Studiul Genelor [PDF]

Zitiervorschau

12/11/2009

Metode de analiză a genelor

Expresia genelor

Expresia genelor

ADN  ARNm  Proteină  Caracter

ADNmut ARNmmut  Proteinăan  Caracteran

5’-ATTGCAAGATTACCATGT 5’ATTGCAAGATTACCATGT--3’ Catena codogenă (netranscrisă) 3’--TAACGTTCTAATGGTACA 3’ TAACGTTCTAATGGTACA--5’ Catena anticodogenă (transcrisă)

5’-ATT 5’ATTA ACAAGATTACCATGT CAAGATTACCATGT--3’ mutaţie G4→A 3’--TAA 3’ TAAT TGTTCTAATGGTACA GTTCTAATGGTACA--5’

Transcripţie 5’--AUUGCAAGAUUACCAUGU 5’ AUUGCAAGAUUACCAUGU--3’

Transcripţie 5’--AUU 5’ AUUA ACAAGAUUACCAUGU CAAGAUUACCAUGU--3’

ARNm

Translaţie Leu – Ala – Arg – Leu – Pro – Cys

ARNmmut

Translaţie polipeptid

Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys

polipeptidan

Maturizare Caracter fenotipic normal

Caracter fenotipic anormal

Utilizarea tehnicilor de analiză a acizilor nucleici în medicină

Analiza genelor

Analiza ADN:

ADN

ARN

Proteine

Secvenţiere

Northern-blot

Western-blot

PCR

RT–PCR

Secvenţiere

Southern-blot

Hibridare in situ

Analiza funcţiei

Hibridare in situ

Analiza histochimică

depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al bolilor genetice (prenatal, postnatal precoce); identificarea polimorfismului individual → dactiloscopie genomică (analiza filiaţiei); depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul bolilor infecţioase şi gradului de infectare. Analiza ARNm: analiza expresiei genice ţesut-specifică; evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice.

1

12/11/2009

Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)

RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z

12 kb 10 kb

10 kb 8 kb

6 kb

2,5 kb

6 kb

5 kb

10 kb 6 kb

4 kb

5 kb

2,5 kb 2 kb

+ M

Tehnici de analiză a genelor  PCR  Southern - blot  Secvenţierea ADN

Principii de bază  Etapele principale  Componente necesare (la general)  Indicaţii şi limite 

PCR reacţia ciclică de polimerizare Principiile PCR  clonarea in vitro = amplificare  Replicare semiconservativă, repetată  Specificitatea primerilor sintetici pentru gena– gena– ţintă  Hibridizarea ADNADN-ţintă – primer ← complementar:  Denaturare termică a ADN - de cercetat

 Modificarea ciclică a temperaturii:  Denaturare  Renaturare  Sinteză

2

12/11/2009

Clonarea in vitro – PCR (reacţia ciclică de polimerizare a noilor copii de ADN)

Componentele necesare pentru clonarea in vitro (PCR): - ADN de cercetat - Primeri specifici secvenţei de clonat – complimentari secvenţelor flancante - Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă - Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTP) - Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii: - tº de denaturare ADN - tº de renaturare (ADN+primer) - tº de polimerizare (elongarea catenelor noi de ADN)

Extragerea ADN

Electroforeza produşilor PCR

Pregătirea componentelor pentru PCR

Colorarea şi vizualizarea produşilor PCR

Etapele tehnicii PCR A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante B. Repetarea automată a procedurilor de denaturarerenaturare-elongare de 30-35 ori •Denaturarea ADN la 96oC •Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor •Elongarea catenelor ADN la 72oC C. Analiza produşilor PCR - electroforeza - colorarea - interpretarea rezultatelor

Amplificarea ADN-ţintă

Interpretarea rezultatelor

3

12/11/2009

Avantajele PCR Metodă rapidă •Metodă ieftină •Utilizarea cantităţilor mici de material analizat •Nu necesită izotopi radioactivi •Interpretarea uşoară a rezultatelor Dezavantajele PCR •Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice amplificate •Necesitatea primerilor sintetici, specifici secvenţei analizate

Identificarea inserţiilor / deleţiilor

Utilizarea PCR •Identificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidice •Identificarea mutaţiilor punctiforme (substituţiile nucleotidice) •Identificarea expresiei genice (RT (RT--PCR PCR)) •Dactiloscopia genomică (filiaţie) •Identificarea agenţilor infecţioşi •Identificarea gradului de infecţie (quantitative (quantitative PCR) PCR)

Identificarea mutaţiilor punctiforme

Identificarea agenţilor infecţioşi

4

12/11/2009

Stabilirea paternităţii (filiaţiei)

Tehnica Southern-blot  Bazată pe RFLPs  Hibridizare cu sonde marcate  Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un

suport solid (pe membrane de nitroceluloză)

Hibridarea acizilor nucleici •Unirea complementară a fragmentelor (moleculelor) de acizi nucleici: •ADN de cercetat cu •sonda oligonucleotidică •În reacţie participă molecule monocatenare •Moleculele ADNADN-ţintă sunt fixate •Moleculele Moleculele--sonde sunt marcate radioactiv sau fluorescent •Identificarea complexelor hibride se realizează prin intermediul autoradiografiei

Utilizarea tehnicii Southern--blot Southern

Tehnica SouthernSouthern-blot

Extragerea ADN

Denaturarea şi transferul ADN pe membrane

Restriţia ADN

Electroforeza ADN

Hibridare cu sonda

Autoradiografia

Vizualizarea şi interpretarea rezultatelor

RFLPs şi analiza genotipului Alela Normală cu 3 SR

• Identificarea inserţiilor / deleţiilor mari • Identificarea mutaţiilor punctiforme ce afectează SR • Dactiloscopia genomică RFLPs

Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2

C (mm) B (Nm) A (NN) Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C

5

12/11/2009

Tehnica Northern-blot Northern•Extragerea ARN din ţesutul ţintă •Electroforeza ARN în condiţii de denaturare •Transfer pe membrană de nailon •Hibridarea cu sonda marcată •Autoradiografia

Tehnica NorthernNorthern-blot

Extragerea ARN

Electroforeza ARN

Utilizarea tehnicii Northern--blot Northern •Identificarea expresiei genice în anumite ţesuturi, anumite condiţii •Identificarea variantei de splicing a proARNm •Identificarea nivelului de expresie

Hibridare cu sonda Transferul ARN pe membrane

Autoradiografia

•Identificarea agenţilor infecţioşi (ribovirusuri)

Vizualizarea şi interpretarea rezultatelor

Identificarea nivelului de expresie şi a variantei de splicing

6

12/11/2009

Secvenţierea ADN

ADNmutARNmmut  Proteinăan  Caracteran

Stabilirea secvenţei de nucleotide Metoda chimică (tehnica MaxamMaxam-Gilbert, 1973 1973)

5’-ATT ATTA ACA CAA AGATTACCATGT GATTACCATGT--3’ mutaţie G4→A 3’--TAA 3’ TAAT TGTTCTAATGGTACA GTTCTAATGGTACA--5’ Transcripţie

Metoda dideoxi (tehnica Sa Sanger, 1975 1975)

5’-AUU AUUA ACA CAA AGAUUACCAUGU GAUUACCAUGU--3’

Metoda automată (cu utilizarea agenţilor fluorescenţi)

Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys

ARNmmut

Translaţie polipeptidan

Caracter fenotipic anormal

Tehnica dideoxi

5’-ATTACA ATTACAA AGATTACCATGT GATTACCATGT--3’ catena codogenă codogenă 3’--TAA 3’ TAAT TGTTCTAATGGTACA GTTCTAATGGTACA--5’ catena anticodogenă (matriţă) 3’-TAA 3’TAAT TGTTCTAATGGTACA GTTCTAATGGTACA--5’ 5’-ATTA ATTAC C-3’

•Sinteza enzimatică a

3’-TAA 3’TAAT TGTTCTAATGGTACA GTTCTAATGGTACA--5’ 5’-ATTA ATTAC CA-3’

5’-ATTA -- primer marcat

3’-TAA 3’TAAT TGTTCTAATGGTACA GTTCTAATGGTACA--5’ 5’-ATTA ATTACA CAA A-3’

A, T, C, T – dNTP (2’ (2’-dNTP)

3’-TAA 3’TAAT TGTTCTAATGGTACA GTTCTAATGGTACA--5’ 5’-ATTA ATTACA CAA AG-3’

A, T, C, T – ddNTP (2 (2’’,3 ,3’’-ddNTP dNTP))

3’-TAA 3’TAAT TGTTCTAATGGTACA GTTCTAATGGTACA--5’ 5’-ATTA ATTACA CAA AGA-3’

P32

pentru ADN-polimerază

pentru sinteza noilor catene

pentru stoparea sintezei

ADN •Utilizarea în paralel a nucleotidelor ce conţin deoxiriboză şi dideoxiriboză •Stoparea sintezei în

3’-TAA 3’TAAT TGTTCTAATGGTACA GTTCTAATGGTACA--5’ 5’-ATTA ATTACA CAA AGA GAT T-3’

cazul incorporării ddNTP

3’-TAA 3’TAAT TGTTCTAATGGTACA GTTCTAATGGTACA--5’ 5’-ATTA ATTACA CAA AGAT GATT T-3’

5’-ATTA ATTAC CA-3’

Tehnica dideoxi

5’-ATTA ATTACA CAA A-3’ ATTACA CAA AGA-3’ A 5’-ATTA 5’-ATTA ATTACA CAA AGATT GATTA A-3’ 5’-ATTA ATTACA CAA AGATTACC GATTACCA A-3’ 5’-ATTA ATTACA CAA AGA GAT T-3’

T

A

T

C

G

-

5’-ATTA ATTACA CAA AGAT GATT T-3’ 5’-ATTA ATTACA CAA AGATTACCA GATTACCAT T-3’ 5’-ATTA ATTACA CAA AGATTACCATG GATTACCATGT T-3’

G

5’-ATTA ATTACA CAA AG-3’ 5’-ATTA ATTACA CAA AGATTACCAT GATTACCATG G-3’ 5’-ATTA ATTAC C-3’

C 5’-ATTA ATTACA CAA AGATTA GATTAC C-3’ 5’-ATTA ATTACA CAA AGATTAC GATTACC C-3’

•Extragerea ADN •Denaturarea ADN •Sinteza catenelor complementare utilizând primeri marcaţi cu 32P în prezenţa dNTP şi ddNTP •Electroforeza în condiţii de denaturare •Vizualizarea fragmentelor marcate prin autoradiografie

+ 5’-ATTA ATTACA CAA AGATTACCATGT GATTACCATGT--3’

7

12/11/2009

-

Metoda automată

(+) 5' TAAATGGCTA TAAATGGCTA.......3'(-)

+

Hibridarea in situ

Hibridarea in situ pentru depistarea secvenţelor ADN

•Pregătirea preparatelor de cromozomi •Denaturarea ADN •Hibridarea cu sonda marcată •Vizualizarea la microscopul optic

Hibridarea in situ cu utilizarea preparatelor de cromozomi metafazici

Hibridarea in situ cu utilizarea preparatelor cu nuclei interfazici

Hibridarea in situ pentru depistarea secvenţelor ARN

Hibridarea in situ cu utilizarea probei sens (stânga) şi antisens (dreapta)

Analiza histochimică – identificarea proteinelor în ţesut

8

12/11/2009

Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor nucleici: 1. Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinţelor mutaţiilor. 2. Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice - prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naşterii copiilor cu anomalii genetice sau manifestării unor patologii severe. 3. Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea vectorilor de gene etc.). 4. Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în diagnosticul bolilor infecţioase. 5. Identificarea polimorfismelor individuale în analiza filiaţiei, în criminalistică.

9