TP 2-1 [PDF]

Zitiervorschau

École Normale Supérieure de Laghouat Master : Semestre : 03

Département de sciences naturelles

TP Extraction et dosage des métabolites secondaires

Biochimie fondamentale et appliquée

TP 2 : Extraction et quantification des phénols totaux, flavonoïdes, tannin condensés et les anthocyanes Métabolites secondaires Les métabolites secondaires Sont des produits à structure chimique souvent complexe sont très différents selon les espèces, s'accumulent en faible quantité. Ils pourraient jouer un rôle dans la défense et les relations entre les plantes et l'environnement. On distingue quatre grandes catégories de métabolites secondaires chez les végétaux : Les composés phénoliques (acides phénoliques, flavonoïdes, coumarines et tanins), les saponines, les alcaloïdes et les composés terpéniques (huiles essentielles).

Les objectifs L'objectif de ce travail est de faire une extraction des métabolites secondaire comme les polyphénols présentent dans une plante et de doses les polyphénols totaux, flavonoïdes, tannin condenses et les anthocyanes par un dosage spectrophotométrique.

Méthodologie Matériales •

Folin-Ciocalteu, Na2CO3, l’acide gallique, Eau distillée, Méthanol.

• •

AlCl3, Quercétine, Ethanol, Méthanol. Vanillin, HCl, Catéchine, Méthanol

•

HCl, Ethanol.

Quantification des phénols totaux Ce dosage est basé sur une technique dont la quelle on utilise le réactif de Folin-Ciocalteu proposé en 1965 par Singleton et Rossi. L’évaluation quantitative des phénols est réalisée par un spectrophotomètre l’UV-visible. Principe : Le principe de cette technique se base sur la coloration en bleue issue de sa réduction par les phénols existants dans l’extrait. Les composés phénoliques réagissent en en milieu basique (pH ~ 10) avec 1

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le RF-C. En effet, dans ces conditions, la dissociation d'un proton phénolique mène à un anion phénolate, qui est capable de réduire le RFC par des réactions réversibles. L’absorption est mesurée à 760nm. L’indicateur est composé par un mélange de l’acide phosphotungestique (H3PW12O40), et l’acide phosphomolybdique (H3PMo12O40). La teneur en phénols totaux est exprimée par rapport l’acide gallique (Phénol standard pour réaliser la courbe d’étalonnage). F-C → F-C+ Polyphénols Jaune Bleu . Protocole : •

Préparez les réactifs : -

F-C 10% : 1ml FC + 9ml Eau distillée

-

Na2CO3 4% : 4g Na2CO3 + 100 ml Eau distillée

-

l’acide gallique: 1 mg/ml [une série de concentration croissante 0.1-0.6]

-

L’extrait : 2mg/ml ou 1 mg/ml

• Les étapes:

[AG] mg/ml

0

ABS 1 (nm)

0

ABS 2 (nm)

0

ABS 3 (nm)

0

ABS (nm)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0. 5

0.6

L’extrait

2

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Les teneurs en phénols des extraits [ ] :

Example de calcule : Extrait des fruits de date o o o o o

ABS : 1.478 (nm) nd : 4 fois pent : 3.4413 (ɛ *l) Vd : 10 (ml) (le volume d'où le résidu d'extraction est dissous) Mass : 20.1066(g) Teneurs des phénols totaux =

𝑨𝑩𝑺 ×𝒏𝒅 𝑽𝒅 × 𝑷𝒆𝒏𝒕 𝒎𝒂𝒔𝒔

=

𝟏.𝟒𝟕𝟖 ×𝟒 𝟏𝟎 × 𝟑.𝟒𝟒𝟏𝟑 𝟐𝟎.𝟏𝟎𝟔𝟔

= 0.8544 mg EAG/g MS

= 85.44 mg EAG/100 g MS

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Quantification des flavonoïdes Principe : Ce dosage est basé sur la technique modifiée par Lamaison et Carnat (1991), qui utilise le trichlorure d’aluminium comme réactif. Le trichlorure d’aluminium forme un complexe stable avec un groupement carbonyle C4 Et les groupements hydroxyles C3 et C5 des flavones et flavonols, et composants non stables avec des groupement dihydroxyles ortho du cycle A ou B des flavonoïdes. La couleur de ce complexe est jaune, la meilleure absorbance est à 430nm. La quercétine est utilisé comme étalon pour réaliser la courbe d’étalonnage. Protocole : •

Préparez les réactifs : -

AlCl3 2% : 2g AlCl3 + 100 ml Ethanol

-

Quercétine : 0.1 mg/ml [une série de concentration croissante 0.01-0.06]

-

L’extrait : 2mg/ml – 1 mg/ml

• Les étapes:

[Qu] mg/ml

0

ABS 1 (nm)

0

ABS 2 (nm)

0

ABS 3 (nm)

0

ABS (nm)

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0. 05

0.06

L’extrait

4

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Les teneurs en flavonoïdes des extraits [ ] :

Quantification des tannins condensés : Principe : Les tanins condensés totaux ont été déterminés comme décrit par Price, Van Scoyoc et Butler (1978). La meilleure absorbance est à 500nm. La Catéchine est utilisée comme. Protocole : •

Préparez les réactifs : -

Vanillin 1%: 1g Vanillin + 100 ml Méthanol

-

HCl 4%: 4/P mL HCl + 100-(4/P) mL Méthanol (21.62 ml de HCl (37%=P) complète jusqu’à 100 ml)

-

Réactif finale : (Vanillin:HCl) (1:1) (V:V)

-

Catéchine: 2 mg/ml [une série de concentration croissante 0.6-1.6]

-

L’extrait : 2mg/ml – 1 mg/ml

• Les étapes:

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[Qu] mg/ml

0

ABS 1 (nm)

0

ABS 2 (nm)

0

ABS 3 (nm)

0

ABS (nm)

0

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

L’extrait

Les teneurs en tannins condensés des extraits [ ] :

Quantification des anthocyanines : Protocole : La concentration d'anthocyanine a été déterminée selon la procédure décrite par Ouchemoukh et al, 2012. Un gramme de fruit ou matière végétale écrasé mélangé avec 10 ml de solution éthanolique (éthanol / HCl (1,5 M)) (85:15, v / v) et laissé reposer dans l'obscurité à 4 ° C pendant une nuit. Après filtration, l'absorbance mesurée à 530 nm. Les concentrations d'anthocyanes sont obtenues en utilisant un coefficient d'extinction ε= 38,000 L*mol-1*cm-1. Les résultats sont exprimés en (mg/g DW).

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