Orvosi biokémia [4 ed.] 9789633314005 [PDF]

Zitiervorschau

Orvosi biokémia r

Szerkesztette:

A dám Veronika

ORVOSI BIOKÉMIA Ádám

Veronika

E g y e t e m i t a n k ö n y v ■N e g y e d i k , á t d o l g o z o t t k i a d á s

Semmelweis Kiadó www.semmelweiskiado.hu

B u d a p e s t ,

201

6

A könyv megjelenését támogatta:

Richter Gedeon Nyrt.

v-ui>o.

és Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar

A könyv illusztrációját © ÁNGYÁN GERGŐ készítette

© Semmelweis Kiadó, 2016 © DR. ÁDÁM VERONIKA, 2016

ISBN 978-963-331-400-5

A könyv és adathordozó (legyen az e-könyv, CD vagy egyéb digitális megjelenés) szerzői jogi oltalom és kizáróla­ gos kiadói felhasználási jog alatt áll. Bármely részének vagy egészének mindennemű többszörözése kizárólag a szer­ kesztő, a szerzők és a kiadó előzetes írásbeli engedélye alapján jogszerű.

Semmelweis Kiadó 1089 Budapest, Nagyvárad tér 4.

ww w.sem m elweiskiado.hu

Felelős kiadó: dr. TÁNCOS LÁSZLÓ Felelős szerkesztő és tördelőszerkesztő: dr. VINCZE JUDIT Borító: © FARKAS BALÁZS SKD 406 Nyomta és kötötte: MESTER NYOMDA

A könyv szerkesztője Dr. ÁDÁM V E R O N I K A e g y e t e m i t a n ár , az MTA rendes tagj a Semmelweis E g y e t e m , Á l ta l á n o s O r v o s t u d o m á n y i Kar, Or vo si B i ok émi ai I n t é z e t , B ud ap es t

A könyv szerzői Dr. ÁDÁM VERO N IKA e g yetem i tan ár, az MTA rendes tagja Sem m elw eis Egyetem , Á lta lá n o s O rvo stu d o m án yi Kar, O rvo si Bio kém iai In té ze t, B udap est

Dr. BÁNHEGYI GÁBOR e g yetem i tan ár, az MTA do ktora Sem m elw eis Egyetem , Á lta lá n o s O rvo stu d o m án yi Kar, O rvo si V e g y ta n i, M oleku láris B io ló g iai és P ato b io kém iai In té ze t, B udap est

Dr. FÉSŰ S LÁSZLÓ e g yetem i tan ár, az MTA rendes tagja D eb receni Egyetem , Á lta lá n o s O rvo stud o m án yi Kar, B io kém iai és M olekuláris B io ló g iai In té ze t, Debrecen

Dr. C SER M ELY PÉTER e g yetem i ta n á r, az MTA le v e le ző tagja S em m elw eis Egyetem , Á lta lá n o s O rvo stu d o m án yi Kar, O rvo si V e g y ta n i, M oleku láris B io ló g iai és Pato b io kém iai In té ze t, B udap est

Dr. Ifj. G A LLYA S FERENC eg yetem i ta n á r, az MTA do ktora Pécsi Tu d o m á n yeg ye tem , Á lta lá n o s O rvo stud o m án yi Kar, Bio kém iai és O rvo si Kém iai In té ze t, Pécs

Dr. DUX LÁSZLÓ e g yetem i ta n á r, az MTA d o ktora Szegedi T u d o m á n yeg ye tem , Á lta lá n o s O rvo stu d o m án yi Kar, B io kém iai In té ze t, Szeged

Dr. KO LEV KRASZIM IR eg yetem i ta n á r, az MTA do ktora Sem m elw eis Egyetem , Á lta lá n o s O rvo stud o m án yi Kar, O rvo si B io kém iai In té ze t, B udapest

Dr. MACHOVICH RAYMUND egyetem i tanár, az MTA do kto ra, Sem m elw eis Egyetem , Általános O rvo stu d o m án yi Kar, O rvosi B io kém iai In té ze t, B udap est

Dr. SA SV ÁRI MÁRIA e g ye te m i ta n á r, az MTA d o kto ra S e m m e lw e is Egyetem , Á lta lá n o s O rvo stu d o m án yi Kar, O rvo si V e g ytan i M oleku láris B io ló g iai és P ato b io kém iai In té ze t, B udapest

Dr. MANDL JÓ ZSEF e g ye te m i tan ár, az MTA rendes tagja Se m m e lw e is Egyetem , Á lta lá n o s O rvo stud om án yi Kar, O rvo si V eg ytan i M olekuláris B io ló g iai és Patobiokém iai In té ze t, Budapest

Dr. SÜM EGI BALÁZS e g yetem i ta n á r, az MTA d o ktora Pécsi Tud o m án yeg ye tem Á lta lá n o s O rvo stu d o m án yi Kar, Bio kém iai és O rvo si Kém iai In té ze t, Pécs

Dr. NAGY LÁSZLÓ egyetem i tanár, az MTA rendes tagja D ebreceni Egyetem , Á ltaláno s O rvo stud om án yi Kar, B iokém iai és M olekuláris Bio ló giai In té ze t, D eb recen; Sanford Burnham Prebys M edical D isco ve ry In stitu te , O rlando

Dr. T R ET T ER LÁSZLÓ e g ye te m i ta n á r, az MTA d o ktora Se m m e lw e is Egyetem , Á lta lá n o s O rvo stu d o m án yi Kar, O rvo si B io kém iai In té ze t, Bud ap est

Alkotó közreműködő Dr. TÖ RŐ CSIK BEÁTA e g yetem i ad ju n k tu s, PhD Sem m elw eis Egyetem , Á lta lá n o s O rvo stu d o m án yi Kar, O rvo si Bio kém iai In té ze t, B udap est

TARTALOM

Előszó a negyedik kiadáshoz............................................................................................................................ XXI I.

A fehérjék és enzimek szerkezete és funkciója.......................................................................................1 1. A fehérjék szerkezete (Csermely P é te r )..........................................................................................3 1.1 A fehérjék szerkezetének általános tulajdonságai.................................................................... 3 1.2

Am inosavak................................................................................................................................4 Fehérjealkotó aminosavak..........................................................................................................4 Nem fehérjealkotó am inosavak................................................................................................ 6 1.3 A peptidkötés,peptidek.............................................................................................................6 1.4 A fehérjék másodlagos szerkezeti e le m e i............................................................................. 8 a-h élix ....................................................................................................................................... 8 p-redős le m e z .............................................................................................................................9 P-hajtü......................................................................................................................................... 9 Rendezetlen szerkezetű fehérjeszakaszok.................................................................................9 1.5 A fehérj edom ének...................................................................................................................... 9 1.6 A fehérjékharmadlagos szerkezete.......................................................................................... 12 1.7 A fehérjék szerkezetét kialakító és stabilizáló e rő k ..................................................................12 1.8 A fehérjék denaturációja.......................................................................................................... 13 Fehérj ék reverzibilis denaturációj a ...........................................................................................13 Fehérjék irreverzibilis denaturációj a ....................................................................................... 14 1.9 A fehérj ék szerkezetének kialakulása in vitro körülmények k ö z ö tt........................................ 14 A fehérjeszerkezet kialakulásának első, gyors lépései.............................................................. 14 A fehérjeszerkezet kialakulásának záró, sebességmeghatározó lépései.................................. 16 1.10 A fehérjeszerkezet kialakulásának termodinamikai v isz o n y a i...............................................16 1.11 Különbségek az in vitro és in vivő fehérj eszerkezet kialakulás között..................................... 17 1.12 A fehérjék szerkezetének kialakulása és megőrzése a sejtben, a molekuláris chaperonok.............................................................................................................................. 19

2.

Enzimek. Kinetika és reguláció (Kolev Kraszimir).......................................................................... 21 2.1 Az enzimműködés termodinamikai aspektusai....................................................................... 22 2.2 Az enzimfünkció szerkezeti alapjai.......................................................................................... 23 Kofaktorok szerepe az enzimműködésben..............................................................................24 Az enzimek katalitikus hatékonysága a pH és a hőmérséklet függvényében........................... 25 Az enzimek osztályozása..........................................................................................................26 Szerkezet-funkció összefüggések az enzimműködés során. Szerin-proteázok..................... 27 2.3 Enzim kinetika..........................................................................................................................29

Vi l i

TARTALOM

Enzimkinetikai paraméterek kísérleti meghatározása.............................................................. 33 Kétszubsztrátos reakciók kinetikai jellem zői...........................................................................34 Az enzimek mint élettani rendszerek komponensei................................................................. 35 2.4 Az enzimaktivitás szabályozása..................................................................................................39 Reverzibilis inhibitorok.......................................................................................................... 39 Irreverzibilis inhibitorok.......................................................................................................... 41 Az enzimgátlás farmakológiai vonatkozásai...........................................................................42 Az enzimek aktiválása. Nemkovalens módosítások................................................................. 43 Kovalens m ódosítások............................................................................................................. 45 Az enzimaktivitás rendszerszintű szabályozása metabolikus utakban..................................... 47 3.

II.

A membránok szerkezete. M em brántranszport-folyam atok........................................................... 55 4. A membránok szerkezete (Ádám Veronika).................................................................................... 57 4.1 A membránok kémiai összetétele..............................................................................................57 M embránlipidek.......................................................................................... 58 Membránfehérjék.......................................................................................................................61 5.

III.

A hemoglobin és a mioglobin (Mandl J ó z s e f) ................................................................................. 49 3.1 A hemoglobin és a mioglobin szerkezete, oxigénkötése........................................................49 3.2 Az oxigénleadás szabályozása.................................................................................................52 A hemoglobin negyedleges szerkezetét befolyásoló effektorok a 2,3-biszfoszfoglicerát szerepe. A hemoglobin oxigénleadása acid o sisb an .........................52

Membrántranszport-folyamatok (Ádám Veronika)...........................................................................66 5.1 A transzportfolyamatok energetikája....................................................................................... 66 5.2 Facilitált diffúzió. Glukóztranszporterek................................................................................. 67 Glukóztranszporterek................................................................................................................ 68 Klorid-bikarbonát cseretranszporter....................................................................................... 70 5.3 Aktív transzport..........................................................................................................................71 A transzport ATPázok csoportosítása....................................................................................... 71 Na+K+-A TPáz-Na+K+-pum pa.................................................................................................72 Másodlagos aktív transzport. A glukóz Na+-függő transzportja...............................................76 ABC-transzporterek................................................................................................................ 79 5.4 Membrán ion- és egyéb csatornák..............................................................................................82 Ioncsatom ák............................................................................................................................. 82 Aquaporinok- vízcsatornák.................................................................................................... 85 5.5 A sejtek Ca2+-transzport-rendszerei. Ca2+-homeosztázis........................................................ 88 Az intracelluláris Ca2+-koncentráció emelkedését kiváltó szignálok és mechanizmusok . . 88 Az intracelluláris Ca2+-koncentrációt csökkentő mechanizmu s o k ........................................ 95

Az anyagcsere............................................................................................................................................99 6. Bioenergetika (Mandl Jó zsef).......................................................................................................... 101 6.1 Az energiatranszformáció - m etabolizm us............................................................................101 Csoportátvitel - kapcsolt reakciók........................................................................................... 103 Foszforiltranszfer szerepe az energiatranszformációban........................................................ 105

IX

TARTALOM

6.2

6.3

6.4

7.

Elektronátvitel szerepe az energiatranszformációban........................................................... 109 Elektronátvivők................................................................................................................... 110 Az oxigén szerepe a hatékony energiatranszformációban.....................................................114 Oxidoreduktázok a metabolizmusban.................................................................................... 114 Terminális oxidáció - oxidatív foszforiláció a mitokondriumokban..................................... 116 A mitokondriális légzési lánc a lk o tó i.................................................................................... 118 A terminális oxidáció folyamata............................................................................................. 119 Az oxidatív foszforiláció....................................................................................................... 121 Az ADP foszforilációj a - az akceptorkontroll........................................................................122 A kemiozmotikus elm élet....................................................................................................... 124 A citrátciklus...................................................................................................................... 125 A citrátciklus helye az intennedier anyagcserében; a ciklus katabolikus és anabolikus fu n k c ió ja ............................................................................................................................ 125 Acetil-CoA képződése piruvátból, a piruvát-dehidrogenáz enzimkomplex.........................126 A citrátkör re a k c ió i............................................................................................................. 128 A citrátkör szerepe a tápanyagok katabolizm usában........................................................... 131 A piruvát-dehidrogenáz enzimkomplex aktivitásának szabályozása...............................132 A citrátciklus szabályozása....................................................................................................134 A ciklust feltöltő (anaplerotikus) reakciók.......................................................................... 135 Az oxigén tökéletlen redukciója..............................................................................................137 Biológiailag jelentős ROS-molekulák k eletk ezése.............................................................. 138 A ROS károsító h a tá s a i.......................................................................................................... 139 A reaktív oxigénszármazékok eliminálása, az antioxidáns védelem mechanizmusai . . . 140

A szénhidrátok anyagcseréje (Ádám Veronika és Mancit J ó z s e f).............................................. 143 7.1 Az emberi szervezet számára legfontosabb szénhidrátok kémiai tulajdonságai............................................................................................................ 143 7.2 A szénhidrátok emésztése....................................................................................................... 147 Em észtőenzim ek................................................................................................................ 148 A monoszacharidok felszívódása a vékonybélben................................................................. 151 7.3 G likolízis............................................................................................................................ 151 A glikolízis helye az intennedier anyagcserében.....................................................................151 A glikolízis reakciói............................................................................................................ 153 A glukóz aerob és anaerob lebontásának energiamérlege.................. 159 A glikolízis regulációja.......................................................................................................... 159 7.4 Redukáló ekvivalensek transzportja a citoszolból a mitokondriumba.................................. 161 7.5 Glukoneogenezis - a glukóz de novo szintézise.....................................................................163 7.6 A glikolízis és a glukoneogenezis szabályozása.....................................................................167 7.7 A fruktóz és a galaktóz m etabolizm usa................................................................................. 170 7.8 A glikogén szintézise és lebontása...........................................................................................174 Glikogénszintézis....................................................................................................................174 Glikogénlebontás....................................................................................................................176 A glikogén-anyagcsere szabályozása.................................................................................... 178 7.9 A vércukorszint szabályozása.................................................................................................183 7.10 A glukóz direkt oxidációja, pentóz-foszfát-út........................................................................189

X

TARTALOM

A glukóz direkt oxidációjának oxidatív szak asza.............................................................. 189 A glukóz direkt oxidációjának nem oxidatív szakasza. Pentóz-foszfát keletkezése glikolízis intermedierekből.................................................................................................... 190 A pentóz-foszfát-út szabályozása, jelentősége, lefolyásának különböző form ái............... 191 7.11 Bioszintetikus folyamatok a szénhidrátok anyagcseréjében. Glikoproteinek, proteoglikánok szénhidrátláncának szintézise............................................194 8.

A lipidek anyagcseréje (Ádám Veronika)....................................................................................196 8.1 A legfontosabb zsírsavak és jelölésük.....................................................................................197 8.2 Acil-gliceridek. Trigliceridek és az energiaraktározás............................................................199 8.3 A zsírsavak de novo bioszintézise.......................................................................................... 200 Az acetil-CoA transzportja a mitokondriumból a citoplazmába........................................ 200 A zsírsavszintézis elkötelező lépése és az acetil-CoA-karboxiláz szabályozása................200 A palmitinsav szintézise. A zsírsav-szintáz...........................................................................201 A zsírsavszintézishez szükséges NADPH forrása................................................................. 203 A zsírsavszintézis szabályozása............................................................................................. 204 A zsírsavlánc elongációj a .......................................................................................................204 Speciális zsírsavak, amelyek a zsírsav-szintáz reakcióban keletkezhetnek.........................206 8.4 A trigliceridek szintézise és raktározása................................................................................. 206 8.5 Lipolízis - a raktározott zsírsavak mobilizálása a zsírszövetből........................................... 211 8.6 A zsírsavak oxidációj a ................................................................................ 212 A páros szénatomszámú telített zsírsavak oxidációj a ........................................................... 214 A páratlan szénatomszámú és a telítetlen zsírsavak oxidációj a............................................217 a-oxidáció és oo-oxidáció....................................................................................................... 219 8.7 A ketontestek keletkezése és felhasználása. Ketonaemia, ketonuria..................................... 220 8.8 A koleszterin metabolizmusa.................................................................................................222 A koleszterin szintézise..........................................................................................................223 A koleszterinszintézis regulációja.......................................................................................... 226 A koleszterin-észterek k eletkezése....................................................................................... 229 8.9 Az epesavak keletkezése, metabolizmusa és je len tő ség e.....................................................230 8.10 A koleszterin és egyéb lipidek szállítása a keringésben.Lipoproteinek................................235 A trigliceridek szállítása. Kilomikron, V LD L........................................................................238 A koleszterin szállítása. LDL, H D L ....................................................................................... 241 Szabad z sírsa v a k ................................................................................................................... 245 8.11 A zsírok emésztése és felszívódása....................................................................................... 246 8.12 A foszfolipidek és szfingolipidek felépítése és jelen tő ség e..................................................249 A foszfatidil-kolin szin tézise.................................................................................................253 Egyéb foszfolipidek szin tézise............................................................................................. 255 A szfingolipidek szerkezete és szintézise..............................................................................259 8.13 A szteroidhormonokmetabolizmusa.................................................................................... 262 Szteroidhormonok szintézise a mellékvesekéregben........................................................... 263 A glukokortikoidok és a mineralokortikoidok inaktiválása és szállítása a plazmában . . . 270 A nemi hormonok szintézise....................................................................................................271 8.14 A D 3-vitaminszintézise.......................................................................................................... 274

TARTALOM

XI

9.

Az aminosavak anyagcseréje. A porfirin-anyagcsere (Machovich Raymund és Tretter László)............................................................................................................................... 276 9.1 Az aminosav-anyagcsere általános ism ertetése.................................................................... 276 9.2 A táplálékból származó aminosavak. A fehérjék em észtése................................................. 278 A fehérjeemésztő enzimek aktivitásának szabályozása.....................................................279 Az aminosavak transzportja................................................................................................... 282 9.3 Az endogén fehérjék le b o n tása............................................................................................. 283 Extracelluláris p ro teázo k ...................................................................................................... 284 Az intracelluláris proteolízis................................................................................................... 285 9.4 Az aminosavak lebontása...................................................................................................... 289 Az aminocsoport eltávolítása az aminosavakról.................................................................... 289 Dezaminálási m echanizm usok............................................................................................. 290 Az aminosavak szénláncának lebontása - glukogén és ketogén aminosavak......................293 A glutamin, aszparagin, glutamát és aszpartát lebontása........................................................294 A prolin, arginin, omitin és hisztidin katabolizmusa..............................................................294 A piroszőlősavvá lebomló aminosavak - a glicin, szerin, cisztein, treonin, alanin és hidroxiprolin le b o n tása.......................................................................................... 295 A fenilalanin és tirozin katabolizmusa....................................................................................298 A metionin katabolizmusa.......................................................................................................300 A triptofán és lizin katabolizmusa.......................................................................................... 301 Az elágazó szénláncú aminosavak - valin, izoleucin, leucin - lebontása............................301 A propionil-CoA átalakulása szukcinil-CoA-vá; a Bj2-vitamin szerepe...............................303 9.5 Az ammóniaeltávolítás mechanizmusai.................................................................................304 Az ammónia eliminációja.......................................................................................................304 Az omitinciklus...................................................................................................................... 304 Az omitinciklus szabályozása................................................................................................ 306 A hyperammonaemia és terápiás lehetőségei....................................................................... 307 9.6 Egy szénatomos csoportok transzferreakciói. A tetrahidrofolát és az S-adenozil-metionin szerepe az aminosav-anyagcserében.............................................. 310 A folsav szerepe az aminosavak metabolizmusában.............................................................. 310 Az S-adenozil-metionin szerepe az aminosavmetabolizmusban........................................... 311 9.7 A nem esszenciális aminosavak bioszintézise....................................................................... 312 9.8. Az aminosavakból képződő nitrogéntartalmú vegyületek......................................................314 A szervek közötti om itinciklus................................................................................... ... . 319 9.9 Porfirinek és epefestékek. Vashomeosztázis............................................................................319 A porfirinek szintézise............................................................................................................. 320 A vashom eosztázis................................................................................................................ 323 A vashomeosztázis szabályozása.......................................................................................... 326 Az oxigéntenzió és a vashomeosztázis kapcsolata................................................................. 329 A porfirinek lebomlása, epefestékek képződése.................................................................... 329

10.

A nukleotidok anyagcseréje (Machovich Raymund és Tretter L á s zló )..................................... 335 10.1 A nukleotidok szerkezete.......................................................................................................335 10.2 A mononukleotidok forrásai.....................................................................................................337 10.3 Apurinnukleotidokbioszintézise.......................................................................................... 338

TARTALOM

XII

A purinváz k ialak u lása.......................................................................................................... 338 Az AMP és a GMP szintézise.................................................................................................341 A purinnukleotidok bioszintézisének szabályozása.............................................................. 342 A purinnukleotidok „mentő” reakciói.................................................................................... 343 10.4 A pirimidinnukleotidok bioszintézise.................................................................................... 345 Az UMP kialakulása................................................................................................................ 345 A citidinnukleotidok szintézise..............................................................................................347 A pirimidinnukleotid-szintézis szabályozása........................................................................347 A pirimidinnukleotidok mentő reakciói................................................................................. 348 10.5 A dezoxiribonukleotidok anyagcseréje................................................................................. 348 A dezoxiribonukleotidok képződése....................................................................................... 348 A dezoxi-timidilát (dTMP) és a timidin-trifoszfát (dTTP) szin tézise ..................................349 Dezoxiribonukleotidok bioszintézisének szabályozása........................................................351 10.6 Purin-és pirimidinnukleotidok lebontása.............................................................................. 353 Nukleotidokból nukleozidok képződése................................................................................. 353 A purinnukleotid-ciklus.......................................................................................................... 353 Purinbázisok leb o n tása.......................................................................................................... 354 A húgysav antioxidáns és prooxidáns h a tá sa i........................................................................356 A húgysav-elimináció............................................................................................................. 356 Pirimidinbázisok lebontása....................................................................................................358 10.7 Nukleotidok egymásba történő átalakulásai................................................. 359 10.8 AB ^-vitamin szerepe a metabolizmusban.............................................................................. 360 10.9 AfolsavszerepeanukleotidszintézisbenésaDNS-metilálásban........................................ 364 10.10 A nukleotidok szerepe további anyagcsere-folyamatokban és egyéb fontos biomolekulák szintézisében..............................................................................364 11.

Biotranszformáció (Mánál József)....................................................................................................368 11.1. A biotranszformáció folyamata, fázisa i.................................................................................369 A biotranszformáció első, előkészítő fázisa...........................................................................370 A biotranszformáció második, konjugációs fázisa................................................................. 373 A biotranszformáció harmadik fá z isa .................................................................................... 375 11.2 A biotranszformáció je len tő ség e.......................................................................................... 375

12.

Az alkohol metabolizmusa (Adám Veronika)................................................................................. 378 12.1 Az alkohol felszívódása és eloszlása a szervezetben.............................................................. 378 12.2 Az alkohol oxidációja............................................................................................................. 378 Alkohol-dehidrogenáz............................................................................................................. 379 Mikroszomális etanoloxidáló re n d sz e r................................................................................. 379 Az acetaldehid oxidációja.......................................................................................................380 12.3 Az alkoholoxidáció általános jellegzetességei és energetikája...............................................381 12.4 A fokozott alkoholoxidáció metabolikus következményei. Az alkohol toxikus hatásai . . 383

X III

TARTALOM

IV.

A genetikai információ tárolása és kifejeződése............................................................................. 13. DNS: genom, replikáció és hibajavítás (Nagy László).............................................................. 13.1 A genetikai információ tárolása....................................................................................... A DNS és az RNS szerkezete.......................................................................................... A DNS-molekula szerkezete............................................................................................. 13.2 DNS-replikáció és hibajavítás.......................................................................................... Az információátadás irányai és lehetőségei.................................................................... A replikációs origó és a h e lik á z ....................................................................................... A replikációs komplex...................................................................................................... A DNS-kapocs és a DNS-kapocs-felhelyező egység........................................................ A lineáris kromoszómavégek replikációja: a telomeráz k o m p lex .................................. A DNS károsodásainak javítása.......................................................................................

387 389 389 392 393 395 395 396 398 401 402 403

14.

RNS: transzkripció és szabályozása (Nagy L ászló)................................................................. 14.1 Az eukarióta transzkripció mechanizmusa....................................................................... A kromatin szerkezete és funkciói.................................................................................... Gének szerkezete, szabályozó szekvenciák.................................................................... Transzkripciós faktorok................................................................................................... A pre-mRN S transzkripciój a .......................................................................................... Az mRNS elongációja, érése és transzportja.................................................................... Az mRNS stabilitását meghatározó tényezők................................................................. A riboszomális RNS (rRNS) transzkripciója és é r é s e ..................................................... A transzfer RNS transzkripciój a és é r é s e ....................................................................... RNS-transzport a magból a citoplazmába....................................................................... 14.2 Az új RNS-világ: nem kódoló RNS-ek, mikroRNS-ek, siRNS-ek.................................. 14.3 Epigenetikai szabályozás................................................................................................ A kromatinstruktúra és a nukleoszómaszerkezet szabályozása..................................... A D N S-m etiláció............................................................................................................ X kromoszóma inaktiválás és im printing....................................................................... 14.4 Génterápia.........................................................................................................................

409 409 411 411 413 415 416 419 420 421 421 422 423 424 426 427 429

15.

Fehérjeszintézis: a transzláció mechanizmusa és a polipeptidlánc további sorsa (Tréttér L á s z ló ) ......................................................................................................................... 15.1 A genetikai k ó d ............................................................................................................... 15.2 A fehérjeszintézis két központi szereplője, a transzfer RNS és a riboszóm a.................. A transzfer RNS (tRNS)................................................................................................... A riboszóm ák................................................................................................................... Poliszómák............................................................................................................. 15.3 A fehérjeszintézis lé p ése i................................................................................................ A fehérj eszintézis lépéseinek összefoglalása................................................................. A tRNS-ek aktiválása, azaz az aminoacil- tRNS komplex kialakítása az aminoacil- tRNS-szintetáz enzimek segítségével........................................................ A mRNS kodon és tRNS antikodon kapcsolat kialakítása, és a „lötyögés” (wobbling) jelensége............................................................................................................................ A fehérj eszintézis iniciációj a ..........................................................................................

432 432 434 434 434 437 437 437 437 439 440

XI V

TARTALOM

Az eukarióta fehérjeszintézis iniciációja.................................................................... 440 A prokarióta fehérjeszintézis iniciációja.................................................................... 441 Afehéjeszintéziselongációjaeukariótákban........................................................................444 A fehérjeszintézis terminációja és a riboszómareciklizációja.............................................. 446 A fehérjeszintézis pontossága............................................................................................. 445 A fehérjeszintézist befolyásoló antibiotikumok................................................................. 447 Az eukarióta fehérjeszintézis g á tlá s a .................................................................................447 15.4 Az eukarióta fehérjeszintézis szabályozása........................................................................447 Az eukarióta fehérjeszintézis iniciációjának szabályozása..................................................448 Az aminosavak aktiváló hatása az mTORC 1 ko m p lex re........................................... 451 A fehérjeszintézis elongációs lépésének szabályozása........................................................... 452 Az egyes mRNS-ek transzlációjának szabályozása - a sejt vasszintjétől függő szabályozás................................................................................................................ 452 A transzláció szabályozása mikroRNS-ekkel........................................................................453 Cap-fuggetlen fehérjeszintézis IRES segítségével................................................................. 454 15.5 A szintetizált fehérjék intracelluláris kompartmentekbe történő irán y ítása ........................ 455 A fehérjetranszport útvonalai.................................................................................................455 A szabad riboszómákon szintetizálódó fehérjék lehetséges ú t j a i ........................................ 456 Citoplazmatikus fehérjék..............................................................................................455 A plazmamembrán felépítésében szereplő perifériás fehérjék..................................... 456 A fehérjék mitokondriumba történő irányítása........................................................... 456 A nukleáris gének által kódolt fehérjék transzportja a mitokondriumba..................... 457 Fehérjék sejtmagba történő transzportja........................................................................458 Fehérjetranszport a peroxiszómákba...........................................................................459 Fehérjeszintézis az ER felszínén.......................................................................................... 460 Fehérjék beépülése az ER m em bránjába.................................................................... 461 Atehérjéksorsaazendoplazmásretikulumban.................................................................... 462 Diszulfidhidak k ialak ítása.......................................................................................... 463 Chaperon fehérjék az ER-ben....................................................................................... 463 ER-rezidens fehérjék....................................................................................................465 Golgiba irányuló fehérjék............................................................................................. 465 Fehérjék transzportja a lizoszómákba...........................................................................465 Szekréciós fehérjék.......................................................................................................457 15.6 Mitokondriális fehérjeszintézis.................................................................................... 467 A mitokondriális riboszómák (m itoriboszóm ák)................................................................. 468 A mitokondriális fehérjeszintézis in iciációja........................................................................468 A mitokondriális fehérjeszintézis elongációja........................................................................469 A mitokondriális fehérjeszintézis term inációja.................................................................... 469 16.

Molekuláris genetikai módszerek és alkalmazásuk az orvostudományban (Sasvári Mária) . . 470 16.1 Polimeráz-láncreakció: a géndiagnosztika új eszköze...........................................................470 A P C R e lv e ................................................................................................................ 47O A DNS-szekvencia egyedi variabilitása: a humán genom polimorfjellege........................... 471 Flosszúság polimorfizmusok vizsgálata.................................................................................472 SNP azonosítási módszerek....................................................................................................474

TARTALOM

I

XV

PCR-RFLP............................................................................................................... 474 Allélspecifikus p ró b á k ................................................................................................ 475

DNS-szekvenálás................................................................................................................... 476 16.2 Rekombináns DNS és rekombináns fe h é rjé k .......................................................................477 A klónozás elvi alapjai.............................................................................................................477 G énkönyvtárak...................................................................................................................... 478 Expressziós vektorok és a génexpresszió vizsgálati m ó d szerei........................................ 479 Az expresszió RNS-szintü vizsgálata: kvantitatív PCR(qPCR)........................................... 480 Az expresszió fehérjeszintü vizsgálata: Western b i o t ...........................................................481 A génexpresszió szabályozásának vizsgálata: riporterrendszerek........................................482 V.

Extracelluláris jelek receptorai és a jelátviteli m echanizm usok.....................................................483 17. Plazmamembrán-receptorok és jelátviteli mechanizmusok (Ádám Veronika)................................485 17.1 A receptorok általános jellemzői és felosztásuk....................................................................486 17.2 Intracelluláris jelpályákat alkotó fehérjék fontosabb d o m é n jei...........................................488 17.3 GTP-kötő fehérjék. G-fehérjékhez kapcsolt receptorok....................................................... 489 Heterotrimer G-fehérj ék ..........................................................................................................490 A receptorok deszenzitizációj a és down-regulációj a...........................................................492 Monomer G-fehérj é k .............................................................................................................493 17.4 A ciklikus AMP-vei működő jelpálya................................................................................... 494 17.5 Ca2+jelpálya. Inozitol-lipidek szerepe....................................................................................503 17.6 A tirozin-kináz-receptorokkal működő jelp ály ák .................................................................510 A növekedési faktorok jelátvitele. MAP-kináz jelp ály a........................................................511 Az inzulin jelpálya................................................................................................................... 514 17.7 JAK-STATjelpálya................................................................................................................519 17.8 A ciklikus GMP-vel működő jelpálya. A nitrogén-monoxid biológiai szerepe.....................520 A nitrogén-monoxid keletkezése és biológiai jelentősége.....................................................522

XVI

TARTALOM

A proteolízis jelentősége a sejtciklusban..............................................................................540 19.2 A természetes sejthalál molekuláris h á tte re ........................................................................541 A természetes sejthalál formái............................................................................................. 541 Az apoptózis elin d ítása...................................................................................................... 541 Effektor mechanizmusok................................................................................................... 543 Az apoptózis gátlása................................................................................................................ 544 Az elhalt sejtek fagocitózisa.................................................................................................... 545 19.3 A tumorsejtek proliferációja.................................................................................................... 545 Protoonkogének és o nkogének..............................................................................................545 Tumorszuppresszor gének....................................................................................................... 546 Humán tumorok genomikai k é p e ...........................................................................................548 VI.

Az intermedier anyagcsere összehangolt szabályozása.................................................................... 551 20. Az intermedier anyagcsere összehangolt szabályozása (Ádám Veronika, Mandl József és Tretter László)................................................................................................................................... 553 20.1 Az enzimek aktivitásának és mennyiségének szabályozása..................................................554 Az enzimek aktivitásának regulációja.................................................................................... 554 Az enzimek mennyiségének transzkripciós szintű szabályozása........................................... 554 Integrált szabályozások az AMP aktiválta kináz (AMPK) és a szirtuinok közreműködésével....................................................................................................................560 20.2 Kompartmentalizációs szabályozás az anyagcsere-integrációban. Az elágazási pontok . . 562 Elágazási pontok a metabolizmusban.................................................................................... 562 20.3 A sejtek redoxhomeosztázisa.................................................................................................565 20.4 Az egyes szervekben zajló anyagcsere-folyamatok. Az anyagcsere szabályozása a szervezet szintjén-éhezés, táplálékbevitel........................................................................566 A máj szerepe az anyagcsere integrációjában........................................................................566 A táplálékfelvétellel összefüggő metabolikus változások a májban és kooperáció a szervek k ö zö tt.......................................................................................................................567 A májban történő metabolizmus jellemzői jóllakott állapotban.................................. 567 A jóllakott állapot jellemzői a szervekben................................................................. 571 A májban történő metabolizmus jellemzői éhezésben..................................................571 A szervek metabolizmusa és a szervek közötti metabolikus kooperáció az éhezés különböző fázisaiban.................................................................................... 574 A haráncsíkolt izom és a szívizom intermedier anyagcseréje...............................................576 A harántcsíkolt izom szénhidrát-, lipid- és aminosav-anyagcseréje............................577 A szívizom-anyagcsere jellegzetességei.....................................................................580 Az izom tápanyanyagforrásai az éhezés-jóllakottsági ciklus különböző fázisaiban . 580 Az izomszövet metabolizmusa fizikai erőkifejtésben..................................................581 A fehér és barna zsírszövet intermedier anyagcseréje........................................................... 581 A központi idegrendszer anyagcseréjének sajátosságai........................................................ 585 A vékony- és vastagbélhámsejtek metabolizmusa................................................................. 587 A vese intermedier anyagcseréje..............................................................................................588 A vörösvértestek intermedier anyagcseréje...........................................................................590 20.5 Az anyagcsere integrációja patológiás állapotokban.............................................................. 592 Diabetes m e llitu s....................................................................................................................592

TARTALOM

X V II

VII. Az egyes szervek és szervrendszerek működésének biokémiai alapjai...........................................597 21. A kémiai ingerületátvitel (neurotranszmisszió) molekuláris alapjai (Ádám Veronika)............ 599 21.1 Az akciós potenciál és a feszültségfüggő Na+-c sa to m a ........................................................599 21.2 A kémiai ingerületátvitel je llem ző i....................................................................................... 602 21.3 Glutamát................................................................................................................................... 607 Glutamátreceptorok............................................................................................................ 611 21.4 GABA...................................................................................................................................... 614 21.5 A cetilk o lin .............................................................................................................................617 Az acetilkolin szintézise, raktározása és felszabadulása a kolinerg neuronokbán...............618 Kolinerg receptorok................................................................................................................ 619 Az acetilkolin inaktiválása.......................................................................................................622 21.6 A katecholamin neurotranszmitterek. Noradrenalin, dopamin és adrenalin........................ 623 A katecholaminok bioszintézise és raktározása.................................................................... 623 A katecholaminok metabolizmusa és inaktiválása................................................................. 625 A noradrenalin és az adrenalin receptorai..............................................................................627 Dopaminreceptorok................................................................................................................ 629 21.7 Szerotonin................................................................................................................................630 Szerotoninreceptorok............................................................................................................. 632 21.8 Neuropeptidek..........................................................................................................................633 Opioidpeptidek.......................................................................................................................634 22.

Kontraktilis rendszer (Dux L á s z ló )............................................................................................. 636 22.1 Az izomszövet kontraktilis rendszere.................................................................................... 637 A vastag filamentumrendszer, a miozin szerkezete.............................................................. 637 A vékony filamentum re n d sz e r............................................................................................. 638 22.2 A kontrakció mechanizmusa....................................................................................................638 Az érett harántcsíkolt izom felépítése. Szupramolekuláris struktúra..................................... 641 A vázizom hossz-feszülés összefüggése, a csúszó filamentum (sliding filament) m odell...................................................................................................................................... 642 22.3 A kalciumszignál keletkezése és eliminációja izom ban........................................................642 A kalciumszignál és az izom szarkotubuláris rendszere........................................................642 A kalciumfelszabadulás mechanizmusa.................................................................................644 A kalcium-visszavétel mechanizmusa.................................................................................... 645 22.4 Az izomkontrakció energiaszükségletének b iz to sítá sa ..................... 646 22.5 Az izomszövet alkalmazkodási reakciói.................................................................................647 Az izomfáradás, iz o m lá z .......................................................................................................647 Az izom adaptációj a, plaszticitása.......................................................................................... 647 22.6 Az izomszövet citoszkeletális vázrendszere...........................................................................648

23.

Extracelluláris mátrix és sejtadhézió molekulái. Sejtek közötti közvetlen kommunikáció (Kolev K raszim ir)......................................................................................................................... 651 23.1 Extracelluláris mátrix fehérj ék szintézise és szerveződése.................................................... 652 K o lla g é n ................................................................................................................................652 A kollagén és a sejtek k ap cso lata.......................................................................................... 655 Hálózatképző ECM fe h é rjé k ................................................................................................ 656

XVI I I

TARTALOM

Proteoglikánok.......................................................................................................................659 23.2 Sejtek közötti kapcsolatok és közvetlen sejt-sejt kommunikáció molekuláris alapjai . . . 661 K adherinek............................................................................................................................. 662 Klaudinek és hozzájuk kapcsolódó fehérjék........................................................................... 663 Konnexinek............................................................................................................................. 665 A Notch jelátviteli rendszer.................................................................................................... 666 Szelektinek, szelektinligandok és immunoglobulin szupercsalád fehérjéi............................667 24.

Lokális hormonok egyes szervek működését befolyásoló hatása. Az eikozanoidok (Mandl József)............................................................................................................................... 673 24.1 Prosztanoidok..........................................................................................................................673 Az arachidonsav metabolizmusa. Az arachidonsav-ellátás. Foszfolipáz-A2.........................673 A ciklooxigenáz út. Prosztanoid- és tromboxánszintézis........................................................ 674 A prosztanoid és a tromboxán katabolizmusa........................................................................676 24.2 Leukotriének..........................................................................................................................676 A lipoxigenáz út. A leukotriének szintézise és lebontása........................................................ 677 24.3 Eikozanoidok biológiai h a tá sa i..............................................................................................678 Eikozanoidreceptorok. Eikozanoidok és szignáltrandukciós ren d szerek ............................679

25.

Hemosztázis (Kolev Kraszimir és Machovich R aym und)........................................................... 682 25.1 A véralvadék képződésének és feloldódásának általános áttek in tése.................................. 682 25.2 A véralvadék képződésének és feloldódásának vérplazmatényezői..................................... 683 Fibrinogénés fíb rin .................................................................................................................683 A trombin szabályozása.......................................................................................................... 686 A pro trombin aktiválása.......................................................................................................... 686 A faktor-X aktiválása............................................................................................................. 687 A véralvadás beindítása és az indító szignál amplifikációja..................................................688 A protein-C-függő negatív visszacsatolás a véralvadási k aszk ád b an .................................. 691 25.3 A véralvadás inhibitorrendszere..............................................................................................692 Fibrinolízis............................................................................................................................. 696 A fíbrin felo ld ása....................................................................................................................696 A plazminogén aktiválása....................................................................................................... 697 Aplazminogénkonformációváltozásai................................................................................. 698 A plazminogénaktivátorok.................................................................................................... 698 A plazminogénaktivátorok inhibitorrendszere........................................................................698 A plazminogénaktiváció kofaktor szintű szabályozása........................................................ 699 A plazmin inhibitorrendszere.................................................................................................699 25.4 A véralvadék képződésének és feloldódásának sejtes té n y e z ő i........................................... 700 Avérlemezkék..........................................................................................................................700 A neutrofil leukociták............................................................................................................. 705 Az endotélsejtek.......................................................................................................................706 A máj szerepe a hemosztázisban..............................................................................................708

26.

A mitokondriumok működése és betegségei (Sümegi Balázs és ifj. Gallyas Ferenc)................710 26.1 A mitokondrium szerkezete és legfontosabb funkciói...........................................................710

XI X

TARTALOM

Energiatermelés a mitokondriumban.................................................................................... 711 A mitokondriális membránrendszer károsodása (M PT ).....................................................713 Mitokondriális ROS-termelés és kapcsolódó betegségek.....................................................714 Mitokondriális dinamika - fragmentáció és fú z ió ................................................................. 716 26.2 A mitokondriális genom..........................................................................................................718 A mitokondriális genom felépítése és speciális tulaj donságai........................................... 718 26.3 Mitokondriális b eteg ség ek ....................................................................................................719 Mitokondriális DNS-mutációk és betegségek........................................................................719 Fehérjeszintézist érintő m utációk.......................................................................................... 720 Mitokondriális DNS-depléció.................................................................................................720 Szomatikus eredetű mitokondriális DNS-mutációk öregedésben és degeneratív betegségekben...................................................................................................................... 721 A mitokondriális terápia lehetőségei....................................................................................721 27.

Az endoplazmás retikulum: egy metabolikus kompartment (Bánhegyi Gábor).........................723 27.1 Metabolizmus az endoplazmás retikulumban........................................................................724 27.2 A glukóz-6-foszfát transzporter és a hozzá kapcsolódó ER luminális aktivitások............... 725 27.3 Biotranszformáció................................................................................................................... 727

28.

A klinikai laboratóriumi diagnosztika biokémiai háttere (Dux L á szló )..................................... 728 28.1 A klinikai laboratóriumi diagnosztika célja, fe la d a ta ........................................................... 728 Élő szervezetek áramlási egyensúlyának nyomon követése..................................................728 Normál-, referenciatartomány fogalma, meghatározása........................................................729 Kóros laboratóriumi eredmények típ u s a i..............................................................................730 28.2 Laboratóriumi diagnosztikai eredmények hibái, értékelése..................................................730 Az eredmények valódisága, pontossága, véletlen és szisztémás hibák..................................730 Laboratóriumi diagnosztikai mérések kalibrálása, standardok típusai..................................731 Külső minőség-ellenőrzés a laboratóriumi diagnosztikában..................................................732 28.3 A laboratóriumi diagnosztikai vizsgálatok fő fázisai.............................................................. 732 A preanalitikai fázis................................................................................................................ 732 Az analitikai fá z is ................................................................................................................... 733 A posztanalitikai fázis............................................................................................................. 735 28.4 Szűrővizsgálatok................................................................................................................... 736

Rövidítésjegyzék............................................................................................................................................... 737 Tárgymutató

741

ELŐSZÓ A NEGYEDIK KIADÁSHOZ

Az Orvosi Biokémia tankönyv negyedik kiadását tartja kezében az olvasó. Valójában azonban egy új könyvet. A korábbi kiadás minden fejezetét újragon­ doltuk, a legtöbbet újraírtuk, mert az első kiadás óta eltelt húsz év felismerései a biokémia számos területét átírták vagy tovább írták. Nincs az orvostudománynak még egy olyan területe, talán csak a képalkotó eljárá­ sok világa, ahol az elmúlt évtizedekben ilyen ütemben és mélységben tárultak volna fel azok az ismeretek, amelyek előbbre vitték az életfolyamatok megértését és az erre alapuló beavatkozási lehetőségeket. A mo­ dem terápia olyan molekuláris célpontokat keres, amelyek kedvezően befolyásolhatnak alapvető bioké­ miai folyamatokat, s ezáltal életfolyamatokat. Ennek alapja pedig a folyamatok megismerése és megértése. A biokémia ezt a kalandot kínálja az olvasónak. Ami logikus, tiszta és érthető - a molekulák világa pedig ilyen annak elsajátítása örömöt, szellemi élvezetet jelent, reményem szerint még azoknak is, akik ehhez egy egyetemi vizsga teljesítésének kényszere alatt látnak neki. Mit talál a könyvben az olvasó? A humán életfo­ lyamatok alapjául szolgáló alapvető molekuláris fo­ lyamatok leírását. Van, amit részletesebben, s van, amit elnagyoltabban. A részletekre ott fordítottunk több figyelmet, ahol muszáj volt, mert a részletek nél­ kül a lényeg nem megmutatható, vagy ott, ahol fontos fiziológiai jelenségek, klinikai elváltozások vagy terá­ piás beavatkozások molekuláris alapjait kívántuk láttatni. A biokémia felismerései, mint az élettudományoké általában, a szakirodalomban angol nyelven váltak közkinccsé. A könyv írása nyelvi dilemma elé is állí­

totta a szerzőket: mit és mennyire célszerű az angol szaknyelvi fogalmakból magyar nyelvre fordítani. Azt választottuk, hogy minél kevesebbet. A leendő orvo­ sok, biológusok pályájuk során nagyobb részt angol szakirodalmat olvasnak majd, s az ebben való eligazo­ dást segíti, ha már a kezdeteknél azokkal a nevekkel ismerkednek meg, amelyeket a nemzetközi szakirodalom használ. így aztán, a könyvben sok angol névvel, illetve annak alapján született rövidítéssel találkozik az olvasó. Tovább bonyolítja a nevekben való eligazo­ dást az, hogy nincs a biokémiának egységes nevezék­ tana; ugyanannak az enzimnek vagy molekulának el­ térő nevei és rövidítései ismertek. Könyvünkben igyekeztünk következetesek lenni, s ugyanazt a dolgot ugyanannak nevezni. Ez el is várható, de a biokémiá­ ban nem triviális. A könyv elkészülte sok ember munkájának kö­ szönhető. Mindenek előtt természetesen a szerzőké az érdem. A letisztult, nagyon igényes grafikai megjele­ nés Ángyán Gergő munkáját dicséri. A könyv gondos kiadói szerkesztését Dr. Vincze Judit végezte. A Sem­ melweis Kiadótól kapott nem lankadó támogatásért és segítőkész hozzáállásért Dr. Táncos Lászlót illeti a köszönet. A könyv szerkesztői munkáiban Dr. Törőcsik Beá­ ta tárgyi tudása, tapintata és igényessége jelentett fel­ becsülhetetlen segítséget. Bízom abban, hogy tanulható és szerethető köny­ vet adunk a hallgatók és a biokémia egyes területeiben elmélyülni kívánó kutatók és klinikusok kezébe.

Budapest, 2016. október 14.

Ádám Veronika

I

A fehérjék és enzimek szerkezete és funkciója 1.

A fehérjék szerkezete (Csermely Péter)

2.

Enzimek. Kinetika és reguláció (Kolev Kraszimir)

3.

Hemoglobin és mioglobin (MaridI József)

1

A FEHÉRJÉK SZER KEZETE

C S E R M E L Y PÉTER

1.1

1.1

A fehérjék szerkezetének általános tulajdonságai

3

1.2

Aminosavak

1.3

A peptidkötés, peptidek

1.4

A fehérjék másodlagos szerkezeti elemei

1.5

A fehérjedomének

1.6

A fehérjék harmadlagos szerkezete

1.7

A fehérjék szerkezetét kialakító és stabilizáló erők

1.8

A fehérjék denaturációja

1.9

A fehérjék szerkezetének kialakulása in vitro körülmények között

1.10

A fehérjeszerkezet kialakulásának termodinamikai viszonyai

1.11

Különbségek az in vitro és in vivő fehérjeszerkezet-kialakulás között

1.12

A fehérjék szerkezetének kialakulása és megőrzése a sejtben, a molekuláris chaperonok 19

4

A FEHÉRJÉK S Z E R K E Z ET É N E K ÁLTALÁNOS TULAJDONSÁGAI

A fehérjék egy vagy több polipeptidláncból épül­ nek fel. Az egyes polipeptidláncokat egymással peptidkötéssel összekapcsolódó aminosavak alkotják. A legtöbb ismert fehérje kb. 100-300 aminosavat tar­ talmaz. A 100 aminosavnál kisebb fehérjéket általá­ ban peptideknek nevezzük. A fehérjék molekulatöme­ gét kilodalton (kDa) egységekben adjuk meg. A fehér­ jék molekulatömege kb. 5 és 1000 kDa között változ­ hat. A fehérjék nagyon sokféle funkciót töltenek be a szervezetben: lehetnek például kémiai folyamatokat katalizáló enzimek, a sejtes és sejt közötti struktúrákat kialakító molekulák, részt vehetnek a membránokon keresztül megvalósuló transzportfolyamatokban, és

6 8

9 12 12

13 14

16 17

extracelluláris jelek hordozói is lehetnek. Egy fehérje a felsorolt funkciókból egyszerre többet is betölthet. A fehérjék változatos működését az aminosavsorrend által meghatározott egyedi, ún. natív térszerkezet teszi lehetővé. Az egyedül aktív natív térszerkezetet a fe­ hérjék sok milliárd lehetséges szerkezet közül kell, hogy megtalálják. Ezt a folyamatot az élő szervezetek­ ben a fejezet végén bemutatott mechanizmusok segítik. A fehérjék szerkezetének az 7-7. ábrán bemutatott négy szintjét különítjük el. Az elsődleges szerkezet az aminosavak peptidkötésekkel meghatározott sorrend­ jét jelöli. A másodlagos szerkezet az aminosavsorrendben egymás melletti vagy egymáshoz közel lé­ vő aminosavak által kialakított, gyakran előforduló fe­ hérjeszerkezeti elemeket különbözteti meg. A fehér­ jék harmadlagos szerkezete egy polipeptidlánc teljes háromdimenziós szerkezetét jelöli. A negyedleges

4

I . A F E H É R ) É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

a elsődleges szerkezet

aminosavak

b

másodlagos szerkezet

1.2

a-hélix

L r l t r l r

r

—

r

—- - **

p-redös lemez

c

szerkezetről akkor beszélünk, ha több polipeptidlánc kapcsolódik össze, avagy a polipeptidlánchoz más, nagyobb molekula is kapcsolódik, pl. hem, lipidek, oligo- vagy poliszacharidok, RNS stb. A negyedleges szerkezet lehet például két azonos monomer fehérje­ egységből kialakult homodimer, avagy két különböző monomerből keletkező heterodimer.

harmadlagos szerkezet

d negyedleges szerkezet

1-1. ábra. A fehérjék szerkezetének négy szintje

A M IN O SAVA K

Fehérjealkotó aminosavak A fehérjéket a karboxilesöpört melletti, a-szénatomon aminocsoportot tartalmazó a-aminosavak alkot­ ják. Az emberi szervezet fehérjéit alkotó 20 aminosavat az 1-2. ábrán mutatjuk be. (A szelenociszteint, az­ az a Sec megjelöléssel és U betűvel rövidített szelén­ tartalmú ciszteinanalóg aminosavat szokták a 21. fe­ hérjealkotó aminosavnak is nevezni; lásd még a 9. és 15. fejezetben.) Az aminosavak közös szerkezeti elemei, az a-amino- és a-karboxil-csoportok a későbbiekben ismerte­ tett módon, víz kilépésével, egymással peptidkötést képeznek. A peptidkötések a fehérjék szerkezetének alapvázát teremtik meg. A fehérjék szerkezetének, tu­ lajdonságainak és funkciójának egyediségét azonban az adott fehérjét felépítő aminosavak oldalláncai hatá­ rozzák meg. Az oldalláncok közül a cisztein S H cso­ portjainak oxidációjával diszulfidhidakat tud képezni. E diszulfidhidak stabilizálják az endoplazmás retikulumban, a Golgi-rendszerben megtalálható, illetve a sejten kívüli oxidatív térben elhelyezkedő fehérjék szerkezetét. Hasonlóan, a fehérjeszerkezetet merevítő hatása van a prolinnak, amely gyűrűs szerkezete miatt a polipeptidlánc forgási képességét erőteljesen csök­ kenteni képes. Ezzel ellentétben, a legegyszerűbb aminosav, a glicin csupán egy protont és egy elektront tartalmazó, igen kis oldallánca miatt hajlékonnyá teszi az őt tartalmazó fehérjerészletet. Az aminosavak közül egyedül a hisztidin rendelke­ zik olyan funkciós csoporttal, amely a fiziológiás pH közelében disszociál, így protondonorként és protonakceptorként egyaránt képes működni. Emiatt a hiszti­ dint igen gyakran találjuk olyan enzimek (pl. szerin-

5

1. A F E H É R J É K S Z E R K E Z E T E

co o -

COO-

COO1 h 3n - C - H r-l— ch3

COOX 1 -o i

0

+ I

alanin (Alá, A)

glicin (Gly, G)

I

+

H,N —C — H 3 I CH c h 3xc h 3 valin (Val, V)

COOCOO1 -C - H

I

X 1 o1

h 3n

-

ch9

1 z CH, 1 2 S

ch2

1 CH c h 3nc h 3

co o + I H,N —C — H

r---1------H —C — CH, I 3 CH, I 2 ch3

ch3

metionin (Met, M)

leucin (Len, L)

fenilalanin (Phe, F)

tirozin (Tyr, Y)

aromás gyűrűt tartalmazó oldalláncok co o + I H,N - C - H

izoleucin

(He, I)

1 i-O -

COO'

i

I

COO'

C

+ I 3 -1-----

-I-

H,N —C — H

H -C -O H

co o + I H,N —C — H

3 -F—

ch2

I

CH, treonin (Thr, T)

szerin (Ser, S)

SH cisztein (Cys, C)

2

1

2

- - I ---------------------

CH,

2

1

C — NH \ CH

2

NH

CH, 1

-- C - H

CH,

CH, 1

h 3n

2

CH,

ch9

co o -

i1

CH, 1

1

co o -

fr— I-------~ i-----------------

X

I

hidrofób, apoláris oldalláncok

triptofán (Trp, W)

2

1

ch2

c

1

+

=

//

nh2

C— N H

1

nh2

+n h 3 lizin (Lys, K)

arginin (Arg, R)

hisztidin (His, H)

pozitív töltést tartalmazó oldalláncok

co o -

co o 1 h 3n - c - h

COO-

+

aszparagin (Asn, N)

/

h 2n

o

glutamin (Gin, Q)

hidrofil, poláris oldalláncok

I

CM

(Pro, P)

o

-

X

prolin

/ ^

h 2n

h 3n

1

C

-C H ,

ch9 1 z c

X

CH,

CH,

COO-

-o- -o-

k "

* I H,N —C — H r 5----- 1---ch9

+

cooI

H N —C —H

3

-----

ch2 ch9

coo-

COO-

aszparaginsav (Asp, D)

glutaminsav (Glu, E)

negatív töltést tartalmazó oldalláncok

1-2. ábra. A fehérjealkotó aminosavak

proteázok) katalitikus helyén, amelyek protonátmcnettel járó reakciókat (pl. hidrolízis) katalizálnak. A különböző fehérjék működését a sejtben különféle poszttranszlációs módosítások is szabályozzák, azaz olyan folyamatok, amelyekben a fehérjébe már be­ épült aminosav kémiai szerkezete pl. enzimhatás kö­ vetkezményeképpen megváltozik. A poszttranszlá­ ciós módosítások gyakori példái a szerin-, treonin- és tirozin-oldalláncok foszforilációja vagy a lizin acetilációja, amelyek szabályozó folyamatok szerkezeti alapját képezik.

Az oldalláncok polaritása döntő módon járni hozzá a globuláris fehérjék háromdimenziós szerkezetének kialakításához. Oldalláncaik szerint az aminosavak polárosak (pl. a fiziológiás pH-n az oldalláncában is töltéssel bíró glutaminsav vagy lizin, illetve az oldal­ láncában töltéssel nem rendelkező, de poláros szerin vagy glutamin) vagy apolárosak (pl. valin, izoleucin) lehetnek. A poláros oldalláncú aminosavak vizes kö­ zegben általában a fehérjék felszínén, az apoláros ol­ dalláncú aminosavak pedig a fehérjék belsejében he­ lyezkednek el. A fehérjealkotó aminosavak (a glicin

6

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó I A

kivételével, amely optikailag nem ak­ tív) L optikai konfigurációval bírnak. A fehérjék optikai aktivitása azonban nem annyira az aminosavaikból, ha­ nem a szimmetriasíkkal nem rendel­ kező szerkezeti elemeikből (így pl. a későbbiekben tárgyalt, jobbmenetes a-hélixből) ered.

’ +\ + H,N -

C n O'

R

R, O

3

1 Ncr H

R

N

I

H

.2 I2 " I ■ i] i 1 f\ H ( 1 H

O

> H^N — C - f c j - N - j - C — C

v

+ H„0

peptidkötes

o\ 11 R/ Cí Q ®n / R 7I H

peptidkötés delokalizációja 1-3. ábra. A peptidkötés.

0

Nem fehérjealkotó aminosavak

-...

'II ' C^ 4 /

H

R2 H .. \ / '\C

cu.-. . \

H-.

I'

N,

. II o •"

R

O -...

II

2.0 'C u

■/

H

r-

--_ \

R,

N I H

A fehéij ealkotó 20 aminosav mel­ 1-4. ábra. A peptidkötés melletti kötésszögpárok. A peptidkötésben a röntlett számos olyan, biológiailag fontos genkrisztallográfiával mért C-N távolság 1,32 Á, ami az egyes (1,49 Á) és a kettős kötés (1,27 Á) C-N távolsága között van, s ez egybecseng azzal, hogy a peptid­ aminosavat ismerünk, amelyek nem kötés körül az elfordulás korlátozott fordulnak elő fehérjékben. Ilyen például a koenzim-A részét a-szénatoinjához kapcsolódó két szigma kötés mentén képező (3-alanin (NEE-CFE-CEE-COOH), az ingerü­ lehetséges a forgás. így e szigma kötések mentén kü­ letátvitelben fontos szerepet betöltő gamma-aminolönböző, (|)-vel és v[/-vel jelölt kötésszögek jöhetnek vajsav (GABA), vagy az ureaciklusban szerepet játszó létre (1-4. ábra). omitin és citrullin. A fehérjealkotó aminosavak dekarAz 1-4. ábrán bemutatott, 4>-vel és vp-vel jelölt boxileződésével biológiailag igen hatékony biogén szögpárok azonban nem akármilyen értékeket vehet­ aminok jönnek létre, mint pl. a hisztidinből keletkező nek fel, ugyanis bizonyos szögpárértékek esetén a két hisztamin. A tirozinból több szintetikus lépéssel szá­ szomszédos aminosav között térbeli gátlás jön létre. mos ingerületátvivő katekolamin, így a dopamin, a A fehérjékben gyakran előforduló szögpárértékeket az noradrenalin és az adrenalin szintetizálódik, tripto1-5. ábrán bemutatott Ramachandran-diagram foglalfánból pedig egy másik neurotranszmitter, a szerotonin keletkezik. Ezekkel, a speciális funkciót ellátó aminosavakkal és aminosavszármazékokkal a könyv további fejezeteiben ismerkedünk meg. + 180 p-redős lemez

120

1.3

(

A PE P T ID K Ö T É S , PE PTID EK

A peptidkötés (1-3. ábra) az aminosavak a-karboxil-csoportjából és a-amino-csoportjából vízkilé­ péssel keletkező szekunder savamidkötés. A peptid­ kötés a karboni le söpört jr-elektronjainak és a nitrogén nem-kötő elektronpárjának a delokalizálódása miatt planáris, merev szerkezetű. A peptidkötés szigma-) kötéseinek szöge a delokalizáció miatt fellépő sp~ hib­ ridállapot következtében 120°-os. A peptidkötés körül a delokalizált elektronpárok miatt nincsen forgás. Ugyanakkor két peptidkötés között lévő aminosav

a-helix

-120

-

-180 -180

T 0

+ 180

O-szög

1-5. ábra. A Ramachandran-diagram. A fehér területre eső szögpárok szerkezetben csak ritkán fordulnak elő

7

1 . A FEHÉRJÉK S Z E R K E Z E T E

ja össze. A Ramachandran-diagram gyakori szögpárértékei a fehérjékben előforduló másodlagos szerke­ zeti elemeket jelölik (1-5. ábra). E másodlagos szer­ kezeti elemek részletes leírását az 1.4. alfejezet alatt adjuk meg.

1-6. ábra. A prolin melletti cisz/transz peptidkötés

f preproinzulin

B-lánc

v f proinzulin

A peptidkötés /ra«sz-konformációjú. Ez alól az egyedüli kivétel, a prolin aminosav gyűrűs iminocsoportja melletti peptidkötés, amely cisz állapotban is lehet (1-6. ábra). A prolin melletti peptidkötés izomerizációját segítő sejtbeli enzimatikus mechaniz­ musok bemutatására a fejezet végén kerül sor. A fehérjék szintézise során az elsőnek beépülő aminosav a-amino-csoportja (N-terminális) és az utol­ sónak beépülő aminosav a-karboxil-csoportja (C-terminális) marad csak szabadon. A fehérjék és a peptidek szerkezetét ennek megfelelően balról jobbra, az N-terminális felől a C-terminális irányába írjuk fel, azaz egy PETERPAL képletü oktapeptid prolint tar­ talmaz az N-terminálisán és leucint a C-terminálisán. Ezen oktapeptid neve: prolil-glutamil-treonil-glutamil-arginil-prolil-alanil-leucin. A háromnál több ami-

1-7. ábra. Az inzulin, az oxitocin, a vazopresszin és a proopiomelanokortin (POMC) peptidcsalád vázlatos szerkezete. ACTH, adrenokortikotrop hormon; (3-LPH, p-lipotropin; a-MSH, a-melanocita-stimuláló hormon; CLIP, corticotropin-like intermediate peptide; y-LPH, y-lipotropin. Az inzulinról az anyagcsere tárgyalása­ kor, a POMC-ból keletkező egyéb peptidekről a 21. fejezetben szólunk

8 3 H—Cys —Tyr— Phe —Glu —Asn —Cys— Pro —Arg —Gly— NH,

I

I

S ------------------------------------------------------- S

humán vazopresszin (Arg -vazopresszin, AVP)

ACTH (1-39)

P-LPH (42-134)

a-MSH

CLIP

y-lp h

(1-13)

(18-39)

(42-101)

fi-endorfin (104-134)

(3-MSH

Y-endorfin

(84-101)

(104-118) a-endorfin (104-117)

az inzulin kialakulása

a pro-opiomelanokortin (POMC) prekurzorból keletkező peptidek

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

8

nosavból felépülő peptidek a oligopeptidek (típuso­ sán 12-20 aminosavból állnak), a néhány tucat aminosav alkotta peptidek a polipeptidek, az 50-nél több aminosavból állókat pedig fehérjéknek (proteinek) nevezzük. Ezek a megkülönböztetések nem egzakt, hanem körülbelüli méretek alapján történnek. A biológiailag fontos peptidek közül az inzulin, az oxitocin, a vazopresszin és a pro-opiomelanokortin peptidcsalád vázlatos szerkezetét tartalmazza az 1-7. ábra. A biológiailag hatékony peptidek, peptidhormonok szintézise igen gyakran egy prekurzor számos egymást követő proteolitikus hasításával megy végbe (lásd pl. pro-opiomelanokortinok, inzulin és az 1-7. ábrán nem bemutatott glukagon). A peptidhormonokban igen gyakran találunk diszulfidhidakat (pl. inzu­ lin, oxitocin, vazopresszin, 1-7. ábra). A diszulfidhidak gyakoriságának két fő oka van. Egyrészt a kismé­ retű peptidek önmagukban csak ritkán képesek stabil szerkezetet kialakítani, ezért szükségük van a diszulfidhidak stabilizáló erejére. Másrészt e peptidek hatás­ módjukat igen gyakran a sejten kívüli térben fejtik ki, amely a sejt belsejével szemben oxidáló, így kedvez a diszulfidhidak kialakulásának és fennmaradásának. Más biológiailag aktív peptidek (pl. az antibiotikum hatású bacitracin, gramicidin és valinomicin) ciklizálódással vagy (pl. az immunszuppresszív ciklosporin esetén) néhány peptidkötésük nitrogénjének metilezésével növelik meg szerkezeti stabilitásukat.

1.4

A F E H É R JÉK M Á S O D L A G O S S Z E R K E Z E T I ELEMEI

a-hélix Az a-hélixet alkotó, a primer struktúrában egymás melletti aminosavak jobbmenetes (az óramutató járá­ sával megegyező) hélixben csavarodnak fel (1-8. áb­ ra). A jobbmenetesség a fehérjealkotó aminosavak Lkonfigurációjából következik, ugyanis a balmenetes a-helikális struktúrában az L-aminosavak oldalláncai a közelükben lévő peptidkötések karbonilcsoportjaival átfedésbe kerülnének. Az a-hélix tipikus hossza 15-25 aminosav. (Ennél azonban kisebb és nagyobb hélixek is előfordulnak.) Az a-hélixek egy menetében 3,6 aminosav található, így az a-hélixben minden he­ tedik aminosav van kb. egymás fölött. Az a-hélixeket a hélix tengelyével párhuzamos, a peptidkötések karbonilcsoportjai és N-H csoportjai között kialakuló hidrogénhídkötések stabilizálják. Az a-hélixek belse­ jében csak nagyon kevés hely van. Emiatt az aminosav-oldalláncok mindegyike az a-hélix külsején, kör­ körösen kifelé helyezkedik el. Az aminosav-oldalláncok a hélix gerincét képező peptidkötéseket eltakar­ ják. Az a-hélixek dipólusok, N-terminális régiójuk kb. +0,5, C-terminálisuk pedig -0,5 töltéssel rendelkezik. Az a-hélixeket egyszerűsített formában sokszor hen­ gerként is ábrázolják. Bizonyos aminosavak, mint pél-

u-hélix

1-8. ábra. A fehérjék másodlagos szerkezeti elemei, a-hélix, p-redős lemez és p-hajtű

9

1. A F E H É R J É K S Z E R K E Z E T E

dául a prolin, „hélixtörők”, azaz a-hélixekben nem fordulnak elő. Ezek az aminosavak az a-szénatom melletti o-kötések forgási szögeit az a-hélix szerkeze­ tével nem összeférhető pozícióban rögzítik.

A P-hajtüben a polipeptidlánc megfordul, emiatt ilyen szerkezeti elemek igen gyakran a fehérjemolekula külső részén fordulnak elő. A fehérjefelszínen megje­ lenő P-hajtü-részletek részt vehetnek a fehérjemoleku­ lák egymáshoz kötésében.

(1-redös lemez

Rendezetlen szerkezetű fehérjeszakaszok A P-redős lemez szerkezetet cikk-cakkos struktúrá­ ra emlékeztető, nyújtott egyedi peptidláncok, p-redők alkotják (1-8. és 1-1/b ábra). A egyedi p-redőket rájuk merőleges, a peptidkötések karbonilcsoportjai és N-H csoportjai között kialakuló hidrogénhídkötések stabi­ lizálják. Több, hidrogénhídkötéssel összekötött P-redő p-redős lemezszerkezetet alkot. Az egyedi P-redő­ ket sokszor az N-terminális aminosavuktól a C-terminális aminosavuk felé mutató vastag nyíllal szokták ábrázolni. A p-redők a P-redős lemezben N- és C-terminális aminosavaik elhelyezkedése szerint vagy egy­ mással párhuzamos (parallel), vagy egymással ellen­ tétes (antiparallel) állásban vannak. A parallel P-redős lemez egymást követő p-redőit hosszú aminosavszakaszok kötik össze. Ezek az összekötő szakaszok sokszor a P-redős lemez síkja felett és/vagy alatt elhe­ lyezkedő a-hélixeket alkotnak. Az antiparallel P-redős lemez egymást követő P-redőit rövid szakaszok kötik össze. Ezek a szakaszok sokszor P-hajtü struktúrát ké­ peznek (lásd alább). A P-redős lemez belsejében igen kevés hely van. Emiatt a P-redős lemez aminosav-oldalláncai vagy a lemez felett, vagy a lemez alatt, a le­ mez síkjából kiállva helyezkednek el. A p-redős le­ mezstruktúra lapszerü képződményt alkot. A lap a fe­ hérjeszerkezetekben hajlott állapotban, sőt, akár hen­ gerpalástot képezve is előfordulhat. Több p-redős le­ mez egymáshoz illeszkedésével alakul ki a P-amiloid struktúra, amely a neurodegeneratív betegségekben (így az Alzheimer- és Parkinson-kórban) előforduló fehérjezárványok szerkezetét alkotja.

fj-hajtű A p-hajtü (vagy P-görbület, P-kanyar, P-turn) struktúrát négy aminosav képezheti, s az aminosavak közötti hidrogénhídkötés tart össze (1-8. ábra).

A fehérjékben másodlagos szerkezettel nem ren­ delkező, rendezetlen szerkezetű (random coil, disordered, unstmctured) szakaszok is előfordulhat­ nak. Ezek a szakaszok vagy rövid, a másodlagos szer­ kezetű szakaszokat összekötő peptidláncrészletek, vagy a fehérje nagyobb részére (néha közel egészére) kiterjedő struktúrák. A rendezetlen fehérjeszakasz fle­ xibilitása az őket hordozó fehérjét alkalmassá teszi ar­ ra, hogy sokfajta más molekulához (pl. fehérjéhez) tudjon kötődni. így ugyanaz a fehérje többféle sejtes funkciót is elláthat. A kötődés során sokszor a rende­ zetlen szakaszok rendeződése zajlik le. A rendezetlen szakaszok enzimatikus módosításával (így pl. szerin, trconin vagy tirozin aminosavakon történő foszforilálásával) e fehérjeszakaszok rendeződésének a mér­ téke, kötődésük specificitása és erőssége, és így az adott fehérje funkciói jól szabályozhatók. A nagyobb rendezetlen szakaszokkal bíró fehérjék elsősorban az emberi szervezet sejtjeire jellemzőek, ahol a sejtes (pl. jelátviteli) folyamatok komplexitását növelik.

1.5

A FE H É R J ED O M É N E K

A fehérjedomének olyan, a másodlagos fehérje­ szerkezeti elemeknél nagyobb (azokat általában tartal­ mazó), de a teljes polipeptidlánc által alkotott szerke­ zetnél általában kisebb fehérjeszerkezeti egységek, amelyek meghatározott funkciókat hordoznak, és szerkezetük viszonylag jól konzerválódott az evolúció során. így például beszélhetünk nukleotidkötő, kináz-, illetve foszfatázdoménekről. Egy fehérjemolekulában több dómén is előfordul­ hat. Egymástól nagymértékben különböző funkciójú fehérjékben igen gyakran hasonló (és hasonló rész­ funkciókat betöltő) domének fordulnak elő. Ennek az

10

az oka, hogy a fehérjék harmadlagos szerkezetének igen erős szerkezeti kötöttségei miatt a természet a konformációs térnek csak megdöbbentően kis száza­ lékát tudja kihasználni. Emiatt meglepően kevés, csu­ pán néhány száz, gyakran előforduló fehérjedomén szerkezettel rendelkezünk. Ezek a földi élet megőrzés­ re érdemes nagy kincsei. A sejt tehát „nem pazarol”. Ha már egyszer „rájött” arra, hogy milyen fehérje­

I . A F E H É R ) É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

domén a legalkalmasabb arra, hogy pl. a fehérjét az aktinszálakhoz hozzákösse, akkor ugyanezt a domént alkalmazza akkor, ha egy a sejtmetabolizmusban és akkor is, ha egy, a jelátvitelben használatos enzimet kell az aktinhoz hozzákötnie. A fehérjedoméneket kódoló génszakaszok gyakran együtt cserélődnek, vándorolnak a különböző gének között az evolúció során.

1-9. ábra. EF-kéz (a), cinkujj (b) és leucincipzár (c, d). Az EF-kéz E és F a-hélixei közötti zsebének aszparaginsav- és glutaminsav-oldalláncai kalciumionnal képeznek komplexet; a cinkujj ciszteinjeinek SH-csoportjai és hisztidinjei imidazolgyűrüinek nitrogénjei cink­ ionok kötőhelyeként szolgálnak; (c) a leucincipzár barna körökkel jelölt, egy egyenes mentén elhelyezkedő, „ragadós", hidrofób leucinjai pedig egymáshoz kötődve fehérjék egymáshoz való kötődését segítik elő. (d) A leucincipzár fehérjék DNS-kötő doménja két polipeptidláncból áll. Ezek a leucincipzáron keresztül dimerizálódnak, a leucinoldalláncok közti hidrofób kapcsolat tartja őket össze (kék színnel jelölve). Ezt követi közvetlenül egy pozitív töltésű aminosavakban (lizin, arginin) gazdag régió, mely a DNS-hez kötődik (zöld színnel jelölve)

1. A F E H É R J É K S Z E R K E Z E T E

11

A különböző domének igen gyakran csak egy vé­ zárszerüen, sorozatosan egymáshoz képes kapcsolód­ kony, strukturálatlan fehérjeszakasszal kötődnek egy­ ni (1-9/d ábra). A dimer struktúra, a cinkujjhoz hason­ máshoz, amely biztosítja egymástól többé-kevésbé lóan, szintén DNS-kötő fehérjeszerkezetet képez. független konformációváltásukat. A strukturálatlan Leucincipzárt tartalmaznak pl. a Fos és Jun transzkrip­ ciós faktorok, amelyek ezekkel a struktúrákkal DNSösszekötő szakaszok miatt az egyes fehérjedomének limitált proteolízissel egymástól elkülöníthetők. (En­ kötődésre képes homo- és heterodimereket képezhet­ nek. nek a szelektivitásnak az az oka, hogy a proteáz enzi­ mek jobban hozzáférnek az összekötő szakaszok sza­ Az 1-10. ábrán az inzulinreceptor vázlatos doménbadon hagyott peptidkötéseihez, mint a domének bel­ szerkezetét mutatjuk be. Az ábra felső részén, az extsejében lévő másodlagos szerkezeti elemek aminoracelluláris térben a receptor diszulfidhidakkal dimert sav-oldalláncai által és a globuláris struktúra rende­ képező a-láncaiban található inzulinkötő doméneket zettsége által egyaránt eltakart peptidkötésekhez.) tüntettük fel. Az ábra alsó részén, a citoplazmában a A fehérjedomének egyik példája a két a-hélixből receptor P-láncaiban található tirozin-kináz-domének találhatók. Amikor az inzulin az a-láncok inzulinkötő alkotott kalciumkötő „EF-kéz” (1-9/a ábra), ahol a doménjeihez kötődik, a receptor olyan konformációs kalciumionnal a két hélix találkozásánál elhelyezkedő glutaminsav és aszparaginsav-oldalláncok karboxilváltozáson megy keresztül, amely aktiválja a P-láncaiban található tirozin-kináz-doméneket. Az inzulin csoportjai képeznek komplexet. (A kialakuló komplex hasonló az általános kémiai komplexometriás bírálá­ receptor funkciójának részletes ismertetésére a 17. fe­ jezetben visszatérünk. sok EDTA-komplexéhez.) EF-kéz szerkezet például a kalciumfüggő jelátvitelben részt vevő kalmodulin fehérjében fordul elő. A fehérjedomének másik példája a négy cisztein- és/vagy hisztidinoldalligandkötő lánccal komplexet képző cinkionnal sta­ domének bilizált „cinkujj”, amely a fehérjék a-lánc DNS-hez, illetve (úgynevezett LIMdoménként) foszfotirozinokhoz való kö­ tésében vesz részt (1-9/b ábra). A cinkujj ujjszerü részét alkotó két aminosavlánc akár 20-30 aminosavat is tartalmazhat, amelyek a-hélixeket formálhatnak. Cinkujj szerkezetek találhatóak pl. a szteroidhormon-receptorokban, amelyek transzmembrándomén cinkujj részletekkel kötődnek a DNShez. membrán p-lánc A „leucincipzárt” két, hidrofób fel­ színnel rendelkező a-hélix alkotja (1-9/c ábra). A hélixekben minden hetedik aminosav leucin, így a hélixek egy hidrofób „szalagot” tartalmaznak az oldalukon. Vizes közegben a hidrofób részek nem stabilak, és csak egymással összetapadva 1-10. ábra. Az inzulinreceptor-domén szerkezete Az inzulinkötő régiót az a-alegységek három-három doménje alkotja. Engedéllyel átvéve: De képesek stabilizálódni. Emiatt, ha két Meyts P, Whittaker J. Structural biology of insulin and IGF1 receptors: leucincipzár kezdő leucinjai közel kerül­ implications fór drug design. Nat Rév Drug Discov. 2002; 1(10):769-83 Box/1/b ábra nek egymáshoz, akkor a többi leucin cip-

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

12

1 .6

A FEH ÉRJÉK HARM ADLAGOS SZERKEZETE

A fehérjék harmadlagos szerkezetének egyik leg­ fontosabb tulajdonságát az a vizes közeg határozza meg, amelyben a fehérjék döntő többsége létezik. A víz igen stabil, hidrogénhidas szerkezete kiszorítja magából a hidrofób aminosav-oldalláncokat, így azok a fehérje belsejében helyezkednek el, a fehérje pedig az olajcsepphez hasonlóan gömb alakú, globuláris szerkezetet vesz fel. A fehérje felszínén a hidrofil, il­ letve töltött aminosav-oldalláncok találhatóak. Amennyiben két fehérje felszínére hidrofób oldallánc kerül (például a fehérje szerkezetének sérülése vagy a fehérje későbbiekben tárgyalt denaturációja során), ezek egymással való kölcsönhatással tudják csökken­ teni a víz hidrogénhidas szerkezetét megbontó, desta­ bilizáló hatást. A hidrofób fehérjefelszínek összetapa­ dását a fehérjék aggregációjának nevezzük. A sejten belül a denaturáció, a hidrofób felszínek megjelenése és nem specifikus kölcsönhatásai funkciózavarhoz ve­ zetnek, emiatt a sejtben számos, a későbbiekben tár­ gyalt mechanizmus alakult ki a fehérjék natív konfor­ mációjának védelmére és helyreállítására. E fenti sza­ bályok alól vannak kivételek is: pl. a membránfehér­ jékben hidrofób aminosav-oldalláncok éppen, hogy „kifelé”, a hidrofób lipidréteg felé orientálódnak. A fehérjék harmadlagos szerkezetének a másik leg­ fontosabb tulajdonsága az, hogy a fehérjék belsejében nagyon kevés „üres” hely van. A térkitöltés 75%-os, ami csaknem akkora, mint a szerves kristályokban mért 80%, és sokkal nagyobb, mint a szerves folyadé­ kok esetén tapasztalt 44%. A szoros illeszkedést csak nagyon egyedi szerkezetek képesek megvalósítani, hi­ szen, ha pl. két egymás mellett lévő a-hélix egyikében glicinoldallánc van, a másikában pedig triptofán, ak­ kor nem lehet a glicint nagyméretű, a triptofánt meg kisméretű oldalláncra cserélni, hiszen így „lyuk” jön­ ne létre a fehérje belsejében. A „lyukba” vízmoleku­ lák kerülnének, azok pedig a hidrofób belső közeget instabilizálnák. Emiatt a fehérjék belsejében a mutáci­ ós szabadság kicsi, azaz a fehérjék belsejében elhe­ lyezkedő aminosavak kevésbé változnak meg az evo­ lúció során, mint a fehérjék külsején levők.

1 .7

A FEH ÉRJÉK SZER KEZETÉT K IA L A K ÍT Ó ÉS ST A B ILIZ Á LÓ ERŐ K

A fehérjék létrejöttének elengedhetetlen feltétele a korábban tárgyalt peptidkötések kialakulása. Azon­ ban, ha a fehérjéket csak a peptidkötések tartanák össze, akkor egy fehérjének számtalan konformációja egyaránt stabil volna. A fehérjék natív konformáció­ ját, amely a legtöbb fehérje esetén az egyedül aktív forma, így a peptidkötésen kívül számos más kötés, erő stabilizálja. Ezek közül a legnagyobb energiával a diszulfidhídkötés bír, amely két cisztein aminosav-oldallánc SH-csoportja közötti, enyhe oxidációjá­ val létrejövő kovalens kötés. A diszulfidhidak a sejt reduktív belső közegében nem stabilak. Emiatt stabil diszulfidhidak csak a sejten kívüli térben, illetve a sej­ ten kivüli térbe való kilépésre a fehérjéket „felkészítő” endoplazmás retikulum és Golgi-rendszer oxidativ belső terében találhatóak. Az egyedi kötések közül a hidrogénhídkötés erős­ sége átmenetet képez a kovalens és egyéb másodlagos kötések kötéserőssége között. Az a-hélixeket és a P-redős lemezeket stabilizáló, peptidkötésekből szár­ mazó hidrogénhídkötések mellett az aminosav-oldal­ láncok (pl. szerin, treonin -OH-csoportok, aszparaginsav, glutaminsav karboxilcsoportjai, hisztidin imidazolgyürű nitrogénjei, lizin aminocsoportja stb.) is képesek hidrogénhídkötések kialakítására, amelyek mind fontos szerepet töltenek be a fehérjék harmadla­ gos és negyedleges szerkezetének kialakításában. A sejtjeinkben, szervezetünkben előforduló semle­ ges pH-n a savas aminosav-oldalláncokról (pl. aszparaginsav, glutaminsav) a proton disszociál, így azok negatív töltésüek. A bázisos oldalláncokhoz (pl. arginin, lizin) proton asszociál, így azok pozitív töltéssel rendelkeznek. Ha pozitív és negatív töltések egymás­ hoz a térben közel kerülnek, akkor úgynevezett sóhidak, vagy más néven sókötések alakulnak ki. Ezek képződéséből jelentős energianyereség szárma­ zik. Ha nem egy teljes töltés alakul ki a fehérjemole­ kulán belül, hanem a különböző elektronegativitású atomok miatt elektroneltolódás megy végbe, és ennek következtében résztöltések keletkeznek, az ellentétes résztöltések párosodása is energianyereséggel jár.

13

1 . A FEHÉRJÉK SZ E R K E Z E T E

A résztöltések kialakulása révén keletkező dipólusok közötti Coulomb vonzóerőket másodlagos kötőerők­ nek, vagy van dér Waals-erőknek nevezzük. (A van dér Waals-erők közül a két dipólus között létrejövő Debye-erők, illetve az egy dipólus és az általa indukált másik dipólus között létrejövő Keesom-erők erőseb­ bek.) A fehérje hidrofób belsejében többnyire a mole­ kulák belső rezgéséből átmenetileg kialakuló tranzi­ ens dipólusok közötti, úgynevezett London-erők hat­ nak, amelyek a kialakult dipólusok vagy indukált di­ pólusok között ható van dér Waals-erőknél kisebbek. A fehérjék szerkezetének kialakításában fontos szerepet játszanak a hidrofób kölcsönhatások. Aho­ gyan korábban tárgyalásra került, a globuláris fehér­ jék vizes oldatában a hidrofób aminosav-oldalláncok a fehérje belsejében találhatók, a hidrofil oldalláncok pedig a fehérje felszínén helyezkednek el. Az 1970-es évekig úgy gondolták, hogy ezt az általánosan jellem­ ző elrendeződést a hidrofób oldal láncok van dér Waals-féle vonzása stabilizálja. Később jöttek csak rá arra, hogy a hidrofób kölcsönhatások mértéke jóval meghaladja azt a szintet, ami pusztán a van dér Waals-kötőerők hatásával megmagyarázható lenne. Kiderült, hogy a globuláris fehérjék harmadlagos szerkezetének stabilitását egy, a fehérjéktől független tényező, a víz szerkezete biztosítja. A víz sok szem­ pontból szinte „kvázikristályos” anyagként viselkedik a benne található nagyszámú, térhálós hidrogénhídkötést stabilizáló hatása miatt. Könnyen belátható, hogy e hidrogénhídkötéses szerkezet jelentős meg­ bomlása nagy energiaveszteséggel jár. Hidrofób anya­ gok képtelenek a vízmolekulákkal hidrogénhidkötéseket létesíteni, így a víz/hidrofób határfelületen a víz hidrogénhidas szerkezete megtörik. Emiatt a jelentős energiaveszteséggel járó szerkezettorzulás miatt a víz igyekszik a hidrofób anyagokat a lehető legkisebb tér­ fogatra összeszorítani (gondoljunk pl. a vízen úszó olajcseppre), hogy ezáltal minimalizálja az érintkező felületet. így már könnyen érthető, hogy nem a fehér­ jemolekula hidrofób magjának a saját magára gyako­ rolt vonzó ereje, hanem a fehérjét körülvevő víz hidro­ génhidas szerkezetének lehető legteljesebb megőrzése az a hajtóerő, amely a fehérjék „bent hidrofób, kint hidrofil” harmadlagos szerkezetét stabilizálja. A fenti­ ekből egyszersmind az is következik, hogy a fehérjék

alakjára az őket körülvevő közeg viszonylag kis válto­ zásai is igen nagy hatással lehetnek. Ebből követke­ zik, hogy a külső közeg változásai a fehérjék denaturációjának igen fontos okai. A fehérjék szerkezetének kialakításában és megőr­ zésében a legnagyobb szerepet a hidrofób és a van dér Waals-erők játsszák. A fehérjemolekulákon belüli hidrogénhídkötések hatása számottevő (egy aminosavra átlagosan 0,75 hidrogénhídkötés esik), míg az egyenként nagy energiát képviselő sókötések és diszulfídhidak összességükben (csekély számuk miatt) csak kevéssé járulnak hozzá a fehérjeszerkezet kiala­ kulásához.

1 .8

A FEH ÉRJÉK D EN A TU R Á C IÓ JA

A legtöbb fehérje csak egyetlen kitüntetett szerke­ zeti állapotban, a natív szerkezetben stabil. Különböző környezeti behatásokra a natív szerkezet felbomolhat, amelyet a fehérje denaturációjának nevezünk. A fe­ hérjék denaturációja lehet reverzibilis és irreverzibi­ lis. A denaturáció visszafordíthatósága függ a fehérje fajtájától és a környezeti változás mértékétől. így a denaturációfajták „reverzibilis” és „irreverzibilis” osztályokra való felosztása csak általános útmutatás­ ként szolgál az adott denaturációfajta hatására.

Fehérjék reverzibilis denaturációja Reverzibilis denaturáció például kisózással jöhet létre. A kisózás során a fehérjeoldat sókoncentrációját a fiziológiás sókoncentráció sokszorosára (pl. több mólosra) növeljük. Azonos fehérjék ugyanabban az oldatban ugyanolyan töltéssel rendelkeznek, azaz ta­ szítják egymást. A nagy sótartalom a Coulomb-crők hatótávolságát lecsökkenti, így a fehérjék szerkezetét stabilizáló sóhidak megszűnnek, ami megbontja a fehéijék szerkezetét. A fehérjék közötti taszítóerők is le­ csökkennek, ami tovább kedvez a fehérjék felszínre kerülő hidrofób részei összetapadásának, azaz a fehér­ jék aggregációjának, kicsapódásának. Az oldószer­ csere során az eredetileg vizes közeget szerves oldó­

14

szerre (például alkoholra) cseréljük le. A fehérjét kö­ rülvevő közeg így egyre inkább a fehérje belsejében lévő hidrofób részeket kezdi kedvelni, azaz a fehérje mintegy „kifordul”, és az addig belül lévő aminosav-oldalláncai kifelé, a kívül lévők pedig befelé töre­ kednek. Az SH-reagensek szulfhidrilcsoportot tartal­ mazó molekulák. Jelenlétük a fehérjékben található diszulfidhidakat redukálja, és ezzel szerkezetstabilizá­ ló hatásukat megszünteti.

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

zsírsavmolekulák is. A detergens molekulák hidrofób részei befúródnak a fehérje hidrofób magjába, a hidro­ fil részeik pedig a fehérje-víz határfelületen segítik elő az oldódást. így a fehérje natív szerkezete felbom­ lik. Az ionos detergens molekulák töltései azonosak, ezek taszítják egymást, így az ionos detergensek még a nemionos detergenseknél is hatékonyabban bontják meg a fehérjék szerkezetét.

1 .9

Fehérjék irreverzibilis denaturációja Az irreverzibilis denaturáció leggyakoribb formája a hődenaturáció. A hődenaturációt alkalmazzuk a fő­ zés során, hogy az ételekben lévő fehérjék natív szer­ kezetét megbontsuk. Erre azért van szükség, mert a peptidkötéseket elbontó proteáz emésztő enzimek a natív szerkezetben nem fémek hozzá a peptidkötésekhez, hiszen a peptidkötések mind az a-hélix, mind pedig a (S-redős lemez szerkezetek belsejében, az aminosav-oldalláncok által takarva, védetten helyezked­ nek el. A hődenaturáció a peptidkötéseket a fehérje felszínére juttatja, és ezáltal a fehérjéket a proteázok számára hidrolizálhatóvá teszi. Extrém pH-változtatás is irreverzibilis denaturációt okozhat, hiszen egynemüvé teszi a fehérjék töltéssel rendelkező aminosav-oldalláncainak töltéseit. így az erősen savas kö­ zegben csak negatív, az erősen lúgos közegben pedig csak pozitív töltések keletkeznek, amelyek a fehérje különböző részeit eltaszítják egymástól, így a fehérjék szerkezetét megbontják. Az erősen savas közeg dena­ turáló hatását a gyomorban, az erősen lúgos közeg ál­ tal okozott denaturációt pedig a mosás során haszno­ sítjuk. A hidrogénhidas szerkezetet megbontó anya­ gok, így a peptidkötések egymással képzett hidrogénhídjainál erősebb hidrogénhidakat képző urea, illetve guanidin, valamint a kaotrop ionok [azaz a jodid(17-), a rodanid- vagy tiocianát (SCN -) és az azid (N3 -) ionok] szintén a fehérjék denaturációját okoz­ zák. A detergensek hosszú, hidrofób láncot és hidro­ fil vagy ionos, töltéssel rendelkező kisebb molekula­ részletet tartalmazó, amfipatikus vegyületek. Detergens jellegű anyagok vannak minden mosószerben, de ilyenek a szappanokban található, hosszú szénláncú

A FEH ÉRJÉK SZERKEZETÉNEK K I A L A K U L Á S A IN V I T R O KÖRÜLM ÉNYEK KÖZÖTT

In vitro körülmények között a fehérjék szerkezeté­ nek kialakulása viszonylag egyszerűen vizsgálható. A fehérjét először valamilyen reverzibilis behatással denaturáljuk, majd a denaturálószert eltávolítva, kü­ lönböző szerkezetvizsgálati eljárásokkal a fehérje szerkezetének kialakulását folyamatosan nyomon kö­ vetjük. A folyamat kiindulási állapota a rendezetlen fehérjemolekulák sokasága (ezeket az 1-11. ábrán csak egyetlen szerkezettel jelöltük). A folyamat vég­ pontja a funkcióval rendelkező fehérje egyetlen, natív állapota. A fehérjék harmadlagos szerkezetének kiala­ kulása nem egymásra épülő lépések egyenes láncola­ taként írható le, hanem egy olyan folyamat, amelyben számtalan zsákutca van. így a betekeredés során a na­ tív, alacsony energiájú szerkezetét kereső fehérjemo­ lekulának sok, különböző konformációjú változata egyidejűleg megtalálható (1-11. ábra). A szerkezet ki­ alakulása gyors lépésekkel indul, a folyamat lassú, sebességmeghatározó lépései a natívhoz közeli állapot kifejlődésére jellemzőek.

A fehérjeszerkezet kialakulásának első, gyors lépései A szerkezet kialakulásának első lépései során azok az egymás melletti aminosav-oldalláncok rendeződ­ nek össze, amelyek a-hélixek (kisebb mértékben (3-hajtűk) kialakítására képesek. Ennek az az oka, hogy (a) az egymás melletti aminosav-oldalláncok

15

1 . A FEHÉRJÉK S Z E R K E Z E T E

1-11. ábra. A fehérjeszerkezet kialakulásának lépései in vitro. Az ábrán a lizozim szerkezetének kialakulása látható. Más, a lizozimnál nagyobb fe­ hérjék kialakulása a bemutatottnál bonyolultabb utakat követ, és az ábrán jelölt 2 másodperccel szemben akár percekig, vagy órákig is eltarthat. A hengerek az a-hélix szerkezetet, a nyilak a p-redős szerkezetet jelzik, az utóbbiak a ? jellel jelölt szakaszokon jönnek létre. Az ábra értelmezéséhez lásd a szöveges leírást

| hidrofób kollapszus

I

produktum) reakció előrehaladtával enzim (E) jelenlét­

energia szerint különböző hőmérsékleteken (Maxwell-

A piros vonal a nem katalizált reakció lefolyá­ sát jelzi (S+ a tranzíciós állapot, AG+ az eléréséhez szükséges Gibbs-féle energiaváltozás). A kék vonal az enzim katalizálta re­ akció lefolyását jelzi (ESf az enzim-szubsztrát komplex tranzíci­ ós állapota, AG) ennek eléréséhez szükséges Gibbs-féle energiaváltozás)

Boltzmann-eloszlás). A kémiai átalakuláshoz szükséges tranzí­ ciós állapot elérésére csak egy kritikus kinetikai energiával ren­ delkező molekulák képesek, amelyet a piros függőleges vonal jelez

ében és anélkül.

23

2 . E N Z I M E K . K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

zötti átmenetben keletkező Gibbs-féle energiaváltozás az ún. aktiválási energiaváltozás, aminek van egy ent­ rópia- és egy entalpiakomponense (lásd bioenergetika fejezetet). A reakció sebessége arányos a tranzíciós ál­ lapotot elérő molekulák számával v & Sf , amely követi a Maxwell-Boltzmann-eloszlás változásait a hőmér­ séklet függvényében (2-2. ábra). Mivel a gyakorlat­ ban az S' általában ismeretlen, de az összes S moleku­ lák száma, illetve koncentrációja ismert, a reakcióse­ bességet ennek függvényében lehet kifejezni: v = k S, ahol k a sebességi állandó, amely az S r és S közötti ará­ nyosságot fejezi ki. Történelmileg először empirikus adatok alapján Arrhenius írta le a kvantitatív össze­ függést az aktiválási energia és a sebességi állandó köEa

zött: k = Ce RT , ahol T az abszolút hőmérséklet, R a gázállandó, C a reakcióra jellemző állandó, Ej a reak­ cióra jellemző Arrhenius-féle aktiválási energia, ami magában foglalja az említett két termodinamikai para­ métert (aktiválási entrópia- és entalpiaváltozás). Min­ den katalizátor úgy emeli a k értékét, hogy csökkenti az aktiválási energiát, ahogy ezt a 2-1. ábra mutatja be E enzim esetében az ES komplexre vonatkozó AG) alakulásával. A AG'E kisebb értéke a AG -hez képest annak köszönhető, hogy az enzim stabilizálja a tranzí­ ciós állapotot az alapállapothoz képest. Azáltal, hogy megköti a szubsztrátmolekulákat és létrehozza az en­ zim-szubsztrát (ES) komplexet, az enzim kedvezően módosítja a Gibbs-féle energiaváltozás mind entrópiafüggő, mind entalpiafüggő összetevőjét. Először ve­ gyük szemügyre az entrópiakomponenst. A tranzíciós állapot kialakulásához a reagáló molekulák megfelelő konformációban és szögben rendeződnek, amit kedve­ zőtlen (negativ) entrópiaváltozás kísér. Másfelől a szabad, oldatban található szubsztrátmolekula entró­ piája nagyobb, mint az enzimhez kötött, fixált állapotú molekuláé. Tehát, ha az enzim már megkötötte a szubsztrátot, a továbbiakban a megkötött molekula re­ latíve kisebb entrópiaveszteséggel jut el a tranzíciós állapotba, mint a szabad molekulák. Ráadásul, míg ol­ datban kicsi a valószínűsége annak, hogy két moleku­ la a reakcióra legalkalmasabb felszínükkel közelíti meg egymást, addig az enzimhez fixált állapotban az optimális pozicionálás dominál. A kedvezőbb AGF alakulása enzim katalizálta reakciókban az entalpia-

változásnak is köszönhető. Az enzimhatás entalpiás komponense abból adódik, hogy az enzim erősebb kö­ tődést létesít a tranzíciós állapotban levő szubsztrátmolekulákkal, mint az alapállapotban, és így csökken­ ti az entalpiakülönbséget a két állapot között. Ez a je­ lenség az indukált illesztés („induced fit”) koncepci­ ójában nyer kifejezést, amely szerint a kezdeti gyenge szubsztrátkötődés szerkezeti változásokat indít el az enzimmolekulában. Ennek következtében több és erősebb kötés jön létre az enzim és a szintén átalakuló­ ban levő szubsztrátmolekula között. Az indukált il­ lesztés mechanizmusában gyakran az enzim sav vagy bázis jellegű funkciós csoportjai szerepelnek, ame­ lyek protonok leadásával vagy felvételével új, elektro­ mos töltésen alapuló interakciókat tesznek lehetővé a tranzíciós állapotú enzim-szubsztrát komplexben. A reakció során az enzim kovalensen is átalakíthatja a szubsztrátot egy vagy több stabil köztitermékké, ame­ lyek között a tranzíciós állapotok kisebb AG'-vel jár­ nak, mint az egylépcsős átalakulás. Az indukált illesz­ tés, ami jelenthet kismértékű, csak az aktív centrumot érintő konformációváltozást, de érinthet egész enzimdomént is, végső soron azt a célt szolgálja, hogy az ak­ tív centrum funkciós csoportjai a katalízishez optimá­ lis helyzetbe kerüljenek.

2 .2

AZ EN Z IM FU N K C IÓ SZ ER K EZ ET I ALAPJAI

Az enzimműködés eddigi tárgyalása során az en­ zim szerkezete nem került szóba, mert a megfogalma­ zott elvek általános érvényűek és nem függenek az en­ zim kémiai természetétől. A funkcionális tulajdonsá­ gok meghatározzák a szerkezeti követelményeket, amelyeknek minden enzimnek meg kell felelnie. Egy­ részt az enzim olyan katalitikus csoportokkal rendel­ kezik, amelyek a szubsztrátmolekula átalakuló részé­ vel közvetlen kapcsolatot létesítenek. Ezek alkotják az enzim aktív centrumát, amelynek elég flexibilisnek kell lennie ahhoz, hogy megfeleljen az indukált illesz­ tés mechanizmusának. Ugyanakkor az enzim túlzott képlékenysége ellehetetlenítené a katalízist, hiszen ha az enzim gumikesztyű módjára rásimulna a szubsztrátmolekulára, csak egy stabil enzim-szubsztrát

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

24

hérje, és csak ritka kivételként találkozunk RNS alapú enzimmel, amelyet ribozimnek szokás nevezni. Az „RNS világ” hipotézise szerint először az RNS szol­ gáltatta mind a genetikai anyagot, mind az enzimkész­ letet a kezdetleges élőszervezetekben. E primitív, RNS alapú metabolizmus talaján fejlődött ki a specificitás és szabályozás szempontjából bonyolultabb és általában nagyobb hatásfokú fehérje alapú katalízis. Ennek nyomait meg lehet találni a mai élővilágban, a baktériumoktól az emberi szervezetig. Például az összes fehérje egy ribozimnek, a riboszómákban mű­ ködő peptidil-transzferáznak köszönheti a peptidkötések kialakulását. Az általános enzimkatalízis el­ veit alkalmazva, a biotechnológiai próbálkozásoknak köszönhetően, manapság olyan reakciókra is kifej­ lesztenek szintetikus (szinzimek) vagy antitest alapú (abzimek) katalizátorokat, amelyekre nem léteznek természetes enzimek, de ezek hatékonysága még nem éri el a természetben előfordulókét.

komplexet hozna létre, amely nem alakulna tovább. Ezt megakadályozandó az aktív centrumnak egy olyan merevítő keretben kell elhelyezkednie, amelyet csak az aktív centrumnál jóval nagyobb méretű enzimmo­ lekula tudna biztosítani. Az enzim optimális rigiditása tehát egy minimális molekulamérethez kötött. A mo­ lekulaméretre vonatkozó követelmény az enzim specificitásából is adódik. Az enzimnek rendelkeznie kell olyan szubsztrátkötő hellyel, amely az aktív cent­ rumtól függetlenül képes megkötni az enzimspeci­ fikus szubsztrátot úgy, hogy az átalakuló része az ak­ tív centrumba kerüljön. A nagyobb méretű szubsztrát­ kötő hely kiterjedtebb felületet biztosít az enzim és a szubsztrát közötti kölcsönhatásokra, amely csökkenti a nemspecifikus anyag kötődésének valószínűségét. A ma ismert legkisebb enzimmolekulák mérete 10 kDa körüli, amely már a makromolekulák tartományá­ ra esik. A mai biológiai világban két típusú makromo­ lekula teljesíti az enzimmel szemben támasztott szer­ kezeti követelményeket: a fehérjék és a ribonuklein­ savak (RNS). A több mint húsz különböző aminosavból álló fehérjék eltérő funkciós csoportokkal rendel­ keznek, amelyek a polipetidláncok stabil térbeli tekeredésének köszönhetően a legváltozatosabb kombiná­ ciókban jelentkezhetnek az enzimek aktív centrumá­ ban és szubsztrátkötő helyein. Az RNS-k ezzel szem­ ben csak négy különböző bázist tartalmaznak, ame­ lyek ráadásul hasonló kémiai tulajdonságokkal ren­ delkeznek, és bár a polinukleotid-láncok szintén képe­ sek komplex térbeli alakzatokat felvenni, azok válto­ zatossága és stabilitása messze áll a fehérjék másodla­ gos vagy harmadlagos szerkezetétől. Ezért nem meg­ lepő, hogy a ma előforduló majdnem összes enzim fe­

Kofaktorok szerepe az enzimműködésben Az aminosav-oldalláncok adta lehetőségeken túl­ menően, az enzimek kofaktorok igénybevételével is bővíthetik az aktív centrumban létesíthető kölcsönha­ tások körét. A kofaktor olyan fémion vagy szerves vegyület (gyakran vitaminszármazék), amely részt vesz a katalitikus mechanizmusban (a tranzíciós állapot stabilizálásában vagy stabil köztitermékek létrehozá­ sában), a katalízis alatt módosul, de a reakció végén ugyanolyan állapotban található, mint a reakció előtt. Egyes enzimek esetében a kofaktor obiigát szerkezeti

> G X

C " 7 ^ \ >D

A

F ^

\ ATP

ADP

NAD

NADH

NADP

NADPH

acetil-koenzim-A

koenzim-A

L 2-3. ábra. Koenzimek szerepe az enzim katalizálta reakciókban. Az E1; E2, E3 enzimek által katalizált reakciókban azonos X koenzim szükséges, amely Y formává alakul át. Egy ezektől független reakcióban, amit az E4 enzim katalizál helyreáll a koenzim X formája

2 . E N Z I M E K . K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

25

2-1. táblázat. Gyakran előforduló koenzimek, ezek vitamineredete és funkciója Koenzim

Vitamin

Reakció

biotin

biotin

karboxilezés

flavin koenzimek (FMN, FAD)

riboflavin (B2 -vitamin)

oxidáció-redukció

kobalamin (Bi2 -vitamin) kobalamin koenzimek (dezoxiadenozil-kobalamin, metil-kobalamin) koenzim-A

pantoténsav

alkil-transzfer

acil-transzfer acil-transzfer

liponsav nikotinamid-koenzimek (NAD, NADP)

niacin

oxidáció-redukció

piridoxál-foszfát

piridoxin (Bő-vitamin)

aminocsoport-transzfer

tetrahidrofolát

folsav

egy C-atom-csoport-transzfer

tiamin-pirofoszfát

tiamin (Bi-vitamin)

karbonil-transzfer

eleme az aktív centrumnak, a kofaktorral működő en­ zimek fehérjekomponense (az apoenzim) önállóan nem rendelkezik katalitikus aktivitással, csak a holoenzim (apoenzim + kofaktor) aktív. A fehérjéhez erősen (gyakran kovalensen) kötődő kofaktorokat prosztetikus csoportként szokás jelölni. Gyakran olyan kofaktorok is részt vesznek az enzim katalizálta reakciókban, amelyek a reakció alatt kémiai átalakulá­ son mennek keresztül és eredeti formájuk egy függet­ len reakcióban, más enzim hatására regenerálódik (ko­ enzimek vagy koszubsztrátok, 2-3. ábra, 2-1. táblá­ zat). Ezek szerkezetének általában valamely vitamin is része. Reakciótól függően egy adott anyag kofaktorként és koenzimként is viselkedhet (pl. FAD a szukcinát-dehidrogenáz és a piruvát-dehidrogenáz komp­ lexben, lásd bioenergetika fejezetet).

dosítja az aktív centrum finoman összehangolt köl­ csönhatásait, amelyek a tranzíciós állapot stabilizálá­ sához szükségesek. Jelentősebb (több egységnyi) pHeltérés esetében a makromolekula harmadlagos szer­ kezete is fellazul elektrosztatikus kölcsönhatások megszűnése miatt, vagy rigidebbé válik új kölcsönha­ tások létrejötte miatt. Azonban, ahogyan korábban tár­ gyaltuk, sem a túlzott flexibilitás, sem a túlzott rigiditás nem kedvez a katalitikus hatásnak. E hatások eredményeképpen sok enzim aktivitása harang alakú görbe szerint változik a pH függvényében (2-4. ábra). A pH-függéshez még a szubsztrátok ionizálhatósága is hozzájárulhat. Nem meglepő, hogy a legtöbb enzim szerkezete adaptálódott a környezethez, ahol az enzim működik, és az enzim pH-optimuma megfelel a kör­ nyezeti pH-nak. Az izolált pepszin pH-optimuma pél­ dául 2,0, ami megfelel a gyomor pH-értékének, ahol a pepszin működik. Előfordulnak viszont ettől eltérő

Az enzimek katalitikus hatékonysága a pH és a hőmérséklet függvényében Az enzimek kémiai természetéből (fehérje, RNS) néhány olyan tulajdonság adódik, amely döntően be­ folyásolja katalitikus hatékonyságukat. A hidrogénion koncentrációja jelentős hatást gyakorolhat az enzim­ aktivitásra, mert a fehérje- és RNS-molekulák számos ionizálható funkciós csoporttal rendelkeznek. A kör­ nyezet pH-változásai mellett változik e csoportok protonáltsági állapota. Már kisfokú pH-eltérés is mó­

2-4. ábra. Enzimaktivitás alakulása a pH függvényében

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

26

szituációk is; az izolált glicerin-kináz pH-optimuma 9,8, a foszfoglicerát-mutázé pedig 5,9, ami jelentősen különbözik a citoszol pH-értékétől (~7,2), ahol ezek az enzimek működnek. A hőmérséklet emelése növeli az enzim katalizálta reakciók sebességét is, mint minden kémiai reakcióét, mert növeli azon molekulák számát, amelyek kinetikai energiája elegendő a tranzíciós állapot eléréséhez (2-2. ábra). A már ismertetett Arrhenius-egyenlet írja le a kémiai reakciók sebességének hőmérsékletfüggé_§A_

sét, miszerint k =Ce RT. Mivel a k és T közötti össze­ függés exponenciális, a kémiai reakciók sebessége rendkívül érzékeny a hőmérséklet-változásokra. A fe­ hérjék és nukleinsavak viszont magasabb hőmérsékle­ ten denaturálódnak, ami aktivitáscsökkenéshez vezet. E két ellentétes hatás eredőjeként alakul az enzimakti­ vitás a hőmérséklet függvényében (2-5. ábra). Érde­ mes megjegyezni, hogy a pEl-optimummal ellentét­ ben, egy enzimre nem lehet optimális hőmérsékletet definiálni, mert a hődenaturálás nemcsak hőmérsék­ let-függő folyamat, hanem időfüggő is. így adott hő­ mérsékleten hosszabb inkubációs idő esetén több en­ zim molekula denaturálódik a vizsgálat ideje alatt és emiatt a kísérleti körülményektől függően eltérő en­ zim aktivitást lehet mérni. Nem meglepő, hogy az en­ zimek szerkezete adaptálódott a környezeti hőmérsék­ lethez; a humán enzimek többsége 45 °C felett denatu­ rálódik, míg a gejzír vizében is túlélő baktériumok en­ zimei kellő stabilitást mutatnak 70 °C feletti hőmér-

2-5. ábra. Hőmérséklet hatása az enzim aktivitásra. 1: a ké­ miai reakcióra érvényesülő általános hatás dominál; 2: denaturáció hatása már érvényesül; 3: ún. „optimális" hőmérséklet, amely balra tolódik hosszabb inkubáció esetén; 4: denaturáció hatása dominál

sékleten is. Ezeknek fontos biotechnológiai alkalma­ zásaik vannak.

Az enzimek osztályozása Az enzimeket az általuk katalizált reakció alapján nevezzük el és ilyen alapon 2014-ben 6547 különböző nevű enzim volt ismert. Ahogy a 2-2. táblázat jelzi, ez a nagyszámú reakció csak 6 típushoz tartozik, így az összes enzimet 6 osztályba soroljuk a nemzetközi nó­ menklatúra szerint. Ugyanakkor meg kell jegyezni, hogy azonos katalitikus hatást többféle szerkezettel le­ het elérni. Ezért azonos reakciót eltérő szerkezetű, de

2-2. táblázat. Az enzimek osztályozása Osztály

Reakció típusa

1. oxidoreduktázok elektrontranszfer

Példa dehidrogenázok, oxidázok, reduktázok, peroxidázok, kataláz, oxigenázok, hidroxilázok

2. transzferázok

kémiai csoportok áthelyezése

transzaldoláz, transzketoláz, acil-, metil-, glukozilés foszforil-transzferázok, kinázok

3. hidrolázok

kémiai kötések hasítása víz hozzáadásával

eszterázok, glukozidázok, peptidázok, foszfatázok, foszfolipázok, amidázok, dezaminázok, ribonukleázok

4. liázok

C-C vagy C-N kötések hasítása

dekarboxilázok, aldolázok, hidratázok, dehidratázok, szintázok, liázok

5. izomerázok

kémiai csoport vagy kettős kötés áthelyezése egy molekulán belül

racemázok, epimerázok, izomerázok, mutázok

6. ligázok

C-C kötés létrehozása nukleozid-trifoszfát egyidejű hasításával

szintetázok, karboxilázok

2. E N Z I M E K . K I N E T I K A ES R E G U L Á C I Ó

azonos nevű enzimek katalizálhatnak, ezeket izoenzimeknek nevezzük. Ha az izoenzimeket is külön identitásnak tekintjük, az ismert enzimek száma meg­ haladja a kilencvenezret. Az izoenzimek különböző gének termékei lehetnek vagy azonos gén esetén elté­ rő poszttranszkripciós módosítások miatt keletkeznek. Az eltérő szerkezet miatt az izoenzimek különböznek katalitikus hatékonyságukban, szubsztrát iránti affini­ tásukban, szabályozásukban vagy lokalizációjukban. Az izoenzimek specifikus lokalizációja sejten belül vagy különböző szövetekben lehetőséget teremt a metabolikus utak finom adaptációjára a helyi környe­ zethez. Az enzimek mennyiségét és koncentrációját molá­ ris egységekben szokás megadni, amennyiben ismert a pontos szerkezetük és a molekulatömegük, valamint aktív centrumuk titrálása is lehetséges. Sok esetben azonban ezek az adatok nem állnak rendelkezésre. Ezért általában az enzim mennyiségét aktivitása alap­ ján, az általa katalizált reakció sebességével fejezik ki. A legelterjedtebb az ún. nemzetközi egység (IU), amely azt az enzimmennyiséget jelöli, amely 1 pmol szubsztrátot alakít át 1 perc alatt standard (az adott en­ zimre nemzetközileg definiált) körülmények között. Az Sí (Systéme /ntemational d’Unités) mértékegy­ ségrendszerben az ennek megfelelő egység a katal (kát), amely 1 mol/s szubsztrátátalakulást katalizáló enzimmennyiséget jelöl.

Szerkezet-funkció összefüggések az enzimműködés során. Szerin-proteázok Az enzimműködés során érvényesülő szerke­ zet-funkció összefüggéseket a szerin-proteázok ha­ tásmechanizmusa szemlélteti. A proteázok a hidroláz enzimek osztályába tartoznak és a fehérj ékmolekulán belüli peptidkötések hidrolízisét katalizálják. A szerin, amely egy aszpartát- és egy hisztidinoldallánccal együtt alkotja az aktív centrum kritikus szerke­ zeti elemeit, adja e proteáztípus nevét, amelynek egyik képviselője a kimotripszin (a proteázok további osz­ tályait lásd az aminosav-anyagcsere fejezetben). A 2-6. ábra bemutatja az aktív centrumban kialakuló kölcsönhatásokat és a hozzátartozó Gibbs-féle ener­

27

giaváltozásokat. A szubsztrátfehérje kimotripszinhez történő kötődése során (2-6/1. ábra) a lebontandó peptidkötésben szereplő fenilalanin az enzim szubsztrátkötő helyébe kerül (2-6/II. ábra), amelynek olyan a szerkezete, hogy hidrofób kölcsönhatások ré­ vén aromás aminosavakat köt meg. Ettől eltérően, a tripszin egy homológ szerkezetű szerin-proteáz, ne­ gatív töltésű aszpartátoldalláncot tartalmaz a szubsztrátkötő helyén, amely bázikus aminosavakat köt, így a tripszin lizin és arginin melletti peptidkötéseket hasít. A szubsztrát kötődése finom szerkezeti változá­ sokat indít el az aktív centrumban (2-6/II. ábra). A Seri95 hidroxilcsoportja lead egy protont a His57-nek, amelyhez az Aspl02 negatív töltésű karboxilcsoportja is szükséges. így a Ser 195 hidroxil oxigénje nukleofil támadást hajt végre a peptidkötés C-atomján, és létrehozza az 1. számmal jelzett tetraé­ deres tranzíciós állapotot. Ebben a tetraéderes állapot­ ban a C-N kötés felbomlik úgy, hogy a nitrogén átve­ szi a His57-től az eredetileg Seri95-től származó pro­ tont, és közben kialakul egy stabil köztitermék, az acilezett enzim, amelyben a megszűnt peptidkötés karboxilcsoportja észterkötést létesít a Seri95 oldal­ láncával (2-6/III. ábra), és a lebontott peptidkötésről a szabad aminocsoport leválik. Helyére egy vízmoleku­ la lép be, amely protont ad át a His57-nek, vagyis a II. fázishoz hasonló átalakulások történnek, de most a víz a protondonor (2-6/IV. ábra), és a víz oxigénje támad­ ja meg az acil köztitermék C-atomját, létrehozva a má­ sodik tetraéderes tranzíciós állapotot (2-6/V. ábra). Ez utóbbi most úgy bomlik le, hogy helyreáll az aktív centrum eredeti állapota, és szabaddá válik a hasított peptidkötés karboxilcsoportja is (2-6/VI. ábra). A fel­ vázolt szerkezeti átalakulások a részt vevő atomok precíz térbeli pozicionálásától függenek. Ennek jelentőségét jól példázza a szerpinek hatásmechanizmusa. A szerpinek (szenn-/;roteáz-mhibitorok) olyan fehérjék, amelyek gátolják a szerinproteázokat (pl. a plazma aj-antitripszin, amely egy sor proteáz inhibitora, lásd 9. fejezet). A szerpinek egy reaktív hurokkal rendelkeznek (2-7. ábra), amelyet a proteáz szubsztrátként ismer fel és elindítja a 2-6. áb­ rán bemutatott katalitikus történéseket. Mivel a reak­ tív hurok feszültség alatt áll, amikor az egyik peptid­ kötés C-N kapcsolata megszűnik, a keletkező szabad

28

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

kimotripszin

2-6. ábra. Szerin-proteázok kataliti­ kus mechanizmusában érvényesülő szerkezeti (bal oldali ábrák) és ter­ modinamikai (jobb oldali ábrák) vál­ tozások. A csillag jelzi a reakció kezdeti lépését (az enzim és szubsztrát kötődé­ se előtt). A nyíl jelöli az adott katalitikus fázisnak megfelelő termodinamikai álla­ potot. Az 1. és a 3. pont jelzi a két tetraé­ deres tranzíciós állapotot, a 2. az acilezett szerin köztiterméket, a 4. pedig a végállapotot

szubsztrát

S eri 95

His57 Asp102

reakció ideje

1

29

2. E N Z I M E K . K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

peptidvégek elmozdulnak és magukkal rántják a közben acilezett köztiterméket képző proteázt (2-7. ábra). A mecha­ nikai elmozdulás miatt eltorzul az aktív centrum szerkezete (a His57 messzebbre kerül a Seri 95-től), és emiatt a belépő vízmolekula nem képes befe­ jezni a katalitikus sorozatot. Az acilezett enzim lesz a végter­ mék ebben az esetben, ami a proteáz irreverzibilis gátlását jelenti, hiszen a Seri95 észter­ kötése spontán hidrolízise rendkívül lassú (a proteázinhibitorok további típusait lásd a 9. és 25. fejezetekben).

2.3

+ p ES átalakulás elhanyagolha­ tó k. S
ES

k. -—> E + P

-1 \E]0-[F.S] [S]=[S]0

[Pl

Az ES — E + P lépés egy elsőrendű reakció, amelynek a sebessége kifejezhető a következő egyen­ lettel: v = k2 m[£0]. A Michaelis-Menten-modell leg­ lényegesebb feltétele, hogy az [£5] állandó a vizsgá­ lat ideje alatt, vagyis a rendszer az ún. stacionárius ál­ lapotban (steady State) található (2-9. ábra). Ebben az állapotban az ES keletkezésének sebessége, v, =&, •[£]•!>>] megegyezik lebomlásának sebessé­ gével, v_, + v 2 = k j ■[£5] + A:, •[EiS1} Mivel a szabad enzim és szubsztrát koncentrációja ([£],[£]) nem is­

30

I . A F E H É R ) É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

mert, ezeket a kezdeti koncentrációkkal kell kifejezni [E] = [E]0 - [ES ] és [5 ] = [S ]0 - [ES } Tekintettel arra, hogy [ES] nem lehet nagyobb, mint [E]o és a legtöbb esetben a szubsztrát koncentrációja nagyságrenddel meghaladja az enzimét, [5]o » [E]o, elfogadható az [S] « [5]o leegyszerűsítés. így a stacionárius állapotra érvényes v_i + V2 = vj feltételből következik, hogy k_, -[ES] + k2 ■[ES] = k [ -([E]0 -[E S ])-[S ]0. Ebből az egyenletből kifejezhető az [£ 5 ]_

vázolt kétlépcsős reakciósémában szerepel) megegye­ zik a ki értékével, de többlépcsős reakciókban több se­ bességi állandóból tevődik össze. Mechanizmustól függetlenül azonban a kcat-ot minden esetben elsőren­ dű sebességi állandóként lehet értelmezni, amely jelzi az enzim maximális katalitikus hatékonyságát. A kcal átviteli számként is ismert paraméter, mert azt mutat­ ja, hogy időegység alatt az enzimmolekula maximáli­ san hány katalitikus cikluson mehet át, és így mértékegysége az idő reciprok értéke.

y [ £ 3o-[^o _ [gjo - t H ^ 1 + *2 + ^ - [ 5 ] 0 (k_i + k2) / k l + [S]0'

E +S
ES Kd

Amennyiben a sebességi állandók helyett bevezet­ őt + k jük a Michaelis-állandót: K m = — ----- - , k\ akkor [£5] = -^ ° 5 ]° K m +[5 ]0

A reakció mechanizmusától függően a Km szintén eltérő állandókból tevődik össze. Amennyiben az egyensúly relatíve gyorsan áll be az [.ES ]— ——>E + P irreverzibilis átalakulás sebességéhez képest (vagyis k ~\~k k-1 » ki), a K n = — ----- - számlálójában a &2 elha-

és a fent használt reakciósebesség egyenlete

k

nyagolható, v = k , - [ E S ]a v = ka" K m +[S]0

formában írható le.

Az utóbbi egyenlet számlálójában levő katalitikus állandó (kcat) egy köztitermék esetében (ahogy a fel­

K

k =Kd k\

és

a

\

Km egyensúlyi

állandóként

jelentkezik. Ilyen reakcióknál a

Michaelis-állandó az enzim szubsztrát iránti affinitá­ sát jellemzi (kisebb Km erősebb szubsztrátkötődést je-

lineáris becslés az első 5 mérési pont alapján = 3,5

2-8. ábra. Kezdeti reakciósebesség meghatározása. A termékkoncentráció (P) változása időegység alatt adja a re­ akciósebességet, de ennek pillanatnyi értéke folyamatosan csökken a reakció ideje alatt a szubsztrát fogyása miatt. A P időgörbe nulladik időpontjánál szerkesztett érintő meredek­ sége adja a valódi kezdeti sebességet

2-9. ábra. A stacionárius állapot (steady State) kialakulása a reakció alatt. A kezdeti időpontban az enzim-szubsztrát komplex [ES] kialakulásának sebessége a legnagyobb, de a sza­ bad enzim [£] koncentrációjának csökkenése és párhuzamosan a termék [P] keletkezése miatt beáll a stacionárius állapot (sötétebb hátterű időzóna), amikor az enzim-szubsztrát komplex koncentrációja állandó

2. E N Z I M E K .

31

K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

lez). Ha nincs arra utaló adat arra, hogy k \ » kj), ak­ kor a Kma steady State megközelítés szerint nyer értel­ mezést K = — + ^2 egy köztitermék esetén. K Amennyiben az enzim moláris koncentrációja nem ismert, egy adott mérésben a Michaelis-Mentenegyenletben szereplő katalitikus állandó és enzimkon­ centráció szorzata állandóként jelentkezik Vmx = kcal ■[E\ , amely nem egy univerzális jellemző­ je az enzimnek, hanem az adott mérési rendszerre vo­ natkozik. Ilyen esetekben a Michaelis-Mentenegyenletet a v =

formában is fel lehet írni. K m+[S]0

Ez a klasszikus Michaelis-Menten-egyenlet, ami a kezdeti reakciósebesség és a szubsztrátkoncentráció közötti összefüggést fejezi ki az enzimre jellemző két paraméter (Fmax, Km) figyelembe vételével. Ez az egyenlet egy hiperbolát ír le (2-10. ábra), amelynek az aszimptotái a Fmax és a -K m, vagyis a konvencionális kmaxjelölés ellenére ez a paraméter nem a reakcióse­ besség maximuma, hanem egy olyan érték, amelyet a sebesség végtelen szubsztrátkoncentráció mellett kö­ zelít meg. A 2-10. ábráról leolvasható, hogy ha a szubsztrátkoncentráció egyenlő a Á)„-mel, a reakció

Michaelis-állandó minden esetben azt a moláris egy­ ségben kifejezett szubsztrátkoncentrációt jelöli, amely mellett a reakció fél Fmax sebességgel zajlik. A 2-10. ábráról még az is leolvasható, hogy ha a szubsztrátkoncentráció a Kmtöbbszöröse, a reakcióse­ besség csak kismértékben változik a szubsztrát­ koncentráció további emelésével, azaz ilyen körülmé­ nyek között a reakció nulladik rendű (az enzim meg­ közelíti telítettségi állapotát). Ugyanakkor érdemes megjegyezni, hogy valós kísérletben nem lehet Fmax reakciósebességet mérni (1 0xKm szubsztrátkoncent­ ráció mellett is majdnem 10% eltérés lesz a Fmax-tói). Sok esetben katalitikus és Michaelis-állandó he­ lyett olyan alternatív állandókkal célszerű kifejezni a Michaelis- -Menten-egyenletet, amelyek jobban szem­ léltetik az enzim tulajdonságait vagy a regulátor anya­ it gok hatásait. Például, ha bevezetjük a ks = á\\anKm

dót, amelyet az S szubsztrátra vonatkoztatott specifícitási állandónak nevezünk, a Michaelis-Mentenegyenlet a következő formában írható fel:

_ (kcal/ K m)-[E] 0 .[S ]0 _ K m+[S] o _ ks -[E]0 -[S]0

sebessége 0,5 Hmax (v = V,mx K = 0,5 F[nax). FüggetK m+Km lenül a fent tárgyalt különböző mechanizmusoktól, amelyek szerint alakulnak a Km összetevői, a

l+ [S ] J K m

1H S ] J K m ' Az utóbbi formának az előnye akkor válik világossá, ha az egyenletet bonyolultabb rendszerekre alkalmaz­ zuk (több különböző szubsztrát vagy inhibitor jelenlé­ te, reverzibilis reakció), mert a ks és Km használatával az eredeti formára analóg és könnyen értelmezhető egyenletekhez jutunk. Például, ha az enzim egyszerre két alternatív szubsztrátra (S és 5”) hat:

ki

k2

E +S
E S ------------------- > E + P

k-i

k\ F. + ,S"


k2 ES' ------------— > E + P '

k\, a két reakció sebességére (v és v ’) a következő egyenleteket lehet le­ vezetni: 2-10. ábra. A Michaelis-Menten-egyenlet által definiált hi­ perbola

v

v fE v m v, k'siEi-is'i l + fo]0//é„+fo’]0//é’„, ’ l +[ S l / K m + [ S ' l / K ' m ■

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

32

Ezek segítségével már kvantitatív módon is tudjuk definiálni az en­

Sajnálatos módon, az irodalomban elterjedt a specificitási állan-

zimeknek a fejezet elején említett alapvető tulajdonságát, a speci-

dó egy indokolatlan felhasználása is. Sok esetben a - f -arány alap-

k

ficitást. Ha az enzim két szubsztrát közül választhat, specificitását az határozza meg, hogy ha a két szubsztrát koncentrációja azonos, az

ján összehasonlítják az azonos reakciót katalizáló enzimek (pl. mu­

enzim melyiket preferálja, melyiknek az átalakulását katalizálja na­

táns, rekombináns) hatását, mondván, hogy ez az arány kifejezi az

gyobb sebességgel. A kérdés megválaszolásához meg kell vizsgál­

enzim katalitikus hatékonyságát. A specificitási állandó ilyen alkal­

nunk a v/v ’ arányt ilyen körülmények között. Mivel a két egyenlet

mazása megtévesztő következtetésekhez vezethet, ahogy a 2-11. áb­

nevezője és az rE]0 azonos, ha [5]o=[5,’]0, akkor — = — , vagyis a v' k s

ra mutatja be ezt. Az ott szereplő két görbe mellett az egyenletekben a kCai és Km értékek szerepelnek egységnyi [£]o mellett. Az ábráról

melyik

leolvasható, hogy a nagyobb specificitási állandóval rendelkező en­

szubsztrátot hasznosítja hatékonyabban az enzim, még ha több ha­

zim (Kmax = 10, Km= 5) csak alacsony szubsztrátkoncentráció mellett

sonló anyag áll rendelkezésére (ebből ered az állandó elnevezése is).

hatékonyabb katalizátor, mint a kisebb specificitási állandójú

specificitási

állandó

teljes

mértékben

meghatározza

(Emax = 15, AT„, = 10). Magas szubsztrátkoncentrációk mellett viszont

A

bevezetésénél részletezett megfontolásokV bői a specificitási állandót is —^ aránnyal lehet heFmax

Km

a kcMértéke határozza meg a katalitikus hatékonyságot. Tehát általá­ nosságban az enzimek katalitikus hatékonyságát nem lehet egyetlen paraméterrel jellemezni, a ks és kca, jelentősége a szubsztrátkoncentrációtól függ.

lyettesíteni olyan esetekben, amikor az enzim moláris koncentrációja nem ismert, de értéke állandó. A specificitási állandó felhasználásával fontos bioló­ giai kérdésekre lehet választ adni. Például ismert, hogy a hexokináz enzim glukózt és ffuktózt is használ szubsztrátként (lásd szénhidrát-anyagcsere fejezetet). Felmerül a kérdés, hogy egy adott szövetben melyik anyag a fiziológiás szubsztrátja a hexokináz által indí­ tott metabolikus útnak, a glikolízisnek. Az agyszövetre vonatkozó hexokináz paramétere­ ket a 2-3. táblázat mutatja be, melyből kiderül, hogy glukózra nézve a hexokináz specificitási állandója két nagyságrenddel nagyobb, mint fruktózra nézve, va­ gyis az agyszövet akkor használna számottevő fruktózt, ha annak intracelluláris koncentrációja 100-szor nagyobb lenne a glukózénál, ami nem valószínű, hogy előfordul (az agyszövetben becsült intracelluláris kon­ centrációk 10 pM glukóz, illetve 1 pM fruktóz). Tehát a specificitási állandó és az in vivő szubsztrátkoncentrációk ismeretében azonosíthatók a metabolikus utak fiziológiás szubsztrátjai.

2-11. ábra. Két eltérő enzim katalitikus hatékonysága azo­ nos reakcióban

A specificitási állandó felhasználásával viszonylag egyszerű formában felírható a Michaelis-Mentenegyenlet reverzibilis reakcióra is:

E +S ,

k. k, 1 > ES < _> E + P k_j k2

2-3. táblázat. Hexokináz szubsztrátspecificitása az agyszövetben

Ilyen esetben v = Szubsztrát

Km

^maX (pmol • min -g )

ÉmM)

V m a x ./K m

(Emin

glukóz

17

10

1,7

fruktóz

25

1000

0,025

.

•g )

ks [E]0 - [ S ] - k p -[E]0 -[P] Ez a 1+ [ S ] / K mS+[P]/ KmP '

forma tekinthető a Michaelis-Menten-egyenlet általá­ nos formájának, amely leegyszerűsödik az eddig tár­ gyalt egyenletre, ha [Pjo = 0.

2. E NZ I ME K . K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

33

rációk mellett a specificitási állandó teljes mértékben határozza meg

vényében ábrázoljuk az alapegyenletnek megfelelően (2.10. ábra), vizuális értékelésünk több nehézségbe ütközik, mert nem egyértelmű a hiperbola aszimptotáinak helyzete (így a Fmax és Kmértékei nem egyértel­ műen azonosíthatók a grafikonon), és nehéz észreven­ ni, ha az adatok lefutása nem követi szigorúan a hiper­ bolikus összefüggést. Ezek kiküszöbölésére olyan for­ mában érdemes átírni a Michaelis-Menten-egyenletet, amely szerint elvégezve az ábrázolást, az eredmé­ nyek egy egyenes mentén helyezkednek el. E megkö­ zelítés legelterjedtebb változata az ún. LineweaverBurk-féle ábrázolás, amely a Michaelis-Menten-egyenlet reciprok formáját használja \ \ K \ — = ----- + —---------- (2-12. ábra). Ez az ábrázolás vy rVmax rVmax ("SÍ l -lo

a katalizált reakció sebességét. Mivel a reakció termodinamikai pa­

jól szemlélteti a kinetikai paraméterek értékeit (az

Ennek az egyenletnek a segítségével tudjuk értelmezni a koráb­ ban említett „egyirányú” enzim koncepcióját. Ha a reverzibilis reak­ ció egyensúlyba kerül, akkor v = 0, ami az utóbbi egyenlet szerint csak akkor lehetséges, ha ks ■[-£]„ -[5 1 , - k p •[£"]o -[P],, = 0, ahol [Sje, és [P]Cq a szubsztrát és a termék egyensúlyi koncentrációi. At. . ks [ P l , , [ P l , ^ ks rendezes után — = ----- d e --------- = K m vagyis K „ = — . Ezek sze-

K

[5f,

[^l,

’ kP

rint az egyensúlyi állandó, amely a bioenergetika fejezetben tárgyalt AG° - - R T -InK eq összefüggés szerint kapcsolatban áll a reakció standard Gibbs-féle energiaváltozásával, meghatározza a két specificitási állandó arányát. Bár a specificitási állandó enzimre és szubsztrátjára (és nem reakcióra) specifikus paraméter, egy adott ks esetén a jelzett termodinamikai kötöttség miatt az ellenkező irány­ ban a specificitási állandó csak kp

- — értéket vehet fel. A 2-11.

ábra kapcsán egyértelművé vált, hogy alacsony szubsztrátkoncent-

raméterei adottak, és nem függenek az enzimtől, ilyen szubsztrátkoncentráció mellett szükségszerű, hogy az enzim azonos mér­ tékben gyorsítsa a reakciót mindkét irányban. Más a helyzet magas szubsztrátkoncentrációknál, mert a 2-11. ábra tanúsága szerint ilyenkor a kca, határozza meg a katalitikus hatékonyságot. Ha a ka­ talitikus állandókat

a

specificitási

állandókkal

fejezzük

ki

(Kas = ks ' K mS és kcatP = kp ■K mP), ezek aránya határozza meg a re­ akció gyorsítását a két irányban. Mivel a termodinamikai kikötés csak a Keq= j~

állandóságára vonatkozik, magas szubsztrát-

koncentráció-tartományban az enzim eltérő mértékben növelheti a

egyenes az —í— értéknél metszi az ordinátát és a — V max Km pontban az abszcisszát), és vizuálisan jelzi a modell szerint elvárt lefutástól eltérő mérési pontokat. Alkal­ mazása viszont nem ajánlott kísérleti adatok értékelé­ séhez és kinetikai paraméterek azonosításához, mert súlyosan torzítja a kísérleti hibák jelentőségét, és emi­ att az így meghatározott kinetikai paraméterek nagy­ fokú bizonytalanságot hordoznak.

reakciósebességet a két irányban, amennyiben jelentős különbség je­ lentkezik a Kmértékekben a szubsztrátra és a termékre nézve. így ért­ hető az a gyakori in vivő szituáció, hogy egy enzim a katalizált reak­ ció csak egyik irányát gyorsítja anélkül, hogy ellentmondásba kerül­ ne a termodinamikai elvekkel.

Enzimkinetikai paraméterek kísérleti meghatározása A Michaelis-Menten-modell alkalmazásához több különböző szubsztrátkoncentráció mellett mért kezde­ ti reakciósebesség adataira van szükség. Matematikai­ lag egzakt módon az egyenlet paramétereit a mérési adatokhoz végzett nem-lineáris regresszióval lehet meghatározni. A kísérlet pontosságát, a modell adekvát jellegét és a kinetikai paramétereket vizuálisan is áldjuk értékelni, ha a mért és a regresszióval szimulált adatokat grafikusan ábrázoljuk. Amennyiben a reak­ ciósebességet (v) a szubsztrátkoncentráció ([S]) függ­

2-12. ábra. A Michaelis-Menten-egyenlet kettős reciprok ábrázolása

Újabban bevezetett lineáris transzformációk segít­ ségével nemcsak vizuálisan tájékozódunk a becsült paraméterek értékéről, hanem megbízhatóan, kellő statisztikai információ kíséretében egyszerűen kiszá-

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ES F U N K C I Ó J A

34

molhatjuk a paraméterek átlagértékeit és konfiden­ ciatartományukat.

az enzim Aim-értékére, amelyet fel lehet használni a kísérlet további tervezésénél a helyes szubsztrátkoncentrációk kiválasztásához, hogy ezek lefedjék a 2.10. ábra szerinti hiperbola mind kezdeti, mind telítési szakaszát.

Bár első látásra furcsának tűnik, de gyakorlati megfontolásokból nagyon hasznos transzformációja a Michaelis-Menten-egyenletnek, ha a következő formában írjuk át: Vmr = v + —— Aí,„ ■Ez a megkö­ t i 1, zelítés változóként kezeli a Fmax és a K„, értékét, a reakciósebességet

Kétszubsztrátos reakciók kinetikai jellemzői

és a szubsztrátkoncentrációt pedig állandóként. így ez az egyenlet olyan egyenest definiál, amely v pontban metszi az ordináta tengelyt és -[S]o pontban az abszcisszát (2-13. ábra). Ez az ún. direkt lineáris ábrázolás tükrözi a biokémiai kísérletek logikáját: ha egy kísérletben egy adott [5]i koncentráció mellett méréssel v, reakciósebességet ál­ lapítunk meg, a további értékeléseknél ezeket tekintjük ismert állan­ dónak, és hozzájuk illesztjük az alkalmazott modell szerint a Vmax-ot és a Km-et (nem pedig fordítva, a mérési pontokat igazítjuk a kineti­ kai paraméterekhez). Minden egyes [Ójj-Vj mérési párhoz végtelen számú Fmax- és a K,„-érték tartozik, amely kielégíti a fenti egyenletet, de ezek mind a -[S]j és v; által egyértelműen definiált egyenesen fek­ szenek. Ha ugyanazzal az enzimmel több szubsztrátkoncentráció mellett végzett méréseket ily módon ábrázoljuk, akkor elméletileg az összes egyenes egy pontban metszi egymást, amely megfelel az enzimre jellemző V ^ - és a K m-értékeknek, ahogy ezt a 2-13. ábra főgrafikonja mutatja. Ez viszont erősen idealizált helyzet. A való­ ságban a kísérleti hibák miatt két-két egyenes metszéspontja kisebb-nagyobb mértékben eltér egymástól (2-13. ábra betét grafikon­

A z eddigiekben ismertetett eljárások egyszubsztrátos reakciókat katalizáló enzimekre vonatkoznak, de a reakciók többségében két szubsztrát szerepel: A +B — P+ Q . Ilyen esetben a kinetikai paramé­ terek meghatározásához két fázisból álló kísérleti megközelítést lehet használni. Első lépésként leegy­ szerűsítjük a vizsgálatot egyszubsztrátos modellre úgy, hogy egy adott [fi] mellett alkalmazzuk a Michaelis-Menten-egyenletet, amelyben most látszó­ lagos paraméterek szerepelnek, mert ezek csak a konkrét B koncentráció mellett érvényesek y f AA] v = "" - ——(a | szimbólum a paraméter látszólagos K i H A]o jellegét jelöli). A fentiekben ismertetett megközelíté­ sekkel így több [fi] mellett meg tudjuk határozni a

ja). így ebben a megközelítésben közvetlen statisztikai információ­ hoz is jutunk, hiszen nemcsak vizuálisan tájékozódunk a becsült pa­ raméterek szórásáról, de egyszerűen kiszámolhatjuk a paraméterek átlagértékeit és konfidenciatartományukat. További gyakorlati elő­ nye a direkt lineáris ábrázolásnak, hogy csak két szubsztrátkoncentrációval végzett mérésből megbízható kezdeti becslést nyerünk

2-13. ábra. A Michaelis-Menten-egyenlet direkt lineáris ábrázolása

és a í/™v értékeit. A látszólagos paraméterek Ki további értékelése és az enzimre jellemző, [fi]-tói füg­ getlen kinetikai paraméterek azonosítása egy második fázisban történik, amely viszont az enzim ismert vagy feltételezett hatásmechanizmusától függ. Ahogy álta­ lában kémiai reakcióknál a trimolekuláris mechaniz­ mus gyakorlatilag lehetetlen, mert azt feltételezné, hogy három különböző és random mozgó molekula egy időben azonos helyen tartózkodik és összeütkö­ zik, így a fenti séma szerinti reakcióban a két szub­ sztrát és az enzim nem egyszerre találkozik, hanem bi­ zonyos sorrendben lép kölcsönhatásba egymással. Aszerint, hogy az A és fi kötődése az enzimhez, vala­ mint a katalitikus lépés hogyan követi egymást, két különböző mechanizmust lehet megkülönböztetni. Az egyik lehetőség, hogy először az egyik szub­ sztrát kötődik az enzimhez, majd a másik szubsztrát (vagy meghatározott, vagy véletlenszerű sorrendben), és ebben a hármas komplexben történik a katalitikus lépés, a szubsztrátok átalakulása termékekké (sok

35

2. E N Z I M E K . K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

esetben csoportáthelyezéssel a szubsztrátok között, pl. hexokináz hatására foszfát kerül át ATP-ről glukózra, lásd szénhidrát-anyagcsere fejezet), majd a termékek leválnak az enzimről (2-14. ábra). Ezt a mechaniz­ must hármas komplex mechanizmusnak nevezzük, amely vagy meghatározott obiigát sorrend szerint zaj­ lik, ha alapállapotban az enzim csak egy szubsztrátkötő hellyel rendelkezik és a másik szubsztrátkötő he­ lye csak az első megkötése után alakul ki az enzim szerkezetében, vagy random sorrendben, ha az enzim alapállapotában is rendelkezik mindkét szubsztrátkötő hellyel. Ezt a mechanizmust más néven szekvenciális­ ként is szokták jelölni, de ez az elnevezés megtévesz­ tő, mert nem fejezi ki a különbséget az alábbiakban is­ mertetett mechanizmustól, amely szerint a szub­ sztrátok szintén egymás után kötődnek az enzimhez, de soha sem található mindkét szubsztrát egyszerre komplexben az enzimmel. Az alternatív mechanizmus szerint az első szub­ sztrát kötődését egy csoport áthelyezése követi a szubsztrátról az enzimre, amelynek eredményeként egy módosult enzimállapot jön létre {EX közti termék a 2-14. ábrán) és az első termék P keletkezik. Ezt kö­ vetően kötődik a másik szubsztrát, átveszi az EX-ről az átmenetileg odahelyezett csoportot, és így keletke­ zik a másik termék is. Ezt a reakciómodellt szubsztituált enzim mechanizmusnak nevezzük, vagy más néven ping-pong mechanizmusnak. Ennek tipi­ kus példája a transzaminázok hatásmechanizmusa (lásd 9. fejezetet).

1

F+A


EA EX+ P EXB E+ Q

szubsztituált enzim mechanizmus 2-14. ábra. Kétszubsztrátos enzim katalizálta reakció al­ ternatív mechanizmusai. A hármas komplex mechanizmus szerint az A és fi szubsztrát egymás után kötődik az enzimhez és ezt követően kerül sor a kémiai átalakulásra P és Q termékké. A szubsztituált enzim mechanizmus szerint az egyik szubsztrát (A) kötődése után keletkezik az első termék (P) és módosul az en­ zim [EX), amelyhez kötődik a másik szubsztrát (6) és keletkezik a másik termék (Q)

Vt

Amennyiben V ^x, K fm és a —^ értékei több [5]0 mellett kerülKm nek meghatározásra kísérletben, az egyes mechanizmusokra jellem­ ző és itt nem részletezett egyenletek segítségével a két szubsztrátra vonatkozó kinetikai paraméterek abszolút értékeit is meg lehet hatá­ rozni.

Az enzimek mint élettani rendszerek komponensei Az élő szervezetben az enzimek metabolikus utakba szerveződnek, amelyekben az egyik enzim terméke egy másik enzim szubsztrátjául szolgál. A metabolikus utakra jellemző, hogy a köztitermékek koncentrációi hosszabb távon állandó szinten vannak, és csak szabályozó hatásokra változnak, amikor átállnak egy másik állandó szintre. Ez az állapot viszont nem nevezhető egyensúlyinak, mert az egyes lépések­ re nem áll fenn a AG = 0. Az alapvető különbség az egyensúlyi állapothoz képest az, hogy az élő szervezet termodinamikailag nyitott rendszer, amely anyagokat fogad be és bocsájt ki, és ez érvényes minden egyes metabolikus útra is. A nyitott rendszer állandósult koncentrációviszonyainak jelölésére a stacionárius állapot („steady State”) fogalmát használjuk. e3

^2 10,01 0.01

± A

100 90

B
P

0,1

A fenti séma egy három reakcióból álló meta­ bolikus út példáján mutatja be, hogyan lehet elérni a steady-state állapotot. A nyilak melletti számok jelzik az adott reakció sebességét (tetszőleges egységben). Annak ellenére, hogy egyik reakció sincs egyensúly­ ban [az egyes lépések esetén az előre (ve) és a visszafe­ lé (v/,) menő reakciók sebessége eltérő], az összes köz­ tianyag koncentrációja állandó, mert az ellentétes irá­ nyú reakciók sebességkülönbsége azonos minden egyes lépésnél (10 egység). Ezt a különbséget meta­ bolikus áramnak is szokás nevezni (J = ve —v/,), és egy metabolikus úton belül ez szükségszerűen azonos minden lépésnél, mert bármilyen eltérés egyes közti­ termékek folyamatos felhalmozódásához, más közti­ termék folyamatos fogyásához vezetne: e változások

36

eredményeképpen az egyes lépések sebességei is fo­ lyamatosan változnának mindaddig, amíg a rendszer el nem érné a steady-state állapotot. Az E\ enzim akti­ vitása alacsony a soron következő reakciót katalizáló enziméhez képest, amely így gyorsan felhasználja az Ei termékét. így érthető miért jelentkezik 1000-szeres különbség a reakciósebességben az S —» A átalakulás két iránya között. Bár elvileg minden átalakulás meg­ fordítható, az £j-katalizálta reakciókhoz hasonlókat irreverzibilisnek tekintjük a metabolizmus szem­ pontjából, mert nagyságrendekkel szükséges változ­ tatni a reakciósebességeket ahhoz, hogy a nettó anyagáramlás megforduljon. Teljesen eltérő állapotot lehet megfigyelni az Ei enzimnél, ahol csak 10%-nyi eltérés jelentkezik az ellentétes irányú reakciók sebességében és így minimális sebességváltoztatással meg lehet for­ dítani a nettó anyagáramlást. A reakció reverzibilitás itt ismertetett enzimkinetikai értelmezése teljes össz­ hangban áll a 6. fejezetben szereplő termodinamikai koncepcióval, amely szerint a jelentős negatív AG-értékkel rendelkező reakciók irreverzibilisek, míg a nullához közeli AG-értékek a reverzibilis reakciókat jellemzik. Érdemes hangsúlyozni, hogy bár izolált re­ akcióban az enzim nem befolyásolja a AG értékét, metabolikus utakban, amelyek sorozatban kapcsolt re­ akciókból álló nyitott rendszerek, az eltérő enzimakti­ vitások a köztitermékek koncentrációin keresztül mó­ dosíthatják az egyes lépések AG értékeit változatlan AG'° mellett. Az enzim katalizálta reakciók reverzibilis vagy ir­ reverzibilis jellegének az ismerete nemcsak elvont el­ méletijelentőséggel bír, hanem megbízható gyakorlati támpont is lehet a reakció élettani szerepének vagy farmakológiai befolyásolhatóságának az értékelésé­ hez. Az irreverzibilis reakciók meghatározzák a me­ tabolikus folyamatok irányát. Ugyanakkor a fent tár­ gyalt háromlépéses sémából kiderül, hogy az irrever­ zibilis reakciókra kisebb, a reverzibilis reakciókra na­ gyobb enzimaktivitás jellemző a metabolikus útban. Tekintettel arra, hogy az enzimaktivitás arányos az en­ zim mennyiségével, az irreverzibilis reakciók jobb célpontjai lehetnek mind az élettani szabályozásnak, mind a farmakológiai beavatkozásoknak, hiszen ki­ sebb szabályozóanyag-koncentrációval lehet elérni a metabolikus áram kívánt változtatását (a fenti példá­

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

ban valószínűsíthető, hogy azonos metabolikus hatás elérése céljából az E2 gátlásához nagyságrendileg na­ gyobb inhibitorkoncentrációt kellene alkalmazni, mint a másik két enzim esetében). A reverzibilis re­ akciók viszont gazdaságosabb katalízist biztosítanak, hiszen egy enzimmel legalább két különböző meta­ bolikus út megvalósítását teszik lehetővé. A reverzibi­ lis reakciók további szerepe a metabolikus utakban, hogy ezeknél könnyen megvalósítható a pozitív AG'°-val járó átalakulások spontán lefolyása. A 6. fe­ jezetben ismertetésre kerül az egyik lehetőség a ter­ modinamikai korlát kiküszöbölésére (endergonikus és exergonikus reakció társulása egy enzim katalizálta lépésben negatív eredő AG'°-val), amelyet az elektro­ mos kapcsolási sémák analógiájára párhuzamos kap­ csolásnak lehet nevezni. Mivel a reakció spontán lefo­ lyása nem a AG'° értékétől, hanem a metabolikus út­ ban érvényesülő aktuális Gibbs-féle energiaváltozás­ tól függ, a AG = AG'° +RT•In— kifejezés még egy [S] lehetőséget kínál az endergonikus problémák megol­ dására. Amennyiben a szubsztrát (S) koncentrációja kellő mértékben nagyobb, mint a termék (P) koncent­ rál rációja a RT -In— tag negatív és abszolút értékben [S] nagyobb lehet, mint a pozitív AG'°. Ilyen helyzetet te­ remthet egy reverzibilis reakció soros kapcsolása a metabolikus útban, amelyre a 2-4. táblázat mutat be egy példát. A soros kapcsolás kínálta lehetőségeknek határt szabnak a szervezeten belül megvalósítható metabolitkoncentrációk. így például ha a glukóz foszforilációja nem a 2-4. táblázatban szereplő hexokináz

2-4. táblázat. Sorosan kapcsolt reakciók a metabolizmusban. A glikolízis három egymást követő reakciójának standard és aktuális Gibbs-féle energiaváltozása. A sejtben ak­ tuálisan beállt hexokináz/foszfofruktokináz-1 aktivitásarány­ nak köszönhetően, a glukóz-6-foszfát-izomeráz szubsztrát/ termék koncentrációarány olyan, hogy az aktuális AG negatív a pozitív standard érték ellenére AG'° kJ/mol

AG kJ/mol

Reakció jellege

-20,9

-27,9

irreverzibilis

gIukóz-6-foszfát- izomeráz

+2,1

-1,3

reverzibilis

foszfofruktokináz-1

-17,1

-26,5

irreverzibilis

Enzim hexokináz

37

2. E N Z I M E K . K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

katalizálta reakcióban glukózból és ATP-ből kiindul­ va történne, hanem glukózból és anorganikus foszfát­ ból, a reakció AG'° értéke +13,8 kJ/mol lenne. Ennek spontán lefolyásához a glukóz-6-foszfát és anorgani­ kus foszfát tipikus intracelluláris koncentrációi mel­ lett 1,6 M értékre kellene emelni a glukóz koncentráci­ óját, ami ozmotikus hatásánál fogva tönkre tenné a sejtet (a legtöbb glukózt felhasználó sejtben a szabad glukóz koncentrációja 10—100 pM). Az alternatív megoldás, a glukóz-6-foszfát nagymértékű koncentrá­ ciócsökkentése pedig megfosztaná az azt felhasználó enzimeket szubsztrátjuktól. Ezért ilyen metabolikus átalakulásoknál csak a párhuzamos kapcsolás (más re­ agensekből kiindulva, enzim katalizálta reakcióban) célravezető biológiai rendszerekben. Az eddigi tárgyalásból is kiderült, hogy a kinetikai paraméterek ismerete akkor nyer értelmet, ha az segíti releváns biológiai kérdések megválaszolását. A fent bemutatott példák mellett (metabolikus út fiziológiás szubsztrátjának azonosítása, egyirányú enzimműkö­ dés értelmezése) még egy ilyen jelentős alkalmazás a metabolikus utak szabályozott pontjainak az azonosí­ tása. A ^3

2

10,01 0.01

± A

100

B
P

kíteni, ha megvizsgáljuk az in vivő szubsztrátkoncentráció és az enzim Km közötti viszonyt. Az ed­ digi tárgyalás során a reakciósebesség alakulását vizs­ gáltuk a szubsztrátkoncentráció függvényében, ami követi a biokémiai kísérletek logikáját, ahol a kísérle­ tező személy állítja be a körülményeket és arra keresi a választ, hogyan alakul az enzimaktivitás különböző szubsztrátkoncentrációk mellett. In vivő viszont a for­ dított kérdés releváns (hogyan alakulnak a szub­ sztrátkoncentrációk a metabolikus utakban különböző enzimaktivitások mellett), mert az élőrendszer az en­ zimaktivitásokat állítja be, és ezek arányától függően alakulnak a köztitermékek koncentrációi a metabo­ likus utakon belül. Ennek megfelelően célszerű más szemszögből megnézni a Michaelis- Menten-összefüggést. A 2-15. ábra a Michaelis-Menten-egyenletnek a következő átrendezett formájának megfelelő görbét

mutatja

be

[—k_ = V^ ^ max Km 1 - v / F max

amit

a

\S]

1 = -------------formában is lehet felírni a jobb átteK m VmJ v - 1

kinthetőség érdekében. Az ábráról leolvasható, hogy az, ami in vitro kísérletben jelentéktelen hatásnak tű­ nik (2,5%-nyi szubsztrát koncentrációemeléssel 0,64% sebességváltozást detektálunk, satírozott rész a betétábrán), hatékony szabályozási eszköz lehet in vivő. Ha változatlan metabolikus áram mellett, ami ál-

2-15. ábra. A Michaelis-Menten-összefüggés alternatív ábrázolása. A szubsztrát-koncentrációt Kmegységben, a reakció sebességet l/max egységben ábrázol­ tuk. A betétábra a Michaelis-Menten-egyenlet hagyományos ábrázolását mutatja be, a főgrafikonon felcseréltük az [S] és v tengelyeket

38

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó I A

landó v-ként jelentkezik, az enzim koncentrációja 2,5%-kal nő, ami a Vmax emeléseként nyer kifejezést az utóbbi egyenletben, akkor a szubsztrátkoncentráció 5-ször nagyobb mértékben (12,6%-kal) csökken (satí­ rozott rész a föábrán). Tehát a relatíve alacsony in vivő Fmax-aktivitást mutató enzimek közül azokat lehet fi­ ziológiás vagy farmakológiai eszközökkel hatéko­ nyan szabályozni, amelyek közel telítve vannak szubsztrátjukkal. Hangsúlyozni kell, hogy az izolált enzimekre vonatkozó adatok alapján csak becsülni le­ het azok szabályozó szerepét. Egy enzim aktivitásvál­ tozásának tényleges hatását a metabolikus áramra csak az intakt sejtekben végzett közvetlen mérésekkel lehet igazolni. E rendszerszintű hatás kvantitatív jel­ lemzésére az ún. metabolikus kontroll együtthatót (CE) lehet használni. A metabolikus vezérlési (kontroll) együttható számszerű megha­ tározásához

a

következő

egyenletet

lehet

C l _ ÓT— •T ^ ~T = ÉT— TllTl ah0i £■' az együttható, (E2- E t) / E 2 (E2 - E l)J2

használni: és E2 az

enzimaktivitás két szinten, J\ és J2 pedig az adott enzimaktivitáshoz tartozó metabolikus áram. A metabolikus kontroll együttható azt fe­ jezi ki, hogy milyen relatív változás (J 2 - J 2) / J 2 következik be a metabolikus út anyagáramlásában, amikor (E2 - E t) / E2 relatív vál­ tozás történik az enzimaktivitásban.

Amennyiben az anyagáram relatív változása meg­ egyezik az enzimaktivitás relatív változásával (CE =1), akkor az adott enzim határozza meg a teljes metabolikus út anyagáramlását, és az az enzim lenne a klasszikus értelemben vett sebességmeghatározó en­ zim. Figyelembe véve a metabolikus utak komplex szerkezetét, nem életszerű elképzelés, hogy mindig egyetlenegy enzimtől függ milyen szintre állnak be a köztitermékek koncentrációi egy soklépcsős folya­ matban, és hogy az egész folyamat aktivitása követi ennek az enzimnek az aktivitását. Inkább az a helyzet áll fenn, hogy az egyes enzimek eltérő metabolikus kontroll együtthatóval járulnak hozzá a metabolikus út vezérléséhez, és ez a helyzet jut kifejezésre az ún. szummációs tételben, amely szerint a metabolikus út összes enzime metabolikus kontroll együtthatóinak az összege 1. A metabolikus kontroll analízisben nem az a helyes kérdés, hogy melyik enzim határozza meg a

metabolikus út aktivitását, hanem milyen mértékben befolyásolja egy enzim az anyagáramot a metabolikus útban. Mivel ilyen információhoz csak intakt élő sej­ tekben nehezen végezhető vizsgálatokkal lehet hozzá­ jutni, egyelőre kevés metabolikus út esetében ismer­ tek a metabolikus kontroll együtthatók. A 2-5. táblá­ zat a vázizom glukózfelhasználásának két útvonalára (glikolízisre és glikogénszintézisre) vonatkozó adatait mutatja be. Ez a példa illusztrálja, hogy az egyes enzi­ meknél érvényesülő szabályozó hatások nem feltétle­ nül állnak arányban a metabolikus útban betöltött ve­ zérlő szerepükkel (pl. foszfofruktokináz-1 vagy glikogén-szintáz metabolikus kontroll együtthatója, és a szénhidrát-anyagcsere fejezetben részletesen tárgyalt szabályozásuk). Az alacsony metabolikus kontroll együtthatóval rendelkező enzimek szabályozása első­ sorban az útvonalon belüli metabolitkoncentrációk fenntartásához szükséges. A 2-5. táblázatról az is le­ olvasható, hogy ha egy enzim eltereli a metabolikus út valamelyik köztitermékét más irányba (a példában a glukóz-6-foszfátot glikolízis irányába, ennek részlete­ it lásd a 7. fejezetben), akkor a hatás negatív meta­ bolikus kontroll együtthatóval fejezhető ki, ami azzal is jár, hogy más enzim metabolikus kontroll együttha­ tója 1-nél nagyobb értéket is felvehet, de a szummá­ ciós tétel továbbra is érvényes marad. Érdemes megje-

2-5. táblázat. Metabolikus kontroll együtthatók (CJ) a glukózt felhasználó metabolikus utakban vázizomban (Puigjaner J, et al, FEBS Lett 1997; 418:47-52; Chase JR, et al, Am J Physiol Endocrinol Metab 2001; 280:E598-E607). A glikogén­ szintézis esetében az első érték olyan állapotra vonatkozik, amikor a glikolízis az összes glukóz 15%-át használja fel, a má­ sodik érték pedig olyan állapotra, amikor 50%-át Metabolikus út Glikolízis első szakasza (glukóz —> triózfoszfátok)

Enzim vagy enzimek cso­ portja

CJ

hexokináz

0,81

glukóz-6-foszfát-izomeráz

0,01

foszfofruktokináz-1

0,17

aldoláz

0,01

Glikogénszintézis glukóztranszporter + hexokináz

1,16 - 1,10

glikogén-szintáz

0,01 - 0,45

glikolízis enzimjei

-0,17 - -0,55

39

2. E N Z I ME K . K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

gyezni, hogy eltérő fiziológiás állapotokban egyes en­ zimek metabolikus kontroll együtthatója jelentősen változhat (pl. glikogén-szintáz a 2-5. táblázatban a glikolitikus aktivitás függvényében). Ezért nem meg­ lepő, hogy egy metabolikus úton belül több szabályo­ zott enzim is megtalálható, és ezek relatív vezérlő sze­ repe változik a sejt állapotától függően.

2.4

AZ E N Z IM A K T IV IT Á S SZABÁLYOZÁSA

aktivitását (abszolút gátlás) vagy csökkent aktivitást mutat (parciális gátlás). A gátlás erőssége a fenti egyensúlyra vonatkozó K . =

[EI]

állandóval (az ín-

hibitor disszociációs egyensúlyi állandója) jellemez­ hető és az inhibitor hatás megszüntethető a szabad in­ hibitor eltávolításával (kísérleti körülmények között dialízissel vagy hígítással), mert ilyenkor a fenti egyensúly a szabad enzim irányába tolódik el.

Reverzibilis inhibitorok

A fejezet bevezető részében kiderült, hogy az en­ zimműködés alapvető tulajdonsága a szabályozhatóság, amely biztosítja az enzimaktivitás alkalmazkodá­ sát az élő szervezet változó igényeihez. A mechaniz­ mustól függően ez a szabályozás különböző időskálán történik (2-16. ábra). A leggyorsabb hatás a szabályo­ zó anyag (ligand) kötődése az enzimhez, amely gya­ korlatilag rögtön (az enzim katalitikus ciklusához ké­ pest rövidebb idő alatt) csökkenti az enzimaktivitást (inhibitor hatás) vagy növeli ezt (aktivátor hatás). Nagyságrendekkel hosszabb időt igényel az enzim ko­ valens módosítása (pl. egyes aminosav-oldalláncok foszforilálásával) vagy új enzim molekulák szintézise. A ligandkötődés során a regulátor anyag (R) rever­ zibilis komplexet alkot az enzimmel

Hatásmechanizmusuktól függően, a reverzibilis in­ hibitorok eltérően befolyásolják az enzimek kinetikai paramétereit, és a paraméterek változása alapján lehet jellemezni az inhibitor biológiai és farmakológiai ha­ tékonyságát. Elsőként olyan inhibitorok váltak ismert­ té, amelyek a szubsztrátok vagy termékek szerkezeti analógjai és az aktív centrumot blokkolva gátolják az enzim működését. Mivel ez az inhibitor verseng a szubsztráttal ugyanazért a kötőhelyért, kompetitív in­ hibitornak nevezzük. A kompetitív inhibitor reverzi­ bilisen kötődik kizárólag a szabad enzimhez az alábbi séma szerint, amelyben az E l komplex egyáltalán nem köt meg szubsztrátot (abszolút gátlás): El A K

> ER,

E +R

amelynek aktivitása eltér a szabad enzimétől. Inhibi­ tor (7) esetében az E l komplex vagy teljesen elveszíti az enzim szintézise az enzim ligandumot köt

a metabolit áthalad a sejten keresztül

az enzim katalitikus ciklusa

10-4 1CT: 1tr­

az enzim kovalens módosítása

a metabolikus út steady-state állapota más szintre áll be

ió-1

1

101

102

103

E < + 1

± ES-

Ha az inhibitor disszociációs állandó Kic (a c az indexben a gátlás kompetitív jellegére utal) felhasználásával a fenti rendszerre levezetjük a Michaelis-Menten-egyenletet v

104

időskála (másodperc) 2-16. ábra. Enzimműködéshez kötődő események időtartama. A színes hasábok az egyes jelenségek tipikus időtartományát jelölik

-> E + P

r L - [ S ] , a követkeKi + [sí

ző összefüggéseket kapjuk a látszólagos kinetikai paraméterek (a f szimbólum a paraméter látszólagos jellegét jelöli) és az inhibitor koncentrációja [7] között

40

I . A F E H É R ) É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

Vrmax

V'max =V max 1

=

Ki

1+ U ] / K ic

Vagyis változatlan Umax mellett a kompetitív inhi­ bitor (l + [/]/ K ic) faktorral csökkenti a specificitási állandót (vagy a hagyományos egyenlet szerint a Michaelis-állandót növeli ugyanilyen faktorral). A ma elfogadott definíció a kinetikai paraméterekre gyakorolt hatás alapján határozza meg egy reverzibilis inhibitor kompetitív jellegét, és nem utal sem az inhi­ bitor szerkezetére, sem hatásának helyére. Mivel a kompetitív inhibitorok nem módosítják a katalitikus állandót, kellően magas szubsztrátkoncentrációk mel­ lett a gátlás felfüggeszthető (a fenti séma szerint ilyen­ kor nem áll rendelkezésre szabad enzim, amelyhez az inhibitor kötődhet). Másképpen fogalmazva, a kom­ petitív inhibitorok csak olyan szubsztrátkoncentrációtartományban hatékonyak, ahol a specificitási állandó határozza meg az enzim hatékonyságát. A reverzibilis gátlás másik szélsőséges esetét az az inhibitor képviseli, amely csak az enzim-szubsztrát komplexhez kötődik, a szabad enzimhez nem az alábbi séma szerint: ESI A Kni S + E E S --------- >E + P + /

Ez utóbbit unkompetitív inhibitornak nevezzük (erre utal az u index a fenti sémában szereplő Kiu egyensúlyi állandó jelölésében). Unkompetitív inhibi­ tor vonatkozásában a következő összefüggéseket kap­ juk a látszólagos kinetikai paraméterek és az inhibitor koncentrációja [/] között: V.. 1+

Vmax K.

Ki

K

k l

__

Vagyis változatlan specificitási állandó mellett az unkompetitív inhibitor (1 + [/] / K iu) faktorral csök­ kenti a Umax értékét és emellett ugyanilyen faktorral csökkenti a látszólagos Km értékét is. A kinetikai pa­ raméterek változásai jelzik, hogy az unkompetitív in­ hibitorok olyan szubsztrátkoncentráció-tartományban hatékonyak, ahol a katalitikus állandó (vagyis a Umax) határozza meg az enzim hatékonyságát (telítéshez kö­ zeli szubsztrátkoncentrációk). A -érték-csökkenés mellett az unkompetitív gátlás egy másik aspektusa, hogy a szubsztrátkoncentráció emelésével az enzim egyre nagyobb arányban kerül gátolt állapotba, hiszen egyre több az ES komplex, amihez kötődik az unkom­ petitív inhibitor. Az alábbi séma egy általánosabb lehetőséget szem­ léltet, amely szerint az inhibitor mind a szabad enzim­ hez, mind az enzim-szubsztrát komplexhez kötődik, de eltérő erősséggel, amely a Kic és Klu állandókban nyer kifejezést:

S + El
ESI

A

/\ K

IC

\f

V

S+E < + I

>E + P

> ES + I

A szubsztrát kötődhet az El komplexhez, de az nem rendelkezik katalitikus hatással. Ebben a modellben a következő összefüggéseket kapjuk a látszólagos kine­ tikai paraméterek és az inhibitor koncentrációja [7] kö­ zött

v L =■ 1+ [ I]/ K L

Vl Ki

v

J

III

1 y 1+ \ I ] I K U

Vagyis ebben az esetben az inhibitor mind a f'max-ot, mind a specificitási állandót csökkenti (1 + [/] / K ju), illetve (1 + [/] / K ic) faktorral. Ezt a gát-

41

2. E NZ I ME K . K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

lástípust kevert típusú gátlásként jelöljük. A kevert típusú inhibitor definíciójánál egyértelmű a specificitási állandó használatának az előnye, hiszen a Km-re gyakorolt hatás változó, a Kic és Klu arányától függően

telnek számít (bár gyakran összetévesztik az alábbiak­ ban ismertetett irreverzibilis gátlással).

a K'í = K ^ + W ^ ic) n5[iet vagy csökkenhet. Az " m(l + U V K J

Irreverzibilis inhibitorok

inhibitor elnevezése abból ered, hogy ez az általános mechanizmus a két szélsőséges (kompetitív és unkompetitív) gátlásmód keverékeként értelmezhető (2-6. táblázat).

Az irreverzibilis inhibitorok hatását nem lehet fel­ függeszteni a gátlószer eltávolításával (kísérleti körül­ mények között dialízissel vagy hígítással), ezért inaktivátoroknak is szokás nevezni. Általában ezek az inhibitorok kovalensen módosítják az enzim esszenci­ ális funkciós csoportját, de néha egyszerű kötődés áll a gátlás hátterében, amelyet nem lehet visszafordítani észszerű időn belül (pl. nehézfémionok). Annak isme­ rete, hogy melyik ion vagy szerves vegyület gátol egy enzimet, felhasználható az enzimműködés szempont­ jából kritikus szerkezeti csoportok azonosításához (pl. Hg2+-vegyületek vagy jodoacetát gátló hatása szulfhidrilcsoportok szerepére utal az enzim katalitikus ak­ tivitásában). Mivel azonos fúnkciós csoportok több enzim működéséhez esszenciálisak, az ilyen nemspe­ cifikus gátlószerek hatása inkább katalitikus mérge­ zésként értelmezhető. Orvosi szempontból (élettani regulátorként vagy terápiás szerként) a specifikus, ún. mechanizmus alapú inhibitorok szerepe jelentős. Ezek az anyagok szuicid szubsztrátként viselkednek: komp­ lexet alkotnak az enzimmel, de ennek kialakulását nem termék keletkezése követi, hanem olyan kémiai módosítás

2-6. táblázat. Reverzibilis inhibitorok osztályozása. A táblázatban megjelölt kinetikai paraméterváltozások defini­ álják a gátlás típusát. A t szimbólum a Michaelis-Mentenegyenletben szereplő paraméterek látszólagos (inhibitor mel­ lett mért) jellegére utal Gátlás típusa

max

Ki

KL

Án (specificitási állandó) kompetitív

nem változik

csökken

nő

unkompetitív

csökken

nem változik

csökken

kevert típus

csökken

csökken

nő vagy csök­ ken

non-kompetitív csökken

csökken

nem változik

Tehát a kevert típusú gátlásban egy kompetitív (vagy a specificitási állandót csökkenő hatás miatt specificitásinak is nevezett) komponens és egy unkompetitív (vagy a Fmax-ot csökkenő hatás miatt kata­ litikusnak is nevezett) komponens jelentkezik. Az előbbit a Kic, az utóbbit a Kiu állandó jellemzi. Elméle­ tileg előfordulhat az a kivételes helyzet, hogy Kic = K m és a kevert típusú inhibitorra leírt összefüg­ gésekből az következik, hogy ebben a speciális eset­ ben a Kmnem változik az inhibitor hatására. Azt az in­ hibitort, amely csökkenti a Vmax-ot és a specificitási állandót változatlan K,„ mellett, non-kompetitív in­ hibitornak nevezzük. Tekintettel arra, hogy a szabad enzim és az enzim-szubsztrát komplex nem azonos molekuláris identitás, nem valószínű, hogy egy anyag azonos affinitással kötődik mindkét molekulához, így a non-kompetitív inhibitorhatás is inkább ritka kivé­

E +I
El ----- 2—> £ ,

Ái amely során az enzim E ’inaktív formája jön létre (erre a korábban ismertetett szerpin hatásmód szolgáltat egy példát). Mivel az irreverzibilis inhibitor csökkenti az aktív enzimmolekulák számát, ez a hatás a Fmax = kcat ■[E] csökkenéseként jelentkezik, a nem érintett enzimmo­ lekulák pedig változatlan tulajdonságokkal szerepel­ nek a reakcióban. így ha nem vizsgálják a reverzibilitás kérdését, az irreverzibilis inhibitor könnyen össze­ téveszthető a non-kompetitív gátlással (csökkent Fmax változatlan Km).

42

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

Az enzimgátlás farmakológiai vonatkozásai

Az ábrán szereplő görbe a Michaelis-Mentenegyenlet átrendezett formáját ábrázolja:

Az orvosi gyakorlatban alkalmazott gyógyszerek jelentős része enziminhibitor. A reverzibilis gátlósze­ rek hatását az eddig tárgyalt inhibitor disszociációs ál­ landókkal lehet precízen jellemezni. Gyakorlati alkal­ mazásuknál viszont nem feltétlenül szükséges a pon­ tos gátlásmechanizmust ismerni. Ezért a gyógyszerha­ tékonyság becsléséhez gyakran az ún. /Cso-értéket használják, amely azt az inhibitorkoncentrációt jelöli, amellyel az enzimaktivitás 50%-os csökkentését lehet elérni. Természetesen ez a koncentráció az inhibitor Kic és KiU állandóitól függ, de meghatározása jóval egyszerűbb, mint az inhibitor disszociációs állandók vizsgálata.

[H Km

v / V ,+ [S]0 1 . , ------- ——, amit a ----- = ------------- formal - v / V max Km rVmax / v —1

bán is lehet felírni. Ha ebbe az egyenletbe behelyette­ sítjük az inhibitor jelenlétében érvényesülő V ^ x és K m f kifejezéseket, a következő összefüggéseket kapjuk: kompetitív inhibitorral: [S], _ ! + [ / ] / K ic Km

Vm / v - l

unkompetitív inhibitorral: [S]0 _ Km

1 Vm / v - l - [ I ] / K lu

Érdemes közelebbről is megnézni ezt az összefüggést, mert az rávilágít az /C 50 helyes használatára. A legáltalánosabb, a kevert tí­ pusú gátlásnál levezett reakcióegyenletet IC$qkoncentrációra vonat­ koztatva a következő formában lehet felírni:

’ 0

K m(1 + IC 50 l K k ) + [S ](1 + /C 50 / K J ’

V •\S] ahol vn = —1—----- - az inhibitor nélkül mért reakciósebesség egy adott [5] szubsztrátkoncentráció mellett. E két egyenletből kapjuk az K + rS 1 IC50-re vonatkozó kifejezést /C 50 = --------- -------------- , amely jelzi, K m 1 K ic +

[S 1/ K

iu

hogy az /C 50 kiválóan alkalmas inhibitorok hatékonyságának az

A két összefüggés nemcsak egyszerűen matemati­ kailag tér el egymástól, hanem alapvető különbsége­ ket jelez az in vivő következményeket illetően. A kompetitív inhibitor koncentrációjának emelése a szubsztrátkoncentrációt növeli a metabolikus út állan­ dó anyagárama mellett (2-17. ábra). Ezért a kompeti­ tív inhibitorokkal a metabolikus utak finom, az alkal­ mazott dózissal arányos befolyásolása lehetséges (ilyenek például az orvosi gyakorlatban széles körben alkalmazott statin típusú gyógyszerek, amelyek a ko­ leszterinszintézist döntően meghatározó 3-hidroxi-3-

összehasonlítására, hiszen ha azonos enzimet azonos szubsztrát­ koncentráció mellett vizsgálunk, értéke kizárólag az inhibitor diszszociációs állandóktól függ. Arra viszont az IC 50 koncentráció már nem alkalmas, hogy rekombináns eljárással termelt enzimek vagy természetes mutáns enzimek inhibitorérzékenységét hasonlítsuk össze, mert ilyen esetekben az /Cso-különbségek eltérő ^„-értékek­ ből is adódhatnak.

A reverzibilis inhibitorok működésében jelentkező kompetitív (specifícitási) és unkompetitív (kataliti­ kus) hatásokat érdemes megkülönböztetni, mert eltérő alkalmazásokra adnak lehetőséget. Ezek jelentőségét az élő szervezetben akkor tudjuk helyesen értékelni, ha továbbvisszük azt a gondolatmenetet, amit a 2-15. ábra kapcsán feltett kérdéssel vezettünk be (hogyan alakul a szubsztrátkoncentráció különböző enzimakti­ vitások mellett?).

2-17. ábra. Kompetitív inhibitor (/) hatása a szubsztrát­ koncentráció alakulására állandó v=0,51/max reakciósebes­ ség mellett

43

2. E N Z I ME K . K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

metil-glutaril-CoA-reduktáz kompetitív inhibitorai, lásd 8. fejezetet). Ezzel szemben az unkompetitív hatás drasztikus következményekkel járhat, hiszen az inhibitorkon­ centráció negatív előjellel szerepel a nevezőben. így magas inhibitorkoncentráció mellett a nevező 0 érté­ ket is felvehet, ami metabolikus katasztrófaként fog­ ható fel, mert azt jelentené, hogy a gátolt enzim szubsztrátja végtelen koncentrációt ér el (2-18. ábra), és ráadásul a korábban tárgyalt mechanizmus szerint az emelkedő szubsztrátkoncentráció tovább fokozza a gátlás fokát. Ez magyarázza például a rendkívüli haté­ konyságát a glifozát nevű („Roundup”) herbicidnek, amely egy növényenzim unkompetitív inhibitora. A fenti elemzés rámutat arra a tényre, hogy unkompe­ titív inhibitorokkal erőteljesebb farmakológiai hatáso­ kat lehetne elérni, mint kompetitív inhibitorokkal, de terápiás tartományuk nagyon szűk. Ezért ilyen inhibi­ torok ritka kivételként fordulnak elő az orvosi gyakor­ latban (pl. a psychosis maniacodepressivában használt litiumkészítmények). A fent jelzett előnyük ellenére a kompetitív inhibitorok in vivő hatékonyságát korlá­ tozza az a tulajdonságuk, hogy emelkedő szub­ sztrátkoncentráció mellett hatásuk felfüggeszthető. A metabolikus úton belül pedig folyamatos szubsztrátutánpótlás esetén egy enzim gátlása óhatatlanul a szubsztrát felszaporodásához vezet, ami mérsékli a kompetitív gátlás fokát. Ilyen hatás nem érvényesül ir-

[/ K 2-18. ábra. Unkompetitív inhibitor (/) hatása a szubsztrát­ koncentráció alakulására állandó v=0,5IZmax reakciósebes­ ség mellett

reverzibilis gátlás esetén, ezért a terápiásán alkalma­ zott enziminhibitorok többsége a mechanizmus alapú inaktivátorok csoportjába tartozik.

Az enzimek aktiválása. Nemkovalens módosítások Az enzimhez reverzibilisen kötődő ligandokat, amelyek növelik az enzimaktivitást, aktivátoroknak nevezzük. Ezek hatását a reverzibilis inhibitorokhoz analóg módon tudjuk modellezni; pl. az alábbi séma szerint az enzim csak a regulátor anyag (R) kötődése után nyer aktivitást: k\ k’ S + ER < > E S R ------ ER +P k ’-1 A K K X

V

E + R

Ez a modell hasonlít a kompetitív inhibitoroknál alkalmazott sémára: a regulátor anyag a szabad enzim­ hez kötődik és megváltoztatja aktivitását (ebben az esetben ez aktivációt jelent). A formális hasonlóság ellenére alapvető különbség adódik az inhibitor és az aktivátor kötődési helyét tekintve. A kompetitív gátlás mechanizmusa könnyen értelmezhető szterikus ténye­ zőkkel, mivel a kompetitív inhibitorok általában ugyanott kötődnek az enzimhez, ahol a szubsztrát is, és a két molekula nem lehet egyszerre ugyanazon a he­ lyen. Aktivátor esetében viszont nehezen képzelhető el, hogy jelenléte a szubsztrátkötő helyen feltétlenül szükséges a szubsztrát kötődéséhez. Ezért a reverzibi­ lis aktivátorok elsősorban alloszterikus helyeken ke­ resztül érvényesítik hatásukat. Az alloszterikus helyek olyan helyek az enzimmolekula szerkezetében, ahol kis molekulák kötődnek, és ennek következtében az enzim konformációja megváltozik (2-19. ábra). A megváltozott konformáció funkcionális következ­ ménye lehet akár aktiválás, akár gátlás (ezért a továb­ biakban alloszterikus regulátorokként említjük ezeket a ligandokat). Az alloszterikus helyek gyakran külön

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

44

szabályozó alegységekben találhatók, és így az alloszterikus regulátorok a negyedleges fehérjeszerkezet módosításán keresztül érvényesítik hatásukat, de az allosztéria a katalitikus alegységen belül is érvénye­ sülhet, ahogy ezt a 2-19. ábra is jelzi.

alloszterikus regulátor ln[R]

alloszterikus kötőhely

2-20. ábra. Egyszerű és kooperatív kötődések telítési gör[R]

béi. A szenzitivitási index S = — — azt fejezi ki, hogy hányszoro[« lo ,i

aktív centrum 2-19. ábra. Alloszterikus hatás az enzim szabályozásában

Amennyiben a regulátor molekulák (R) az egysze­ rű E+R
ER

sára kell emelni a ligand koncentrációját ahhoz, hogy az enzim telítése (azaz a módosított enzim aránya az összmennyiséghez képest) 10%-ról 90%-ra emelkedjen (a nyíllal jelzett telítésválto­ zás). Ha [R]0, mellett [Ffi] = 0,1-[F] 0 és [R] 0,9 mellett [ER] = 0,9-[F]0, , [ER] [/?] akkor az egyszerű kötődésre érvényes egyenlet —— = —— — [c]0 Kd + |KJ alapján kiszámolható, hogy 5 = 81 (azaz a regulátor koncentráció­ ja 81-szeresére nő, amit a világosabb színnel satírozott tarto­ mány jelöl). Pozitív kooperativitás esetén az S csökken, vagyis a ligand kisebb koncentrációváltozással azonos aktivitásváltozást ér el, és az enzim érzékenyebb a szabályozásra (a sötétebb szín­ nel satírozott tartományban a kooperativitás miatt a regulátor koncentrációja csak 3-szorosára szükséges emelni azonos telítés eléréséhez). A h paraméter a Hill-együtthatót jelöli

kötődési séma szerint lépnek kölcsönhatásba az enrzrDl

zimmel (E), az enzim telítése ------ (a módosított és az [E] o összes enzimmolekulák aránya) és a szabad regulátor koncentrációja között a következő összefüggés áll fenn [ E\

= — — — 5amelyet a disszociációs állandó K d +[R]

alapegyenletének (K d =

^

^ ^ —) átrende­

zésével nyerünk. Mivel az enzim- regulátor komplex eltérő aktivitással rendelkezik a szabad enzimhez ké­ pest, a telítés egyben az aktiválás vagy gátlás fokát is

jelzi. A 2-20. ábrán bemutatott példa szerint ez a hi­ perbolikus összefüggés azt jelenti, hogy 9-szeres enzimaktivitás-változáshoz 81-szeresére szükséges emelni a regulátor koncentrációját. Az ábra bonyolul­ tabb kötődési sémák következményeit is bemutatja, amelyek érzékenyebbé teszik az enzimet az inhibitor vagy aktivátor hatására (81-szeres helyett csak 3-szoros regulátor koncentrációváltozással érik el ugyanazt a hatást). Ezek követik az ún. kooperativitás elvét, amely több alegységből álló enzimeknél úgy érvénye­ sül, hogy a ligand kötődése az egyik alegységhez meg-

2-21. ábra. A kooperativitás szimmetria modellje két alegységből álló enzim esetében. Az enzim alegységei két konfor mációt vehetnek fel, R és T, de egyszerre a két alegység csak azonos konformációban lehet (fl2 vagy T2). A ligand (L) kezdeti kötő­ dése a T2 formához eltolja a V2 R2 egyensúlyt az R konformáció irányába, amihez a következő ligandmolekula már nagyobb affini­ tással kötődik

2. E NZI MEK. K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

45

változtatja a többi alegységhez történő kötődést: ezek­ hez az újonnan belépő ligand vagy erősebben (pozitív kooperativitás), vagy gyengébben (negatív kooperativitás) kötődik. Az egyik legegyszerűbb modell, amely magyarázza a kooperativitást, az ún. szimmetria mo­ dell (2-21. ábra). Két alegységre vonatkozó változata szerint az alegységek két konformációban léteznek, R („relaxed”) és T („tense”), de mindkettő csak azonos konformációban lehet, vagyis az enzim csak R 2 és T2 formában létezik (R E-ként már nem), és a kettő között egyensúly áll fenn. A ligand kezdeti kötődése a T2 for­ mához eltolja a ligand-T2 ligand-R2 egyensúlyt az R konformáció irányába, amihez a ligand már erő­ sebben kötődik, létrehozva a (ligand)2-/£? telített for­ mát. így a ligandkoncentráció emelésével folyamato­ san nő a nagyobb affinitással történő kötődés relatív aránya. Ennek következménye, hogy míg az egyszerű E +R
ER A,

kötődés esetében ben

[£]o

[£*] m , addig kooperatív kötődés eseté­ m Kd+[R]

^ 1 ; amely összefüggéshez empirikus úton A ' + [2?J'

Archibald Hill jutott el az oxigén-hemoglobin kölcsönhatás tanul­ mányozása során, és ezért a h paramétert Hill-együtthatónak nevez­ zük (a K állandó fizikai tartalma változik az alkalmazott modelltől függően). A két kötődés eltérő következményeit a 2-20. ábra mutat­ ja be: kooperativitás esetén azonos telítésváltozást jóval kisebb ligand koncentrációváltozással lehet elérni. Vagyis kooperatív kötő­ déssel az enzim érzékenyebb az inhibitor vagy aktivátor hatásokra. A kooperativitás erősségét a Hill-együttható jellemzi, amelyet viszonylag egyszerűen lehet meghatározni, ha az egyenletet átrendezzük, és az így nyert

[£*]

[*í

[E l

K h+ [R f

[A]*

[El-[ER]

= 1—f- egyenlet Kh

\ FR\

logaritmikus formáját használjuk lg------ = h • lg[2?]- h ■lg A. Tehát [E] ha különböző ligandkoncentrációk mellett meghatározzuk a kötött és szabad enzim arányát, a két változó logaritmusa között lineáris összefüggés áll fenn és a Hill-együttható adja ezen egyenes mere­ dekségét. Pozitív kooperativitás esetén a Hill-együttható 1-nél na­ gyobb értékeket vesz fel (általában legfeljebb 4-ig), míg 1-nél kisebb h negatív kooperativitást jelöl. Az így meghatározott Hill-együttható empirikus jellegű és értékéből nem lehet következtetni a konkrét kooperativitási mechanizmusra, mert a fentiekben felvázolt szimmetria modell mellett több más kooperativitási modell is létezik, többek kö­

zött olyanok is, amelyek monomer enzimek valamint szubsztrátok kooperatív viselkedését értelmezik (ritka esetekben a kooperativitás nem feltétlenül több alegységhez vagy allosztériához kötött jelen­ ség).

Kovalens módosítások Az enzimaktivitás szabályozásának fontos eszköze az enzimek kovalens módosítása. Ezek egy része irre­ verzibilis. Erre tipikus példa az inaktív proenzim (zimogén) proteolitikus hasítása, amelynek eredmé­ nyeként aktív enzim keletkezik. A véralvadás során (lásd 25. fejezet) több ilyen limitált proteolitikus lépés követi egymást (az egyik lépésben keletkezett aktív proteáz aktiválja a soron következő zimogént). Egy ilyen szabályozási lánc a szignál katalitikus amplifikációjához vezet. Míg az érfal sérülését jelző szöveti faktor, a Vlla-komplex koncentrációja 10 fM körül van, az általa aktivált FIXa már 1 pM, az ezt követő FXa 500 pM, még a láncolat végén levő trombin kon­ centrációja 500 nM a sérülés helyén, azonos térfogatra vonatkoztatva. Kovalens módosítások nemcsak a proenzimek aktivációjához, hanem aktív enzimek ir­ reverzibilis inakti vációjához is vezetnek. Erre példa a már tárgyalt szerpinhatás, de nagyon gyakori az enzi­ mek ubikvitinálása, amikor bizonyos szignál hatásá­ ra az enzimhez kötődő ubikvitin a 26S proteaszóma felé irányítja a fehérjét lebontásra. Az ubikvitinálás te­ hát mintegy kijelöli a fehérjét a degradációra (lásd 9. fejezetben). A fenti kovalens módosítások visszafordíthatatlanok az enzimmolekula szempontjából (a fehéijemolekula részleges vagy teljes lebontásával járnak). Ezért minden egyes enzimmolekula csak egy ilyen szabá­ lyozó eseményben vehet részt. Jóval gazdaságosabb szabályozási lehetőséget kínál az enzim ciklusos ko­ valens módosítása, amely során egy reakcióban cso­ portátvitel történik az enzimre, és egy másik reakció­ ban ez a csoport eltávolításra kerül. Közben az enzim aktivitása változik, de a fehérjemolekula integritása megmarad. Eukarióta sejtekben a leggyakoribb ilyen jellegű módosítás foszfátcsoport átvitelével történik (2-22. ábra). Ebben a folyamatban egy protein-kináz áthelyezi az ATP y-foszfátcsoportját az enzim szerin-,

46

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

2-22. ábra. Ciklusos kovalens sza­ bályozás foszforiiáció-defoszforiláció útján. E, enzim; E-P, foszforilált enzim; P,, anorganikus foszfát

treonin- vagy tirozinoldalláncára. A foszforilált enzim (E-P) szubsztrátja lehet foszfoprotein-foszfatáznak, amely hidrolízissel leválasztja a foszfátcsoportot az enzimről. Egyes enzimek esetében a foszforiláció az enzimaktivitást fokozza, más enzimek a foszforiláció következtében elvesztik aktivitásukat. Mindkettőre számos példát látunk a metabolikus utak szabályozá­ sában (pl. a glikogén metabolizmusában részt vevő enzimek esetében). A foszforiláció-defoszforilációval történő szabályozás gyakoriságát megközelíti az acilezés-deacilezéssel működő ciklusok előfordulása eukarióta sejtekben. Általában acetil-CoA (de sok

esetben szukcinil-CoA vagy más acil-CoA) felhaszná­ lásával történik az enzim lizinoldalláncainak módosí­ tása (acetil-transzferázok hatására vagy mitokondriumban akár spontán módon is). Az acilcsoport eltávo­ lítása szirtuinok (SÍRT) hatására történik a 2-23. áb­ rán bemutatott reakcióban. Annak köszönhetően, hogy a szirtuin nincs telítve NAD+-dal, aktivitása ará­ nyos az oxidált NAD koncentrációjával. Mivel e sza­ bályozási ciklus mindkét oldalán a sejt energiafeltöltöttségét jelző indikátorok szerepelnek (acetil-CoA és oxidált NAD), ez a mechanizmus sok olyan enzimnél érvényesül, amely közvetlenül szerepel energiaterme­ lő folyamatokban (pl. SIRT3 aktiválja a hosszú láncú zsírsav acil-CoA-dehidrogenázt és 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA-szintázt a mitokondriumban, ezek szere­ pét a 8. fejezetben ismertetjük). Az ilyen típusú szabályozásokra gyakran a „rever­ zibilis kovalens módosítás” jelölést használják, ami nemcsak megtévesztő (a felsorolt példákból kiderült, hogy a ciklus mindkét reakciója irreverzibilis), de el­ fedi a szabályozás lényegét is, hiszen in vivő a ciklu­ sos enzimmódosítás számos előnye a ciklus létéből adódik, ahogy a rendszerszintű szabályozás alábbi tár­ gyalásából ki fog derülni. Az enzimaktivitás génexpresszió útján történő szabályozása a molekuláris biológia fejezet tárgyát képezi.

2-23. ábra. Szirtuin által katalizált fehérjedeacilezés. A szirtuin (SÍRT) eltávolítja az acetilcsoportot a fehérje egyik módosított lizinoldalláncáról NAD+felhasználásával

protein-i:-acetil-lizin

protein-lizin

2'-0-acetil-ADP-ribóz

3'-0-acetil-ADP-ribóz

47

2. E N Z I M E K . K I N E T I K A ÉS R E G U L Á C I Ó

\

Az enzimaktivitás rendszerszintű szabályozása metabolikus utakban Egy metabolikus úton belül az enzimaktivitások összehangolása szükséges ahhoz, hogy hosszabb tá­ von a köztitermékek koncentrációja állandó szinten legyen és ugyanakkor szabályozó hatásokra a metabolikus áram az élő szervezet igényeinek megfe­ lelően változzék. E koordináció egyik általános eszkö­ ze, hogy a metabolikus utak köztitermékei gyakran alloszterikus inhibitorként hatnak az út kezdeti lépése­ inél működő enzimekre (2-24. ábra). Amennyiben egy metabolikus út végterméke egy másik reakcióso­ rozat kezdeti szubsztrátja, az általa megvalósított ne­ gatív visszacsatolás lehetővé teszi, hogy az igény fo­ kozásával, ami az £4 enzimaktivitásban nyer kifeje­ zést az ábrán, az ellátó út anyagáramlása adekvát mó­ don növekedjék. Az ilyen visszacsatolási szabályozá­ soknál a fentiekben tárgyalt kooperativitás nagymér­ tékben növeli az ellátó út érzékenységét a felhasználó út aktivitására (az S3 kisebb fokú koncentrációcsökke­ nésével nagyobb fokú £ /-aktivitás-növelést lehet elér­ ni; 2-20. ábra). A 2-7. táblázat egy további lehetőséget mutat be a szabályozási érzékenység növelésére a metabolikus utakban a szubsztrátciklusok segítségével. A metabolizmusban gyakran előfordul a táblázat reakciósé-

/

ellátó út

I'

gátlás

lE>

végtermék

| S 3 |.

felhasználó út

2-24. ábra. Negatív visszacsatolás a metabolikus útban. A végtermék jelölés csak konvenció kérdése, a metabolikus utak határait a termék biológiai funkciója alapján szokás meghatároz­ ni, ami eltérő módon definiálható

májában felvázolt szituáció, amikor egy enzim katali­ zálja az A —>B átalakulást és egy másik enzim az el­ lentétes irányú átalakulást más reakcióban. Pl. a glikolízisben a foszfofruktokináz-1 katalizálja a fruktóz-6-foszfát —> fruktóz-1,6-biszfoszfát átalaku­ lást ATP felhasználásával, míg a glukoneogenezisben a fruktóz-1,6-biszfoszfatáz a fruktóz-1,6-biszfoszfát hidrolízisét fruktóz-6-foszfáttá (lásd 7. fejezetet). Az ily módon kapcsolt ellentétes irányú reakciók szub-

2-7. táblázat. Szubsztrátciklusok jelentősége a szabályozás érzékenységében (szignál-amplifikáció). A táblázat az A-> B irány anyagáramlás változását mutatja be azonos regulátorkoncentráció-változás esetén szubsztrátciklus nélkül (azaz nul­ la £5 enzimaktivitás mellett) és szubsztrátciklussal, ha a regulátor az £ 2 aktivátora és az £ 5 inhibitora. Azonos alap metabolikus áram esetén a ciklus magasabb fordulatszáma nagyobb szabályozási érzékenységet biztosít

A regulátor anyag koncentrációja

Ciklus nélkül

(£ 5

inaktív)

alap

Qklusban ( £ 2 és £ 5 emelt aktivitás, azonos anyagáram)

£2

£5

10

0

Nettó A-*B anyagáramlás (mM/s)

Relatív növekedés

10

-

40

0

40

4

10

9,6

0,4

-

az alap 4-szerese

40

2,4

37,6

alap

40

39,6

0,4

az alap 4-szerese Qklusban ( £ 2 és £ 5 aktív)

Enzimaktivitás (mM/s)

alap

az alap 4-szerese

160

9,9

150,1

94 -

375

48

sztrátciklust alkotnak, amelyben nem történik nettó anyagáramlás egyik irányban sem, ha a két reakció se­ bessége azonos. Ilyenkor az egyetlen nettó változás az ATP hidrolízise, aminek biológiai szerepe nem magá­ tól értetődő. A szubsztrátciklusok létezése akkor nyer értelmet, ha figyelembe vesszük a szabályozásban be­ töltött szerepüket. A 2-7. táblázatban bemutatott pél­ da illusztrálja, hogy szubsztrátciklus nélkül az £2 en­ zim lineáris aktiválása esetén a regulátor csak a saját koncentráció növekedésével megegyező anyagáram­ lás-növekményt tud elérni. Amennyiben viszont a cik­ lusban kapcsolt mindkét enzimre hat (az egyikre aktivátorként, a másikra inhibitorként), az A —>B irá­ nyú anyagáramlás a 2-7. táblázatban szereplő példák szerint 24-szer vagy 96-szor érzékenyebben reagál a regulátorkoncentráció azonos változására. így a szub­ sztrátciklusok szignál-amplifikációt valósítanak meg, amely nem azonos a véralvadási kaszkád példá­ ján korábban említett katalitikus amplifikációval. A szignál-amplifikáció tovább növelhető, ha a regulá­ tor anyag nem lineáris, hanem kooperatív hatásokat

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A

gyakorol. A szubsztrátciklusok több szignál integráci­ óját is lehetővé teszik, ha a ciklus két oldalán eltérő re­ gulátor anyagok hatnak. A 2-22. ábrán bemutatott példa is ilyen szubsztrátciklusként értelmezhető, amelyben a foszforilált és a defoszforilált enzim képviseli a ciklus két oldalát, így a ciklusban történő kapcsolásból adódóan a kova­ lensen szabályozott szabályozó enzimek esetén is ér­ vényesülhet a szignál-amplifikáció. Ilyen ciklusos ko­ valens módosítások egymás utáni soros kapcsolásával katalitikus amplifikációt is el lehet érni a limitált proteolízissel kapcsolatban ismertetett kaszkádrendszerekhez hasonlóan. így a ciklusos kovalens módosí­ tások komplex szabályozási mechanizmusokat kínál­ nak a szabályozás finomhangolására (kooperativitás, katalitikus amplifikáció, szignál-amplifikáció, több oldalról érkező szignálok integrációja), és ennek kö­ szönhetően a metabolikus utak precíz adaptációját te­ szik lehetővé (lásd glikogén-foszforiláz szabályozását a 7. fejezetben).

3

A HEMOGLOBIN ÉS A MIOGLOBIN

MÁN DL J Ó Z S E F

3.1

A hem oglobin és a m iog lob in szerkezete, oxigénkötése

3.2

Az oxigénleadás szabályozása

Az energiatranszformáció során a tápanyagokkal felvett energia kémiailag hasznosítható formákba (nagyrészt ATP-vé) alakul (lásd 6. fejezet). Ez a folya­ mat aerob körülmények között, oxigén jelenlétében körülbelül tizennyolcszor hatékonyabban történik, mint anaerob viszonyok esetén. Ehhez azonban az oxigén állandó jelenléte szükséges. A keringési rend­ szer önmagában a sejtek oxigénellátását a szükséges szinten nem lenne képes biztosítani, mivel az oxigén gáz és oldékonysága vízben nagyon kicsi. A megfele­ lő oxigénkoncentrációt speciális oxigénkötő, illetve -szállító molekulák biztosítják. Ilyen oxigént kötő és szállító molekula a vörösvértestekben a hemoglobin (Hb), izomsejtekben pedig a mioglobin (Mb). A két molekula funkciója különbözik egymástól. A Mb fő­ ként oxigén tárolására, a Hb az oxigén szállítására szolgál. A Hb-mentes vér oxigénkoncentrációja 5 ml (Vl, a normális Hb-tartalmú véré 250 ml O2/I. Ezen a különbségen túlmenően a Mb csak oxigént köt, a Hb mint gázszállító molekula - azonban CE mellett CO2ot (és NO-ot) is. A CO megkötésére mindkét molekula képes. Mind a Hb, mind a Mb rendkívül részletesen és aprólékosan ta­ nulmányozott fehérje. Szerkezetük megismerése, a Hb negyedleges szerkezetének és allosztérikus szabályozásának tanulmányozása a röntgen-krisztallográfíás módszerek alkalmazásával tudománytörté­ neti jelentőségű. Ezek a módszerek lehetővé tették a Hb (és a Mb) térszerkezetének igen alapos megismerését, az oxigénkötődés kö­ vetkezményeinek pontos elemzését.

3.1

49

52

A HEMOGLOBIN ÉS A MIOGLOBIN SZERKEZETE, O X IG É N K Ö T É S E

Mindkét molekula hemoprotein; prosztetikus cso­ portként hemet tartalmaz. A hemet Fe2+ (ferrovas) és protoporfirin-IX alkotja (ez adja a Hb és a Mb jelleg­ zetes vörös színét). A hem prosztetikus csoportot tar­ talmazó fehérjék - citokrómok - az oxigénkötésen és -transzporton kívül redoxreakciókban is részt vesz­ nek. Ezek különböző folyamatok, azonban a moleku­ lán belül az oxigén- és az elektronakceptor azonos: a hem-vas. A vas a hemben a tetrapirrol gyűrűrendszer közepén mind a négy nitrogénhez kötődik, ezen kívül további két koordinatív kötésre képes a hem síkjának két oldalán (3-1. ábra). Az egyik kötés révén a hem a globinhoz kapcsolódik, a másik az oxigénkötő hely. Az oxigén 02-molekula formájában kötődik. A hemvas ötödik koordinációs kötőhelyéhez a globinlánc egyik hisztidinje (proximális His) kapcsolódik. Hb-ban a vas a porfiringyűrű síkjából a proximális His irányába kiemelkedik. Az 02-molekula a vas hatodik koordinációs kötőhelyéhez kapcsolódik a hem másik oldalán. Az oxigénkötő hely kialakításában meghatá­ rozó funkciója van a globinlánc egy másik hisztidin­ jének (disztális His) is, amely nem kötődik a vasatom­ hoz. A szén-monoxid az Ü2-nél jóval erősebben kötő­ dik mind a Hb, mind a Mb hem-vasához (ezért is olyan

I . A F E H É R ) É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó ) A

50

3-1. ábra. A bem szer­ kezete, a hem-Fe2+ hat kötőhelye

veszélyes a CO-mérgezés). A Hb és a Mb affinitását a CO-hoz (ha a Hb és a globin nélküli hem CO-kötését hasonlítjuk össze) éppen a disztális His mérsékli. Az oxigénkötés képessége a hem-Fe oxidáltsági állapotá­ tól függ. 02-kötésre csak a Fe2^ hem-vas alkalmas, a hem-vas oxidált állapotban (Fe3+, ferrivas; methemoglobin) erre nem képes. Ez a feltétel nemcsak a Hb-ra és Mb-ra, hanem más hemoproteinekre is igaz. Ily módon elektronfelvétellel, illetve -leadással az oxigénkötés szabályozható (pl. citokróm-P450 enzimek működése, lásd 11. feje­ zet). A hemoproteinek egy része ugyanis enzim, amely szinten köti az oxigént, azonban a kötődést valamilyen enzimatikus folyamat kö­ veti, amelynek során az oxigén átalakul (lásd pl. terminális oxidáció, oxigenizáció).

így a hemoproteinek egy része: ♦ Fe2 -állapotban C>2-t köt, illetve transzportot bo­ nyolít le (Hb, Mb); a Mb, illetve Hb oxigénkötése reverzibilis. ♦ Fe2 Fe3* redoxrendszer, elektrontranszferben vesz részt (citokrómok), ♦ Fe2+-állapotban CF-t köt, majd Fe‘ Hb(0 + H+ + HCO - + 2,3-BPG teljesen ismert. Az értágító hatású NO szövetekben 2,3-BPG HCOy miatt a vörösvérsejteknek is értágító ha­ tása van. 3-5. ábra. A hemoglobin 0 2- és C 0 2-szállítása 2 )4

3

I . A F E H É R J É K ÉS E N Z I M E K S Z E R K E Z E T E ÉS F U N K C I Ó J A 54

A Hbsoston az a-láncon tirozint (genetikai kódja UAU, UAC) tartalmaz a proximális His (CAU, CAC) he­ lyén; ennek a változásnak a következtében a Fe2+ ki­ emelkedik a porfiringyürü síkjából és Fe3 -ná oxidáló­ dik; methemoglobinaemia alakul ki. Ezért ezt a Hb-t HbM-nek nevezik. A methemoglobin nem tud oxigént kötni és szállítani. Ilyenkor az a-láncon az R-T ekvilibrium a T irányába tolódik, ezért csökken az 0 2-affinitás, nincs Bohr-effektus, emiatt hypoxia, majd vörösvérsejtszám-emelkedés, polycytaemia ala­ kul ki. Methemoglobin a normális vérben nemcsak mutáció, hanem más ok miatt is képződik. Aránya nor­ mális körülmények kötött 1% alatt van. Az 0 2például képes elektront elvonni a hem-Fe2+-tól és hem-Fc3' képződik, valamint szuperoxid-anion, amelyet a hem-Fe3+ elenged. A methemoglobint a NAD+ koenzimmel működő methemoglobin-reduktáz redukálja vissza. Az enzim öröklődő hiánya kongenitális methemoglobinaemiát okoz. A H b n e a th ro w esetében egy fenilalanin helyén szerepel leucin, amely a hemoglobin R- (relaxált) módosulatát stabilizáló tényező. Az eredmény az 0 2-affmitás foko­ zódása. A Hb számos más formáját is leírták a HbLjoston-on kí­ vül, a H b M ilw a u k e e j H b s a s k a to o n i H b n y d e Park mind-mind egyetlen a-, illetve (Elánéban elhelyezkedő aminosav mutációja nyomán alakulnak ki. Magyarországon is leírtak abnormális Hb-t. A methaemoglobinaemiával járó H b K lsk U nhaias a HbBoston-nal azonos defektus ered­

ményének bizonyult. Az irodalomban ismert a Hbguda és a Hbpest is. Egy-egy aminosaveltérés a harmadlagos szerkezet megváltozásához, instabil Hb-ok kialakulásához vagy a negyedleges szerkezet módosulásához, ez esetben az allosztérikus effektorokra való reagálás készségé­ nek változásához vezet. A hemoglobin egy vagy több polipeptidlánca szintézisének genetikai rendellenes­ sége a thalassaemiáknak nevezett betegségcsoport létrejöttét eredményezi. Különböző mutációk nem stabil, gyorsan bomló Hb-láncok képződését is okoz­ hatják. A Hb-szintézis öröklődő zavarai a thalassaemias z i n d r ó m á k , a HbF (a2y2) előfordulása felnőttkorban a (3-láncok szintézisének elégtelensége miatt alakul ki. A thalassaemia szindróma súlyos, az esetek egy ré­ szében gyerekkorban fatális betegség, anaemiával (vörösvérsejtszám csökkenésével), vörösvértest-rendellenességekkel okozhat magzati halált is. Az a-láncszintézis zavarait a-thalassaemiának a (3-lánc zavarait P-thalassaemiának nevezik. A Hb mérését a vérben az anaemiák, illetve a Hb-szin­ tézis zavarainak diagnosztikájában használják. Glikált Hb a vércukorszintnek megfelelően kb. 5%-ban fordul elő a vérben. A glikált Hb meghatározásának diagnosztikai jelentőségével a 7. fejezetben foglalko­ zunk. Mb a vérben akut myocardialis infarctus során mutatható ki (általában az első 24 órában).

A membránok szerkezete, Membrántranszport­ folyamatok 4.

A membránok szerkezete (Ádám Veronika)

6.

Membrántranszport-folyamatok (Ádám Veronika)

4

A MEMBRÁNOK SZER KEZETE

ÁDÁM V E R O N I K A

4.1

A membránok kémiai összetétele Membránlipidek Membránfehérjék

A membránok olyan dinamikus struktúrák, ame­ lyek elhatárolják a sejteket a környezetüktől, a sejten belüli különböző intracelluláris kompartmenteket pe­ dig egymástól. A szerkezeti elhatárolás mellett a membránok a korlátozott permeabilitás következtében megakadályozzák az ionok és molekulák szabad dif­ fúzióját, és ezáltal biztosítják az intracelluláris tér és az intracelluláris kompartmentek sajátos összetételét. Amembránokban ugyanakkor speciális transzportfo­ lyamatok teszik lehetővé, hogy a sejtek hozzájussanak a szükséges anyagokhoz, másokat pedig eltávolíthas­ sanak. Fontos szerepet játszanak a sejtek energiater­ melésében, a sejtek közötti kommunikációban: szinte minden sejtfunkció feltétele, hogy szerkezetileg és funkcionálisan ép membránok biztosítsák a megfelelő intracelluláris környezetet.

57

58 61

funkciónak megfelelően. Egyik végletnek tekinthető az egyes neuronokat határoló mielinmembrán, ahol a lipidek aránya a 70%-ot is eléri, ami jól szolgálja a mielin védő, szigetelő funkcióját. A másik véglet a mitokondrium belső membránja, ahol viszont a fehér­ jék vannak túlsúlyban, s ez tükrözi a belső membrán komplex funkcióját a sejtek anyagcseréjében és az ATP-szintézisben. Kis mennyiségben szénhidrátok is jelen vannak a membránban. Ezek soha nem szabadon, hanem vagy lipidekhez, vagy fehérjéhez kötve fordulnak elő. A 4-1. táblázat néhány membrán lipid- és fehérje­ összetételét mutatja.

4-1. táblázat. Néhány membrán kémiai összetétele a teljes tömeg százalékában

4.1

A M E M B R Á N O K K ÉM IA I

Lipid (%)

Fehérje (%)

Szénhidrát (%)

mielin

65

30

5

hepatocita plazmamembrán

39

54

7

szarkoplazmás retikulum

32

64

4

mitokondrium külső membrán

46

50

4

mitokondrium belső membrán

23

75

2

ÖSSZETÉTELE

A sejtmembránok komplex funkciója a sajátos ké­ miai összetételből és szerkezeti tulajdonságokból adó­ dik. A membrán alapszerkezetét lipidek és fehérjék al­ kotják, leegyszerűsítve azt szokták mondani, hogy kö­ rülbelül azonos arányban. Ez általában igaz a sejtek plazmamembránjára, azonban nagyon nagy eltérések lehetnek a különböző membránok között a speciális

58

I I . A M E M B RÁ N Ő K S Z E R K E Z E T E . M EM B R Á N T R A N SZ P O R T - F O L Y A M Á T O K

Membránlipidek A membránok alapszerkezetét egy lipid kettős ré­ teg alkotja, amelybe különböző mélységig ágyazódva találhatók a fehérjék (4-1. ábra). A kettős réteg (kb. 4,5-5,5 nm) - mint membrán alapszerkezet - a memb­ ránalkotó lipidek molekuláris sajátosságából követke­ zik. A membrán alkotásában a foszfolipidek játszák az alapvető szerepet, azaz a foszfogliceridek és a szfingomielin. A foszfogliceridek közül a foszfatidilkolin, a foszfatidil-etanolamin, a foszfatidil-szerin, a foszfatidil-inozitol és a kardiolipin a legjelentőseb­ bek, amelyekről a 8. fejezetben szólunk. A foszfo­ gliceridek közös jellemzője, hogy bennük a glicerin 1. és 2. C-atomját hosszú szénláncú zsírsavak észteresítik, a 3. C-atomhoz pedig foszforsavon keresztül vala­ milyen alkohol kapcsolódik (4-2. ábra). Az 1. C-atomon általában telített, a 2. szénatomon telítetlen zsír­ sav található, s bizonyos törvényszerűség van abban, hogy melyik foszfolipidben melyek ezek a telített, il­ letve telítetlen zsírsavak. A foszfatidil-kolinban álta­

oligoszacharidok glikoproteinekpn

oligoszacharidok glikolipideken

lában sok a palmitinsav és a linolsav, míg a foszfa­ tidil-etanolamin és a foszfatidil-szerin különösen gaz­ dag arachidonsavban. A telítetlen zsírsavak kettős kö­ tése körüli cisz-konfiguráció következtében a szénhid­ rogénlánc megtörik, ennek a membrán fluiditás szem­ pontjából van jelentősége (lásd később). Úgy tűnik, hogy bizonyos összefüggés van a táplálékkal elfo­ gyasztott és a membránban található zsírsavak össze­ tétele között. Ha a táplálék elsősorban telített zsírsava­ kat tartalmaz, a membrán-foszfolipidekben is megnő a telített zsírsavak aránya, míg a telítetlen zsírsavakban gazdag étrend növeli a membránokban a telítetlen zsírsav arányát. Ismeretes, hogy a telítetlen zsírsavak fogyasztása kedvezően befolyásolja a plazmakoleszterin-szintet, és valószínűleg nem kedvez a trombociták aggregációjának, azaz csökkenti a coronariabe­ tegségek rizikóját. A foszfolipidek amfipatikus tulajdonságúak, a mo­ lekulában poláros és apoláros csoportok egyaránt megtalálhatók. A poláros molekularészt a foszforsav és a hozzákapcsolódó csoport jelenti, ezt a molekula

4-1. ábra. A plazmamembrán alapszerkezete. Fluid-mozaik modell

koleszterin integráns fehérje

4-2. ábra. A foszfogliceridek általános képlete és szokvá­ nyos jelölésük a membránok­ ban. A foszfogliceridek rajzos ábrázolásában (jobb oldali ke­ ret) a kék gömb a poláros részt, a sárga „lábak" a hidrofób oldal­ láncokat jelzik

poláros ré sz

hidrofób lánc

4. A M E M B R Á N O K S Z E R K E Z E T E

59

„fej"-részének is hívják, míg a zsírsavak hidrofób tulajdonságúak. Ábrázolásuk gyakran egyszerűsített formában a 4-2. ábrán látható módon történik. Ugyan­ ez az amfipatikus tulajdonság jellemzi a szfingomielint is, amelyben a poláros rész a foszforsav és a hozzákapcsolódó kolin. A membránokban a foszfolipidek olyan kettős ré­ teget alkotnak, amelyben a poláros csoportok a vizes közeg, vagyis az extracelluláris és az intracelluláris tér felé, míg a hidrofób oldalláncok egymás felé fordul­ nak (4-1. ábra). A töltéssel rendelkező részek a vízzel poláros, az oldalláncok pedig egymással hidrofób köl­

LU

csönhatásba lépnek. A szerkezet így nagyon stabil, s az utóbbi kölcsönhatás azt is biztosítja, hogy a víz gyakorlatilag kiszorul a kettős réteg belsejéből. A sejt­ membránokban koleszterin is jelen van, amelynek ori­ entációja ugyanezen törvényszerűség alapján történik: a poláros 3-OH-csoport a felszín felé fordul és köl­ csönhatásba léphet a foszfolipidek poláros csoportjá­ val, míg az apoláros gyűrű és a szénhidrogénlánc a membrán belsejében a foszfolipidek zsírsavoldalláncával lép kölcsönhatásba. Az egyes foszfolipidek és a koleszterin aránya elté­ rő a különböző típusú membránokban, de az egyes egyének között nagyfokú hasonlóság van az adott membrántípus lipidösszetételében. A legnagyobb % egyéni variáció a plazmamembrán lipidösszetételében lehet, mivel ezt a táplálék zsírsavösszetétele is befo­ lyásolja. Koleszterin és szfíngomielin legnagyobb u arányban a plazmamembránban található, míg kardio­ L fll KL lipin elsősorban a mitokondrium belső membránban U l K SL fordul elő. A foszfogliceridek közül minden memb­ Jl FE ránban a foszfatidil-kolin van túlsúlyban (4-3. ábra). FK U A lipid kettős réteg létrejötte a foszfolipidek am­ fipatikus tulajdonságából következik, és ez érvénye­ sül akkor is, ha foszfolipidek vizes közegbe kerülnek. A foszfolipidek oly módon orientálódnak, hogy apo­ láros lipidoldalláncaikat a vizes közeg elől elrejtsék, 4-3. ábra Néhány sejtmembránban a különböző lipidek aránya. Az adatok patkány máj preparátumból származnak. FK, poláros csoportjaikkal pedig a víz felé forduljanak. foszfatidil-kolin; FE, foszfatidil-etanolamin; SL, szfingolipid; K, ko­ Megfelelő koncentráció és hőmérséklet esetén, spon­ leszterin; KL, kardiolipin; E, egyéb; ER, endoplazmás retikulum; mito, mitokondrium tán módon ún. micellák jöhetnek létre, amelyek egyetlen lipidrétegében a poláros csopor­ tok a felszín felé, az apoláros oldalláncok a micella belseje felé orientálódnak (4-4. ábra). A foszfolipid kettős réteg kiala­ kulása szintén spontán folyamat. A stabil struktúrát az oldalláncok közötti apolá­ ros, valamint a poláros csoportok és a víz között létrejövő poláros kölcsönhatások hozzák létre. In vitro körülmények között, vizes kö­ zegben olyan foszfolipid-struktúrák is létrehozhatók, amelyekben a foszfolipid kettős réteg záródik és vezikulák, ún. liposzómák jönnek létre (4-4. ábra). A liposzómák létrejöttéhez a vizes kö­ 4-4. ábra. Vizes közegben létrejövő foszfolipid-képződmények zegbe tett foszfolipideket ultrahanggal 1 1

1

60

I I . A M E M B R Á N O K S Z E R K E Z E T E . M E M B RÁ N T R A N SZ PO R T - F O L Y AM Á T O K

kell kezelni, s kialakulnak a kb. 250 nm átmérőjű gömböcskék. A különböző foszfolipid-összetételű liposzómákkal jól vizsgálhatók a lipid kettős réteg tu­ lajdonságai, s mivel a lipidrétegbe alkalmas körülmé­ nyek között fehérjéket is be lehet építeni, transzportfo­ lyamatok, enzim- és receptorfunkciók is modellezhe­ tők.

%

Klinikai vonatkozások Jelentős a liposzómák felhasználása az orvosi gyakor­ latban. Mivel a liposzómák keletkezésekor a vizes kö­ zeg, amelyben a foszfolipideket elegyítették, a lipo­ szómák belső terébe zárva, „csapdában” marad, létre­ hozhatók olyan liposzómák, amelyek tetszőleges en­ zimeket vagy gyógyszereket tartalmaznak. A liposzó­ mák megjelölésével, pl. sejtmembránreceptorok által felismert speficikus fehérjékkel, a liposzómákkal cél­ zottan lehet gyógyszereket a megfelelő szervekhez el­ juttatni. A liposzómákat a sejtek endocitózissal felve­ hetik, vagy a liposzómamembrán fuzionál a sejt­ membránnal, s így a gyógyszer közvetlenül a sejtekbe jut. Ily módon csökkenthetők a nem kívánatos, sok­ szor nagyon súlyos toxikus mellékhatások, amelyek pl. a daganatellenes terápiában komoly problémát je­ lentenek. Antibiotikumok, vírus- és gombaellenes szerek, gyulladáscsökkentők liposzómában történő alkalmazása stabilabb koncentrációt biztosít a plaz­ mában, s javul azoknak a gyógyszereknek a hatékony­ sága is, amelyek egyébként túl gyorsan metabolizálódnak. A liposzómák tehát új lehetőséget jelenthet­ nek a terápiában, s legújabban már próbálkoznak a génterápiában való felhasználásukkal is. A membránok két rétegében a foszfolipidek elosz­ lása nem azonos, ami a fehérjék eltérő orientációjával együtt meghatározza a membránok aszimmetriáját. A plazmamembránokban általában a szfmgomielin és a foszfatidil-kolin inkább a külső rétegben, a foszfatidil-etanolamin és a foszfatidil-szerin a belső réteg­ ben, míg a koleszterin egyenletesen, a membrán mind­ két rétegében megtalálható (4-5. ábra). Ennek a lipidaszimmetriának a fenntartása feltétele a membránok és végsősoron a sejtek integritásának és funkcióképes­ ségének.

4-5. ábra. Az egyes foszfolipidek százalékos aránya az eritrociták plazmamembránjának külső (kék) és belső (na­ rancssárga) rétegében. FK, foszfatidil-kolin; FE, foszfatidiletanolamin; FSZ, foszfatidil-szerin; FI, foszfatidil-inozitol; SM, szfingomielin; FI-4P, foszfatidil-inozitol-4-foszfát

A lipid kettős rétegben az egyes foszfolipidek nagyfokú mozgékonysággal rendelkeznek, mivel a foszfolipidek között nemkovalens kölcsönhatások működnek. A foszfolipidek zsírsavoldalláncai egy­ máshoz képest elmozdulhatnak, a foszfolipid-molekulák a saját tengelyük mentén rotálhatnak, és a membrán síkjában elmozdulhatnak (4-6. ábra). Ezek a mozgások, amelyek a másodperc töredékei alatt vég­ bemennek, a membránnak nagyfokú dinamizmust ad­ nak, megteremtik a membránfehérjék mozgásához is a lehetőséget, és ez együttesen a membránok alapvető tulajdonságát, a fluiditást biztosítja. A foszfolipidek

oldalláncok mozgása

laterális diffúzió

flip-flop (ritka) 4-6. ábra. A foszfolipidek spontán mozgásai a membrá­ nokban

4. A M E M B R Á N O K S Z E R K E Z E T E

spontán átjutása a membrán egyik rétegéből a másikba („flip-flop” mozgás) nagyon korlátozott, mert ehhez a foszfolipidek poláros csoportjának át kell hatolni a membrán hidrofób belső közegén, ami termodinami­ kailag nem kedvező folyamat. Fontos viszont azoknak atranszportfehérjéknek a működése, amelyek a két ré­ teg közötti foszfolipidmozgást lehetővé teszik (lásd alább). A membránokban a lipidek mozgékonysága a hő­ mérséklettől és a lipidek összetételétől függ. A fázis­ átalakulási hőmérséklet alatt a membrán merev, ún. gélkristályos állapotban van, amelyben a lipidek moz­ gása rendkívül korlátozott. A hőmérséklet emelésével az ún. folyadékkristály állapot alakul ki, amelyben a fluiditás növekszik. A lipidek, illetve a lipidek és fe­ hérjék közötti kölcsönhatás különbözősége miatt a membránok egyes területei között eltérő lehet a fluidi­ tás mértéke. A szervezetben a normális testhőmérsék­ leten a membránok általában folyadékkristály (fluid) állapotban vannak. Minél inkább fluid egy membrán, annál nagyobb a permeabilitása. A membrán fluiditását befolyásolja a lipidek összetétele is. A foszfolipidekben a telítetlen zsírsa­ vakjelenléte a fluiditást fokozza, mert a kettős kötések törést okoznak az oldalláncban, s ez megakadályozza az oldalláncok közötti túl szoros kapcsolat létrejöttét. Ezzel szemben nagy mennyiségű telített zsírsav a membránokban a fluiditást, következésképpen a permeabilitást is csökkenti. A membránfluiditás mértékét jelentősen befolyásolja a koleszterin. A merev szteránváz, amely a zsírsavoldalláncok közé ékelődik, kettős hatású. Egy kevéssé fluid membránban a ko­ leszterin a fluiditást növeli azáltal, hogy a zsírsavol­ dalláncok közötti kölcsönhatásokat csökkenti, míg egy nagymértékben fluid membránban a koleszterin jelenléte a fluiditást csökkenti, mert korlátozza a zsír­ savoldalláncok szabad mozgását.

Membránfehérjék A membránban a lipid kettős rétegbe ágyazódva helyezkednek el a fehérjék. Singer és Nicolson dol­ gozta ki azt a membránmodellt, az ún. fluid-mozaik modellt, amelyet később a legkülönbözőbb kísérleti

61

extracelluláris domének

transzmembrándomén

intracelluláris domének

b ligand extracelluláris oldal

intracelluláris oldal

4-7. ábra. Integráns membránfehérjék a plazmamembrán­ ban. (a) Az egy transzmembránszakasszal rendelkező EGF (epidermal growth factor) receptor (engedéllyel átvéve: AppertCollin A, Hubert P, Crémel G and Bennasroune A (2015) Role of ErbB Receptors in Cancer Cell Migration and Invasion. Front. Pharmacol. 6:283. dói: 10.3389/fphar.2015.00283), és (b) a hét transzmembránszakasszal rendelkező p-adrenerg receptor inak­ tív állapotban (arany) és ligandkötött állapotban (zöld)

62

I I . A M E M B R Á N O K S Z E R K E Z E T E . M EM B RÁ N T R A N S Z P O R T - F O L Y AM Á T O K

módszerekkel igazoltak, s amely szerint a lipid kettős rétegbe különböző mélységig ágyazódva fehérjék épülnek be (4-1. ábra). A membránfehérjék csoportosítása annak alapján történik, hogy milyen erőteljes behatással vonhatók ki a membránból. A perifériás membránfehérjék vi­ szonylag enyhe kezeléssel, pl. a pH változtatásával vagy különböző ionerősségű sóoldatokkal kinyerhe­ tők, s ez a lipid kettős réteg integritását nem befolyá­ solja. Az integráns fehérjék csak erőteljes kezelés, pl. detergensek vagy szerves oldószer hatására távolítha­ tók el, amely a membránt is tönkreteszi. Az integráns fehérjék a membránból kinyerve vízben általában old­ hatatlanok. Azok a fehérjék tudnak a membránba in­ tegrálódni, amelyek egy-egy szakaszon hidrofób aminosav-oldalláncokat tartalmaznak (pl. alanin, valin, leucin, izoleucin), s így a lipid kettős rétegben a hidro­ fób zsírsavoldalláncokkal kölcsönhatásba léphetnek. Az integráns membránfehérjék egy vagy több transzmembránrégióval rendelkeznek, amelyeket a lipidrétegből „kilógó” hajtüszakaszok kötnek össze (4-7. ábra). A 4-7. ábra az egy transzmembránszakasszal rendelkező EGF-receptor és a 7 transz-

I Q i

palmitilláncon belüli ciszteinnel tioészterkötés 4-8. ábra. A membránhoz lipidekkel kapcsolódó tidilinozitol

membránszakasszal rendelkező adrenerg (1-rcceptor sémáját mutatja. A perifériás membránfehérjék a lipid kettős réteg­ hez lazán kapcsolódó, vízben oldékony fehérjék. Rög­ zülhetnek a lipidekhez elektrosztatikus kölcsönhatás­ ok révén, kapcsolódhatnak integráns membránfehér­ jékhez, vagy valamelyik végükön egy rövid hidrofób szakaszon beépülhetnek a membránba. A perifériás membránfehérjék kapcsolódásának egy sajátos módja történik a glikozil-foszfatidil-inozitol horgonyon (GPI, glycosyl-phosphatidylinositol) keresztül. A fe­ hérjék a C-terminális aminosavval foszfoetanolaminon keresztül egy rövid szénhidrátlánchoz kapcso­ lódnak. A szénhidrátlánc, amelyet glikánnak hívnak, mannózokból, galaktózból és glukózaminból áll. A glikán kovalens kötéssel a lipid kettős rétegben el­ helyezkedő foszfatidil-inozitol inozitolrészéhez kap­ csolódik (4-8. ábra). Ily módon rögzül a sejtmembrán­ hoz például az acetilkolin-észteráz és az alkalikus foszfatáz. Azok a fehérjék, amelyek foszfatidil-inozitolon keresztül kapcsolódnak a membránhoz foszfolipáz-C hatására (amely a foszfát és a glicerin-3-OH közötti kötést hidrolizálja; lásd 17. fejezet) felszaba­ díthatok. Tekintettel arra, hogy ezt az enzimet bizonyos receptorok GPI-horgony a fehérje aktiválják, a fehérjemobilizálás­ karboxi-terminálison keresztül nak szerepe lehet a hormonok és neurotranszmitterek hatásának közvetítésében. Egyes perifériás fehérjékhez az N-terminális glicinen keresztül mirisztát (14 C-atomos telített zsírsav) kapcsolódik, és ez rögzíti a fehérjét a plazma­ membrán citoplazmatikus felszí­ néhez. így rögzül pl. a p21ras fe­ hérje a plazmamembrán belső fel­ színéhez. Rögzülhet a fehérje egy láncon belüli ciszteinen keresztül palmitát vagy C-terminális ciszte­ inen keresztül famezil segítségé­ vel is (ez utóbbi esetben a cisztein mindig metilált). farmezil-cisztein A membránfehérjék egy része C-terminálison glikoprotein, amelyekben kova­ fehérjék. GPI, glikozil-foszfalens kötéssel szénhidrátok kap-

63

4. A M E M B R Á N O K S Z E R K E Z E T E

csolódnak a fehérjékhez. A membránok szénhidrát al­ kotórésze így glikoproteinek (kisebb részben glikolipidek) részeként fordul elő. A szénhidrátláncban glukóz, galaktóz, N-acetil-glukózamin, N-acetilgalaktózamin, mannóz, fukóz és sziálsav található. A szénhidrátok a plazmamembránban mindig az extracelluláris oldal, az endoplazmás retikulumban pedig a luminális oldal felé orientálódnak. A legtöbb plazmamembrán-receptor és transzportfehérje glikoprotein. A membránfehérjék hozzájárulnak a membránok fluiditásához és a membránaszimmetria kialakulásá­ hoz egyaránt. A fehérjék a fluid lipid kettős rétegben laterálisán elmozdulhatnak, bár ez a mozgás lassúbb, mint a foszfolipidek laterális mozgása. Integráns fehérjék diffúzióját a membránban látványosan de­ monstrálták egérből és emberből származó sejtek fúziójával. A sej­ tek antigén tulajdonságú membránfehérjéit előzőleg olyan marke­ rekkel jelölték, amelyek fluoreszcens mikroszkóp alatt eltérő színt mutattak. A sejtek fúziója után a mikroszkóp alatt a két szín az új sejt két felén jól elkülönült, azonban mintegy 40 perccel a fúzió után a kétféle szín, azaz a két sejtből származó két különböző fehérje egyenletes eloszlást mutatott az új sejt membránjában (4-9. ábra).

humánsejt

egérsejt

4-9. ábra. A plazmamembrán-fehérjék la­ terális diffúziójának kimutatása humán és egérsejtek fúziójával. A fehérjéket fajspecifi­ kus antigénekkel, majd fluoreszcens mikroszkóp alatt eltérő színt mutató markerrel jelölték. A fú­ zió után a két szín random elhelyezkedést mu­ tatott a sejt felszínén

Bizonyos fehérjék esetében az elmozdulási lehető­ ség korlátozott és az eloszlás a membránban nem random, hanem szigorú fúnkcionális szervezettség

szerint történik. Erre a legjellemzőbb példa a mitokondrium belső membránban elhelyezkedő elektron­ transzport-lánc, amelyben az egyes funkcionális egy­ ségek meghatározott szervezettségben kapcsolódnak egymáshoz. Más fehérjék intracelluláris struktúrák­ hoz rögzülnek, ami szintén gátolja a szabad elmozdu­ lást. A membránfehérjék változatos orientációja a membránok aszimmetriáját eredményezi. Mint láttuk, a membrán két rétegében eltérő a foszfolipidek össze­ tétele, ami önmaga aszimmetriát okoz. Ehhez járul az integráns és perifériás fehérjék eltérő extracelluláris és intracelluláris felszínéből és a glikoproteinek szigorú orientációjából eredő további aszimmetria. A külön­ böző foszfolipidek eltérő eloszlása által teremtett aszimmetria számos biológiai folyamathoz elenged­ hetetlen, ilyen pl. a fagocitózis, a vezikuláris transz­ port, az exocitózis, az apoptózis, a membránfehérjék működése, a véralvadás vagy a sejtek, organellumok jellegzetes alakjának megőrzése. A foszfolipidek egyenetlen eloszlásának fenntartásában membránfe­ hérjék játszanak szerepet, amelyek a kedvezőtlen sza­ badenergia-változás ellenére biztosítani tudják a foszfolipid-transzportot a membrán két rétege között (4-10. ábra). A flippázok a foszfatidil-etanolamint és a foszfatidil-szerint transzportálják a plazmamembrán ext­ racelluláris rétegéből a citoszol felőli belső rétegbe. A flippázok a P-típusú ATPázok családjába tartoznak, transzportálandó foszfolipid-molekulánként egy ATP-t hidrolizálnak. Ezekről az ATPázokról az 5. fe­ jezetben részletesen szó lesz. A flippázaktivitással rendelkező P-típusú ATPáz-t P4 -ATPáz-nak nevezik. A foszfatidil-szerin benntartása a kettős réteg belső ré­ tegében azért fontos, mert felszaporodása a külső ré­ tegben „kijelöli” a sejtet a makrofágok számára, ame­ lyek ezt felismerik, és a sejteket elpusztítják. Ellentétes irányú lipidmozgást, azaz exportot tesz­ nek lehetővé a floppázok, amelyek az ABC-transzporterek családjába tartoznak, és szintén ATP-hidrolízis terhére transzportálják a lipideket a kettős réteg belső rétegéből a külsőbe. A későbbiekben látni fog­ juk, hogy különféle ABC-transzporterek képesek ilyen funkcióra, és ez nemcsak a membránaszimmet­ ria szempontjából jelentős, hanem részét képezi a

64

I I . A M E M B R Á N O K S Z E R K E Z E T E . M EM B R Á N T R A N S Z P O R T - F O L Y A M Á T O K

4-10. ábra. Foszfolipidek transzportja a membránlipid kettős réteg két rétege kö­ zött. FE, foszfatidil-etanolamin; FSZ, foszfatidilszerin; FL, foszfolipid

í flippáz

[floppáz

íszkrambláz

(P 4 -ATPáz) FE-, FSZ-import a belső rétegbe

(ABC-transzporter) FL-export

kétirányú lipidmozgás

foszfolipidek sejtekből történő tényleges exportjának, ami szerepet játszik pl. a HDL (high density lipoprotein, lásd 8. fejezetben) keletkezésében vagy az epekiválasztásban. Végezetül, a szkramblázok (scramblase) foszfolipidek kétirányú mozgását teszik lehetővé a membrán két rétege között a koncent­ rációgradiens mentén, ezért ATP-t nem igényelnek. Az ER membránban például, ahol a citoplazma felőli rétegben történik a glicerofoszfolipidek szintézise, szkramblázok biztosítják a két rétegben a foszfoli­ pidek egyenletes eloszlását (a plazmamembránnal szemben itt ez a jellemző).

Klinikai vonatkozások A vörösvértestekben a sejtek öregedése során a foszfatidil-szerin egyre inkább a külső rétegben jelenik meg, aminek az a jelentősége, hogy a makrofágokban foszfatidil-szerint felismerő receptorok vannak, ame­ lyek ezen keresztül megkötik, intemalizálják és a sej­ ten belül lebontják a vörösvértesteket. A vörösvértes­ tekben az az enzim, amely a foszfatidil-szerint a belső membránrétegből a külsőbe transzportálja, fiziológiás körülmények között nem aktív, azonban aktivitása megnő akkor, amikor stressz hatásra (pl. ATPszint-csökkenés vagy ozmotikus sokk) emelkedik az intracelluláris Ca2 -konccnlráció. Ismeretes, hogy pl. uraemiában szenvedő betegekben megnő a foszfatidil-szerin jelenléte a vörösvértestmembrán külső ré­ tegében és anaemia alakul ki.

A membrán aszimmetriának egy speciális formája valósul meg azokon a területeken, ahol a membrán külső rétegében feldúsul a szfingomielin és a koleszte­ rin mennyisége, és relatíve sok a GPI-horgonnyal kap­ csolódó fehérjék száma. Ez a terület a membrán síkjá­ ban, mint tengeren a tutaj, el tud mozdulni, ezért is ne­ vezik „m em bránraft”-nak, membrántutajnak (4-11/a ábra). A membrán tutajokhoz egyes területeken intracellulárisan egy kaveolin nevű fehérje kapcsoló­ dik, ami a C-terminálishoz közeli szakaszán a memb­ ránhoz rögzül palmitát- vagy mirisztáthorgonnyal, egy hidrofób szakasza pedig a membránba ágyazódik. A kaveolin dimereket alkot, és a membránt „behúzza” betüremkedéseket, kaveolákat alkotva. A membrán­ nak ezek a speciális régiói fontos szerepet játszanak sejten belüli transzport- és jelátviteli folyamatokban, köztük a mechanikus erők érzékelésében és a rájuk adott biokémiai válaszban. Szemben a klatrin borította vezikulákkal, a kaveolint tartalmazó membránrészek ritkán alakulnak át endocitotikus vezikulákká; ilyen­ kor hordozhatnak vírusokat (pl. papillomavírus) vagy toxinokat (pl. koleratoxin). Különösen jellemző a membrántutajokra és kaveolákra, hogy itt sok olyan fehérje lokalizálódik, amelyeket receptorok stimulálása aktivál, illetve ioncsatomák és iontraszporterek ta­ lálhatók itt, amelyek a jelátviteli mechanizmusok ha­ tékonyságát és gyorsaságát szolgálják (4-11/b ábra). Simaizomban például, ahol a szarkoplazmás retiku9+ lum (SR) Ca -raktára fontos szerepet játszik a sima­ izom-kontrakciót szabályozó jelátvitelben, az SR a kaveoláknál szoros közelségben van a plazmamemb­ ránnal.

65

4. A M E M B R Á N O K S Z E R K E Z E T E

kaveola

lipidtutaj

GPI-horgony

koleszterin

iontranszporter

jelátalakító másodlagos messenger

jelátalakító iontranszporter másodlagos messenger 4-11. ábra. Membrántutajok és kaveolák vázlatos szerkezete (a). Ezekben a membránrégiókban számos, a jelátvitelben szerepet játszó membránfehérje lokalizálódik (b) és egyes sejtekben (pl. simaizom) az endo/szarkoplazmás retikulum (ER/SR) szoros közelségben található

5.

MEMBRANTRANSZPORTFOLYAMATOK

ÁDÁM V E R O N I K A

5.1

A transzportfolyamatok energetikája

5.2

Facilitált diffúzió. Glukóztranszporterek

5.3

Aktív transzport

5.4

Membrán ion- és egyéb csatornák

5.5

A sejtek Ca2+-transzport-rendszerei. Ca2+-homeosztázis

A membránok szelektív barrierek. így lehet össze­ foglalni azt a kettősséget, hogy a legtöbb anyag átjutása a membránon erősen korlátozott, ugyanakkor bizto­ sított a sejtek életében szerepet játszó anyagok felvé­ tele és leadása. A sejtmembrán lipid kettős rétegének korlátozott permeabilitása adja a membránok barrier tulajdonsá­ gát, így a töltéssel rendelkező és poláros anyagok gya­ korlatilag nem vagy csak nagyon limitált mértékben képesek áthaladni. Ez a nagyfokú impermeabilitás ab­ ból adódik, hogy jelentős energiát igényel a poláros csoportok átjutása a lipid kettős réteg belső, erősen hidrofób közegén. Egyszerű diffúzióval gázok (mole­ kuláris O2, N2, CO2, CO, metán stb.) jutnak át a membránon. Viszonylag permeábilis a membrán a zsírban oldó­ dó, töltéssel nem bíró anyagok számára, mint amilye­ nek pl. a zsírsavak vagy a koleszterin. Exogén, lipidoldékony anyagok is átjutnak a membránokon, s ennek terápiás (pl. altatók, gáz narkotikumok) és toxi­ kus (pl. szerves foszfát növényvédő szerekkel történő kontamináció) jelentősége egyaránt nagy. Vízben ol­ dódó és töltéssel rendelkező anyagok átjutása a membránokon erősen korlátozott, és igaz ez bizonyos fokig magára a vízre is, amely bár diffundál a memb­ ránokon keresztül, érdemleges és szabályozott vízát-

66

67

71 82 88

jutás a plazmamembránban fehérjék közreműködésé­ vel valósul meg.

5 .1

A TRANSZPORTFOLYAM ATOK EN ER G ET IK Á JA

A transzportokat jellemzi az a szabadenergia-vál­ tozás (Gibbs-féle energiaváltozás), ami akkor törté­ nik, amikor egy anyag a membrán egyik oldaláról, ahol ci koncentrációban van, átkerül a másik C2 kon­ centrációjú oldalra. Töltéssel nem rendelkező moleku­ lák esetében a szabadenergia-változás csak a két kon­ centráció arányától függ és a következő képlettel fe­ jezhető ki: AG' = 23i?T lo g[C^

[e j ahol R az egyetemes gázállandó (8,315 J/mol-K), T az abszolút hőmérséklet (K), [ci] és [C2] az illető anyag koncentrációja a membrán két oldalán. Ha az anyag a nagyobb koncentrációjú kompartmentből az alacso­ nyabb koncentrációjú közeg felé transzportálódik ([ci] > [C2], a transzport iránya ci —>■C2), a AG’ nega­ tív, azaz spontán lefolyása termodinamikailag lehetsé-

5. M E M B R Á N T R A N S Z P O R T - F O L Y A M A T O K

67

ges, és ezért passzív transzportnak nevezzük. Ha a transzport ci -» Ci irányba történik a AG’ értéke pozi­ tív, azaz spontán lefolyása termodinamikailag nem le­ hetséges. Az ilyen transzportot aktív transzportnak nevezzük, és feltétele az, hogy valamely más folyamat fedezze a transzport energiaigényét. Ionok transzportja esetén nem egyszerűen a kon­ centrációgradiens határozza meg a AG' értékét, hanem amembrán két oldalán lévő eltérő polaritásból adódó membránpotenciái is, azaz

C1

>C 2

lipidoldékony apoláros molekulák 5-1. ábra. A koncentrációgradiens irányában történő anyagmozgás a membránokban, néhány példával, c,, c2, koncentrációk a membránnal elválasztott két kompartmentben

AG' = 2 ^ R T lo g ^ } + z F V [c, ]

ahol z az ion elemi töltéseinek száma (pl. —1, +1, +2...), F a Faraday-állandó (96 480 C/mol), V pedig az elektromos feszültség a membrán két oldala között (azaz a két kompartment közötti potenciálkülönbség, V=XP2— 'Hi). Egy ion transzportjának az energiaigényét tehát az elektrokémiai potenciálkülönbség, azaz a koncentrációarány és az elektromos potenciálkülönb­ ség együttesen határozza meg. Passzív transzport ese­ tén az ion az elektrokémiai gradiensnek megfelelő irányba transzportálódik, míg aktív transzport esetén ezzel ellentétesen. Az aktív transzporthoz ionok eseté­ ben is energia befektetése szükséges.

5.2

FA C ILIT Á LT D IF F Ú Z IÓ . GLUKÓZTRANSZPORTEREK

Az egyszerű diffúzió, amikor tehát egy anyag a koncentrációgradiens irányában szabadon permeál a

facilitált diffúzió

membránon keresztül, a szervezetben nagyon korláto­ zott mértékben áll csak rendelkezésre. A legtöbb anyag - tápanyag, metabolit, ionok - átjutását a membránban fehérjék biztosítják, melyeket transz­ portereknek, magát a folyamatot pedig transzportnak nevezzük. A transzportot, amely fehérje közreműkö­ désével a koncentrációgradiens irányában történik, passzív transzportnak, más néven facilitált diffúzió­ nak nevezzük. A facilitált diffúzió (5-1. ábra) sok szempontból hasonlít az enzimreakciókhoz, bár a fo­ lyamatban nem keletkezik új termék. A transzporterek megkötik a szubsztrátot, azaz a transzportálandó anyagot. A felismerés specifikus sztereokémiailag is, és a transzport specifikusan gátolható. A transzport se­ bessége ábrázolható a transzportálandó anyag kon­ centrációjának függvényében, s ez hasonló összefüg­ gést mutat, mint az enzimreakció függése a szubsztrátkoncentrációtól (5-2. ábra). Az ábrából, a MichaelisMenten-állandó analógiájára, meghatározható a

egyszerű diffúzió

koncentrációgrádiens koncentrációja

5-2. ábra. A facilitált diffúzió és az egyszerű diffúzió sebességének és a transzportálandó anyag koncentráci­ ójának összefüggése. K, a transzportá­ landó anyagnak az a koncentrációja, amelynél a transzport a maximális sebes­ ség felénél működik

68

I I . A M EM B R Á N O K SZER KEZETE. M EM B RÁNT RA N SZPO RT-FO LY AM Á TOK

transzport Kt-értéke, vagyis a transzportálandó anyag­ nak az a koncentrációja, amelynél a transzport az elér­ hető maximális sebesség felével működik. Facilitált diffúzióval az anyagok mindig a koncentrációgradi­ ensnek megfelelő irányban mozognak, legfeljebb ad­ dig, amíg az egyensúly kialakul a membrán két olda­ lán. Anyagok sejten belüli akkumulációja, azaz az extracellulárisnál magasabb koncentráció elérése faci­ litált diffúzióval nem lehetséges. A transzporterek in­ tegráns membránfehérjék, általában több transzmembránrégióval, amelyben hidrofd aminosav-oldalláncok hozzák létre azt a csatornát, amelyen az anya­ gok áthaladhatnak. Kotranszportnak nevezzük azt a transzportot, amelynek során egynél több anyag egyidejű transz­ portja történik, szemben az egyetlen anyag transzport­ ját végző uniporttal. A kotranszport, ha az anyagok azonos irányban transzportálódnak, a szimport, ha el­ lentétes irányban, akkor az antiport nevet viseli.

eritrociták folyamatos glukózellátásának biztosítása (GLUT1) (5-3. ábra). Mai ismereteink szerint az em­ beri szervezetben legalább 14 olyan fehérje expresszálódik, amely a glukóztranszporterek családjába tarto­ zik. Ezek közül néhánynak a szerepe jól ismert, de vannak olyanok is, amelyeket az emberi genomból azonosítottak, de funkciójukat még nem ismerjük. A különböző GLUT fehérjéknek eltérő az expreszsziója az egyes szervekben, a transzport kinetikája, a szubsztrát specificitása, a megjelenése a plazma­ membránban, és eltér a regulációjuk is (5-1. táblázat). Ez a metabolizmus igényeihez való nagyfokú alkal­ mazkodásra ad lehetőséget az egyes szervekben. Az eritrocitákban azonosított GLUT1 transzporter a legáltalánosabban előforduló glukóztransz­ porter, ami a legtöbb szervben megtalálható. A transz5-1. táblázat. Glukóztranszporterek (GLUT) előfordulá­ sa és legfontosabb szerepe az emberi szervezetben K,

Előfordulás

Fontosabb tulajdonság

Glukóztranszporterek

GLUT1

3 mM

általános

hypoxia, tumorszövet fokozott expresszió

Facilitált diffúzióval működnek a sejtek plazma­ membránjában azok a glukóztranszporterek (GLUT), amelyeken keresztül a legfontosabb tápanyagot, a glu­ kózt veszik fel a keringésből. Legelőször azt a glukóztranszportért sikerült megismerni, amely az eritrociták membránjában található, és amelynek feladata az

GLUT2

17 mM

hasnyálmirigy p-sejtek hepatociták vékonybél epitélsejtek vese-PKCS agy egyes sejtjei

inzulinelválasztás

5-3. ábra. A humán glukóztranszporter (GLUT1) szerkeze­ te. (A fehérjeszerkezeti adatbázisban [Protein Data Bank] a kris­ tályszerkezet az 4PYP azonosító alatt található)

glukóz felvétel/leadás glukózfelszívódás glukóz-visszaszívódás glukózszenzor étvágy, táplálékfelvétel reguláció

GLUT 3

1,5 mM

transzlokáció agy limfocita, monocita, intracelluláris vezikulákból trombocita spermium

GLUT4

10 mM vékonybél epitélsejtek (vese, agy, here, izom)

inzulinhatásra transzlo­ káció intracelluláris vezikulákból fruktóztranszporter

húgysavtranszporter

GLUT9

máj, vese, vékony­ bél

GLUT 7

vékony- és vastag­ fiziológiás szubsztrát nem ismert bél

GLUT6 , - 8

nem ismert

emberi genomból azo­ nosították

GLUT 13

agy

mioinozitoltranszporter

PKCS, proximális kanyarulatos csatornák

5. M E M B R Á N T R A N S Z P O R T - F O L Y A M A T O K

porter egy 12 transzmembránszakasszal rendelkező integráns membránfehérje, amely ~500 aminosavat tartalmaz, D-glukózra specifikus, s alacsony Kt-értéke (~3 mM) azt jelenti, hogy a plazma fiziológiás, éhezési glukózkoncentrációja mellett (4-5 mM) egy kons­ tans, alap glukózfelvételt biztosít a sejtek számára. D-galaktóz és D-mannóz is kötődik a transzporterhez, de a Kr érték sokkal magasabb, a fruktóz gyakorlatilag nemtranszportálódik a GLUTl-en. Ilyen transzporter biztosítja a glukóz átjutását a vér-agy gáton (agyi ka­ pilláris endotélsejtek), vagyis meghatározó szerepet játszik az agy glukózellátásában. A GLUT1 fokozott mértékben expresszálódhat a szervek hipoxiás állapo­ tában, amikor a megnövekedett glukózfelvétel a meg­ növekedett glikolitikus aktivitással együtt részlegesen kompenzálja a lecsökkent oxidatív ATP-termelést. Hasonlóképpen, az alapvetően glikolitikus ATP-ter­ melést szolgálja a tumorokban megfigyelt fokozott GLUTl-expresszió. A GLUT2 egészen más természetű transzporter: különlegesen magas Kr értékének (17 mM) köszönhe­ tően speciális feladatokat szolgál. Ezen a transzporteren keresztül a sejtekbe érdemleges glukózfel­ vétel csak akkor történik, amikor megemelkedik a vér­ plazma glukózkoncentrációja. A fokozott glukóz­ felvétel a GLUT2 fehérjéken keresztül úgy tud meg­ valósulni, hogy intracellulárisan a felvett glukóz azon­ nal foszforilálódik egy szintén magas Km-értékkel jel­ lemezhető hexokináz izoenzim, a glukokináz hatásá­ ra, ami fenntartja a glukóz koncentrációgradiensét. Je­ len van a májban, ahol a GLUT2-n keresztül megva­ lósuló fokozott glukózfelvétel meghatározó a máj sej­ tek táplálékfelvételt követő metabolikus folyamatai­ nak elindításában. A transzporteren ellenkező irányú glukóztranszport történik akkor, amikor a májban megnő a glukoneogenetikus aktivitás (glukóz de novo szintézise) és a glukóz koncentrációgradiense a vér­ plazma felé történő transzportnak kedvez. A hasnyál­ mirigy p-sejtjeiben is jelen van, és szerepet játszhat az inzulinelválasztás beindításában: a táplálékfelvételt követő megnövekedett glukózfelvétel indítja el azokat a metabolikus folyamatokat, amelyek az inzulin­ elválasztáshoz vezetnek. A vékonybél epitélsejtek bazális membránjában a GLUT2 transzporter a glu­ kóz- és galaktózfelszívódásban játszik szerepet. Meg

69

kell említeni, hogy fokozott szénhidrátfogyasztás kö­ vetkeztében, amikor megnő a lumenben a glukóz­ koncentráció, a GLUT2 az apikális membránban is megjelenhet, ahol egyébként a fő glukóztranszportáló fehérje, a nátrium-glukóz-kotranszporter (lásd alább). A vesében, a proximális kanyarulatos csatornák felső szakaszának epitélsejtjeiben szintén a bazális memb­ ránban foglal helyet a GLUT2, amelynek itt a glomerulus által filtrált glukóz visszaszívásában van je­ lentősége (lásd később 5-13. ábra). GLUT2 transzpor­ ter van még egyes neuronokbán a központi idegrend­ szerben, amelyek feltehetően az étvágy és táplálékfel­ vétel regulációjában játszanak szerepet. A neuronok legfőbb glukóztranszportere a GLUT3, amely nagy affinitású (Kt =1,5 mM), és mind az axonok, amint a dendritek membránjában jelen van. Megtalálták a GLUT3 fehérjét limfocitákban, monocitákban/makrofágokban és trombocitákban is, ahol intracelluláris vezikulák membránjában található, s csak a sejtek aktiválásakor kerül ki a plazmamembrán­ ba, aminek egyelőre nem ismert a szerepe, de feltehe­ tően összefüggésben van a gyulladásos és immunvála­ szok aktiválásával. A GLUT4 transzporter jelentőségét az adja, hogy az inzulin reguláié hatása alatt áll. A transzporter az adipocitákban és a harántcsíkolt izomban expresszálódik, ahol azonban inzulin hiányában nem a plazmamembránban, hanem intracelluláris vezikulák membránjában található, tehát glukózt a vérplazmából nem transzportál. Táplálékfelvétel után, amikor inzulin választódik el a hasnyálmirigy P-sejtekből, a haráncsíkolt izomban és a zsírszövetben lévő inzulin­ receptorok stimulációja hatására a GLUT4-tartalmú intracelluláris vezikulák a plazmamembránnal fuzio­ nálnak, a transzporter megjelenik a plazmamembrán­ ban, ahol nagy affinitással (Kt < 5 mM) köti a glukózt, és ennek megfelelően jelentősen megnő a glukózfel­ vétel sebessége. Megjegyzendő, hogy a vázizomban kontrakció alatt, Ca2+-függő módon, inzulintól füg­ getlenül is fokozódik a GLUT4 transzporterek transz­ lokációja a plazmamembránba. Az eddig megismert transzporterek közül a GLUT5 az egyetlen, amely nagy specificitással transzportálja a fruktózt. Számos szervben expresszálódik (vese, zsírszövet, agy, izom), de legjelen-

70

I I . A MEMBRÁNOK SZERKEZETE. M EM BRÁN TRAN SZ PORT-FOLYAM ÁTOK

perifériás kapillárisok

tősebb előfordulása a v é k o n y b é l epitélsejtek apikális membránja, ahol a táplálékkal elfogyasztott fruktóz felszívódásában játszik szerepet. A többi transzporterről lényegesen kevesebbet tu­ dunk. A GLUT9 fiziológiai jelentősége úgy tűnik, hogy nem a szénhidrátok transzportjában keresendő. A májban, vesében és a bélrendszerben van jelen és legfőbb szubsztrátja a húgysav; a vesében a húgysav visszaszívódásban van szerepe. Megemlítendő még a GLUT7, ami a vékony- és vastagbél epitélsejtek apikális membránjában található, de mind a glukóz, mind a fruktóz iránt kicsi az affinitása, s valószínűleg egy ezidáig nem azonosított szubsztrát felszívódásá­ ban játszik szerepet, valamint a GLUT13, amely pe­ dig mioinozitoltranszporter és az agyban expresszálódik. A többi transzporter létezéséről a humán genom megismerése óta van tudomásunk, de szerepük egy­ előre tisztázatlan.

plazma

HCO,

szensavanhidráz eritrocita

> V > -* Y V

tüdő

kilégzés

HCO3-

Klorid-bikarbonát cseretranszporter Az eritrociták membránjában található egy másik fontos transzporter, amely a szén-dioxid-transzportban játszik szerepet, s jó példa a facilitált diffúzió mű­ ködésére és jelentőségére (5-4. ábra). A k l o r i d - b i ­ k a r b o n á t cseretranszport HCO3 és Cl” ellentétes irá­ nyú transzportját végzi az eritrociták membránján ke­ resztül, a koncentrációviszonyok által meghatározott irányban. A szervekből, a katabolizmus során keletke­ ző CO2 a kapillárisokba kerül, ahol az eritrocitákba diffundál. Az eritrocitákban a szénsavanhidráz enzim hatására H2CO3 keletkezik, amely reakcióban 1 s-on belül - azaz rövidebb idő alatt, mint amit a vér a kapil­ lárisokban tölt - egyensúly alakul ki. A H2CO3 spon­ tán reakcióban, gyakorlatilag azonnal disszociál, HCO3” és H+ keletkezik. A HCO3- a klorid-bikarbo­ nát cseretranszporton keresztül visszakerül a plazmá­ ba, s így szállítódik a tüdőbe. Mivel a HCO3 jobban oldódik a plazmában, mint a CO2, az eritrocitáknak ez a funkciója lényegesen megnöveli a vérplazma CO2szállító kapacitását. A tüdőben a HCO3 a cseretranszporteren ellentétes irányban transzportálódva visszakerül az eritrocitákba, ahol a fenti folyamatok ellentétes irányban zajlanak le, CO2 keletkezik, ami

5-4. ábra. HCO3 -Cl cseretranszport az eritrociták memb­ ránjában és a C 0 2-szállítás

diffúzióval elhagyja az eritrocitákat és kilégzésre ke­ rül. A plazmában szállítódó CO2 80%-a kerül így a pe­ rifériáról a tüdőbe, s ehhez a folyamathoz esszenciális a HCO3 -C l- cseretranszport vagy másnéven anion-cseretranszport működése. A transzporter - amit még bánd 3 fehérjének is neveznek az SDS poliakrilamid gélen elektroforézissel látható helyzete mi­ att - integráns membránfehérje, valószínűleg 12 transzmembránrégióval rendelkezik. A transzport so­ rán nem történik nettó töltésváltozás a membrán két oldalán, vagyis a folyamat nem elektrogén. A mitokondriumok belső membránja is számos olyan transzporterrel rendelkezik (lásd 6. fejezet), amelyen az anyagok koncentrációgradiens irányában történő transzportja történik. Ezek is, a HCO3 -Cl" cseretranszporthoz hasonlóan, többnyire két anyag egyidejű, ellentétes irányú elmozdulását teszik lehető­ vé.

5. M E M B R Á N T R A N S Z P O R T - F O L Y A M A T O K

5.3

A K TÍV T R A N SZ P O R T

A sejtek fiziológiai működéséhez elengedhetetlen számos olyan transzport működése, amelynek segítsé­ gével anyagok a koncentráció- vagy az elektrokémiai gradienssel ellentétes irányban mozognak. A legtöbb ilyen transzport közvetlenül kapcsolt az ATP-terminális foszfátjának hidrolíziséhez, ami a transzport ener­ giaigényét fedezi. Ezek az ún. elsődleges aktív transzportok. Ilyen a plazmamembránban található, a sejtek Na+- és K+-eloszlását meghatározó Na+K+-ATPáz vagy a sejtek Ca2+ homeosztázisában fontos szerepet játszó Ca' -ATPázok. Vannak olyan transzporterek, amelyekben az ATP hidrolízise nem közvetlenül része a folyamatnak, ha­ nemaz aktív transzport energiaigényét az fedezi, hogy egyidejűleg egy másik anyag az elektrokémiai gradi­ ensnek megfelelő irányban transzportálódik, vagyis exergonikus folyamat történik. A legtöbb ilyen transzporter a sejtek plazmamembránjában a Na+-gradienst használja fel, és Na+ egyidejű transzportja történik a sejtekbe. Minthogy a Na+-gradiens fenntartása ATP energiájának a terhére történik, az ilyen transzportokat másodlagos aktív transzportnak nevezzük. Másod­ lagos aktív transzporttal történik például a glukóz és bizonyos aminosavak felszívódása a bélhámsejteken keresztül vagy számos neurotranszmitter transzportja az idegi membránokban. Az aktív transzportokra egyébként ugyanaz jellemző, mint a facilitált diffúzió­ ra: a transzporter specifikus a szubsztrátra, specifiku­ san gátolható és működése telítési kinetikával írható le.

k transzport ATPázok csoportosítása Az aktív transzporterek jelentős része az ún. P-típusú ATPázok családjába tartozik, amelyek függetlenül attól, hogy milyen iont vagy molekulát transzportálnak, néhány közös tulajdonsággal bírnak: integráns membránfehérjék, aminosavsorrendjükben nagyfokú hasonlóság van, működésük során foszforilálódnak és defoszforilálódnak, foszforilációjuk egy meghatározott aszparaginsav-oldalláncon törté­ nik, és mindegyik gátolható a foszfátanalóg vanadáttal

71

(HV042 ). P-típusú ATPáz a sejtek Na+ és K+ egyen­ súlyát meghatározó plazmamembrán Na+K+-ATPáz és a plazmamembránban, valamint az endo/szarkoplazmás retikulumban található Ca -ATPáz, amely 24az intracelluláris Ca" -koncentráció szabályozásában játszik szerepet (lásd Ca -homeosztázis). Hasonló működésű a gyomor parietális sejtjeiben található K H -A T P áz, amely a lumenből K+-t pumpál a sejtbe, a sejtből pedig H+-t a lumenbe, s ezáltal a gyomomedv savas pH-jának létrehozásában van meghatározó sze­ repe. Ide sorolhatóak a flippázok (4-10. ábra) és egyes nehézfémeket transzportáló ATPázok is. A P-típusú ATPázok szerkezetének közös jellemzője, hogy négy, jól megkülönböztethető domént tartalmaznak: a transzportfunkciót ellátó T-domént, amely a 10 transzmembránszakaszt tartalmazó transzmembránrégióban van, az N-domént, amely köti az ATP-t és foszforilálja a másik, P-doménben helyetfoglaló aszparaginsavat és az A-domént, amely foszfatázaktivitással rendelkezik. Az egyes domének jelentőségét a Na+ K -ATPáz enzim működésének kapcsán ismertet­ jük. Eltérő, de mind ez ideig nem egészen tisztázott me­ chanizmussal működnek azok az ATPázok, amelyek az intracelluláris organellumok - lizoszómák, endoszómák, szekréciós és szinaptikus vezikulák, Golgikomplex - membránjában találhatók, és protont transzportálnak. Ezek a V-típusú ATPázok (vakuola), amelyeknek az a feladata, hogy a citoplazmáénál alacsonyabb pH-t hozzanak létre ezen organellumok belsejében. A szekréciós vezikulák vagy a szinaptikus vezikulák például a kialakuló protongradiens terhére veszik fel az egyes hormonokat és neurotranszmittereket, ahol ezek raktározódnak (21. fejezet). A V-típusú ATPázok nem foszforilálódnak és nem gá­ tolhatok vanadáttal, szerkezetük az F-ATPázokhoz hasonló. Végezetül, az ATPázok egy harmadik csoportjába tartozik a mitokondrium belső membránjában találha­ tó F-típusú ATPáz. Ez fiziológiásán a protonok transzmembrán, koncentrációgradiens irányában tör­ ténő áramlásával párhuzamosan az ATP - ADP+Piből történő - szintézisét katalizálja, ezért helyesebb ATP-szintáznak nevezni, noha az enzim ATPáz funk­ cióra is képes. (Eredetileg ezt energy-coupling

72

l i . A MEMBRÁNOK SZERKEZETE. MEM BRÁNTRANSZPORT-FOLYAM ÁTOK

plazmamembrán

/actomak tartották, innen az elnevezés.) A mitokondriális ATPáz részletes leírására a 6. fejezetben kerül sor. A transzport ATPázokhoz sorolhatók még az ABC-transzporterek családjába tartozó fehérjék (lásd később).

Na+K+-ATPáz - Na+K+-pumpa Az élő sejtek jellemzője, hogy belső terükben az egyes ionok koncentrációja lényegesen eltér az extracelluláris közegben található ionkoncentrációk­ tól. Ehelyütt csak a Na+- és K+-eloszlásról lesz szó, amelyekről ismert, hogy nagyságrendbeli eltérés van az intracelluláris és extracelluláris koncentrációik kö­ zött (5-5. ábra). A Na+ 140 mM koncentrációban van jelen a plazmában, míg intracelluláris koncentrációja a különböző sejtekben 10-15 mM, szemben a K+-mal, amelynek koncentrációja a plazmában 4 mM, intracellulárisan pedig 140-150 mM. Ez az ionelosz­ lás meghatározó a sejtek nyugalmi potenciáljának lét­ rejöttében, ami -60 és -90 mV közötti tartományban van. A nyugalmi potenciál megközelíti a K -egyensúlyi potenciált, vagyis a K7-eloszlás a plazmamemb­ rán két oldalán közel egyensúlyi helyzetet jelent. Na+-ra nézve azonban a koncentrációkülönbség és a belső negatív potenciál együttesen olyan jelentős elektrokémiai gradienst jelent, ami - a korlátozott plazmamembrán-permeabilitás ellenére - a Na+-t a sejtbe hajtja, s ezzel párhuzamosan K lép ki a sejtből. Ha ez a folyamat nem kompenzálódna, a sejtek képte­ lenek lennének az ioneloszlást és így a nyugalmi po­ tenciált fenntartani, s ez a sejt halálát jelentené. A Na+K+-ATPáz - mely minden sejt plazmamemb­ ránjában jelen lévő enzim - feladata, hogy a Na+-t visszapumpálja az extracelluláris térbe, a K -t pedig a sejtbe. (Ezért nevezik ezt a transzportrendszert, Na+K+-pumpának, vagy egyszerűen, Na+-pumpának.) Az elektrokémiai gradiens ellenében történő ion­ transzporthoz az energiát az ATP hidrolízise biztosít­ ja, amely szintén a Na+K-ATPáz hatására megy vég­ be. Az enzim fontosságát jelzi, hogy a sejtek a teljes ATP-termelésüknek mintegy 30%-át e funkció fenn-

5-5. ábra. A Na+K+-ATPáz működésének sémája. Extra­ celluláris és intracelluláris Na+- és K+-koncentrációk

tartására fordítják (ideg- és izomsejtekben 65-70%ot). Az enzim működése úgy is felfogható, mint ami az ATP-hidrolízis energiáját egy iongradienssé alakítja, s az ebben rejlő energia számos sejtfűnkcióhoz közvet­ lenül hasznosítható (lásd másodlagos aktív transzpor­ tok). A Na+K+-ATPáz integráns fehérje a plazmamemb­ ránban, amelyet intracellulárisan a NaT, extracellulárisan a K+ aktivál; az enzim működéséhez mindkét ion együttes hatása szükséges. Működése közben ATP felhasználásával a P-doménben egy meghatározott he­ lyen lévő aszparaginsavat foszforilál, amelyről a kata­ litikus ciklus későbbi fázisában az anorganikus foszfát hidrolízissel leválik. Az enzim két különböző konfor­ mációban létezik, ezeket Ei- és E2-vel jelöljük. Az ATP-t kötött E|-konformációjú enzim az intra­ celluláris oldalon köti a Na+-t, és foszforilálódik (5-6. ábra). Az E|-P foszfoenzim konformációváltozással átalakul, miközben először egy, majd további két Na -iont pumpál ki a sejtből. Az E2-P foszfoenzim kö­ ti a K+-t az extracelluláris oldalon, és az enzim defoszforilálódik. Megtörténik a K+ sejtbe történő transzportja, miközben az eredeti, E|-konformáció visszaalakul, és az enzim megköti az ATP-t. A legtöbb sejtben az enzim egy ATP-molekula hidrolízisével párhuzamosan 3 Na+ és 2 K+ transzportját végzi. Ez extra pozitív töltések megjelenését okozza az extra

5. M E M B R Á N T R A N S Z P O R T - F O L Y A M A T O K

73

intracelluláris oldal

2K1 ATP E 2 2K'+ ^

3Na* >

F 1 ATP

ADP

----—^ ------- >

/

e, mpj: 3Na *----- ^

----->

E,

3Na+

^N a+ V e2( J

E2( P 2K‘

2K+

extracelluláris oldal

E, i P 2Na* 2Na+

5-6. ábra. A Na+K+-ATPáz működésének egyes lépései. E1; E2 az enzim a-alegységének két konformációs állapota

celluláris közegben, amely néhány mV-tal közvetle­ nül hozzájárul a nyugalmi potenciálhoz, ezért a pumpa elektrogén. A Na+K+-ATPáz működésének ma legva­ lószínűbbnek tartott egyszerűsített modelljét az 5-7. ábrán mutatjuk be . A Na+K+-ATPáz szerkezetét és doménösszetételét az 5-8. ábra mutatja. Az enzimfehérje alkotásában minden szövetben részt vesz két alegység: a 10 transzmembránszakasszal rendelkező a-alegység (112 kDa), amely a fent leírt katalitikus sajátsággal rendel­ kezik és az egy transzmembránszakaszt tartalmazó (5-alegység (35 kDa), amely glikozilált, és feltehetően a megfelelő membránorientációhoz és az a-alegység plazmamembránbajuttatásához szükséges. Bár a (3-alegység a jelen ismereteink szerint katalitikus sajátos­ sággal nem rendelkezik, jelenléte elengedhetetlen az a-alegység transzportfunkciójának működéséhez. Az a-alegység citoplazmatikus N-doménje tartalmazza az ATP-kötőhelyet, a P-domén azt az aszparaginsavoldalláncot, ahol az enzim foszforilálódik. A enzim al­

extracelluláris oldal

E,ATP

3

E,ATP3Na+

kotásában részt vesz még egy harmadik alegység, az ún. FXYD családba tartozó fehérje is. (A fehérjecsa­ lád minden tagja egy transzmembránszakasszal ren­ delkezik, az elnevezés az N-terminális szakaszon kon­ zekvensen előforduló Phe-X-Tyr-Asp motívum alap­ ján történt.) Ennek jelenléte és az a-alegység enzimak­ tivitását reguláié szerepe egyes szervekben jól ismert, az azonban nem bizonyított, hogy mindenhol része lenne a Na+K+-ATPáznak. A Na+K+-ATPáz nagyfokú változatosságát az adja, hogy minden alegység több izoformában fordul elő, amelyeket külön gének kódolnak. Az a-alegységnek négy (at, a2, a3, a4), a P-alegységnek három (pi, (32, P3), az FXYD fehérjének hét izoformája van, így a Na+K+-ATPáz számos alegység-összetételben fordul­ hat elő, ami az egyes szervekben eltérő. Az a [-al­ egység minden szervben előfordul, az a2-izoforma el­ sősorban a harántcsíkolt- és simaizmokban, de az agy­ ban (asztrociták), szemben, zsírszövetben és a szívben is megtalálható. Az a3-izoforma a neuronokbán, a

Na*

E2P

5-7. ábra. A Na+K+-ATPáz működésének modellje. Az enzim alapállapotban (E,ATP) az intracelluláris oldalon megköt 3 Na+-t (E,ATP 3Na+). Az enzimfoszforiláció konformáció változást indukál, és a Na+disszociál az extracelluláris oldal felé (E2 P). A megváltozott konfor­ mációban 2 K+kötődik az extracelluláris oldalon (E2 P2K+), ami defoszforilációhoz vezet. A defoszforilált enzim konformációváltozással elengedi a két K+-t az intracelluláris oldalon és megköt egy ATP-molekulát (E,ATP)

74

I I . A M E M B R Á N O K S Z E R K E Z E T E . M E M B RÁ N T R A N S Z P O R T - F O L Y AM Á T O K

szívben és az ovariumban, míg az 014-izoforma a heré­ ben fordul elő (5-2. táblázat). A funkcionális enzim­ hez minimálisan az a (3 alegység-összetétel szükséges, és csak ebből is 12 lehetséges izoenzim-összetétel adódik, amelyek eltérő transzport- és farmakológiai sajátossággal rendelkeznek. Ehhez adódik még az FX YD alegységből adódó további változatosság. Az intracelluláris oldal

FXYD

fehérjék általánosságban az a [-alegység-

transzport kinetikáját befolyásolják, különböző izoformáinak jelenléte szövetspecifikus és szerepük a ve­ extracelluláris oldal

sében és a szívizomban jól ismert. Fegtöbbet az FX Y D 2 (korábban y-alegységnck nevezték) funkció­ járól tudunk, amely a vesében található (legnagyobb sűrűségben a Henle-kacsok külső medulláris vastag felszálló szegmentumán), és jelenléte csökkenti az a 1-alegység Na+ iránti affinitását és növeli az ATP iránti affinitást. Ezek kismértékű változások, amelyek ebben a zömében anoxiás veserégióban (mitokondrium alig van) is biztosítják a Na+K +-ATPáz hatékony működését és a Na+-visszaszívódást.

A szívben ai-, ob- és 013-izoforma egyaránt jelen van, összességében az ai-izoforma a domináns, míg az 013 csak néhány százalékban van jelen. Az ai- és Ob-alegységek eloszlása a szívizomsejtekben egyenet­ len: a szarkolemmában a domináns izoforma az ai-, míg az 012-alegységek a T-tubulusokban koncentrálód­ nak, bár az ai-izoforma itt is meghatározó. Ez azt je­ lenti, hogy a szarkolemmában a globális Na+-koncentrációt az oii határozza meg, míg a szarkolemma és a szarkoplazmás retikulum mikrokömyezetében az aj-

5-2. táblázat. A Na+K+-ATPáz a-alegység izoformáinak előfordulása az egyes szövetekben Előfordulás

Izoforma

5-8. ábra. A Na+K+-ATPáz doménszerkezete a kristályszer­ kezet alapján (a) és a Na+-t kötött Er konformációban levő enzim kristályszerkezete (b) (Dr. Chikashi Toyoshima, Structural Biology Professor, Institute of Molecular and Cellular Biosciences, University of Tokyo ábrája, szíves hozzájárulásával). A (b) ábra mutatja az egy transzmembránszakasszal és nagy extracelluláris glikozizált doménnel rendelkező p-alegység szer­ kezetét is, de az FXYD alegység nem látszik. A kötött 3 Na+ a transzmembrán doménben látható (I, II, III, piros körök). T, transz­ membrán dómén; N, nukleotidkötő dómén; P, foszforilációs dómén, A, aktivátor dómén

ai

minden szervben vese külső medullában csak ez

^ [A][B] ahol a szögletes zárójelben jelölt értékek az aktuálisan jelen levő koncentrációkat jelölik (R, gázállandó, 8,31 J m o f'lC 1; T, abszolút hőmérséklet, °K) Ha AG = 0 AG’° =-2,303 RT lóg Ke’(J),

Ha T = 298 °K, akkor

AG,0 = -5,69 lóg K ; (kJ)

Gyakoribb az összefüggés fordított felhasználása, mivel redox folyamatokban redoxpotenciál-mérésekkel a AG'° meghatározható, s ebből számítható a Ke'. A AG állapotfüggvény, így értéke független a reakcióúttól.

AZANYAGCSERE

energia továbbalakításában sejttípusonként más és más. Egy inzulint termelő és azt elválasztó pancreas (3-sejt esetében az energiát fogyasztó folyamatok kö­ zött inkább a fehérjeszintézis dominál, simaizomsejtnél a kontraktilis elemek működtetése, egy neuron esetében viszont inkább a transzportfolyamatok a meghatározók. A bioenergetika a teljes szervezet, egyetlen sejt, de egyetlen reakció szintjén is tanulmá­ nyozható. Az energiaigényt meghatározza a szervezet/sejt aktuális állapota. Egy növekvő sejt vagy egy nyugalomban lévő izomsejt energiaigénye például je­ lentősen különbözik egymástól. Az információkat közvetítő, jelátviteli folyamatokat sejtszinten ezért közvetve, döntően befolyásolja, hogy mennyi a sejt aktuális energiaszükséglete; felhalmoz-e, vagy éppen mobilizálja energiatartalékait (6-2. ábra).

A AG ugyanakkor termodinamikai és nem kinetikai fogalom, így ér­ tékéből nem következtethetünk a reakció sebességére. Annak, hogy egy reakció spontán menjen végbe, az a feltétele,

anyag/energia

információ/jelek

hogy a AG < 0. Ezeket a spontán, negatív szabadenergia változással rendelkező reakciókat exergonikus reakcióknak nevezzük. A sejt azokat a reakciókat, amelyekben szabadenergia szabadul fel, kap­ csolhatja pozitív AG-vel rendelkező, szabadenergia befektetésével járó endergonikus reakciókhoz. így a folyamat teljes energiaválto­

■ r tt-w tr t e r f tr r t te t-.

-> f jelátvitel

metabolizmus szukcinát + CoA GDP + P;

exergonikus endergonikus COO-

I

GDP + P

CH„

GTP

[ CoA~)— SH

C —S —fcÖA|

II

-----

O

szukcinil-CoA

I I

CH, CH,

I

[~szukcinil-CoA-szintetáz

COOszukcinát

(AG’° = -2,9 kJ/mol)

b foszfoenol-piruvát + HzO ----- > piruvát + P.

V I

C —O

II

endergonikus

o-

CH.

0 II

P — o-

1

o

foszfoenol-piruvát

zat). Tehát éppen a kulcsszerepet játszó, átvivő mole­ kulák azok, amelyeket sejtjeink nem képesek - vagy elegendő mennyiségben nem képesek - önmaguk megtermelni. Az élővilágban az átvivők többnyire univerzális molekulák. A csoportátvitel tendenciáját jellemző csoportát­ viteli potenciált a kérdéses csoportátviteli reakció standard szabadentalpia-változása határozza meg. A csoportátvitel iránya gyakran változó, és a csoport­ átviteli reakció reverzibilis.

exergonikus

ADP + P Ov

AZ ANYAGCSERE

ADP V

Ov

ATP Mg2*, K*

f piruvát- kináz

V

o-

I I

c= o

COO-

COCr

CH

c =o

I hJnJ I

ch3

I I

ch3

alanin

piruvát

COO-\ 1 --C — H _ 1 Cl-L

c=o

ch3

(AG 0 = -31,4 kJ/mol) piruvát

6-5. ábra. Kapcsolt reakciók, (a) A szukcinil-CoA-szintetáz által katalizált reakció. A szukcinil-CoA-szintetáz a citrátkör egyik enzime. Az általa katalizált exergonikus folyamatban a szukcinil-CoA tioészterkötésének bomlása során felszabaduló energia úgy hasznosul, hogy ehhez endergonikus folyamat is tár­ sul, savanhidridkötés jön létre, GDP foszforilálódik GTP-vé. (b) A piruvát-kináz által katalizált reakció. A piruvát-kináz a glikolízis egyik enzime. A kapcsolt reakció exergonikus részében a foszfoenol-piruvát (PÉP) savanhidridkötése bomlik és enolpiruvát, majd spontán tautomerizációval oxo-piruvát képződik. A kapcsolt reakció endergonikus részében a PEP-ből származó foszforilcsoport ugyanakkor ADP-re kerül át, és így új savanhidridkötéssel ATP keletkezik. Mindkét reakció eredő szabad­ energia-változása negatív. Mindkét reakcióban szubsztrátszinten keletkezik nagy energiájú (makroerg) kötés (szubsztrátszintű foszforiláció)

i z

(\|

X

-o -

rendszerezhető. Azonos csoport átvitelével járó reak­ ciók különböző molekulák között többnyire azonos, vagy kisszámú (csoport) átvivő(k) közvetítésével bo­ nyolódnak. A csoportátvitelre jellemző, hogy a (cso­ port) átvivő molekulához az átvivendő részecske, vagy atomcsoport átmenetileg kapcsolódik (6-6. áb­ ra). így az átvivő a helyzettől függően egyaránt lehet csoportdonor vagy -akceptor. Enzimatikus folyama­ tokról lévén szó a csoportátvivő molekula része az en­ zimreakciónak; koenzim vagy prosztetikus csoport­ ként funkcionál. Külön érdekesség, sőt ellentmondás, hogy táplálkozás-élettani szempontból az átvivő gyakran vitamin vagy annak származéka (6-1. táblá­

COO'

Cl-L Cl-L 1

COO-

COO-

glutamát

a-ketoglutarát

6 -6 . ábra. Aminocsoport átvitele transzamináz által katali­ zált reakcióban. Az aminosav-anyagcsere (lásd 9. fejezet) egyik fontos reakciója a transzaminálás, amelyben az aminocsoportátvivő piridoxál-foszfát átmenetileg felveszi az aminocsoportot az alanintól, és átadja azt az a-ketoglutarátnak. Ennek eredmé­ nyeképpen az alanin piruváttá, az a-ketoglutarát glutamáttá ala­ kul. A reakció reverzibilis, így mindez fordítva is történhet: glutamát adja át az aminocsoportot piruvátnak, miközben a-ketoglutaráttá alakul, s közben a piruvátból a transzaminálás során alanin képződik. A piridoxál-foszfát B6 -vitamin-származék

105

6. B I O E N E R G E T I K A

6-1. táblázat. Csoportátvitelben szerepet játszó vita­ minszármazék csoportátvivők Vitamin

Átvivő

Csoport elektronok

FAD

riboflavin (B2 -vitamin)

hidridion (PT)

NAD+

nikotinsav (niacin, B3 -vitamin)

amino-

piridoxál-foszfát

piridoxin (Bö-vitamin)

acil-

koenzim-A

pantoténsav (B5 -vitamin)

H-atom és alkil- 5'-dezoxiadenozilkobalamin, metil-kobalamin

ló központi, átvivő szerepre: képes további, foszforilcsoporto(ka)t felvenni és a felvett csoportot át is adni. A magasabb foszforilációs potenciállal rendelkező

kobalaminok (Bi2 -vitamin)

co2

biotin

biotin

Q-töredék

tetrahidrofolát

folsav

A csoportátviteli reakciók közül bioenergetikai szempontból kétféle transzfer, az elektron- és a foszforilcsoport átvitelével járó reakciók (6-1. ábra) ki­ emelkedő jelentőségűek.

Foszforiltranszfer szerepe az energia­ transzformációban Az energiaigény fedezésében meghatározó az egyes vegyül etek foszfátcsoportjainak lehasadásából származó energia hasznosítása. A foszforiltranszferben kitüntetett szerepe van a nukleozid-foszfátoknak, amelyek viszonylag stabil molekulák és enzimek hatá­ sára foszforilálódnak vagy defoszforilálódnak. Az exergonikus és endergonikus folyamatok közötti ener­ giaátvitelben az ATP (adenozin-trifoszfát) a legfon­ tosabb szereplő (6-7. ábra). Különböző, anyagcseré­ ben részt vevő foszfátvegyületek foszforilcsoportjai hidrolízisének szabadentalpia-változás értékeit a 6-2. táblázat foglalja össze. Az ATP és az ADP (adenozin-difoszfát) terminális foszforilcsoportjai hidrolí­ zisének szabadentalpia-változás értékénél - foszforilációs potenciáljánál, amivel a foszforilcsoportátvitel jellemezhető - a 6-2. táblázatban magasabb és alacsonyabb értékek is találhatók. Pontosan ez teszi alkalmassá az AMP-t a foszforilcsoport-átvitelben va­

6-7. ábra. ATP, ADP, AMP. Az ATP (adenozin-trifoszfát) adeninból, ribózból és három - ADP (adenozin-difoszfát) eseté­ ben kettő, AMP (adenozinmonofoszfát) esetében egy - foszfát­ csoportból áll. A sejtben Mg2+-komplex formájában találhatók

IN.

106

6-2. táblázat. Az anyagcserében jelentős né­ hány foszfátvegyület foszfátcsoportja hidro­ lízisének DG'0 értéke

f nukleofil támadás (hidrolízis)

foszfoenolpiruvát

-61,9

1,3-biszfoszfoglicerát (-> 3-foszfoglicerát + Pj)

-49,3

ATP (-» AMP + Pj)

-45,6

h

- o:

ribóz

I

AG'° (kJ/mol)

O II

CL -

O II P— I1 O-

I o

Foszforilált vegyület

CT

ATP4

H negatívan töltött foszforilcsoportok taszítják egymást

o o II

II

o II

foszfokreatin

-43,7

P — OH + HO— P — O — P — i1 i 1 1 1 OOO'

ADP (-» AMP + Pj)

-27,6

A

ATP (-» ADP + P|)

-30,5

AMP (—» adenozin + Pi)

-14,2

PPi (-»

-27,6

Pi)

glukóz-1-foszfát

-20,9

fruktóz-6 -foszfát

-15,9

glukóz-6 -foszfát

-13,8

glicerol-1-foszfát

-9,2

adenin

1

l

O-

2

AZANYAGCSERE

ribóz — adenin ADP4

a rezonancia (delokalizáció) stabilizáló hatása

8‘ O — P — Ö 5‘

savi disszociáció

H++ ’O— P — O — P — O — ribóz

I

I

O -

O -

adenin

1

ADP3'

6-8.

ábra. Egy „magas energiájú" kötés felszakadása - az ATP hid­ rolízise

foszfátokat makroerg foszfátoknak is nevezik és (miként a magas energiájú kötéseket általában) jellel jelölik. A magasabb energiájú kötések az ATP esetében foszforsavanhidrid-kötések (6-7. ábra). Itt a poláros P=0 kettős kötés a foszforatomokat érzé­ kennyé teszi a nukleofil támadás, s így a hidrolízis iránt. A (fiziológiás pH-n) negatív töltéssel rendelke­ ző foszforilcsoportok taszítják egymást, ugyanakkor az eltávolított foszfátot a rezonancia (delokalizáció) stabilizálja. A foszforilcsoport hidrolízisét fiziológiás pH-n savi disszociáció követi (6-8. ábra). A magas energiájú kötést értelmező ilyen típusú magyarázatok egy része más magasabb energiájú kötések eseteire is alkalmazható. Ilyenek pl. a foszforsav-karbonsav ve­ gyes anhidridkötések (1,3-biszfoszfoglicerát Cl fosz­ fátja), a savamid- (foszforsavamid) pl. foszfokreatinban, de akár tioészterkötések, pl. acetil-CoA-ban (6-9. ábra). E kötések bomlása során a felszabaduló energia kapcsolt reakcióban hasznosulhat. Az adenilát nukleotidkészlet (pool) viszonylag ál­ landó, foszforiláltsági állapota azonban folyamatosan változik. Ennek - és ezzel az egész sejt energetikai ál­

lapotának - jellemzésére az energiatöltést szokták használni. energiatöltés —-

2[ATP] + \ADP] [ATP\ + [ADP] + [AMP]

Az ATP 2, az ADP 1 magas csoportátvitelű kötést tartalmaz, míg az AMP egyet sem. így az energiatöltés értéke 1-0 között változhat: ha minden adenilát ATP lenne, akkor 1, ha minden adenilát AMP, akkor 0. Hihetetlenül csekély az emberi szervezet ATPkészlete; körülbelül 50 g. Az ATP intracelluláris kon­ centrációja 1-10 mM. Különböző kalkulációk szerint ez kb. 30 s tartósságú „élethez” lenne elegendő, nem számolva például egy éppen 100 méteres síkfutás ver­ senyében lévő atléta, vagy egy kapásra váró horgász igen különböző élethelyzetéből adódó energiafo­ gyasztási különbséggel. Miután ezen kalkulációk sze­ rint az ATP-szükséglet „alapállapotban” kb. 0,1 kg/perc, egy ADP-molekula naponta átlag legalább 3000-szer foszforilálódik. Az ADP-ből történő ATP regenerálódásnak két alapvető mechanizmusa van. Legnagyobb mennyiség-

107

6. B I O E N E R G E T I K A

CE 2

rezonancia delokalizáció

°\ P / PX

O

O,

O'

-V 1 I HC — OH I

3 CH,

I 0 1 o —p=o I cr

V

—

8“

OH

V

i—

HC — OH

I O'

I I 0 1 -O— P = 0 I O-

3-foszfoglicerinsav

3-foszfoglicerát

savi disszociáció

0 1

-o— P = 0

(A G ’° = -49,3

cooI CH, I

-O - p— NH — C — N — CH,

I

II

O-

(A G °

S° '

S-CoA

acetil-CoA

I

N

CH2

I 8-

'C —N —CH,

*

3

kreatin

foszfokreatin

\

COCr

> h 2n - c - n — c h 3

o '2 ~

-------- -

szuperoxidgyök

' 2H+

ciálja: az oxigén erős oxidálószer, így önmaga könnyen redukálható. Az oxigén teljes redukciója négy elektron felvéte­ lét igényli (6-14. ábra). Ez a folyamat elsősorban a terminális oxidációban a citokróm-oxidáz által katali­ zált reakcióban megy végbe. Az emberi szervezetbe kerülő oxigén mintegy 85%-a így redukálódik. Tör­ ténhet azonban tökéletlen oxigénredukció is, amely­ ben elsősorban nem enzimatikus reakciók játszanak szerepet, és kevesebb elektron átvitele valósul meg. Az oxigén tökéletlen redukciójával a fejezet végén foglalkozunk.

6-3. táblázat. Néhány fontos vegyület által alkotott redoxelektród standard redoxpotenciálja

6 p *

------->

h 2o 2

e

—

hidrogén-peroxid

7 ^ \ H

* OH’ ---- ^ T hidroxil- L-I6+ H20 gyök n

e'

9 > H20 víz

Elektronátvivők A metabolizmusban enzimatikus redoxreakciók zajlanak, amelyekben a legfontosabb elektronátvivők az E’° növekvő sorrendjében az alábbiak: nikotinsavamid-adenin-dinukleotid (NAD+), nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP+), flavinadenin-dinukleotid (FAD) és flavin-mononukleotid (FMN), ubikinon (koenzim-Q), vas-kén komplexek, hem. Hasonlóan a nukleozid-foszfátokhoz az elekt­ ronátvivők is stabil molekulák. A pirimidinnukleotidok zömmel koenzim, míg a flavinnukleotidok zömmel prosztetikus csoport szere­ pet töltenek be. Első megközelítésben a katabolikus folyamatok esetén az intermedierek oxidációja, az anabolikus reakcióknál az intermedierek redukciója dominál.

E'° (V) szu kei nát/a- ketog Iutarát

-0,67

a-ketoglutarát/izocitrát

-0,38

NAD+/NADH + H+

-0,32

liponsav/dihidroliponsav

-0,29

glutation-diszulfid/glutation

-0,23

FAD/FADH2

-0,21

piruvát/laktát

-0,19

oxálacetát/malát

-0,17

fumarát/szukcinát

+0,03

citokróm-b Fe3+/Fe2+

+0,08

citokróm-ci Fe3+/Fe2+

+0,22

citokróm-a Fe3+/Fe2+

+0,29

O2/H2 O2

+0,30

1/2 O2 /H2 O2

+0,82

6-15. ábra. A NAD+ redoxciklusa. A nikotinsavamid-adenin-dinukleotid nikotinsavamid gyűrűjének hidridion-felvétele és -leadása. A NAD+ esetében R1( H, NADP+ esetében R1( foszforilcsoport

A NAD+ zömmel a katabolikus folyamatok oxidoredukcióiban tölt be elektronátvivő szerepet (6-15. áb­ ra). A katabolizmus során számos dehidrogenálás két hidrogénatom leadásával jár, erre példa a piruvát laktát átalakulás is (6-12. ábra)', a NAD+ nikotinsavamid gyűrűje két elektront és egy protont (ami összességében megfelel egy hidridionnak; H ) vesz fel, a maradék H+ oldatba kerül (6-16. ábra).

H NAD++ R — C — R ’ NADH + H+ + R — C — R'

I

II

OH

O

6-16. ábra. A NAD+-függő dehidrogenázok általános reak­ ciósémája. A NAD+ koenzimmel működő dehidrogenázok által katalizált reakciókra a két hidrogénatom felvétele, illetve leadása ajellemző.

Az anabolikus folyamatok egy része redukció, amihez elektrondonorra van szükség. Ez gyakran a NADPH + H+; reduktív bioszintézisek esetében a NADPH + H+ a „redukáló erő”. A NAD+ oxidált és re­ dukált formában kb. 1(T5 M koncentrációban található

oxidált flavin

H(LOH

a szövetekben, általában az oxidált forma irányába el­ tolva (a mitokondriumokban a NAD+/NADH arány körülbelül 10:1). A NADP+ oxidált és redukált formá­ jának összmennyisége kevesebb, kb. 10 6 M, és az oxidált/redukált forma aránya a redukált forma irányá­ ba eltolt (aNADP+/NADPH arány a mitokondriumok­ ban hozzávetőleg 1:100). Ez az elkülönültség lehetővé teszi a NADPH-függő reduktív, bioszintetikus folya­ matokat azokban az esetekben is, amikor ugyanabban az időben fokozott NADE1 oxidációra van szükség energiahiányos állapotban, az ATP-szintézis-igény miatt. A NADPH és a NADH közti közvetlen kapcso­ latot a mitokondriális belső membrán belső felszínén elhelyezkedő piridin-nukleotid-transzhidrogenáz által katalizált reakció teszi lehetővé. NADPH + NAD+ NADP+ + NADH A NAD+/NADH arány a metabolizmus állapotá­ nak fontos jellemzője, és az AMP, illetve az ATP/ADP mellett szabályozó szereppel bír az inter­ medier anyagcsere számos folyamatában, amelyeket megfelelő fejezetekben mutatunk be.

szabad gyök intermedier

redukált flavin

(szemikinon)

(kinon)

I HCOH I

6-17. ábra. A FAD és az FMN redoxciklusa. A flavin-adenin-dinukleotid és a flavin-mononukleotid izoalloxazin gyűrűje két lépésben re­ dukálódik

112

III.

A F A D (flavin-adenin-dinukleotid) izoalloxazint, ribitolt, foszfátot és AMP-t, az F M N (flavinmononukleotid) izoalloxazint, ribitolt, foszfátot tartal­ maz (6-17. ábra). Szemben a NAD+ oxidoredukciójában szereplő nikotinsavamid-gyűrüvel a FAD és FMN redoxciklusában szerepet játszó izoalloxazingyürű nemcsak egy, hanem két hidrogént is képes fel­ venni, illetve leadni (6-17. ábra). Ez lehetővé teszi a két lépésben történő elektronátvitelt, aminek az elektrontranszfer-láncokban (pl. mitokondriális légzési lánc, mikroszomális légzési lánc) igen nagy jelentősé­ ge van. Megteremti az átmenet lehetőségét az egy, il­ letve két elektront átvivő molekulák/molekulakomplexek között, így a két elektron transzferét kata­ lizáló NAD+-függő dehidrogenázok, illetve az egy elektron transzferét közvetítő prosztetikus csoporttal működő dehidrogenázok között (például vaskomp­ lexek oxidoredukciója a terminális oxidációban). A FAD prosztetikus csoporttal működő dehidroge­ názok két szomszédos szénatomról vonnak el vagy két

H

I I

■FAD + R —C-

-R’ A - 0 2H

Dehidrogenázok. A dehidrogenázok által katali­ zált reakcióban nem vesz részt oxigén (6-24. ábra). A redoxtranszfert NAD+, NADP , FAD, citokrómok bonyolítják. Az intermedier anyagcsere dehidrogenázai nemcsak a szubsztrátjaikra, hanem gyakran a ko-

b

(hidroperoxil-csoport)

monooxigenázok AH + [ átvivő H2] + 0 2 ---- > A - OH + [ átvivő ] + HzO

6-25. ábra. Az oxigenázok által katalizált reakciók általá­ nos sémája

116

I I I . AZ ANYAGCSERE

eikozanoid-anyagcserében (lipoxigenáz) vesznek részt. A monooxigenázokat, mivel a reakcióban a szubsztrát hidroxilálódik, hidroxilázoknak vagy ke­ vert funkciójú oxigenázoknak is nevezik. A monooxigenázok több részből álló membránkötött elektrontranszfer-rendszer részei lehetnek, mint például a mitokondriális szteroidszintézisben szereplő monooxigenázok, vagy a drogmetabolizmus citokrómP450-rendszere az endoplazmás retikulum membrán­ ban (mikroszomális légzési lánc). Prosztetikus cso­ portjuk a hem. Az oxigén kötését a hem-Fe oxidáltsági állapota megszabja: hem-Fe2+ esetében kötődik az 'y i r oxigén molekula, azonban hem-Fe esetén nem. így az oxigénmolekula kötését egy elektrontranszfer teszi lehetővé. (A folyamatot részletesen a hemoglobin oxi­ génkötésénél, illetve a citokróm-P450-rendszer mű­ ködésénél tárgyaljuk.)

6 .2

TER M IN Á LIS O X ID Á C IÓ O X ID A T ÍV FO S Z FO R ILÁ C IÓ A M IT O K O N D R IU M O K B A N

A mitokondriumokat előszeretettel nevezik a sejt erőműveinek. Katabolikus szempontból a metabo­ lizmus konvergens: sokféle anyagból igen kisszámú vegyület képződik, míg az anabolizmus divergens: a rendkívül sokféle metabolit igen kisszámú, bioszinte­ tikus előanyagból (prekurzor) keletkezik. A tápanya­ gokat lebontó folyamatok végtermékei egyben a szin­ tetikus folyamatok kiinduló pontjai is lehetnek. így a metabolizmus egy központosított, kiválóan szervezett rendszert képez. A mitokondriumok a metabolizmus központjai. A katabolizmus végére képződő viszony­ lag kisszámú vegyület a mitokondriumba kerül, vagy ott keletkezik (6-26. ábra). A hidrogénátvivő NAD+ra és FAD-ra került hidrogének végső, terminális oxi­ dációja a mitokondrium belső membránjában történik, amelynek végén a hidrogén vízzé oxidálódik. A terminális oxidáció exergonikus folyamat; a hid­ rogénatomokat végül Oo-molekula veszi fel, amely­ nek mindkét atomja 4 elektron és 4 proton felvételével így vízzé redukálódik: 1/2 0 2 + 2H+ + 2e“ -+ H20

A 1/2 0 2/H20 redoxelektród; AE'° = +0,82 V. Az oxigén redukciójának fő hidrogénforrása a NADH + H+/NAD+ redoxelektród; AE'° = -0,32V. A két redoxelektród közti potenciálkülönbség AE'° = 1,14 V, az ennek megfelelő AG'°-érték = -220 kJ/mol. Ehhez kapcsoltan történik az oxidatív foszforiláció, amelynek során ADP foszforilálódik ATP-vé endergonikus folyamatban. A terminális oxidáció - oxida­ tív foszforiláció térben és időben összerendezett, kap­ csolt folyamatrendszer. Összehangolt működése nem­ csak az ebben részt vevő enzimek, hanem egy egész sejtorganellum, a mitokondrium strukturális épségé­ hez kötött. Feltételezhetően a mitokondriumok, mint eukarióta sejtorganellumok, az evolúció során prokariótákból származnak: aerob baktériumok és primitív anae­ rob eukarióta sejtek szimbiózisából jöhetett létre a je­ len állapot. A mitokondriális fehérjéket részint magi, részint a cirkuláris, mitokondriális DNS kódolja. A légzési láncot alkotó különböző fehérjekomplexek egyes összetevői egyrészt magi, másrészt mitokond­ riális gének szerinti fehérjeszintézis termékei. Ez egy igen komplex génexpressziós szabályozási rendszert feltételez. A mitokondriumok szerkezetét és sejtéletta­ ni szerepeiket a 26. fejezet tárgyalja. A mitokondriu­ mok száma sejttípusok szerint változó. Hepatociták például sejtenként 800-2500 mitokondriumot tartal­ maznak; a nagyon aerob szívizomszövet sejtjei citoplazma-térfogatának kb. a felét mitokondriumok ké­ pezik. Az érett vörösvértestekben pedig nincsenek mi­ tokondriumok, így nem képesek oxidatív foszforiláció útján ATP-t termelni, csak anaerob úton, az oxigén­ szállítási funkció ellenére. A mitokondriumokat két membrán határolja (6-26. ábra, keretezett rész). A külső membrán kb. 50%-ban lipidekből, 50%-ban fehérjékből áll, viszonylag egy­ szerűbb szerkezetű. A belső membrán szerkezete vi­ szont igen bonyolult, kb. 75%-ban fehérjéket tartal­ maz. A külső membrán permeábilis az intermedier anyagcsere legtöbb intermedierje számára, mivel egy porin nevű fehérje viszonylag nagy átmérőjű csatorná­ kat formál a membránon keresztül. A belső membrán lipidrétege ugyanakkor valamennyi ionra nézve impermeábilis. A belső membránban helyezkedik el a légzési lánc elektronátvivő rendszere és az ATP-

^1 7

6. B I O E N E R G E T I K A

[zsírsav

membrán közti tér belső membrán mátrix

I acil-CoA

külső membrán

g

mitokondrium

Ml belső membrán

( piruvát

■> f piruvát

i p-oxidáció

cifrát izocitrát

oxálacetát

NADH + H+

fg-ketoglutarát

fumarát szu keinát

FADH.

komplex-IV

komplex-l komplex-ll

komplex-lll

6-26. ábra. A mitokondriumban zajló katabolikus folyamatok vázlatos összefoglalása. A tápanyagok emésztésekor a legfon­ tosabb szénhidrátszármazék a glukóz, illetve a lipidekből zsírsavak szabadulnak fel. A citoszolban a glukóz lebontása - glikolízis - során keletkező piruvát bekerül a mitokondriumba, és ott a piruvát-dehidrogenáz enzimkomplex által katalizált reakcióban acetil-CoA-vá ala­ kul. Acetil-CoA a zsírsavoxidáció során is képződik. Az acetil-CoA acetilcsoportjának C-atomjai a citrátciklusban C02-dá oxidálódnak, a hidrogének pedig NADH + H+(zöld vonalak), illetve FADH2formájában a terminális oxidáció elektrontranszfer-láncába kerülve végül az oxigén vízzé redukálásban vesznek részt. A fehérjék lebontásakor keletkező aminosavak nagy többsége is piruváttá, acetil-CoA-vá, il­ letve citrátciklus intermedierré alakul (az ábrán nincs feltüntetve). A terminális oxidációhoz kapcsolt oxidatív foszforilációban az ADP ATP-véfoszforilálódik. Az ábra fő része csak a mitokondrium belső membránt mutatja. A keretezett részben a mitokondriumok szerke­ zetének sémáját mutatjuk

szintáz. Májban egyetlen mitokondriumban például több mint 10 000 légzési lánc és ATP-szintáz találha­ tó. A belső membrán által határolt kompartmentben, a mitokondriális mátrixban található számos, alapvető, metabolikus enzimrendszer (pl. a citrátkör, zsírsav­ oxidáció enzimei). A belső membrán transzporterrendszerei biztosítják a metabolikus kapcsolatot a

citoszol és a mátrix között. A bioenergetikai szem­ pontból legjelentősebb anionkicserélődési transzpor­ tereket a 6-27. ábra foglalja össze. A NADH-ról, illetve a FADHo-ről az elektronok a belső membránban elhelyezkedő légzési lánc kompo­ nensein, oxidoredukciók sorozatán keresztüljutnak el az Oo-re, és ily módon tb O keletkezik (6-28. ábra).

III.

118

membrán közti tér

AZANYAGCSERE

A mitokondriális légzési lánc alkotói

A mitokondriális légzési lánc a mito­ kondriumok belső membránjában helyez­ kedik el. Komponensei egyrészt prosztetikus csoportokat tartalmazó fehérjék, ame­ lyek a membránban négy komplexet (I, II, III, IV) alkotnak. Ezeket a komplexeket azonban két elektronszállító molekula, a lipid jellegű koenzim-Q, vagy ubikinon (UQ) és a viszonylag kis molekulatömegű fehérje, a citokróm-c köti össze, amelyek szabadabban mozognak; az UQ a memb­ ránban, a citkróm-c a membránközti tér­ ben (6-28. ábra). A légzési lánc folyamat­ rendszerében az elektrondonor a NADH + H+, illetve a komplex-II-n ke­ resztül a FADEE. így a légzési láncba egy­ szerre két elektron lép be. A biológiai oxi­ dáció egységének ezt a redukáló ekviva­ 6-27. ábra. A mitokondriumok belső membránjának a metabolizmus lens párt tekintik. A végső elektronszempontjából legjelentősebb transzportrendszerei akceptor a rendszerben az oxigénmolekula (O2), amelynek redukálásához 4 elektron átvitele szükséges (6-14/a ábra). A komplex-I és a komplex-II (valamint a komplexA lánc meghatározott komponensei exergonikus II-höz hasonló, az UQ redukciójában szerepet játszó oxidoredukciókhoz, elektrontranszferhez kapcsoltan egyéb dehidrogenázok) egyaránt flavoprotein-tartalprotonokat pumpálnak ki a mitokondriális mátrixból a mú fehérjekomplexek. Ily módon két elektront egy­ membránok közti térbe. A protonok kipumpálása szerre vesznek fel, azonban egyenként adják azokat elektrokémiai gradiens kialakulásához vezet. Proton­ tovább. Mind a mitokondriális, mind pedig a mikromotoros erő generálódik, amely két komponensből te­ szomális elektrontranszportlánc első tagja flavovődik össze: a membránpotenciáiból és abból, hogy a protein; az elektronok további transzferé egy elektront pH-különbség következtében koncentrációs elem ala­ szállító prosztetikus csoportok részvételével folytató­ kul ki. A protonok a mitokondrium belső membránjá­ dik. ban protoncsatomát tartalmazó ATP-szintázon ke­ A légzési lánc komponenseinek standard redoxresztül kerülhetnek vissza a mátrixba (6-26. és 6-28. potenciál-értékeit (lásd 6-3. táblázat) és a terminális ábra). Ezzel csökken az iongradiens, a töltés és prooxidáció folyamatát, a lépések egymásutániságát átte­ tonkoncentráció-különbség, és ehhez az exergonikus kintve adódik a következtetés: a mitokondriális légzé­ folyamathoz kapcsoltan ADP foszforilálódik ATP-vé. si láncnak, mint membránstruktúrának felépítésében a A belső membrán két oldala között kialakuló proton­ rendező elv a redoxpotenciálok sorrendje. A lánc há­ gradiens összekapcsolja az oxidációt és a foszforilárom fehérjekomplexe (komplex-I, -III, -IV) tartalmaz ciót, a kapcsolás alapfeltétele pedig a mitokondrium olyan polipeptidláncokat, amelyek transzmembránszerkezetének, membránjának épsége. Ezen összetett fehérjék, és protont pumpálnak ki a mátrixból. folyamat egyes elemeit alább foglaljuk össze.

119

6. B I O E N E R G E T I K A

a membrán közti tér

membrán

mátrix

NAD+ NADH

szukcinát

fumarát

b

6-28. ábra. Proton- és elektrontranszport a mitokondrium belső membránján, (a) A római számok a légzési lánc komplexeit je­ lölik (komplex-l, komplex-ll, komplex-lll, komplex-IV). Sárgával az ATP-szintázt ábrázoltuk. A fekete nyilak az elektronok útját mutatják. Piros nyilak a H+ kipumpálást jelzik. Fe-S, vas-kén centrumok; cit, citokróm; UQ, ubikinon; F0, F1( a mitokondriális ATP-szintáz alegysé­ gei. (b) A komplex-l szerkezete

Aterminális oxidáció folyamata A komplex-I (egyéb nevén NADH-UQ-oxidoreduktáz vagy NADH-dehidrogenáz) 25 polipeptidláncból álló nagy (850 kD) fehérjekomplex. ANADH-ról hidridionok formájában érkező elektro­ nok transzferében FMN-t, majd több, különböző Fe-S központokat prosztetikus csoportként tartalmazó fe­ hérje vesz részt. A komplex-I NADFl-kötő helye a mátrix felé néz, így a mátrixban keletkező NADH-t köti meg és oxidálja.

Az első komplexről az elektronok az ubikinonra kerülnek (6-20. ábra). Ez a légzési lánc NAD-on kívü­ li egyetlen olyan elektronátvivője, amely nem kötődik kovalens kötéssel fehérjéhez, így a mitokondrium bel­ ső membránjában viszonylagos mozgási szabadsága van. A komplex-I-től az ubikinon az elektronokat a komplex-III-hoz szállítja. Az ubikinon azonban nem­ csak a komplex-I-tői képes átvenni elektronokat, elektrondonorként más FADFE prosztetikus csoport­ tal rendelkező enzim(komplex) is szerepelhet (6-29. ábra). így elektronok nemcsak a NADH közvetítésé-

1 20

II I .

acil-CoA

szukcinát

I (acil-CoA-dehidrogenáz FAD peS

glicerin-3-P

I

I komplex-ll szukcinát-UQ-oxidoreduktáz

AZ ANYAGCSERE

( glicerin-3-P-dehidrogenáz FAD, FeS

komplex-IV citokróm-oxidáz

NADH

t rotenon amitál

antimicin-A

cianid azid CO

6-29. ábra. A légzési lánc komplexei és gátlószerei

vei, hanem más metabolitokról is a légzési láncba ke­ rülhetnek. Ha az elektronok forrása nem a NADH + H+/NAD+ redoxelektród, hanem a szukcinát oxidálódik fumaráttá, és az ebből származó elektronok kerülnek C>2-re, akkor a AE'° kisebb, mivel fümarát/szukcinát AA'° = 0,031 V; ennek alapján AG'°érték = -152 kJ/mol (szemben a -220 kJ/mol érték­ kel). A komplex-II (szukcinát-UQ-oxidoreduktáz) a szukcinátról képes elektronokat átvinni az ubikinonra. Ezt a reakciót a szukcinát-dehidrogenázt tartalmazó komplex katalizálja, amelynek prosztetikus csoportja FAD. A szukcinát-dehidrogenáz a citrátkör egyetlen membránhoz kötődő enzime, amely a szukcinátot fumaráttá oxidálja (lásd később), és a redukálódott FADH2 prosztetikus csoportjáról Fe-S fehérjéken ke­ resztül kerülnek az elektronok az ubikinonra. A NADH + H+/NAD+:UQ/UQH2 redoxpárok közötti redoxpotenciál-különbséggel összehasonlítva, a FADH2/FAD:UQ/UQH2 redoxpárok közötti redoxpotenciál-különbség kisebb; nem elégséges ahhoz, hogy a protonpumpának, mint endergonikus folya­ matnak az energiaigényét kielégítse, a komplex-II nem is tartalmaz protonpumpát. A glicerin-3-foszfát-dehidrogenázról, amely a redukáló ekvivalens transzportban játszik szerepet (lásd 7. fejezet), mint szintén FAD-dal működő oxidoreduktázról, szintén Fe-S központú prosztetikus cso­ portot tartalmazó fehérjék közbeiktatásával kerülnek az elektronok az ubikinonra. A zsírsav-oxidációban részt vevő flavoprotein acil-CoA-dehidrogenáz ha­

sonló mechanizmussal, szintén az UQ redukálásával csatlakozhat a légzési lánchoz (6-29. ábra). A légzési lánc második protonpumpa-aktivitással rendelkező komplexe a komplex-III (UQID-citokróm-c-oxidoreduktáz). Az elektronok ezen komp­ lex segítségével az UQH2-ról egy vízoldékony fehér­ jére, a citokróm-c-re kerülnek, amely a belső memb­ rán külső felszínén helyezkedik el (6-28. ábra). A III-as komplexet többek között citokrómok (citokróm-b562, -bs66 és -ej), valamint Fe-S-fehérje alkotják. A citokróm-b, -ci és -c ugyanolyan hemet (protoporfirin-IX) tartalmaz, mint a mioglobin vagy a hemoglobin. A citokróm-c, az ubikinonhoz hasonló­ an, az élővilág rendkívül elterjedt molekulája: a növé­ nyektől kezdve minden olyan organizmusban megta­ lálható, ahol van légzési lánc. A komplex-IV, a citokróm-oxidáz (Warburg-féle légzőfermentum) a légzési lánc harmadik protonpum­ pa-aktivitású fehérjekomplexe. A citokróm-oxidáz re­ dukálja az oxigénmolekulát vízzé. Az elektrondonor a redukált citokróm-c: 4 cit-c (red) + 4H+ + O2 —» 4 cit-c (ox) + 2H2O A citokróm-oxidáz négy elektron átvitelét katali­ zálja. Mivel minden olyan körülmény, amely részle­ gesen redukált oxigénszármazék szabaddá válását eredményezi, súlyos veszélyeket jelent, ezért az oxi­ gén redukciója rendkívül pontosan és szigorúan szer­ vezett folyamat. A komplex legalább nyolc alegység-

6. B I O E N E R G E T I K A

121

6-30. ábra. Az oxigénmolekula redukciója a lég­ zési lánc IV. komplexében. A komplex-IV-ben a citokróm-oxidáz enzim négy elektron és négy proton segítségével redukálja az oxigénmolekulát. A több lé­ pésben történő folyamatban az 0 2, valamint az elekt­ ronok kötésében Fe- és Cu-ionok vesznek részt, vala­ mint átmenetileg képződő tökéletlenül redukált oxi­ génszármazékok alakulnak ki. Az 0 2 kötéséhez - az endoplazmás retikulum membránjában működő mikroszomális légzési láncban analóg funkciót játszó citokróm-P450 enzim működéséhez hasonlóan - a Fe3+-» Fe2+ redukcióra van szükség, így az enzimre­ akció szubsztrátkötése az elektronellátottság függ­ vénye

bői áll. A négy elektron transzferjében négy fémion Ivesz részt. Két hem-vas (citokróm-a, -a2), illetve két rézioncentrum kapcsolódik be az oxigénmolekula kö­ tésébe, valamint a négy elektronátvitel lebonyolításá­ ba (6-30. ábra). A légzési láncban az elektronok átvitele különböző pontokon gátlószerekkel megakadályozható. A 6-29. ábrán láthatók a légzési lánc legfontosabb gátlószerei, illetve az. hogy mely komponenseknél állítja meg az elektronátvitel folyamatát. Különböző toxinok eltérő támadáspontokon gátolják a légzési lánc különböző összetevőit. A cianid és azid például a Fe3+-, a CO 9+ (szén-monoxid) pedig a Fe -ionhoz kötődik a komplex-IV-ben.

Az oxidatív foszforiláció A terminális oxidáció a mitokondriumban exergonikus folyamat. Az oxidatív foszforiláció - az ADP és P; kondenzációja - a NADF1 oxidációjához, mint exergonikus elektrontranszfer folyamathoz kap­ csolt foszforiltranszfer, endergonikus folyamat. A légzési láncban végigmenő elektronpár redoxrendszerről redoxrendszerre vándorol. Mindegyik fo­ lyamathoz rendelhető két redoxelektród (redoxelektródpár), amellyel a lépés redoxpotenciál-változása mérhető. A légzési lánc, mint a mitokondrium

belső membránjában kialakított struktúra, a standard redoxpotenciálok sorrendjének, mint rendező elvnek megfelelően szerveződött. A különböző redoxelektródok közötti redoxpotenciál-különbség három esetben tesz lehetővé az egyébként protonokra impermeábilis belső membránon keresztül a mátrixból kifelé történő protonpumpálást, ami endergonikus folyamat (6-28. ábra). így a protonpumpa a légzési lánc redoxfolyamataihoz kötött. Két elektron transzferjéhez kap­ csoltan 4-4 proton pumpálódik ki a komplex-I és komplex-III által. A IV. komplex egy oxigénmoleku­ lára számítva 4 protont, tehát két elektronra számítva két protont pumpál ki. A protonok visszatérhetnek a mátrixba (ami exergonikus folyamat, s ezáltal a kiala­ kult elektrokémiai gradiens megszűnik, illetve csök­ ken) egy protoncsatomán keresztül, amely egy több alegységből álló enzim, az ATP-szintáz része. Termodinamikai számítások szerint 1 mól NADH oxidációjához 2,5 mól ADP foszforilációja kapcsoló­ dik, míg 1 mól szukcinát oxidációjához csak 1,5 mól ATP képződése társul, mivel a komplex-II-n keresztü­ li elektrontranszfer esetében a NADH-UQ-oxidoreduktázhoz kapcsolt protonpumpa kimarad. A kor­ rektség kedvéért megjegyezzük, hogy a legutóbbi idő­ ben pontosított számítások szerint egy acetil-CoAmolekula eloxidálása során 10,83 ATP szintézisével; egy FADFF oxidálása során 1,64, míg egy NADH ese­ tében 2,73 molekula ATP szintézisével számolnak. Je­

122

len könyvben az egyszerűség kedvéért maradunk a ko­ rábbi, 1,5 (FADH2) és 2,5 (NADH+ + H) ATP keletke­ zés adatainál.

Az ADP foszforilációja az akceptorkontroll Az ATP-szintáz univerzális enzim, amely két rész­ ből —Ft, F0 —áll (6-31. ábra). Az F0-egység nevét on­ nan kapta, hogy oligomycinnel gátolható. Elektronmikroszkóppal az Fi-rész látható, mint a mitokond-

I I I . AZANYAGCSERE

rium belső membránjának a mátrix felé irányuló kitü­ remkedése, amelyet nyomógombhoz hasonlítanak. Az Fj-et ötféle polipeptidláncból álló kilenc alegység épí­ ti fel ((X3, [F,, y, 8, e, molekulatömeg: 380 kD); ez kata­ lizálja az ADP foszforilációját. A F0-egység „^'-al­ egysége és a hozzá kapcsolódó c-gyűrű képezi a protoncsatomát. Az Fj, F0 fehérjéket alkotó alegységek forgó motorszerű szerkezetet hoznak létre, melyet a protoncsatomában mozgó protonok hajtanak. Az aj-, P3-alegységekhez köthető katalitikus helyek konfor­ mációs változásai a forgó y-alegységtől függenek. A konformációs változás első lépésében az ADP és P,

6-31. ábra. Az ATP-szintáz szerkezete vázlatosan (a) és alegységeinek kristályszerkezete alapján (b, c). A fehérjeszerkezeti adatbázisban (Protein Data Bank) a kristályszerkezetek az 1YCE, 2WSS, 1B9U és 2°CLY azonosítók alatt találhatók. Az ATP-szintáz memb­ ránba ágyazott F0-alegységén belül az „a" és a két „b " alegység alkotja az ATP-szintáz álló részét, ami a molekuláris motort a membrán­ ban rögzíti. Az F0-alegység c-gyűrűje, mely a különböző fajokban változó számú (8-15; az ábrán 11) „c" alegységből áll, a protonok ván­ dorlásának hatására elfordul a statikus részhez képest. Ez a forgás az Fr egység y-alegységén keresztül az Fr egység a- és (3-alegységeinek konformációváltozását okozza. Az ábra (a) és (b) részén az ATP-szintáz oldalról látható. A (b) részben egy a- és egy p-alegység ki van hagyva, hogy a y-alegység láthatóvá váljon. Az ábra (c) részén az intermembrán tér felől tekintünk az ATP-szintázra. Az ábra rajzolása a Lehninger Principles of Biochemistry (hatodik kiadás, Macmillen Learning, 2013) 19-25. ábrája alapján történt

6. B I O E N E R G E T I K A

kötődik, a második lépésben ATP képződik, míg a harmadik konformációs változás eredményezi a kép­ ződött ATP elengedését. A teljes 360°-os rotációhoz 3 molekula ATP képződése kapcsolódik. Mindez azon­ ban a protoncsatomán áthaladó protonoktól függ, mi­ közben a protonok belépését az ATP szintézise teszi lehetővé. Az F0Fi-ATPáz-nál egy ATP keletkezésé­ hez megközelítőleg 3 proton átjutása kell (az enzim j szerkezetétől függően 2,7 -3,3). Plusz egy proton átjuI tásával egyenértékű változást eredményeznek a kap! csolódó transzportok (ATP/ADP-kicserélődés és I Pj/OH-kicserélődés). Az átjutás gátlása esetében a protongradiens nem tud kiegyenlítődni, és ezzel az I ATP szintézisét gátolni lehet. Normális proton­ gradiens mellett az ADP foszforilációja folyamatos. Az ATP/ADP arány nyugvó izomban körülbelül 10-szeres. A mitokondrium belső membránja különböző sze­ rekkel protonokra permeábilissá is tehető. Ilyen I „klasszikus” protonofor pl. a 2,4-dinitrofenol. Mivel a I 2,4-dinitrofenol, mint hidrofób molekula átjut a I membránon, s a citoszol oldalon megkötött proton a I mátrix oldalon disszociál, lerontja a protongradienst, I így szétkapcsolja az elektrontranszfert és a foszforiK lációt. Ilyen mechanizmust tulajdonítanak nagy kon| centrációban a bilirubinnak is, amely csecsemőkön a I súlyos hyperbilirubinaemiában kialakuló agykároso■ dásokban játszhat szerepet. Az elektrontranszfer nem I akadályozott, sőt az oxigénfogyasztás szabályozatla­ nul csak fokozódik az azt korlátozó akceptorkontroll I (lásd később) kiesésével, de nincs ATP-szintézis. [ Az ATP-szintézist ily módon gátló szereket szétkap­ csoló szereknek nevezik. Az eredmény az ATPI képződés szempontjából nézve így azonos: az ATP I szintézise akkor is gátlódik, ha a protonok akadálytaI lanul juthatnak át a mitokondrium belső membránján | (azATP-szintáz helyett) és akkor is, ha a protonok átI jutása teljesen gátolt (mivel nem tud működni az I ATP-szintáz). Kérdés azonban, hogy az ADP foszforilációjának, I így a foszforiltranszfer energiaigényének kiesésével I mivé transzformálódhat a terminális oxidációban, | mint exergonikus folyamatban felszabaduló energia. [ A hőtermelésben - termogenezisben - igen fontos I szerepet játszik a mitokondriumokban igen gazdag

123

barna zsírszövet. A benne található mitokondriumok tartalmaznak termogenint, egy szétkapcsoló fehér­ jét (uncoupling protein), az UCPl-et, amely protoncsatornát képez, így megakadályozza a protongra­ diens kialakulását. Ezáltal az ATP-szintézis elmarad. Ezért a fiziológiás szétkapcsolásnak szerepe van a hő­ termelésben, a testhőmérséklet fenntartásában, külö­ nösen a téli álmot alvó állatok, újszülöttek (ember is) hőmérséklet-adaptációjában. A szétkapcsoló szerek általánosságban a fentiek miatt mérgező hatásúak, a szervezet túlmelegedését okozhatják, hőgutát is ered­ ményeznek. Az elektrontranszfer szorosan kapcsolt az ADP foszforilációjához. Az oxidatív foszforiláció elektron(a tápanyagokból származó hidrogénnel folyamatosan újra redukálódó NADH, illetve FADFE), oxigén-, ADP-, valamint Pj-ellátást igényel. Az oxidatív foszforiláció sebességét elsősorban az ADP koncent­ rációja szabja meg. Mivel az adenilátkészlet viszony­ lag állandó, az ADP mennyisége attól függ, mennyi ATP használódik el a sejtben. Fia az ATP/ADP arány az ADP javára tolódik el, ez jelzés az oxidatív foszforiláció fokozására. Az ADP-szint oxidatív foszforiláció sebességét meghatározó szerepét légzési (respirációs) kontrollnak vagy akceptorkontrollnak nevezik. Az ADP-szint így nemcsak az oxidatív foszforiláció, hanem ebből következően a terminális oxidáció sebességét is meghatározza. Az oxidatív foszforiláció gátlása - azáltal, hogy a mitokondrium belső membránján az elektrokémiai gradiens fennma­ rad, így új protonok transzportja a légzési lánc komp­ lexein már nem lehetséges - visszahat a terminális oxidációra, és gátolja azt. Az ATP szintézisének gátlá­ sa tehát közvetve az elektrontranszfert, emiatt a NADF1 oxidációját blokkolja, és ezért az intracelluláris NAD+/NADH + H+ arány csökkentésével a katabolizmust gátolja. Az ADP, illetve az ATP a mitokondrium belső membránján egy specifikus transzportfehérje, az ATP-ADP transzlokáz (adeninnukleotid-transzporter) (6-27. ábra) segítségével jut keresztül. Az ADP-nek a mátrixba történő belépése az ATP kilépé­ séhez kötött, és viszont. (Ennek a transzportemek atraktiloziddal történő gátlása közvetve gátolja az oxidatív foszforilációt).

124

I I I . AZ ANYAGCSERE

mechanikai munka

A kemiozmotikus elmélet

A aktív transzportok

hő

Az energiatranszdukció általánosan elfogadott me­ chanizmusát a kemiozmotikus elmélet írja le (6-32. ábra). A légzési láncban az elektronátvitel a mitokondrium belső membránja mentén protongradiens kialakulásához vezet azáltal, hogy protonok pumpálódnak a mátrixból a membrán közti térbe. Ez hozzájá­ rul egy 100-200 mV közötti membránpotenciái kiala­ kításához (A'F-vel szokták jelölni) és fenntartásához, amelynek negatív oldala a mátrix. A mátrix lúgosabb lesz a membrán közti térhez viszonyítva, illetve töltés­ különbség alakul ki, amennyiben a mátrix negatívabb lesz. Az így kialakuló elektrokémiai potenciál, pro­ tonmotoros erő (Ap) tehát két komponensből tevődik össze: a membránpotenciáiból és H+-koncentrációkülönbségből. Az oxidoredukciók szabadenergia­ csökkenése ily módon elektrokémiai energiává transz­ formálódott. A protonmotoros erő különböző élőlé­ nyekben többféle munka energiaigényét képes fedezni (egyes egysejtüekben akár a mechanikai munkáét is), közvetlenül a bioszintetikus folyamatok energiaigé­ nyét azonban nem, ezt az ATP-bomlás fedezi (6-33. ábra). A protonok spontán, az elektrokémiai gradiens­ nek megfelelő visszaáramlása a mátrixba szabadener­ gia-csökkenéssel járó folyamat. Ez transzformálódik az ADP foszforilációjával kémiai energiává.

4.

crm +

+

4

protongradiens Ap

V bioszintetikus folyamatok

mechanikai munka

aktív transzportok

6-33. ábra. A protongradiens közvetlen és (ATP keletkezé­ sen keresztüli) közvetett szerepe különböző energiaigé­ nyes sejtfunkciók biztosításában

Ha a protonok áramlása az Fo komplexen keresztül gátolt, ADP nem foszforilálódik ATP-vé, és a termi­ nális oxidáció tovább folyik, a protongradiens egyre nagyobb, így egyre több energia szükséges a proton­ pumpához, amely a mátrixból a gradiens ellenében történik. Ha ennek energiaszükséglete meghaladja az elektrontranszfer kapcsán felszabaduló energiát, az elektrontranszfer megáll, a NADH oxidációja csök­ ken, majd abbamarad. Ez a légzési, akceptorkontroll magyarázata. Az egész folyamatrendszer ép struktúrá­ hoz, kompartmentalizáltsághoz, a mitokondrium ép­ ségéhez kötött.

+

+

+

+' ^ +

külső membrán membrán­ közti tér belső membrán

mátrix

ATP-szintáz

mátrix______________________ A 'Pm ~ - 1 7 0 mV P^mátrix > P^membrán közti tér

6-32. ábra. A kemiozmotikus elmélet sematikus ábrázolása. A mitokondriális belső membrán három légzési komplexének protonkipumpálása következtében protongádiens épül fel a membrán két oldala között, s ennek a gradiensnek az energiája fedezi az ATP-szintáz által katalizált reakcióban az ADP-ből történő ATP szintézist

125

6. B I O E N E R G E T I K A

K lin ik a i v o n a tk o z á so k Körülbelül 1:5000 gyakoriságúak az elsősorban a lég­ zési lánc kompenenseit érintő öröklődő betegségek, amelyeket mitokondriális betegségeknek neveznek. Ezzel a 26. fejezet foglalkozik. A mitokondriális me­ dicina az elmúlt évtizedekben szinte az orvostudo­ mány külön ágává nőtte ki magát. Mindez következik amitokondriumokkal kapcsolatos ismeretanyag hihe­ tetlen növekedéséből. Felismerték a mitokondriális stressznek és a mitokondrium ciklusnak a sejtfunkciók fenntartásában, az apoptózisban és a betegségek kiala­ kulásában betöltött szerepét (elsősorban szívizomban,

a

glukózl

zsírsavak!

vázizomban, májban, pancreas (3-sejtekben, agyban). Reményt keltők a mitokondriális támadáspontú gyógyszerfejlesztések kezdeti eredményei.

6.3

A CITRÁTCIK LUS

A citrátciklus helye az intermedier anyagcserében; a ciklus katabolikus és anabolikus funkciója A tápanyagok lebontása során túlnyomó többsé­ gükből a különböző anyagcsereutakon keresztül acetil-CoA képződik (6-34. ábra). Az acetilcsoport a

aminosavak anyagcsereutak

citrátciklus

fadh

2

terminális oxidáció oxidatív foszforiláció

egyszerű sémája (a) és a koenzim-A képlete (b)

126

citrátciklusban (citrátkömek is nevezzük) teljesen oxi­ dálódik: CO2 keletkezik, a hidrogén pedig redox koenzimekre kerül. A citrátciklust zömmel NAD+-függő dehidrogenázok alkotják, melyek a citrátköri interme­ diereket oxidálják, NADH-t generálnak, illetve FADredukciót eredményeznek. A légzési láncba kerülő hidrogének a mitokondriális belső membránban a ter­ minális oxidáció során redukálják az oxigént. így kép­ ződik víz a tápanyagokból kivont hidrogénből, és eh­ hez az oxidációhoz kapcsoltan - az oxidatív foszforiláció révén - ADP foszforilálódik ATP-vé (6-34. áb­ ra). A katabolizmus így teljes; a tápanyagokban lévő szén C 0 2-dá, a belőlük eltávolított hidrogén pedig oxigénre kerül, az energiatranszformáció optimális. A folyamat feltétele az, hogy a sejtek felvegyék és fel­ használják az 02-t. A teljes katabolizmust sejtlég­ zésnek is nevezik.

I I I.

AZANYAGCSERE

igen lényeges különbség. Ha az acetil-CoA glukogén szubsztrátokból, vagyis glukózból vagy olyan aminosavakból keletkezik, melyek lebontásának köztitermé­ ke a piruvát, akkor az acetil-CoA képződésének meg­ határozó lépése a piruvát —» acetil-CoA átalakulás. Acetil-CoA képződhet a zsírsav-oxidáció terméke­ ként zsírsavakból is. Ez utóbbi esetben ketogén és nem glukogén szubsztrátok terhére keletkezik az acetilCoA. A glukogén szubsztrátok olyan molekulák, ame­ lyek hozzájárulhatnak a vércukorszint fenntartásához oly módon, hogy belőlük glukóz képződhet. Ezzel szemben a ketogén szubsztrátokból nem képződik glukóz. Ennek jelentőségét a 7. fejezetben tárgyaljuk. A piruvát oxidációja a citrátkörrel koordináltan zajló folyamat (kezdetben a citrátciklus első lépésének vélték), amelyeknek során irreverzibilis reakciósoro­ zatban a piruvátból oxidatív dekarboxilezéssel acetilCoA keletkezik.

A citrátciklus különböző tankönyvekben citromsavciklus, trikarbonsavciklus, Krebs-ciklus, Szent-Györgyi-Krebs-ciklus né­ ven található meg. Reakcióinak felfedezése, a ciklus felismerése szemléletileg is igen nagy jelentőségű a biokémia történetében. Ezért kapott Hans Krebs Nobel-díjat. A ciklus megismeréséhez több

piruvát + CoA + NAD+ —» acetil-CoA + NADH + H+ + C 0 2 AG’° = -33,4 kJ/mol

fontos megfigyeléssel járult hozzá Szent-Györgyi Albert szegedi la­ boratóriuma. A citrátciklus aerob állati és növényi sejtekben, vala­ mint számos aerob prokarióta sejtben is megtalálható.

Acetil-CoA képződése piruvátból, a piruvát-dehidrogenáz enzimkomplex A tápanyagok döntő többsége lebontása során vagy piruváttá, vagy közvetlenül acetil-CoA-vá alakul. Ez

A reakciót eukarióta sejtekben a mitokondriumban található piruvát-dehidrogenáz komplex katalizálja (6-35. ábra). A komplexet meghatározott térbeli el­ rendezésben és arányban háromféle enzim, a piru­ vát-dehidrogenáz (Éj-alegység), a dihidrolipoiltranszacetiláz (E2-alegység), valamint a dihidrolipoil-dehidrogenáz (E3 -alegység) alkotja, de mind­ egyikből több darab. A különböző csoportátviteli re­ akciókhoz öt kofaktor; három prosztetikus csoport és

6-35. ábra. A piruvát-de­ hidrogenáz enzimkomp­ lex működése, alegysé­ gei és kofaktorai. E1( pi­ ruvát-dehidrogenáz; TPP, tiamin-pirofoszfát; E2, dihidrolipoil-transzacetiláz; LA, liponsav; E3, dihidrolipoildehidrogenáz

6. B I O E N E R G E T I K A

127

ciós állapotú C2-atomján keresztül, mint hidroxietilcsoport kötődik a TPP-hez. Következő lépésként a hidroxietil-csoport az első enzimről a második enzim­ re, a dihidrolipoil-transzacetilázra kerülve oxidálódik. Miközben a dihidrolipoil-transzacetiláz prosztetikus csoportjában a liponsavban található diszulfídkötés felbomlik, az egyik S-gyök SH-csoporttá redukálódik, a másik acetil-tioésztert (nagy csoportátviteli potenci­ álú vegyület!) képez. A liponsav tehát részben elekt­ ronátvivő, részben aciltranszferben képes részt venni (redukálódik, illetve acetilálódik) (6-37. ábra). Az acetilcsoportot a dihidrolipoil-transzacetiláz CoA-nak Az egységek szerkezete speciesenként eltérő. Emlősök májából, adja át, így magas csoportátviteli potenciálú tioészterveséjéből, szívéből vagy E. coliból például 4,6-8,5-106 D molekula­ kötést tartalmazó acetil-CoA és dihidroliponsav kelet­ tömegű, a riboszómánál nagyobb, elektronmikroszkóppal is tanul­ kezik. A dihidroliponsavat a harmadik enzim, a dihidmányozható multienzim-komplexeket izoláltak. A komplexet alkotó rolipoil-dehidrogenáz oxidálja, amely prosztetikus háromenzimen belül az egyes enzimek „darab”-száma is speciesen­ csoportként FAD-ot tartalmaz. A dihidrolipoil-dehidként változó. A komplex „közepe” a dihidrolipoil-transzacetiláz, rogenáz-FADH2 elektronjait NAD+-nak adja át (6-35. amely a lipoil-lizin mozgó „karjával” közvetít a komplex másik két ábra). így a reakciósorozat végén mindhárom enzim enzime között. újra kiindulási állapotába jut, miközben piruvátból acetil-CoA és CO2 lesz, valamint a NAD+ redukáló­ Az első reakciót katalizáló piruvát-dehidrogedik. A komplex ezenkívül tartalmaz még két szabályo­ názhoz a piruvát a TPP-n keresztül kötődik, majd zó funkciójú enzimet, egy protein-kinázt és egy dekarboxilálódik (6-36. ábra). A reakció eredménye­ foszfoprotein-foszfatázt, amelyeknek szubsztrátja az ként CO2 keletkezik, illetve a piruvát karbonil oxidáenzimkomplex első enzime, a piruvát-dehidrogenáz, va­ H NH, lamint egy katalitikus aktivi­ I I c —s tással nem rendelkező E3Cx // oo'c —ch24 n+ kötő fehérjét. Az enzim sza­ \ I C = C -j-(CH2)2 —O — P - O — P —o bályozását a citrátkör regulá­ H3C- C^ CH o o ciójával együtt alább ismer­ tiamin-pirofoszfát (TPP) tetjük. O O A piruvát-dehidrogenáz II I C — C—CH komplex minden sejttípus­ / piruvát ban, ahol mitokondrium van, megtalálható. Különösen nagy mennyiségben fordul •CO, elő a szívizomban és a vesé­ OH ben, kitüntetetten fontos sze­ I H— C—CH, repe van az agyban és a máj­ ban. A piruvát-dehidrogenáz c —s // (-36. ábra. A tiamin-pirofoszfát által katalizált reakcióban — N+ (TPP) szerepe a piruvát-dehidro­ \ keletkező acetil-CoA a citc = c — genáz által katalizált reakcióban. I Apiruvát dekarboxilálódik, C2-atomrátkörben oxidálódhat to­ CH, ján keresztül hidroxietilcsoportként vább. kapcsolódik a TPP-hez hidroxietil-TPP

két koenzim szükséges. A piruvát-dehidrogenáz prosztetikus csoportja a tiamin-pirofoszfát (TPP). A komplex második tagja, a dihidrolipoil-transzacetiláz prosztetikus csoportja, a liponsav (LA), mely savamidkötéssel lizinen keresztül kapcsolódik az en­ zimhez. A harmadik enzim, a dihidrolipoil-dehidrogenáz prosztetikus csoportja, a flavin-adenin-dinukleotid (FAD). A részt vevő koenzimek a CoA-SH és a NAD+. A három egymáshoz asszociálódó enzim szer­ kezetileg integrált egységeket (multienzim komplexe­ ket) alkot.

128

I I I.

AZ ANYAGCSERE

OH

J' O -CH , V CH,

H3C —C — s -

HS'

HS-

HS.

/

'CH \

CH, / 2 CH,

liponsav lizin

-CH , V CH,

/

'CH \

CH,

TPP-E.) 1/

/ \ CH, / CH, \ c= o CH,

\ CH, / CH, \ c= o

dihidroliponsav

NH

NH

\

\

CH, / 2 CH,

\ 2

CH, / CH,

acetilált

redukált

E2-polipeptid lánca

oxidált 6-37. ábra. A liponsav szerepe a dihidrolipoil-transzacetiláz (E2) által katalizált reakcióban. A liponsav (LA, lipoic acid) lizinen keresztül kapcsolódik az E2-alegységhez (E2-LA), a liponsav diszulfidkötése hasad és a TPP-Er ről a két C-atom acetilcsoportként az egyik tiolcsoporthoz kapcsolódik, a másik tiol redukálódik (E2-LAH), az acetilcsoport innen kerül a CoA-SH-ra (acetil-CoA keletkezik) miközben a tiolcsoport redukálódik (E2-LAH2). E1( piruvát-dehidrogenáz; TPP, tiamin-pirofoszfát

A citrátkör reakciói A citrátkört reverzibilis és irreverzibilis reakciók alkotják, amelyeket intramitokondriális enzimek kata­ lizálnak (6-38. ábra). A ciklus első reakciója a citrát képződése. Az acetil-CoA oxálacetáttal citrátot képez aldolkondenzáció, illetve az ezt követő hidrolízis során (6-39. ábra). Az irreverzibilis reakciót (AG'°= -32,2 kJ/mol) a citrát-szintáz katalizálja. A citrát-szintáz a reakció során először az oxálacetátot köti; az ezt követő kon­ formációváltozás teszi lehetővé az acetil-CoA megkö­ tését. Intermedierként citril-CoA képződik, amelyből víz belépésével felszabadul a CoA. A magas csoport­ átviteli potenciálú tioészterkötés hidrolízise teszi a re­ akciót erősen exergonikussá és irreverzibilissé. Ez fontos, mivel az oxálacetát koncentrációja a mitokondriumban igen alacsony. Az a tény, hogy az enzim csak akkor köt acetil-CoA-t, ha az oxálacetátot már

megkötötte, jelentős körülmény, mert a citrát-szintáz ezért nem képes az acetil-CoA-t hidrolizálni. A kon­ denzációt követő tioészter-hidrolízis előfeltétele a citril-CoA létrejöttéhez kötődő újabb konformáció­ változás. A keletkezett citrát vagy tovább alakulhat a mitokondriumban, vagy egy transzportrendszeren ke­ resztül kikerülhet a mitokondriumból a citoszolba. A citrát citoszolba történő transzportja a mitokond­ riumban képződő acetil-CoA citoszolba jutását szol­ gálhatja. A citoszolban ugyanis a citrátból (a) részint acetil-CoA képződhet, amely zsírsav- és koleszterin­ szintézis előanyaga lehet (lásd 8. fejezet), (b) részint izocitrát keletkezik, amely a citoplazmatikus NADP függő izocitrát-dehidrogenáz által katalizált reakció­ ban a-ketoglutaráttá alakul. Ez a reakció (is) lehetővé teszi a NADPH képződését a citoszolban. A citrát-szintáz a citrátkör egyik fontos regulációs pontja: az enzimet allosztérikusan gátolja a NADH és

129

6. B I O E N E R C E T I K A

acetil-CoA

malátdehidrogenáz

o = c —cooI

COCr

I I

oxálacetát

HO —CH ( fumaráz

-

NADH + H+ NAD

I

CH — COO'

COO'

citrát

( akonitáz

\

cooI

CH,— COO"

I

C — COO"

I

CH HC

II

I

COO-

CH— COO"

citrátkör

c/sz-akonitát

fumarát

. FADH, szukcinátdehidrogenáz

■FAD H—C — COO"

NAD+

CH,

I

HO —CH — COO" izocitrát

I I c —sII o

CH,

NADH + H+ NAD+

I I

V

CH,

■CoA

pzocitrát-dehidrogenáz

CH,

CO,

C- ■COO'

II

o

CoA-SH

co.

u-ketoglutarát

szukcinil-CoA

a-ketoglutarátdehidrogenáz 6-38. ábra. A citrátkör folyamata, enzimei és kofaktorai. Az ábra a folyamat irányát mutatja és nem jelzi az egyes lépések reverzi­ bilisjellegét

6-39. ábra. A citrát-szintáz által katalizált reakció

-S-CoA

O

II

acetil-CoA

CH2— C' ^ S -C o A

c h 2— COO'

H20 0 = C —COO"

->

I

HO—C -C O O "

V

I

CH2—COO'

HS-CoA

^

>

HO—C —COO"

I

c h 2—COO'

CH2-C O O '

oxálacetát

citrát

citril-CoA citrát-szintáz

a ciklus egyik intermediere, a szukcinilCoA a fiziológiásnál nagyobb koncentrá­ cióban. A mitokondriumban maradó citrát re­ verzibilis izomerizáció során izocitráttá alakulhat át. A kétlépéses, átmeneti dehidratálással és hidratálással járó folyamatot (6-40. ábra) az akonitáz katalizálja,

H ,0 ^

CH2— COO' un

r

rn n -

HCH —COO' citrát

v

N.

H„0 ‘

CH2—COO' p

PO O ‘


0 = C — COOc h 2— COO-

oxálacetát

6-46. ábra. A malát-dehidrogenáz által katalizált reakció

COO-

CH,—COO’

co ° szukcinát

FAD

FAÍ?H2

fszukcinát-dehidrogenáz

I I HC I

CH

COOfumarát

6-44. ábra. A szukcinát-dehidrogenáz által katalizált re­ akció

A fumarátból víz belépésével reverzibilis reakció­ ban malát képződik a fumaráz enzim közreműködé­ sével (6-45. ábra). Az addíció szigorúan sztereospeci­ fikus, kizárólag a malát L-izomerje képződik, illetve ellenkező irányban csak fumarát képződhet. (Maleát, a fumarát cisz-izomérje, illetve D-malát nem szubsztrátjai az enzimnek.)

A citrátkör szerepe a tápanyagok katabolizmusában A piruvát-dehidrogenáz és a citrátkör reakciói együttesen 1 piruvátmolekula teljes oxidációját ered­ ményezik: a három oxidatív dekarboxilálás során a piruvát három C-atomja C 0 2-dá oxidálódik. Acetil-CoA-ból indulva a citrátkör reakcióinak összessége a következőképpen írható fel: acetil-CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + P; + 2FI20 —> 2C 02 + 3NADH + 3H+ + FADH2 + GTP + CoA A körfolyamat reakcióiban egy acetilcsoport telje­ sen oxidálódik, ez végső soron a keletkező két C 02

ill.

132

forrása (annak ellenére, hogy az acetilcsoport nem azonnal a belépés utáni első ciklusban oxidálódik köz­ vetlenül). Négy dehidrogenálási reakcióban négy pár hidrogén kerül elektronkarrierekre (3 NAD , 1 FAD redukálódik). Ezzel összefüggésben fontos körül­ mény, hogy egy ciklushoz 2 molekula víz is szüksé­ ges. Egy ciklus folyamán egy GDP foszforilálódik GTP-vé. A redukált, elektront szállító molekulák a légzési láncban oxidálódnak, így 1 acetilcsoport teljes oxidációja 10 magas csoportátviteli potenciálú kötés létrejöttét (3 NADH -4 7,5 ATP, 1 FADH2 -» 1,5 ATP, plusz 1 GTP) eredményezi. (A GDP/ADP specifitás változásainak megfelelően GTP helyett to­ vábbi ATP.) A C 0 2 a C 0 2/H C03“ puffer része, a szén-dioxidot kilélegezzük, azon kívül karboxilázok szubsztrátja is.

A piruvát-dehidrogenáz enzimkomplex aktivitásának szabályozása

rejlő energia végül lipidek formájában hasznosul. Ez azt is jelenti, hogy a komplex szabályozott aktivitására mind energiagazdag, mind energiaszegény állapotban szükség van. További szempont, hogy a piruvátdehidrogenáz komplex által katalizált reakció során a piruvát, mint glukogén szubsztrát ketogén szubsztráttá, acetil-CoA-vá alakul, és ez az átalakulás irre­ verzibilis. Ily módon egy glukogén szubsztrát „el­ vész” a vércukorszint fenntartása szempontjából. A komplex szabályozása a komplexet alkotó piruvát-dehidrogenáz aktivitásának kontroliján ke­ resztül valósul meg. Ennek módja részint (a) a piruvát-dehidrogenáz-aktivitás allosztérikus szabá­ lyozása, részint (b) poszttranszlációs kovalens módo­ sítása. Ez utóbbi foszforilációval valósul meg: a piruvát-dehidrogenáz a-alegységét alkotó aminosavak közül három szerin bármelyikének (vagy mind­ nek) a foszforilációja az enzim inaktiválódását ered­ ményezi. A foszforiláció/defoszforiláció két külön en-

allosztérikus szabályozás

A piruvát-dehidrogenáz komp­ lex funkciója kettős, ráadásul e két funkció egymásnak látszólag el­ lentmondó: a komplex részint energiamobilizálási, részint energiarak­ tározási célokat szolgálhat. Ebből adódóan szabályozása is komplex, kétszintű (6-47. ábra). Ez abból is adódik, hogy az általa katalizált re­ akcióban keletkezett acetil-CoAnak energetikai szempontból kettős szerepe van: (a) ha a sejtnek ATPre van szüksége, az acetil-CoA oxi­ dálódik a citrátkörben, a képződő redukált koenzimek oxidálódnak a terminális oxidációban, és az oxidatív foszforiláció ATP-t termel; (b) ha viszont az intracelluláris ATP-szint megfelelő, a mitokondriumban képződött acetil-CoA a citráttranszport (citrát-malát antiport) révén kiléphet a citoplazmába, ahol a zsírsav- és koleszterin­ szintézis előanyagaként a benne

AZANYAGCSERE

kovalens módosítás allosztérikus szabályozás

6-47. ábra. A piruvát-dehidrogenáz enzimkomplex szabályozása. A piruvátdehidrogenáz a piruvát-dehidrogenáz enzimkomplex Er alegysége. Az enzimkom­ plex szabályozása a piruvát-dehidrogenáz szabályozásán keresztül valósul meg, ré­ szint allosztérikus módon (bal oldalon keretben), részint az enzim foszforilációs gát­ lásával vagy a foszforilált, inaktív enzim defoszforilációjával, azaz aktivációjával. A foszforilációt katalizáló piruvát-dehidrogenáz-kináz (PDH-kináz) és a defoszforilációt katalizáló piruvát-dehidrogenáz-foszfatáz (PDH-foszfatáz) szintén allosztéri­ kus szabályozás célpontja. Az allosztérikus effektorok részint az enzimreakció köz­ vetlen résztvevői, részint a keletkező acetil-CoA oxidációja után képződő ATP (illetve annak hiányában az emelkedő ADP-, illetve AMP-szint). Ha viszont az acetil-CoA nem oxidálódik, hanem a benne rejlő energia zsírsavakban raktározódik, akkor ennek „üzenetét" a zsírsavak allosztérikus gátló hatása hordozza, amely potencírozza a re­ akció termékeinek gátló hatását, így csökkenti az acetil-CoA képződését. Az ábrán az allosztérikus stimulációkat a +, a gátlásokat a - jelzi. Piros keretben a piruvát-dehid­ rogenáz aktivitást csökkentő, kék keretben az aktivitást serkentő körülményeket mutatjuk

6. B I O E N E R G E T I K A

zim, a piruvát-dehidrogenáz-kináz és a piruvát-dehidrogenáz-foszfatáz révén történik, amelyek a piruvátdehidrogenáz-komplex részei. A szabályozásban nemcsak a piruvát-dehidrogenáz, hanem az azt foszforiláló és a foszfoenzimet defoszforiláló enzim is az allosztérikus szabályozás célpontja. Az enzimreakcióban keletkező acetil-CoA és NADH, valamint a közvetve képződő ATP allo­ sztérikus gátlói a pimvát-dehidrogenáznak. Ez a gát­ lásjelentősen fokozódik hosszú szénláncú zsírsavak jelenlétében, amelyek szintén a jó energiaellátottság jelzői. Másrészt azonban részben ugyanezek a mole­ kulák serkentik a piruvát-dehidrogenáz foszforilációval történő inaktivációját is. ATP, acetil-CoA és NADH aktiválják a kinázt; így a piruvát-dehidrogenáz foszforilálódik, inaktiválódik. A piruvát-dehidroge­ náz defoszforilálódik és aktiválódik, amikor csökken az acetil-CoA, illetve amikor emelkedik az ADPszint. A CoA-SH-, a NAD+-, illetve az AMP-kon­ centráció növekedése viszont allosztérikusan aktiválja apiruvát-dehidrogenázt, és így fokozza az acetil-CoA képződését és belépését a ciklusba. Mindezen szabá­ lyozások biztosítják a komplex működését energiahi­ ányban (emelkedett ADP, AMP), energiaraktározás lehetősége idején (magasabb ATP), vagy akkor, ami­ kor a piruvát megőrzése kívánatos a vércukorszint fenntartása érdekében. A piruvát-dehidrogenázt a Ca is stimulálja a piruvát-dehidrogenáz-foszfatáz stimulációján, azaz a piruvát-dehidrogenáz defoszforilációján keresztül. Ez a metabolizmus alkalmazko­ dását szolgálja a megnövekedett igénybevételekhez minden olyan szövetben (pl. izom, agy, szekréciós sejtek), amelyek működését a Ca serkenti. Különböző szövetekben, sejttípusokban speciális regulációs mechanizmusok működnek. A piruvátkoncentráció emelkedése, illetve az inzulin serkentik a piruvát-dehidrogenáz aktivitását. Májban a piruvát gátolja a kinázt, zsírszövetben az inzulin serkenti a foszfoprotein-foszfatázt. Ez szoros kapcsolatban van azzal a követelménnyel, hogy amikor glukóztöbblet van, a piruvát-dehidrogenáznak intenzívebben kell működnie a glukóz hasznosítása érdekében. Étkezé­ sek között azonban az aktivitást csökkenteni kell (az agy kivételével), mert a komplex aktivitásának foko­ zódása csökkentené a vércukorszint fenntartásához

1 33

szükséges glukóz-prekurzorok mennyiségét. A piru­ vát-dehidrogenáz komplex által katalizált reakció sza­ bályozása ugyanis nemcsak az adott sejt, hanem a szervezet energiaforgalma szempontjából is alapvető, amennyiben meghatározó a glukóz képzésére alkal­ mas (glukogén) prekurzorok szintjének alakításában. Ezt a kérdéskört a 7. fejezetben tárgyaljuk.

Klinikai vonatkozások A pimvát-dehidrogenáz csökkent működése. A piruvát-dehidrogenáz működéséhez több vitamin származéka is szükséges. Eb-vitamin (tiamin) hiányá­ ban a piruvátoxidáció, így a glukózoxidáció zavara alakul ki. Ez a beriberi kór tünetegyüttesét okozza, többek között gyengeséget, idegrendszeri és kardioló­ giai tüneteket. A betegség tiaminhiányos táplálkozás miatt gyakran olyan helyeken lép fel, ahol alacsony tiamintartalmú rizs a fő táplálék. De kialakulhat alko­ holistáknál is, a rendszerint nem megfelelő táplálko­ zás és felszívódási problémák miatt. A piruvát-dehidrogenáz csökkent működése, a tiamin hiánya, a glukózoxidáció súlyos zavarát okozva, elsősorban az agy működését veszélyezteti, tekintettel arra, hogy az agy energiaforrása elsősor­ ban a glukóz, energiaigényét viszont csak a glukóz aerob lebontása képes biztosítani. Piruvát-dehidrogenáz csökkent működésével já­ ró állapotokban a glukóz nem alakulhat át acetilCoA-vá, ezért csak a glikolízisben tud ATP terme­ lődni. Ez komoly tüneteket, eszméletvesztést, kómás állapotot is okozhat. A keletkezett piruvát nem tud a PDH által tovább alakulni, laktát (tej sav) és alanin képződik, a laktátkoncentráció emelkedik, laktát-acidosis jön létre. Ilyenkor egy Bi-vitamin nélkül adott glukóz infúzió csak súlyosbítja az álla­ potot, mivel fokozza a laktát-acidosist és fatális ki­ menetelű is lehet. Alkoholisták esetében az acidosist csak fokozza az ilyenkor fellépő ketosis (keton­ testek keletkezése). A gyerekkorban fellépő, neurológiai tünetekkel járó piruvát-dehidrogenáz-elégtelenség gyakran halálos

134

kimenetelű betegség. A piruvát-dehidrogenázkomplex különböző összetevőinek károsodott ex­ pressziója okozhat klinikai tüneteket. Az emelkedett szérum laktát-, piravát-, alaninszint krónikus laktátacidosissal jár. A piruvát-dehidrogenáz funkciójának kiesése miatt az anaerob metabolizmus válik domi­ nánssá, mivel a citrátkör nem jut elegendő mennyiség­ ben acetil-CoA-hoz. Az acetil-CoA hiányos képződé­ sét ketogén diétával lehet részben ellensúlyozni, illet­ ve csökkentett szénhidrátbevitellel lehet egyes esetek­ ben javulást elérni. Az E3-alegység hiánya esetén nincs megfelelő diéta.

A citrátciklus szabályozása

III.

AZANYAGCSERE

szintáz aktivitásán, illetve részben az oxálacetát-koncentráció változásán keresztül szabályozódik. A citrát-szintáz allosztérikus gátlói az ATP, NADH, vala­ mint az acil-CoA. Ez jól demonstrálja a citrát szintézi­ sének kettős funkcióját: egyrészt szerepét a katabolizmusban, másrészt a citrátszintézis és a zsírsavszin­ tézis összefüggését. A ciklus intermedierjeinek kon­ centrációemelkedése szintén gátló hatású; a szukcinil-CoA a citrát-szintáz allosztérikus gátlója. A citrát-szintáz allosztérikus aktivátora az ADP. A citrátciklus katabolikus részének bevezető, eb­ ben az irányban elkötelező lépését, a második irrever­ zibilis reakciót katalizáló izocitrát-dehidrogenáz ak­ tivitását elsősorban az ATP/ADP, illetve a NADH/NAD arány szabályozza. Az allosztérikus szabályozásban a legfontosabb aktivátor az ADP, míg az ATP, illetve NADH az izocitrát-dehidrogenáz gát­ lói. Ez szoros összefüggésben van az akceptorkontrollal. Az ADP-koncentráció emelkedése így nemcsak az oxidatív foszforilációt és ezen keresztül a terminá-

A citrátciklus az anabolizmus és a katabolizmus szempontjából egyaránt központi reakcióút. A szabá­ lyozás összehangolt, mind a ciklust bevezető piruvátdehidrogenáz komplex aktivitá­ sának, mind a ciklust követő acetil-CoA oxidatív foszforilációnak a regu­ lációjával. A fő szabályozási pontokat ré­ szint az irreverzibilis reakciókat katalizáló enzimek - citrátszintáz, izocitrát-dehidrogenáz, a-ketoglutarát-dehidrogenáz aktivitásának (6-48. ábra), részint az oxálacetát koncentrációjának változása jelentik. fúrna rát A citrátciklus kontrollját két tényező határozza meg; a reduká­ ló ekvivalenssel való ellátás (NADH/NAD+ hányados), vala­ mint az adenilátkészlet foszforilációs állapota (az ATP/ADP arány). A NAD+ redukciója, illet­ ve az ATP optimális képződésé­ a-ketoglutarátCa2+a nek igénye szabja meg a ciklus dehidrogenáz működését. 6-48. ábra. A citrátkör szabályozása. Piros keretben a citrátkör megfelelő lépését Az irreverzibilis reakciók kö­ gátló, kék keretben a stimuláló körülmények láthatók. A cikluson belüli szukcinát-CoA zül a citrát képződése a citrátáltal kifejtett allosztérikus gátlást a piros szaggatott vonal jelzi

6. B I O E N E R G E T I K A

lis oxidációt gyorsítja, hanem biztosítja a terminális oxidáció fokozott redukáló ekvivalens szükségletének kielégítését is. Ha az ATP-koncentráció emelkedik, a terminális oxidáció ennek következtében lassul, ezért aNADH oxidációja csökken, az izocitrát oxidációjá­ nak sebessége visszaszorul. A citráttermelés ettől füg­ getlenül még folyhat, a piruvát-dehidrogenáz a két­ szintű szabályozás miatt még aktív állapotban lehet. Ilyenkor a termelődő citrát inkább bioszintézisre, energiaraktározásra fordítódik. A harmadik irreverzibilis lépést katalizáló a-ketoglutarát-dehidrogenáz enzimkomplex a piruvátdehidrogenáz komplexhez hasonlóan szabályozott. Ez esetben azonban nincs kétszintű szabályozás, hiány­ zik a kináz, illetve a foszfatáz által katalizált foszforilációs-defoszforilációs mechanizmus. A komplex aktivitását gátolja az ATP és a NADH, valamint a szukcinil-CoA és GTP. Hasonlóan a piruvát-dehidrogenázhoz, a citrátkör működését is serkenti a Ca , két enzim: az izocitrátdehidrogenáz és az a-ketoglutarát-dehidrogenáz allosztérikus stimulációján keresztül, ami a metabolizmus optimális működését szolgálja Ca" által stimu­ lált sejtműködések esetén (pl. izomkontrakció, hor­ monszekréció , neurotranszmitter-felszabadulás). A metabolikus enzimek szabályozásának egy má­ sik lehetősége, ami érinti a citrátkör működését is, acetilált enzimek deacetilálása. Számos fehérje a metabolizmusban lizin-NH2-csoporton acetilálódik, ami olyan poszttranszlációs módosulatnak tekinthető, amely az adott fehérje működését megváltoztatja. Acitrátkörben csaknem minden enzim acetilálódhat különösen jellemző ez az izocitrát-dehidrogenáz, a szukcinát-dehidrogenáz és a malát-dehidrogenáz en­ zimekre -, mindegyik enzim aktivitását csökkentve. Az acetilcsoportot eltávolító enzimek hatása ennek következtében az enzimaktivitások fokozása. Ebből a szempontból meghatározó enzimek a szirtuinok (SÍRT), emelyek NAD+-dal működő deacetilázok (a reakciót lásd a 2-23. ábrán), és több izoformában for­ dulnak elő, amelyek eltérő intracelluláris lokalizációjúak. A mitokondriális szirtuinok (elsősorban SIRT3) egyebek mellett a citrátkör enzimeit is deacetilálják, és ezáltal aktiválják. Mivel NAD+-függő enzimek, szerepet játszanak a NADH/NAD+ arány által szabá­

135

lyozott metabolikus változásokban. A SIRT3 ex­ presszióját egyébként a rendszeres testmozgás jelen­ tősen fokozza, s ezt az élettartam növelésében is fon­ tosnak gondolják.

A ciklust feltöltő (anaplerotikus) reakciók A citrátciklus szabályozásának másik fontos szem­ pontja az oxálacetát koncentrációjának alakulása. A citrátkör intermedierjei egyben bioszintetikus prekurzorok is, ezért igen fontosak a ciklust feltöltő (anaplerotikus) reakciók (6-49. ábra). Ezek emelik, illetve biztosítják az oxálacetát mennyiségét. A leg­ fontosabb anaplerotikus reakció a piruvát —» oxál­ acetát átalakulás. A reakciót a piruvát-karboxiláz ka­ talizálja. piruvát + CO2 + ATP —» oxálacetát + ADP + P, Elsősorban a glukóz de novo szintézisére képes májban, illetve vesében fontos ez a reakció, mivel a keletkezett oxálacetát glukoneogenezis intermedier­ ként közvetve elhagyhatja a citrátkört (lásd 7. fejeze­ tet). A piruvát-karboxiláz CC^-fixálást katalizál, prosztetikus csoportja a biotin. Az enzim allosztérikus serkentője az acetil-CoA; tulajdonképpen az enzim működésének abszolút feltétele az, hogy ez az allo­ sztérikus stimuláció megvalósuljon. Emelkedett acetil-CoA-koncentráció serkenti a piruvát —» oxál­ acetát átalakulást, így a ciklus több acetil-CoA-t képes felvenni. A reakció részletes ismertetésére a 7. fejezet­ ben visszatérünk. További anaplerotikus lehetőség elsősorban szív­ ben és vázizomban a foszfoenol-piruvát-karboxikináz (PEPCK) által katalizált reverzibilis reakcióban képződő oxálacetát. foszfoenol-piruvát + CO2 + GDP LOOH (lipid-peroxid) + L’ T* LH

T ox 6-54. ábra. A lipidperoxidáció folyamata és leállítása E-vitamin hatására. (1) A tökéletlenül redukált reaktív OH' zsírsavak redu­ kált láncából von el hidrogént, és így lipidgyök (L) keletkezik. (2) A lipidgyökhöz 0 2 kapcsolódik, és ily módon peroxilgyök (LOO') kép­ ződik. (3) A peroxilgyök újabb zsírsavakat támad meg, újabb lipidgyök képződéséhez, illetve lipid-peroxid (LOOH) kialakulásához ve­ zet. Az E-vitamin (tokoferol, TH), mint zsíroidékony H-donor állítja le a lipidperoxidáció folyamatát tokoferilgyök (T*) képződésével. Az oxidált E-vitamin (Tox) keletkezése két lépésben történik

I II.

140

amelyben hidrogénelvonás történik egy többszörösen telítetlen, a membránban vagy lipoproteinben (LDL) található zsírsavoldalláncból (6-54. ábra). Ennek so­ rán folyamatosan lipidgyökök képződnek, oxigén épül be a zsírsavláncba és a peroxidok képződése membránkárosodásokat, fluiditás- és permeabilitászavarokat okoz, és károsítja a membránfehérjéket is. Többek között ez történik stroke-ban vagy atherosclerosisban. Nukleinsav bázisok változásai, DNSben például timin-glikol-, 5-hidroximetil-uracil(6-55. ábra) vagy 8-hidroxi-guanin-képződés, és ezek károsító - például mutagén - hatásai jól ismertek aktív hidroxilgyök „támadásban”. Egészséges emberekben 100 nmol/nap mennyiségben mutathatók ki ROS kö­ vetkeztében keletkező oxidált bázisszármazékok. A repair-t, mint forrást feltételezve, DNS-molekulánként 10 oxidatív találatot kalkulálnak naponta. A mitokondriális DNS sokkal védtelenebb, és a repair is kevésbé hatékony. o

AZANYAGCSERE

van, s nemcsak fehérjekárosító hatású, hanem további ROS-képződést is elindíthat.

A reaktív oxigénszármazékok eliminálása, az antioxidáns védelem mechanizmusai Az antioxidáns védelem a redoxegyensúly megha­ tározója. Evolúciós kialakulását az oxigén megjelené­ séhez kötik; az igen könnyen reakcióba lépő, erőteljes oxidáns hatású ROS ellen az általános védelmet bizto­ sítani kell. Ennek különböző formái alakultak ki. A ROS-eliminálás mechanizmusai között az antioxidáns enzimek alapvetőek. A szuperoxid-dizmutáz (SÓD) által katalizált re­ akcióban szuperoxid eliminálódik (6-56. ábra). Kü­ lönböző SÓD izoenzimek expresszálódnak különböző kompartmentekben: Cu-, Zn-SOD a citoszolban és a mitokondrium membrán közti térben, Mn-SOD a mitokondrium mátrixban. Meg kell jegyezni, hogy eb­ ben a reakcióban H2O2 keletkezik, ami szintén ROS, bár nem gyök, de nagy reakciókészségü, és szemben a szuperoxiddal, membránpermeábilis oxigénszárma­ zék, amit további reakcióknak kell eliminálni (lásd alább).

6-56. ábra. A szuperoxid-dizmutáz (SÓD) által katalizált reakció 5-hidroximetil-uracil 6-55. ábra. Oxigénéit timinszármazékok képződése aktív hidroxilgyök „támadás" hatására DNS-károsodásokban

A ROS nem-enzimatikus keletkezése után kialaku­ ló reakciók sajátos esete a másik ROS-sal való kap­ csolat. Erre a lehetőségre példa az O* és a NO által képzett peroxinitrit (ONOO) képződés (NO* + O2* —>ONOO ), amely számos kóros folyamat résztvevő­ je, tekintettel arra, hogy rendkívül erős oxidáló hatása

A H2O2 eliminálásában a peroxidázoknak van je­ lentős szerepük, amelyek működéséhez hidrogéndo­ nor szükséges. Ide tartozik a szeléntartalmú, glutation-peroxidáz az antioxidáns védelem igen jelentős enzime, amely a H202-ot vízzé alakítja (6-21. ábra)', a reakcióban a GSH a hidrogéndonor. Az enzim csök­ kent működésével magyarázzák a szelénhiányban ki­ alakuló peroxidszint-növekedést. A glutation redoxciklusának zavara jön létre a glutation-reduktáz elég­

6. B I O E N E R G E T I K A

télén hidrogén- (NADPH) ellátása következtében glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz-elégtelenségben (lásd 7. fejezet), amikor is vörösvérsejt membránkárosodás és hemolízis (pl. drogindukált hemolitikus anémia) lép fel a kialakuló EEC^-felhalmozódás következté­ ben. A peroxiredoxinok peroxidokat redukálnak. Az enzim aktív centrumában elhelyezkedő Cys-SH a peroxid szubsztrátokkal (pl. H2O2) Cys-SOH-vá oxidáló­ dik, majd ez redukálódik SH-vá. A peroxiredoxinok ily módon H2O2 szenzorként viselkednek, amely re­ dukció útján eliminálja ezt a reaktív oxigénszármazé­ kot. Az aktív centrumban tiol keletkezése az egyes peroxiredoxinokban történhet glutation, illetve aszkorbinsav közreműködésével. A peroxiredoxin redu­ kálásában további antioxidáns fehérje, a tioredoxin vehet részt. A H2O2 eliminálásában szerepet játszik az ubikviter kataláz is, amely hemoprotein, és elsősor­ ban a peroxiszómák tartalmazzák. Az alábbi reakciót katalizálja: 2 H20 2 -> 2 H20 + 0 2 Az enzimek mellett az antioxidáns védelem haté­ kony részei az endogén antioxidáns hatású molekulák, amelyek részben hidrogéndonorként hathatnak. Kö­ zöttük kiemelkedő jelentőségű, mint egyetlen zsíroldékony antioxidáns, az E-vitamin, y-tokoferol (6-22. ábra). Membránokban, lipoproteinekben hidro­ géndonorként képes a lipidperoxidáció láncreakciójá­ nak leállítására - ezért peroxilgyök „scavenger” (6-54. ábra). A vízoldékony antioxidáns védelem részei a hidrogénátvivő C-vitamin és a glutation. Több metabolitnak - bilirubin, urát - tulajdonítanak az em­ beri szervezetben antioxidáns funkciót. A plazmakomponensek között a transzferrin, coeruloplasmin, albumin, haptoglobin, metallotionein számít jelentős antioxidáns hatásúnak, elsősorban a különböző redoxfolyamatokban, így a ROS képződé­ sében is részt vevő fémionokkal (Fe, Cu, Zn) való komplexkötő képessége miatt. Az ubikinon is anti­ oxidáns (6-20. ábra). Egyes növényi hatóanyagok antioxidáns hatása jól dokumentált. Többek között a (narancssárga-vörös

141

színanyag) (3-karotin, paradicsomban a napfény hatá­ sára termelődő likopin, a vörösborban és keserű cso­ koládéban található flavonoidok antioxidáns hatása közismert.

Klinikai vonatkozások A ROS-képződés és az antioxidáns védelem közti egyensúly megbomlásakor, amikor a ROS-hatás kerül előtérbe, oxidatív stressz alakulhat ki. Az elégtelen antioxidáns védelem miatt bekövetkező oxidáns hatá­ sok patogenetikai szerepét a legkülönbözőbb kórké­ pekben bizonyították vagy feltételezik. Az oxigénel­ látottság zavara (oxigénhiányos, hypoxiás állapotok), majd a helyreálló oxigénellátás (reperfúzió) után fo­ kozott a ROS-keletkezés. Ilyen ischaemia-reperfűzió állapottal szinte valamennyi sebészeti beavatkozás­ ban technikai okok folytán, vagy átmeneti keringési akadály (infarctus, stroke) esetén számolni kell. Más részről az oxigén részvételével a különböző sejtorganellumokban zajló folyamatok (pl. mitokondrium - terminális oxidáció, endoplazmás retikulum fehérjékben diszulfidhidak létrejötte) változó intenzi­ tása és ennek következtében változó oxigénfogyasztá­ sa is eltérő mennyiségű ROS-képződést eredményez, amihez az antioxidáns védelemnek alkalmazkodnia kell(ene). ROS-képződés-fokozódást anyagcsere-be­ tegségektől (pl. diabetes mellitus), neurodegeneratív megbetegedésekig (pl. Parkinson-kór, amyotrophiás lateralsclerosis), számos kórképben észleltek, és en­ nek patogenetikai jelentőséget tulajdonítanak. Ezen alapul a különböző antioxidánsok és gyökfogók terá­ piás alkalmazása, illetve az ilyen típusú étrend­ kiegészítők propagálása. Az öregedésnek, mint ismét­ lődő oxidatív stresszek következményének, jelentős irodalma van, csak úgy, mint a testmozgás ROStermelődést csökkentő hatásának. Az antioxidáns ubikinon mennyiségét a rendszeres testedzés például növeli, míg az életkor előrehaladtával csökkenő ubikinonszinteket mértek. Többen úgy tartják, hogy az antioxidáns védelem a hosszú élet titka, és ezért az E-vitamint egyesek öregedés ellenes vitaminnak is nevezik.

142

Az oxigénellátottság és a ROS-képződés az egész metabolizmus szempontjából döntő jelentőségű. A korábbi, főként toxikológiai kérdéseket a regulációs szemlélet váltotta fel: mindkettő szabályozási szem­ pontból is az érdeklődés középpontjába került az elmúlt évtizedekben. Az oxigénellátottság a meghatározó az egyik legki­ terjedtebb génexpressziós, transzkripciós szintű sza­

II I .

AZANYAGCSERE

bályozási rendszerben. Az oxigénszenzorként műkö­ dő, az oxigént szubsztrátként használó oxigenázok (pl. prolin-hidroxilázok) által katalizált poszttranszlációs módosítások a HIF (hypoxia-inducible factor) transz­ kripciós faktoron keresztül közvetítik a jelenleg is­ mert, legtöbb génre kiterjedő eukarióta szabályozási rendszert - a glikolízistől kezdve a vörösvérsejtképzésen keresztül az érrendszerig (lásd 18. fejezet).

7

A SZÉNHIDRÁTOK ANYAGCSERÉJE

ÁDÁM V E R O N I K A ÉS MÁN DL J Ó Z S E F

7.1

7.1

Az emberi szervezet számára legfontosabb szénhidrátok kémiai tulajdonságai 143

7.2

A szénhidrátok emésztése

7.3

Glikolízis

7.4

Redukáló ekvivalensek transzportja a citoszolból a mitokondriumba 161

7.5

Glukoneogenezis - a glukóz de novo szintézise

163

7.6

A glikolízis és a glukoneogenezis szabályozása

167

7.7

A fruktóz és a galaktóz metabolizmusa

7.8

A glikogén szintézise és lebontása

7.9

A vércukorszint szabályozása

7.10

A glukóz direkt oxidációja, pentóz-foszfát-út

7.11

Bioszintetikus folyamatok a szénhidrátok anyagcseréjében. Glikoproteinek, proteoglikánok szénhidrátláncának szintézise

147

151

AZ EMBERI S Z E R V E Z E T SZÁMÁRA L E G F O N T O S A B B SZ É N H ID R Á T O K KÉMIAI TUL A JD O N S Á G A I

A szénhidrátok aldehid- vagy ketocsoportot tartal­ mazó több szénatomos molekulák, amelyek minimáli­ san két vagy több alkoholos OH funkciós csoportot tartalmaznak. A szénhidrátok legkisebb egységei a monoszacharidok. Két monoszacharidból összekap­ csolt molekulák a diszacharidok, 2-8 monoszacharidegységet tartalmaznak az oligoszacharidok, míg a >8, esetenként több száz vagy ezer monoszacharidot tar­ talmazó szénhidrátok a poliszacharidok. A monoszacharidok a jellegzetes funkciós csoport szerint áldozok (aldehidet tartalmaznak) vagy ketózok (ketocsoportot tartalmaznak), a molekulát felépítő C-atomok száma szerint pedig triózok (3 C-atom),

170

174

183 189 194

tetrózok (4 C), pentózok (5 C), hexózok (6 C), heptózok (7 C) lehetnek. Monoszacharidok. Az emberi szervezet metabolizmusában szerepet játszó fontosabb monoszachari­ dok képletét a 7-1. ábra mutatja. A monoszacharidok szerkezetileg legegyszerűbb képviselői a triózok: a glicerinaldehid és a dihidroxi-aceton, az előbbi aldotrióz, míg az utóbbi ketotrióz. A glicerinaldehid királis molekula, tartalmaz egy aszimmetrikus C-atomot, a dihidroxi-aceton nem. A glicerinaldehid két sztereoizomér módosulata D-, illetve L-glicerinaldehid.

H^C-^OH c h 2oh

D-glicerinaldehid

HO^-C^H c h 2oh

L-glicerinaldehid

144

I N . AZANYAGCSERE

ÁLDOZOK

KETOZOK

V I

C= 0

H - C —OH I D -g lic e rin a ld e h id

c h 2o h

Cf-LOH

0-

0

d ih id ro x ia c e to n

c= o

0

HO — C — H

*

-

I

1

X

1

1 X

-O

1

I

1

H — C — OH c h 2o h D - r ib ó z

a -D -rib o fu ra n ó z

V

H

2l

HO—C — H X

1

1

-O -

O

X

c h 2oh D -m an n ó z

c h 2o h D - x ilu ló z

CH,OH

1

H—C —OH

X

1

1

a -D - g lu k ó z

H—C —OH

0

OH 3 OH H

0-

D -g lu k ó z

4H

HO —C —H

1 X

C H 2OH

H/n

C — OH

O

-

5l H—C —OH 6l

V

HO —C —H

3l

4l H—C —OH

H

O

V

H—C - O H HO —C — H

D -rib u ló z

H—

H—C — OH c h 2oh D -g a la k tó z

21 2 0= 0 3l

HO —C —H 4l H—C — OH

5l

H—C —OH

6Í.. D -fru k tó z

x -D -fru k to fu ra n ó z

1CH-OH 2 1

^0

=

0

3I

HO — C — H

4 1

H — C — OH

5 I

H — C — OH

6I 7I

H - C — OH

7-1. ábra. A szervezetben előforduló legfontosabb monoszacharidok

A további monoszacharidok egy vagy több kira-

D - s z e d o h e p tu ló z

mereknek nevezik. Ilyen epimerek pl. a D-glukóz és a

litáscentrumot tartalmaznak, így különböző sztereo-

D-mannóz vagy a D-glukóz és a D-galaktóz.

izomérek léteznek. Rendszerezésük alapja, hogy ké­

Vizes oldatban az aldehid- vagy a ketocsoport egy távolabbi (4. vagy 5.) szénatom alkoholos OH-csoportjához térben közel kerül, és félacetál vagy félketál jön létre, amely a molekula egyidejű gyűrűvé záródá­ sát is maga után vonja. A glukóz gyűrűs (ciklusos) félacetál szerkezete a heteroaromás piránmolekulára emlékeztet, illetve abból származtathatónak is felfog­ ható; piranóz típusú monoszacharid. Ezzel szemben a D-ribóz ugyanilyen reakció következtében a furánhoz hasonló 5 tagú gyűrűt, ciklusos félacetált alakít ki: furanóz típusú monoszacharid. A D-fruktóz szintén furanóz típusú szerkezetet formál azzal a különbség-

miai reakciók útján melyik glicerinaldehid-konfigurációból származtathatók, illetve melyikké bonthatók le. Ezek alapján D-, illetve L-konfigurációval rendelkező monoszacharidokat különböztetünk meg. Általános szabályként elfogadott, hogy a D-, illetve L-konfiguráció úgy állapítható meg, hogy a karbonil szénatom­ tól legtávolabbi kiralitáscentrum körül a konfiguráció a D- vagy L-glicerinaldehiddel megegyező. A z emberi szervezetben jellemzően D-monoszacharidok vannak. Ha két monoszacharid csak egyetlen kiralitáscentrum körüli konfigurációban tér el egymástól, azokat epi-

7.

145

A SZÉNHIDRÁTOK ANYAGCSERÉJE

gél, hogy a reakció ciklusos félketált eredményez. A ciklusos félacetál, illetve félketál létrejöttének van egy további következménye, nevezetesen az eredeti C=0 csoport szénatomja a reakció után egy újabb kiralitáscentrummá vált, a hozzá kapcsolódó OH-csoport viszont a többi alkoholos OH-csoporthoz képest némileg eltérő tulajdonságokkal rendelkezik. Ezért megkülönböztetésül g l i k o z i d o s O H - c s o p o r t n a k ne­ vezik. A glikozidos OH-csoport térbeli elrendeződése újabb két konfigurációt eredményezhet, ezeket anomereknek nevezzük; ha a glikozidos OH a D-konfigurációt meghatározó C-atomon levő OH-csoporttal azonos térállású, akkor a-anomer (a-D-glukóz és a-D-fruktóz a 7-1. ábrán), ha ellentétes, akkor [3-anomer (erre nem mutat példát a 7-1. ábra). A glikozidos OH-csoport egy másik molekula (pl. monoszacharid, aminosav, egyéb molekulák) alkoho­ los vagy egy másik monoszacharid glikozidos OHcsoportjával acetált, illetve ketált képez kondenzáció útján. Az így kialakult vegyületeket összefoglaló né­ ven glikozidoknak, ún. „ 0 ”-glikozidoknak nevezik. Aminokkal a monoszacharidok glikozidos OH-ja szintén kondenzációval „N”-glikozidokat képez (pl. purin- vagy pirimidinbázisok ribózzal vagy dezoxiribózzal). Az aldehid-, illetve ketocsoport megfelelő redoxpartnerrel reagálva alkoholos OH-csoporttá redukáló­ dik polialkoholt, ún. cukoralkoholt eredményezve (pl. ribóz —» ribitol, glukóz -> glucitol, másik neve szórói­ tól). Ezeknek a vegyületeknek az orvosi gyakorlat szempontjából nagy jelentősége van, ugyanis pl. a szorbitolt (szorbitot) mesterséges édesítőszerként al­ kalmazzák. Ha a glukóz aldehidcsoportja karboxillá oxidáló­ dik, glukonsav keletkezik (anionja a glukonát). A karboxilcsoport - az aldehiddel kapcsolatban leírtakhoz hasonlóan - reagálhat a C5 OH-csoporttal észtert ké­ pezve. Ez a reakció ismét gyűrűzáródáshoz vezet, bel­ ső észtert, ún. laktonszerkezetet hozva létre (pl. glukonolakton, 7-2. ábra). A primer alkoholos OHcsoport oxidációja ún. uronsavakat (anionjaik az uronátok) eredményez (7-3. ábra). Az anyagcsere-folyamatokban a monoszacharidok nagyon jellemző reakciója a foszforsavval alkotott

o

V

cr

I I HO — C — H 1 H — C — OH I H - C — OH I H— C — OH

D-glukonolakton

D-glukonát

7-2. ábra. D-glukonát és D-glukonolakton

COOH

COOH

H

OH

H

p-D-glukuronsav

OH

P -D -g a la k tu ro n s a v

7-3. ábra. Uronsavak

észterképzés. A heteropoliszacharidokban mono­ szacharidok kénsavas észterei is megtalálhatóak. A monoszacharid-származékok közül fontosak az ún. dezoxi-monoszacharidok. Legismertebb képvise­ lőjük a (3-2-dezoxi-D-ribóz (7-4. ábra). A glukóz, illet­ ve galaktóz aminoszármazéka a heteropoliszachari­ dokban fordul elő, amelyekben a hexóz C2 OH-csoportját - NHo szubsztituálja. Ennek további változata az ecetsavval alkotott amid (7-5. ábra). A glikoprotei-

r .H

OH

OH

H

P -2 -d e z o x i-D -rib ó z

7-4. ábra. p-2-dezoxi-D-ribóz

H

NH2

p-D-glukózamin

C=0 N - a c e til-p -D -g lu k ó z a m in

7-5. ábra. Glukózam in és acetilszármazékai

I II.

146

CH,

c= o

HO

I I

H —C —OH H —C —OH

N -a c e til- n e u ra m in s a v (s z iá ls a v )

7-6. ábra. N-acetil-neuraminsav (sziálsav)

nek alkotórésze az N-acetil-neuraminsav (sziálsav, 7-6. ábra). Táplálkozási szempontból fontos diszacharidok. A diszacharidok redukáló tulajdonságuk alapján két fő csoportra oszthatók: redukáló és nem redukáló diszacharidok. Táplálkozási szempontból három diszacharid a legfontosabb: a szacharóz (nádcukor), a maltóz és a laktóz (tejcukor). A maltóz és a laktóz re­ dukáló diszacharid, ugyanis az egyik monoszacharid glikozidos OH-csoportja „szabad”, nem vesz részt a

0-a-D-glukopiranozil-(1,4)-a-D-glukopiranóz [Glc(ADP

ffruktóz-1 ,6-biszfoszfát

( fruktóz-1-foszfát (aldoláz-B

JL

r

f f dihidroxi-aceton-foszfát

íü icerinaldehid ATP

(dihidroxi-aceton-foszfát

f trióz-klnáz

ADP (glicerinaldehid-3-foszfát

JM .

aldoláz-A- izom aldoláz-B - máj

(glicerinaldehid-3-foszfát

'ki ["piruvát]

1 ("acetil-CoA

--->

zsírsav

oxidáció 7-34. ábra. A fruktóz metabolizmusa a májban. Az aldoláz-A a legtöbb szövetben megtalálható, legnagyobb mennyiségben az izomban expresszálódik. Expressziója lecsökken felnőtt szervezetben a májban, a vesében és a bélhámsejtekben

alakulás is lassú, mert a hexokináz glukóz iránti affini­ tása jóval nagyobb, és a glukóz-6-foszfát negatív feedback kontrollja alatt áll. Fruktózból fruktóz-6foszfát számottevő mennyiségben csak adipocytákban keletkezik. A fruktokinázt nem gátolja a reakcióban keletkező fruktóz-1-foszfát, vagyis a sejtekbe került fruktóz kontroll nélkül foszforilálódik. Ennek fiziológiás kö­ rülmények között az a következménye, hogy a máj sej­ tek fruktózfelvétele és a fruktóz-1-foszfát keletkezése nem korlátozott. Ezért a fruktóz metabolizmusának sebessége a glikolízisben gyakorlatilag csak a fruktóz mennyiségétől függ, mivel kikerüli a glikolízis sebes­ ségmeghatározó lépését katalizáló, szabályozó enzi­ met, a foszfofruktokináz-l-et. A fruktóz így gyorsan metabolizálódik, és a keletkező acetil-CoA a májban könnyen zsírsavvá alakul. A különböző aldoláz izoenzimek közül (aldoláz-A, -B, -C) az aldoláz-B enzim az, amelynek fruktóz-1foszfát is a szubsztrátja, de az aldoláz-B-nek is na­ gyobb az affinitása a fruktóz-1,6-biszfoszfát iránt, en­ nek következtében a fruktóz-1-foszfát metabolizmusa lassú. Aldoláz-B a májban, a vese proximális tubulusokban és a bélhámsejtekben fordul elő, ahol a fruktóz a 7-34. ábrán bemutatott módon alakul át.

Klinikai vonatkozások Ha a fruktóz továbbalakulása enzimdefektus miatt akadályozott, a fruktóz-1-foszfát-felszaporodás sú­ lyos következményekkel jár. Ez történik herediter fruktózintolerancia esetén, amikor elégtelen az aldo­ láz-B működése. Ilyenkor lecsökken a májsejtekben az anorganikus foszfát mennyisége, mert a foszfát a továbbalakulni nem tudó fruktóz-1-foszfát „csapdájá­ ban” marad. Foszfát hiányában csökken a terminális oxidációban az ATP keletkezése, aminek súlyos sejt­ károsító hatása van, ha olyan fokú, hogy a Na+K+-ATPáz nem tud a működésének eleget tenni. (Az enzimről lásd az 5. fejezetet.) Részben az anorga­ nikus foszfát hiánya miatt következik be a fruktóz­ intolerancia egyik legsúlyosabb akut tünete is, a hypoglykaemia, ami fruktózfogyasztás után lép fel. A hypoglykaemia oka az, hogy nem tud glikogénből glukóz-1-foszfát keletkezni, s így kiesik egy, a vércukorszint fenntartásához elengedhetetlen akut szabá­ lyozás. Csökken ugyanakkor a szabályozás másik le­ hetősége, a glukoneogenezis is, elsődlegesen az ATP-szint csökkenése miatt. További tényező a vércukorszint csökkenésben a fruktóz-1-foszfát gluko-

I II.

1 72

kinázt aktiváló hatása. Mivel a tej savfelhasználás a májban a glukoneogenezis folyamatában csökken, tej­ savas acidosis alakul ki. A fruktózfogyasztást követő rosszullét (émelygés, gyengeségérzet, verejtékezés, szédülés) miatt alakul ki a fruktózintoleranciában szenvedő egyénekben a fruktóztartalmú ételek fo­ gyasztásával szembeni averzió. Nagy mennyiségű fruktóz hasonló problémákat okoz­ hat enzimdefektus nélkül is, mert az aldoláz-B fruk­ tóz- 1-foszfát iránti kisebb affinitása miatt, a működé­ se lassúbb, mint a fruktokinázé, és a korlátozás nélküli fruktózfoszforiláció az ATP-szint csökkenését okoz­ za. Ezért kell elvetni a fruktóz adását parenterális táp­ lálásban, noha sok szempontból a glukóznál kedve­ zőbb lenne (felvétele a sejtekbe nem függ az inzulin­ tól). A fruktózhoz hasonlóan, májsejtkárosító hatású a szorbitol glukóz helyett történő parenterális alkalma­ zása is. Előfordul, de jóindulatú állapot az esszenciális fructosuria, amelyben elégtelen a fruktokináz működése. Fruktózfogyasztást követően ilyenkor a vérben meg­ nő a fruktózkoncentráció, és a fruktóz megjelenik a vi­ zeletben is.

Klinikai vonatkozások A szorbitol keletkezését katalizáló aldóz-reduktáz nem specifikus enzim, és a szervezetben máshol is megtalálható. Magas vérglukóz-koncentrációnál a szemlencsében is keletkezik szorbitol, ami összefüg­ gésben lehet a diabetesre jellemző cataracta (szür­ kehályog) kialakulásával. A szorbitol felszaporodása a perifériás idegekben és izomzatban pedig valószínű­ leg hozzájárul a diabeteses neuropathia kialakulásá­ hoz.

A galaktóz szintén fontos tápanyag, különösen a születés után, amikor a tej meghatározó táplálék. A tejcukorból (laktóz) az emésztés során keletkező galaktóz a májban metabolizálódik. Az átalakulásban a glukózmetabolizmus intermedierjei keletkeznek, te­ hát csakúgy, mint a fruktóz, a galaktóz is a glukóz­ metabolizmus valamelyik útvonalába csatlakozik (7-36. ábra). A galaktózt a galaktokináz foszforilálja, és a reak­ cióban galaktóz-1-foszfát keletkezik. A következő lé­ pést a galaktóz-1-foszfát-uridil-transzferáz katalizál­ ja, amelynek eredményeképpen UDP-galaktóz és glukóz-1-foszfát képződik. Ennek a reakciónak az a jelentősége, hogy az epimeráznak, amely a C4-en a hidroxilcsoport térállását megváltoztatja (galaktóz glukóz), az UDP-galaktóz a szubsztrátja (7-37. ábra). A keletkező UDP-glukóz továbbalakulását a metabolizmus egyéb tényezői határozzák meg.

Fruktóz keletkezhet is az emberi szervezetben glu­ kózból, szorbitolon keresztül (7-35. ábra). A fruktóz a spermiumok legfőbb energiaforrása, amihez a fruktóz a vesicula seminalisban keletkezik és innen szekretálódik. A spermiumokban a fruktóz a glikolízis és a citrátkör folyamataiban CCb-dá és FEO-zé oxidálódik, a keletkező energia pedig a spermiumok mozgását fe­ dezi.

c h 9oh

H—C —OH

1

HO—C —H | H—C —OH

1 NADPH + H+ NADP+ H—C —OH 1 ^ HO —C —H

>

f aldóz-reduktáz

H—C —OH

H—C —OH

c h 2oh

c h 2oh

glukóz

c h 2oh

NAD+

V

NADH + H+

^

|

H—C —OH

szorbitol

7-35. ábra. Fruktóz keletkezése szorbitolon keresztül

AZ ANYAGCSERE

szorbitoldehidrogenáz

>

0= 0 1 HO —C —H |

H—C — OH H—C —OH c h 2oh

fruktóz

1 73

7. A S Z É N H I D R Á T O K A N Y A G C S E R É J E

Klinikai vonatkozások Nem metabolizálódik a galaktóz akkor, ha elégtelen az UDP-galaktóz szintéziséhez szükséges galaktóz1-foszfát-uridil-transzferáz működése, mert a folya­ mat a galaktóz-1-foszfátnál megáll. Ez az állapot a galactosaemia, amelyre jellemző a tejfogyasztás után fellépő hányás, hasmenés, a máj megnagyobbodása, sárgaság és mentális retardáció kialakulása. A galac­ tosaemia galactosuriával jár. A tejet és tejtermékeket az ilyen egyének étrendjéből ki kell hagyni, s így vala­ mennyi klinikai tünet visszafejlődik, a mentális retar­ dációt kivéve. Ezért nagyon fontos a betegség korai felismerése. Galactosaemiában a galaktóz az aldóz-

reduktáz hatására redukálódik és galaktitol képződik (7-38. ábra). A galakitol képződése a szemlencsében cataracta kialakulásához vezet.

I I

H—C -O H HO

C- -H

HO—C —H

I I

H—C —OH 7-38. ábra. Galaktitol

A galaktóz nem esszenciális tápanyag. Tekintettel arra, hogy az epimeráz által katalizált reakció reverzi­ bilis, a glikoproteinek, a glikolipidek, illetve szoptatás alatt a tejcukor szintéziséhez szükséges galaktóz glukóz­ ból szintetizálódhat. [galaktóz A laktózszintézis az em­ s ATP lőmirigyben történik a lak­ ( galaktokináz tóz-szintáz hatására. Az en­ S * ADP Vt zim katalitikus alegysége, a (galaktóz-1 -foszfát galaktozil-transzferáz, mely­ [ UDP-glukóz nek szubsztrátspecificitását galaktóz-1-foszfát-uridil-transzferáz az határozza meg, hogy jelen van-e egy másik alegység is, |'glukóz-1-foszfát f laktóz-szintáz laktó az a-laktalbumin. Ennek hiá­ -> f laktóz | + f UDP | f UDP-galaktóz +f glukóz + a-laktalbumin nyában a laktóz-szintáz a íglukóz-6-foszfát galaktózt N-acetil-glukózepimeraz aminhoz köti, aminek szá­ fglikolízis| { glukóz| fUDP-glukóz| — - > fglikogénszintézis mos szövetben a glikoprotei­ (máj) nek szintézisében van jelen­ tősége: 7-36. ábra. A galaktóz metabolizmusa

Y

[epimeráz

UDP-galaktóz 7-37. ábra. UDP-galaktóz - UDP-glukóz átalakulás

UDP-glukóz

1 74

III.

UDP-galaktóz + N-acetil-glukózamin —> galaktóz-N-acetil-glukózamin (1-4) + UDP a-laktalbumin módosítja a katalitikus alegység specificitását úgy, hogy jelenlétében az UDP-galaktóz a glukózhoz kapcsolódik, és tejcukor keletkezik (7-36. ábra). Az a-laktalbumin szintézise hormonális szabá­ lyozás alatt áll, és prolaktin hatására a szülést követő­ en csak az emlőmirigyben keletkezik. Ezért laktóz csak itt szintetizálódik.

7 .8

A G LIK O G ÉN S Z IN T ÉZ ISE ÉS LE B O N T Á S A

A glikogén olyan tápanyagraktár, amelyből a glu­ kóz gyorsan mobilizálható és amelybe gyorsan beépít­ hető. A sejtek egy része képes a glukóz raktározására glikogén formájában, de a két legfontosabb glikogén­ raktár a májban és a vázizomban található. A gliko­ génben történő raktározás előnye, hogy igény esetén gyorsan mobilizálható a benne tárolt glukóz (glukóz-1-foszfát). Hátránya, hogy nagyobb a raktáro­ zás helyszükséglete annál, mint amikor a glukózból zsírsavak képződnek, amelyekből azonban glukóz nem nyerhető. A gyors felépítés és mobilizálás lehető­ ségét a glikogén szerkezete biztosítja: a lineáris, a -1,4-kötésekkel felépült glukózláncokon, 8-10 glukózegységenként, a-l,6-kötésekkel induló elága­ zások vannak (7-9. ábra), ami nagyszámú olyan lánc­ véget (nem redukáló vég) eredményez, ahol a lebontó és a felépítő enzimek a molekulához hozzáférnek. A glikogén, a lánc legelején lévő egyetlen szabad

f glukóz

vi íglukóz-6-foszfát

I

glikolízis ]

'Y

(piruvát

7-39. ábra. A glikogén szintézisének és lebontásának sémája

AZ ANYAGCSERE

anomer szénatomjával a glikogenin nevű fehérjéhez kapcsolódik, szabad redukáló vége tehát nincs. A glikogenin, túl azon, hogy a glikogénpartikulum központi magjának tekinthető, katalitikus aktivitással is rendelkezik, amelynek a glikogénszintézisben van jelentősége (lásd alább). A legsúlyosabb éhezésben is, legalább négy glukózegység kötve marad a glikogeninen. A sejt glikogéntartalma az éhezés-táplálékfelvétel függvényében változik, de a glikogenintartalom meghatározza a sejt elérhető legmagasabb glikogén­ tartalmát. A glikogén nagy molekulatömegü polimer (~10 -10 Da), a citoszolban mikroszkóppal jól felis­ merhető, ún. glikogénpartikulumokban raktározódik, amelyben a glikogént lebontó és szintetizáló, valamint az ezeket reguláló enzimek is jelen vannak. A májban és az izomban található glikogénraktár szerepe külön­ böző; a májban a glikogénből mobilizálható glukóz a keringésbe kerül, és a vércukorszint fenntartását szol­ gálja, míg izomban a glukóz a sejten belül felhaszná­ lódik. A glikogénszintézis és -lebontás vázlatát a 7-39. ábra mutatja.

Glikogénszintézis A glikogén szintézisében a molekulába beépülő glukóz forrása az UDP-glukóz (képletét lásd a 7-31. ábrán), ami a glukóz „aktivált” formájának tekinthető. Ennek keletkezéséhez először glukóz-1-foszfátnak kell keletkezni, ami glukóz-6-foszfátból történik, re­ verzibilis reakcióban, a foszfoglukomutáz enzim ha­ tására (7-40. ábra). Az enzim aktív centruma foszforilált szerint tartalmaz, amely reverzibilisen elveszti

1 75

7. A S Z É N H I D R Á T O K A N Y A G C S E R É J E

glukóz-6-foszfát

glukóz-1,6-biszfoszfát

glukóz-1-foszfát

7-40. ábra. Glukóz-6 -foszfát > glukóz-1-foszfát átalakulás a foszfoglukomutáz által katalizált reakcióban

foszfátcsoportját, amikor a glukóz-6-foszfátból glu­ kóz-1,6-biszfoszfát képződik. A foszfoenzim regene­ rálódik, amikor a glukóz-1,6-biszfoszfátról (a 6. Catomról) a foszfát visszakerül az enzimre, és kialakul a glukóz-1-foszfát. A keletkezett glukóz-1-foszfát rea­ gál az UTP-vel, és kialakul az UDP-glukóz, amely nemcsak a glikogénszintézis, hanem több más bio­ szintetikus útnak is prekurzora.

glukóz-1-foszfát + UTP -» UDP-glukóz + PP; (—>Pi + Pi) A reakció kondenzáció, az UDP-glukóz-pirofoszforiláz enzim katalizálja, miközben pirofoszfát szabadul fel. A pirofoszfát az anorganikus pirofoszfatáz által katalizált reakcióban anorganikus fosz­ fátokra hasad, így az UDP-glukóz képződése irrever-

glikogén (glukóz)n+1

7-41. ábra. A glikogén-szintáz által katalizált reakció

III.

1 76

zibilis (AG'° = -25 kJ/mol), és két nagy energiájú kö­ tés hidrolízisével jár. A glikogén-szintáz által katalizált reakcióban az UDP-glukózról a glikogén láncvégi glukózához (nem redukáló vég) egy újabb glukóz kapcsolódik (7-41. ábra). A glikogén-szintáz a lánc szintézisét nem tudja elkezdeni, működéséhez egy, már legalább nyolc glu­ kózt tartalmazó lánc szükséges. Ezt a kezdeti láncot a glikogenin építi fel, amelynek egy Tyr-OH csoportjá­ hoz kötődik be az első glukóz, UDP-glukózról. Mind ezt a lépést, mind a további néhány glukózbeépülést UDP-glukózról a glikogenin katalizálja. Amikor kész a ~ 8 glukózból álló lánc, akkor veszi át a lánc tovább­ építését a glikogén-szintáz. A glikogenin mindvégig kötve marad a glikogén egyetlen redukáló végéhez. A glikogén-szintáz mellett a glikogén szintézisé­ ben igen jelentős az elágazásokat kialakító amilo-(l—»4)-(l-»6)-transzglikoziláz vagy glikozil(4—>6)-transzferáz („branching” enzim) működése (7-42. ábra). Ha egy, legalább 11 glukózból álló lánc elkészül, az enzim egy kb. 7 glukóz által alkotott lánc­ részt áthelyez, és a-l,6-kötéssel kapcsolja a poli-

nem redukáló

nem redukáló vég

AZ ANYAG CSERE

glukózlánchoz. Ez megnöveli a nem redukáló láncvé­ gek számát, ahol a glikogén-szintáz folytathatja a lánc továbbépítését.

Glikogénlebontás A glikogén lebontása során az a-l,4-kötéseket a glikogén-foszforiláz enzim hasítja. A reakcióhoz anorganikus foszfátra van szükség, a lehasadó glukóz foszforilálódik, és glukóz-1-foszfátként szabadul fel (7-43. ábra). A reakció foszforolízis, ami energetikai­ lag igen kedvező. így a glikogén-foszforiláz által kata­ lizált reakció különbözik a glikogén hidrolitikus bon­ tásától, amelyet az amiláz katalizál, és a szénhidrátok emésztésében van szerepe. A glikogén-foszforiláz működéséhez piridoxál-foszfát szükséges. Az elágazásokat külön enzim, a bifűnkcionális el­ ágazást bontó enzim, angol neve „debranching” en­ zim [oligo-(a—>6)-(a—»4)-glukán-transzferáz] bontja, ami akkor jut szerephez, amikor a lebontás bizonyos közelségbe jutott az elágazáshoz (kb. 4 glukóz­

7-42. ábra. Elágazások képződése a gliko-

1 77

7. A S Z É N H I D R Á T O K A N Y A G C S E R É J E

7-43. ábra. A glikogénlánc rövidülése a nem redukáló végen a glikogén-foszforiláz hatására

egység). Ekkor az enzim egy 3 glukózból álló láncot áthelyez egy másik nem redukáló végre, majd hidrolizálja az a-l,6-kötést (ez nem foszforolízis!), s

innen szabad glukózt szabadít fel (7-44. ábra). A glikogén-foszforiláz pedig folytatja az a-l,4-kötések anorganikus foszfáttal történő hasítását. így - az

1 78

elágazások hasítása következtében - 7-8 glukóz-1foszfát-molekulánként egy glukóz is keletkezik. A képződött glukóz-1-foszfát glukóz-6-foszfáttá alakulva (7-40. ábra) csatlakozik a glukózmetabolizmusba; vagy a glikolízisben alakul tovább (izom), vagy a glukóz-6-foszfatáz hatására glukózzá alakul (máj), és a keringésbejut.

A glikogén-anyagcsere szabályozása Az izom- és máj glikogén funkciója az anyagcseré­ ben különbözik egymástól, s ez kifejeződik a glikogénmetabolizmus eltérő szabályozásában. A glikogénmetabolizmus regulációja a májban azt a célt szol­ gálja, hogy csökkenő vércukorszint esetén a glikogén­ ből glukóz kerüljön a keringésbe, vércukorszint-emelkedés esetén pedig glukóz épüljön be a glikogénrak­ tárba. Izomban a glikogénmobilizálás a saját energiaigény kielégítését szolgálja. Vannak azonban a szabá­ lyozásnak alapvető, közös jellemzői. A glikogénanyagcsere szabályozása két enzim, a glikogén-szintáz és glikogén-foszforiláz szabályozá­ sán keresztül valósul meg. A szabályozásban döntő szerepet játszik a két enzim foszforilációja/defoszforilációja, de a kovalens módosításon kívül allosztérikus szabályozások is fontos szerephez jutnak. A foszforilációval történő szabályozás reciprok, va­ gyis a glikogén-foszforiláz gátlása párhuzamos a glikogén-szintáz stimulációjával és fordítva, a gliko­ gén-foszforiláz stimulációját a glikogén-szintáz gátlá­ sa kíséri. Ennek az az alapja, hogy foszforilált állapot­ ban a glikogén-foszforiláz aktív, míg a glikogén-szin­ táz inaktív, defoszforiláció pedig a glikogén-foszforilázt inaktiválja, a glikogén-szintázt aktiválja. A foszforiláció és a defoszforiláció a májban és az izomban is hormonális kontroll alatt áll. A glikogén-foszforiláz két azonos alegységből fel­ épülő dimer, amelyek mindegyikén van egy aktív centrum, egy allosztérikus kötőhely, és egy olyan szerin-OH-csoport, ahol az enzim foszforilálódhat. Az enzim nyugalmi állapotban zömmel foszforilálatlan, és kevésbe aktív (glikogén-foszforiláz-ó). Foszforilációra akkor kerül sor, amikor a csökkent vércukor­ szint következtében glukagonelválasztás történik, és a

I I I . AZ ANYAGCSERE

glukagon hat a máj sejteken lévő receptorain. A recep­ torstimulációt követő intracelluláris folyamatokat a 17. fejezetben ismertetjük, itt csak annyit hangsúlyo­ zunk, hogy megnő a sejtekben a ciklikus AMP szintje, ami aktiválja a cAMP-dependens protein-kinázt, más­ néven protein-kináz A-t (PKA), ami számos fehérjét foszforilál ATP felhasználás mellett. A PKA közvet­ lenül nem foszforilálja a glikogén-foszforilázt, hanem egy másik protein-kinázt, a glikogén-foszforiláz-kinázt, amit ezáltal aktivál. A glikogén-foszforiláz-kináz, amint a neve is kifejezi, a glikogén-foszforilázt (foszforiláz-ó) foszforilálja, a dimer mindkét megha­ tározott szerin-OH-csoportján, s ennek következtében aktiválja (az aktív enzimet glikogén-foszforiláz-a-nak szoktuk jelölni). A glikogén-foszforiláz-a és a foszforiláz-kináz defoszforilációval kerül a kevésbé aktív b állapotba, ezt a folyamatot a foszfoprotein-foszfatáz-1 (PP1) enzim katalizálja. Amikor a PKA aktív, nem történik defoszforiláció, mert egy fehérje (foszfoprotein-foszfatáz-inhibitor) kötődik a PP 1-hez, és gátolja azt. A PP 1-inhibitor is aktiválódik a PKA által történő foszforiláció következtében. A folyamatot a 7-45. ábrán mutatjuk be. A glikogén-foszforiláz-kináz 4 különböző alegy­ ségből álló enzim, s mindegyikből négy van jelen az enzimben (a, p, y, 8)4. Az a- és a P-alegység tartalmaz­ za azokat a Ser-oldalláncokat, amelyek a PKA hatáséra foszforilálódnak. A 5-alegység 4 Ca kötőhellyel rendelkezik és megfelel a kalmodulinnak (erről a fehérjéről az 5. és 17. fejezetben szólunk). A Ca" -kötés hatására aktiválódik a y-katalitikus alegység, defoszforilált enzim esetében is. A foszforilált enzim is csak Ca" jelenlétében működik teljes aktivitással. Ennek, az izomkomtrakcióval összefüggő intracelluláris Ca2+-szint-emelkedés miatt elsősorban az izomban van jelentősége, ahol a kalciumot a foszforiláz-ú-kináz allosztérikus aktivátorának tekinti. A glikogén-foszforiláz-a a májban allosztérikusan is szabályozódik; az effektor molekula itt a glu­ kóz. Emelkedett vérglukóz-koncentráció esetén, a glukóz bekerülve a hepatocitába a foszforiláz-a-hoz kötődik. A foszforiláz-ű közelében jelen van a PP1 is, de nem fér hozzá a foszfátcsoportokhoz, csak akkor, amikor a glukózkötődés konformációs változást okoz. Ennek következtében a foszforiláz-a szubsztrátja lesz

1 79

7. A S Z É N H I D R Á T O K A N Y A G C S E R É J E

glukagon

glukagon adrenalin

7-45. ábra. A glikogén-foszforiláz aktiválása és a glikogén-szintáz gátlása májsejtekben a glukagon/adrenalin által kiváltott foszforilációs kaszkád következtében. PKA, protein-kináz A; PP1, foszfoprotein-foszfatáz-1

a PP 1-nek, és a foszforilált Ser defoszforilálódik, a foszforiláz-a foszforiláz-ó-vé alakul, és a glikogénle­ bontás abbamarad. A máj glikogén-foszforiláz-a-t ezért glukózszenzor molekulának tekintik, ami a máj glikogénmetabolizmusát a vércukorszintnek megfele­ lően alakítja (7-46. ábra). A májban a glikogénlebontás primer hormonális szabályozója a glukagon, a cAMP-mediált jelátviteli útvonal közreműködésével. Szerepe van még az adre­ nalinnak is, amelynek itt jelen levő egyik receptora, a P-receptor úgyszintén a cAMP-jelátviteli útvonalon keresztül, a glukagonnal megegyező módon aktiválja a glikogén-foszforilázt. Az adrenalin stimulálja a hepatociták membránjában előforduló aj-adrenerg re-

L

9lukóz

glukóz-6foszfát

P gátolt glikogénmobilizálás

( stimulált glikogénszintézis

7-46. ábra. A glikogén-foszforiláz glukózszenzor szerepe a májban és a glikogén-szintáz glukóz- 6 -foszfát-szenzor funkciója

180

ceptorokat is, amelyek jelátvitelében az intracelluláris Ca2 -szint emelkedése a meghatározó. Ezekről a jelát­ viteli útvonalakról a 17. fejezetben szólunk részlete­ sen. Az adrenalin hatását a i-receptorokon keresztül a Ca_+ közvetíti a glikogén-foszforiláz-kináz 8-alegységéhez kötődve, amit aktivál, s így megtörténik a glikogén-foszforiláz-ó foszforilációja és aktiválása. A glikogén-szintáz szabályozása összetettebb, és még nem is minden részletében ismert. A szabályozás alapja itt is a foszforiláció, amely az enzimet inak­ tiválja (az enzim jele ilyenkor glikogén-szintáz-ó vagy glikogén-szintáz-D; D itt arra utal, hogy foszforilált állapotban az enzim aktivitása függ - dependent - az allosztérikus szabályozástól, lásd alább), és a defoszforiláció, ami aktiváló hatású (glikogén-szintáz-ű vagy glikogén-szintáz-/; independent). A glikogénszintázon legalább kilenc foszforilálható Ser található, s a foszforilációt több enzim végezheti (PKA, glikogén-foszforiláz-kináz, kazein-kináz, Ca2 -kalmodulin-dependens protein-kináz, protein-kináz C, glikogén-szintáz-kináz-3), eltérő foszforilációs helyeken, amelyeknek eredménye is eltérő mértékű csökkenés az enzimaktivitásban. Általánosságban azt lehet meg­ állapítani, hogy egyes foszforilációk elősegítik a más helyeken történő foszforilációkat. A kinázok közül a legjelentősebb reguláló enzim a glikogén-szintázkináz-3 (lásd alább). A glukóz-6-foszfát allosztérikus kötőhelyen kötődik a foszforilált glikogén-szintázhoz, és aktiválja, mert a létrejövő konformációváltozás a foszfátcsoportokat hozzáférhetővé teszi a foszfatáz számára. A foszforilálatlan glikogén-szintáz a glukóz-6-foszfátot nem köti. A mechanizmus hasonló ah­ hoz, ahogy a glukóz gátolja a glikogén-foszforilázt; ennek analógiájaként a glikogén-szintázt glukóz-6foszfát szenzornak lehet tekinteni (7-46. ábra). Az en­ zim defoszforilációját a PP1 végzi. Az enzim foszfo­ rilációja és inaktiválása a májban a glukagon és az adrenerg stimuláció következtében jön létre (7-45. áb­ ra), mert a PKA és az aktív glikogén-foszforiláz-kináz is foszforilálja a glikogén-szintázt, továbbá a cAMP jelpálya a PP1-inhibitor aktiválásán keresztül a defoszforilációt is gátolja. Az adrenalin ezen hatását ki­ egészíti az a i-receptor-stimuláció következtében lét­ rejövő hatása is, ami a Ca2+-szint-emelkedés követ­

II I .

AZANYAGCSERE

keztében stimulálja a glikogén-foszforiláz-kinázt. A glikogénmobilizálást serkentő hormonális szabá­ lyozások tehát a májban egyidejűleg a glikogénszinté­ zist gátolják. A glikogénszintézis elsődleges hormonális stimulálója az inzulin. Hatásában a g l i k o g é n - s z i n t á z k i n á z - 3 regulációja az egyik döntő tényező. A glikogén-szintáz-kináz által létrehozott foszforiláció (a glikogén-szintáz három Ser-OH-csoporton) a gliko­ génszintézis egyik legerőteljesebb gátlását jelenti. Ez a gátlás szűnik meg inzulin jelenlétében. (A glikogén-szintáz-kináz csak akkor tudja foszforilálni a glikogén-szintázt, ha előzőleg a kazein-kináz már foszforilálta). Az inzulinreceptor-stimuláció egy összetett foszforilációs kaszádot indít el (lásd 17. feje­ zet), ami aktiválja a protein-kináz B-t, s ennek egyik szubsztrátja a glikogén-szintáz-kináz, ami a fosz­ foriláció következtében inaktiválódik (7-47. ábra). Az inzulin ugyanakkor a PPl-et is stimulálja, tovább erő­ sítve a glikogén-szintáz stimulációját, a glikogénfoszforiláz-kináz és a glikogén-foszforiláz gátlását. (A PP1-gátlás komplex mechanizmus; lényege az, hogy inzulin jelenlétében a PPl-et egy targetáló fehér­ je tartja a glikogén és azoknak a fehérjéknek glikogén-foszforiláz-kináz, a glikogén-foszforiláz és a glikogén-szintáz - a közelében, amelyeket defoszforilál. Amikor a targetáló fehérje a glukagon vagy ad­ renalin jelpálya stimulációja következtében a PKA ál­ tal foszforilálódik, akkor a PP1 disszociál a komplex­ ről és megszűnik az enzimek defoszforilációja.) Az in­ zulinnak ez a hatása mind a májban, mind a harántcsí­ kolt izomban érvényesül. (Megjegyzendő, hogy a glikogén-szintáz-kináz-3-nak a glikogén-szintázon kívül egyéb szubsztrátjai is vannak, amelynek révén részt vesz az embrionális fejlődés, az mRNS és a fe­ hérjeszintézis regulációiban is.) I z o m b a n a glikogénmetabolizmus több részleté­ ben különbözik a májban megismert folyamattól, mert a glikogénlebontásban keletkező glukóz-1-foszfát a glukóz-6-foszfáttá történő átalakulás után nem ered­ ményez glukózkeletkezést, lévén hiányzik a glukóz6-foszfatáz enzim. Az izomműködés specifikumainak megfelelően a glikogénanyagcsere regulációja is né­ hány fontos ponton specifikus.

7.

1 81

A SZÉNHIDRÁTOK ANYAGCSERÉJE

adrenalin

7-48. ábra. A glikogénlebontás re­ gulációja a harántcsíkolt izomban

(Vreceptor

hormonális

(adrenalin)

stimulusra

és a kontrakcióval összefüggő allosztérikus hatásokra. Az allosztérikus

stimulációkat (Ca2+ és AMP) piros szag­ gatott vonalak jelzik

("kontrakció

1 (glukóz-1-foszfát

[A T P ]^ [A M P ]f

( glukóz-6-foszfát ("glikolízis

182

1. Az izomban nincs glukagonreceptor, az izom ezért sem játszik szabályozó szerepet vércukorszint csökkenése esetén. 2. Izomban a P-adrenerg receptorok stimulációja a meghatározó, ahol az adrenalin kötődik, és a cAMP jelpálya stimulációján keresztül a fent leírt módon foszforilációval aktiválja a glikogénfoszforiláz-kinázt, ezen keresztül aktiválja a glikogén-foszforilázt és gátolja a glikogén-szintázt. Az adrenalin a „flight or fight” („menekülj vagy har­ colj”) reakció részeként így növeli a fokozott izom­ működés energetikai fedezetét (7-48. ábra). 3. Fontos szerepet játszik az inzulin a vércukorszint-emelkedés bekövetkeztekor a glukóz gliko­ génbe történő beépülésében. 4. A glikogén-foszforiláz izomban található izoformája (ami nem azonos a májban található enzim­ mel) nem tartalmaz a glukóz számára allosztérikus kötőhelyet, tehát a glikogén-foszforiláz az izom­ ban nem glukózszenzor. 5. Az izomban jelen lévő glikogén-foszforiláz izoforma olyan allosztérikus kötőhellyel rendelkezik, ahol az AMP kötődik, és az enzimet aktiválja, defoszforilált állapotban is. Izommunkában, ami­ kor csökken a sejtekben az ATP-szint, és emelke­ dik az AMP-szint (nagyobb mértékben, mint ahogy az ATP-szint csökken, lásd adenilát-kináz reak­ ció), az AMP aktiválja a glikogén-foszforilázt, így is hozzájárulva az izommunka energiaigényét szol­ gáló glukózlebontáshoz. (Az AMP allosztérikusan stimulálja a foszfofruktokináz-1-et is.) Az AMP hatása ms-on belül létrejön, gyorsabb, mint a fosz­ forilációval történő szabályozás, ami másodperc­ ben belül megy végbe. Amikor az izom nyugalmi helyzetbe kerül, és helyreáll a megfelelő ATP-koncentráció, az ATP ugyanahhoz az allosztérikus helyhez kötődve felfüggeszti az AMP stimuláló hatását. Ennek a regulációnak a jelentőségét az ad­ ja, hogy erőteljes izommunka kezdeti, anaerob fá­ zisában, amikor lecsökken az ATP-szint, és megnő a glukózigény, az AMP közvetlenül tudja stimulál­ ni a glikogénlebontást. 6. A glikogénanyagcsere regulációjában fontos szere­ pet játszik a Ca2 glikogén-foszforiláz-kinázt sti­ muláló hatása. A motoros ideg stimulációja acetil-

II I .

AZANYAGCSERE

kolin felszabadulást vált ki a neuromuszkuláris junkcióban, az izomban az acetilkolin nikotinre­ ceptorának stimulációja depolarizációt okoz, és Ca" -felszabadulást vált ki a szarkoplazmás retikulumból. A Ca2+ az izomkontrakció közvetlen ki­ váltója, ugyanakkor kötődik a glikogén-foszforiláz-kináz 8-alegységét alkotó kalmodulinhoz, és aktiválja az enzimet. A glikogénanyagcserében, különösképpen a gliko­ génmobilizálásban szerepet játszó foszforilációs kaszkád, együtt a cAMP jelátviteli útvonalban a PKA akti­ válásához vezető többlépéses folyamattal, azzal a kö­ vetkezménnyel jár, hogy a hormonstimuláció hatása a sejten belül felerősödik. Ennek hangsúlyozására a 17. fejezetben visszatérünk.

K lin ik a i v o n a tk o z á so k Glikogéntárolási betegségek. A glikogén-anyagcse­ re öröklődő rendellenességei a „glycogenosisok”, a glikogéntárolási betegségek. Ezeknek a nem túl gya­ kori betegségeknek a segítségével igen jól értelmez­ hetők és érthetők a glikogénmetabolizmus összefüg­ gései és szervspecifikus tulajdonságai. Tizenegy kü­ lönböző típusú glycogenosist (Type I - Type XI) írtak le, amelyek a glikogén-anyagcsere különböző enzi­ meinek defektusai. Közülük csak a legismertebb és legfontosabb betegségeket említjük. A von Gierke-kór (Type Ib) esetében egy nem glikogénmetabolizmusban részt vevő enzim, a glukóz-6-foszfatáz expressziója igen alacsony a májban, a vesében és a vékonybélben. A von Gierke-kór volt nemcsak az első leírt glikogéntárolási betegség, ha­ nem az első megismert öröklődő máj enzimdefektus is. A betegségen belül megkülönböztetik a glukóz-6foszfát-transzporter csökkent expressziója miatt ki­ alakuló formát. A glukóz-6-foszfatáz hiánya következtében a gliko­ gén nem tud lebomlani, mivel nincs meg a glukóz­ szekréció lehetősége. Ezért hypoglykaemia alakul ki, étkezések közötti éhségrohamok jellemzik az állapo­ tot. A megnövekedett mennyiségű glukóz-6-foszfát a glikolízisben metabolizálódik, megnő a tejsavkeletke-

7. A S Z É N H I D R Á T O K A N Y A G C S E R É I É

zés (tej savas acidosis) és a zsírok szintézise (hyperlipaemia). A máj glikogénszerkezete normális, de a mennyisége igen nagy, és hepatomegalia jön létre. A McArdle-szindróma (Type V) az izom glikogén-foszforiláz-hiánya miatt alakul ki. Hiába magas az izom glikogéntartalma, az egyébként normálisan fejlett betegekben hirtelen intenzív izommunkát köve­ tően izomgörcsök lépnek fel a lecsökkent ATP-szint következtében. Az Andersen-betegségben (Type IV) a májban az el­ ágazásokat katalizáló enzim (branching enzim) expressziója károsodik. Az így szintetizálódott gliko­ gén kevés elágazást tartalmaz, mennyisége nagy, és funkcióját nem képes ellátni. A betegség általában ha­ lálos kimenetelű.

7.9

A V É R C U K O R S Z IN T SZABÁLYOZÁSA

A vércukorszint normálértéken belül tartása a szer­ vezet számára életfontosságú feladat. A glukózkon­ centráció csökkenése az idegsejtek glukózfüggősége miatt az agyban elégtelen ATP-termelést eredményez, ami súlyos következményekkel jár - szédülés, álmos­ ságérzésként jelentkezik, amit eszméletvesztés követ­ het. A magas vércukorszint pedig akutan, a glukóz oz­ motikus hatása miatt a sejteket dehidrálja, tartós emel­ kedése pedig számos olyan sejtkárosodást okoz, ame­ lyekkel kezeletlen diabetesben lehet találkozni. Bár­ melyik irányban tér el a vércukorszint a normálistól, kompenzáló mechanizmusok lépnek életbe, amelyek az egyes sejtek szintjén és a szervek között is össze­ hangolt szabályozásokat jelentenek a vércukor nor­ málszinten tartása érdekében. Fiziológiás állapotban, a vérben aktuálisan jelen lé­ vő glukóz koncentrációja a táplálékfelvételtől függ. Az éhgyomri glukózkoncentráció a plazmában (éjsza­ kai éhezést követően mért érték) akkor tekinthető nor­ málisnak, ha f ribó ribóz-5-foszfát CCL

2 NADP+ 2 NADPH + H+

l l ukóz-6-foszfát t

— ^

4

—

ribóz-5-foszfát

CO,

ífruktóz-6-foszfát

t ífruktóz-1,6-biszfoszfát

( dihidroxi-aceton-foszfát f"ribóz-5-foszfát

C02

1

ífruktóz-6-foszfát 'f

I

^-U TP \ ft 'f UDP-N-acetil- UDP-N-acetil-glukózamin] galaktózamin

I acetil-mannózamin

I fglikoproteinek

r

I ^-GTP

f N-acetil-glukózamin-6-P

^N-acetil’ ' glukózamin

>' galaktóz-[3-N-acetilglukózamin

I

( mannóz-1-P

íglukózamin-6-P

, — [ UDP-glukóz

AZ ANYAGCSERE

I f N-acetil-mannózamin-6-P

r ~

- “

f N-acetil-neuraminsav-9-P

I [

N-acetil-neuraminsav

>r y

CTP

CMP-N-acetil-neuraminsav 7-61. ábra. Szénhidrátok szintézisének fontosabb útjai. A glikoproteinek, proteoglikánok szénhidrátláncának egyes alkotóit pi­ rossal kiemeltük

195

7. A S Z É N H I D R Á T O K A N Y A G C S E R É J E

Az UDP-xilóz, amely a glikoproteinek szénhidrát­ láncának alkotórésze, dekarboxilezéssel keletkezik UDP-glukuronsavból. A glikoproteinek és proteoglikánok szénhidrátlán­ cában előforduló aminocukrok aminocsoportja glutaminból származik. A különböző aminocukrok a glikoproteinek, glikoszfmgolipidek és glukózaminoglikánok fontos alkotórészei. A legfontosabb amino­ cukrok a hexózaminok - glukózamin, galaktózamin és mannózamin, és a 9 szénatomos sziálsav (N-acetilneuraminsav). A szintézis során az aminocsoportdonor a glutamin. Az aminocukrok zömmel N-acetilált formában fordulnak elő, az acetildonor az acetilCoA. A glikoproteinek szénhidráttartalma 1-85% kö­ zött ingadozhat. A humán glikoproteinek hétféle monoszacharidot tartalmaznak. Közülük a legjelentő­ sebbek az oligoszacharidlánc végén elhelyezkedő N-acetil-neuraminsav, amely rendszerint galaktózhoz vagy N-acetil-galaktózaminhoz kapcsolódik. Ezen kí­ vül a glikoproteinek szénhidrát-oldalláncában glukóz, mannóz, fukóz és N-acetil-glukózamin fordul elő. Az oldalláncok komponensei először „aktiválódnak” és aztán kerülnek rá az oldalláncra. Az egyes „aktivált” nukleotidcukrok képződését a 7-61. ábra mutatja. A szénhidrátoldalláncra egymás után kerülnek rá a komponensek. A különböző glikozil-transzferázok által katalizált glikozilációs lépések a Golgi-hálózat lumenében történnek, az UDP-cukrok antiportrendszereken keresztül transzportálódnak a citoszolból a szekréciós pálya lumenébe. A nukleotidcukor belépéséhez a vonatkozó nukleotid kilépése társul. A szénhidrátoldallánc a polipeptidlánc szerinjéhez, treoninjához vagy hidroxilizinjéhez O-glikozidos kö­ téssel vagy aszparaginhoz N-glikozidos kötéssel kap­ csolódik. Ennek megfelelően O-kötött és N-kötött glikoproteineket különböztetnek meg. Egy fehérjének több mint 30 oligoszacharidlánca lehet, amelyek hosszúsága különböző. A glikoproteinek szénhidrátláncát specifikus glikozidázok bontják. Proteoglikánok azok a fehérjék, amelyek kova­ lensen kötött glukózaminoglikánokat (GAG) tartal­ maznak. Tulajdonságaik inkább a poliszacharidokra

jellemzőek, mint a fehérjékre. Régebben mukopoli-

szacharidoknak nevezték őket. A proteoglikánok 95%-a szénhidrát lehet, amely a következő glukózaminoglikánokból áll: hialuronsav, kondroitin-szulfát, keratán-szulfát-I, -II, heparin, heparán-szulfát, dermatán-szulfát. A GAG nem elágazó poliszaharid, amely ismétlődő diszacharidokból épül fel. Az egyik alkotó aminocukor D-glukózamin vagy D-galaktózamin, a másik komponens uronsav (D-glukuronsav vagy L-iduronsav). A hialuronsav kivételével szulfá­ tot tartalmaznak O-észter vagy szulfát-észter formá­ ban.

A GAG a fehérjéhez szerinen vagy treoninon ke­ resztül O-glikozidos kötéssel kapcsolódik. A szénhid­ rát UDP-cukorról kerül a fehérjére. Ezen kívül a glikoproteinekhez hasonlóan, N-glikozid kötés is ki­ alakulhat az Asn amid-N, illetve a GAG között. A proteoglikánok szintézise az endoplazmás retikulum luminális kompartmentjében történik, illetve a Golgi-hálózatban fejeződik be. A GAG-lánc szintézi­ se után további módosítások történhetnek, például szulfatálás.

Klinikai vonatkozások A GAG lebontása specifikus enzimek segítségével történik általában a lizoszomákban. A lebontást endoglikozidázok, exoglikozidázok, proteázok, deacetilázok és szulfatázok katalizálják. A lebontó enzimek öröklődő hiánya a GAG felhalmozódásához vezet. Számos ilyen kórképet leírtak, ezeket mucopolysaccharidosisoknak, illetve mucolipidosisoknak ne­ vezik. Ezeket a betegségeket proteoglikánok tökélet­ len lebontása során képződő oligoszacharidok felhal­ mozódása jellemzi a szövetekben. A dermatán-, illet­ ve heparán-szulfát lebontását katalizáló hidrolázok hi­ ánya különféle kóros állapotokat eredményez, ame­ lyek súlyos, halálos betegségek lehetnek. Szellemi visszamaradottság és különböző más tünetegyüttesek alakulnak ki. A mucopolysaccharidosis ritka, 30 000 születésből egy ilyen beteg jön a világra.

8

A LIPIDEK A NYAGCSERÉJE

ÁDÁM V E R ONI K A

8 .1

A legfontosabb zsírsavak és jelölésük

8.2

Acil-gliceridek. Trigliceridek és az energiaraktározás

197

8.3

A zsírsavak de novo bioszintézise

8.4

A trigliceridek szintézise és raktározása

199

200 206

8.5

Lipolízis - a raktározott zsírsavak mobilizálása a zsírszövetből

8 .6

A zsírsavak oxidációja

8.7

A ketontestek keletkezése és felhasználása. Ketonaemia, ketonuria 220

8 .8

A koleszterin metabolizmusa

222

8.9

Az epesavak keletkezése, metabolizmusa és jelentősége

8.10

A koleszterin és egyéb lipidek szállítása a keringésben. Lipoproteinek 235

8.11

A zsírok emésztése és felszívódása

230

246

8 .1 2

A foszfolipidek és szfingolipidek felépítése és jelentősége

8.13

A szteroidhormonok metabolizmusa

8.14

A D3-vitamin szintézise

A lipidek olyan eltérő felépítésű és funkciójú mole­ kulák, amelyek közös tulajdonsága, hogy vízben nem vagy csak nagyon rosszul oldódnak, ezért szövetekből csak apoláros oldószerekkel vonhatók ki. Az emberi szervezetben számos fontos feladatot látnak el, ame­ lyek közül a legfontosabbak:

211

212

249

262

274

1. A metabolizmusban játszott szerep; a zsírsavak oxidációja a sejtek számára energiát szolgáltat, il­ letve trigliceridek formájában a zsírok biztosítják az energiaraktározás leggazdaságosabb formáját. 2. A sejtmembrán felépítésében meghatározó szere­ pet játszanak. A membránok alapszerkezete egy

8-1. ábra. A legfontosabb lipidek és funkcióik \t

{ energiaraktározás

v -f struktúraalkotás

\t [ trigliceridek

[foszfolipidek

-----

1t

y

[" glikolipidek

[" koleszterin

f speciális funkció

I szteroidhormonok eikozanoidok vitaminok (A, D, E, K) epesavak

197

8. A U P I D E K A N Y A G C S E R É J E

lipidstruktúra, amely a membránok barrier tulaj­ donságát biztosítja, és megfelelő közeget jelent a fehérjék számára. 3. Mennyiségileg kevésbé, ám az emberi szervezet működése szempontjából nem kevésbé fontos a szteroidhormonok, illetve a zsírsavakból keletkező másodlagos messengerek szerepe. 4. Felületaktivitással bírnak az emésztésben szerepet játszó epesavak. 5. Oldékonysági tulajdonságaik miatt a lipidekhez sorolhatók az A-, D-, E-, valamint a K-vitaminok. Hidrofób tulajdonságuk következtében a zsírok legtöbb funkciója (pl. membránstruktúra felépítése), raktározása (trigliceridcseppek az adipocitákban) és szállítása (lipoproteinek) a vizes környezettől elkülö­ nülve, kompartmentekben történik. A 8-1. ábra a lipidek funkció szerinti felosztását mutatja.

8.1

A LEGFON TOSABB Z S ÍR S A V A K ÉS J E L Ö L É S Ü K

A legtöbb lipidtermészetü anyag vagy zsírsavat tartalmaz, vagy zsírsavakból származik. Kisebb mennyiségben a zsírsavak nem észter formában, nagy­ részt azonban komplexebb molekulák részeként, zsír­ savészterekként fordulnak elő. A lipidek két legfonto­ sabb funkciója szempontjából is meghatározó a zsírsa­ vak szerepe; oxidációjuk során a sejtekben (elsősor­ ban a májban és izomszövetben) felszabaduló energia ATP-szintézist eredményez, a trigliceridek részeként alegfontosabb energiaraktárként szolgálnak, a foszfolipidek (és szfingolipidek) részeként pedig meghatá­ rozzák a membránok felépítését és számos tulajdonsá­ gát. Részt vesznek a glikolipidek, a prosztaglandinok és a koleszterin-észterek alkotásában is. A zsírsavak egy szénhidrogénláncból és egy termi­ nális karboxilcsoportból állnak, amelyet legegysze­ rűbben a CH3-(CH2)n-COOH képlettel lehet leírni. Aszénhidrogénlánc hossza különböző lehet, így kon­ vencionális felosztás alapján rövid szénláncú a 2-5, közepes szénláncú a 6-11, hosszú szénláncú a 12-26 szénatomot tartalmazó zsírsav. A szénhidrogénlánc

hidrofób karaktere meghatározó a zsírsavak legtöbb funkciója szempontjából. Ez a tulajdonság határozza meg a membránokat felépítő lipidekben a zsírsavak orientációját, így végső soron a membránok alapszer­ kezetét, és ez teszi lehetővé azt is, hogy a trigliceridekben az energiaraktározásnak egy gazdaságos és koncentrált formája valósul meg. A zsírsavakban a szénatomokat többféle módon je­ lölhetjük, amelyek közül a legáltalánosabb a számo­ zás, a karboxilcsoport C-atomját tekintve az első szén­ atomnak. Elterjedt még a görög ábécé betűinek a hasz­ nálata, ahol az a-szénatom a karboxilcsoport melletti szénatomot jelzi, az ómega pedig az ettől legtávolabbit. (B

p

4

a

3

2 1 CH3— (CH2)n- c h 2- c h 2- c h 2— c o o h

A zsírsavak ezen általános képlete kettős kötést nem tartalmazó, telített zsírsavat mutat. A szervezet­ ben jelentőséggel bíró zsírsavak egy része azonban egy vagy több kettős kötést tartalmaz, azaz egyszere­ sen vagy többszörösen telítetlen. A szervezetben szintetizálódó zsírsavakban a kettős kötés mindig cAz-konfigurációjú, s ha a molekulában egynél több kettős kötés található, ezek soha nem egymás mellett, hanem három szénatomnyi távolságra helyezkednek el. A kettős kötést általában a delta és egy számjelöli, amely megadja a kettős kötések pontos helyét is. A 16:1 A9 tehát a palmitoleinsavat írja le, amely 16 szénatomot és egy kettős kötést tartalmaz a 9. és a 10.

8-1. táblázat. A szervezetben előforduló zsírsavak Catomok száma

Kettős kötések száma

palmitinsav

16

0

palmitoleinsav

16

1

sztearinsav

18

0

olajsav

18

linolsav

Zsírsav neve

Kettős kötések helyzete

A9

co-7

1

A9

a>9

18

2

A9,12

co-6

linolénsav

18

3

A9,12,15

co-3

arachidonsav

20

4

A5,8,11,14

co-6

A A és oj jelek magyarázatát lásd a szövegben

I II.

198

AZANYAGCSERE

8-2. ábra. A sztearinsav (a) az olajsav (b) és a linolsav (c) képlete és térkitöltő modellje

szénatom között. A szervezetben előforduló legfonto­ sabb zsírsavakat és jelöléseiket az 8-1. táblázat mutat­ ja. A kettős kötés helyzetét megadhatjuk az ©-véghez viszonyítva is, így négy olyan fontos csoport írható le, melyek az 8-1. táblázatban látható „szülő” zsírsavak­ ból keletkeznek, de egymásba átalakulni nem tudnak. A 20 szénatomot tartalmazó arachidonsav pl. az ©-6-csoportba tartozó linolsavból szintetizálódik, nem keletkezhet azonban a szintén 18 szénatomos, de az ©-9-csoportba tartozó olajsavból. A zsírsavakban a kettős kötés jelenléte megváltoz­ tatja a szénhidrogénlánc mozgékonyságát, amely telí­ tett zsírsavakban egy flexibilis, lineáris struktúra. A telítetlen zsírsavak az emlősszervezetekben ciszkonfigurációban fordulnak elő, ezért a molekula hossztengelye megtörik (8-2. ábra). A szervezet számára szükséges zsírsavak részben a bioszintézis során a szervezetben keletkeznek, rész­ ben a táplálékkal elfogyasztott zsírsavakból származ­ nak. Mivel a metabolizmus során a zsírsavak jelentő­ sen módosulhatnak a szervezet, illetve az adott sejt pillanatnyi igényeinek megfelelően, a táplálékkal el­ fogyasztott zsírsavak összetétele nincs közvetlen be­ folyással a sejtek zsírsavösszetételére. Két szempont­ ból is meghatározó azonban a táplálékban található többszörösen telítetlen zsírsavak mennyisége, vala­ mint a telített és telítetlen zsírsavak aránya. A bioszin­ tézisben a 9. szénatomtól disztálisan nem tud kettős kötés kialakulni, ezért linolsav (©-6) és linolénsav

(©-3) nem szintetizálódik. Ezek az esszenciális zsír­ savak, amelyeket a táplálékkal kell a szervezetbe jut­ tatni, s amelyek szükségesek a membránalkotó több­ szörösen telítetlen zsírsavak és az eikozanoidok szin­ téziséhez (lásd 24. fejezet). Valószínűleg ezek hiánya magyarázza azoknak a tüneteknek egy részét (dermatitis, rossz sebgyógyulás), amelyek tartósan zsírmen­ tes diétán tartott egyénekben alakulnak ki.

Klinikai vonatkozások A táplálékban található többszörösen telítetlen és telí­ tett zsírsavak aránya fontos tényező a szív- és érrend­ szeri megbetegedések megelőzése szempontjából is. Általában leszögezhető, hogy ennek az aránynak az emelése csökkenti a szérumban a koleszterin- (mind az LDL-, mind a HDL-koleszterin, lásd alább) és a trigliceridszintet, és ezáltal csökkent kardiovaszkuláris rizikó tényezőt jelent. Az ©-6- és ©-3-zsírsavak nem teljesen azonos hatásúak: az ©-6-linolsav, amely növényi olajokban található, elsősorban a koleszterin­ szintet csökkenti, és kevésbé befolyásolja a trigli­ ceridszintet, míg a tengeri halakban és egyes növé­ nyekben, pl. salátákban nagy mennyiségben található ©-3-linolénsav inkább a trigliceridszintet csökkenti, a koleszterinszint lényeges változása nélkül. A kardiovaszkuláris rizikótényezők csökkentése szempontjá­ ból jelentőséggel bír az ©-6- és ©-3-zsírsavak aránya, amely optimálisan 1:1 és 1:4 között van. Az ©-3-zsír-

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

savak kedvező hatása még a trombociták aggregációjának és a gyulladásos reakcióknak a csökkentése is. Kardiovaszkuláris rizikótényezőt jelentenek a táplá­ lékban előforduló „traw.vz-zsírsavak” is. A trasz-zsírsavak felszaporodása a membránokban megváltoztat­ ja az optimális fluiditást, aminek kedvez az a tényező, hogy mind a tridlicerid-lipáz, mind a foszfolipáz ki­ sebb affinitással hasítja a transz-zsírsavakat. A keres­ kedelmi forgalomban lévő növényi olajokat gyakran részlegesen hidrogenálják azért, hogy a gyors avasodást megelőzzék és tartósságukat növeljék. Ennek so­ rán a cisz kettős kötések egy része redukálódik, de egy részük transz kettős kötéssé alakul. A táplálékkal elfo­ gyasztott transz-zsírsavak emelik a vérben a trigliceridek és az LDL-koleszterin szintjét, és csökkentik a HDL-szintet - ezeknek a jelentőségéről a későbbiek­ ben részletesen szólunk. Egyes országokban szigorú­ an korlátozzák az ilyen olajok éttermi, különösen gyors-éttermi használatát.

199

rűbb néven mono-, di- vagy trigliceridek (8-3. ábra). A trigliceridek ún. neutrális zsírok. Ha a glicerin 1. és 3. szénatomjához kapcsolódó primer alkoholos OHcsoport két különböző zsírsavval alkot észtert, vagy csak az egyik vesz részt észterkötésben, a molekula optikailag aktív, a glicerin 2. szénatomja a kiralitás centrum. Az emlősszervezetekben ezek a vegyületek L-konfigurációban fordulnak elő. A trigliceridek telítetlen zsírsav (pl. olaj sav-) tar­ talma jelentősen befolyásolja a zsírok olvadáspontját, a zsírok „keménységét”. A cz'sz-konfigurációval ren­ delkező telítetlen zsírsavakban a kettős kötésnél a lánc megtörik, így a környező apoláros zsírsavláncokkal kisebb mértékű apoláros (London-féle) kölcsönhatás kialakítására van lehetőség. A magasabb telítetlen zsírsav tartalom a zsírok olvadáspontját csökkenti, „lágyítja” a zsírokat. A telített és telítetlen zsírsavak aránya fajonként eltérő, ugyanazon faj esetében is vál­ tozó lehet a földrajzi helytől és az évszakoktól függő­ en. A monoacil-gliceridekben a glicerinnek vagy a primer, vagy a szekunder alkoholos OH-csoportja ész­ teresített, így 1-monoacil-glicerid vagy a 8-3. ábrán látható 2-monoacil-glicerid fordulhat elő. A monoacil-gliceridek a zsírok felszívódása során a bélhám­ 8.2 A C IL-G LIC ER ID EK . T R IG L IC E R ID E K ÉS sejtekben, illetve a lipidek intermedier metabolizmusa során keletkeznek. AZ EN ER G IA R A K T Á R O Z Á S Szintén a zsírsavak molekulán belüli helyzete alap­ ján különíthetünk el 1,2- és 1,3-diglicerideket. Ezek A glicerin zsírsavakkal alkotott észterei az acilis részben a lipidanyagcsere intermedierjei, részben gliceridek, amelyek - attól függően, hogy a glicerin pedig fontos szerepet játszanak bizonyos hormonok és hány alkoholos OH-csoportja észteresített - lehetnek neurotranszmitterek hatásának közvetítésében. monoacil-, diacil- és triacil-gliceridek vagy egysze­ A zsíranyagcsere szempontjából a trigliceridek a legnagyobb jelen­ tőségűek, mivel triglicerid formá­ J' H H p H2C - 0 - C - ( C H 2)14- C H 3 ban történik a zsírsavak raktározása I I / CH3- (C H 2)7 - C = C - (CH2)7 — c — O — CH .0 és részben szállítása is. A triglice­ I h 2c - o - c - ( c h 2)16- c h 3 ridek szintézise, raktározása és mo­ L-triacil-glicerid (triglicerid) bilizálása jellemzően a zsírszövet­ ben, az adipocitákban történik. Az H,C — OH c4— 'r, energiaraktározás hatékonyságát I R - C —O - C H R ,- C —O — CH két tényező biztosítja; részben az, I 2 I hogy a zsírsavak erősen redukált L-1,2-diacil-glicerid (diglicerid) 2-monoacil-glicerid (monoglicerid) molekulák, részben pedig az, hogy i-3. ábra. Acilgliceridek. Az R, R1( R2 a zsírsavak szénhidrogénláncát jelölik hidrofób tulaj donságúak.

III.

200

8 .3

A Z SÍR S A V A K

AZ ANYAGCSERE

fa-ketoglutarát

DE NOVO B IO SZ IN T ÉZ IS E

Az acetil-CoA transzportja a mitokondriumból a citoplazmába A zsírsavak bioszintézise az em­ beri szervezetben a májban, a zsír­ szövetben, a laktáló emlő mirigyei­ ben és kisebb mértékben a vesében, mindenütt a sejtek citoplazmájában történik. A szintézis kiinduló anyaga az acetil-CoA, amely a szénhidrátok, az aminosavak és a zsírsavak lebom­ 8-4. ábra. Az acetil-CoA transzportja a mitokondriumból a citoplazmá­ lása során keletkezhet. A zsírsavakba ba, a zsírsavszintézis helyére beépülő acetil-CoA elsősorban a szénhidrátok metabolizmusából szár­ A zsírsavszintézis elkötelező lépése és mazik, tehát közvetlenül a piruvát-dehidrogenáz az acetil-CoA-karboxiláz szabályozása komplex által katalizált reakcióban keletkezik. Ez az enzim a mitokondriumban található, ahonnan az A zsírsavszintézisben az elkötelező lépés a maloacetil-CoA-nak el kell jutni a citoplazmába, a zsírsav­ nil-CoA keletkezése acetil-CoA-ból az acetil-CoAszintézis helyére, s ez egy több lépéses folyamat, mi­ karboxiláz hatására (8-5. ábra). vel a molekula koenzim-A-része a mitokondrium Az acetil-CoA-karboxiláz működése hasonló a membránján nem tud átjutni, az acetilgyök pedig citrát piruvát-karboxiláz enziméhez; kofaktora a biotin, formában transzportálódik a trikarbonsav-transzmely ATP energiájának terhére megköti a CCE-ot, s ez porter közreműködésével. A mitokondriumban az az „aktivált” CCE kapcsolódik az acetil-CoA-hoz. acetil-CoA oxálacetáttal citráttá kondenzálódik, mely Az acetil-CoA —>malonil-CoA átalakulás azért ki­ a citromsavciklusban alakulhat tovább. A citrát cito­ tüntetett jelentőségű, mert itt történik a zsírsavszinté­ plazmába történő transzportjára akkor kerül sor, ami­ zis legfontosabb regulációja. In vitro az acetil-CoAkor az izocitrát-dehidrogenáz gátlása miatt a citrát és karboxiláz működéséhez citrátra van szükség, ami az az izocitrát felszaporodik. Az izocitrát-dehidrogenáz inaktív monomerekből az enzim aktív polimer formá­ gátlását a megnövekedett koncentrációjú ATP okozza jának kialakulását teszi lehetővé. A citrát tehát egy­ (lásd citrátkör), ami egyben annak a lehetőségét és részt a szubsztrátot szállítja az enzim számára, más­ szükségességét is megteremti, hogy az energia zsírsav részt, mint allosztérikus aktivátor, serkenti az enzim formában raktározódjon. A citoplazmában az működését. A citrát hatása in vivő is logikusnak tűnik; ATP:citrát-liáz enzim hatására a citoplazmatikus CoA felhasználásával, ATP energiájának terhére ismét acetil-CoA és oxál[ acetil-CoA-karboxiláz acetát keletkezik (8-4. ábra). Az 7 7 oxálacetát szénváza malát formában 7 " ^ malonil-CoA acetil-CoA ATP ADP + P, visszakerül a mitokondriumba (lásd 8-5. ábra. Malonil-CoA keletkezése 7.22. ábra).

201

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

az enzim aktiválásához akkor áll elegendő mennyisé­ gű citrát rendelkezésre, amikor a sejt energiaállapota megfelelő az energia zsírsavakban történő raktározá­ sához. Ugyanígy észszerű, hogy a zsírsavszintézis végterméke, a palmitil-CoA gátolja az acetil-CoAkarboxiláz enzimet, az aktív polimer kialakulásának gátlása révén.

f acetil-CoA-karboxiláz í

inaktív monomerek

f

a citrát

aktív polimer

a palmitil-CoA

A metabolizmus általános állapota, konkrétan a vércukorszint hormonális úton is befolyásolja az en­ zim működését. Az acetil-CoA-karboxilázt a cAMPfüggő protein-kináz foszforilálja és ennek következ­ tében gátolja. A glukagon és az inzulin ezen a módon szabályozza a zsírsavszintézist: a glukagon hatására az enzim foszforilálódik, azaz amikor a vércukorszint csökken, a sejtekben nem történik zsírsavszintézis és energiaraktározás. Az inzulin, amely akkor választó­ dik el, amikor a szervezet Jóllakott”, ezzel ellentétes hatású, mivel aktiválja a májban a foszfoproteinfoszfatáz-1 enzimet, ami az acetil-CoA-karboxilázt defoszforilálja. Mind az allosztérikus, mind a foszforiláció-defoszforilációval történő szabályozás azonnali változást je­ lent a zsírsavak szintézisének sebességében a metabo­ lizmus pillanatnyi állapotának megfelelően. A zsír­ savszintézis tartós alkalmazkodását a szervezet tápláltsági állapotához az enzim szintézisének, vagyis mennyiségének változása biztosítja: szénhidrátokban gazdag vagy zsírszegény étrend az enzim szintézisét fokozza, míg tartós éhezés vagy nagy mennyiségű zsír fogyasztása csökkenti az acetil-CoA-karboxiláz mennyiségét.

A palmitinsav szintézise. A zsírsav-szintáz A zsírsavszintézis következő lépéseiben megtörté­ nik a 16 szénatomos palmitinsav szintézise, a többi zsirsav a palmitinsavból alakul ki. A szintézis lényege

az, hogy a zsírsavlánc két szénatomonként hosszabbo­ dik, s ezek a szénatomok az acetil-CoA acetilcsoportjából származnak. Az első acetil-CoA metilcsoportja lesz a palmitinsav co-szénatomja, a további két szén­ atomos egységeket a malonil-CoA adja, amelyben az acetil-CoA metilcsoportja karboxilálással aktiváló­ dott. A lánc felépülése során azonban a malonil-CoA dekarboxileződik, így a zsírsav minden szénatomja acetil-CoA-ból származik. A szintézist egy multifunkcionális enzimkomplex, a zsírsav-szintáz végzi. Emlőssejtekben ez az enzim­ komplex két azonos alegységet tartalmaz, amelyekben hét, különböző enzimaktivitással rendelkező fehérje kapcsolódik össze. Az emlősszervezetekben megtalál­ ható zsírsav-szintáz kristályszerkezetét és az egyes domének elhelyezkedését a 8-6. ábra mutatja. Mindegyik alegységen két kitüntetett SH-csoport található, amelyek az acetil- és az acilcsoportokat kö­ tik meg. Az egyik SH-csoportot a 4 ’-foszfopantetein

8 -6 . ábra. Az emlősökben található l-es típusú zsírsav-

szintáz a kristályszerkezet alapján (a) és a domének lineá­ ris elhelyezkedése a polipeptidláncban (b). A szerkezet az ACP-t (acyl carrier protein) és a tioészteráz domént (TE) nem mu­ tatja, valamint azokat a doméneket sem, amelyek sem katalitikus aktivitással, sem linker szereppel nem rendelkeznek. Az enzim­ komplexben két azonos alegység van, amelyek mindegyike, egy-egy polipeptidláncon, tartalmazza a zsírsavszintézishez szükséges valamennyi enzimet. MÁT, malonil-transzferáz; KS, (3-ketoacil-szintáz (kondenzáló enzim); DH, dehidratáz; ER, enoilreduktáz; KR, ketoacil-reduktáz

202

I I I . AZ ANYAGCSERE

c h 3 oh

o

1

1

0

//

1 CL -

o

A következő három lépés azt a célt szolgálja, Ser— CH, 1 hogy redukciók során 0CH,O {____ Jl ) kialakuljon a négy szén­ ACPJ pantoténsav ciszteamin atomos butiril-S-ACP 4'-foszfopantetein (8-8. ábra). Ennek során 8-7. ábra. Az ACP-hez (acyl carrier protein) kapcsolódó 4'-foszfopantetein először egy redukció tör­ ténik, majd dehidratálás és újabb redukció, ame­ tartalmazza, mely a pantoténsav származéka, és meg­ lyekhez a hidrogént a NADPH szolgáltatja. A redukci­ található a koenzim-A-ban is (8-7. ábra). A 4 ’-foszfoók eredményeképpen kialakul a négy szénatomos zsír­ panteteint kötő fehérjét acyl carrier proteinnek (ACP) savlánc és kezdődhet a következő ciklus, amelyben is­ nevezik, mert a zsírsavlánc az ACP-hez kötődve épül mét két szénatommal hosszabbodik a lánc. Az újabb fel. ciklus úgy indul, hogy a kész, négy szénatomos zsír­ A lánc indítása, az alacsonyabb rendű szervezetek­ sav az ACP-SH-csoportról átkerül a P-ketoacil-ACPtől eltérően, emlősökben úgy történik, hogy az acetilszintáz cisztein SH-csoportjára (analóg az 1. lépéssel). csoport az acetil-transzferáz enzimhez, a malonilAz ACP szabaddá vált SH-csoportja megköti a követ­ csoport a malonil-transzferáz enzimhez kötődik. Az kező malonilcsoportot (analóg a 2. lépéssel) és létre­ acetilcsoport innen átmenetileg egy másik nevezetes jön a kondenzáció (analóg a 3. lépéssel), ami után a SH-csoportra, a kondenzáló enzim (P-ketoacil-szinmost már hat szénatomos lánc az ACP-SH-csoporton táz) cisztein SH-csoport-jára tevődik át, amely a to­ maradva hat szénatomos zsírsavvá redukálódik (8-8. vábbiakban is kitüntetett szerepet játszik majd. 4

o O 1 1 II II CH2— C — CH — C — NH — CH — CH2— C - N H — C H — CH2— SH

1. acetil-CoA + enzim-SH —> acetil-S-enzim + CoA-SH enzim: acetil-transzferáz

o

II

A C P —S — C — CH2— C — CH3 acetoacetil-ACP NADPH + H+

A malonil-CoA pedig átkerül a zsírsav-szintáz másik alegységén található ACP-SH csoportra.

f p-ketoacil-ACP-reduktáz S * NADP NADP+

2. malonil-CoA + ACP-SH —» malonil-S-ACP + CoA-SH enzim: malonil-CoA-ACP-transzaciláz (malonil-transzferáz)

OH

I

p-hidroxi-butiril-ACP

(± hidroxi-acil-ACP-dehidratáz Ezt követően kerül sor az acetil- és a malonilcsoport kondenzációjára, miközben felszabadul az a C 02, amely az acetil-CoA-karboxiláz reakcióban beépült a moleku­ lába. Ez a dekarboxiláció fedezi a két molekula össze­ kapcsolódásához szükséges energiát (ami így végül is az acetil-CoA-karboxiláz reakcióban felhasznált ATP energiájából származik). A reakciót a p-ketoacil-ACPszintáz (kondenzáló enzim) katalizálja. 3. malonil-S-ACP + acetil-S-enzim —» acetoacetil-S-ACP + C O

o

II

' S * H„0

ACP —S — C — CH = CH —CH3 krotonil-ACP • NADPH + H+ enoil-ACP-reduktáz 'N * n a d p +

butiril-ACP

8-8.

ábra. A p C-atomon történő redukciós lépések a zsír­ savszintézisben

203

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

o - c —a

ábra). Ily módon, egymást követő hét ciklusban alakul ki a palmitil-SCoA, amiből a tioészteráz dómén ha­ tására szabadul fel a palmitinsav. Az ACP-hez kapcsolódó 4’-foszfopantetein-molekula relatíve hoszszú, mozgékony lánca teszi lehetővé, hogy a kondenzálódott és az ACP-n kötve maradó láncrész a redukáló en­ zimekhez közel kerülhet és szubsztrátul szolgálhat. Minden ciklus vé­ gén az ACP-ről a redukált acilcsoport átmenetileg a kondenzáló enzim SH-csoportjára transzlokálódik, és az ACP-SH-csoport megkötheti a malonil-CoA-ról a következő malonilcsoportot (8-9. ábra). Egy molekula palmitinsav szintézise tehát az aláb­ biak szerint foglalható össze: 8 acetil-CoA + 14 NADPH + 14 H+ + 7 ATP —>palmitinsav + 14 NADP+ + 7ADP + 7P; + 7 H20 + 8 CoA

transzlokáció + a kővetkező malonil-CoA belépése

O //

O

S-- C —CÉL -C —O-

8-9. ábra. A felépülő zsírsavlánc „ingajárata" az ACP-SH és a kondenzáló enzim-SH között. A rövidítésekhez lásd a 8-6. ábrát

A zsírsavszintézishez szükséges NADPH forrása A zsírsavszintézishez elengedhe­ tetlen, hogy a sejtekben elegendő NADPH álljon rendelkezésre. Ennek forrása a glukóz direkt oxidációja (lásd 7. fejezet), de emellett NADP+ redukciója kíséri a citoplazmában az almasav piruváttá alakulását, amit az almasav enzim (malic enzyme) ka­ talizál (8-10. ábra). Almasav oxálecetsavból keletkezik a citoplazmatikus malát-dehidrogenáz hatására, így végsősoron a zsírsav-szintézis­ hez a szubsztrátot szállító citrát hoz­ zájárul a szintézis egy másik kompo­ nensének, a NADPH-nak a keletke­ zéséhez is. Az almasav enzim által

204

I I I . AZANYAGCSERE

(lpiruvát-dehidrogenáz í

_

-rí r' - a

mitokondrium mátrix mitokondrium belső membrán

citoplazma

8-10. ábra. A zsírsavszintézist szolgáló folyamatok és transzportok a mitokondrium belső membránon keresztül. Az ábrán a külső membránt nem ábrázoljuk

katalizált folyamat reverzibilis, fordított irányban malát keletkezését teszi lehetővé piruvátból, ami a citrátkör intermedierjeit pótló, ún. anaplerotikus reak­ ció (lásd 6. fejezet). NADPH keletkezhet még a citoplazmában az izocitrát-dehidrogenáz által katalizált reakcióban. Nem tisztázott, hogy in vivő melyik reakció, mi­ lyen mértékben vesz részt a zsírsavszintézishez szük­ séges NADPH előállításában, valószínű, hogy ez a sejten belüli egyéb reakcióutaknak is függvénye.

karboxiláz mennyiségének változása mellett a zsírsav-szintáz szintézisének szabályozása. Szénhidrát­ dús vagy zsírszegény étrend az enzim mennyiségének növekedésével jár, míg éhezés vagy zsírdús táplálko­ zás az enzim szintézisét csökkenti. Az acetil-CoAkarboxiláz és a zsírsav-szintáz enzim mellett az ATP:citrát-liáz, a glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz és az almasav enzim is ezen a módon tud tartósan adaptálódni a zsírsavszintézis igényeihez.

A zsírsavlánc elongációja A zsírsavszintézis szabályozása A zsírsavszintézis sebességét elsősorban a már em­ lített acetil-CoA-karboxiláz szabályozása határozza meg a citráttal történő allosztérikus és a foszforilációval történő kovalens módosítás révén, ami azonnali változást jelent az enzim működésében a metabolizmus aktuális állapotának megfelelően. A zsírsavszin­ tézis tartós alkalmazkodását szolgálja az acetil-CoA-

Mint az eddigiekből kitűnt, a de novo zsírsavszin­ tézis végterméke a 16 szénatomos telített zsírsav, a palmitinsav. Ez alól néhány kivétel van csak, ame­ lyekről később szólunk. A szervezet számára szüksé­ ges egyéb zsírsavak - a többszörösen telítetlen zsírsa­ vak kivételével - a palmitinsavból alakulnak ki a lánc hosszabbításával (ez az elongáció), illetve kettős köté­ sek kialakításával (ez a deszaturáció).

205

8. A U P I D E K A N Y A G C S E R É J E

Az elongáció vagy a mitokondriumban, vagy az endoplazmás retikulumban történik, s ennek során a zsírsavlánc két szénatomos egységekkel hosszabbodik. A mitokondriumban a két szénatomos egységet az acetil-CoA, az endoplaz­ más retikulumban - ahol az elongáció a legtöbb vizsgált emlős sejtben aktívabb, mint a mitokondriumban amalonil-CoA szolgáltatja. Ez utóbbi esetben a dekarboxilációval éppúgy elvész az a CO2, ami a malonil-CoA keletkezése­ kor a molekulába beépült, mint a de novo szintézisben. 8-11. ábra. A zsírsavak Akialakult P-ketoacil-CoA cit, citokróm redukciója is ugyanúgy há­ rom lépésben, NADPH részvételével történik, mint ahogy a zsírsavak de novo szintézisénél láttuk. A különbség az, hogy a részt vevő enzimek különállóak és nem részei egy enzim­ komplexnek, továbbá, hogy a hosszabbodó zsírsav nem egy carrier fehérjéhez kötve, hanem CoA-val ak­ tivált formában (makroerg tioészterkötés) vesz részt a folyamatban. A mitokondriumban a redukció ettől né­ mileg eltérően NADH és NADPH igénybevételével, lényegében a p-oxidáció fordított irányú lépéseiben történik, ahol az utolsó lépésben a FADH helyett NADPH vesz részt a redukcióban. A legtöbb sejtben az elongáció során az endo­ plazmás retikulumban palmitinsavból sztearinsav ke­ letkezik, amelyet az alábbiak szerint lehet összefog­ lalni: palmitil-CoA + malonil-CoA /

'V

2 NADPH + H+

2 NADP+

sztearil-CoA + CoA-SH + C 0 2 + H20

sztearil-CoA

deszaturációjában részt vevő elektrontranszport-rendszer.

A telítetlen zsírsavak kialakulása, a deszaturáció szintén az endoplazmás retikulumban történik. A cisz kettős kötések kialakításában NADPH, O2, továbbá három enzim vesz részt - egy flavoprotein, a citokróm-b5 és egy nem hem-vasat tartalmazó deszaturáz -, melyek a mikroszomális elektrontranszportlánc ré­ szei (8-11. ábra). A deszaturáz enzimek szubsztrátja, az acil-CoA - a deszaturázok specificitásától függően - lehet telített vagy telítetlen. A A9-deszaturáznak a sztearil-CoA a szubsztrátja, a másik három desza­ turáz, a A6-, A5- és A4-deszaturázok a kettős kötést már tartalmazó zsírsavba visznek be további kettős kötéseket a már meglévő kettős kötés és a tioészter kö­ zé. Hangsúlyozni kell, hogy az co-vég és a meglévő kettős kötés között egyik enzim sem tud kettős kötést kialakítani, azaz a 18:2A9,12 (co-6, linolsav) és a 18:3A9,12,15 (co-3, linolénsav) a szervezetben nem tud szintetizálódni, amiért is az ember számára ezek esszenciális zsírsavak. A deszaturáció regulációja a szervezet aktuális igé­ nyeinek megfelelően működik. A májban található sztearil-CoA-deszaturáz enzim aktivitása éhezésben

I II.

206

jelentősen csökken, míg a táplálkozás megindulása után fokozódik. Ez utóbbi állapotban alakulnak ki a te­ lítetlen zsírsavak olyan mennyiségben, ami biztosítja a membránlipidek optimális fluiditását. A deszaturációt jelentősen befolyásolja a táplálékban található te­ lítetlen zsírsavak mennyisége is. Minél nagyobb mér­ tékben járul ez hozzá az optimális fluiditáshoz szüksé­ ges telítetlen/telített zsírsav arány kialakulásához, an­ nál kevésbé van szükség az endogén zsírsavak deszaturációjára, s ilyenkor a sztearil-CoA-deszaturáz akti­ vitása csökken. A regulációban valószínűleg az en­ zimkomplex terminális komponense, a deszaturáz enzim a meghatározó. A telítetlen zsírsavak a membránfluiditás reguláci­ ója mellett részt vesznek koleszterin-észterek alkotá­ sában is. Ezen túlmenően, a többszörösen telítetlen zsírsavak közül az arachidonsav fontos reguláló mole­ kulák (prosztaglandinok, leukotriének, tromboxán) szintézisének kiinduló anyaga. A transz-zsírsavak kompetitív módon zavarják a többszörösen telítetlen cAz-zsírsavak deszaturációját és elongációját. A hatá­ sukra megváltozott membránfluiditás az egyik olyan tényező, amely hozzájárul a kedvezőtlen kardiovaszkuláris hatásokhoz.

Speciális zsírsavak, amelyek a zsírsav-szintáz reakcióban keletkezhetnek A zsírsavak de novo szintézisének végterméke az esetek túlnyomó többségében a palmitinsav, amely­ ből, mint láttuk, utólagos módosítás során alakulnak ki a szervezetben jelentőséggel bíró egyéb zsírsavak. Néhány speciális esetben azonban ettől eltérően is lét­ rejöhetnek zsírsavak, mégpedig a zsírsav-szintáz által katalizált reakcióban. A palmitinsavnál rövidebb szénláncú zsírsavak találhatók a legkülönbözőbb ál­ latokban keletkező tejben. Valószínűleg igaz az em­ beri szervezetre is, hogy az emlőmirigyben a zsírsavszintáz rövidebb szénláncú zsírsavakat is képes szinte­ tizálni, mégpedig úgy, hogy a lánc lehasad az acyl carrier proteinről még azelőtt, hogy a 16 szénatomos lánc kialakult volna. Ezt a lehasítást egy szolubilis tioészteráz végzi, amely hormonális szabályozás alatt áll.

AZ ANYAGCSERE

Egy másik lehetőség az elágazó szénláncú zsírsa­ vak szintézise. Ezek a zsírsavak a magasabb rendű szervezetekben speciális funkciókat szolgálnak (pl. a faggyúmirigyekben termelődő viasz). A legtöbb el­ ágazó szénláncú zsírsav a telített egyenes szénláncú zsírsav metilált származéka, amelynek szintézisét a zsírsav-szintáz végzi. Amikor a malonil-CoA helyett a metil-malonil-CoA a szubsztrát, a zsírsavba egy metilcsoport épül be a 8-12. ábrán látható módon.

CH3

/>

C H j— (CH2)n- C — S - A C P

+

I

HOOC— CH — C — S - A C P

metil-malonil-CoA CH,

//.0 |I,,3 J 'O

CH3— (CH2)n— C ---- CH — C — S — ACP + C 0 2 + CoA-SH

redukciós lépések |

v

ch3

1 3 yp

CH3- ( C H 2)n— CH2— CH — C — S — ACP

8-12. ábra. Elágazó szénláncú zsírsavak keletkezése a zsír­ sav-szintáz reakcióban

Ezek a reakciók számos sejtben megtörténnek, csak több nagyságrenddel lassabban, mint amikor malonil-CoA a szubsztrát. Az elágazó szénláncú zsír­ savak keletkezését valószínűleg az határozza meg, hogy a szubsztrátok, azaz a malonil-CoA és a metilmalonil-CoA milyen arányban állnak rendelkezésre. Fokozódik az elágazó szénláncú zsírsavak szintézise akkor, amikor a malonil-CoA mennyisége csökken, ami számos szövetben a malonil-CoA-dekarboxiláz enzim hatására bekövetkezhet. Patológiás körülmé­ nyek között is, pl. Bi2-vitamin hiányában emelkedhet a metil-malonil-CoA mennyisége, ami az elágazó szénláncú zsírsavak keletkezésének fokozódásához vezet.

8 .4

A T R IG IIC E R ID E K SZ IN T ÉZ ISE ÉS R A K T Á R O Z Á S A

A szervezetben a zsírsavak trigliceridek formájá­ ban raktározódnak. A legtöbb szövet képes trigliceri-

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

207

q f acil-CoA-szintetáz q deket szintetizálni, azonban legna­ CH3—(CH2)n—c f + ATP + CoA-SH--------------- > CH3—(CH2)n— C - S - C o A gyobb mennyiségben a májban és a X0" zsírsav acil-CoA zsírszövetben keletkeznek. A szin­ részreakciók tézis aktivált zsírsavakból és glice0 rin-3-foszfátból történik. 1 R CX + ATP -------x R — C — A M P + PPj A zsírsavak aktiválását az \r P zsírsav acil-adenilát endoplazmás retikulumban vagy a O o mitokondriumok külső membránjá­ 2 R — C — A M P + CoA-SH V s R — C — S — CoA + A M P ban az acil-CoA-szintetáz (tiokináz) acil-CoA végzi (8-13. ábra). A reakció két lé­ pésben történik, amelynek során elő­ 8-13. ábra. A zsírsavak aktiválása. A részreakciók leírásánál a zsírsav szénhid­ rogénláncát R jelöli ször egy acil-adenilát intermedier keletkezik, miközben az ATP-ről pirofoszfát hasad le. A koenzim-A musból vagy gliceroneogenezisből (lásd alább) SH-csoportja az enzimhez szorosan kötődő acilszármazik. adeniláttal reagál, és létrejön az aktivált zsírsav, az Ha a glicerin egyik primer alkohol OH-csoportját acil-CoA, amelyben a zsírsav nagy energiájú tiofoszforsav észteresíti, a molekula királis lesz. A konfi­ észterkötéssel kapcsolódik a koenzim-A-hoz. Az akti­ guráció egyértelmű leírásához a glicerin szénatomjait válás részreakciói reverzibilisek, irreverzibilissé az te­ ún. „sn” (stereospecific numbering) számozással lát­ szi a reakciót, hogy a pirofoszfatáz hatására a PPj juk el. (inorganikus) foszfátokra hidrolizál. Ez a mechaniz­ mus nemcsak a zsírsavak aktiválásában, hanem szá­ 1c h 2oh mos egyéb bioszintetikus folyamatban biztosítja azt, h o » - 2c ^ h hogy a folyamat irreverzibilis legyen. Az acil-adenilát 0 intermedier keletkezése úgyszintén általános mecha­ H~C—O— P —O1 nizmusnak tekinthető a karboxilcsoportok aktiválásá­ CT ban, ez történik pl. a fehérje-szintézisben felhasználó­ dé aminosavak esetében is. A szervezetben a glicerin-3-foszfát L-konfíguráA trigliceridek szintézisében az aktivált zsírsav cióban fordul elő, így a belőle származtatható vala­ vagy a dihidroxi-aceton-foszfáthoz, vagy a glicerinmennyi királis lipidmolekula L-konfigurációjú. 3-foszfáthoz kapcsolódik. A dihidroxi-aceton-foszfát mind a májban, mind pedig a zsírszövetben a glu­ kózból a glikolízis során keletke­ zik, és ebből NADH-val történő re­ dukció során - a glicerin-3-foszfátdehidrogenáz hatására - alakul ki a glicerin-3-foszfát (8-14. és 8-15. áb­ ra). A májban egy másik lehetőség is van a glicerin-3-foszfát kialakulásá­ ra, mégpedig a glicerinből a glicerin-kináz hatására. Ez az enzim a zsírszövetben hiányzik, így ott a glicerin-3-foszfát a glukózmetaboliz-

III.

208

AZ AN YAGC SERE

[ inzulin ]

triglicerid (VLDL, kilomikron)

8-15. ábra. A trigliceridekbe beépülő glicerin-3-foszfát és a zsírsavak forrása az adipocitákban.

VLDL, very low density

lipoprotein

A trigliceridek szintézise során (8-16/a ábra) elő­ ször lizofoszfatidsav keletkezik aktivált zsírsavból (acil-CoA) és glicerin-3-foszfátból vagy egy acil-dihidroxi-aceton-foszfát intermedieren keresztül dihidroxi-aceton-foszfátból. A lizofoszfatidsavat egy további aktivált zsírsav észteresíti, és kialakul a f o s z f a t i d s a v , ami kulcs intermedier más lipidek szin­ tézisében is. A foszfatidsavról a foszfatidsav-foszfatáz (más néven lipin) hatására a foszfátcsoport hidrolizál és diglicerid keletkezik, ami végül egy har­ madik acil-CoA-val trigliceriddé alakul. A bélhámsejtekben a trigliceridszintézis során nem keletkezik foszfatidsav, mivel a béllumenben az emésztés eredményeképpen 2-monoacil-glicerid ke­ letkezik és abszorbeálódik a mucosasejtekbe, ahol is acil-CoA-val először 1,2-diglicerid, majd triglicerid alakul ki (lásd még A zsírok emésztése és felszívódása című alfejezetet). Bizonyos törvényszerűséget mutat a különböző zsírsavak helyzete a glicerin három szénatomján. Az első szénatomon általában telített zsírsav, gyakran palmitinsav, a 2. szénatomon telítetlen zsírsav találha­ tó, a 3. szénatomon bármelyik előfordulhat. A trigli­ ceridekbe beépülő zsírsavak milyenségét és helyzetét

valószínűleg részben az aciltranszferázok specificitása, részben pedig az határozza meg, hogy az acilCoA készletben milyen arányban találhatók a külön­ böző zsírsavak. A trigliceridek szintézise, mint láttuk, némileg el­ térő lehet a májban és a zsírszövetben, de az enzimek mindkét szervben az endoplazmás retikulum memb­ ránjában fejtik ki aktivitásukat, és az itt keletkező triglicerid membránstruktúrába zárva válik le az ER membránról, a zsírszövetben zsírcsepp (8-16/b, c áb­ ra), a májban (és a bélhámsejtekben is) lipoproteinek keletkeznek (ezekről később lesz szó). Ennek megfe­ lelően a trigliceridek sorsa is markánsan különbözik e két szervben. A májban a szintetizált triglicerid a very low density lipoproteinbe (VLDL) épül, amely a keringés­ be kerül és szállítja a lipideket a perifériás szervekhez (lásd később). A z s í r s z ö v e t (ún. „fehér” zsírszövet) a trigliceridek szintézisére, raktározására és mobilizálására speciali­ zálódott szövet. A szintézisben a glicerin-3-foszfát ki­ zárólag a glukózanyagcseréből származik, s a beépülő zsírsavak egy része is glukózból szintetizálódik az adipocitákban (8-15. ábra). A többi zsírsavat triglice-

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

209

J' I

o=c

h 2c

- o —Q

s°

H ,C - 0 - C - R ,

‘I

HO —CH

I

^

h2c - o- i^

_

\ R ,- C

H ,C -0 -C -R .

I

—O — CH h 2c1- o — ^

s°

„

H -C -O -C -R .

%

I

R ,—C —O — CH acil-CoA aciltranszferáz

S.

CoA-SH

V

H,C —O—C —R. I V R , - C —O —CH

ftriglicerid

lipidcsepp 8-16. ábra. Trigliceridek szintézise, a) A szintézis reakciói, b) Az enzimek lokalizációja az ER membránban, c) zsírcsepp keletkezése az adipocitákban. AS, acil-CoA-szintetáz; AT, aciltranszferáz; FSF, foszfatidsav-foszfatáz; G-3P, glicerin-3-foszfát; DG, diglicerid; TG, triglicerid; ER, endoplazmás retikulum

210

ridek formájában lipoproteinek (VLDL, kilomikron) szállítják a zsírszövethez, ahonnan a kapillárisok endothelsejtjeinek felszínén található lipoproteinlipáz szabadítja fel a zsírsavakat (lásd később), s ezt az adipociták felveszik. A szénhidrát-ellátottság tehát komplex módon határozza meg a trigliceridek kelet­ kezését és raktározását. A glukóz-ellátottságtól függ a glicerin-3-foszfát keletkezése, és mint láttuk, a zsírsa­ vak szintézise is (lásd acetil-CoA-karboxiláz szabá­ lyozása). A zsírszövet - szemben a májjal - glukózt csak inzulin jelenlétében képes felvenni, s inzulin nö­ veli a lipoprotein-lipáz aktivitását is, ami a trigliceridekben ideszállított zsírsavakhoz hozzájuttatja a zsírszövetet (8-15. ábra). Bőséges szénhidrát-ellátott­ ság esetén tehát a zsírszövet triglicerideket szintetizál, és ezeket az adipociták citoplazmájában raktározza. Korábban összefoglaltuk azokat a mechanizmusokat, amelyek ebben az állapotban a zsírsavak szintézisét stimulálják (201. és 204. oldal), a zsírsavak viszont stimulálják a trigliceridek szintézisét. A szintetikus út egyik enzimje, a foszfatidsav-foszfatáz a citoszolból zsírsavak hatására transzlokálódik az ER membrán­ hoz, ahol aktivitását kifejti. Ennek az enzimnek a sza­ bályozására visszatérünk majd a foszfolipidek szinté­ zisének tárgyalásánál. A szervezet fehérjéket, illetve aminosavakat gyakorlatilag nem raktároz, szénhidrá­ tot is csak korlátozott mennyiségben, jórészt csak a máj és izomszövetben, glikogén formájában. Ezzel szemben a zsírokat tartósan, nagy mennyiségben, egy erre specializálódott szövetben tudja raktározni. A metabolizmus regulációi úgy működnek, hogy a szén­ hidrátokkal elfogyasztott felesleges energia zsírsavak­ ba, majd trigliceridekbe épül be. Ez a raktár jelenti a szervezet legfontosabb energiatartalékát, ahonnan a zsírsavak, a szervezet igényeinek megfelelően mobili­ zálódnak. A trigliceridek féléletideje néhány nap, ami azt mutatja, hogy a zsírszövetben folyamatos és inten­ zív trigliceridszintézis és -lebontás folyik. Amikor a zsírszövetben túlzott mértékűvé válik a zsírok felszaporodása, kialakul az obesitas (elhízás), amelynek során az adipociták száma és az egyes adi­ pociták mérete egyaránt megnő. A zsírszövet szintetizál triglicerideket az éhezés ál­ lapotában is. Ez paradoxnak tűnik, de valójában a tar­ talékok megmentését, illetve minél gazdaságosabb

III.

AZANYAGCSERE

felhasználását szolgálja. Éhezésben a zsírszövetben a trigliceridekből zsírsavak szabadulnak fel, amelyek a keringéssel más szervekhez eljutva, azok táplálását végzik (lásd következő alfejezet). A mobilizálódó zsírsavak mennyisége azonban nagyobb, mint ami a zsírszövetből kikerül, illetve a táplált szervekben oxi­ dálódik. A fel nem használt zsírsavak a keringéssel a májba kerülnek, ahol beépülnek trigliceridekbe, ame­ lyek lipoproteinekbe csomagolva kerülnek vissza a zsírszövetbe. A zsírszövet és a máj között ily módon megvalósuló együttműködést triglicerid/zsírsav kör­ forgásnak nevezzük (8-17. ábra). A zsírszövetben fe­ leslegben felszabadult zsírsavak egy része ott helyben épül vissza trigliceridekbe. Az ilyenkor végbemenő trigliceridszintézishez szükséges glicerin-3-P előállí­ tása azonban nem tud végbemenni a glukózanyag­ csere folyamatában, mivel éhezésben a glukózanyag­ csere visszaszorul a májban is, a zsírszövet pedig inzu­ lin hiányában nem is jut glukózhoz. A glicerin-3-P szintézise ilyenkor a gliceroneogenezis folyamatában megy végbe, ami a glukoneogenezis egy szakaszával azonos (8-17. ábra). A gliceroneogenezis folyamatá­ ban a glicerin-3-P keletkezéséhez bármely olyan szubsztrát hozzájárulhat, amely metabolizmusa révén becsatlakozik a citrátkörbe. Ez a metabolikus folya­ mat teszi érthetővé a foszfoenol-piruvát-karboxikináz (PEPCK) zsírszövetben való jelenlétét, minthogy ez az enzim nemcsak a glukoneogenezis, de a gliceroneogenezisnek is kulcsfontosságú enzime. A trigli­ cerid/zsírsav körforgás és az azt lehetővé tevő, a máj­ ban és a zsírszövetben végbemenő gliceroneogenezis a zsírsavtartalékok minél gazdaságosabb felhasználá­ sát szolgálja. A folyamat fontosságára utal az a tény, hogy a 2-es típusú diabetes gyógykezelésében hasz­ nált egyik molekula, a thiazolidindion, a PPAR magi receptorok közreműködésével (lásd 20. fejezet) a zsír­ szövetben megnöveli, egyéb fehérjék mellett, a PEPCK indukcióját, ennek következtében fokozza a zsírsavak trigliceridekbe történő beépülését és csök­ kenti a keringésben a szabad zsírsavak szintjét. A glukokortikoidok, amelyek fokozzák a májban, de csök­ kentik a zsírszövetben a PEPCK expresszióját, növe­ lik a glukoneogenezis és a májban folyó gliceroneo­ genezis sebességét, hozzájárulva a triglicerid/zsírsav körforgás megnövekedéséhez.

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

21 1

máj

zsírszövet (adipocita)

DHAP

[oxálacetát hcerin

PÉP

karboxikinaz [foszfoenol-piruvát

zsírsav zsírsav

PEP-

karboxikináz dihidroxi-aceton-P — ^fglicerin-SP

zsírsav oxálacetát

(albumin) licerin oxálacetát

fglicer

malát

malát

Xpiruvát, glutamát, aszpartát szervek táplálása (izom)

mitokondrium

8-17. ábra. A trigliceridciklus a zsírszövet és a máj között. A gliceroneogenezis lépései a zsírszövetben és a májban. Atrigliceridciklust a piros nyilak mutatják. Ez a folyamat az éhezésben végbemenő trigliceridszintézist írja le a zsírszövetben és a máj­ ban, amely újrahasznosítja a zsírszövetben feleslegben felszabaduló zsírsavakat. A folyamathoz glicerin-3-foszfátra van szükség, amely ilyenkor a májban részben, a zsírszövetben teljes egészében a gliceroneogenezis folyamatában keletkezik (kék nyilak). PÉP, foszfo­ enol-piruvát; DHAP, dihidroxi-aceton-foszfát

8.5

L IP O L ÍZ IS A RAKTÁROZOTT Z S ÍR S A V A K M O B IL IZ Á LÁ SA A ZSÍRSZÖVETBŐL

Ahhoz, hogy a raktározott zsírsavak eljussanak a szervekhez és energiát szolgáltassanak, először a zsír­ szövetben ki kell szabadulniuk a triglicerid-raktárból. A trigliceridek az adipociták citoplazmájában zsírcseppekben raktározódnak, amelyet foszfolipidréteg határol. Ebbe a rétegbe ágyazódik be egy p e r i l i p i n ne­ vű fehérje, amely fontos szerepet játszik a trigliceridraobilizálás regulációjában. A trigliceridek hidrolízi­ sét a zsírcseppek felszínén három enzim végzi: az első zsírsavat felszabadító a d i p o c i t a - t r i g l i c e r i d - l i p á z (A T G L ), a második zsírsavat lehasító h o r m o n s z e n zitív l i p á z (E IS L ) és a hidrolízist befejező m o n o g l i c e r id - l ip á z ( M G L ) . A lipázok aktivitása révén a trigliceridekből zsírsavak és glicerin keletkezik. A glice­ rin, amit a zsírszövet, a glicerin-kináz enzim hiányá­ ban nem tud hasznosítani, az adipocitákból kidiffundál, a vérkeringéssel a májba szállítódik, és ott glicerin-3-foszfáttá alakul. Itt vagy trigliceridszintézisre használódik, vagy dihidroxi-aceton-foszfáttá alakul a 8-14. ábrán bemutatott reverzibilis reakcióban, és

vagy a glikolízis, vagy a glukoneogenezis folyamatá­ ba kapcsolódik. A felszabaduló zsírsavak intracelluláris szállító fehérjék segítségével (fatty acid binding protein, FABP) az adipociták membránjához vándo­ rolnak, azon átdiffundálva a vérpályába kerülnek, ahol azonnal albuminhoz kötődnek, és szabad (nem észteresített) zsírsavként (FFA; free fatty acid) szállítódnak a szervekhez (izom, szívizom, vesekéreg). Az albuminkötés teszi az egyébként vízben nem oldódó zsír­ savakat szállíthatóvá a plazma vizes közegében. A szabad zsírsavak alkotják a vérplazmában található összes lipidnek azt a kis hányadát (~5%), ami nem lipoproteinekben szállítódik. Ez a lipidfrakció azon­ ban meghatározó szerepet játszik abban, hogy étkezé­ sek között vagy éhezésben a szervek zsírsavak formá­ jában megfelelő mennyiségű tápanyaghoz jussanak. A trigliceridek mobilizálása h o r m o n á l i s s z a b á ­ l y o z á s alatt áll. A lipázok közül az A T G L és a H S L enzimek regulációja biztosítja, hogy a keringésben mindig legyen elegendő mennyiségű zsírsav a szervek ellátásához. Zsírsavak mobilizálódnak a zsírszövet­ ből, amikor a vércukorszint csökken, így étkezések közötti időszakban, éhezés alatt, valamint tartós fizi­ kai és pszichés igénybevétel során. Ezzel szemben ét­ kezések után, állandó, bőséges táplálékbevitel mellett,

I I I.

212

AZ ANYAGCSERE

glukagon adrenalin noradrenalin

8-18. ábra. Zsírsavak mobilizálása a zsírszövet trigliceridraktárából. Az ábra az alapállapot és a hormon-stimulusra bekövetke­ ző változások sémáját mutatja. R, receptor; PKA, protein-kináz A; HSL, hormonszenzitív lipáz; ATGL, adipocita-triglicerid-lipáz; IVIGL, monoglicerid-lipáz; FA, zsírsav; FFA, szabad zsírsav; DG, diglicerid; TG, triglicerid; MG, monoglicerid; FABP, (fatty acid binding protein) zsírsavkötő fehérje. Az ábra a keletkező glicerin sorsát nem mutatja

testi és lelki nyugalomban a zsírsavak nem mobilizá­ lódnak, hanem éppen ellenkezőleg, a trigliceridraktárba épülnek be. A folyamatot a 8-18. ábrán látható mó­ don hormonok szabályozzák. Az adipociták memb­ ránjában receptorok kötik a szimpatikus neurotranszmitter noradrenalint, illetve számos, a vérben keringő hormont (glukagon, adrenalin), aminek kö­ vetkeztében aktiválódik az adenilát-cikláz, cAMP ke­ letkezik és aktiválódik a cAMP-függő protein-kináz (PKA). Az adipocitákban a PKA-nak két olyan szubsztrátja van, ami a lipolízist meghatározza: foszforilálódik a zsírcsepp felszínén található perilipin és a citoplazmában elhelyezkedő hormonszenzitív lipáz. A foszforilálatlan perilipinhez egy fehérje kötődik (CG1-58), amely a perilipin foszforilációja következ­ tében leválik és kötődik az ATGL-hez, amit aktivál. Az aktív ATGL felelős az első zsírsav lehasításáért, ami egyszersmind az egész lipolízis sebességmeg­ határozó lépése. A keletkező diglicerid a szubsztrátja a HSL-nak, ami a foszforiláció következtében a zsír­ csepp felszínéhez transzlokálódik és hozzáfér a zsírcseppben keletkező digliceridhez. A folyamatot a monogliceridet hasító MGL fejezi be. A szabaddá vált zsírsavak a plazmamembránon keresztül a vérplazmá­ ba kerülnek.

Stimulálják a lipolízist egyéb hormonok is, mint pl. a kortikoszteroidok, a tiroxin és különböző növekedé­ si hormonok, amelyek azonban az enzimek mennyisé­ gét növelik és ezért hatásuk lassúbb és hosszan tartóbb.

8 .6

A Z S ÍR S A V A K O X ID Á C IÓ JA

A keringésben jelen lévő zsírsavak - a zsírszövet­ ből származó szabad zsírsavak és a lipoproteinekből a lipoprotein-lipáz hatására keletkező zsírsavak egy­ aránt - a sejtmembránokon keresztül a sejtekbe kerül­ nek, ahol oxidálódnak és energiát szolgáltatnak. A kü­ lönböző szervek nem azonos mértékben képesek zsír­ savakat felhasználni; az idegsejtek, a vörösvértest, a mellékvese velőállománya egyáltalán nem hasznosítja a zsírsavakat, míg a szívizom és a harántcsíkolt izomzat számára a zsírsavak nagyon jelentős energiaforrást jelentenek. A zsírsavak felhasználása természetesen a metabolizmus állapotától is függ. Jóllakott állapotban, amikor a sejtek elsősorban szénhidrátokat oxidálnak, a felesleget pedig raktározzák, nem történik zsírsav­ oxidáció. Étkezések közötti időszakban, tartós fizikai munkavégzés közben és különösen éhezésben a

213

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

zsírsav-oxidáció jelentősége megnő. Hosszan tartó éhezésben a legtöbb sejt zsírsavat vagy ketontesteket oxidál az energiaszükséglet fedezésére. A sejtekbe került 12 szénatomot tartalmazó vagy annál rövidebb zsírsavak transzporterek közreműkö­ dése nélkül jutnak el a mitokondriumba, az oxidáció helyére. Az adipocitákból a szervekhez szállított, illet­ ve a táplálékban előforduló zsírsavak legnagyobb ré­ sze azonban hosszabb szénláncot tartalmaz, ezek beju­ tása a sejtbe úgynevezett zsírsavtranszport fehérje (FATP, fatty acid transport protein) segítségével törté­ nik, a citoplazmából a mitokondriumba történő beju­ tás pedig több enzimet, kamitint és egy transzportért igényel. A sejtekbe került zsírsav először koenzim-A-val aktiválódik pontosan olyan módon, ahogy a trigliceridszintézis tárgyalásánál láttuk (lásd 8-13. ábra), és ennek során aktivált zsírsav, acil-CoA keletkezik.

Az aktiválás az endoplazmás retikulumban vagy a mitokondrium külső membránjában elhelyezkedő acil-CoA-szintetáz hatására történik. A mitokond-

CH, CH 3

J'

N+—CH, — C —CH ,— COO"

I

CH,

2 I

OH

kamitin

+ R —C —S —CoA

2

karnitinaciltranszferáz

CH,

I

CoA-SH H

I

C H3,— N+ —CH,2 —C! —C H ,— COO" | CH,

3

O

I c= o I R

acil-karnitin

8-19. ábra. A karnitin-aciltranszferáz által katalizált reak­ ció

mitokondrium külső membrán

mitokondrium belső membrán

* | ft-oxidáció 8-20. ábra. A zsírsavak transzportja a citoplazmából a mitokondriumba. FATP, fatty acid (zsírsav) transport protein

214

III.

rium belső membránja az acil-CoA számára nem átjár­ ható. A transzporthoz a zsírsav egy speciális carrier, a karnitin alkoholos OH-csoportjához kapcsolódik az acil-CoA-ról (8-19. ábra). A reakciót a karnitin-aciltranszferáz-I katalizálja, amely a mitokondrium kül­ ső membránjában található (8-20. ábra). Az acil-karnitin a mitokondriummatrixba transzportálódik egy kamitinmolekuláért cserébe. A belső membrán belső felszínén egy másik enzim, a karnitin-aciltranszferáz-II visszaalakítja az acil-CoA-t, a mitokondriális CoA felhasználásával. A szabaddá váló karnitin azon a cseretranszporton keresztüljut vissza a citoplazmába, amely az acilkamitint a mitokondriumba juttatja, az acil-CoA pedig a mitokondriumban készen áll az oxidációra.

A Z AN Y A G C S E R E

A páros szénatomszámú telített zsírsavak oxidációja A mitokondriumban a zsírsavak a p-oxidáció során bomlanak le, ciklusonként két szénatommal rövidül­ nek, miközben egy acetil-CoA, egy FADEE és egy NADH + H+ keletkezik két pár elektron és négy ^ e l ­ távolítása révén. A 8-21. ábrán a palmitinsav lebomlá­ sának első ciklusában a P-oxidáció négy egymást kö-

3

2

1

o

CH3 — (CH2)12— CH2— CH2— C - S - CoA P

a

palmitoil-CoA FAD acil-CoAdehidrogenáz

A

K lin ika i v o n a tk o zá so k

FADH,

H

I

/

O

CH3 - (CH2)12— C = C —C — S — C oA

Számos okból alakulhat ki zavar a hosszú szénláncú zsírsavak mitokondriális transzportjában. Oka lehet ennek a karnitin hiánya, amely kialakulhat például a karnitin szintézisének elégtelensége, vagy vese erede­ tű fokozott kamitinürités miatt, esetleg szövetspecifikusan a vázizom fokozott kamitinvesztesége követ­ keztében. A változó súlyosságú tünetek, amelyek a metabolizmus, a szívműködés, a májfunkciók vagy az izomműködés elégtelenségét jelzik, karnitin adására kedvezően befolyásolhatók. Ismert számos olyan állapot, amelyben a kamitinaciltranszferáz-II gén mutációja következtében válto­ zó mértékben csökken az enzim aktivitása. Enyhébb esetben ennek izomgyengeség a következménye, kü­ lönösen erőteljesebb izommunka során, nagyfokú funkciókiesés azonban már korai életkorban súlyos izomgörcsöket okozhat, különösen éhezésben vagy zsírdús táplálkozás után. Ilyen mutációk esetén fontos elkerülni azokat az állapotokat, amelyekben az izom normálisan zsírsavakat égetne (pl. éhezés), illetve csökkenteni kell a táplálékkal elfogyasztott hosszú szénláncú zsírsavak és növelni a közepes és rövid szénláncú zsírsavak mennyiségét.

H A2-transz-enoil-CoA enoil-CoAhidratáz

OH

,o

I

CH3 — (CH2)12- C H —C H - C - S - C o A L-p-hidroxiacil-CoA NAD+ p-hidroxiacilCoA-dehidrogenáz

A

NADH + H+

/P

P

CH3 — (CH2)12— C —CH2— C — S — CoA p-ketoacil-CoA -HS-CoA acetil-CoA-aciltranszferáz _____________ p-ketotioláz

r //O

CH3 - (CH2)10— CH2—CH — C — S — CoA acil-CoA

acetil-CoA 8-21. ábra. A zsírsavak ti-oxidációja

215

8. A U P I D E K A N Y A G C S E R É J E

vető lépése látható. Az első lépés oxidáció, melynek során kialakul az a- és (3-szénatom közötti kettős kö­ tés, amely transz-konfigurációjú, és közben FADH2 keletkezik. A reakciót katalizáló acil-CoA-dehidrogenáz a mitokondrium belső membránjához kötött en­ zimés több izoformában fordul elő, amelyek különbö­ ző hosszúságú zsírsavláncra specifikusak. így elkülö­ níthető hosszú szénláncú acil-CoA-dehidrogenáz (12-18 szénatomszámú zsírsavakra), közepes szénlán­ cú acil-CoA-dehidrogenáz (4-14 szénatomszámú zsír­ savakra) és rövid szénláncú acil-CoA-dehidrogenáz (4-8 szénatomszámú zsírsavakra). A második lépés hidratálás, ami a transz-konfiguráció következtében L-konfigurációjú P-hidroxi-acil-CoA-t eredményez. A sztereospecifitás azért fontos, mert a következő lé­ pésben az oxidációt katalizáló dehidrogenáz enzim az L-izomérre specifikus. Ebben a lépésben NADH + H+ keletkezik és a P-szénatom ketocsoporttá oxidálódik (innen a P-oxidáció elnevezés). Az utolsó lépésben

tiolízis történik, amelynek során újabb CoA belépésé­ vel acetil-CoA hasad le, s így kialakul a most már két szénatommal rövidebb aktivált zsírsav. Az utóbbi há­ rom enzim egy a belső membránhoz kötött trifunkcionális multienzimkomplex (TFP; trifunkcionális peptid) részeként vesz részt a 12 szénatomnál hosszabb zsírsavak lebontásában. Amikor az oxidáci­ ókkal a zsírsav ennél rövidebbé válik, a további ciklu­ sokban a reakciókat a mátrixban szolubilisen jelen lé­ vő enzimek katalizálják. A tiolízissel keletkező két szénatommal rövidebb acil-CoA egy újabb P-oxidációs ciklusban alakulhat tovább. A p-oxidáció lépései hasonlóak a zsírsav de novo szintézis fordított irányú lépéseihez, azonban attól mégis markánsan eltérőek: 1. Mindenekelőtt, más kompartmentben történnek; a zsírsavszintézis a citoplazmában, az oxidáció a mitokondriumban folyik.

r

acil-CoA (16 C)

(14 C)

(12 C)

(8 C)

(6 C)

— acil-CoA (10 C)

•CoA faciM

(4 C)

8-22. ábra. A palmitinsav hét egymást követő lépésben történő p-oxidációjának sémája és a keletkező összes NADH + H+ és FADH2

216

2. A zsírsavszintézisben a folyamat ACP-hez, az oxi­ dációban koenzim-A-hoz kötve történik. 3. A szintézis során a redukciókban NADPH, az oxi­ dációban a FAD és a NAD+ a koenzim. 4. A szintézisben D-hidroxi-, az oxidációban L-hidroxi-intermedier keletkezik.

5. Végül pedig a szintézisben közvetlenül malonilCoA vesz részt, míg az oxidációban acetil-CoA ke­ letkezik. A P-oxidáció során keletkező acetil-CoA a citrátkörben oxidálódik, ahogy azt a 6. fejezetben láttuk. Végezetül pedig a P-oxidációban, valamint az itt ke­ letkező acetil-CoA citrátköri oxidációja során keletke­ ző NADH és FADH t a mitokondriális légzési láncban oxidálódik és szolgáltat elektronokat a H2O és az ATP keletkezéséhez. A NADH-ról az elektronok közvetle­ nül a komplex-I-re (NADH-dehidrogenáz) kerülnek, míg az acil-CoA-dehidrogenáz által katalizált reakció­ ban keletkező FADFF-ről az elektronok az elektron-transzferáló flavoprotein közreműködésével jut­ nak el a CoQ-ra. A palmitinsav teljes lebontásához hét egymást kö­ vető ciklusra van szükség, amelynek végeredménye­ képpen 8 acetil-CoA, 7 FADIF és 7 NADH + H+ (majd a citrátkörben 16 CO2 és 16 H2O molekula) ke­ letkezik. A összes NADH + H+ és FADH2 keletkezés sémáját a 8-22. ábra mutatja. Tekintve, hogy egy acetil-CoA molekula eloxidálása 10 ATP szintézisét eredményezi (lásd 6. fejezet), valamint, hogy egy FADH2 oxidálása 1,5, míg egy NADH-é 2,5 molekula ATP szintézisét eredményezi, a palmitinsav oxidációja során keletkező ATP-molekulák száma: 8x10 + 7x1,5 + 7x2,5 = 108, viszont le kell vonni az aktiválás során felhasznált két makroerg foszfátkötés miatt 2 ATP-t. Vagyis a palmitinsav-molekula teljes oxidációja molekulánként 106 ATP kelet­ kezését teszi lehetővé. A legutóbbi időben pontosított számítások egy acetil-CoA-molekula eloxidálása során 10,83 ATP szintézisével és egy FADHt oxidálása során 1,64, míg egy NADH-nál 2,73 molekula ATP szintézisével szá­ molnak, így a palmitinsav oxidációja során keletkező ATP-molekulák száma: 8x10,83 + 7x1,64 + 7x2,73 =117,23 (116, egy tizedesig) -2, azaz 114 ATP. Jelen

II I .

AZANYAGCSERE

könyvben az egyszerűség kedvéért maradunk a koráb­ bi, 1,5 (FADH2) és 2,5 (NADH + H+) ATP keletkezés adatainál. Nem standard körülményekkel, hanem a valóságos intracelluláris koncentrációk figyelembevételével számolva az oxidációban létrejövő szabadenergia-vál­ tozás értékét, az energiahasznosulás mértéke az elér­ hető elméleti maximum >60%-ának adódik, ami azt jelenti, hogy a zsírsavak raktározása, felszabadítása és a p-oxidációban történő lebontása az energiaraktáro­ zásnak és felhasználásnak egy nagyon hatékony mód­ ját jelenti. A zsírsavak P-oxidációjának regulációja a zsírsav­ szintézissel összehangolt módon történik. Ebben a meghatározó szerepet a zsírsavszintézis elkötelező lé­ pésében a citoplazmában keletkező malonil-CoA játssza, amely gátolja a kamitin-aciltranszferáz-I-et és megakadályozza, hogy a zsírsav eljusson az oxidáció helyére. (Ha az acil-CoA bejut a mitokondriumba, ak­ kor a P-oxidáció enzimei a folyamatot elindítják.) A malonil-CoA ily módon meggátolja, hogy a sejtben egyidejűleg zsírsavszintézis és -lebomlás történjen, vagyis a citoplazmában szintetizálódó zsírsavak a mitokondriumba jussanak és eloxidálódjanak. Ez a reguláció akkor érvényesül, amikor a szerve­ zetben elegendő szénhidrát áll rendelkezésre és az acetil-CoA zsírsavakba épül be, vagyis a metabolizmus folyamatait az inzulin határozza meg (8-23. áb­ ra). Ezzel szemben csökkent táplálékbevitel, vagy éhezés esetén a glukagon és az adrenalin hatására in­ aktiválódik az acetil-CoA-karboxiláz, csökken a malonil-CoA szintje, megszűnik a zsírsavak mitokond­ riális transzportjának a gátlása és az acil-CoA bejut a mitokondriumba, a P-oxidáció helyére. Ezek a hormo­ nok, mint láttuk (8-18. ábra), az adipocitákban mobi­ lizálják a zsírsavakat a trigliceridraktárból, tehát hoz­ zájuttatják a sejteket a p-oxidáció szubsztrátjához is. Erőteljes izommunka során vagy éhezésben, ami­ kor az izomban lecsökkent az ATP-szint és megemel­ kedik az AMP-szint, aktiválódik az AMP aktiválta protein-kináz (AMPK, lásd 20. fejezet), amely egye­ bek mellett foszforilálja és gátolja az acetil-CoAkarboxilázt, és ezáltal a fent leírt módon lehetővé teszi a zsírsavak mitokondriális transzportját és oxidáció­ ját.

217

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

Reguláié szerepet játszik még a zsír­ savakat oxidáló sejtek aktuális jó ener­ giaállapota, amely gátolja a P-oxidációt azért mert a magas NADH/NAD+ arány csökkenti a NAD+-dal működő p-hidroxi-acil-CoA-dehidrogenáz, az acetilCoA pedig a ketotioláz működését. A zsírsavoxidáció tartós aktiválását okozza a zsírsav oxidáció egyes kulcsfe­ hérjéinek fokozott traszkripciója a PPAR transzkripciós faktorok közreműködésé­ vel (lásd 20. fejezet). A sejtek vagy a szervezet olyan állapotaiban, amikor fo­ kozott zsírsav-oxidációra van szükség (pl. tartós éhezés) a PPARa, amely zsír­ savak magi receptoraként működik, fo­ kozza a zsírszövetben, az izomban, illet­ ve a májban a zsírsav-oxidációt szolgáló gének transzkripcióját (kamitin-aciltranszferáz-I és -II és acil-CoA-dehidrogenáz). Ugyancsak ez a mechanizmus indítja be a szívizomban a zsírsav-oxidá­ ció enzimeinek expresszióját a születés után, amikor a szívizom a magzati metabolizmusról (glukóz- és tej savfelhaszná­ lás) átáll a zsírsavak égetésére.

glukagon adrenalin

csökkent táplálékés glukózellátottság

II s! U cA

Mp I

1 protein-kináz A

i

acetil-CoA

malonil-CoA-------- > karnitin-aciltranszferáz-l

i

zsírsavszintézis

a

i

gátlás

zsírsav p-oxidáció gátlás

8-23. ábra. A zsírsavszintézis és lebontás összehangolt szabályozása. A csökkent glukózellátottság esetén érvényesülő szabályozásokat kék nyilak, a bőséges glukózellátottság esetén jellemző szabályozásokat piros nyilak jelölik

Klinikai vonatkozások A zsírsavak P-oxidációjának károsodását okozza az az öröklődő enzimdefektus, amelynek lényege az acil-CoA-dehidrogenáz elégtelen működése. Attól függően, hogy a mutáció következtében melyik dehidrogenáz érintett, különböző hosszúságú zsírsa­ vak oxidációja károsodhat; a leggyakoribb a közepes hosszúságú acil-CoA-dehidrogenáz elégtelensége. Atünetek többnyire több óráig tartó éhezést követően jelentkeznek, általában már az első két életévben, há­ nyás, letargia, gyakran coma formájában. A zsír­ sav-oxidáció gátlása következtében ketontestek sem keletkeznek, az izmok csak glukózt égetnek, ami kö­ vetkezményes hypoglykaemiához vezet. A közepes

szénlánchosszúságú zsírsavak alternatív úton alakul­ nak át, részben az ©-szénatomon oxidálódnak és kö­ zepes hosszúságú dikarbonsavak jönnek létre, részben glicinnel és kamitinnel észtereket alkotnak, amelyek a vizeletben megjelennek és a diagnózis megállapítását teszik lehetővé. Hosszan tartó éhezés elkerülésével, kamitinadással és szénhidrátokban gazdag étrenddel a metabolikus komplikációk elkerülhetők és az érintett egyének egyensúlyban tarthatók.

A páratlan szénatomszámú és a telítetlen zsírsavak oxidációja A szervezetben oxidálódnak - bár lényegesen ki­ sebb mennyiségben, mint a telített, páros szén­ atomszámú zsírsavak - a páratlan szénatomszámú és a telítetlen zsírsavak is. Ehhez a P-oxidáció enzimein kívül néhány kiegészítő enzimre is szükség van.

II I .

218

A páratlan szénatomszámú zsírsavak oxidáció­ ja az utolsó ciklusig ugyanúgy történik, mint a palmitinsav oxidációja (8-21. ábra). Itt azonban nem acetil-CoA, hanem a három szénatomos propionilCoA keletkezik. A propionil-CoA-ból karboxilálással metil-malonil-CoA keletkezik (8-24. ábra). A propionil-CoA-karboxiláz, csakúgy, mint számos egyéb karboxiláz, biotin-kofaktorral működik. A metil-malonilCoA a szénatomok átrendeződésével a metil-malonilCoA-mutáz hatására szukcinil-CoA-vá alakul, ami be­ lép a citromsavciklusba. Propionil-CoA keletkezik a metionin, a treonin és az izoleucin lebontása során is, és ugyanebben a folyamatban alakul szukcinilCoA-vá.

zpropionil-CoA HCCL propionil-CoAkarboxiláz

ATP

A

ADP + P,

C °°-

CH3—CH— C —S —CoA metil-malonil-CoA metil-malonilCoA-mutáz

O -QOC —CH2—CH2— C / -—S —C oA szukcinil-CoA 8-24. ábra. A propionil-CoA metabolizmusa

Klinikai vonatkozások A metil-malonil-CoA-mutáz működéséhez B12-vitaminra van szükség, melynek hiányában ez a reakció nem történik meg, és propionsav és metil-malonsav jelenik meg a vizeletben. A mutáz enzim veleszületett hiánya okozza az öröklődő metil-malonsavas acidaemiát és aciduriát, melyben metil-malonsav szapo­ rodik fel a vérben és jelenik meg a vizeletben.

AZ ANYAGCSERE

A telítetlen zsírsavak oxidációját is nagyrészt a p-oxidáció enzimei végzik. Amennyiben a zsírsavban a kettős kötés transz-konfigurációjú és a (3-oxidációban, amikor a folyamat eljut a kettős kötésig - helyze­ te A2, vagyis megegyezik azzal, ami a p-oxidációban amúgy is kialakulna akkor az első dehidrogenálási lépés kivételével az oxidációt a P-oxidáció további en­ zimei végzik. Néhány ettől eltérő helyzet is lehetsé­ ges, melynek megoldására további enzimekre van szükség. Ha a kettős kötés a megfelelő helyen van, de a molekula cAz-konfigurációjú (8-25/a ábra), akkora P-oxidációban megtörténik a hidratálás, mely azonban nem L - , hanem D-hidroxi-acil-CoA-t eredményez, s ez nem szubsztrátja a következő, NAD -dal működő dehidrogenáznak. Ilyenkor egy epimeráz megváltoz­ tatja a konfigurációt, és a molekula már tovább alakul­ hat. Ha a kettős kötés a 3-4-es szénatom között találha­ tó, s a molekula cAz-konfígurációjú (8-25/b ábra), ak­ kor egy izomerázra van szükség, ami egyszerre vál­ toztatja meg a kettős kötés helyzetét és a konfiguráci­ ót, létrehozva a transz-A2 módosulatot. Ezt az inter­ mediert az első dehidrogenálás kivételével a P-oxidáció enzimei alakítják tovább. A linolsav (18A9,12) oxidációjában fordul elő, hogy az első négy acetil-CoA keletkezése után a P-oxidáció következő fordulójában az eredetileg a 12-13-as szénatomok közötti kettős kötés a 4-5. szén­ atomok között helyezkedik el (8-25/c ábra). Az acil-CoA-dehidrogenáz által katalizált oxidáció egy transz-A2, c/.vz-A4-enoil-CoA-t hoz létre. Ezt a prob­ lémát egy olyan reduktáz oldja meg, amely NADPHval működik és redukcióval egy transz-A3-enoilCoA-t eredményez, amely izomerizációval transzA2-enoil-CoA-vá alakul, és szubsztrátja a P-oxidációban az enoil-CoA-hidratáznak. A telítetlen zsírsavak oxidációja természetesen ke­ vesebb ATP szintézisét teszi lehetővé, mint az ugyan­ olyan szénatomszámú telített zsírsavaké, mivel keve­ sebb redukált FAD keletkezik, ami a terminális oxidá­ cióban ATP szintézisét eredményezné.

219

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

H H I I

n //

CH3— (CH2)n— CH2— C = C — C — S — CoA 4

5

3

4

3

—CoA

2

c/sz-A4-enoil-CoA

c/sz-A2-enoil-CoA

acil-CoAdehidrogenáz

^

f hidratáz

H H I I CH3- (CH2)4- c = c - ch2—ch2- -C — S

H

H H

O ^

I

CHg— (CH2)n—CH2— C —CH2—C —S —CoA

CH3— (CH2)4— C = C — C = C — C — S — C oA 5

4

3

OH

|

2

1

H

p-D-hidroxi-acil-CoA

frar?sz-A2-cisz-A4-enoil-CoA NADPH + H+

epimeraz fépi' | reduktáz OH

i

r

O

S * NADP

CHg— (CH2) — CH2— C — CH —C — S —CoA

H CH 3- ( C H 2)4- C H 2— C = C — CH2— C - S - C

p-L-hidroxi-acil-CoA

I

H

I

I

4

3

3

2

oA

1

H

[ p-oxidáció

íransz-A3-enoil-CoA

'V

H

|

4

H

O

CH3— (CH2)n- C = C — CH2- C —S —CoA 2

5

1

J 'O

CH3- ( C H 2)4- C H 2- C H 2— C = C —C — S -C o A 4

3

|

2

1

H fransz-A2-enoil-CoA

c/'sz-A3-enoil-CoA

ii ii v

tzomeraz

H

.0

P-oxidáció

CH3— (CH2)n—CH2— C = C — C —S —CoA 4

|

3

2

1

H transz-A2-ertoil-CoA

I

| p-oxidáció

8-25. ábra. A telítetlen zsírsavak oxidációjának kiegészítő lépései (az a, b és c reakciókhoz lásd a szöveget)

a-oxidáció és co-oxidáció Néhány esetben a P-oxidációnál leírtaktól némileg eltérően is történhet a zsírsavak oxidációja, ami mennyiségileg nem jelentős ugyan, azonban egy-egy esetben fiziológiai vagy patofíziológiai jelentőségű le­ het. Ilyen az a-oxidáció, amikor rövidebb szén­ atomszámú zsírsavak a-szénatomján történik egy

CH,

I 3

CH 3

I 3

CH 3

I 3

CH 3

l

a

CHj— CH - (CH2)3- CH - (CH2)3- CH - (CH2)3- CH - CH2- COO'

hidroxilálás, s az ezt követő dekarboxilálás után kez­ dődik el a p-oxidáció. Ez történik a 8-26. ábrán látha­ tó fitánsav oxidációjában. Fitánsav a fitol metabolizmusában keletkezik és nagyobb mennyiségben, a tej­ ben és állati zsírokban található. A P-oxidáció a 3. szénatomon lévő -CfE-csoport miatt csak akkor tud elkezdődni, ha először megtörténik az a-szénatomon a hidroxilálás, majd a dekarboxilálás. Ezt követően a

8-26. ábra. Fitánsav

I II.

220

P-oxidációban három propionil-CoA, három acetilCoA és egy izobutiril-CoA molekula keletkezik. A hidroxilálás valószínűleg az endoplazmás retikulumban és a mitokondriumban történik az ún. kevert funkciójú oxigenázok részvételével.

Klinikai vonatkozások Egy ritka genetikai betegségben, a Refsum-kórban nem történik meg az a-hidroxiláció, a fitánsav nem bomlik le, hanem felhalmozódik a szövetekben és a szérumban, aminek súlyos neurológiai következmé­ nyei vannak (retinitis pigmentosa, perifériás neuropathia, cerebellaris ataxia). A tejtermékek és a hús fo­ gyasztásának visszaszorításával az állapot lényegesen javítható.

Szintén ritkán, de előfordul, főleg a közepes szén­ atomszámú zsírsavakkal, hogy a hidroxilálás az omega-szénatomon történik (omega-oxidáció), s to­ vábbi oxidációval dikarbonsav alakul ki. A dikarbonsavak bármelyik karboxilcsoporton aktiválódhat­ nak és a P-oxidációban rövidebb szénláncú dikarbonsavvá alakulnak. A folyamat elsősorban a peroxiszómákban történik, szintén kevert funkciójú oxigenázok részvételével.

8 .7

A KETONTESTEK K E L E T K E Z É S E ÉS FELHASZNÁLÁSA. K ET O N A EM IA , K ET O N U R IA

A ketontestek az acetil-CoA-ból keletkező, vízoldékony molekulák, amelyek elsősorban a májban, kisebb mértékben a vesében szintetizálódnak és a pe­ rifériás szövetek számára alternatív energiaforrásul szolgálnak. A ketontestek szintézise a 8-27. ábrán látható mó­ don a máj sejtek mitokondriumában történik. Két mo­ lekula acetil-CoA-ból a P-ketotioláz hatására acetoacetil-CoA keletkezik, amely egy újabb acetil-CoA-

AZANYAGCSERE

val 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA-vá (HMG-CoA) alakul. Ez a szintézis sebességmeghatározó lépése, amit a ElMG-CoA-szintáz katalizál. A HMG-CoA-ból a HMG-CoA-liáz hatására keletkezik egy acetil-CoA és az acetecetsav. Az acetecetsavból redukcióval ala­ kul ki egy másik ketontest, a p-hidroxivajsav (p-hidroxi-butirát). Ennek az átalakulásnak a sebessége a mitokondriumban lévő NADII/NAD aránytól függ. A HMG-CoA-szintáznak két izoenzime létezik, ame­ lyek különböző kompartmentekben helyezkednek el: a mitokondriumban található az egyik izoenzim, a citoplazmában pedig a másik. Intramitokondriálisan HMG-CoA-szintáz elsősorban a májban található, ezért jelentős mértékben ketontestszintézisre itt van lehetőség. A citoplazmában csaknem minden sejtben keletkezik EIMG-CoA a citoplazmatikus HMG-CoAszintáz hatására. A citoplazmában nincs liáz enzim, vagyis ketontestek nem keletkeznek, a HMG-CoA itt a koleszterinszintézisben alakul tovább (lásd később). Kis mennyiségben, az acetecetsav-dekarboxiláz hatására az acetecetsavból aceton keletkezik, ami pa­ tológiás körülmények között, pl. diabeteses ketoacidosisban olyan mennyiséget érhet el, hogy a tüdő­ ben kiválasztódik, és érzékelhetővé válik a leheletben. A ketontestek a májsejtekből a keringésbe diffundálnak, s mivel viszonylag jól oldódnak vizes közeg­ ben, carrier nélkül szállítódnak a perifériás szervek­ hez. A sejtekbe diffúndálva a mitokondriumban a P-hidroxi-butirát a P-hidroxi-butirát-dehidrogenáz hatására oxidálódik acetoacetáttá, az pedig a P-ketoacil-CoA-transzferáz hatására acetoacetil-CoA-vá alakul, amiből a tioláz által katalizált reakcióban 2 acetil-CoA keletkezik, s ez a citromsavciklusba lépve eloxidálódik (8-28. ábra). A májsejtekben hiányzik a CoA-transzferáz, vagyis a ketontestek nem tudnak a keletkezés helyén azonnal eloxidálódni. Normális körülmények között, egyensúlyban lévő metabolizmus során is keletkeznek ketontestek, ame­ lyek koncentrációja a vérben a 0,2 mM-t nem haladja meg. A perifériás szervek, különösen a szívizom és a vesekéreg ilyen körülmények között is oxidálnak ketontesteket, sőt előnyben is részesítik őket a glukóz­ zal szemben. Nagyobb mennyiségben akkor keletkeznek keton­ testek, amikor a metabolizmusban az egyensúly a zsír-

221

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

acetil-CoA

CoA-SH

2 ChL— C — S-CoA f tioláz

CoA-SH

HMG-CoA-szintáz acetoacetil-CoA

2 acetil-CoA

3-hidroxi-3-metil-glutaril (HMG-CoA)

o II

V

acetecetsavdekarboxiláz

HMG-CoA-ház

0 II

c h 3— c

c h 3— C — c H3

— c h 2— c o c r

acetoacetát

aceton NADH + NAD+

OH I

p-hidroxi-butirátdehidrogenáz

c h 3— c h —c h 2— COO' p-hidroxi-butirát

8-27. ábra. A ketontestek - acetoacetát, p-hidroxi-butirát, aceton - keletkezése a májban

8-28. ábra. A ketontestek keletkezésének és felhasználásának összefoglalása. A piros nyilak azokat a folyamatokat jelzik, amelyek fokozottan érvényesülnek éhezésben és inzulinhiányos diabetesben

I I I.

222

savak oxidációja felé tolódik el. Ez történik éhe­ zésben, amikor szénhidráthiány alakul ki, vagy inzu­ linhiányos diabetesben, amikor a sejtek - a magas vércukorszint ellenére - relatív szénhidrátínségben vannak. Ilyenkor az energiaszükséglet fedezésére a sejtekben, a májsejtben is, előtérbe kerül a zsírsavak oxidációja. Ahhoz, hogy a (3-oxidációban keletkező acetil-CoA a citrátkörbe léphessen, elegendő mennyi­ ségű oxálacetátra van szükség, ami azonban ilyen esetben nem áll rendelkezésre, mert a májban a relatív glukózhiány kompenzálására megindul a glukoneogenezis, melyben elhasználódik az oxálacetát egy ré­ sze. A citrátkör nem tudja felvenni a nagy mennyiség­ ben keletkező acetil-CoA-t, ami ilyenkor fokozott mértékben terelődik a ketontest-keletkezés irányába (8-28. ábra). A P-oxidációban termelődő acetil-CoA a HMG-CoA-szintáz néhány lizin oldalláncának acilezéséhez vezet, ami az enzim gátlását okozza. így dön­ tő jelentőségű az, hogy éhezésben a mitokondriális szirtuin, a SIRT3 aktivitása megnő, ez a HMGCoA-szintázt deacetilálja és aktiválja a ketontesttermelést. A periférián a sejtekben a glukózhiány mi­ att fokozott jelentőségűvé válik a ketontestek égetése, különösen az agyban, ahol elenyésző a zsírsavégetés. Éhezésben és diabetesben az agyszövet - ahol normá­ lis metabolizmus mellett glukózégetés folyik - az energiaszükségletének akár 75%-át is képes ketontes­ tekből fedezni.

AZANYAGCSERE

5 g-ot. A ketontestek hidrofil molekulák, kiválasztá­ suk jelentős vízveszteséggel is jár, ami a keringő vér­ térfogat csökkentésével tovább rontja a beteg állapo­ tát.

8 .8

A K O LESZ T ER IN M ETABOUZM USA

A koleszterin a szervezet egyik legellentmondáso­ sabb molekulája, amely minden sejtben megtalálható, és életfontosságú funkciók ellátásához nélkülözhetet­ len, ugyanakkor, ha a normálisnál nagyobb mennyi­ ségben fordul elő, korunk egyik leggyakoribb beteg­ ségének, az atherosclerosisnak és ennek következté­ ben a szívinfarctus és az agyvérzés kialakulásának lehet kiinduló tényezője. A koleszterin minden sejtmembránnak alkotóré­ sze, és fontos feladata a membránok fluiditásának szabályozása. Koleszterinből történik a különböző szteroidhormonok szintézise, amelyek esszenciáli­ sak a normális metabolizmus, a só- és vízháztartás és a nemi működések szabályozásához egyaránt. Kolesz­ terin a kiinduló anyaga a D3 -vitamin és az epesavak szintézisének is, ez utóbbiak a lipidek emésztéséhez szükségesek. A koleszterin ciklopentanoperhidrofenantrénvázat tartalmazó 27 szénatomból álló molekula, amelynek képletét és a szénatomok számozását a 8-29. ábra mutatja.

Klinikai vonatkozások 21

Amikor a ketontestek keletkezésével nem tart egyen­ súlyt a periférián történő oxidáció, ketonaemia alakul ki. A ketontestek fokozott mértékű keletkezése éhe­ zésben normális regulációnak tekinthető, s ilyenkor a vérben a koncentráció 3-5 mM is lehet (fiziológiás ketosis). Ezzel szemben a diabeteses ketoacidosis olyan patológiás körülmény, amelyben a ketontestek koncentrációja a 20 mM-t is elérheti a vérben. Tekin­ tettel arra, hogy a ketontestek savak (pKs3,5), jelentő­ sen csökkentik a vér pH-ját (metabolikus acidosis). A ketontestek megjelennek a vizeletben (ketonuria), súlyos diabetesben a napi ketontestürítés elérheti az

22

24

27

8-29. ábra. A koleszterin képlete

A szteránvázhoz (A-, B-, C-, D-gyürük csupa íransz-konfigurációjúak) két anguláris metilcsoport, a C18 és C19 kapcsolódik, amelyek a gyűrű síkja elé

223

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É I É

irányulnak, azaz (3-konfigurációjúak. A C3-hoz egy szintén (3-konfigurációjú szekunder alkoholos hidroxilcsoport, a Cl7-hez egy nyolc szénatomból álló alifás oldallánc kapcsolódik, és a B-gyürűben a C5-C6 között egy kettős kötés található. A szervezetben előforduló koleszterin 70%-a nem szabad koleszterinként, hanem koleszterin-észterként van jelen, amelyben az alkoholos OH-csoporthoz észterkötéssel kapcsolódik egy zsírsav, legtöbb eset­ ben olajsav vagy linolsav. A koleszterin vízben na­ gyon rosszul oldódó, hidrofób molekula, ezért kulcs­ kérdés azoknak a mechanizmusoknak a normális mű­ ködése, amelyek a szervezetben megakadályozzák a szabad koleszterin felhalmozódását és koleszterin­ kristályok kialakulását.

Akoleszterin szintézise Az életfontosságú funkciók ellátásához a megfele­ lő mennyiségű koleszterin két forrásból áll rendelke­ zésre; részben a táplálékkal kerül a szervezetbe, rész­ ben de novo szintetizálódik. Koleszterinszintézis a legtöbb sejtben folyik, azonban azokban a szervekben, ahol a koleszterinből más anyagok szintetizálódnak, vagyis koleszterinre nagyobb mennyiségben van szükség, a szintézis is nagyobb mértékű és jelentősé­ gű. így kitüntetett fontosságú elsősorban a májban, valamint a mellékvesében, az ovariumban és a testisben folyó koleszterinszintézis. Jelentős mennyisé­ gű koleszterin szintetizálódik még a bélhámsejtek­ ben. A máj a koleszterin de novo szintézisén kívül meghatározó szerepet játszik a táplálékkal a szerve­ zetbe került koleszterin további sorsában és szervek­ hez történő szállításában is.

A szintézis a sejtek citoplazmájában megy végbe egy soklépéses reakció során, amelynek egyes enzi­ mei a citoszolban, mások az endoplazmás retikulum membránjához kötve helyezkednek el. A koleszterin­ szintézis lépései és a keletkező intermedierek a 8-30. ábrán láthatók. A szintézis acetil-CoA-ból indul ki; a koleszterin minden szénatomja acetil-CoA-ból származik. Az acetil-CoA citrátba épülve szállítódik a mitokondriumokból a citoplazmába, ahol az ATP:citrát-liáz ha­ tására válik szabaddá (8-4. ábra). A szintézis első sza­ kasza, amelyben mevalonsav keletkezik, a reguláció szempontjából a legfontosabb. A szintézis első lépései azonosak a ketontestek szintézisénél leírtakkal, vagyis a tioláz által katalizált reakcióban 2 acetil-CoA-ból acetoacetil-CoA keletkezik, majd még egy acetilCoA-val kondenzálódva, a HMG-CoA-szintáz hatásá­ ra 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA jön létre (8-31. áb­ ra). Ezek a reakciók, szemben a ketontestek szintézi­ sével, minden sejtben a citoplazmában történnek. A HMG-CoA a következő lépésben mevalonsawá alakul, amelyben redukcióval egy alkoholos OHcsoport alakul ki, koenzim-A felszabadulása közben. A reakciót a HMG-CoA-reduktáz katalizálja, amely az endoplazmás retikulumban lokalizálódó enzim és működéséhez NADPH-ra van szükség. Ez a koleszte­ rinszintézis sebességmeghatározó lépése, a HMGCoA-reduktáz szabályozásán keresztül valósul meg az egész szintézis regulációja. A mevalonsav két, egy­ mást követő lépésben, az ATP terminális foszfátcso­ portját felhasználva 5-pirofoszfomevalonsavvá ala­ kul. Ez az intermedier egy újabb ATP felhasználásá­ val dekarboxilálódik, és kialakul az az öt szénatomos izoprénegység, ami a további lépésekben a koleszterin szénatomjait szolgáltatja. Ez az öt szénatomos izo-

i -1 ^ A f acetil-iCoA ------------- > acetoacetil-CoA

10

I"foszfomevalonsav

h

15 ( farnezil-pirofoszfát

:

5-pirofoszfomevalonsav| —> ( izopentenil-pirofoszfát | — 30 szkvalén

30 ------------->panoszterin

geranil-pirofoszfát 27 koleszterin

8-30. ábra. A koleszterinszintézisben keletkező intermedierek. A számok az intermedierek szénatomszámát mutatják. HMG-CoA, 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA

I II.

224

citoplazmatikus HMG-CoA-szintáz

CH,

CH,

c= o I

tioláz

I c=o — I S-CoA

COCr 1 CH0 1 2 CH, •C—OH

r

acetil-CoA

CH,

I I

CoA-SH

CH,

T

' c= o

2 NADPH + 2H+ 2NADP+

c= o

■SH S —CoA

2 acetil-CoA

' HMG-CoAreduktáz

mevalonát CH, CH,

vV

X

-0 -

1

V

ADP

CM

ADP ATP

ATP

CH. — C — OH

V ^

ADP

CH, CH,

+P

^

1

>

\

CH, c h 2- o -

CH, -OH

3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA

COCr

ATP

cooI CH, I 2 CH,— C — OH I CH, I

CoA-SH

S — CoA

acetoacil-CoA

AZ ANYAGCSERE

HCOy

Q -- Q

5-pirofoszfomevalonát

vV c

2

CH

I

1

CH,

CH,

C H -O -Q -Q

CH,

I 2

C —CH,

izopentenil-pirofoszfát

I

A

CH

I

PP;

CH, CH,

geranil-pirofoszfát

\V J C II CH I

CH, - 0 - & 4 - Í

dimetil-allil-pirofoszfát izopentenil-pirofoszfát

CH,

^3\

S>

CH,

I

- > 1

T —CH — c h 2-§>-c h 2—c = c h - c h 2- ^ - c h 2—c = c h - (

CH,

PP: NADPH + H+

farnezil-pirofoszfát NADP+ >

farnezilpirofoszfát

szkvalén

2PP|

8-31. ábra. A koleszterinszintézis lépései a szkvalén kialakulásáig

prén, az izopentenil-pirofoszfát, illetve a belőle izomerizációval kialakuló dimetil-allil-pirofoszfát. A ko­ leszterinszintézisben a következő intermedier, a 10 szénatomos geranil-pirofoszfát egy izopentenil-piro­ foszfát és egy dimetil-allil-pirofoszfát kondenzációjá­ val jön létre, s ebből egy újabb izopentenil-pirofoszfáttal történő kondenzáció során a 15 szénatomos far­ nezil-pirofoszfát. Két farnezil-pirofoszfát kondenzá­ ciója hozza létre a 30 szénatomos szkvalént, miközben pirofoszfát szabadul fel, s ebben a reakcióban ismét NADPH-ra van szükség. A reakciót katalizáló szkvalén-szintáz az endoplazmás retikulumban található. A szkvalénben a gyűrűs szerkezet még nem alakult ki, noha a molekula már bizonyos mértékben emlékeztet

a koleszterinvázra (8-32. ábra). A gyűrű záródása egy epoxid kialakulásával kezdődik, ugyanis egy monooxigenáz hatására molekuláris CE-ből egy oxigénatom épül be úgy, hogy kapcsolódik mind a C2-, mind a C3-atomokhoz. A kialakuló szkvalén-2,3-epoxidbana kettős kötések 71-elektronjai elmozdulnak, és megtör­ ténik egy cikláz által katalizált reakcióban a gyürüzáródás. A lanoszterinben jelen van már a P-orientációjú C3-OH-csoport. A gyűrűzáródáshoz a szkvalén egy carrier fehérjéhez (sterol carrier protein; SCP) kötő­ dik, majd a keletkező lanoszterin egy másik fehérjé­ hez (SCP2) kapcsolódik, és kialakul a koleszterin. Eb­ ben a reakcióban több lépésben, oxigén, NADH és NADPH részvételével, három metilcsoport (C4 és

225

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

| c ik lá z

v

k o le s z te rin

la n o s z te rin

8-32. ábra. A koleszterin keletkezése szkvalénból

Ci4-ről) CO2 formában felszabadul, a B-gyürüben a kettős kötés a C5-C6 helyzetbe kerül, és NADPH-val redukálódik az oldalláncon a C24-C25 kettős kötés. Egy molekula koleszterin szintéziséhez 18 mole­ kula acetil-CoA használódik fel és 36 molekula ATP-re van szükség. 18 ATP az ATP:citrát-liáz reak­ cióban használódik fel, amelyben a mitokondriumból citrát formában a citoplazmába transzportált acetilCoA visszaalakul. A felhasznált NADPH nagy része a glukóz direkt oxidációban keletkezik. A koleszterin­ szintézisben tehát jelentős energia- és reduktív ekvi­ valens felhasználás történik. A koleszterinből a sejtek mitokondriumjaiban vagy az endoplazmás retikulumban, a citokróm-P450rendszerhez tartozó koleszterin-hidroxilázok közre­ működésével különböző oxidált származékok, az ún. oxiszterolok jönnek létre, amelyekben a koleszterin­ molekula valamelyik C-atomja oxidálódik. A külön­ böző oxiszterolok eltérnek aszerint, hogy az oxigén milyen formában (hidroxil, keto, epoxi stb.) és melyik C-atomra épül be a molekulában, és hogy mi a bioló­ giai szerepük (8-33. ábra). Oxiszterolok nem-enzimatikus reakciókban, gyakran szabadgyökös reakciók­

ban (autoxidációval) is keletkeznek. Féléletidejük a koleszterinénél jóval rövidebb, így a koleszterinkatabolizmus egyik lehetőségének is tekinthetők. Bár kis mennyiségben vannak jelen mind a szövetekben, mind a vérben (koncentrációjuk itt 0,1-0,01 pM, szemben a 5 mM koleszterinkoncentrációval) külön­ böző oxiszterolok fontos szerepet játszanak számos életfolyamatban (pl. szfmgomielinszintézis szabályo­ zása, apoptózis, trombocitaaggregáció, epesavak szin­ tézise, szteroidhormonok szintézise) és különösen a koleszterinszintézis regulációjában. Az oxiszterolok a sejtekben szabadon vagy a 3-OH-csoporton keresztül (a koleszterin-észterekhez hasonlóan, lásd alább) észteresített formában fordul­ nak elő. Atheroscleroticus plakkokban például az oxiszterolok >80%-a észterezett. Oxiszterolok a táplá­ lékkal is bekerülhetnek a szervezetbe, a vékonybélben felszívódnak, a keringésben a koleszterinhez hasonló­ an szállítódnak (lásd alább), de a koleszterinnél gyor­ sabban jutnak át a membránokon, mivel a koleszterin­ hez képest polárosabb vegyületek. A nagyszámú oxiszterol közül megemlítendő a 7aés a 27-hidroxikoleszteron, amelyek a májban kelet­ keznek a 7a-, illetve a 27-koleszterin-hidroxiláz hatá-

226

I II.

AZANYACCSERE

nokbán keletkezik, mert az ezt előállító enzim csak itt expresszálódik, és fontos szerepet játszik a központi idegrendszerben a koleszterin-háztartás szabályozásá­ ban. A szervezetben található összes koleszterin 25%-a az agyban található, és ennek is 70%-a a mielin alkotásában vesz részt. Az agy koleszterinnel való el­ látását, amely független a keringő koleszterin mennyi­ ségétől, teljes egészében az itt zajló koleszterinszinté­ zis biztosítja. Az agyból folyamatosan 24(S)-hidroxikoleszterin kerül a keringésbe, és lipoproteinekkel a májba jutva ott átalakulhat. A 25-hidroxikoleszterin keletkezésében a citokróm-P450 enzimeken kívül dioxigenázok is szerepet játszanak, s bár viszonylag kis mennyiségben keletkezik, de fontos szerepet ját­ szik a koleszterinszintézis szabályozásában. Hasonló jelentőséggel bír a 24- és 27-hidroxikoleszterin és a 24(S-), 25-epoxikoleszterin is. Mint alább látni fog­ juk, ezek az oxiszterolok az LXR magi árva receptor (liver [máj] X receptor) ligandjai, és befolyásolják a koleszterinszintézist és egyéb, a zsíranyagcserét meg­ határozó enzimek génjének az expresszióját. Az oxi­ szterolok kötődnek fehérjékhez a citoplazmában is, ily módon vesznek részt annak a regulációnak a működé­ sében, amely a SREBP-n (sterol regulatory elementbinding protein) keresztül a koleszterinszintézis leg­ fontosabb enzimjének, a HMG-CoA-reduktáznak a mennyiségét befolyásolja (lásd alább).

A koleszterinszintézis regulációja

24(S)-hidroxikoleszterin 8-33. ábra. Koleszterinből keletkező néhány fontos oxiszterol képlete

sára és intermedierek az epesavak szintézisében, de 27-hidroxikoleszterin keletkezik pl. a tüdőben is. A 24(S)-hidroxikoleszterin kizárólag az agyi neuro­

A koleszterin de novo szintézisének szabályozása egyike azoknak a tényezőknek, amelyek szerepet ját­ szanak a normális plazmakoleszterin-szint reguláció­ jában. Mivel az endogén koleszterin szintézisében mennyiségileg a legfontosabb szerepet a máj, kisebb részben a bél játssza, a szintézis szabályozásának is itt van a legnagyobb jelentősége. A szabályozásban, je­ len ismereteink szerint, a HMG-CoA-reduktáz regu­ lációja játssza a meghatározó szerepet. Az enzim két mechanizmussal szabályozódik: egy­ részt a meglevő enzim aktivitása változhat, másrésztés a koleszterin-anyagcsere szabályozása szempontjá­ ból ez a fontosabb - az enzim mennyisége változhat a génexpresszió szabályozása, illetve az enzimfehérje

227

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

oxiszterol f energiaellátottság ^ | lanoszterin lebomlása révén. Az enzim rövid (transzkripció) (ATP-szint^, AMP-szint'f) (lebontás) távú szabályozása függ a sejtek ___ / és a szervezet energiaellátottsá­ f foszforiláció gától, s ez foszforiláció-defoszfo(AMPK) riláció révén valósul meg (8-34. / m ábra). Foszforiláció az enzimak­ tivitás csökkenését, defoszfori—> f mevalonsav---- > fikoleszterin [ acetil-CoA---- >f HMG-CoA láció az enzim reaktiválását idézi a elő. A sejtekben az ATP-szint gátló hatású gyógyszerek csökkenése, amit az AMP-szint (statinok) emelkedése kísér, aktiválja az 8-34. ábra. A hidroxi-metil-glutari-CoA-reduktáz (HMG-CoA-reduktáz) aktivi­ AMP által aktivált kinázt tásának szabályozása. AMPK, AMP-aktivált kináz (AMPK), ami - egyéb fehérjék mellett - a HMG-CoA reduktázt zulin hatására létrejön-e az enzim defoszforilációja és foszforilálja, és ezáltal a koleszterinszintézist csök­ aktiválása. kenti. (Az AMPK-ról a 20. fejezetben bővebben szó­ A koleszterinszintézis szabályozásában fontosabb lunk.) Glukagon hatására úgyszintén megtörténik az szerepet játszik a HMG-CoA-reduktáz mennyiségé­ enzim foszforilációja és gátlása, míg vitatott, hogy in­

alacsony koleszterin- és oxiszterolszint

SREBP

Golgi-membránban két proteáz kihasítja a regulátoros domént

sejtmag

SRE HMG-CoA-reduktáz-szint f LDL-receptor-szám + 8-35. ábra. A hidroxi-metil-glutari-CoA-reduktáz (HMG-CoA-reduktáz) mennyiségének szabályozása. Az ábra értelmezé­ séhez lásd a szöveges leírást

228

nek változása. Ebben a koleszterin és az oxiszterolok játsszák a meghatározó szerepet, ez utóbbi mennyisé­ ge a koleszterinszint változását követi. Az alapvető mechanizmus itt a génexpresszió szabályozása egy sok komponensü folyamat végén (8-35. ábra). A HMG-CoA-reduktáz gén expressziója a sterol regulatory element-binding proteinek (SREBP) nevű transzkripciós faktorok szabályozása alatt áll. Az SREB fehérjék a koleszterinszintézis és -felvétel, illetve a zsírsavszintézis számos egyéb fehérjéinek génátkását is regulának. Magas koleszterinszint mellett az endoplazmás retikulum membránjában egy koleszterinszenzomak is tekinthető fehérje, a SCAP (SREBP cleavage [hasí­ tó] activating protein) köti a SREB fehérjét, valamint egy másik, Insig (//isulin- induced^ene) nevű fehérjét is. Ilyenkor a megfelelő kötőhelyen koleszterin kap­ csolódik a SCAP-hoz, az oxiszterolok pedig az Insig fehérjéhez kötődnek. Ebben a kihorgonyzott formá­ ban a SREB fehérje génexpresszió szempontjából ak­ tív része, a regulátoros dómén (ami egy helix-loophelix leucincipzár transzkripciós faktor) nem tud eljut­ ni a magba, a DNS közelébe. Ez akkor történik meg, amikor alacsony koleszterinszint mellett koleszterin (és esetleg oxiszterol) nem kapcsolódik a megfelelő fehérjékhez. Ekkor a SREBP-SCAP komplex, egy kí­ sérő fehérjével együtt a Golgi-ba vándorol, ahol két proteáz kihasítja a SREB fehérjéből az aktív transz­ kripciós faktort, ami aztán a magba vándorolva, a DNS-en a megfelelő gén promóter régióján kötődik (SRE, sterol regulatory element), és elindítja a HMG-CoA-reduktáz, az LDL-receptor, a SREBP és egyéb gének transzkripcióját. így végeredményként, fokozódik a koleszterinszintézis sebessége és az LDL-receptorokon keresztül a koleszterin sejtekbe történő felvétele is. Magas koleszterinszint nemcsak a HMG-CoA reduktáz szintézisét állítja le a fenti módon, hanem a meglevő enzim mennyiségét is csökkenti, mert ilyen­ kor a megnövekedett oxiszterol és a következményes kötődés az Insig fehérjén elindítja a HMG-CoA reduktáz ubikvitinálódását és degradációját. Ennek előfeltétele, hogy lanoszterin, ami jelzi az endogén szintézis fokozott aktivitását, kötődjön a HMG-CoAreduktázhoz.

III.

AZANYAGCSERE

A magas koleszterinszint részben oxiszterolokon keresztül egy másik transzkripciós faktor, az LXR működését is befolyásolja. Az LXR (liver X receptor) egy olyan magi receptor, amely a májban, adipocitákban, vékonybélben, vesében, makrofágokban expreszszálódik és számos olyan fehérje génjének az átírását regulálja, amelyek a koleszterin felszívódásában, a reverz koleszterintranszportban, az epesavak szintézi­ sében, valamint a zsírsavak és a glukóz anyagcseréjé­ ben játszanak fontos szerepet. Az LXR egy másik ma­ gi receptorral, a retirvord X-receptorra\ (RXR) heterodimért alkot, és oxiszterolok hiányában egy ko­ mpresszorral kötődve ez a komplex gátolja számos gén átírását. Oxiszterolok/koleszterin kötődése az LXR-en, plusz a c/.vz-retinsav kötődése az RXR-en azt eredményezi, hogy a komplex elengedi a ko­ mpresszort, köti a koaktivátort és beindul az LXRE (response element) által kontrollált gének ex­ pressziója (8-36. ábra). A sejtek magas koleszterin­ szintje tehát a SREBP transzkripciós faktort némítja, az LXR-t aktiválja, és komplex génexpressziós válto­ zást okoz. Ez érinti a HMG-CoA-reduktáz szintézisé­ nek a csökkenését (SREBP-n keresztül), az LXR-n ke­ resztül pedig számos, a koleszterin-háztartást befolyá­ soló enzim és transzporter fokozott szintézisét (apoproteinek a koleszterin szállításához, citokróm-P450 enzimek az epesavak szintéziséhez, ABC-transzpoterek a reverz koleszterintranszporthoz), sőt a lipidés glukózanyagcsere enzimeinek megnövekedett szin-

8-36. ábra. Koleszterin és oxiszterolok génexpressziót be­ folyásoló hatása magi LXR receptoron keresztül. LXR, liver X receptor; LXRE, LXR element; RXR, retinoid X receptor

229

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É I É

tézisét is (zsírsav-szintáz, acetil-CoA-karboxiláz, GLUT4). Relatíve magas koleszterinszint a májban a de novo szintézis eredményeként vagy koleszterinben gazdag táplálék elfogyasztása következtében jön létre. A táp­ lálékban jelen lévő koleszterint, mint a későbbiekben részletesen ismertetjük (238. oldal), a vékonybélből lipoproteinek - kilomikronok - szállítják a májhoz. A hepatociták membránjában receptorok ismerik fel és kötik meg a lipoproteineket, majd ezeket a koleszte­ rinnel együtt intemalizálják, s a sejten belül a kolesz­ terin felszabadul a lipoproteinből. Ugyanez a mecha­ nizmus biztosítja az LDL-ben (low density lipoprotein) szállított koleszterinnek a vérplazmából a sej­ tekbejutását. A lipoprotemekről és ezen mechanizmu­ sokról a későbbiekben részletesen is szó lesz (241. ol­ dal). Amikor tehát a táplálékkal elfogyasztott kolesz­ terin mennyisége megnő, a májban csökken a kolesz­ terin de novo szintézise. Ezzel szemben alacsony ko­ leszterintartalmú étrend mellett az endogén szintézis fokozódik. A sejten belüli koleszterinszint csökkentésén ke­ resztül befolyásolhatják a koleszterin-anyagcserét az epesavak. Mennyiségi szempontból ugyanis az epe­ savak szintézise jelenti a koleszterinátalakulás leg­ főbb útját. Amikor az epesavak szintézise fokozódik, megnő a májsejtek koleszterin iránti igénye. Ez azért érdemel külön említést, mert a kórosan megnöveke­ dett plazmakoleszterin-szint csökkentésében ennek a mechanizmusnak a kihasználása lehetőséget jelenthet aterápiában. Úgyszintén terápiás jelentőségű azoknak a gyógyszereknek, az ún. statinoknak a hatása, ame­ lyek közvetlenül gátolják a HMG-CoA-reduktázt, és ezáltal csökkentik az endogén koleszterinszintézist (lásd még alább).

A plazma koleszterinszintjének szabályozása komplex mechanizmus, amelyben a HMG-CoA-reduktáz szabályozásán kívül egyéb tényezők is fontos szerepet játszanak. Ennek részletes összefoglalására a felszívódás és a lipoproteinek tárgyalása után vissza­ térünk.

A koleszterin-észterek keletkezése A májban, illetve kis részben az extrahepatikus szervekben keletkező koleszterin további átalakulásai fontos élettani funkciókat szolgálnak (8-37. ábra). A koleszterin vízben rosszul oldódó molekula, ezért a sejtekben a feleslegben jelen lévő koleszterin, illetve a keringésben szállítódó koleszterin nem szabadon, ha­ nem észterek formájában található, amelyben a ko­ leszterin alkoholos OH-csoportjához észterkötéssel egy zsírsav kapcsolódik. Koleszterin-észterek kelet­ keznek a szervekben akkor, amikor a koleszterin fe­ leslegben van jelen és nem használódik fel sem a sejt­ membrán, sem hormonok vagy epesavak szintézisére. A koleszterin-észterek a sejtekben, elsősorban a máj­ ban, a mellékvesekéregben, a bélhámsejtekben és az artériák falában, aktivált zsírsavakból keletkeznek a 8-38. ábrán látható reakcióban. A szintézist az endoplazmás retikulumban található enzim, az acilCoA:koleszterin-aciltranszferáz (ACAT) katalizál­ ja. Amikor a sejtekben megnő a szabad koleszterin mennyisége, fokozódik az ACAT aktivitása és elrak­ tározódik az éppen fel nem használódó koleszterin. A mechanizmus emlékeztet a trigliceridszintézisnél látottakra, amennyiben a koleszterin-észterek is az ER membránban keletkeznek és foszfolipiddel fedett lipidcseppben válnak le a membránról.

membránalkotás

epesavak (máj)

lipoproteinekben történő szállítás

D-vitaminok (máj, vese) szteroidhormonok (mellékvesekéreg, gonádok)

oxiszterolok (máj, agy, egyéb szervek) koleszterin-észterek (máj, extrahepatikus szervek, keringés-HDL)

8-37. ábra. A koleszterin sorsa és átalaku­ lásai

III.

230

zsír;

I

acil-CoA: koleszterinaciltranszferáz (ACAT)

aktiválás

;g

f acil-CoA

AZANYAGCSERE

+ |jkoleszterin

-> fkoleszterin-észter + fCoA-SH endoplazmás retikulum

máj, bélhámsejtek, mellékvesekéreg, artériafal

H2C - 0 —C —(CH2)n- C H 3

I

c= o

CH,

C+-0—C —H

(CH2)7

h 2c

ni E N m

CH, I 2 CH

y

CH,

lecitin

lecitin: koleszterinaciltranszferáz (LCAT)

> (íkoleszterin-észter

CL

koleszterin

—o —p —o —c h 2—c h 2—n +— c h 3

CH

I

+

(jizolecitin

II CH I

(ch2)5 lecitin---------- > koleszterin-észter +

koleszterin linolsavas észtere

"7~

W'

—

HDL

8-38. ábra. A koleszterin-észterek keletkezése intracellulárisan (felső panel) és a high density lipoproteinben (HDL, al­ só panel)

Ettől eltérő mechanizmussal történik a koleszte­ rin-észterek keletkezése a plazmában. A keringésben a koleszterint - tekintettel arra, hogy erősen hidrofób lipoproteinek szállítják. A lipoproteinekben a kolesz­ terin mintegy 70%-a koleszterin-észterként van jelen. A lecitin :koleszterin-acil-transzferáz (LCAT) egy olyan enzim, amely a keringésben katalizálja a kolesz­ terin-észterek keletkezését, és a zsírsavat a lecitin 2. szénatomjáról (ahol általában linolsav található) adja át a koleszterinnek (8-38. ábra). A plazmában a reak­ ció a high density lipoproteinekben (HDL) történik, és a foszfolipid-szubsztrát is lipoproteinekből származik. A keletkező koleszterin-észterek hidrofób tulajdonsá­ ga a koleszterinnél erősebb, s azonnal a keletkezés után a HDL belsejébe kerülnek, s a májba szállítód­ nak. Ennek a mechanizmusnak fontos szerepe van a szervekben felhalmozódott koleszterin eltávolításá­ ban és májba történő szállításában (reverz koleszterin­ transzport, lásd még a lipoproteineknél). Az LCAT enzimet a máj szintetizálja és juttatja a keringésbe. Máj sejtkárosodással járó kórképekben csökken a plazmában a koleszterin-észterek mennyisége annak

következtében, hogy károsodik a májban részben az enzim, részben a foszfolipidek szintézise. A koleszterin-észtereket a koleszterin-észterázok hasítják, és koleszterin, valamint zsírsav keletkezik. Koleszterin-észterázok találhatók intracellulárisan a lizoszómákban, itt történik a lipoproteinekkel a sejtek­ be felvett koleszterin-észterek hidrolízise. Kolesz­ terin-észterázok szekretálódnak a pancreasból is, ame­ lyek hatása extracelluláris és feladata a táplálékkal a bélbe került koleszterin-észterek hasítása.

8 .9

AZ EPESA V A K KELETKEZÉSE, M E T A B O L IZ M U S A ÉS JELEN TŐ SÉGE

Az epesavak szintézise, amely a májban történik, mennyiségileg jelentősebb koleszterinfelhasználást jelent, mint a másik metabolikus út, a szteroidhormonok szintézise, ez utóbbi azonban a hormonok funkciója miatt kitüntetett jelentőségű.

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

Az epesavak a koleszterinből keletkező molekulák, amelyek számos, jelentős funkcióval rendelkeznek. Ezek a következők: 1. Szerepet játszanak a zsírok emésztésében. Mivel térben elkülönülő poláros és apoláros csoportokat tartalmaznak, detergens tulajdonsággal rendelkez­ nek; a vékonybélben a táplálékkal elfogyasztott zsírokat emulgeálják, felületüket megnövelik, en­ nek következtében a pancreas-lipáz számára a lipideket hozzáférhetőbbé teszik. Ezen túlmenően, micellákat képezve a keletkező szabad zsírsavakat eljuttatják a bélhámsejtek membránjához. 2. Feladatuk, hogy a foszfolipidekkel együtt oldatban tartsák az epébe kiválasztódó koleszterint, meg­ akadályozva ezáltal a koleszterin kiválását és ko­ leszterinkövek kialakulását. 3. A koleszterinkiürülés lehetőségét biztosítják. Jelen pillanatban nem ismert olyan enzimatikus mecha­ nizmus, amelynek során a koleszterin gyűrűs váza lebomlana, és a szervezetből kiürülne. Mennyisé­ gileg a legfontosabb lehetőség a koleszterin eltávo­ lítására az, hogy epesavak keletkeznek belőle, amelyek egy része (a koleszterin egy részével együtt) a széklettel kiürül. Az epesavak a májban keletkeznek. A koleszterin­ molekulán történő változások és a szintézis vázlatos összefoglalása a 8-39. ábrán látható. A szintézis sebességmeghatározó lépését a 7-a-hidroxiláz katalizálja, ami a koleszterin 7. szén­ atomján egy a-helyzetü alkoholos OH-csoportot ered­ ményez. A kólsav, az egyik elsődleges epesav, közve­ tett módon ebben a lépésben gátolja az epesavszintézist. A 3. szénatomon az OH-csoport P-konfigurációja a-ra változik. A kólsav kialakulásában a 12. szénatomon is hidroxilálás történik, ami után az 5-6. szénatomok közötti kettős kötés redukálódik. Az ol­ dalláncok rövidülnek, mégpedig úgy, hogy először hidroxilálás, majd további oxidáció történik a 26. szénatomon és kialakul egy karboxilcsoport. Hidroxiláció és oxidáció történik a 24. szénatomon is, ami után a 24. és 25. szénatom között a kötés felhasad, mi­ közben CoA-SH-val a kialakuló elsődleges epesavak aktiválódnak és propionsav keletkezik. Az elsődleges

231

epesavak, a kólsav és a kenodezoxikólsav, mielőtt a májból kiválasztódnak, glicinnel vagy taurinnal konjugálódnak, s ezek a konjugált elsődleges epesavak az epecsatomák felé hagyják el a májsejteket aktív transzporttal egy ABC-transzporter családba tartozó transzporter közreműködésével (Bile Salt Export Pump, BSEP). Az epesavak, mint a szerkezetükből látható, poláros és apoláros csoportokat egyaránt tar­ talmaznak. Az epesavak esetében az AB gyűrűk kon­ figurációja cisz, a poláros karakterű valamennyi funk­ ciós csoport azonos irányba orientálódik. így a mole­ kula amfipatikus jellegű: egyik oldala tisztán apo­ láros, míg a másik poláros. Az amfipatikus tulajdon­ ság meghatározó mind a lipidek emulgeálásában, mind a koleszterin oldatban tartásában. Az epesavak -COOH-csoportja, csakúgy, mint a konjugált szárma­ zékok -COOH-, illetve -SC^H-csoportjai savasan disszociálnak, az anionok Na+-, illetve K+-nal sókat alkotnak, amiért epesavas sóknak is nevezik őket. A nevezéktan nem egységes, használják ezt az elneve­ zést az epesavakra és a konjugált származékokra egy­ aránt. Az epesavak az epehólyagban tárolódnak és táplálékfelvételt követően, hormonok hatására a duodenumba ürülnek. A vékonybélben közreműködnek a lipidek emésztésében, a lipideket emulgeálják, ami esszenciális a pancreas-lipáz hatékony működéséhez, és így a trigliceridek és egyéb lipidek (pl. zsírban ol­ dódó vitaminok) tökéletes felszívódásához. Ezt a ha­ tást egészíti ki a pancreas lipáz/kolipáz fázishatár akti­ válása. A bélben bakteriális enzimek hatására az elsődle­ ges epesavak nagy része átalakul; dekonjugálódnak, a 7. C-atomon dehidroxilálódnak és kialakulnak a má­ sodlagos epesavak. A kólsavból dezoxikólsav, a kenodezoxikólsavból litokólsav keletkezik. A másod­ lagos epesavak és az át nem alakult elsődleges epesa­ vak nagy része nem vész el a szervezet számára, mert a vastagbél-mucosán keresztül felszívódnak és a portális keringéssel visszajutnak a májba, ahol a nem kon­ jugált származékok konjugálódnak és ismét kiválasz­ tódnak az epébe (8-40. ábra). A másodlagos epesavak felszívódása elsősorban a jejunumban és a colonban passzív diffúzióval történik. Az elsődleges epesavak az ileumban aktív transzporttal, egy Na+-epesav (2:1) kotranszporter segítségével kerülnek be az entero-

III.

232

citákba. A portális keringésben az epesavak albumin­ hoz kötve szállítódnak, innen megint egy Na+-kotranszporter juttatja vissza őket a hepatocitákba. Az epesavaknak egy kis része, napi kb. 300 mg nem szí­

AZ ANYAGCSERE

vódik fel, hanem a széklettel távozik. Ez viszonylag kis mennyiség, de biztosítja, hogy érdemleges menynyiségü koleszterin a szervezetből eltávozhat. A többi epesav a májba visszakerül, és újra felhasználódik. Ezt

E

8-39. ábra. Az epesavak szintézise a májban és metabolizmusa a bélben

233

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

akörforgást az epesavak enterohepatikus körforgá­ sának nevezik. Meg kell jegyezni, hogy epesavak, konjugált és nem konjugált formában, kis mennyiség­ ben passziv diffúzióval is átjutnak a bélhámsejtek membránján, de mennyiségi szempontból sokkal fon­ tosabbak a fehérjék által működtetett transzporterek. Az enterohepatikus körforgásban szigorúan irányított az epesavak transzportja, amely annak köszönhető, hogy specifikus transzporterek biztosítják a hepatocitákban a canaliculusok felé történő epesav (ABCB11 - másik ne­ vén bile sah export pump [BSEP]) és foszfolipid transz­ portot (ABCB4-transzporter, lásd 5. fejezetben), illetve a portális keringés oldalán a másodlagos epesavak visszavételét (Na+-kotraszporter). Hasonlóképpen irá­ nyított a másodlagos epesavak vékonybélből történő

felszívódása; a luminális oldalon egy Na+-kotranszporter (IBAT), a bazális oldalon pedig egy ABCtranszporter és egy anion cseretranszporter működése következtében. Speciális traszportereken keresztül vá­ lasztódnak ki a májsejtekből az epeutak felé a kolesz­ terin és a foszfolipidek is. Az epesavak naponta 5-10-szer megfordulnak az enterohepatikus körfor­ gásban, a májból 15-30 g epesav választódik ki, de a nagyon hatékony intesztinális abszorpció következté­ ben (kb. 95%) de novo szintézisben csak kb. 0,5 g epe­ sav keletkezik. A parenchimasejtekben történő szinté­ zis lényegében csak a széklettel kiürült mennyiség pótlására szolgál. A de novo szintézis és a körforgás koordinált sza­ bályozás alatt áll, amely érzékeli a bélben levő epesav

{konjugált elsődleges epesavak GLIKOKOLÁT ■

TAUROKOLAT

GLIKOKENODEZOXIKOLÁT ■

TAUROKENODEZOXIKOLÁT

C -N H -(C H 2)2- S 0 3

t e

epe

JL

dekonjugáció kólát

f

elsődleges epesavak

7-dehidroxilálás

8-39. ábra. Az epesavak szintézise a májban és metabolizmusa a bélben (folytatás)

kenodezoxikolát

^

234

I I I . AZANYAGCSERE

mennyiségét. Bélhámsejtekben és hepatocitákban ta­ lálható egy magi epesavreceptor (FXR), amely ha epe­ savat köt, módosítja a folyamat kulcsfehérjéinek transzkripcióját. így bélhámsejtekben indukálja az

ileális epesavtranszportert (IBAT) és a reabszorpció fokozásával megakadályozza a túlzott epesaweszteséget. A visszaszívott epesavak pedig a májban az FXR útján visszaszorítják a de novo epesavszintézist

["koleszterin

r

"A >/ másodlagos epesavak

r

^ de novo szintézis

["elsődleges epesavak (300 mg/nap)

(glicin, taurin)

konjugalt másodlagos epesavak

r

konjugált elsődleges epesavak

epe 15-30 g/nap

duodenum

jejunum colon ileum

| passzív J diffúzió aktív transzport

felszívódás 15-30 g/nap

konjugalt másodlagos epesavak

konjugalt elsődleges epesavak

K I

["elsődleges epesavak

konjugált és nem konjugált elsődleges és másodlagos epesavak mg/nap)

belhamsejt

V

SSSESSS9

széklet

8-40. ábra. Az epesavak enterohepatikus körforgása. IBAT, ileal bile add (epesav) transporter. Keretben az epesavak által a máj­ ban iniciált génátírás-reguláció vázlata látható. FXR, farnesoid X receptor; SHP, short heterodimer partner; CYP7A1, 7cr-hidroxiláz gén

235

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

(az FXR indukál egy represszor fehérjét, SHP-t, amely gátolja a 7a-hidroxiláz transzkripcióját) (8-40. ábra, keretben). Ez a szabályozási mechanizmus biz­ tosítja a lipidemésztéshez szükséges epesavmenny isé­ get és ugyanakkor konzerválja a szervezet koleszte­ rinkészletét.

Klinikai vonatkozások Az enterohepatikus körforgást meg lehet szakítani olyan gyanták per os alkalmazásával, amelyek a bél­ ben az epesavakat megkötik, és a széklettel kiürülnek. Amájban ilyenkor, a teljes kiürült mennyiség pótlásá­ ra fokozódik az epesavak szintézise. Ilyen gyógysze­ reket a kórosan megnövekedett plazmalipoproteinszint csökkentése céljából állítottak elő, de a mellék­ hatások miatt alkalmazásuk egyelőre nem vált be.

Az epe olyan vizes oldat, amely az epesavakon kí­ vül foszfolipideket, szabad koleszterint és más, szá­ mos szerves (pl. epefestékek) és szervetlen anyagot tartalmaz. Szemben a plazmával, ahol a koleszterin nagyobb része, kb. 70%-a koleszterin-észterként van jelen, itt csaknem teljes egészében szabad koleszterin található. A koleszterin az epében a foszfolipidekkel és az epesavakkal ún. vegyes micellákat alkot, ami le­ hetővé teszi, hogy a koleszterin oldatban maradjon. Ebben a funkcióban - mennyiségileg - különösen fon­ tos szerepet játszanak a májból az epébe kiválasztódó foszfolipidek, elsősorban a lecitin. Az epe analízise és i8-41. ábrán látható háromszögletű koordináta-rend­ szerben történő ábrázolás lehetővé teszi annak megál­ lapítását, hogy az adott epesav, foszfolipid és kolesz­ terin arány mellett a koleszterin oldatban van-e. Ha az alkotórészek ilyetén ábrázolása olyan metszéspontot ad, ami a sárgával jelzett területbe esik, a koleszterin oldatban van, ha ezen a területen kívül van, akkor a koleszterin az epében kiválik és koleszterinkövek ke­ letkeznek. Az ábrán a P-vel jelzett pont egy olyan nor­ mális epeösszetételt jelez, amelyben a lipideken belül ~4% a koleszterin, -10% a foszfatidil-kolin és -80% az epesavak aránya.

Klinikai vonatkozások Koleszterinkövek keletkezésére akkor kerül sor, ami­ kor megnő az epébe kiválasztott koleszterin relatív mennyisége, s a foszfolipidek és az epesavak nem tud­ ják a koleszterint oldatban tartani. Az epekőbetegség, a cholelithiasis, korunk egyik leggyakoribb betegsé­ ge, s az esetek 80%-ában a köveket elsősorban a kivált koleszterin alkotja. Kedvező körülményt teremt a fo­ kozott koleszterinkiválasztásra az obesitas, a koleszte­ rinben gazdag étrend és bizonyos genetikai faktorok. Ez utóbbiak érinthetik a májsejtekben található koleszterintranszportert, fokozott működést okozva, vagy az epesav és foszfolipid-transzporterek valame­ lyikét, csökkent működést okozva. Hasonlóképpen el­ tolódik a koleszterin/epesav arány, ha mutáció követ­ keztében csökken a koleszterin-7a-hidroxiláz aktivi­ tása és ezáltal az epesavak szintézise.

epesavas sók (%) 8-41. ábra. Az epe három fő alkotórészének ábrázolása. P, normál epeösszetétel

8 .1 0

A K O L E S Z T E R IN ÉS E G Y É B LIP ID EK SZ Á LLÍT Á SA A K ER IN G ÉS B EN . LIP O P R O T EIN EK

A lipidek a plazma vizes közegében nem oldódnak, ezért szállításuk a különböző szervek között bonyolul­ tabb feladat, mint a glukózé, ami vízoldékony moleku-

I I I.

236

AZANYAGCSERE

la lévén oldott állapotban van a keringésben. Miért és hogyan történik a zsírok szállítása? A szervezet részben a táplálékkal jut lipidekhez, részben a bioszintézis biztosítja megfelelő mennyiségű zsír jelenlétét. A táplálékkal elfo­ gyasztott lipideknek a vékonybélből el kell jutni azokhoz a szervekhez, amelyek zsírok oxidálásával tudnak energiát termelni, illetve a májhoz, ami az anyagcsere központi szerve. Mint ilyen, a máj szintetizál is zsírokat a többi szerv táplálá­ sa céljából, amit el kell szállítani a felhasználás helyére azokkal a zsírokkal együtt, amelyek a 8-42. ábra. A lipidek szállításának vázlata. Pirossal a szállított táplálékból kerülnek a májba. Egy harmadik lipideket, feketével a szállító lipoprotein nevét, illetve a szabad zsírsa­ „központ” a zsírszövet, ahol a raktározás törté­ vat (FFA) jelöltük. VLDL, very low density lipoprotein; HDL, high density lipoprotein; LDL, low density lipoprotein nik, s ahonnan a szükséglet­ nek megfelelően mobilizá­ koleszterin lódnak a zsírok és szállítód­ triglicerid nak a megfelelő szervekhez koleszterin-észter (8-42. ábra). A lipidek szál­ lítása azért is érdemel külön foszfolipid figyelmet, mert az atheroscrelosis és a coronariabe­ tegségek kialakulásában a lipidszállítási rendellenessé­ gek meghatározó jelentősé­ gűek, és ezért ún. rizikófak­ tornak tekinthetők. Lipid­ szállítási rendellenességek gyakran fellépnek olyan ál­ talános anyagcsere-beteg­ ségben is, mint pl. a diabetes vagy az elhízás. A problémát leginkább a zsírsavak, a trigliceridek és a koleszterin, illetve a kolesz­ terin-észterek szállítása je­ lenti, mert ezek a leginkább |_| — Q — Q M A M M / V hidrofób molekulák. A leg­ J— |_| __ __ Q M M / W W egyszerűbb mechanizmus a zsírsavak szállítására alakult .Q / A A M A A V ki, amelyek a plazmában al­ triglicerid buminhoz kötődnek, és ezál­ tal oldatban maradnak. Bo­ nyolultabb a trigliceridek, a koleszterin-észter koleszterin és a koleszte8-43. ábra. A lipoproteinek felépítése q

q

q

237

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

8-2. táblázat. A lipoproteinek néhány tulajdonsága. Zárójelben az adott lipid összlipid-tartalmon belüli %-os előfordu­ lását, vastagon szedve az adott lipoprotein funkcióját leginkább meghatározó apoproteineket mutatjuk Denzitás

Lipoprotein

LipidFehérjetartalom tartalom (%) (%)

Legfontosabb apoproteinek

Legfontosabb lipid

Kilomikron

1-2

98-99

triglicerid (85%)

A-l, A-IV, A-V, B-48, C-ll, C-lll, E

VLDL (very low density lipoprotein)

7-10

90-93

trigilcerid (50%)

B-100, C-l, C-ll, C-lll

IDL (intermediate density lipoprotein)

15-20

80-85

triglicerid koleszterin-észter

B-100, C-ll, C-lll, E

20-25

75-80

koleszterin-észter (37%)

B-100

40-55

50-55

foszfolipid (24%) koleszterin-észter (15%)

A-l, A-II, E

LDL (low density lipoprotein) HDL (high density lipoprotein)

NV

rin-észterek szállítása. Ezeket komplex struktúrák, az ún. lipoproteinek szállítják. A lipoproteinek általános jellemzője, hogy bennük ahidrofób lipidek egy hidrofil burokba csomagolva és ezáltal a plazma vizes közegétől elválasztva találhatók (8-43. ábra). A burok részben fehérjékből áll, amelye­ ket apoproteineknek nevezünk, továbbá foszfolipidekből, amelyek poláros csoportjaikkal a vizes közeg, apoláros csoportjaikkal pedig a lipoprotein belseje fe­ lé irányulnak. Az apoproteinek és a foszfolipidek kö­ zött kovalens kötés nem jön létre, a szerkezetet csak nemkovalens kötések stabilizálják. Ebben a burokban tud helyet foglalni a koleszterin, 3-OH-csoportjával a foszfolipidek poláros feje felé fordulva. A lipo­ proteinek belsejében helyezkednek el az apoláros lipidek, a trigliceridek és a koleszterin-észterek, ame­ lyekkel kölcsönhatásba lépnek a burokban elhelyez­ kedő foszfolipidek apoláros csoportjai. Ez a szerkezeti adottság minden lipoproteinre jellemző, függetlenül attól, hogy mely szervben keletkezett és milyen lipid

szállítására specializálódott. A különböző lipoproteinekben azonban eltérő a lipid- és a fehérjetartalom, és ennek következtében a denzitásuk is különböző (mi­ nél magasabb a fehérjetartalom, annál nagyobb a sűrűség). A lipoproteinek ultracentrifugálással és elektroforézissel választhatók el egymástól. A denzitás alapján történt meg a lipoproteinek megkülön­ böztetése, amely szerint az alábbi lipoproteinek ismer­ tek: kilomikron, VLDL (very low density lipo­ protein), IDL (intermediate density lipoprotein), LDL (low density lipoprotein) és HDL (high density lipo­ protein). A legfontosabb lipoproteineket és főbb tulaj­ donságait a 8-2. táblázat mutatja. Vastagon szedve azokat az apoproteineket mutatjuk, amelyek az adott lipoprotein funkciója szempontjából a legfontosabb szerepet játsszák. Legalább 10 különböző apoprotein ismert, amelyek részt vesznek a plazmában keringő lipoproteinek alkotásában. Az apoproteinek szerepe a lipoproteinek működésében összetett. Egyrészt a lipo­ proteinek szerkezetének alkotásában vesznek részt,

8-3. táblázat. Az apoproteinek előfordulása az egyes lipoproteinekben és néhány fontos funkciójuk

A-l

Előfordulás

Funkció

Apoprotein

aktiválja az LCAT enzimeket, ABC-transzporter fehérjéket

HDL

A-ll

HDL

A-IV

kilomikron, HDL

B-48

kilomikron

B-100

kötődik az LDL-receptorhoz

VLDL, HDL

C-l C-ll

aktiválja a lipoprotein-lipázt

C-lll

gátolja a lipoprotein-lipázt

kilomikron, VLDL, HDL

HDL

D E

VLDL, IDL, LDL

elősegíti a kilomikronmaradvány felvételét a májban

kilomikron, VLDL, IDL, HDL

I II.

238

vagyis a lipidek oldatban tartását szolgálják. Számos apoprotein emellett mintegy „megjelöli” a lipoproteineket, ezt a jelölést a máj és az egyéb sejteken talál­ ható receptorok felismerik, a lipoproteineket felveszik és ezáltal a keringésből eltávolítják. Végezetül, az apoproteinek egy része a lipoproteinek metabolizmusában meghatározó enzimek, fehérjék működését akti­ válja vagy gátolja. Az apoproteinek eddig megismert, legfontosabb funkcióit és előfordulásukat az egyes lipoproteinekben a 8-3. táblázat foglalja össze. Az apoproteinek a bélhámsejtekben vagy a májban szintetizálódnak, itt épülnek be az egyes lipoproteinekbe, de a keringésben a lipoproteinek közötti intenzív lipid és apoprotein kicserélődés folyamán más lipoproteinekre is átkerülnek (lásd alább).

Klinikai vonatkozások Az apoproteinek közül az egyes APOE alléleknek je­ lentőséget tulajdonítanak az egyik legrettegettebb be­ tegség, a teljes szellemi leépüléssel és a személyiség elvesztésével járó Alzheimer-kór kialakulása vagy legalább is a kialakulás előrejelzése szempontjából. Három olyan APOE génvariáció (alléi) ismert, amely­ nek humán előfordulását leírták. Az APOE3 alléi, amely egyébként az allélek közül a leggyakoribb, ho­ mozigótajelenléte esetén az Alzheimer-kór kialakulá­ sa csak nagyon magas életkorban valószínű. Ezzel szemben a ritkábban előforduló A P O E 4 alléi megléte megnöveli az Alzheimer-kór kialakulásának valószí­ nűségét és viszonylag fiatalkorban való megjelenését, különösen a homozigóta előfordulás esetében. A pon­ tos molekuláris mechanizmus, ami megmagyarázná az apoE4 szerepét az Alzheimer-kór kialakulásában, nem ismert.

A trigliceridek szállítása. Kilomikron, VLDL A táplálékkal elfogyasztott és felszívódott zsírokat a kilomikron szállítja el a bélből. A kilomikron a leg­ nagyobb méretű és százalékos összetételében a legna­ gyobb lipidtartalmú (a száraztömeg 98-99%-a), ezért

AZANYACCSERE

a legkisebb denzitású lipoprotein. A kilomikronban található lipidek legnagyobb része triglicerid. A kilo­ mikron a bélhámsejtekben keletkezik a béllumenből abszorbeálódott és a sejtekben reszintetizálódott trigliceridekből és koleszterinből (lásd zsírok emésztése és felszívódása). Mivel mind a diglicerid-aciltranszferáz, mind az ACAT az ER membránban foglal he­ lyet, keletkezésük után a trigliceridek és a koleszte­ rin-észterek közvetlenül a membrán két foszfolipidrétege közé kerülnek, és a hidrofób mag növekedése folytán egy foszfolipidréteg által körülvett részecske keletkezik, amely kiegészül azokkal az apoproteinekkel, amelyek szintén a bélhámsejtekben szintetizálódnak (apoB-48, mint legfontosabb), és létrejön az ún. naszcens kilomikron (8-44. ábra). A kilomikron meg­ jelenése tehát a keringésben az étkezések utáni állapot jellemzője. A naszcens kilomikron - ami tehát a táplá­ lékból származó, közben lebomlott, de a bélhámsej­ tekben újraszintetizálódott triglicerideket és koleszte­ rin-észtert tartalmazza - a sejteket a nyirok kapillári­ sok felé hagyja el és a nyirokereken, majd a ductus thoracicuson keresztül jut a véráramba. Itt további apoproteinekkel kiegészülve érett kilomikronná ala­ kul. A kilomikronok jellegzetes apoproteinje az apoB-48, amely a bélhámsejtekben keletkezik és ugyanaz a gén kódolja, ami az apoB-100-at a májban. Azért „48”, mert itt szövetspecifikus módon az apoB mRNS-ben található egyik Gin kodon (CAA) stop kodonná (UAA) módosul (RNS „editing”), és nem en­ gedi a transzlációt csak a teljes szakasz 48%-áig. így az apoB-48 hossza 48%-a az apoB-100-énak. Az apoB-100, mint látni fogjuk, a májban szintetizálódik és a VLDL-be épül be. A zsírszövetben, a szívben, a harántcsíkolt izomban és a laktáló emlőben a kapillári­ sok tartalmaznak egy extracelluláris enzimet, a lipoprotein-lipázt, amely a kilomikron (és VLDL - lásd később) által szállított triglicerideket zsírsavra és gli­ cerinre bontja. A lipoprotein-lipáz a kapillárisok endotélsejtjein a sejtfelszíni glukózaminglikánokhoz kötődik, és onnan heparinnal szabadítható fel. Az en­ zim kofaktora a C-II apoprotein, amely aktiváló hatá­ sú. A glicerin a keringéssel a májba kerül, a zsírsava­ kat pedig a szervek felveszik. Az izomban a zsírsavak eloxidálódnak és az izomműködés energiaszükségle­ tét biztosítják, a zsírszövetben pedig trigliceriddé

239

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É I É

bél

kilomikron

8-44. ábra. A kilomikron metabolizmusa. Koleszterin- és trigliceridszállítás a bélből. Az ábrán csak a funkció szempontjából legjelentősebb apoproteinek jelenlétét mutatjuk. B-48, bélhámsejtben szintetizálódó apoprotein; HDL, high density lipoprotein. Az áb­ ra értelmezéséhez lásd a szöveges leírást

szintetizálódva raktározódnak. A kilomikron, ami ily módon trigliceridtartalmának jelentős részét elveszí­ tette, kisebb méretű és nagyobb denzitású részecskévé alakul. Ezt az ún. kilomikron maradványt a máj sejtek felszínén receptorok ismerik fel, az apoE fehérjén ke­ resztül megkötik és endocitózissal a keringésből fel­ veszik. Az anyagcsere állapotától függően a trigliceridek itt lebomolhatnak, és energiát szolgáltatnak. Ha a táplálék nagy mennyiségben, feleslegben tartalmaz zsírsavakat, akkor a májban azonnal újraszintetizálódik a triglicerid, és VLDL formájában a zsírszövethez

szállítódik. A kilomikron maradvánnyal a májba kerül a táplálékkal elfogyasztott koleszterin is. A kilomikronok metabolizmusát a 8-44. ábra foglalja össze. A lipideket a májból a very low density lipoprotein, a VLDL szállítja el, amely kb. 10% fehérjét és 90% lipidet tartalmaz. A VLDL zsírtartalma főleg trigliceridekből áll, amelyhez a zsírsavak több forrásból szár­ maznak. A trigliceridek szintéziséhez felhasználód­ hatnak a táplálékból származó, a kilomikron marad­ vánnyal a májba kerülő zsírsavak, illetve azok, ame­ lyeket a keringő szabad zsírsavakból a májsejtek fel­

240

III.

vesznek, továbbá a májban de novo szintézissel kelet­ kező zsírsavak, amelyek legfőbb forrása a táplálékkal feleslegben elfogyasztott szénhidrátokból keletkező acetil-CoA. A VLDL szállítja el a májból a koleszte­ rint is, amely szintén részben a táplálékból származik, másrészt a májban de novo szintetizálódik, továbbá a plazmából felvett lipoproteinekkel kerül a májba. A VLDL-ben a koleszterin/triglicerid arány általában 1:4, ami azonban koleszterindús étkezést követően akár 1:1 is lehet. Jellegzetes fehérje a VLDL-ben a májban szintetizálódó B-100 apoprotein, ami a VLDL-ből keletkező LDL (low density lipoprotein) felismerését teszi lehetővé. A VLDL a keringéssel transzportálódik a szervekhez, elsősorban a zsírszö­

máj

8-45. ábra. Triglicerid- és koleszterinszállítás a májból

AZANYAGCSERE

vethez, ahol a már említett lipoprotein-lipáz - amit az apoC-II aktivál - a triglicerideket hasítja. A keletkező zsírsavakat a sejtek felveszik, oxidálják vagy újraszin­ tetizálják a triglicerideket és intracelluláris lipidcseppek formájában raktározzák. Táplálékfelvételt követően, amikor az inzulinérzékeny sejtek glukózt tudnak felvenni, a VLDL elsődlegesen a zsírszövet számára szolgáltat zsírsavakat, ami raktározásra kerül, míg étkezések közötti időben vagy éhezésben a VLDL-ben lévő zsírsavak a szívizomban és a haránt­ csíkolt izmokban oxidálódnak. A VLDL-ből a plaz­ mában ily módon kialakuló IDL (intermediate density lipoprotein) koleszterint és kevés maradék trigliceridet tartalmaz, relatív fehérjetartalma nagyobb, zsír­

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

tartalma kisebb, mint a VLDL-é (8-45. ábra). A plaz­ mában keringő VLDL összetétele eltér attól, ami a májból közvetlenül kerül a keringésbe. A lipid- és az apoproteintartalom mind a kilomikronban, mind a VLDL-ben lényegesen és folyamatosan változik a ke­ ringésben. A VLDL koleszterint vesz fel közvetlenül a vörösvértestekből és a HDL-ből, illetve triglicerideket ad le a HDL-nek (lásd később). A lipidek cseréjét a HDL és a VLDL között a koleszterin-észter transz­ fer protein végzi, amely a májban (és kisebb mérték­ ben az adipocitákban) szintetizálódik és a HDL felszí­ nén helyezkedik el. Fokozott expresszióját koleszte­ rinben gazdag étkezés váltja ki. Az apoproteinek is cserélődnek a különböző lipoproteinek között. Az apoprotein transzfer reakciók gyorsak és végbemen­ nek az alatt a viszonylag rövid idő alatt, amit pl. a kilomikron a keringésben tölt. A kilomikronok a plaz­ mába történő belépést követően 5-10 percen belül el­ tűnnek a keringésből, a VLDL esetében ez több órát vesz igénybe. A VLDL-ből a keringésben kialakuló IDL további átalakulással LDL-lé alakul (8-45. ábra). Ennek során az apoB-100 kivételével az apoproteinek a lipoprotei­ nek közötti fehérjetranszport révén a HDL-re kerül­ nek, a maradék triglicerid pedig elbomlik. A trigliceridek hidrolízise a májsejtek felszínén, a hepatikus lipáz (máj-lipáz) hatására megy végbe, amely a lipoprotein-lipázhoz sok szempontból hasonló enzim. Atriglicerideken kívül a felszíni foszfogliceridek hid­ rolízisét is katalizálja és nemcsak az IDL-ben, hanem aHDL2-ben levő trigliceridek is szubsztrátjai.

A koleszterin szállítása. LDL, HDL A keringésben lévő VLDL mintegy fele fokozatos átalakulás után, melynek során trigliceridtartalmát el­ veszti és az apoproteinek nagy részét a HDL-nek átad­ ja, LDL-lé alakul. Az LDL-ben a meghatározó lipid a koleszterin-észter, a fehérjék közül pedig a B-100 apoprotein. A szervezet legtöbb sejtje rendelkezik LDL-receptorral, amely a B-100 fehérje felismerésére képes, azonban mégis kevés szervnek van meghatározó sze­ repe az LDL metabolizmusában. A receptor csak a

241

B-100 apoproteint köti, annak ellenére, hogy a B-48 és B-100 fehérjékben számos közös epitop van. (ApoB-100 a VLDL-ben is megtalálható, itt azonban az LDL-receptor nem fér hozzá a fehérje receptorkötő doménjéhez.) Az LDL-nek mintegy kétharmada ezen nagy affinitású receptor közreműködésével hagyja el a keringést. Az LDL metabolizmusában kvantitatíve a máj játssza a legfontosabb szerepet, mivel itt történik az LDL-lebomlás legalább fele. Fontos még a bélrend­ szer, illetve a mellékvese és a gonádok részvétele az LDL keringésből történő eltávolításában. Az LDL-receptorok kettős funkciót látnak el: meg­ határozzák az LDL keringésből történő eliminációját, és lehetővé teszik a koleszterin sejtekbe juttatását. Az LDL-receptor az apoB-100-at ismeri fel és köti meg, ami után az LDL-receptor-LDL komplex endocitotikus vezikulákban intemalizálódik. A sejten belül az LDL disszociál a receptorról, a receptor visszavándo­ rol a sejtfelszínre, az LDL-t tartalmazó endocitotikus vezikulák pedig lizoszomákkal fuzionálnak, s a lizoszomális enzimek hatására az LDL fehérjekomponen­ se lebomlik (8-46. ábra). A koleszterin-észterázok ha­ tására felszabaduló koleszterin komplex módon sza­ bályozza a sejtek koleszterinmetabolizmusát. Egy­ részt gátolja az LDL-receptorok szintézisét - a SREBP közreműködésével -, s ezáltal gátolja felesle­ gesen nagy mennyiségű koleszterin felvételét a plaz­ mából, másrészt a sejten belül gátolja a koleszterin de novo szintézisét a 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoAreduktáz már részletezett szabályozásán keresztül. Koleszterin és az ebből keletkező oxiszterolok jelen­ létében a HMG-CoA-reduktáz gyorsabban bomlik le, mint a többi enzim az endoplazmás retikulumban és csökken az enzim szintézise is (lásd 8-35. ábra). Vég­ eredményben tehát a koleszterin a sejtekben mind a koleszterinfelvételt, mind pedig a szintézist gátolja, s így megakadályozza kontrollálatlanul nagy mennyisé­ gű koleszterin felhalmozódását a sejtekben. Koleszte­ rinre minden sejtnek szüksége van a membránok fel­ építéséhez. A mellékvesekéregben és a gonádokban a szteroidhormonok szintéziséhez is felhasználódik ko­ leszterin, a májban pedig epesavak szintetizálódnak belőle. A felesleges koleszterint a sejtekben az acil-CoA:koleszterin-aciltranszferáz (ACAT) észtere-

I II.

242

f reguláció

ER

HMG-CoAreduktáz

AZANYAGCSERE

koleszterin

( raktározás

(szintézisek

ACAT koleszterin-észterek

- sejtmembrán - szteroidhormonok (mellékvesekéreg, gonádok) - epesavak (máj)

8-46. ábra. LDL-receptorok felvétele a sejtekbe. ACAT, acil-CoA:koleszterin-aciltranszferáz

siti, ami az LDL-felvétel következtében aktiválódik, és a koleszterin-észterek a citoplazmában lipidcseppekben raktározódnak. Koleszterinfelvétel történik a makrofágokba is, ahol hiányzik a felvétel fent leírt szabályozása. Ennek kitüntetett jelentősége magas LDL-koleszterin-szint esetén van, különösen akkor, amikor az LDL-ben nagyfokú a részlegesen oxidált zsírsavak előfordulása, ami kedvez az atherosclero-

ticus plakkok kialakulásának. A makrofágok a kontrollálatlan felvétel következtében nagy mennyiségű koleszterint és koleszterin-észtereket képesek akku­ mulálni, és ún. habsejtekké tudnak alakulnak (mikro­ szkóp alatt habszerü képletnek látszanak). Ezek a sej­ tek azután elpusztulnak, ami fontos szerepet játszika koleszterinben gazdag atheroscleroticus plakkok ki­ alakulásában.

243

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É I É

Klinikai vonatkozások Az LDL-receptorok számának vagy funkciójának elégtelensége súlyos zavarokat okoz a koleszte­ rin-anyagcserében. Az ún. familiáris hypercholesterinaemiák mutációk következtében jönnek létre, melyek leggyakrabban a receptorok szintézisének hi­ ányát okozzák. Sérülhet mutációk következtében a re­ ceptorok poszttranszlációs módosítása, vagy szerke­ zeti módosulás jöhet létre a ligandkötő doménben. A familiáris hypercholesterinaemia heterozigóta for­ májában, amelyben egy LDL-receptor gén hibás (szemben a homozigótával, ahol kettő), a receptorok száma a normálisnak a fele, s ennek megfelelően csökken az LDL keringésből történő eliminációja. A homozigóta formában gyakorlatilag nincs LDLreceptor-szintézis. A familiáris hypercholesterinaemia heterozigóta for­ májában hatékony terápiás lehetőség a HMG-CoAreduktáz gátlók (statinok) alkalmazása. A statinok szerkezetének egy része a mevalonát szerkezetéhez hasonló, ami a kompetitív enzimgátló hatást magya­ rázza. A szerkezet egyéb részeinek módosítása révén többféle molekula áll a terápia rendelkezésére. Ezek a szerek rendkívül előnyösen befolyásolják a plazma LDL-koleszterin-szintjét és a legelterjedtebben hasz­ nálatosak a koleszterinszint csökkentése és az atherosclerosis szövődményeinek megelőzése céljából. A de novo koleszterinszintézis gátlásával csökkentik a sej­ tek koleszterintartalmát, amely következményes LDL-receptorszám-emelkedéssel és a plazmából tör­ ténő fokozott LDL-felvétellel jár. A koleszterinszint csökkentése mellett ezek a szerek számos pozitív ha­ tással bírnak, egyebek mellett pl. a trombocitaaggregációt, a gyulladásos folyamatokat, sőt eseten­ ként a meglévő plakkokat is csökkentik. A familiáris hypercholesterinaemia homozigóta formájában a gyógyszeres terápiának nincs hatása, egyedüli lehető­ ségként a korai életkorban elvégzett máj transz­ plantáció jöhetne szóba.

A koleszterinhomeostasis fenntartásában fontos szerepet játszik a high density lipoprotein (HDL), amely az ún. reverz koleszterintranszporttal kolesz­

terint szállít az extrahepatikus sejtekből és az artériák falából a májba. A májban a koleszterin epesavakká alakul, kiválasztódik az epébe, és ily módon a szerve­ zetből kiürülhet vagy beépül VLDL-be. Ezért nevezik a HDL-ben szállított koleszterint ,jó ” koleszterinnek, szemben az LDL „rossz” koleszterinnel. A HDL a keringésben kialakuló lipoprotein. Lehérjekomponensei a májban szintetizálódnak és onnan kerülnek a keringésbe (apoE és apoA-I mint a legfon­ tosabbak). A májból a keringésbe kerülő struktúra lipidekben szegény, fehérjében gazdag lapos képződ­ mény, ami az érett struktúra kialakulásához a kolesz­ terint a keringésben veszi fel. A szabad, nem észtere­ zett koleszterint az extrahepatikus szervekben a sejt­ membránok adják, és ebben az ABC-transzporterek családjába tartozó membránfehérje, az ABC A 1játszik szerepet, amellyel az apoA-I lép kapcsolatba. Az ABCA1 fehérje közreműködésével a szabad koleszte­ rin mellett foszfolipidek is beépülnek az apoA-I-et tar­ talmazó struktúrába, és az LCAT enzim szubsztrátjaként hozzájárulnak a koleszterin-észterek keletkezé­ séhez. A koleszterin-észtereket a lecitin:koleszterinacil-transzferáz (LCAT) hozza létre, melyek, mint ne­ utrális lipidek a naszcens HDL apoláros, belső részébe mozogva a bilayert szétfeszítik, és kialakul a gömbszerű érett HDL. Az érett HDL további koleszterint vesz fel a szervekből, amelyben az ABCA1 mellett egy másik transzporter, az ABCG1 játszik szerepet.

Klinikai vonatkozások Egy nagyon ritka genetikai betegségben, a Tangierkórban, az ABCA1 homozigóta mutációja következ­ tében a HDL apoA-I nem tud a szervekből koleszte­ rint felvenni, a koleszterinszegény HDL-t a máj felve­ szi, s a keringésben HDL gyakorlatilag nem található.

A HDL nem egy statikus struktúra, összetétele a keringésben folyamatosan változik. Ennek során ko­ leszterint vesz fel a sejtek membránjából, amit az LCAT koleszterin-észterré alakít (biztosítva ily mó­ don a koleszterindiffűzió irányát), foszfolipidek és

244

triglicerid épülnek be, koleszterin-észtereket ad le, il­ letve apoproteineket ad le vagy vesz fel más lipoproteinektől. A lipidek felvétele a HDL-be részben egy lassú spontán folyamat, részben a HDL felszínén található koleszterin-észter transzfer fehérjék közre­ működésével megy végbe. Ez a fehérje a májban és az adipocitákban szintetizálódik, és a keringésben kerül a HDL-re. A HDL foszfatidil-kolin-komponense egy­ szersmind az LCAT enzim egyik szubsztrátja, és más foszfolipidekkel együtt szubsztrátja a máj-lipáznak is. Az apoproteinek is cserélődnek a lipoproteinek kö­ zött. Az érett HDL-ben az apoA-1 egy része apoA-IIre cserélődhet, az apoC és apoE számára pedig a HDL egy olyan „raktár”, ahonnan a trigliceridtartalmú naszcens lipoproteinekre transzferálódhat. A HDL-nek szubpopulációi léteznek, amelyek fő­ leg a lipidösszetételben különböznek. A HDL2 trigliceridekben gazdagabb és nagyobb méretű, mint a HDL3. A trigliceridek a VLDL-ről kerülnek a HDLre, amelyek viszont koleszterin-észtereket vesznek fel a HDL-ről. Klinikailag is megfigyelhető, hogy posztprandiálisan (táplálkozás után) megnő a HDL trigli-

I II.

AZ ANYAGCSERE

ceridtartalma. A HDL-trigliceridek a máj-lipáz szubsztrátjai, a belőlük keletkező zsírsavakat a máj sejtek veszik fel. A HDL-ből a koleszterin-észtereket is a máj veszi fel, egy scavenger receptor (SR-B1) közre­ működésével. A máj veszi fel a HDL-ről a VLDL-re került koleszterint is, amint azt az LDL metabolizmusa tárgyalása során már láttuk. A koleszterin a máj­ ban a már megbeszélt utakon alakulhat tovább. A HDL-metabolizmus összefoglalása a 8-47. ábrán látható. Epidemiológiai vizsgálatokban egyértelmű fordí­ tott arányosságot találtak a plazma-HDL-szint és az atherosclerosis kialakulása között. A HDL védő hatá­ sa vélhetően a reverz koleszterintranszport normális funkciójából adódik, amely megszabadítja a sejteket a felesleges koleszterintől. A reverz koleszterintransz­ port a makrofágoktól és habsejtektől is felveszi a ko­ leszterint, így megakadályozza atheroscleroticus plakkok lerakódását az artériák falán. Nem kizárt azonban az sem, hogy a HDL - ma még nem ismert módon - közvetlenül befolyásolja az atherogenesis folyamatát.

8-47. ábra. Reverz koleszterintranszport. HDL-metabolizmus. Az ábra értelmezéséhez lásd a szöveget

245

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

Klinikai vonatkozások Olyan kórképekben, amelyek a lipidek transzportjá­ nak zavara következtében jönnek létre, extrém magas plazma-triglicerid- és/vagy -koleszterinszint figyel­ hető meg. Ritka, de súlyos állapot a lipoprotein-lipáz működésének elégtelensége vagy hiánya, amelyben lehetetlenné válik a kilomikron keringésből történő eliminációja. Az állapoton, amelyben zsírdepozitok jelennek meg a bőrben és pancreatitis alakulhat ki, zsírszegény diétával javítani lehet. Még súlyosabb a kép az abetalipoproteinaemiában, melyben az apoprotein-B szintézise sérült. A plazmá­ ban a kilomikron, a VLDL és LDL egyaránt hiányzik, ami nagyon súlyos lipidfelszívódási és anyagcsereza­ varokat okoz. A hyperlipidaemiával járó egyes kórké­ pek felosztását a 8-4. összefoglaló táblázat mutatja.

Szabad zsírsavak A keringésben a zsírsavak több mint 95%-a trigliceridekben, foszfolipidekben és koleszterin-ész­ terekben található, amelyeket a fent összefoglalt lipoproteinek szállítanak. A keringő zsírsavaknak néhány százaléka nem észteresített formában és nem lipoproteinekben található, ezek az ún. szabad zsírsavak

(FFA; free fatty acids), amelyek albuminhoz kötve szállítódnak. Bár mennyiségileg ez nem tűnik jelen­ tősnek, a metabolizmusban a szabad zsírsavak nagyon fontos szerepet játszanak. A zsírszövetben raktározott trigliceridekből mobilizált zsírsavak a keringésben szabad zsírsavként jelennek meg. Kis részben hozzá­ járul a plazma szabadzsírsav-tartalmához a lipopro­ tein-lipáz által a lipoproteinekből felszabadított zsír­ sav is, ennek nagy része azonban, mint láttuk koráb­ ban, közvetlenül a szervekbe kerül. A keringésben a zsírsavaknak egy kis hányada ténylegesen szabadon, albuminhoz nem kötve van jelen, ami egyensúlyban van az erős albuminkötésben található zsírsavval (zsírsav/albumin - zsírsav + albumin). A szervek a nem kötött zsírsavat veszik fel, ami azonnal pótlódik a zsírsav-albumin kötésből disszociáló zsírsavval, s ez újra a szervek rendelkezésére áll. A keringő szabad zsírsavak így nagyon gyorsan a szervekbe kerülnek. A szabad zsírsavak mennyisége a keringésben a metabolizmus állapotától függ: éhezésben és erőteljes izom­ munka során megnő, étkezés után, amikor elegendő glukóz áll rendelkezésre az energiaigény fedezésére, csökken a szabadzsírsav-tartalom. Éhezésben a szer­ vek számára az energia nagy részét a szabad zsírsavak lebomlása biztosítja. A szabad zsírsavak a szöveti lipidek szintézisére is felhasználhatók. A májba fel­ vett szabad zsírsavak a ketontestek szintézisével az

8-4. táblázat. Hyperlipidaemiák felosztása Általános elnevezés (az érintett lipoprotein) Exogén hypelipaemia (kilomikron)

Típus 1.

Elsődleges károsodás familiáris lipoprotein-lipáz-elégtelenség C-ll apolipoprotein-elégtelenség

Endogén hyperlipaemia (VLDL)

IV.

familiáris hypertrigliceridaemia (enyhe) familiáris többszörös lipoprotein típusú hyperlipidaemia sporadikus hypertrigliceridaemia

Vegyes hyperlipaemia (VLDL + kilomikron)

V.

familiáris hypertrigliceridaemia (súlyos) familiáris lipoprotein-lipáz-elégtelenség C-ll apolipoprotein-elégtelenség

Hypercholesterinaemia (LDL)

Ila

familiáris hypercholesterinaemia (LDL-receptor-elégtelenség) familiáris többszörös lipoprotein típusú hyperlipidaemia különböző eredetű hypercholesterinaemia

Összetett hyperlipidaemia (LDL + VLDL)

llb

familiáris többszörös lipoprotein típusú hyperlipidaemia, ismeretlen eredetű

Egyéb hyperlipidaemia (p-VLDL)

III.

familiáris dysbetalipoproteinaemia, ismeretlen eredetű

Familiáris lecitin: koleszterin-aciltranszferázelégtelenség

-

LCAT részleges vagy teljes elégtelensége

246

I I I . AZ ANYAGCSERE

agy

8-48. ábra. Szabadzsírsav-forgalom az egyes szervek között. ATGL, adipocita-triglicerid-lipáz

agy számára is fontos energiaforrást jelentenek, de közvetlenül, zsírsavként az agyban nem hasznosítha­ tók. A plazma szabadzsírsav-metabolizmusának leg­ fontosabb tényezőit a 8-48. ábra foglalja össze.

8.11

A Z S ÍR O K E M É S Z T É S E ÉS FELS Z ÍV Ó D Á S A

Egy felnőtt ember napi átlagos zsírfogyasztása 50-150 g, amelynek 90%-át trigliceridek, a többit ko­ leszterin, koleszterin-észterek, foszfolipidek és zsírsa­ vak alkotják. A zsírok enzimatikus bontása kismértékben bár, de megkezdődik a szájüregben a nyelv mirigyei által ter­ melt lipáz hatására, amely aktív marad a gyomorban is a savas közeg ellenére. A hidrolízis lassú, mivel a zsí­ rok vízben nem oldódó molekulák lévén, elkülönülő fázisban, lipidcseppekben vannak jelen, s a vizes kö­ zeg felé, ahonnan az enzimek a zsírokhoz hozzáfér­ nek, kis felülettel rendelkeznek. Ezt a problémát az epesavak oldják meg, amelyek a májban szintetizálódnak, az epehólyagban raktározódnak és az epével a

duodenumba választódnak ki. Az epesavak detergens hatásúak, kölcsönhatásba lépnek a cseppekbe tömö­ rült lipidekkel és a vékonybél vizes közegével egy­ aránt, s ennek következtében a lipideket emulgeálják. A lipidcseppek emulgeálásához hozzájárul a perisztal­ tika is, a béltartalom mechanikus keverésével. A lipidek tényleges emésztése a vékonybélben tör­ ténik, s az enzimek a pancreasból hormonhatásra ürül­ nek a duodenumba. A jejunumban és a duodenumban a béltartalommal megjelenő zsírok és fehérjék hatásá­ ra kolecisztokinin szekretálódik, amely a keringéssel transzportálódik és az epehólyag kontrakcióját, vala­ mint a pancreasenzimek kiválasztását okozza. A má­ sik hormon a szekretin, amelynek hatására a pancreas­ ból bikarbonátban gazdag nedv ürül. A trigliceridek emésztését a hasnyálmirigy-Iipáz végzi. Az enzim a glicerin 1. és 3. szénatomján lévő észterkötéseket hidrolizálja, így zsírsav és 2-monoglicerid keletkezik (8-49. ábra). A lipáz működését egy másik, kis molekulatömegü, szintén a hasnyálmi­ rigyben keletkező fehérje, a kolipáz segíti (lehetővé teszi a lipáz fázishatár-aktiválását epesavak jelenlété­ ben).

247

8. A U P I D E K A N Y A G C S E R É I É

// A lipáz mellett ke­ [ hasnyálmirigy-lipáz O H2C—OH R, — COO" H2c — O — C — R, vésbé specifikus ész-> R., —C —O - C H R, —C—O—CH .0 I // terázok is ürülnek a H2c —OH Rg—COO' h2c —o—c—r3 2-monoglicerid zsírsavak pancreasból, amelyek triglicerid 8-49. ábra. A trigliceridek hidrolízise a hasnyálmirigy-lipáz hatására egyéb lipidek mellett a koleszterin-észtereket hidrolizálják koleszte­ mucosasejtekhez, ahol a lipidkomponensek a sejt­ rinre és zsírsavakra. A pancreasnedvvel nagy mennyi­ membránon áthaladva a sejtekbe abszorbeálódnak. ségű foszfolipáz-A2 proenzim is a vékonybélbe kerül, Epesavak hiányában is történik trigliceridemésztés és ahol tripszin hatására aktiválódik. A foszfolipáz-A2 a zsírsav, valamint monoglicerid felszívódás, azonban foszfolipidek 2. szénatomjáról távolítja el a zsírsavat, ennek hatásfoka nagyon csekély. A zsírsavak és a akeletkező lizofoszfolipidről további észteráz hatásra monoglicerid nagyrészt diffúzióval jut át az epitéla másik zsírsav is hidrolizál. A keletkező glicerosejtek plazmamembránján, de a hosszú szénláncú zsír­ foszforil-kolin a széklettel távozik vagy további hid­ savak transzportját specifikus traszporterek is segítik. rolízis után felszívódik. A foszfatidil-kolin-lebomlás A koleszterin felszívódása komplex folyamat és több | lépéseit a 8-50. ábra mutatja. transzportért is igényel, tekintettel arra, hogy a kolesz­ A lipidek hidrolízisének eredménye tehát a terin vízben teljesen oldhatatlan molekula. Transzjejunumban 2-monoglicerid, zsírsavak és koleszterin porter viszi a koleszterint az epitélsejtek citoplazmájákeletkezése. Ezek az epesavakkal micellákat alkotnak, ba (Niemann-Pick-Cl-like fehérje, NPC1L1). Az amelyekben a lipidek hidrofób csoportjai a micella epitélsejtek által felvett koleszterin egy része ABCbelső, a hidrofil csoportok pedig a felszín felé orientá­ transzporterek segítségével vissza is kerül a béllumen­ lódnak, így az egyébként vízben rosszul oldódó be, ami azért érdemel említést, mert így a növényi lipidek a bél vizes közegében oldott állapotban van­ szterolok nem kerülnek felszívódásra, hanem a szék­ nak. A lipideket a micellák viszik a béllumenben a lettel kiürülnek. Az ABC-transzporterek száma az epitélsejtekben LXR-szabályozás alatt áll, és befolyá­ solja a felszívódás hatékonyságát. A transzporterek // jelenléte ellenére a koleszterinfelszívódás hatékony­ 0 H,C—O—C—R. I R,—C —O —CH sága csak ~40%. H2c - O- P- O- CH- ch2- N+(CH3)3 Nofoszfatidil-kolin Klinikai vonatkozások f foszfolipáz-,

H2C - 0 —C — R, HO-CH

.O

//

H2C - 0 - P - 0 - C H - C H 2- N +(CH3)3

+ R2-C O O -

X0lizofoszfatidil-kolin

zsírsav

f lizofoszfolipáz

A koleszterinfelszívódásban részt vevő transzpor­ terek lehetőséget teremtettek olyan gyógyszerek elő­ állítására, amelyek gátolják a koleszterinfelszívódást és kiegészítő terápiás lehetőséget nyújtanak, esetleg statinok mellett, a szérumkoleszterin-szint csökkenté­ sére. Ilyen hatású szer az ezetimibe, ami a bélből fel­ szívódik, a májban glukuronsavhoz kötődik, így kerül vissza a bélbe, ahol gátolja a koleszterin felszívódását.

HO-CH

O H2C—O—V—O—CH2—CH2—N+(CH3)3 + R,-COOX 0-

glicerofoszforil-kolin

zsírsav

8-50. ábra. A foszfatidil-kolin lebomlása a vékonybélben

A sejtekben a 2-monogliceridből és a hosszú szén­ láncú zsírsavakból a trigliceridek újraszintetizálódnak. Az endoplazmás retikulumhoz, ahol a triglicerid-

I II.

248

AZ ANYAGCSERE

portális keringés

8-51. ábra. A trigliceridek és koleszterin-észterek emésztése és felszívódása.

FAB, fatty acid-binding protein (zsírsavkötő fe­

hérje); NPC1L1 (Niemann-Pick-CI-like protein-1)

szintézis végbemegy, egy zsírsavtranszporter (FAB, fatty acid-binding protein) viszi a zsírsavakat és a 2-monoacilgliceridet (8-51. ábra). Megtörténik a ko­ leszterin-észterek és a foszfolipidek szintézise is. A bélhámsejtekben a foszfolipidekből, a trigliceridek-

f felszívódás

bélhámsejt-

8-52. ábra. A steatorrhoea lehetséges okai

bői, a koleszterin-észterekből és a sejtekben szinteti­ zálódó A-l és B - 4 8 apoproteinekből létrejön a n a sz c e n s k i l o m i k r o n , az a lipoprotein, amely a bélhámsej­ teket a nyirokutakon hagyja el, és feladata a táplálék­ kal elfogyasztott lipidek elszállítása a zsírszövethez, az izomhoz és végül a májba a ko­ rábban leírtak szerint (8-44. ábra). Ez alól kivétel a 12-nél kisebb szénatomszámú zsírsavak felszívó­ dása, melyek a sejteken keresztül közvetlenül a portális keringésbe és ezen keresztül a májba kerülnek. A lipidek felszívódásának vázlata a 8-51. ábrán látható. Fiziológiás körülmények között a lipidek emésztése és felszívódása teljes, a székletben gyakorlatilag nincs zsír. S t e a t o r r h o e a az az álla pót, amikor nagy mennyiségű zsír jelenik meg a székletben, ami azt jelzi, hogy az emésztés és a felszí vódás folyamatának valamely ele­ me károsodott. Ez a máj, az epehó­ lyag vagy az epeutak betegsége, a pancreas vagy a bélhámsejtek el változása következtében jöhet létre (8-52. ábra).

249

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

8.12

■( poláros lipidek

A F O S Z F O L I P ID E K ÉS S Z F IN G O L IP ID E K F E L É P ÍT É S E ÉS JELENTŐSÉGE

-f szfingolipidek

foszfolipiidek

£glicerofoszfolipidek

f szfingomielin

("glikoszfingolipidek

A foszfolipidek és a szfingolipidek a tri8-53. ábra. A membránalkotó lipidek csoportosítása. A koleszterin részt vesz a membránok alkotásában, de a jelen felosztásban nem szerepel gliceridektől eltérő tulajdonságú és fíziológiaijelentőségü lipidek. A trigliceridek az ener­ giaraktározásban betöltött szerepük miatt el­ sősorban metabolikus jelentőségűek, a fosz­ folipidek és szfingoli­ pidek ezzel szemben 8-5. táblázat. A leg fontosab b g lice ro fo szfo lip id e k felép ítése struktúr lipidek. Leg­ fontosabb tulajdonsá­ H X -O -C -R , guk, hogy szemben az I // ^ I R„— C — O — CH R „-C -0 -C H apoláros trigliceridekHcT-)- P^ O H ] [ HO-j-fpoláros csoport h 2c -(-oh /> kel, egy molekulán be­ - O —

C

—

R,

-P -O -R ,

lül hidrofób és hidrofil részekkel egyaránt ren­ delkeznek. Ez az amfipatikus sajátság mind a foszfolipideket, mind a szfingolipideket jellem­ zi, és meghatározza a molekulák legfőbb funkcióját is (8-53. áb­ ra). Bár a foszfolipidek jelen vannak a plazmá­ ban és az epében is, leg­ fontosabb funkciójuk mégis az, hogy a membránok alkotásá­ ban vesznek részt (lásd 4. fejezet). A foszfolipidekben a szfmgomielin kivéte­ lével az alapvegyület a foszfatidsav. A legfon­ tosabb glicerofoszfolipidek (foszfogliceridek elnevezés is elfogadott) szerkezetét a 8-5. táblá­ zat mutatja. Az emberi szervezetben a memb­ ránok alkotásában, leg-

diglicerid

foszforsav

poláros molekula

foszfatidsav

(alkoholos OH-csoporttal) az R , a foszfolipid neve képlete

neve foszfatidil-szerin

etanolamin

foszfatidil-etanolamin

kolin

foszfatidil-koiin

inozitol

foszfatidil-inozitol

glicerol

foszfatidil-glicerol

foszfatidil-glicerol

kardiolipin

250

III.

nagyobb mennyiségben a foszfatidil-kolin (lecitin), a foszfatidil-etanolamin kefalin) és a foszfatidil-szerin vesz részt. Közülük a fiziológiás pH mellett a foszfatidil-szerin rendelkezik egy nettó negatív töltés­ sel, amiért is savanyú foszfolipidnek tekinthető. A másik két foszfolipid ikerionként viselkedik. A foszfatidil-inozitol a sejtmembránban játszik szerepet számos hormon és neurotranszmitter hatásá­ nak a közvetítésében. A foszfatidil-glicerol, amelyben a foszfatidsavhoz egy glicerin kapcsolódik, viszonylag nagy mennyi­ ségben van jelen a mitokondriumok membránjában. Mind a foszfatidil-inozitol, mind a foszfatidil-glicerol savanyú foszfolipidek, neutrális pH-n egy nettó nega­ tív töltéssel rendelkeznek. A kardiolipin savanyú tulajdonsága még kifeje­ zettebb, mivel a molekula, amelyben két foszfatidsav kapcsolódik össze egy glicerinen keresztül, két nega­ tív töltéssel rendelkezik. Kardiolipin főleg a mito­ kondriumok belső membránjában található. A foszfolipidekben a glicerin 1. és 2. szénatomjá­ hoz nem azonos zsírsavak kapcsolódnak, az 1. szén­ atomon általában 16 vagy 18 szénatomos telített zsír­ sav, a 2. szénatomon pedig valamilyen telítetlen zsír­ sav található. A felsorolt foszfolipidekben a glicerin alkoholos OH-csoportjához észterkötéssel kapcsolódnak a zsír­ savak. A plazmalogénben az 1. szénatomhoz éterkö­ téssel kapcsolódik a hosszú szénláncú (18) enol (8-54. ábra, bekeretezett rész ). A mielinmembrán viszony­ lag nagy mennyiségű etanolamin-plazmalogént tartal­ maz, míg a kolin-plazmalogén inkább a szívizomban található.

AZ ANYAGCSERE

keletkezik, és innen szabadul fel a sejtek aktivációjakor. A PAF nemcsak a trombociták aggregációját okozza, hanem szerepe van a gyulladásos és allergiás folyamatok létrejöttében is (vazodilatáció, kemotaxis, bronchuskonstrikció). h 2c

—o — c h 2— (c h 2)16— c h 3

// CH,

I 2 I

H ,C —O — P^-O— CH ,—C H ,— N+— N CH,

2

I

2

CH,

8-55. ábra. Trombocitaaktiváló faktor (PAF)

Különleges szerepet tölt be a dipalmitil-lecitin (8-56. ábra). Egy olyan foszfatidil-kolin, amelyben a glicerin 1. és 2. szénatomján az OH-csoportot palmitinsav észteresíti. A dipalmitil-lecitin alkotja azoknak az extracelluláris foszfolipideknek a 80%-át, amelyek a tüdőben az alveolusokkal közvetlenül érintkező extracelluláris folyadékban találhatók. A dipalmitillecitin („surfactant”) csökkenti a felületi feszültséget az alveolusok felszínén, s ezáltal megakadályozza, hogy az alveolusok a kilégzés végére teljesen összees­ senek. Ez a felületaktív hatás csak a dipalmitil-lecitint jellemzi; olyan foszfatidil-kolin, amely nem tartalmaz két palmitinsavat, nem rendelkezik ezzel a képesség­ gel.

h, c c h 3— (CH2)14-

- o - c - ( c h 2)14- c h 3

J-

C -0 -C H

CH,

I J' H,C —O— P — O— CH,—C H ,— N+— N' CH, 2 I 2 2 I CH,

h 2c

✓ °

—o - - c h = c h —(CH2)15— c h 3 8-56. ábra. Dipalmitil-lecitin. Tüdő-„surfactant"

2i

R„— C — O — C - H

.0 h 2c - o - p - o — c h 2- c h 2- nh 3+ 0-

8-54. ábra. Etanolamin-plazmalogén

Foszfolipid a trombocitaaktiváló faktor (piatelet activating factor; PAF, 8-55. ábra), amely főként a polimorfonukleáris leukocitákban, makrofágokban, monocitákban, trombocitákban és endotélsejtekben

Klinikai vonatkozások A dipalmitil-lecitint a II. típusú pneumociták termelik, s mennyisége az intrauterin élet 34. hetére éri el azt a szintet, ami a tüdő normális működéséhez szükséges. Ezen kor előtt a tüdőben főleg szfingomielin szin-

251

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

tetizálódik. Ha a „surfactant”-hatás elégtelen, a tüdő éretlen a funkciója ellátására, és kialakul az újszü­ löttkori (infantilis típusú) respirációs distressz szindróma (IRDS). A fejlett országokban az új­ szülöttkori elhalálozás 15—20%-át RDS okozza, ami azonban csak koraszülött csecsemőkben alakul ki. Az állapot nagy biztonsággal előre jelezhető, ha az

amnionfolyadékban meghatározzák a foszfatidilkolin/szfingomielin arányt és az 2-nél kisebbnek mu­ tatkozik. Exogén surfactant adása ilyen esetekben jó hatású. A dipalmitil-foszfatidil-kolin, a foszfatidilglicerol, valamint a foszfatidil-inozitol mennyiségé­ nek közvetlen meghatározása is informatív az RDS előfordulására nézve.

A foszfolipidek szintézise során felépül a molekula váza (glicerin vagy szfingozin), megtörténik a zsírsa­ vak kapcsolódása, létrejön a foszfodiészter kötéssel

kapcsolódó hidrofil (poláros) molekula beépülése és végül módosulhat, vagy kicserélődhet az eredetileg beépült poláros molekula.

dihidroxiaceton-foszfát

j glicerin

NADH + H+^

z

zsírszövet NAD+

A

H,C —OH

I

-» HO—CH

ATP máj, vese, bél ADP

144 44

II I .

268

AZANYAGCSERE

ACTH

tekben koleszterin mobilizálódik a koleszterin-észter-raktárból, és a gyorsan aktiválódó StAR gén transz­ kripció, valamint a protein-kináz A által történő foszforiláció következ­ ATP cAMP tében fokozódik a koleszterin l mitokondriumba történő transzport­ ja. Az ACTH az azonnali (perceken belüli) hatásokon túl hosszabb távú (órák) befolyást is gyakorol a szteroidhormonok szintézisére azáltal, hogy az angiotenzin-II-vel együtt fo­ kozza számos a szintézisben részt vevő enzim transzkripcióját. Tartós hatásaként (hetek, hónapok) pedig mellékvese-hipertrófia jön létre, te­ hát megnő a szteroidhormon-szintézisre képes sejtek száma. Ebben a ha­ tásban a cAMP-n kívül egyéb ténye­ zők (IGF-II, EGF, BFGF, basic fibroblast growth factor) is szerepet játszanak. Valószínűleg ugyanezeken a pon­ tokon és ezzel a mechanizmussal tör­ ténik a nemi hormonok szintézisének a szabályozása az ovariumban és a testisben, azonban ezt nem az 8-77. ábra. Intracelluláris kompartmentek részvétele a kortizolszintézisben. A szintézis szabályozása. Az adrenokortikotrop hormon (ACTH) a plazma­ ACTH, hanem a hypophysis megfe­ membránban receptoraihoz (R) kötődik, ami cAMP-szint emelkedést és proteinlelő hormonjai, a luteinizáló hor­ kináz A aktiválást eredményez. A protein-kináz A foszforilálja és aktiválja a koleszterin-észterázt, foszforilálja és stimulálja a StAR-t (ACTH hatásra fokozódik a StAR mon (LH) és a folliculusstimuláló gén átírása is) és stimulálja a koleszterin mitokondriumba történő transzportját hormon (FSH) stimulálják. (Terhes­ ség alatt a placenta progeszteronszintézisét a humán choriogonahypothalamus által szintetizált („releasing”) hormo­ dotrop hormon szabályozza.) Az egyes hormonok nok hatására szabadulnak fel, amelyek szintézise szintézisét szabályozó szignálokat a 8-8. táblázat fog­ csökken, amikor a plazmában a megfelelő szteroidlalja össze. A stimuláló hormonok a hypophysisből a

8 -8. táblázat. Szteroidhormonok szintézisének stimulálói

Szteroidhormon

Stimuláló

Szintézis helye

Stimulus eredete

kortizol

zóna fasciculata

ACTH

hypothalamus-hypophysis

progeszteron

corpus luteum

LH

hypothalamus-hypophysis

tesztoszteron

Leydig-sejt

LH

hypothalamus-hypophysis

17(S-ösztradiol

ovariumtüsző

FSH

hypothalamus-hypophysis

aldoszteron

zóna glomerulosa

angiotenzin-ll

renin-angiotenzin rendszer

269

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

hormon szintje megemelkedik. így a keringés és több szerv közreműködésével, indirekt módon a szteroidhormonok negatív feedback hatással gátol­ ják önmaguk szintézisét. Ennek a rendszernek a váz­ latát a kortizol esetében mutatja a 8-78. ábra. A sé­ ma erősen leegyszerűsített, mert a kortizolszintézisre a központi idegrendszer is befolyást gyakorol: a fizikai és a pszichés állapot, a stressz, a hőmérsék­ let-változás, fertőzések és számos más tényező is, amelyekkel itt nem foglalkozunk.

f angiotenzinogén (plazma a 2-globulin) ("renin

- vese juxtaglomeruláris sejtek

\/ ( angiotenzin-l (Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe-His-Leu)

( angiotenzinkonvertáló enzim (ACE) (tüdő, máj, endotélsejtek, vese stb.) (angiotenzin-II (Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe) ( aminopeptidáz

hypothalamus

a

kortikotrop releasing horrrion (CRH)

>/ ->\ hypophysis

>f [angiotenzin-II 1 (Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe) 8-79. ábra. A renin-angiotenzin rendszer

adrenok ortikotrop hormo (ACTH)

>t [ mellékvesekéreg kori izol \f plazmakortizol 8-78. ábra. A kortizol - megemelkedett plazmaszint ese­ tén - gátolja a CRH és az ACTH szintézisét (géntranszkrip­ ciót) a hypothalamusban, illetve a hypophysisben

A mineralkortikoidok legfontosabb hatása az, hogy a vese disztális tubulusaiban a Na+-transzportot fo­ kozzák, vagyis Na+-retenciót okoznak. Szintézisük­ nek legfőbb stimulálója az angiotenzin-II, amely egy oktapeptid, és hatását a zóna glomerulosa sejtek membránjában lévő receptorán keresztül fejti ki. (A receptoraktiválás nem befolyásolja a cAMP-szintet, hanem az intracelluláris Ca2 -szint emelkedését váltja ki, lásd 17. fejezet). Angiotenzin-II akkor keletkezik, amikor szükségessé válik a plazma Na+-koncentráció­ jának, illetve a vérnyomásnak az emelése (8-79. áb­ ra). A plazma Na+-koncentrációjának csökkenése vagy hypovolaemia a vese juxtaglomeruláris sejtjei-

bői renint, egy proteázt szabadít fel, ami a keringés­ ben a máj által termelt, mintegy 400 aminosavat tar­ talmazó angiotenzinogénből (egy ot2-globulin) egy dekapeptidet hasít le, amelyet angiotenzin-I-nek ne­ vezünk. Az angiotenzin-I-ből az angiotenzinkon­ vertáló enzim (ACE) két aminosavat lehasít a C-terminális végről, és angiotenzin-II keletkezik. Az angiotenzin- II-ből egy aminopeptidáz hatására angiotenzin-III keletkezik, ami szintén hatékony stimu­ lálója az aldoszteronszintézisnek, azonban a kerin­ gésben az angiotenzin-II-nél sokkal kisebb mennyi­ ségben van jelen.

Klinikai vonatkozások Az angiotenzin-II az aldoszteronszintézis stimulálása mellett nagyon hatékony vazokonstriktor is, ezért ke­ letkezésének gátlása (ACE-gátlókkal) bizonyos típu­ sú hypertensiókban vérnyomáscsökkentő hatású. (Az ACE-gátlók hatásához hozzájárul a vazodilatátor ha­ tású bradikinin elbontásának gátlása is, tekintettel ar­ ra, hogy az ACE nem specifikus lévén, a bradikinint is elbontja.)

II I .

270

Az angiotenzinnel ellentétes hatású a pitvari (atrial) nátriumürítő faktor (ANF), amely a pitvar­ ban keletkezik és receptora megtalálható a zóna glomerulosa sejtek membránjában. A receptor guanilát-cikláz-aktivitással rendelkezik (lásd 17. fejezet) és hatására csökken az aldoszteron szintézise és szek­ réciója.

Klinikai vonatkozások A mellékvesekéreg-hormonok szintézise számos ok­ ból zavart szenvedhet, s akár túlprodukció, akár csök­ kent szintézis bekövetkezhet. A kóros állapotok közül csak egy enzimdefektusról, a 21-hidroxiláz-eIégtelenségről teszünk említést. Azokat az állapotokat, amelyekben genetikai enzimdefektus következtében elégtelen a kortizolszintézis, kongenitális adrenális hyperpiasiáknak nevezzük, mert a csökkent kortizolszint a negatív feedback gátlás csökkenése követ­ keztében ACTH-túlprodukcióhoz és mellékvesehyperplasiához vezet. Az esetek 90%-ában az ok a 21 -hidroxiláz elégtelen működése, ami lehet részleges vagy teljes. A 21-hidroxiláz elégtelen működése kö­ vetkeztében csökken a kortizol és a mineralokortikoidok szintézise. A fokozott ACTH-stimulus vi­ szont serkenti a koleszterin —» pregnenolon lépést és azon intermedierek keletkezését (lásd 8-75. ábra), amelyek nem lévén más lehetőség, az androgének irá­ nyában alakulnak tovább. Az androgén-túlprodukció a külső genitáliák férfi nemi jellegű differenciálódását okozza, és - nemtől függően különböző mértékben, de általában - már újszülöttkorban felismerhető jele­ ket okoz a genitáliákon. Később korai nemi éréshez és nőkben férfias másodlagos nemi jelleg kialakuláshoz vezethet. Ez az adrenogenitalis szindrómában nyil­ vánul meg, mint pl. virilismus, hirsutismus, jellegze­ tes kopaszodás, kis emlők stb. Az aldoszteron hiánya vagy erősen csökkent szintje súlyos sóveszteséggel és hypotoniával jár.

AZ ANYAGCSERE

A glukokortikoidok és a mineralokortikoidok inaktiválása és szállítása a plazmában A szteroidhormonok inaktiválása, amelynek során a molekula a C3-ketocsoporton és az A-gyűrüben re­ dukálódik, elsősorban a májban történik, és NADPHval működő reduktázok katalizálják. A redukált (dihidro- és tetrahidro-) metabolitok glukuronsawal vagy szulfáttal konjugálódnak, s vízoldékonnyá válva a vesében kerülnek kiválasztásra. A vérplazmában a szteroidok fehérjéhez kötve szállítódnak. A mineralokortikoidok albuminhoz, a glukokortikoidok specifikus fehérjéhez, a transzkortinhoz (más néven kortikoszteroidkötő fehérje, CBG) kötődnek. A transzkortin köti még a dezoxikortikoszteront és a progeszteront is. A keringésben lévő kortizol kb. 8%-a szabadon található, s ez képezi a biológiailag aktív kortizolfrakciót. A szteroidhormonok biológiai hatásukat specifikus receptoraikon keresztül fejtik ki. Receptoraikról, ame­ lyek intracelluláris lokalizációjúak, a 18. fejezetben külön szólunk. A glukokortikoidok inaktiválásában a kortizol -» kortizon átalakulást külön is meg kell említeni. Ezt az oxidációt a 2-es típusú 11 P-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz enzim (lipH SD ) katalizálja, NAD+ kofaktorral, aminek következtében 11 -ketoszteroid, kortizon jön létre. A 11PHSD2 azokban a szövetekben expresszálódik, pl. a vese disztális tubulusokban, amelyek mineralokortikoid-receptorokkal rendelkez­ nek, ahol a mineralokortikoidok biológiai hatásukat kifejtik. A kortizol, amely a plazmában három nagy­ ságrenddel nagyobb koncentrációban van jelen, mint az aldoszteron, kötődik a mineralokortikoid-receptorhoz és ott agonista hatású. Ezt akadályozza meg a 11PHSD2 jelenléte, amelynek révén a mineralokortikoid hatással nem bíró kortizon keletkezik. Ez az en­ zim a placentában is jelen van és védi a magzatot az anyai szervezetben jelenlévő endogén, vagy terápiás céllal kapott kortikoszteroidok odakerülésétől. Az en­ zim 1-es izoformája, a l l PHSD1, in vivő a kortizon -> kortizol átalakulást katalizálja, aminek az az oka, hogy az endoplazmás retikulum luminális oldalán lokalizálódik, ahol a redox környezet a redukciónak

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

271

kedvez. Az enzim működése a reakciót mindkét irány­ ban lehetővé teszi, függően elsősorban a NADPH/ NADP aránytól, s minthogy ez az arány az ER-ben magas, reduktív folyamat, azaz a kortizon —>kortizol átalakulás történik. A lipH SD l a glukokortikoidérzékeny szervekben található (máj, tüdő, here, zsír­ szövet, vese proximális tubulusok). A szintetikus 11-ketoszteroid-glukokortikoidokat (kortizon és pregnenon) a máj 1ípHSDl redukálja aktív hormonná.

A nemi hormonok szintézise A tesztoszteron a here Leydig-sejtjeiben koleszte­ rinből szintetizálódik, amelynek lépései a dehidroepi-

androszteron keletkezéséig azonosak a 8-73. és a 8-75. ábrán látottakkal. A Leydig-sejtekben a 3PHSD mel­ lett egy másik dehidrogenáz, a 17p-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz (17pHSD) is jelen van, amely a DHEA-t tovább alakítja tesztoszteronná (8-80. ábra). Az elsődleges útvonal az androszténdion keletkezésen keresztül vezet, de a DE1EA —» androszténdiol - » tesz­ toszteron átalakulás is jelentősen hozzájárul a herében történő tesztoszteronszintézishez. (Az androszténdion keletkezésében kisebb jelentőségű a 17-hidroxi-progeszteronon keresztül vezető út, lásd 8-75. ábra) A 17PHSD több izoformában előforduló, több szubsztrátot átalakító, oxidációt és redukciót egyaránt katalizálni képes enzim, amely a nemi hormonok szin­ tézisének számos pontján jelentőséggel bír. A külön-

[ koleszterin (pregnenolon ---------> [j7-OH-pregnenolon ---------> fdehidroepiandroszteron

[3[3HSD

\

[17pHSD3 '4 OH

3|3-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz; 17(3HSD3, szteroid-dehidrogenáz (3-as izoforma)

17p-hidroxi-

H 5-ix-dihidrotesztoszteron

272

böző izoenzimek egyebek mellett eltérő szubsztrát- és kofaktor-specificitással és fiziológiai funkcióval bír­ nak, s ezek közül csak a legjelentősebbekkel foglalko­ zunk. A herében történő tesztoszteronszintézisben a 17(3HSD3 izoformának van jelentősége, amely csak­ nem kizárólag itt expresszálódik. A tesztoszteronból a herében csak kis mennyiségű, a célsejtekben (vesicula seminalis, prostata, külső genitáliák) nagyobb mennyiségű 5a-dihidrotesztoszteron keletkezik, ami a tesztoszteron aktív metabolitja. Ebben az átalakulásban az A-gyürüben levő kettős kö­ tés redukálódik, a reakciót az 5a-reduktáz katalizálja (8-80. ábra). A herében és egyes célsejtekben a tesztoszteronból 17P-ösztradiol is keletkezik, amely­ nek során az A-gyűrü aromássá válik (lásd alább). A tesztoszteronszintézist a hypophysis által termelt luteinizáló hormon szabályozza, ugyanolyan módon és receptorhatással, ahogyan az ACTH a glukokortikoidok szintézisét. A tesztoszteront a keringésben jórészt a tesztoszteron-ösztrogén-kötő globulin (TEBG), más néven a szexuálhormonokat kötő globulin (SHBG) szállítja, kisebb mennyiségben albuminhoz kötődik. A kerin­ gésben lévő teljes mennyiség 97-99%-a fehérjékhez

III.

AZ A N Y A G CSER E

kötve található, s csak néhány százalék van szabadon, ami a biológiailag aktív frakció. A tesztoszteronmetabolizmusban, amely elsősor­ ban a májban zajlik, a 17. szénatomon oxidáció törté­ nik, az A-gyürü és a 3-keto-csoport redukálódik. A ki­ alakuló 17-ketoszteroidok androgén hatással nem ren­ delkeznek. A tesztoszteron és az 5a-dihidrotesztoszteron cél­ sejtekben található receptorai az intracelluláris recep­ torok családjába tartoznak (lásd 18. fejezet). Befolyá­ solják a spermatogenezist, a szexuális érést, a másod­ lagos nemi jelleg kialakulását, a szexuális magatartást és anabolikus hatásúak. A legfőbb női nemi hormon, a 17p-ösztradiol az ovariumban keletkezik, de egyéb ösztrogének máshol is keletkeznek (pl. placenta, bőr, zsírszövet, máj, cson­ tok). A szintézis kezdeti lépései a koleszterinből azo­ nosak a mellékvesekéreg szteroidjainak szintézisével. A további folyamatokat a 8-81. ábra mutatja. A szin­ tézis során oxidatív demetilálás történik - vagyis a ke­ letkező termék 18C-atomos -, és az A-gyűrű aromássá válik. Az enzim a mikroszomális P450-aromatáz (P450aro), amely molekuláris oxigénnel és NADPHval működik. Fiziológiásán érdemleges mennyiségű ösztrogén csak a P450aro közreműkö­ désével keletkezik. Az ösztradiol szintéziséhez szükség van egy másik 17PHSD izoenzimre, ez a 17pHSDl. A 17PHSD1 a citoszolban lokalizáló­ dé enzim, amely az ösztron -» P17[3HSD3 ösztradiol átalakulását katalizálja, va­ gyis redukál, és ehhez NADPH a kofaktora. Kis affinitással androgéneket is átalakít (pl. DHEA), de nagy affinitást igazán az ösztron iránt mu­ tat, az aromás A-gyűrü jelenléte miatt. A kódoló gén elsősorban a placentában és az ovariumban, a kifejlődő tü­ sző granulosasejtjeiben expresszáló­ dik, s ezen izoforma szerepe a biológi­ ailag aktív ösztradiol szintézise. A granulosasejtekben az ösztrogének 8-81. ábra. Ösztradiol keletkezése. A szintézis fő útvonala az ösztron ke­ szintézise bonyolult azért, mert részt letkezésén át vezet, a tesztoszteron-útvonal kisebb jelentőségű. 17ftHSD, 17p-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz (a számok a különböző izoformákat jelölik). vesznek ebben a theca intema sejtek Kék nyíllal a 17PHSD2 hatására bekövetkező oxidációt jelöljük. P450aro, is, tekintettel arra, hogy az enzimek P450aromatáz

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

Az ösztradiol szintézise a menstruációs ciklussal párhuzamos ciklikusságot mutat, és a tüszőérés fázisá­ ban történik. A folyamatokat két hypophysishormon, az FSH és az LH regulálja. FSH hatásra a granulosa­ sejtek proliferálnak, és thecasejt-toborzás történik, il­ letve mindkét hormonnak szerepe van a szintézishez szükséges enzimek indukciójában. A ciklus közepén, amikor az ösztradiol pozitív feedback hatására nagy mennyiségű LH-elválasztás történik, létrejön az ovu­ láció, s a megrepedt tüszőből ezt követően alakul ki a corpus luteum, amelyben a progeszteronszintézis a meghatározó. A placenta is szintetizál ösztrogéneket, ami a mag­ az ösztradiol. zati mellékvese által termelt és a magzati keringéssel Az ösztradiol az ovariumban főként a granulosa­ ideszállított DHEA-ból történik a 3pHSD, 17[3HSD1 sejtekben keletkezik, kisebb mennyiségben a corpus és a P450aro közreműködésével. Az ösztrogének szin­ luteum is termeli, ahol elsősorban progeszteron szintézise a plancenta jó állapotát jelzi. tetizálódik. (A férfi szervezetben is keletkezik kis A keringésben az ösztrogének ugyanahhoz a fehér­ mennyiségű ösztradiol a tesztoszteronból, és ugyan­ jéhez, az SHBG-hez kötődnek, ami a tesztoszteront is ezen útvonalon kis mennyiségben a granulosasejtek is köti, a progeszteron pedig a glukokortikoidokat is előállítanak ösztradiolt, lásd 8-81. ábra szaggatott szállító kortikoszteroidkötő fehérjéhez kötődve szállínyilak). Az ösztrogének legfőbb forrása posztmenotódik. Az ovariális szteroidok nem raktározódnak, a pauzában a mellékvese eredetű androszténdion, plazmaszint a menstruációs ciklus során változik, és amelyből a mikroszomális P450-aromatáz (P450aro) tükrözi az ovariumban folyó szintézist. hatására ösztron keletkezik. Az ösztrogének és a pro­ geszteron metabolizmusa a májban történik. A progesz­ teron metabolizmusa gyors (ezért a progeszteron oráli­ cAMP — > P450scc-expresszio san nem hatékony), amely­ fP450c17 nek során az A-gyürü, a C3------------------- > 117-OH-pregnenoion koleszterin ------- ------ > [ pregnenolon és C20-keto-csoport reduká­ f P450CI7 lódik és glukuronsavval konjugálódik. Orális fogamzásDHEA ■( progeszteron gátláshoz olyan progesztef3|3HSD ronszármazékokat használ­ Nt í P450aro m ---------nak, amelyek a májban ke­ (1ösztron “V-----------------véssé metabolizálódnak. Az f 17[3HSD1 ösztrogének glukuronsavval t tesztoszteron és szulfáttal konjugálódva f ösztradiol választódnak ki a vizeletbe, theca intema granulózasejt epébe és a székletbe. 8-82. ábra. Nemi hormonok szintézise az ovariumban tüszőérés során. Progeszteron Az ösztrogének (és az a szintézis végeredményeként csak a luteális fázisban keletkezik (corpus luteumban). P450scc, citokróm P450 side-chain cleavage; P450c17, 17a-hidroxiláz; P450aro, P450androgének) inaktiválásában aromatáz; 17(3HSD1, ( -hidroxiszteroid-dehidrogenáz (1-es izoforma); 3(3HSD, 3p-hidroxiszerepet játszik a mikroszoszteroid-dehidrogenáz/A5,4-izomeráz; LH, luteinizáló hormon

egy része sejtspecifikus módon ott, más részük a granulosasejtekben expresszálódik (8-82. ábra). A koleszterin -» pregnenolon átalakulás a granulosa­ sejtekben történik LH-stimulusra, aminek következté­ ben expresszálódik a P450scc. A granulosasejtekben azonban nincs P450cl7, van viszont a theca internában, és a pregnenolon a további átalakulásokhoz ide diffundál. Itt folytatódik a szintézis az androszténdion keletkezéséig, amelyből kis mennyiség kiválasztód­ hat, vagy tesztoszteronná alakulhat, legnagyobb rész­ ben azonban visszakerül a granulosasejtekbe. AP450aro és a 17(3HSD1 hatására végül itt keletkezik

c

17 3

III.

274

mális 2-es típusú 17PHSD izoenzim, amely számos szervben expresszálódik és szemben a 17PHSD1gyel, amely az ösztron —> ösztradiol átalakítással az ovariumban, illetve a placentában az aktív ösztrogént állítja elő, a 17PHSD2 az ellentétes irányú reakcióval, inaktiváló hatású. Jelen van az uterus endometrium-

ban és a placentában is, ahol az anyai ösztradiol és tesztoszteron (mert a tesztoszteront is oxidálja a C17-en) bekerülésétől védi a magzatot.

8.14

H,C 3 \

UV-sugárzás

[c-25 oxidáció májban C-1 oxidáció ) vesében

1,25-dihidroxi-kolekalciferol aktív hormon

8-83. ábra. A D3-vitamin és aktív m etabolitjának keletke­ zése

1a,25-dihidroxi-kolekalciferol^

J f

Ca2+-felszabadulás a csontokból ^ Ca2*-kiürülés a vesében 'l'

Koleszterinből történik a kalcium- és a foszfát-metabolizmusban alapvető szerepet játszó D3-vitamin szintézise. A szintézis, amelyhez a 7-dehidrokoleszterin a közvetlen prekurzor, a 8-83. ábrán látható módon történik. A bőrben a napsugár ultraibolya-komponense hatására alakul ki a D3-vitamin, a kolekalciferol, amely azonban még nem a biológiailag aktív anyag. A Ü3-vitamin kelet­ kezéshez elégséges, de egyszersmind szükséges is, hogy naponta legalább 10-15 percig a bőrt kis felü­ leten (arc, kéz) napsugárzás élje. D3-vitamin számos táplálékban megtalálható (tengeri halak, máj, tojássárga), amelyek alkalmasak arra, hogy a ^ - v i ­ tamin-szükségletet pótolják. A kolekalciferolból először a májban 25-hidroxi-kolekalciferol keletkezik, majd ebből a vese proximális tubulusaiban alakul ki a hatékony metabolit, az la,25-dihidroxi-kolekalciferol. Kelet­ kezését a parathyreoidhormon szabályozza, mely stimulálja a la,25-dihidroxi-kolekalciferol szintézi­ sét, míg hiányában inkább az inaktív 24,25-dihidroxi-kolekalciferol keletkezik. A parathyreoidhormon-elválasztást az alacsony szérum-Ca -szint váltja ki. A keletkező la,25-dihidroxi-kolekalciferol, mint szteroidhormon magi receptorokon hat, amelyek jelen vannak a bélhámsejtekben, a csont­ sejtekben és a vesetubulusok epitélsejtjeiben. A bél­ hámsejtekben a kolekalciferol számos, a Ca2+-háztartásban szerepet játszó fehérje indukció­ ját váltja ki, egyebek között megnő a calbindin és a

szérum-Ca2+-szint esetén

I

I

A D 3-VITAMIN S ZIN TÉZ IS E

8-84. ábra. A kalciumanyagcsere változása alacsony

[szérű m-Ca2+-szint4r

[parathyreoid hormon^

AZ AN Y A G CSER E

Ca2+-felszívódás a bélben ^

8. A L I P I D E K A N Y A G C S E R É J E

bazolaterális membrán Ca2 -ATPáz szintézise és megnő a Ca2+ epitélsej teken keresztül történő felszí­ vódása. A csontokban a parathyroidhormonnal együtt egyensúlyban tartják a Ca2+-lerakódás és -felszaba­ dulás folyamatát, a vese disztális tubulusokban pedig stimulálják a Ca2+-reabszorpciót, vagyis a Ca -kiürülést gátolják. Az alacsony Ca2+-szint esetén végbeme­ nő folyamatokat a 8-84. ábra mutatja. Amikor megnő a szérumban a Ca2+-koncentráció, csökken a parathyreoidhormon-elválasztás, a 25-hidroxi-kolekalciferolból az inaktív 24,25-dihidroxi-kolekalciferol ke­

275

letkezik és a Ca2+- forgalom a szervezetben ellentéte­ sen változik azzal, ami a 8-84. ábrán látható. A D-vitamin-hiány súlyos formájában alakul ki a csontelváltozásokkal járó rachitis, illetve osteomalacia.

A fejezet megírásával kapcsolatban tett javaslato­ kért és kritikai megjegyzésekért a szerző köszönetét mond Dr. Kolev Kraszimirnek és Dr. Komorowicz Er­ zsébetnek.

9

AZ AMINOSAVAK A NYAGCSERÉJE A PORFIRIN-ANYAGCSERE

MACHOVI CH RAYMUND ÉS T R E T T E R L Á S Z L Ó

9.1

Az am inosav-anyagcsere általános ism ertetése

9.2

A táplálékból szárm azó am inosavak. A feh érjék em észtése

9.3

Az endogén fehérjék lebontása

9.4

Az am inosavak lebontása

9.5

Az am m óniaeltávolítás m echanizm usai

9.6

276 278

283

289 304

Egy szénatom os csop ortok transzferreakciói. A te tra h id ro fo lá t és az S-adenozil-m etionin szerepe az am inosav-anyagcserében

9.1

9.7

A nem esszenciális am inosavak b io szintézise

9.8

Az am inosavakból képződ ő nitogéntartalm ú veg yü le tek

9.9

Porfirinek és ep efestékek. Vashom eosztázis

AZ AMINOSAVA NY A GC SER E ÁLTALÁN OS IS M ER TET ÉSE

Az aminosav-anyagcsere első látásra elrettentő komplexitású lehet az olvasó számára. Nem a reakciók kémiája teszi nehézzé, hanem a reakciók és az inter­ medierek nagy száma. Ezek az anyagcsereutak azon­ ban átláthatók, ha szem előtt tartjuk a metabolizmus alapelveit, koncentrálunk a metabolikus prekurzorokra és csomópontokra, illetve az általános reakciótípu­ sokra. Az orvostanhallgató sokat profitálhat abból, hogy az öröklődő betegségek nagy számban az aminosav- és nukleotid-anyagcserét érintik, továbbá a daga­ nat kemoterápiájában szerepet játszó gyógyszerek egy része is az aminosav- és nukleotid-anyagcsere bizo­ nyos pontjait támadja. A fejezetben a nagyszámú öröklődő enzimopátia közül azokat tárgyaljuk, ame­ lyek vagy előfordulások gyakorisága miatt fontosak, vagy pedig az enzimdefektusból a biokémiai folyama­ tok ismeretében le tudjuk vezetni a betegség pato-

310

312 314

319

mechanizmusát, tüneteit, lehetséges kezelését. Sajnos, jelenleg is nagy a száma azoknak az enzimdefektusok­ nak, melyekben a patomechanizmus hiányos ismerete miatt nem tudunk hatékony terápiát alkalmazni. Az aminosavak azon kívül, hogy a fehérjék építő­ elemei, szerepet játszhatnak a szervezet energiagaz­ dálkodásában, és kulcsszerepet töltenek be a nitrogéntartalmú molekulák (pl. nukleotidok, porfirinek, hor­ monok) szintézisében. Az aminosavak szintéziséhez elsősorban szénhid­ rátokra és nitrogénre van szükség. Az evolúció során bizonyos sejtféleségek elvesztették szintetizálóképes­ ségüket és az aminosavak egy részét kész formában veszik fel, amivel energiát takarítanak meg. így példá­ ul a humánsejtek egyáltalán nem képesek egyes ami­ nosavak szintézisére; ezeket esszenciális aminosavaknak nevezzük (9-1. táblázat). Szemiesszenciális aminosavként tartunk számon néhány olyan aminosavat, amelyeket az emberi szer­ vezet ugyan képes szintetizálni (Arg), de a szintézis sebessége kicsi, és így mennyiségük nem elégséges

277

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R FI R I N - A N Y A G CS E R E

(elsősorban a fejlődésben lévő szervezetek számára). Azokat az aminosavakat pedig, amelyeket a humán szervezet elegendő mennyiségben képes szintetizálni, nem esszenciális aminosavaknak nevezzük. A nem esszenciális aminosavak szintézise általában kevés enzimmel, néhány lépésben történik, más metabolikus utak köztitermékeiből. így szelekciós előnyt élvezhet az az organizmus, amely nem használ energiaigényes metabolikus utakat az összes aminosav szintéziséhez, illetve nem kódolja és replikálja azt a genetikai infor­ mációt, mely a nagyszámú, aminosavat szintetizáló enzim szintéziséhez szükséges. A Föld légköre bőségesen tartalmaz molekuláris nitrogént, ez azonban nem hozzáférhető az eukarióták és a legtöbb prokarióta számára, amelyek a nitrogént csak redukált formában tudják felhasználni. A nitro­ gén redukciója csak nagy nyomáson (a légkörinél 10 000-szer magasabb), magas hőmérsékleten (500 °C felett) és vas katalizátor jelenlétében követke­ zik be. Egyes organizmusok azonban, mint pl. a ké­ keszöld algák és többféle talaj baktérium is, rendelkez­ nek olyan enzimrendszerrel (nitrogenáz komplex), amely „helyettesíteni” tudja a magas nyomást és hő­ mérsékletet. A nitrogenáz komplex leglényegesebb komponense a nitrogenáz és reduktáz; ATP energia felhasználásával és 6 e" transzportja révén N2-ből NfV-t képez. Az ammónia ezután már több úton is beépülhet organikus vegyületekbe. Mind prokariótákban, mind eukariótákban köz­ ponti szerepet játszik a glutamát-glutamin rendszer az ammónia beépítésében, majd mint aminodonor a kü­ lönböző aminosavak szintézise során (lásd később). Az ember aminosavszükségletét elsősorban a táp­ lálkozással biztosítja, bár bizonyos aminosavak szin­ tézisére képes, valamint a saját fehérjéinek lebontásá­ ból származó aminosavakat is újra felhasználhatja. Normál körülmények között az utóbbiak 75%-a ismét fehérjék szintézisére fordítódik, míg csupán a fennma­ radó 25% kerül lebontásra energiát szolgáltatva vagy válik elérhetővé speciális molekulák szintéziséhez. Extrém fehérjebevitel esetén az aminosavak kisebb százaléka használódik fel a fehérjeszintézisre, és na­ gyobb százalékuk kerül lebontásra, illetve szénláncuk zsirsavszintézishez szolgál alapul. Jóllehet az emberi szervezetben mindig találhatók szabad aminosavak,

azokból nem jönnek létre olyan energiaraktárak, mint a zsírsavakból a trigliceridek vagy a glukózból a gli­ kogén. Egy átlagos súlyú nőnek, illetve férfinak 46-56 g fehérjére van szüksége naponta. A terhesség, illetve szoptatás ezt ~50%-kal megemeli. Elégtelen fe-

9-1. táblázat. Az em beri szervezetben leggyakrabban m egtalálható aminosavak

Rövidítés

Teljes név

Egybetüs kód

Nem esszenciális

Alá

A

alanin

Asn

N

aszparagin

Asp

D

aszpartát, aszparaginsav

Cys

C

cisztein

Gin

Q

glutamin

Glu

E

glutamát, glutaminsav

Gly

G

glicin

Pro

P

prolin

Ser

S

szerin

Tyr

Y

tirozin

Gla*

gamma-karboxi-glutaminsav

Hyl*

hidroxilizin

Hyp*

hidroxiprolin

Szemiesszenciális

R

arginin

His

H

hisztidin

He

1

izoleucin

Leu

L

leucin

iys

K

lizin

Met

M

metionin

Phe

F

fenilalanin

Thr

T

treonin

Trp

W

triptofán

Val

V

valin

Arg Esszenciális

* Aminosavak, amelyek fehérjébe történő beépülésük után (poszttranszlációs módosulással) keletkeznek

I II.

278

hérjebevitel esetén a szervezet saját szöveti fehérjéit nagyobb mértékben kezdi lebontani, mint az normál­ állapotban történik, s a felszabadult aminosavak nagy mennyiségű energiaforrásként szolgálhatnak. A fehér­ jékből származó legjelentősebb energiaforrás az izomszövet; egy 70 kg súlyú felnőttben ~100 000 kJ (24 000 kcal). Egészséges felnőtt szervezet normális táplálkozás mellett úgynevezett nitrogénegyensúlyban van, azaz a napi bevitt nitrogén és a napi kiürített nitrogén mennyisége egyenlő. Pozitív a nitrogénegyensúly, ha a szervezetbe bekerülő nitrogén mennyisége megha­ ladja a szervezetből távozó nitrogén mennyiségét; ez jellemzi a növekedésben lévő szervezetet, a terhesség, a hosszú éhezés utáni táplálkozási periódust, valamint a posztoperatív állapotokat. Negatív nitrogénegyen­ súlyról beszélünk, ha a szervezetből több nitrogén tá­ vozik, mint amennyi beépül; ez történik senyvesztő betegségekben vagy hosszan tartó éhezésben. A nitrogénegyensúly kiszámításához tudnunk kell, hogy az átlagos aminosav tömegének kb. 16%-a nitro­ gén. Ennek megfelelően (ha 100 grammnak vesszük az aminosavak átlagos molekulatömegét): nitrogénbe­ vitel = fehérjemennyiség x 0,16 (gramm), míg a nitro­ génürítés = teljes vizeletnitrogén (gramm) + 3 gramm (ez utóbbi egy becsült faktor, ami a széklettel, és a bőr hámlásával történő átlagos nitrogénvesztést veszi fi­ gyelembe). Ennek alapján tehát (grammban):

AZANYAGCSERE

bán gyermekek) gyakran megtévesztően pufók kiné­ zetűek, ami a testszerte észlelhető ödémának tulajdo­ nítható. A betegek fertőzésre fogékonyak, limfocitaszámuk jelentősen csökkent.

9 .2

A TÁPLÁLÉKBÓL SZ Á R M A Z Ó A M IN O SA V A K . A FEH ÉRJÉK EM ÉSZTÉSE

A napi táplálékfelvételből származó fehérjeterhe­ lés kb. 70-100 g, amit kiegészít az a 35-200 g endo­ gén fehérje, mely az emésztőenzimekből és a gyo­ mor-bél nyálkahártya leváló sejtjeiből származik. Mindezen fehérjék a gyomor-bél csatornában emész­ tődnek és felszívódnak. Ezek a folyamatok meglehe­ tősen hatékonyak, hiszen a széklettel naponta nem több, mint 1-2 gramm nitrogént, azaz kb. 6-12 gramm fehérjét veszítünk. A táplálékkal elfogyasztott fehérjék a gyomor-bél traktusban emésztő enzimek hatására kis peptidekre és aminosavakra degradálódnak. A születést követő rö­ vid időszaktól eltekintve poli- vagy oligopeptidek nem szívódnak fel értékelhető mennyiségben. A peptidkötések vizes fázisban spontán hidrolízis­ sel bomlanak:

Nitrogénegyensúly = bevitt fehérjemennyiség x 0,16 - teljes vizelet­ nitrogén - 3

Klinikai vonatkozások Fehérjehiányos táplálkozásból származó orvosi prob­ lémák a „fejlett” társadalmakat alig érintik, ezzel szemben a harmadik világban súlyos gondokat okoz­ nak; általános energia- és proteinhiány a marasmus nevű kórképet hozza létre, míg a fehérjebevitel elégte­ lensége normál kalóriabevitel mellett a kwashiorkort eredményezi. A kwashiorkorban szenvedők (általá-

A reakció irreverzibilis (jelentős mértékben exergonikus), de sebessége a fiziológiás pEl- és hőmér­ séklet-tartományokban rendkívül kicsi, proteázok ha­ tására azonban felgyorsul. Az emésztőtraktus proteázai hatásmechanizmusuk alapján az alábbi csoportokba sorolhatók: 1. szerin-proteázok (az aktív centrumot Ser-Ehs-Asp alkotja), 2. metalloproteázok (az aktív centrumot Glu és Zn2+ alkotja), 3. karboxil-proteázok vagy savanyú proteázok (az aktív centrumot 2 Asp alkotja).

9. A Z A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R F I R I N - A N Y A G C S E RE

Mindhárom típusú proteáz működésének lényege, hogy az enzim által felismert szubsztrátban az enzim aktív centruma és a peptidkötés szén-, illetve nitrogén­ atomja között labilis kötés alakul ki, és egy olyan in­ termedier jön létre, amely víz jelenlétében gyorsan hidrolizál. A működést részletesen a 2. fejezet szerinproteázokról szóló részében mutatjuk be. A gyomor széles szubsztrátspecificitással rendel­ kező proteáza a pepszin (karboxil-proteáz), amely aromás aminosavak aminocsoportja melletti peptidkötéseket bont, elsősorban denaturált fehérjékben. Az enzim savanyú proteáz (pH-optimuma 1-2 között van). Az optimális pH-t a gyomor sósavszekréciója biztosítja, amely egyben felelős a fehérjék denaturációjáért is. A fehérjék degradálása „nagy” peptideket eredményez. A gyomorban kezdődött fehérjeemésztés a bélben folytatódik, ahol a legjelentősebb enzimek a tripszin, a kimotripszin és az elasztáz (szerin-proteázok), illetve a karboxipeptidáz-A (metalloproteáz). Ezek pH 7-8 közegben aktív enzimek, és az egyes fehérjeféleségek­ re nem specifikusak. Míg a karboxipeptidáz-A a peptidek C-terminális végét ismeri fel, a tripszin olyan peptidkötéseket hidrolizál, amelyek karbonilcsoportja lizin vagy arginin eredetű, a kimotripszin aromás ami­ nosavak mellett bont, az elasztáz pedig Gly, Alá, Ile és Ser melletti hidrolízist katalizál.

A fehérjeemésztő enzimek aktivitásának szabályozása A nem megfelelő helyen és időben működő proteázok súlyos károsodásokat hozhatnak létre a külön­ böző szövetekben. A proteázok által okozott destruk­ ció és önemésztődés ellen a szervezet főleg két módon védekezik: ♦ a gasztrointesztinális proteázok inaktív prekurzorok (zimogének, proenzimek) formájában szintetizálódnak, amelyek megfelelő stimulusra aktivá­ lódnak; ♦ hatásos proteáz-inhibitor-rendszer működik, amely a nem megfelelő helyen lévő enzimeket inaktiválja.

279

A zimogének két okból lehetnek enzimatikusan inaktívak: ♦ bár az aktív centrumuk kialakult, mégsem műkö­ dőképesek, mert a fehérje egy másik része „lefedi” (pepszinogén), ♦ az aktív centrum azért nem alakulhat ki, mert az azt alkotó aminosavak távol vannak egymástól és csak a részleges proteolízist követő konformációválto­ zás után jöhet létre térbeli közelségük, illetve köl­ csönhatásuk (tripszinogén, kimotripszinogén, proelasztáz, prokarboxipeptidáz-A). A pepszin zimogénjéből, a pepszinogénből (40 kDa) keletkezik (9-1. ábra). A pepszinogént a gyomor fősejtjei termelik, és szekrécióját a gasztrin indukálja. A pepszinogénben ugyan az aktív centrum már kiala­ kult, de neutrális pH-tartományban az aktivitásért fe­ lelős két aszpartát, a prekurzor távolabbi pozíciójában lévő argininekkel és lizinekkel ionos kötést képezve működésképtelen. A savas pH (pH ketimin), a ketimin hidrolizál, R,-ketosav keletkezik, míg az aminocsoport a piridoxál-foszfáton marad (piridoxamin-foszfát). A reakciósorozat reverzibilis, és egy másik ketosav (R2) magas koncentrációja esetén visszafelé játszódik le R2-aminosavat eredményezve

náz). Különböző szövetek károsodása során az elhalt sejtekből nagyobb mennyiségben szabadulnak fel, és így koncentrációjuk megemelkedik a vérkeringésben. Egyéb enzimaktivitások változásától függően diag­ nosztikus értéket jelenthetnek elsősorban myocardialis infarctusban és toxikus májkárosodásban. Továbbá terápiásán is felhasználhatók: esszenciális aminosavakból képzett ketosavak bevitelekor a szöve­ tekben normálisan jelen lévő transzaminázok esszen­ ciális aminosavakat produkálnak. A reakció egyszerre jelent esszenciális aminosavpótlást és csökkenti az ammóniaképződést is.

Dezaminálási mechanizmusok Glutamát-dehidrogenáz. A glutamát központi helyet foglal el az aminosavak anyagcseréjében. A Glu keletkezésében, illetve lebontásában a transz­ aminázok mellett a glutamát-dehidrogenáz játssza a kulcsszerepet (9-13. ábra). A glutamát-dehidrogenáz a legfontosabb dezamináló enzim, az általa katalizált reakciót oxidatív dezaminálásnak nevezzük. Az enzim részt vesz mind a katabolikus, mind pedig az anabolikus folyamatok­ ban. Működése elsősorban a szubsztrátok és termékek

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R F I RI N - A N Y A G CS E R E

291

COO'

COO'

karboxilcsoport, valamint szabad ammó­ nia keletkezik (9-15. ábra). A glutamát, ________ » + NH. ból történő glutaminszintézis a 9-13. áb­ I 2 c= o glutamátrán látható reakcióban, a glutaminI dehidrogenáz COO' COO' szintetáz hatására történik. a-ketoglutarát Glu Dezaminálás egyéb aminosavak metabolizmusa során. A szerint és a treNH, ^A T P onint ugyanaz a dehidratáz enzim dezfglutamin- szintetaz aminálja ammóniát képezve, piridoxálA ADP + P, foszfát mint kofaktor segítségével (lásd alább 9-21. és 9-23. ábra). A hisztidin —> 0 II urokanát átalakulás is ammónia felszaba­ C—NH, 1 dulásával jár (9-19. ábra), valamint dez­ CH, I 2 aminálás történik a glicin lebontása során CH, I + 9-13. ábra. A glutamát-dehidrois (9-20. ábra). H—C —NH, genáz által katalizált reakció és I Purinnukleotid-ciklus. A purinnukCOO' glutamin (Gin) keletkezése glutaGln mátból leotid-ciklus az ammóniaképzés intenzív forrása elsősorban az izmokban és az agyban. A ciklusban az AMP —» IMP át­ alakulás során képződik az ammónia, mivel azonban [Glu, a-ketoglutarát, NH4* és NAD(P)H] koncentrá­ ciklusról van szó, ahol a körfolyamat tagjai újrakép­ cióarányától függ, de emlősökben az aktuális szubződnek, az AMP -» IMP átalakulásban felszabaduló sztrátkoncentrációk mellett néhány kivételtől (peri­ ammónia úgy is felfogható, hogy az aszpartát —» fúcentrális hepatociták) eltekintve az enzim valószínű­ marát átalakulás közben az aszpartát dezaminálódott leg távol az ekvilibriumtól, csak az ammóniafelsza(9-16. ábra). A ciklust részletesebben a nukleotidbaditás irányában működik. A glutamát-dehidrogenáz anyagcsere kapcsán ismertetjük. nagyon érzékenyen szabályozott enzim, GTP gátolja, I CH, I 2 CH, I 2* H—C —NH, I

NAD(P)+ NAD(P)H + H+

I

CH, I 2 CH,

ADP és L-leucin pedig aktiválja. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy az aminosavakAminosav-oxidázok. Az aminosavak aminoról az -NH2-csoport eltávolítása, végső soron az am­ csoportjai döntő részben a transzaminázok és a glu­ móniaképzés, a szervezet számára igen fontos, mert ez tamát-dehidrogenáz kombinált működésének eredmé­ teszi lehetővé, hogy szükség esetén az aminosavak nyeképpen szabadulnak fel. Az aminosav-oxidáz en­ zimek elsősorban a májban és a vesében lokalizálódnak. A vesében történő oxidatív COO' dezaminálás lassú reakció, és így az ami­ coococr f L-aminosav-oxidáz I ♦ I -> C = 0 + NH, nosavak katabolizmusa szempontjából kih 3n - -CH C = NH, I I 2 ~7* I R R sebb jelentőségű. A folyamatban a redu­ R FMNH, FMN kált flavin prosztetikus csoport molekulá­ ris oxigénnel hidrogén-peroxidot képez, ami a kataláz vagy glutation-peroxidázok által katalizált reakcióban alakul vízzé és molekuláris oxigénné (9-14. ábra). Glutamináz és aszparagináz. A glutamináz és aszparagináz a glutamin és aszparagin savamidcsoportját hidrolizálja, 9-14. ábra. Az L-aminosav oxidázok működése melynek eredményeképpen a molekulán

III.

292

o c —NH, I CH, I H — C — NH, I coo

cooa-ketoI I Glu glutarát CH, CH, I I 2 —> c = o > H - C — NH, c I 3 I transzamináz COO'

NH.

W aszparaginaz

Asn

C — NH,

I I 2 CH, I + H —C — NH, I 3 cooCH,

AZANYAGCSERE

COOAsp

COO-

oxálacetát

cooCOO' I I CH, CH , I 2 NH. a-ketosav aminosav ^ CH, I I > H —C — NH, —> C =o I 3 I [glutamináz transzamináz cooCOO-

Gln

szénvázát legnagyobb hatásfok­ kal az energiatermelés szolgála­ tába állítsuk a citrátkör és a ter­ minális oxidáció segítségével, valamint az aminosavak szénlán­ cát felhasználjuk nitrogént nem tartalmazó molekulák szintézisé­ re (mint amilyen éhezésben a glukóz, vagy aminosav túlkínálat esetén, jóllakott állapotban a zsírsavak). Az aminocsoport el­ távolításának, az ammónia fel­ szabadításának leggyakoribb út­ ja a transzdezaminálás; a transzaminálás és a dezaminálás kombinációja. Ennek alapja az, hogy a transzaminálások köz­ ponti ketosav-aminosav párja az a-ketoglutarát-glutamát páros, s a legnagyobb kapacitású dezamináló enzim a glutamát-dehidrogenáz, amely a glutamátot dezaminálja a-ketoglutaráttá. A dezaminálások során felszabaduló ammóniát az emberi szervezet el­ sősorban ureába építi be, és a ve­ sén keresztül választja ki (9-17. ábra).

Glu

a-ketoglutarát

9-15. ábra. Az aszparagináz (a) és a glutamináz (b) működése. Az aszpara­ gináz és glutamináz enzimek a savamidkötés hidrolítikus hasításával szabad karboxilcsoportot és ammóniát képeznek. Az aszpartát mindig transzaminálással, a glutamát transzaminálással vagy a glutamátdehidrogenáz segítségével szabadul meg aminocsoportjától. A glutaminsavnak több transzaminációs partnere lehet

9-16. ábra. A purinnukleotid-ciklus. A purinnukleotid-ciklus felfogható a dezaminá­ lás egyik módjának, melyben az Asp aminocsoportja szabadul fel ammónia formájában. IMP, inozin-monofoszfát; HPX, hipoxantin; X, xantin l-

és D-aminosavak aminosavoxidázok

- 0 - 0 '0 ' ['Asn ÍGIn"

kiválasztás a vesében

9-17. ábra. Az aminosavak transzaminálása és dezaminálása. Pirossal az amino­ csoport útját jelöljük. GDH, glutamát-dehidrogenáz

293

9. A Z A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R F I R I N - A N Y A G C SE R E

zik, ezeket glukoplasztikus és ketoplasztikus amino­ savaknak nevezzük. Az aminosavak lebontásának vázlatát citrátköri, glikolitikus intermedierekké vagy acetil-CoA-vá a 9-18. ábra mutatja be. Az aminosavak lebontásának orvosi jelentőségét elsősorban a lebontás során előforduló enzimdefektu­ sok adják. Ezek az enzimdefektusok nem túl gyakori­ ak, de kora csecsemőkorban jelentkezhetnek, gyakran fatális kimentelüek, igen sokszor társulnak súlyos, ir­ reverzibilis mentális retardációval, és korai kezelésük kulcsfontosságú lehet. Az aminosav-anyagcserét érin­ tő enzimdefektusok diagnózisa nem mindig egyszerű, gyakran a metabolom tömegspektrometriás analízisét vagy genomszekvenálást igényelhet. Kezelésük gyak­ ran csak diétás, a lebontásban akadályozott aminosav csökkent bevitelét jelenti. Az aminosavlebontás enzimopátiái is gyakran öröklődő megbetegedések, ezért családi halmozódás esetén a prenatális diagnosz­ tika lehetőségét kell keresni.

Az aminosavak szénláncának lebontása -

glukogén és ketogén aminosavak Az aminosavak lebontásuk során, az aminocsoport eltávolítása után a glikolízis vagy a citrátkör intermedierjeivé, vagy acetil-CoA-vá, vagy ketontestté alakulnak. Ezekből a vegyületekből a szervezet szük­ ség esetén energiát nyerhet, jóllakott állapotban fel­ használhatja őket neutrális zsírok (vagy glikogén) szintéziséhez. A májban és a vesében éhezés során a glikolitikus és citrátköri intermedierek szénláncából glukóz képződhet, a májban az acetil-CoA-ból éhe­ zéskor ketontestek képződhetnek. Azokat az aminosavakat, melyek lebontása során a glukózszintézisben felhasználható intermedierek keletkeznek, glukoplasztikus (13 aminosav), melyekből a máj keton­ testeket képez, ketoplasztikus aminosavaknak hív­ juk. Vannak olyan aminosavak, melyek szénláncának lebontása során mindkét tipusú intermedier keletke­ í^ ]

1 11 itt

a a i 1\ ti a T

(Alá] (Cysl

I

>/ > (piruvát ——>(acetil-CoA (acetoacetil-CoA

-\ oxálacetát

Llfp j

t

[Phe]

(Asn |

(q-ketoglutarát

-ffumarát

t (Phe |

jszukcinil-CoA

1 [metil-rnalonil-CoA

1 f propionil-CoA

t t1t

fvái] Q

S

a

9-18. ábra. Az aminosavak szénláncának sorsa; glukoplasztikus és ketoplasztikus, illetve mind gluko-, mind ketoplaszti­ kus „vegyes" aminosavak és kapcsolódásuk a metabolizmushoz. A glukoplasztikus aminosavakat fekete színnel, ketoplasztikusokat kék színnel, a „vegyes" metabolizmust mutatókat pirossal jelöltük. (A Leu-ból és Tyr-ból közvetlenül acetecetsav keletkezik)

294

III.

A glutamin, aszparagin, glutamát és aszpartát lebontása A savamid típusú monoamino-dikarbonsavak amidcsoportját a megfelelő glutamináz, illetve aszparagináz enzim hidrolizálja glutamátra és aszpartátra, illetve ammóniára (9-15. ábra). A keletkező glutamát és aszpartát transzaminálással alakul át a-ketoglutaráttá illetve oxálacetáttá. Míg a dezamidáláshoz a két aminosavnak különböző enzimre van szüksége, a transzamináláshoz közös enzimet (ASAT) is használhatnak. Aszpartát szolgáltatja az urea egyik nitrogénjét is, így az omitinciklus az aszpartáton ke­ resztül kapcsolódik a citrátkörrel (lásd alább), és aszpartát használódik fel a purinnukleotid-ciklusban (9-16. ábra), illetve az AMP és a pirimidinek szintézi­ sében is. A glutamát nemcsak transzamináció, hanem

-C H ,—C H -C O O '

2 u

HN^

N

7

H2C

A Z AN Y A G C S E R E

amint azt korábban már említettük, oxidatív dezaminálás révén is a-ketoglutaráttá tud alakulni. Az a-ketoglutarát, illetve oxálacetát citrátköri intermedierek, így belőlük glukóz keletkezhet, tehát a fenti négy aminosav glukoplasztikus aminosav.

A prolin, arginin, ornitin és hisztidin katabolizmusa A p r o l i n lebomlása három lépésben glutamáty-szemialdehid intermedieren keresztül glutamátképződéshez vezet (9-19. ábra). Mivel a prolin nem vesz részt transzaminálásban - hiszen iminosav - nit­ rogénjét a katabolizmus első két lépcsőjében megtart­ ja. A metabolizmusban részt vesz a NADP kofaktorral működő prolin-dehidrogenáz, amely mitokond-

\

+ .CH —COO-

NH,

[Glu-dehidrogenáz

f transzamináz

y a-ketoglutarát

9-19. ábra. A prolin, arginin, ornitin, hisztidin és glutamin glutamáton keresztüli lebontása. Az öt aminosav lebontásában közös, hogy glutamáttá, majd a-ketoglutaráttá (a-KG) képesek átalakulni, így glukoplasztikus aminosavak

295

9. AZ AMI N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R F I R I N - A N Y A G C S E R E

riális enzim, egyike a p53 antionkogén által leginkább indukált fehérjéknek, és szerepet játszhat az apoptózis indukciójában. A harmadik lépést katalizáló glutamát-szemialdehid-dehidrogenáz részt vesz az arginin, omitin és hidroxiprolin lebontásában is. Az a r g i n i n az omitinciklusban található argináz enzimmel omitinné és ureává alakul (9-19. ábra). Az ornitin a mitokondriumban transzaminálással (omitin-aminotranszferáz, OAT) alakul át glutamát-y-szemialdehiddé, mely glutamáttá oxidálódik (9-19. áb­ ra). Az OAT aktivitásnak fontos szerepe van a vé­ konybél-hámsejtek citrullintermelésében (lásd 20. fe­ jezet). A májban az OAT a hepatociták véna centrális körüli populációjában mutat jelentős aktivitást, így nem vetélkedik az omitinért az omitin-transzkarbamiláz enzimmel, mely az omitinciklus többi enzimé­ vel együtt elsősorban a periportális hepatocitákban ak­ tív. A h is z tid i n katabolizmusa szintén glutamát képző­ déséhez vezet (9-19. ábra).

hidrogenáz azonos a piruvát-dehidrogenáz komplex, valamint az a-ketoglutarát-dehidrogenáz és az elágazó szénláncú ketosav-dehidrogenáz E3-alegységével.

Klinikai vonatkozások A n e m k e t o t i k u s h y p e r g l y c i n a e m i á b a n a glicint ha­ sító enzimkomplex valamelyik tagja hiányzik, s glicin akkumulálódik a szövetekben, az agyat is beleértve. Általában újszülöttkorban manifesztálódik, letargiá­ val, hypotoniával mioklónusos görcsökkel, apnoéval jár, gyakran halálos. Azoknál, akik az akut szakaszt túlélik, kezelhetetlen epilepszia és súlyos mentális re­ tardáció lép fel. A glicin a gerincvelőben és elsősor­ ban az agytörzsben gátló neurotranszmitter - ez a tu­ lajdonság lehet felelős az apnoe kialakulásáért -, a glutamáterg NMDA-receptorokat stimulálja. Szintén

COCr

+ I H,N—CH 3 I

Apiroszőlősavvá lebomló

c h 2oh

aminosavak a glicin, szerin, cisztein, treonin, alanin és hidroxiprolin lebontása A glicin átalakulásának egyik útja a szerinné alakulás, az N5,N10metilén-tetrahidrofolsav (THF) C ldonorral a szerin-hidroximetiltranszferáz segítségével, s ebből piruvát keletkezhet. A katabolizmus legfőbb átalakulását a glicinhasító enzim katalizálja, amelyben a Glyből NAD+ és tetrahidrofolát jelenlét­ ében HCO3 és NH4+, valamint N5,Nl0-metilén-tetrahidrofolsav ke­ letkezik irreverzibilis reakcióban (9-20. ábra). Az enzim működése ha­ sonlóságot mutat a piruvát-dehidro­ genáz enzimmel, amennyiben tartal­ mazhárom hasonló alegységet, közü­ lük az E3, a dihidrolipoamid-de-

glioxalát 9-20. ábra. A glicin lebontása és szintézise.

THF, tetrahidrofolsav

I II.

296

V ♦

ket0^av

1

H3N—C - H

aminosav

,

O ^ /0'

NADH + H+

NAD+ *

0=C glicerátdehidrogenáz

transzamináz

C

y

ADp

----- > HO—C — H — ^ ---- ^ íglicerát-kináz

3-hidroxi-piruvát

23

a tp

glicerát

AZ ANYAGCSERE

V/° C HO—C - H

'2 w 1w3 3-foszfoglicerát glikolízis

u o ■V / O' n2U C \ I \

Ov

O

CH.

PLP ">

!

C—O CH.

NH,

_____________________________ I

( szerin-dehidratáz

o-

V

,

|

glikolízis

9-21. ábra. A szerin lebontása glikolitikus intemedierekké. PLP, piridoxál-foszfát

COCr

♦ I 3 I CH, I 2

H,N—C —H

SH

20. 2NADPH + H+

2H20

'V f cisztein-dioxigenáz

2NADP+

coo+ I

H.N—C - H

3

I I 2 so3-

(oxf oxigenaz

dekarboxiláz _

CH,

CO.

hipotaurin

taurin

cisztein-szulfinát A

a-ketoglutarát

%

transzamináz

É

y

-> j" aktív szulfát

9-22. ábra. A cisztein katabolizmusa. A deszulfatáció enzim nélkül is gyors reakció. A szulfitból tioszulfáton keresztül szulfát kelet­ kezik, amely két ATP-vel reagálva „aktív szulfátot" (PAPS-ot) eredményez. Az ábrán a taurinszintézis is látható, amely cisztein-szulfinátból történik

297

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R F I RI N -A N Y A G C S E R E

ez a tulajdonság magyarázhatja a befolyásohatatlan epileptikus görcsöket és a mentális retardációt. A „nemketotikus” jelzővel különböztetjük meg a ketotikus hyperglycinaemiától, amely a FAD-ot tar­ talmazó dihidrolipoamid-dehidrogenáz elégtelensé­ gekor lép fel, és érinti a glicinhasító enzim mellett a piruvát-dehidrogenázt, az a-ketoglutarát-dehidrogenázt és az elágazó szénláncú ketosav-dehidrogenáz komplexeket is. Ebben az esetben jelentős ketosavfelszaporodás észlelhető - nem tévesztendő össze a ketontestekkel! - a hyperglycinaemia mellett.

Az anorganikus szulfát részben a ciszteinből, részben a bélből származik. A treonin lebontása két úton történhet. Az egyik a treonin-aldolázzal kezdődik, amely glicinné és acetaldehiddá hasítja az aminosavat. A glicin a már megis­ mert módokon metabolizálódhat tovább, míg az acetaldehidből acetát, majd ATP felhasználásával acetilCoA lesz. A másik út analóg a szerin lebontással, amennyiben a dehidratáz reakció és egy vízfelvétellel történő dezaminálás a treonint a-ketobutiráttá (a-ketovajsav) alakítja, melyet egy a piruvát-dehidrogenázhoz hasonló enzimkomplex oxidatív dekarboxilezéssel propionil-CoA-vá alakít. Ennek továbbalakulása a citrátköri intermedier, szukcinil-CoA keletkezé­ sét eredményezi (9-23. ábra). Az alanin transzaminálással piruváttá alakul. A hidroxiprolin a prolinnal analóg módon katabolizálódik (a részleteket nem mutatjuk). A kataboliz-

A szerin katabolizmusának több alternatív útja van. A szerin egy lépésben glicinné tud alakulni a 9-20. ábrán látható reakcióban, s innen lebontása a glicin katabolizmusával egyezik meg. A szerinből 3-foszfoglicerát (9-21. áb­ ra, a) vagy a piridoxálfoszfáttal működő szerindehidratáz hatására, az treonin-aldoláz aminocsoport távozásával piruvát jön létre (9-21. áb­ ra, b). Mindkét végtermék glikolitikus/glukoneogenetikus intermedier. A cisztein legfőbb le­ bontási útvonalát a 9-22. ábra mutatja. A reakció je­ lentőségét nem elsősorban a piruvát keletkezése adja, hanem a cisztein lebomlá­ acetát sakor keletkező anorgani­ ATP kus szulfát, amely aktív acetát-tiokináz HS-CoA szulfáton keresztül a szul­ A A 1AMP + PP, fáttartalmú vegyületek (pl. V heparin, kondroitin-szulfát) acetil-CoA szintéziséhez járulhat hoz­ zá. Ilyenkor az anorganikus szulfát először ATP-vel re­ agál, és 3’-foszfoadenozin5’-foszfoszulfát (PAPS, „aktív szulfát”) keletkezik J-23. ábra. A treoninlebontás két útja. 3LP, piridoxál-foszfát (lásd még a 10. fejezetben).

dehidratáz

Ov

O-

V

I o=c I CH, I

ch3

a-ketobutirát

I I I

propionil-CoA

metilmalonil-CoA

szukcinil-CoA

II I .

298

mus utolsó lépésében egy aldoláz vesz részt, és glioxalát keletkezik. A glioxalát oxálsawá oxidálódhat, vagy transzaminálással glicinné alakulhat (9-20. áb­ ra).

Klinikai vonatkozások A májban a peroxiszómákban expresszálódó alanin:glioxalát-aminotranszferáz (lásd 9-20. ábra) deficienciája következtében primer hyperoxaluria jön létre. A primer hyperoxaluria 1-es típusában, a vesé­ ben kalcium-oxalát rakódik le, vesekő képződik. A betegség előrehaladtával oxálsavlerakódás észlel­ hető az egész szervezetben, melynek következtében szinte az összes szervben súlyos funkciózavar lép fel.

A fenilalanin és tirozin katabolizmusa A fenilalanin katabolizmusa a Tyr képződésével kezdődik (9-24. ábra). Ez a reakció tetrahidrobiopterint (THB) igényel, amelyből dihidrobiopterin (DHB) keletkezik, a THB visszaalakulása NADPHval történik (9-24. ábra, keretben). Ezután mindkét aminosav sorsa közös; keto- és glukoplasztikus aminosavak, mert fumarát és acetoacetát keletkezik belő­ lük. Tirozinból történik a katekolaminok (dopamin, adrenalin, noradrenalin) szintézise (ezt a 21. fejezet­ ben ismertetjük), valamint a tiroxin és a melanin szin­ tézise.

Klinikai vonatkozások A fenilalanin katabolizmusa során enzimopátiák kö­ vetkeztében különböző anyagcserezavarok jöhetnek létre. Ilyenek a tyrosinaemiák, a phenylketonuria és az alcaptonuria. A defektusok helyének követéséhez lásd a 9-24. ábrát. A tirozinkatabolizmus enzimeinek genetikai defektu­ sa tyrosinaemiát eredményez. A tyrosinaemia I-es tí­ pusát a fumarilacetacetát-hidroláz hiánya okozza.

AZANYAGCSERE

Ritka, de rendkívül súlyos kórkép; az enzimhiány mértékétől függően egy, de kezeletlenül legkésőbb 10 éven belüli halált eredményez. A tünetek kifejlődésé­ ért a fumarilacetacetát dekarboxilezése következtében keletkező kóros vegyület, a szukcinilaceton (SA) és további toxikus intermediereinek felhalmozódása fe­ lelős. A tyrosinaemia Il-es típusát a tirozin-aminotranszferáz hiánya váltja ki. Szem- és bőrléziókkal, mentális retardációval jár. Fenilalanin- és tirozinszegény diétával kezelik. A homogentizát-dioxigenáz defektusa a homogentizinsav felhalmozódásával jár, amely részben a kötő­ szövetekbe kerül, és pigment formában tárolódik (ochronosis), illetve arthritist okoz, részben szekretálódik a vizeletbe, ahol állás közben oxidálódik és polimerizálódik (sötét színű vizelet; alcaptonuria). A betegség közvetlenül nem veszélyezteti az életet (a homogentizát felszaporodása nem jár tirozinfelszaporodással, s így nem alakul ki a tyrosinaemia), de szívbillentyű-károsodással és koszorúér-meszesedéssel jár. Az alcaptonuria volt az első felismert veleszü­ letett öröklődő enzimopatia, amely az egy gén, egy enzim koncepció kiindulópontja lett. A phenylketonuria (PKU) a fenilalaninanyagcserezavarok közül a leggyakoribb kórkép (1:9000) Ma­ gyarországon. A fenilalanin-hidroxiláz defektusa­ ként („klasszikus PKU”) jön létre. Nagyon ritkán a tetrahidrobiopterin-hiány, illetve a dihidrobiopterinreduktáz elégtelensége okozza („kofaktor defektusos PKU”). A fenilalanin nem tud tirozinná alakulni, fel­ halmozódik, illetve transzaminázokkal átalakul fenilpiruváttá, fenillaktáttá és fenilacetáttá, amelyek az összes testfolyadékban megjelennek. A klasszikus PKU patomechanizmusa nem tisztázott. A mentális retardációt több mechanizmus is okozhatja. A fenil­ alanin alternatív metabolitjainak magas koncentráció­ ja károsíthatja az idegsejtek mielinhüvelyét vagy a mielinhüvely-képzést és szellemi fogyatékosságot eredményezhet. A magas Phe-koncentráció gátolja a neutrális aminosavak felvételét a vér-agy gáton ke­ resztül, és ez is okozhatja a mentális károsodást. (A „kofaktor defektusos PKU” klinikai szimptómái színesebbek és súlyosabbak, mint a „klasszikus PKU-é”, mert a kofaktorelégtelenség nemcsak a Phe és a fenilketontestek felszaporodását eredményezi,

299

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R F I Rl N - A N Y A G C S E R E

COO-

COO-

I

c=o

tyrosinaemia-

p-hidroxifenilpiruvát

f dioxigenáz

HCO,

O-

I o II

0= c

2 P, > S-adenozil-L-metionin (SAM)

metioninadenozil-transzferáz

I 2 I

akceptor

A

S

í metiltranszferázok

ch3

A

metil-akceptor

FBI S-adenozil-L-homocisztein (SAH)

SAH-hidroláz

A

adenozin

OA HI C - C - C H ,— CH --SH / J 2 2 NH,

homocisztein -Ser

cisztationin-szintáz

A

A NH,

NH,

\ C —CH I 3—CH,—CH,— i S —CH,—CH— I 3 C/ / 2 2 2 vc )" cisztationin

fcisztationin-liáz NH,

A_ 1

f

NH,

I

a-ketobutirát

ES

A metionin katabolizmusa

HS-CoA NAD

A metionin ATP-vel reagálva pirofoszfát és anorganikus foszfátképződés mellett S-adenozil-L-metioninná alakul (ez az „aktív metionin, SAM”). Metilcsoportját megfelelő akceptor molekulá­ nak átadva S-adenozil-L-homocisztein (SAH) keletkezik. A SAH-ból az adenozin hidrolízisével homocisztein képző­ dik, mely szerinnel a cisztationin-P-szintáz katalizálta reakcióban cisztationinná alakul. A cisztationin ciszteinné és a-ke-

■Cl cisztein

i

r

piruvát oxidativ dekarboxilezés

NADH CO. 1

V O propionil-CoA

I I szukcinil-CoA 9-25. ábra. A metionin katabolizmusa. Az S-adenozil-L-metionin (SAM) az „aktivált" metionin. A reakcióút egyszersmind a cisztein szintézisét is szolgálja

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R F I RI N -A N Y A G C S E R E

tovaj savvá (a-ketobutirát) hidrolizál. A reakció útvo­ nal egyszersmind a ciszteinszintézis útvonala is. Em­ lékeztető: ugyancsak a-ketobutirát keletkezik a Túr­ ból (9-23. ábra). Az a-ketovajsav oxidatív dekarboxi-

301

lezéssel (analóg a piruvát-dehidrogenáz, a-ketoglutarát-dehidrogenáz által katalizált folyamatokkal) egy szénatommal rövidebb acil-CoA származékot, propionil-CoA-t képez NADH keletkezésével (9-25. ábra).

A triptofán és lizin katabolizmusa

kinurenin

A triptofán glukoplasztikus és keto­ plasztikus is, mert katabolizmusa során Alá és acetoacetil-CoA keletkezhet. A Trp 99%-a katabolizálódhat, míg 1%-a szerotoninszintézisre használódik fel. A lebomlás meglehető­ sen bonyolult, sok lépésből álló folyamat, amelynek néhány lépését mutatjuk be a 9-26. ábrán. Az Alá a kinurenináz által katalizált reakcióban keletkezik, amely B6-vitaminkofaktorral működő enzim. A reakciók ez­ után két irányban haladhatnak; az egyik út a-ketoadipáton keresztül acetoacetil-CoA (97%) képződéséhez vezet, a másik a nikotinsavamid, illetve NAD szintézise (3%). Az a-ketoadipinsav a lizin- és triptofánlebontás közös intermediere. A lizin katabolizmusa is több lépésben történik, és a negyedik lépés intermedierétől (a-ketoadipát) a lebontás megegyezik a Trp katabolizmusával, s végül acetoacetil-CoA keletkezik. A Lys tehát ketogén aminosav.

NAD+ (3%)

Az elágazó szénláncú aminosavak valin, izoleucin, leucin - lebontása

O

O

acetoacetil-CoA

(96%)

ketoplasztikus 9-26. ábra. A triptofán katabolizmusa. A hidroxi-antranilátból törté­ nő NAD+-szintézis lépéseit, illetve az acetoacetil-CoA keletkezéséhez ve­ zető 8 reakciót nem tüntettük fel. A kinurenin képződése során a THF (tetrahidrofolsav) formilálása ATP-t igényel (az ábrán nem tüntetjük fel)

A három esszenciális, elágazó szénláncú aminosav katabolizmusának első lépései megegyeznek (9-27. ábra). A transzaminálást követő oxidatív dekarboxilezés egy szén­ atommal rövidebb CoA-származékot ered­ ményez, ami oxidálódik. A legtöbb aminosav lebontásától eltérően, az elágazó szénláncú aminosavak a májban nem metabolizálódnak, mert hiányzik az első lépést katalizáló transzamináz enzim. A katabolizmus elsődle­ ges helye az izom, a zsírszövet és az agy.

302

I I I . AZANYAGCSERE

A lebontás fontos szabályozott reakciója a transzaminálást követő elágazó szénláncú a-ketosavdehidrogenáz által katalizált lépés. Az enzimkomplex

X

-o -

rokon a piruvát-dehidrogenáz komplexszel, szintén mitokondriális lokalizációjú, háromféle katalitikus al­ egységből áll, és működése öt kofaktort igényel (lásd 6. fejezetben). A katalitikus alegységeket két szabályozó fehérje, a dehidrogenáz-kináz és cocr COO-foszfatáz enzim egészíti ki. Az enzim foszI COCr H ,N —CH h 3n - ch forilált formában inaktív, defoszforiláltan ak­ H ,C —CH H,N —CH J | tív. A kináz az El-alegységet foszforilálja, ak­ H,C —CH CH, H,C —CH | *■ tivitását az elágazó aminosav ellátottság szabá­ ch3 ch3 ch3 lyozza; alacsony aminosavkoncentráció esetén P7T1 n a a kináz aktiválódik, a katabolizmus gátlódik és az elágazó aminosavak a fehérjeszintézis ren­ delkezésére állnak. Bőséges elágazó aminosavellátottság mellett a komplex defoszforilálódik, aktiválódik, és az aminosavak lebomlanak. Génexpressziós szinten is szabályozott a dehidrogenáz komplex; alacsony fehérjetartal­ mú diétán az El-, E2-, E3-alegységek ex­ I pressziója csökken, a kinázé nő. Az enzimc= o CH, I I 2 komplex aktivitása éhezésben nő, az elágazó CH, -CH I I aminosavak közül a Val és Ile részt vesznek a CH, CH, CH, glukoneogenezisben. A három elágazó amino­ sav végső lebontási útvonalának teljes részle­ tességű ismertetésétől eltekintünk. A leucin tisztán ketoplasztikus aminosav, mert katabolizmusa acetil-CoA, illetve acetecetsav kelet­ kezéshez vezet. A l e u c i n m i n t s z i g n á l m o l e k u l a . A leucin különleges helyet foglal el az aminosavak kö­ zött: intracelluláris koncentrációja a fehérjeszintézist globálisan befolyásolja. A leuciltRNS-szintetáz aktiválja az mTOR utat és sti­ mulálja a fehérjeszintézist. A leucin az AMPkináz gátlásán keresztül is fokozhatja az mTOR-aktivitást. A leucin fokozza az inzulin­ felszabadulást és gátolja az autofágiát. Leucinhiányos állapotban a fent említett leucil-tRNS[ 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA szintetáz csökkent aktivitása növeli az aminoO COO' savval „nem töltött” tRNSLeu koncentrációját, I / - S-C o A C^-S — CoA J l CH, I I ami kinázaktiválás révén eIF2a (eukarióta I CH CH, c= o I iniciációs faktor-2a) foszforilációja által csök­ CH, I CH, kenti a transzláció iniciációt. propionil-CoA acetil-CoA acetecetsav Az i z o l e u c i n lebontása során acetil-CoA és 9-27. ábra. Az elágazó szénláncú aminosavak (valin, leucin, izopropionil-CoA keletkezik, így ez az aminosav leucin) lebontása. Az ábra a metabolizmusban közös első két lépést ketoplasztikus és glukoplasztikus. Minthogy a mutatja, a többi részlet ismertetésétől eltekintünk (N

9. A Z A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R F I R I N - A N Y A G C S E R E

valin lebontása propionil-CoA keletkezését eredmé­ nyezi, a valin glukoplasztikus aminosav.

A propionil-CoA átalakulása szűkeinil- CoA-vá; a Bú-Vitamin szerepe A valin, izoleucin, treonin, metionin lebomlása, a páratlan szénatomszámú zsírsavak oxidációja és a ko­ leszterin oldalláncának lebontása propionil-CoA kép­ ződéshez vezet, mely szukcinil-CoA-vá alakul. A re­ akciót a páratlan szénatomszámú zsírsavak oxidációja kapcsán ismertettük (8-24. ábra). A folyamat utolsó lépésében Bi2-koenzimmel működő metil-malonilCoA-mutáz szukcinil-CoA-t képez, ami citrátköri in­ termedierként részt vehet a glukoneogenezisben. A Bn-vitamin azonban önmagában nem funkcionál; csak akkor lesz reaktív, ha ATP-vel reagálva aktív koenzim, az 5’-dezoxi-adenozil-kobalamin lesz belőle (9-28. ábra). B12-vitamin-származék a kofaktora még a homocisztein-metiltranszferáz enzimnek az S-adenozil-metionin-ciklusban (lásd alább).

303

A szintén idesorolható metil-malonsavas acidaemiáról, amely a metil-malonil-CoA-mutáz elégte­ lensége vagy B12-vitamin-hiány miatt jön létre és nemcsak az elágazó szénláncú aminosavak, hanem a páratlan szénatom számú zsírsavak oxidációját is érinti, a 8. fejezetben szóltunk.

B.,-vitamin + ATP

b

PP + P.t

Klinikai vonatkozások Az elágazó szénláncú aminosavak lebontási útvonala­ iban nagyszámú enzimopátiát ismerünk, melyek rész­ letes ismertetése meghaladja e tankönyv kereteit, ezért ezek közül csak a leggyakoribb betegségről, az ún. Maple Syrup (juharfaszirup) betegségről te­ szünk említést. A juharfaszirup betegséget az elágazó szénláncú a-ketosav-dehidrogenáz deficienciája okozza; az elágazó szénláncú aminosavak és ketosavak felhalmozódnak a cerebrospinális liquorban, a vérben és a vizeletben, miközben súlyos mentális ká­ rosodások jönnek létre. A betegség elnevezése onnan ered, hogy a vizelet jellegzetes, juharfaszirupra emlé­ keztető szagú. Kezelés nélkül egy éven belül végzetes kimenetelű. A betegeknek élethossziglan csökkentett elágazó szénláncú aminosav (elsősorban leucin) tar­ talmú diétán kell élni.

9-28. ábra. 5'-dezoxiadenozil-kobalamin koenzim képző­ dése a B12-vitaminból. A kobalamin 5'-dezoxiadenozil formája kizárólag a metil-malonil-CoA-mutáz reakcióban szerepel koenzimként, a metionin-szintáz katalizálta reakcióban metil-kobalamin formában vesz részt

304

9 .5

III.

AZ A M M Ó N IA ELT Á V O LÍT Á S M ECH A N IZM U SA I

Az aminosavak felvétele és szintézise normál kö­ rülmények között egyensúlyt tart felhasználásukkal (fehérjeszintézis és nitrogéntartalmú biológiailag ak­ tív molekulák képződése) és lebontásukkal (energia­ szolgáltatás). A legtöbb aminosav degradációjánál az első lépés a nitrogén eltávolítása. Ez történhet dezaminálással, amikor ammónia keletkezik, vagy kezdődhet transzaminálással és a közös intermedierből, a glutamátból történő ammónia felszabadulással a glutamát-dehidrogenáz reakcióban (transzdezaminálás). Ammónia keletkezhet még a glutamináz által katalizált reakció­ ban, illetve a szerin, a hisztidin és a treonin metabolizmusában direkt dezaminálással. A fent leírt folya­ matok elsősorban a májban játszódnak le. Dezaminálás történhet a vesében is, a D-aminosavakból a peroxiszomális a-aminosav-oxidázok hatására. Mint­ hogy a D-aminosavak aránya az L-aminosavakhoz ké­ pest alacsony, így ennek az aminosavak katabolizmusa szempontjából csekély a jelentősége.

Az ammónia eliminációja Az ammónia fontos a szervezet számára; szerepe van a nukleotid- és aminosavszintézisben és egyéb nitrogéntartalmú vegyületek előállításában. Az am­ mónia, más oldalról nézve viszont rendkívül toxikus, elsősorban a központi idegrendszer számára. Emelke­ dett szintje a vérplazmában hallucinációt, tremort, zavartságot okoz, súlyos májbetegségekben pedig kó­ mát, majd halált eredményez, így a szervezet számára létfontosságú a vérplazma ammóniakoncentrációjá­ nak normális szinten tartása ( urea + 2ADP + 2Pj + AMP + PP; + fumarát

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R F I RI N - A N Y A G C S ER E

Tehát az ammónia eliminációjához aszpartátra és bikarbonátra van szükség. Az omitinciklus első reak­ ciója, a karbamil-foszfát szintézise a mitokondriumban történik (9-29. ábra). A reakciót a karbamil-foszfát-szintetáz-I (CPS-I) katalizálja. Az NH3ból és HC03--ból keletkező karbamilcsoport és az ATP által szolgáltatott foszfátcsoport között nagy energiájú anhidridkötés alakul ki, amely biztosítja a további reakció energiaigényét. Az így keletkezett karbamil-foszfát szintézise és lokalizációja eltér a nukleotidok szintéziséhez szükséges karbamil-foszfát kelet­ kezésétől. A nukleotid-anyagcsere során képződő karbamil-foszfát nitrogénje glutaminból származik, és az enzim a citoszolban találha­ tó minden sejtben (lásd még a 10. fejezetet). Megjegyezzük, hogy az

ureaszintézis karbamil-foszfát-szintetáza nem NH4+-t, hanem NH3-t használ szubsztrátként, vagyis a reakció egy proton leadásával kez­ dődik (a 9-29. ábrán ezt nem mutatjuk).

Az omitinciklus második reakciója egy transzfer, amelynek során omitinből és karbamil-foszfátból citrullin keletkezik az ornitin-transzkarbamiláz (OTC) hatására. Az OTC génje az X kromoszómán lokalizált. A citrullin ezután omitin-cseretranszporttal elhagyja a mitokondriumot, és a citoplazmában aszpartáttal kondenzálódik, a reakciót az argininoszukcinát-szintetáz (AS) katalizálja. A reakció nem meg­ fordítható, mert az energiát szolgáltató ATP —» AMP átalakulás után a pirofoszfátot a pirofoszfatáz elbont­ ja. A termék, az argininoszukcinát-liáz (ASL) hatá-

II I ooc

C —H

9-29. ábra. Az omitinciklus

305

fumarát

I II.

306

AZANYAGCSERE

("glukóz

gininszükséglet fedezésére, ha a szervezetben nem fo­ ("PÉP | --------> (piruvát--------> (acetil-CoA lyik gyors fehérjeszintézis. Ezért terhességben vagy például növekedésben az arginint a táplálékkal kell biztosítani (szemiesszenciális). Azzal, hogy az ureaszintézishez aszpartátra van szükség, az ornitinciklus szorosan kapcsolódik a citrátciklushoz, mert az aszpartátot az oxálacetát gluta9-30. ábra. Az ornitinciklus kapcsolódása a citrátkörhöz. PÉP, foszfoenol-piruvát. Az máttal történő transzamináábra könnyebb áttekinthetősége céljából nem tüntetjük fel az összes intermediert lása szolgáltatja (9-30. áb­ ra). Minthogy lebomlásuk során más aminosavak szénváza is bekerülhet a citrátsára, fumarátra és argininre bomlik. A reakciók eddig körbe, nemcsak a Glu és Asp, így egyéb aminosavak is az arginin szintéziseként is felfoghatók. Az arginin ez­ felelősek lehetnek az ornitinciklus fenntartásáért. után argináz hatására ureára és omitinre hidrolizál. Ezen lépés jelenti lényegében az urea szintézisét, va­ gyis két nitrogén eliminációját. Az urea ezután a citoAz ornitinciklus szabályozása szolból a vérkeringésbe kerül, majd a vese kiválasztja. A vizeletben ürülő nitrogén 86%-át az urea szolgáltat­ Az ornitinciklus szabályozása alloszterikus mo­ ja, míg a többit az ammónia, szabad aminosavak, dulátorokkal. Az urea szintézisének semmiféle dikreatinin, urát és egyebek. Az arginázreakció eredmé­ rekt feedback szabályozása nem ismert (csak nagyon nyeképp keletkező omitin ezután a citoplazmából visszakerül a mitokondriumba, és ott egy újabb citrullin szintézisében vesz részt. Ezzel a lépéssel zárul a acetil-CoA ciklus, s mint látható, az omitin ha­ N -a c e til-g lu ta m á t-s z in tá z sonló szerepet tölt be az omitin■HS-CoA ciklusban, mint az oxálecetsav a citNH„ rátkörben. Az arginin azonban nem feltétle­ nül alakul át ureává, hanem felhasz­ nálódhat más reakciókra is a szerve­ zetben. Ilyenkor a ciklus működésé­ hez (az ammónia eltávolításához) az omitint de novo szintetizálni kell. Az omitin glutamátból történő szin­ tézise azonban lassú, aminek ered­ ményeként, ha a ciklus argininszintézisre (nem ureaszintézisre) hasz­ nálódik, csak akkor elégséges az ar9-31. ábra. Az N-acetil-glutamát keletkezése és hatása

9. A Z A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R FI RI N - A N Y A G C S E RE

magas ureakoncentráció - ami uraemiában fordulhat elő - gátolja az argininoszukcinát-liázt). Az omitinciklus reakciói közül több enzim is szabályozódik alloszterikus modifikátorokkal, így a karbamil-foszfát-szintetáz-I is. Ennek az enzimnek az ammóniára vonatkozó Km-értéke magas, így aktvi­ tása az ammóniakoncentráció növelésével nő. A karbamil-foszfát-szintetáz aktivitását módosító faktorok közül a legismertebb az N-acetil-glutamát (NAG), amely az enzim alloszterikus aktivátora (9-31. ábra). Az N-acetil-glutamát glutamátból és acetil-CoA-ból szintetizálódik; a reakciót a mitokondriális N-acetilglutamát-szintáz (NAGS) katalizálja. A NAG kon­ centrációja függ az arginin koncentrációjától is, mert a NAGS egyik leghatásosabb aktivátora az agmatin, az arginin dekarboxilált származéka, amely a mitokond­ riális arginin-dekarboxiláz hatására keletkezik. Az omitinciklus transzkripciós szintű szabályo­ zása. Kimutatták, hogy az omitinciklus enzimeinek aktivitása a fehérjebevitel növelésével háromszorosá­ ra nőtt. Ismert, hogy az éhezés következtében meg­ emelkedett fehérjekatabolizmus szintén növeli az omitinciklus kapacitását. Az omitinciklus minden en­ zime transzkripciós szintű szabályozás alatt áll; éhe­ zésben megnő a CPS-1, az OTC, az argininoszukcinát-szintetáz, az ASL és az argináz mRNS-szintje. Hasonló hatása van a glukokortikoidoknak és a cAMP-szint emelkedésének. Az omitinciklus szabályozása acetilációval és deacetilációval. Az omitinciklus két enzimével kap­ csolatban is leírtak acetilációval/deacetilációval törté­ nő szabályozást. A CPSl-et a SIRT5 deacetilálja, így aktiválja, míg a SIRT3 - amelynek deacetiláz aktivitá­ sa éhezésben emelkedett - az OTC enzimet deaceti­ lálja, s ezáltal aktiválja. Az omitinciklus működése acidosisban. A máj metabolikus funkciói tekintetében meg kell említeni a különbséget a periportális és perivénás hepatociták között (9-32. ábra). Normális körülmények között a periportális hepatociták a véna portáé által szállított ammónia, a saját dezamináló és glutaminázaktivitásuk eredményeképp keletkezett ammónia eliminációját az omitinciklusban végzik. A minimális mennyiségű, omitinciklusban nem detoxikálódott ammónia a peri­ vénás hepatociták glutamin-szintáza által glutaminná

307

alakul, és a keringésbe jut. Összességében azonban a máj glutaminfelhasználása jelentősen meghaladja a glutaminképzését. Az acidosissal egybekötött éhezésben, a peripor­ tális hepatocitákban az omitinciklus aktivitása csök­ ken, ennek következtében jelentősebb mennyiségű ammónia éri el a véna centrális közeli máj sejteket, melyekben nagy mennyiségű glutamin képződik, és a máj nettó glutaminfelvevő szövetből nettó glutamindonor lesz, a májból kibocsájtott glutamin tekintélyes részét pedig a vese használja fel a glukoneogenezis céljaira (lásd 20. fejezet). Az omitinciklus aktivitás­ csökkenéséhez részint a szubsztrátok csökkenő mennyisége vezet, melynek okai: ♦ csökkent aminosavfelvétel a májsejtekbe alacsony pH mellett, ♦ a CPS-I szubsztrátja az NH 3 , nem pedig az ammóniumion (acidosisban az NH3/NH4+ egyensúly a protonált forma felé tolódik el), ♦ a máj glutamináz aktivitása acidosis hatására csök­ ken, ♦ az omitinciklust aktiváló N-acetil-glutamátból ke­ vesebb keletkezik, mert a NAG-szintáz Km-értéke acidosisban glutamátra vonatkozóan emelkedik.

A hyperammonaemia és terápiás lehetőségei A hypermammonaemia életveszélyes állapot, mert a központi idegrendszer számára az ammónia súlyo­ san mérgező, és az idegrendszer extrém érzékenyen reagál a vér ammóniaszintjének emelkedésére. Az omitinciklus fenntartása létfontosságú, hiánya nem egyeztethető össze az élettel. így, az omitinciklus en­ zimdefektusait illetően csak részleges enzimdefícienciákkal találkozhatunk. A különböző enzimek defek­ tusait különböző nevekkel illetik (I. és II. típusú hyperammonaemia, citrullinuria, argininosuccinaturia, hyperargininaemia, argininuria, attól függően, hogy az omitinciklus melyik intermediere halmozódik fel nagyobb mértékben). A defektusok legjellemzőbb közös megnyilvánulá­ sa a vér és a cerebrospinális liquor ammóniakoncent-

III.

308

AZ ANY AGC S ER E

a

b

9-32. ábra. Az ammóniaelimináció kompartmentalizációja a májban (a) jóllakott állapotban és rövid távú éhezésben, illet­ ve (b) acidosissal kombinált éhezésben. A májban az ornitinciklus elsőrendűen a periportális hepatocitákban, míg a glutaminszintetáz (Gln-szintetáz) a pericentrális májsejtekben lokalizálódik. Jóllakott és rövid távú éhező állapotban a máj periportális hepatocitáiban a véna portae-ból érkező ammónia és a portális glutamin N-je az ornitinciklusban ureává alakul, csak kis mennyiségű nem méregtelenített N (NH3) éri el a perivénás hepatocitákat, ahol az ammónia a glutamin-szintetáz segítségével Gln-ná alakul és elhagyja a májat. A máj ilyenkor nettó Gin felvevő (a nyilak száma szemikvantitatívan a metabolitok koncentrációját jelzi). Acidosissal kombinált hosszú éhezésben a periportális hepatociták aminosavfelvétele és az ornitinciklus kapacitása csökken, így több ammónia éri el a pericentrális hepatocitákat, melyek a periportális hepatociták által nem detoxikált ammóniát glutaminná alakítják; ilyenkor a máj nettó Gin-képző

rációjának emelkedése és a jellegzetes klinikai tünetek megjelenése (hányás, görcsök, letargia, később króni­ kus fázisban EEG-elváltozások, mentális retardáció). A kórképek súlyosságát a maradék enzimaktivitáson

túlmenően a deficiens enzim omitincikluson belül el­ foglalt helye is meghatározza. A klinikailag legsúlyo­ sabb állapotok az ornitinciklus bevezető lépésének a CPS-I vagy az OTC deficienciáihoz társulnak.

309

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É I É . A P R O R FI RI N - A N Y A G C S E R E

A hyperammonaemia terápiájának célja a katabolizmus és az ammóniaképződés lassítása. Ennek eszköze a megfelelő glukóz-, illetve lipidbevitel, szükség esetén inzulinnal kombinálva. Az inzulin mint anabolikus hormon serkenti az aminosavak fe­ hérjékbe való beépülését, csökkenti a katabolizmust. Fehérjeszegény diétára van szükség, illetve az esszen­ ciális aminosavaknak megfelelő ketosavak szervezet­ be juttatására; ezek transzaminálása csökkenti az ammóniaterhelést és pótolja az esszenciális aminosa­ vak hiányát. A magas ammóniaszint csökkenthető fenilacetát (vagy per os alkalmazható prekurzora, a fenilbutirát) adásával, ami kihasználva a máj konjugáló kapacitá­ sát, glutaminnal fenilacetil-glutaminná alakul, illetve benzoesav adásával, ami glicinnel hippursavat képez. Ezek a konjugátumok vízoldékonyak és a vizelettel ürülnek. Fontos tudni, hogy olyan májbetegségekben, melyekben az egész májparenchima vagy sokféle máj­ funkció károsodott, a fenilacetáttal hatás nem érhető el. Az arginin az omitinciklus enzimopátiái esetén (kivéve az argináz hiányt) esszenciális aminosav lesz, és pótolni kell. Amennyiben ezek a kezelések nem csökkentik az ammóniaszintet a kívánt mértékben, hemodialízist kell alkalmazni. A krónikus kezelésben alacsony fehérjetartalmú diéta, fenilbutirát, és ha az omitinciklus egyes specifikus enzimeinek egyedi hiá­ nyáról van szó, akkor a kórok szerinti specifikus keze­ lésjön szóba. A nem kezelhető eseteknél a májtranszplantáció lehet megoldás. Krónikus májbetegség végstádiumában a béltarta­ lomsavanyítása nem felszívódó, a bélben fermentáló­ dó diszacharidok adásával lehet jótékony hatású, ugyanis a béltartalom savanyítása ammóniából a las­ sabban felszívódó ammóniumion képződését eredmé­ nyezi. A bélbaktériumok számát, így az általuk kép­ zett ammóniaszint csökkentését széles spektrumú antibiotikumok adásával érhetjük el. Újabban ismerték fel, hogy az omitin lebontásában szerepet játszó omitin-aminotranszferáz (OAT, 9-19. ábra) gátlószerei eredményesen használhatók az am­ móniaszint csökkentésére. A hatás magyarázata az, hogy az omitin-túlkínálat fokozni tudja a ciklus akti­ vitását, így az NH3-elimináció sebességét.

Klinikai vonatkozások Az omitinciklus enzimopátiáinak kezelésében a legkomolyabb fehérjerestrikciót a CPS-I- és OTC-deficienciák esetében alkalmazzák. Az esszen­ ciális aminosavak adásával csökkenthető a fehérjeter­ helés. CPS-I- és OTC-deficienciák esetén citrullint azért adnak, mert így megtartott AS, ASL és argináz enzimaktivitások mellett az aszpartát nitrogénje be tud épülni az argininoszukcinátba, és a ciklus citrullin utáni része működőképes lesz. AS-deficiencia esetében a citrullin nem tud a ciklusban továbbalakulni, a vizelettel ürül, citrullinuria észlelhető. Igaz ugyan, hogy a citrullinnal három N-atom ürítése történik, de minden citrullin ürítésével egy omitin is elveszik, és így hamarosan nem lenne elég omitin a karbamil-foszfát fogadásá­ ra, a részleges ciklus is leállna. Ha azonban argininnal egészítjük ki az étrendet, az argininból omitin képződik, és egy részleges ciklust működtetünk, arginin -» omitin —» citrullin intermedierekkel, arginint viszünk be diétásán, és a három N-atomot tartalmazó citrullin ürül a vizelettel. ASL-deficienciához argininoszukcinát-aciduria csat­ lakozik. A vizelettel ürülő argininoszukcináttal ilyen­ kor molekulánként 4 N ürítése történik, ami hasznos, de a hamarosan bekövetkező omitindeficiencia gátat szab a N-eltávolításnak, így az omitint pótoljuk a leg­ egyszerűbben, arginin adásával. Az omitinciklus deficienciáját nemcsak az omitinciklusban közvetlenül részt vevő enzimek enzimo­ pátiái, hanem más, közvetetten ható enzim vagy transzporter működésének elégtelensége is okozhatja. Ilyen az N-acetil-glutamát-szintáz elégtelensége (megszűnik a CPS-I aktivációja) vagy a mitokondriális ornitin-citrullin antiporter deficienciája („HHH szindróma” - hyperammonaemia, hyperomithinaemia, homocitmllinaemia - jön létre. (Omi­ tin hiányában az OTC enzim a lizin e-aminocsoportához kapcsolja a karbamil-foszfátot és az így keletkező, a citrullinnál egy metiléncsoporttal hoszszabb metabolitot nevezik homocitrullinnak.)

II I .

310

9.6

EGY SZÉNATOM OS CSO P O RT O K TRA N SZ F ER R EA K C IÓ I. A T E T R A H ID R O F O L Á T ÉS AZ S-AD ENOZIL-METIO NIN S ZER EP E AZ AMINOSAVA NYA GC SER ÉB EN

Az egy szénatomos „töredékekre” az aminosavak anyagcseréjén kívül szükség van még a nitrogéntartal­ mú specifikus funkciót ellátó molekulák keletkezésé­ hez, a nukleotidok szintéziséhez és a makromolekulák

AZANYAGCSERE

posztszintetikus módosulásához. Az egy szénatomos töredékeket a tetrahidrofolát és az S-adenozil-metionin-ciklus szolgáltatja.

A folsav szerepe az aminosavak metabolizmusában A tetrahidrofolát az egy szénatomos csoportokat, amelyeket elsősorban szerintői, továbbá glicintől, hisztidintől és triptofántól kap, az N5- és NI0-hez kapcsolva szállítja (9-33. ábra). A szénatom redu-

pteridin p-amino9 benzonát CH, „ ----O

\

glutamát

cooII I \\—r.—N—C —CH2—CH2—COCr H

folát NADPH + H+

NADP+

V,--------------------

dihidrofolat-reduktaz

NADPH + H+

's NADP+ H

I

H Ns-metil-THF

0 = C —H

N5,N,0-metenil-THF

N10-formil-THF 9-33. ábra. Különböző redukáltsági fokú folsavszármazékok. A folsav három fő alkotórésze a pteridinváz, a p-aminobenzoát és a glutamát. A folsavat a dihidrofolát-reduktáz két lépésben redukálja. A tetrahidrofolát különböző mértékben redukált C1 töredékei egymásba átalakulhatnak

311

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R FI RI N - A N Y A G C S E R E

káltsági állapotától függően lehet metil (-CH3), metilén (-CH2-), formil (-CHO), formimino (-CHNH) vagy metenil (-CH=). A legoxidáltabb formát (C 02) a biotin szállítja, míg a legredukáltabbat (-CH3) első­ sorban az S-adenozil-metionin. A különböző redu­ káltsági fokú szénatomtöredékek egymásba átalakul­ hatnak, így ezek donor és akceptor szerepeket is játsz­ hatnak. Nemcsak a szénatomtöredék, hanem magának a folsav pteridingyűrüjének a redukáltsági foka is vál­ tozhat. A folsav a táplálékkal történő felvétel után az em­ beri szervezetben két lépésben redukálódik dihidrofolát-reduktázzal, először dihidrofolát, majd tetrahidrofolát keletkezik (a négy hidrogén a C7 és N8, majd C6 és N5 atomokra kerül a pteridingyürüben).

A folsavhiány a „harmadik világ” legáltalánosabb vitaminelégtelensége, de előfordulhat terhesség kap­ csán és bizonyos betegségek folytán jóléti társadal­ makban is (lásd még a 10. fejezetet). Kimutatták, hogy a terhesség előtt megkezdett folsavkiegészítés szigni­ fikánsan csökkenti a magzatban a velőcsőzáródási rendellenességek előfordulását.

Az S-adenozil-metionin szerepe az aminosavmetabolizmusban Az S-adenozil-metionin a legjelentősebb metilcsoportdonor. Ezen funkciója mellett a homocisztein szintézisében is részt vesz, amely a Cys-szintézis

COO'

♦ I H,N —C —H 3 I

CH, 1 z N

homocisztein

9-34. ábra. Az aktivált metilciklus. A metilcsoport át­ adása után az S-adenozilmetioninból S-adenozil-homocisztein keletkezik, majd hidrolízist követően adenozin leválása után homocisztein marad vissza. A homocisztein felhasználódhat ciszteinszintézisre, de a ciklusban metilcsoportot vesz fel, amelyet metil-tetrahidrofolát szolgál­ tat (a molekulának csak töre­ dékét mutatja az ábra) és így metionin keletkezik. Az utób­ bi reakciót egy B12-vitaminszármazék kofaktort (metilkobalamin) tartalmazó enzim, a homocisztein-metiltranszferáz katalizálja (metioninszintáz) (ennek jelentőségét lásd a 10. fejezetben). A Metből ATP jelenlétében S-adenozil-metionin képződik és ezzel a ciklus záródik

I I I . AZ ANYAGCSERE

312

egyik köztiterméke. A két folyamat az aktivált metilciklusban szorosan kapcsolódik, és maga a ciklus a tetrahidrofolát-rendszerrel is társul (9-34. ábra). A tetrahidrofolát és az aktivált metilciklus között Bi2-vitaminnal működő enzim tartja a kapcsolatot. Az S-adenozil-metionin metildonor szerepét az teszi le­ hetővé, hogy az S-adenozil-metionin keletkezésével a metionin kénatomja, valamint az adenozin C5-atomja között történő reakció során, a kénatomhoz kapcsoló­ dó metilcsoport kötéserőssége csökken. Ha megfelelő akceptor van jelen, akkor a metilcsoport arra átkerül és metilezés történik. Ilyen lehet például a DNS, a rRNS, a tRNS, a noradrenalin, a foszfatidil-etanolamin és még számos egyéb molekula.

9 .7

Asp + Gin + ATP + H20 -> Asn + Glu + AMP + PPj

Klinikai vonatkozások Bizonyos leukaemiafajtákban a daganatsejtek aszparagin-szintetáz (az aszparagin aszpartátból történő szintézisét végző enzim) aktivitása igen alacsony. Ezek a sejtek ezért nagymértékben függnek az extra-

A NEM E S S Z E N C IÁ L IS A M IN O SA V A K B IO SZ IN T ÉZ IS E

A Tyr és a Cys kivételével a nem esszenciális aminosavak bioszinté­ zise a citrátkörhöz, illetve a glikolízishez kapcsolódik és a glutamát centrális szerepet játszik a folyama­ tokban (9-35. ábra). A Pro, Arg, Gin szintéziséhez a glutamát szénváza szükséges, a glu­ tamát aminocsoportja pedig az Alá, Asp és az Asn szintéziséhez szüksé­ ges. A Pro és Arg szintézisében kö­ zös intermedier a glutamát-y-szemiaidehid (Glu-ból történő szinté­ ziséhez ATP és NADPH szüksé­ ges), amelyből két lépésben Pro ke­ letkezhet, vagy omitin egy újabb Glu részvételével (9-36. ábra). Az omitinből Arg keletkezhet. A Pro és Arg katabolizmus köztitermékei sok vonatkozásban megegyeznek a szin­ tézis intermedierjeivel, a lebontási reakciósor Glu-t, illetve a-ketoglutarátot eredményez (9-19. ábra). A nem esszenciális aminosavak közül a Gin bioszintézise Glu-ból

történik a glutamin-szintetáz közreműködésével (9-13. ábra). Az enzim a központi idegrendszerben is megtalálható és szerepet játszhat az ammónia agyi ká­ rosító hatásának csökkentésében. Az aszpartátból történő aszparaginszintézishez nem a szabad ammónia, hanem Gin szolgáltatja az amidcsoportot humán sejtekben:

f glukóz

a

Gin

transzaminálás

L f oxálacetát

Glu

[A sn |

szukcinil-CoA

[q-ketoglutarát

f transzaminálás ->

G in

Pro 9-35. ábra. A nem esszenciális aminosavak bioszintézisének kapcsolata a szénhidrát-anyagcserével. *A szintézishez esszenciális aminosav is szükséges. Az ábrán a reakciók reverzibilitását nem tüntettük fel

313

9. A Z A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R F I RI N - A N Y A G C S E R E

extracelluláris aszparagintól, számukra az aszparagin esszenciális aminosavnak tekinthető. Az extracellu­ láris aszparaginszint csökkentése bakteriális eredetű aszparagináz keringésbe juttatásával a daganatsejt metabolizmusát károsítva a sejtek apoptózisát ered­ ményezi. A humánsejtekben található többféle asz­ paragináz enzim közül egyik sem alkalmas arra, hogy a kemoterápiában a bakteriális enzimeket kiváltsa, mert Km-értékük túl magas az aszparagin vérszintjének hatékony csökkentéséhez. A rekombináns humán enzim katalitikus aktivitásának fokozása alternatívát jelenthet a számos mellékhatással bíró bakteriális en­ zimterápiával szemben.

A tirozin fenilalaninból (esszenciális aminosav) szintetizálódik a fenilalanin-hidroxiláz katalízisével (9-24. ábra). A glicin szintéziséhez szerin szükséges (9-20. áb­ ra). A szerin származhat a táplálékból, hisz bőségesen fordul elő benne, de képződhet a 3-foszfoglicerátból (9-37. ábra). Glicin szintetizálódhat még treoninból (9-23. ábra), a kollagén eredetű 4-hidroxiprolin le­ bontásából, illetve kolinból vagy etanolaminból is (nem mutatjuk). Az utóbbi, mennyiségileg egyébként nem számottevő metabolikus út jelentőségét orvosi szempontból az adja, hogy a bioszintézis utolsó lépé­ sében keletkező glioxalátból transzaminálási reakció­ val keletkezik a Gly (9-20. ábra), de a májban működő glicin-transzamináz defektusakor a glioxalátból nem keletkezik Gly. így a glioxalát oxidálódik oxaláttá,

ED 9-36. ábra. A prolin és az arginin bioszintézise. A glutamát-y-szemialdehid keletkezése glutamátból két lépésben ját­ szódik le. A szintetáz enzim először foszfátcsoportot transzferál ATP-ről a glutamát y-karboxil-csoportjára, majd az aktivált karboxilcsoportot redukálja aldehiddé. Ezután az aldehid a pri­ mer aminnal (a-amino-csoport) addicionál egyidejű H20-eliminációval. Ez utóbbi nem igényel enzimkatalízist. A prolinszintézis utolsó lépése a pirrolingyürű redukciója. A prolin lebontása glutamáttá a y-glutamil-P kivételével azonos köztitermékeket eredményez, az enzimek és kofaktorok viszont eltérőek a szin­ tézisben résztvevőktől. Az argininszintézis irányába először ornitin keletkezik transzaminálással kapcsolt reakció során, ami­ kor glutamát a-ketoglutaráttá alakul. A reakció megfordítható, lehetővé téve prolin ornitin átalakulásokat. Az ornitin -> arginin de novo szintézis az ornitinciklusban valósul meg

III.

314

COO‘

I I

NAD+

H—C —OH h 2c

NADH + H+

W

- - >

AZ ANYAGCSERE

cocr I c=o I

H2c —O— PO3 2-

- o - p o 32-

3-foszfohidroxi-piruvát

3-foszfoglicerát

Glu transzaminaz A

Ns, N10-metilén-THF

coo-

< W h 2o

THF

a-l a-ketoglutarát

COO♦ I H,N —C — H H2c1 —O—PO3 2 3-foszfoszerin

9-37. ábra. A szerin bioszintézise. THF, tetrahidrofolsav

amely rosszul oldódik, és a vesében kicsapódhat (hyperoxaluria; vesekőképződés). A cisztein szintéziséhez metionin és szerin szüksé­ ges. A szintézis lépéseit a 9-25. ábra mutatja. A folya­ mat köztiterméke a homocisztein, amelyből két, piridoxál-foszfát koenzimmel működő enzim, a cisztationin-szintáz és a cisztationin-liáz hatására keletke­ zik cisztein. A homocisztein, szükség esetén, a homocisztein-metiltranszferáz (metionin-szintáz; a homo­ cisztein mellett másik szubsztrátja az 5-metil-tetrahidrofolát, kofaktora a metil-kobalamin), segítségével alakulhat vissza metioninná és vehet részt újabb metilálási ciklusban (9-34. ábra).

Klinikai vonatkozások A homociszteinszint felszaporodása súlyos egészségi kockázatokkal jár. A hyperhomocysteinaemia és a homocistinuriák növelik az arteriosclerosis és szö­ vődményeinek kockázatát, illetve a szellemi teljesít­ mény idő előtti csökkenéséhez vezetnek. A hyperhomocysteinaemiához vezető állapotok sokszor örök­ lődő enzimopátiák vagy vitaminhiányos állapotok kö­ vetkezményeképpen lépnek fel. A vér emelkedett homociszteinszintje a homocysteinaemia. A homocisztein spontán homocisztinné oxidá­ lódik. Ebben az esetben a glutation oxidált formájá­ hoz, a GSSG-hez hasonlóan két SH-csoport között alakul ki kötés. A hyperhomocysteinaemia nem egy­

séges kórkép, mivel több különböző ok válthatja ki, és bár a homociszteinszint emelkedése önmagában is kó­ ros tüneteket produkál, a különböző kiváltó okok is to­ vábbi kóros elváltozásokhoz vezethetnek. Homocysteinaemiát és homocysteinuriát okoz egyebek mel­ lett a cisztationin-szintáz defektusa, illetve a B6-vitamin krónikus hiánya.

9 .8 .

AZ A M IN O SA V A K B Ó L K É P Z Ő D Ő N ITR O G ÉN TARTALM Ú V EG YÜ LETEK

Az egyes aminosavak több, fontos metabolit szin­ tézisének kiindulópontjául szolgálhatnak. A teljesség igénye nélkül a 9-2. táblázatban összefoglaljuk a kü­ lönböző aminosavakból szintetizálható nitrogéntartal­ mú metabolitokat, illetve más aminosavakat. A táblá­ zatból több vegyület szintézisét e fejezetben már is­ mertettük, számos egyéb vegyület szintézisével és szerepével ebben az anyagrészben nem foglalkozunk, ezek más fejezetekben kerülnek tárgyalásra. Glutamátból képződő vegyületek. A glutamát és cisztein a glicinnel együtt részt vesz a glutation szin­ tézisében (9-5. ábra). A redukált glutation (GSH) oxi­ dációja során két glutationmolekula S-S híddal össze­ kapcsolódhat és oxidált glutation keletkezik (GSSG). Normális körülmények között az egyensúly a redukált forma irányában van eltolva és a GSH koncentrációja

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É I É . A P R O RE I RI N - A N Y A G C S E R E

9-2. táblázat. Az aminosavak szerepe az intermedier anyagcse­ re metabolitjainak képződésében

315

A glutamát a központi idegrendszer legjelentősebb excitátoros neurotranszmittere, belőle szintetizálódik egy másik, de Az aminosavból képződő vegyületek Prekurzor aminosav gátló neurotranszmitter, a y-aminovajsav glutation, GABA, prolin (hidroxiprolin), ornitin, Glu (GABA) (lásd 21. fejezet). y-karboxi-glutamát, Gin Szerinből képződő vegyületek. Ami­ foszfatidilszerin, etanolamin, kolin, bétáin, cisztein, szfingozin, Ser kor szerinből kolin szintetizálódik, az első szelenocisztein lépésben a Ser dekarboxilálódik, majd a ke­ S-adenozil metionin (metildonor), homocisztein, homocisztin, Met letkezett etanolamin metilálódik 3 mole­ poliaminok kula S-adenozil-metioninnal, és kolin, illet­ NO, kreatin, poliaminok Arg ve 3 molekula S-adenozil-homocisztein ke­ szerin, kreatin, glutation, hem Gly letkezik (9-38. ábra). A kolinszintézis az emberi szervezet számára nem feltétlenül taurin, 3-foszfoadenozin-5-foszfoszulfát (PAPS), glutation Cys szükséges, mert a táplálék általában elégsé­ dopamin, noradrenalin, adrenalin, melanin, pajzsmirigyTyr ges mennyiségű kolint tartalmaz. Kolin kell hormonok a neurotranszmitter acetilkolin és bizonyos tirozin és a belőle származó további metabolitok Phe foszfolipidek szintéziséhez. A bétáin - más nikotinsav mononukleotid, NAD, NADP, szerotonin, melatonin Trp néven trimetil-glicin - kolinból szintetizá­ karnitin lódik a kolin hidroxilcsoportjának két lé­ lys pésben karboxilcsoporttá történő oxidáció­ hisztamin His jával. A bétáin enzimatikusan, metil-kobanukleotidok, Asn Asp lamin és tetrahidrofolsav nélkül képes a nukleotidok, Asn, aminocukrok Gin homocisztein metioninná történő metilápoliaminok, arginin Ornitin ciójára, így felhasználható a magas homociszteinszint csökkentésére. Táplálékkie­ gészítőként is használják. CH, 3 S -a d e n o zill + Szerinből képződik a szelenocisztein is. m etionin H ,C — N — CH H> °3 N H ,+ COOI / 1 t 1 A szelenocisztein a 21. proteinogén amino­ ► CH, H,N — CH I 1 i sav, több mint 25 humán fehérje szerkeze­ CH, CH, CH, h 2o 1 2 | 3 S -a d e n o zilI tében megtalálható (pl. a glutation-perOH OH OH h o m o cisz te in kolin oxidáz aktív centrumában), szintézise pe­ e ta n o la m in Ser dig egyedülálló módon kotranszlációsan 4 történik egy speciális tRNS-hez kötött szerinből. [A t(transzfer)RNS a fehérjeCH, l+ szintézis helyére szállítja az aminosavaH , C — N — CH. I kat.] A tRNS- hez kötődött aminosavak a CH, '2 I tRNS-en nem, legfeljebb a polipeptidláncCOOb e t a i n 9-38. ábra. A kolin és bétáin szintézise ba történő beépülés után módosulhatnak kovalensen. Ez alól a szabály alól egyetlen ismert kivétel a szelenocisztein képződése. A tRNS-éhez kötött szerin hidroxilcsoportjának oxi­ magas a sejtekben (~5 mM). A rendszer „szulfhidril génje egy ATP hidrolízise által biztosított energiával puffért” képez, amely fontos szerepet játszik a fehér­ szelénre cserélődik (9-39. ábra). A szelenociszteint jék korrekt diszulfidhídjai kialakításában, valamint a tartalmazó fehérjék mRNS-ében az UGA a szeleno­ különböző detoxikációs reakciókban (lásd 6-21. áb­ cisztein kodonja. Az UGA egyébként általában termira).

4

316

III.

AZ ANYAGCSERE

H

3' Sec

9-39. ábra. A szelenociszteinil-tRNS képződése. A szelenocisztein (Sec) kotranszlációsan, speciális tRNS-hez (tRNS(Ser)5ec) kötött szerinből szintetizálódik. A szelenocisztein az egyetlen ismert aminosav, mely egy tRNS-hez kötött másik aminosav kovalens módosítá­ sa révén keletkezik. A reakciókhoz a Se forrása a szelenofoszfát (SeP032“)

nációs kodon, és annak biztosítására, hogy a szelenociszteinil-tRNS a transzlációban részt tudjon venni, egy, legalább öt komponensből álló rendszer szüksé­ ges, melynek részleteit itt nem ismertetjük.

Az argininból képződő vegyületek közül a nitrogén-monoxid szerepével a 17. fejezetben foglalko­ zunk. Argininból szintetizálódik a kreatin, illetve kreatin-foszfát. A kreatinszintézis első lépése transzamidinálás, melynek során Arg és Gly-ből guanidinoNH, acetát keletkezik a vesében, I 2+ C = NH, majd a májban S-adenozilI S-adenozilNH S-adenozil metioninnal történő metileI metionin homocisztein NH, NH, CH, ^ f transzamidináz zéssel kreatin szintetizáló­ I 2+ I I 2 ____w 1 -» C = NH, —> C = NH, CH, I I dik. Ez utóbbi reakciót I 2 guanidinoacetátNH N—CH, CH, ornitin metiltranszferáz I I 3 I 2+ guanidinoacetát-metiltranszch2 CH,2 HC — NH, I 3 I feráz katalizálja (9-40. ábra). COOcocr COOA guanidinoacetát metilálása Arg guanidinoacetát kreatin kreatinné az aktivált metilA ATP csoport mennyiségileg egyik [^kreatin-kináz legfontosabb felhasználása. A ADP V Végeredményben a krea­ o tin szintéziséhez 3 aminosav szükséges: Arg, Gly és Met. 1 HN HN = C3 C = 0 globin

hem

Fe3+) V

C )X N

I

H

l

H

i

N/

C^S'N N

H

H

i

biliverdin

falbumin

1

I

H

N

I

H

hem-oxigenáz rendszer katalizálja és biliverdin ke­ letkezik (9-53. ábra). A hem-oxigenáz a makrofágok endoplazmás retikulumában lokalizálódik, molekulá­ ris oxigént és NADPH-t használ további szubsztrátokként, és a reakció során a pirrolgyürüket összekötő metilénhidak közül az alfánál hasít az enzim, és ez a szénatom CO-ként felszabadul. Emberben jelenleg ez az egyetlen ismert, enzim katalizálta reakció, amely szén-monoxidot képez. Az enzim csak hemmel reagál (a protopofirin-IX nem szubsztrátja az enzimnek), mert más oxigenázokhoz hasonlóan a molekuláris oxi-

9-53. ábra. A hem degradációja. A bilirubin képződése és transz­ portja a vérplazmában. A könnyebb áttekinthetőség céljából a hem porfirinvázának csak azt a részét ábrázoltuk teljes részletességgel, ahol a váz az oxidáció során felnyílik. A pirrolgyűrűk szubsztituenseinek rövidíté­ sei: M, metil; V, vinil, P, propionát. A hem-oxigenáz működése során szén-monoxid (CO) képződik. A reakciók leginkább a lép makrofágokban mennek végbe. Az ábrán a bilirubin „klasszikus" ábrázolása mellett az intramolekuláris H-kötések létrejötte következtében kialakuló hidrofób mo­ lekulaszerkezetet is feltüntettük (keretben)

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É I É . A P R O R FI RI N - A N Y A G C S E R E

gén aktiválásához a NADPH eredetű elektronok transzferé a hemvas közvetítésével történik, amely eb­ ben az esetben egyedülálló módon nem az enzim prosztetikus csoportja, hanem maga a szubsztrát. A re­ dukciós lépést a biliverdin-reduktáz katalizálja, bilirubint eredményezve. A biliverdin színe sötétzöld, a bilirubiné pedig narancssárga. Az utóbbi molekula ezután a vérkeringésbe kerül, ahol oldékonysága na­ gyon alacsony, amit az intramolekuláris hidrogénhidak képződése magyaráz (9-53. ábra)', a vérkeringés­ ben albuminhoz kötve szállítódik a máj­ hoz. Az albuminmolekulán egy nagy és egy kis affinitású kötőhely van a bilirubin számára.

331

endoplazmás retikulum felszínére transzportálódik. A vízben rosszul oldódó bilirubin 2 propionátcsoportja 2 UDP-glukuronáttal két lépésben konjugálódik UDP-glukuronozil-transzferáz (UGT1A1) segítségé­ vel (9-54. ábra)', a keletkezett bilirubin-mono- (BMG) és bilirubin-diglukuronid (BDG) már jó oldékonyságú és az epével kiürül. Az UDP-glukuronozil-transzferáz a legkülönbö­ zőbb gyógyszerekkel (pl. fenobarbitállal) indukálha­ tó. A bilirubin konjugált formáját „direkt bilirubin-

M

P H

c '/N s n-/N r H

Klinikai vonatkozások

I

H bilirubin

I

H

2 COO-

A hem-oxigenáz aktivitásnövekedése rosszindulatú daganatokban kedvezőtlen prognosztikus jel. A daganatokban kifeje­ ződő hem-oxigenáz elősegíti a tumor­ szövet vaszkularizálódását és a tumor­ sejtek oxidatív stressztűrő képességét fo­ kozza. A hem-oxigenáz gátlása szerepet játszhat a daganatok terápiájában. A HOX ugyanakkor termékei, a biliverdin és a CO révén fontos szerepet játszik az oxidatív stressz elleni védekezésben. Pozitív sze­ repe van az ischaemiás kórképekben.

A konjugált bilirubin kialakulása és további sorsa. A bilirubin a májsejtekbe facilitált transzporttal kerül [a transzportelek) valószínűleg az OATP, organic anion transport proteins családba tartoz­ nak], ahol a bilirubin két fehérjéhez, a glutation-S-transzferáz-1B-hez (GST1B) és a zsírsavkötő fehérjéhez (FABP-hez) kapcsolódik. A GST1B affinitása a bili­ rubinhoz sokkal nagyobb, mint az albumi­ né, s ez elősegíti a bilirubin felvételét és akkumulációját a hepatocitákban. A to­ vábbiakban a bilirubin a sima felszínü

epe bél urobilinogén

9-54. ábra. A bilirubin sorsa a májban. A bilirubin a májban UDP-glukuronsavval konjugálódik, majd a bilirubin-diglukuronát aktív transzporttal a bélbe ürül. Az ábrán a bilirubinnak csak a reaktív részét tüntettük fel. A glukuronáció az ER-ban történik

I I I . AZ A N Y A G CS E R E

332

nak”, konjugálatlan, de albuminhoz kötött formáját „indirekt bilirubinnak” is nevezik a klinikumban, az elnevezés a klinikai laboratóriumban használt kimuta­ tási reakcióra utal. A konjugált bilirubin az endoplazmás retikulumot elhagyva a máj sejt kanalikuláris (apikális), vagy szinuszoidális (bazolaterális) felszínéhez juthat. A ka­ nalikuláris felszínen az ABCC2-transzporterrel (MRP2, multidrug resistance protein-2) az epekanalikulusokba szekretálódik. Érdekes, hogy a kép­ ződött bilirubin-glukuronoid nem elhanyagolható ré­ sze a szinuszoidokba „vissza”-szekretálódik, majd a májsejtek felveszik és végül az epével kerül kiválasz­ tásra. A szekrécióban az ABCC3- (MRP3-) transzporter játszik szerepet, a visszavételben két OATP tí­ pusú transzporter működik közre (9-55. ábra). A bilirubin az epe fontos összetevőjeként a vé­ konybélbe kerül, és a bélbaktériumok által termelt en­ zimek hatására további átalakulásokon megy keresz­ tül. Először a glukuronát hidrolizál, majd a vinilcsoport etilcsoporttá redukálódik, majd újabb redukci­ ós lépések következnek, és urobilinogén keletkezik {9-55. és 9-56. ábra). Az urobilinogén egy része a ter­ minális ileumból, illetve a vastagbélből reabszorbeálódik, visszakerül a májba és újra szekrécióra ke­ rül, vagy ha sok urobilinogén szívódott fel, akkor a ve­ sén keresztül távozik. A visszaszívódott urobilinogén egy része urobilinné alakul (oxidáció), felszívódik, majd a vesén keresztül kiválasztódik. Az urobilin fele­ lős a vizelet sárga színéért. A koncentráltabb vizelet a nagyobb koncentrációjú urobilin miatt sötétebb sárga színű. A vissza nem szívódott urobilinogén a bélben szterkobilinné (redukció) is alakulhat, és a széklettel ürül. (Az urobilin és szterkobilin képletét nem tüntet­ jük fel.) A porfirinek lebontásának és ürülésének összefoglaló sémáját a 9-55. ábra mutatja.

elégtelen működése vagy a vörösvértestek fokozott szétesése váltja ki. Gyakori az újszülöttek fiziológiás sárgasága is; az UDP-glukuronozil-transzferáz és a szekrécióért fele­ lős enzimek szintézise a májban még nem történt meg, aminek következménye, hogy újszülöttekben a foko­ zott hemoglobinlebontással járó hemoglobintípus-váltás során a bilirubin nem kerül kiválasztásra (emelke­ dett az „indirekt bilirubin” szintje). A rosszul oldódó bilirubin penetrál az éretlen vér-agy gáton, a bazális ganglionokat károsítja és megfesti (kem-icterus vagy mag-icterus), s halálos bilirubin-encephalopathiát is okozhat. Az állapot kezelésére kék fényt alkalmaznak, mert a 420-470 nm tartományú fény a bőrben a bilirubin szerkezetében izomerizációt hoz létre, mely­ nek eredményeképpen oldékonysága jelentősen meg­ nő. Az így átalakult nem konjugált („indirekt”) bilirubin elveszti toxikus hatását, mert glukuronidáció nélkül is kiürül a vesén és a bélen keresztül. Hepatitis, cirrhosis vagy mérgek, mint pl. gomba, szén-tetraklorid okozta májkárosodásokban emelke­ dett elsősorban az „indirekt bilirubin” és a „direkt bilirubin” szérumszintje és kismértékben a vizelet urobilinogénszintje, a vizeletben bilirubin jelenik meg, csökkent vagy normális viszont a széklet urobilin- és szterkobilinszintje. Elzáródásos icterusban (mechanikus okok miatt: leggyakrabban epekő vagy pancreas-carcinoma következtében) a szérum­ ban emelkedett a „direkt bilirubin” szintje, a vizelet­ ben bilirubin jelenik meg, de hiányzik a vizeletben és a székletben az urobilinogén, illetve a szterkobilin, mert a máj képes ugyan konjugált („direkt”) bilirubint ké­ szíteni, de az nem kerül be a bélbe. (Ha az elzáródásos icterus hosszabb ideje áll fenn, akkor májkárosodás is létrejön, amely megnehezíti a pontos diagnózist.) A la­ boratóriumi leletek különben logikusan tükrözik a ká­ rosodás okát.

Klinikai vonatkozások A bilirubin-anyagcsere zavarai sárgaságot (icterust) okozhatnak, amelynek lényege, hogy bilirubin rakó­ dik le a bőrben és a sclerában. A sárgaság különböző betegségek tünete is lehet. Leggyakrabban a máj

Hemolízis (a vörösvértestek érpályán belüli pusz­ tulása) során emelkedett a szérum „indirekt biliru­ bin”-, a vizelet urobilinogén- és a széklet urobilin-, il­ letve szterkobilinszintje, de nem emelkedik a vizelet­ ben a bilirubin. A hemolitikus anaemiák esetében

333

9. AZ A M I N O S A V A K A N Y A G C S E R É J E . A P R O R FI RI N - A N Y A G C S E R E

löregedett rösvértest m akrofág

f Hb |— > (verdoglobin

9-55. ábra. Az epefesték-anyagcsere összefoglalása. A hemoglobin hem prosztetikus csoportja elsősorban a lép makrofágokban bilirubinná bomlik le. A rosszul oldó­ dó bilirubin a keringésben albuminhoz kötődik (indirekt bilirubin), és a májba felvételre kerül. A bilirubin glukuronsavval konjugálódik a májsejtekben (direkt bilirubin), majd az epekanalikulusokba szekretálódik. A vékonybélben a bilirubin dekonjugálódik, urobilinogénné (ubg) alakul, mely részben redukciós termékével, a szterkobilinnel együtt ürül a székletben, részben visszaszívódik a keringésbe. A visszaszívódott ubg újból kivá­ lasztódhat az epével, ürülhet a vizelettel, vagy a vizelet színét adó urobilinné oxidálód­ hat (az ubg színtelen). HOX, hem-oxigenáz; BVR, biliverdin-reduktáz; OATP, organic ani­ on transport protein; UGT1A1, UDP-glukuronozil-transzferáz; BMG, bilirubin-monoglukuronát; BDG bilirubin-diglukuronát

bélrendszer

ileum colon

vizelet

fennáll a lehetősége annak, hogy a szervezet a vesén keresztül jelentős mennyiségű vasat veszítsen. Ennek megelőzésére specifikus plazmafehérjék állnak ren­ delkezésre. A transzferrin a vasat megköti és alkal­ massá teszi arra, hogy szabályozottan vegyék fel a szervek a vérből. A szabad, vörösvértestből kiszaba­ dult hemoglobin, ha a vas ferroformában van, dime-

r H

H

H

H

I H

o

9-56. ábra. Az urobilinogén. Az urobilinogén a bélbaktériu­ mok hatására keletkezik bilirubinból. Egy része visszaszívódik a keringésbe, másik része a széklettel ürül. Diagnosztikai szem­ pontból fontos vegyület. M, metil; E, etil; P, propionát

334

I II . AZ ANY AGCS ER E

rekre disszociál, majd a haptoglobin nevű fehérjéhez kötődik. A haptoglobint a máj szintetizálja, két polipeptidláncból (a és (3) áll. A haptoglobin-hemoglobin komplex nagysága miatt nem fíltrálódik a vesé­ ben. Amennyiben azonban a felszabaduló hemoglobin meghaladja a haptoglobin kapacitását, a hemoglobin dimer a vizeletbe kerül. A haptoglobinhoz kötött he­ moglobint a makrofágok veszik fel receptormediált endocitózissal. Emiatt hemolízis után a plazma haptoglobinszintje csökken, mert a haptoglobin felvétele után nem reciklizálódik. Az oxidálódott Hb nem kötő­ dik a haptoglobinhoz, nagy valószínűséggel transzlokálódik az extravaszkuláris térbe (vagy szövetközti bevérzés esetén ott is szabadul fel). Oxidatív környe­ zetben (például az extravaszkuláris térben) a hem fel­ szabadul a Hb-ból. A szabad hem a keringésben és az extravaszkuláris térben a hemopexin nevű [3-globulinhoz kötődik, ami receptorhoz kötődve intemalizálódik a másejtekbe, makrofágokba, neuronokba. Ha a hemkoncentráció a vérben meghaladja a hemopexin kötőkapacitását, a többlet hemet az albumin köti meg. Mind a hapto­ globin, mind a hemopexin által kötött porfirinek végül bilirubinná alakulnak, vastartalmúk pedig a ferroportin —» transzferrin úton kerül vissza a vashomeosztázisba, vagy ferritin formában intracellulárisan tá­ rolódik. Ezeknek a fehérjéknek az a jelentősége, hogy védik a vaszkuláris endotéliumot és a vesét a Hb és hem toxikus hatásaitól, mint pl. a prooxidáns hatások­ tól, gyulladásos reakciók indukciójától.

Klinikai vonatkozások Az örökletes enzimdefektus közül az UDP-glukuronozil-transzferáz (UGT1A1) hiánya a CriglerNajjar-szindróma I-es vagy Il-es típusát és a Gilbert-szindrómát eredményezheti. Az UGT1A1

génnek a könyv írásakor 130 mutációja ismert. Az I-es típusú Crigler-Najjar-szindróma az öröklődő hyperbilirubinaemiák legsúlyosabb formája. Az UGT1A1 enzimaktivitás hiányzik, bilirubin-glukuronid nem képződik. Az enzim aktivitása barbiturátokkal sem in­ dukálható. A máj egyéb funkciói normálisak. A szé­ rumban a konjugálatlan bilirubin koncentrációja nő meg, valamennyi bilirubin nem tisztázott utakon a bél­ be kerül, és a székletben minimális mennyiségű urobilinogén képződik. A fototerápia bevezetése előtt a betegek nagy része kem-icterusban, azaz bilimbinencephalopathiában csecsemőkorban meghalt. A be­ tegség autoszomális recesszív módon öröklődik, májtranszplantációval lehet gyógyítani. A Il-es típusú Crigler-Najjar-szindrómában a konjugálatlan biliru­ bin szintje kevésbé nő meg, a vérben a bilirubinmonoglukuronid koncentrációja emelkedik, a kemicterus ritka. A májfunkciók normálisak. A betegek fenobarbitálra reagálnak, de ez nem normalizálja a konjugáltbilirubin-szintet. Agresszív fototerápiával és alkalmankénti fenobarbitál kezeléssel a prognózis jó. A Gilbert-szindróma a leggyakoribb öröklődő hyperbilirubinaemia szindróma, a populáció 3-13%-át érin­ ti. Az UGT1A1 -aktivitás legalább 50%-ban hiányzik. Klinikailag enyhe intermittens nem konjugált hyperbilirubinaemia jellemzi, megelőző hemolízis vagy májkárosodás nélkül. A Crigler-Najjar- (I, II) és Gilbert-szindrómák ugyanannak a génnek különböző súlyosságú mutációiból erednek. A konjugált bilirubin szekréciós zavara a D u b i n J o h n s o n - s z i n d r ó m á t eredményezi. Dubin-Johnsonszindrómában az ABCC2-transzporter működészava­ ra mutatható ki (lásd 9-55. ábra), s jellemzi a májkáro­ sodás nélküli konjugált hyperbilirubinaemia, ami nem súlyos, mert a BDG és BMG a vesével is képes ürülni.

A fejezet összeállításában nyújtott segítségéért köszö­ net illeti Dr. Kolev Kraszimirt.

10

A NUKLEOTIDOK ANYAGCSERÉJE

,

MACHOVI CH RAYMUND ÉS T R E T T E R L Á S Z LÓ

10.1

A nukleotidok szerkezete

335

10.2

A mononukleotidok forrásai

10.3

A purinnukleotidok bioszintézise

337 338

10.4

A pirimidinnukleotidok bioszintézise

10.5

A dezoxiribonukleotidok anyagcseréje

345

10.6

Purin- és pirimidinnukleotidok lebontása

10.7

Nukleotidok egymásba történő átalakulásai

10.8

A Bu-vitamin szerepe a metabolizmusban

10.9

A folsav szerepe a nukleotidszintézisben és a DNS-metilálásban

10.10

A nukleotidok szerepe további anyagcsere-folyamatokban és egyéb fontos biomolekulák szintézisében 364

348 353 359 360 364

A nukleotidok széleskörű szerepet játszanak a bio­ lógiai folyamatokban:

10.1

♦ ♦ ♦ ♦ ♦

A nukleotidok heterociklusos bázisból (purin vagy pirimidin), szénhidrátból (ribóz vagy dezoxiribóz) és foszforsavból épülnek fel: a bázis (3-N-glikozidkötéssel kapcsolódik a szénhidrát Cl-atomjához, a foszfát pedig észterkötéssel a szénhidrát C5’-cso­ portjához (10-1. ábra). A bázis-szénhidrát egységet nukleozidnak, míg a nukleozid-foszfát egységet nukleotidnak (NMP) vagy attól függően, hogy hány molekula foszfát épül be, nukleozid-mono-, -di- vagy -trifoszfátnak nevezik. A di- és trifoszfátokban a fosz­ fátok makroerg savanhidridkötéssel kapcsolódnak egymáshoz. A purin- és pirimidinbázisok szerkezetét a 10-2. ábra szemlélteti. A nukleotidokban két planáris gyűrű, a ribofuranóz és a purin vagy pirimidin síkja található, amelyek egymáshoz képest közel vagy távol helyezkedhetnek el. A rotáció az N-glikozidos kötés körül történhet. Ha a purinbázisok N3-atomja

a DNS és az RNS prekurzorai, energiahordozók, makroerg vegyületek (pl. ATP), szabályozó molekulák (pl. cAMP, cGMP, ADP), koenzimkomponensek (pl. NAD, FAD, CoA), származékaik a szénhidrát- és lipidanyagcsere in­ termedierei (pl. UDP-galaktóz, CDP-diglicid).

Szintézisük és lebontásuk sebessége, illetve azok szabályozása nagymértékben eltér a különböző szö­ vetféleségekben. Ez utóbbi orvosi szempontból figye­ lemreméltó: a nukleotidok anyagcseréjébe történő be­ avatkozás terápiás lehetőséget kínál bizonyos betegsé­ gek (pl. rosszindulatú daganatok) kezelésében.

A N U K L EO T ID O K SZERKEZETE

II I .

336

AZ ANYAGCSERE

vagy a pirimidinbázisok C2-atomja (10-1. és 10-2. ábrák) közel kerül a szénhidrátgyűrühöz, ,,syn "-konfor­ mációról beszélünk (a 10-1. ábrán ez a szerkezet látható), ha viszont a glikozidkötés körül 180°-os elfordu­ lás történik, a két planáris sík egy­ mástól távol kerül, „anti”-kon­ ■N-glikozid-kötés formáció jön létre. A nukleotidok ezen „mozgásképessége” jelentősen befolyásolja a polinukleotidok má­ sodlagos szerkezetét. Bázisok és nukleozidok szabad formában kis mennyiségben találha­ adenozin-5'-monofoszfát, AMP, adenilát adenozin (nukleotid) (nukleozid) tók a sejtekben; és főleg a ribo10-1. ábra. Az adenilát szerkezeti elemei nukleotidok, azokon belül is a ribonukleozid-trifoszfátok dominálnak, amelyek mM-os koncentrációban fordulnak elő. A ribonukleotidok koncentrációja általában nagyság­ rendekkel haladja meg a dezoxiribonukleotidokét. Az egyes nukleoti­ > > N N dok, pl. az adeninnukleotidok kon­ I I H H centrációja meglehetősen állandó, habár ezen belül az ATP, ADP és (X; 2,6-dioxopurin) (G; 2-amino-6-oxopurin) AMP aránya változó. A természetben a leggyakrabban NH, előforduló bázisok mellett kisebb H -N- \ IN 3 5 mennyiségben találhatók egyéb pu­ rin- és pirimidinbázisok is. Eddig "NT N' I I közel 40-féle ritka bázist írtak le H H tRNS-ekben (biológiai szerepüket uracil citozin (C; -oxo- -aminopirimidin) (U; 2,4-dioxopirimidin) (T; 2,4-dioxo-5-metil-pirimidin) lásd később). Ritka bázis pl. a 10-2. ábra. Purin- és pirimidinbázisok szerkezete 6-dimetil-adenin, az 5-metil-citozin és az 5-hidroxi-metil-citozin (a purinbázisokban a szubsztitúció több­ nyire az aminocsoportokon történik, míg a pirimidinvázban az 5-ös szén­ O OH atomon). Mind a purin-, mind a pirimidinbázisok szárma­ zékai laktám-laktim tautomer formában fordulhat­ nak elő (10-3. ábra), de fiziológiás körülmények kö­ I H zött általában a laktám forma dominál, amely a timin timin pirimidineknél az N-glikozid kialakulásának előfel­ (laktám) (laktim) 10-3. ábra. A timin tautomér formái tétele.

A

2

4

X

337

10. A N U K L E O T I D O K A N Y A G C S E R É J E

Orvosi szempontból a purinbázisok fontos tulaj­ donsága, hogy „rossz” az oldékonyságuk; ez különö­ sen érvényes a xantinra és a guaninra, illetve szárma­ zékukra, az urátra (húgysav). Az oldékonyságot a pH értéke nagymértékben befolyásolja, például savas pH-tartományban a húgysav és a xantin oldékonysága rendkívül alacsony. Ezen tulajdonság biológiai-orvosi jelentőségére, az ember számára kedvező vagy kedve­ zőtlen hatásaira a purin- és pirimidinnukleotidok le­ bontásáról szóló fejezetrészben még visszatérünk.

10.2

10-1. táblázat. A nukleozidok fontosabb transzporterei Transzporter név

Ekvilibratív nukleozidtranszporterek ENT1

purin- és pirimidinnukleozidok

mindenütt

ENT2

purin- és pirimidinnukleozidok, valamint bázisok

mindenütt, kifejezett a ha­ rántcsíkolt izomban

ENT3

purin- és pirimidin­ nukleozidok, valamint bázisok

intracelluláris membránokban

ENT4

adenozin

mindenütt

A M O N O N U K LEO T ID O K FORRÁSAI

Lokalizáció

Szállított nukleozid

Koncentratív nukleozidtranszporterek

A purin- és pirimidinnukleotidok aminosavakból, Cl-töredékből, szén-dioxidból, ribózból és foszfátból de novo szintetizálódhatnak minden emberi sejtben. Habár az emésztő apparátus bőségesen tartalmaz nukleázokat (ribonukleáz és dezoxi-ribonukleáz), foszfatázokat, nukleozidázokat, amelyek hatékonyan degradálják a táplálék nukleinsavait, ezáltal lehetővé téve azok felszívódását, mégis ez a felszívódás mini­ mális, a táplálék nukleotidjainak kb. 5%-a lép be a vérkeringésbe elsősorban szabad bázisként vagy ki­ sebb részben nukleozidként. A vékonybélben felszí­ vódó nukleozidok a bélhámsejtekben „mentő reakci­ ókkal” nukleotidokká alakulnak, és beépülnek DNSbe vagy RNS-be, vagy a nukleozid-foszforiláz enzi­ mekkel bázisokká alakulnak és lebontásra kerülnek a később ismertetésre kerülő reakciókban. A bélhámsej­ tekben a „ de novo ” nukleotidszintézis lassú, ezért a táplálék nukleozidjainak felhasználása különösen je­ lentős, tekintettel arra, hogy ezek a sejtek a leggyor­ sabban proliferáló sejtek az emberi szervezetben, és emiatt a nukleinsavszintézisük nagy mennyiségű nukleotidot igényel. így a vékonybél villusainak sejt­ jei a táplálékeredetű nukleozidok legjelentősebb fel­ használói. A fennmaradó nukleozidok vagy a belőlük képződő bázisok a bélhámsejtek bazolaterális oldalán helyet foglaló transzporterek útján kerülnek a vérbe, majd a szövetekbe felvételre kerülve a nukleinsavakba is beépülhetnek. Reakcióikat a „mentő utak” írják le (lásd később), de a felvett mennyiség nem elégíti ki a legtöbb eukarióta sejt nukleotidigényét, és a „de

CNT1

pirimidinnukleozidok és vékonybél, máj, agy, vese adenozin

CNT2

purinnukleozidok és uridin

ubikviter

CNT3

purin- és pirimidinnukleozidok

izom és agy kivételével a leg­ több szervben

Az ENT-k (ekvilibratív nukleozidtranszporterek) kétirányban képesek a nuklezidok transzportjára a nukleozid aktuális koncentráció­ gradiensének megfelelően. A koncentratív nukleozidtranszporterek (CNT-k) a Na+-gradiens energiáját használják fel a transzport hajtó­ erejéül

novo’’ szintézisre a legtöbb sejtnek szüksége van. (A nukleotidokban leggazdagabb táplálékok a sör, a belsőségek és a tenger gyümölcsei.) A nukleozidtranszporterek fontos szerepet játsza­ nak a daganatos betegségek és a vírusfertőzések elleni nukleozidanalógok sejteken keresztül történő transz­ portjában; ismeretük segíti ezen anyagok hatásmódjá­ nak és szelektivitásának megértését (10-1. táblázat). Általában azt mondhatjuk, hogy a sejtek nukleozidokat felvevő oldalán koncentratív, azaz Na+-kotranszportot használó transzporterek találhatók, míg a nukleozidok leadására szolgáló felszínen (epitélsejtekben a bazolaterális membrán) az ekvilibratív tí­ pusú transzporterek találhatók. A vékonybélben a nukleozidok felszívódása a béllumenből a vérbe, míg a vesében a nukleozidok visszaszívása a filtrátumból a vérbe az elsőrendű feladat (10-4. ábra).

III.

338

béllumen

bélhámsejt

vér (véna portáé)

vesetubulussejt

filtrátum

Na+ CNT

10.3

AZ A N Y A G CS E R E

Na+K+- ATPáz

10-4. ábra. Nukleozid-transzportfolyamatok a vékonybélben és a ve­ sében. A bélben a nukleinsavak emész­ tése során keletkezett nuklezidok (B-R, bázis-ribóz) a koncentratív nukleozidtranszporterekkel (CNT) jutnak a bél­ hámsejtekbe, majd vagy mentő reak­ ciókkal nukleotidokká alakulnak, vagy lebomlanak (B, bázis), vagy az ekvilibratív nukleozidtranszporterekkel (ÉNT) hagyják el a bazolaterális oldalon a sej­ teket. A purinnukleozidok jelentős ré­ sze húgysavvá (HS) alakul és így kerül a vérkeringésbe a GLUT9-en keresztül. A vesetubulus sejtjeiben a CNT-k szin­ tén az apikális, az ENT-k a bazolaterális oldalon találhatók. A transzportokhoz szükséges Na+-gradienst a Na+K+-ATPáz tartja fenn

A P U R IN N U K LEO T ID O K B IO SZ IN T ÉZ IS E

A purinnukleotidok bioszintézisének jellemzője, hogy a bázisok kialakulása ribózfoszfáthoz kötve tör­ ténik és a dezoxi-ribonukleotid-molekulák a már elké­ szült ribonukleotidokból keletkeznek.

A purinváz kialakulása A purinváz kialakulását szolgáló komponenseket szemlélteti a 10-5. ábra. A bioszintézis kiindulási ve-

10-5. ábra. A purinvázat alkotó atomok eredete. A piros számozás a bioszintetikus lépések időbeli sorrendiségét jelenti. A fekete számozás a purinváz atomjainak konvencionális számo­ zását jelöli. Kékkel a beépülő molekularészt emeltük ki

339

10 . A N U K L E O T I D O K A N Y A G C S E R É J E

IMP AMP GMP

I i

a

a

PRPPamidotranszferáz

y ' Gin

K h2° pPj Glu

10-6. ábra. A foszforibozil-pirofoszfát (PRPP) szerepe a purinnukleotidok szintézisében. Az ábra a PRPP képződését, annak szabá­ lyozását és a PRPP 5-foszforibozil-1-aminná alakulását szemlélteti. A két reakcióban részt vevő enzimek szabályozása sok tekintetben hasonló. A PRPP-glutamin-amido-transzferáz aktív monomer és inaktív dimer formában fordulhat elő. A monomer-dimer állapotot az allosztérikus modifikátorok változtatják. 2,3-BPG, 2,3-biszfoszfoglicerát

gyülete a D-ribóz-5-foszfát (R-P). A ribóz-foszfáton azonban nem kezdődik el a nukleotidszintézis, hanem előbb 5-foszforibozil-l-pirofoszfát (PRPP) képző­ dik, amely makroerg kötéseket tartalmaz (10-6. ábra). Csak ezután történik a purinváz első tagjának szintézi­ se, amikor glutamin jelenlétében 5-foszforibozil-lamin keletkezik. Az utóbbi reakció során konfigurá­ cióváltozás is történik: a PRPP-ben lévő C 1 a-helyzet P-konfigurációjú lesz. A C-N glikozidkötés (3-konfígurációja jellemző a természetben előforduló nukleotidokra. A reakciók energiát és specifikus enzime­ ket igényelnek. Figyelemreméltó, hogy a PRPP és az

5-foszforibozil-1 -amin

5-foszforibozil-1-amin szintézisét katalizáló enzimek, a PRPP-szintetáz (ribóz-foszfát-pirofoszfokináz) és a PRPP-glutamin-amidotranszferáz a nukleotidszin­ tézis közti és végtermékeivel, az IMP-vel, az AMP-vel és a GMP-vel gátolhatok negatív feedback szabályo­ zást eredményezve. Meg kell azonban jegyezni, hogy a PRPP-szintetáz nem a purinnukleotid-szintézis elkötelező lépése, mivel a PRPP más folyamatokban is felhasználódik (10-2. táblázat). A PRPP-szintetáz enzimen a 2,3-biszfoszfoglicerát (2,3-BPG) gátolja a ribóz-5-foszfát, az ADP pedig az ATP kötődését. A PRPP szintéziséhez szükséges ribóz-5-foszfát a

10-2. táblázat. A foszforibozil-pirofoszfát (PRPP) felhasználása az intermedier anyagcsere reakcióútjaiban Kémiai reakció

Reakcióút neve Apurinnukleotidok„c/e novo" szintézise

PRPP + glutamin -» 5-foszforibozil-1-amin + glutamát + PPj

Apurinbázisok „mentő" reakciói

PRPP + hipoxantin (guanin) -> IMP (GMP) + PPj PRPP + adenin -> AMP + PPj

Apirimidinnukleotidok „de novo" szintézise

PRPP + orotsav -> OMP + PPj

Apirimidinbázisok „mentő" reakciói

PRPP + uracil -> UMP + PPj

NAD-szintézis

PRPP + nikotinsav —» nikotinsav-mononukleotid + PPj PRPP + nikotinamid nikotinamid-mononukleotid + PPj

I II.

340

NH* Gly

NH.

ATP

I

ADP + P.

CH_

N10 -formilTHF

THF

C —H

I

o=c

R —P 5-foszforibozilglicinamidszintetáz

foszforibozilamin

AZ AN YA GCSERE

O formiltranszferáz

N -H 1

O

N—H

I

R -P

R -P

foszforibozilglicinamid

foszforibozllformilglicinamid Gin

//■ ATP foszforibozil-formilglicinamidin-szintetáz

\^^ A A D P ++ IP;

Glu H

C

II

HCO,

o —c

c-

h 2c

H—C '

c —H C.

I

ATP

ADP + P:

^

/

■N

I

P

r

c

—h

C — H ^— aminoimidazolkarboxiláz

foszforibozilaminoimidazol-karboxilát

/ H0N

c.

N

/

1

aminoimidazolszintetáz

■N — H

I

R —P

R -P

foszforibozilaminoimidazol

foszforibozilformilglicinamidin

Asp ATP

szukcinokarboxiamid-szintetáz

ADP + P,

o II

COO' C — NT i

II

CH0 H

C

1

fumarét

„ N

1

2

COO-

nh 2

c— / " N 1

- Z

/ C■ —

N

H2hT

II

c.

adeniloszukcinát-liáz (adeniloszukcináz)

' N

/

C -H

I

R —P

R —P

foszforibozil-aminoimidazolszukcinokarboxamid

foszforibozil-aminoimidazolkarboxamid (AICAR) N10 -formil-THF forrni Itranszferáz

s . O

O

II

•c ^

H —N

I H -C ^

■C'

II

_N

-C s

O II H—C«

C—H

/

,C .

N'

THF

'N R —P

inozinát (IMP)

IMP-ciklohidroláz (IMP-szintáz)

.N C—H

/

■N

I

R —P foszforibozil-formamidoimidazol-karboxamid

10-7. ábra. Az IMP szintézise. Az ábra a purinnukleotid-szintézis elkötelező lépését (5-foszforibozil-l-amin keletkezése) követően mutatja be az IMP szintézisét

341

10. A N U K L E O T I D O K A N Y A G C S E R É I É

pentóz-foszfát-ciklusból származik. (Ennek jelentősé­ gevan bizonyos köszvénytípusok kialakulásában.) Az IMP-szintézis elkötelező lépése a PRPP-glutaminamido-transzferáz. A purinváz bioszintézisének következő lépései so­ rán (10-7. ábra) a foszforibozil-amin ATP felhaszná­ lásával a glicin karboxilcsoportjával reagál, majd Nl0-formil-tetrahidrofolátból (N10-formil-THF) formilcsoport-átvitel történik a glicinamid-ribonukleotid szabad aminocsoportjára. A formil-glicinamid egy újabb glutaminnal reagál, amelynek aminocsoportja a purinváz következő nitrogénjét (N3) szolgáltatja, majd kialakul az imidazolgyűrü. Mind a glutaminnal történő reakció, mind a gyűrüzáródás ATP-t igényel. A továbbiakban CC^-fixálás történik (mely itt ki­ vételesen sem biotint, sem ATP-t nem igényel), majd egy aszpartát szolgáltatja a purinváz N 1-atomját (ATP használódik fel), végezetül egy újabb N 10-formil-THF által nyújtott Cl-töredék teszi lehetővé az inozinsav (IMP) képződését (10-7. ábra). Az IMP szintézise energiaigényes, a reakciókhoz 4 ATP, illetve a PRPP szintéziséhez még további 2 ATP szükséges. A prokariótákban minden egyes reakciót külön enzim katalizál, míg eukariótákban az evolúció során génfúzióval három multifunkcionális enzimrendszer jött létre, melyek sokkal hatékonyabbak, pontosabban és gazdaságosabban szabályozzák a szükséges intermedierek mennyiségét.

Klinikai vonatkozások Orvosi szempontból figyelemreméltó, hogy a Cl-töre­ déket szállító THF a purin- és pirimidinbázisok szinté­ zisében „elkötelezett” molekula; képződésének vagy a különböző redukáltsági fokú Cl-töredékek egymásba történő átalakulásának gátlásával a nukleotidok de novo szintézise is gátlódik. Gátlás történhet patológiás körülmények között, illetve orvosi beavatkozás során (lásd később). Fontos tudni, hogy a purinnukleotidok szintézisének egyik intermediere, az AICAR (foszforibozil-aminoimidazol-karboxamid, másik nevén az 5-amino-imida-

zol-4-karboxamid-ribonukleotid) AMP analógjaként az AMP-kináz (AMPK) aktiválója, fokozza a teljesít­ ményt, és aktivál egyéb AMP-vel aktiválható enzime­ ket, mint pl. a glikogén-foszforilázt és a foszfofruktokinázt is, továbbá gátolja az adenozinfelvételt az extracelluláris térből. Az AMPK metabolizmust reguláié szerepéről a 20. fejezetben részletesen szó­ lunk. Az AICAR-t „exercise mimetikumként” is isme­ rik és szerepel a WADA (World Anti-Doping Agency) dopping listáján.

Az AMP és a GMP szintézise Az ATP és a GTP adenilát (AMP), illetve a guanilát (GMP) intermediereken keresztül IMP-bői szintetizálódik. Az IMP-bői adenilát vagy guanilát ke­ letkezhet egy aminocsoport bevitelével. Az egyik irányban a reakció aszpartátot és GTP-t igényel; az adeniloszukcinát-szintetáz enzim az inozinát-6-karbonil oxigénatomját az aszpartát aminocsoportjára cseréli ki, majd az adeniloszukcinát-liáz fumarátot hasít le az adeniloszukcinátból, adenilátot eredmé­ nyezve (10-8. ábra). Az adeniloszukcinát-szintetáz ál­ tal katalizált reakció analóg az omitinciklusban az argininoszukcinát-szintetáz által katalizált reakcióval. A másik irányban (GMP-szintézis) aminocsoportdonor a glutamin, és a reakciót egy oxidációs lépés előzi meg. Az oxidációs lépés során az inozinsavból xantilsav (XMP) keletkezik (az inozinsavban lévő 6-hidroxipurint hipoxantinnak, míg a xantilsavban ta­ lálható 2,6-dihidroxipurint xantinnak nevezik). A GMP-szintézis reakcióit az IMP-dehidrogenáz és a GMP-szintetáz katalizálják (10-8. ábra). A purinnukleotid-bioszintézis ezen szakaszában is található feedback szabályozás, nevezetesen az AMP az ade­ niloszukcinát-szintetáz aktivitását, a GMP az IMPdehidrogenáz aktivitását gátolja. Összességében elmondhatjuk, hogy a purinváz ki­ lenc atomjából (négy nitrogén és öt szén) nyolc aminosavakból származik, mivel a két Cl-töredéket adó N 10-formil-THF létrehozásában is zömmel aminosavak, mint szerin, glicin, triptofán és hisztidin vesznek részt.

I I I.

342

AZANYAGCSERE

Asp

adeniloszukcinátszintetáz

AMP

I

N -H

XMP (xantilát, xantozin-monofoszfát)

adeniloszukcinát

N

adeniloszukcinát-liáz (adenil-szukcinát-liáz)

ATP

f GMP-szintetáz AMP + PP, A

f A

V

Glu

O N

>

>

N

I

I

R—P

R—P

AMP (adenilát, adenozin-monofoszfát)

(guanilát, guanozin-monofoszfát)

10-8. ábra. Az IMP átalakulása adeniláttá és guaniláttá

Az adenilátból és guanilátból ezután ATP és nukleozid-monofoszfát-kináz, illetve difoszfát-kináz enzimek katalízi­ sével nukleozid-trifoszfátok képződhet­ nek (10-9. ábra).

nukleozidmonofoszfát-kináz GMP

nukleoziddifoszfát-kináz

> ATP

ADP

1 GDP

> L2Z

n ATP

ADP

10-9. ábra. Purinnukleozid-di- és trifoszfátok képződése

A purinnukleotidok bioszintézisének szabályozása Minthogy a purinnukleotidok de novo szintézise energiaigényes folyamat, érthető, hogy ha elegendő mennyiségű végtermék áll a sejtek rendelkezésére, to­ vábbi szintézisük felesleges. A szabályozásra többféle lehetőség is van. Az egyik a PRPP-szintetáz és a PRPP-amidotranszferáz feedback gátlása IMP és AMP, illetve GMP jelenlétében. Mint korábban emlí­

tettük, a két enzim közül a purinnukleotid-szintézis irányába elkötelezett lépés a PRPP-amidotranszferázé. Az amidotranszferáz inaktív dimer és aktív monomer lehet. IMP és az összes „A”, illetve „G” nukleotid a dimer felé tolja az egyensúlyt, tehát gátol, míg a PRPP az enzimet a monomer állapot valószínű­ ségét növelve aktiválja (10-10. ábra). A másik szabályozási út az IMP-ből történő AMP-, illetve GMP-szintézis kontrollja; a GMP az IMP-

10. A N U K L E O T I D O K A N Y A G C S E R É J E

dehidrogenázt, míg az AMP az adeniloszukcinátszintetázt kompetitíven gátolja. Ezeket a negatív visszacsatolási szabályozási módokat kiegészíti az, hogy az IMP-ből történő AMP-szintézis GTP-t, a GMP- szintézis pedig ATP-t igényel. Ez kereszt regu­ lációt eredményez, és hozzájárul a két nukleotidkoncentráció egymáshoz viszonyított egyensúlyának fenntartásához. A különböző szabályozási lehetősége­ ket foglaljuk össze a 10-10. ábrán.

343

A purinnukleotidok „mentő" reakciói

A „mentő” (ún. salvage) mechanizmusok is fontos szerepet játszanak a purinnukleotidok anyagcseréjé­ ben. A purinbázisok és nukleozidok közvetlenül átala­ kulhatnak mononukleotidokká, és így a nukleinsavak degradációja során keletkező purinbázisok újra felhasználásra kerülhetnek. A mentő utakat nagymérték­ ben a polimorfonukleáris sejtek, az immunrendszer és az agy használja fel. A purinbázisok származhatnak még a táplálékból, illet­ f ribóz-P ve az adenin az S-adenozil-metioninból is (lásd a 9. fejezetben). A mentő utak egyik típusa, amikor egy szabad purinbázis PRPP-tal reagál és mononukleotid keletkezik; a reakci­ óhoz az energiát a PRPP pirofoszfát hidrolízise szolgáltatja. A reakciókat az adenin-foszforibozil-transzferáz (APRT) és a hipoxantin-guaninfoszforibozil-transzferáz (HGPRT) katalizálják, aminek eredményeként AMP és GMP, illetve IMP keletkezik (10-11. ábra). A mentő utak sebességét a PRPP mennyisége, illetve a fent em­ lített foszforibozil-transzferáz enzimek aktivitása határozza meg. A PRPP mennyiségét viszont az határozza meg, hogy mennyi az elérhető ribóz-5foszfát és milyen a PRPP-szintetáz ak­ tivitása, illetve a PRPP-t milyen mér­ tékben fogyasztja a „ de novo ” szinteti­ kus út. A mentő út további szabályozá­ sát jelenti, hogy az IMP és a GMP, il­ letve az AMP gátolják saját keletkezé­ süket katalizáló foszforibozil-transzferázokat (10-11. ábra). Ezen mentő utakkal kapcsolatban érdemes hangsú­ lyozni, hogy működésűk hatékonyan gátolja a de novo nukleotidszintézist, részben elhasználván a PRPP-t, rész­ ben azért, mert a termékek, az AMP és 10-10. ábra. Purinnukleotidok szintézisének szabályozása. A szabályozó hatásokat piros vonalak jelölik. A visszacsatolásos gátlásokat (-) az aktiválásokat a GMP gátolják az IMP szintézisét (+) szimbólumok jelzik. Az IMP-ből kiinduló ATP- és GTP-szintézisben a megfelelő (10-10. ábra). így tehát a nukleotidok nukleozid-trifoszfátok kölcsönösen részt vesznek a másik nukleotid szintézisé­ nek energiaigényes lépésében (szaggatott vonalak) de novo szintézise és a bázismentő út

I I I . AZANYAGCSERE

344

10-11. ábra. Purinbázisok újrahasznosítása. „Mentő reakciók" foszforibozil-transzferázokkal és szabályozásuk. PRPP, 5-foszforibozil-1pirofoszfát; H(G)PRT, hipoxantin(guanin)-foszforibozil-transzferáz; APRT, adenin-foszforibozil-transzferáz; AS, adeniloszukcinát; ÁSS, adeniloszukcinátszintetáz; IMPD, IMP-dehidrogenáz; APRT, adeninfoszforibozil-transzferáz; HX, hipoxantin. A piros vo­ nalak a visszacsatolásos gátlásokat jelzik

(h g p r t

['h g p r t

PP;

PRPP guanin

összehangolt működése nagy jelentőséggel bír. Ennek orvosi vonatkozásaira alább térünk ki. A mentő út másik típusa, amikor nem a szabad bá­ zis, hanem a purin-ribonukleozid (adenozin és guanozin) ATP-vel foszforilálódik és AMP, illetve GMP keletkezik. A reakciókat kinázok (pl. adenozin-kináz) katalizálják, amelyek nem specifikusak a ribo- vagy dezoxiribonukleozidokra. Mennyiségi szempontból a ribo- és a dezoxiribonukleozidok direkt foszforilációja nem látszik olyan fontosnak, mint a foszforibozilációs út. Az emlőssejtek egy része (pl. agy, eritrociták, polimorfonukleáris sejtek, illetve általában a magasan differenciálódott sejtek) nem tudnak purinnukleotidot de novo szintetizálni, és szükségletüket exogén purinnukleozidok felvételével fedezik. Mint­ hogy a sejtek foszforilált nukleozidokat (nukleotidokat) általában nem tudnak a környezetükből felvenni, - csak purinbázisokat vagy nukleozidokat a nukleotidszintetizáló kapacitás nélküli sejtek nukleotiddal történő ellátásában a két mentő út lényeges szerepet játszik. Emberben a máj a purinnukleozidok fő forrá­ sa.

Klinikai vonatkozások A foszforibozil-pirofoszfát-szintetáz (PRPPS) azok közé az enzimek közé tartozik, melyeknek mind a túl­ működése, mind a csökkent működése klinikailag re­ leváns eltéréseket okoz. A PRPPS 1 génben történő aktiváló mutáció eredményeképpen a purinszintézis

megnő, hyperurikaemia, hypotonia, járászavar, ideg­ rendszer-fejlődési rendellenességek és halláskároso­ dás következik be. A betegség molekuláris alapja az enzimen található allosztérikus kötőhely feedback in­ hibitorokkal szembeni érzékenységének elvesztése vagy a normál kinetikai paraméterekkel bíró enzim fo­ kozott expressziója. A PRPPS csökkent működése a de novo purinnukleotid-szintézis elégtelenségével jár, ami súlyos kórképeket okoz; az állapot purinpótlással, leginkább S-adenozil-metionin adásával kezelhető. A PRPP-glutamin-amidotranszferáz allosztérikus gátlásának hiánya. Ha a purinnukleotidok szintje emelkedik, az normál körülmények között gátolja a PRPP-szintetáz és a PRPP-amidotranszferáz aktivitá­ sát (10-10. ábra)\ az enzimek bizonyos defektusa ese­ tén (az allosztérikus alegység károsodása) azonban ez nem következik be, a magas nukleotidszintet követő fokozott purinlebontás (urátképződés) mellé intenzív purinnukleotid-szintézis társul. A PRPP-amidotranszferáz aktivitásának befolyásolá­ sa daganatos betegségekben jelentőséggel bír. Az intracelluláris glutaminkoncentráció normál körülmé­ nyek között relatíve stabil, így a fiziológiás glutaminkoncentráció-ingadozások nem befolyásolják jelentő­ sen az enzimaktivitást. A daganatos betegségekben kezelésre használt glutaminázaktivitással is bíró aszparagináz enzim azonban hatékonyan csökkenti a glutamin szintjét, így a PRPP-amidotranszferáz szubsztrátellátottságának csökkentése révén hozzájá­ rulhat a purinnukleotid-szint és közvetve a DNS/RNSszintézis sebességének csökkentéséhez.

345

10. A N U K L E O T I D O K A N Y A G C S E R É J E

A purinnukleotid „mentő út” károsodása, a hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz X kromo­ szómához kötött defektusa esetében a „felesleges” bá­ zisok nem kerülnek újra felhasználásra, és a nukleotidok lebomlanak fokozott urátképződést eredmé­ nyezve. Az enzim teljes hiánya esetén (LeschNyhan-szindróma) a fenti tünetek mellé bizarr pszi­ chés magatartási formák társulnak (agresszivitás, gör­ csök, öncsonkítás, illetve mentális visszamaradott­ ság). A xantin-oxidáz gátlása a hyperurikaemiával egyértelműen összefüggő tüneteket megoldja, de nem befolyásolja a viselkedésbeli és neurológiai rendelle­ nességeket.

10.4

A Pl R I M I D I N N U K L E O T I D O K B IO SZ IN T ÉZ IS E

kz UMP kialakulása A pirimidinváz atomjai karbamil-foszfátból és aszpartátból származnak (10-12. ábra). Bár látszatra a pirimidingyürü szintézise egyszerűbb, mint a puriné, a valóságban mégis nagyon sok a kettő között a hasonóság, mert a karbamil-foszfát szintéziséhez CO2, glutamin és ATP, míg a timidin kialakulásához tetrahidrofolát is szükséges. így a pirimidin- és a purinbázisok bioszintézisében a purin bioszintéziséhez

szükséges Gly-t leszámítva az elemek közösek. Az en­ zimek specificitásán kívül a legszembetűnőbb eltérés az, hogy a pirimidinnukleotidokban az N-glikozidos kötés (ugyancsak PRPP közvetítésével) a szintézis ké­ sőbbi fázisában alakul ki, mint a purinnukleotidokban, és míg a purinnukleotid-szintézis kizárólag a citoszolban történik, a pirimidinnukleotid-szintézis részben mitokondriális. A bioszintézis során először karbamil-foszfát ke­ letkezik HCO3 -ból és glutaminból. A reakcióhoz két ATP-re és karbamil-foszfát-szintetáz-II-re van szükség (10-13. ábra). A szintézis a citoszolban ját­ szódik le. (Az omitinciklushoz szükséges karba­ mil-foszfát a mitokondriumban szintetizálódik, és nem Gin, hanem NH4 szolgáltatja az aminocsoportot; 9-29. ábra.) A citoszolban a karbamil-foszfát-szintetáz-II allosztérikus regulátora az UTP és CTP, ame­ lyek gátolják aktivitását, illetve a PRPP és az ATP, amely stimulálja. A pirimidinbázis szintézisének következő lépése a karbamil-foszfát és az aszpartát kondenzációja, majd a gyűrű záródása vízvesztés közben. A keletkezett dihidroorotsav ezután oxidálódik és orotsav keletke­ zik. A reakció oxidált NAD-ot és dihidroorotátdehidrogenázt igényel (10-14. ábra). Az első három lépést prokariótákban három különböző enzim katali­ zálja; a már említett karbamil-foszfát-szintetáz, az aszpartát-transzkarbamiláz és a dihidroorotáz. Emlő­ sökben a három enzim, hasonlóan a purinszintézisben részt vevő enzimkomplexekhez, multifunkcionális egységet képez: a három enzim egyetlen polipeptid-

HOOC, CH,

I

CH

NH, 1

O' I CT— P —O— C —NHII I o o ra 12

O PO karbamil-foszfát

C;

4 feli 5m

karbamil-foszfát

T N - 'V

pirimidinváz

10-12. ábra. A pirimidinvázat alkotó atomok eredete. Apirimidingyürü atomjai karbamil-foszfátból (narancs) és | aszpartátból (zöld) származnak. A karbamil-foszfátból a gyűrűbe beépülő N forrása a glutamin savamidcsoportja, aC-atom a bikarbonátból származik

10-13. ábra. A citoszolikus karbamil-foszfát-szintáz-ll által katalizált reakció és szabályozása. A piros nyilak (-) jellel a gátló, a zöld nyíl (+) jellel az aktiváló hatást jelzi

II I .

346

AZ A N Y A G C S E R E

0

karbamilfoszfát

11 0

— H—

S CH,

1

1

1 1

aszpartáttranszkarbamiláz

^CH, -O

NH9 1 z 1 C \

Asp ■

dihidroorotáz

# CS H— C—cooO N

1

H

H

karbamil-aszpartát

dihidroorotát NAD+

dihidroorotátdehidrogenáz (mitokondrium)

S., y

^ NADH+H+

o H—NX

^ C —H C —COO-

//

N I H

orotát PRPP orotát-foszforiboziltranszferáz

PP; y

O I

HC03-

,C . H— N'

O I

,C S H—N'

’ C -H

C —H

II

II

* O'

C —H

orotidilátdekarboxiláz

'N

C —COON

I

R —H

R —H

orotidilát, OMP (orotidin-5'-monofoszfát)

UMP (uridilát, uridin-5'-monofoszfát)

10-14. ábra. Az UMP szintézise. A komplexekben működő enzimeket (CAD, UMPS) külön jelezzük

láncon helyezkedik el (240 kDa), és CAD néven is­ mert az irodalomban. A dihidroorotát-dehidrogenáz a mitokondriumok belső membránjának külső felszínén helyezkedik el. A légzési lánchoz történő kapcsolódás miatt (az ubikinonnak ad át elektronokat) abszolút oxigénfüggő, azaz anoxiában a de novo pirimidinszintézis leáll. nukleoziddifoszfát-kináz

f UMP-kináz [ UMP

' UTP ATP

ADP

T ' PP:

('specifikus UTPáz

ATP

ADP

A pirimidinnukleotidok bioszintézise a citoszolban folytatódik, s megtörténik a ribóz-foszfát kapcsolódá­ sa; a donor ismételten a PRPP (10-14. ábra). AzN-glikozidos kötés kialakulását az orotát-foszforiboziltranszferáz katalizálja. Az ezt követő dekarboxilálás révén UMP keletkezik. A két utóbbi enzim bifunkcionális enzimkomplexet (UMPS, UMP-szintáz) képez. 10-15. ábra. Pirimidinnukleozid-di- és trifoszfátok képződése. A nukleozid-monofoszfátokat monofoszfátkinázok, a difoszfátokat difoszfát-kinázok foszforilálják

10. A N U K L E O T I D O K A N Y A G C S E R É I É

347

(ATP + HCO3 - + Gin

Klinikai v o n a tk o z á so k Az UMP-szintézis utolsó két lépését katalizáló bifunkcionális enzimkomp­ lex bármely tagjának defektusa a ritka, ö r ö k lő d ő o r o t s a v u r i a nevű betegség­ hez vezet, amelyet növekedési vissza­ maradottság, súlyos anaemia, és a vize­ letben nagy mennyiségű orotsav kivá­ lasztása jellemzi. A pirimidinmetabolizmus megértése a betegség ered­ ményes kezelését tette lehetővé. A nö­ vekedési visszamaradottság és anaemia a sejtosztódáshoz szükséges pirimidinnukleotid-készlet csökkenésének kö­ vetkezménye. A betegeket uridinnal kezelve nemcsak az anaemia rendezhe­ tő, de a vizelettel ürülő orotsav is csök­ ken. A sejtekbe felvett uridint az uridin-kináz UMP-vé alakítja, majd az UMP két lépésben UTP-vé alakul (10-15. ábra), és mivel a citidinnukleotidok is az UTP-ből alakulnak ki (lásd alább), az uridinpótlás helyreállít­ ja a teljes pirimidinnukleotid-készletet. Az UTP gátolja a karbamil-foszfátszintetáz-II-t, így az orotsavhoz vezető szintetikus út - mely a betegségben fo­ kozott - a normálisra csökken.

D 0= C

6c — H

1

I R—PPP UTP

karbamil-foszfátszintetáz II

fkarbamil-foszfát

3

(uridin-trifoszfát)

v PRPP

A,

ATP A U

V

Gin

fcTP-szintetáz

-»f0MP|

'-----------ADP + P;

Glu OMPdekarboxiláz

v NH, I

a

UMP í

'C —H

1

C -H 1N

f UDP|

''

I R—PPP CTP

1 f UTP

__X

t ( CTP

)3

(citidin-trifoszfát)

10-17. ábra. A tidok

„ de

pirimidinnukleo-

novo"

szintézisének

A karbamil-foszfátszintetáz-ll aktivitását serkenti az ATP és PRPP (5-foszforibozil-1-pirofoszfát), gátolja az UTP és CTP. Az OMP (orotidin-monofoszfát) kialakulását az UMP, az UTP-t a CTP gátolja szabályozása.

10-16. ábra. A CTP keletkezé­

Az ábra a CTP-szintetáz reak­ ciót mutatja, valamint keretben a CTP, mint termék gátló hatását il­ lusztrálja se.

Acitidinnukleotidok szintézise A bioszintézis során képződött UMP tovább foszforilálódhat (10-15. ábra). Az UDP, a dUDP és dTTP kiindulási vegyülete. Az UTP, azon kívül, hogy anukleinsavszintézis egyik komponense, a CTP szin­ tézisét is szolgálja (10-16. ábra). Az UTP-ből Gin és ATP jelenlétében CTP keletkezhet. A reakciót a CTP-szintetáz katalizálja, s a reakciómechanizmus hasonló a purinbázisok szintézisénél leírtakhoz. Az -NH2-csoport a glutamin savamid részéből szárma­ zik. A reakciósebesség az UTP-szubsztrát koncentrá­

ciójának emelésével szigmoid kinetikát mutat, míg a termék, a CTP gátolja a reakciót (10-16. ábra, kerete­ zett rész). Az enzimaktivitás ily módon történő szabá­ lyozása a megfelelő CTP/UTP arány fenntartását szol­ gálja.

A pirimidinnukleotid-szintézis szabályozása A pirimidinnukleotidok szintézisének legfőbb feedback szabályozói emlőssejtekben a PRPP, amely

348

I I I . AZANYAGCSERE

stimulálja, illetve az UTP, amely gátolja a karbamilfoszfát-szintetáz-II aktivitását (10-13., 10-16. ábra). Továbbá az UMP gátolja az orotidilát-dekarboxiláz (OMP—>UMP) aktivitását (10-16. ábra). Az UTP —> CTP átalakulás szabályozását a 10-17. ábra mutatja.

10.5

A D EZ O X IR IB O N U K LEO T ID O K A N YA G CSERÉJE

A dezoxiribonukleotidok képződése

A dezoxiribonukleotidok (dNTP) koncentrációja nyugvó sejtekben több mint egy nagyságrenddel ala­ A pirimidinnukleotidok mentő reakciói csonyabb, mint a ribonukleotidoké. A sejtciklus S-fázisában és intenzív DNS-hibajavítás közben azonban Az uridin- és citidinnukleotidok egyik „mentő út­ ez a koncentráció sokszorosára nő. A dezoxiribonuk­ ját” az uridin-citidin-kinázok alkotják. A reakciók leotidok kialakulásáért a ribonukleotid-reduktázeredményeként a nukleozidokból nukleozid-monokomplex a felelős, amely csak olyan sejtekben aktív, foszfátok képződnek (10-18. ábra). Az uridin-kináz amelyek sejtosztódás irányába elkötelezettek. A reak­ által katalizált reakciót lehet kihasználni a korábban ció lényege, hogy a ribóz 2 ’-szénatomján lévő leírt öröklődő orotsavuria kezelésében. A másik hidroxilcsoport redukálódik és az oxigénből víz kelet­ „mentő út” hasonlít a purinbázisoknál leírtakhoz kezik (10-19. ábra). A reakciót katalizáló enzimrend­ (10-11. ábra), amikor is a pirimidinbázis PRPP-vel re­ szer azonban több komponensből épül fel. A riboagál, pl. uracil + PRPP —>UMP + PPj. nukleotid-reduktáz SH-tartalmú fehérje, amely a tioEz a „mentő út” citozint nem képes használni. redoxin vagy glutaredoxin nevű kis molekulatömegü fehérje kofaktorral működik. Az enzim működése köz­ f uridin-kináz (citidin- kináz ben az SH-csoportok oxidálódnak (±3— ^ >Íümp] É 3 — > CMP (S-S). A kofaktor visszaredukálását a ATP ADP ATP ADP glutation-reduktáz, vagy a tioredoxin-reduktáz katalizálja, amelyek 10-18. ábra. Az uridin- és citidinnukleozidok „mentő útja". R, ribóz

[

CT

Cr

10-19. ábra. A ribonukleotid-reduktáz. A reakció, melyet a ribonukleotid-reduktáz katalizál, egy nukleozid-difoszfát redukciója, melynek eredményeképpen dezoxiribonukleozid-difoszfát keletkezik. Az enzim dimer szerkezetű. A kisebb alegység teszi lehetővé a ribózról az oxigén eltávolítását, a nagyobb alegység tartalmazza az SH-csoportokat, melyek oxidálásuk so­ rán a hidrogént szolgáltatják, továbbá felelős a szubsztrát megkötéséért, a specificitásért, az aktivitás mér­ tékéért. A különböző nukleotidok allosztérikusan sza­ bályozzák saját szintézisüket. A működés közben oxidá­ lódott SH-csoportokat a tioredoxin redukálja vissza, mely tioredoxin-reduktázzal és NADPH-val kapcsolt re­ akció

10. A N U K L E O T I D O K A N Y A G C S E R É J E

NADPH-t használnak hidrogéndonorként. Végered­ ményben a dezoxinukleotidok szintézise úgy írható le, hogy a ribóz hidroxilcsoportja redukálódik, és a reak­ cióhoz szükséges hidrogént a NADPH szolgáltatja. Az enzimrendszer, amely ezt a reakciót katalizálja, az összes nukleotidot szubsztrátnak tekinti, de csak ak­ kor, ha azok nukleozid-difoszfát formájában vannak

349

jelen. A ribonukleotid-reduktáz aktivitása komplikált módon szabályozódik; a különböző nukleozid-trifoszfátok koncentrációjuktól függően pozitív és negatív effektorként hatnak (10-20. ábra). A dATP felszapo­ rodása minden ribonukleotid redukcióját gátolja. A ribonukleotid-reduktáz kétféle alegységből álló tetramer enzim, melyben a nagyobbik (RÍ) alegység­ hez kötődnek a szabályozó molekulák. Az R2 kis al­ egységnek újabban egy p53R2-nek nevezett homológ­ ját fedezték fel, amely fontos szerepet játszik a DNSkárosodás korrekciójában, és a mitokondriális DNS replikációjában, így a dezoxinukleotid-szintézis és a sejtciklus összekapcsolásában. A ribonukleotid-reduktáz gátlószerei hatékony DNS-szintézis-gátlók, így effektív citosztatikumok.

A dezoxi-timidilát (dTMP) és a timidin-trifoszfát (dTTP) szintézise

10-20. ábra. A ribonukleotid-reduktáz szabályozása. Az en­ zim R2 -alegysége a tirozil hidroxilcsoporton keresztül szabad­ gyök típusú reakcióban vesz részt, amihez oxigénhez kötött vas kofaktorra van szükség. Az enzim aktív centruma a két alegység (Rí és R2) határán alakul ki úgy, hogy a katalízisben az R1alegység két SH-csoportja is részt vesz. Az Rl-alegység egyben felelős az enzimaktivitás szabályozásáért is. Az elsődleges szabá­ lyozó helyhez kötődő ATP fokozza, míg a dezoxi-ATP gátolja az enzimaktivitást. A másodlagos szabályozó helyen az ATP, dATP, dGTP, dTTP pozitív allosztérikus hatásokon keresztül befolyásol­ ják a szubsztrátok képződésének arányát

A DNS-szintézishez szükséges timidin-trifoszfát több úton is keletkezhet. Az egyik út a dUMP metilálása, amely a dTMP keletkezését eredményezi. A metilcsoportot N5,Nin-metilén-THF szolgáltatja, és a reakciót a t i m i d i l á t - s z i n t á z enzim katalizálja. A re­ akció szorosan kapcsolódik a folát oxido-redukciós ciklusával, mert a tetrahidrofolát hidrogéndonorként is szerepel. A tetrahidrofolát nemcsak a C 1-töredéket, hanem a transzfer reakció során a metilén —> metil re­ dukcióhoz szükséges hidrogént is szolgáltatja; így az N5,N10-metilén-THF-ból dihidro folát keletkezik. A dihidrofolát tetrahidrofoláttá redukálását a NADPH-függő dihidrofolát-reduktáz katalizálja, míg a metiléncsoport főleg szerinből származik (10-21. ábra; lásd 9-33. ábrát is). A dTMP-t a nukleozid-monofoszfát- és nukleozid-difoszfát-kináz foszforilálja és alakítja ki a DNS-szintézishez szüksé­ ges dTTP-t. A dUMP azonban két úton is keletkezhet. Az egyik út a dUDP átalakulása dUMP-vé, a másik, nagyobb je­ lentőségű út a dCDP —» dCMP —>dUMP reakciósoro­ zat. A dCMP —>dUMP átalakulást a dCMP-dezamináz katalizálja, mely kettős szabályozás alatt áll, a dCTP fokozza és a dTTP gátolja (10-22. ábra), így a dTTP képződését a szükséglethez igazítja.

350

H—N'

//

III.

O II ,c . H -N '

' C —CH, C —H

N

N

I

I

P —dR

P -d R

dUMP

dTMP

AZ AN YAG CS ER E

10-21. ábra. A dezoxi-timidilát (dTMP) szintézise. A metiltranszferhez az N5,*N'°-metilén-tetrahidrofolsav (N5 ,N10-metilén-THF) a köz­ vetlen metildonor. A reakció ered­ ményeképpen a dTMP mellett dihidrofolsav (DHF) képződik. Az újabb N5,N10-metilén-THF kialakulá­ sához a DHF NADPH + H+-nal redu­ kálódik THF-fé, majd a Ser->Gly át­ alakulással képződik újra az N5,N10metilén-THF

[ NDPK (ADP

-> ( dADP

- Ű dATP

GDP

dGDP

-»(ádGTP

dCDP

-> dCTP

fCDP| ■

timidilátszintáz

NDPK dTMP

dTDP


dezoxiribóz átalakulás nukleozid-difoszfát szinten törté­ nik, majd ezek, a nukleozid-difoszfát-kináz (NDPK) segítségével foszforilálódnak trifoszfátokká. Az UDP is dUDP-vé alakul, de a timidilát-szintáznak dUMP a szubsztrátja, így a dUMP alakul át dTMP-vé. Ugyancsak dTMP képződik a dezoxi-timidinből (dT) a timidin-kináz révén. Innen a dTMP-t ugyanúgy kinázok foszforilálják dTTP-vé, mint a többi nukleotidot

K lin ika i v o n a tk o zá so k A dTMP és dTTP szintézise több okból is fontos az or­ vos számára. Egyrészt a timidilát-szintáz enzim (dUMP —» dTMP) gátlása, másrészt a dihidrofoláttetrahidrofolát ciklus gátlása is csökkentheti a DNSszintézishez szükséges dTTP-szintet, amely sejtosztó­ dás irányába elkötelezett sejtek (pl. rosszindulatú da­ ganat sejtek, de a vérképző rendszer sejtjei is) proliferációjának gátlására felhasználható. Az első típusú gátlás mechanizmusát az 5-fluorouracil szemlélteti. Emberi szervezetbejuttatása után a sejtekbe kerülve a pirimidinnukleozidok foszforilációját katalizáló kinázokkal - ATP felhasználásával - a fluor-uridin-szár-

mazék is foszforilálódik, és a keletkezett F-dUMP-t a timidilát-szintáz szubsztrátjának tekinti (10-23. ábra). A szubsztrát-enzim komplex kialakulása után azon­ ban az enzim nem tudja elereszteni „hamis” szubsztrátját, azzal kovalens komplexet képez, és elveszti katalitikus funkcióját („szuicid enzim”). Az 5-fluo­ rouracil, azon kívül, hogy a timidilát-szintáz inhibito­ ra, beépül az RNS-be is, annak funkcióit gátolva. A dihidrofolát-tetrahidrofolát-ciklus gátlását a tetrahidrofolát-analógok (pl. metotrexát, aminopterin) szemléltetik, amelyek az N5,N10-metilén-THF reszintéziséhez szükséges dihidrofolát-reduktáz kompetitív gátlószerei (K, IMP átalaku­ lásban felszabaduló ammónia úgy is felfogható, hogy az aszpartát —» fumarát átalakulás közben az aszpartát dezaminálódott (9-16. ábra). Ugyanakkor a purinnukleotid-ciklust, mint az aminosavak energiaterme­ lésbe történő bevonásának módját is említhetjük, mert az aszpartát dezaminálódása fumaráttá egy citrátköri intermediert eredményez. A purinnukleotid-ciklus en­ zimeinek aktivitása a harántcsíkolt izmokban az egyéb szövetekben mért aktivitások sokszorosa. A cikluson belül is azonban az izomspecifikus AMP-dezamináz izoenzim (mioadenilát-dezamináz) aktivitás kb. száz­ szorosa a másik két enzim aktivitásának. Kimutatott, hogy a ciklus működése fizikai munka során a haránt-

I II.

354

f UMP

fcM P

aGMP

h2o h2cw

►nh 4+ ^

p.

. r 1 v

pí

(V-nukleotidáz

['ö'-nukleotidáz

H20 guanozin

AZANYAGCSERE

NH.+ uridin

citidin citidindezamináz

dUMP

dCMP

1

5'-dezoxinukleotidáz

P; ^

A

ÉdTMP 5'-dezoxinukleotidáz

r

H=l

dezoxi-citidin dezoxi-citidindezamináz NH,+ < / -> dezoxi-uridin

dezoxi-timidin

10-28. ábra. A nukleotidok degradálásának kezdeti lépései: a nukleozidok keletkezése

csíkolt izomban jelentősen felgyorsul. A fluxus növe­ kedésében a mioadenilát-dezamináznak van meghatá­ rozó szerepe. Amennyiben az ATP-képződés sebessé­ ge nem éri el a felhasználás sebességét, az ATP-szint csökken, az ADP- és AMP-koncentrációk pedig nő­ nek, az NH3-képződés szintúgy emelkedik. A fizikai munka közötti pihenő időszakban az IMP adeniloszukcináttá és AMP-vé alakul vissza. A purinnukleotid-ciklus azonban az AMP —>IMP átalakulás után nem szükségszerűen folytatódik ciklusként a korábbi­ akban leírt módokon. Amennyiben a sejtnek tartósan nincs elég GTP-je az adeniloszukcinát-szintáz (ÁSS) működéséhez az akkumulálódott IMP az 5’-nukleotidázzal inozinná, majd a purin-nukleozid-foszforiláz segítségével hipoxantinná és két lépésben húgysawá alakul. A purinnukleotid-ciklus bioenergetikai jelen­ tősége az, hogy az AMP-dezamináz enzim segítségé­ vel az aszpartát aminocsoportja felszabadul, és foko­ zott izommunkában a citrátkörben több intermedier áll az energiatermelés rendelkezésére.

Purinbázisok lebontása A reakciók lényege az, hogy az adenozinból inozin, majd az inozinból és a guanozinból is xantin keletkezik. Ez utóbbi oxidációjával urát (húgysav) képződik. A reakciók több lépésben játszódnak le (10-29. ábra). Az adenozinból először inozin keletke­ zik az adenozin-dezamináz katalízise révén, majd a ribóz-1-foszfát lehasadásával, amely reakciót nem specifikus purinnukleozid-foszforiláz katalizálja, hipoxantin jön létre. A hipoxantin a továbbiakban xantinná, majd húgysawá oxidálódik. A reakció két enzimaktivitás eredménye; a dehidrogenáz reakció­ ban a szubsztrátból származó elektronokkal a NAD ból NADH + H+ keletkezik; Az oxidáz reakcióban egyelektronos vagy kételektronos elektrontranszfer történik a molekuláris oxigénre és szuperoxid-anion, illetve hidrogén-peroxid keletkezik. Ez a reakció volt az első olyan biológiai reakció, melyben a szuperoxid keletkezését bizonyítani sikerült. A xantin-oxidáz- és

10. A N U K L E O T I D O K A N Y A G C S E R É J E

355

O adenozin

o

ribóz guanozin

hipoxantin

ribóz-1-P-*

IN

> guanin

N N

I

H húgysav (enol)

húgysav (keto)

10-29. ábra. A purinnukleozidok lebomlása, a húgysav képződése. A hipoxantin —> xantin és xantin —> húgysav átalakulást ugyanaz az enzim katalizálja, a xantin-dehidrogenáz/oxidáz. Normális körülmények között a xantin-dehidrogenáz reakcióban NADH + H+ képződik, reaktív oxigénszár­ mazékok nélkül. Ischaemia/reperfúzióban és az enzim SH-csoportjainak oxi­ dációjakor vagy gyulladásban az enzim működése megváltozik; szuperoxid és hidrogén-peroxid képződése kíséri a gyűrű oxidációját

I II.

356

xantin-dehidrogenáz-aktivitás ugyanazon enzimhez rendelhető (xantin-oxidoreduktáz): gyulladásos reak­ ciók során, vagy ischaemia/reperfúziós kórképekben a xantin-dehidrogenáz bizonyos cisztein-SH-csoportjai oxidálódnak, vagy korlátozott proteolízissel a dehidrogenáz oxidázzá alakul. Guanozinlebontás esetében a reakció a ribóz-1foszfát eltávolításával kezdődik, amelyet ugyancsak purinnukleozid-foszforiláz katalizál, majd a követke­ ző lépés a dezaminálás, amelyet a guanin-dezamináz katalizál. A xantin végül O2 és víz felhasználásával a xantin-oxidáz által katalizált rekacióban húgysavvá oxidálódik. A húgysav keto-enol tautomér formában jelenhet meg (10-29. ábra). A dezaminációs lépések során keletkezett ammóniából karbamid keletkezik az omitinciklusban, a xantin-oxidáz működése során ke­ letkező hidrogén-peroxidból pedig kataláz hatására víz és oxigén képződik.

Klinikai vonatkozások A súlyos kombinált immundeficienciában szenvedő betegek kb. 20%-ában a betegség hátterében az adenozin-dezamináz hiánya áll. A fokozott dATPszint a ribonukleotid-reduktáz gátlásához és fokozott apoptózishaj Iámhoz vezet, különösen a B-, az NK- és a T-limfocitákban. A betegek kezelhetők enzimbevi­ tellel és génterápiával kezelt őssejtek transzplantáció­ jával. A génterápia során humán őssejtekben ex­ presszáltatják az adenozin-dezamináz gént. A nagyon ritka purinnukleozid-foszforiláz-hiány szintén súlyos immundefícienciát eredményez. Az ilyen betegekben a dATP és dGTP szintje százszo­ rosra is emelkedhet.

A húgysav antioxidáns és prooxidáns hatásai A purinbázisokból emberben urát (húgysav) kelet­ kezik. Orvosi szempontból a purinbázisok degradáci­

AZANYAGCSERE

ója két szempontból is jelentős. A degradáció végter­ méke az urát, vízben rosszul oldódó vegyület, és az emberben egy nagyságrenddel magasabb a szérum­ szintje, mint a többi emlősben. Koncentrációjának bármilyen okból bekövetkező további emelkedése kó­ ros. A magas szint ugyanakkor „előnyös” is lehet, ugyanis a bilirubin, a C- és E-vitaminok mellett az urát a legjelentősebb antioxidáns, amely szerepet játszhat a tumoros betegségek kifejlődésének késleltetésében vagy az emberi élettartam meghosszabbításában. A húgysav részt vehet a nitrogén-monoxidból és szuperoxidból képződő peroxinitrit (lásd 17-24. ábra) eli­ minálásában, a lipidperoxidáció és a fehérjenitroziláció gátlásában. Csökkenti az LDL oxidációját. Meg kell azonban jegyezni, hogy a legtöbb antioxidánshoz hasonlóan, a húgysav is egy redox-aktív vegyület, mely mind antioxidánsként, mind pedig prooxidánsként szerepelhet. így igazolódott, hogy az emelkedett szérumhúgysavszint nemcsak az úgyneve­ zett „civilizációs betegségek” (obezitás, hypertonia, 2-es típusú diabetes, ischaemiás szívbetegség, stroke, vaszkuláris demenciák) biomarkere, hanem ezeknek a betegségeknek független rizikófaktora is. (Emlősök­ ben az urát tovább katabolizálódhat; urikáz enzim ha­ tására - ez emberben hiányzik - a puringyürü felsza­ kad, és rendkívül jó vízoldékonyságú vegyület, allantoin keletkezik, amely kiválasztásra kerül.)

A húgysav-elimináció A húgysav emberben a purinok metabolizmusának végterméke, folyamatosan képződik, így folyamato­ san üríteni is kell. A szervezet teljes húgysavkészlete a képződött és ürült húgysav mennyiségének különbsé­ ge. A húgysavkészletet befolyásoló tényezők: a purinnukleotidok de novo szintézise, nukleinsavak szintézise és lebomlása, a foszforibozil-transzferázok által katalizált mentő reakciók és a táplálékkal történő purinbevitel. Az ürítésben döntő a renális exkréció (kb. 70%), a másik út a bélrendszeren keresztüli transzport (kb. 30%). Hyperurikaemia (magas húgysavszint a vérben) esetén a húgysav úgynevezett tophus uraticusokban (köszvényes csomókban) ra­ kódhat le (10-30. ábra).

1 0 . A N U KLEO TID O K ANYAGCSERÉJE

357

(purin)

f húgysav 3_ válik szabaddá, és P-amino-izobutirát keletkezik (10-33. ábra), mely részben a vizelettel ürül, részben metabolizálódik. Szintje a vizeletben megnő nagy DNStartalmú ételek fogyasztásakor vagy tumoros betegsé­ gekben, az utóbbi esetben a kezelés hatására bekövet­ kező nagyfokú sejtpusztulás eredményeképpen. A P-amino-izobutirát egy része a metabolizmusban transzaminálódik, metil-malonil-CoA-t eredményez-

10. A N U K L E O T I D O K A N Y A G C S E R É J E

359

dezoxiuridin •P,

/

-> uridin

citidin

dezoxitinidin dezoxiribóz-1-P

. r Pí

ír ribóz-i-I-P-é/

■| pirimidin-nukleozid-foszforiláz

11-4. ábra. A fenobarbitál oxigenációja. A barbiturátok közé tartozó fenobarbitál Sevenal néven volt sokat hasznánt gyógyszer. Az oxigénmolekula egyik oxigénatomja hidroxilcsoportot képez, a másik redukálódik vízzé

11. BIO TRAN SZFO RM ÁCIÓ

373

enzimatikus konjugáció helyett spontán módon adduktok képződnek (11-2. ábra), amelynek számos károsító hatása lehet. Glukuronidáció. A glukuronidképződés UDPglukuronsavval (11-6. ábra) történő konjugáció ered­ ménye. Az UDP-glukuronsav UDP-glukózból képző­ dik, így egyetlen molekula glukuronidációval történő A biotranszformáció második, konjugációs eliminálása energetikailag egy glukóz-„veszteséggel” fázisa jár. A reakciót UDP-glukuronozil-transzferázok (UGT) katalizálják. Indukálhatóságuk átlagban A konjugációs enzimek különböző kofaktorokkal 3-5-szörös - jóval kisebb, mint a P450 enzimeké. In­ konjugálják az első fázis enzimek hatására kialakuló, dukciójukban a P450 enzimek indukciójában is részt konjugációra képes funkciós csoportokkal immár ren­ vevő transzkripciós faktorok (pl. AHR), illetve indukdelkező vegyületeket. Ugyanazzal a szabad funkciós torok (pl. fenobarbitál, etanol) játszanak szerepet. Az csoporttal rendelkező vegyület akár több konjugációs UGT-k elsősorban a májban találhatók, de a tüdőben, enzim szubsztrátja is lehet. A leggyakoribb konjugáci­ bőrben, vékonybélben, szaglóhámban is expresszáós forma, a konjugációk mintegy 80%-át jelentő lódnak. (A szaglás folyamatában az odoránsokat konglukuronsavas konjugáció. Általában igaz, hogy az jugáló UGT-k szerepe jelentős.) ER-membrán kötött első fázis után képződött, nukleofil származékok első­ enzimek, amelyek működése sokban hasonlít a szin­ sorban glukuronsavval és szulfáttal, az elektrofíl szár­ tén az ER membránjához kötött glukóz-6-foszfatáz mazékok glutationnal konjugálódnak (11-5. ábra). Az rendszerhez, amennyiben aktív centrumuk az ER első fázisban létrejövő elektrofíl intermedierek eseté­ luminális kompartmentben van és ER membrántransz­ ben különösen nagy a veszélye annak, hogy az port-folyamatok is szükségesek a rendszer működéséhez. A különböző UGT-k két xenobiotikum géncsaládba tartoznak. Az I. géncsalád izoenzimei fenolok, a bilirubin konjugáci­ fázis I CYP óját végzik. A II. géncsalád izoenzimei a szteroidok, az epesavak konjugációjáért f DNS felelősek. UGT izoenzimek általában [nukleofil származék [elektrofíl származék inaktiválnak endo- és xenobiotikumokat, fehérje szerepük azonban lehet az aktiválás is fázis I mind fiziológiás, mind gyógyszerszubsztrátok esetében (pl. retinoidok, morfinszulfokonjugátum, származékok). glukuronid A fiziológiásán és patológiai szempont­ fázis I ból legismertebb, természetes UGT-szubABCC2 (MRP-transzporterek) sztrát a hemkatabolizmus terméke, a bili­ rubin. Glukuronidáció nélkül a bilirubin 11-5. ábra. A konjugáció leggyakoribb módjai. A biotranszformáció első felhalmozódik, anyagcseréje megakad, fázisát katalizáló P450 enzimek (CYP) vagy nukleofil, vagy elektrofíl szárma­ sárgaság (icterus) alakul ki, ami megoldat­ zékokat hoznak létre. A nukleofil származékok leggyakrabban UDP-glukulan esetben fatálissá válhat. A bilirubint ronozil-transzferázok (UGT) segítségével glukuronidokká, vagy szulfotranszferázok (SÜLT) segítségével szulfo-konjugátumokká alakulnak. Az konjugáló UGT izoenzimek hepatocitákigen reakcióképes, így a DNS-t és a fehérjéket is nem enzimatikus reakciók­ ban expresszálódnak. A bilirubin-UGT-k kal könnyen „megtámadó", elektrofíl származékokból általában glutationS-transzferázok (GST) glutation (GSH) konjugátumokat képeznek. A konjuindukciója - hasonlóan több, más hepatogátumok leggyakrabban az ABC transzporterek közvetítésével kerülnek ki a citában expresszálódó enzimhez (pl. glusejtekből

enzimek profilja a gyógyszerszedés, környezeti viszo­ nyok, étkezési szokások függvényében állandóan vál­ tozik, a mikroszomális légzési láncban a flavoprotein/citokróm-P450 arány is folyamatosan módosul.

374

II I .

AZANYAGCSERE

ringésbe is bekerül, de a szülés után az újszülött nem tudja átalakítani (morfi­ um adása fájdalomcsillapítóként szülő nőnek ezért kontraindikált), így méregteleníteni. Az újszülöttek hyperbilirubinaemiája, amely főleg koraszülöttek betegsége, az UGT-k nem megfelelő indukciója miatt jön létre. A jóindulatú Gilbert-kórban a konjugálatlan biliru­ bin koncentrációja megemelkedik a szérumban. Ezt a lakosság jelentős ré­ szét (amerikai adatok szerint 6%-át) érintő állapotot a bilirubin-UGT-k expressziós zavara, SNP a promóter ré­ gióban idézi elő. Az I. géncsaládba tartozó enzim korai stop kodonja okozza a jóval súlyosabb CriglerNajjar-szindrómát, amelynek különbö­ ző típusai között fatális következmé­ nyekkel járók is lehetnek. Szulfatálás. A szulfatálást a szul11-6. ábra. A szalicilsav konjugációja UDP-glukuronsavval. A szalicilsav, fotranszferázok katalizálják. A konju­ mely számos gyógyszer alapvegyülete mind OH- (1), mind COOH- (2) csoportján gáció kofaktora az aktivált szulfát, a konjugálódhat glukuronsavval UDP-glukuronozil-transzferáz katalizálta reakció­ ban. A COOH-csoporton keresztül glicinnel is történhet konjugáció (3) PAPS (3’-foszfoadenozin-5'-foszfoszulfát), amely szulfátból és ATP-ből képződik. A szulfát eredete kéntartal­ A M P -Q mú aminosavak oxidációja. A 11-7. ábra az antikoaguláns hatású 3-hidroxi-kumarin szulfatálását mutatja. Glutationkonjugáció. Az emberi konjugációk kb. 10%-a glutationnal történik két lépésben. A konjugáció el­ ső lépése az általában elektrofil szubsztrát glutationnal történő kapcso­ lódása, amit a glutation-S-transzferáz (GST) katalizál és a glutation cisztein11-7. ábra. A kumarin szulfatálása. Az antikoagulánsként használt kumarin jének SEI-csoportjának részvételével PAPS (aktivált szulfát, 3'-foszfoadenozin-5'-foszfoszulfát) kofaktorral szulfatálójön létre (11-8. ábra). A második kon­ dik szulfotranszferáz katalizálta reakcióban jugációs lépés a glutationt alkotó glicin, majd a gamma-glutaminsav lehasadása után következik be a cisztein aminocsoportkokináz, glukóz-6-foszfatáz) - születés után történik; jának acetilálódásával. Az acetilcsoport-donor az a magzati májban általában még nincs biotransz­ acetil-CoA. formáció, miként vércukorszint-szabályozás sem. Ez Metilezés. A metilezés a legkülönbözőbb, részben a tény alapjaiban megszabja a vajúdó nő gyógyszeres szabályozási okokból történhet, így a konjugáció kezelését, amennyiben a gyógyszer a magzati vérke­

11. B IO T R A N S Z F O R M Á C IÓ

375

port révén az epevezetéken ke­ resztül a széklet a lehetséges kiürítési irány. ABCC1 (koráb­ bi nevén MRP1; multidrog re­ zisztencia protein-1) expreszszálódik a hepatocita bazolaterális membránban, ABCC2 (MRP2) az epekanalikulus ré­ szen. Az ABCC2 károsodott experessziója okozza a DubinJohnson-szindrómát májban, amely icterust okoz. Ennek az oka a konjugált bilirubin ABCC2 közvetítette transz­ portjának zavara, amely az icterus mellett pigmentlerakó­ dást és máj megnagyobbodást, 11-8. ábra. A paracetamol konjugációja glutationnal. A többek között fájdalom- és lázcsillapító hatású paracetamol oxidációja után (amelyet leggyakrabban a CYP2E1 katali­ hepatomegaliát is okoz. Inten­ zál) két lépésben konjugálódik. Az első lépés glutationnal (yGlu-Cys-Gly) történő konjugá­ zív kutatások tárgyai az epesa­ ció, amelyet glutation transzferáz katalizál. A második lépés acetiláció, amelynek kofaktora az acetil-CoA vak, szteroidok, más endogén és xenogén konjugált moleku­ lák kiürülése, amely nemcsak az epével a bélcsatomába, hanem a hepatocita egyik formája is lehet. A metildonor kofaktor a SAM bazolaterális membránján keresztül a véráramba is (S-adenozil-metionin). történik. Számos gasztrointesztinális kórkép kialaku­ A fentieken túlmenően aminosavakkal és más mó­ lása függ össze ezekkel a transzport zavarokkal. don is konjugálódhatnak különböző molekulák. A biotranszformáció szabályozása elsősorban in­ Összességében, a kofaktorigény miatt valamennyi dukciós szinten ismert. Ennek mechanizmusa gyakran konjugációs forma energetikai szempontból is jelen­ a koordinált indukció: az első fázisú oxigenázok, a tős terhet ró az anyagcserére. második fázisú konjugációs enzimek és a harmadik fá­ zis transzporterek együtt indukálódnak. Erre példa az AHR „gene battery”, amelyben a CYP1A1 mellett A biotranszformáció harmadik fázisa UGT és GST is megtalálható. A biotranszformáció első két fázisa felfogható a si­ keres transzport, kiürítés előkészítéseként (11-5. áb­ 1 1 .2 A B IO TR A N SZ FO R M Á C IÓ ra). A konjugálódott molekulák sejtekből történő JELEN TŐ SÉGE szekréciója transzporterek közvetítésével történik. Az eddigi transzporter kutatások során a legtöbb in­ A biotranszformáció miközben igen gyakran ki­ formáció a transzport ATPázok közé tartozó ABCürülést, inaktiválást szolgál, molekuláris értelemben (ATP binding casette) transzporterek szerepéről gyűlt alapvetően szintetikus folyamat. A NADPH fogyasz­ össze. Az ABC-transzporterek különböző biológiai tása mellett a sikeres biotranszformáció a konjugációs szerepeinek egyike a konjugált molekulák szekréció­ kofaktor szükséglet miatt közvetve jelentős ATPjában való részvétel. Hepatocitákban vagy a bazoteher a metabolizmus számára. Koordinált szabályo­ laterális membránon keresztül a vér, majd vizelet, zása a génexpresszió szintjén gyakran együtt történik vagy az epekanalikulus membránján át történő transz­

I I I . AZ ANYAGCSERE

376

intermedier metabolizmus reakciók és komplex anyagcsere folyamatok szabályozásával (pl. NADP redukáló enzimek, hemszintézis - P450 enzimek, ER-membrán-szintézis). A biotranszformációs enzimek a legkülönbözőbb biológiai folyamatok részei lehetnek. Számos endo­ gén, szabályozó - szignálként ható - molekula (pl. szteroid-, eikozanoidhormonok) így inaktiválódik. Többen a szignál metabolizmust tekintik a biotransz­ formáció „eredeti”, élettani funkciójának. Emellett azonban több szabályozó molekula képződésében is meghatározó reakciókat katalizálnak biotranszfor­ mációs enzimek - így például a szteroidhormonok szintézisében, epesavak szintézisében és konjugáció­ jában, D-vitamin hidroxilációjában, peptid-leukotriének - LTD4 képződésében. A leggyakoribb fizio­ lógiás, biotranszformációs enzimekkel átalakuló anyagok különféle lipidek: retinoidok, szteroidok, zsírsav-, különösen arahidonsav-származékok. A széles szubsztrátspecificitás lehetőség a xenogén anyagok átalakítására. Ez általában inaktiválást jelent például a gyógyszerhatásban és a méregtelenítést biz­ tosítja. Vannak azonban olyan molekulák, köztük gyógyszerek is, amelyeket éppen biotranszformációs enzimek aktiválnak. Ez nemcsak egyes gyógyszerek hatásában lehet előre kalkulált folyamat, hanem sú­ lyosan károsító, mérgező anyagok hatásmechanizmu­ sában is. Például a több élelmiszerben természetes anyagként jelen lévő nitrózaminszármazékok mindad­ dig ártalmatlan molekulák, ameddig a máj sejtben nem oxigenálódnak CYP2E izoenzimekkel (11-9. ábra). Ekkor válnak rákkeltővé. Idegen eredetű molekulák, gyógyszerek nemcsak biotranszformációs szubsztrátok, hanem induktorok is. Idegen ligandjai nemcsak gyógyszerhatásokat köz­ vetítő receptoroknak, hanem közvetlenül vagy köz-

R, —OH R. — N— R ,

I

N II

R, —NH --------- > CYP2E

O alkil-nítrózam in

I

N --------- > [ R . - N , +OH-] || spontán O

alkil-diazo h idroxid reaktív addukt- k é p z ő m o lek ula

11-9. ábra. Nitrózaminszármazékok aktiválódása

vetve azoknak a transzkripciós faktoroknak, amelyek a lebontásukat katalizáló enzimek képződését szabá­ lyozzák (11-2. ábra). Az indukálhatóság mértéke szubsztrátonként/ligandokként változhat; az indukált/represszált állapot azonban valamennyi metabolikus szubsztrát lebontását megváltoztatja. Az átfe­ dő szubsztrátspecificitás a gyógyszer-kölcsönhatások tág rendszerét teremti meg: részint a szubsztrátok ugyanazon enzimekért versengenek, másrészt esetle­ ges indukciós hatásuk több más molekula átalakulását befolyásolhatja; az indukcióban részt vevő transzkrip­ ciós faktorok is több enzim indukciójához vezethet­ nek. Ez alapvetően befolyásolhatja a gyógyszerek ha­ tásait, dózisát, toxicitását és kölcsönhatásait. A farmakogenomika ma már külön tudomány. A biotranszformációs enzimek genetikai polimorfiz­ musa intenzíven vizsgált terület, gyógyszerfejlesztési szempontból is jelentős kérdéskör az individuális gyógyszerterápia egyik alapproblémája. Különböző személyeknél ugyanaz a gyógyszer eltérő sebességgel alakul át; megkülönböztetnek különböző fenotípusokat: PM (poor: lassú), EM (extensive: gyors) metabolizálókat és ezek altípusait. A gyors metaboliz­ mus nagyobb dózist tesz szükségessé. Ha az első fázist katalizáló enzim indukált állapotban van, ez aztán szá­ mos más anyag metabolizmusát is gyorsíthatja, ami azzal is járhat, hogy az első fázis végén keletkező re­ aktív intermedierek mennyisége megnő. Például az al­ kohol számos enzim induktora, többek között közvet­ ve befolyásolja a tesztoszteron metabolizmusát, a diazepam típusú nyugtatok anyagcseréjét és gyorsít­ hatja a nitrózaminszármazékok metabolizmusát is, ugyanakkor, mint szubsztrát, kompetálhat is velük. Mindez része lehet az adverz gyógyszerhatások kialakulásának; egymástól teljesen eltérő hatású, kémiai szerkezetű gyógyszerek befolyásolhatják egymás hatásait, dózisát ennek összes veszélyeivel. A biotranszformációt - poetikus hajlammal is meg­ áldott kutatók - a növény- és állatvilág közti küzdelem egyik terepének tekintik. A rendkívül változatos szer­ kezetű növényi anyagok a tápláléklánccal óhatatlanul bekerülnek az állati szervezetekbe. Ezeknek az anya­ goknak egy része a növényvilág védekezése az őt pusztító élőlényekkel - így az állatvilággal - szemben.

11. B I O T R A N S Z F O R M Á C I Ó

Egyes - esetleg éppen biotranszformációs enzimek ré­ vén szintetizálódó - növényi molekulák toxikusak ál­ latokra. Ugyanakkor az állatokban éppen ezen növé­ nyi molekulák hatására indukálódó biotranszformá­ ciós enzimek az induktor molekulákat átalakítják, inaktiválják. így az egyes élőlényekben bioszintetikus célokat szolgáló enzimek, más élőlényekben ezzel ellentétes célok megvalósítását szolgálják.

377

A biotranszformáció az állatvilágban egyfajta vé­ delem, lehetősége túlélési érték; biztosítja a környe­ zetből bekerülő anyagok átalakítását és eliminálását. A P450 differenciálódás legfőbb mozgatójának a nö­ vényvilágot tartják. A kemizáció azonban a mestersé­ ges induktorok elterjedését hozza, amelyeknek hatásai ma még nehezen mérhetők fel.

12

AZ ALKOHOL METABOLIZMUSA

ÁDÁM V E R O N I K A

12.1

Az alkohol felszívódása és eloszlása a szervezetben

12.2

Az alkohol oxidációja

12.3

Az alkoholoxidáció általános jellegzetességei és energetikája

12.4

A fokozott alkoholoxidáció metabolikus következm ényei. Az alkohol toxikus hatásai 383

Az alkohol metabolizmusa jelentős energiaforrást jelent az emberi szervezet számára és jelentősen befo­ lyásolja más, konvencionális tápanyagok metabolizmusát, tárgyalása ezért az anyagcseréről szóló fejezet­ be kívánkozik. A krónikus nagy mennyiségű alkoholfogyasztás pedig súlyos egészségkárosodással jár, amelynek alapjai jelentős részben az alkoholmetabolizmusban keresendők.

1 2 .1

AZ A LK O H O L F E L S Z Í V Ó D Á S A ÉS ELOSZLÁSA A SZERVEZETBEN

Az alkohol metabolizmusa és felszívódása már a gyomorban elkezdődik, de a felszívódás a duodenumban és a jejunumban nagyobb sebességgel zajlik. Az alkohol keringésben való megjelenése tehát nagymér­ tékben függ a gyomor kiürülésének sebességétől; mi­ nél gyorsabban távozik a gyomortartalom a duodenum felé (üres gyomor), annál kisebb a gyomorban zajló metabolizmus és annál gyorsabb az elfogyasztott al­ kohol felszívódása. Az alkohol jelen ismereteink sze­ rint passzív diffúzióval jut át a membránokon a kon­ centrációgradiens által hajtva. A keringésben detek­

378

378 381

tálható alkoholszint a felszívódás és a metabolizmus sebességétől függ. Az alkohol a keringésből a membránokon átdiffundálva bejut a szervekbe, s egyensúlyban van a plazma etanolkoncentrációjával. (Alkohol, etanol, etilalkohol - szinonim fogalmak e fejezetben.) A disztribúció az egyes szervek lipid/víz arányától függ, mivel az alko­ hol az emberi szervezet körülményei között zsírban rosszul oldódik, a relatív víztartalom határozza meg az alkohol jelenlétét a szövetekben. A női szervezet vi­ szonylag magasabb lipidtartalma szerepet játszik ab­ ban, hogy ugyanakkora alkoholdózis elfogyasztása után a vérben az alkoholszint általában magasabb. A pulmonális erekből az alveolusokba történő diffúzió nyomán jelenik meg az alkohol a kilélegzett levegő­ ben, ami detektálható. A kilélegzett, a verejtékben, illetve a vizeletben kiválasztott alkohol összesen sem éri el az elfogyasztott mennyiség 10%-át.

12.2

AZ A L K O H O L O X ID Á C IÓ JA

Az elfogyasztott etanol 90%-a oxidálódik; az oxi­ dációért felelős legfontosabb enzim az alkoholdehidrogenáz (ADH); magasabb alkoholkoncentrá­ cióknál szerepe van a mikroszomális etanoloxidáló

12. AZ A L K O H O L M E T A B O L I Z M U S A

379

NAD+ NADH + H*

V etanol

^

[a lk o h o l-d e h id ro g e n á z

NAD+ NADH + H+ > C H ,— C

J

V

-A

\ H

(a c e ta ld e h id -d e h id ro g e n á z

> C H ,— C - O

12-1. ábra. Az etanoloxidáció lépései

a c e tá t

a c e ta ld e h id

rendszernek is (MEOS, microsomal ethanol oxidizing system). (Kismértékű etanoloxidáció a peroxiszómákban található kataláz enzimnek is tulajdonítható.) Az ADH által katalizált reakcióban acetaldehid ke­ letkezik, amelynek további oxidációját az acetaldehid-dehidrogenáz (ALDH) végzi (12-1. ábra). A re­ akció végterméke az acetát. Az ADH citoplazmatikus enzim, a keletkező acetaldehid pedig a mitokondriumban oxidálódik acetáttá. Az enzimek legnagyobb mennyiségben a májban expresszálódnak; az alkohol oxidáció elsődleges szerve a máj. ADH izoenzimek azonban a gyomorban is jelen vannak, így az oxidáció mára gyomorban elkezdődik. Ennek mértéke és jelen­ tősége attól függ, hogy mennyi ideig tartózkodik a gyomortartalom a gyomorban.

Alkohol-dehidrogenáz Az ADH széles szubsztrátspecificitású enzim, az etanol mellett egyéb alkoholokat és a szteroid, illetve az epesav-metabolizmus egyes intermedierjeit is oxi­ dálja. Az ADH több izoformában fordul elő az emberi szervezetben; az ADH gének által kódolt különböző alegységekből (a, p, y, 7t, x, a; ezeknek is további vál­ tozatai vannak) épül fel az enzimet alkotó homo- vagy heterodimer. Az ADH izoenzimeket a szerkezet és a kinetikai tulajdonságok alapján öt osztályba sorolták (ADH1-ADH5), amelyek közül az etilalkohol oxidá­ ciójában az ADH1 izoenzimek játsszák a legfonto­ sabb szerepet. Három gén tartozik ehhez a családhoz, amelyek az a- (ADH 1A), P- (ADH 1B) és y- (ADH 1C) alegységeket kódolják (további allélvariációk is létez­ nek), s ezek változatos alegység-összetételben alkot­ ják az enzimet (aa, pp, ap stb). Az ADH1 izoenzimek legnagyobb mennyiségben a májban találhatók, speci­ fikusak és nagy affinitással rendelkeznek az etanol iránt (Km= 0,05^1,2 mM), aminek következtében ala­ csony etanolkoncentrációknál ezek az enzimek a fő­ szereplők az etanol oxidációjában. Ezekre az izo-

enzimekre vonatkozik a máj alkohol-dehidrogenáz összefoglaló elnevezés. Az ADH2 gén terméke (a nn összetételű ADH en­ zim) szintén jelen van a májban; etanol iránti magas Km-értéke (23 mM) azt jelenti, hogy az enzimnek ma­ gas etanolkoncentrációnál van jelentősége a metabolizmusban. Magas Km-értéke (~3 M) van az ADH3 izoenzimnek (xx homodimer), amely csaknem minden szervben jelen van, s főként a hosszú C-láncú alkoho­ lok oxidációjában játszik szerepet. Az ADH4 izoenzim (a-alegységek alkotják) nincs jelen a májban, viszont a gyomor-bél traktus felső sza­ kaszában, elsősorban a gyomorban ez az enzim kezdi el az etanol oxidációját. Krónikus alkoholistákban, különösen nőkben, az ADH-aktivitás a gyomorban csökken, ami hozzájárul az alkoholfogyasztás utáni gyors véralkoholkoncentráció-emelkedéshez. Egyes gyógyszerek, pl. aszpirin gátolja a gyomorban az ADH-aktivitást, hasonló hatást kiváltva. Nagy mennyiségű alkoholfogyasztás esetén, ami­ kor a gyomorban az etanolkoncentráció magas, az ADH4 enzim működése következtében nő meg az acetaldehid-keletkezés, aminek az alkoholfogyasztás­ sal összefüggő megnövekedett tumorelőfordulásban tulajdonítanak jelentőséget. Az ADH 1 enzimeket a pirazol típusú gyógyszerek, pl. phenylbutazon gátolják, gátolva így az alkohol oxi­ dációját.

Mikroszomális etanoloxidáló rendszer (MEOS) Magasabb etanolkoncentrációk oxidálásában ját­ szik szerepet az endoplazmás retikulum citP450 ke­ vert funkciójú oxigenáz rendszere. (Az endoplazmás retikulum biokémiai izolálása során nyert membrán­ frakciót nevezik mikroszómának.) A citP450 enzi­ mekről a l l . fejezetben részletesen szólunk. A több

II I .

380

12-2. ábra. Az etanol oxidációja az endoplazmás retikulumban

mint 100 citP450 izoenzim közül a CYP2E1 izoenzim játssza a legfontosabb szerepet az etanol oxidációjá­ ban. Egyéb citP450 izoenzimek is oxidálják az etanolt, de ezek jelentősége sokkal kisebb. A MEOS el­ nevezés az összes citP450 együttes etanoloxidáló aktivitására utal. A reakcióban - csakúgy, mint az ADH-reakcióban - acetaldehid keletkezik, de NADH-keletkezés nincs; a reakció NADPH-felhasználással jár (12-2. ábra). Az enzim etanol iránti magas Km-értéke (10 mM) magya­ rázza, hogy a CYP2E1 fokozott alkoholfogyasztás esetén és krónikus alkoholizmusban válik fontossá az alkohol oxidálásában. A CYP2E1 - szemben az ADH-val - indukálható; krónikus alkoholfogyasztás mellett mennyisége megnő a májban, s ennek tudható be, hogy ilyenkor megnő az etanoloxidáció, ami a fo­ kozott alkoholbevitelhez történő metabolikus adaptá­ ciót jelenti. Ennek azonban az is a következménye, hogy felszaporodhat az acetaldehid - ha az ALDHreakció nem tud lépést tartani az acetaldehid keletke­ zésével, ami toxikus hatású (lásd alább). Indukálódik az enzim diabetesben, éhezésben és gyógyszerek hatá­ sára (számos olyan gyógyszer hatására is, amelyek más citP450 izoenzimek szubsztrátjai). A CYP2E1 enzim nem specifikus az etanolra, egyéb alkoholokat és számos gyógyszert is oxidál, s ez utóbbiak tartós szedése is az enzim indukcióját okozza. Ugyanakkor az etanol indukálja nemcsak a CYP2El-et, hanem egyéb citP450 enzimeket is, ame­ lyek gyógyszerek metabolizálásában vesznek részt. A gyógyszerek és az alkohol metabolizmusa tehát egymást befolyásolja. Egyrészt krónikus alkoholiz­ musban, amikor a májban indukálódik a CYP2E1, egyes gyógyszerek metabolizmusa is fokozódhat, ami

AZANYAGCSERE

a hatékonyságukat csökkenti. Másrészt viszont az eta­ nol és a gyógyszerek között kompetíció van a CYP2E1 által történő oxidációban, ami gyógyszersze­ dés mellett megejtett jelentős alkoholfogyasztás esetén mind a gyógyszerek, mind az alkohol csökkent metabolizmusához vezet. A CYP2E1 számos kémiai anyagot oxidáció kö­ vetkeztében reaktív termékké alakít, ilyen pl. a széntetraklorid, a nitrózaminok, az acetaminophen vagy a halothan. Fontos figyelembe venni, hogy a CYP2E1 által ka­ talizált reakcióban reaktív oxigénszármazékok is ke­ letkeznek, aminek jelentősége van az alkoholfogyasz­ tás következtében kialakuló májsejtkárosodásban és az etanol karcinogén hatásában.

Az acetaldehid oxidációja Az acetaldehid továbbalakulásáért az ALDH en­ zim a felelős. ALDH izoenzimek jelen vannak a citoszolban, a mikroszómában és a mitokondriumban. Az acetaldehidoxidáció gyakorlatilag teljes egészében a mitokondrium mátrixban, az ALDH2 izoenzim ha­ tására történik, amelynek specificitása, nagy affinitása (Km= 0,2 pM) és kapacitása biztosítja, hogy az acetal­ dehid teljes egészében acetáttá alakul, s a keringésbe acetaldehid nem kerül. A citoszolban lokalizálódó kis affinitású ALDH1 izoenzim csekély mértékben járul csak hozzá az acetaldehid oxidációjához. Mennyiségi­ leg szintén jelentéktelen, de valamennyi acetaldehidátalakítás a nem specifikus aldehid-dehidrogenáznak is tulajdonítható. Az ALDH2 nem ritka genetikai variánsa (ALDH* 2) egyetlen glutamát-lizin-szubsztitúció mi­ att, megváltozott kinetikai tulajdonsággal bír. ALDH*2 affinitása nagyságrendekkel nagyobb (Km = 45 pM) az acetaldehid iránt, aminek az a következ­ ménye, hogy az alkohol oxidációja során megnő az acetaldehid koncentrációja. Az acetaldehid toxikus anyag, felszaporodása kellemetlen szubjektív tünetek­ kel jár; émelygés, hányás, palpitáció, kipirulás jelent­ kezik, amelyek megjelennek az ALDH*2 alléit hordo­ zó egyénekben kis mennyiségű alkohol fogyasztását követően. Ez a variáns viszonylag gyakori Ázsia la­

1 2. A Z A L K O H O L M E T A B O L I Z M U S A

kosságában (40-50%-a), s (homozigóta) jelenléte, a kellemetlen tünetek következtében kialakuló averzió miatt, csaknem abszolút védelmet jelent az alkoholiz­ mus kialakulásával szemben. Az alkohol iránti aver­ zió kialakítását célozzák azok a gyógyszerek, amelyek az ALDL2 gátlói (disulfiram, cianamid), és krónikus alkoholizmusban az alkoholról való leszokást segít(het)ik. Krónikus alkoholfogyasztás mellett az ALDH2aktivitás általában csökken, s megnő az acetaldehid keletkezése az egyidejűleg megnövekvő fokozott al­ koholoxidáció (metabolikus adaptáció) miatt. Ennek jelentősége van az alkoholizmusban kialakuló toxikus sejtkárosodásban.

12.3

AZ A LK O H O LO X ID Á C IÓ ÁLTALÁNOS J E L L E G Z E T E S S É G E I ÉS EN ER G ET IK Á JA

Az alkohol oxidációja a májban nem reguláit, nincs olyan ismert hormonális mechanizmus, ami a metabolizmust befolyásolná, ezért egyrészt az ebből szárma­ zó energiatermelés nem kontrollált, másrészt az oxidá­ ció más metabolitok kárára történik, ami a nagymérté­ kű alkoholfogyasztás következtében kialakuló meta­ bolikus zavarok alapjául szolgál.

etanol

381

Az oxidáció két kulcsfontosságú enzimének műkö­ déséhez elengedhetetlen a keletkező NADH oxidálása a mitokondrium belső membrán légzési láncában. A citoszolban, az ADH reakcióban keletkező NADH a malát-aszpartát vagy a glicerofoszfát-ingán keresztül jut be a mitokondriumba, amelyek jellegzetességeit a 7. fejezetben ismertetjük. Ha a NADH-oxidáció aka­ dályozott - akár a transzporterek, akár a légzési lánc elégtelen működése miatt - vagy amikor a NADH-keletkezés sebessége meghaladja ezek kapacitását, a megemelkedő NADH/NAD+ arány gátolja az alkohol­ oxidációt. A NADH/NAD+ arány megemelkedése ezen túlmenően a májban zajló metabolizmus súlyos zavarait okozza, amelyre alább visszatérünk. Az ADH-reakcióban keletkező acetaldehid a máj­ ban gyakorlatilag teljes egészében acetáttá alakul, normális körülmények között a keringésben acetalde­ hid nincs. Az oxidáció végterméke, az acetát azonban a májban csak kismértékben oxidálódik, mert ilyenkor a NADH-keletkezés és oxidáció miatt a máj energeti­ kailag telített és lecsökken a citrátkör sebessége. Az acetát a keringésbe jut, ahonnan a szervek, elsősorban az izom, felveszik és acetil-CoA-vá alakítják, a zsírsa­ vak aktivásával analóg reakció során, az acetil-CoAszintetáz hatására (12-3. ábra). Az extrahepatikus szervekben és a májban is a keletkező acetil-CoA felhasználása az aktuális metabolikus állapottól függ, és megfelel annak, amit a tápanyagok oxidációja tárgya-

12-3. ábra. Az etanol oxidációjában részt ve­ vő kompartmentek a májban és az acetát felhasználása az extrahepatikus szervekben (elsősorban az izomban). ADH, alkoholdehidrogenáz; MEOS, mikroszomális etanoloxidáló rendszer; ALDH, acetaldehid-dehidrogenáz; ÁCS, acetil-CoA-szintetáz rADH

___ >

I I I.

382

etanol -2,5 ATP CH3- C = N — R leg hyperglykaemia alakul ki. H Az etanol okozta krónikus toxicitásban ismert az acetaldehid szerepe, amelynek el­ sődlegesjelentőséget tulajdo­ nítanak az alkoholizmussal összefüggő gasztrointesztinális tumorok kialakulásában. OH Normális körülmények kö­ zött és kis mennyiségű alko­ holfogyasztás esetén a kerin­ gésben található acetaldehid mennyisége elenyésző. Az ALDH enzim működése 12-7. ábra. Fehérje- (1) és DNS-addukt (2) kulcsfontosságú az acetaldekeletkezése acetaldehidből N-etil-dezoxiguanozin hid-eliminálásban, aminek a toxikus hatások megelőzésén kívül az is a szerepe, hogy oxidációja visszaszorul, és ketoacidosis jön létre. Le­ megakadályozza, hogy az ADH-t az acetaldehid gá­ csökken a glukoneogenetikus prekurzorok és interme­ tolhassa, ami csökkentené az etanoloxidációt. Hetedierek mennyisége is; a citoszolban a piruvát

„ OH ° \ I

hY

4'?\H A

J

OH

cukor

{__

„ OH ° \ I

i OH

|

OH

5'

H O C H, I>

—

i2

I 3

OH

OH

rib óz

í

/h

|2

H

2 '-d e z o x irib ó z

__ J n u k le o z id

J

l n ukleotid (n u k le o z id -m o n o fo sz fá t)

H

H

I1 U

5 II Jl

HC^

7^

I3 ur-2 HCA

8CH

C- V

V

H

611 1 CH l\K

pirim idin

purin

í

1 NH,

“A O ^

N ^

I

O

■sA sJk O ^ ^

N ^

X

X =H bázis X = ribóz (dezoxiribóz) nukleozid

0 '^

c h

3

N "X dX

a d e n in

g uan in

citozin

uracil

timin

(A d e, A)

(G ua, G)

(Cyt, C)

(Ura, C)

(Thy. T)

a d e n o z in

g u a n o zin

citidin

uridin

d ezo xitim idin

(Adó)

(G uo)

(Cyd)

(Urd)

(dThd)

g u a n o z in -m o n o fo s z fá t

citid in -m o n o fo szfá t

u rid in -m o n o fo szfá t

d e z o x itim id in -m o n o fo s z fá t

( G M P ) g u an ilát

( C M P ) citidilát

( U M P ) uridilát

( d T M P ) dezoxitim idilát

X = ribóz-foszfát a d e n o z in - m o n o fo s z fá t (dezoxiribóz-foszfát) ( A M P ) a d e n ilá t

nukleotid

13-1. ábra. A nukleotidok összetétele (a), a nukleinsavakban található bázisok, nukleozidok és nukleotidok nevei, azok rö­ vidítése (b). A puringyűrűt tartalmazó bázisok az adenin és a guanin, a pirimidingyűrűt tartalmazó bázisok a citozin, uracil és a timin. A bázisok RNS esetében ribózhoz, DNS esetében dezoxiribózhoz (rövidítése: „d") kötődnek, így jönnek létre a nukleozidok. A ribóz, illetve a dezoxiribóz 5'-szénatomjához kapcsolódó foszfátcsoport 5'-nukleotidokat eredményez, a foszfátcsoportok számától függően nukleozid-monofoszfát, -difoszfát vagy -trifoszfát jön létre

IV.

392

A DNS és az RNS szerkezete A DNS- és az RNS-molekulák nukleotidegységekből felépülő lineáris polimerek. A nukleotidok szerkezete és metabolizmusa a 10. fejezetben kerül részletesen ismertetésre. A nukleotidok három össze­ tevőből, nitrogéntartalmú bázisból, cukormolekulából és foszfátcsoportból állnak (13-1. ábra). A nitrogéntartalmú bázis purin- vagy pirimidingyürüt tartalmaz. A cukor (ribóz , illetve dezoxiribóz) 1’ szénatomján

adenin (A)

5'-vég

o-

oI 0 1

-Q-

II o

I 0 1

-Ű-

II o

0I

I p-

II o

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

keresztül kapcsolódik (3-N-glikozidos kötéssel a pirimidinbázis Nl-es vagy a purinbázis N9-es nitrogénjé­ hez. [A pentózok szénatomja vessző (’) jelölést kap, így különböztetjük meg a bázisok számozott atomjai­ tól.] Az ilyen módon létrejött molekulát nukleozidnak nevezzük. A DNS dezoxiribózt tartalmaz, míg az RNS ribózt, ezen alapul az elnevezésük. A ribózdezoxiribóz közti minimális szerkezeti különbség (a ribóz egy OH-csoportot tartalmaz a pentózgyürű 2’ szénatomjához kapcsolva) csökkenti az RNS stabilitá-

13-2. ábra. A polinukleotidlánc alkotóelemei. Zárójelekkel a DNS- és RNS-molekulák közti szerkezeti különbségeket jelöltük. A nukleotidok sorrendjét mindig 5'—>3' irányba írjuk fel, balról jobbra haladva. A fenti DNS-szekvencia így leírható az ATCG rövi­ dítéssel, vagy az ApTpCpGp rövidítéssel, ahol a „p" betű a foszfodiészter-kötés jele. A bázisokat a DNS-szekvenálás során (lásd 16. fejezet) alkalmazott színkóddal (adenin, zöld; timin, piros; citozin, kék; guanin, fekete) jelöljük

uracil (U), (timin, T)

citozin (C)

guanin (G)

(OH) 3’-vég

393

1 3 . D N S : G E N O M , R E P L I K Á C I Ó ÉS H I B A J A V Í T Á S

sát, és egyben reaktívabbá is teszi az RNS-t vizes kö­ zegben a DNS-hez képest. Ez magyarázhatja, hogy míg a DNS a genetikai állomány stabil hordozó mole-

kulája, az RNS a genetikai információt továbbító sze­ repe mellett egyéb, pl. katalitikus funkcióval is bírhat a sejtben. Ha egy nukleozidhoz észterkötéssel egy foszfátmolekula kapcsolódik, azt nukleotidnak nevez­ zük. Ezekből az alkotóelemekből állnak össze a polinukleotidok, a nukleotidok hosszú láncai (13-2. ábra). A polinukleotidok cukor-foszfát gerincét 3’—>5’ foszfodiészter-kötések tartják össze, és ehhez kapcsolód­ nak l ’N-glikozidos kötéssel a bázisok. Fiziológiás pH-n a foszfátcsoportok negatív töltésűek, a nukleinsavak tehát polianionok. A nitrogéntartalmú bázisok közül a két purin, az adenin (A) és a guanin (G) megta­ lálható úgy a DNS-ben, mint az RNS-ben. A pirimidinbázisok közül a citozin (C) mind a DNS-ben, mind az RNS-ben; a timin (T) a DNS-ben, az uracil (U) az RNS-ben található meg. Szintézisekor a nukleinsavlánc első nukleotidja egy szabad 5’-foszfát-csoporttal rendelkezik, míg az utolsó szabad 3’ -OH-csopottal. Ennek megfelelően a konvenció az, hogy a nukleoti­ dok sorrendjét, szekvenciáját (a primer szerkezetet) 5’—>3’ irányba írjuk fel balról jobbra haladva. A nukleotidok egymás között nem kovalens kapcsoló­ dásokat hoznak létre, melyek eredményeképpen kiala­ kul a nukleinsavak másodlagos, illetve harmadlagos szerkezete. RNS-molekulák esetében rendkívül válto­ zatos szerkezetek alakulnak ki (13-3. ábra), míg a DNS leggyakrabban előforduló natív formája a jobb­ menetes kettős hélix.

A DNS-molekula szerkezete

13-3. ábra. Az RNS-molekulák másodlados (a) és harmadlagos (b) szerkezete. Az RNS-molekulák döntően egyláncú mo­ lekulák, melyek nukleotidjai között komplementer, WatsonCrick-bázispárok (AU, GC) (az „a" részen vonallal jelölve), és ún. nemkanonikus bázispárok (pl. UG) (az „a" részen ponttal jelölve) alakulnak ki. A másodlagos szerkezetben kialakuló struktúrákat, doméneket a képen fekete, nyíllal jelölt vonalak kötik össze. A harmadlagos szerkezet színkódolása a másodlagos szerkezet doménjeinek felel meg. Az RNS-molekulák sokféle harmadlagos szerkezetet alakíthatnak ki, és ez rendkívül változatos biológiai szerepeket biztosít számukra. Ezt a tulajdonságukat a mestersé­ ges, számítógéppel tervezett RNS-molekulák esetében is kihasz­ nálják. Engedéllyel átvéve: Serganov A, Patel DJ. Ribozymes, riboswitches and beyond: regulation of gene expression without proteins. Nat Rév Génét. 2007; 10:776-90.

Vizes közegben a DNS-molekula többféle konfor­ mációt vehet fel, melyek közül fiziológiás körülmé­ nyek között legstabilabb az ún. B-forma. A B-DNS-t két helikális polinukleotidlánc alkotja, melyek közös tengely körül, jobbmenetesen csavarodnak. Az egyik lánc 5’—> 3 a másik 3’—>5’ orientációjú, azaz a két polinukleotidlánc antiparallel lefutású (13-4. és 13-5. ábra). A cukor-foszfát-gerinc kívül helyezkedik el, és negatív töltéseket hordoz, míg a bázisok a kettős hélix belseje felé néznek. A G specifikusan kötődik a C-hez három hidrogénhídkötéssel, és az A a T-hez két hidro­ génhidas kapcsolattal. Ezt bázispárosodásnak nevez­ zük, és ez képezi a komplementaritás alapját. Az

IV.

394

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS KI F E J E Z Ő D ÉSE

13-4. ábra. Az adenin-timin és citozin-guanin bázisok között kialakuló hidrogénhidak (komplementer bázispárosodás) (a) és a DNS kettős hélix szerkezete (b). A hélix átmérője 2 nanométer (nm) az egymás alatti bázisok távolsága 0,34 nm (3,4 Á). Egy for­ dulatot 10 nukleotid alkot

antiparallel lefutás és a bázisok kapcsolódását megha­ tározó, komplementer bázispárosodás minden nukleinsav-nukleinsav kapcsolódásra igaz, és számos sej­ ten belüli folyamat, így a replikáció, transzkripció , il­

letve molekuláris biológiai módszer, így a polimerázláncreakció (PCR), hibridizáció alapját biztosítja. Mi­ vel a DNS-lánc belsejében két egymás feletti bázispár közötti távolság a van dér Waals-határon belüli, a

b

a

3'-vég 13-5. ábra. A DNS kettős hélix kristályszerkezeti modellje pálcika (a) és térkitöltő (b) ábrázolásban. Az 5:>3' lefutású lánc zöld, a 3'—>5' lefutású lánc sárga színt kapott. Az oxigént és a foszfort eltérő színnel jelöltük. A DNS kettős hélixhez szekvenciaspecifikusan kötődő fehérjék elsődlegesen a nagy árok, esetenként a kis árok nukleotidjat ismerik fel. [A szerkezeti adatbázisban (Protein Data Bank) a kristályszerkezet PDB 1BDNA azonosító alatt található]

395

13. DNS: G E N O M , R E P L I K Á C I Ó ÉS H I B A J A V Í T Á S

bázispárok között gyenge apoláris kölcsönhatások is kialakulnak, melyek egyrészt jelentősen növelik a DNS-szerkezet stabilitását, másrészt kiszorítják a DNS belsejéből a vízmolekulákat, melyek a bázisok­ kal hidrogénhidas szerkezeteteket képezve lazítanák annak struktúráját. A cukor-foszfát-gerinc negatív töl­ tésének semlegesítésében fehérjék játszanak szerepet asejten belül. Ezeknek a fehérjéknek fontos szerepük vana genom kifejeződésében is. A kettős hélixtengely körüli csavarodásának oka, hogy a bázispárok N-glikozidos kötései nem száznyolcvan fokos szögeket zár­ nak be egymással, és ennek egyik következménye az ún. kis árok és nagy árok kialakulása, aminek szintén van szabályozási jelentősége (13-5. ábra). A DNS-t szekvenciaspecifíkusan felismerő fehérjék csak a bá­ zispárok oldaléléit ismerhetik fel (ez a fehérje-DNS kölcsönhatás alapja), és ezeket is csak a kis és a nagy árkok mentén. A DNS kettős hélix szerkezetének fel­ ismerése megnyitotta az utat a DNS-replikáció és ké­ sőbb a genetikai információ kifejeződésének megérté­ se irányában is. Az 1950-es évek közepére több kísérlet valószínűsítette, hogy a DNS hordozza az örökítőanyag szerepét a sejtben. 1953-ban a tudo­ mánytörténet eddigi legsikeresebb modellépítésének eredménye­ ként James Watson és Francis Crick megalkotta a DNS kettős hélix modelljét, mely nemcsak az „élet molekulája” szerkezetének megis­ merését jelentette, hanem az öröklődés molekuláris mechanizmusá­ nak megsejtését is. A DNS szerkezetének leírását több fontos felfe­ dezés előzte meg. Linus Pauling ismertette a kémiai kötések elméle­ tét. A C/iargí^-szabályok kimondták, hogy különböző DNS-mintákban az adeninek mennyisége megegyezik a timinekével, illetve a guaninoké a citozinokéval. A Rosalind Franklin által gyűjtött röntgendiffrakciós adatok alapján arra lehetett következtetni, hogy a

DNS helikális, kettősláncú molekula, melyben a láncok egymással szemben helyezkednek el az egész szerkezetnek egyenletes átmérőt biztosítva úgy, hogy a purinbázisok mindig a pirimidinbázisokkal vannak szemben.

13.2

DNS-REPLIK ÁCIÓ ÉS HIBAJAVÍTÁS

A z információátadás irányai és

lehetőségei A molekuláris biológia centrális dogmája, azaz, hogy a genetikai információ áramlása a DNS-molekuláktól a fehérjék irányában történik az RNS-molekulák közvetítésével, kiegészítésekkel ma is alkal­ mazható (13-6. ábra). Az élő szervezetek többségében az információtáro­ lás molekulája a DNS, habár a vírusok számos család­ jában RNS-genomot találunk. A sejt genomjában ta­ lálható információ több feladatot valósít meg: egy­ részt lehetővé teszi az egész DNS-állomány lemásolá­ sát, megkettőződését - ezt a folyamatot nevezzük DNS-replikációnak, ami mindig megelőzi a sejtek osztódását. Másrészt a DNS a transzkripció során (14. fejezet) átíródhat RNS-molekulákká, amelyek szabá­ lyozó RNS-ként működve különféle sejtfolyamatokat irányítanak, fehérje-RNS komplexeket alkotva enzim­ ként működnek (lásd a riboszómák peptidil-transzferáz aktivitása vagy a splicing folyamata), vagy a transzláció során (15. fejezet) a fehérjeszintézis templátjaiként szolgálnak. Az információátadás azon­ ban nemcsak DNS-RNS, illetve DNS-RNS-fehérje

DNS-replikáció, repair

tran szk rip ció

-^["nem kódoló RNS 13-6. ábra. A molekuláris biológia centrális dogmája, kiegészítésekkel. A genetikai információ-áramlás eredeti sémája szerint a replikáció alatt a DNS saját maga irányítja másolását, a transzkripció során a DNS-ben található információ íródik át RNS-molekulává, míg a transzlációban az RNS-molekula közvetíti az in­ formációt a fehérjéhez. Az eredeti kép kiegészült a repair folyamatokkal, melyek­ ben a DNS-templátként szolgál saját maga kijavításához, az RNS replikációval, mi­ kor az RNS szintéziséhez az RNS a templát is, és a reverz transzkripcióval, melyben a DNS-szintéziséhez az RNS a templát. Az utóbbi időben többféle nem kódoló RNS-t azonosítottak, melyek a DNS-ről transzkripcióval átíródnak, de nem készül róluk fehérje, hanem strukturális, katalitikus vagy szabályozó szereppel bírnak

396

irányban valósul meg. Régóta ismert, hogy az RNSgenommal rendelkező vírusok bizonyos családjaiban a szaporodás során az RNS először DNS-sé íródik át a reverz transzkripciónak nevezett folyamat révén, más víruscsaládokban pedig az RNS-genomról RNS-másolat készül, amit RNS-replikációnak nevezünk. A reverz transzkripció eukarióta sejtekben is megjele­ nik, így a retrotranszpozonok genomon belüli mozgá­ sa, vagy a telomeráz (lásd később) működése során. A genomban tárolt információ kifejeződése (expressziója) szigorúan szabályozott. Újabb kutatá­ sok szerint a környezeti hatásokra válaszul a sejtek megváltoztathatják a genomjukban található informá­ cióhoz való hozzáférés lehetőségét, méghozzá úgy, hogy a változások a sejtosztódások során is megőr­ ződnek és továbbadódnak, azaz örökletesek. Ez azt is jelenti, hogy az információátadás és -rögzítés a kör­ nyezet —>DNS irányban is megvalósul. Jó példa erre a genom DNS-metilációjának szabályozott változásai, vagy a kromatinszerkezetet befolyásoló hisztonfehérjék kovalens módosításai, melyek gének expressziós aktivitását szabályozzák. Ezek ugyan rever­ zibilis folyamatok, mégis számos példája van annak, hogy pl. a DNS-metilációs mintázat stabilan megma­ rad a sejtosztódások során, sőt a DNS-metilációs min­ tázat speciális esetekben szülő-utód között is öröklőd­ het, azaz a genomban tárolt információ egy része több generáción keresztül hozzáférhetetlen maradhat. Ezekkel a változásokkal az epigenetika tudománya foglalkozik.

A replikációs origó és a helikáz A DNS szintézise a replikációs origóknak nevezett DNS-szakaszoknál kezdődik. A DNS másolásához a két DNS-szálat először el kell választani egymástól egy rövid szakaszon, ami a replikációs origók közelé­ ben kötődő, helikázaktivitással rendelkező fehérjék feladata. A helikázok ATP-hidrolízise mellett felbont­ ják a hélix hidrogénkötéseit. A bakteriális genomban egyetlen replikációs origó van, míg pl. a humán genomban kromoszómánként átlagosan 220 repliká­ ciós origót találunk. A nagyobb eukarióta genomokban tehát egyidejűleg több helyről indul meg a DNS

IV.

A G É N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

replikációja, ami jelentősen lerövidíti a teljes genom replikációjához szükséges időt. A bakteriális repli­ kációs origók mérete és szekvenciája fajtól függően változó, de mindegyik A-T gazdag, ami megkönnyíti a DNS-szálak szétválasztását; ezen kívül több kötőhe­ lyet is tartalmaznak a monomer origókötő fehérje, a DnaA számára. Az eukarióta replikációs origók jóval komplikáltabbak - bár Saccharomyces cerevisiae-ben sikerült azonosítani a replikációs origók szekvenciáját (ARS, autonóm replikációs szekvencia), ez nem kon­ zervált sem a többi élesztő fajban, sem a többsejtű eukarióták genomjában. A replikációs origók kijelölése eukariótákban már a sejtciklus G1-fázisában megtörténik (13-7. ábra). A DNS-hez először a heterohexamer ORC komplex (origin recognition complex, origó felismerő komp­ lex) kötődik, majd az ORC-hez kötődik a CDC6 (cell division cycle 6) és a CDT1 (chromatin licensing and DNA replication factor 1) fehérje. A CDC6 és CDT1 fehérjék segítik elő az MCM2-7 (mini-chromosome maintenance) helikáz kötődését a DNS-hez. Az MCM2-7 heterohexamer gyűrű alakú komple­ xet alkot, amelyből legalább kettő kapcsolódik az ori­ gó közelében a kettős szálú DNS köré. így jön létre két, egyelőre inaktív prereplikációs komplex a Glfázis elején, s ezzel az origó készen áll a replikációra. A következő lépés a helikáz aktivációja a korai S-fázisban, amikor az S-fázis ciklin-ciklindependens kináz (ciklin-CDK) komplexek aktivitása megjelenik. A ciklin-CDK komplexek célfehérjéik foszforilálásán keresztül a sejtciklus központi szabályozó kinázai (lásd 19. fejezet). Az S-fázis ciklin-CDK-komplexek aktiválják a prereplikációs komplexet, majd megaka­ dályozzák, hogy a már replikálódott origó az S-fázis alatt ismét replikálódjon (re-replikációs blokk). Több­ sejtű eukariótákban az aktív helikáz az MCM2-7 és to­ vábbi fehérjék komplexéből áll, melyek a foszforiláció hatására meghatározott sorrendben kötődnek, köz­ tük a DNS szintézisét, polimerizációját végző enzim, a DNS-polimeráz. Az aktív helikázok a késlekedő szá­ lon (lásd később) haladva választják szét a DNS két szálát, a replikációs origótól mindkét irányban halad­ va. Ezt követően további, a replikációban részt vevő fehérjék kötődnek. Ha a helikáz komplex egyszer el­ hagyta az origót, az S-fázis alatt már nem alakulhat ki

13. DNS: G E N O M , R E P L I K Á C I Ó ÉS H I B A J A V Í T Á S

397

r e p lik á c ió s o rig ó

n G 1 -fázis

^

korai S -fá z is

Q 3

c ik lin -C D K -

13-7. ábra. A replikációs origók kialakulása és aktivációja. Az origóhoz elsőként kötődő fehérjék az ORC, (origin recognition complex, origó felismerő komplex) a CDC6 (cell division cycle 6) és a CDT1 (chromatin licensing and DNA replication factor 1) fehérje. Kö­ tődésükkel elősegítik az MCM2-7 (mini-chromosome maintenance) helikáz kötődését. A helikáz aktivációjához elengedhetetlen az S-fázis ciklin - ciklindependens-kináz (ciklin-CDK) komplexek aktivációja, melyek további, a replikációban résztvevő fehérjéket (az ábrán név nélkül jelölve), illetve DNS-polimerázokat (az ábrán csak egy van jelölve) foszforilálnak, és ezzel elősegítik azok aktivációját, vala­ mint kötődésüket az origóhoz. A helikáz aktivációja további fehérjéket vonz a komplexhez. A replication protein A (RPA) a kialakuló egyláncú DNS-hez köt, és a replikáció mellett a repair folyamatokban is fontos szerepet játszik. A proliferating cell nuclear antigén (PCNA) egy gyűrű alakú homotrimer molekula, ami csúszó kapocsként rögzíti a DNS-polimerázokat a DNS-molekulához, biztosítva ez­ zel, hogy sokáig képesek legyenek a templát-láncon maradni. A PCNA rögzítését a DNS-kapocs-felhelyező egység biztosítja. Enge­ déllyel átvéve: Fragkos M. et al. DNA replication origin activation in space and time Natúré Reviews Molecular Cell Biology 2015; 16:360-374.

398

újabb prereplikációs komplex. Az S-fázis ciklin CDK-komplexek ugyanis további célfehérjéket foszforilálnak, ami az ORC disszociációjához, a CDC6 ubikvitinálódásához és degradációjához, illetve a CDT1 nukleáris exportjához vezet. Ez a fontos szabá­ lyozó mechnizmus kizárja azt, hogy az eukarióta genom adott régiói többször replikálódjanak az S-fázis alatt. A prereplikációs komplex működését tehát a sejt szigorúan szabályozza, részben az aktivációját, amely a CDK és további szabályozó kinázok aktivitásának megjelenésével összhangban, és az S-fázis során kö­ vetkezik be, részben ezt követő inakti vációját, továb­ bá a DNS-en való összeszerelődését, amely kizárólag a sejtciklus késő M- és Gl - fázisaiban következhet be, azaz akkor, amikor a CDK aktivitás alacsony. A többsejtű eukarióták esetében nem minden prereplikációs komplex aktiválódik minden sejtosztó­ dásnál, és a kiválasztott origók aktiválódása sem egy­ idejű az S-fázis alatt. A prereplikációs komplexek ki­ választásának mechanizmusa nem ismert, bár a koráb­ ban aktívan átíródó, vagyis lazább kromatinszerkezetü genomi régiókban nagyobb valószínűséggel talál­ hatók aktív replikációs origók. A fel nem használt prereplikációs komplexek egyfajta tartalékként szol­ gálhatnak - ha a replikáció valahol elakad és a rep­ likációs komplex szétesik, egy másik, közelben levő prereplikációs komplexet aktiválva és a replikációt új­ raindítva az adott DNS-szakasz replikációja még befe­ jezhető. A replikáció áthaladásával a fel nem használt prereplikációs komplex disszociál a DNS-ről. Az S-fázis elején, korán replikálódó DNS-szakaszok szintén átfednek a korábban aktívan átíródó genomi régiókkal. Mivel a korábban replikálódó régióknál több idő marad a replikációs hibák javítására, ezekre a genomi régiókra az alacsony mutációs ráta jellemző.

A replikációs komplex A helikáz komplex aktivációja több, a replikációhoz szükséges fehérje bekötődését is lehetővé teszi, melyek együttesen alkotják a replikációs komplexet. A replikációs komplex mindkét szétválasztott szálat egyidejűleg másolja, ezzel mindkét irányban Y alakú

I V.

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS KI F E J E Z ŐDÉ S E

struktúrát, más néven replikációs villát eredményez (13-7. ábra). Minden replikációs origótól két repli­ kációs villa indul, azaz a replikáció kétirányú - bakté­ riumokban 1000 bp/s, míg emberben átlagban 100 bp/s sebességgel haladnak végig a genomon. A heli­ káz előrehaladása következtében a DNS-hélixek fel­ csavarodnak, DNS-szuperhélix alakul ki, ami gátolja a replikációt. A DNS szuperhelikális szerkezetének ellazítására jöttek létre a topoizomerázok. Ezek az enzimek idő­ ről időre elvágják a DNS-szálakat, majd a szuperhélix letekeredése után összekapcsolják (ligálják, lásd ké­ sőbb) a szálvégeket. A topoizomerázok két nagy cso­ portba oszthatók: a topoizomeráz-I a DNS egyik lán­ cának reverzibilis hasítását, míg a topoizomeráz-II a DNS mindkét láncának reverzibilis hasítását végzi. A topoizomeráz-II ATP-függő enzim, bakteriális megfelelőjét giráznak nevezzük. A girázgátlók a bak­ tériumok pusztulását okozó, ún. baktericid antibioti­ kumok (lásd 15-5. táblázat), míg az eukarióta topoizomerázgátlók megakadályozzák a sejtek osztódását, így a daganatellenes szerek (citosztatikumok) közé tartoznak. A replikációs komplex központi fehérjéi a DNSfüggő DNS-polimerázok, melyek a DNS-templát szekvenciája alapján, a komplementer bázispárosodás szabálya szerint az új DNS-szálat szintetizálják (13-8. ábra). A DNS-szintézis összefoglaló egyenlete: (dNMP)n + dNTP -> (dNMP)n+l + PP; Az eukarióta sejtek többféle DNS-polimerázt tar­ talmaznak: a replikatív polimerázokként ismert DNSpolimeráz-a, -e, -8 és az új DNS szintézisét végzik, míg más DNS-polimerázok elsősorban a DNS-ben lét­ rejött károsodások kijavításáért felelősek (a hibajaví­ tás, repair folyamatában, lásd később). A DNS-poli­ merázok közös tulajdonsága, hogy nem csak templát, de primerfiiggőek is, azaz nem képesek a lánc de novo szintézisére: csak már meglévő nukleinsavlánc szabad 3’-OH-csoportjához tudják a következő nukleotidot hozzákapcsolni. Ezért a DNS replikációját nem a DNS-polimerázok kezdik meg, hanem egy templátfüggő, de primerfüggetlen RNS-polimeráz, a primáz, ami a DNS-templát alapján egy rövid, 7-12

399

13. DNS: G E N O M , R E P L I K Á C I Ó ÉS H I B A ) A V Í T Á S

5'-vég

3 '-v é g

I O

I 0 1 -o—p = o I 0 1

CH,

H,C

ú jo n n an sz in tetizáló d ó lánc

I 2 0 1 0=P —OI o

0 1 -o— p = o I 0 1

tem p látlá n c

CH,

*>=====m o=

O

3'-vég -IOH

o o -o—P —O— P — o-^p — O —CH, | Y IP Ia ooop irofoszfát

I 2 0 1 P —OI o

CH,

cl :

I 2 0 1 o = p —OI o

KJ HO

ú jo n n an b e é p ü lő d e z o x irib o n u k leo tid -trifo szfát

5' exonukleáz aktivitással bíró, hibajavító (proofreading) helyére (arany), ahol az inkorrekt nukleotid lehasad. Ezt követően a 3'-vég visszahajlik, és folytatódik a polimerizáció. További, színkóddal jelölt, de nem részletezett domének: nagyujj, világoskék; N-terminális dómén, világossárga; P-domain, sötétkék. Engedéllyel átvéve: Hogg M. et al. Structural basis fór processive DNA synthesis by yeast DNA polymerase s Natúré Structural & Molecular Biology 2014; 21:49-55.

400

nukleotid hosszúságú RNS-primert szintetizál. Az RNS-primert ezután a DNS-polimeráz-a hosszabbítja meg további kb. 25 nukleotiddal. A primáz-DNS-polimeráz-a komplex egy másik fehérjén keresztül kötő­ dik a helikázhoz, és azzal együtt mozog a DNS-szál mentén. A DNS-polimerázok másik tulajdonsága, hogy csak 5’—>3’ irányban képesek az új DNS-t szin­ tetizálni, míg a templátot 3’—>5’ irányban olvassák le. Ezért a felnyíló replikációs villában az egyik szál komplementerét tehát a DNS-polimeráz folyamatosan szintetizálja 5’—>3’ irányban, a másik szál komple­ menterének egyidejű szintézise viszont problémát je­ lent a replikációs villában található másik DNSpolimeráz számára, mivel a templát csak szakaszok­ ban jelenik meg, így a replikáció szemidiszkontinuus (13-9. ábra). A replikáció kezdetekor a primázDNS-polimeráz-a komplex először a 3’-»5’ irányú templátszálhoz szintetizálja meg a prímért, majd átad­ ja helyét a DNS-polimeráz-e replikádv polimeráznak, és átvándorol az 5’—>3’ irányú templátszálhoz. A helikáz komplex előrehaladtával a DNS-polimeráz-s fo­ lyamatosan szintetizálja az egyik új DNS-szálat. A másik templátszálhoz egy ideig csak egyszálú DNS-kötő fehérjék kötődnek [replication protein A,

IV.

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

RPA fehérjék (bakteriális megfelelőjük az ssb, single strand binding protein)], melyek megakadályozzák, hogy a két lánc újra összekapcsolódjon, vagy a szétvá­ lasztott láncon komplementer hurkok alakuljanak ki. Majd a primáz-DNS-polimeráz-a komplex e templátszálon is megszintetizálja a hibrid, RNS-ből és DNSből álló prímért. A primerrel ellátott templátszál ez­ után mintegy hurkot képezve visszahajlik a helikázzal kapcsolt másik replikatív polimerázhoz, a DNS-polimeráz-8-hoz, így az 5’—>3’ irányban haladva egy 150-200 bázispámyi DNS-szakaszt szintetizál (köz­ ben lelöki az egyszálú DNS-t kötő fehérjéket), majd elengedi a DNS-t. Ezalatt a replikációs villa már előre­ haladt, és újabb 150-200 bp egyszálú DNS-szakasz keletkezett, melyet ugyanúgy egyszálú DNS-kötő fe­ hérjék stabilizálnak. Amint a DNS-polimeráz-ö elen­ gedi a DNS-t, lehetővé válik egy újabb RNS-DNS pri­ mer szintézise a primáz-DNS-polimeráz-a által, majd a DNS-polimeráz-5 veszi át az új DNS-szál szintézi­ sét, egészen az előző primerig haladva (13-10. ábra). Vagyis az egyik új DNS-szál folyamatosan szintetizálódik - ezt nevezzük vezető szálnak - míg a másik szál szakaszosan szintetizálódik, ezért ezt késlekedő szálnak nevezzük. A késlekedő szál újonnan szinteti-

13-9. ábra. A vezető szál és a késlekedő lánc szintézise. A DNS-szál szintézise 5' -> 3' irányban, a templát szál leolvasása 3'—>5' irányban történik. A vezető szál szintézise folyamatos, a késlekedő szál szintézise szakaszos, a replikáció szemidiszkontinuus. Az Okazaki-fragmentumok a késlekedő szálon szintetizálódó DNS-fragmentumok, melyek RNS-ből és DNS-ből állnak

13. DNS: G E N O M , R E P L I K Á C I Ó ÉS H I B A J A V Í T Á S

401

primáz/DNS-polimeráz-a komplex PCNA

D N S -ka p o csfelhelyező e g y s é g PCNA v e z e tő lá n c

13-10. ábra. Az eukarióta replikációs komplex. A késlekedő lánc primerjeit a vezető lánchoz hasonlóan a primáz-DNS-polimeráz-a

komplex szintetizálja. A késlekedő láncot ezt követően a DNS-polimeráz-5, a vezető láncot a DNS-polimeráz-s polimeráz szintetizálja. A kát polimeráz egymás mellett dolgozik a helikáz mögött felnyíló replikációs villában, emiatt a késlekedő láncnak hurkot kell leírnia. A helikáz mögött megjelenő egyláncú DNS-hez RPA (replication protein A) fehérjék kapcsolódnak. A PCNA (proliferating cell nuclear antigén) DNS-kapocs biztosítja, hogy a polimerázok a replikációs villában maradjanak, és a megfelelő pillanatban váljanak le a szinteti­ zálódó szálról

zálódott DNS-szakaszait a felfedező kutatóról Okazaki-fragmentumoknak nevezzük (13-9. ábra). Az Okazaki-fragmentumok összekapcsolása során először el kell távolítani a DNS-molekulában idegen RNS-t, ki kell tölteni a keletkező hézagot, és ezután történhet meg a DNS-fragmentumok tényleges össze­ kapcsolása, a ligálás (13-11. ábra). A DNS-polimeráz-8-ttöbb fehérje is segíti a hibrid RNS-DNS primer eltávolításában és a hézagok kitöltésében. A hézagok kitöltése után a két DNS-fragmentum között egy hi­ ányzó 3’-»5’ foszfodiészter kötés (nick) van, melyet a DNS-polimeráz nem tud létehozni, mivel a DNS-polimeráz szubsztrátja a dNTP. így az utolsó hiányzó foszfodiészterkötés létrehozását a D N S - l i g á z végzi (13-11/b ábra). A foszfodiészterkötés kialakulása energiaigényes, ATP hidrolízisével (baktériumokban NAD+ hidrolízisével) jár együtt. A DNS-ligázt a rekombináns DNS-technológiában is használják, mi­ kor eltérő forrásból származó DNS-molekulák között

alakítanak ki foszfodiészterkötéseket, és ezzel újra­ egyesített, rekombináns molekulákat alakítanak ki (lásd 16. fejezet).

A DNS-kapocs és a DNS-kapocs-felhelyező egység A replikáció során viszonylag rövid idő alatt kell a nagyméretű eukarióta genomot lemásolni. Ugyanak­ kor az eukarióta DNS-polimerázok önmagukban nem túl hatékonyak - segédfehérjék nélkül körülbelül 10 nukleotidnyi DNS lemásolása után disszociálnak a templát DNS-szálról. In vivő azonban a replikatív DNS-polimerázok egy gyűrű alakú, homotrimer fehérjekomplexhez, az úgynevezett D N S - k a p o c s h o z [mely eukariótákban a proliferating cell nuclear anti­ gén ( P C N A ) f e h é r j e trimerje] kötődnek, ami körül­ öleli a templát DNS-szálat, és a DNS-polimerázzal

IV. A GÉ N ÉTI KAI I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS KIFEJEZŐDÉSE

402

3 '^

templát DNS

m Nick-

RNS-primer

DNS

(dNTP)^

DNS-polimeráz-8 és segítő fehérjék

(PP.)n < ribonukleotidok

3 '^

újonnan szintetizált DNS

b

Y

DNS-ligáz

m

i

í

j i r

-

O13-11. ábra. Az Okazaki-fragmentumok összekapcsolása, a DNS-ligáz aktivitása. Amikor a DNS-polimeráz-8 és a hozzá kapcsolódó fehérjék elérik az RNS prímért (piros), a segítő fehér­ jék 5’>3' exonukleáz aktivitása eltávolítja az RNS prímért. Az RNS primer helyén maradó nukleotid hiányt (gap) a DNS-polimeráz-8 tölti ki (a). A keletkező DNSIáncok közti foszfodiészter kötés hi­ ányt (nick) a DNS-ligáz pótolja (b)

együtt szabadon csúszik a DNS-szintézis során a szál mentén (13-10. ábra). A DNS-kapocs egyik fúnkciója, hogy a replikatív DNS-polimerázt a templát szállal asszociálódva tartsa, ameddig csak lehet (vezető szál), vagy amíg a kb. 150-200 bázispámyi Okazaki-fragmentumot meg nem szintetizálta (követő szál). A DNS-kapocs másik funkciója, hogy a replikatív DNS-polimerázt ahhoz a ponthoz irányítsa, ahol a pri­ mer 3’-OH-vége van, és az egyszálú templát DNS kezdődik. Erre a vezető szál esetében csak egyszer van szükség, a követő szál esetében azonban minden Okazaki-fragmentum szintézise ezzel kezdődik. A DNS-kapcsot a replikációs komplexben található DNS-kapocs-felhelyező egység (clamp loader) helye­

zi fel a DNS-szálra. A felhelyező egység először ATP-t köt, majd felnyitja a DNS-kapocs zárt gyűrűjét. A DNS-kapocs-felhelyező egység-ATP hármas komplexe nagy affinitással kötődik a primer templátduplexben a primer 3’-végéhez, de a DNS-kapocs gyűrűjének keskeny nyílásán csak egyszálú DNS, az­ az a templátszál csúszhat át. Ez teszi lehetővé azt, hogy a felhelyező egység a DNS-kapcsot pontosan a primer 3’-végéhez pozícionálja, ami egyben biztosítja a DNS-kapocshoz kötődő replikatív DNS-polimeráz pontos pozicionálását is. Amint a DNS-kapocs körülöleli a DNS-t, és létre­ jön közöttük az interakció, a felhelyező egység hidrolizálja az ATP-t, és elengedi a DNS-kapcsot, ami a kapocs gyűrűzáródásához is vezet. Ekkor kötődhet a replikatív DNS-polimeráz a DNS-kapocshoz, és kezd­ heti meg az új DNS-szál szintézisét. A DNS-kapocs eltávolítását és újabb primer templátduplex 3’-véghez való áthelyezését ugyanúgy a DNS-kapocs felhelyező egység fogja végezni a DNS-kapocs gyűrűnyitása után, ATP felhasználásával. Az eukarióta replikációs komplexben tehát több más szabályozó fehérje mellett megtalálható a helikáz komplex, a DNS-kapocs-felhelyező egység és a primáz-DNS-polimeráz-a komplex, illetve a vezető szálat szintetizáló DNS-kapocs-DNS-polimeráz-g, valamint a követő szálat szintetizáló DNS-kapocsDNS-polimeráz-5 is, habár az egyes komplexek kö­ zötti interakciókat még nem térképezték fel teljes mértékben.

zi lineáris kromoszómavégek replikációja:

a telomeráz komplex A baktériumok körkörös genomjának replikációja befejeződik, amint a két replikációs villa összetalálko­ zik. Az eukarióta kromoszómák lineárisak, végükön több kilobázis hosszúságban nem kódoló, G-gazdag, ismétlődő szekvenciákat találunk (gerincesekben TTAGGG), amely a követő szál templátjánál kb. 200 nukleotiddal túlnyúlik a másik szálon. A túlnyúló is­ métlődő DNS-szakasz a kromoszómavégen sajátos térbeli szerkezetet vesz fel, és a hozzákötődő fehérjék­ kel együtt a telomert alkotja. A telomer ezért ellenáll

13. DNS: G E N O M , R E P L I K Á C I Ó ÉS H I B A J A V Í T Á S

403

késlekedö lánc, kromoszómavég

3'-

' TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA 3' ■AATCCCAATCCCAAUCCCA— RNS-primer az RNS-primer lebontásra kerül

3’“

■TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA 3' ■AATCCCAATCC telomeráz kötődik TÉRT ■TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA belső RNS-templát ■AATCCCAATCC v ^ p - A A U CCCAALj/-^

DNS-szintézis

■TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA GGGTTA ■AATCCCAATCC v >— AAUCCCAA

telomeráz transzlokálódik, DNS-szintézis meghosszabbított 3'-vég

/H

3G(TTA GGGTTAGGGTTAA ■TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA GGGTTAGGGTTA ■AATCCCAATCC v , — AAUCCCAAU,

13-12. ábra. DNS-replikáció a követő szálak végénél. Részletes magyarázat a szövegben található. TÉRT, telomeráz - reverz transzkriptáz

azexonukleázoknak, a DNS-rekombinációnak és kro­ moszóma-fúziónak, illetve a hibajavító enzimek sem azonosítják törött DNS-ként a kromoszómavéget. Az eukarióták lineáris kromoszómáinak replikációja so­ rán a vezető szál teljes egészében, a kromoszóma vé­ géig replikálódik. Ugyanakkor a követő szál végén az eltávolított hibrid RNS-DNS primer által hagyott hé­ zagot a DNS-polimeráz nem tudja betölteni, hiszen nincs szabad 3’-OH-véget nyújtó nukleotid, amit meghosszabbíthatna (13-12. ábra). Ezért az eukarióta kromoszómák vége a replikáció során egyre rövidül, de mivel nem kódoló, ismétlődő szekvenciákból álló DNS, sok replikációs ciklust (sejtosztódást) tesz lehe­ tővé anélkül, hogy a kromoszómák információs tartal­ ma sérülne. Amikor a szomatikus sejtekben az ismét­

lődő régió hossza egy kritikus ér­ ték alá csökken, a sejtek nem képe­ sek tovább osztódni, és elpusztul­ nak. Az ivarsejteket termelő szöve­ tekben és szöveti regenerációért fe­ lelős embrionális őssejtekben azonban a kromoszómavégek nem rövidülnek, mivel ezekben a sej­ tekben megtalálható és a telomerhez kötődik a telomeráz nevű ribonukleoprotein komplex. A telomeráz komplex a reverztranszkriptáz-aktivitással bíró telo­ meráz enzimből, a TTAGGG DNS-szekvencia szintéziséhez templátként szolgáló RNS-ből és több járulékos fehérjéből áll. A telomeráz enzim az RNS-templátot másolva meg tudja hosszabbítani a követő szál 3’-végét, ezzel templátot biztosít a lánc szintézisé­ ben részt vevő primáznak (13-12. ábra). A tumoros sejtek folytonos osztódását többek között az is biz­ tosítja, hogy ezek a sejtek újraakti­ válják a telomeráz komplex génje­ it, és így kromoszómáik nem rövi­ dülnek a sejtosztódások során.

el DNS károsodásainak javítása A DNS szekvenciájában bekövetkező változások akár szelekciós előnyt is biztosíthatnak az organiz­ musnak, és minden bizonnyal hozzájárultak az evolú­ ció során az élőlények túléléséhez és diverzifikációjá­ hoz a változó környezetben. Ettől függetlenül minden organizmusban komplex ellenőrző és javító mecha­ nizmusok alakultak ki, melyek fő célja a DNS-szek­ vencia változatlan megőrzése a sejtosztódások és az organizmus élete során. Az első ilyen védelmi vonal a replikatív DNS-polimerázok azon képessége, hogy rendkívül alacsony hibaszázalékkal (1 hiba/107 nuk­ leotid) másolják a DNS-t. A replikatív DNS-polime­ rázok a templát nukleotidját felismerve kiválasztják a

I V . A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

404

megfelelő új, komplementer nukleotidot, és kialakít­ ják az új nukleotid és a 3’-OH között az észterkötést PPj felszabadulása közben. Ha a DNS-polimeráz még­ sem a komplementer nukleotidot köti meg, akkor az enzim aktív centruma a nukleotidok hibás bázispárosodása miatt kedvezőtlen konformációt vesz fel, és a kovalens kötés kialakítása késedelmet szenved. A kés­ lekedés alatt lehetőség van arra, hogy a nem megfelelő nukleotid disszociáljon az enzimről, és helyébe a meg­ felelő nukleotid kötődjön be. Ha az enzim mégis be­ épített egy nem komplementer nukleotidot, akkor a torz szerkezetű bázispárt érzékeli, és a DNS-szál 3’-végét odahajlítja a saját hibajavító doménjéhez. A replikatív DNS-polimerázok hibajavító doménje

3’—>5’ exonukleáz-aktivitással rendelkezik, és leha­ sítja az újonnan beépített inkorrekt nukleotidot. Ez­ után a DNS-szál vége ismét visszahajlik az enzim polimeráz doménjéhez, és a DNS szintézise folytató­ dik. Az 1 hiba/107 nukleotid a genom méretéhez képest még mindig elfogadhatatlan mértékű hibaszázalék, így a hibás bázispárosodás (mismatch) kijavítását egy javitó (repair) mechanizmus, a mismatch repair vég­ zi. Első lépésként a sejtnek el kell döntenie, a két, egyébként ép nukleotid közül melyik az eredeti, „jó” szekvencia része. A javító fehérjekomplexeknek azo­ nosítania kell a frissen szintetizálódott szálat, és a javí­ tást azon kell elvégezniük. Az azonosítás történhet az

a depurináció

O

DNS-lánc

b

dezamináció citozin uracil

O

c

5' TTGCCTTTG 3' 3' A A CG G A AAC 5'

vad típusú DNS

5' TTGCCTTTG 3' vad típusú DNS-szál 3' AAU— AAAC 5' mutációt szenvedett DNS-szál 3' AAU— AAAC 5' mutációt szenvedett DNS-szál 5' TTT — TTTG 3' komplementer, replikációban beépülő DNS-szál

13-13. ábra. A guanin depurinációja apurin helyet (a) a citozin dezaminációja uracilt eredményez (b), ami megváltoztatja a DNS nukleotidsorrendjét (c). (a, b) Az R a DNS-lánc 5'-végét jelöli. A vad típusú DNS-szálon a citozin dezaminációja uracilra (U, pirossal), a guanin de­ purinációja AP helyre (-, pirossal) módosítja a DNS szekven­ ciáját. A replikáció során az uracillal komplementer timin (T, pirossal) épül be a vad típusú DNS-ben található citozin he­ lyett. Az apurin helyeket a replikáció alatt a DNS-polimeráz átugorja, ezért a vad típusú láncban található két guanin el­ veszik, deletálódik

1 3. DNS: G E N O M , R E P L I K A C I O ES H I B A J A V Í T Á S

Okazaki-fragmentumok között meglévő, még be nem töltött vagy ligálás előtti rések alapján, az új DNS-szál eltérő metilációja alapján, és az újonnan bekötődő hiszton-oktamerek eltérő kovalens módosításai alap­ ján. A hibás nukleotid azonosítása után megtörténik a nukleotid kivágása, a hézag betöltése és a DNS-végek ligálása. A hibás bázispárosodások kijavításával a replikáció hibaszázaléka századrészére csökken (1 hi­ ba történik 109 nukleotid beépítése során). Mivel a diploid humán genom replikációja során sejtenként körülbelül 2x(3,2xl09) nukleotid kerül beépítésre, a DNS szekvenciájának minimális módosulása minden egyes replikáció elkerülhetetlen velejárója.

405

A sejtek élete során a DNS-t naponta 104-106/sejt károsodás éri. Ezek nagy részét a repair mechanizmu­ sok kijavítják. Azokat a károsodásokat, amelyek maradandóak a DNS szerkezetében, m u t á c i ó n a k nevez­ zük. A replikációs hibákon túl a szerkezeti változások bekövetkezhetnek spontán, továbbá a metabolizmusban keletkező vagy exogén genotoxikus molekulák és nagy energiájú sugárzások hatására. A szerkezeti vál­ tozások érinthetik csak a bázisokat, mint például a depurináció, dezamináció, alkilálódás vagy timidindimer-képződés, de okozhatnak egyszálú vagy kétszálú DNS-törést is (13-13. és 13-14. ábra). A replikáció során ezek a kémiai változások megváltoztathatják az

aflatoxin-B, máj citokróm-

szomszédos timinbázisok

UV-sugárzás

OV .

H ' C ------ N

/

\

\

/

dezoxiribóz — N

C= 0

/ ------ cx

H

CH,

H\ \

CH,

C \

/

dezoxiribóz — N

\

c= o

DNS-addukt

c

timindimer 13-14. ábra. A timin dimérek (a) és az aflatoxin-BI-ből kialakuló DNS-addukt (b). A Nap UV-sugárzásának hatására az egymás melletti pirimidinbázisok között kovalens kötés (az ábrán pirossal) alakul ki. Az aflatoxint a rosszul tárolt magvak felszínén megjelenő penészgomba, azAspergillus flavus termeli. A toxin hőre rezisztens, tehát az elkészült élelmiszerekben, pl. kenyérben is megtalálható. A máj citokróm rendszere tovább növeli a molekula reaktivitását, ami a DNS-hez kötődve mutagén hatású. A DNS-hez kötődő aflatoxin-adduktot pirossal jelöltük. Az aflatoxinexpozíció kimutatható a vizeletben megjelenő biomarker (aflatoxin-N7-guanin ) segítsé­ gével

IV. A GÉ N ÉTI KAI I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z ŐDÉ S E

406

új DNS-szál szekvenciáját, vagy a replikációs villa blokkolásához vezethetnek, felszaporodásuk a sejt ha­ lálát okozza, ezért a sejtek igyekeznek hatékonyan korrigálni őket. Amennyiben a mutációk fehérjekódo­ ló szekvenciát érintenek, létrejöhet csendes (silent) mutáció (az aminosavak szekvenciája nem változik, mivel egy aminosavat többféle triplet is kódolhat, lásd 15. fejezet), missense mutáció (a triplet kodon másik aminosavat kódol), és nonsense mutáció (a korábban aminosavat kódoló triplet helyén stop kodon jelenik meg). Történhet egy vagy több nukleotid beépülése (inzerció) és eltűnése a szekvenciából (deléció). A báziskivágásos javítás (base excision repair, BÉR) enzimei a kémiailag módosult bázisokat ismerik

dezaminált citozin

úI I I I

? I I I I N-glikozidáz

•o

I l i i

f 1 1 1 1 AP-endonukleáz

tttt ? 1 1 1 1

©

DNS-polimeráz AP-liáz-aktivitás

TTTT ? I I I I DNS-polimeráz DNS-ligáz

TTTT ? I I I I vad típusú DNS 13-15. ábra. A báziskivágásos javítás (base excision repair, BÉR) mechanizmusa. Részletes magyarázat a szövegben talál­ ható U, uracil; G, guanin; C, citozin

fel. Ilyen módosulások pl. a depurináció vagy dezamináció (13-13. ábra). A depurináció ún. apurin he­ lyet hoz létre, ami a következő replikációban deléciót okoz. (Az apurin, apirimidin helyeket AP-helynek rö­ vidítik.) A citozin dezaminációja uracilt eredményez, ami a következő replikációban timin beépülését ered­ ményezné a komplementer láncban, a vad típusú gua­ nin helyett (13-13/c ábra). Mivel az uracil idegen nukleotid a DNS-ben, a DNS integritását ellenőrző fe­ hérjék könnyen felismerik. A jelenség arra is magya­ rázatot ad, hogy a DNS-ben miért van timin uracil he­ lyett; enélkül a csere nélkül a dezaminációval megje­ lenő uracilok felismerhetetlenek lennének a DNS-ben előforduló „normál” uracilok mellett, és ez elfogadha­ tatlan mutációs rátához vezetne. Az uracil-guanin mismatch-et (a DNS szerkezeti torzulását) egy N-glikozidáz ismeri fel, és a glikozidos kötést hasítva a bá­ zist levágja a dezoxiribózról. A sejtben számos glikozidáz található a különböző módosult nukleotidok felismerésére és eltávolítására. A hasítást követően egy AP-hely jön létre, a dezoxiribóz-foszfát-vázat egy AP-endonukleáz és a javító DNS-polimeráz AP-liáz aktivitása távolítja el. A létrejövő nukleotidhiányt gap-nek nevezzük, akár egy, akár több nukleotid hiá­ nyáról van szó, és ennek kitöltését az egyik javító DNS-polimeráz végzi úgy, hogy a sértetlen komple­ menterláncot használja templátnak. Az utolsó hiányzó foszfodiészterkötést (nick) a DNS-ligáz hozza létre (13-15. ábra). A nukleotid ki vágásos javítás (nucleotide excision repair, NER) enzimei inkább a kémiai módo­ sulások miatt létrejött nagyobb méretű, több nukleotidot érintő eltorzult DNS-konformációt ismerik fel. Ilyen a DNS-láncon egymás mellett elhelyezkedő pirimidinbázisok között kialakuló ciklobutángyürű (pirimidindimer, timindimer), ami UV-fény hatására jön létre, vagy DNS-adduktok kialakulása miután mutagén molekulák kapcsolódnak a DNS-molekulához (13-14. ábra). A NER enzimei egy 24-32 nukleotidnyi szakasz kivágásával a hibás részt is eltávolít­ ják. A hiányzó szakaszt a replikatív DNS-polimerázok szintetizálják újra, a végeket pedig ismét a DNS-ligáz kapcsolja össze. A DNS kettős szálú törése több szempontból ve­ szélyes. A létrejött szabad végeket nukleázok kezdik

407

13. DNS : G E N O M , R E P L I K Á C I Ó ÉS H I B A J A V Í T Á S

emészteni, és a kromoszóma, ezzel a DNS-ben tárolt információ egy része elveszhet. A hibásan összekap­ csolt DNS-végek a kromoszómák átrendeződését, ese­ tenként hibrid gének kialakulását eredményezhetik. Akettős szálú törés más javító mechanizmust igényel, hiszen ilyenkor nem lehet egyszerűen a hibátlan szál

a \ nem homológ végek összekapcsolása

b

szekvenciája alapján újraszintetizálni a hibás részt. Ehelyett a sejtek kétféle javító mechanizmust aktivál­ hatnak (13-16. ábra). Az egyik mechanizmus a nem homológ végek összekapcsolása (non-homologous end-joining), melynek során a törés két végénél a DNS-t először egy

homológ rekombináció alapú hibajavítás

DNS-lánc kettős törés 3' nukleázok

v 3' ....................................... ............... ........... ..........

..... ■

..........................- 5'

exonukleázok eltávolítják a lelógó végeket 5'i-

13-16. ábra. A nem homológ végek összekapcsolása (a) és a homológ rekombináció alapú hibajavítás (b). A kettős lánctörést követően fehérjék jelennek meg, melyek lefedik a DNS újonnan létrejött végét. A fehérjekomplexben kináz fehérjéket is találunk, me­ lyek aktivációja a komplex kialakulásának függvénye. A kinázok célmolekuláinak foszforilációja és ezt követő aktivációja elengedhetet­ len a repair mechanizmushoz

408

exonukleáz kissé visszaemészti és tompa végeket hoz létre, amelyeket végül a DNS-ligáz kapcsol össze. Ez a mechanizmus csak akkor működik, ha a két DNSfragmentum még közel maradt egymáshoz (ami a viszkózus nukleoplazmában valószínű), és minden­ képpen valamennyi nukleotid elvesztésével jár. A másik javító mechanizmus a homológ rekombi­ náció alapú hibajavítás, amely viszont csak akkor ak­ tiválható, ha a DNS replikációja már megtörtént, így a testvérkromatidák már jelen vannak, de még nem vál­ tak el egymástól, azaz az S-fázisban a már megkettő­ zött szakaszokon, és a G2-sejtfázisban. A javításhoz egy exonukleáz kissé visszaemészti a törött DNS 5’-végeit, majd ezek a törött végű DNS-szálak mint­ egy befurakodnak az ép testvérkromatida DNS-duplex szálai közé, és megkeresik a komplementer sza­ kaszt (13-16. ábra). Kellően hosszú komplementer duplex kialakulása után a törött DNS-véget a javító DNS-polimeráz elkezdi meghosszabbítani, egészen addig, amíg az újraszintetizált DNS-szakasz elér a tö­ rés végéhez. A DNS-ligáció után esetlegesen jelen lévő láncke­ resztezés feloldása a DNS hasításával és újraligálásával történik. A rekombinációval kialakított DNSduplexből nem hiányoznak nukleotidok, vagyis a ho­ mológ rekombinációs javítás nem jár információvesz­ téssel.

I V . A G E N E T I K A I I N FO R M Á C I Ó T Á R O L Á S A É S KI F E) EZŐDÉSE

Klinikai vonatkozások A DNS-repair betegségei. A mismatch repair génjei­ nek mutációja mutatható ki herediter (öröklődő) nonpolyposis coloncarcinomában (HNPCC). Az autoszomális domináns családi halmozódást mutató, fiatal­ korban (50 év alatt) megjelenő coloncarcinoma és a további malignus megbetegedések (ovarium-, endometriumtumorok) a repair hiányában létrejövő geneti­ kai instabilitás következményei. A nukleotid excíziós repairben részt vevő fehérjék génjének inaktiváló mutációja egy ritka, autoszomális recesszív öröklődésmenetet mutató betegséget, a xeroderma pigmentosumot okozza. A betegek extrém érzékenységet mutatnak a nap UV-sugaraira, és a bőr­ tumorok incidenciája többezerszeresére növekszik a kijavítatlan timidin dimérek miatt. A kettős lánctörésben résztvevő fehérjék kóros műkö­ dése a humán tumorok nagy százalékában kimutatha­ tó. Ilyen fehérjéket kódolnak az emlő- és ovariumtumorokban kimutatott BRCA1 és BRCA2 tumorszuppresszor gének.

A fejezet végleges formájának kialakításában nyúj­ tott alkotó közreműködéséért a szerkesztő köszönetét mond Dr. Törőcsik Beátának.

14 .

RNS: TRANSZKRIPCIÓ ES SZABALYOZASA

NAGY L ÁS Z LÓ

14.1

Az eukarióta transzkripció mechanizmusa

14.2

Az új RNS-világ: nem kódoló RNS-ek, mikroRNS-ek, siRNS-ek

14.3

Epigenetikai szabályozás

14.4

Génterápia

422

423

429

A genom legalapvetőbb funkciója annak biztosítá­ sa, hogy a különböző sejtekben és szövetekben, idő­ benés térben szabályozottan fejeződjenek ki a szüksé­ ges fehérje- és RNS-molekulák. Ennek biztosítása a génexpresszió komplex folyamatának a feladata. Agénexpresszió tehát a genomban tárolt információ alapján a funkcionális fehérje- vagy RNS-molekula alakulásáért felelős biokémiai folyamatok összességétjelenti (14-1. ábra). Didaktikai okokból a folyama­ tot szakaszokra bontva tárgyaljuk. A transzkripció fo­ lyamatának leírásában az eukarióta transzkripció ke­ rül részletes bemutatásra.

14.1

409

mitokondriális RNS-polimerázt ismerünk. Az euka­ rióta sejtmagban elhelyezkedő RNS-polimerázok ter­ mékeit a 14-1. táblázat mutatja be, a mitokondriális transzkripció a 15. fejezet végén kerül tárgyalásra. Az RNS-polimerázok DNS-templát alapján, a komple­ mentaritás törvényének megfelelően, a négy ribonukleozid-trifoszfát: ATP, GTP, UTP és CTP felhaszná­ lásával, pirofoszfát felszabadulása mellett, 3’-5’ irányítottságú foszfodiészterkötések létrehozásával szin­ tetizálják a ribonukleotidláncot (14-2/a ábra). Az RNS-polimeráz a DNS-templátot a DNS-polimerázhoz hasonlóan, 3’-»5’ irányban olvassa le, és az RNS-lánc szintézisének iránya 5’->3’, ugyanakkor a

AZ E U K A R I Ó T A TR A N SZ K R IP C IÓ M EC H A N IZ M U SA

14-1. táblázat. Az eukarióta RNS polimerázok lokalizá­ ciója és termékei Polimeráz

Agénexpresszió folyamatán belül a transzkripció a DNS-ről RNS-re történő információátírást jelenti. Atranszkripciót a DNS-függő RNS-polimerázok (to­ vábbiakban: RNS-polimerázok) végzik. Prokariótákban egy RNS-polimeráz található, melynek gátlósze­ rei, a rifamicinek (rifampin) baktericid hatású antibio­ tikumok, melyek többek között a Mycobacterium tuberculosissal szemben hatékonyak (15-5. táblázat). Eukariótákban három nukleáris lokalizációjú és egy

Lokalizáció

Termék

RNS-polimeráz-l (Pol-I)

nukleólusz

preriboszomális-RNS; 28S, 18S és 5.8S rRNS prekurzor

RNS-polimeráz-ll (Polli)

nukleusz

pre-messenger-RNS (hnRNS), miRNS, snRNS

RNS-polimeráz-lll (Pollii)

nukleusz

5S rRNS, tRNS, snRNS

hnRNS, heterogén nukleáris RNS; snRNS, small nuclear RNS; miRNS, mikro RNS; rRNS, riboszomális RNS

I V. A G É N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z ŐDÉ S E

410

DNS-vírus

RNS-vírus

nukleólusz replikáció

rRNS

transzkripció RNS-polimeráz nukleusz

mRNS aminosavak riboszomális alegység

protein

transzlációs faktorok

tRNS transzláció

citoszol

14-1. ábra. A genomban tárolt információ továbbításának áttekintése. A DNS-ben tárolt információ transzkripcióval RNS-molekulákba íródik át. Az RNS-molekulák érésük után a citoplazmába transzportálódnak, a fehérjeszintézis (transzláció) helyére. A transzlá­ cióban részt vevő riboszómák rRNS-molekulái döntő részben a nukleoluszból származnak, ahol az őket kódoló DNS-molekulák találha­ tók. A DNS- és RNS-vírusok a megtámadott sejt apparátusát használják fel genomjuk kifejezésére

5' - CGCTATAGC - 3' 3' - GCGATATCG - 5'

DNS-kódoló szál (szensz, sense) DNS-templát szál (antiszensz, anti-sense)

5' - CGCUAUAGC - 3'

átírt RNS

transzkripció iniciációja, starthely

I +1

— > transzkripció iránya

„felfelé” (upstream)

1 JL_

---------------gének közötti régió

JL promóter

„lefelé” (downstream)

Id

........................................................... ---------------JL JL . átírt régió

A

gének közötti régió

terminátor

14-2. ábra. A nevezéktan alapfogal­ mainak ismertetése, (a) Azt a DNS-szálat, ami az átírt RNS-molekulával komple­ menter, templát szálnak nevezzük. A templát szállal komplementer DNS-szálat kódoló, vagy szensz szálnak nevezik, igya templát szál antiszensz (a szensz szállal szemben helyezkedik el), (b) A transzkrip­ ció iniciációja az ún. starthelynél vagy +1 nukleotidnál kezdődik. Az ettől 5' irány­ ban (felfelé) elhelyezkedő nukleotidokat negatív előjellel írjuk

14. R NS : T R A N S Z K R I P C I Ó ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

szintézis elindítása nem igényel prímért. Az enzimek nagy processzivitásúak (képesek a teljes pre-RNSláncot megszintetizálni, ami elengedhetetlen a funk­ cióképes érett RNS-molekula létrejöttéhez), de nincs 3’-»5’ hibajavító (proofreading) aktivitásuk, így az RNS-polimerázok 104—105 nukleotid beépítésekor át­ lagosan 1 hibát vétenek, szemben a DNS-polimerázok 1hiba/109—1010 nukleotid hibaarányával. Az eukarióta primer transzkriptumok (pre-RNS) különböző mér­ tékű érési folyamatokon mennek keresztül, aminek so­ rán érett, funkcióképes RNS keletkezik. A primer transzkriptumot kódoló DNS-szakaszt egy, a transz­ kripció kezdőpontját kijelölő promóter régió és egy, a transzkripció végpontját kijelölő terminátor régió ha­ tárolja (14-2/b ábra). Az eukarióta RNS-polimeráz a promóterhez kötődő fehérjéket ismeri fel, és a létrejött fehérjekomplexhez kötődik. Transzkripció csak fella­ zult kromatinszerkezetben történhet, így először a fel­ lazult kromoszómaszerkezet kialakulásának feltételeit ismertetjük.

A kromatin szerkezete és funkciói A kromatinszerkezet és a kromoszómakondenzá­ ció alapja az ún. nukleoszómaszerkezet, amelyben a duplaszálú DNS kisméretű, bázikus jellegű (argininben és lizinben gazdag) hisztonfehérj ékből álló dobszerü szerkezetre feltekeredve helyezkedik el a sejt­ magban (14-3. ábra). A nukleoszómaszerkezet átmé­ rője 11 nanométer, és elektronmikroszkópos képe alapján gyöngyfüzér szerkezetnek is nevezik. A nukleoszómaszerkezetben a DNS-nek egy kb. 146 bázis­ pár (bp) hosszú szakasza tekeredik fel a 8 hisztonfehérjéből (hisztonoktamer; 2 H2A, 2 H2B, 2 H3, 2 H4) álló dobszerü, globuláris szerkezetre. A nukleoszóma globuláris részét olyan hosszú DNS-szakasz veszi körül, ami 1,65 fordulatnak felel meg, és a tekeredés iránya balmenetes. Egy nukleoszómában hozzá­ vetőleg 14 kontaktpont van a DNS és a hisztonok kö­ zött, amelyek a DNS kis árkába esnek; e többszörös nemkovalens kölcsönhatás miatt egy nagyon stabil DNS-protein kölcsönhatás jön létre. Fontos tulajdon­ sága a nukleoszómaszerkezetnek, hogy a hisztonok N-terminális végei a szerkezetből kifelé állnak, és így

41 1

alkalmassá válnak poszttranszlációs módosításokra. Ezeknek a módosításoknak a szabályozó szerepét az epigenetika keretében tárgyaljuk. Két nukleoszóma között kb. 50 bp hosszúságú összekötő szakasz (linker DNS) található. A nukleoszómaszerkezet a H 1 hiszton (linker hiszton) kapcsolódását követően tömörül, és 30 nm átmérőjű szolenoid kábelekké alakulhat át, amit további magasabb rendű szerkezetekbe (hurkok) való tömörülés követhet egészen a legkondenzáltabb álla­ potig, a sejtosztódás metafázisában lévő állapotig. Eb­ ben az esetben az összetömörülés és ezáltal a rövidülés 700-szoros, a metafázikus kromoszóma átmérője 1400 nm (14-3. ábra). Ez a szerkezet teszi lehetővé a genetikai anyag kicsiny térfogatban való elhelyezését és azt, hogy ez az információ szükség esetén hozzáfér­ hető legyen. A kromatinszerkezetnek tehát fontos sze­ repe van: 1) a nukleoszómaszerkezet tömörülése, illet­ ve fellazulása, 2) a hisztonok módosítása és 3) a kü­ lönböző, a transzkripciót befolyásoló faktorok kötése szempontjából. Ezekről részletesen szólunk a követ­ kezőkben. A kromatinszerkezet kondenzáltsága alap­ ján megkülönböztetünk eukromatint és heterokromatint. Az eukromatin a lazább gyöngyfüzér szerkezetű kromatint jelenti, melyben a transzkripció megtörtén­ het, míg a heterokromatin a 30 nm-es kromatinkábeleknél tömörebb szerkezetet. A laza kromatinszer­ kezet a génátíródás szükséges, de nem elégséges felté­ tele. Azaz transzkripció elsősorban az eukromatikus régiókban történhet, a kromatin tömörülésével gátlódik, a kromatin legkondenzáltabb állapotában, a me­ tafázikus kromoszómában pedig gyakorlatilag nincs génátíródás. Az aktív, azaz eukromatikus szerkezet ki­ alakításában ún. kromatinszerkezet-átalakító faktorok/komplexek és a transzkripcióban részt vevő egyéb faktorok is szerepet játszanak.

Gének szerkezete, szabályozó szekvenciák A gének átírását elsődlegesen és specifikusan a DNS szekvenciájában és a kromatin szerkezetében lé­ vő információk határozzák meg. A c/sz-elemek olyan nem kódoló DNS-szakaszok, melyek részt vesznek a transzkripció szabályozásában, ilyen a promóter, az enhanszer és a silenszer. Közülük a legfontosabb a

412

IV.

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS KI F E J E Z Ő DÉSE

DNS kettős hélíx

2 nm hiszton oktamer: 2 x H2A/H2B 2 x H3/H4

nukleoszóma (gyöngyfüzér) szerkezet

H1 (linker) hiszton

nukleoszóma

szolenoid 30 nm

kondenzált kromatin

kromoszóma 14-3. ábra. A kromatin szerveződésének szintjei. Részletes magyarázat a szövegben található. Engedéllyel átrajzolva: Tonna S, et al. Metabolic memory and diabetic nephropathy: potential role fór epigenetic mechanisms Natúré Reviews Nephrology 2010; 6:332-341.

promóter, ami nélkül nem lehetséges génkifejeződés. Minden kifejeződő gén esetében megtalálható leg­ alább egy promóter, számos esetben több (alternatív) promótere is lehet egy génnek, amik hozzájárulnak a szövetspecifikus génkifejeződéshez. A promóter a szabályozott géntől 5’ irányban, közvetlenül a transz­ kripciós starthely előtt helyezkedik el, 200-1000 bázispár hosszú DNS-szakasz, és kötőhelyet biztosít a génátíródást szabályozó faktorok számára, ezáltal biz­ tosítva az RNS-polimeráz működésének elindulását.

A promóterhez kötődő faktorok közé tartoznak az alap transzkripciós faktorok (lásd később). A promóter hatása mindig 5’—>3’ irányú. A DNS-molekulában elhelyezkedő szabályozó ré­ giók másik nagy csoportja az ún. enhanszer/silenszer szekvenciák. Ezek a transzkripció starthelyétől 5’ és/vagy 3’ irányban is elhelyezkedhetnek, attól akár 10-100 kilobázisra vagy más kromoszómán is. Attól függően, hogy aktiváló vagy gátló faktorok kötődnek hozzá, nevezzük enhanszemek (enhanszer, aktiváló

14. R N S : T R A N S Z K R I P C I Ó ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

szakasz) vagy silenszemek (gátló szakasz). Az aktiváló/gátló szakaszok hossza 15 bázispártól több száz bp között változik függően attól, hogy hány és milyen minőségű faktor kötődik hozzá.

Transzkripciós faktorok A transzkripciós szabályozás szignál- és szekven­ ciaspecifikus távolra ható (transz) faktorai a transz­ kripciós faktorok. Bár számos módon lehet definiál­ ni ezeket a faktorokat, az általunk alkalmazott definí­ ció szerint a transzkripciós faktorok olyan fehérjék, amelyek közvetlenül és specifikusan kötődnek a DNS-hez, ez a kötés a promóterhez vagy enhanszerhez/silenszerhez történik, ugyanakkor nem a hatás he­ lyén, hanem távol levő géneken szintetizálódnak (transz-hatás), és oda diffúzióval jutnak el. A DNShez történő kötés szekvenciaspecifikus, és általában egy rövid, 6-15 bázispámyi szakaszhoz köthető. Eze­ ket a DNS-szakaszokat nevezzük válaszadó elemek­ nek (response elements, RE). Ezek általában palindromszekvenciák, azaz a DNS két szálán 5’—>3’ irány­ ban olvasva ugyanazt a bázissorrendet találjuk. Ennek megfelelően a transzkripciós faktoroknak kell, hogy legyen DNS-kötő doménjük. Ahhoz, hogy egy fehérje transzkripciós faktorként működjön, szükséges, hogy valamilyen módon szabályozza az RNS-polimerázok működését, azaz a génátíródás sebességét. Ezt a tanszkripciós faktorok valamilyen fehérje-fehérje kölcsönhatáson keresztül érik el, és ezért azt a fehérje­ szerkezeti elemet, ami ilyen kölcsönhatásban vesz részt, transzaktivációs, gátló hatás esetén repressziós doménnek nevezzük. Ezért tehát egy transzkripciós faktornak legalább két fehérjedoménnel kell rendel­ keznie: egy DNS-kötő doménnel és egy transzaktivációs/gátló doménnel. Természetesen a legtöbb transz­ kripciós faktor ennél több szerkezeti elemmel rendel­ kezik, ezáltal különböző szignálok fogadására is al­ kalmas, így bekapcsolja a transzkripciós szabályozás­ ba a különböző szignálokat közvetítő jelpályákat is. Ilyen domének lehetnek poszttranszlációs módosítá­ sokra alkalmas domének, kis molekulák (pl. hormo­ nok) kötésére alkalmas domének, más fehérjékkel va­

41 3

ló kölcsönhatásra specializálódott domének. Ezekre látunk majd példát a továbbiakban. A harmadik fajta fehérje, ami szerepet játszik a transzkripcióban, az a molekula, ami közvetlenül kap­ csolódik az RNS-polimerázhoz vagy az ahhoz kapcso­ lódó transzkripciós faktorokhoz, de nem kötődik köz­ vetlenül a DNS-hez. Ezek tehát a transzkripciós fakto­ rokat befolyásoló faktorok, sok esetben éppen a kap­ csolatot biztosítják egy adott transzkripciós faktor és az alaptranszkripciós-apparátus között. Ezeket a fe­ hérjéket transzkripciós kofaktoroknak hívjuk, és at­ tól függően, hogy aktiválnak vagy gátolnak, koaktivátoroknak vagy kompresszoroknak nevezzük. Ezek a faktorok a legtöbb esetben nagyobb, sokszor több tucat fehérjét tartalmazó komplexek formájában léteznek, amelyek számos különböző funkciójú fehér­ jéből állnak, és így egyfajta információintegrátorként szolgálnak. A következőkben áttekintjük a transzkripciós fak­ torok alaptípusait DNS-felismerő doménjük szerint csoportosítva. A DNS-felismerő domének szerkezeti motívumai, így a cinkujj és leucincipzár domének az 1. fejezetben ismertetésre kerültek, a 14-4. ábrán konkrét transzkripciós faktorokkal szemléltetjük őket. A transzkripciós faktorok tehát definíciónk szerint olyan fehérjék, amelyek közvetlen és specifikus köl­ csönhatásba lépnek a DNS-sel. Az ilyen kölcsönhatá­ sok erre a célra specializálódott fehérjedomének segít­ ségével valósulnak meg, és nem csupán a DNS általá­ nos biokémiai sajátságait ismerik fel, hanem a bázissorrendet is, és ezáltal szekvenciaspecifikus felisme­ rést biztosítanak. Általános elvként elmondható, hogy a transzkripciós faktorok a legtöbb esetben, de nem ki­ zárólag, dimerként kötődnek a DNS-hez. Ez lehet ho­ mo- vagy heterodimer attól függően, hogy önmagával vagy egy másik hasonló, gyakran ugyanabba a fehérjecsaládba tartozó fehérjével képez-e dimert az adott transzkripciós faktor. A másik általános elv, hogy a transzkripciós faktorok és más szekvenciaspecifikus DNS-felismerő molekulák a DNS kettős spirál ún. kis és nagy árkán keresztül ismerik fel a DNS bázissor­ rendjét, ugyanis ezen a részen keresztül érhető el az összes információ, amit a bázisok sorrendje megjele­ nít.

I V.

414

a

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

homeodomén komplex (hélix-kanyar-hélix)

c

b

Myc-Max (hélix-hurok-hélix)

ösztrogénreceptor dimer (cinkujj)

14-4. ábra. Eltérő DNS-felismerő doménekkel rendelkező transzkripciós faktorok kristályszerkezetének modellje. Az áb­ rán a DNS-t bordó, a hozzájuk kötődő fehérjéket kékkel és sárgával jelöltük, (b) a Myc fehérje sárga, a Max fehérje kék színű a képen [A szerkezeti adatbázisban (Protein Data Bank) a kristályszerkezetek (a) 2ME6 (b) 1NKP (c) 1HCQ azonosító alatt találhatók]

A DNS-felismerő domének a fehérjékben a kö­ vetkezők: Hélix-kanyar-hélix. Két alfa-hélix kapcsolódik egymáshoz egy rövid megtöréssel (turn, kanyar) elvá­ lasztva. Az egyik hélix a DNS-szekvencia felismerés­ ben vesz részt. Erre a DNS-felismerő doménre a leg­ többet idézett példa az ún. homeobox fehérjék család­ ja. Ezek a fehérjék az egyedfejlődésben fontos szere­ pet játszanak, és az a feladatuk, hogy biztosítsák a testszelvények polaritását az egyedfejlődés során. A fe­

hérjecsalád szerepét az ecetmuslica genetikai és fejlő­ désbiológiai vizsgálata során ismerték fel, de funkció­ juk magasabbrendüekben is konzervált. Nevüket a homeodoménről kapták, ami egy 60 aminosavból álló konzervált dómén. Ezt a transzkripciós faktor család­ nak minden tagja tartalmazza (14-4/a ábra). A hélixkanyar-hélix szerkezet nagyon hasonlít a bakteriális transzkripciós fehérjék felépítéséhez. Ez is azt mutat­ ja, hogy ezen faktorok működése egy ősi mechaniz­ mus konzervált maradványa.

415

14. RNS: T R A N S Z K R I P C I Ó ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

Hélix-hurok-hélix (helix-loop-helix). Egy rövid a-hélix kapcsolódik egy hosszabb a-hélixhez egy hu­ rokkal (loop). A flexibilitás miatt az egyik hélix visszahajlik a másikra. Képes dimerizálódni, és így felismerni egy adott DNS-szekvenciát. Ilyen domént találunk a Myc transzkripciós faktor családban, mely­ ben mind a helix-loop-helix (HLH), mind a leucincipzár-domén megtalálható (14-4/b ábra). Cinkujj. Talán a legkiterjedtebb DNS-felismerő motívum az emlősök genomjában. Szerkezetileg 2 P-redő és egy a-hélix van a cinkkel stabilizálva. Ez a kapcsolat koordinációs kötések segítségéveljöhet lét­ re: 4 cisztein vagy 3 cisztein és egy hisztidin, olykor 2 cisztein és 2 hiszti din kapcsolódik a cinkhez. A DNSszekvencia felismerése az a-hélixeken keresztül törté­ nik. A szerkezet sajátossága, hogy számos fehérjében több cinkujj motívum is található, ezzel a DNS-kötés specificitása és a kötés erőssége is szabályozható. Ti­ pikus példa a cinkujj at használó transzkripciós fakto­ rokra a szteroid hormonreceptorok családja (14-4/c ábra', lásd még a 18. fejezetben). Leucincipzár. A többi DNS-kötő fehérjénél általá­ ban a dimerizáló és a DNS-kötő rész a fehérje eltérő doménjein található. A leucincipzár esetében ugyanaz ahelikális szerkezet felelős a DNS felismeréséért és a

dimerizációért. Mindkét fehérjelánc alfa-helikális sza­ kaszában minden hetedik aminosav leucin. Ezek egy­ más alá kerülve egy hidrofób élt hoznak létre. Az egy­ mással szemben lévő hidrofób leucinoldalláncok biz­ tosítják a dimerizációt. A leucincipzár transzkripciós faktorok heterodimereket is képezhetnek, ami által transzkripciós faktor komplexek jöhetnek létre (lásd 1. fejezetben).

A pre-mRNS transzkripciója A transzkripció folyamatai közül az egyik legjob­ ban tanulmányozott és ismert rész a messenger RNS (mRNS) transzkripciója. A folyamat megértéséhez is­ mernünk kell a tipikus mRNS-ek szerkezetét. A 14-5. ábrán látható, hogy a DNS-ről történő átírás után egy ún. prekurzor mRNS [pre-mRNS, avagy heterogén nukleáris RNS (hnRNS)] keletkezik, ami tartalmazza az exonokat (az érett mRNS-ben megtalálható régiók, melyek nukleotid tripletek formájában kódolják az aminosavakat), az intronokat (az exonok között talál­ ható nem kódoló régió) és az ún. 5’, illetve 3’ nem kó­ doló régiókat (untranslated region, UTR). A premRNS érése során az intronok kihasadnak, a pre-

UAG AUG \ / exon 1 hnRNS

intron

exon Á /

\

/ \ /

5' l____ 5' UTR

l_____________________ J 3' UTR

14-5. ábra. A hnRNS szerkezete. A DNS-molekuláról átírt régió a következő elemeket tartamazza 5'->3' irányban: 5' nem kódoló ré­ gió(5'-UTR), start kodon (AUG triplet, amelynek a DNS kódoló szálán található megfelelője az ATG triplet), az érett mRNS-molekulában benne maradó exonokat, a hnRNS-ből az érés során kivágódó intronokat, a STOP kodont (az ábrán az UAG triplet, de két további stop kodont ismerünk, lásd 15. fejezet) és 3' nem kódoló régiót (3'-UTR)

416

I V . A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

mRNS 5’-és 3’-vége módosul. A kialakuló érett mRNS tartalmazza az exonokat és az 5’- és 3’-végen elhelyezkedő nem kódoló régiókat. Utóbbiaknak fon­ tos szabályozó szerepük van, amiről később még ej­ tünk szót. Az eukarióta mRNS szintézisét az RNS-polimeráz-II végzi (14-1. táblázat). Egy adott gén átíródása a DNS-ről az ún. transzkripciós starthelyen kez­ dődik (14-2., 14-5. ábra). Miért éppen ott kezdődik az átírás? A DNS-t a transzkripciós starthely előtt 5’ irányban megelőzi a speciális szekvenciákat tartalma­ zó promóter, amit az ún. alap transzkripciós faktorok ismernek fel. Ilyen például az ún. TATA-szekvencia, angolul TATA-box, amit a TBP (TATA binding pro­ tein, TATA-kötő fehérje) ismer fel (14-6. ábra). Ezt követi számos más alap transzkripciós faktor kötődé­ se, amelyek együttesen a TFIID komplexet alkotják. Ezen faktorok közül nem mindegyik kötődik közvet­ lenül a DNS-hez, hanem fehérje-fehérje kölcsönha­ tásokon keresztül fehéijekomplexek jönnek létre. To­ vábbi faktorkomplexek (TFII E, F, FI) bekötődése után kialakul az a komplex, ami már lehetővé teszi, hogy az RNS-polimeráz-II felismerje a kötőhelyet, és a promóterhez kapcsolódjon a már odakötődött fehér­ jéken keresztül. Fontos megjegyezni, hogy eukariótákban nem a DNS-t ismeri fel az RNS-polimeráz-II, hanem az ahhoz kötődő faktorokat, és azokhoz kap­ csolódik. Ezt a lépést (RNS-polimeráz-II bekötődése) további faktorok és fehérjekomplexek csatlakozása követi. Ezek közül megemlítjük az ún. mediátor komplexet, ami legalább 30 fehérjéből áll, és kapcso­ latot biztosít az enhanszerhez kötődő szekvencia- és szignálspecifikus transzkripciós faktorok, valamint az alap transzkripciós faktorok között (14-6. ábra). Ezen

enhanszer

fehérje-DNS és fehérje-fehérje kölcsönhatások ered­ ményeként létrejön a stabil preiniciációs komplex. A TFIIH komplex foszforilálja az RNS-polimeráz-II-t, és ezzel a promóter elhagyására és elongációra, a DNS-ben kódolt informácó RNS-láncba történő átírására készteti. Fontos megjegyeznünk, hogy az ún. alap transzkripciós faktorok szintje állan­ dó a sejtekben, mivel kifejeződésük, szintjük nem áll szabályozás alatt. Ezzel szemben a szignál- és szek­ venciaspecifikus transzkripciós faktorok általában szigorú transzkripciós és sokszor posztranszlációs szabályozás alatt is állnak. Az mRNS szintézisének terminációját az mRNS 3’-végén a szekvenciában kó­ dolt hasítási és poliadenilációs szignál elérése indítja be, de ezek a lépések már az mRNS processzálásához tartoznak.

Az mRNS elongációja, érése és transzportja A transzkripció elindulása után az RNS-lánc meghosszabítását elongációnak nevezzük. Az euka­ rióta messenger RNS pre-mRNS, más néven hetero­ gén nukleáris RNS (hnRNS) formájában íródik át a DNS-ről, amelybe intronok és exonok egyaránt máso­ lódnak. Eközben a transzkripciós komplex stabilitását biztosítani kell. Ezt a feladatot látják el az elongációs faktorok (TFIIF, ELL, elongin), melyek működésével részletesen nem foglalkozunk. Az mRNS érés (processzálás) során kialakuló mó­ dosítások az mRNS stabilitását biztosítják, illetve azt szabályozzák. Az 5’-végre már az elongáció alatt egy

14-6. ábra. Az eukarióta transzkripciós iniciációs complex. Részletes magyarázat a szövegben található. RE: válaszadó elem (response element); TBP, TATA-kötő (binding) fehérje; TFIID, alap transzkripciós faktor IID; HE, IIF, UH; alap transzkripciós faktor IIE, IIF, IIH TFIID RNS-polimeráz-II

enhanszer

promóter

41 7

14. RNS: T R A N S Z K R I P C I Ó ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

ún. cap (sapka) struktúra kerül (14-7. ábra). A capképződést végző, bifünkcionális mRNS-capping en­ zim trifoszfatáz aktivitásával lehasítja az 5’-vég y-helyzetü foszfátját, majd guanilil-transzferáz aktivi­ tásával pirofoszfát lehasadása mellett GTP-ből GMP-t alakít ki, ami 5’-5’-trifoszfát-kötéssel kapcsolódik az 5’-véghez (14-7/a ábra). Ez a különleges kötés rend­ kívül ellenállóvá teszi az mRNS-t a nukleázokkal szemben. Az 5’-véghez kapcsolódott guanozin metilálódik [7-metilguanozin (7 mG) alakul ki], emellett további metilációs lépések történnek az első és máso­ dikkódolt nukleotidon (14-7/b ábra). Az így kialakult metilációs kódnak szerepe van az mRNS magból tör­ ténő transzportjában, és a transzlációs iniciációs fak­ torokkötődésében a transzláció mechanizmusa során. A processzálás további lépése a splicing, ami azt jelenti, hogy az átírt intronok kivágódnak, és ezúton eltávolítódnak, míg az exonok egymáshoz kapcsolód­ nak (14-8. ábra). A folyamat rendkívüli pontosságú

RNS 5'-vég

kell, hogy legyen, hiszen egyetlen extra vagy hiányzó nukleotid megváltoztatja a tripletek leolvasási keretét (lásd később). A különböző gének különböző számú exonból állhatnak, és az egyes exonok hossza is eltérő. Az emberi genomban az átlagos exonhossz néhány száz bázispár, az átlagos intronhossz pedig néhány ezer bázispár, de a különbségek az egyes gének között óriásiak. A splicing legfőbb faktorai a U l, U2, U4, U5, U6 snRNSek (small nuclear RNA). Ezek fehérjé­ vel kapcsolódva hozzák létre az snRNP-ket (small nuclear ribonucleoprotein). Az snRNP-k további fe­ hérjékkel kapcsolódva egy komplexet hoznak létre, ami a splicingért felelős, ez a spliceosoma. Ez a komp­ lex hajtja végre az intron kivágását. Az intronok 5’- és 3’-végén konzervált szekvenciamotívumok találha­ tók, melyek a splicingot lehetővé teszik. A legtöbb mRNS intron GU-val kezdődik és AG-vel végződik. Az intronon belül egy, az intron ki­ vágásában központi szerepet játszó adenin (elágazási

b

pppNp

f trifoszfatáz I k CD

5'-5'-trifoszfátkötés

O C) Q. C L T 0O c;zh: 01

E

7-metilguanozin

PPNp GTP

(guanilil-transzferáz

z' PP.

GpppNp]^

0‘—p = o

• SAM guanin-7metiltranszferáz

N vsah

m'GpppNp

1___ )

első kódolt nukleotid

7-metilguanozin

14-7. ábra. Az 5’cap-képződés (a) és a cap-struktúra szer­ kezete (b). Részletes magyarázat a szövegben található. SAM, S-adenozil-metionin; SAH, S-adenozil-homocisztein. Engedéllyel átrajzolva: Bentley DL, Coupling mRNA Processing with transcription in time and space. Natúré Reviews Genetics 2014; 15:163-175.

második kódolt nukleotid

IV.

418

elágazási pont

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő DÉSE

hatására ugyanabból a hnRNS-molekulából eltérő exonok kerülhetnek a OH végső, érett mRNS-be. így egy génről exon 1 - A — [YAG pre-mRNS exon 2 iintron különböző fehérjék jöhetnek létre, ami U1 ! Q nagymértékben megnöveli az eukarió3' splice hely U4 U5 ta fehérjék sokféleségét anélkül, hogy a gének számát növelni kellett volna. Ezt nevezzük alternatív splicingnak, 1. transzészterifikáció U1 i U4 ami nagyon jelentősen kiterjeszti a ge­ nom kódoló erejét. A mRNS 3’-végének védelmét a poszttranszkripcionálisan felkerülő 3’-poli(A)-farok biztosítja (14-9/a áb­ ra). Az RNS szintézise során a polimeráz áthalad egy poliadenilációs szignál szekvencián, ami jelet ad a po­ 2. transzészterifikáció liadenilációs fehérjekomplex felépülé­ U122 05 U6 sére a szintetizálódó láncon. A komp­ lex fehérjéi közé tartozik a vágást sti­ muláló faktor (cleavage stimulating eltávolított intron mRNS factor, CstF), valamint a vágó és poli­ YAGp mRNS exon 1 P exon 22 adenilációs faktor (cleavage and poliadenylation factor, CPF). A komp­ 14-8. ábra. A splicing mechanizmusa. A konzervált szekvenciamotívumokat lex elhasítja az RNS-t, majd az RNS pirossal jelöltük. A nukleofil támadást követően (szaggatott nyíl) az intron jelleg­ zetes lasszó-formátumot vesz fel. p, foszfodiészter kötés; Y, pirimidin nukleotid; hasítása után a poli(A)-polimeráz ATP U1, 2, 4, 5, 6: snRNP-k (small nuclear ribonucleoprotein). Engedéllyel átrajzolva: felhasználásával megszintetizálja a Bentley DL, Coupling mRNA processing with transcription in time and space. Natúré Reviews Genetics 2014; 15:163-175. poli(A)-farkat, mely 50-250 adenilátból áll. A poli(A)-polimeráz egy pri­ merfüggő, de templátfüggetlen RNSpont) és tőle 3’ irányban többnyire egy polipirimidin polimeráz, mely primerként az elhasított RNS 3’-vérégió helyezkedikel. A spliceosoma felületén az el­ gét használja. ágazási pontban lévő adenin nukleofil támadást indít A transzkripció és az RNS érése funkcionálisan az intron 5’-vége ellen (5’-splice hely), emiatt az nagymértékben integrált folyamat, s az RNS érése már 5’-vég elhasad, és 5’-2’-foszfodiészter-kötés alakul ki a szintézis közben elkezdődik. A capping faktorok, a (első transzészterifikáció). Ezt követően az első exosplicing faktorok már az mRNS szintézise közben non keletkezett szabad 3’-OH-vég indít nukleofil tá­ kapcsolódnak az RNS-hez és aktiválódnak. A polimadást a 3’-splice hely ellen, így lezajlik a második adenilációért felelős fehérjék szintén az RNS-polimetranszészterifikáció, s ezzel az exonok „összecsomórázhoz kapcsolódva keresik az mRNS-en a termináció zódnak”, az intron kivágódik. szignálszekvenciáit. Az intronok számának növekedésével egyben a le­ Az mRNS-ek bázisai az átírás és processzálás után hetséges splice helyek száma is emelkedik. Ebben az módosulhatnak, ezt nevezzük RNS-szerkesztésnek esetben fontos a megfelelő hasítási hely kiválasztása, (RNS-editing) (14-9/b ábra). Különböző szerkeszamit speciális fehérjék (SR - konzervált szerin és artő/editing mechanizmusok léteznek a sejtben, így ginin aminosavakat tartalmazó fehérjék) segítenek. citozinról uracilra (C-ET) vagy adeninről inozinra (A-I) A különböző szövetekben, különböző körülmények módosulhat a nukleotid az adott pozícióban. A C-U 5' splice hely

polipirimidin-régió

419

14. RNS: T R A N S Z K R I P C I Ó ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

exonukleáz degradálja a poli(A)-farkot, amit az 5’-cap eltávolítása követ egy decapping enzimmel. Cap nélküli mRNS nem transzlálódik, így sorsa a teljes degradáció 5’—>3’ exonukleázok által.

editálás (dezaminációval) egyik fontos példája az apoB48 fehérjét kódoló mRNS létrejötte (lásd 8. feje­ zet). Az A-I szerkesztés következében pl. az AMPA receptorok egyik alegysége glutamin helyett arginin aminosavat tartalmaz, ami a receptor megváltozott Ca2+-permeabilitásához vezet.

Klinikai v o n a tk o z á so k

a

L L . .......................

3'

AAUAAA v'— -----

Az snRNP-k felfedezése és a splicingban betöltött szerepük igazolása beteganyagok vizsgálatával kezdődött. A szisztémás lupus erythaematosus (SLE) autoimmun betegségben a betegek szérumában képző­ dő egyes autoantitestek snRNP-khez kö­ tődnek, és meggátolják azok működését.

Az mRNS stabilitását meghatározó tényezők Az eukarióta sejtekben az mRNS fél­ életideje általában hosszabb, mint a prokarióta mRNS-eké; emlősöknél ez átlagban néhány óra. Eukariótákban többféle módon degradá­ lódnak az mRNS-ek: 1. Exoszóma által: ez egy több fehérjéből álló komplex, 3’—>5’ irányban bontja az RNS-t (3 >5’ exonukleázaktivitás). Először élesztőben írták le, magasabbrendüekben az a feladata, hogy a sejtma­ got ne hagyja el poli(A)-farok nélküli mRNS [kivételt jelentenek a hiszton mRNSek, amelyek nem rendelkeznek poli(A) véggel], 2. Deadenilációfiiggő decapping: a poli(A)-kötő fehérje - ami stabilizálja az mRNS farkát - elvesztése után egy

5' [

[AAUAAA

—AAA(A)n — OH (3')

b

adenozin \

J v /

14-9. ábra. A poli(A)-farok sz in té zise (a) és az m R N S -ed itálás (b).

(a) A poliadenilációs szignálszekvencia (AAUAAA) után az RNS elhasad és létrejön poszttranszkripcionális módosítások hatására a 3' poli(A) farok. CstF, cleavage stimulating factor; CPF, vágó és poliadenilációs faktor (cleavage and poliadenylation factor). Engedéllyel átrajzolva: Bentley DL. Coupling mRNA processing with transcription in time and space. Natúré Reviews Genetics 15, 163-175 (2014) (b) Az adenin dezaminációját inozinra egy RNS-molekulákra specifikus adenozin-dezamináz (adenosine deaminase acting on RNA, ADAR) enzim végzi, mely kettősláncú RNSmolekulát ismer fel szubsztrátként. Az ADAR enzim által felismert régió az ábrán kékkel van jelölve

420

A riboszomális RNS (rRNS) transzkripciója és érése Az eukarióta riboszómák érésének helye a nukleólusz (14-10. ábra). A riboszómák rRNS-komponensei az 5S, 5,8S, 18S és 28S rRNS-molekulák. Az 5S RNS-t az RNS-polimeráz-III írja át, és változatlan formában, érési folyamatok nélkül transzportálódik a nukleóluszba. Az 5,8S, 18S, 28S rRNSek egy nagy­ méretű primer transzkriptum formájában íródnak át (47S pre-rRNS), amiből kihasadnak, és további érési

I V.

A GENETIKAI

IN F O R M Á C

I Ó T Á R Ó L Á S A ÉS KI F E) E Z Ő D ÉSE

folyamatokon mennek keresztül, mielőtt elnyerik vég­ leges szerkezetüket. Az rRNS-ek processzálását a kis nukleoláris RNS-ek (snoRNS) végzik fehérjékkel kapcsolt formában (snoRNP).

Az S, a Svedberg-egység (szedimentációs koefficiens) rövidíté­ se, az anyag ülepedésének mértékét mutatja, és az ultracentrifuga feltalálójáról nevezték el. A szedimentációt több tényező befolyá­ solja (tömeg, forma), ezért az S értékei nem additívak (pl. a riboszó­ mák esetében az eukarióta kis alegység 40S, a nagy alegység 60S, míg a riboszóma maga 80S méretű).

14-10. ábra. Az eukarióta riboszóma képződése. Az eukarióta riboszómák rRNS-komponensei közül az 5,8S, 18S, 28S rRNSek egyn méretű pre-rRNS transzkriptum formájában íródnak át. Az érésükhöz szükséges snoRNS-eket az RNS-polimeráz-ll (Pol-ll) írja át. Az ér' rán a pre-rRNS-ből kihasadnak az 5,8S, 18S, 28S rRNSek, és további érési folyamatokon mennek keresztül, mielőtt elnyerik végleges sze zetüket Az RNS-polimeráz-ll írja át a riboszomális fehérjéket és a riboszómák összeszereléséhez szükséges faktorok mRNS-ét is. Ezé mRNS-ek a citoplazmába transzportálódnak, majd a róluk transzlálódott fehérjék visszajutnak a sejtmagba, a riboszóma-alegységekö szerelésének helyére. A pre-rRNS-t kódoló gének clusterekben tandem módon ismétlődve helyezkednek el az akrocentrikus kromosz' rövid karján, köztük ún. spacerek helyezkednek el, melyen nem íródnak át. Ez a nucleolar organizer region (NOR), amely köré a nukle' szerveződik. Átrajzolva engedéllyel: Lafontaine DL), Noncoding RNAs in eukaryotic ribosome biogenesis and function Natúré Structu Molecular Biology 2015; 22:11-19.

421

14. RNS: T R A N S Z K R I P C I Ó ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

Atranszfer RNS transzkripciója és érése A transzfer RNS-eket (tRNS) az RNS-polimerázIII írja át. A tRNS érése során 5’-, illetve 3’-vég elha­ sad, a hasítást RNázok végzik. Az 5’-véget hasító RNáz-P egy ribonukleoprotein, egyike az elsőként fel­ fedezett ribozimoknak. A 3’-végre hasítás után kerül a CCA-vég, melyhez az aminosavak kötődnek a transz­ láció során (lásd 15. fejezet). A 3’-CCA-vég csak a hi­ bátlan térszerkezetű tRNS molekulákra kerül rá. Egyes tRNS-molekulák intront tartalmazhatnak, amely az érés során kihasad. A tRNS nagy mennyisé­ gű módosult bázisa szintén poszttranszkripcionálisan alakul ki (14-11. ábra).

RNS-transzport a magból a citoplazmába Az eukarióta RNS-ek folyamatosan transzportálódnak a sejtmaghártya pórusain keresztül a citoplaz­ mába. Az mRNS csak a splicing elkészülte után válik

5'Ü i

késszé a transzportálásra. Mivel csak a teljesen pro­ cesszált mRNS kerülhet ki a citoplazmába és íródhat át fehérjévé, ezért számos mechanizmus biztosítja, hogy csak minden részében érett mRNS kerüljön ki. Ezek olyan RNS-fehérje kölcsönhatások, amelyek so­ rán az adott fehérje felismeri az mRNS bizonyos ré­ szét pl. cap, poli-A-farok, exon, és csak az az mRNS jut ki a sejtmagból, amelyik ezekkel a fehérjékkel komplexet képez. Ilyen módon biztosítható, hogy „éretlen”, azaz nem teljesen processzált mRNS ne jus­ son ki, és így ne keletkezzen értelmetlen fehérje a sejt­ ben. Az RNS-ek transzportja a citoplazmába energiaigényes folyamat. Történhet a kis GTP-kötő Ran fe­ hérje közvetítésével, ebben az esetben az energiát a Ran fehérjéhez kötött GTP hidrolízise biztosítja. (A transzport részletei a 15. fejezetben olvashatók, a GTP-kötő fehérjékről a 17. fejezetben szólunk.) A transzport történhet Ran fehérjétől független mó­ don, ebben az esetben az ATP biztosítja az energiát. A transzportot karioferinek segítik, melyek funkcio­ nálhatnak exportinként és importinként is. Ezek

u A U C A G !U u A A U U

14-11. ábra. A pre-tRNS érés lépé­ sei. A pre-tRNS 5:-végének hasítását az Rnáz-P-ribozim végzi, a 3’-vég hasítását az Rnáz-D (ami fehérje alapú enzim). A3'-végre, szintén enzimatikus aktivi­ tás eredményeként rákerül a CCA-vég. Egyes tRNS-ek intront tartalmaznak (az ábrán kék színű), mely az érett RNS-ből kihasad. A nukleotidok poszttransz­ kripciós módosításának eredménye a módosult bázisok (az ábrán sárga szín­ nel), így a dihidrouridin (D) vagy pszeudouridin ('¥) kialakulása is

antikodon hurok

érett tRNS

pre-tRNS

422

I V . A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

általában az RNS-hez kötött fehérjét ismerik fel, megkötik és elősegítik az átjutását.

14.2

A Z ÚJ R N S - V I L Á G : NEM K Ó D O L Ó R N S -EK , m ik ro R N S -E K , siR N S -E K

A genomprojektek, azaz az egyes organizmusok genomjának szekvenálása és az azt követő kísérletes munka azzal a meglepő felismeréssel járt, hogy a fehérjekódoló gének az emberi genom esetében a teljes szekvenciának kevesebb mint 2%-át adják. Ezzel szemben a genom egy jelentős része átíródik RNS-be, és különböző, ún. nem kódoló RNS-ek formájában funkciót tölt be a sejt működésében (14-2. táblázat). Ezt a felismerést úgy is szokták jellemezni, hogy egy „új RNS-világ” tárult fel, ami más megvilágításba he­ lyezi az RNS-molekulák szerepét. Ezért érdemes átte­ kinteni a nem kódoló RNS-ek csoportjait és funkcióit, különös tekintettel azokra az új RNS-típusokra, ame­ lyek jelentősége az utóbbi években vált világossá. A nem kódoló RNS-ek csoportjába tartoznak a ribo-

14-2. táblázat. A humán kódoló (mRNS) és nem kódoló RNS-ek szerepe Osztály

Rövidítés

Funkció

hírvivő, messenger RNS

mRNS

fehérjekódolás

riboszomális RNS

rRNS

a riboszóma strukturá­ lis és funkcionális (ka­ talitikus) része

transzfer RNS

tRNS

adapter szerep a transzlációban

kis magi (small nuclear) RNS snRNS

pre-mRNS-érés

kis magvacskai (small nudeolar) RNS

snoRNS

rRNS érés

hosszú nem kódoló (long noncoding) RNS

IncRNS

kromatinmodifikáció

mikro-RNS

miRNS

mRNS degradáció, transzláció gátlás

small interfering RNS

siRNS

poszttranszkripcionális géncsendesítés

PlWI-interacting RNS

piRNS

a genom integritásá­ nak védelme

szórna szerkezeti felépítéséhez nélkülözhetetlen RNSek (a riboszomális RNS-ek), a fehérjeszintézis eseté­ ben az aminosavak szállításáért felelős transzfer RNSek, a splicing-ban szerepet játszó kis nukleáris RNSek, a kromoszómák végének szerkezetét meghatározó telomeráz RNS-ek, a kromatin szerkezetét meghatáro­ zó, az X kromoszóma inaktiválásához elengedhetetlen Xist RNS-molekula, vagy a fehérjék ER-be történő transzportját segítő szignálfelismerő partikulumban található RNS. Az utóbbi időben egy teljesen új csoport, a kis reguláló RNS-ek kerültek a kutatások középpontjába. A kis reguláló RNS-ek közé tartoznak a mikroRNS-ek (miRNS). Ezek rövid, általában duplaszálú RNSintermedieren keresztül fejtik ki hatásukat, és a génki­ fejeződés gátlásában van jelentős szerepük. A miRNS-ek prekurzorát, a pri-miRNS-t - a fehérje­ kódoló RNS-ek átírásáért is felelős - RNS-polimeráz-II írja át (14-12. ábra). Ezután a Drosha fehérje ál­ tal egy hajtű szerkezetű RNS hasítódik ki, amit premiRNS-nek nevezünk. Ez a folyamat a sejtmagban játszódik le, ahonnan az exportin-5 fehérje segítségé­ vel a pre-miRNS kijut a citoplazmába. Ott a Dicer fe­ hérje a hajtű szerkezetű RNS-molekulából egy dupla­ szálú RNS-molekulát hoz létre, ami a RISC nevű (RNA Induced Silencing Complex) komplexre kerül. A duplaszálú (szensz és antiszensz szálat is tartalma­ zó) molekulából a komplex AGO (Argonaute) fehér­ jéje alakítja ki az egyláncú, anti-szensz RNS-mole­ kulát, ami a komplementaritás szabálya alapján kötő­ dik a cél-mRNS-hez. A kötődés a cél-mRNS molekula transzlációjának gátlásában vagy annak lebontásában nyilvánul meg, attól függően, milyen mértékű a szek­ venciaazonosság a miRNS és cél-mRNS molekulája között. Ezzel a mechanizmussal a fehérjeszintézis fi­ nomszabályozása valósul meg. A miRNS-ek jellegze­ tessége, hogy több gén szabályozásában is részt tud­ nak venni. Célpontjuk a szabályozott mRNS 3’-UTRrégiója. Egy különleges formája a kis RNS-en alapuló sza­ bályozásnak az ún. PIWI interacting RNS-ek (piRNS), amelyek hosszú, egyszálú RNS-ből jönnek létre, és gátolják a csírasejtekben és az őssejtekben a mobilis genetikai elemek, a transzpozonok vándorlá­ sát.

14. RNS: T R A N S Z K R I P C I Ó ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

I

423

> ( Pol-ll )

V pre-miRNS (exportin-5)

pre-miRNS

nukleusz

—

C

s n

cltoplazma

Dicer

Q

I Dicer

írn iT V

miRNS út

4 lllllllllllllllllllll lllllllllllllllllllll

4 14-12. ábra. Az miRNS út. Részletes magyarázat a szöveg­ ben található. Az mRNS degradáció helye az ún. P-test [„mRNA Processing body (P body)] Pol-ll, RNS-polimeráz-ll; RISC, RNA Induced Silencing Complex; AGO, Argonaute; UTR, untranslated region. Engedéllyel átrajzolva: Antonin F, et al. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics Natúré Reviews Drug Discovery 2007; 6:443-453.

14.3 EPIGENETIKAI SZABÁLYOZÁS A következőkben összefoglaljuk az epigenetikai szabályozás alapelveit és biokémiai mechanizmusait. Az epigenetika azoknak a mechanizmusoknak az összefoglaló neve, amelyek eredményeként megfor­ dítható, öröklődő változások jönnek létre a génkifeje­ ződésben, ami a DNS bázissorrendjének (genotípus) megváltozása nélkül valósul meg.

transzláció repressziója mRNS-degradáció

Egy alkalmas példa a jelenség érzékeltetésére az, hogy a többsejtű szervezetekben a sejtidentitás fenn­ tartása az öröklődő celluláris memórián alapszik. Ez a memória epigenetikus markerek formájában tároló­ dik. Kiindulva az embrionális őssejtből, a differenciá­ lódás során különféle génexpressziós programok akti­ válódnak, amelyek meghatározzák a sejtek fejlődésé­ nek irányát. A sejtek identitása sok esetben a korai embriogenezis során rögzül, és ez akár az élet végéig is fennmarad változatlan formában.

424

I V . A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

Az epigenetikai mechanizmusokat a kromatinszerkezet ismeretében lehet értelmezni, s két részre oszthatjuk aszerint, hogy a kromatinszerkezet fehérje­ komponenseit vagy a DNS-t magát érintik. Ennek megfelelően ezt a két mechanizmust külön tárgyaljuk.

át, amelyek a fehérjék (elsősorban a H3 és H4 hisztonok) N-terminális részét érintik. A legfonto­ sabb posztranszlációs módosítások a foszforiláció, acetiláció, metiláció. Az acetiláció és a metiláció a lizinoldalláncokat érinti, míg a foszforiláció a szerinoldalláncokon történik. Ezen kívül ubiquitinációt is lehet detektálni bizonyos lizinoldalláncokon, amelyeknek szabályozó szerepe van, és nem vezet a fehérje proteolitikus degradációjához. Nyilvánvalóan egyszerre több aminosav is módo­ sulhat egy N-terminális végen, és ezen módosítá­ sok együttesét egy kódként is értelmezhetjük. Azaz egy adott nukleoszóma esetében meghatározható, hogy milyen módosításokat tartalmaz. Ez jelzi, hogy milyen módosító fehérjékkel lépett kapcso­ latba az adott nukleoszóma, és így mintegy dekó­ dolható, hogy milyen fehérjékkel léphet kapcsolat­ ba. A könnyebb érthetőség kedvéért azokat a fehér­ jéket (enzimeket), amelyek a módosításokat vég­ zik, az epigenetikai kód íróinak, azokat a fehérjé-

A kromatinstruktúra és a nukleoszómaszerkezet szabályozása Az előzőekben tárgyalt kromatinszerkezet és a kromatin tömörülése vagy fellazulása nagymértékben meghatározott, illetve befolyásolt epigenetikai me­ chanizmusok által. A kromatinszerkezetet meghatározó tényezők a következők: 1. Hisztonmódosítások (poszttranszlációs kovalens módosítások) (14-13. ábra). A hisztonfehérjék kü­ lönböző poszttranszlációs módosításokon eshetnek

Me Me

ACi Me'

AC

r

Me

AC;

Me

ll

|1

r

1718

23

Me

Me

AG Me

'imtieSP

i

I

ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPH 2

4

910

14

262728

hiszton H3

36

135 aa

79

ACi

ACj

ACi

y Me

I

I

AC;

I

r

SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLAR

— hiszton H4

1

i

r

£

í

O

>■

■' ■'■ ■■■■■ ■

ACi

ACi

N— SGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNY — hiszton H2A

1

102 aa

129 aa

119

ÁCi

I

iA ű Y

I

N — PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDSKKRKRSRKESYSV

£

hiszton H2B

125 aa

120 Q J foszforiláció

ACi | acetiláció

Me [ metiláció (arginin)

Mej I

Me metiláció f metiláció (aktiváló lizin) (gátló lizin)

0Y

ubikvitináció

14-13. ábra. A hisztonok legismertebb posztranszlációs módosításai. A hisztonfehérjék N-terminálisán található aminosavakat egybetűs aminosavkóddal jelöltük. A módosított aminosavak esetében feltüntettük a módosítás típusát, illetve, hogy az N-terminálistól számítva hányadik aminosav módosult

14. RNS: T R A N S Z K R I P C I Ó ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

két, amelyek leolvassák, a kód olvasóinak nevez­ zük. Azokat a fehérjéket (szintén enzimeket) pe­ dig, amelyek eltüntetik (levágják) a módosításokat, a kód törlőinek vagy radírjainak nevezzük. így felépül egy komplex rendszer, ami posztranszlációs módosítások által megváltoztatja a hisztonfehérjéket, és ezáltal meghatározza a kromatin szerkezetét - közvetlenül, a nukleoszómafehérjék töltése, biofizikai, biokémiai sajátságainak módo­ sítása által, illetve közvetetten, a leolvasó fehérjék kötődésének meghatározása által. Az egyes módo­ sítások és így a hisztonkód értelmezése egyelőre még nem egységes (14-14. ábra), ezért most csak egyetlen poszttranszlációs hisztonmódosítás szere­ pét tárgyaljuk részletesen: a hisztonok lizin-oldalláncának acetilációját, amelynek szerepe egyértel­ művé vált az elmúlt években végzett kutatások ál­ tal. A hisztonok lizinen történő módosítása a töltés­ viszonyok megváltozása miatt a kromatinszerkezet fellazulásához vezet, azaz közvetlenül hozzájárul-

a kanonikus nukleoszóma

b

H3.3 nukleoszóma

425

f génaktivátor odavonzza a hiszton-aciltranszferázt

géngátló vagy represszor odavonzza a hiszton-deacetilázt

14-14. ábra. Az acetilált hiszton szerepe a génaktiválás­ ban. HAT, hiszton-acetiltranszferáz; HDAC, hiszton-deacetiláz; AC, acetiláció; UAS, upstream activator sequence (enhanszer); URS, upstream repressor sequence (represszor)

hat a nyitottabb kromatinszerkezet kialakulásához. A módosítás írói a hiszton-acetiltranszferázok (HAT), míg a módosítás olvasói az acetilált lizi-

c

CENP-A nukleoszóma

14-15. ábra. Kanonikus (a) és hisztonvariánsokat (b és c) tartalmazó nukleoszómák. A nukleoszómák egymás alatt felül- és ol­ dalnézetből láthatók, a H3 hiszton piros, a H4 hiszton zöld, a H2A hiszton kék, a H2B hiszton sárga, a DNS szürke színű. A H3 és a H4 hisz­ ton N-terminális részét (melyeken a poszttranszlációs-módosítások nagy része található) az ábrán zöld és piros körök jelölik. Az ábra „b" részén a H3.3 hisztonvariánsok sötétrózsaszínnel vannak jelölve. A H3.3 hiszton variáns öt aminosavban különbözik a kanonikus H3 hisztonvariánstól, melyek direkt interakcióba lépnek a H4 hisztonnal („b" ábra négyzetekben kiemelt részei). Az ábra „c" részén a centromerspecifikus CENP-A világos rózsaszín. A CENP-A a DNS egy kisebb darabjához kötődik (kb. 121 bp szemben a szokásos 147 bp DNS-sel). Engedéllyel átvéve: Melters DP, et al, Chromatin Dynamics in Vivő: A Game of Musical Chairs. Genes 2015; 6(3):751-76.

426

neket felismerő, ún. bromodomént tartalmazó fe­ hérjék. Ezeken keresztül kromatinátalakító, ún. remodelláló komplexek kerülnek az acetilált hisztonvégeket tartalmazó kromatin közelébe, amelyek szintén a kromatinszerkezet fellazítását végzik és működésűk ATP-t igényel. A módosítás kiradírozásában az ellentétes enzimaktivitást hordozó hiszton-deacetilázok (HDAC) játszanak szerepet. A szignálspecifikus transzkripciós faktorokhoz kapcsolódó fehérjekomplexek gyakran tartalmaz­ nak HAT- vagy éppen HDAC-aktivitást attól füg­ gően, hogy transzkripciós aktiválás (ebben az eset­ ben HAT) vagy gátlás (ebben HDAC) a funkciójuk (14-15. ábra). Erre mutatunk példát a 18. fejezet­ ben a magreceptorok működésének bemutatása kapcsán. 2. Kromatinátrendeződés (nukleoszóma-migráció, illetve -elimináció). A kromatin szerkezete meg­ változhat azáltal is, hogy a nukleoszómák elmoz­ dulnak vagy egyenesen eliminálódnak egy adott genomi régió közeléből. Ezt a folyamatot kromatinremodellálásnak nevezzük. 3. Hisztonvariánsok beépülése a nukleoszómákba. Az is lehetséges, hogy kicserélődnek a hisztonok bizonyos ritkább variánsokra. Ilyenek lehetnek a H3.3, illetve a H2A.Z. A H3.3 beépülése az aktív génekre jellemző. A H2A.Z-t tartalmazó nukleo­ szómák a transzkripcióra kompetens állapotot hoz­ zák létre, illetve meggátolják a heterokromatin ki­ alakulását. Végül a transzkripció gátlásának egyik lehetséges mechanizmusa, hogy bizonyos starthelyek nukleoszómákat tartalmaznak szoros pakolásban, viszont az aktív transzkripciós starthelyek nukleoszómamentesek. Valószínűleg valamilyen aktív mechanizmus biz­ tosítja a nukleoszómák eltávolítását, elcsúsztatását.

I V.

A G É N É T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

H

\ ,/

H

H

\ ,/

H

14-16. ábra. Metilcsoport kapcsolódása a citozin 5'-pozíciójához

fontos megjegyezni, hogy a kialakult metilcitozin nem befolyásolja a GC bázispár komplementaritását, de a metilcsoport a DNS-hélix nagyárkában helyezkedik el, ami bizonyos fehérjék DNS-kötését módosíthatja. Tehát annak ellenére, hogy a módosítás a DNS-en tör­ ténik, nem változtatja meg a bázissorrendet. Az enzi­ mek, amelyek felelősek a DNS-metilációért, a DNSmetiltranszferázok (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b), ezek az enzimek tehát a DNS-metiláció írói. Ezen en­ zimek közül a DNMT3a és 3b ún. de novo metiltranszferáz, azaz az előzetesen nem metilált DNS-t metilálják (14-17. ábra). A DNMT1 pedig az ún. fenntartó metiláz, ami a DNS-replikáció (sejtosztó­ dás) során keletkező hemimetilált DNS-t metilálja, az­ az fenntartja a metilációt a DNS mindkét szálán. A génexpresszió szempontjából a promóter metilálása fontos (14-18. ábra). A promóterek egy része ún. CpG

l lllllllllllllll m e tilá la tla n D N S

de novo metiláció

'D N M T 3 a D N M T3b

l l l l l l l l l l l l llll m e tilá lt D N S DNS-

A DNS-metiláció A DNS-metiláció az egyik legfontosabb epigenetikai nyom vagy marker. Egy enzimreakció ered­ ményeként metilcsoport kerül a citozin 5’-csoportjára az ún. CpG dinukleotidokban (14-16. ábra). Nagyon

replikáció

f DNMT1

h e m im e tilá lt D N S

14-17. ábra. De novo és fenntartó metiláció. DNMT, DNSmetiltranszferáz

1 4 . R N S : T R A N S Z K R I P C I Ó ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

427

általános transzkripciós faktorok

génszabályozó fehérjék

Á

1

*

jQ tS j

\ - l)

J =

^

1

9én

be

>

génszabályozó fehérjék Nt gén ki (részlegesen) új DNS-metiláció >/

j Y V y f1T* T 1 --------------1 1 1 1 1 1 1 1 "1------------- ^--------------- L

metil-citozint felismerő fehérjék kötődése

v o

a t

szigeteket tartalmaz, ami C és G nukleotidok ismétlődését jelenti. Ezek metilálódhatnak, ami a promóteraktivitás jelen­ tős csökkenéséhez vezet. A metilált CpG-t a metil-citozin-kötő fehérje (MeCBP) ismeri fel, ez tehát az olvasó. Az MeCBP pedig egy olyan fehérje­ komplex kötődéséhez vezet, ami tartal­ maz HDAC enzimeket is. A HDAC pedig zárt kromatinszerkezetet hoz létre deacetiláció által. így molekuláris mechaniz­ musát tekintve is összekapcsolódik a DNS-t érintő metiláció és a hisztonok lizinoldalláncát érintő acetiláció, illetve deacetiláció. Ezek a mechanizmusok egy anyasejtről utódsejtre öröklődő epigenetikai mintázat kialakítását és sejtről sejtre való továbbadását biztosítják. En­ nek egyik legjobban ismert példája az X kromoszóma inaktiválása.

j j j j j . r r r r f i * W - ) _____________________________

------------ r í i i i i 1

-J

gén ki

14-18. ábra. A DNS-metiláció szerepe a génkifejeződés szabályozásá­ ban. Az átírt részt a DNS-molekulán pirossal jelöltük. A DNS-metilációt piros körökkel, a metilcitozint kötő fehérjéket zölddel jelöltük. Gén ki, a gén átírásá­ nak gátlása; gén be, a gén átírása

14-19. ábra. Az X kromoszóma inaktiválása. A XIC (X Inactivation Center) régiót világosbarnával jelöltük. A XIST hosszú nem kódoló RNS-hez (bordó) kötődő fehérjekomplexben található metiltranszferázok a CpG-szigetek dön­ tő részét metilálják. Az ábrán a H3 hiszton 27. lizin aminosavának (K27) metilációja látható

X kromoszóma inaktiválás és imprinting Emberben és számos más élőlényben is a nemek eltérő genommal rendelkez­ nek. A női nem XX kromoszómapárja lé­ nyegesen több genetikai információt tar­ talmaz, mint a hím nem XY kromoszó­ mapárja, ami a nemi jellegért felelős gé­ neken túl is nagymértékben eltérő géndó­ zist jelent. Ezt kompenzálni kell azzal, hogy a női nemben az egyes sejtek az egyik X kromoszómát kikapcsolják, azaz inaktiválják, ami az embriófejlődés korai stádiumában történik meg, és az egyes sejtekben véletlenszerűen inaktiválódik az apai (apától örökölt) vagy az anyai (anyától örökölt) kromoszóma. Ez aztán továbbörökítődik az utódsejtekre, tehát az inaktiválódó X kromoszóma tekinteté­ ben a női szervezet sejtjei mozaikosak le­ hetnek. Az inaktiváció elindításában egy nem kódoló RNS-nek van jelentős szere-

428

IV.

pe, ez az XIST (X Inactivation Specific Transcript). Ez az RNS-molekula kötődik az egyik X kromoszóma XIC (X Inactivation Center) régiójához (14-19. ábra). Ez a kötődés DNS-metiltranszferázok régióhoz való vonzását eredményezi, amelyek mindkét irányban el­ kezdik a kromoszomális DNS-t metilálni, míg a kro­ moszóma végére nem érnek. A metilációt ebben az esetben is a metil-citozin-kötő fehérje kötődése és hiszton-deacetilázok aktiválása követi. Ezen lépések és enzimaktivitások eredményeképpen egy teljesen zárt kromatinszerkezet és egy mikroszkóposán is lát­ ható inaktív X kromoszóma keletkezik a női szervezet összes sejtjében - ezt nevezzük Barr-testnek. Hasonló módon, de egy génre vagy génklaszterre inaktiválódik az apai vagy anyai kromoszóma. Azaz, az adott gén az egyik szülőből származó kromoszómán metilált és ez­ által inaktivált. Génkifejezödés csak a másik szülőtől származó alléiról lehetséges. Ezt a jelenséget nevez­ zük imprintingnek. Ezen gének esetében a két kro­ moszóma nem ekvivalens. Az imprinting tehát egy olyan epigenetikai folyamatnak is felfogható, ahol DNS-metiláció tartja fenn a monoallélikus génexpressziót. Az imprintált gének általában klasztereket képez­ nek, melyek kialakításáért az ún. „imprint control element” felelős. Nagyon sok imprintinget mutató génnek fontos szerepe van az embrionális és az újszü­ lött szervezet fejlődésében. Érdekes módon az apai kromoszómán expresszálódó imprintált gének fokoz­ zák a magzati növekedést, az anyai kromoszómán ak­ tív gének viszont gátolják a magzati növekedést (szülői konfliktus elmélet).

Klinikai vonatkozások A génexpresszió zavarai betegségekben. Az epi­ genetikai kódban bekövetkező változások közül ki­ emelt jelentősége van a DNS-metiláció zavarainak. Tumorsejteknek szelekciós előnyt biztosít az, hogy a tumorszuppresszor gének (lásd 19. fejezetben) gyak­ ran inaktívak a promóter metilációja miatt. Terápiás próbálkozások vannak ennek visszafordítására. Ezzel

A GENETIKAI

IN F O R M Á C

I Ó T Á R Ó L Á S A ÉS KI F E| E Z Ő D ÉSE

párhuzamos a genom nagy részét elfoglaló repetitív szekvenciák alulmetiláltsága (hipometilálás). Ennek az a következménye, hogy nő a genom instabilitása, és ez is a legjobban osztódó sejtek kiválasztódását, ki­ szelektálódását segíti. Összességében a tumorsejt hipometilált, mert a repetitív szekvenciák aránya sok­ szorosa a tumorszuppresszor gének promótereinek a teljes genomban. A Prader-Willi- és Angelman-szindrómák: az imprinting zavara. A Prader-Willi- (PWS) és Angelman-szindrómákban (AS) a genetikai rendellenessé­ gek ugyanazt a kromoszómarégiót, a 15-ös kromoszó­ ma PWS-AS régióját érintik. Ugyanakkor a betegsé­ gek eltérő fenotípussal rendelkeznek: a PraderWilli-szindróma mentális retardációval, alacsony ter­ mettel, elhízással, hypogonadismussal; az Angelmanszindróma mentális retardációval, kontrollálatlan ne­ vetéssel, egyensúlyzavarokkal, ataxiával jár. Az elté­ rő fenotípus hátterében az áll, hogy PWS esetében a rendellenes kromoszóma apai, AS esetében anyai ere­ detű. Az apai és anyai kromoszómán ebben a régióban más a DNS CpG-metilációs mintázat, más gének inaktiválódnak, illetve maradnak aktív állapotban, te­ hát génexpresszió szempontjából az apai és anyai kro­ moszóma nem egyenrangú. Fragilis-X-szindróma. A fragilis-X-szindróma a mentális retardációk egyik leggyakoribb oka. A be­ tegség kialakulásának hátterében tripletexpanzió áll, a Huntington-kórhoz hasonlóan (lásd 16. fejezetben). Az X kromoszómán elhelyezkedő FMR1 gén fehérje­ terméke számos szövetben megtalálható, az idegrend­ szerben a szinapszisok kialakításában és adaptációjá­ ban (plaszticitás) játszik szerepet. A normál alléi a gén 5’ UTR-jében 6-60 CCG ismétlődést („repeaf’-et) tar­ talmaz, az úgynevezett premutációs alléi 60-200 is­ métlődést, a betegekben viszont a CCG-szakaszból több mint 200 darab van. Az ismétlődések generáció­ ról generációra történő ugrásszerű növekedését (ex­ panzióját) dinamikus mutációnak nevezzük. A CCG repetitív szakasz expanziója az FMR 1 gén abnormális metilációjához és kikapcsolásához vezet. Erre a be­ tegségre tehát az jellemző, hogy egy elsődleges gene­ tikai mutáció egy másodlagos epigenetikai változást hoz létre.

14. R N S : T R A N S Z K R I P C I Ó

14.4

ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

G ÉN T ER Á P IA

A molekuláris medicina rohamléptekkel történő fejlődése lehetővé tette az emberi betegségek moleku­ láris diagnosztikáját; a sejtekben átmenetileg megjele­ nő idegen nukleinsavak kimutatásától (fertőzések), a szomatikus sejtekben történt mutáción át (karcinogenezis), a csírasejteket ért mutációkig (öröklődő be­ tegségek). Ismertté vált a betegségek egy részének ge­ netikai háttere; a hatalmas léptekkel növekedő elméle­ ti tudás (köztük a humán genom projekt befejezése) le­ hetőséget adott rá, hogy az ismereteket a klinikai gya­ korlatban alkalmazva a betegségek génszinten kezel­ hetőek legyenek. Ezek a terápiás megközelítések, amelyeket molekuláris terápiának vagy génterápiának nevezünk, az elmúlt évtizedekben hatalmas fejlődésen mentek keresztül, részletes tárgyalásuk messze túlmu­ tat a tankönyv keretein. A génterápia célja, hogy sejtbejuttatott nukleinsavakkal a hibás, betegséget okozó gént pótoljuk, módo­ sítsuk vagy kiüssük. A nukleinsavakat többnyire vek­ torokba építik be, amelyek segítik a DNS-molekula sejtbe való bejutását, és a sejten belüli replikációját. Avektorok sejtbe juttatása történhet in vivő vagy ex vivő. Utóbbi esetben a beavatkozást a betegből nyert sejteken laboratóriumi körülmények között végzik, majd a sejteket a módosítás után visszajuttatják a be­ tegbe (autológ transzplantáció). A vektorokat két nagy csoportba osztjuk, virális, illetve nem virális vektorok. Jelen pillanatban a klinikai próbák 90 százalékában virális vektorokat használnak. A vírusokkal történt génbevitelt transzdukciónak, míg általánosságban a DNS beépülését a genomba inzerciónak nevezzük. Attól függően, milyen vektort választunk, a terápiás hatású DNS-molekula beépülhet a gazdasejt kromo­ szómaállományába (és nagy eséllyel továbbjut az utódsejtekbe) vagy extrakromoszomális DNS formá­ jában marad. Létrehozható mesterséges emberi kro­ moszóma (humán artificial chromosome, HAC), mely a sejtbe juttatva, mint új kromoszóma működik. Agénpótlás a leggyakrabban alkalmazott klinikai el­ járás; a mutáns gén mellett megjelenő normál gén expressziója pótolni képes a hiányzó vagy nem műkö­ dő (mutáns) fehérjét. A kezdeti génterápia azokat a recesszív, monogénes, fúnkcióvesztő mutáció követ­

429

keztében kialakult betegségeket célozta meg, ahol ha nem történik meg a fehérje pótlása, a betegség halálos kimenetelű. Technikailag jóval nehezebb a hibás gé­ nek módosítása vagy kiütése. Ezen a területen nagy előrelépést jelentett olyan fúziós fehérjék létrehozása, melyekben DNS-felismerő/kötő fehérjék és nukleázok vannak jelen, így képesek DNS-szekvenciákhoz specifikusan kötődni és kötődés után azokat elhasíta­ ni. Ilyenek a cinkujj-nukleázok vagy a transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Ugyan­ akkor ezek a technikák bonyolult és drágán előállítha­ tó laboratóriumi módszerek, amelyek akadályozzák az elterjedésüket. Az utóbbi években megjelent egy, az előbbi módszereknél olcsóbb és pontosabb génsebé­ szeti eljárás, a CRISPR-Cas9 technológia, mely pilla­ natok alatt forradalmasította a géntechnológiát. A CRISPR-Cas9 technológia kidolgozásához a baktérium bakteriofágok elleni védekező mechaniz­ musának a megismerése vezetett. A baktériumokban talált jellegzetes szekvencia (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) darabjai a „bakteriális vakcinádé” nyomai. A bakteriofágok (olyan vírusok, melyek baktériumokat fertőznek meg) genomjának egy darabja beépül a megtámadott bakté­ rium genomjába, melyről a vírus újabb támadása ese­ tén a baktérium RNS-darabokat ír át. Az átírt RNSdarabok a vírusban található komplementer szekven­ ciákhoz kötődnek, nukleázokat (Cas fehérje) vonza­ nak oda, és degradálják a virális DNS-t vagy RNS-t. A rendszer tehát RNS-molekula által irányított, szekvenciaspecifikus nukleinsavhasítást biztosít. Többféle Cas fehérje létezik, a laboratóriumi körülmé­ nyek között kifejlesztett CRISPR-Cas9 rendszer elő­ nye, hogy nemcsak baktériumokban, hanem metazoákban is működik, és mindössze két elemből, az irá­ nyító (guide) RNS (gRNS) molekulából és a Cas9endonukleázból áll (14-20. ábra). A módosítani kí­ vánt sejtekben expresszálják a gRNS-molekulát, ami egy komplementer szekvenciából [ezzel a módosítani kívánt génhez (célgén) kötődik], és egy scaffold (áll­ vány) szekvenciából (ami a sejtekben szintén expresszált Cas9-endonukleázt köti meg) áll. A célgén­ hez irányított Cas9-endonukleáz kettős lánctörést okoz. A kettős lánctörés javítása két módon, a repair folyamatoknál már ismertetett nem homológ végek

IV.

430

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS KI F EJ E Z Ő DÉSE

14-20. ábra. A Cas9 endonukleáz az irányító RNS segítségével a DNS-hez köt és kettős lánctörést okoz. Az irá­ nyító RNS egy komplementer (kék színű) és scaffold (piros színű) részből áll

r

I

deléció

korai stop kodon

precíz

génmódosítás

1

Nf

3' 5'

5'' 3' i

14-21. ábra. A kettős lánctörés repair mechanizmusa előmozdítja a genom editálását. A Cas9-endonukleáz létrehozza a DNS kettős szálú törését, melynek kijavító (repair) mechanizmusait részletesen tárgyaltuk a 13. fejezetben. A nem homológ végek összekap­ csolása (non-homologous end-joining, NHEJ) a DNS-ben található információ elvesztésével (delécióval), esetenként inzercióval jár. Haa deléció az mRNS-t kódoló nyitott leolvasási keretet érinti (lásd 15. fejezet) a leolvasási keretben található tripletek jelentése megválto­ zik, és korai stopkodon is kialakulhat. Amennyiben egy templát DNS-t is bejuttatnak a sejtbe, ami a kijavítandó DNS molekulával homo­ lóg, és a kívánt szekvenciát hordozza, lehetőség van homológia irányította javításra [homology-directed repair (HDR)]. Ez a kijavítási mechanizmus precíz génmódosítást eredményez. gRNS, guide RNS; DSB, double strand break; a repair mechanizmusokban résztvevő fehérjéket név nélkül, a DNS-lánchoz kapcsolódva jelöltük

14. RNS: T R A N S Z K R I P C I Ó ÉS S Z A B Á L Y O Z Á S A

összekapcsolásával, illetve a homológ rekombináció alapú hibajavítással történhet. A nem homológ végek összekapcsolásával deléciók keletkeznek a célgénben, amivel az inaktívvá tehető. A homológ rekombináció alapú hibajavítással elérhető a célgén pontos módosí­ tása, pontmutációk létrehozásától nagyobb méretű DNS-darabok irányított beépítéséig (14-21. ábra). Kívülről bevitt nukleinsavakkal lehetőség van a génexpresszió és a fehérjefunkció befolyásolására is. Ilyenkor nem a genetikai állományba avatkoznak be, a terápia nem a DNS, hanem az RNS-molekulák szint­

431

jén történik. Az RNS-interferencia (RNAi) során a sejtbe juttatott vagy a sejten belül expresszált rövid kettősláncú RNS-molekulák (small interfering RNS, siRNS) a mikro-RNS-ek leírásánál már tárgyalt RISC komplexbe kapcsolódnak be, és a miRNS-ekhez ha­ sonlóan a cél-mRNS molekula lebontását vagy szek­ venciaspecifikus gátlását eredményezik. A fejezet véglegesformájának kialakításában nyúj­ tott alkotó közreműködéséért a szerkesztő köszönetét mond Dr. Törőcsik Beátának.

FEHÉRJESZINTÉZIS: A TRANSZLÁCIÓ 15

MECHANIZMUSA ÉS A POLIPEPTIDLÁNC TOVÁBBI SORSA T R E T T E R L Á S Z LÓ

15.1

A genetikai kód

15.2

A fehérjeszintézis két központiszereplője, a transzfer RNS és a riboszóma 434

15.3

A fehérjeszintézis lépései

15.4

Az eukarióta fehérjeszintézis szabályozása

15.5

A szintetizált fehérjék intracelluláris kompartmentekbe történő irányítása 455

A fehérjeszintézis, más néven transzláció feladata a DNS nukleotidsorrendjében kódolt és a transzkrip­ ció során a messenger RNS (mRNS) bázissorrendjébe átírt genetikai információ lefordítása a fehérjék aminosavsorrendjére.

15.1

A G EN ETIK A I KÓ D

A DNS dezoxiribonukleotid polimer, melynek szekvenciája négyféle bázis [adenin- (A), guanin- (G) purin- és citidin- (C), timin- (T), pirimidin- (P) bázis] kombinációjából épül fel. A DNS-ben található információ a transzkripció során RNS-be íródik át, mely ribonukleotidokból épül fel, és ahol a T-bázisokat uracilbázisok (U) he­ lyettesítik. A molekuláris biológia alap­ dogmáját, a DNS-től a fehérjékig tartó információáramlás irányát és annak ne­ vezéktanát a 75-7. ábra mutatja be. A négy bázis kombinációjából kelet­ kező nukleotidszekvenciák úgy a DNSben, mint a mRNS-ben három bázisból

432

437 447

(tripletből, kodonból) álló egységekre oszthatók. Bár több száz, fehérjében található aminosavat ismerünk, klasszikus genetikai kóddal csupán 20 aminosav ren­ delkezik, a többi szervezetben megtalálható aminosav poszttranszlációs módosítások eredménye. A geneti­ kai kód (azaz az aminosavakhoz rendelhető bázishár­ masok) kapcsolatot teremt a DNS bázissorrendje és a fehérjék aminosavsorrendje között. A tripletekben szereplő négyfajta bázisnak 64 (azaz 43) kombinációja lehetséges. A 64-féle báziskombinációból 61 amino-

5 '- C A A G C A C T C

-3 '

DNS-kódoló szál (szensz, sense)

3 '- G T T C G T G A G

-5 '

DNS-templát szál (antiszensz, anti-sensejj

transzkripció

v 5 ' - C A A G C A C UC - 3 '

mRNS kodon

3 '- GUU C G U GAG

tRNS antikodonok

transzláció

15-1. ábra. A DNS-ről átírt mRNS, a mRNS kodonjait felismerő tRNS antikodonjai és a kódolt aminosavak kö­ zötti kapcsolat

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A PO LI P E PTI D LÁ NC T O V Á B B I S O R S A

433

15-1. táblázat. A genetikai kód

2. pozíció

1. pozíció |5'-végi)

c

u UUU T-fenilalanin (Phe, F) UCU ucc UUC UCA UCG UUA J-leucin (Leu, L) UUG

C

CUU CUC -leucin (Leu, L) CUA CUG J

3. pozíció (3'-végi)

szerin (Ser, S)

ccu CCC -prolin (Pro, P) CCA CGC -

A

UAU UAC

| tirozin (Tyr, Y)

UAA UAG

^STOP

CAU Thisztidin (His, H) CAC J 1-glutamin (Gin, Q)

G

UGU Jcisztein (Cys, Q UGC UGA

STOP

UGG

triptofán (Trp, W)

CGU CGC -arginin (Arg, R) CGA CGG J

CAG J

A

AUU izoleucin (He, 1) AUC AUA AUG

G

ACU ACC treonin (Thr, T) ACA ACG -

metionin (Val, V)

GUU GUC valin (Val, V) GUA GUG -

GCU -i GCC -alanin (Alá, A) GCA GCG J

AAU

aszparagin (Asn, N)

AAA lizin (Lys, K) AAG J y

GAC ^AA

savat kódol, 3 pedig a fehérjeszintézis végpontját jelö­ lő, úgynevezett STOP kodon (15-1. táblázat). Az iniciációs vagy START kodon az AUG triplet, mely metionint kódol. Az AUG triplet határozza meg a láncközi metioninokat is, megkülönböztetésüket a metioninokat a fehérjeszintézis helyére szállító tRNSekeltérő szekvenciája biztosítja. A kód r e d u n d á n s (más szóval d e g e n e r á l t ) , azaz egy aminosavat több kodon is meghatározhat, csupán két olyan aminosav van, a metionin és a triptofán, me­ lyeket egy-egy triplet kódol. Ezzel szemben az argininnak és a leucinnak hat kodonja is ismert. Amennyi­ ben egy aminosavat több triplet is kódol, a tripletvariánsok első két betűje általában ugyanaz; a kódszó­ tárkialakítása elősegíti, hogy az esetleges mutációk ne eredményezzenek a szintetizált fehérjékben aminosavcserét, vagy ha megtörténik, akkor hasonló fizikokémiai sajátságú aminosavak helyettesítik egymást (pl. leucin-, izoleucin-, valincserék). Az egy aminosa­ vat kódoló több triplet közül, eltérő fajok különféle „dialektusokat” is használhatnak, azaz a kodonhasználat gyakorisága eltérő lehet az egyes fajok kö­

AGU AGC

szerin (Ser, S)

AGA AGG

arginin (Arg, R)

Laszparaginsav (ASP, D) GGU GGC glicin (Gly, G) GGA GGG Jglutaminsav (Glu, E)

J

U C A G

U C A G

U C A G

zött. A kódszótárra jellemző még, hogy v e s s z ő - , k i h a ­ g y á s - é s á t f e d é s m e n t e s , azaz a START kodont köve­ tően az aminosavakat kódoló tripletek folyamatosan követik egymást a mRNS-en a STOP kodonig. A START és STOP kodon között elhelyezkedő régió a n y i t o t t l e o l v a s á s i k e r e t (open reading frame, ORF). A kétszálú DNS-en hat leolvasási keret, az mRNSeken három leolvasási keret alakítható ki. A baktériu­ moktól az eukariótákig ugyanazt az aminosavat ugyanazok a kodonok írják le, a kód u n i v e r z á l i s . A kód változatlan formában történő megőrzése sze­ lekciós előnyt jelent; a módosulások olyan nagy mennyiségű fehérjében jelentenének változást, ami az élettel valószínűleg összeegyeztetthetetlen lenne. Egy kód nem jelölhet többféle aminosavat, a kód e g y é r t e l ­ m ű . A kódrendszer egyértelműségével ellentétes az a megfigyelés, hogy az UAG STOP kodon úgy prokariótákban mint eukariótákban szelenocisztein (a 21. aminosav) beépülését is diktálhatja; igaz, hogy ehhez a mRNS speciális harmadlagos térszerkezete és az aminosav beépülését katalizáló fehérjefaktorok egy­ idejű jelenléte is szükséges.

434

15.2

I V . A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J EZ ŐDÉ SE

A FEH ÉR JESZ IN T ÉZ IS KÉT KÖZPONTI SZEREPLŐ JE, A T R A N S Z F E R R N S ÉS A R IB O S Z Ó M A

(C) bázisokat tartalmaz és a nagyobbik riboszóma al­ egység rRNS-ével lép kapcsolatba.

A riboszómák A transzfer RNS (tRNS) A mRNS kodonjai egyértelműen meghatározzák a fehérjékben megtalálható 20 aminosavat; ugyanakkor nem képesek kötődni ezekhez az aminosavakhoz. Szükség van egy adapter molekulára, a tRNS-re, mely a mRNS bázissorrendjében rejlő információ és az in­ formációt értelmező riboszomális fehérjeszintetizáló rendszer között teremt kapcsolatot (15-1. ábra). A tRNS-ek kétdimenziós szerkezete háromlevelű ló­ here alakú, térbeli alakja pedig leginkább egy háromdimenziós L betűként mutatható be (15-2. ábra). Jel­ lemző a tRNS-re, hogy minden más nukleotidfajtánál nagyobb mennyiségben tartalmaz úgynevezett módo­ sított bázisokat, melyek az RNS-ben részt vevő stan­ dard bázisok kisebb kémiai módosításával keletkez­ nek: pl. uridinből dihidrouridin, 5-metiluridin (ribotimidin) vagy pszeudouridin; a citidinből 3-metilvagy 5-metil-citidin; az adenozinból inozin; a guanozinból 7-metilguanozin. A 3’-CCA-vég szintén a tRNS érésekor, poszttranszkripciós módosítás során alakul ki. A kémiai módosítások elengedhetetlenek a tRNS szerkezetének kialakításához, funkciójához és stabilitásához. Egyes, az antikodon közelében találha­ tó módosítások például az antikodon-kodon kapcso­ lódást stabilizálják, azaz biztosítják a fehérjeszintézis pontosságát. Általánosságban elmondható, hogy a nem megfelelően módosított tRNS-ek lebomlanak. A tRNS-módosítások zavarát számos humán beteg­ ségben leírták, így 2-es típusú diabetesben, tumorok­ ban vagy neurológiai betegségekben. A molekula legfontosabb részei az 15-2. ábrán lát­ hatók. Az a n t i k o d o n h u r o k tartalmazza a tRNS 3 bá­ zisból álló antikodon] át, mely komplementer módon kapcsolódik a mRNS szintén 3 bázisból álló kodonjához. A 3’CCA véghez (aminosavkötő hely) az aminosavak kapcsolódnak aktiválódásuk során. További részei a D-hurok, mely nevét dihidrouridin-tartalmáról kapta, és változó hosszúságú, valamint a T'FC-hurok, mely ribotimidin (T), pszeurouridin (VF) és citidin

A riboszómák komplex szupramolekuláris képle­ tek, melyek két alegységből - a kis és a nagy alegység­ ből - állnak, és nélkülözhetetlenek a fehérjeszintézis­ hez. Az eukarióta és prokarióta riboszómák sok szem­ pontból hasonlóak, de jellegzetes különbségeket is mutatnak (lásd 15-2. táblázat). A riboszomális RNS-ek (rRNS) alkotják a riboszó­ ma szerkezeti vázát, a fehérjék ezt a vázat szegélyezik és burkolják. Az újonnan létrejövő peptidkötés kiala­ kulását katalizáló p e p t i d i l - t r a n s z f e r á z - c e n t r u m kö­ rül 18 Á távolságban nem található semmiféle ribo­ szomális fehérje (míg a kovalens kötések hossza ki­ sebb mint 2 Á). A peptidkötés kialakulását egy nukleotid (adenin) katalizálja, tehát a peptidkötést létre­ hozó peptidil-transzferáz enzim egy enzimaktivitással rendelkező RNS, azaz r i b o z i m . Mind prokariótákban, mind eukariótákban a riboszóma nagy alegységének egyik rRNS molekuláján található a peptidil-transzferáz-aktivitás (ez prokariótákban a 23S, míg eukarió­ tákban a 28S rRNS). A riboszomális RNS-eknek tehát kiemelt szerepe van a fehérjeszintézisben. Prokarióták esetében eztto-

15-2. táblázat. A bakteriális, az eukarióta és a mitokondriális riboszóm ák szerkezetének összehasonlítása

Riboszóma

Alegy­ ség mérete

rRNS mérete

Fehér­ jék száma

50S

23S = 2904 bázis 5S = 120 bázis

31

30S

16S = 1542 bázis

21

60S

28S = 4718 bázis 5,8S = 160 bázis 5S = 120 bázis

49

40S

18S = 1874 bázis

33

Emlős mitokondriumok

39S

16S = 1558 bázis

49

55S tömeg: kb. 2,64x 106D

28S

12S = 954 bázis

28

Baktérium

tömeg: 2,5x106 D 70S rRNS-tartalom 66% Emlős

80 S tömeg: 4,2x 106 D rRNS tartalom 60%

RNSmjto < RNSbact

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A PO U PE PTI D LÁ N C T O V Á B B I S O R S A

15-2. ábra. A transzfer RNS (tRNS) szerkezete, (a) A tRNS kétdimenziós szerkezete. Az aminosav a tRNS hosszabb, 3'-OH CCA-végéhez kötődik karboxilcsoportjával. A D- (dihidrouridin) hurkon változó számú 5,6-dihidrouridin található, melyekből az ábrán kettő került bejelölésre. A TTC-hurok ribotimidint (T), pszeudouridint PP) és citozint (C) tartalmaz. Sárga négyze­ tekkel vannak feltüntetve azok a nukleotidok, melyek humánpatológi­ ákhoz kapcsolhatók, (b) A tRNS háromdimenziós szerkezete röntgendiffrak­ ciós analízis alapján. Az ábra „a" részén j feltüntetett szerkezeti részek meg­ egyező színekkel vannak feltüntetve. A számok a bázisok 5'—>3' irányban történő számozását jelzik. A tRNS-ek általában 73-93 bázisból állnak, a hosszúságbeli különbségekért a variá­ bilis hurok, illetve a D-hurok tehető fe­ lelőssé

a

435

3'

aminosavkötő (akceptor) kar

d ih id ro u rid in -

T ^PC -hurok

hurok

varábilis hurok antikodonhurok

antikodon b T H 'C -h u r o k

i

I

aminosavkötő (akceptor) kar

i---------------------- 1

d ih id r o u r i d i n - (D ) hurok

antikodonhurok

antikodon

vábberősíti, hogy a 16S rRNS komplementer bázispárosodással kapcsolódik a mRNS Shine-Dalgamoszekvenciájához, így részt vesz a fehérjeszintézis START helyének kiválasztásában; illetve, hogy a fe­ hérjeszintézist gátló antibiotikumok sokkal inkább az

rRNS-ekkel lépnek kölcsönhatásba, mint a riboszomális fehérjékkel. Jelenleg a bakteriális riboszóma a legnagyobb ob­ jektum, melynek struktúráját röntgenkrisztallográfiával felderítették. Az ismeretek azonnal hasznosultak a

IV. A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E I E Z Ő D É S E

436

60S

50S

RNS

protein

vályú RNS

4 0S

30S

A szerkezeti modelleken jól megkülönböztethető a kis és a nagy riboszóma-alegység. A vékonyabb, fonalszerű struktúrák a riboszomális fehérjéket, míg az agytekervényekre emlékeztető vasta­ gabb képletek a rRNS-molekulákat jelölik. A mRNS mind pro-, mind eukariotákban a kis és nagy alegység találkozásánál kialakuló vályú­ ban mozog 15-3. ábra. Bakteriális (a) és eukariota (b) riboszómák szerkezete.

struktúrát eredményez, amelyben egy alagút képző­ dik, amelyen a mRNS keresztülfuződik, és a transzlá­ ció során ebben a vályúban változik helyzete a riboszómán belül (15-3/a ábra). Ugyancsak létezik egy, a növekvő polipeptidlánc elvezetésére szolgáló, a ribo­ szóma szerkezetéből kivezető alagút struktúra is. A bakteriális riboszómát alkotó fehérjék méretükben

gyakorlatban; a fehérjeszintézist gátló antibiotikumok kötőhelyének megismerésében, az antibiotikum­ rezisztencia okainak kiderítésében, és a lehetséges új, hatásosabb antibiotikumok fejlesztésében. A bakteriális riboszóma két alegységének együttes molekulatömege ~2,7 millió dalton. A két szabályta­ lan formájú riboszóma-alegység összeillesztése olyan

peptidil-tRNS

15-4. ábra. A bakteriális riboszóma kristály-

aminoacil-tRNS

mRNS

3'

A riboszóma három kötőhelyet tartalmaz a tRNS-molekulák számára: az A-helyen a beérkező aminoacil-tRNS, a P-helyen a peptidil-tRNS míg az E-helyen a peptidil-tRNS talál­ ható a peptidkötés kialakulása után, mielőtt távo­ zik a riboszómáról. Az 50S-alegységen az rRNS-molekulák világos-, a fehérjék sötétbarna, a 30Salegységen az rRNS molekulák világos-, a fehérjék sötétkék színűek. Engedéllyel átvéve: Schmeing TM és Ramakrishnan V. What recent ribosome structures have revealed about the mechanismof translation. Natúré 2009; 461(7268):1234-42.

szerkezete feliilnézetből.

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O L I P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

éstérszerkezetükben is nagyban különböznek. Sok, a riboszómák felületén elhelyezkedő fehérjének van az rRNS vázba benyúló, annak térszerkezetét stabilizáló nyúlványa. Az eukarióta riboszómák hasonló elven épülnek fel, csak komplexebb szerkezetűek, mint prokarióta társaik. [ A riboszómák kis és nagy alegységein megkülön­ böztethetők a fehérjeszintézis funkcionális szempont­ ból kitüntetett helyei az A- (aminoacil-tRNS-kötő), P(peptidil-tRNS-kötő) és E- (exit) helyek (15-4. ábra).

Poliszómák

Ariboszómák a mRNS-en 5’ —>3’ irányban halad­ vavégzik a polipeptidláncok szintézisét, amíg a fehér­ je szintézise annak N - t e r m i n á l i s á t ó l C - t e r m i n á l i s a felétart. Amint egy riboszóma a mozgása során meg­ felelő távolságra került az 5’-végtől, egy újabb riboI szóma lesz képes kötődni a mRNS-hez, így egy mRNS-molekulához egy időben több riboszóma is ; kapcsolódhat. Az egy mRNS-en egyidejűleg található riboszómák együttesét poliszómának nevezzük. Eukarióták esetében a két riboszóma-alegység körül­ belül 80 nukleotidnyi helyet fed le, és az egymást kö­ vető riboszómák között körülbelül 100 nukleotidnyi távolság található.

15.3

A FEH ÉR JES Z IN T ÉZ IS LÉPÉSEI

437

az aminosavaknak az adott aminosavra specifikus tRNS-hez való kapcsolása. ATP-igényes enzimatikus folyamat, mely az aminosav karboxilcsoportját kapcsolja a tRNS 3’-végi ribózának egyik hidroxilcsoportjához. I n i c i á c i ó : az a folyamat, melyben a mRNS és az iniciátor aminoacil-tRNS komplex kötődnek először a kisebb riboszóma-alegységhez, majd csatlakozik hoz­ zájuk a nagyobbik riboszóma-alegység. E l o n g á c i ó : az a ciklikus folyamat, mely során a mRNS bázissorrendjének megfelelően az aminoaciltRNS-ek kötődnek a riboszóma-mRNS komplexhez, a peptidkötés kialakul az aminosav és a növekvő peptidlánc között, míg a riboszómák el nem érnek a STOP kodonhoz. T e rm in á c ió és a rib o s z ó m á k ú jr a h a s z n o s ítá s a : a STOP kodon felismerésével a fehérjeszintézis befeje­ ződik, a fehérje-mRNS-riboszóma komplex szétesik. A riboszómák újabb iniciációs lépésben vehetnek részt. A m in o s a v a k tiv á lá s :

A h á ro m d im e n z ió s f e h é rje s z e rk e z e t k ia la k u lá ­

A fehérjék há­ romdimenziós szerkezetének kialakulása, „betekeredése” (angol terminológiával: foldingja) az 1. fejezet­ ben került ismertetésre. A folding és a fehérjék további, poszttranszlációs enzimatikus módosítása elengedhetetlen fiziológiás funkciójuk betöltéséhez. A magasabb rendűek fehér­ jéinek féléletideje másodpercektől akár ezer óráig tart­ hat; az intracelluláris fehérjék féléletidejének átlaga kb. 46 óra. A fehérjék degradációjával a 9. fejezet fog­ lalkozik. sa és p o s z ttra n s z lá c ió s m ó d o s ítá s o k :

Afehérjeszintézis lépéseinek

összefoglalása ; Afejezetben döntően az eukarióta fehérjeszintézis­ sel foglalkozunk, de említésre kerülnek a bakteriális fehérjeszintézis jellegzetességei is. A bakteriális fe­ hérjeszintézis megismerésének orvosi jelentőségét az indokolja, hogy az antibiotikumok bizonyos csoport­ jai a bakteriális fehérjeszintézis gátlásával fejtik ki hatásukat. Mind pro-, mind eukarióta sejtek esetében a fehér­ jeszintézis az alábbi egymást követő szakaszokra ható fel.

A tRNS-ek aktiválása, azaz az aminoaciltRNS komplex kialakítása az aminoaciltRNS-szintetáz enzimek segítségével A tRNS-eknek a megfelelő aminosavakkal való kapcsolódását az aminoacil-tRNS-szintetázok katali­ zálják (15-5. ábra). A reakció nettó egyenlete a követ­ kező: aminosav + ATP + tRNS —> aminoacil-tRNS + AMP + PPi

IV.

438

A reakció eredményeképpen magas csoportátviteli potenciálú, makroerg észterkötés jön létre az aminosav és a tRNS 3’-vége között; „töltött”, aktivált tRNS keletkezik. A kötésben rejlő energia a fehérjeszintézis során, a peptidkötés kialakításakor használódik fel. A tRNS-aminoacil-tRNS-szintetáz és az aminosav közti kapcsolat kialakítása nagyon specifikus kell, hogy legyen, ellenkező esetben a peptidlánc szintézise során a tRNS nem a megfelelő aminosavat viszi a mRNS-hez. (Az aminoacil-tRNS kötődése az mRNShez kizárólag az antikodon-kodon kapcsolaton alapul, a tRNS-hez kötött aminosavtól független.) A megfelelő aminosav azonosítására minden aminoacil-tRNS-szintetáz más stratégiát alakított ki.

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

Az egyes aminosavak és az enzim között eltérő erőssé­ gű (kötési energiájú) kötések alakulnak ki, de ez a na­ gyon hasonló szerkezetű aminosavak esetében (pl. izoleucin-valin) nem elegendő az aminosavak elkülö­ nítéséhez; az aminosavak felismerését specifikus aminosav-oldalláncok koordinálják, és az enzimek hiba­ javító (proofreading) aktivitással is rendelkeznek, melynek segítségével a hibás aminosavat képesek el­ távolítani (lásd később). Az aminoacil-tRNS-szintetázok a nekik megfelelő tRNS-t a tRNS szekvenciája alapján, a tRNS több pontján is azonosítják. Az aminoacil-tRNS-szintetá­ zok felismerhetnek egyetlen vagy többféle, de ugyan­ azt az aminosavat meghatározó antikodonnal rendel-

15-5. ábra. Az aminoacil tRNS-szintetáz által katali­ zált reakció és az enzim hi­ bajavító aktivitása

(aminoacil-adenilát)

OH

OH

II. editálás (hibajavítás) [ aminosav + AMP + tRNS

439

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O L I P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

hibajavító

hibajavító

katalitikus katalitikus aminosavspecifikus

aminosavspecifikus

IRNS

antikodonkötö

antikodonkötö C -term in á lis

f hibajavítás

szintézis

15-6. ábra. Az aminoacil-tRNS-szintetáz enzim hibajavító aktivitása. Az ábra az enzim doménjeit a kristályszerkezeti kép alapján, eltérőszínekkel mutatja be. A szintézis során az aminoacilációban részt vevő tRNS a katalitikus doménhez hajlik. Editálás (hibajavítás) alatt a tRNS áthajlik a hibajavító doménhez

kezőtRNS-t. Bár a transzláció folyamatában nem kí­ vánalomaz olyan fokú pontosság, mint a tovább örö­ kített DNS-molekulák esetében (ahol a hiba kialakulá­ sának valószínűsége 1:109) az aminoacil-tRNS-szintetázok (a DNS-polimeráz-I-hez hasonlóan) rendel­ keznekhibajavító, proofreading aktivitással (15-6. áb­ ra). A hibajavítás során az aminosav-AMP komplex (vagy, ha már létrejött, az aminoacil-tRNS komplex) aszintézis helyéről átkerül az enzim editáló (hibajaví­ tó) helyére, ahol a szigorú térszerkezetbe nem illesz­ kedő, hibásan beépített aminosav hidrolizál. A hibaja­ vítóaktivitások eredményeképpen annak a valószínű­ sége, hogy hibás aminosav aktiválódjon kb. 1:104.

lása, azaz a megfelelő aminosavval való feltöltése kétlépéses folya­ mat. Az első lépésben az enzimen megkötődik az enzimre specifikus aminosav és egy ATP-molekula, majd a reakciójuk során aminoacil-AMP és pirofoszfát keletkezik. Az ATP savanhidridkötésének hasítása szolgáltatja az észterkötés kialakításához szükséges szabadentalpia-változást, a pirofoszfát hidrolízise pedig biztosítja a reakció irreverzibilitását. Az enzim-aminosav-AMP hármas komplex a kö­ vetkező lépésben tRNS-t köt, megtörténik az aminosav és a tRNS kölcsönhatása a tRNS 3’CCA-végén, kialakul az aminoacil-tRNS és az AMP felszabadul.

A mRNS kodon és tRNS antikodon kapcsolat kialakítása, és a „lötyögés" (wobbling) jelensége

Az am in oacil-tR N S s z in t e t á z o k á lta l k a t a liz á lt r e a k c ió . Az aminoacil-tRNS-szintetázok két csoportba oszthatók: az I. osztályba tartozó enzimek az aminosavat a 3’CCA-vég ribózának 2’OH-csoportjához kapcsolják, míg a II. típusú enzimek az aminosavat a 3’CCA-vég ribózának 3’OH-csoportjához rögzítik. Az I. osztályba tartozó enzimek által katalizált reakciót transz-észterifikálás követi, ami biztosítja, hogy az aminosav ebben az esetben is a 3’CCA-vég ribózának 3’OH-csoportjához rögzüljön. Emiatt az aminosav mindig a3’-pozícióból épül be a polipeptidláncba. (A 15-5. ábrán csak a II. típusú enzimek által katalizált reakciót mutatjuk be.) A tRNS aktivá­

A fehérjeszintézis pontosságának szempontjából döntő fontosságú a helyes, de ugyanakkor energetikai­ lag optimális kodon antikodon párosodás kialakítása. A mRNS tripletjeinek 64 lehetséges varációjából 61 az úgynevezett kódoló kodon, melyeket fajonként vál­ tozó számú tRNS ismer fel. (Az elmúlt évek humán genom szekvenálási projektjei több száz tRNS gént azonosítottak a humán genomban, azaz jóval többet,

I V.

440

A fehérjeszintézis iniciációja

mint amennyi a fehérjeszintézishez szükséges. Szere­ pük tisztázása további kutatások tárgya.) Általános­ ságban elmondhatjuk, hogy a sejtben található fehér­ jeszintézisben részt vevő tRNS-ek száma több, mint az aminosavak száma, de kevesebb, mint a kodonok száma. A tRNS-ek és a kodonok száma közötti diszkre­ panciát az teszi lehetővé, hogy a kodon-antikodon kölcsönhatásokban a három kialakuló bázispár között eltérő erősségű kötés alakul ki. Amikor a kodon első és második bázisa találkozik az antikodon harmadik és második bázisával (a mRNS és tRNS kapcsolódásakor a két nukleinsavszál antiparalell lefutású, 15-1. ábra), akkor a Watson-Crick által leírt módon történik meg a bázispárosodás (A-U, C-G párok kötődnek egymás­ hoz). A kodon 3. bázisa és az antikodon első bázisa közötti kapcsolat azonban kevésbé egyértelmű, azaz az antikodon első pozíciójában lévő bázis többféle kodontriplet utolsó bázisával tud kapcsolódni (lásd 15-3. táblázat, 15-7. ábra). Ezt a jelenséget - az anti­ kodon és a kodon közötti lazább kapcsolatot wobble-nak, „lötyögésnek” nevezik. A lötyögő bázispárosodás jelensége optimalizálja a fehérjeszintézis sebességét is, azaz ha mindhárom bázispár egyformán erős Watson-Crick-pár lenne, a kodon-antikodon kölcsönhatás disszociációja jóval lassabb lenne és lelassítaná a polipeptidlánc szintézi­ sének sebességét. A wobbling következtében ugyan nő a hibaelkövetés gyakorisága, de ez az elfogadható határon belül van, ugyanakkor optimális a fehérjeszin­ tézis sebessége.

15-3. táblázat. A kodon-antikodon interak­ ció. A „lötyögés" (wobbling) jelensége. A lötyö­ gős azt jelenti, hogy a kodon-antikodon inter­ akció során a kanonizált Watson-Crick-féle bázispárok közötti kapcsolattól eltérő bázis­ bázis interakciók is létrejöhetnek a mRNS kodonja és a tRNS antikodonja között Ha a kodon harmadik bázisa

Az antikodon első bázisa lehet

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z ŐDÉ S E

A z e u k a r i ó t a f e h é r j e s z i n t é z i s iniciációja

Az átlagos eukarióta mRN S-ek monocisztronosak, az 5’-végi cap struktúrát az 5’-UTR (untranslated region) követi, melyet a polipeptidláncot kódoló sza­ kasz (ORF, cisztron) követ (15-8. ábra). Ezután talál­ juk a 3’-UTR-t és a mRNS-ek döntő többségében a poli(A)-farkat. Az eukarióta fehérjeszintézis iniciációs lépése során egy „scanning” (pásztázó) mecha­ nizmus biztosítja a START [iniciációs, (AUG)] kodon azonosítását a mRNS-eken (15-9. ábra). A scanninget a 40S riboszóma-alegységgel komplexet alkotó eukarióta iniciációs faktorok (elF) és a riboszóraa P-helyéhez kötődő Met-tRNSi (az iniciátor metionint hordozó tRNS) végzi. Az iniciációs faktorok fehérjék, melyek részt vesznek az iniciáció folyamatában, de i riboszómának nem állandó részei. Eukariótákban több polipeptidláncból állnak, számuk tíz feletti. Jelen tan­ könyvben azoknak a faktoroknak az ismertetésé szorítkozunk, melyek a transzláció mechanizmusáná és szabályozásának megértéséhez szükségesek. A Met-tRNSi-t az eIF2 iniciációs faktor aktív for­ mája szállítja a 40S-alegységhez. Az eIF2 egy ún. heterotrimer G-fehérje, GTP kötött formában aktív, GDP kötött formában inaktív (lásd 17. fejezet A GTP hidrolízise csak az iniciációs AUG kodon je­ lenlétében történik meg. A scanning az ún. aktivált mRNS-en törtér: amely egy stabil, cirkuláris mRNS-fehérje komplex.

uracil H

adenin

/ H— N

\

I C c=o HC^ I I H-N\ c ^ NH.

H

V ^ Cx c / N h

H / C ^ C ^N

A

U vagy 1

II

C

G vagy 1

^N^C

G

C vagy U

U

A vagy G vagy 1

inozin

X o //

H

o

0 II

1

N 1 H

’o II

hn/Cv i ii

\J

HC^ N/ C

|

inozin

H

15-7. ábra. Az adenin-inozin és uracil-inozin bázispárok. A H-N részlet jelö­ li a cukor kapcsolódási helyét

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O U P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

eukarióta m RNS

AUG (START) kodon kódoló szekvencia (ORF)

1 nfGpppNp

3'

AAAAA, 50_25o

\mrnrn~ -----------

______ I 5'UTR

|

5' cap

3'UTR

E________ J poli(A)-farok

441

15-8. ábra. Az eukarióta és a prokarióta mRNS szerkezete. Az iniciációs AUG kodeinok azonosítását euka­ rióta mRNS-eken többnyire a Kozakszekvencia, míg prokarióta mRNS-eken az AUG kodonok előtt, a nem kódoló ré­ szeken található Shine-Dalgarno-szekvencia segíti (zöld vonallal jelölve). UTR, untranslated region; ORF, open reading frame)

fehérje karióta m RNS

C

AUG (START)

kódoló szekvencia (ORF)

5’ PPP

5'UTR

fehérje 1

fehérje 2

fehérje 3

Acirkuláris komplex létrejöttét számos fehérje bizto­ sítja; az 5’végi cap-hez kapcsolódik az eIF4E cap-kötő fehérje melyhez egyéb, az eIF4 komplexet alkotó fehérjék kötődnek. A 3’-poli(A)-farokhoz kö­ tődik a PABP (poly-A binding protein) fehérje. Az eIF4Eés a PABP fehérjék egy közös állványfehérjéhez, az eIF4G fehérjéhez kötődnek; ezzel kialakul a cirkuláris mRNS-molekula. A cirkuláris mRNS-forma kialakulása egyrészt mutatja a mRNS molekula ipségét, másrészt védelmet nyújt a degradációs nukleázokkal szemben. Az iniciációs AUG kodon kivá­ lasztását az AUG triplet körüli szekvenciák is elősegí­ tik; gyakran egy jellegzetes szekvencia veszi körül [5'-(A/G)NNAUGG-3’j, melyben kitüntetett szerepe van a -3-as pozícióban elhelyezkedő purinbázisnak (az mRNS nukleotidjainak számozásában az AUG éninja viseli a + 1 számot). A szekvenciát felfedező­ jeután Kozak-szekvenciának nevezik. Ahhoz, hogy a ing megtörténhessen, a mRNS másodlagos szer­ zetének, hajtűkanyarjainak megszüntetése is szük­ séges, melyet a komplexben megtalálható más fehérje faktorok végeznek. Ilyen az eIF4A, melynek helikáz aktivitása van, így működését ATP hasítása kíséri. A40S riboszóma-alegység a hozzá kötődött transz­ kripciós faktorokkal elkezdi a mRNS pásztázását. Az

iniciációs kodon megtalálásakor az iniciációs kodon és a Met-tRNSi antikodonja között bázispárosodás alakul ki, majd ezt követően az eIF2-höz kötött GTP GDP-vé hidrolizál, és az eIF2-GDP, iniciációs fakto­ rok kíséretében leválik a komplexről. Ahhoz, hogy az eIF2 újra aktív legyen, GTP-kötött állapotba kell ke­ rülnie. Az eIF2-GTP regenerációját (a GDP-GTP cse­ rét) az eIF2B guaninnukleotid-kicserélő (exchange) faktor (GEF) végzi. Az iniciáció végén a 60S alegység kapcsolódását az eIF5B GTP-kötő fehérje serkenti, eIF5B-GTP formájában. A kötődést követően (a 60S alegység GTPáz-aktiváló hatásának eredményeként) eIF5B-GDP keletkezik, majd távozik a még hátrama­ radt iniciációs faktorokkal együtt.

A p r o k a r i ó t a f e h é r j e s z i n t é z i s iniciációja

Prokariótákban az egy adott biológiai fűnkció megvalósításához szükséges gének általában együtt regulálódó génszakaszon találhatók, transzkripciójuk egyszerre történik. A gének és az expressziójuk szabá­ lyozásában részt vevő DNS-régiók (promóter, operá­ tor) együttesét operonnak nevezzük. így az átírt prokarióta (és archaea) mRNS-ek zöme policisztro-

I V.

442

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

40S riboszómaalegység

15-9. ábra. Az eukarióta transzláció iniciációja. Az iniciáció fő lépései: a riboszóma kis alegység aktiválása iniciációs faktorok által, az aktivált, elF2-GTP-hez kötött iniciátor Met tRNS és az aktivált, cirkuláris mRNS kötődésea riboszómához, majd az mRNS pásztázása az első AUG megtalálásáig. Az AUG kodon illesz kedik a kis riboszóma-alegység inkomplett P-helyére, megtörténik a kodon-antikodcr kapcsolódás, az elF2-GDP leválik. A továb iniciációs faktorok leválása lehetővé teszi a nagy (60S) riboszomális alegység kapcsolódá­ sát, a 80S iniciációs komplex kialakulását

15, F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O L I P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

30S riboszóma-alegység

iniciációs faktorok

fMet-tRNSi

3' mRNS iniciátor AUG Shine-Dalgarno-szekvencia 16S RNS

Baktériumokban először az IF3és IFI kötődik a 30S kis riboszóma-alegység E- és A-helyére, majd az mRNS-t a 16SrRNS-sel komplementer Shine-Dalgarno-szekvenciák irányítják a P-helyre. A P-hely kiválasztása után (a riboszóma inkomplett P-helyén az mRNS AUG szek­ venciája rögzült) a formil-metionin-tRNS™6' az IF2-GTP-vel hármas komplexet al­ kotva kötődik a mRNS AUG tripletjéhez 15-10. ábra. A prokarióta transzláció iniciációja.

443

nos, azaz több polipeptidláncot kódol­ nak (15-8. ábra). A már megtárgyalt eukarióta iniciációs stratégia itt nem lehet eredményes, mert ha csak az 5’-véghez legközelebbi AUG kódot keresnénk meg, akkor minden mRNSről csak egy polipeptidlánc transzlálódna, a fehérjék jelentős része elvesz­ ne. így az iniciációs kodon kiválasztá­ sához az AUG kodonok környezetét is értelmezni kell; az iniciációs kodont prokariótákban egy specifikus szek­ vencia, a Shine-Dalgarno-szekvencia előzi meg. A szekvencia komple­ menter a 30S riboszóma alegységen belül található 16S rRNS egy szaka­ szával és a policisztronos mRNS-en belül minden transzlálandó ORF előtt megtalálható. Prokariótákban az iniciációs tRNS formil-metionint hordoz. Baktériu­ mokban két tRNS képes metionin kö­ tésére: a tRNSMet és a tRNS™61. Mind­ két tRNS esetében először a korábban már leírt módon a tRNS metioninkötése történik meg két makroerg kö­ tés felhasználása terhére. A metionil-tRNSMet ezután csak a láncközi metioninokat kódoló AUG kodonokhoz kötődik. A Met-tRNS™61 (az iniciátor tRNS) azonban szubsztrátja lesz a metionil-tRNS-formiltranszferáz enzimnek (röviden transzformiláznak). A formilálás az iniciátor tRNSen történik N 10-formil-tetrahidrofolát közreműködésével. A fMet-tRNS™61az egyetlen tRNS prokariótákban, mely az úgynevezett inkomplett P-helyre kötődni képes, melyet az mRNS (az iniciátor AUG) és a 30S-alegység alkot. Ennek oka, hogy míg a P-helyre illeszkedő fM et-tRNSf^-et az IF2-GTP komp­ lex kíséri helyére, addig a többi aminosav-tRNS komplex a Tu-GTP elongá-

444

ciós faktorral asszociálva találja meg az egész (70S) riboszómán az A-helyet (lásd elongáció). A prokarióták kevesebb iniciációs faktorral rendel­ keznek, mint az eukarióták. Esetükben a kis 30Salegység IF3-mal közös komplexe a mRNS-hez és az IF2-GTP-fMet-tRNSfVkl komplexhez kötődik (15-10. ábra). Az IFI a 30S riboszóma A-helyére kö­ tődik, és megakadályozza, hogy az iniciáció során bármilyen töltött tRNS odakötődjön. Az iniciáció kö­ vetkező lépésében kialakul az ún. preiniciációs komp­ lex, ahol az IF2-GTP kötődik a 30S riboszóma-alegységhez, a formilmetioninnal töltött iniciátor tRNS antikodonja kapcsolódik az AUG iniciációs kodonhoz. Ezt követi az 50S riboszomális alegység bekötődése, mely az eukarióta nagy alegységhez hasonlóan GTPáz aktiváló hatású. A GTP hidrolizálódik és a há­ rom iniciációs faktor disszociál a 30S riboszóma al­ egységről, ezzel kialakul a 70S iniciációs komplex, mely készen áll a peptidlánc elongációjára.

A fehéjeszintézis elongációja eukariótákban Az eukarióta és prokarióta elongáció nagyfokú ha­ sonlósága miatt kizárólag az eukaróta elongációt is­ mertetjük, és jelezzük a prokarióta elongációban talál­ ható esetleges különbségeket. A fehérjeszintézis elongációs lépését a 15-11/a ábra mutatja. Az ini­ ciáció befejeztével a riboszóma P-helyén az iniciációban részt vevő metionil-tRNS (prokariótákban formil-metionil-tRNS) található, az A-hely üres. Az elongáció első lépéseként az A-helyen található kodonnak megfelelő aminoacil-tRNS kötődik az A-helyre. Az aminoacil-tRNS eukariótákban komple­ xet képez az eEFl (eukarióta elongációs faktor-1) fe­ hérje GTP-kötött formájával (prokariótákban: EF-Tu). Ez az aminoacil-tRNS-eEFl-GTP komplex kötődik az A-helyre, amennyiben megfelelő a kodon-antikodon interakció. Ekkor a GTP hidrolizál és az eEFl-GDP komplex disszociál a töltött tRNS-ről. Az eEFl aktivációját, vagyis a GDP-GTP cserét) az eEFlB guaninnukleotid-kicserélő faktor (GEF) végzi el (15-11/b ábra). Az eEFlB fehérjének prokariótákban az EF-Ts fehérje felel meg. A ribo­

I V . A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R Ó L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

szomális peptidil-transzferáz aktivitás peptidkötést hoz létre a P-helyen található iniciátor metionin (ké­ sőbbiekben peptid) karboxil- és az A-helyen levő aminoacil-tRNS komplex aminocsoportja között (15-11/c ábra). A lépés gyorsasága és pontossága nagyrészt a riboszómáktól független elongációs fakto­ rokon múlik. A peptidkötés létrejötte nem igényel ATP-felhasználást, az energia az aminosav karboxil és a tRNS 3’-vége közötti makroerg észterkötésből származik. A következő elongációs lépés megkezdése előtt az apparátust alaphelyzetbe kell hozni, azaz a mRNS-t, a dipeptidil-tRNS-t és a 40S riboszóma A-helyet kell újrarendezni. Ez a folyamat egy újabb G-fehérje, az eukarióta elongációs faktor-2 (eEF2) transzlokáz feladata (prokariótákban: EF-G). A transzlokáz a dipeptidil-tRNS-t a mRNS-sel együtt, a kodon-antikodon interakciót nem megszakítva há­ rom nukleotiddal az 5’-vég irányába viszi, a 40S ribo­ szóma A-helyéről a P-helyére. A transzlokáció ener­ giaigényes folyamat, GTP hidrolízisével jár, mely energia a mozgáshoz szükséges. A transzlokáció ered­ ményeképpen az A-hely üres lesz. A dipeptidil-tRNS P-helyre való kötődésével az aminosav nélküli ini­ ciátor tRNS az E-helyre kerül, és kezdődhet egy újabb ciklus. A következő, az mRNS bázissorrendje által meghatározott tRNS-t az eEF 1 elongációs faktor szál­ lítja az A-helyre, az aminosav nélküli tRNS pedig az E-helyről disszociál. A fehérjeszintézis elongációjának főbb lépéseit az aminosav-tRNS kötődése, a peptidkötés létrejötte és a komponensek transzlokáci­ ója képezi. A fehérjeszintézis mindig az N-terminálistól a C-terminális felé zajlik. A fehérjeszintézis pontossága szempontjából az elongáció is kitüntetett jelentőségű. Az eEFl, illetve bakteriális megfelelője, az EF-Tu GTPáz-aktivitása nagyban meghatározza a fehérjeszintézis sebességét és pontosságát. Az az idő, ami az aminoacil-tRNSeEFl-GTP komplexnek a mRNS kodonnal, illetve a riboszómával történő kölcsönhatására rendelkezésre áll, azaz a GTP hidrolízisének az ideje, használható fel a kodon-antikodon pontos illeszkedésének vizsgála­ tára. Ha a kodon-antikodon párosodás nem megfelelő, akkor az aminosav-tRNS-eEFl-GTP komplex disszociál az A-helyről. Amennyiben a GTP hidrolízi­ se hamarabb megtörténik, mintsem az aminoacil-

445

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O L I P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

a

15-11. ábra. Az eukarióta transzláció elongációja. (a) Az ábra az első elongációs ciklust mutatja, melyben a 80S riboszómakomplex P-helyén az iniciátor metionin-tRNS komplex van kötve. Az A-helyen elhelyezkedő következő kodonhoz kötődik a következő aminosav-tRNS, mely az elongációs faktor-1 (EF1) GTPáz fehérje által komplexálva lép be az A-helyre. A kötődés aktiválja a GTPáz aktivitást és az EF1-GDP komplex távozik a riboszómáról. A P- és A-helyen álló amino­ sav-tRNS komplex közelít egy­ máshoz, és a nagy riboszóma-alegység peptidil-transzferáz akti­ vitása létrehozza a peptidkötést a metionin karboxilcsoportja és a második aminosav szabad aminocsoportja között. A transzlokáció során az EF2-GTP komplex (transzlokáz) csatlakozik a riboszómához, és GTPáz aktivitásának hatására a riboszóma az mRNS-en 3 nukleotiddal, azaz egy kodonnal az mRNS 3'-vége felé mozdul el. A dipeptidil-tRNS a P-helyen, az iniciátor tRNS az E-helyen talál­ ható, az A-hely pedig szabaddá válik újabb aminoacil-tRNSeEFI-GTP komplex fogadására. Az E-helyről az üres tRNS disszociál. (b) Az eEFI GTP/GDP ciklusa, (c) A peptidkötés kialakulásának me­ chanizmusa. A szaggatott vona­ lak Fl-hidat mutatnak

GTP

I peptidkötés kialakítása

5'

AUG GCC GGU

v

3'

transzlokáció

UA A

3'

STOP

H H O

H H O

I I

H

I -C— R I c=o \ o

II

H - N —C —C. H R OH

OH

R

O

I II

H

I

H

I

N—C —C—N—C

I I H H

OH

I

c=o \ o

OH

Ade

p e p tid il-tR N S

a m in o a c il-tR N S

p e p tid il-tR N S

a m in o a c il-tR N S

446

IV.

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

Eukariótákban egy release factor (RE), az eRFI is­ meri fel mindhárom terminációs kodont. Az eRFl GTP-kötött formájában kapcsolódik a riboszóma A-helyén a terminációs kodonokhoz és aktiválja a peptidil-transzferázt, mely most hidrolázként működ­ ve a peptidláncot vízre viszi át. Az utolsó tRNS az E(exit) helyre kerül, és onnan szabadul fel. A folyamat­ A fehérjeszintézis terminációja és hoz szükséges az eRF3 is, mely szintén GTPáz fehérje a riboszóma reciklizációja és nem teljesen tisztázott módon működik közre a fo­ lyamatban (15-12. ábra). A fehérjeszintézis befejeztét az mRNS bázissor­ Baktériumokban két release faktor ismeri fel a rendjében felbukkanó terminációs kodonok jelzik. Te­ terminációs kodonokat, ezek az RF1 és az RF2. A fak­ kintve, hogy a négy bázis 64 különböző tripletet alkot­ torok a riboszóma A-helyére és a mRNS terminációs hat, és ezek közül 61 kódol aminosavat, három úgyne­ kodonjához kötődnek, és működésükhöz a P-helyena vezett terminációs kodont ismerünk. Ezek közül az polipeptidil-tRNS jelenlétét igénylik. A kodonspeciUAG, UAA kodonok nem kódolnak aminosavakat, az fíkus RF-ek működésükhöz egy GTP-kötő fehérjét, az UGA a fehérjékben igen ritkán előforduló szelenoRF3-at is igénylik. A RF1 és RF2 hatására a riboszó­ cisztein kódját is hordozza. A nem kódoló tripleteket ma peptidil-transzferáz aktivitása a polipeptidlánc nonszensz kodonoknak is nevezik. A nonszensz kodoC-terminálisa és az azt hordozó tRNS közötti kötést nokhoz nem kapcsolódnak tRNS-ek, csak fehérje hidrolizálja. A RF3 funkciója az RF1-RF2 komplex természetű terminációs vagy más néven „release” disszociációjának felgyorsítása. faktorok. A termináció végén a riboszómák alegységeikre esnek szét, majd az ese­ tek döntő részében újabb iniciációban ) ;Q vesznek részt. Ezt eukarióták esetében polipeptld elősegíti az aktivált mRNS cirkuláris ü formája. tRNS távozna, a jelen levő és esetleg hibás aminosav fog beépülni a fehérjébe. Az eEFl vagy az EF-Tu GTPáz aktivitásának fokozása növeli a fehérjeszinté­ zis sebességét, de csökkenti pontosságát.

A fehérjeszintézis pontossága

15-12. ábra. Az eukarióta transzláció terminációja. Amikor a fehérjeszintézis transzlokációs lépése után terminációs kodon kerül a riboszóma A-helyére, mivel az azzal komplementer tRNS antikodon nem létezik, így ezek helyett a riboszómához release faktor (eRFl) kapcsolódik, és hatására a riboszóma peptidiltranszferáz aktivitása hidrolizálja a tRNS és a polipeptid közötti észterkötést, majd a peptid, a tRNS és a riboszómaalegységek disszociálnak

A fehérjeszintézis pontossága az élő szervezet három kitüntetett polimerizációs reakcióútja - a replikádé, transzkripció és a transzláció - közül talán a legkevésbé fontos, a hibás aminosavbeépülés fiziológás követ­ kezménye a legelhanyagolhatóbb A helytelen aminosav-beépülés való­ színűsége 1:103—104. A fehérjeszintézis pontosságát több transzlációs rész­ lépés pontossága együttesen határozza meg. Ezek az aminoacil-tRNS-szintetáz pontos aminosavfelismerése, majd az aminoacil-tRNS-enzimkomplexre-

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O L I P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

ációja a megfelelő tRNS-sel, a megfelelő kodon-anodon párosítás az elongáció folyamatában, végül pedig a terminációs kodon megfelelő felismerése a releasing faktorok közreműködésével.

f\fehérjeszintézist befolyásoló antibiotikumok

xin egyik célfehérjéje az elongációban szereplő eEF2G fehérje, melyet ADP-ribozilál és ezzel inak­ tivál. A ricin növényi eredetű glikozidáz, mely a peptidil-transzferáz-aktivitással rendelkező 28S RNS-t gá­ tolja.

15.4

Az antibiotikumok egy része a bakteriális fehérje' tézist gátolva fejti ki hatását (15-4. táblázat). Egyes antibiotikumok az eukarióta transzlációt is gá­ tolják. Ilyen az aminoacil-tRNS-analóg puromycin vagya fuzidinsav (acidum fusidicum), amelyek gátol­ jákaz EF-G-GDP és eukarióta megfelelője, az eEF2 ' szociációját a riboszómáról.

Az eukarióta fehérjeszintézis gátlása

Az eukarióta fehérjeszintézist gátló molekulák kö­ zül két toxint emelünk ki. A diftéria kórokozójának, a Corynebacterium diphtheriae-mk toxinja ADP-ribozil-transzferáz-aktivitással rendelkezik. A diftériato-

447

AZ EU K A R IÓ TA FEH ÉR JES Z IN T ÉZ IS SZABÁLYOZÁSA

A fehérjeszintézis szabályozása elengedhetetlen a sejt homeosztázisának fenntartásában, a sejt proliferációjának, növekedésének, differenciációjának, stresszválaszának, túlélésének szabályozásában. A fe­ hérjék szintézisét külső és belső jelek befolyásolják, mint a tápanyagellátás, a glukóz-, az oxigénszint, va­ lamint a sejtfelszíni receptorokról induló jelátviteli utak. Ezen hatások közvetítésében központi szerepet játszik az mTOR-kináz (lásd 17. fejezet), de számos más jelátviteli út ismert, melyek szabályozzák a transzlációban részt vevő fehérjék aktivitását. Azok­ ban a sejtekben, melyekben nem történik transzkrip­ ció, mint az oociták vagy a retikulociták, a génex-

15-4. táblázat. Bakteriális makromolekulaszintézist gátló antibiotikumok Antibiotikum likációgátlók

Transzlációgátlók

Hatásmechanizmus

fluoroquinolonok (pl. ciprofloxacin, levofloxacin)

topoizomeráz-ll (DNS-giráz), topoizomeráz-IV-gátló (emellett több, a replikációtól füg­ getlen folyamatot gátol, pl. citrátkör)

rifamicinek (rifampicin)

DNS-függő RNS-polimeráz-gátlók

aminoglikozodok (gentamicin, a 30S riboszómához kötődik, gátolja az iniciációs komplex kialakítását és az elongációt tobramycin, streptomycin, (az aminoacil-tRNS kötését a riboszóma A-helyére); genetikai háttértől függően nefrokanamycin) és ototoxikus lehet a mitokondriumok fehérjeszintézisének gátlása miatt tetraciklinek (tetraciklin, doxycydin)

a 30S riboszómához kötődik, gátolja az elongációt (az aminoacil-tRNS kötését a riboszó­ ma A-helyére)

tigecyclin

a tetraciklinekhez hasonló hatásmechanizmusú, viszonylag új antibiotikum

makrolidek (erythromycin, azithromycin)

az 50S riboszómához kötődik, blokkolja a a riboszóma „alagutat" így korai terminációt okoz, a peptidlánc nem tud növekedni

chloramphenicol

az 50S riboszómához kötődik, peptidil- transzferáz gátló; a mitokondriumok fehérjeszin­ tézisét is gátolja; toxicitása miatt korlátozottan alkalmazható

clindamycin

a chloramphenicolhoz hasonló hatásmechanizmusú, régóta ismert, és még kiterjedten használt antibiotikum

oxazolidinonok (linezolid)

a chloramphenicolhoz hasonló hatásmechanizmusú, viszonylag új antibiotikum

448

I V.

presszió szabályozása a transzláció szabályozására korlátozódik. A gyorsan osztódó vagy a bioszintetiku­ sán aktív sejtekben (például máj sejt) szintén esszenci­ ális a fehérjeszintézis szabályozása; ezekben a sejtek­ ben nagy mennyiségű ATP fordítódik fehérjeszinté­ zisre. A fehérjeszintézis szabályozása érintheti a fehérjeszintézis bármelyik szakaszát, de eukariótákban döntő részben a szabályozás célpontja az iniciáció fázisa. A szabályozás korlátozódhat egy mRNS-molekulára, egy mRNS-csoportra vagy a sejt mRNS-einek döntő részére. Általánosságban azt mondhatjuk, hogy a glo­ bális szabályozások a transzlációs gépezet valamelyik elemére hatnak (pl. iniciációs faktorok), míg az egyes mRNS-ek szabályozása szekvenciaspecifíkusan kötő­ dő fehérjék (ilyen a vashomeosztázisban részt vevő fehérjék transzlációjának szabályozása) vagy miRNSek kötődésén alapul.

Az eukarióta fehérjeszintézis iniciációjának szabályozása A sejt szinte minden fehérjéjét érintő, globális sza­ bályozási módok közül részletesebben ismertetjük az eIF2a foszforilációját, ami megakadályozza a MettRNSi kötődését a riboszómákhoz, ezzel a fehérje­

a

m V

specifikusan egyes fehérjék szintézise (pl. ATF4)

V általános fehérjeszintézis

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

szintézist gátolja, valamint az eIF4E iniciációs fakto­ rokat megkötő fehérje, a 4E-BP (4E-binding protein) foszforilációját, melynek következtében a 4E-BP-k elengedik az addig hozzájuk kapcsolódó és így inaktivált eIF4E cap-kötő fehérjéket, elősegítve ezzel a transzláció iniciációjat. 1. Az iniciáció szabályozása az eIF2a foszforilációján kérészül Az elF2 egy heterotrimer fehérje, a-, (3-, y-alegységekből épül fel. Az eIF2 a-alegységének foszforilációja eredményeként az eIF2a sokkal erősebben köti GEF fehérjéjét, az eIF2B fehérjét, mint defoszforilált állapotban, gátolva annak működését (a GDP-GTP cserét). Ennek következtében nem történik meg az ak­ tivált iniciátor Met-tRNSi kötődése a 40S riboszóma-alegységhez, azaz az iniciáció gátolt. Mivel az eIF2B kópiaszáma alacsonyabb, mint az eIF2-é, így az eIF2 töredékének foszforilációja is minimálisra csök­ kenti az eIF2B szintjét, megakadályozva ezzel az eIF2 GTP kötött formájának kialakulását és további fehér­ jék szintézisének iniciációját. Az eIF2a szekvencia­ specifikus foszforilációját több, egymástól eltérő, más körülmények között aktiválódó kináz enzim is képes katalizálni, így egy fontos szabályozási csomópont alakul ki. Az alábbiakban négy kinázt mutatunk be (a részletes mechanizmus mellőzésével), melyek az

15-13. ábra. Az eukarióta transzláció iniciációjának szabályozása elF2a reverzibilis foszforilációján keresztül. Az elF2 a-alegység foszforilációja eredményeként az elF2a inaktív komplexet képez az elF2B fehérjével. Az elF2ot tartós inaktív állapota a fehérjeszintézist összességé­ ben gátolja, ugyanakkor egyes fehérjék, mint az ATF4 átírásának kedvez

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O L I P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

eIF2a reverzibilis foszforilációján keresztül befolyá­ solják a transzlációt (15-13. ábra). A retikulocitákban a hem elérhetősége befolyásolja aglobin transzlációját. Hem hiányában a HRI-kináz (heme-responsive inhibitor kinase) retikulocitákban aktiválódik, és foszforilálja az eIF2a-t, gátolva ezzel a retikulocitákban zajló fehérjeszintézist. Tekintve, hogy a retikulocitákban 95%-ban globinláncok szintetizálódnak, ez a mechanizmus a hem és globin össze­ hangolt szintézisét biztosítja. A HRI-kináz a májsej­ tekben is megtalálható. Genetikusán prediszponált be­ tegekben (így hepatikus porfíriában) az enzim felelős lehet a máj sejt fehérjeszintézisének fatális következ­ ményekkel járó gátlásáért. A PKR (double-stranded RNA-activated prote­ inkinase) közvetíti az interferonok transzlációt gátló hatását. Az interferonok hatására szintetizálódó PKR érzékeli a vírusok kettősszálú (double-stranded) RNS-ének (dsRNS) sejtbeni jelenlétét, aktiválódik és asejt fehérjeszintézisét blokkolja. Az ER-ben a hibásan feltekeredett fehérjék felhal­ mozódása irreverzibilis károsodást okoz. A PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase) érzékeli azER stresszállapotot, és leállítja a fehérjeszintézist. A GCN-2-kináz az elégtelen aminosavellátottságrareagál, és így lesz résztvevője az integrált stresszválasznak, melyben a GCN2-kináz a transzláció iniciációjának blokkolásáért felelős. Amikor a sejtben az aminosavak szintje lecsökken, megemelkedik az aminosavat nem kötő, töltetlen tRNS mennyisége. A töl­ tetlen tRNS-ek kötődnek a GCN2-kinázhoz, fokozva annak katalitikus aktivitását. Az eIF2a szabályozása mellett ismert az eIF2-GEF fehérjéjének, az eIF2Bnekdirektfoszforilációs szabályozása is (lásd 17. feje­ zet). Mint láttuk, az eIF2ot foszforilációja a legtöbb I mRNS transzlációját csökkenti. Bizonyos mRNS-ek S esetében, az mRNS eltérő szerkezete miatt a transzlá­ ció az eIF2a foszforilációját követően fokozódik. Ál­ talánosságban elmondhatjuk, hogy pl. a PERK aktivációja gátolja a sejtciklust előmozdító (pl. ciklin-Dl) fehérjék, és serkeni az apoptózist, stresszválaszokat közvetítő fehérjék expresszióját. Asejt stresszválaszában részt vevő fehérjék transz­ kripciójának központi, „mester” regulátora az ATF4

449

transzkripciós faktor. Az ATF4 transzkripciós faktor azok között a fehérjék között van, melyek transzláció­ ja megemelkedik eIF2a foszforilációját követően. A jelen tudásunk szerint elfogadott magyarázatot a 15-14. ábra mutatja. Az eukarióta mRNS-ek 5’-vége és a fehérjét kódoló régió (ORF) között elhelyezkedő ún. 5’-UTR (untranslated region) szabályozó eleme­ ket tartalmaz. Ezek lehetnek többek között hajtűka­ nyarok, IRES (belső riboszóma belépési hely; internál ribosome entry sites) (lásd a továbbiakban), illetve egy vagy több rövid kódoló régió (upstream open reading frames, uORF). Fehérjeszintézis során az első (5’-véghez legközelebb levő) ORF transzlációját kö­ vetően a kis alegység tovább pásztázza a mRNS-t, a következő ORF START kodonjánál újabb iniciációs komplex alakul ki, majd erről az ORF-ről is fehérje szintetizálódik, azaz az ilyen uORF-szekvenciák lehe­ tővé teszik a fehérjeszintézis újrakezdését egy mRNS-en, azaz reiniciációját. A humán ATF4 esetében két uORF (uORFl és 2) található, melyek közül a második átfedésben van az ATF4 ORF-jével (15-14/a ábra), így vagy az uORF2ről vagy az ATF4 tényleges ORF-jéről készül fehérje. Normál körülmények kötött, mikor az eIF2-GTPmet-tRNSi komplex nagy mennyiségben van jelen, az uORFl transzlálódik, ezt követően az uORF2 is (15-14/b ábra). Stresszkörülmények között az eIF2 foszforilációja csökkenti az eIF2-GTP-met-tRNSi komplex koncentrációját. Ilyenkor az uORFl transz­ lációja változatlanul megtörténik, de a reiniciáció so­ rán a faktorok csökkent mennyisége miatt az uORF2-t elérő kis alegység még nem tud iniciációs komplexet kialakítani, ezért tovább pásztázza a mRNS-t. Az az idő, míg eléri az ATF4 tényleges ORF-jét elegendő, hogy a faktorok mennyisége újból megemelkedjen (az eIF2 nem maradhat tartósan foszforilált állapotban, ez a sejt halálát jelentené); kialakulhat az iniciációs komplex, megtörténhet az ATF4 transzlációja (15-14/c ábra). 2. Az iniciáció szabályozása az eIF4E faktort meg­ kötő 4E-BP fehérje foszforilációjának segítségé­ vel (15-15. ábra) Az eukarióta iniciációs faktorok között a cap-et fel­ ismerő eIF4E fehérje intracelluláris szintje a legala-

IV.

450

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS KI F E J E Z Ő D É S E

a ATF4 ORF

transzláció iniciáció

transzláció reiniciáció

15-14. ábra. Az ATF4 transzkripciós faktor transzlációjának szabályozása. Az ATF4 mRNS a cap után két rövid kódoló szakaszt (open reading frame, ORF) tartalmaz uORF1 és uORF2 néven. Az ATF4 transzkripciós faktort kódoló szakasz (ATF4 ORF) részben átfed az uORF2-vel, de azzal nincs keretben (az uORF2 és az ATF4 nem tartalmaz közös aminosavakat) (a). Normális körülmények (pl. megfelelő aminosavellátottság) mellett az első uORF-ről egy rövid peptid szintetizálódik, majd a termináció után szétesik a fehérjeszintézis appa­ rátusa, de a 40S riboszóma-alegység folytatja az mRNS szkennelését, és az uORF2-t felismerve reiniciáció és fehérjeszintézis kezdődik, így ATF4 fehérje nem szintetizálódik (b). Amennyiben az intracelluláris aminosavkoncentráció alacsony, a GCN2 foszforilálja az elF2-t, ezáltal az elF2B és a szabad, GTP-kötött elF2 koncentrációja lecsökken. Az uORFI-en (bár lassabban, de) megtörténik az iniciáció, majda rövid peptid képződése után a 60S-alegység disszociál, de a 40S riboszóma folytatja a szkennelést. Mikor az uORF2 AUG-jéhez ér, az ala­ csony szabad elF2-GTP koncentráció miatt az iniciáció valószínűsége lecsökken, azonban ahogy a riboszóma halad tovább az mRNS-en, nagyobb lesz az esély, hogy elF2-GTP rendelkezésre álljon, így az ATF4 ORF-ről elindulhat a transzláció (c). Engedéllyel átrajzolva: Kilberg MS, et al. ATF4-dependent transcription mediates signaling of amino acid limitation. Trends Endocrinol Metab. 2009; 20(9):436-43.

csonyabb, így kiváló célpontja a fehérjeszintézis sza­ bályozásának. A reguláció többféle mechanizmusa is­ mert, közülük az eIF4E-t kötő fehérjék (4E-BP) foszforilációján kérészül történő szabályozást ismer­ tetjük. Az iniciáció kezdete előtt az eIF4E cap-kötő fe­

hérjéket a 4E-BP tartja inaktív állapotban, tehát a sza bad eIF4E elérhetőségét a 4E-BP mennyisége, aktivi­ tása meghatározza. 4E-BP-k fehérjekötő aktivitását a foszforiláció gátolja, így foszforiláció hatására a sza bad eIF4E-k mennyisége magas marad. A 4E-BP-

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O L I P E P T I D L A N C T O V Á B B I S O R S A

451

megvonást követően gátolt. Bár az amino­ savak megvonása általános represszióhoz vezet, egyes mRNS-ek esetében, pl. me­ lyek a riboszóma biogenezisében szerepet játszanak, a gátlás fokozott. Ezeket az mRNS-eket gyakran egy jellegzetes 5’UTR-régió különbözteti meg [citozinnal kezdődő, 4-14 pirimidinnukleotid hosszú­ ságú szekvencia, mely alapján TOP (terminál oligopyrimidine) mRNS-eknek nevezzük őket].

Az a m in o sa v a k a ktivá ló hatása az m TO RC I k o m p l e x r e

Az aminosavak, elsősorban a leucin és az arginin elősegítik az mTORCI komplex (lásd 17. fejezet) transzlokációját a lizoszómák felszínére. A transzlokáció elen­ gedhetetlen az mTORCI aktivációjához. Jelen ismereteink szerint az aminosavak az alábbi úton fejtik ki hatásukat: a sejtbe be­ kerülő aminosavak (Leu és Arg) a lizoszómákban akkumulálódnak, majd a vezikuláris ATPáz által kreált protongradienst használva egy transzportfehérje segítségével kijutnak a lizoszóma felszínére (15-16. ábra). Ott elősegítik az úgynevezett Rag fehérjék közül a RagA/B GTP-kötött

15-15. ábra. Az eukarióta transzláció iniciációjának szabályozása a 4E-kötő fehérjék (4E-BP) reverzibilis foszforilációján keresztül. A 4E-BP hipofoszforilált állapotban kötődik az elF4E-hez, a cap-kötő fehérjé­ hez, így elmarad a cap felismerése és csökken a mRNS-ek többségének transzlációja. Az mTOR-kináz aktivitásának függvényében a 4E-BP foszforilálódik, és az elF4E-t kötő aktivitása megszűnik, az elF4E felszabadul, és részt vehet az mRNS aktivációjában. Az mTOR aktivitását az éhezés, stresszállapotok csökkentik, így a fehérjeszintézist is gátolják, míg a növekedési faktorok, mitogének, inzulin, aminosavak az mTOR aktivitását növelik, így a fehérjeszintézist stimulálják

kinázok közül különösen fontos az mTOR, mely növekedésifaktor-szignálok és aminosavban dús táp­ lálék hatására aktiválódik, míg stressz és táplálék

15-16. ábra. Az mTORCI komplex transzlokációja a lizoszóma felszínére emelkedett aminosavszint mellett. A vakuoláris ATPáz (v-ATPáz) és az aminosavtranszporter fehérje (AT), mely az aminosavak transzportját végzi a lizoszóma felszínéhez horgonyozva találhatók. A v-ATPáz protonokat pumpál a lizoszóma belsejébe, az ebből adódó gradienst használja az AT az aminosavtranszportra. Akijutó aminosavak a Ragulátor fehérje közreműködésével a RagA/B GTP-kötött formájának kialakulását stimulálják, a RagA/B-GTP pe­ digaz mTORCTet a lizoszómamembránhoz közelíti, ahol az mTORCI-et a Rheb fehérje aktiválja

452

IV. A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó TÁ RO LÁS A ÉS KI F E| E Z Ő DÉSE

és a RagC/D GDP-kötött formájának képződését. A G-fehérjék családjába tartozó Rag fehérjék az aminosavak hatására kölcsönhatásba lépnek az ún. Ragulátor fehérjekomplexszel, mely a Rag fehérjék guaninnukleotid-kicserélő faktora (GEF). A követke­ ző lépésben az aktív Rag heterodimerek kötik az mTORCl Raptor komponensét és elősegítik az mTORCl lizoszómák külső felszínéhez való kötődé­ sét. Az mTORCl valószínűleg egy citoplazmatikus kompartmentből transzlokálódik a lizoszómák külső felszínére, és ott aktiválódik egy másik G-fehérje, a Rheb GTP-kötött formája által. A növekedési fakto­ rok a Rheb közreműködésével fejtik ki mTOR-t aktiváló hatásukat.

nak az alacsony tápanyagmennyiséghez. Az intracelluláris Ca -szint emelkedése is aktiválja az eEF2kinázt (és ezzel inaktiválja a eEF2-t) kalmodulinon keresztül. Harántcsíkolt izmokban ez a mechanizmus biztosítja, hogy az intenzíven működő izmok az ATP-t ne fehérjeszintézisre fordítsák. A 17. fejezetben bemutatjuk a növekedési faktorok és az inzulin serkentő hatását a fehérjeszintézisre. Az inzulin az mTOR jelátviteli úton keresztül aktivál­ ja az S6-kinázt (S6K), amely az eEF2K-t foszforilálja és ezáltal gátolja. A gátolt eEF2K nem képes foszforilálni (és ezzel gátolni) az eEF2-t, ami a gátlás gát­ lását, vagyis a transzláció szempontjából aktiválást eredményez.

A fehérjeszintézis elongációs lépésének szabályozása

Az egyes mRNS-ek transzlációjának szabályozása - a sejt vasszintjétől függő szabályozás

Az elongáció szabályozási mechanizmusai közül az eEF2 (eukarióta elongációs faktor-2) szabályozását emeljük ki (15-17. ábra). Energiahiányban megemel­ kedik az intracelluláris AMP-szint, amelyet az AMPkináz (AMPK) aktivációja követ. Az AMPK aktiválja az eEF2-t foszforiláló kinázt (eEF2K). Az eEF2 foszforilációja megakadályozza az elongációs faktor riboszómához való kötődését, és így a transzlokáció gátlását eredményezi. Ez a szabályozás lehetőséget te­ remt a sejt túlélésére tápanyagmegvonás alatt, mivel az energiaigényes transzláció gátolt. A tumorsejtek is kihasználják ezt a mechanizmust, hogy adaptálódja-

(am pk

aktív

inaktív

15-17. ábra. Az eukarióta transzláció elongációjának sza­ bályozása az eEF2-kináz foszforilációján keresztül. AMPK, AMP-kináz; mTOR, mammalian target of rapamycin; eEF2, eukarióta elongációs faktor-2

A fentebb bemutatott példákban a fehérjeszintézis szabályozásának olyan eseteit mutattuk be, ahol a sza­ bályozás általános jellegű volt, azaz sok fehéije expressziója szabályozódott egyetlen mechanizmus­ sal. Itt most egy olyan példát ismertetünk ahol egy speciális, egyedi funkciójú rendszer egyedi szabályo­ zása valósul meg a transzláció szintjén. Amint a 6. fejezetben említettük, az akonitáz en­ zimnek van egy citoplazmatikus formája, mely vashi­ ányos állapotban elveszti vas-kén központját, és a sejt vashomeosztázisának szabályozásában játszik szere­ pet. A vashomeosztázis két központi fehérjéje a transzferrin-receptor-I, a sejtbe transzportált vas jelen­ leg legjobban ismert receptora és az intracelluláris vaskötő fehérje, a ferritin, mely megakadályozza, hogy toxikus mennyiségű szabad vas legyen a citoplazmában (lásd 9. fejezet). A szabályozás során vas­ hiányos állapotban az akonitáz hajtűkanyar struktúrá­ kat ismer fel a transzferrin-receptor-I mRNS 3’- és a ferritin mRNS 5’-UTR régiójában, és kötődik ezekhez (15-18. ábra). A kötődés hatására a transzferrinreceptor mRNS ellenállóbb lesz az endonukleázokkal szemben, féléletideje megnő, azaz megemelkedik a sejtben a transzferrinreceptor szintje. Ezzel szembena ferritin mRNS 5’-régiójához kötődő akonitáz megaka-

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A PO L I P E PTI D LÁ NC T O V Á B B I S O R S A

453

citoszolikus akonitáz

ferritin mRNS M1AAAA3'

v f ferritinszintézis-gátlás

ferritin mRNS IAAAA 3' mRNS degradáció

v f ferritinszintézis

V [transzferrinreceptor-szintézis gátlása

15-18. ábra. A ferritin és a transzferrin receptor szintézisének szabályozása a sejt vastartalmának függvényében. Vashiá­ nyos állapotban az akonitáz kötődik a ferritin mRNS 5'-UTR és a transzferrinreceptor mRNS 3'-UTR-régiójában található hajtűkanyar struktúrához. A stabil fehérje-RNS interakció gátolja a ferritin mRNS-ről történő transzlációt, így a citoplazmatikus ferritinszint csökke­ nése az intracelluláris szabadvas-szintet normalizálja, míg a transzferrinreceptor mRNS ellenállóbb lesz az endonukleázokkal szemben (a). Avastartalom növekedésével az akonitáz és a hajtűstruktúrák közötti kölcsönhatás megszűnik, és a preiniciációs komplex kötődni tud a mRNS-hez, ferritin keletkezik, mely köti a vasat és az emelkedett szabadvas-tartalom normalizálódik, míg a transzferrinreceptor mRNS szintje csökken (b)

dályozza annak transzlációját, csökkentve ezzel a ferritin szintjét sejten belül. A mRNS-hez kötő akonitázt, mint szabályozó fehérjét, IRBP-nek vagy IRPnek(iron response element binding protein) nevezzük, míg a mRNS-en található speciális struktúra, amihez kötődik az IRE (iron response element).

A transzláció szabályozása

mikroRNS-ekkel A mikroRNS-ek (miRNS) transzkripcióban betöl­ tött szabályozó szerepe, melynek részletei a 14. feje­ zetben olvashatók, e helyütt kiegészül a transzláció szabályozásában betöltött szereppel. Az RNS-indu­

kált csendesítési komplexbe (RNA-induced silencing complex, RISC) beépülő miRNS kötődik a neki meg­ felelő, részlegesen komplementer szekvenciát hordo­ zó messenger RNS-ekkel. A mRNS felismerését és a kötődést elősegíti egy, az Argonaute (AGO) családba tartozó fehérje, mely a RISC fehérjekomplex része. A kötődést követően a fehérjeszintézis repressziója két szinten valósul meg; egyrészt a fehérjeszintézis gátlása által, másrészt az mRNS fokozott degradációja révén. A 15-19. ábra a lehetséges támadáspontokat mu­ tatja: (a) a cap felismerésének gátlását, (b) az mRNS deadenilációját (3’-5’ irányban történő degradáció­ ját), (c) a cap eltávolítását, a mRNS 5’-3’ irányban tör­ ténő degradációját.

454

I V . A G E N E T I K A I IN F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS KI FEJEZŐDÉSE

a cap-felismerés gátlása

elF4 fehérjekomplex

deadeniládó

miRISC

1

exonuleázok

cap-eltávolítás (decapping)

I (mRNS-tárolás vagy -lebontás)

15-19. ábra. Az eukariota transzláció szabályozása mikroRNS-ekkel. A miRISC (microRNA-induced silencing complex) Argonaute (AGO) fehérjéhez kötött mikroRNS-ek (miRNS) komplementer bázispárosodással felismerik kö­ tőhelyüket a mRNS-en. A miRNS-ek a mRNS-sel kölcsönhatásba lépve tóvá' fehérjéket vonzanak a citoplazmából, és a fehérjeszintézis gátlását eredm nyezik az elF4 komplexet alkotó fehérjék gátlásával, a poli(A)-farok rövidítés vei, a cap eltávolításával. PABP, poli(A)-kötő fehérje

1. A cap-szekvencia felismerésének szabályozása miRNS-ek segítségével Az eIF4E iniciációs faktor központi szerepet ját­ szik a cap felismerésében és így az iniciációban. Kötő fehérjéjén keresztüli (4E-BP) szabályozását korábban ismertettük. A RISC komplexben található AGO fe­ hérje vetélkedik az eIF4E iniciációs faktorral a cap-hez történő kötődésért. Az AGO cap-hez történő kötődése lehetetlenné teszi az iniciáció megvalósulá­ sát. 2. Az miRNS-ek szerepe az mRNS-ek deadenilációjában A mikroRNS-ek fehérjeszintézist szabályozó hatá­ sának másik célpontja az mRNS-ek deadenilációja. Az AGO fehérjecsalád tagjai között endoribonukleáz (RNáz) aktivitással rendelkezők is vannak; nem csak a kötődést segítik elő a mRNS-hez de kötődést követő­ en azt el is hasítják. Ezt követi a mRNS deadenilá­ ciója. A deadenilált mRNS-ekhez nem képes a PABP kötődni, a mRNS nem ciklizálódik és így a transzláció hatékonysága csökken. A deadenilálás ugyanakkor megkönnyíti a mRNS-ek 3’—>5’ exonukleázok általi hasítását is.

3. miRNS felhasználásával történő cap-eltávolítás (decapping) A miRNS-ek és a hozzájuk kötődő fehérjekomi lexek a cap eltávolításával is tudják gátolni a transzl' ciót. A decapping a deadenilációt követő folyamat, és ún. decapping enzimek végzik. A cap eltávolítás' több fehérje is képes különböző módokon stimulá mely fehérjéket és funkciójukat itt nem részletez-” A cap eltávolítása után az mRNS 5 ’—>3 ’ irányban deg­ radálódik exoribonukleázok által. Az inaktivált mRNS-ek, valamint a transzláció gá lásában és a mRNS lebontásában részt vevő fehérjéka citoplazmában ún. P-testekben [„mRNA process' bodies (P bodies)] lokalizálódnak.

Cap-független fehérjeszintézis IRES segítségével A cap-függő, szkennelő fehérjeszintézis iniciáci megkerülhető az úgynevezett belső riboszomális belé­ pési hely (internál ribosomal entry site, IRES) felhas nálásával. Az IRES szekvenciák voltaképpen átves az iniciációs faktorok egy részének funkcióját; kötika

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A PO L I P EPTI D LÁ N C T O V Á B B I S O R S A

kisriboszomális alegységet és a töltött tRNS-t a ribo!ma P-helyére irányítják. Az IRES szekvenciákat detileg vírusokban ismerték fel, de később megta­ lálták megfelelőiket celluláris mRNS-ekben is. Való­ jábanaz IRES nem egy meghatározott szekvencia, ha­ nemtöbbféle másodlagos szerkezet együttese, mely­ nek jelenlétét elsősorban kísérletesen igazolják. Avirális IRES lehetővé teszi a fehérjeszintézist azok­ banaz esetekben is, mikor vírusfertőzések során a sejt saját fehérjéinek transzlációja gátolt; korábban részle­ teztük pl. az interferonok transzlációgátló mechaniz­ musát. Jó példa a virális IRES használatára a hepatitis-C-vírus (HCV), melynek IRES szekvenciája az iniciációs faktorok legnagyobb részének kihagyásával teszi lehetővé az iniciáció létrejöttét. Mitózis során, illetve a sejtet érő stresszválaszban vagyapoptózisban a cap-függő fehérjeszintézis gátolt. Azon fehérjék számára, melyek ezen folyamatok so­ rán szintetizálódnak, kézenfekvő lehetőség, hogy az IRES-szekvencia segítségével kerüljék ki az általános gátlást. Ilyen fehérje pl. a HIF-1 (hypoxia-inducible factor) transzkripciós faktor. Hypoxiában az mTOR gátolt, így a cap-függő transzláció is; ezzel magyaráz­ ható, hogy a hipoxiában megemelkedő HIF-1 transz­ lációja IRES-függő.

15.5

A SZ IN T ET IZ Á LT FEH ÉR JÉK IN T R A C ELLU LÁ R IS KOM PARTM ENTEKBE TÖRTÉN Ő IR Á N YÍTÁ SA

Ateljes proteom nagysága jelenleg az eddig azono­ sított fehérjék száma szerint 30 057, egy átlagos, dif­ ferenciált szomatikus sejtben 1-2x109 fehérjemoleku­ latalálható, míg egyes sejttípusokban a legnagyobb és legkisebb mennyiségben található fehérjék közti kon­ centrációkülönbség 107 is lehet. A fehérjék döntő ré­ sze a citoplazmában, a többi kompartmentekben he­ lyezkedik el. A membránfehérjék száma 4500-5000, a szekrécióra kerülők száma 2000-2500. A kompartmentek önálló funkciókkal bírnak, és bennük kizáró­ lagolyan fehérjék helyezkednek el, melyek ezekben a funkciókban szerepet játszanak. Amennyiben egy fe­

455

hérje nem a megfelelő helyre irányítódik, vagy saját kompartmentjébe nem tud bejutni, ez a sejt vagy a szervezet szintjén súlyos funkciózavart okoz. A fehér­ jék osztályozásának (angolul sorting) általános elvét Blöbel fogalmazta meg a „szignálpeptid” hipotézis­ ben. Eszerint a fehérjéknek belső szignáljaik vannak, melyek megszabják transzport útvonalaikat és sejten belüli lokalizációjukat. A belső szignálok (szignál­ szekvenciák) között megkülönböztetünk szignálpeptidet, mely elhelyezkedhet a fehérje N- vagy C-terminálisán, de a fehérjén belül is, és szignálfoltot (ebben az esetben a szekvenciák elszórva, több ponton vannak jelen a fehérje aminosavszekvenciájában és a fehérje végleges térszerkezetének elnyerésekor kerül­ nek egymás mellé).

A fehérjetranszport útvonalai A fehérjeszintézis folyamata prokariótákban a sej­ tek citoplazmájában zajlik, és azután transzferálódnak az egyes speciális fehérjék a sejtmembránba vagy akár a periplazmatikus résbe. Eukarióták esetében több kompartmentben, a citoplazmában és a mitokondriumban zajlik fehérjeszintézis. A mitokondriumokban speciális mitokondriális funkciójú fehérjék szinté­ zise zajlik (lásd később). A fehérjék szintézisének döntő hányada a sejtek citoplazmájában indul el. Sza­ bad riboszómákon kezdődik és fejeződik be a citoplazmatikus, a sejtmagi, a mitokondriális és a peroxiszomális fehérjék szintézise. Ugyanakkor az endoplazmás retikulum (ER), a Golgi-apparátus, a lizoszómák, a plazmamembrán felépítésében szerep­ lő integráns membránfehérjék vagy a szekrécióra kerülő fehérjék szintézise citoplazmatikus kezdés után az ER-ez kötődve folytatódik (15-20. ábra). Ezt a képet komplexebbé teszi, hogy az ER-en szintetizáló­ dó fehérjék egy része csoportosan, vezikuláris transz­ porttal jut el végső rendeltetési helyére. Ebben az eset­ ben a fehérjének meg kell találnia saját, specifikus transzportvezikuláját és a vezikulának is specifikusan el kell jutni a „végállomásra”, ahonnan „rakományát lerakva” vissza kell jutnia a kiindulópontra, az újabb küldemény felvételére.

456

I V . A GÉ N ÉTI KAI I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS KIFEJEZŐDÉSE

riboszómák ■ retenció

!f citoszol

(endoplazmás retikulum

I mitokondrium

(peroxiszómák

f sejtmag

í plazmamembrán

-fGolgij-

belső felszín lizoszómák 15-20. ábra. Az eukarióta sejtekben szintetizálódó fehérjék transzportjának egyszerűsített útvonalterve. A kék nyilak azokat az utakat jelölik, melyek nem igényelnek (további) szignál szekvenciá­ kat. Az ER-ból a Golgi-apparátuson keresztül konstitutív szekrécióra kerülő fehérjék számára csak az ER-ba, vagy annak membránjába való transzporthoz szükségesek irányító szekvenciák

A szabad riboszómákon szintetizálódó fehérjék lehetséges útjai C i t o p la z m a t ik u s f e h é r j é k

A citoplazmatikus fehérjék a szabad riboszómákon szintetizálódnak, és semmilyen irányító szekvenciával nem bírnak, így szintézisük után a citoplazmában maradnak.

A p la zm a m e m b rá n fe lé p íté sé b e n szerep lő p e r ifé r iá s f e h é r j é k

A perifériás membránfehérjék jellegzetességeinek részletes ismertetése, kapcsolódásuk a membránhoz a 4. fejezetben található. A fehérjék memránhoz kötődé­ sének egyes módjait a 4-8. ábra mutatja be.

A fe h é rjék m ito ko n d riu m b a tö rtén ő i r á n y ítá s a

A fehérjetranszportok legösszetettebbike a mitokondriális proteom kialakítása. Az összetettséget ré­ szint a mitokondriumok topológiai sokszínűsége, azaz a különböző kompartmentek, részint a különböző időkben kialakuló mitokondriális fehérjéket kódoló gének okozzák. A mitokondriumok az endoszimbionta hipotézis szerint ősi baktériumok sejtekbe történő

szabályozott szekréció

v ■konstitutív szekréció extracelluláris t áris tér

f plazmamembrán

transzlokációja révén alakultak ki. Az eukarióta sejttel való együttélés ideje alatt az eredeti mitokondriális I genom jelentős része a sejtmagba vándorolt. Ezeknek | a géneknek a fehérjetermékei a citoszolban szabad ri­ boszómákon szintetizálódnak, majd mitokondriális irányító szekvenciájuk segítségével találnak vissza a mitokondriumokba. A mitokondriumok megtartották saját DNS-ük egy részét, mely mRNS-t, annak transz­ lációjához szükséges tRNS-t és riboszomális RNS-t kódol. A szintetizált fehérjék a mitokondrium mátri­ xában maradnak, vagy a belső membránba épülnek be. Végül pedig az endoszimbionta lét következtében filogenetikailag újabb gének jöttek létre a sejtmagon be­ lül, melyeknek fehérjetermékei a mitokondrium és a sejt többi része közötti kapcsolatot segítik elő (például transzporterek) vagy a mitokondrium biogenezisét | szabályozzák. A mitokondrium fehérjéinek 99%-a a nukleáris | genomban kódolt, és mint prekurzor fehérje a cito­ plazmában szabad riboszómákon szintetizálódik. A mitokondrium fehérjéi végleges konformációjukat a mitokondriális dajkafehérjék (pl. mtHsp70) segítsé­ gével veszik fel, a fehérjék transzportja „feltekeredés” (folding) előtt történik. A transzportra váró prekurzor | fehérjéket (preprotein) a Hsp70 és Hsp90 dajkafehér­ jék tartják a citoplazmában (lásd 1. fejezet), majd a) külső membránon elhelyezkedő receptorok kötik meg a prekurzor fehérjéket, mely receptorok a mitokond­ riális irányító szekvenciákat ismerik fel. A fehérjék ezután a TÓM (translocase of the outer membráné) és

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A PO LI PE PT I D LÁ N C T O V Á B B I S O R S A

457

15-21. ábra. Fehérjék importja a mitokondrium kompartmentjeibe. Az ábra részletes ismertetése a szövegben található. TÓM, translocase of the outer membráné; TIM, translocase of the inner membráné; MIA, mitochondrial intermembrane space assembly; SAM, sorting and assembly machinery; OXA, oxidase assembly protein

TIM (translocase of the inner membráné) nevezetű transzlokáz komplexek segítségével kerülhetnek be amitokondriális kompartmentekbe. A TÓM komplex alkotásában részt vevő fehérjék között találunk import receptorokat, mint a Tom70, Tom20 és Tom22, illetve a transzlokációt biztosító csatomafehérjét, ilyen a Tom40. A TIM komplexek csatomaképző elemei a Tim22 és 23 fehérje. Amitokondrium kompartmentjeibe irányuló fehér­ jetranszport elemeit a 15-21. ábra foglalja össze.

Anukleáris g é n e k á lta l k ó d o l t f e h é r j é k

transzportja a m i t o k o n d r i u m b a

A mátrixba irányító szekvenciák jellemzője az aminoterminális végen található alfa-hélix szerkezet,

melyen pozitív töltésű aminosavak találhatók. A mát­ rixba irányuló fehérjék először a TÓM komplex mitokondriális import receptoraihoz kapcsolódnak, majd az importálandó fehérje a Tom40-re kerül át. A Tom40 általános import pórusként funkcionál, elég tág ahhoz, hogy a harmadlagos szerkezetét még fel nem vett peptidláncok keresztülhaladhassanak rajta. A külső membránon keresztül történő transzlokáció kapcsolt a belső membránon keresztüli transzporttal, melynek strukturális alapját a TIM transzlokázkomplexbe szerveződött fehérjék képezik. Amint a transzportálandó fehérje N-terminálisa belép a mátrix­ ba, a mátrixba irányító szekvenciát egy proteáz leha­ sítja. A szintetizálódó fehérje egy dajkafehérjéhez, a mátrix Hsp70-hez kötődik, mely a Tim44-hez is kap­ csolódik. A Tim44-mtHsp70 kapcsolat fokozza a mtHsp70 ATPáz aktivitását, így az ATP hidrolízis

458

energiája mintegy behúzza a fehérjéket a mitokondrium mátrixba. Egyes fehérjék transzportjuk során a mátrixba jut­ nak, de végleges helyük a belső membrán, ahová az OXA (oxidase assembly protein) transzlokázon ke­ resztül helyeződnek. (Az OXA-transzlokáz részt vesz a mitokondriális DNS által kódolt, mátrixban lévő mitoriboszómákon szintetizálódott fehérjék belső membránba történő transzlokációjában is.) A mitokondrium belső membránjába történő transzlokáció további mechanizmusokkal is történhet, a fehérjék irá­ nyító szekvenciájuktól függően a TIM komplex tagja­ inak közvetítésével épülnek be a belső membránba. A TIM komplex pórusképző fehérjéje alapján megkü­ lönböztetünk Tim22 és Tim23 fehérjével rendelkező komplexet. A mitokondrium külső membránjába olyan fe­ hérjék irányulnak, mint a TOM-transzlokáz komplex pórus fehérjéje, a Tom40 fehérje, vagy a porin. Ezek jellemzően (3-hordó struktúrák ((3-redős lemezek, me­ lyekben a P-redők úgy helyezkednek el, mint a hordó dongái, így egy középső csatornát fognak közre). A membránba történő beépülésükhöz először a TÓM komplexen jutnak át, majd innen átkerülnek a SAM nevű (sorting and assembly machinery) fehérje­ komplexre, mely elősegíti a P-hordó struktúra kiala­ kulását. A mitokondrium intermembrán terébe is több lehetséges módon, irányító szekvenciájuktól függően történhet a fehérje eljuttatása. A fehérjék transzportálódhatnak a TÓM- és TIM-transzlokázok segítségé­ vel, illetve a TOM-transzlokázon átjutva közvetlenül az intermembrán térbe kerülhetnek. A diszulfidhidakkal rendelkező fehérjék SH-csoportjait a reaktív ciszteinekkel rendelkező MIA-oxidoreduktáz (mitochondrial intermembrane space assembly) alakítja intramolekuláris diszulfídhidakká. A MI A fehérje rege­ nerálását (SH-csoportjainak oxidációját) a légzési lánc fehérjéi végzik.

F e h é rjé k s e j t m a g b a t ö r t é n ő t r a n s z p o r tj a

A sejtmagot határoló membrán kétrétegű, külső ré­ sze folytatólagos az ER membránjával. A sejtmag

I V . A GÉ N ÉTI KAI I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

makromolekula transzportfolyamatai a magpóruso­ kon keresztül történnek, melyeken át mRNS-ek, tRNS-ek, riboszóma-alegységek transzportálódnak kifelé. A magpórusok a maghártya mindkét rétegét át­ érik. A nukleáris pórus komplex (NPC) igen jelentős transzportkapacitással rendelkezik. Percenként egyegy NPC-egység 60 000 fehérjemolekulát képes fel­ venni, míg 10-20 riboszomális alegység, 1000 tRNS és 50-250 mRNS hagyja el rajta keresztül a sejtmagot. A sejtmagba irányuló fehérjék nukleáris lokalizációs szignállal (NLS) bírnak. Eltérő NLS-szekvenciákat ismerünk, s ezekhez különböző felismerési mechaniz­ musok társulnak. Az elsőnek leírt NLS-szekvencia Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val 7 tagú polipeptid kife­ jezett pozitív töltéssel rendelkezik. Az ilyen NLS-sel rendelkező fehérjék transzportjához a citoszolikus monomer GTP-kötő fehérje, a Ran szükséges. (A mo­ nomer GTP-kötő fehérjéket részletesen a 17. fejezet tárgyalja.) A GTP-kötő fehérjék GTP-kötött állapot­ ban aktívak, GDP-kötött állapotban inaktívak. A mo­ nomer GTP-kötő fehérjéknél a GDP-GTP cserét egy guaninnukleotid-kicserélő (exchange) faktor (GEF) végzi, mely a Ran esetében a sejtmagban helyezkedik el. A Ran fehérjéhez kötött GTP hidrolízise lesz a nuk­ leáris fehérjetranszport hajtóereje. A nukleáris transz­ portot végző fehérjék, a karioferinek. Közülük a fe­ hérjék magba szállítását az importinok, a magból tör­ ténő exportját az exportinok végzik. Nukleáris transzportreceptor köti meg az importálandó fehérjét az NLS felismerésekor, majd a receptor-fehérje komplex a nukleáris pórus központi csatornáján ke­ resztül a sejtmagba jut. A nukleáris transzport recepto­ rok mind a szállítandó fehérjék NLS-éhez, mind pedig a pórushoz kötődnek. Az import mechanizmusa az alábbi: a szabad importin a citoplazmában megköti az NLS-sel rendelkező importálandó fehérjét. Az importin-fehérje komplex diffúzióval jut be a sejtmagba, ahol Ran-GTP hatására a fehérje disszociál az importinról (15-22. ábra). Az importin-Ran-GTP komplex elhagyja a sejtmagot, és a citoplazmában a Ran GTPáz aktivitását aktiválja a Ran GTPáz-aktiváló protein (GAP), mely része az NPC citoplazma fílamentumainak. A GTP hidrolízise csökkenti a Ran importin iránti affinitását, így a felszabaduló importin kötni tudja a cargót.

15, F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O LI P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

15-22. ábra. Fehérjék iráítása a sejtmagba. A cilazmában a nukleáris )port receptor (importin) üti a transzportálandó fei nukleáris lokalizációs 1 nálját (NLS). Az imporfehérje komplex keüljut a mag pórusán, majd a nukleoplazmában az importinról a Ran-GTP importinhoz való kötődése eredményeképpen leválik a fehérje és az importinJGTP komplex a cito~mába vándorol. A citomában a GTPázt aktivá­ lóprotein (GAP) elősegíti a 5 hidrolízisét, és a kelet­ kezőRan-GDP disszociál az ;portinról, mely így újabb 5-sel rendelkező fehérjét I megkötni. A Ran-GDP komplex sejtmagba jutásá­ nak mechanizmusát nem tárgyaljuk

NLS

459

transzportálandó fehérje

Egyes nukleáris fehérjéken nemcsak nukleáris Io­ nizációs szignálok, hanem nukleáris export (azaz ki­ feléirányuló transzport, NES) szignálok is találhatók, melyeka fehérjék magból való távozásához szüksége­ sek.

Fehérjetranszport a p e r o x i s z ó m á k b a

Aperoxiszomális kompartmentbe irányított fehér­ jékC-terminális részükön Ser-Lys-Leu (SKL az aminosavak egybetüs kódjával) aminosavakat tartalmaz­ nak. Ez a három aminosavból álló szekvencia a PTS1 (peroxisomal targeting sequence 1). A citoszolban a PTS1 a Pex5-nek nevezett receptorhoz kapcsolódik. APex5receptor a citoszolban oldott, monomer formá­ lván jelen, és a transzportálandó fehérje kapcsoló­ dása után képes a peroxiszóma membránjába ágya­ zódni és ott a Pex 14 fehérjékkel oligomerizálódni. Eb­ bena formában transzportálják a fehérjéket a peroxi­

mag­ membrán

szóma belsejébe. Sajátsága ennek a transzportnak, hogy feltekeredett fehérjék is képesek a peroxiszómába jutni. A transzportfolyamat befejeztével a Pex5 oligomer ubikvitin és egyéb fehérjék segítségé­ vel ATP energiájának terhére ismét monomerekké alakul (15-23. ábra). A peroxiszomális fehérjék ki­ sebb része N-terminális import szekvenciával (PTS2-vel) rendelkezik. Ezek a fehérjék más citoszolikus receptorhoz kötődnek, de egyébként a transz­ port hasonlóan történik a fentebb leírtakhoz. (Megem­ lítendő, hogy a peroxiszómák membránjába történő fehérjetranszport más mechanizmussal történik, mint a mátrixfehérjék transzportja.)

Klinikai vonatkozások Zellweger-szindrómában szenvedő betegekben a peroxiszomális fehérjeimport elégtelenül működik,

460

IV.

A G E N E T I K A I I N F O R M A C I Ó T Á R Ó L Á S A ÉS KI F E J E Z Ő DÉSE

15-23. ábra. Fehérjék irányí­ tása a peroxiszómákba. A PST1 szignállal rendelkező ci­ toplazmában szintetizálódott I fehérjék a citoplazmában a Pex5 receptorral kapcsolódva a peroxiszóma membránjában I található Pex14-gyel képeznek komplexet. A PST1 szignállal rendelkező fehérje ebből a komplexből kerül a peroxiszó­ ma mátrixba. A Pex5 receptor I oligomerje ubikvitinilálódik, ás ATPázok segítségével kerül vissza a citoplazmába. Fontos, hogy már feltekeredett fehér- 1 jék is importálódni tudnak a peroxiszómákba

ennek következtében a peroxiszomális funkciók (el­ sősorban a 22C-atomnál hosszabb szénláncú zsírsa­ vak oxidációja és a plazmalogénszintézis) működés­ képtelenné válnak. A betegekben elsősorban az agy, a vese és a máj károsodik, igen korai halálozást eredmé­ nyezve. A betegség legsúlyosabb formájában a Pex5 receptorfehérje sérülése mutatható ki.

Fehérjeszintézis az ER felszínén Az ER bonyolult szerkezetű cisztemarendszer, mely közlekedik az extracelluláris térrel, és a maghár­ tyán keresztül közvetlen kapcsolata van a sejtmaggal is. Minden fehérje szintézise a citoplazmában kezdő­ dik, de bizonyos fehérjék szintézise az ER felszínén folytatódik, ami azt jelenti, hogy ebben az esetben az egész transzlációs apparátus transzlokálódik az ER-re, amit ilyenkor durva felszínű ER-nek (angolul rough

ER-nek) neveznek. A citoplazmában vagy az ER fel­ színén lokalizálódó riboszómák nem különböznek egymástól, vagyis a fehérjeszintézis helyét nem a riboszóma, hanem az irányító szekvencia határozza meg. Miután a fehérjeszintézis a citoszolban lévő riboszómákon elkezdődött, egy 16-30 aminosavból ál­ ló irányító szekvencia szükséges ahhoz, hogy a ribo­ szómák az ER felszínre helyeződjenek. Az ER retikulumra irányító szekvenciát általában szignálszekvenciának vagy szignálpeptidnek nevezik. Jel­ legzetessége, hogy a fehérje aminoterminális részén található, egy vagy több nettó pozitív töltésű aminosavat tartalmaz, melynek folytatásában 6-12 hidrofób aminosav található. Amennyiben a szignálszekvenciá­ val rendelkező fehérje ER-mentes közegben szintetizálódik, majd a fehérjeszintézis befejeztével adjuk a rendszerhez az ER-t, a fehérje már nem kerül be az ER-be. Ez a kísérlet mutatja, hogy az ER-be való transzlokáció kotranszlációs, azaz a fehérjeszintézis­ sel egyidejűleg történő folyamat. Az ER-be transz-

B5. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O LI P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

lokálódó fehérjék szintézise kb. 70 aminosavig jut el, mikor az N-terminális szignálszekvenciához a szigoálfelismerő partikulum [signal recognition partiele (SRP)] kapcsolódik. Az SRP-nek hármas funkciója van: a) a szignálpeptidhez való kötődés, b) a fehérje­ tézis átmeneti leállítása (a riboszómához kötődé­ seitkeresztül), c) az SRP-receptorhoz való kapcsoló­ dás. Afehérjeszintézis lassítása azért szükséges, hogy afehérjeszintetizáló apparátus anélkül tudjon eljutni azER-re, hogy a fehérje szintézise befejeződne, mert ebbenaz esetben a fehérjét újra „kitekeréssel” kellene [transzportra alkalmas állapotba hozni. Szerkezetileg azSRP ribonukleoprotein, egy RNS és több fehérjemolekula alkotja. Az SRP kapcsolódik az ER memb­ ránjában elhelyezkedő SRP-receptorral; mindkettő G-fehérje, és ebben az állapotban GTP-t köt. A két fehérjekomplex kapcsolódása (SRP-receptor-SRP) GTPáz-aktivitást indukál, a GTP hidrolízis után a SRP elengedi a szignálpeptidet, visszakerül a citoszolba, a riboszómák pedig a naszcens polipeptidlánccal áthe­ lyeződnek az ER azon részére, ahol a fehérje transzlokálódhat az ER lumenébe. A fehérjekomplex, melyaz ER membránján keresztüli csatornát képezi, a

SRP-

461

transzlokon. A szignálpeptidet a transzlokonon való áthaladást követően a transzlokonhoz kapcsolódó szignál-peptidáz enzim hasítja. A riboszóma-alagutat elhagyó polipeptidlánc közvetlenül, feltekeredés nél­ kül kerül át a transzlokon pórusába (15-24. ábra). A transzlokonon való áthaladás nem igényel extra energiabefektetést, tehát a fehérjeszintézis lánc­ hosszabbító fázisának energiája mintegy áttolja a polipeptidláncot a transzlokonon. A riboszóma és a transzlokonfehérjék közötti illeszkedés igen szoros (az ER-ben akkumulálódó kalcium sem tud kiegyenlí­ tődni a transzlokonon keresztül). A transzlokon kiváló szigetelő tulajdonságát többek között egy rövid helikális peptidrésznek is köszönheti, mely abban az időben, amikor a transzlokonon nem halad át, peptiddugóként zárja el a transzlokon csatornáját.

F e h é rjé k b e é p ü lé s e a z ER m e m b r á n j á b a

A sejtekben igen nagy számú membránba épült (transzmembrán) fehérjét találunk. Ezek közül a fe­ hérjék közül az ER, a Golgi, a liszoszomális és az in-

transzlokon

receptor

szignálpeptidáz

15-24. ábra. Fehérjeszintézis az endoplazmás retikulum felszínén. A citoplazmában a szintetizálódó fehérjék egy része az aminoterminális részen ER irányító szekvenciát tartalmaz. A szignálfelismerő partikulum (SRP) a riboszómaalagútból kibukkanó ER szig­ nálpeptidhez kötődik, megállítja a fehérjeszintézist és a riboszómákat az mRNS-sel és növekvő polipeptidlánccal az ER felszínre irányít­ ja.AzER-felszínen az SRP kapcsolódik az SRP-receptorral, mindkét fehérje GTP-t köt. A riboszóma ezáltal a transzlokon közelében hor­ gonyoz le. A nascens polipeptidlánc és a riboszómák áthelyezése a transzlokonra mind az SRP-n, mind az SRP-receptoron GTP-hidrolízissel jár, majd az SRP- és SRP-receptor disszociálnak a transzlokonról. Az elongáció folytatódik, a polipeptidlánc a transzlokonon keresztül kerül az ER lumenébe, a szignálpeptidet pedig a szignál-peptidáz lehasítja. A transzláció befejeztével a riboszómaalegységek disszociálnak és új iniciációban vesznek részt, a transzlokon pedig záródik

462

I V.

tegráns plazmamembrán fehérjék mind a durva felszí­ ni! ER felszínén szintetizálódnak, beépülnek az ER membránjába és végső felhasználási helyükre történő transzportjuk közben is megmaradnak az ER-ben ki­ alakult, membránhoz kötött formájukban, azaz az ere­ detileg a lumen felé néző rész továbbra is a lumen felé (a plazmamembrán fehérjéinek esetében az extracelluláris tér felé), a citoszol felé eső rész a citoszol fe­ lé néz. Döntő részben a transzmembrán fehérjék egyvagy több membránon átívelő a-hélixet (20-25 aminosavból álló hidrofób régiót) tartalmaznak. ((3-hordó struktúrákat a mitokondriumok és a baktériumok membránfehérjéi között találunk.) A membránfehér­ jéket osztályozhatjuk funkciójuk vagy a membránban elfoglalt helyük, topológiájuk alapján. A topológiai osztályozás figyelembe veszi, hogy a fehérje egy vagy több transzmembrán szakasszal rendelkezik, a memb­ rán melyik oldalán helyezkedik el a fehérje N- és C-terminális vége, rendelkezik-e a fehérje C-termi-

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS KI F E) E ZŐDÉSE

nális hidrofób szakasszal, ami mint horgony rögzíti a membránban, és milyen típusú szignálszekvencia se­ gítette a membránba épülést. A fehérjék membránba épülésének további lehetősége, amikor nem polipeptid-szekvencia révén rögzül a fehérje a membrán­ hoz, hanem egy preformált glikofoszfolipid (glikozilfoszfatidilinozitol, GPI) horgonyhoz kapcsolódik. Te­ kintve, hogy a membránfehérjék térszerkezetének vizsgálata nem egyszerű, elterjedtek a fehérjeszekven­ cia ismeretében történő számítógépes molekulamodellező módszerek.

A fehérjék sorsa az endoplazmás retikulumban A fehérjék membránba történő beépülését szolgáló proteolitikus átalakulásokon túlmenően a fehérjék to­ vábbi proteolítikus hasításoknak lehetnek szubsztrát

15-25. ábra. Az N-glikozilált nagy mannóztartalmú oligoszacharidlánc szintézise. A 75-95 szénatomszámú dolikol-foszfát membrán ágyazott lipidhez egyenként adódik két N-acetil-glukózamin (GIcNAc) és öt mannóz. A dolikol-foszfát ezután a hozzá kapcsolt szénhidrátokkal együtt befordul az ER lumene felé, ahol négy további mannóz- és háro glukózegység kapcsolódik hozzá, majd a kialakult oligoszacharidlánc egy darabban tevődik át a fehérje kitüntetett Asn aminosavának savamidcsoportjára N-glikozidos kötéssel. A beépülő monoszacharidok UDP- vagy GDP-aktiváltak citoplazmatikus felszín

JJJJJJJJJJJ ER-membrán

dolikol-P

[olig oszacharid-transzferáz

luminális felszín GcNAc

Asn

N-glikozilálan fehérje mannóz

j

)

v# glukóz

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O LI P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

jai, glikozilálódhatnak, díszül fi dhidak képződhetnek jés összeépülhetnek többalegységes komplexekbe, lelyek eredményeképpen kialakul a fehérjék végső, cionális konformációja. A legtöbb, ER-ben szintetizálódó fehérje poszt'‘tetikusan szénhidrátok hozzáadásával módosul, " ozilálódik. A glikoziláció történhet a szerin és nin aminosavak - OH-csoportjához kapcsolódó­ an, ekkor O-glikozidációról, vagy az aszparagin amid nitrogénjéhez kapcsolódva, ilyenkor N-glikozidációról beszélünk. Az N-glikozilált glikoproteinek glikoálása az ER-ben kezdődik, elágazó oligoszacharid;túrákat tartalmazó komplex glikoproteineket hozva létre. Az O-glikozilált fehérjék legtöbbször li­ neáris, egytől négy szacharid egységet tartalmazó lán­ cokat tartalmaznak, melyek a Golgi-ban képződnek. Az N-glikoziláció egy 14 tagú [három glukóz, ki­ lenc mannóz és két N-acetil-glukózamin (GlcNAc)] oligoszacharidegység fehérjéhez kapcsolásával törté­ nik. A14 tagú lánc „összeszerelése” a dolikol-foszfátpoliizoprénen történik. Az első glikozidegység (GlcNAc) pirofoszfátkötéssel kapcsolódik a dolikolhoz. A 15-25. ábrán látható módon a 7 szacharidség rátétele után, mely a citoszol felé néző oldalon irténik, a dolikol-pirofoszfát-oligoszacharid-egység fordul az ER lumene felé, ahol további hét cukor­ egység kapcsolódik hozzá. Végül az oligoszacharid­ egységen bloc kerül át a polipeptidláncra. (A reakciót katalizáló oligoszacharid-transzferáz a szintetizálódó polipeptidláncban vagy egy Asn-X-Ser, vagy Asn-X-Thr tripeptid szekvenciát ismer fel, melyben azXa prolin kivételével bármely aminosav lehet.) Az ily módon glikozilált polipeptidlánc oligoszacharidláncai tovább módosulnak, három glukóz és egy mannóz eltávolítása után kerül a fehérje a Golgiapparátus cisz-részébe. I Az N-glikozidáció elősegíti a fehérjék megfelelő feltekeredését. A glikozilált fehérjék általában ellenál­ lóbbak a proteázokkal szemben, mint nem glikozilált megfelelőik. Anem megfelő folding, illetve hibás glikoziláció esetén a fehérjét az ER minőségellenőrző mechaniz­ musa visszatartja, hosszabb visszatartás esetén a mannozidázok az oligoszacharidláncot visszabontják, a rövidült oligoszacharidláncot az OS-9 (osteo-

463

sarcoma amplified 9) fehérje felismeri és az ER-ből el­ távolítja. A nem megfelelően feltekeredett fehérjék az ER-ből való eltávolítás után ubikvitinilálódnak és proteaszomális lebontásra kerülnek.

D i s z u lfid h id a k k i a l a k í t á s a

A diszulfidhidak szerepet játszanak a fehérjék megfelelő feltekeredésében, a harmadlagos és ne­ gyedleges szerkezet kialakításában, stabilizálásában. A diszulfidhidak kovalens kötések a fehérjék cisztein aminosavai között, a tiol- (-SH) csoportok oxidációjá­ val jönnek létre. A tiolcsoportok oxidációjához meg­ felelő, szabályozott oxidáló környezetre van szükség és ez az ER lumenében adott. Ebből következően di­ szulfidhidak leginkább a membránfehérjék külső (úgynevezett exoplazmikus) doménjaiban, illetve a szekrécióra kerülő fehérjékben találhatók. A szabad riboszómákon szintetizálódó fehérjék esetében ritkák a diszulfidhidak. A diszulfidhidak képződésében a protein-diszulfid-izomeráz (PDI) és ERŐ fehérjék [az ER-ben talál­ ható oxidoreduktázok, mint az ER oxidoreductin 1 (Erol)j vesznek részt. A PDI az ER-ben levő fehérjék diszulfidhídjainak kialakítását végzi, a reakció során a PDI-n kialakuló SH-csoportokat az Erői fehérje oxi­ dálja úgy, hogy a hidrogéneket közvetlenül molekulá­ ris oxigénre átvíve hidrogén-peroxidot képez (a PDI szerepe hasonló a korábban leírt mitokondriális Mia40 fehérje szerepéhez) (15-21. ábra).

C h a peron f e h é r j é k a z ER-ben

Az ER-ben a fehérjék feltekeredésére megfelelő molekuláris dajkafehérje-rendszerek állnak rendelke­ zésre. A BiP fehérje (binding immunoglobulin prote­ in) egy Hsp70 dajkafehérje mely a naszcens, szinteti­ zálódó fehérjékhez kötődik átmenetileg. A kötés meg­ akadályozza a fehérjék helytelen feltekeredését, illet­ ve az ER-on szimultán szintetizálódó fehérjék közötti nemkívánatos kölcsönhatásokat, aggregációt. A gli­ koproteinek szénhidrátláncait felismerő fehérjék, a lektinek is segíthetik az ER-ben a megfelelő konfor­ máció kialakulását. Közülük a kalnexin és kalretiku-

I V.

464

lin az olyan N-glikozilált glikoproteinek feltekeredését segíti elő, melyek a GlciMan9(GlcNac)2 szekven­ ciát tartalmazzák. Az egyetlen glukózt ezen a poliszacharidláncon egy speciális glikoziltranszferáz kép­ zi, és ezt az egy glukózt tartalmazó fehérjét ismeri fel a kalnexin és kalretikulin, kötődik a fehérjéhez és korri­ gálja a nem megfelelő térszerkezetet. A peptidil-prolil-izomerázok olyan enzimek, me­ lyek a peptidláncban jelen lévő prolinok peptidkötésének cisz-transz izomerizációját katalizálják és ezzel a kötés rotációját segítik elő. A rotáció elősegítésével a termodinamikailag legstabilabb konformáció elérésé­ hez szükséges idő rövidül le. A fentebb ismertetett mechanizmusok az egyes fe­ hérjék optimális konformációjának elérését segítik elő, az ER-ben meglevő, mindig jelen levő eszközök­ kel. Előfordulnak azonban olyan esetek, mikor ezek az eszközök mennyiségileg vagy minőségileg elégtelen­ nek bizonyulnak és a sejtben meg kell növelni azon fe­ hérjék mennyiségét, melyek a hibás konformációjú fe­

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

hérjékkel reagálni képesek. Ez az állapot az ER stresszállapota. ER stresszben az XBP1 (X-box binding protein 1) fehérje a magba vándorolva, transz­ kripciós faktorként szolgálva elindítja a chaperon fe­ hérjék szintézisét. Az XBP 1-nek ehhez aktív állapot­ ban kell lennie. Normál körülmények között a BiP fe­ hérjéknek csak kis mennyisége kötődik hibás konfor­ mációjú fehérjékhez, így marad elég BiP ahhoz, hogy az Ire-1 (Inositol-requiring enzyme 1) fehérjék egy ré­ szét kösse. Az Irel monomer formájában nem képes endonukleázként működni, azonban, ha az ER lumen­ ben a denaturált fehérjék száma megnő, több BiP lesz kötött állapotban, így a szabad Irel-ek dimert képez­ nek, endonukleáz aktivitásuk nő, az XBP1 mRNS-ből kivágnak egy intront, a két exon szekvencia fuzionál és a mRNS transzlációja után az XBP1 transzkripciós faktor a magba vándorolva beindítja az ER stressz(unfolded protein response, UPR) választ (15-26. ábra). Az indukált gének közé tartoznak az ER minő­ ségellenőrzésben és az ER-hez kapcsolódó fehérjele-

> f UPR-válasz inaktív XBP1 fehérje

XBP1 mRNS

XBP1-TF

y endonukleáz dómén

/

\

Ire1 monomer

feltekeretlen fehérjék normális mennyiség

15-26. ábra. A feltekeretlen fehérje válasz [unfolded protein response (UPR)] mechanizmusa. Normál körülmények között az ER-fehérjék döntő többsége megfelelő konformációjú, a BiP dajkafehérjék kötődve az Irel fehérjékhez monomer formában tartják az Ire-t és gátolják endonukleáz aktivitásukat (a). A nem megfelelő konformációjú fehérjék elvonják a BiP-eket az Ire 1fehérjékről, melyek dimerizálódnak és endonukleázaktivitásuk megnő. Az endonukleázaktivitás egy intron jellegű szakaszt távolít el az XBP1 mRNS-ből, mely így a transzláció során az aktív XBP1 szintézisét kódolja. Az XBP1 transzkripciós faktorként (TF) funkcionálva elősegíti az UPR-válaszhoz szükséges fehérjék mRNS-einek átírását (b)

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O LI P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

•ntásban (ER-associated protein degradation, D) szerepet játszó fehérjék génjei. Emlőssejtekben egy másik mechanizmus is aktivá­ lódik a nem megfelelően feltekert fehérjék hatására. Ezeknek a fehérjéknek a felszaporodása a transzmembrán elhelyezkedésű ATF6 fehérje membránon belüli hasításához vezet, és a citoplazmatikus oldalon Fáddá váló fehérjerészlet szolgál transzkripciós torként és elindítja az UPR válaszmechanizmust.

Ell-rezidens f e h é r j é k

Azok a fehérjék, melyek az ER-ben maradnak, nem úgy maradnak az ER-ben, hogy ott mintegy lehoryzódnak, hanem az ER-ből továbbítódnak vezikuláris transzporttal a Golgi-apparátusba, és a GolgiCOP-borított (coat protein) vezikulákkal térnek vissza az ER-be. Az ER membránfehérjék szignálszekvenciája a Lys-Lys-X-X. Az ezt a szignált hordozó fehérjék köz­ vetlenül képesek kötődni a COP-I fehérjékkel borított

465

vezikulák COP-I köpenyéhez és a vezikulák Golgiból az ER-be történő retrográd transzporttal térnek vissza az ER-be. Az ER-ben lokalizált szolubilis fehérjék döntő többsége kifejezi a Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) pepii­ det. Az ER lokalizációjú fehérjék, mivel nagyon nagy kópiaszámúak, sokszor véletlenül kerülnek bele az ER-ből a dsz-Golgiba irányuló, COP-II-vel jelzett vezikulákba. Annak elkerülésére, hogy ezek az ER-be szánt fehérjék végül is szekretálódjanak, kifejlődött egy a cz.vz-Golgiból visszafelé irányuló transzportot bonyolító vezikulacsoport, melyben az ER-rezidens fehérjék a KDEL receptorhoz kapcsolódva térnek vissza az ER-be (15-27. ábra).

G olgiba irá n y u ló f e h é r j é k

A Golgi-apparátusba a szekréciós útvonal fehérjéi elsősorban az ER-ből kerülnek be. A fehérjék vándor­ lásuk során folytonosan módosulnak. A különböző kompartmentek közötti fehérjeforgalom lehet előre­ irányuló, de lehet visszafelé mutató is, mint például a kompartmentből véletlenszerűen kikerült fehérjék visszaszállítása abba az eredeti kompartmentbe, ahol hatásukat ki­ fejtik. Az ER-ből a Golgiba irányuló transzport kívülről COP-II fehérjék­ kel borított vezikulákban történik.

KDEL-

receptor

F e h é r jé k t r a n s z p o r tj a a l iz o s z ó m á k b a

A lizoszomális enzimek a transzGolgi-hálózatból vezikuláris transz­ porttal kerülnek a lizoszómákba. c/sz-Golgi

■KDELszekvencia

15-27. ábra. A szolubilis, KDEL szekvenciával bíró ER fehérjék receptormediált folyamattal kerülnek vissza az ER-ba. Az ER-ből anterográd transzporttal távozó rezidens fehérjéket KDEL-receptorok is­ merik fel, megkötik őket, és a visszafelé történő transzportért felelős vezikulákban receptoraikhoz kötődve utaznak vissza az ER-ba

I V.

466

A lizoszomális fehérjék felismerését és a vezikulákba való bekerülését egy egyedi lizoszomális marker, a mannóz-6-foszfát (M6P) felismerése teszi lehetővé. Az M6P-csoport kizárólag az N-glikolizált glikoproteineken alakulhat ki a cAz-Golgi zsákjaiban. A transz-Golgiban (TG) található M6P-receptorfehérjék felismerik a M6P-mintázatot, kapcsolódnak a lizoszomális hidrolázokkal, klatrinnal fedett veziku­ lákba kerülnek majd a vezikulák (klatrinborításuk el­ vesztése után) fuzionálnak a késői endoszómákkal. Az M6P és receptora közötti kötés a TG-ban uralkodó pH 6,5-6,7-en erős, a késői endoszómák 6 alatti pH ér­ tékénél azonban a hidrolázok disszociálnak a M6Preceptorról, és fúzióval a lizoszómákba kerülnek. Az M6P-receptor a késői endoszómákból retrográd vezikuláris transzporttal visszatér a TG-ba, és további

A G É N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

M6P-mintázatot kifejező fehérjék lizoszomális transzportját tudja végezni. Figyelembe véve azt, hogy minden glikoprotein azonos N-kapcsolt oligoszacharidlánccal hagyja el az ER-t, a M6P kialakítása az oligoszacharidláncon spe­ cifikus folyamat, melyet a fehérje primer szerkezete kell, hogy irányítson. A glikoziláció specificitását a fehérjében lévő úgynevezett szignálfolt „signal patch” adja.

Klinikai vonatkozások Az abnormális glikoziláció következménye az I-sejt-betegség. Ismert a lizoszomális hidrolázok hiá-

(normális állapot mannóz-6 Pszignál megjelenése

lizoszomális

alacsony pH, disszociáció

fehérjeprekurzor

f l-sejt-betegség

korai endoszóma receptor

nincs hidroláz a lizoszómákban

hiányzó M6 P-szignál

konstitutív szekréció 15-28. ábra. A lizoszomális hidroláz enzimek transzportja az endoszómákba. Az ábra felső része a normál folyamatokat, alsó ré­ sze az „l-sejt-betegség" kialakulását mutatja. Normális körülmények között a lizoszomális hidrolázok mannóz-6 -foszfáttal „jelölődnek meg". A mannóz-6 -foszfátot expresszáló fehérjéket M6 P-receptorok vezikuláris transzporttal szállítják az endoszómákba. Az endoszómákban az alacsony pH-n a receptor-ligand kölcsönhatás gyengül, a cargo leválik, a receptor visszatér az ER-kompartmentbe és újabb fehérjét szállít, l-sejt-betegség ben az M6 P nem alakul ki, ezért a fehérjék nem kapcsolódnak receptorokhoz, hanem konstitutív szekrécióra kerülnek és szolubilis fehérjeként a vérbe ürülnek. így a lizoszómákban a felhalmozott hidrolizálatlan anyagok zárványok formájában jelentkeznek

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O LI P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

nyával járó lizoszomális tárolási betegség. A beteg­ ségben a hidrolázok emésztetlen szubsztrátjai halmo­ zódnak fel a lizoszómákban és súlyos, elsősorban köz­ ponti idegrendszeri zavarokat okoznak. Ez az oka a Hurler-szindrómának, amikor bizonyos glukozaminoglikánok bontása nem megy végbe. ! Az I-sejt-betegségben (inklúziós sejt betegség), mely a legsúlyosabb lizoszomális tárolási betegség, majd­ nem minden hidrolitikus enzim hiányzik, szubsztrátjaik felhalmozódnak a lizoszómákban és inklúziók képződnek. Minden sejttípus érintett, a betegek ritkán érik meg a hat évet. A betegekben a lizoszo­ mális hidrolázok a vérbe ürülnek, lizoszomális transz­ port helyett a szekréciós utat követik. Az eltérés oka az N-acetil-glukózamin-foszfotranszferáz hiányzó aktivitása. Az enzim az N-acetil glukózamin-P-ot he­ lyezi el az N-glikozidos mannóz oligoszacharidlánc végére. Enzimatikus hidrolízis távolítja el az N-acetil glukózamint, melynek eredményeképpen M6P kelet­ kezik. Amennyiben az N-acetil-glukózamin foszfotranszferáz hiányzik, nem alakul ki a M6P, így a lizo­ szomális hidrolázok a szekretorikus útra kerülnek (15-28. ábra).

Szekréciós f e h é r j é k

A transz-Golgi kompartmentből folyamatosan in­ dulnakútra vezikulák, melyek membránfehérjéi a sejt­ membránnal történő fúzió után a sejtmembránba in­ tegrálódnak, míg szolubilis fehérjéi az extracelluláris térbe szekretálódnak. Ezen az úton kerülnek ki a sejt­ ből az extracellulári mátrix fehérjéi. A folyamatos szekréciót biztosító utat konstitutív szekréciónak ne­ vezzük és megkülönböztetjük a szabályozott szekréci­ ós útvonaltól, mely jellemzi az emésztőenzimek, neurotranszmitterek, vagy hormonok szekrécióját. Anem szelektív konstitutív szekréciós útvonal nem igényel specifikus szignalizációt, így ez tekinthető a default útvonalnak. A tartalmukat valamilyen szignál hatására ürítő vezikulákat szekréciós vezikuláknak nevezik.

15.6

467

M IT O K O N D R IÁ LIS FEH ÉR JES Z IN T ÉZ IS

Az eukarióta sejtekben a mitokondriális fehérjeszintézis mechanizmusa a bakteriális transzláció me­ chanizmusára hasonlít leginkább. A mitokondriumokban, ahol a mutációs ráta jóval magasabb, speciális, csak a mitokondriumokban talál­ ható triplet-aminosav párosításokat is találunk (15-5. táblázat). A mitokondriális genetikai kódra jellemző, hogy nemcsak az univerzális (eukarióta, prokarióta) kódhoz képest mutat eltéréseket, de az egyes specie­ sek mitokondriumaiban is lehetnek eltérések a geneti­ kai kódban.

15-5. táblázat. A gerincesek mitokondriumaiban ész­ lelt kódvariációk eltérése az univerzálistól Kodonok UGA

AUA

AGA AGG

Univerzális jelentés

STOP

He

Arg

Gerinces mitokondriumokban

Trp

Met

STOP

A mitokondrium mátrixában elhelyezkedő mito­ kondriális DNS speciestől függően igen eltérő nagy­ ságú és szerveződésű lehet. Ennek a biodiverzitásnak az ismertetésére jelen keretek között nincs mód, ezért itt csak a humán mitokondriális DNS-ben lévő infor­ mációval foglalkozunk. A humán mtDNS 13 mito­ kondriális fehérjét (lásd 26-1. táblázat) és a fehérjék előállításához szükséges összes RNS molekulát (22 tRNS és 2 rRNS) kódolja. Ezeken kívül az összes töb­ bi, a fehérjeszintézishez szükséges komponenst a mitokondrium a citoszolból importálja. A mitokondriális DNS-függő RNS-polimeráz je­ lentős homológiát mutat bizonyos bakteriofágok RNS-polimerázaival. Az elsődleges transzkriptum egy nagy policisztronos (több fehérjét kódoló) pre-mRNS, melyből endonukleáz hasítással kilenc monocisztronos, tehát egy fehérjét kódoló és két

468

bicisztronos, tehát két-két fehérjét kódoló mRNS-t ke­ letkezik. A bicisztronos mRNS-ek egymással részben átfedő leolvasási kereteket tartalmaznak. A humán mitokondriális mRNS-ek sapka nélküliek, igen rövid 5’- és 3’-UTR régiókat tartalmaznak, de poliadenilálódnak. A mitokondriális mRNS-ben nincs Shine-Dalgamo-szekvencia. A mitokondriális tRNSek kis száma azzal magyarázható, hogy a „lötyögés” jelenségének megfelelően egy tRNS általában több kodon felismerésére képes. A mitokondriális tRNS-ek általában valamivel kisebbek, mint bakteriális vagy eukarióta megfelelőik.

A mitokondriális ríboszómák (mitoriboszómák) A mitoriboszómák jelentősen különböznek az eukarióta, és a bakteriális társaiktól abban, hogy mind a kis, mind a nagy alegységben csak egy-egy mitokondriumban kódolt, rövid rRNS található, illet­ ve abban, hogy a mitoriboszómák sűrűsége (28S a kis alegységé és 39S a nagy alegységé) jelentősen kisebb, mint az önálló organizmusokban található riboszómáké, illetve a fehérje:rRNS arány 2:1 a mitoriboszómákban, míg eukarióta társaikban ez 1:2-höz (15-2. táblázat). Valószínűsíthető, hogy a mitoriboszómákban is van 5S rRNS, ezt azonban nem a mitokondriális DNS kódolja, hanem a citoplazmából importálódik. Érdekesség, hogy a mitokondriális rRNS-ben nincs anti-Shine-Dalgamo-szekvencia, és ezzel összhang­ ban a mitokondriális mRNS-ek sem tartalmaznak Shine-Dalgamo-régiót. A mitokondriális riboszómák tartalmaznak olyan, jelenleg még ismeretlen funkciójú fehérjéket is, melyeket nem fedezhetünk fel a prokarióta riboszómákban. További különbség a mito­ kondriális és az egyéb riboszómák között, hogy mind­ eddig a mitoriboszómákon az E- (exit) helyet sem si­ került kimutatni. A mitokondriumok riboszómáin szintetizálódó fehérjék mind a belső membránba transzlokálódnak, és jelentős mértékben hidrofóbok. Ez a sajátosság magyarázhatja a mitoriboszómákban leírt „polipeptide accessible site” (PÁS) üreg funkció­ ját, melyről feltételezik, hogy az újonnan szintetizált

I V.

A G E N E T I K A I I N F O R M Á C I Ó T Á R O L Á S A ÉS K I F E J E Z Ő D É S E

fehérjék kilépési pontja lehet. Elképzelhető azonban az is, hogy a mitoriboszómák az ER-hez asszociált riboszómákhoz hasonlóan a transzláció idejére a belső membránhoz kapcsolódnak.

A mitokondriális fehérjeszintézis iniciációja Hasonlóan az eukarióta és prokarióta iniciációhoz itt is a mRNS és az iniciátor tRNS (jelen esetben a fM et-tRNSf^1) kapcsolódik a kis riboszomális alegy­ séghez az iniciációs faktorok segítségével. A mito­ kondriális fehérjék szintézisekor is az első aminosava formil-metionin, ez egy igen erős érv a mitokond­ riumok bakteriális eredete mellett. Hasonlóan a bakté­ riumokhoz, a mitokondriumok is három iniciációs faktorral bírnak. Emlősökben a mitokondriális mRNS-ekre a nagyon rövid 5’-UTR-szekvencia (pél­ dául a citokróm-oxidáz I-es alegysége esetében csak 3 nukleotid) jellemző. A riboszóma végigpásztázza az mRNS-t a START kodont keresve. A megtalált START kodon a riboszóma P-helyéhez illeszkedik, a mitokondriális IF2 GTP-kötött formában elősegíti a fMet-tRNSi dokkolását a mRNS-hez, és stabilizálja a komplexet. Ha nem jön létre stabil kölcsönhatás a START kodon és az antikodon között, a 28S-alegység folytatja a szkennelést, és végül disszociálnak a kom­ ponensek a mRNS-ről. Amennyiben létrejön a START kodon és az antikodon közötti stabil kapcso-1 lat, a 39S nagy riboszóma alegység kapcsolódik a komplexhez, és hasonlóan az eukarióta és prokarióta iniciáció befej eztéhez, az IF2 mitokondriális megfele­ lőjén a GTP hidrolizálódik, majd az iniciációs fakto­ rok távoznak. Emlősök mitokondriumaiban ugyanaz a tRNSMet használódik mind az iniciációban, mind az elongációban. A helyes tRNS - azaz a formil-metioninnal töltött az iniciáció számára és a metioninnal töl­ tött az elongáció számára - kiválasztását a kettős me­ chanizmus teszi lehetővé; a mitokondriális IF2 affini­ tása a formilált metionint kötött tRNS-hez 50-szerna-1 gyobb, mint a formilálatlanhoz, illetve a mitokond­ riális EF-Tu nem képes a formilmetionint tartalmazói tRNS megkötésére.

15. F E H É R J E S Z I N T É Z I S : A T R A N S Z L Á C I Ó M E C H A N I Z M U S A ÉS A P O L I P E P T I D L Á N C T O V Á B B I S O R S A

469

Amitokondriális fehérjeszintézis elongációja

A mitokondriális fehérjeszintézis terminációja

Az elongáció a mitokondriumokban nagymérték­ ben analóg a baktériumokban leírt folyamattal. Amitokondriális EF-Tu (EF-Tumt) elongációs faktor GTP-vel komplexet kötve szállítja az aminosavakat az A-helyre, majd a riboszóma katalizálja a peptidkötés képződését, az iniciátor tRNS deacilálását. Ezt köve­ tően az EFG1 elongációs faktor hatására az mRNS 3 nukleotidot lép, az iniciátor tRNS elhagyja az mRNS-t és ariboszómát, a dipeptid-tRNS komplex a P-helyre kerül, majd az EF-Tumt felszabadul. Az EF-TumtGDP komplexen a GDP-t az EF-Tsmt cseréli ki GTP-re. Érdekesség, hogy az EF-Tumt a fenti felada­ tontúlmenően molekuláris chaperonként is szerepelve a nem megfelelően feltekeredett fehérjéket a mito­ kondriális proteázok számára prezentálja.

A mitokondriális fehérjeszintézis befejeztét a STOP kodon A-helyre belépése jelzi. A terminációs kodont a release faktor (RFlamt) ismeri fel, melynek funkciója a P-helyen lévő peptidil-tRNS peptidlánca és a tRNS közötti észterkötés hasítása. A peptid ezt követően disszociál a riboszómakomplexről, majd a RRFlmt (ribosome recycling factor 1) és az EF-G2mt-GTP együtt idézik elő az mRNS és a riboszómakomplexek disszociációját.

A szerkesztő köszönetétfejezi ki Dr. Törőcsik Beá­ tának és Dr. Bauer Pálnak a fejezet összeállításában nyújtott segítségükért.

MOLEKULÁRIS GENETIKAI 16.

MÓDSZEREK ÉS ALKALMAZÁSUK

________AZ ORVOSTUDOMÁNYBAN SASVÁRI MÁRI A

1 6.1

16.1

Polimeráz-láncreakció: a géndiagnosztika új eszköze

16.2

Rekombináns DNS és rekombináns fehérjék

P O LIM ER Á Z -LÁ N C R EA K C IÓ : A G É N D I A G N O S Z T I K A ÚJ ESZKÖZE

A polimeráz-láncreakció (polymerase chain reaction, PCR) egyike azon molekuláris biológiai módszereknek, melyet széleskörűen használnak az or­ vostudományban, elsősorban a géndiagnosztikában. A PCR lényege, hogy a humán vagy más sejtekből származó DNS-molekulák tetszőleges részletét fel­ sokszorozza. A PCR egyszerűen kivitelezhető és nem különösebben költséges, így felhasználható rutin vizs­ gálatokra is. A PCR-alapú módszerek alkalmasak le­ hetnek mutációk vizsgálatára, vagy annak megállapí­ tására, hogy az adott szövetmintában jelen van-e ide­ gen (pl. virális eredetű) DNS. Érdekes alkalmazásai közé tartozik a DNS „ujjlenyomat” vizsgálat, mely nemcsak a kriminológiában, de például a rokonsági fok (apasági perek, ikervizsgálatok) megállapítására is alkalmas.

A humán genomi DNS hossza 3 milliárd bázispár (bp), melyből általában mindössze néhány száz bázispámyi szakaszt kívánunk felsokszorozni a PCR során. A kiválasztás rövid (16-20 bázis hosszú), egyszálú DNS-sel, az úgynevezett primerekkel (más néven

477

oligonukleotidokkal vagy oligókkal) történik (16-1. ábra, hullámos vonal). Mivel a humán genom szek­ venciája ismert, megfelelő programokkal kiválaszt-

1

denaturáció (96 °C)

---------------------------------------- ► - foszfoPr°teir 1-------------------------- :--------------------------

I

fo sz fa ta z o k

10 OOOx

f glikogén-foszforiláz

I

100 OOOx

íglukóz-1P 17-16. ábra. A cAMP-jelpálya kaszkád jellege a glukagon/ adrenalin receptorstimuláció májsejtekre gyakorolt hatá­

Kékkel az egyes lépéseket inaktiváló mechaniz­ musokat mutatjuk. A számok az eredeti hatás erősödésének mértékét jelzik sának példáján.

alulbecsült értékek, de az kijelenthető, hogy a soklépéses reakciósor végén a hatás már több nagyságrend­ del felerősödött, s egyetlen molekula glukagon vagy adrenalin hatása legalább 100 000 molekula glukóz májsejtből történő mobilizálását képes kiváltani. A jelátviteli kaszkádnak ez a jelfelerősítő hatása ma­ gyarázza azt, hogy hormonok kis mennyisége is ro­ busztus sejtválaszokat képes iniciálni. A jelátviteli kaszkádban egyes résztvevők funkciója az elektro­ nikából vett analógia alapján is leírható, ami kifejezi azt, hogy a receptorstimuláció hatását egy jelátalakító, ebben az esetben a G-fehérje közvetíti ahhoz a sejtfunkcióhoz, ahol a hatás felerősödése már kifejezett. A cAMP-rendszerben ez az erősítő az adenilát-cikláz, amely a másodlagos messenger, a jelátvivő molekula szintéziséért felelős. Lényegében minden jelátviteli út ezzel az analógiával írható le, de az egyes funkciók nem minden esetben különülnek el olyan vi­ lágosan, mint ahogy az a cAMP jelátviteli rendszerben látható. Egyes esetekben a receptor is részt vesz a jelátalakításban együtt G-fehérjékkel (ez monomer G-fehérje, lásd alább) és egyéb fehér­ jékkel (pl. tirozin-kináz-aktivitású receptorok esetében), vagy a re­ ceptor, a jelátalakító és az erősítő funkciót ugyanaz a fehérje látja el (ilyenek pl. az ioncsatoma receptorok).

Egy másik fontos jellegzetessége a jelátviteli me­ chanizmusnak, hogy az nem feltétlenül diffúzán a sejt minden részét érinti, hanem gyakran annak csak egy részére, ún. mikrodoménekre szorítkozik. A cAMP a citoplazmában jól oldódó, gyorsan diffundáló mole­ kula, tehát mint egy globális szignál, könnyen eléri a PKA-molekulákat, mégis egyes hatásai jól kimutatha­ tóan a sejtnek csak adott régióját érinti. Ilyen például a szívizomban az L-csatomák stimulációja, amely csak a T-tubulus invaginációinál érvényesül, vagyis ott, ahol a T-tubulus és az SR szoros közelségben (junkció) van egymással (lásd 5-22. ábra). A cAMP mikrodomén itt azt jelenti, hogy a p|-adrcnerg receptorok szoros közelségben vannak a cAMP jelpálya elemei­ vel, ideértve a PKA-t is (AKAP kapcsolódással), ami ebben a régióban foszforilálja az L-csatomákat és a RYR2-t, és növeli a kamrai Ca2+-jel nagyságát. A T-tubulus-SR junkcióban lokalizálódó Pi-receptorok stimulációja a foszfolambant és az SR Ca2+felvételét nem befolyásolja, ez az SR egy távolabbi ré­ szén történik, másik (31-receptor-populáció stimuláci­ ója következtében, az ott lokalizálódó PKA aktivációja és a foszfolamban foszforilációja következtében,

1 7 . P L A Z M A M E M B R Á N - R E C E P T O R O K ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

amelynek a SERCA-ra kifejtett gátló hatása ezáltal megszűnik. A jelátviteli folyamatokban fontos tehát a jel térbe­ li (és időbeli) megjelenése is, amit gyakran az AKAP-hoz hasonló, ún. állványfehérjék tesznek lehe­ tővé. Az AKAP nemcsak a PKA-t tudja megkötni (amit a 17-11. ábrán mutatunk), hanem a jelátviteli út­ vonalak egyéb szereplőit is (pl. plazmamembrán-receptor, adenilát-cikláz, foszfoprotein-foszfatáz, target fehérje), azokat így egymással szoros közelségben tartja, s ez a jelátvitel térbeli koncentrálódását és felgyorsulását okozza.

17.5

C A 2+ J E L P Á L Y A . IN O Z IT O L-LIP ID EK SZ ER EP E

Ebben a jelpályában nem egyedül a Ca2+ a megha­ tározó messenger molekula, hanem az inozitol-lipidek metabolizmusával szoros összefüggésben lé­ vő, az inozitol foszfolipidek hidrolízise során keletke­ ző diacil-glicerol (diglicerid) és inozitol-1,4,5-triszfoszfát is. A jelpálya alapvető sejtfunkciók szabályo­ zásábanjátszik szerepet (17-5. táblázat). A folyamatot

17-5. táblázat.

IP3/Ca2+ jelálya által szabályozott né­

hány sejtmüködés Sejtműködés

Szerv

metabolizmus

máj

folyadékszekréció

bélhámsejt nyálmirigy hasnyálmirigy

aggregáció

trombocita

szinaptikus plaszticitás

hippocampus

exocitózis (nem szinaptikus)

limfocita makrofág hízósejt

kontrakció

simaizom

aldoszteronszekréció

glomerulosasejt

fertilizáció proliferáció

barna zsírszövet T-sejt simaizom

503

a foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát (PIP2) hidrolízise indítja el. A PIP2 a foszfatidil-inozitolból keletkezik két egymást követő foszforilációs lépésben, amelynek során az inozitol először a 4., majd az 5. szénatomon foszforilálódik (17-17. ábra). Mint a foszfolipidek ál­ talában, a PIP2 is úgy helyezkedik el a membránban, hogy a lipidoldalláncok beépülnek a membrán hidrofob közegébe, az inozitol-foszfát-rész pedig az intracelluláris közeg felé néz. A PIP2 hidrolízise a foszfatidil-inozitolokra specifikus foszfolipáz-C (PLC rövidítést használunk, de ez alatt itt a fosz­ fatidil-inozitolokra specifikus enzim értendő) hatására történik meg. A 17-18. ábrán látható séma olyan re­ ceptorok stimuláló hatását mutatja, amelyek aq-alegységet tartalmazó G-fehérjével vannak kapcsolatban. Az aq-alegység a receptorstimulációt követően disszociál a (3y-alegységről és a membránhoz-kötött PLC-t stimulálja. A PLC a PIP2-t hidrolizálja a 17-17. ábrán mutatott helyen és inozitol-l,4,5-triszfoszfát (IP3) és diacil-glicerol (DAG) keletkezik. Ezen két messengerrel két különböző útvonalon folytatódik a jelpálya: az IP3 az endoplazmás retikulumhoz diffundál és Ca" -t mobilizál az ER raktárból, ami számos Ca" -függő folyamatot stimulál, a DAG pedig, a Ca' -nal együtt a klasszikus protein-kináz C izoenzimeket (PKC) aktiválja, ami viszont fehérjefoszforilációk révén regulái sejtfolyamatokat. Mielőtt ezen a két útvonalon tovább folytatjuk a jelpályák folyamatát, fontos kiegészítéseket és ponto­ sításokat kell tenni a 17-18. ábrán mutatott erősen le­ egyszerűsített összefoglaló sémával kapcsolatban. Mindenek előtt le kell szögezni, hogy ezt a jelpályát nemcsak G-fehérjével kapcsolt receptorok stimulál­ ják, hanem tirozin-kináz-aktivitással bíró receptorok is. A PLC több izoformában létezik, amelyek szerke­ zete némileg eltérő, alapvetően különböznek a stimu­ láció mechanizmusában, de mindegyik enzim aktivi­ tásához elengedhetetlen a Ca2+jelenléte. A PLCp izoformát elsődlegesen a Gaq stimulálja. A PLCP akti vá­ ciója nagyon gyors és gyorsan inaktiválódik is, annak következtében, hogy a PLCp GAP- (GTPáz-aktiváló protein) aktivitással is rendelkezik, vagyis stimulálja az a-alegység egyébként alacsony endogén GTPázaktivitását, s megtörténik a GTP hidrolízise. Az enzi­ met a Py-alegységek is stimulálhatják, az a-alegységé-

504

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

17-17. ábra. A foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát kezése

(PIP2) kelet­

foszfatidil-inozitolból.

A képlet keretezett részei külön ki­ emelik a molekula glicerin és mioinozitol részét. A PIP2-n a kék hullá­ mos vonal azt a helyet jelöli, ahol a foszfolipáz-C a molekulát hasítja I foszfatidilinozitol

^ ATP S * ADP >/ f foszfatidilinozitol-4-foszfát

foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát (PIP )

a

ligand

2=0

I 0 1

fehérjefoszforiláció diacil-glicerol DAG

foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát PIP2

inozitol-1,4,5-triszfoszfát IP,

PH

Y

C2

17-18. ábra. lnozitol-1,4,5-triszfoszfát (IP3) és diacil-glicerol (DAG) keletkezése foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfátból (a) és

PLCp, foszfolipáz-C p-izoforma; PKC, protein-kináz C; ER, endoplazmás retikulum; PH, pleckstrin homológia dómén; X és Y, katalitikus domének; C2, C2-domén

a foszfolipáz-C p-izoforma dómén szerkezetének vázlata (b).

17. P L A Z M A M E M B R Á N - R E C E P T O R O K ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

17-19. ábra. A foszfolipáz-Cy (PLCy) aktivációja tirozin-kináz-aktivitással rendel­ kező receptorok stimulációja következté­ ben (a) és a foszfolipáz-Cy-domén szerke­ zetének sémája (b). RTK, receptor-tirozinkináz (tirozin-kináz aktivitással rendelkező re­ ceptorok); PIP2, foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát; DAG, diacil-glicerol; IP3, inozitol1,4,5-triszfoszfát; SH2, Src homológia 2 dó­ mén; SH3, Src homológia 3 dómén; PH, "leckstrin homológia dómén. A kék nyilak azo­ kat a helyeket jelölik, ahol a PLCy tirozinoldalláncokon foszforilálódik

505

ligand

li PH

tői eltérő kötőhelyen kötődve és annál kisebb haté­ konysággal. A PLC(3-n foszforilációs helyek vannak, ahol a PKA foszforilálja az enzimet (egyes alcsoport:), és ezáltal csökkenti az aktivitását, ami újabb pél­ daa különböző jelpályák közötti kölcsönhatásra. Az itt tárgyalt jelátviteli mechanizmust aktiváló, G-fehérje-kapcsolt receptorral rendelkező fontosabb ligandokat, amelyek a PLC[3-t aktiválják, a 17-6. táb­ lázat mutatja be. APLCy a tirozin-kináz-aktivitású receptorok hatá­ sáraaktiválódik, tartalmaz SH2-domént (17-19. ábra, b)- aminek következtében a tirozin-kináz-receptorok tirozinon foszforilált helyeihez kötődik - és SH3-domént - amely további fehérje-fehérje kapcsolatokat tesz lehetővé. A PLCy-t a foszfatidil-inozitol-3,4,5triszfoszfát (PIP3) is aktiválja, ami a foszfatidil-inozitol-3-kinázjelpálya része (ennek ismertetésére alább kerül sor), ily módon a PLCy ezen két jelpálya közös pontja. Mindkét PLC izoforma szerkezetében vannak kö­ zös domének (17-18/b ábra és 17-19/b ábra), mint a pleckstrin homológia dómén (PH), ami biztosítja, hogy az egyébként citoplazmában lokalizálódó enzim plazmamembránhoz transzlokálódjon, ahol szubsztrátját, a PIP2-t megtalálja; Ca2l-kötő „EF-kéz” ■mén és az X-nal és Y-nal jelölt katalitikus dómén. Mindkét PLC izoenzimnek további alcsaládjai is vanná, amelyek esetenként meghatározott szövetspecificitást is mutatnak; a p és y mellett még további, leg-

X

SH2 SH2

SH3

1-

Y

17-6. táblázat. Néhány heterotrimer G-fehérjéhez kapcsolt neurotranszmitter- és hormonreceptor, amelyek a foszfolipáz-Cp stimulációját okozzák Neurotranszmitterek acetilkolin muszkarin (Mi, M3 , M5 ) adenozin (P2 Y1-2, P2 Y4 -6 ) adrenalin/noradrenalin (cxi) glutamát (mGluRi; mGluRs) szerotonin (5 -HT2 ) ízlelő receptorok

Hormonok adrenalin (cg) angiotenzin (ATi) bradikinin (B2) gonadotrop kemokin-releasing hormon kolecisztokinin/gasztrin hisztamin (Hí) melatonin (MTi, MT3 ) oxitocin prosztaglandinok thyreotrop-releasing hormon vazopresszin (VJ

Zárójelben a receptor típusa

alább négy alcsalád, a PLC5, a PLCs a PLCp és a PLC^ létezik, eltérő aktivációs mechanizmusokkal. Bár ezekkel itt nem foglalkozunk, megemlítésük azért fontos, mert jelzi, hogy már a PLC szintjén biztosított ennek a jelátviteli útnak a változatos stimulálhatósága és esetenként a szövetspecificitása. A PIP2 hidrolízise során keletkező IP3 feladata a jelpályában az, hogy az ER-hez diffundálva, ott a re­ ceptorát, ami egyszersmind Ca2+-csatoma is, stimulálja, és Ca‘ -t szabadít fel az ER-ből. Az ^-receptorral az 5. fejezetben már foglalkoztunk. Most csak azt a tu­ lajdonságát hangsúlyozzuk, hogy a receptort az IP3 és

V.

506

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

ER-membrán

[Ca2+], 1,0 pM

U -

_ __z l___ _

0,1 pM ------- 1-------- 1-------- 1-------- 1-------- r 100

2+

200

300

400

500

a Ca együtt stimulálja és teszi lehetővé a maximális Ca2+-felszabadulást és a Ca2+-koncentráció megemel­ kedését a citoszolban. Az intracelluláris Ca“ -koncentráció-emelkedés, amely valamilyen stimuláció hatására a sejtekben lét­ rejön, nem egy egységes, minden sejtre leírható válto­ zás, hanem különböző nagyságú és időtartamú Ca2+ -koncentráció-változást jelent, ami kiterjedhet a sejt egészére vagy annak csak egy részére. A Ca2+j élnék ez a térbeli és időbeli lefolyása eltérő az egyes sejtekben, és sokszor meghatározza, hogy a Ca2+-jel milyen folyamatokat regulái. Az izomkontrakció pél­ dául globálisan az egész sejtre kiterjedő Ca2 -koncentráció-emelkedés hatására jön létre, míg az idegin­ gerület hatására a preszinaptikus neuronnak csak egy része, a vezikulák környezete érintett a Ca2 -kon-

mp

17-20. ábra. Ca2+-hullámok létrejötte és Ca2toszcilláció az IP3-receptor-stimuláció hatására. Tovaterjedő Ca2+-felszabadulás az ER-ból (endoplazmás retikulum) IP3-receptorokon keresztül a Ca2+ IP3-receptort stimuláló hatása következtében (a). A Ca2+-felszabadulás fokozatos megszűnése az IP3receptor Ca2+ hatásra bekövetkező deszenzitizációja miatt (b). Egy példa az intracellulláris Ca2+oszcilláció­ ra (c)

o i

centráció-emelkedésben. A Ca -jel a sejtben gyakran nem egyetlen, átmeneti Ca -koncentráció-emelke­ désként jelenik meg, hanem többszörös, egymást kö­ vető Ca2+-jelek, ún. Ca2+-oszcillációk jönnek létre (17-20. ábra). Ennek magyarázata abban rejlik, hogy az IP3-receptort (és a RYR-t is) a Ca2+ is stimulálja, s amikor plazmamembrán-receptor stimulációja követ­ keztében IP3 jelenik meg a sejtben, az stimulálja az ER-en az IP3-receptorok egy csoportját, ahonnan megtörténik a Ca -felszabadulás, s ez a környező IP3-receptorokon hatva további Ca -felszabadulást okoz, ami így tovaterjedve, pozitív feedback mecha­ nizmussal, egyre több Ca2+-t hoz ki az ER-ből (17-20/a ábra). Ez a Ca -hullám úgy csendesül le, hogy az IP3-receptorok a környezetükben megemelke+ dő magas Caz'-koncentráció következtében inakti2

507

17. P l A Z M A M E M B R Á N - R E C E P T O R O K ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

9+

bi karakterisztikát ad az egyes sejtekben létrejövő 9+ Ca -jeleknek. A legáltalánosabban előforduló, s gyors Ca“ -puffemek tekinthető a calbindin, amely­ nek különösen fontos a jelenléte a neuronokbán, ahol jelentős szerepet játszik a Ca' -jelek térbeli és időbeli lefolyásának meghatározásában. (A parvalbumin las­ súbb hatású puffer, és nagy mennyiségben expreszszálódik pl. a Purkinje-sejtekben, a calretinin pedig egyes GABA-val működő gátló intemeuronokban.)

válódnak, megszűnik a Ca" -kiáramlás (17-20/b áb­ ra), a Ca2+-pumpák pedig eltakarítják a Ca2+-t a recep­ tor környezetéből. Az IP3-receptorok átmeneti érzé­ ketlenség után újra reagálnak a Ca2 -ra, s a folyamat újraindul. A sejt számára információ van abban, hogy a(^"-oszcilláció milyen frekvenciával jelenik meg, a Ca2+-koncentráció milyen magasra emelkedik, mennyi idő alatt cseng le, s mennyi ideig tart az oszcil­ láció. A Ca2' -jelnek (Ca2+-tranziensként is emlegetik) tehát kritikus tulajdonsága a térbeli és időbeli lefolyás, ami meghatározza egyes sejtekben azt, hogy mely folyamatokat és milyen módon befolyásol a Ca -jel. Ezek a paraméterek nagyban függnek a citoplazma Ca' -pufferelő kapacitásától is, amelyben fehérjék játsszák a főszerepet. A citoplazma legfőbb Ca' pufferelő fehérjéi: a parvalbumin, a calbindin és a calretinin (az SR-ban a calsequestrin, az ER-ben a calreticulin). Ezek pufferkapacitása eltérő, és eltérő az egyes szervekben történő expressziójuk is, ami továb­

Klinikai vonatkozások Az egész inozitol-lipid/Ca2+jelpálya működéséhez el­ engedhetetlen, hogy az IP3 metabolizmusa során inozitol keletkezzen, ami a foszfatidil-inozitol reszintézisre használódhat (17-21. ábra). Ennek során az IP3-ból egymást követő lépésekben, foszfatázok

f foszfatidilinozitol-3,4,5-trisz® (PIP3)

f PI-3K ►( foszfatidilinozitol-4®---- >f foszfatidilinozitol-4,5-bisz®

foszfatidilinozitol

(PIPA

úPLC f

inozitol-1,3,4,5-tetrakis®

jjdiacil-glicerol

inozitol-1,4,5-trisz® (IP3 )

(l P3-5-foszfatáz í inozitol-1,4-bisz®

( inozitol-1,3-bisz® t p k b r foszforiláció izom

a

máj s

GLUT4transzlokáció

zsírsejt

0

v ( PKSota) proliferáció

(^AS160)

GLUT4transzlokáció

GSK~j

( PDE j

glikogén-a szintézis 1

PDE~j f lipolízis^

BacP) ["túlélés

mTOR) fehérje- A szintézis 1

^FO Xo) géntranszkripció sejtciklus glukoneogenezis^

17-27. ábra. Az inzulin jelp á lya. IRS, inzulinreceptor-szubsztrát; Grb2, growth factor receptor bound protein-2; SoS, Són of Sevenless; MEK, MAP kinase/ERK-activating kinase; ERK, extracellular signal regulated kinase; PI-3K, foszfatidil-inozitol-3-kináz, PIP2, foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát; PIP3, foszfatidil-inozitol-3,4,5-triszfoszfát; PDK, foszfoinozitid-dependens-kináz; PKB, protein-kináz B(Akt); mTORC2, mammalian target of rapamycin complex-2; PKC, protein-kináz-C; AS160, AKT substrate of 160 kDa; GSK, glikogénszintáz-kináz; PDE, foszfodiészteráz; Bad, Bcl-2-antagonist of cell death; mTOR, mammalian target of rapamicin; FOXO, forkhead transz­ kripciós faktorok; Cbl, adapter fehérje; CAP, Cbl-associated protein; TC10, kis G-fehérje. A + és - jelek a PKB foszforiláció hatására bekö­ vetkező stimulációra, illetve gátlásra utalnak. Az mTOR szabályozása közvetett, több lépésen keresztül valósul meg (szaggatott vonal). Piros csillag a protoonkogén, kék csillag a tumorszuppresszor tulajdonságot jelzi

csolódik. A receptor tirozin-kináz-doménje az IRS-t is több tirozin-oldalláncon foszforilálja, ami megteremti azokat a foszfotirozin-felszíneket, ahova SH2-doménnel rendelkező fehérjék kötődhetnek. így kötődik azIRS-hez a foszfatidil-inozitol-3-kináz (PI-3K), ami az itt tárgyalandó jelátviteli út következő eleme. Az SH2 doménjén keresztül kötődhet az IRS-hez a Grb2 adapter fehérje is, ami a növekedési jelpályánál tár­ gyaltak szerint a MAP-kináz útvonalon keresztül be­ folyásolja a sejtmüködést (17-27. ábra). Mind az inzulinreceptort, mind az IRS-t szerin/treonin protein-kinázok (PKA, PKC) is foszforilálhatják, ez a foszforiláció, szemben a tirozinon törté­ nő foszforilációval, gátolja az inzulin jelpályán törté­ nőjelátvitelt.

Az IRS expressziója változhat patológiás állapo­ tokban. Hyperinsulinaemia az IRS proteaszomális le­ bontásának fokozódását indukálja. 2-es típusú diabetesben gyulladásos jelpályák aktiválódnak, amelynek során JNK aktiválódik, ami az IRS szerin foszforilációját idézi elő, s ez az inzulin-jelátvitelt gátolja. Foszfatidil-inozitol-3-kináz-AKT-mTOR útvo­ nal. A PI-3K jelútvonal, amelynek vázlatos összefog­ lalása a 17-27. ábrán látható, sokféle folyamat regulá­ ciójában játszik szerepet. Ezek között van a glikogén­ szintézis, lipidszintézis, sejtnövekedés, proliferáció, fehérjeszintézis, géntranszkripció vagy az apoptózis. Az inzulin metabolikus hatásainak nagy részét ezen az útvonalon fejti ki; a jelpálya csökkent működése inzu­ linrezisztenciát, illetve diabetest okoz. A jelpálya szá­

516

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

mos elemének mutációját megtalálták különböző hu­ mán tumorokban, ami ennek a jelátviteli mechaniz­ musnak további kiemelt orvosi jelentőséget ad. A PI-3-kinázok lipid-kinázok, amelyek a foszfatidil-inozitolt, illetve a foszfoinozitideket a 3-hidroxilcsoporton foszforilálják. A PI-3K elsődleges szubsztrátja (a PLC-hez hasonlóan) a foszfatidil-inozitol4,5-biszfoszfát (PIP2), amely a membránba ágyazódik a 17-18. ábrán mutatott séma szerint. A PI-3-kináz a PIP2-t foszforilálja és foszfatidil-inozitol-3,4,5-triszfoszfát (PIP3 ) keletkezik a plazmamembránban. A PH-doménnel rendelkező fehérjék a PIP3-at felis­ merik, kötik, ezen keresztül „kihorgonyozódnak” a plazmamembránhoz és aktiválódnak. Ilyen fehérje a jelátviteli út meghatározó kináza, a protein-kináz B (PKB), másik nevén Akt, ami egy szerin/treonin-kináz és aktivációjának feltétele, hogy a PIP3-at kötve a membránhoz asszociáljon. Aktivációjához az is szük­ séges, hogy foszforilálódjon, ami a PDK1 (foszfoinozitid-dependens-kináz-1) hatására történik. A PDK1 szintén PH-doménnel rendelkező fehérje, s aktivációja a PIP3-hoz történő kapcsolódás következménye. Az Akt/PKB teljes aktivációjához szükséges még, hogy az mTOR (mechanistic/mammalian target of rapamycin) nevű kináz is foszforilálja; ezt az mTOR az mTORC2 fehérjekomplexben végzi el (lásd alább). A PIP3 defoszforilációját és ezzel az Akt út gátlását egy lipid-3-foszfatáz, a PTEN tumorszuppresszor (phosphatase and tensin homolog) katalizálja. A foszforilálódott és aktiválódott PKB disszociál a plazmamembránról és számos fehérjét foszforilálhat a citoszolban és a sejtmagban (17-27. ábra). Ezek ré­ szint a metabolizmusban már ismertetett enzimek, ré­ szint szabályozó fúnkciókat betöltő fehérjék és transz­ kripciós faktorok. PKB-szubsztrát a glikogén-szintáz-kináz-3 (GSK), mely foszforilálva inaktív, s így elmarad a glikogén-szintáz foszforilációval történő inaktiválása, vagyis glikogénszintézis történik. A GSK foszforilálja, s ezzel inaktiválja az eIF2B-t is, ami a fehérjeszintézist gátolja; így a GSK foszforilá­ cióval történő inaktiválása a gátlás gátlásán keresztül a fehérjeszintézist is fokozza. A foszfodiészteráz (PDE3B izoforma) foszforilációval történő aktiválása a cAMP hidrolízisét eredményezi, ami a cAMP köz­ vetítésével ható hormonok (pl. glukagon) hatásának

antagonizálását, azaz a májban glikogénszintézist, a fehér zsírszövetben pedig a lipolízis csökkentését se­ gíti elő. Az inzulin hatásra bekövetkező glukoneogenezisgátlás a FOXO (forkhead transzkripciós faktorok) foszforilációjának a következménye. A FOXO részt vesz a glukóz-6-foszfatáz és a PEPCK expresszió­ jának stimulálásában; PKB általi foszforilációja kö­ vetkeztében kikerül a sejtmagból, a citoszolban ubikvitinálódik és lebomlik, vagyis elmarad a glukoneogenetikus gének expressziójának serkentése. A PKB a túlélési jelátvitelben is részt vesz: gátolja az apoptózist és serkenti a sejt növekedését. A PKB proapoptotikus fehérjéket foszforilál; köztük a Bad (Bcl-2-antagonist of cell death) fehérjét, ami foszforiláció hatására a 14-3-3 adapter fehérjéhez kötődik és inaktiválódik. A PI-3-kináz-PKB/Akt útvonal az mTOR-kináz aktivációjának útvonala is. Az mTOR (mammali target of rapamicin) egy szerin/treonin-kináz, amely kulcs szerepet játszik a sejtnövekedés és proliferáció szabályozásában. Aktív állapotban stimulálja a fehér­ jeszintézist és gátolja az autofágiát. Aktivitását mind hormonális/növekedési faktor szignálok, mind a táp­ anyag- és energiaellátottság befolyásolja, ilyen érte­ lemben integráló szerepe van; általánosságban el­ mondható, hogy növekedési faktorok az mTOR fehér­ jén keresztül a proliferációt fokozzák, míg az elégf len aminosav- és energiaellátottság az mTOR-t j ja, ami a proliferációt leállítja. A folyamat összefogla­ lása a 17-28. ábrán látható. Intracellulárisan az mTOR-kináz fehérjekomple­ xekben fordul elő, melyek közül az mTOR-komplex-1 (mTORCl) és az mTOR-komplex-2 (mTORC2) összetétele ismert. A komplexben állványfehéijék, gátló és stimuláló fehérjék vesznek részt, de ezek rész letes leírásától eltekintünk. Jelen tudásunk szerint az mTORCl a „mester regulátor” a sejtnövekedés, sejt ciklus, proliferáció és túlélés szabályozásában, s eb­ ben a fejezetben elsősorban ezzel foglalkozunk. (Az mTORC2 főként a növekedési faktorok jelátvitelébe játszik szerepet és a PKB/Akt szerin/'treonin-kin’ foszforilálja, 17-27. ábra.) Az inzulin és növekedési faktor jelpályában azak tiválódó PKB/Akt hatására történik meg az mTORCl

517

1 7 . P L A Z M A M E M B R Á N - R E C E P T O R O K ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

17-28. ábra. mTORCI aktívá­ dé mechanizmusa és az ak­ tív mTORCI hatásai. PKB, protein-kináz B (Akt); TSC1/2, tuberous sclerosis complex-1 és -2; Rheb, Ras homologue enriched in brain; mTORCI, mammalian target of rapamycin complex 1; GAP, GTPáz aktiváló protein; PPARy, peroxisome proliferator activated receptor y; PGC-1a, PPARy-koaktivátor-1a; HIF-1, hypoxia-inducible factor-1; 4E-BP1, eukariota iniciációs faktor 4E (elF4E) kötő fehérje; PFC, pentóz-foszfát-ciklus; AMPK, AMP-aktivált kináz; ULK1-2, az autofágia iniciációjában résztvevő fehérje. A + és -jelek a kaszkádban megelőző faktor aktív állapotban kifej­ tettaktiváló, illetve gátló hatá­ sára utalnak. Piros csillag a protoonkogén, kék csillag a tumorszuppresszor tulajdon­ ságot jelzi

( növekedési faktorok

*

i i \k ( PKB/Akt

Ia cTSC 1/2 (GAP)

■ÜAMPK "W

- - - ( tápanyag-ellátottság

-( aminosavszint'^

a Rheb G-fehérje rapamicin

a i mTORCI-

-r

(S6-kináz-1

>

kináz 1 f 4E-BP11

I

>t (ULK1-2

J

S6-foszforiláció

aktiválása, közvetve és nem a fehérje direkt foszforilálása következtében (17-28. ábra). Az mTORC 1et egy kis G-fehérje, a Rheb (Ras homologue enriched in brain) stimulálja, GTP-kötött állapotban. A Rheb aktivitása megszűnik, amikor az intrinsic GTPáz-aktivitás a GTP-t GDP-vé hidrolizálja. Ez történik a TSC1/TSC2 (TSC 1/2) fehérjekomplex (tuberous sclerosis complex) hatására, ami GAP-ként működik. Amikor a TSC 1/2 aktív, akkor a Rheb inaktív, és nem történik meg az mTORCI aktiválása. Az aktív PKB azonban a TSCl/2-t foszforilálja, ezzel inaktiválja, s így megszűnik a TSC 1/2 Rheb-re gyakorolt gátló ha­ tása, ami az mTORC 1-t stimulálja. Itt tehát a PKB foszforiláció egy gátló hatás gátlásával teszi lehetővé azmTORCI stimulációját. A TSC1/TSC2 fehérje egy heterodimer, amelynek mindkét eleme (TSC1, hamartin és TSC2, tuberin) tumorszuppresszor, amelyek deléciója a tuberous sclerosis nevű - multiszisztémásan megjelenő jóindu­ latú tumorok kialakulásával járó ritka genetikai - be­ tegséget okozza.

' (glukózfelvétel

transzláció iniciációja

fehérjeszintézis ^

(Esi nukleotid-, szintézis

( autofágia^ ]

Az mTORCI szubsztrátjai kiemelkedő szerepet játszanak a fehérjeszintézis regulációjában. Az mTORCI foszforilálja és ezzel stimulálja a riboszomális S6-kinázt. Úgyszintén foszforilálja az eukarióta iniciációs faktor-4E- (eIF4E-) kötő fehérjét, a 4E-BP-t. A foszforilált 4E-BP-ről az eIF4E leválik és részt tud venni az iniciációs komplex kialakulásá­ ban. A fehérjeszintézis stimulációja nyomán megnő a sejtekben a proliferációs és túlélési utakban szerepet játszó fehérjék száma. Az mTOCl gátolja az autofágia folyamatát. Az autofágia során a sejt elemeinek szabályozott lebontá­ sa történik; a folyamat lehetővé teszi a károsodott, fe­ lesleges molekulák újrahasznosítását és energiaforrás­ ként történő hasznosulását. Az mTORCI több, az autofágiában részt vevő kinázt foszforilál (így az ULK2 jelű fehérjét) és gátol, ezzel is biztosítva a sejt növekedését. Az mTORCI az energiahomeosztázist is befolyá­ solja, különböző transzkripciós faktorok (PPARy, PGCla, HIF-1) foszforilációja révén, fokozott gén-

8

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A j E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

expressziót eredményezve. Ennek eredménye foko­ zott adipogenezis a zsírszövetben, fokozott angiogenezis, fokozott glukózfelvétel (megnövekedett VEGF-transzkripció következtében) és mitokondriális metabolizmus. Az mTORCl aktivitását nemcsak növekedési fak­ torok, hanem a tápanyag-ellátottság is befolyásolja. Megfelelő tápanyag-ellátottság mellett az aktív mTORCl fentiekben leírt és a 17-28. ábrán bemuta­ tott hatásai érvényesülnek; fokozódik a makromole­ kulák szintézise, a riboszómák és mitokondriumok biogenezise, az angiogenezis. A jelpályán belül a TSC1/2 fehérjék integrálják a növekedési szignálokat (foszforilálódnak a PKB és az ERK hatására is) és a tápanyag-ellátottságot jelző szignálokat. A megfelelő tápanyag-ellátottságot az aminosavak megnövekedett szintje jelzi, míg a hiányos energiaellátottságot az AMP-felszaporodás következtében aktívvá váló AMP-kináz közvetíti. Az AMPK foszforilálja a TSC1/2 fehérjét, amit ezáltal aktivál, ez gátolja a Rheb fehérjét, és elmarad az mTORCl aktiválása. Az ami­ nosavak ezzel szemben az mTORCl-aktivációnak kedveznek; a növekedési faktorok hatására bekövet­ kező aktiváció csak aminosavak jelenlétében történik meg, amelyek lehetővé teszik az mTORC 1-transzlo­ kációt a lizoszómák felszínére, az aktiváció helyére. Az aminosavaknak így az mTOR aktivációjában meg­ engedő, permisszív szerepe van. (A transzlokációban az aminosavakat érzékelő Rag kis G-fehérje családnak van jelentősége.) Az mTOR nevét alloszterikus gátló molekulájáról, a rapamicinről kapta (Streptomyces hygroscopicus baktériumokból izolált antimikotikum), amelynek proli ferációgátló hatása van. Jelenleg a rapamicin és a hozzá hasonló szerkezetű molekulák (első generációs inhibitorok) mellett számos mTOR-gátlót fejleszte­ nek, melyek a kináz ATP-kötését gátolják. Az mTORmhibitorok immunszuppresszánsok; gátolják a T-sejteken az IL2 hatását. Ezt a tulajdonságát transzplantá­ cióra váró betegek kezelésében és coronariarestenosis megakadályozásában használják ki. Az mTOR út számos eleme protoonkogén vagy tumorszuppresszor fehérje. Konstitutív aktivációjuk, illetve deléciójuk, ennek következtében az mTOR út megemelkedett aktivitása a humán tumorok nagy szá-

zalékában megtalálható. A rapamicin származékait kemoterápás kezelésekben alkalmazzák. Az mTOR állandó aktivációja (például krónikus túlevés esetében) lipidfelhalmozódáshoz, inzulinre­ zisztenciához és végső soron 2-es típusú diabeteshez vezethet, az mTOR-inhibitorok terápiás felhasználása ezen a területen is klinikai vizsgálatok alatt áll. Az el­ múlt években felfigyeltek a rapamicin élettartamot meghosszabbító hatására. (Az AMPK-serkentő metforminhoz hasonlóan, mely szintén gátolja az mTOR-t.) Az állatkísérletek biztató eredményei elle­ nére a rapamicin egyéb (pl. immunszuppresszáns) hatásai valószínűtlenné teszik rekreációs hasznosítá­ sát. Az inzulin hatása a GLUT4 transzporterek transzlokációjára némileg eltér a fenti mechanizmu­ soktól. A GLUT4-transzlokáció a plazmamembránba ami a zsírszövetben és az izomban a fokozott glukózfelvétel feltétele — igen bonyolult folyamat, amelynek során vezikuláris transzporttal jut el a GLUT4 a Golgi-hálózatból a plazmamembránba. Az inzulin jelpályában két útvonal szerepét bizonyítot­ ták ennek szabályozásában. Az egyik a PI-3-kináz ak­ tiválásához kapcsolt mechanizmus, ami a GLUT4 Golgi-hálózatból való transzlokációját, a másik PI-3-kináz aktiválásától független út - a GLUT4 plaz­ mamembránhoz történő fúzióját segíti elő. A PI-3kináz útvonal aktiválása foszforilációs szabályozások révén gyorsítja a GLUT4-transzlokációt. Ebben a fo­ lyamatban a Rab monomer G-fehérje (amelyet a 21. fejezetben, az exocitózis részletes mechanizmusának tárgyalásakor említünk meg) játszik központi szere­ pet. A Rab GAP fehérjéje, az A S160 (Akt substrate of 160 kDa) foszforiláció hatására inaktiválódik, a Rab aktív, GTP-kötött állapotban marad, és elősegíti a GLUT4 lefuződését a Golgi-hálózatból. Inzulin jelen­ létében az AS 160-GAP fehérjét az Akt/PKB foszforilálja és inaktiválja (17-27. ábra). A PDK1 a PKCj0ta-t is foszforilálja, az aktív PKCt szerepet ját­ szik a GLUT4 transzlokációjában. (Izomsejtekben inzuhn jelenléte nélkül, az izomkontrakció hatására is bekövetkezik a GLUT4 transzlokációja, amelynek hátterében a megemelkedett Ca2+-szint által közvetí­ tett jelátviteli folyamatok és a megemelkedett AMP-szint által aktivált AMPK áll.)

1 7 . P L A Z M A M E M B R Á N - R E C E P T O R O K ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

A másik, inzulin által stimulált jelpálya a PI-3kináz aktiválásától független (17-27. ábra). Ez az út­ vonal az IR-hez közvetlenül kötődő Cbl adapter fehér­ jéről indul. A Cbl és a hozzá kötődő fehérjék [CAP (Cbl associated proteins)] fehérje-fehérje kapcsolódá­ sokon keresztül aktiválják a lipidtutaj mikrodoménnel asszociált TC10 nevű kis G-fehérjét. Ez teszi lehetővé a Golgi-hálózatból érkező GLUT4 fúzióját a plazma­ membrán lipidtutajához. Az inzulin további anabolikus hatása a lipidszintézis serkentése, ami elsősorban a lipidszintézist foko­ zó sterol regulatory element-binding protein (SREBP) transzkripciós faktor aktivációján alapul. A SREBP aktivációja több lépésből álló folyamat; a fehérje átvándorol a Golgi-apparátusba, ahol nukleázok hatására felszabadul, majd a sejtmagba transzlokálódik. Az inzulinhatás közvetítésében mTOR-függő és független jelátviteli utakat is azosítottak, de a pon­ tos molekuláris mechanizmus még nem ismert. A génexpresszió fokozásának célenzimjei az acetil-CoAkarboxiláz, illetve a zsírsav-szintáz, amelyek serken­ tésével fokozza az inzulin - elsősorban májban és zsír­ szövetben - a zsírsavak szintézisét. Az Akt ezen túlmenően a zsírsavszintézist az ATP:citrát-liáz aktiválásával is serkenti. Meg kell említeni, hogy a tirozin-kináz-receptorok és a róluk induló jelátviteli utak aktivációja és inaktivációja szigorú szabályozás alatt áll. A szignálok gyengítésére, inaktivációjára számos általános mecha­ nizmus ismert. Közülük néhány orvosi szempontból jelentős, az inzulin-jelátvitel kapcsán részletesebben vizsgált példát említünk. (1) A tirozin-kináz-receptorok foszforilációja szerin/treonin-kinázok által gátló hatású. Ilyen például az inzulinreceptor és az IRS-ek PKC hatására létrejövő foszforilációja, melynek szerepet tulajdonítanak az obezitás okozta inzulinrezisztencia kialakulásában. (2) A protein-tirozin-foszfatáz szupercsalád a kinázok antagonistájaként működik. Az aktiváló foszfotirozinokat eltávolító és ezzel a jelátvitelt gátló PTP-k a gyógyszertervezés célmolekulái közé tartoznak. (3) Végül, inzulinrezisztenciát okoz az inzulinreceptor-ligand komplex emelkedett, a fiziológástól eltérő mértékű endocitózisa és ubikvitinációt követő proteoszomális degradációja.

17.7

519

JA K-STAT JELP Á LYA

A citokin és egyes faktorok - például az interleukin (pl. IL2, -7, -9), interferon, eritropoetin, prolaktin, nö­ vekedési hormon, leptin - kiváltotta jelátvitelt közve­ títő receptorok nem rendelkeznek enzimaktivitással; citoplazmatikus oldalukon inaktív JAK (Janus kinase) nemreceptor tirozin-kinázokkal asszociálódnak (17-29. ábra). A ligandkötődés hatására itt is

17-29. ábra. A JAK-STAT jelátpálya bemutatása az eritro­ poetin jelátvitelén keresztül. Az eritropoetin (EPO) receptor­ hoz kötődése a receptor aktív konformációját eredményezi. En­ nek hatására az addig inaktív Janus-kinázok egymást, majd to­ vábbi fehérjéket, köztük magát a receptort foszforilálják, kötési helyeket teremtve ezzel az SH2-doménekkel rendelkező fehér­ jék számára. A JAK fehérjék foszforilált tirozinjaihoz STAT transz­ kripciós faktorok kapcsolódnak, foszforilálódnak majd dimerizálódnak. A STAT-dimerek aktív transzkripciós faktorok, melyek a magba transzlokálódnak és ott enhanszer elemekhez kötőd­ nek. A citokinreceptorokról további, így PI-3K, PLCy és MAPK út is indulhat. JAK, Janus kinase; STAT, signal transducer and activator of transcription; PI-3K, foszfatidil-inozitol-3-kináz; PLCy, foszfolipáz-Cy; MAPK, mitogén aktiválta protein-kináz

V.

520

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

receptordimerizáció történik, ami után a JAK proteinkinázok egymást foszforilálják, s ez egyszersmind az aktivációjukat is jelenti. Az aktiválódott JAK tirozinoldalláncokon foszforilálja a receptort, s ezzel megte­ remti a kötőhelyet a receptoron az SH2-doménnel ren­ delkező STAT (signal transducer and activator of transcription) számára. A receptoron kötődött STAT szubsztrátja a JAK-nak, s tirozinoldalláncokon foszforilálódik. A foszforilált STAT dimert képez úgy, hogy a foszfotirozinok a másik STAT SH2doménje révén kapcsolódnak össze. A dimer leválik a receptorról, a magba transzlokálódik, a DNS-hez kö­ tődik és beindítja a transzkripció szabályozását. Szá­ mos különböző szerkezetű (monomer, dimer, trimer) citokin, növekedésifaktor-receptor, többféle JAK izoenzim, illetve STAT izoforma, valamint ily módon szabályozott célgén ismert. A receptorokról a JAK7STAT jelátvitel mellett más jelátviteli út, mint Ras/ERK és PI-3K jelátviteli út is elindulhat. A STAT foszforiláció kapcsolódhat nemcsak citokinreceptor, de más, például G-fehérjéhez kapcsolt receptormediált jelátvitelhez is.

17.8

Az egy transzmembránszakasszal rendelkező re­ ceptorok családjába tartozik az a receptor, amely guanilát-cikláz-aktivitással rendelkezik (receptorguanilát-cikláz) és ligandkötött állapotban a GTP-ből történő cGMP keletkezést katalizálja. A reakció ana­ lóg a cAMP keletkezésével. Ebben a jelpályában a cGMP (17-30. ábra) tölti be a másodlagos messenger szerepét. A receptor extracelluláris doménje köti a ligandot, és stimulált állapotban dimert alkot, de a

o

oANF BNF

(PKG)

A C IK LIK U S G M P-VEL MŰKÖDŐ J E L P Á L Y A . A NITROGÉN -M ONOXID BIO LÓGIA I S Z E R E P E

17-30. ábra. A ciklikus guanozin-3,5-monofoszfát (cGMP) képlete 17-31. ábra. A cGMP jelpálya sémája. A receptor guanilát-cikláz hormonkötő doménje (FID) köti a ligandokat (L), ami lehet a pitvari nátriumürítő faktor (ANF), az agyi nátriumürítő faktor (BNF), a guanilin és az uroguanilin. A receptor intracelluláris guanilát-cikláz doménjén (GC) vagy a szolubilis guanilát-cikláz (sGC) hatására keletkezik cGMP. NO, nitrogén-monoxid; NOS, nitrogén-monoxid-szintáz; nNOS, neuronális, eNOS, endoteliális, iNOS, indukálható nitrogén-monoxid-szintáz; PDE, foszfodiészteráz

1 7 . P L A Z M A M E M B R Á N - R E C E P T O R O K ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

dimer receptor csak egy ligandot köt (17-31. ábra). Ebben a jelpályában a receptor intracelluláris guanilát-cikláz doménje, amely a cGMP keletkezésért fe­ lelős, tölti be a jelátalakító és az erősítő szerepet. A re­ ceptor endogén ligandjai natriuretikus hormonok [pitvari (atrial) natriuretikus faktor, ANF; agyi (brain) natriuretikus faktor, BNF; C-típusú natriuretikus fak­ tor, CNF), valamint a bélben termelődő guanilin és uroguanilin. A cGMP legtöbb hatását a cGMP-dependens protein-kináz (PKG) aktiválása révén fejti ki. A PKG a szerin/treonin protein-kinázok családjába tartozik, a sejtekben homodimerként van jelen, és cGMP nélkül olyan konformációs állapotban van, amelyben a regulátoros dómén a katalitikus domént gátolja (a két dómén ugyanazon polipeptidláncon található). cGMP kötődése a regulátoros doménhez okozza azt a konfor­ mációváltozást, ami a katalitikus domént felszabadítja agátlás alól, és lehetővé válik fehérjék foszforilációja. A cGMP által kiváltott hatásoknak az vet véget, hogy a cGMP-ből specifikus foszfodiészterázok hatá­ sára 5’-GMP keletkezik. A cGMP-foszfodiészterázoknak több izoformája ismert, amelyek a különböző szövetekben eltérő mennyiségben expresszálódnak. A cGMP jelpálya által közvetített változatos hatá­ sok közül ki kell emelni a vesében és a bélhámsejtek­ ben a Na - és CF-transzportokra gyakorolt hatást és a

521

simaizmokra gyakorolt relaxációs hatást. Az ANF vazodilatációt, natriuresist és aldoszteronszintézisgátlást okozó peptid, amelyet a pitvari sejtek választa­ nak el akkor, amikor megnő a keringő vér térfogata. (A BNF is elsődlegesen a pitvari sejtekből kerül a ke­ ringésbe, a CNF az endotélsejtekből.) A vesében, el­ sősorban a disztális kanyarulatos csatornákban és a gyűjtőcsatornákban található receptorain hatva fokoz­ za az epitélsejtekben a cGMP-termelést, aktiválja a PKG-t, ami foszforilálja a luminális membránban ta­ lálható Na+-csatomákat, gátolva azokat (17-32/a áb­ ra). A hatás következménye az, hogy csökken az epitélsejteken keresztül történő Na+-visszaszívódás, megnő a Na+-ürítés és folyadékürítés, és a keringő vértérfogat csökken. Az érfali simaizomban, amely szintén expresszál ANF-receptort, a PKG több külön­ böző fehérjét is foszforilál, amelyek csökkentik a [Ca ]j szintet: a cGMP-szint emelkedése gátolja mind az IP3-receptoron át történő Ca2+-felszabadulást az ER-ből, mind a plazmamembránon keresztül az L-csatornán történő Ca“ -belépést, ugyanakkor a plazma2+ membrán Ca" -ATPáz foszforilációja révén stimulálja a Ca -kipumpálást a sejtből. Ezeknek eredményeként a simaizmok elemyednek, vazodilatáció és vémyomáscsökkenés jön létre. Az ANF a mellékvese zóna glomerulosában gátolja az aldoszteronszekréciót, amelyben jelentőséget tulajdonítanak a cGMP PDE2-t r

r

vese

disztális kanyarulatos csatornák kérgi gyűjtőcsatornák

17-32. ábra. A receptor guanilát-cikláz stimulációjának hatása az epitélsejteken a vesében (a) és a bélhámsejteken (b). ANF, pitvari nátriumürítő faktor; PKG, cGMP-függő protein-kináz

522

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

stimuláló hatásának; csökken a cAMP-szint, nem stimulálódik a PKA, csökken az L-csatomák foszorilációja, így a Ca2+-belépés. A bélben a guanilin és uroguanilin peptidek recep­ torai rendelkeznek guanilát-cikláz-aktivitással (17-32/b ábra). Sóban gazdag étkezés után az ileum, jejunum és proximális colon epitélsejtjei szekretálják a guanilint és az uroguanilint a béllumenbe, ahol parakrin módon a közeli epitélsejteken a luminális ol­ dalon lévő receptoraikat stimulálják. A cGMP-szintemelkedés —> PKG-aktiválás következtében foszforilálódó CFTR-csatomákon (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) keresztül megnő a Cl -szekréció az epitélsejtekből, valamint csökken a Na+-felszívódás. Ez folyadékvisszatartást jelent a lu­ menben és hasmenést okoz. Ezen a receptoron stimu­ láló hatású az Escherichia coli és más Gram-negatív baktériumok egyik hőstabil toxinja is. cGMP nemcsak a receptor guanilát-cikláz hatására keletkezik, hanem létezik a guanilát-cikláznak olyan formája, amely a citoszolban lokalizálódik és plazmamembrán-receptorral nincs kapcsolata; ez a szolubilis guanilát-cikláz. A szolubilis guanilát-cikláz jellem­ zője, hogy hem prosztetikus csoporttal működik és a nitrogén-monoxid (NO) stimulálja. A NO (és min­ den olyan anyag, amelyből a sejtekben NO keletkezik) a szolubilis guanilát-ciklázt aktiválja és cGMP-szintemelkedést okoz (17-31. ábra). A NO az enzim prosz­ tetikus csoportjával, a hem-vassal lép kapcsolatba, nitrózo-hem keletkezik, s ez az enzimaktivitás fokozó­ dásával jár. A NO számos fiziológiás és patológiás ha­ tásának a hátterében ez a molekuláris kölcsönhatás áll (lásd alább). Létezik olyan speciális jeltovábbító rendszer is, amelynek mű­ ködése során az extracelluláris jel nem a citoszol cGMP-szintjének a növekedését, hanem éppen ellenkezőleg a cGM P-szint csökkenését idézi elő. Ez a rendszer a fényt érzékelő retinapálcikákban található. Ezekben a sejtekben (sötétben) a cGMP nyugalmi koncentrációja nagyságrendekkel magasabb, mint a többi sejtben általában, és a cGMP közvetlenül (nem a protein-kináz G segítségével) egy kationcsatomát tart nyitva, annak egyik fehérjekomponenséhez kö­ tődve. A sejtmembrán nyugalmi polarizációját (a membránpotenciái a szokásos — 70 mV helyett -3 0 mV) az ezen a csatornán beáramló és a pumpaenzimek segítségével eltávolított ionok által teremtett egyensúly határozza meg. Fény (fotonok) hatására (itt nem részlete­ zett mechanizmus segítségével) a pálcikák külső korongjában elhe­

lyezkedő rodopszin aktiválódik. A rodopszin a heterotrimer G-fehérjék családjába tartozó G, (transzducin) segítségével aktivál egy specifikus cGMP-foszfodiészterázt, amely a cGMP-t GMP-vé hidrolizálja. A cGMP-szint csökkenésekor az ioncsatoma záródik, az ionkoncentráció csökkenése a plazmamembrán hiperpolarizációját hozza létre. A retinapálcíkák plazmamembránjában történő változás az alapja a fény érzékelésének.

A nitrogén-monoxid keletkezése és biológiai jelentősége A nitrogén-monoxid az eddig megismert legkisebb és az első gáz halmazállapotú molekula, amelynek je­ lentős fiziológiai és patológiai szerepe van a szerve­ zetben. Szerepet játszik az érfal simaizomtónus szabá­ lyozásában, immunfolyamatokban és neurotranszmitter a központi és a perifériás idegrendszer egyes terü­ letein. NO a nitrogén-oxid-szintáz (NOS) hatására argininből keletkezik a 17-33. ábra a részén bemutatott reakcióban. A NOS dimer szerkezetű, tartalmaz egy reduktáz és egy oxigenáz domént (a reduktáz dómén szerkezete és működése hasonló a citP450-éhez), s összesen öt kofaktor szükséges a működéséhez (NADPH, FAD, FMN, hem és tetrahidrobiopterin). A két dómén egy kalmodulin-kötőhellyel kapcsolódik egymáshoz (17-33/b ábra). A NOS három izoformában fordul elő: neuronális (nNOS vagy NOS-1), endoteliális (eNOS vagy NOS-III) és indukálható NOS (iNOS vagy NOS-II). Az nNOS és az eNOS konstitutív enzimek, vagyis folyamatosan expresszálódnak a megfelelő sejtekben, de csak akkor aktívak, amikor az intracelluláris Ca2 -koncentráció megemel­ kedik és létrejön a Ca2+ kalmodulin komplex, amely kötődik a NOS-hoz. Ezzel szemben az iNOS nem konstitutív enzim, csak adott körülmények között expresszálódik, viszont amikor jelen van a sejtben, a Ca" -koncentrációtól függetlenül, folyamatosan köti a kalmodulint, vagyis folyamatosan aktív. Mint alább részletezzük, a NO jelentős fiziológiai folyamatok regulációjában játszik szerepet, azonban meg kell említeni, hogy főleg nagyobb (nM-os) kon­ centrációban sejtkárosító hatású. Ennek egyik ténye­ zője az, hogy a NO gyök természetű molekula (párosítatlan spinű elektront tartalmaz, NO’-ként is jelölik),

17. P L A Z M A M E M B R Á N - R E C E P T O R O K ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

523

a NH9 | z C = NH 1 NH (CH2)3 HC — NH, COOH L-arginin

nh9

O,

H ,0 ,

/ "

NADPH

'N NADP+

NH,

I z C = N — OH

I

c=o I

NH (CH2)3 1 H C -N H ,

NO + 1/2 NADPH 1

1/2 NADP+

NH | (CH2)3 H C -N H ,

I

COOH

COOH N-OH-L-arginin

2

citrullin

17-33. ábra. A nitrogén-monoxid-szintáz által katalizált reakció (a) és az enzim doménszerkezete a kofaktorokkal (b). Kai, kalmodulin; THB, tetrahidrobiopterin. PDZ domént csak az nNOS tartalmaz

és nagy reaktivitással lép kölcsönhatásra fehérjékkel, lipidekkel és a DNS-sel egyaránt. A NO előszeretettel reagál szuperoxid-gyökkel (O2’ ), amelynek során mind a NO-nál, mind a szuperoxidnál nagyobb reakti­ vitáséi peroxinitrit (O N O O ) keletkezik (17-34. ábra). Aperoxinitrit jelentős nitrozilálóképességgel rendel­ kezik, ami azt jelenti, hogy fehérjék cisztein SH-csoportjához kovalensen kötődik a NO, s ez egyes enzi­ mek esetében az aktivitás csökkenéséhez, másoknál aktivitásfokozódáshoz vezet. (Megjegyzendő, hogy a nitrozilálás sok esetben fontos poszttranszlációs fe­ hérjemódosítást jelent és nem patológiás folyamatot.) Anitrozilálás érinti a glutation SH-csoportját is, ami részben további fehérje-nitrozilálást eredményez, részben hozzájárul az oxidatív stresszhez (17-34. áb-

ra). Szintén nagy reaktivitású a NO-nak Mn“ -nal al­ kotott komplexe. Ezeket a nitrozovegyületeket (ONOO , GSNO, Mn2+-NO) éppen nagyfokú reakti­ vitásuk miatt reaktív nitrogénszármazékoknak ne­ vezzük (a reaktív oxigénszármazékok analógiájára).

eNOS. Az eredetileg endotélsejtekben megtalált és ezért eNOS-nak nevezett enzim a vaszkuláris endotél­ sejtekben és a szívizomsejtekben expresszálódik. Aktivitását [Ca‘ ]i-emelkedés fokozza, ami endotél­ sejtekben acetilkolin-, bradikinin- és trombinstimulusra történik meg, illetve az endotélsejteken a kerin­ gés által keltett fokozott nyíróerők hatására (17-35. ábra). A Ca2+-kalmodulin által aktivált eNOS NO-ot termel, amelynek elsődleges hatása azonban nem az endotélsejtekben, hanem a szomszédos simaizom­ sejteken érvényesül. A NO ugyanis gáz halmazállapo­ tú anyag, a membránokon szabadon diffundál, s a kör­ nyező simaizomsejtekben a szolubilis guanilát-cikláz hemcsoportjával kölcsönhatásba lépve stimulálja a cGMP-keletkezést. Az aktiválódó PKG a Ca2 homeosztázis fent említett számos komponensét foszforilálja, végeredményben a [Ca2 ],-szintet csökkenti és létrejön a simaizom-relaxáció.

17-34. ábra. Fehérjék S-nitrozilálása NO-ból keletkező re­ aktív nitrogén-származékok hatására. GSH, oxidált gluta­ tion; ONOO , peroxinitrit, GSNO, nitrozilált glutation, 0 2’~ szuperoxid-gyök

Az eNOS membránhoz kötött enzim, annak következtében, hogy az N-terminálishoz közeli szakaszon mirisztil- és palmitil-

524

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

makrofágok

17-35. ábra. Simaizom-relaxáció az érfalban NO hatására. Az endotélsejtben található nitrogén-monoxid-szintáz (eNOS) konsti­ tutív, a makrofágokban indukálható (iNOS). Arg, arginin; NO, nitrogén-monoxid; sGC, szolubilis guanilát-cikláz; Kai, kalmodulin

csoportokat tartalmaz, amelyek a membrán-kaveolákhoz kötik, ahol, alacsony [Ca2+]r koncentrációnál, a kaveolin-1 a kalmodulin-kötőhelyen kötődik a NOS-hoz és gátolja azt. A Ca2+-stimulus során lét­ rejövő Ca2+-kalmodulin komplex leszorítja a kaveolint a NOS-ról és aktiválja az enzimet.

A NO hatásának erőssége attól függ, hogy milyen

hatás lényege az, hogy a coronariaerek dilatációja kö­ vetkeztében javul a szívizomzat vérellátása. A NO-nak egy másik jótékony terápiás hatása érvé­ nyesülhet akkor, amikor inhalációval közvetlenül a tü­ dőbe juttatják, ahol csökkenti a pulmonális hypertensiót a szisztémás vérnyomás befolyásolása nélkül.

távolságra diffundál. Féléletideje áltálában 5-20 s, mert a sejtekben és a keringésben átalakul; a keringés­ ben egyebek mellett kötődik a hemoglobin betű­

CH2— O— N02

csoportjához, a sejtekben elsősorban nitritté (N 0 2~) és nitráttá (N 0 3~) oxidálódik.

CH — O— NO,

K lin ika i v o n a tk o zá so k

I

c h 2-

17-36. ábra. A nitroglicerin képlete

2

o— no2

Az eNOS által termelt NO szerepet játszik a kardiális hypertrophia gátlásában is, amit szintén an­ nak tulajdonítanak, hogy a NO a miocitákban a

A NO vaszkuláris simaizom relaxáló hatásának meg­ ismerése magyarázatot adott arra a régi megfigyelés­ re, hogy nitrovegyületek, mint pl. a nitroglicerin (17-36. ábra), hatékonyan csökkentik a szívizomzat elégtelen oxigénellátottsága miatt kialakuló, nagy mellkasi fájdalommal járó angina pectoris tüneteit. A nitroglicerinből a mitokondriális nem specifikus aldehid-dehidrogenáz hatására nitrit szabadul fel, ami tovább redukálódik NO-dá. A NO-felszabadulás elhú­ zódó folyamat, így a NO rövid féléletideje ellenére a nitrovegyületek hatása órákon át tart. A jótékony

cGMP-szint-emelkedés PKG-aktiválás következ­ tében csökkenti az L-csatomákon keresztül történő Ca~ -belépést. A NO kardiális hatásában szerepet ját­ szik a cGMP hatására létrejövő PDE2-aktiválás is, aminek következtében lecsökken a cAMP-szint és az L-típusú Ca"4-csatornák PKA általi foszforilációja, s ez csökkent Ca2 -belépéssel jár. A NO-termelés ezen túlmenően jótékony hatású a trombocitaaggregáció csökkentése következtében is. j nNOS. Konstitutív NOS található a központi és a perifériás idegrendszer egyes területein és a harántcsí-

1 7 . P L A Z M A M E M B R Á N - R E C E P T O R O K ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

költ izomban is. A neuronokbán mediátor és transzmitter szerepet tölt be, de tulajdonságai teljesen eltér­ nek a többi ismert neurotranszmitter sajátosságaitól (szintézisét a Ca2+ regulálja, nincs vezikuláris raktára, szabadon diffundál, nincs sem enzimatikus, sem visszavétellel történő inaktiválódása, lásd 21. fejezet). A központi idegrendszerben az nNOS enzimet el­ sősorban a glutamáterg posztszinaptikus neuronokbán

525

Mivel PDE5 megtalálható a vaszkuláris simaizmok­ ban is, a Viagra hatására vémyomáscsökkenés is elő­ fordul, ami általában enyhe fokú, de veszélyes mérté­ kű lehet nitrovegyületek együttes szedése esetén. Úgyszintén mérlegelni kell Viagra alkalmazását más gyógyszerek szedése esetén, amelyek a Viagra metabolizmusát befolyásolják.

a glutamát NMDA-receptorain beáramló Ca2+ stimu­ lálja. Az nNOS enzim PDZ doménnel is rendelkezik (17-33/b ábra), s ez tartó fehérjéken keresztül (pl. a posztszinaptikus denzitás-95 nevű fehérje [PSD-95] szoros kapcsolatban van az NMDA-receptorral, így a Ca2~ hatása az nNOS-on azonnal, a belépés helyén ér­ vényesül. A NO diffúzióval eljut a szomszédos neuronokhoz, de a preszinaptikus glutamáterg neu­ ronhoz is, ahol stimulálja a szolubilis guanilát-ciklázt, s a cGMP-keletkezésen keresztül stimulálja a gluta­ mát szintézisét, pozitív feedback hatással erősítve a glutamáterg szinapszis működését. E folyamatnak a tanulás és emlékezés mechanizmusában tulajdoníta­ nak jelentőséget. A periférián nNOS-tartalmú neuronok vannak a

iNOS. A z indukálható NOS jellemzője az, hogy mint a neve is jelzi, csak valamilyen indukáló ágens hatására expresszálódik olyan sejtekben, amelyek iNOS gént tartalmaznak. Ezek közül legfontosabbak a makrofágok, leukociták, asztrociták, vaszkuláris si­ maizomsejtek és hepatociták. iNOS fontos fiziológiai szerepet játszik a szervezet kórokozók elleni védeke­ zésében, az immunfolyamatokban, de patológiás je ­ lentősége is kiemelkedő pl. gyulladásos folyamatok­ ban vagy neurodegenerációban. Az iNOS-t az jellemzi, hogy köti a kalmodulint Ca2+ hiányában is, tehát az enzim, ha egyszer ex-

gasztrointesztinális rendszerben, a tüdőben, a vaszku-

presszálódott, akkor folyamatosan aktív, és termeli a NO-ot, vagyis sokkal nagyobb mennyiségű NO-kelet-

láris és az urogenitális rendszerben. A keletkező NO mindenhol simaizom-relaxációt okoz, így bronchus-

kezést okoz, mint a konstitutív enzimek, amelyek Ca2t-nal regulálódnak. Az iNOS expresszi ójának leg­

dilatáló, vérnyomáscsökkentő és bélmotilitás-reguláló

fontosabb indukálói a citokinek (tumomekrózis fak­ tor, interferon-y, interleukin-1) és bakteriális lipo-

szerepe van.

poliszacharid endotoxinok. A kórokozó patogének el­ pusztításában fontos szerepet játszik a makrofágokban

K lin ik a i v o n a tk o z á so k

Az nNOS-tartalmú neuronok a penis erekcióját regulálják: a véredények környezetében lévő neuro­ nokbán [Ca2+]j-emelkedés következtében stimulálódik az nNOS, NO keletkezik, ami az erekhez diffundálva azokat relaxálja, és lehetővé teszi a corpus cavemosum vérrel történő feltöltődését. A NO hatása úgy cseng le, hogy az aktiválódó szolubilis guanilátcikláz által termelt cGMP-t a foszfodiészterázok 5’-GMP-vé alakítják. A corpus cavemosumban talál­ ható foszfodiészteráz izoforma (PDE5) gátlása a NO hatását prolongálja. Ennek az enzimnek a gátlója a Viagra, amit erekciós zavarok enyhítésére ajánlanak.

termelődő NO, amely a kórokozóban található hemtartalmú enzimeket gátolja, illetve fehérjék nitrozilációja következtében fejt ki gátló hatást.

K lin ik a i v o n a tk o zá so k

Az iNOS által szintetizált nagy mennyiségű NO fele­ lős a szeptikus sokkban kialakuló súlyos vérnyomáscsökkenésért, ami a legdrasztikusabb vémyomásemelő stimulusok (pl. adrenalin) adásával sem befolyásol­ ható. Ennek kiváltói bakteriális endotoxinok, ame­ lyek indukálják az iNOS-t, a NO pedig a vaszkuláris simaizmokba diffundálva, a szolubilis guanilát-cikláz

526

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

stimulációja következtében, a fent leírt mechanizmus­ sal relaxációt okoz (17-35. ábra). Argininanalógokkal - amelyek nem jutnak be az endotélsejtekbe, tehát nem szolgálhatnak szubsztrátul a NOS számára, de gátolják az argininfelvételt csökenthető a NO-szintézis, és ezekhez a szerekhez nagy reményeket fűztek az endotoxinok okozta szep­ tikus sokk kezelésében. A drámai vémyomáscsökkenés csakugyan visszafordítható ezekkel az anyagok­ kal, de a mortalitási adatok mégsem javultak, aminek oka nem tisztázott, de mindenképpen a NO egyéb, fontos fiziológiai szerepére utal.

A fejezet elkészítésében nyújtott értékes segítségé­ ért a szerző köszönetét mond Dr. Törőcsik Beátának. A fejezet tartalmaz néhány olyan megfogalmazást, amely az Orvosi Biokémia tankönyv korábbi kiadásá­ ból származik, ezért köszönet illeti Faragó Annát, a korábbi kiadás e fejezetének egyik szerzőjét.

18

SEJTM AGRECEPTOROK

MANDL J Ó Z S E F ÉS NAGY L ÁS ZL Ó

18.1

Jelátvitel intracelluláris receptorokkal

18.2

A magi receptorok családja

18.3

A hypoxia jelpálya

527

528

532

■

18.1

J E L Á T V IT E L IN TR A CELLULÁ RIS RECEPTOROKKAL

térből érkező ligandokat kötik, amelyek általában kis molekulatömegű zsíroldékony molekulák. A plazma­ membránon keresztül belépnek a sejtekbe, és a cito-

Ajelátvitel nemcsak plazmafelszíni receptorokkal, hanem intracelluláris receptorok közvetítésével is tör­ ténhet. Orvosi szempontból az intracelluláris recepto­

szolban vagy a sejtmagban kötődnek az intracelluláris receptorokhoz (18-1. ábra). Más intracelluláris recep­ torok esetében a ligandok képződése, a receptorok ak­ tiválása sejten belül zajló folyamatok eredménye is le­

rok közül a magi receptorok közvetítette jelátvitel a

het. Az intracelluláris receptorok a ligandjaik kötése,

legjelentősebb. A magi receptorok az extracelluláris

illetve az aktiválódásuk nyomán transzkripciós faktor­

sejtm em brán

lipofil ligandok

receptor

DNS

sejtm ag

receptor

DNS

18-1. ábra. A magi receptorok által közvetített jelátvitel sémája

528

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

ként kötődnek a DNS-hez, és a génexpressziót módo­ sítják. Szerkezeti kategorizálás szerint az intracelluláris receptorként működő transzkripciós fakto­ rok a DNS-kötő szekvenciájuk szerint csoportosíthatóak. Ebben a fejezetben az intracelluláris receptorok

szekvenciájának felismeréséért felelős aminosavakat és egy dimerizációs régiót is. A magi receptorok má­ sik fontos doménje az ún. ligandkötő dómén, aminek

közül a Zn-ujj DNS-kötő szekvenciával rendelkező

segítségével kicsiny lipidmolekulákat tudnak megköt­ ni. A kötődés konformációváltozásokat és ezen ke­ resztül a receptor aktiválását idézi elő. Ez a dómén

magi receptorokkal, illetve a helix-loop-helix (HLH) DNS-kötő szekvenciával bíró receptorok közül a

szerkezetileg egy három rétegű, alfa-hélixekből álló „szendvics”, aminek a belsejében található egy „hid-

hypoxia szabályozásában meghatározó HIF (hypoxia-

rofób zseb”. Ebbe a zsebbe kötődik a kis molekulatö-

inducible factor) transzkripciós faktorral foglalko­ zunk.

megü ligand, amire a kötőhely specifikus. A zsír ter­ mészetű ligandok alapvetően háromféleképpen kerül­ hetnek a sejt belsejébe, 1. a véráramon keresztül, 2. prekurzorból keletkezhetnek a sejten belül, illetve 3.

18.2

A MAGI R EC E P T O R O K CSALÁDJA

az intermedier anyagcsere folyamán termelődhetnek a sejten belül. A magi receptorok harmadik fontos és

Az evolúció során közös ősgénből fejlődtek ki a magi receptorok, amelyek hasonló funkciókat tölte­ nek be a rovaroktól az emlősökig. Kezdetben a hormonreceptorok körébe sorolták őket, a tudomány fejlődésével azonban biológiai szerepük és orvosi je ­ lentőségük jóval szélesebb körűnek bizonyult.

A magi receptorok szerkezete

nélkülözhetetlen doménje a transzkripciós aktivációs dómén, ami a fehérjemolekula C-terminális végén he­ lyezkedik el. Ez egy rövid peptid, amely lehetővé teszi transzkripciós aktivátor molekulák kötődését. Ezt az a fehérjeszerkezeti változás teszi lehetővé, amit a ligand kötődése idéz elő. így a receptor, mint egy kapcsoló, a ligand hatására a génátíródást elősegiti, bekapcsolja.

A magi receptorok csoportosítása

A magi receptorok Zn-ujj DNS-kötő, evolúciósán

Az emberi genom 47 magreceptort kódol. Ezek az

konzervált dómén szerkezettel rendelkező transzkrip­ ciós faktorok (18-2. ábra). A Zn-ujj dómén szerkeze­

aktiváló ligand természete alapján csoportosíthatóak (18-3. ábra).

tét az 1. fejezetben mutattuk be (1-9/b ábra). A két Zn-ujjból álló DNS-kötő dómén tartalmazza a DNS

Az endokrin receptorok alcsoportja tartalmazza azokat a receptorokat, amelyeknek aktiváló ligandjaa

receptorkötő helye (response element) nukleotid-

magi receptorhoz nagy affinitással (nM nagyságrendű

________________ 1____ ( ) DNS-kötés _J

TA D -CO O H

LBD ___ )

1____ ligandkötés (___

transzaktiválás

J transzaktiválás ___ J

dimerizáció t_____________________________ J transzlokáció L _ ___________________1 Hsp-kötés

18-2. ábra. A magi receptorok szerkezete. A magi receptorok különböző doméneket tartalmaznak, ame­ lyek a receptor kötődését a DNS-hez (DBD; DNA binding domain), illetve a ligandkötést (LBD; ligand binding domain) biztosítják. Emellett a C-terminális részen transzaktivációs dómén (TAD) található. Ez a dómén transzkripciós aktivációs molekulák kötődését teszi le­ hetővé. A transzaktivációban azonban az esetek egy ré­ szében az N-terminális rész is szerepet játszhat. Az egyes domének, szerkezeti elemek különböző szerepe­ ket játszanak a receptorok további sorsában, illetve mo­ lekuláris kapcsolataiban, így a receptordimerizációban, más kompartmentekbe történő transzlokációjukban, vagy a hősokk fehérjékhez (Hsp) történő kötődésükben

1 8. S E J T M A G R E C E P T O R O K

529

endokrin receptorok

„adoptált” árva receptorok

árva receptorok

bolitliganddal vagy ligandokkal aktiválhatok. Ide tar­ toznak a PPAR-ok (peroxiszóma proliferátor aktivált

n a g y affinitásul

a l a c s o n y a ffin itá su l

ism e re tle n

horm on

m eta b o lit

receptor), amelyeket zsírsavak, az FXR, amit epesa­ vak, az LXR (liver X receptor), amit módosított koleszterolmolekulák aktiválnak.

ER PR AR GR MR

RAR TR VDR

RXR PPAR LXR FXR

TLX HNF-4 COUP-TF

A harmadik alcsoportba tartozó magi receptorok­ hoz az eddigi kutatások (még) nem találtak endogén,

18-3. ábra. A magi receptorok csoportosítása. ER, ösztrogénreceptor; PR, progeszteronreceptor; AR, androgénreceptor; GR, glukokortikoid-receptor; MR, mineralokortikoid-receptor; RAR, retinsavreceptor; TR, tiroidreceptor; VDR, D-vitamin-receptor; PPAR, peroxisome proliferator activated receptor; RXR, retinoid X-receptor, FXR, farnezil X-receptor; LXR, liver X-receptor. Azárva receptorok közül pár receptor rövidítését csak megemlít­ jük

azaz a természetben az adott élőlényben fiziológiás körülmények között előforduló ligandot. (Ilyen példá­ ul a COUP-TF, a HNF-4 vagy a TLX. Ez a csoport különösen intenzív kutatások tárgya.)

A magi receptorok közvetítette jelátvitel folyamata Km-érték) kötődő hormon. Ilyenek a klasszikus szteroidhormon-receptorok mint a glukokortikoid-receptor

Funkcionális csoportosítással a magi recptorokat két alcsoportra oszthatjuk. Az egyikbe azok a recepto­

(GR), a mineralokortikoid-receptor (MR), az androgén- (AR), az ösztrogén- (ER) és a progeszteron­

rok kerülnek, amelyek homodimerként működnek, az­ az két azonos fehérje alkot egy fehérjekomplexet és

receptor (PR). Ide tartoznak nemszteroid-receptorok

így kötődik a receptor a DNS-en lévő kötőhelyéhez, az ún. válaszadó elemhez, a korábban említett „response

is, mint a tiroid- (TR), a D-vitamin- (VDR) és a retin­ savreceptor (RAR). A második nagy alcsoport az árva (angolul orphan) receptorok azon csoportja, amelyekhez már sikerült találni endogén ligandot. Ezek a receptorok általában alacsony affinitással jellemezhetők, sok esetben meta-

element”-hez, mely tipikusan egy rövid, specifikus, ismétlődő DNS-szekvencia. Ezen homodimerek ese­ tében a kötőhely általában egy palindrom szekvencia, azaz a DNS két szálán 5’-3’ irányban olvasva ugyanaz a bázissorrend.

glukokortikoid

CltOSZO

G R GR

Hsp90

A

> transzkripció

DNS sejtmag

18-4. ábra. A glukokortikoid-receptor közvetítette jelátvitel folyamatának sémája. GR, glukokortikoid-receptor; Hsp90, lósokk fehérje 90; HRE, hormoné response element

V.

530

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

A másik csoportba heterodimer típusú receptorok

egyik az, hogy elősegíti a citokintermelést serkentő

tartoznak. A heterodimerben a retinoid X-receptor (RXR) szolgál valamennyi receptor esetében dimeri-

NF kB transzkripciós faktor gátló fehérjéjének, az iKBa-nak a termelését. Ezáltal egy transzkripciót nem

zációs partnerként. A heterodimer másik monomerje lehet a retinsavreceptor (RAR), a PPAR, az LXR és a VDR. Ezek a heterodimerek tipikusan egyirányban is­

aktiváló komplex jön létre, és a citokintermelés csök­ ken. Ezen kívül más GR által közvetített mechanizmu­ sok is gátolják a gyulladás folyamatát. Ilyen a proszta-

métlődő szekvenciákat ismernek fel ún. direkt repeat-eket. Ezek, szemben a palindrom szekvenciák­

glandinok termelődésének gátlása, az annexin/lipokortin indukciója, ami gátolja a foszfolipáz-A2-t és így

kal a DNS egyik szálán ismétlődnek, szintén kétszer. A két ismétlődő szakasz közötti távolság (nukleotidok

az arachidonsav-felszabadulást, a ciklooxigenáz-2 gátlása, és az NFicB közvetlen gátlása ún. transz

száma) adja a heterodimer specifícitását.

represszió által. Ezek a hatások együttesen gyors és

A szteroid homodimerek prototípusa a GR. Szere­ pe az endokrin szabályozásban és az orvosi gyakorlat­

hatékony, de nem specifikus gyulladásgátlást tesznek

ban is igen jelentős. A GR az aktiváló hormon (pl. kortizol) hiányában a citoplazmában helyezkedik el hősokk fehérjékhez (Hsp90) horgonyozva (18-4. áb­ ra). A ligand megjelenésekor az a GR-hez kötődik, és a kötődést eredményeként létrejövő konformáció­ változás a hősokk fehérjéről való leváláshoz vezet, GR-dimer képződik, amely a sejtmagba transzlokálódik. A sejtmagban a GR-dimer kötődik válaszadó

lehetővé. A nemszteroid típusú magi receptorok, így például a TR nem a citoplazmában hősokk fehérjéhez kötve, hanem eleve a sejtmagban a DNS-hez, válaszadó ele­ méhez kötve helyezkedik el (18-5. ábra). Ott köti meg érkező ligandját - ez esetben a tiroid hormonokat. A TR heterodimert képezve az RXR-rel, a DNS-hez kötődve aktiválódik. Hasonlóan közvetítődik az A-vitamin egyik biológiailag aktív termékének, a retin-

eleméhez, és célgének aktiválását segíti elő. A GR élettani szerepe mellett orvosi jelentőségét az is adja,

savnak a génkifejeződésre gyakorolt hatása. A rétin sav az RAR- RXR heterodimeren keresztül fejti ki ha­

hogy nemcsak hormonokat köt, hanem a gyógyszer­

tását. Az aktiváló ligand, azaz a retinsav hiányában

ként előállított, szintetikus agonistákat is, amelyek gyors hatású, gyulladásellenes szerek.

receptor heterodimer a sejtmagban a válaszadó elemé­ hez kapcsolódva helyezkedik el, valamint olyan fehér

A GR aktiválása hozzájárul a gyulladásos folyama­ tok fenntartásáért felelős citokinek termelésének gát­

j ékhez kapcsolódik, amelyek a hisztonok módosításá­ val befolyásolják a kromatin szerkezetét. Az ilyen

lásához. Ezt a hatást többféle módon éri el. Közülük az

fehérjekomplexeket gátló komplexnek nevezik, és az

18-5. ábra. A tiroidreceptor közvetítette jelátvitel folyamatának sémája. TR, tiroidreceptor; RXR, reti­

tiroidhormon

noid X-receptor; TRE, thyroid response element .

citoszol

18. S E J T M A G R E C E P T O R O K

531

enzimaktivitást, ami a gátlást létrehozza, hisztondeacetiláznak. A hiszton-deacetilázok az acetilált hisztonvégeket deacetilálják, és ezáltal hozzák létre a

nyos oldalláncaira, és ezáltal lazább kromatinszerkezet alakul ki, és megindulhat a génkifejeződés. Ez az

gátolt kromatinszerkezetet (18-6. ábra). A ligandnak, ebben az esetben a retinsavnak a RAR-hoz való kötő-

enzimaktivitás így éppen az ellenkezője a gátló komp­ lex hiszton-deacetiláz aktivitásának. Tehát a ligand ál­ tal szabályozott magi receptor egyfajta kapcsolóként

| dése konformációváltozást hoz létre: a DNS-en a vá­ laszadó eleméhez kötött receptor a gátló komplexet el­

működik. A gátolt állapotból átkapcsol az aktiváltba. Ez a hormonhatás molekuláris kapcsoló modellje.

engedi, és „lecseréli” egy másik fehérjekomplexre,

Egyes magi receptorok - így a peroxiszóma proliferátor aktivált receptorok (PPAR) családjába tarto­

amit aktiváló komplexnek nevezünk. Az aktiváló komplex számos fehérjéből áll [CBP: CREB (cAMP response element binding) binding protein, amely

zók - ligandjai az intermedier anyagcserében is kép­ ződhetnek. A PPARa elsősorban a májban fejeződik

többjelátviteli folyamatban is szerepel és számos más | transzkripciós faktor kötésére képes - CBP/p300 koaktivátor komplex, 18-6. ábra], amelyek közül van

ki, és ligandjai zsírsavak. Aktiválásának hatására fo­

olyan, amelyiknek hisztonacetiláló (hiszton-acetil-

is. A PPARa-receptort a gyógyászatban használt

| transzferáz) aktivitása van. Ez az aktivitás acetilcsoportokat tesz a nukleoszomát alkotó hisztonok bizo­

fibrátok aktiválják, amelyek a vér trigliceridszintjét csökkentik.

I

kozódik a szabad zsírsavak (FFA) oxidációja a peroxiszómákban, a mikroszómákban és a mitokondriumban

gátló komplex

18-6. ábra. A hormon indukálta kapcsoló modell. Az RXR-RAR heterodimer kötődik a DNS válaszadó eleméhez és gátolja a transzkripciót egy gátló komplex kötésével, amelynek hiszton-deacetiláz aktivitása van. Ligand - ez esetben retinsav - receptorához történő kötése esetén a gátló komplex helyett koaktiváló komplex (CBP/p300) kötődik a heterodimerhez. Az aktiváló komplexnek hiszton| acetiltranszferáz aktivitása van, amely megindítja a régió által vezérelt gének átírását. RXR, retinoid X-receptor; RAR, retinsavreceptor; CBP, CREB [cAMP response element binding] binding protein, amely a hasonló funkciójú p300 fehérjével számos további fehérjét köt itt nemrészletezendő módon az aktiváló komplexhez

532

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

A PPARy-receptor legmagasabb szinten a zsírsej­ tekben fejeződik ki és elengedhetetlen a zsírsejt diffe­

pezni, és ez a heterodimer is kötődik a DNS egy másik válaszadó eleméhez. Ebben a bHLH doménnel rendel

renciálódáshoz. Aktivátorai bizonyos módosított zsír­ savak. Az aktiválás hatására zsírszállító fehérjék (mint pl. CD36, FATP) aktiválódnak és hozzájárulnak a zsírraktározáshoz. Ezen receptorok gyógyszerként ki­

kező transzkripciós faktorokkal történő jelátvitelben a HIF-1 p tölti be azt a - mester regulátomak is nevezett - szerepet, amely hasonló az előzőekben tárgyalt jelát viteli útban a szintén több heterodimerben is részt ve­ vő RXR funkciójához.

fejlesztett szintetikus aktivátorai (tiazolidinedionok) az inzulinhatás érzékenyítését érik el, és így a 2-es tí­ pusú diabetes kezelésében használhatóak. A PPAR

A H IF -la szerkezetében a bHLH dómén mellett szabályozási szempontból az ODDD (oxygendependent degradation domain) a legjelentősebb

transzkripciós faktorok metabolizmust reguláié szere­ péről a 20. fejezetben szólunk.

18.3

Emellett a H IF -la még két transzaktivációs domént, és NLS-t (nuclear localization signal) tartalmaz. Az ODDD-ben két hidroxilálható prolin található. Ezek hidroxilációja annak a jelzése, hogy normális mennyi ségben kap a sejt oxigént.

A HYPO XIA J E L P Á L Y A

A hypoxia jelpálya talán a legkiterjedtebb és átfo­ góbb jelátviteli rendszer emlős szervezetekben. Az

A hypoxiafüggő génexpresszió szabályozása

oxigénhiány érzékelése és az arra adandó sejtválasz alapvető alkalmazkodási folyamat. A válasz központi eleme a HIF (hypoxia-inducible factor) transzkripciós faktor aktiválása.

Az oxigénellátás érzékelése H IF -la prolil-hidroxilázok révén történik. Ezek a hidroxilázok a dioxigenázok közé tartoznak, és működésükhöz molekuláris oxigén szükséges. Ha elegendő oxigén áll rcndelk" zésre, akkor prolinon hidroxilálják a H IF-la-t (18-8. ábra). Ha a H IF-la-nak az ODDD doménje hidroxi prolinokat tartalmaz, akkor kötődik hozzá a von Hippel -Lindau-fehérje (pVHL). A pVHL kötődése a H IF -la ubikvitinációjához és gyors fehérjedegradáló­ dáshoz vezet. A keletkező H IF -la tehát lebomlik, és nem kerül be a sejtmagba. Ha viszont nincs elegendő

A HIF (hypoxia-inducible factor) szerkezete A HIF a bHLH (basic helix-loop-helix) doménnel a DNS-hez kötődő transzkripciós faktorok családjába tartozik (18-7. ábra). Ide sorolható még a biotransz­ formáció fejezetben tárgyalt AHR (aromásszénhidrogén-receptor) is. A HIF transzkripciós faktorok közül a HIF-1 a legjelentősebb, amely a DNS hypoxia response element (HRE) válaszadó eleméhez kötő­ dik. A HIF-1 heterodimer: egyik al­ egysége, a H IF -la indukálható, a másik alegysége, a HIF-1 [3 ex­ pressziója konstitutív. A HIF-1 p fe­ leslegben képződik, a heterodimer HRE-hez történő kötődését a mag­ ba bejutó H IF -la határozza meg. Ennek mennyisége az oxigénhomeosztázis függvénye. Megjegyezzük, hogy az AHR is képes HIF-ip-val heterodimert ké­

h; n

-

ia

1 DNS-kötés dimerizáció transzaktiválás

ODDD

N-TAD

1

1

pVHL-kötés

C-TA[f

COOH

I NLS CBP/p300 kötés

18-7. ábra. A HIF-la (HIF, hypoxia-inducible factor) transzkripciós faktor szerkezete. A transzkripciós faktor DNS-hez történő kötődéséért a bHLH (basic helix-loop-helix) dómén felelős. A fehérjének következő szakasza a magba kerülő HIF-la HIF-l(3-val alkotott heterodimerjének képzésében vesz részt. Az ODDD (oxygen-dependent degradation domain) és az N-TAD (transactivation domain) tar talmazza azt a két hidroxilálódó prolint, amely a pVHL (von Hippel Lindau-protein) kötésében szerepel. A VHL-kötés nyomán a HIF-1a nem a magba kerül, hanem ubikvitinálódik. Az NLS (nuclear localisation signal) teszi lehetővé a fehérje magba jutását. C-TAD szintén a transzaktivációban vesz részt, amelynek része a p300 kötése a mag­ ban

533

18. S E J T M A G R E C E P T O R O K

oxigénfüggö fehérjék szintézise

18-8. ábra. A HIF-1 közvetítet­ te jelátvitel folyamata. Ele­ gendő oxigén hiányában a HIF-1a a magba transzlokálódik, ahol komplexet képez a már ott lévő HIF-ip-val. A keletkezett HIF-1 heterodimer komplex kötődik a DNS-hez. A kötődés eredménye­ képpen és több más fehérje által képzett komplex (amelyben itt is részt vesz a már említett CBP/p300 fehérje) hatására bein­ dul az oxigénfüggő fehérjék szintézise. Oxigén jelenlétében a HIF-1a ODDD és N-TAD (lásd 18-7. á b r a ) doménjében lévő egy-egy prolin hidroxilálódik. A hidroxi-prolinokon keresztül a HIF-1a köti a pVHL (von Hippel Lindau-protein) fehérjét. A pVHL az E3 multiprotein ubikvitin-ligáz komplex része. Ennek hatására a HIF-1a ubikvitinálódik, majd igen gyorsan lebomlik.

CBP/p300

pVHL;

V lebomlás

NLS révén a magba kerül, dimerizálódik a feleslegben

másik szubsztrátja maga a szabályozó fehérje (HIF-la). A szabályozó fehérje nemcsak azért képző­

lévő HIF-1 (3-val, és a DNS HRE-hez (hypoxia response element) kötődik. Ez a rövidítés korábban is

dik, hogy szabályozzon, hanem adott (fiziológiás) kö­ rülmények között (normoxia) úgy szabályoz, hogy le­

előfordult, mint hormoné response element, ami nem a szerzők, hanem a szakirodalom következetlensége.

bomlik. Ez egyébként a szabályozásoknak igen költ­

oxigén és nincs prolin-hidroxiláció, akkor a HIF-1a az

Megindul az oxigéndependens génexpresszió folya­ mata. Ebben részt vesz a már említett CBP/p300 fehérjekomplex is, amelynek a HIF-1-hez való kötő­

séges formája, amely számos más esetben is hasonló módon történik. A szabályozás lényeges szempontja magának a

désében további aminosav, az aszparagin hidroxilációjajátszik szerepet. Oxigén jelenlétében ugyanis

H IF -la szintézisének szabályozása is, amiről jelenleg kevesebbet tudunk. Hypoxiában a HIF-la-szintézis igen gyorsan megemelkedik, mindez felfogható egy

a HIF-1 a nemcsak prolin-, hanem aszparagin-hidro-

tápanyaghiány következtében kialakuló azonnali vá­

xiláz szubsztrátja is, több aminosavon is hidroxi­ lálódik. A fehérjelebomlás szabályozása azonban el­

lasznak.

sősorban a prolil-hidroxiláció függvénye. Ez a szabályozás több szempontból is sajátságos,

A HIF-1 által szabályozott génexpresszió

gyrészt a szabályozás lényegi pontja, hogy a szabá­ A HIF-1 alapvető folyamatokban részt vevő fehér­

lyozó fehérje lebomlik-e, vagy odakerülhet-e a szabá­ lyozás helyére. Ez oly módon függ az extracelluláris

jék szintézisében meghatározó. Glikolizis enzimek

ligandtól (molekuláris oxigén), hogy az enzimatikus folyamatok (prolin- és részben aszparagin-hidroxi-

(pl. hexokináz, foszfofruktokináz-1), a glukóztranszporterek (GLUT1, GLUT3), tartoznak többek között

lázok által katalizált reakciók) szubsztrátja, aminek

az oxigénfüggő génexpresszió célgén termékei közé.

534

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

Az érképződés (angiogenezis), a vörösvértest-képződés (eritropoezis) szerepe az oxigénellátottságban nem szorul indoklásra. Ezekben a folyamatokban a

ben és kóros állapotokban, így többek között cukorbe­

legfontosabb fehérjék, így például a VEGF (vascular endothelial growth factor) vagy az eritropoetin, H IF-1

tegségben, érelmeszesedésben, szembetegségekben tanulmányozzák részleteiben ezeket a folyamatokat, illetve összefüggéseket. Rosszindulatú daganatokban a H IF-1a-expresszió jelentősen megnő.

által szabályozott gének termékei. A vasanyagcsere

Az igen ritka von Hippel Lindau-kórban a pVHL

számos fehérjéje, valamint több növekedési faktor szintén HIF-1 által szabályozott.

mutációja miatt nincs HIF-la-ubikvitináció, -lebom­ lás, így normoxiában is intenzívvé válik a hypoxiában felszaporodó fehérjék, például a VEGF szintézise; ez

Ebből az élettani szerepből következik, hogy a hypoxia ismert patológiai következményeinek kiala­ kulásában fontos az, hogy miképp változik a HIF-1 mediálta génexpresszió. Daganatos betegségek létre­ jöttében, anaemiákban, a legkülönbözőbb betegségek­

érképződési zavarokat okoz, kapilláris hemangioblasztomák keletkeznek elsősorban a retinában és a kisagyban.

A SEJTPROLIFERÁCIÓ ÉS 19.

A TERM ÉSZETES SEJTHALÁL

________BIOKÉMIÁJA F É S Ű S L ÁS Z LÓ

19.1

A sejtosztódási ciklus biokémiai sajátságai és szabályozása

19.2

A term észetes sejthalál molekuláris háttere

19.3

A tum orsejtek proliferációja

535

541

545

Az emberi szervezet fiziológiás működése során a

az emberi sejtek összetömörítik kromoszómáikat a

I sejtproliferáció és a sejthalál egymást kiegészítő egyensúlyi folyamatok. Szervezetünk legtöbb sejtje

kohezin komplexek segítségével (profázis), a mag­ membránt lebontják, felsorakoztatják a 46 kromoszó­

meghatározott élettartammal rendelkezik, naponta sejtjeink milliárdjai halnak el, helyettük ugyanilyen

mát a centromerekből képződő mikrotubuláris orsó

számban kell új sejteknek keletkezni. A sejtproliferá­ ció különösen jelentős mértékű az embriogenezis so­ rán, a növekvő szervezetben, a csontvelőben, a bőr bazális rétegében, a bélhámsejtek napi pótlásában, de elengedhetetlen feltétele a sebgyógyulásnak vagy más megnövekedett igény kielégítésének. Ma már részle­

segítségével (prometafázis, metafázis), a testvérkromatidokat a sejt ellentétes pólusára csoportosítják (anafázis), majd kromoszómák dekondenzációját és a magmembrán újraképződését követően az utódsejtek szétválnak (telofázis, citokinezis). Az interfázis fekete doboz maradt addig, amíg fel nem fedezték, hogy a

tesen ismerjük azokat a biokémiai folyamatokat, ame­

DNS hordozza a kromoszómákban tárolt információt. Ezt követően kimutatták a kromoszómaállomány

lyek a sejtproliferáció és a természetes sejthalál folya­

megduplázódását, és hogy ez az interfázis idején, an­

matokat meghatározzák.

nak rövid időszakában zajlik. Ez a felismerés az interfázist három szakaszra osztotta: Gi, a mitózis és a DNS-replikáció kezdete közötti időszak; S-fázis, a

19.1 A S E J T O S Z T Ó D Á S I CIKLUS BIOKÉMIAI SAJÁTSÁ GAI ÉS SZABÁLYOZÁSA

DNS-szintézis ideje; és G2-, az S- és az M-fázis közöt­

j A sejtosztódási ciklus precízen szervezett, egyirá­ nyú és irreverzibilis események sora, amelynek során

kutatásának legfontosabb célja olyan biokémiai ese­ mények azonosítása lett, amelyek kiváltják az egyik

akromoszómák és a sejtállomány megduplázódnak és két sejtre osztódnak. A korai fénymikroszkópos vizs­

fázisból a másikba való átmenetet. Kiemelkedő jelen­ tősége van az ún. stabil pontoknak, nevezetesen a

gálatok során ismerték fel, hogy a mitózis (M-fázis), vagyis a sejtek kettéosztódásának periódusa több, a

start, vagyis az S-fázis kezdete előtti (st), a G2/M át­ menet (gm) és a metafázis (m) pontoknak, amelyek a

ettéosztódást előkészítő szakaszból áll. Mitózis alatt

sejtosztódási ciklus stabil állapotai és egyben ellenőr-

ti időszak (19-1. ábra). A Gj-, S-, G2- és M-fázisok, mint meghatározó sejtciklusszakaszok jelentősége fo­ kozatosan vált egyértelművé, és a sejtosztódási ciklus

536

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M USOK

kedésének üteme elsősorban attól függ, hogy a sejtek mekkora hányada van a sejtciklusban a Go-fázisban lévő sejtek számához viszonyítva. A Go-állapotban lé­ vő sejtek visszatérhetnek a sejtciklusba, amennyiben átesnek az ún. mitogén kaszkád biokémiai eseménye­ in.

Proliferációs szignál útvonalak, a mitogén kaszkád A Go-ban lévő sejtek proliferációs szignálok hatá­ 19-1. ábra. A sejtosztódási ciklus sémás ábrázolása. A Gr fázis eseményei közül azok, amelyek az S-fázis előkészítői már az előző ciklus alatt a G2 és a mitózis eseményei idején indulhatnak. Ugyanígy, a mitózisra való, döntően G2-előkészületek már az S-fázisban megkezdődnek. A G0-ból a Gr be való belépés növe­ kedési faktorok hatására lehetséges (folyamatosan proliferáló sejtek nem lépnek ki a G0-ba). A kritikus szabályozási pontok az R (restrikciós pont), az st a start előtt, a gm az M fázisba lépés előtt és az m a metafázisban. A belső nyilak a ciklindependens-kinázok (CDK) és a megfelelő ciklinek komplexeinek kialakulását jelzik. A ciklindependens kináz-ciklin komplexekhez átmenetileg inhi­ bitorok (CKI) kötődhetnek. APC, anafázist elindító komplex

sára jutnak el a sejtosztódási ciklus Gi szakaszába és onnan a restrikciós ponton át az S-fázisba. A proli­ ferációs szignál útvonalat, más nevén a mitogén bio­ kémiai kaszkád útvonalat, növekedési faktorok indít­ ják el, amelyeket három fő csoportba lehet osztani: 1. Tirozin-kináz-receptorokra hatók, így a trombocita eredetű (PDGF), az epidermális (EGF), a fibroblaszt (FGF), a hepatocita növekedési faktor (HGF) és mások. 2. Egy transzmembrán-domént tartalmazó, de saját

ző pontjai; a sejtciklus csak akkor halad tovább, ha megfelelő információk érkeznek a következő lépéshez szükséges összes biokémiai esemény bekövetkeztéről. A három ellenőrző pont közül kettő esetében (st, gm) az áthaladás biokémiai meghatározói döntően a ciklus adott pontján újonnan szintetizálódott ciklinek és az

tirozin-kináz-aktivitással nem rendelkező recepto­ rokra hatók, így az eritropoetin (EPO), a kolónia­ stimuláló faktor (CSF), az interleukin-1, az interleukin-2 és mások. 3. Hét transzmembrán-szegmenssel rendelkező re­ ceptorokra ható, bizonyos sejtekben mitogén kaszkádot is indítani tudó bombezin, noradrenalin,

azok által aktivált, a sejtciklus során állandó koncent­ rációban lévő ciklindependens-kinázok (CDK-k),

szerotonin és mások.

amelyeket konstitutív és indukálható inhibitorok (ciklindependens kináz-inhibitorok, CKI-k) ellenőriz­

A receptorokhoz kötődő növekedési faktorok má­

nek. A metafázis stabil pontból történő kilépés első­

sodlagos hírvivők képződéséhez vezetnek; sejtkultú­ rákban végzett kísérletek során intenzív fehéije-

sorban az anafázist elősegítő komplex (APC) proteolitikus hatásának az eredménye.

foszforiláció, diglicerid- és inozitolfoszfát-képződés, I nátrium-, kalcium- és protonbeáramlás történik. Már

A szomatikus sejtek, például hepatociták és neuronok in vivő hosszú ideig funkcióképesek tudnak ma­ radni akkor is, ha nem proliferálnak; ezt, a sejtproli-

néhány órán belül megfigyelhetők a korai, azonnali

feráció szempontjából nyugalmi állapotot gyakran ne­

transzkripciós fehérjék szintézisét követi a sejtmag szerkezetének átrendeződése, újabb gének indukciója, I

vezzük Go-helyzetnek. Az ilyen Go-állapotban tartott sejtekben nincsenek jelen a ciklindependens kinázok. A Go- és Gi-sejtek megkülönböztetése jelentős kér­ dés, mivel adott sejtpopuláción belül a sejtszám növe­

válaszadó gének (Jun, fos, myc transzkripciós fakto-1 rok) transzkripciójának fokozódása, majd ezen, főleg

újabb és újabb fehérjék megjelenése (ciklinek, pro-1 teázok), beleértve a DNS szintéziséhez, poliaminok előállításához szükséges enzimeket. Az enzimek egy I

537

19. A S E J T P R O L I F E R Á C I Ó ÉS A T E R M É S Z E T E S S E J T H A L Á L B I O K É M I Á J A

része a sejtmagba vándorol, ott multienzimkomplexek alakulnak ki (prereplikációs komplexek), elkezdődik aDNS és a hisztonok szintézise, vagyis az S-fázis. A proliferációs szignál útvonalak egyikének, a Ras mitogén kaszkád útvonalnak minden lépését sikerült felderíteni. A tirozin-kináz-receptorokkal működő jel­ pályák leírásakor ez az útvonal már részletes ismerte­ tésre került (lásd 17-24. ábra), itt csak röviden össze­ foglaljuk. A 21 kD méretű Ras fehérje család tagjai a hozzájuk kovalensen kötődő palmitát- és famezilmolekulák segítségével sejtmembránhoz vannak ki­

sejtmag mRNS

horgonyozva és aktív, GTP-t kötő állapotba annak ha­ tására kerülnek, hogy a növekedési faktor (pl. EGF) a tirozin-kináz-aktivitású

receptorához

kötődik

(EGFR), a receptor ennek hatására dimerizálódik és keresztfoszforilálja specifikus tirozinoldalláncait.

19-2. ábra. cJun és cFos transzkripciós faktorok foszforilációja aktivált (foszforilált) ERK hatására. A Ras kö zrem ű­ ködéssel m egvalósuló ERK aktiváció m echanizm usát a 17. fe je ­ zetben ism ertettük (lásd 17-24. á b ra )

Ezekhez SH2-doménjével adapter fehérje (Grb2) kap­ csolódik, annak SH3-doménjei pedig a citoplazmából kihorgonyozzák azt a guaninnukleotid-kicserélő fak­ tort (GEF, guanine-nucleotide exchange factor; SoS),

A kritikus ciklin-D-szint létrejöttében moduláló, erősítő szerepe van a tirozin-kináz útvonalon bekövet­

amely a Ras-GDP-t GTP-re cseréli. Az SoS aktivációja bekövetkezhet bizonyos hét

kező foszfolipáz-Cy (PLCy) aktiválódásnak és hatás­ nak, illetve a foszfatidil-inozitol-3-kináz (PI-3K) ha­

transzmembrán-szakaszt tartalmazó receptorok eseté­ ben is, illetve olyan saját tirozin-kináz-aktivitással

tására bekövetkező Akt/PKB (protein-kináz) aktiválá­

nem rendelkező receptor esetében, mint pl. az eritropoetin (EPO) receptora. (Ilyenkor a receptoraktiválás

menően más hatásokat is kivált; hisztonokat fosz­ forilál, növeli a nukleotid- és fehérjeszintézist. Fontos

azSrc, nemreceptor tirozin-kináz enzimet aktiválja, ez

felismerés, hogy sejttípustól és körülménytől függően többféle protein-kináz útvonal aktiválódhat a Ras-

azShc adapter fehérjét foszforilálja, amihez a Grb2 és azon keresztül az SoS kötődni képes.)

sának is. A MAP-kináz a Jun és Fos foszforiláción túl­

aktiválást követően. Ezek a Ras-tól függetlenül is akti­

Az igen rövid ideig aktív Ras aktív állapotba hozza Raf fehérjét (és más Ras effektor célfehérjéket),

válódhatnak citokinek, stressz, UV-fény vagy más kö­ rülmény hatására, majd sejtosztódást, differenciáló­

majd endogén GTPáz-aktivitása és az azt több száz-

dást és túlélést (PI-3K által aktivált Akt) vagy apop-

orosan felgyorsítani képes GAP (GTPázt aktiváló protein) hatása révén a kötött GTP-t GDP-vé alakítva

tózist (c-Jun N-terminal kinase) válthatnak ki.

inaktív állapotba kerül. A Raf fehérje-kináz, foszforilációval aktivál más kinázokat, így a MEK fehérjét is, amely az ERK fehérjét foszforilálja. A MAP“ázok családjába tartozó ERK fehérjéket foszforilál

A restrikciós pont szabályozása

a citoszolban és transzlokálódik a sejtmagba, ahol ~“tén foszforilációval aktiválja a Jun és Fos transz-

A restrikciós pont a Gi-fázis azon pontja, amelyen átlépve a sejtek további mitogénstimulus nélkül is to­ vábbhaladnak a sejtciklus lépésein. Feltehetően egy­

pciós faktorokat (19-2. ábra), amelyek egyik fontos

beesik a ciklin-E-szintézis megtörténtével. A restrik­

Igénje a Myc. A Myc transzkripciós faktor szintjé­

ciós ponton való áthaladást és az S-fázisba való belé­ pést CDK-k szabályozzák, amelyeket a ciklin-D és -E,

nek növekedése nagyszámú további gén, így a cikn-D és az E2F transzkripciós faktorok indukciójához ezet.

illetve -A egymást követően kapcsol be. A D-típusú ciklinek mintegy növekedési faktor érzékelőként hat-

V.

538

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A ( E L Á T V I T E L I ME C HA NI Z MUS OK

nak, mivel kifejeződésük inkább függ az extracelluláris környezet bői érkező információktól (nőve kedési faktorok, Ras-MAPK kasz kád), mint az adott sejt sejtciklus­ ban fennálló pozíciójától. Amint a sejt belép a sejtciklusba (a Go-ból vagy amikor újabb sejtciklus indul a Gi-ből), D-típusú ciklinek indu­ kálódnak a növekedési faktorok hatására bekövetkező elnyújtott korai válasz részeként; mind a D-ciklinek szintézise, mind katali­ 19-3. ábra. A restrikciós pont szabályozásának sémája. Am int a sejt belép a sejt­ ciklusba G0-ból, egy vag y töb b D -típusú ciklin (D) indukálódik; mind a D-ciklinszintézis, mind a katalitikus partnerrel (CDK4, ciklind ependens kináz-4) való összeállásuk a m itogén stim uláció fü g g vén ye. A ciklin-D-függő kináz foszforilálja a retinoblastom a fehérjét (RB), am ely ennek következtében már nem köti az E2F tran szkrip ci­ ós fak to rt. Az E2F-k elind ítják töb bek között a dih id rofolát-redu ktáz (DHFR), a timidin-kináz (TK), a tim idilát-szintáz (TS), a DN S-polim eráz (POL), a ciklin-E (E) és más fe ­ hérjék szintézisét. M indez p o zitív visszacsatolást ered m én yez, elő seg ítve a RB fe n n ­ tartó fo szfo rilálását ciklin-E-C D K2-vel, hozzájárulva a restrikciós pont irreverzibilis át­ lépéséhez, az S-fázis elindításához. A p 16 a ciklin-D -C D K 4 , a p27 a ciklin-E (ciklin-A )CDK2 kom p lex alapállapotú gátló feh érjéje. Az ábra m egértéséhez lásd még a szö veg ­ ben található leírást

tikus partnereikkel (döntően CDK4) való összeállásuk a mito­ gén stimuláció függvénye (19-3. ábra). Egyidejűleg a CDK ciklin-D komplexet gátló CKI (pl6 fehérje) proteolízissel degradáló­ dik. A ciklin-D-függő kinázok hiperfoszforilálják a retinoblasztoma fehérjét (RB). Az RB és más RB-hez hasonló fehérjék közvetve génexpressziót szabályoznak, mert

DNS-károsodás, UV hypoxia, hypoglykaemia

1 kinázok (ATM, DNS-PK, ATR)

onkogén stimulusok c-Myc, R as

aktív

1 j célgének transzaktivációja

/

sejtciklusleállás

I \

DNS-hibajavítás

apoptózis

19-4. ábra. A p53 stabilizálása és aktiválódása. ATM, szerin/treonin protein-kináz (nevét onnan kapta, hogy ataxia telangiectasiáb an mutálódott); DNS-PK, DNS-függő protein-kin áz; ATR, szerin /treonin proteinkináz (ATM -hez kapcsolódik); ARF, tu m o rszu p p resszo r feh érje; mdm2, E3-ubikvitin-ligáz. Az ábra m egértéséhez lásd a szöveges leírást

19 . A S E J T P R O L I F E R Á C I Ó ÉS A T E R M É S Z E T E S S E J T H A L Á L B I O K É M I Á J A

539

inaktív komplexben tartják az E2F transzkripciós fak­

ábra). A p21 transzkripciójának fokozása mellett, a

torcsalád tagjait. Ez utóbbiak aktiválják azon géneket, amelyek termékei fontosak az S-fázisba történő belé­

p53 aktiválja a DNS-hibajavító enzimrendszert is. Amennyiben a DNS-károsodás túl nagy vagy a hibaja­

péshez. Alulfoszforilált állapotban az RB az E2F komplexekhez kötődik, és ezzel gátolja a E2F célgé­ nek átírását. Az RB több helyen történő foszforilá-

vítás nem elégséges, a p53 apoptózist kiváltó géneket indukál (Bax, PUMA, NOXA, Fás és mások), és elin­ dítja a károsodott sejt eliminálását.

lásának hatására az E2F transzkripciós faktor szabad­ dá válik, lehetővé teszi az E2F célgének indukcióját, köztük a ciklin-E-t, majd a ciklin-A -t, vagyis az S-fázist bevezető folyamatot.

Az M-fázis-kináz (CDK1)

A sejtciklus szabályozásának igen fontos eleme a

Az S-fázis meghatározó biokémiai történései után

p53-fehérje funkciója. A p53 szintje normális körül­ mények között alacsony, mert az mdm2 ubikvitin-

(többek között a DNS-állomány megkettőződése, hisztonok szintézise) a sejt a G2-állapotba kerül, mely­

ligáz hozzákötődik, ubikvitinálja, s ennek következté­ ben a p53 a proteaszómákban lebomlik. DNS-károso-

nek során felkészül a mitózisra és ellenőrzi, hogy az

dás, illetve hypoxia, hypoglykaemia, kóros sejtproliferációs szignálok esetén a p53-fehérje mennyi­ sége megnövekszik, mert N-terminális része a DNSkárosodást érzékelő protein-kinázok (ATM, DNS-PK, ATR) hatására foszforilálódik, és ezzel az mdm2-hatásgátlódik, a p53 fehérje stabilizálódik (19-4. ábra). Ezt követően aktiválódik a p53 DNS-kötő képessége a C-terminális rész defoszforilációja és acetilációja ál­ tal, és a p53 transzkripciós faktorként többek között indukálja a p21 ciklindependens-kináz-inhibitor (CKI) génjét. A p21, gátolja a CDK4-et és megakadá­ lyozza, hogy a CDK2 elindíthassa az S-fázist (19-1.

S-fázis eseményei rendben lezajlottak. Ez az ellenőrző funkció adja a gm stabil állapot elsődleges jelentősé­ gét; addig nem megy tovább a sejtciklus, amíg minden fontos biokémiai eseményről be nem fut a „megnyug­ tató” információ. Az ellenőrzések visszajelzései az ún. M-fázis-kináz, a ciklindependens kináz-1 (CDK1, tör­ ténelmi okokból nevezik még cdc2-nek is) szabályo­ zásában jelentkeznek. A CDK1 a sejtciklusnak ebben a szakaszában megjelenő ciklin-B-vel komplexet al­ kot. A komplex azonban inaktív a G2-fázisban, mert a CDK1 bizonyos ATP-kötőhelyein foszforilált. A fo­ lyamat sémáját a 19-5. ábra mutatja. A cdc25-foszfatáz (amelyet a visszajelző szignálok aktiválnak) az

gátló foszforilációk

'CKI i

aktív PK kulcsszubsztrátokat foszfornál

—>

S Z J— Q

'i-UJ ciklin-B

- SZ;

------

Q

foszfatázok

19-5. ábra. Az M-fázis-kináz (CDK1) szabályozó mechanizmusai és működése. APC, anafázist elősegítő kom p lex; CKI, ciklinipendens-kináz-inhibitor; SZ, szub sztrát. Az ábra m egértéséhez lásd a szöveges leírást

540

V.

E X T R A C E L L U L Á R I S J E L E K R E C E P T O R A I ÉS A J E L Á T V I T E L I M E C H A N I Z M U S O K

aktív centrum közelében foszforilált treonin- és tirozinoldalláncokat defoszforilálja. Az M-fázis-kináz ak­ tiválásához inhibitorának (CKI) elbontása és egy má­

4. CDK-gátlás inhibitor alegységekkel. A négy font

sik treoninoldallánc foszforilációja is szükséges. Az aktívvá vált CDK1 katalizálja a mitózis eseményeit,

CD K2- és a CDK4-ciklin komplexeket prefer ják. A p ló és p l 5 egymáshoz szintén hasonl

egészen a metafázis bekövetkeztéig. Kulcsszubsztrátjai között megemlítendő a H l hiszton, a

CKI-k, amelyek CD K4- és CDK6-ciklin kompi

laminok (amelyek foszforilációja teszi lehetővé proteolitikus degradációjukat és ezzel a magmembrán szétesését), citoszkeletális fehérjék, centroszóma és más fehéijék, amelyeknek ki kell kerülniük a kromatinból ahhoz, hogy a kromoszómakondenzáció bekö­ vetkezhessen. A Gi-fázis idejére ezek a szubsztrátok defoszforilálódnak, a ciklin-B elbomlik, az M-fáziskináz a metafázis után már nem aktív.

sabb emlős-CKI két csoportba tartozik: a p21 és p27 egymáshoz hasonló fehérjék, amelyek a

xeket gátolják. A CDK-inhibitorok el kell bomolja nak a CDK-ok aktiválásakor. 5. Ciklinek és CDK inhibitorok szabályozottproteol. zise, amelyet ubikvitin-ligázok által katalizált ub! kvitinálásuk indít el. 6. Szabályozás kompartmentalizációval: a ciklin és í CDK egyazon sejtkompartmentben kell, hogy e,J helyezkedjen.

A proteolízis jelentősége a sejtciklusban A ciklindependens kinázok szabályozásának főbb elvei A sejtciklus kulcsenzimeit, a ciklindependens kinázokat extra- és intracelluláris jelek rendkívül precí­ zen szabályozzák. A CDK-k aktivitását több, az evo­ lúció során megőrzött biokémiai mechanizmus szabá­ lyozza, amelyek összességében a szabályozó útvona­ lak szinte utolérhetetlen eleganciájú és bonyolultságú hálóját alkotják. 1. CDK-aktiválás ciklinkötődéssel. Mindegyik CDK periodikusan megjelenő ciklinek specifikus alcso­ portjával tud komplexet alkotni. A szabályozás transzkripciós szinten a megfelelő ciklinek adott időpontban indukált szintézisével történik. 2. CDK-gátlásfoszforilációval. A CDK-ciklin komp­ lexek aktivitását gátolja két, az N- terminális vég közelében elhelyezkedő oldallánc foszforilációja. A defoszforilációt a cdc25 foszfatáz katalizálja. 3. CDK-aktiválás foszforilációval (komplexstabilizá­ ló foszforiláció). A CDK-k maximális aktiválása foszforilációt igényel konzervatív treonin oldallán­

A proteolízis kémiai irreverzibilitását kihasznál a sejtek a sejtciklus kritikus pontjain adnak döntő nyultságot, sorrendiséget és időzítést a biokémiai fo­ lyamatoknak. A proteolízis a CDK-k aktivitását CDK-inhibitorok eltávolításával (bekapcsolás) : aktivátor ciklinek lebontásával (kikapcsolás) megh tározó módon szabályozza. A szabályozás szempo jából fontos ubikvitin-ligáz az APC (anafázist előse tő fehérjekomplex), mely a ciklin-B elbontásáv (enélkül a sejt nem tudja elhagyni az M-fázist) a meghatározó irányultságot. Az APC szükséges anafázisinhibitorok és a kohezin elbontásához is, a a kromoszómaszegregációt és az anafázisból törté továbblépést nagymértékben elősegíti. Ennek dön lépése a kromoszómapárok kettős orientációjának b következtét követően a szekurin fehérje defoszforil ciója, majd annak az APC által történő elbon A szekurin a szeparáz enzim inhibitora, az elboml val aktívvá váló szeparáz bontja le a kromoszóm összetartó kohezin komplexeket. Egy másik, a sejté lus regulációjában szerepet játszó ubikvitin-ligáz G|/S- és az S-fázis CDK-inhibitorok lebontásával

cokon. A foszforilációt olyan kinázok végzik, ame­

DNS replikáció elindítását szabályozza. A proteo

lyek aktiválódása meghatározott biokémiai esemé­

tikus enzimek távolítják el a sejtciklus egyes lépé után feleslegessé váló fehérjéket is.

nyek bekövetkeztétől függ.

9. A S E J T P R O L I F E R Á C I Ó ÉS A T E R M É S Z E T E S S E J T H A L Á L B I O K É M I Á J A

19.2 A T E R M É S Z E T E S S EJ T H A L Á L M O LE K U L Á R IS HÁTTERE A természetes sejthalál az élő szövetekben állandó­ anelőforduló fiziológiás folyamat olyan sejtek zökke=mentes eltávolítására, amelyeknek nincs funkciója ((duplikálódó struktúrák,

541

A fenti sejthalálformák között a nyilvánvaló kü­ lönbségek mellett sok a hasonlóság, a közös biokémiai elem. A következőkben a leggyakrabban megfigyel­ hető apoptózis molekuláris mechanizmusának részle­ teit tekintjük át, hangsúlyozva, hogy annak számos biokémiai eleme a további sejthalálformákban is sze­ repet játszik.

szexuális dimorfízmus),

íelyek fiziológiás körülmények között felesleges nban képződnek, nem megfelelően fejlődnek (pl. fociták egy része), már teljesítették funkciójukat (pl. endometrium, szöveti sejt „tumover”) vagy poten’~lisan kárt okoznak (pl. autoreaktív T-sejtek, neutrofil granulociták).

Az apoptózis elindítása Az apoptózist elindító, ún. apoptotikus faktorok, tényezők lehetnek sejtfelszíni receptorok, sejthalál­ receptorok ligandjai (pl. a tumomekrózis faktor TNF, Fás ligand, antigén a T-sejt negatív szelekciója esetén) vagy olyanok, amelyek magreceptorokon át

k természetes sejthalál formái

hatnak (glukokortikoidok, retinsav, p53). Az apop­ tózis kiváltásának másik módja a túlélési faktorok hiá­

1. Programozott sejthalál. Az embriogenezis során [ gyakori jelenség; funkcionális, fejlődéstani definí[ ció olyan sejthalálra, amely időben és térben meg! jósolható, valamint aktív fehérjeszintézist és új gé| nek expresszióját igényli. |2. Specializált sejthalál. Szövetspecifikus terminális I differenciálódás; a sejthalál programja egy adott

nya, koncentrációjuk csökkenése. A túlélési faktorok is lehetnek sejtfelszíni receptorokon át hatók (pl. eritropoetin a normoblasztok esetében, antigén a pozi­ tív szelekció során, ILI a monociták számára, idegi növekedési faktor - NGF a fejlődő idegrendszerben, CSF a mieloid prekurzorok számára), vagy magrecep­ torokra hatók (pl. tesztoszteron a prostata epitél-

| ponton felfüggesztődik, a részleges sejthalál speci■ fikus szöveti funkciót szolgál, pl. a komifikáció,

sejteiben), illetve sejt-sejt kölcsönhatáson alapulók (pl. idegrendszer fejlődése, sejtérés a thymusban). Is­

amely aktív fehérjeszintézist, új gének expresszió­ ját igényli.

merünk nem fiziológiás hatásokat (UV vagy röntgensugárzás, toxikus anyagok, hypoxia, gyógyszerek),

3. Apoptózis. Elsősorban morfológiai, az 1970-es évek elején született definíció: típusos esetben a

amelyek szintén apoptózishoz vezetnek.

sejtmag állománya kondenzálódik, majd fragmen-

Többféle jelátviteli útvonal vezethet apoptózisra jellemző molekuláris mechanizmusok beindításához,

' tálódik, a citoplazma zsugorodik, az elhaló sejt leg1 többször fragmentálódik, az organellumok többsé-

akár egy adott sejt esetében is (19-6. ábra). Ezek közül a kaszpáz nevezetű proteázok aktiválódásához vezető

| ge épen marad, az apoptotikus testek fagocitózissal ; gyorsan eliminálódnak. A sejtekből nincs makro­

és azok részvételével zajló biokémiai folyamatok részletei a legismertebbek. A kaszpázok (caspase) ak­

molekula-kiáramlás, nem követi gyulladás és heg[ képződés. Nem fiziológiás ágensek is kiválthatják, } nem mindig igényel aktív fehérjeszintézist, új gé­

tív centrumukban cisztein-hisztidin diádot tartalmazó,

nek expresszióját. p. Az elmúlt évek kutatásai alapján a sejthalál számos