Chapitre 3 La Classification Bactérienne HAMAMES [PDF]

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Chapitre 3 : La classification bactérienne La systématique est la science des classifications des organismes vivants. Elle regroupe 3 disciplines distinctes :  La classification (taxonomie) : elle permet d’établir des groupes taxonomiques ou taxons qui sont des organismes vivants apparentés sur la base de critères suffisamment spécifiques, reconnaissables et distincts des autres groupes.  La nomenclature : elle affecte à chaque taxon une dénomination conventionnelle.  L’identification : elle permet l’intégration des organismes vivants inconnus à l’un des taxons préalablement définis sur la base de la comparaison de leurs caractères spécifiques. 1. Classification L’unité élémentaire de la classification est l’espèce. En taxonomie bactérienne, deux types de classifications sont généralement utilisés : 1.1. Classification artificielle C’est une classification phénétique ou phénotypique, donc basée sur la considération de caractères observables tel que : la forme cellulaire, le type respiratoire, la température ou le pH de croissance… Parmi ces classifications, certaines sont simplifiées et basées sur une clé d’identification connue qui regroupe un ensemble de bactéries partageant une même propriété phénétique (physiologique, métabolique, écologique ou autre) aisément reconnaissable par sa présence (+) ou son absence (-). 1.2. Classification naturelle Elle est aussi appelées classification phylogénétique. Elle est basée sur l’existence d’espèces clairement identifiées et génétiquement homogènes qui, à partir d’un ancêtre commun, ont évolué différemment. Les modèles de cette classification phylogénétique proposées pour les bactéries ont pour principe de base l’étude comparative de marqueurs moléculaires, spécifiquement retenus en raison de leur grande stabilité ou de leur faible variabilité. Ces marqueurs sont soit directement liés au génome (ADN, ARN ou les protéines qui en dérivent), soit des molécules structurales stables telles que les composants membranaires ou pariétaux. 

Classification de BERGEY’s Manual

Le Bergey’s Manual of systematic bacterioloy (Bergey’s Manual) fut édité dès 1923 aux Etats Unis avec alors pour objectif initial le regroupement, en compilation, des espèces bactériennes connues de manière à faciliter l’identification des organismes inconnus. Le mode classification retenu est phénétique et basé sur la détermination de caractères simples (coloration de Gram, type respiratoire, mobilité, sporulation…). En effet, de nombreux taxons réunis par le Bergey’s Manual, sur la base de propriété phénétiques, se sont révélés génétiquement peu ou pas apparentés. La taxonomie classique a constituée pendant longtemps le seul outil des taxonomistes. Elle reste aujourd’hui encore d’apport déterminant mais insuffisant pour établir une classification naturelle acceptable des bactéries. 1.3. Critères de classification 1.3.1. Caractères morphologiques La morphologie bactérienne est aisément établie par une simple observation microscopique. Elle est d’une grande stabilité évolutive et d’une grande importance taxonomique du fait de sa dépendance de l’expression génétique.

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Chapitre 3 : La classification bactérienne 1.3.2. Caractères métaboliques Le métabolisme et la physiologie cellulaires sont déterminés par la nature des enzymes et leurs conditions d’activité. Ces enzymes sont sous le contrôle des gènes et leur analyse permet donc de comparer indirectement des génomes. 1.3.3. Caractères génomiques L’étude des caractères génomiques est réalisée soit directement sur le génome, c’est-à-dire l’ADN, soit sur les molécules qui ont dérivent directement (ARN et protéines). Les acides nucléiques sont principalement analysés par des tests d’hybridation ADN/ADN qui sont maintenant d’application universelle alors que pour les protéines, elles peuvent être comparées de différentes manières telle que la détermination des séquences en acides aminés des protéines ayant la même fonction chez les différents organismes confrontés. 1.4. Unités de classification 1.4.1. Rangs taxonomiques L’unité de base de la classification bactérienne est l’espèce. Plusieurs espèces présentant entre elles suffisamment de caractères communs sont réunies en genre. Sur le même principe, plusieurs genres composent une famille et ainsi de suite (ordre, classe, division (embranchement), règne). 1.4.2. Souche bactérienne Dans certains cas, les espèces sont elle mêmes subdivisées en sous espèce ou variants, désignant des souches différentiées par quelques critères stables. Une espèce comprend donc plusieurs souches : biovars (caractères biochimiques), sérovars (caractères antigéniques), antibiovars (sensibilité aux antibiotiques), pathovars (facteurs de pathogénicité), etc. 1.4.3. Espèce bactérienne La définition de l’espèce bactérienne donnée par l’ICSB (International Committee on Systematic Bacteriology) puis réactualisée par l’ICSP (International Committee on Systematic of Procaryotes), est exclusivement basée sur l’analyse de caractères génomiques. L’espèce bactérienne regroupe l’ensemble des souches considérées comme suffisamment proche de la souche type de l’espèce pour y être assimilées. La souche type de l’espèce ayant été au préalable clairement définie par les caractères génomiques retenus et déposées comme souche de référence. 1.4.3.1. Critères d’espèce Plusieurs paramètres de nature génomique ont été proposés pour définir l’espèce bactérienne mais l’évolution rapide des techniques et des connaissances ont amené les comités de l’ICSB puis l’ICSP, à revoir périodiquement la conformité de la définition de l’espèce bactérienne et à réadapter ses critères :  En 1980, elle est définie par 5 paramètres : * Coefficient G+C% ; * Taille du génome ; * Homologie ADN/ADN à Tor (Température optimale de renaturation) ; * Stabilité thermique des hybrides (ΔTm(e) : thermal elution midpoint) ; * Homologie ADN/ADN à température restrictive de renaturation (Trr).

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Chapitre 3 : La classification bactérienne  En 1987, elle est définie par 2 paramètres : * Hybridation ADN/ADN à Tor (Température optimale de renaturation) ; * Stabilité thermique des hybrides (ΔTm(e) : thermal elution midpoint).  En 2000, elle est définie par 4 paramètres : * Hybridation ADN/ADN à Tor (Température optimale de renaturation) ; * Stabilité thermique des hybrides (ΔTm(e) : thermal elution midpoint) ; * Coefficient G+C% ; * Séquençage de l’ARNr 16S. 2. Nomenclature C’est l'ensemble des règles utilisées pour donner un nom à chaque taxon. La nomenclature bactérienne utilise des mots latins ou latinisés qui sont traditionnellement écrits en italique ou ils sont soulignés dans un manuscrit. Les principaux régules de cette nomenclature sont les suivantes :  Aucun signe diacritique (á, à, â, ä, ã, é, è, ê, ë, í, î, ï...) n'est toléré et les mots ne doivent pas contenir de trait d'union.  Les noms de famille et de genre s’écrivent avec une majuscule ;  Les noms des espèces sont formés d'une combinaison binaire dont le premier terme est le nom de genre et d’un deuxième terme (« une épithète »). Le premier terme prend une majuscule et le deuxième terme commence par une minuscule (exemple : Escherichia coli).  Après une première citation, l’utilisation de la première lettre du nom de genre suivie d’un point puis de l’épithète est tolérée (exemple : E. coli).  Les noms des sous-espèces sont formés d'une combinaison ternaire commençant par le nom d’espèce suivi par l'abréviation « subsp. » et d’un troisième terme propre à la sous-espèce (exemple : Bacillus subtilis subsp. subtilis). 3. Identification L’identification d’une souche bactérienne ne peut se faire que par rapport à des espèces déjà définies et classées. Elle se fait sur une culture pure par la mise en évidence de plusieurs caractères phénétiques (phénotypiques) :  Observation microscopique avec ou sans coloration spécifique ;  Tests métaboliques primaires (type respiratoire, recherche de l’oxydase…) ;  Analyse du profil biochimique et la mise en évidence de métabolisme spécifique. 4. Méthodes de taxinomie La taxinomie classique est basée sur l’étude des caractères morphologiques et structuraux des bactéries, ainsi que sur leur profil métabolique. Parallèlement, se sont développées d’autres méthodes de taxinomie bactérienne bien plus fiable qui font appel à des techniques d’analyse de différents composés moléculaires génomiques ou dérivant du génome (la taxinomie moléculaire). 4.1. Taxinomie phylogénétique Les progrès de la biologie moléculaire ont permis de comparer les bactéries entre elles d’une manière plus rigoureuse. La classification est obtenue par la comparaison des molécules d’ADN des bactéries :

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Chapitre 3 : La classification bactérienne 4.1.1. Le coefficient G+C% Chaque base azotée est présente dans une certaine concentration molaire dans une molécule d’ADN donnée. Cette molécule d’ADN peut être caractérisée par le rapport molaire des bases :

Le contenu en bases puriques et pyrimidiques est le même chez tous les individus d’une même espèce et différents d’une espèce à l’autre. L’intervalle de variation du G+C % chez les bactéries est de 25 à 75%. Le pourcentage d’hétérogénéité du G+C % à l’intérieur d’une espèce bactérienne doit être inférieur à 5%. Le G+C% ne peut être qu’un critère d’exclusion ; il permet seulement d’affirmer que deux individus sont éloignés du point de vue génétique. En effet, des bactéries avec des G+C % significativement différents n’appartiennent certainement pas à la même espèce, ni probablement au même genre. Mais l’inverse n’est pas forcement vrai. 4.1.2. Hybridation ADN/ADN Cette méthode permet la comparaison de la totalité du génome de deux bactéries par la mesure du degré d’homologie des deux ADN. Les différentes techniques reposent sur le même principe : la renaturation in vitro de deux brins d’ADN hétérologues (chaque brin provenant de deux bactéries comparées) conduit à la formation d’un hétéroduplex. Le degré d’homologie est le pourcentage de séquences complémentaires par rapport aux séquences totales. 4.1.2.1. Homologie ADN/ADN à Tor La renaturation de l’ADN est maximale à une température définie, appelée température optimum de renaturation (Tor), inférieure de 25 à 30°C à la température de dénaturation. A Tor, l’homologie est de 70 à 100% entre souches appartenant à la même espèce. 4.1.2.2. Homologie ADN/ADN à Trr Dans le cas d’un appariement sans réelle homologie, l’hybridation est possible par quelques paires de bases se retrouvant au hasard en vis-à-vis. Ces liaisons seront encore moins nombreuses à se former si l’hybridation est réalisée à une température de renaturation défavorable supérieure à celle de la Tor. Cette température, fixée de 10 à 15°C en dessous de la température de dénaturation, est appelée température restrictive de renaturation (Trr). A Trr, les souches d’une même espèce bactérienne ont une homologie ADN/ADN de 55 à 100%. 4.1.3. Stabilité thermique des hybrides C’est la température de dénaturation de 50% des hybrides (Tm(e) : thermal elution midpoint). Ce paramètre est obtenu par élévation progressive de la température dans la solution d’ADN hybridé, au-dessus de la Tor. La comparaison des Tm(e), obtenues respectivement dans des réactions d’hybridation homologues prises comme témoins, et des réactions d’hybridation hétérologues permet d’obtenir une estimation précise de la stabilité thermique des hybrides hétérologues. Les souches appartenant à une même espèce bactérienne ont des ΔTm(e) comprise entre 1 et 5°C, soit aux environs de 5% des bases non appariées, alors que les souches d’espèces différentes présentent des ΔTm(e) situées entre 8 et 20°C. Enseignant : Hamames M.

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Chapitre 3 : La classification bactérienne 4.1.4. Séquençage de l’ARNr Les ARNr sont considérés comme des « chronomètres moléculaires » :    

Ils sont présents dans les cellules procaryotes et eucaryotes, Ils ont une structure bien conservée chez tous les êtres-vivants, Des portions d'ARNr ont une séquence identique chez tous les êtres vivants. Ils sont abondants dans la cellule, faciles à purifier et à séquencer (utilisation d’une reverse transcriptase).

Les ARNr s'associent à des protéines pour former les ribosomes. La sous-unité 30S d'un ribosome contient de l'ARNr 16S et la sous-unité 50S contient de l'ARNr 5S et de l'ARNr 23S. L'ARNr 5S est formé d'environ 120 nucléotides, l'ARNr 16S de 1 500 nucléotides et l'ARNr 23S comprend environ 2900 nucléotides. Le plus utilisé pour les études taxonomiques est l'ARNr 16S. Les travaux sur ces ARNr 16S ont permis de distinguer les Eubactéries (« bactéries vraies ») des Archaebactéries (ou Archéobactéries). Sur le plan méthodologique, deux approches sont utilisées : l’hybridation ADN/ARN (sur le même principe de de l’hybridation ADN/ADN) ou actuellement le séquençage comparatif des nucléotides des ARNr 16S ou de leurs gènes codants. Dans ce dernier cas, les séquences établies sont comparées à des catalogues d’oligonucléotides qui sont des banques de données issues des organismes déjà étudiés. 4.2. Taxinomie numérique De manière schématique, la méthode consiste à étudier, pour chaque souche, plus d'une centaine de caractères (30 à 300) morphologiques, biochimiques, culturaux, structuraux... et à attribuer le même poids à chacun des caractères qui sont codés 1 (présence du caractère) ou 0 (absence du caractère). Le but recherché est de rassembler dans une classe de similitude (phénon) les individus les plus semblables. L’analyse mathématique de quantités importantes de données concernant les caractères phénotypiques et moléculaires permet le calcul des distances existant entre différents groupes taxonomiques. Les résultats obtenus peuvent être représentés graphiquement sous forme de dendrogramme. En pratique, on se sert plutôt d’un indice de distance (d) qui le complément de l’indice de similitude (s) : d = (1 – s) Ces similitudes ou différences sont calculées en tenant compte des résultats d’une série de tests auxquels sont soumises les souches étudiées. On compare deux souches en tenant compte des résultats différents (D) et doublement positifs (P) et on ne tient pas compte des résultats doublement négatifs qui pourraient n’être pas discriminants. L’indice de distance entre les deux souches est donné par la formule :

On calcule cet indice pour chacun des couples de souches à classer. Si l’indice est égal à 0, les deux souches sont identiques, s’il est égal à 1, les deux souches sont totalement dissemblables pour les tests effectués. Les souches ayant les plus faibles indices sont les plus semblables et peuvent formées un groupe G1 dont on calculera, pour chacune des souches non incluses dans le groupe, un nouvel indice qui sera la moyenne des indices des constituants de G1. On forme ensuite un deuxième groupe G2 constitué des souches ou groupe les plus semblables. On calcule les indices de ce nouveau groupe et de proche en proche on pourra constituer un groupe unique qui contiendra toutes les souches soumises au classement. On peut ensuite dessiner le dendrogramme qui représente les relations de ressemblance entre les sujets et les groupes. Enseignant : Hamames M.

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Chapitre 3 : La classification bactérienne Cette méthode qui nécessite de nombreux calculs, a grandement bénéficié des outils informatiques qui en rendu l’utilisation plus accessible. Exemple :

Figure 01 : Tableau des indices de distance pour un classement de 5 souches bactériennes.

Figure 02 : Dendrogramme des 5 souches bactériennes testées. 

Classification de BERGEY’s Manual

La classification adoptée par la majorité des microbiologistes a été celle de Bergey, dont la première édition, intitulée Bergey’s manual of determinative bacteriology date de 1923. Elle a, elle-même, beaucoup évolué au cours de ses éditions successives. Contrairement à toutes les éditions passées, la 2ème édition de Bergey’s manual of systematic bacteriology (2001-2003) présente donc une classification phylogénétique des microorganismes. Elle comprend 5 volumes :     

Volume 1 (2001) : les Archaea et les Bacteria les plus anciennes et les Bacteria phototrophes ; Volume 2 (2001) : les Proteobacteria ; Volume 3 (2002) : les Bacteria Gram positif pauvres en GC ; Volume 4 (2002) : les Bacteria Gram positif riches en GC ; Volume 5 (2003) : les Planctomycetes, les Spirochaetes, les Fibrobacteres, les Bacteriodetes et les Fusobacteria.

Les volumes 2, 3, 4 et 5 ont fait l’objet d’une nouvelle édition respectivement en 2005, 2009, 2010 et 2012.

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