STP PHARMA - VAL ANA - 2006 - PART III Final [PDF]

Zitiervorschau

Validation des procédures analytiques quantitatives : harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches Part III. Examples of application

Validation des procédures analytiques quantitatives : harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Commission SFSTP, P. Hubert, J.J. Nguyen-Huu, B. Boulanger, E. Chapuzet, N. Cohen, P.A. Compagnon, W. Dewé, M. Feinberg, M. Laurentie, N. Mercier, G. Muzard, L. Valat

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches Part III. Examples of application

U

A

ne démarche harmonisée pour la validation des méthodes analytiques basée sur le profil d’exactitude a été proposée par une commission SFSTP sur la validation des méthodes analytiques. Cette troisième et dernière partie illustre la méthodologie ainsi que les aspects statistiques liés à son application à partir d’exemples réels d’application tels que le contrôle qualité de médicaments, la quantification d’impureté dans des matières premières, la bioanalyse ou encore la quantification de nutriments. Afin de montrer son applicabilité à différents types de méthodes, les exemples portent sur des méthodes chromatographiques (LC-UV, LC-MS) mais aussi spectrophotométrie ou encore ELISA.

harmonized approach for the validation of analytical methods based on accuracy profile was introduced by a SFSTP commission on the validation of analytical procedure. This third and last document aims at illustrating this methodology and the statistics used. Therefore the validation of real case methods are proposed such as methods for the quality control of drugs, for the quantitation of impurities in drug substances, for bioanalysis or for the determination of nutriments. Furthermore, different types of analytical methods are used in order to demonstrate the applicability of the proposed approach to a wide range of methods such as liquid chromatography (LC-UV, LC-MS), spectrophotometry or ELISA.

Mots clefs : Validation analytique – Erreur totale – Risque – Profil d’exactitude – Chromatographie liquide – Spectrophotométrie – ELISA.

Keys words: Analytical validation – Total error – Risk – Accuracy profile – Liquid chromatography – Spectrophotometry – ELISA.

I Introduction

I Introduction

Cette publication forme la dernière partie d’un triptyque destiné à décrire une nouvelle démarche harmonisée et globale de validation interne (intralaboratoire) des procédures d’analyse. La première partie avait pour but de présenter les aspects méthodologiques et conceptuels de cette démarche, dont le point central est le profil d’exactitude, et d’en préciser le vocabulaire, en particulier la typologie des plans d’expériences applicables [1]. La deuxième partie présentait les aspects statistiques et algorithmiques de la démarche et fournissait au lecteur l’ensemble des formules de calcul indispensables à la mise en œuvre pratique [2]. Cette troisième partie présente une série d’applications déjà opérationnelles dans divers domaines : le contrôle des médicaments, la quantification des impuretés dans les matières premières, l’analyse biologique et l’analyse des nutriments. Chaque exemple a été choisi car il illustre une situation spécifique, classiquement rencontrée par les analystes.

This publication consists in the third part of a trilogy intending to describe a new harmonized global approach of analysis procedure internal validation (intra-laboratory). The first part aimed at presenting the methodological and conceptual aspects of this approach, which central point is the accuracy profile, and specifying its vocabulary, particularly the applicable experimental designs typology. [1]. The second part presents the statistical and algorithmic aspects of the approach, and provides the reader with all the computation formulas, indispensable for practical implementation [2]. This third part presents a series of already operational applications in various fields: drugs control, impurities quantification in raw materials, biological analysis and food analysis. Each example has been chosen because it illustrates a specific situation, classically faced by analysts. All examples are presented in the same way. A brief reminder of the procedure provides the type of

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Le mode de présentation est le même pour tous les exemples. Un rappel succinct de la procédure fournit le type de technique analytique employée et les objectifs à atteindre. En général, une représentation graphique des données d’étalonnage et de validation illustre les données brutes et le type de plan d’expérience appliqué. Puis, le profil d’exactitude fait l’objet d’une autre figure et permet l’interprétation et la prise de décision quant à la validation de la méthode. Les données correspondantes de justesse, de fidélité, d’exactitude ainsi que les limites haute et basse de l’intervalle de tolérance sont finalement résumées dans des tableaux. Lorsque cela s’est avéré nécessaire, des limites de quantification ont été calculées. En revanche, aucune limite de détection n’a été estimée, même si la démarche proposée le permet [2]. Dans les cas où il a été nécessaire d’appliquer un coefficient de correction en fonction du taux de recouvrement, la droite de linéarité (ou de justesse) permet de comprendre comment ce coefficient a été obtenu et un second profil d’exactitude montre si la méthode peut être validée après correction. En effet, dans plusieurs cas il est apparu indispensable d’appliquer un coefficient de correction pour compenser un taux de recouvrement (ou de récupération) trop faible. Cette possibilité de déterminer un coefficient de correction cohérent pour l’ensemble du domaine d’application illustre la puissance de cette démarche. Et il faut signaler, dès à présent, que le fait de corriger les données augmente de façon tout à fait visible l’incertitude des mesures. Ce qui est en parfait accord avec la théorie métrologique du calcul d’incertitude. Par ailleurs, on a pu montrer que l’incertitude des mesures pouvait se déduire facilement de la largeur de l’intervalle de tolérance. Le lecteur intéressé peut se reporter aux travaux de Feinberg et al. [3]. L’objectif de cette publication est de fournir aux analystes une série d’études de cas afin de mieux faire comprendre en quoi la démarche harmonisée proposée par la commission SFSTP représente une avancée importante pour les laboratoires, quelles que soient les procédures analytiques qu’ils ont à valider. Cependant, cette prétention à l’universalisme doit être modérée en se rappelant la note 4 qui figure dans la clause §5.4.5.3 de la norme ISO 17025 et qui indique que « la validation est toujours un équilibre entre les coûts, les risques et les possibilités techniques ». À côté des outils statistiques présentés, pour efficaces qu’ils soient dans le calcul des risques, les analystes doivent toujours considérer les aspects pratiques et économiques de la validation. Ainsi, même si un document préconise de réaliser dix essais dans une même journée, alors que les contraintes techniques de la méthode ne le permettent pas, cela n’implique pas que toute validation est impossible. À travers quelques exemples, nous avons essayé de montrer qu’il était toujours possible d’appliquer l’approche globale, pour autant que le risque d’obtenir des résultats incorrects reste acceptable, même si il est plus grand.

analytical technique used, as well as the goals to be achieved. In general, raw data and type of applied experimental design are illustrated by a diagram representing the calibration and validation data. Then, the accuracy profile is illustrated in another figure, and allows interpreting and decision making regarding the method validation. Finally, the corresponding trueness, precision, accuracy data, as well as the higher and lower tolerance interval limits are then summarized in figures. When necessary, quantification limits have been computed. However, no detection limit has been assessed even though it is allowed by the proposed approach [2].

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Part III. Examples of application

Whenever it has been necessary to apply a correction coefficient, due to a poor recovery rate, the linearity (or trueness) straight line allows to understand how this coefficient has been achieved and a second accuracy profile shows whether the method can be validated after correction. Actually, it appeared to be indispensable, in various cases, to apply a correction coefficient in order to compensate a too weak recovery (or recuperation) rate. This possibility to determine a consistent correction coefficient for the whole application range illustrates this approach potency. Moreover, it should be mentioned, from now on, that, correcting data increases, in a very visible way, the uncertainty of measurements: which is perfectly consistent with the metrological theory behind the computation of uncertainty. In addition, it has been demonstrated that the uncertainty of measurements could easily deduce itself from the tolerance interval width. Any interested reader can refer to the works of Feinberg et al. [3]. This publication aims at providing the analysts with a series of case studies with a view to helping them better understand how the harmonized approach proposed by the SFSTP Commission represents an important advance for the laboratories, whatever the analytical procedures they have to validate. However, this ambition to universalism must be moderated by remembering the note 4 posted in the clause § 5.4.3 of the ISO 17025 standard, stipulating that “validation is always a balance between costs, risks and technical possibilities”. In addition to the presented statistical tools, as efficient as they may be in risk computing, the analysts must always consider the validation economic and practical aspects. Thus, even though a document recommends carrying out 10 trials in the same day, while the technical constraints of the method do not allow it, this does not imply that any validation is impossible. Through several examples, we have intended to demonstrate that it was always possible to apply the global approach, as long as that the risk to achieve incorrect results remains acceptable, even if greater.

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II Données STP Pharma Pratiques 1992

II 1992 STP Pharma Pratiques Data

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Part III. Examples of application

1. Objectif et contexte

1. Objective and background

Les données de cet exemple publié en 1992 ont servi à illustrer la procédure de validation proposée à l’époque [4]. Il était donc intéressant de les reprendre et de leur appliquer la nouvelle méthodologie de validation de 2003 qui débouche sur le profil d’exactitude [1] afin de comparer les conclusions obtenues dans les deux cas. Cette comparaison concerne plus particulièrement les résultats obtenus pour les critères de justesse (nommée exactitude en 1992) et de fidélité (répétabilité et fidélité intermédiaire). Les résultats provenaient d’un département de développement pharmaceutique et furent obtenus lors de la validation d’une méthode HPLC pour la détermination d’un principe actif dans une spécialité pharmaceutique.

The data of this example that was published in 1992 have been used to illustrate the validation procedure proposed at that time [4].Thus, it was interesting to revisit them in order to apply the new 2003 validation approach, that leads to the accuracy profile [1], and compare the conclusions obtained in both cases. This comparison concerns more particularly the results obtained for the trueness (named accuracy in 1992) and precision criteria (repeatability and intermediate precision). The results were coming from a pharmaceutical development department and have been achieved during the validation of a HPLC method aiming at determining an active ingredient within a pharmaceutical product.

2. Plans d’expérience

2. Experimental designs

En se référant aux protocoles proposés dans la publication de 2003 [1], les essais réalisés et illustrés dans l’article de 1992 se rapprochent du protocole V4 avec diverses particularités dont la principale est l’absence de répétitions pour les essais d’étalonnage. Plan P1. Standards d’étalonnage sans la matrice aussi appelés « échantillons principe actif seul » selon la terminologie 1992 : - cinq niveaux de concentration répartis de 60 à 140% de la valeur nominale du médicament sous épreuve, - trois séries réalisées dans des conditions de fidélité intermédiaire, c’est-à-dire sur trois jours différents, - ces mesures sont faites sans répétition. Plan P2. Standards d’étalonnage avec la matrice ou « échantillons forme reconstituée » selon la terminologie 1992 : - cinq niveaux de concentration répartis de 60 à 140%, - trois séries dans des conditions de fidélité intermédiaire, - ces mesures sont faites sans répétition. Plan P3. Standards de validation dans la matrice : - un seul niveau de concentration, à 100% de la valeur nominale, - trois séries dans des conditions de fidélité intermédiaire, - six répétitions indépendantes par série. Les plans d’expériences P1 et P2 étaient destinés à vérifier la fonction de réponse, en particulier la linéarité selon la terminologie de 1992, l’absence d’un éventuel effet de matrice et l’estimation du biais et le plan P3 permettait d’estimer la fidélité. Compte tenu de ces plans d’expérience, il faut souligner que le calcul des composantes de la variance et de la fidélité intermédiaire ne peuvent se faire qu’à la concentration nominale (100%) et non pas sur l’ensemble du domaine de validation ; ce qui est d’ailleurs devenue une exigence avec la publication ultérieure de ICH

Referring to the protocols proposed in the 2003 publication [1], the trials carried out and illustrated in the 1992 article get close to the V4 protocol with various particularities, being the absence of repetition for the calibration trials the most important of them. Design P1. Calibration standards without matrix, also called “samples of active ingredient alone” according to the 1992 terminology: - five concentration levels distributed from 60 to 140% of the tested medicine nominal value, - three series carried out in intermediate precision conditions, i.e. over three distinct days, - these measurements are carried out without any repetition. Design P2. Calibration standards with matrix or “samples under reconstituted shape”, according to the 1992 terminology: - five concentration levels distributed from 60 to 140%, - three series carried out in intermediate precision conditions, - these measurements are carried out without any repetition. Design P3. Calibration standards without matrix: - one single concentration level, at 100% of the nominal value, - three series carried out in intermediate precision conditions, - six independent repetitions by series. The P1 and P2 designs were intended to check the response function, particularly the linearity according to the 1992 terminology, the absence of a possible matrix effect and the bias assessment and the P3 design allowed to assess the precision. Taking into account these experimental designs, it must be outlined that the computation of the variance of intermediate precision can only be done at the nominal concentration (100%), and not on the whole validation range, which, moreover, has become a requirement when

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Q2A [5]. La figure 1 présente une vue globale de ces plans d’expériences.

ICH Q2A [5] was later issued. Figure 1 presents a global vision of these experimental designs.

Part III. Examples of application

Milliers Thousands

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132000

200 180

128000

Surface de pic Peak surface

160 124000

140

95%

105%

100%

120 100 80 60 50%

70%

90%

110%

130%

150%

% teneur nominal Nominal content %

Figure 1. Données SFSTP 1992. Illustration graphique du plan d’expérience. Les six (2 x 3) droites d’étalonnage sont indiquées sur le graphique. Le zoom de la zone des 100% indique la disposition des données d’étalonnage et de validation en ce point. Figure 1. 1992 SFSTP data. Experimental design graphical illustration. The six (2 x 3) calibration functions are indicated on the diagram. Zooming on the 100% area indicates the calibration and validation data position.

3. Résultats

3. Results

À partir des données issues du plan d’expérience P3, deux modes d’exploitation des données ont été utilisés. Le premier consiste à n’utiliser qu’un seul niveau de concentration pour l’étalonnage, le second est de garder les cinq niveaux. Cependant, du fait que les standards de validation ne comportent qu’un seul niveau de concentration, les deux profils d’exactitude ne peuvent être tracés qu’à ce seul niveau de concentration de 100% de la valeur nominale. La limite d’acceptation a été fixée arbitrairement à ± 3% et la probabilité que les futures mesures se situent dans l’intervalle de tolérance est de 95%. Le tableau I fournit les diverses statistiques qui sont illustrées dans la figure 2. Selon la méthodologie 1992, la fidélité de la méthode était jugée très bonne puisque le coefficient de variation (CV) de répétabilité était de 0,25% et celui

Two ways of exploiting data coming from P3 experimental design have been used. The first one consists in using only a single concentration level for the calibration, the second one is to keep all the five levels. However, given that the validation standards only include a single concentration level, both accuracy profiles can only be drawn at that 100% nominal value of the concentration level. The acceptability limit has arbitrarily been set at ±3% and the probability for the future measurements to stand inside the tolerance interval is 95%. Table I provides the various statistics illustrated on Figure 2. According to the 1992 methodology, the method precision was considered very good since the repeatability relative standard deviation (RSD) was 0.25%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

4%

2%

0%

-2 %

-4 % 1

2

Figure 2. Données SFSTP 1992. Profils d’exactitude obtenus à la concentration nominale en utilisant deux protocoles d’étalonnage hors matrice : 1) avec un seul niveau, 2) cinq niveaux (limites d’acceptation à ± 3%). Figure 2. 1992 SFSTP Data. Accuracy profiles obtained at the nominal concentration by using two calibration protocols out of matrix: 1) with a single level, 2) five levels (acceptability limits ± 3%).

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Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Tableau I. Données SFSTP 1992 exprimées en mg. Les deux profils d’exactitude obtenus selon deux protocoles d’étalonnage à un ou cinq niveaux. Table I. 1992 SFSTP data expressed in mg. Both accuracy profiles obtained according to two calibration functions with one or five levels. Critères de performance/Performance criteria

Un seul niveau d’étalonnage à 100% One single calibration level at 100%

Cinq niveaux d’étalonnage de 60 à 140% Five calibration levels from 60 to 140%

Concentration (% de la teneur nominale) Concentration (% of the nominal value)

100%

100%

Quantité théorique/Theoretical quantity

162.1

162.1

Limite basse de tolérance/Tolerance lower limit

161.8

161.7

Limite haute de tolérance/Tolerance higher limit

165.1

165.2

Limite basse relative de tolérance (%) Relative tolerance lower limit (%)

-0.1766%

-0.2433%

Limite haute relative de tolérance (%) Relative tolerance higher limit (%)

1.8440%

1.899%

Écart-type de répétabilité Repeatability standard deviation

0.4134

0.4127

Écart-type de fidélité intermédiaire Intermediate precision standard deviation

0.5972

0.6169

CV répétabilité (%)/RSD repeatability (%)

0.2551%

0.2546%

CV fidélité intermédiaire (%) RSD intermediate precision (%)

0.3685%

0.3806%

163.4

163.4

Quantité prédite inverse Inverse predicted quantity

1.351

1.342

Biais relatif (%)/Relative bias (%)

Biais absolu/Absolute bias

0.834%

0.828%

Recouvrement (%)/Recovery (%)

100.8%

100.8%

CV : coefficient de variation/RSD: relative standard deviation.

de fidélité intermédiaire de 0,37%. On peut rappeler que ce calcul n’était possible qu’à la valeur nominale. Cependant, la justesse ne semblait pas satisfaisante dans la mesure où l’intervalle de confiance du taux recouvrement moyen se situait entre 100,7% et 100,9% et ne contenait donc pas la valeur cible de 100%. Cette conclusion un peu ambiguë est déjà largement discutée dans la référence [1]. Si on s’appuie sur la figure 2 obtenue en appliquant la démarche proposée en 2003, les deux profils d’exactitude démontrent que la méthode pouvait être déclarée valide, quelles que soient les données d’étalonnage utilisées (un ou cinq niveaux de concentration) : en effet, dans les deux cas, l’intervalle de tolérance est entièrement inclus dans les limites d’acceptation. L’utilisation des données de 1992 reste un peu artificielle car, à l’évidence, les plans d’expérience employés ne correspondent pas à ceux qui sont développés dans l’approche de 2003. Cependant, il était intéressant de faire cet exercice pour montrer la continuité entre les deux approches.

and the intermediate precision RSD 0.37%. It is to be reminded that this computation was only possible at the nominal value. However, trueness did not seem to be satisfactory as the confidence interval of the mean recovery yield was located between 100.7% and 100.9% and thus did not include the 100% target value. This little ambiguous conclusion is already widely discussed in the reference [1]. If we base on Figure 2, obtained by applying the approach proposed in 2003, both accuracy profiles demonstrate that the method could have been declared valid, whatever the used calibration data (one or five concentration levels): actually, in both cases, the tolerance interval is entirely included inside the acceptability limits. Using the 1992 data remains a little artificial because, obviously, the used experimental designs do not match those developed in the 2003 approach. However it was interesting to do this exercise in order to show the continuity between both approaches.

III Détermination de substances actives par HPLC dans un comprimé

III Active substances determination by HPLC (high performance liquid chromatography) within a tablet

1. Matériel et méthodes

1. Equipment and methods

Cet exemple porte sur le dosage, dans un comprimé, de deux substances actives A et B aux doses

This example concerns the determination, within a tablet, of two active substances, A and B, contain-

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de quelques mg/comprimé. Le dosage est effectué par couplage HPLC-UV et par étalonnage externe, permettant ainsi de quantifier simultanément les deux substances. Le mode opératoire consiste à mettre en solution un comprimé dans un mélange acétonitrile-eau puis à filtrer cette solution avant injection. L’étalonnage est réalisé au moyen de deux solutions indépendantes des substances de référence des principes actifs à la concentration nominale (niveau 100%).

ing few mg/tablet. The determination is carried out by HPLC-UV coupling and by external calibration, thus allowing to simultaneously quantifying both substances. The operating procedure consists in dissolving a tablet into a mixed solution acetonitrile - water, then filtrate this solution before injection. Calibration is carried out with two independent solutions of the active ingredients references subtances, at the nominal concentration (level 100%).

2. Plans d’expérience

2. Experimental designs

Le plan d’expérience de validation consiste en trois jours, trois niveaux et trois répétitions (3x3x3), soit vingt-sept essais. Il s’agit d’un protocole de type V1. Les niveaux de concentration choisis sont 70, 100 et 130% de la concentration nominale, de façon à couvrir une gamme de concentrations correspondant au contrôle réglementaire d’uniformité de la teneur du comprimé, soit 75 à 125% de la teneur nominale (ou ± 25%). En ce qui concerne les données d’étalonnage, le plan d’étalonnage consiste en un seul point à 100%. Ce choix implique que la prédiction des concentrations supérieures à 100% se fasse par extrapolation. La figure 3 illustre ces données dans le cas du composé A ; le composé B suit le même protocole. Ce graphique montre en outre que les solutions ont été préparées de façon indépendante, à partir de pesées indépendantes, puisque pour un même « niveau » on voit que les réponses ne sont pas alignées verticalement. Rappelons que la démarche de validation proposée comprend une étape de réalignement pour compenser ces légères différences, lorsqu’elles existent, dans la concentration de référence [2].

The validation design consists in three days, three levels and three repetitions (3 x 3 x 3), i.e. twenty seven trials. It is question of a V1 protocol. The chosen concentration levels are 70, 100 and 130% of the nominal concentration, in order to cover a concentrations range corresponding to the regulatory control of the tablet content uniformity, i.e. 75 to 125% of the nominal content (or ± 25%). Regarding calibration data, the calibration function consists in a straight line with a single point, at 100%. This choice implies that the prediction of concentrations higher than 100% are done by extrapolation. These data relating to product A are illustrated in Figure 3; the compound B follows the same protocol.

Part III. Examples of application

Millions

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

In addition, this diagram shows that the solutions have been prepared independently, from independent weightings; since for an identical “level”, we observe that the responses are not vertically aligned. Let us remind that the proposed validation approach includes a realignment step in order to compensate these slight differences, when existing, in the reference concentrations [2].

3.0

2.5

Surface de Pic Peak surface

2.0

9 4

1.5

9 5

9 6

97

98

9 9

1 00

10 1

1 0 2

1.0

0.5

0.0 0

20

40

60

80

100

120

140

160

% Concentration teneur nominale Nominal content concentration % Figure 3. Détermination du composé A. Les données collectées le jour 1, 2 ou 3 sont respectivement représentées par des carrés, des losanges et des ronds. L’encart est un zoom de la partie centrale du graphique. Figure 3. Compound A determination. Data collected day 1, day 2 or day 3 are represented by squares, triangles and circles, respectively. The insert is a zoom on the diagram central part.

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

3. Résultats

3. Results

Le traitement de ces données, selon la procédure décrite en [2], permet de construire le tableau II qui contient l’ensemble des critères de performances pour les deux analytes, à chaque niveau de concentration. La plupart de ces critères sont exprimés en valeurs absolues et en valeurs relatives. Ce sont ces valeurs relatives qui permettent de construire le profil d’exactitude des figures 4 et 5. Le profil d’exactitude pour le composé A, en prenant comme limites d’acceptation ± 5%, permet de conclure à la validité de la méthode, comme le montre la figure 4. Rappelons que ces limites d’acceptation ne doivent pas être confondues avec le niveau de probabilité qui a servi au calcul du profil, c’est-à-dire de l’intervalle de tolérance à 95%. On peut rappeler que l’intervalle de tolérance est sensé contenir une proportion attendue de 95% des futures mesures. En revanche, pour la substance B on peut observer qu’au-delà de 120% de la valeur nominale, l’intervalle de tolérance ne s’inscrit plus dans les limites d’acceptation ± 5% comme le montre la figure 5. Une limite de quantification supérieure peut alors être calculée en prenant l’intersection entre la limite d’acceptation et l’intervalle de tolérance : dans ce cas elle est égale à 121% de la valeur nominale du produit. Par conséquent, on peut conclure que la méthode n’est pas valide sur l’ensemble du domaine étudié mais répond toutefois à son objectif entre 60 et 121%. L’élargissement de l’intervalle de tolérance audelà de 100% peut raisonnablement s’interpréter en fonction des choix faits pour le plan d’expérience d’étalonnage. En effet, l’utilisation du seul niveau

Processing these data, according to the procedure described in [2], makes it possible to build up Table II that contains all the performance criteria for both analytes, at each concentration level. Most of these criteria are expressed both in absolute and relative value. The relative values allow to build up Figures 4 and 5. The accuracy profile for the compound A, if setting a ±5% acceptability limit, allows to conclude that the method is valid, as shown Figure 4. Let us remind that these acceptability limits must not be confounded with the likelihood level that was used for the profile computation, i.e. the 95% tolerance interval. To be reminded: an expected 95% proportion of future measurements are supposed to be included inside the tolerance interval. On the contrary, it can be observed for substance B, that beyond 120% of the nominal value, the tolerance interval is no longer inside the ± 5% acceptability limits, as shown Figure 5. A higher quantification limit can then be calculated, by taking the intersection point between the acceptability limit and the tolerance interval: in this case, it equals 121% of the product nominal value. As a result, it can be concluded that the method is not valid for the whole studied range, but however achieves its objective, between 60% and 121%. The tolerance interval broadening beyond 100% can reasonably be interpreted according to the choices made for the calibration experimental design. Actually, using the single 100% level forces to com-

Tableau II. Dosage : profils d’exactitude pour les deux molécules exprimés en% de la teneur nominale. Table II. Determination: accuracy profiles for both molecules expressed in% of the nominal content . Critères de performance/ Performance criteria

Concentration ajoutée (% de la teneur nominale) Added concentration (% of the nominal content)

Substance A

Substance B

Niveau 1 Level 1

Niveau 2 Level 2

Niveau3 Level 3

Niveau 1 Level 1

Niveau 2 Level 2

Niveau 3 Level 3

68.21

97.27

127.6

70.47

100.5

131.5

Limite basse de tolérance/Tolerance lower limit

67.52

95.36

126.9

69.12

98.74

122.8

Limite haute de tolérance/Tolerance higher limit (%)

68.83

98.97

129.8

71.37

101.7

137.8

Limite basse relative de tolérance (%) Relative tolerance lower limit (%)

-1.02%

-1.97%

-0.58%

-1.91%

-1.70%

-6.64%

Limite haute relative de tolérance (%) Relative tolerance higher limit (%)

0.90%

1.74%

1.69%

1.28%

1.27%

4.80%

Écart-type de répétabilité Repeatability standard deviation

0.2670

0.6100

0.46

0.5933

0.3821

1.632

Écart-type de fidélité intermédiaire Intermediary precision standard deviation

0.2670

0.6910

0.5933

0.46

0.512

2.414

CV répétabilité (%)/RSD repeatability (%)

0.39%

0.63%

0.46%

0.65%

0.38%

1.24%

CV fidélité intermédiaire (%) RSD intermediary precision (%)

0.39%

0.71%

0.46%

0.65%

0.51%

1.84%

Concentration prédite inverse (%) Inverse predicted quantity

68.17

97.16

128.30

70.24

100.2

130.3

-0.004

-0.111

0.708

-0.2232

-0.2184

-1.207

Biais absolu/Absolute bias Biais relatif (%)/Relative bias (%)

-0.01%

-0.11%

-0.55%

-0.32%

-0.22%

-0.92%

Recouvrement (%)/Recovery yield (%)

99.94%

99.89%

100.60%

99.68%

99.78%

99.08%

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93

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Erreur relative/Relative error (%)

10%

5%

0% 60

70

80

90

100

110

120

130

140

-5%

% de la teneur nominale nominal content %

-10%

Figure 4. Profil d’exactitude pour la substance A (limites d’acceptation à ± 5%). Figure 4. Substance A accuracy profile (± 5% acceptability limits).

Erreur relative (%)/Relative error (%)

10%

5%

0% 60

70

80

90

100

110

120

130

140

-5%

-10%

% de la teneur nominale nominal content %

Figure 5. Profil d’exactitude pour la substance B (limites d’acceptation à ± 5%). Figure 5. Accuracy profile for substance B (±5% acceptability limits).

100% oblige à calculer les valeurs prédites en retour par extrapolation pour les niveaux supérieurs. Or il bien connu que cette méthode a tendance à dégrader la qualité des prédictions [6]. Une solution pour sortir de cette situation serait de choisir une probabilité de 90%, ce qui aurait pour conséquence de rétrécir l’intervalle de tolérance mais aussi d’augmenter le risque d’avoir en routine des dosages en dehors des limites d’acceptation. Une autre possibilité qui a un effet comparable, serait de 94

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pute, by extrapolating, the inverse predicted values for the higher levels. Yet, it is well known that this method tends to degrade the prediction quality [6]. One solution to get out of this situation would be to choose a 90% probability, which would result in narrowing the tolerance interval, but also increasing the risk to have routine determinations beyond the acceptability limits. Another possibility with a comparable effect would consist in reporting every

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

rapporter chaque résultat comme étant la moyenne de deux résultats indépendants ou plus : dans ce cas la variance de fidélité intermédiaire est diminuée. Cet exemple de validation d’une méthode destinée à contrôler la teneur d’un principe actif dans une spécialité pharmaceutique, illustre bien la flexibilité de la nouvelle démarche proposée. On peut à la limite parler de « potentialité » du profil d’exactitude, au sens où il intègre en un seul graphique un ensemble de critères de performance tels que la variance, la justesse, le risque associé et indirectement le nombre de répétitions.

result as being the mean between two independent results or more: in this case, the intermediate precision variance is reduced. This example of validation of a method aiming at controlling the concentration of an active ingredient in a medicine illustrates well the new proposed approach flexibility. We can almost speak of the accuracy profile “potentiality”, in the sense that it integrates in a single diagram a set of performance criteria such as variance, accuracy, associated risk, and indirectly the number of repetitions.

IV Inf luence du protocole d’étalonnage sur le prof i l d’exactitude Détermination de l’hydrocortisone par HPLC-UV dans une pommade

IV Inf luence of the calibration protocol on the accuracy profile Hydrocortisone determination by HPLC-UV in an ointment

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Part III. Examples of application

1. Matériel et méthodes

1. Equipment and methods

Dans le cadre du contrôle qualité d’une pommade à 0,1% en hydrocortisone, une méthode de dosage a été développée et validée. Le dosage est effectué par couplage HPLC-UV. Le mode opératoire consiste à extraire le principe actif et à le mettre en solution dans la phase mobile. L’étalonnage est réalisé au moyen d’une solution indépendante de la substance de référence du principe actif. La gamme d’étalonnage s’étale de 0.8 à 1.2 mg/g de pommade.

As part of the quality control of an ointment at 0.1% hydrocortisone, a method has been developed and validated. The determination is carried out by HPLC-UV coupling. The operating procedure consists in extracting the active ingredient and dissolving it into the mobile phase. The calibration is carried out with an independent standard of the active ingredient reference substance. The calibration range extends from 0.8 to 1.2 mg/g of ointment.

2. Plan d’expérience

2. Experimental design

En ce qui concerne le plan d’expérience (tableau III), le protocole de type V4 a été appliqué en utilisant trois niveaux de concentration et deux répétitions par niveau pendant trois jours, soit au total dix-huit essais (3 x 2 x 3). Les standards d’étalonnage ont été réalisés avec et sans la matrice. En effet, au moment de lancer la validation, aucune information n’était disponible quant à l’existence d’un effet de matrice et à la possibilité de quantifier le principe actif avec un seul niveau d’étalonnage. Par conséquent, l’option la plus sûre mais la plus lourde en termes de nombre d’essais a été retenue. Les standards de validation comportent trois niveaux et trois répétitions pendant trois jours, soit vingt-sept essais. Tous les standards de validation (neuf) sont indépendants, et ce chaque jour.

As far as the experimental design (Table III) is concerned, a V4 protocol has been applied using three concentration levels and two repetitions per level during three days, i.e. eighteen trials in total (3 x 2 x 3). The calibration standards were carried out with and without matrix. Actually, at the time of launching the validation, no information was available regarding the existence of a matrix effect and the possibility to quantifying the active ingredient with a single level of calibration. As a result, the safest but heaviest option in terms of number of trials has been kept. The calibration standards include three levels and three repetitions during three days, i.e.twenty seven trials. All the validation standards (nine) are independent and this, every day.

3. Résultats

3. Results

Le traitement des données issues des essais réalisés selon le protocole V4 permet de construire différents profils en appliquant plusieurs modèles d’étalonnage. En effet, il est possible de calculer des modèles de régression en utilisant les données d’étalonnage : A) entre 80 et 120% de la concentration nominale ; B) à 100% de cette concentration ; ou C) à 120%. Et pour chaque cas, on peut utiliser les mesures en présence ou en absence de la matrice. Au total, on peut donc proposer six profils d’exactitude reposant

Processing collected data according to the V4 protocol makes it possible to build up different profiles by applying different calibration models. Indeed, it is possible to compute regression models by using the calibration data: A) between 80 and 120% of the nominal concentration; B) at 100% of this concentration; C) at 120%. And for each case, the measurements can be used with or without matrix. In total, we can thus propose six accuracy profiles based on six calibration functions. In all the cases, the calibration

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Tableau III. Détail du plan d’expérience utilisé pour le dosage de l’hydrocortisone. Table III. Detail of the experimental design used for hydrocortisone determination. Type de données/Type of data

Niveau Level

Concentration en hydrocortisone (mg/g) Hydrocortisone concentration (mg/g)

Nombre de répétition par jour Number of repetitions per day

Nombre d’essais pour les trois jours de validation Number of trials for the three validation days

Standard d’étalonnage sans matrice Calibration standard without matrix

SE1

0.8

2

6

SE2

1.0

2

6

SE3

1.2

2

6

Standard d’étalonnage avec matrice Calibration standard with matrix

SE1

0.8

2

6

SE2

1.0

2

6

SE3

1.2

2

6

Standard de validation avec matrice Validation standard with matrix

SV1

0.8

3

9

SV2

1.0

3

9

SV3

1.2

3

Total

9 63

sur six conditions d’étalonnage. Dans tous les cas le modèle d’étalonnage retenu est la droite. La figure 6 rassemble ces graphiques et permet de sélectionner celui qui donne les résultats les plus performants. Finalement, il apparaît que le profil le mieux adapté est celui qui consiste à étalonner à un seul niveau de 120% en absence de la matrice. Le tableau IV contient l’ensemble des critères de performance de cette méthode à chaque niveau de concentration, dans le cas où le modèle d’étalonnage est construit avec un seul niveau de concentration à 120% de la valeur nominale. Cet exemple de validation d’une méthode classique destinée à contrôler la teneur d’un principe actif

model that has been kept is the straight line. Figure 6 gathers these diagrams and makes it possible to select the one providing the most efficient results. Finally, it appears that the best adapted profile is the one consisting in calibrating only at the120% level, without matrix. Table IV includes all these methods performance criteria, at every concentration level, in the case where the calibration model is built up with a single concentration level at 120% of the nominal value. This example of validation of a classical method intended to control an active ingredient concentration in a medicine illustrates once again, the proposed

Tableau IV. Dosage de l’hydrocortisone en µg/g. Profil d’exactitude pour un étalonnage à 120%. Table IV. Hydrocortisone determination expressed in µg/g. Accuracy profile for a calibration at 120%. Critères de performance Performance criteria

Hormone A Niveau 1/Level 1

Niveau 2/Level 2

Niveau 3/Level 3

80

100

120

Limite basse de tolérance Tolerance lower limit

797.8

964.7

1161.0

Limite haute de tolérance Tolerance higher limit

812.9

1034

1234

Limite basse relative de tolérance (%) Relative tolerance lower limit (%)

- 0.21%

- 3.37%

- 3.12%

Limite haute relative de tolérance (%) Relative tolerance higher limit (%)

1.73%

3.61%

2.94%

Écart-type de répétabilité Repeatability standard deviation

1.865

0.982

1.658

Écart-type de fidélité intermédiaire Intermediate precision standard deviation

1.804

7.124

7.588

CV répétabilité (%)/RSD repeatability (%)

0.23%

0.09%

0.14%

CV fidélité intermédiaire (%) RSD intermediate precision (%)

0.33%

0.72%

0.65%

Concentration prédite inverse (%) Inverse predicted quantity

799.1%

998.3%

1198.0%

Concentration ajoutée (%) Added concentration (% of the nominal content)

96

01-hubert.indd 96

Biais absolu /Absolute bias

6.061

1.180

-1.099

Biais relatif (%)/Relative bias (%)

0.76%

0.12%

0.09%

Recouvrement (%)/Recovery yield (%)

100.8%

100.1%

99.9%

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Erreur relative (%)/Relative error (%)

10%

avec matrice/with matrix sans matrice/without matrix

5%

0% 750

1000

1250

-5%

Etalonnage entre 80-120%/Calibration between 80-120% -10%

Concentration µg/g

A)

Erreur relative (%)/Relative error (%)

10%

avec matrice/with matrix sans matrice/without matrix

5%

0% 750

1000

1250

-5%

Etalonnage à 100%/Calibration at 100% -10%

Concentration µg/g B)

Erreur relative (%)/Relative error (%)

10%

avec matrice/with matrix

sans matrice/without matrix 5%

0% 750

1000

1250

-5 %

Etalonnage à 120%/Calibration at 120% -1 0 %

Concentration µg/g C)

Figure 6. Hydrocortisone dans la pommade. Profils d’exactitude pour un étalonnage avec et sans matrice à différents niveaux de concentration (limites d’acceptation à ± 5%). A) Trois niveaux de concentration : 80, 100 et 120%. B) Un niveau à 100%. C) Un niveau à 120%. Figure 6. Hydrocortisone in the ointment. Accuracy profiles for a calibration with and without matrix at different concentration levels (±5% acceptability limits). A) Three concentration levels: 80, 100, 120%. B) One level at 100%. C) One level at 120%.

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

dans une spécialité pharmaceutique illustre à nouveau la flexibilité de la démarche proposée. Il traduit comment le mode opératoire peut être finalisé et la procédure d’étalonnage choisie de façon à assurer des performances optimales en routine.

approach flexibility. It expresses how the operating procedure can be finalised and the calibration procedure chosen in order to ensure optimum routine performances.

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

V Détermination de l’acrylamide par LC-MS dans le plasma de porc 1. Matériel et méthodes L’acrylamide est un produit néoformé lors de la cuisson de certains aliments. Il est issu de la réaction de Maillard par combinaison d’un monosaccharide (glucose) et de certains acides aminés comme l’asparagine. Si de nombreuses études documentent la teneur en acrylamide dans les aliments peu d’études ont permis d’en quantifier l’absorption après ingestion. Une étude de pharmacocinétique, réalisée chez le porc doit permettre de déterminer la biodisponibilité de l’acrylamide. Au préalable une méthode analytique est nécessaire pour quantifier dans le plasma de porc les concentrations en acrylamide. La méthode retenue pour effectuer ce dosage est une méthode HPLC associée à une détection par spectrométrie de masse (LC-MS). La validation est ensuite réalisée sur une gamme très étendue, allant de 10 à 5000 mg/L, choisie par manque d’information sur les taux plasmatiques observables après ingestion d’aliments contenant de l’acrylamide. L’absence de matériaux de référence nous a conduit à utiliser une méthode d’ajouts dosés en utilisant un plasma de porc témoin. Deux gammes ont été préparées : une gamme d’étalonnage (standards d’étalonnage) et une gamme d’ajouts dans du plasma (standards de validation). La gamme d’étalonnage est réalisée dans une solution d’acétate d’ammonium 0.01M ramenée à pH 6 avec de l’acide formique. La préparation de l’échantillon consiste en un prélèvement de 200 µL de plasma auxquels on ajoute 100 µL d’une solution saturée de ZnSO4, 1000 µL d’acétonitrile puis 100 µL d’acrylamide D5 marqué utilisé comme standard interne. Après agitation et centrifugation le surnageant est évaporé. Le culot est repris avec 200 µL d’acétate d’ammonium 0.01M pH 6. Le volume d’injection est de 50 µL. Les conditions analytiques utilisées sont un débit chromatographique de 0.2 mL/min à travers une colonne Hypercarb (5µ 50-2 mm) et une détection MS sur l’ion moléculaire 72 de l’acrylamide. La réponse utilisée est la surface du pic.

Part III. Examples of application

V Pork plasma acrylamide determination by LC-MS 1. Equipment and methods Acrylamide is a newly formed product when certain foods are being cooked. It comes from the Maillard reaction by combining a monosaccharide (glucose), and some amino acid such as asparagine. If the food acrylamide concentration is documented by various studies, yet, few ones have allowed to quantify acrylamide absorption after ingestion. A pharmacokinetic study, carried out on pork, is likely to make it possible to determine the acrylamide bioavailability. Beforehand, an analytical method is necessary to quantify the acrylamide concentrations within the pork’s plasma. The selected method to carry out this dosage is a HPLC method combined with a mass spectrometry detector (LC-MS). Validation is then carried out on a very broad range, extending from 10 to 5000 mg/L, chosen because information is lacking on plasmatic levels observable after ingesting foods containing acrylamide. The lack of reference materials led us to use spiked amounts on control pork plasma. Two sets of standards were prepared: calibration standards and spiked plasma samples (validation standards). The calibration range is carried out in a 0.01 M ammonia acetate solution, adjusted at pH 6 with formic acid. The sample preparation consists in adding into plasma 200 µL, saturated ZnSO4 solution 100 µL, acetonitrile 1000 µL, then 100 µL of D5 labelled acrylamide used as internal standard. After stirring and centrifuging, the supernatant is evaporated. The residue is processed again with ammonium acetate 200 µL, 0.001M, pH6. The injection volume is 50 µL. The used analytic conditions are a 0.2-mL/min chromatographic injected through a Hypercarb column (5µ 50-2mm) and MS detection on the acrylamide 72 molecular ion. The used response is the peak surface.

2. Plans d’expérience

2. Experimental designs

Le plan d’expérience utilisé consiste en cinq jours, six niveaux de concentrations et deux répétitions (5 x 6 x 2), soit soixante essais pour les standards d’étalonnage et de validation. Selon la typologie proposée, c’est un plan de type V2 selon [1] avec une modification du nombre de répétitions (deux au lieu de trois) et du nombre de niveaux de concentra-

The used experimental design consists in five days, six concentration levels and two repetitions (5x6x2), i.e. sixty trials for calibration and validation standards. According to the proposed typology, it is a V2 protocol according to [1], with a modification of the number of repetitions (two instead of three) and of concentration levels (six instead of three). Figure 7

98

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

tion (six au lieu de trois). La figure 7 illustre ce plan d’expériences et l’ensemble des réponses obtenues en fonction des concentrations introduites pour la gamme d’étalonnage et pour la gamme de standards de validation.

illustrates this experimental design as well as the whole set of responses obtained for the calibration standards and the spiked validation standards.

3. Résultats

3. Results

Les données ont été traitées en trois étapes : - l’analyse des données brutes et le tracé du profil d’exactitude, - une analyse pour déterminer le coefficient de correction de l’effet de matrice à partir du taux de recouvrement, - le calcul des profils d’exactitude après correction des concentrations.

The data have been processed in three steps: - raw data analysing and accuracy profile drawing; - analysis to determining the matrix correction coefficient from the recovery yield, - accuracy profiles computation after correcting the concentrations.

3.1. Analyse des données brutes

3.1. Raw data analysis

Dans cet exemple, la fonction de réponse la plus appropriée permettant de décrire la relation entre les concentrations et la réponse est une régression quadratique pondérée avec un facteur de pondération de type 1/X où X représente la concentration introduite. La figure 8 présente le profil d’exactitude obtenu en utilisant ce modèle de régression et un intervalle de tolérance à 95%. Le graphique montre un décalage entre le profil d’exactitude et les limites d’acceptation qui ont été fixées à ± 25%. Ce décalage est dû à l’effet matrice.

In this example, the most adapted response function allowing to describe the relationship between the concentrations and the response is a weighted quadratic regression with a 1/X weighting factor, where X represents the introduced concentration. Figure 8 represents the accuracy profile achieved by using this regression model and a 95% tolerance interval. The diagram shows a gap between the accuracy profile and the acceptability limits that have been set at ±25%. This gap is due to the matrix effect.

3.2. Calcul du coefficient de correction

3.2. Correction coefficient computation

Pour corriger cet effet de matrice, un coefficient de correction a été calculé à partir de la pente de l’équation de linéarité qui relie les concentrations théoriques introduites et les concentrations retrouvées, calculées par étalonnage inverse. Le coefficient de correction appliqué correspond à l’inverse de la pente obtenue avec les standards de validation. La figure 9 illustre ces calculs.

In order to correct this matrix effect, a correction coefficient has been computed from the linearity equation slope linking the introduced theoretical concentrations to the recovered concentrations, computed by inverse prediction. The applied correction coefficient corresponds to the inverse of the slope achieved with the validation standards. Figure 9 illustrates these computations.

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

3.5

Surface de Pic Peak surface

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Concentration mg/L Figure 7. Détermination de l’acrylamide (données brutes non corrigés en mg/L). Les résultats sont obtenus sur cinq jours, six niveaux et deux répétitions par niveau. On peut déjà noter un effet matrice entre les standards d’étalonnage et les standards de validation dans le plasma. Figure 7. Acrylamide determination (non corrected raw data in mg/L). The results are achieved over five days, six levels and two repetitions by level. It can already be noticed a matrix effect between the calibration standards and the validation standards within the plasma.

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99

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

30%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

20% 10% 0% 0

1000

2000

3000

4000

5000

- 10% - 20% - 30% - 40% - 50% - 60%

Concentration mg/L

Figure 8. Détermination de l’acrylamide en mg/L. Profil d’exactitude réalisé avec les données brutes et montrant que la méthode n’est pas valide en l’état. Les résultats sont obtenus avec une régression quadratique pondérée pour modéliser la fonction de réponse (limites d’acceptation à ±25%). Figure 8. Acrylamide determination in mg/L. Accuracy profile carried out with the raw data and showing that the method is not valid as it is. The results are obtained with a weighted quadratic regression in order to model the response function (acceptation limits at ± 25%). 6000

Retrouvée (mg/L) Recovered (mg/L)

5000

4000

3000

2000

[Retrouvée] = 1.9829 + 0.686 [Ajoutée] [Recovered] 1.9829 + 0.686 [Added]

1000

0 0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Ajoutée (mg/L) Added (mg/L) Figure 9. Détermination de l’acrylamide en mg/L. Droite de régression entre les concentrations introduites et les concentrations prédites en retour. Figure 9. Acrylamide determination in mg/L Regression straight line between the introduced concentrations and the in return predicted concentrations.

L’équation de la droite est : [Retrouvée] = 1,9829 + 0,686 x[Ajoutée] Le coefficient de correction (Fc) à appliquer à la réponse instrumentale est donc de 1/0,686, soit 1,457.

The equation of the straight line: [Recovered]= 1.9829 + 0.686[Added] The (Fc) correction coefficient to be applied to the instrumental response is thus of 1/0.686, i.e. 1.457.

3.3. Calcul du profil d’exactitude après correction

3.3. Accuracy profile computation after correction

Un nouveau calcul du profil d’exactitude est réalisé en tenant compte du coefficient de correction. La correction est effectuée sur les réponses des données de validation. La figure 10 montre ce nouveau profil d’exactitude. Comme l’illustre le profil d’exactitude obtenu après application du coefficient de correction, la méthode n’est valide que sur une partie du domaine étudié. En effet, la borne inférieure du profil d’exactitude est au delà de la limite d’acceptation fixée à ± 25% pour

A new accuracy profile computation is carried out taking the correction coefficient into account. The correction is carried out on the validation data responses. Figure 10 shows this new accuracy profile.

100

01-hubert.indd 100

As illustrated by the accuracy profile obtained after applying the correction coefficient, the method is only valid on a part of the studied application range. In effect, the accuracy profile lower limit is beyond the acceptability limit set at ± 25%, for the

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

30%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

20% 10% 0% 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

-10% -20% -30% -40% Concentration (mg/L)

Figure 10. Détermination de l’acrylamide en mg/L. Profil d’exactitude réalisé avec les données corrigées. Les résultats sont obtenus avec une régression quadratique pondérée (type 1/X) pour modéliser la fonction de réponse (limites d’acceptation à ± 25%). Figure 10. Acrylamide determination in mg/L. Accuracy profile carried out with corrected data. The results are obtained with a weighted quadratic regression (1/X type) to model the response function (acceptability limits ±25%).

le niveau de concentration égal à 10 mg/L. Le calcul des limites de quantification inférieure et supérieure donne respectivement 14.05 mg/L et 5000 mg/L. Cette méthode reste donc correctement adaptée à l’objectif que l’on s’est fixé car les LOQ sont compatibles avec les teneurs classiquement rencontrées. Le tableau V résume pour l’ensemble des niveaux de concentrations les résultats obtenus. Cette étude démontre que, dans la mesure où on utilise un modèle de régression quadratique pondérée, la méthode est parfaitement valide pour l’intervalle de dosage qui s’établit entre 14,05 et 5000 µg/mL. Il est également montré que l’effet matrice est systématique et que pour le corriger il faut appliquer un coefficient de correction de 1,457. On constate alors que la zone

concentration level equal to 10 mg/L. The lower and higher quantification limits computation respectively gives 14.05 mg/L and 5000 mg/L. Thus, this method remains correctly fitted to the objective that has been defined, because the LOQs are compatible with the concentrations usually met. Table V summarizes the results obtained for the whole set of concentration levels. This study demonstrated that, as far as a weighted quadratic regression model is used, the method is perfectly valid for an application range set between 14.05 and 5000 µg/mL. It is also shown that the matrix effect is systematic and that, in order to correct it, a 1.457 correction coefficient must be applied. It is then noted that the area included in the tolerance interval

Tableau V. Détermination de l’acrylamide en mg/L. Profil d’exactitude après correction des données brutes. Table V. Acrylamide determination in mg/L. Accuracy profile after raw data correction. Critères de performance Performance criteria Concentration ajoutée/Added concentration

Niveau 1 Level 1

Niveau 2 Level 2

Niveau3 Level 3

Niveau 4 Level 4

Niveau 5 Level 5

Niveau 6 Level 6

10

20

50

500

1000

5000

Limite basse de tolérance/Tolerance lower limit

6.98

16.52

44.93

192.5

894.8

4482

Limite haute de tolérance/Tolerance higher limit

12.26

24.16

60.07

223

1145

5515

Limite basse relative de tolérance (%) Relative tolerance lower limit (%)

-30.18%

-17.40%

-10.14%

-3.77%

-10.52%

-10.35%

Limite haute relative de tolérance (%) Relative tolerance higher limit (%)

22.59%

20.82%

20.15%

11.50%

14.48%

10.30%

Écart-type de répétabilité Repeatability standard deviation

0.608

0.428

1.624

5.784

32.26

136.7

Écart-type de fidélité intermédiaire Intermediate precision standard deviation

0.992

1.313

2.813

6.318

48.01

199.2

CV répétabilité (%)/RSD repeatability (%)

6.08%

2.14%

3.25%

2.89%

3.23%

2.73%

CV fidélité intermédiaire (%) RSD intermediate precision (%)

9.92%

6.57%

5.63%

3.16%

4.80%

3.98%

Concentration prédite inverse Reverse predicted quantity

9.62

20.34

52.5

207.7

1020

4999

Biais absolu/Absolute bias

-0.3796

0.3418

2.501

7.731

19.78

-1.354

Biais relatif (%)/Relative bias (%)

-3.796%

1.709%

5.002%

3.866%

1.978%

-0.028%

Recouvrement (%)/Recovery (%)

96.2%

101.7%

105.0%

103.9%

102.0%

100.0%

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

comprise dans l’intervalle de tolérance est plus large après correction. Cette augmentation de l’incertitude est attendue vu l’application du facteur de correction.

is broader after correction. This uncertainty increase is expected given the correction factor application.

VI Détermination de la vitamine B3 par HPLC-Fluorimétrie dans le lait

VI Milk Vitamin B3 determination by HPLC-Fluorimetry

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Part III. Examples of application

1. Matériel et méthodes

1. Equipment and methods

La détermination de la vitamine B3 (aussi appelée vitamine PP ou niacine) dans les aliments requiert la mesure de ses deux formes chimiques : l’acide nicotinique et la nicotinamide. La concentration totale est alors exprimée en faisant la somme des deux valeurs obtenues. Le tableau VI indique les teneurs maximales et minimales auxquelles on trouve la vitamine B3 dans les aliments. L’étude présentée ici porte sur le lait dont les teneurs varient entre 0,6 et 1,0 mg/L selon la nature du produit. Du fait des traitements thermiques ou des autorisations de supplémentation accordées, les produits du marché se situent plutôt entre 0,4 et 2,0 mg/L. Afin de couvrir un domaine d’application raisonnable, la validation a été étendue entre 0,2 et 4,0 mg/L. La méthode officielle de dosage AOAC 94-413 (1990) repose sur une technique microbiologique délicate et d’incertitude élevée de 15%. Le but de cette validation est de vérifier si la méthode HPLC [7] est acceptable comme méthode alternative. C’est pourquoi les limites d’acceptabilité ont été fixées à ± 20%, ce qui est bien en deçà des performances classiques de la méthode de référence qui se situent plutôt autour de ± 40%. La méthode HPLC consiste en une extraction de l’acide nicotinique et du nicotinamide par une hydrolyse HCl 0,1 M à 100°C pendant 1 h, suivie

Vitamin B3 (also called vitamin PP or niacin) determination in food is based on two chemical forms: nicotinic acid and nicotinamide. The total concentration is then expressed by adding the two obtained values. Table VI indicates the maximum and minimum vitamin B3 contents potentially found in food. The study herein presented concerns milk which concentrations vary between 0.6 and 1.0 mg/L, according to the product nature. Due to thermal treatments or authorized supplementation, the marketed products rather stand between 0.4 and 2 mg/L. In order to cover a reasonable application field, validation has been extended between 0.2 and 4.0 mg/L. The official AOAC 94-413 (1990) determination method is based upon a delicate, high uncertainty, (15%) microbiological technique. This validation study aims at checking whether HPLC [7] is acceptable as an alternative method. This is the reason why the acceptability limits have been set at ±20%, which is clearly inferior to the reference method classic performances which stand rather around ±40%. HPLC method consists in a 1-h extraction of nicotinic acid and nicotinamide by a HC1 0.1 M at 100°C hydrolysis, followed by an elution on a 60 RP

Tableau VI. Teneurs usuelles en vitamine B3 des grandes familles d’aliments exprimées en mg/kg ou mg/L. Table VI. Large food families usual Vitamin B3 contents expressed in mg/kg or mg/L Famille d’aliments/Food family

Minimum

Maximum

Abats/Variety meat

20.0

155.0

Boulangerie et viennoiserie/Bakery and rolls

10.0

34.0

Céréales et pâtes/Cereals and pasta

1.0

57.0

Céréales pour petit déjeuner/Cereals for breakfast

41.0

176.0

Charcuterie et salaison/Assorted cooked meats and salted meats

2.5

102.0

Fromages/Cheese

0.6

24.0

Fruits/Fruits

1.0

32.0

Graines oléagineuses et châtaignes/Oilseeds and chestnuts

2.0

150.0

Légumes/Vegetables

1.0

65.0

Légumes secs/Dry vegetables

1.0

30.0

Oeufs et dérivés/Eggs and derivatives

0.7

0.9

Pâtisserie et biscuits/Pastries and biscuits

1.0

18.0

Poissons et batraciens/Fishes and batrachians

2.1

140.0

Pommes de terre et apparentés/Potatoes and related products

6.0

40.0

Produits laitiers et desserts lactés Dairy products and desserts containing milk

0.6

10.0

Viandes/Meats

26.0

90.0

Volailles et gibiers/Poultry and game

29.0

92.0

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

d’une élution sur colonne Lichrospher 60 RP Select B (5 µm, diamètre 4 mm, longueur 250 mm) par un tampon phosphate 0,07 mol/L contenant du peroxyde d’hydrogène 0,075 mol/L et du sulfate de cuivre 5,10-6 mol/L. Une dérivation photochimique post-colonne est réalisée à l’aide d’une lampe UV, éliminant la raie d’absorption à 254 nm, et permet d’obtenir des dérivés détectables par spectrofluorimétrie à 380 nm après excitation à 322 nm. La quantification des deux espèces chimiques est obtenue par étalonnage externe. Dans la mesure où la validation du dosage du nicotinamide ne présente aucun problème, nous ne parlerons que de l’acide nicotinique pour lequel on observe un effet de matrice tout à fait significatif.

Select B (5 µm, 4 mm diameter, 250 mm length) Lichrospher column, with a 0.07-mol/L phosphate buffer, containing 0.075 mol/L hydrogen peroxide and 5.10-6 mol/L copper sulphate. A post-column photochemical derivation is carried out with a UV lamp, eliminating the absorption line at 254 nm, and allowing to obtain detectable derivatives by spectrofluometry at 380 nm after excitation at 322 nm. Both chemical species quantification is obtained by external calibration.

2. Plans d’expérience

2. Experimental design

Le même plan d’expérience a été utilisé pour l’étalonnage et la validation ; il consiste en vingt-sept essais réalisés à trois niveaux sur trois jours et trois répétitions (3 x 3 x 3). C’est donc un plan de type V4 selon [1] auquel on a ajouté un niveau supplémentaire aux standards d’étalonnage : 3 x 3 x 3 au lieu de trois jours x deux répétitions x deux niveaux. Ce choix est motivé, d’une part, par un nombre total d’essais économiquement acceptable, d’autre part, par le mode opératoire de la méthode qui préconise trois niveaux de concentration au minimum pour l’étalonnage. Étant donné qu’il n’existe pas de matériau de référence adapté, on a décidé de réaliser des séries de droites d’ajouts sur deux échantillons de lait. La figure 11 illustre, à partir de données expérimentales, le plan d’expérience complet, la variabilité inter-jours et l’effet de matrice. On retrouve trois séries de données : - les standards d’étalonnage (Etalon) obtenus par mise en solution d’acide nicotinique pur dans de l’eau distillée,

The same experimental design has been used for both calibration and validation; it consisted in twenty seven trials carried out at three levels over three days and three repetitions (3x3x3). Thus it is a V4 protocol according to [1], to which an additional level has been added to the calibration standards: 3x3x3 instead of three days x two repetitions x two levels. This choice is motivated, on the one hand, by an economically acceptable total number of trials, and, on the other hand, by the operating procedure that recommends a minimum of three concentration levels for calibration. Given that adapted reference material does not exist, it has been decided to carry spiked standards on two milk samples. Figure 11 illustrates, from experimental data, the complete experimental design, the inter-days variability and the matrix effect. Three series of data are recovered: - calibration standards obtained by dissolving pure nicotinic acid into distilled water,

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

300

Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Lait A1 Lait A2 Lait A3 Lait B1 Lait B2 Lait B3

250

Hauteur (UA) Height (UA)

As nicotinamide determination validation does not present any difficulty, we shall only speak about nicotinic acid, for which a highly significant matrix effect is observed.

200

150

100

50

0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

Concentration mg/L Figure 11. Acide nicotinique (données brutes non corrigées en mg/L). Le Jour 1 est représenté par un carré, le jour 2 par un cercle et le jour 3 par un losange. Les différentes droites d’ajouts sur les laits A et B illustrent l’effet de matrice. Figure 11. Nicotinic acid (non-corrected raw data in mg/L). Day 1 is represented by squares, day 2 by circles, and day 3 by diamonds. The spiked standards on milks A and B illustrate the matrix effect.

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

- les standards d’étalonnage par ajouts dosés dans la matrice Lait A, - les standards de validation par ajouts dosés dans la matrice Lait B.

- spiked calibration standards into the Milk A matrix, - spiked validation standards into the Milk B matrix.

3. Résultats

3. Results

Les données ont été traitées en deux étapes : - le calcul du coefficient de correction de l’effet de matrice à partir du taux de recouvrement, - le calcul des profils d’exactitude. En appliquant la procédure proposée, on a calculé les valeurs retrouvées pour le lait A par prédiction inverse, en utilisant l’ensemble des données d’étalonnage. La figure 12 illustre les vingt-sept valeurs obtenues pour cette matrice. Il apparaît clairement qu’elles ne s’alignent pas sur la droite de linéarité, illustrée par la première bissectrice, et qu’il y a un effet de matrice. On a alors calculé la droite selon la méthode des moindres carrés et on obtient (entre parenthèses figurent les écarts-types des coefficients) : [Retrouvée] = 0.018 + 0.518 [Ajoutée] Si on calcule les intervalles de confiance des coefficients :

The data were processed in two steps: - computation of the matrix effect correction coefficient, from the Recovery yield, - accuracy profiles computation. By applying the proposed procedure, the values for milk A, calculated by inverse prediction, have been computed, using the whole calibration data set. Figure 12 illustrates the twenty seven values obtained for this matrix. It clearly appears that they do not fit to the linearity straight line, illustrated by the first bisecting line, and that there is a matrix effect. The straight line was then computed according to the least squares method, and we obtain: [Recovered] = 0.018 + 0.518 [Added]

Ordonnée à l’origine

Pente

Coefficient de correction

Ordinate at the origin

Slope

Correction coefficient

Limite inférieure

-0.045

0.493

2.028

Lower limit

-0.045

0.493

2.028

Limite supérieure

0.082

0.542

1.845

Higher limit

0.082

0.542

1.845

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Comme la valeur 0 fait partie de l’intervalle de confiance de l’ordonnée à l’origine, on a décidé de la considérer comme nulle ; cette démarche est applicable dans ce cas car nous sommes près du zéro, elle serait risquée si la gamme d’étalonnage était très éloignée de la valeur zéro. Par contre pour la pente, la valeur 0,5 appartient à l’intervalle et par simplification, on a donc décidé d’appliquer un coefficient de correction Fc = 2,0 sur toutes les données prédites par étalonnage inverse pour le lait B. Ces données corrigées ont alors servi à calculer le profil d’exactitude de la figure 13 ; les statistiques calculées comme il est décrit par ailleurs sont reportées dans le tableau VII.

Computing the coefficients confidence intervals:

As the 0 value is part of the confidence interval of the ordinate at the origin, it has been decided to consider it as non signifcant. This approach is applicable in this case, because we are close to zero. It would be risky if the calibration range was very far from the zero value. Conversely, as for the slope the 0.5 value belongs to the interval and, to simplify, it has been decided to apply a correction coefficient Fc = 2.0 to all the data predicted by inverse calibration for milk B. These corrected data have then been used to compute the Figure 13 accuracy profile; the statistics calculated as described elsewhere are reported in Table VII.

4.5

Calculée / Calculated (mg/L)

4.0 3.5 3.0 2.5 y = 0.518x + 0.018

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

Ajoutée / Added (mg/L)

Figure 12. Acide nicotinique en mg/L. Droite de linéarité obtenue sur les données brutes du lait A avant correction. Le coefficient de correction de l’effet de matrice correspond à l’inverse de la pente de la droite. Figure 12. Nicotinic acid in mg/L. Linearity straight line obtained on milk A raw data before correction. The matrix effect correction coefficient corresponds to the inverse of the slope.

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

25%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

20% 15% 10% 5% 0% 0 .0

1 .0

2 .0

3 .0

4 .0

5 .0

-5 % -1 0 % -1 5 % -2 0 % -2 5 % C o nce ntra tio n (m g/L )

Figure 13. Acide nicotinique en mg/L. Profil d’exactitude (limites d’acceptation à ± 20%). Figure 13. Nicotinic acid in mg/L. Accuracy profile (±20% acceptability limits) . Tableau VII. Acide nicotinique en mg/L. Profil d’exactitude après correction par un coefficient déduit du taux de recouvrement. Table VII. Nicotinic acid in mg/L. Accuracy profile after correction by a coefficient deduced from the recovery yield. Critères de performance/Performance criteria

Niveau 1/Level 1

Niveau 2/Level 2

Niveau 3/Level 3

0.2

2.0

4.0

Limite basse de tolérance/Tolerance lower limit

0.161

1.796

3.709

Limite haute de tolérance/Tolerance higher limit

0.233

2.157

4.268

Limite basse relative de tolérance (%) Relative tolerance lower limit (%)

-19.57%

-10.19%

-7.26%

Limite haute relative de tolérance (%) Relative tolerance higher limit (%)

16.72%

7.86%

6.69%

Écart-type de répétabilité/Repeatability standard deviation

0.0148

0.0559

0.1141

Écart-type de fidélité intermédiaire Intermediary precision standard deviation

0.0148

0.0668

0.1141

CV répétabilité (%)/RSD repeatability (%)

7.42%

2.80%

2.85%

CV fidélité intermédiaire (%)/RSD intermediate precision (%)

7.42%

3.34%

2.85%

Concentration prédite inverse/Inverse predicted quantity

0.197

1.977

3.988

Concentration ajoutée/Added concentration

Biais absolu/Absolute bias

0.003

-0.023

-0.012

Biais relatif (%)/Relative bias (%)

-1.43%

-1.16%

-0.29%

Recouvrement (%)/Recovering (%)

98.58%

98.84%

99.71%

Le profil d’exactitude de la figure 13 montre que la méthode peut être validée sur la totalité du domaine de concentrations 0,2 à 4,0 mg/L pour une limite d’acceptation de ±20%. Les critères de performances de la méthode HPLC - objet de l’étude - sont présentés dans le tableau VIII et comparés à ceux de la méthode microbiologique, dite de référence. Les résultats montrent que les valeurs obtenues sont meilleures pour la méthode HPLC, en termes de limite de quantification inférieure et d’incertitude [7, 3]. Néanmoins l’incertitude pour le niveau le plus bas du domaine d’application est un peu plus élevée que pour la méthode de référence mais reste comparable. Plusieurs résultats acquis lors de cette étude de validation nous ont amené à modifier le mode opératoire : - le profil d’exactitude a été obtenu avec un modèle

The Figure 13 accuracy profile shows that the method can be validated on the whole 0.2 to 4.0 mg/L concentration range, and for a ±20% acceptability limit. The herein studied HPLC method Figure of merit are presented in Table VIII, and compared to the microbiological method so called “the reference method”. The results show that the values obtained are better for the HPLC method in terms of lower quantification limit and uncertainty [7, 3]. Nevertheless, the uncertainty for the application range lowest level is a little higher than for the reference method, but remains comparable. Several results obtained at the time of this validation study have led us to amend the operating procedure: - the accuracy profile has been obtained with a linear

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Validation des procédures analytiques quantitatives : harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches Part III. Examples of application

Tableau VIII. Vitamine B3 en mg/L. Comparaison des critères de performance de la méthode HPLC et de la méthode microbiologique Tableau VIII. Vitamin B3 in mg/L. HPLC and microbiological methods performance criteria comparison. Critères/Criteria Limite de détection/Detection limit

Méthode HPLC HPLC method

Méthode microbiologique Microbiological method

0.2

n.d.

Limite de quantification inférieure/Lower quantification limit

0.2

0.4

Limite de quantification supérieure/Higher quantification limit

0.4

n.d.

15.6% 7.2% 6.0%

15% 15% 15%

Incertitude (%) à Uncertainty (%) at

0.2 mg/L 2.0 mg/L 4.0 mg/L

linéaire passant par 0 et le niveau de concentration le plus élevé. Par conséquent, en routine, l’étape d’étalonnage est simplifiée et ne comporte plus qu’un niveau de concentration à 4,0 mg/L, - un coefficient de correction de 2,0 est systématiquement appliqué aux réponses mesurées. À partir des données de la figure 12, il aurait été possible de calculer un profil d’exactitude en utilisant les ajouts sur le lait A comme mesures d’étalonnage puis celles sur le lait B comme mesures de validation. Le profil obtenu est alors tout à fait comparable et ne nécessite pas l’application d’un coefficient de correction. Cependant, si cette approche est tout à fait complémentaire, elle correspond moins aux pratiques de l’analyse de routine et exigerait surtout de disposer en permanence d’un échantillon de référence blanc. Étant donné la nature dégradable du lait, le choix de cette autre méthode d’étalonnage compliquerait fortement la procédure.

model running through 0 and the highest concentration level. Consequently, in routine, the calibration step is simplified and only includes one concentration level at 4.0 mg/L, - a 2.0 correction coefficient is systematically applied to the observed responses. From Figure 12 data, it would have been possible to compute an accuracy profile by using the spiked milk A samples, as calibration measures, then on milk B as validation measures. The obtained profile is then absolutely comparable and does not require a correction coefficient to be applied. However, if this approach is fully complementary, it less corresponds to the routine analysis practices and would, above all, demands to permanently have a blank reference sample. Given the milk degradable nature, choosing this other calibration method would strongly complicate the procedure.

VII Détermination d’une protéine de biomarquage d’une maladie neurologique par un test ELISA

VII Determination of a neurological disease biomarker protein by a ELISA test

1. Objectifs et moyens

1. Goals and means

Un test ELISA de type « sandwich » a été développé afin de quantifier avec exactitude une protéine pressentie comme biomarqueur et utilisée pour un projet de recherche thérapeutique sur une maladie neurologique. Le test ELISA consiste en l’incubation d’échantillons sur des plaques enduites d’anticorps spécifiques pour la capture de la protéine d’intérêt. Cette phase est suive d’une détection immunologique de la liaison spécifique de la protéine par un enzyme conjugué et une mesure par densité optique du produit coloré. Afin de valider ce test, les standards d’étalonnage et les standards de validation ont été préparés dans des matrices appropriées à partir de solution stock de la protéine par des dilutions en série [8].

A “sandwich” type ELISA test has been developed in order to exactly quantify a protein likely to be a biomarker and used for a neurological disease-related therapeutic project. ELISA test consists in incubating samples on plates coated with specific antibodies with a view to capturing the protein of interest. This phase is followed by an immunologic detection of the protein specific linkage by a conjugated enzyme and a measurement of the coloured product by optical densitometry.

2. Plans d’expérience

2. Experimental designs

Cette procédure a été exécutée sur quatre séries indépendantes, avec deux plaques par essai sur quatre jours. Tous les essais – que ce soit pour les standards d’étalonnage ou de validation – ont été conduits en triple.

This procedure has been carried out on four independent series, with two plates by trial, over four days. All the trials – either for calibration or validation standards – have been conducted in triple.

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In order to validate this test, the calibration standards and the validation standards were prepared in appropriate matrixes, from protein stock solutions, by serial dilution [8].

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

3. Résultats

3. Results

Une régression logistique à quatre paramètres (4PL) a été ajustée sur les données (par essai et par plaque) par la méthode de maximum de vraisemblance en utilisant comme pondération une fonction exponentielle des niveaux observés (POM, power of the mean).

A four-parameter logistic regression (4PL) has been adjusted on the data (by trial and by plate) by the maximum of likelihood method, by using, as weighting, an exponential function of the observed levels (POM, power of the mean).

Y =α +

δ −α  γ β 1+   X

Y =α +

δ, α, γ et β sont respectivement l’asymptote haute, l’asymptote basse, la concentration correspondant au point d’inflexion de la courbe et la pente en ce point. Graphiquement, pour une série de mesures réalisées sur quatre jours, les courbes d’étalonnage se présentent comme à la figure 14. Les concentrations estimées des échantillons de validation ont été calculées en inversant la fonction de réponse, c’est-à-dire : x ijk,calc =

γˆ i

 δˆ − αˆ  i −1  i  y ijk − αˆ i 

δ −α  γ β 1+   X

δ, α, γ and β are respectively the higher asymptote, the lower asymptote, the concentration corresponding to the curve inflexion point and the slope in this point. Graphically, for a series of measurements carried out on four days, the calibration curves appear like in Figure 14. The validation samples estimated concentrations have been computed by inversing the response function, i.e.: x ijk,calc =

1 βˆ

i

Connaissant la teneur théorique de ces échantillons par dilution, la justesse, la fidélité et l’intervalle de tolérance ont été calculés pour chaque niveau de concentration (tableau IX). Le profil d’exactitude est représenté en figure 15. L’intervalle de tolérance à 95% est compris dans les limites d’acceptation de ± 30% à tous les niveaux de concentration, excepté aux niveaux inférieurs à 28 ng/mL (figure 15). La limite de quantification est estimée à 24 ng/mL. En dessous de cette limite, par définition, la méthode n’offre plus de garantie suffisante. Sur la base de ces expériences de validation nous pouvons conclure que les garanties sont suffisantes. En effet, la méthode fournira des résultats à moins de 30% de la vraie valeur dans au moins 95% des cas lorsque la concentration se situe entre 24 ng/mL et 450 ng/mL.

γˆ i

1

 δˆ − αˆ  βˆi i −1  i  y ijk − αˆ i 

Knowing the samples theoretical contents by dilution, trueness, precision, and tolerance interval have been computed for each concentration level (Table IX). The accuracy profile is represented in Figure 15. The 95% tolerance interval is included inside the ± 30% acceptability limits, at every concentration level, except at the levels lower than 28 mg/mL (Figure 15). The quantification limit is estimated at 24 ng/mL. Below this limit, by definition, the method does no longer offer sufficient guarantee. On the basis of these validation experiments, we can conclude that the guarantees are sufficient. Actually, the method will provide results at less than ±30% of the real value, in at least 95% of the cases, when the concentration stands between 24 ng/mL and 450 ng/mL

4 .0 J o u r 4/Day 4 J o u r 2/Day 2 J o u r 3/Day 3 J o u r 1/Day 1

3 .5

3 .0

Absorbance

2 .5

2 .0

1 .5 1 .0

0 .5

0 .0 0

100

200

300

400

500

600

700

800

C o n c e n tra tio n n g /m L

Figure 14. Dosage ELISA en ng/mL. Ajustement du modèle logistique à quatre paramètres pour des série de données d’étalonnage collectées sur les quatre jours de l’étude. Figure 14. ELISA dosage in ng/mL. Adjustment of a four-parameter logistic model for series of calibration data collected during the four-day study.

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

120%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

80%

40%

0% 0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

-4 0 %

-8 0 % C o n ce n tra tio n (n g /m L )

Figure 15. Dosage ELISA d’une protéine de biomarquage. Profil d’exactitude (limites d’acceptation à ± 30%). Figure 15. ELISA determination of a biomarker protein. Accuracy profile (± 30% acceptability limits). Tableau IX. Dosage ELISA en ng/mL. Résultats des calculs du profil d’exactitude pour les échantillons de validation et de la fidélité pour les échantillons inconnus. Table IX. ELISA dosage in ng/mL. Computation results of accuracy profile for validation samples and precision for unknown samples.. Critères de performance Performance criteria

Echantillons de validation/Validation sample

Concentration théorique Theoretical concentration

3.5

7

14.1

28

56

113

225

450

Limite basse de tolérance Tolerance lower limit

1.179

4.395

10.67

22.7

47.64

96.3

207.7

335.9

Limite haute de tolérance Tolerance higher limit

6.859

11.97

19.28

35.82

68

136.9

270.6

555.3

Limite basse relative de tolérance (%) Relative tolerance lower limit (%)

-66.33%

-37.22%

-24.3%

-18.64%

-14.93%

-14.78%

-7.678%

-25.35%

Limite haute relative de tolérance (%) Relative tolerance higher limit (%)

95.97%

71.05%

36.75%

27.93%

21.42%

21.16%

20.27%

23.41%

Écart-type de répétabilité Repeatability standard deviation

1.344

1.193

1.899

1.187

1.774

3.606

9.106

23.33

Écart-type de Fidélité intermédiaire Intermediate precision standard deviation

1.344

1.588

2.004

2.304

3.556

7.127

12.82

40.55

CV de répétabilité (%) RSD repeatability (%)

38.41%

17.04%

13.47%

4.238%

3.168%

3.191%

4.047%

5.185%

CV de fidélité intermédiaire (%) RSD intermediate precision (%)

38.41%

22.69%

14.21%

8.229%

6.349%

6.307%

5.696%

9.01%

Concentration moyenne prédite Inverse predicted quantity

4.019

8.184

14.98

29.3

57.82

116.6

239.2

445.6

Biais absolu /Absolute bias

0.5187

1.184

0.8777

1.301

1.818

3.607

14.16

-4.367

Biais relatif (%)/Relative bias (%)

14.82%

16.91%

6.225%

4.647%

3.246%

3.192%

6.294%

-0.970%

Recouvrement (%)/Recovery yield (%)

114.8%

116.9%

106.2%

104.6%

103.2%

103.2%

106.3%

99.03%

VIII Détermination d’impuretés par HPLC-UV dans une préparation pharmaceutique

VIII Impurities determination by HPLC-UV in a pharmaceutical product

1. Objectifs et méthodes

1. Goals and methods

Dans le cadre d’un contrôle qualité en vue d’une libération de lot, une méthode a été développée pour déterminer le niveau d’impuretés dans deux formes pharmaceutiques, ayant différents niveaux de dosage du principe actif. Cette méthode repose sur la chromatographie liquide à haute performance

As part of a quality control aiming at releasing a batch, a method has been developed with a view to determining the impurities level in two pharmaceutical preparations, having different concentration levels of active ingredient. This method is based upon reversed phase high performance liquid chromatog-

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

phase inverse, couplée à un détecteur UV travaillant à une longueur d’onde de 269 nm. Les impuretés sont détectées sur base de leur temps de rétention. La préparation des échantillons s’effectue comme suit. 20 mg de principe actif sont extraits d’un broyat de 20 comprimés et dissout dans 20 mL de méthanol. La phase mobile composée d’acétonitrile, d’acétate d’ammonium et d’acide acétique glacial est alors ajoutée. Le volume d’injection est de 40 µL. L’objectif de cette phase de validation est de donner des garanties que dans 95% des cas, le résultat est à moins de 10% de la vraie valeur. Cette validation doit également permettre d’estimer la limite de quantification de la méthode.

raphy, coupled with a UV detector working at a 259 nm wavelength. Impurities are detected according to their retention time. Sample preparation is carried out as follows: 20 mg of active ingredient are extracted from a 20 tablet crushed residue and then dissolved in methanol 20 mL. Then, the mobile phase, composed of acetonitrile, ammonium acetate and glacial acetic acid, is added. The injection volume is 40 µL. This validation study aims at guaranteeing that, in 95% of the cases, the result is at less than ±10% of the true value. Moreover, this validation has to make it possible to assess the quantification method limits.

2. Plans d’expérience

2. Experimental designs

Différentes sources de variation ont été considérées pour cette validation: l’opérateur, l’équipement et le jour. En considérant deux niveaux pour chaque facteur, le plan factoriel complet compte huit combinaisons. Un plan factoriel partiel moins contraignant a été sélectionné et il est décrit dans la tableau X. Pour chaque série, on a préparé des standards d’étalonnage, des standards de validation. Les standards d’étalonnage ont été préparés hors matrice, à quatre niveaux de concentration : 0,05% (100 ng/mL), 0,50% (1000 ng/mL), 1,25% (2500 ng/mL) et 2% (4000 ng/mL) avec deux préparations indépendantes par niveau de concentration. N’ayant ni les impuretés ni les excipients à notre disposition, les standards de validation ont été préparés à partir du principe actif seul à cinq niveaux de concentration : 0,01% (20 ng/mL), 0,05%, 0,25% (500 ng/mL), 0,50% et 1,25% avec trois préparations indépendantes par niveau de concentration. Dans le cadre de cette étude, il a été supposé que les impuretés ont une réponse similaire à celle du principe actif, des échantillons ont été préparés à partir des formes pharmaceutiques pour simuler un niveau d’impureté de 0,5% (par rapport à la quantité théorique de substance active) qu’auraient des échantillons inconnus. Ces préparations consistaient à broyer un nombre fixé de comprimés, d’en extraire une quantité déterminée et de la diluer pour obtenir le niveau de concentration requis. Cet exemple a été réalisé dans un but plus didactique que pratique car l’approche décrite ne correspond pas à celle qui est recommandée pour la validation de méthodes destinées à quantifier des impuretés.

Different uncertainty sources have been considered for this validation: the operator, the equipment, and the day. Considering two levels for each factor, the full factorial design includes eight combinations. A fractional factorial design has been selected and is described in Table X. For each series, calibration and validation standards have been prepared. Calibration standards have been prepared out of the matrix, at four concentration levels: 0.05% (100 ng/mL), 0.50% (1000 ng/mL), 1.25% (2500 ng/mL) and 2.00% (4000 ng/mL), with two independent preparations at each concentration level. As neither impurities nor excipient were available as pure product, the validation standards have been prepared from the active ingredient alone, at five concentration levels: 0.01% (20 ng/mL), 0.05%, 0.25% (500 ng/mL), 0.50% and 1.25%, with three independent preparations for each concentration level. As part of this study, impurities were supposed to have a similar response as the active ingredient one: samples have been prepared from the pharmaceutical presentations with a view to simulating a 0.50% impurity level (compared to the active substance theoretical quantity) that could be found in unknown samples Sample preparations consisted in crushing tablets, extracting a determined quantity to be diluted in order to get the required concentration level. This example has been carried out in a more pedagogical than practical purpose. Actually, the described approach does not correspond to the guidance to validate methods intended to quantify impurities.

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Part III. Examples of application

Tableau X. Dosage d’impuretés. Facteurs de variation et niveaux pris en compte. Table X. Impurities determination. Factors and levels used. Série/Series

Jour/Day

Opérateur/Operator

Équipement/Equipment

1

1

1

1

2

1

2

2

3

2

1

2

4

2

2

1

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

3. Résultats

3. Results

Parmi les différents modèles testés, c’est la régression linéaire passant par zéro qui a donné des résultats en accord avec les objectifs. Ce type de modèle de régression a donc été ajusté à chaque série, en considérant un seul niveau de concentration à 2%. Les concentrations estimées des échantillons de validation ont été calculées en divisant simplement le signal par l’estimation de la pente de la droite de régression de la série. Connaissant la concentration théorique de ces échantillons, la justesse, la fidélité et l’intervalle de tolérance ont été calculés pour chaque niveau de concentration (tableau XI). Le profil d’exactitude est représenté en figure 16. L’intervalle de tolérance est compris dans les limites d’acceptation ± 10% à tous les niveaux de concentration excepté 0,01%. La limite de quantification est estimée à 97 ng/mL (figure 16), c’est-à-dire légèrement sous 0,05%. La validation donne suffisamment de garantie sur la méthode et montre qu’elle fournira des résultats à moins de 10% de la vraie valeur dans au moins 95% des cas lorsque la concentration se situe entre 97 et 2500 ng/mL.

Among the various tested models, linear regression, running through zero, is the one that has provided results complying with the objectives. This type of regression model has, consequently, been adjusted for every series, considering a single concentration level at 2%. The estimated concentrations of validation standards have been computed by simply dividing the signal by the estimated slope of the series regression straight line. Knowing the sample theoretical concentrations, trueness, precision and tolerance interval have been computed for each concentration level (Table XI). The accuracy profile is represented in Figure 16. The tolerance interval is included within the ± 10% acceptability limits, at all the concentration levels, except 0.01%. The limit of quantification is estimated at 97 ng/mL (Figure 16), i.e. a little lower than 0.05%. Validation gives enough guarantees that the method will provide results at ± 10% of the true value in at least 95% of the cases, when the concentration stands between 97 and 2500 ng/mL.

IX Détermination du phosphate dans un plasma par spectrophotométrie dans le visible

IX Plasma Phosphate Determination by Spectrophotometry in the Visible Light

1. Objectifs et méthodes Le dihydrogénophosphate de sodium est ajouté à

1. Goals and Methods Sodium dihydrogen phosphate is added into

Tableau XI. Dosage d’impuretés en ng/mL. Résultats des calculs du profil d’exactitude pour les standards de validation. Table XI. Impurities determination in ng/mL. Accuracy profile calculation results for validation standards. Critères de performance/Performance criteria Teneur en impuretés/Content of Impurities

Échantillons de validation/Validation samples 0.01%

0.05%

0.25%

0.50%

1.25%

20

100

500

1000

2500

Concentration moyenne introduite Mean introduced concentration

20.15

100.8

503.6

1008

2519

Limite basse de tolérance/Lower tolerance limit

14.39

98.05

490.7

979.1

2431

Concentration nominale/Nominal concentration

39.26

106.5

524.5

1028

2530

Limite basse relative de tolérance (%) Relative lower tolerance limit (%)

Limite haute de tolérance/Higher tolerance limit

-28.58%

-2.705%

-2.556%

-2.840%

3.521%

Limite haute relative de tolérance (%) Relative higher tolerance limit (%)

94.81%

5.659%

4.159%

2.027%

0.4171%

Écart-type de répétabilité Repeatability standard deviation

4.644

1.546

6.713

7.764

18.74

Écart-type de Fidélité intermédiaire Intermediate precision standard deviation

5.214

1.758

6.713

9.803

20.87

CV de répétabilité (%)/Repeatability CV (%)

23.04%

1.534%

1.333%

0.770%

0.744%

CV de fidélité intermédiaire (%) Intermediate precision CV (%)

25.87%

1.745%

1.333%

0.973%

0.828%

Concentration moyenne prédite Predicted mean concentration

26.83

102.3

507.6

1004

2480

Biais absolu/Absolute bias

6.674

1.488

4.036

-4.098

-39.10

Biais relatif (%)/Relative bias (%)

33.12%

1.477%

0.8015%

-0.4067%

-1.552%

Recouvrement (%)/Recovery yield (%)

133.1%

101.5%

100.8%

99.59%

98.45%

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Erreur relative (%)/Relative error (%)

60

40

20

0

-2 0

-4 0 0

500

1000

1500

2000

2500

C o n c e n tra tio n (n g /m L )

Figure 16. Dosage d’impuretés en ng/mL. Profil d’exactitude (limites d’acceptation à ± 10%). Figure 16. Impurities determination ng/mL. Accuracy profile (acceptability limits ± 10%).

certains plasmas à usage thérapeutique dans le but de les maintenir à pH neutre et de stabiliser les facteurs de coagulation. La teneur en phosphate doit cependant rester de l’ordre de 5 mMol/L afin d’éviter une hyperphosphatémie. La méthode de dosage par spectrophotométrie dans le visible développée ici a donc pour but de permettre ce contrôle. La mesure est réalisée à 710 nm sur un complexe phosphomolybdique réduit par le chlorure stanneux. Les protéines sont préalablement éliminées par précipitation à l’aide d’acide trichloracétique et centrifugation. La gamme d’étalonnage est comprise entre 0.28 et 0.70 µMol/mL.

some therapeutic plasma with a view to keeping them at neutral pH and stabilizing the coagulation factors. However, phosphate concentration must stay at around 5 mMol/L, in order to avoid any hyperphosphatemia. Thus, the herein developed determination method by spectrophotometry in the visible light aims at making it possible this control. The measurement is performed at 710 mm, on a stannous chloride reduced phosphomolybdic complex. Proteins are previously eliminated by trichloracetic acid precipitation and centrifugation. The calibration range extends from 0.28 to 0.70 µMol/mL.

2. Plans d’expérience

2. Experimental designs

Il s’agit d’un protocole de type V4 sur trois jours. Les standards d’étalonnage comportent quatre niveaux et deux répétitions, respectivement avec et sans matrice, soit quarante-huit essais. Les standards de validation comportent trois niveaux et trois répétitions, soit vingt-sept essais (tableau XII). Toutes les standards d’étalonnage (12) et de validation (9) sont indépendants. Les réponses obtenues en densité optique (DO) en fonction de la concentration pour les standards d’étalonnage sont présentées sur la figure 17. On peut observer qu’il n’y a pratiquement aucune influence de la matrice et que les équations de régression obtenues pour chaque ensemble de données sont très proches. Par ailleurs, on peut aussi observer que les réponses ne sont pas parfaitement alignées. Ceci est dû à des différences dans les niveaux de concentrations car les ajouts ou les solutions étalons sont obtenus par pesées exactes (échantillons indépendants). Une étape de réalignement des données par interpolation linéaire permet de compenser ces légères différences.

It is question of a V4 protocol over three days. Calibration standards include four levels and two repetitions, respectively with and without matrix, or fourty eight trials. The validation standards include three levels and three repetitions, or twenty seven trials (Table XII). All the calibration (12) and validation (9) standards are independent. Responses expressed in optical density units (OD), according to the concentration, for the calibration standards are presented in Figure 17. No matrix effect is virtually observable and the regression equations calculated for every data set are very close. In addition, it can also be observed that the responses are not perfectly aligned. This is due to the differences between the concentration levels, as the spiking and standard solutions are obtained through accurate weighing (independent samples). A data realigning step through linear interpolation makes it possible to compensate these slight differences.

3. Résultats

3. Results

La fonction de réponse la mieux adaptée est la régression linéaire pondérée avec un facteur de pondération de 1/X. Les concentrations estimées

The best adapted response function is the linear regression weighted by the 1/X weighting factor. The concentrations predicted by the weighted linear in-

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Tableau XII. Phosphate dans le plasma. Organisation des essais utilisés pour la procédure de validation. Table XII. Plasma phosphate. Organization of the trials used for the validation procedure.

Standard d’étalonnage sans matrice Calibration standard without matrix Standard d’étalonnage avec matrice Calibration standard with matrix Standard de validation avec matrice Validation standard with matrix

Niveau Level

Quantité de Na2HPO4 , 2H2O (nMol/L) Na2HP04 , 2H2O quantity (nMol/L)

Nombre de répétition par jour Daily repetition number

Nombre d’essais pour les 3 jours de validation Number of trials for the validation 3 days

T1

280

2

6

T2

420

2

6

T3

560

2

6

T4

700

2

6

A1

280

2

6

A2

420

2

6

A3

560

2

6

A4

700

2

6

Bas/Low

280

3

9

Médian/Medium

420

3

3

Haut/High

560

3

9

Total

75

Densité optique / Optical density

0 .5 0

0 .4 5

0 .4 0

0 .3 5

0 .3 0

Sans matrice/Without matrix Avec matrice/With matrix Étalonnage sans matrice Calibration without matrix Étalonnage avec matrice Calibration with matrix

0 .2 5

y = 0.4821x + 0.1233 y = 0.4824x + 0.1214

0 .2 0 0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

0 .6

0 .7

0 .8

µMol/L phosphate

Figure 17. Phosphate dans le plasma en µMol/L. Standards d’étalonnage en présence et en absence de la matrice. Figure 17. Plasma phosphate in µMol/L. Calibration standards with and without matrix.

par la fonction inverse du modèle linéaire pondéré, à partir des standards de validation, montrent qu’il existe un léger effet de matrice. En effet, les équations de linéarité entre la concentration introduite T et la concentration retrouvée R valent respectivement : - étalonnage sans la matrice : R = 0,9589 x T + 5,901, - étalonnage avec la matrice : R = 0,9671 x T + 5,359. Cependant, on a décidé de ne pas appliquer de coefficient de correction, car cela se révèle inutile comme le montrent les figures 18 et 19. Par ailleurs, dans la mesure où on a à disposition un jeu de données consistant à réaliser l’étalonnage dans la matrice et non plus dans l’eau, on a pu calculer un deuxième profil d’exactitude illustré par la figure 19. Les données ainsi estimées ont été traitées avec des limites d’acceptation de ±15% et un intervalle de 112

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verse function, from the validation standards, show there is a slight matrix effect. Actually, the linearity equations values, between introduced concentration T and recovered concentration R are respectively: - calibration without the matrix: R = 0.9589 x T + 5.901, - calibration with the matrix: R = 0.9671 x T + 5.359. However, it has been decided not to apply this correction coefficient, for it proved to be useless, as showed in Figures 18 and 19. In addition, as a data set is available consisting in carrying out the calibration in the matrix, and no longer in water, it has been possible to compute a second accuracy profile illustrated by Figure 19. Data estimated in this way have been processed with a ±15% acceptability limits and a 90% tolerance

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

20%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

15%

10%

5%

0% 250

300

350

400

450

500

550

600

-5 %

-1 0 %

-1 5 %

-2 0 % C o n ce n tra tio n (n M o l/L P h o sp h a te )

Figure 18. Phosphate dans le plasma en nMol/L. Profil d’exactitude pour un étalonnage sans matrice (limites d’acceptation à ± 15%). Figure 18. Plasma phosphate in nMol/L. Accuracy profile for a calibration without matrix. (acceptability limits ± 15%). 20% 15%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

10% 5% 0% 250

300

350

400

450

500

550

600

-5 % -1 0 % -1 5 % -2 0 % -2 5 % C o n c e n tra tio n (n M o l/L )

Figure 19. Phosphate dans le plasma. Profil d’exactitude pour un étalonnage dans la matrice (limites d’acceptation à ± 15%). Figure 19. Plasma phosphate. Accuracy profile for a calibration in the matrix, (acceptability limits ± 15%). Tableau XIII. Phosphate dans le plasma en nMol/L. Résultats des calculs du profil d’exactitude. Table XIII. Plasma phosphate in nMol/L. Accuracy profile results. Niveau/Level

Bas/Low

Médian/Medium

Haut/High

Concentration moyenne introduite/Mean introduced concentration

281.6

421.9

562.3

Limite basse de tolérance/Lower tolerance limit

232.7

387.9

529.9

Limite haute de tolérance/Higher tolerance limit

322.1

427.1

563.1

Limite basse relative de tolérance (%)/Relative lower tolerance limit (%)

-17.37

-8.054

-5.749

Limite haute relative de tolérance (%)/Relative higher tolerance limit (%)

14.40

1.234

0.1551

Écart-type de répétabilité/Repeatability standard deviation

8.627

9.946

8.427

Écart-type de fidélité intermédiaire/Intermediate precision standard deviation

16.66

9.946

8.427

CV de répétabilité (%)/Repeatability RSD (%)

3.064%

2.358%

1.499%

CV de fidélité intermédiaire (%)/Intermediate precision RSD (%)

1.499%

5.915%

2.358%

Concentration prédite inverse/Predicted mean concentration

277.4

407.5

546.5

Biais absolu/Absolute bias

-4.192

-14.39

-15.75

Biais relatif (%)/Relative bias (%)

-1.489%

-3.410%

-2.797%

Recouvrement (%)/Recovery yield (%)

98.51%

96.59%

97.20%

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

tolérance à 90%. L’examen des profils d’exactitude (figure 18 et figure 19) conduit aux observations suivantes : - il est préférable d’utiliser des standards d’étalonnage sans matrice, - dans ces conditions, le profil d’exactitude montre une forte augmentation de la dispersion des mesures au niveau bas (vers 300 nMol/L). Les résultats des calculs du profil d’exactitude avec un étalonnage sans la matrice sont regroupés dans le tableau XIII. La validation montre que la méthode proposée donnera des résultats à moins de 15% [9] de la valeur vraie dans au moins 90% des cas quand la concentration est comprise entre 320 et 560 nMol/L. Le taux de recouvrement étant supérieur à 96%, il n’a pas été jugé nécessaire d’appliquer un coefficient de correction avec les limites d’acceptation choisies. Les performances de la méthode pourraient être nettement améliorées en adaptant la procédure opératoire de façon à obtenir un domaine de travail situé au-delà de 400 nMol/L.

interval. Examining accuracy profiles (Figure 18 and Figure 19) leads to the following observations: - using calibration standards without matrix is preferable, - under these conditions, the accuracy profile shows a high increase of the measurement dispersion at the lower level (at about 300 nMol/L). The results of the accuracy profile computed with no-matrix calibration conditions are brought together in Table XIII. Validation shows that the results given by the proposed method are less than 15% under the true value [9] in at least 90% of the cases, when the concentration is included between 320 and 560 nMol/L. Recovery yield is higher than 96%, thus it was decided as unnecessary to apply a correction coefficient within the selected acceptability limits. Method performances could clearly be improved by adapting the operating procedure with a view to achieving a working range located beyond 400 nMol/L.

X Dosage du R-timolol et des autres impuretés dans des échantillons de maléate de (S)-timolol

X R-timolol and other impurities determination within (S) -timolol maleate samples

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Part III. Examples of application

1. Objectifs et moyens

1. Goals and means

Le maléate de (S)-timolol est susceptible de contenir comme impureté principale l’énantiomère R-timolol dont la présence ne doit pas dépasser 1,0% (15 µg/mL) selon la Pharmacopée européenne. D’autres impuretés peuvent aussi être présentes mais leur concentration ne doit pas dépasser 0,4%. L’objectif de la méthode est de contrôler par HPLC-UV la pureté de la matière première maléate de (S)-timolol. Les échantillons sont préparés et dilués dans du 2-propanol. Les standards d’étalonnage sont obtenus par dilution d’une solution mère de R-timolol. Cependant, pour obtenir les standards de validation, les dilutions de la solution mère de R-timolol sont faites de manière à contenir du maléate de timolol à raison de 1,5 mg/mL dans les solutions finales. La gamme d’étalonnage va de 1,5 à 24 µg/mL.

(S)-timolol maleate is likely to contain, as main impurity, the R- timolol enantiomers, which must not exceed 1.0% (15 µg/mL), according to the European Pharmacopoeia. Other impurities may equally be present, however, their concentrations must not exceed 0.4%.The method aims at controlling, by HPLC-UV, the (S)-timolol raw materials purity.

2. Plans d’expérience

2. Experimental designs

Concernant le plan d’expérience (tableau XIV), un protocole de type V2 a été appliqué en utilisant quatre niveaux et trois répétitions pendant trois jours, soit au total trente-six essais. Les standards de validation comportent cinq niveaux et trois répétitions pendant trois jours, soit quarante-cinq essais. Toutes les standards d’étalonnage (12) et de validation (15) sont indépendants, c’est-à-dire préparés séparément afin qu’une erreur éventuelle ne se répercute pas sur l’ensemble des valeurs de référence (tableau XIV).

A V2 experimental design (Table XIV) has been applied, using four levels and three repetitions during three days, or in total thirty six trials. Validation standards include five levels and three replicates during three days, or fourty five trials.

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Samples are prepared and diluted in 2-propanol. Calibration standards are obtained by diluting a Rtimolol mother solution .However, in order to obtain validation standards, the dilutions of the R-timolol mother solutions are made in such a way that they contain 1.5 mg/mL of timolol maleate in the end solutions. The calibration range extends from 1.5 to 24 µg/mL.

All calibration standards (12) and validation standards (15) are independent, i.e. separately prepared in order to prevent any possible error to propagate over all reference values (Table XIV).

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Tableau XIV. Détail du plan d’expérience utilisé pour le (S)-timolol. Table XIV. Details of the experimental design used for (S)-timolol. Type de données Type of data Standard d’étalonnage sans matrice Calibration standards without matrix Standard de validation avec matrice Validation standards with matrix

Niveau Level

Concentration du Rtimolol (µg/mL) R-timolol concentration (µg/mL)

Nombre de répétition par jour Daily repetition number

Nombre d’essais pour les 3 jours de validation Trials number for the validation 3 days

T1

1.5

3

9

T2

3.0

3

9

T3

12.0

3

9

T4

24.0

3

9

V1

1.5

3

9

V2

3.0

3

9

V3

6.0

3

9

V4

12.0

3

9

V5

24.0

3

9

Total

81

3. Résultats

3. Results

Les trente-six données d’étalonnage ont permis de calculer trois modèles (un par jour) : la fonction de réponse la mieux adaptée est la régression linéaire pondérée (1/X2). Ensuite, ces modèles ont été appliqués aux standards de validation pour obtenir les concentrations calculées en retour. Afin d’illustre l’absence de tout effet de matrice et la bonne linéarité de la méthode, les concentrations ajoutées et celles calculées sont représentées par la graphe de linéarité de la figure 20. Les données expérimentales ont été traitées avec des limites d’acceptation de ± 10% et un intervalle de tolérance de 95%. L’examen du profil d’exactitude (figure 21) conduit aux observations suivantes : - en utilisant les standards d’étalonnage sans matrice, le profil d’exactitude montre un élargissement de l’intervalle de tolérance plus important en dessous de 12 µg/mL et moins important au dessus de ce niveau de concentration, intervalle toujours compris dans les limites d’acceptation de 10%,

The thirty six calibration data were used to compute three models (one every day): the best adapted response function is the weighted linear regression (1/X2). Then these models have been applied to the validation standards in order to calculate the inverse predicted concentrations. In order to illustrate the absence of any matrix effect and the good method linearity, the added concentrations and the recovered ones are represented by the Figure 20 linearity graph. The experimental data have been processed with a ± 10% acceptability limits and a 95% tolerance interval. Examining the accuracy profile (Figure 21) leads to the following observations: - when using calibration standards without matrix, the accuracy profile shows that the width of the tolerance interval is the smallest at 12 µg/mL and large below and above this concentration level, while this interval is still included within the acceptability interval of 10%,

Concentration retrouvée (mg/L) Recovered concentration (mg/L)

30

25

R = 0.989T + 0.072

20

15

10

5

0 0

5

10

15

20

25

30

Concentration introduite (mg/L) Introduced concentration (mg/L) Figure 20. R-timolol dans des échantillons de maléate de (S)-timolol. Droite de linéarité obtenue après étalonnage selon une régression linéaire pondérée indiquant un taux de recouvrement excellent. Figure 20. R-timolol in samples of (S)-timolol maleate. Linearity straight line achieved after calibration according to a weighted linear regression indicating an excellent recovery rate.

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

15%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

10%

5%

0% 0

5

10

15

20

25

30

-5 %

-1 0 %

-1 5 % C o n ce n tra tio n

(µ g / m L )

Figure 21. R-timolol dans des échantillons de maléate de (S)-timolol exprimé en µg/mL. Profil d’exactitude (limites d’acceptation à ± 10%). Figure 21. R-timolol in samples of (S) timolol maleate. Expressed in µg / mL. Accuracy profile (± 10%acceptability limits). Tableau XV. R-timolol dans des échantillons de maléate de (S)-timolol exprimé en µg/mL. Résultats des calculs du profil d’exactitude. Table XV. Concentration of R-timolol in (S)-timolol maleate in µg/mL. Results of the accuracy profile. Critères de performance Performance criteria

Niveau 1 Level 1

Niveau 2 Level 2

Niveau 3 Level 3

Niveau 4 Level 4

Niveau 5 Level 5

Concentration moyenne introduite/Mean introduced concentration

1.513

3.027

6.053

12.11

24.21

Limite basse de tolérance/Mean introduced concentration

1.448

2.885

5.545

11.91

23.04

Limite haute de tolérance/Higher tolerance limit

1.610

3.269

6.575

12.31

24.96

-4.350%

-4.685%

-8.404%

-1.630%

-4.830%

Limite basse relative de tolérance (%)/Relative lower tolerance limit (%) Limite haute relative de tolérance (%)/Relative higher tolerance limit (%)

6.365%

8.005%

8.617%

1.707%

3.077%

Écart-type de répétabilité/Repeatability standard deviation

0.02096

0.03685

0.07222

0.06972

0.2099

Écart-type de fidélité intermédiaire Intermediate precision standard deviation

0.02791

0.05873

0.1406

0.07795

0.3085

CV de répétabilité (%)/precision/Repeatability RSD (%)

1.385%

1.217%

1.193%

0.576%

0.867%

CV de fidélité intermédiaire (%)/Intermediate precision RSD (%)

1.845%

1.940%

2.323%

0.644%

1.274%

Concentration prédite inverse/Predicted mean concentration

1.529

3.077

6.060

12.11

20.00

Biais absolu/Absolute bias

0.01525

0.05023

0.00643

0.00462

-0.2122

Biais relatif (%)/Relative bias

1.007%

1.660%

0.106%

0.038%

-0.876%

Recouvrement (%)/Recovery yield (%)

101.0%

101.7%

100.1%

100.0%

99.12%

15%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

10%

5%

0% 0

5

10

15

20

25

30

-5 %

-1 0 %

-1 5 % C o n c e n tra tio n (µ g /m L )

Figure 22. R-timolol dans des échantillons de maléate de (S)-timolol. Profil d’exactitude (standard d’étalonnage à 12 µg/mL). Limites d’acceptation à ± 10%. Figure 22. R-timolol in (S) timolol maleate samples. Accuracy profile (calibration standard at 12µg/mL). Acceptability limits at ± 10%.

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

- on observe aussi un biais positif pour les niveaux 1 et 2, et négatif pour le niveau 5. Dans tous les cas le biais observé n’excède cependant pas 2%. Les résultats des calculs du profil d’exactitude qui ont servi à réaliser la figure 21 sont regroupés dans le tableau XV. En voyant les résultats de la validation, on peut conclure que la méthode développée donnera des résultats à moins de 10% de la valeur vraie dans au moins 95% de cas et ce, dans toute la gamme de concentration sélectionnée. De plus, le taux de recouvrement est supérieur à 99% (figure 21). Toutefois comme la Pharmacopée européenne préconise le plus souvent l’utilisation d’un étalonnage à un seul niveau de concentration pour la recherche des impuretés, nous avons testé ce que devenait le profil d’exactitude de la figure 21 si l’étalonnage était réalisé avec le seul niveau de concentration de 12 µg/mL. Ce niveau de concentration est en effet celui qui est le plus proche de la limite d’impureté tolérée de 15 µg/mL (1%). Le profil correspondant est illustré dans la figure 22. À l’examen de la figure 22, nous pouvons constater que, quel que soit le protocole d’étalonnage retenu, il n’y a pas de différence quant à l’aptitude de la méthode à fournir des résultats quantitatifs correctes puisque les limites du profil d’exactitude (limites inférieure et supérieure) sont toujours comprises entre les limites d’acceptation de ± 10% fixées a priori. Toutefois, nous constatons que le biais de la méthode augmente significativement (± 5%) pour les concentrations les plus basses et n’est pas altéré pour les niveaux à 12 et 24 µg/mL. L’ensemble de ces résultats est donc acceptable et ce d’autant plus que, comme nous l’avons déjà signalé, la limite admise par la Pharmacopée européenne pour le R-timolol dans le maléate de (S)-timolol a été fixée à 15 µg/mL. Les résultats correspondant à ce dernier profil sont présentés dans le tableau XVI.

- a positive bias is also observable for levels 1 and 2, and a negative one for level 5. However, in all cases, observed bias does not exceed 2%. The results of the computation used to build the accuracy profile in Figure 21 are shown in Table XV.

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Part III. Examples of application

It can be concluded, from the validation results, that the results provided by the developed method will be less than 10% under the true value, in at least 95% of the cases, within all the selected concentration range. In addition, the recovery yield is higher than 99% (Figure 21). Whereas, the use of a single concentration level calibration for the determination of impurities is mostly recommended by the European Pharmacopoeia, we tested what the Figure 21 accuracy profile was becoming should the calibration be carried out only with the 12 µg/mL level. Actually, this concentration level is the closest one to the impurity tolerated limit of 15 µg/mL (1%). The corresponding profile is illustrated Figure 22. When examining Figure 22, we can observe that, whatever the selected calibration model, there is no difference as for the method capability to provide with fair quantitative results, given that the accuracy profile limits (lower limits and higher limits), are always included between the ± 10% acceptability limits set a priori. However, we observe that the bias increases significantly (± 5%) for the lowest concentrations and does not change for the levels included between 12 to 24 µg/mL. Thus, these results as a whole are acceptable, especially because, as already reported, the limit accepted by the European Pharmacopoeia for Rtimolol included in (S)-timolol maleate has been set at 15 µg/mL. The results corresponding to this profile are presented in Table XVI.

XI Conclusions

XI Conclusions

La démarche de validation harmonisée développée par la commission SFSTP a déjà connu un grand nombre d’applications. Nous en avons présenté ici une sélection choisie en fonction de diverses situations auxquelles sont confrontées quotidiennement les analystes. Elles permettent de tirer un certain nombre d’enseignements. 1. D’une façon très globale, si on prend la définition de la validation telle que la fournit la norme ISO 17025, à savoir que « la validation est la confirmation par examen et l’apport de preuves effectives du fait que les prescriptions particulières en vue d’une utilisation prévue déterminée sont remplies », la nouvelle démarche proposée suit très exactement cette définition. En effet, on doit : 1) partir d’une exposition claire des objectifs à atteindre en termes de limites d’acceptation, 2) collecter les preuves effectives grâce à un plan d’expériences, et finalement 3) les examiner

The harmonized validation approach developed by an SFSTP commission has already been given a lot of applications. Herein, we have presented a selection of these, chosen according to different situations any analyst is facing every day. Several conclusions can be drawn from these studies. 1. Globally speaking, should we consider the validation definition as provided by ISO 17024 standard, i.e. “validation is the confirmation, by examination and effective evidence, that the particular prescriptions regarding a foreseen, determined utilization are respected”, the new proposed approach very exactly matches this definition. Actually, we must: 1) start by clearly setting out the objectives to be fulfilled in terms of acceptability limits, 2) collect the effective evidences, thanks to various experimental designs and, finally, 3) examine data in order to statistically

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

Validation des procédures analytiques quantitatives :

Part III. Examples of application

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Tableau XVI. R-timolol dans des échantillons de maléate de (S)-timolol exprimé en µg/mL. Résultats des calculs du profil d’exactitude (étalonnage à 12 µg/mL). Table XVI. R-timolol in (S)-timolol maleate samples expressed in µg/Ml. Accuracy profile computing results (calibration at 12 µg/mL). Critères de performance Performance criteria

Niveau 1 Level 1

Niveau 2 Level 2

Niveau 3 Level 3

Niveau 4 Level 4

Niveau 5 Level 5

Concentration moyenne introduite Mean introduced concentration

1.513

3.027

6.053

12.11

24.21

Limite basse de tolérance/Lower tolerance limit

1.551

2.983

5.712

11.92

23.30

Limite haute de tolérance/Higher tolerance limit

1.640

3.283

6.478

12.29

24.52

Limite basse relative de tolérance (%) Relative lower tolerance limit (%)

2.481%

-1.430%

-5.637%

-1.528%

-3.772%

Limite haute relative de tolérance (%) Relative higher tolerance limit (%)

8.401%

8.468%

7.013%

1.488%

1.269%

Écart-type de répétabilité/Repeatability standard deviation

0.01831

0.03651

0.07183

0.06905

0.20870

Écart-type de fidélité intermédiaire Intermediate precision standard deviation

0.00000

0.03468

0.09119

0.02309

0.10740

CV de répétabilité (%)/Repeatability RSD (%)

1.210%

1.206%

1.187%

0.5703%

0.8620%

CV de fidélité intermédiaire (%)/Intermediate precision RSD (%)

1.210%

1.664%

1.918%

0.6013%

0.9694%

Concentration prédite inverse/Predicted mean concentration Biais absolu/Absolute bias

1.596

3.133

6.095

12.10

23.91

0.08235

0.1065

0.04165

-0.00237

-0.3029

Biais relatif (%)/Relative bias (%)

5.441%

3.519%

0.6881%

-0.0196%

-1.251%

Recouvrement (%)/Recovery yield (%)

105.4%

103.5%

100.7%

99.98%

98.75%

statistiquement et graphiquement pour confirmer ou infirmer la validité. 2. Le mode de calcul du profil niveau par niveau permet de couvrir une très large gamme dynamique de concentrations. L’approche est donc applicable à des méthodes dont le domaine d’application peut comprendre plusieurs décades. On peut alors valider des méthodes dont les mesures dont les variances ne sont pas homogènes en fonction du niveau de concentration. Ce point est important car pour beaucoup d’autres démarches, l’hypothèse d’homogénéité des variances dans tout le domaine d’application est indispensable. On peut rappeler que cette dépendance entre la concentration et l’incertitude est un phénomène général clairement mis en évidence et modélisé par Horwitz [10]. 3. On peut utiliser des modèles d’étalonnage variés et même non linéaires, comme une courbe logistique à quatre paramètres. En effet, selon cette approche, l’hypothèse de linéarité de la fonction d’étalonnage peut être totalement abandonnée pour conduire la validation. En outre, on peut aussi employer des techniques de régression pondérée qui permettent là encore de traiter des données dont les variances ne sont pas homogènes. De même, on a pu voir comment sélectionner le meilleur modèle de régression dans le cas d’un exemple très classique de contrôle d’une substance entre 80 et 120% de sa valeur nominale. 4. La démarche proposée étant globale, on peut enfin régler les conflits entre la justesse et la fidélité. Les approches classiques de validation vont généralement traiter séparément la justesse et la fidélité. On peut alors déboucher sur des conclusions ambiguës si seulement l’un de ces deux critères est satisfaisant. La méthode du profil d’exactitude permet de représenter simultanément, sur un même graphique, ces deux critères (ou des combinaisons de ces critères). En cela, cette approche est beaucoup plus flexible et en accord 118

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and graphically confirm or refute validity of the method. 2. Computation of figures of merit level by level for establishing the profile makes it possible to cover a very wide concentration range. Thus, the approach is applicable to methods which scope of application may include several decades. Then it is possible to validate methods which variances are not homogenous according to the concentration level. This point is very important because, for many other approaches, the variances homogeneity hypothesis over the whole application field is indispensable. It can be reminded that this dependency between concentration and uncertainty is a general phenomenon, which evidence has clearly been showed and modelled by Horwitz. [10] 3. Different and even non-linear calibration models, like a four-parameter logistic function, may be used. Actually, according to this approach, the calibration function linearity hypothesis can totally be dropped when conducting the validation. In addition, weighted regression techniques may be used, making it possible, here again, to process data which variances are not homogenous. Similarly, we could see how to select the best regression model, in the case of the very classical example of controlling a substance between 80 and 120% of its nominal value. 4. Conflicts between trueness and precision can be simply settled. Classic validation approaches are generally addressing separately trueness and precision. This can then lead to ambiguous conclusions, should only one of these two criteria be satisfactory. The accuracy profile method makes it possible to simultaneously represent, on a same graph, both criteria (or combinations of these criteria). For this reason, this approach is much more flexible and complies with the uncertainty and accuracy definitions

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Validation des procédures analytiques quantitatives : harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

avec les définitions de l’incertitude et de l’exactitude qui doivent toujours combiner justesse et fidélité. 5. Classiquement les démarches de validation consistent à tester la conformité d’un critère de performance par rapport à une valeur de référence. Au plan statistique cela revient à tester l’hypothèse nulle sur ces seuls paramètres. En revanche, l’approche proposée, prend directement les résultats tels qu’ils seront fournis aux demandeurs ; ceci correspond enfin aux exigences des nouveaux référentiels d’assurance qualité qui mettent l’accent sur la « satisfaction du client ». Le profil d’exactitude consiste à fixer la proportion attendue minimum de futurs résultats se situant entre les limites d’acceptation fixées a priori. Mais une démarche complémentaire serait possible consistant à calculer sur ces bases statistiques le risque client. Rappelons que ce risque peut se traduire comme la probabilité d’avoir un résultat, en dehors des limites d’acceptation. 6. Dans deux des exemples présentés, on a vu qu’il était possible de calculer un coefficient de correction qui peut être assimilé à l’inverse d’un taux de recouvrement. Cette question a suscité de nombreux débats, surtout dans le domaine de l’analyse environnementale, pour savoir s’il faut ou non corriger les mesures dans le cas où le taux de recouvrement est très différent de 100%. La réponse apportée par la méthode du profil d’exactitude est sans ambiguïté : le taux de recouvrement peut et doit être pris en compte. En outre, on a pu démontrer expérimentalement que cette prise en compte entraîne une augmentation de l’incertitude ; ce qui est parfaitement en accord avec

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches Part III. Examples of application

that always must combine trueness and precision. 5. Typically, validation approaches consist in testing the conformity of performance criteria with reference values. Statistically speaking, this means testing the null hypothesis only on these parameters. Conversely, the proposed approach directly takes the results in the way they will be provided to end-users: this better corresponds to the new quality insurance guidelines requirements that put emphasis on “customer satisfaction”. Accuracy profile consists in setting the minimum expected proportion of future results between the a priori acceptability limits. However, a complementary approach consisting in computing on these statistical bases the client risk could be possible. Let us remind that this risk can be expressed as the possibility to get a result out of the acceptability limits. 6. It stands out from two of the presented examples that it was possible to calculate a correction coefficient that can possibly be deduced from the inverse of an averaged recovery rate. This point gave rise to many discussions, especially in the field of environmental analysis, in order to know whether measurements have or not to be corrected, when the recovery rate is very different from 100%. The answer provided by the accuracy profile is unambiguous: recovery yield may and must be taken into account. In addition, it has been possible to experimentally demonstrate that, taking this into account leads to increasing uncertainty: which is perfectly in harmony

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Validation des procédures analytiques quantitatives :

Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

les recommandations des métrologues. Bien sûr, cette méthode soulève un certain nombre de questions. Dans les exemples, le coefficient de correction le plus élevé était de 2, ce qui sous-entend que le taux de recouvrement n’était que de 50%. On peut se poser des questions sur la « qualité » d’une méthode si le taux de recouvrement n’était que de 5 ou 10%. De toute façon, il est vraisemblable que dans de telles situations, le profil d’exactitude s’élargira à un point tel qu’on conclura à la non validité de la méthode. En dépit des nombreuses réponses pratiques qu’apporte la méthode du profil d’exactitude, certaines restent en suspens. Par exemple, dans quelle mesure s’applique-t-elle aux comptages microbiologiques très répandus en chimie agroalimentaire ou en biologie clinique. Par ailleurs, une exigence classique pour les laboratoires accrédités est de valider une méthode alternative par rapport à une méthode dite de « référence ». Dans ce cas, les calculs devront prendre en compte le fait que la valeur théorique est connue avec une incertitude. Il est donc nécessaire de réaliser un certain nombre d’applications complémentaires pour mieux affirmer l’« universalité » de la méthode du profil d’exactitude. Enfin, pour conclure, il nous semble indispensable de rappeler que la validation doit toujours intervenir après le développement de la méthode. Si on essaie de conduire les essais avec une méthode encore mal connue, on risque d’avoir de sérieuses déconvenues ; on pourrait alors conclure à son inefficacité.

with metrologists’ recommendations. Obviously, this method gives rise to a number of questions. In the examples, the highest correction coefficient was 2, which suggests that the recovery yield was only 50%. The “quality” of a method may possibly be questionable, should the recovery yield be only 5 to 10%. Anyway, in such situations, the accuracy profile will likely enlarge to such a point that the method will be considered as non valid.

harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Part III. Examples of application

In spite of the numerous practical answers provided by the accuracy profile method, some of them are still pending. For example, to which extent does it apply to microbiological countings that are highly used in food hygiene or clinical biology. In addition, validating an alternative method by comparing it to a so called “reference” method is a classical demand for accredited laboratories. In this case, the fact that the theoretical value is known with uncertainty must also be taken into account in the computations. It is thus necessary to carry out a number of further applications with a view to better asserting the accuracy profile method universality. Finally, it seems to be indispensable to remind that validation must always intervene after the method development. Trying to carry out trials with a method still badly known, may probably lead to serious disappointments and could then lead to conclude to its inefficiency.

Remerciements

Acknowledgments

Les résultats sur la détermination de l’acrylamide dans le plasma ont été obtenus grâce au concours de Jean-Michel Delmas, assistant ingénieur dans l’Unité de Pharmacocinétique-Pharmacodynamie de l’Agence française de sécurité sanitaire des aliments à Fougères. Les résultats sur l’acide nicotinique ont été obtenus grâce au concours de Jinadevi Redon et Hugues Biaudet de la Société scientifique d’hygiène alimentaire à Longjumeau et ceux sur le dosage des impuretés dans une préparation pharmaceutique grâce à Élodie Londiche de la société Elli Lilly. Les résultats sur le dosage des phosphates dans le plasma ont été obtenus grâce au concours de Sandrine Coué et Ghislaine Griffon (Afssaps, Unité Physicochimie, Saint-Denis). Les résultats sur le dosage du R-timolol ont été obtenus grâce au concours de Roland Marini Djang’eing’à du Laboratoire de Chimie analytique de l’Université de Liège (Belgique) et ceux du dosage de l’hydrocortisone dans une pommade avec la collaboration de Gaëlle Martin du service d’Analyse des médicaments de l’Université de Liège (Belgique).

Plasma acrylamide determination results have been achieved thanks to the assistance of Jean-Michel Delmas, assistant engineer, French Food Safety Agency, Pharmacokinetics - Pharmacodynamics Unit, Fougères. Nicotinic acid related determinations have been achieved thanks to the assistance of Jinadevi Redon and Hugues Biaudet, Société d’Hygiène Alimentaire et d’Analyse, Longjumeau France, and the determinations of impurities in a pharmaceutical preparation have been achieved thanks to Elodie Londiche, Elli Lily Company. Plasma phosphates determinations have been achieved thanks to Sandrine Coue and Ghislaine Griffon assistance (French Health Products Safety Agency - Afssaps- PhysicoChemistry Unit, Saint-Denis). The R-timolol determinations have been achieved thanks to the assistance of Roland Marini Djang’eing, Analytical Chemistry Laboratory, University of Liège (Belgium) and those related to hydrocortisone in an onguent with the collaboration of Gaëlle Martin, Pharmaceutical Analytical Chemistry Department, University of Liège, Belgium.

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Validation des procédures analytiques quantitatives : harmonisation des démarches Partie III. Exemples d’application

Références/References 1/ Commission SFSTP. P. Hubert, J.J. Nguyen-Huu, B. Boulanger, E. Chapuzet, P. Chiap, N. Cohen, P.A. Compagnon, W. Dewe, M. Feinberg, M. Lallier, M. Laurentie, N. Mercier, G. Muzard, C. Nivet, L. Valat. Validation des procédures analytiques quantitatives. Harmonisation des démarches Partie I, STP Pharma Pratiques (2003) 13(3), 101-138. 2/ Commission SFSTP. P. Hubert, J.J. Nguyen-Huu, B. Boulanger, E. Chapuzet, P. Chiap, N. Cohen, P.A. Compagnon, W. Dewe, M. Feinberg, M. Lallier, M. Laurentie, N. Mercier, G. Muzard, C. Nivet, L. Valat. Validation des procédures analytiques quantitatives. Harmonisation des démarches Partie II : aspects statistiques, STP Pharma Pratiques, 16, 1, 30-60, 2006.

3/ Feinberg M., Boulanger B., Dewé W. & Hubert P. New advances in method validation and measurement uncertainty aimed at improving the quality of chemical data Anal Bioanal Chem (2004) 380, 502-514. 4/

Guide de validation analytique. Rapport d’une commission SFSTP, STP Pharma Pratiques (1992) 2 (4) 227-239.

5/ ICH Q2A. Téléchargeable à partir de http://www.ich.org. 6/ Hunter JS. Current practices in regression J of the AOAC (1981) 64, 574-583. 7/ Lahély S., Bergantzlé M., Hasselmann C., Fluorimetric de-

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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches Part III. Examples of application

Adresse des auteurs/Authors’ addresses ■ P. Hubert, Laboratoire de Chimie analytique, Institut de Pharmacie, Université de Liège, CHU, B36, B-4000 Liège 1, Belgique,. ■ J.J. Nguyen-Huu, Sanofi-Aventis, quai Jules Guesde, B.P. 14, F-94403 Vitry sur Seine, France. ■ B. Boulanger, W. Dewé, Eli Lilly, European Early Phase Statistics, rue Granbompré, 11, B-1348 Mont-Saint-Guibert, Belgique. ■ E. Chapuzet, N. Mercier, Qualilab, rue de la Bergeresse, F45160 Olivet, France. ■ N. Cohen, Expanscience, rue des quatre Filles. BP 25034, F-28231 Epernon, France. ■ P.A. Compagnon, Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé (Afssaps), boulevard Anatole France, Les Portes de Pleyel, F-93285 Saint Denis, France. ■ M. Feinberg, Met@risk, Institut National de la Recherche Agronomique (Inra), rue Claude Bernard, F-75231 Paris, France. ■ M. Laurentie, LERMDV, Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (Afssa), BP 90203, F-35032 Fougères Cedex, France. ■ G. Muzard, Merck-Theramex, avenue Prince Héréditaire Albert, F-98007 Monaco, France. ■ L. Valat, Viatris-Manufacturing, avenue J.F. Kennedy, BP 100, F-33701 Mérignac, France.

9/ Guidance for Industry : Bioanalytical Methods Validation for Human Studies (Draft guidance), U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), December 1998. 10/ Horwitz W., & Albert R. Standardization of Analytical Procedures Anal. Proc. (1987) 24, 49-55.

STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006

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