TD 1 Chromatographie [PDF]

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TD : La chromatographie

Exercice 1 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 ml / min) : MM

tr (min)

Aldolase

145000

10,4

Lactate déshydrogénase

135000

11,4

Phosphatase alcaline

80000

18,4

Ovalbumine

45000

26,2

Lactoglobuline

37100

28,6

 

1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve Que remarquez-vous ? 2 - Pour la glucokinase, tr = 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du graphique précédent. Existe t'il une autre méthode pour déterminer la MM ? Exercice N°2 : Exercice 2 : On veut séparer 3 acides-aminés : l'acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-). Les pH isoélectriques de l'acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, à 25 °C. On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en amenant progressivement le pH à 7. Question : 1 - Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interactions acide aminé-résine sont uniquement d'ordre électrostatiques).

Exercice 3 : La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxyméthyls (-CH2COOH). Questions : 1 - Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76). 2 - Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CMcellulose à pH 7 ? (On considérera que les interactions protéine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre électrostatiques). Exercice 4 : Le coefficient de partage de l'iode (I2) entre les deux solvants non-miscibles : tétrachlorométhane et eau, est égal à 100 à 25 °C. À 10 ml de solution aqueuse d'iode à 10 g/l, on ajoute 10 ml de tétrachlorométhane (CCl4). Donnée : I2 est plus soluble dans le tétrachlorométhane que dans l'eau. Question : Déterminer la concentration en iode dans le tétrachlorométhane et dans l'eau, après agitation et décantation. Exercice 5 :

On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d'une protéine p par chromatographie d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM. L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les volumes d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant : MM (Da)

Ve (ml)

Dextran

2000000

45

Fibrinogène

340000

60

Catalase

230000

75

Lactoglobuline

19000

132

 

Questions : 1 - Rappeler à quoi correspond le Dalton. 2 - La protéine p montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM. Exercice 6 : Une enzyme a été purifiée en trois étapes, en partant de 1000 g d'un extrait brut

Exercice 7 : Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6. Question : 1 - Dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ? Exercice 8 :  Un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM = 67000 Da) est déposé sur colonne de séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da). Rappel : MM = masse moléculaire. Question : 1 - Tracer un diagramme d'élution vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le volume mort

Exercice 9 :  Marquage radioactif d'une sonde nucléotidique :

Lors du criblage d'une banque (d'ADNc ou génomique) ou de la réalisation d'un northern blot, southern blot, ou pour des expériences d'hybridation in situ, il est nécessaire de réaliser une sonde nucléotidique radiomarquée au 32P. Le marquage d'une séquence d'ADN est réalisé par la technique de "random-priming" (multi-amorçage au hasard) qui utilise un mélange de courts oligonucléotides (6 à 9 nucléotides) comportant une combinaison de toutes les séquences possibles. Le marquage radioactif (incorporation d'ATP marqué par le 32P) s'effectue après dénaturation de la séquence d'ADN double brin qui va être utilisée comme matrice, et appariement du mélange de courts oligonucléotides. L'enzyme T4 ADN polymérase va permettre la polymérisation en 5' des amorces, dans le sens 5' vers 3'. La séquence d'ADN est incubée 30 min à 37 °C en présence de 32P déoxy-ATP.et des 3 autres nucléotides (dCTP, dGTP, dTTP) non radiomarqués. Ceci conduit à la synthèse d'un mélange d'amorces radiomarquées de quelques centaines de nucléotides de long.

Le mélange réactionnel ainsi obtenu est chargé sur une colonne de Séphadex G-50, des fractions de 100 ml sont recueillies et la radioactivité est comptée ( voir tableau ci-après).

Fraction cpm/ml 1

100

2

150

3

700

4

1000

5

630

6

140

7

480

8

1200

9

1500

10

1300

11

750

12

470

13

130

Schéma tiré de : Biologie moléculaire et médecine - JC. Kaplan, M. Delpech - Médecine-Sciences Flammarion. Questions : 1 - Quel est le type de chromatographie employé ici ? Donner son principe (une demi-page). 2 - Tracer le diagramme exprimant la radioactivité en fonction du n° de fraction. A quoi correspond le premier pic de radioactivité ? A quoi correspond le second pic ? Quelle(s) fraction(s) allez vous récupérer afin de vous en servir comme sonde radiomarquée ? 3 - Quel est le volume mort de la colonne ?

Correction TD Chromatographie Exercice N°1 1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appelée : tamisage moléculaire, gel filtration, perméation de gel). La connaissance du débit de la colonne (5 ml / min) et des différents temps de rétention nous permet de calculer le volume d'élution pour chaque composé (voir tableau), selon la relation : Ve (volume d'élution) = d (débit) x tr (temps de rétention) La représentation graphique du log de la masse moléculaire (log MM) qu'il faut calculer préalablement (voir tableau) en fonction du volume d'élution (Ve) nous donne une droite :  

MM

Log MM

tr (min)

Ve (ml)

Aldolase

145000

5,16

10,4

52

Lactate déshydrogénase

135000

5,13

11,4

57

Phosphatase alcaline

80000

4,9

18,4

92

Ovalbumine

45000

4,65

26,2

131

Lactoglobuline

37100

4,57

28,6

143

Le fait de visualiser une droite signifie qu'aucune protéine n'est exclue du gel.

2 - La glucokinase, avec un temps de rétention de 21 min, est éluée à un volume d'élution de 5 x 21 = 105 ml. Il suffit de se reporter au graphe pour déterminer un log de MM = 4,82 environ, soit une masse moléculaire de 66070 Da (ou 66070 g/mol ou 66,07 kDa), environ. Ici, on a tracé le logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution : log MM = f (Ve). L'autre représentation serait de porter le logarithme de la masse moléculaire en fonction du KAV, le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f (KAV). KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm) Mais pour cela, il faudrait connaître le volume mort (Vm) et le volume total de la colonne (Vt).

Exercice N°2 1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie échangeuse d'ions. Une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-) est chargée négativement et est donc une résine échangeuse de cations. Lorsque le pH est supérieur au pHi (pH > pHi), l'acide aminé est chargé négativement (forme anionique). Lorsque le pH est inférieur au pHi (pH < pHi), l'acide aminé est chargé positivement (forme cationique). Le tableau ci-dessous donne les charges des 3 acids aminés, à pH = 2 et à pH = 7. acide aminé : Acide L-Glutamique (Glu) L-Leucine (Leu) L-Lysine (Lys)

pHi : 3,22 5,98 9,74

charge à pH = 2 : + + +

charge à pH = 7 : +

Ainsi, à pH = 2, les trois acides aminés sont chargés positivement, et seront retenus lors du passage sur la colonne. A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargés négativement, seront élués. Lys reste fixé à la colonne. Glu est élué en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98).

Exercice 3 : 1 - Proportion des groupements carboxyméthyls (pKa = 4,76) chargés négativement aux pH : 1, 4,76, 7 et 9. Le pH est donné par la relation suivante :

À pH = 1 :

= pH - pKa = 1 - 4,76 = -3,76    donc :

= 1,74 10-4

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 1,74 10-4.(A),    on en déduit que (A) + 1,74 10-4. = 100 (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 1,74 10-4)

(A

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,98 % et (B) = 0,02 % À pH = 4,76 :

= pH - pKa = 4,76 - 4,76 = 0    donc :

=1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A),    on en déduit que (A) + (A) = 100 (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(2) On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 % À pH = 7 :

= pH - pKa = 7 - 4,76 = 2,24    donc :

= 173,78

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A),    on en déduit que (A) + 173,78(A) = 100 (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(174,78) On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) = 99,425 % À pH = 9 :

= pH - pKa = 9 - 4,76 = 4,24    donc :

= 13378

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A),    on en déduit que (A) + 13378(A) = 100 (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(13379) On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 5,73 10-3 % et (B) = 99,994 % Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-CH2-COOH). À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme basique (-CH2-COO-) 2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,425 % sous forme basique, chargée négativement (-CH2-COO-). Protéine :

pHi :

Charge à ph = 7 :

Ovalbumine Cytochrome c Lysozyme

4,6 10,65 11

négative positive positive

Ainsi, seule l'ovalbumine, qui à pH = 7 est chargée négativement, ne sera pas retenue sur la colone. Le cytochrome c et le lysosyme seront retenus.

Exercice 4 : Coefficient de partage de l'iode dans le tétrachlorométhane et l'eau. D'après les données de l'exercice, on peut écrire les deux égalités suivantes :

On peut en déduire que :

Concentration dans le tétrachlorométhane (solvant organique) = 9,9 g/l Concentration dans l'eau (solvant aqueux) = 0,099 g/l

Exercice 5 : 1 - Le Dalton est une unité de masse atomique et correspond à 1,66 . 10-27 kg. La masse moléculaire d'un composé s'exprimera soit en dalton (Da), soit en grammes par mole (g/mol). Noter que l'abréviation de dalton s'écrit avec un D majuscule : Da et que le kilodalton s'écrit kDa. 2 - Afin de déterminer la masse moléculaire (MM) de la protéine p (Ve = 113 ml), il faut au préalable tracer la représentation du log (masse moléculaire) = f(Ve). Le schéma ci-dessous représente le tracé de log (MM) = f(Ve pour les composés suivants : Dextran, Fibrinogène, Catalase et Lactoglobuline. Une colonne a été rajoutée dans le tableau pour le calcul du log de la masse moléculaire :  

MM (Da)

Ve (ml)

log MM

Dextran

2000000

45

6,3

Fibrinogène

340000

60

5,53

Catalase

230000

75

5,36

Lactoglobuline

19000

132

4,28

Il suffit de reporter sur le tracé : log (MM) = f(Ve), le volume de 113 ml pour en déduire un log MM = 4,93, soit une masse moléculaire de 85114 Da ou 85114 g/mol pour la protéine p. Il est très important de noter que : - 45 ml représente le volume mort de la colonne, c'est à dire le volume d'élution des substances exclues (ici, le dextran). - 132 ml représente le volume d'exclusion des protéines totalement incluses. - la droite a été traçée en ne tenant compte que des points correspondants au fibrinogène et à la catalase, car le dextran est un composé totalement exclu, alors que la lactoglobuline est une protéine totalement incluse dans le gel. Ainsi, il aurait été totalement faux de tracer une droite à partir des points correspondant à la catalase et la lactoglobuline (qui sont les protéines dont les volumes d'élution encadrent celui de la protéine p).

Exercice 6 : Afin de remplir le tableau, il faut connaître quelques définitions : - L'activité spécifique (AS) représente un nombre d'unités enzymatiques (UE) par gramme de protéines (g) : AS = (UE / g) - Le taux de purification d'une enzyme est le rapport de l'AS mesurée après une étape de purification, sur l'AS mesurée à l'étape précédente : Taux de purification = AS après une étape / AS avant cette même étape - Le rendement correspond à un nombre d'UE mesuré après une étape de purification, sur un nombre d'UE mesuré à l'étape précédente :

Rendement = UE après une étape / UE avant cette même étape Connaissant ces définitions, on peut remplir le tableau. Il faudra rajouter une colonne supplémentaire "AS" qui nous permettra de calculer le taux de purification :

 

protéine (g) :

activité (UE) :

AS :

taux de rendement : purification :

Extrait brut

1000

20000

20

-

-

Chromato. d'exclusion

200

14000

70

3,5 fois

70 %

Chromato. d'échange d'ions

15

4500

300

4,28 fois

32 %

Chromato. d'affinité

0,5

3500

7000

23,3 fois

77,7 %

On pourra utilement calculer : - Le taux global de purification, qui est égal à l'AS mesurée à la fin de toutes les étapes, divisée par celle de départ. Ici, le taux global de purification est égal à 7000 / 20 = 350. - Le rendement global qui est égal à 3500 / 20000 = 17,5 %, Conclusion : Suite aux différentes étapes de purification, on a pu récupérer 3500 unités, sur les 20000 que l'on avait au départ, soit 17,5 %. L'enzyme a été purifiée 350 fois.

Exercice 7 :

Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6. Question : dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ? Si les trois acides aminés ont été retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a été réalisée à un pH inférieur au plus petit des pHi, soit un pH inférieur à 2,87, afin que les acides aminés se présentent sous une forme chargée positivement et qu'ils puissent être retenus sar la résine échangeuse de cations, chargée négativement.

Acide aminé : pHi Charge à pH < 2,87 Charge à pH 6 Asp 2,87 + Leu 6 + neutre (50%/50%) Arg 10,76 + + À un pH de 6, Asp est chargé négativement; il est donc élué de la colonne. La leucine est ensuite éluée. L'Arginine, toujours chargée positivement à pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas éluée.

Exercice 8 : Voici un diagramme d'élution vraisemblable pour une chromatographie d'exclusion séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da), sur laquelle on aurait déposé un un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM = 67000 Da). Ici on a représenté la mesure de la densité optique (DO) de l'éluat en fonction du volume d'élution (Ve).:

Les IgG présentent une masse moléculaire supérieure à la valeur de la limite d'exclusion de la colonne (100000 Da). Elles seront donc éluées en premier, et donneront la valeur du volume mort de la colonne (Vm = Ve IgG) L'albumine de masse moléculaire 67000 g/mol, sera incluse dans le gel et éluée plus tard, avec un Ve albumine qui est égal à Vm + Ve' albumine

Exercice 9 : 1 - Le type de chromatographie utolisé ici est la chromatographie d'exclusion, ou tamisage moléculaire, gel filtration. (Faire un schéma). 2 - On peut tracer directement le nombre de cpm / ml en fonction du numéro des fractions, ou bien le nombre de cpm par fraction, en fonction du numéro des fractions (ce que l'on a fait ci-desous.

Le premier pic correspond à des composés exclus du gel, donc de haute masse moléculaire : la sonde radiomarquée. Le second pic correspond à des composés retenus dans le maillage du gel d'exclusion : les nucléotides libres : le 32P dATP ainsi que le dCTP, le dGTP et le dTTP. Les fractions 3, 4 et 5 sont mélangées afin de constituer la sonde. 3 - Rappel : le volume mort est le volume d'élution des composés dont le diamètre est supérieur à celui des pores du gel d'exclusion. Ici, cela correspond à la quatrième fraction. Le volume mort est donc de 400 microlitres.