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Zitiervorschau

UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES et TECHNIQUES TANGER

Master des Sciences Agroalimentaires Module : Microbiologie Alimentaire

Année universitaire : 2019-2020

Travaux Pratiques de Microbiologie Alimentaire

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RÈGLES À SUIVRE DURANT LES TRAVAUX PRATIQUES DE MICROBIOLOGIE

1. Présentation d'un poste de travail : - Matériels (bec bunsen, pipettes, verres, béchers anse, pinces lame,...), - Produits (eau, alcool, colorants divers,….) 2. Les consignes de sécurité : 

Procéder à un lavage minutieux des mains, avec brossage des ongles avant et après les manipulations, et avant toute sortie même momentanée de la salle de TP.



Éviter les ouvertures des fenêtres pendant les manipulations



Ouvrir avec précaution les récipients contenant des cultures microbiennes, afin d'éviter toute projection.



Flamber, avant et après manipulations, les anses métalliques utilisées pour les prélèvements, en commençant par chauffer la partie moyenne de l'instrument afin de dessécher les restes de culture avant de porter l'extrémité dans la flamme, ceci pour éviter toute projection.



Prévenir immédiatement le responsable de TP en cas de bris d'un récipient contenant une culture en cas de contamination accidentelle d'un manipulateur ou tout incident dispersant le matériel microbien.



Interdiction formelle de boire, manger et fumer pendant les TP.



Stériliser tout le matériel septique à la fin de la manipulation.



Prendre toutes dispositions indispensables pour la mise à l'abri des souches microbiennes ainsi que leur destruction afin d'éviter toute contamination.

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Introduction Les produits alimentaires sont souvent contaminés soit de façon primaire, soit lors des diverses manipulations auxquelles ils sont soumis durant leur fabrication. Certains contaminants ne présentent aucun inconvénient. En revanche, d’autres sont susceptibles de nuire gravement à la santé humaine. L’objectif de l’analyse microbiologique est de rechercher des contaminants par identification des micro-organismes et quantification du nombre de colonies. L’analyse microbiologique alimentaire s’intéresse également à des germes témoins de mauvaises pratiques hygiéniques.

Objectifs des séances de TP : Faire acquérir des connaissances pratiques de microbiologie appliquée au domaine des industries alimentaires.

Compétences visées : Préparation d'échantillons, méthodes de dénombrement, confrontation aux normes réglementaires.

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SOMMAIRE

TP. N°1 : Contrôle microbiologique des aliments ................................................................... 5 TP. N°2 : Etude des bactéries lactiques à potentiel probiotique ............................................ 16

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TP. N°1 : Contrôle microbiologique des aliments 1. Technique de dénombrement des principaux microorganismes Prendre ou, prélever « 10 g d’aliment mélangé dans 90 ml d’eau » et broyé dans un broyeur Stomacher. On obtient une solution homogène représentant la solution. Cela peut se réaliser avec « 25 g d’aliment et 225 ml d’EPT » : d’eau peptonnée tamponnée ou « 10 g d’aliment et 90 ml d’EPT ». Pour les aliments liquides, on prend 10 ml de l’aliment et on mélange avec 90 ml de diluant.

1.1. Dilution décimale On utilisera comme diluant l’eau peptonnée on prélève « 1 ml du broyat » (solution mère) dans « 9 ml d’EPT», ce qui correspond à la dilution 10-2  A l’aide d’une pipette de 1ml 

Prélever 1 ml du tube marqué 10-2 et l’introduire dans le tube d’eau peptonnée tamponnée marqué 10-1 et homogénéiser. On obtient ainsi la dilution 10-3



Reprendre la même opération du 10-3 au tube 10–4 et, ainsi de suite jusqu'à la valeur de dilution souhaitée en changeant de pipette après chaque dilution. Jeter chaque fois la pipette utilisée dans le bac d’eau de javel

2. Recherche des principaux microorganismes des aliments 2.1. Les Germes Aérobies Mésophiles 2.1.1. Caractéristiques Le terme de germes aérobies mésophiles (GAM) regroupe les bactéries, les levures, les moisissures se développant en aérobiose à une température caractéristique, il s’agit de la «

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flore totale» mésophile et psychrophile. Ces microorganismes sont des germes qui contaminent souvent les aliments et qui peuvent être néfastes pour la qualité des produits alimentaires. Ces « GAM » sont des indicateurs d’hygiène. Ils sont tolérés dans la limite d’une certaine quantité au-delà de laquelle, ils constituent un problème hygiénique. Le dénombrement des « GAM » est couramment utilisé dans le domaine alimentaire en matière de contrôle qualité. Il permet une évaluation relative de la salubrité des procédés à l’usine et / ou de la préparation des aliments dans les établissements alimentaires. Il nous renseigne également sur l’efficacité des contrôles de température lors de la manipulation des produits, leur transport et leur entreposage. Les « GAM » présentent les caractères communs aux levures, moisissures et bactéries. Ils se développent en aérobiose c’est à dire en présence d’oxygène. Ils se développent entre 30°- 37° C. Tous ces germes sont cultivés sur milieux ordinaire.

2.1.2. Dénombrement et identification des « GAM » (ISO 4833) a. Prise d’essais : on prend 10 grammes d’aliment (pour le lait 1 ml) b. Pré - enrichissement : il permet de revivifier les germes présents Les 10 g d’aliment sont mis dans 90 ml d’eau peptonnée tamponnée (EPT) c.

Dilution décimale et ensemencement

A partir de la suspension mère, des dilutions décimales sont réalisées et, 1 ml de chaque dilution est utilisé pour un ensemencement en boite de Pétri par incorporation en double couche avec le milieu PCA (Plat Count Agar). d. Incubation Après cet ensemencement en profondeur, les boîtes sont incubées: mise à l’étuve à 30° C pendant 72 heures. Dénombrement de toutes les colonies (on compte entre 30 et 300). e.

Expression des résultats

Ce sont des critères microbiologiques d’appréciation, seuil limite ICSMF (International Commission Microbiological Specification Foods) et le Codex Alimentarius. Si l’on utilise ces deux critères, on distingue deux types de limite : une valeur “m” correspondant au seuil d’acceptabilité en dessous duquel le produit est de qualité

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microbiologique satisfaisante, et un seuil limite “M” supérieur à “m” correspondant au rejet du produit. Ce seuil “M” étant un multiple du seuil “m”, la qualité du produit est inacceptable.

2.2. Dénombrement des Bactéries lactiques 2.2.1. Caractéristiques La flore lactique est utilisée en industrie laitière, sous forme de ferment ou levain pour la fabrication de produits laitiers fermentés. L’intérêt technologique des bactéries lactiques réside dans la production de l'acide lactique par la fermentation du lactose. La production d'acide lactique, en faisant baisser le pH, provoque une déstabilisation progressive de la dispersion micellaire, ce qui rend le lait de moins en moins stable aux traitements thermiques et peut entraîner sa coagulation, même à température ambiante. Lors de la fermentation, en plus de l’acide lactique, certaines bactéries lactiques produisent du gaz carbonique ainsi que divers composés qui contribuent à l'arôme des produits laitiers. 2.2.2. Dénombrement 

Après préparation et stérilisation, refroidir et maintenir le milieu MRS à 47°C.



Transférer 1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales dans des boîtes de Petri stériles.



Couler 15 ml de milieu MRS.



Homogénéiser parfaitement.



Laisser solidifier sur une surface froide.



Placer les boîtes ensemencées dans les conditions spécifiées dans le mode opératoire choisi.



Incuber à 30 ou 37°C pendant 72h.

2.2.3. Lecture des résultats On retient que les boites qui contiennent entre 30 et 300 colonies. Identification et purification : A l’aide de la coloration Gram et du test de catalase, on procède à une série de repiquage sur la gélose MRS et incubation (répéter l’opération jusqu’à avoir des colonies de la même forme et de la même taille renseignant sur la pureté des souches). Pour une conservation de courte durée (prochaine utilisation dans la séance 2 des TP) les souches ainsi purifiées sont ensemencées dans des tubes de gélose inclinée, après l’incubation à 30°C, les tubes sont placés à +4°C jusqu’à utilisation. Travaux Pratiques de Microbiologie Alimentaire

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2.3. Les Coliformes Totaux, Coliformes Fécaux, Escherichia Coli (E. Coli) 2.3.1. Caractéristiques Les Coliformes sont en fait des Entérobactéries. Ce sont des bacilles Gram (-), mobiles, péritriche ou immobiles, acapsulés, asporulés, pas de cytochrome oxydase, possèdent une catalase, réduisent les nitrates en nitrites, et réduisent le glucose. Pratiquement, on retrouve dans ce groupe des Escherichia coli dont le dénombrement est réalisable. C’est une espèce bactérienne dont certains types sérologiques sont pathogènes. Bactérie considérée dans le cadre de la microbiologie alimentaire comme un indicateur de contamination fécale et donc indicateur de bactéries pathogènes. Escherichia coli est toujours dénombré en faible quantité ; elle est même souvent absente dans les aliments de qualité microbiologique correcte. La présence de cette bactérie hors critère indique que les règles d’hygiène n’ont pas été respectées (souillures par les fèces) ou au cours des manipulations. Le dénombrement est réalisé selon la norme AFNOR NF V08 017 par comptage des colonies ou par toute autre méthode donnant des résultats équivalents. L’on classe ces bactéries entériques en trois (3) groupes : les Coliformes Totaux (C.T.) qui se développent entre 30-35°C, les Coliformes Thermotolérants (C. Th.) ou Coliformes Fécaux (C.F) qui ont la faculté de se développer à des températures élevées entre 44-45°C et, les bactéries Escherichia coli (E. coli). Ces germes sont à l’origine d’infections alimentaires sous forme de gastroentérites et des diarrhées après une incubation allant de 5 à 24 heures. Les aliments impliqués sont : les fromages, bœuf haché saignant, viandes et volailles, eau, crudités …

2.3.2. Dénombrement et identification a. Prélèvement et prise d’essai : on prend 10 gramme d’aliment. b. Pré-enrichissement : pour donner du tonus à la bactérie, on utilise l’eau peptonnée tamponnée (EPT). c. Enrichissement : importante chez les E. coli car, elle se développerait de façon anormale. Les bouillons d’enrichissement sélectifs sont : * Bouillon Lactosé au Bromocresol Pourpre * Bouillon Lactosé Bilié au vert brillant * Bouillon MacConkey. * Bouillon au glutamate … d. Isolement : réalisé sur les milieux de culture, en général en double couche (couler le

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milieu, étaler 0,1 ml des dilutions et recouvrir avec la gélose) sur les géloses suivantes : * au Desoxycholate Lactose 1% * EMB (Eosine au bleu de méthylène) * Milieu SS * VRBL (violet-cristal rouge neutre bilié lactosé) * Gélose Lactosée de Driglaski … e. Incubation: 30°C pour les coliformes totaux et, 44°C pour les thermotolérants pendant 24 à 48 h. f. Dénombrement : Les coliformes apparaissent « rouges foncés », seules les colonies de diamètre supérieur à 0,5 mm sont dénombrées. g. Vérification Afin de vérifier si les colonies dénombrées sont Escherichia coli, 3 colonies sont repiquées sur la gélose EMB (gélose lactose éosine bleu de méthylène) et incubation pendant 24h à 37°C. Après incubation, les colonies de chaque boite sont plates, violet foncé avec reflet métallique : ce sont des colonies caractéristiques de Escherichia coli. Avant une confirmation par le test IMVIC, on repique une colonie par boite sur gélose nutritive pour revivifier la bactérie. Le test IMVIC va nous permettre de confirmer la présence d’Escherichia coli. A. Recherche de l’indole : Apres incubation pendant 24h à 37°C d’une suspension bactérienne dans un bouillon Urée Indole, 0.5 ml de réactif de Kovacs sont ajoutés. L’apparition d’une couleur rouge dans la phase alcoolique du réactif témoigne de la production d’indole. B. Recherche de l’utilisation du citrate : Une gélose inclinée de citrate de Simmons est ensemencée en surface puis incubé 24h à 37°C. Ce milieu constitué de Bleu de Bromotymol (jaune = acidification et bleu = basification) et de citrate permet de montrer l’utilisation du citrate dans le métabolisme bactérien. Une acidification du milieu entraînera une teinte jaune témoignant de la dégradation du citrate par la bactérie. Les différents tests donnent les résultats suivants :

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Ce tableau présente les caractéristiques biochimiques d’E. coli. 2.4. Les Staphylococcus aureus 2.4.1. Caractéristiques Staphylococcus aureus aussi appelé Staphylocoque doré, est une bactérie en forme de coques, Gram positive, disposée en grappes. Elle est non motile, asporulée et anaérobie facultative. Ce microorganisme est fréquemment trouvé dans la muqueuse nasale, la bouche, la gorge et sur la peau d’individus sains, autant chez les humains que les animaux à sang chaud. Cette bactérie peut être disséminée facilement dans l’environnement et peut ainsi contaminer les aliments. Les intoxications alimentaires sont en majorité causées par S. aureus coagulase positive qui produit une entérotoxine thermorésistante. Cependant, S. intermedius et S. hyicus sont aussi capables de produire une entérotoxine. En revanche, la présence de S. aureus coagulase positive dans les aliments chauffés et manipulés après cuisson est un indice de contamination humaine et possiblement de mauvaises pratiques de manipulations et d’une hygiène inadéquate des manipulateurs. Elle peut aussi indiquer une recontamination par des matières premières ou de mauvaises conditions d’entreposage. L’ensemble de ces lacunes peut éventuellement entraîner des risques pour la santé humaine si des actions correctives ne sont pas appliquées.

2.4.2. Dénombrement et identification Le dénombrement est réalisé selon la norme AFNOR V08 014 modifié : ensemencement de 0,1 ml de suspension mère ou de dilution à la surface du milieu Baird – Parker. Incubation à 37° C. Lecture des boites après 24 à 28 heures d’incubation. a. Prise d’essai : on prend 10 grammes d’aliment ou d’échantillon b. Enrichissement : il permet de revivifier les germes présents les 10g d’aliment sont mis dans 90 ml d’eau peptonnée tamponnée (EPT) pour une suspension mère qui est diluée au 1/10 c. Dilution décimale et ensemencement : à partir de la suspension mère, des dilutions décimales sont réalisées. Ensuite 0,1 ml de chaque dilution est utilisée pour un ensemencement par étalement sur milieu Baird Parker (préalablement additionné de

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tellurite de Potassium et de jaune d’œuf stérile, et coulé en boite de Petri). Le milieu Baird Parker est le milieu sélectif avec trois agents sélectifs : la glycine, le tellurite de potassium et le chlorure de lithium. L’on va assister au métabolisme lipidique des germes avec la production de lécithine. Le milieu prêt à l’emploi en boîtes de Pétri contient en plus des 950 ml du milieu de base, 50 ml de la solution de jaune d’œuf et 10 ml de tellurite de potassium 10g/L. d. Identification : après cet ensemencement, les boites sont incubées à 37°C pendant 45 à 48 heures. e. Dénombrement : Après ces deux jours, les colonies de Staphylocoque aureus qui se présentent sous forme de « colonies noires » brillantes, bombées sont dénombrées. Leur diamètre est compris entre 0,5 et 2 mm entourée d’un halo clair ou, une auréole transparente s’étendant dans le milieu opaque et, traduisant la digestion des lipoprotéines. L’examen microscopique confirme l’existence de Staphylococcus regroupé en grappe de raisin. En général, on choisit les géloses contenant les boites ayant entre 20 à 200 colonies suspectes. f. Vérification 1. Test de coagulase Pour caractériser ces bactéries. Un test de coagulase est réalisé. Après avoir incubé une colonie dans un bouillon cœur cervelle (24h à 37°C), 0,1mL de la suspension obtenue est incubé dans du plasma de lapin. Si la bactérie a développé une coagulase dans le bouillon cœur cervelle celle-ci va transformer le fibrinogène en fibrine et ainsi former un caillot dans le culot du tube. 2. Test de DNAse 

Après Préparation de la gélose DNAse.



Ensemencer les boîtes par stries sur la surface de la gélose.



Inonder les boîtes avec HCl 1N. Observer après quelques minutes les zones claires autour des colonies.

2.5. Les Anaérobies Sulfito-Réducteurs (ASR) 2.5.1. Caractéristiques C’est une espèce bactérienne pathogène. Elle peut être présente sous forme de spore, en très petite quantité. C’est une bactérie anaérobie stricte, mésophile ne se développant pas

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dans les aliments quand les règles de bonnes pratiques des opérations de transformation et de conservation sont respectées. D’autre part on peut toujours craindre une croissance de cette bactérie au cours de refroidissement mal conduit de produits après cuisson. En théorie, le dénombrement des spores et des cellules végétatives de Clostridium est considéré comme révélant la présence de Clostridium perfringens.

2.5.2. Dénombrement et Identification des A.S.R C’est en fait le dénombrement des spores des « ASR » qui peuvent être isolées en utilisant des milieux gélosés contenant du sulfite reparti dans des tubes. Le milieu doit contenir environ 0.45% de sulfite. Ex : *milieu TSN (Tryptone –Sulfite- Neomycine) / *milieu TSC (Tryptone –SulfiteCycloserine). a. Préparation : Préparation de la gélose de base: Mélanger 23 g de poudre à 500 ml d’eau distillée et chauffer lentement jusqu’à dissolution complète. Stériliser 10 minutes à 121°C à l’autoclave. Laisser refroidir à 50°C. Préparation de la gélose TSC: A 500 ml de gélose de base refroidie à 50°C ajouter le contenu d’un flacon de supplément TSC reconstitué et 25 ml d’émulsion de jaunes d’œufs. Bien mélanger et répartir. b. Isolement 1.

Préparer le milieu selon la méthode décrite auparavant. Couler dans les boîtes

contenant une couche de base d’environ 20 ml de milieu TSC. 2.

Déposer 0,1 ml d’une série de dilutions adaptées de l’échantillon homogénéisé,

et les étaler à la surface de la couche basale. 3.

Recouvrir avec 10 ml de gélose TSC.

4.

Incuber les boîtes 18 à 24 h à 37°C en anaérobiose.

Elles sont identifiées par la présence de « colonies noires » floconneuses avec un diamètre supérieur à 1 mm.

2.6. Le genre Salmonella : 2.6.1. Caractéristiques Les Salmonella sont présentes chez toutes les espèces animales domestiques ou sauvages, qui constituent avec l'environnement leur véritable réservoir. Le rôle des porteurs

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sains dans la diffusion des Salmonella est déterminant. Les aliments servent de principaux vecteurs vers l'homme, spécialement ceux d'origine animale. Dans la majorité des cas, les Toxi-Infections Alimentaires Communes (TIAC) font suite à des erreurs permettant une croissance bactérienne importante. Lors de TIAC due à la bactérie Salmonella, la symptomatologie est celle d'une gastro-entérite fébrile avec évolution favorable en général. Cependant, il peut y avoir des formes sévères et parfois mortelles chez les sujets fragiles. La recherche comporte quatre étapes successives : 

Le pré enrichissement,



L'enrichissement en milieux sélectifs liquides,



L'isolement sur milieux sélectifs solides,



L'identification.

Quel que soit le produit, aucun germe de ce genre ne doit être détecté dans l'échantillon analysé.

2.6.2. Recherche et identification a. Prise d’essai ou échantillonnage : la recherche se fait sur 10 grammes d’aliment en général b. Pré-enrichissement : c’est la préparation de la suspension mère qui se fait avec 225 ml d’eau peptonnée tamponnée (EPT) et, l’on met à l’étuve à 37°C pendant 16 à 20 heures. Il favorise la revivification des bactéries et, leur croissance. Ce milieu n’est toutefois pas sélectif. c. Enrichissement : il est réalisé en ensemençant dans les bouillons d’enrichissement sélectifs (0,1 ml dans 10 ml de RVS - Bouillon Rappaport Vassiliadis) et incubation pendant 24 à 48 heures à 43°C. Ces milieux ont la propriété de favoriser la croissance de Salmonella et, de limiter celle des autres germes de la famille des Entérobactéries. d. Isolement : Deux géloses sélectives ont été utilisées : SS et Hektoen. Elles sont ensemencées sous hotte par technique de stries d'épuisement à l’aide d’une anse dans des boites de pétri à partir d'un même bouillon d'enrichissement et mis en incubation à l'étuve 37°C pendant 24 h à 48h. e. Lecture : Après 24 heures à 37°C en aérobiose, en général : Après 24 heures, soit les boites seront nettes donc résultat négatif soit le résultat sera positif dont les colonies sur les géloses présentant les caractéristiques macroscopiques des

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salmonelles (colonies rosâtre avec ou sans centre noir sur SS et colonies verdâtre ou bleuâtres à centre noir sur Hektoen). Les colonies caractéristiques de Salmonella (lactose négatif) sont opaques, translucides ou transparentes et généralement avec un centre noir (H2S positif). 1°) Utilisation du lactose: Colonies rouges: acidification du milieu par fermentation du lactose : bactéries lactose + Colonies incolores: absence d'acidification du milieu : bactéries lactose -. 2°) Production d'H2S: Colonies noires ou à centre noir: production de sulfure de fer noir due à la réduction du thiosulfate en H2S: souche H2S +. Colonies sans centre noir: absence de production de sulfure de fer par réduction du thiosulfate en H2S: souche H2S -. Orientation : 

Colonies incolores à centre noir : suspicion de Salmonella



Colonies incolores sans centre noir : suspicion de Shigella ou Salmonella

f. Identification: sur au moins 5 colonies isolées, L'identification des souches de salmonelles fait appel à une sélection biochimiques des isolats analysés, en fonction de réactions biochimiques déterminantes; et à une identification sérologique. 

La coloration de Gram : Toutes les souches suspectées et observées sont de petits bacilles à coloration rouge ou orange caractérisant les bactéries Gram négatif. 

Le milieu urée-indole : On a introduit environ 1 ml de ce milieu dans un tube à

hémolyse stérile. Par la suite on l’a ensemencé avec une souche pure, prélevée sur gélose Hektoen. Après incubation à 37°C pendant 24 heures, une lecture est faite. La couleur du milieu reste inchangé pour les souches suspectes, et sont dites uréase négative (non productrices d'uréase). Dans le cas contraire, il vire au rose. Pour la mise en évidence de la production d'indole, on a ajouté quelque goutte du réactif de Kovacs dans les tubes du milieu urée-indole. La dégradation du tryptophane est marquée par l'apparition d'un anneau jaune, pour les salmonelles qui sont dites indole négatif. Dans le cas contraire, nous avons un anneau rouge.

*Milieu Citrate de Simmons, ensemencé par strie longitudinale sur la pente du milieu pour rechercher l’utilisation du citrate.

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2.7. La recherche de Listeria 2.7.1. Caractéristiques On peut les retrouver dans les pays tempérés, dans les produits d’origine animale et, dans tous les aliments. Elle se développe de 25 à 30°C, on peut les trouver dans le milieu extérieur, dans le sol, les eaux d’égouts, eaux courantes, poussières, les végétaux en particulier les ensilages de maïs. C’est une bactérie qui ne donne pas d’intoxications alimentaires mais, donne plutôt des « septicémies » : présence de bactéries dans le sang. Elle est d’autant plus grave chez la femme enceinte. 2.7.2. Recherche de Listeria. sp dans les aliments a.

Prélèvement et prise d’essai : La quantité prélevée d’aliment est de 10 g.

b.

L’enrichissement primaire : L'analyse est effectuée en utilisant 10 g

d'aliment homogénéisé 2 min dans un sachet stérile au près du bec benzène avec 90 ml de bouillon demi Fraser (additionné de supplément Fraser demi formé par acide Nalidixique, Acriflavine, Citrate de fer ammoniacal) par le Stomacher, puis incuber 24 heures à 30°C. c.

L’enrichissement secondaire : Après incubation, on ensemence sous hotte des

volumes de 10 ml de bouillon sélectif de Fraser (additionné de supplément Fraser) avec 0,1 ml de la culture d’enrichissement primaire. Le bouillon sélectif a été incubé à 37°C durant 48 heures. d.

Isolement :

Après enrichissement primaire : les boites du milieu Oxford sont ensemencées sous hotte par technique de stries d'épuisement à partir d'un même bouillon d'enrichissement primaire et mis en incubation à l'étuve 37°C pendant 48 h. Après enrichissement secondaire : Le même processus de l’enrichissement primaire est rétablit mais cette fois-ci en utilisant le bouillon de l’enrichissement secondaire. e.

Lecture de résultat : Après 48 heures d'incubations, soit les boites seront

nettes donc le résultat est négatif soit le résultat sera positif et les L. monocytogenes forment sur le milieu Oxford des colonies noires de 2 à 3 mm de diamètres entourés d'un halo noir et dont le centre est affaissé. f.

Identification

a/- Caractères morphologiques: * Bacille Gram (-), acapsulé, mobilité péritriche en pirouette. b/- Caractères biochimiques : *Oxydase négatif (-) * Catalase positif (+).

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TP. N°2- Etude des bactéries lactiques à potentiel probiotique

Introduction Les bactéries lactiques sont des cocci ou des bâtonnets Gram+, catalase-. Elles synthétisent leur ATP grâce à la fermentation lactique des glucides. Les bactéries lactiques sont en général aérotolérantes. Cependant certaines espèces, habitants le tube digestif des animaux sont anaérobies strictes. En 2001, les probiotiques ont été définis par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme des « micro-organismes vivants qui, lorsqu’ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels » La flore intestinale, ou microbiote intestinal, représente l’ensemble des microorganismes vivant dans l’intestin désignant ici à la fois l’intestin grêle et le côlon. Concrètement, les probiotiques, ou souches microbiotiques, permettent de renforcer temporairement la flore intestinale pour que l’équilibre bonnes bactéries / mauvaises bactéries soit rétabli et que les premières puissent prendre le dessus sur les secondes. Pour être considéré comme idéal, un probiotique doit satisfaire aux exigences suivantes:  Etre non pathogène  Avoir une action bénéfique sur l’hôte  Etre apte à résister au transit digestif (acidité gastrique, sels biliaires…) et à adhérer à la muqueuse intestinale   Avoir la capacité de se multiplier  Etre capable de créer un environnement défavorable à la colonisation des microorganismes pathogènes  Rester vivant jusqu’à la date limite d’utilisation Objectifs : Isoler et caractériser des bactéries lactiques à potentiel probiotique.

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Etape 1 : Isolement et purification des bactéries lactiques Les germes se trouvent souvent dans la nature sous forme de mélange de plusieurs espèces. Isoler c'est séparer les divers micro-organismes contenus dans le prélèvement initial. Un isolement peut être envisagé pour : 

Séparer des micro-organismes différents au sein d'un mélange (prélèvement par

exemple) 

Purifier une souche donnée.

L'isolement peut être réalisé par épuisement de la semence en étalant le produit initial à la surface d'un milieu solide approprié. Pendant l'incubation, chaque micro-organisme déposé se multiplie pour donner un clone de cellules identiques. Lorsque les microorganismes déposés sont suffisamment éloignés. le clone se développe abondamment pour produire une colonie (amas de cellules identiques). L'objectif de l'isolement est donc d'obtenir pour chaque micro-organisme différent des colonies distinctes. Les colonies obtenues, en étalant une souche pure, doivent toutes présenter les mêmes caractères. A l'opposé, l'isolement d'un mélange donnera autant de colonies différentes que de micro-organismes différents contenus dans ce mélange. Notez : deux colonies de même aspect et de mêmes caractères ne contiennent pas forcément des micro-organismes identiques.

1. Purification des souches de bactéries lactiques 

L’isolement a été réalisé sur gélose MRS préalablement coulée et solidifiée dans des boites de Pétri, en portant quelques gouttes des dilutions 10-4 et 10-5 à la surface du milieu suivi d’un étalement.



La purification consiste à réaliser des repiquages successifs sur gélose et bouillon MRS, avec une incubation à 37°C pendant 24h, jusqu’à l’obtention de colonies de même taille, même forme et même couleur renseignant sur la pureté des souches.



L’incubation est faite à 37°C pendant 24 h à 48h en conditions d’anaérobie.

Etape 2 : Identification des bactéries lactiques isolées et purifiées L’identification des souches a été réalisée par l’application des techniques classiques de microbiologie, basées sur la recherche d’un certain nombre de caractères morphologiques,

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physiologiques 1. Examen microscopique Après l’examen macroscopique des colonies sur gélose MRS, et dans le but d’écarter tout ce qui ne peut être une bactérie lactique, les isolats ont été soumis à la coloration de Gram. Celle-ci permet de différencier les bactéries à Gram positif de celles à Gram négatif, les bâtonnets, les coques et le mode de regroupement. Technique : 1. Préparer un frottis, pour chaque couche bactérienne, sur une lame de verre et fixer à la flamme. 2. Ensuite, couvrir le frottis avec une solution de violet de Gentiane, souffler légèrement sur la lame pour bien mélanger. Laisser agir pendant 1 min. 3. Rejeter le colorant, puis ajouter le Lugol et laisser agir pendant 30 secondes à 1 minute, puis laver soigneusement avec l’eau de robinet. 4. Décolorer la lame avec le mélange d’alcool-acétone jusqu'au moment où celui-ci n’entraîne pas de colorant (30-50 secondes), rincer à l’eau. 5. Couvrir le frottis avec la Fushine pendant 30 sec à 1 min. Laver la lame à l’eau. 6. Sécher la face inférieure de la lame avec du papier Joseph. 7. Examiner le frottis à l’immersion. Interprétation :

Gram - : Bactéries colorées en rose. Gram + : Bactéries colorées en violet.

2. Tests physiologiques et biochimiques a. Recherche de la catalase : La catalase est mise en évidence en émulsionnant la culture bactérienne à tester dans une solution fraîche d’eau oxygénée à 10 volumes. Un dégagement gazeux abondant sous forme de mousse traduit la décomposition de l’eau oxygénée sous l’action de l’enzyme à tester.

Etape 3 : Mise en évidence du potentiel probiotique : Survie dans differents conditions gastriques et propriétés d’agrégation. 1. Tolérance à l’acidité gastrique

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Principe : Le premier facteur de défense majeur est la sécrétion acide de l’estomac. Selon le type de bactérie, la capacité à résister sera différente : certaines bactéries survivent partiellement voire totalement au passage gastrique alors que d’autres n’ont pas la capacité à résister. Ainsi, pour avoir une action au niveau intestinale, il faut impérativement utiliser des souches bactériennes résistantes au passage dans l’estomac. Cette résistance à l’acidité gastrique serait améliorée par l’ingestion concomitante de nourriture. Mode opératoire : 1. Inoculer les souches dans le bouillon MRS. 2. Préparer les tubes avec NaCl (0.85%) pour les dilutions (1 ml de culture avec 9 ml de NaCl, jusqu’à dilution 10-4). 3. Préparer PBS stérile. Composants

Molarité

Masse

NaCl (M: 58.4 g/mol)

0.137 M

8g

KCl (M: 74.551 g/mol)

0.0027 M

200mg

0.01 M

1.44g

0.0018 M

240mg

Na2HPO4 (M: 141.96 g/mol) KH2PO4 (M: 136.086 g/mol)

o Préparez 800 ml d’eau distillée dans un flacon 1L. o Ajouter 8 g de NaCl. o Ajouter 200 mg de KCl. o Ajouter 1,44 g de Na2HPO4. o Ajouter 240 mg de KH2PO4. o Ajuster la solution au pH souhaité (pH 7.4). o Ajouter de l'eau distillée jusqu'à atteindre un volume de 1 L. 4. Préparer les boites MRS agar. 5. Préparer le JGF frais (3.2g/l pepsine + 2g/l NaCl, pH 1,5) 6. Filtrer la solution (filtre 0,45µm).

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Contrôle

-

PBS (9ml + 0.5ml culture) Faire les dilutions (jusqu’à -4).

-

Ensemencer les boites de MRS avec les -

Ensemencer les boites de MRS avec les

dilutions préparées (par étalement) et

dilutions préparées (par étalement) et

incuber à 37°C (c’est le temps T0)

incuber à 37°C (c’est le temps T0)

Incuber le tube initial contenant la souche -

Incuber le tube initial contenant la souche

pendant 30min à 37°C (sous agitation

pendant 30min à 37°C (sous agitation

200rpm).

200rpm).

-

-

-

Jus gastrique (9ml + 0.5ml culture) Faire les dilutions (jusqu’à -4).

-

Faire les dilutions (jusqu’à -4)

-

Ensemencer les boites de MRS et incuber -

Ensemencer les boites de mrs et incuber

les boites à 37°C.

les boites à 37°c.

Faire les dilutions (jusqu’à -4)

Lecture de résultats : Après incubation, dénombrer les colonies qui poussent sur la surface de la gélose. Calcule des taux de survie : 1. Log UFC/ml = (Nombre de colonie x Facteur de dilution) / volume ensemencé. 2. Taux de survie = (Log UFC/ml (contrôle PBS) x 100) / Log UFC/ml (souche testée (SGF)).

2. Concentration en sels biliaires : Principe Les bactéries ayant résisté au passage dans l’estomac poursuivent leur transit vers le duodénum. Les acides biliaires sont libérés à ce niveau et exercent alors leur action antiseptique. Ils influencent essentiellement la survie des lactobacilles et des bifidobactéries. Plusieurs bactéries probiotiques ont développé des mécanismes de résistance aux sels biliaires. Il s’agit essentiellement d’une activité enzymatique via la Bile Salt Hydroxylase qui va permettre de déconjuguer les acides biliaires et donc d’augmenter les chances de survie des probiotiques.

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Mode opératoire :  Inoculer les souches en bouillon MRS pendant 24h.  Préparer le milieu MRS gélosé (Laisser refroidir et ajouter la bile avec des concentrations de 1 – 2 - et 3%).  Mélanger et couler les boites.  Ensemencer les boites en strie en utilisant l’anse ou les écouvillons stériles. (diviser la boîte sur 4 au cas où les le nombre des souches est important)  Incuber pour 72h à 37°C en anaérobie Lecture de résultats : Présence ou absence d’une croissance bactérienne.

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