Genie Génétique [PDF]

Zitiervorschau

Génie génétique : Introduction Chapitre 1 : les outils enzymatiques du génie génétique. - Les enzymes de et de restriction. - Les nucléase. - Les Ligase. - Les polymérases. Chapitre 2 : systèmes hôte- vecteur et clonage moléculaire. ADN d’un

cellule végétale

Organisme

cellule animale

E. coli

microorganisme

Clonage

humain

Chapitre 3 : hybridation moléculaire sonde et marquage de de l'ADN (radioactif et fluorescent) Chapitre 4 : techniques d'analyse du génome et de ses modifications. amplification génique : Les banques génomiques de l'ADNc.

ARNm ADN d’un seul bras

ADN complet

-Amplification sélective in vitro (prc). -Production de protéines recombinantes intérêt thérapeutique (insuline, hb..) puce d'ADN. Chapitre 5 : détermination des séquences des nucléique, Banque d'ADN génomique et ADNc. Chapitre 6 : techniques d'analyse de l'expression des genes. - Modification du matériel génétique northen-blot....run-on, RT- pCR

- PCR quantitative, gène reporteur, retard sur gel, empreinte ADN ase ; foot printing. Chapitre 7 : applications biotechnologiques de l'ADN recombinant.

1ere sous-unité : ADN recombinant dans la médecine et l'industrie.

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   

1er exemple : production de l'insuline ; le premier médicament recombinant dans l’utilisation sur l’homme a été autorisé. 2eme exemple : production de l'hormone de croissance humaine recombinant 3eme exemple : vaccin contre les virus de l'hépatite B 4eme exemple : amélioration de l'enzyme présente dans un détergent

2eme sous-unité : création des plantes et d’animaux intéressant pour l'agriculture      

1er exemple : les plantes qui expriment la protéine de l'enveloppe d'un virus résiste aux infections. 2eme exemple : les plantes qui expriment une toxine bactérienne résiste aux insectes. 3eme exemple : les plantes trans géniques (génétiquement modifier) tolérante à l’herbicide. 4eme exemple : gène génétique d'une fleur à une couleur et motif nouveau Développement d'animaux de fermes transgénique. Production de protéines pharmaceutiques dans les animaux transgénique.

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Historique en génie génétique un peu historique

1944 oswald Theodore avery et ses collaborateurs. Font la preuve que l’ADN contenu dans le noyau d'une cellule porte les éléments d'information nécessaire au maintien de la vie. Ils établissent ainsi les fondements de la génétique moderne et de la biologie moléculaire. 1953 James Watson et Francis Crick décrivent la structure à double hélice de l'ADN.

1968 Marshall w. Nuremberg et har Gobind khorana se voient attribuer un prix Nobel pour avoir déchiffrer le code génétique des 20 acide aminé ; par la suite ; les chercheurs ont pu conclure que le code génétique est universel chez toutes les créatures vivantes. Universel : constitué les 4 nucléotides A, T, C, G défirent en ordre d’ADN chez toutes les espèces. En fait, les différences que l'on observe entre les espèces sont le résultat de variations dans la disposition des composantes de l'ADN. Cette découverte a permis aux scientifiques d'envisager qu'un gène de n'importe quelle espèce puisse être ajoutée et fonctionner chez n'importe quelle autre espèce. À l'époque ; cette idée défiait l'imagination et ouvrait la porte à des nouvelles possibilités d'amélioration génétique ; notamment chez les plantes cultivées et chez les bactéries. Et donc donne naissance à une nouvelle science qui le génie génétique. Le rôle d’interface entre la partie hydrophobe et hydrophile

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1971 la première synthèse complète d'un général. 1973 Stanley Cohen et Herbert Boyer réalisent avec succès la première expérimentation de génie génétique en insérant un gène d'un dactyléthre africain ( la grenouille. Un amphibien) dans de l'ADN bactérien. 1978 l'insuline humaine est produites pour la première fois par une bactérie transgénique. 1983 vente autorisée au Canada de première produits issu du génie génétique, L'insuline humaine. 1990 la commercialisation du premières produits alimentaires modifié par la biotechnologie ; la chymosine et approuvée canada et aux États-Unis en tant que substitut à la présure ; utilisée pour cailler le lait. Chymosine : il coupe les liaisons peptidiques entre Phe 105+met 106 de la caséine k afin de coaguler le lait pour produit le fromage c’est une endopeptidase. Présure : extré de chymosine et de pepsine ; 2 enzymes utilisé pour produit le fromage.

1996 première plante transgénique commercialisées aux États-Unis pour tolérer. 1997 un herbicide et résister aux insectes : Le soja Roundup Ready et le coton bollgard.

Isolement et incorporation d’un fragment d’ADN dans un vecteur

ADN recombinant

Définition du génie génétique :

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Le génie génétique désigne l'ensemble des techniques permettant d'introduire et de faire exprimer dans un organisme vivant un ou des gènes provenant de n'importe quel autre organisme ; les organismes ainsi obtenus sont dits Organisme Génétiquement Modifié (OGM). On distingue les techniques de biologie moléculaire qui permettent de préparer les séquences d'ADN que seront introduites ; on parle de construction génétique ; et les techniques de transgenèse qui permettent de transférer le gène. La génie génétique et principalement basée sur le clonage monoculaire qui permet La recombinaison d'un fragment double brin d'ADN avec un vecteur et son introduction dans un hôte approprié.

Glossaire : Clonage : Manipulation génétique permet d'isoler des fragments d'acides nucléiques de leur organisme d'origine et de les propager dans un organisme hôte qui peut-être le même que l'organisme original où un organisme différent. Clonage moléculaire : Isolement et incorporation d'un fragment d'ADN dans un vecteur pouvant le répliquer. Un organisme trans génétique où Organisme Génétiquement Modifié(OGM) : Un organisme contient de l'ADN recombinant grille de manière stable dans toutes ses cellules. On utilise généralement le terme transgénique lorsqu'on fait illusion à des animaux ; et l'expression génétiquement modifié lorsqu'on veut parler de plantes ou des microorganismes auxquels on à intégrer de l'ADN recombinant. L'ADN recombinant : C'était un fragment de matériel génétique d'un organisme qui est un introduit artificiellement dans l'ADN d'un notre organisme ; généralement une bactérie ou un virus dans lequel il va s’intégrer. Cellule hôte : Cellule hébergeant un matériel génétique étranger apporté par un vecteur (bactérie, levure...). Vecteur de clonage : Élimination génétique capable de se répliquer et permettant le transfert dans une cellule réceptrice d'un fragment d'ADN étranger préalablement insérer (un virus, un plasmide bactérien...) Construction génétique : Séquence d'ADN destiné au transfert dans un cellule ; comprenant un gène d'intérêt ; séquence promotrices et régulatrices indispensable à son expression et à sa régulation dans la cellule receveuse et un gène marqueur. Transgenèse : Technique de transfert et d'intégration d'un ou plusieurs gènes à l'intérieur du patrimoine génétique d'un organisme vivant.

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Le génie génétique a d’abord concerné les organismes les plus simples qui ont souvent des génomes de petite taille comme les bactéries (EX : E. COLI ; subtilus ; agrobacterium ; tumefaciens.. etc.) ; et les levures (S. cerivisae) ; ce n'est que le plus tard que la transgenèse stable des cellules végétales et animales. Mais actuellement les OGM (végétaux, animaux transgéniques) sont nombreux et certains commencent à parvenir dans nos assiettes. Le génie génétique permet d'apporter des solutions à des problèmes très variés. Ils touchent aussi bien l'agronomie, l'amélioration des qualités alimentaires, la santé, l'industrie ou l'environnement. Le premier apport de cette technologie à la médecine fut de rendre des protéines thérapeutiques telle : insuline, HGH (human growth hormone), disponibles en quantités suffisantes. La médecine a retiré bien d'autres bénéfices de la technologie de l'ADN recombinant, vaccins (anti hépatite…etc.), sondes (diagnostique, identification …etc.), agents thérapeutiques (thérapie génique, …etc.). La technologie de l'ADN recombinant a touché d'autres produits d'intérêt agro-alimentaire et industriel, enzymes (présure, protéases, …etc.), acides aminés (glutamate, succinate, …etc.), vitamines (B2, B12, C …etc.). Dans les deux dernières décennies plusieurs milliers d'entreprises de biotechnologie ont été créés dans le monde surtout en USA et le Japon. Les deux principales caractéristiques du génie génétique en comparaison de la sélection classique basée sur la reproduction sexuée : - Le génie génétique est une source de gènes étendue : On peut franchir la barrière des espèces, des genres et des règnes. Ainsi, il est possible d'introduire des caractères qu'il ne serait pas possible d'introduire par sélection classique. - Le génie génétique permet le transfert d'un gène précis: Il permet de transférer le seul gène désiré et non de transférer plusieurs gènes comme lors de la reproduction sexuée. Les différentes étapes successives à entreprendre en génie génétique sont les suivants:

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Chapitre I : Outils enzymatiques du génie génétiques. 1- Les enzymes de restriction : 1-1- Définition : Chaque espèce de bactéries produit une collection d’endo-désoxyribonucléases, dont le site est spécifique d’une séquence de 4 à 10 nucléotides, qui leur permet de s’opposer à l’infection de certains virus en hydrolysant leur ADN, sans hydrolyser leur propre ADN protégé par le bais d’une méthylation des séquences partielles spécifiques (fig1). On parle donc de restriction virale et on appelle ses nucléases des enzymes de restriction.

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Figure 1 : Défense bactérienne contre l'infection virale par les systèmes de restrictionmodification. Ces enzymes hydrolysent un pont phosphodiester de chacune de ces deux chaines de l’ADN. La plupart du temps la séquence nucléotidique reconnue (le site de restriction) est identique sur les deux brins (lorsque on lisons dans le même sens: le sens 5' → 3' sur un brin et dans le sens 5' → 3' sur le brin complémentaire), on dit que le site de restriction est palindromique (fig. 2). Une séquence palindromique est également une séquence possède une symétrie avec sa séquence complémentaire et non avec elle-même (fig. 2). C'est par exemple le cas de la séquence suivante, qui est reconnue par l‘enzyme appelée EcoRI, une enzyme de restriction d'E. coli :

En effet la restriction est un phénomène génétique propre aux bactéries débouche sur une révolution en biologie.

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Les enzymes de restriction deviennent un outil de choix pour toutes les techniques de biologie moléculaire d’autant que le nombre d’enzymes de restriction purifiés est relativement grand : environ 500. Ces enzymes ont trouvé rapidement une application dans les différentes expériences d’ADN recombinant (en génie génétique).

1-2 Les différents types de système de restriction-modification (Système R-M) : Il existe au moins quatre types différents de systèmes R-M : les types I, II, III, IIs. Les différences principales entre ces différents types sont :

Type I : Une enzyme comportant des sous-unités distinctes pour la reconnaissance, la coupure et la méthylation. Reconnaît et méthyle une séquence caractéristique mais coupe l’ADN à une distance qui peut aller jusqu’à 1000 pb ou plus loin dans certain cas. Son action nécessite la présence de Mg++, d’ATP comme co-facteur, et de S-adénosyle-méthionine (SAM) comme donneur de groupement méthyle (-CH3) lors La méthylation.

Exemple de type I : le système de restriction d’E. coli K-12 L’enzyme active comporte : - Deux sous-unités impliquées dans la restriction. - Deux sous-unités impliquées dans la modification (méthylation). - Une sous-unité responsable de la reconnaissance.  Les réactions de méthylation et de coupure de l’ADN nécessitent toutes deux l’ATP et S-adénosyle-méthionine.  Les séquences reconnues sont assez longues et ne présentent pas de caractéristiques facilement identifiables telles que la symétrie.  De plus, l’enzyme coupe à une certaine distance de la séquence reconnue.  Comme la même enzyme effectue les réactions de coupure et de méthylation, l’ADN cible peut être modifié avant d’être coupé, ce qui limite considérablement l’utilité des systèmes du type I pour la manipulation génétique.

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Type II : Deux enzymes distinctes qui reconnaissent la séquence-cible symétrique. Les enzymes coupent ou modifient la séquence cible. Pratiquement les seules utilisées en génie génétique. Ils présentent une série d’avantages par rapport aux autres systèmes de types I et III : - D’abord, la restriction et la modification sont s’effectuées par des enzymes distinctes, de sorte qu’il est possible de couper l’ADN sans interférence de la modification. - La réaction de restriction ne nécessite pas de co-facteur ATP ni S-adénosylméthionine que Mg++. - Le facteur le plus important que ces enzymes coupent l’ADN dans la séquence qu‘elles reconnaissent spécifiquement, en général un motif symétrique. - Également beaucoup de ces enzymes coupent l’ADN de façon décalée. Type IIs : Deux enzymes distinctes. La séquence reconnue est asymétrique. La coupure s’effectue à une distance de la séquence reconnue qui peut aller jusqu’à 20 pb. Les enzymes de ce type ressemblent à ceux de type II mais le fait que la restriction s’effectue à une distance fixe du site de reconnaissance limite leur utilité. Type III : Une enzyme comportant deux sous-unités spécialisées, une pour la reconnaissance et la modification, l’autre pour le clivage. Elles reconnaissent et méthylent la même séquence mais coupent l’ADN 24 à26 pb plus loin. Les enzymes de type III reconnaissent des séquences symétriques mais ressemblent à celles du type I pour la séparation des sites de reconnaissance et de coupure et sont donc de peu d’utilité.

1-3 Nomenclature des enzymes de restriction : La découverte d’un grand nombre de systèmes de restriction-modification rendait nécessaire l’utilisation d’une nomenclature uniformisée. Une nomenclature adéquate fut proposée par Smith et Nathans (1973). Les caractéristiques principales sont :  Les trois premières lettres de chacune d’entre elle concernent la première lettre du nom de genre en majuscule, par exemple E (Escherichia) et les deux premières lettres du nom de l’espèce en minuscule, par exemple Co (coli). Cette abréviation est toujours écrite en italique.  Des fois une quatrième lettre est ajoutée concernant la souche bactérienne d’où est extraite l’enzyme en question, par exemple E. coli souche R.  Le chiffre romain : indique l’ordre de la caractérisation de l’enzyme chez la même souche. HindIII signifieque c’est la troisième (III) Enzyme de restriction isolée et caractérisée de la souche bactérienne Haemophilus influenza Rd (tableau1).

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1-4 Les sites de reconnaissance : La plupart des enzymes de restriction de type II ont un site de reconnaissance de 4 ou 6 paires de bases, et un certain nombre d’enzymes de restriction reconnaissent des séquences à 5 ou à 7, 8 … paires de bases. Les enzymes à site de reconnaissance tétra-nucléotidique ou hexa- nucléotidique présentent en générale un axe de symétrie rotatoire palindromique (fig. 2), au centre de leur séquence. Le site de coupure, compris dans le site de reconnaissance est représenté par le symbole «/» ou par une flèche verticale et les nucléotides méthylés (Cytosines ou Adénines) par l’enzyme de modification sont marqués d’un astérisque.

On simplifie souvent la description de site de reconnaissance en ne montrant qu’un des brins d’ADN, dans le sens 5’ vers 3’ comme suit :

G/AA*TTC

Les produits de la digestion d’un génome par les enzymes de restriction sont appelés les fragments de restriction. Selon la position de la coupure (dans l'axe ou loin de l'axe) on distingue deux types de coupure : Coupure franche : dans l’axe Extrémités franches (bouts francs). - Coupure cohésive (collant) : N’est pas dans l’axe Extrémités cohésives (bouts collants). 12

Les extrémités cohésives peuvent s’associer par formation des liaisons hydrogènes entre leur extrémités 5’ ou 3’ chevauchantes (sortantes) ou ils peuvent se circulariser par association intramoléculaire (fig.3). Pour cette raison, on dit que ces extrémités sont cohésives ou collants.

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Figure 2: Les extrémités cohésives des fragments d’ADN produit par EcoRI. Des fragments d’ADN d’origine différente peuvent être joints par leurs extrémités cohésives complémentaires et, comme nous le verrons plus loin, les coupures dans les molécules peuvent être scellés de façon à produire une molécule intacte d’ADN recombinant(fig.4)..

Fig. 4 : Les extrémités cohésives permet la production de l’ADN recombinant.

1.5 Le nombre et la taille des fragments de restriction : Le nombre et la taille des fragments générés par une enzyme de restriction dépendent de la fréquence avec laquelle le site de reconnaissance correspondant apparait dans l’ADN traité (tableau 2, 3). Tab.2 Nombre des sites de coupure de quelques enzymes de restriction de type II sur le génome des virus SV40, λ, et l'adénovirus 2.

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Certaines endonucléases de restriction montrent une préférence pour certains sites de coupure dans un ADN déterminé. Par exemple l’ADN du phage λ contient 5 sites de coupure de EcoRI, mais ces sites ne sont pas coupés avec la même efficacité. Le site le plus proche de l’extrémité droite du génome est coupé 10 fois plus fréquemment que le site du milieu; il ya quatre sites SacII dans l’ADN de phage λ , mais les trois sites proches du centre de la molécule sont coupés 50 fois plus rapidement que le quatrième. Tab.2 taille moyenne (en pb) des fragments générés par quelques enzymes de restriction à partir de l’ADN de différents organismes.

1.6 Classification des enzymes de restriction : Les enzymes sont souvent des protéines présentant des propriétés de catalyse spécifique d’une réaction chimique. Elles sont réparties en 6 classes : E.C. 1 Oxydoréductases : catalysent les réactions redox. E.C. 2 Transférases : transfèrent d'un groupement fonctionnel. E.C. 3 Hydrolases : catalysent l'hydrolyse de différentes liaisons. (exp les enzymes de restriction). E.C. 4 Lyases : Coupe des liaisons variées sans réaction d’hydrolyse ou de redox 15

E.C. 5 Isomérases : isomérisation au niveau de la même molécule E.C. 6 Ligases : joins deux molécules par une liaison covalente.

1.7 Enzymes de restriction utilisées en génie génétique : Les enzymes de restriction de type II sont pratiquement les plus utilisées en génie génétique, à cause de leurs propriétés de coupure et de reconnaissance. Le E.C. de ces enzymes est le suivant : E.C.3.1.21.4. Nom Commun : Les endonucléases de restriction de type II Réaction : Coupure à l'intérieur de la séquence d'ADN db au niveau des sites de reconnaissance et de coupure spécifiques, générant des fragments d'ADN double brin se terminant par 5'-phosphate libre.

Le E.C. de ces enzymes est le suivant:

E.C.3.1.21.4. 3 (classe): Hydrolase 1 (sous classe): Agissent sur les liaisons esters (Estérases) 21 (sous-sous classe): Leurs produits gardent leurs phosphates 5’initial 4 : Nécessite la présence de Mg++dans le milieu.

1.8 Réaction générale des enzymes de restriction : La réaction générale catalysée par les enzymes de restriction (E.C.3.1.21.n) implique la présence dans le milieu des facteurs suivants. - Enzyme (E.C.3.1.21.n) - Substrat ADN double brin non digéré - Cofacteur : En général, seul le Mg++ est indispensable. Quelques enzymes de restriction font appel à d’autres cofacteurs. Les enzymes de méthylation ont pour coenzymes le S-adénosylMéthionine. - Facteurs physico-chimiques : Ces facteurs contrôlent aussi ces réactions, pH, potentiel d’oxydoréduction, forces ioniques. L’énergie libre dégagée par l’hydrolyse est suffisamment 16

importante pour que la réaction ne soit pratiquement pas réversible dans les conditions habituelles. - Différents tampons sont utilisés pour les enzymes de restriction permettant l’optimisation des réactions de multiples enzymes avec le même tampon :  Toutes les enzymes de restriction nécessitent la présence de l’ion Mg++ .  Le pH (7,0 - 7,9), le potentiel d’oxydo-réduction (dithiothréitol 1 mM), la force ionique (NaCl ou CH3COOK (acétate de potassium) de 0 à 100 mM) varient d’un tampon à l’autre.  De rares enzymes nécessitent des conditions spéciales précisées par leur mode d’emploi.

Exemples d’un tampon incubation :

Remarque: le DTT (dithiothréitol) régule le potentiel d’oxydo-réduction.

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1.9 Exemples des enzymes de restrictions type II :

EcoR I est une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R. 

 



Le site de liaison à l’ADN est formé de six paires de nucléotides: 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, c’est à dire qu’ils sont identiques sur les deux brins de l’ADN (mais antiparallèles sur l’autre brin). Lorsque l’hydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symétrie du palindrome certaines paires de nucléotides restent non appariées : les fragments qui en résultent sont dits « à bouts collants ». La méthylation des adénines ou de la cytosine du site d’hydrolyse inhibent la reconnaissance du site par EcoR I. L’ADN de la bactérie ainsi méthylé n’est pas hydrolysé alors que l’ADN parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.

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EcoR V est une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R.  Le site de liaison à l’ADN est formé de six paires de nucléotides : 5’ GATATC 3’ 3’ CTATAG 5’  Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, c’est à dire qu’ils sont identiques sur les deux brins de l’ADN (mais antiparallèles sur l’autre brin).  

Lorsque l’hydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symétrie du palindrome toutes les paires de nucléotides restent appariées : les fragments qui en résultent sont dits « à bouts francs ». La méthylation des adénines du site d’hydrolyse inhibe la reconnaissance du site par EcoR V. L’ADN de la bactérie ainsi méthylé n’est pas hydrolysé alors que l’ADN parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.

Pvu II est une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris.  Le site de liaison à l’ADN est formé de six paires de nucléotides : 5’ CAGCTG 3’ 3’ GTCGAC 5’  Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, c’est à dire qu’ils sont identiques sur les deux brins de l’ADN (mais antiparallèles sur l’autre brin).  Lorsque l’hydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symétrie du palindrome toutes les paires de nucléotides restent appariées : les fragments qui en résultent sont dits « à bouts francs ».  La méthylation des cytosines au niveau du site d’hydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Pvu II. L’ADN de la bactérie ainsi méthylé n’est pas hydrolysé alors que l’ADN parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.

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Hae III est une enzyme de restriction produite par Haemophilus aegypticus.  Le site de liaison à l’ADN est formé de quatre paires de nucléotides : 5’ GGCC 3’ 3’ CCGG 5’  Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, c’est à dire qu’ils sont identiques sur les deux brins de l’ADN (mais antiparallèles sur l’autre brin).  Lorsque l’hydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symétrie du palindrome toutes les paires de nucléotides restent appariées : les fragments qui en résultent sont dits « à bouts francs ».  La méthylation de la cytosine immédiatement en aval du site d’hydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hae III. L’ADN de la bactérie ainsi méthylé n’est pas hydrolysé alors que l’ADN parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.

Pvu I est une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris. 

Le site de liaison à l’ADN est formé de six paires de nucléotides : 20

  

5’ CGATCG 3’ 3’ GCTAGC 5’ Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, c’est à dire qu’ils sont identiques sur les deux brins de l’ADN (mais antiparallèles sur l’autre brin). Lorsque l’hydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symétrie du palindrome certaines paires de nucléotides restent non appariées : les fragments qui en résultent sont dits « à bouts collants ». La méthylation de la deuxième cytosine proche du site d’hydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Pvu I. L’ADN de la bactérie ainsi méthylé n’est pas hydrolysé alors que l’ADN parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.

Pst I est une enzyme de restriction produite par Providencia stuartii. 

 



Le site de liaison à l’ADN est formé de six paires de nucléotides : 5’ CTGCAG 3’ 3’ GACGTC 5’ Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, c’est à dire qu’ils sont identiques sur les deux brins de l’ADN (mais antiparallèles sur l’autre brin). Lorsque l’hydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symétrie du palindrome certaines paires de nucléotides restent non appariées : les fragments qui en résultent sont dits « à bouts collants ». La méthylation de la première cytosine ou de l’adénine du site d’hydrolyse inhibent la reconnaissance du site par Pst I. L’ADN de la bactérie ainsi méthylé n’est pas hydrolysé alors que l’ADN parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.

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Kpn I est une enzyme de restriction produite par Klebsiella pneumoniae. 

  

Le site de liaison à l’ADN est formé de six paires de nucléotides : 5’ CTGCAG 3’ 3 GACGTC 5’ Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, c’est à dire qu’ils sont identiques sur les deux brins de l’ADN (mais antiparallèles sur l’autre brin). Lorsque l’hydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symétrie du palindrome certaines paires de nucléotides restent non appariées : les fragments qui en résultent sont dits « à bouts collants ». La méthylation de l’adénine ou des cytosines du site d’hydrolyse inhibent la reconnaissance du site par Kpn I. L’ADN de la bactérie ainsi méthylé n’est pas hydrolysé alors que l’ADN parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.

1.10 Alphabet dégénéré du code génétique : La spécificité large de certaines enzymes ou encore la dégénérescence du code génétique implique qu’on doit indiquer quelquefois dans les séquences des lettres correspondant à plusieurs bases azotées différentes pour le même nucléotide présent à une position. Le choix peut porter sur deux des 4 nucléotides : A ou G, C ou T, G ou T, A ou C, C ou G, A ou T ; ou bien sur 3 nucléotides : C, G ou T, A, G ou T, A, C ou T, A, C ou G ; ou enfin sur les 4 nucléotides : A, C, G ou T. Les règles de complémentarité impliquent évidemment une dégénérescence de la séquence de l’autre brin en regard d’une position dégénérée.

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Quelques exemples :

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Ava II est une enzyme de restriction produite par Anabaena variabilis. 

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Le site de liaison à l’ADN est formé de cinq paires de nucléotides : 5’ GGWCC 3’ 3 CCWGG 5’ Les sites de restriction sont souvent de type palindrome. Les fragments qui en résultent sont « à bouts collants ». La méthylation des cytosines du site d’hydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Ava II. L’ADN de la bactérie ainsi méthylé n’est pas hydrolysé alors que l’ADN parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.

Rq : R= A ou G, Y= T ou C Hind II est une enzyme de restriction produite par Haemophilus influenzae, souche Rd.  Le site de liaison à l’ADN est formé de six paires de nucléotides : 5’ GTYRAC 3’ 3 CARYTG 5’  Les sites de restriction sont souvent de type palindrome.  Les fragments qui en résultent sont « à bouts francs ».  La méthylation de l’adénine du site d’hydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hind II. L’ADN de la bactérie ainsi méthylé n’est pas hydrolysé alors que l’ADN parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.

1.11 Isoschizomères, néoschizomères et enzymes compatibles : a) Les isoschizomères sont des enzymes de restriction qui reconnaissant la même séquence et la coupent de façon identique.

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b) Les néoschizomères sont des enzymes de restriction qui reconnaissant la même séquence mais la coupent de façon différente.

b) Les enzymes compatibles sont des enzymes de restriction qui reconnaissant des sites de restriction différents mais génèrent des fragments aux extrémités cohésives et complémentaires qui pourront être ligaturées (tableau 4) .

Autres exemples des enzymes compatibles : Tab.4 Un groupe d’enzymes produisent la même extrémité 5’ cohésives complémentaire

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1.12 la modification de l’ADN ;méthylation : La restriction et la modification furent découvertes dans les années 1950 comme des phénomènes commun, observés lors de l’infection d’une variété d’espèces bactériennes par des phages virulentes. Arber et Dussoix identifièrent la base moléculaire de ces phénomènes. Ils montrèrent que la restriction du phage est associé à une dégradation rapide de son ADN dans la bactérie-hôte. Ils montrèrent aussi que la modification rend l’ADN du phage insensible à la restriction et observèrent que la modification d’un seul brin suffit à empêcher la restriction. Par la suite, des expériences montrèrent que la méthylation est impliquée dans le phénomène de modification (fig.5).

Fig.5: Systèmes de restriction et de méthylation. 26

Les phénomènes de restriction et modification ont été très bien mis en évidence et étudiés par le comportement du phage λ infectant deux souches différentes d’E.coli (fig. 6).

Fig.6: Restriction et modification contrôlées par l’hôte E.coli K de la propagation du phage λ, montrées par la capacité de produire des plages de lyse (EPO, efficiency of plating). Si une suspension de phage λ est préparée par l’infection de souche E.coli C, par exemple, puis titrée sur des d’E.coli C et d’E.coli K, les titres mesurés sur deux souches diffèrent de plusieurs ordres de grandeur, celui mesuré sur E.coli C est élevé (EOP=1) alors que celui -4

mesuré sur E.coli K étant le plus faible (EOP= 10 ). On dit que le phage λ subit une restriction imposée par la seconde souche-hôte (E.coli K). Quand les phages produits par l’infection d’E.coli K sont retitrés sur E. coli K, il ne sont plus soumis à cette restriction, tandis que s’il repassent d’abord par un cycle d’infection d’E.coli C, ils subissent à nouveau la restriction par E.coli K (fig. 6). Donc l’efficacité de titration du phage λ sur une souche déterminée dépend de la souche sur laquelle il a été cultivé en dernier lieu. Cette modification non héréditaire du phage qui lui permet d’être retitré sans restriction sur cette même souche est appelée modification.

Les méthylases Dam et Dcm : La plupart des souches de E. coli contiennent deux enzymes qui méthylent l'ADN : la Dam méthylase et la Dcmméthylase. a) Dam méthylase : Dam méthylase , abréviation de Deoxyadenosine methylase , est une enzyme qui ajoute un groupe méthyle à l' adénine de la séquence 5'-GA*TC-3‘ dans l' ADN nouvellement synthétisé. Immédiatement après la synthèse de l'ADN , le brin fille reste non méthylé pendant une courte période (fig.7). ; pour vérifier les erreurs sil y a des erreurs.

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C'est une méthyltransférase orpheline qui ne fait pas partie d'un système de restrictionmodification et régule l'expression des gènes. Dam méthylase est unique aux procaryotes et aux bactériophages.

Fig.7 La méthylation de l'adénine des sites GATC par Dam après la réplication. Les sites de reconnaissance de plusieurs enzymes de restriction telles que PvuI, BamHI, BclI, BglII, XhoII, MboI et Sau3AI contiennent cette séquence de même qu'une certaine proportion des sites reconnus par ClaI, TaqI, MboII et HphI.

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Certaines enzymes ne coupent pas si l'adénine est méthylée. L'enzyme MboI ne coupe pas la séquence GATC si elle est méthylée tandis que l'enzyme Sau3AI reconnaît la même séquence que MboI et n'est pas affectée par la méthylation Dam.

a) Dcm méthylase (Deoxycytosine methylase) : 5

Cette méthylase ajoute un groupement méthyle à la position C du résidu cytosine interne des séquences 5'-CC*AGG-3' et 5'-CC*TGG-3'. Une enzyme affectée par la dcm méthylation est EcoRII. On peut contourner le problème en utilisant BstNI qui reconnaît la même séquence qu’EcoRII, mais qui ne la coupe pas au même endroit. Si BstNI ne convient pas, on peut préparer l'ADN à partir de souches d’E. coli qui sont dcm-. Remarque: E.coli K contient au moins 3 systèmes de restriction différents dépendant de la méthylation qui reconnaissent leurs séquences cibles seulement lorsqu'elles sont méthylées : mrr (6méthyladénine), mcrA (m5CG où m5C est la 5-méthylcytosine) et mcrB (m5C). Des fragments d'ADN méthylés à un de ces sites sont clonés inefficacement dans des souches sauvages de E. coli. Par exemple, comme les CG de l'ADN de mammifère sont largement méthylés in vivo, l'ADN humain est restreint par mcrA. Il est important d’inactiver les systèmes de restriction des souches d’E.coli utilisées comme hôtes pour des molécules recombinants Si l’ADN étranger est introduit dans un hôte E.coli, il peut être attaqué par les systèmes de restriction de l’hôte. Il est donc important d’inactiver les systèmes de restriction des cellules hôtes. Si par exemple de l’ADN de mammifère est inséré dans un vecteur plasmidique bactérien, la transformation d’un hôte E.coli déficient pour le système de restriction EcoK élimine le risque de dégradation de l’ADN transformant, même si la séquence de mammifères contient des sites de restriction EcoK non modifiés. Si de plus l’hôte déficient pour la restriction EcoK peut effectuer la modification EcoK, la propagation de l’ADN recombinant dans cet hôte assurera sa modification par méthylation et rendra possible sa propagation ultérieure dans des souches possédant la restriction EcoK, si cela s’avère nécessaire. Tous les gènes des systèmes de restriction sont groupés dans une région du génome d’environ 14 kb surnommée «région de contrôle de migration ». Plusieurs souches souvent utilisées contiennent des mutations dans un de ces gènes. Les souches DH1 et DH5 ont une mutation dans le gène hsdR et sont déficientes pour l’endonucléase de restriction EcoKI. D’autres souches telles E.coliC contiennent une délétion de toute la région entre mrcC et mrr et sont donc dépourvues de toutes activité de restriction.

1.13 l’utilisation des enzymes de restrictions en génie génétique :

29

NB: la mappe de restriction (carte de restriction): c’est la localisation des différents sites de restriction des différentes enzymes dans un fragment d’ADN (exp: plasmide) .

2- Les nucléases : Les nucléases sont des phosphodiestérases spécifiques qui catalysent l’hydrolyse des acides nucléiques. Ces enzymes sont présents dans la plupart de toutes les cellules. Les nucléases de haute spécificité sont les enzymes de restriction. Elles présentent des niveaux de spécificité et sont classées par: - Leur mode d’attaque de la chaîne: extrémité (exonucléase) ou intérieur (endonucléase) - Leur spécificité vis à vis du substrat (ADN, ARN ou les deux) et de la structure (simple ou double brin) - Leur spécificité de reconnaissance des sites: bases ou leur enchaînement - Le type de coupure de la liaison phosphodiester

2-1- Ribonucléases A (RNase): EC3.1.27.5 : Cette hydrolase agit comme une endonucléase, préférentiellement après les nucléotides à pyrimidines (U, C). En hydrolysant la liaison entre le phosphate et le carbone 5' du nucléotide suivant. Elle hydrolyse les ARN simples brin (inactive sur l'ARN double brin) jusqu'à un mélange d'oligonucléotides se terminant tous par un nucléotide à pyrimidine estérifié par un phosphate en 3‘ (fig.8).

30

Fig.8: Digestion de l'ARN simple brin par l'RNase. Il existe des inhibiteurs de l'RNase, Ex. Le SDS (Sodium Dodecyl Sulphate), des protéines extraites du placenta (ces inhibiteurs sont utilisés souvent pour protéger les ARN lors de l'extraction ou les réactions enzymatiques). 2-2- Désoxyribonucléase I (DNase I): EC 3.1.21.1: La DNase est une enzyme catalysant les acides désoxyribo- nucléiques en nucléotides ou polynucléotides. Elle réalise une coupure, de préférence sur les bases pyrimidiques (C, T) (ou les liaisons adjacentes) des ADN simple ou double brin. 2+

2+

L'activité de cette enzyme est dépendante de la présence du Mn ou Mg

:

2+

- En présence d'ions Mn , elle coupe les deux brins en bouts francs 2+

- avec des ions Mg , elle coupe un brin en petits fragments.

Elle est utilisée pour l'analyse des sites de liaison protéines –ADN par la technique de footprinting (empreinte de pas). Car la protéine liée à l'ADN le protège de l'hydrolyse par cette enzyme (fig. 9). Cette enzyme est extraite du pancréas de bœuf.

31

Fig.9: Détection des sites de liaison des protéines sur l'ADN par la technique de "foot printing". 2-3- Exonucléase de phage λ: EC 3.1.11.3 : L'exonucléase de phage λ, elle est aussi rencontrée chez le T4 ou T7, ainsi que chez les animaux (DNase IV) hydrolyse de préférence les extrémités 5'-phosphate des DNA double brin en continuant vers le coté 3' (5'→3' exonucléase). Elle produit des nucléosides 5'-phosphate ; et des extrémités 3’ sortantes (fig. 10). Cette enzyme est produite par les cellules bactériennes infectées par les phages.

Fig. 10: Hydrolyse des extrémités 5' de l'ADN db par l'exonucléase de phage λ 2-4- Exonucléase III: EC 3.1.11.2 : Cette enzyme produite par E. coli, et aussi par Haemophilus influenza, au contraire de l'exonucléase de phage λ, hydrolyse de préférence les extrémités 3' des ADN doubles brin en remontant vers le coté 5' (3' → 5' exonucléase sortantes). Elle produit des extrémités avec nucléosides 5'-phosphate sortantes (fig.11). Cette enzyme peut hydrolyser aussi un radical phosphorylé lié à la fonction 3'-OH du dernier nucléotide.

Fig.11: L'hydrolyse des extrémités 3' de l'ADN db par l'exonucléase III. 32

2-5- Nucléase S1 : EC 3.1.30.1 : La nucléase S1 est une métalloprotéine (PM: 32000 Da) produite par le champignon Aspergillus oryzae. Elle est une nucléase spécifique des ADN (ou ARN) simple brin, bien qu’à des concentrations élevées elle agisse aussi sur les hybrides. Elle agit en milieu acide, en présence d’ions Zinc. Elle est utilisée en plusieurs applications: La nucléase S1 est particulièrement utile lorsque l'on veut transformer une extrémité débordante en extrémité franche pour la reliée avec un fragment d'ADN dont les extrémités ne sont pas compatibles (fig.12).

Fig.12: L'utilisation du nucléase S1 pour la formation des bout francs Les fragments 1 et 2 présentent respectivement comme extrémités cohésives GC et AA. Ces deux extrémités ne sont pas compatibles: on ne peut pas reliés le fragment 1 avec le fragment 2. Pour refaire une liaison covalente entre ces deux fragments on va d'abord les rendre bouts francs par action de la nucléase S1. Les fragments 1' et 2' sont maintenant prêts pour être recollés par action d'une ligase. Pour hydrolyser les fragments d'ADN simple brin au niveau des brèches (même qu'il manque une seule liaison) (fig.13).

Fig.13: L'utilisation du nucléase S1 pour l’hydrolyse des fragments d’ADN au niveau des brèches et la formation des bout francs Pour ouvrir les épingles à cheveux formés lors de la synthèse de l'ADNc (fig.14). 33

Fig.14: L'utilisation du nucléase S1 pour ouvrir les épingles à cheveux formés lors de la synthèse de l'ADNc Pour isoler des hybrides ADN/ADN, ADN/ARN, ou ARN/ARN. C'est un outil de choix pour mesurer le taux d'hybridation (fig.15).

Exemple d’un hybride ADN/ARN

Fig.15: L'utilisation du nucléase S1 pour isoler l’hybride ADN/ARN afin de déterminer du site d'initiation de la transcription 34

2-6- Ribonucléase T1: EC 3.1.27.3 : Cette nucléase est produite par Aspergillus oryzae, elle a un PM de 11000 Da Elle hydrolyse spécifiquement les ARN simple brin en rompant les liaisons 3'-5' phosphodiester en aval des GMP, de telle manière que le produit soit une guanosine 3'phosphate ou un oligonucléotide se terminant par une guanosine 3'-phosphate (fig. 16). Elle est utilisée le séquençage de l'ARN et pour hydrolyser les ARN non-hybridés lors des expériences d’hybridation ARN:ADN (fig. 16).

Fig.16: L'hydrolyse de l'ARN simple brin par la ribonucléase de T1. 2-7- Ribonucléase T2: EC 3.1.27.3 : Cette nucléase comme celle T1 est produite par Aspergillus oryzae, elle a un PM de 36000 Da. Elle hydrolyse spécifiquement les ARN sb en rompant les liaisons 3'-5' phosphoester en aval de l'adénosine (AMP) (fig. 17). Elle est utilisée aussi dans le séquençage de l'ARN.

Fig.17: L'hydrolyse de l'ARN simple brin par la ribonucléase de T2.

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2-8- Nucléase Bal31 : Cette enzyme multifonctionnelle est produite par Alteromonas espegiana. Elle est tout d’abord une exonucléase 3’→5’ qui résorbe progressivement les extrémités 3’ des ADN double brin. Sur les brins 5’ sortants qu’elle isole elle agit ensuite comme une endonucléase pour détruire les fragments d’ADN simple brin. ++

Elle est absolument dépendante de la présence de Ca d’activité sur les ARN.(fig. 18).

comme cofacteur. Elle a peu

Fig.18: Activité exonucléase sur l'extrémité 3' puis endonucléase sur le fragment simple brin sortant du BAL31 sur l'ADN. La nucléase BAL 31 est surtout utilisée pour le caractère progressif de son activité exonucléasique : on peut ainsi faire disparaître un à un les sites de restriction d’un ADN pour connaître l’ordre dans lequel ils sont présents dans la séquence de cet ADN.

3- Les polymérases : 3.1 L’ADN polymérase : 3.1.1 Définition : Une ADN polymérase est un complexe enzymatique intervenant dans la réplication de l’ADN au cours du cycle cellulaire, mais aussi dans des processus de réparation et de recombinaison de l'ADN. Il existe plusieurs familles de polymérases, qui diffèrent selon leurs propriétés catalytiques.

3.1.2Réaction générale de l’ADN polymérase : Les ADN polymérases nécessitent comme substrats: - Un brin d'ADN comme matrice, - Des désoxyribonucléotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP), - Des amorces d’ADN ou d’ARN synthétisée par une primase (ARN polymérase capable de synthétiser un brin d’ARN complémentaire d’un brin de DNA sur 10 nucléotides). 2+

la présence d’ions Mg comme cofacteurs. Réaction générale de l’ADN polymérase : -

36

3.1.3 Mécanisme de l’ADN polymérase :

a. Démarrage : Toutes les ADN polymérases chez tous les organismes vivants synthétisent l’ADN dans le sens 5’ → 3’. Aucune ADN polymérase n’est capable de commencer la synthèse d'un brin de novo. Elles ne peuvent qu'ajouter des nucléotides à une extrémité hydroxyle libre, en général le 3’-OH du brin en cours de synthèse. Pour cette raison, l'ADN polymérase a besoin d’une amorce (ou primer), sur laquelle ajouter de nouveaux désoxyribonucléotides. L’amorce peut être formée d’ADN ou d’ARN: → Dans le cas des processus de réparation et de recombinaison, l'amorce est constituée d'un segment d'ADN résultant de la coupure par une endonucléase du brin endommagé ou recombiné, qui libère une extrémité 3’-OH libre. → Dans le cas de la réplication, l'amorce constituée d'ARN est synthétisée par une enzyme, appelée primase, au sein du complexe de réplication appelé réplisome. 37

Rq: Le réplisome contient cinq types de protéines différents: L'hélicase: séparer les deux brins de l'ADN à répliquer. Deux molécules d'ADN polymérases: une synthétise le brin continu ou brin précoce, et l'autre le brin discontinu ou brin tardif. Une primase: synthétise les amorces ARN. Deux clamps glissants: des anneaux protéiques encerclent l'ADN et se lient à l’ADN polymérases augmentant sa processivité. Un chargeur de clamp: qui ouvre les clamps pour pouvoir les mettre sur l'ADN au niveau du site de réplication. Le chargeur de clamp sert également de protéine d'infrastructure pour lier toutes les autres au sein d'un complexe unique.

b. Élongation et processivité : Les diverses ADN polymérases se différencient par leur capacité à allonger l'ADN sans se dissocier du brin matrice, une caractéristique qui s'appelle la processivité. On distingue: - Certaines ADN polymérases qui sont faiblement associées à leur substrat et se détachent après avoir polymérisé seulement quelques nucléotides. On parle alors d'ADN polymérases distributives (exp: les polymérases de réparation). - Les ADN polymérases réplicatives, au contraire, sont très fortement liées au brin matrice. Elles peuvent polymériser plusieurs centaines de milliers de nucléotides en une seule fois. On parle alors d'ADN polymérases processives. Le cofacteur protéique, la pince (ou clamp ,)appelé PCNA (proliferating cell nuclear antigen) chez les eucaryotes et les archées, et complexe β chez les bactéries), se lie aux polymérases réplicatives permettent d’augmenter considérablement leur processivité .

Structure tridimensionnelle du PCNA

C. Fidélité et activité de relecture : La fidélité de réplication est très grande et elle est en très grande partie due à l'ADN polymérase, qui incorpore les bases nucléiques en fonction de la complémentarité des appariements Watson-Crick (A-T, C-G). En effet, ce très faible taux d'erreur de l'ADN polymérase pendant la réplication est dû au fait que les ADN polymérases réplicatives disposent d'une activité de relecture qui leur permet de vérifier que le dernier nucléotide incorporé dans le brin néoformé est bien le bon. Lorsque l'ADN polymérase fait une erreur et qu'un mésappariement est formé au niveau du site actif de l'enzyme, celle-ci peut revenir en arrière et hydrolyser le nucléotide incorrect : 38

c'est l’activité exonucléase 3' → 5‘, appelée également fonction d'édition. Elle peut alors réinsérer la base correcte, et reprendre la réplication. Ce processus de relecture par l'ADN polymérase améliore la fidélité du processus réplicatif et fait baisser le taux d'erreur.

Rq: On dit une activité exonucléasique ou fonction d’édition

3.1.4 ADN polymérases chez les procaryotes : Cinq ADN polymérases ont été identifiées chez les procaryotes: Pol I: impliquée dans la réparation et la réplication de l’ADN. Elle possède une activité polymérase 5’ → 3’, une activité exonucléase 3’ → 5’ pour la relecture, et enfin une activité exonucléase 5’ → 3’ qui lui permet d'éliminer les amorces d'ARN des fragments d'Okazaki pendant la réplication. La Pol I est peu processive et se dissocie de la matrice après l'ajout d'une vingtaine de nucléotides. Pol II: impliquée dans la réplication de l'ADN endommagé, elle possède une activité polymérase 5’ → 3’ et une activité exonucléase 3’ → 5’. 39

La Pol II est peu processive. Pol III: c’est la principale polymérase, qui intervient dans l'élongation de la chaîne d'ADN lors de la réplication au niveau du brin avancé et de la synthèse des fragments d’Okazaki. Elle est formée de trois sous-unités qui en constituent l'holoenzyme : la sous-unité α (alpha) possède l'activité polymérase 5’ → 3’, la sous-unité ε (epsilon) possède l'activité exonucléase 3’ → 5’, et la sous-unité θ (thêta) stimule l'activité précédente. Cette enzyme forme le noyau d'un réplisome Elle est très processive. Pol IV et V: Ces polymérases sont des polymérases de la famille Y, caractérisées par leur capacité à tolérer des lésions de l’ADN lors de la réplication. Elles sont appelées polymérases de translésion (TLS pour translesion sythesis polymerases). Elles ne possèdent pas de fonction exonucléase 3’ → 5’. Leur fidélité lors de la synthèse d’ADN est faible, même en absence d’ADN endommagé.

3.1.5 ADN polymérases chez les eucaryotes : Parmi les polymérases des eucaryotes on trouvent:

Pol α-primase (alpha) : également nommée ARN Pol, elle synthétise de courtes amorces d'ARN à l'origine de la réplication sur le brin avancé ainsi que des amorces d'ARN pour les fragments d'Okazaki du brin retardé. Cette polymérase ne possède pas de fonction exonucléasique 3’ → 5’. Pol β (bêta) : cette polymérase est impliquée dans des processus de réparation de l'ADN. Elle ne possède pas de fonction exonucléasique. Elle correspond à la Pol II bactérienne. Pol γ (gamma) : cette polymérase intervient dans la réplication de l'ADN mitochondrial. Pol δ (delta) : c'est la polymérase principale qui intervient dans la réplication de l'ADN chez les eucaryotes, avec l'ADN Pol ε, dans la synthèse du brin avancé et du brin retardé. Elle possède aussi une activité exonucléasique 3' vers 5' intervenant dans la correction des erreurs et dans des processus de réparation. La polymérase δ est hautement processive lorsqu'elle est associée au PCNA. Cette polymérase correspond à la Pol III bactérienne. Pol ε (epsilon) : elle possède une activité polymérase 5’ → 3’ et une activité exonucléase 3’ → 5’ et intervient dans la réplication et la réparation de l'ADN. Elle lit dans le sens 3’ → 5’ et synthétise 5’ → 3’ la zone du télomère qui ne peut être synthétisée par la Pol δ. Pol η (êta), Pol ι (iota) , Pol κ (kappa), Rev1 : sont des polymérases de la famille Y: caractérisées par leur capacité à tolérer des lésions de l’ADN lors de la réplication. Elles ne possèdent pas de fonction exonucléase 3’ → 5’. Leur fidélité lors de la synthèse d’ADN est faible, même en absence d’ADN endommagé.

3.1.6 Quelques exemples d’ADN polymérases : 3.1.6.1L’ADN pol I (E. Coli) : •

•

La DNA polymérase I d’Escherichia coli( DNA pol I) est une protéine qui assure la fonction de réplication de l’ADN bactérien : elle permet de compléter les désoxyribonucléotides qui se manque entre les fragments d'Okazaki, corrigeant les erreurs de transcription au fur et à mesure de sa progression. Elle initie la réaction à l’extrémité 3’ d’une amorce d’ADN ou d’ARN, incorporant des nucléotides, en hydrolysant un pyrophosphate et en incorporant le nucléoside et le phosphate . 40

Elle possède quatre activités enzymatiques distinctes : • activité polymérase 5’ → 3’, qui a besoin d'une amorce et d'un brin d'ADN servant de matrice ; • activité exonucléase 3’ → 5’ permettant la correction des erreurs de polymérisation par excision des nucléotides incorrects du point de vue de l'appariement des bases nucléiques ; • activité exonucléase 5’ → 3’ permettant la réparation de l'ADN ; • activité transcriptase inverse mais avec une efficacité considérablement réduite. Rq: Les activités d’exonucléase s’exercent aussi sur les brins d’ARN hybridés (amorces).

•

L’ADN pol I est utilisée pour la synthèse de brins d’ADN marqués sur toute la longueur de la chaîne par la technique de translation de brèche avec des dNTP marqués.

3.1.6.2Fragment de Klenow : La digestion de l’ADN polymérase I par une protéase (subtilisine) donne deux fragments : celui de 76 kD (fragment de Klenow) possède encore deux des activités catalytiques de la polymérase : 5’→3’ polymérase et 3’→5’ exonucléase mais a perdu son activité d'exonucléase 5'→3' responsable de la dégradation de l'ADN néosynthétisé. C'est pourquoi il est souvent préféré à l'enzyme entière. Ce fragment peut-être utilisé pour synthétiser le deuxième brin à partir d’un ADN simple brin et d’une amorce.

41

La réaction est la même que celle de l’ADN polymérase I. Les conditions de milieu et la vitesse de réaction sont les mêmes que celles de l’enzyme entière. Le fragment de Klenow est utilisé pour : • la synthèse du deuxième brin, complémentaire d’un ADNc ; • Remplir les extrémités 5’ sortantes pour former des extrémités franches (fig.19). • Hydrolyser les extrémités 3’ sortantes pour former des extrémités franches(fig.19). • le marquage des extrémités 5’ sortantes de l’ADN double brin (fig.19) ; • le marquage de l’ADN .

42

Fig.19: Remplissage de l’extrémité 5’ sortante et l’élimination de l’extrémité 5’ sous l’action du fragment de Klenow .

3.1.6.3 T4 DNA polymérase : La T4 DNA polymérase est purifier à partir d’une culture d’E. coli infectée par le bactériophage T4. • Comme le fragment de Klenow, elle est dépourvue d’activité 5’→3’ exonucléase, mais elle possède une activité 3’→5’ exonucléase 200 fois plus grande. • En l’absence de désoxynucléosides triphosphates, seule l’activité 3’→5’ exonucléase se manifeste, aboutissant à un DNA avec de longues extrémités 5’ sortantes. Lorsque les substrats sont ajoutés au milieu, la resynthèse se fait rapidement, permettant l’incorporation de nucléotides marqués. • La DNA polymérase du phage T4 est utilisée pour le marquage du DNA. •

3.1.6.4 Taq polymérase : •

• •

Thermus aquaticus est une bactérie thermophile des sources chaudes du parc de Yellowstone (Californie). Elle possède des enzymes thermorésistantes, dont une DNA polymérase (Taq polymérase) résistante à l’ébullition et active à 75-80 °C. La Taq polymérase est dépourvue d’activités d’édition (5’→3’ exonucléase et 3’ → 5’ exonucléase). La Taq polymérase est inhibée par les ions phosphates.

43

La Taq polymérase est utilisée pour la réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction = PCR). Mais parce qu’elle est dépourvue d’activités d’édition la Taq polymérase est responsable de nombreux misappariements : de l’ordre de 1 pour 100 paires de bases. L'amplicon produit de la réaction de Taq polymérase peut utiliser que pour les analyses. Mais si l'on veut « cloner » le produit de réaction, alors on utilisera plutôt une ADN polymérase Pfu, qui font moins d'erreurs.

3.1.6.5 ADN polymérase Pfu : L'ADN polymérase Pfu est l'ADN polymérase de Pyrococcus furiosus, une archée hyperthermophile. Elle a pour fonction de répliquer l'ADN au cours de la division cellulaire. Elle est utilisée au laboratoire pour la PCR, fonction pour laquelle elle présente plusieurs avantages par rapport à la Taq polymérase : • elle est thermiquement plus stable, • et surtout elle possède une activité exonucléase 3' vers 5' permettant d'éliminer les erreurs d'insertion de bases nucléiques au cours de la réplication, de sorte que la PCR par Pfu polymérase est plus fiable que celle réalisée à l'aide de la Taq polymérase. L'ADN polymérase Pfu est cependant plus lente que la Taq polymérase, requérant typiquement une à deux minutes par cycle pour amplifier 1 kb d'ADN à 72 °C.

3.1.6.6 La transcriptase inverse : La transcriptase inverse est un ADN polymérase qui peut synthétiser un brin d’ADN complémentaire (ADNc) en prenant un ARN comme matrice, pour former un hybride ADN:ARN. Elles catalysent donc la réaction inverse de la transcription, d’où le nom de transcriptase inverse. Cette enzyme dépourvue de l’activité exonucléase. Les transcriptases inverses sont produites par des cellules infectées par des rétrovirus (virus à ARN) (fig.20). 44

Fig.20: Cycle de l'intégration et de la reproduction d’un rétrovirus. Une fois le rétrovirus pénétré dans le cytoplasme, l'ARN est converti en ADN double brin par la transcriptase inverse qui se trouve à l'intérieur de la capside. L'ADN produite, dit pro-viral, est ensuite transporté au sein du noyau et vient s'incorporer sous l'effet d'une enzyme virale (intégrase) dans l'ADN de la cellule hôte (fig.20). La transcriptase inverse est utilisée pour: - la synthèse de l’ADNc.

45

-

l’étude des ARN: Après la synthèse de l’ADNc, on détruit l’ARN matrice, puis on soumet l’ADNc à l’amplification par la PCR, qui fournit une grande quantité d’ADNc hybridé avec une copie ADN de la séquence de l’ARN de départ.

3.2 L’ARN polymérase : 3.2.1 Définition : L'ARN polymérase est un complexe enzymatique responsable de la synthèse de l'acide ribonucléique, ou ARN, à partir d'une matrice d'ADN. Ce processus biologique, présent dans toutes les cellules, s'appelle la transcription. Chez les eucaryotes, il existe essentiellement trois ARN polymérases: l'ARN polymérase I, l'ARN polymérase II et l'ARN polymérase III tandis que chez les procaryotes il n'existe qu'une seule ARN polymérase.

3.2.2 Quelques exemples d’ARN polymérases utilisés en génie génétique : 3.2.2.1 RNA polymérases (phages) : Les RNA polymérases sont les enzymes de la transcription, essentielles au cycle des bactériophages à ADN comme le SP6 de Salmonella typhimurium ou le phage T7 d’Escherichia coli. Les RNA polymérases des phages sont capables d’incorporer 17 picomoles de nucléotides à la minute à 37 °C.

Les RNA polymérases des phages sont utilisées pour la transcription in vitro, pour la synthèse des sondes d’ARN

3.2.2.2 Poly(A) polymérase : Après la terminaison de transcription, l’extrémité 3’OH terminale du dernier exon du transcrit est d’abord coupée par une nucléase environ 15 nucléotides après la boîte de polyadénylation. 46

Ensuite, une polyA polymérase ajoute de nombreux résidus Adénine (50 chez les levures, 200 chez les eucaryotes supérieurs) à l'extrémité 3' du brin d'ARN pour constituer une « queue » polyA. La réaction se fait sans matrice, à partir de l’ATP et en présence de Magnésium. La queue polyA est indispensable à la sortie du mRNA du noyau vers le cytoplasme. Elle protège le mRNA au cours de la traduction. Les mRNA désadénylés ne sont plus traduits et seront rapidement digérés par la ribonucléase.

+2

Mg

Fig.21: Addition La queue polyA par polyA polymérase Exemple de polyA polymérase: E. coli Poly(A) Polymérase Le réactif de la poly(A) polymérase d’ E. coli est utilisée pour: • Marquage de l'ARN avec ATP • L’addition de la queue poly (A) d'ARN pour le clonage. • Améliorer la traduction de l'ARN transféré dans les cellules eucaryotes.

47

4- Les ligases et les procédés de ligation : Après avoir décrit les méthodes qui permettent de couper les molécules d’ADN voyons de quelle manière ces fragments d’ADN peuvent être joints pour créer des molécules recombinantes artificielles. Quatre méthodes permettant de joindre des fragments d’ADN in vitro : 1. La première utilise la capacité de l’ADN ligase d’E.coli de joindre de façon covalente des extrémités cohésives produites par restriction, qui se sont associées du fait de leur complémentarité. 2. La deuxième repose sur la capacité de l’ADN ligase du phage T4, isolée de celulles d’E.coli infectées par T4, d’établir des liaisons phosphodiester entre des fragments d’ADN à bout francs. 3. La troisième méthode repose sur l’utilisation de molécules synthétiques de jonction (adaptateurs) 4. La quatrième basée sur l’utilisation de la désoxynucléotidyl transférase terminale pour prolonger les extrémités 3’ des fragments par l’addition de séquences homopolymériques complémentaires.

4.1 les ADN ligases : •

Les DNA ligases sont des enzymes qui sont capables de reconstituer la liaison phosphodiester entre le carbone 3'-OH et le phosphate-5' de deux nucléotides voisins sur un brin d’ADN.

•

Elles interviennent dans la réplication pour lier ensemble les brins de DNA ou les fragments d'Okazaki synthétisés par les DNA polymérases. • Elles interviennent aussi dans de la processus de réparation de l’ADN génomique. • La formation de la liaison phosphodiester nécessite un cofacteur, en général l'ATP (ou le NAD+) qui est hydrolysé en AMP (ou NMN) lors de la réaction. • Les ADN ligases sont des enzymes qui jouent un rôle essentiel en biologie moléculaire et en génie génétique, comme l'un des outils majeurs de production d'ADN recombinant. • L'ADN ligase permet en particulier de suturer les fragments d'ADN produits par des enzymes de restriction. La réaction générale de l’ADN ligase :

(ou NAD+)

48

Deux types d’ADN ligases sont caractérisés et utilisée de façon courante en génie génétique : L’ADN ligase de E. coli L’ADN ligase du bactériophage T4

4.1.1 l’ADN ligase d’E.coli : • •

• • •

L’ADN ligases catalysent la liaison de l’extrémité 5’-phosphate terminale d’un brin d’ADN avec l’extrémité 3’-OH terminale d’un autre brin. L’ADN ligase de E. coli ne lie les bouts francs de l’ADN qu’en présence de réactifs d’exclusion (polyéthylène glycol ou Ficoll), mais elle est toujours active pour souder les fragments d’ADN double brin à extrémités cohésives L’ADN ligase de E. coli utilise le NAD+ (Nicotinamide adénine dinucléotide) comme coenzyme donneur d’énergie selon la réaction Elle n’a pas d’activité sur les RNA. Les ADN ligases sont utilisées dans le clonage des fragments d’ADN et dans la construction des vecteurs.

NMN : Nicotinamide mononucléotide.

4.1.2 l’ADN ligase du phage T4 : •

• •

La DNA ligase du bactériophage T4 est moins spécifique que celle de E. coli : elle lie bien les fragments d’ADN à bouts francs et fonctionne dans la plupart des tampons utilisés par les enzymes de restriction. La T4 DNA ligase agit aussi mais moins rapidement sur les ARN. L’ADN ligase du phage T4 utilise l’ATP comme donneur d’énergie.

49

Contrairement à l’ADN ligase d’E.coli, la DNA ligase du bactériophage T4 d’établir des liaisons phosphodiesters entre des fragments d’ADN à bout francs.

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4-2-L’utilisation de molécule synthétique de jonction (Adaptateur) : Lorsque l’ADN étranger ou le vecteur ne possède pas des sites de reconnaissance pour l’enzyme de restriction ou pour l’enzymes de restriction qui produise des extrémités cohésives, des adaptateur synthétique « linkers » peuvent être utilisés. Dans une des premières expériences de ce type, Scheller et al. (1977) ont synthétisé des oligonucléotides décamériques complémentaires qui contiennent les sites d’une ou plusieurs endonucléases de restriction. Exp: un adptateur contenant un site EcoRI (figure 22). Des molécules d’adaptateur peuvent être ligaturée aux deux extrémités du fragment d’ADN à cloner utilisant l’ADN ligase de T4, puis coupée par l’endonucléase de restriction de façon à produire des extrémités cohésives qui peuvent être introduites dans un vecteur coupé par la même enzyme de restriction.

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Fig.22: Un adptateur décamérique contenant un site EcoRI

4.3 l’addition des extrémités cohésives homopolymériques complémentaires : Cette méthode est très générale pour joindre des molécules d’ADN. Si on ajoute des séquences oligo (dA) aux extrémités 3’ d’une population de molécules d’ADN et des séquences oligo (dT) aux extrémités 3’ d’une population, les deux types de molécules peuvent s’associer pour former des dimères circulaires (Fig 23). Cette méthode consiste à: 1. Traiter les molécules d’ADN par l’exonucléase du phage λ qui produire des extrémités 3’ sortantes. 2. En suite ajouter la désosoxyribonucléotidyl transférase terminale, enzyme purifiée à partir de thymus de veau, permet de synthétiser les extensions homopolymériques. En effet, elle ajoute systématiquement des désoxynucléotides qu’on lui fournit sous forme de triphosphates aux extrémités 3’OH d’une population de molécules d’ADN: À l’un des deux molécules on ajoute la désosoxyribonucléotidyl transférase terminale + dATP Et à l’autre l’enzyme + dTTP.

3. Finalement mélanger les deux fragments en présence d’ADN ligase pour former l’ADN recombinant.

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Fig.23: la désosoxyribonucléotidyl transférase terminale de thymus de veau, permet de synthétiser les extensions homopolymériques

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Chapitre II. Les systèmes hôtes-vecteurs et clonage moléculaire 1. Vecteurs de clonage : Un vecteur de clonage est un petit élément génétique à réplication autonome, utilisé pour produire de multitude de copie du gène d’intérêt. Ces vecteurs de clonage sont spécialement conçus pour permettre l’intégration de la portion d’ADN exogène dans un site spécifique sans que cela affecte sa propre réplication. Il existe plusieurs types de vecteurs pouvant introduire des molécules d’ADN recombinant dans les bactéries, les levures, les cellules végétales ou les cellules de mammifères et humaines. Note : On utilise des vecteurs avec des petits poids moléculaire. 1- les avantages lié à un petit masse moléculaire de plasmide sont multiples d'abord le plasmide et facile à manipuler dans la mesure à l’il résiste bien aux tensions mécaniques et qu'il isoler facilement à partir des cellules-hôtes. 2- le plasmide de faible poids moléculaire sont souvent présent en bocaux exemplaires mais sur tout amplifié l'expression de tous les gènes qui sont clonés. 3- leur petite taille augmente leur probabilité des trouver des sites de restriction unique.

Cellule bactérienne

La cellule ne peut pas de multiplier plus que 2 fois (Poids élevé) ; et consomme beaucoup de temp et des besoins nécessaires.

1.1 Caractéristiques d'un vecteur de clonage idéal :

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1.2 les différent types de vecteurs : Ils existe plusieurs types de vecteurs de clonage parmi les quelles on peut citer: •

les plasmides,

•

les phages,

•

les cosmides,

•

les phagmides,

•

les BAC

•

les YAC etc.

1.2.1 les plasmides : Les plasmides sont des petits éléments génétiques extra-chromosomiques doués de la réplication autonome, ce sont typiquement des molécules d'ADN double brin, circulaires, leur taille varie de 1 kb à deux ou trois centaines de kb (< 5% de la taille du chromosome bactérien). Ils contiennent des gènes codants souvent pour des protéines qui donnent un ou des avantage(s) à la cellule hôte. Comme par exemple : - Résistance aux antibiotiques - Résistance aux métaux lourds 55

- Production de toxines - Production d'antibiotiques - Induction des tumeurs chez les plantes Les plasmides peuvent être présents en nombre de copies variable. Les grands plasmides naturels (>50 kb) sont souvent présent à une ou deux copies par cellule, comme le chromosome. Les plasmides construits par génie génétique pour des utilisations biotechnologiques ont souvent été modifiés pour être présents à un nombre de copies beaucoup plus élevé, de l'ordre quelques dizaines à quelques centaines, ce qui permet une amplification de la production d'ADN et/ou de protéines. Des mutations dans les plasmides peuvent affecter le nombre de copies du plasmide par cellule, surtout celles qui touchent au répresseur. En absence de ce répresseur, le nombre de copies augmente jusqu'à ce que la machinerie cellulaire responsable de la réplication soit saturée. On obtient la même chose par l’utilisation des antibiotiques interférant avec la synthèse des protéines. Par exemple le chloramphénicol (inhibe la synthèse du répresseur), le nombre peut atteigne plusieurs milliers. Les plasmides naturels possèdent dans leur génomes un locus nommé "par" qui fonctionne à la façon de centromère des chromosomes eucaryotes, ce locus contrôle la répartition précise des plasmides parmi les cellules filles lors de la division cellulaire. Pour réduire la taille des plasmides qui servent de vecteurs de clonage, le locus "par" est très souvent éliminé. C'est notamment le cas du plasmide pBR322 et leurs dérivés. Les plasmides sont de bons vecteurs de clonage chez les bactéries parce qu’ils se multiplient en nombre de copies important et qu’ils sont aisément purifiables. Les marqueurs de sélection (Ex. gènes de résistance aux antibiotiques) permettent l’identification des bactéries recombinantes (transformées) qu’ils les portent.

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Fig.24: Composants basiques d'un vecteur plasmidique qui peut se répliqué chez E. coli(Lodish et al.,2003).

1.2.1.1Propriétés requises des plasmides utilisés comme vecteurs de clonage : Un plasmide de clonage idéal devrait combiner les propriétés suivantes:    

L’ADN est bicaténaire circulaire avec une masse moléculaire peu élevée (< 10 Kb). Nombre de plasmide dans une cellule-hôte peut être considérable (plusieurs centaine). la capacité de conférer un phénotype de sélection aux cellules-hôtes. possède une réplication autonome et sites uniques pour un série d’endonucléases de restriction.

1.2.1.2 La purification de l’ADN plasmidique : La méthode qui actuellement la plus utilisée est celle Birnboim et Doly (1979). Cette méthode exploite l’observation qu’il existe une zone de pH étroite (12.0-12.05) dans la quelle l’ADN linéaire est dénaturé, mais pas l’ADN circulaire: Les bactérie contenant les plasmides sont mis en culture dans un grand volume jusqu’à 2 litre de milieu de culture, quand la concentration bactérienne atteint une valeur suffisante; on traite les bactéries par le chloramphénicol qui empêche la croissance sans affecter la réplication des plasmides. En suite en récupère les bactéries par centrifugation. Les bactéries récupérées contenant le plasmide sont traitées au lysozyme (ou EDTA) pour affaiblir la paroi cellulaire, puis lysées par l’hydroxyde de sodium (NaOH) et le dodécyl sulfate de sodium (SDS): à ce pH très alcalin, l'ADN est dénaturé. On neutralise ensuite rapidement la solution avec l’acétate de sodium acide, ce qui provoque la renaturation brutale. L'ADN chromosomique, très long (~10⁶ paires de base), ne parvient pas à se réapparier complètement et forme des enchevêtrements insolubles. La concentration élevée d’acétate de sodium provoque également la précipitation des complexes protéines-SDS et de l’ARN de haut poids moléculaire. 57

L'ADN plasmidique, court (~10³ paires de base), parvient à se réassocier complètement et reste en solution. On sépare alors les espèces par centrifugation. Les protéines précipitées, sont également éliminées avec le détergent et l'ADN chromosomique. L'ADN plasmidique, resté en solution, est alors concentré par précipitation à l‘éthanol.

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1.2.1.3 exemple du plasmidique :

a) Plasmide pBR322 : Le pBR322 appartient à une série de vecteurs de clonage de première génération, partiellement construit par génie génétique. Qui fut construit sur la base d’une chimère rassemblant les éléments intéressants des plasmides naturels et en augmentant le nombre de sites uniques de coupure par les enzymes de restriction.

Caractéristiques du plasmide pBR322 1- pBR322 est un petit plasmide constitué de 4361 paires de bases, dont la séquence nucléotidique est complètement connue. 2- Il est maintenu de façon stable dans son hôte à un niveau voisin de 20 à 30 copies par cellule. 3- Sa production peut être portée à plusieurs milliers de copies (1000 à 3000 copies par cellule) lorsque l’on inhibe la synthèse protéique par l’addition de chloramphénicol dans la culture. 4- Il est facilement purifiable sous la forme superenroulée par les techniques usuelles d’extraction et d’isolement. 5- Il est possible d’y insérer un fragment d’ADN de bonne dimension sans toutefois dépasser la taille de 10kpb sous peine de l’instabilité plasmidique. 6- Il possède deux gènes de résistances aux antibiotiques : l’un pour l’ampicilline (ApR), l’autre pour la tétracycline (TcR), l’expression de l’un de ces deux gènes facilite la sélection des clones recombinants (fig.25). 7- Il possède également vingt sites uniques pour des enzymes de restriction. 8- Il est facilement transférable par transformation ou par électroporation.

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Fig.25: La carte du plasmide pBR322 d’E. coli. La localisation des sites de coupure par certaines enzymes de restriction est montrée. Ce vecteur possède deux gènes de résistance (Apr: Résistance à l’ampicilline, Tetr: Résistance à la tétracycline).

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