina letargia y vómitos seguido de coma y finalmente la muerte. El mecanismo de la toxicidad del amonio no está del todo esclarecido y al respecto se han propuesto muchas teorías. Los defectos en las enzimas del Ciclo de la Urea ocurren con una frecuencia de 1 por cada 25,000 nacimientos y generalmente se hacen manifiestos durante las primeras semanas de vida si el defecto de la enzima es severo; sin embargo, los síntomas pueden aparecer más tarde (niñez o edades más avanzadas) cuando el defecto enzimático es sólo parcial. Todos los pacientes con defectos en las enzimas del Ciclo de la urea tienen elevados los niveles de amonio plasmático y también incrementada la concentración de glutamina y

alanina, esto último como intento a contrarrestar el aumento de amonio. En efecto, durante los episodios de hiperamonemia los niveles de glutamina pueden alcanzar valores de 3,000 M NH4+

+

HCO3-

Carbamil Fosfato Sinteasa I

+

2 ATP

2 ADP + Pi

O NH2 – C – O – PO32Ornitina Carbamil Transferasa

H3N+ – CH – COO-

Pi

(CH2)3 NH

Ornitina

C=O

Citrulina

NH2 H2N+ – CH – COO(CH2)3

Ornitina

NH3+

Citrulina

CICLO DE LA UREA

Arginino Succinico Sinteasa

O = C – NH2 NH2 Urea H2O

Arginasa

H3N+ – CH – COOH3N+ – CH – COOArginina

(CH2)3

(CH2)3 Arginino Succinico Liasa

NH C = NH2 NH2

Arginino Succinato

NH C – N – CH – COO-

+

NH2+

CH – COO-

CH – COOCH – COOFumarato

Figura Nº 1 .- Ciclo de la Urea o Ciclo de la Ornitina

CORRELATO CLINICO-BIOQUIMICO.

NH3+ – C H – COOCH – COOAspartato

Nuestro paciente muestra el curso típico de un defecto hereditario en las enzimas del Ciclo de la Urea. Esto incluye: 

Síntomas Clínicos (letargia e irritabilidad) que comienzan durante las 48 horas posteriores al nacimiento.



Disminución en la concentración de urea en la sangre y aumento del amonio plasmático.



Alcalosis respiratoria



Estado comatoso



Aumento en la concentración de glutamina y alanina plasmática El aumento en la excreción de ácido orótico en la orina y la ausencia de citrulina

plasmática orientan hacia el diagnóstico de la deficiencia de OCT (Ornitina Carbamil Transferasa), la cual es una enfermedad ligada al cromosoma X. Infantes con defectos en la Carbamil Fosfato Sinteasa, Arginino Succínico Sinteasao de la Arginino Succínico Liasa, muestran un cuadro clínico similar al señalado para nuestro paciente, estando la severidad del cuadro en relación con la actividad residual de la enzima y un cuidadoso análisis de las alteraciones en la concentración de los aminoácidos plasmáticos permite orientas hacia la enzima comprometida. La deficiencia de la quinta enzima del ciclo de la urea (Arginasa) tiene manifestaciones algo diferente. En estos casos, la hiperamonemia severa en el recién nacido es muy rara. Las manifestaciones como retardo mental y parálisis espástica de las extremidades inferiores aparecen gradualmente en el primer año de vida y se hace obvia a los 4 años de edad. El diagnóstico se apoya con el dato del aumento de la arginina plasmática. Puede presentarse aciduria orótica, que se explica porque la falta de arginasa impide la regeneración de la ornitina mitocondrial y la falta de este sustrato impide que la OCT pueda funcionar y se acumula el carbamil Fosfato (ver figura 1). Existen otras enfermedades genéticas que cursan con hiperamonemia en el recién nacido y con las cuales debe hacerse el diagnóstico diferencial. Estas enfermedades, que se transmiten con carácter autosómico recesivo conducen a una acumulación de ácido propiónico y ácido metil malónico, derivados de la degradación de los aminoácidos

Valina, treonina, Isoleucina, metionina. Propionil CoA y metil Malonil CoA, inhiben competitivamente la utilización de acetil CoA en la síntesis de N-Acetil Glutamato (NAG) que es un efector alostérico positivo de la Carbamil Fosfato Sinteasa I. En estas situaciones la síntesis de Carbamil Fosfato se detiene y resulta en una hiperamonemia. Estas enfermedades son usualmente fáciles de reconocer debido a la acumulación de ácidos orgánicos que posibilita su detección. Además, estos ácidos determinan una disminución del pH sanguíneo a diferencia de lo que ocurre en los defectos de las enzimas del ciclo de la úrea donde más bien el pH se incrementa.

BIBLIOGRAFIA MONTGOMERY R., CONWAY T. SPECTOR A. and CHAPELL D. (1996). Biochemistry: Acase oriented approach. VI Ed. Mosby EEUU. SUMI S. IMAEDA M. , ITO T., UETA A., BAN K., OHKUBO Y. AND TOGARY H. (2005). Urinay uracil in female patients with ornithine transcarbamylase deficiency. Pediatr. Int 47 (3): 262-266. SUMMAR M. anda TUCHMAN M. (2003). Urea cicle Disorders Overiew. Gene Reviews. www,genetests org CUESTIONARIO. 1.- ¿Además de la participación de la arginina en la síntesis proteica, ¿qué otras funciones importantes tiene en el organismo? 2.- Carbamil fosfato, producto de la acción de la carbamil fosfato sinteasa, puede servir como sustrato para dos reacciones enzimáticas de vías metabólicas diferentes. Nombre las enzimas involucradas en estas reacciones, su localización celular y los productos formados. ¿Cuál es el destino de cada uno de estos productos? 3.- ¿Cómo se explica el aumento en la excreción urinaria de ácido orótico en la deficiencia de OCT? 4.- ¿Cómo estarán los niveles de ácido orótico y arginina plasmática en los casos de deficiencia de arginasa? ¿Por qué?

5.- Se ha descrito que los pacientes con deficiencia de OCT suelen tener valores aumentados de uracilo en la orina. ¿Cómo se podría explicar este hallazgo? 6.- Escriba los nombres de las 5 enzimas del ciclo de la urea, la reacción que catalizan y su localización celular. 7.- ¿Qué revisó respecto al mecanismo de toxicidad cerebral del amonio? 8.- ¿Tiene alguna importancia que dos hermanos de la madre del paciente del caso clínico hubieran muerto con encefalitis? ¿Por qué? 9.- ¿Cómo se explica la alcalosis que presentó nuestro paciente?

Apellidos y Nombres: _____________________________________ Fecha: ________________________ Firma: __________________