Dinh Luong Protein Theo Phuong Phap Lowry [PDF]

Zitiervorschau

GVHD: CHU VĂN THÁI

BÀI BÁO CÁO ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY I. MỤC ĐÍCH Xác định hàm lượng protein có trong mẫu thực phẩm II. NGUYÊN TẮC Hầu hết các protein đều chứa tyrosin và tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau. Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu. Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng là hàm lượng protein). Vì thế, ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein. III. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 1. Dụng cụ và hóa chất * Dụng cụ  Buret 25ml  Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml chính xác  Bình định mức 50ml  Erlen 250ml * Hóa chất  Dung dịch albumin 0,1% : cân chính xác 0,1g albumin pha với nước cất thành 100ml.  Dung dịch A: cân 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH N/10 thành 100ml  Dung dịch B: cân 0,5g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch citrate natri 1% tạo thành 100ml.  Dung dịch C: (chỉ pha để dùng trong ngày) là hỗn hợp của hai dung dịch A và B được pha theo tỷ lệ 49:1  Thuốc thử Folin : thuốc thử này đã pha sẵn, cách đều chế như sau: o Cân: 100g Natri tungstat và 25g Natri molybdate thật tinh khiết. Thêm vào đó 700ml nước cất và 50ml acid orto phosphoric 85%. Khuấy cho hòa tan và thêm vào đó 100ml acid clohydric đậm đặc. Tiếp tục khuấy rồi cho vào đó một bình cấu nút nhám 2 lít. Đun hoàn lưu trong 10 giờ. o Sau khi đun cho vào đó 150g Lithium sulfat. Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi đổ vào đó thêm 5 – 10ml brom 1/3 (hoặc 2 – 3ml Brom lỏng). Khuấy đều và đun sôi trong tủ hút khí độc trong 15 phút. Làm lạnh ở nhiệt độ thường. Cho vào bình định mức 1 lít và thêm nước cất cho đủ. Lắc kỹ và lọc (nếu dung dịch không trong). Dung dịch có màu vàng chanh, nếu chuyển sang màu xanh là không dùng được. Bảo quản trong chai thủy tinh màu. 2. Tiến hành thí nghiệm * Dựng đường chuẩn Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thường là albumin của bò đã đông khô theo bảng sau để có được các dung dịch albumin chuẩn có nồng độ protein từ 0 đến 250 µg/ml:

SVTH: ĐẶNG ĐỨC HẬU

NHÓM 5

GVHD: CHU VĂN THÁI

Ống nghiệm số Dung dịch albumin 0,1%(ml) Nước cất (ml) Nồng độ protein µg/ml

0 0 10 0

1 0,5 9,5 50

2 3 4 5 1,0 1,5 2,0 2,5 9,0 8,5 8,0 7,5 100 150 200 250

Ta có được nồng độ protein µg/ml từ công thức sau: C% = (mct/mdd)*100% Cppm = ( mct/mdd)*106 Mct = ( ( Cppm*mct)/(mdd*106)*100 Cppm *104 => nồng độ protein ở bảng trên Hút 0,4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 0 đến 5 vào bảy ống nghiệm sạch khác nhau (gồm hai ống thử không và năm ống từ 1 đến 5). Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 750nm ta thu được bảng số liệu sau và vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ dung dịch Glucose và giá trị OD tương ứng: Ống nghiệm số Nồng độ Protein (µg/ml) Giá trị OD

0 0 0

1 50 0.060

2 100 0.121

3 150 0.192

Ta dựng đường chuẩn y = ax+b như sau:

Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ dung dịch Protein (mg/ml) và giá trị OD

SVTH: ĐẶNG ĐỨC HẬU

NHÓM 5

4 200 0.227

5 250 0.272

GVHD: CHU VĂN THÁI

* Xác định hàm lượng protein trong mẫu Hút 0,4ml dung dịch protein cần xác định cho vào một ống nghiệm sạch và sấy khô. Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 750nm . (thực hiện 2 ống nghiệm để lấy mẫu trung bình). Ta thu được giá trị OD sau 3 lần đo mẫu lần lượt là: ODM1 = 0.170 0.170 + 0.172 ODM2 = 0.172 ODM = y = 2

= 0.171

Phương trình đường chuẩn: y = 0.0011x + 0.0154, R2 = 0.9842 Từ giá trị ODM = 0.171 ta thay vào phương trình y = 0.0011x + 0.0154 ta được : 0.171 = 0.0011x +0.0154 Suy ra x = 141,45 (mg/ml) Vậy hàm lượng Protein có trong mẫu là 141,45 (mg/ml) IV. NHẬN XÉT 1. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm - Thao tác trong suốt quá trình thí nghiệm của người thực hiện. - Dụng cụ thí nghiệm chưa sạch. - Cách xử lý mẫu chưa đúng. - Cuvet máy đo quang không chính xác - Sau mỗi lần đo tráng lọc Curvet bằng nước cất không kĩ 2. Biện pháp khắc phục - Yêu cầu sinh viên phải thao tác chuẩn, tập trung, không đùa giỡn. - Phải vệ sinh dụng cụ sạch sẽ trước khi tiến hành thí nghiệm. - Xử lý mẫu phải đúng quy trình. - Pha loãng mẫu sao cho giá trị đo OD nằm trong giới hạn đường chuẩn. - Khi thao tác với Curvet phải cẩn thận đảm bảo Curvet phải thật sạch và trong suốt hạn chế sai số.

SVTH: ĐẶNG ĐỨC HẬU

NHÓM 5