Industrial Microbiology An Introduction Waites (1) .En - Es [PDF]

Zitiervorschau

Microbiología Industrial: Una introducción Michael J. Waites BSc, PhD, Cbiol, MIBiol

Neil L. Morgan BSc, PhD, MIFST

John S. Rockey BSc, MSc, PhD

Gary Higton BSc, PhD

Todas: Facultad de Ciencias Aplicadas, Universidad de South Bank, Londres, Reino Unido

Microbiología Industrial: Una Introducción

Microbiología Industrial: Una introducción Michael J. Waites BSc, PhD, Cbiol, MIBiol

Neil L. Morgan BSc, PhD, MIFST

John S. Rockey BSc, MSc, PhD

Gary Higton BSc, PhD

Todas: Facultad de Ciencias Aplicadas, Universidad de South Bank, Londres, Reino Unido

del propietario del copyright. Primera edición 2001

© 2001 por Blackwell Science Ltd oficinas editoriales: Osney Mead, Oxford OX2 0EL 25 John Street, Londres WC1N 2BS 23 Ainslie Place, Edimburgo EH3 6AJ 350 Main Street, Malden MA 02148-5018, EE.UU. 54 University Street, Carlton Victoria 3053, Australia 10, rue Casimir Delavigne 75006 Paris, Francia Otras oficinas editoriales: Blackwell Wissenschafts-Verlag GmbH Kurfürstendamm 57 10707 Berlín, Alemania Blackwell Science KK MG Kodenmacho Edificio 7-10 Kodenmacho Nihombashi Chuo-ku, Tokio 104, Japón Iowa State University Press Un Blackwell Science Company 2121 S. Avenida Estado Ames, Iowa 50014-8300, EE.UU. El derecho de los autores a ser identificados como los autores de este trabajo se ha afirmado, de acuerdo con los derechos de autor, diseños y Patentes de 1988. Todos los derechos reservados. Ninguna parte de Esta publicación no puede ser reproducida, almacenada en un sistema de recuperación, o transmitida en cualquier forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, fotocopia, grabación o de otro tipo, excepto lo permitido por el Reino Unido Derecho de Autor, Diseños y Patentes de 1988, sin la previa permiso

Definido por la configuración Mejor máquina de componer Ltd., Hong Kong Impreso y encuadernado en Gran Bretaña por TJ International Ltd, Padstow, Cornualles.

distribuidore s Marston Book Services Ltd PO Box 269 Abingdon, Oxon OX14 4YN (Órdenes: Tel: 01235 465500 Fax: 01235 465555) Estados Unidos Blackwell Science, Inc. Comercio Place 350 Main Street Malden, MA 02148-5018 (Órdenes: Tel: 800 759 6102 781 388 8250 Fax: 781 388 8255) Canadá Entrar hermanos Book Company 324 Saulteaux Media Luna Winnipeg, Manitoba R3J 3T2 (Órdenes: Tel: 204 837 2987) Australia

Ltd 54 la calle Blackwell Science Pty Universidad Carlton, Victoria 3053 (Órdenes: Tel: 9347 0300 3 Fax: 3 9347 5001) Un registro de catálogo de este título está disponible en la Biblioteca Británica ISBN 0632-05307-0 Biblioteca del Congreso Catalogación en la fuente de datos Introducción a la Microbiología Industrial / Michael J. Waites. . . [Et al.]. p.cm. ISBN 0-632-05307-0 (pbk.) 1. Microbiología Industrial: una introducción. I. Waites, Michael J. QR53 .I522 2001 660.6 ¢ 2-DC21 2001025874 Para más información sobre Blackwell Science, visite nuestro sitio web: www.blackwell-science.com El logo Blackwell Science es una marca registrada de Blackwell Science Ltd, registrada en el Registro de Marcas del Reino Unido

Dedicación Este libro está dedicado a la memoria de nuestro gran amigo y co-autor Gary Higton que, a la edad de sólo 40 años murió inesperadamente durante la etapa final de su preparación. Gary fue un microbiólogo bien, un buen profesor, colega de apoyo y un amigo leal. Se le echará mucho de menos por todos nosotros.

Conteni do

Prefacio, ix Agradecimientos, xi Introducción a la microbiología industrial, 1 Parte 1 Microbial fisiología 1 estructura de la célula microbiana y la función, 7 2 El crecimiento microbiano y la nutrición, 21 3 El metabolismo microbiano, 46 Parte 2 Bioprocesamiento 4 5 6 7 8

Microorganismos Industriales, 75 medios de fermentación, 86 Los sistemas de fermentación, 94 procesamiento aguas abajo, 109 El desarrollo de productos, regulación y seguridad, 124

Parte 3 procesos y productos industriales 9 enzimas microbianas, 133 10 Combustibles y productos químicos industriales, 144 11 productos para el cuidado de la salud, 165 12 Fermentaciones de alimentos y bebidas, 179 13 Los aditivos alimentarios y suplementos, 210 14 la producción de biomasa microbiana, 218 15 La biotecnología ambiental, 229 16 biodeterioro microbiana de los materiales y su control, 247 17 Animales y cultivo celular de plantas, 258 Index, 265

vii

Prefaci o

microbiología industrial se asocia principalmente con la explotación comercial de los microorganismos, e implica procesos y productos que son de gran importancia económica, ambiental y social en todo el mundo. Hay dos aspectos clave de la microbiología indus- trial, la primera relativa a la producción de productos microbianos valiosos a través de procesos de fermentación. Estos incluyen alimentos fermentados tradicionales y edades bever-, como el pan, la cerveza, el queso y el vino, que se han producido desde hace miles de años. Además, en los últimos cien años más o menos, los microorganismos se han empleado más en la producción de numerosas materias primas Chemical, fuentes de energía, enzimas, ingredientes alimentarios y productos farmacéuticos. El segundo aspecto es el papel de los microorganismos en la prestación de servicios, en particular para el tratamiento de residuos y control de la contaminación, que uti- lizes su capacidad para degradar prácticamente todos los productos naturales y artificiales. Sin embargo, estas actividades deben ser controlados, mientras que estos materiales están en uso, de lo contrario el consiguiente deterioro biológico conduce a grandes pérdidas económicas. Este libro de texto pretende ser una introducción a la in- microbiología industrial. En escribirlo, los autores se han basado en su experiencia en la enseñanza la microbiología industrial y otros aspectos de la microbiología aplicada a estudiantes de licenciatura y de maestría en una gama de biología aplicada, microbiología, biotecnología, ciencia de los alimentos cursos de ENCE y de ingeniería química. Se supone que el lector tenga un conocimiento elemental de la microbiología y la bioquímica. Sin embargo, incluso los estudiantes con un conocimiento básico de la química y la biología celular, y los que no son

especialistas microbiólogos, debe encontrar el material accesible. El libro está dividido en tres secciones. Parte 1 está diseñado para apuntalar la página principal. Su objetivo es proporcionar un suficiente, aunque breve, descripción de la estructura microbiana, fisiología y bioquímica para permitir al estudiante para apreciar plenamente la diversidad de los microorganismos y sus capacidades metabólicas. El lector pronto debe llegar a reconocer la versatilidad de microorganismos

ismos, su capacidad para crecer en una amplia gama de sustratos y para producir una amplia gama de productos, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Parte 2 está dedicado al proceso de transformación. En él se examinan las operaciones comerciales de fermentación y los requisitos para el cultivo a gran escala de los microorganismos. Esto implica la adquisición y desarrollo de cepas de producción adecuados que luego deben ser provistos de nutrientes, carbono especialmente apropiado y fuentes de energía. El objeto de cualquier fermentación industrial es entonces para optimizar o bien el crecimiento del organismo o la producción de un producto microbiano de destino. Esto se consigue normalmente mediante la realización de fermentaciones en condiciones rigurosamente controladas en grandes fermentadores con capacidades de cultivo a menudo en exceso de varios miles de litros. El diseño y la operación de estos procesos de fermentación se discute, junto con las operaciones posteriores de transformación necesarias para la recuperación y purificación de los productos objetivo.

También se examinan los aspectos de las prácticas de seguridad y la buena fabricación. procesos en los últimos veinte años, muchos tradicionales y estableci- dos de fermentación industrial se han avanzado a través de la contribución de la ingeniería genética (tecnología de ADN recombinante in vitro). Esta tecnología también ha facilitado el desarrollo de muchos procesos y productos novedosos. No sólo acelera el desarrollo de la tensión, lo que lleva a las mejoras en los microorganismos de producción, pero puede ayudar al procesamiento aguas abajo y otros elementos del proceso. Inicialmente, se trataba de la manipulación de las bacterias, pero se ha movido a la clonación en levaduras, hongos filamentosos, y células de plantas y animales. Los avances en este campo continúan creciendo rápidamente. Hay varios buenos textos que cubren los aspectos fundamentales de la manipulación genética de microorganismos. En consecuencia, no hemos intentado dar una explicación detallada de estas técnicas aquí, son simplemente se sugiere la lectura producida y más introducción. Sin embargo, muchos ejemplos de la aplicación y el potencial de

ix

x

Prefacio

Se discuten los microorganismos manipulados genéticamente dentro de los procesos industriales. Parte 3 explora la amplia gama de procesos y productos microbianos industriales, incluyendo la alimentación humana y la producción de alimentos para animales, el suministro de materias primas químicas, fuentes alternativas de energía, enzimas y productos para su aplicación en la salud humana y animal. Consideramos que la importancia económica y científica de los procesos de fermentación tradicionales y establecidos a largo puede ser un poco alto, ya que la atención suele estar dominada por los desarrollos más recientes. Por lo tanto hemos tratado de dar una cobertura sive equilibrada e integral de los procesos industriales actuales y su

productos. También se incluye la producción de materias primas valiosas de los animales y cultivo de células vegetales, principalmente porque la cultura y la manipulación de tales células implica técnicas similares a las usadas para la propagación de microorganismos. Un aspecto adicional de la microbiología industrial, ex amined aquí, es la aplicación de amplias capacidades de degradación de los microorganismos, en particular el aprovechamiento de estas propiedades en el tratamiento de residuos y control de la contaminación. La necesidad de limitar estas actividades en situaciones inapropiados, es decir, la prevención de la biodeteriora- de materiales, mientras que todavía está en uso, también se discute.

nosotros le gustaría dar las gracias a los siguientes autores y los editores para permitirnos usar figuras y tablas de sus publicaciones: Figuras 1.1 y 3.12 son de Dawes, IW y Sutherland, IW (1992) Fisiología Microbiana, 2ª Edición. Publicaciones Científicas Blackwell. Higo. 1.2 es de Poxton, IR (1993) Journal of Applied Bacteriología Suplemento 74, 1S-11S. Figuras 4.3, 7.8 y 7.9 son de Brown, CM, Campbell, I. y Sacerdote, FG (1987) Introducción a la Biotecnología. Publicaciones Científicas Blackwell. Higo. 12.7 es de Lewis, M. & Young, TW (1995) Brewing. Chapman & Hall. Mesas 12.3 y 12.4 se basan en las tablas de Bamforth, CW (1985) El uso de enzimas en la industria cervecera. Cerveceros Guardián 114, 21-26. Además, queremos dar las gracias a nuestro colega el Dr. Tom Coultate por su asesoramiento y apoyo entusiasta.

Expresiones de gratitud

xi

Introducción a la microbiología industrial

procesos de fermentación tradicionales, tales como los implicados en la producción de productos lácteos fermentados y bebidas alcohólicas, se han realizado desde hace miles de años. Sin embargo, es hace menos de 150 años que la base científica de estos procesos se examinó en primer lugar. El nacimiento de la microbiología industrial comenzó en gran medida con los estudios de Pasteur. En 1857 se demostró finalmente fuera de toda duda que la fermentación alcohólica de la cerveza y el vino de producción fue el resultado de la actividad microbiana, en lugar de ser un proceso químico. Antes de esto, Cagniard-Latour, Schwann y varios otros científicos notables habían conectado actividades de levadura con los procesos de fermentación, pero en gran medida habían sido ignoradas. Pasteur observó también que ciertos organismos podrían echar a perder la cerveza y el vino, y que algunos eran fermentaciones aeróbicas, mientras que otros eran anaeróbica. Luego pasó a diseñar el proceso de pasteurización, una importante contribución a la conservación de alimentos y bebidas, que fue origi- nalmente desarrollado para conservar el vino. De hecho, muchos de los primeros avances de la microbiología, tanto puras como aplicadas eran través de estudios sobre la fabricación de la cerveza y la elaboración del vino. publicaciones de Pasteur,Études sur le Vin (1866), Études sur la Bière (1876) y otros, fueron catalizadores importantes para el avance de los procesos de fermentación industrial. De los nuevos avances que siguieron, ninguno era más importante que el desarrollo de técnicas de cultivo puro por Hansen en la fábrica de cerveza Carlsberg en Dinamarca. elaboración de la cerveza cepa pura se llevó a cabo aquí por primera vez en 1883, usando una levadura aislado por Hansen, referido como Carlsberg levadura No. 1 (Saccharomyces carlsbergensis, Ahora clasificado como una cepa de cerevisiae Saccharomyces).

Durante la primera parte del siglo 20, el avance en este campo fue relativamente lento. Alrededor de la vuelta del siglo había habido importantes mentos Advance- en el tratamiento a gran escala de las aguas residuales, lo que permite una mejora significativa de la salud pública en las comunidades urbanas. Sin embargo, la primera novela proceso de fermentación a escala industrial para ser introducido era la fermentación de acetona-butanol, desarrollado por Weiz-

mann (1913-1915), utilizando la bacteria influencia en procesamiento tradicionales, Clostridium acetona tobutylicum. A principios de establecidos y nuevos de fermentación es y la década de 1920 se introdujo también un proceso de productos. Se permite que los genes sean fermentación industrial para la fabricación de ácido transferidos de un organismo a otro y permite cítrico, el empleo de un hongo filamentoso nuevos enfoques para la mejora de cepas. La base de (moho),Aspergillus niger. Otras innovaciones en la la transferencia de genes es la inserción de una secuencia de gen específico a partir de un donante tecnología de fermentación se aceleraron en gran ISM zación, a través de un vector de expresión, en medida en la década de 1940 a través de los esfuerzos un huésped adecuado. Hosts para los vectores de para producir el antibiótico penicilina, estimulado por expresión pueden ser procariotas tales como la la necesidad vital de este medicamento durante la bacteriaEscherichia coli; Alternativamente, cuando Segunda Guerra Mundial. No sólo la producción se se requiere un procesamiento posterior a la mueve rápidamente de la superficie de cultivo a traducción, al igual que con algunas proteínas pequeña escala para fermentaciones a gran escala humanas, se requiere generalmente un huésped sumergidos, pero dio lugar a grandes avances en eucariota, ambos medios de comunicación y desarrollo de la cepa microbiana. El conocimiento Adquirido tuvo un e.g. una levadura. gran impacto en el desarrollo exitoso de muchas otras Una amplia gama de productos importantes, industrias de fermentación. muchos de los cuales anteriormente estaban un progreso más reciente incluye la capacidad de fabricados mediante procesos químicos, se producen producir anticuerpos monoclonales para fines de ahora económicamente más por los procesos de análisis, diagnóstico, tera- péuticos y purificación, biotransformación tación y la fermentación por primera vez por Kohler y Milstein a principios microbiana. Los microorganismos también de 1970. Sin embargo, muchos de los grandes proporcionan valiosos servicios. Han demostrado ser avances se han seguido los tos masivos desarrollos particularmente útil debido a la facilidad de su en ingeniería genética (ADN recombinante) la cultivo en masa, velocidad de crecimiento, el uso de tecnología en los últimos 20 años. Esta tecnología sustratos baratos ha tenido y seguirá teniendo, una enorme

1

2

Introducción a la microbiología industrial

que en muchos casos son desechos, así como la los residuos de Producto efluentes diversidad de productos potenciales. Además, su capacidad para comprender fácilmente ir a la manipulación genética ha abierto posibilidades casi ilimitadas para los nuevos productos y servicios de las industrias de fermentación. El desarrollo exitoso de un proceso de fermentación requiere grandes contribuciones de una amplia gama de otras disciplinas, particularmente bioquímica, genética y biología molecular, química, ingeniería de procesos químicos y, y las matemáticas y la tecnología ordenador. Una operación típica implica tanto procesamiento aguas arribaEn g (USP) y las etapas de procesamiento aguas abajo (DSP) (Fig. I). La USP se asocia con todos los factores y procesos que lleva a e incluyendo la fermentación, y se compone de tres áreas principales. 1 El microorganismo productor. Los factores clave relativos a este aspecto son: la estrategia para obtener inicialmente una suit- capaces microorganismo industrial, la mejora de cepas para mejorar la productividad y el rendimiento, el mantenimiento de la pureza cepa, preparación de un inóculo fiable y el desarrollo de FPC de cepas seleccionadas para mejorar la la eficiencia económica del proceso. Por ejemplo, la producción de cepas mutantes estables que enormemente ducen sobreproducción el compuesto diana es a menudo esencial. Algunos productos microbianos son metabolitos primarios, producidos durante el crecimiento activo (el trophophase), que incluyen aminoácidos, ácidos orgánicos, vitaminas y disolventes industriales, tales como alcoholes y acetona. Sin embargo, muchos de los productos industriales más importantes son metabolitos secundarios, que no son esenciales para el crecimiento, por ejemplo, alcaloides y antibióticos. estos com-

procesamiento aguas arriba materias primas de fermentación microorganismo de producción

Fermentación Procesamiento en bajada la purificación del producto

Higo. yoEsquema de un proceso de fermentación.

libras se producen en la fase estacionaria de un cultivo discontinuo, después de la producción de biomasa microbiana ha alcanzado su pico (La idiophase). 2 El medio de fermentación. La selección de fuentes adecuadas y rentables de carbono y energía y otros nutrientes esenciales, junto con la media general optimizaciones son aspectos vitales del desarrollo de procesos para asegurar la maximización del rendimiento y la rentabilidad. En muchos casos, la base de los medios industriales son productos de desecho de otros procesos industriales, en particular los desechos del procesamiento de azúcar, residuos lignocelulósicos, suero de queso y licor de maíz fermentado. 3 La fermentación. microorganismos industriales son normalmente cultivados en condiciones rigurosamente controladas desarrollado para optimizar el crecimiento del organismo o la producción de un producto microbiano de destino. La síntesis de metabolitos microbianos es por lo general estrechamente regulada por la célula microbiana. En consecuencia, con el fin de obtener altos rendimientos, las condiciones ambientales que desencadenan mecanismos de regulación, en particular la represión y la inhibición de la retroalimentación, deben ser evitados. Las fermentaciones se llevan a cabo en grandes fermentadores a menudo con capacidades de varios miles de litros. Estos van desde los tanques simples, que puede agitarse vos o no se movió, a los sistemas integrados complejos que implican diferentes niveles de control por ordenador. El fermentador y tuberías ed aso-, etc., deben estar construidos con materiales de acero inoxidable, usualmente, que pueden

ser esterilizados en varias ocasiones y que no reaccionará de manera adversa con los microorganismos o con los productos objetivo. El modo de operación del fermentador (lote, lote alimentado de un sistema continuo o), el método de su aireación y agitación, en caso necesario, y el método adoptado para procesar ampliación tiene una gran influencia sobre el rendimiento de fermentación. Convencional DSP incluye todos los procesos unitarios que siguen fermentación. Implican la recolección de células, la ruptura celular, la purificación del producto a partir de extractos de células o el medio de crecimiento, y los pasos de acabado. Sin embargo, ahora se están haciendo intentos para integrar la fermentación con las operaciones de DSP, que a menudo aumenta la productividad del proceso. En general, DSP debe emplear métodos rápidos y eficientes para la purificación del producto, mientras se mantiene en una forma estable. Esto es especialmente importante cuando los productos son inestables en forma impura o sujetos a modificaciones no deseables si no purificada rápidamente. Para algunos productos, especialmente los enzimas, la retención de su actividad biológica es vital. Por último, debe haber una eliminación segura y económica de todos los productos de desecho generados durante el proceso.

Introducción a la microbiología industrial 3 Los productos de fermentación La economía general de los procesos de fermentación están influidos por los costes de las materias primas y consumibles, servicios, mano de obra y mantenimiento, junto con los gastos fijos, gastos de capital, los gastos generales de la fábrica y gasto de operación de trabajo. Los productos de fermentación se pueden dividir en dos categorías: alto volumen, productos de bajo valor o de bajo volumen, productos de alto valor. Los ejemplos de la primera categoría se encuentran la mayoría de los productos alimenticios y de bebidas de fermentación, mientras que muchos productos de química fina y productos farmacéuticos están en esta última categoría.

Alimentos, bebidas, suplementos

aditivos

alimentarios

y

Una amplia gama de alimentos y bebidas fermentadas se han producido a lo largo de la historia. Siguen siendo los principales productos de la fermentación en todo el mundo y son de gran importancia económica. productos lácteos fermentados, por ejemplo, el resultado de las actividades de las bacterias del ácido láctico en la leche, que modifican el sabor y la textura, y aumentan la estabilidad del producto a largo plazo. Las levaduras se expresan explotados en la producción de bebidas alcohólicas, no- hábilmente cerveza y vino, debido a su capacidad para fermentar azúcares, derivados de diversas fuentes de la planta, a etanol. La mayoría de los procesos utilizan cepas de una especie,S. cerevisiae, Y otras cepas de esta levadura se utilizan como levadura de panadería para la producción de masa de pan. Varios ácidos orgánicos derivados de la acción microbiana se emplean en la fabricación de alimentos y para una amplia gama de otros fines. El primero era uso humano para el ácido acético, como el vinagre, producido como resultado de la oxidación de bebidas alcohólicas por bacterias de ácido acético. Una fermentación aeróbica adicional implica la producción de ácido cítrico por el hongo filamentoso,A. niger, Que se ha convertido en un producto de fermentación industrial importante, ya que ha nume- alimentos ous y aplicaciones no alimentarias. Además, la mayoría de los aminoácidos y vitaminas como suplementos utilizados en la alimentación humana y animal humano se producen económicamente más por microorganismos, sobre todo si de alto rendimiento exceso de cepas productoras se desarrollan. Además, algunos microorganismos contienen altos niveles de

proteína con buenas características nutricionales adecuados tanto para el consumo humano y animal. Esta llamada "proteína unicelular '(SCP) se puede producir a partir de una amplia gama de microorganismos cultivados en fuentes de carbono de bajo coste.

Productos para el cuidado de la salud En términos de proporcionar el beneficio humano, los antibióticos son, probablemente, los compuestos más importantes producidas por microorganismos industriales. La mayoría son metabolitos secundarios sintetizados por hongos filamentosos y bacterias, en particular los actinomicetos. Bastante más de 4000 tibiotics an- ahora se han aislado, pero sólo alrededor de 50 se utiliza regularmente en la quimioterapia antimicrobiana. Los más conocidos y probablemente los antibióticos más útiles en medicina son lossegundolactámicos, penicilinas y cefalosporinas, junto con aminoglucósidos (por ejemplo estreptomicina) y las tetraciclinas. Nuevos antibióticos todavía se están buscando como resistencia a los antibióticos establecidos se ha convertido en un problema importante en los últimos años, a través del mal uso y abuso de estos fármacos. Otros productos farmacéuticos importantes derivados de la fermentación microbiana y / o las biotransforma- son alcaloides, esteroides y vacunas. Más recientemente, las proteínas humanas recombinantes terapéuticas, tales como insulina, interferones y la hormona del crecimiento humana han sido producidas por una gama de microorganismos. Este es un campo en rápida expansión y muchos más productos terapéuticos recombinantes son propensos a entrar en el mercado en los próximos años.

enzimas microbianas enzimas microbianas, en particular las enzimas extracelulares, tic hydroly- tienen numerosas funciones como auxiliares de proceso o en la producción de una amplia gama de alimentos específicos y productos no alimentarios. Las proteasas, por ejemplo, se utilizan ampliamente como aditivos para detergentes en polvo, en la eliminación de hazes de proteínas de cerveza y como cuajos microbianos para la producción de queso. Varios carbohidrasas están emplearse en la producción de una diversidad de jarabes de azúcar de almidón. Por ejemplo, el jarabe de maíz de alta fructosa se produce por hidrólisis de almidón de maíz en glucosa usandoun-amilasa y amiloglucosidasa y la glucosa resultante se isomeriza a una molécula más dulce, fructosa, por una glucosa isomerasa. Todos estos ejemplos implican el uso de enzimas a granel ''. Pequeñas cantidades de enzimas altamente purificadas finos '' se utilizan para numerosos fines especializados. La inmovilización de enzimas o células completas, por su unión a soportes poliméricos inertes, permite la recuperación más fácil y la reutilización del biocatalizador, y algunas enzimas son mucho más estable en esta forma. Además, el producto no se contamine con la enzima. aplicaciones de catalizadores biológicos inmovilizados incluyen la

4

Introducción a la microbiología industrial

producción de aminoácidos, ácidos orgánicos y jarabes de azúcar.

productos químicos industriales y combustibles productos químicos materias primas industriales suministrados a través de la fermentación incluyen diversos alcoholes, disolventes tales como acetona, ácidos orgánicos, polisacáridos, lípidos y materias primas para la producción de plásticos. Algunos de estos productos de fermentación también tienen aplicaciones en la fabricación de alimentos. Los combustibles fósiles, especialmente el petróleo, son propensos a convertirse en ex Hausted dentro de los próximos 50-100 años, lo que resulta en la necesidad de desarrollar fuentes alternativas de energía. la generación de combustible biológico puede hacer una contribución cada vez mayor, sobre todo en la conversión de masa vegetal renovable biocombustibles líquidos y gaseosos. Esta biomasa vegetal puede ser en forma de cultivos energéticos, la vegetación natural y residuos orgánicos agrícolas, industriales y domésticos. Actualmente, el metano y el etanol son los principales productos, aunque otros combustibles potenciales se pueden generan a usando microorganismos, incluyendo hidrógeno, etano, propano y butanol.

funciones ambientales microorganismos

de

microbios presentes en las aguas residuales, en particular los organismos causantes de las enfermedades transmitidas por el agua el cólera, la disentería y la fiebre tifoidea. El segundo objetivo es descomponer la materia orgánica de las aguas residuales a la mayor parte por metano y dióxido de carbono, produciendo de esta manera un efluente final (salida) que puede ser descargada de forma segura en el medio ambiente. las actividades microbianas se pueden emplear también en la degradación de compuestos xenobióticos artificiales con- en flujos de residuos y en la biorremediación de ambientes contaminados por estos materiales. microbiana basada en la "tecnología limpia" también está siendo utilizado cada vez más in- en la desulfuración de combustibles y la lixiviación de metales (por ejemplo, cobre, hierro, uranio y zinc) a partir de minerales de baja ley y los desechos utilizando especies de Thiobacillus y Sulfolobus. el control biológico del medio ambiente es un sector en el que los microorganismos son emplearse en un esfuerzo para reducir nuestra dependencia de los plaguicidas químicos sintéticos. Bacterias, hongos, protozoos y virus-ES se cultivan para producir biomasa de células o productos para el control de hongos, insectos y nematodos plagas de cultivos agrícolas, además de algunos vectores de enfermedades humanas y animales.

los

Los microorganismos son particularmente importantes en el tratamiento de aguas residuales, que utiliza las actividades metabólicas de las diversas poblaciones microbianas mixtas capaces de clasificación de- cualquier compuesto que pueda ser presentado a ellos. Los dos objetivos principales son para destruir toda patógena

Conclusión Como puede observarse a partir de esta breve introducción, los microorganismos tienen un papel importante en el suministro de alimentos, materias primas y servicios esenciales. Este papel es probable que se expanda debido a nuestras necesidades crecientes de recursos y la Ty abili- para manipular microorganismos para mejorar sus rendimientos y la gama de sus productos y actividades.

Parte

1 fisiologí a microbi ana

1 estructura de la célula microbiana y la función

La célula es la unidad básica de todos los organismos vivos, muchos de los cuales son unicelulares, mientras que otros son formas multicelulares, lo que permite la especialización celular. Todas las células están llenas de una matriz de fluido y rodeadas por una membrana citoplasmática, principalmente compuesta de lípidos y proteínas. También contienen ácidos nucleicos, los portadores físicos de la información genética, además de ribosomas que intervienen en la síntesis de proteínas. Las células se dividen en dos categorías: los de los archaea y eubacterias son prokaryotic, mientras que las células de los hongos, protozoos, algas y otras plantas y animales son eucariotas. Las células procariotas son normalmente menos de 5 micras de diámetro, con muy pocas excepciones notables, como la bacteria sos marinos, Thiomargarita namibiensis, en más de 100 veces más grande. Los procariotas raramente poseer orgánulos unidos a la membrana y tienen poco ultraestructura interna reconocible, aparte de los cuerpos de inclusión (gránulos de compuestos orgánicos o inorgánicos), varios vacuolas y algunos invaginaciones especializadas de la membrana celular, por ejemplo, las láminas de células fotosintéticas (Fig. 1.1a). La mayoría de las células procarióticas contienen un solo cromosoma compuesto de ácido desoxirribonucleico (ADN), que se encuentra en una región de la célula se hace referencia como el nucleoide. El cromosoma es generalmente circular, aunque en algunos procariotas es lineal. ribosomas procariotas son 70 S (unidades Svedberg), que se refiere a su velocidad de sedimentación de centrifugación y es una medida de su tamaño, aunque la densidad y la forma de la partícula

también puede influir en este valor. Casi todos los procariotas tienen paredes celulares o envolturas celulares situados fuera de la membrana citoplasmática, que por lo general contienen algunos de peptidoglicano. lado de salida de esta pared que puede tener cápsulas o capas de limo y flagelos propulsión que son menos complejos que los de las células eucariotas. La división celular en procariotas es normalmente por simple fisión binaria. Las células eucariotas son generalmente más grandes que los de los procariotas y contienen una serie de orgánulos unidos a la membrana, incluyendo las mitocondrias, lisosomas, aparato de Golgi y un extenso retículo endoplásmico (Fig. 1.1b). células fotosintéticas también contienen cloroplastos.

El ADN de las células eucariotas, en forma de varios cromosomas lineal, es característicamente acomplejado con proteínas histonas y se encuentra en un núcleo unido doble membrana. ribosomas eucariotas, además de los ubicados dentro de ciertos orgánulos, son 80 S, algo más grandes que los de los procariotas. Si las paredes celulares están presentes, que están compuestos de materiales distintos de peptidoglicano, tales como celulosa y bglucanos relacionados, quitina o de sílice. Las células eucariotas dividir por un complejo proceso de la mitosis y por lo general tienen un ciclo de vida sexual, que implica la meiosis (división de reducción). Este proceso reduce a la mitad el número de cromosomas diploides de pares (2n) de cromosomas para producir células haploides (n) que contienen un único conjunto de cromosomas, facilita la recombinación genética y los resultados en la formación de los gametos.

Los procariotas Los procariotas se han separado en dos grupos distintos en la base del estudio de las

relaciones filogenéticas (evolutivo). Son el arqueobacterias o arqueas ( 'antiguos' bacterias) y las eubacterias ( 'verdaderos' bacterias), el grupo que contiene los procariotas industriales casi todos establecidos (Tabla 1.1).

arqueas Estos procariotas son muy diferentes de las eubacterias y tienen algunas características, especialmente los aspectos de la cripción y traducción maquinaria transcripción asociado con la síntesis de proteínas, que son similares a las células eucariotas. La mayoría de los archaea viven en ambientes extremos similares a las que se cree que las formas tempranas de la vida que han sufrido. Tres tipos fisiológicos básicos se encuentran, a saber, los halófilos (adaptadas a altas concentraciones de sal), thanogens me(productores de metano) y termófilos (adaptado a las altas temperaturas), y algunos de ellos también son barófilos (adaptados a la alta presión) (véase el capítulo 2 ). Arqueas tienen genomas relativamente pequeños que contienen

7

Capítulo

8

Tabla 1.1 géneros microbianos con papeles industriales establecidos (por ejemplos específicos de sus funciones véase la Tabla 4.1) eubacterias archaea

Gram-negativo

Methanobacterium Methanococcus Pyrococcus Sulfolobus

Acetobacter Acinetobacter Agrobacterium Alcaligenes Azotobacter Erwinia Escherichia Klebsiella Methylocococcus Methylophilus Pseudomonas Ralstonia Salmonela Sphingomonas Spirulina Thermus Thiobacillus Xanthomonas zoogloea Zymomonas

hongos Gram positivas Actinomyces Actinoplanes Arthrobacter Bacilo Brevibacterium Clostridium Corynebacteriu m Lactobacillus Lactococcus Leuconostoc Micrococcus Mycobacterium Nocardia Propionibacteri um Estreptococo Streptomyces

(un) laminillas o fotosintética otros invaginaciones PiliCápsula ADN

Filamentoso

levaduras

Acremonium Agaricus Aureobasidium Aspergilo Claviceps Coniothyrium Curvularia cylindrocarpon Fusarium Lentinus Mortierella Mucor Paecilomyces Penicillium Rhizomucor Rhizopus Sclerotium Trametes Trichoderma Trichosporon

Blakeslea Candida Hansenula Kluyveromyces Pachysolen Phaffia Pichia Rhodotorula Saccharomyces Xanthophyllomy ces Yarrowia Zygosaccharomy ces

(B) Cápsula Pared celular

Membrana vacuola

ribosoma partículas

Los ribosomas flagelo

flagelo

vacuola de gas mesosomagránulos de almacenamiento Pared celular Membrana

Núcleo

cloroplasto endoplásmico retículo mitocondria nucléolo gránulos de almacenamiento

Higo. 1.1Representación esquemática de las principales estructuras de (A) procariotas y células microbianas eucariotas (b). No todas las estructuras están siempre presentes, incluyendo cápsulas, cloroplastos, flagelos, pili, gránulos de almacenamiento y vacuolas (de Dawes y Sutherland (1992)).

menos de la mitad del ADN de las eubacterias. Por ejemplo, el genoma de Methanococcus jannaschii se ha se- extinguió y se encontró que contenía 1760 genes

compuestas de 1700 pares de kilobases (kbp). Aunque pocos son los archaea

actualmente se utiliza con fines industriales, poseen muchas propiedades interesantes que podrían ser explotadas para usos biotecnológicos en el futuro. Sus enzimas son de particular interés. Todos los procariotas pueden subdividirse inicialmente de acuerdo con sus características en el procedimiento de tinción de Gram, que está

estructura de la célula microbiana y

9

determinada por la estructura celular de la pared / sobre. composición de la pared celular Archaeal varía considerablemente, algunos apareciendo Gram-positivo mientras que otras son Gram-negativas. Sus constituyentes de la pared celular son bastante

diferentes de los de las eubacterias, en que 5 Planctomyces y Pirella, Peptidoglicano contienen los polímeros único, bacterialacking; algunas con nucleoide unido a methanochondroitin y pseudomureína. la membrana. 6 Bacteroides y También poseen lípidos de membrana Flavobacterias, un subgrupo que contiene una mezcla de tipos fisiológicos. distintivos. El arqueas se puede dividir en tres reinos. 1 Euryarchaeota son principalmente 7 chlorobi, como Chlorobium, un fototrofo anaeróbica. los metanógenos, como Methanobacterium y Methanosarcina, y los halófilos extremos 8 Las espiroquetas y parientes que son bacterias Gram-negativas en espiral. Halobacterium y Halococcus. 2 Crenarchaeota son en su mayoría barófilos extremas y termófilos que incluyen Pyrodictium, Pyrolobus, Sulfolobus y Thermoproteus. 3 Korarchaeota son hyperthermophiles que, hasta ahora, no han sido aislados como cultivos puros.

eubacterias Las eubacterias son un grupo muy diverso que puede ser dividido en 12 subgrupos. Sin embargo, casi todas las bacterias industriales están contenidos dentro de sólo dos de ellos, el proteobacteria y las eubacterias Grampositivo. 1 El proteobacterias es un reino importante de bacterias Gram-negativas que se divide en cinco grupos, a, b, g, d, e. Incluyen teria púrpura fotosintética rianas y parientes no fotosintéticas, en particular el de enterobacterias (por ejemplo, Escherichia coli), junto con Hyphomicrobium, Nitrobacter, Pseudomonas, Bacillus tio y Vibrio. 2 Las eubacterias Gram-positivas se componen de dos subdivisiones principales: (a) la baja guanina (G) + grupo citosina (C), que se refiere a la proporción de este par de bases en el ADN del organismo e incluye Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Leuconostoc, Staphylococcus, tococcus Strep- y Mycoplasma; y (b)el grupo G + C de alta, que contiene los micetos actino- (bacterias filamentosas, por ejemplo, Streptomyces), Corynebacterium, Mycobacterium y Micrococcus. Los otros subgrupos, que contienen algunos ejemplos de bacterias industriales, son los siguientes. 3 Las cianobacterias y familiares, que son fototrofas oxigénica, por ejemplo, Anabaena, Nostoc y Spirulina. 4 Chlamydia, Un grupo de parásitos intracelulares obligados.

9 Deinococci, micrococos radioresistant y familiares, e.g. Deinococcus radiodurans y Thermus aquaticus. 10 Greennonsulphurbacteriaandanaerobic fototrofas. 11 Thermotoga y Thermosulfobacteria, ter- mophiles de aguas termales y los sedimentos marinos. 12 Aquiflex, Un grupo de hyperthermophiles quimiolitotróficas y autótrofos obligados. Probablemente no hay tal cosa como una célula ótica prokary- típico. Hay una gran cantidad de diversidad, incluyendo: la diversidad morfológica (tamaño y forma; varillas, cocos, SPI-rales, filamentos, etc.), la diversidad estructural (paredes celulares / sobres, estructuras externas grampositivos o gramnegativos tales como flagelos y pili, y la capacidad de formar esporas), junto con metabólica, ecológica y diversidad comportamental. Sin embargo, vale la pena considerar, con cierto detalle, las características celulares clave de ejemplos de bacterias industrialmente valiosos Gramnegativas y Gram-positivas. ESCHERICHIA COLI, Una bacteria gramnegativa

E. coli fue descubierto en 1885 por el alemán Theodor ogist bacteriol- Escherich. Es un habitante importante del colon de los humanos y el intestino inferior de otros animales de sangre caliente. Algunas cepas

pueden causar enfermedades por los alimentos y transmitidas por el agua que producen diarrea y pueden ser especialmente problemáticos para los bebés humanos y animales jóvenes. Una cepa particularmente virulenta es E. coli 0157: H7, la causa de la colitis hemorrágica, que recientemente ha surgido y se ha asociado con la ingestión de carne de vacuno cruda y leche cruda. Amplia información se ha acumulado sobre la bioquímica, la fisiología y la genética de E. coli. Este conocimiento y la rápida tasa de crecimiento del organismo, con un tiempo de duplicación tan bajo como 20 min (véase el capítulo 2), ha llevado a que se convierta en un importante microorganismo industrial. E. coli se ha usado ampliamente como un modelo para el estudio de la biología molecular y a menudo se considera que es el anfitrión ideal en experimentos de genes de clonación. En consecuencia, se ha demostrado ser de gran utilidad para la producción de proteínas heterólogas, procedentes de otros organismos. Sin embargo, la secreción de proteínas de E. coli es más bien más problemático, debido a la naturaleza de su envoltura celular (véase a continuación), mientras que la secreción de las bacterias Gram-positivas a menudo se consigue más fácilmente. E. coli es un anaerobio facultativo Gramnegativas, pertenencia a la familia Enterobacteriaceae, cuyos miembros se refieren a menudo como las enterobacterias y bacterias entéricas. Las células son varillas rectas cortas, aproxi-

madamente 0,3-1,0 mm de ancho y 1.0-3.0 mm de largo, que vide di por fisión binaria después de la elongación de aproximadamente el doble de su longitud normal. Los miembros del género Escherichia son oxidasa-negativas (que carece de citocromo c ox- idase) y llevar a cabo la fermentación de ácido mixto, principalmente la producción de lactato, acetato, succinato y formiato. El compañero de lucro puede ser degradado aún más para formar H2 y CO2. Membrana externa Las cubiertas externas de las células bacterianas Gram-negativos se refieren a menudo como sobres, en lugar de las paredes, ya que son más complejas que las paredes celulares de las bacterias Grampositivas (Fig. 1.2a). Se compone esencialmente de dos capas que protegen la célula y proporcionar rigidez. La capa más externa se llama la membrana externa, que es aproximadamente 7-8 nm de espesor, que contiene lipopolisacárido y mucopéptido. Esta estructura no impida el movimiento de moléculas pequeñas, cargadas o no cargadas, y es más permeable que el / membrana celular cito- plásmica (ver abajo), pero es una barrera a las moléculas hidrófobas y las proteínas. Contiene PORIN proteínas, compuestos por tres subunidades, que forman canales estrechos de aproximadamente 1-2 nm de diámetro a través de los cuales pueden pasar las moléculas pequeñas. porinas no específicos permitir el paso de moléculas hasta 600-700 Da, mientras que las porinas específicos tienen sitios de unión para una o más sustancias de hasta 5000 Da. componentes lipopolisacáridos de la envolvente son efectivos en la protección de la célula de detergentes y otros agentes antimicrobianos. La proteína de membrana externa más común es la lipoproteína de Braun, que se extiende a través de la membrana externa y enlaces a los peptidoglicano subyacentes. Flagelos de cepas móviles a impulsar la célula a través de medios acuosos. En E. coli, flagelos están dispuestos alrededor de toda la célula, se hace referencia como una disposición de peritricoso, mientras que otras bacterias tienen flagelos polares o arreglos específicos alternativos. Cada flagelo es varias crometres migrantes largos, compuestos de la flagelina de proteínas, y se

une a la capa de la membrana externa a través de un cuerpo basal, compuesto de cuatro anillos. Además, las fibrillas (briae FIMCAP o pili), pueden estar unidos a la membrana externa, que son proyecciones cortas similares a pelos, 5-7 nm de diámetro y 400 nm de longitud. Permiten E. coli a adherirse a las superficies, tales como el epitelio intestinal. Algunas cepas también poseen cápsulas situadas fuera de la membrana externa, que están compuestos de polisacáridos. Su producción está influenciada por las condiciones químicas y físicas en el entorno local. Estos exopolisacáridos pueden proporcionar una barrera para

ciertas moléculas, ayudan a proteger contra la desecación, o ayudan a la fijación de las cepas patógenas para el anfitrión de las superficies celulares. El peptidoglicano y el espacio periplásmico Dentro de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, y unido covalentemente a él a través de las lipoproteínas, es una fina capa de peptidoglicano algunos 2-3 nm de espesor. Se constituye sólo el 5-10% de la dotación de células y se compone de una a tres capas, en comparación con los 20-25 capas de peptidoglicano en las paredes de muchas bacterias Gram-positivas. Sin embargo, es un componente estructural muy importante. Cuando la capa peptiglycan es incompleta, las células bacterianas pueden hinchan y revientan en última instancia (véase el capítulo 3, la biosíntesis de peptidoglicano). El peptidoglicano se extiende hacia abajo en el espacio periplásmico subyacente, que es de aproximadamente 12 a 15 nm de ancho. Esta región no está vacío, que contiene una serie de proteínas, proteínas de unión, los quimiorreceptores y varias enzimas. proteínas de unión a iniciar el transporte de sustancias específicas en la célula llevándolos a sus portadores branas unida miembros. Los quimiorreceptores están implicados en la quimiotaxis, que es el movimiento de una célula hacia atrayente y lejos de los productos químicos repelentes. enzimas hi- drolytic, fosfatasa alcalina, en particular ases nucleación y proteasas, se

secretan en el periplasma del citoplasma y se retienen cerca de la célula, ya que no pueden pasar normalmente a través de la membrana externa. Están asociados con la ruptura de las grandes nutrientes permeables imper- en moléculas más pequeñas que pueden ser transportados a través de la membrana celular en la célula (véase el capítulo 2, La absorción de nutrientes). Algunas enzimas desintoxicantes y de defensa también se encuentran aquí, por ejemplo, la penicilinasa. Celda de membrana (citoplasmática) A continuación se encuentra el espacio periplásmico de la membrana celular interna (citoplásmica) que encierra la matriz citoplasmática (Fig. 1.2a). Esta estructura es altamente selectiva, el control de la entrada de nutrientes y la secreción de iones y compuestos más grandes. La membrana está en la forma de una bicapa lipídica, compuesto principalmente de fosfatidil etanolamina. Se intercalan con las dos proteínas de transporte, tales como la lactosa permeasa, y poros formados por porinas que controlan selectivamente la entrada de moléculas y iones cargados en las células. proteínas respiratorias, incluyendo los citocromos y otras proteínas de transferencia de electrones, también se encuentran dentro de esta membrana (véase el capítulo 3).

(a) dotación de células Gram-negativas Cápsula

porina

LPS

Membrana externa PL LP

PAG

periplasma SP

TP

PL

peptidoglicano

Membrana interna

(b) envoltura celular Gram-positivas

Cápsula

capa Protein

peptidoglicano

2º polímero de pared

Higo. 1.2 Representación esquemática de la estructura de la típica (a) Gram negativo y (B) sobres de células Grampositivos. LPS = lipopolisacárido; LP = Lipoproteína; P = proteína; PL = fosfolípido; proteína = superficie SP; proteínas TP = transmembrana (desde Poxton (1993)).

matriz citoplasmática y contenido de la celda

Lipocarbohydrate

TP

PL

SP

Membrana citoplasmá tica

La matriz citoplasmática se mantiene a pH 7.6 a 7.8, con diferencias entre el intracelular y

extracelular pH lular siendo controlado por la bomba de protones primarios

asociado con el transporte de electrones y la respiración. Contiene intermediarios metabólicos, y las enzimas y coenzimas necesarias para el metabolismo catabólico y anabólico (ver Capítulo 3). Maquinaria para la síntesis de proteínas, la transcripción y la traducción, también se encuentra aquí.

Esto incluye ARN polimerasas para transcribir antibióticos (bacitracina, gramicidina y polimixina) e insecticidas. el código genético de ADN en ARN mensajero (ARNm), y alrededor de 18 000 ribosomas y B. subtilis es un microorganismo del ARN de transferencia para la traducción de suelo común que es las secuencias de mensajes de ARNm en menudo recuperado de residuos de agua, aire y vegetal en proteínas. descomposición. Esta bacteria es El cromosoma reside en la región nucleoide considerada como benigna, ya que no que ocupa aproximadamente el 10% del posee rasgos de la enfermedad, a volumen de la célula. Es una sola molécula diferencia de algunos de sus familiares, circular de ADN de doble hebra compuesta de en particular B. anthracis, la causa del aproximadamente 4600 kpb, que constituye ántrax. La gama de enzimas más de 4000 genes, y se une a la parte extracelulares producidas por este interior de la membrana celular en, o cerca microorganismo permite degradar una de, el origen de replicación. Esta molécula de variedad de naturales ADN es de aproximadamente 1 mm de longitud y 1 nm de espesor, pero está extensamente doblada y enrollada, y estabilizado por proteínas asociadas. Plásmidos, relativamente pequeñas moléculas de ADN extracromosómicos circulares, también pueden estar presentes. Incluyen el factor de resistencia, plásmidos fertilidad (F) (R) y Col plasmas frecuencias medias que codifican para colicinas, ocins bactericidas antibacterianos específicos. En las cepas enteropatógenas de E. coli son conocidas por ser plásmido codifica al menos dos toxinas. El glucógeno polisacárido es un almacén principal de carbono y energía, y puede ser visto como cuerpos de inclusión dentro de la matriz citoplasmática. Bajo ciertas circunstancias betaínas osmoprotective (N, N, N-trimetil glicina) también se acumulan.

BACILLUS SUBTILIS, Una bacteria Grampositivas

El género Bacillus se compone de un gran número de diversos, bacterias, en forma de barra chemoheterotrophic, Gram-positivos. Estas células son por lo general algo más grande que E. coli, a 0,5-2,5 mm de ancho y 1.2-10 mm de largo. Algunas especies son estrictamente aeróbico, otros son anaerobios tativos facultades o microaerofılico, pero todos son catalasa positivo (véase el capítulo 2). especies de Bacillus también producen endosporas ovales o cilíndricas que son resistentes a las condiciones ambientales adversas y proporcionar una ventaja selectiva para la supervivencia y la difusión (Fig. 1.3). Varios miembros del género tienen importantes papeles industriales, en particular como fuente de enzimas,

Membrana citoplasmática

capa de la espora Corteza ADN

exosporium El citoplasma de ribosomas

Higo. 1.3La estructura de una endospora bacteriana típica.

sustratos y contribuye al ciclo de nutrientes. Muchas de estas enzimas son explotados comercialmente y B. sub Tilis se ha usado ampliamente para la producción de enzimas industriales, en particular amilasas y proteasas. Algunas de estas amilasas se utilizan ampliamente en procesos de modificación del almidón y las proteasas se emplean como la limpieza de SIDA en los detergentes biológicos. B. subtilis también ha demostrado ser muy útil para la fabricación de productos de química fina, especialmente nucleósidos, vitaminas y aminoácidos, y algunas cepas se utilizan en la protección de cultivos contra hongos patógenos. Esta bacteria también es un huésped de clonación

capaz valiosa para la producción de proteínas heterólogas. Las principales características de B. subtilis que la distinguen de E. coli son la estructura de la pared celular y la capacidad de producir esporas. B. subtilis paredes celulares son típicos de bacterias Gram-positivas, siendo mucho menos complejos que los de las bacterias Gram-negativas tales como E. coli. Son 20-50 nm de espesor y simplemente compuesta de 20-25 capas de peptidoglicano, asociados con algunos lípidos, proteínas y ácidos teicoicos (Fig. 1.2b). teichoic ácido es un polímero aniónico distintivo de glicerol fosfato, ribitol fosfato y otros fosfatos de azúcar. Se covalentemente está vinculada a las unidades de ácido N-acetilmurámico del peptidoglicano o a los lípidos de la membrana celular subyacente. Este componente no se encuentra en las bacterias Gram-negativas. Fuera de la pared celular, B. subtilis produce una cápsula polipéptido que contiene tanto unidades de ácido D y L-glutámico. lae Flagelpuede estar presente y las formas flageladas son capaces de quimiotaxis. El B. subtilis cromosoma es un poco más pequeño que el de E. coli a 4188 kpb, pero otras características intracelulares son similares. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, una diferencia importante es la capacidad de los miembros de este género para formar esporas (Fig. 1.3). Las células vegetativas continúan creciendo y

dividir por fisión binaria hasta que se convierten en nutrientes limitantes. La privación de nutrientes inicia la esporulación a través de una señal química hasta ahora desconocido. Desigual división celular produce una menor preespora célula y una célula más grande er madres por la formación de un tabique asimétrico cerca de uno de los polos de la célula. La célula madre se va a hundir a los preespora. Una pared primordial de peptidoglicano se forma entonces alrededor de la preespora, que más tarde se convierte en la pared celular de la célula vegetativa que surge cuando germina la espora. Esta pared primordial es luego cubierta por una capa mucho más gruesa de peptidoglicano compleja, conocida como la corteza de esporas. Esta corteza tiene una composición de esporas específico único, donde más del 50% de los residuos de ácido murámico están presentes como lactama ácido murámico d-. Después de la deposición corteza, la estructura es finalmente encerrado dentro de una cubierta proteica, y la célula madre que rodea muere y lisa para liberar la espora. Estas esporas son extremadamente latente, que presenta una falta de metabolismo, y son altamente resistentes a la desecación, calor, radiación y tratamientos químicos agresivos. Ellos pueden permanecer viables durante largos períodos. En condiciones favorables de crecimiento de la espora germina para formar una célula vegetativa.

hongos Los hongos son un grupo diverso de microorganismos eucarióticos que ocupan una gran variedad de hábitats. La mayoría de las especies de hongos se compone de hifas filamentosas y se refieren a menudo como moldes, mientras que las levaduras, que se describirán más tarde, son hongos unicelulares. De los miles de especies conocidas, son relativamente pocos los hongos filamentosos se utilizan con fines industriales (Tabla 1.1). hongos filamentosos son tous no fotosintética y tienen estricta nutrición de absorción chemoheterotrophic (véase el capítulo 2). Muchos segregan una serie de enzimas hidrolíticas para degradar las moléculas poliméricas complejas encontradas en unidades más pequeñas que pueden ser absorbidas. La mayoría están

sapro- fítico, la utilización de animales muertos o restos de plantas. Algunos son parásitos facultativos de plantas o animales, y varios forman relaciones simbióticas mutualistas y con otros organismos, por ejemplo, con un alga para formar un liquen (un hongo, el mycobiont, en asociación simbiótica con un alga, la phycobiont). Los hongos filamentosos se originan ya sea de los fragmentos de hifas o esporas dispersas que germinan en condiciones ambientales adecuadas. Las hifas puede crecer rápidamente en longitud, a velocidades de hasta varios micrómetros por minuto. Sin embargo, en general hay poco aumento en la circunferencia, lo que maximiza el área de superficie para la absorción

de nutrientes. Se ramifican para formar esteras de entrelazamiento que por lo general se establecen alrededor y dentro de su fuente de alimento, y se organizan estructuralmente en el micelio vegetativo macroscópica. En los hongos superiores, las hifas se pueden agregar juntos para producir estructuras sólidas grandes y complejas, tales como los cuerpos de fructificación de setas, rizomorfos, esclerocios y estromas. hifas individuales son 1-15 mm de diámetro dependencia ing de la especie. Sus paredes celulares están compuestas de 80 a 90% de polisacárido, junto con algunos de los lípidos y componentes proteicos. Excepto en ciertos hongos inferiores, el polisacárido es principalmente microfibrillas de quitina, un polímero lineal de unidades de Nacetilglucosamina con enlaces-b-1,4, que es un material fuerte y flexible, similar a la encontrada en los exoesqueletos de artrópodos. A diferencia de las paredes celulares de levadura (véase p. 16), glucano y manano son componentes relativamente menores. Glucanos son en su mayoría establecen en las puntas de las hifas ING creciente. Aquí las paredes celulares son sólo el 50 nm de espesor, pero detrás del espesor de pared punta aumenta hasta 125 nm a través de la deposición adicional de la quitina. hifas de los hongos puede ser aseptados o tabicado. Las hifas de los hongos aseptados carecen de paredes transversales y dichas células se denominan coenocytic. Este es un estado multinucleadas que resulta de la división nuclear repetida sin citocinesis

(división celular). Las hifas de los hongos septadas se divide en celdas por paredes transversales llamados septos, que contiene poros que permiten orgánulos y otros materiales celulares para pasar de una célula a otra (Fig. 1.4). orgánulos celulares de los hongos son típicamente eucariótica y son particularmente asociado con las puntas de hifas en crecimiento, que a menudo están llenas de mitocondrias, ribosomas y pequeños culos vesi-. Además, las hifas tienden a tener numerosas vacuolas que contienen productos de almacenamiento, normalmente glucógeno, lípidos y volutin (un polímero de metafosfato). cromosomas por hongos y los núcleos son relativamente pequeñas, y la división nuclear es algo diferente de la de la mayoría de otros eucariotas. Durante la mitosis, la Velope ennuclear permanece intacta con el husillo situado dentro. Después de la separación de los cromosomas replicados, la envoltura nuclear clara contrae para formar dos nuevos núcleos, durante el cual desaparece el huso. Aunque hifas de los hongos y las esporas son normalmente haploides, excepto para las etapas diploides transitorios en los ciclos de vida sexuales, algunos micelios pueden ser genéticamente heterogénea, lo que resulta de la fusión de hifas de orígenes distintos. En tales casos, cada uno contribuye hifa núcleos que pueden permanecer separados en diferentes partes de la misma micelio, o pueden mezclarse y incluso intercambiar genes en un proceso similar a los acontecimientos de sobrecruzamiento durante la meiosis. La mayoría de los hongos se reproducen por la liberación de grandes cantidades de

poro septal citoplasmática La pared celular de membranaperiplasma

Golgi aparato vesículas

vacuola mitocondria Almacenamiento gránulo

Núcleo

esporas unicelulares. Estos propágulos se encuentran dispersas en una amplia área por el viento o el agua. Ellos son estables durante largos períodos de tiempo, pero si se germinan las condiciones y sustrato ambientales son adecuadas. Hay varias maneras por las cuales las esporas se pueden formar asexualmente, dependiendo de sobre el hongo (Fig. 1.5). Su modo de formación determina si son blastosporas, giospores sporan-, conidiosporas, y así sucesivamente. Las variaciones en la forma y disposición de las estructuras de portadores de esporas se utilizan a menudo como una base para la identificación de hongos. El ciclo sexual en los hongos difiere de la de otros organismos eucariotas en que singamia, unión sexual de células haploides de cepas de apareamiento opuesto, + y -, se produce en dos etapas separadas en el tiempo: primero, mogamy plasma, la fusión del citoplasma, seguido algún tiempo más tarde por cariogamia, la fusión de núcleos. Tras plasmogamia, un dicarión se forma a través de la pareja formada por núcleos haploides de cada cepa parental, pero los pares de núcleos no se funden inmediatamente. Estos pares nucleares dentro de un dicarión pueden permanecer separados y seguir dividiendo de forma sincronizada durante largos períodos. Eventualmente se fusionan para formar una célula diploide que entendemos directamente va meiosis, produciendo finalmente genéticamente diversas esporas haploides.

endoplásmico retículo

Higo. 1.4Representación esquemática de una hifa septadas hongos.

Tradicionalmente, las 100 000 especies conocidas de hongos se han dividido en cuatro clases principales, basados principalmente en cómo y dónde se generan específicamente sus esporas sexuales.

Fitomicetos Fitomicetos son los hongos inferiores, que se subdividen en Mastigomycotina (zoosporic, esporas móviles) y

Zygomycotina (Zygosporic). Ellos son los hongos más simples y su hifas vegetativas son aseptados. El Mastigomycotina contiene los mohos acuáticos, nia Saproleg-, y la planta de patógenos importantes de Pythium y Phytophthora. Inusualmente, sus paredes celulares están compuestas de celulosa, junto con otros glucanos o quitina. aliado miembros importantes industrializados del Zygomycotina incluyen Mucor, Rhizopus Rhizomucor y especies, que se utilizan en algunas fermentaciones de alimentos tradicionales, y de células enteras y bioconversiones de enzimas. Resultados de la reproducción asexual en la formación de Sac como esporangios en las puntas de las hifas en posición vertical o giophores sporan(Fig. 1.5a). Cientos de esporas haploides son producidos por mitosis dentro del esporangio, que luego se dispersan viento. En micelios la reproducción sexual de los tipos de apareamiento opuestos cada forma gametangios, con tener varios núcleos haploides. Plasmogamia de + y -

gametangios, y emparejamiento de núcleos haploides, los resultados en la formación de un zygosporangium dicariótico. Esta estructura es metabólicamente inactivo y resistentes a la desecación. Cuando las condiciones son favorables, cariogamia se produce entre los núcleos vinculados y la RESULTEN núcleos diploides sufren meiosis para producir esporas haploides.

Ascomycetes o Ascomycotina (hongos de saco) Esta es la clase más grande de hongos y levaduras se incluyen los que se utilizan en muchos procesos industriales de fermentación. Otros miembros filamentosos que tienen funciones industriales y comerciales son las especies de Neurospora, especies de Claviceps, y hongos comestibles importantes, incluyendo especies Morchella (morillas) y especies de tubérculo

(un)

(B) Esporangio

conidiosporas

esporulación aérea micelio sporangiophore

conidiosporas liberados

esporulación aérea micelio Conidiaphore

vegetativo coenocytic micelio

Higo. 1.5la formación de esporas asexuales (a) en los esporangios de Mucor, un hongo filamentoso coenocytic y (b) conidios de Penicillium, un hongo filamentoso septadas.

(trufas). Su hifas son septadas, y en la reproducción asexual, las puntas de las hifas especializadas (phores conidioforos) forman cadenas de conidiosporas haploides que suelen ser dispersadas por el viento. esporas o ascosporas sexuales están contenidas dentro de un ascus en forma de saco, que puede estar cerrado en- dentro de un cuerpo fructífero o ascocarpo. Las levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, producen el equivalente de un ascus durante la reproducción sexual y la mayor parte del brote durante la reproducción asexual de una manera similar a la formación de conidiosporas (ver abajo). Sin embargo, ciertas levaduras, en particular las especies de Schizosaccharomyces, NO brote, pero se someten a la fisión binaria de una manera similar a las bacterias.

Basidiomycetes o Basidiomycotina (hongos del club) Los miembros de esta división agrícola de hifas septadas y sus basidiosporas haploides sexuales son producidas en estructuras conformadas por clubes llamadas basidios. En algunos casos, éstos están contenidos dentro de grandes cuerpos fructíferos sexuales, los iocarps basid-, como en las setas, por ejemplo Agaricus bisporus (champiñón botón) y especies Lycoperdon (bolas de hojaldre).

vegetativo tabicado micelio

Otros basidiomicetos industrialmente importantes son ciertos hongos que pudren la madera que intervienen en los procesos de biodeterioro y biodegradación, por ejemplo Phanerochaete chrysosporium (podredumbre blanca). También se incluyen en esta división son las royas y tizones, que son importantes patógenos de las plantas.

Deuteromycetos o Deuteromycotina (Hongos 'imperfecta') Esta división contiene un grupo diverso de alrededor de 25 000 especies, que se han agrupado simplemente Debido a que carecen de una fase sexual definida (perfecto), o uno no se ha observado. Se supone que este grupo puede representar las etapas de conidios de ascomicetos cuya ascus etapa todavía no se ha descubierto o se ha perdido en el curso de la evolución. Parasexuality se ha demostrado en algunas especies, lo que ha demostrado ser importante para el estudio genético y desarrollo de la cepa. Muchos hongos trially importantes industrias se clasifican como Deuteromycetes, incluyendo especies de Aspergillus, Cephalosporium, Fusarium, Penicillium (Fig. 1.5b) y Trichoderma.

levaduras

Las levaduras, en particular S. cerevisiae, son dignos de especial atención, debido a su importante contribución como microorganismos industriales. El término "levadura" se refiere a una forma unicelular en lugar de a una clasificación filogenética. Puede ser utilizado para describir una fase unicelular de los ciclos de vida de hongos que pueden ser predominantemente filamentosos, pero dimorfismo ex HiBit levadura-molde. Los cambios de una forma a la otra son a menudo influenciados por las condiciones nutricionales predominantes. Sin embargo, este término se usa más comúnmente como nombre genérico para los hongos que sólo tienen una fase unicelular, como la cocción o elaboración de la cerveza levaduras. Estos verdaderos levaduras y muchos otros de importancia industrial son cepas de S. cerevisiae, un miembro de los ascomicetos. Las levaduras son heterótrofos y se encuentran en una amplia gama de hábitats naturales, siendo especialmente frecuente en

los órganos aéreos de las plantas, especialmente las flores, y los restos vegetales en las capas superficiales del suelo. A diferencia de la mayoría de los hongos, que son aerobios obligados, muchas levaduras son anaerobios facultativos, capaces de crecer en ausencia de oxígeno. En general, tienen necesidades nutricionales relativamente simples que incluyen una fuente reducida de carbono, que puede ser tan simples como compuestos de etilo, y una variedad de minerales. fuentes de nitrógeno inorgánico, tales como sales de amonio, son asimilados fácilmente, aunque una variedad de compuestos de nitrógeno orgánico también se puede utilizar, incluyendo urea y diversos aminoácidos. A menudo, los únicos otros compuestos complejos o factores de crecimiento necesarios son las vitaminas, por ejemplo, biotina, ácido pantoténico y tiamina. Varios levaduras tienen usos industriales y de alimentación, y algunos, sobre todo S. cerevisiae, tienen GRAS (generalmente considerado como seguro) de estado. Las cepas de S. cerevisiae son las levaduras más conocidas y comercialmente importantes, y durante mucho tiempo han sido empleados para producir erages bebi- alcohólicas y pan de levadura. Están ahora también se utiliza en la producción de varios otros productos de fermentación, paretanol espe- combustible, proteína unicelular, enzimas y proteínas heterólogas, por ejemplo insulina humana. En adición, S. cerevisiae ha sido el modelo de sistema en ge- molecular investigación netics porque sus mecanismos básicos de la replicación, la recombinación, la división celular y el metabolismo son muy similares a las de eucariotas superiores, incluidos los mamíferos. Muy pocas levaduras son patógenos animales. Cryptococcus neoformans provoca una forma relativamente rara de la meningitis, pero la más conocida es la candida albicans. Este organismo se realiza por la mayoría de la gente de una forma benigna, pero puede comúnmente infectar la piel y las membranas mucosas de la boca, la vagina y el tracto alimentario. C. albicans puede convertirse en un serio patógeno oportunista, particularmente en individuos cuya respuesta inmune está debilitado. Tales infecciones son difíciles de tratar, debido a la similitud entre el host de y el metabolismo del patógeno. Este dimorfismo exposiciones de levadura, creciendo predominantemente como una

forma de levadura, sino que se desarrolla en la ramificación hifas, con el acompañamiento de los cambios en la composición de la pared celular, en ciertas condiciones culturales.

El crecimiento celular y la levadura CICLO DE VIDA

Los miembros del género Saccharomyces producen células que son esférica a elipsoidal y varían en tamaño de aproximadamente 1-7 mm de ancho y 5 a 10 mm de largo. poliploides cepas industriales, que contienen múltiples grupos de cromosomas, tienden a estar en el extremo más grande de este rango. La célula de levadura está rodeado por una pared de espesor, dentro de

que es la membrana celular, que encierra la matriz citoplasmática que contiene enzimas, gránulos de almacenamiento, varios tipos diferentes de sistemas de orgánulos y membranas. Su división celular asexual consiste en ciernes de una célula hija de una célula madre y el crecimiento celular se asocia en gran medida con el desarrollo de la yema (Fig. 1.6). Una célula madura inicia un brote en un sitio donde la pared celular se ha debilitado por enzimas líticas y el brote crece a aproximadamente el mismo tamaño que la célula madre. crecimiento de la pared está polarizada, principalmente por el depósito de nuevo material de pared celular en su punta, que se asocia con microvesículas en la matriz citoplasmática subyacente. Durante este período se produce la mitosis. Los cromosomas se replican, y las formas huso mitótico y se alinea a través de la unión entre las dos células. It puertas entonces alargadas y facilita la formación de dos conjuntos separados de los cromosomas que encerrarse dentro de los núcleos separados, uno en cada celda. La pared celular entre la célula madre y el brote se convierte completado, y las dos células puede luego separarse. Este ciclo puede entonces comenzar de nuevo por ambas células, cada uno puede brotar 10-20 veces. La reproducción sexual implica células haploides de dos tipos de apareamiento (A y A) y el apareamiento está mediada por la secreción de pequeñas feromonas peptídicas. Cada tipo de apareamiento responde al detener la formación de yemas, a continuación, cada célula se alarga y se diferencia para llegar a ser un gameto especializada

en forma de pera. Las células de tipos de apareamiento opuestos que están en contacto o muy cerca someten plasmogamia y cariogamia para formar una célula diploide. Estas formas diploides son estables y pueden realizar la división celular repetida. Sin embargo, si las condiciones fisiológicas son adecuados se produce la meiosis. Esto da lugar a la esporulación, normalmente la producción de cuatro núcleos haploides, que se incorporan en cuatro ascosporas resistentes al estrés, encapsuladas dentro de un asca.

ESTRUCTURA DE PARED CELULAR

Algunas levaduras se desarrollan cápsulas de polisacáridos viscosos salidas lado de la pared celular que pueden tener una función protectora o de ayuda en el apego a las superficies. La propia pared celular es de aproximadamente 100 a 200 nm de espesor y comprende 15 a 25% del peso seco de una célula. Sus principales componentes, algunos 80-90% de material de la pared, son los polisacáridos Glu- puede, phosphomannan y quitina, junto con algunas proteínas (Fig. 1.7). Glucano es un polímero altamente ramificado de unidades de glucosa b ligada, predominantemente b-1,3 vínculos, en forma de microfibrillas que proporcionan fuerza en la pared interior adyacente a la membrana celular. Phosphoman- nan, un polímero ramificado de la manosa azúcar hexosa,

La placa similar cuerpos polares del huso

endoplásmico retículo Brote aparato de Golgi

Divisor núcleo Mitocondrio gránulos de almacenamiento

vacuola

cicatriz Bud

Pared celular

periplasma Membrana citoplasmática

Higo. 1.6Representación esquemática de una célula de levadura en ciernes.

está situado hacia el exterior de la pared celular. La quitina puede formar menos de 1% de la pared de la levadura y se encuentra principalmente alrededor de cicatrices brote. El número de cicatrices brote en la pared indica el número de veces que una célula ha injertados y ya que nunca se producen dos veces en el mismo lugar, que se puede utilizar para estimar la "edad" de una célula. pared de proteínas son componentes estructurales y enzimática; los primeros se asocia en gran medida con manano. Las enzimas que se han encontrado aquí y en el periplasma incluyen los asociados con la biosíntesis de la pared y la hidrólisis de sustratos que no pueden cruzar la membrana

celular. Incluyen glucanasa, mananasa, lipasa, fosfatasa alcalina e invertasa, un manoproteica involucrados en la utilización de sacarosa. La floculación de las células es una característica común en algunas levaduras y es particularmente importante para ciertas cepas AL industrializados. Flóculos son agregados de células, no cadenas de brotes no separadas. Hay dos teorías principales de flóculo

formación. La primera de puente preocupaciones de calcio, donde un ión de calcio une dos células a través de componentes de la pared celular cargados negativamente. El apoyo a esta teoría proviene de la observación de que los flóculos se dispersan por el ácido tetraacético etilendiamina agente quelante (EDTA). Ly segundo, la hipótesis de la lectina, que implica la unión de hidratos de proteína-bohidratos, propone que una proteína de superficie de enlaces de una célula a un residuo de manosa en una celda

adyacente. Esta hipótesis se ve apoyada por el hecho de que los azúcares, particularmente manosa, inhiben la formación de flóculos. Además, los salientes de la pared celular proteicos de 0,1 a 10 mm, denominadas fimbrias, están presentes en muchas cepas y pueden estar asociados con las interacciones célula-célula, incluyendo la floculación.

ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA CELULAR

Entre la pared subyacente, hay

celular

y

la

membrana

Phosphomannan Mannan

Proteína

glucano Membrana citoplasmática

transmembrana esterolproteína

fosfolípidos

proteína globular

Higo. 1.7Representación esquemática de la estructura de una pared celular de levadura y de la membrana celular.

un espacio periplásmico de 3.5 a 4.5 nm que contiene proteínas que no pueden escapar a través de la pared, incluyendo las enzimas mencionadas anteriormente secretada. Los controles de la membrana celular todos los materiales que entran y salen de la célula, y se cree que es propietario de la biosíntesis de la pared celular. membranas de las células de levadura, como las de otras células, se componen principalmente de una bicapa lipídica unos 7,5 nm de espesor que es DIMANANTES de la alineación de cola a cola de moléculas de lípidos (Fig. 1.7). Esto produce regiones hidrófilas interior y exterior que se intercalan los lípidos hidrofóbicos las "colas". Los lípidos constituyentes están compuestos de mono-, di- y ERIDES triglyc-, glicerofosfátidos y esteroles. componentes de esteroles insaturados incluyen ergosterol y zimosterol, que no se encuentran en las membranas celulares procariotas. Son vitales para la estabilización de la membrana y la rigidez de la membrana, y se requiere

son componentes de transducción de señales que responden a estímulos externos y en última instancia inician una respuesta interna. enzimas asociadas a la membrana incluyen una gama de permeasas para el transporte de compuestos, tales como azúcares y aminoácidos; junto con la adenosina trifosfatasa (ATPasas), en asociación con los sistemas responsables de la generación de la fuerza protón-motriz través de la membrana, que proporcionan energía para el transporte de solutos. También hay pared de la síntesis de enzimas. Por ejemplo, la sintetasa de quitina está presente en una forma inactiva, que se activa por escisión proteolítica cuando se requiera. oxígeno molecular para su biosíntesis. composición lipídica de la membrana varía dependiendo de las condiciones de crecimiento y también afecta a la tolerancia de la célula a etanol. Por ejemplo, se han encontrado cepas de elaboración de la cerveza que contienen niveles más altos de colina phatidyl fosfato de hornear cepas. Situado en, dentro ya través de la bicapa lipídica son ambos moléculas de proteínas estructurales y funcionales, junto con una pequeña porción de hidratos de carbono. Los componentes proteicos pueden estar involucrados con el transporte de solutos, o

EL NÚCLEO

El núcleo está rodeado por una doble membrana que tiene poros regularmente espaciados. Este orgánulo contiene la mayoría (80-85%) del ADN celular; el resto está presente como moléculas circulares en la mitocondria o el citoplasma (ver abajo). Las células haploides de S. cerevisiae contienen aproximadamente 12 000 kpb de ADN, que es 3-10 veces más que una bacteria típica y alrededor de 100 a 150 veces menos que las células de mamífero. El ADN nuclear se asocia con histonas proteínas básicas y está en la forma de 16 cromosomas lineales compuestas de 150 a 2500 kpb. Más de 6000 genes han sido identificados, pero alrededor del 50% tienen función desconocida. Asociado con el núcleo es una estructura que se refiere como una placa, que tiene los microtúbulos que pasan en tanto en el núcleo y la matriz citoplasmática. Funciona de manera similar a los centriolos de células animales, formando el eje sobre el que los cromosomas replicados se separan durante la mitosis.

Las mitocondrias

Totalmente mitocondrias desarrollados están presentes sólo en levaduras que crecen aeróbicamente. Bajo condiciones anaero- bic son estructuras simples, se refiere como promitochondria, como el crecimiento anaeróbico induce su desdiferenciación. organelas completamente desarrolladas son esféricos en forma de varilla, cerrado por una membrana doble. La membrana interna posee proteínas implicadas en el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa, y se pliega en el lumen del orgánulo para formar estructuras de dedos, llamadas crestas. Situado dentro de la luz es una matriz de líquido que contiene la mayor parte de las enzimas del ácido tricarboxílico (TCA) del ciclo, ribosomas y 75 kpb moléculas de ADN circulares que codifican para un 10% de las proteínas mitocondriales.

mutantes de levadura 'Petite' carecen de mitocondrias y por lo tanto son incapaces de respiración. Ellos sólo pueden crecer por fermentación en medio sólido y sus colonias son muy pequeñas, en comparación con las colonias de tipo salvaje, de ahí su nombre.

Otros orgánulos citoplasmáticos Y ESTRUCTURAS

La matriz citoplasmática también contiene ribosomas, diversos orgánulos unidos a la membrana individuales y vacuolas, un citoesqueleto compuesto por microtúbulos y crofilaments migrantes, y un sistema de membrana elaborada, el retículo endoplásmico. El retículo endoplasmático es continuo con la membrana celular y la membrana externa de las mitocondrias. Se asocia con la producción de vesículas de una manera similar a los cuerpos de Golgi de otros eucariotas, pero el aparato de la levadura está menos definido. En madurez de la célula tiene una gran vacuola que surge de la fusión de vacuolas más pequeñas. Esta puede contener enzimas hidrolíticas y también actúa como un almacén para ciertos nutrientes. Microcuerpos, incluidos los peroxisomas y oxysomes Gly-, son orgánulos unidos a la membrana que contienen diversas enzimas específicas. Los peroxisomas contienen catalasa y diferentes oxidasas, y glioxisomas poseen catalasa y las enzimas del ciclo de glioxilato. El número y tamaño de los peroxisomas varía dependiendo del medio ambiente y los nutrientes disponibles. Por ejemplo, cuando las levaduras metilotróficas (por ejemplo Pichia pastoris) son crecido en sustratos C1 tales como metanol, se desarrollan varios peroxisomas grandes, que contiene metanol oxidase, catalasa y otras enzimas necesarias para el metabolismo de este sustrato. gránulos de almacenamiento citoplásmica de levaduras principalmente con- lípidos Tain o hidratos de carbono. Estos últimos incluyen el polisacárido glucógeno y el disacárido trehalosa, que comprenden dos residuos de glucosa unidos por su extremo reductor (Noside 1-1-a-glucopyranosido-a-glucopyra-). Estos carbohidratos pueden constituir hasta el 40% del peso en seco de una célula de levadura. El glucógeno es el material de almacenamiento predominante, pero la

proporción de los pliegues de trehalosa in- en condiciones aeróbicas y bajo ciertas tensiones. Se considera que el glucógeno tiene un papel durante períodos de inanición y adaptación respiratoria, mientras que la trehalosa pueden estar involucrados en sólo el primero. La matriz citoplasmática de S. cerevisiae también puede 50-60 contener copias de la extracromosómico mm plásmido circular 2. Sin embargo, la única información que estos plásmidos parecen contener es para su propio mantenimiento. Ellos parecen ofrecer ninguna ventaja obvia de

las células que las poseen. Sin embargo, han demostrado ser muy útiles en los vectores de la modifi- cación genética de las levaduras a través de procesos de transformación (véase el capítulo 4). Otros elementos extrachromasomal también se han encontrado en algunas cepas, e incluyen moléculas de ARN de doble hebra lineales similares a virus.

Otras lecturas Papeles y comentarios gooday, GW diversidad envolvente (1993) Cell y la dinámica en levaduras y hongos filamentosos. Journal of Applied bactericidas logía Suplemento 74, 12S-20S. Johnstone, K. (1994) Los mecanismos de activación para la germinación de esporas: conceptos actuales. Journal of Applied Bacteriología del suplemento 76, 17S-24S. Madden, K. & Snyder, M. (1998) La polaridad celular y morfogénesis de levadura en ciernes. Revisión Anual de Microbiología 52, 687-744. Poxton, IR (1993) sobre la diversidad procariota. Journal of Applied Bacteriología del suplemento 74, 1S-11S. Rose, AH (1993) Composición de las capas de envoltura de Saccharomyces cerevisiae en relación con la floculación. Journal of Applied Bacteriología del suplemento 74, 110S- 118S.

Wipat, A. y Harwood, CR (1999) La secuencia del genoma de Bacillus subtilis: el modelo molecular de Mycobacterium un terreno bacteriemia. FEMS Microbiology Ecology 28, 1-9.

Libros Bennett, JW y Klich, MA (eds) (1992) Biología Aspergillus y Aplicaciones Industriales. Butterworth-Heinemann, Boston. Danson, MJ, Hough, DW y Lunt, GG (1992) El chaebacteria Ar-: Bioquímica y Biotecnología. PortlandPress, Londres. Dawes, IW y Sutherland, IW (1992) Microbiana Physio-logía, 2ª edición. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Dickinson, JR y Schweizer, M. (eds) (1998) El Metabolismo y Fisiología Molecular de Saccharomyces cerevisiae. Taylor & Francis, Londres. Doi, RH & McGloughlin, M. (eds) (1992) Biología de bacilos. Butterworth-Heinemann, Bostón. Ghuysen, JM & Hakenbeck, R. (1994) Bacterial Cell Wall. Elsevier, Nueva York. Griffin, DH (1994) Fungal Physiology, 2ª edición. Wiley, New York. Holt, JG (ed.) (1989) Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática, Vols 1-4. Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore. Holt, JG (ed.) (1993) Manual de Bergey de Bacteriología Determinativa, 9ª edición. Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore.

Lengeler, JW, Drews, G. & Schlegel, HG (1998) Biología de las procariotas. Blackwell Science, Oxford. Logan, NA (1994) Sistemática bacteriana. Blackwell Science, Oxford. Sonenshein, AL, Hoch, J. y Losick, R. (1992) Bacillus

subtilis y otras bacterias Gram-positivas: Bioquímica, Fisiología y Genética Molecular. Sociedad Americana de Microbiología, Nueva York. Walker, GM (1998) Fisiología y Biotecnología de la levadura. Wiley, Chichester.

2

El crecimiento microbiano y la nutrición

la nutrición microbiana La biosíntesis de los componentes celulares necesarios para el crecimiento, la reproducción y el mantenimiento requiere un suministro de nutrientes básicos y una fuente de energía. clasificación nutricional se establece sobre la base de determinadas fuentes de energía, los electrones / hidrógeno y carbono utilizados por un organismo (Tabla 2.1). Los microorganismos han desarrollado una amplia gama de mecanismos para obtener energía, pero se divide esencialmente en dos categorías. Quimiotrofos obtienen energía mediante la oxidación de compuestos orgánicos o inorgánicos, mientras que fototrofas utilizan ener- gía derivada de la luz. Ambos tienen dos posibles fuentes de átomos de hidrógeno o electrones. Organotrofos oxidan moléculas orgánicas preformadas, tales como azúcares, para obtener los electrones o de hidrógeno, mientras que lithotrophs adquieren electrones de las moléculas inorgánicas reducidas, incluyendo sulfuro de hidrógeno y amoníaco. nutrición de carbono se divide en dos clases. Los autótrofos utilizan CO2 como fuente única o principal de carbono, mientras que varios heterótrofos utilizan una amplia gama de moléculas orgánicas reducidas, incluidos los hidrocarburos, lípidos, ácidos orgánicos, azúcares simples y polisacáridos. Las células microbianas deben obtener una gama de elementos químicos para cumplir con sus requerimientos nutricionales. Cuatro de estos, los macronutrientes carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno, deben estar disponibles en cantidades de gramos por litro de medio de crecimiento. Estos elementos, junto con el fósforo y el azufre, son los principales componentes de los principales polímeros celulares: lípidos, ácidos nucleicos,

polisacáridos y proteínas (Tabla 2.2). Otros elementos menores, incluyendo calcio, hierro, potasio y magnesio, se requieren al nivel de unos pocos miligramos por litro; se necesitan los elementos traza, principalmente cobalto, cobre, manganeso, molibdeno, níquel, selenio y zinc, en sólo cantidades de microgramos.

Los macronutrientes fermentaciones autótrofos que utilizan CO2 son raramente

operado a escala industrial: casi todas implican un crecimiento erotrophic Het. En fermentaciones heterótrofos, se requieren fuentes de carbono en concentraciones relativamente altas de medios de comunicación, a menudo alrededor de 10-20 g / L o mayor, ya que proporcionan 'esqueletos' para la biosíntesis de carbono y muchos también sirven como fuente de energía. En general, los azúcares son buenas fuentes de carbono y energía, cose particularmente Glu-, el sustrato preferido de la mayoría de los microorganismos. El hidrógeno y el oxígeno se pueden obtener a partir de agua y compuestos orgánicos. Sin embargo, muchos organismos también son dependientes de oxígeno molecular como aceptor terminal en la respiración aeróbica y para la síntesis de compuestos específicos, tales como los esteroles insaturados (ver pag. 34, efectos del oxígeno en el crecimiento). Los microorganismos pueden contener más de 15% (w / w) de nitrógeno, sobre todo dentro de las proteínas estructurales y funcionales, y ácidos nucleicos. Para cumplir con estos requisitos de una fuente de nitrógeno se suministra normalmente en medios de crecimiento a concentraciones de

1-2 g / L. Las sales de amonio son a menudo la fuente de nitrógeno preferida, pero nitrato, aminoácidos o compuestos ricos en nitrógeno, tales como urea, se pueden utilizar a veces. Además, ciertas bacterias fijadoras de nitrógeno especializadas, en particular las especies de Azotobacter y Rhizobium, pueden utilizar el nitrógeno molecular.

elementos menores El fósforo se proporciona generalmente en forma de iones de fosfato inorgánicos, a menudo como un tampón de pH. Este elemento es esencial para la síntesis de ácidos nucleicos, productos intermedios del metabolismo de hidratos de cary compuestos implicados en la transducción de ener- gía, por ejemplo, trifosfato de adenosina (ATP) y fosfato de adenina nicotinamida dinucleótido (NADP). concentración de los medios normalmente no necesita ser mayor de 100 mg / L. El azufre se requiere para la producción de la azufre que contienen aminoácidos cistina, cisteína y ine methion-, y algunas vitaminas. Se suministra a menudo como un sulfato inorgánico o sal de sulfuro a una concentración de 20-30 mg / L.

21

2 2

Capitulo

Tabla 2.1 categorías nutricionales de los microorganismos Fuente de tipo fisiológico

Energía

quimiótrofo Químico fototrofo Ligero Organotroph Lithotroph autotro ph Heterot Chemoorgano (hetero) troph Compuesto (Animales, hongos, protozoos, muchas bacterias) Chemolitho (automático) trophInorganic moleculeInorganic (algunas bacterias) Photolitho (automático) trophLightInorganic (Plantas, la mayoría de las algas, algunas bacterias) Photoorgano (hetero) trophLightOrganic (algas, algunas bacterias)

Tabla 2.2 Composición de un microorganismo típico Agua 70 a 80% Protein15-18% Polysaccharide1-3% Lipid1-2% Nucleico acids3-7% Inorgánico salts1-2% composición de las células elementales principal = C4MARIDO7O2norte

Otros elementos menores, en su mayoría de calcio, hierro, potasio y magnesio, se deben proporcionar en cantidades relativamente pequeñas, pero significativas, por lo general menos de 10 a 20 mg / L. Varios elementos menores son esenciales para la actividad de las enzimas específicas. Por ejemplo, el hierro es esencial para varias enzimas de oxidaciónreducción, tochromes particularmente ci- y potasio se requiere por las enzimas involucradas en la síntesis de proteínas y, como contra-ión para la cadena principal de fosfato del ADN. Varios elementos menores también tienen funciones estructurales: iones de magnesio están involucrados en la estabilización de los ribosomas, y algunos son necesarios para mantener la integridad de la pared celular y la membrana. El sodio y el potasio se utilizan en las bombas de energía quimiosmóticos, pero el primero no parecen

Los electrones

Compuesto orgánico molécula inorgánica Compuesto

Carbón

CO2 Compuestos orgánicos Compuesto

moleculeCO

2

moleculeCO

2

compoundOrganic

compuesto

tener otras funciones excepto en sal microorganismos halófilos.

específicas, 'amante'

oligoelementos Rastro elementos incluyen cobalto, cobre, manganeso,

molibdeno, níquel, selenio y zinc. Estos elementos se requieren generalmente en concentraciones de 0,1 a 1 mg / L, o menos, por una serie de enzimas específicos. Sus concentraciones normales en los suministros de agua, o como contaminantes en otros ingredientes de medios de comunicación, a menudo cumplen este requisito. demandas total de nutrientes varían para los diferentes microorganismos. Muchas bacterias pueden crecer en medios meramente conteniendo fuentes de carbono y energía, minerales y elementos básicos. Los microorganismos que son capaces de crecer en este medio mínimo se conocen como prototrofos. Sin embargo, otros microorganismos se debe dar compuestos específicos en una parte o totalmente construido formulario. Los que son incapaces de crecer sin sustancias orgánicas adicionales, tales como aminoácidos o vitaminas, son llamados auxótrofos. Los medios de cultivo para muchos

El crecimiento microbiano y la

2

microorganismos organotrófico menudo 3 requieren algunos suplementos de vitaminas y factores de crecimiento, especialmente las vitaminas del grupo B (thiAmin, B1; riboflavina, B2; piridoxina, B6; cobalamina, B12; biotina; ácido nicotínico; y ácido pantoténico). Unos microorganismos requieren vitaminas liposolubles (A, D, E y K); y la vitamina C, aunque a menudo la mejora del crecimiento, no es un verdadero factor de crecimiento microbiano.

La absorción de nutrientes Los nutrientes de medio ambiente deben ser transportados a través de la membrana celular en la célula. Esto es a menudo el paso limitante de la velocidad en la conversión de la materia prima a los productos y por lo tanto es de gran importancia para la indus-

procesos de fermentación juicio. La absorción de un par de nutrientes es por difusión pasiva, que no requiere portadores. Tales nutrientes son generalmente solubles en lípidos y pueden entrar en las membranas hidrófobas, por ejemplo, glicerol y urea. Sin embargo, es un mecanismo ineficiente, ya que la tasa de absorción depende de la magnitud del gradiente de concentración a través de la membrana. La mayoría de los solutos deben ser transportados a través de mecanismos activos específicos, ya que son las membranas de permeabilidad selectiva. Además, los microorganismos normalmente habitan entornos naturales en los que las concentraciones de nutrientes son bajos. En consecuencia, es esencial que se pueden acumular solutos contra gradientes de concentración, como las concentraciones intracelulares de los compuestos son a menudo más alto que los niveles ambientales. La mayor absorción de soluto involucra proteínas portadoras (meases per-) que atraviesan la membrana. Su participación en la difusión facilitada no requiere la intervención directa de la energía. Es impulsado únicamente por el gradiente de concentración a través de la membrana y es reversible. Sin embargo, la absorción de nutrientes en la célula continúa, debido a que su concentración intracelular no aumenta, a medida que se metabolizan inmediatamente en la entrada. Este mecanismo, rara vez se ve en procariotas, se utiliza para el transporte de azúcares y aminoácidos, y sus portadores selectivos generalmente funciona para un grupo de solutos relacionados. Ellos aumentan en gran medida las velocidades de difusión, al menos hasta concentraciones a las que la proteína portadora se satura con su nutriente. Transporte activo mecanismos permiten la acumulación de materiales contra un gradiente de concentración, que es importante en entornos en los que los niveles de nutrientes son bajos. Algunos sistemas permiten la acumulación a 100-1000 veces mayor que la concentración externa. Sin embargo, estos mecanismos requieren la aportación directa de cantidades sustanciales de energía, ATP o gradientes de protones metabólicos, para impulsar el transporte. Al igual que en la difusión cilitated favorecida, portadores de proteína están involucrados; muchos de ellos son muy específicos,

mientras que otros funcionan con grupos de compuestos relacionados. Cuando se trata de gradientes de protones (véase el capítulo 3, Electron transporte), el nutriente entrar en la célula, tal como un azúcar, aminoácido o molécula de ácido orgánica, se transporta de forma simultánea con un protón, y se conoce como symport. gradientes de protones también se pueden utilizar para establecer un gradiente de iones sodio a través de la membrana. Aquí iones de sodio salen de la célula a cambio de la entrada de protones, que se denomina antiport. El gradiente de sodio estableció unidades de absorción de nutrientes, por ejemplo, azúcares y aminoácidos. Algunos compuestos pueden ser modificados durante la captación. Azúcares, por ejemplo, pueden ser fosforilados utilizando

fosfoenolpiruvato (PEP) como el donador de fosfato. Esto se conoce como translocación grupo, que se realiza por muchas células procariotas. Durante períodos en los que las concentraciones de nutrientes son muy bajos, como durante la fase estacionaria de un cultivo discontinuo (véase a continuación, la cinética de crecimiento microbiano), algunos organismos producen metabolitos capaces de Scavaging para iones metálicos restante. Sideramines, que incluyen la hydroxamcomieron ferricromo, son ejemplos bien conocidos. Alternativamente, algunos microorganismos pueden producir compuestos cuyo papel in vivo es el de proporcionar sus membranas más permeables a ciertos iones metálicos, por ejemplo macrotetralides (antibióticos ionóforos; véase el capítulo 3, el metabolismo secundario).

La utilización de materiales de alto peso molecular La utilización de sustratos poliméricos (polisacáridos, proteínas y lípidos) requiere actividades adicionales. protozoos y otros organismos eucariotas sin paredes celulares pueden ingerir relativamente grandes trozos de materiales alimenticios a partir de su entorno por fagocitosis (inmersión) en lo que se convierte en una vacuola alimento unido a la membrana. enzimas drolytic hicontinuación se secretan en la vacuola para descomponer los polímeros a sus

monómeros constituyentes. Para los organismos con una pared celular rígida esto no suele ser posible. Ellos deben segregar enzimas hidrolíticas extracelulares-proteasas, amilasas, celulasas, etc.-directamente en el medio ambiente y luego tomar los productos de hidrólisis resultantes. Muchas de estas enzimas extracelulares tienen importantes aplicaciones industriales (véase el capítulo 9).

la cinética de crecimiento microbiano El crecimiento microbiano se puede definir como un incremento ordenada en componentes celulares, dando como resultado la ampliación de células y, finalmente, conduce a la división celular. Esta definición no es estrictamente exacto ya que implica que una consecuencia del crecimiento es siempre un aumento en el número de células. Sin embargo, bajo ciertas condiciones de crecimiento puede ocurrir sin la división celular, por ejemplo, cuando las células están sintetizando compuestos de almacenamiento, por ejemplo glucógeno o poli bhidroxibutirato. En esta situación las fibras de células mero permanecen constantes, pero la concentración de la biomasa sigue aumentando. Esto también es cierto para los organismos coenocytic, como algunos hongos, que no se dividen en celdas separadas. Su crecimiento se traduce sólo en el aumento de tamaño. Cinética de crecimiento de suspensión unicelular homogénea

culturas sión pueden ser modelados usando las ecuaciones diferenciales en un modelo continuo. Sin embargo, el crecimiento filamentoso y el crecimiento de los agregados celulares heterogéneas y conjuntos, en particular los biofilms, colonias, flóculos, colchonetas y unas películas, es mucho más compleja. De hecho, los sistemas heterogéneos requieren un enfoque muy diferente usando autómatas celulares y modelos de sistemas Swarm, por ejemplo BacSim. no se discutirán aquí la cinética de crecimiento de organismos filamentosos y sistemas heterogéneos. El modelo de crecimiento que será examinada es la fisión binaria bacteriana en cultivos de suspensiones homogéneas, cuando la división celular produce células hijas idénticas. Cada vez que una célula se divide se llama una generación y el tiempo necesario para que la célula dividir se conoce como el tiempo de generación. Por lo tanto, el tiempo de generación o duplicar tiempo (td) es el tiempo requerido para una población microbiana al doble. Teóricamente, después de una generación, tanto el población de células microbianas y la concentración de biomasa se han duplicado. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, en ciertas condiciones de crecimiento puede estar asociada con un aumento de la biomasa y no teléfonos números. También, el tiempo de generación registrada durante el crecimiento microbiano es en rea- lidad un valor medio, ya que las células no se dividen exactamente a la misma velocidad. En un momento dado hay células en diferentes etapas de su ciclo celular. Esto se denomina asíncrono crecimiento chronous. Sin embargo, bajo ciertas condiciones de crecimiento sincrónico puede ser inducida de manera que todas las células se dividen de forma simultánea, que es una herramienta de investigación útil en el estudio de la fisiología microbiana.

fermentaciones microbianas en medios líquidos pueden ser llevada a cabo bajo diferentes condiciones de operación, es decir, de crecimiento por lotes, de crecimiento discontinuo alimentado o de crecimiento continuo. crecimiento por lotes implica un sistema cerrado en el que todos los nutrientes están presentes en el inicio de la fermentación dentro de un volumen fijo. Las únicas adiciones pueden ser ácidos o bases para el control de pH, o gases (por ejemplo, aireación, si rido re-). En los sistemas discontinuos alimentados los componentes del medio o medio fresco se alimentan continuamente, intermitentemente o se añaden como un solo suplemento y el volumen de los lotes aumenta con el tiempo. fermentaciones continuas son sistemas abiertos en los medio fresco se alimenta continuamente en el recipiente de fermentación, pero el volumen permanece constante a medida que pasaban medio y las células se retiran a la misma velocidad.

crecimiento por lotes Durante las fermentaciones por lotes la población de microorganismos pasa por varias fases distintas de crecimiento: lag, la aceleración, la desaceleración del crecimiento exponencial, estacionaria, y la muerte (Figura 2.1.). En la fase de retardo prácticamente no se produce el crecimiento y la población microbiana se mantiene relativamente constante. Sin embargo, es un período de intensa actividad metabólica como inóculo microbiano se adapta al nuevo entorno. Cuando las células se inoculan en medio fresco que pueden ser deficientes en enzimas esenciales, vitaminas o cofactores, etc., que deben ser sintetizados con el fin de utilizar los nutrientes disponibles, antes de la división celular que tienen lugar. La composición química de la fermentación

Los microorganismos capaces de esporuladas producen esporas de supervivencia durante la fase estacionaria

Iniciar sesión celda números (células / ml) o Iniciar sesión biomasa (G / L)

Desaceleración

Estacionario

fase de muerte Exponencial

Aceleración Idiophase * (Metabolismo secundario) Sólo se observa en algunos microorganismos Higo. 2.1El crecimiento de un Retraso Trophophase * microorganismo en un cultivo (Metabolismo primario) Tiempo (h)

discontinuo. * Trophophase y idiophase: véase el Capítulo 3, el metabolismo secundario.

medios tación influye en la duración de la fase de latencia. Es generalmente más largo si el inóculo se cultivó utilizando una fuente de carbono diferente de la de el medio fresco, debido a que las células deben sintetizar enzimas necesarias para catabolizar el nuevo sustrato. estrés fisiológico puede tener también un efecto, sobre todo porque a menudo las células se transfieren desde un medio de inóculo de baja Seguro (baja concentración de soluto) de presión osmótica a un medio fresco de alta presión osmótica (alta concentración de soluto). Otros factores que influyen en la duración de la fase de retardo son la edad, la concentración, la viabilidad y la morfología del inóculo. En general, los inóculos preparados a partir de células cosechadas en la fase de crecimiento exponencial (período de más rápido crecimiento) muestran más cortas fases de retraso que las mazo de investida de etapas posteriores. Una vez que las células se han adaptado a su nuevo entorno en el que entran en la fase de aceleración. La división celular se produce al aumentar la frecuencia hasta que la tasa de crecimiento máximo (M máx) para las condiciones específicas de la fermentación por lotes se alcanza mentación. En este punto el crecimiento exponencial comienza y el número de células / aumento de la biomasa a una velocidad constante. Matemáticamente, este crecimiento exponencial puede ser descrita por dos métodos; uno está relacionado con biomasa (x) y el otro a la celda número (N). Para la biomasa celular, el crecimiento se puede considerar como una reacción autocatalítica. Por lo tanto, la tasa de crecimiento depende de la concentración de biomasa, es decir, catalizador, que está presente en cualquier momento dado. Esto se puede describir como sigue:

velocidad de cambio de la biomasa es dx / dt = mx 2.1 donde x = concentración de la biomasa (g / L), m = tasa de crecimiento específico (por hora) y t = tiempo (h). Cuando se dibuja el gráfico de la biomasa celular contra el tiempo, el producto es una curva con una pendiente constante aumento (Fig. 2.2a). La ecuación 2.1 también puede ser reorganizado para estimar la tasa de crecimiento específico (m): m = 1 / x * dx / dt

2.2

Durante cualquier período de crecimiento exponencial cierto, la ecuación 2.1 se puede integrar para proporcionar la siguiente ecuación: xt = xomi

monte

2.3

donde la concentración de xt = biomasa después del tiempo t, xo = concentración de biomasa en el crecimiento exponencial de inicio, y e = base de los logaritmos naturales. Tomando logaritmos naturales, loge (ln), da ln xt = Ln xo + MT

2.4

Esta ecuación es de la forma y = c (intersección con el eje y) + Mx, donde m = gradiente (m en la ecuación 2.4), que es la ecuación general para una gráfica de línea recta. Para las células en fase exponencial, una parcela de logaritmo natural de la concentración de la biomasa contra el tiempo, un gráfico semilogarítmico, debe producir una línea recta con la pendiente (gradiente) igual a m (Fig. 2.2b), o

0

50

o célula números

a o celda números

(B)

100150200 Tiempo (min)

050 gradiente = 

Tiempo (min)

100150

Higo. 2.2El crecimiento exponencial de un microorganismo unicelular con un tiempo de duplicación de 20 min (A) parcela aritmética, (b) la gráfica semilogarítmica usando logaritmos naturales y (c) la gráfica semilogarítmica usando logaritmos a la (m = tasa de crecimiento específico) de base 10.

Iniciar sesión10 celda biomasa o celda números

(c)

gradiente =   

050

100150200 Tiempo (min)

200

m = (Ln xt - ln xo) / T

2.5

(Nota: al trazar valores log10 en lugar del logaritmo natural, la pendiente de la gráfica semilogarítmica es igual a m / 2.303; véase la figura 2.2c.). Un segundo enfoque es examinar el crecimiento en relación con el número de células, donde el número de células en el comienzo del crecimiento exponencial es No. Si consideramos un caso hipotético de que la población de células microbiana en este punto de crecimiento exponencial es uno (n = 1), podemos describir fisión binaria como sigue: Número de divisiones No. de células Matemátic amente

eo2

0 1 n -

norte

1 2 no no rte

2 4 norte norte 2 o2

norte 3 8 2norte norteo2 norteo2 3

Se trata de un crecimiento equilibrado, y una relación directa BE- tasa de crecimiento específico entre el tiempo de duplicación y también puede ser establecida. Sin embargo, bajo condiciones en las que un nutriente esencial se hace limitante, de crecimiento es DIMANANTES desequilibradas, y las variaciones en el número de células (N) y la biomasa de concentración (x) se producen, ya que durante la síntesis de compuestos de edad de células de almacenamiento. Si consideramos una situación en la que en el momento cero, la biomasa celular es xo, a continuación, después de un período fijo de tiempo (t) de la ex el crecimiento exponencial, equivalente a un tiempo de duplicación (TD), la biomasa microbiana se duplicará a 2xo, es decir, xt = 2xo, cuando t = td. Sustituyendo estos parámetros en la ecuación 2.3 da monte

nort

2xo = xomi

re

Tomando logaritmos naturales

En consecuencia, después de un período de crecimiento exponencial, el tiempo (t), el número de células (Nt) viene dada por

produce En 2xo = ln + mtd xo

nortet =

o

2.6

No 2norte donde n = el número de divisiones, n = célula inicial número. Tomando logaritmos naturales da En Nt N = lno N +

2.7

ln 2

Por lo tanto, el número de divisiones (n) que han tenido lugar está dado por

En Nt norte = Ln No ln 2

2.8

El número de divisiones por unidad de tiempo durante este período de crecimiento exponencial se determina dividiendo por el período de tiempo (t):

norte En Nt -

2.11

L

montere = Ln 2

2.12

2.13

Por lo tanto, en este caso 0,693 2.14

tre =

metro Ecuación 2.1, velocidad de cambio de la biomasa (dx / dt = mx), predice que el crecimiento se producirá de forma indefinida. Sin embargo, durante el crecimiento de los microorganismos por lotes están continuamente metabolizar una oferta limitada de nutrientes disponicapaz en el caldo de fermentación. Después de un cierto tiempo de la tasa de crecimiento disminuye y finalmente se detiene. Esta la cesación del crecimiento puede ser debido al agotamiento de los nutrientes esenciales (fuente de carbono, aminoácidos esenciales, etc.) o lan N o

= tt

2.9 ln 2

donde n / t = constante de velocidad de división (número medio de generaciones por hora). A menudo, no estamos realmente interesados en el número de divisiones por hora, unidad de tiempo, sino más bien en el momento generación media o tiempo de duplicación (td), es decir, el tiempo requerido para someterse a una sola generación que duplica la población. Así,

t =T= re

t ln 2 En Nt Ln No

2.10

norte Durante el crecimiento exponencial, cuando todos los nutrientes se manejaron apoyo en exceso y son por lo tanto no limitativo, hay una relación directa entre el número de células y la concentración de biomasa, suponiendo que quiere decir tamaño de la celda es constante.

la acumulación de metabolitos tóxicos, tales como etanol y ácido láctico, o una combinación de agotamiento de los nutrientes y la acumulación de toxinas. Monod mostró que la tasa de crecimiento es una función hiperbólica aproximada de la concentración del nutriente que limita el crecimiento (s) (Fig. 2.3). Este impacto de agotamiento de los nutrientes esenciales en el crecimiento se puede describir matemáticamente por la ecuación de Monod, en una forma similar a la utilizada en bioquímica, donde la cinética de Michaelis-Menten definen la velocidad de una reacción catalizada por enzimas en relación con su sustrato concentración:

metro S max m= Ks + S

2.15

donde mmax = máxima de crecimiento específico (por hora) de las células, es decir, cuando la concentración de sustrato no es limitante;

0,4

max

Específico crecimiento tasa / h

0.35 0,3 0.25 0,2

1/2 max

0.15 0,1 0.05

Ks = 1,0 g / L

Higo. 2.3La relación entre la concentración de sustrato y la tasa de crecimiento específico.

S = Concentración de limitar sustrato (g / L); ks =constante de saturación, La concentración (g / L) de limitar trient nuclear que permite el crecimiento en medio la tasa máxima de crecimiento específico, es decir, m = 1/2 mmax, y es una medida de la afinidad de las células para este nutriente. Cuando un microorganismo se proporciona con el sustrato limitante en una concentración mucho mayor que el Ks, y con todos los otros nutrientes en exceso, el microorganismo crecerá de manera exponencial a su velocidad máxima, es decir, cuando S >> Ks, entonces m = mmax. Sin embargo, como el nivel de este sustrato disminuye, con el tiempo se convierte en limitante y ya no puede sostener mmax. Este es el principio de la fase de desaceleración. A medida que la concentración residual del sustrato limitante se acerca Ks y luego cae por debajo de esta concentración, hay una disminución gradual de acompañamiento en la tasa de crecimiento (m). La tasa de crecimiento de un microorganismo con una afinidad muy alta para un sustrato limitante de la velocidad (es decir, un bajo Ks) no se verá afectado hasta que la concentración de sustrato es muy bajo. Sin embargo, donde hay una baja afinidad por el sustrato limitante (es decir, una alta Ks), la tasa de crecimiento se empiezan a caer incluso a concentraciones relativamente altas de sustrato y el organismo exhibe una fase de frenado más largo. La tasa de crecimiento específico de los UE contingentes de microorganismos de

01 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 La concentración de sustrato (g / L)

20

deceleración hasta que toda la limitación de sustrato disponible se metaboliza. El crecimiento ya no es sostenible y las células entran en la fase estacionaria. En este punto, la tasa de crecimiento global ha disminuido a cero y no hay cambio neto en el número de células / biomasa (tasa de división celular es igual a la tasa de muerte celular). Sin embargo, los microorganismos siguen siendo metabólicamente activo, involucrado en el metabolismo de compuestos intracelulares de almacenamiento, los nutrientes que utilizan re-

arrendado a partir de células lisadas, y en algunos casos producen metabolitos secundarias. La duración de la fase estacionaria varía dependiendo de los microorganismos implicados y de las condiciones ambientales. Para las células que no pueden sobrevivir mediante la formación de esporas, esto es seguido por una fase de muerte exponencial cuando las células mueren a una velocidad constante y, a menudo se someten a lisis.

APLICACIÓN DE fermentaciones discontinuas

Durante fermentaciones discontinuas ciertas condiciones ambientales cambian continuamente, en particular las concentraciones de nutrientes y de productos, así como la tasa de

crecimiento específico, debido a que las células deben pasar a través de la secuencia de las fases de crecimiento descrito anteriormente. En consecuencia, el sistema nunca alcanza condiciones de estado estacionario. Una desventaja adicional es que varias etapas distintas prácticas están asociados con la operación de una fermentación por lotes: 1 carga del fermentador con medio fresco; 2 esterilización del fermentador y medio; 3 la inoculación del fermentador; 4 producción de productos microbianos; 5 la recolección de la biomasa y el caldo de fermentación agotada; y finalmente 6 la limpieza del recipiente. Esto tiene importantes implicaciones económicas para los procesos strial indu-. Durante un período considerable de tiempo, el recipiente de fermentación no está produciendo productos microbianos, pero se está limpiando, llenado, esterilizado, etc. El período improductivo que se conoce como el tiempo de inactividad del fermentador.

OPTIMIZACIÓN DE fermentaciones discontinuas

Durante el desarrollo de un proceso por lotes, el crecimiento clave los parámetros se pueden determinar que permiten la producción de un producto microbiano dado a ser optimizado, si se trata de la biomasa en sí o un metabolito específico. Un parámetro importante es el coeficiente de rendimiento (Y), que se determina sobre la base de la cantidad de nutriente limitante RATE, normalmente la fuente de carbohidratos, convertido en el producto microbiano. Con respecto a la biomasa, que se define como x = Sx S (S - Sr

2.16

) donde x = concentración de biomasa (g / L), Yx / S = rendimiento coeciente (g sustrato de biomasa / g utiliza), S = primera suscripción concentración Strate (g / L), y la concentración de sustrato Sr = residual (g / L). En el caso de la producción de biomasa, el coeficiente de rendimiento se refiere a la cantidad de biomasa producida por gramo de sustrato utilizado. Por lo tanto, mayor es el rendimiento coefi- ciente, mayor es el porcentaje de sustrato original convertido en biomasa microbiana. Para los productos metabólicos microbianos (p) el coeficiente de rendimiento está relacionado con la cantidad de metabolito producido en relación con la can- tidad de sustrato utilizado (Yp / S). Determinación de coeficientes de rendimiento es de vital importancia debido a que el costo del medio de fermentación, en particular la fuente de carbono, puede ser una parte importante del coste total de producción (véase el capítulo 5). Mediante la realización de una serie de experimentos bajo diferentes condiciones de operación, variando los componentes del medio y las concentraciones de componentes, pH, temperatura, etc., de crecimiento óptimo / condiciones de producción puede ser establecida. También es importante para determinar la tasa máxima de crecimiento específico (mmax) del organismo de producción. Esto es particularmente cierto para los metabolitos primarios, donde la formación de pro- ducto está relacionada con

o 1

Ks

=

S

+

metromax S

metro metromaxS y 1

Ks

= metro

11 *

S

+

2.18 metromax

max

Una gráfica de 1 / m frente a 1 / S debe producir una línea recta con la intersección con el eje y en 1 / M máx y un gradiente ecuacionesl to Ks/ MMAx. Por lo tanto, Alabamal ºmi key kinetido parámetro tros se pueden determinar fácilmente y cuando los valores de Ks, metr e Y son conocidos, una descripción omax cuantitativa completa el crecimiento. Para optimizar el exceso de toda la productividad del sistema, el microorganismo por lo general debe ser cultivado en su mmax. Como se dijo anteriormente, la concentración de sustrato operativo tiene un efecto importante en la tasa de crecimiento de un microorganismo. Mediante la realización de una serie de fermentaciones discontinuas, cada uno con una concentración inicial diferente del sustrato limitante, la tasa de crecimiento específica (m) para cada experimento puede ser determinada. Estos datos pueden ser utilizados para estimar tanto mmax y la constante de saturación (Ks) simplemente tomando los valores recíprocas en la ecuación de Monod y reordenando la ecuación 2.15 para dar

ción se puede dar de los eventos de crecimiento que se producen durante un cultivo discontinuo.

cinética de crecimiento continuo fermentaciones de cultivo continuo tienen muchas aplicaciones para los procesos tanto de investigación de laboratorio y escala industrial. Los estudios se pueden realizar en todos los aspectos del crecimiento celular, la fisiología y la bioquímica. Son útiles para los estudios ecológicos y como herramienta genética para el examen de las tasas de mutación, efectos mutágenos, etc. Aplicación en fermentaciones industriales supera muchas limitaciones de los procesos por lotes. Inicialmente, fermentaciones continuas comienzan como lotes culturas, pero el crecimiento exponencial a continuación, se pueden extender indefinidamente, en teoría, a través de la adición continua de medio de fermentación fresco. El reactor se agita continuamente y un volumen constante se mantiene por calificación incorpora un 1 = Ks + 2.17 S metro metromaxS

rebosadero o de otro dispositivo de nivelación (Fig. 2.4). medio fresco se añadió continuamente y desplaza un volumen igual de caldo de fermentación agotada y células a la misma velocidad que se introduce medio fresco. condiciones de estado estacionario prevalecen, donde la tasa de crecimiento de la célula microbiana es igual a la velocidad a la que las células se desplazan desde el recipiente. Al igual que con las fermentaciones por lotes, la velocidad específica a la que el microorganismo crece en cultivo continuo es controlada por la disponibilidad del nutriente limitante de la velocidad. Por lo tanto, la velocidad de adición de medio fresco controla la velocidad a la que crecen los microorganismos. Sin embargo, la tasa real de crecimiento no sólo depende de la velocidad de flujo volumétrico del medio en el reactor, sino también de la velocidad de dilución (D). Este es igual al número de volúmenes de reactor pasa a través del reactor por unidad tiempo y se expresa en unidades de tiempo recíproco, por hora.

Residual sustrato concentración (G / L)

Biomasa (concentración de células) Bomba Aire en

biomasa (G / L)

Poner a secar filtro de aire estéril

rebosadero

concentración de sustrato residual

Nutritivo depósito El grado de dilución (D) fermentador

recrit

Higo. 2.5El crecimiento de un microorganismo en cultivo chemostat continua.

mx = Dx

depósito de la cosecha

y m=D

Higo. 2.4aparato de cultivo continuo.

re = F V

2.1 9

donde D = tasa de dilución (por hora), F = caudal (l / h) y V = Volumen del reactor (L). El término D es el recíproco del tiempo medio de residencia o tiempo de retención hidráulico, tal como se utiliza en el tratamiento de las aguas residuales (véase el capítulo 15). La adición de medio fresco en el reactor puede ser controlado en un valor fijo, por lo tanto la velocidad de adición del nutriente limitante de la velocidad es constante. Dentro de ciertos límites, se determinaron la tasa de crecimiento y la tasa de pérdida de células del fermentador por la velocidad de entrada media. Por lo tanto, en condiciones de estado estacionario el saldo neto de la biomasa puede ser dedescribe como

2.22

2.23

En consecuencia, a caudales fijos y las tasas de dilución bajo la constante física y química las condiciones de funcionamiento, es decir, bajo condiciones de estado estacionario, la tasa de crecimiento específico del microorganismo depende de la tasa de dilución de funcionamiento, hasta un valor máximo igual a mmax (Fig. 2.5). Si la tasa de dilución se incrementa por encima mmax, completo de lavado de las células se produce, como las células no tener tiempo suficiente para "doble" antes de ser lavados fuera del reactor a través del rebosadero. El punto en el que esto se acaba de evitar que se conoce como la tasa de dilución crítica (Dcrit). Para cualquier tipo de dilución dada, bajo condición de estado estacionario ciones, la concentración de sustrato residual en el reactor se puede predecir mediante la sustitución de D para m en la ecuación de Monod (ecuación 2.15):

r =

metro S max r Ks + Sr

2.24

d o rex tasa de crecimiento

tasa de pérdida de

2.2 0

nde Sr es la concentración en estado estacionario sustrato residual tración en el reactor a una tasa de dilución fija. Rearrang-

= ret en reactor

-

o dx

espera)

Dx dt

= Mx -

ción da

del reactor

(lavado de

re(Ks + Sr ) = mmax Sr o DKs + DSr = mmax S r 2.2 1

En condiciones de estado estacionario, la tasa de crecimiento = tasa de pérdida, por lo tanto, dx / dt = 0 y por lo tanto

dividiendo por Sr da entonces DK

Sr

+ D = mmax

Por lo tanto,

Sr =

DKs

2.25

metrom ax

-D

En consecuencia, la concentración de sustrato residual en el reactor se controla por la tasa de dilución. Cualquier ación alternativa a esta tasa de dilución como resultado un cambio en la tasa de crecimiento de las células que va a depender de la disponibilidad de sustrato a la nueva tasa de dilución. Por lo tanto, el crecimiento se controla por la disponibilidad de un nutriente limitante de la velocidad. Este sistema, cuando se fije la concentración del nutriente limitante de la velocidad de entrar en el sistema, se describe a menudo como un quimiostato, en oposición a la operación como un turbidostat, donde los nutrientes en el medio no son limitantes. En este caso la turbidez o absorbancia del cultivo se controla y se mantiene a un valor constante mediante la regulación de la tasa de dilución, es decir, la concentración de células se mantiene constante. A bajas velocidades de dilución con concentraciones de sustrato fijo, la concentración de sustrato residual será baja (Fig. 2.5). Sin embargo, como D se acerca MMAX la concentración de sustrato residual aumenta junto con el crecimiento tasa del microorganismo. Más allá de Dcrit, entrada de la concentración de sustrato será igual a la concentración de la producción, ya que todas las células se han perdido desde el sistema. Por lo tanto, este reactor continuo se puede describir como un quimiostato en nutrientes limitado autorregulador. La concentración de biomasa o metabolito microbiano en un fermentador continuo bajo condiciones de estado estacionario puede estar relacionado con el coeficiente de rendimiento, como se describe en la sección de carga de fermentación. Inserción de la ecuación de sustrato residual (ecuación 2.25) en el coeficiente de la biomasa o el rendimiento de producto metabólico ecuación (ecuación 2.16) da, en este caso para la biomasa en estado estacionario (x), DKs ˆ MI 2.26 x = Sx S metr - D MI omax SR

en estado estacionario concentración de biomasa. A medida que se acerca mmax D, la concentración de biomasa se vuelve aún más baja, sin embargo, las células crecen más rápido y hay una in- concurrente pliegue en la concentración de sustrato residual (Fig. 2.5).

El monitoreo del microbiano en la cultura

crecimiento

Durante una fermentación, se requieren métodos para la determinación rutinaria de la población microbiana, el número de células y / o de la biomasa, con el fin de controlar su progreso. Numerosos métodos directos e indirectos disponibles para este propósito. procedimientos directos implican la determinación del peso seco, el recuento de células mediante métodos de microscopía y recuento en placa. Los métodos indirectos incluyen turbidimetría, espectrofotometría, la estimación de los componentes de la célula (proteínas, ADN, ARN o ATP), y la supervisión de la línea de producción en sitio de dióxido de carbono o la utilización de oxígeno. El método adoptado en cualquier situación dada depende de la fermentación y los requisitos específicos. Varios factores deben ser considerados, tales como el grado de exactitud y sensibilidad necesaria, y la duración del análisis. Estimación de organismos unicelulares, a condición de que no son propensos a la floculación ción, es relativamente sencillo, pero organismos filamentosos, hongos y actinomicetos presentan problemas adicionales. Además, los medios de cultivo varían en viscosidad, el color y la cantidad de sólidos en partículas, todos los cuales pueden influir en la elección del método de monitorización. La velocidad de análisis puede ser crítico, ya que a menudo se requiere una indicación instantánea de la biomasa o de la concentración celular. Obs- tante, los métodos más rápidos suelen ser menos fiables, y los procedimientos más largos son generalmente más precisa y reproducible.

métodos de conteo microscópico directo

donde SR es la concentración de sustrato de flujo de entrada o

x = Sx S (SR - Sr )

2.27

Por lo tanto, la concentración de biomasa en condiciones de estado estacionario se controla por la concentración de alimentación del sustrato y la tasa de dilución de funcionamiento. En condiciones no inhibidores, donde no hay inhibición de sustrato o producto, mayor es la concentración de la alimentación, mayor es la concentración de biomasa y la concentración de sustrato residual se mantiene constante. Sin embargo, cuanto mayor es la velocidad de dilución, más rápido que las células crecen, lo que resulta en un aumento simultáneo de la concentración de sustrato residual y la consiguiente reducción de la

El número de células en una suspensión se puede medir, a excepción de organismos filamentosos, por el recuento microscópico directo, utilizando Petroff-Hauser o de tipo Neubauer cuenta atrás ing cámaras. El primero es más adecuado para el recuento bacterias. Las rejillas de recuento, cuando la cámara se cubre con un cubreobjetos de vidrio, tienen un volumen conocido de la cultura. Contando el número de células dentro de una parte de la red, el número de células por mililitro se puede determinar. recuentos microscópicos directos son rápidos, pero limitados por su incapacidad para distinguir vivir de células muertas, a menos diferenciados por uso de una técnica de tinción vital. Además, las muestras deben contener concentraciones relativamente altas de células, normalmente un mínimo de 5 ¥ 106 células / ml.

contadores de células electrónicos equipos de recuento de células electrónico es también rápido, pero la mayoría de los métodos son más adecuados para los microbios unicelulares más grandes, tales como levaduras, protozoos y algunas algas, y menos útil para la estimación de las bacterias. El contador Coulter, por ejemplo, se utiliza para contar y tamaño de partículas, y se basa en la medición de los cambios en la resistencia eléctrica producidos por partículas no conductivas en suspensión en un electrolito. Este método consiste en retirar una suspensión de células a través de una pequeña abertura a través de la cual se mantiene una corriente eléctrica. Como una célula pasa a través de la abertura que desplaza su propio volumen de electrolito y cambia la resistencia eléctrica. Estos cambios se detectan y se convierten en un pulso contable. Sin embargo, es esencialmente cuenta partículas, de forma que es propenso a errores debido a las células de aglutinación y de la presencia de restos de partículas.

técnicas de conteo de placa métodos de recuento de placa detectan células viables, es decir, aquellos capaces de formar colonias en un nutriente sólido apropiado Medi-um. Los dos métodos utilizados rutinariamente se extienden chapado y verter en placas. Antes de placas, por lo general es necesario preparar una serie de diluciones en serie en diluyente estéril para suspensiones celulares concentradas. Alternativamente, para muestras con bajo número de células, como en el análisis de agua, se requiere una etapa de concentración. En chapado propagación, las muestras, por lo general 0,1 ml, se extienden sobre la superficie de un medio nutriente a base de agar adecuado utilizando un dispositivo de extensión estéril, por ejemplo una varilla de vidrio doblado. Las placas se invirtieron y se incubaron a la temperatura de crecimiento óptima. Todas las colonias resultantes deben estar bien separados y contarse con facilidad. Esto también permite el aislamiento de cultivos puros cuando sea necesario. Sin embargo, los microorganismos con una baja tolerancia al oxígeno no crecen (a menos que se incuba en condiciones adecuadas; ver p

35.) Y se vierte chapado puede ser preferido. Aquí una suspensión de microorganismos, normalmente un 1 ml Sample, se coloca en una placa de Petri y se mezcla a fondo con medio de agar fundido a 48-50∞C, y se deja solidificar antes de la incubación. Verter en las placas resultan en el desarrollo de las colonias microbianas en todo el agar. Esos organismos con menor tolerancia al oxígeno crecen en el agar. Las colonias de organismos aeróbicos suelen tener tamaños variables, como los que cerca de la superficie tienen un mejor suministro de oxígeno. En consecuencia, a menudo es más difícil de ver similitud en la morfología colonial entre las colonias en la superficie y aquellos dentro de la agar. Además, el recuento puede ser más

difícil que para las placas de propagación. El cuidado tiene que ser tomado para asegurar que el agar fundido no es demasiado caliente, de lo contrario algunas células microbianas pueden ser lesionados y lento para formar colonias visibles o incluso asesinados. Para una fiabilidad estadística, los resultados se registran sólo para las placas que contienen 30-300 colonias. Cálculo de la concentración de células en la muestra original se lleva entonces a cabo, teniendo en cuenta la dilución y el volumen plateado. Ambos métodos miden unidades formadoras de colonias (CFU). Esto puede o no ser el mismo como el número de células Dependiendo de la extensión de la formación de grumos y la morfología celular del microorganismo. Estas técnicas son exactos, pero un mínimo de 1-2 días de incubación suele ser necesario antes de las colonias son contables. Sin embargo, las técnicas más rápidas de conteo microcolonias están también disponibles.

Turbidimétrico y técnicas espectrofotométricas Estos métodos proporcionan un medio simple, rápido y conveniente de estimación de biomasa total. Por lo general, se realizan a una longitud de onda óptima específica para cada microorganismo. turbidimétrico métodos miden la luz dispersada por una suspensión de células, que es proporcional a la concentración de células. Alternativamente, se puede emplear la

espectroscopía, utilizando la absorbancia o transmitancia de una suspensión celular. Algunos sistemas de seguimiento de fermentación modernas ahora emplean métodos basados en la espectroscopia de infrarrojo cercano. Turbidimétrico y métodos espectrofotométricos requieren la construcción de curvas de calibración adecuados, preparados usando suspensiones de células estándar conteniendo concentraciones conocidas de células. Además, se debe tener cuidado al interpretar los resultados si el caldo de fermentación contiene partículas o está altamente coloreado.

la estimación del peso en seco Este método permite determinar el peso del total de células, tanto vivos como muertos, en muestras de cultivo líquidos. Se trata de la separación de la biomasa a partir de un volumen conocido de una suspensión de células homogéneo. Esto se consigue normalmente por filtración al vacío, a través de un filtro de membrana previamente pesado con un tamaño de poro de 0,2 mm o 0,45 mm. El filtro con células recogidas se 'lava' con agua para eliminar cualquier medio de cultivo residual y se secó hasta un peso constante en una estufa a 105∞C. Los resultados se expresan como normalmente miligramos de células por mililitro de cultivo. Obviamente, cualquier otra suspendida materiales no celulares

por encima del tamaño de los poros del filtro también se recoge y puede conducir a errores. Otras limitaciones son el tiempo necesario para obtener los resultados y el volumen relativamente grande de de la muestra necesarias para obtener suficiente biomasa para el pesaje exacto, como una bacteria individuo pesa sólo aproximadamente 10 a 12 g.

bioluminometry ATP ATP se pierde rápidamente de células muertas; en consecuencia, es muy útil para determinar la concentración de microorganismos viables. La cantidad de ATP en una muestra puede cuantificarse utilizando bioluminometry ATP. Esta técnica utiliza un complejo enzima-sustrato, luciferina luciferase-, obtenido de la luciérnaga, Photinus pyralis, que genera un fotón de luz por cada molécula de ATP. Cuando se añade una parte alícuota de luciferasa-luciferina a ATP extraído de una muestra de suspensión celular, la luz generada puede ser detectada en un bioluminometer. La señal resultante se amplifica y se expresó como una salida de datos digital o analógica. l

UCIF

era

SE

ATP + O + Luciferina æ æ æ æ Æ 2 oxiluciferina + AMP + PPi + CO2 + fotón de luz (562 nm) Este procedimiento es muy rápido y sensible. Bajo condiciones ópti- mamá tan poco como 10 femtomoles (1 femtomol = 10-15 mol) de ATP puede ser detectado, que es aproximado madamente equivalente a 1 célula de levadura o sobre 10 bacterias. ATP bioluminometry es más adecuado para la medición directa de las muestras que no son de color, como la extinción de la luz puede ser un problema. Sin embargo, como el método es muy sensible, las muestras pueden requerir la dilución considerable, que a menudo supera cualquier problema de color de temple.

On-line de estimación monitoreo en línea de fermentadores puede proporcionar la estimación en tiempo real de

la biomasa, y reduce al mínimo la necesidad de repetir los muestreos y análisis fuera de línea. Los sistemas de monitoreo pueden implicar la densidad óptica o sondas basadas capacitancia. Además, los microorganismos implicados en la mayoría de los procesos de fermentación se o bien tienen un requisito para el oxígeno y / o producirán dióxido de carbono. En tales casos, es teóricamente posible establecer una relación matemática entre los factores, tales como el desprendimiento de dióxido de carbono o la utilización de oxígeno, y la concentración de biomasa en el biorreactor. Por lo tanto, es-

Timation de concentraciones de biomasa y la formación de incluso producto se puede hacer mediante la medición de estos parámetros en línea usando detectores de dióxido de carbono o de oxígeno y biosensores conectados a un ordenador. Esto puede dar una estimación cura acción de la concentración de biomasa, a condición de que los algoritmos matemáticos desarrollados son fiables.

Efectos de las condiciones ambientales sobre el crecimiento microbiano Crecimiento y desarrollo de microorganismos se genial- mente afectados por las condiciones químicas y físicas de su entorno. Sin embargo, los microorganismos han evolucionado para ocupar nichos en toda la gama de ambientes en la Tierra, algunos de los cuales son muy hostil. Como se muestra en las secciones posteriores, los microorganismos de algunos de estos ambientes extremos tienen propiedades útiles que pueden ser explotadas.

Efectos de la temperatura sobre el crecimiento Cuando la temperatura aumenta, la velocidad de las reacciones químicas aumenta. Esta tasa se duplica por cada aumento de temperatura 10∞C. Por lo tanto, las células deben crecer más rápidamente a medida que aumenta la temperatura. Sin embargo, hay límites máximos más allá del cual algunas macromoléculas sensibles a la temperatura

(proteínas, ácidos nucleicos y lípidos) se convertirán en de- carácter, y por lo tanto, no funcionales. Hay también una temperatura mínima para el crecimiento, por debajo del cual la membrana de lípidos no es suficiente fluido para funcionar correctamente. Todos los organismos tienen una temperatura óptima para grupos de crecimiento y diferentes de los microorganismos han evolucionado para crecer sobre diferentes rangos de temperatura. Un microorganismo típico, conocido como estenotérmicas, puede crecer en un intervalo de temperatura de aproximadamente 30∞C, y organismos euritérmica crecen sobre aún más amplia rangos. En cuanto a la temperatura óptima, mesófilos tienen temperaturas de crecimiento óptimo en el rango de 20 45∞C y un mínimo en torno 15-20∞C (Fig. 2.6). Psicrófilos lo general tienen sus temperaturas óptimas de abajo 15∞C y estos organismos a menudo se mataron por la exposición a temperatura ambiente. Ellos son capaces de funcionar a baja temperatura debido a que sus membranas contienen una alta proporción de ácidos grasos insaturados. Estas moléculas permanezcan fluidas a las temperaturas más bajas, mientras que las membranas que contienen ácidos grasos saturados se convierten en no funcional. Psicrótrofos se refieren a veces como psicrófilos facultativos. Que más crecen

Relativo crecimiento tarifa

0102030405060708090100110 Temperatura (ºC) clave:psicrófilospsicrótrofos

Higo. 2.6Rangos de temperatura para el crecimiento microbiano.

mesófilostermófilos termófilos extremos

rápidamentea temperaturas por encima Tabla 2.3 Ejemplos de procariotas termofílicos y su 20∞C, pero son capaces de crecimiento lento temperatura optima a temperaturas de hasta alrededor de 0∞C. Varios son responsables de la descomposición La temperatura de los productos refrigerados. óptima (∞C) organismos con Optima encima 50∞C son denominado Thertasa de crecimiento y contribuir a la inhibición y mophiles. Varios de algas, protozoos y hongos tienen máximos de las especies temperatura finalmente la muerte. Los mecanismos reales de hasta 55∞C. Sin embargo, es sólo ciertos termotolerancia no están completamente aclaradas. Sin procariotas que son verdaderamente embargo, los ribosomas de termófilos funcionan termófila, como no hay microbios eucariotas eficazmente a temperaturas más altas y sus membranas crecer a temperaturas tan altas. Algunos también permanecen intactos. Las enzimas de (hiper) termófilos extremos pueden crecer a termófilos, tales como 100∞C o superior. Por ejemplo, Pyrolobus fumarii tiene un óptimo de 106∞C y continúa creciendo hasta 113∞C. Todos estos son los archaea (Tabla 2.3), que son principalmente los reductores de sulfato anaeróbicas o tienen otra metabolismo con menores necesidades de cofactores termolábiles tales como NADH y NADPH. Tienen potenciales usos industria- les en la desulfuración de carbón, la lixiviación de metales, la generación de metano y la producción de enzimas comerciales, especialmente polimerasas de ADN y endonucleasas de restricción. La exposición de los no termófilos a temperaturas elevadas normalmente causa daño a las membranas citoplasmáticas, la ruptura de los ribosomas, enzimas irreversible desnaturalización y la cadena de ADN rotura. Es difícil determinar cuál de estas lesiones de calor '' es la más perjudicial para los microorganismos, ya que todo se reducirá la

archaea Methanobacterium thermoautotrophicum 65 (methanogen) Methanococcus jannaschii (Methanogen) 85 Pyrococcus furiosis (Acumula H2) 100 fumarii Pyrolobus (Obligar H2 106 quimiolitotrofo) Sulfolobus acidocaldarius (acidophilic75 oxidante de azufre) eubacterias Bacillus stearothermophilus 60-65 Clostridium thermocellum 60 (Anaerobio celulolítica) lividans Synechococcus (Cianobacteria) 67 Thermoanaerobacter ethanolicus 70

(Productor de etanol)

Bacillus stearothermophilus, Son generalmente más estables al calor, que puede ser el resultado de unos pocos cambios de aminoácidos dentro de una proteína que puede aumentar notablemente la termoestabilidad. El mantenimiento de la integridad del ADN en estas condiciones es obviamente crucial y algunos termófilos extremos tienen ADN con una alta proporción de guanina-citosina, dando a los enlaces de hidrógeno entre cadenas que el aumento

proporcionar una mayor termoestabilidad. También mantienen los niveles de iones de potasio intracelular más altas, a menudo con el contra-ión inusual, 2,3-difosfoglicerato, que ayuda a estabilizar las proteínas. esporas microbianas son particularmente resistente al calor. Estas estructuras latentes tienen capas gruesas de esporas y baja actividad de agua (véase más adelante). endosporas bacterianas (Fig. 1.3) contienen altos niveles de dipicolinato calcio, que puede constituir hasta el 15% de su peso seco. Su función se cree que es en la estabilización de los ácidos nucleicos y proteínas. Sin embargo, algunos mutantes que carecen de este compuesto parecen conservar la resistencia al calor.

Efectos del pH sobre el crecimiento Como con la temperatura, cada microorganismo tiene una timum opción pH y un intervalo de pH sobre la que crece. En general, los hongos tienden a crecer a pH más bajos (pH 4-6) que la mayoría de las bacterias. acidophiles verdaderos tienen un pH óptimo entre 1 y 5,5, y con frecuencia tienen mecanismos para la exclusión de protones con el fin de mantener su pH interno a un nivel superior. Sin embargo, la mayoría de los microorga- nismos son los neutrófilos, cada vez mayor entre pH 5 y 9, como la mayoría de los entornos naturales caen dentro de este rango. Alcalófilos, tales como especies de Bacillus y fibra micro, tienen un pH óptimo entre 8,5 y 11,5, pero ocupan protones para mantener su pH interno a un valor inferior.

Efectos de solutos y la actividad del agua en el crecimiento La mayoría de los microorganismos contienen aproximadamente un 70-80% de agua y requieren una cierta cantidad de agua libre para la realización de actividades metabólicas específicas. Cuando migrantes células microbianas con paredes celulares rígidas se colocan en soluciones hipotónicas (menor presión osmótica de contenidos celulares), que absorben agua para convertirse en erecto, mientras que los que no tienen paredes se hinchan y finalmente estalló. En ambientes secos y hipertónicas absorción de agua y la retención es problemático.

ambientes hipertónicos pueden contener cantidades considerables de agua, pero no es necesariamente disponibles. De hecho, los altos niveles externos de solutos, tales como sal o azúcares, hace que el agua a pasar hacia fuera de la mayoría de las células y el crecimiento se detuvo. la disponibilidad real de agua a un microorganismo está indicada por la actividad de agua plazo (Aw). Esta es la relación de la presión de vapor de agua en la solución que rodearon ing el microorganismo, Psoln, a la presión de vapor del agua pura:

la = P

Soln agua

es decir, el agua pura tiene una Aw de 1. especies microbianas varían en su tolerancia a la sequía y entornos de alta resistencia osmótica. La mayoría de las bacterias, con algunas excepciones, no pueden crecer por debajo de un Aw de 0,9, que puede proporcionar un medio valioso para la conservación de alimentos. Muchos hongos que causan deterioro biológico de los granos almacenados (Aw = 0,7), incluyendo restrictus Aspergillus, Son xerotolerant y puede crecer a bajos niveles de humedad. Sin embargo, los hongos y levaduras osmofílicas tous filamentosos verdaderamente xerófilas, por ejemplo Zygosaccharomyces rouxii, han evolucionado para sobrevivir en medios donde el Aw puede ser tan bajo como 0,6. Algunas de estas especies pueden no crecer bajo condiciones de alta el agua disponibilidad. Las bacterias marinas están perfectamente adaptados a la concentración de sal en el agua de mar (Aw = 0,98) y poseen enzimas que tienen un requisito específico de iones de sodio. Los verdaderos halófilos, por ejemplo, Halobacterium halobium, que se encuentra en áreas como el Mar Muerto y lagos de sal, no va a crecer en concentraciones de sal a menos de 3 mol / L. Estos son los archaea que han paredes de las células y los lípidos de membrana altamente inusuales modificados.

Osmophilic, xerófilo y organismos halófilos w acumulan solutos de compensación, que P equilibran la fuerza osmótica del soluto externa. Los ejemplos in- cluyen polioles; arabitol se acumula por varias levaduras y hongos filamentosos, y altos niveles de glicerol se encuentran en el alga Dunaliella salina halófilas. Muchos halófilos también almacenan grandes cantidades de iones de potasio y algunas bacterias acumulan aminoácidos, especialmente prolina y ácido glutámico. Aunque no especialistas, Escherichia coli sintetiza betaína osmoprotective (N, N, N- trimetilglicina) y Penicillium chrysogenum puede ac- glucosa cumulate, fructosa y cloruro de potasio.

Efectos del oxígeno sobre el crecimiento Los microorganismos se clasifican en cinco grupos principales sobre la base de sus requisitos de oxígeno. 1 obligar a los aerobios crecer sólo en presencia de oxígeno, ya que se requiere como aceptor terminal de electrones para el transporte de electrones en la respiración aeróbica (véase el capítulo 3). 2 Los anaerobios facultativos funcionar con o sin oxígeno, pero crecen más eficientemente cuando el oxígeno está disponible.

3 microaerófilos requerir algo de oxígeno para la biosíntesis de ciertos compuestos, pero no puede crecer a concentraciones normales de oxígeno atmosférico de 21% (v / v). Deben tener bajos niveles de oxígeno de 2- 10% (v / v). 4 anaerobios aerotolerant ignorar esencialmente oxígeno y crecer igual de bien en su presencia o ausencia. 5 anaerobios obligados no puede tolerar el oxígeno; exposición a la misma da lugar a su muerte. En la exposición al oxígeno, la mayoría de los organismos interactúan con él para producir productos tóxicos altamente reactivos. Estos productos 2 reducción de 22 oxígeno atmosférico incluyen superóxido (O • -), peróxido de hidrógeno (HO) y los radicales hidroxilo (OH •). A menos que desintoxicado, estos productos reaccionan de forma destructiva con cualquier molécula orgánica que EScontador, incluyendo lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Tres grupos de enzimas catalizan radicales libres para ayudar a hacerlos inocuos: superóxido dismutasa, catalasa y peroxidasas: superóxido re ismo uta

s

2

3

4

Efectos de la radiación en el crecimiento

mi

æ æ æ æ22æ • superóxido (2O ) + ÆO + HO 2 catalasa 2H+

1

en un ambiente anaeróbico. Los procedimientos adecuados incluyen: el uso de medios que contienen agentes reductores, tales como tioglicolato, que se combinan químicamente con el oxígeno; eliminación física de oxígeno de una cámara de crecimiento, mediante el bombeo hacia fuera el aire con una bomba de vacío, y luego el lavado del recipiente con gas nitrógeno ± dióxido de carbono; el uso de jarras GasPak, que implica el sellado de los cultivos microbianos en el interior del tarro, junto con un catalizador de paladio y un sistema de generación de gas de hidrógeno; el oxígeno se elimina a través de su reacción con el hidrógeno para formar agua; y armarios anaeróbicos para el crecimiento y la manipulación de los organismos, los cuales se lavan con una mezcla de gas de nitrógeno: dióxido de carbono: hidrógeno (80: 10: 10) y tienen un "sistema de lavado" para eliminar el oxígeno residual.

2

peróxido de hidrógeno (2H 2O2 ) ÆæææÆO2 + 2H 2O glutatión peroxidasa

2GSH æææææÆ 2MARIDO MARI 2O+ GSSG DO glutatión glutathioneoxidized O + 2 2

Aerobios y todos los demás organismos capaces de tolerar el oxígeno tienen la superóxido dismutasa, que disipa cualquier superóxido. Muchos aerobios, sino organismos no aerotolerantes, también poseen catalasa para eliminar el peróxido de hidrógeno. La presencia de ácido ascórbico, vitamina E y Bcarotenos también puede ser útil en la eliminación de los radicales libres no enzimática. anaerobios obligados estrictos carecen de la superóxido dismutasa y catalasa, o inproducen cantidades adecuadas. En consecuencia, tienen capacidad ed muy LIMIT- para desintoxicar los

Visible y la luz ultravioleta (UV) son partes del electro espectro magnético, que se extiende desde fuerte radiación ción (rayos g) a muy débil radiación (calor y la radio olas). Incluso la luz visible, en particular los más enervioleta Getic y regiones azules, pueden ser perjudiciales. Se puede generar oxígeno atómico, un agente oxidante muy potente, que puede causar daños a los componentes celulares radicales de oxígeno y son incapaces de sobrevivir en presencia de oxígeno. hábitats anaeróbicos son bastante más común de lo que esperarse. Ellos pueden surgir de la utilización de oxígeno por anaerobios facultativos para crear un anaerobio pequeños e investigar am- donde anaerobios obligados pueden crecer. En general, donde la materia orgánica se acumula, los microorganismos utilizar el oxígeno más rápido de lo que puede ser reemplazado, la creación de un ambiente anaerobio. Para crecer anaerobios estrictos en el laboratorio, los procedimientos para excluir el

oxígeno de la cultura debe ser utilizado y todas las manipulaciones deben realizarse

y puede destruir algunos microorganismos. luz UV, que es más dañino a 260 nm, que causa daño al ADN específico, en particular la formación de dímeros de timina. Ionizante radiación ing, tales como G-rayos emitidos desde el cleus nuclear excitado de 60Co, genera radicales libres, OH • y • H, y los electrones hidratados. Los daños resultantes incluye roturas en los enlaces de hidrógeno en las moléculas funcionales, la oxidación de muchos grupos químicos y la rotura de cadenas de ADN. Ciertos microorganismos, en particular la bacteria Deinococcus radiodurans, exhiben una considerable resistencia natural a la radiación, al igual que las endosporas bacterianas. Muchas bacterias transportadas por el aire gozan de cierta protección por los pigmentos que absorben la radiación, y en otros microorganismos resistencia implica mecanismos de reparación eficaces, especialmente para el ADN dañado. En ambos coli Saccharomyces cerevisiae y E., por ejemplo, hay al menos tres sistemas para la reparación del ADN; mutantes que carecen de estas enzimas de reparación exhiben una mayor sensibilidad a la radiación. Algunos microorganismos, incluyendo E. coli, también son menos susceptibles al daño por radiación en anaero-

ambientes bic que cuando respiran aeróbicamente, y pueden estar protegidos parcialmente por los agentes y compuestos phydryl sulfatos reductor.

Efectos de la presión hidrostática en el crecimiento En la naturaleza, muchos microorganismos no están sometidos a presiones superiores a 1 atm (101,3 kPa o 1.013 bar) y presiones más altas generalmente inhibir el crecimiento microbiano. Por ejemplo, en la producción de sidra, levadura rendimiento se deteriora donde las profundidades del fermentador son mayores que 14,5 m, que producen presiones hidrostáticas por encima de 1,5 atm. Sin embargo, es difícil determinar qué proceso o función es más dañado y el orden de inhibición. La interferencia con las síntesis de proteínas y transferencia de energía desde catabólica a biosyn- sistemas téticos se observa a menudo, como es la incapacidad de los microorganismos para adaptarse a nuevos sustratos. Sin embargo, muchos organismos marinos deben barotolerant, ya que viven en las profundidades de los océanos en los que pueden ser sujeto-ed a presiones de hasta varios cientos de atmósferas, y sólo dejar de crecer por encima de 200-600 atm. Algunos incluso pueden crecer mejor en estas condiciones y son verdaderamente barófilo, capaz de vivir bajo 700- 1000 atm.

El control (inhibición) del crecimiento microbiano es el control o la prevención de la proliferación microbiana necesaria en muchas situaciones prácticas, sobre todo en el cuidado de la salud, el procesamiento y preparación de alimentos, y en la conservación de materiales. El control puede lograrse usando agentes físicos o químicos que, o bien matar microorganismos o inhibir su crecimiento adicional. Los agentes que matan las células se denominan agentes '' cida, mientras que los agentes '' -static inhiben el crecimiento de células sin matarlas. Algunos agentes afectan a grupos de organismos; el término bactericida, por ejemplo, se refiere a la eliminación de bacterias y bacteriostático se refiere a inhibir el crecimiento de células bacterianas. Los procedimientos de esterilización destruyen o

eliminan por completo todos los organismos viables, incluyendo esporas, y se pueden realizar usando el calor, la radiación y los productos químicos, o por eliminación física de las células. Los microorganismos no mueren al instante en la exposición a un agente letal. La población disminuye Ly exponential-, por una fracción constante a intervalos constantes, y varios factores influyen en la efectividad de cualquier tratamiento antimicrobiano. Éstas incluyen:

1 tamaño de la población: cuanto mayor sea la población microbiana, mayor será el tiempo requerido para matar todos los microorganismos presentes; 2 composición de la población: los diferentes microorganismos varían en su sensibilidad a un agente letal específica, y su eficacia puede verse influida por su edad, GY morfologías y estado fisiológico; 3 concentración del agente antimicrobiano o intensidad del tratamiento: Las concentraciones más altas o mayores intensidades son generalmente más eficiente, pero la relación es raramente lineal; 4 periodo de exposición al agente letal: cuanto mayor sea la exposición, mayor es el número de organismos muertos; 5 temperatura: normalmente una temperatura más alta incrementa la eficacia del agente; y 6 condiciones ambientales, tales como el pH, viscosidad media y la concentración de materia orgánica, pueden tener una gran influencia sobre la eficacia de la mayoría de los agentes antimicrobianos.

Control del crecimiento microbiano por agentes físicos CALOR

Siempre que se utiliza calor para controlar el crecimiento microbiano tanto temperatura y tiempo de exposición debe ser considerarse con-. La

temperatura requerida para matar un microorganismo específico (la temperatura letal) varía bastante ampliamente. Además, el tiempo necesario para matar depende de varios factores (ver arriba). El calor es el medio más importante y ampliamente utilizados de la esterilización (ver términos relativos a la esterilización por calor en la Tabla 2.4), y puede lograrse a través de: 1 incineración, donde la quema en 500∞C físicamente destruye los organismos y es particularmente útil para algunos desechos sólidos; 2 calor húmedo, Que es adecuado para la esterilización mayoría de los artículos, excepto las sustancias termolábiles que serían dena- rado o destruidos. Se lleva a cabo utilizando vapor de agua a presión para lograr 121∞C durante 15 minutos, y se utiliza ampliamente en procesos de fermentación para la esterilización de recipientes, tuberías de conexión y medios de cultivo (véase el capítulo 6); o 3 calor seco es menos eficiente que el calor húmedo, que requiere temperaturas más altas y tiempos de exposición más largos. Se lleva a cabo en hornos de aire caliente en 160∞C durante 2 h, y se puede utilizar para la cristalería, objetos de metal y los materiales sensibles a la humedad tales como polvos y aceites. Hirviendo de soluciones acuosas o inmersión de

Tabla 2.4 Términos relativos a la esterilización por calor utilizados en las industrias alimentarias y de fermentación Tiempo de destrucción térmica (TDT) es el tiempo más corto requerido para matar todos los microorganismos en una muestra a una temperatura específica y en condiciones definidas tiempo de reducción decimal (Valor D) es el tiempo requerido para matar 90% de los microorganismos en una muestra a una temperatura específica. Este término se utiliza ampliamente en la industria alimentaria Z-valor es el aumento de temperatura necesaria para reducir a D 1/10 de su valor anterior F- valor es el tiempo en minutos a una temperatura específica (por lo general 250∞F o 121.1∞C) necesarias para matar a una población de células o esporas del factor de (-) = Ln (No/NORTEt), Donde No es el número de organismos en el inicio de la esterilización y el Nt es el número restante después del tiempo t. Por lo tanto, el factor es una medida Del de la reducción fraccionaria en el organismo viable recuento producido por un cierto calor y el tiempo de régimen. Cuanto mayor sea el factor de Del, mayor será el régimen requiere la esterilización. Este término se utiliza sobre todo en la industria de la fermentación

sólido objetos en agua hirviendo a 100∞C durante 30 min no garantiza la esterilidad. Se mata a las células vegetativas más, pero no todas las endosporas. Para matar endosporas, se requiere de ebullición intermitente o tyndallization. Esto implica la exposición del material a temperaturas elevadas para matar las células vegetativas, seguido de incubación en 37∞C para permitir que las esporas germinen y forman nuevas células vegetativas. Una segunda exposición a temperaturas elevadas destruye las células vegetativas recién germinadas. La esterilización por calor se emplea comúnmente en el enlatado y embotellado, y tratamientos de temperatura ultra alta (UHT) se utilizan en algunos procedimientos de embalaje estériles. La pasteurización es un tratamiento térmico más suave, que se utiliza para reducir el número de microorganismos en productos o alimentos que son sensibles al calor y capaz de soportar la exposición prolongada a altas temperaturas. pasteurización por lotes

unt 63∞C de 30 min se puede utilizar para botellas llenas; Sin embargo, la pasteurización flash a 72∞C durante 15 s puede se prefiere para ciertos alimentos y bebidas. Por ejemplo, se realiza en leche y cerveza, ya que tiene menos efectos indeseables sobre la calidad o sabor. En el caso de la pasteurización de la leche, el tiempo y la temperatura utilizados están dirigidos a la eliminación de patógenos transmitidos por la leche, especialmente estafilococos, estreptococos, brucelosis La abortus, Mycobacterium bovis y Mycobacterium tuberculosis.

BAJA TEMPERATURA

Estos tratamientos incluyen la refrigeración o congelación. orga- nismos no suelen ser asesinados, pero la mayoría no crecen o crecen muy lentamente a temperaturas por debajo 5∞C. Los alimentos perecederos se almacenan a bajas temperaturas para disminuir la tasa de crecimiento microbiano y el consiguiente deterioro. A menudo, es psicrótrofos, en lugar de verdaderos chrophiles gos, que son la causa del deterioro de los alimentos en los alimentos nerada refriger-.

Baja actividad de agua

Esto es ampliamente utilizado para conservar los alimentos, frutas, especialmente granos y algunos productos cárnicos. Métodos implican la eliminación de agua del producto mediante el calentamiento o secado por congelación; Alternativamente, la actividad de agua se puede reducir mediante la adición de solutos, por lo general sal o azúcar.

IRRADIACIÓN

Microondas, UV, X y g radiación se pueden utilizar para determinar los microorganismos stroy. radiación UV es eficaz, pero su uso está limitado a esterilización de la superficie, ya que no penetra en el vidrio, películas de suciedad, agua y otras sustancias.

Tratamiento con radiación ionizante implica sobre todo los rayos X o rayos g. Esto es particularmente eficaz debido a su capacidad de penetrar materiales. La irradiación se utiliza comercialmente para esterilizar artículos tales como cajas de Petri, y en algunos países, especias, frutas y verduras son irradiados para aumentar su vida de almacenamiento de hasta 500% mediante la destrucción de microorganismos causantes de deterioro. El proceso es relativamente caro, y debido a la naturaleza de los materiales alimenticios y dosis dada, no se mató a todos los organismos. La irradiación también puede destruir algunas vitaminas. En algunos alimentos los niveles de vitamina C y E pueden ser reducidos por 5 a 10% y hasta el 25%, respectivamente. Estos tratamientos no son adecuados para todos los productos; por ejemplo, cuando la cerveza y algunos champús se irradian, sulfuro de hidrógeno se puede generar. La irradiación de alimentos no ha sido aceptado en todo el mundo. En la actualidad, unos 40 países han aprobado leyes al-al de su uso para los materiales especificados. Sin embargo, está ganando mayor aceptación, sobre todo con el aumento de la incidencia de las enfermedades transmitidas por los alimentos, tales como E. coli 0157: H7. En los EE.UU., el uso de estas técnicas se ha extendido para el tratamiento de la carne de vaca, cordero y productos de cerdo después de la aprobación por la Food and EE.UU. Drug Administration (FDA).

Alta intensidad de campos eléctricos

glutaraldehído, óxido pirocarbonato dietílico.

de

etileno

y

pulsantes TRATAMIENTO

Este es otro tratamiento no térmico e implica la exponga el material a un campo eléctrico de 15-20 kV / cm durante unos pocos milisegundos o menos. El mecanismo subyacente de la inactivación celular no se ha aclarado completamente, pero se cree que incluyen la ruptura de las membranas a través de electroporación (es decir, la formación de poros en las membranas). Se considera que los tratamientos de campo eléctrico de alta intensidad pulsadas podrían, en el futuro, tener varias aplicaciones, incluyendo la conservación de alimentos.

filtración estéril La filtración estéril implica la eliminación física de todas las células de un líquido o gas. Es especialmente útil para la esterilización de soluciones lábiles al calor de antibióticos y otros medicamentos, aminoácidos, azúcares, vitaminas, medios de cultivo de células animales y algunas bebidas. Sin embargo, los productos resultantes no pueden estar libres de virus y ultrafiltración es necesario para eliminar los virus. Hay tres tipos principales de filtro estéril: 1 filtros de profundidad son filtros fibrosos o granulares gruesas que eliminan microorganismos por cribado físico, ción atrapamiento y la adsorción; 2 filtros de membrana son los filtros finos con tamaños de poro definidos, por lo general de 0,2 o 0,45 mm, a través del cual no pueden pasar los microorganismos; y 3 de alta eficiencia para partículas de aire (HEPA) se utilizan en cabinas de seguridad biológica de flujo laminar y salas de contención para esterilizar el aire que circula en el recinto.

Control del crecimiento microbiano por agentes químicos agentes antimicrobianos químicos se pueden utilizar para matar microorganismos o inhibir su crecimiento y pueden ser de origen natural o sintético. Ellos incluyen conservantes químicos, desinfectantes, antisépticos y medicamentos utilizados en la quimioterapia antimicrobiana. Algunos también se utilizan como esterilizantes líquidos y gaseosos. Estos son altamente tóxicos y matan a todas las formas de vida, por ejemplo, formaldehído,

Antisépticos y desinfectantes

Antisepsia es la prevención de la infección de tejido vivo. Esto se logra usando agentes microbicidas antisépticas que

no dañar la piel y las mucosas, pero no debe ser tomado internamente. Los ejemplos incluyen la solución de yodo, alcoholes y compuestos de amonio cuaternario (Tabla 2.5). Los desinfectantes son agentes que matan a los microorganismos, pero no necesariamente sus esporas. No son lo suficientemente seguros para su aplicación directa a los tejidos vivos y se utilizan en objetos inanimados tales como mesas, suelos, utensilios, etc. cloro, hipocloritos, compuestos de cloro y fenoles son ampliamente utilizados como desinfectantes. Desinfectantes y antisépticos se distinguen sobre la base de si son seguros para su aplicación a las membranas mu- cus. A menudo, la seguridad depende de la concentración del compuesto. Algunos compuestos fenólicos, por ejemplo, se utilizan como desinfectantes en concentración alta, pero a bajas concentraciones que son adecuados para uso como antisépticos (Fig. 2.7).

Conservantes antimicrobianos para la Alimentación y productos afines

Estos compuestos son agentes su mayoría estáticos usados para inHiBit el crecimiento de microorganismos en los alimentos y los productos farmacéuticos o cosméticos que pueden ser congestionadas in- (Tabla 2.6 y Fig. 2.7). Hay relativamente pocos compuestos aprobados para estos fines. La mayoría de los países utilizan tres categorías de clasificación para los conservantes de alimentos '' añadido, basados en la emitida por la FDA. Grupo 1 son ácidos orgánicos naturales

(láctico, cítrico, etc.); mientras que el grupo 2 ha clasificado sustancias como generalmente considerados como seguros (GRAS), que incluye otros ácidos orgánicos (ben- zoico, propiónico, sórbico, etc.), los parabenos (ésteres de ácido para-hidroxibenzoico) y SO2. Otros compuestos demostraron ser seguros para el hombre o los animales que no se pueden colocar dentro del grupo 1 ó 2 se asignan al grupo 3. La sal común, azúcares, especias, vinagres y aceites tienen algún tipo de acción preservante, pero no se clasifican como "agentes de conservación añadidos '. Obviamente, cualquier conservante utilizado en los alimentos, además de ser seguro, debe idealmente estar libre de sabor y aroma. La concentración mínima debe añadirse conservantes y no debe ser utilizado para encubrir prácticas de fabricación pobres. En el caso de los ácidos orgánicos y los parabenos, es su forma no disociada que exhibe las propiedades antimicrobianas. Sus valores de pKa (el pH en el que hay 50% de disociación de las moléculas) se encuentran en el rango de pH 3-5. A medida que el pH cae la concentración de la forma undissociaumenta ATED, elevando así la actividad antimicrobiana. Sin embargo, por encima de pH 5,5-5,8 mayoría son ineficaces, además de ácido sórbico y los parabenos. Recordaron tain actividad antimicrobiana a pH 6,5 y pH 7,0-8,0,

Tabla 2.5 agentes antimicrobianos químicos comunes que se utilizan como antisépticos, desinfectantes, conservantes no alimentaria y esterilizantes Químico

acción

Usos

alcoholes El etanol (50 a 70%, v / v) Isopropanol (50-70%, v / v)

Desnaturalizar las proteínas y solubilizar lípidos

Formaldehído (8%) y glutaraldehído (5%) (Esterilización en frío)

Reaccionar con NH2, SH y grupos. muy reactivo

desinfectantes ampliamente no antisépticos; usados matará y endosporas utilizado en la Antiséptico piel Desinfectantes, matan

donadores de formaldehído (Por ejemplo, Germall 115- urea efectiva en el imidazolidinil 0,3%) Tintura de yodo (2% en 70%, v / v de

ver formaldehído

alcohol) Cloro (Cl2) de gas

Forma ácido hipocloroso (HClO),agente una oxidante fuerte cl2 + H2O Æ HCl + HClO HClO Æ HCl + O (oxígeno naciente, poderoso agente oxidante)

piel La desinfección del agua potable; desinfectante general,

Nitrato de plata (AgNO3)

precipita proteínas

Antiséptico general y utiliza de productos farmacéuticos para los ojos

Cloruro de mercurio

Inactiva las proteínas mediante la reacción con grupos sulfhidrilo

Desinfectante, aunque de vez en cuando se utiliza como una en la piel antiséptico

Compuestos de amonio cuaternario por ejemplo, cetrimida y cloruro de benzalconio

Rompe las membranas celulares Los tensioactivos catiónicos Actividad reducida por la materia orgánica, más eficaz contra las bacterias Gram (+) que Gram (-) bacterias bacterias, levaduras o moldes. efecto rápido, y la actividad realzado por EDTA, alcohol bencílico y ciertos otros compuestos

antisépticos para la piel y desinfectantes para utensilios de baja comida, Se utiliza en toxicidad preparaciones oftálmicas en 0,001% (w / v)

Compuestos fenólicos

Desnaturalizar las proteínas y alterar celular membranas.

Antisépticos a bajas concentraciones; desinfectante en mayor concentraciones

Fenol

Más eficaz contra las bacterias Gram (+) bacterias

0.5% (w / v) en los cosméticos y artículos de aseo; Nota: 0,5% (w / v) utilizada como un solución estándar contra la cual otra Los agentes antimicrobianos se mesurado

Orto-cresol

Similar al fenol

0.3% (w / v) usado en los inyectables, conservante de cremas y ungüentos

clorocresol

Más eficaz que el fenol y orto-cresol

0.1% (w / v) usado en gotas para los ojos cremas para e inyectables, la piel y ungüentos

chloroxylenol

Actividad contra bacterias Gram (-) bacterias mejorada mediante la adición de EDTAen particular de agente

Se utiliza en muchos cosmética preparativos

La esterilización de los gases por ejemplo, óxido de etileno, pirocarbonato de dietilo bronopol (2-bromo-2-nitropropan-1,3-diol)

inactiva las proteínas

alquilación grupos sulfhidrilo

de amplio espectro contra Gram (+) y (-) bacterias, hongos, amplio rango de pH de afecta a las membranas y 3-8, enzimas deshidrogenasa

endosporas a alta conc., puede irritar la piel; posible carcinógenos Ventajas con respecto a formaldehído libre, utilizado en algunos cosméticos Antiséptico utilizado en la

Desinfectante; se utilizan para esterilizar objetos sensibles al calor, tales como caucho y plásticos. mata las esporas y virus Conservante para combustibles, pinturas, los textiles y en particular cosméticos y productos farmacéuticos, utilizado en 0,01 a 0,02% (w / v)

Capitulo

4 0 alcohole s

Ohio CH3

CH2 Ohio

CH3

CH CH3

EthanolIsopropanol aldehídos OOO MARIDO CCH

HCH

CH2

CH2

CH

2

FormaldehydeGlutaraldehyde compuestos fenólicos Ohio

CH3

ClOHOHCl

Ohio

CH2

Ohio

cl

OCl

CH3 Orto-cresol

Compuestos de amonio cuaternario

MARIDO3do

norte

cl

ClOH

El hexaclorofeno (di- (3,5,6-tricloro2-

El triclosán (5-cloro-2- (2,4-

hidroxifenil) metano)

diclorofenoxi) fenol)

Fenol

CH3

CLCL

cl

cl clorocresol

CH3 +

donorteMARIDO2n + 1br

-

CH2

norte+ donorteMARIDO2n

CH3

+ 1cl

(N = 12,14 o 16) (n = 8 a cetrimida (Una mezcla de dodecil-tetradecil- y bromuro de hexadecil-trimetilamonio)

-

CH3

18) Cloruro de benzalconio (Una mezcla de cloruros de amonio alkyldimethylbenzyl-)

ácidos benzoico y compuestos relacionados

COOHHOCOOR

Ácido benzoico

paghidroxibenzoatos (R = metilo, etilo, propilo, butilo o bencilo)

El ácido sórbico y bronopol CH3 CH CHHOH CHNO

br 2CC

CH2Ohio 2

CH (Ácido 2,4-hexadienoico) CH2COOH Acido sorbico

El crecimiento microbiano y la

bronopol (2-bromo-2-nitropropan-1,3-diol)

Higo. 2.7Ejemplos de antisépticos, desinfectantes químicos y conservantes de alimentos.

4 1

Tabla 2.6 conservantes de alimentos comunes y sus usos Preservativo

La concentración efectiva

Usos

Ácido acético

0.4% (w / v)

Se utiliza en productos horneados

El ácido benzoico (E210), benzoatos y* parabenos

0.1% (w / v) 0,01-0,05% (w / v) *

Los agentes antimicrobianos en la margarina, la sidra, suave bebidas, cosméticos, etc.

Ácido láctico

0.3% (w / v)

La nisina (E234)

50-500 UI / g eficaces contra las bacterias Gram (+) bacterias; particularmente útil 0.3% (w / v)

agente antimicrobiano en el suero de leche, quesos, yogur y alimentos en escabeche Se utiliza en el queso fundido, otros

El ácido propiónico (E280) y propionatos El nitrito de sodio (E250)

0,02% (w / v) más eficaz a un pH de 5,0 a 5,5

El ácido sórbico (E200) y sorbatos

0.2% (w / v)

El dióxido de azufre (E220), sulfitos

0,02-0,03% (w / v) forma activa es el ácido sulfuroso no disociado

productos lácteos y productos enlatados a pH ácido agente antifúngico en panes, pasteles, quesos, frutos secos agente antibacteriano en embutidos y pescado. Retarda el crecimiento de Clostridium botulinum. Los problemas debidos agente antifúngico en quesos, jarabes, tortas, jugos de frutas, etc.

respectivamente. En consecuencia, los parabenos tienen uso generalizado en alimentos, productos farmacéuticos y cosméticos, particularmente ya que son insípido, incoloro y estable. Los parabenos tienen una alta LD50 de 8 g / kg y tienen Comunidad Europea y aprobación de la FDA (nota: DL50 es la dosis letal de una sustancia, en gramos por kilogramo de peso corporal de los animales de ensayo, tales como ratones, en la que 50% de una población mueren). Los únicos problemas evidentes con los parabenos son la sensibilización de bajo grado exhibido por algunos individuos, su tendencia a sufrir partición en aceite, los aceites vegetales en particular, y su reducida efi- cacia en presencia de glicerol y etilenglicol. Los parabenos inhiben muchas bacterias, levaduras y hongos, pero son mucho menos eficaces contra las bacterias Gram-negativas. Su acción se cree que es en las membranas microbianas, sino que también puede afectar el metabolismo del ácido nucleico. efectiva en uso concentraciones de los parabenos son normalmente 0,01 a 0,05% (w / v). Las mezclas se usan a menudo porque parecen tener una acción sinérgica, por ejemplo, dos

agente antimicrobiano en frutos secos, uvas, melaza y bebidas. Inhibe hongos y bacterias. Se utiliza ampliamente en el pasado, ahora reducciones en el uso debido a la inducción de ataques de asma en

partes de metil parabeno más una parte paraben de propilo. Muy unos productos microbianos, aparte de los ácidos orgánicos, se utilizan como conservantes de alimentos. Normalmente, los agentes bióticos ic no son aceptables en la alimentación humana debido al desarrollo potencial de cepas resistentes, y la posible

alteración de la ecología microbiana del intestino o reacciones alérgicas. Sólo nisina, y en un grado menor natamicina, actualmente tienen aplicaciones en alimentos (véase el Capítulo 13). Otros conservantes biológicos posibles incluyen la lactoferrina de fijación del hierro; avidina, un quelante de biotina; ovoinhibidor, un inhibidor de la proteasa; y la lactoperoxidasa, un oxidante de grupos SH. La lisozima, que causa la lisis celular bacteriana, se puede utilizar como conservante, pero tiene un espectro bacteriolítica limitada. enzimas bacteriológicas similares, tales como las del moho del lodo celular, Polisphondylium especie, en última instancia, puede ser más útil.

la quimioterapia antimicrobiana quimioterapia antimicrobiana implica el control o la destrucción de los microorganismos causantes de la enfermedad una vez dentro de los tejidos de seres humanos y otros animales. Probable- mente la propiedad más importante de un agente antimicrobiano clínicamente útil es su toxicidad selectiva, es decir, el agente actúa para inhibir o matar al microorganismo patógeno, pero tiene poco o ningún efecto tóxico en el host. toxicidad selectiva se consigue más fácilmente en el tratamiento de enfermedad bacteriana, debido a las diferencias estructurales y funcionales entre células bacterianas procariotas y el anfitrión,

células animales eucariotas. Las principales diferencias son la ausencia de las paredes celulares en células animales; el tamaño de sus ribosomas, a excepción de los ribosomas mitocondriales; y los detalles específicos del metabolismo. agentes antimicrobianos químicos son de origen sintético, mientras que los antibióticos son a menudo definidos como "compuestos de bajo peso molecular orgánicos, producidos por microorganismos, que matan o inhiben otros microorganismos. Sin em- er, una definición más amplia de un antibiótico incluye productos químicos naturales de cualquier tipo de célula que matan o inhiben el crecimiento de otras células. Algunos antibióticos pueden ahora ser completamente sintetizados químicamente o antibióticos naturales pueden ser modificados químicamente para mejorar sus propiedades (véase el Capítulo 11).

Los productos químicos sintéticos utilizados en quimioterapia antimicrobiana

Muchos agentes quimioterapéuticos sintéticos son inhibidores competitivos, a menudo referida como antimetabolitos, y pueden ser bacteriostáticos o bactericidas. La mayoría son análogos del factor de crecimiento '', que son estructuralmente similares a un factor de crecimiento microbiano, pero no puede cumplir su función metabólica. Algunos son análogos de bases de purina y pirimidina que se incorporan a los ácidos nucleicos, pero no son capaces de formar pares de bases funcionales. En consecuencia, los procesos de replicación y transcripción se interrumpen. Las sulfonamidas fueron los primeros compuestos que se encuentran para suprimir las infecciones bacterianas selectivamente. Inhiben la síntesis del ácido tetrahidrofólico (THF), que es esencial para las reacciones de transferencia de un carbono. El ácido fólico también funciona como una coenzima para la síntesis de bases de purina y pirimidina de ácidos nucleicos. Sulfonamidas son estructuralmente similar al ácido paraaminobenzoico (PABA) o sus derivados, que sirven como sustratos para enzimas en la ruta THF. Ellos inhiben competitivamente la síntesis de ácido fólico, lo que detiene el crecimiento microbiano. La selectividad se proporciona como células animales no

sintetizan su propio ácido fólico: deben obtener el vitamina preformada de su dieta. Las quinolonas, tales como ácido nalidíxico, son agentes quimioterapéuticos sintéticos que son bactericidas, matando bacterias principalmente Gram-negativos. Se unen a, y HiBit ción, la ADN girasa (topoisomerasa). Esta enzima es esencial durante la replicación del ADN, ya que permite percoils ADN su- estar relajado y re-formado.

ANTIBIÓTICOS

En la actualidad, la mayoría clínicamente útiles son los antibióticos pro-

producida por los microorganismos y se usan para tratar infecciones bacterianas. Los antibióticos pueden tener efectos bactericidas o estática en una amplia gama de microorganismos. Están clasificados atendiendo a su rango de efectividad y el grupo en general microbianos que actúan en contra, es decir, antibacterianos, antifúngicos o antiprotozario. La gama de bacterias u otros microorganismos afectados por un antibiótico específico se expresa como su espectro de acción. Los antibióticos eficaces contra una amplia gama de bacterias negativas Gram-positivas y Gram-se dice que son de amplio espectro. Si son predominantemente eficaz contra las bacterias Gram-positivas o Gram-negativas, son espectro estrecho; y antibióticos de espectro limitado son eficaces contra un único organismo o enfermedad. Los antibióticos son compuestos de bajo peso molecular que se producen como metabolitos secundarios por sobre todo los microorganismos del suelo. Son moléculas no proteicas, aunque hay algunos antibióticos peptídicos. La mayoría de los microorganismos productores de esporas forman una u otra célula mant dor-. Además, no se piensa que es una relación, además de temporal, entre la producción de antibióticos y los procesos de esporulación (véase el capítulo 3, el metabolismo secundario). Entre los hongos filamentosos, los productores de antibióticos son notables Penicillium y Cephalosporium (Acremonium), que son la principal fuente de blacantibióticos TAM, por ejemplo, la penicilina y compuestos relacionados. Dentro de las bacterias,

los actinomicetos filamentosos, especialmente muchas especies de Streptomyces, producen una variedad de antibióticos, incluyendo aminoglucósidos, macrólidos y tetraciclinas. formación de endosporas de Bacillus y especies parientes producen antibióticos polipeptídicos, tales como la polimixina y bacitracina. Los antibióticos presentan cuatro modos primarios de acción. La inhibición de la síntesis de la pared celular Inhibidores de la síntesis de la pared celular bacteriana / envolvente general se dirigen a algún paso en la formación de PEP-tidoglycan. Los antibióticos b-lactámicos, penicilinas y cefalosporinas, son los ejemplos más conocidos. La penicilina fue el primer antibiótico a ser descubierto y utilizado terapéuticamente. penicilinas naturales, como la penicilina G (Fig. 2.8) o penicilina V, se producen comercialmente mediante la fermentación de Penicillium chrysogenum (véase el Capítulo 11). La mayoría de las penicilinas son derivados del ácido 6-LANIC aminopenicil- y como todos los antibióticos blactámicos contienen un anillo de lactama b-, que es esencial para la actividad. Las cadenas laterales unidas pueden proporcionar otras características, inresistencia a la degradación enzimática INCLUYENDO y el mecanismo de penetración de la pared celular. La penicilina G y V

acilo sustituyente

CH2

CO

6-aminopenicilánico ácido S CH3 CH do NH CH C O CH3 norte do MARIDO

Higo. 2.8La estructura de la penicilina G.

se considera que son de espectro estrecho, ya que no son efectivas contra bacilos Gramnegativos. Además, la penicilina G es inestable en condiciones ácidas, por lo tanto, la administración oral es ineficaz debido a que el pH bajo en el estómago. En un esfuerzo por superar estas deficiencias, formas téticos semisyn- se desarrollaron con propiedades mejoradas sobre las penicilinas naturales. La porción principal de la molécula, el ácido 6-aminopenicilánico, es producido por la fermentación y luego se modifica químicamente por la adición de diversas cadenas laterales (véase el capítulo 11). La mejora de las propiedades exhibidas por estas penicilinas semisintéticas incluyen resistencia a la penicilinasa, la idoneidad para la administración oral y una mayor espectro de actividad, por ejemplo, la Eficacia contra bacilos Gram-negativos. Las penicilinas inhibir la síntesis de peptidoglicano y no tienen efecto en las paredes celulares establecidas. En consecuencia, son bactericida a las células en crecimiento activo, que a través de la acción de la penicilina se vuelven sensibles al estrés osmótico. peptidoglicano de la pared celular se realiza en tres etapas (véase el capítulo 3). La tercera etapa implica dases carboxypeptiy transpeptidases en las cadenas laterales finales de reticulación BE- peptídicos tween, para formar una matriz rígida. Las penicilinas tienen un parecido estructural con el fin dresiduos alanil-D-alanina de los pequeños péptidos implicados en los peptidoglicano enlaces cruzados. Por lo tanto, las penicilinas AP- pera para actuar como análogos de sustrato. Ellos covalentemente unen a transpeptidasa a través del anillo b-lactama y prevenir funcionamiento Ther fur- de la enzima. Como resultado, una pared celular que contiene este peptidoglicano libremente formado es mucho más débil y la célula se

COOH

anillo de tiazolidina

anillo de lactama

somete a lisis. Además, las penicilinas pueden inducir ciertos eventos autolíticos. Las cefalosporinas son producidos por especies de cefalosporinas sporium (Acremonium) y son antibióticos b-lactámicos con esencialmente el mismo modo de acción que las penicilinas. Tienen una baja toxicidad y un espectro más amplio que las penicilinas naturales, y son particularmente útiles para los pacientes alérgicos a las penicilinas. La vancomicina, un producto de Streptomyces orientalis, se ha convertido en un antibiótico clínicamente importante, ya que la aparición de cepas resistentes a la meticilina de Staphylococcus

aureus (MRSA). Es también inhibe la síntesis de peptidoglicano, pero lo hace por la unión al grupo de alanina D-alanil-D-en la cadena lateral de las unidades de sub-ácidopentapéptido murámico N-acetil glucosamina-N-acetilo, inhibiendo su incorporación a nueva peptido- glicano (véase el capítulo 3). Bacitracina, un antibiótico péptido producido por especies de Bacillus, también evita peptidogly- puede síntesis. Actúa mediante la inhibición de la liberación de las subunidades de glicano peptido- de la molécula de lípido-soporte que los transporta a través de la membrana citoplasmática. Teicoicos la síntesis de ácidos, que requiere el mismo soporte, también se inhibe. Bacitracin tiene una alta toxicidad y se utiliza principalmente para tratamientos tópicos (externos), en lugar de para las aplicaciones sistémicas. inhibidores de la membrana de la célula En las bacterias, la integridad de la membrana citoplasmática es de vital importancia tanto para el transporte de nutrientes y la generación de energía. membranas externas de las bacterias Gramnegativas también tienen un papel protector.

Cualquier agentes que interrumpen estas membranas matan a las células microbianas. Sin embargo, al eubacteri- y las membranas eucariotas tienen estructuras y componentes similares. Por lo tanto, los compuestos antimicrobianos con este modo de acción rara vez son lo suficientemente específicas para permitir su uso sistémico. Polimixina es el único antibiótico antibacteriano membrana de metas de importancia clínica. Actúa mediante la unión a la membrana fosfolípidos para interferir con la función de la membrana. Este ótica bióticos es principalmente eficaz contra las bacterias Gram-negativas, pero normalmente se limita a uso tópico debido a dañinos efectos secundarios. Las infecciones por hongos son generalmente mucho más difícil de tratar que las enfermedades bacterianas. La similitud entre los hongos y huésped animal (ambos son eucariota) limita la capacidad de un fármaco para tener un punto selectiva de ataque. Sin embargo, un objetivo potencial es ergosterol, un componente de las membranas celulares de los hongos, que se sustituye por el colesterol en eucariotas superiores. antibióticos macrólidos poliénicos, tales como la nistatina, y los azoles sintéticos, utilizar esta

diferencia. Los azoles inhiben la biosíntesis de ergosterol, mientras que la nistatina se une a ergosteroles para desestabilizar la membrana fúngica. inhibidores de la síntesis de proteínas La síntesis de proteínas es un proceso complejo que implica la transcripción del ADN a ARNm, que se traduce a continuación para formar polipéptidos (montaje lineal de aminoácidos) a través de la interacción con los ribosomas y ARN de transferencia (t) (véase el capítulo 3). Esto proporciona una serie de objetivos específi- cos para diferentes grupos de antibióticos. Varios tibiotics an- dirigen a la etapa de traducción en los que su ataque es invariablemente en el ribosoma, en lugar de la etapa de activación de aminoácidos o de su adhesión a tRNAs. En cuanto a la toxicidad selectiva, es una suerte que hay una diferencia importante entre la estructura mal riboso- procariotas como eucariotas. Aparte de algunos ribosomas organellar, los ribosomas eucariotas son 80 S, que consiste en un 60 S y una subunidad 40 S (nota: las unidades Svedberg no son aditivos); mientras que procariótico 70 S ribosomas están compuestos de un 50 S y una subunidad 30 S. Esta diferencia explica la toxicidad selectiva de varios antibióticos que se dirigen a estas alturas de la síntesis de proteínas. La mayoría tienen una afinidad o especificidad para 70 S, en lugar de 80 S, los ribosomas. Sin embargo, como las mitocondrias de las células eucariotas contienen 70 S ribosomas, muy similares a las de las bacterias, los antibióticos de orientación 70 S ribosomas pueden tener efectos adversos en las células huésped. antibióticos importantes con este modo de acción incluyen aminoglucósidos, macrólidos y líneas tetracyc-. Los aminoglucósidos, en particular estreptomicina, kanamicina, tobramicina y gentamicina, son productos de la especie de Streptomyces. Se unen a los ribosomas bacterianos y prevenir la iniciación de la síntesis de proteínas. Macrólidos, como la eritromicina y oleandomicina, contienen grandes anillos de lactona vinculados con aminoácidos a través de enlaces glicósido. Se unen a la bacteriana 50 S ribosomal subunidad, que interfiere con 'alargamiento' de la proteína por peptidil transferasa o impide translocación del ribosoma.

Las tetraciclinas son también productos de Streptomyces, aunque algunos derivados semisintéticos son ahora producido. Ellos incluyen tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina y doxiciclina, que son antibióticos de amplio espectro, activo contra bacterias tanto Gram-positivas y Gramnegativas. Estos compuestos bloquean la unión de la aminoacil-tRNA al sitio A del ribosoma. Las tetraciclinas inhiben la síntesis de proteínas por ambas aisladas 70 S y 80 S ribosomas. Sin embargo, a pesar de

esta acción general aparente, que presentará una muy baja toxicidad en animales. Esto es porque la mayoría de las bacterias poseen un sistema de transporte activo para la tetraciclina que resulta en la acumulación intracelular del antibiótico a concentraciones de 50 veces mayor que en el medio externo. Como consecuencia, un nivel en sangre de tetraciclina que es inocuo para los tejidos animales, ya que no se acumulan los niveles de inhibidores, se puede evitar la síntesis de proteínas en bacterias ING invad-.

Novobiocina, como las quinolonas (ver pág. 42), es un inhibidor de la ADN girasa. Este antibiótico es producido por Streptomyces niveus y tiene algunas aplicaciones clínicas. Sin embargo, se emplea generalmente como una droga de reserva, cuando otros antibióticos han fallado para curar una infección.

Otras lecturas Papeles y comentarios

Efectos sobre los ácidos nucleicos Varios antibióticos pueden bloquear el crecimiento de las células por interfiriendo con la síntesis de ADN o ARN. Sin embargo, la mayoría no tienen uso terapéutico porque son colectiva unse-, que afecta tanto a las células microbianas y células animales. Un grupo que hace la selectividad exponer son los mycins rifa- de especies de Streptomyces. La más conocida es la rifampicina, un derivado semisintético de la micina rifa-. Es relativamente específica hacia ADN bacteriana ARN polimerasa dependiente, que no presenta efecto sobre la RNA polimerasa a partir de células animales o de la polimerasa de ADN poli-. bloquea la síntesis de mRNA Rifampicina mediante la unión a la subunidad B de la polimerasa. Esto parece bloquear la entrada de la primera de nucleótidos, que es necesaria para activar la enzima.

Adams, MWW (1993) Enzimas y proteínas de los organismos del que crecen cerca y por encima de 100∞C. Revisión Anual de Microbiología 47, 627-658. Battista, JR (1997) Contra todo pronóstico: las estrategias de supervivencia de Deinococcus radiodurans. Revisión Anual de Microbiología 51, 203-224. Debono, M. & Gordee, RS (1994) Los antibióticos que inhiben el desarrollo de la pared celular fúngica. Annual Review of microbiólogos Gy 48, 471-497. Kreft, J.-U., Booth, G. & Wimpenny, JWT (1998) BacSim, una Simulador para el modelado de base individual del crecimiento de colonias bacterianas. Microbiología 144, 3275-3287. Madigan, MT y Marrs, BL (1997) Los extremófilos. científico estadounidense 276, 82-87. Morris, JG (1994) bacterias anaerobias obligatoriamente en biotecnología

logía. Bioquímica y Biotecnología Aplicada 48, 75-106. Prosser, JL y difíciles, AJ (1991) y los mecanismos de crecimiento cinética de crecimiento de los microorganismos filamentosos. Critical Reviews in Biotechnology 10, 253-274. Scheper, T.-H. Y Lammers, F. (1994) el seguimiento y control del proceso de fermentación. Current Opinion in Biotechnology 5, 187-191. Setlow, P. (1994) Los mecanismos que contribuyen a la supervivencia a largo plazo de las esporas. Journal of Applied BacteriologíaSuplemento 76, 49S-61S. Welch, WJ (1993) ¿Cómo responden las células al estrés. Scientific American 268, 56-64. Wimpenny, JWT y Colasanti, R. (1997) Una hipóunificador ESIS para la estructura de las biopelículas microbianas basados en modelos autómata celular. FEMS Microbiology Ecology 22, 116. Yayanos, AA (1995) Microbiología de 10 a 500 metros en el fondo del mar. Revisión Anual de Microbiología 49, 777-805.

Libros Berry, DR (ed.) (1988) Fisiología de Hongos Industriales. Blackwell Scientific Publications, Oxford.

Dawes, IW y Sutherland, IW (1992) Microbiana Physio-logía, 2ª edición. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Dickinson, JR y Schweizer, M. (eds) (1998) El Metabolismo y Fisiología Molecular de Saccharomyces cerevisiae. Taylor & Francis, Londres. Griffin, DH (1994) Fungal Physiology, 2ª edición. Wiley, New York. Isaac, S. & Jennings, D. (1995) Cultura microbiana. BIOS tíficos cien- Publishers, Oxford. Jennings, DM (1995) La Fisiología de la Nutrición por hongos. Cambridge University Press, Cambridge. Foso, AG & Foster, JW (1995) Fisiología Microbiana, 3ª edición. John Wiley, New York. PIRT, SJ (1975) Los Principios de Microbio y período de cultivo celular. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Russell, AD, Hugo, WB & Ayliffe, GAJ (1992) los principios y práctica de la Desinfección, Conservación y la esterilización, 2ª edición. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Wainwright, M. (1990) Curación milagrosa: La historia de Antibióticos. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Walker, GM (1998) Fisiología y Biotecnología de la levadura. Wiley, Chichester.

3

El metabolismo microbiano

Metabolismo abarca todas las reacciones catalizadas por enzimas de una celda, y se puede dividir en los procesos primarios y secundarios. rutas metabólicas primarias son en gran medida comunes a la mayoría de los organismos. Implican tanto el metabolismo de generación de energía, que se refiere lismo como catabo-, y el anabolismo, que utiliza esta energía en la biosíntesis de los componentes celulares para el crecimiento y mantenimiento. El catabolismo y el anabolismo son considerábamos separado por conveniencia, pero son altamente procesos de trabajo integrados. Artículos de metabolismo primario que son de particular importancia industrial incluyen alcoholes, aminoácidos, ácidos orgánicos, nucleótidos, enzimas y células microbianas (biomasa). Algunos microorganismos también realizan el metabolismo secundario, que implica las vías que no se utilizan durante el crecimiento rápido. metabolismo secundario produce diversos, a menudo los productos finales específicos de la especie; los muchos metabolitos secundarios industrialmente importantes incluyen alcaloides, antibióticos, toxinas y algunos pigmentos. Ciertos metabolitos secundarios pueden conferir una ventaja ecológica, mientras que otros no tienen un valor evidente para el organismo productor.

El catabolismo Todas las células microbianas vegetativas requieren un suministro continuo de energía para los procesos asociados con el crecimiento, el transporte, el movimiento y mantenimiento. En los microorganismos heterotróficos quimio-, las fuentes de energía orgánicos se adquieren desde el medio ambiente y luego transformados por una serie ordenada de reacciones enzimáticas

controlado dentro de las vías metabólicas específicas. Este metabolismo descomposición (catabolismo) conduce a la genera- ción de energía potencial en forma de adenosina 5 ¢ trifosfato (ATP) y coenzimas reducidas, tales como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), fosfato de nicoti- namide adenina dinucleótido (NADPH) y dinucleótido de flavina adenina (FADH2), y el calor. microorganismos tienen una muy amplia diversidad de metabolismo para la generación de ATP y coenzimas reducidas, que

46

en muchos casos también proporciona precursores para la biosíntesis de los componentes celulares (ver pág. 54, anabolismo). La mayoría de los microorganismos pueden utilizar hidratos de carbono, que pueden actuar como fuentes de carbono y energía. La hexosa, de seis carbonos (C6) el azúcar, la glucosa es el sustrato preferido para un gran número de microorganismos y hay muy pocos organismos que no pueden utilizarlo. En la naturaleza, la glucosa libre no está normalmente disponible, pero se puede obtener a través de varias rutas. Se puede derivar de la interconversión de otros hexosas, la hidrólisis de los disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos del medio ambiente, o a partir de materiales de almacenamiento de células, tales como almidón, glucógeno y trehalosa. Generación de energía de la glucosa es precedida por su fosforilación, seguida inicialmente por oxidación a través de la mayoría de piruvato (C3). Metabolismo de la glucosa en piruvato, la glucólisis en general denominado, ofrece ATP, precursores y poder reductor (principalmente NADH). Sin embargo, sólo una cantidad limitada de ATP que se produce, que se forma a través de la

fosforilación a nivel de sustrato. Un máximo de dos moléculas de ATP se genera para cada unidad de glucosa oxidada a este punto. piruvato resultanteocupa una posición central en el metabolismo intermediario y es el punto de partida para una mayor catabolismo. Las diversas rutas a este intermedio clave operados por diferentes organismos incluyen los siguientes. 1 La ruta de Embden-Meyerhof Parnas-(EMP), que es la ruta más común y se encuentra en todos los principales grupos de organismos, incluyendo hongos filamentosos, levaduras y muchas bacterias (Fig. 3.1). Esta vía puede operar bajo condiciones anaeróbicas o aeróbicas condiciones y se compone de una secuencia de 10 reacciones catalizadas por enzimas situadas dentro de la matriz citoplasmática. Las tres enzimas reguladoras clave de la vía (hexoquinasa, phofructokinase fosfato y piruvato quinasa) actúan de forma irreversible (Fig. 3.1). Todos los demás pasos son libremente reversible, que es importante para el papel de la vía de biosíntesis durante la síntesis de glucosa (gluconeogénesis, ver p. 55). Los pasos irreversibles tienen bypasses para permitir la manera Path- para operar en este modo anabólico.

El metabolismo microbiano

La glucosa (C6) ATP

muchos procariotas

fosforilar usando fosfoenol piruvato durante la absorción de azúcar

hexoquinasa * ADP

Glucosa-6-fosfato (C6)

fosfofructoquinasa *

ADP Fructosa 1,6-bifosfato (C6) aldolasa Dihidroxiacetona + gliceraldehído

fosfato (C3)

3-fosfato (C3)

isomerasa

2 x gliceraldehído 3-fosfato (C3)

2Pyo

para cada molécula de glucosa oxidada a dos moléculas de piruvato, la ganancia neta es sólo dos ATP, debido a su el consumo en las reacciones anteriores. La glucosa (C6) + 2ADP + 2 + Pi + Æ 2NAD 2 piruvato (C3) + 2ATP + 2NADH + 2H +

La fructosa 6-fosfato (C6) ATP

4 7

2 NAD 2 NADH + 2 H+

2 x 1,3-difosfoglicerato (C3) 2 ADP

A nivel de

substrato 2 ATP

fosforilación

2 x 3-fosfoglicerato (C3)

2 x 2-fosfoglicerato (C3) 2H2O 2 x fosfoenolpiruvato (C3)

2 ADP 2 ATP 2 x piruvato (C3)

piruvato quinasa * Fosforilación a nivel de sustrato

Higo. 3.1ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (* medidas irreversibles).

2 La vía o monofosfato de hexosa vía del fosfato de pentosa (PP) se encuentra en muchas bacterias y la mayoría de los organismos eucariotas (Fig. 3.2). Esta vía a menudo funciona al mismo tiempo como la vía EMP. En las levaduras, por ejemplo, 10 a 20% de glucosa (más durante el crecimiento rápido) se degrada a través de la vía de PP, y el resto es catabolizado a través de la EMP camino. Las funciones de la vía PP bajo aeróbico o condiciones anaeróbicas, y tiene tanto catabólico y analógicas papeles metabólicos. Esta vía es importante en la provisión de NADPH, principalmente para el uso en los pasos reductoras en anaprocesos metabólicos; intermedios para los aminoácidos aromáticos síntesis, en particular eritrosa-4-fosfato; toses pensiones, especialmente ribosa para la biosíntesis de ácidos nucleicos; y otros intermedios biosintéticos. azúcares de pentosa tales como xilosa también pueden ser catabolizados por esta vía. La vía de PP es cíclico y como todas estas vías glucolíticas, sus enzimas se encuentran en la matriz citoplasmática. Se inicia con la oxidación en dos etapas de la glucosa 6-fosfato (G6P) a la pentosa fosfato (C5), ribuperder 5-fosfato (grupa), a través de 6fosfogluconato. Esto implica la pérdida de un átomo de carbono en forma de CO2 y la formación de dos NADPH. Después de esta oxidativo fase, Rump se somete a reordenación en una serie de De dos carbonos y de tres carbonos intercambios de fragmentos, catalizada por las enzimas clave transcetolasa y dolase transal-. Por cada tres unidades de glucosa procesados, uno GAP, seis NADPH y dos fructosa 6-fosfato (F6P) Las primeras etapas de degradación de la glucosa realmente consumen dos moléculas de

4

Capítulo

se generan moléculas. moléculas F6P se ATP 8 en3 la formación de tres etapas de la convierten de nuevo a G6P para mantener el fructosa 1,6-bisfosfato. Esta molécula se funcionamiento del ciclo. El GAP puede estar escinde a continuación, a través de la acción oxidado a piruvato por enzimas de la ruta de aldolasa para formar dos fosfatos EMP o también puede ser devuelto al inicio de diferentes triosa (C3), gliceraldehído 3-fosfato la vía a través de la conversión de dos a uno (GAP) y dihidroxiacetona fosfato (DAP). Sólo GAP G6P. GAP se procesa directamente en esta vía y DAP debe isomeriza a GAP antes de que 3 glucosa 6-fosfato (C6) + + + 3H2O 6NADP Æ pueda ser utilizado. La oxidación de la 2 fructosa 6-fosfato (C6) + resultante de dos moléculas de piruvato a gliceraldehído 3-fosfato (C3) + 3CO2 + 6NADPH + 6H + GAP genera energía en la forma de cuatro moléculas de ATP a través de dos reacciones 3 La ruta Entner-Doudoroff (ED) (Fig. 3.3) es utilizado por un número relativamente de fosforilación a nivel de sustrato. Sin reducido de microorganismos que carecen de embargo, la vía EMP. La mayoría son bacterias Gramnegativas, incluyendo especies de Azotobacter, Pseudomonas, zobium rizomas, Xanthomonas y Zymomonas, pero es poco común en los hongos. La vía comienza con la formación de 6-fosfogluconato, como en la vía de PP. De todos modos, eso

3NADP+ 3 glucosa-6-P (C6)

3NADPH + 3H+ 3NADP+ 3 6-fosfogluconato (C6)

3H2O3CO

3NADPH + 3H+ 3 ribulosa-5- P (C5)

2

La ribosa-5- P (C5) Xilulosa-5- P

(DO5)

transcetolasa Gliceraldehído-3- P (C3) Sedoheptulosa-7- P (DO7) transaldolasa La fructosa-6-P (C6)

Eritrosa-4-P (C4)

Xilulosa-5- P (C5)

transcetolasa La fructosa-6-P (C6) Gliceraldehído-3- P (C3) PAG

(B) Fructosa-1,6-bis-P (C6)

La fructosa-6-P (C6)

o (un) piruvato (DO3)

Glucosa ATP ADP La glucosa 6-fosfato NADP+ NADPH + H+ 6-fosfogluconato MARIDO2O 2-oxo-3-desoxi-6-fosfogluconato (ODPG)

piruvato

aldolasa ODPG Gliceraldehído 3-fosfato NAD+ NADH + H+ ADP ATP

ADP

Como en la sección inferior de la vía de EMP

Higo. 3.2La vía de las pentosas fosfato.

ATP piruvato

Higo. 3.3La ruta Entner-Doudoroff.

es entonces deshidratado, en lugar de oxidado, para formar 2-oxo- 3-desoxi-6fosfogluconato. Esta molécula de seis carbonos se escinde por una aldolasa para formar dos compuestos C3, piruvato y GAP, y este último también se puede convertir en piruvato. En general, a partir de cada molécula de glucosa metabolizada, la vía puede generar dos moléculas de piruvato, un ATP, una NADH y NADPH uno, que es un rendimiento energético más bajo que para la vía de EMP. 4 La vía fosfocetolasa (PK) o vía WarburgDickens (Fig. 3.4) es operado por algunas bacterias del ácido láctico, en particular especies de Lactobacillus y Leu conostoc. Se trata de la oxidación y descarboxilación de la glucosa-6-fosfato a la rabadilla, como en el PP vía. Rump se isomeriza en xilulosa 5-fosfato (C5) Y luego cortada por una fosfocetolasa a las BPA (C3) Y fosfato de acetilo (C 2). El primero es en última instancia, ed convertidor de a lactato y el segundo a etanol (ver heteroláctica fermentación p. 52). Esta vía solo produce la mitad de la producción de ATP en comparación con la vía de EMP.

re-glucosa

ADP P

NAD+ NADH + H+ 6-fosfogluconato NAD+

CO2

En muchas bacterias, levaduras, hongos filamentosos, algas y protozoos, más catabolismo del piruvato bajo condiciones aeróbicas implica su dirección en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) (Fig. 3.5). enzimas del ciclo TCA se CATed lo- dentro de la matriz mitocondrial en eucariotas, mientras que en procariotas son citoplasmática. El paso inmediatamente antes del ciclo consiste en la carboxilación de- oxidativa del piruvato para formar la unidad C2 acetil coenzima A (acetil CoA), catalizada por el complejo multienzimático, piruvato deshidrogenasa. La acetil CoA se puede formar también a través de degradación de los lípidos y algunos aminoácidos, y de la oxidación de alcanos, que ciertos microorganismos pueden utilizar. Piruvato (C3) + NAD + + CoA Æ acetil CoA (C2) + CO2 + NADH + H +

formada indirectamente por una fosforilación a nivel de sustrato.

NADPH + H+

Ribulosa-5- P

El ciclo del ácido tricarboxílico

El ciclo comience el apropiadas con la condensación de este compuesto de dos carbonos con oxaloacetato (C4) para formar citrato (C6). Durante los siguientes ocho pasos del ciclo TCA completa, el fragmento de dos carbonos se oxida a dos moléculas de CO2 y oxaloacetato se regenera para aceptar una unidad de dos carbonos más. Tres reacciones dentro del resultado del ciclo en la formación de NADH y FADH2 uno genera, y una única molécula de ATP es

ATP

re-glucosa-6-

Sin embargo, no se permite la formación de pentosa de los azúcares de hexosa para la síntesis de ácido nucleico y el catabolismo de las pentosas.

H 2

Xilulosa-5- P

A fosfocetolasa T

+ Pyo

P

acetil-P CoA

2 re-glyceraldehyde-3PPyo NAD+

NADH + H+ 2ADP

O

PAGyo La acetil CoA NADH + H+

rendimiento neto es el siguiente: acetil CoA (C2) + + + 3NAD FAD + ADP Æ 2CO2 + 3NADH + 3H + + + FADH2 ATP piruvato NADH + H+ NAD+

En términos de catabolismo, el ciclo TCA completa la oxidación de piruvato en CO2, y reduce de electrones NAD+

CoA

El acetaldehído NADH +

lactato

H+ NAD+ Etanol

Higo. 3.4 La vía de fosfocetolasa.

portadores car- para producir NADH y FADH2. Estas coenzimas reducidas pueden utilizarse entonces para una mayor síntesis de ATP en la respiración (ver pág. 50), y esto es importante, por lo tanto sonreoxidado a participar en catabolismo adicional. El ciclo de TCA no es sólo una vía catabólica, pero también proporciona intermedios, compuestos C4 y C5, para la biosíntesis de aminoácidos, purinas y pyrimidines. En condiciones anaeróbicas no funciona como un ciclo. Sin embargo, como varios productos intermedios todavía son necesarios para la biosíntesis, funciona como una ruta biosintética ramificado. Esta facilidad para producir productos intermedios téticas biosyntambién está presente en otros microorganismos ismos que carecen de un ciclo TCA completa.

piruvato (do3) CoA NAD+ NADH + H+ CO2 La acetil CoA (C2) Oxaloacetato (C4)

Citrato de (C6)

NADH +

MARIDO2O

H+ NAD+ Cis-aconitato (C6)

Malato (C4)

MAR IDO2 O

MARIDO2O

Isocitrato (C6)

Fumarato de (C4)

NAD+ NADH + H+

FA DH2 MODA

CO2 Oxoglutarato (C5)

Succinato de (C4)

NAD CoASH GTP PIB ADP

Succinil-CoA (C4)

CoASH+ + CO2 NADH + H

ATP

Respiración Toda la formación de ATP a partir de la oxidación de glucosa ha, hasta este punto, ha formado a través de la fosforilación a nivel de sustrato. La respiración conduce a la generación de más ATP de la oxidación de NADH y FADH2. Se requiere oxígeno o, como en algunos procariotas anaerobias facultativas y obligados, otro compuesto o ion que tiene un bajo potencial redox, para actuar como el aceptor terminal de electrones. El oxígeno es ideal para esto, ya que tiene un bajo potencial redox y se reduce al agua, mientras que algunos de los productos finales

Higo. 3.5 El ciclo del ácido tricarboxílico.

de la respiración anaerobia son tóxicos, por ejemplo, nitrato reduce a nitrito. Con el fin de transferir electrones y protones (H +) de oxígeno o un aceptor final de electrones alternativo, una serie especial de transportadores de electrones intermedios, que constituyen el sistema de transporte de electrones (ETS), que se requiere. Los eucariotas tienen su ETS localizada en la membrana interna mitocondrial, mientras que en los procariotas está obligada dentro de

la membrana citoplasmática. La serie de reacciones involucradas se puede acoplar a procesos que requieren energía, tales como el transporte de solutos, o para la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Los electrones derivados de la oxidación de sustratos se transmiten de NADH o FADH2, a través de una serie de redox o reducción-oxidación reacciones, a la terminal aceptor (Fig. 3.6). En este proceso, la energía liberada durante el flujo de electrones se utiliza para crear un gradiente de protones a través de una membrana. Este gradiente de protones se utiliza

para conducir la generación de ATP por un mecanismo de fosforilación oxidativa quimiosmótica. La hipótesis quimiosmótica propuesta por Mitchell (1961) explica el proceso de la siguiente manera: como los electrones fluyen a través del sistema de transporte, los protones (H +) se mueven desde el interior al lado de fuera de la membrana (excreción). Debido a que la membrana es esencialmente impermeable a los protones no pueden pasar de nuevo y se establece un gradiente de protones. Como cargas positivas se eliminan desde el interior de la membrana,

AH2 (Donante de electrones inicial, por ejemplo NADH) AH2 NADP + nPyo NATP

1 / 2O2 la

-

NO3 mi- fluir

ASI QUE4 o MARIDO2O

carga negativa se mantiene dentro de, sobre todo en la forma de iones de hidróxido (OH-). En consecuencia, el pH inme- diatamente fuera de la membrana puede llegar a 5,5, mientras que en su interior se aproxima a 8,5. Esto representa potencial energía almacenada como un gradiente de protones o fuerza protón-motriz, que impulsa la síntesis de ATP a través de la fosforilación quimiosmótica, mediada por la ATP sintasa (ADP + Pi Æ ATP). Una molécula de NADH contiene aproximadamente 218 kJ de energía potencial y se tarda aproximadamente 30 kJ para generar una molécula de ATP. Por lo tanto, un máximo de siete moléculas de ATP podría, en teoría, ser generada por el NADH si la conversión de energía fuera del 100% de eficiencia. Sin embargo, estos sistemas son sólo hasta 40% de eficiencia y, en consecuencia producen un máximo de sólo tres moléculas de ATP por NADH. Respiración aeróbica se realiza por aerobios estrictos y anaerobios facultativos en presencia de oxígeno. electrones entran en la ETS de los transportistas, en particular NADH o FADH2. Cuando estas compañías donan sus electrones se reoxidan para permitir su posterior participación en el metabolismo. Los electrones se pasan luego a través de una serie de portadores dentro de la membrana, mientras que los protones se mueven desde

aerobio

CO2

o

NO- 2

NO 2 y N

Higo. 3.6La respiración aeróbica y anaeróbica.

2-

MARIDO2S

2

CH4

anaeróbica

el interior al exterior de la membrana, como se ha descrito anteriormente. Los protones en última instancia, se adhieren al oxígeno, el agua formando. En eucariotas, el ETS dentro de la membrana interna de la mitocondria genera tres moléculas de ATP por NADH, y se compone de la siguiente cadena de transportadores de electrones: NADH Æ Æ flavoproteına proteínas hierroazufre Æ Æ quinona citocromo b Æ Æ citocromo c citocromo a Æ Æ citocromo a3 oxígeno

En procariotas la ETS dentro de la membrana citoplásmica tiene algo diferentes portadores, con cadenas incompletas a menudo más cortos que generan sólo una o dos moléculas de ATP por NADH. Los citocromos que participan incluyen: b558, b595, B562, d, y o. Ciertos anaerobios facultativos, tales como Escherichia coli, tienen al menos dos sistemas respiratorios de terminales, cada uno con una afinidad diferente por el oxígeno. En consecuencia, pueden adaptarse a las diferentes concentraciones de oxígeno, sin dejar de utilizar el oxígeno como aceptor terminal de electrones, incluso a niveles bajos de oxígeno. Algunas bacterias que son anaerobios facultativos o anaerobios obliga- comieron realizan la respiración anaerobia. Esto implica actividad de una ETS similar, pero tiene aceptores terminales de electrones distintos al oxígeno. Ejemplos de respiración anaeróbica incluyen los siguientes.

1 la respiración de nitrato, Que se lleva a cabo por las bacterias anaerobias facultativas. El potencial redox de nitrato es +0.42 Voltios, en comparación con +0.82 voltios para el oxígeno. En consecuencia, menos energía se obtiene que con oxígeno como aceptor terminal de electrones y un menor número de moléculas de ATP se pueden formar. El proceso puede tener varios pasos, donde el nitrato se reduce a través de nitrito y óxido nitroso en última instancia a dinitrógeno, que se conoce como reducción de nitrato dissimi- reglamen- o desnitrificación. Desnitrificadores incluyen especies de Pseudomonas, latas Paracoccus desnitrificación y Thiobacillus denitrificans. Otros anaerobios facultativos, incluyendo E. coli y familiares, más que reducir el nitrato a nitrito, y la enzima responsable, re reductasa de nitrato, se reprime en presencia de oxígeno. 2 sulfato de respiración es practicada por un pequeño grupo de bacterias heterotróficas, que son todos los anaerobios obligados, por ejemplo, especies Desulfovibrio. su principal

producto es el sulfuro de hidrógeno, formado a través de varios productos intermedios. 3 carbonato de respiración se lleva a cabo por los archaea como Methanococcus y Methanobacterium. Ellos son anaerobios estrictos que reducen el CO2, y alguien monóxido de carbono veces, a metano. Estas bacterias methano- génicas suelen utilizar hidrógeno como su fuente de energía y se encuentran en ambientes anóxicos con bajo contenido de nitrato y sulfato, por ejemplo, el intestino de algunos animales, pantanos, campos de arroz y digestores de lodos de depuradora. CO2 + 4H2Æ CH4 + 2H2O Además de nitrato, sulfato y dióxido de carbono, el hierro férrico (Fe3 +), manganeso (Mn4 +) y varios compuestos ic zaciones (sulfóxido de dimetilo, fumarato, glicina y óxido de trimetilamina) puede servir como terminal de aceptores de electrones para la respiración anaerobia en ciertas bacterias.

Las fermentaciones Cuando la respiración no es una opción, los organismos deben utilizar un mecanismo alternativo para la regeneración de la oferta limitada de coenzimas, reducido durante la la oxidación de la glucosa a piruvato. Si NAD (P) H no se oxida de nuevo a NAD (P) +, más catabolismo cesará. En consecuencia, un aceptor terminal de electrones adecuada debe encontrarse a tomar los electrones. Fermentaciones utilizan una molécula orgánica, el piruvato o un derivado, ya que esto aceptor de electrones final, regenerando de este modo la NAD (P) + y permitiendo catabolismo para continuar. Esto da lugar a la formación de la reducción de productos residuales '', tales como alcoholes y ácidos, que se excretan a continuación, a partir de la célula (Fig. 3.7). Sin embargo, esto es un gran desperdicio en términos de recuperación de la energía potencial de la glucosa, como poco o no se forma más ATP. A la inversa, completa oxidación a CO2, en conjunción con la fosforilación oxidativa durante la respiración, puede generar un posible otras 36 moléculas de ATP por molécula de glucosa. La fermentación alcohólica se lleva a cabo por las levaduras y ciertos hongos filamentosos y bacterias. Es un proceso de dos etapas,

donde piruvato a partir de la vía de EMP, o por medio de la vía de la disfunción eréctil en el caso de Zymomonas, se descarboxila primero a acetaldehído; NAD + se regenera durante la reducción de acetaldehído a etanol (Fig. 3.7a). fermentaciones de ácido láctico se llevan a cabo por una serie de bacterias, incluyendo Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus y Leuconostoc, junto con algo de hongos, algas y protozoos. Aquí piruvato, en lugar de un derivado

tiva de piruvato, es el aceptor de electrones y las formas de lactato. Hay dos formas de esta fermentación: 1 homoláctica fermentación es operado por bacterias tales como Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus casei, que reducen prácticamente todos piruvato generados por analysis glicol a ácido láctico (Fig 3.7b.); Esto también ocurre en el músculo de los animales privados de oxígeno; y 2 heteroláctica fermentación genera otros productos junto con el ácido láctico (Fig. 3.7c). Los organismos que llevan a cabo se incluyen Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus brevis, que operan la ruta de PK. Forman lactato a partir de piruvato y etanol a partir de fosfato de acetilo, y en algunos casos algo de acetato se pueden producir. la fermentación de ácido mixto se lleva a cabo por E. coli y anaerobios facultativos relacionados. Los productos incluyen lactato, acetato, pequeñas cantidades de etanol y formiato. Algunos organismos tienen la capacidad de reducir aún más el compañero de lucro en hidrógeno y CO2 (Fig. 3.7d). fermentación de 2,3-butanodiol se lleva a cabo por Enterprise obacter, Erwinia, Klebsiella y Serratia. Es similar a la fermentación de ácido mixto, pero genera butanodiol, junto con el etanol y los ácidos (Fig. 3.7e). la fermentación del ácido propiónico se lleva a cabo por varias bacterias intestinales, tales como especies de Propionibacterium, algunos de los cuales están involucrados en la producción comercial de

algunos quesos tipo suizo y vitamina B12 (cobalamina). El propionato se forma a partir de piruvato a través de la vía de malonil CoA metil-, donde se carboxilado piruvato a oxalacetato, y después se redujo a propionato través de malato, fumarato y succinato (Fig. 3.7f). Esto requiere que el cofactores importante, biotina, CoA y CoB12. Butírico fermentación del ácido se lleva a cabo por especies de Clostridium. Estos formadores de esporas anaerobias también acetona pro- duce, butanol, propanol, otros alcoholes y ácidos (Fig. 3,7 g). También fermentan aminoácidos y otros compuestos nitrogenados, así como hidratos de carbono.

El catabolismo de los lípidos y proteínas otras fuentes de carbono que los carbohidratos deben ser procesados antes de que puedan entrar en el catabolismo. Lípidos tales como di- y triglicéridos se hidrolizan por las lipasas pro- ácidos grasos libres Duce y glicerol. Los ácidos grasos pueden entonces ser degradados por la vía b-oxidación. Aquí FAD y NAD + se utilizan para aceptar electrones, y las unidades de dos carbonos se eliminan con éxito, en la forma de acetil CoA, lo que puede alimentar directamente en el ciclo TCA. El glicerol puede ser fosforilada a glicerol fosfato, seguido de su oxidación a DAP y la isomerización

(un)

CO2 +

La fermentación alcohólica piruvato

NAD+

NADH + H+

El acetaldehído NADH + H+ NAD+

(B) fermentación homoláctica

Etanol

lactato

piruvato

(do fermentación CO ) heteroláctica + 2

NAD+

NADH + H+

PK Glucosa

piruvato +

NAD+

NADH + H+

acetil fosfato

La acetil CoA

(re la fermentación de ácido ) mixto 2x 4 piruvato

NADH + H+

NAD+

El acetaldehído

2NADH +

2NAD+

H+ NADH +

NAD+

NADH + H+

lactato

Etanol

NAD+

2 lactato

H+ La acetil CoA o

2x

El acetaldehído

Etanol Acetato

2 Formate

(mi fermentación de 2,3) butanodiol

2CO2 + 2H2

CO2 2 piruvato

NAD+

NADH + H+

CO2

AcetolactateAcetoin2,3-butanodiol

(F) la fermentación del ácido propiónico CO2 piruvato

MARIDO2O

CO2

OxaloacetateMalateFumarateSuccinatePropionate

(gramo) Butírico fermentación del ácido 2 piruvato

NAD+

NADH + H+

butanol NADH + H+

acetoacetil CoA

NAD+

o

NADH + H+

butirato

butiril CoA NADH + H+

Acetona + CO2

Higo. 3.7productos de fermentación común derivan de piruvato.

NAD+

NAD+

isopropanol

zación a las BPA. Esta unidad C3 puede entonces entrar en la vía EMP.

Las proteínas extracelulares se hidrolizan por proteasas para producir aminoácidos libres, que se pueden transportar en la célula. catabolismo de aminoácidos implica inicialmente remoción de su grupo (s) amino. Esto se consigue normalmente a través de transaminación, donde el grupo amino es donado a un huésped ceto, por ejemplo, aminación de piruvato para formar alanina. El ácido ceto resultante de transaminación

a continuación, puede ser oxidado en el ciclo de TCA. El exceso de grupos amino pueden acumularse y con frecuencia se excretan en forma de iones de amonio, lo que explica el aumento del pH de los medios de comunicación durante el crecimiento de algunas bacterias.

Almacen de energia Cuando el exceso de nutrientes están disponibles, los microorganismos que normalmente sintetizan compuestos que pueden ser almacenados para su uso posterior durante los períodos de escasez de nutrientes. hidratos de carbono de almacenamiento incluyen los polisacáridos, el glucógeno y el almidón, y el disacárido trehalosa, todos los cuales

actuar como fuentes de carbono y energía. La trehalosa es producida por los hongos filamentosos, levaduras y algunas bacterias, y el glucógeno es un carbohidrato de almacenamiento principal en muchos grupos de microorganismos. Cuando se requiere, estas reservas poliméricos se hidrolizan por fosforilasas, formando glucosa 1-fosfato, que se puede introducir directamente el catabolismo. Muchos microorganismos almacenan lípidos ricos en energía. Poli b-hidroxibutirato se encuentra comúnmente en las bacterias, pero no es producida por los eucariotas. Los hongos filamentosos y levaduras suelen almacenar lípidos neutros (triglicéridos) dentro de vacuolas. gránulos Volutin, compuestos de fosfatos polymetaphos-, también se almacenan por algunos procariotas y eucariotas, que actúan como los dos reservas de fosfato y de la energía. bacterias de azufre pueden acumularse por gránulos de azufre la oxidación del H2S. Cuando no hay suministro de medios adicionales de sulfuro están disponibles, esta tienda de azufre se oxida a sulfato, proporcionando equivalentes de reducción de CO2 la fijación o la fosforilación oxidativa (ver pág. 61, autotrofia chemolithotrophic).

El anabolismo: biomoléculas

la

síntesis

de

El anabolismo es la biosíntesis de novo de moléculas orgánicas complejas a partir de otras más simples. Estos procesos son endergónica, lo que requiere un aporte de energía para manejarlas, que proviene en su mayoría del ATP proporcionado por el catabolismo. Los procesos anabólicos a menudo comprenden dos etapas, que implica la síntesis de pequeños compuestos intermedios metabólicos que luego se ensamblan para formar polímeros. Muchos procesos catabólicos no sólo generan energía, en forma de ATP y coenzimas reducidas, para su uso en la biosíntesis, sino que también proporcionan esqueletos de carbono que pueden alimentar en el anabolismo. Pathways con funciones catabólicas y anabólicas duales se conocen como anfibólica. Amphibol-

a partir de estas vías para la biosíntesis anfibólicos, sus niveles pueden llegar a reducirse. Por ejemplo, oxaloacetato se toma del ciclo TCA para suministrar la demanda de esqueletos de carbono en la biosíntesis de aminoácidos. Por lo tanto, estos productos intermedios tienen que ser repuesto a través de una ruta alternos, se hace referencia como una vía anaplerótica, con el fin de mantener el funcionamiento de este ciclo. Uno de tales ruta anaplerotic es el ciclo del glioxilato (Fig. 3.8). Este ciclo actúa en muchos organismos para la reposición del oxaloacetato, en particular para la gluconeogénesis (ver más abajo) a partir de lípidos y durante el crecimiento en compuestos C2. Se trata de la isocitrato liasa, que escinde isoci- trar a succinato y glioxalato. La acetil CoA se condensa con glioxilato para generar malato y coenzima A (CoASH) por la acción de malato sintasa. El malato puede transformarse en oxalacetato para permitir la continuidad del funcionamiento del ciclo del TCA. bacterias Gram-negativas tales como E. coli y otras bacterias entéricas pueden generar oxaloacetato, un compuesto de carbono de cuatro, mediante la fijación de CO2 al compuesto de tres carbonos, fosfoenolpiruvato (PEP), utilizando PEP carboxilasa. Muchas bacterias y levaduras Gram-positivas tienen un sistema de carboxilación similar, pero una que uti- lizes la enzima que requiere biotina, piruvato carboxi lase, añadir CO2 a piruvato. Sin embargo, esta ruta consume energía ya que tiene un requisito de ATP. Ambas reacciones "fijación" son casi irreversible:

La acetil CoA (C2) CoASH

ic vías incluyen la vía EMP y el ciclo de Krebs. El primero proporciona piruvato, fosfatos de hexosa y fosfatos de triosa, mientras que el segundo suministros ox- aloacetate y oxoglutarato. Estos productos se pueden utilizado en la síntesis de los componentes celulares y materiales de almacenamiento. Muchas de las reacciones de las vías anfibólicos son libremente reversible o tener 'puentea' de pasos irreversibles para facilitar su doble función. Los pasos irreversibles tienen enzimas separadas para las dos direcciones que pueden proporcionar puntos de control adecuados para la regulación independiente de catabolismo y anabolismo.

Anaplerotic (reposición) reacciones Como consecuencia de la eliminación de los compuestos intermedios

Oxaloacetato (C4)

Citrato de (C6)

Malato (C4) CoASH Iso-citrato (C6) 2

Glioxilato (C2)

1

Fumarato de (C4) Oxoglutarato (C5)

Succinato de (C4) 1 isocitrato liasa 2 malato sintasa ciclo del TCA por alto reacciones

Higo. 3.8 El ciclo del glioxilato.

fosfoenolpiruvato + CO2 piruvato + CO 2

+ ATP + H 2O

fosfoenol piruvato do

arb

oxi

æ æ æ Las mi æ æ Æ

oxaloacet ato + Pyo

piruvato carboxilasa oxaloacetato

æææææÆ

+ ADP + Pi

gluconeogénesis, Esencialmente, la reversión de la glucólisis, también cumple un papel anaplerotic similar. Es particularmente importante durante el crecimiento en piruvato, relacionados con los compuestos C3 y unidades C2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, no todos los pasos son reversibles y derivaciones adecuadas es necesario. La inversión del flujo de carbono a partir de piruvato mantiene un suministro de hexosas, que de otra forma llegar a reducirse. Estos intermediarios son en su mayoría requeridas para la síntesis de componentes de la pared celular y carbohidratos de almacenamiento.

Biosíntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos Los nucleótidos se componen de una base nitrogenada cíclico, un azúcar pentosa (ribosa o desoxirribosa) y fosfato. La base puede ser una purina, adenina o guanina, o uno de los tres pirimidinas, citosina, timina o uracilo. Estos nucleótidos son los bloques de construcción de ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Ellos son también componentes importantes de varias coenzimas, y tienen un papel clave en la activación y la transferencia de azúcares, aminoácidos y componentes de la pared celular. La mayoría de los microorganismos pueden sintetizar su propia purinas y pirimidinas. la síntesis de purina es compleja, el esqueleto de purina que se deriva de varios componentes, mientras que las pirimidinas se originan a partir de ácido orótico, un producto de la condensación de carbamoil fosfato con ácido aspártico. Ribosa 5-fosfato se genera en la vía de PP (ver pág. 48) y se utiliza aquí en la forma activada de pirofosfato phoribosyl fosfato (PRPP). Se condensa con el ácido orótico precursor base para formar pirimidinas. En la

ÁCIDOS NUCLEICOS

Como se mencionó anteriormente, hay dos tipos de ácido nucleico, ADN y ARN, y ambos están compuestos de bloques de construcción de nucleótidos. Los dos ácidos nucleicos difieren en el azúcar encontraron en sus nucleótidos, ya sea la desoxirribosa o ribosa. biosíntesis de purina, los compuestos se construyen mediante adiciones varios de los fragmentos de la molécula de PRPP. formas oxyribose mento de los nucleósidos continuación, se generan por reducción del resto de azúcar de ribonucleósidos. Los nucleósidos se fosforilan finalmente para formar nucleótidos trifosfato por fosforilación sucesiva de ATP, con el fin de que puedan participar en otros procesos metabólicos.

Ambos polímeros son hechas por la formación de enlaces covalentes entre los grupos azúcar y fosfato de los nucleótidos contiguos ciento. Esta cadena principal de azúcar-fosfato es común a todas las moléculas de ácido nucleico. La natu- raleza única de moléculas de ácido nucleico reside en la secuencia de bases. Cuatro bases pueden ocurrir en cada ácido nucleico. Tres bases, adenina, citosina, guanina y son comunes a ambos ARN y ADN, pero timina del ADN es reemplazada por uracilo en el ARN. Las diversas formas de RNA, que desempeñan papeles clave en la síntesis de proteínas (ver abajo), incluyen mensajero (ARNm), ribosomal (rRNA) y de transferencia (ARNt). ADN es de doble cadena, compuesta de dos cadenas helicoidales cada una espiral alrededor del mismo eje. Ambas cadenas siguen hélices dextrógiras, con las dos cadenas fun- ciona en direcciones opuestas. Bases de cada cadena están en el interior de la hélice con los fosfatos en el lado exterior. Una característica clave de la estructura es la manera en la que las dos cadenas se mantienen unidas por las bases de purina y pirimidina (Fig. 3.9). Una única base de una cadena es hidrógeno unido a una única base de la otra cadena, de modo que el lado dos

mentira por lado. Uno del par debe ser una purina y la otra una pirimidina, y sólo los pares específicos de bases pueden unirse juntos. Estos pares de bases son: adenina (purina) con timina (pirimidina) y guanina (purina) con citosina (pirimidina). Por lo tanto, las dos hebras de ADN tienen una secuencia complementaria de bases.

Biosíntesis de aminoácidos y proteínas Los microorganismos son normalmente capaces de sintetizar los 20 aminoácidos necesarios para la producción de proteínas. Los esqueletos de carbono de los aminoácidos se derivan de metabolismo intermediario (Tabla 3.1), y los grupos amino se introducen por aminación directa, o aliado más no baja de la mayoría de los aminoácidos, a través de transaminación. microorganismos asimilan fácilmente amoníaco, pero si nitrato, nitrito o más nitrógeno molecular rara vez son la fuente de generación de nitro, primero tienen que ser reducidos a amoníaco. Pri- asimilación mary de amoníaco en muchas bacterias implica deshidrogenasa L-glutamato deshidrogenasa y L-alanina, que catalizan la aminación reductora sin el requisito de ATP. Sin embargo, cuando

las concentraciones de iones de amonio son bajos, la asimilación de nitrógeno puede ser a través de la glutamina sintetasa, que tiene una mayor afinidad por los iones de amonio, sino que exige ex penditure de ATP (Fig. 3.10). El glutamato es el componente predominante de la piscina libre de aminoácidos citoplasmática. En consecuencia, es fácilmente disponible para amino

nucleótido BaseHydrogen

cautiverio

grupo fosfato 5 ' T

3'

la

desoxirribosa

do

G

do

G

T

do

3'

la

G

5'

Higo. 3.9la representación de dos dimensiones de una sección de ácido desoxirribonucleico. Bases: adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G).

donación grupo en reacciones de transaminación que forman otros aminoácidos. Los polipéptidos consisten en una cadena de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos covalentes muy estables. Estos enlaces se forman entre el grupo amino de un aminoácido y el grupo ácido carboxílico de otra. El término "proteína" se refiere normalmente a la totalidad de conjunto funcional final, que puede estar compuesto por uno o varios polipéptidos. El orden de los aminoácidos dentro de un polipéptido se determina por la secuencia de bases del ADN que constituye el gen estructural que codifica para el polipéptido específico. códigos de ADN no se leen directamente, pero transcriben en copias móviles del código, en forma de ARNm. Estos actúan como plantillas para la síntesis de polipéptidos y se tradujeron en una secuencia específica de aminoácidos. La iniciación y terminación de la transcripción y la traducción son estrictamente controlados. Los ARNm se sintetizan mediante polimerasas de ARN que se unen al sitio promotor localizado aguas arriba del gen estructural que codifica para el polipéptido. secuencias de bases de la plantilla o el sentido cadena de ADN de doble cadena, compuesto de adenina, guanina, citosina y timina, se transcriben en copias de ARNm de cadena sencilla. Ellos contienen la secuencia complementaria de las bases, excepto que el uracilo sustituye los timina. Existen varias diferencias entre los modos de la transcripción en procariotas y eucariotas, pero el resultado es esencialmente el mismo. Varias copias de ARNm se hacen, con el número de copias de ARNm producidos y su tasa de producción y la degradación que juega un papel en el control metabólico, es decir, la regulación de concentraciones de enzimas específicas. los procesos de transcripción procariotas y traducción están acoplados, lo que permite la síntesis de proteínas para iniciar la transcripción antes de que termine. En las células eucariotas, el ARNm debe salir primero el núcleo y moverse en el

mesa 3.1 grupos de aminoácidos con rutas biosintéticas comunes (el compuesto / esqueleto de la que se derivan está en paréntesis) El glutamato familia (2-oxoglutarato) El glutamato, glutamina, prolina,

arginina

familia aspartato (Oxaloacetato) aspartato,

asparagina, lisina, metionina, treonina, isoleucina

familia piruvato (Piruvato) alanina, leucina,

valina

familia de las serina (3-fosfoglicerato) serina,

glicina, cisteína

aminoácidos aromáticos (eritrosa 4-phosphatePhenylalanine, triptófano, + Fosfoenolpiruvato) HistidineHistidine biosintética (fosforribosil pirofosfato (PRPP) + ATP)

tirosina

es el único miembro de aminoácidos de su recorrido

(a) El glutamato deshidrogenasa (GDH) Oxoglutarato * + NAD (P) H + H+ + NH+

El glutamato + NAD (P)+ + H2O 4 * Compuesto 5-carbono producido en el ciclo TCA (Reemplace con piruvato de alanina deshidrogenasa, y el producto es alanina) Nota: no requiere ATP (b) La glutamina sintetasa (GS)La aminación -direct El glutamato + NH4 + ATP Glutamina + ADP + Pyo El glutamato sintetasa (GOGAT)transaminación -a

Higo. 3.10mecanismos de aminación (a) la aminación directa (b) la ruta de asimilación a bajas concentraciones de iones de amonio.

La glutamina + oxoglutarato + NAD (P) H + H+

citoplasma o al retículo endoplasmático rugoso, donde se encuentran los ribosomas. El código genético se compone de una serie lineal de tripletes de bases (codones) que representan los aminoácidos de las proteínas, junto con señales de inicio y parada de la proteína

2 glutamato + NAD (P)+ + H2O

MARIDO NUEVA

COOH

H A M P S H I R E 2

C R

síntesis. Este código es prácticamente el mismo para todos los organismos del y es degenerado para la mayoría de los aminoácidos, es decir, hay 20 aminoácidos y 64 posibles combinaciones de tripletes de las cuatro bases. En consecuencia, cada aminoácido está representado por más de un código de tripletes. la síntesis de polipéptidos se lleva a cabo cuando una molécula de ARNm forma un complejo con un ribosoma. Se trata de la interacción entre la pequeña unidad ribosomal y el sitio de unión ribosomal del mensaje. ribosomas bacterianos tienen un valor de sedimentación de 70 S y eucariotas

los ribosomas, a excepción de las contenidas dentro de ciertos orgánulos, son más grandes 80 S estructuras. Sin embargo, ambos tipos se componen de dos subunidades que contienen proteínas y rRNA. Varios ribosomas pueden "leer" una molécula de ARNm GLE pecado al mismo tiempo, formando una bosome polyri-. Cada ribosoma tiene el mRNA, se mueve a lo largo de su longitud en los 5 ¢ a 3 ¢ dirección, y construye el polipéptido a partir del extremo terminal amino al extremo terminal carboxilo. Diferentes moléculas de ARNt se vuelven a responsable de la entrega de aminoácidos específicos a los ribosomas en una forma activada como aminoacil-ARNt. El orden de

montaje se determina por la coincidencia de los codones en el ARNm a tripletes codones complementario anti-en el ARNt. enlace ácidos secuencialmente Amino entre sí para formar el polipéptido, que en la terminación de forma espontánea, o con la ayuda de proteínas chaperonas, se pliega para formar estructuras secundarias y terciarias. aminoácidos constituyentes exhiben diferentes propiedades químicas determinadas por sus cadenas laterales. Por ejemplo, algunos son hidrófobos y otros tienen característico hidrófila

Higo. 3.11 La estructura de un aminoácido. El grupo lateral R puede ser cualquiera de los 20 productos químicos diferentes. Algunas cadenas laterales son muy polar, otros muy polares o con carga eléctrica.

tics (Fig. 3.11). Por lo tanto, las propiedades de diferentes regiones de las moléculas de proteína se determinan por el tipo de aminoácidos presentes. Algunos polipéptidos pueden sufrir modificaciones después de la traducción antes de ser funcional. Esto puede implicar la glicosilación, la fosforilación y la escisión de preproteínas o secuencias señal.

Biosíntesis de monosacáridos y polisacáridos Los hidratos de carbono pueden existir ya sea como unidades simples (monosacáridos) o bien coordinados en las moléculas que van desde dos unidades (disacáridos) a miles de unidades (polisacáridos). Los monosacáridos que contienen un grupo aldehído se denominan aldosas, mientras que los que contienen un grupo cetona son cetosas. monosacáridos también se clasifican por el número de átomos de carbono que contienen, es decir, trioses tetraoses, pentosas, sistemas operativos, etc. hex azúcares libres casi nunca se encuentran en las células, sino que están presentes en pequeñas cantidades como fosfatos de azúcar o nucleótidos de azúcar, por ejemplo, difosfato de uridina (UDP) -glucosa, UDP-N-acetilglucosamina, guanosina difosfato (GDP) -manosa. Los monosacáridos se derivan de sustratos de azúcar comunes tales como glucosa o sustratos de polisacáridos hidrolizados. Como

se ha mencionado anteriormente, durante el crecimiento de las fuentes de hidratos de carbono no bohidratos, monosacáridos debe ser sintetizado a través de la gluconeogénesis, lo que requiere la inversión de las secciones de la vía EMP y la elusión de medidas irreversibles (Fig. 3.1). Dentro de cada célula la mayor parte de los monosacáridos están presentes en la forma de polisacáridos. Las unidades de azúcar de componentes de estos polímeros están unidas por enlaces glucosídicos covalentes. No se ensamblan a partir ars cias libres, pero a partir de los nucleótidos de azúcar. Diferentes polisacáridos se pueden formar mediante la variación de la orientación del enlace glicosídico para formar a- o b-vínculos, o cambiando el monómero. Los homopolímeros están compuestos de unidades de un solo monómero, mientras que heteropolímeros contienen más de un tipo de monómero. Los ejemplos de polisacáridos microbianos importantes incluyen los siguientes. 1 El glucógeno y almidón, homopolímeros de cadena ramificada de unidades de un ligado de glucosa que funcionan como reservas de carbono y energía. El glucógeno, por ejemplo, se sintetiza a través de las actividades de ADP-glucosa lase pyrophosphory- y la enzima de ramificación, la glucógeno sintasa. 2 Celulosa y otra pared celular b-glucanos, compuesta de unidades de glucosa b-ligado. 3 La quitina, un polímero de Nacetilglucosamina. 4 El peptidoglicano, un polímero de Nacetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico, reticulado con péptidos. 5 Varias gomas tales como dextrano (en su mayoría a-1,6 unidades de glucosa unidas) y xantana (esencialmente una estructura principal de celulosa con un trisacárido de manosa-ácido glucurónico-manosa, vinculados a unidades de glucosa alternos).

BIOSÍNTESIS peptidoglicano

El peptidoglicano (PG) se compone de una cadena principal de polisacárido lineal rígida de unidades de N-acetil glu- cosamine (NAG) y N-acetil ácido murámico (NAM) alterna, con tetrapéptidos cadenas laterales de aminoácidos cuyos componentes pueden variar dependiendo de la bacteria . Cada tetrapéptido está unido a un residuo NAM a través de una unidad de lactato (Fig. 3.12). La estructura es rígida transversal que une una

proporción de cadenas laterales adyacentes tetrapéptido ya sea directamente oa través de puentes peptídicos cortos para formar una estructura general en forma de red. En E. coli, esto se consigue por transpeptidación directa entre el ácido diaminopimélico (DAP) en una cadena lateral con d-alanina en una cadena peptídica adyacente. En general, existe en peptidoglicano Gram-negativas menos de puente transversal que en las paredes celulares Gram-positivos. Biosíntesis de peptidoglicano requiere dos tipos de azúcares de nucleótidosamino, uridina difosfato-N-acetil

glucosamina (UDP-NAG) y ácido murámico UDP-Nacetil (UDP-NAM). se añadieron cinco aminoácidos para UDP-moléculas del MNOAL en secuencia, cada uno dirigido por ligasas separadas, formando UDPNAM-pentapéptidos. Algunos de estos aminoácidos son formas D (isómeros), mientras que en las proteínas que son siempre las formas L. El pentapéptido NAM se transfiere a continuación a partir de UDP a un portador prenol bacto- (un fosfato de lípido isoprenoide) unido en el lado interior de la membrana celular. UDP-NAG a continuación, añade su resto NAG con el pentapéptido bactoprenol-NAM, formando una subunidad completa de ensamblaje de PG. Cada unidad bactoprenol-NAG-NAM-pentapéptido se transporta después a través de la parte exterior de la membrana celular, donde su NAG-NAMpentapéptido se suelta. Esta subunidad se mueve en el periplasma se unan a peptidoglicano incompleta, dejando el portador bactoprenol para volver al otro lado de la membrana. Nuevos enlaces cruzados se forman entonces entre las cadenas de peptidoglicano por transpeptidación para formar una red rígida. Energía para esto es proporcionado por la escisión del aminoácido terminal del pentapéptido por una carboxipeptidasa, como ATP no está disponible en esta ubicación.

Biosíntesis de ácidos grasos y lípidos Los lípidos son una familia muy diversa de compuestos, agrupados juntos en la base de su relativa insolubilidad en agua y solubilidad en

disolventes no polares. Ellos son componentes importantes de las membranas y pueden funcionar como reservas de energía en algunos organismos, por ejemplo, poli hidroxibutirato B y triglicéridos. Los lípidos simples son los glicéridos, ésteres de glicerol y ácidos grasos. Cada ácido graso se compone de una larga cadena no polar de 1224 átomos de carbono con un grupo de ácido carboxílico polar en un extremo. La mayoría de los ácidos grasos naturales contienen un número par de átomos de car- bono. Ellos pueden ser saturados, insaturados o poliinsaturados, que no contiene dobles enlaces, un enlace dou- ble o dos o más dobles enlaces, respectivamente. Síntesis de ácidos grasos saturados implica derivados de la coenzima A y las proteínas portadoras de acilo (ACP). El ácido graso se construye por adición sucesiva de unidades de dos carbonos en la forma de unidades de acetilo, donados indirectamente a través de acetil CoA (es decir, después de su carboxilación de malonil CoA), que luego se reduce por NADPH. Dos rutas son conocidos para la síntesis de ácidos grasos insaturados, uno de los cuales tiene una necesidad de oxígeno molecular. Monoglicéridos, que poseen un ácido graso, son raros, pero diglicéridos son lípidos de membrana comunes y los triglicéridos a menudo se utilizan como materiales de almacenamiento de energía por algunas levaduras. Las bacterias contienen unos glicéridos, se

unidad de cadena principal de polisacárido Repitiendo NAMNAG CH2OH

CH OH 4 O

O O

Ohio

1 O NHC CH3

LAla

2

O

O

O O

NHC

CH2Ohio O Ohio

O

O CH

NHC CH3

CH3

CH

O

CH3

O

O O

NHC CH3 CO

lactato unidadtetrapéptido

CH3 doO NUEVA HAMPSHIRE CH O CH3 C NH CH (CH2)2 COOH do

tetrapéptido de la cadena lateral

reglu

SALTO

NUEVA HAMPSHIRE O HOOC CH O (CH2)2 do CH NUEVA HAMPSHIRE HN2 do

re-alaHOOCCH

Higo. 3.12unidad de peptidoglicano (repitiendo desde Dawes y Sutherland (1992)).

principalmente tener fosfolípidos (fosfoglicéridos), que son diglicéridos que contienen un grupo fosfato. Estos son muy solubles en agua (hidrófilo) en el extremo de fosfato, pero muy insoluble en agua (hidrófobo) al final de ácido graso. El fosfato puede ser esterificado adicionalmente a la etanolamina, inositol o serina. Otros lípidos importantes incluyen esteroles, tales como ergos- terol, que son componentes clave de la membrana celular en los hongos, sintetizados sólo bajo condiciones aeróbicas. colípidos Gly-, incluyendo lipopolisacáridos, ERIDES glycosyldiglyc- y ácido lipoteicoico, se encuentran también en muchos microorganismos.

autotrofia Los autótrofos pueden obtener todos sus requisitos de carbono CO2, que es fijo

(asimilado) a través del ciclo de Calvin (ver pág. 62). Hay dos tipos básicos de autótrofos

y se caracterizan por su método de obtención de energía. Fototrofas usan la energía derivada de la luz y quimiolitotrofos utilizan compuestos inorgánicos como fuente de energía.

fotoautotrofia Fotoautótrofos son capaces de absorber energía de la luz y la transforman en energía química (ATP y coenzima reducida) a través de las reacciones de luz '' de la fotosíntesis.

La energía química generada se utiliza en la conducción del ciclo de Calvin para fijar el CO2. La fotosíntesis es iniciado por la absorción de cuantos de luz por los pigmentos fotosintéticos específicos. Hay tres tipos principales empleadas. 1 bacterioclorofila se encuentra en las bacterias púrpuras de azufre, bacterias púrpuras no del azufre y bacterias verdes, que incluye todas las eubacterias fotosintéticas excepto las cianobacterias. 2 clorofilas son los fotopigmentos de cianobacterias, algas y plantas superiores.

3 bacteriorhodopsin, Un pigmento no clorofila, es utilizado por archaea, como halobacterias, pero no será discutido aquí. Las clorofilas (CHL) son porfirinas que contienen un átomo de magnesio en su centro. Ellos tienen una cadena lateral hidrófoba que permite a las moléculas asociarse con membranas. Los diferentes clorofilas pueden distinguirse por las variaciones en las cadenas laterales, que también afectan sus espectros de absorción. La mayoría de los organismos tienen más de un pigmento, lo que permite la absorción de una gama más amplia de longitudes de onda de luz. Fotopigmentos operan en grupos de unos pocos cientos de moléculas situadas dentro de las membranas. En procariotas que están asociados con los sistemas de membrana interna, el cromatóforos, y en eucariotas de las membranas se encuentran dentro de orgánulos específicos, los cloroplastos. Pigmentos distintos de clorofilas pueden servir como agentes de captura de luz como de accesorios, incluyendo carotenoides y ficobiliproteınas. La energía luminosa que absorben se transfiere a las clorofilas.

BACTERIAS anoxigénicas FOTOSINTÉTICOS

unidades fotosintéticas en las eubacterias, distintos de las cianobacterias, constará de tres componentes: el complejo de recolección iluminación, que contienen bacterioclorofila y accesorios pigmentos; un centro de reacción, compuesto por bacterioclorofilas y bacteriopheophytins; y un ETS. compuestos de azufre reducido, compuestos orgánicos gen o carburos moleculares se utilizan como donadores de electrones finales. En consecuencia, el oxígeno no se genera durante este tipo de fotosíntesis. Cuando el phyll bacteriochloro- dentro de un centro de reacción es excitado por la luz, una

electrón es donado a una bacteriofeofitina. Se transmite a una quinona y, a continuación, a través de una serie de citocromos, volviendo al centro de reacción oxidada bacteriológico clorofila. Durante el curso cíclico que viaja cada electrón, ATP se sintetiza. Este proceso se conoce como fotofosforilación cíclico. Con el fin de generar NADPH, que se necesita, junto con ATP para la fijación de CO2, se requiere un donante de electrones reducida, por ejemplo, H2S o H2. Su donación de electrones al NADP + es independiente de la luz. Sin embargo, algunos de la ATP sintetizado a través de la fosforilación cíclica se requiere para forzar a los electrones de reductores débiles a los más fuertes, que luego puede reducir NADP +, es decir, la inversión de la cadena de transporte de electrones. Invertida puerto de electrones transmisión también es utilizado por lithotrophs para superar el mismo problema (ver pág. 61).

fotosíntesis oxigénica

Las cianobacterias, algas y plantas superiores tienen dos sistemas fotografías, fotosistemas I y II, vinculados a través de una serie de portadores de electrones (Fig. 3.13). Estos sistemas son res- ponsables de la generación tanto de ATP y NADPH. Los electrones se elimina del centro de reacción del tem photosys- que, al ser excitado por la luz, se pasan a la ferredoxina, y luego directamente al NADP + para formar NADPH. Esto deja el fotosistema I con carga positiva y es incapaz de suministrar cualquier electrones adicionales. Los electrones son suministrados al sistema de foto-I del fotosistema II, cuando también se activa por la luz. Los electrones fluyen a Fotosistema I a través de un sistema de transporte de electrones, generando de este modo ATP. Esta es la fotofosforilacion no cíclicos, como los electrones nunca regresan a fotosistema II. En consecuencia, la

Bajo NADP+ NA TP

redox poten cial escala

CHL

Ligero

fotosistema yo

MARID O2O

CHL 1 / 2O2 + 2H+ Lige ro fotosistema II

ionado electrones

NAD + H+

NADP + nPyo

Alto

Higo. 3.13Un esquema simplificado para fotofosforilacion no cíclico.

centro de reacción del fotosistema II requiere un suministro de electrones para mantener el funcionamiento del proceso. Ellos son proporcionados por la fotólisis del agua y como resultado el oxígeno se libera, es decir, este proceso es oxigénica. Fotólisis del agua: MARIDO2O (+ energía de la luz) 2e Æ- + 2H+ + 1/2 O2 ATP también puede ser producido a partir de electrones generados por el fotosistema I, si no se utilizan en la producción de NADPH. El aceptor primario de electrones del fotosistema I puede pasar electrones a través de los citocromos y ciclos de vuelta al centro de reacción del fotosistema I, de donde vinieron. Durante este, ATP se sintetiza por fotofosforilación cíclica (Fig. 3.14).

autotrofia chemolithotrophic Quimiolitotrofos utilizan electrones obtenidos a partir de compuestos inorgánicos reducidos como fuente de energía y inorgan-

Emocionado electrones

NATP

Electrón transporte sistema

NADP + nPyo

Bajo

redox escala potencial

CHL

fotosistema I

Higo. 3.14Un esquema simplificado para fotofosforilacion cíclico.

Nitrosomonas: 2NH4+ + 3O2Æ 2NO- 2 (Nitrito) + 2H2O + 4H Nitrobacter: 2NO2- + O2Æ 2NO3- (nitrato)

Alto Ligero

carbono ic, generalmente CO2, como su fuente de carbono, que se fija a través del ciclo de Calvin. Poseen sistemas de transporte de electrones, generan una fuerza protónmotriz y producir ATP mediante la fosforilación oxidativa. La reducción de potencia, NAD (P) H, se genera utilizando el transporte de electrones inversa, como en la fotosíntesis bacteriana. Reversión de transporte de electrones es impulsado por el ATP o la fuerza motriz de protones y electrones se proporcionan por los donantes inorgánicos disponibles (Fig. 3.15). El ATP y NAD (P) H generada se utilizan entonces en la fijación de CO2. fuentes de energía inorgánicos utilizados incluyen formas reducidas de nitrógeno, azufre, hierro e hidrógeno. Amoniaco (NH3) y el nitrito (NO2) son los compuestos nitrogenados inorgánicos más comunes utilizados chemoautotrophically. Ellos se oxidan aeróbicamente por un rango limitado de bacterias, un -proceso conocido como la nitrificación. Nitrosomonas oxida el amoníaco a nitrito, y Nitrobacter oxidan el nitrito a nitrato (NO3). bacterias nitrificantes aerobias también utilizan el ciclo de Calvin para la fijación de CO2. Los requisitos de ATP para este proceso son considerables y suponen una carga adicional a un sistema de generación de energía ineficiente.

Estos organismos están muy extendidas en agua y particular- mente en el suelo en el que tienen un impacto significativo en la fertilidad del suelo. Nitrato, el producto final de la nitrificación, es soluble en agua y lixiviados rápidamente de suelos, mientras que el amoniaco es catiónico y adsorbe minerales de arcilla fácilmente para carga negativa. Por lo tanto, la nitrificación es un proceso indeseables en la agricultura, especialmente en áreas con alta precipitación. La escorrentía de nitrato producido de esta manera y de los fertilizantes agrícolas añadido, en embalses, ríos y aguas subterráneas, también constituye un importante problema de la contaminación. La nitrificación se produce en suelos bien drenados

transporte de electrones inversa para la producción de NADH NADH + H+ ADP + Pyo NAD+

Higo. 3.15 transporte de electrones inverso.

donador de electrones inorgánica, por ejemplo, 1 / 2O2 TP la

mi_ A P + Pyo

sistema de transporte de electrones

ATP

receptor terminal de electrones, por ejemplo, O2 MARIDO2O

a pH neutro, pero es inhibida por condiciones anaerobias y acidez. Las fuentes de energía quimioautotróficas más comunes que contiene formas reducidas de azufre, hidrógeno sul- fosfuro (H2S), el azufre elemental (S0) y tiosulfato (S2O 3 ). Sulfato (SO ) Es el producto final de 22azufre oxidació n.

4

2+

Tiosulfato: S2O32- + 2O2 + H2O Æ 2SO4 + 2H azufre libre: 2S0 + 2H2O + 3O2 Æ 2SO 2- + 2H +

quimioautotróficas varias bacterias, incluyendo Ralstonia eutropha (anteriormente Alcaligenes eutrophus) lo utilizan como fuente de energía con el oxígeno como aceptor terminal de electrones. Tales bacterias tienden a ser totrophs chemoau- facultativos, capaces de crecer chemoheterotrophic, alaunque algunas especies tienen también autótrofos obligatorios ha encontrado. Ciertas bacterias incapaces de autotrofia oxidar el hidrógeno como fuente de energía, pero no pueden utilizar este poder reductor para fijar CO2 y debe estar provisto de una fuente de carbono orgánico. Estas bacterias son alguien

4

Un género capaz de obtener energía de este modo es Thiobacillus. Son bacilos Gramnegativos aproximadamente 2 mm de longitud, algunas de las cuales son acidófilos que pueden reducir considerablemente el pH de su entorno. Por ejemplo, Thiobacillus thiooxidans oxida el azufre no planchar, y T. ferrooxidans oxida ambos. Esta bacteria acidófila de azufre es uno de los pocos microorganismos capaces de la generación de energía indirecta a través de la oxidación aerobia de ferroso (Fe2 +) a férrico iones (Fe3 +). La energía se genera a partir del gradiente de pH a través de la membrana celular, creado por condiciones ácidas. Como los protones (H +) fluyen en, se forma ATP. Una vez dentro, los protones deben ser "eliminado", para mantener el pH interno cercano al neutro. iones ferrosos se utilizan como donadores de electrones al oxígeno como aceptor terminal de electrones, que combina con H + para formar agua, es decir, las funciones de hierro como proveedor de electrones para eliminar los protones. Las células procesan una gran cantidad de hierro para rendimientos muy pequeñas de energía, que puede ser visto como un precipitado de color amarillo rojizo insoluble de hidróxido férrico (Fe (OH) 3). T.ferrooxidans es común en ambiente ácido contaminado mentos tales como minas de carbón y residuos mineros. Aquí, una de las formas más comunes de hierro y azufre en tura nacional, el mineral pirita (FeS2), es por lo general presente. El problema de drenaje ácido de minas se produce después de la oxidación de pirita por este organismo, ya que

conduce a la formación de ácido sulfúrico (H2SO4). Este proceso es aeróbico y siempre que el carbón es sin explotar no puede ocurrir oxidación de pirita. Sin embargo, como las capas de carbón están expuestos por las operaciones mineras, el oxígeno disponible, y rápidamente se contamine con T. ferrooxidans. Las actividades de este organismo generan ácido sulfúrico y metales Lize solubilización, que lixivia rápidamente en Wa- tros circundantes, donde tanto la acidez y metales pesados disueltos son tóxicos para la vida acuática. No obstante, estas actividades se pueden emplear de forma útil en operaciones de biominería comerciales, tales como la lixiviación de cobre a partir de minerales de azufre de bajo grado (véase el capítulo 15). Con respecto a la utilización de hidrógeno molecular,

veces referidos como mixotrofismo. Las bacterias como sulreductores de Phate y metanógenos el uso de hidrógeno como donante de electrones y todos son anaerobios obligados. Por último, algunas bacterias de azufre púrpura fototróficas pueden crecer como oxidantes de hidrógeno, en condiciones aerobias en la oscuridad. MARIDO

2

NAD ++ æææææÆ NADH + H+

(Alternativamente, los electrones donados directamente a la ETS).

pueden

ser

la fijación de dióxido de carbono (asimilación) a través del ciclo de Calvin El ciclo de Calvin (vía ribulosa bifosfato) para la asimilación de CO2 es operado por autótrofos: algas, plantas superiores, la mayoría de las bacterias fotosintéticas y chemolitotróficas y trophs methylo- autótrofos (véase la página 63.). En eucariotas autótrofos esta vía se encuentra dentro del estroma (matriz) de los cloroplastos, y algunos procariotas tienen oxysomes Carb especiales que contienen enzimas clave del ciclo de Calvin. Esta

formación de compuestos multicarbon a partir del compuesto de carbono de uno, CO2, requiere considerables cantidades de ATP y NADPH. El ciclo de Calvin se divide esencialmente en tres fases: carboxilación, reducción y regeneración (Figura 3.16.). carboxilación inicial implica la adición de CO2 a una molécula C5hidrogenasa aceptor, ribulosa 1,5-bisfosfosfato (RuBP), por RuBP carboxilasa. El producto C6 resultante se divide inmediatamente en dos unidades C3, formando dos moléculas de 3-fosfoglicerato (PGA). En la fase de reducción siguiente, un grupo fosfato (de ATP) y de hidrógeno (de NADPH) se añaden a cada molécula de PGA para producir BPA. El ciclo debe completar tres vueltas, la fijación de una molécula de CO2 cada vez, con el fin de producir una ganancia neta de una GAP (C3), que puede entonces entrar en el metabolismo anabólico. 3CO2 + + 9ATP 6NADPH + 6H + + 6H2O Æ GAP + + 9ADP 6pi + + 6NADP

Sin embargo, no todos GAP se toma como producto, algunos se deben utilizar en la regeneración de más aceptor RuBP para mantener el funcionamiento del ciclo. Esta fase de regeneración implica enzimas de la ruta de PP, incluyendo transaldolasa y la transcetolasa. Juntos producen ribulosa 5fosfato, que es más fosforilado para formar la RuBP CO2 aceptor (Fig. 3.16).

el ciclo de Calvin, o la ruta de la serina. Las levaduras operan la ruta xilulosa monofosfato (ciclo de tono dihydroxyace-). enzimas clave de cada vía se muestran en la Fig. 3.17. En las tres vías de asimilación de la reducida C1 compuestos son asimilados a nivel de formaldehído y existe la generación neta de tres carbonos

metabolismo metilotrófica Metilotrofo es la capacidad de los organismos para utilizar los compuestos de carbono de uno, distintos de dióxido de carbono, como su única fuente de carbono. Esto incluye compuestos tales como el metano, metanol, formiato, monóxido de carbono, clorometano y cianuro. La definición generalmente se extiende a la utilización de compuestos que pueden con- tienen más de un átomo de carbono, pero no hay enlaces carbonocarbono, tales como dimetilamina, trimetilamina y methylsulphide di-. Methylotrophs se encuentran dentro de bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Pueden ser aeróbico o anaeróbico y pueden ser divididos en tres categorías (ejemplos que se muestran en la Tabla 3.2). 1 Methylotrophs heterótrofos, que también pueden crecer en heterótrofa compuestos policarbono. 2 Obligar a Methylotrophs, incapaces de crecer sobre sustratos bon policarboxılicos o CO2. 3 Methylotrophs autótrofos o C1-utilizers que oxidize reduce compuestos C1 a CO2, antes de fijarla a través del ciclo de Calvin, como se describe anteriormente. metilotróficas bacterias heterótrofas y obliguen operan una de las dos vías de asimilación: la vía de monofosfato de ribulosa (ciclo Quayle), que tiene dos variantes y puede ser un antecedente evolutivo de

Tabla 3.2 Ejemplos de microorganismos metilotróficas Methylotrophs heterótrofos Las bacterias Arthrobacter organophylum P1 (PGR) Methylobacterium (S) Hyphomicrobium especies (S) Bacilo PM6 (RMP) Levaduras boidinii Candida (XMP) angusta Pichia (Hansenula polymorpha) (XMP) Los hongos filamentosos deliquescens Gliocladium Paecilomyces variotii Trichoderma lignorum Obligar a las bacterias metilotróficas Methylococcus especies de especies (PGR) Methylomonas especies (PGR) Methylocystis (S) Methylophilus methylotrophus (RMP) Autótrofos bacteria metilotrófica (C1-utilizers) Paracoccus denitrificans (DO) carboxydovorans Pseudomonas (DO) do1 vía de asimilación entre paréntesis: C, ciclo de Calvin; RMP, vía monofosfato de ribulosa; S, ruta de la serina; XMP,vía monofosfato xilulosa.

3CO2 3 Ribulosa-1,5-bisphosphate6

6ATP fosfoglicerato

ribulosa bifosfato carboxilasa 3 ATP

phosphoribulokinase

3 ribulosa-5-fosfato

6NAD (P) H

6 gliceraldehído-3-fosfato 4 moléculas 1 molécula

3C5

Higo. 3.16El ciclo de Calvin.

Reordenamiento reacciones

2 L a fructosa 6-fosfato

1 lécula

mo

biomasa celular

vía monofosfato de ribulosa fosfato hexulosa fosfato synthaseHexulose El formaldehído + ribulosa 5-phosphatehexulose

isomerasa 6-phosphatefructose

6-fosfato

ruta de la serina transhydroxymethylase serina El formaldehído + glycineserine

vía monofosfato xilulosa dihidroxiacetona sintasa (A transcetolasa especial) El formaldehído + xilulosa 5-fosfato de gliceraldehído 3-fosfato + dihidroxiacetona

ciclo de Calvin

ribulosa bifosfato carboxilasa

CO2 + H2O + ribulosa 1,5-bifosfato 2 fosfoglicerato

compuesto a partir de la fijación de tres moléculas de formaldehído, o tres moléculas de CO2 en el caso del ciclo de Calvin. Estos compuestos C3 están entonces disponibles para entrar en las rutas biosintéticas (Fig. 3.18). Los Methylotrophs tienen separación funcional de la asimilación de carbono y disimilación (generación de energía). La mayoría de los organismos generan energía por la desasimilación de una parte del formaldehído producido, a través de una vía lineal, para formar CO2 (Fig. 3.18), aunque, en algunas bacterias, esta disimilación se produce en la vía de fosfo- gluconato cíclico.

la regulación metabólica Los microorganismos, naturalmente, tienen un estricto control sobre su metabolismo, pero esto a menudo hay que superar cuando se utilizan en las fermentaciones industriales, por ejemplo, en AT- tentadora a un exceso de producción de metabolitos específicos. En consecuencia, el estudio de la regulación metabólica es de especial importancia en microbiología industrial. El conocimiento obtenido permite que las vías metabólicas de los microorganismos industriales para ser manipulada específicamente para satisfacer las necesidades del proceso industrial. Esto puede lograrse a través de la selección de cepas inicial, el desarrollo de deformación y la optimización de las condiciones de fermentación (véase el capítulo 4).

La mayoría de las rutas metabólicas están controlados por una combinación de varios sistemas diferentes organizadas para con- servir a la energía y las materias primas, mientras que el mantenimiento de la célula

Higo. 3.17enzimas característicos de C1 asimilación en Methylotrophs.

de la actividad enzimática y el control de la síntesis de la enzima.

Modificación de la actividad enzimática componentes en las concentraciones óptimas necesarias. La regulación del catabolismo y el anabolismo son algo diferentes. Ambos pueden ser reguladas por sus productos finales y la concentración de ATP, difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP) y NAD +, pero en el anabolismo regulación del producto final es de mayor importancia (véase más adelante). Anabólicas y catabólicas Pathways formas también pueden ser compartimentadas en localizaciones celulares separadas y que a menudo utilizan diferentes cofactores. Por ejemplo, el catabolismo principalmente produce NADH, pero es NADPH que se utiliza normalmente en la biosíntesis. La regulación se impone en dos niveles, la modificación

Esto implica la estimulación o inhibición de enzimas específicas para cambiar rápidamente el flujo de carbono dentro de una vía.

Separación física de enzima y sustrato

El mecanismo más simple para la regulación de la actividad enzimática simplemente implica el control de la concentración de sustrato y coenzimas disponible. El mecanismo más obvio es el control de la entrada de sustrato en una célula a través de la membrana citoplasmática. Esto está mediada por sistemas de transporte específicos que controlan la absorción de

El Metilamina (CH3NUEVA HAMPSHIRE2) dimetilamina (CH3)2NUEVA HAMPSHIRE Sulfuro de dimetilo (CH3)2S

Disimilación

metan o (CH4)

ENERGÍA El transporte de electrones

metanol La reducción de equivalentes

(CH3OH)

Formiat o (HCOOH)

Formaldehído

CO

CO2

(HCHO)

vía de monofosfato de xilulosa (levaduras)

dihidroxiacetona fosfato

ruta de la serina

vía monofosfato de ribulosa

dihidroxiacetona fosfato o piruvato

ácido fosfoglice rico

ciclo de Calvin

ácido fosfoglicerico do 3

Compuestos

Asimilación Anabolismo

Higo. 3.18Un diagrama simplificado de desasimilación y asimilación vías en Methylotrophs.

biomasa

enzimas reguladoras

muchos nutrientes y pueden actuar como un simple medio de la regulación de algunas enzimas intracelulares. En las células eucariotas, que tienen orgánulos unidos a membrana numerosos, la compartimentación puede utilizarse para controlar el transporte de metabolitos y coenzimas entre las diferentes regiones de la célula. la compartimentalización también permite que el, ación y la regulación de las vías similares operación simultánea, pero separada. Los procariotas carecen de orgánulos, pero el desarrollo de la concentración de metabolitos gra- dients y coenzimas, entre las diferentes regiones de la matriz citoplasmática, puede jugar un papel regulador similar.

Muchas vías metabólicas contienen enzimas reguladoras cuya actividad se puede ajustar para proporcionar un mecanismo para el ajuste fino del flujo de carbono a través de una vía. Algunas de estas enzimas son alostérico, generalmente compuesta de varias subunidades, y no siguen una cinética de Michaelis-Menten. Su actividad puede ser alterada por una pequeña

molécula llamada un efector o modulador. Esta molécula efectora se une reversiblemente a través de fuerzas no covalentes en el sitio de regulación de la enzima, provocando la enzima de cambiar de forma. Como resultado, el sitio catalítico se altera. efectores positivos provocar un aumento de la actividad de la enzima y efectores negativos causar inhibición de la enzima. Además, algunas enzimas reguladoras se conectan y desconectan por su modificación covalente reversible, como la fosforilación y la desfosforilación. Cada vía metabólica tiene al menos una enzima marcapasos que cataliza la reacción más lenta o limitante de la velocidad. Este

suele ser el primer paso o el primer paso de la vía única y es a menudo irreversibles. Controla la tasa general de flujo a través de la vía y, normalmente, es inhibida por el producto de la última etapa en la ruta, que se llama la inhibición por retroalimentación o producto final inhibición. Si los niveles de los productos finales se vuelven demasiado alta, la vía se hace más lenta a través de este mecanismo. Vías con ramas son controladas además por tener enzimas reguladoras similares en cada brazo del punto de ramificación, permitiendo ing control independiente de las ramas. Productos finales de

cada rama a menudo inhiben tanto la enzima en el inicio de su respectiva rama y la enzima de marcapasos en el comienzo de la vía principal. En algunos Pathways ramificados, varias isoenzimas (isozimas) pueden controlar la primera etapa, en lugar de tener una sola enzima marcapasos inicial (Fig. 3.19a). Esto proporciona una más sutiles medios de control para el flujo de carbono, ya que cada isoenzima puede ser controlado por un producto final diferente. Como alternativa, cuando sólo hay una enzima, puede ser regulada por todos los productos finales de las ramas. En algunos casos, todos los productos finales deben estar presentes en niveles elevados a completa- mente inhibir la enzima, un efecto concertado (Fig. 3.19b), o pueden tener un efecto acumulativo (Fig. 3.19c). En algunas vías ramificados control es secuencial. En primer lugar, la intermedia en el punto de ramificación se acumula, debido a la inhibición del producto finales de las enzimas responsables de su metabolismo en adelante, después de lo cual inhibe la enzima al comienzo de la vía (Fig. 3.19d).

Control de la síntesis de la enzima La concentración de cualquier enzima está determinada por su tasa de síntesis, la velocidad de dilución (donde Ceeds procrecimiento cuando la síntesis de la enzima cesa), y la tasa de inactivación y degradación por proteasas. Sin embargo, es la síntesis de enzimas que generalmente desempeña el papel más im- portante en la regulación, aunque proporcionando un medio más lentos de regulación de flujo a través de las vías metabólicas que hace la modificación de la actividad enzimática. Se puede considerar como un mecanismo de ajuste grueso, en lugar de

la sintonización fina proporcionada por las enzimas reguladoras, y es más difícil de revertir. Algunas enzimas son constantemente sintetizados y son componentes constitutivos de la célula, mientras que otros se sintetizan sólo cuando sea necesario. Incluso las enzimas constitutivas se producen a diferentes concentraciones, ya que algunos genes son más altamente expresados que otros. La expresión se controla por la fuerza de su promotor del gen, que se encuentra aguas arriba del gen estructural para la enzima. promotores fuertes son muy útiles en la ingeniería genética. Su fijación a genes heterólogos que se clonan en un organismo huésped por lo general garantiza un alto nivel de la expresión génica. Muchas enzimas catabólicas se regulan por inducción, ya que es eficiente para ellos pueden sintetizar sólo cuando sus sustratos están presentes, mientras que la síntesis de enzimas anabólicas se controla principalmente a través de la represión. Cuando una célula se acumula el exceso de producto final de una vía anabólica, tal como un ácido amino, o si un suministro de ese compuesto se encuentra en el medio ambiente, que responde en retardar o detener la síntesis de enzimas en la ruta biosintética para este producto. Un efecto más inmediato, como se discutió anteriormente, es que las enzimas reguladoras de esta vía se inhibe, lo que impide el flujo de carbono adicional innecesaria a través de la vía. La etapa de traducción de la síntesis de proteínas no AP- pera ser un punto de control importante en procariotas, pero puede ser de mayor importancia en organismos eucariotas. el control de la síntesis de la enzima en procariotas es normalmente a

(un) isoenzimas

yo1

(B) Concertado realimentac ión yo

(do) Acumulativo realimentac ión yo1

(re) Secuencial realimentaci ón yo

1

mi1a mi1b

1

m i1

yo2

mi1

yo

m i1

yo2

yo

2

mi2 yo3 mi3 e5 yo4 mi4

2

m i2

yo5 mi6

yo mi33 yo4 mi4

mi2

m i2

mi5

yo3 mi3

mi5

yo mi33

mi5

yo5 mi6

yo4 mi4

yo5 mi6

yo4 mi4

yo5 mi6

PAG1

PAG1

PAG1

PAG1

PAG2

PAG2

PAG2

PAG2

Higo. 3.19Ejemplos de control de la regeneración de las vías ramificadas (e = enzimas; I = intermedios, p = productos finales y las líneas discontinuas son los caminos de inhibición).

el nivel de transcripción (síntesis de ARNm). Los estudios sobre la inducción de la bgalactosidasa en E. coli han proporcionado una considerable cantidad de información sobre los mecanismos implicados. Esta enzima cataliza la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa, y no se sintetiza activamente si la lactosa no está presente. En ausencia de lactosa, una proteína represora, producido bajo la dirección de los genes reguladores, se une al operador re- gión del ADN, aguas arriba del gen estructural para bgalactosidasa, bloqueando así la síntesis de ARNm por la ARN polimerasa . Sin embargo, cuando el productor in-, lactosa (específicamente alolactosa), está disponible, se une de manera reversible a moléculas de represor, que cambia su forma para inactivar ellos. El cambio de la conformacional les impide la unión a la región del operador del ADN y permite la transcripción del gen de proceder. Para la síntesis enzimática controlada por la represión, ocurre lo contrario. Represores cambian a formas activas en presencia de un corepressor, lo que les permite unirse a la región del operador inhibiendo de este modo la transcripción. El corepressor es el metabolito cuya síntesis está controlada por la enzima y que efectivamente regula su propia producción. Por ejemplo, en la biosíntesis de triptófano, el exceso de triptófano actúa como un corepressor que activa la proteína represora. Cuando un metabolito se cataboliza o sintetizado por una serie de enzimas, por lo general es ventajoso para todas las enzimas de la vía que se conectan o desconectan al mismo tiempo. En las bacterias se logra más fácilmente esta acción coordinada como los genes para estas enzimas se encuentran a menudo juntos como un grupo en el cromosoma llamado un operón. Por ejemplo, la lactosa (lac) operón consta de tres genes estructurales para b-galactosidasa, b-galactósido permeasa y b-galactosidasa transacylase, cuya síntesis se controla simultáneamente tanto por la proteína represora lac y la proteína activadora de catabolitos (ver abajo). En eucariotas la situación es mucho más compleja, como los genes para las actividades relacionadas tienden a estar dispersos, en lugar de agrupados juntos como un operón.

síntesis de la enzima también puede ser controlado por un mecanismo de llamada atenuación, donde la regulación de la expresión génica es a través de la terminación de la transcripción, en lugar de control de la iniciación. Esto implica sitios de terminación dentro del operón que se traducen en ARNm truncado. la biosíntesis de triptófano, que implica un operón de cinco enzimas, se coordina a través tanto de la represión, como se mencionó anteriormente, y la atenuación.

Mecanismos de regulación general Regulación de la respiración y la fermentación

La respiración aeróbica y la fermentación pueden ser regulados por las condiciones ambientales, que incluyen la disponibilidad de oxígeno y azúcares. En condiciones aeróbicas, muchos organismos presentan una tasa más lenta de azúcar catabolismo a través de la glucólisis que cuando mantenido bajo condiciones anaero- bic. Esto es debido a un menor número de unidades de carbono tienen que ser metabolizado para obtener la misma cantidad de ATP, como la respiración aeróbica y asociado fosforilación oxidativa es considerablemente más eficiente que la fermentación. Esta supresión de la glucólisis por el oxígeno es un fenómeno de reglamentación contemplado como el efecto Pasteur, que es evidente sólo en concentraciones de azúcar bajo (menos de 5 mmol / L para algunas levaduras). El flujo a través de la glucólisis parece estar controlada principalmente por la fosfofructoquinasa enzima alostérica, que está regulado por las concentraciones relativas de ATP y AMP. Cuando las concentraciones de ATP caen en relación con AMP, la actividad enzimática aumenta. Varias levaduras exhiben un fenómeno aún más, el efecto de Crabtree, donde a altas concentraciones de azúcar, incluso en presencia de oxígeno, la fermentación anula

la respiración. En consecuencia, NADH generado a través de la vía de EMP se oxida principalmente por medios fermentativos en lugar de por la respiración mitocondrial. Esto puede explicarse por la saturación de la capacidad respiratoria limitado de organismos Crabtree positivas.

CARBONO represión catabólica

En muchos microorganismos para las enzimas catabolismo de la glucosa son constitutivas, mientras que las enzimas adicionales por lo general deben ser producidos para el catabolismo de cualquier otra fuente de carbono y energía. Si la glucosa está presente en el medio, junto con otros azúcares, siempre es la primera que se utilizará. El resultado es la utilización secuencial que la produce un diauxic (bifásica) patrón de crecimiento (Fig. 3.20). Esto se debe a la producción de enzimas para la absorción y la utilización de los otros azúcares, y varias otras enzimas, es reprimida por la glucosa o un producto inicial de su metabolismo. En algunos casos, es debido a la inactivación inducida por la glucosa de las enzimas clave; para otros, represión re- sultados de la captación de glucosa rápida, que hace que el nivel intracelular de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) a caer. Este compuesto importante está involucrado en el control positivo de muchas enzimas catabólicas, por ejemplo, el

Concentración inicial de cada azúcar Glucosa y lactosa concentración (G / L)

Crecimiento: celda números o biomasa concentración (log células / mL o mg / ml)

ATP + 12 ADP EC = AMP + ATP + ADP

Tiempo (h) clave:

Glucosa

LactoseGrowth

Higo. 3.20crecimiento diauxic de un microorganismo en una mezcla de glucosa y lactosa.

operón lac. cAMP es el activador de una proteína llamada proteína de catabolitos activador (CAP), que en el estado activo se une a un sitio dentro de la región promotora del gen. Sin ella, la ARN polimerasa es incapaz de unirse e iniciar la transcripción de genes. Por lo tanto, en ausencia de cAMP sólo las moléculas de la PAC inactivos están presentes y la transcripción no tiene lugar. Los niveles de cAMP se elevan sólo cuando la velocidad de transporte de glucosa en la célula cae por debajo de un cierto nivel. Aunque la glucosa se ha estudiado ampliamente los más, este fenómeno no se re- restringida a la glucosa, como han demostrado otros sustratos de carbono para actuar de una manera represiva similar. Catabolitos de carbono regulación del metabolismo primario proporciona una ventaja selectiva para el organismo, ya que modo se asegura el uso económico de la maquinaria metabólica. También juega un papel en el control del metabolismo secundario. Por ejemplo, la glucosa tiene un efecto represivo sobre la producción de muchos metabolitos secundarios, incluyendo bióticos antibióti(b-lactámicos y tetraciclinas) y algunos alcaloides. En

Si todo es ciclasa en la forma de ATP, el valor CE es 1.0 ( "completamente cargada"). Los valores para las células que crecen activamente están normalmente en el intervalo de 0,8 a 0,95. Las enzimas implicadas en la síntesis ATP tienden a ser inhibido a niveles altos de EC y, a la inversa, aquellas enzimas anabólicas que consumen ATP a menudo se estimularon si la CE es alta. La CE también puede jugar un papel en la regulación del metabolismo secundario. consecuencia, si la glucosa se utiliza como sustrato para su producción industrial, que tiene que ser alimentado en tasas bajas con el fin de superar este efecto represivo.

ADENILATO DE ENERGÍA

Adenilatos (ATP, ADP y AMP), tanto individual como colectivamente tienen importantes funciones de control dentro de la célula. La relación de carga total de energía de la adenilato (CE) de una célula se determina por la siguiente fórmula:

metabolismo secundario y su control metabolismo secundario se lleva a cabo por muchos hongos filamentosos tous, pero es bastante menos extendida entre las bacterias. Los microorganismos que producen metabolitos secundarios presentan dos fases durante el cultivo por lotes, el trophophase y idiophase (Fig. 2.1). Trophophase es la fase de crecimiento de una cultura y idiophase es el período siguiente cuando se forman los metabolitos secundarios. Producción con frecuencia comienza cuando activa el crecimiento ha cesado, a menudo como la concentración de sustrato limitante del crecimiento se acerca al valor de Ks para la cultura (véase el capítulo 2). El éxito de cualquier biosíntesis aún más en el idiophase depende de la trophophase pre cedente. metabolismo secundario durante la idiophase utiliza metabolitos primarios para producir especies específicas y químicamente diversos productos finales que no son esenciales para el crecimiento del microorganismo. Su producción consiste en las rutas metabólicas que no

se utilizan durante la fase de crecimiento, al menos no durante el crecimiento exponencial (Tabla 3.3). Estas vías son a menudo no tan bien caracterizados como aquellos para el metabolismo primario. Aunque el metabolismo secundario se puede demostrar fácilmente en cultivo discontinuo, que puede ser estudiado en sistemas continuos, ya que se produce a tasas bajas de dilución (crecimiento). Aquí, el metabolismo secundario se puede demostrar para operar al mismo tiempo que, y no después, el metabolismo primario. Gran parte de la energía puede ser gastado en la producción de metabolitos secundarios. Sin embargo, muchos de estos productos parecen no tener ninguna función metabólica reconocible para el organismo que produce, sin embargo, no se limita a poner fin a los subproductos del metabolismo, tales como productos de fermentación finales. Aquellos que realizan funciones específicas para su organismo productor incluyen sideramines (ferrichromes y ferrioxamines) y antibióticos ionóforos (macrote- tralides). Ambos grupos están implicados en la absorción de

mesa 3.3 Algunas rutas metabólicas implicadas en la producción de metabolitos secundarios por los hongos

Tabla 3.4 Algunos ejemplos de metabolitos secundarios industrialmente importantes y sus microorganismos productores

Secundario metabolitePathways Cornezuelo origen biosintético alkaloidsMixed (amino ácidoisoprenoide) GriseofulvinDerived a partir de 7 unidades de acetato a través de las vías de policétido giberélico acidDerived de mevalonato a través de vías isoprenoides galo acidDerived a partir de intermedios de la vía de shikimato kójico acidDerived directamente a partir de glucosa segundo-lactamsDerived partir de los aminoácidos L-a-ácido aminoadıpico (p.ej penicilina) d-cisteína y Lvalina

agrícola SIDA moniliforme

Giberelinas (hormonas vegetales) -Fusarium

analgésicos purpurea-

alcaloides del cornezuelo del centeno Claviceps

Los antibióticos chrysogenum

Cefalosporina (a b-lactámicos) -Acremonium La eritromicina (un macrólido) -Saccharapolyopora erythraea La penicilina (a b-lactámicos) -Penicillium chrysogenum estreptomicina (aminoglucósido) -Streptomyces griseus

contra el cáncer drugsAnthracycline antibióticos (por ejemplo adriamicina) -Streptomyces peucetius antibioticus actinomicina D-Streptomyces Bestatina-Streptomyces olivoreticuli Los alucinógenos

Ácido lisérgico-

Claviceps paspali Los inmunosupresores

inflatum

Ciclosporina-Tolypocladium pigmentos

trispora

carotenoides-Blakeslea Plástica

ácido kójico Aspergillus oryzae

toxinas

Difteria toxina Corynebacterium diphtheriae toxina Clostridium tetani tétanos Micotoxinas, por ejemplo, las aflatoxinas-hongos Aspergillus flavus

Úlcera tratamiento testaceus

Pepstatina (inhibidor de pepsina) -Streptomyces

cationes. Algunos compuestos pueden inhibir la competencia orga- nismos y otras como gramicidinas están asociados con la promoción de la formación de esporas. Por casualidad, muchos metabolitos secundarios exhiben propiedades que han demostrado ser muy útiles y se han convertido en los

principales productos microbianos industrial (Tabla 3.4). La síntesis de metabolitos secundarios es generalmente estrechamente regulada por la célula. Algunos mecanismos de regulación son comunes a ambos metabolismo primario y secundario, incluyendo ciclasa de las células CE y la represión catabólica por carbono. Las

fuentes de carbono que soportan altas tasas de crecimiento tienden a ser represiva; por ejemplo, glucosa suprime la producción de varios antibióticos INCLUYENDO penicilina y cloranfenicol.

el control adicional de metabolismo secundario es proporcionado por el siguiente. la síntesis de péptidos 1 no ribosomal. Normalmente, la síntesis de proteínas implica la transcripción del código genético de ADN a ARNm, que se traduce a continuación para formar un polipéptido por un ribosoma. Sin embargo, varios péptidos pequeños, tales como algunos antibióticos, se forman a través de un mecanismo alternativo, independiente de mRNA y ribosomes. El péptido se sintetiza por la acción del péptido sintetasas, a veces se hace referencia a las enzimas comprometidos como los antibióticos, producidas al final del crecimiento exponencial. Estas enzimas, en lugar de mRNA, actúan como la plantilla para la síntesis de péptidos. Por ejemplo, S gramicidina, producido por Bacillus brevis, se compone de dos

dímeros de pentapéptidos, y cada dímero se forma a partir de cuatro aminoácidos activados (derivados de amino-acilo). El otro aminoácido, L-fenilalanina, se activa por gramicidina sintetasa II y se convierte a la forma D. Este se transfiere luego a la gramicidina sintetasa I y los otros aminoácidos activados están vinculados a su vez para formar un pentapéptido. Dos dímeros de pentapéptidos entonces se combinan para formar la molécula de gramicidina S cíclico activo. péptido sintetasas similares están implicados en la síntesis de los compuestos antifúngico de equinocandina (un lipopéptido cíclico producido por Aspergillus nidulans) y ciclosporina (un undecapéptido de Tolypocladium inflatum). La ciclosporina es explotada como un inmunosupresor que se utiliza ampliamente en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y en la cirugía de trasplante. La sintetasa implicado en su formación es un gran polipéptido único con una masa molecular de 1.700.000 Daltons. 2 La autorregulación. Esto puede implicar pequeñas moléculas, tales como "factor A '(2 (S) -isocapryloyl-3- (S) - hidroximetil-g-butirolactona), que es producida por especies de Streptomyces. Ellos parecen funcionar como compuestos autorreguladores similares a las hormonas que esti- mular la formación de metabolitos secundarios. Factor A controla la biosíntesis de estreptomicina, resistencia estreptomicina y esporulación, y es eficaz a concentraciones tan bajas como 1 ¥ 10-9 prostituta. 3 regulación de producto final. Como en el metabolismo primario, los productos finales pueden jugar un papel en la inhibición de la retroalimentación de determinadas rutas metabólicas secundarias. Por ejemplo, el antibiótico cloranfenicol inhibe synthatase arilamina, una enzima implicada en la biosíntesis de cloranfenicol. 4 efectos inducibles. La producción de varios antibióticos es estimulada por la adición de compuestos inductor al medio de fermentación. Muchos inductores son metabolitos primarios; Por ejemplo, el aminoácido metionina induce la producción de cefalosporina en Acremonium chrysogenum (Cephalosporium). El ergolina alcaloide, que se produce por Claviceps purpurea, es estimulada por la adición de análogos de L-triptófano o triptófano al medio de cultivo durante la fase exponencial de crecimiento. 5 la regulación de nitrógeno y fosfato. Fácilmente metabolitos fuentes lizable de nitrógeno, por ejemplo, amoniaco, se ven a menudo para inhibir la producción

de metabolitos secundarios, como la penicilina. Además, la formación de candicidina, estreptomicina y la tetraciclina es inhibida por concentraciones de fosfato en exceso de 10 mmol / L. Por lo general, un máximo

nivel de 1 mmol / L de fosfato es necesario para garantizar que la inhibición no se produce. Este fenómeno puede estar asociado con cambios en la CE, que se ha demostrado ser influenciado directamente por la tasa de flujo de fosfato en algunas células. Una alta tasa de flujo aumenta la formación de ATP y eleva el CE en general. En ciertos casos, el ATP puede actuar como un corepressor en la síntesis de enzimas clave implicadas en la biosíntesis de metabolitos secundarios. Con el fin de obtener altos rendimientos de los metabolitos secundarios de las fermentaciones industriales, las condiciones ambientales que provocan estos mecanismos de regulación, en particular la represión y la inhibición de la retroalimentación, deben ser evitados. Si se utilizan los nutrientes potencialmente supresores, se les debe proporcionar a bajas tasas de subsuppressive. Además, superproductoras cepas mutantes se desarrollan a menudo para estos procesos.

Otras lecturas Papeles y comentarios Maden, BE (1995) No hay sopa para empezar? Autotrofia y los orígenes de metabolismo. Tendencias en Ciencias Bioquímicas 20, 337-341. Marianos, KJ (1992) la replicación del ADN procariótico. AnualRevisión de Bioquímica 61, 673-719.

Mitchell, P. (1961) de acoplamiento de la fosforilación y la transferencia de hidrógeno por un tipo de mecanismo de quimiosmótica. Naturaleza 191, 144-148. Russell, JB & Cook, GM (1995) Energética de origen bacteriano el crecimiento: el equilibrio de anabólicas y catabólicas reacciones. Opiniones de microbiología 59, 48-62. Sebald, M. & Hauser, D. (1994) Pasteur, el oxígeno y el anaerobios obe revisited. Anaerobio 1, 11-16. Shively, JM, van Keulen, G. & Meijer, WG (1998) algo casi de la nada: la fijación del dióxido de carbono en quimioautótrofos. Revisión Anual de Microbiología 52, 191-230. Tijian, R. (1995) Las máquinas moleculares que controlan los genes. Científico americano 258, 56-63.

Libros Baya, DR (ed.) (1988) Fisiología de Hongos Industriales. Publicaciones Científicas negro- así, Oxford. Caldwell, DR (1995) Fisiología y metabolismo microbiano. William C. Brown, Oxford. Danson, MJ, Hough, DW y Lunt, GG (1992) El arqueobacterias: Bioquímica y Biotecnología. PortlandPress, Londres. Dawes, IW y Sutherland, IW (1992) Fisiología Microbiana, Segunda edición. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Dickinson, JR y Schweizer, M. (eds) (1998) El Metabolismo

y Fisiología Molecular de Saccharomyces cerevisiae. Taylor & Francis, Londres. Griffin, DH (1994) Fungal Physiology, 2ª edición. Wiley, New York. Koch, AL (1995) el crecimiento bacteriano y la forma. Chapman & Hall, New York.

Grande, PJ y Bamforth, CW (1988) y metilotrofo Biotecnología. Longman, Harlow. Foso, AG & Foster, JW (1995) Fisiología Microbiana, 3ª edición. Wiley, New York. Walker, GM (1998) Fisiología y Biotecnología de la levadura. Wiley, Chichester.

Parte

2

Bioprocesamiento

4

microorganismos industriales

Microoorganisms se utilizan ampliamente para proporcionar una amplia gama de productos y servicios (Tabla 4.1). Han demostrado ser particularmente útil debido a la facilidad de su cultivo en masa, velocidad de crecimiento, el uso de sustratos baratos (que en muchos casos son residuos) y la diversidad de productos potenciales. Su capacidad para in- manipulación genética dergo también ha abierto fácilmente nuevas posibilidades casi ilimitadas para los nuevos productos y servicios de las industrias de fermentación. fermentaciones tradicionales se realizaron originalmente (y siguen siendo en algunos casos) por una mezcla de microorganismos silvestres que emanan de las materias primas o el medio ambiente local, por ejemplo, algunas fermentaciones de alimentos y bebidas alcohólicas. Los primeros intentos de mejorar los microorganismos implicados ocurrieron hace poco más de 120 años, cuando se aislaron por primera vez a partir de estos procesos como cultivos puros de la que a continuación se seleccionaron las cepas más útiles. Esos procesos de fermentación desarrollados durante los primeros 80 años del siglo 20 tienen monocultivos más utilizados. Los microorganismos específicos empleados a menudo eran aislados del medio natural, que implicó la selección aleatoria de un gran número de aislados. Alternativamente, los microorganismos adecuados fueron adquiridos de colecciones de cultivos (ver pág. 78). La mayoría de estos microorganismos, con independencia de su origen, fueron modificados posteriormente por las estrategias de mejora de cepas convencionales, utilizando programas de mutagénesis o de cría, para mejorar sus propiedades de uso industrial. Varios procesos desarrollados en los últimos 20 años han participado microorganismos recombi- nantes

y GY tecnologías de ingeniería genética cada vez más se ha utilizado para mejorar las cepas industriales establecidos. En la mayoría de los casos, las consideraciones regulatorias son de gran importancia la hora de elegir los microorganismos para uso industrial. industrias de fermentación a menudo prefieren utilizar establecida GRAS (generalmente considerado como seguro) microorganismos (Tabla 4.2), en particular para la fabricación de productos alimenticios e ingredientes. Esto se debe a que los requisitos para la aprobación del producto y el proceso utilizando una

"Nuevo" microorganismo son más estrictos y los costos asociados son mucho más altos. Cuando se utilizan los agentes patógenos y algunos microorganismos manipulados genéticamente (MMG) como el organismo productor, medidas de seguridad adicionales se deben tomar. se emplean las instalaciones de contención especiales y puede ser posible utilizar modificada ( «cripse declaró ') de las cepas que no pueden existir fuera del fermentador en- entorno (véase el capítulo 8).

Aislamiento de microorganismos adecuados desde el entorno Las estrategias que se adopten para el aislamiento de un microorganismo industrial adecuado del ambiente se pueden dividir en dos tipos, 'escopeta' y enfoques objetivos. En el enfoque de escopeta, muestras de microorganismos de vida libre, los biofilms o otras comunidades microbianas se recogen de los flujos de residuos animales y material vegetal, el suelo, las aguas residuales, el agua y, en particular, de los hábitats artificiales y naturales inusuales. Estas cepas se criban para rasgos deseables. La alternativa es tomar un enfoque más

objetivo mediante un muestreo de los sitios específicos donde se considera que los organismos con las características deseadas para ser componentes probables de la microflora natural. Por ejemplo, cuando Si se intenta aislar un organismo que puede degradar o desintoxicar un compuesto diana específico, los sitios pueden ser muestreados que se sabe que están contaminados por este material. Estas condiciones ambientales pueden seleccionar microorganismos capaces de metabolizar este compuesto. Una vez que se han recogido las muestras de un problema importante es decidir sobre los medios de cultivo y condiciones de cultivo que se deben utilizar para aislar los microorganismos diana. Un paso inicial es a menudo para matar o reprimir la proliferación de organismos comunes y fomentar el crecimiento de los raros. Los cultivos de enriquecimiento pueden entonces ser realizadas en cultivo discontinuo, o más a menudo de forma adecuada en los sistemas continuos. Esto alienta el crecimiento de aquellos organismos con los rasgos deseados y aumenta la cantidad de estos organismos objetivo, antes del aislamiento

75

Tabla 4.1 Ejemplos de productos de fermentación industrial y sus microorganismos productores Las bacterias Los productos tradicionales Pan, cerveza, vino y spiritsMainly Quesos, otros productos lácteos ácido productsLactic bacterias La maduración de azul y De tipo camembert quesos carnes y verduras fermentadas las bacterias del ácido láctico Mayormente Hongos Salsa de soja Sufu (cuajada de soja) Vinagre

Acetobacter especies

Productos agrícolas giberelinas fungici das Insecti Ensilaje

bacilo turingiensico Bacterias de ácido láctico

Aminoácidos L-glutamina L-lisina L-triptófano

Corynebacterium glutamicum Brevibacterium lactofermentum Klebsiella aerogenes

Las enzimas carbohidrasas unami lasa bamiloglucosi dasa glucosa isomerasa invertasa lactasa (b-galactosidasa) Celul asas Lipas as pecti nasas prote asas Combustibles y materias primas químicas Acetona but ano l Glic erol Meta Los nucleótidos 5 ¢ -Inosine monofosfato 5 ¢ -Guanosine monofosfato Ácidos orgánicos ac éti co fumárico gluc ónic o kó jic o

Bacillus subtilis Streptomyces olivaceus

levaduras y hongos filamentosos Saccharomyces cerevisiae Penicillium especies Agaricus bisporus, Lentinula edodes Aspergillus rouxii oryzae Zygosaccharomyces Mucor especies Fusarium moniliforme Coniothyrium minitans

Aspergillus niger Aspergillus niger Kluyveromyces especies cylindraceae Kluyveromyces lactis Trichoderma viride Candida Aspergillus wentii

Bacillus licheniformis miehei Aspergillus oryzae Rhizomucor Clostridium especies Clostridium acetobutylicum Zymomonas mobilis archaea metanogénicas

Saccharomyces cerevisiae Zygosaccharomyces rouxii

Bacillus subtilis Brevibacterium ammoniagenes xylinum Acetobacter

suboxydans Acetobacter Lactobacillus delbrueckii

Aspergillus niger lipolytica Yarrowia Rhizopus Aspergillus itaconicus Aspergillus flavus

Continuado

Tabla 4.1 continuado Las bacterias Productos farmacéuticos y compuestos relacionados alcaloides ergotamina ergometrina d-lisérgico ácido antibióticos aminoglucósid os estreptomicina Streptomyces griseus segundolactámicos penicilinas cefalosporinas clavulánico ácido Streptomyces clavuligerus lantibióticos nisina Lactococcus lactis Los macrólidos eritromicina erythraea Saccharapolyopora péptidos bacitracina Bacillus licheniformis gramicidina Bacillus brevis tetraciclinas clortetraciclina Streptomyces aureofasciens hormonas Hormona del Recombinante crecimiento Escherichia coli Insulina humano Recombinante Los inmunosupresores La ciclosporina El interferón Recombinante Los esteroides Escherichia coli Arthrobacter especies vacunas Bacillus Anthracis Clostridium tetani Recombinante Escherichia coli Salmonella typhi vitaminas Pseudomonas denitrificans segundo12 (Cianocobalamina) El ácido ascórbico suboxydans Acetobacter (vitamina C) Riboflavina Recombinantes de Bacillus subtilis polímeros Los alginatos Azotobacter vinelandii Celulosa xylinum Acetobacter dextrano Leuconostoc mesenteroides gellan Sphingomonas paucimobilis polihidroxibutirato Ralstonia eutropha pululano escleroglucano xantana Xanthomonas campestris proteína unicelular

capsulatus Methylococcus Methylophilus methylotrophus

levaduras y hongos filamentosos

Claviceps purpurea Claviceps fusiformis Claviceps paspali

Penicillium chrysogenum Acremonium chrysogenum

Recombinante Saccharomyces cerevisiae Recombinante Trichoderma polysporum Recombinante Saccharomyces Rhizopus especies cerevisiae

trispora Blakeslea gossypii Ashbya

Aureobasidium pullulans Sclerotium rolfsii Candida utilis venenatum Fusarium Kluyveromyces marxianus Paecilomyces variotii Saccharomyces cerevisiae

7 8

Capítulo

mesa 4.2 Ejemplos de microorganismos clasificados como GRAS (generalmente considerados como seguros) Las bacterias Bacillus subtilis Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis Leuconostoc oenos levaduras Candida utilis Kluyveromyces marxianus Kluyveromyces lactis Saccharomyces cerevisiae Los hongos filamentosos Aspergillus niger Aspergillus oryzae Mucor javanicus (Mucor circinelloides F. circinelloides) Penicillium roqueforti Nota: Normalmente, estos microorganismos no requieren pruebas adicionales si se utiliza bajo condiciones de cultivo aceptables.

y cribado. Sin embargo, este modo de selección es adecuada sólo para los casos en que el rasgo deseado proporciona una ventaja competitiva para los organismos. subsiguiente aislamiento como cultivos puros en medio de crecimiento sólido consiste en elegir o el desarrollo de los medios selectivos y condiciones de crecimiento apropiado. Una vez aislado como cultivos puros, cada uno debe ser examinados para la propiedad deseada; la producción de una enzima específica, compuesto inhibidor, etc. Sin embargo, en esta etapa el nivel de actividad o concentración del producto objetivo per se no es motivo de gran preocupación, ya que la aparición de cepas normalmente se puede emplear para mejorar notablemente el rendimiento. aislamientos seleccionados también deben ser examinados para otras funciones importantes, tales como la estabilidad y, en su caso, la no toxicidad. Estos procedimientos de aislamiento y detección se aplican más fácilmente a la búsqueda de un único microorganismo. Sin embargo, es mucho más difícil de aislar consorcios que en conjunto tienen la capacidad / característica que se busca y cuya composición puede variar con el tiempo. Tales grupos pueden ser más eficientes, en

particular cuando la capacidad de degradar un compuesto recalcitrante complejo está involucrado.

colecciones de cultivos colecciones de cultivos microbianos constituyen una rica fuente de microorganismos que son del pasado, el interés actual y potencial futuro. Hay cerca de 500 colecciones de cultivos en todo el mundo; la mayoría de ellas son pequeñas, especializadas

colecciones que suministran culturas u otros servicios relacionados únicamente mediante acuerdo especial. Otros, en particular las colecciones nacionales, edita catálogos inventario de los organismos mantenidos y ofrecen amplios servicios para las organizaciones industriales y académicos (Tabla 4.3). En el Reino Unido, por ejemplo, la Colección Nacional de Cultura (UKNCC) se compone de varias colecciones. Están alojados en establecimientos diferentes y tienden a especializarse en bacterias, levaduras, hongos filamentosos o las algas de importancia, ya sea industrial o médico; mientras que en los EE.UU. hay una colección principal centralizada, la American Type Culture Collection (ATCC), que posee todo tipo de microorganismos. Las funciones principales de una colección de cultivos son para mantener la colección existente, para continuar recogiendo nuevas cepas y para proporcionar muestras de cultivos puros, autenticadas de cada organismo. Los problemas de manteni- miento de cultivo han sido ayudados por el desarrollo y uso de la crioconservación y el secado por congelación (liofilización) técnicas, junto con los métodos de almacenamiento en miniatura. Un método conveniente consiste en la adsorción de células a perlas de vidrio (2 mm de diámetro) que pueden ser colocados en el almacenamiento congelado, de la que los granos individuales pueden ser retirados sin descongelar toda la muestra.

microorganismos

7

El uso de microorganismos seleccionados 9 de una cultura colectiva ción, obviamente, proporciona importantes ahorros de costes en comparación con el aislamiento del medio ambiente y tiene la ventaja de que ya se han realizado algunos caracterización del microorganismo. Sin embargo, la desventaja es que los competidores tienen acceso al mismo microorganismo.

cepas industriales y la mejora de cepas

1 2

3 4

6

8

Independientemente de los orígenes de un microorganismo industrial, lo ideal es que exhiben: estabilidad genética; la producción eficiente del producto diana, cuya ruta de la biosíntesis debe ser preferiblemente racterizado bien caracterizado; poca o ninguna necesidad de vitaminas y factores de crecimiento adicionales; utilización de una amplia gama de fuentes de carbono fácilmente disponibles a bajo costo y; 5 susceptibilidad a la manipulación genética; la seguridad, no patogenicidad y no debe producir agentes tóxicos, a no ser que este es el producto de destino; 7 cosecha listo de la fermentación; rotura listo, si el producto diana es intracelular; y

Tabla 4.3 Ejemplos de algunas colecciones de cultivos importantes útiles para los microbiólogos industriales * Cultura colección celebrada

Tipo de microorganismos

American Type Culture Collection (ATCC) Manassa, Virginia, USAAll Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Baarn, hongos NetherlandsFilamentous

y

levaduras Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) París, FranceAll Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture (DSMZ) Braunscheig, todos Alemania colecciones de cultivos microbianos del Reino Unido Colección de Cultivos de Algas y Protozoos (marina) (CCAP), Dunstaffnage Marina y protozoos (marino) Laboratorio, Oban Colección de Cultivos de Algas y Protozoos (de agua dulce) (CCAP), Instituto para protozoos Ecología de agua dulce (de agua dulce), Ambleside

Las algas Las algas y

Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC), Centre for Aplicado cultivos de células animales microbiológica de Investigación (CAMR), Porton Down CABI Bioscience Centro UK, Egham (anteriormente Internacional de Micología Institute) filamentosa

Colección

Nacional de hongos bacterias de los alimentos (NCFB), AberdeenFood

bacterias

Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas (NCIMB), Aberdeen Las bacterias (en general, industriales y marinas) Colección Nacional de hongos patógenos (NCPF), Laboratorio de Salud Pública, Bristol

hongos patógenos

Colección Nacional de bacterias fitopatógenas (NCPPB), Centro Ciencia Plantas bacterias patógenas de laboratorio, Sand Hutton, York Colección Nacional de Cultivos Tipo (NCTC), Central de Salud Pública Laboratorio, microorganismos médicos Colindale Colección Nacional de hongos que pudren la madera (NCWRF), Edificio ResearchWooddescomposición Establecimiento hongos, Watford Colección Nacional de cultivos de levaduras (NCYC), Instituto para la Alimentación Investigación, levaduras (Distintos de los agentes patógenos conocidos) Norwich * Para obtener una lista completa, véase el Centro Mundial de Datos de microorganismos.

9 producción de subproductos limitados para aliviar los problemas de purificación posteriores. Otras características que pueden ser explotadas son propiedades termófilas o halófilos, que pueden ser útiles en un entorno de fermentación. Además, en particular para las células cultivadas en suspensión, deben crecer bien en biorreactores convencionales para evitar la necesidad de desarrollar sistemas alternativos. En consecuencia, no deben ser sensibles al esfuerzo cortante, o

generan un exceso de espuma, ni propensos a la adhesión a las superficies.

mejora de cepas Nuevas mejoras cepa es una parte vital del proceso de de-

ser

desarrollo en la mayoría de las industrias de fermentación. Se proporciona un medio por el cual los costos de producción pueden reducirse mediante el aumento de la productividad o la reducción de los costes de fabricación. Ejemplos de algunos objetivos para la mejora de cepas se dan en la Tabla 4.4. En muchos casos la mejora de cepas ha sido acompa- plished usando métodos naturales de recombinación genética, que

reúnen elementos genéticos de dos genomas diferentes en una sola unidad para formar nuevos genotipos. Una estrategia alternativa es a través de mutagénesis. Esos binants ciones y mutantes se someten entonces a la detección y selección para obtener cepas cuyas características son adecuadas más específicamente al proceso de fermentación industrial. Sin embargo, tales cepas son poco probable que sobreviva

mesa 4.4 Ejemplos de objetivos para la mejora de las cepas Estabilidad genética crecimiento rápido No toxicidad para los seres humanos tamaño de células grandes, para facilitar la extracción del fluido de cultivo Capacidad para utilizar sustratos más baratos La modificación de la morfología sumergido Eliminación de la producción de compuestos que pueden interferir con el procesamiento aguas abajo des-represión catabólica por la desregulación de fosfato alteraciones de permeabilidad para mejorar las tasas de exportación de productos de resistencia de metabolitos Producción de enzimas adicionales compuestos para inhibir microorganismos contaminantes proteínas heterólogas que también pueden modificarse por ingeniería genética con el procesamiento aguas abajo "SIDA", por ejemplo, poliarginina colas (véase el capítulo 7, p. 122)

así en la naturaleza, ya que a menudo han alterado los controles reglamentarios que crean desequilibrios metabólicos. Además, a continuación, se deben mantener en un medio específico que seleccione para, y ayudar a retener, la característica especial (s).

recombinación natural

El ADN bacteriano es por lo general en la forma de un único cromosoma y plásmidos; estos últimos son auto-replicantes accesorios autónomas de ADN (Fig. 4.1). Cada plásmido lleva hasta unos pocos cientos de genes adicionales y puede haber un máximo de 1000 copias de un plásmido por célula. Contienen información genética que codifica para suplementario rasgos que no se encuentran en el ADN cromosómi- de la bacteria. A diferencia de la mayoría de los organismos eucariotas, bacterias no tienen forma de reproducción sexual. Sin embargo, son capaces de intercambiar material genético a través de los procesos de

*Cla yo

*Posterior III

*Bam HOLA

*Eco Rhode Island *sal yo resisten cia a la ampicili na

Te re

resisten cia tracyclin e

*pst yo

Origen de replicación

Higo. 4.1El plásmido pBR322, que contiene 4361 pares de bases y es un ejemplo típico de un vector de clonación (* sitios de restricción).

conjugación, transducción y la transformación. Conjugación implica el contacto de célula a célula, donde los contactos de donantes al destinatario con una estructura de la proteína filamentosa llamado un pilus sexo, que atrae a las dos células juntas. Las copias donantes todo o una parte de su medio o cromosómico plásmido de ADN y se lo pasa a través de la pilus al destinatario. En la transducción, un virus bacteriano (bacteriófago) actúa como un vector en la transferencia de genes BE- bacterias Tween. El bacteriófago se une a una célula bacteriana e inyecta su ADN en el huésped para incorporarse en el cromosoma del huésped. Durante la replicación del bacteriófago del fago puede adquirir piezas del ADN del huésped adyacente. Si los fagos van a introducir nuevos

anfitriones, que son capaces de integrar su ADN original, y los genes recogidos desde su anterior anfitrión, en el cromosoma del nuevo huésped. Los bacteriófagos, como plásmidos, también puede adquirir transposones, que son piezas de ADN que puede "saltar" de una pieza de ADN a otro, por ejemplo, de un plásmido a un cromosoma y viceversa. Los bacteriófagos pueden llevar a nuevas transposones en las células bacterianas anfitrionas, donde son capaces de "saltar" a un mediados plásmido o el ADN cromosómico del huésped. El tercer proceso, la transformación, implica la captación celular de una pieza desnudo de ADN a partir del medio circundante, que entonces se incorpora en la célula. En ambientes naturales es un proceso totalmente al azar, los fragmentos de ADN disponibles para la absorción que se derivan de las células que han lisadas. Los fragmentos de ADN pueden ser relativamente grandes y pueden contener varios genes. Sin embargo, son capaces de entrar y por lo tanto la transformación de las células

solamente los llamados 'competentes', que están en un estado fisiológico específico haciéndolos permeable al ADN. En eucariotas, la recombinación genética natural OC- curs durante la reproducción sexual. Nuevos genotipos resultan de la combinación de los cromosomas parentales y, como consecuencia de los acontecimientos de sobrecruzamiento durante la meiosis. El último implica la rotura de secciones de ADN cromosómi- y el intercambio de estos segmentos entre cromosomas homólogos para formar nuevas combinaciones. Algunos hongos industrialmente importantes, incluyendo Penicillium y Aspergillus, no tienen una verdadera fase sexual. Sin embargo, un ciclo parasexual ha proporcionado una vía por la que las nuevas cepas pueden ser producidos. Esto se promueve

cuando dos cepas haploides genéticamente diferentes se cultivan juntos, lo que permite la fusión de sus hifas. Estos acontecimientos dan lugar a la formación de un heterocarión, compuestas por núcleos de micelio que contiene derivados de cada cepa. formación directa de heterocariones ahora se puede realizar in vitro por protoplastos de fusión, que son células que han tenido sus paredes quitados. También, ciertos eucariotas, incluyendo algunas levaduras y hongos filamentosos, plásmidos autónomos sess posesiones, tales como el plásmido de 2 micras de Saccharomyces cerevisiae, que han demostrado ser útiles como vectores de la ingeniería genética (ver abajo).

Mutagénesis: UNA HERRAMIENTA convencional para la mejora de cepas

Las mutaciones son el resultado de un cambio físico en el ADN de una célula, tal como deleción, inserción, duplicación, inversión y translocación de una pieza de ADN, o un cambio en el número de copias de todo un gen o cromosoma. inyección sub de microorganismos a las repetidas rondas de mutagénesis, seguido por la selección y examen de los supervivientes adecuado, ha sido una herramienta muy eficaz en la mejora de muchos microorganismos industriales. Como mutantes pueden surgir de forma natural o ser inducida, que se considera que son el producto de eventos naturales. En consecuencia, hay menos problemas en la obtención de la aprobación de las autoridades reguladoras que cuando la tecnología del ADN recombinante se utiliza para desarrollar un microorganismo industrial. las tasas de mutación espontánea son bajos; en la mayoría de genes bacterianos, por ejemplo, la tasa es de aproximadamente 10 a 10por generación por gen. La tasa de mutación se puede aumentar en gran medida mediante el uso de mutágenos, que son de dos tipos. mutágenos físicos incluyen ultravioleta, radiación X gy ción; y mutágenos químicos son compuestos tales como sulfonato de etano metano (EMS), guanidina nitroso de metilo (NTG), ácido nitroso y mostazas de acridina. Los mutantes se forman cuando los mutágenos inducen modificaciones de las secuencias de bases de ADN que dan lugar a sustituciones de pares de bases, marco turno mutaciones o

deleciones grandes que van sin reparar. Mutagénesis también puede ser inducida utilizando transposones entregadas por un vector adecuado. Ellos producen mutantes de inserción cuya normal de nu- secuencia cleotide es interrumpida por la secuencia de transposón. Los métodos de mutagénesis por lo general tienen un uso bastante limitado, ya que logran principalmente ya sea la pérdida de una producción característica o el aumento indeseable de un producto, debido a la alteración de un mecanismo de control. Estos métodos tradicionales han empleado con éxito en la eliminación del color amarillo de la penicilina principios de preparación

las causadas por chrysogenin, un pigmento amarillo producidas por Penicillium chrysogenum. programas de mutagénesis han sido también muy eficaz en aumentar el rendimiento de la penicilina en cepas industriales del mismo organismo. Otros ejemplos notables de deterioro de los procesos de control, lo que resulta en mayores rendimientos de producto, se observan en varios microorganismos utilizados en la producción de aminoácidos. Más recientemente, se han desarrollado métodos para ES- Hance tanto la tasa de mutabilidad y la mutación general de genes específicos, con el fin de obtener el máximo cy cuencia de tipos de mutantes deseados. Esta mutagénesis dirigida obviamente requiere un conocimiento de los genes que controlan el producto objetivo y, a menudo un mapa genético de la orga- nismo. Además, la mutagénesis in vitro ahora se utiliza en combinación con la ingeniería genética (véase más adelante) para modificar genes aislados o partes de genes.

INGENIERÍA GENÉTICA DE MICROORGANISMOS

Durante los últimos 20 años el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante y métodos de fusión celular, tales como la formación de bridoma hi- anticuerpo monoclonal para la producción de (Capítulo 17), han tenido un impacto importante en microbiología industrial. En contraste con los procesos de recombinación naturales, ADN recombinante moderna tecnología de ofrece

oportunidades casi ilimitadas para la producción de nuevas combinaciones de genes. Estos métodos también son muy específicos y bien controlada, y una amplia gama de información genética está disponible en la mayoría al- cualquier ser vivo e incluso organismos extintos. Reco- tecnología de ADN binant ha permitido a las secuencias de genes específicos que deben transferirse de un organismo a otro y permite a los anunmétodos adicionales para ser introducidos en los sistemas de mejora de cepas. Esto se puede utilizar para incrementar el rendimiento del producto mediante la eliminación de cuellos de botella metabólicos en las vías y mediante la amplificación o modificación de etapas metabólicas específicas. En general, los procedimientos de ingeniería genética permiten totalmente nuevas propiedades que se añaden a las capacidades de los microorganismos industriales. Los microorganismos pueden manipulación RELAClONADAS de sintetizar y, a menudo excretan mejorados rangos de enzimas, que pueden facilitar la producción de nuevos compuestos o permitir la utilización de sustratos complejos más baratos. Como no hay ninguna restricción a los orígenes de los genes que expresan los microorganismos, se hace posible la producción de proteínas vegetales y animales. productos valiosos ya producidos incluyen la hormona del crecimiento humano, insulina y los interferones (véase el Capítulo 11). Sin embargo, estos métodos no han reemplazado totalmente

mutatagenesis métodos tradicionales y los dos enfoques deben ser vistos como estrategias complementarias para la mejora de cepas. Estrategias para la ingeniería genética de bacterias La ingeniería genética implica la manipulación de la banda de ADN fuera de la célula. Se requiere el aislamiento inicial y recupera- ción del gen (s) de interés desde el genoma del organismo donante. secuencias de ADN aislados pueden entonces ser modificados y la regulación de su expresión al- cados, antes de la inserción en organismos huésped a través de un sistema de vector fácilmente manipulado adecuado. El primer paso requiere la extracción de ADN total del organismo donante, que se corta en pequeñas secuencias utilizando una endonucleasa de restricción específica. Muchas de estas enzimas de restricción, que se encuentran en varias especies de bacterias, hacer un corte escalonado a través de una molécula de ADN de doble cadena en una secuencia específica o palíndromo (Fig. 4.2). Como resultado, los extremos de las moléculas de corte tienen secuencias de cadena simple complementarios. Las secciones pequeñas de ADN (fragmentos de restricción) a continuación, se pueden unir o empalmar en moléculas de ADN del vector que se han cortado con el mismo enzima de restricción. Splicing se lleva a cabo por una enzima, ADN ligasa, y crea una molécula de ADN sintético. Los plásmidos y bacteriófagos han sido los vectores de clonación más útiles. Juegan un papel importante como sistemas de administración para introducir las moléculas recombinantes en células huésped vía transformación o transducción. Una vez lado in- que son capaces de replicación autónoma, que mantiene el ADN recombinante dentro de la célula huésped. Introducción de plásmidos recombinantes en células bacterianas se puede lograr después de cloruro de calcio tratamiento, lo que hace que las membranas celulares más permeables al ADN. Después de la introducción de los plásmidos se replican de forma autónoma. En algunos casos, numerosas copias son pro-

producido en la célula huésped para aumentar la cantidad del ADN recombinante por célula. Los plásmidos pueden ser diseñados para contener marcadores genéticos seleccionables, tales como resistencia a los antibióticos re-, vitamina requisito, etc. Estos marcadores se pueden usar para seleccionar sólo aquellas células huésped que incorpora han valorado el plásmido durante la transformación, por ejemplo el plásmido pBR322 de 4,3 kb, ampicilina y llevar a los marcadores de resistencia a la tetraciclina (Fig. 4.1). Los bacteriófagos son vectores de clonación particularmente útiles como hasta la mitad de su genoma puede ser extraído o sustituido con ADN extraño. Esto se logra in vitro utilizando enzimas de restricción de una manera similar al plásmido manipu- lación. Los fragmentos de ADN adecuados son luego empaquetados en partículas de fago, que son capaces de infectar a un huésped seleccionado. La mezcla de fragmentos de restricción, procedente de un extracto de ADN de todo, una vez empaquetado dentro de fagos o plásmidos, se utiliza para transformar o transducir células huésped. Esto genera una biblioteca de ADN que consiste en clones individuales que contienen diferentes moléculas de ADN recombinantes, que representan todas las secuencias de ADN / genes del genoma donante. Una vez que la biblioteca ha sido establecido, los clones se les permite formar colonias en medios selectivos sólidos. En esta etapa, el clon específico contenedores ing la molécula de ADN recombinante de interés puede ser identificado. Si el gen extraño se expresa con éxito en la bacteria huésped y se hace una proteína heteróloga, la detección se puede lograr mediante el uso de una reacción de anticuerpo específico con la proteína. Alternativamente, si la proteína nant recombinación es una enzima que no se produce normalmente por el anfitrión, la actividad enzimática puede ser detectado. Limitaciones de huéspedes procariotas El procedimientos de ingeniería genética brevemente descrito anteriormente, y el ejemplo de una estrategia de clonación se describe en

Enzima

Fuente

sitio de restricción

Eco Rhode Island

Escherichia coli RY13

5 '- GAATTC - 3' 3 '- CTTAAG - 5'

Bam HOLA

Bacillus amyloliquefaciens MARIDO

5 '- GGATCC - 3' 3 '- CCTAGG - 5'

pst yo

Providencia stuartii 164

5 '- CTGCAG - 3' 3 '- GACGTC - 5'

Higo. 4.2Ejemplos de endonucleasas de restricción y sus sitios de restricción.

Higo. 4.3, son bastante simplista. En la práctica, la situación puede ser bastante más compleja. A menudo, todo el propósito de la clonación de un gen es la obtención de grandes cantidades de su producto. Si Escherichia coli se usa como el huésped y el gen in- introdujo no es de una cepa de E. coli, es decir, un gen heterólogo, que no puede ser expresado. Este problema puede superarse usando vectores de expresión en los que se inserta el gen extraño en una configuración que la pone bajo controles Atory regulreconocidas por el huésped. Además, para maximizar la producción de la proteína extraña, el vector de expresión debe replicar a un alto número de copias y ser estable. El gen extraño idealmente debería estar vinculada a un promotor fuerte que tiene una alta afinidad por ARN poli-

merasa y el ARNm transcrito se deben traducir de manera eficiente. A veces, puede ser ventajoso para la expresión del gen clonado para ser manipulado por colo- ing bajo el control de un conmutador de regulación, con el fin de que la producción de la proteína recombinante no se produce hasta que se requiera. Generalmente, las bacterias Gramnegativas son capaces de expresar genes de las bacterias Gram-positivas. Sin embargo, Lo contrario no siempre es tan fácil de lograr. Otros problemas también surgen si el objetivo es clonar genes y externas de prensa de un organismo eucariota en una bacteria como E. coli. Aquí las diferencias entre tic prokaryo- y la expresión de genes eucariotas hay que tener en

Fuente de ADN (a) digerir con enzimas de restricción

(b)ADN copia (ADNc) (c) sintético

cromosómico Donor

ADN

ARNm La transcriptasa inversa ssDNA ADN polimerasa

La adición de enlazadores

La inserción en un vector de plásmido

ADN ligasa

TetR

Higo. 4.3Esbozo de una estrategia para la clonación ADN en E. coli (después de Brown et al. (1987)). La fuente de ADN es generalmente de fragmentos de ADN de bacterias, o, para las fuentes eucariotas, sintético o de ADNc (derivado a través de la transcripción inversa de ARNm) se utiliza. El fragmento de ADN, de cualquier fuente, se liga en un vector plásmido que contiene marcadores adecuados; en este

Ap R

TetS

Restricción

caso, la resistencia a la ampicilina (ApR) Y tetraciclina (TetR). La ligadura es en el gen de resistencia a la tetraciclina que inactiva por lo tanto, (TetS). El vector se utiliza para transformar las células huésped. Todas las células transformadas con éxito exhibición

de Escherichia coli y enzima selección para ApR

La tra nsf orm aci ón de cél ulas

Cloruro de calcio células tratadas

ApR

Insertar Las colonias resistentes a Ap

Chapada en medios sólidos

resistencia a la ampicilina. Sin embargo, de ellos, sólo las células que contienen ADN extraño son sensibles a la tetraciclina. Los que contienen ADN extraño a continuación, se pueden cribar para el producto génico o gen deseado.

Los transformantes apantallado (transformantes) para la sensibilidad Tet transformantes sensibles Tet (es decir, que contiene ADN insertado) no forman colonias

cuenta. genes eucariotas contienen regiones no codificantes, intrones, lo que obviamente causar problemas si el gen se transfirió directamente a un sistema procariota. Sin embargo, los intrones se escinden durante procesamiento de ARN normal. Por consiguiente, el ARNm eucariotas se pueden utilizar para sintetizar un gen que puede funcionar dentro de un procariota. Esto requiere el uso de la transcriptasa inversa para generar una copia de ADN complementario o ADNc a partir del ARN. Alternativamente, si se conoce la secuencia de ácido secuencia génica de nucleótidos o aminoácidos de la proteína del producto, un gen sintético que se puede sintetizar. La secreción de proteínas recombinantes se prefiere a menudo para la estabilidad del producto y puede hacer procesamiento aguas abajo para recuperar el producto menos problemático. Sin embargo, se presenta un nuevo reto, ya que algunos organismos excretan más eficiente que otros. En las bacterias Gram-negativas, la secreción es a menudo en el espacio periplásmico en lugar de directamente en el medio, como las proteínas no pueden atravesar fácilmente su membrana externa. Para algunos propósitos, esto puede ser beneficioso, ya que a menudo simplifica el procesamiento corriente abajo. Cuando es necesario secreción en el medio, puede conseguirse mediante el uso de bacterias de la pared celular, menos (formas L). La secreción de proteínas es más complicada por el hecho de que deben ser sintetizados con una secuencia de aminoácidos adicional en su extremo Nterminal. Esta secuencia señal de 20-25 aminoácidos ayuda al paso de la proteína a través de la membrana celular y se elimina durante la secreción. Otros problemas generales en la expresión de proteínas heterólogo, que también se pueden encontrar con algunos huéspedes eucariotas (véase más adelante) incluyen: 1 la inestabilidad de ciertos productos de genes dentro del microorganismo huésped, lo que lleva a su rápida degradación por proteasas; 2 el plegamiento incorrecto del polipéptido que genera una molécula inactiva, que puede acumularse para formar cuerpos de inclusión dentro de la célula; y 3 dificultades para lograr la modificación post-traduccional de proteínas, tales como la escisión, la glicosilación o amidación.

Los huéspedes eucarióticos Una estrategia alternativa preferida para la expresión de genes eucariotas heterólogos es a menudo el empleo de un huésped eucariótico adecuado que, naturalmente, realizar cualquier modificación de la proteína después de la traducción necesaria y la secreción. Inicialmente, Saccharomyces cerevisiae era una opción popular porque es seguro y una vasta cantidad de información que se ha acumulado alrededor de su genética,

fisiología y el rendimiento en los procesos de fermentación industrial. Además, tiene una tasa de crecimiento relativamente rápido y fácilmente se somete a manipulación genética, pero a diferencia de eucariotas superiores (células animales y vegetales) esta levadura se cultiva fácilmente y de forma económica a una escala industrial. Varias proteínas eucariotas heterólogos se han producido con éxito en masa por S. cerevisiae. Sin embargo, los rendimientos del producto son relativamente bajos en el 1-5% de la proteína total y algunas proteínas son retenidos dentro del periplasma. Otras levaduras pueden ser mejores anfitriones, particularmente los Methylotrophs, Pichia angusta (anteriormente Hansenula polymorpha) y Pichia pastoris, que tienen una serie de ventajas sobre S. cerevisiae. Tienen fuertes promotores inducibles y son capaces de generar la modificación de proteínas después de la traducción similares a las realizadas por las células humanas. tratamiento aguas abajo también es menos problemática, ya que no secretan muchos de sus propias proteínas en el medio. P. angusta menudo ha sido preferido para aplicaciones industriales debido a una mayor versatilidad; ejemplos de productos heterólogos establecidos de esta levadura incluyen la vacuna de la hepatitis B, la enzima fitasa aditivo para la alimentación y la hirudina antitrombótico. Los avances en el campo del ADN recombinante tecnología están avanzando a una velocidad y clonación de genes rápido en las células animales y vegetales es ahora relativamente rutinaria. Por ejemplo, vectores basados en virus, como el virus

de papiloma bovino, los retrovirus y virus de simio 40 se utilizan para transformar de manera estable células de mamífero. La transformación de células de plantas dicotiledóneas se puede realizar utilizando plásmidos derivados de las bacterias del suelo Agrobacterium tumefaciens y A. rhizogenes. In vivo, A. tumefaciens induce tumores que implica su plásmido Ti, y A. rhizogenes induce la formación de raíces peludas, que está mediada por el plásmido Ri. Las proteínas individuales ahora pueden ser diseñados por Cambio de un componente de algunos ácidos amino con el fin de modificar sus propiedades, y existe la posibilidad de 'edificio en' características que ayudan a los procesos posteriores (véase el capítulo 7). Además, la secuenciación completa de muchos genomas microbianos, incluidos los organismos de grado de alimentos varios, está estimulando nuevos avances en la ingeniería metabólica. Ingeniería metabólica relativamente menor ya ha sido implementado para mejorar la producción de metabolitos existentes, permitirá la producción de nuevos metabolitos, impartir nuevas actividades catabólicas y mejorar el rendimiento de fermentación. Sin embargo, las redes metabólicas enteras dentro de un microorganismo pueden ahora ser reestructurado y tan extensa ingeniería metabólica tiene importantes implicaciones dentro de la microbiología industrial.

estabilidad de la cepa Un factor clave en el desarrollo de nuevas cepas es su estabilidad. Un aspecto importante de esto es los medios de conservación y almacenamiento de los cultivos de reserva de modo que sus atributos cuidadosamente seleccionados no se pierdan. Esto puede implicar el almacenamiento en nitrógeno líquido o liofilización. Las cepas transformadas por los plásmidos se deben mantener bajo selección continua para asegurar que el plásmido es retenido estabilización dad. La inestabilidad puede ser el resultado de deleción y reordenamientos de los plásmidos recombinantes, que es para denominar tanto a la inestabilidad estructural, o pérdida completa de un plásmido, denominado estabilidad de segregación. Algunos de estos problemas se pueden superar mediante una cuidadosa construcción del plásmido y la colocación de los genes esenciales dentro de ella. inestabilidad segregacional también se puede superar mediante la construcción de los llamados cepas suicidas que requieren marcadores específicos en el plásmido para la supervivencia. En consecuencia, plásmido libre de células mueren y no se acumulan en la cultura. Estas cepas se construyen con un marcador letal en el cromosoma y un represor de este marcador se encuentra en el plásmido. Las células expresan el represor siempre que poseen el plásmido, pero si se pierde las células expresan el gen letal. Sin embargo, la integración de un gen (s) en el cromosoma es normalmente la mejor solución, ya que supera muchos de estos problemas de inestabilidad.

Otras lecturas Papeles y comentarios Baneyx, F. (1999) expresión de la proteína recombinante en Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology 10, 411-421. Braun, P., Gerritse, G., van Dijl, J.-M. Y Quax, WJ (1999)La mejora de la secreción de proteínas por componentes de ingeniería de la maquinaria de la translocación bacteriana. Current Opinion in Biotechnology 10, 376-381. Cameron, DC y Chaplen, FWR (1997) La evolución de la ingeniería metabólica. Current Opinion in Biotechnology 8, 175-180.

Hochney, RC (1994) La evolución reciente de la producción de proteína heteróloga en Escherichia coli. Tendencias en Biotechnology 12, 456-463. Horikoshi, K. (1995) El descubrimiento de nuevas bacterias, con la vista puesta

aplicaciones biotecnológicas. Current Opinion in Biotechnology 6, 292-297. Nakayama, K. (1981) Las fuentes de microorganismos industriales. En: Biotecnología, Volumen 1 (eds H.-J. Rehm y G. Reed). VCH, Weinheim, pp. 355-410. Nielsen, J. (1998) El papel de la ingeniería metabólica en la producción de metabolitos secundarios. Current Opinion in Biotecnología 1, 330-336. Ogawa, J. & Shimizu, S. (1999): enzimas microbianas nueva aplicaciones industriales de los métodos de detección tradicionales. Trends in Biotechnology 17, 13-19. Roessner, CA & Scott, AI (1996) por ingeniería genética síntesis de productos naturales: desde Alcaloides a corrinas. Revisión Anual de Microbiología 50, 467-490. Stephanopoulos, G. (1994) Ingeniería metabólica. Current Opinion in Biotechnology 5, 196-200. Sudbery, P. E. (1996) La expresión de proteínas recombinantes en levaduras. Current Opinion in Biotechnology 7, 517-524.

Libros Anke, T. (1997) Biotecnología de hongos. Chapman & Hall, Londres. Brown, CM, Campbell, I. y Sacerdote, FG (1987) la Introducción a la Biotecnología. Blackwell Scientific Publications, Oxford.

Dale, JW (1998) Genética Molecular de Bacterias, 3ª edición. Wiley, Chichester. Demain, AL, Davies, JE y Atlas, RM (1999) Manual de Microbiología Industrial y Biotecnología. American Society for Microbiology, Washington, DC Drlica, K. (1997) DNA La comprensión y la clonación de genes, 3ª edición. Wiley, Chichester. Glazer, AN y Nikaido, H. (1995) Biotecnología Microbiana. WH Freeman, Nueva York. Glick, BR & Pasternak, JJ (1998) Molecular biotecnología gía: Principios y Aplicaciones de ADN recombinante, 2ª edición. ASM Press, Washington, DC Murooka, Y. y Imanaka, T. (eds) (1994) Los microbios recombinantes para aplicaciones industriales y agrícolas. Marcel Dekker, New York. Viejo, RW y la primavera, SB (1994) Principios de Gen manipu- ulación, 5a. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Peters, P. (1993) Biotecnología: una Guía de Genetic Engineering ing. William C. Brown, Dubuque, IA. Snyder, L. & Champness, W. (1997) Genética Molecular de Bacterias. ASM Press, Washington. Walker, GM (1998) Fisiología y Biotecnología de la levadura. Wiley, Chichester.

5

medios de fermentación

formulación de los medios La mayoría de las fermentaciones requieren medios líquidos, a menudo referida como el caldo, aunque algunas son operadas las fermentaciones-sustrato sólido. medios de fermentación deben satisfacer todas las necesidades nutricionales del microorganismo y cumplir los objetivos técnicos del proceso. Los nutrientes se deben formular para promover la síntesis del producto diana, ya sea la biomasa celular o un metabolito específico. En la mayoría de los procesos industriales de fermentación hay varias etapas que se requieren medios de comunicación. Pueden incluir varias inóculo (cultivo iniciador) pasos de propagación, fermentaciones a escala piloto y el principal de la fermentación de producción. Los objetivos técnicos de la propagación del inóculo y la fermentación principal son a menudo muy diferentes, lo que puede reflejarse en diferencias en sus formulaciones de medios. Donde la biomasa o metabolitos primarios son el producto objetivo, el objetivo es proporcionar un medio de producción que permita el crecimiento óptimo del microorganismo. Para la producción de metabolitos secundarios, tales como antibióticos, su biosíntesis no está relacionada crecimiento. En consecuencia, para este propósito, los medios de comunicación están diseñados para proporcionar un período inicial de crecimiento de las células, seguido por condiciones optimizadas para la producción de metabolitos secundarios. En este punto, el suministro de uno o más nutrientes (carbono, fósforo o fuente de nitrógeno) puede ser limitado y rápido crecimiento cesa. La mayoría de las fermentaciones, excepto las que implican sustratos sólidos, requieren grandes cantidades de agua en el que se

formula el medio. Requisitos generales de los medios incluir una fuente de carbono, que en prácticamente todas las fermentaciones industriales ofrece dos unidades de energía y carbono para la biosíntesis y fuentes de nitrógeno, fósforo y azufre. Otros elementos menores y traza también deben ser suministrados, y algunos microorganismos requieren la adición de vitaminas, tales como biotina y riboflavina. Fermentaciones aeróbicas dependen de un aporte continuo de oxígeno molecular, e incluso algunas fermentaciones anaeróbicas requieren aireación inicial de los medios de comunicación, por ejemplo, fermentación de la cerveza

86

ciones. Por lo general, los medios de comunicación incorporan tampones, o el pH es controlado por adiciones de ácidos y alcalinos, y pueden ser necesarios agentes antiespumantes. Para algunos procesos, precursor, inductor o compuestos inhibidores se deben introducir en ciertas etapas de la fermentación. El paso inicial en la formulación de los medios de comunicación es el examen del proceso global basado en la estequiometría para el crecimiento y formación de producto. Esto implica principalmente la consideración de la entrada de las fuentes de carbono y nitrógeno, minerales y oxígeno, y su conversión a la biomasa celular, productos metabólicos, dióxido de carbono, agua y calor. A partir de esta información que debería ser posible calcular las cantidades mínimas de cada elemento requerido para producir una cierta cantidad de biomasa o metabolito. Por lo general, el principal elemental fórmula de células microbianas es aproximadamente C4H7O2N, que sobre una base de peso seco es de 48% C, 7% H, 32% de O y 14% de N. La composición elemental de panadería levadura, por ejemplo, es C3.72 MARIDO6.11 O1.95 norte0.61 S 0,017 PAG0,035 y K Composición 0,056. elemental varía ligeramente con la tasa de

crecimiento, pero el rango es relativamente pequeño comparado con diferencias entre especies, particularmente entre bacterias y hongos. Idealmente, un conocimiento de la composición elemental com- pleta del microorganismo industrial específica permite refinamiento adicional de los medios. Esto asegura que ningún elemento es limitante, a menos que esto se desea para un propósito específico. Una vez se han establecido los requisitos elementales de un microorganismo, fuentes de nutrientes adecuados se pueden incorporar en los medios de comunicación para cumplir con estas demandas. Sin embargo, es importante ser conscientes de los posibles problemas que pueden surgir cuando se utilizan ciertos compuestos. Por ejemplo, los que se metaboliza rápidamente puede reprimir la formación de producto. Para superar esto, adición intermitente o continua de medio fresco se puede llevar a cabo para mantener una concentración relativamente baja que no es represivo. Ciertos nutrientes del medio o condiciones ambientales pueden afectar no sólo a la fisiología y la bioquímica, sino también la morfología del microorganismo. En algunas levaduras las células individuales pueden convertirse en

medios de fermentación

8 7

pseudo-micelio o floculado, y hongos 6 Los niveles y gama de impurezas, y el potencial para la generación de otros filamentosos pueden formar pellets. Esto productos no deseados durante el proceso. puede o no puede ser deseable, ya que tales cambios morfológicos pueden influir en el 7 implicaciones generales de salud y rendimiento del producto y otras propiedades seguridad. de fermentación. La composición final de los medios de Los medios de comunicación adoptada comunicación industrial no es únicamente la también dependen de la escala de la preocupación de la etapa de fermentación. fermentación. Para fermentaciones de sustratos de crudo proporcionan ahorros de laboratorio a pequeña escala de productos costos iniciales, pero sus niveles más altos de químicos puros se utilizan a menudo en impurezas pueden requerir ery y purificación medios bien definidos. Sin embargo, esto no peración más costosas y complejas aguas es posible para la mayoría de los procesos de abajo, y posiblemente aumento de los costos fermentación a escala industrial, simplemente de tratamiento de residuos. También, las debido a los costos, como componentes de propiedades físicas y químicas de los medios medios de comunicación pueden representar formulado pueden influir en las operaciones de hasta el 60-80% de los gastos del proceso. esterilización empleadas. Un medio que es fermentaciones a escala industrial fácilmente esterilizada con daño térmico principalmente usan sustratos complejos mínimo es de vital importancia. El daño rentables, donde muchos bon fuentes de térmico no sólo nitrógeno y car- son casi indefinible. La mayoría son derivados de materiales naturales de plantas y animales, a menudo subproductos de otras industrias, con una composición variada y variable. Los efectos de tales variaciones por lotes a lote deben ser determinados. ensayos a pequeña escala se suelen hacer con cada nuevo lote de sustrato, en particular para examinar el impacto en el rendimiento del producto y la recuperación del producto. Los principales factores que afectan a la elección final de las materias primas individuales son como sigue. 1 Costo y disponibilidad: idealmente, los materiales deben estar barato y de calidad constante y disponibilidad durante todo el año. 2 Manejabilidad en formas sólidas o líquidas, junto con transporte y almacenamiento de los costos asociados, por ejemplo, los requisitos para el control de la temperatura. 3 requisitos de esterilización y cualquier desnaturalización potencial problemas de racionamiento. 4 Formulación, mezcla, de complejos y las características de viscosidad que pueden influir en la agitación, la aireación y la formación de espuma durante las etapas de fermentación y procesamiento aguas abajo. 5 La concentración del producto objetivo alcanzado, su tasa de la formación y el rendimiento por gramo de sustrato utilizado.

8

Capítulo

reduce 5el nivel de ingredientes específicos, 8 pero pueden también Duce subproductos potencialmente inhibidoras pro- que también pueden interferir con el procesamiento aguas abajo. Otras características de medios pueden afectar a la recuperación del producto y la purificación, y la facilidad con que las células se separan del medio gastado (véase el capítulo 7).

Las fuentes de carbono Se requiere una fuente de carbono para toda la biosíntesis conduce a la reproducción, la formación de producto y mantenimiento celular. En la mayoría de las fermentaciones que también sirve como la fuente de energía. requisitos de carbono pueden ser determinadas a partir del coeficiente de rendimiento de biomasa (Y), un índice de la eficiencia de la conversión de un sustrato en material celular. Ycarbono (gg) =

biomasa producida (g) sustrato de carbono utilizada (g)

Para las fermentaciones comerciales de la determinación de los coeficientes de rendimiento para todos los otros nutrientes suele ser esencial. Cada uno se puede determinar mediante la realización de una serie de experimentos de cultivo por lotes en el que el sustrato específico es el único componente de medios que limita el crecimiento y el resto de los alimentos son en exceso (véase el capítulo 2). Mediante la variación de la concentración inicial de el sustrato limitante del crecimiento y, a continuación el trazado de crecimiento total

frente a la concentración de sustrato para cada lote, el rendimiento de crecimiento (Y) puede ser estimado. Sin embargo, el valor obtenido se refiere a un conjunto específico de condiciones de funcionamiento; variando el pH, la temperatura, etc., pueden alterar el coeficiente de rendimiento. Varios organismos pueden exhibir diferentes coeficientes de rendimiento para el mismo sustrato (Tabla 5.1), debido principalmente a la vía por la que se metaboliza el compuesto. Las diferencias también se pueden ver dentro de un individuo. Por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae cultivado en glucosa tiene coeficientes de rendimiento de biomasa de 0,56 y 0,12 g / g en condiciones aeróbicas y anaeróbicas, respectivamente. Como la mayoría de los sustratos de carbono también sirven como fuentes de energía, la eficiencia del organismo tanto de la generación de trifosfato de adenosina (ATP) y su utilización son factores clave observadores riormente adicionales. A menudo, es muy útil, aunque bastante difícil, para estimar la cantidad de ATP es necesaria para el crecimiento. Sin embargo, las estimaciones de YATP (rendimiento de células por mol de ATP generado durante el crecimiento) se pueden calcular si el metabolismo del organismo ha sido completamente aclarada (véase también el capítulo 14, la producción de proteína unicelular). Los hidratos de carbono son las fuentes tradicionales de carbono y energía para las fermentaciones microbianas, aunque pueden utilizarse otras fuentes, tales como alcoholes, alcanos y

Yglucosa crecimiento aeróbico Aspergillus nidulans 0.61 Candida utilis 0.510.68 Escherichia coli 0.52 angusta Pichia Penicillium chrysogenum 0.43 aeruginosa Pseudomonas 0.43 Pseudomonas species0.541.07 Saccharomyces cerevisiae 0.560.63 el crecimiento anaeróbico thermacetica Moorella Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Saccharomyces cerevisiae

Yetanol

Ymetanol

Yoctano

Tabla 5.1 Crecimiento rendimiento (Ycarbón) en medio mínimo más diversos de carbono y fuentes de energía

0.36

0.11 0.13 0.12 0.12 EXTRACTO DE MALTA

Ácidos orgánicos. Las grasas animales y los aceites vegetales también se pueden incorporar en algunos medios de comunicación, a menudo como suplementos a la fuente de carbono principal.

MELAZA

glucosa pura y sacarosa rara vez se utilizan para las fermentaciones a escala industrial, principalmente debido a los costos. Melaza, un subproducto de la producción de caña y de remolacha azucarera, es una fuente más barata y más habitual de sacarosa. Este material es el residuo que queda después de la mayor parte de la sacarosa se ha cristalizado a partir del extracto de la planta. Es un jarabe viscoso de color oscuro que contiene un 50-60% (w / v) de carbohidratos, principalmente sacarosa, con un 2% (w / v) nitroge- sustancias nous, además de algunas vitaminas y minerales. En general la composición varía dependiendo de la fuente de la planta, la ubicación del cultivo, las condiciones climáticas en las que se cultiva y la fábrica en la que se procesó. La concentración de hidratos de carbono puede reducirse durante el almacenamiento por microorganismos contaminantes. Un producto similar, melaza hidrol, también se puede utilizar. Este subproducto del procesamiento de almidón de maíz contiene principalmente glucosa.

Los extractos acuosos de cebada malteada se pueden concentrar para formar jarabes que son fuentes de carbono particularmente útil para el cultivo de hongos filamentosos, levaduras y actinomicetos. extracto de preparación es esencialmente el mismo que para la producción de mosto de malta en la elaboración de cerveza (Capítulo 12). La composición de los extractos de malta varía a

en cierta medida, pero por lo general contiene aproximadamente 90% de carbohidratos, sobre una base de peso seco. Este comprende un 20% de hexosas (glucosa y pequeñas cantidades de fructosa), 55% de disacáridos (principalmente maltosa y trazas de sacarosa), junto con el 10% de maltotriosa, un trisacárido. Además, estos productos contienen una variedad de dextrinas ramificados y no ramificados (15-20%), que pueden o no pueden ser metabolizados, dependiendo del microorganismo. Los extractos de malta también contienen algunas vitaminas y aproximadamente el 5% de sustancias nitrogenadas, proteínas, péptidos y aminoácidos. La esterilización de medios que contienen extracto de malta debe controlarse cuidadosamente para evitar el sobrecalentamiento. El constituyente azúcares reductores y aminoácidos son propensos a la generación de productos de la reacción de Maillard cuando se calienta a un pH bajo. Estos son

productos de condensación de color marrón resultante ing de la reacción de grupos amino de aminas, aminoácidos y proteínas con los grupos carbonilo de azúcares reductores, cetonas y aldehídos. Esto no sólo causa cambio de color, sino que también resulta en la pérdida de materiales fermentables y algunos productos de reacción puede inhibir el crecimiento microbiano.

Almidón y dextrinas

Estos polisacáridos no son tan fácilmente utilizados como monosacáridos y disacáridos, pero pueden ser metabolizados por microorganismos directamente amilasa productoras, en particular los hongos filamentosos. Su extracelular en- enzimas hidrolizar el sustrato a una mezcla de glucosa, maltosa o maltotriosa para producir un espectro de azúcar similar a la encontrada en muchos extractos de malta.

almidón de maíz es el más ampliamente utilizado, pero también puede obtenerse a partir de otros cultivos de cereales y raíces. Para permitir el uso de una gama más amplia de las fermentaciones, el almidón se suele convertir en jarabe de azúcar, que contiene principalmente glucosa. Se gelatiniza primero y luego hidrolizado por ácidos diluidos o enzimas amilolíticas, a menudo glucoamilasas microbianas que operan a temperaturas elevadas.

SULFITO RESIDUOS DE LICOR

El azúcar que contienen residuos derivados de la industria de fabricación de pasta de papel se utilizan principalmente para el cultivo de levaduras. licores residuales de árboles de coníferas contienen 2-3% (w / v) de azúcar, que es una mezcla de hexosas (80%) y pentosas (20%). Hexosas incluyen glucosa, manosa y galactosa, mientras que los azúcares de pentosa son en su mayoría xilosa y arabinosa. Estos licores derivadas de árboles de hoja caduca contienen principalmente pentosas. Por lo general, el licor requiere un procesamiento antes de su uso, ya que contiene dióxido de azufre. El bajo pH se ajusta con hidróxido de calcio o carbonato de calcio, y estos licores se complementan con fuentes de nitrógeno y fósforo.

CELULOSA

La celulosa se encuentra predominantemente como lignocelulosa en las paredes celulares de las plantas, que se compone de tres polímeros: celulosa, hemicelulosa y lignina (véase el Capítulo 10, Bio- conversión de lignocelulosa). Lignocelulosa está disponible a partir de productos agrícolas, forestales, industriales y desechos domésticos. Relativamente pocos microorganismos pueden utilizarlo di- rectamente, ya que es difícil de hidrolizar. El componente de celulosa es, en parte, cristalino, con incrustaciones de lignina, y proporciona poca superficie para el ataque enzimático. En la actualidad se utiliza principalmente en las fermentacionessustrato sólido para pro- ducir varios hongos (véase el Capítulo 14). Sin embargo, es potencialmente una fuente renovable muy valioso de azúcares fer- mentable vez

hidrolizadas, en particular en la bioconversión a etanol para uso como combustible (véase el Capítulo 10).

SUERO

El suero es un subproducto acuoso de la industria láctea. La producción mundial anual es de más de 80 millones de toneladas, que contiene más de 1 millón de toneladas de lactosa y 0,2 millones de toneladas de proteína de la leche. Este material es costoso de almacenar y transportar. Por lo tanto, los concentrados de lactosa a menudo se preparan para la fermentación después de la evaporación del suero de leche, después de la extracción de proteínas de la leche para su uso como complementos alimenticios. La lactosa es generalmente menos útiles como una

materia prima de fermentación de la sacarosa, como se metabo- lizó por un menor número de organismos. S. cerevisiae, por ejemplo, no fermentan la lactosa. Este disacárido se utilizó former- Ly ampliamente en fermentaciones de penicilina y todavía se emplea para la producción de etanol, proteína unicelular, ácido láctico, goma de xantano, la vitamina B12 y ácido giberélico.

Alcanos y ALCOHOLES

n- Alcanos de longitud de cadena C10-DO20 fácilmente se Me- tabolized por ciertos microorganismos. Las mezclas, en lugar de un solo compuesto, son generalmente más adecuados para las fermentaciones microbianas. Sin embargo, su uso industrial depende del precio vigente del petróleo. El metano se utiliza como una fuente de carbono por unos micro organismos, pero su producto de conversión de metanol se prefiere a menudo para las fermentaciones industriales, ya que presenta un menor número de problemas técnicos. metanol de alta pureza se obtiene lectura ily y es completamente miscible con agua. El metanol tiene un alto contenido de carbono por ciento y es relativamente barato, aunque sólo un número limitado de organismos se metabolizar. Además, a diferencia de muchas otras fuentes de car- bono, sólo bajas concentraciones, 0,1-1% (v / v), se toleran por microorganismos, siendo mayores niveles tóxicos. Durante las fermentaciones en metanol, la demanda de

oxígeno y el calor de la fermentación son altos, pero esto es aún más problemático cuando crecen en alcanos. Varias empresas utilizan metanol en la producción de proteína microbiana en la década de 1970 y principios de 1980, pero estos procesos son actualmente antieconómico (véase el capítulo 14, la biomasa microbiana). El etanol es menos tóxico que el metanol y se utiliza como un único o cosustrato por muchos microorganismos, pero es demasiado caro para el uso general como fuente de carbono. Sin embargo, su biotransformación a ácido acético por bacterias del ácido acético sigue siendo un importante proceso de fermentación (ver Capítulo 12, la fabricación del vinagre).

GRASAS Y ACEITES

grasas animales duros que están compuestos en su mayoría por glicéridos de ácidos palmítico y esteárico son raramente utilizados en las fermentaciones. Sin embargo, los aceites vegetales (principalmente a partir de semillas de algodón, semillas de lino, maíz, oliva, palma, semilla de violación y soja) y aceite de pescado de vez en cuando, se pueden utilizar como fuente de carbono primaria o suplementaria, especialmente en la producción de antibióticos. Los aceites vegetales son en su mayoría compuesto de ácidos oleico y linoleico, pero de linaza y aceite de soja también tienen una cantidad sustancial de ácido linolénico. Los aceites contienen más energía por unidad de peso que los hidratos de carbono. En

Además, los hidratos de carbono ocupa un volumen mayor, debido a que por lo general se preparan como soluciones acuosas de concentraciones no mayor que 50% (w / w). En consecuencia, los aceites pueden ser particularmente útiles en discontinuas alimentadas las operaciones, ya que se necesita menos capacidad de repuesto para acomodar más adiciones de la fuente de carbono.

Las fuentes de nitrógeno La mayoría de los microbios industriales pueden utilizar dos fuentes de nitrógeno orgánicas e inorgánicas. El nitrógeno inorgánico puede suministrarse como sales de amonio, sulfato de amonio y a menudo hidrógeno fosfato de diamonio, o amoníaco. El amoníaco también se puede utilizar para ajustar el pH de la fermentación. fuentes de nitrógeno orgánico incluyen aminoácidos, proteínas y urea. El nitrógeno se suministra a menudo en formas crudas que son esencialmente subproductos de otras industrias, como la maceración de maíz, extractos de levadura, tonos PEP-y harina de soja. aminoácidos purificados se utilizan sólo en situaciones especiales, por lo general como precursores para productos específicos.

LICOR DE MAÍZ FERMENTADO

Licor de maíz es un subproducto de la extracción de almidón de maíz y su primera utilización en fermentaciones era para la producción de penicilina en la década de 1940. La composición exacta del licor varía dependiendo de la calidad del maíz y las condiciones de procesamiento. Los extractos concentrados generalmente contienen alrededor de 4% de nitrógeno (v / w), incluyendo una amplia gama de aminoácidos, junto con las vitaminas y minerales. Cualquier azúcares residuales generalmente se convierten en ácido láctico (9-20%, w / v) por bacterias contaminantes. Licor de maíz a veces puede ser sustituido por licores similares, tales como los derivados de la producción de almidón de patata.

Los extractos de levadura

Levadura extractos pueden ser producidos a partir de levadura de cerveza de residuos Baker y, u otras cepas de S. cerevisiae. Las fuentes alternas son Kluyveromyces marxianus (anteriormente clasificado como K. fragilis) cultivadas en suero y Candida utilis cose- chada el uso de etanol o desechos del procesamiento de la madera y el papel. Esos extractos utilizados en la formulación de medios de fermentación son concentrados normalmente libres de sal de los componentes solubles de las células de levadura hidrolizada. Extractos de levadura con concentraciones de cloruro de sodio mayor que 0,05% (w / v) no se puede utilizar en los procesos de fermentación debido a los posibles problemas de corrosión.

Levadura hidrólisis de células se realiza generalmente mediante la autolisis, el uso de enzimas endógenas de la célula, por lo general sin la necesidad de enzimas hidrolíticas adicionales. La autolisis puede ser iniciado por la temperatura o choque osmótico, provoca que las células mueren, pero sin inactivar sus enzimas. La temperatura y el pH se controlan pasantes a cabo para garantizar un proceso de autolisis óptima y estandarizada. El control de temperatura es particularmente importante para evitar la pérdida de vitaminas. La autolisis se realiza a 50-55 ° C durante varias horas antes de que la temperatura se eleva a 75 ° C para inactivar las enzimas. Por último, las células se rompen por plasmolysis o rotura mecánica. materiales de la pared celular y otros residuos son eliminados por filtración o centrifugación y el extracto resultante se concentra rápidamente. Los extractos están disponibles como líquidos que contienen 50-65% de sólidos, pastas viscosas o polvos secos. Contienen aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua (Tabla 5.2) y un poco de glucosa, derivados de los hidratos de carbono de almacenamiento de levadura (trehalosa y glucógeno).

PEPTONAS

Peptonas son por lo general demasiado caro para las fermentaciones industriales a gran escala. Se preparan mediante hidrólisis ácida o en- enzima de fuentes contienen invariablemente cantidades relativamente grandes de hidratos de carbono.

COMIDA DE FRIJOLES DE SOYA

Los residuos que quedan después de las semillas de soja se han procesado para extraer la mayor parte de su petróleo se compone de 50% de proteínas, compuestos nitrogenados no proteicos 8%, 30% de carbohidratos y 1% de aceite. Esta comida de soja residual se utiliza a menudo en las fermentaciones de antibióticos debido a que los componentes se metabolizan lentamente, eliminando así la posibilidad de la represión de la formación de producto.

Agua Todos los procesos de fermentación, exceptosustrato sólido mentaciones fer-, requieren grandes cantidades de agua. En muchos casos también proporciona oligoelementos minerales. No sólo es el agua un componente importante de

materiales de alto contenido en proteínas: carne, caseína, gelatina, queratina, cacahuetes, harina de soja, semillas de algodón, etc. Sus composiciones de aminoácidos varían dependiendo de la fuente de proteína original. Por ejemplo, peptonas gelatin- derivados son ricos en prolina y la línea de hidroxipropilmetilcelulosa, pero son casi desprovista de aminoácidos que contienen azufre; mientras que peptona queratina es rico en prolina y la cistina, pero carece de lisina. Peptonas de origen vegetal

mesa 5.2 Proteínas y vitamina composición de extracto de levadura total proteínas, péptidos y aminoácidos (%, w / v) 73-75 amino libre acids35-40 péptidos de menos de 600 Da10-15 material por encima de 600 Da20-30 Vitaminas (mg / g) thiamin30 riboflavin120 niacin700 pyridoxine20 fólico acid30 calcio pantothenate300 biotin2.5 Nota: el contenido mineral varía con las distintas fases de elaboración utilizadas.

todos los medios de comunicación, pero es importante para los equipos auxiliares y limpieza. Una fuente fiable de grandes cantidades de agua limpia, de composición constante, es por lo tanto esencial. Antes de su uso, por lo general se requiere la eliminación de sólidos en suspensión, coloides y microorganismos. Cuando el suministro de agua es "dura", es tratado para eliminar las sales tales como carbonato de calcio. El hierro y el cloro también pueden requerir la extracción. Para algunos mentaciones fer-, especialmente la planta y cultivo de células animales, el agua debe ser altamente purificado. Agua es cada vez más caro, necessitat- al de su reciclaje / reutilización cuando sea posible. Esta mini-Mizes costos de agua y reduce el volumen que requiere tratamiento de las aguas residuales.

minerales Normalmente, una cantidad suficiente de cobalto, cobre, hierro, manganeso, molibdeno y zinc están presentes en los suministros de agua, y como impurezas en otros ingredientes de los medios. Por

ejemplo, licor de maíz fermentado contiene una amplia gama de minerales que por lo general va a satisfacer el menor y trazas de minerales necesidades. En ocasiones, los niveles de calcio, magnesio, fósforo, potasio, azufre y los iones cloruro son demasiado bajos para cumplir con los requisitos y éstos se pueden añadir en forma de sales específicas.

Las vitaminas y los factores de crecimiento Muchas bacterias pueden sintetizar todas las vitaminas necesarias a partir de elementos básicos. Para otras bacterias, filamentosas

hongos y levaduras, que deben ser añadidos como suplementos del medio de fermentación. La mayoría de las fuentes de carbono natural y nitrógeno también contienen al menos algunas de las vitaminas requeridas contaminantes como menores. Otros factores de crecimiento necesarios, aminoácidos, nucleótidos, ácidos grasos y esteroles, se añaden ya sea en forma pura o, por razones económicas, como menos costosos de plantas y animales ex tractos.

precursores Algunas fermentaciones deben complementarse con los precursores específicos, en particular para la producción de metabolitos secundarios. Cuando sea necesario, a menudo se añaden en cantidades controladas y en una forma relativamente pura. Los ejemplos incluyen ácido fenilacético o fenilacetamida añadido como precursores de la cadena lateral en la producción de penicilina. treonina d- se usa como precursor en la producción de L-isoleucina por marsescens Serratia, y las adiciones de ácido anthranillic se hacen para fermentaciones de la anomala Hansenula levadura durante la producción de L-triptófano.

Inductores e inductores Si la formación de producto es dependiente de la presencia de un compuesto inductor específico o un análogo estructural, debe ser incorporado en el medio de cultivo o se añade en un punto específico durante la fermentación. En cultivo de células vegetales la producción de metabolitos secundarios, tales como flavonoides y terpenoides, puede ser desencadenada por la adición de inductores. Estos pueden ser aislados de diversos microorganismos, en particular los patógenos de las plantas (véase el capítulo 17). Los inductores son a menudo necesarios en las fermentaciones de microorganismos modificados genéticamente (MMG). Esto se debe a que el crecimiento de los microorganismos modificados genéticamente puede verse afectada cuando los genes clonados se 'encienden', debido a los muy altos niveles de la transcripción y la traducción. En consecuencia, los sistemas inducibles para los genes clonados se incorporan que permiten la maximización inicial de crecimiento para establecer de alta densidad de la biomasa, después de lo cual el gen clonado entonces puede ser "activados 'por la adición del inductor químico específico.

inhibidores Los inhibidores se usan para redirigir el metabolismo hacia el producto objetivo y reducir

la formación de otros intermediarios metabólicos; otros detener una vía en un determinado punto para evitar un mayor metabolismo del producto objetivo. un ex

amplio de un inhibidor empleada específicamente para redirigir el metabolismo es bisulfito de sodio, que se utiliza en la producción de glicerol por S. cerevisiae (véase el capítulo 10). Algunos microorganismos modificados genéticamente contienen plásmidos que llevan un gen de resistencia a antibiótico, así como el gen de la (s) heteróloga. La incorporación de este antibiótico en el medio utilizado para la producción del producto heterólogo de manera selectiva inhibe las células sin plásmidos que podría surgir.

modificadores de la permeabilidad de la célula Estos compuestos aumentan la permeabilidad celular por las paredes celulares ING Modificar- y / o membranas, la promoción de la liberación de productos intracelulares en el medio de fermentación. Los compuestos usados para este propósito incluyen las penicilinas y tensioactivos. Se añaden con frecuencia a los amino ácidos de fermentación, incluidos los procesos para la producción de L-ácido glutámico usando miembros de la Mycobacterium Corynebacterium y Brevibacterium géneros (véase el Capítulo 10).

Oxígeno Dependiendo de la cantidad de oxígeno requerida por el orga- nismo, puede ser suministrado en forma de aire que contiene aproximadamente 21% (v / v) de oxígeno, u oxígeno puro en ocasiones como cuando los requisitos son particularmente altos. las necesidades de oxígeno del orga- nismo pueden variar ampliamente dependiendo de la fuente de carbono. Para la mayoría de las fermentaciones el suministro de aire o el oxígeno se esterilizó por filtración antes de ser ed inyectables en el fermentador.

antiespumantes Antiespumantes son necesarias para reducir la formación de espuma du- rante la fermentación. La formación de espuma se debe en gran medida a las proteínas de los medios pro- que se pegan a la interfaz de aire caldo donde se desnaturalizan para formar una espuma estable. Si no controlada de la

espuma puede bloquear los filtros de aire, lo que resulta en la pérdida de condiciones asépticas; el fermentador se vuelve contaminado y los microorganismos se liberan en el medio ambiente. De posiblemente más importancia es la necesidad de permitir 'francobordo' en fermentadores para proporcionar espacio para la espuma generada. Si se reduce al mínimo la formación de espuma, a continuación, se puede aumentar rendimientos. Hay tres posibles enfoques para controlar la producción de espuma: modificación de la composición medio, el uso de destructores de espumas mecánicas y la adición de antiespumantes químicos. antiespumantes químicos son agentes activos superficiales que reducen la tensión superficial que se une

la espuma juntos. El antiespumante ideal debe tener las siguientes propiedades: 1 fácil y rápidamente dispersada con una acción rápida; 2 alta actividad a bajas concentraciones; 3 acción prolongada; 4 no tóxico para los microorganismos, la fermentación personas o animales; 5 bajo costo; 6 termoestabilidad; y 7 compatibilidad con los componentes de otros medios de comunicación y el proceso, es decir, que no tiene efecto sobre las tasas de transferencia de oxígeno u operaciones de procesamiento aguas abajo. antiespumantes naturales incluyen aceites vegetales (por ejemplo, de soja, de girasol y de colza), aceite de pescado desodorizado, aceites minerales y de sebo. Los antiespumantes sintéticos son en su mayoría aceites de silicona, alcoholes de polietileno y glicoles alquilados. Algunos de estos pueden afectar negativamente a las etapas de procesamiento aguas abajo, especialmente la filtración de membrana.

nacido o de suero de caballo. Sera proporcionan una fuente de factores de crecimiento esenciales, incluyendo la iniciación y dores de fijación factor, y proteínas de unión. También suministran hormonas, oligoelementos y los inhibidores de proteasa. La composición muy compleja de sueros hace que la sustitución con ingredientes de menor costo muy difícil. La esterilización de medios de cultivo y animales formuladas constituyentes de los medios también es más problemático, ya que muchos componentes son termolábiles, lo que requiere la esterilización del filtro. Normalmente, los sueros constituye 5-10% (v / v) del medio, pero se han hecho intentos para reducir y finalmente eliminar su uso. Esto es necesario debido a su alto coste y el hecho de que es una fuente potencial de priones y virus. En algunas circunstancias los niveles ahora se han reducido a 1-2% (v / v) y algunas líneas celulares se han desarrollado que crecen en medio libre de suero.

medios de cultivo celular Animal

medios de cultivo celular de la planta

medios de cultivo de células animales se basan normalmente en medios basales complejas, tales como medio de cultivo celular de Eagle que contiene glucosa, sales minerales, vitaminas y aminoácidos. Para las células de mamífero por lo general se añade un suero, tal como suero fetal de ternero, suero de ternera, suero de ternero recién

En contraste con la mayoría de los medios de cultivo de células animales, las utilizadas para cultivo de células vegetales lo general son definidos químicamente. Ellos contienen una fuente de carbono orgánico (como la mayoría de las células vegetales se cultivan heterotróficamente), una fuente de nitrógeno,

sales minerales y hormonas de crecimiento. Sacarosa se frecuente- mente incorporada como la fuente de carbono, en particular para la producción secundaria metabolito, pero glucosa, fructosa, maltosa y lactosa incluso se han utilizado. El nitrato es la fuente de nitrógeno usual, a menudo suplementado con sales de amonio. Sin embargo, algunas especies pueden requerir nitrógeno orgánico, normalmente en forma de aminoácidos. La combinación y concentración de monas vegetales zontal proporcionadas dependen de la fermentación específica. Las auxinas son generalmente suministrados, así como citoquininas para promover la división celular. Un cultivo de dos fases a menudo ha demostrado ser útil en el aumento de la productividad, particularmente para la producción de metabolitos secundarios, tales como shikonin (véase el capítulo 17). La primera fase utiliza una formación de producto Medi um optimizado para el crecimiento, el segundo promueve.

medios de mantenimiento de la cultura Estos medios se utilizan para el almacenamiento y el subcultivo de las cepas industriales clave. Están diseñados para conservar una buena viabilidad celular y reducir al mínimo el posible desarrollo de la variación genética. En particular, deben reducir la producción de metabolitos tóxicos que pueden tener efectos de deformacióndesestabilizador. Si las cepas son inestables por naturaleza, deben ser mantenidos en medios selectivos para la característica específica que debe conservarse.

Otras lecturas Papeles y comentarios Blanch, HW y Yee, L. (1993) definen la optimización de los medios para el crecimiento de Escherichia coli recombinante X90. Biotecnología y Bioingeniería 41, 221-230. Kennedy, M. & Krouse, D. (1999) Estrategias para mejorar el rendimiento medio de fermentación: una revisión. Revista de Microbiología Industrial y Biotecnología 23, 456-475. Russell, JB & Cook, GM (1995) Energética de crecimiento bacteriano: Balanza de anabólicas y catabólicas reacciones. Microbiological Reviews 59, 48-62. Vardar-Sükan, F. (1992) La formación de espuma y su control. En: Avances recientes en Biotecnología (eds F. Vardar-Sükan y S. Suha-Sükan), pp. 113-146. Kluwer, Dordrecht.

Libros Atkinson, B. & Mavituna, F. (1991) Ingeniería Bioquímica y Biotecnología Manual, 2ª edición. MacmillanPrensa, Basingstoke. Blanch, HW & Clark, DS (1997) Ingeniería Bioquímica. Marcel Dekker, New York. Demain, AL, Davies, JE y Atlas, RM (1999) Manual de Microbiología Industrial y Biotecnología. Sociedad Americana de Microbiología, Washington DC Isaac, S. & Jennings, D. (1995) Cultura microbiana. BIOS tíficos cien- Publishers, Oxford. Stanbury, PF, Whitaker, A. & Hall, SJ (1995) Principios de la tecnología de fermentación, 2ª edición. Butterworth-Heinemann (Pérgamo), Oxford.

6

Los sistemas de fermentación

Los microbiólogos usan el término fermentación en dos contextos diferentes. En primer lugar, en el metabolismo, la fermentación se refiere a los procesos de generación de energía, donde los compuestos orgánicos actúan como donante de electrones y el aceptor (véase el capítulo 3). En segundo lugar, en el contexto de ology microbicidas industrial, el término también se refiere al crecimiento de las grandes cantidades de células en condiciones aeróbicas o anaeróbicas, dentro de un vaso se hace referencia como un fermentador o biorreactor. Además de su uso para el cultivo de células, y para biotransformaciones celulares y esporas vegetativas vivo, barcos similares se utilizan en los procesos que implican transformaciones de enzimas libres de células y mejorar movilizados. Sin embargo, aquí vamos a considerar fermentadores de origen microbiano, vegetal y cultivo de células animales. A pesar de que vamos a ser principalmente ex amining fermentadores convencionales, debe ser recordarse que, sobre todo con el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante, los sistemas alternativos para la producción de productos celulares específicos ya están disponibles. los anticuerpos monoclonales ya se extraen del líquido ascítico de roedores (véase el capítulo 17), las vacunas pueden ser producidas en la leche de oveja o en la fruta (por ejemplo, la biosíntesis de la malaria vacuna en bananas) y varios otros pro- ductos recombinante puede ser fabricado en plantas agrícolas. Aunque son operados fermentacionessustrato sólido (véase p. 105), la mayoría de las fermentaciones utilizan medios líquidos, a menudo referido como el caldo, en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Algunos, como cerveza y vino fermentaciones, son no agitado, no aireado y

no operan de forma aséptica (ver Capítulo 12), mientras que muchos otros se agitan, aireación ado y aséptica (Tabla 6.1). Las fermentaciones también se clasifican en líneas generales de acuerdo con la organización de la fase biológica (Tabla 6.2), ya sea en suspensión o en forma de una película de apoyo. Para el crecimiento en suspensión, las células se dispersan libremente en el crecimiento me- dium e interactúan como unidades individuales o floculadas. Estos sistemas pueden parecer simple, pero en realidad de nutrientes y oxígeno gradientes pueden desarrollar. En crecimiento sostenido, las células se desarrollan como un biofilm, normalmente en un material de soporte inerte y dan como resultado la formación de una comunidad interacción compleja de células. Soportado

94

sistemas de crecimiento se pueden subdividir en los procesos de película fija, en el que el medio fluye sobre el material de apoyo estática; y / sistemas expandido fluidizado, donde las partículas de material de soporte se suspenden en un medio líquido. Además, algunos microorganismos pueden crecer como películas superficiales no unidas en una interfase aire-líquido.

el diseño y la construcción fermentador La función principal de un fermentador es proporcionar un entorno adecuado en el que un organismo puede producir de manera eficiente un producto de destino que puede ser la biomasa celular, un producto metabolito o bioconversión. La mayoría están diseñados para mantener altas concentraciones de biomasa, que son esenciales para muchos procesos de fermentación, mientras que las estrategias de control dependen en gran medida del proceso en particular y de sus objetivos específicos. La realización de cualquier fermentador depende de muchos factores, pero los parámetros físicos y químicos clave que deben controlarse son la velocidad de agitación, la transferencia de oxígeno, pH, la temperatura y la producción de espuma. fermentaciones de laboratorio pueden realizarse en botellas o frascos cónicos que pueden ser

sacudidas para proporcionar la aireación cuando sea necesario. Estas embarcaciones están normalmente conectados con un algodón o un tapón de espuma de poliestireno para prevenir la contaminación microbiana, pero esto puede dar lugar a pérdidas por evaporación y el intercambio de gases restringidos. En consecuencia, incluso a escala de laboratorio, los vasos específicamente construct- ed para las fermentaciones son generalmente preferidos. Para procesos strial indu-, se utilizan fermentadores con capacidades de hasta varios cientos de miles de litros. Estos son en su mayoría propósito plantear construidos y diseñados para un proceso específico, aunque algo de flexibilidad puede ser necesaria en ciertos casos. Su diseño, calidad de la construcción, el funcionamiento y el nivel de sofisticación dependen en gran medida del organismo de producción, las condiciones óptimas de operación necesarios para la formación del producto de destino, el valor del producto y la escala de producción. consideraciones primordiales son la fiabilidad y la necesidad de reducir al mínimo la inversión de capital y gastos de funcionamiento.

Los sistemas de Tabla 6.1 Ejemplos de fermentaciones asépticas y no asépticas Aséptico aerobio célula animal y vegetal culturas alcaloides Aminoácidos La mayoría de los antibióticos La mayoría de la producción mayoría de las enzimas mayoría de los ácidos orgánicos proteínas de ADNr biotransformaciones esteroides algunas toxinas La mayoría de las vacunas La

9 5

No aséptico anaeró bica Aceton a butanol Etanol Glicero l Ácido láctico Alguna

aerobio

anaeróbica

Acétification de etanol en la producción de * Lavinagre maduración de algunos quesosde La producción hongosresiduales aguas aeróbico tratamiento

Bebidas alcohólicas; cerveza, vino, etc. * fermentaciones lácteos primarias la producción de * ensilaje aguas residuales anaeróbico tratamiento

mayoría de las vitaminas goma de xantano * Por lo general, una operación de limpieza refiere a menudo como "comercialmente estéril".

Tabla 6.2 Clasificación de las fermentaciones industriales de acuerdo con la organización de la fase biológica modo suspendido Las células individuales vasos cilindrocónicos Saccharomyces cerevisiae (cerveza) fermentador de transporte aéreo Methylophilus (Biomasa) methylotrophus reactor de tanque agitado Bacillus subtilis (enzimas)

modo soportado Flóculos y agregados reactor de lodos activados cultivo mixto (tratamiento de aguas de residuales) reactor tanque agitado Aspergillus niger (Producción de ácido de cítrico) reactor tanque agitado Penicillium (penicilina) chrysogenum

Gran volumen, productos de bajo valor que incluyen muchos de los productos de fermentación tradicionales, tales como bebidas alcohólicas, por lo general se producen utilizando fermentadores relativamente simples y pueden no funcionar en condiciones asépticas. A menudo hay menos riesgos al operar este tipo de

película fija Goteando generador debacterias película del ácido acético (Vinagre) filtros de goteo cultivo mixto (tratamiento de aguas residuales) fermentador de fibra hueca células animales (anticuerpos monoclonicos)

Películas sobre soportes fluidizado reactor de lecho fluidizado cultivo mixto (tratamiento de aguas reactor deresiduales) lecho fluidizado células animales (anticuerpos monoclonicos)

fermentaciones no asépticos a pH extremos o altas temperaturas, o cuando se utilizan sustratos protegidos. Estos son sustratos que algunos microorganismos se uti- lize. Sin embargo, la adhesión estricta a las buenas prácticas de manufactura reduce el riesgo de contaminación microbiana de cultivo puro fermentaciones (axénicos). Otros las

9

Capítulo

fermentaciones no implican inóculo un cultivo 6 puro y activamente

fomentar el desarrollo de microorganismos indígenas, por ejemplo, algunas fermentaciones de alimentos y el tratamiento de las aguas residuales. Por el contrario, la producción de fermentaciones de alto valor, productos de volumen relativamente bajo, especialmente farmacéuticos, invariablemente exigir sistemas más elaborados y operar bajo estrictas condiciones de asepsia. Tradicionalmente, fermentadores han sido cilíndrica abierta o recipientes rectangulares hechas de madera o de piedra. Algunos de éstos todavía se utilizan, sobre todo para ciertas fermentaciones de alimentos y bebidas. Sin embargo, la mayoría de las fermentaciones se realizan ahora en recipientes cerrados diseñados para excluir la contaminación microbiana. Estos fermentadores deben con-

soportar la esterilización repetida y limpieza, y debe ser construido a partir de mate- riales no tóxicos, resistentes a la corrosión. Pequeños recipientes de fermentación de unos pocos litros de capacidad se construyen a partir de vidrio y / o acero inoxidable. escala piloto al y muchos recipientes de producción normalmente están hechos de acero inoxidable con superficies internas pulidas, mientras que muy grandes fermentadores se construyen a menudo a partir de acero suave revestido con vidrio o plástico, con el fin de reducir el costo. Si se requiere una operación aséptica, todas las tuberías asociadas transporte de aire, el inóculo y nutrientes para la fermentación deben ser esterilizables, por lo general mediante vapor de agua. Normalmente, fermentadores hasta 1000 L de capacidad tiene una camisa externa, y los vasos más grandes tienen bobinas internas. Ambos proporcionan un mecanismo para la esterilización buque y control de la temperatura durante la fermentación. Como se dijo anteriormente, las fermentaciones pueden llevarse a cabo en condiciones no asépticas en los que no es una preocupación importante el riesgo de contaminación. Sin embargo, muchos fermentadores deben ser diseñados para un funcionamiento prolongado aséptica (Tabla 6.1). Las reglas de diseño para una demanda biorreactor aséptico que no hay contacto directo en- tre las secciones estériles y no estériles para eliminar la contaminación microbiana. Cualquier conexión con el fermentador debe ser adecuado para el tratamiento de vapor para matar los microorganismos residentes y los sistemas deben estar diseñados para permitir que la inoculación aséptica, el muestreo y la recolección. Cada parte individual debe ser de fácil mantenimiento, limpieza y vapor de forma independiente válvulas larmente, esterilizables particular. La mayoría de las operaciones de limpieza de recipientes están ahora automatizados utilizando chorros de agua, que se encuentran dentro de los vasos. Se dispersan de manera eficiente los líquidos de limpieza y este mecanismo de limpieza se conoce como la limpieza in situ (CIP). tuberías asociadas también debe estar diseñado para reducir el riesgo de contaminación microbiana. No debe haber tuberías horizontales o juntas innecesarias y espacios muertos donde el estancamiento de

material puede acumular, de lo contrario esto puede conducir a la esterilización ineficaz. La superposición de las articulaciones son inaceptables y conexiones de brida deben evitarse ya que la vibración y la expansión térmica puede producir desprendimiento de las articulaciones para permitir la entrada de contaminantes microbianos. Se prefieren las uniones soldadas a tope con las superficies interiores pulidas. Otras características que se deben incorporar son indicadores de presión y válvulas de presión de seguridad, que son necesarios durante la esterilización y funcionamiento. Las válvulas de seguridad evitan el exceso de presurización, reduciendo así los riesgos potenciales de seguridad. Ellos son por lo general en la forma de un disco de lámina metálica realizada en un soporte fijado en la pared del fermentador. Estos discos romperse a una presión especificada y presentan una

mucho menor riesgo de contaminación que las válvulas de muelle. Las bombas deben ser evitados si se requiere una operación aséptica, ya que pueden ser una fuente importante de contaminación. Las bombas centrífugas se pueden usar, pero sus sellos son rutas potenciales de contaminación. Estas bombas generan fuerzas de cizallamiento elevadas y no son adecuados para el bombeo de suspensiones de células sensibles al cizallamiento. Otras bombas utilizadas incluyen magnética, un chorro y bombas peristálticas. Los métodos alternativos de transferencia de líquido de alimentación son la gravedad o la presurización del vaso. En fermentaciones que operan a altas temperaturas o que contienen compuestos volátiles, un condensador esterilizable puede ser necesaria para evitar la pérdida por evaporación. Por razones de seguridad, es particularmente importante para contener cualquier aerosoles generan a dentro del fermentador por filtro de esterilización de los gases de escape. Además, fermentadores son a menudo operados bajo presión positiva para evitar la entrada de contaminantes. Sin embargo, esto puede no ser aplicable si se utilizan agentes patógenos o ciertos microorganismos de ADN recombinante (véase el capítulo 8).

Control de las condiciones químicas y físicas El concepto básico de un biorreactor es separar, mediante el uso de los límites, el medio ambiente de fermentación interna del ambiente externo. Por

lo tanto, cualquier cosa que ingresaron a o salir de la fermentación se puede supervisar y esto introduce la noción básica de 'energía y balances de masas'. Sin embargo, algunos parámetros en un sistema no pueden ser equilibrados. Estas son propiedades intensivas (temperatura, concentración, presión y calor específico) cuyas propiedades son independientes del tamaño del sistema, mientras que las propiedades extrinsive (masa, volumen, entropía y ener- gía) pueden equilibrarse. Por ejemplo, si se añade 10 g de agua a 30 ° C a 35 g de agua a 30 ° C, el agua resultante tiene una temperatura (propiedad intensiva) de 30 ° C no 60 ° C, pero la masa de agua (extrinsive propiedad) es aditivo a 45 g. Los parámetros clave son extrinsive masa y energía, en consecuencia, el número de átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno, etc., y la energía presente en el sistema en el inicio de la operación, y cualquier entrada adicional durante la fermentación, todos deben explicarse para al final del proceso. Si el inventario de masa y energía en el sistema en el equilibrio de salida y meta, entonces se entiende el sistema. Esto proporciona una poderosa herramienta de análisis, especialmente cuando se combina con la determinación de propiedades termodinámicas (transferencia de calor, la densidad, la reología y la temperatura) y ecuaciones de velocidad (biomasa

la producción, la utilización de nutrientes y la formación de producto de desecho). Juntos esta información se puede utilizar para construir modelos matemáticos y de ordenador que se pueden utilizar para supervisar y controlar las fermentaciones futuras.

Agitación La agitación de fermentaciones de células en suspensión se lleva a cabo con el fin de mezclar las tres fases dentro de un fermentador. La fase líquida contiene nutrientes disueltos y los metabolitos, la fase gaseosa es predominantemente de oxígeno y dióxido de carbono, y la fase sólida se compone de las células y los sustratos sólidos que pueden estar presentes. de mezclado debe producir condiciones homogéneas y nutrientes pro- mover, el gas y la transferencia de calor. La transferencia de calor es necesario durante la esterilización y para el mantenimiento de la temperatura durante el funcionamiento. una mezcla eficaz es particularmente importante para la transferencia de oxígeno en mentaciones feraeróbicos, ya que los microorganismos pueden tomar oxígeno sólo de la fase líquida. Transferencia en el líquido de la fase gaseosa se ve reforzada por la agitación. prolonga

la retención de burbujas de aire en suspensión, reduce el tamaño de la burbuja para aumentar el área superficial para la transferencia de oxígeno, los respiraderos pre burbuja coalescencia y disminuye el espesor de la película en la interfase gas-líquido (ver p. 99, aireación). Sin embargo, el mantenimiento de condiciones de cizallamiento adecuados durante la fermentación es muy importante, debido a que ciertos sistemas de agitación de alto cizallamiento se desarrollan que pueden dañar las células sensibles al cizallamiento. Por el contrario, los sistemas de bajo cizallamiento pueden dar lugar a la floculación o el crecimiento celular no deseado en las superficies, tales como en las paredes del vaso, agitador y electrodos. agitación del fermentador requiere una entrada considerable de energía y hay tres mecanismos principales que pueden ser utilizados. 1 reactores de tanque agitado (ROS) tiene agitadores ING mecánicamente MOV o impulsores dentro de un recipiente cilíndrico desconcertado (Fig. 6.1). Los deflectores son generalmente placas verticales planas cuya anchura es aproximadamente una décima parte del diámetro del vaso. Normalmente, 46 deflectores se colocan en las paredes de los vasos en el interior para facilitar la transferencia de mezclado y la masa mediante el aumento de la turbulencia, lo que impide la formación de torbellinos y la eliminación de espacios muertos ''.

gases de escape estériles La adición puerto sello del eje agitador

en

Vapor de agu El aire estéril

Chaqueta externa

Estéril filtro

El vapor de entrada / salida del agua deflector

eje del agitador Disc impulsor de turbina

rociador

Higo. 6.1Diagrama de un reactor de tanque agitado.

puerto de la cosec ha

Aire en

los gases de escape fuera estériles

Aire en

Poner a secar

ng r cabo

Cooli finales

enfriador medio externo

tubo Calado (tubería vertical)

Enfriamiento agua en Bomba

El aire estéril en

La figura

Higo. 6.3Un fermentador profundo-jet.

Higo. 6.2Un diagrama que ilustra el principio de un fermentador de puente aéreo.

ROS son los vasos más comúnmente utilizado y se han adoptado para una amplia gama de procesos de fermentación pro-. Dentro de cada recipiente el impulsor está conectado a un motor externo que acciona el sistema de agitador. El conjunto agitador, incluyendo el sello, es a menudo una fuente potencial de contaminación. Para evitar este problema, el eje tiene que pasar en el fermentador a través de un conjunto de sellos asépticas. Existen regulaciones específicas con respecto a los números y tipos de sellos. Para ciertas fermentaciones, se requieren dos o tres juntas para reducir al mínimo el riesgo de contaminación del fermentador, y la liberación de los microorganismos y sus productos en el medio ambiente. La eficacia de la agitación depende del signo de- de las palas del impulsor, la velocidad de agitación y la profundidad del líquido. La mayoría de los RTS tienen relaciones de altura-diámetro de aspecto de 3: 1 o 4: 1. RTS deben crear alta turbulencia para mantener las tasas de transferencia, pero esto también genera con- fuerza de cizallamiento considerable que es perjudicial

para ciertas células. Por ejemplo, muchas células animales y vegetales son sensibles y agitación excesiva cizalla puede dar lugar a disrupción celular. En estos casos los ROS pueden ser inadecuados sin modificación, y el transporte aéreo o pueden preferirse reactores de biopelículas compatibles. 2 Los sistemas neumáticos, Tales como fermentadores de transporte aéreo, no tienen partes móviles y el uso de la expansión del gas comprimido

para llevar a cabo la mezcla (Fig. 6.2). Estos sistemas tienen menores requerimientos de energía y generan menos cizalladura de los RTS. movimiento del líquido es iniciada por la inyección de aire comprimido en la parte inferior de la columna de riser interno o externo y las burbujas de aire se expanden en el tubo ascendente haciendo que el movimiento ascendente del líquido y el inicio de su bicicleta en el fermentador. Incluso grandes fermentadores no requieren serpentines de refrigeración internos como una chaqueta puede Noruega Mally proporciona suficiente transferencia de calor, debido al rápido movimiento del líquido dentro del recipiente. 3 mecanismos hidrodinámicos utilizar la energía cinética de líquido para mezclar el contenido del fermentador, que se consigue mediante el uso de una bomba de líquido externo para la circulación y

la reinyección externo, por ejemplo, fermentadores de profundidad de chorro (Fig. 6.3). La mezcla de nutrientes y el intercambio gaseoso dentro de cualquier fermentador es compleja. Está influenciada por la densidad media y la reología, el tamaño y la geometría del recipiente, y la cantidad de energía utilizada en el sistema. RTS tiene agitadores con múltiples impulsores para dar un entorno homogéneo bien mezclada. Sin embargo, en realidad, las condiciones no uniformes prevalecen normalmente en buques de más de 500 L de capacidad. Los patrones de flujo de movimiento del fluido en estos tanques agitados pueden ser de dos tipos, NAR estratificado y de flujo turbulento, como una función del número de Reynolds (Re) del impulsor.

fuerzas de re = inercia fuerzas viscosas Flujo laminar y turbulento se caracterizan por alta y baja Re, respectivamente. El valor Re que marca la transición entre los dos regímenes depende de la geometría de la turbina y de los vasos. El Re es un ejemplo de una variable natural o dimensión número sionless, cuya magnitud, a diferencia de las variables importantes (longitud, masa, volumen, temperatura, etc.), no requiere de unidades. Esto es porque las dimensiones del numerador cancelan exactamente las del denominador, tales como razones de variables sustanciales, por ejemplo, la relación de aspecto de un cilindro (longitud dividida por el diámetro). análisis adimensional se utiliza ampliamente para la solución de problemas en ingeniería química / bioquímica y es particularmente útil aquí, donde dichas hidrodinámica complejos están asociados con los procesos de transferencia físicas que operan dentro de un fermentador. En cultivo líquido el comportamiento reológico, propiedades de flujo de fluidos, son de vital importancia, ya que tienen un impacto importante en la mezcla y la transferencia de masa, en particular para la transferencia de oxígeno en las fermentaciones aeróbicas. Cuando los fluidos se agitan que pueden comportarse como sigue. 1 newtoniano fluidos, que obedecen a la ley de visco sidad de Newton. Su viscosidad no varía con cizallamiento o velocidad de agitación. La viscosidad del fluido o la resistencia del fluido al flujo (h) esfuerzo cortante o fuerza = por la velocidad de cizallamiento unidad área o gradiente de de velocidad 2 No newtoniano líquidos, cuya viscosidad varía con velocidades de cizallamiento o agitación. Por ejemplo, los fluidos pseudoplástico exhibición disminuir la viscosidad aparente con la velocidad de cizallamiento ING o agitación creciente, mientras que en las soluciones dilatantes ocurre lo contrario. Para comportamiento Bingham-plástico, el flujo no se produce a menos que una tensión se impone primero. 3 viscoelástico fluidos, los cuales no respetan las propiedades normales del estado liquidez cuando se agitan, como algunos polímeros.

Muchos fermentaciones bacterianas y por hongos exhiben las características del fluido Tonian nacidos. cultivos de micelio, y los que implican sustratos y productos poliméricos, particu- larmente geles de polisacáridos (por ejemplo xantana), a menudo presentan propiedades no newtonianos que inhiben el flujo de alta diná- mica dentro del fermentador. Sin embargo, pocos las fermentaciones se comportan como soluciones viscoelásticas.

Transferencia de calor En el diseño del fermentador, transferencia de calor es importante

eficiente

en el control de la temperatura durante las operaciones de esterilización y mantener la temperatura de funcionamiento requerida en toda la operación de fermentación. El calor generado en la fermentación se debe principalmente a la actividad meta- bólico de microorganismos y procesos de agitación mecánica mecánicas. Para la mayoría de las fermentaciones este calor debe ser disipado por enfriamiento. Por el contrario, para las fermentaciones que operan por encima de la temperatura ambiente, tales como aquellos que involucran organismos termófilos, es necesario que haya una entrada de calor. La transferencia de calor se logra principalmente mediante una camisa exterior que rodea a la fase interna o por medio de serpentines internos. No existe ningún contacto directo entre el sistema de refrigeración / calefacción y el medio de fermentación. El calor es conducido a través de los vasos de paredes, las bobinas y los deflectores. Estos sistemas también se utilizan para esterilizar el recipiente y el contenido antes de la inoculación, mediante la inyección de vapor ized presurización (ver p. 104, esterilización). Control automático de temperatura durante la fermentación se lleva a cabo mediante la inyección de agua, ya sea frío o caliente en la cubierta exterior y / o serpentines internos. En algunas circunstancias se pueden utilizar medios alternativos de refrigeración, por ejemplo, glicol.

Transferencia de masa

Transferir de los nutrientes de la fase acuosa a las células microbianas durante la fermentación es relativamente sencillo ya que los nutrientes se proporcionan normalmente en exceso. Sin embargo, la transferencia de oxígeno en fermentaciones aeróbicas es bastante más compleja.

AIREACIÓN

Algunas fermentaciones operan en condiciones anaerobias, pero la mayoría son aeróbicos y requieren el suministro de grandes cantidades de aire u oxígeno normalmente estéril que deben ser dispersados por todo el fermentador. La aireación es también útil para purgar productos metabólicos volátiles no deseados del medio. El aire comprimido que entra un fermentador por lo general se despojó de la humedad y los vapores de aceite que pueden originarse en el compresor. Para evitar el riesgo de contaminación, los gases introducidos en el fermentador se deben pasar a través de un filtro estéril. Un filtro similar en el sistema de escape de aire evita la contaminación del medio ambiente. Estéril aire u oxígeno normalmente filtrada entra en el fermentador a través de un sistema rociador, y las tasas de flujo de aire para grandes fermentadores rara vez excede de 0,5-1,0 volúmenes de aire por volumen de medio por minuto (vvm). Para promover la aireación en tanques agitados, el rociador normalmente se encuentra directamente debajo del agitador.

Los sistemas de estructura de rociador puede afectar a la transferencia total de oxígeno en el medio, ya que influye en el tamaño de las burbujas de gas producidas. Las pequeñas burbujas son deseables debido a la más pequeña de la burbuja, mayor es la relación de superficie a volumen, lo que proporciona una mayor transferencia de oxígeno. Sin embargo, los rociadores con poros pequeños que son eficaces en la producción de pequeñas burbujas de aire son más propensos a la obstrucción y requieren una entrada de energía más alto. El oxígeno es poco soluble en solución acuosa y la solubilidad disminuye a medida que aumenta la temperatura. Esto se suma a las otras dificultades, en particular las causadas por el gran volumen del recipiente, en el que habrá regiones en donde la mezcla es menos eficiente. Cuando se usan altas concentraciones de biomasa para aumentar la pro- ductividad también crea una enorme demanda de oxígeno. En consecuencia, la operación de los procesos aeróbicos es generalmente más exigente, ya que es difícil evitar que el oxígeno se convierta en un factor limitante de la velocidad. la transferencia de oxígeno es complejo, ya que implica un cambio de fase de la fase gaseosa a la fase líquida, y está influenciada por los siguientes factores. 1 las condiciones físicas imperantes; la temperatura, la presión y la zona segura de la superficie de las burbujas de aire / oxígeno; 2 la composición química del medio; 3 el volumen de gas introducido por unidad de volumen del reactor por unidad de tiempo; 4 el tipo de sistema rociador utilizado para introducir aire en el fermentador; 5 la velocidad de agitación; o 6 una combinación de estos factores. Durante las fermentaciones aeróbicas oxígeno molecular debe mantenerse a concentraciones óptimas para asegurar la máxima productividad. Los dos pasos asociados con un balance de masa de oxígeno son la velocidad a la cual el oxígeno se puede entregar al sistema biológico (velocidad de transferencia de oxígeno, OTR) y la velocidad a la que es utilizado por los microorganismos (demanda crítica de oxígeno). Si la tasa de utilización de oxígeno es mayor que la OTR, las condiciones anaeróbicas se desarrollan, lo que puede limitar el crecimiento y

10 1

donde C * = concentración de oxígeno disuelto saturado (mmol / dm3); CL = concentración de oxígeno en el tiempo, t (mmol / dm3); KL = coeficiente de transferencia de masa (cm / h), es decir, la suma de los recíprocos de las residencias de transferencia de oxígeno de la gaseosa a la fase líquida; y un área de interfase = gas-líquido por volumen de líquido (cm2 / cm3). Cabe señalar que tanto KL y una son difíciles de medir individualmente y por lo general están unidos entre sí como KLa, el coeficiente de transferencia de masa volumétrica (por hora). La fuerza impulsora para la oxigenación es el oxígeno gradientes ent (C * - CL). En consecuencia, la tasa de oxigenación es más rápido en las concentraciones de oxígeno disuelto, en comparación con las concentraciones más altas. Sin embargo, el ELK en general no se ve afectada. Con el fin de transferir oxígeno a partir de la fase gaseosa a una célula individual o en el sitio de la reacción, debe pasar a través de varios puntos de resistencia (Fig 6.4.): 1 resistencia dentro de la película de gas a la frontera de fase; 2 penetración del límite de fase entre la burbuja de gas y líquido a granel; 3 traslado desde el límite de la fase de líquido a granel; 4 movimiento dentro del líquido; 5 transferir a la superficie de la célula; 6 entrada en la célula; y 7 el transporte al sitio de reacción dentro de la célula. La etapa limitante de la velocidad (factor de control) en la transferencia de oxígeno es el movimiento de oxígeno de la fase gaseosa a la capa límite de gas-líquido, en particular para fluidos viscosos. moléculas de oxígeno gaseoso se mueven rápidamente, debido a su energía cinética. Sin embargo, para entrar en el líquido que tienen que cruzar esta capa límite en la superficie de la burbuja. Este se compone de una fina capa de moléculas de oxígeno que recubren el interior de la burbuja y una capa más gruesa de moléculas de agua que recubren la cara de la burbuja superficie. Difusión a través de este límite está muy influida por la temperatura, solutos y surfactantes.

10

Capítulo

La tasa 0 de transferencia de oxígeno de una burbuja de aire a la fase líquida se describe por productividad. Sin embargo, se puede intentar levantar la OTR mediante la elevación de la presión, el enriquecimiento del aire de entrada con el oxígeno, y el aumento tanto de los caudales de aire y agitación. La OTR se determina por la fuerza de conducción, el oxigradiente de gen, y la resistencia a la transferencia de oxígeno. tasa de transferencia

=

fuerza impulsora resisten cia

gradiente de = oxígeno (C * - CL) KL un

corriente continuaL (C * - C)

=Ka

6.2

LL ret La integración de la ecuación 6.2 da

do* CL

=e

-KL a

6.3

y en términos de logaritmos naturales, para su uso en KLa determinar minación más adelante, esto es ln (C * - CL ) = -KL

6.4

un * t 6.1

Por lo tanto, KLa es una medida de la capacidad de aireación del fermentador y se debe mantener por encima de una

burbuja de gas

película líquida 1

2

célula microbiana 3

Transferir a través de / a través de: La fase de gas mayor en la burbuja. La interfase gas-líquido. La película de líquido alrededor de la burbuja. El medio de cultivo líquido a granel. La película de líquido alrededor de la célula microbiana * La interfaz célula-líquido * Higo. 6.4transferencia de masa deLa resistencia a la transferencia de oxígeno intracelular *

4

56 7 Sitio de la utilización de oxígeno

oxígeno pasos de una burbuja de * Menor resistencia aire en el lugar de utilización dentro de una célula microbiana (no a escala).

nivel crítico mínima para suministrar el oxígeno REQUISITOS del organismo. Determinación de KLa es relativamente sencillo y se utiliza para comparar los fermentadores, tanto en la ampliación y la a escala reducida. Un método dinámico adecuado para algunos buques consiste en llenar el fermentador bajo investigación con el medio, y la fijación de las tasas específicas de aireación y agitación. El porcentaje de saturación de oxígeno puede ser monitorizada mediante el uso de un polarográfico respuesta rápida o la sonda de oxígeno galvánico. Cuando el oxígeno disuelto alcanza la saturación y se alcanza un estado estacionario, el suministro de aire es reemplazado con nitrógeno. Una vez que el oxígeno en la solución se ha reducido a un nivel suficientemente bajo, por lo general 10% de su valor de saturación (equilibrio), el aire se vuelve a introducir y el perfil de la reoxigenación exponencial se registra. El KLa para estas condiciones específicas se

determina por un gráfico semilogarítmico del perfil de la reoxigenación, ln (C * - CL) frente al tiempo, la pendiente de la que es el negativo del coeficiente de transferencia de masa (-KLa) (véase la ecuación 6.4 y Fig. 6.5). Este procedimiento se puede repetir en diferentes condiciones de operación, por ejemplo, variando la velocidad de agitación, tasa de flujo de aire, etc. Una vez en el líquido, la tasa de adquisición de oxígeno por las células depende de la gradiente de oxígeno entre el oxígeno en el líquido a granel y en el lugar de utilización.

Movimiento en el líquido a granel es ayudado por una buena mezcla. El índice de utilización por el sistema biológico será determinada por las características de afinidad y la saturación de la oxidasa terminal. Como microorganismos exhiben las necesidades de oxígeno diferentes, el nivel de aireación necesaria variará de fermentación para la fermentación.

el control y fermentador

la

supervisión

del

Los sistemas de fermentación deben ser controlados de manera eficiente con el fin de optimizar la productividad y el rendimiento del producto, y asegurar la reproducibilidad. Los parámetros físicos y

químicos clave que participan en gran medida dependen del biorreactor, siendo utilizada su modo de funcionamiento y el microorganismo. Son principalmente de aireación, de mezcla, temperatura, pH y control de la espuma. Control y mantenimiento a nivel óptimo en el interior del reactor está mediada por los sensores (electrodos), junto con sistemas compatibles de control y registro de datos (Tabla 6.3). Los sensores internos que están en o por encima del medio de fermentación (pH, oxígeno, espuma, redox, el análisis a medio y sondas de presión) debe ser esterilizable de vapor y robusto. Algunos sensores no entran en contacto directo con cualquier componente interno del biorreactor y no necesitan esterilización; por ejemplo, células de carga, potencia en el eje agitador y medidores de velocidad, y

Los sistemas de Tabla 6.3 Los sensores utilizados en la vigilancia y control del fermentador

10 3

Medición Sensor

Físico

Químico

Los electrodos

Temperatura (termistor, resistencia

Biológico

Los nutrientes de oxígeno disuelto dióxido de (Biosensores, por ejemplo, para la glucosa) pH Los iones metálicos detección de nivel de espuma MetersAir caudal en y outAcid / alcalino Además potencia en el eje de agitación Velocidad de agitación, por ejemplo, el tacómetro impulsor TransducersPressure líquido fluir Masa spectraDirectly on line o desconectado

Biosensores para productos

productos nutrientes y en el flujo y gases de escape

100

C * = saturado, 100%

C * -CL

En (C * -CL)

Oxígeno saturación (%) (DOreal = doL)

SpectrophotometersBiomass (Determinación en línea y off-line)

50

Gradiente = -KLun

doL

t2 0 Inicio de nitrógeno purga (u n)

t1

t3

t4 Hora (Min)

Reoxigenación (t0) Tiempo

t2

(B)

(min)

Higo. 6.5Determinación del coeficiente de transferencia de masa volumétrica (KLun). (A) Curva de reoxigenación; (B) representación de log natural (ln) de C * (concentración de oxígeno disuelto saturado) - CL (Concentración de oxígeno en el tiempo, t) frente al tiempo.

sensores externos utilizados para analizar muestras retiradas regularmente desde el

biorreactor. Las muestras pueden ser tomadas fuera de línea para varios análisis, tales como el recuento de células y determinación de ADN, ARN, lípidos, proteínas específicas,

10

Capítulo

hidratos2de carbono y otros metabolitos clave y sustratos. El control del pH es generalmente un factor importante como muchas fermentaciones dan productos que pueden alterar el pH del medio de crecimiento. medios de fermentación a menudo

contienen sales de tamponamiento, por lo general fosfatos, pero su capacidad para controlar el pH se pueden superar y la adición de ácido o pueden ser requeridos al-kali. El pH se puede mantener en el valor deseado por su adición automática en respuesta a

cambios registrados por el electrodo de pH. Muchos las fermentaciones producen ácido y el ajuste del pH se puede hacer con hidróxido de amonio, que también puede actuar como una fuente de nitrógeno. Control de la temperatura es por lo general a través de los termómetros de resistencia y termistores vinculados a los sistemas de calefacción o enfriamiento automático. Los niveles de display O2 y CO2 resuelto se determinan usando electrodos de O2 y CO2. Producción de espuma en biorreactores es a menudo un problema importante, sobre todo en las fermentaciones gaseosas. La formación de espuma se debe a la presencia de agentes de superficie, proteínas cialmente es-, que producen espumas estables. Si no se controla esto puede conducir a la contaminación y la obstrucción de los filtros de aire. Hay básicamente tres métodos utilizados para controlar la producción de espuma: modificación de los medios de comunicación, dispositivos de desintegración de espuma mecánicas o la adición automática de agentes antiespumantes químicos (véase el capítulo 5). El principio básico de control implica un sistema sensorial vinculado a un sistema de control y circuito de realimentación (Fig. 6.6). Los sensores se utilizan para medir y registrar los eventos dentro del biorreactor. En combinación con el control de proceso, mantienen la diferencia entre los valores medidos y deseados a un nivel mínimo. El control general puede ser manual o automatizado; Los sistemas más nuevos tienen integral y sistemas de control derivados. Los datos registrados por los sensores y las decisiones de control se descargan en un ordenador donde los cálculos apropiados se pueden formar persona para determinar la producción de biomasa y el pro- ducto, las tasas de transferencia de oxígeno y dióxido de carbono en general, la utilización de nutrientes, el uso de energía, etc. Todo esto Controlador / ordenador

Probeta de temperatura

Agua v fuera

camisa de refrigeración

la información se puede utilizar para construir un modelo matemático / equipo del proceso. Esto se puede aplicar en el futuro fermentaciones para comparar la fermentación real con el modelo compuesto. Si la desviación es Ered descubri-, alarma apropiado y sistemas correccionales se activan, dando un mayor control de la fermentación. Sin embargo, cualquier sistema de control tiene que ser calibrado regularmente cuando se instala por primera vez y después se comprueba regularmente para ajustarse a las buenas prácticas de fabricación (GMP).

lote (véase el Capítulo 2). El producto se recogió y el fermentador debe limpiarse antes de reiniciar el ciclo. Esta fase no productiva se conoce como "tiempo de inactividad '. Ejemplos de este modo de operación incluyen la producción de bebidas alcohólicas, la mayoría de los aminoácidos, enzimas, ácidos o- inorgá-, etc. Las variaciones incluyen sistemas discontinuos alimentados que se han utilizado con éxito para la producción de levadura y la penicilina de Baker. Para este modo de funcionamiento se añaden nutrientes adicionales como la fermentación progresa, lo que aumenta el volumen de fermentación. Las adiciones se pueden hacer de forma continua, intermitente o como una sola administración de suplementos, a menudo cuando un AP cultivo discontinuo enfoques al final de la fase de crecimiento rápido. la operación de alimentación por lotes se puede extender la fase de formación de producto y puede superar los problemas asociados con el uso de represiva, rápidamente metabolizado, sustratos (véase el capítulo 14, la producción de la levadura de Baker). Este método también es útil cuando un sustrato provoca problemas de viscosidad o es tóxico en altas concentraciones. Fedbatch con reciclado de las células (biomasa) se puede utilizar también para fines específicos, por ejemplo, algunas fermentaciones de etanol y procesos de tratamiento de aguas residuales. Las ventajas de los sistemas de lotes son que el gasto de capital inicial es menor y, si la contaminación OCcurs, es relativamente simple para terminar y reiniciar un nuevo

modos de operación fermentaciones industriales funcionan como se indica por lotes, por lotes o federación cultivos continuos (véase el capítulo 2, el crecimiento microbiano). La mayoría son procesos por lotes, que están cerrados los sistemas donde no hay adiciones siguientes de la inoculación, además de ácido o álcali para controlar el pH y la entrada de aire para las fermentaciones aeróbicas. En fermentaciones discontinuas hay un principio y un fin al proceso. Un fermentador se carga, se esteriliza y se inocula, y el organismo se cultiva a través de un perfil típico fermenta dor

Válv ula

Higo. 6.6Un esquema para controlar la temperatura de fermentación.

Enfria v miento agua en

ciclo de fermentación. Como se mencionó anteriormente, los sistemas de lotes se utilizan con éxito en la producción de muchos productos de fermentación tradicionales; y para producir secmetabolitos secun-, tales como antibióticos, donde las células

Los sistemas de se cultivan primero allá de la fase de crecimiento rápido antes de la acumulación de estos metabolitos. Sin embargo, fermentaciones discontinuas son teóricamente menos eficaz para la producción de biomasa y productos metabólicos primarios (asociadas a crecimiento). Sólo una pequeña fracción de cada ciclo de carga de fermentación es productivo, ya que puede haber un período de retraso considerable y es sólo en las últimas etapas de la fase exponencial que se generan grandes cantidades de producto. Otras desventajas de los sistemas de lotes son la variabilidad de lote a lote del producto; además aumentó no productivo el tiempo de inactividad, que implica la limpieza, esterilización, recarga y refrigeración poststerilization. La frecuencia aumentado de esterilización también puede causar un mayor estrés sobre los instrumentos y sondas. Además, los costes de fun- ciona son mayores para la preparación y mantenimiento de cultivos madre, y por lo general son más personal rido re para los procesos por lotes de operación. El cultivo continuo es un sistema abierto en el que se añade continuamente medio reciente y la cultura se retira simultáneaormente a la misma velocidad, lo que resulta en un volumen de trabajo constante. En sistemas continuos, las células crecen exponencialmente durante largos períodos a una tasa de crecimiento predeter- minado especificado. Además, el sistema tiene la propiedad de alcanzar un estado estacionario en el que la concentración de la limitación de nutrientes y el número de células no varían con el tiempo (véase el capítulo 2). En consecuencia, en teoría, estos sistemas son más productivas que los sistemas por lotes. fermentaciones continuas son particularmente adecuados para la producción de biomasa y de metabolitos primarios asociados al crecimiento. Su reducido el tiempo de inactividad y reducir los costos de operación son también atributos deseables. Sin embargo, requieren gastos de capital inicial más alto y, hasta la fecha, son relativamente pocos en gran escala industrial ex ejemplos se han establecido, que no sea para la biomasa, combustible / etanol industrial y tratamiento de efluentes. Los problemas asociados con los procesos de cultivo pro- continuas, distintos de tratamiento de aguas residuales, incluyen el

10 5

hecho de que a lo largo de sus 20-50 días o la operación más larga, la esterilidad debe mantenerse y un suministro continuo de los medios de composición constante proporcionado. Sin embargo, estas dificultades se pueden superar por las BPF y las buenas prácticas microbiológicas. Sin embargo, las condiciones de funcionamiento colocan fuerte presión de selección sobre el organismo. Cualquier inestabilidad genética puede conducir a la generación de mutantes de bajo rendimiento que pueden superar la cepa de alto rendimiento originales.

Esterilización Los principios básicos de esterilización se han discutido

10

Capítulo

en el 4 capítulo 2. Aquí vamos a considerar los aspectos específicos re- lating al proceso de fermentación.

esterilización de aire A evitar la contaminación de cualquiera de la fermentación por microorganismos transportados por el aire o el medio ambiente a través de aerosoles generados dentro del fermentador, puertos, tanto de entrada de aire y escape de aire tienen filtros de aire conectados. Estos fil- tros están diseñados para atrapar y contener microorganismos. Filtros están hechos de fibra de vidrio, fibras minerales, fluoroetileno polytetra(PTFE) o cloruro de polivinilo (PVC), y deben ser esterilizables vapor y cambiar fácilmente. En algunas circunstancias, en particular cuando se cultivan organismos patógenos, de escape del fermentador también pueden someterse a esterilización por calor seco (incineración) como una medida de seguridad adicional.

Medios y esterilización buque Por escala piloto y fermentaciones industriales asépticas el fermentador puede ser esterilizado vacía. El recipiente se llena a continuación con medio estéril, preparado en un proceso por lotes o continuo con- 'cocina' medio que puede suministrar varias fermentaciones. Alternativamente, el fermentador se llena con medio formulado y los dos se esterilizan juntos en una sola operación. Sin embargo, algunos las fermentaciones industriales

no son aséptico, pero la contaminación microbiana todavía se mantiene a un nivel mínimo por ebullición o la pasteurización de los medios de comunicación. De lo contrario, un rápido crecimiento contaminante podría superar el microorganismo industrial, o al menos utilizar algunos nutrientes valiosos. inants minación de microbios también pueden metabolizar el producto objetivo, producir compuestos tóxicos o secretar productos que puedan bloquear los filtros y interferir con el procesamiento aguas abajo. Si el contaminante es un bacteriófago que puede lisar la cultura, como puede ocurrir en las fermentaciones que implican bacterias de ácido láctico. Pequeños fermentadores a escala de laboratorio de 1-5 L de capacidad se llenan generalmente de medio y luego esterilizados en un autoclave de vapor. Aquí la esterilización se forma normalmente realizó mediante vapor a presión para alcanzar una temperatura de 121 ° C durante 15 min. Se debe tener cuidado para evitar cualquier acumulación de presión en el interior del fermentador por ventilación sin contaminar el contenido. Para fermentadores a escala piloto e industriales de esterilización más riguroso es necesario, que implica un aumento del tiempo de esterilización y / o temperatura más elevada. Normalmente, el objetivo es proporcionar condiciones de esterilización que dan una de probabilidad aceptable de contaminación de 0,1% (1 en 1000). cuencia

guiente, si el número original de células microbianas (n) es conocido, el factor Del (- = ln n / Nt) se puede calcular (véase el capítulo 2). El valor de Nt, cuando se adopta un riesgo 0,1%, será 10-3 células. Un perfil de esterilización de un fermentador típico se muestra en la Fig. 6.7. Destrucción de las células se produce durante el calentamiento (a 121 ° C en este caso) y la ventilación (aquí desde 121 ° C a la temperatura de funcionamiento de la fermentación). Por lo tanto el factor general Del puede representarse como -total = -calefacción + -participación + -enfriamiento Por lo tanto saber tanto -calefacción y -cooling para un sistema de fermentación particular, el tiempo de mantenimiento necesario necesario para lograr el factor global Del requerida se puede calcular. Alternativamente, la aproximación se puede utilizar Richards, que emplea sólo la parte de la curva por encima de 100 ° C (Fig. 6.7). Esto supone que: 1 calefacción y refrigeración entre 0 ° C y 100 ° C es portante unim- para la esterilización; 2 calentamiento entre 100 ° C y 121 ° C está en 1 ° C por minuto, es decir, 20 min; y 3 refrigeración a partir de 121 ° C a 100 ° C es al 1 ° C por minuto, es decir, 20 min. En la práctica, la esterilización con vapor que consiste en pasar el vapor a presión en la camisa del recipiente y / o bobinas internas. El vapor también puede ser inyectado directamente en el espacio de cabeza por encima del medio de fermentación. Esto ayuda a la esterilización, pero puede dar lugar a cambios en el volumen de medios de comunicación. La esterilización por vapor es eficaz y más barata que la esterilización por calor seco. Sin embargo, ciertos componentes de los medios pueden ser lábiles y destruidos por el calor excesivo, por ejemplo, glucosa, vitaminas y algunos componentes del medio de cultivo de células animales calor. Tales ingredientes sensibles al calor a menudo se esterilizaron por filtración antes de su uso; Como alternativa, algunos pueden ser esterilizados con calor mínima degradación utilizando un alto

temperatura durante un tiempo muy corto, por ejemplo 140 ° C durante 50 s. Esto es generalmente una operación continua en el que el tiempo de retención es controlado por el caudal a través del esterilizador y el material a continuación, se enfría rápidamente en un intercambiador de calor.

fermentaciones-sustrato sólido fermentaciones-sustrato sólido se han utilizado para produ- ciendo varios alimentos fermentados en Asia desde hace miles de años, pero este método se utiliza muy poco en Europa y América del Norte. Se trata de la proliferación de microorganismos en materiales sólidos, normalmente orgánicos, en ausencia o casi ausencia de agua libre. Los sustratos utilizados son a menudo los granos de cereales, salvado, legumbres y materiales lulosic lignocel-, como la paja, virutas de madera, etc. Los procesos tradicionales son fermentaciones en gran parte de los alimentos que producen el tempeh y Sufu oriental, quesos (capítulo 12) y setas (Capítulo 14); junto con el compost y el ensilado (Capítulo 15). Además, las enzimas, ácidos orgánicos y el etanol se producen ahora por fermentaciones sustrato sólido-, especialmente en las zonas donde el equipo de fermentación moderna no está disponible. fermentaciones-sustrato sólido carecen de los mecanismos de control sofisticados que se asocian generalmente con fermentaciones sumergidas. Su uso se ve obstaculizado por la falta de conocimiento de la cinética intrínseca de crecimiento microbiano bajo estas condiciones de funcionamiento. El control del medio ambiente dentro de los biorreactores también es difícil de lograr, en particular el mantenimiento simultáneo de la temperatura y la humedad óptima. Sin embargo, en algunos casos, las fermentaciones-sustrato sólido son los métodos más adecuados para la producción de ciertos productos (ver Tabla 6.4). Por ejemplo, la mayoría de los hongos no forman esporas en fermentaciones sumergidas, pero

Temperatura ºC

140 120

Los datos utilizados en la aproximación Richards

121 ° C 100 ° C

100 80 60 40 20

Calefacción Participación

04080120160200240280

Higo. 6,7La esterilización de un fermentador.

Tiempo (min)

Enfria mient o

Los sistemas de Tabla 6.4 Ventajas y desventajas de las fermentaciones-sustrato sólido Ventajas desventajas proporcionar potencialmente superiorSlower productividad crecimiento microbiano Bajo costo mediaProblems con la acumulación de calor Sencillo technologyBacterial la contaminación puede ser problemática bajo capital costsDifficulties a menudo se encuentra en ampliación requisitos de nivel de humedad del sustrato de energía reducido difícil de controlar la salida de las aguas residuales de baja No hay problemas con la formación de espuma

esporulación se logra a menudo en fermentaciones sustrato sólido. Este método se emplea con éxito en la producción de esporas Coniothyrium minitans para el biocontrol del patógeno de plantas por hongos, Sclerotinia sclerotiorum. fermentaciones-sustrato sólido son procesos de varios pasos Mally Noruega, que implica: 1 el pretratamiento de un sustrato que a menudo requiere un procesamiento mecánico biológico, químico o; 2 la hidrólisis de los sustratos poliméricos, principalmente, por ejemplo, polisacáridos y proteínas; 3 la utilización de productos de hidrólisis; y 4 separación y purificación de los productos finales. Los microorganismos asociados a fermentaciones-sustrato sólido son aquellos que toleran relativamente baja actividad de agua a valores de Aw de alrededor de 0,7. Ellos se pueden emplear en la forma de: 1 monocultivos, como en la producción de hongos, por ejemplo, Agaricus bisporus; 2 culturas duales, por ejemplo, paja de bioconversión utilizando Chaetomium cellulilyticum y Candida tropicalis; y 3 cultivos mixtos, como se usa en el compostaje y la preparación de ensilaje, donde los microorganismos pueden ser indígena o añadido cultivos iniciadores mixtos (inoculantes).

Los parámetros ambientales que influyen en las fermentacionessustrato sólido ACTIVIDAD DE AGUA, A

Capítulo 2)

W

10 7

(Véase el

Agua se pierde durante la fermentación a través de la evaporación y la actividad metabólica. Esto se sustituye normalmente por hu-

10

Capítulo

midification o adiciones periódicas de agua. Si los 6 niveles de humedad son demasiado bajos, el sustrato es menos accesible, ya que no se hincha y el crecimiento microbiano se reduce. Sin embargo, si los niveles de humedad son demasiado alta hay una reducción de la porosidad del sustrato, la reducción de las tasas de difusión de oxígeno y generalmente la disminución de intercambio gaseoso. En consecuencia, la tasa de degradación del sustrato se reduce y también hay un aumento del riesgo de contaminación microbiana.

TEMPERATURA

La generación de calor puede ser más problemática que en fermentaciones líquidos y tiene una influencia importante en la humedad relativa dentro de una fermentación. La temperatura se controla en gran medida por la aireación y / o agitación del sustrato.

AIREACIÓN

La mayoría de las fermentaciones-sustrato sólido son aeróbicos, pero los requisitos particulares para el oxígeno dependen del microorganismo (s) utilizado y el proceso específico. Las tasas de aireación previstas también están estrechamente relacionados con la necesidad de disipar el calor, CO2 y otros compuestos volátiles que pueden ser inhibitorio. La cinética de la transferencia de oxígeno en fermentaciones-sustrato sólido son poco

conocidos. Sin embargo, la tasa de transferencia de oxígeno está en gran medida influenciada por el tamaño de las partículas de sustrato, que determina el espacio vacío. la transferencia de oxígeno dentro de este espacio vacío está estrechamente relacionado con el nivel de humedad, ya que el oxígeno se disuelve en la película de agua alrededor de las partículas de sustrato. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, si el exceso de agua llena los espacios vacíos, que tiene un efecto perjudicial sobre la transferencia de oxígeno.

Biorreactores utilizados para las fermentacionessustrato sólido La mayoría de las fermentaciones-sustrato sólido son procesos por lotes, aunque se están haciendo intentos para desarrollar semi- continua y sistemas continuos. Algunos procesos no requieren biorreactores, que simplemente implican ing de cálculo del sustrato sobre un suelo adecuado. Aquellos procesos que emplean los vasos presentan variaciones considerables. Unos procesos anaeróbicos, como la producción de ensilaje, no requieren mecanismos de agitación o aireación. Sin embargo, la mayoría son fermentaciones aeróbicas, que requieren aireación y agitación ocasional o continua. Biorreactores utilizados comúnmente incluyen los siguientes (Fig. 6.8).

(un)

Po ne ra se ca r

humidific ado aire en

(B)

Poner a secar

cama sustrato sólido

forza do humidific ado aire en (c)

Higo. 6.8Tres tipos de fermentadores-sustrato sólido: (a) hacer girar fermentador de tambor; (B) fermentador bandeja; (C) un sistema de lecho.

1 Rotación de fermentadores de tambor, Que comprende un recipiente cilíndrico de alrededor de 100 L de capacidad montado en su lado sobre los rodillos que giran tanto apoyo y el recipiente (Fig. 6.8a). Estos fermentadores se utilizan en la producción de

3 Los sistemas de lecho, Tal como se utiliza en la producción de koji comercial (véase el capítulo 12), que consiste en un lecho de sustrato de hasta 1 m de profundidad, a través del cual se humidifica el aire es forzado continuamente desde abajo (Fig. 6.8c). 4 biorreactores de columna, que consiste en una columna de vidrio o de plástico, en el que se embala sin apretar el sustrato sólido, rodeado por una chaqueta que proporciona un medio de control de temperatura. Estos vasos se usan para producir ácidos orgánicos, etanol y biomasa. 5 reactores de lecho fluidizado, Que proporcionan una agitación continua con aire forzado para evitar la adhesión y la agregación de las partículas de sustrato. Estos sistemas han sido particularmente útiles para la producción de biomasa para la alimentación animal. biomasa y la enzima microbiano. Su principal desventaja es que el tambor está lleno con sólo el 30% de su capacidad, de lo contrario la mezcla es ineficiente. 2 Bandeja fermentadores, Que se utilizan ampliamente para la producción de alimentos y enzimas orientales fermentados. Sus sustratos se extienden en cada bandeja hasta una profundidad de sólo unos pocos centímetros y luego apilados en una cámara a través del cual se hace circular aire humidificado. Estos sistemas requieren numerosas bandejas y grandes cámaras volumen de incubación de hasta 150 m 3 capacidad (Fig. 6.8b).

el desarrollo fermentación

del

proceso

de

Una vez que un microorganismo ha sido seleccionado como el organismo productor para un proceso concreto, la investigación se lleva a cabo inicialmente en condiciones a escala de laboratorio utilizando 1-10 L fermentadores. Esto implica un examen de la formulación de los medios de comunicación y las estrategias de alimentación '(por lotes, lotes alimentados, continuo, etc.), junto con la selección del tipo más adecuado de sistema de fermentación (tanque agitado, puente aéreo, de lecho compacto, de estado sólido, hueco fibra, etc.). Otros factores que se consideran incluyen reactor configu- ración, y el control de pH, oxígeno disuelto, la espuma y la temperatura. Optimización de rendimiento del producto en el laboratorio es seguido por escalado del proceso; primero a escala piloto de 10 a 100 L y finalmente a escala industrial de 1000- 100 000 L, o más, dependiendo del proceso específico. Sin

1

2

3

4

embargo, durante la ampliación, disminución de los rendimientos del producto a menudo se experimentan; la razón es que las condiciones en los fermentadores a gran escala no son idénticos a los experimentados en los sistemas de laboratorio o de planta piloto de menor escala. Los factores clave que influyen en el rendimiento durante el escalado del proceso son los siguientes. procedimientos de propagación del inóculo adoptadas, y la calidad y cantidad de inóculo usado para iniciar la fermentación. Elección del medio; fuentes de nutrientes más baratos a menudo se emplean para operaciones a gran escala debido a las limitaciones de costo. protocolos de esterilización a escala industrial pueden dar lugar a una mayor degradación de compuestos termolábiles, que afecta a la calidad final del medio. fermentadores más grandes son a menudo objeto de el desarrollo de nutrientes, temperatura, pH y oxígeno gradientes, que no tenían experiencia en la más pequeña, bien mezclados, fermentadores.

5 Expansión también se puede alterar la generación de espuma, las fuerzas de corte y velocidad de eliminación de dióxido de carbono. Las variaciones en cualquiera de estos factores pueden signifi- cativamente el cambio de las condiciones operativas y En consecuencia influir en el rendimiento del producto, en comparación con los experimentos a escala de laboratorio. Aunque deseable, puede que no sea posible mantener todos los parámetros en el mismo valor en cada etapa de aumento de escala. Sin embargo, es posible fijar un parámetro clave y asegurar que se mantiene inalterada a lo largo de la ampliación. Esos parámetros eligen a menudo para permanecer firmemente fijado son la relación de aspecto fermentador altura y diámetro, entrada de energía por unidad volumen, el coeficiente de transferencia de oxígeno (ELK), el nivel de oxígeno disuelto o velocidad de la punta del impulsor (para mantener similares cortar). En los estudios de escala hacia abajo, el enfoque opuesto puede ser implementado, en el que se imitaban las condiciones en el fermentador a gran escala, en la medida de lo posible, en los sistemas a pequeña escala.

Otras lecturas Papeles y comentarios Cooney, CL (1983) biorreactores: diseño y operación. Ciencia 219, 728-733. Corte, JR (1988) Ordenadores en el control de la fermentación: aplicaciones de laboratorio. El progreso en Microbiología Industrial 25, 1-45. procesos de recupera- ción Daugulis, AJ (1994) y la fermentación integrada. Current Opinion in Biotechnology 5, 192-195. Daugaulis, AJ (1997) biorreactores de partición. Current Opinion in Biotechnology 8, 169-174. Longobardi, GP (1994). Fed-batch vs. fermentación por lotes. Ingeniería de Bioprocesos 10, 185-194. Reisman, HB (1993) Problemas en el escalado de la biotecnología

procesos de producción. CRC Critical Reviews in biotecnologías Gy 13, 195-253. Ritzka, A., Sosnitza, P., Ulber, R. & Scheper, T. (1997) fermentación de vigilancia tación y control de procesos. Current Opinion in Biotechnology 8, 160-164. Sharma, MC & Gurtu, AK (1993) Asepsia en biorreactores. Los avances en la Microbiología Aplicada 3, 1-27. van't Riet, K. (1983) La transferencia de masa en fermentación. Trends in Biotechnology 1, 113119.

Libros Asenjo, JA y Merchuk, JC (1995) Sistema de biorreactor signo De-. Marcel Dekker, New York. Atkinson, B. & Mavituna, F. (1991) Ingeniería Bioquímica y Biotecnología Manual, 2ª edición. Macmillan, Basingstoke. Bastin, G. & Dochain, D. (1990) on-line Estimación y Control Adaptativo de biorreactores. Elsevier, Amsterdam. Blanch, HW & Clark, DS (1997) Ingeniería Bioquímica. Marcel Dekker, New York. Bu'lock, J. & Kristiansen, B. (1987) Básico Biotecnología. Academic Press, Londres. Demain, AL, Davies, JE y Atlas, RM (1999) Manual de Microbiología Industrial y Biotecnología. Sociedad Americana de Microbiología, Washington DC Doran, PM (1995) Principios de Ingeniería de Bioprocesos. demiaemic Press, Londres. Jackson, AT (1990) Ingeniería de Procesos en Biotecnología. Open University, Milton Keynes. McNeil, B. & Harvey, LM (1990) Fermentación: Un enfoque práctico. IRL, Oxford. Scragg, AH (1991) biorreactores en Biotecnología. Ellis Horwood, Nueva York. Stanbury, PF, Whitaker, A. & Hall, SJ (1995) Principios de la tecnología de fermentación, 2ª edición. Butterworth-Heinemann (Pérgamo), Oxford. Vogel, HC y Todaro, CL (1997) Fermentación y Ingeniería Bioquímica Manual-Principios, diseño de procesos y equipos. Noyes Publications, Westwood, Nueva Jersey.

7

Procesamiento en bajada

fermentaciones industriales comprenden tanto procesamiento aguas arriba pro- (USP) y las etapas de procesamiento aguas abajo (DSP) (Fig. 7.1). USP involucra a todos los factores y procesos que conducen a, y entre ellos, la fermentación, y se compone de tres áreas principales. El primero se refiere a los aspectos relacionados con el microorganismo productor. Incluyen la estrategia para obtener inicialmente un microorganismo adecuado, mejora de cepas industrial para mejorar la productividad y el rendimiento, mantenimiento de la pureza cepa, preparación de un inóculo adecuado y el continuo desarrollo de cepas seleccionadas para aumentar la eficiencia económica del proceso (véase el capítulo 4). El segundo aspecto de la USP consiste en medios de fermentación (véase el capítulo 5), especialmente la selección de fuentes de carbono y energía rentables adecuadas, junto con otros nutrientes esenciales. Esta optimización de los medios de comunicación es un aspecto vital del desarrollo de procesos para asegurar la maximización del rendimiento y la rentabilidad. La tercera componente de la USP se refiere a la fermentación (véase el Capítulo 6), que se realiza generalmente en condiciones rigurosamente controlados, desarrollado para optimizar el crecimiento del organismo o la producción de un producto microbiano de destino. DSP abarca todos los procesos posteriores a la fermentación. Tiene el objetivo principal de recuperar de manera eficiente, reproducible y segura del producto diana a las especificaciones requeridas (actividad biológica, pureza, etc.), al tiempo que maximiza el rendimiento de recuperación y minimizar los costes. El producto objetivo puede ser recuperado de la transformación de las células o el medio gastado dependiendo

de si se trata de un intracelular o producto extracelular. El nivel de pureza que debe lograrse es generalmente determinada por el uso específico del producto. A menudo, la pureza de un producto se define por lo que no está presente en lugar de lo que es. La pureza de una enzima, por ejemplo, se expresa como unidades de actividad de enzima por unidad de proteína total. No sólo es importante para reducir las pérdidas de masa de producto, pero en muchos casos la retención de activi- dad biológica del producto es de vital importancia. Cada etapa en el procedimiento de recuperación global es fuertemente dependiente del protocolo de la fermentación precedente

mentación. factores que afectan a la fermentación DSP incluyen las propiedades de los microorganismos, particularmente fología dad, las características de floculación, tamaño y rigidez de la pared celular. Estos factores tienen una gran influencia en la capacidad de filtración, la sedimentación y la eficiencia de homogeneización eficiencia. La presencia de subproductos de fermentación, impurezas y aditivos de los medios de fermentación, tales como espumas anti, puede interferir con los pasos de DSP y análisis de los productos de acompañamiento. En consecuencia, se requiere un enfoque holístico en el desarrollo de una nueva estrategia de la purificación industrial. Todo el proceso, ambos factores de aguas arriba y aguas abajo, debe ser considerado. Por ejemplo, la elección de las influencias sustrato de fermentación DSP posterior. Una fuente de carbono y energía barata que contiene muchas impurezas puede proporcionar ahorros de costos iniciales, pero puede requerir un aumento de los costos de DSP. Por lo tanto, reducir el coste global pueden conseguirse con un sustrato sive pero más puro más cara. Además, la adopción de métodos que utilizan equipo disponible existente puede ser más rentable que la introducción de las

técnicas más eficientes que requieran la inversión en nuevas instalaciones. Las propiedades físicas y químicas del producto, junto con su concentración y localización, son, evidentemente, los factores clave que determinan las etapas de separación inicial y la estrategia global de purificación. Puede ser las células enteras sí mismos que son el producto diana o un producto intracelular, posiblemente situado dentro de un orgánulo o en forma de cuerpos de inclusión. Alternativamente, el producto objetivo puede haber sido secretado en el espacio periplásmico de las células productoras o el medio de fermentación. La estabilidad del producto también influye en el requisito para cualquier tratamiento previo necesario para evitar que el producto tivación y / o degradación inactiva. DSP se puede dividir en una serie de procesos unitarios distintos unidos entre sí para lograr la purificación del producto (Fig. 7.2). Ejemplos de las estrategias de purificación de dos productos se muestran en la Fig. 7.3. Por lo general, el número de pasos se mantiene a un mínimo. Esto no es sólo debido a su costo, sino porque a pesar de los pasos indivi- duales pueden obtener altos rendimientos, las pérdidas totales

109

11 0

capítulo Procesos aguas arriba La cepa de

materias primas de fermentación Las fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo y azufre, elementos menores, elementos traza, factores de crecimiento, agua, etc. (disponibilidad, coste, estabilidad, y el tratamiento previo y los requisitos de esterilización)

microorganismos mejora el aislamiento inicial

desarrollo de los medios

cepa de producción Restricciones: requisitos nutricionales, controles metabólicos, sensibilidad al cizallamiento, temperatura óptima, morfología, O2 y compañía2 efectos y requisitos, estabilidad genética, subproductos metabólicos, los efectos de la viscosidad

medio de propagaci ón

Cultura inicial propagationmedium

+/Oxígeno Antiespum ante de control de pH Refrigeración / calefacción

Los procesos aguas abajo Bajo la influencia de la concentración del producto y la estabilidad. Otras consideraciones son producir en cada paso, proceso de los costes y los requisitos de pureza

Fermentación

El medio de mantenimie nto

Producción

Con el apoyo o el crecimiento en suspensión. Tipo de fermentador, el mecanismo de agitación, el tamaño, la geometría, modo de operación, instrumentación y automatización

centrifugación o filtración de separación de células

en el lugar DSP ex situ DSP

residuos de biomasa: si el producto es extracelular

Las células cosechadas

intracelular o producto periplásmico

El medio gastado

producto extracelular

etapa de concentración

La disrupción celular

Celda centrifugación o ultrafiltración escombros extracto libre de células

Cuerpos de inclusió n

medio concentrado

recupera ción primaria

Procesamiento en bajada

La diálisis, precipitación, de partición, etapas cromatográficas, la ultrafiltración, la destilación, etc.

La cristalización, secado, liofilización, filtración estéril, empaquetado, etc.

Efluente

Producto terminado

Higo. 7.1Un esquema de operaciones de tratamiento de aguas arriba y aguas abajo.

11

la 1 purificació n del

Refinamie nto procesos

medio clarificado

separación de células La sedimentación o centrifugación de flotación Filtración

(productos extracelulares)

Caldo acondicionado floculación pila de discos, tubulares, filtros de cámaras múltiples de profundidad y sistemas de flujo cruzado Las células cosechadas

(productos intracelulares)

La disrupción celular Mecánico No mecánico Aclaración La filtración de la centrifugación Concentración Precipitación cromatografía de filtración Destilación de reparto

homogeneización de cizallamiento líquido, grano molinos, sonicación Antibióticos, autolisis, detergentes, enzimas, choque osmótico pila de discos, tubulares, filtros de cámaras múltiples de profundidad y sistemas de membrana

sulfato de amonio, cromatografía de gel de disolventes sistemas de filtración por membranas de flujo cruzado en dos fases sistemas Alambique, todavía continua

técnicas de alta resolución cromatografía

electroforesis en diálisis

Higo. 7.2procesos unitarios típicos utilizados en los procesos posteriores.

Acabado / Packaging cristalización Filtración cromatografía de gel El secado

de procesos de purificación de varias etapas pueden ser prohibitivos (Fig. 7.4). Los pasos unitarios específicos elegidos serán influidos por los aspectos económicos del proceso, la pu- ridad requerida del producto, el rendimiento alcanzable en cada paso y aspectos de seguridad. En muchos casos, ahora se prefiere la integración de la fermentación y DSP. Integración a menudo puede aumentar la productividad, reducir el número de operaciones unitarias y reducir tanto el tiempo de proceso en general y los costes. la integración de procesos físico puede conseguirse mediante la colocación de

La adsorción, de afinidad, filtración en gel, HPLC, hidrófoba, intercambio iónico, quelato de metal, etc. El enfoque isoeléctrico diafiltración, electrodiálisis Añadido sales, los sistemas disolventes de membrana de acabado, no concentración La liofilización de (liofilización), secado por pulverización, secado en bandeja

unidades de separación en el interior del fermentador o por di- rectamente que une los dos sistemas. Cuando la formación de producto se acopla con el crecimiento, es decir, los metabolitos primarios, una mayor productividad puede lograrse mediante el uso de sistemas integrados que mantienen altas densidades celulares a través de la retención de células o reciclaje. Cuando los productos son inhibidores, se han empleado una amplia gama de métodos

particionar biorreactores para permitir la rápida en la eliminación in situ de los productos por extracción, adsorción o separación, a menudo aumentar el rendimiento y la productividad. Alternativamente, el procesamiento puede ser ex situ, donde se extrae el producto fuera del fermentador y el medio de procesado se devuelve a la fermentación. Tales procesos han sido particularmente exitoso para la eliminación de alcoholes y disolventes, pero ahora también es posible extraer algunas proteínas. Este modo de

retirada del producto a menudo puede mejorar la conversión de la materia prima, sobre todo cuando existen equilibrios termodinámicos desfavorables, es decir, la eliminación ducto UCT 'tira' la reacción en la dirección de la formación del producto del ther de pieles. la extracción de productos temprano también puede mejorar el rendimiento para los productos sensibles a la exposición prolongada al medio ambiente de fermentación, donde la cizalladura, enzimas proteolíticas, oxidación, etc., puede ser destructivo.

La purificación de una proteína bacteriana intracelular soluble la recolección de células por ejemplo, centrifugación flotante (Caldo gastado) La interrupción de células recuperadas por ejemplo, la homogeneización de cizalladura líquida separación restos celulares por ejemplo, centrifugación

La purificación de un ácido orgánico a partir de un cultivo de hongos aclaración caldo por ejemplo, filtración a vacío rotativo micelio Clarificado decoloración caldo por ejemplo, tratamiento con carbón activado

Evaporación restos celulares

Cristalización

la precipitación de proteínas del extracto libre de células por ejemplo, sulfato de amonio La recuperación de la proteína por centrifugación

Cromatografía de intercambio de iones por ejemplo, celulosa DEAE Recuperación de cristales por ejemplo,

La desalación de proteína de pellets resuspendido filtración en gel

filtración de limpieza Crystal secado Crystal

Diálisis

Higo. 7.3Ejemplos de procesamiento aguas abajo unidad.

La liofilización

95% de rendimiento en cada etapa un rendimiento del 90% en cada etapa un rendimiento del 80% en cada etapa

100 90

En general rendimiento (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 0

12345678910 Número de operaciones de la unidad

la recolección de células

Higo. 7.4El efecto de rendimiento en la purificación de varias etapas.

El primer paso en el procesamiento aguas abajo de los cultivos en sus-

pensión es una separación sólido-líquido para eliminar las células del medio gastado. Cada fracción puede entonces

someterse a procesamiento adicional, dependiendo de si el producto se encuentra intracelularmente, o se ha secretado en el espacio periplásmico o el medio. Elección del método de separación sólido-líquido se ve influida por el tamaño y la morfología del microorganismo (células individuales,

agregados o micelios), y el peso específico, la viscosidad y la reología del medio de fermentación agotada. Estos factores también pueden tener importantes influencias en la transferencia del líquido a través de bombas y tuberías.

método de separación es la sedimentación por gravedad, lo que para una partícula esférica se puede representar por la Ley de Stokes: re2 (pag - pag )gramo Vgra

pag

sl

7.1

18 h

caldo acondicionado

mo

técnicas Broth acondicionado se utilizan sobre todo en asociación con la sedimentación y la centrifugación para la separación de células a partir de medios líquidos. Alteran o

donde Vg = velocidad de sedimentación de partículas (m / s); dp = diámetro de la partícula (m); ps - pl = diferencia de densidad entre la partícula y medio circundante 32 (Kg / m); g = aceleración de la gravedad (m / s); y h = viscosidad (Pascal segundo (Pa s)). Por lo tanto, para una rápida sedimentación de la diferencia de densidad entre la partícula y el medio tiene que ser grande, y la viscosidad media debe ser bajo.

=

explotar alguna propiedad de un microorganismo, o de otro material suspendido, de modo que flocula y por lo general precipitados. Sin embargo, en ciertos casos, puede ser utilizado para promover la flotación. Esto utiliza la capacidad de algunas células para adsorber a las interfaces de gaslíquido de burbujas de gas y flotar a la centrifugación superficie para la recolección, que se produce de forma natural en la cerveza tradicional y Si en lugar de simplemente usar la fuerza de las fermentaciones levadura de panadería la gravedad para separar partículas en (véase el Capítulo 12, fabricación de la suspensión, se aplica un campo centrífugo, la cerveza). métodos pitation Certain flóculos velocidad de separación sólido-líquido se precisión también se utilizan en el extremo de incrementa significativamente y partículas muchos procesos de cerveza y vino de mucho más pequeñas se puede separar. fermentación tradicionales, donde la adición centrifugación se puede usar para separar de finings (albúmina de huevo, cola de partículas tan pequeñas como pescado, etc.) se puede emplear para 1.1 diámetro micras y también es adecuado precipitar las células de levadura. Las para algunas separaciones líquidas a líquidos. principales ventajas de estas técnicas son su Su eficacia, también, depende del tamaño de bajo coste y capacidad para separar las partícula, la diferencia de densidad entre las células microbianas a partir de grandes células y el medio, y de viscosidad media. volúmenes de medio. En una centrífuga, la velocidad terminal de Algunos organismos naturalmente flocular, una partícula es que pueden ser mejoradas con químicos, repag (pags - pagl )wr físicos y tratamientos biológicos. Tales tratamientos también pueden ser eficaces con las células que de otro la modo no formar flóculos. La coagulación, 2

formación de pequeños copos de coloides dispersos, células u otro material en suspensión, se puede promover el uso de coagulación agentes lating (electrolitos simples, ácidos, bases, sales, iones multivalentes y polielectrolitos). floculación posterior, la aglomeración de estos flóculos más pequeños en partículas sedimentables más grandes, a menudo es ayudada por sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro de calcio) o polielectrolitos. Estos son de alto peso

Vdo =

2

18h

7.2

molecular, soluble en agua, tensioactivos aniónicos, compuestos orgánicos catiónicos o no iónicos, tales como poliacrilamida y sulfato de poliestireno.

Sedimentación

La sedimentación se utiliza ampliamente para sepa- rado de levadura primaria en la producción de bebidas alcohólicas, y en el tratamiento de las aguas residuales. Esta tecnología de bajo costo es relativamente lenta y es adecuado sólo para flóculos grandes (de más de 100 m de diámetro). La tasa de sedimentación de partículas es una función del tamaño y densidad. Por lo tanto, cuanto mayor sea la partícula y mayor es su densidad, más rápida es la velocidad de sedimentación. La base de este

donde Vc = velocidad de sedimentación centrífuga o velocidad de las partículas (m / s); w = velocidad angular de la centrífuga (rad / s); y r = distancia de la partícula desde el centro de giro (m) (para h, ps - pl y dp, véase la ecuación 7.1). Por lo tanto, más rápida será la velocidad de funcionamiento (W) y la mayor es la distancia desde el centro de rotación, más rápida es la velocidad de sedimentación (Vc). Centrífugas se pueden comparar utilizando la fuerza centrífuga relativa (RCF) o el número g (la relación de la velocidad en una centrífuga a la velocidad bajo la gravedad = w2 r / g). La elección de centrífuga depende del tamaño de las partículas y la densidad, y la viscosi- dad del medio. centrifugadoras velocidad superior son rerido para la separación de los microorganismos más pequeños, tales como bacterias, en comparación con levaduras. Por ejemplo, centrifugación relativamente lento recupera eficazmente las células de levadura residuales que quedan en la cerveza después de que el mayor ha sedimentado a cabo. A la inversa, una RCF de 20 000 g puede ser necesaria para recuperar las células bacterianas en suspensión, restos de células y proteínas precipita de medios líquidos.

caldo clarificad o a cabo

Aliment ar

sobrenadante a cabo

sólidos recogidos

Higo. 7.6 Diagrama de una centrífuga de tazón multicámara. Alimentar

Higo. 7.5 Diagrama de una taza de la centrifugadora tubular.

Ventajas de la centrifugación incluyen la disponibilidad de sistemas totalmente continuas que pueden procesar rápidamente grandes volúmenes en pequeñas centrifugadoras de volumen. Centrifugadoras se pueden esterilizar a vapor, lo que permite el procesamiento aséptico, y no hay costes de gastos para las membranas, productos químicos o auxiliares de filtrado. Sin embargo, las desventajas de centrifugación son los altos costos de capital inicial, el ruido generado durante el funcionamiento y el coste de la electricidad. Además, la rotura física de las células se puede producir debido a la alta cizalla y la temperatura puede no ser lable estrechamente control-, que puede afectar a los productos sensibles a la temperatura. generación de bioaerosoles es una desventaja importante adicional, particularmente cuando se utilizan centrífugas para ciertos organismos de ADN

recombinantes o patógenos. En estas circunstancias, el equipo debe estar contenido (véase el capítulo 8).

Centrífugas industriales

Centrifugadoras se pueden dividir en unidades de laboratorio a pequeña escala y grandes centrifugadoras entre pilotos y escala industrial. centrifugadoras de laboratorio por lotes incluyen, en orden ascendente de la velocidad alcanzable: en banco, de alta velocidad y

ultracentrifugadoras, capaces de aplicar las FCR de 5000- 500 000 g. Aunque centrifugadoras lotes industriales están disponibles, para la mayoría de los propósitos industriales centrifugadoras semicontinuos y continuos son necesarios para procesar los grandes volúmenes en cuestión. Sin embargo, las FCR obtenidos son relativamente bajos. se utilizan comúnmente com- cuatro tipos principales de centrifugadora industrial. 1 Tubular centrifugadoras generalmente producir la más alta fuerza centrífuga de 13 000 a 17 000 g. Tienen rotor tubular hueco cuencos proporcionar un camino de flujo largo de la suspensión, que se bombea en la parte inferior y fluye hacia arriba a través del rotor (Fig. 7.5). El material particulado es arrojado a un lado de la taza, y el líquido clarificado pasa a cabo en la parte superior para la recolección continua. A

medida que el material en partículas se acumula en el interior de la taza, el diámetro de operación se reduce. En consecuencia, debe ser retirada periódica de los sólidos. 2 centrifugadoras tazón multicámara consistir en un recipiente que se divide por los cilindros de interconexión montados verticalmente y son capaces de funcionar a 5000 a 10 000 g (Fig. 7.6). La alimentación de líquido pasa desde el centro a través de cada cámara a su vez, y las partículas más pequeñas se acumulan en las cámaras exteriores. 3 centrífugas de discos puede operar a 000 g 500013. La taza de la centrifugadora contiene una pila de discos cónicos cuya estrecha relleno de separación de ayudas (Fig. 7.7). como líquido

En

Alimentar en Flotante salida

sólidos recogidos

Compresión abrazadera

Tela filtrante

Pila de discos

Fuera Abrir para descarga de sólidos recogidos

Higo. 7.8 Un filtro de placa y bastidor (de Brown et al. (1987)).

radios huecos tambor redondo

Higo. 7.7 Diagrama de una centrífuga de discos.

entre en el material particulado centrífuga es arrojado fuera salas, que incide sobre la cara inferior de los discos de cono. A continuación, las partículas viajan hacia el exterior de la pared del tambor donde se acumulan. Estas centrifugadoras por lo general tienen la cility fa- para descargar el material recogido periódicamente durante el funcionamiento. 4 centrífugas decantadoras de rosca operar continuamente a 1500-5000 g y son adecuados para la deshidratación de materiales sólidos gruesos a altas concentraciones de sólidos. Se utilizan en sistemas de aguas residuales para la separación de los lodos, y para las levaduras de cosecha y micelio fúngico.

Filtración La filtración convencional de líquidos que contienen sólidos en suspensión implica filtros de profundidad de compuestos de medios porosos (tela, lana de vidrio o de celulosa) que retienen los sólidos y permiten el filtrado líquido clarificado pase a través. A medida que avanza fil- trado sólidos recogidos se acumulan por encima del medio de filtro, la resistencia a los aumentos de filtración y fluyen a través del filtro disminuye. Estas técnicas se generan aliado útil para la recolección de hongos filamentosos, pero son

Vacío aplicado a tubo central (eje)

menos eficaces para la recogida de las bacterias. Los dos tipos principales de filtración Alimentar convencionales comúnmente utilizados en la industria son las siguientes. 1 placa y marco filtros o prensas de filtro, que son Canal sistemas de filtración por lotes industria- les (Fig. 7.8). Son normalmente en forma de una pila horizontal alternante de placas porosas y marcos de huecos. La pila está montada en una estructura de soporte en el que se lleva a cabo junto con una

Higo. 7.9Un filtro de vacío rotatorio que muestra la eliminación de la torta de filtro con un cuchillo.

ariete hidráulico o un tornillo. telas de filtro se mantiene en su lugar entre las placas que contienen canales de flujo para la alimentación y permeado corrientes. Esto forma esencialmente una serie de cámaras de tela forrada en el que la suspensión de células se fuerza bajo presión. Después de la

filtración por lotes el aparato debe ser desmantelado para retirar la torta de filtración recogida. Estos sistemas se utilizan para la recolección de microorganismos ismos de fermentaciones, incluida la preparación de bloques de la levadura del pan, la recuperación de proteínas precipitados y la deshidratación de lodos de depuradora. filtros de hoja presión hori- y verticales horisimilares también están disponibles. 2 filtros de vacío rotativos son sistemas de filtración continuos simples que se utilizan en diversos procesos industriales, en particular para la cosecha micelio de hongos durante bióticos fabricación ótica, para la producción de levadura de panadería y en la deshidratación de lodos durante el tratamiento de aguas residuales. El dispositivo comprende un tambor perforado hueco que apoya el medio de filtro (Fig. 7.9). Este tambor de rotación lenta

Tates en un tanque agitado de forma continua que contiene la suspensión a filtrar. Los sólidos se acumulan en el medio de filtro como se dibuja filtrado líquido, bajo vacío, a través del medio de filtro en el tambor hueco a un recipiente de recepción. A medida que el tambor gira, sólidos recogidos mantenidos en el medio de filtro se retiran por un cuchillo que corta / ellos se sacude en un recipiente de recogida. Los filtros podrán recubrieron previamente con un coadyuvante de filtración, por ejemplo tierra de diatomeas (tierra de diatomeas), que puede ser continuamente re plenished. La tasa de filtración (flujo de filtrado), para una constante a la presión (vacío) y la torta incompresible, se determina por la resistencia de la torta y el medio de filtración. En cuanto a la seguridad de la biotecnología, ninguno de los sistemas de filtración es adecuada para el procesamiento de productos tóxicos, patógenos o ciertos microorganismos de ADN recombinante y sus productos.

La filtración por membrana

Los métodos modernos de filtración implican filtros absolutos en lugar de filtros de profundidad. Estos consisten en apoyo a las membranas con tamaños de poro específicos que se pueden dividir en tres categorías principales. Ellos son, en orden de tamaño de poro, la microfiltración, ultrafiltración y membranas de ósmosis inversa decreciente. La suspensión a filtrar se bombea a través de la membrana (/ tangencial de flujo transversal) en lugar de en un ángulo recto a ella, como ocurre con los métodos de filtración convencionales. Esto retarda el ensuciamiento de la membrana por materiales en partículas. Las partículas cuyo tamaño está por debajo de la membrana línea de corte 'van a pasar a través de la membrana para convertirse en el ultrafiltrado o permeado, mientras que el resto se mantiene como el retenido. A medida que progresa tración filtro, el flujo a través de la membrana puede retrasar debido al ensuciamiento de la membrana. Esto puede ser causado por la acumulación de una capa de moléculas de soluto en la superficie de la membrana, conocido como polarización de la concentración. La presencia de agentes

antiespumantes de silicio puede tener un efecto negativo similar. La microfiltración se utiliza para separar las partículas de 10-2 micras a 10 micras, incluyendo la eliminación de las células microbianas del medio de fermentación. Este método es relativamente

las membranas tienen tamaños de poro más pequeños, y se utilizan para fraccionar soluciones de acuerdo con el peso molecular, normalmente dentro de la gama de 2.000 a 500 000 Da. Las membranas tienen una estructura anisotrópica, compuesto por una fina membrana con poros de diámetro especificado proporcionar selectividad, acostado en la parte superior de una estructura gruesa, muy porosa, apoyo puerto. Una membrana fabricada con un tamaño de exclusión intercambio de 100 000 Da, por ejemplo, debe producir un retenido de proteínas y otras moléculas más de 100 000 Da y un ultrafiltrado de todas las moléculas por debajo de 100 000 Da. Sin embargo, las proteínas no esféricas pueden exhibir diferentes reacciones de exclusión ENT para la membrana. membranas planas están disponibles, pero para las operaciones de mayor envergadura se prefieren por lo general los sistemas de fibras huecas (Fig. 7.10). Varias de estas unidades de ultrafiltración se pueden vincular caro debido al alto coste de las membranas, pero

To- juntos para producir un sistema de purificación sofisticado. Estos métodos se emplean ampliamente para la purificación de proteínas, y para separar y concentrar

Retenido / concentrado a cabo

Permear / ultrafiltrado a cabo de fibra hueca con tamaño de poro especificado

eso

Volver

purga

tiene varias ventajas en comparación con la centrifugación. Incluyen un funcionamiento silencioso, menores requisitos de energía, el producto se puede lavar fácilmente, un buen control de la temperatura es posible, la contención se consigue fácilmente y no se producen bioaerosoles. En consecuencia, es adecuado para el manejo de los agentes patógenos y microorganismos recombinantes. ultrafiltración es similar a la de microfiltración excepto que

apagado

Muestra en

Higo. 7.10Una representación esquemática de una unidad de ultrafiltración de fibra hueca.

materiales. La ultrafiltración también es eficaz en la eliminación de pirógenos (lipopolisacáridos de la pared celular bacteriana), restos de células y virus de medios de comunicación, y para el procesamiento de suero de leche. Otra variación en el sistema de ultrafiltración es de diafiltración, en donde se filtra el agua u otro líquido para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular no deseados. Esto se puede utilizar como una alternativa a la filtración en gel o di- ÁLISIS para la eliminación de sulfato de amonio a partir de una preparación de proteína precipitada por esta sal (desalado, ver pag. 119), para el cambio de una memoria intermedia o en la purificación de agua. Osmosis inversa se utiliza para la deshidratación o la concentración pasos y se ha empleado para desalinizar el agua de mar para beber. En agua de ósmosis cruzará una membrana semipermeable si la concentración de solutos osmóticamente tivas acciones, como la sal, es mayor en el lado opuesto de la membrana. Sin embargo, si se aplica presión a la "banda de sal 'luego revertir ocurrirá osmosis, y será impulsado agua a través de la membrana desde el lado de la sal. Esta inversión de la ósmosis requiere una alta presión, por ejemplo, una presión de 30-40 bar se necesita para eliminar el agua de una solución de sal / L de 0,6 mmol (nota: 1 bar = 100 kPa = 0,987 atm). En consecuencia, se requiere una carcasa de metal fuerte como para albergar este equipo. A medida que las membranas tienen tamaños de poro de solamente 10-2 a 10-4 m de diámetro, las moléculas del soluto se pueden depositar en la superficie, causando una gran resistencia al disolvente de flujo. Sin embargo, este ensuciamiento se puede superar mediante el aumento de la turbulencia en la superficie de la membrana.

La disrupción celular Algunos productos objetivo son intracelulares, incluyendo muchas enzimas y proteínas recombinantes, varios de los cuales se forman cuerpos de inclusión (véase p. 122). Por lo tanto, se requieren métodos para interrumpir los microorganismos y liberar estos productos. La ruptura de la pared celular / sobre y membrana citoplasmática puede plantear problemas, particularmente donde las células poseen fuertes paredes celulares.

Por ejemplo, se necesita una presión de 650 bar para romper las células de levadura, aunque esto puede variar algo en diferentes momentos durante el ciclo de crecimiento y en función de las condiciones de crecimiento específicas. Los problemas generales asociados con la ruptura de células in- cluyen la liberación de ADN, que puede aumentar la viscosidad de la suspensión. Esto también puede afectar aún más el procesamiento, tales como el bombeo de la suspensión a la siguiente unidad de proceso y el flujo a través de columnas de cromatografía. Una etapa de precipitación de ácido nucleico o la adición de DNasa puede ayudar a prevenir este problema. Si se utiliza la rotura mecánica a continuación, el calor se genera invariablemente, lo que desnaturaliza las proteínas a menos apropiada

se implementan medidas de enfriamiento. Productos liberados de las células eucariotas están a menudo sujetos a la degradación por las enzimas hidrolíticas (proteasas, lipasas, etc.) liberados de los lisosomas interrumpidas. Este daño puede ser reducida por la adición de inhibidores de la enzima, el enfriamiento de la célula ex tracto y el procesamiento rápido. Como alternativa, se pueden hacer intentos para producir cepas mutantes del microorganismo productor que carecen de las enzimas perjudiciales. La disrupción celular puede lograrse por ambos métodos mecánicos y no mecánicos. El proceso de interrupción a menudo se cuantificó por seguimiento de los cambios en la absorbancia, tamaño de partícula, la concentración total de proteína o la actividad de una enzima intracelular específico liberado en la suspensión rrumpida pantalla.

métodos de disrupción celular mecánicas Varios métodos mecánicos están disponibles para el ruption dis- de las células. Los basados en cizalla sólida implican la extrusión de las preparaciones de células congeladas a través de un orificio estrecho a alta presión. Este enfoque se ha usado a escala de laboratorio, pero no para operaciones a gran escala. Métodos que utilizan cizallamiento líquido son por lo general más eficaz. La prensa (celda de presión) francés se utiliza a menudo en el laboratorio y los homogeneizadores de alta presión, como el Manton Gaulin y

homogeneizador (APV de tipo molino), se emplean para piloto- y producción a gran escala de células disrupción. Se pueden usar para las células bacterianas y de levadura, y micelio fúngico. En estos dispositivos la suspensión celular se extrae a través de una válvula de retención en un cilindro bomba der. En este punto, se ve obligado a presión (hasta 1500 bar) a través de un espacio anular o descarga de la válvula muy estrecha, sobre la que la presión cae a la atmosférica. Cell ruption dis- se consigue principalmente por alto cizallamiento líquido en el orificio y la caída de presión repentina en la descarga provoca la explosión de las células. La velocidad de liberación de proteínas (eficiencia de interrupción) es independiente de la concentración de células, pero es una función de la presión ejercida, el número de ciclos a través del homogeneizador y la temperatura. La interrupción de las preparaciones de células de levadura, por ejemplo, normalmente requiere de tres pasos a través de la celda de presión a 650 bar, mientras que de tipo salvaje de Escherichia coli generalmente necesita 1500-00 bar. Durante el procesamiento, la temperatura se eleva en alrededor de 2/2 a 2/4 ° C por 100 bar, es decir, por aproximadamente 20 ° C durante una pasada a 800 bar. En consecuencia, el preenfriamiento de la preparación de células es generalmente esencial. La entrada de energía necesaria es de aproximadamente 0,35 kW por 100 bar y el rendimiento es de hasta 6000 l / h. Un problema con este método de disrupción celular es que todos mate- intracelular

riales son liberados. Como resultado, el producto de interés debe ser separado de una mezcla compleja de proteínas, ácidos nucleicos y fragmentos de pared celular. Algunos fragmentos de restos de células no se separan fácilmente, haciendo que la solución difícil de aclarar. Además, las proteínas pueden ser desnaturalizado si el equipo no está suficientemente frío y microorganismos filamentosos puede bloquear la válvula de descarga. Cuando se usa para ciertas categorías de microorganismos, los homogeneizadores tienen que estar contenidos para evitar el escape de aerosoles. A pequeña escala, rectificado manual de células con sivos abrasiones, normalmente alúmina, perlas de vidrio, tierra de diatomeas o de sílice, puede ser un medio eficaz para la interrupción, pero los resultados pueden no ser reproducibles. En la industria, molinos de perlas de alta velocidad, equipadas con camisas de refrigeración, a menudo se utilizan para agitar una suspensión de células con perlas pequeñas (0,5 hasta 0,9 micras diá- metro), de vidrio, óxido de zirconio o carburo de titanio. resultados de rotura de la célula de las fuerzas de corte, de rectificado entre los talones y las colisiones con los granos. La eficiencia de la rotura celular es una función de la velocidad de agitación, concentración de perlas, densidad del grano y de diámetro, densidad caldo, la tasa y la temperatura de flujo. La concentración de células es también un factor importante (óptimo 30 a 60% de peso en seco), que es una diferencia importante con las genizers homocizallamiento líquidos descritos anteriormente. Rendimiento máximo en estos sistemas es de aproximadamente 2000 L / h. Ultrasónico la interrupción de las células implica la cavitación, burbujas microscópicos o cavidades generadas por las ondas de presión. Se lleva a cabo mediante vibradores ultrasónicos que pro- ducir un sonido de alta frecuencia con una densidad de onda de aproximada- mente 20 kilohercios / s. Un transductor convierte las ondas en oscilaciones mecánicas a través de una sonda de titanio sumergido en la suspensión celular concentrada. Sin embargo, esta técnica también genera calor, que puede desnaturalizar las proteínas termolábiles. bacterias en forma de bastón son a menudo más fácil de romper que los cocos y los

organismos del Gram-negativas son más fácilmente alteradas que las células Gram-positivas. La sonicación es eficaz en una pequeña escala, pero no se utiliza rutinariamente en operaciones a gran escala, debido a problemas con la transmisión de energía y disipación de calor. La disrupción celular es una zona un poco descuidada de procesamiento bio, ya que ha habido relativamente poca innovación y el progreso. Incluso los métodos mecánicos utilizados rutinariamente establecidos se diseñaron originalmente para otros propósitos. Sin embargo, se están desarrollando algunos sistemas de disrupción nuevas para dar una mejor disrupción a gran escala, a menudo con la contención integral. Incluyen un molino de bolas de nuevo diseño, el molino CoBall; la Constant Systems disruptor de alta presión, que opera a velocidades de hasta 2700 bar; y dos sistemas sin partes móviles, el

sistema de chorro de microfluidos pinzamiento y el nebulizador Glass-Col. La bomba Parr Instrumentos ruptura celular está diseñado para interrumpir las células de mamíferos. Este es un método relativamente suave relación que funciona en el principio de descompresión de nitrógeno y no genera calor. El nitrógeno se disuelve en células a alta presión, y de liberación de presión repentina a continuación, hace que las células estallen.

métodos de disrupción celular no mecánicos Una alternativa a los métodos mecánicos de rotura de las células es hacer que su permeabilización. Esto puede ser plished acompa- por autolisis, choque osmótico, rotura de cristales de hielo (congelación / descongelación) o choque térmico. La autolisis, por ejemplo, se ha utilizado para la producción de levadura ex- tracto y otros productos de levadura. Tiene las ventajas de menor costo y utiliza las enzimas propias de los microbios, por lo que no hay sustancias extrañas se introducen en el producto. choque osmótico a menudo es útil para la liberación de los productos desde el espacio periplásmico. Esto puede lograrse equilibrando las células en 20% (w / v) de sacarosa tamponada, a continuación, recogiendo y resuspensión en agua a 4 ° C con rapidez. Una amplia gama de otras técnicas han sido desarrolladas para la interrupción microbiana pequeña escala usando diversos productos químicos y enzimas. Sin embargo, algunos de estos pueden conducir a problemas con etapas de purificación

posteriores. disolventes orgánica, por lo general acetona, butanol, cloroformo o metanol, se han utilizado para liberar enzimas y otras sustancias de microorganismos mediante la creación de canales a través de la membrana celular. tratamiento simple con álcalis o detergentes, tales como lauril sulfato de sodio o Triton X-100, también puede ser eficaz. Varios pared celular enzimas degradantes se han empleado con éxito en la ruptura celular. Por ejemplo, la lisozima, que hidroliza b-1,4 enlaces glucosídicos dentro de la peptidoglicano de la pared celular bacteriana, es útil para la lisis de los organismos Grampositivos. La adición de ácido de etileno diamina tetraacético (EDTA) para quelar iones metálicos también mejora la eficacia de la lisozima y otros tratamientos en bacterias Gram-negativas. Esto es porque EDTA tiene la capacidad de secuestrar los cationes divalentes que estabilizan la estructura de sus membranas externas. destrucción enzimática de las paredes celulares de levadura se puede lograr con las enzimas del intestino de caracol que contienen una mezcla de b-glucanasas. Estos preparados de enzimas también son útiles para producir esferoplastos de levadura que viven o protoplastos. El antibióticos penicilina y cicloserina pueden utilizarse para lisar creciendo activamente células bacterianas, a menudo en combinación

nación con un choque osmótico. Otras técnicas de permeabilización incluyen el uso de proteínas básicas, tales como protamina; el quitosano polisacárido catiónico es eficaz para las células de levadura; y permeabiliza estreptolisina mamíferos células de Mali.

la recuperación del producto La recuperación de proteínas extracelulares es del medio clarificado, mientras que las preparaciones de células rotas se usan para ambas proteínas intracelulares y los mantenidos dentro del espacio periplásmico. En el caso de algunas proteínas recombinantes expresadas en niveles altos, que a veces se forman cuerpos de inclusión que son liberadas por la rotura celular (véase p. 122). Después de la ruptura celular, las proteínas solubles son generalmente separados de los restos celulares por centrifugación. El sobrenadante resultante, que contiene las proteínas, se procesa entonces de una manera similar al medio de crecimiento de contención ing proteínas excretadas. Esto puede implicar varios tipos diferentes de métodos, algunos de los cuales han sido descritos anteriormente, tales como la ultrafiltración. An, método más antiguo, pero Sin em- bargo eficaz utilizado en esta etapa está salando de proteínas, seguido de la recuperación de proteínas precipitadas por centrifugación. La precipitación se consigue mediante la adición de sales inorgánicas a alta fuerza iónica, por lo general en forma de soluciones sólidas o saturada de sulfato de amonio. El sulfato de amonio es popular causa BE- de su alta solubilidad, baja toxicidad y bajo coste, pero se puede liberar amoníaco a valores altos de pH y es corrosivo a las superficies metálicas, por ejemplo centrifugadoras. La solubilidad de la sal varía con la temperatura, por lo que se requiere un control estricto de la temperatura. Reducción de la solubilidad de la proteína también se puede lograr mediante la adición de disolventes orgánicos, tales como acetona tono, el etanol y el isopropanol. Esto se realiza a baja temperatura y reduce la constante dieléctrica del medio, causando la precipitación de las proteínas. Acuosa de separación de dos fases implica la partición de la proteína entre las dos fases, dependiendo de su peso molecular y la carga.

sistemas comúnmente usados incluyen dextrano y polietilenglicol (PEG), o PEG y fosfato de potasio. Las dos fases se pueden separar por centrifugación. Este método es barato, tle género y versátil, y se pueden ampliar para aplicaciones industriales, incluyendo la purificación de enzimas, por ejemplo la ARN polimerasa de E. coli. alcaloides Muchos, antibióticos, esteroides y vitaminas son recuperado por métodos de extracción líquidolíquido con disolventes orgánicos. Los antibióticos, por ejemplo, se extraen de los medios de cultivo en disolventes tales como acetato de amilo.

Los disolventes utilizados deben ser no tóxico, selectivo, inex- pensativo, inmiscible con el caldo y debe tener un alto coeficiente de distribución para el producto, es decir, la relación del producto en las dos fases. La recuperación eficiente del disolvente para su reutilización es un aspecto esencial de la economía global del proceso.

cromatografía Las técnicas cromatográficas se emplean generalmente para productos de mayor valor. Estos métodos, normalmente columnas Rotatorio inde medios cromatográficos (fase estacionaria), se utilizan para el desalado, la concentración y purificación de preparaciones de proteína. En la elección de una técnica cromatográfica una serie de consideraciones deben ser tomadas en cuenta. Para productos de proteína de estos factores incluyen el peso molecular, punto isoeléctrico, hidrofobia y afinidad biológica. Cada una de estas propiedades pueden ser explotadas por métodos cromatográficos específicos que pueden ser ampliadas para formar una unidad de proceso industrial. El orden y la elección de la técnica dependerá del producto en particular, pero los siguientes parámetros cromatográficos se deben considerar: la capacidad, la recuperación y el poder de resolución (selectividad). La capacidad se refiere al tamaño de la muestra que se puede aplicar al sistema en términos de la concentración

de proteína y el volumen, y la recuperación es el rendimiento de producto en cada etapa. Los valores de rendimiento debe ser tan alta como sea posible de otro modo el proceso global será antieconómico. poder de resolución y la selectividad se refieren a la capacidad de separar dos componentes, uno que es el producto y la otra la impureza. Esto es particularmente importante en la etapa de purificación final. Se debe tener cuidado de no permitir que una proteína se desnaturalice durante la purificación, por lo que las columnas están generalmente se ejecuta a 4 ° C. Los cambios de pH, la dilución excesiva y la adición de ciertos productos químicos también pueden afectar a la estabilidad de la proteína. cromatografía de adsorción separa de acuerdo con la afinidad de la proteína, u otro material, para la superficie caras de la matriz sólida. Alúmina (Al2O3), atite hydroxyap- (Ca10 (PO4) 6 (OH) 2) o de sílice (SiO2) se utilizan parala purificación de moléculas no polares, mientras poliestireno resinas a base de matrices son eficaces para las moléculas polares. Esta técnica consiste en la unión de hidrógeno y / o fuerzas de van der Waals. Las proteínas adsorbidas se eluyen generalmente mediante el aumento de la fuerza iónica, a menudo mediante el uso de un gradiente de concentración creciente de ion fosfato. Cromatografía de afinidad es una técnica de purificación particularmente potente y altamente selectivo. A menudo puede dar hasta varios miles de veces la purificación en una sola

paso. Sin embargo, este método cromatográfico es sive expen- a escala industrial. La técnica implica interacciones especies químicas especí- entre las moléculas de soluto, tales como proteínas, y un ligando inmovilizado (molécula funcional). Los ligandos se unen covalentemente al material de matriz, por ejemplo agarosa, a través de un brazo espaciador para evitar el impedimento estérico. Algunos ligandos interactúan con un grupo de proteínas, en particular adenina dinucleótido nicotinamida, monofosfato de adenosina, y colorantes Procion y Cibacron; otros ligandos son altamente específicos, STRATES especialmente sub, análogos de sustrato y anticuerpos. Dado que los anticuerpos monoclonales se han vuelto más fácilmente disponibles, métodos de cromatografía de inmunoafinidad se han desarrollado para la purificación de varios antígenos. La capacidad de carga de columnas de afinidad es grande, ya que el volumen de la muestra no es importante y alta reso- lución se puede alcanzar. Esto también es una tecno- elución nique y de alta velocidad se logra utilizando cofactores o sustratos específicos; Alternativamente, la elución no específica se puede realizar con sal o cambio de pH. Para operaciones a escala industrial, a menudo es necesario esterilizar los medios de comunicación cromatográfico con el fin de cumplir con diferentes requisitos reglamentarios. Esto puede ser problemático como algunos ligandos son sensibles a agentes esterilizantes. cromatografía de filtración en gel esencialmente implica la separación sobre la base de tamaño molecular (tamizado molecular), aunque la forma molecular también puede influir en el rendimiento de separación. En consecuencia, es particularmente útil para las preparaciones de proteína de desalado. La fase estacionaria se compone de esferas porosas compuestas de polímeros acrílicos, de agarosa, celulosa, dextrano reticulado, etc., que tienen un tamaño de poro definido. Estos materiales de apoyo deben ser esterilizables, químicamente inerte, estable, altamente poroso e hidrófilo, que contiene algunos grupos iónicos. rigidez mecánica es particularmente importante con el fin de mantener buenas velocidades de flujo. La elección inicial del material de la fase

estacionaria es también un factor clave, ya que algunos pueden in- interactúan con el producto diana, por ejemplo matrices a base de carbohidratos interactúan con glicoproteínas. moléculas de soluto por debajo del tamaño de la exclusión del material de soporte entran y salen de las perlas. Moléculas por encima del tamaño de exclusión pasan solamente alrededor del exterior de las perlas a través de los espacios intersticiales y el volumen aparente de la columna es más pequeño para estas moléculas excluyeron más grandes. Como resultado, ellos fluyen más rápido de la columna, la separación de moléculas más pequeñas y eluyendo primero. Las moléculas más pequeñas capaces de entrar en los poros se eluyen en orden de tamaño decreciente. Cromatografía de intercambio de iones implica la adsorción selectiva de iones o compuestos cargados eléctricamente

sobre partículas de resina de intercambio iónico por fuerzas electrostáticas. El material de la matriz se basa a menudo en la celulosa sustituido con diversos grupos cargados, ya sean cationes o iones an-. Un ejemplo de uso común es la celulosa de dietilaminoetilo resina de intercambio aniónico (DEAE). Las proteínas posi- sess positiva, negativa o ninguna carga en función de su punto isoeléctrico (pI) y el pH del tampón circundante. Si el pH del tampón está por debajo del pI, una proteína tiene una carga global positiva, mientras que un tampón a los resultados de pI de la proteína que tiene sin cargo y pHs por encima de su pI producir una carga global negativa. Por ejemplo, si una proteína tiene un pI de 4,2, a pH 4,2 esta proteína es des- cargado y no se unirá a ya sea positiva o negativa resinas tivamente cargadas. Cuando el pH se eleva a pH 7,0 la proteína está cargada negativamente y se une a las resinas con carga positiva. En condiciones de pH por debajo de 4,0 la proteína está cargado positivamente y se une a las resinas con carga negativa. Si la proteína está en un estado aniónico capaz de adsorber a DEAE celulosa, por ejemplo, los contaminantes pasan a través de la columna. El producto puede entonces ser desorbido como una fracción purificada mediante la alteración de la fuerza iónica del tampón, a menudo mediante el uso de un gradiente de concentración creciente de tampón de fosfato. Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se desarrolló originalmente para la separación de moléculas orgánicas en disolventes no acuosos, pero ahora se utiliza para las proteínas en solución acuosa. Este método utiliza densamente poblada

por columnas que contienen partículas muy pequeñas rígidas, 5-50 micras de diámetro, de sílice o un polímero reticulado. En consecuencia, se requieren altas presiones. El método es rápido y da de alta resolución de las moléculas del soluto. Equipo para su uso en operaciones a gran escala ya está disponible. cromatografía hidrofóbica descansa sobre una interacción hidrófoba entre las regiones hidrofóbicas o dominios de red de una proteína soluto y grupos funcionales hidrófobos de las partículas de soporte. Estos soportes son a menudo de agarosa sustituidos con grupos octilo o fenilo. La elución de la columna se consigue normalmente mediante la alteración de la fuerza iónica, cambiando el pH o el aumento de la concentración de iones caotrópicos, por ejemplo, tiocianato. Esta técnica proporciona una buena resolución y, como cromatografía de intercambio de iones cromato, tiene una capacidad muy alta, ya que no está limitado por volumen de muestra. cromatografía de quelatos metálicos utiliza una matriz con iones metálicos unidos, por ejemplo, agarosa que contiene calcio, cobre o iones de magnesio. La proteína a purificar debe tener una afinidad para este ion y se une a ella por encofrado ing complejos de coordinación con grupos tales como el idazole im- de residuos de histidina. Las proteínas unidas son entonces

se eluyó con soluciones de ligandos de unión a metal libre, por ejemplo aminoácidos.

caldo frío fintas reciclan Escape

Diálisis y electrodiálisis Estas técnicas de separación por membranas se utilizan principalmente para la eliminación de solutos de bajo peso molecular y los iones inorgánicos a partir de una solución. Las membranas CORRE PELIGRO in- son de tamaño selectivo con peso molecular puntos de corte específicos. solutos de bajo peso molecular se mueven a través de la membrana por ósmosis de una región de concentración alta a una de baja concentración. métodos de electrodiálisis separar moléculas cargadas de una solución mediante la aplicación de una corriente eléctrica directa llevada por contraiones móviles. Las membranas utilizadas contener grupos de intercambio iónico y tienen un cargo fijo; por ejemplo, membranas cargadas positivamente permiten el paso de aniones y cationes repelen. Son esencialmente resinas de intercambio iónico en forma de lámina y también se han utilizado para la desalinización de agua.

Espíritu colección

lavado con agua caliente

el vapor de alcohol caliente El vapor de drenaje

Destilación La destilación se utiliza para recuperar alcohol combustible, acetona y otros disolventes de los medios de fermentación, y para la preparación de aguardientes. la destilación por lotes en alambiques se sigue utilizando para la producción de algunos whiskys (véase el capítulo 12), pero para la mayoría de otros fines de destilación continua es el método de elección. Con el etanol, por ejemplo, el sistema continuo produce un producto con una concentración máxima de etanol del 96,5% (v / v). Esta mezcla azeotrópica es la concentración más alta que se puede lograr a partir de etanol acuoso, a menos que una etapa de deshidratación se introduce utilizando un agente de arrastre de agua, tal como benceno o ciclohexano. Algunas imágenes fijas continuas pueden estar en la forma de cuatro o cinco columnas separadas, pero el tipo Coffey todavía comprende sólo dos columnas, el "rectificador" y "analizador ', conteniendo cada uno una pila de placas perforadas 30-32 (Fig. 7.11). caldo de fermentación entrante se calienta, a

medida que pasa por un tubo enrollado dentro de la columna rectificadora, por el vapor caliente ascendente producido por la columna de analizador. El caldo ahora caliente se libera en un canal en la parte superior de la columna de analizador y a medida que cae hacia abajo de la columna se calienta por el vapor. vapores calientes generados se transportan desde la parte superior de la columna de analizador a la parte inferior de la columna rectificadora. A medida que pasa hacia arriba que se condensa sobre las bobinas que llevan caldo entrante. Hay un gradiente de temperatura en la columna rectificadora

Higo. 7.11Un tipo Coffey todavía (sólo seis de la columna 30 secciones mostradas) (de Brown et al. (1987)).

y cada compuesto volátil se condensa en su apropiada comió nivel, desde donde se recoge la fracción.

Acabado pasos Cristalización la cristalización del producto se puede conseguir mediante la evaporación, el tratamiento a baja temperatura o la adición de un Chemical reactivo con el soluto. la solubilidad del producto puede ser reducido mediante la adición de disolventes, sales,

polímeros (por ejemplo, no PEG iónico) y polielectrolitos, o mediante la alteración del pH.

El secado El secado implica la transferencia de calor al material húmedo y la eliminación de la humedad en forma de vapor de agua. Por lo general, esto debe realizarse de una manera tal como para retener la actividad biológica del producto. Parámetros que afectan de secado son las propiedades físicas del sistema sólido-líquido, las propiedades intrínsecas del soluto, las condiciones de los parámetros del entorno de secado y de transferencia de calor. La transferencia de calor puede ser por contacto directo, por convección o radiación.

secadores de tambor rotativo eliminar el agua por conducción de calor. Una película delgada de solución se aplica a la superficie calentada de vapor del tambor, que se raspa con un cuchillo para recuperar el producto se seca. En el vacío bandeja Secadores el material a secar se coloca en las estanterías de calefacción dentro de una cámara a la que se aplica un vacío. Esto permite temperaturas más bajas para ser utilizados debido a la menor punto de ebullición de agua a presión reducida. El método es adecuado para pequeños lotes de costosos materiales, tales como algunos productos farmacéuticos. El secado por pulverización Volves inatomización y pulverización de la solución de producto en una cámara climatizada, y partículas secas resultantes se separan de los gases utilizando ciclones. secadores utilizan para el transporte neumático de aire caliente que suspende y transporta partículas. Secar en frío (Liofilización) se utiliza a menudo en los productos finales son células vivas, al igual que en las preparaciones del cultivo iniciador, o para productos termolábiles. Esto es especialmente útil para algunas enzimas, vacunas y otros productos farmacéuticos, en los que la retención de la actividad biológica es de gran importancia. En este método, las soluciones congeladas de antibióticos, enzimas o suspensiones de células microbianas se preparan y se elimina el agua por sublimación al vacío, directamente del estado sólido al estado de vapor. Este método elimina el daño térmico y osmótico.

Los cuerpos de inclusión y el papel de la ingeniería genética en los procesos posteriores Como se mencionó anteriormente, muchas proteínas recombinantes están formados como cuerpos de inclusión, que son agregados inactivos insolubles de polipéptidos sobre-expresados. Surgen debido a la acumulación de polipéptidos nacientes parcialmente plegadas que han expuesto las superficies hidrófobas. Dando como resultado interacciones hidrofóbicas hacer que se forman agregados insolubles. Esto es a menudo Afortunadaitous, ya que proporciona una forma concentrada de la proteína, ya que los agregados pueden contener más de 50% de proteína diana.

Una vez que las células productoras se rompen y se retiran los restos de células grandes, los cuerpos de inclusión se recuperan fácilmente de los extractos libres de células por centrifugación a baja velocidad a 5000 a 20 000 g durante 15 a 60 min. La proteína recuperada debe entonces ser solubilizada; sin embargo, en este punto que no son solubles en tampones acuosos ordinarios. Su solubilización requiere las soluciones concentradas de agentes desnaturalizantes de proteínas (chaotrophic), tal como 5 a 10 mmol / L y urea 4-8 mmol / L de guanidina-HCl, o detergentes. Cuando sea necesario, los enlaces disulfuro se rompen por el uso de mercaptoetanol o ditiotreitol.

Después de la disolución, los desnaturalizantes y agentes reductores se eliminan por diálisis, diafiltración o gel filtración ción. Esto comienza replegamiento de proteínas (renaturalización) para producir la conformación funcional y restaurar bioactividad lógica. El replegamiento puede conseguirse por la lenta retirada de desnaturalizantes, junto con los tratamientos adicionales utilizando tampones específicos y diferentes regímenes de temperatura. Para algunas proteínas recombinantes bonos disuphide también debe ser reformada, que a menudo se acompaplished por oxidación con aire o reacciones de intercambio tiol-disulfuro. DSP puede ser ayudado por la introducción de ayudas específicas en las etapas aguas arriba. Los organismos pueden ser modificados para suprimir la producción de subproductos y enzimas que pueden interferir con las operaciones de DSP o degradar el producto objetivo. productos proteicos recombinantes pueden ser diseñados para ser excretada de la célula, y la rotura de células y la liberación de productos intracelulares también pueden ser asistidos. La dotación de células de un organismo puede modificarse de modo que sea permeable, o es en algún momento inducido a ser permeable al producto. Por ejemplo, recombinantes de E. coli a menudo se lisaron mediante la coexpresión de lisozima (bajo control inductor apropiado). Siguiente al de la inducción de lisozima al final de la fermentación, la rotura celular se promueve mediante una etapa de congelacióndescongelación. productos proteicos recombinantes pueden ser diseñados con una alta afinidad para ciertas

matrices de separación o unidos a otra molécula con características de separación deseables. Una técnica ahora bien establecida es la construcción de proteínas de fusión (Tabla 7.1) (quiméricos o híbridos). Por ejemplo, el gen estructural para la Tarobtener péptido recombinante / proteína se puede fusionar / etiquetado con ADN adicional que codifica un polipéptido natural o sintético en el 5 ¢ o 3 ¢ final del gen. La etiqueta puede ser una enzima completa, tales como bgalactosidasa, cloranfenicol phenicolacetyltransferase o glutatión-Stransferasa. Estas etiquetas se pueden emplear para proteger a péptidos cortos que a menudo se degradan rápidamente, o ayuda en el procesamiento de aguas abajo y el ensayar específica del producto péptido / proteína. Las etiquetas pueden ser utilizados para permitir de afinidad, de intercambio iónico, covalente hidrófoba o separación de metal-quelato del péptido / proteína. Algunos métodos son adecuados para ambas proteínas secretadas y aquellos que forman cuerpos de inclusión. Un sitio de la enzima de escisión química o también se puede incluir en el enlazador entre la proteína diana y su etiqueta, con el fin de facilitar la eliminación posterior de la etiqueta. sitios de corte de enzimas se encuentran las de tidases endopep-, enteroquinasa y trombina, mientras que los sitios químicas son las contempladas por, bromuro de cianógeno ácido o hidroxilamina.

Tabla 7.1 Ejemplo de proteínas de fusión para ayudar a la purificación de proteínas recombinantes etiqueta de purificación

Matriz

La elución

Afinidad cloranfenicol acetiltransferasa glutatión-S-transferasa proteína A

pag-amino cloranfenicol-Sepharose El glutatión-agarosa IgG-Sepharose

5 mmol / L de cloranfenicol El exceso de glutatión reducido ácido / L acético 0,5 mmol

El intercambio iónico S-Sepharose poliarginina Metal-quelato histidina-triptófano dipeptideImindiacetic-Sepharose

gradiente de cloruro sódico (Ni2+) Bajo pH

gradiente

Etiquetas que codifica para un dipéptido específico o una secuencia de residuos de aminoácidos, tales como arginina, fenilalanina o cisteína, se puede añadir en el extremo Cterminal que forma una "cola" de la proteína diana. colas de poliarginina, por ejemplo, dan lugar a una proteína particular básica que a diferencia de otras proteínas celulares se une a las resinas de intercambio catiónico. Una vez recuperado de la resina, las colas de poliarginina se pueden eliminar haciendo pasar la proteína a través de una columna de una exopeptidasa inmovilizado, por ejemplo carboxpeptidase A. Este modo de purificación se ha utilizado para la preparación de urogastrona y el interferón-g. Alternativamente, un gen para una proteína que se une a IgG, tales como Staphylococcus proteína neumocócica A (SPA), puede fusionarse con el gen de la proteína diana. El producto con la etiqueta SPA se puede purificar por cromatografía de inmunoafinidad utilizando IgG como ligando.

Otras lecturas Papeles y comentarios Bernardez-Clark, ED (1998) El replegamiento de proteínas recombinantes. Current Opinion in Biotechnology 9, 157-163. Christi, Y. y Moo-Young, M. (1986) La alteración de las células microbianas de los productos intracelulares. Enzyme y Microbial Technology 8, 194-204. Christi, Y. y Moo-Young, M. (1990) a gran escala de proteínas separado raciones: aspectos de ingeniería de cromatografía. Los avances biotecnológicos 8, 699-708.

Datar, RV, Cartwright, T. & Rosen, CG (1993) Comentario: la economía del proceso de cultivo de células animales y las fermentaciones bacterianas: un análisis de estudios de caso de activador del plasminógeno tisular. Bio / Technology 11, 349357. fermentación y recuperación de procesos Daugulis, AJ (1994) integradas. Current Opinion in Biotechnology 5, 192-195. Fomentar, D. (1995) La optimización de la recuperación del producto recombinante a través de mejoras en las tecnologías de células de interrupción. Opinión actual alquilar en Biotecnología 6, 523-526.

Harrison, STL (1991) Bacterial disrupción celular: una unidad clave OPERACION en la recuperación de las proteínas intracelulares. Los avances biotecnológicos 9, 217-240. Harrison, STL, Dennis, JS & Chase, HA (1991) Comisión combinarse los procesos mecánicos para la interrupción de las bacterias y químicas. Bioseparation 2, 95-105. Marston, FAO, Angal, S., Lowe, PA, Chan, M. & Hill, C. R. (1988) Escala-up de la recuperación y reactivación de proteínas recombinantes. Bioquímica Sociedad Transacciones 16, 112115. proteínas de ingeniería Sassanfeld, HM (1990) para la purificación. Tendencias en Biotecnología 8, 88-92.

Libros Serie Biotol (1992) Recuperación del producto en Bioprocesos Technology. ButterworthHeinemann, Oxford. Atkinson, B. & Mavituna, F. (1991) Bioquímica Engineering Handbook y Biotecnología, 2ª edición. Macmillan, Basingstoke.

Blanch, HW & Clark, DS (1997) Ingeniería Bioquímica. Marcel Dekker, New York. Brown, CM, Campbell, I. y Sacerdote, FG (1987) Introducción a la Biotecnología. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Bu'lock, J. & Kristiansen, B. (1987) Básico Biotecnología. Academic Press, Londres. Doran, PM (1995) Principios de Ingeniería de Bioprocesos. Academic Press, Londres. Hambleton, P., Melling, J. & Salusbury, TT (1994) Bioseguridad en Biotecnología Industrial. Blackie Academic y Professional, Glasgow. Harrison, RG (ed.) (1993) Protein Purification Aplicaciones. Un enfoque práctico. Marcel Dekker, New York. Jackson, AT (1990) Ingeniería de Procesos en Biotecnología. Open University, Milton Keynes. Stanbury, PF, Whitaker, A. & Hall, SJ (1995) Principios de la tecnología de fermentación, 2ª edición. Butterworth-Heinemann (Pérgamo), Oxford. Wheelwright, SM (1991) Protein Purification: Diseño y scale-up de la elaboración secundaria. Hanser Publications, Nueva York.

8 El desarrollo de productos, regulación y seguridad

El desarrollo de cualquier nuevo producto de fermentación depende de muchos factores, incluyendo el mercado, el nivel actual de los conocimientos científicos y el entorno reglamentario. Algunos de estos factores están fuera del control del desarrollador. El mercado está obviamente afectada por la singularidad del producto y donde se percibe un mercado que existe para un nuevo producto, denominado "demanda de mercado ', habrá un incentivo para tratar de llenar ese nicho, por ejemplo, fármacos para tratar el cáncer, infección por VIH, demencia, etc. En el caso de productos médicos, un nuevo tratamiento para una enfermedad intratable riormente pre- o un fármaco más eficaz puede ser muy rentable para una empresa. Sin embargo, el tamaño del mercado es una consideración importante. Por ejemplo, el desarrollo de fármacos dirigidos a enfermedades raras no puede ser económicamente viable para las empresas comerciales. En los EE.UU. y Japón, y pronto en la Unión Europea, su desarrollo se puede lograr a través de programas de fármaco huérfano '' patrocinados por el gobierno. Un problema adicional surge cuando el mercado potencial no puede proporcionar el producto, como en los países en desarrollo. En estos casos, las agencias internacionales, como las Naciones Unidas pueden estar implicados en el suministro de los productos. El nivel de conocimiento científico es un factor clave adicional. Algunos avances en la ciencia resultado de la rápida evolución de los procesos industriales, denominados "empuje científica '. Por ejemplo, el descubrimiento de la penicilina en 1928 de Fleming en última instancia condujo a la creación de la industria de antibióticos en la década de 1940. Un desarrollo particularmente rápido fue visto con anticuerpos monoclonales. Su producción

fue desarrollado por primera vez en la década de 1970 y dio lugar a una industria de muchos millones de dólares en tan sólo unos años. El rápido avance de la tecnología del ADN recombinante en los últimos años también ha generado un "empuje" para muchos nuevos productos y, muy importante, esta tecnología se puede aplicar fácilmente a los procesos de fermentación establecidos. Sin embargo, existen algunos mercados importantes, pero en la actualidad la ciencia no puede- producir el producto necesario, por ejemplo, una vacuna eficaz contra el VIH y los medicamentos para el tratamiento de cánceres, la nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), trastornos mentales, enfermedades del corazón, etc. .

124

En la elaboración de una propuesta para la producción de cualquier nuevo producto de fermentación, ya lo largo de su desarrollo, una gran cantidad de entrada debe provenir de disciplinas diferentes a la microbiología. Las principales contribuciones se requieren, entre otros, bioquímicos, genetistas, biólogos moleculares, químicos, ingenieros de procesos químicos y, matemáticos y tecnólogos informáticos. la transición desde el descubrimiento inicial a través de un nuevo producto comercial puede ser un proceso largo y costoso. Una farmacéutica típica, por ejemplo, en la actualidad lleva a 10-12 años para llegar al mercado e incurre en costos de desarrollo de más de $ 200 millones (Fig. 8.1). Sin embargo, el objetivo es ahora para reducir a un máximo de 8 años. Un factor importante que influye en el tiempo de desarrollo de largo es el marco regulador, que implica la seguridad del producto, los empleados y el medio ambiente, junto con los aspectos legales, patentes, licencias de productos, y los aspectos sociales y éticos. La protección de patentes de una invención que normalmente se buscó en una etapa temprana, con el fin de dar al titular de la patente el derecho legal de excluir a otros de su uso comercial para un periodo que suele ser de 17-20 años, dependiendo

de la prueba país. Las patentes se pueden separar en tres tipos distintos. Patentes de productos (sustancias, la composición de la materia y dispositivos) como bioinsecticidas, proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales, plásmidos, etc. son los más fácilmente protegidos como la infracción de patente puede ser determinado por análisis del producto. La fabricación de las patentes de procedimiento, por ejemplo, el aislamiento de ADN, la purificación de una proteína recombinante, etc., presuponen un método mejorado de producción y son bastante más difíciles de aplicar. Los métodos de las patentes de uso suponen un nuevo papel para un producto, tales como modo de aplicación bioinsecticida, administración de fármacos, etc. Patentamiento de microorganismos, donde son parte de un proceso, se ha llevado a cabo durante más de cien años. Sin embargo, las patentes de secuencias de genes y organismos enteros, en particular las plantas y los animales, es muy controvertido ya que plantea enormes problemas legales, económicos, ambientales y no por ello menos éticos y morales. aspectos sociales y éticos de producto biotecnológico

El desarrollo de productos, regulación y

seguridad y eficacia, y las especificaciones requeridas para la pureza y actividad. licencias de producto sólo se conceden cuando el producto ha pasado todos los requisitos del sistema regulatorio. Rante la prueba necesaria es largo y puede ser muy caro, pero es considerablemente más fácil que el organismo de producción tiene un estatus GRAS (generalmente considerado como seguro). En el caso de los productos farmacéuticos, por ejemplo, el proceso de la fabricación debe ser validado y el producto "bien caracterizado

descubrimiento inicial del producto farmacéutico potencial Patentar aplicaciones caracterización del producto ensayos preclínicos la aprobación reglamentaria de los ensayos en humanos Los ensayos clínicos (duración media de 6 años) Fase I (voluntarios sanos) Fase II (eficacia y seguridad de las pruebas a pequeña escala en los pacientes) Fase III (eficacia y seguridad de las pruebas a gran escala en pacientes)

Sumisión a las autoridades reguladoras para la aprobación del producto

Producto concedió una licencia para la fabricación y comercialización

Producto disponible para la venta (Fase IV, la vigilancia posterior a la comercialización)

Higo. 8.1 Desarrollo de un producto farmacéutico.

desarrollo se están volviendo cada vez más importante, como se vio en los últimos años, por la destrucción de los cultivos agrícolas genéticamente manipulado camente (GM) en Europa y Asia. Además, existe preocupación por los cerdos de cría con sistemas inmunes humanos de parte para su uso como fuente de órganos para trasplantes (xenotrasplante), patente de secuencias de ADN humano y la liberación de los sistemas de ADN recombinantes en el medio ambiente.

La calidad seguridad

del

producto

y

12 5

la

Antes de la aprobación para su comercialización, cualquier nuevo producto alimenticio o de atención de salud que va a ser utilizado por los seres humanos y los animales domésticos o de granja debe ser probado a fondo. Esto se refiere a aspectos de

12

Capítulo

zado '. Esto implica un examen riguroso de 6 su identidad (estructura, características fisicoquímicas y de inmunoquímica), la cuantificación de potencia y pureza, y la identificación y cuantificación de los impurdades. Además, los productos farmacéuticos deben pasar a través de tres niveles de ensayos antes de su comercialización y someterse a la vigilancia posterior a la comercialización de seguridad (Fig. 8.1). La aprobación por falta de alimentos y productos no medicamentosos es bastante menos costoso y las evaluaciones de riesgo dependerá del microorganismo implicado, el producto específico, y el modo de su producción y el procesamiento aguas abajo. Sin embargo, esto es obviamente más complejo para los microorganismos modificados genéticamente (MMG) y patógenos (véase p. 138). Una vez aprobado, el producto debe ser fabricado con los estándares de calidad especificados. niveles estipulados de pureza y actividad dependerán de producto individual. Es importante destacar que el producto no debe estar contaminado por sustancias o agentes patógenos potencialmente peligrosos. Esto significa que un producto, tal como un fármaco inyectable para uso humano, tendría un conjunto algo diferente y más estricta de los criterios de calidad de ensilaje para la alimentación de animales de granja. Sin embargo, el ensilaje todavía tendría que ser producido a criterios de calidad especificados. Cualquier producto que se va a liberar al mercado tiene que ajustarse a los

procedimientos de calidad, que por lo general se componen de al menos tres fuentes, dependiendo del producto específico. Estos son los requisitos reglamentarios nacionales e internacionales, que son Sory legal y compulsión; requisitos de la Guía, a menudo ideadas por las asociaciones de fabricantes, que no son necesariamente obligatoria; y 'en casa' estándares de la compañía. El enfoque de la producción debería implicar un exceso de todo carácter distintivo de garantía de calidad (QA). Esta se define como la suma total de las medidas adoptadas con el objeto de asegurar que los productos se fabrican consistentemente a una calidad adecuada para el uso previsto (Fig. 8.2). Dentro de esto, se deben adoptar buenas prácticas de fabricación (GMP) apropiados, por ejemplo, las impuestas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) (GMP emitido por el Código de Reglamentos Federales nes sobre el diseño, validación y operación de Estados Unidos de la planta de fabricación farmacéutica / biotecnología). También se requieren procedimientos operativos estándar (SOP) validadas. Su validación implica el establecimiento de pruebas documentadas que proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso específico producirá consistentemente un producto que cumpla con las especificaciones predeterminadas y atributos de calidad. En general, el trabajo del GMP marco determina la organización y funciones de los procesos de producción y purificación. implican

Seguro de calidad

Producto manufactureProduct

designProduct

developmentResearch

buenas prácticas de fabricación practicesQuality controlar

Higo. 8.2 Los componentes de aseguramiento de la calidad.

tanto de fabricación y control de calidad (QC). Estos últimos se ocupa de los procedimientos de muestreo, normas, ensayos, organización, documentación y lanzamiento de productos. En general, la implementación de estas prácticas debe dar lugar a la producción controlada de un producto seguro con la eliminación de las importantes variaciones de un lote a otro en la calidad.

Fabricación y seguridad ambiental Seguridad de los empleados que participan en un proceso de fabricación es una preocupación primordial. No deben ser expuesto a posibles patógenos o alergenos e irritantes que pueden causar enfermedades. Por ejemplo, los polvos generados a partir de polvos enzimáticos han causado reacciones alérgicas en personas que trabajan en plantas de fermentación Manufacturing estos productos. Ciertas operaciones de la unidad de procesamiento aguas abajo, tales como el uso de centrifugadoras para recolec- ción celular y algunos métodos mecánicos de disrupción celular, pueden generar aerosoles biológicos que podrían afectar potencialmente empleados. Estos aerosoles biológicos pueden ser contenidos, pero a un costo adicional. El GMP aprobado, que implica el uso del envase de seguridad adecuado (métodos para la gestión del agente infeccioso '), cuando sea necesario, y equipo de seguridad, etc., debe eliminar estos posibles proble- mas de seguridad. Además, todos los empleados deben estar completamente entrenados, llevar a cabo las prácticas de trabajo seguras y ser conscientes de los peligros potenciales.

Los microorganismos son liberados deliberada en el medio ambiente como pesticidas y para la biorremediación, pero todavía hay un debate considerable sobre algunos aspectos de la liberación intencional, especialmente cuando son microorganismos modificados genéticamente que se trate. Sin embargo, la población y el medio ambiente deben ser protegidos de la liberación accidental de microorganismos potencialmente dañinos o productos microbianos a partir de procesos de fermentación a gran escala.

Los protocolos deben ser establecidos para asegurar que esto no ocurra. También debe haber una eliminación segura de los residuos que se derivan de estos procesos, que pueden requerir la esterilización y otros tratamientos antes de su liberación. Seguridad en las industrias de fermentación es particularmente importante cuando se emplean agentes patógenos conocidos y ciertos microorganismos modificados genéticamente. La clasificación de los microorganismos en términos de peligro para los seres humanos los divide en cuatroCategorías, una división que se actualiza periódicamente por las autoridades reguladoras. Estas categorías son similares a los reglamentos formulados por el Reino Unido, los Estados Unidos y las autoridades de la UE, y por la Organización Mundial de la Salud (OMS), cuya clasificación se muestra en la Tabla 8.1. El cultivo de microorganismos requiere la implementación de diferentes niveles de los sistemas de barrera / de contención, dependiendo del proceso de fermentación y la clasificación del microorganismo productor (Fig. 8.3). establecidas 'probadas' procesos de fermentación tradicionales y muchos re- quieren un nivel mínimo de contención y la esterilidad, mientras que el cultivo de agentes patógenos y otros microorganismos modificados

genéticamente requiere altos niveles de contención y la esterilidad (véase más adelante). barreras de contención primaria proteger al personal y las instalaciones de procesamiento inmediato al impedir la fuga de los microorganismos del fermentador o como aerosol generado a partir de la elaboración secundaria equipos de (Tabla 8.2). Esta protección es proporcionada por Menting buenas técnicas microbiológicas implementación y el uso de equipo de seguridad apropiado. Algunas de las áreas problemáticas en fermentaciones a gran escala son el eje del agitador y sus sellos. Por lo general, dos o tres sellos ahora se requieren de manera que si uno rompe otro se mantenga. Además, todas las válvulas, juntas tóricas, grifos y bombas deben ser revisados regularmente. barreras secundarias implican el uso de ropa de protección, supervisión médica regular y la vacunación del personal de labo- ratorio y de fabricación. Otras barreras de contención secundaria implican criterios de diseño específicos para plantas y laboratorios de fabricación. Estos incluyen el uso de presión de aire positiva y negativa, filtros de aire de alta eficiencia de partículas (HEPA), bolsas de aire y

Tabla 8.1 clasificación de la Organización Mundial de la Salud de los microorganismos sobre la base de peligro contención requerida El grupo de riesgo 1 gran escala (GILSP) Bajo riesgo individual y comunitario. Un microorganismo que es probable que causen enfermedades o animal enfermedad humana de importancia veterinaria

Las buenas prácticas industriales a

El grupo de riesgo 2 riesgo individual moderado, riesgo comunitario limitado. Un patógeno que puede provocar una enfermedad humana o enfermedades de los animales, pero es poco probable que sea un serio peligro para los trabajadores de laboratorio, la comunidad, animales de granja o el medio ambiente. exposiciones laboratorio puede provocar una infección grave, pero el tratamiento de profilaxis eficaces están disponibles y el riesgo de propagación es limitada, por ejemplo, la intoxicación alimentaria por Salmonella. Las vacunas y los antibióticos están disponibles

Nivel 1 de contención

El grupo de riesgo 3 Alto riesgo individual, de bajo riesgo para la comunidad. Un patógeno que provoca generalmente una enfermedad humana grave, pero no se transmite de un individuo infectado a otro. Profilaxis y el tratamiento pueden estar disponibles

Nivel 2 de contención

El grupo de riesgo 4 Alto riesgo individual y comunitario. Un patógeno que provoca generalmente una enfermedad humana o animal grave y puede transmitirse fácilmente de un individuo a otro. Sin profilaxis o

Grado 3 de confinamiento

tratamiento eficaz está disponible, por ejemplo, el virus del Ébola

proceso organismo

No GMMGMM

grupo de peligro Otras categorías (ver Tabla 8.1)

Inofensiv o Grupo I

Potencialmente peligroso Grupo II

1234 pequ eña escal a

Higo. 8.3Categorías de microorganismos de proceso y el nivel de contención requiere cuando se utiliza en la investigación y sitios industriales dentro de la Federación Europea de Biotecnología (GILSP = buena práctica a gran escala industrial; GMM = genéticamente microorganismos manipulados).

Nivel de contención requiere

la equivalent e a GILSP

GILSP123

Gran de escal a

pequ eña escal a

Gran de escal a

BAB al menos contención primaria

B1B2B3

B4

niveles de contención equivalentes

vestuarios para el personal de operación, junto con protocolos específicos para la esterilización de los residuos antes de que abandone el sitio y su eliminación segura. seguridad global está controlada principalmente por las agencias gubernamentales internacionales y particulares que regulen: alimentos, bebidas y productos farmacéuticos; protección del ambiente; y seguridad en el lugar de trabajo. Los controles en los EE.UU. son impuestas principalmente por la FDA, el Ambiente

Agencia de Protección del medio (EPA) y los Institutos Nacionales de Salud (NIH). En Japón esto es en gran medida excesiva visto por el Ministerio de Salud y Bienestar. Dentro de la UE, la Comisión Europea y el Parlamento Europeo ción, así como los estados miembros individuales, enmarcar las nuevas normas y garantizar su aplicación. Por ejemplo, en el Reino Unido, el Health and Safety Executive (HSE) tiene un papel importante policial. Se está intentando

mesa 8.2 Los ejemplos de las medidas de seguridad necesarias para los diferentes niveles de contención, como se requiere en la Federación Europea de Biotecnología categoría de contención (ver Fig. 8.3) microorganismos no modificados

GILS

1

2

3

genéticamente modificadas procedimientos código escrito de la práctica Manual de bioseguridad acceso restringido vigilancia médica La contención primaria uso de sistemas cerrados para viable

P B1

B2

+ -

+ + + +

B 3 + + + +

B 4 + + + +

MinimizationPrevention Prevención microorganismsof liberarse de lanzamiento de la liberación tratamiento de gases de escape los gases MinimizationPrevention Prevención de liberarse de lanzamiento de la liberación eliminación de materiales, productos y efluentes MinimizationPrevention Prevención de liberarse de lanzamiento de la liberación la penetración de la cerrada sistema, MinimizationPrevention Prevención por ejemplo, eje del agitador, dispositivos de control, etc. Por liberarse de lanzamiento de la liberación

Contención secundaria desinfección instalaciones ducha de emergencia instalaciones esclusa de aire + obligatoria ducha descontaminado efluentes HEPA filtros en el aire conductos zona herméticamente sellable negativa controlada presión

-

- +++ - ++ --- + - ++ - ++ --- + --- +

GILSP, las buenas prácticas a gran escala industrial.

hecho para estandarizar las regulaciones para facilitar el comercio internacional libre cional de productos. Antes de que cualquier nuevo proceso industrial puede empezar a funcionar, la mayoría de los países exigen que una evaluación del análisis de riesgos se llevará a cabo. Esto se requiere específicamente para procesos que utilizan microorganismos modificados genéticamente. El riesgo es una función de la probabilidad estimada de que un evento tenga un efecto adverso, multiplicado por una estimación de la magnitud (gravedad y las consecuencias) de dicho efecto. El análisis de riesgos requiere tanto la evaluación cuantitativa del riesgo y gestión del riesgo. Este último se lleva a cabo una vez que se ha acordado que el proceso debe seguir adelante como cualquier riesgo se ve compensado por los beneficios.

Parte de esta evaluación de riesgos depende de si el microorganismo contiene ADN extraño. Si el organismo es un no-GMM se puede colocar en una de cuatro categorías que se han mencionado anteriormente (Tabla 8.1). La categorización específica de un microorganismo depende de su patogenicidad, virulencia, la dosis infecciosa necesaria para causar la enfermedad, la vía de infección, el nivel de incidencia en

la comunidad y si se necesitan vectores. Obviamente, la disponibilidad de profilaxis, tales como la vacunación y otros tratamientos, es una consideración importante. Las técnicas a utilizar y la escala de producción son también factores clave. Por ejemplo, la manipulación y eliminación de 1 L de Escherichia coli (un microorganismo clase 2) tiene problemas completamente diferentes, y riesgos, por lo tanto separadas, en comparación con un 100 000 L fermentación del mismo microorganismo. Grupo de riesgo 1 microorganismos son los menos propensos a causar un problema y, para uso industrial, simplemente requieren buenas prácticas industriales a gran escala (GILSP). La mayor parte

in- microorganismos industriales pertenecen a esta categoría. El uso de microorganismos dentro de los grupos de riesgo 2, 3 y 4 debe ser controlado de manera más estricta, lo que exige niveles de contención 1, 2 y 3, respectivamente (Tabla 8.1). microorganismos se clasifican en estos grupos se utilizan industrialmente, por ejemplo, para la producción de vacunas, pero tienen requisitos de fabricación muy especializado. fermentación a gran escala de los microorganismos modificados genéticamente tiene po- específica

problemas potencia-, caso de que escapen del fermentador. Por ejemplo, a menudo contienen marcadores de selección de resistencia a antibióticos que podrían plantear problemas eran que al ser liberados en el medio ambiente. En algunos casos, el microorganismo se puede diseñar de manera que es incapaz de sobrevivir fuera del entorno de la fermentación. ertheless bargo, las fermentaciones con MMG requieren análisis caso- por caso, pero se pueden clasificar básicamente en organismos que son inofensivas (grupo I) o potencialmente dañinos (grupo II). El nivel de su contención de- pende del tamaño del proceso: Clase de institutos concentraciones de menos de 10 dm3 A (a pequeña escala) y mayor de 10 dm3 es de clase B (a gran escala). La evaluación de riesgos de la producción a gran escala de un grupo que requiere GMM GILSP, mientras que cul- tivo de un organismo de clase II en esta escala, y también a pequeña escala, exigiría un mayor análisis de riesgos. Esto es necesario para determinar el nivel necesario de contención, B2, B3 o B4; éstos son equivalentes a los niveles 1, 2 y 3 para los microorganismos no GMM (Fig. 8.3 y la Tabla 8.2). Esos microorganismos modificados genéticamente clasificados en estos grupos de alto riesgo deben tener contención secundaria o integral de equipos, en particular cuando se generan aerosoles. El equipo está también validado (es decir, a prueba de las especificaciones específicas antes de su uso y regularmente vuelto a probar) y se requieren también procedimientos normalizados de trabajo validados especiales. Los inspectores de las agencias reguladoras deben dar permiso para que un proceso para iniciar y para que siga funcionando. Ellos inspeccionan la planta de fabricación y laboratorios sobre una base regular, para determinar si el fabricante está operando en un estado de control, y en cumplimiento de las leyes y reglamentos. Aunque deseable, por el momento, no hay ni una categorización unificado global para la fermentación de microorganismos modificados genéticamente ni estandarización de los procedimientos normalizados de trabajo.

Otras lecturas

Papeles y comentarios Chiu, YH (1988) Validación del proceso de fermentación para la producción de un medicamento de ADN recombinante. Pharmaceutical Technology 12, 132-138.

Claude, el Sr. R. (1992) Las dificultades en la concepción y aplicación de directrices para la evaluación de la seguridad de los medicamentos producidos con biotecnología: algunos ejemplos. Toxicology Letters 64/65, 349-355. Crespi, RS (1997) las patentes de biotecnología y la moral. Tendencias en Biotecnología 15, 123-129. Jeffcoate, SL (1992) Las nuevas biotecnologías: retos para las autoridades reguladoras. Diario de Farmacia y Farmacología OGy 44 (Suplemento 1), 191-194. Kirsop, B. (1993) la normalización europea en biotecnología. Tendencias en Biotecnología 11, 375-378. Lunel, J. (1995) Biotecnología reglamentos y directrices en Europa. Current Opinion in Microbiology 6, 267-272. Seamon, KB (1998) Especificaciones para Medios Biotecnológicos fármacos de proteínas derivadas. Current Opinion in Microbiology 9, 319-325. Wilson, M. & Lindow, SE (1993) La liberación de microorganismos recombinantes. Revisión Anual de Microbiología 47, 913944.

Libros Brown, F. & Fernández, J. (1997) La evolución de Patrones Biológicos. Karger, Nueva York.

Chiu, Y.-YH y Gueriguian, JL (eds) (1991) Drogas Biotechnology regulación: Bases y las prácticas científicas. Marcel Dekker, New York. Collins, CH y Beale, AJ (eds) (1992) Seguridad en Microbiología Industrial y Biotecnología. Butterworth-Heinemann, Oxford. Crespi, RS (1988) Patentes: Una guía básica de patentes en biotecnología. Cambridge University Press, Cambridge. Hacking, AJ (1986) Aspectos económicos de la biotecnología. Cambridge University Press, Cambridge. Hambleton, P., Melling, J. & Salusbury, TT (1994) Bioseguridad en Biotecnología Industrial. Blackie Academic y Professional, Glasgow. Moisés, V. & Capas, RE (1991) Biotecnología: La Ciencia y el negocio. Harwood Academic, Chur. Ono, RD (1991) El negocio de la biotecnología. Mantequilla-pena-Heinemann, Boston. Peters, MS & Timmerhaus, KD (1991) Diseño de Plantas y Economía para Ingenieros Químicos, 4ª edición. McGraw-Hill, New York. Thomas, JA & Myers, LA (eds) (1999) Biotecnología y evaluación de la seguridad, 2ª edición. Raven Press (Taylor &Francis), Londres.

Parte

3

Industrial procesos y productos

9

enzimas microbianas

enzimas microbianas comerciales son cada vez más susti- ing catalizadores químicos convencionales en muchos procesos industriales. Las enzimas tienen varias ventajas sobre los catalizadores químicos, incluyendo la capacidad de funcionar der condiciones relativamente suaves ONU-de temperatura, pH y presión. Esto resulta en el consumo de menos energía y generalmente no hay necesidad de equipo costoso sión resistente corrosión. Las enzimas son específicas, a menudo estereoselectiva, catalizadores, que no producen subproductos no deseados. En consecuencia, hay menos necesidad de una amplia refinación y purificación del producto objetivo. Además, en comparación con los procesos químicos, los procesos basados en enzimas son "medio ambiente" como enzimas son biodegradables y hay menos problemas dis- propuesta residuos asociados. Ciertas enzimas no están restringidos a ambientes acuosos y pueden operar en sistemas de disolvente orgánicoagua de dos fases y en los medios de organic no acuoso, disolventes particularmente hidrofóbicas. la operación en estas condiciones a menudo puede mejorar el rendimiento de la enzima, especialmente cuando los sustratos han solubilidad en agua limitada. clasificación de enzimas se basa en un sistema establecido originalmente por la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (1979). Existen seis clases principales, agrupados de acuerdo con el tipo de reacción catalizada: 1 oxidorreductasas (Clase 1) catalizan la oxidación / reacciones de reducciones, la transferencia de átomos de hidrógeno, átomos de O o electrones; 2 transferasas (Clase 2) catalizan la transferencia de un grupo de una molécula a otra;

3 hidrolasas (Clase 3) catalizan la hidrólisis, la escisión de los enlaces mediante la adición de una molécula de agua; 4 liasas (Clase 4) catalizar la división de bonos, que no sean a través de la hidrólisis u oxidación; 5 isomerasas (Clase 5) catalizar mentos estructurales reordenación de las moléculas; y 6 ligasas o sintetasas (clase 6) catalizan la formación de nuevos enlaces, por ejemplo, CN, C-O, C-C y C-S, con descomposición de ATP.

1

2

3

4

Cada enzima tiene un código de cuatro cifras para la clase, subclase, etc. Por ejemplo, invertasa, una hidrolasa, se clasifican como EC 3.2.1.26. células y esporas microbianas en suspensión o inmovilizada se pueden emplear como biocatalizadores en algunas conversiones bio industriales, en particular cuando coenzimas son necesarios. Sin embargo, en muchos casos, esto tiene limitaciones debido a que: las células de energía «residuo» y de los recursos en las actividades de mantenimiento del crecimiento y / o; reacciones secundarias pueden conducir a una reducción en el potencial de rendimiento del producto diana; condiciones para el crecimiento microbiano, cuando sea necesario, pueden ser diferentes de las necesarias para la formación óptima del producto; y pueden encontrar dificultades en el aislamiento y la purificación del producto a partir de las células o del medio de fermentación gastado. A superar estos problemas, el uso de preparaciones parcialmente purificadas 'a granel' microbianas de enzimas se prefiere a menudo por numerosos y variados procesos

industriales. En algunos casos, los procesos de enteros convencionales microbianas fermentaciones finalmente podrán ser sustituidos por sistemas de enzimas múltiples que podrían proporcionar la utilización de sustratos más eficiente, mayor rendimiento y una mayor uniformidad del producto. Varios miles de toneladas de enzimas comerciales se producen actualmente cada año, los cuales tienen un valor en ex ceso de 1500 US $ millones. Algunos animales y plantas ES- se utilizan enzimas, pero la mayoría de las enzimas comerciales ahora se obtienen a partir de fuentes microbianas. Muchos de estos son enzimas extracelulares, y la mayoría se deriva de diversas especies de Bacillus. Sus proteasas y amilasas son los más ampliamente utilizados, y hay una demanda particular para las enzimas termoestables que están disponibles a partir de varios miembros de este género. La proporción est grandeza de todas las enzimas comerciales, alrededor del 34%, se utilizan como enzimas detergentes, 14% para usos relacionados con lácteos, con un 12% para el procesamiento de almidón y 11% para aplicaciones textiles. El se dividen restante 29%

133

13 4

Capítulo

Tabla 9.1 Las aplicaciones de una gama de enzimas microbianas a granel Las proteasas, Proteasas neutras o principalmente metaloproteasa de zinc a partir de especies de Aspergillus y Bacillus, junto con algunas serina proteasas alcalinas (a) detergentes biológicos, por ejemplo, la proteasa alcalina subtilisina EC 3.4.4.16 de Bacillus licheniformis y B. subtilis (b) modificación de hornear-masa / el debilitamiento del gluten y la mejora del sabor (c) fabricación de la cerveza, por ejemplo, "chillproofing 'de cerveza para eliminar la neblina de proteínas (d) cebo cuero y licitación (e) queso fabricación-coagulación de la proteína de la leche y la promoción de la maduración, por ejemplo, una proteasa aspártica (CE 3.4.23.6) a partir de especies de Rhizomucor y especies de Kluyveromyces recombinantes que produce la quimosina de ternero. Aminopeptidasa de Lactococcus lactis también se utilizan para mejorar el desarrollo del sabor (f) enternecimiento de la carne y la retirada de carne de los huesos (g) control de sabor y producción en productos alimenticios (h) tratamiento de residuos, por ejemplo, la recuperación de la plata de las películas fotográficas pasado

Las lipasas EC 3.1.1.3, principalmente de especies de Bacillus, Aspergillus, Rhizopus y Rhodotorula a) detergentes biológicos, también disponible de Aspergillus oryzae recombinante que produce lipasa de Humicola b) la eliminación de procesamiento de grasa del cuero ) producción de compuestos de sabor y la aceleración de la maduración de los productos lácteos y cárnicos

carbohidrasas a- Amilasa EC 3.2.1.1, principalmente derivado de las especies de Aspergillus y Bacillus (a) almidón de procesamiento de licuefacción del almidón en la producción de jarabes de azúcar (b) degradación de hornear-parcial de almidón en la modificación de la harina y la generación de azúcares fermentables, y para la mejora de color de la corteza (c) hidrólisis elaboración de la cerveza de almidón durante la preparación del mosto (d) detergentes-almidón biológicos de eliminación de manchas de comida (e) textiles fabricación-desencolado b- Amilasa EC 3.2.1.2 a partir de especies de Bacillus tales como B. polymyxa, y especies de Streptomyces y Rhizopus a) La producción de jarabe de maltosa b) elaboración de la cerveza mayor fermentabilidad mosto Amiloglucosidasa (glucoamilasa) EC 3.2.1.3 a partir de Aspergillus niger y Rhizopus niveus a) jarabe de glucosa-producción completa de sacarificación de almidón b) color de la corteza del pan horneado-mejorado ) sacarificación elaboración de la cerveza-dextrina en la producción de la cerveza baja en carbohidratos d) extracción del vino y zumo de frutas en almidón segundoGalactosidasa (lactasa) EC 3.2.1.23 de especies de Bacillus, Kluyveromyces y Candida a) suero de leche melazna-hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa para dar mayor dulzor b) leche y productos lácteos sin lactosa procesamiento de reducción / eliminación para aquellos que son intolerantes a la lactosa ) fabricación de helados, la prevención de la textura 'arena' causada por cristales de lactosa La glucosa isomerasa EC 5.3.1.5 a partir de especies de Actinoplanes, Arthrobacter y Streptomyces (A) fabricación de jarabes de alta fructosa como "conversión alta sweeteners'-glucosa en fructosa La glucosa oxidasa EC 1.1.3.4 a partir de Aspergillus niger y Penicillium notatum (A) antioxidante, que se utiliza a menudo junto con catalasa para eliminar el oxígeno de productos alimenticios inulinasa EC 3.2.1.7 de Aspergillus niger, especies de Candida y especies de Kluyveromyces (A) el tratamiento de los tubérculos de pataca-hidrólisis de polifructanos y levanos invertasa EC 3.2.1.26 de especies de Saccharomyces y Kluyveromyces a) dulces y confitería-producción de licuefacción de sacarosa, por ejemplo, chocolates suaves centrada b) azúcar invertido conversión de la producción a la sacarosa en glucosa y fructosa pululanasa EC 3.2.1.41 de Klebsiella pneumoniae y Bacillus acidopullulyticus (A) almidón de procesamiento utilizado para la desramificación de almidón en la fabricación de jarabe de azúcar y elaboración de la cerveza pectinasas (Una mezcla de enzimas, tales como poligalacturonasa EC 3.2.1.15, producida por Aspergillus niger y Penicillium especies, a menudo por fermentación en sustrato sólido) a) jugo de la planta y la extracción de petróleo b) zumo de fruta y la clarificación del vino

) la fermentación del grano de café

enzimas

13 5 Continuado

Tabla 9.1 continuado

(a) (b) (c) (d) (e) (a) (b) (c) (d) (e)

hemicelulasas y segundo-glucanases / celulasas segundo-Glucanases, Por ejemplo celulasas EC 3.2.1.4 a partir de Trichoderma reesei, Penicillium funiculosum, Aureobasidium pullulans y Bacillus especies, y b-glucanasas específicas de Penicillium emersonii zumo de fruta y la producción y transformación de las aceitunas la producción de vino y la cerveza y el procesamiento de la hidrólisis de las encías b-glucano para mejorar las tasas de filtración malteado velocidades modificación de granos Producción de tejidos-biopulido de fibras de celulosa procesamiento de pulpa de madera hemicelulasas Del Cryptococcus levaduras y Trichosporon, por ejemplo xilanasa EC 3.2.1.32 hornada-pentosanasas se utilizan para alterar la consistencia de masa fabricación de cerveza alimentos para animales nutracéuticos procesamiento de pulpa de madera

Varios enzimas y sus usos catalasa EC 1.11.1.6 de Aspergillus niger, Corynebacterium glutamicum y lysodeikticus Micrococcus (a) blanqueo de tejidos (b) la fabricación de queso fitasa 3.1.3.8 CE (A) Además de piensos para animales monogástricos, a fin de liberar fosfato del ácido fítico, por ejemplo de Pichia angusta recombinante La ureasa EC 3.5.1.5 Lactobacillus fermentum de (a) la producción de vino (b) fabricación de cerámica, para mejorar la fabricación y la calidad de la cerámica moderna que son de importancia para las industrias de la informática y la aeronáutica o para la ortopedia Las enzimas en procesos de biotransformación diverso (a) Penicilina y cefalosporina acilasas (Amilasas) EC 3.5.2.6, por ejemplo, Bacillus megaterium y Escherichia coli producen penicilina acilasa y especies de Pseudomonas producir cefalosporina acilasa. Se utiliza para la conversión de antibióticos para eliminar los grupos secundarios de penicilinas o cefalosporinas para formar ácido 6-aminopenicilánico o ácido 7-aminocefalosporánico, respectivamente, las moléculas de base para la síntesis de penicilinas semisintéticas y cefalosporinas (b) Lacilasas -amino EC 3.5.1.14 a partir de especies de Aspergillus, que se utiliza para la resolución de Laminoácidos a partir de mezclas racémicas acilados de re,Lmezclas de ácidos -amino, por ejemplo, véase el capítulo 10, Lla producción de lisina (c) biotransformaciones esteroides, Por ejemplo, 11-b-hidroxilasa (monooxigenasa) EC 1.14.15.4 de Curvularia lunata para la producción de prednisolona a partir de 11 deoxycortisone (ver Capítulo 11)

entre una amplia gama de aplicaciones (Fig. 9.1 y la Tabla 9.1). Además de su papel como auxiliares en los procesos tradicionales, enzimas 'a granel' están en el centro de muchos procesos novedosos y la innovación biotecnológica continúa ampliando la gama de aplicaciones. enzimas a granel son normalmente preparaciones bastante crudo que se purifican suficientemente única para cumplir los requisitos del cliente para la actividad y la estabilidad. A menudo contienen muchas otras enzimas, que en algunos casos son beneficiosas para el rendimiento general aplicación. También se requieren menores cantidades de raciones de enzimas de alta pureza "fino" preparación para numerosas aplicaciones.

Estos incluyen papeles como agentes terapéuticos, muchos de los cuales son ahora productos recombinantes (véase el Capítulo 11),

aplicacion es de panadería 5% la alim enta ción anim al 7%

Otros us os 9 %

Bebidas y elaboración de la cerveza 7%

Textil 11%

Detergentes 34%

procesamiento de almidón de 12%

Dairy procesa 14%

componentes de kits de pruebas de diagnóstico médico y alimentos, biosensores, como herramientas de investigación y muchos otros propósitos

Higo. 9.1 Aplicaciones de las enzimas microbianas a granel.

(Mesa 9.2). Hay una demanda creciente de empleado en biosensores y sistemas de enzimas finos utilizados en biología pruebas analíticas, se utilizan a menudo en molecular, en particular de endonucleasas de una forma inmovilizada. En los procesos restricción y polimerasas de ADN, por industriales (Tabla 9.3), la inmovilización ejemplo, ADN de la polimerasa de Thermus facilita el confinamiento y recuperación ción, aquaticus poli- (Taq DNA poli- merasa) o y estos preparados enzimáticos tener varias furiosus Pyrococcus (ADN polimerasa de Pfu). otras características beneficiosas, incluyendo: Estas enzimas se utilizan en la reacción en 1 reutilizar; cadena de la polimerasa (PCR) para la 2 idoneidad para su aplicación en servicio amplificación de fragmento de ADN. El la continuo; purificación de ADN polimerasa Taq nativa y 3 su producto es la enzima libre, por lo tanto recombinante se describe en la Fig. 9,2, como procesamiento adicional para eliminar o un ejemplo de los protocolos necesarios para inactivar no se requiere la enzima; entregar una enzima altamente purificada. La 4 estabilidad de la enzima mejorada; y mayoría de las otras enzimas finos también 5 la reducción de los problemas de eliminación de efluentes. son intracelulares y son sometidas a altos Las enzimas pueden inmovilizarse por unión niveles de purificación, en particular aquellos a través de adsorción física, unión covalente o para uso clínico. iónica Las enzimas que son más caros de producir, INCLUYENDO muchas enzimas microbianas intracelulares, y aquellos

Tabla 9.2 Ejemplos de enzimas microbianas utilizadas con fines analíticos, de diagnóstico y terapéuticos Enzima

Fuente

Utilizar

a-amilasa EC 3.2.1.1 El alcohol deshidrogenasas ECo 1.1.1.1 alcohol oxidasas EC 1.1.3.13 Asparaginasa EC 3.5.1.1

Aspergilo y especies de Bacillus Saccharomyces cerevisiae boidinii Candida Y Pichia pastoris Escherichia coli, Serratia marcescens Y Erwinia carotovora

ayudas digestivas El etanol para

Catalasa EC 1.11.1.6

Aspergillus niger, Corynebacterium glutamicum Y lysodeikticus Pseudomonas fluorescens Micrococcus Pseudomonas putida y recombinante Escherichia coli Aspergillus niger Bacillus cereus & Escherichia Varias coli fuentes bacterianas y

El colesterol esterasa EC 3.1.1.13 Creatininasa EC 3.5.2.10 (Creatinina amidohidrolasa) La glucosa oxidasa EC 1.1.3.4 b-lactamasa EC 3.5.2.6 Las proteasas (varios)

Mantiene los niveles bajos de asparagina en de cánceres el tratamiento (linfomas y cuyas células no leucemias) pueden sintetizar el aminoácido sistemas de limpieza de lentes Seguimiento de los niveles de colesterol en suero Determinación de los niveles de creatinina sérica El análisis de los niveles de glucosa en sangre El tratamiento de la alergia a la penicilina Se utiliza para facilitar la desbridamiento y limpieza de Trichoderma speciesTreatment

lentes de contacto rodanasa CE 2.8.1.1 para el envenenamiento por cianuro (Transferasa de azufre tiosulfato) La estreptoquinasa CE 3.4.22.10Various hemolítica estreptococos A disolver los coágulos de sangre (una proteasa cisteína) La ureasa CE 3.5.1.5 Lactobacillus fermentum La eliminación de la urea de la sangre en renal fracaso Uricasa EC Se utiliza en el tratamiento y Arthrobacter globiformis y 1.7.3.3 diagnóstico de Candida utilis (Urato oxidasa) gota Algunas enzimas microbianas utilizadas en biología molecular (* ADN enzimas dirigidas) ADN ligasas (por ejemplo, Unión de piezas de ADN Escherichia coli ATP, 6.5.1.1) * EC ADN EC polimerasa la síntesis de ADN, por Thermus aquaticus

Las endonucleasas de restricción por ejemplo, Bam HI y Eco RI ARN

Bacillus amyloliquefaciens H & Escherichia coli RY13 Salmonella typhimurium

análisis 'Corte' de ADN en secuencias de bases específicas la síntesis de ARN

Thermus aquaticus o Escherichia coli transformada con un plásmido que contiene el gen de la polimerasa de ADN Taq Producción mediumInoculum

desarrollo

Producción de fermentación (proceso por lotes) la recolección de células (Centrifugación) Flotante La interrupción de las células recogidas centrifugación Restos celulares extracto libre de células de amonio precipitación con sulfato centrifugación Flotante La resuspensión de la proteína de la diálisis precipitado cromatografía de fosfocelulosa de celulosa hidroxiapatita cromatografía DEAE cromatografía de celulosa DEAE Taq ADN polimerasa purificada

Higo. 9.2Un ejemplo de una estrategia de purificación de ADN de la polimerasa (EC 2.7.7.7) a partir de Thermus aquaticus (Taq DNA la polimerasa) y Escherichia coli genéticamente modificada.

de unión, a un soporte sólido materiales inorgánicos u orgánicos inertes, tales como nylon, bentonita, celulosa y dextrano. Alternativamente, pueden ser microencapsuladas dentro de las membranas

semipermeables, atrapado dentro de geles o fibras, y las enzimas intracelulares pueden inmovilizarse dentro de sus células productoras.

la producción de microbianas comercial

enzimas

enzimas microbianas son producidas principalmente por las fermentaciones sumergida, aunque se utilizan algunas fermentaciones-sustrato sólido, sobre todo para la producción de enzimas extracelulares fúngicas (véase el capítulo 6, fermentaciones sustrato sólido-). De hecho, la primera preparación de la enzima microbiana comercial fue producido a través de la fermentación del sustrato sólido-. Esta enzima, 'Takadiastase', una amilasa fúngica, fue producido mediante el cultivo de Aspergillus oryzae en el arroz húmedo o salvado de trigo. El proceso fue inicialmente desarrollado por el Dr. Jokichi Takamine y patentado en los EE.UU. en 1884. Sin embargo, la producción a gran escala de enzimas microbianas en general no fue posible hasta después de mediados del siglo 20. Se hizo posible sólo después de las vastas mejoras en la tecnología de fermentación sumergida que siguieron el desarrollo de fermentaciones de penicilina en la década de 1940. La mayoría de las enzimas industriales son productos de procesos por lotes y pocos son actualmente producido mediante fermentación continua. Los fermentadores para producción de enzimas a granel son de hasta 100 m3 de capacidad, pero las enzimas finas pueden producirse en las escalas más pequeñas de unos pocos cientos de litros o menos. La mayoría de los fermentadores se agitan los reactores de tanque que son operados en condiciones asépticas y se utilizan bajo costo medios complejos indefinido.

Al igual que en el desarrollo de cualquier proceso de fermentación, los procesos de producción de la enzima tradicionalmente comienzan con la búsqueda de un organismo productor adecuado. Uso de la lista GRAS (generalmente considerado como seguro) organismos (Tabla 4.2) es una consideración importante para las enzimas que se van a utilizar en los alimentos o aplicaciones médicas. Un programa de la detección de microorganismos y de selección es necesario, para determinar las propiedades de la enzima, tales como pH óptima madre y resistencia al calor, y el examen de la capacidad de secretar la enzima diana. Las enzimas de ter- mophiles generalmente proporcionan varias ventajas. Son termoestable, capaz de operar a temperaturas más altas que las enzimas de mesófilos, lo que aumenta las tasas de difusión y la solubilidad, y la disminución tanto la viscosidad como el riesgo de contaminación microbiana. El sistema de fermentación y condiciones para la producción máxima de la enzima por unidad de biomasa, usando baratas de Bon y nitrógeno materias primas car-, a continuación, deben ser determinados. Aparte de la productividad de la enzima, una consideración adicional es la estabilidad de la enzima, lo que puede influir en el tiempo, y las operaciones utilizadas en, el procesamiento aguas abajo. El nivel de purificación aplicado varía considerablemente dependencia ción de si la enzima es lar intracelular o extracelular, y de su uso final. el procesamiento posterior implica la separación, purificación, estabilización y preservación

Tabla 9.3 Algunos importantes enzimas microbianas industriales que se utilizan en una forma inmovilizada Enzima aminoacilasa amiloglucosidasa (Glucoamilasa) La glucosa isomerasa hidantoinasa invertasa

número CE 3.5.1.14 3.2.1.3 5.3.1.5 4.5.2.2 3.2.1.26

Fuente

Producto / papel

Aspergillus oryzae Aspergillus niger Rhizopus niveus Actinomyces missouriensis Bacillus coagulans ammoniagenes Flavobacterium Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger Aspergillus oryzae Kluyveromyces fragilis arrhizus Rhizopus decumbens Penicillium

L-aminoácidos la producción de glucosa a partir de almidón jarabe de maíz con alta fructuosa

La lactasa 3.2.1.23 (Blipasa 3.1.1.3 galactosidasa) naringinasa * 3.2.1.40 (Hesperidinase) 3.2.1.21 nitrilo hidratasa 4.2.1.84 Rhodococcus rhodochrous La penicilina 3.5.2.6 Escherichia coli acilasa (Amidasa de Bacillus subtilis penicilina) Melibiase 3.2.1.32 Aspergillus niger (raffinase) (ASaccharomyces cerevisiae termolisina 3.4.24.2 galactosidasa) Bacillus thermoproteolyticus 7 (Una proteasa de zinc) * Consta de dos enzimas, un A-ramnosidasa y un b-glucosidasa

(Figura 9.3;. También ver el Capítulo 7 para los métodos de purificación de proteínas específicas). mejora de las cepas se puede intentar para mejorar aún más la productividad de la enzima. En el pasado, esto a menudo ha implicado ciclos de mutagénesis aleatoria y selección. Sin embargo, otras estrategias están ahora disponibles para los dos organismo y la ingeniería de proteínas. Los objetivos para la mejora a menudo incluyen una mayor eficacia de secreción de enzimas extracelulares y superación de los propios mecanismos de regulación del organismo. Este último puede implicar Los intentos para aliviar la represión catabólica, un mecanismo regulador común de muchas enzimas hidrolíticas. Otras mejoras pueden lograrse mediante la mejora de vida media del mRNA y el aumento de la dosis de genes a través de la amplificación mal cromosómi- o por amplificación del plásmido, si la enzima es el plásmido codificado. Los objetivos para la ingeniería de enzimas (proteínas) son la mejora de la actividad enzimática, mejoró la estabilidad, alterado óptimo de pH o la temperatura de la to- lerancia, especificidad modificada y mejoras generales de su rendimiento industrial. Sin embargo, tales cambios implican la manipulación de

ácidos D- y L-aminoácidos azúcar invertido (glucosa + fructosa) leche sin lactosa y suero de leche sucedáneos de la manteca de cacao eliminación del amargor de zumo de cítricos acrilamida penicilina escisión de la cadena lateral eliminación de la rafinosa a partir de extractos de remolacha El aspartamo (L-aspartilL-fenilalanina éster metílico) un edulcorante bajo en calorías

constituyentes de aminoácidos específicos y dependen de un conocimiento previo de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Hoy en día, si una enzima útil se identifica en un microorganismo, planta o animal, que es en sí difícil de cultura

tura, o si se sabe poco de su fisiología y bioquímica, se pueden adoptar otras estrategias para la producción comercial. En lugar de proceder con amplios programas de investigación y desarrollo para facilitar la producción de la enzima por el organismo productor natural, el gen estructural para la enzima puede ser transferido a un microorganismo seleccionado, fácilmente cultivada "anfitrión", junto con mecanismos adecuados de control. La ingeniería genética ahora hace posible la expresión del gen que codifica para casi cualquier enzima, independientemente de su origen. Esto permite a los fabricantes de enzimas para desarrollar rápidamente un proceso para producir grandes cantidades de la enzima.

La expresión en los organismos enumerados-GRAS ofrece ventajas evidentes. Los principales candidatos para esta función son las especies dentro de tres géneros de microorganismos, a saber, Bacillus, Aspergillus y Saccharomyces. Su biología está bien entendida, y han demostrado ser seguro de manejar, rápido para crecer y puede producir altos rendimientos de enzimas, muchas de las cuales pueden ser excretados en el medio de fermentación. Una ventaja adicional es que el medio y las condiciones bajo las cuales crecen y funcionan bien son ya conocidos, minimizando así la experimentación más costoso para optimizar las condiciones de fermentación.

De la cultura de la cepa de producción

etapas de propagación del cultivo iniciador

fermentación en sustrato sólido fermentación sumergida

Acuoso extracción procesamiento de medio gastado La enzima extracelular

Tratamiento de células cosechadas

enzima intracelular *

la rotura de la célula Filtración La eliminación de restos de células Concentración

concentrado enzimático líquido

componentes Gent, las enzimas no tienen un impacto negativo en los procesos de tratamiento de aguas residuales. Ellos se biodegradan por completo y rápidamente para no dejar residuos nocivos. En consecuencia, son ambientalmente seguro y no supone un riesgo para la vida acuática. El primer uso comercial de las enzimas microbianas en detergentes fue en 1959. Un químico suizo Jaag, que trabajaba para la empresa Gebrüder detergente Schnyder, desarrolló un nuevo producto que contiene una proteasa bacteriana, que sustituyó a la tripsina animal que previamente habían sido incorporados en estos productos detergentes. A partir de este punto se hizo un uso cada vez mayor de las enzimas microbianas en los detergentes. En la década de 1960, hubo más mejoras a través de la introducción de proteasas activas a pH alcalino. Eran relativamente poco afectada por otros componentes del polvo de lavado y funcionaron en las temperaturas de lavado deseados. Un ejemplo bien conocido es la subtilisina, una proteasa de serina bacteriana alcalina de Bacillus licheniformis y B. subtilis, que se utiliza ampliamente en detergentes para la ropa a niveles de 0.015- 0.025% (w / w). Esta enzima ha sido diseñado para mejorar las características de pH y temperatura, y re- ducir la sensibilidad al peróxido. Las proteasas no son las únicas enzimas utilizadas en los detergentes; Desde finales de 1980, amilasas y lipasas han estado disponibles para la incorporación, por ejemplo, Lipolase de Novo Nordisk. Lipolase fue la primera enzima detergente a ser producido a través de tecnología de ADN recombinante. El gen de la lipasa se aisló de una cepa del hongo Humicola tous filamentosas y luego se transfiere a AS Aspergillus oryzae, Que se cultiva en más fácilmente fermentaciones sumergidas. enzimas para digerir ácidos grasos Superior ahora se han descubierto, tal como una cutinasa de Fusarium solani, que degrada de forma natural la mezcla de ácidos grasos que forman cutícula. El gen de esta enzima ha sido transferido a Saccharomyces cerevisiae y ahora está siendo examinado la producción comercial.

La adición de agentes estabilizantes precipitación preparación preparación enzimática enzimática en líquida polvo Filtración

Higo. 9.3la producción de enzimas industriales a granel. * Nota: algunas enzimas intracelulares, como la glucosa isomerasa, no pueden El secadoser extraídos de las células, pero inmovilizados dentro. Molienda

Normalización

Normalización

enzimas detergentes

La incorporación de enzimas en detergentes proporciona varios beneficios. El ahorro de energía se hacen como una temperatura de lavado inferior puede ser utilizada y los niveles de productos químicos detergentes menos deseables se puede reducir. A diferencia de otros deter-

enzimas de procesamiento de almidón y carbohidrasas relacionados enzimas microbianas han demostrado ser de gran valor en el procesamiento de almidón, un polisacárido compuesto de amilosa (lineal a-1,4-ligado unidades de glucosa) y lopectin amilosa (polímero ramificado tanto con un 1,4 y un 1 6, vínculos). a-amilasa (lase glucanohydro- 1,4-ad-glucano) es uno de los más importantes de estas enzimas industriales. Este endo-enzima actúa al azar en un 1,4-vínculos, y en última instancia genera glucosa, maltosa y

unidades de maltotriosa. También puede catalizar la escisión de in- ternas a-enlaces 1,4 en glucógeno y oligosacáridos. Desde la década de 1950, amilasas fúngicas se han utilizado para la fabricación de jarabes de azúcar que contienen mezclas específicas de azúcares que no podían ser producidos por hidrólisis ácida convencional de almidón. Además, a-amilasas se utilizan en varias industrias, en particular elaboración de la cerveza y la levadura, cuando se requieren licuefacción del almidón y dextrina hidrólisis (Tabla 9.1). También se secretan por muchos otros microorganismos, incluyendo bacterias y algunas levaduras. Los termoestables aamilasas de las especies lus Bacil-, por ejemplo, B. licheniformis, han demostrado ser especialmente útil. Otro éxito ha sido amiloglucosidasa (coamylase glu) de Aspergillus niger y la especie Rhizopus, que primero estaba disponible a principios de 1960. Esta enzima puede romper por completo el almidón y las dextrinas en glucosa. Dentro de unos pocos años de su introducción, casi toda la producción de glucosa a través de la hidrólisis ácida convencional fue sustituido por procesos basados en enzimas, debido al mayor rendimiento, mayor grado de pureza y más fácil la cristalización del producto. El proceso fue Ther fur- mejorado mediante el uso de amilasa bacteriana altamente termoestable en el pretratamiento del almidón (licuefacción). La glucosa isomerasa También ha sido un éxito notable en la industria de procesamiento de almidón. Esta enzima puede obtenerse de muchas bacterias, incluyendo especies de Bacillus y Streptomyces, y por lo general se inmoviliza para su uso en la conversión de glucosa a fructosa. El producto, donde se completa la conversión a la fructosa, tiene el mismo valor calorífico como la glucosa, pero su efecto edulcorante es de aproximadamente el doble. glucosa sustrato es normalLy deriva de almidón de maíz hidrolizado (véase más arriba), y luego se convierte en una mezcla de glucosa y fructosa por glucosa isomerasa. rendimientos de conversión prácticas están en el rango de 40-50% y los productos que se conocen como "jarabe de maíz de alta fructosa '(JMAF) o' isosyrup '. concentración fructosa se puede aumentar a 55% en enriquecimiento cromatográfico. Alternativamente, la fructosa puede ahora ser

separado de la mezcla de glucosafructosa y la fracción de glucosa restante se isomeriza para pro- ducir un producto final combinada que contiene hasta 80% de fructosa. Estos jarabes, derivados del almidón, se alguien lo más barato que la sacarosa de la caña o de remolacha fuentes, pero tienen el mismo poder edulcorante. En consecuencia, se han convertido en los principales ingredientes alimentarios, en particular en América del Norte, y la producción anual de HFCSs que ahora es de más de 8 ¥ 109 kg. invertasa (B-fructofuranosidasa) fue la primera enzima a ser inmovilizado para su uso a escala industrial. Fue desarrollado en el Reino Unido por la Tate y Lyle durante la primera

1940 para la producción de jarabe. La conversión de la sacarosa en glucosa y fructosa usando este invertasa inmovilizada sustituye métodos de hidrólisis ácida convencionales. Esta enzima se preparó originalmente a partir de preparaciones autolisados S. visiae cere-, que se ajustaron a pH 4,7, se clarificó por filtración a través de sulfato de calcio y luego se adsorbió sobre carbón animal. Invertasa ahora también se obtiene a partir de otras levaduras u hongos filamentosos, por ejemplo, A. niger y A. oryzae. Aparte de la producción de jarabe, se emplea en la producción de confitería. Por ejemplo, chocolates soft- centrados se preparan mediante la adopción de un sólido de relleno a base de sacarosa, que contiene algo de la invertasa, y revestimiento con chocolate. Dentro de 2 semanas, el ESTÁ el centro, éste convierte en un jarabe de fructosa / glucosa. La lactasa (B-galactosidasa) se emplea en varios inprocesos industriales que requieren la hidrólisis de la lactosa de la leche, en el que el disacárido está presente a una concentración de 4,7% (w / v). La hidrólisis de la lactosa a glucosa y galactosa se realiza en leche y productos lácteos para los niños que son intolerantes a la lactosa, y en regiones del mundo donde una gran proporción de la población adulta de exposiciones intolerancia a la lactosa, por ejemplo, las regiones de África y El sudeste de Asia. hidrólisis de lactosa es también útil en la fabricación de productos tales como helados, como la baja solubilidad de este disacárido conduce a la formación de cristales que pueden dar una textura arenosa desagradable. Además, su conversión en

glucosa y galactosa aumenta el dulzor relativo en alrededor de cuatro veces. lactasa comercial se obtiene a partir de Kluyveromyces marxianus (anteriormente K. fragilis), A. niger o A. oryzae. Las enzimas de la levadura tiene un pH óptimo de 6,0-7,0, mientras que las enzimas de Aspergillus tienen óptimos tan bajo como pH 3,0-4,0. Estas enzimas se pueden utilizar libre o inmovilización Lized, siendo esta última particularmente útil para el tratamiento de suero de leche. enzimas de la levadura se han inmovilizado por la corporación in- en fibras de acetato de celulosa y el Aspergillus enzimas se han inmovilizado en 0,5 mm de diámetro de sílice porosa para su uso en reactores de lecho empacado.

Las enzimas queso

en

la

producción

de

preparaciones de cuajo de los estómagos de terneros, corderos y cabritos se han utilizado en la producción de queso durante miles de años. Estos cuajos contienen la enzima renina (quimosina, una proteasa aspártico), que lleva a cabo la proteolisis limi- tado de la proteína de la leche (caseína) para formar cuajadas en el inicio de la producción de queso (véase el Capítulo 12, fer- mentaciones lácteos). Fig savia, que contiene la ficina enzima proteolítica, a veces se ha utilizado para el mismo propósito, pero muchas otras proteasas llevar a cabo demasiado proteólisis.

cuajos de origen animal, especialmente de terneros, en su mayor nado en la fabricación de queso hasta la década de 1960, cuando un aumento en la producción de queso coincidió con una escasez de cuajo animal disponible. proteasas fúngicas específicas, que tienen propiedades muy similares a la pantorrilla quimosina, fueron desarrollados como cuajos microbianos, tales como proteasas de Rhizomucor miehei y R. pusillus. Esto superó el déficit y facilitó la producción de queso llamado "vegetariano". Algunas preparaciones de enzimas microbianas son también más sensibles a la temperatura (termolábiles) de cuajo de ternera, que es útil en ciertos procesos de fabricación de queso. Más recientemente, el gen de la quimosina de ternero ha sido introducido en varios microorganismos, incluyendo E. coli, K. lactis, Aspergillus nidulans y A. niger var. awamori. Estos microorganismos manipulados genéticamente son capacidades bla de expresar y secretar la enzima. preparaciones nante quimosina recombinación ahora tienen la aprobación para su uso como aditivos alimentarios en más de 20 países. Animal y quimosinas microbianos (que constituye aproximadamente un tercio de la mercado) se han combinado las ventas mundiales un valor de más de $ 75 millones. lipasas microbianas también se utilizan en los productos lácteos, especialmente quesos, para la hidrólisis de ésteres de ácido graso para acelerar el desarrollo del sabor.

Las enzimas en la producción de jugo de la planta Varias enzimas microbianas se emplean en la elaboración de zumo de fruta, pero probablemente el más importante son NASes pecti-. Estos adyuvantes de procesamiento se producen a menudo por fermentaciónsustrato sólido de A. niger o especies de Penicillium. Las frutas y bayas contienen cantidades variables de pectina, que actúa como una capa de unión entre las células de las plantas para mantener las paredes celulares adyacentes. La pectina es un eropolymer Het- de ácido galacturónico, ésteres metílicos de ácido turonic galactosidasa y otros residuos de azúcar. En la producción de jugo de la planta, parte de esta pectina se extrae durante el prensado.

Se produce un aumento de la viscosidad jugo, que conduce a dificultades en la obtención de rendimientos de zumo óptimas, y en la clarificación del jugo y la filtración. Estos problemas se pueden superar mediante la adición de preparaciones de pectinasa a la pulpa de la fruta antes de pulsar. tratamiento con enzimas similares se utiliza para aumentar el rendimiento de aceites de pulpa de la aceituna, fruto de la palma y de la carne de coco. El 'pectinasa' comercial no es una enzima, pero por lo general es un complejo cóctel de enzimas (terases pectina metil es-, poligalacturonasas y pectina liasas) capaces de atacar una variedad de enlaces en las moléculas de pectina verso correspondientemente di-. Las composiciones de las preparaciones de pectinasa comerciales varían considerablemente en las proporciones de estos diferentes enzimas. pectinasas son hongos

También disponibles que permanecen activos en los jugos muy ácidos de frutas cítricas, donde el pH puede ser tan baja como 2,2-2,8. Se pueden usar en el pelado de la fruta enzimática rus citrato para el enlatado. El araban polisacárido, un polímero de la arabinosa pentosa, es también un componente importante de las paredes celulares de la fruta. Al igual que la pectina, a menudo se extrae durante el prensado de algunas frutas, especialmente las peras. Esto puede conducir a la for- mación bruma, pero ahora puede ser eliminado mediante el uso de arabanases comercial. Además, algunos extractos, tales como zumo de manzana, contienen almidón, que debe ser degradado para producir zumos y concentrados claras. Esto se logra mediante la adición de Amylases, junto con la pectinasa, durante despectinización del jugo. En la elaboración del vino, las enzimas comerciales se utilizan para varios fines, así como para la extracción de jugo. Para los vinos tintos, la extracción de color de las pieles de la uva durante el prensado puede ser promovida por la adición de celulasas comerciales, por ejemplo, a partir del hongo Trichoderma reesei. Además, las glucosidasas pueden emplearse para hidrolizar glucósidos penyl ter-, la liberación de los terpenos que son constituyentes importantes del ramo vino. Vinos elaborados a partir de uvas permitidas para someterse a ataque por el hongo Botrytis cinerea antes de la cosecha ( "podredumbre noble") son a menudo difíciles de aclarar y filtro, debido a la presencia de hongos b-glucanos. Estos polímeros pueden ser degradados por la

adición de un microbiana b-glucanasa específica al vino (véase también el Capítulo 12, elaboración de la cerveza de la cerveza). Las frutas cítricas, tales como pomelos y naranjas amargas, contienen el flavonoide fruta de sabor amargo llamada naringina. La amargura de los productos derivados de estas frutas se puede ajustar usando naringinasa (a-ramnosidasa + b-glucosidasa) de A. niger. En primer lugar, convierte a la naringina prunina compuesto menos amarga, y luego a la naringenina no amargo. El nivel de hidrólisis naringina puede ser controlada mediante la regulación de la velocidad de flujo de zumo de fruta a través de una columna de naringinasa inmovilizado. La glucosa oxidasa de A. niger o Penicillium especies, a menudo junto con la catalasa, se puede emplear para eliminar el oxígeno molecular a partir de vino, cerveza, jugos de frutas y bebidas sin alcohol. Esto evita la oxidación potencialmente perjudicial que de otra manera afecta a la calidad del producto. gramo

2 glucosa 2 + O do

ATA

æ

la

æ

SE

luc

ose

Oxi

æ æ æ

das

æ

mi+

æ

æ æ Æ 2 glucónico ácido

Las enzimas textiles

en

la

fabricación

de

Las enzimas se utilizan cada vez más en la industria textil Processing para el acabado de tejidos y prendas de vestir, especialmente en el desencolado, biopulido y lavado de mezclilla. Antes de telas de tejido de algodón, o mezclas de

algodón y fibras sintéticas, los hilos se refuerzan con un adhesivo (denominado "tamaño") para evitar la rotura de hilos de urdimbre. El tamaño puede estar compuesto de almidón, derivados de almidón, goma vegetal y derivados de celulosa solubles en agua, tales como metily carboximetilcelulosa. Antes de la tinción, blanqueo y de impresión, el tamaño debe ser retirado de la tela. Esto ya ha sido llevada a cabo por tratamiento con ácidos, álcalis y agentes oxidantes que pueden dañar las fibras. En consecuencia, el desencolado enzimático con amilasas o celulasas es ahora ampliamente utilizado, ya que no son corrosivos y no emiten los residuos de efluentes nocivos. Las celulasas también se emplean en algodón bio-pulido y otras fibras de celulosa para producir telas con una apariencia más suave y más brillante. Procesos similares utilizando proteasas microbianas se han desarrollado para tratamientos fibras de lana de ING, que se componen de queratina. El tratamiento de prendas de denim para darle un aspecto desgastado BE- venta tanto se llama "lavado a la piedra '. Tradicionalmente, esto se ha logrado mediante el lavado de las prendas en una lavadora Bling tum con piedras pómez. Las celulasas se utilizan ahora para acelerar la abrasión y ayudar al aflojamiento del tinte añil. Este 'bio-lavado a la piedra' es menos perjudicial para las prendas de vestir, reduce el desgaste de las máquinas y genera menos polvo de piedra pómez.

Las enzimas en la fabricación de cuero Proteasas y lipasas ahora se utilizan ampliamente en el procesamiento de cueros y pieles. Estas enzimas son más fáciles de usar, más agradable para manejar y más seguro que los productos químicos agresivos que se emplearon previamente. Sus aplicaciones más importantes están en remojo, pelambre, de- engrase y cebo. El remojo es la primera funciona- miento importante del tratamiento del cuero. Aparte de la limpieza de los cueros y pieles mediante la eliminación de los desechos derivados de la sangre, la carne, la grasa y el estiércol, que les rehidrata. Las proteasas en- absorción de agua Hance por disolución de proteínas intrafibrilar que el

cemento de las fibras entre sí e impiden la penetración del agua. Las lipasas también se utilizan para dispersar las grasas como una alternativa a desengrasado con disolventes. Estas enzimas hidrolizan las grasas superficiales y aquellos dentro de la estructura de los cueros y pieles, pero sin causar ningún daño físico. El depilado de cueros y pieles tradicionalmente empleados ha sustancias químicas tales como cal apagada y fosfuro de sodio sul-, que en el pasado han hecho curtiduría efluentes un problema grave contaminación. Enzima asistida depilado implica proteasas, a menudo la proteasa alcalina de Aspergillus flavus As-. Su utilización reduce o totalmente sustituye a la

requisitos para el procesamiento químico y proporciona una reducción de coste importante en el tratamiento de efluentes. cebo de cuero prepara la piel para el bronceado. Se in- eliminación Volves de cualquier proteína no deseada restante para hacer la superficie del grano del cuero acabado limpio, suave y fino. Los métodos tradicionales empleados para perros, palomas o pollo abonos. Éstas eran muy desagradable de usar, poco fiable y lento, y han sido sustituidos por las proteasas microbianas.

Las enzimas usadas en el tratamiento de pastas de madera fabricación de papel es una importante industria mundial. Sólo en EE.UU., más de 70 millones de toneladas de papel y cartón se fabrican cada año, los cuales tienen un valor en ex ceso de US $ 50 mil millones. fabricación de papel implica el procesamiento de fibras vírgenes en su mayoría, pero no hay aumento de la utilización de algunos materiales reciclados o de fibras secundarias. El reciclaje ahorra ambos árboles y energía, disminuye efluentes residuales y reduce las cargas de relleno sanitario. Tradicionalmente, procesamiento de la pulpa de madera ha implicado el uso extensivo de los productos químicos, lo que puede conducir a problemas con el tratamiento de efluentes y la contaminación ambiental. Por lo tanto, el desarrollo de la tecnología a base de enzimas para el

1 2

4

7 8

procesamiento de pulpa y fabricación de papel tiene importantes ventajas. enzimas microbianas se pueden utilizar en varias etapas de la pulpa y el procesamiento de papel a: mejorar la digestión de celulosa; mejorar las tasas de drenaje en la eliminación de agua durante la formación del papel; 3 aumentar la flexibilidad de la fibra; eliminar de forma selectiva xilano sin afectar a otros componentes; 5 eliminar resinas; 6 mejorar el blanqueo; eliminar los contaminantes, tales como en el destintado de papel usado de alta calidad; y fibrilar o aumentar interfibras unión de pastas químicas y fibras herbáceas. Esas enzimas microbianas utilizadas en estos procesos incluir una amplia gama de celulasas, hemicelulasas, NASes pecti- y lipasas. Sin embargo, aún no pueden sustituir a todos los tratamientos mecánicos y químicos.

Enzimas como síntesis orgánica

catalizadores

en

Hay un mercado de rápido crecimiento de enzimas microbianas utilizadas en la síntesis de alto valor compuestos orgánicos para la industria química, farmacéutica y alimentaria

industrias. Un área de gran valor comercial implica la aplicación de ciclodextrina glicosiltransferasas, a menudo obtenidos a partir de termófilos extremos, para crear ciclodextrinas de moléculas de almidón simples. Estas ciclodextrinas son vehículos útiles de compuestos frágiles tales como las vitaminas y sabores. No hay medios químicos existe para la creación de esta clase de sustancias, por lo que la ruta enzimática es único. Un campo cada vez más importante es la síntesis de compuestos RAL chi-. Los compuestos quirales existen en dos formas denominadas enantiómeros, que son no superponibles imágenes ROR miR el uno del otro y son, por lo tanto asimétrica. En prácticamente todos los aspectos, los dos enantiómeros son físicamente y químicamente idénticos. Sin embargo, las soluciones de un enantiómero rotan el plano de luz polarizada en una dirección hacia la derecha (+), mientras que las soluciones de la otra enantiómero gire en sentido antihorario (-), pero por exactamente la misma cantidad. Este fenómeno se conoce como actividad óptica y los enantiómeros se refiere a veces como isómeros ópticos. La quiralidad es de vital importancia en la biología como la mayoría de los compuestos orgánicos naturales son quirales. Por ejemplo, la mayoría de los aminoácidos son enantiómeros, con una sola tiomer Enagás por lo general se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, cuando los compuestos se sintetizan químicamente un casi 50: se hace mezcla de enantiómeros 50, que se denomina una mezcla racémica. Por lo general, para la mayoría de las moléculas biológicas, como para los aminoácidos, sólo una de sus variantes o enantiómeros es biológicamente eficaz como Strate una enzima sub-, fármaco, nutriente, etc. Su otro enantiómero puede ser inútil / inútil o incluso perjudicial para salud. La razón de que moléculas idénticas de quiralidad opuesta pueden tener tal comportamiento biológico diferente es que las proteínas, especialmente las enzimas y los ácidos nucleicos son ellos mismos moléculas quirales. En consecuencia, cualquier fármaco o nutriente deben tener la quiralidad adecuada si se va a interactuar con una proteína de la quiralidad específico. En la síntesis industrial de estos compuestos, tiene

que haber controles para garantizar la producción de sólo el enantiómero deseado, a menudo a una pureza superior al 99%. No sólo es económicamente desventajoso para hacer una gran cantidad de productos químicos cuando sólo la mitad (un enantiómero) está biológicamente funcional, pero para algunos fármacos el otro enantiómero puede ser tóxico. Ciertos síntesis quirales pueden realizarse químicamente, pero las rutas enzimáticas son generalmente preferidos. procesos a base de enzimas se pueden utilizar para preparar enantiómeros específicos y resolver enantiómeros a partir de mezclas racémicas. Estos procesos utilizan racemasas, que son una

familia de enzimas que aceptan cualquier enantiómero, aunque ellos mismos son quirales como todas las otras proteínas. Su función biológica es convertir un sustrato de una quiralidad en su forma opuesta. Pueden ser utilizados para sintetizar las aminas quirales, alcoholes y muchos otros compuestos.

Otras lecturas Papeles y comentarios Adams, MWW y Kelly, RM (1995) enzimas aisladas a partir de microorganismos que crecen en ambientes extremos. Chemical and Engineering News 73, 32-42. Benkovic, SJ y Ballesteros, A. (1997) biocatalizadores - la siguiente generación. Trends in Biotechnology 15, 385-386. Headon, D. & Walsh, G. (1994) La producción industrial de enzimas. Los avances de la biotecnología 12, 636-646. Jaeger, K.-E., Dijkstra, BW y Reetz, MT (1999) biocatalizadores bacterianas: biología molecular, tridimensionales estructuras y aplicaciones biotecnológicas de lipasas. Revisión Anual de Microbiología 53, 315351. Marrs, B., Delagrave, S. & Murphy, D. (1999) Novela AP- enfoques para el descubrimiento de las enzimas industriales. opi- nión actual en Microbiología 2, 241-245. Ogawa, J. & Shimizu, S. (1999) enzimas microbianas: nuevas aplicaciones indus-

triales de los métodos de detección tradicionales. Trends in Biotechnology 17, 1319. Shulze, B. & Wubbolts, MG (1997) biocatálisis para la industrialización de producción al de productos químicos finos. Current Opinion in Biotechnology 10, 609-615.

Libros Bornscheuer, U. y Kaszlauskas, R. (1998) Biotecnología. Biotransformaciones, vol. 8. VCH, Weinheim. Chaplin, MF y Bucke, C. (1990) Tecnología Enzimática. Cambridge University Press, Cambridge. Drauz, K. & Waldmann, H. (eds) (1995) catálisis enzimática in Organic Synthesis. VCH, Weinheim. Faber, K. (1996) Biotransformación en Química Orgánica. Springer Verlag, Berlín. Fogarty, WM & Kelly, CT (1990) Las enzimas microbianas y Biotecnología. Elsevier, Londres. Gerhartz, W. (1990) Las enzimas en la industria. VCH, Weinheim. Koskinen, AMP y Klibanov, AM (eds) (1996) enzimática Las reacciones en medios orgánicos. Blackie Academic y Professional, Londres. Nagodawithana, T. y Reed, G. (1993) Las enzimas en el procesamiento de ali- mentos. Academic Press, San Diego. Sheldon, R. & Kuster, A. (1993) Chirotechnology. Marcel Dekker, New York. Fatigar, GA & Woods, LFJ (1995) Las enzimas en el procesamiento de ali- mentos, 2ª edición. Blackie Academic and Professional, Londres.

10 Combustibles y productos químicos industriales

Dentro de los próximos 50-100 años algunos suministros de combustibles fósiles, en particular el petróleo, es probable que llegar a reducirse. En consecuencia, existe una necesidad urgente de desarrollar fuentes alternativas de energía. La mayoría de los requisitos se cumplirán a partir de fuentes geotérmicas, nucleares, solares, agua y viento. Sin embargo, la generación de combustible biológico es probable que se convierta cada vez más importante, especialmente en lo que puede ofrecer tanto a los combustibles líquidos y gaseosos. Es importante destacar que estos combustibles se producen a partir de recursos renovables, principalmente la biomasa vegetal, en forma de cultivos energéticos, la vegetación natural y residuos agrícolas, domésticos e industriales. Los dos productos principales de combustible microbianas Actualmente derivados de estos recursos son el metano y etanol, pero estos no son los únicos combustibles que se pueden formar. Otros ejemplos incluyen líquidos y gaseosos de hidrógeno, propano, metanol y butanol; electricidad también puede ser generada por los sistemas microbiológicos. Otros numerosos compuestos químicos importantes ahora son producidos por procesos económicamente más tación y biotransformación fermentación microbiana. La mayoría son metabolitos primarios que incluyen ácidos orgánicos, aminoácidos, disolventes industriales y una amplia gama de biopolímeros. Muchos de estos productos microbianos se utilizan como materias primas químicas e ingredientes funcionales en una amplia gama de productos industriales y de alimentación.

alcanos

El metano se utiliza tanto para combustible doméstico e industrial. En la actualidad, los suministros en su mayoría provienen de yacimientos de gas y petróleo o la gasificación de carbón. En consecuencia, el metano de producción a través de la fermentación es atractiva sólo en situaciones locales a pequeña escala limitada. Sin embargo, este modo de producción puede llegar a ser cada vez más importante más adelante en el siglo 21, cuando los suministros de las fuentes no renovables comienzan a disminuir. La producción de metano por microorganismos es un proceso muy complejo, que implica una mezcla de microorganismos anaerobios que se encuentra naturalmente en los pantanos, sedimentos orgánicos y en los estómagos (rumen) de rumiantes

144

animales. producción microbiana actual de metano para la combustión puede ser a través de la digestión anaerobia de residuos agrícolas culturales, industriales y urbanas (véase el Capítulo 15). Estos residuos son predominantemente biomasa vegetal (material lignocelulósico) que tienen altos costos de recolección. Un potencialmente atractivo, pero costoso, modo de producción a gran escala es mediante el depósito en vertederos (véase el Capítulo 15), siempre que la producción de gas estable a largo plazo puede ser desarrollado. Por el contrario, los fermentadores de biogás utilizan tecnología baja en la pequeña escala de la producción local de metano. A menudo utilizan los excrementos de animales y son particularmente valiosos en lugares en los otros combustibles no están disponibles. El biogás generadas se compone principalmente de un 50-80% de metano y 15-45% de CO2, junto con algunos gases traza. poblaciones microbianas mixtas asociadas con generación de metano son muy versátiles con respecto a la gama de sustratos que pueden utilizar. El metano producción de materiales orgánicos implica tres fases específicas. En primer lugar, un grupo de microorganismos hidrolizar polímeros orgánicos, incluyendo grasas, proteínas y

polisacáridos, a sus respectivos monómeros solubles. Estos compuestos son entonces metabolizados a ácidos orgánicos por organismos acidogénicas anaeróbicas. En la fase final, los ácidos orgánicos se convierten en alcanos y dióxido de carbono (Fig. 10.1). bacterias metanogénicas producen metano a partir de acetato, que es el producto principal. Sin embargo, el metano tiene un rendimiento de energía más baja que la más alcanos de cadena, etano y propano (Tabla 10.1), que se derivan de propionato y butirato, respectivamente (Fig. 10.1). Normalmente, sólo se producen pequeñas cantidades de estos dos ácidos orgánicos durante sis acidogene-, pero las cantidades generadas dependen de las condiciones específicas. Por lo tanto, existe un potencial para el futuro la manipulación de tales fermentaciones para producir una mayor proporción de los combustibles más atractivo etano y propano.

butanol La acetona, butanol, ácido isopropanol, a lo largo de

butírico

y

el

Combustibles y productos hidrolizante microbesAcidogenic microbios PolymersMonomers

Higo. 10.1La producción de alcanos de cadena corta por fermentación.

Tabla 10.1 rendimiento energético de los alcanos de cadena corta Producción de alcano energía (kJ / El metano (CH) 37 64 El etano 4 94 Propano (C3MARIDO8)

con otros ácidos orgánicos y alcoholes, se pueden obtener por fermentación clostridial de una gama de materias primas, incluyendo almidón, melaza y materiales celulósicos hidrolizadas. La cantidad relativa de cada producto de fermentación depende de las especies bacterianas y la cepa específica utilizada, y las condiciones ambientales de la fermentación. Hay tres principales tipos de fermentación: 1 acetona-butanol (Clostridium acetobutylicum), adproductos condicional: ácido butírico, ácido acético, acetoína, etanol, CO2 y H2; 2 butanol-isopropanol (Clostridium butylicum), productos adicionales: ácido butírico, ácido acético, CO2 y H2; y 3 ácido acético butírico (Clostridium butyricum), productos adicionales: CO2 y H2. Los miembros del género Clostridium son Gram-positivo varillas con flagelos peritricoso y son por lo tanto muy móviles. Se caracterizan por su capacidad de formar esporas resistentes al calor, un metabolismo fermentativo altamente y su respuesta al oxígeno. Todos son anaerobia, pero van desde anaerobios obligados a aerotolerant especies. Normalmente, no contienen derivados de hemo, tales como los citocromos y la catalasa. Sin embargo, algunas especies pueden producir citocromos si se suministra con precursores adecuados. La mayoría son mesófilos, aunque se conocen varias especies

microbesMethanogenic Los ácidos orgánicos ácido propiónico El ácido butírico ácido acético Principalmente

14 5

El metano + CO2 Etano + CO2 Propano + CO2

mophilic ter-, por ejemplo, C. thermoaceticum. Crecen bien a pH neutro y alcalino, pero se ininhibidos en condiciones ácidas y varían ampliamente en la gama de sustratos que pueden utilizar. La fermentación acetona-butanol tiene una larga historia como un exitoso proceso de fermentación industrial. Fue Weizmann en el Reino Unido, a principios del siglo 20, que llevó a cabo gran parte de la investigación básica en la producción de acetona, butanol y etanol por C. aceto

14

Capítulo

butylicum. Esto fue muy valiosa durante la 6 Primera Guerra Mundial, en particular para la producción de acetona, que era necesario en la fabricación de explosivos. La acetona se usa específicamente como un agente de gelatinización de nitrocelulosa en la producción de pólvora. El proceso de Weizmann también produjo riboflavina (vitamina B2) como subproducto. Después de la Primera Guerra Mundial, se convirtió en el principal butanol producto de interés. Se utiliza ampliamente como un producto químico de la realimentación en la producción de lacas, de rayón, plastificantes, recubrimientos, detergentes, líquidos para frenos y dieno butadieno para la fabricación de caucho sintético. Butanol también se utilizó como disolvente de grasas, ceras, resinas, goma laca y barniz, y como agente de extracción valiosa y disolvente en la industria alimentaria. La producción anual de butanol derivada fermentation- era de más de 20 000 toneladas en 1945, pero en el mundo occidental el proceso comenzó a declinar a finales de la década de 1940. Esto era debido a los cambios en el suministro de materias primas de fermentación (melaza, caña de azúcar, etc.) y el aumento de la disponibilidad de materias primas petroquímicas de bajo costo para su síntesis química. Butanol es ahora predominantemente fabricado a partir de materias primas a base

de petróleo. En los EE.UU., por ejemplo, la producción actual de butanol sintetizado químicamente es más de 500 000 toneladas / año, con un crecimiento anual del 3-4%. Sin embargo, las fermentaciones butanol todavía están operados en ciertos países. En los antiguos estados de la Unión Soviética algunos procesos se basan en la melaza de remolacha, mientras que las fermentaciones utilizando la melaza de caña de azúcar continuó hasta hace relativamente poco tiempo en África del Sur, y China aún mantiene algunas plantas de fabricación basados fermentation-. El futuro de la producción basada en la fermentación se ve muy brillante, especialmente en lo que el consumo mundial de butanol se ha disparado en los últimos años. Esto proporciona una oportunidad para la introducción de nuevos y más eficiente tecnología de proceso de fermentación, especialmente en el suministro de productos petroquímicos disminuye. Además de la función existente como un material de alimentación de disolvente y química, butanol tiene varias propiedades que son favorables para el uso de combustibles de motor, ya sea sola o cuando se mezcla con la gasolina (Tabla 10.2). Butanol tiene buenas propiedades de octano de mejora, un relativamente alto calor de combustión y una presión de vapor mucho más baja que tanto el metanol y el etanol. Estas características hacen

Propiedad fisica Calor de combustión (kJ / g) Combustible valores*: MON RON (Octanaje) miscibilida d con Gasolina diesel Agua

metan ol 23.9 110 91

Etan ol 30. 6 108 90

buta nol 36. 7 100 87

Gasol ina 43.8 92 83

Pobre Pobre Alto

Justa Pobr e Alto

buen o buen o Bajo

Bajo

di es 4 2. 15 -

Tabla 10.2 Características de los alcoholes para su uso como cosolventes y mejoradores

B aj * Índice de octano define la calidad antidetonante de un combustible en un motor de combustión interna, es decir, su resistencia a la preignición. El valor de rendimiento para iso-octano se le da el valor arbitrario de 100 y n-heptano un valor de cero, y se utiliza para la normalización de los combustibles mediante la comparación de un combustible con mezclas de estos dos alcanos. Hay dos pruebas de laboratorio, que se utiliza RON (índice de octanos), que se correlaciona mejor con baja velocidad, condicionesgolpeando leves, y MON (índice de octano de motor), que se correlaciona con la alta velocidad, condiciones de alta temperatura.

butanol un extensor aún mejor líquido combustible que el etanol, que se utiliza actualmente en la formulación de gasohol. Por otra parte, el butanol tiene una baja miscibilidad con el agua, pero de alta miscibilidad con diesel y gasolina. Debido a su alto calor de la combustión, las soluciones de butanol que contienen agua tanto como 20% (v / v) tienen el mismo valor de combustión como etanol anhidro. Esto puede indirectamente reducir el óxido de nitrógeno (NOx) por lower- ing la temperatura de funcionamiento de los motores de combustión interna. Como aditivos para combustibles, alcoholes tales como butanol también tienen el potencial para reducir las emisiones de monóxido de carbono.

proceso de producción Butanol En el pasado, la producción económicamente viable de butanol normalmente ha requerido un volumen fermentador de al menos 1.000 m3. Los fermentadores no se agitaron, como la evolución de los gases proporciona una mezcla suficiente. Estas fermentaciones se hicieron funcionar como procesos por lotes, a menudo usando 5-7% (w / v) de almidón o melaza como sustrato de carbono. Más recientemente, con la creciente demanda de butanol, procesos avanzados basados en el maíz, se han propuesto subproductos de procesamiento de maíz y otros residuos

celulósicos, en particular en los EE.UU. (véase más adelante). En el proceso convencional, antes de la fermentación, el medio y se esterilizan fermentador y se purgó con CO2. El fermentador fue inoculado con un relativamente bajo nivel de inóculo, 0,03% (v / v) C. aceto butylicum. En el primero 18-24 h el pH cae de una nivel inicial de 5,8 a 6,0 a pH 5,2, debido a la producción de ácido butírico y ácido acético durante este rápido crecimiento

fase. Durante la siguiente 20-24 h el pH se eleva de nuevo a pH 5,8 a 6,0, ya que estos ácidos son metabolizados para formar la disolventes neutros acetona, butanol y etanol. Su concentración total alcanza alrededor de 2% (v / v) en una relación de 6: 3: 1 para la acetona, butanol y etanol, respectivamente. Los rendimientos globales de hasta 37% (w / w), basado en el hidrato de carbono inicial, se puede lograr. la recuperación del producto ha implicado tradicionalmente destilación fraccionada. Los gases generadas durante la fermentación, en particular el CO2, pueden ser recuperados para su venta como subproductos y los residuos de destilación pueden ser vendidos como alimento para animales. Una proporción de la producción de butanol en China y algunos otros países todavía puede ser a través de procesos de fermentación similares, pero la última fermentación de etanol-acetona con butanol industrial operado en el mundo occidental se cerró en la década de 1990. Esto se llevó a cabo

por National Chemical Products en Germiston, Sudáfrica, usando C. acetobutylicum P262. Se fermentaciones en lotes involucrados con la melaza como sustrato, que se emitió durante 40-60 horas y se genera concentraciones medias de productos de 15-18 g / L. Sin embargo, via- bilidad económica de estas fermentaciones exige ahora un rendimiento disolvente de 22-28 g / L dentro de este tiempo, de lo contrario no CAN- compiten con los procesos químicos. El eco exacta económicamente competitivo concentración depende del precio vigente de aceite. Los métodos por lotes tradicionales han sufrido de varios problemas, incluyendo la contaminación por lactobacilos, ataque bacteriófago, la inhibición del producto, los altos costos de energía para la destilación y el hecho de que se obtiene una mezcla de productos de fermentación. procesos más eficientes se están desarrollando con una mejor

cepas que producen predominantemente un producto de fermentación y utilizan sustratos más baratos, incluidos los desechos domésticos y agrícolas. Pueden implicar, suspensión, temperatura-continua culturas de varias etapas programadas o células inmovilizadas incorporados en reactores de lecho fluidizado. Tales procesos de fermentación son propensos a tener sistemas de recuperación de productos integrados, como vaporation persona. Este método en particular implica la separación selectiva de la membrana de componentes disolventes en una cámara de baja presión (por ejemplo, utilizando membranas de poli dimetilsilano) seguido de la condensación del producto. Estos procedimientos mejorados tienen el potencial para producir una concentración de disolvente total superior a 30 g / L y permiten la recuperación simultánea de disolventes a partir del caldo durante la fermentación. Esto elimina producto La inhibición y permite la utilización completa del sustrato de carbono a una tasa relativamente alta durante la fermentación continua.

etanol Industrial La mayoría de las regiones del mundo se han producido tradicionalmente bebidas alcohólicas a partir de sustratos disponibles a nivel local (véase el Capítulo 12). fermentaciones alcohólicas similares ahora se utilizan en algunos países para producir el tipo de combustible o etanol como materia prima química. ción de etanol del mundo anual de producción es de más de 30 mil millones de litros, aproximadamente el 70% de los que se produce por la fermentación, el der restante se fabrican sobre todo mediante la hidratación catalítica del etileno. Casi el 12% de la fermentación es etanol de las bebidas alcohólicas, el 20% es para el vario al industrialización y utiliza el 68% restante es el etanol combustible. El etanol es un combustible atractivo porque puede ser utilizado solo o mezclado con otros combustibles líquidos, por ejemplo, 'gasohol', una mezcla de 10 a 22% (v / v) de etanol con la gasolina (véase la Tabla 10.2). En la década de 1970, Brasil y algunos otros países emprendieron la producción a gran escala de etanol a partir de biomasa recursos renovables autóctonas para compensar los crecientes costos de las importaciones de

petróleo. El etanol se producido por la fermentación de la sacarosa, derivado de la caña de azúcar, el uso de Saccharomyces cerevisiae. Brasil es ahora responsable de más del 46% de la producción mundial anual,

cerca de 14,5 mil millones de litros de etanol. Sin embargo, esto no es suficiente para mantenerse al día con la creciente demanda de combustible. Incapacidad para desarrollar sus procesos de producción se ha traducido en la necesidad de importar etanol de los EE.UU. y otros países productores. Además de la sacarosa, otros sustratos de fermentación convencionales para fermentaciones de etanol incluyen ars cias simples derivados de plantas y residuos lácteos. Estos requieren relativamente poco procesamiento (figuras 10.2 y 10.3). Sin embargo, el uso de almidón de raíces y tubérculos (yuca, patata, etc.) o almidón de cereales (maíz, trigo, arroz, etc.) exige operaciones de procesamiento gy consume energías para lograr la hidrólisis. Incluso un mayor procesamiento es necesaria antes de la utilización de materiales de plantas lignocelulósicos (ver p. 149).

Bioconversión de almidón de maíz En América del Norte, los procesos de molienda húmeda o seca se han desarrollado para la transformación de maíz para el aceite de maíz por separado a partir del almidón. Esto también genera subproductos que se pueden utilizar para la alimentación animal. almidón extraído se

somete a la gelatinización y la sacarificación, y los azúcares resultantes puede entonces someterse a fermentación alcohólica. La tecnología utilizada inicialmente se basó en gran medida en que guardado previamente desarrollado para la producción de bebidas alcohólicas, pero ahora los procesos son mucho más eficientes. sacarificación enzimática se utiliza para la conversión de almidón en azúcares fermentables que emplean diversas amilasas termoestables, incluyendo glucoamilasas. La fermentación de los azúcares resultantes, principalmente glucosa, se lleva a cabo por cepas seleccionadas de S. cerevisiae a 32-38 ° C y pH 4,5 a 5,0. Las fermentaciones pueden ser procesos por lotes o continuos, a menudo con alguna forma de reciclaje celular, lo que reduce tanto el tiempo de fermentación y la cantidad de sustrato 'perdido' en la conversión de biomasa no deseado. El funcionamiento en vacío, lo que facilita remoción continua de etanol para reducir la inhibición de etanol, e incluso la inmovilización de células se han puesto a prueba (Tabla 10.3). Estas fermentaciones alcohólicas generan una «cerveza» conteniendo aproximadamente 10% de etanol (v / v) de la que la levadura se separa generalmente antes de la destilación. Re- etanol cubierta puede entonces estar deshidratado (véase el capítulo 7,

fuentes de azúcar directos (Caña, remolacha, suero de leche, etc.) requieren menos energía que consume el procesamiento y están fácilmente fermentada sacarificación

Higo. 10.2 Los sustratos para el etanol producción (* mucho menos fácilmente fermentada producto s).

almidon es

productos fácilmente fermentadas (glucosa, maltosa)

deslignificació sacarificación n lignocelulosa celulosa y y hemicellulosehexoses pentosas *

cultivos de almidón cereales, Suero y otros desechos lácteos

cultivos materiales de azúcar lignocelulósicos virutas de madera, serrín, paja, residuos d remolacha o caña

gelatinizaci ón y sacarificació n a la glucosa, maltosa y

pretratamientos reducción de tamaño y deslignificación mecánica La lignina

La extracción de jugo (sacarosa) desproteinización

La celulosa y la hemicelulosa Hidrólisis ácida o enzimática a glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, etc.

Fermentación por etc.) lotes, semi-continuo y continuo suplementos de medio de fermentación (nitrógeno, fosfato, vitaminas, +/- Eliminación continua etanol Subproductos de fermentación (Alimento para animales, etc.) Destilación 95,6% (v / v) de etanol

azeotrópica Destilación 99,8% (v / v) de etanol

Higo. 10.3la producción industrial de etanol a partir de diferentes sustratos.

Fermentación tipo etanol (g / l / h) Batch2.5-3.5 Lotes con levadura recycle5.0-6.5 Continua (tanque agitado reactor) 12-14 Continuo (bajo un vacío de 35 mm Hg y * reciclaje de levadura) (Levadura inmovilizada continua células)>

tasa de producción de

Tabla 10.3 La producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae en diversos sistemas de fermentación

60-80 100

* En sistemas similares Zymomonas mobilis produce hasta 120 g de etanol por litro por hora.

Destilación). El coste de esta recuperación de etanol es a menudo hasta el 50% del gasto total del proceso. subproductos de proceso incluyen metanol, glicerol y alcoholes superiores, tales como alcoholes de amilo, butilo y propilo. Las posibles enfoques alternativos para la recuperación de etanol incluyen el uso de procesos de fermentación continuos usando

extractivas no volátiles, disolventes no tóxicos, tales como el alcohol oleico, que tienen una alta afinidad por el etanol. Este stategy es útil para superar producto final in-

prohibición. Los disolventes empleados se introdujo continuamente en el fermentador y se elevan a través del medio para formar una capa que se retira continuamente. El paso a través de una centrífuga da como resultado la separación de solvente cargado etanol a partir de los medios de

comunicación y las células, que están regresado a su fermentador. El etanol puede ser recuperado por vaporización instantánea y se vuelve a utilizar el disolvente no volátil. Aunque S. cerevisiae está todavía ampliamente utilizado para la

fermentación alcohólica de sustratos de explotados. Miles de millones de toneladas de azúcar simple, hay otros organismos con estos materiales celulósicos actualmente se potencial comercial (Tabla 10.4). Estos desperdician cada año, lo que podría ser ed incluyen especies del género bacteriano convertibilidad en energía química u otros Zymomonas, como Z. mobilis, que son Gram productos de fermentación útiles. negativos anaerobios facultativos que Lignocelulosa se compone de los siguientes normalmente fermentan solamente glucosa, polímeros. fructosa o sacarosa. Ellos ofrecen mayores 1 La lignina (10 a 35%, w / w), un polímero de rendimientos de etanol que hace S. tres alcoholes fenólicos (p-cumaril, sinapílico cerevisiae, pero no son tan etanol tolerante. y alcoholes coniferılico) que incrusta la En el futuro, es probable que implicar celulosa. Este material no puede ser organismos manipulados genéticamente que degradada por microorganismos en tienen la capacidad de utilizar una amplia condiciones anaerobias, pero puede ser gama de fuentes de carbono y tienen mejores utilizado como fuente de la vainillina, catecol, propiedades de fermentación rutas methylsulphide di- (DMS) y sulfóxido de alternativas. Por ejemplo, Escherichia coli, dimetilo (DMSO) a través de procesos que normalmente sólo produce relativamente químicos. pequeñas cantidades de etanol, se ha 2 Celulosa (15 a 55%, w / w), un homopolímero transformado con un plásmido que codifica la lineal de unidades de glucosa b-1,4-ligado. alcohol deshidrogenasa y piruvato Una vez hidrolizado, la glucosa resul- tante se descarboxilasa de Z. mobilis. Tales fermenta fácilmente por muchos transformantes producen etanol bajo microorganismos, pero pocos pueden utilizar condiciones aeróbicas y anaeróbicas. directamente el polímero nativa. 3 La hemicelulosa (25 a 85%, w / w), una clase de polímeros que contienen varios heteroLa bioconversión de materiales lignocelulósicos hexosas (d-glucosa, galactosa d- y d-manosa) A diferencia de los cultivos energéticos y pentosas (l-arabinosa y D-xilosa). La xilosa (cereales, caña de azúcar y remolacha, etc.), es la segunda azúcar más abundante en la residuos vegetales lignocelulósica (serrín, naturaleza después de d-glucosa y puede virutas de madera, paja, bagazo, desechos de constituir hasta 25% del peso seco de algunos papel, etc.) no tienen ningún uso directo de árboles leñosas, pero sólo unos pocos los alimentos. Son recursos renovables sin microorganismos fermentar pentosas a embargo, para ser totalmente franco etanol. Es importante destacar que la producción de etanol a partir de lignocelulosa

Tabla 10.4 Microorganismos productores de etanol

Las bacterias Clostridium thermohydrosulfuricum Clostridium thermocellum Thermoanaerobacter ethanolicus Zymomonas mobilis fermenta la glucosa,

termófilo extrema Termófilo, hidroliza la celulosa Fermenta xilosa y almidón * La de tipo salvaje solamente fructosa y sacarosa, pero con una alta productividad

levaduras pseudotropicalis Candida, C. tropicalis Candida xilosa y speciesFerment Kluyveromyces lactis† desechos lácteos * Kluyveromyces marxianus (polifructosano) Pachysolen tannophilus Pichia stipitis Saccharomyces cerevisiae

Fermenta xilosa * celobiosa * Fermenta la lactosa en los inulina hidrólisis Fermenta xilosa * Fermenta xilosa * La mayoría de las cepas fermentan solamente glucosa, sacarosa,

S. cerevisiae var. distaticus Schwanniomyces alluvius Los hongos filamentosos Fusarium speciesFerment Monilia speciesHydrolyse celulosa y Mucor xilosa y speciesFerment

fructosa, maltosa y maltotriosa Se hidroliza el almidón Se hidroliza el almidón xilosa * xilano arabinosa *

* Además de los monosacáridos hexosa comunes y disacáridos. † no exhibe el efecto Crabtree.

es económicamente viable sólo si se fermentan los dos pentosas y hexosas. Pocos microorganismos pueden utilizar dirlignocelulosa rectamente y los que lo hacen, como algunas especies de Closing triduo, producen poco o nada de etanol. Por lo tanto, la fermentación microbiana directa de materiales celulósicos para el etanol es una oportunidad lejana. Un enfoque más probable que sea exitosa en el corto plazo implica varios pasos. En primer lugar, el tratamiento previo del material lignocelulósico es necesaria antes de la sacarificación de la hemicelulosa y componentes de celulosa. Los azúcares resultantes de la hidrólisis química y / o enzimática pueden entonces ser fermentados para producir etanol, que puede ser separada de la fase acuosa por destilación. Pretratamiento y sacarificación deben llevarse a cabo de una manera que maximiza el rendimiento de bioconversión posteriores y reduce al mínimo la formación de compuestos inhibitorios potencialmente in-, especialmente furfuroles y fenoles solubles. La mayoría de los materiales lignocelulósicos requieren un pretratamiento para hacer que la celulosa y la hemicelulosa más susceptibles de hidrólisis ácida o enzimática. requisitos de pretratamiento varían con la materia prima y son a menudo mucho menos por los materiales procesados, tales como papel y cartón. Los métodos empleados incluyen la reducción mecánica de tamaño por molienda, la fabricación de pasta química, hidrólisis ácida, tratamiento alcalino, autohidrólisis, extracción con disolvente, al vapor y explosión de vapor (la descompresión explosiva después del tratamiento de vapor de alta presión a 4000 kPa durante 5-10 min). Varios combinaciones de procesos de pretratamiento se pueden utilizar dependiendo de la fuente de materiales lignocelulósicos (Fig. 10.3). Algunos alcanzan la saccharifica- parcial, pero el tratamiento ulterior con ácido o enzimas es usualmente necesario. La hidrólisis ácida se lleva a cabo generalmente con ácido diluido (por ejemplo, 0,5 a 5% (v v) / ácido sulfúrico) bajo presión para alcanzar temperaturas elevadas de 100 a 240 ° C. Este tratamiento es relativamente barato, sino que también genera grandes cantidades de subproductos de degradación y los compuestos inhibidores indeseables. hidrólisis ácida fuerte a menudo utiliza el ácido clorhídrico concentrado a temperatura

ambiente, lo que da la más alta de azúcar

puede ser necesario con el fin de eliminar estos compuestos, antes de la fermentación. Los azúcares generados por hidrólisis son principalmente glucosa, celobiosa (un disacárido compuesto por b-1,4- unidades de glucosa unidas) y xilosa. La fermentación de xilosa es problemática. S. cerevisiae, que actualmente está responsa- ble de 95% de todo el etanol producido por fermentación, no fermenta este monosacárido. De esos organismos que (véase la Tabla 10.4), no son el etanol tolerante y dan rendimientos de etanol pobres. Hay un número de formas posibles por los que S. cerevisiae podría ser empleado en la fermentación alcohólica de xilosa (Fig. 10.4). 1 La isomerización de la aldo-azúcar, D-xilosa, a la forma ceto d-xilulosa, que S. cerevisiae puede fermentar. Esto puede conseguirse llevando a cabo la fermentación de la levadura en presencia de una xilosa isomerasa bacteriana. 2 La ingeniería genética de S. cerevisiae, para expresar genes, ya sea para: (a) una xilosa isomerasa bacteriana, por ejemplo de especies de Actinoplanes, Bacillus, etc .; o (b)xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa de una levadura de fermentación de pentosa, por rendimiento de cualquier proceso de hidrólisis ácida. Sin embargo, este tipo de operaciones son altamente corrosivos y recuperación casi completa del ácido es esencial para que el proceso sea económicamente viable. La hidrólisis ácida de las mezclas de celulosa y hemicelulosa es difícil de controlar. La hemicelulosa se hidroliza más fácilmente que la celulosa y genera azúcares temprano en el proceso. Estos azúcares pueden someterse a una ruptura de compuestos inhibidores, por ejemplo furfuroles. Por consiguiente, el acondicionamiento de los hidrolizados

ejemplo, especies de Candida, Pichia, etc. Sin embargo, hay problemas con probables desequilibrios cofactor con esta opción. Z. mobilis también se ha modificado genéticamente para fermentación de xilosa ción y puede desempeñar un papel en el futuro en la producción de etanol a partir de biomasa de la planta, como puede la E. coli por ingeniería genética se mencionó anteriormente, y ciertos microorganismos mophilic ter-.

Hidrógeno El hidrógeno es un combustible muy atractiva debido a su alto contenido de energía (118,7 kJ / g), que es aproximadamente cuatro veces mayor que el etanol y más de dos veces mayor que el metano. La tecnología para su uso ya se ha desarrollado y el producto de su combustión es agua. Una amplia gama de microorganismos producir hidrógeno como parte de los mecanismos para la eliminación de electrones que se generan durante las reacciones metabólicas: 2e+

2H3O+ ion hidrógeno hidratado (ion hidronio)

'H2 + 2H2O

La generación de hidrógeno a partir de microorganismos, o sistemas libres de células en base a componentes microbianos, es todavía muy en su infancia. Sin embargo, hay tres rutas posi- bles de producción. 1 Biophotolysis de agua consiste en descomponer el agua utilizando energía de la luz y no requiere un sub exógeno

xilosa isomerasa bacteriana

xilosa OPU reductasePFY deshidrogenasa xilulosa xilosa

Xylitol

NAD (P) H

NAD (P)

NAD

NADH

xilulosa ATP

xiluloquinasa

ADP + Pyo Xilulosa 5-fosfato Vía pentosa fosfato La levadura fermenta OPU = Pentose ruta de EmbdenMeyerhof- Parnas (glucólisis)

Higo. 10.4Estrategias para la fermentación de pentosas a etanol por Saccharomyces cerevisiae.

* aparato fotosintético

MA RID O2O

1/ 2O2 +

Etanol + CO2

hidrogenasa **

2H+

m ari do 

MARIDO2 + 2e portador de electrones Añadido por ejemplo, la ferredoxina

* Por ejemplo aislado cloroplastos ** bacteriana purificada enzima

Higo. 10.5Esquema de biophotolysis libre de células.

Strate. Esto se puede realizar utilizando los sistemas fotosintéticos, tales como los cloroplastos de algas, que pueden considerarse como células solares. In vivo, la energía generada se utiliza normalmente para formar fosfato reducido nicotinamidaadenina-dinucleótido (NADPH). Sin embargo, en la presencia de una hidrogenasa bacteriana y un transportador de electrones apropiado, hidrógeno molecular puede ser generada (Fig. 10.5). 2 fotorreducción, La descomposición dependiente de la luz de los compuestos orgánicos, se lleva a cabo por las bacterias fotosintéticas. Este es un proceso anaeróbico que requiere luz y un sustrato orgánico

ria genera una pequeña cantidad de hidrógeno. Por ejemplo, algunas enterobacterias producen hidrógeno y CO2 escindir formiato, y en clostridios se produce a partir ferredoxina reducida. Teóricamente, 4 moles de hidrógeno se puede generar a partir de cada mol de glucosa, lo que representa sólo un rendimiento de energía 33%. Sin embargo, la mayoría ORnismos producen mucho menos. En consecuencia, hay poca exógeno, que es inhibida por los iones de oxígeno, dinitrógeno y amonio. La formación de hidrógeno se atribuye a una nitrogenasa que puede reducir protones, así como de dinitrógeno. Los miembros de la Chlorobiaceae, Chromatiaceae y Rhodospirillaceae llevar a cabo fotorreducción. Esas bacterias con mayor potencial son probablemente las bacterias no del azufre púrpura, tales como las especies Rhodospirillium, que photometabolize ácidos orgánicos. 3 Fermentación de compuestos orgánicos por muchos teriana

posibilidad para la producción comercial de hidrógeno a través de esta ruta en un futuro próximo. do6MARIDO12O6 + 2H2O Æ 2CH3ARRULLO- + 2H+ + 2CO2 + 4H2

Electricidad El papel de los microorganismos en la generación de electricidad puede implicar microbianamente produce combustibles gaseosos y líquidos, tales como etanol o metano, que se utilizan para accionar generadores mecánicos convencionales. Alternativamente, di- generación rect puede ser utilizado, pero esto es todavía en las primeras etapas de desarrollo. Las posibles

rutas son a través de microorganismos o enzimas microbianas intactas incorporados dentro de las células de combustible (Fig. 10.6). se prefieren los sistemas a base de enzimas, como la transferencia de electrones entre las células enteras y los electrodos es en general menos eficiente. En algunos casos, mejorar movilizaron enzimas pueden ser utilizados. Los posibles candidatos son deshidrogenasas microbianas acoplados al electrodo sistemas y catalizar la interconversión de hidrógeno y electricidad. Además, hay la posibilidad de que los microorganismos fotografías tróficos, o sus sistemas fotoactivos, podría convertir directamente la luz solar en electricidad. Por ejemplo, el uso de membranas artificiales que incorporan sistemas basados en bacteriorrodopsina de archaea, por ejemplo,

mi-

mi-

sustrato de carbono

Electrón moléculas aceptoras

Microbiano Electrón células (transporte de electrones) moléculas portadoras

Oxidación

Reducción

Ánodo cátodo MARIDO+

De intercambio catiónico membrana

Higo. 10.6Una célula de

combustible microbiana.

halobium halobacterium. Tales sistemas facilitan la translocación dependiente de la luz de protones y el ING transmembrana gradiente electroquímico resultante creado podrían utilizarse para generar electricidad.

Aminoácidos Varios aminoácidos son producidos en cantidades comerciales a través de los procesos de fermentación directa utilizando exceso de producción de cepas microbianas, o mediante biotransformación microbiana. Se emplean sobre todo como suplementos de alimentación humana o animal y compuestos de sabor. Sin embargo, varios aminoácidos también tienen usos en productos farmacéuticos y cosméticos, y en la industria química para la fabricación de polímeros.

l-Ácido glutamico De todos los procesos de producción de aminoácidos, la del ácido glutámico l- es probablemente el más importante en términos de cantidad. Su uso principal es como el potenciador del sabor, L-glutamato monosódico (MSG), que puede aumentar

tración (FDA) clasifica MSG como "generalmente considerados como seguros" (GRAS) debido a su historial de uso seguro, y la Organización para la Agricultura y la Alimentación Común (FAO) / Organización Mundial de la Salud (OMS) Comité de Expertos en Aditivos Alimentarios (1970) dio la ingesta diaria aceptable como 0-120 mg / kg peso corporal. Desde principios de la década de 1960, los métodos clásicos de producción que utilizan fuentes de la planta han sido sustituidos por procesos de fermentación, que ahora son responsables de una producción anual de más de 400 000 toneladas. El precio de MSG en el comercio internacional es un promedio de US $ 1.20 / kg y aparte de un amplio uso en alimentos orientales, que se añade a una amplia gama de productos alimenticios, en particular las sopas, salsas, salsas y productos de aperitivo. microorganismos productores de ácido glutámico incluyen especies de los géneros estrechamente relacionados Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium y Micrococcus. Estos son Gram-positivas, que requiere biotina bacterias, no móviles que tienen una intensa actividad de la deshidrogenasa Tamate glu. ácido oxoglutárico + NH + + NAD (P) H + H+

4

e intensificar el sabor de los alimentos sin añadir sabor señal sig- propia. MSG es presente de forma natural en ciertos alimentos y se descubrió que era el componente "activo" de un alga marina de valores tradicionales para mejorar el sabor utilizado en alimentos del Lejano Oriente. Este compuesto se aisló primero a partir de las algas, Laminaria japonica, en 1908. La producción comercial en Japón siguió al- más inmediatamente, utilizando extractos de proteína de soja y gluten de trigo. En 1959 los EE.UU. de Alimentos y Medicamentos de EE.UU.

G

lu

tam

æ æ æ

norteamericana

comió

deh

YDR

oGE

norte

æ æ æ æ æ Æ lglutámico ácido

Plaza bursátil

æ

+ NAD (P) + + HO 2 Las especies de Brevibacterium y Corynebacterium se utilizan para la mayoría de las fermentaciones industriales. El Corynebacterium glutamicum de tipo salvaje, por ejemplo, exhibe la inhibición de retroalimentación cuando traciones de ácido glutámico celular concen- suben a 5% sobre una base de peso seco. Sin embargo, las cepas de producción desarrollados usando mutagénesis y

programas de selección son ambos mutantes tróficos de regulación y auxo-. Estas cepas se han desarrollado con un alto estado estacionario piruvato citoplasmática amino ácido concentración. Se acumulan sobre 30% de La acetil CoA ácido L-glutámico y el rendimiento de 1 mol de glutamato por 1,4 mol de glucosa, y esto es importante son resistentes fago. Más recientemente, la tecnología de ADN recobinant se ha utilizado para aumentar la actividad de enzimas biosintéticas específicas por transformación ción con plásmidos multicopia que llevan los genes estructurales para estas enzimas. La estrategia general para achievsobreproducción ing del aminoácido implica: 1 el aumento de la actividad de las enzimas anabólicas; 2 la manipulación de la regulación para eliminar los mecanismos de control de realimentación; 3 el bloqueo de las vías que conducen a los subproductos no deseados; 4 el bloqueo de las vías que dan lugar a la degradación del producto diana; y 5 limitar la capacidad para procesar la precursoras inmediata de ácido L-glutámico, es decir, ácido oxoglutárico, a la siguiente intermedio del ácido tricarboxílico (TCA) ciclo, succinil coenzima A (CoA), es decir, el uso de mutantes que carecen de deshidrogenasa del ácido oxoglutárico. Durante la fase de crecimiento de estos mutantes producen intermedios esenciales de isocitrato a través del ciclo del glioxilato (Fig. 10.7). Además, ya que estas bacterias normalmente no secretan glutamato, se emplea una amplia gama de tratamientos para hacer que la liberación de las células más permeables y la ayuda de los amino ácido en el medio. Estos tratamientos incluyen: limitación de la biotina, la restricción de la biosíntesis de fosfolípidos por la adición de ácidos grasos saturados C16C18 durante la fase de crecimiento, y la inclusión de agentes tensioactivos (por ejemplo Tween 40) y penicilina en los medios de producción.

Producción industrial de ácido L-glutámico

fermentadores a escala industrial son normalmente de acero inoxidable agitada

hexosas EM P

athway

oxaloacetato

Citrato

CoASH Isocitrato

malato glioxilato

3 succinato

oxoglutarato 2

1 L-Ácido

NUEVA HAMPSHIRE3 glutamico

El glutamato deshidrogenasa oxoglutarato deshidrogenasa (ausente) isocitrato deshidrogenasa

Higo. 10.7 biosíntesis de los ácidos L-glutámico en las cepas mutantes.

TCA Ciclo

reactores de depósito de hasta 450 m3. Estos son procesos por lotes, operados aeróbicamente a 30-37 ° C, la temperatura específica en función de los microorganismos utilizados. Aparte de las fuentes de carbono y nitrógeno, el medio de fermentación contiene normalmente sales inorgánicas, provee- ing magnesio, manganeso, fosfato y potasio, y los niveles limitantes de la biotina. Corinebacterias son nutricionalmente exigente y puede requerir también otras vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. Las fuentes de carbono preferidas son carbohidratos, preferentemente glucosa o sacarosa. Azúcar de caña o de remolacha melaza se pueden utilizar, pero el

medio requiere la modificación adicional ya que sus niveles de biotina tienden a ser demasiado alto. Esto se puede superar mediante la adición de ácidos grasos saturados, penicilina o tensioactivos

tantes que promueven la excreción. La fuente de nitrógeno (sales de amonio, urea o amoníaco) se alimenta lentamente a la inhibición de ventilación pre- de la producción de L-glutamato. pH del medio se mantiene a 7-8 mediante la adición de álcali, de lo contrario el pH cae progresivamente a medida que el L-glutamato se excreta en el medio. La acumulación de ácido L-glutámico no se hace evidente hasta la mitad de la fermentación, que normalmente tiene una duración de 3540 h y alcanza niveles de ácido glutámico en el caldo de l- de 80 g / L. la recuperación del producto implica la separación de las células del medio de cultivo. El ácido L-glutámico es entonces cristalización lizó a partir del medio gastado mediante la reducción del pH a su punto isoeléctrico de pH 3,2 usando ácido clorhídrico. Los cristales de ácido L-glutámico se separaron luego por filtración y se lavan. MSG se prepara añadiendo una solución de hidróxido de sodio al ácido L-glutámico cristalina seguido de recristalización. L-lisina

L-lisina no es sintetizada por los seres humanos y otros mamíferos. Este aminoácido "esencial" debe ser adquirido como parte de su dieta. Sin embargo, muchos cereales y hortalizas

son relativamente bajos en lisina. En consecuencia, los productos alimenticios y alimentos para animales derivados de estas fuentes se complementan a menudo con este aminoácido. La producción mundial anual de L-lisina necesaria para cumplir con estos requisitos es ahora de más de 380 000 toneladas. Más de 90 000 toneladas de esta lisina se producen actualmente mediante métodos de fermentación y de biotransformación microbianos directos. La parte restante es producido por síntesis química. Sin embargo, esta ruta tiene la gran desventaja de que se sintetiza una mezcla de los D- y L-isómeros, pero es sólo l-lisina que el cuerpo utiliza. Por lo tanto, se requiere que la resolución óptica después de la síntesis química, mientras que la producción microbiana tiene la ventaja de que sólo se forma el isómero L-.

Producción industrial de L-lisina

El control metabólico de la producción de Llisina de tipo salvaje C. glutamicum se muestra en la Fig. 10.8. El primer paso clave de la vía metabólica, aspartato de aspartil fosfato, catalizada por aspartoquinasa, se controla a través de la inhibición de realimentación por dos productos finales de esta vía ramificado, lisina y treonina. Homoserina deshidrogenasa actividad nase también está sujeto a inhibición por retroalimentación mediante treonina y represión por la metionina. Sin embargo, la sintetasa dihydropicolinate no es inhibida por la acumulación de lisina, que es inusual para las primeras enzimas siguientes al punto de una vía de rama. Las cepas más productoras de C. glutamicum seleccionados para la producción de lisina tienen defectos en estos mecanismos de control de retroalimentación. Carecen de homoserina deshidrogenasa

Represión Inhibición * Insensible a la lisina

actividad y por tanto son auxótrofos homoserina. Estos auxótrofos convertir todos aspartato semialdehído a LY seno, y debido a la falta de la síntesis de treonina, allí no es control de retroalimentación más largo (véase la Fig. 10.8). Sin embargo, cantidades cuidadosamente medidas de treonina, metionina e isoleucina se deben añadir al medio de cultivo para permitir que esta bacteria auxotrófica a crecer. La mayoría de las fermentaciones comerciales L-lisina funcionan como procesos por lotes en reactores de tanque agitado aireados. Melaza de caña es la fuente de carbono preferida, aunque otros carbohidratos, ácido acético o etanol, se pueden utilizar, a menudo suplementado con hidrolizados de soja. La temperatura se mantiene a 28 ° C y el pH se mantiene a, o cerca de, la neutralidad por la alimentación de amoníaco o urea, que también actúan como una fuente de nitrógeno. El control del nivel de biotina es muy importante, ya que concentraciones por debajo de 30 mg resultado / L en la acumulación de Lglutamato en lugar de L-lisina (ver la producción de ácido L-glutámico arriba). Sin embargo, la melaza de caña por lo general contiene biotina suficiente para cumplir con este requisito. La fase de retardo se acorta mediante el uso de una alta concentración de inóculo, normalmente alrededor de 10% (v / v) del volumen de fermentación. La producción de lisina se inicia en la fase exponencial temprana y continúa a través de la fase estacionaria. Estas fermentaciones duran alrededor de 60 horas y el rendimiento de 4045 g / L de L-lisina de la con- centración de 200 g / L de melaza, que contiene 100 g / l de sacarosa. recuperación de lisina es relativamente simple. Una vez que se han eliminado las células, el medio de fermentación es acidificado a pH 2,0 con ácido clorhídrico y la l-lisina se

oxaloacetato L-Ácido

aspártico

aspartoquinasa

Lsemialdehído

homoserina deshidrogena sa

Ltreonina

sintetasa dihydropicolinate *

L-homoserina

Lmetionina LIso-leucina

aspártico

Llisina

Higo. 10.8Control de la producción de L-lisina en Corynebacterium glutamicum.

adsorbido en una columna de intercambio C. laurenti para convertir los isómeros L del catiónico en forma de amonio. Una solución sustrato a la L-lisina. El isómero D restante de diluida de amoníaco se utiliza para eluir la-amino-caprolactama se pone de nuevo en el lisina de la columna. Este eluato se acidificó y camino Path- producción por una racemasa el producto es finalmente cristalizó como en A. obae (Fig. 10.9b). métodos similares hidrocloruro de l-lisina. también están disponibles para la síntesis de D-aminoácidos, algunos de los cuales son importantes precursores de la cadena lateral MÉTODOS biotransformación ALTERNATIVOS PARA de penicilinas y cefalosporinas semisintéticas, por ejemplo dp- hidroxifenilglicina. LA PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS La producción de L-aminoácidos también se puede realizar mediante la hidrólisis enantioselectiva de precursores racémicas. ácido L-glutámico, por ejemplo, puede producirse a partir de síntesis química dlhidantoína ácido 5-propiónico. Este proceso utiliza Bacillus brevis, que produce la hidantoinasa necesario y da un rendimiento del 90% (Fig. 10.9a). l-lisina también se puede producir a través de un proceso de biotransformación lote de dla-aminocaprolactama, una material de partida barato deriva químicamente a partir de ciclohexano. dlaaminocaprolactama se añade a un recipiente de reacción a una concentración de 100 g / L, junto con la levadura Cryptococcus laurentii y la bacteria Achromobacter obae. El resultado es una conversión casi completa del sustrato a la L-lisina. Este método aprovecha la estereoespecificidad de una hidrolasa que se encuentra en

Ácidos orgánicos Ácido acético Véase el Capítulo 12, la producción de vinagre.

Ácido cítrico El ácido cítrico se usa ampliamente en la industria alimentaria como un agente acidulante y aromatizante en bebidas, confitería y otros alimentos, y en levadura sistemas para productos horneados. Como componente de alimentos, su uso está irrestricto porque tiene estatus GRAS. Este ácido orgánico también tiene muchas aplicaciones no alimentarias. Ellos incluyen papeles en el mantenimiento de los metales en solución para ING electroplat-, como un agente limpiador y 'decapado' para los metales, y como

(a) L-Ácido glutamico Material de partida: una mezcla racémica de

re-

y Lhidantoína 5-propiónico 2 Lácido glutámico + 2NH3 + 2CO2

hidantoinasa Lhidantoína

+ MARIDO2O 5propiónico

rehidantoína

racemización espontánea en condiciones de fermentación básicas (PH 9,0 a 42ºC)

5-propiónico acid5-propiónico

hidantoinasa + H2O Lhidantoína ácido

(b) Llisina Material de partida: una mezcla racémica de

re-

y L--aminocaprolactam L--aminocaprolactam

L--aminocaprolactam

hidrolasa

2 Llisina -aminocaprolactam hidrolasa

L-

Higo. 10.9La producción de Laminoácidos por biotransformación.

re--aminocaprolactam

racemasa

L--aminocaprolactam

un reemplazo de los polifosfatos en el detergente indus- tria, junto con varios usos farmacéuticos. Hasta la década de 1920 el ácido cítrico fue preparado principalmente de jugo de limón, pero en 1923, Pfizer comenzó a funcionar un proceso basado en la fermentación en el EE.UU.. El organismo de producción fue el hongo filamentoso Aspergillus niger, un aerobio obligado, que se cultiva en la superficie de cultivo en un medio de sales minerales y sacarosa. Prácticamente toda la producción en todo el mundo ahora se produce por fermentación, que se encuentra principalmente en Europa Occidental, EE.UU. y China. El ácido cítrico se ha convertido en uno de los principales productos de la fermentación del mundo, con una producción anual de más de 550 000 toneladas y un valor cercano a los US $ 800 millones. La demanda de ácido cítrico es todavía plegado in-, en particular para aplicaciones de bebidas. métodos superficiales son ejecutados, pero desde finales de la década de 1940, las fermentaciones sumergidas han convertido en la principal vía de la producción. Muchos microorganismos, INCLUYENDO hongos filamentosos, levaduras y bacterias, se pueden utilizar para producir este metabolito primario. Sin embargo, A. niger sigue siendo predominante como el productor industrial. cepas específicas se han desarrollado para varios tipos de procesos de fermentación, que son capaces de generar altos rendimientos de ácido cítrico, a menudo en exceso de 70% del rendimiento teórico a partir de la fuente de carbono.

Ácido cítrico BIOSÍNTESIS

Las vías metabólicas implicadas en la síntesis de ácido cítrico biotecnología son la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) y el ciclo de Krebs. A. niger también opera la vía del fosfato de pentosa, que puede competir con la glucólisis para unidades de carbono. Las primeras etapas de la formación de ácido cítrico implican la ruptura de las hexosas a piruvato en la glucólisis, seguido por su descarboxilación para producir acetil CoA (Fig. 10,10). Muy importante, el CO2 liberado durante esta reacción no se pierde, pero se recicla por boxylase car- piruvato (producida constitutivamente en Aspergillus) en la

formación de oxaloacetato (anaplerotic otras rutas lerotic anapa oxaloxacetate también son operados; ver Capítulo 3). Normalmente, el oxalacetato en gran medida sería suministrado a través de la terminación del ciclo TCA, al- reanudación bramido de ciclo por condensación con acetil CoA para formar citrato, catalizada por la sintasa de citrato sintetasa. Sin embargo, con el fin de acumular citrato, su metabolismo en sitio Ward (continuación del ciclo) debe ser bloqueada. Esto se consigue mediante la inhibición de la aconitasa, la enzima que cataliza el paso siguiente en el ciclo TCA. la inhibición se logra mediante la eliminación de hierro, un activador de la

hexosas

oxaloacetato

Camino EMP

piruvato

Citrato

aumento directo del flujo a través de la vía principal se puede lograr por la La acetil sobreproducción CoA de las enzimas constituyentes. CO2

Los procesos de fermentación UTILIZADOS EN LA

Higo. 10.10 la biosíntesis de ácido cítrico. TCA Ciclo

aconitasa. En consecuencia, durante la acumulación de citrato, el ciclo TCA es en gran parte inoperante allá de forma- ción de citrato, de ahí la importancia de las rutas anaplerotic de formación de oxaloacetato. métodos de mejora de la cepa convencional y el de la ingeniería genética de los elementos del metabolismo primario en A. niger se están empleando en un esfuerzo para mejorar la producción de ácido cítrico. El objetivo es aumentar el flujo metabólico que conduce directamente a la formación de ácido cıtrico por flujos de ING disminuir a través de las ramas de esta vía, por lo tanto, producir menos subproductos, particularmente el ácido glucónico y ácido oxálico. Utilización de los mutantes que carecen de la glucosa oxidasa, y por lo tanto incapaces de producir ácido glucónico a partir de glucosa, son ejemplos de este enfoque. Alternativamente, un

aconitasa

cis-aconitato

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO

En superficie y en sustrato sólido fermentaciones Estos métodos utilizan una tecnología sencilla y tienen bajo coste de ener- gía, pero son más mano de obra. métodos superficie del líquido implican colocar el medio esterilizado, por lo general contiene la melaza más diversas sales de aluminio, a poca profundidad (5-20 cm de profundidad) o bandejas de acero inoxidable apilados en una sala aséptica. El medio está formulado con niveles relativamente bajos de hierro, de lo contrario el cítrico

rendimiento de ácido se reduce (véase más arriba). Las bandejas se inoculado por pulverización con esporas de A. niger, o bien una suspensión de esporas o esporas secas. Luego el hongo se desarrolla en la superficie del medio. se sopla aire estéril sobre estos cultivos, lo cual es importante para mantener las condiciones aeróbicas, control de temperatura y en la reducción del nivel de CO2. Medio pH cae gradualmente hasta por debajo de 2, en el que comienza punto de la producción de ácido cítrico. A 30 ° C, la fermentación tarda unos 8-12 días para completar y alcanza una productividad de alrededor de 1,0 kg / m3 por día. procesos de fermentación en estado sólido para la producción de ácido cítrico ción son operaciones a pequeña escala. Cada planta genera sólo unos pocos cientos de toneladas por año, y utiliza un medio sólido de salvado de trigo se esterilizó con vapor o residuos de patata dulce que tiene un contenido de humedad del 70-80%. Este puré se inocula con esporas de A. niger y luego se extendió sobre bandejas o un suelo limpio a una profundidad de 3-5 cm. la circulación de aire ayuda a mantener la temperatura a aproximadamente 28 ° C. Este proceso tiene una duración de 5-8 días, después de lo cual se recoge el puré y el citrato es extraído por medio de agua caliente. Varios residuos de procesamiento de alimentos sólidos están siendo uated luación para determinar si ellos también podrían servir como sustratos de bajo costo para la producción de ácido cítrico. Además, se están buscando desarrollos tecnológicos, tales como el uso de reactores de lecho compacto. Los ensayos preliminares han producido altos niveles de ácido cítrico con bajos niveles de biomasa de hongos, ya que estos reactores retardan el crecimiento de hongos y promover una mayor conversión de sustrato a ácido cítrico. procesos sumergidos Más de 80% de la oferta mundial de ácido cítrico se produce utilizando la fermentación por lotes sumergida en tanques agitados de capacidad de 40 a 200 m3 o fermentadores de transporte aéreo más grandes de 200 a 900 m3 de capacidad. Los fermentadores son resistentes a la corrosión, hecho de acero

inoxidable, o acero revestido con vidrio o plástico especial. Estas fermentaciones utilizan sobre todo remolacha o de caña melaza como fuente de carbono. A diferencia de los métodos de superficie, inóculos vegetativo, en lugar de esporas, se utilizan normalmente. En consecuencia, el organismo de cultivo se toma a través de varias etapas de propagación con el fin de generar una cantidad suficiente de inóculo. Inicialmente, las esporas de la cepa de producción de A. niger se producen en un medio sólido y luego se utilizaron para inocular un pequeña escala sumergido fermentación donde la formación de gránulos fúngica se lleva a cabo. cantidades de pellets de hongos estables son luego desarrolladas para la inoculación del fermentador de producción. La estructura de estos gránulos tiene una gran influencia sobre la productividad. Gránulos pequeños de menos de 1 mm de diámetro,

con centros suaves y superficies lisas son las preferidas. Estas propiedades estructurales y su fisiología son fuertemente dependientes de la composición del medio y condiciones de funcionamiento. Pellets que producen altos niveles de ácido cítrico se caracterizan por corto, hifas de bulbo en forma de horquilla. La presencia de niveles incluso bajos de algunos metales pesados, en particular de manganeso, puede ser perjudicial para sedimentar la formación, lo que resulta en hifas que son largas y no ramificado. Por lo tanto, es necesario tratar previamente todas las materias primas para reducir las concentraciones de manganeso por debajo 1.2 mmol / L. niveles de manganeso bajos también limitan la operación de la vía de las pentosas fosfato, que de otro modo desviar el flujo lejos de la glucólisis y reducir la producción de citrato. Alternativamente, los iones de cobre pueden ser añadidos a contrarrestar el manganeso, mediante la prevención de su absorción. los rendimientos de ácido cítrico, también se mejoran mediante la formulación lating el medio con niveles mínimos de hierro. Esto reduce en adelante el metabolismo del citrato, ya que, como se ha mencionado anteriormente, la aconitasa tiene un requisito para el hierro. Además, la adición de cobre más disminuye aconi- actividad tase, ya que actúa como un antagonista de hierro, así como de manganeso. Con el fin de mantener buenos rendimientos de ácido cítrico, azúcar concentraciones de medios de comunicación

deben ser de al menos 140 g / l, que promueve la actividad de ambas enzimas glucolíticas y piruvato carboxilasa. También es importante restringir el crecimiento a través de la limitación de nitrógeno. Esto normalmente se consigue proporcionando sales de amonio a niveles de 0,1 hasta 0,4 g / L. Los iones de amonio también estimulan la producción de ácido cítrico al contrarrestar el efecto inhibidor de citrato en la fosfofructoquinasa, una enzima clave de analysis glicol. Estas fermentaciones son muy aireada y mantenidos a 30 ° C. Para la fase de crecimiento inicial, el pH comienza a 5-7, pero entonces debe mantenerse por debajo de 2, de lo contrario oxálico y ácido glucónico se acumula a expensas del ácido cítrico, es decir, pH bajo inhibe la glucosa oxidasa. Los rendimientos globales de 0,7-0,9 g de citrato por gramo de glucosa pueden ser ATcontenida en estas fermentaciones sumergidas con actividades productivas de hasta 18,0 kg / m3 por día. Los volúmenes más pequeños de ácido cítrico también se producen utilizando levaduras tales como Candida guilliermondii y Yarrowia (anteriormente Candida) lipolytica. Estas levaduras están libres de problemas con iones metálicos, y proporcionan fermentaciones más cortos y más productivas que las actualmente disponibles con A. niger.

Ácido cítrico RECUPERACIÓN

La recuperación de ácido cítrico comienza con la eliminación de micelio fúngico del medio de cultivo. además tica

filtración Ishing puede ser necesario para eliminar el micelio residual y oxalato precipitado. La solución clarificada resultante se calienta y se añade cal (CaO) para formar un precipitado de citrato de calcio. Este es separado por la filtración y se trató con ácido sulfúrico para generar ácido cítrico y un precipitado de sulfato de calcio (yeso). Después de la filtración, la solución de ácido cítrico diluido es de- coloreada con carbón activado y se evaporó para pro- ducir cristales de ácido cítrico. Estos cristales se recuperaron por centrifugación, después se secan y se empaquetan. métodos de recuperación alternativos siendo evaluados con el fin de evitar el uso de cal y ácido sulfúrico incluyen extracción con disolventes, extracción de par de iones y la electrodiálisis.

El ácido glucónico El gluconato de calcio y gluconato ferroso son ampliamente utilizados como agentes terapéuticos para el tratamiento de pacientes con deficiencia de calcio y hierro. El ácido libre también se utiliza como un acidulante leve en la industria del curtido. Más de 50 000 toneladas de ácido glucónico se producen cada año utilizando A. niger cultivado en fermentaciones sumergidas en glucosa y licor de maíz fermentado, tanto en virtud de fosfato y nitrógeno limitación ción. Estas fermentaciones muy aeróbicas se llevan a cabo a un pH de 6-7 y 30 ° C. Duran durante 20 horas y alcanzar rendimientos superiores al 90%.

se produce comercialmente mediante cultivo sumergido de terreus o A. itaconicus Aspergillus, a menudo utilizando la melaza y el licor de maíz fermentado, con rendimientos de producto de hasta un 65%. La fermentación de 3 días debe ser altamente aireada y que funciona a una temperatura relativamente alta de 35 a 42 ° C. El ácido itacónico se forma en una rama del ciclo de TCA a través de descarboxilación de cisaconitato (Fig. 10,12), que normalmente es seguido por su oxidación a ácido itatartaric. En adelante el metabolismo del ácido itacónico debe evitarse en las fermentaciones comerciales, de lo contrario el rendimiento es reducirse. Esto se logra mediante la formulación del medio, con altos niveles de iones de calcio, lo cual inhibe la oxidasa del ácido itacónico, que cataliza la oxidación del ácido itacónico a ácido itatartaric.

Ácido láctico El ácido láctico se utiliza principalmente en la industria alimentaria, donde 30 000 toneladas se incorporan en alimentos cada año para actuar como un conservante, un acidulante, o en la preparación de acondicionadores de masa. Sus sales también se utilizan en otras industrias, por ejemplo, lactato de antimonio se utiliza como Dant mor- en el teñido y sodio lactato tiene aplicaciones como un inhibidor de plastificante y la corrosión. El ácido láctico es producido en fermentaciones anaeróbicas pro- 20 000-100 000 L utilizando Lactobacillus delbruckii u otro homoláctica

ácido itacónico Este ácido dicarboxílico se utiliza en la fabricación de adhesives,hexosas productos de papel y textiles. También se incorpora una clasificación en los plásticos como un copolímero con ácido acrílico, acrilato de metilo y estireno (Fig. 10,11). ácido itacónico

CH2 CCOOH CH2

Higo. 10.11 ácido itacónico.

Camino EMP piruvato ácido

COOH

Citrato

ácido CO2 aconitasa

TCA Ciclo

cis-aconitato

ácido

descarboxil asa del ácido aconítico

itacónico oxidasa (Inhibida por iones de calcio)

oxoglutarato

Higo. 10.12 la biosíntesis de ácido itacónico.

bacterias tales como L. bulgaricus. Los medios de comunicación normalmente contienen una fuente de nitrógeno compleja y suplementos vitamínicos, junto con hasta 12% (w / v) de sacarosa o glucosa como fuente de carbono y energía. Alternativamente, la lactosa se puede usar, en forma de permeato de suero. Estos carbohidratos son metabolizados en piruvato a través de la forma Path- EMP, que luego se convierte en l (+) lactato de L-lactato deshidrogenasa (véase el capítulo 3). las de ácido láctico fermentación se hacen funcionar a 45-60 ° C con un pH de 5-6. Duran durante 4-6 días y se puede obtener un rendimiento de más del 90% basada en el azúcar suministrado.

Los polihidroxialcanoatos Los polihidroxialcanoatos (PHA) tienen un considerable potencial como alternativas biodegradables al petróleo como a los plásticos derivados. PHAs son poliésteres termoplásticos homoquirales lineales producidos como reservas de energía intracelulares por numerosos microorganismos. Estos meros biopolyacumulan 0,2-0,7 mm de diámetro cuerpos de inclusión lar granulomas como distintas en respuesta a la limitación de nutrientes, especialmente en las pseudomonas. Los PHAs cados más ampliamente encuen- son poli bhidroxibutirato (PHB) y ácido láctico poli (polyhydroxypropionate), formado a partir de los monómeros de ácido hidroxibutírico y ácido láctico, respectivamente. PHAs son producidos por una vía metabólica distinta que se divide en dos etapas. En primer lugar es la biosíntesis de los monómeros CoA hidroxiacil, seguido por su cabeza a la cola de polimerización para formar las cadenas de polímero, que puede ser superior a 10 000 unidades de longitud. La vía más plenamente caracterizada es que para la biosíntesis de PHB en Ralstonia eutropha (anteriormente Alcaligenes eutrophus). Esto implica tres enzimas: tiolasa cataliza una condensación de Claisen de dos moléculas de acetil CoA para formar acetoacetil CoA, que se reduce a la quiral intermedio CoA R-3-hidroxibutiril por una reductasa. polimerización se lleva a cabo a continuación, por una sintasa PHA (polimerasa).

Las empresas privadas son las más útiles de los plásticos derivados de microbios. Estos polímeros biocompatibles son recursos renovables que puede ser completamente y muy rápidamente biodegradado a dióxido de carbono y agua, proporcionando de este modo ciertas ventajas sobre los plásticos a base de petróleo convencionales. Cuando copolimerizado con droxyvalerate polyhy-, como PHBV, el producto tiene un tiempo de degradación incluso más rápido que el homopolímero. PHBV es producido por Monsanto bajo el nombre comercial Biopol. En muchos aspectos, se asemeja PHB polipropileno; ambos tienen una masa molecular similar, punto de fusión, cristalitos

tallinity y resistencia a la tracción, pero PHB carece de la resistencia al impacto de polipropileno. Los principales obstáculos para el uso generalizado son su alto coste y el hecho de que pueden llegar a ser frágiles con el tiempo. Actualmente, PHBs se utilizan en aplicaciones biomédicas y de embalaje, en particular para suturas que se degradan lentamente por las enzimas del cuerpo, materiales de almacenamiento de alimentos y botellas de champú. Los derivados de poli ácido láctico también se han utilizado en la medicina, como plantillas para el crecimiento de tejido y en los plásticos para las articulaciones de reemplazo. R. eutropha se emplea para la producción comercial ción de PHBs como el polímero puede constituir hasta el 90% del peso seco celular. Con el fin de obtener el rendimiento máximo del producto con respecto a la fuente de carbono, mentaciones fer- industriales tienen una fase de crecimiento anterior a la etapa de formación de producto. Este último opera con baja concentración de oxígeno y de nitrógeno limitada, fosfato, magnesio o sulfato. En la actualidad, los comandos de PHB un precio relativamente alto de US $ 15-30 / kg. En consecuencia, se están buscando medios más baratos de producción. PHAs ahora pueden ser sintetizados por microorganismos recombinantes, por ejemplo E. coli, que con- tienen los genes que codifican las enzimas necesarias para la biosíntesis de PHA. Tales recombinantes microbianos pueden convertirse en una fuente económicamente atractiva de PHAs.

De manera alternativa, la transformación de una planta superior con estos genes podría proporcionar un medio incluso más barato de la producción de PHA en el largo plazo. huéspedes transgénicos probables incluyen Arabidopsis thaliana (berro de Thale), Brassica napus (Canola / aceite de semilla de violación) o Zea mays (maíz).

alcoholes polivalentes levaduras producir varios alcoholes polivalentes, incluyendo glicerol, arabitol, eritritol, manitol y xilitol. El xilitol se ha ido extendiendo como un edulcorante bajo en calorías y es particularmente útil para endulzar productos alimenticios para los diabéticos. Puede ser producido por las levaduras de fermentación de pentosa, especies de Candida, Pachysolen tannophilus y Pichia stipitis (ver pág. 147, la producción de etanol industrial). El glicerol tiene las organizaciones médicas, alimentos y aplicaciones industriales como plastificante, disolvente y edulcorante. Probablemente el más importante comercialmente es su papel como materia prima para la fabricación de explosivos. la producción de glicerol microbiana se observó por primera vez por Louis Pasteur, que descubrió que en las fermentaciones de vino y cerveza, levaduras forman aproximadamente 2,5 g por cada 100 g de azúcares fer- mentado. Por lo tanto, el glicerol es normalmente sólo un producto de fermentación menor de cualquier fermentación alcohólica de levadura.

A principios del siglo 20, Neuburg descubrió que contienen grupos O-acetilo. Estos importantes que la acumulación de glicerol polímeros están formados por especies de podría ser en gran medida Enhanced fijando Pseudomonas y Azotobacter Vin landii. Se el acetaldehído formado durante la pueden usar como agentes de encolado en la fermentación mediante la adición de bisulfito. industria del papel y textiles, o como Esto suprime la reducción de acetaldehído a estabilizadores de alimentos. etanol por alcohol deshidrogenasa, que es el 2 Celulosa, Un glucano b-1,4, formada como una último paso en la vía de la fermentación película por cepas de la bacteria del ácido alcohólica de levaduras y normalmente Acetobacter xylinum acético. Este material funciona para oxidar NADH. Como resultado, puede ser producido en superficie o cultivo la levadura es "forzado" para volver a generar sumergido y tiene varios usos potenciales. NAD a través de una ruta alternativa, si no se Estos incluyen aplicación como un ingrediente detiene la vía de EMP. Una vía alternativa alimentario, como piel artificial temporal para la dación NADH oxidasa es a través de la después de la cirugía o quemaduras en la piel reducción de la dihidroxiacetona fosfato y las membranas acústicas. (DAP), un producto anterior de la manera 3 La quitina, Un polímero de residuos de Nacetilglucosamina, y su derivado desacilado, Path- EMP. DAP se reduce a glicerol 3-fosfato y quitosano, son componentes de pared celular luego en glicerol. de hongos. Preparación profesional de estos NADH + H+ polímeros se encuentra actualmente a partir de desechos de mariscos, pero en el SALTO Æ glicero futuro que pueden purificarse más fácilmente a partir de hongos NAD+ l haciendo realidad. exopolisacáridos ææææææÆ 3 AEAEÆ glicerol -fosfato microbianos están empezando a + PAGyo reemplazar tradicional de plantas superior y polisacáridos de algas Como resultado, un «orientó 'fue desarrollado proceso de fermentación (almidón, alginato, carragenano, goma industrial, donde 4% (w / v) de bisulfito de árabe, goma de algarroba, goma guar, sodio se incorpora en un medio de etc.) como espesantes y estabilizadores fermentación compuesto de 10% (w / v) de en numerosas aplicaciones alimentarias sacarosa, 0,5% (w / v) de nitrato de amonio y y no alimentarias. Esto es debido a su 0.075% (w / v) de fosfato de potasio. El medio creciente propiedades variadas y se inoculó con 1% (v / v) S. cerevisiae y se novedosas disponibilidad, facilidad de mantuvo a 30 ° C durante 48 a 60 h para dar producción y la rentabilidad. La gama rendimientos de 20 a 25% (v / v) de glicerol. de la pared celular y ex Estos métodos de fermentación se utilizan opolysaccharides incluye lo siguiente. ampliamente hasta mediados de la década de 1 Los alginatos, Que son 1940, pero por lo general se prefiere la heteropolımeros lineales de ácido síntesis química actualmente. gulurónico l- y ácido D-manurónico, algunas unidades de

exopolisacáridos microbianos Una amplia gama de microorganismos producir sacáridos exopolysac- en forma de cápsulas discretas o lodos solubles situados fuera de la célula. Estos son o bien homopolymers o heteropolımeros y tienen varias funciones. Pueden proteger el microorganismo contra la desecación, ayudará en la evasión del sistema inmune para los patógenos de origen animal, actuar como una barrera para virus y agentes químicos, el apego ayudas a las superficies, y las reservas de carbono y energía vide pro. Su pronóstico potencial comercial ahora se está

paredes celulares. Estos polímeros pueden ser Pseudomonas elodea) en las fermentaciones realizados en fibras para hacer vendajes para aeróbicas. Este polisacárido es capaz de heridas y también tienen usos que agentes formar geles que muestran diferentes quelantes, agentes clarificantes y conservantes de propiedades dependiendo de si está en forma alimentos. sustituido o no sustituido. El polisacárido 4 curdlan, Un glucano b-1,3 de especies de nativo de forma geles elásticos, mientras que Alcaligenes desacilado mediante tratamiento alcalino y Agrobacterium. Este polisacárido es capaz de produce geles frágiles y tiene aplicaciones formar un gel irreversible duro cuando se calienta separadas. Gellan se utiliza sobre todo como en una suspensión acuosa en un amplio intervalo de un reemplazo para el agar polímeros de algas pH de 2,0 a 9,5. Curd- lan se fabrica en Japón, y carragenina, en particular en aplicaciones donde se utiliza en diversas preparaciones alimentarias. alimenticias. Sin embargo, actualmente no se 7 glicanos y phosphomannans son componentes acepta como un ingrediente alimentario, ya sea en de las paredes celulares de levadura. Glicanos los EE.UU. o la UE. de S. cerevisiae tienen varios usos en 5 dextranos son glucanos ramificados cortos que alimentos, productos farmacéuticos y contienen a- 1,6 enlaces glucosídicos y un 1,3 cosméticos. aplicaciones en alimentos puntos de ramificación. Son producidas por varios específicos incluyen papeles como microorganismos, incluyendo espesantes, sustitutos de grasa y como Leuconostoc mesenteroides, Y se utilizan como suplementos alimenticios para animales. suplementos plasma sanguíneo y adsorbentes. glicano de levadura también se pueden usar 6 gellan goma (E418) es un heteropolímero que en cosméticos reparación de la piel, contiene glucosa, ramnosa y ácido glucurónico en tratamientos de colesterol re- ducción, la una proporción de 2: 1: 1, producido por cicatrización de heridas, adyuvantes de Sphingomonas paucimobilis (merly forvacunas,

y como un inmunoestimulante en la salud animal y humana. Phosphomannans son gomas solubles en agua que pueden ser obtenidos a partir de Hansenula y Pichia. Éstos sobre- HiBit varias propiedades interesantes y son resistentes al ataque microbiano. 8 pululano, Un lineal a-1,4 glucano con un 1,6vínculos cada tercera o cuarta unidad de glucosa, se produce por el hongo pullulans Aurobasidium semejantes a las levaduras. Este material tiene propiedades de formación de capas y adhesivos que se utilizan en la producción de película de envoltura para alimentos. 9 escleroglucano es un glucano b-1,3, con ocasionales b-1,6 puntos de ramificación, producidas por hongos como Sclerotium glucanicum. Exhibe pseudoplasticidad y se utiliza en pinturas, tintas y lodos de perforación. Varios otros polisacáridos gelificantes, que exhiben características novedosas, han sido aislados de diversos microorganismos. Ellos incluyen polisacáridos que el gel en asociación con cationes monovalentes o divalentes, tales como gel de Enterobacter XM6, beijeran de Azotobacter Beijerinckia, un polímero a partir de un mutante de Rhizobium meliloti y heteropolímero S-53 a partir de Klebsiella pneumoniae. Modificación de polisacáridos microbianos, para alterar su funcionalidad, puede aumentar aún más su gama de aplicaciones. Esto se puede conseguir por tratamiento químico y enzimático del polisacárido, o por medio de ingeniería genética del organismo productor.

La goma de xantano Con mucho, el ejemplo de mayor éxito comercial de un

exopolisacárido microbiano es goma de xantano, que es producida por especies de Xanthomonas, por ejemplo, X. campestris, X. carotae, X. malvacearum y X. phaseoli. estos bacteriemia teria son pequeñas varillas, móviles, aerobios Gram-negativos que producen pigmentos amarillos. Muchos son los fitopatógenos, incluyendo X. campestris, las especies utilizadas para la producción comer- cial de xantana, que causa enfermedades de la coliflor, las coles y nabos. Gran parte del trabajo original sobre xantana se llevó a cabo en el Departamento de Northern Regional Research Laboratory Agricultura de Estados Unidos a finales de 1950 y la producción comercial se inició en 1961 por Kelco. La aprobación para uso alimentario fue determinado por la FDA en 1969 y el polisacárido ahora tiene estatus GRAS. En la UE, xantana se clasifica como espesante E415. Xantano es un peso molecular alto eropolymer helicoidal Het- de 1,0-2,0 ¥ 106 Da, compuesto de glucosa d-,, ácido Dglucurónico d-manosa (en una relación molar de 2: 2: 1, respectivamente). unidades de Dglucosa son b-1,4-ligado y formar la columna vertebral de la molécula, que es similar a la celulosa. Las ramas de polímero regularmente como unidades de glucosa alternos de la cadena principal están unidos a una cadena lateral de trisacárido, que consta de admanosa, ácido D-glucurónico b- y otro admanosa en la posición terminal (Fig. 10,13). Sin embargo, puede haber variaciones en los sustituyentes de estas cadenas laterales, que pueden afectar diversas propiedades del polímero. El piruvato puede estar presente en la unidad de manosa terminal y la manosa Internal puede ser O-acetilado. thans xancomerciales tienen un grado de sustitución de 30 a 40% de piruvato y 60 a 70% para el acetato. Las diferencias

CH2Ohio

CH2Ohio O Glucosa columna vertebral

O

Ohio O METRO + = Na, K, 1 / 2Ca

CH2OCCH3 O Ohio HO

O

Ohio Ohio O

O

ARRULLO - METRO O O COO -+ M

Higo. 10.13La unidad de pentasacárido de goma xantana repetir.

Ohio O CH2 O

do

OH OH

CH3 O

O

Ohio

+

dependerá de la cepa de X. campestris utilizado para la producción y la composición del medio de crecimiento. Encías con Abrecadenas laterales viated, formados por mutantes de X. campestris, exhiben propiedades físicas muy diferentes de los producidos por la bacteria de tipo salvaje. Diversas aplicaciones industriales se basan en la capacidad de la goma de xantano para disolver en agua caliente o en frío y el rendimiento de alta viscosidad, incluso a concentraciones tan bajas como 0,05% (w / v). Soluciones de xantano tienen una viscosidad más alta que otras gomas en la misma concentración. A una concentración de polímero de 1% (w / v) en 1% (w / v) de solución de cloruro de potasio, los valores de viscosidad de la goma de xantano, goma guar, carboximetilcelulosa y alginato son 11 300, 4000, 410 y 210 mPa s, respectivamente. Además cionales características clave incluyen: translucidez de xan- que las soluciones; compatibilidad con ácidos, bases y sales; la estabilidad a temperatura ambiente; y el comportamiento reológico pseudoplástico, es decir, soluciones de xantano recuperar la viscosidad después del cizallamiento. Xantana también interactúa ticamente sinérgica con otros polímeros. Por ejemplo, se puede formar geles termorreversibles en combinación con nans galactoman- o glucomananos, mientras que ni el componente gel solo. Aproximadamente el 60% de la de xantano producido se utiliza en aplicaciones no alimentarias. Estos incluyen el uso como un estabilizador para emulsiones de pintura, un vehículo de fertilizantes y herbicidas, un espesante para colorantes textiles, un lubricante de perforación

revestimientos de arcilla de peralte y de recuperación para terciaria en la industria del petróleo, y en de papel de alta calidad. Xantana también ayuda al flujo de pastas, por ejemplo, facilita el flujo de pasta de dientes de los contenedores, pero se recupera la viscosidad después de la eliminación de la fuerza de corte. Aplicaciones alimentarias implican papeles como un espesante, un adhesivo, un aglutinante en películas y recubrimientos, un agente emulsionante y un estabilizante (Tabla 10.5). Xantana también puede ayudar a la rápida liberación de sabor y proporciona buenas características de sabor de boca ''. Actualmente, xantana tiene casi una cuarta parte del mercado estadounidense para los espesantes de alimentos. Sin embargo, el uso generalizado de xantano es algo restringida debido a su coste relativamente alto de US $ 20-25 / kg, en comparación con el almidón o algunos polímeros sintéticos. Sin embargo, su precio es similar a la de otras gomas con funcionalidades comparables.

PRODUCCIÓN XANTANA

Aproximadamente 20 000 toneladas de xantana se producen cada año. La producción está influenciada por varios factores, tales como el tipo de reactor utilizado, el modo de operación, la composición del medio y las condiciones operativas. Oxi suministro de gen, normalmente de 1 volumen de aire por volumen de reactor por minuto (vvm), es particularmente importante, pero su mantenimiento no es sencillo. Como xantano es sintetizado durante la fermentación, la viscosidad de la

Espesamiento agentJams, salsas, jarabes y rellenos de pasteles

FunctionApplication AdhesiveIcing y Unión agentPet CoatingConfectionery emulsionante agente La encapsulación Película formationProtective de embutidos Espuma stabilizerBeer StabilizerIce ensaladas Hinchazón agente sinéresis inhibitorCheeses, congelado

esmaltes alimentos aderezos para ensaladas sabores en polvo recubrimientos, envolturas crema, aderezos para productos cárnicos procesados alimentos

mezclas de xantanogalactomananos sinérgicos La formación de gel y el gel stabilizationIce crema

Queso y cre de queso g Postre batidos de y bebidas

Viscosidad controlIce

lácteas pudines y rellenos de pasteles crema sopas instantáneas chocolate batidos de leche bebidas

Tabla 10.5 El papel de la goma de xantano en los alimentos

aumenta medianas, lo que impide la mezcla y conduce a la reducción de las tasas de transferencia de oxígeno. En consecuencia, el diseño del fermentador, la velocidad de agitación y el caudal de aire son factores clave. sistemas de fermentación de alimentación por lotes se utilizan principalmente, pero de xantano también se pueden producir en procesos continuos, a menudo bajo limitación de nitrógeno con tasas de dilución de 0,025 a 0,05 / h. Esto ofrece la ventaja de altos rendimientos y menores costos de operación. Normalización de las condiciones fisiológicas también resulta en un producto más uniforme. Sin embargo, las operaciones continuas pueden sufrir de problemas de aireación y la contaminación microbiana. X. campestris pueden utilizar varias fuentes de carbono, inINCLUYENDO almidón, hidrolizados de almidón, jarabe de maíz, melaza, glucosa y sacarosa. Otros sustratos aceptables y más baratos son de suero, hidrolizados de granos de cereales y almidón de maíz seco molido. Las características de la xantana producido, en particular su peso molecular y las propiedades reológicas, se ven influidas por la composición de los sustratos utilizados. Inicialmente, la bacteria se cultiva en un medio de propagación rico para construir el inóculo en un fermentador de escala piloto al. Esta cultura de entonces utilizó para inocular fermentadores agitados mecánicamente a escala industrial de 50-200 m3 de capacidad. Los medios de producción normalmente contienen: 1 una fuente de carbono, comúnmente dglucosa, sacarosa, almidón o almidón hidrolizado en 30-40 g / L; 2 una fuente de nitrógeno: la caseína o soja hidrolizado de soja, sales de amonio, peptona, licor de maceración de maíz, levadura extracto o urea. Los mejores rendimientos de productos se obtienen con una relación carbono: nitrógeno de aproximadamente 10: 1; 3 MgCl2 y otras sales de trazas; y 4 K2HPO4 como un amortiguador. En el modo de alimentación por lotes, la fermentación es por lo general mantiene a 28-30 ° C y pH 7,0; Si se permite que el pH a caer disminuye la producción de goma rápidamente. La bacteria comienza a producir xantano durante la fase exponencial a tasas

en relación con la tasa de crecimiento y la producción continúa en la fase estacionaria. Estas las fermentaciones se realizan normalmente en un plazo de 3 días. Una concentración final de 25 g / L es la normalmente mínimo requerido para que el proceso sea económicamente viable, pero la mayoría de las fermentaciones industriales alcanzar hasta 50 g / L. Al final de la fermentación, el caldo se calienta a 100-110 ° C durante 10 min para matar las bacterias y mejorar las propiedades reológicas de la xantana. Esto va seguido de una serie de etapas de purificación que se define por el uso final del polímero (Fig. 10,14). Para algunas aplicaciones es necesario para eliminar las células mediante filtración o centrifugación. El xantano se precipita con metanol, isopropanol o (especialmente en la preparación de

Xanthomonas campestris cultura

Inóculo acumulación

depósito de semillas 5% (v / v) de inóculo Fermentación

pasteurización caldo completo

producto de calidad alimentaria), y después se separa por centrifugación. Más de 50% de los costes de producción se in- pada por estas etapas de procesamiento aguas abajo y que es esencial que se recupera el disolvente. El producto se deshidrata, de tambor o secado por pulverización, se muele, se tamiza y finalmente empaquetado como un polvo granulado dispersable.

Bioemulsans

Bioemulsans son proteínas anfipáticas y polisacáridos que poseen propiedades tanto hidrófilas hidrófobas dentro de la misma recuperación de disolvente de caldo e pasado molécula. Tales compuestos son capaces de La centrifugación o filtración para la recuperación de goma estabilizar emulsiones de aceite-en-agua. Son exopolímeros producidos por una amplia gama de microorganismos, hacia el final de Tambor o secado por pulverización su fase de crecimiento. Sin embargo, su papel in vivo no han sido completamente aclarada. Los ejemplos incluyen RAG-1 emulsano Molienda producido por el aceite bacteria Acinetobacter calcoaceticus degradantes. Este bioemulsan, a diferencia de la mayoría de los otros, contiene Embalaje ácidos grasos de cadena larga hidrófobos unidos covalentemente a un Higo. 10.14la producción de goma de xantano. heteropolisacárido aniónico. Bioemulsans tienen aplicaciones potenciales en muchos precipitación con disolvente Gum

industrias, incluyendo la fabricación de alimentos, pintura, textiles, cosméticos y productos farmacéuticos. Un bioemulsan polisacárido de Candida utilis, una levadura de calidad alimentaria, tiene promesa obvia por sus papeles en la fabricación de alimentos. Estos polímeros tienen varias ventajas sobre los emulsionantes sintéticos de bajo peso molecular que se utilizan actualmente en la industria, ya que forman emulsiones muy estables y son biodegradables, pero son relativamente caros. Sin em- bargo, se prevé que lleguen a ser utilizado cada vez más como proceso de deformación y mejoras conducen a mayores rendimientos que debería reducir considerablemente los costos de producción.

Otras lecturas Papeles y comentarios Amore, R., Kötter, P., Küster, Ciriacy, M. & Hollenberg, CP (1991) Clonación y expresión en Saccharomyces cerevisiae de la NAD (P) Hdependiente gen xilosa reductasa de codificación (XYL1) de la levadura xilosa asimilar, Pichia stipitis. Gen 109, 89-97. Anderson, AJ y Dawes, EA (1992) Ocurrencia, el metabolismo, las funciones metabólicas y usos industriales de polyalkanoates bacterianas. Microbiological Reviews 54, 450-472. Awang, GM, Jones, GA y Ingledew, WM (1988) La fermentación acetona-butanol. Critical Reviews in Microbiología 15 (Suplemento 1), S33-S67. Dahn, KM, Davis, BP, Pittman, PE, Kenealy, WR y Jeffries, TW (1996) Aumento de la actividad xilosa reductasa en la xilosa de fermentación de la levadura Pichia stipitis por la sobreexpresión de XYL1. Bioquímica y Biotecnología Aplicada 57/58, 267-276. Daniell, H. & Guda, C. (1997) producción de biopolímeros en microorganismos y plantas. Química e Industria, el 21 de julio de 1997 (núm. 14), 555. Jeffries, TW y Kurtzman, CP (1994). la selección de cepas, taxonomía y la genética de las levaduras de fermentación de xilosa-. Enzyme y Microbial Technology 16, 922-932. Kötter, P., Amore, R., Hollenberg, CP & Ciriacy, M. (1990) Aislamiento y caracterización de la Pichia stipitis gen xilitol deshidrogenasa, XYL3, y construcción de un xilosa utilizando Saccharomyces cerevisiae transformante. Current Genética 18, 493-500. Kötter, P. Y Ciriacy, M. (1993) La xilosa fermentación mediante Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology 38, 776-783.

Ladisch, MR (1991) La fermentación derivado de butanol y escenarios para sus usos en aplicaciones relacionadas con la energía. Enzyme y Microbial Technology 13, 280-283. Lovitt, RW, Kim, BH, Shen, G.-J. Y Zeikus, JG (1988) la producción de solventes por microorganismos. CRC puntos de vista crítico Re- en Biotecnología 7, 107-186. Lynd, LR (1996) Descripción y evaluación de etanol combustible a partir de biomasa celulósica: la tecnología, la economía, el ambiente

Ambiente y la política. Revisión Anual de Energía y el entorno de 21, 403-465. Qureshi, N. y Maddox, ES (1995) Producción continua de acetona-butanol-etanol utilizando células inmovilizadas de Clostridium acetobutylicum e integrado con retirada del producto por extracción líquido-líquido. Diario de la fermentación Bioingeniería 2, 185-189. Roberts, ES (1996) La bioquímica y genética de la producción de polisacárido capsular en bacterias. Revisión Anual de Microbiología 50, 285-315. Rosenberg, E. & Ron, EZ (1997) Bioemulsan: emulsionantes poliméricos microbianas. CRC Critical Reviews in biotecnología gía 8, 313-316. Sahm, H., Eggeling, L., Eikmanns, R. & Kraemer, R. (1995) diseño metabólico en aminoácidos bacteria productora de Corynebacterium glutamicum. FEMS Microbiology Research vistas 16, 243-252. Sutherland, IW S (1998) Novela y aplicaciones establecidas de polisacáridos microbianos. Trends in Biotechnology 16, 41-46. Madriguera, RAJ (1996) Microbiana hidrólisis de los polisacáridos. Revisión Anual de Microbiología 50, 183-212. Ronchas, AE, Bajo, LC, Alves, DMG y Amorim, Y. (1999). etanol combustible después de 25 años. Trends in Biotechnology 17, 482-487. Madera, DR (1995) La ingeniería genética de la producción de solventes microbiana. Trends in Biotechnology 13, 259-264.

Libros

Bennett, JW y Klich, MA (eds) (1992) Aspergillus Biología y Aplicaciones Industriales. Butterworth-Heinemann, Boston. Crueger, W. Y Crueger, A. (1990) Biotecnología: Un libro de texto de Microbiología Industrial, 2ª edición. Sinauer AssociatesSunderland, Massachusetts. Demain, AL, Davies, JE y Atlas, RM (1999) Manual de Microbiología Industrial y Biotecnología. Sociedad Americana de Microbiología, Washington DC. Ericksson, K.-E. (Ed.) (1997) Los avances en bioquímica Engineering 17: Biotecnología en la industria de pulpa y papel. Springer-Verlag, New York. Finkelstein, M. & Davison, BH (eds) (2000) Vigésimo Primer Simposio de Biotecnología de combustibles y productos químicos. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Glazer, AN y Nikaido, H. (1995) Biotecnología Microbiana. WH Freeman, Nueva York. Nagodawithana, T. y Reed, G. (eds) (1993) Las enzimas de procesamiento de comida, 3ª edición. Academic Press, San Diego. Columpios, JG y Civerolo, EL (1993) Xanthomonas. Chapman & Hall, Londres. tumbas, M. & Harding, SE (1998) Introducción a la poli- sacárido Biotecnología. Taylor & Francis, Londres. Fatigar, GA & Woods, LFJ (1995) Las enzimas en el procesamiento de ali- mentos, 2ª edición. Blackie Academic and Professional (una impresión de Chapman & Hall, ahora Aspen Publishers), Londres.

11 salud

Productos para el cuidado de la

Los antibióticos son probablemente el grupo más importante de compuestos sintetizados por microorganismos industriales. Ellos no se producen en la mayor cantidad, ni son los más valiosos económicamente. Sin embargo, durante los últimos 60 años su influencia en la mejora de la salud humana ha sido inmensa. Los otros importantes productos para el cuidado de la salud derivados de las fermentaciones y / o biotransformación microbiana son alcaloides, esteroides, toxinas y vacunas; junto con las vitaminas (véase el Capítulo 13), ciertas enzimas (véase el capítulo 9) y preparaciones de células microbianas viables utilizados como probióticos (véase el Capítulo 12). Ade- más, las técnicas de ingeniería genética han hecho posible que los microorganismos producen una amplia variedad de proteínas de mamíferos y péptidos que tienen diversas propiedades terapéuticas. Aquellos de gran importancia médica y con mercados establecidos incluyen insulina, interferones, hormona de crecimiento humana y anticuerpos monoclonales (véase el Capítulo 17). Aparte de estos agentes terapéuticos, que se curan o reducir la incidencia de la enfermedad, muchos productos de diagnóstico también se derivan de microorganismos. Estos se utilizan ampliamente para detectar la presencia de diversos estados de salud y enfermedad.

Los antibióticos La mayoría de los antibióticos son metabolitos secundarios producidos por hongos y bacterias filamentosas, en particular los micetos actino-. Bastante más de 4000 antibióticos se han aislado de diversos organismos, pero sólo el 50 se utilizan

regularmente en la quimioterapia antimicrobiana (véase el capítulo 2). Los más conocidos y probablemente los antibióticos más importantes en medicina son los blactámicos, penicilinas y cefalosporinas; junto con aminoglucósidos, tales como la estreptomicina, las tetraciclinas y de amplio espectro (Tabla 11.1). El resto no cumplen con ciertos criterios impor- tante, en particular, su falta de selectividad, toxicidad hibiting ex a seres humanos o animales, o sus altos costos de producción. Algunos antibióticos tienen aplicaciones que no sean de la quimioterapia antimicrobiana. Por ejemplo, actinomicina y mitomicina, producidas por Streptococcus

myces peucetius y S. caepitosus, respectivamente, tienen un papel como agentes antitumorales; y otros antibióticos se utilizan para el control de enfermedades microbianas de plantas de cultivo, o como herramientas en la investigación bioquímica y la biología molecular. Varios antibióticos también se añaden a la alimentación animal como promotores del crecimiento. Sin embargo, las preocupaciones sobre el desarrollo de la resistencia ha hecho que algunos antibióticos, utilizados o destinados a uso humano, pueden ser retirados de su uso en la alimentación animal. Por ejemplo, la Comisión de la UE votó a favor de prohibir la aplicación de bacitracina, espiromicina, tylomycin y virginiamicina como promotores del crecimiento a partir de enero de 1999.

segundolactámicos Más de 100 b-lactámicos, en su mayoría penicilinas y cefalosporinas, han sido aprobados para uso humano, y que representan más de la mitad de los antibióticos producidos en todo el mundo. Este grupo es especialmente útil debido a su amplio margen de seguridad. Se dirigen específicamente la síntesis de

peptidoglicano, un componente de la pared celular bacteriana vital, que no está presente en los organismos del eucarióticas, proporcionando así un alto nivel de selectividad. Inhiben principalmente la reacción de transpeptidación de reticulación, lo que resulta en la formación de doglycan pepti- incompleta, lo que debilita seriamente la estructura de la pared celular bacteriana (véase el capítulo 2, antibióticos, y en el capítulo 3, la síntesis del peptidoglicano).

PENICILINA

La penicilina fue descubierta por Fleming en 1928 después de su famosa observación de una zona circundante inhibitoria ing un contaminante fúngico, Penicillium notatum, en una placa de Staphylococcus aureus. A finales de la década de 1930 Florey, Chain y Heatley caracteriza el inhibidor compuesto responsable, la penicilina, y desarrolló un protocolo que permitió que se produce en una forma pura. El descubrimiento de la penicilina y su posterior caracterización y purificación en última instancia condujo a importantes avances en

165

Tabla 11.1 Ejemplos de antibióticos importantes Antibiótico

organismo productor

Actividad contra

segundolactámicos penicilinas naturales bacterias gramPenicillium chrysogenum La penicilina G (bencilpenicilina) penicilina V (fenoximetilpenicilina) penicilinas semisintéticas Mejora de espectro penicillinsSome Bacilos Gramnegativos Aminopenicilinas ampicilina La amoxicilina hetacilina Penicilinasa-resistentes penicillinsAntistaphylococcal meticilina Cloxacilina dicloxacilina nafcilina oxacilina espectro extendido penicillinsAntipseudomonal carboxipenicilina carbenicilina ticarcilina ureidopenicilin as Azlocilina Mezlocillin Piperacilina cefalosporinas Amplio espectro Cephalospori um acremonium monobactamas Bacterias GramChromobacteri negativo um antibióticos polipeptídicos bacterias grambacitracina Bacillus subtilis positivas polimixina B Bacterias Grampolymyxa Paenibacillus negativo Los macrólidos bacterias gramEritromicina Saccharapolyopora erythraea (antes Streptomyces erythraeus) tilosina bacterias gramStreptomyces fradiae positivas Aminoglycides gentamicina Amplio espectro Micromonospora purpurea Neomicina Amplio espectro Streptomyces fradiae Estreptomicina Bacterias GramStreptomyces griseus negativo Amplio espectro tetraciclinas Streptomyces especies La vancomicina

Streptomyces orientalis

rifamicinas

Amycolatopsis mediterranei (Anteriormente Streptomyces mediterranei)

antibióticos antifúngicos Polienos anfotericin aB nistatina griseofulvina

Streptomyces nodosus Streptomyces noursei Penicillium griseofulvum

bacterias grampositivas Tuberculosis

hongos hongos hongos dermatofitos

Sitio o modo de acción síntesis de la

síntesis de la pared síntesis de la pared síntesis de la pared Membrana celular Síntesis de

Síntesis de proteínas Síntesis de proteínasde Síntesis proteínas Síntesis de proteínas Síntesis de proteínas peptidoglicano la síntesis de ARN

Membrana celular Membrana celular Los microtúbulos

Productos para el la medicina y la tecnología de fermentación. La velocidad de estos desarrollos fue influenciado en gran medida por la necesidad ur- gente para suministrar la penicilina durante la Segunda Guerra Mundial. exposiciones penicilina las propiedades de un metabolito secundario típico, que se forman en o cerca del final del crecimiento exponencial. Su formación depende de la composición del medio y la sobreproducción dramático es posible. Sin embargo, P. notatum, el organismo se encuentra originalmente para producir el antibiótico, genera poco más de 1 mg / L de los cultivos de superficie inicialmente utilizados para la producción de penicilina. Un aumento de 2025 veces en el rendimiento se logró cuando licor de maíz fermentado se incorporó en el medio de fermentación (véase el capítulo 5, las materias primas de fermentación). Este subproducto del procesamiento de maíz CONTIENE diversas fuentes de nitrógeno, junto con los factores de crecimiento y precursores de la cadena lateral, y permanece como un ingrediente principal de la mayoría de los medios de producción de penicilina. Incluso los mayores rendimientos de la penicilina se obtuvieron de una especie estrechamente reRELAClONADAS, Penicillium chrysogenum, que originalmente fue aislado de un melón cantalupo moho. Se lograron nuevos aumentos en el rendimiento cuando la producción de acercó a la fermentación sumergida. Los requisitos de tiempo de guerra para la penicilina estimularon el desarrollo rápido de un sistema de cultivo sumergido a gran escala utilizando reactores de tanque agitado (STR). Cada recipiente se agitó continuamente a través de los impulsores de turbina de eje impulsado verticales y burbujeo de aire incorporado. Estos desarrollos tecnológicos han tenido un impacto importante en el avance de todo el campo de la tecnología de fermentación. Desde la década de 1940, el rendimiento de la penicilina y la productividad de la fermentación se ha mejorado enormemente extensa mutación y selección de cepas productoras. El enfoque tra- dicional para mejorar los rendimientos de penicilina involucrado mutación al azar y selección de cepas que producen altos. mutantes resultantes fueron cultivadas en medio y filtrados de cultivos líquidos se analizaron para determinar la penicilina. Esto era lento y

16 7

laborioso como un gran número de cepas tuvieron que ser probado. Sin embargo, estos métodos fueron la clave para el aumento dramáticamente los rendimientos obtenidos desde el descubrimiento de la penicilina. fermentaciones penicilina ahora rendimientos pro- duce por encima de 50 g / L, un aumento de 50 000 veces a partir de los niveles producidos por primera vez por aislamiento original de Fleming. La contribución de los métodos clásicos de la cepa de Mejora hasta ahora ha sido superior al resto de enfoques, incluyendo las técnicas de manipulación genética, más recientemente disponibles. Estos últimos han contribuido más a nuestra comprensión de los complejos mecanismos de la biosíntesis de la penicilina, en particular la disposición genética de cepas mejoradas, la identificación de los cuellos de botella en

16

Capítulo

la 8 síntesis de la penicilina y la regulación del metabolismo secundario en la sobreproducción de cepas. La estructura básica de las penicilinas es 6-aminopeniácido cillanic (6-APA), compuesto de un anillo de tiazolidina condensado con un anillo b-lactama cuya posición 6-amino lleva una variedad de sustituyentes de acilo (Fig. 2.8). Esta estructura de lactama-tiazolidina b-, sintetizado a partir de La- aminoadipato, Lcistina y L-valina, es común a las penicilinas, cefalosporinas y cefamicinas. En ausencia de agregados precursores de la cadena lateral al medio de fermentación de P. notatum o P. chrysogenum, una mezcla de las penicilinas naturales se obtiene de filtrados de cultivo, en particular, la penicilina G (bencilpenicilina) y el más resistente a los ácidos penicilina V (fenoximetil penicilina). Estas penicilinas son más activos frente a bacterias Gram-positivas. Sin embargo, un papel más amplio para las penicilinas vino del descubrimiento de que diferentes penicilinas biosintéticas pueden formarse por la adición de los precursores de cadena lateral al medio de fermentación y que las penicilinas naturales se pueden modificar químicamente para producir compuestos con características mejoradas. La mayoría de las penicilinas son ahora semisintético (véase más adelante), producida por la modificación química de penicilinas naturales, obtenido por fermentación utilizando cepas de P. chrysogenum. Modificación se logra mediante la eliminación de

su grupo acilo natural, dejando 6-APA, a la que otros grupos acilo se pueden añadir para conferir nuevas propiedades. Estas penicilinas semisintéticas, tales como la meticilina, benicillin car- y ampicilina (véase la Tabla 11.1), exposición variable de mejoras OU, incluyendo la resistencia a los ácidos del estómago para permitir la administración oral, un grado de resistencia a la penicilinasa y una amplia gama de actividad en contra de algunas Gram bacterias gramnegativas. La producción comercial de la penicilina (Fig. 11.1) la producción de penicilina es generalmente a través de un proceso de alimentación por lotes llevado a cabo de forma aséptica en fermentadores de tanque agitado de 40 000200 000 l de capacidad, aunque a veces se utilizan sistemas de transporte aéreo. La fermentación implica una fase de crecimiento vegetativo inicial seguida de la fase de producción de antibióticos. Durante todo el proceso, el nivel de oxígeno es muy importante y debe ser mantenido a 25- 60 mmol / L / h. Sin embargo, esto no es sencillo, por- que la tasa de transferencia de oxígeno está afectada por la viscosidad, que aumenta a medida que la fermentación progresa. Estos procesos se mantienen a 25-27 ° C y pH 6.5 a 7.7, las condiciones específicas dependiendo de la cepa P. chrysogenum utilizado. Diversas fuentes de carbono se han adoptado para penitente

Producción mediumInoculum

desarrollo

Producción de fermentación (Un proceso de alimentación por lotes) aclaración caldo por ejemplo, filtración a vacío rotativo micelio se lavó La extracción con disolventes de caldo libre de células por ejemplo, acetato de amilo purificación del extracto por ejemplo, tratamiento con carbón activado y filtración La cristalización del antibiótico por ejemplo, la adición de acetato de sodio La recuperación de cristales de penicilina por ejemplo, filtración lavado de cristal por ejemplo, lavado con etanol anhidro y filtración secado de cristal por ejemplo, secador de bandejas de vacío tratamiento de penicilina acilasa y la adición de un "nuevo" cadena lateral Natural penicilina

penicilina semisintética

Higo. 11.1 La producción de penicilina.

producción cillin, incluyendo glucosa, lactosa, sacarosa, etanol y aceites vegetales. Sobre 65% de la fuente de carbono se metaboliza para el mantenimiento celular, 25% para el crecimiento y 10% para la producción de penicilina. En el pasado, se ha utilizado una mezcla de glucosa y la lactosa, el primero un buen crecimiento produ- cir, pero pobres rendimientos de penicilina, mientras que el segundo tuvo el efecto contrario. El modo de "alimentación" de una fuente de carbono en particular es de vital importancia, ya que puede influir en la producción de este metabolito secundario (véase el Capítulo 3, el metabolismo secundario). Licor de maíz fermentado todavía se utiliza como una fuente de nitrógeno, nutrientes adicionales y los precursores de cadena lateral. Su naturaleza ácida crea un requisito para el carbonato de calcio (1%, w / v) y un tampón

de fosfato para neutralizar el medio, Por lo mediante la optimización de su pH para la producción de penicilina. nia, sales minerales y amoprecursores específicos de la cadena lateral, por ejemplo, ácido fenil acético o ácido fenoxiacético, también se pueden añadir. Sin embargo, ya que algunos precursores son tóxicos, deben ser alimentados de forma continua a concentraciones no inhibidoras.

el desarrollo del inóculo se inicia generalmente mediante la adición de esporas liofilizadas a un pequeño fermentador a una concentración de 5 ¥ 103 esporas / ml. micelio fúngico puede entonces ser crecido a través de una o dos etapas adicionales hasta que haya suficiente para inocular el fermentador de producción. Inicialmente, hay una fase de crecimiento vegetativo dedicado al desarrollo de la biomasa, que se duplica cada 6 h. Esta alta tasa de crecimiento se mantiene durante los primeros 2 días. Para garantizar un rendimiento óptimo de la penicilina en la siguiente fase de producción, el micelio debe desarrollar gránulos sueltos, en lugar de formas compactas. Durante la fase de producción si- guiente, la fuente de carbono se alimenta a una velocidad y bajos aumentos de la producción de penicilina. Esto continúa durante otros 6-8 días, a condición de que la alimentación de sustrato apropiadas se mantienen. La penicilina se excreta en el medio y se recupera al final de la fermentación. extracción de caldo completo se puede realizar, pero puede conducir a problemas de procesamiento aguas abajo, como materiales adicionales de lixiviación a partir del micelio. Por lo general, la recuperación de la penicilina sigue remoción de micelio usando filtros rotativos de vacío, la eficiencia de los cuales puede verse afectada por la composición del medio de cultivo, en particular de sus componentes proteicos. a continuación, se recuperó el micelio se lava para eliminar la penicilina residual, antes de su uso como alimento para animales o fertilizante.

recuperación de los antibióticos es a menudo por extracción con disolvente del medio libre de células, lo que da rendimientos de hasta el 90%. Este implica la reducción del pH del medio de filtrado a 2,0-2,5 por adición de ácido sulfúrico o fosfórico, seguida por una de dos etapas de extracción continua en contracorriente rápida a 0-3 ° C utilizando acetato de amilo, acetato de butilo o metil isobutil cetona. La baja temperatura es necesaria para reducir el daño a la penicilina, debido al bajo pH. Alternativamente, la extracción de par de iones se puede usar a pH 5-7, en el que la penicilina gama es estable. Cualquier pigmentos y trazas de impurezas se eliminan por tratamiento con carbón acti- vado. La penicilina se recupera entonces del disolvente por adición de sodio o acetato de potasio. Esto reduce la solubilidad de la penicilina y se precipita como una sal de sodio o de potasio. cristales de penicilina resultantes se separan mediante la filtración de vacío rotativo. El disolvente se recuperó de la licor separado y cualquier otro material utilizado, tal como el carbón vegetal, que es muy importante en términos de la economía general del proceso. cristales de penicilina se mezclan con un disolvente volátil, etanol anhidro generalmente, butanol o isopropanol, para eliminar impurezas adicionales. Los cristales se recogieron por filtración y se secó al aire. En esta etapa la penicilina es 99,5% puro. Este producto puede estar más lejos

procesada para formar un producto de calidad farmacéutica o se utiliza en la producción de penicilinas semisintéticas. La producción de penicilinas semisintéticas y cefalosporinas Como se mencionó anteriormente, el objetivo en la producción de penicilina semisintética es generar compuestos con propiedades mejoradas, por ejemplo, estabilidad de ácido, resistencia a la degradación enzimática, más amplio espectro de actividad, etc. (Tabla 11.1). Se trata de la eliminación de la cadena lateral de la penicilina base para formar 6APA. Esto se consigue mediante pasaje a través de una columna de la penicilina inmovilizado acylase, generalmente obtenido a partir de Escherichia coli, a pH neutro. La penicilina G, por ejemplo, se convierte a 6-APA y ácido fenilacético. El 6APA se acila a continuación químicamente con una cadena lateral apropiada para producir una penicilina semisintética. Los rendimientos de las cefalosporinas de fermentaciones directos son mucho más bajos que los de las penicilinas. En consecuencia, como 6-APA también puede servir como un precursor de cefalosporinas, a menudo se utiliza como material de partida para su producción semisintética. A la penicilina natural de la base se convierte a 6-APA, como se describe anteriormente, seguido de su conversión al precursor preferida, el ácido 7amino deace- toxycephalosporic (7-ADCA), por expansión de anillo. Una cadena lateral adecuada a continuación, se puede unir fácilmente.

La aparición de resistencia a los antibióticos El éxito de la penicilina en los mediados de los años 1940 llevó a la búsqueda de otros microorganismos productores de antibióticos. Uno de los primeros éxitos más notables fue el descubrimiento de la estreptomicina de un actinomiceto del suelo, Streptomyces griseus myces. Posteriormente, actinomicetos, especialmente las especies de Streptomyces, han producido la mayor parte de los antibióticos utilizados en medicina clínica hoy (véase la Tabla 11.1). Sin embargo, el creciente desarrollo de cepas bacterianas que presentan resistencia a los antibióticos exige la búsqueda continua de nuevos antibióticos y

agentes alternativos para el tratamiento de enfermedades microbianas. La resistencia a antibióticos no es un fenómeno reciente, se reconoció poco después se introdujeron las penicilinas naturales. El uso de antibióticos crea presión de selección que favorece el crecimiento de los mu- tantes resistentes a los antibióticos, que está promovido por el mal uso y abuso de estos fármacos. Durante los últimos 10 años, la situación ha convertido en alarmante, debido a la aparición de cepas bacterianas patógenas que muestran resistencia múltiple a una amplia gama de antibióticos. Uno de los mas importantes

ejemplos es el desarrollo de múltiples resistentes a cepas de S. aureus. Ciertas cepas, particularmente resistente a la meticilina S. aureus (MRSA) causan infecciones nosocomiales graves (nosocomiales). Son resistentes a prácticamente todos los antibióticos que se utilizan en la quimioterapia antimicrobiana, incluyendo la meticilina, cefalosporinas y otros b-lactámicos, la eritromicina macrólido, y la estreptomicina y antibióticos aminoglucósidos neomicina. El único compuesto que se puede utilizar de manera efectiva contra estos estafilococos es una mayor y potencialmente más tóxico antibiótico, la vancomicina. resistencia incluso a este antibiótico se ha detectado en algunas cepas. Muchos de los genes de resistencia a antibióticos de los estafilococos son llevados en plásmidos que se pueden intercambiar con especies de Bacillus y Estreptococo, proporcionando los medios para la adquisición de nuevos genes y combinaciones de genes. Algunos genes de resistencia se realizan en transposones segmentos de ADN que pueden existir ya sea en el cromosoma o dentro de plásmidos.

alcaloides del ergot Los alcaloides son un grupo diverso de pequeñas que contienen nitrógeno los compuestos orgánicos producidos por ciertas plantas y microorganismos. Muchos son

tóxicos, pero algunos tienen diversas propiedades terapéuticas. Especies de los hongos filamentosos Claviceps, que son patógenos de hierbas, producen una gama de alcaloides (Tabla 11.2). Algunos de los más conocidos son los alcaloides del ergot. Estos compuestos se producen dentro de los esclerocios (fructificación cuerpos) de Claviceps purpurea que se desarrollan de forma natural cuando este organismo infecta el desarrollo de los granos de cereales. granos infectados se convierten en negro y se conocen como ergóticos. Estas estructuras contienen alcaloides de indol, derivados de un sistema de anillo tetracíclico ergolina (Fig. 11.2), que se clasifican en dos grupos. Los miembros del primer grupo se basan en Clavin y no contienen ningún componente peptídico. alcaloides basados en Clavin también son producidas por otros grupos de hongos, incluyendo especies de Aspergillus y Penicillium. Algunos poseen actividad antibiótica y antitumoral, pero pocos son producidos comercialmente. El segundo grupo, a base de ácido lisérgico (LSA) y que contiene un tripéptido o un aminoalcohol, se encuentran solamente en las especies de Claviceps. Los ejemplos incluyen la ergometrina, gocristine ER-, ergosina y ergotamina. Ergotamina, por ejemplo, es un análogo estructural de la serotonina (un neurotransmisor) y se forma a partir LSA por la acción de un péptido sintetasa que añade alanina, prolina y fenilalanina.

Clase de compoundMetabolite

organismo

productor AlkaloidsAgroclavine *

Claviceps

fusiformis ergometrina

`` ``

Tabla 11.2 metabolitos fúngicos con actividad terapéutica

Los antibióticos

cefalosporin as Fusidane griseofulvin a penicilinas

Claviceps paspali Claviceps purpurea `` `` `` `` Acremonium (Cephalosporium) las especies coccineum Fusidium Penicillium griseofulvum Penicillium especies

agente antitumoral agente antiviral

lentinan

Lentinus edodes

Funiculosin

funiculosum Penicillium

inhibidor del colesterol Las enzimas

ácido zaragócico La lactasa

intermedia Sporomiella

hipotensor

ácido fusárico La

Fusarium especies

ácido lisérgico ergocristina ergosina ergotamina

inmunorregulad ores

Kluyveromyces especies Ganoderma cylindrocarpon inflatum Tolypocladium Trichoderma polysporum Aspergillus fumigatus

ciclosporina gliotoxina

* Grupo 1, todos los otros alcaloides de la siguiente lista son grupo 2.

8 97 12 13

10 11

6 NH 5

C.A. 14

15 HN 1

re

dieciséis 4 3 segundo 2

Higo. 11.2 La estructura de ergolina.

Estos alcaloides basados en LSA tienen papeles médicos como analgésicos en el tratamiento de la migraña, como alucinógenos y para el tratamiento de problemas de circulación. Otros tienen usos particulares en obstetricia, para inducir el músculo liso de la contracción del útero durante el parto y después del parto. Anteriormente, los alcaloides se extrajeron de ergots que se desarrollaron en cultivos de cereales infectados, por lo general de centeno, o por síntesis química. La mayoría ahora son producidos por la fermentación de Claviceps fusiformis, C. paspali o C. propósito p ™ rŠa en superficie, inmersión o en cultivo celular inmovilizado. Inóculo para el fermentador de producción puede ser desarrollado a partir de micelio o conidiosporas. El medio de producción contiene un ácido orgánico de la tricarboxílico

ácido ciclo (TCA) y un hidrato de carbono, tal como citrato y sacarosa, la combinación específica dependiendo del alcaloide de destino. En etapas posteriores, lates el ácido orgánico estimulación del cambio metabólico necesario del ciclo de Krebs con el ciclo del glioxilato. producción de alcaloides, como la de muchos metabolitos secundarios, exhibe la regulación de fosfato. La síntesis se retrasa hasta que el fosfato medio se ha utilizado durante el trophophase y la cultura entra en el idiophase. Sin embargo, la inhibición de fosfato se puede superar mediante la adición de trypto- Phan o un análogo de triptófano, que actúan como inductores y precursores.

biotransformaciones esteroides El uso de microorganismos en la biotransformación de compuestos ha sido particularmente exitoso en la fabricación de esteroides terapéuticos que se utilizan para el tratamiento de alergias, inflamación, enfermedades de la piel y los anticonceptivos orales como (Tabla 11.3). Inicialmente, fueron preparados por extracción a partir de tejidos animales o por medio de síntesis química com- plex, las cuales fueron extremadamente costoso. Muchos esteroides se fabrican ahora mediante una combinación de pasos de transformación químicos y microbianos. Estos procesos emplean esteroles relativamente baratos como

Tabla 11.3 Ejemplos de algunos esteroides en cuya elaboración se biotransformación microbiana, y una selección de biotransformaciones específicos (A) Los esteroides Los andrógenos Los corticosteroides Los estrógenos gestágenos

La testosterona La cortisona, hidrocortisona, prednisona y dexametasona Estradiol y estrona Progesterona

(B) La biotransformación 1-deshidrogenación 11 a-hidroxilación 11 b-hidroxilación la escisión de la cadena lateral

SubstrateProduct

Organismo

HydrocortisonePrednisolone Progesterone11 unhidroxiprogesterona compuesto Reichstein SHydrocortisone segundo-sitosterolAndrostadienedione

Arthrobacter Rhizopus nigricans lunata Curvularia Mycobacterium especies

20 18 19 1

10 AB 357 46

2

9

12 1113 do 14

17 dieciséis r 15

8

Higo. 11.3La estructura tetracíclico de un ciclopentanoperhidrofenantreno.

los materiales de partida, a menudo diosgenina extraídos del ñame mexicano (Dioscorea composita), o terol estigmastadienos, un subproducto de la fabricación de aceite de soja. Los microorganismos implicados son en su mayoría hongos filamentosos (especies de Rhizopus, Curvularia, Fusarium y Aspergillus) y micobacterias, en forma de suspensiones o células en crecimiento inmovilizados, las células en reposo, las esporas y extractos libres de células. Realizan reacciones clave para modificar la estructura esteroide básico, un drophenanthrene cyclopentanoperhy-, incluyendo hidroxilaciones en las posiciones 11 y 17 (Fig 11.3.); diversas divisiones de la cadena lateral, hidrogenaciones y deshidrogenaciones; siones y la expansión de anillo, de una de cinco miembros a un anillo de seis miembros. Cuando se usan células vegetativas en vivo para las transformaciones bio esteroides, el

antes de añadir el sustrato, o la biomasa puede ser cosechado para establecer sistemas de columnas inmovilizadas. Los precursores de esteroides son insolubles en agua y deben disolverse en disolventes, por ejemplo metanol, etanol o acetona. Estos disolventes y algunos sustratos son tóxicos. cuencia medio se mantiene tan simple como sea posible con el fin de hacer la purificación más tarde lematical menos probabilidad. los medios de comunicación aún más simples pueden ser formulados para su uso con preparaciones de esporas y hay menos necesidad de antiespumante indeseables, lo que puede afectar de otro modo la extracción de productos. Para las células vegetativas, el cultivo se hace crecer a través de la fase exponencial para obtener la máxima biomasa

guiente, concentraciones de sustrato raramente exceden 2-5 g / L, pero su conversión acerca al 100%. Procesamiento del producto depende de si se acumula dentro de las células o se excreta en el medio. Agua im- disolventes miscibles, cloruro de metileno, generalmente cloruro de etileno o cloroformo, se utilizan para la extracción del producto a partir de extractos de células medianas o aclarados. El producto puede ser purificado adicionalmente si es el producto final, o se utiliza directamente en una etapa adicional de bioconversión si es un compuesto intermedio.

Las vacunas bacterianas Las vacunas bacterianas tempranas consistieron en culturas enteras de bacterias que habían sido inactivados por calor o

formaldehído, pero ahora se pueden dividir en dos categorías, las vacunas y vacunas inactivadas (Tabla 11.4) que viven. vacunas vivos están formados por cepas vivas atenuadas (debilitó) de la cepa virulenta de los padres. formas inactivadas están compuestas de células enteras bacterianas, o un componente celular o producto metabólico (antígeno de la pared celular, antígenos capsulares, toxina, etc.), que ahora pueden ser productos de tecnología de ADN recombinante. toxinas microbianas proteínas pueden servir como vacunas siguiente al de su inactivación con formaldehído o calor para formar toxoides. La vacunación con una vacuna de toxoide antigénico conduce a la generación de antitoxina que neutraliza el efecto farmacológico de la toxina activa. Estas vacunas han tenido éxito contra las bacterias Gram-positivas

Productos para el Las vacunas vivas atenuadas de bacterias Bacillus Anthracis (espora vacuna) Ántrax Brucella abortus S19Brucellosis Salmonela typhi Tifoidea Shigella sonnei La shigelosis

17 3

Tabla 11.4 Ejemplos de vacunas para uso médico y veterinario

vacunas bacterianas inactivadas antígenos capsulares Escherichia coli K88, K99 y 987P La diarrea y la intoxicación alimentaria Neisseria meningitidis UN & CMeningitis Pasteurella multocida pasteurelosis antígenos de la pared de la célula Bordetella tos ferina La tos ferina (pertussis) Salmonela paratyphi Paratifoidea Salmonela typhi Fiebre tifoidea Vibrio cólera Cólera antígenos toxoide Clostridium perfringens Comida envenenada Clostridium tetani Tétanos Corynebacterium difteria Difteria Las vacunas recombinantes Bacteriano Chlamydia speciesChlamydia pélvica) Clostridium tetani Corynebacterium difteria por protozoos Plasmodium vivax Hepatitis viral

ADN vacunas

(enfermedad inflamatoria Tétanos Difteria Malaria segundo El herpes simple Influenza Sarampión (rubéola) Poliomielitis Rabia Malaria

responsable de la difteria, el tétanos y otras enfermedades causadas por especies de Clostridium. vacunas de toxoide similares empleadas para contrarrestar algunas enfermedades bacterianas Gram-negativas han demostrado ser menos eficaz. Sin embargo, sus antígenos de superficie, algunos de los que están implicados en su adhesión a los tejidos epiteliales, se han utilizado para desarrollar vacunas eficaces. Vacuna La producción requiere muy controlado condiciones de funcionamiento y la estricta adhesión a las buenas prácticas de fabricación (véase el capítulo 8). Normalmente implica el crecimiento de cultivos bacterianos en fermentadores sofisticados de alta calidad de por lo general no capacidad mayor de 1000 L. Las

fermentaciones están diseñados para un rendimiento optimizado de antígeno (células o componentes celulares) y de contención, in- Rotatorio la adherencia estricta a los protocolos que pre ventilador de salida de bacteriana en el medio ambiente. Las presiones internas nunca exceden la presión atmosférica, para reducir los riesgos de fuga, y gases de escape de los fermentadores

17

Capítulo

debe pasar 2 a través de filtros esterilizantes, incineradores o ambos. Las fermentaciones para la producción de vacunas basadas en células enteras tienen como objetivo maximizar la producción de biomasa. Para las vacunas de células enteras inactivadas, procesamiento aguas abajo por lo general sigue la inactivación celular mediante tratamiento térmico o la adición de formaldehído. Las células microbianas, inactivados o vivos, se separan después del medio por centrifugación. Todos los equipos de recolección incorpora contención microbiana absoluta y está situado dentro de una habitación mantenida bajo

presión negativa, de modo que nadie se escape está contenido. Las vacunas vivas atenuadas se preparan por lo general como productos liofilizados. Para la producción de vacunas basadas en toxinas o antígenos de superficie (de la pared celular o componentes capsulares), las condiciones de crecimiento se dirigen a producir niveles máximos de estos antígenos celulares específicos. toxinas excretadas y antígenos de superficie débilmente unida que se desprenden en el

medio se purificó a partir del caldo de cultivo clarificado y se descartan de forma segura las células cosechadas. Como se ha mencionado anteriormente, las toxinas son normalmente inactivados por tratamiento con calor o formaldehído para convertirse en toxoides bacterianos que no tienen ninguna toxicidad, pero conservan su ciudad antigeni-. Sin embargo, en algunos casos, en particular Clostridium toxina botulínica, la neurotoxina activo se preparó también para otros usos terapéuticos. Vacuna antígenos para inmunización humana son altamente purificada. Los procedimientos de purificación pueden incluir técnicas cional precipitación con sulfato amónico convencionales y diversas etapas cromatográficas. cromatografía de afinidad se incorpora habitualmente, utilizando anticuerpos específicos como ligandos, preferentemente anticuerpos monoclonales (véase el capítulo 7). Para obtener la máxima eficacia como una vacuna, los antígenos purificados son adsorbidos sobre un adyuvante que incrementa la potencia inmunizante. adyuvantes incluyen sales minerales, tales como hidróxido de aluminio y sulfato de aluminio y potasio, o emulsiones de aceite en agua. Para algunas enfermedades con un número de serotipos, las mezclas de antígenos se usan en la vacuna final. Las preparaciones de vacuna pueden ser inyectados parenteralmente o administrarse por vía oral. formas inactivadas son normalmente inyectan y las vacunas vivas son en su mayoría toman por vía oral es, particularmente las de las enfermedades entéricas. vacunas inyectadas estimulan la producción de anticuerpos en el torrente sanguíneo, mientras que las vacunas orales estimulan la producción local de anticuerpos en la superficie de la mucosa del intestino. vacunas virales anteriormente sólo estaban disponibles a través de la cultura en animales vivos o de tejido animal y culturas celulares. Sin embargo, la ingeniería genética ha permitido la producción de vacunas virales recombinantes a través de la clonación de antígenos virales en un microorganismo huésped adecuado. Por ejemplo, el factor de virulencia de la hepatitis B y la proteína viral del virus de la fiebre aftosa puede ser expresada en E. coli para la producción de vacunas valiosos; vacuna contra la hepatitis B recombinante sola tiene un valor de ventas en todo el mundo más de US $ 1000 millones.

Además, la producción segura de vacunas recombinantes para bacterias patógenas peligrosas es ahora posible, el uso de organismos huésped benignos muy apropiadas para la fermentación a gran escala. Esto tiene la ventaja añadida de que el anfitrión puede ser manipulado para amplificar la producción de antígeno (Tabla 11.4). Algunas bacterias del ácido láctico son huéspedes adecuados y están siendo evaluados para su uso en la inmunización oral. Estas bacterias generalmente se han reconocido como seguro (GRAS) estatus y baja inmunogenicidad, y se pueden utilizar para expresar antígenos, tales como fragmentos de tétanos y la difteria

péptidos terapéuticos recombinantes y proteínas Anteriormente, las proteínas terapéuticas y péptidos de mamíferos pueden ser preparados a partir de fluidos corporales Sues TIS animales o humanas, y, y estaban disponibles en cantidades muy limitadas. Estas preparaciones eran extremadamente costosos de producir, algunos tenían efectos secundarios no deseados, y en ciertos casos no eran desafortunados problemas con virus y contaminación con priones. tecnología del ADN recombinante ha permitido la producción de muchas proteínas terapéuticas recombinantes a partir de diversas fuentes, incluyendo más de 400 proteínas humanas y péptidos con potenciales aplicaciones médicas. En la actualidad, sólo el 10% han recibido la aprobación para su uso por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) (Tabla 11.5). En general, el amplio mercado mundial para los productos farmacéuticos recombinantes vale alrededor de US $ 20 mil millones y está creciendo a un ritmo de más del 10% anual. Sin embargo, el volumen de fermentación para la producción a escala industrial de proteínas terapéuticas humanas es generalmente no mayor de 2.000 a 5.000 L. A diferencia de las vacunas recombinantes, donde es esencial para retener o

toxinas.

mesa 11.5 Los ejemplos de proteínas recombinantes para uso médico anticuerpos factor de necrosis un tejido de anticuerpos (tratamiento de la artritis reumatoide) interferones cáncer y las enfermedades virales interleucinas factores de necrosis de tejido factores de crecimiento transformantes Enfermedades cardiovasculares eritropoyetina (aumenta la proliferación de las células rojas de la sangre) hirudina (inhibidor de trombina a partir de la sanguijuela) uroquinasa (tratamiento trombosis) activador del plasminógeno tisular (coágulo de disolución) hormonas crecimiento humano hormona de la insulina enfermedades neurológicas endorfinas factores de crecimiento nervioso neuropéptidos Las vacunas (también véase la Tabla 11.4) de la fiebre aftosa de la hepatitis B curativas y coagulación de la sangre de la herida factores de factor de crecimiento epidérmico factor de crecimiento de fibroblastos factor de coagulación VIII (tratamiento de la hemofilia)

17 4

Capítulo

incluso aumentar la antigenicidad, estos productos recombinantes terapéutica deben estar libres de antigenicidad.

DNasa La fibrosis quística es una enfermedad genética mortal que implica un mal funcionamiento en el tejido epitelial. Esta condición se caracteriza por la presencia de una mucosidad espesa que se produce en un número de órganos, especialmente los pulmones, donde afecta la respiración y aumenta el riesgo de infección microbiana. Como consecuencia de la infección, que forma parte de la respuesta inmune implica fagocitos que atacan a los microorganismos, que a menudo incluyen Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia (anteriormente Pseudomonas) cepacia, Staphylococcus aureus y Haemophilus influenzae ción. Esto resulta en la liberación de ADN libre de bacterias y fagocitos en los pulmones. El ADN es muy viscosa y espesa aún más el moco. preparaciones DNasa genéticamente modificados están ahora disponibles que pueden ayudar a eliminar estas secreciones mediante la ruptura de las hebras largas de ADN en secciones más pequeñas para reducir la viscosidad del moco. Pulmozyme, una DNasa ingeniería genética desarrollado por Genentech, recibió la aprobación de la FDA de Estados Unidos en 1996. Esta glicoproteína humana 37 000 Da, que consiste en residuos de ácido 260 aminoácidos, se produce en líneas de células de ovario de hámster chino (CHO) y se pueden administrar en un aerosol. Las ventas anuales de este producto se encuentran ahora en más de US $ 110 millones.

La eritropoyetina La eritropoyetina es una hormona de 34 000 Da glicoproteína producida principalmente en los riñones. Es un factor de crecimiento hematopoyético, es decir, un factor de regulación implicados en el control de la producción de eritrocitos de mamíferos en la médula ósea. Sin cantidades suficientes de eritropoyetina, el número de células rojas de la sangre en el cuerpo se reduce drásticamente, dando lugar a anemia. la producción de eritropoyetina nante recombinación ha sido desarrollado utilizando líneas celulares de CHO y de riñón de cría de

hámster (BHK), o células B-linfoblástica humanos (véase el Capítulo 17, cultivo de células animales). Amgen, por ejemplo, ha tenido su producto recombinante, Epogen, en el mercado desde el año 1989. Estos productos se utilizan a menudo para tratar la anemia asociada a enfermedad renal, el cáncer y la infección por el VIH, y ahora tienen un valor de mercado anual de más de US $ 1 mil millones.

la hormona de crecimiento humana (somatotropina) la hormona de crecimiento humana (hGH) es una hormona de proteína que se sintetiza en la glándula pituitaria en la base del cerebro. Esta hormona está implicada en el control del crecimiento y la estatura. Los preparativos de la hGH se utilizan para tratar a los niños con 'enanismo hipofisiario', una enfermedad congénita en la cual la hipófisis no secreta la hGH suficiente para el crecimiento normal. Esta hormona no puede ser ad- ministró por vía oral, pero debe ser inyectada. La dosis estándar es de desde 0,5 hasta 0,9 UI / kg de peso corporal por semana. Además, la hGH tiene valor terapéutico en el tratamiento de una serie de otras enfermedades, en particular los asociados con la edad ing, y en la curación de heridas. Esta hormona es una única cadena de proteína que se sintetiza en el cuerpo como un precursor, prehormona, compuesta de 217 aminoácidos. El prehormona contiene una secuencia señal de 26 aminoácidos que se escinde enzimáticamente para dar la proteína biológicamente activa. Activo de hGH tiene un peso molecular de 21 500 Da y consta de 191 aminoácidos con dos enlaces disulfuro que une las cisteínas en las posiciones 53 y 165, y 182 y 189. La primera aplicación clínica de la hGH para tratar el enanismo fue en 1958, el uso de la hormona extraída de las glándulas tarias pitui- de cadáveres humanos. Su fabricación re- rido casi 40 glándulas pituitarias por paciente y año, y, en consecuencia, el producto era escaso. En 1985 este producto fue

Productos para el

17

retirado del mercado, ya que el uso de estas 5 preparaciones de hGH estaba directamente relacionada con el desarrollo de una encefalopatía humana llamada enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ). El agente causante de la ECJ aún no se conoce con seguridad y se han propuesto al menos dos teorías: un virus no identificado lenta, o una proteína priónica que copurifies con hGH. La teoría del prión consiste en una proteína que cambia la forma conformacionales de otras proteínas, después de lo cual se vuelven resistentes a las proteasas naturales en el cuerpo humano, lo que resulta en la formación de parches mieloides característicos en el tejido cerebral. Un problema similar que sucedió en la década de 1980 cuando los hemofílicos fueron infectados con el VIH, que había copurified con el factor VIII de coagulación de la sangre humana. Ambos problemas ilustran los peligros potenciales de los animales y los productos humanos, y la vital importancia de la caracterización completa de estos productos, especialmente para la presencia de contaminantes. Una búsqueda de fuentes alternativas de la hGH se inició con productos de origen animal, pero bovina y hormonas de crecimiento porcino resultaron ser ineficaces. Mayores cantidades de un suministro más seguro ahora se proporcionan a través

hGH recombinante, que se inició el desarrollo a finales de 1970. Dos empresas, Kabivitrum en Suecia y Genentech en los EE.UU., formaron una empresa conjunta para desarrollar un derivado de ADN recombinante hGH. Sin embargo, en ese tiempo, la producción de productos recombinantes no se SUPUSTOS en Suecia, por lo que el trabajo se llevó a cabo en los EE.UU.. Los sistemas de ADN recombinante original utilizado la secuencia de ADN de la hormona biológicamente activo se inserta en un vector plásmido que se usó para transformar el huésped bacteriano E. coli. La proteína resultante contiene 192 aminoácidos, su aminoácido adicional de ser un N-formylme-

medio de producción

el desarrollo del inóculo (recombinante Escherichia coli)

Producción de fermentación la recolección de células por ejemplo, ultrafiltración

El medio gastado

La centrifugación de células mecánica de

restos celulares descartados

rotura extracto libre de células

tionina situada en el extremo N- (amino) -terminal final de la proteína (es decir, N-formilmetionil-hGH). Este aminoácido se utiliza como el iniciador de la síntesis de proteínas en la mayoría de bacterias. En algunas proteínas en bacterias sintetizados este aminoácido adicional se escinde después de la traducción, pero en este caso no se elimina. Hubo cierta preocupación inicial de que el aminoácido adicional podría ser inmunogénicas y podría causar una Reponse inmune durante las pacientes. Como resultado de ello, se hicieron intentos para desarrollar pasos enzimáticos para eliminar el aminoácido adicional, pero esto resultó difícil. Sin embargo, este producto, N-formilmetionil-hGH, no tenía diferencias clínicas aparentes a la hGH derivada de la pituitaria y Genentech comenzó a comercializar su producto (Protropin) en 1985. Fue la segunda farmacéutica recombinante para ser aprobado para uso clínico después de la insulina recombinante . Un esquema de esquema para la producción de la hGH recombinante se muestra en la Fig. 11.4. Un enfoque alternativo a la producción recombinante de hGH es clonar el prehormona, que contiene 217 aminoácidos, y luego escindir enzimáticamente la secuencia de péptido señal de 26 aminoácidos para proporcionar el producto biológicamente activo. Otros investigadores también han utilizado diferentes huéspedes, incluyendo Bacillus subtilis y P. aeruginosa, que producen producto soluble en el espacio periplásmico. cultivo de células animales a través del ratón y líneas celulares humanas es

también una posible ruta de la producción de la hGH.

Insulina La insulina es una hormona polipeptídica 5808 Da producida en el páncreas por los islotes de Langerhans. Esta hormona está involucrada en la regulación de los niveles de glucosa en sangre, y en el metabolismo de carbohidratos, grasas y almidón. Se compone de dos cadenas de péptidos, una 'A' de la cadena compuesta por 21 aminoácidos y una cadena de 'B' que contiene 30 aminoácidos. La insulina extraída del páncreas de animales bovinos, y particularmente la insulina porcina, ha sido previamente

(Precipitación de ácidos nucleicos con polietilenimina) precipitado descartados tratamiento con sulfato de amonio de sobrenadante

Hormona de crecimiento humana purificada

Higo. 11.4La producción de la hormona de crecimiento humana recombinante.

Recuperación de la fracción de proteína por centrifugación Resuspensión de cromatografía de intercambio de aniones proteína de pellets (Por ejemplo dietilaminoetil celulosa) cromatografía de intercambio catiónico (Por ejemplo, carboximetil celulosa) Sulfato de amonio de recuperación de precipitación y resuspensión de la proteína La filtración en gel (Por ejemplo Sephacryl S200)

utilizado para cumplir con las necesidades de los pacientes diabéticos que sufren de diabetes mellitus insulino-dependiente. Sin embargo, esto ha sido sustituido en parte por la insulina humana recombinante. El producto recombinante fue desarrollado por primera vez por Genentech y comercializado por Eli Lilly como Humulin. Se BE- llegó el primer producto recombinante para ser aprobado para el tratamiento de enfermedades humanas, tras la concesión de una licencia de comercialización por la FDA en 1981. cadenas de insulina A y B fueron clonados por separado y cada host se cultiva de forma independiente. Cada cadena se purifica de su respectivo fermentación y luego se combinan en una etapa de cal químicamente para formar la molécula de insulina completa. Ahí-

producto recombinante es idéntica a la producida por el cuerpo humano. insulina recombinante ya está disponible en E. coli o Saccharomyces cerevisiae.

El interferón El interferón (IFN) es un miembro de las citoquinas, una gran familia de proteínas de señalización pequeños implicados en la regulación de la inmunidad mediada por células, que también incluye interleuquinas (véase abajo), factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonias ( CSF), eritropoyetina (ver arriba) y trombopoyetina. Todos los vertebrados producen una variedad de interferones, y mamíferos, incluyendo seres humanos, producir tres tipos; a, b, g. IFN-a formas se produce Primarschule AIA por los leucocitos y consisten de una sola cadena de polipéptido de 165-166 residuos de aminoácidos. Algunos están glicosilados con cantidades variables de restos de carbohidratos y su masa molecular está en el intervalo de 16 000 a 26 000 Da. La porción de carbohidrato no parece conferir cualquier funcionalidad en IFN-a y

medio de producción

el desarrollo del inóculo (recombinante Escherichia coli)

Producción de fermentación la recolección de células por ejemplo, ultrafiltración

El medio gastado

La centrifugación de células mecánica de

puede ser eliminado sin afectar su actividad. Esta propiedad permite recombinante IFN-a que se produce en sistemas procariotas, tales como E. coli, que no son ca- paz de las modificaciones post-traduccionales necesarias para formar polipéptidos glicosilados (Fig. 11.5). Recombinante IFN-a aprobación recibida de la FDA en 1991 para su uso en el tratamiento de la hepatitis C. Sub- consecuencia, se ha aprobado para el tratamiento de una serie de condiciones, incluyendo la leucemia de células pilosas, leucemia mieloide crónica, cáncer renal, melanoma , mielomas múltiples y las verrugas genitales, y en un aerosol nasal para proporcionar protección contra los resfriados causados por rinovirus. Recombinante IFN-a ahora es fabricado por una serie de empresas, por ejemplo, Hoffmann-La Roche producir Roferon y Schering Plough hacen Intron, que han combinado las ventas de un valor de más de US $ 750 millones. IFNsegundo es, naturalmente, sintetizada por células blásticas fibrosis de mamíferos y puede ser producido de forma recombinante a partir de E. coli. Estos productos, como Betaseron y Rebif, se utilizan en el tratamiento de la esclerosis múltiple recidivante. IFNgramo, A veces referido como el interferón inmune, se produce de forma natural por los linfocitos T activados. Es el interferón más importantes implicados en el sistema inmune, donde activa células T helper (Th1), células asesinas naturales (NK), linfocitos T citotóxicos (CTL) y macrófagos, y también exhibe propiedades antivirales y oncostatic. Preparaciones de IFN-g recombinante a partir de E. coli, Actimmune de Genentech por ejemplo, se utilizan en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica y el cáncer renal.

restos celulares descartados

rotura extracto libre de células (Precipitación de ácidos nucleicos con polietilenimina) precipitado descartados tratamiento con sulfato de amonio de sobrenadante

interleucinas Las interleucinas son también una subclase de las citoquinas.

Recuperación de la fracción de proteína por centrifugación

La diálisis de cromatografía de afinidad de proteína inmunoadsorbente pellet resuspendido (Ligando anticuerpo monoclonal) cromatografía de intercambio catiónico interferón humano purificado

Higo. 11.5 La producción de interferón humano recombinante.

Por lo general son proteínas glicosiladas de cadena simple con masas moleculares de 8000 a 30 000 Da. Hay por lo menos 15 miembros diferentes de la familia de las interleucinas (IL-1-IL15). En 1992, la Chiron Corporation recibió la aprobación de la FDA para una preparación IL2 recombinante, comercializado como Proleukin, que se utiliza en el tratamiento del carcinoma de células renales metastásico. Varias otras interleuquinas presentan un potencial terapéutico y se encuentran en diferentes etapas de desarrollo de fármacos.

Activador del tejido plasminógeno activador del plasminógeno tisular (tPA) es una proteasa de serina compuesta de 572 residuos de aminoácidos con una masa molecular de 70 000 Da, producida naturalmente en el vascular

endotelio. Es parte de la cascada de serina proteasas implicadas en la fibrinólisis (disolución de coágulos de sangre), que actúa como un activador de plasminógeno, una glicoproteína precursoras de la plasmina, que rompe los coágulos de sangre de fibrina. tPA recombinante de Genentech, Activase, fue aprobada por primera vez en 1987, y se utiliza en el tratamiento de enfermedades que implican la obstrucción de los vasos sanguíneos por coágulos de sangre, incluyendo ataques al corazón causados por vasos sanguíneos cardíacos bloqueados, embolias pulmonares (coágulos de sangre en los pulmones) , trombosis venosa profunda y accidentes cerebrovasculares. TPA recombinante es fabricado por cultivo de células animales, pero recientemente se ha producido en la leche de animales transgénicos, que actualmente está sometido a ensayos clínicos.

El colágeno El colágeno es la proteína más abundante en el cuerpo humano y es utilizada por los cirujanos para suturar y reparación. Se obtiene actualmente para este propósito de ganado o cadáveres humanos. En consecuencia, existe la preocupación acerca de su seguridad con respecto a la posible contaminación con virus y priones. Las levaduras Pichia pastoris augusta y Pichia ahora han sido diseñados genéticamente para producir humano tipo I y III fragmentos de colágeno, respectivamente, y pueden ser fuentes seguras futuras de esta proteína para uso médico y quirúrgico.

Los bacteriófagos terapéuticos

como

agentes

Debido a los crecientes problemas causados por los antibióticos patógenos bacterianos resistentes, las alternativas a la quimioterapia antibacter- ial usando ahora se están buscando los antibióticos. Una opción puede ser la terapia de bacteriófagos (virus bacteriano), que hasta hace relativamente poco tiempo era poco conocido fuera de los antiguos estados de la Unión Soviética. Gran parte de la investigación en este campo se ha realizado en los últimos 80 años en el Instituto de bacteriófagos en Tbilisi, capital de

Georgia. Los beneficios de la terapia de fagos son bacteriológico que las bacterias no desarrollan resistencia a los virus, ya que ellos también evolucionan para seguir invadiendo sus bacteria huésped. Además, son específicas y no matan a las bacterias beneficiosas de la microflora natural, humano o animal. Esta terapia parece ser particularmente útil para el tratamiento del cólera, disentería, meningitis, septicemia, tuberculosis, e infecciones causadas por S. aureus y especies de Campylobacter y Pseudomonas. En caso de esta forma de terapia cada vez más aceptada en la medicina occidental, habrá una necesidad de que el cultivo a gran escala de una gama de bacteriófagos dentro de bacterias huésped adecuadas.

Otras lecturas Papeles y comentarios Alisky, J., Iczkowski, K., Rapoport, A. y Troitski, N. (1998) Los bacteriófagos son prometedores como agentes antimicrobianos. Diario de la infección 36, 5-15. Bruggin, KA, Roos, EC & Vroom, E. (1998) La penicilina acilasa en la producción de antibióticos b-lactámicos. Proceso Orgánico de Investigación y Desarrollo 2, 128-133. Datar, RV, Cartwright, T. & Rosen, C.-G. economía (1993) Proceso de célula animal y fermentaciones bacterianas: un análisis de estudios de caso de activador del plasminógeno tisular. Bio / Technology 11, 349-357. Hutchinson, RC y Fujii, I. gen sintasa (1995) policétido la manipulación: un enfoque estructura-función en la novela de ingeniería antibióticos. Revisión Anual de Microbiología 49, 201-238. Johnson, I. (1983) La insulina humana a partir de la tecnología de ADN recombinante. Science 219, 632-637. Johnson, EA (1999) toxinas clostridiales como agentes terapéuticos: beneficios de las proteínas más tóxicas de la naturaleza. Revisión Anual de Microbiología 53, 551-575. Khachatourians, GG (1998) El uso agrícola de antibióticos y la evolución y la transferencia de bacterias resistentes a los antibióticos. Canadian Medical Association Journal 159, 1129-1136.

Koths, K. (1995) Las proteínas recombinantes para uso médico: las tracciones y desafíos At-. Current Opinion in Biotechnology 6, 681-687. Marcas, T. y Sharp, R. (2000) Los bacteriófagos y biotecnología: una revisión. Diario de Tecnología Química y Biotechnology 75, 6-17. Martineau, P. y Rambaud, J.-C. (1993) Potencial de la utilización de bacterias lácticas para la terapia y immunodulation en el hombre. FEMS Microbiology Review 12, 207-220. Nielsen, J. (1998) El papel de la ingeniería metabólica en la producción de metabolitos secundarios. Current Opinion in Biotechnology 10, 330-336. Penalva, MA, Rowlands, RT y Turner, G. (1998) la optimización de la biosíntesis de la penicilina en los hongos. Trends in Biotechnology 16, 483-489. Rallabhandi, P. & Yu, P.-L. (1996) Producción de proteínas terapéuticas en las levaduras: una revisión. Biotecnología australiana 6, 230237. Robinson, A. y Melling, J. (1993) La estructura del sobre y el desarrollo de nuevas vacunas. Journal of Applied Bacteriol-gía: Suplemento 74, 43S-51S. Roessner, CA & Scott, AI (1996) de ingeniería genética síntesis de productos naturales: a partir de alcaloides de corrinas. Revisión Anual de Microbiología 50, 467-490. Seaman, KB (1998) Especificaciones para medicamentos de proteínas derivadas de la biotecnología. Current Opinion in Microbiology 9, 319-325. Wiseman, A. (1996) proteínas terapéuticas y enzimas de levaduras genéticamente modificadas. Endeavour 20, 130-132.

Libros Crueger, W. Y Crueger, A. (1990) Biotecnología: Un libro de texto de Microbiología Industrial, 2ª edición. Sinauer Associates, Sunderland, MA. Demain, AL, Davies, JE y Atlas, RM (1999) Manual de Microbiología Industrial y Biotecnología. Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC. Ellis, RW (ed.) (1992) Vacunas: nuevos enfoques a problemas im- munological. ButterworthHeinemann, Londres.

Finkelstein, DB & Ball, C. (eds) (1992) Biotecnología de Hongos filamentosos. ButterworthHeinemann, Boston. Glazer, AN y Nikaido, H. (1995) Biotecnología Microbiana. WH Freeman, Nueva York. Strohl, WR (ed.) (1997) Biotecnología de Antibióticos. Marcel Dekker, New York. Wainwright, M. (1992) Introducción a la biotecnología de hongos gía. Wiley, Chichester. Walsh, G. (1998): Los productos biofarmacéuticos Bioquímica y Biotecnología. Wiley, Chichester.

12 Fermentaciones de alimentos y bebidas

Los microorganismos han jugado un papel importante en la producción de alimentos y bebidas. productos alimenticios tradicionales fer- mentados incluyen: 1 bebidas alcohólicas, Especialmente cervezas, vinos y licores descubrimientos de arada, que se derivan de azúcares y almidones; 2 productos lácteos, especialmente quesos, yogur, crema agria y el kéfir; 3 el pescado y los productos cárnicos, Como la salsa de pescado y salchichas mentados fer-; y 4 productos vegetales, Panes y productos de arroz fermentados en particular a base de cereales; junto con las frutas fermentadas, verduras y legumbres, incluyendo aceitunas en conserva y pepinillos, chucrut, salsa de soja, tofu, yuca fermentada, cacao y granos de café. Muchos de estos productos evolucionaron originalmente como un medio de conservación de alimentos. La actividad microbiana estabilizador puede resultar en actividad de agua inferior, pH modificado, la generación de compuestos inhibidores (alcohol, bacteriocinas, etc.) y eliminación de nutrientes fácilmente utilizados por organismos de deterioro cial ciales. Es importante destacar que, además de proporcionar estabilidad a largo plazo, estos procesos de fermentación también generan sabor deseable, aroma y textura. El papel de los microorganismos en este campo es ahora aún más diversa. La biomasa microbiana se utiliza como nuevo alimento, tales como productos de proteína unicelular, champiñones especializadas y preparados probióticos; numerosos productos de fermentación microbiana también se incorporan como ditives ad- alimentos y suplementos (véanse los capítulos 13 y 14). Además, las enzimas microbianas se utilizan

ampliamente como coadyuvantes de elaboración de alimentos, y algunos pueden ser añadidos a la alimentación animal para mejorar su valor nutricional (véase el capítulo 9).

Bebidas alcohólicas Las bebidas alcohólicas se han producido a lo largo de la historia humana. Se fabrican en todo el mundo a partir de materiales fermentables disponibles localmente, que son azúcares derivados ya sea de zumos de frutas, savia de las plantas y miel, o a partir de cereales y almidón hidrolizado raíz (Tabla 12.1). Algunas bebidas alcohólicas se beben fresca,

pero es más común que tienen la edad para modificar su sabor, mientras que otros se destilan para aumentar el grado alcohólico. Aunque las bacterias tales como las especies de Zymomonas pueden estar involucrados en la producción de ciertos productos, las levaduras se utilizan principalmente, ya sea en las culturas individuales o mixtos. Sus productos de fermentación son etanol, una serie de características organolépticas deseables (sabor y aroma) compuestos y CO2 (carbonatación proporciona para algunos productos). Las levaduras que participan en estas fermentaciones alcohólicas son en su mayoría cepas de Saccharomyces cerevisiae, que no puede fermentar directamente almidón. Requieren hidrólisis previa del polisacárido en azúcares simples y dextrinas pequeñas (no más de tres unidades de glucosa). Tradicionalmente, esto se logra mediante el uso de hongos o vegetales amilasas. Estas enzimas pueden ser elementos inherentes de la fuente de hidratos de carbono o añadido durante el procesamiento.

fabricación de la cerveza El término cerveza se da a bebidas alcohólicas no destiladas, elaborados a partir

de granos de cereales parcialmente germinadas, se refiere como la malta. Ellos incluyen cervezas, cervezas y cerveza negra, que normalmente contienen 3-8% (v / v) de etanol. Sus otros ingredientes principales son el sector del lúpulo (dando la cerveza un sabor característico y aroma), agua y levadura. El proceso de elaboración de la cerveza se divide básicamente en cuatro etapas principales (Fig. 12.1). 1 malteado es la germinación parcial del grano de cereal durante 6-9 días para formar la malta. Este es el ingre- diente cerveza primaria y contiene principalmente almidón, algunas proteínas y enzimas hi- drolytic. La cebada malteada es predominantemente usado, pero también cervezas se hacen con trigo malteado, en ocasiones, la avena malteada y hasta el sorgo malteado. 2 preparación de maceración y la hierba implica la producción del medio de fermentación acuosa, también conocido como hierba. Contiene azúcares fermentables, aminoácidos y otros nutrientes, y se prepara por los componentes de ING malta solubiliz- a través de la acción de enzimas hidrolíticas endógenas. En la mayoría de los países, la proporción de

179

18 0

Capítulo

Tabla 12.1 Algunos ejemplos de las bebidas alcohólicas de todo el mundo

sustrato

Sin destilar bebidas

Producto de la fermentación alcohólica destilada para formar

Los jugos de frutas y jugos vegetales Manzanas De cactus / suculentas Uvas

Sidra pulque Vino

Apple brandy, calvados, etc. tequila aguardiente de uva, el coñac, armagnac, etc.

Palmyra peras miel la caña de azúcar o melazas almidones Cebada, además de otros cereales *

Ponche Pe rr y M cerveza -

Arak brandy, williams, Pera etc. Ron Whisky†

Arroz‡

ubicación

El norte de Europa, AméricaAmérica del Norte México, Central S. Europa, N. y S. América, Australia, Nueva N.Zelanda Europa Reino Unido Cerveza: cervezas en el lager-Bata Reino Unido en su en todo el mundo (e) y: Escocia, Japón India

shochu Sak e Pach Sorgo*‡ wai África Central y del Sur Sont * Sacarificado principalmente por las amilasas de malta. † preparó esencialmente de una cerveza sin lúpulo. ‡ sacarificado por amilasas fúngicas. Nota: alcohol neutro, ginebra, vodka, etc., se pueden preparar a partir de la fermentación de virtualmente cualquier hidratos de carbono, incluida la lactosa. En el norte de Europa y los EE.UU., el almidón se emplea sobre todo en forma de trigo y maíz, mientras que en Europa del Este y Rusia, las patatas son de uso frecuente. Estos almidones son generalmente hidrolizan utilizando enzimas de malta.

ahora también se añaden adyuvantes, que son el cereal no malteada y fuentes de almidón no cereales, y jarabes de azúcar. El mosto líquido resultante es entonces 'esterilizar' hirviendo; al mismo tiempo se añaden lúpulo para impartir su sabor amargo y aroma característico. En general, la preparación de mosto toma aproximadamente 5-8 h. 3 Levadura fermentación es un proceso por lotes no aséptico que utiliza un cultivo iniciador de una cepa seleccionada de elaboración de la cerveza S. cerevisiae. El mosto inoculado se somete a una fermentación alcohólica para producir etanol, CO2 y metabolitos menores que contribuyen al sabor y aroma. mentaciones fermentación suelen durar 2-7 días, dependiendo del tipo de cerveza que se produce. 4 Posfermentativa Los tratamientos se llevan a cabo de ma- tura o condicionar la nueva cerveza para que quede listo para el consumo, que puede tardar de una a varias semanas.

Las materias primas, con exclusión de lúpulo, la preparación del mosto y la fermentación de la levadura, son esencialmente la misma para la producción tanto de whisky y malta viña gar (véase pp. 200 y 201). Sin embargo, los principales objetivos son algo diferentes. Para el whisky y el vinagre

la producción, el objetivo principal es maximizar la producción de alcohol antes de las etapas respectivas de destilación y acetification. En la elaboración de cerveza, la producción de etanol por sí es bastante menos crucial, ya que el desarrollo del perfil de sabor de sonido y otros factores de calidad es igualmente importante. Tradicionalmente, todas las actividades enzimáticas necesarias para el proceso fueron proporcionados por la malta, que genera el mosto, junto con las enzimas de levadura, que convierte el mosto comcomponentes a compuestos de etanol, CO2 y sabor. Sin embargo, las enzimas comerciales se emplean

Fermentaciones de alimentos y

18

ahora cuando las materias primas son enzima 1 deficiente, o para producir nuevos productos, o actuar como ayudas en el procesamiento y en la estabilización de producto.

MALT y malta

Malteado implica la germinación parcial controlada de grano de cebada. Esto modifica el grano vítreo duro en una forma friable (fácilmente aplastado) que contiene más fácilmente degradables de almidón y genera enzimas hidrolíticas, especialmente amilasas, b-glucanasas y proteasas.

1 malteado tanque empinada Cebad a

Horno recipiente de germinac ión

Agua 2 preparación maceración hierba

y

de la

Malta y algunos adjuntos de almidón

tienda de la malta

Molino Agua (espíritu) La trituración y separación del mosto mosto dulce

Adjunto almidón cocina adjuntos

bagazos

Alimentación animal

El lúpulo adjuntos de cobre (jarabes de azúcar)

Cobre (cocción del mosto)

Wort recepto r mosto lupulado aclarado

3 Fermentació n

el almacenami ento y la preparación

enfriamient o del mosto y la aireación

bagaz o de lúpul o

Fertilizante

cilindrocónicos fermentador o tradicional

Procesami ento (extracto de levadura, El vitaminas, exceso de etc.) cultivos de levadura

cerveza "verde" 4 Posfermentativa Azúcar y clarificado res

tanque de Maturati dispensar

Filtración estéril o pasteurización Aclaración en embalaje (botellas, latas, barriles y tanques)

Higo. 12.1El proceso de fabricación de la cerveza.

granos de cebada contienen aproximadamente 65% de almidón, que se encuentra dentro de la región endospermo

(Fig. 12.2). células endosperma se llenan con gránulos de almidón embebidos en una matriz de proteína, y sus paredes se componen de

una unión mixta (B-1,3; 1,4) b-glucano tosans pensiones, semicelulósico y proteínas. Los gránulos de almidón no pueden ser rebajada acción hasta que las paredes celulares se han infringido y la matriz de proteína ha sido al menos parcialmente degradado. Por lo tanto, el requisito de niveles adecuados de glucanasas b- y proteasas. Malteado comienza por inmersión o remojo la cebada en

agua durante 2 días a 10-16 ° C, a fin de aumentar el contenido de humedad de alrededor de 45% (w / w). Periódicamente, el agua se drena temporalmente y la aireación se proporciona, evitando de este modo las condiciones anaeróbicas que pueden causar daño embrión. El agua utilizada para el remojo a menudo se reutiliza para ahorrar en costes de agua y de tratamiento de efluentes. Después de la maceración, la cebada se germinó parcialmente durante 3-5 días a 16° C. Tradicionalmente, esto simplemente Barrica o botella de cerveza19 acondicionado implicado la difusión del grano en los pisos de malteado a una profundidad de 10 a 20 cm. Sin embargo, diversos sistemas mecanizados son

Cáscara

Embrión pericarpio-testa

Aleurona endospermo amiláceo células del endospermo almidón grande gránulo

Laminilla del medio

pequeño gránulo de almidón

Cuando suficientemente modificado, la malta se 'Secada' a través de un proceso de dos etapas. En primer lugar se seca a 50-60 ° C y luego 'curar' a 80-110 ° C. Estofa toma alrededor de 2 días y tiene varias funciones. Se detiene el crecimiento del embrión y la actividad enzimática, y reducir al mínimo la desnaturalización de la enzima, y se desarrolla el sabor y el color (melanoidina compuestos). maltas pálidas lager que requieren poco desarrollo de color se someten a condiciones suaves. En consecuencia, conservan una mayor actividad enzimática que hacer maltas de color. maltas muy coloreados necesarios para aromatizantes y colorantes cervezas oscuras tienen una baja actividad enzimática. En un contenido de humedad final de 2 a 3% (w / w), la malta es biológicamente estable durante varios meses.

HIERBA DE PREPARACIÓN Pared celular

matriz de proteínas

glucano + pentosano pared celular de las células del endospermo Interio glucano

r

pared

Exterio r Proteín a

Higo. 12.2 Estructura de un grano de cebada.

que ahora es operado, que tienen camas de grano de aproximadamente 1 m de profundidad. Estos se aireó con aire fresco húmedo y se volvieron mecánicamente cada 8-12 h para ayudar a la respiración por el grano y evitar la acumulación de calor, de lo contrario el embrión puede resultar dañado. modificación del grano puede ser promovida de varias maneras. La abrasión (el

Los objetivos de la preparación del mosto se van a formar, y ex- tracto en solución, los azúcares fermentables, aminoácidos, Tamins vi-, etc., a partir de malta y otros ingredientes sólidos. Malta proporciona normalmente la mayor parte de los materiales fermentables y enzimas potenciales suficiente para generar un medio de fermentación bien equilibrado. Típicamente, cerveza británica se prepara a partir del 75% de malta, y 25% de cereal no malteada y fuentes de almidón no cereales, referido como "adjunto '. En algunos casos, una porción del coadyuvante puede estar en forma de jarabes de azúcar que pueden añadirse más tarde durante la cocción del mosto. En los EE.UU., hasta el 60% adjuntos pueden ser utilizados, mientras que un máximo del 40% se recomienda en la UE. Sin embargo, en Alemania la ley de pureza de la cerveza conocido como el Reinheitsgebot de 1516 todavía prohíbe el uso de cualquier adjuntos. Sustitución de una parte de malta con agentes auxiliares es principalmente para daño controlada de la cáscara antes de remojo) mejora el acceso de agua y aditivos. La aplicación del ácido giberélico hormona de la planta, a niveles de 0,1 a 0,5 mg / kg de cebada, se puede hacer a aumentación Ment la hormona de embriones producidos natural que estimula la síntesis de novo de determinadas en- hidrolítica

enzimas, incluyendo a-amilasa. suplementos de celulasa, tales como enzimas de Trichoderma reesei, a niveles de 24 a 48 mg / kg de cebada, también acelerar la germinación ayudando endospermo rotura de la pared celular. Supresión de la raíz innecesaria y crecimiento de los brotes se puede lograr mediante la adición de bromato en niveles de 100-200 mg / kg de cebada.

razones económicas. Sin embargo, ciertos adyuvantes, tales como productos de arroz, pueden mejorar las propiedades específicas de la cerveza, pero contribuyen poco sabor y la actividad enzimática. Otros adyuvantes incluyen puré de cebada cruda, harina de trigo, sémola de maíz, y otros cereales en copos o micronizadas. Los que tienen una temperatura de gelatinización de almidón de alta pueden requerir la cocina antes de la masa principal. Tradicionalmente, se añadió 5-10% (w / w) de malta durante la cocción para proporcionar amyl- ases que aceleran el proceso. Sin embargo, ahora se prefieren microbianas termoestable a-amilasas. Malta y aquellos que requieren adyuvantes de molienda son generalmente rodillo-blanqueado antes de la maceración. Esto se realiza a menudo en una forma tal como para retener en gran parte la cáscara intacta, reduciendo al mismo tiempo el resto a un polvo grueso. La cáscara después actúa como un auxiliar de filtración en la separación del mosto. ingre- dientes fresadas son transportados al recipiente de mezcla y se mezcla con agua caliente, el licor de elaboración de la cerveza, cuya composición puede influir en la calidad de la cerveza final. En consecuencia, puede ser

necesario añadir o eliminar ciertos iones y ajustar el pH. Tras la maceración el extracto líquido se separa de los sólidos residuales para formar el mosto, que luego debe ser estabilizado por ebullición. Dando como resultado la hierba debe ser un medio líquido bien equilibrada que suministrará las levaduras con todos los requerimientos nutricionales para la fermentación posterior.

superficie, que se filtra a través del lecho de granos y se lava el extracto soluble. La cama de grano se sienta en el doble fondo de la cuba de puré, que tiene ranuras de aproximadamente 1 mm de ancho. Estos se mantienen claro por los grandes fragmentos de cáscara en el puré que actúan como un coadyuvante de filtración. extracto líquido resultante se llama 'mosto dulce'. El burbujeo se contingencias UED hasta que el peso específico del mosto cae a un nivel sistemas de maceración especificado que indica que los azúcares poco Tres sistemas principales de maceración se o nada más soluble permanecen en el puré. 2 maceración por decocción se ha utilizado hacen funcionar. tradicionalmente en Europa y es adecuado 1 maceración de infusión es el método clásico para maltas menos modificados. La británico de cervezas y cerveza negra, temperatura inicial puré comienza en utilizando malta bien modificada y un equipo alrededor de 35-40 ° C, con una relación de relativamente sencillo. mash ingredientes líquido a molienda de hasta 5: 1. Esta inicial sólidos se mezclan con licor de infusión más baja temperatura facilita más extensa caliente para conseguir una temperatura de hidrólisis del glucano B y proteínas, y muchas puré de 62-65 ° C. La mezcla se realiza veces se llama una "proteína descanso'. La durante el paso a un recipiente sin agitación temperatura se eleva entonces a 50 hasta 55 aislado, la cuba de puré (Fig. 12.3), que es 7-9 ° C, mediante la eliminación de una porción m de diámetro y 2 m de profundidad. En de la masa, que se hierve e inmediatamente algunas cervecerías estas embarcaciones devuelto al recipiente de puré. Esto se puede tradicionales han sido sustituidos por los repetir una o dos veces más, con períodos de mezcladores de puré. espera intermedio. El objetivo es elevar la El puré tiene una relación de licor de sólidos temperatura por etapas a aproximadamente (molienda) de entre el 3: 1 y esta espesa puré 65 ° C, para lograr la degradación del ayuda a estabilizar algunas enzimas de la almidón, y finalmente a 75 ° C. la separación malta. Las temperaturas de infusión de puré del mosto es por lo general a través de un son adecuados para la degradación del sistema de filtración, con la ayuda de almidón, pero la malta b-glucanasas y facilita rastrillos o cuchillos que cortan la cama de prot- son rápidamente inactivados; de ahí la granos; Como alternativa, se pueden utilizar necesidad de la malta bien modificada cuyas los sistemas de filtro de mosto. paredes celulares y las proteínas que ya se han degradado considerablemente durante el 3 maceración a temperatura programada sistemas son operación lización creada por muchas fábricas malteado. Maceración tiene una duración de modernas. La temperatura se eleva puré 1-2 horas y es seguido por el Ing puré sparg-. utilizando una camisa de calentamiento de Esto implica la pulverización de agua a 70-75 ° C en el alrededor de 40 ° C por encima de 70 ° C a través de cualquier número de etapas que llevan a cabo. Esto permite un mayor control sobre el proceso de maceración y el programa Giratorio el brazo de rociado puede ser adaptado para maltas ficados diversamente modi-. puré de separación es por lo general a través de un filtro de dispositivo de clarificación o puré moderna. Grist en

licor caliente para el burbujeo

cama de grano Ranurado fondo falso

Aislamiento

El resultado de maceración, con independencia del sistema utilizado, es un extracto acuoso, el mosto dulce (para composición típica, véase la Tabla 12.2) y los granos gastados insolubles. Estos últimos son subproductos altamente perecedero y, a menudo son transportados rápidamente lejos

par a uso dire cto

como alimento para el ganado. También se han hecho intentos para generar

más azúcares elaboración de la cerveza mentable fer- de los componentes celulósicos de bagazo utilizando ácido o hidrólisis enzimática (véase el Capítulo 10, bioconversión de lignocelulosa). Bioquímica de maceración

mosto dulce

Higo. 12.3 Una infusión tun puré.

hidrólisis del almidón. El objetivo en maceración es convertir la mayor cantidad de malta y almidón adjunto como sea posible para fermentación azúcares mentable. El almidón se compone de 25% de amilosa, un polímero lineal de unidades de glucosa unidas-a-1,4, y 75% de amilopectina, que es un polímero ramificado que contiene tanto un 1,4 y un 1,6-vínculos. enzimas implicadas malta

mesa 12.2 mosto de cerveza típica

g/L

Carbohidrato Fermentable carbohydrate71 glucosa + fructose10 sucrose4 maltose42 maltotriose15 Mayor dextrins23 (No fermentado por la mayoría de las levaduras de cervecería) Total carbohydrate94 Aminado acids1.5 Vitaminas y crecimiento factorsmg / L biotina