FT 6 Dénombrement Coliformes BLBVB [PDF]

Zitiervorschau

Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB.

FICHE TECHNIQUE N°6 : Dénombrement des coliformes sur milieu liquide (BLBVB) par la technique du NPP.

BLBVB : Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant. Utilisation : Milieu sélectif pour le dénombrement des coliformes totaux et fécaux dans l’eau et les produits alimentaires. Composition : Pour 1 litre de milieu : o Tryptone.................................................................................................. 10,0 g o Bile de bœuf bactériologique (agent sélectif).................................... 20,0 g o Vert brillant (agent sélectif)............................................................... 13,3 mg o Lactose.................................................................................................... 10,0 g o pH du milieu prêt-à-l ’emploi à 25 °C : 7,2 ± 0,2. Principe : La présence simultanée de deux agents sélectifs (la bile de boeuf et le vert brillant) assure l’inhibition des bactéries Gram positif et sélectionne les bactéries Gram négatif les coliformes. La fermentation du lactose avec production de gaz se manifeste par une turbidité et la présence de gaz dans la cloche de Durham. Le test se réalise en deux étapes : le test présomptif pour le dénombrement des coliformes totaux suivi par le test confirmatif pour le dénombrement des coliformes fécaux ou thermo tolérants (E. coli). Technique : voir schéma

 Test présomptif : 1) Préparation des dilutions décimales : voir fiche technique 1. 2) Ensemencement : 

Transférer 1 ml de la solution mère et de ses dilutions dans un tube contenant 10 ml du milieu BLBVB avec cloche de Durham.



Bien homogénéiser le tube et s’assurer que la solution est bien répartie y compris sous la cloche.



Evacuer les bulles d’air de la cloche pour éviter d’avoir de faux négatifs.



Pour chaque dilution une répétition de 2, 3, 4 ou 5 tubes est effectuée. 1

Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB.

3) Incubation : les tubes sont incubés pendant 24 – 48 h à 30 – 37 °C. 4) Lecture : un test positif se manifeste par un trouble ET la production de gaz visible grâce à la présence d’air sous la cloche de Durham. 5) Dénombrement : le dénombrement se fait par la technique du nombre le plus probable (NPP) :  Annoter tous les tubes positifs par (+). Pour chaque dilution, affecter un chiffre égal à la somme des tubes positifs.  Déterminer le nombre caractéristique : Pour une répétition de trois tubes, choisir le plus grand nombre inférieur à 330, pour une répétition de quatre tubes choisir le plus grand nombre inférieur à 440………  Déterminer le nombre le plus probable (npp) correspondant au nombre caractéristique par lecture directe sur la table de Mac Grady.  En déduire la concentration en coliformes : N = npp x 1/V x 1/D. le résultat est exprimé en nombre de coliformes totaux/ml (ou gr). N : le nombre de coliformes totaux. npp : nombre le plus probable. V : le volume ensemencé. D : la plus grande dilution de la série choisie pour le nombre caractéristique.

 Test confirmatif : 1) A partir de chaque tube positif, ensemencer deux tubes : un tube contenant du BLBVB ET un tube contenant de l’eau peptonée exempte d’indole. 2) Incubation : les tubes sont incubés pendant 24 – 48 h à 44 °C. 3) Lecture : un test positif se manifeste par le trouble et la production de gaz au niveau du tube de BLBVB ET l’apparition de l’anneau rouge après l’ajout du réactif de Kovacs au niveau du tube contenant l’eau peptonée exempte d’indole. 4) Dénombrement : le dénombrement se fait comme précédemment par la technique du nombre le plus probable. 5) Le résultat est exprimé en nombre de coliformes fécaux ou thermotolérants/ml (ou gr).

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Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB. Test présomptif

1 ml

1 ml

1 ml

Préparation des dilutions décimales

9 ml

Solution mère Dilution 10 -1

Dilution 10 -2

Dilution 10 -3

Dilution 10 -4

1 ml

Ensemencement

Incubation 24h 37 °C

+

+

+

+

+

+

+

3 3

3

+

-

+

-

-

-

1 1

22

-

-

0 Nombre caractéristique = 321 : npp = 15. N = 15 x 1/1 x 1/10-1 . N = 150 coliformes totaux/ml (ou gr).

Test confirmatif

Incubation 24h 44 °C

-

+ 2

+

-

+ 1

0

Nombre caractéristique = 210 : npp = 1,5. N = 1,5 x 1/1 x 1/10-1 . N = 15 coliformes fécaux/ml (ou gr).

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