TNHoasinh Phong [PDF]

Zitiervorschau

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH 1.1.

Mục tiêu của bài thí nghiệm:

Tìm hiều về enzyme α-amylase Nắm rõ quy trình, nguyên tắc cách xác định hoạt độ enzyme Nắm rõ về hoạt tính xúc tác α-amylase trong xúc tác thủy phân tinh bột thành dextrin. 1.2.

Nguyên tắc thí nghiệm:

Alpha amylase (EC 3.2.1.1) là một enzyme có khả năng thủy phân ngẫu nhiên liên kết α-1,4 glucosidic trong tinh bột để tạo thành các đoạn dextrin ngắn (Van Oort, 2010). Alpha amylase có nhiều trong các loại hạt nói chung và đại mạch nói riêng. Thông thường, những hạt đại mạch chưa nảy mầm không có hoặc có rất ít hoạt độ amylase. Tuy nhiên, trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, hoạt độ amylase tăng lên đáng kể. enzyme này có tác dụng xúc tác quá trình thủy phân của tinh bột có trong các hạt thành các đoạn dextrin ngắn, cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho việc nảy mầm. Amylase nói chung và α-amylase nói riêng, có vai trò quan trọng trong công nghiệp nhất là công nghiệp thực phẩm. Chúng được sử dụng nhiều nhất trong các ngành công nghiệp sản xuất bia rượu, mạch nha và bánh mì. Sự thủy phân tinh bột của α-amylase có thể tóm lược thông qua phương trình sau:

Tinh bột

α-amylase

Dextrin phân tử lượng thấp

Phương pháp Wohlgemuth dựa trên nguyên tắc tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân tinh bột thành dextrin đến 30 phút ở 37 oC có Cl- làm chất hoạt hóa. Dùng iodine 0.3% để kiểm tra sự có mặt của tinh bột, nếu trong mẫu thí nghiệm vẫn còn xuất hiện phức chất màu xanh tím chứng tỏ enzyme alpha-amylase vẫn chưa thủy phân hết lượng tinh bộ có trong mẫu.

1.3.

Tiến hành.

1.3.1. Dụng cụ và hóa chất: -

11 ống nghiệm

-

Pipet 1ml ( 4 cái)

-

Tủ ấm

-

NaCl 0.5%

-

Tinh bột 0.5%

-

H2SO4 10%

-

Iodine 0.3% trong KI 0.3% 1.3.2. Chuẩn bị dịch chiết amylase:

Cân khoảng 10g malt xay cả vỏ, chuyển vào bình định mức 1000ml, định mức đến 100ml, lắc thật kỹ. Ngâm 15 phút, thỉnh thoảng lắc đều bình định mức. Lọc qua 2 lần giấy lọc mịn thu được dịch trong suốt chứa enzyme amylase (có thể dùng dung dịch alpha amylase đã pha loãng để thay thế) Malt đã nghiền mịn

Định mức 100ml trong

Ngâm

Lọc lần 1

Lọc lần 2

Enzyme amylase

Sơ đồ 1.1 Quy trình chiết dịch enzyme amylase từ malt

Hình 1.1. Chuẩn bị chiết dịch enzyme amylase từ malt 1.3.3. Tiến hành pha loãng 10 ống nghiệm: -

Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự Hút vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch NaCl 0.5% Trong ống nghiệm 1 cho vào 1ml dung dịch amylase và lắc thật kỹ Sau đó lấy 1ml từ ống nghiệm cho vào ống nghiệm 2, lắc kỹ và lặp lại cho tới ống nghiệm thứ 10 thì hút 1ml và bỏ đi Trong mỗi ống nghiệm cho vào 1ml dung dịch hồ tinh bột 0.5% để lắc đều, để ở tủ điều nhiệt ở 37oC. Sau 30 phút lấy ra và thêm vào mỗi ống 1ml H2SO4 10% và 2 giọt iodine trong KI lắc đều

10 ống nghiệm

Cho vào mỗi ống 1ml đ NaCl 0.5%

Chuẩn bị ống nghiệm 1 (lắc kỹ)

1ml dd amylase

Chuẩn bị ống nghiệm 2 (lắc kỹ)

1ml dd từ ống nghiệm 1

Lặp lại đến ống thứ 10 1ml từ ống nghiệm 9

10 ống nghiệm đã pha loãng

Sơ đồ 1.2 Quy trình pha loãng 10 ống nghệm

1.3.4. Khảo sát hoạt độ enzyme amylase Lấy ống nghiệm còn lại (ống thứ 11) cho 3ml nước cất, 2 giọt thuốc thử iodine trong KI, so sánh màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzyme thấp nhất thủy phân hoàn tòa tinh bột thành dextrin.

10 ống nghiệm đã pha loãng

Cho vào mỗi ống 1ml dd hồ tinh bột 0.5%

Để vào tủ điều nhiệt 370C trong 30 phút

Cho vào mỗi ống 1ml dd H2SO4 10%

Cho vào mỗi ống 2 giọt iodine trong KI và lắc đều

3ml nước cất

2 giọt iodine trong KI

Chuẩn bị ống nghiệm số 11

So sánh màu

Kết quả

Sơ đồ 1.3 Quy trình khảo sát hoạt độ enzyme amylase được trích dịch từ malt

1.4.

Ống

Kết quả:

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

nghiệm Nồng độ pha loãng Nồng độ enzyme Màu

2

4

8

16

32

64

128

256

n/ 2 v

n/4

n/8

n/16

n/32

n/64

n/128 n/256 n/512 n/1024

v

v

v

v

v

n

x

512

x

1024

x

Chú thích: V: Vàng N: Nâu X: Xanh Tính toán: Lượng enzyme (n) được cho vào ống nghiệm (1):

n=

mxV 1 V2

Trong đó: V1- thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml) V2- thể tích dịch chiết enzyme (100ml) m- Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (mg) Ta được kết quả: n=

100 0 0.1 =100( mg) 100

Một đơn vị Wohlgemuth (W): W=

n 100 = =1.25 Fx 5 16 x 5

Trong đó: F- Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu trung với màu của ống nghiệm thứ 11).

Công thức phải chia 5, vì theo định nghĩa, đơn vị Wohlgemuth được tính trên 1mg tinh bột, trong bài chúng ta sử dụng tinh bột 0.5% tương đương lượng 5mg. Ta chọn F = 16, ống nghiệm thứ 4 là ống nghiệm có độ pha loãng lớn nhất có màu trùng với màu của ống nghiệm thứ 11. Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1ml dịch chiêt enzyme (NW): N w=

n 100 = =80 V 1 xW 1 x 1.25

Hình 1.2. Ống nghiệm sau khi khảo sát

Ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5, 6 tinh bột bị thủy phân hoàn toàn nên dung dịch có màu vàng nhạt, màu giống với ống nghiệm 11.

Hình 1.3. So sánh màu ống nghiệm 11 và các ống nghiệm khác

Hình 1.4. Ống nghiệm số 4 có màu sắc giống với ống nghiệm 11 Ống nghiêm 6 là ống có nồng độ enzyme thấp nhất thủy phân hoàn toàn tinh b ột thànhdextrin. Ống nghiệm 7 có màu nâu do một phần tinh bột chưa bị thủy phân. Các ống nghiệm 8, 9, 10 có độ pha loãng cao, nồng độ enzyme α-amylase th ấp không đủ để thủy phân hoàn toàn tinh bột nên ống nghiệm có màu xanh tím do tinh bột không bị thủy phân và tạo phức với Iodine. 1.5. Bàn luận Amylase là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng trong các ngành nh ư công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt đối với ngành công nghiệp th ực phẩm.

Kết quả bài thí nghiệm đã xác định hoạt tính của enzyme: α-amylase có trong đậu nành. α-amylase có hoạt tính cao nhất đối với cơ chất là tinh bột tiếp theo là cyclodextrin, glicogen, maltotriose. α-amylase mà tinh bột sẽ được thủy phân thành dextrin, maltose, glucoseNồng độ enzyme càng lớn thì lượng tinh bột bị thủy phân càng nhiều.

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 3: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASE 3.1.

Mục tiêu thí nghiệm:

Qua bài thí nghiệm, bước đầu biết cách khảo sát hoạt độ của 1 enzyme ở các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt độ của nó (nhiệt độ, pH, thời gian…) Tính toán các kết quả thu được từ thí nghiệm từ đó đưa ra các kết luận 3.2.

Nguyên tắc:

Enzyme Invertase là một enzyme thủy phân Saccharose thành Glucose và Fructose. Lượng Glucose sinh ra được xác định gián tiếp qua bước định phân dung dịch Iodine dư với Na2S2O3 .

(1) I 2 + 2NaOH ==> NaIO + NaI + H2O (2) NaIO + CH2OH - (CHOH)4 – CHO ==> NaI + CH2OH-(CHOH) 4 –COOH (3) 2NaIO + 2NaI + 2H2SO4 ==> I2 + 2Na2SO4 + 2H2O (4) I2 + 2Na2S2O3 ==> 2NaI + Na2S4O6 Phản ứng (1) và (2) xảy ra trong bóng tối. Toàn bộ lượng Iod dư tồn t ại trong mu ối s ẽ được chuyển trở lại thành Iod (3) và sau đó được định phân (4). Từ lượng Iod d ư được xác định bằng chất chuẩn Na2S2O3 , tính được số mol Glucose t ạo thành (c ũng chính là số mol Saccharose bị thủy phân) thông qua sự chênh lệch lượng NaIO ở phương trình (1) và (3). 3.3. Tiến hành điều chế dung dịch urease: 3.3.1. Dụng cụ hóa chất: Cốc thủy tinh 100-250ml Bình tam giác 250ml Pipette 2ml-10ml Buret 25ml Phễu thủy tinh Saccharose 10% NaOH 0,1N: hòa tan 2 g NaOH cho đủ 500 ml bằng nước nước cất. Iodine 0,1N: cân 20 g KI và hòa tan với 50 mL nước cất. Cân 12.7 g I 2 cho và bình c ầu trên và lắc cho đến khi tan hoàn toàn. Nhỏ 3 giọt 37% HCl. Định mức cho đủ 500 ml bằng nước cất.

H2SO4 1N: hòa tan 13.85 ml H2SO4 96% cho đủ 500 ml bằng nước cất. Hồ tinh bột 1%: 1 g hồ tinh bột hòa tan trong 100 ml. Đun cách thủy trong 15 phút. Dung dịch Na2S2O3 0,05N: cân 6.25 g Na2S2O3.5H2O trong nước cất cho đủ 500 ml. 3.3.2. Tiến hành thí nghiệm Điều chế dung dịch invertase: cân 1g men bánh mì, hòa tan vào 50ml nước cất, cho vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch, lắc đều trong 5 phút. Để lắng, lọc lấy dịch lọc. Thực hiện 3 ống nghiệm như sau: Bảng 3.1. Các ống nghiệm cần chuẩn bị Ống nghiệm

1

2

3

Dung dịch saccharose 10%(ml)

0

10

10

Nước cất (ml)

10

0

0

Dịch enzyme (ml) Dịch enzyme đã đun cách thủy

10 0

10 0

0 10

Sau khi chuẩn bị xong 3 ống nghiệm thì để ở nhiệt độ thường chính xác 30 phút thì đem đi đun cách thủy 10 phút. Sau đó hút 5mL dung dịch ở từng ống nghiệm ra các erlen có đánh số tương ứng.

Hình 2.1. Tiến hành đun cách thủy các ống nghiệm đã chứa các thành phần

Xác định glucose: thêm vào mỗi bình tam giác 10ml dung dịch iodine 0,1N và 15ml NaOH 0,1N. Chú ý nhỏ chậm từng giọt NaOH vào sao cho th ời gian nh ỏ kéo dài kho ảng 2 phút (việc này đảm bảo cho nồng độ NaIO được kiểm soát, phản ứng (2) sẽ x ảy ra t ốt hơn). Để yên trong bóng tối 20 phút. Lấy ra, thêm vào 2ml H2SO4 1N. Định phân l ượng iodine thêm thừa bằng Na2S2O3 0,05N với hồ tinh bột 1% làm ch ất ch ỉ th ị. L ặp l ại thí nghiệm 3 lần. Chuẩn độ đến khi dung dịch chuyển từ nâu thành tím rồi thành trong su ốt (r ất d ễ nh ận ra)

Nấm men

Hòa tan, khuấy đều

Chuẩn bị ống nghiệm

Lọc lấy dịch

Để ở yên 30ph

Đun cách thủy 10ph

Lắc đều

Xác định glucose

10ml dung dịch iodine0.1N và 15ml NaOH 0.1N

2ml H2SO4,

Xử lý, tính toán

Na2S2O3 0,05N Kết quả

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình thực hiện xác định hoạt độ Invertase

3.4. Kết quả 3.4.1. Cách tính toán: Hoạt độ của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose bị thủy phân bởi lượng ezyme có trong 1g men bánh mì trong 1 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Hoạt độ I này có giá trị là: I = (V1 – V2 )× A × B / (1000 × 20 × 2 × a × b × t × m) Trong đó: V1 : số ml Na2S2O3 0,05N dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1 V2 , V3 : số ml Na2S2O3 0,05N dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 2, 3 A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm (ml) a: thể tích dung dịch đem đi xác định glucose (ml) B: tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m (g) men bánh mì (mL) b: thể tích dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (mL) t: thời gian thủy phân (phút) 3.4.2. Tính Toán Bảng 3.2. Kết quả chuẩn độ

Mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3

V1 19.2 18.8 19

Đối với tất cả các mẫu: A = 20 mL B = 50 mL a = 5 mL b = 10 mL t = 30 phút m=1g Đối với dịch enzyme không đun cách thủy:

V2 7.4 5.8 7.0

V3 17.4 18.6 18.2



I1= (V1 – V2 ) × A × B / (1000 × 20 × 2 × a × b × t × m)

= (19.2 –7.4 ) × 20 × 50 / (1000 × 20 × 2 ×5 × 10 × 30 × 1) = 1.9667×10-4 

I2= (V1 – V2 ) × A × B / (1000 × 20 × 2 × a × b × t × m)

= (18.8 –5.8 ) × 20 × 50 / (1000 × 20 × 2 ×5 × 10 × 30 × 1) = 2.1667×10-4 

I3= (V1 – V2 ) × A × B / (1000 × 20 × 2 × a × b × t × m)

= (19 –7 ) × 20 × 50 / (1000 × 20 × 2 ×5 × 10 × 30 × 1)) = 2×10-4  ´I = 2.04467×10-4 Độ lệch chuẩn SD: SD

¿

√

2

2

( 1.9667 × 10−4 −2.04467 ×10−4 ) + ( 2.1667 ×10−4 −2.04467× 10−4 ) + ( 2× 10−4 −2.04467 ×10−4 ) 2

=1.0716×10-5

Hoạt độ của Enzyme Invertase được xác định: −5

SD 1.0716× 10 I = ´I ± t × =2.04467 ×10−5 ± 4.3 × 3 √n ¿ 2.04467 ±1.535 ×10−5 ¿)

Đối với dịch enzyme đã đun cách thủy: 

I1= (V1 – V3 ) × A × B / (1000 × 20 × 2 × a × b × t × m)

= (19.2 –17.4 ) × 20 × 50 / (1000 × 20 × 2 ×5 × 10 × 30 × 1) = 3×10-5 

I2= (V1 – V2 ) × A × B / (1000 × 20 × 2 × a × b × t × m)

= (18.8 –18.6 ) × 20 × 50 / (1000 × 20 × 2 ×5 × 10 × 30 × 1) = 3.3333×10-5 

I3= (V1 – V2 ) × A × B / (1000 × 20 × 2 × a × b × t × m)

= (19 –18.2 ) × 20 × 50 / (1000 × 20 × 2 ×5 × 10 × 30 × 1) = 1.3333×10-5  ´I = 2.5333×10-5 Độ lệch chuẩn SD:

2

SD

¿

√

2

2

( 3 × 10−5−2.5333 ×10−5 ) + ( 3.3333 ×10−5 −2.5333× 10−5 ) + ( 1.3333 ×10−5−2.5333 ×10−5 ) 2

2

=¿

1.0715×10-5 =1.0715×10-5 Hoạt độ của Enzyme Invertase được xác định: I = ´I ± t ×

SD 1.0715× 10−5 =2.5333× 10−5 ± 4.3 × 3 √n ¿ 2 5. 333 ±3.5717 × 10−6 ¿)

3.5.

Bàn luận

Ta thấy, hoạt độ của enzyme không đun cách thủy gấp hơn 8 l ần so v ới enzyme đã bị đun cách thủy. Khi đun cách thủy thì enzyme invertase sẽ bị bất hoạt (ho ạt độ gần bằng 0), kết quả thu được có kết quả xấp xỉ bằng 0 nhưng vẫn chưa bằng 0. Giải thích cho v ấn đề này, s ự sai lệch có thể xuất phát từ việc đun sôi chưa đạt đến điều kiện để cho enzyme bị bất hoạt. Kết quả bài thí nghiệm cho thấy khi đun cách thủy thì enzyme bị ức ch ế làm gi ảm hoạt độ.