35 0 2MB
Biologie Celulara si Histologie
Curs 5 – Tehnici de biologie moleculara si inginerie genetica
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cuprins ⇨
The Human Genome project
⇨
Tehnici de genetica moleculara
⇨
Secventierea acizilor nucleici
PCR
Clonarea unor gene
Vectori
Transfectii
Animale transgenice; linii knock-out
Aplicatii ale ingineriei genetice
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
The human genome project
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
The human genome project
⇨
Proiect desfasurat pe durata a 13 ani: 1990 – 2003
⇨
Initiat de U.S. Dept. of Energy + National Institute of Health
Partener major: Wellcome Trust (UK)
Alte contributii: Japonia, Franta, Germania, China etc
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
The Human Genome Project Obiective
⇨ Identificarea
25000)
tuturor genelor din ADN-ul uman (in total 20-
⇨ Determinarea
intregii secvente de nucleotide din ADN-ul uman (aprox. 3 miliarde)
⇨ Crearea
unor baze de date cu aceste informatii
⇨ Perfectionarea ⇨ Transferul
de instrumente pentru analiza and
tehnologiilor catre sectorul privat
⇨ Identificarea
problemelor legale si etice care pot aparea si propunerea de solutii
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Continutul informational al genomului uman
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Probleme speciale legate de identificarea si localizarea genelor ⇨
Centromerii – contin secvente cu grad inalt de repetitivitate, dificil de mapat cu tehnicile actuale
⇨
Telomerele – contin la randul lor secvente repetitive, de multe ori sunt incomplete / se pierd partial la replicarea ADN-ului
⇨
Existenta multigenelor – locusuri cromozomiale care contin gene multiple, corelate functional si intricate, dificil de identificat individual
⇨
Aprox. 93% din ADN a fost efectiv cartografiat in prezent; studiul telomerelor si centromerilor ramane limitat de tehnologia actuala
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomul 1 ⇨
Cel mai mare dintre cromozomii umani; contine aprox. 8% din informatia genetica
⇨
Boli genetice:
⇨
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
▶
Parkinson
▶
Alzheimer
▶
Charcot-Marie Tooth (neuropatie ereditara)
In cancer apar frecvent modificari ale regiunilor sale terminale
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 2 si 4
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
⇨
Au cea mai mica rata de recombinare dintre cromozomii umani
⇨
Cromozomul 2 – unic prin provenienta (fuziunea a 2 cromozomi ancestrali)
⇨
Cromozomul 4: ▶
Boala Huntington
▶
Boala polichistica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 3, 5, 6 ⇨
⇨
⇨
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Cromozomul 3 ▶
Cea mai scazuta rata de duplicare segmentala
▶
Zone implicate in diferite cancere
Cromozomul 5 ▶
Redundanta informationala mare, continut genetic scazut
▶
Implicat in atrofia musculara spinala
Cromozomul 6 ▶
Contine cea mai mare secventa de codificare a ARN-t (activitate transcriptionala)
▶
Gene implicate in cancer, schizofrenie, autoimunitate Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 7, 8, 9 ⇨
Cromozomul 7 ▶
⇨
Cromozomul 8 ▶
⇨
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Gena CFTR - implicata in fibroza chistica
Contine o gena implicata in cresterea dimensiunii creierului la primatele mari
Cromozomul 9 ▶
Gene implicate in transsexualitate spontana (reversie de sex mascul → femela)
▶
Gene tumorale: leucemii, melanoame familiale etc Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 10, 11, 12, 13 ⇨
Cromozomul 10 ▶
⇨
Tumori, boli neurologice
Cromozomul 12 ▶
Leucemii, limfoame, alte cancere
▶
2 gene asociate diabetului
▶
⇨
Gene implicate in tulburari psihiatrice
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
⇨
Cromozomul 11 ▶
Unul dintre cei mai bogati in gene
▶
Numarul cel mai mare de gene ptr receptori olfactivi
Cromozomul 13 ▶
Contine gena cancerului de san (de tip II)
▶
Contine gena asociata retinoblastomului
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 14, 15, 16, 17 ⇨
Cromozomul 14 ▶
⇨
⇨
Gene pentru ARNr in bratul scurt
Cromozomul 16 ▶
Duplicare segmentala mare
▶
Gene implicate in boala polichistica renala, leucemii acute
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Cromozomul 15 ▶
⇨
Unul din cromozomii cu rata mare de duplicare segmentala
Cromozomul 17 ▶
Cea mai mare diferenta de structura dintre un cromozom uman si cromozomi similari mamalieni
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 18, 19, 20, 21 ⇨
Cromozomul 18 ▶
⇨
Translocarea 14-18 este una din cele mai comune cauze genetice de cancer la oameni
Cromozomul 20 ▶
▶
⇨
Contine gene prionice (boala Creutzfeld-Jacob) Implicat in diabetul zaharat de tip II, obezitate, cataracta, boala Graves
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Cromozomul 19 ▶
⇨
Gene implicate in hipercolesterolemia familiala si diabetul insulino-rezistent
Cromozomul 21 ▶
Cel mai mic cromozom
▶
O copie suplimentara (trisomie) determina sindromul Down
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 22, X, Y ⇨
Cromozomul 22 ▶
⇨
Cromozomul X ▶
⇨
Cromozomul sexual feminin
Cromozomul Y ▶
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Implicat in schizofrenie, alte boli psihiatrice
Cromozomul sexual masculin
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Exemplu – cromozomul 21
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/chooser.shtml
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Baze de date ⇨
NCBI Human Genome Sequencing Progress ▶
⇨
University of California (Santa Cruz) ▶
⇨
http://genome.ucsc.edu/
Ensembl Genome Browser (Wellcome Trust Sanger Institute & EMBL-European Bioinformatics Institute ▶
⇨
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/
http://www.ensembl.org/
EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory's Nucleotide Sequence Database) ▶
http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Aplicatii, beneficii din urma HGP ⇨
⇨
Medicina moleculara:
Diagnostic timpuriu al bolilor / predispozitiilor la o boala
Design rational de medicamente
Terapie genica
Farmacogenomica
Aplicatii energetice si de ingineria mediului
Aplicatii de genomica microbiana pentru a obtine biocombustibili, sisteme de detectare a poluantilor, tehnici de purificare a mediului
⇨
Bioarheologie si antropologie
⇨
Medicina legala
⇨
Agricultura
Genetically modified foods (GMF)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Patentarea genelor, secventelor genetice ⇨
Se poate face atunci cand:
Este identificata o noua secventa genetica
Este specificat produsul (proteina) secventei genetice respective
Este specificata functia produsului respectiv
Este dezvoltata o metoda de valorificare a produsului genei, care poate fi utilizata de specialisti din domeniu
⇨
Patentele sunt pe o perioada de 20 de ani
⇨
Patentarea prespune si punerea la dispozitie a intregii informatii referitoare la produsul patentat
⇨
Informatii suplimentare (argumente pro/contra, situatia legala in USA etc): http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/patents.shtml
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Tehnici de genetica moleculara
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Secventierea ADN ⇨
Reprezinta succesiunea de proceduri utilizate pentru identificarea secventei de nucleotide intr-un lant de and
⇨
Metode de baza: ▶
▶
Secventierea chimica (Maxam – Gilbert)
Bazata pe inducerea unor modificari chimice ale ADN-ului si apoi clivarea lantului la nivelula cestor modificari
Utilizata in prezent doar in domenii restranse (studiul interactiunilor ADNproteine etc)
Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger)
Necesita: un lant simplu de ADN (single-stranded), un primer (secventa de ADN care serveste ca punct de plecare a polimerizarii), ADN-polimeraza si nucleotide marcate radioactiv sau fluorescent
Fragmentele sintetizate sunt denaturate termic si separate prin electroforeza pe gel si autoradiografie / fotografie UV
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Alte metode de secventiere
Electroforeza capilara
Dye-termination method DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Clonare in vectori bacterieni Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Secventierea ADN Metoda shotgun ⇨
Cromozomii sunt taiati in fragmente mai mici
⇨
Fiecare fragment este folosit ca matrita pentru crearea unor fragmente noi, care difera de original printr-o singura baza (care urmeaza a fi identificata intr-o etapa ulterioara)
⇨
Fragmentele dintr-un set sunt separate prin electroforeza pe gel
⇨
Markeri fluorescenti de generatie noua permit separarea fragmentelor din cadrul aceleiasi benzi de migrare in gel
⇨
Se identifica ultima baza azotata din fiecare fragment – se recreaza astfel secventa originala de A – T – C – G pentru fiecare fragment
⇨
Rezultatele sunt analizate de sisteme de secventiere automate, obtinandu-se o cromatograma in 4 culori, cu varfuri corespunzatoare celor patru baze azotate
⇨
Dupa “citirea” bazelor, secventele scurte sunt reconstituite pe calculator si este analizata structura lor din punctul de vedere al tipului de informatie genetica stocata.
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Exemplu (principiu de baza)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
PCR = polymerase chain reaction ⇨
Reactie de copiere si amplificare a informatiei ADN
⇨
Necesita:
⇨
Fragmentul de ADN-ul care se doreste a fi amplificat
Primeri = secvente de nucleotide complementare celor doua capete ale lantului de ADN
ADN-polimeraza
Nucleotide
Buffer, ioni divalenti
Utilizare:
Secventializarea ADN-ului (“citirea” informatiei genetice)
Clonari
Scopuri diagnostice
Crearea de plasmide, vectori pentru utilizarea in ingineria genetica
Scopuri criminalistice
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
PCR
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Clonari de gene
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Clonari de gene ⇨
Clonare moleculara = izolarea unei anumite portiuni de ADN si realizarea de copii multiple ale acesteia
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro10.swf DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Vectori ⇨ Sunt
molecule de ADN utilizate pentru transferarea de material genetic strain intr-o celula
⇨ Tipuri
de vectori:
Plasmide Bacteriofagi, alte virusuri Cromozomi artificiali
⇨ Transferul
de material genetic intr-o celula = Transfectie
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Plasmide ⇨
Fragmente de ADN dublu spiralat, de obicei circulare
⇨
Capabile de autoreplicare
⇨
Se pot integra sau nu in genomul celulei gazda
⇨
Origine bacteriana / sinteza in vitro
⇨
Utilizare in transfectii, terapie genica Wikimedia Commons
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120082/bio35.swf DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Vectori virali ⇨
Bacteriofagi – virusuri care infecteaza bacterii
⇨
Retrovirusuri – se integreaza in genom, se replica o data cu celula gazda
⇨
Lentivirusuri (subclasa a Retrovirusurilor)
⇨
Adenovirusuri – nu se integreaza in genom, nu se replica o data cu celula gazda (utilizare limitata; genereaza un raspuns imun puternic → utilizare in crearea de vaccinuri)
CONDITII DE UTILIZARE: Nepatogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene ● Toxicitate redusa pentru celulele pe care le infecteaza ● Stabilitate – sa nu prezinte mutatii frecvente ● Specificitate pentru o anumita linie celulara ●
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Vectori virali Bacteriofag
Vector lentiviral Wikimedia Commons Wikimedia Commons
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomi artificiali ⇨ Cromozomi
de drojdie (YAC – yeast artificial chromosome)
⇨ Cromozomi
bacterieni (BAC)
⇨ Cromozomi
umani (HAC) – functioneaza ca un cromozom suplimentar (47), sunt multiplicati la diviziunea celulara; pot fi utilizati pentru introducerea in celula de gene noi
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Transfectii ⇨
Reprezinta transferul intr-o celula de material genetic strain, cu ajutorul unui vector
⇨
Metode: ✗
Utilizarea unor plasmide + a unei modalitati de destabilizare temporara a membranei celulare, pentru a permite intrarea ADN-ului plasmidic in celula ➔
➔
➔
➔
✗
Metoda fosfatului de calciu (istorica; functioneaza!) Utilizare de lipozomi in care este inclus plasmidul, si care fuzioneaza cu membranele celulare Utilizare de polimeri cationici de care se ataseaza ADN-ul, care ulterior sunt introdusi in celule prin endocitoza Electroporare, ultrasonoporare, magnetoporare, soc termic etc.
Utilizarea de vectori virali: ➔
Transfer mai simplu; are loc infectia celulelor care vin in contact cu virusul modificat genetic, infectie care se propaga rapid in toata cultura de celule
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Animale transgenice ⇨
Crearea, in scopuri de cercetare, a unor linii de animale de laborator (soareci, sobolani etc), ce prezinta o anumita mutatie a unei gene
⇨
Utilitate: ➔
➔
Modele pentru anumite boli Studierea implicarii anumitor gene in anumite lanturi de control, in aparitia anumitor maladii
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Expert Reviews in Molecular Medicine, Vol. 5; 7 April 2003 Generation of YAC-transgenic mice Kenneth R. Peterson
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Linii knock-out ⇨
Linii de organisme modificate genetic (de obicei soareci), la care una sau mai multe gene au fost blocate de la expresie
⇨
Utilizate in studiul patogeniei unor boli
Wikimedia Commons
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Wikimedia Commons Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Aplicatii ale ingineriei genetice
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Aplicatii ale ingineriei genetice
⇨
Screening genetic
⇨
Vaccinuri
⇨
Sinteza de proteine in vitro (ex: insulina!)
⇨
Terapie genica
⇨
GMF/O
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Screening genetic ⇨
Analiza informatiei genetice din ADN-ul unei persoane
⇨
Aplicatii:
Screening al purtatorilor (identificarea persoanelor care poseda o gena din doua necesare transmiterii unei boli genetice)
Diagnostic prenatal
Teste in perioada presimptomatica la persoanele cu risc pentru boli genetice (Coree Huntington, Alzheimer, cancer de san, etc)
Medicina legala
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Terapie genica ⇨
Introducerea in genom a unei gene normale (clonata), care sa inlocuiasca gena cu defect cauzatoare a unei boli genetice
⇨
Cum se introduce gena?
Vectori:
Retrovirusuri Adenovirusuri Virusuri herpes simplex
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Terapia genica ⇨
Probleme actuale de rezolvat:
Durata scurta a efectului – in prezent, integrarea genei in genom este de scurta durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie
Controlul raspunsului imun – declansat de prima sedinta de terapie, accentuat la repetarea sedintei
Probleme speciale legate de vectorii virali – efecte adverse nedorite (raspuns inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun, posibilitatea redobandirii virulentei odata incorporat in genomul gazdei)
Bolile multigenice – dificultati in identificarea tuturor genelor implicate, ale tipului de intricare functionala; dificultati in inlocuirea tuturor regiunilor de genom implicate
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Terapia genica ⇨
Rezultate semnificative in prezent: ▶
2008: UCL Institute of Ophthalmology and Moorfields Eye Hospital NIHR Biomedical Research Centre – ameliorarea vederii in urma terapiei genice a unei forme ereditare de cecitate
▶
2007: University of Texas M. D. Anderson Cancer Center and the University of Texas Southwestern Medical Center - un studiu pe soareci, cu o combinatie de terapie genica + tehnici nanotehnologice de introducere a genelor au indus scaderea semnificativa a volumului unor tumori pulmonare
▶
2006: National Cancer Institute (NCI) – au obtinut limfocite modificate genetic care ataca cu succes celule tumorale de melanom malign
▶
2006: tratarea cu succes prin terapie genica a unor pacienti suferind de sindroame mieloide
▶
2005: tratata cu succes surditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la hamsteri, prin introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule cohleare
▶
Alte rezultate promitatoare – deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de laborator sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie etc
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Farmacogenomica ⇨
Studiul felului in care bagajul genetic al unui individ afecteaza raspunsul organismului la medicamente
http://www.freewebs.com/pharmacogenomics/impactonyou.htm
⇨
Informatii suplimentare: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica
Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara