Ecbu 2022 [PDF]

Zitiervorschau

ISPITS RABAT Filière : Techniques de Santé Option : Laboratoire Année Universitaire : 2021-2022

Examen cytobactériologique des urines -ECBU-

DR F. EL MEHDAOUI

Plan • • • • • • • • • • • • • • • • • •

INTRODUCTION CONTEXTE CLINIQUE PRÉLÈVEMENT DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE EXAMEN MACROSCOPIQUE EXAMEN MICROSCOPIQUE: Etat frais Etat fixé et coloration de Gram UROCULTURE EPIDEMIOLOGIE BACTERIENNE ET RESISTANCE INTERPRETER LES RESULTATS DU LABORATOIRE LES ESPÈCES MICROBIENNE QU’ON PEUT RENCONTRER DANS L’INFECTION URINAIRE LES INFECTIONS URINAIRES CHOIX DE MILIEU DE CULTURE ENSEMENCEMENT ET ISOLEMENT ETUDES DES CARACTÈRES CULTURAUX COLORATION DE CONTRÔLE TEST DE DIFFERENCIATION LA GALERIE BIOCHIMIQUE ANTIBIOGRAMME

Introduction L'examen cytobactériologique des urines ou ECBU est l’un des examens les plus prescrits.

Il permet de diagnostiquer une infection urinaire et d’identifier le microorganisme

responsable afin de prescrire le traitement le plus efficace.

Examen cytobactériologique des urines : ECBU CONTEXTE CLINIQUE: Circumstances de prescription  Symptomatologie d’infections urinaires,

 Bilan pré-opératoire en Urologie,  Examen systématique chez la femme enceinte,  Contrôles post-thérapeutiques ( rares). PRELEVEMENT - CONSERVATION - TRANSPORT ECHANTILLON

1- Objectif  Eviter

: Etape pré-analytique essentielle, prélèvement de qualité pour une Biologie de qualité

toute contamination par des bactéries de l’environnement fécal ou

périnéal.

 Eviter de laisser proliférer les bactéries contaminantes peu abondantes.  Recueillir les urines vésicales (bactéries infectantes qui se sont multipliées donc abondantes).

2- En pratique: Prélèvement victime de son apparente simplicité

 Nécessité d’une toilette intime soigneuse : ASEPSIE +++ Prélever les urines du matin, idéalement en milieu de jet (10 ml) ou bien par sondage si problème chez l’adulte, au moyen d’une poche stérile chez le nourrisson (Urinocol®),  à la seringue dans l’opercule des tubulures chez les patients sondés par système clos. Circonstances particulières: Urines du 1er jet si suspicion infection urétrale ou prostatique et recherche de Mycoplasmes et Chlamydia trachomatis.  Les urines doivent séjourner dans la vessie au moins 3H avant le prélèvement.  Fermer hermétiquement le flacon, l'identifier très précisément et le porter immédiatement au laboratoire accompagné de sa prescription et de l’heure de prélèvement.

•

Chez les sujets avec une sonde urinaire, le prélèvement pourra se faire directement par ponction de la sonde qui sera au préalable désinfectée à l'alcool iodé.

• Chez le nourrisson, le prélèvement se fait en laboratoire. Après une toilette et une désinfection locale, une poche stérile adhésive adaptée à son anatomie est maintenue autour de ses organes génitaux pendant une demi-heure. Au-delà de ce délai, si l’enfant n’a pas uriné, il faudra recommencer l’opération pour éviter une contamination par les selles.

EXAMEN MACROSCOPIQUE

Aspect et couleur des urines Couleur

Interprétation

jaune ambrée

état normal

Jaune très pale

polyurie

Grisâtre

L’urine contient de pus

rouge ou rose

L’urine contient du sang

Brune

hémoglobinurie

jaune canaris fluorescent avec tendance au vert

Urine ictère

urine a l’état normal

urine rouge

urine brun

urine vert

• Aspect: Les urines troubles sont le plus souvent le témoin d'une infection urinaire haute (pyélonéphrite) ou basse (cystite, prostatite). Urine trouble à l’émission

Urine neutre ou alcaline

le trouble provient de la précipitation des phosphates

Urine très acide et concentrée

Du a la présence des urate et cristaux d'acide urique

L’urine contient du pus

présence des nombreux globules blancs

- Urine trouble après l’émission: Du a la présence de bactérie qui se sont développées étant donné que l'urine constitue un excellent milieu de culture dans ce cas l'urine présente une odeur ammoniacale caractéristique due a la fermentation • Odeur: L’urine à l’état normal n’a pas d’odeur désagréable - Odeur ammoniacale dans le cas de fermentation bactérienne - Odeur de chaire purifiée lorsqu’elle contient de sang . • pH: l'urine a un pH qui va varier entre 5 et 6.

EXAMEN MICROSCOPIQUE Délai inférieur à 2h pour éviter toutes altérations des éléments cellulaires. Apport des milieux avec borate de sodium: Conservation des urines à +4°C

possible.

Rôle du Laboratoire: Cytologie des urines : Présence de leucocytes (réaction de l’hôte), leucocyturie significative si > 104/ml. Présence d’hématie: Hématurie Présence d’éléments type cristaux (dépend état physico-chimique des urines lié à l’alimentation et aux médicaments) ou cylindres (atteinte tubulaire) Présence de bactéries, Bactériurie significative si > 105/ml.

La bandelette urinaire n’a qu’une valeur d’orientation, intérêt de la valeur prédictive négative.

Examen microscopique 1. Etat frais : 1.1 - Aspect quantitatif (nombre/ mm3): A l'aide d'une cellule de Malassez on dénombre les globules blancs et les globules rouges contenus dans un volume donné de l'urine à étudier.  Technique : • Mélanger les urines par retournement du tube pour avoir un échantillon homogène. • Déposer une goutte entre lame et lamelle.  Lecture : • Examiner au microscope au faible grossissement (x10), puis au grossissement moyen (x40).

 Les globules rouges : o A l'état normal le nombre de hématies est inférieur à 1 000/ml (ou 1/mm3) ; o En cas d'infection urinaire, le nombre d’hématies augmente :  plus de 10 000 hématies/ml (ou >10/mm3). On parle alors d’hématurie. Observation microscopique des GR dans les urines.

 Les globules blancs : o A l'état normal le nombre des leucocytes est inférieur à 10 000/ml (ou 10/mm3). o En cas d'infection urinaire, le nombre des leucocytes augmente :  Plus de 10 000 leucocytes/ml soit > à 10/mm3). La leucocyturie traduit une réaction inflammatoire suite à une infection urinaire.

Observation microscopique des leucocytes dans les urines

1.2 - Aspect qualitatif (absence ou présence; nombre /champ) : On centrifuge l’urine et on étale une goutte du culot entre lame et lamelle et on observe :

 Bactéries : o La découverte de microbes n’a de valeur que si l’examen est pratiqué juste après l’émission. Il est indiqué de faire un étalement coloré au bleu de méthylène ou au Gram.

 Les cylindres :

o Les cylindres hyalins sont normaux, s’ils sont < 8 /µL. o Les cylindres leucocytaires : traduisent une maladie infectieuse. o Les cylindres granuleux s’observent dans toutes les pathologies rénales. Ils sont normaux s’ils sont < 1 /µL o Les cylindres hématiques : indiquent une probable atteinte des glomérules. o Les cylindres graisseux sont retrouvés en cas de glomérulonéphrite.

 Les cristaux : • Dans la majorité des cas, la présence de cristaux ne correspond pas à un état pathologique, et, selon le pH de l'urine, on pourra mettre en évidence :  Dans l'urine acide : o Des urates (normaux en quantité modérée, leur nombre augmente au cours de la goutte et chez les malades sous chimiothérapie.) o Cristaux d'acide urique (Normaux en quantité modérée, leur nombre augmente au cours de la goutte, où leur présence peut témoigner d'une néphropathie.) o Oxalates de calcium (Normaux en quantité modérée, leur nombre augmente au cours de certaines maladies rénales chroniques)  Dans l'urine alcaline : o phosphates, carbonates de calcium, urates d'ammonium (normaux en quantité modérée).

Mais les plus fréquents sont :

Acide urique

urates amorphes

 Les cellules épithéliales : o Elles sont en général de grande taille avec des noyaux petits. o Dans le cas normal < 3cellules /µL, au-delà de cette valeur on suggère une possible affection tubulaire.

Observation microscopique des cellules épithéliales

 Trichomonas vaginalis mobiles, œufs de bilharzies, levures et filaments mycéliens, spermatozoïdes.

Coloration de Gram Premiers éléments d’orientation des bactéries observées (quantité, morphologie, mode de

regroupement, Gram positif ou négatif).

2- L’état fixé et la coloration de gram : o Permet d'observer les différentes bactéries présentes et oriente le choix des milieux de culture.  Technique :  Placer 15 ml d’urine dans un tube  Centrifuger pendant 5 minutes à 1500 tours/minute  Verser doucement le liquide surnageant  Mélanger avec la pipette Pasteur le culot, et on dépose une goutte dans la lame ,étaler , sécher, fixer , et colorer.

Les étapes de coloration de Gram

Lecture de la coloration de Gram

o Après la coloration de gram on examine la lame au microscope a l’objectif x100 pour différencier entre les bactéries Gram positifs et les bactéries gram négatifs dans un échantillon d’urine. o Elle permet aussi de déterminer les différents types de bactéries présents selon leur Gram (+ ou -), leur forme ( Cocci, bacille, coccobacille …), et leur mode de regroupement (isolé, diplocoques, en grain de café, en chainette, en grappe de raisin …)

o Si on trouve :  Des Bacilles Gram Négatifs (coloration rose) on suspecte alors soit : La famille des entérobactéries :

La famille de Pseudomonas :

 Coccis gram positifs : (coloration violettes) on suspecte soit :

 Bacilles Gram Positifs : on suspecte

Listéria monocytogènes :

 Coloration de Ziehl Neelsen ou à l’auramine : o Si on a absence de germes + une leucocyturie est supérieure à 104/ml, il faut rechercher des mycobactéries.  Préparer un frottis à partir du culot de centrifugation des urines et le colorer par la coloration de Ziehl Neelsen. o Si on trouve des BAAR, il faut procéder à une décontamination des urines et ensemencement des milieux spécifiques: MGIT, Loewenstein Jensen et Colestos.

Observation microscopique des BAAR

UROCULTURE Importance capitale de la méthologie  Quantifier la bactériurie et identifier la bactérie infectante après incubation à

37°C pendant 24 h. Dénombrement des unités formant colonies (UFC) par ml. Apprécier la bactériurie entre 103-105/ml sur le milieu ensemencé.

Si suspicion de bactérie à croissance difficile, ajouter un milieu riche type gélose au sang(GS). Si recherche inhabituelle, dialogue clinico-biologique indispensable: Recherche

de Gonocoques, Chlamydiae, Ureaplasma, anaérobies ou Mycobacterium tuberculosis.

EPIDEMIOLOGIE BACTERIENNE ET RESISTANCE %

Infections communautaires

Infections nosocomiales

85

50

Proteus et groupe KES*

10

25

Staphylococcus sp.

3

5

Streptococcus sp.

2

7

Pseudomonas aeruginosa

-

10-20

Escherichia coli

* Klebsiella-Enterobacter-Serratia

INTERPRETER LES RESULTATS DU LABORATOIRE

1.Présentation des résultats:

Doivent être précis et comporter La nature du prélèvement. Le mode de prélèvement la cytologie :

Hématurie et Leucocyturie Présence éventuelle de cellules épithéliales (témoin contamination vaginale chez la femme) Présence éventuelle de cristaux ou de cylindres La culture et l’identification : Numération en culture de la bactérie identifiée (DGU), Identification bactérienne et Antibiogramme Standard

NB Commentaires éventuels notamment si mesures d’hygiène et bactéries multirésistantes.

Interprétation fonction du contexte Clinique Bactériurie < 103/ml : sans signes cliniques exclut une infection urinaire à germes banals.

Bactériurie > 105/ml : Infection urinaire probable (critères de Kass) et Colonisation. Bactériurie 103-105/ml : véritables infections urinaires si cystite de la jeune femme, si prostatite, si malade sondé, si bactérie qui s’agglutine ou bien si infection à Staphylococcus saprophyticus.

INTERPRETER LES RESULTATS DU LABORATOIRE EN FONCTION DE LA REACTION LEUCOCYTAIRE ET NOMBRE DE GERME GERMES < 10 3 ET LEUCOCYTES < 104 GERMES > 10 3 ET LEUCOCYTES < 104

PAS DE COLINISATION CONTAMINATION

PLYMICROBIENNE GERMES < 10 3 ET LEUCOCYTES > 104

   

(Leucocytes dans le sang):

BK, Bilharziose Tumeur, Calculs, Opération ATB NTIC(Néphropathie chronique)

GERMES > 10 3 ET LEUCOCYTES > 104 INFECTION (monomicrobienne)

COLINISATION OU

Les espèces microbienne qu’on peut rencontrer dans l’infection urinaire: Bactérie gram positif

Bactéries gram négatif

Staphylocoque

Escherichia coli

Corynebacterium urealyticum

klebsiella

mycobactéries

Proteus mirabilis

Streptocoque B et D

Serratia

Pseudomonas Enterobacter

On peut rencontrer le parasite Trichomonas et les levures.

Les infections urinaires • La cystite infectieuse, quand on retrouve la bactérie Escherichia coli dans les urines . touche presque uniquement les femmes. • L’urétrite infectieuse : Il s’agit souvent d’infections sexuellement transmissibles sexuellement (IST) courante chez les hommes. Les plus communs sont la chlamydia et le gonocoque (la bactérie responsable de la gonorrhée). • Une pyélonéphrite est une infection du rein par une bactérie. La plus fréquente parmi elles Escherichia coli (70 à 80 % des cas) • Le Proteus mirabilis est souvent en cause dans les infections des voies urinaires, des brûlures lors des mictions, des envies fréquentes d’uriner, une urine trouble et parfois malodorante, si l’infection concerne la vessie (cystite) ou l’urètre (urétrite) ;

Le choix des milieux de culture :  Milieux non chromogènes : o Milieux ordinaires:

o Milieux sélectifs :  Le choix des milieux sélectifs est en fonction de l’observation microscopique de la coloration de gram.  Si présence de BGN :

 Si présence de CGP :

 Si Présence des BGP : o on suspecte Listéria monocytogéne et on ensemence la gélose PALCAM Listeria pour différencier entre Listeria monocytogenes et les autres Listeria sp. o Composants du milieu : 





Agents nutritifs : o

Peptone: 23,0 g/l

o

Chlorure de sodium : 5,0 g/l

o

Mannitol : 10,0 g/l

o

Fer-III-citrate : 0,5 g/l

o

Esculine : 0,8 g/l

o

Glucose : 0,5 g/l

Agents inhibiteurs : o

Chlorure de lithium : 15,0 g/l

o

Ceftazidime : 10,0 mg dans 500 ml

Indicateur coloré : o

Rouge de phénol : 0,08 g/l

o Réactions : o la différenciation est basée sur :

 L’hydrolyse de l'esculine : Toutes les Listeria spp. Hydrolysent l’esculine, (présence d’un noircissement). Le produit de l'hydrolyse, l'esculetine lié aux ions ferriques en formant un noircissement.  La fermentation du mannitol : un changement de coloration du milieu, du rouge au jaune (acidification du milieu) à l’aide du rouge phénol (indicateur coloré) qui permet de différencier des microorganismes présents dans l’échantillon (staphylocoques, entérocoques…) autres que Listeria et qui fermentent le mannitol.

 Les levures : o Parfois on peut noter la présence des levures dans les urines : il faut utiliser un milieu Sabouraud sélectif pour les levures.

 Milieux chromogènes : o Les milieux chromogènes consacrés pour la mise en évidence d'activités enzymatiques par l'apparition d'une coloration spécifique à chaque espèce bactérienne.

Ensemencement et isolement :

Incubation à 37°C pendant 24H

LECTURE DES CULTURES COLONIES OBTENUES APRES L’ENSEMENCEMENT DES MILIEUX DE CULTURE 

Les milieux non chromogènes :

 Pour les milieux ordinaires : on étudie la dégradation ou non du lactose par la bactérie.

 Pour les milieux sélectifs :  Pour les BGN :

 Pour les CGP :

noter bien que streptocoque D est non hémolytique ( hémolyse gamma).



 Pour les BGP : - Listéria monocytogéne : la gélose PALCAM Listeria -Présence de Listeria monocytogène : •

Couleur gris-vert des colonies + la présence

d'une auréole ou halo noir (à confirmer par une identification biochimique/sérologique) -Présence d’autres microorganismes fermentant le mannitol : •

Couleur jaune des colonies + la présence

d'un halo jaune.

 Pour les levures : On observe des colonies blanchâtres sur le milieu Sabouraud



Les milieux chromogènes :

 Pour les BGN :

 Pour les CGP : : 

 Pour les BGP : Listéria monocytogène

 

 Les levures :

Coloration de contrôle  Le but de cette méthode est de confirmer la présence des espèces des bactérie qui sont à Gram positif ou à Gram négatif pour éviter toute sorte d’erreurs, soit: • A partir des boîtes de pétri ensemencées lors de la séance précédente. • A partir d’une suspension bactérienne ou bouillon de culture.  La coloration de contrôle en deux étapes : - Réalisation du frottis . - Technique de coloration .

Réalisation du frottis

1. Stériliser l’oese

4. Sécher et fixer le frottis

2. Dépôt sur la lame

3. Réaliser le frottis par mouvement circulaire

Test de différenciation

Catalase: La catalase est une enzyme qui catalyse la dégradation du peroxyde d’hydrogène (H2O2) selon la réaction :

Technique:

Bulles d’oxygène, la bactérie possède la catalase Pas de bulle, la bactérie ne possède pas la catalase

Catalase + Catalase –

• les bactéries des genres Staphylococcus, Listeria, Corynebacterium et Micrococcus (catalase +) ; • des bactéries des genres Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc (catalase -).

Oxydase •

Le test consiste à mettre en évidence une enzyme : la phénylène diamine oxydase que possède la bactérie pour oxyder un réactif incolore (la NNdiméthyl-paraphénylène diamine) en un dérivé rose violacé.

Technique:

Positive

-

Négative

Présence d’une teinte rose, violette Si la colonie reste incolore

oxydase + oxydase –

• Principaux bacilles oxydase positive : Pseudomonas • Principaux bacilles oxydase négative : la famille des Entérobactéries, Acinetobacter.

La galerie biochimique •

Pour l’étude des caractères biochimiques des bactéries ( métabolisme glucidique ,protidique et énergétique), on ensemence une galerie d'identification :  soit en tubes (macro-galerie)

 soit en système miniaturisé (micro-galerie)

ou Colonies isolés

Ensemencements des milieux de la galerie biochimique :

Kligler-Hajna

Urée Indole

MannitolMobilité-Nitrate

MRVP

Citrate de Simmons

esculine

Kligler-Hajna Généralement pour les entérobactéries :E.coli , Klebsiella, Proteus…et aussi pour les pseudomonas. Ensemencer à l’aide d’une pipette Pasteur fermée: • la pente par stries serrées • le culot par piqûre centrale Incuber 24 heures à 37°C

Le test d’ONPG : Le test ONPG permet de recherche directement la présence d’une β-galactosidase en fournissant à la bactérie un substrat de cette enzyme Une bactérie lactose (-) peut avoir l’absence de : • une β-galactoside-perméase • une β-galactosidase

incuber 30 min à 37°C

Urée indole: •

Un milieu urée indole est un milieu permettant l'identification de germes, particulièrement des entérobactéries, par la recherche de 3 activités enzymatique: Recherche de l'uréase

Recherche de la tryptophanase(indole) Ajout de réactif de Kovacs

Urée -

urée +

indole+ indole -

Recherche de la TDA Ajout de chlorure de fer III

Mannitol-Mobilité-Nitrate • Le milieu Mannitol-Mobilité-Nitrate est utilisé pour l’identification des entérobactéries basée sur la fermentation du mannitol, la mobilité et sur la réduction des nitrates en nitrites.

Mannitol :

Mobilité :

Nitrate réductase :

MRVP: • Mise en évidence des voies fermentaires des entérobactéries : o Réaction de vosges-proskauer(VP) : explore la voie de fermentation butandiolique de la bactérie . o Réaction ou rouge de méthyle (RM) : explore la voie de fermentation lactique.

Citrate de Simmons • Le citrate de Simmons est un milieu de culture utilisant le citrate comme seule source de carbone. • Seules les bactéries possédant une citrate perméase seront capables de se développer sur ce milieu. Généralement pour les entérobactéries et Pseudomonas : Citarte - : E.coli Citrate +: Enterobacter, Citrobacter, Serratia Si le milieu :  Reste vert  Bleu

citrate – citrate +

bactérie caractère

E.COLI

Klebsiella

Proteus

Serratia

Lactose

+

+

-

-

glucose

+

+

+

+

gaz

+

+

+

+

H2S

-

-

+/-

-

urée

-

+

+

-

indole

+

+/-

+/-

-

TDA

-

-

+

-

citrate

-

+

+/-

+

MR

+

+

+

+/-

VP

-

+

-

+

Mobilité

+

-

+

+

Identification des staphylocoques 1. La coagulase :

2. DNase : •

La mise en évidence pour un Staphylocoque sur milieu Dnase. Par bleu de toluidine

par HCL

Identification des streptocoques :

- Gélose au sang. - test a la bacitracine - test a l’optochine - Le sérotypage a une importance capitale dans le classement des Streptococcus, la plupart des antigènes recherchés sont des antigènes de paroi.

La galerie API : •

C’est une galerie de 10 microtubes prêts à l’emploi contenant un susbtrat déshydraté, permettant de réaliser 10 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles à Gram (–) appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE

Antibiogramme : •

Le milieu de culture est MULLER HINTON pour toutes les bactéries sauf les streptocoques et les gonocoque (on utilise le gélose au sang) .

antibiogramme de Proteus

Cas particuliers dans ECBU : • LA PRÉSENCE D’UNE LEUCOCYTURIE SANS GERME IDENTIFIÉ • Dans ce cas, on soupçonne :Le patient a déjà reçu un traitement antibiotique. On parle alors d’une d’infection urinaire "décapitée". • Dans ces cas précis, le délai de culture sera prolongé de 24 heures avant de conclure à l’absence de germe. • Les urines ont pu être contaminées par des leucocytes du vagin, en cas de vaginite lors d’un problème lors du recueil des urines. • Ces résultats peuvent traduire chez l’homme une prostatite (inflammation de la prostate), une urétrite (inflammation de l’urètre) ou une posthite (inflammation du prépuce).

Fréquence globale des germes isolés

Conclusion • L'ECBU est un examen simple et peu coûteux Il peut donner une première indication dés le 1er jour • Les bactéries les plus fréquemment rencontrées sont des entérobactéries (E.coli +++). • l'infection urinaire est très fréquente généralement peu grave... sauf chez certains patients à risque