BIOCEL Carte PDF Umftvb [PDF]

Zitiervorschau

Capitolul I CELULA CA SISTEM BIOLOGIC DESCHIS Obiectul de studiu al Biologiei Celulare şi Moleculare îl constituie modul de organizare structurală, ultrastructurală, precum şi legile de desfăşurare a proceselor vitale comune tuturor celulelor. Altfel spus, într-o formulă lapidară, studiază o celulă ideală (Gh. Benga, 1985) şi nu diferite tipuri de celule specializate cum ar fi neuronii, hematiile, celulele musculare etc.; cu acest studiu se ocupă citologia. Celula poate fi definită ca fiind unitatea elementară a lumii vii, produs al unei îndelungate evoluţii, cu o ordine internă complexă care îi conferă caracterele de creştere, dezvoltare şi reproducere cu organizare dinamică, aflată în relaţii de echilibru cu mediul înconjurător (I. Diculescu). Biologia Celulară şi Moleculară s-a conturat ca o disciplină nouă în ultimele decenii ale secolului nostru, datorită perfecţionării metodelor de investigare şi a progreselor conceptuale care au permis acumularea de noi date şi totodată reevaluarea ştiinţifică a celor vechi. Constituie rezultatul unei îndelungate evoluţii, se află într-un continuu progres care sintetizează cunoştinţele biomedicale şi şterge graniţele artificiale dintre morfologie (citologie), biochimie celulară, fiziologie celulară, genetică moleculară, farmacologie etc., asigurând cunoaşterea sintetică a proceselor vitale. Ea concepe celula ca un adevărat microcosmos în care structurile şi funcţiile se îmbină armonios; activitatea acestui microcosmos este determinată şi reglată genetic, astfel că funcţionarea sa se realizează cu o mare eficienţă. 1. TEORIA SISTEMICĂ Modul dominant de gândire într-o anumită epocă s-a răsfrânt şi asupra metodologiei de cercetare. Ca toate ştiinţele, cercetarea naturii a parcurs etape progresive de cunoaştere: • În cursul Evului Mediu, marcat de gândirea mistică, încercările timide de cunoaştere a naturii au fost dominate de metoda scolastică. Ea consta doar în comentarea textelor permise, traduceri şi interpretări neştiinţifice. • Gândirea metafizică mecanicistă a secolelor XVI-XVIII a avut drept cauză şi totodată efect apariţia metodei analitice denumită apoi carteziană. Ea este prima metodă ştiinţifică de cercetare a naturii necesară si larg aplicată, dar insuficientă. În domeniul biologic metoda constă în analiza cât mai profundă şi mai corectă a structurilor şi mecanismelor concrete ale diferitelor procese biologice. Această analiză se perfecţionează pe măsura dezvoltării diferitelor

tehnici. Rezultatele obţinute în această direcţie reprezintă principalul merit al metodei. Th. Dobzhansky şi E. Boesinger (1968) şi G.G. Simpson (1969) citaţi de Botnariuc (1976) numesc această metodă şi reducţionistă, relevând prin acest termen neajunsul ei principal: tendinţa de a explica însuşirile, legile întregului, prin reducerea lor la legile, însuşirile părţilor componente. Reducţionismul este de fapt o anumită interpretare a relaţiilor dintre parte şi întreg. • În secolul XIX, secolul apariţiei şi consolidării gândirii evoluţioniste şi în primele decenii ale secolului XX, această gândire se concretizează în metoda istorică (darwiniană). Esenţa metodei constă în aceea că orice structură sau funcţie biologică, fiecare mecanism concret ce caracterizează materia vie sunt privite ca un rezultat al unui proces de dezvoltare istorică a vieţii. Prin această metodă se tinde la clarificarea valorii, a semnificaţiei evolutive şi totodată adaptative a structurilor şi proceselor biologice. În timp ce metoda carteziană lămureşte componenţa întregului, mecanismele proceselor, legităţile de structură şi funcţie, metoda istorică lămureşte originea acestor mecanisme, caracterul lor adaptativ şi semnificaţia lor în desfăşurarea evoluţiei. • A apărut evident că metoda analitică şi cea istorică nu se opun, ci au un caracter complementar, ceea ce face necesară aplicarea lor concomitentă. Aceasta aplicare a dus la rezultate importante în dezvoltarea concepţiei evoluţioniste, reprezentată prin neodarwinismul actual sau teoria sintetică a evoluţiei, ilustrată prin lucrările unor eminenţi biologi, ca J.S. Huxley, I.I. Smalgausen, B. Rensch, E. Mayr etc. • Analiza deficienţelor teoriei sintetice, sesizate adesea chiar de reprezentanţi de seamă ai ei, precum şi încercările de a le depăşi, arată că neajunsul principal constă în neglijarea unui aspect esenţial, acela al organizării materiei vii. La ora actuală, metoda ştiinţifică de cercetare a naturii este reprezentată de teoria sistemică. Ideea de bază a teoriei sistemice este aceea că întreaga materie, atât cea lipsită de viaţă cât şi cea vie, este organizată în sisteme ierarhizate. Orice sistem este alcătuit din subsisteme şi la rândul sau devine parte componentă (subsistem) a unui sistem mai cuprinzător. Fiecare sistem se comportă ca un întreg şi în cadrul ierarhiei relaţiile dintre sistemele ierarhizate sunt relaţii dintre parte şi întreg. În cadrul acestor interacţiuni, metoda sistemică permite reevaluarea modului în care conexiunile părţilor componente duc la apariţia unor noi însuşiri ale întregului şi invers, a modului în care întregul influenţează însuşirile părţilor componente. După definiţia lui Ludwig von Bertalanffy (1960) un sistem reprezintă "un ansamblu de elemente aflate în interacţiune". Esenţial este faptul că legăturile şi interacţiunile dintre elementele sistemului fac ca sistemul să se comporte ca un întreg, ca un tot, faţă de sistemele înconjurătoare. Menţinerea sistemului va depinde

de gradul şi de modul lui de organizare, de felul cum funcţionează, de capacitatea lui de a contracara într-un fel sau altul acţiunile exterioare care în general tind să îl dezorganizeze. În funcţie de schimburile pe care le realizează cu mediul înconjurător, sistemele se clasifică în trei categorii: sisteme izolate, sisteme închise şi sisteme deschise. Sistemele izolate sunt acele sisteme care nu fac nici un fel de schimburi (materiale sau energetice) cu mediul înconjurător. În natură asemenea sisteme nu există, ele sunt postulate doar teoretic (ipotetice). Postularea teoretică a unor asemenea sisteme este utilă şi chiar necesară deoarece ele reprezintă starea "ideală" a unui sistem. Ştiinţele operează cu asemenea stări ideale, inexistente în natură, dar necesare teoretic. Sistemele închise sunt sisteme care stabilesc schimburi energetice cu mediul înconjurător, fără a face şi schimburi materiale. De exemplu, un vas cu apă ermetic închis nu va avea cu mediu schimburi materiale ci doar energetice: dacă aerul înconjurător se va răci, apa va ceda din căldura ei, iar dacă se va încălzi, apa va absorbi căldura. Din punct de vedere termodinamic, sistemele închise evoluează spre starea termodinamică cea mai probabilă, în care energia liberă a sistemului tinde către minim, iar entropia tinde către valoarea maximă. O asemenea evoluţie duce deci la nivelarea termodinamică a sistemului faţă de mediul înconjurător. Sisteme apropiate de cele închise pot exista în condiţii naturale. Sistemele deschise sunt acele sisteme care stabilesc schimburi de materie şi energie cu mediul ambiant. În această categorie sunt cuprinse o mare diversitate de sisteme lipsite de viaţă, precum şi toate sistemele biologice. Deoarece noţiunea de sistem deschis este mai largă decât cea de sistem biologic, este necesară o caracterizare diferenţiată a celor două noţiuni. Din punct de vedere sistemic, celula reprezintă un sistem deschis biologic. 2. LOCUL CELULEI ÎN ORGANIZAREA IERARHICĂ A LUMII VII Întreaga natură este organizată în sisteme de diferite ordine şi grade de complexitate. Sistemele, atât cele anorganice cât şi cele biologice, nu sunt izolate unele de altele ci se află în diferite corelaţii, constituind succesiuni de sisteme ierarhizate. Ierarhia sistemelor rezultă din faptul că orice sistem este alcătuit din subsisteme şi la rândul său intră în alcătuirea unui alt sistem, mai vast. Ierarhia sistemelor reprezintă deci un fenomen obiectiv, o trăsătură esenţială a organizării materiei. La ora actuală se acceptă faptul că din punct de vedere organizatoric lumea vie prezintă două nivele de organizare: nivelul de organizare morfofiziologică sau individuală şi nivelul supraindividual (fig.I.1).

IERARHIA NIVELELOR DE ORGANIZARE SUPRAINDIVIDUALĂ

IERARHIA NIVELELOR DE ORGANIZARE INDIVIDUALĂ

BIOSFERĂ ↑↓ BIOCENOZĂ ↑↓ SPECIE ↑↓ ORGANISM ↑↓ SISTEME ↑↓ APARATE ↑↓ ORGANE ↑↓ ŢESUTURI ↑↓ CELULĂ ↑↓ ORGANITE ↑↓ MACROMOLECULE ↑↓ MOLECULE ↑↓ ATOMI ↑↓ PARTICULE SUBATOMICE

Fig. I.1. Locul celulei în organizarea ierarhică a lumii vii

a) nivelul de organizare morfofiziologică sau ierarhia individuală. Constă în ierarhia morfofiziologică a sistemelor de control din interiorul unui individ, indiferent de gradul lui de complexitate. Aceste sisteme sunt integrate în mod organic în corpul unei fiinţe, neavând o existenţă de sine stătătoare, deci având un grad redus de libertate. Ele sunt elemente componente ale unui organism aflate în relaţii de subordonare şi coordonare, începând de la sisteme intracelulare, de nivel molecular, apoi celule, ţesuturi, până la organismul ca sistem integral. La organismele unicelulare (protiste), componenţa ierarhiei morfofiziologice se opreşte la celulă. În această situaţie celula reprezintă un organism

monocelular de sine stătător. b) nivelul supraindividual. Fiecare individ aparţine unei specii (populaţii). Pentru nivelul supraindividual, nivelul inferior este reprezentat de individ. O populaţie trăieşte în cadrul unei biocenoze. Biocenoza împreună cu biotopul alcătuiesc ecosistemul. Mai multe ecosisteme la un loc alcătuiesc biosfera. În cadrul acestei scheme, celula este un sistem în raport cu subsistemele sale: organite, structuri macromoleculare, molecule, atomi şi particule subatomice; iar în raport cu ţesutul din care face parte, celula devine un subsistem. În acelaşi timp, ea este considerată a fi punctul nodal de la care începe viaţa. 3. CARACTERELE SISTEMELOR 3.1. CARACTERUL ISTORIC

Pentru a putea explica organizarea şi comportarea unui sistem biologic nu este suficientă cunoaşterea parametrilor săi actuali, ci trebuie cunoscute şi istoria sistemului, trecutul lui, legăturile lui de înrudire. Însuşirile unui organism reprezintă rezultatul interacţiunii genotipului său cu mediul concret în care îşi desfăşoară activitatea. Celula ca sistem s-a format în decursul timpului, ca rezultat al evoluţiei filogenetice. Primele celule, archebacterium, au apărut acum 3,5 miliarde de ani, iar eucariotele acum 1,5 miliarde de ani (fig. I.2). Diversificarea lumii vii a început acum 600 milioane de ani, ultima apariţie filogenetică ca specie fiind Homo sapiens sapiens.

Fig.I.2. Evoluţia eucariotelor actuale 3.2. CARACTERUL INFORMAŢIONAL

Având un caracter istoric, sistemele biologice moştenesc de la sistemele

ascendente un important stoc informaţional la care se adaugă propria informaţie dobândită prin relaţia cu mediul. Sistemele informaţionale utilizează transformările energetice ca mijloc pentru recepţionarea, prelucrarea, acumularea şi transmiterea informaţiilor. Unitatea informaţională a celulei este înscrisă în codul genetic şi este reprezentată de codon (un codon semnifică un aminoacid). În procesele de transmitere a informaţiei în sau între sistemele biologice, mărirea stabilităţii şi asigurarea fidelităţii mesajelor este determinată de repetarea lor. De exemplu, caracterul diploid al garniturii cromozomiale în celulele organismelor, repetarea acestei garnituri în toate celulele nucleate, multiplicarea patrimoniului genetic, mai mult sau mai puţin complet, sunt fenomene de redundanţă care cresc stabilitatea informaţiei biologice în existenţa speciei. Mai mult, un anumit număr dintre celulele nervoase, glandulare, sanguine este de o importanţă vitală pentru autoconservarea organismului şi deci pentru realizarea în final a reproducerii. Fenomene ca poliploidizarea garniturii cromozomiale, "suprapopulaţia" în termenii concepţiei informaţionale, pot fi interpretate ca reprezentând o redundanţă excesivă care denaturează mesajul şi devine dăunătoare menţinerii sistemului biologic dat. Faptul că succesiunea semnalelor este cea care determină conţinutul informaţional ne arată legătura dintre gradul de organizare al sistemului şi cantitatea de informaţie. Această informaţie este conţinută în structura sistemului, deci în configuraţia lui spaţială şi în conexiunile temporale ale părţilor lui componente. 2.3. CARACTERUL DE PROGRAM

Acest parametru este legat de capacităţile structurale şi funcţionale ale sistemului. Factorii interni determină modul de reacţie al sistemului la stimuli externi dar şi modul în care va acţiona sistemul asupra mediului. Structura unui sistem biologic nu este rigidă, la fel şi modul său de funcţionare. Relaţiile sistemelor biologice cu mediul schimbător presupun capacitatea fiecărui sistem de a realiza diferite stări. Aceste stări nu pot depăşi anumite limite impuse de capacităţile structurale şi funcţionale ale sistemului. Un program reprezintă tocmai una dintre stările posibile pe care le poate realiza sistemul, în limitele permise de organizarea sa. Deoarece orice sistem are mai multe stări posibile, înseamnă că el are totodată mai multe programe. În orice sistem putem distinge trei categorii de programe: • programe pentru sine reprezentate de programele structurale, funcţionale care asigură autoconservarea sistemului dat. De exemplu stările care asigură capturarea, devorarea, digerarea hranei, apărarea etc. • programe inferioare reprezentate de programele subsistemelor componente. În cazul unui organism monocelular acestea sunt programele organitelor, ale complexelor moleculare. În cazul unui organism complex acestea sunt programele

ţesuturilor, organelor, sistemelor de organe. • programe superioare sunt programele sistemului dat având drept scop asigurarea existenţei sistemului superior în care este integrat. La un organism, în această categorie intră programele care asigură reproducerea şi înmulţirea, deci îndeplinirea funcţiei lor în viaţa speciei. O ilustrare a existenţei ierarhiei programelor o prezintă modificările suferite de celulele scoase dintr-un ţesut (sistem superior) şi cultivate izolat. În cultură, celulele celor mai multe ţesuturi îşi pierd specificul citologic. De exemplu, celula acinoasă a pancreasului are o polaritate bine pronunţată in situ. Această polaritate se pierde in vitro, celulele formează o peliculă pe suprafaţa mediului de cultură, morfologia celulei se modifică în funcţie de condiţiile create. Celulele epiteliale renale în culturi devin fuziforme, complet diferite de cele din cadrul ţesutului. Ele devin aproape identice morfologic şi comportamental cu clonele obţinute din diferite alte surse: fibroblastele din piele, osteocite, hepatocite etc. Acest fapt demonstrează că în cultură se menţin programele proprii celulare, "pentru sine", care asigură viabilitatea celulelor, în timp ce programul superior care reflectă specificul funcţional al celulei în cadrul ţesutului integral şi al organismului, dispare. Dispar structurile specifice care deserveau nu nevoile proprii celulei, ci acelea ale sistemului superior. Toate acestea demonstrează încă o dată rolul integralităţii sistemului. 3.4. CARACTERUL DE ECHILIBRU DINAMIC

Starea caracteristică a sistemelor biologice este echilibrul dinamic. Organismul ca întreg nu este niciodată într-un adevărat echilibru şi procesele legate de metabolism (anabolism, catabolism) duc doar la o stare staţionară, menţinută la o distanţă constantă de echilibrul adevărat, printr-un continuu flux de intrare şi ieşire, de construire şi degradare a materialelor componente (L.von Bertalanffy). Altfel spus, echilibrul dinamic reprezintă starea de continuă îmbinare a stabilităţii şi schimbării; în orice moment sistemul este altul prin schimburile pe care le realizează cu mediul înconjurător. Când echilibrul dinamic încetează, sistemul moare. O altă consecinţă a stării de echilibru dinamic este faptul că în timp ce sistemele nebiologice evoluează întotdeauna în sensul creşterii entropiei, deci în sensul dezorganizării lor şi al realizării echilibrului termodinamic, sistemele biologice au capacitatea de a compensa creşterea entropiei şi de a o depăşi pe seama surselor de energie exterioare sistemului. Ele au deci un comportament antientropic. Această însuşire permite sporirea cantităţii de substanţă organică în sistemele biologice, asigură productivitatea biologică şi stă la baza evoluţiei cel puţin sub aspect cantitativ. 3.5. CARACTERUL DE INTEGRALITATE

O trăsătură însemnată a sistemelor deschise care interesează îndeaproape

sistemele biologice este integralitatea. Ea constă în faptul că un sistem nu se reduce la suma însuşirilor părţilor sale componente. Sistemul privit ca un tot prezintă însuşiri structurale şi funcţionale noi, pe care părţile componente luate izolat nu le au. Integralitatea apare ca rezultat al diferenţierii structurale şi funcţionale a părţilor componente ale sistemului. Această diferenţiere determină în mod necesar dependenţa reciprocă a părţilor şi deci integrarea lor. Cu cât diferenţierea părţilor este mai mare, cu atât independenţa lor va fi mai mică ceea ce va creşte gradul de integralitate al sistemului. Odată apărută integralitatea, adică odată apărute trăsăturile structurale (organizatorice) şi funcţionale noi ale întregului, ea poate deveni cauza unor diferenţieri structurale şi funcţionale în cadrul sistemului dat, ceea ce va conduce la îmbogăţirea conţinutului său informaţional. Între gradul de dezvoltare al integralităţii sistemelor deschise şi organizarea lor există o strânsă interdependenţă. Dezvoltarea integralităţii reprezintă dezvoltarea organizării sistemului, înseamnă dezvoltarea cantitativă şi calitativă a legăturilor dintre elementele sistemului. Prin creşterea heterogenităţii structurale şi funcţionale ale sistemului, prin creşterea canalelor de comunicaţie între părţile sistemului, precum şi a sistemului ca întreg cu exteriorul, creşte viteza de reacţie deci eficacitatea funcţionării, atât a componentelor sistemului cât şi a sistemului ca întreg. 3.6. CARACTERUL DE AUTOREGLARE

Menţinerea unui sistem biologic ca un tot, deci menţinerea integralităţii sale, nu este posibilă decât dacă sistemul posedă mijloace prin care să controleze procesele sale interioare în funcţie de relaţiile pe care le stabileşte cu mediul. Deci autoreglarea reprezintă capacitatea sistemului de a-şi controla procesele interioare în relaţia cu mediul în vederea menţinerii homeostaziei, respectiv a integralităţii şi echilibrului dinamic. Influenţele mediului tind permanent să dezechilibreze sistemul, să-1 dezorganizeze. Sistemele biologice prezintă mecanisme de autoreglare care funcţionează pe principiul sistemelor cibernetice. Sistemul cibernetic are o organizare care îi permite recepţia informaţiei, circulaţia ei între elementele sistemului, acumularea şi prelucrarea ei, selecţia răspunsului celui mai potrivit din mai multe posibile, precum şi realizarea unui răspuns faţă de stimulul primit. Pentru a realiza aceasta, mecanismele cibernetice dispun de un receptor (R), un centru de prelucrare şi comandă (C) şi un efector (E) (fig.I.3). Autoreglarea se realizează pe două căi: • calea conexiunii directe. Stimulii din mediu acţionează asupra receptorului, acesta transmite mesajul la centrul de prelucrare şi comandă; de aici se realizează transmiterea la efector care realizează răspunsul. • calea conexiunii inverse. Pentru ca autoreglarea să devină posibilă,

răspunsurile sistemului trebuie să fie comparate, pe o cale sau alta, cu comanda. Acest lucru se realizează prin conexiune inversă sau feed-back. Semnalele pornite de la receptor şi apoi comanda către efector reprezintă ceea ce trebuie să se obţină în procesul reglării; semnalul venit de la efector prin conexiune inversă la receptor reprezintă ceea ce s-a realizat în mod concret. Diferenţa dintre primul şi al doilea semnal va constitui un nou stimul, un nou semnal, care la rândul său va acţiona asupra mecanismului de reglaj. După acelaşi principiu funcţionează multe sisteme fiziologice de homeostazie: reglarea cantităţii de glucoză din sânge, reglarea temperaturii corpului, a presiunii sângelui ca şi a altor parametri fizici sau chimici ai mediului intern, mişcările respiratorii, fluxul de lumină ce cade pe retină etc. Pe acelaşi principiu se bazează o serie de sisteme biologice din nivelul supraindividual: numărul indivizilor dintro populaţie, structura polimorfă a populaţiilor, proporţiile dintre diferitele populaţii ale unui ecosistem.

Fig.I.3. Schema ciclului de informaţie

Conexiunea inversă, rezultat al interacţiunii părţilor sistemului este un fenomen universal, comun sistemelor deschise din cele mai diferite domenii: astronomic, tehnic, biologic şi chiar social. Deci în cadrul sistemelor biologice, parametrii lor pot fi controlaţi pe căi multiple. Cu cât sistemul este mai bine organizat, mai complex, mai evoluat, cu atât acest control multiplu este mai accentuat, răspunsurile pot fi mai diversificate, mai fin coordonate. La nivel celular, autoreglarea se realizează pe trei căi: • conexiunea directă este exemplificată de teoria reglajului genic care demonstrează că celulele îşi sintetizează componentele utile în anumite cantităţi şi la timpul necesar; • conexiunea inversă se realizează pe seama ciclurilor metabolice; • controlul structural se realizează pe seama membranelor celulare (ecto şi endomembrane) care compartimentează celula. Datorită permeabilităţii selective a membranelor are loc controlul efluxului şi influxului de materie, respectiv materie

şi energie. Altfel spus, celula ar putea fi comparată cu o mare "uzină de prelucrare" în cadrul căreia fiecare organit poate fi comparat cu un vas de reacţie în care, datorită enzimelor specifice, au loc reacţii specifice, menţinute la acest nivel datorită compartimentării realizate de membrane. 3.7. CARACTERUL DE HETEROGENITATE

Heterogenitatea reprezintă capacitatea sistemelor de a fi alcătuite din mai multe componente, deci de a fi mai mult sau mai puţin heterogene. Orice sistem biologic este alcătuit din sisteme mai mult sau mai puţin diferite. Tendinţa evolutivă generală a sistemelor biologice de orice nivel este în sensul creşterii heterogenităţii interne. Prin urmare există un anumit grad de heterogenitate, o heterogenitate optimă care asigură cel mai bine menţinerea sistemului în condiţiile concrete ale existenţei sale şi care reprezintă deci strategia dezvoltării sale.

Capitolul II

CLASIFICAREA LUMII VII DIN PUNCT DE VEDERE AL ORGANIZĂRII CELULARE

1. FORME ACELULARE DE VIAŢĂ Prionii sunt agenţi infecţioşi care se replică în celula gazdă prin copierea unei structuri proteice aberante. Se pot forma în levuri şi provoacă diverse maladii degenerative la mamifere. Maladia cea mai cunoscută provocată de prioni este encefalopatia spongiformă bovină (boala vacii nebune), boală care se poate transmite ocazional la om în cazul ingestiei de carne infectată. Virusurile sunt agenţi infecţioşi care se replică în celula gazdă prin copierea propriului material genetic. Prezintă o structură simplă formată dintr-un acid nucleic (ADN sau ARN) învelit într-o capsidă proteică. La unele virusuri, capsida este înconjurată de o anvelopă lipoglicoproteică de formă şi dimensiune

diferită (fig.II.l). Virusurile se pot multiplica doar în interiorul unei celule gazdă utilizând energia şi aparatul de sinteză proteică al acesteia. În general, replicarea implică dezasamblarea particulei virale, replicarea genomului viral, sinteza proteinelor virale, reasamblarea componentelor cu formarea particulelor virale fiice (fig.II.2.). Efectul major celular al infecţiei virale depinde de forma sa de organizare structurală : • În cazul virusurilor fără anvelopă, o particulă virală (virion) poate produce mii de cópii virale ceea ce va conduce la moartea celulei gazdă. Celula gazdă este lizată şi permite în acest fel accesul virusurilor nou formate la celulele vecine (de exemplu moartea celulelor epidermice din zona cutanată afectată de virusurile herpes simplex şi al variolei). • Virusurile cu anvelopă lipoproteică pot părăsi celula fără să distrugă membrana plasmatică, deci fără să o omoare. Acestea pot provoca infecţii cronice (HIV, virusul hepatitei B, C, D), iar unele dintre ele determină transformarea celulei infectate în celulă malignă (ex.papilloma virus implicat în etiologia cancerului de col uterin, virusul Epstein-Barr implicat în etiologia anumitor tipuri de limfoame).

Fig.II.1. Exemple de morfologie virală (după Alberts, 2002)

Fig.II.2. Schema ciclului de viaţă al virusurilor (după Alberts, 2002)

2. FORME CELULARE DE VIAŢĂ Materia vie este organizată în celule, iar viaţa se manifestă numai în cadrul organismelor cu structură celulară. Organismele vii, indiferent de sistemul taxonomic în care sunt încadrate, aparţin la două tipuri de organizare celulară procariot şi eucariot, fiecare fiind caracterizat printr-o anumită structură şi compoziţie chimică. Indiferent de organizare, celula, ca punct nodal de la care apare viaţa, manifestă "triada viului": autoreglare, metabolism şi reproducere.

Fig. II.3. Elementele ultrastructurale ale celulei PK

Fig.II.4. Schema ultrastructurii celulei eucariote (după Benjamin, Garman and Funston)

Procariotele (PK) (gr.pro = primitiv, karyon = sâmbure) sunt organisme unicelulare, în timp ce eucariotele (EK) (lat.eu = bun) formează sisteme pluricelulare, diferenţiate şi intră în alcătuirea majorităţii organismelor vii. Studiile de microscopie electronică şi biochimice au dat posibilitatea să se cunoască ultrastructura, compoziţia chimică şi organizarea moleculară a diferiţilor constituenţi celulari, a particularităţilor biologice şi genetice ale celulelor procariote şi eucariote, pe care le prezentăm succint în tabelul II.I şi fig.II.3 şi II.4. Existenţa unor trăsături comune procariotelor şi eucariotelor a sugerat ideea că aceste două tipuri de organizare celulară au evoluat împreună, separarea lor având loc într-un anumit moment al evoluţiei, printr-un mecanism încă neelucidat. Multe dintre cunoştinţele actuale de biologie moleculară au fost obţinute în urma studiilor efectuate pe procariote. Acestea au servit şi servesc ca material experimental. Bacteriile joacă în prezent un rol esenţial în experienţele de recombinare a ADN-ului (inginerie genetică şi genică). În tabelul II.I sunt redate sintetic asemănările şi diferenţele esenţiale dintre celulele procariote (PK) şi eucariote (EK).

Caracterul studiat Celula procariotă Organisme cu acest tip Bacteriile şi algele albastre verzi de organizare Dimensiunile celulei

Celula eucariotă Celelalte alge, ciuperci, protozoare, celule vegetale şi animale Sunt în exclusivitate Au dimensiuni microorganisme, cu superioare celulei PK, dimensiuni microscopice, variind de la 3 μ la 18 cm. care variază între 0,1 şi câţiva microni.

Peretele celular

Este rigid şi are în compoziţia sa glicoproteine (mureină).

Relativ rigid la celula vegetală şi absent la celula animală. La plante, componentul chimic esenţial este celuloza.

Membrana citoplasmatică (celulară)

Citoplasmă

Permeabilă numai pentru molecule mici, impermeabilă pentru macromolecule. Permite transport unidirecţional. Se prezintă în permanenţă în stare de gel, ceea ce asigură menţinerea şi localizarea genoforului, în absenţa unei membrane proprii.

Permite transport bidirecţional, selectiv, de tip microtransport şi macrotransport (endocitoză şi exocitoză). Prezintă stări alternante sol-gel, funcţie de momentul metabolic.

Curenţii citoplasmatici

Absenţi

Nucleul

Structură simplă, numit nucleoid. Nu prezintă membrană şi nucleol.

În interfază, prezintă o structură complexă: membrană dublă cu pori; unul sau mai mulţi nucleoli, cromatină şi matrice nucleară.

Organizarea materialului genetic

Moleculă unică de ADN, circulară (cromozomul bacterian) în lungime de circa 1400μ, neasociată cu histone. În citoplasmă se găsesc şi structuri genetice extracromozomiale (plasmide).

Materialul genetic este în cantitate mare şi formează mai multe grupe de linkage. ADN-ul nuclear este asociat cu proteine de tipul histonelor. La materialul genetic nuclear se adaugă informaţia genetică localizată în mitocondrii.

Prezenţi

Diviziunea celulară

Diviziunea simplă, directă Diviziune indirectă (amitoză). (mitoză şi meioză).

Înmulţirea sexuată

De regulă absentă. In mod excepţional se întâlneşte fenomenul de proto- sau parasexualitate. In procesul de conjugare are loc transferul unidirecţional de material genetic. Absent; echipartiţia materialului genetic este asigurată de mezozom. Absente

Aparatul mitotic Mitocondriile

Nu conţine RE cu o structură caracteristică. A fost evidenţiat un sistem format din membrane şi vezicule care au fost echivalate cu RE. 70S

Reticulul endoplasmic

Ribozomii Aparatul Golgi Echipamentul enzimatic (enzime oxidative şi ale fotosintezei) Capacitatea de a forma organisme multicelulare Capacitatea de diferenţiere celulară Organite de locomoţie

Prezentă. Formarea gameţilor este precedată de diviziunea reducţională. În urma procesului de fecundaţie rezultă zigotul, diploid.

Prezent Prezente; sunt sediul funcţiilor respiratorii. Se prezintă sub forma unui sistem tridimensional de canalicule, vezicule şi cisterne, dispus între membrana celulară şi cea nucleară. 80S în citoplasmă, 70S în mitocondrii şi cloroplaste Prezent Echipamentul enzimatic este încorporat în structuri specifice ca mitocondrii, cloroplaste, peroxizomi, lizozomi etc. În mod frecvent formează organisme multicelulare.

Absent Enzimele sunt legate de membrana citoplasmatică sau diverticulii acesteia nefiind încorporate în structuri caracteristice. PK sunt organisme unicelulare (solitare sau unicelular coloniale). Este o caracteristică a Absentă celulei EK Unele bacterii prezintă Cilii şi flagelii prezenţi flageli cu o structură simplă la unele celule EK au o în compoziţia cărora intră structură proteică complexă proteine fibrilare. („9+2”).

Tabel II.I. Principalele caractere ale celulelor procariote şi eucariote

3. CARACTERELE GENERALE ALE CELULELOR EUCARIOTE

Celulele din corpul omului şi a celorlalte organisme animale prezintă o foarte mare diversitate în ceea ce priveşte morfologia, dimensiunile, structura şi ultrastructura, gradul de mobilitate şi de diferenţiere. 3.1. CARACTERE MORFOLOGICE 3.1.1. Forma celulelor reprezintă rezultatul interacţiunii genotip-mediu. Celulele eucariote au o formă foarte variată. Ea este dependentă de diverşi factori: genetici, funcţionali, de caracterele fizice şi chimice ale mediului înconjurător ca şi de densitatea celulelor ce cresc şi se diferenţiază în acest mediu, precum şi de raporturile pe care le stabilesc între ele. Există o mare diversitate morfologică de la un ţesut la altul, de la un tip celular la altul, precum şi în funcţie de vârsta celulei. Forma celulelor se modifică sub influenţa factorilor interni cum sunt: vâscozitatea, procesele de sinteză şi acumulare de substanţe specifice, formarea de organite celulare, tensiunea superficială a plasmalemei, funcţia pe care o îndeplinesc, precum şi în funcţie de condiţiile normale sau patologice. Forma primară, sferică este prezentă la celula ou (zigot), la celulele tinere nediferenţiate şi, în general, la celulele din medii mai puţin dense (măduva hematopoetică). După formă, celulele se clasifică în: celule cu formă variabilă şi cu formă fixă. O altă clasificare morfologică a celulelor din corpul omului are la bază mobilitatea celulară. În funcţie de aceasta, există celule imobile, cu formă constantă, şi celule mobile, cu formă variabilă: microfage, macrofage (în timpul endocitozei). a) celule cu formă variabilă. Celulele care se găsesc suspendate în mediu lichid (sânge, limfă, lichid cefalorahidian), au de regulă forme variabile datorită capacităţii lor de a emite prelungiri ectocitoplasmatice cu caracter temporar; de exemplu, neutrofilele emit pseudopode. b) celule cu formă fixă. Celulele diferenţiate care intră în alcătuirea ţesuturilor şi organelor realizează contacte strânse între ele, sau cu elemente ce aparţin matricei extracelulare. Ele îndeplinesc o funcţie specifică şi au o formă fixă, adaptată îndeplinirii acestei funcţii. • în ţesutul epitelial, spaţiul intercelular este mic, sub 20-30 nm, iar celulele au forme geometrice (fig.II.5). Ele pot fi izodiametrice (diametre şi laturi egale): poliedrice, prismatice, cubice, sau anizodiametrice (diametre şi laturi inegale): piramidale, cilindrice, trunchi de con sau de piramidă. În epiteliul vezicii urinare au aspect “de umbrelă” sau “rachetă de tenis”. În organul lui Corti se găsesc celule “stâlp”, în retină - celule cu “con” sau cu “bastonaş”. În această categorie se încadrează şi celulele cu polaritate funcţională, care prezintă un pol apical şi un pol bazal diferiţi ca structură şi funcţie (ex: enterocite, nefrocite, celule secretorii etc.).

•

în ţesutul conjunctiv spaţiul intercelular este mai mare, celulele nu sunt supuse la presiuni reciproce, astfel ele prezintă formă variată; de exemplu fibrocitele prezintă formă alungită de “fus” cu prelungiri, osteocitele au formă stelată, melanocitele au formă neregulată, (fig.II.6). • în ţesutul muscular, celulele au forme diferite în funcţie de localizarea ţesutului: formă de coloană polinucleată (celulele musculare striate scheletale), formă de “fus” (celulele musculare netede) şi formă de coloane scurte, mononucleate (celulele musculare cardiace), (fig.II.7). • în ţesutul nervos, celulele au forme foarte variate: rotund-ovalară (neuronii pseudounipolari din ganglionii spinali), stelate (neuronii multipolari din coarnele anterioare ale măduvei), piramidale (neuronii din scoarţa cerebrală), formă de “pară” sau de “coşuleţ” (neuronii Purkinje). Variaţia morfologică este amplificată de prezenţa prelungirilor dendritice şi axonice; după numărul şi dispoziţia prelungirilor, neuronii se clasifică în unipolari, bipolari, pseudounipolari, multipolari (fig.II.8). • în sânge interdependenţa dintre formă şi funcţie este pregnantă în cazul hematiei, care îşi menţine activ forma de disc biconcav, formă ce oferă suprafaţa maximă pentru un volum dat (fig.II.9). 3.1.2. Dimensiunile celulelor se determină prin metoda micrometrică şi metoda stereologică (v. caiet lucrări practice). Dimensiunile celulelor din lumea vie acoperă o scară largă. Dacă se compară diametrul oului de struţ (cea mai mare celulă), cu diametrul celei mai mici bacterii, raportul este de 75.000/1. Totuşi, în general celulele de acelaşi tip au dimensiuni comparabile în scara animală. În mod obişnuit, dimensiunile celulelor de acelaşi tip sunt constante indiferent de talia individului, dar variază în funcţie de vârsta celulară şi de activitatea metabolică a celulei. Celulele tinere şi cele în plină activitate au în general dimensiuni mai mari decât cele îmbătrânite. Dimensiunile celulelor umane se măsoară în microni. După diametre, celulele se împart în trei categorii:

Fig. II.5. Celule epiteliale

Fig. II.6. Celule şi structuri din ţesutul conjunctiv

Fig. II.7. Celule musculare

Fig. II.8. Celule nervoase

Fig.II.9. Celule sanguine

Fig.II.10. Celule senzoriale

Fig. II.11. Celule germinale

• celule de talie mică cu diametre sub 10μ: limfocitele mici (5-6μ), neuronii moleculari (3-4μ), eritrocitele (7,5μ), capul spermatozoidului (4-5μ). • celule de talie mijlocie cu diametre cuprinse între 10-30μ sunt majoritatea celulelor din corpul omului: hepatocite, enterocite, splenocite, nefrocite, tireocite etc.; • celule de talie mare cu diametre peste 30μ: neuronii pseudounipolari din ganglionii spinali (40-60μ), neuronii Purkinje din scoarţa cerebeloasă (30-50μ), neuronii piramidali din scoarţa cerebrală (80-120 μ), ovulul (200μ), celula

musculară striată scheletală (12 cm diametrul longitudinal şi până la 100 μ diametrul transversal).

3.1.3. Volumul celulelor Ca şi talia, volumul celulelor este de regulă constant pentru acelaşi tip celular. El prezintă modificări în anumite perioade ale vieţii celulei, ca şi în anumite momente ale activităţii ei, de exemplu când acumulează şi stochează substanţe elaborate sau captate din mediul extracelular. Volumul celulelor umane variază de la un tip de celulă la altul, fiind cuprins între 300-15.000 μ3 . În cadrul regnului volumul unui anumit tip celular este constant, indiferent de specie şi de dimensiunea organismului (hepatocitul de şoarece, om sau elefant are aceeaşi mărime). Deci dimensiunea organului nu este determinată de volumul celulei, ci de numărul celulelor care intră în alcătuirea sa. Aceasta este denumită legea constanţei volumului. Volumul celular este influenţat de o serie de factori proprii celulei precum şi de factori de suprafaţă: • Factori proprii celulari - vârsta celulei: pe parcursul vieţii sale, celula trece prin etape diferite de activitate care se însoţesc şi de modificări de volum. Celulele tinere conţin o cantitate mai mare de apă ceea ce le conferă un volum mai mare decât al celor îmbătrânite. - funcţia celulară este factorul cel mai important; ea influenţează atât volumul celulei ca atare, cât şi volumul nucleului său. Pentru aprecierea stării funcţionale a unei celule la un moment dat pot fi utilizaţi trei parametri: raportul nucleo-citoplasmatic, raportul dintre suprafaţa celulară şi volumul celular şi raportul metabolismului celular. Conform teoriei raportului nucleo/citoplsmatic, volumul nucleului şi al citoplasmei se găsesc în interdependenţă, astfel că modificarea unuia determină concomitent modificarea celuilalt. De exemplu, mărirea setului de cromozomi dintr-o celulă (poliploidia) determină mărirea volumului nucleului şi concomitent, creşterea volumului citoplasmatic. De asemenea, în cadrul ciclului celular, creşterea în volum a nucleului în faza “S” (când are loc autoreplicarea semiconservativă a ADN) antrenează şi creşterea în volum a celulei. În ceea ce priveşte raportul suprafeţei nucleare faţă de volumul celular, acesta urmează regula conform căreia o creştere a suprafeţei cisternei perinucleare la pătrat antrenează o creştere a volumului citoplasmei la cub. Dar creşterea volumului unei celule nu se poate produce nelimitat. De aceea, raportul nucleo-citoplasmatic al celulelor aflate în proces de creştere rapidă se restabileşte prin diviziunea

celulei. De asemenea, volumul celular se autoreglează prin menţinerea constantă a raportului metabolic, respectiv a raportului dintre anabolism şi catabolism. Metabolismul realizează un schimb de materie între celulă şi mediul înconjurător. Pentru ca o celulă să-şi poată menţine limitele de volum, orice modificări în procesele anabolice trebuiesc compensate prin modificări corespunzătoare în procesele catabolice. • factorii de suprafaţă care influenţează volumul celulei sunt reprezentaţi de: rezistenţa filmului lipoproteic al plasmalemei, rezistenţa tramei citoscheletului membranar, precum şi a tramei de colagen extracelular. 3.1.4. Numărul celulelor se estimează de regulă prin stabilirea echivalentului nuclear. Organismul uman este alcătuit dintr-un număr foarte mare de celule. Se apreciază că în corpul unui adult numărul total al celulelor este de 1017, adică câteva milioane de miliarde de celule. La naştere, un copil de 3 kg este alcătuit din aproximativ 1012 celule. Celulele care alcătuiesc organismul uman pot fi sistematizate în câteva sute de tipuri. Populaţia celulară cea mai numeroasă o alcătuiesc celulele sanguine. La adult numărul hematiilor este de mai multe zeci de mii de miliarde, numărul hepatocitelor este de circa 100 de miliarde, neuronii 100 miliarde, nevrogliile 1000 miliarde (tab.II.II). 1. Dimensiunea medie la om 2. Volumul la om 3. Numărul la om

10-30 μm 300-15000 μm3 1012 - 1017

Tabelul.II.II. Caracterele generale ale celulelor umane

3.1.5. Durata de viaţă şi turnover-ul celular Viaţa celulelor este variabilă în funcţie de tipul celular, de la 10 minute până la întreaga durată de viaţă a individului. Astfel, celulele musculare cardiace au o durată de viaţă echivalentă cu durata de viaţă a organismului. Celulele epiteliului intestinal au o durată de viaţă de 3-4 zile, hematiile de 120 de zile. Celulele îmbătrânite şi/sau moarte sunt înlocuite cu altele, provenite din diviziuni. În organismul uman adult se petrec în fiecare secundă peste 4 milioane de diviziuni celulare. Într-o zi au loc 350 miliarde de diviziuni, iar într-un an 1014. Numărul diviziunilor anuale este apropiat totalului celulelor care alcătuiesc corpul unui adult. Această valoare este o medie realizată de unele tipuri de celule care se divid foarte rapid şi compensează ritmul lent sau chiar absenţa diviziunii altor tipuri de celule. Celulele sunt alcătuite din molecule, macromolecule, organite, care se află întro permanentă înnoire. Ritmul de preschimbare a diferitelor niveluri de organizare a

lumii vii poartă denumirea de turnover. Procesul stă la baza persistenţei şi continuităţii celulei vii deoarece pe seama sa celulele se adaptează permanent la fluctuaţiile condiţiilor de mediu şi îşi înlocuiesc componentele uzate în cursul desfăşurării proceselor vitale. Turnover-ul se determină prin măsurarea intervalului de timp scurs de la apariţia până la consumul unor molecule organice (colesterol, aminoacizi, glucide etc). Acest interval de timp este denumit timp de înjumătăţire. Tehnica utilizată este histoautoradiografia moleculelor organice marcate cu izotopi radioactivi (C14, H3, Ca45, P32). Unele componente persistă un timp îndelungat pe parcursul ciclului vital al celulei. Este cazul moleculelor de ADN şi a cromatinei nucleare care au un timp de înjumătăţire de 215 zile, altele persistă un timp scurt (raportat la durata de viaţă a celulei): proteinele mitocondriale din celulele nervoase 16,4 zile, cele ale celulei musculare cardiace 12 zile şi proteinele mecanocontractile ale celulei cardiace 21 zile (experienţele au fost efectuate pe celule de şobolan). 3.1.6. Raporturile intercelulare În organismul uman se găsesc celule libere suspendate în lichide cum sunt celulele sanguine, celulele lichidului cefalorahidian, spermatozoizii din lichidul spermatic. Aceste celule se mobilizează independent prin capacităţi proprii (pseudopode, flagel), sau sunt antrenate de curentul lichidian în care sunt suspendate (hematiile adulte circulante). Majoritatea celulelor din organism sunt asociate formând diferite tipuri de ţesuturi: epitelial, conjunctiv, muscular, nervos. Fiecare celulă este individualizată morfofuncţional prin membrana proprie, dar în acelaşi timp vine în contact intim cu matricea extracelulară. La formarea unui ţesut participă o populaţie celulară împreună cu matricea extracelulară care le solidarizează. În acest fel, in vivo se realizează, aşa cum afirmă Policard, “independenţă în interdependenţă”. În ţesutul epitelial celulele sunt separate între ele printr-un spaţiu mic de aproximativ 20 nm. Substanţa fundamentală este sărac reprezentată, greu evidenţiabilă prin tehnici obişnuite de colorare în microscopia optică. Pentru a-şi îndeplini funcţia în mod unitar, celulele epiteliale stabilesc între ele joncţiuni puternice de adezivitate şi comunicare (v. Cap. Adezivitate intercelulară). Contactul intim intercelular participă la realizarea formei geometrice a celulelor epiteliale. În ţesutul conjunctiv celulele sunt separate printr-un spaţiu larg, matricea extracelulară este bogat reprezentată, de consistenţă diferită: fluidă, semidură, dură (v. Cap. Matrice extracelulară). Deoarece nu stabilesc contacte joncţionale puternice, iar cantitatea matricei extracelulare este mai mare, celulele conjunctive au forme neregulate cu multiple prelungiri. 3.2. COMPARTIMENTAREA INTERNĂ A CELULEI EUCARIOTE

Celula eucariotă prezintă o ordine internă riguroasă şi o compartimentare realizată de un sistem de endomembrane care delimitează organitele citoplasmatice şi permite funcţionarea lor. Structura de bază a tuturor endomembranelor este aceeaşi cu a membranei celulare, modelul acestei structuri fiind modelul “mozaic fluid”. Totuşi, fiecare tip de endomembrană realizează un compartiment distinct datorită compoziţiei chimice şi funcţiei specifice pe care o îndeplineşte. Principalele compartimente intracelulare realizate de endomembrane sunt: 1) compartimentul nuclear realizat de învelişul nuclear. Delimitând nucleul de citoplasmă, membrana nucleară realizează separarea proceselor nucleare (autoreplicarea ADN şi transcripţia), de procesele citoplasmatice (traducerea informaţiei genetice la nivelul ribozomilor). 2) compartimentul citoplasmatic, în care au loc toate procesele vitale ale celulei şi sinteza componentelor celulare este la rândul său subdivizat în: a) compartimentul plasmatic (matricial, compartiment P sau A) reprezentat de citosol, b) compartimentul cisternal (compartiment B) reprezentat de matricele organitelor citoplasmatice delimitate de endomembrane, c) compartimente speciale (compartimente C) reprezentate de matricea mitocondrială şi matricea cloroplastidială (în celulele vegetale). Deşi aceste compartimente reprezintă tot matricea unor organite delimitate de endomembrane (mitocondrii şi cloroplaste), ele sunt clasificate aparte deoarece prezintă un material genetic propriu: ADN-ul şi ARN-ul mitocondrial (şi cloroplastidial). Graţie conţinutului lor matricial, mitocondriile (şi cloroplastele) sunt capabile de biosinteză proteică proprie şi de diviziune. Compartimentarea internă a celulei permite o specializare funcţională a tuturor organitelor celulare. Astfel: • membrana celulară conferă individualitate celulei, reglează schimburile cu mediul exterior, asigură adezivitatea şi comunicarea directă cu celulele adiacente precum şi recepţia mesajelor venite de la distanţă; • nucleul este centrul genetic şi reglator al tuturor proceselor celulare; • reticulul endoplasmic neted este specializat în metabolismul lipidic şi participă la fenomenul de detoxifiere celulară; • reticulul endoplasmic rugos intervine în sinteza proteinelor de export; • aparatul Golgi prelucrează, maturează şi stochează produşii de sinteză şi secreţie; • lizozomii realizează apărarea organismului, curăţirea ţesuturilor şi hrănirea celulei prin procesele de heterofagie şi autofagie;

• peroxizomii intervin în metabolismul apei oxigenate şi în procesele de detoxifiere celulară; • mitocondriile sunt sediul de sinteză al ATP prin procesul de fosforilare oxidativă şi realizează respiraţia celulară. Fiecare compartiment, reprezentat de un tip de organite citoplasmatice, are o anumită compoziţie chimică la nivelul matricei şi endomembranelor sale, permiţând astfel realizarea unor funcţii specifice. Între compartimente există relaţii de colaborare şi coordonare ceea ce permite celulei să funcţioneze ca un tot unitar şi să-şi îndeplinească funcţia în cadrul ţesutului. 3.3. ORGANIZAREA STRUCTURALĂ ŞI ULTRASTRUCTURALĂ A CELULEI EUCARIOTE În microscopia optică celula eucariotă apare formată din trei componente: membrana plasmatică, nucleul şi citoplasma. Structura celulei variază în funcţie de perioadele ciclului celular, şi anume: în interfază (perioada de creştere şi maturare a celulei) cele trei componente se pot vizualiza distinct, fie direct pe preparate proaspete necolorate, fie pe preparate durabile, colorate. În acest caz, membrana plasmatică apare ca o structură subţire, liniară, refringentă pe preparatele necolorate, sau acidofilă pe preparatele colorate. Citoplasma cuprinde două zone: spre exterior ectoplasma, mai opacă, lipsită de organite, iar spre interior

endoplasma, mai luminoasă, populată cu organite. Organitele citoplasmatice sunt vizibile pe preparatele necolorate observate în microscopia optică sau cu ajutorul microscopului cu contrast de fază, dar nu pot fi identificate, toate fiind de formă granulară. Pe preparatele colorate pot fi individualizate prin coloraţii specifice. Nucleul apare format din: membrană nucleară, cromatină şi 1-2 nucleoli. În timpul diviziunii, datorită fragmentării membranei nucleare, materialul genetic (cromozomii) se dispersează în citoplasmă. Fig.II.12.Elementele ultrastructurale ale celulei eucariote (după Diculescu)

Microscopia electronică a permis stabilirea ultrastructurii celulei eucariote: (fig.II.12 şi tabel II.III): Compartimentul 1. Periferia celulară 2. Nucleul interfazic

Componente ultrastructurale Glicolemă Plasmalemă Citoschelet membranar Membrană nucleară (anvelopă, nucleolemă) Matrice nucleară (suc nuclear, nucleoplasmă) Cromatina Nucleoli Matricea citoplasmatică (citosol, hialoplasmă) Citoscheletul microtrabecular Citoscheletul Filamente de actină celular Filamente de miozină Filamente intermediare Microtubuli Organite intracitoplasmatice

Nespecifice

3. Citoplasma Specifice

Mitocondria Ribizomii Reticul endoplasmatic Aparat Golgi Lizozomii Peroxizomii Centrul celular Cloroplastele Glioxizomii Miofibrile Gliofibrile Neurofibrile Tonofilamente

Organite ectocitoplasmatice

Incluziuni citoplasmatice

Joncţiuni Microvili Cili Flagel Cu caracter Pseudopode temporar Văluri de membrană Filopodii Lamelipodii De depozit (glucidice, lipidice etc.) De secreţie (proteice) Patologice (virale, bacteriene) Cu caracter permanent

Tabel II.III. Ultrastructura celulei eucariote

Capitolul III CONSTITUENŢII MOLECULARI AI CELULELOR ŞI ROLUL LOR BIOLOGIC „Logica moleculară” a lumii vii Cea mai remarcabilă proprietate a organismelor vii este gradul înalt de complexitate şi organizare. Celula, unitatea morfo-funcţională a viului este alcătuită dintr-un număr mare de componente ultrastructurale formate la rândul lor din mai multe tipuri de molecule complexe. Cu toate acestea, deoarece miile de macromolecule diferite prezente în celulă sunt formate din numai câteva molecule simple cu rol de unităţi constituente, se poate afirma că organizarea moleculară a celulei este de o extraordinară simplitate. Cu alte cuvinte, celula conţine moleculele cele mai simple cu putinţă, în cel mai mic număr de tipuri diferite, atât cât îi este suficient pentru a-i conferi viaţă şi particularitate de specie, în condiţiile de mediu în care trăieşte. Mai mult, cunoştinţele actuale au demonstrat că biomoleculele ca unităţi constituente sunt comune tuturor speciilor cunoscute, ceea ce înseamnă că toate organismele vii au un strămoş comun, identitatea fiecărei specii fiind asigurată de seturi caracteristice de acizi nucleici şi proteine. Pe de altă parte, fiecare parte componentă a organismului viu are un scop sau o funcţie specifică. Acest lucru este valabil pentru structurile macroscopice: ochii, nasul, membrele etc., pentru componentele ultrastructurale: nucleul, membrana plasmatică, mitocondria etc., dar şi pentru grupele de compuşi chimici: glucide, lipide, proteine, acizi nucleici. Principalele clase de biomolecule au funcţii

identice în toate tipurile de celule. Acizii nucleici servesc pretutindeni la depozitarea şi transmiterea informaţiei genetice. Proteinele joacă în toate celulele rolul de produşi şi efectori direcţi ai acţiunii genelor: unele au activitate catalitică specifică şi funcţionează ca enzime, altele servesc ca elemente structurale. Polizaharidele au două funcţii importante în toate celulele: unele servesc ca forme de depozitare a materialului care furnizează energia necesară activităţii celulare (glicogenul, amidonul), altele servesc ca elemente structurale (celuloza la plante). Lipidele au de asemenea acelaşi rol în toate celulele şi anume fie ca formă de depozit cu rol energetic, fie sub formă de componenţi structurali principali ai membranelor. Dacă ne referim însă la moleculele-unităţi constituente care intră în alcătuirea tuturor macromoleculelor, acestea prezintă un grad înalt de adaptabilitate ceea ce le permite îndeplinirea mai multor funcţii în celula vie. Astfel, pe lângă rolul de unităţi constituente a proteinelor, aminoacizii servesc ca precursori ai hormonilor, alcaloizilor, porfirinelor, pigmenţilor şi ale multor altor biomolecule. Unele nucleotide servesc nu numai ca unităţi constituente ale acizilor nucleici, ci şi ca molecule purtătoare de energie sau coenzime. Este posibil deci ca biomoleculele-unităţi constituente să fi fost selectate în timpul evoluţiei după capacitatea lor de a îndeplini diverse funcţii şi aceasta pentru a asigura simplitatea organizării moleculare a celulei cu menţinerea concomitentă a maximului de eficienţă. O a doua proprietate deosebită a celulelor vii este capacitatea de a se reproduce cu o fidelitate aproape perfectă pe parcursul a zeci de generaţii celulare şi zeci (sau sute ?) de generaţii individuale. Factorii care fac posibilă realizarea acestui mecanism demonstrează încă o dată principiul guvernor al viului - simplitate de organizare cu eficienţă maximă. La ora actuală sunt în discuţie următoarele aspecte: • simbolurile prin care este codificată informaţia genetică în ADN sunt de dimensiuni submoleculare. Informaţia genetică este prezentă în cromozomi sub formă codificată în secvenţe specifice de unităţi nucleotidice ale ADN. Celulele responsabile de transmiterea informaţiei (spermatozoidul sau ovulul uman) posedă o cantitate de ADN de aproximativ 6 picograme. Codificarea a fost necesară datorită faptului că unele organisme vii sunt atât de complexe încât cantitatea de informaţie genetică transmisă ar fi depăşit proporţiile extrem de mici ale celulelor care o poartă. • informaţia genetică depozitată în ADN prezintă un grad deosebit de stabilitate. Cercetări recente au demonstrat că bacteriile de astăzi au aproape aceeaşi mărime, formă şi structură internă, sunt formate din aceleaşi tipuri de unităţi constituente şi aceleaşi tipuri de enzime ca cele care au trăit în urmă cu sute de milioane de ani, în ciuda faptului că bacteriile, ca toate organismele au suferit modificări constante în timpul evoluţiei. Capacitatea celulelor vii de a conserva informaţia genetică este rezultatul acţiunii principiului complementarităţii structurale: o catenă de

ADN serveşte ca matriţă pentru copierea unei noi catene complementare din punct de vedere structural. Mai mult, atunci când o catenă de ADN se rupe este rapid şi automat reparată de către enzime specifice. Erorile sau mutaţiile fără consecinţe negative majore pot oferi unei specii posibilitatea de a-şi modifica identitatea în mod gradat, în scopul adaptării la schimbările de mediu petrecute în timpul evoluţiei. În procesul de transmitere a informaţiei, mărirea stabilităţii şi asigurarea fidelităţii mesajelor este determinată de repetarea lor (v. caracterul informaţional al sistemelor biologice). • informaţia unidimensională conţinută de ADN este tradusă în componenţi tridimensionali macromoleculari (proteinele) şi supramoleculari. În cursul procesului de sinteză a proteinelor, secvenţa liniară specifică a bazelor din ADN este tradusă într-o secvenţă liniară de aminoacizi din lanţul polipeptidic. Spre deosebire de molecula de ADN, polipeptidul nu este stabil în forma liniară, desfăşurată. El suferă o răsucire spontană şi se pliază într-o structură tridimensională specifică, stabilă, a cărei geometrie este determinată de secvenţa de aminoacizi din lanţul polipeptidic. Fiecare tip de lanţ polipeptidic presupune o conformaţie tridimensională proprie, care la rândul său îi conferă un anumit tip de activitate biologică. Mai mult, numeroase tipuri de molecule proteice diferite, care realizează structuri de tipul ribozomilor sau lipoproteinelor membranare, se pot recunoaşte reciproc şi se pot grupa în ansambluri tridimensionale perfect reproductibile, potrivindu-se între ele de manieră specifică, după principiul complementarităţii structurale. Evoluţia biomoleculelor primordiale Principalii constituenţi ai organismelor vii sunt compuşii organ ici ai carbonului; ei prezintă structură şi funcţionalitate specifică care asigură însăşi existenţa vieţii, motiv pentru care au fost denumiţi biomolecule. Compuşii organici sunt prezenţi atât în materia vie cât şi în scoarţa terestră. Cercetări recente sugerează că în istoria îndepărtată a pământului, la suprafaţa oceanelor, existau numeroşi compuşi organici diferiţi. Vârsta pământului este considerată a fi de 4,8 x 10 9 ani, iar organismele vii au apărut probabil în urmă cu 4.000 de milioane de ani. La începutul secolului XX, A.I. Oparin şi ulterior J.B.S. Haldane au emis ipoteza că prin componenţa în metan, amoniac şi vapori de apă, atmosfera primitivă ar fi putut conduce la formarea spontană a unor compuşi organici simpli ca aminoacizi şi glucide. Produşii astfel formaţi au condensat şi s-au dizolvat în oceanul primitiv. Teoria lui Oparin presupune că prima celulă vie a apărut spontan din această soluţie caldă şi concentrată numită "supă primordială".

Ulterior, odată cu dezvoltarea tehnicilor de laborator, Stanley Miller a demonstrat originea abiotică a moleculelor organice. El a supus un amestec de metan, amoniac, apă şi hidrogen închise într-un recipient la 80°C, unei scântei electrice produse de o pereche de electrozi (simulând fulgerul) timp de o săptămână. Analiza condensatului obţinut a demonstrat prezenţa unor cantităţi semnificative de substanţe organice solubile în apă, pe care le-a separat prin metode cromatografice. Printre compuşii identificaţi se numărau α-aminoacizi de tipul: glicocol, alanină, acid aspartic şi acid glutamic, cunoscuţi ca făcând parte din structura proteinelor, dar şi acizi organici simpli: formic, acetic, propionic, lactic şi succinic, care se găsesc în organismele vii. Experienţe mai recente efectuate cu amestecuri conţinând azot, hidrogen, oxid de carbon şi dioxid de carbon (fără metan sau amoniac) expuse la diferite forme de energie sau radiaţii (lumina vizibilă, lumina U.V., raze X, radiaţii γ, descărcări electrice cu scânteie sau neluminoase, ultrasunete, unde de şoc) au condus la obţinerea câtorva sute de compuşi organici diferiţi. Printre aceştia se numără toţi aminoacizii prezenţi în proteine, bazele azotate, mulţi acizi organici şi glucide. Rezultatele experienţelor au condus astfel la o prezumţie de foarte mare importanţă: condiţiile de mediu care guvernau Terra în timpul primului său miliard de ani au permis producerea componentelor necesare fabricării nucleotidelor. Experimentele care simulau etapa primitivă a pământului au adeverit ipoteza lui Oparin şi au demonstrat originea abiotică a moleculelor organice. Dar numărul mare de compuşi organici diferiţi izolaţi în cadrul experimentelor nu este în concordanţă cu numărul restrâns de compuşi organici care ar fi putut fi necesari pentru formarea primelor biostructuri capabile să supravieţuiască. S-a născut astfel ipoteza selecţiei. Un argument în sprijinul ipotezei selecţiei îl reprezintă faptul că deşi pe plan biologic sunt cunoscuţi peste 150 de aminoacizi, proteinele din toate speciile sunt alcătuite din acelaşi grup de 20 de aminoacizi primordiali. Este de presupus că dacă oricare dintre ceilalţi aminoacizi ar fi corespuns mai bine structurii şi funcţiei proteinelor, perioada lungă de evoluţie ar fi permis selectarea şi utilizarea lor de către organismele vii. Deoarece în toate organismele vii macromoleculele sunt constituite dintr-un număr mic de tipuri de molecule care au rol de unităţi constituente s-a sugerat că primele celule care au apărut pe Terra ar fi fost formate din numai câteva zeci de molecule organice diferite. Acestea sunt cunoscute sub denumirea generică de biomolecule primordiale şi cuprind cei 20 de aminoacizi esenţiali (primari), cele 5 baze azotate, unul sau mai mulţi acizi graşi, două glucide, dintre alcooli - glicerolul şi ca amină - colina. Moleculele primordiale pot fi astfel considerate ca strămoş al tuturor celorlalte biomolecule, constituind primul alfabet al materiei vii. Biomoleculele primordiale au suferit în timp procese de specializare şi diferenţiere, fapt ce a făcut posibilă evoluţia organismelor vii spre forme din ce în ce mai diferenţiate şi complexe: • astăzi sunt cunoscuţi în natură peste 150 de aminoacizi diferiţi, dar aproape

toţi provin din cei 20 de aminoacizi de bază care intră în alcătuirea proteinelor; • sunt cunoscute zeci de nucleotide diferite şi derivaţi ai lor, toate fiind descendenţi ai primelor 5 baze azotate; • peste 70 de glucide simple derivă biologic din glucoză, iar în cadrul organismelor formează o mare varietate de polizaharide; • numărul mare de acizi graşi cunoscuţi astăzi provine dintr-unul sau câţiva acizi graşi primordiali. La ora actuală se consideră că toate organismele şi celulele lor constituente descind dintr-o unică celulă ancestrală, care a urmat un proces îndelungat de evoluţie prin selecţie naturală. Evoluţia implică două procese esenţiale: apariţia unei variaţii întâmplătoare în informaţia genetică transmisă de individ la descendenţii săi şi selecţia informaţiei genetice destinată supravieţuirii şi reproducerii. Evoluţia este considerată astăzi principiul central al biologiei, deoarece ne ajută să înţelegem semnificaţia varietăţii lumii vii. În cursul evoluţiei, biomoleculele primordiale au beneficiat de condiţii necesare pentru a dezvolta sisteme chimice complexe. Astfel, aminoacizii s-au asociat prin legături peptidice, în timp ce nucleotidele s-au asociat prin punţi fosfodiesterice. Prin repetabilitate s-au format polimeri (polipeptide şi polinucleotide). Polipeptidele (proteinele) şi polinucleotidele (ARN şi ADN) sunt considerate constituenţii cei mai importanţi ai organismelor actuale. Formarea primilor polimeri a fost favorizată fie de încălzirea compuşilor organici uscaţi, fie de activitatea catalitică a unei mari concentraţii de fosfat anorganic sau a altor catalizatori minerali. Odată format, polimerul acţionează la rândul său ca un catalizator şi influenţează sinteza unui alt polimer. Se formează în acest fel un sistem de monomeri organici şi polimeri care funcţionează împreună pentru a crea molecule de acelaşi tip. Mecanismul funcţionează continuu şi se autoîntreţine atâta timp cât există aport de materie primă din mediul înconjurător. Un astfel de sistem autocatalitic trebuie să prezinte o serie de proprietăţi caracteristice materiei vii: • selecţia determinată (nu provocată de hazard) a moleculelor capabile de interacţiune; • tendinţa la reproducere; • competiţia cu alte sisteme care depind de aceleaşi materii prime; • în condiţiile absenţei materiei prime sau atunci când echilibrul reacţiilor este perturbat de o modificare de temperatură, sistemul va evolua spre starea de echilibru chimic şi moarte. În organismele actuale, moleculele monocatenare de ARN îndeplinesc două funcţii principale: ARNm dirijează sinteza proteică, pe când ARNr şi alte tipuri de ARN non-mesageri au acţiune catalitică. Dubla sa proprietate (genetică şi catalitică) sugerează că ARN a apărut primul în cursul evoluţiei; este probabil ca dezvoltarea mecanismelor autocatalitice esenţiale organismelor vii să fi debutat cu

evoluţia familiei de molecule de ARN capabile de a-şi cataliza propria replicare. Cu timpul, una dintre aceste familii de ARN catalizator şi-a dezvoltat capacitatea de a dirija sinteza polipeptidelor. În evoluţie, celulele au cunoscut o dezvoltare a complexităţii structurale şi funcţionale, s-au acumulat catalizatori proteici suplimentari, iar informaţia ereditară nu a mai putut fi suportată de moleculele monocatenare de ARN. Aceasta a fost probabil momentul în care evoluţia a impus apariţia unui alt model macromolecular – ADN-ul, capabil de a suporta şi transmite informaţia ereditară. Fiind structurată în dublu helix, macromolecula de ADN este mai stabilă decât cea de ARN, iar prezenţa perechilor de polinucleotide complementare îi conferă posibilitatea de autoreplicare şi de reparare (sistemul de reparare utilizează lanţul intact ca matriţă pentru corectarea leziunilor lanţului alterat). În celulele actuale ADN -ul are rolul de a stoca şi controla funcţia genetică primară, proteinele reprezintă catalizatori principali, în timp ce ARN realizează doar intermedierea dintre cele două categorii anterioare.

Macromolecule informaţionale Compuşii biochimici cu greutăţi moleculare mai mari de 10.000 daltoni poartă denumirea de macromolecule. Acest grup cuprinde polizaharide, complexe lipoproteice, marea majoritate a proteinelor şi acizilor nucleici. Macromoleculele care participă la transferul de informaţie de la nivelul genelor la nivelul caracterelor corespunzătoare acestora poartă denumirea de macromolecule informaţionale. Din această categorie fac parte acizii nucleici şi proteinele. Macromoleculele informaţionale posedă o serie de caracteristici comune: • au structură bazală monocatenară fără ramificaţii, • unităţile monocatenare pot forma structuri tridimensionale prin agregări omologe (ale aceleiaşi categorii de molecule) sau heterologe (proteine ADN, proteine - ARN, ADN - ARN), • prezintă extremităţi distincte ale catenelor, • posedă situsuri active şi porţiuni moleculare de organizare şi control, • majoritatea prezintă o conformaţie sferică bifuncţională, • dispun de o mare diversitate actuală şi potenţială, • biosineza lor urmeză căi complexe diferite, dar cu etape analoge de desfăşurare. Participarea ADN, ARN şi a proteinelor la realizarea transferului de informaţie are loc în trei etape: • etapa de transcriere în care secvenţele dezoxiribonucleotidice din ADN au rolul de a specifica secvenţele ribonucleotidice din ARN,

• etapa de traducere în care secvenţele ribonucleotidice din ARN „dictează” secvenţele de aminoacizi din lanţurile polipeptidice, • etapa de finisare a caracterelor complexe în care proteinele definitivează ansamblul de caractere specifice organismului. Conform relaţiei ADN → ARN → proteină s-ar putea crede că transferul de informaţie genetică are ca destinaţie finală sinteza moleculelor proteice. Dar, aşa cum în acizii nucleici nucleotidele sunt dispuse în secvenţe specifice, proteinele la rândul lor sunt alcătuite din secvenţe particulare de aminoacizi specificate prin codificare datorită informaţiei genetice existente în fiecare celulă. Prin aminoacizii pe care îi conţin, proteinele transferă la rândul lor informaţia genetică la nivelul caracterelor complexe. Relaţia devine astfel: ADN → ARN → proteine → caractere complexe Proteinele constituie baza structural-funcţională a caracterelor morfologice, fiziologice şi biochimice care participă la alcătuirea organismului. Aceste caractere sunt reprezentate de subansambluri specifice la alcătuirea cărora participă proteine, lipide, derivaţi glucidici, micromolecule organice, săruri anorganice. Asamblarea acestor componente pentru a forma un caracter particular (de exemplu formarea membranei plasmatice) este determinată specific de proteine datorită multiplelor funcţii: structurale, enzimatice, de transport, hormonale, de sistem tampon, de receptori specifici, de menţinere a presiunii osmotice şi a valorilor de pH. În concluzie, în cadrul transferului de informaţie proteinele prezintă un rol dublu: de destinatar şi de transmiţător; în etapa de finisare a caracterelor complexe, proteinele acţionează pe două căi: direct ca şi constituent structural şi în modularea specifică a celorlalte molecule care concură la realizarea caracterului complex. 1. COMPOZIŢIA ELEMENTARĂ A MATERIEI VII Se presupune că materia vie provine din univers. Acesta este alcătuit din elemente chimice care luate separat nu sunt (nici unul din ele) specifice viului. Organismele vii selecţionează şi utilizează din mediul înconjurător numai elementele chimice de care au nevoie. Din totalitatea elementelor din tabloul lui Mendeleev, numai 92 sunt considerate a fi elemente naturale. Dintre acestea, în celule au fost identificate aproximativ 60, dar numai 20 sunt componente esenţiale ale diferitelor organisme vii. Acest lucru dovedeşte unitatea materială a lumii vii şi nevii, materia vie fiind rezultatul evoluţiei materiei lipsite de viaţă. Concentraţia elementelor din materia vie este diferită de cea a elementelor care caracterizează non-viul. Dacă în scoarţa terestră predomină elementele grele (Si, Al, Fe), în celule predomină elementele uşoare. Elementele grele nu sunt

adecvate vieţii, datorită insolubilităţii lor în soluţii apoase, la pH fiziologic. Elementele uşoare au volum mic, traversează cu uşurinţă membranele, pot ceda sau accepta uşor electroni, ceea ce determină apariţia unor compuşi stabili. Din acest punct de vedere, compoziţia mediului intern este apropiată de cea a Cosmosului (cu excepţia gazelor inerte) şi de cea a apei de mare. Elementele din compoziţia materiei vii prezintă o distribuţie specifică. Compoziţia chimică diferă de la un regn la altul (tab.III.I.), de la o specie la alta, de la un tip celular la altul. Compoziţia chimică Substanţe anorganice -apă -săruri minerale Substanţe organice - glucide - lipide - proteine

Celula animală

Celula vegetală

65% 4,3%

75% 2,5%

11,2% 11,7% 17,8%

18% 0,5% 4%

Tabel III.I. Compoziţia chimică a materiei vii în regnul animal şi vegetal

După concentraţia intracelulară, elementele chimice se clasifică în: 1.1. Elemente majore (macroelemente). Sunt reprezentate de O, C, H, N. Aceste elemente, formează 2-60% din totalul compoziţiei celulare, reprezentând 95-98% din masa uscată a celor mai multe celule şi au rol plastic (structural). Cele patru elemente formează compuşi care posedă o capacitate moleculară unică, aceea de a participa la procesele ce constituie în ansamblu starea vie.

Fig.III.1. Formarea legăturilor covalente între atomii aceluiaşi element şi între atomii unor elemente diferite (după Gerard J.Tortora) a) legătură covalentă simplă între doi atomi de hidrogen; b) legătură covalentă dublă între doi atomi de oxigen; c) legătură covalentă triplă între atomii de azot; d) legătură covalentă simplă între un atom de carbon şi patru atomi de hidrogen.

Carbonul, hidrogenul, azotul şi oxigenul au o proprietate comună, aceea de a forma cu uşurinţă legături covalente prin punerea în comun a electronilor. Hidrogenul are nevoie de un electron, oxigenul de doi, azotul de trei, iar carbonul de patru, pentru a-şi completa ultimul strat de electroni şi astfel să formeze legături

covalente stabile. Aceste patru elemente se combină între ele formând un mare număr de compuşi diferiţi. Carbonul, azotul şi oxigenul pot pune în comun una sau două perechi de electroni, pentru a forma legături simple sau durabile, proprietate ce conferă o considerabilă mobilitate legăturilor chimice (fig.III.1). Legăturile covalente stabilite între cele patru elemente sunt foarte puternice; forţa legăturii covalente este invers proporţională cu masa atomilor între care se stabileşte legătura. Atomii de carbon, posedă şi o altă proprietate semnificativă, aceea de a se lega între ei. Deoarece un atom de carbon poate să doneze sau să accepte patru electroni pentru a realiza un octet exterior, el poate realiza legături covalente cu alţi patru atomi de carbon. Astfel iau naştere catene liniare, ramificate sau ciclice, pentru o imensă varietate de molecule organice diferite. Nici un alt element chimic nu poate forma molecule de mărimi şi forme atât de diferite, sau cu o varietate atât de mare de grupări funcţionale. 1.2. Elemente puţin abundente (microelemente). În această grupă se încadrează P, S,

Cl, Na, K, Ca, Mg. Acestea alcătuiesc o proporţie de 0,02-0,1% din constituenţii celulari şi îndeplinesc un rol dublu, plastic şi funcţional. Fosforul. Importanţa fosforului pentru organism este determinată de rolul său de constituent celular, atât sub formă minerală îndeosebi în oase şi dinţi ca fosfat de calciu, cât şi sub formă organică ca în componenţa acizilor nucleici şi a fosfolipidelor. Pe lângă rolul plastic, fosforul îndeplineşte în organism un rol energetic şi informaţional, fiind denumit “hormon anorganic al creşterii”. De asemeni, are rol în diviziunea şi multiplicarea celulară, în contracţia musculară, în formarea vitaminelor şi a fermenţilor. Fosforul acţionează într-un echilibru mineral cu calciul, raportul de 2/1 fiind mai important decât cantitatea absolută a fiecăruia. Aportul insuficient de fosfor, dar şi excesul de fosfor în absenţa calciului, stau la baza apariţiei rahitismului. Calciul. Importanţa calciului pentru organism este legată de rolul său în numeroase structuri şi funcţii celulare. El intră în compoziţia oaselor şi a dinţilor, influenţează excitaţia şi funcţia sistemului nervos, influenţează contracţia musculară, participă la fenomenul de coagulare a sângelui, ia parte la menţinerea homeostaziei mediului intern, participă la menţinerea echilibrului de membrană şi la schimbul ionic transmembranar. Bolile corelate calciului sunt datorate carenţei sau dezechilibrelor metabolice şi doar foarte rar exceselor sale în organism. Un exces de calciu exogen scade permeabilitatea membranei pentru K+ şi Na+, iar o concentraţie redusă de calciu creşte permeabilitatea membranei pentru ionii amintiţi. Pe de altă parte, o carenţă a calciului determină apariţia fenomenelor osoase de osteoporoză până la osteomalacie, pe când hipercalcemia (calciu în exces) determină afectări ale sistemului neuro-locomotor (hiperexcitabilitate, hiperextensie articulară), ale aparatului excretor renal (poliurie), ale inimii (bradicardii, aritmii).

Natriul îndeplineşte în organism un rol major, de mineralizare a lichidului extracelular şi de păstrare a pH-ului umorilor. Natriul intră şi în alcătuirea unor structuri organice cum sunt condroitinsulfatul, fosfolipidele, hemoglobina, miozina şi se găseşte absorbit la suprafaţa ţesutului osos. Excesul intracelular de sodiu se datoreşte unei alterări a funcţiei Na+-K+-ATP-azei şi apare în boli cardiovasculare (insuficienţa cardiacă decompensată, hipertensiune arterială), boli de nutriţie, intoxicaţii. Pierderea excesivă de natriu are loc prin deshidratare, în boli renale, endocrine şi ale SNC. Hiponatremia determină tulburări neuro-musculare sub formă de crampe dureroase. Potasiul este considerat a fi primul cation intracelular fiind principalul constituent salin al citoplasmei. El influenţează creşterea, repararea ţesuturilor, biosinteza proteinelor şi formarea glicogenului. Are rol fundamental în contracţia musculară, în menţinerea echilibrului acidobazic şi a celui hidrosalin, în activitatea enzimatică şi în funcţia unor organe cum sunt inima, rinichiul etc. De concentraţia potasiului pe cele două feţe ale membranei celulei nervoase depinde polarizarea şi funcţia neuronului. Împreună cu natriul, realizează echilibrul electrostatic al celulei. Clorul este un element necesar homeostaziei şi echilibrului osmotic. El intră în alcătuirea lichidului extracelular, plasmei, acidului clorhidric gastric. Participă la înlesnirea funcţiei respiratorii şi a celei renale. În mod direct, clorul are rol fundamental în metabolismul apei şi al azotului sanguin. În stări grave (şoc traumatic şi chirurgical, răniri, arsuri), păstrarea nivelului normal al clorului este deosebit de importantă, deoarece scăderea concentraţiei sale antrenează modificări ale metabolismului natriului, potasiului şi al apei. Sulful constituie şi el unul din elementele biogene primordiale, deoarece intră în compoziţia aminoacizilor esenţiali, proteinelor, polizaharidelor. Dintre compuşii organici principali amintim metionina, cisteina, cistina, glutationul, coenzima A, tiamina, acidul condroitinsulfuric, heparina. Carenţa în sulf determină malnutriţia proteică şi calorică. Magneziul prezintă în organism o importanţă deosebită deoarece este un element constitutiv al ţesuturilor dure şi moi şi în acelaşi timp este activator al unui mare număr de enzime. Intracelular, magneziul ia parte la procese metabolice de bază cum sunt fosforilarea oxidativă şi biosinteza proteinelor. În organism carenţa sa determină deprimarea SNC, a sensibilităţii nervilor şi îndeosebi a plăcii motorii a muşchilor, determină scăderea tensiunii arteriale, mergând in extremis până la oprirea inimii în diastolă. Insuficienţa sa, asociată cu cea de calciu, determină creşterea frecvenţei bolilor cardiovasculare, tulburări de pigmentare ale pielii şi părului, modificări neuromusculare, tulburări renale şi hepatice. 1.3. Oligoelemente. Sunt reprezentate de Fe, Cu, Co, Mn, Zn, I, Mo, F, B, V, Si. Ele

prezintă o concentraţie celulară sub 0,02% şi îndeplinesc un rol catalitic,

influenţând activităţile enzimatice. Cu toate că se găsesc în concentraţie foarte mică, rolul lor biologic este deosebit de important. Carenţa sau excesul lor în apă şi sol în unele zone geografice determină în organism apariţia unor boli, denumite “endemii bio-geo-chimice”. Astfel, absenţa iodului în zonele submuntoase determină boala numită “guşă endemică”, iar absenţa zincului determină nanism şi hipogonadism (boala a fost descrisă la popoarele asiatice, care au o alimentaţie predominant cerealieră; cerealele inhibă absorbţia intestinală a zincului). Fierul are rol fundamental în transportul oxigenului, fiind un component al pigmenţilor respiratori (hemoglobina), al enzimelor respiratorii (citocromi), al catalazelor şi peroxidazelor. Intră de asemenea în componenţa miozinei, siderofilinei, feritinei. Deficitul de fier de origine endogenă (hemoragii, boli parazitare, boli metabolice) sau exogenă (aport insuficient) determină anemii feriprive. Fluorul este un constituent al dinţilor şi oaselor. Concentraţia sa scăzută favorizează apariţia cariei dentare, iar excesul determină fluoroza dentară. De asemeni, creşterea concentraţiei de fluor determină dezechilibre minerale în organele aparatului locomotor, disfuncţii tiroidiene, renale, miocardice. Iodul intră în componenţa hormonilor tiroidieni asigurând astfel funcţia glandei tiroide şi a tuturor proceselor metabolice ce ţin de aceasta. Carenţa în iod determină insuficienţa tiroidiană cu tulburări trofice şi neuropsihice de diferite grade. Boala se combate prin administrare profilactică de sare iodată. Cuprul este implicat în funcţia hematopoetică (sinteza hemului, adeseori în conexiune cu fierul) şi în funcţia metabolică, fiind necesar activităţii unor enzime tisulare. Participă la formarea pigmenţilor şi la asigurarea apărării antiinfecţioase. În organism el intră în componenţa unor enzime cum sunt: citocromoxidaza, ceruloplasmina, aminoxidaze, fenoloxidaza, hepatocupreine. Dezechilibrul metabolic al cuprului antrenează tulburări ale sintezei proteinelor. Excesul de cupru determină în organism boli care au la bază dereglări ale metabolismului proteic (boli reumatice, sanguine, cardiovasculare, tiroidiene, infecţii bacteriene şi virale). Manganul este un element necesar creşterii, metabolismului lipidic şi funcţiei “marţiale” a fierului. Excesul de mangan determină scăderea funcţiei hepatice şi a eritropoezei. De asemenea, creşterea concentraţiei de mangan determină inhibiţia enzimelor oxidative implicate în biosinteza catecholaminelor (tirozinhidroxilaza) şi în fosforilarea oxidativă. Efectele dezechilibrelor de concentraţie ale manganului se repercută şi la nivel genetic, prin tulburarea activităţii enzimelor care asigură metabolismul ADN şi funcţia ribozomilor.

2. SUBSTANŢELE ANORGANICE

2.1. APA 2.1.1. Importanţa apei în celulă. Apa reprezintă una dintre cele mai importante

substanţe anorganice din organismul uman. Ea reprezintă constituentul celular cel mai abundent, cu excepţia ţesutului osos şi al smalţului dentar (fig.III.2). Apa reprezintă mediul în care are loc organizarea structurilor celulare şi în care se desfăşoară toate procesele fizico-chimice ale vieţii. Este indispensabilă activităţii metabolice deoarece procesele fiziologice au loc în mediu apos. Fără apă, viaţa nu este posibilă, dar ea nu constituie substratul proceselor vitale. Prin extragerea apei din celule, procesele vitale sunt doar stagnate, nu suprimate. Un exemplu în acest sens sunt experienţele efectuate pe seminţele de cereale, bacteriile şi sporii de ciuperci găsite în mormintele faraonilor, care reintroduse în mediu propice (rehidratate), şi-au continuat ciclul biologic. 2.1.2. Originea apei. Pentru organism, sursa de apă este de natură exogenă prin

ingestia de lichide şi alimente (care în mod normal este de aproximativ 2 litri pe zi) şi de natură endogenă, rezultată din reacţiile metabolice. Deci, pe de o parte moleculele de apă participă la realizarea reacţiilor intracelulare şi pe de altă parte ele însele pot proveni din reacţiile metabolice.

Fig.III.2. Repartiţia procentuală a componentelor moleculare celulare 2.1.3. Repartiţie intracelulară. În lumea vie cantitatea de apă variază de la un regn

la altul, de la o specie la alta şi de la un tip celular la altul. Celulele umane conţin o cantitate crescută de apă, ponderea acesteia depinzând de mai mulţi factori: a) vârsta individului. Celulele embrionare conţin aproximativ 94% apă, cele ale nou-născutului - 80-85%, la tineri - 75%, la adult - 65-70%, pentru ca la un organism îmbătrânit să conţină doar 58-60% apă. După cum se observă, cu cât organismul

este mai tânăr, cu atât celulele sale conţin apă într-o proporţie mai mare. Acesta este şi motivul pentru care, privarea de apă este mai greu suportată de către copil. Deshidratarea din cadrul unor boli care se manifestă prin transpiraţie excesivă, febră, diaree, vărsături, în lipsa unor măsuri de compensare hidrică, poate determina în timp scurt (3-6 ore) decesul sugarului. b) tipul celular. Ponderea intracelulară a apei variază de la un tip celular la altul. Astfel, neuronii conţin 80% apă, hepatocitele şi nefrocitele 70% apă, celula musculară 70-80% apă, celula adipoasă 15%, iar smalţul dentar 2% . c) vârsta celulei. Celulele tinere cu o activitate metabolică mai intensă prezintă în general un conţinut crescut de apă faţă de cele îmbătrânite. d) activitatea metabolică la un moment dat. Deoarece apa reprezintă mediul în care se petrec reacţiile metabolice intracelulare, în momentele de activitate celulele se caracterizează printr-un conţinut mai crescut în apă decât în momentele de repaus metabolic. 2.1.4. Repartiţia apei în organism. Un adult de 70 kg conţine aproximativ 40 kg de

apă, deci aproximativ 60% din greutatea sa. Aceasta este repartizată pe compartimente după cum urmează: 40% în mediul intracelular şi 20% în mediul extracelular. Apa extracelulară este repartizată la rândul său astfel: 15% în sectorul intravascular (plasmă, limfă) şi 5% în sectorul extravascular (lichid interstiţial, lichid cefalorahidian, cavităţi, seroase etc.) Apa extracelulară, alcătuieşte mediul intern al organismului. Cantitatea sa trebuie să se menţină constantă, pentru a putea asigura homeostazia organismului (homeostazie = capacitatea organismelor superioare de a-şi menţine echilibrul morfofiziologic în condiţii variabile de mediu). Apa intracelulară. O celulă se compune dintr-o fază apoasă şi o fază neapoasă. Faza neapoasă este alcătuită din sistemul de membrane, insolubile în apă datorită filmului lipidic pe care îl conţin. Acestea permit numai dizolvarea moleculelor lipofile. Faza apoasă a celulei comportă două forme: apa liberă şi apa legată. a) apa liberă reprezintă 95% din totalul apei intracelulare. Ea joacă rol de solvent, este sediul proceselor metabolice şi totodată asigură mediul de dispersie al sistemului coloidal citoplasmatic. b) apa legată reprezintă 4-5% din totalul apei intracelulare; este legată prin legături slabe de hidrogen şi prin alte forţe de proteine, lipide şi alte componente celulare. Ea cuprinde şi “apa de imbibiţie” sau imobilizată între fibrele macromoleculelor. 2.1.5. Proprietăţile fizico-chimice ale apei

Apa posedă proprietăţi fizico-chimice care îi permit să importante funcţii în organism:

îndeplinească

a) Proprietăţi fizice. Apa are punct de topire, punct de fierbere, căldură de evaporare,

căldura de fuziune şi tensiune superficială mai mari decât ale celor mai multe lichide obişnuite. Aceste proprietăţi indică faptul că forţele de atracţie dintre moleculele apei lichide, respectiv coeziunea sa internă, sunt relativ mari. b) Organizare moleculară. Apa este o moleculă polară. Caracterul de dipol se datorează aranjamentului atomilor de hidrogen şi oxigen în triunghi isoscel, la care polul pozitiv este reprezentat de atomii de hidrogen, iar cel negativ de oxigen (fig.III.3). Datorită faptului că sunt polarizate, două molecule de apă adiacente se pot lega prin legături chimice, numite legături de hidrogen. Acestea sunt legături chimice slabe, de 20 de ori mai slabe decât o legătură covalentă. c) Coeziune internă mare. Datorită aranjamentului tetraedric al atomilor de hidrogen în jurul atomului de oxigen, fiecare moleculă de apă este capabilă să formeze legături de hidrogen cu patru molecule de apă vecine. Din această proprietate rezultă marea coeziune internă a apei lichide (fig.III.4). Legăturile de hidrogen se formează nu numai în apa lichidă, ci şi în vapori şi în gheaţă. Procentajul legăturilor de hidrogen este diferit în funcţie de temperatură: • la temperatura de 0oC, punţile de hidrogen se realizează între toate moleculele de apă, în întreg cristalul. În acest fel apa ia forma de reţea cristalină, macroscopic are aspect acicular, iar reacţiile sale sunt inhibate. Dacă aceste temperaturi sunt realizate brusc şi pe suprafeţe mici, apa îngheaţă amorf neproducând distrucţii celulare. Pe această proprietate au fost iniţial imaginate şi realizate tehnicile de conservare celulară (băncile de spermă etc.). • la temperaturi cuprinse între 0oC şi 15oC, punţile de hidrogen se desfac în proporţie de aproximativ 15%, ceea ce dă posibilitatea apariţiei unei asocieri de 5-6 molecule (aspect pentagonal, hexagonal) favorabile proceselor reactive. • la temperaturi de 35oC - 40oC, legăturile de hidrogen se desfac în proporţie de aproximativ 50%, în acest fel apa devine reactivă, favorabilă proceselor celulare.

Fig.III.3. Structura moleculei de apă (după Alberts şi colab.,1989)

d) Caracterul de solvent. Tot datorită caracterului de dipol, moleculele de apă se pot

orienta în jurul altor molecule, dizolvându-le. Astfel, apa este un bun solvent al substanţelor minerale şi organice din celule. Ea nu este numai un mediu de dispersie, ci influenţează substanţele dispersate. La rândul lor, substanţele dizolvate produc asupra solventului modificări ale proprietăţilor fizice, cum sunt: punctul de îngheţ, punctul de fierbere şi conferă presiune osmotică. Dacă două soluţii apoase sunt separate printr-o membrană permeabilă doar pentru apă, moleculele de apă se vor deplasa înspre soluţia mai concentrată, proces numită osmoză. În soluţia mai concentrată se crează astfel o presiune osmotică, datorită creşterii volumului.

Fig.III.4. Aranjarea tetraedrică a moleculei de apă în gheaţă (după Benga, 1985) e) Formează învelişul de hidratare al ionilor. Prin această proprietate, apa favorizează

transportul ionilor la nivelul membranei celulare. Astfel, în cadrul transportului transmembranar Ca++ este învelit de 12 molecule de apă, Na+ de 8 molecule, iar K+ de 4 molecule de apă. f) Constanta dielectrică mare conferă apei o mare capacitate de “ecranare termică”. În acest fel, structurile celulare sunt apărate de distrugerile termice ce ar putea apărea la eliberările bruşte de căldură rezultate din reacţiile exotermice. g) Căldura mare de vaporizare este conferită de dispoziţia legăturilor de hidrogen. Această proprietate permite reglarea temperaturii corpului prin evaporare. h) Capacitatea de a disocia. Apa se comportă ca acid sau bază, având o uşoară tendinţă de a se ioniza. Când se comportă ca un acid slab, ea eliberează un proton pentru a forma un ion hidroxil. Când acţionează ca bază, molecula de apă acceptă un proton, formând un ion de hidroniu. Deoarece masa atomului de hidrogen este mică şi unicul său electron este atras de atomul de oxigen, atomul de hidrogen are tendinţa de a se disocia de oxigenul moleculei din care face parte şi de a “sări” spre

atomul de oxigen al moleculei învecinate. În acest fel, iau naştere ionii hidroxil şi hidroniu, care influenţează reacţiile celulare. Ei sunt însă instabili, reacţia este reversibilă şi conduce la refacerea moleculelor de apă, după următoarea formulă: H2O → H+ + OH↓ H+ + H2O → H3O+

→ H3O+ + OH‾ = 2 H2O

i) Dispersează moleculele amfipatice (compuşi care conţin grupări puternic nepolare

cât şi grupări puternic polare). Aşa cum s-a arătat anterior, filmul lipidic din compoziţia membranelor realizează o compartimentare celulară în două faze (apoasă şi neapoasă). Moleculele fosfolipidice sunt molecule amfipatice. La contactul cu o cantitate de apă în exces se aglomerează, formând micelii. În cadrul acestora, grupările hidrofobe se orientează spre interior pentru a evita contactul cu moleculele de apă, pe când grupările hidrofile (polare) se orientează spre exterior (v. cap. lipide). j) Participă la tranziţiile de stare gel-sol ale citoplasmei (v. proprietăţile fizico-chimice ale citoplasmei). k) Efect lubrefiant. Apa extracelulară îndeplineşte efect lubrefiant la diferite nivele: • intră în alcătuirea matricei extracelulare unde participă la protecţia suprafeţelor celulare împotriva frecării; • intră în alcătuirea seroaselor: pleurală, peritoneală acolo unde organele interne se ating şi se freacă unele de altele; • intră în alcătuirea lichidelor articulare, a structurilor ligamentare şi tendinoase, unde există de asemenea suprafeţe mari de frecare; • la nivelul tractului gastro-intestinal participă la procesul de digestie, datorită faptului că alcătuieşte o mare parte din constituţia mucusului şi a secreţiilor digestive. 2.2. SĂRURILE MINERALE

Intracelular, sărurile minerale apar sub două forme: a) formă disociată de ioni liberi. Aceştia sunt anioni de tipul Cl-, PO4--, SO4--, CO3, NO3- sau cationi ca: Na+, K+, Ca++, Mg++. b) combinaţii organominerale: hemoglobină, hemocianină, mioglobină, hemosiderină etc. Sărurile minerale îndeplinesc multiple roluri: menţin presiunea osmotică şi echilibrul acidobazic, influenţează activitatea enzimatică (rol catalitic) şi intervin în numeroase procese celulare ca: permeabilitate, excitabilitate, contractilitate, vâscozitatea citoplasmei, diviziune. Ele determină încărcătura electrică a

macromoleculelor şi constituie surse importante de energie. Retenţia ionilor produce creşterea presiunii osmotice, antrenând deplasarea apei spre interior. Unii ioni anorganici sunt indispensabili activităţii enzimatice (magneziu, iod, zinc etc.); fosfatul anorganic este principalul producător de energie metabolică (ATP) pentru procesele vitale ale celulei. Ionii de calciu se găsesc în cantitate crescută în sânge, dar şi intracelular. La nivelul oaselor, ionii de calciu se combină cu ionii fosfat şi carbonat pentru a forma trama (reţeaua) cristalină. Ionii fosfaţi liberi se găsesc în sânge, în lichidul tisular, dar cea mai mare parte a fosfatului din organism intră în alcătuirea fosfolipidelor, fosfoproteinelor, nucleotidelor. Fosfatul monovalent (H2PO4-) şi fosfatul bivalent (HPO4--) contribuie la formarea sistemelor tampon ale organismului, stabilizând pH-ul sângelui şi al lichidelor tisulare. Pe lângă aceştia, în lichidul interstiţial sunt prezenţi şi ionii sulfat, carbonat şi bicarbonat. 2.3. GAZELE

Gazele prezente în celulă sunt oxigenul şi bioxidul de carbon. Oxigenul este prezent permanent intracelular, variind în limite largi, care depind de tipul celular, starea fiziologică a celulei şi vârsta acesteia. Cel mai mare consum de oxigen (30% din cantitatea totală inhalată), îl realizează neuronii de la nivelul scoarţei cerebrale. Intracelular, oxigenul se găseşte în stare de gaz, disociat în masa de apă liberă, sub formă moleculară, ioni de oxigen sau atomi activaţi în procesele de oxidare. Bioxidul de carbon rezultă din procesele de oxidoreducere şi este eliminat în timp scurt. 3. SUBSTANŢELE ORGANICE Substanţele organice reprezintă aproximativ 27% din constituenţii celulari, după cum urmează: proteine 15%, acizi nucleici 7%, glucide şi metaboliţii lor 3%, lipide şi metaboliţii lor 2%. 3.1. PROTEINELE

Proteinele reprezintă aproximativ 15% din constituenţii celulari şi constituie 50% din masa uscată a celulei. Din punct de vedere biochimic sunt substanţe cuaternare, alcătuite din C, O, H, N la care se pot adăuga S, P, Fe, Zn sau Cu. Intracelular proteinele se găsesc la toate nivelele, deoarece sunt esenţiale pentru constituirea tuturor structurilor şi participă la toate mecanismele celulare (tab.III.II). Unităţile structurale de bază ale proteinelor sunt aminoacizii. Aceste “cărămizi de construcţie” conţin cel puţin o grupare carboxil şi o grupare -amino,

dar diferă între ele prin structura radicalilor (R), sau a lanţurilor laterale. În mod obişnuit, la alcătuirea proteinelor iau parte 20 de aminoacizi diferiţi (tab.III.III). În moleculele proteice, aminoacizii sunt legaţi covalent şi formează lanţuri lungi, neramificate. Condensarea aminoacizilor pentru formarea moleculei proteice se face în aşa fel încât gruparea acidă a unui aminoacid se combină cu gruparea bazică a aminoacidului subjacent cu pierderea simultană a unei molecule de apă, după modelul:

Legătura R’-CO-NH-R” se numeşte legătură peptidică. Molecula nou formată îşi menţine caracterul amfoter deoarece una dintre extremităţi posedă un grup acid, iar cealaltă o grupare bazică. În plus, moleculele prezintă reziduuri laterale dintre care unele sunt bazice, altele acide. Doi aminoacizi formează un dipeptid, trei - un tripeptid. Când un număr mic de aminoacizi se leagă între ei, formează un oligopeptid. Polipeptidele sunt formate dintr-un mare număr de aminoacizi. Unele proteine conţin doar un lanţ polipeptidic, altele conţin două sau mai multe. Fiecare lanţ polipeptidic are masă moleculară, compoziţie chimică, ordine secvenţială a aminoacizilor componenţi şi structură bine definite. După compoziţia lor, proteinele se împart în două clase principale : simple şi conjugate. Proteinele simple sunt cele care la hidroliză dau numai aminoacizi şi nici un alt produs organic sau anorganic de hidroliză. Ele conţin de obicei 50% carbon, 7% hidrogen, 23% oxigen, 16% azot şi 0-3% sulf. Proteinele conjugate sunt cele din a căror hidroliză rezultă nu numai aminoacizi, ci şi alţi compuşi organici sau anorganici. Partea din proteina conjugată care nu este aminoacid, se numeşte grupare prostetică. După natura chimică a grupării prostetice, proteinele conjugate pot fi clasificate în: nucleoproteine, lipoproteine, fosfoproteine, metaloproteine, glicoproteine (tab.III.IV). Tabelul III.II. Clasificarea grupelor de proteine după funcţia biologică Clasa de proteine Funcţia Exemple - rol plastic - keratina (păr, unghii) • structurale - elastina (pereţii vaselor) - glicoproteine (membrane) - rol de susţinere - colagen (matricea

• reglatoare • contractile

- modulează procesele fiziologice - motilitate

• imunologice • de transport şi depozitare

- protecţie imună - transport prin membrane biologice - transportul O2, CO2, Fe, Cu

• controlul proceselor metabolice

- generarea şi transmiterea influxului nervos - controlul creşterii şi diviziunii celulare

• enzime

- nutriţie - transmiterea informaţiei ereditare - rol în coagulare - catalizează reacţiile biochimice

Tabel III.III. Aminoacizii esenţiali Grupul Aminoacizi Monoamino- glicină monocarboxilici - alanină - valină - leucină - izoleucină monoamino- ac. glutamic dicarboxilici - ac. aspartic diamino- arginină monocarboxilici - lizină - hidroxilizină cu grup hidroxil - threonină - serină

extracelulară) - hormoni (insulina) - miozina -dineina - actina - nexina - tubulina - anticorpi - proteine intrinseci ale plasmalemei - hemoglobina - mioglobina - globulina fixatoare de Fe - ceruloplasmina - rodopsina - receptorii sinaptici - chalone - hormoni - factori de creştere - ovalbumina - nucleoproteine - fibrinogen, trombină - amilaza, lipaza etc.

Simbolul Gly Ala Val Leu Ile Glu Asp Arg Lys Hyl Thr Ser

cu sulf Aromatici Heterociclici

- cysteină - metionină - phenilalanină - tyrozină - triptofan - prolină - hidroxiprolină - histidină

Cys Met Phe Tyr Trp Pro Hyp His

Tabel III.VI. Proteine conjugate şi structurile la formarea cărora participă Clasa Gruparea prostetică Struct. la care participă Nucleoproteine - ARN - ribozomi Lipoproteine - fosfolipide - 1lipoproteine - colesterol plasmatice - lipide neutre Glicoproteine - hexozamină - gamma globulina - galactoză - manoză - acid sialic Fosfoproteine - fosfaţi esterificaţi - cazeina Hemoproteine - Fe protoporfirinic - hemoglobina - citocrom C - catalaza Flavoproteine - flavin-adenin - succindihidrogenaza dinucleotid Metaloproteine - Fe(OH)3 - feritina - Fe şi Cu - citocromoxidaza - Zn - alcool dehidrogenaza

3.1.1. Nivelele de structură ale proteinelor a) Structura primară se referă la scheletul covalent al lanţului polipeptidic şi la secvenţa de aminoacizi componenţi. Ea este structura de bază, cea mai specifică, care determină ulterior structura secundară şi terţiară. În cadrul lanţului polipeptidic aminoacizii sunt dispuşi ca “mărgelele pe fir”, iar secvenţa lor are o mare importanţă biologică. Schimbarea ordinii aminoacizilor determină sinteza unei proteine cu alterări biologice importante. b) Structura secundară este evidentă în special la proteinele fibrilare, unde lanţurile polipeptidice prezintă o pliere longitudinală sau extinsă. Se întâlneşte de asemenea şi la fragmente de lanţuri polipeptidice ale proteinelor globulare. Metoda de

difracţie în raze X a permis clasificarea acestor proteine în trei grupe structurale: structura - helicoidală (ex. -keratina)(fig.III.5), structura de foiţă pliată (ex.  keratina)(fig.III.6) şi structura triplu helix, de trei lanţuri helicoidale răsucite (ex. colagenul) (fig.III.7). c) Structura terţiară demonstrează modul de înclinare şi pliere al lanţurilor polipeptidice în spaţiu, pentru a forma structura compactă a proteinelor globulare (fig.III.8). În cadrul structurii terţiare aranjamentul spaţial este predeterminat de secvenţa aminoacizilor (din structura primară) şi de legăturile ce se stabilesc între reziduurile laterale. Cele mai multe proprietăţi biologice ale proteinelor, cum sunt activităţile enzimatice şi antigenice, depind de structura terţiară. Agenţii fizici (temperaturi înalte, radiaţii), precum şi chimici pot determina ruperea structurii terţiare, ceea ce antrenează denaturarea proteinei. Denaturarea se însoţeşte de obicei de pierderea activităţii biologice. Uneori proteinele sunt capabile de a-şi reface configuraţia naturală şi de a reveni astfel la activitatea normală. d) Structura cuaternară se referă la modul de aranjare al lanţurilor polipeptidice individuale unele faţă de altele. Cele mai multe proteine mari conţin 2 sau mai multe lanţuri polipeptidice legate prin legături slabe, necovalente (fig.III.9). 3.1.2. Conformaţia proteinelor În stare naturală fiecare tip de moleculă proteică are o formă tridimensională caracteristică denumită conformaţie. În funcţie de conformaţia lor, proteinele pot fi clasificate în două mari clase: a) Proteine fibrilare. Sunt formate din lanţuri polipeptidice aranjate paralel în lungul unei singure axe, dând naştere la filamente lungi sau foiţe. Ele sunt rezistente fizic, insolubile în apă sau în soluţii saline diluate. Din această cauză ele reprezintă elemente structurale de bază ale ţesutului conjunctiv. Exemple de proteine fibrilare sunt: colagenul din matricea extracelulară,-keratina din păr, piele, unghii şi elastina din ţesutul conjunctiv elastic. b) Proteine globulare. Sunt formate din lanţuri polipeptidice pliate compact în forme sferice sau globulare. Cele mai multe dintre ele sunt solubile în sisteme apoase. Intracelular îndeplinesc o funcţie dinamică cu rol contractil (actina, tubulinele) sau enzimatic. Din cele aproximativ 2000 de enzime cunoscute până în prezent, aproape toate sunt proteine globulare; de asemenea anticorpii, o serie de hormoni şi multe proteine cu rol de transport (albumina serică, hemoglobina). c) Există şi o a treia categorie de proteine, clasificată între cele două tipuri prezentate anterior. Acestea, se aseamănă cu proteinele fibrilare deoarece au o structură de baghete lungi, dar şi cu cele globulare datorită solubilităţii în soluţii apoase saline. Exemple sunt: miozina (important element structural al muşchiului) şi fibrinogenul (element structural al cheagului sanguin).

3.1.3. Legăturile din cadrul moleculelor proteice În structura proteinelor sunt implicate diferite tipuri de legături. Structura primară este determinată de legături chimice sau covalente. Punţile disulfurice -S-S- pot lega reziduuri de cisteină, ca în cazul insulinei şi a ribonucleazei. Structurile secundare şi terţiare prezintă o serie de legături mai slabe, de tip: legături ionice sau electrostatice care leagă ioni pozitivi şi negativi la o distanţă de aproximativ 2-3 Ǻ; legături de hidrogen care îşi exercită acţiunea la o distanţă de 2,5-3,5 Ǻ şi sunt mai slabe decât cele ionice; legături slabe care se produc prin interacţiunea lanţurilor laterale nepolare şi prin respingerea faţă de moleculele solventului; forţe van der Waals stabilite între atomii care vin în contact.

Fig.III.5. Structură secundară de tip α helix: A- atomii scheletului polipeptidic, Baranjamentul tridimensional al atomilor, C- α helixul

Fig.III.6. Structură secundară de tip foiţă β: A- atomii scheletului polipeptidic, B-aranjamentul tridimensional al atomilor, C- traseul antiparalel al foiţei β

Fig.III.7. Structură secundară de tip triplu helix

Fig.III.8. Structură terţiară - modele de tip panglică a trei domenii diferite: A-citocrom b562, B-domeniu de legătură al NAD la lacticodehidrogenază, C- domeniu variabil al unui lanţ uşor din componenţa unui anticorp

Fig.III.9. Structură quaternară: hemoglobina, formată din asamblarea simetrică a două subunităţi

3.1.4. Specificitatea proteinelor. Anticorpii şi răspunsul imun. Proteinele îşi pot îndeplini funcţiile atât de variate datorită specificităţii lor. Din miile de molecule cu care vin în contact, proteinele le recunosc pe acelea cu care se pot combina sau asocia specific: enzima cu substratul, transportorul cu substanţa ce urmează a fi transportată, anticorpii cu antigenele. Specificitatea proteinelor se datorează structurii lor moleculare spaţiale şi constituie baza diferenţelor între specii şi între indivizii aceleiaşi specii. Dintre

numeroasele proteine din organismele vii, anticorpii sau imunoglobulinele au avut o importanţă deosebită în demonstrarea faptului că proteinele sunt specifice pentru fiecare specie de organisme. Moleculele de anticorpi, apar în serul sanguin, sau pe suprafaţa a diferite celule (limfocite T, limfocite B) ca răspuns la prezenţa unei macromolecule proteice străine denumită antigen. Anticorpii se combină în mod specific cu antigenul care a determinat formarea lor, formând un complex antigenanticorp responsabil de răspunsul imun. Imunoglobulinele sunt glicoproteine sintetizate de plasmocite, care la rândul lor provin din limfocitele B transformate blastic. Imunoglobulinele nou sintetizate au aceeaşi specificitate antigenică ca şi cea a imunoglobulinelor exprimate la suprafaţa limfocitelor B (IgM sau IgG). Molecula de bază a imunoglobulinei este constituită din 4 lanţuri polipeptidice (2 grele şi 2 uşoare) solidarizate prin punţi disulfurice. Studiile de clivare proteolitică cu papaină au arătat că imunoglobulinele sunt alcătuite din trei fragmente diferite structural, cu particularităţi funcţionale distincte (fig.III.10): • două fragmente identice Fab (fragment antigen binding) constituite din extremităţile NH2 terminale ale lanţurilor grele şi câte un lanţ uşor. Ele au funcţia de a recunoaşte şi a angaja legături cu antigenul. • un fragment Fc (fracţiune cristalizabilă) alcătuit din jumătatea COOH terminală a lanţurilor grele. El este purtătorul specificităţii antigenice, caracteristic fiecărei clase de imunoglobuline, purtătorul situsului de activare a complementului, al situsului implicat în transportul transplacentar al imunoglobulinelor etc. Organismul uman produce câteva milioane de tipuri diferite de anticorpi care recunosc şi fixează orice tip de antigen. Numărul tipurilor de anticorpi depăşeşte cu mult numărul tipurilor de proteine pe care un organism le sintetizează în mod normal, sau altfel spus, organismul poate sintetiza mult mai multe tipuri de anticorpi decât numărul de gene de care dispune. La sinteza unui lanţ polipeptidic imunoglobulinic participă mai multe gene, aceasta permiţând producţia unui număr imens de varietăţi de anticorpi.

Fig.III.10. Structura de principiu a imunoglobulinelor (Ig)

3.2. ACIZII NUCLEICI Acidul dezoxiribonucleic (ADN) şi acidul ribonucleic (ARN) sunt macromolecule tip lanţ care au funcţia de a depozita şi transmite informaţia genetică în succesiunea generaţiilor de celule, asigurând în acest fel specificitatea biologică (ADN). Pe de altă parte acizii nucleici asigură controlul activităţii celulare prin transcripţia informaţiei genetice de pe ADN pe ARN, în vederea realizării biosintezei proteice. Ei sunt componente ale tuturor celulelor (cu excepţia hematiilor) şi reprezintă 5-15% din masa uscată celulară. Acizii nucleici se găsesc şi în virusuri, care sunt complexe infecţioase proteină-acid nucleic capabile să se replice în celula gazdă. 3.2.1. Structura generală Macromoleculele de acizi nucleici au dimensiuni mari şi greutăţi moleculare situate între 106 - 109 daltoni. Aşa cum aminoacizii sunt elemente constitutive ale polipeptidelor, nucleotidele sunt unităţile monomerice ale acizilor nucleici. Deci ADN şi ARN sunt macromolecule formate prin policondensarea nucleotidelor. Unităţile monomer ale ADN se numesc dezoxiribonucleotide, iar cele ale ARN sunt denumite ribonucleotide. Un nucleotid este format din: 1) bază heterociclică azotată (un derivat purinic sau pirimidinic), 2) o pentoză, 3) o moleculă de acid fosforic. Bazele azotate prezente în ADN sunt adenina (A), guanina (G), citozina (C) şi timina (T), iar pentru ARN: adenină, guanină, citozină şi uracil (U). Din punct de vedere chimic aceste componente sunt purinice (A, G) şi pirimidinice (C, T, U) (fig.III.11). Pentozele prezente în acizii nucleici sunt dezoxiriboza pentru ADN şi riboza pentru ARN. Dezoxiriboza permite pozitivarea reacţiei Feulgen, specifică pentru ADN (fig.III.12). Acidul fosforic leagă pentozele celor două nucleotide consecutive. În acest fel,

acidul fosforic utilizează doi dintre cei trei radicali acizi. Gruparea acidă restantă permite moleculei să formeze legături ionice cu proteine bazice (histone şi protamine) care conferă bazofilia cromatinei. Nomenclatura folosită pe plan internaţional pentru desemnarea nucleotidelor şi a componentelor lor este următoarea: BAZĂ AZOTATĂ + PENTOZĂ = NUCLEOZID BAZĂ AZOTATĂ + PENTOZĂ + FOSFAT = NUCLEOTID BAZĂ AZOTATĂ Adenina Guanina

NUCLEOZID Adenozina Guanozina

ABREVIERE A

Citozina Uracil Timina

Citidina Uridina Timidina

C U T

G

Nucleotidele se abreviază prin trei litere, după cum urmează: AMP = adenozin monofosfat; ATP = adenozin trifosfat; UDP = uridin difosfat; dAMP = dezoxiadenozin monofosfat etc.

Fig.III.11. Structura chimică a bazelor purinice şi pirimidinice

Fig.III.12. Pentozele din componenţa acizilor nucleici

3.2.2. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) a) Structura primară a ADN corespunde configuraţiei monocatenare în care nucleotidele sunt înşiruite într-o ordine caracteristică fiecărei specii, rezultând o catenă polinucleotidică formată dintr-o coloană glucidofosforică bazată pe legături covalente stabile fosfodiesterice 3’– 5’. Legăturile fosfodiesterice 3’–5’ condiţionează formarea de catene lungi, polinucleotidice, neramificate, conferind macromoleculei de ADN posibilitatea de a înscrie sub forma unor secvenţe de baze azotate informaţia genetică de mare diversitate, teoretic nelimitată. b) Structura secundară a ADN (structura bicatenară) este reprezentată de configuraţia spaţială bicatenară, dublu helicoidală a macromoleculei de ADN. Ea rezultă în urma unirii prin legături de hidrogen a bazelor azotate din două catene polinucleotidice complementare. Complementaritatea catenelor se bazează pe împerecherile specifice, prin legături de hidrogen, a bazelor azotate de pe cele două catene. Modelul dublului helix al moleculei de ADN Descrierea organizării spaţiale a moleculei de ADN elaborată în 1953 de Watson şi Crick a reprezentat un moment crucial în biologie deoarece a permis explicarea mecanismului prin care informaţia genetică este conservată (fig.III.13). Fenomenul de replicare semiconservativă a ADN permite conservarea informaţiei, iar cel de transcripţie permite transmiterea informaţiei prin intermediul ARN. Caracterele esenţiale ale modelului sunt: a) fiecare moleculă este compusă din 2 lanţuri lungi, polinucleotidice, orientate în direcţii opuse, care formează un dublu helix în jurul unui ax central, imaginar. Diametrul helixului este de 20 Ǻ, iar pasul este de 33 Ǻ cuprinzând circa 10 perechi

de baze/spiră. Această structură generează două şanţuri de adâncimi şi lărgimi diferite (şanţul minor şi major), ambele înfăşurându-se helicoidal de-alungul întregii macromolecule de ADN. Pe aceste şanţuri se deplasează enzimele implicate în procesele de reparare, replicare şi transcripţie. b) nucleozidul este dispus într-un plan perpendicular faţă de planul lanţului polinucleotidic. c) cele două lanţuri sunt unite prin legături de hidrogen care se stabilesc între perechile de baze. d) deoarece între cele două fracţiuni glucidice ale nucleotidelor opuse este o distanţă fixă de 11 Ǻ, o bază purinică nu se poate lega decât de una pirimidinică. Astfel, AT şi G-C sunt singurele perechi care se pot forma. Între A-T se formează legături duble de hidrogen, iar între G-C, legături triple. e) secvenţa axială a bazelor în lungul lanţului polinucleotidic poate să varieze considerabil, dar în cel de al doilea lanţ secvenţa trebuie să fie complementară, ca în exemplul următor: A T T C G A G || || || ||| ||| || ||| T A A G C T C În timpul reduplicării ADN, cele două lanţuri se despart şi fiecare serveşte ca matriţă pentru sinteza unui lanţ complementar. În acest fel, cele două noi molecule de ADN au aceeaşi configuraţie moleculară. Dispoziţia secvenţială variabilă a celor 4 baze în lungul lanţului de ADN stă la baza informaţiei genetice. Cele 4 baze pot să determine mii de caractere ereditare diferite, deoarece moleculele de ADN sunt polimeri lungi, pe care se pot produce un număr imens de combinaţii.

Fig.III.13. Modelul moleculei de ADN, propus de Watson şi Crick

Localizarea intracelulară a ADN La procariote, molecula de ADN se prezintă sub forma unui dublu helix inelar, neconjugat cu proteine. El reprezintă 1% din masa celulei, alcătuieşte nucleoidul sau echivalentul nuclear şi de obicei este ataşat punctiform de un pliu al membranei celulare numit mezozom. Uneori, în citoplasma bacteriilor se găsesc molecule mici de ADN extracromozomial care poartă doar câteva gene şi se numesc plasmide sau epizomi. În celulele eucariote ADN se găseşte situat la nivel nuclear şi în cantităţi mici la nivel citoplasmatic. Localizarea nucleară este dublă: • ADN-cromozomial (nuclear) intră în alcătuirea cromatinei (în interfază) şi a cromozomilor (în timpul diviziunii) şi are rolul de a transcrie informaţia genetică pe ARN mesager şi ARN de transport. ADN-ul nuclear este legat prin legături ionice cu proteine bazice, numite histone. • ADN-extracromozomial, asociat nucleolului. Rolul său biologic este acela de a transcrie ARN ribozomal. • În citoplasmă, ADN este localizat în matricea mitocondrială (la celulele animale) şi cloroplastidială (la celulele vegetale). ADN-ul mitocondrial (ADNmt) are o formă circulară asemănătoare cu ADN-ul procariotelor şi proprietăţi biochimice diferite de cel cromozomial. ADNmt codifică 22 de tipuri de ARN mitocondrial şi 13 proteine mitocondriale, motiv pentru care mitocondria este capabilă de a-şi sintetiza singură 5% din proteinele structurale şi enzime. Virusurile care conţin ADN poartă denumirea de adenovirusuri. 3.2.3. Acidul ribonucleic (ARN) Structura primară a ARN este asemănătoare celei a ADN, cu diferenţa că el conţine riboză şi uracil, în loc de dezoxiriboză şi timină. La procariote. În celulele bacteriene, cea mai mare parte a ARN se află în citoplasmă, dar o anumită cantitate este ataşată necovalent de ADN, pe măsură ce se formează în procesul de transcripţie. În celulele eucariote, diferitele tipuri de ARN au o distribuţie intracelulară distinctă. În celula hepatică aproximativ 11% din totalul cantităţii de ARN se află în nucleu, 15% în mitocondrii, peste 50% în ribozomi, iar 24% în citosol. Ca şi ADNmt, ARN ribozomal şi de transfer mitocondriali se deosebesc de formele extramitocondriale. Pe baza greutăţii lor moleculare, a proprietăţilor fizico-chimice şi a rolului îndeplinit, ARN se clasifică în trei clase: ARN ribozomal (ARNr), ARN mesager

(ARNm) şi ARN solubil sau de transfer (ARNt). Toate cele trei tipuri îşi au originea în nucleu şi trec în citoplasmă unde contribuie la sinteza proteinelor. Fiecare dintre cele trei tipuri majore există în forme moleculare multiple: ARNr există în cel puţin trei forme majore, ARNt în 60 de forme, iar ARNm în sute de forme distincte. ARN mesager se sintetizează în nucleu prin procesul de transcripţie; secvenţa bazelor dintr-un lanţ de ADN cromozomial este copiată enzimatic în lanţul de ARNm. Secvenţa bazelor din lanţul de ARNm este complementară celei din lanţul ADN care se transcrie. După transcripţie, ARNm trece în citoplasmă şi apoi la ribozomi, unde serveşte ca matriţă pentru ordonarea secvenţială a aminoacizilor în procesul de biosinteză a proteinelor. Molecula este monocatenară; datorită flexibilităţii crescute se poate plia temporar formând zone bicatenare acolo unde bazele azotate care vin faţă în faţă sunt complementare (fig.III.14). În momentul formării poliribozomului şi începerea biosintezei proteice se depliază, redevenind monocatenar. ARN de transfer sunt molecule relativ mici care funcţionează ca transportori specifici ai aminoacizilor la ribozomi în cadrul procesului de biosinteză proteică. Fiecare din cei 20 de aminoacizi esenţiali are cel puţin un ARNt corespunzător, iar unii au chiar mai mulţi. Forma moleculei este de „frunză de trifoi” cu zone bicatenare şi zone monocatenare sub formă de bucle (fig. III.15). Prezintă un situs specific pentru ataşarea unui aminoacid şi un anticodon specific pentru codonul de pe ARNm. ARN ribozomal reprezintă 60% din masa ribozomilor la procariote şi 50% la eucariote. Sunt molecule monocatenare prezente la procariote în trei tipuri caracteristice (cu constante de sedimentare 23S, 16S, 5S), iar la eucariote în patru tipuri caracteristice (5S, 7S, 18S, 28S) (fig.III.16) .

Fig.III.14. Conformaţia moleculei de ARNm (după Alberts, 2002)

Fig. III.15. Conformaţia moleculei de ARNt (după Alberts, 2002) (stg.) structura ARNt specific pentru fenilalanină (Phe) (dr) structura ARNt determinată prin difracţie în raze X (imagini din unghiuri diferite) (jos) secvenţa nucleotidică liniară a moleculei.

Fig.III.16. Dispoziţia ARNr 5S şi ARNr 23S în subunitatea mare ribozomală bacteriană, determinată prin cristalografie în raze X.

3.3. GLUCIDELE Glucidele sunt alcătuite din C, H şi O şi reprezintă pricipala sursă energetică a celulelor animale şi vegetale. După structură, glucidele cu importanţă biologică se clasifică în monozaharide, dizaharide şi polizaharide. 3.3.1. Monozaharidele sunt zaharuri simple cu formula chimică Cn(H2O)n. După numărul atomilor de carbon se clasifică în trioze, pentoze, hexoze etc. (fig.III.17). Cele două pentoze: riboza şi dezoxiriboza intră în alcătuirea acizilor nucleici. Dintre hexoze amintim: glucoza, galactoza, manoza, fructoza. Glucoza reprezintă principala sursă de energie a celulei. Aranjamentul spaţial al moleculei de glucoză (fig.III.18) permite utilizarea ei ca substanţă cheie în metabolismul celular. Glucoza posedă o serie de proprietăţi cu semnificaţie biologică cum sunt: este uşor degradată pe cale oxidativă (glicoliza aerobă şi anaerobă), este solubilă în apă, este mai stabilă decât pentozele şi mai reactivă decât monozaharidele cu mai mult de 6 atomi de carbon. Glucoza se depozitează intracelular sub formă polimerizată de amidon în celula vegetală şi glicogen în celula animală. 3.3.2. Dizaharidele se formează prin condensarea a doi monomeri monozaharidici cu pierderea unei molecule de apă. Formula lor chimică este C 12H22O11. Cele mai

importante dizaharide sunt zaharoza (sucroza) şi maltoza (pentru plante) şi lactoza (pentru animale şi om). Procesul prin care iau naştere dizaharidele poartă numele de sinteză de deshidratare. În acest mod, dintr-o moleculă de α-glucoză şi una de β-fructoză rezultă zaharoză şi apă. În mod similar, sinteza de deshidratare a glucozei şi galactozei conduce la formarea lactozei. Reacţia este reversibilă: adiţia apei la un dizaharid determină formarea a două monozaharide; procesul poartă denumirea de hidroliză (fig.III.19).

Fig. III.17. Monozaharide

Fig.III.18. Structura spaţială a glucozei

Fig. III.19. Sinteza de deshidratare şi hidroliza unei molecule de sucroză la care participă glucoza şi fructoza (după G.J. Tortora, 1995)

3.3.3. Polizaharidele rezultă prin condensarea mai multor molecule de monozaharide odată cu pierderea unui număr corespunzător de molecule de apă. Procesul este şi el reversibil, prin hidroliză obţinându-se monozaharide. Din punct de vedere biologic, cele mai importante polizaharide sunt glicogenul (pentru celula

animală) şi amidonul (pentru celula vegetală). Glicogenul reprezintă o importantă rezervă energetică pentru organism. El poate fi pus în evidenţă în celulele multor ţesuturi, dar este mai bine reprezentat în celulele hepatice şi musculare. Glicogenul este format din lanţuri de glucoză legate prin legături ,1:4 glicozidice care prezintă ramificaţii legate ,1:6 glicozidic tot la 6 resturi de glucoză (fig.III.20). Structura moleculei de glicogen corespunde perfect funcţiei de depozitare a glucozei, deoarece fiind o macromoleculă nu poate difuza prin membrana celulară. El participă la formarea soluţiilor coloidale în citoplasmă. Gruparea moleculelor de glucoză într-o singură macromoleculă înlătură posibilitatea creerii unei presiuni osmotice mari care ar apare dacă moleculele de glucoză ar fi libere.

Fig.III.20. Structura ramificată a macromoleculei de glicogen

Procesele de glicogenogeneză şi glicogenoliză sunt catalizate enzimatic. Localizarea enzimelor la capetele ramificaţiilor permite realizarea simultană a proceselor de glicogenogeneză şi glicogenoliză, în acest fel menţinându-se constantă concentraţia intracelulară de glucoză liberă; unităţile de glucoză sunt eliberate rapid atunci când concentraţia este scăzută şi sunt rapid adiţionate la lanţul de glicogen când concentraţia glucozei este crescută. Intracelular, glicogenul se prezintă sub formă de granule clasificate în funcţie de mărimea lor: granule de ordinul I cu diametrul de 15 nm, granule de ordinul II cu diametrul de 15-150 nm; ambele sunt entităţi ultrastructurale vizibile numai în microscopia electronică. Granulele de ordinul III cu diametre peste 150 nm sunt vizibile şi în microscopia optică. Ele reprezintă incluziunile citoplasmatice de glicogen şi se pot evidenţia prin coloraţia PAS (Periodic Acid Schiff), carmin Best sau coloraţii histochimice cu iod. 3.3.4. Glicozaminoglicanii (GAG). Sunt polizaharide în care unităţile monomer sunt formate din derivaţi aminaţi ai monozaharidelor (glucozamină, galactozamină) şi acid glicuronic la care se pot asocia, sau nu, resturi esterificate de acid sulfuric; din acest punct de vedere se

clasifică în sulfatate şi nesulfatate. • GAG nesulfataţi: cel mai răspândit este acidul hialuronic prezent în învelişul celular şi în spaţiul extracelular din ţesutul conjunctiv. Se găseşte de asemenea în lichidul sinovial şi în umoarea vitroasă a ochiului. Acidul hialuronic contribuie la creşterea vâscozităţii substanţelor la alcătuirea cărora participă; este hidrolizat de hialuronidază, proces urmat de scăderea vâscozităţii. • GAG sulfataţi sunt reprezentaţi de: condroitin sulfaţi, heparansulfaţi, dermatansulfaţi, keratosulfaţi. Constituenţii acestora, precum şi răspândirea lor în organism este redată în tabelul III.V. Soluţiile apoase ale GAG sunt gelatinoase, vâscozitatea datorându-se hidratării excesive şi legăturilor de hidrogen dintre lanţuri. Datorită proprietăţilor lor structurale, GAG îndeplinesc o funcţie mecanică de susţinere, lubrefiere, amortizare a şocurilor, dar intervin şi în metabolismul ţesuturilor. GAG

Răspândire

Condroitinsulfat Dermatansulfat Keratansulfat Heparansulfat

Cartilaj Piele Cornee Plămâni

Tabel III.V. Glicozaminoglicanii şi răspândirea lor în organism

3.3.5. Glicoproteinele sunt compuşi macromoleculari formaţi dintr-un lanţ polipeptidic la care sunt legate covalent resturi zaharidice. Ele reprezintă un grup mare, cu o largă distribuţie la nivel celular şi o considerabilă semnificaţie biologică. Glicoproteinele sunt sintetizate intracelular şi se localizează apoi atât intracelular, cât mai ales extracelular. Dintre glicoproteinele cu localizare extracelulară se pot enumera glicoproteinele sanguine, formele circulante ale unor hormoni proteici, anticorpii, diferite enzime digestive, glicoproteinele din membranele fundamentale extracelulare (tabel III.VI). Localizare • plasmă

• urină • hormoni

Exemple - fibrinogen - imunoglobuline - proteine de grup sanguin - tiroxină legată proteic - glicoproteine urinare - gonadotropină corionică

• enzime

• secreţiile mucoaselor • ţesut conjunctiv • membrane celulare • membrane extracelulare

- hormon stimulator al foliculinei - hormon stimulator al tiroidei - ribonucleaza B -  glucuronidaza - pepsina - colinesteraza serică - glicoproteine submaxilare - glicoproteine gastrice - colagen - glicoforina - glicoproteine din membrana bazală

Tabel III.VI. Exemple de glicoproteine grupate în funcţie de răspândirea în organism (după Lehninger, 1987).

3.3.6. Proteoglicanii Glicoproteinele cu concentraţie crescută glucidică poartă denumirea de proteoglicani. Sunt sintetizaţi de fibroblaste, condroblaste, osteoblaste, macrofage, histiocite, enterocite etc. Din punct de vedere al organizării moleculare sunt formaţi dintr-un miez proteic numit proteină core pe care se ataşează lanţuri de GAG (fig.III.21). Clasificarea şi localizarea lor este redată în tabelul III.VII. Clasificare 1. Extracelulari

2. Membranari 3. Intracelulari

Exemple Agrecan Neurocan, Brevican Biglican, Perlecan Versican Decorină, Lumican Cerebroglican, Glipican, Syndecan, Betaglican Serglicina

Localizare Cartilaje ţesutul nervos membrane bazale pereţii vaselor cornee membranele celulare granulele de secreţie din: mastocite, bazofile, eozinofile, neutrofile, monocite, trombocite, limfocite T citotoxice

Tabel III.VII. Clasificarea şi localizarea claselor de proteoglicani

Fig.III.21. Organizarea moleculară a proteoglicanilor (după Goodman, 1994)

Datorită faptului că sunt substanţe considerate „gelatinoase, lipicioase”, proteoglicanii asigură lubrefierea şi stabilitatea la presiune. Fiind constituenţi ai matricei extracelulare li se atribuie rolurile de modulatori ai activităţii factorilor de creştere, de reparare a ţesuturilor lezate, rol anticoagulant şi de intervenţie în migrarea celulară în cursul morfogenezei (vezi cap. Matrice extracelulară). 3.4. LIPIDELE Lipidele reprezintă aproximativ 2% din constituenţii celulari. Ele sunt substanţe alcătuite din C, O, H la care se pot adăuga P şi N (fig.III.22). Lipidele sunt biomolecule organice insolubile în apă care se pot extrage din celule şi ţesuturi cu ajutorul solvenţilor nepolari: eter, cloroform, benzen etc. Sunt substanţe care nu formează singure compuşi macromoleculari, dar organizarea structurilor vii nu se poate realiza fără prezenţa lipidelor. Rolurile generale ale lipidelor pot fi sintetizate după cum urmează: a) reprezintă o importantă sursă energetică alcătuind “combustibilul” cu cea mai ridicată valoare calorică; b) rol plastic deoarece intră în constituţia tuturor membranelor celulare; c) rol de înveliş protector al celulei; d) ca şi componente ale suprafeţei celulare sunt implicate în mecanismele de

recunoaştere intercelulară, specificitate de specie, imunitate tisulară, transport transmembranar; e) rol reglator deoarece intră în componenţa vitaminelor, hormonilor steroizi şi a prostaglandinelor. Intracelular, lipidele se găsesc sub formă de lipide simple şi lipide complexe (fosfolipide, glicolipide, sfingolipide, glicosfingolipide, lipoproteine, lipocromi). 3.4.1. Acizii graşi liberi apar în concentraţii mici. Au rol energetic şi structural. Ei intră în căile de metabolizare, participând la: a) -oxidare în mitocondrii şi peroxizomi; b) biosinteza trigliceridelor cu formarea de depozite intracitoplasmatice; c) biosinteza lipidelor complexe; d) biosinteza prostaglandinelor. 3.4.2. Trigliceridele (triacilglicerolii) sunt esteri ai glicerolului cu acizii graşi. Constituie familia cea mai numeroasă de lipide şi reprezintă componentele majore ale lipidelor de depozit (rezervă) din celulele animale. Se depun în citosol sub forma unor picături de dimensiuni variabile, evidenţiabile în MO prin tehnici de colorare Sudan III, IV. Incluziunile lipidice au diametre cuprinse între 0,2-5 m şi au rol de depozit energetic. În adipocitele albe incluziunile lipidice pot atinge un diametru de 80 m, ocupă întreg citosolul, împing nucleul la periferie şi conferă astfel celulei aspectul caracteristic de “inel cu pecete”. Fiziologic, lipidele se depun în citosol în scopul existenţei unei rezerve de combustibil. Procesul este reversibil, la nevoie acizii graşi sunt eliberaţi prin hidroliză sub acţiunea lipazelor.

Fig.III.22. Organizarea moleculară a diferitelor clase de lipide

3.4.3. Steroizii sunt lipide care intră în alcătuirea unor substanţe importante pentru organism: hormoni sexuali, hormoni corticosuprarenalieni, vitamina D, acizi biliari. Steroizii care posedă o grupare OH se numesc steroli. Reprezentantul cel mai răspândit este colesterolul. El se găseşte în bilă, creier, glande suprarenale şi alte ţesuturi. La nivel celular, colesterolul este un important component membranar cu rol modulator al fluidităţii membranare. El reprezintă aproximativ 20% din lipidele

membranare şi se găseşte în zona hidrofobă a dublului strat lipidic din plasmalemă (predomină pe versantul extern) şi în endomembrane. 3.4.4. Prostaglandinele sunt o familie de derivaţi ai acizilor graşi care îndeplinesc o gamă largă de activităţi biologice de natură hormonală sau reglatorie. Cele mai cunoscute sunt prostaglandinele E1, F1 şi F2 , prescurtat PGE1, PGF1 şi PGF2 . Sunt sintetizate în toate celulele nucleate din organism şi influenţează funcţionalitatea oricărui tip celular. Deşi sunt sintetizate în cantităţi minime, au efecte foarte variate asupra organismului. Sunt implicate în modularea răspunsurilor hormonale (inducerea menstruaţiei, inducerea avortului în trimestrul II de sarcină), contribuie la răspunsul antiinflamator, previn ulcerul peptic, au efect bronhodilatator, influenţează procesul de agregare plachetară, reglează temperatura corpului, scad tensiunea arterială şi induc contracţia muşchilor netezi. 3.4.5. Fosfolipidele (fosfatide, fosfogliceride) sunt componente majore ale membranelor celulare; în alte compartimente celulare pot fi găsite doar în cantităţi foarte mici. Cele mai reprezentative datorită abundenţei lor sunt fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinozitolul, fosfatidilglicerolul, cardiolipina şi plasmalogenii. Structura lor moleculară corespunde perfect funcţiei. Sunt denumite molecule bimodale sau amfifile deoarece prezintă un cap hidrofil (reprezentat de gruparea polară) şi o coadă hidrofobă (reprezentată de doi acizi graşi esterificaţi) (fig.III.23). Moleculele care se pot intercala în structura apei fără a o perturba energetic, intrând în relaţie cu legăturile de hidrogen sunt hidrofile şi deci solubile în apă. Din contră, moleculele nepolare rup structura de legături de hidrogen fără a forma în schimb alte interacţiuni favorabile cu moleculele de apă. Ele sunt hidrofobe şi deci insolubile. • Fosfatidiletanolamina şi fosfatidilcolina au gruparea polară formată din aminoalcoolii etanolamină, respectiv colină. În fosfatidilserină, acidul fosforic este esterificat cu gruparea hidroxil a aminoacidului L-serina. În fosfatidilinozitol, gruparea polară este reprezentată de un alcool ciclic cu 6 atomi de carbon, inozitolul. În fosfatidilglicerol capul moleculei este reprezentat de glicerol. • Cardiolipina este un fosfolipid înrudit cu fosfatidilglicerolul. Este prezentă în membranele celulare ale bacteriilor, iar la om în membranele interne mitocondriale. A fost izolată pentru prima dată din muşchiul cardiac, foarte bogat în mitocondrii, şi este implicată în scăderea fluidităţii membranare. Conferă membranelor interne mitocondriale un rol de barieră între spaţiul perimitocondrial şi matricea mitocondrială. • Plasmalogenii se deosebesc de celelalte fosfolipide deoarece “coada” este formată dintr-un acid gras cu lanţ lung şi un lanţ alifatic lung -nesaturat. Ei alcătuiesc aproximativ 10% din constituenţii membranari şi se găsesc cu

precădere în membranele celulelor musculare şi nervoase.

Fig.III.23. Reprezentarea schematică a organizării moleculare a fosfatidilcolinei (după Alberts, 1989)

3.4.6. Sfingolipidele sunt lipide complexe care se găsesc în cantităţi mari în ţesutul nervos. Ele sunt formate dintr-o moleculă de acid gras, o moleculă de sfingozină şi o grupare polară. Cele mai abundente sfingolipide sunt sfingomielinele, prezente în teaca de mielină a nervilor. Alte sfingolipide conţin ca şi grupare polară una sau mai multe glucide. Dintre acestea fac parte cerebrozidele, galactocerebrozidele, gangliozidele. Deşi sunt constituente minore ale membranelor celulare, se dovedesc a avea un rol important într-o serie de funcţii specializate. Astfel, gangliozidele sunt concentrate îndeosebi în terminaţiile nervoase ceea ce a condus la ipoteza rolului lor în transmiterea influxului nervos la nivelul sinapselor. Sunt prezente şi în receptorii pentru acetilcolină precum şi în neurotransmiţători. 3.4.7. Glicosfingolipidele de la nivelul suprafeţei celulare sunt legate de specificitatea de grup sanguin, dar şi de specificitatea de organ sau ţesut. Aceste lipide complexe sunt implicate în imunitatea tisulară şi în recunoaşterea intercelulară, fenomene fundamentale pentru dezvoltarea şi integritatea ţesuturilor. Celulele canceroase posedă glicosfingolipide caracteristice, diferite de cele ale celulelor normale. În boala Tay-Sachs, în celula nervoasă are loc o acumulare a gangliozidului GM2, ca urmare a deficienţei genetice de sinteză a enzimei responsabile de degradarea acestui compus. Acumulări anormale de glicosfingolipide se constată şi în alte boli care se datorează unor deficienţe genetice de sinteză enzimatică (v. tezaurismozele lizozomale). 3.4.8. Lipoproteinele sunt lipide legate de molecule proteice. Sunt constituenţi frecvenţi ai ţesuturilor, membranelor celulare, nucleilor, dar sunt prezente şi sub formă circulantă în sânge. Există două tipuri majore de lipoproteine: lipoproteine

de transport şi sistemele de membrană (acestea din urmă vor fi studiate la capitolul “ membrana celulară”). Lipoproteinele de transport din plasma umană se împart în patru clase, în funcţie de densitatea şi dimensiunea particulelor: kilomicroni, lipoproteine cu densitate foarte mică (VLDL - very low density lipoproteins), lipoproteine cu densitate mică (LDL - low density lipoproteins) şi lipoproteine cu densitate mare (HDL - high density lipoproteins). 3.4.9. Lipocromii sunt complexe formate din lipide şi pigmenţi. Exemplul cel mai reprezentativ este lipofuscina (pigmentul de îmbătrânire) care se acumuleză în celulele care nu au capacitatea de a-şi exocita corpii reziduali formaţi în urma procesului de digestie intracelulară. 3.5. ENZIMELE Enzimele sunt catalizatori biologici care au rolul de a accelera reacţiile chimice ale celulei. Sunt molecule de natură proteică cu unul sau mai multe situsuri active pe care se ataşează substratul (substanţa asupra căreia acţionează). Clasificare după tipul de reacţie catalizată: 1) oxidoreductaze (reacţia de oxidoreducere); 2) transferaze (favorizează transferul unor radicali de pe un substrat pe altul); 3) hidrolaze (scindează substratul prin adiţia unei molecule de apă); 4) liaze (favorizează adiţia la dubla legătură); 5) izomeraze (reacţia de izomerizare); 6) ligaze sau sintetaze (formare de legături cu scindare de ATP). Activitatea enzimatică se desfăşoară specific, fiecare enzimă este capabilă să acţioneze asupra unui substrat determinat. Specificitatea este absolută atunci când enzima se ataşează unui singur substrat (ex. succindehidrogenaza). Specificitatea este stereochimică atunci când acţiunea depinde de configuraţia stereochimică (ex. lactatdehidrogenaza); specificitatea este relativă atunci când enzima se ataşează la o varietate de substraturi de acelaşi tip (ex. fosfataza alcalină). Factorii care pot influenţa viteza de reacţie enzimatică sunt: • numărul de contacte dintre moleculele de enzime şi cele ale substratului. Numărul de molecule enzimatice este în mod normal mult mai mic decât cel al moleculelor substratului. • concentraţia relativă a enzimelor faţă de cea a substratului influenţează viteza de reacţie. Dacă concentraţia enzimatică este crescută, viteza de reacţie creşte în mod proporţional. Dacă concentraţia substratului este crescută, activitatea enzimatică încetează atunci când enzima este saturată. • concentraţia în ioni de hidrogen este un factor care acţionează direct asupra enzimei. Fiecare enzimă are un pH optim la care activitatea sa este maximă.

De exemplu pH-ul optim al fosfatazei alcaline (FAL) este 8,5-10, iar al fosfatazei acide (FAC) este 4,5-5; cele mai multe enzime au un pH optim de acţiune apropiat de cel neutru. • temperatura - în mod normal enzimele acţionează optim la temperatura normală a corpului. O creştere uşoară de temperatură creşte viteza de reacţie, pe când temperaturile ridicate pot determina inhibiţia sau chiar distrugerea prin denaturare a enzimelor (excepţie face ribonucleaza care rămâne activă şi la 80ºC). Multe dintre enzime se găsesc în celulă sub formă inactivă, de zimogen. Zimogenii sunt activaţi de kinaze; de exemplu, tripsinogenul produs de celulele pancreatice este activat în intestin de enterokinază. Pepsinogenul secretat de celulele epiteliului gastric este activat de acidul clorhidric secretat de celulele parietale. Alte enzime hidrolitice cum sunt papaina şi catepsina necesită agenţi reducători (glutation) pentru a fi activate. Coenzimele şi grupările prostetice Multe dintre enzime sunt proteine conjugate care conţin o grupare prostetică. De exemplu citocromii (enzime care participă la transferul electronilor între substrat şi oxigen) conţin un complex metaloporfirinic. Aceste enzime nu îşi pot desfăşura activitatea catalitică fără ajutorul unor coenzime cu care se leagă numai pe durata reacţiei. De exemplu, dehidrogenaza utilizează NAD+ (nicotinamid-adenină-dinucleotid) sau NADP (nicotinamidadenină-dinucleotid fosfat), după reacţia: substrat + NAD+ + enzimă → substrat oxidat + NADH + H+ Constituenţii esenţiali ai coenzimelor sunt vitaminele, mai ales cele din complexul B. Acidul pantotenic (vitamina B5) formează o parte importantă a coenzimei A; riboflavina (vitamina B2) este încorporată în molecula FAD, iar piridoxalul (vitamina B6) este cofactor de transaminare şi decarboxilare. Accelerarea cineticii enzimatice este favorizată şi de cationii metalici: Na+, K+, Rb+, Cs+, Mg++, Ca++, Cr++, Cu++, Mn++, Fe++, Zn++, Co++, Al+++, NH4+. 3.6. HORMONII Hormonii sunt substanţe complexe elaborate de celulele glandelor endocrine care alături de enzime şi vitamine au rol de biocatalizatori. Din punct de vedere biochimic sunt de natură proteică, glicoproteică şi steroizi. Hormonii nu sunt constituenţi celulari, dar sunt produşi de elaborare ai celulelor eliberaţi în sânge. În concentraţii foarte mici, hormonii sunt transportaţi spre diferite celule asupra cărora îşi exercită acţiunea în mod specific. Ei joacă rol de mesageri chimici, reglatori chimici sau excitanţi funcţionali specifici. De exemplu, tiroxina disociază

fosforilarea de oxidare, scăzând în acelaşi timp sinteza de ATP în cadrul ciclului Krebs; adrenalina creşte glicogenoliza, transformând fosforilaza b (inactivă) în fosforilază a (activă) în prezenţa ATP şi a ionilor de magneziu; insulina inhibă activitatea hexokinazei, enzimă care catalizează transformarea glucozei şi a ATP în glucozo-6-fosfat şi ADP. 3.7. VITAMINELE Ca şi hormonii, vitaminele nu sunt componente structurale ale celulelor. Ele nu pot fi sintetizate în organismul omului şi al animalelor superioare, dar în acelaşi timp constituie o categorie de substanţe care sunt absolut necesare metabolismului. Aportul lor este exogen, din raţia alimentară. Din punct de vedere biochimic, ele se clasifică în hidrosolubile şi liposolubile. Vitaminele hidrosolubile sunt componente necesare ale unor coenzime, importante pentru căile metabolice centrale: Vitamina B1 (tiamina) este componentul activ al tiaminpirofosfatului, coenzimă necesară pentru decarboxilarea cetoacizilor. Carenţa sa determină la om boala numită “beri-beri”. Vitamina B2 (riboflavina) este component al coenzimelor FMN (flavin-mononucleotid) şi FAD (flavin-adenin-nucleotid) care sunt grupările prostetice transportoare de hidrogen ale unor enzime oxidative. Acidul nicotinic este component al NAD şi NADP, transportori de electroni ai dehidrogenazelor. Carenţa sa determină apariţia pelagrei. Acidul pantotenic este component esenţial al coenzimei A care intervine în oxidări enzimatice şi metabolismul acizilor graşi. Vitamina B6 influenţează activitatea transaminazelor. Biotina este transportor al dioxidului de carbon. Acidul folic este precursor al enzimei ce intervine în transferul enzimatic al grupărilor cu un atom de carbon. Vitamina B12 (cobalamina) este esenţială pentru mecanismele nutriţionale ale majorităţii animalelor superioare. Vitamina C (acidul ascorbic) are rol în procesele de hidroxilare. Carenţa sa determină la om boala numită scorbut. Vitaminele liposolubile par să nu aibă rol de coenzime, dar îndeplinesc alte funcţii importante: Vitamina A cu precursorul său -caroten funcţionează ca pigment receptor fotosensibil în celulele cu bastonaş. Vitamina D are o acţiune de tip hormonal asupra activării, legării şi transportului calciului în intestin şi oase. Vitamina K este implicată în biosinteza componentelor mecanismelor de coagulare. Vitamina E (tocoferolul) are activitate antioxidantă prevenind oxidarea acizilor graşi foarte nesaturaţi; prin aceasta protejează lipidele din membranele biologice

împotriva acţiunii oxigenului molecular. Carenţa determinată experimental, provoacă la animalele de experienţă sterilitate, pigmentarea brună a lipidelor de depozit, necroză hepatică, distrofia muşchilor scheletici.

Capitolul IV

MATRICEA EXTRACELULARĂ Matricea extracelulară sau spaţiul intercelular reprezintă mediul extern al celulelor care alcătuiesc oganismele pluricelulare. Totodată ea participă la alcătuirea mediului intern al organismului alături de sânge şi limfă. Se află în relaţii de continuitate şi contiguitate cu celulele prin intermediul componentei externe a membranei celulare - glicolema. Între celule şi matricea extracelulară există o interrelaţie de tip structural şi funcţional, deoarece o parte a componentelor matriciale provin din secreţii celulare, iar ea la rândul său influenţează procesele celulare de tip: adezivitate, comunicare intercelulară, diferenţiere, metabolism. Din această cauză, cantitatea şi calitatea matricei extracelulare diferă de la un tip de ţesut la altul. Matricea extracelulară a ţesuturilor conjunctive este uneori mai voluminoasă decât celulele pe care le înconjoară şi determină proprietăţile fizice ale ţesutului. Ţesuturile conjunctive formează eşafodajul corpului vertebratelor, dar cantitatea lor variază de la un organ la altul: în cartilaje şi în os ele reprezintă constituenţi majori, pe când în creier şi măduva spinării nu reprezintă decât constituente minore. Din punct de vedere biochimic, matricea extracelulară este alcătuită din: faza fluidă formată din apă, electroliţi, micro- şi macromolecule solubile şi faza solidă formată din micro- şi macromolecule insolubile, vizibile în microscopia optică, cu o organizare stratificată. Raportul dintre cele două faze diferă de la un tip de ţesut la altul, astfel încât matricea poate avea aspect apos, gelatinos, elastic sau rigid. Din punct de vedere structural, matricea este alcătuită din diferite tipuri de proteine şi polizaharide care formează fibre libere sau asamblate în reţea şi se asociază intim cu suprafaţa celulară. La interfaţa dintre un epiteliu şi ţesutul conjunctiv matricea formează o membrana bazală care controlează comportamentul celular. Macromoleculele care constituie matricea extracelulară sunt sintetizate de celule de tipul: fibroblaste, condroblaste, osteoblaste etc.

• • •

Se disting trei clase principale de macromolecule extracelulare: Lanţuri de polizaharide din clasa glicozaminoglicanilor (GAG) care se leagă la proteine formând proteoglicanii. Proteine fibrilare de tip colagen şi elastină. Fibrele de colagen conferă matricei rezistenţă, pe când fibrele elastice asigură elasticitatea matricei. Proteinele matriciale ca fibronectina şi laminina care joacă rol de molecule de adezivitate de tip celulă-celulă sau celulă-membrana bazală. 1. GLICOZAMINOGLICANII ŞI PROTEOGLICANII MATRICIALI

GAG sunt lanţuri polizaharidice neramificate compuse dintr-o unitate dizaharidică repetitivă. Unul dintre zaharuri este aminat (N-acetil glucozamină, Nacetil galactozamină) şi în cele mai multe cazuri este şi sulfatat. Celălalt este reprezentat în general de un acid uronic (glucuronic sau iduronic). Organizarea lor moleculară determină încărcătura ionică negativă a suprafeţei celulare (fig.IV.1 şi 2). În funcţie de prezenţa sau absenţa grupării sulfat, GAG se clasifică în: nesulfatate – acidul hialuronic şi sulfatate – condroitin sulfat, heparan sulfat, dermatan sulfat, keratan sulfat (v. cap. Constituenţii moleculari ai celulelor şi rolul lor biologic). Proteoglicanii sunt alcătuiţi din lanţuri de GAG legate covalent la un miez proteic numit proteină core (fig.IV.3). Miezul proteic este sintetizat de poliribozomii ataşaţi membranei reticulului endoplasmatic, trece apoi în lumenul acestuia unde începe ataşarea lanţurilor polizaharidice, glicozilare care se va finaliza în aparatul Golgi. Ataşarea GAG este mediată de un tetrazaharid care amorseză elongarea lanţului polizaharidic. Tot în aparatul Golgi are loc sulfatarea care creşte încărcătura negativă a proteoglicanilor (fig.IV.4). Proteoglicanii prezintă o heterogenitate practic nelimitată deoarece o proteină core poate ataşa un număr foarte mare de tipuri de GAG. În ţesuturile conjunctive proteoglicanii formează „substanţa de bază” puternic hidratată, asemănătoare unui gel şi în care sunt incluse proteinele fibrilare. Gelul polizaharidic rezistă forţelor de compresiune aplicate asupra matricei şi în acealşi timp permite difuzia rapidă a substanţelor nutritive, metaboliţilor şi hormonilor din sânge în celulele ţesutului. Deşi cantitativ gelul reprezintă doar 10% din greutatea proteinelor fibrilare, el are rolul de a umple cea mai mare parte a spaţiului extracelular şi participă la rezistenţa mecanică a ţesutului. Densitatea mare a sarcinilor negative atrage cationii activi din punct de vedere osmotic (în special Na+), ceea ce va determina atragerea unei mari cantităţi de apă în matrice. Acesta la rândul său creează o presiune de turgescenţă (umflare) care permite matricei să reziste la forţele de compresiune. De exemplu, matricea din ţesutul conjunctiv

cartilaginos care tapetează articulaţia genunchiului poate să suporte presiuni de sute de atmosfere.

Fig.IV.1. Secvenţă dizaharidică repetitivă din componenţa unui GAG sulfatat

Fig. IV.2. Secvenţă dizaharidică repetitivă din componenţa unui GAG nesulfatat

Fig. IV.3. Organizarea moleculară a agrecanului

Fig. IV.4. Tetrazaharidul care amorsează elongarea lanţului polizaharidic

Localizarea şi funcţiile unor proteoglicani matriciali şi membranari sunt prezentate sintetic în tabelul următor: Proteoglicani Agrecan Betaglican Decorină Perlecan

Localizare Cartilaj Matrice şi suprafaţa celulară Ţesuturi conjunctive Membrana bazală

Syndecan

Suprafaţa celulelor epiteliale

Funcţii Susţinere mecanică Fixare pe TGF-β Fixare pe colagen tip I şi TGF-β Component structural şi asigură funcţia de filtru a membranei bazale Participă la adezivitate intercelulară

Tabel IV.I.

Implicaţiile medicale ale proteoglicanilor matriciali şi membranari sunt prezentate sintetic în tabelul IV.II. Patologia se datoreză alterărilor de ordin cantitativ sau calitativ a acestor componente matriciale. Patologia

GAG şi proteoglicanii implicaţi

Mucopolizaharidoze Degenerescenţa şi distrofia cartilajului Ateroscleroza Distrofia maculară corneeană Cancer Maladia Alzheimer

GAG sulfatate Agrecan Versican Lumican Syndecan-1 Perlecan

Tabel IV.II. Patologia asociată proteoglicanilor

2. PROTEINELE FIBRILARE 2.1. Colagenul. Fibrele de colagen. Colagenul este o proteină cu largă răspândire în organism (25% din totalul proteinelor), deoarece participă la alcătuirea fibrelor de colagen şi reticulină, a membranelor bazale şi a glicolemelor. Celulele implicate in sinteza colagenului sunt celule mezenchimale, fibroblaste, osteoblaste, condroblaste, adipocite, miocite, endotelocite, celule epiteliale corneene. 2.1.1. Biosinteza colagenului are loc în două etape: intracelulară şi extracelulară. A. Etapa intracelulară a biosintezei colagenului implică mai multe faze: • transcripţia mesajului genetic din genom pe moleculele de ARNm; • moleculele de ARNm traversează porii membranei nucleare, apoi trec în citoplasmă unde partcipă la formarea poliribozomilor. Deoarece lanţul polipeptidic ce urmează a fi sintetizat este foarte lung, el necesită poliribozomi mari formaţi din 100 de ribozomi; • activarea aminoacizilor şi transportul lor de către ARNt la poliribozomi; • traducerea mesajului genetic prin asamblarea aminoacizilor şi formarea lanţurilor polipeptidice pro-alfa. Asamblarea este un proces rapid (aproximativ 200 aminoacizi/minut), aşa încât formarea unui lanţ durează 5-6 minute. Fiecare lanţ conţine 1056 de aminoacizi în secvenţă liniară, cel mai frecvent fiind glicina care apare invariabil în poziţia trei (fig.IV.5). Glicina permite ataşarea a trei lanţuri α şi răsucirea lor helicoidală pentru formarea superhelixului final de colagen. Alţi aminoacizi care participă la sinteza colagenului sunt: prolina, hidroxiprolina, alanina, lizina, hidroxilizina, acidul glutamic, metionina, cisteina, histidina, tirozina, izoleucina. • trecerea lanţurilor pro-α în lumenul reticulului endoplasmic rugos unde au loc următoarele mecanisme (fig IV.6): a) hidroxilarea prolinei şi lizinei cu formarea hidroxiprolinei şi hidroxilizinei. Procesul este catalizat de prolinhidroxilază şi lizinhidroxilază, enzime localizate în membrana reticulului endoplasmic şi necesită prezenţa ionilor de fier, a oxigenului molecular, acidului ascorbic şi α-cetoglutaratului. Deoarece

prolina are rolul de a stabiliza conformaţia helicoidală a viitorului lanţ α, absenţa unuia dintre aceşti factori duce la imposibilitatea hidroxilării prolinei, ceea ce va conduce la destabilizarea organizării spaţiale a triplului helix de colagen. Consecinţa constă în pierderea elasticităţii şi a stabilităţii structurii fizice a ţesuturilor. Un exemplu în acest sens este fragilitatea pereţilor vaselor sangvine cu apariţia microhemoragiilor la nivelul mucoaselor, simptom patognomonic în scorbut. b) glicozilarea (ataşarea moleculelor de glucoză, galactoză la grupările hidroxil) începe în cisternele reticulului endoplasmic rugos. Procesul este catalizat de glicoziltransferază şi galactoziltransferază. c) în cisternele RER, trei lanţuri pro-α se asociază şi se răsucesc, formând molecula de pro-colagen de forma triplului helix. Legăturile în interiorul lanţului şi între lanţuri sunt realizate de punţi disulfidice. • transportul moleculelor de pro-colagen la sacii golgieni prin intermediul microveziculelor desprinse din RER. Aici are loc definitivarea glicozilării şi ambalarea lor în macrovezicule care vor fi apoi transportate la periferia celulei şi eliminate prin exocitoză.

Fig. IV.5. Organizarea moleculară a colagenului: (A) unul dintre cele trei lanţuri polipeptidice cu glicina în poziţia 3 (B) triplul helix de colagen

B. Etapa extracelulară a biosintezei colagenului constă în: • transformarea pro-colagenului în colagen prin scurtarea lanţurilor şi reducerea greutăţii moleculare. Procesul se realizează prin clivarea pro-peptidelor terminale de la cele două extremităţi ale lanţului. Reacţia este catalizată de pro-colagen peptidaze (pro-colagen aminopeptidaza şi pro-colagen carboxil peptidaza). Molecula de colagen

are o lungime de aproximativ 300 nm şi un diametru de 1,5 nm. Ea este formată din trei lanţuri polipeptidice răsucite helicoidal unul în jurul celuilalt, asemănător firelor într-o frânghie (fig.IV.7). • în spaţiul extracelular, moleculele de colagen au capacitatea de a se autoasambla, formând : a) microfibrile cu o grosime de 4-8 nm, rezultate din polimerizarea liniară a 5 molecule de colagen; b) fibrile de colagen rezultate din agregarea mai multor microfibrile; odată formate, fibrilele de colagen se ataşează puternic prin legături covalente încrucişate stabilite între reziduurile de lizină. c) fibre de colagen, forme superioare de organizare a macromoleculei de colagen, vizibile în MO, cu un diametru de 1-200 μ. Au aspect de şuviţe de păr, nu se ramifică, nu se anastomozează, se dispun ordonat paralel sau se întretaie asemeni unei ţesături. Apar birefringente în lumina polarizată şi se colorează selectiv cu eozină, fuxină acidă, verde de lumină.

Fig. IV.6. Etapa intracelulară a biosintezei colagenului

Fig. IV.7. Etapa extracelulară a biosintezei colagenului

2.1.2. Tipuri de colagen: După organizarea structurală, localizare şi rol au fost descrise 20 de tipuri de colagen dintre care amintim: • tipul I reprezintă 90% din colagenul organismului şi este adaptat rezistenţei la tracţiune. Intră în alcătuirea fibrelor groase de 80-100 nm distribuite în piele, oase, tendoane, dentină, ligamente. • tipul II este adaptat rezistenţei la presiune, intră în alcătuirea cartilajului, discurilor intervertebrale, corpului vitros. • tipul III, adaptat distensiilor multidirecţionale, intră în alcătuirea fibrelor de colagen subţiri din piele, vase sangvine, organe interne şi în alcătuirea fibrelor de reticulină. • tipul IV intră în alcătuirea membranelor bazale şi glicolemelor, conferindu-le rezistenţă şi o oarecare permeabilitate. 2.1.3. Funcţiile colagenului: a) Principalul rol este acela de a realiza rezistenţa ţesuturilor conjunctive la tensiune şi tracţiune. Acest fapt este mai evident în ţesuturile conjunctive dense (ligamente şi tendoane), dar este la fel de important în toate tipurile de ţesuturi conjunctive. Rezistenţa este realizată de legăturile transversale intermoleculare, prin forţele dintre fibrilele şi fibrele de colagen, precum şi prin interacţiunile fizice şi chimice pe care colagenul le are cu celelalte componente ale matricei extracelulare. b) Colagenul permite plierea şi extensibilitatea ţesuturilor conjunctive, fapt realizat prin sinuozitatea fibrilelor şi fibrelor, precum şi posibilităţii de alunecare ale unora în raport cu celelalte. c) Fibrele de colagen au capacitatea de a limita mişcarea ţesuturilor şi organelor

din vecinătate, limitând mişcarea proteoglicanilor şi a lichidului tisular. d) Colagenul are capacitatea de a induce agregarea trombocitelor, deci participă la formarea cheagului sangvin. e) Rol în reglarea diferenţierii celulare în timpul dezvoltării embrionare. De exemplu, colagenul sintetizat de celulele epiteliale corneene formează fibrile de colagen care vor servi ca substrat pentru invazia fibroblastelor corneene definitive. f) Colagenul din membranele bazale formează o reţea de suport pentru structurile supraiacente, limitând mobilitatea glicoproteinelor necolagenice. g) Colagenul din ţesutul osos reprezintă un substrat pentru depunerea cristalelor de hidroxiapatită. 2.1.4. Implicaţii medicale: În procesul de îmbătrânire, colagenul suferă modificări structurale progresive, cum ar fi creşterea numărului de legături transversale. Odată cu înaintarea în vârstă se observă modificări ale raportului dintre diferitele tipuri de colagen. Astfel, ţesutul conjunctiv din dermul pielii fătului conţine peste 60% colagen tip III; la adult, colagenul tip III se regăseşte în procent de sub 20% fiind înlocuit cu colagenul tip I. Boli genetice. Biosinteza colagenului poate fi alterată prin defecte de transcripţie şi traducere sau în cursul proceselor post traducere prin deficienţe ale enzimelor implicate. Aceste procese duc la alterări ale structurii primare, scăderea numărului de legături transversale, scăderea cantităţii de hidroxilizină, ceea ce determină instabilitatea legăturilor interfibrilare. Aceasta conduce la fragilitatea şi/sau hiperextensibilitatea moleculelor de colagen. Defectele în biosinteza colagenului determină boli sau sindroame ereditare cum sunt: osteogeneza imperfectă, sindromul Marfan, sindromul Ehlers-Danlos. Boli câştigate. Condiţiile de viaţă şi alimentaţie neadecvate conduc la apariţia unor boli câştigate, cum sunt: scorbutul (avitaminoza C), anemiile feriprive (lipsa fierului). Carenţa în vitamina C, fier sau oxigen face imposibilă hidroxilarea prolinei şi formarea legăturilor de hidrogen dintre lanţurile polipeptidice. Boli autoimune. Conţinutul bogat în glicină (care este rezidiul cel mai activ imunologic) implică colagenul în manifestările patologice ale răspunsului imun, în special în fenomenele de autoimunitate prezente în cele două boli caracteristice ţesutului conjunctiv: lupusul eritematos diseminat şi artrita reumatoidă. 2.2. Elastina. Fibrele elastice. Elastina este o proteină care conţine pe lângă aminoacizii caracteristici colagenului (glicină, prolină) şi valină, alanină, glicocol, desmozină, izodesmozină. Hidroxiprolina se găseşte într-o cantitatate de 10-12 ori mai mică decât în organizarea colagenului. Elastina este proteina dominantă din matricea extracelulară a arterelor şi reprezintă 50% din masa uscată a aortei. Biosinteza elastinei începe intracelular, celulele implicate fiind fibroblastele, condroblastele, miocitele netede etc. Se formează astfel proelastina care, după

eliminarea în matricea extracelulară, se transformă în elastină. Desmozina şi izodesmozina permit realizarea unor punţi între lanţurile polipeptidice ale elastinei. Se crează astfel posibilitatea de lungire sau scurtare a fibrelor în direcţii diferite (fig.IV.8). Fibrele elastice sunt formate dintr-un nucleu de elastină înconjurat de o teacă de microfibrile compusă dintr-un număr mare de glicoproteine, dintre care amintim fibrilina. Fibrele sunt subţiri, lungi şi ramificate, formând reţele cu ochiuri mari, neregulate. Au proprietatea de a-şi dubla lungimea sub acţiunea factorilor de tracţiune şi de a reveni la starea iniţială. Sunt răspândite în tot organismul, dar predomină la nivelul ţesuturilor care suferă modificări de volum. Organizarea spaţială diferă de la un ţesut la altul. Astfel, la nivelul interstiţiului pulmonar se organizează în reţea, ceea ce conferă ţesutului elasticitatea cauciucului; la nivelul pereţilor arterelor de tip elastic, reţeaua este tridimensională, cu ochiuri strânse, alcătuind lamele elastice groase care permit elasticitatea ritmică. Implicaţii medicale. Mutaţiile genetice ale fibrilinei determină sindromul Marfan, maladie relativ frecventă la om care afectează ţesuturile conjunctive bogate în fibre elastice. La aceşti bolnavi se poate produce ruptură de aortă.

Fig. IV.8. Organizarea în reţea a fibrelor elastice.

3. PROTEINELE MATRICIALE Glicoproteinele prezente în substanţa fundamentală sunt fibronectina, condronectina, laminina, uvomorulina şi mai recent descoperită glicoproteina 115. 3.1. Fibronectina este o glicoproteină cu largă răspândire la nivelul suprafeţei celulare, în matricea extracelulară (inclusiv membranele bazale) şi în plasma

sanguină. Ea este sintetizată de o gamă largă de celule: hepatocite, fibroblaste, celule epiteliale şi endoteliale. Fibronectina este sintetizată în RER ca monomer care conţine oligozaharide bogate în manoză. În aparatul Golgi, fibronectina devine dimer (cele două subunităţi fiind ataşate prin legături disulfidice), iar oligozaharidele sunt prelucrate până la forma complexă care este exocitată. Dimerul prezintă situsuri de ataşare la colagen, fibrină, heparină, acid hialuronic, actină (fig.IV.9), dar şi situsuri de ataşare la suprafeţele celulare, în acest fel modulând adezivitatea celulelor la matrice (v. cap. Adezivitate celulară). Fiecare monomer prezintă domenii cu funcţie specifică. Principalul domeniu numit „domeniu repetitiv de tip III al fibronectinei” facilitează fixarea pe integrine, deci realizează ataşarea la receptorii celulari de suprafaţă. Acest fragment conţine o secvenţă tripeptidică specifică Arg-Gly-Asp sau RGD care reprezintă o caracteristică centrală a situsului de ataşare. Secvenţa RGD poate intra în competiţie cu componenta majoră a situsului de ataşare a fibronectinei la celule şi inhibă astfel ataşarea celulelor la matricea extracelulară. Implicaţii medicale 1. Efectul anticoagulant al RGD. Secvenţa RGD a fost găsită în componenţa a numeroase proteine extracelulare printre care fibrinogenul, unul dintre factorii de coagulare. Peptidele fibrinogenului care conţin secvenţa RGD au fost utilizate în sinteza medicamentelor anti-coagulante. Şerpii utilizează o strategie asemănătoare pentru a provoca hemoragii victimelor lor: veninul lor conţine proteine anti-coagulante numite dezintegrine care conţin RGD. 2. Procesul de metastazare. La suprafaţa celulelor maligne, fibronectina se găseşte în cantitate redusă, ceea ce determină adezivitatea scăzută a acestor celule, precum şi capacitatea lor de a invada ţesuturile local (creşterea tumorii) şi la distanţă (formarea metastazelor).

Fig. IV.9. Modelul de organizare moleculară al fibronectinei

3.2. Laminina este o glicoproteină cu o greutate moleculară mare (l million de daltoni), compusă din trei polipeptide (α, β şi γ) legate prin legături disulfurice într-o structură asimetrică în formă de cruce (fig.IV.l0). Sunt cunoscute 5 tipuri de lanţuri α, 3 tipuri de lanţuri β şi 3 tipuri de lanţuri γ care pot să se autoasambleze pentru a forma 45 de izoforme de laminină. Laminina este localizată în membrana bazală în imediata apropiere a celulelor, ceea ce sugerează intervenţia ei în interacţiunea celulă epitelială - membrană bazală. 3.3. Condronectina este o glicoproteină care mediază specific ataşarea condrocitelor de colagenul tip II din cartilaj. Este sintetizată de condrocite şi interacţionează cu condroitin sulfatul. 3.4. Uvomorulina este o glicoproteină implicată în adezivitatea celulelor embrionare în faza de morulă. La adult ea a fost identificată în ţesuturile epiteliale, de exemplu în jurul domeniului latero-bazal al enterocitelor. A fost pusă în evidenţă şi la suprafaţa celulelor maligne (carcinom nediferenţiat) unde se presupune că are rol în agregarea celulară calcium-dependentă. La organizarea matricei extracelulare mai iau parte epibolina care favorizează adezivitatea fibrocitelor şi etalarea celulelor epiteliale, epinectina pusă în evidenţă exclusiv în matricea epitelială, precum şi lectine extracelulare.

Fig. IV.10. Organizarea lanţurilor polipeptidice în cadrul lamininei (A) Laminina în microscopie electronică de transmisie (B)

4. MEMBRANA BAZALĂ 4.1. Localizare, structură, ultrastructură Membrana bazală este o formă particulară de organizare a matricei extracelulare localizată la interfaţa dintre ţesutul epitelial şi cel conjunctiv. Alte localizări ale membranei bazale sunt: între două straturi unicelulare (la nivelul glomerulului renal), înconjoară celule individuale (musculare, adipoase, celule Schwann) (fig.IV.11). În MO, membrana bazală se evidenţiază selectiv prin reacţia PAS în roşu purpuriu (datorită conţinutului crescut în polizaharide) şi prin impregnare argentică. Grosimea sa variază de la o localizare la alta: zecimi de micron la nivelul epiteliilor respirator, glandular endocrin, epiderm şi câţiva microni la nivelul epiteliilor cristalinian şi cornean. În ME se prezintă sub forma unei foiţe suple şi fine, cu o grosime de 40-120 nm, localizată sub celulele epiteliale şi în jurul tubilor realizaţi de celulele epiteliale, asociindu-le de ţesutul conjunctiv subiacent. 4.2. Organizare moleculară În membranele bazale au fost identificate mai multe tipuri de molecule: colagen

tip IV, laminină, nidogen (numit şi entactină) şi perlecan. Proporţia acestora variază de la un tip de ţesut la altul şi chiar de la o regiune la alta în cadrul aceleiaşi lamine. Colagenul de tip IV şi laminina formează reţele intricate în care se inseră nidogen şi perlecan (fig.IV.12.). Ataşarea membranelor bazale la celulele pe care le susţin este realizată de o familie aparte de proteine, numite integrine (vezi cap. Adezivitate intercelulară). 4.3. Roluri şi implicaţii medicale Graţie componenţilor lor, membranele bazale prezintă multiple funcţii: • rol structural. La interfaţa dintre ţesuturile epiteliale şi cele conjunctive are un rol dublu: de susţinere, solidarizare şi cimentare a celulelor epiteliale şi de asociere a ţesutului epitelial cu ţesutul conjunctiv; • filtru semipermeabil. La nivelul glomerulilor renali reglează trecerea macromoleculelor din sânge în urină. Îngroşarea ei determină scăderea capacităţii de filtrare; modificările sunt descrise în cadrul afectării renale din diabetul zaharat şi nefropatii. Lezarea membranelor bazale de către toxinele microbiene stă la baza iniţierii pielonefritei. • membrana bazală realizează o barieră celulară: nu permite trecerea fibroblastelor, dar permite trecerea limfocitelor şi macrofagelor. • membrana bazală care înconjoară celula musculară are rol în regenerarea joncţiunii neuromusculare în cazul distrugerii celulei musculare şi/sau a axonului. • cercetări recente aduc dovezi conform cărora, membrana bazală este implicată în: polaritatea celulară, inducerea proceselor de supravieţuire, proliferare, diferenţiere celulară, influenţează migrarea celulară în cursul embriogenezei, influenţarea metabolismul celular, induce organizarea proteinelor din membranele plasmatice adiacente. În concluzie, matricea extracelulară este o structură dinamică, activă, în strînsă conexiune cu tipurile de celule care au format-o şi al căror mediu extern îl reprezintă. Compoziţia sa chimică variază de la un tip de ţesut la altul, ca o adaptare particulară la funcţia organului respectiv. Varietatea de molecule care iau parte la organizarea sa face ca matricea extracelulară să îndeplinească multiple roluri: 1) Stabilizează structura fizică a ţesuturilor prin amortizarea şocurilor mecanice, rezistenţă la presiune, elasticitatea ţesuturilor. 2) Protejează şi solidarizează celulele de acelaşi tip, deci rol în adezivitatea intercelulară, fiind considerată un "liant universal intercelular". 3) Rol de lubrefiere prin conţinutul în GAG şi proteoglicani. 4) Influenţează forma celulelor, proliferarea, recunoaşterea intercelulară, migrarea celulelor în timpul dezvoltării embrionare şi în general întregul metabolism celular.

Fig. IV.11. Diferitele localizări ale membranei bazale

Fig. IV. 12. Organizarea moleculară a membranei bazale

Capitolul V BIOLOGIA MOLECULARĂ A MEMBRANELOR CELULARE 1.

CONCEPTUL DE MEMBRANĂ CELULARĂ

1.1. Definiţie, clasificare topografică Membrana celulară constituie un complex molecular care delimitează frontul unui anumit teritoriu, compartimentând materia vie la nivel celular şi intracelular (George Emil Palade). După localizare se disting două tipuri de membrane celulare: a) Ectomembrane Membrana plasmatică (plasmalema) face parte din categoria membranelor biologice de suprafaţă şi conform definiţiei lui G. E. Palade delimitează materia vie la nivel celular. Ea separă celula de mediul înconjurător, conferindu-i individualitate. Mediază şi controlează interacţiunile celulei cu mediul exterior sau cu alte celule şi în acelaşi timp permite efectuarea schimbului de substanţe cu mediul extracelular. b) Endomembrane Sunt reprezentate de membranele organitelor intracelulare şi au rolul de a delimita materia vie la nivel intracelular. Aici se înscriu membranele nucleară, mitocondrială, ale reticulului endoplasmic şi aparatului Golgi, ale lizozomilor şi peroxizomilor. 1.2. Rolurile generale ale membranelor celulare a) Realizează compartimentarea. Deoarece membranele sunt asemănătoare unor foiţe fără soluţii de continuitate, ele delimitează compartimente. Membrana citoplasmatică este o peliculă subţire (aproximativ 7,5 nm) şi flexibilă care delimitează conţinutul întregii celule, conferindu-i individualitate morfologică. Ca şi în incinta unei fabrici, şi în celulă trebuie să existe compartimente distincte pentru diferite tipuri de activitate. Astfel, prin intermediul endomembranelor celula este subdivizată în compartimente distincte, în funcţie de activitatea metabolică diferită care se realizează la nivelul fiecăruia. Compartimentarea are o importanţă deosebită deoarece fiecare spaţiu are un conţinut lichidian cu compoziţie biochimică şi activitate metabolică specifică, iar amestecul lor poate avea grave repercursiuni asupra integrităţii şi funcţionalităţii celulare (vezi „compartimentarea internă a celulei eucariote”). b) Reprezintă o barieră cu rol în reglarea schimbului de substanţe. Membranele împiedică liberul schimb de substanţe de pe una din feţe pe cealaltă. Fiecare celulă preia din mediu apă, oxigen, ioni şi alte substanţe nutritive. În acelaşi timp, celula elimină

în mediul extracelular produşi de anabolism şi catabolism. Membrana celulară este aceea care „decide” care sunt substanţele importate/exportate şi în ce concentraţie. Deci, membrana plasmatică posedă capacitatea de permeabilitate selectivă cu rol în reglarea influxului şi efluxului de materie; este substratul material al relaţiilor cu mediul exterior. Reglarea transportului transmembranar nu este un proces care se petrece numai la nivel de membrană plasmatică, ci şi la nivel de endomembrane. Nici un organit citoplasmatic nu are autonomie funcţională deplină. Funcţiile lor depind de comunicarea între compartimente, comunicare mediată prin intermediul endomembranelor care le delimitează. c) Realizează controlul fluxului de informaţii între celulă şi mediul înconjurător. Celulele comunică cu mediul exterior printr-un proces mediat de membrana plasmatică. Membranele celulare conţin receptori capabili de a cupla molecule specifice, cu o configuraţie complementară receptorilor. Diverse tipuri de celule prezintă diverse tipuri de receptori care sunt capabili de a se combina cu substanţe diferite. Aceste substanţe poartă denumirea de liganzi (mesageri sau molecule semnal) şi pot fi: hormoni, factori de creştere, neurotransmiţători, anticorpi, virusuri, bacterii etc. Ei iau contact cu membrana prin intermediul receptorilor, dar nu o traversează. Interacţiunea dintre un receptor şi un ligand de pe o faţă a membranei determină pe cealaltă faţă apariţia unui semnal care va purta informaţia în interiorul celulei. Astfel, membrana plasmatică este responsabilă de reglarea a numeroase şi diverse evenimente interne celulare care au loc ca răspuns la mesajul primit. d) Rol în interacţiuni intercelulare. Ţesuturile sunt alcătuite din tipuri celulare diverse care se găsesc în interrelaţii reciproce de cooperare în vederea realizării unor funcţii complexe. Prin structura şi compoziţia moleculară, membrana plasmatică permite recunoaşterea intercelulară, comunicarea, dar şi aderarea celulelor între ele. Adezivitatea intercelulară este realizată de dispozitive de natură proteică (joncţiuni) localizate în membrană. Unele dintre ele realizează atât contactul intercelular, cât şi comunicarea de vecinătate. Datorită funcţiei de comunicare, deşi independente morfologic, membranele sunt interconectate funcţional. e) Rol direct în metabolismul celulei. Majoritatea sistemelor enzimatice conţinute în celulă sunt localizate la nivelul endomembranelor. Astfel, membrana internă mitocondrială posedă enzimele care catalizează fosforilarea oxidativă, convertirea energiei rezultate din oxidarea alimentelor în ATP. Tot la acest nivel se găsesc componentele lanţului transportor de electroni, responsabil de respiraţia celulară. La nivelul membranelor cloroplastidiale are loc procesul de fotosinteză care converteşte energia fotonică în energie chimică. Membranele reticulului endoplasmic şi ale aparatului Golgi conţin enzime care participă la reacţii specifice: maturarea produşilor de sinteză, detoxifierea medicamentelor, realizarea unor etape ale metabolismului lipdic etc. (vezi cap. Organite ale sintezei şi secreţiei celulare). f) Permite polarizarea electrică. O consecinţă importantă a permeabilităţii selective este capacitatea membranelor de a separa ionii, ceea ce determină o diferenţă de potenţial pe cele două feţe membranare. Proprietatea caracterizează atât membrana

plasmatică, cât şi endomembranele, şi permite: • menţinerea echilibrului acido-bazic, presiunii osmotice şi volumului celular (v.„pompele ionice”); • transmiterea influxului nervos la nivelul membranelor sinaptice (v.„canalele cu poartă comandată de voltaj”); • excitabilitatea şi contractibilitatea celulelor musculare (v.„mecanismul contracţiei musculare”). g) Alte funcţii. • rol în imunitate prin prezenţa antigenelor de suprafaţă; • asigură protecţia mecanică a celulei în special prin intermediul tramei glucidice a glicolemei; • participă la mişcările celulare de suprafaţă (emiterea de pseudopode etc.); • endomembranele RE oferă suport de sprijin pentru fixarea ribozomilor. 1.3. Compoziţie biochimică a) substanţe anorganice: apă şi electroliţi în cantităţi scăzute. Apa reprezintă aproximativ 30% din masa membranelor celulare. Apa şi ionii sunt repartizaţi de o parte şi de alta a zonei hidrofobe, având rol în menţinerea polarităţii membranei. b) substanţele organice constituie aproximativ 70% din masa membranei şi sunt reprezentate de lipide, proteine şi glucide în cantitate redusă. Resturile glucidice sunt întotdeauna ataşate lipidelor şi proteinelor şi sunt localizate exclusiv pe versantul extern, la nivelul glicolemei. Repartizarea procentual-cantitativă a acestor componente diferă de la un regn la altul, de la o specie la alta, de la un tip celular la altul. Raportul lipide/proteine variază considerabil în funcţie de tipul de membrană celulară (plasmatică, mitocondrială, a reticulului endoplasmic, golgiană etc.), de tipul organismului (procariot, eucariot) şi de tipul celular (celulă musculară, nervoasă, hepatică etc.) (tab. V.I). Membrana

Proteine %

Lipide %

Glucide %

Membrana mielinică

18

79

3

Plasmalema cel. hepatice de şoarece

46

34

2-4

Plasmalema eritrocitelor umane

49

43

8

Membr.nucleară a cel. hepatice de şobolan

59

35

2,9

Membrana externă a mitocondriei

52

48

2-4

Membrana internă a mitocondriei

76

24

1-2

Reticulul sarcoplasmatic

67

33

Membrana internă a cloroplastelor

70

30

6

Bacterii Gram +

75

25

10

Tabel V.I. Compoziţia chimică a membranelor celulare (după Guidotti citat de Benga, 1985)

După cum se observă din tabel, cel mai mare procentaj în structura moleculară

a membranelor îl prezintă proteinele şi lipidele. Din punct de vedere al rolului primordial îndeplinit, proteinele sunt implicate în asigurarea funcţiilor membranare, pe când lipidele au rol protector, de barieră. Sub aspectul raportului proteine/lipide se disting trei tipuri de membrane celulare: a) membranele la care raportul P/L este aproximativ 1/1 sunt membrane de suprafaţă cu rol funcţional (conferit de proteine) şi cu rol de protecţie (conferit de lipide), de exemplu membrana plasmatică. b) membranele la care raportul P/L este aproximativ 2/1 sunt membrane la care rolul predominant este cel funcţional, de exemplu membrana internă mitocondrială, cloroplastidială, membranele citoplasmatice ale bacteriilor. c) membranele la care raportul P/L este aproximativ 1/2 sunt membrane cu rol predominant de protecţie (barieră), de exemplu teaca de mielină. Cu cât o membrană are o activitate metabolică mai mare, cu atât ea conţine mai multe proteine şi mai puţine lipide. 1.4. Modele de organizare moleculară a plasmalemei Membrana plasmatică are o grosime de ordinul nanometrilor, din această cauză pe preparatele necolorate studiate la MO este doar intuită, apărând ca o interfaţă între celulă şi mediul extracelular. La MCF (microscop cu contrast de fază), membrana celulară apare intens refringentă la celulele tinere sau la cele disociate din ţesuturi. Pe preparatele colorate se prezintă ca o peliculă subţire slab acidofilă (la celulele tinere) sau mai intens acidofilă (la celulele îmbătrânite); în ME cu putere mică de mărire (10.000 x) apare ca o linie unică, electronodensă. La o putere de mărire de peste 100.000 x, când planul secţiunii este perpendicular pe planul membranei are un aspect caracteristic, trilaminat. Ea constă dintr-o bandă electronoclară localizată median, cu grosimea de aproximativ 3 nm, de natură lipidică, delimitată de o parte şi de alta de două benzi electronodense cu grosimea de aproximativ 2,5 nm fiecare, de natură proteică. Endomembranele au acelaşi aspect electrono-microscopic. În microscopia electronică de transmisie (TEM), la o putere de mărire de peste 100.000 x, suprafaţa celulară apare formată din trei structuri (foiţe) suprapuse. Dinspre exterior spre interior acestea sunt: glicolema, plasmalema şi citoscheletul membranar. Până la obţinerea imaginii actuale a organizării moleculare a biomembranelor au fost parcurse mai multe etape, pe care le prezentăm succint; prezentarea se încadrează astăzi în „caracterul istoric” al cunoaşterii sistemului biologic numit „membrană”. Considerăm totuşi utilă această retrospectivă pentru înţelegerea modului de evoluţie al cunoştinţelor referitoare la organizarea moleculară adaptată realizărilor funcţiilor membranei, cu atât mai mult cu cât unele dintre teoriile enunţate au reuşit să reziste presiunii timpului. • Cercetări iniţiale asupra vitezei de difuzie a solvenţilor lipidici, care difuzează mai rapid decât apa şi sărurile anorganice au fundamentat ideea că membrana celulară este de natură lipidică (Overton, 1895).

• Gorter şi Grendel (1925) introduc teoria bistratului lipidic deoarece cercetările efectuate pe membrane eritrocitare demonstrează că suprafaţa filmului lipidic obţinut prin extracţie corespunde la dublul suprafeţei eritrocitelor. • Modelul paucimolecular - Danielii şi Davson (1935). În perioada anilor 1930, conceptul naturii lipidice a membranelor celulare a fost zdruncinat de constatarea că tensiunea superficială a suprafeţei celulare (0,1-2 dine/cm) este semnificativ mai mică decât a membranelor artificiale, exclusiv lipidice (9-12dine/cm). În 1943, Danielii şi Harvey au arătat că tensiunea superficială poate fi scăzută prin adaos de proteine la filmul de lipide, ajungându-se astfel până la valoarea tensiunii superficiale a suprafeţei celulare. Pornind de la această constatare, Danielii şi Davson imaginează un model de organizare moleculară al membranelor celulare cunoscut ca modelul paucimolecular (lat. pauci = puţin numeroase). Conform acestui model se presupunea că membranele sunt alcătuite din lipide aranjate în bistrat, orientate cu capetele polare spre exterior şi tapetate de o parte şi de alta de proteine. • Teoria membranei unitare a fost formulată de Robertson (1959) pe baza cercetărilor de microscopie electronică. El a stabilit că toate membranele plasmatice au o organizare ultrastructurală unitară, după modelul trilaminat care implică o zonă centrală clară reprezentată de lipide, flancată de două zone dense la fluxul de electroni reprezentate de proteine. Teoria membranei unitare a constituit o dezvoltare a ipotezei paucimoleculare căreia îi sunt consacrate concepte noi: universalitatea bistratului lipidic şi asimetria chimică (glucidele sunt ataşate numai pe versantul extern). Pe baza răspândirii generalizate a membranelor cu aceeaşi structură trilaminată şi cu aceeaşi origine, Robertson introduce termenul de "structură membranară unitară". Critica adusă acestor modele "lamelare" a fost că ignoră dinamismul molecular (mişcări moleculare care participă la asigurarea funcţiilor membranare, compartimentarea pe microdomenii), cât şi ideea existenţei unor proteine transmembranare; criticile aduse teoriilor anterioare au condus la elaborarea teoriei „mozaicului fluid”. Teoria mozaicului fluid elaborată de Singer şi Nicolson în 1972 este acceptată şi la ora actuală. Modelul de organizare moleculară al plasmalemei care corespunde atât din punct de vedere structural, cât şi funcţional este cel de "mozaic fluid lipo-proteic" (fig.V.1.): - "mozaic" datorită numărului mare de molecule proteice plonjate în dublul strat lipidic care dau aspectul mozaicat al "icebergurilor" care plutesc în ocean; - "fluid" datorită faptului că atât proteinele, cât şi lipidele sunt animate de permanente mişcări care le permit realizarea funcţiilor în cadrul membranei.

Fig.V.l. Organizarea moleculară a plasmalemei (Alberts, 2002): imagine TEM a unui fragment din plasmalema eritrocitelor umane (stg), prezentarea schematică tridimensională a componentelor membranare (dr.)

2. PLASMALEMA (citolema, membrana plasmatică propriu - zisă) Plasmalema reprezintă partea centrală a periferiei celulare, apare de aspect trilaminat cu organizare moleculară de tip lipoproteic („mozaic fluid”) şi are dimensiuni medii de 7,5 nm. Lipidele şi proteinele constituente îi conferă permeabilitate selectivă. 2.1. Lipidele membranare şi rolul lor biologic 2.1.1 Natura şi organizarea lipidelor membranare Membranele celulare conţin o mare diversitate de lipide care formează matricea pentru fixarea proteinelor şi a celorlalte componente. Principalele clase de lipide membranare sunt fosfolipidele, glicolipidele şi colesterolul care apar în raportul cantitativ 70/5/25. 1. Fosfolipidele reprezintă aproximativ 70-75% din totalul lipidelor membranare. Ele sunt de două categorii: a) fosfogliceride (rezultate din esterificarea acizilor graşi saturaţi şi nesaturaţi cu glicerina). Exemple de fosfogliceride: fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinozitol (PI), fosfatidilglicerol (PG), difosfatidilglicerolul sau cardiolipina (CE). b) sfingolipide (rezultate din saturarea acizilor graşi cu aminoalcooli - sfingozina), de exemplu sfingomielina cu cea mai mare răspândire în membrana neuronală. 2. Glicolipidele sunt compuşi formaţi din lipide şi oligozaharide. Glicolipidele au fost evidenţiate în membranele neuronale, membranele celulelor renale, hepatice, musculare. Ele sunt de două categorii: a) cerebrozide (lipid plus un oligozaharid: glucoza sau galactoză); porţiunea glicozidică proiectată spre exteriorul membranei este implicată în numeroase

funcţii de recunoaştere intercelulară, în special în specificitatea grupelor sanguine. Galactocerebrozida este o componentă de bază a mielinei, alcătuind 40% din lipidele stratului extern al plasmalemelor celulelor Schwann. b) gangliozide (lipid plus mai multe oligozaharide). Conţin lanţuri ramificate până la 7 unităţi glucidice şi intervin de asemenea în numeroase funcţii de recunoaştere celulară. Acidul sialic (N-acetil neuraminic este situat de regulă în poziţie terminală, ceea ce conferă suprafeţei celulare încărcătură ionică negativă (fig.V.2). Gangliozidele apar în cantităţi mai mici în plasmalemele tuturor tipurilor celulare şi alcătuiesc 6% din lipidele stratului extern ale plasmalemei neuronilor.

Fig.V.2. Câteva gangliozide reprezentative NANA- ac. sialic, Gal-galactoză, Glc-glucoză, GalNAc-N-acetilgalactozamină (după Alberts şi colab, 1986)

3. Colesterolul este un steroid absent la procariote, dar prezent ca lipid major în membranele celulelor eucariote (fig.V.4). Proporţia este diferită la cele două regnuri, găsindu-se în cantitate scăzută la regnul vegetal. În celulele animale se găseşte în cantitate mai mare pe versantul lipidic extern al plasmalemei decât pe cel intern. De asemenea, proporţia de colesterol este mai mare în membranele în care predomină funcţia de barieră (plasmalema şi mielina), decât în majoritatea endomembranelor. Molecula de colesterol este constituită din patru cicluri carbonate acolate care îi conferă o anumită rigiditate; singura grupare polară (hidrofilă) este gruparea OH a C3, ea fiind situată la interfaţă şi interacţionează cu grupările vecine. Compoziţia lipidică a membranelor celulare variază de la un tip celular la altul, de la o specie la alta şi chiar în cadrul aceleiaşi celule, de la o membrană la alta. De asemenea compoziţia în acizi graşi a fosfolipidelor este variabilă, ceea ce are consecinţe asupra caracteristicilor fizice ale membranei, dar şi asupra activităţii proteinelor de membrană. 2.1.2. Conformaţia lipidelor membranare. Toate lipidele din membrană sunt molecule amfifile, amfipate. Ele posedă o extremitate - cap (hidrofilă, polară) şi o extremitate - coadă (hidrofobă sau apolară), adesea preponderentă (fig.V.3 şi V.5). Extremitatea hidrofilă este orientată spre exterior, la contactul cu apa, iar cea nepolară este orientată spre interior. Acest caracter

amfipatic conferă lipidelor o proprietate fundamentală, aceea de dispunere sub forma unui film bimolecular. Dispunerea în strat dublu, adoptată spontan de fosfolipide, reprezintă structura de bază, matricea membranelor biologice.

Fig. V.3. Reprezentarea schematică a fosfatidilcolinei (stg); modelul compact al moleculei (dr.)

Fig.V.4. Structura colesterolului. Formula chimică (A), reprezentare schematică (B), model compact (C).

Fig.V.

Fig.V.5. Molecule de glicolipide

Fig.V.5. Molecule de glicolipide

2.1.3. Proprietăţile lipidelor din membrana celulară şi semnificaţia lor biologică a) Fiind molecule amfipate, la interfaţa cu apa se organizează spontan sub formă de strat dublu lipidic care reprezintă forma cea mai stabilă de autoasamblare a lipidelor. În cazul excesului de apă, forma de organizare este cea de micelii (fig.V.6). Odată formate, straturile duble lipidice au tendinţa să delimiteze compartimente închise, evitându-se în acest fel contactul cozilor hidrofobe cu apa. Se produce astfel o autoînchidere în urma căreia rezultă vezicule. Veziculele au capacitatea de refacere (autoînchidere), chiar dacă peretele este dezagregat. Aceste proprietăţi se exprimă şi in vitro, unde fosfolipidele extrase din biomembrane se dispun spontan în strat dublu, formând membrane artificiale. Acestea au fost utilizate în studii experimentale pentru formarea lipozomilor. Formarea poate fi accelerată prin agitare mecanică. Lipozomii pot

fi multilamelari sau unilamelari (fig.V.7.) şi sunt utilizaţi în aplicaţii terapeutice, deoarece permit vehicularea substanţelor medicamentoase în sistemul circulator şi dirijarea acestora către celulele ţintă.

Fig. V.6. Asamblarea moleculelor lipidice la contactul cu apa

Fig.V.7. Lipozomi. (A) imagine de microscopie electronică; (B) schema

b) Datorită mobilităţii lor, lipidele au rol în menţinerea fluidităţii membranelor.

Moleculele de fosfolipide prezintă mai multe tipuri de mişcări: • mişcări în interiorul moleculei fosfolipidelor. - mişcări de flexie a atomilor de carbon din grupările metilenice (-CH2-) din lanţurile acizilor graşi. Aceste mişcări sunt mai active spre centrul stratului dublu lipidic şi mai rigide spre gruparea polară; - mişcări ale atomilor din gruparea polară. • mişcări ale întregii molecule de fosfolipid: - mişcări de translaţie (mişcări de difuziune laterală); - mişcări de rotaţie în jurul axei longitudinale a moleculei; - mişcări de difuziune transversală (flip-flop) (fig.V.8). Mişcările de difuziune laterală şi de rotaţie se petrec cu o viteză foarte mare, într-o secundă o moleculă străbate circa 2 μ, pe când mişcarea de difuziune transversală se face foarte încet, moleculele trecând dintr-un strat monolipidic în celălalt în 7-14 zile.

Fig.V.8. Mişcările moleculelor de fosfolipide în stratul dublu lipidic

Prezenţa colesterolului influenţează puternic fluiditatea membranelor (tabel.V.II). El creşte fluiditatea atunci când este introdus în straturi duble lipidice, artificiale cu lipide saturate şi o scade în cazul prezenţei lipidelor nesaturate; intercalarea sa între fosfolipidele membranei produce creşterea rigidităţii lanţurilor de acizi graşi spre gruparea polară şi creşterea fluidităţii spre interiorul membranei. Fluiditatea stratului lipidic este influenţată şi de factori fizici (temperatură, presiune) şi chimici (acid arahidonic, medicamente, gradul de nesaturare al acizilor graşi, raportul P/L). Fluiditatea membranelor este o condiţie majoră a desfăşurării tuturor funcţiilor membranelor biologice.

Tabel

V. II. A. Modulatori chimici 1. concentraţia colesterolului (colesterol/fosfolipide); 2. gradul de nesaturare a lanţurilor acizilor graşi din fosfolipide; 3. nivelul sfingomielinei (sfingomielină/lecitină); 4. fosfatidiletanolamina; 5. conţinutul de proteine în membrană ( proteine/lipide). B. Modulatori fizici 1. temperatura; 2. presiunea hidrostatică. Modulatori fiziologici ai microvâscozităţii membranei (după Shinitzky, citat de Rusu)

c) Lipidele membranare prezintă proprietatea de mezomorfism; trecerea din starea cristalină în starea lichidă se realizează prin stări intermediare de cristal lichid. La pH şi temperatură fiziologică, lipidele se găsesc în stare de cristal lichid, în această stare fiind capabile să-şi îndeplinească rolurile. În urma modificărilor de temperatură şi potenţial electric are loc blocarea lanţurilor de acizi graşi, ceea ce conduce la modificări de permeabilitate până la moartea celulară. d) Cele două monostraturi lipidice au o compoziţie lipidică sensibil diferită. Asimetria lipidelor pe cei doi versanţi interesează toate tipurile de lipide. Astfel, fosfolipidele care conţin colina (fosfatidilcolina, sfingomielina) predomină în monostratul extern, pe când în monostratul intern sunt mai bine reprezentate fosfolipidele cu grupări amino (fosfatidilserină, fosfatidiletanolamina). În cazul membranei eritrocitului, 70% din fosfatidilcolina şi 80-85% din sfingomielina sunt localizate în monostratul extern. Cea mai pronunţată asimetrie o prezintă glicolipidele care sunt localizate exclusiv pe versantul extern. Acest lucru demonstrează rolul lor în comunicarea intracelulară şi posibil, un rol de receptor în legarea specifică a unor substanţe străine. e) Lipidele au rol în recepţionarea şi fixarea ionilor în cadrul transportului transmembranar. Cel mai important ion, cu rol primordial în menţinerea structurii membranei este Ca++. În cazul în care Ca++ este îndepărtat prin intermediul unui agent chelator, se antrenează o scădere semnificativă a coeziunii membranei. Alţi cationi legaţi de membrană din punct de vedere structural şi funcţional sunt Mg2+, Na+, K+. 2.2. Proteinele din membranele biologice 2.2.1. Roluri, tipuri şi localizare Dacă lipidele asigură funcţia de barieră a membranei celulare, proteinele conferă funcţionalitate membranei, având rol de transport, enzimatic, de receptori şi asigură

adezivitatea intercelulară. Concentraţia proteinelor membranare variază între 20 % în cazul mielinei şi 75% în membranele mitocondriale. Dimensiunile proteinelor sunt mai mari decât ale lipidelor, astfel că la un procent de 50% proteine în membrane, corespund aproximativ 50 molecule de lipide la o moleculă proteică. Datorită diversităţii funcţiilor lor, varietatea proteinelor membranare este mai mare decât cea a lipidelor. Din punct de vedere structural şi funcţional, proteinele membranare sunt de două tipuri: fibrilare - care îndeplinesc de regulă un rol plastic şi globulare -cu rol enzimatic, funcţional. Din punct de vedere topografic, în plasmalemă există două tipuri de proteine, şi anume: a) proteine periferice (extrinseci) ataşate la exteriorul dublului strat lipidic, pe ambii versanţi. Ele interacţionează prin forţe electrostatice cu grupările polare ale lipidelor sau cu proteinele intrinseci. În funcţie de monostratul lipidic pe care sunt ataşate sunt denumite endoproteine (localizate pe versantul intern) şi ectoproteine (localizate pe versantul extern). Proteinele extrinseci alcătuiesc aproximativ 25% din totalul proteinelor membranare. Se pot extrage relativ uşor prin tratarea cu soluţii diluate de săruri. b) Proteine integrale (intrinseci) alcătuiesc 75% din totalul proteinelor membranare. Ele sunt molecule amfifile (bimodale), alcătuite din două capete polare (hidrofile) şi o zonă hidrofobă care străbate stratul dublu lipidic. Se inseră asimetric în stratul lipidic (fig.V.9). Proteinele transmembranare (intrinseci) sunt menţinute în plasmalemă prin interacţiuni hidrofobe cu bistratul lipidic şi pot fi extrase din membrană, după o prealabilă solubilizare a lipidelor cu ajutorul detergenţilor. Detergenţii dizolvă lipidele legate de proteinele integrale şi le solubilizează; după îndepărtarea detergenţilor, proteinele integrale precipită. Tehnica utilizată pentru separarea proteinelor transmembranare este electroforeza în gel de poliacrilamidă, în prezenţa detergentului dodecilsulfat de sodiu (SDS). 2.2.2. Proprietăţile proteinelor membranare • Prin forma şi dispoziţia lor, proteinele realizează sectorizarea plasmalemei în endo şi ectodomenii hidrofile şi mezodomenii hidrofobe. Totodată ectodomeniul lor (partea din moleculă care proemină pe versantul extern al plasmalemei) diferă de endodomeniu (partea din moleculă localizată spre citosol sau mediul intracelular). Fiecare este constituit astfel încât să interacţioneze cu ioni sau molecule diferite, în medii diferite. Toate proteinele transmembranare poartă pe ectodomeniul lor lanţuri ologozaharidice, fiind deci glicoproteine care vor lua parte alături de glicolipide la alcătuirea glicocalixului. • Numărul proteinelor care iau parte la alcătuirea membranelor diferă de la un tip celular la altul şi de la un organit la altul. Astfel, unele membrane conţin 1-3 proteine

majore cum sunt bastonaşele retiniene, mielina, reticulul sarcoplasmatic. Alte membrane conţin zeci de tipuri de proteine, de exemplu membranele mitocondriale, plasmalema etc. • Localizarea specifică a unor enzime în membrane face ca enzimele respective să fie folosite ca "enzime marker". Exemple sunt: 5'-nucleotidaza pentru plasmalema, monoaminoxidaza (MAO) pentru membrana externă a mitocondriei, citocromoxidaza şi adenozintrifosfataza (ATP-aza) pentru membrana internă a mitocondriei, glucozo-6 fosfataza pentru reticulul endoplasmatic etc. • Proteinele intrinseci ale membranei prezintă două tipuri distincte de mişcare: a) rotaţie rapidă în jurul axului proteinei, perpendicular pe planul stratului lipidic. b) difuziunea laterală rapidă în interiorul aceluiaşi strat bimolecular lipidic. Ambele tipuri de mişcare sunt o rezultantă a fluidităţii dublului strat lipidic. Coeficientul de difuziune laterală scade foarte mult în tranziţiile de fază ale lipidelor, când proteinele se reunesc în conglomerate. Imobilizarea completă se produce la trecerea lipidelor din faza de cristallichid în faza solidă, sub influenţa temperaturii. • Proteinele extrinseci (endo şi ectoproteine) sunt solidarizate în planul membranei, fie prin ataşare directă la lipidele membranare cu care formează sisteme lipoproteice de membrană, fie prin ataşare la domeniile hidrofile ale proteinelor intrinseci (fig. V.10).

Fig.V.9. Tipurile şi localizarea proteinelor din plasmalema

Fig. V.10. Posibilităţi de ataşare a proteinelor periferice

• Din punct de vedere al nivelului de structură, proteinele intrinseci prezintă în mare parte o structură terţiară cu 1-7 şi chiar zeci de domenii transmembranare. • Proteinele transmembranare prezintă multiple asimetrii. S-a arătat deja că grupările glucidice sunt localizate exclusiv pe ectodomeniul, nu şi pe endodomeniul moleculei proteice. O altă asimetrie derivă din faptul că partea proteinei aflată în stratul dublu lipidic este de obicei mult mai mică comparativ cu partea ce predomină în afara lui. Părţile din moleculă situate în afara stratului dublu lipidic permit stabilirea interacţiunilor cu matricea extracelulară şi cu citoplasma. 2.3. Modificări ale configuraţiei componentelor membranare Datorită mişcărilor la care participă, macromoleculele din componenţa membranelor îşi pot schimba conformaţia. Mişcările laterale în planul membranei crează o zonă cu proprietăţi speciale datorită predominenţei unei molecule particulare de fosfolipid sau proteină. Aceste mişcări pot fi induse de mecanisme celulare sau extracelulare. Exemple în acest sens sunt formarea canalelor hidrofile, formarea interacţiunilor stabile cu alte celule (joncţiuni), endocitoza, exocitoza etc. Proteinele intrinseci pot prezenta modificări de conformaţie, ceea ce le asigură rolul de transportori ai apei, ionilor, glucozei etc. Proteinele extrinseci de pe versantul intern, precum şi cele intrinseci care proemină spre citosol, se continuă cu elemente ale citoscheletului (microfilamente, microtubuli). Astfel, ele au rol de ancorare a citoscheletului şi de menţinere a formei celulare. Proteinele extrinseci de pe versantul extern al bistratului lipidic participă la legarea tranzitorie a diferitelor substanţe informaţionale (hormoni, neuro transmiţători), substanţe care traversează membrana (metaboliţi), ori care iau parte la reacţii biochimice (ex. coagularea).

2.4. Dispoziţia topografică a apei şi ionilor în membrane După cum s-a arătat anterior, la baza organizării tuturor membranelor celulare se află structurile lipoproteice hidratate de o parte şi de alta a filmului lipidic hidrofob. Din această cauză, în microscopia electronică membranele prezintă imaginea trilaminată caracteristică (strat electronoclar aşezat median încadrat de două straturi electronodense). Celelalte structuri cu compoziţie proteică (glicolema şi citoscheletul membranar) care încadrează plasmalema sunt şi ele puternic hidratate, dar sunt mai greu evidenţiabile decât lipoproteinele în imaginile electronomicroscopice de rutină. Prin metode speciale de evidenţiere, cum este metoda difracţiei în raze X, s-a demonstrat că apa "legată" este esenţială pentru integrarea structurilor lipoproteice în membrană. Apa de la nivelul suprafeţei celulare este distribuită în două zone ale membranei: • zona externă sau frontul E cuprinde foiţa externă a plasmalemei şi glicocalixul; • zona internă sau frontul P (plasmatic) cuprinde foiţa internă a plasmalemei şi citoscheletul membranar. Cele două zone hidrofile sunt despărţite de o zonă intermediară hidrofobă care corespunde filmului lipidic, electronoclar. a) Zona hidrofilă externă (frontul E) prezintă pe suprafaţa sa radicali ionizabili, în majoritate anioni organici care conferă un bilanţ general negativ al suprafeţelor celulare. Potenţialul zeta reprezintă potenţialul din "zona de alunecare", deci zona situată la l mm extern de suprafaţa plasmalemei. Acesta este cu câţiva mV mai mic decât adevăratul potenţial de suprafaţă al plasmalemei. b) Zona hidrofilă internă (frontul P) a membranei celulare este şi ea bogată în radicali ionogeni elecronegativi, între care predomină radicalii PO4- de pe suprafeţele proteinelor. La un pH fiziologic, frontul P este mai bogat în grupări electrogene negative decât frontul E. În repaus, faţa internă a membranei celulare are un potenţial electric de -50mV până la -100 mV faţă de faţa externă. Această valoare este denumită potenţial electric de repaus. Potenţialul de repaus sau potenţialul electric transmembranar este valoarea în mV a diferenţei de potenţial electric dintre interiorul şi exteriorul suprafeţei celulare. El se datorează distribuţiei inegale a ionilor care prezintă sarcini electrice pe cei doi versanţi. Repartiţia unui anumit ion pe suprafaţa membranei este determinată de propria concentraţie, dar este influenţată şi de ceilalţi ioni din sistemul membranar. Un sistem membranar este în echilibru atunci când suma totală a sarcinilor electrice pozitive şi negative de pe ambele feţe sunt egale (echilibrul Gibbs-Donnan). Conform acestui principiu, un ion cu o anumită sarcină electrică poate traversa membrana numai atunci când în schimbul său vine un alt ion de pe faţa opusă care transportă o sarcină similară şi egală. Permeabilitatea membranei este diferită pentru diverşi ioni, astfel: a) este permeabilă pentru apă şi foarte permeabilă pentru Cl- şi HCO3-

b) este impermeabilă pentru anionii organici electronegativi de pe frontul P (radicali fosfaţi şi izotianaţi) şi de pe frontul E (anioni COO- ai acidului sialic). c) prezintă permeabilitate selectivă pentru K+, Na+ şi Ca++. Aceştia sunt denumiţi ioni mobili deoarece în urma unor stimuli, echilibrul electrostatic se destabilizează şi ei sunt schimbaţi de pe o faţă a membranei pe alta; se produce în acest fel depolarizarea membranei. Celulele îşi desfăşoară activitatea normală numai dacă reuşesc să menţină o concentraţie de Na+, Cl- şi Ca++ mai mică decât cea a mediului extracelular şi o concentraţie de K+ mai mare decât cea extracelulară. Mecanismele implicate în schimbul acestor ioni anorganici se află localizate la nivelul membranei şi se desfăşoară cu consumul a 25% din întreaga energie a celulei (v. Cap.”microtransport”). Distribuţia ionilor anorganici variază de la un tip celular la altul şi chiar în planul suprafeţei celulei. Astfel, Ca++ poate fi mai concentrat pe frontul E al unui tip de celule şi pe frontul P al altui tip celular. Variabilitatea locurilor de legare a Ca++ pe suprafaţa celulară se datorează anionilor organici (care exercită atracţie asupra ionilor de calciu şi stabilesc cu acesta legături electrostatice) şi diferenţei în distribuţia calmodulinelor în citoscheletul membranar. Calmodulinele sunt proteine cu mare afinitate pentru calciu. Ele sunt distribuite în toate celulele cu variaţii concentraţionale diferite de la un tip celular la altul. Încărcarea electrică negativă a suprafeţei celulare este dată de grupările polare ale fosfolipidelor, glicoproteinelor sulfatate, glicozaminoglicanilor şi radicalilor carboxilici ai acidului sialic. Pe suprafaţa celulelor există şi un număr scăzut de radicali cationici, precum şi numeroşi cationi anorganici (Ca++, Na+). Datorită predominenţei sarcinilor electrice negative de pe frontul E, celulele izolate în culturi migrează la polul pozitiv atunci când prin mediul de cultură este trecut un curent electric. Densitatea sarcinilor electrice nu este distribuită uniform în planul suprafeţei şi nici în grosimea zonei externe. Astfel, din punct de vedere elctrochimic suprafaţa celulară prezintă trei straturi concentrice (fig.V.11): • suprafaţa plasmalemei (porţiunea cea mai profundă a frontului E), cu sarcinile electrice negative cele mai frecvente; • stratul median, cu o grosime de 1nm în care moleculele de apă şi ionii metalici sunt imobili datorită atracţiei exercitate de suprafaţa plasmalemei; • lamina externă a glicolemei în care ionii sunt mobili, deoarece forţa de atracţie a plasmalemei este scăzută. La contactul dintre stratul ionilor mobili şi cel al ionilor imobili se găseşte "zona de alunecare". Încărcătura electrică negativă de pe faţa externă a plasmalemei determină existenţa la acest nivel a unui câmp electrostatic denumit potenţial de suprafaţă. La un pH fiziologic, valoarea potenţialului de suprafaţă este cuprinsă între -8,5 mV şi -38 mV, cu o medie de -28 mV. Potenţialul de suprafaţă se măsoară prin microelectroforeză, tehnică ce constă în măsurarea mobilităţii celulelor plasate într-un câmp electric.

Fig.V.11. Schema repartiţiei încărcăturii electrice la suprafaţa celulei (A) şi a potenţialului zeta (B)

3. GLICOLEMA (glicocalix) 3.1. Localizare, organizare moleculară Prin tehnici de impregnare metalică şi coloraţie negativă s-a demonstrat că suprafaţa externă a membranei prezintă un înveliş cu aspect pufos, numit glicolemă, glicocalix, înveliş dulce al celulei, denumire datorată conţinutului crescut în glucide. Este reprezentat de lanţuri oligozaharidice ancorate de ectodomeniul proteinelor extrinseci şi transmembranare şi de unele fosfolipide din stratul extern al stratului bimolecular lipidic. Glicolema este prezentă la toate tipurile de celule eucariote şi are o grosime variabilă de la un tip celular la altul (10-100 nm, cu o medie de 50 nm). Este mai bine reprezentată la polul apical al celulelor absorbante (ex. enterocite). În microscopia fotonică este greu de diferenţiat, se evidenţiază prin metode citochimice (PAS) sau cu albastru alcian datorită abundenţei glucidelor din compoziţia sa. În microscopia electronică apare alcătuită din două lamine, una internă mai puţin densă, cu o grosime de aproximativ 20 nm şi o lamina externă mai densă, cu o grosime de aproximativ 30 nm. Lamina externă vine în legătură cu matricea extracelulară, iar cea internă cu plasmalema. Din punct de vedere biochimic, glicolema este alcătuită din substanţe anorganice: apă şi ioni (îndeosebi Ca++) legaţi selectiv în reţeaua oligozaharidică, pentru

a fi disponibili proceselor intracelulare. Dintre substanţele organice fac parte grupările glucidice ale glicoproteinelor şi glicolipidelor din plasmalemă, dar şi glicoproteine şi proteoglicani secretaţi de celule şi adsorbiţi apoi pe suprafaţa celulară (fig.V.12).

Fig. V. 12. Organizarea moleculară a glicocalixului

Dintre cele aproximativ 100 de zaharide naturale, în glicoproteinele şi glicolipidele membranare se găsesc doar 9, principale fiind: galactoza, manoza, fructoza, galactozamina, glucozamina, glucoza şi acidul sialic (N - acetilneuraminic, NANA). Extremităţile lanţurilor şi ale ramificaţiilor lor sunt ocupate de acidul sialic, glucoza nefiind niciodată admisă ca monozaharid terminal. La baza lanţurilor oligozaharidice se află un anumit monozaharid care se leagă de un aminoacid specific al proteinei transmembranare, astfel încât nu este posibilă decât interacţiunea dintre cinci tipuri de monozaharide şi cinci tipuri de aminoacizi corespunzători. Compoziţia, ordinea moleculară şi aşezarea lanţurilor oligozaharidice legate de proteinele transmembranare conferă specificitate funcţională şi identitate fiecărui tip de celulă, datorită numeroaselor variante moleculare determinate de monozaharidele componente. De exemplu, trei aminoacizi diferiţi pot da naştere la 6 tripeptide. Trei monozaharide diferite pot produce 1056 de trizaharide diferite. Prezenţa acidului sialic la capătul lanţurilor oligozaharidice ale glicolipidelor conferă sarcină electrică negativă suprafeţei celulelor eucariote. 3.2. Funcţiile glicolemei

a) joacă rol important de protecţie şi participă la adezivitatea intercelulară în special în ţesutul epitelial; b) asigură individualitatea celulei, deoarece glicoproteinele sunt specifice nu numai speciei, ci şi tipului celular. Grupele sanguine umane A, B, O sunt determinate de grupările glucidice terminale ale glicolipidelor şi glicoproteinelor din membrana eritrocitului. c) joacă un rol important în mecanismul de recepţie a mesajelor, deoarece grupările glucidice terminale ale glicoproteinelor intră în alcătuirea receptorilor specifici pentru molecule biologic active (ioni, hormoni, neurotransmiţători, medicamente, toxine etc); d) îndeplineşte rol imunologic, deoarece la nivelul său sunt localizate antigenele A, B, Lewis; antigene terminale specifice, citolizine H etc.; e) îndeplineşte funcţia de filtru ionic întârziind intrarea ionilor de K+ în celulă şi ieşirea ionilor de Na+. De asemenea, deoarece prezintă încărcătură electrică negativă stochează temporar Ca++ pentru nevoile ulterioare ale celulei. f) prin conţinutul în proteoglicani îndeplineşte funcţia de lubrefiere, amortizarea şocurilor, intervine în procesul de "captare" al substanţelor ce urmează a fi endocitate, asigură spaţiul extracelular cu cationi. 3.3. Implicaţii medicale • Boli metabolice. Etiologia unor maladii metabolice se poate explica prin alterarea structurilor membranare care controlează endocitoza şi permeabilitatea. Toate celulele acţionează sub control hormonal şi nervos. Pentru aceasta, ele prezintă receptori de suprafaţă capabili de a recunoaşte şi a cupla specific cu diferiţi mesageri. Alterarea moleculară a receptorilor de suprafaţă nu le permite acestora recunoaşterea şi ataşarea mesagerului (hormonului de exemplu), ceea ce determină modificări majore ale metabolismului celular. • Maladii virale. Fiind biofite obligatorii, virusurile pătrund în celulele umane şi utilizează mecanismele de sinteză a acestora pentru a se multiplica. Pătrunderea intracelulară a materialului genetic viral are loc ca urmare a cuplării glicoproteinelor virale cu receptorii celulari localizaţi specific: în suprafaţa limfocitelor T pentru HIV, în suprafaţa limfocitelor B pentru virusul EpsteinBarr etc. În acest caz, alterarea moleculară a receptorilor face imposibilă ataşarea virusurilor pe celulele „ţintă”, deci are un efect benefic pentru organism, deoarece individul infectat va fi doar purtător al virusului, fără să dezvolte boala. Cercetări recente de inginerie genetică (axate în principal pe ataşarea virusului HIV) urmăresc realizarea unor mutaţii la nivelul genelor care codifică sinteza receptorilor membranari. S-ar putea astfel realiza receptori modificaţi care să nu permită ataşarea virusurilor la membrana celulară. • Rejetul de grup sanguin şi de organ. La nivelul glicolemei sunt localizaţi determinanţii antigenici ai grupelor sanguine (aglutinogenele A şi B) precum şi antigenele de histocompatibilitate (HLA). Aglutinogenele A şi B sunt

molecule de suprafaţă a căror distribuţie în glicolema hematiilor determină existenţa grupelor sanguine. Atunci când hematiile care prezintă în suprafaţă antigenul A, sunt puse în contact cu un ser care conţine anticorpi anti-A, anticorpii „recunosc" situsurile antigenice ale celulelor străine şi determină aglutinarea hematiilor şi hemoliză. • Celulele canceroase. Celulele sănătoase introduse în mediu de cultură se „recunosc", proliferează până intră în contact una cu cealaltă după care îşi opresc diviziunile; proprietatea este denumită inhibiţie de contact. Din contră, celulele canceroase manifestă un caracter „asocial"; îşi pierd inhibiţia de contact şi proliferează anarhic, determinând formarea de straturi celulare suprapuse în mediul de cultură. Acest comportament se explică prin incapacitatea de a primi semnale venite din mediul înconju rător, incapacitate determinată de alterări ale extremităţilor receptorilor de la nivelul glicolemei. 4. CITOSCHELETUL MEMBRANAR (corticala celulară) Cea de-a treia componentă a suprafeţei celulare este situată pe faţa internă a plasmalemei şi are o grosime de 5-9 nm. Citoscheletul membranar este o structură exclusiv proteică, vizibilă doar în ME, care solidarizează proteinele plasmalemale cu proteinele citoscheletului celular. În microscopia electronică se prezintă ca o reţea fibrilară orientată neuniform care conferă susţinerea şi flexibilitatea periferiei celulare. 4.1. Organizare moleculară Organizarea moleculară a citoscheletului membranar a fost studiată iniţial pe membrana eritrocitelor, la care corticala celulară reprezintă aproximativ 60% din masa proteinelor membranare. Reţeaua proteică este formată din proteine structurale şi funcţionale, după cum urmează: • reţeaua proteică de bază este realizată din tetrameri de spectrină; • în nodurile reţelei se situează complexe proteice care solidarizează reţeaua la proteinele intrinseci ale plasmalemei; • pe braţele reţelei sunt localizate proteine de legătură cu citoscheletul celular. • în ochiurile reţelei se găsesc protein-enzime care modulează polimerizarea şi interacţiunea proteinelor structurale. 4.1.1. Proteine structurale Prin tehnica de electroforeză în gel de poliacrilamidă au fost izolate şi studiate un mare număr de proteine structurale, dintre care : Spectrina este o proteină fibrilară alcătuită din două subunităţi: α şi β

(heterodimer; cu greutăţi moleculare de 240.000 şi respectiv 220.000 daltoni). Dimerii au formă de bastonaş. Polimerizarea heterodimerilor cu răsucirea subunităţilor una în jurul celeilalte duce la formarea unor tetrameri lungi care reprezintă structura de bază a reţelei. Ankirina este o proteină globulară care leagă proteina banda 3 de reţeaua de spectrină. Are o greutate moleculară de 200.000 daltoni. Interacţiunea spectrinăankirină-proteina banda 3 ancorează citoscheletul la nivelul membranei celulare. Actina se găseşte sub formă fibrilară (actina F); este compusă din 30 de monomeri de actina G care alcătuiesc un lanţ dublu helicoidal cu o lungime de aproximativ 25 nm. Actina se asociază cu spectrina şi proteina banda 4.1. Proteina banda 4.1 este o proteină globulară care se leagă de capetele libere ale tetramerilor de spectrină. Greutatea moleculară este de 78.000-82.000 daltoni. Are rol în conectarea citoscheletului membranar la proteinele intrinseci ale plasmalemei şi în interacţiunea spectrină-actină. În concluzie, citoscheletul membranar este realizat dintr-o reţea de tetrameri de spectrină solidarizată cu proteinele integrale ale plasmalemelei şi cu reţeaua proteică a citoscheletului celular (fig.V.13).

Fig.V.13. Organizarea moleculară a citoscheletului membranar

4.1.2. Proteine funcţionale Calmodulinele sunt proteine ale căror molecule cuprind până la 147 aminoacizi cu 4 locusuri de legare a Ca++. Acest grup de proteine joacă un rol important în reglarea proceselor intracelulare. Legăturile dintre diferite tipuri de proteine care intră în alcătuirea citoscheletului membranar, ca şi gradul lor de polimerizare sunt modulate prin intermediul unor proteine reglatoare cum sunt: gelsonina (calcium-dependentă), filamina, fimbrina, proteinkinaze, proteinfosfataze etc.

4.2. Rolurile citoscheletului membranar a) Rol de susţinere a arhitectonicii suprafeţei celulare. Experienţele efectuate pe membrane eritrocitare au demonstrat că liza bistratului molecular lipidic cu detergenţi permite menţinerea citoscheletului membranar (păstrându-se astfel nemodificată forma celulei). Dacă însă se distruge citoscheletul membranei prin tratarea cu soluţii cu forţă ionică mică, celula se fragmentează în mici vezicule. b) Citoscheletul membranar conferă membranei elasticitate şi rezistenţă. Elasticitatea se datorează dispoziţiei în reţea a proteinelor fibrilare, iar rezistenţa este atribuită complexelor proteice de la nivelul nodurilor reţelei. c) Rol în adezivitatea intercelulară. Filamentele de actină din componenţa citoscheletului membranar interacţionează cu plasmalema prin intermediul unei proteine numită vinculină (proteină izolată din plăcile de adeziune – regiuni specializate ale plasmalemei în care se termină fibrele de stress ale fibroblastelor). În celulele canceroase are loc o alterare a vinculinei datorată fosforilării ei sub acţiunea tirozinkinazelor produse de diverse oncogene. Astfel, alterarea vinculinei determină alterarea legăturilor citoschelet-plasmalemă, ceea ce conduce la pierderea formei specifice a celulelor, ele tinzând spre rotunjire. În acelaşi timp, celulele canceroase îşi micşorează mult capacitatea de adezivitate, în felul acesta ele putând fi uşor antrenate de curentul sanguin şi transportate la distanţă (metastazare). d) Rol în motilitatea periferiei celulare. Citoscheletul membranar iniţiază şi participă la procesul de emitere a pseudopodelor, precum şi la invaginarea suprafeţei celulare în timpul fenomenului de pinocitoză. e) Datorită legăturilor de continuitate cu citoscheletul celular are rol în direcţionarea substanţelor endocitate în interiorul citoplasmei. f) Rol în recepţia şi transmiterea intracelulară a mesagerilor. Calciul şi nucleotizii ciclici sunt mesageri intracelulari de ordinul II; citoscheletul celular participă la formarea şi transmiterea lor către diferite organite „ţintă” din interiorul celulei. 4.3. Implicaţii medicale • Plachetele sanguine sunt fragmente celulare derivate din fragmentarea megacariocitelor. Au rol important în coagularea sângelui şi în vindecarea rănilor. Citoscheletul unei plachete trebuie să suporte rearanjamente complicate în timpul reacţiei de coagulare a sângelui, rearanjamente care induc numeroase modificări ale formei. Din această cauză, citoscheletul plachetar necesită componente proteice suplimentare (ex.fodrina), faţă de citoscheletul eritrocitelor. Malsinteza fodrinei, determinată genetic, conduce la imposibilitatea modificărilor de formă plachetară şi în consecinţă la alterarea mecanismului de coagulare.

• În celulele musculare contracţia este influenţată de legătura reţelei corticale cu sarcolema. Pe faţa citoplasmatică a sarcolemei celulelor musculare striate cardiace şi scheletale a fost evidenţiată prezenţa unei proteine numită distrofină. Alterarea cantitativă sau calitativă a sintezei acesteia determină apariţia unui grup de boli ereditare caracterizate prin distrugerea celulei musculare (distrofia musculară Duchenne, distrofia musculară Becher). • Experienţele efectuate pe eritrocite au demonstrat că citoscheletul membranar menţine forma de disc biconcav a celulei, şi în acelaşi timp asigură flexibilitatea şi deformabilitatea sa, fapt esenţial pentru ca eritrocitul să poată străbate capilarele sanguine cu un diametru mai mic decât al său. Defecte genetice ale sintezei proteinelor din componenţa citoscheletul membranar determină instabilitatea acestuia, fapt ce duce la apariţia unor anemii hemolitice. Astfel, defecte ale spectrinei care constau în scăderea capacităţii de a forma tetrameri determină sferocitoza ereditară şi piropoikilocitoza ereditară. Absenţa ankirinei determină boala denumită eliptocitoza ereditară.

FUNCŢIILE MEMBRANEI CELULARE Periferia celulară este o structură stratificată cu o compoziţie moleculară şi macromoleculară complexă care delimitează celula de mediul extracelular, controlează schimburile cu mediul înconjurător, participă la comunicarea intra şi intercelulară şi realizează recunoaşterea şi asocierea intercelulară.

1. FUNCŢIA DE ADEZIVITATE Adezivitatea reprezintă capacitatea celulelor de a realiza contacte între două sau mai multe celule sau între celule şi alte substraturi. Membrana celulară este implicată în fenomenele de recunoaştere şi adezivitate intercelulară. Adezivitatea este o proprietate a suprafeţei tuturor celulelor şi se manifestă atât in vivo, cât şi in vitro faţă de un substrat corespunzător. Din punct de vedere al adezivităţii, asocierea poate fi temporară: asocierea faţă de un substrat în culturi celulare sau in vivo luând contact pasager cu alte celule (leucocitele cu bacteriile) sau permanentă: celulele din cadrul ţesuturilor. În ţesuturi, adezivitatea se manifestă în două moduri: - celulele se asociază între ele (adezivitate celulă-celulă);

- celulele se asociază la membrana bazală (adezivitate celulă-matrice extracelulară). Fenomenul de recunoaştere şi asociere intercelulară este prezent în toate etapele de dezvoltare ale populaţiilor celulare şi se manifestă pe toată durata de viaţă a individului. Astfel, el stă la baza recunoaşterii şi unirii gameţilor, permite diferenţierea şi organizarea ţesuturilor în cadrul embriogenezei, are importanţă capitală în integrarea normală a celulelor în ţesuturile organismelor adulte, precum şi în evoluţia unor fenomene cum sunt: regenerarea ţesutului, inflamaţie, proliferare malignă. Adezivitatea celulelor la matricea extracelulară este mediată de un sistem de molecule matriciale cărora le corespund molecule receptor ale suprafeţei celulare. Adezivitatea celulă-celulă este mediată de un sistem de glicoproteine integrale ale plasmalemelor adiacente care au locuri de interacţiune complementare. Acest tip de adezivitate, mediată de molecule şi complexe moleculare este denumită adezivitate simplă. Ea a fost pusă în evidenţă la nivelul suprafeţelor celulelor hepatice, neuronilor etc. Există însă ţesuturi (în special epiteliale) supuse unor solicitări mecanice crescute (de exemplu epiteliul intestinal, epiteliile de acoperire etc.). Celulele acestor epitelii sunt strâns legate una de alta prin intermediul unor diferenţieri locale ale plasmalemei şi ale matricei sau ale plasmalemelor adiacente. Acestea dau o conformaţie stabilă locului de joncţiune şi poartă denumirea de dispozitive joncţionale speciale. Joncţiunile au dimensiuni de zeci de nanometri, nu pot fi vizualizate în MO, dar sunt uşor de evidenţiat în ME. Toate joncţiunile au o organizare moleculară de tip proteic. 1.1. Clasificarea funcţională a joncţiunilor: 1) Joncţiuni de etanşeizare - zonula occludens (joncţiunea strânsă) 2) Joncţiuni de ancorare a. cu participarea filamentelor de actină - celulă-celulă: zonula adherens - celulă-MEC: contacte focale sau plăci de adeziune b. cu participarea filamentelor intermediare - celulă-celulă: desmozomi - celulă-MEC: hemidesmozomi 3). Joncţiuni de comunicare - joncţiunea GAP (nexus) - sinapsa chimică 1.2. Organizare moleculară, localizare şi rol 1.2.1. Joncţiunile de etanşeizare • Joncţiunea strânsă (zonula occludens) Joncţiunile strânse se realizează prin "sudarea" plasmalemelor a două celule

vecine, spaţiul intercelular lipsind în totalitate. La edificarea acestor dispozitive participă proteinele integrale ale plasmalemelor adiacente care traversează membranele, se dispun în şiruri de câte două şi se sudează în spaţiul extracelular asemănător unui "fermoir". Proteinele care iau parte la organizarea zonulei occludens sunt ocludina şi claudina (fig.VI.1). Datorită acestei structuri, ele alcătuiesc dispozitive de adezivitate impermeabile care separă net compartimentele tisulare cu compoziţii chimice diferite. Sunt situate în apropierea polului apical al tuturor celulelor care delimitează lumenul unor cavităţi şi au rolul de a împiedica pătrunderea macromoleculelor din lumen în spaţiile intercelulare. Cele mai bine studiate sunt joncţiunile strânse din apropierea polului apical al celulelor absorbante intestinale, unde alcătuiesc în ansamblu un "cadru de închidere" pe toată suprafaţa absorbantă. Prin aceasta se împiedică scurgerea fluidelor printre celule, toate substanţele fiind obligate să traverseze zona apicală prevăzută cu microvili. De exemplu, glucoza este pompată activ din lumenul intestinal în celulă prin suprafaţa apicală, iar din celulă trece în sânge prin difuziune mediată de transportori situaţi în zonele bazo-laterale ale plasmalemei. Joncţiunile strânse împiedică retrodifuziunea glucozei din spaţiul intercelular în lumenul intestinal. Din acest punct de vedere, zonulla occludens joacă un rol principal în împărţirea în domenii a suprafeţelor celulare: un domeniu apical-absorbant şi un domeniu laterobazal.

Fig.VI.l. Organizarea moleculară a joncţiunii strânse (după Alberts et al., 2002)

1.2.2. Joncţiunile de ancorare

• Zonula adherens Organizarea moleculară cuprinde: a) proteine de ataşare la citoscheletul celular sunt reprezentate de un mănunchi de filamente de actină localizat pe faţa internă a plasmalemei, care înconjoară ca o bandă domeniul lateral al celulei epiteliale. Benzile dintre celulele vecine sunt situate la acelaşi nivel (fig.VI.2). b) proteine de ancorare intracelulară; filamentele de actină se ataşează la membrană prin intermediul unor proteine de ancorare numite catenine α, β şi γ (plakoglobina), vinculină, α-actinina (fig.VI.3.). c) proteine care solidarizează plasmalemele în spaţiul extracelular; acestea fac parte din clasa de proteine Ca++- dependente numite cadherine. Cadherinele reprezintă principalele molecule de adezivitate celulară (CAM) ale ţesuturilor vertebratelor. Sunt descrise 4 tipuri „clasice” şi un mare număr de cadherine „non-clasice” din care mai mult de 50 sunt exprimate în ţesutul nervos. Cele 4 tipuri „clasice” sunt: E-cadherina (în ţesuturile epiteliale), N-cadherina (în ţesutul nervos, cardiac, muşchi scheletic, cristalin), P-cadherina (în ţesutul placentar, epiderm şi epiteliul mamar) şi VE-cadherina (la nivelul celulelor endoteliale). Datorită numărului mare în care au fost descrise sunt cunoscute sub denumirea de superfamilia proteică a cadherinelor.

Fig. VI.2. Localizarea zonulei adherens la nivelul domeniului lateral al celulelor absorbante

Fig.VI.3.Organizarea moleculară a zonulei

•

Contactele focale (plăcile de adeziune) Plăcile de adeziune sunt structuri proteice care fixează celulele la matricea extracelulară, mai exact la membrana bazală. Organizarea moleculară cuprinde trei clase de proteine (fig. VI. 4): a) proteine de ataşare la citoscheletul celular reprezentate de filamente de actină; b) proteine de ancorare intracelulară: talina, vinculina, α-actinina, filamina; c) proteine de adeziune transmembranară numite integrine. Domeniul extra celular al integrinelor transmembranare se fixează la componentele proteice ale matricei extracelulare, în timp ce domeniile intracelulare se fixează indirect la filamentele de actină. Fixarea este mediată de proteinele de ancorare intracelulară.

Fig. VI. 4. Participarea integrinelor la organizarea moleculară a plăcilor de adeziune

Integrinele formează o mare clasă de receptori omologi transmembranari care

concură la ataşarea celulelor la MEC. Molecula este formată din două sub-unităţi glicoproteice transmembranare (α şi β), unite prin legături necovalente. Fixarea acestor domenii extracelulare la diferite proteine matriciale depinde de concentraţia cationilor bivalenţi Ca++ sau Mg ++ din spaţiul extracelular. Ca orice receptor, integrinele au şi rolul de a activa căile de semnalizare intracelulară care „comunică” celulei caracterele matricei la care s-a ataşat. Implicaţii medicale Integrinele se găsesc în membranele tuturor celulelor şi au afinitate pentru liganzi extracelulari de tipul: laminină, fibronectină, fibrinogen, imunoglobuline. La om au fost descrise alterări genetice care conduc la malsinteza subunităţilor β ale integrinelor. Astfel: - imposibilitatea sintezei fragmentului proteic corespunzător subunităţii β 2 determină incapacitatea leucocitelor de a contacta imunoglobulinele (anticorpii). Boala se numeşte insuficienţă de adeziune leucocitară şi se caracterizează prin infecţii bacteriene repetate; - malsinteza sau absenţa sintezei fragmentului peptidic corespunzător subunităţii β 3 determină incapacitatea trombocitelor de a ataşa fibrinogenul în vederea realizării unor etape din procesul de coagulare. Boala poartă numele de maladia Glanzmann, iar simptomatologia principală este reprezentată de hemoragii.

•

Desmozomii (macula adherens) Elementele care concură la organizarea unui desmozom sunt: a) membranele plasmatice adiacente aşezate paralel care încadrează un spaţiu intercelular de 25-30 nm; b) pe feţele citoplasmatice ale plasmalemelor adiacente se găsesc două formaţiuni discoidale alcătuite din proteine de ancorare intracelulară numite plakoglobină şi desmoplakină care în ME apar de aspect electronodens. Ele sunt responsabile de ataşarea elementelor citoscheletului celular (filamentele de keratină) la proteinele de adezivitate transmembranară. c) Proteine de adezivitate transmembranară: desmogleina şi desmocolina care fac parte din familia cadherinelor. Prin interacţiunea domeniilor lor extracelulare, ele realizează ancorarea membranelor plasmatice adiacente. d) filamente intermediare (tonofilamente sau filamente de keratină în celulele epiteliale, filamente de desmină în celulele musculare); acestea au rolul de a ancora plăcile proteice discoidale cu citoscheletele celulare ale celulelor ce intră în joncţionare (fig.VI.5). Alcătuirea macromoleculară a acestor dispozitive joncţionale determină o puternică "ancorare" intercelulară. Un grup de celule joncţionate în acest fel sunt

capabile să funcţioneze ca o unitate structurală. Din această cauză, desmozomii sunt mai abundenţi între celulele ţesuturilor supuse la solicitări mecanice severe cum sunt epidermul, epiteliul colului uterin, epiteliile absorbante etc. Implicaţii medicale În bolile dermatologice numite „dermatoze buloase” se sintetizează anticorpi împotriva propriilor glicoproteine transmembranare. Legarea anticorpilor de desmogleine afectează structura desmozomilor responsabili de aderarea intercelulară a celulelor ţesutului epitelial din piele.

Fig. VI.5. Organizarea moleculară a unui desmozom

• Hemidesmozomii Hemidesmozomii au organizarea moleculară a unei jumătăţi de desmozom, deoarece se află situaţi la polul bazal al celulelor epiteliale, unde au rol de a solidariza celulele cu lamina bazală. Sunt formaţi dintr-o placă citoplasmatică, tonofilamente şi integrine care solidarizează placa cu lamina bazală (fig.VI.6). În concluzie: 1. Grupele proteice care intervin în joncţionarea de ancorare sunt: - familia cadherinelor care realizează ancorarea de tip celulă-celulă participând la organizarea zonulei adherens şi a desmozomilor. - familia integrinelor care realizează ataşarea de tip celulă - MEC, intrând în organizarea adeziunilor focale şi a hemidesmozomilor. 2. În ambele cazuri are loc o ancorare la elementele citoscheletului celular: - la filamentele de actină în cazul zonulei adherens şi a plăcilor de adeziune, - la filamentele intermediare în cazul desmozomilor şi a hemidesmozomilor.

Fig. VI.6. Distribuţia desmozomilor şi hemidesmozomilor la nivelul celulei absorbante intestinale

1.2.3. Joncţiunile de comunicare • Joncţiunile GAP (nexus) Acest tip de joncţiune, denumită şi permeabilă, permite trecerea unor molecule mici dintr-o celulă în alta. Joncţiunea GAP este cea mai răspândită joncţiune, întâlnindu-se în toate tipurile de ţesuturi. Dispozitivele joncţionale sunt realizate de structuri proteice numite conexoni care străbat plasmalema şi proemină de o parte şi de alta a stratului dublu lipidic. Fiecare joncţiune constă din sute de conexoni aşezaţi în planul plasmalemei, întro reţea hexagonală. Fiecare conexon este format din 6 subunităţi proteice. Conexonii din cele două celule învecinate se aşează cap la cap realizând un canal de comunicare între citoplasme. Canalul străbate spaţiul intercelular care are o grosime de 2-4 nm, interiorul canalului fiind complet izolat de spaţiul intercelular. Lumenul canalului are un diametru reglabil de 0,4-2nm, reglarea fiind se pare dependentă de concentraţia ionilor de Ca++ (fig.VI.7). Joncţiunile GAP sunt permeabile pentru o gamă largă de molecule hidrofile, de la ioni până la molecule organice cu greutate moleculară până la 5000 daltoni. Printre acestea sunt glucidele, aminoacizii, nucleotidele, hormonii, vitaminele. Nu pot trece macromoleculele cum sunt proteinele şi acizii nucleici. Ele permit trecerea

curentului electric şi sunt de 10000 de ori mai permeabile pentru ionii metalici decât restul suprafeţei membranelor (fig. VI.8).

Fig. VI.7. Reprezentarea schematică a joncţiunii GAP

Fig. VI.8. Permeabilitatea canalelor joncţionale GAP

Joncţiuni de tip GAP au fost evidenţiate între toate tipurile de celule care acţionează împreună şi reprezintă principala cale de comunicare intercelulară. Prezintă multiple roluri. - cuplarea celulelor prin joncţiuni GAP prezintă o mare importanţă în embriogeneză. Încă din fazele timpurii (stadiul de 8 celule), celulele sunt cuplate electric una cu alta. Prezenţa joncţiunilor GAP între aceste celule permite cuplarea metabolică, reprezentând o importantă cale pentru distribuirea substanţelor trofice, înainte ca sistemul circulator să se dezvolte. În acelaşi timp, joncţiunile permeabile participă la recunoaşterea intercelulară, menţinerea gradientului de concentraţie a unor molecule şi modulează diferenţierea celulară în cadrul embriogenezei. - joncţiunile permeabile realizează cuplarea electrică în miocard, asigurând astfel contracţia inimii. - realizează cuplarea electrică între celulele musculare netede din intestin, asigurând astfel peristaltismul intestinal. - au fost puse în evidenţă şi între celulele altor ţesuturi epiteliale: glande salivare, rinichi, tiroidă, piele etc, unde realizează cooperarea metabolică intercelulară. • Sinapsele Sinapsele sunt dispozitive de comunicare intercelulară care se stabilesc între celulele nervoase sau între celulele nervoase şi celulele musculare. Sinapsa, ca joncţiune funcţională între două sau mai multe celule nervoase, constă în principal din două componente: un versant presinaptic care conduce

impulsul nervos şi un versant postsinaptic care îl primeşte (fig.VI.9).

Fig. VI.9. Reprezentarea schematică a componentelor sinapsei chimice

Microscopia electronică a arătat că axonul presinaptic se termină la locul de contact cu neuronul postsinaptic prin fibre terminale de 0,5-2 μ în diametru denumite, datorită formei lor, „butoni” sinaptici sau terminali. În măduva spinării, terminaţiile presinaptice sunt strâns aplicate pe soma neuronului (sinapsă axosomatică) şi/sau pe porţiunile proximale ale dendritelor neuronului postsinaptic (sinapsa axo-dendritică). Numărul butonilor sinaptici variază în diferitele părţi ale măduvei spinării şi creierului, de la unul pe celula postsinaptică (în mezencefal), până la 1300 pe neuronul motor spinal şi 10.000 pe celulele piramidale din cortex. S-a aproximat că fiecare din cele 30 miliarde de neuroni din SNC posedă aproximativ 100 de aferenţe covergente şi, la rândul lui, fiecare neuron transmite aferenţe divergente la alţi 100 de neuroni; de aceea, numărul de căi posibile pe care un impuls le poate lua prin reţeaua neuronală este enorm. Tot prin ME s-a arătat că membranele butonului terminal şi cea a neuronului postsinaptic sunt separate de o fantă sinaptică (synaptic cleft) cu o grosime de 100-500 Å. Deşi fanta este îngustă, liniile de forţă ale potenţialului de acţiune nu sunt suficiente pentru a depolariza membrana postsinaptică (99% din curentul bioelectric se pierde în lichidul intercelular şi numai 1% ajunge la membrana postsinaptică). Pentru ca această „barieră” să fie învinsă este necesară intervenţia excitaţiei chimice (mediatorilor chimici). În interiorul butonului presinaptic există numeroase mitocondrii (mai multe decât într-un volum similar de citoplasmă celulară) şi în medie 10000-15000 de vezicule cu diametrul de 400-800 Å, mai numeroase în apropierea spaţiului sinaptic. Veziculele se mai numesc sinaptozomi şi conţin stocate mici „cuante” de

transmiţător chimic (acetilcolină, norepinefrină, dopamină etc). Sinapsa conţine şi mari concentraţii de enzime implicate în procesul de inactivare al mediatorului (ex: acetilcolinesterază). Ea reprezintă zona neuronală cea mai susceptibilă la acţiunea agenţilor toxici şi farmacologici cu un efect local mai mult sau mai puţin specific. 1.2.4. Complexele joncţionale Celulele epiteliale secretorii, celulele din epiteliile intestinal şi renal se solidarizează între ele spre polul apical prin mai multe elemente joncţionale numite complexe joncţionale. Acestea sunt formate din joncţiuni strânse spre domeniul apical şi elemente desmozomale în domeniul latero-bazal. În poziţii intermediare se găsesc joncţiuni de tip GAP. Complexele joncţionale realizează toate tipurile de legături intercelulare necesare îndeplinirii funcţiilor specifice celulei, cât şi funcţionării ţesutului ca un tot unitar.

2. FUNCŢIA DE SEMNALIZARE INTERCELULARĂ ŞI INTRACELULARĂ

2.1. Principiul general al semnalizării celulare Sistemele de comunicare intercelulară asigură funcţionarea armonioasă a celor aproximativ 1017 celule din organismul uman. Comunicarea intercelulară începe odată cu primele diviziuni ale celulei ou, controlează creşterea şi diferenţierea în timpul embriogenezei şi mai apoi coordonează activitatea celulelor mature. Nici una dintre celulele care alcătuiesc organismul nu funcţionează individual, toate se află sub o dublă coordonare, nervoasă şi endocrină, astfel încât mecanismele lor interne sunt riguros controlate. Pentru ca acest lucru să poată fi realizat, comunicarea necesită conlucrarea mai multor tipuri de molecule: 1. molecule de semnalizare extracelulară care sunt produse de celule pentru a „informa” celulele vecine sau celule aflate la distanţă. Acestea poartă denumirea de mesageri sau liganzi; 2. molecule de recepţie a mesajelor situate pe membrana sau în citoplasma celulelor ţintă şi care poartă denumirea de receptori; 3. dispozitive de semnalizare intracelulară care să distribuie ulterior mesajele în diferite părţi ale celulei. Proteinele de semnalizare intracelulară cuprind kinazele, fosfatazele, proteine capabile să lege GTP şi multe alte proteine cu care acestea interacţionează. 4. la sfârşitul fiecărei căi de semnalizare se găsesc proteinele ţintă care, atunci când calea de semnalizare este activată, suferă modificări şi în felul acesta modifică comportamentul celular. În funcţie de efectele semnalului, proteinele ţintă pot fi: activatoare ale genelor, canale ionice, componenele unei căi metabolice, componente ale citoscheletului etc. 2.2. Modalităţi de semnalizare intercelulară 2.2.1. Comunicarea de vecinătate • Semnalizarea contact-dependentă Unele dintre moleculele de semnalizare rămân fixate în periferia celulelor care le-au sintetizat (celule semnalizatoare). Ele acţionează numai pe celulele care vin în contact cu celula semnalizatoare (fig.VI.10a). Semnalizarea contact-dependentă este prezentă la celulele embrionare, iar în organismul adult, la celulele care asigură răspunsul imunitar. O altă posibilitate de comunicare contact-dependentă o reprezintă joncţiunile GAP. • Semnalizarea paracrină O altă parte a moleculelor de semnalizare sunt secretate în spaţiul extracelular şi acţionează asupra celulelor „ţintă” din apropierea celulei semnalizatoare. Moleculele care acţionează asupra celulelor aflate în apropierea celulelor semnalizatoare poartă denumirea de mediatori chimici locali (fig.VI.10b). • Semnalizarea autocrină O altă posibilitate este aceea în care o celulă secretă în spaţiul intercelular

molecule de semnalizare care se pot întoarce spre a se lega pe proprii receptori. De exemplu, în timpul procesului de diferenţiere celulară, atunci când celula a fost deja „dirijată” spre o cale de diferenţiere, ea poate sintetiza semnale autocrine destinate accentuării şi accelererării procesului de specializare. Semnalizarea autocrină este şi mai eficace atunci când se petrece simultan în mai multe celule vecine de acelaşi tip; în acest fel, celulele manifestă un „efect de comunitate”, pentru a-şi stimula proliferarea şi diferenţierea. 2.2.2. Comunicarea la distanţă Cea mai mare parte a moleculelor de semnalizare sunt secretate şi acţionează asupra celulelor „ţintă” aflate la mare distanţă de celula semnalizatoare. • Semnalizarea sinaptică Transmiterea nervoasă realizează o comunicare rapidă şi selectivă a mesajelor prin intermediul neurotransmiţătorilor. Moleculele de semnalizare secretate de soma neuronală sunt vehiculate în lungul axonului şi acţionează asupra unui alt neuron sau asupra celulei efectoare prin intermediul sinapsei chimice (fig.VI.10c). • Semnalizarea endocrină Celulele endocrine secretă molecule de semnalizare numite hormoni. Aceştia sunt secretaţi în sânge, vehiculaţi astfel la mare distanţă şi controlează comportamentul celulelor „ţintă” răspândite în întregul organism (fig.VI.10d). Celulele endocrine şi cele nervoase „lucrează” împreună pentru a coordona activitatea a miliarde de celule. Deşi ambele sunt căi de semnalizare la distanţă, între calea sinaptică şi cea endocrină există diferenţe în ceea ce priveşte modul de acţiune: - celulele endocrine secretă în sânge numeroşi hormoni care conduc semnale specifice la celulele „ţintă”. Acestea prezintă receptori care le permit să extragă şi să fixeze în mod specific anumiţi hormoni . - în transmiterea sinaptică, comunicarea este condiţionată de contactul între terminaţiile nervoase şi celulele „ţintă”. Numai celula care se află în contact cu terminaţia nervoasă este expusă acţiunii neurotransmiţătorului. - dacă celulele endocrine trebuie să utilizeze mai mulţi hormoni pentru comunicare, celula nervoasă poate utiliza acelaşi neurotransmiţător pentru a comunica specific cu mai multe celule „ţintă”. - deoarece hormonii sunt vehiculaţi de sânge, viteza lor de transport este relativ lentă pe când celula nervoasă poate transmite mesaje la mare distanţă graţie impulsului electric care se propagă cu o viteză de 100 m/s. Odată eliberat la nivelul butonului terminal, neurotransmiţătorul difuzează prin fanta sinaptică în mai puţin de 1 milisecundă. - hormonii sunt diluaţi în fluxul sanguin şi lichidul interstiţial şi trebuie astfel să acţioneze în concentraţii foarte mici ( norepinefrină > izoproterenol, iar pentru receptorii β ordinea este: izoproterenol > norepinefrină >

epinefrină. Fiecare categorie poate fi subdivizată mai departe în α1 şi α2 după afinitatea faţă de o substanţă blocantă, iar receptorii β în β1 şi β2 după afinitatea la epinefrină şi norepinefrină. b) Receptorii pentru hormoni au localizare intracelulară diferită în funcţie de natura hormonului (hidrofil sau hidrofob) (fig.VI. 11). • Hormonii liposolubili (tiroidieni, steroizi) sunt molecule mici care pot străbate bistratul lipidic hidrofob şi interacţionează cu receptori specifici din citosol sau din nucleu. Acţionează asupra ADN nuclear, modificând transcripţia unor gene specifice. • Hormonii hidrofili se leagă de receptorii din plasmalemă şi aceştia transmit celulei informaţia necesară pentru a-şi modifica metabolismul. În această categorie intră receptori pentru insulină, hormoni hipofizari, parathormon, glucagon, adrenalină.

Fig. VI.11. Localizarea receptorilor funcţie de natura chimică a mesagerului

c) Receptorii implicaţi în reacţiile imunitare sunt reprezentaţi de : • receptori pentru antigene endogene – se găsesc la suprafaţa celulelor implicate în răspunsul imun (limfocite T) şi la suprafaţa tuturor celulelor din organism. Receptorii de pe suprafaţa limfocitelor T sunt codificaţi genetic pentru a recunoaşte celulele proprii organismului („self”). Ei intervin în fenomenele de recunoaştere şi respingere a grefelor. Toate celulele din organism posedă pe suprafaţa lor macromolecule denumite antigene de suprafaţă, prin care celulele se recunosc între ele, se asociază în cursul diferenţierii pentru a forma ţesuturi şi organe. Antigenele de suprafaţă sunt recunoscute de receptorii de pe celulele implicate în răspunsul imun. • receptori pentru anticorpi - sunt descrişi receptorii din suprafaţa eozinofilelor şi a mastocitelor. Aceştia au proprietatea de a lega la suprafaţa celulelor molecule de imunoglobuline E (Ig E) venite pe cale sanguină. Fiind anticorpi

fixaţi, la unirea cu receptorul specific (Fc) şi în prezenţa antigenului, Ig E declanşează procesul de degranulare a celor două tipuri de celule (fig.VI.12). Degranularea este o reacţie de tip imun; în cazul mastocitelor, eliberarea de histamină, cu efect bronhoconstrictor, reprezintă cauza declanşării crizei de astm alergic. Sunt descrişi de asemenea receptori pentru IgG localizaţi în periferia celulelor din sistemul fagocitar mononuclear; la contactul cu antigenele opsonizante ei induc fagocitoza şi pinocitoza (v. cap. macrotransport). • receptori pentru complement - sunt situaţi în glicolema celulelor din sistemul fagocitar mononuclear şi induc fagocitoza mediată imun. Au fost descrise 5 tipuri notate CR1 - CR5 care interacţionează cu subcomponenta C3 a complementului. O altă clasă de receptori ai complementului poartă denumirea de β-integrine. d) Receptori pentru factorii de creştere Factorii de creştere sunt molecule proteice cu rol fundamental în multiplicarea, diferenţierea şi supravieţuirea celulară (inclusiv în cursul embriogenezei), în controlul homeostaziei tisulare şi în repararea ţesuturilor lezate. Au fost identificaţi receptori specifici la suprafaţa celulelor ţintă, pentru factori de creştere mitogeni: pentru EGF (factor de creştere epidermic), pentru PDGF (factor de creştere derivat din plachetele sanguine) etc. Ca urmare a interacţiunii dintre factorii de creştere şi receptori se declanşează o cascadă de evenimente intracelulare care precede răspunsul mitogen.

Fig.VI. 12. Mecanismul de degranulare a mastocitelor ca urmare a interacţiunii antigen-anticorp-receptor

Receptori pentru substanţe exogene. a) receptori pentru virusuri Fiecare tip de virus îşi are receptori specifici pe celulele „ţintă”: virusul HIV are receptori pe suprafaţa limfocitului T (numiţi CD4 şi CD8), virusul Epstein-Barr are receptori pe suprafaţa limfocitului B, toxina virusului rabic are receptori situaţi la nivelul joncţiunii neuromusculare etc. b) receptori pentru antigene „non-self” Sunt localizaţi la suprafaţa limfocitelor B. Ei sunt responsabili de transformarea blastică a limfocitelor B ca urmare a contactului cu un antigen exogen. c) receptori pentru lectine Lectinele sunt glicoproteine identificate iniţial la plante; au fost recent izolate şi din celule animale. Imunocitochimic s-a stabilit că lectinele sunt sintetizate şi concentrate în celule, apoi exportate la suprafaţa celulelor. Au fost descrişi receptori pentru phitohemaglutinină, concavalină (origine vegetală) şi lectine β galactozidice ce se găsesc într-o concentraţie mare în imediata apropiere a fibrelor elastice din plămân, în jurul alveolelor şi capilarelor plămânului, ca şi în peretele vaselor sanguine. d) receptori pentru droguri (medicamente). Au fost descrişi în plasmalema mai multor tipuri de celule. Medicamentele au asupra acestor receptori o acţiune antagonică, blocându-le legarea de alte substanţe specifice. De exemplu, clorpromazina se leagă de receptorii pentru dopamină de pe suprafaţa celulei nervoase, blocând astfel transmiterea influxului nervos mediat de dopamină. e) receptori pentru toxine bacteriene Bacteriile patogene sintetizează şi secretă toxine, proteine care modifică sau omoară celulele receptive şi sunt agenţii cauzali ai bolilor de natură bacteriană. De exemplu, receptori pentru toxina difterică secretată de Corynebacterium diphteriae şi pentru exotoxina secretată de Pseudomonas. 2.4.1.2. După modul de activare În funcţie de mecanismul de transducţie utilizat, proteinele receptoare de pe suprafaţa celulară pot fi încadrate în trei clase: receptori cuplaţi la canale ionice, receptori cuplaţi la proteina G şi receptori cuplaţi la enzime.

• Receptorii cuplaţi la canale ionice sunt denumiţi şi canale ionice cu deschidere controlată de neurotransmiţător sau receptori ionotropici. Sunt proteine transmembranare, prezente la suprafaţa tuturor celulelor, care permit pasajul selectiv al unor ioni anorganici (fig.VI.13). Canalele ionice nu sunt deschise continuu; ele se deschid ca răspuns la un stimul specific: variaţii de voltaj, stimul mecanic, concentraţia ionică, liganzi, nucleotide (v. cap. microtransport pasiv). Semnalizarea sinaptică între celule excitabile electric se realizează rapid şi este mediată de un număr mic de neurotransmiţători care au proprietatea de a se ataşa la receptorii de pe membrana postsinaptică. Un exemplu în acest sens îl constituie deschiderea canalelor de Na+ de pe membrana celulei musculare ca răspuns la acetilcolină (fig.VI.9).

Fig.VI.13.Receptori cuplaţi la canale ionice

• Receptorii legaţi la proteina G (RCPG). La eucariote, această categorie de proteine reprezintă cea mai mare familie de receptori de suprafaţă. Ei mediază răspunsul celular la o imensă diversitate de molecule de semnalizare (hormoni, neurotransmiţători şi mediatori chimici locali). Morfologic, studiile de secvenţiere a ADN au demonstrat că toţi RCPG au o structură similară şi sunt aproape sigur înrudiţi din punct de vedere evolutiv. RCPG sunt proteine monomerice cu şapte domenii transmembranare, având fiecare o structură în helix (de la I la VII), legate prin trei bucle externe (el, e2, e3) şi trei bucle interne (i1, i2, i3) (fig.VI.14).

Fig.VI.14. Structura receptorilor legaţi de proteina G

Fig.VI.15. Localizarea RCPG şi relaţia sa cu proteina G

Funcţional, RCPG sunt capabili să recunoască semnale cu cele mai variate structuri: fotoni, ioni, molecule aromatice diverse (odorante), aminoacizi, nucleotide, nucleozide, lipide, proteine. În acelaşi timp, acelaşi ligand poate activa diferiţi membri ai familiei. De exemplu, adrenalina activează cel puţin nouă receptori legaţi de proteina G, acetilcolina activează cinci receptori, iar serotonina cel puţin 15. • Receptorii cuplaţi cu o enzimă reprezintă al doilea important tip de receptori celulari de suprafaţă. Sunt implicaţi în captarea moleculelor de semnalizare care favorizează creşterea, proliferarea, diferenţierea şi supravieţuirea celulară în cadrul ţesutului. Morfologic, sunt proteine cu un singur domeniu transmembranar, cu o extremitate externă pentru ataşarea ligandului şi un domeniu citosolic care prezintă activitate enzimatică intrinsecă sau este direct asociat unei enzime (fig.VI.16).

Fig.VI.16. Receptori cuplaţi cu o enzimă

La ora actuală sunt cunoscute şase clase de receptori cuplaţi la o enzimă:

I. II. III. IV. V. VI.

receptori cu activitate tirozin-kinază receptori asociaţi la tirozin-kinazele intracelulare receptori cu activitate tirozin-fosfatază receptori cu activitate serin/threonin kinază receptori cu activitate guanilat ciclază receptori asociaţi la histidin-kinaze

2.5. Semnalizarea prin intermediul receptorilor celulari de suprafaţă legaţi de proteina G În 1994, Premiul Nobel pentru medicină a fost conferit cercetătorilor americani Alfred Gilman şi Martin Rodbell pentru stabilirea rolului proteinelor G ca releu de transmisie între receptor şi mesagerul celular de ordinul II. Toate moleculele semnalizatoare hidrosolubile precum şi unele molecule semnalizatoare liposolubile se leagă de proteine receptoare specifice de pe suprafaţa celulelor ţintă pe care le influenţează. Aceste proteine receptoare de pe suprafaţa celulei acţionează ca transductori ai semnalului: ele leagă ligandul semnalizator cu mare afinitate şi transformă acest eveniment extracelular într-unul sau mai multe semnale intracelulare care modifică activitatea celulei ţintă. Interacţiunea dintre receptor şi proteina ţintă este mediată de o a treia proteină numită "proteină trimerică reglatoare" sau "proteina G". Proteinele heterotrimerice care leagă GTP (proteinele G) au rolul de a cupla receptorii descrişi cu enzimele lor ţintă sau cu canale ionice din membrana plasmatică. Deşi diferă structural de proteinele monocatenare care leagă GTP (GTPaze monomerice), ambele clase de proteine sunt GTPaze şi funcţionează ca adevărate "comutatoare" moleculare care pot oscila între două stări: activă (când leaga GTP) şi inactivă (când leaga GDP). Proteina G trimerică este compusă din trei lanţuri polipeptidice diferite, numite α, β şi γ. Lanţul α, numit αs, leagă şi hidrolizează GTP şi activează AC (adenilatciclaza). Lanţurile β şi γ formează un complex strâns unit - βγ. Acest complex are rolul de a ancora proteina Gs (stimulatoare) pe faţa citoplasmatică a membranei plasmatice. În forma sa inactivă, Gs se prezintă ca un trimer cu GDP legat de αs (fig.VI.17). Evenimentele care se produc în urma contactului ligand-RCGP sunt în ordine: 1. modificări structurale ale membranei 2. modificări funcţionale ale membranei a) formarea mesagerului de ordinul II b) creşterea permeabilităţii pentru ioni 3.modificări specifice metabolismului celular (răspuns celular specific sau efect secundar).

•

Modificări structurale ale membranei În general, receptorii specifici pentru legarea unui anumit ligand se găsesc în număr mare pe suprafaţa unei celule, unde sunt răspândiţi la întâmplare. Imediat după contactul cu mesagerul are loc o redistribuire a receptorilor care difuzează în planul membranei şi se dispun în zone restrânse numite "plaje". Mecanismul este facilitat de fluiditatea membranelor şi mişcările proprii ale proteinelor receptor. Acest lucru se datorează faptului că atât ligandul, cât şi receptorul prezintă cel puţin două situsuri de legare; în acest fel fiecare moleculă de ligand se poate lega la cel puţin două molecule de receptor. Legarea se face de regulă prin interacţiuni slabe (hidrofobe sau punţi de hidrogen). În unele celule, complexele receptor-ligand acoperă suprafeţe mari la unul dintre polii celulei formând o „cupolă”.

•

Modificări funcţionale ale membranei a) modificările de permeabilitate pentru ionii de Na+, K+, Ca++ se produc la legarea neurotransmiţătorilor de membrana postsinaptică şi au rol în transmiterea şi generarea influxului nervos. Unii receptori de suprafaţă sunt cuplaţi funcţional cu canalele de Ca ++ din plasmalemă. Formarea complexului hormon-receptor determină deschiderea acestor canale, urmată de creşterea influxului de Ca ++ în citosol, din fluidul extracelular sau din depozitele interne de Ca++. Creşterea concentraţiei de Ca++ este temporară deoarece canalele intraplasmalemale de Ca++ se deschid tranzitoriu, iar Ca++ intrat în citosol este rapid pompat în afara celulei şi/sau legat intracelular de fosfaţi, calmoduline sau de membranele unor organite intracitoplasmatice (RE, mitocondrii). b) formarea mesagerului de ordinul II Hormonii hidrofili (hipofizari, epifizari, paratiroidian, medulosuprarenalieni) circulă repede prin sânge, acţionează rapid, iar efectele încep la câteva secunde după legarea de receptor şi se termină după câteva minute. Legarea hormonului hidrofil de receptorul specific determină formarea unui complex ligand-receptor considerat a fi mesager de ordinul I. În acelaşi timp are loc o modificare conformaţională a moleculei receptoare care va conduce la apariţia mesagerului de ordinul II: AMPc (adenozin 3'5'monofosfat ciclic) şi GMPc. Când un ligand extracelular se cuplează cu un receptor legat de proteina G, receptorul îşi modifică conformaţia şi activează proteinele G trimerice care se asociază cu el. Activarea constă în stimularea acestor proteine pentru a elibera GDP, preluând în schimb GTP. Comutatorul este decuplat în momentul în care proteina G îşi hidrolizează propriul GTP legat, transformându-1 înapoi în GDP. Dar înainte ca acest lucru să se producă, proteina G are capacitatea de a difuza la distanţă de receptor şi de a transmite mesajul pentru o perioadă lungă, ţintei sale din aval. Pe această cale are loc generarea unor mediatori intracelulari numiţi mesageri secundari sau mesageri de ordinul II care transmit la rândul lor semnalul, modificând comportamentul anumitor proteine şi prin aceasta, comportamentul

celular. Cei mai cunoscuţi mediatori intracelulari sunt AMPc şi Ca++. Modificările concentraţiilor lor sunt stimulate pe căi distincte în majoritatea celulelor animale. Pe calea AMPc, enzima activată produce un mediator solubil (inozitoltrifosfat) care eliberează Ca++ din reticulul endoplasmic. La rândul lor, AMPc şi Ca++ transmit semnalul la alte proteine specifice din celulă, modificându-le conformaţia şi deci activitatea. Mecanismul prin care proteina receptoare poate fi cuplată funcţional la adenilat ciclază se desfăşoară în etape succesive: • Etapa I: legarea ligandului modifică conformaţia receptorului expunând situsul de legare a proteinei Gs; • Etapa II: difuzarea în bistratul molecular lipidic conduce la asocierea complexului ligand-receptor cu proteina Gs şi prin aceasta activarea pentru schimbul GDP cu GTP • Etapa III: înlocuirea GDP cu GTP determină disocierea subunităţii α de complexul G, expunând situsul de legare pentru adenilat ciclază • Etapa IV: subunitatea α utilizează GTP pentru a lega şi activa adenilat ciclaza. Odată activată, aceasta va cataliza producerea de AMPc din ATP • Etapa V: hidroliza GTP la GDP determină disocierea subunităţii α de adenilat ciclază şi reasocierea cu complexul βγ

Fig. VI. 17. Modelul detaliat al cuplajului funcţional: receptor-proteină G-AC

Ligandul semnalizator se poate disocia de receptor odată cu asocierea GTP la subunitatea α. În cazul în care ligandul semnalizator rămâne ataşat de proteina receptoare, el poate continua să activeze moleculele proteinei Gs şi să amplifice răspunsul. Mai mult, subunitatea αs poate să rămână activă continuând să stimuleze o moleculă de AC mai multe secunde, după ce ligandul semnalizator se disociază de receptor, realizând în acest fel o amplificare şi mai marcată.

Fig.VI.18. Cascada enzimatică generată de o moleculă de ligand

Fig. VI.18. Cascada enzimatică generată de o moleculă de ligand

• Modificări specifice metabolismului celular Mesagerii de ordinul II traduc semnalele extracelulare în semnale intracelulare, dar concomitent realizează şi o amplificare foarte mare a semnalului iniţial. Aceasta se produce şi datorită faptului că, prin fiecare ligand ce se leagă de un receptor care activează adenilat ciclaza, se realizează activarea mai multor proteine G care la rândul lor activează mai multe molecule de adenilat ciclază. La rândul ei această enzimă catalizează conversia unui mare număr de molecule de ATP în AMPc. AMPc şi complexul Ca++- calmoduline activează intracelular mai multe proteine şi enzime, provocând adevărate "cascade enzimatice" după legarea unei singure molecule de ligand (fig.VI.18). Deşi procentul de receptori plasmalemali nu depăşeşte 1% din totalul proteinelor din membrană, datorită acestui mecanism de amplificare eficienţa lor în activarea proceselor celulare este extrem de mare. Odată sintetizat, AMPc este considerat mesager de ordinul II care determină în citoplasmă o serie de fenomene metabolice specifice. AMPc activează proteinkinazele care determină modificări ale metabolismului celular, cum sunt: - sinteza de glicogen prin stimularea glicogensintazei

- glicogenogeneză prin activarea fosforilazei - activarea sintezei de proteine în RER - activarea sintezei acizilor nucleici în nucleu etc. Exemple de răspuns celular specific ca urmare a sintezei de AMPc determinate de un ligand de tip hormonal sunt prezentate în tab.VI.I. Aşa cum s-a arătat, efectele secundare ale formării ligand-receptor pot fi agoniste sau de stimulare a unor funcţii celulare (de exemplu, insulina are efect agonist asupra metabolismului glucidic) sau antagoniste - de blocare a unor funcţii celulare (insulina are efect antagonist asupra lipolizei). Ţesutul

Răspunsul metabolic

Hormonul

Ţesut adipos

Adrenalina, glucagon

Ficat

Adrenalina, noradrenalina, glucagon

Degradarea glicogenului la glucoza Inhibiţia sintezei de glicogen Creşterea captării aminoacizilor Stimularea gluconeogenezei

Foliculi ovarieni

FSH, LH

Sinteza de estrogeni şi progesteron

Corticosuprarenala

ACTH

Sinteza de aldosteron şi cortizol

Celule musculare cardiace

Adrenalina

Creşterea ritmului cardac şi a forţei de contracţie

Tiroida

TSH

Sinteza şi secreţia tiroxinei

Celulele osoase

Parathormon

Rezorbţia calciului din oase

Muşchiul scheletic

Adrenalina

Degradarea glicogenului

Intestin

Adrenalina

Secreţie de lichide

Rinichi

Vasopresina

Rezorbţia apei

Plachete sanguine

Prostaglandina I

Inhibiţia agregării

ACTH, Degradarea trigliceridelor Scăderea captării aminoacizilor

Tabel VI.I. Răspunsuri celulare induse de hormoni via AMPc (după Sutherland, 1972 modificat după Alberts 2002)

Ca++ este şi el considerat a fi un mesager de ordinul II. Ionii de Ca++ reprezintă a doua cale majoră prin care RCGP generează mediatori intracelulari de mici dimensiuni (fig.VI.19).

Fig. VI.19. Căile majore de formare a mediatorilor intracelulari de mici dimensiuni

Sunt descrise trei tipuri principale de semnalizare prin intermediul Ca++: 1. Canalele de Ca++ voltaj dependente care se deschid ca răspuns la depolarizarea membranei. În acest caz, intrarea ionilor de Ca în terminaţiile nervoase declanşează secreţia de neurotransmiţători. 2. Canale de eliberare a Ca cu deschidere controlată de inozitol fosfat. Activarea căii de semnalizare prin inozitol-fosfolipide permite calciului să părăsească reticulul sarcoplasmatic şi să activeze proteinele mecanocontractile ceea ce va conduce la realizarea contracţiei musculare. 3. Receptorii ryanodinici (numiţi astfel deoarece sunt sensibili la un alcaloid vegetal – ryanodina). Aceşti receptori determină modificarea de potenţial a membranei plasmatice, eliberarea Ca++ din reticulul sarcoplasmatic ceea ce va antrena stimularea contracţiei musculare. Receptorii ryanodinici sunt prezenţi şi în membrana plasmatică a numeroase celule nemusculare, inclusiv în neuroni. • Calea de semnalizare a inozitol-fosfolipidelor Aşa cum proteina Gs activează adenilat ciclaza, proteina Gq activează o enzimă legată la membrana plasmatică – fosfolipaza C-β. Fosfolipaza acţionează asupra fosfatidilinozitol 4,5-bifosfat localizat pe versantul intern al membranei plasmatice ceea ce va genera producerea de inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3)şi diacilglicerol (fig.VI.20). IP3 este o moleculă hidrosolubilă care părăseşte membrana plasmatică, migrează în citosol şi se fixează pe canalele de eliberare a Ca++ localizate pe membrana reticulului sarcoplasmatic determinând astfel creşterea concentraţiei de Ca++ în citosol. Diacilglicerolul activează protein-kinaza C care la rândul ei este activată şi de creşterea concentraţiei citosolice de Ca++ .

Fig.VI.20. Calea de semnalizare prin inozitol-fosfolipide Fig.VI.20. Calea de semnalizare prin inozitol-fosfolipide

2.6. Implicaţii ale receptorilor în patologie Receptoropatologia este larg implicată în domeniul endocrinologiei, dar se acumulează date şi în domeniul neurologiei, patologiei cardiace, cerebrovasculare, renale etc. Patologia comunicării chimice intercelulare este la ora actuală subdivizată în: - tulburări datorate genezei şi structurii moleculare a factorului hormonal (ligandului), de exemplu tulburări genetice ce duc la modificări de sinteză a insulinei determină diabetul zaharat insulinorezistent. - tulburări ţinând de modificări ale structurii membranare care conduc la absenţa, densitatea scăzută sau modificarea structurii moleculare a receptorilor (miastenia gravis, determinată de inactivarea receptorilor pentru acetilcolină de către un autoanticorp). - mutaţii ale genelor care conduc la sinteza subunităţilor αs (stimulatoare) sau αi (inhibitoare) ale proteinei G (fig.VI.21). - tulburări ţinând de alterarea mecanismelor de formare a mesagerilor de ordinul II sau de modificarea configuraţiei canalelor transmembranare. - tulburări ţinând de capacitatea funcţională a mecanismelor intracelulare ce trebuie activate de mesagerii de ordinul II. Se pare că există un raport între scăderea densităţii receptorilor şi malignitate, raport ce depinde de gradul de diferenţiere al celulei. Cunoaşterea densităţii receptorilor poate avea valoare prognostică, diminuarea numărului acestora constituind un indiciu defavorabil. Terapia tumorilor maligne (mamare, endometriale, prostatice, leucemiile) urmăreşte densitatea receptorilor pentru a stabili sensibilatea tumorii la citostaticele

administrate.

Fig. VI.21. Patologia legată de alterarea subunităţilor αs şi αi ale proteinei G

3. FUNCŢIA DE TRANSPORT A MEMBRANEI CELULARE Ca sistem deschis biologic, celula realizează în mod permanent schimburi de energie şi materie cu mediul extracelular, cu rol în controlul autoreglării. Membrana celulară constituie astfel o barieră care controlează schimburile dintre celulă şi mediul extracelular datorită proprietăţii de permeabilitate selectivă. Ea asigură în acest fel efectuarea transportului de molecule esenţiale şi participă la desfăşurarea proceselor vitale ale celulelor. Permeabilitatea selectivă se manifestă dinamic aflându-se sub influenţa mediului extracelular şi a metabolismului celulei. Mai mult, această caracteristică a membranelor celulare prezintă particularităţi în raport cu diferenţierea funcţională a celulelor. Selectivitatea diferenţiată se manifestă atât la trecerea substanţelor din exterior în celulă, cât şi invers. Deci, la baza noţiunii de permeabilitate selectivă stă conceptul de membrană ca barieră a schimburilor celulare. Din mediul extracelular, celula înglobează o serie de factori nutritivi necesari proceselor metabolice, ca: apă, săruri minerale, aminoacizi, monozaharide, gaze, biocatalizatori etc. În mediul extracelular, celulele elimină o serie de metaboliţi

rezultaţi din catabolismul celular: CO2, uree, amoniac, sau din anabolism: hormoni, enzime, anticorpi, substanţe de natură proteică, glucidică, pigmentară. Traficul de substanţe se desfăşoară atât prin membrana plasmatică cât şi prin membranele organitelor şi antrenează diferite mecanisme de transport. După dimensiunea materialului care traversează periferia celulară, transportul se clasifică în: • microtransport (transport transmembranar) prin intermediul căruia se realizează traversul de apă, ioni, micromolecule; • macrotransport (transport în masă, transport prin intermediul veziculelor) în care se încadrează fenomenele de endocitoză şi exocitoză. 3.1. MICROTRANSPORTUL (transportul transmembranar) Maniera în care substanţele trec prin membranele celulare este determinată pe de o parte de caracteristicile substanţelor (greutate moleculară, dimensiuni, formă, grad de ionizare, grad de hidratare), iar pe de altă parte de compoziţia chimică a membranelor. La realizarea transportului transmembranar, fiecărei componente a suprafeţei celulare îi revine un rol specific. • glicolema - are rol de filtru, reţinând în trama oligozaharidică cationi (Na+, K+, Ca++) şi permiţând trecerea apei şi a anionilor; • plasmalema - controlează influxul şi efluxul de substanţe datorită permeabilităţii selective. Filmul bimolecular lipidic permite trecerea cu uşurinţă a substanţelor liposolubile, pe când cele hidrosolubile traversează membrana printr-un mecanism complex la care concură proteinele integrale; • citoscheletul membranar - are rol în dirijarea intracelulară a substanţelor care traversează periferia. Clasificarea microtransportului A) După numărul şi sensul speciilor transportate. Majoritatea substanţelor sunt transportate prin intermediul unor proteine de transport care au rol în menţinerea polarităţii membranei, respectiv în menţinerea preferenţială a concentraţiei unor ioni de o parte şi de alta a periferiei. Acestea pot transporta substanţele în mai multe moduri. Sistemele uniport realizează transportul unei singure molecule de pe o parte pe alta a membranei. Sistemele cotransport realizează transferul a două substanţe (sau ioni) în aceeaşi direcţie (simport) sau în direcţii opuse (antiport) (fig. VI.22). B) După consumul de energie metabolică (ATP). Există două tipuri de transport: pasiv şi activ. Transportul pasiv are loc fără consum de ATP, deoarece substanţele se deplasează în sensul gradientului de concentraţie (pentru molecule fără sarcină

electrică), sau în sensul gradientului electrochimic (pentru ioni). Gradientul electrochimic este compus din gradientul de concentraţie şi gradientul electric. Energia care provoacă difuziunea este energia cinetică normală a mişcării materiei. Prin contrast, transportul activ reprezintă deplasarea prin membrană a ionilor sau a altor substanţe cu ajutorul unei proteine transportoare, dar împotriva unui gradient de concentraţie sau electrochimic. Procesul necesită o sursă energetică suplimentară, pe lîngă energia cinetică moleculară.

Fig. VI.22. Tipuri de transport după numărul şi sensul speciilor transportate

3.1.1. Microtransportul pasiv (difuziunea) Deoarece se realizează fără consum de energie, microtransportul pasiv este independent de metabolismul celular. El se supune legilor fizico-chimice de difuziune şi osmoză. Transportul pasiv se realizează pe două căi: - difuziunea simplă; - difuziunea facilitată. 3.1.1.1. Difuziunea simplă Schimbul de substanţe prin intermediul difuziunii simple este condiţionat de: - dimensiunile moleculei: viteza de penetrare a moleculei este invers proporţională cu volumul său. Regula se aplică doar pentru moleculele de dimensiuni mici. - absenţa polarităţii: o moleculă polarizată nu traversează membrana plasmatică. - absenţa încărcării electrice: o moleculă cu încărcătură electrică şi cu un grad înalt de hidratare sau un ion (chiar de dimensiuni mici) nu poate traversa dublul strat lipidic. Din contră, CO2 (GM = 44d) traversează cu uşurinţă bistratul lipidic. - coeficientul de partiţie (raportul liposolubilitate/hidrosolubilitate): cu cât raportul este mai mare, cu atât transportul transmembranar al substanţei

respective este mai rapid. Moleculele solubile în lipide (alcool, aldehide, cetone, glicerol, anestezicele) traversează foarte rapid membrana plasmatică. - gradientul concentraţional: viteza de transport este direct proporţională cu diferenţa de concentraţie pe o parte şi pe cealaltă a membranei (moleculele se deplasează din zone cu concentraţie mare spre zone cu concentraţie mică). Deşi apa este extrem de insolubilă în lipidele membranei, totuşi ea traversează foarte repede membrana celulară. O bună parte din apă traversează chiar prin bistratul lipidic, dar cea mai mare parte traversează prin canale proteice. Recent a fost identificată proteina specializată în transportul apei (aqvaporina) la nivelul membranei eritrocitare, polul apical al nefrocitelor şi în alte celule din organism. Există şi alte molecule mici (uree) care străbat porţiunea lipidică "ca nişte gloanţe", înainte de a fi stopate de caracterul "hidrofob" al lipidelor. Pentru substanţele hidrosolubile, stratul bimolecular lipidic se comportă ca o barieră. Ele traversează periferia prin intermediul unor peptide numite ionofori sau prin proteine de tip canal cu deschidere comandată (canale cu "poartă"). A) Ionoforii sunt polipeptide produse de microorganisme. După formă, ionoforii sunt de două categorii. Ionoforii de tip canal formează pori care străbat dublul strat lipidic. Moleculele sunt liniare, cu resturi laterale hidrofobe; două molecule se dispun paralel realizând un canal, perpendicular pe planul membranei, prin care trec cu uşurinţă cationii şi apa. A doua categorie o reprezintă ionoforii mobili care au capacitatea de a „înveli" ionul pe o faţă a membranei şi apoi de a-1 elibera pe faţa opusă (fig.VI.23). Exemple de ionofori: gramicidina, filipina, nistatina, amfotericina B. Ele sunt antibiotice (produse de microorganisme şi împiedică formarea altor microorganisme), dar şi antimicotice, deoarece formează pori numai în membranele ce conţin steroli (membranele fungilor). Ionoforii sunt utilizaţi în studiul efectelor intracelulare a Ca++ deoarece au capacitatea de a transporta cationi bivalenţi (introduc în celulă Ca++ şi Mg++, transportând apoi în afară doi H+). Transportul prin proteine ionofori este stimulat de vasopresină.

Fig.VI.23. Difuziunea simplă prin ionofori

B)Proteine de tip canal cu deschidere comandată. Canalele proteice prezintă permeabilitate faţă de anumite substanţe. Ele pot fi deschise permanent sau tranzitor. Închiderea şi deschiderea se realizează prin intermediul unor mecanisme de comandă, cum sunt ( fig. VI.24):

• canalele cu poartă comandată de ligand au la bază un mecanism de recepţietransducţie la care comanda este dată de ligand, iar operarea deschiderii este efectuată de receptor. Unele proteine ale porţii canalului sunt deschise ca urmare a fixării altor molecule pe aceste proteine. În acest fel se produce o modificare conformaţională a moleculei proteice care închide sau deschide poarta. Un exemplu este canalul cu deschidere comandată de acetilcolină localizat pe membrana postsinaptică.

Fig. VI.24. Diagrama canalelor cu deschidere comandată (după Benga, 1985)

• în cazul canalelor cu poartă comandată de voltaj deschiderea canalului este condiţionată de potenţialul membranei. În starea normală membrana este polarizată, iar canalul este închis; depolarizarea membranei determină deschiderea canalului. Un exemplu în acest sens îl constituie canalele de Ca++ voltaj dependente situate pe membrana butonului terminal al axonului, precum şi canalele de Na+ voltaj dependente de pe membrana plasmatică a celulelor musculare de la nivelul joncţiunii neuro-musculare. • în cazul canalelor cu poartă comandată de ioni deschiderea canalului se produce ca răspuns la creşterea concentraţiei intracelulare a unor ioni, de exemplu: canalele pentru K+ se deschid atunci când creşte concentraţia citoplasmatică a Ca++. • canale cationice cu deschidere comandată de un stimul mecanic.

Există o categorie specială de celule senzoriale, sensibile la stimulii mecanici. Deoarece la polul apical prezintă stereocili, au fost denumite celule „păroase" şi sunt responsabile pentru variate tipuri de mecanorecepţie prezente în structuri speciale din urechea internă. Condiţiile ionice din labirintul membranos al urechii interne se caracterterizează prin existenţa unui gradient electrochimic crescut pentru K+ şi nu pentru Na+. De aceea se presupune că aceste canale, din membrana celulelor păroase sunt canale pentru K+comandate mecanic. Un exemplu de activitate a canalelor proteice cu deschidere comandată este funcţionarea joncţiunii neuro-musculare. Impulsul nervos produce contracţia muşchiului prin următoarele mecanisme care se desfăşoară şi se condiţionează succesiv: 1. Depolarizarea membranei terminaţiei neuronale deschide canalul de Ca++ comandat de voltaj. Rezultă astfel creşterea concentraţiei de Ca++ în butonul terminal. 2. Creşterea intracelulară a Ca ++ determină descărcarea veziculelor de acetilcolină în spaţiul sinaptic. 3. Acetilcolina este un ligand care se leagă de receptorul specific de pe suprafaţa celulei musculare. Se determină în acest fel deschiderea canalului cu poartă comandată de ligand pentru difuziunea Na+ spre interior şi a K+ la exteriorul celulei. 4. Deoarece gradientul de concentraţie al Na+ este mult mai mare decât cel al K+, influxul de Na+ depăşeşte efluxul de K +. În acest fel se produce depolarizarea plasmalemei celulei musculare. Depolarizarea deschide canalele dependente de voltaj pentru Na + , ceea ce determină o undă de depolarizare (potenţial de acţiune) care se răspândeşte pe toată suprafaţa membranei. 5. Datorită potenţialului de acţiune se deschid canalele de Ca ++ din membrana reticulului sarcoplasmatic, permiţând ieşirea Ca++ în citosol. Creşterea bruscă a concentraţiei de Ca++ în citosol determină activarea proteinelor mecano-contractile ceea ce conduce la contracţia miofibrilelor (fig.VI.25).

Fig.VI.25. Diagrama funcţionării canalelor ionice din joncţiunea neuro-musculară

3.1.1.2. Difuziunea facilitată Se produce tot în sensul gradientului concentraţional, până la egalizarea concentraţiilor pe ambele părţi ale membranei, iar substanţele transportate au o viteză de trecere de aproximativ 100.000 de ori mai mare. Proteinele care realizează acest tip de difuziune au o mare specificitate şi se comportă ca enzime legate de membrană. Din această cauză, difuziunea facilitată are caracteristici comune cu cataliza enzimatică, motiv pentru care poartă denumirea de "difuziune catalizatoare prin membrană". Acest tip de difuziune are la bază capacitatea unor proteine transmembranare de a suferi modificări conformaţionale reversibile. Într-o anumită stare conformaţională ("status A"), locul de legare al substanţei transportate este dispus la exteriorul stratului lipidic. În altă stare conformaţională ("status B"), locul de eliberare al substanţei se află pe partea opusă a membranei (fig.VI.26). Proteinele care realizează difuziunea facilitată poartă denumirea de permeaze. Cea mai bine caracterizată permează, D-gluco-permează (sau D-hexozopermează) catalizează difuzia facilitată a glucozei prin membrana celulelor eritrocitare. Gluco-permeaza are o greutate moleculară de 45.000 d şi este o proteină alcătuită din 12 domenii transmembranare care au un caracter hidrofob spre exterior şi hidrofil spre interior. S-a observat că odată legată glucoza la situsul specific, se produce o modificare conformaţională a moleculei transportoare. Astfel se sugerează că această modificare constă în deplasarea spre interiorul proteinei a lanţurilor de aminoacizi hidrofili ce delimitează un canal prin care glucoza poate trece. Prin difuziune facilitată se realizează transportul anionilor, ureei şi glicerolului prin membrana eritrocitului, precum şi transportul glucozei şi al aminoacizilor prin plasmalema mai multor celule. Astfel, la nivelul membranei hepatocitului există aproximativ 800.000 proteine transportoare pentru glucoză, fiecare realizând transportul a 180 de molecule/secundă. Proteina carrier a glucozei are o greutate moleculară de aproximativ 45.000 d; ea poate transporta şi alte monozaharide cu o structură asemănătoare glucozei: manoza, galactoza, arabinoza. Insulina poate mări rata difuziunii facilitate a glucozei de 10-20 de ori. Acesta este principalul mecanism prin care insulina controlează utilizarea glucozei în organism.

Fig.VI.26. Mecanismul transportului mediat de D-gluco-permează

3.1.2. Microtransportul activ Numim microtransport activ, transportul care se realizează împotriva gradientului de concentraţie şi electrochimic cu consum concomitent de energie. Deoarece la realizarea sa participă energia rezultată din hidroliza ATP, iar ATP rezultă din reacţiile de metabolism, transportul activ se mai numeşte transport metabolic dependent. După modul de utilizare al energiei, transportul activ este de mai multe tipuri: a) transportul activ primar - este modul de transport prin membrane al ionilor. Se desfăşoară cu consum de ATP prin pompe ionice cu proprietăţi ATPazice. b) transportul activ secundar - este modul de transport transmembranar al glucozei şi aminoacizilor. El foloseşte energia gradientelor ionice (realizată prin ATP); deoarece transportul acestor substanţe are loc în cotransport cu Na +, acest tip de transport se mai numeşte şi "cuplat". c) transportul activ prin intermediul transportorilor ABC. d) unele bacterii, care conţin bacteriorodopsina, utilizează energia luminoasă pentru transportul H+. 3.1.2.1. Transportul activ prin pompe ionice Pompele ionice sunt protein-enzime integrate la nivelul plasmalemei şi endomembranelor, care au capacitatea de a-şi modifica conformaţia şi prezintă capacităţi ATP-azice. După natura ionilor în transportul cărora intervin, se clasifică în pompe pentru anioni (CI-, I- etc.) şi pentru cationi (Ca++, Mg++etc). După numărul ionilor pe care îi transportă există pompe pentru un singur ion ++ (Ca în celula musculară, CI- în celulele parietale ale mucoasei gastrice, I- în tireocite) şi pentru doi ioni (Na+ şi K+). Au fost descrise trei clase principale de enzime care cuplează hidroliza ATP cu transportul ionilor împotriva gradientului electrochimic. Deoarece hidrolizează ATP, ele se numesc ATP-aze. ATP-aze din clasa P sunt polipeptide transmembranare care se fosforilează în timpul procesului de transport. Această categorie include Na +-K+ ATP-aza din membrana celulară, Ca ++ ATP-aza din membrana celulară şi membrana reticulului endoplasmic şi ATP-azele care transportă protoni în cotransport cu K+. ATP-azele din clasa V sunt transportori de protoni localizaţi în membrana lizozomală. Au rolul de a menţine pH-ul acid al matricei lizozomale; deşi hidrolizează ATP-ul, ele nu se fosforilează în timpul transportului.

ATP-azele din clasa F (ATP-sintetaze) sunt prezente în membrana internă mitocondrială. Ele transportă protonii în sensul gradientului de concentraţie realizând în acelaşi timp sinteză de ATP din ADP şi fosfat. Ca exemplificare, vom prezenta structura şi mecanismul de funcţionare al pompelor de Na+ şi K+ din plasmalemă şi al pompei de Ca ++ din plasmalema şi reticulul sarcoplasmatic al celulei musculare. A) Pompa de Na+ şi K" (Na+-K"-A TP aza) Plasmalemele tuturor celulelor sunt polarizate, prezentând un potenţial de membrană ce variază în funcţie de tipul celular şi specie între -20 mV şi -200 mV. Faţa citoplasmatică (internă) a plasmalemei este încărcată negativ, iar cea externă pozitiv. După cum s-a arătat anterior, celulele îşi desfăşoară activitatea normală numai dacă reuşesc să menţină o concentraţie de Na+, CI- şi Ca++ mai mică decât a mediului extracelular şi o concentraţie de K+ mai mare decât cea extracelulară. Generarea potenţialului de membrană şi implicit desfăşurarea activităţii normale a celulei este condiţionată de funcţionarea a două sisteme proteice membranare: pompa de Na+ şi K+ şi canalul de pierdere al K+. Concentraţia intracelulară de K+ este de 400 mM, iar în spaţiul extracelular de 20 mM. Concentraţia intracelulară de Na + este de 50 mM, iar în spaţiul extracelular de 440 mM . Proteina care realizează canalul pentru K+ permite difuziunea pasivă a K+ din celulă la exterior, conform gradientului concentraţional. În acest fel, interiorul celulei devine tot mai negativ şi de aceea, la o anumită valoare a potenţialului de membrană (-75 mV), tendinţa K+ de a părăsi celula (datorită gradientului concentraţional) este contrabalansată de tendinţa K+ de a intra în celulă (datorită potenţialului de membrană). Canalul de K+ este permeabil şi pentru Na+. Deci unii ioni intră în celulă conform gradientului electrochimic al Na+. Prin intrarea Na+ scade potenţialul de membrană, ceea ce permite ieşirea altor ioni de K +. Prin repetarea acestor procese, celula tinde la egalarea concentraţiilor de Na+ şi K+ de o parte şi de alta a membranei, ceea ce ar duce la dispariţia potenţialului de membrană. Rolul pompei de Na+ şi K+ este acela de a pompa activ Na+ în afara celulei şi K+ în citoplasmă (cotransport antiport), menţinând astfel gradientul de concentraţie şi generând potenţialul de membrană. Pompa de Na+ şi K+ se găseşte în periferia tuturor tipurilor celulare. Pentru funcţionarea sa, ea consumă aproximativ 25-30% din energia celulei, iar în celulele nervoase (care trebuie să-şi refacă polaritatea după depolarizare), consumă până la 70 % din totalul energiei celulare. Pompa de Na+ şi K+ este o protein-enzimă (Na+-K+ ATP-aza) care scindează ATP-ul în ADP + Pi + E. Deci, ea realizează un cotransport antiport (Na+-K+) cuplat cu hidroliza ATP-ului. Pentru fiecare moleculă de ATP hidrolizată se pompează la exterior 3Na+ şi spre interior 2K+; fiecare ATP-ază poate scinda 100 molecue de ATP pe secundă.

Din punct de vedere structural, Na+-K+ - ATP-aza este constituită dintr-o subunitate mare cu rol catalitic (de aproximativ 100.000 daltoni) şi o glicoproteină asociată (cu GM de 45.000 daltoni) (fig. VI.27). Subunitatea mare este asimetrică (mai voluminoasă pe faţa internă), prezintă pe faţa citoplasmatică situsuri de fixare pentru Na+ şi ATP-ază, iar pe faţa externă prezintă locuri de fixare pentru K+ şi pentru inhibitori cardiotonici steroizi (ouabaină). Se presupune că transportul celor doi ioni are loc prin modificări conformaţionale asemănătoare celor descrise la difuziunea facilitată, cu excepţia că aici modificările se datorează unui ciclu de fosforilare şi defosforilare, cu următoarea secvenţă: 1. legarea Na+ pe faţa citoplasmatică; 2. fosforilarea feţei citoplasmatice a proteinei determină modificarea conformaţională, cu deschidere spre exterior a proteinei; 3. ca urmare, are loc eliberarea Na+ la exterior; 4. urmează legarea K+ din exterior, pe locusul specific; 5. defosforilarea, care determină 6. readucerea proteinei la conformaţia iniţială şi eliberarea K + la interior (fig.VI.28). Procesul se reia ciclic, pompele ionice caracterizându-se prin reversibilitate.

Fig.VI.27. Reprezentarea schematică a Na+-K+ -ATP azei

Fig.VI.28. Etapele mecanismului de transport prin intermediul pompei de Na +şi K+

Importanţa pompei de Na+ şi K+ 1. Pompând la exterior 3Na+ şi la interior 2K+, proteina contribuie direct la generarea şi menţinerea potenţialului de membrană. 2. Contribuie la reglarea presiunii osmotice şi a volumului celular. Volumul celulelor este determinat de echilibrul dintre presiunea osmotică intracelulară şi cea a spaţiului extracelular. În spaţiul extracelular presiunea osmotică este determinată de concentraţia de Na + şi CI - (acesta din urmă se găseşte în concentraţie de 540 mM extracelular şi 100 mM în citosol). Datorită gradientelor lor de concentraţie mult mai mari în spaţiul extracelular, Na+ şi CI- tind să intre pasiv în celulă. Dacă acest lucru ar fi permis, presiunea osmotică intracelulară ar creşte mult şi celula şiar creşte volumul până la limita ruperii membranei. Na+-K+ ATP-aza pompează la exterior Na+ şi menţine interiorul celulei negativ (ceea ce contracarează gradientul de concentraţie al CI-) în acest fel împiedică creşterea volumului celulelor. 3. Rol în conductibilitatea nervoasă aşa cum s-a arătat anterior în cazul joncţiunii neuromusculare. Majoritatea bolilor cardiace au la bază o alterare funcţională în exces a pompei de Na+ şi K+. Gangliozidele cardiotonice (digitala, ouabaina) inhibă în mod specific funcţia pompei ionice pentru Na + şi K+; din această cauză ele sunt utilizate ca medicamente în tratamentul acestor boli. B). Pompa de Ca++ Acţionează în menţinerea concentraţiei scăzute de Ca++ în citosol (10-7 M) faţă de o concentraţie mai mare în spaţiul intercelular (10 -3 M). În plasmalemă există o structură proteică numită "pompa de Ca++" sau "Ca++ATPază", care transportă activ Ca++ în exterior. Prin acţiunea sa, aceasta asigură nivelul optim de Ca++ în spaţiul intercelular, necesar transmiterii semnalelor de la exterior în interiorul celulei. Reglarea concentraţiei de Ca++ în citosol este necesară în desfăşurarea proceselor de

secreţie celulară şi motilitate. În membrana reticulului endoplasmic din celula musculară, Ca++ ATP aza pompează Ca++ din citosol în membranele reticulului unde este depozitat. Când impulsul nervos depolarizează plasmalema celulei musculare, Ca++ este eliberat din reticulul sarcoplasmatic în citosol unde stimulează contracţia musculară. Această pompă se găseşte şi la nivelul membranei mitocondriale. Din punct de vedere structural, protein-enzima Ca++ ATPază este un polipeptid format din aproximativ 1.000 de aminoacizi. Pentru fiecare moleculă de ATP hidrolizată, enzima pompează 2Ca++ şi poate hidroliza până la 10 molecule de ATP pe secundă. La fel cu Na+-K" ATPaza, Ca++ATPaza se caracterizează prin reversibilitate. 3.1.2.2. Transportul transcelular (transportul cuplat cu gradiente ionice) Transportul cuplat permite proteinei transportoare să exploateze energia stocată în gradientul electrochimic al unui ion pentru a transporta o altă moleculă. În acest fel, energia liberă eliberată în timpul deplasării ionului în sensul gradientului său electrochimic este utilizată ca forţă de pompare a unei alte molecule în contra gradientului său concentraţional sau elecrochimic. Unii transportori cuplaţi pot funcţiona simport, alţii antiport. În plasmalema celulei animale Na+ este de obicei co-transportat, iar gradientul său electrochimic furnizează forţa necesară pompării active a unei alte molecule. În celulele epiteliale intestinale şi renale există numeroase sisteme de transport simport acţionate de gradientul de Na+; astfel, la polul apical al enterocitelor se găsesc transportorii pentru cotransportul simport al glucoză-Na+ şi aminoacizi-Na+. Deşi filtratul glomerular al rinichiului conţine glucoza în concentraţie aproximativ egală cu cea din plasmă, în urină nu apare în mod normal glucoza, deoarece ea este reabsorbită în tubii contorţi printr-un proces de transport activ. La nivelul enterocitelor, glucoza trebuie să intre în celule şi pe calea unui transport activ, deoarece transportul pasiv ar presupune existenţa unei permanente concentraţii crescute de glucoza intraluminal faţă de cea plasmatică. În ambele cazuri, glucoza este transportată împotriva gradientului concentraţional, în simport cu Na +. Cu cât gradientul de Na+ este mai mare, cu atât viteza cotransportului este mai mare; dacă se reduce transportul de Na+ se reduce şi transportul glucozei. Na+ care intră în cotransport cu glucoza este pompat în afară de Na+-K+ ATPază (fig.VI.29).

Fig.VI.29. Transportul cuplat al glucozei cu Na+ la nivelul polului luminal al celulei absorbante intestinale

Transportul aminoacizilor se face tot prin simport cu Na+. În acest mecanism sunt incriminate cel puţin 5 proteine diferite (una pentru fiecare grup de aminoacizi înrudiţi structural). Alt exemplu de transport activ secundar este transportul cotransport antiport + al Na -Ca++ şi Na+-H+. Antiportul de Ca++ are loc în majoritatea membranelor celulare, cu deplasarea Na+ în celulă şi a Ca++ în afara ei, ambii ioni fiind legaţi la aceeaşi proteină de transport. Antiportul Na+-H+ se petrece numai în câteva ţesuturi; o localizare de mare însemnătate este la nivelul tubului contort proximal al nefronului, unde Na+ se deplasează dinspre lumenul tubului în nefrocit concomitent cu deplasarea H+ spre lumen. Acest mecanism reprezintă cheia transportului H+ din lichidele organismului. 3.1.2.3.Transportul activ prin transportorii ABC Transportorii ABC formează cea mai mare familie de proteine de transport membranar. Au fost iniţial descrise la bacterii, dar progresele realizate în ultimii ani în ceea ce priveşte funcţiile lor în membrana eucariotelor, le conferă o importanţă clinică crescută. Poartă numele de transportori ABC deoarece fiecare membru al familiei conţine două domenii de legare a ATP (fig.VI.30). Fixarea ATP determină dimerizarea celor două domenii de legătură a ATP, iar hidroliza ATP conduce la disocierea lor. Transportorii ABC utilizează fixarea ATP şi hidroliza sa pentru a transporta molecule de o parte şi de alta a membranei. Primii transportori ABC identificaţi la eucariote au fost cei care pompează medicamentele hidrofobe din citosol în mediul extracelular. Unul dintre ei poartă numele de proteina de rezistenţă multiplă la medicamente (MDR – multidrug resistance); se crede că supraexpresia acestei proteine în celulele canceroase este responsabilă de rezistenţa celulelor canceroase la medicaţia citotoxică utilizată în chimioterapie. Transportorul pompează medicamentul în exteriorul celulei ceea ce reduce citotoxi citatea acestuia şi conferă rezistenţă celulară la o gamă largă de substanţe terapeutice. Cercetări recente indică faptul că 40% din cancerele umane dezvoltă rezistenţă multiplă la medicamente, ceea ce reprezintă un obstacol major

în „bătălia” contra acestei maladii. În cea mai mare parte a celulelor animale a fost evidenţiat un transportor ABC al reticulului endoplasmic care transportă activ produse de degradare proteică din citosol în RE. Aceasta este prima etapă a unei căi metabolice cu mare importanţă în supravegherea celulelor de către sistemul imunitar. Fragmentele proteice transportate în RE sunt transportate la suprafaţa celulară (via Aparatul Golgi). Aici ele sunt expuse examinării de către limfocitele T citotoxice care vor omorî celula dacă recunosc aceste fragmente proteice ca non-self (de natură virală sau aparţinând oricărui microorganism ascuns în citosol). Un alt membru al familiei ABC a fost evidenţiat în cadrul studiului mucoviscidozei – maladie genetică provocată de mutaţia unei gene codante pentru un transportor ABC cu rol de reglare a canalelor de Cl - din membrana plasmatică a celulelor epiteliale.

Fig.VI.30. Transportorul ABC tipic (A) dispoziţia lanţului polipeptidic în membrană (B) reprezentare tridimensională

3.1.3. Reglarea schimburilor prin membrane Factorii care influenţează schimburile prin membrană pot fi clasificaţi în: factori chimici, fizici şi biologici. a) Factorii chimici acţionează asupra enzimelor din membrană cum sunt: adenilat ciclaza, Na+-K+ ATPaza, colinesteraza. b) Factorii fizici: temperatura modifică transportul activ, iar la 37°C este favorizat transportul pasiv. c) Factorii biologici sunt cei mai ampli şi mai variaţi. Exemple sunt: • hormonii mineralocorticoizi favorizează permeabilitatea epiteliului tubilor uriniferi pentru Na+, K+, aminoacizi şi apă; • testosteronul şi estradiolul stimulează transportul intracelular al glucozei şi aminoacizilor; • hormonii glucocorticoizi reduc permeabilitatea membranelor pentru glucoză şi aminoacizi, deci au efect antagonic insulinei; • acţiunea nervilor vagi determină o creştere a permeabilităţii membranelor din epiteliul alveolar pentru Na +, CI- şi apă şi în acest fel pot conduce la instalarea edemului pulmonar; • toxinele microbiene de exemplu endotoxina vibrionului holeric determină modificări ireversibile la nivelul pompei Na + - K + ceea ce conduce la

deshidratare severă intracelulară până la deces. 3.2. MACROTRANSPORTUL (transport în masă, transport prin intermediul veziculelor) Proteinele transportoare care mediază pasajul ionilor şi a moleculelor mici prin membrana plasmatică nu pot transporta macromolecule de tipul proteinelor, polizaharidelor, polinucleotidelor. Mecanismul prin care celulele introduc din mediul extracelular sau elimină în mediul extracelular particule de natură diferită poartă denumirea de "transport în masă". Deoarece această modalitate de transport are la bază formarea de vezicule pe seama membranei celulare, el mai este denumit "transport prin intermediul veziculelor" sau " mecanism de translocare prin veziculare". După sensul translocării veziculelor, deosebim două tipuri de transport: endocitoza şi exocitoza. A) Endocitoza este procesul de internalizare al macromoleculelor şi particulelor de natură diferită din mediul extracelular cu formarea de vezicule (endozomi). Sunt endocitate agregate bacteriene sau virale, particule inerte, macromolecule alterate, resturi celulare sau chiar celule întregi. După natura materialului endocitat se disting două tipuri de endocitoză: fagocitoză şi pinocitoză. B) Exocitoza constă în externalizarea în spaţiul intercelular a produşilor de sinteză şi secreţie şi a produşilor proveniţi din catabolismul celular, prin intermediul veziculelor. Este caracteristică celulelor secretorii. 3.2.1. FAGOCITOZA Fagocitoza reprezintă mecanismul prin care celulele înglobează din mediul extracelular particule solide. Termenul provine din limba greacă veche, fagein = a devora. Este un proces complex descoperit şi evidenţiat de MECINIKOV la sfârşitul secolului al XlX-lea, proces care îndeplineşte multiple roluri: • rol de apărare a organismului contra nonself-ului. Prin fagocitoză, celulele specializate înglobează şi apoi distrug bacteriile, virusurile şi în general orice structură străină. • rol de curăţire a ţesuturilor de self-ul alterat: celule degenerate, îmbătrânite, moarte etc. • rol de nutriţie a celulei fagocitare, deoarece în urma procesului de fagocitoză şi digestie intracelulară rezultă produşi finali (aminoacizi, monozaharide) pe care celulele cu rol fagocitar îi utilizează în propriul metabolism. 3.2.1.1. Celulele cu rol fagocitar

Fagocitoza este proprietatea unui grup mare de celule, numite celule fagocitare care, după dimensiunile particulei endocitate, se clasifică în: microfage şi macrofage. Microfagele sunt polimorfonuclearele neutrofile din sânge. Macrofagele iau naştere din celula stem, în măduva hematogenă. De aici, trec în sânge unde rămân aproximativ 60 de ore, apoi prin diapedeză ajung în ţesutul conjunctiv unde se transformă în macrofage tisulare şi îşi desfăşoară activităţile specifice. Totalitatea macrofagelor din organism alcătuiesc "sistemul fagocitar mononuclear". în acest sistem se disting trei compartimente celulare: • compartimentul medular cuprinde ansamblul celulelor care proliferează din celula stem hematopoetică pluripotentă şi sunt incomplet diferenţiate: monoblastele, promonocitele, monocitele medulare; • compartimentul sanguin cuprinde monocitele sanguine care reprezintă forma circulantă sau de distribuire a macrofagelor în organism; • compartimentul tisular cuprinde monocitele migrate în ţesuturi, unde se diferenţiază ca macrofage tisulare. Acestea se grupează în două categorii: macrofage libere (histiocite, macrofage pleurale şi peritoneale, macrofage alveolare, microglia, macrofage din măduva osoasă, splină etc.) şi macrofage fixe (macrofagele din foliculii limfatici, macrofage fixe din splină, ficat etc). Pe lângă procesul de apărare al organismului, datorită capacităţii lor fagocitare, macrofagele intervin în reglarea hematopoezei, în degradarea pigmenţilor biliari, în metabolismul lipidic. 3.2.1.2. Etapele fagocitozei a) Chemotactismul De obicei, bacteriile se localizează în spaţiul interstiţial dintr-un ţesut. Celulele cu rol fagocitar sunt atrase la acest nivel de semnale emise sau induse de bacterii sau de semnale proprii organismului (proteine serice - kalicreina, componentele sistemului complement, citokine, factori eliberaţi de neutrofile). Acestea sunt denumite semnale chemotactice, iar mişcarea dirijată a fagocitelor spre locul infectat se numeşte chemotactism. Ca urmare a receptării semnalului, fagocitele se ataşează de peretele vaselor mici care irigă ţesutul afectat apoi, prin diapedeză, trec prin peretele vasului şi se deplasează la locul infecţiei. b) Recunoaşterea particulei ce urmează a fi fagocitată (opsonizarea) În vederea înglobării particulelor din mediul extracelular, fagocitele prezintă la suprafaţa membranei, receptori. Cu ajutorul acestora, fagocitele recunosc macromoleculele proprii organismului de cele străine, dar şi propriile structuri alterate faţă de cele sănătoase. Toate aceste structuri sunt antigene. Deoarece antigenele sunt de natură foarte diferită, recunoaşterea lor de către fagocite trebuie mediată. În acest scop, în spaţiul intercelular există proteine plasmatice denumite opsonine, care sunt recunoscute de receptorii de la suprafaţa fagocitelor.

Opsoninele pot fi neimunospecifice (fibronectina) şi imunospecifice (anticorpi de tip IgG, IgM şi fracţiunea C 3 a complementului). Ele recunosc şi învelesc particulele ce urmează a fi fagocitate formând în acest fel un complex antigen-opsonină. Procesul poartă denumirea de "opsonizare" (gr. opsonien = a pregăti pentru mâncare). Recunoaşterea celulară se desfăşoară astfel la două nivele: la nivel tisular prin opsonizare, iar la nivel celular prin intermediul receptorilor. c) Ataşarea fagocitelor de particule fenomen numit şi acolare este realizat de receptorii din plasmalema fagocitului, care recunosc liganzii de pe suprafaţa particulei. Se apreciază că un macrofag foarte activ poate prezenta pe suprafaţa sa aproximativ 8 milioane de receptori. La nivelul membranei celulare a macrofagului au fost evidenţiate trei tipuri de receptori: • receptori Fc care recunosc şi fixează antigenele opsonizate cu Ig G. Ei recunosc fracţiunea cristalizabilă (Fc) a Ig G. (fig. VI.31). • receptori C3 care recunosc şi fixează antigenele opsonizate cu fracţiunea C3 a complementului. • receptori nespecifici care recunosc şi fixează self-ul alterat reprezentat de grupările glucidice de la suprafaţa membranelor celulelor îmbătrânite, degenerate sau maligne. De exemplu, glicolema celulelor maligne prezintă o concentraţie scăzută de acid sialic, de aceea ele sunt recunoscute ca anormale şi sunt distruse de sistemul fagocitar mononuclear de cele mai multe ori înainte de a dezvolta o tumoră. d) Înglobarea particulei Ataşarea complexului antigen-opsonină la nivelul receptorului determină activarea acestuia. Activarea receptorului determină activarea proteinelor mecanocontractile din citoscheletul membranar, fenomen care este urmat de emiterea de pseudopode. Pseudopodele înconjoară progresiv particula astfel încât apar interacţiuni receptori-particulă pe toată suprafaţa ei. Capetele distale ale pseudopodelor fuzionează favorizând formarea unei vezicule care cuprinde particula. Vezicula care conţine particula fagocitată este învelită de un fragment de membrană a macrofagului şi poartă denumirea de fagozom. e) Digestia intracelulară a particulei fagocitate Odată format, fagozomul migrează în citosol şi fuzionează cu lizozomii primari, formând un lizozom secundar sau fagolizozom în interiorul căruia are loc procesul de digestie intracelulară (vezi cap. Lizozomi). În cazul fagocitozei bacteriilor, un rol important în distrugerea acestora revine oxidazei din plasmalemă care în cursul înglobării ajunge în membrana fagozomului. Oxidaza catalizează reacţia: 2 O2 + NADPH → 2O 2 + NADP - + H +

Anionul superoxid (O2-) este convertit spontan în H2O2. Din reacţia O2 + H2O2 rezultă hidroxil (OH-) şi oxigenul singlet, ambele foarte reactive şi toxice pentru bacterii. Malsinteza genetică a oxidazei conduce la apariţia a numeroase focare de infecţie numite granuloame şi la maladia numită "boală cronică granulomatoasă". La aceşti bolnavi leucocitele nu pot distruge nici microbii banali care pătrund în permanenţă în organism. Deoarece comportă emitere de pseudopode, fagocitoza este un proces energodependent. Sursa de energie diferă de la un tip de macrofag la altul. Astfel, macrofagele pulmonare utilizează glicoliza aerobă, în timp ce macrofagele peritoneale utilizează glicoliza anaerobă.

Fig.VI.31.Ataşarea particulei la suprafaţa macrofagului şi emiterea de pseudopode

3.2.1.3. Factori modulatori ai procesului de fagocitoză Modularea procesului este realizată de factori activatori şi inhibitori . Activatorii cunoscuţi sunt endotoxinele bacteriene, hormonii estrogeni, virusurile. Activarea macrofagului este realizată prin sporirea capacităţii de ingerare a diferitelor particule din mediul extracelular. Cel mai adesea, activarea apare în infecţii ale organismului cu diferite tipuri de microorganisme care stimulează secreţia de limfokine de către limfocitul T. Sub efectul limfokinelor, macrofagul creşte ca volum, organitele celulare devin mai abundente. Suprafaţa celulară devine neregulată prin multiplicarea pseudopodelor; numărul de receptori pentru IgG şi C3 creşte. Sub acţiunea limfokinelor, macrofagele activate sunt capabile să înglobeze şi să distrugă orice tip de antigen fără recunoaştere imunologică. Acest fenomen prezintă o importanţă deosebită în imunoterapia anticanceroasă. Supresorii procesului de fagocitoză sunt de natură fizică: şocul traumatic,

iradierea cu raze X, temperatura scăzută; chimică: hipooxigenarea şi biologică: septicemia, bolile neoplazice, consumul de droguri, alcoolismul cronic etc. 3.2.2. PINOCITOZA Pinocitoza este procesul de transport în masă a unei cantităţi variabile de fluid tisular împreună cu macromoleculele pe care acesta le conţine. Termenul provine din limba greacă (pinein = a bea). Pinocitoza este întâlnită la toate tipurile de celule, ea reprezentând o cale importantă prin care celulele captează o gamă largă de substanţe necesare propriului metabolism. După mecanismele care stau la baza procesului de înglobare a fluidului tisular se deosebesc două forme: pinocitoza independentă de receptori şi pinocitoza mediată de receptori. 3.2.2.1. Pinocitoza independentă de receptori este forma de înglobare a substanţelor din mediul extracelular în vezicule formate din învelişul celular, fără fixarea prealabilă a substanţelor la nivelul receptorilor membranari. Teoretic, toate celulele eucariote internalizează continuu porţiuni din propriile membrane plasmatice sub formă de mici vezicule de pinocitoză. Viteza cu care membrana plasmatică este internalizată variază de la un tip celular la altul. De exemplu, un macrofag ingeră într-o oră o cantitate de lichid egală cu 25% din propriul volum; aceasta înseamnă că ingeră 3% din propria membrană în fiecare minut sau 100% în jumătate de oră. Aria şi volumul suprafeţei celulare nu se modifică în cursul acestui proces deoarece pierderile sunt permanent acoperite prin exocitoză (ciclul endocito-exocitar). După modul de formare, veziculele de pinocitoză sunt de două categorii: • într-o primă posibilitate, formarea veziculelor are loc la nivelul unor porţiuni depresionate ale membranei, numite puţuri, care sunt tapetate pe faţa citosolică de proteine numite clatrine. Aceste regiuni specializate acoperă aproximativ 2% din aria membranei plasmatice. La aproximativ 1 minut de la formare, puţul se invaginează progresiv şi prin pensare va conduce la formarea unei vezicule acoperită cu clatrine (fig.VI.32). S-a demonstrat că în cazul fibroblastelor în cultură are loc formarea a aproximativ 2500 de vezicule pe minut. La câteva secunde după formare, veziculele îşi pierd clatrinele şi fuzionează cu endozomii precoce. Deoarece în momentul formării veziculele înglobează lichidul extracelular existent în puţuri, acest tip de pinocitoză poartă denumirea de endocitoză în fază lichidă.

Fig.VI.32. Imagine de microscopie electronică care prezintă etapele formării unei vezicule

• o a doua posibilitate o reprezintă formarea veziculelor neacoperite de clatrine. Acest mecanism debutează la nivelul unor invaginări profunde ale plasmalemei numite caveole (fig.VI.33). Caveolele sunt localizate în membrana plasmatică a majorităţii celulelor şi au capaciatea de a forma vezicule şi de a le vehicula în citosol. Unele veziculele formate prin pensarea caveolelor îşi deversează conţinutul la nivelul endozomilor sau în reticulul endoplasmic. Altele traversează celula şi îşi deversează conţinutul pe faţa celulară opusă, fenomen numit transcitoză.

Fig.VI.33. Caveole la nivelul membranei plasmatice a unui fibroblast (după K.G.Rothberg, 1992 cit. de Alberts et al., 2002)

3.2.2.2. Pinocitoza cuplată la receptori se realizează cu ajutorul receptorilor din plasmalemă care recunosc macromoleculele specifice din lichidul extracelular. Un exemplu de pinocitoza mediată de receptori este captarea colesterolului în celulele animale. Majoritatea colesterolului este transportat în sânge sub forma unor complexe numite lipoproteine cu densitate mică (low-density lipoproteins -LDL). Când o celulă animală necesită colesterol pentru sinteza membranelor sale, se produc receptori pentru LDL care sunt inseraţi în plasmalemă. Odată formate, complexele LDL-receptor se deplasează la nivelul depresiunilor îmbrăcate în clatrină, de unde vor fi endocitate. După endocitoză, veziculele îşi pierd reţeaua de clatrină şi fuzionează cu endozomii. Receptorii se aglomerează la un pol, de unde se desprind sub forma unei vezicule care migrează spre plasmalemă. Se produce în acest fel reciclarea receptorilor. LDL fuzionează cu lizozomii şi esterii de colesterol sunt

hidrolizaţi (fig.VI.34).

Fig.VI. 34. Etapele pinocitozei mediate de receptori pentru LDL (după Alberts, 2002)

Implicaţii medicale • în mod normal, concentraţia optimă de colesterol liber în citoplasmă inhibă reciclarea receptorilor sau formarea de noi receptori pentru LDL. În cazul bolii genetice numită hipercolesterolemie familială are loc o producere exagerată de receptori pentru LDL, ceea ce va conduce la o acumulare anormală de colesterol liber în citoplasmă. • dimpotrivă, dacă receptorii pentru LDL nu se sintetizează, absorbţia LDL este blocată, colesterolul se acumulează în sânge şi contribuie la formarea de plăci aterosclerotice în pereţii vaselor. Plăcile aterosclerotice sunt formate din colesterol şi ţesut fibros; ele determină îngustarea vaselor până la blocarea fluxului sanguin, fiind responsabile de episoadele ischemice coronariene, cerebrale, pulmonare etc. 3.2.3. TRANSCITOZA S-a arătat mai sus că urmare a procesului de pinocitoză cuplată la receptori, unele vezicule nu fuzionează cu lizozomii ci traversează celula de pe o parte pe cealaltă deversându-şi conţinutul preluat din lumenul vascular în spaţiul interstiţial. Deci transcitoza este o formă particulară a pinocitozei. Fenomenul a fost observat de G.E. Palade încă din 1953 la nivelul celulelor endoteliale. Contribuţii deosebite în studiul acestui fenomen au adus Baciu şi colab (1971), Maya şi Nicolae Simionescu (1983) şi G.E. Palade (1985).

Se cunoaşte astăzi că celulele care alcătuiesc endoteliul capilar sunt specializate în transportul unor substanţe. Celula endotelială este din punct de vedere metabolic foarte activă şi se comportă ca o barieră semipermeabilă. Ea are o permeabilitate crescută pentru apă şi soluţii, inclusiv pentru macromoleculele proteice din plasma sanguină. Maya şi Nicolae Simionescu au demonstrat că în celulele endoteliale transportul veziculelor de pinocitoză se realizează în două moduri: • transcitoza distributivă în care veziculele trec de pe o faţă pe alta a celulei endoteliale sub formă de şiraguri şi, • transcitoza conectivă în care veziculele se unesc şi formează canale cu diametrul de până la 700 Å. Unele canale se pot forma şi prin invaginarea adâncă a plasmalemelor (fig.VI.35).

Fig.VI.35. Diagramă reprezentând transcitoza în endoteliul vascular (după N.Simionescu)

Unii receptori de suprafaţă ai celulelor epiteliale cu polaritate funcţională (ex. enterocitele) transferă macromolecule specifice dintr-un spaţiu extracelular în altul prin transcitoză (fig.VI.36). Mecanismul se realizează în următoarele etape: • complexele receptori-anticorpi sunt internalizate la nivelul puţurilor acoperite de clatrine, • veziculele fuzionează cu endozomul precoce, • prin burjonare, din endozom se formează vezicule de transport care conduc complexul receptor-anticorp la un endozom de reciclare. Endozomul de reciclare este un compartiment care poate stoca proteinele internalizate un timp mai lung sau mai scurt, în funcţie de nevoile celulare. De exemplu, celulele adipoase şi celulele musculare conţin un număr mare de transportori ai glucozei. Aceste proteine sunt trecute în rezervă în endozomii de reciclare până în momentul când celula va fi stimulată de un hormon, insulina. În acel moment, prin burjonare se vor forma noi vezicule de transport care vor conduce transportorii glucozei în membrana plasmatică şi în acest mod viteza de absorbţie intracelulară a glucozei va creşte.

Fig.VI.36. Etapele transcitozei anticorpilor la nivelul enterocitului (după Alberts, 2002)

Capitolul VII CITOPLASMA SEDIUL MECANISMELOR CELULARE Citoplasma reprezintă mediul intern al celulei, cuprins între membrana plasmatică şi membrana nucleară. După cum am prezentat în cap. „Compartimentarea internă a celulei eucariote”, prezenţa endomembranelor realizează compartimente cu structură, compoziţie chimică şi funcţie specifică. Astfel, în citoplasmă se pot desfăşura simultan aproximativ 2500 de reacţii chimice diferite fără a interfera unele cu altele. Totuşi, atunci când nevoile metabolice o cer, endomembanele permit comunicarea între compartimente, comunicare intermediată de citosol. Din punct de vedere structural, citoplasma este formată din: • citosol

• incluziuni citoplasmatice • organite intracitoplasmatice nespecifice nedelimitate de endomembrane

şi

specifice,

delimitate

şi

1. CITOSOLUL

Citosolul este mediul intern al celulei, cuprins între membrana plasmatică şi endomembranele care delimitează organitele intracitoplasmatice, inclusiv membrana nucleară. Structură Studiat în microscopie optică, citosolul numit şi hialoplasmă (gr. hyalos – sticlă) are un aspect omogen, sticlos şi este aparent nestructurat. Hialoplasma este monorefringentă optic şi are proprietăţi contractile. Prin coloraţii specifice se pot observa structuri granulare ca rozete de glicogen, picături lipidice, cristale proteice şi organite intracitoplasmatice nespecifice. Tinctorial, citosolul are caracter bazofil la celulele tinere şi caracter acidofil la celulele adulte şi îmbătrânite. Pe preparatele proaspete necolorate, hialoplasma apare formată din două zone: o zonă perinucleară populată cu organite şi o zonă periferică săracă în formaţiuni granulare. Ultrastructură Cu ajutorul microscopiei electronice de voltaj supraînalt (HVEM 1.000.000V), K. Porter şi colab. (Premiul Nobel 1979) au descris în hialoplasmă structuri fibrilare subţiri cu un diametru de 4-5 nm, denumite microtrabecule care formează reţeaua microtrabeculară. Se consideră că ea interconectează elementele de citoschelet şi organitele celulare într-o singură unitate morfofuncţională, CITOPLASMA. În ochiurile reţelei microtrabeculare se găsesc apă şi ioni. Mai mult, se consideră că de microtrabecule s-ar afla legate şi enzimele din citosol ceea ce ar asigura trecerea substratului de la o enzimă la alta în mod coordonat. Structura sa dinamică poate suferi modificări reversibile induse de factori diverşi: temperatură, pH, presiune hidrostatică, inhibitori ai proceselor metabolice celulare. Proprietăţi fizico-chimice • hialoplasma este un sistem coloidal heterogen alcătuit din două faze: 1. faza de dispersie (mediu de dispersie) reprezentată de H2O (70-85%), molecule solubile şi ioni anorganici: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, Fe2+(2-3%), 2. faza dispersată constituită dintr-un ansamblu de molecule organice aflate în mişcare browniană.

• • • • •

densitate mai mare ca a apei 1,35- 1,50; indice de refracţie 1-1,04; pH-7,2; realizează dispersia luminii; prezintă mişcări browniene şi de sedimentare în câmp gravitaţional şi centrifugal; • în funcţie de interacţiile dintre macromoleculele dispersate în faza solubilă sau de dispersie, hialoplasma se poate afla în stare de gel sau în cea de sol. Starea de gel se caracterizează prin vâscozitate. Acest fapt se datorează scăderii libertăţii de mişcare a macromoleculelor organice ca urmare a unor interacţii puternice şi fixării lor în ochiurile reţelei microtrabeculare. În faza de sol, macromoleculele se mişcă liber în mediu de dispersie, interacţiile sunt mai slabe, iar hialoplasma se fluidifică. Remanierea permanentă a legăturilor dintre componentele macromoleculare ale hialoplasmei explică caracterul reversibil al tranziţiilor sol ↔ gel. Aceste tranziţii sunt influenţate de factori: endogeni: diviziunea celulară, activitatea metabolică la un moment dat şi exogeni: variaţii ale temperaturii, pHului şi luminii (la celulele vegetale). Compoziţie chimică Cea mai mare parte a hialoplasmei este constituită din apă, până la 85%. Restul de 15% este reprezentat de proteine solubile (enzime) şi insolubile (proteine de structură), glicogen, lipide, substanţe care participă la metabolismul intermediar: ARN, monozaharide, aminoacizi, acizi graşi, nucleotide, nucleozide, săruri minerale. Roluri şi activităţi fiziologice Ansamblul componentelor moleculare precum şi interacţiunile care se desfăşoară între acestea stau la baza multiplelor funcţii pe care hialoplasma le deţine în celulă. 1. Practic întregul metabolism celular îşi are originea în hialoplasmă. Unele căi şi cicluri metabolice se desfăşoară în totalitate în citosol (glicoliza anaerobă, sinteza holoproteinelor, sinteza nucleotidelor etc.), altele sunt iniţiate în citosol şi finalizate în compartimente specifice (glicoliza aerobă, sinteza heteroproteinelor etc.). În acelaşi timp, organitele intracitoplasmatice importă din citosol substanţele necesare realizării propriului anabolism şi tot la acest nivel îşi descarcă produşii de catabolism. Un exemplu reprezentativ îl reprezintă mitocondria care importă din citosol produşi necesari realizării fosforilării oxidative, dar şi majoritatea proteinelor structurale şi a enzimelor de care are nevoie şi care au fost sintetizate în citosol pe seama informaţiei cuprinse în ADN-

ul nuclear. Pe de altă parte, mitocondria deversează în citosol CO 2 provenit din ciclul Krebs, H2O formată la finele pasajului electronilor în lanţul respirator, ATP precum şi precursorii biosintetici pe care îi produce.

Fig.VII.1. Principalele căi metabolice cu pornire de la glucozo-6-fosfat (după Berkaloff)

2. Hialoplasma joacă un rol important în iniţierea mişcărilor intracelulare. Proteinele insolubile aflate în suspensie se polimerizează şi depolimerizează permanent realizând elementele labile ale citoscheletului celular. Acestea poziţionează şi susţin organitele intracitoplasmatice, formează organitele ectocitoplasmatice temporare cu rol în deplasare şi fagocitoză, formează organitele ectocitoplasmatice permanente şi participă la diviziunea celulară. 3. Citosolul constituie o rezervă de materiale de construcţie a căror asamblare are loc fie în hialoplasmă (glicogenogeneza, sinteza acidului palmitic, biosinteza lanţurilor polipeptidice etc.), fie în alte compartimente (sinteza acizilor nucleici, biogeneza ribozomilor, sinteza hemului etc). 4. Citosolul realizează funcţia de stocare temporară a substanţelor cu rol combustibil: lipide, glucide şi a substanţelor elaborate: hormoni, enzime,

proteine structurale etc. Toate aceste substanţe formează incluziunile citoplasmatice.

2. INCLUZIUNILE CITOPLASMATICE 2.1. Incluziunile glucidice sunt reprezentate de glicogen în celula animală şi de amidon în celula vegetală. Glicogenul împreună cu lipidele reprezintă principalele rezerve metabolice depozitate în matricea citoplasmatică, prezenţa lor putând fi sesizată atât în condiţii normale cât şi patologice. Fiziologic, depozitele de glicogen sunt mai bine reprezentate în citoplasma hepatocitelor şi celulelor musculare, dar apar şi în celulele epidermice embrionare şi în trombocite. În microscopie optică, incluziunile de glicogen se pun în evidenţă prin metoda PAS (periodic acid Schiff) sau carmin Best, apărând sub forma unor granule sau “plaje” de culoare roşie-purpurie. Aceste metode permit aprecierea cantitativă a incluziunilor de glicogen. În microscopia electronică, apar sub forma de granule electronodense cu un diametru de 20-30 nm, numite „particule beta”, sau sub forma de particule mari, neregulate cu un diametru de 150 nm, „particule alfa”. Patologic, au fost evidenţiate depozite în celulele canceroase şi în boli genetice cauzate de absenţa enzimelor glicogenolitice, boli care poartă denumirea de glicogenoze. Malsinteza sau absenţa sintezei acestor enzime conduce la imposibilitatea degradării glicogenului, ceea ce face ca acesta să se acumuleze intracitoplasmatic până la alterarea majoră a funcţiilor citoplasmatice şi moartea celulei. Maladia face parte dintr-un grup larg de boli genetice numit „tezaurismoze lizozomale” şi este letală (vezi cap. Lizozomi). 2.2. Incluziunile lipidice. În citosol, incluziunile lipidice se prezintă sub formă de picături cu mărimi de 0,2μ – 0,5μ, dar pot atinge 80μ în adipocitele albe. În microscopia optică, coloraţiile utilizate pentru vizualizarea şi determinarea lor cantitativă sunt Sudan III şi Sudan IV; în aceste coloraţii, incluziunile lipidice apar colorate în galben până la portocaliu. După modul de formare şi depozitare, incluziunile lipidice pot fi: a) depozite fiziologice tranzitorii prezente în: - hepatocite: apar postprandial, depind de cantitatea de grăsimi ingerată şi sunt de scurtă durată fiind rapid metabolizate; - celulele secretorii ale glandei mamare în timpul lactaţiei. b) depozite fiziologice permanente prezente în: - adipocitele albe localizate în hipoderm sau în jurul organelor mari. Mărimea incluziunilor este variabilă putând ajunge la 80μ, dimensiunile

fiind în funcţie de echilibrul lipogeneză-lipoliză. Depozitele au rol termoizolator, energetic şi protector contra şocurilor mecanice. - adipocitele brune se găsesc în ţesutul celular subcutanat, mai bine reprezentate numeric la nou-născut, numărul lor scade cu înaintarea în vârstă fiind localizate la bătrâni doar în regiunea interscapulară. Sunt prezente în număr mare la animalele care hibernează având rol energetic şi în termogeneză. - în celulele secretoare de hormoni steroizi (corticosuprarenala şi gonadele) incluziunile lipidice conţin mari cantităţi de esteri ai colesterolului. c) depozite patologice permanente: - apar în hepatocite, în cadrul bolilor genetice caracterizate de alterarea metabolismului lipidic (lipidoze); malsinteza enzimelor implicate în degradarea lipidelor conduce la acumularea progresivă a acestora, urmată de alterarea funcţiilor citoplasmatice. - în boli dobândite cum este alcoolismul cronic are loc o alterare a metabolismului lipidic care conduce la “încărcarea grasă” a celulelor hepatice. 2.3. Incluziunile proteice sunt prezente în celulele secretorii ale glandelor endocrine şi exocrine în momentele de activitate maximă. Timpul de depozitare este relativ scurt, 1-4 ore, apoi sunt exocitate. 2.4. Incluziunile pigmentare Intracelular se observă adesea depozite de pigmenţi. Aceştia pot fi sintetizaţi intracelular (melanina), sau pot proveni din aport extern (vitamina C). Melanina, pigmentul melanic negru este sintetizat de melanocite fiind abundent în epiderm şi în celulele pigmentare ale retinei. Apare sub formă de granule intracelulare dense, acolate la membrana plasmatică. Sinteza melaninei este determinată pe cale umorală: este activată de MSH (melanocito-stimulator-hormon) şi inhibată de melatonină. Un alt factor cu efect stimulant asupra melanogenezei este radiaţia solară. Lipofuscina sau pigmentul brun de uzură se acumulează în celulă o dată cu îmbătrânirea acesteia. Granulele de lipofuscină derivă din lizozomii secundari şi reprezintă depozite de substanţe nedigerate (corpi reziduali). Lipofuscina este prezentă în celulele care nu se divid: neuroni, celule musculare. 2.5. Incluziunile de cristale şi cristaloizi sunt prezente în eozinofile şi celulele Leydig. 2.6. Incluziunile de natură virală sunt determinate de prezenţa intracelulară a unor virusuri şi reprezintă semne patognomonice în diagnosticul bolilor produse de virusurile respective. În microscopie optică, incluziunile prezintă diferite forme şi mărimi, fiind înconjurate de un halou luminos. În microscopie electronică apar aglomerări de virioni. După localizare, aceste incluziuni pot fi intranucleare şi

intracitoplasmatice. a) Incluziunile nucleare apar în nucleul celulelor în care se replică obişnuit virusurile cu ADN, de exemplu în meningoencefalita virală apar incluziunile de tip Joest – Dogen în celulele nervoase. b) Incluziunile citoplasmaticice apar în citoplasma celulelor în care se multiplică virusurile cu ARN, de exemplu în variolă apar incluziuni acidofile de formă rotund-ovalară, fuziforme sau triunghiulare, cu un diametru de 1-10μ localizate în citoplasma celulelor epiteliale; în turbare apar incluziuni oxifile în celulele piramidale din bulbul olfactiv, cornul lui Amon, celulele Betz din creier şi Purkinje din cerebel. 3. ORGANITELE INTRACITOPLASMATICE Celula eucariotă beneficiază de o organizare internă complexă şi de o heterogenitate optimă a componentelor structurale. Această heterogenitate asigură fiecărui tip celular funcţionarea la parametri ceruţi de “comunitatea celulară”. Heterogenitatea structurală a celulei eucariote este realizată de organitele intracitoplasmatice. Deşi marea majoritate a acestora se găsesc în toate tipurile celulare (organite nespecifice), numărul, localizarea intracelulară şi activitatea lor metabolică variază de la un tip celular la altul şi chiar cu vârsta celulei. Astfel, aparatul de sinteză şi secreţie celulară reprezentat de ribozomi, reticulul endoplasmic, aparatul Golgi este mai bine dezvoltat în celulele secretorii, lizozomii sunt mai numeroşi în celulele fagocitare, iar peroxizomii sunt mai bine reprezentaţi numeric în celulele organelor care asigură detoxifierea organismului. Deşi se găsesc în toate celulele cu excepţia celor înalt specializate, mitocondriile sunt mai numeroase în celulele tinere, cu nevoi energetice mai mari decât celulele îmbătrânite.

3.1. MOTILITATEA CELULARĂ Mişcările celulare sunt asigurate de proteinele care participă la formarea citoscheletului celular. Acestea realizează două grupe de mişcări: mişcări intracitoplasmatice şi mişcări de suprafaţă. Mişcările intracelulare sunt reprezentate de: • curenţii citoplasmatici formaţi în timpul stării de sol şi care antrenează organitele într-un „dans” circular în jurul nucleului, • mişcări determinate de polimerizarea şi depolimerizarea microtubulilor care au rolul de a fixa organitele intracitoplasmatice şi de a le modifica poziţia în funcţie de nevoile metabolice de moment.

Mişcările de suprafaţă pot fi clasificate după cum urmează: • mişcările ameboidale care realizează deplasarea celulei, • emiterea de pseudopode care participă la procesul de fagocitoză, • emiterea de filopodie şi lamelipodie cu scopul ataşării celulei la un substrat, • mişcările ciliare şi flagelare. 3.1.1. ELEMENTELE CITOSCHELETULUI CELULAR Rolurile generale ale citoscheletului celular - coordonarea traficului intracelular al moleculelor - formarea curenţilor intracitoplasmatici - coordonarea activităţilor enzimatice - realizarea diviziunii - participarea la mecanismele de fagocitoză şi pinocitoză - unirea componentelor celulare într-o unitate de structură şi funcţie. 3.1.1.1. Microfilamentele de actină Actina este prima structură proteică izolată şi descrisă din muşchiul scheletal. Mult timp s-a crezut că actina ar fi o proteină care apare exclusiv în ţesutul muscular, dar ulterior s-a observat că actina este o componentă a tuturor celulelor, reprezentând 5% până la 30% din totalul proteinelor celulelor nemusculare. În celulele umane şi animale au fost descrise 6 izoforme diferite de actină: tipul α scheletal în muşchii scheletici, tipul α cardiac în muşchiul cardiac, tipul α vascular în musculatura netedă a vaselor sangvine, tipul δ enteric în musculatura netedă a viscerelor, tipul β citoplasmatic şi δ citoplasmatic care se găsesc preponderent în celulele nemusculare. Diferenţele dintre aceste izoforme constau în grupările NH2 terminale ale secvenţelor de aminoacizi, având rol în rata polimerizării monomerilor de actină din aceste tipuri variate de izoforme. Intracelular, actina se găseşte sub două forme: a) forma monomerică numită actina G este un polipeptid cu o greutate moleculară de 43 Kda, de formă globulară, cu diametru de 5,5 nm. Fiecare moleculă de actină G prezintă locusuri pentru cuplarea ionului de Ca 2+ care stabilizează conformaţia globulară, pentru ataşarea miozinei, a unei molecule de ATP şi a proteinelor asociate (fig. VII.2).

Fig. VII.2. Polimerizarea monomerului de actină G cu formarea actinei F (după Berkaloff)

b) forma polimerizată numită actina F datorită formei filamentoase. Polimerizarea este energodependentă se desfăşoară în următoarele faze: 1. faza de "lag", în care 3 monomeri de actină G formează un trimer ce reprezintă "punctul de nucleere"; 2. faza de polimerizare în timpul căreia monomerii de actină G se ataşează în mod preferenţial la capătul (+) al filamentului de actină. Altfel spus, polimerizarea continuă în cea de-a doua fază, cu o viteză mai mare la capătul (+) şi cu o viteză mai mică la celălalt capăt (-) . 3. faza de echilibru este denumită astfel, deoarece rata de adiţie a monomerilor de actină G la capătul (+) al microfilamentului, este egală cu rata de desfacere a monomerilor de la capătul (-) al microfilamentului (fig.VII.3). Pentru a polimeriza în actina F, fiecare monomer de actină G trebuie să lege o moleculă de ATP. Dacă se adaugă ATP şi Mg2+ în concentraţii ridicate, actina G polimerizează spontan în actina F. Deci, microfilamentul de actină are o polaritate, şi anume prezintă un capăt (+) unde polimerizarea are loc de 5-10 ori mai repede faţă de capătul (-), unde polimerizarea are o viteză mai mică. Pentru fiecare capăt de microfilament corespunde o concentraţie critică pentru asamblarea monomerilor în microfilamente: 1μM pentru adiţia la capătul (+) şi 8μM pentru adiţia la capătul (). Mecanismul polimerizării este condiţionat de legarea unei molecule de ATP, pentru fiecare monomer nou adiţionat ATP-ul fiind hidrolizat la ADP cu eliberare de fosfat anorganic. Filamentele de actină se află în echilibru cu monomerii de actină din citosol şi acest echilibru între polimerizarea şi depolimerizarea actinei joacă un rol esenţial în mişcările celulare bazate pe actină - miozină. Polimerizarea actinei este însoţită de creşterea vâscozităţii citoplasmei, în timp ce depolimerizarea se asociază cu scăderea vâscozităţii citoplasmei. Astfel, aceste procese de polimerizare - depolimerizare a actinei, joacă rolul principal în tranziţiile din starea de gel în starea de sol a citoplasmei. Modul de formare al microfilamentelor este influenţat de o serie de proteine asociate: - profilina, timozina -împiedică polimerizarea actinei G, - gelsolina -determină fragmentarea microfilamentelor, - filamina- favorizează organizarea microfilamentelor în reţea tridimensională, prin legarea nodurilor reţelei,

- fimbrina, α-actinina, vilina- leagă microfilamentele în mănunchiuri.

Fig.VII.3. Fazele polimerizării actinei F

Polimerizarea microfilamentelor de actină este influenţată de o serie de droguri. Astfel, polimerizarea este înhibată de citochalazine (o familie de metaboliţi secretaţi de diferite mucegaiuri), care înhibă mişcările celulare ce au la bază mecanismul actină-miozină, pe când faloidina (alcaloid toxic produs de ciuperca Amanita phalloides), inhibă depolimerizarea şi stabilizează microfilamentele de actină. Aşa cum am menţionat mai sus, microfilamentele de actină se găsesc în toate celulele eucariote, organizarea lor fiind diferită de la un tip celular la altul. În celulele nemusculare fiecare microfilament de actină F este alcătuit din 2 lanţuri de monomeri G, înşiraţi ca "perlele într-un şirag" răsucite helicoidal, fiecare rotaţie completă având loc la o distanţă de 37 nm, respectiv la 14 monomeri. Diametrul actinei F devine astfel de 7 nm (fig.VII.4).

Fig.VII.4. Strucura microfilamentului de actină F . Actina F este un filament helicoidal format prin polimerizarea monomerilor de actină G

În celulele nemusculare, microfilamentele de actină se pot găsi izolate, dar cel mai adesea apar sub formă de mănunchiuri dispuse la periferia citoplasmei, imediat sub plasmalemă; astfel ele formează : - fibrele de stress în cazul celulelor în cultură, - inelul contractil care se formează în faza finală a diviziunii celulare şi finalizează citodiereza (separarea celulelor fiice), - inelul necontractil din structura zonulei adherens, localizată pe domeniile laterale ale celulelelor absorbante, - mănunchiurile de filamente de actină din organizarea moleculară a microvililor de la polul apical al enterocitelor şi nefrocitelor, precum şi din stereocilii din urechea internă. În celulele nemusculare microfilamentele de actină îndeplinesc următoarele roluri: -rol structural sau de susţinere, formând suportul prelungirilor amintite; -rol dinamic, în mişcările celulare care au la bază mecanismul molecular actinămiozină. Acest lucru demonstrează că în cazul mănunchiurilor de microfilamente, în celulele nemusculare, miozina este totdeauna asociată microfialmentelor de actină. În celulele musculare, actina F este asociată cu proteine reglatoare formând împreună filamentele subţiri. Aceste proteine reglatoare sunt tropomiozina şi troponina. Tropomiozina este o proteină fibrilară (~ 41 nm lungime), cu o greutate moleculară de 64 Kd şi este denumită astfel datorită structurii similare cu miozina. Este alcătuită dintr-un dimer cu două subunităţi helicoidale identice şi este localizată în şanţul dublului helix al actinei F, conferind stabilitate şi o structură compactă acesteia. Troponina este un complex de 3 polipeptide: troponina T, troponina I şi troponina C, complex cu o greutate moleculară de 80 Kd. Denumirile acestor polipeptide sugerează funcţia realizată în cadrul compexului: - Troponina T (GM de 37-40 Kd) se ataşează de tropomiozină şi ancorează şi compexul troponinei. - Troponina I (GM de 22-24 Kd) se ataşează de actină şi de troponina C şi inhibă contracţia actină-miozină. - Troponina C (GM de 17-18 Kd) este o proteină mică cu rol în legarea ionilor de Ca2+ . Complexul de polipeptide troponină este alungit, subunităţile I şi C formând regiunea globulară, iar polipeptidul T reprezintă formaţiunea sub formă de coadă (fig.VII.5).

Fig.VII.5. Polimerizarea monomerilor de actină şi aranjamentul microfilamentelor de actină în sarcomer. Participarea proteinelor reglatoare la această structură (după Goodman)

Aceste filamente de actină se găsesc numai în muşchii scheletici şi în muşchiul cardiac; în miofibrilele, filamentele de actină sunt aranjate ordonat, dispuse paralel cu filamentele groase de miozină împreună cu care participă la realizarea contracţiei musculare. 3.1.1.2. Microfilamentele de miozină Miozina a fost descrisă pentru prima dată în celulele musculare, dar astăzi se ştie că această proteină este o componentă constantă a tuturor tipurilor celulare. Microfilamentele de miozină au un diametru de aproximativ 7nm şi se formează prin polimerizarea unei proteine structurale şi contractile, miozina. În citosol, miozina se găseşte sub formă monomerică şi polimerizată. Molecula de miozină are o greutate moleculară de aproximativ 460kd. Este alcătuită din două lanţuri grele de polipeptide cu o greutate moleculară de 200kd fiecare şi din două

perechi de lanţuri uşoare de polipeptide, o pereche având o greutate moleculară de 20 kd, iar cealaltă pereche cu greutatea moleculară de 18kd. Lanţul greu de miozină are două porţiuni distincte: o porţiune alungită α-helicoidală şi un cap globular. Porţiunile alungite ale lanţurilor grele sunt răsucite în spirală una în jurul celeilalte, iar capetele globulare rămân libere. Lanţurile uşoare sunt asociate cu capetele globulare. În ansamblu, molecula de miozină are o coadă cu o lungime de 134nm şi un cap bilobat de circa 20nm (fig.VII.6).

Fig.VII.6. Structura moleculei de miozina

Fig.VII.7. Digestia moleculei de miozină a) tripsina clivează molecula de miozină în HMM şi LMM b) papaina clivează molecula de miozină în HMM-S2 şi HMM-S1

Sub acţiunea proteazelor, molecula de miozină este fragmentată, ceea ce permite studiul organizării diferitelor lanţuri polipeptidice (fig.VII.7): - tripsina scindează miozina în două fragmente inegale: meromiozina uşoară ("light meromyosin" LMM) care reprezintă coada miozinei şi meromiozina grea ("heavy meromyosin" HMM). - sub acţiunea papainei această ultimă porţiune poate fi subdivizată în subunitatea globulară S1 şi fragmentul helicoidal S2 care leagă S1 de LMM. Cea mai importantă parte a moleculei de miozină o constituie HMM-S1 deoarece conţine locusurile de legare pentru ATP-ază şi actină. Polimerizarea moleculelor de miozină este energodependentă şi determină formarea microfilamentelor de miozină. Această polimerizare se produce prin agregarea cozilor moleculelor de miozină, în timp ce capetele globulare (SF1) rămân la exterior. Astfel filamentul de miozină are o structură bipolară, cu o zonă "nudă" la mijloc (acolo unde se unesc cozile miozinelor) şi cu două zone la extremităţi, mai groase, în care proemină de jur împrejurul filamentului capetele globulare ale miozinelor.

În celulele nemusculare, microfilamentele de miozină formează agregate subţiri, obţinute prin polimerizarea a 10 -20 molecule de miozină şi poartă numele de miozină I. Aceste microfilamente au un caracter labil, fiind greu de observat în microscopie şi sunt asociate cu microfilamentele de actină; intervin în mişcările care au la bază mecanismul contracţiei actină-miozină.

Fig.VII.8. Formarea filamentelor groase de miozină

În celulele musculare, miozina reprezintă mai mult de jumătate din totalul proteinelor constituente. În aceste celule, filamentele groase de 15nm se formează prin polimerizarea a aproximativ 300-400 molecule de miozină (fig.VII.8). În miofibrile, filamentele groase se găsesc dispuse paralel cu microfilamentele subţiri de actină. Fiecare filament de miozină este înconjurat de 6 microfilamente de actină, motiv pentru care, pe secţiune transversală se prezintă sub forma unei reţele hexagonale. La organizarea spaţială a sarcomerului participă şi o serie de proteine asociate (fig.VII.9): - titina este o proteină cu elasticitate crescută, care ataşează filamentul de miozină la discul Z, - nebulina este o proteină fibrilară dispusă, ca şi tropomiozina, în şanţul helixului de actină, - tropomodulina protejează extremitatea (-) a filamentului de actină, - cap Z ancorează extremitatea (+) a filamentului de actină la discul Z. Rolul filamentelor groase este de a produce contracţia musculară prin interacţiune cu filamentele subţiri. Contracţia se realizează prin glisarea microfilamentelor de

actină între cele de miozină şi nu prin scurtarea lor (fig.VII.10).

Fig.VII.9. Organizarea proteinelor accesorii în sarcomer (după Alberts, 2002)

Fig.VII.10. Modelul glisării filamentelor în timpul contracţiei musculare (după Alberts, 2002)

Glisarea miofilamentelor în timpul contracţiei este determinată de interacţiunile ciclice stabilite între moleculele de miozină şi cele de actină (fig.VII.11). Etapele ciclului de contracţie/relaxare 1. ataşarea capetelor de miozină la actină 2. hidroliza ATP legat la capul de miozină provoacă pivotarea acestuia, ceea ce determină deplasarea filamentului de actină 3. detaşarea capului de miozină necesită fixarea unei alte molecule de ATP ; în absenţa ATP capul miozinei rămâne ataşat la actină. Acest lucru se petrece în momentul morţii şi explică instalarea rigidităţii cadaverice.

Fig.VII.11. Etapele succesive realizate în ciclul contracţie/relaxare (după Berkalof)

3.1.1.3. Filamentele intermediare Filamentele intermediare poartă această denumire deoarece diametrul lor de aproximativ 10 nm este intermediar diametrului microfilamentelor de actină (7nm) şi diametrul microtubulilor (25nm). Proteinele care alcătuiesc filamentele intermediare sunt molecule fibrilare. Polimerizarea lor are loc prin alăturarea şi împletirea lor ca într-o frânghie, astfel că filamentele intermediare o dată asamblate nu se mai depolimerizează. Datorită acestui lucru, filamentele intermediare au o structură foarte rezistentă care poate fi întărită la nevoie prin legături covalente între subunităţile proteice. Proteinele care intră în alcătuirea filamentelor intermediare sunt foarte diferite, variaţie ce depinde de tipul celulei în care se găsesc şi de specie. De asemenea, în structura unui tip de filament intermediar intră mai multe polipeptide diferite, cu greutate moleculară care variază în limite foarte largi. De exemplu neurofilamentele din axonii mamiferelor sunt formate din 3 polipeptide cu GM de 70 Kd, 140 Kd şi 210 Kd, pe când în cazul axonului de sepie, neurofilamentele conţin 2 polipeptide de 60 şi 200 Kd. În ciuda heterogenităţii, filamentele intermediare au o organizare structurală comună (de Robertis), conţinând un domeniu central α helix de aproximativ 310 aminoacizi, cu aspect de baghetă, flancat de domenii amino şi carboxil terminale. Domeniul central are rol în asamblarea filamentului, în timp ce domeniile terminale, care sunt variabile

de la o proteină la alta, determină funcţiile specifice ale filamentelor intermediare (fig.VII.12).

Fig.VII.12 Asamblarea filamentelor intermediare (după Goodman)

Mecanismele de asamblare şi dezasamblare ale filamentelor intermediare sunt mai puţin cunoscute decât cele ale filamentelor de actină şi miozină, dar este clar că ele reprezintă structuri foarte dinamice. Filamentele intermediare nu prezintă polaritate, sunt insolubile în soluţii fiziologice, dar se dizolvă la variaţii mari de pH. După dezasamblare pot fi reconstituite formând filamentele intermediare iniţiale. Se intuieşte că dezasamblarea are loc printr-un mecanism proteolitic Ca++-dependent (de Robertis). Filamentele intermediare sunt formate din subunităţi proteice care aparţin unei clase multigene exprimată diferit în variate tipuri celulare. Au fost puse în evidenţă 4 tipuri de filamente intermediare (tabel VII.1). 1. Tipul epitelial cuprinde filamentele de keratină, numite şi tonofilamente, sau citokeratine. Reprezintă cea mai complexă clasă de filamente intermediare şi cuprind keratinele de tip I (acide) şi keratinele de tip II (alcaline). La om au fost descrise aproximativ 20 de tipuri, cu localizare în diferite tipuri de celule epiteliale şi 10 tipuri localizate în păr şi unghii. Aceste filamente se prezintă sub formă de reţea neregulată, fiind ancorate în desmozomi şi hemidesmozomi. Au rol structural şi asigură rezistenţa mecanică a celulelor epiteliale şi derivaţilor lor (piele, păr, unghii). Filamentele de keratină se acumulează în celulele epiteliale

mature din piele, unde sunt legate prin punţi disulfurice pe măsură ce aceste celule îmbătrânesc. Chiar după moartea celulelor continuă să formeze un strat protector cum ar fi stratul cornos al epidermului, părul sau unghiile. Implicaţii medicale • mutaţiile genelor răspunzătoare de sinteza keratinelor determină la om boala numită epidermoliză buloasă simplă. Boala se datorează desprinderii celulelor bazale ale epidermului ca urmare a unor traumatisme minore şi se manifestă prin formarea de vezicule mari la nivelul pielii. • alte maladii buloase din patologia bucală, esofagiană şi corneeană se datorează malsintezei keratinelor care se exprimă în mod normal la nivelul acestor celule epiteliale. • evidenţierea filamentelor de keratină este utilă în diagnosticul cancerelor epiteliale (epitelioame) deoarece dau o indicaţie asupra ţesutului de origine al cancerului şi pot astfel să ghideze opţiunea terapeutică. Tipul Nucleare

Proteine componente

Localizare celulară

Lamina A,B şi C

Tip vimentină

Vimentina Desmina Proteine acide ale fibrelor gliale

- pe faţa internă a învelişului nuclear - celule mezenchimale - celule musculare - celule gliale (astrocite şi celule Schwann) - o parte din neuroni - celule epiteliale şi derivaţii lor (piele, păr, unghii) - neuroni

Epitelial

Axonal

Periferina Keratine de tip I (acide) Keratine de tip II (alcaline) Neurofilamente proteice (NF-L, NF-M, NF-H)

Tabel VII.1. Principalele tipuri de proteine din alcătuirea filamentelor intermediare

2. Tipul axonal cuprinde neurofilamentele, caracteristice neuronului, fiind cele mai importante structuri de la nivelul axonului, dendritelor şi regiunilor perinucleare. Sunt formate din 3 polipeptide cu GM cuprinsă între 68 şi 200 Kd, numite NF-L, NF-M şi NF-H. Nivelul lor de expresie (cantitatea în care se sintetizează) este responsabil de diametrul axonului care, la rândul său, este responsabil de rapiditatea deplasării semnalului. Implicaţii medicale

• anomalii ale acumulării şi asamblării neurofilamentelor în corpul celular al neuronilor motori şi în axoni determină scleroza laterală amiotrofică (SLA). Acumularea anormală a neurofilamentelor împiedică propagarea normală în lungul axonului; are loc o degenerescenţă axonală care conduce la atonie musculară urmată de atrofie, în general fatală. 3. Tipul vimentină. În această categorie sunt incluse filamentele care prezintă aceeaşi morfologie, dar conţin proteine diferite cum ar fi: vimentina, desmina, şi sinemina. a)Filamentele de desmină intră în structura muşchilor netezi, scheletici şi cardiac. În cazul celulelor musculare striate, filamentele străbat întreaga miofibră şi leagă discurile Z între ele şi de membrana plasmatică. Se apreciază că filamentele de desmină au rol strucural prin susţinerea discurilor Z şi miofibrilelor. b)Filamentele de vimentină se găsesc în celule de origine diferită. Prin imunofluorescenţă s-a observat că aceste filamente au o dispoziţie ondulantă, ceea ce le explică şi numele (lat. "vimentus" = "ondulat"). Vimentina are o GM de 52 Kd. Filamentele de vimentină sunt insolubile şi tind să se lege de membrana nucleară şi de centrioli. Aceste tipuri de filamente intermediare sunt rezistente la colchicină şi citochalazina B, substanţe care depolimerizează microtubulii şi filamentele de actină. c) Sinemina este o proteină de 230 Kd care intră în componenţa filamentelor intermediare ale celulelelor musculare, asociată cu desmina şi vimentina. d) Proteinele acide ale filamentelor gliale sunt caracteristice citoplasmei astrocitelor şi sunt alcătuite dintr-o proteină cu GM de 51 Kd. Se găsesc doar în astrocite şi sunt absente în oligodendrocitele din creier. 4. Tipul nuclear este reprezentat de lamina nucleară, formată dintr-o reţea de subunităţi proteice numite laminele nucleare. Reţeaua proteică pe care o alcătuiesc este intim legată de foiţa internă a membranei nucleare şi are rolul de a menţine forma şi stabilitatea anvelopei nucleare. Se pare că are un rol important în reorganizarea membranei nucleare în timpul telofazei. Evidenţierea filamentelor intermediare permite diagnosticul tumorilor maligne la om. Astfel, carcinoamele conţin filamente de keratină, pe când sarcoamele conţin filamente de desmină, glioamele conţin filamente gliale, iar neuroblastoamele au neurofilamente. Chiar şi în metastaze se păstrază tipul de filamente intermediare caracteristice ţesutului de origine, ceea ce are mare importanţă diagnostică. Identificarea tipului de filament intermediar se face prin anticorpi monoclonali marcaţi fluorescent sau cuplaţi cu o enzimă capabilă de a da reacţie de culoare.

3.1.1.4. Microtubulii Pe lângă microfilamentele de actină şi de miozină, microtubulii reprezintă cel de-al 3-lea tip de filament ce aparţine citoscheletului, fiind un component obligatoriu al acestuia. Organizare moleculară Microtubulul se formează prin polimerizarea proteinei numită tubulină. Tubulina este un heterodimer alcătuit din subunitatea α şi subunitatea β care sunt neidentice (datorită secvenţelor diferite de aminoacizi) şi care au o GM de 50 Kd fiecare. În cursul asamblării microtubulilor, dimerii de tubuline polimerizează şi formează protofilamente cu un diametru de 5 nm. Polimerizarea subunităţilor α şi β se face în lungul protofilamentului, ceea ce conferă polaritate microtubulului. Din 13 asemenea protofilamente se formează peretele unui microtubul, care în microscopie electronică are aspectul unui cilindru aparent gol pe dinăuntru, cu un diametrul extern de 25 nm şi lungimea de câţiva microni (fig.VII.13).

Fig. VII.13. Structura microtubulului şi a subunităţilor sale (A) subunităţile α şi β ale dimerului; (B) protofilamentul; (C) microtubul format din 13 protofilamente; (D) imagine de microscopie electronică a unui microtubul în secţiune transversală şi longitudinală

Polimerizarea şi depolimerizarea microtubulilor În citosol, se află un echilibru între microtubuli şi tubuline. Similar cu microfilamentele de actină, microtubulii în creştere prezintă o polaritate structurală inerentă. Această polaritate apare datorită orientării subunităţilor de tubulină în polimerul de microtubul, subunităţile se adaugă cu o viteză mai mare la un capăt al microtubulului denumit capătul (+), faţă de celalaltă extremitate denumită capătul (). Capătul (-) se află în legătură cu centrozomul (centrul organizator al microtubulilor), astfel că doar evenimentele care se petrec la capătul (+) sunt luate în considerare. Polimerizarea microtubulilor este acompaniată de hidroliza guanozin trifosfat (GTP) la guanozin difosfat (GDP). Opiniile curente referitoare la dinamica microtubulilor se concentrează asupra modului de legare a GTP-ului de subunitatea de tubulină şi hidroliza consecutivă a GTP-ului legat la GDP. Astfel, pentru ca un monomer de tubulină să se adauge unui microtubul, tubulina trebuie să lege GTPul. Complexul GTP-tubulină poate apoi să se lege de capătul în creştere a microtubulului şi uneori după legare de microtubul, GTP-ul va fi hidrolizat la GDP. Acest lucru face ca microtubulul în formare să aibă un capăt fie tubulină - GTP, fie tubulină- GDP. Atâta timp cât microtubulul continuă să crească rapid, subunităţile de tubulină se vor adăuga mai repede decât se poate realiza hidroliza GTP-ului, în consecinţă capătul cu GTP din moleculă va rămâne intact. Acest lucru este important

deoarece subunităţile de tubulină se leagă cu eficienţă mult mai mare de microtubulul ce conţine GTP faţă de microtubulul ce conţine GDP. Dar, dacă viteza de asamblare a microtubulului scade, va avea loc hidroliza GTP-ului, hidroliză ce va ajunge din urmă polimerizarea. Microtubulii care conţin GDP sunt instabili şi tind să elibereze subunitatea GDP-tubulină din porţiunea terminală, ceea ce conduce la scurtarea microtubulului. Adăugarea de GTP- tubulină la microtubulii cu porţiunea terminală GDP nu mai este atât de eficientă, o dată ce microtubulul a început să se disocieze. Această formare şi distrugere catastrofică a microtubulilor este denumită instabilitate dinamică. Această proprietate oferă explicaţia pentru modul în care celula e capabilă să-şi reorganizeze citoscheletul microtrabecular atât de rapid (Goodman). Polimerizarea tubulinei este un proces de autoasamblare care se petrece spontan la temperatura de 370 C, în timp ce la 5 0C are loc dezasamblarea. Pentru polimerizare sunt necesari şi cationi bivalenţi (Ca2+, Mg2+) în concentraţie micromoleculară. S-a constatat că în structura microtubulilor, pe lângă tubuline mai intră şi alte proteine denumite MAPs (microtubular associated proteins) proteine asociate microtubulilor. Aceste proteine au o greutate moleculară cuprinsă între 55-300 Kd. O proteină este caracterizată ca fiind MAPs dacă se leagă şi se copurifică cu microtubulii în timpul izolării din omogenatul celular. Există tipuri diferite de MAPs pentru diferite tipuri celulare. Experimental s-a demonstrat că aceste proteine se leagă de monomerii de tubulină şi determină polimerizarea acestora, fiind implicate în formarea de legături strânse între microtubuli (fig.VII.13). Cele mai importante MAPs sunt proteinele tau. Din această categorie fac parte 4 clase de proteine cu greutăţi moleculare mici, rolul acestora fiind în sensul accelerării polimerizării microtubulilor.

Fig.VII.14. Proteinele MAP şi tau (A şi B) modul de ataşare la microtubuli; (C) secţiune transversală printr-un fascicul de microtubuli dintr-o celulă care supraexprimă MAP; (D) secţiune transversală printr-un fascicul de microtubuli dintr-o celulă care supraexprimă tau

Polimerizarea tubulinei este influenţată de medicamente. Colchicina, un alcaloid, blochează polimerizarea tubulinei prin legarea unei molecule de colchicină de un dimer α şi β tubulina. Alte medicamente: vinblastin şi vincristin sunt folosite ca citostatice, deoarece au capacitatea de a destabiliza fusul de diviziune, oprind ciclul celular al celulelor cu ritm mitotic accelerat (celule maligne). Răspândire Microtubulii se pot găsi liberi în citoplasmă sau formează ansambluri de microtubuli în unele structuri celulare cum ar fi: axonemele cililor şi flagelilor, corpusculul bazal al cililor, centriolii, fibrele fusului de diviziune. Microtubulii din citoplasmă sunt structuri labile, cu o capacitate rapidă de asamblare şi dezasamblare. Această caracteristică este importantă pentru funcţiile celulare; de exemplu microtubulii din citoplasmă trebuie să se dezasambleze rapid când celula intră în diviziune. În acelaşi fel, microtubulii dezasamblaţi trebuie să se reformeze pentru a forma fusul de diviziune. La rândul lui fusul de diviziune se dezasamblează, ceea ce este esenţial pentru separarea cromozomilor. De asemenea, în acelaşi timp, mulţi microtubuli cresc rapid, în timp ce alţii se dezasamblează. În realitate, media de viaţă a microtubulilor este de 10 minute. Datorită instabilităţii dinamice, microtubulii conferă citoplasmei o imagine de continuă schimbare. Celula posedă însă şi mecanisme de stabilizare a microtubulilor din citoplasmă. Unul din

acestea este captarea capătului (+) al microtubulului. Acest lucru se petrece când celula intră în mitoză, iar unii microtubuli sunt captaţi la capătul (+) de proteinele din cinetocor. Funcţiile microtubulilor 1. Funcţie mecanică de menţinere a formei celulare. Se consideră că microtubulii formează o reţea care modelează celula şi-i redistribuie componentele. Acest lucru este evident în axonii şi dendritele neuronilor. Experienţele au demonstrat că distrugerea microtubulilor în celulele musculare conduce la pierderea formei de coloană şi adoptarea unei forme ovalare (fig.VII.15).

Fig.VII.15. Rolul microtubulilor în menţinerea formei celulare (după Berkaloff)

2. Morfogeneză. Structura şi funcţia de susţinere a microtubulilor permite modificarea formei celulei în cursul diferenţierii celulare; de exemplu, creşterea prelungirilor în cursul diferenţierii neuronului. 3. Fixează organitele şi le modifică poziţiei în citoplasmă. 4. Rol de organizator al citoscheletului prin faptul că ei determină distribuţia filamentelor intermediare şi a filamentelor de actină. De exemplu, inelul contractil de actină care desparte cele 2 celule la sfârşitul diviziunii celulare apare totdeauna între cei 2 centrii celulari. Dacă fusul de diviziune este deplasat mecanic într-o jumătate a celulei în diviziune, atunci şi inelul contractil se formează tot în acea jumătate (Alberts 1989). 5. Rol în mişcarea celulară. Asigură toate mişcările celulare care au la bază sistemul molecular mecanocontractil tubulină-dineină (mişcarea cililor, flagelilor, mişcări din timpul diviziunii celulare, curenţii citoplasmatici).

3.1.2. MIŞCĂRI CELULARE CARE AU LA BAZĂ SISTEMUL MECANOCONTRACTIL ACTINĂ- MIOZINĂ Mişcarea este o caracteristică a materiei vii, mişcarea sau motilitatea celulară fiind o proprietate de bază a celulei. Doar atunci când se produce moartea celulei dispar mişcările biologice rămânând doar mişcarea browniană, care este un fenomen fizic. Mişcările celulare sunt foarte variate. În funcţie de modificarea raporturilor celulare faţă de mediu, putem distinge trei categorii de motilitate celulară (tabel VII.II.

Categorii de mişcări celulare 1. Mişcările din timpul contracţiei musculare 2. Mişcări ce modifică raporturile dintre celulă şi mediul extern a) mişcarea de locomoţie ameboidală b) mişcarea de locomoţie cu ajutorul flagelilor c) mişcarea cililor 3. Mişcări ce nu modifică poziţiile reciproce ale celulei şi ale mediului extern (mişcări intracelulare) a) mişcările din cursul diviziunii celulare b) mişcările din microvili c) curenţii citoplasmatici

Sistemul molecular motil de bază Actină-miozină Actină-miozină Microtubul-dineină Microtubul-dineină

Microtubul-dineină Actină-miozină Actină-miozină Microtubul-dineină

Tabel VII.II. Categoriile de motilitate celulară şi sistemul motil de bază (după Benga, 1985)

În esenţă, modificările de formă şi mişcările celulare se datoresc acţiunii la nivel molecular a două sisteme motile de bază: sistemul actină-miozină şi sistemul microtubul-dineină. Se consideră că există două tipuri clasice de motilitate celulară în care sunt implicate microfilamentele şi interacţiunile dintre actină şi miozină. Una dintre acestea este denumită cicloza sau curenţii citoplasmatici - vizibilă în special în celulele vegetale, iar celălalt tip de motilitate este mişcarea ameboidală-observată la nivelul protozoarelor şi în celulele animale. 3.1.2.1. Cicloza sau curenţii citoplasmatici Acest tip de motilitate celulară se observă cu uşurinţă în celulele vegetale, la nivelul cărora citoplasma este redusă cantitativ, situată imediat sub peretele celular. Cicloza este caracteristică celulei eucariote vii şi dispare la moartea celulei. Deşi în

aparenţă curenţii citoplasmatici par neregulaţi, ei asigură mişcarea cloroplastelor precum şi a altor granule citoplasmatice. La nivelul unor plante, curenţii protoplasmici pot fi iniţiaţi de substanţe chimice (chemodynesis) sau de lumină (photodynesis). Cicloza (curenţii citoplasmatici) reprezintă un fenomen biologic care poate fi influenţat de temperatură, de acţiunea ionilor, de variaţiile de pH. Electroşocul, injuriile mecanice şi unele anestezice pot opri cicloza. Mecanismul molecular al curenţilor citoplasmatici nu este încă elucidat. Se consideră că interacţiunea dintre microfilamentele de actină şi de miozină stă la baza mişcărilor din interiorul citoplasmei celulare. Recentele experimente au propus ideea că pe filamentele de actină situate la periferia celulei se deplasează filamentele de miozină care au legate pe ele organitele celulare. Acest mecanism poate explica şi alte tipuri de motilitate din celule nemusculare, ca de exemplu transportul axoplasmatic din axonul neuronului. Aici, pe lângă mecanismul actină-miozină, un rol important revine microtubulilor. Prin acest tip de motilitate, transport axoplasmatic, se asigură transportul organitelor celulare, a veziculelor sinaptice şi a proteinelor din corpul celular al neuronului spre periferia axonului sau invers. Au fost evidenţiate braţe de legătură între microtubulii din axon şi organitele transportate. 3.1.2.2. Mişcarea de locomoţie ameboidală Mişcarea de locomoţie ameboidală este un tip particular de motilitate întâlnită frecvent la protozoare, dar este comună şi unor tipuri de celule care intră în alcătuirea organismului uman. Mişcarea ameboidală se realizează prin modificări ale formei celulare, care constau în emiterea şi retracţia de prelungiri citoplasmatice numite pseudopode şi are la bază trecerea reversibilă a citosolului din starea de gel în starea de sol. Acest tip de motilitate este cel mai bine observat la nivelul protozoarelor, şi anume la Amoeba proteus. Unele amoebe prezintă un singur pseudopod, sunt considerate monopoidale, dar alte amoebe pot avea mai multe pseudopode cu emitere temporară sau permanentă şi sunt considerate polipoidale. Forma pseudopodului poate varia între o formă cilindrică - lobopodium şi filamente subţiri sau cu ramificaţii - filopodium (fig.VII.16). În organismul uman (ca şi la celelalte vertebrate) există mai multe tipuri celulare considerate a avea o formă variabilă datorită capacităţii de formare a organitelor ectocitoplasmatice cu caracter temporar. Aceste celule sunt de regulă suspendate în medii puţin dense, iar capacitatea de formare a prelungirilor ectocitoplasmatice se datorează nevoii de mobilizare în mediu, ataşării la un substrat sau de mobilizare pe substrat. Astfel, pentru a răspunde unui stimul chemotactic, pentru a se deplasa pe peretele vasului sanguin şi a realiza diapedeza, iar apoi pentru înglobarea bacteriilor, polimorfonuclearele neutrofile emit lobopodii; pentru

înglobarea celulelor bolnave sau moarte, monocitele emit pseudopode fine cu aspect lamelar; pentru ataşarea la peretele vasului sanguin, leucocitele şi trombocitele emit lamelipode şi filopode; pentru deplasarea la nivelul plăgilor cu scopul de a sintetiza proteine cu rol în cicatrizare, fibroblastele dispun de lamelipode şi văluri de membrană.

Fig.VII.16. Emitere de filopode (stg) şi lamelipode (dr). Imagini de microscopie electronică cu baleiaj

Aceeaşi celulă poate emite tipuri diferite de pseudopode în funcţie de nevoile de la un moment dat. Emiterea de pseudopode se datorează unei permanente asamblări şi dezasamblări a filamentelor de actină realizată sub coordonarea proteinelor accesorii (profilina, gelsonina, fimbrina, α-actinina, filamina) şi a filamentelor de miozină I. Un exemplu reprezentativ în acest sens îl reprezintă mecanismul de activare al trombocitelor. Trombocitele sunt celule mici, anucleate, care participă la formarea coagulului sanguin la nivelul plăgilor. Activarea lor are loc în mai multe etape (fig.VII.17): • în repaus, trombocitele au formă discoidală, uneori neregulată şi conţin filamente scurte de actină şi un mare număr de monomeri de actină legaţi la profilină ; • contactul cu peretele vasului de sânge lezat sau cu un semnal chimic de coagulare determină creşterea permeabilităţii membranei trombocitului pentru ionii de Ca++ (1); • Ca++ activează gelsonina care va determina fragmentarea filamentelor de actină (2); • inactivarea ulterioară a gelsoninei va permite actinei să se polimerizeze cu rapiditate; se formează astfel filamente lungi, aşezate în reţea (3) care vor determina etalarea trombocitului pe peretele vasului;

• fimbrina şi α-actinina leagă filamentele de actină în mănunchiuri ceea ce va determina formarea de filopodii, iar filamina va stabiliza reţeaua de actină. Contracţia concomitentă a miozinei va determina formarea filopodiilor (4).

Fig.VII.17. Activarea trombocitelor Secvenţa etapelor de activare a trombocitelor (sus) B. Imagine de microscopie electronică a trombocitelor înaintea activării; C.imagine de microscopie electronică a unui trombocit activat care etalează un lamelipod; D.trombocit activat în stadiu avansat, care se contractă sub influenţa miozinei.

Mişcarea ameboidală se realizează prin emiterea şi retracţia continuă de pseudopode şi are la bază trecerea succesivă a celor două regiuni citoplasmatice din starea de sol în starea de gel; pe parcursul formării psedopodului are loc deplasarea endoplasmei care este fluidă (stare de sol) din centrul celulei în prelungirile celulare. În regiunea distală a pseudopodului, endoplasma se transformă în ectoplasmă (stare de gel) prin tranziţia sol-gel a citosolului. Pseudopodul fiind fixat pe suport (placă de adeziune), corpul celulei este tras pe direcţia prelungirii. În esenţă ectoplasma este în stare de gel, iar endoplasma este în stare de sol. Aceste mişcări ale celulei, datorate modificărilor citoplasmatice au fost comparate cu "o şenilă de tractor" care determină de fapt înaintarea celulei (fig.VII.18). Procesele inverse au loc în momentul retractării pseudopodelor; retractarea se produce şi în mod patologic, sub acţiunea electroşocurilor, radiaţiilor ultraviolete şi a factorilor mecanici. Mecanismul molecular al mişcării pseudopodelor nu a fost pe deplin elucidat. S-a constatat că, concentraţia intracelulară a ionilor de calciu şi pH-ul afectează organizarea filamentelor de actină atât în endoplasmă cât şi în ectoplasmă. De asemenea, proteinele asociate filamina şi α-actinina sunt implicate în stabilizarea

reţelei de filamente de actină, deci asigură starea de gel. La creşterea concentraţiei intracelulare de calciu, filamentele de gelsolină scindează filamentele de actină, iar citoplasma trece în starea de sol. Există diferenţe între rata de progresie a amoebelor, între 0,5 şi 4,6μm/s. În cazul leucocitelor rata progresiei este aproximativ 0,6μm/s. Această rată poate fi influenţată de temperatură sau alţi factori externi. Adesea, emiterea prelungirilor şi deplasarea celulei se face spre direcţia unui stimul chimic, această mişcare direcţionată se numeşte chemotactism. Pe aceasă bază, amoeba îşi găseşte hrana iar leucocitele se acumulează la locul infecţiei, având rol în mecanismele de apărare ale organismului, în special în cazul inflamaţiei.

Fig.VII.18. Reprezentarea schematică a etapelor de locomoţie la fibroblastele în cultură

Dintre celulele organismului uman care se deplasează prin mişcări

ameboidale, cele mai bine studiate au fost fibroblastele în culturi de celule observate prin microcinematografiere. Fibroblastul emite continuu pe direcţia mişcării, prelungiri citoplasmatice numite lamelipode. În timpul deplasării, unele lamelipode aderă de substrat cu ajutorul unor structuri specializate denumite plăci de adeziune, iar alte lamelipode se întorc spre corpul celulei pe faţa dorsală formând ondulaţiile de suprafaţă. Pe măsură ce are loc înaintarea celulei, la spatele ei rămâne o coadă, în interiorul căreia se află fibrele de retracţie; alteori din coadă se rup fragmente de fibre pe care celula le lasă în urmă. Se admite că şi mişcarea fibroblastelor se produce datorită trecerilor succesive ale citoplasmei din starea de gel în starea de sol şi reciproc. 3.1.2.3. Mişcarea din microvili Microvilii sunt prelungiri citoplasmatice ale majorităţii celulelor epiteliale. Observaţi în microscopie electronică la diferite tipuri de celule epiteliale, microvilii pot apărea mici, de formă neregulată sau se prezintă sub forma unor prelungiri mari care determină o mărire a suprafeţei celulare. În general, numărul şi forma microvililor este corelată cu capacitatea de absorbţie a celulelor. Astfel, în celulele cu funcţie absorbtivă redusă, numărul microvililor este redus, sunt neregulaţi şi mai puţin înalţi. În celulele cu funcţie predominantă de absorbţie (enterocite, nefrocite) microvilii sunt în număr mare şi de dimensiuni crescute (fig.VII.19).

Fig.VII.19. Imagine de microscopie electronică a microvililor de la suprafaţa celulelor epiteliului intestinal enterocite

Fig.VII.20. Imagine de microscopie optică a platoului striat (microvilii de la polul apical al enterocitelor) PS-platou striat Ep-epiteliu intestinal

Rolul microvililor este de a mări suprafaţa de absorbţie şi de a interveni în mod activ în procesul absorbţiei, împingând substanţele absorbite spre interiorul celulei. Acest lucru se realizează prin contracţia microfilamentelor de actină şi a microfilamentelor de miozină din organizarea moleculară a microvilului. Structura În microscopia optică, la polul apical al enterocitelor şi nefrocitelor se poate observa o margine distinctă, formată din striaţii verticale. Această structură a fost numită platou striat la nivelul enterocitelor şi margine în perie la nivelul nefrocitelor. Microvilii de la nivelul enterocitelor sunt mai înalţi şi au un aranjament mai ordonat faţă de microvilii de la nivelul nefrocitelor din tubii contorţi ai nefronului (fig.VII.20).

F i g . 1 . I m a g i n e d e m i c r o s c o p i e e l e c t r o n i c ă a m i c r o v

Ultrastructura În microscopia electronică se observă că microvilii au o grosime de 80 nm şi o lungime de 1μ, poziţia şi forma acestora fiind menţinută de structura stabilă a citoscheletului subiacent. Microvilul este format dintr-un miez de 20-30 filamente de actină, dispuse paralel de-a lungul axului longitudinal al acestuia. Filamentele sunt solidarizate de membrana plasmatică printr-un complex de proteine, cum ar fi calmodulinele şi miozina I care se ataşează pe faţa citoplasmatică a plasmalemei, acest lucru având rol de suport. Microfilamentele de actină sunt solidarizate între ele prin două proteine: fimbrina şi vilina. Aceste proteine de legătură se caracterizează prin faptul că prezintă două situsuri de legare pentru actina F, legarea de situsuri se face în spirală, grupând astfel filamentele într-un mănunchi paralel. Vilina are o funcţie secundară, la o concentraţie a Ca2+ mai mare de 10-6M determină separarea filamentelor de actină. Spre capătul apical al microvilului, mănunchiul de filamente de actină care prezintă aceeaşi polaritate este ataşat de plasmalemă printr-o proteină nedefinită. La polul bazal, filamentele de actină din microvili se termină într-o reţea perpendiculară de filamente denumită buton terminal. Această structură este alcătuită din filamente de actină, proteine de legare a actinei şi filamente intermediare. Proteinele de legare a actinei, spectrina II şi filamentele scurte de miozină (miozina II), cad perpendicular pe mănunchiul de filamente de actină a microvilului. Această legătură are rolul de a menţine microvilul în poziţie verticală (fig.VII.21). Se presupune că mişcarea întregului mănunchi de filamente de actină, ca şi contracţia întregului microvil, se realizează prin intermediul interacţiunii actinămiozină din reţeaua terminală, precum şi prin interacţiunea miozinei cu filamentele axiale.

Fig.VII.21. Imagine de microscopie electronică a microvililor (stg.) Aranjamentul mănunchiului de microfilamente de actină şi a proteinelor asociate care intră în alcătuirea microvilului (dr.)

3.1.3. MIŞCĂRI CELULARE CARE AU LA BAZĂ SISTEMUL MICROTUBUL-DINEINĂ Cilii şi flagelul sunt organite ectocitoplasmatice prezente la suprafaţa câtorva tipuri celulare, fiind variante ale aceluiaşi organit şi având un mecanism molecular de mişcare identic: interacţiunea dintre tubulină şi dineină. 3.1.3.1. Cilii Sunt prelungiri multiple localizate la suprafaţa celulelor epiteliale din trahee, bronhii şi oviduct. În arborele traheo-bronşic cilii sunt implicaţi în curăţirea mucusului de la acest nivel, iar la nivelul oviductului au rol în deplasarea oului spre cavitatea uterină. Acest lucru se datorează mişcării cilului care este ciclică, în doi timpi (bătaierevenire) cu o durată de 0,1- 0,2 secunde. Mişcarea cililor este regulată şi sincronă, se propagă în valuri succesive ca "într-un lan de grâu bătut de vânt".

Structură şi ultrastructură Cilul are o grosime de 0,2-0,5 μm şi câţiva m lungime. Principalele componente structurale ale cilului sunt: a) porţiunea liberă sau cilul propriu-zis care proemină la suprafaţa liberă a celulei, b) corpusculul bazal este un organit intracelular, similar cu centriolul şi reprezintă originea cilului, c) rădăcinile cilului sunt fibrile fine care pornesc din corpusculul bazal şi se termină într-un mănunchi conic localizat în aproapierea nucleului. În microscopia optică cilii se prezintă sub forma unor filamente subţiri, fine, care proemină la suprafaţa liberă a celulei. La baza cilului, sub membrana celulară se observă o bandă fină care se colorează bazofil, determinată de prezenţa corpusculilor bazali. Aceştia captează colorantul, iar în microscopul optic se vizualizează ca o bandă continuă (fig.VII.22). De fapt, fiecare cil este asociat cu un singur corpuscul bazal, care este separat de corpii bazali ai cililor adiacenţi. În microscopia electronică porţiunea liberă a cilului este formată dintr-un complex de structuri microtubulare denumit axonemă, îmbrăcat în hialoplasmă şi membrană celulară. Axonema este o structură complexă care pe lângă microtubuli mai conţine şi alte proteine ce permit mişcarea cilului. Pe secţiune transversală, microtubulii din axonemă sunt aranjaţi în dispoziţia "9+2": 9 dublete de microtubuli aranjaţi circular, periferic, care înconjoară o pereche centrală (fig.VII.23). Microtubulii centrali sunt compleţi, fiecare este format din 13 protofilamente. Fiecare dublet periferic este alcătuit dintr-un microtubul complet, numit subfibra A format din 13 protofilamente, de care este ataşat pe o parte un microtubul incomplet - subfibra B format din 11 protofilamente. Tubulinele α şi β care formează subfibra A sunt diferite de tubulinele omologe din subfibra B. Aceşti microtubuli dispuşi în structura "9+2" traversează axonema de la vârful cilului până la baza lui, unde perechile externe de microtubuli întâlnesc corpusculii bazali. Fiecare pereche de microtubuli se continuă cu 2 microtubuli din tripleţii corpusculului bazal. Perechea centrală de microtubuli se termină la capătul superior al corpusculului bazal. De altfel, o secţiune transversală a corpusculului bazal arată 9 triplete de microtubuli aranjaţi circular, fără a exista o pereche centrală, pe care o întâlnim la nivelul cilului. (vezi corpusculul bazal). Pe lângă microtubuli, axonema cuprinde şi alte proteine absolut necesare pentru o funcţionare normală a cililor: • de subfibra A, pe partea opusă subfibrei B, se leagă două braţe proteice dispuse sub formă de cleşte. Această proteină este numită dineina, are activitate ATPazică şi apare în lungul microtubulului la intervale regulate de 24 nm.

• la intervale mai mari, între dubletele vecine se stabilesc legături elastice, formate din proteine denumite nexine. • de la subfibra A a fiecărui dublet pleacă fibre radiare; acestea fac legătura cu o zonă electronodensă care înconjoară perechea centrală de microtubuli. În felul acesta microtubulii din perechea centrală sunt conectaţi cu dubletele periferice. Toate componentele proteice accesorii, braţele de dineină, nexina şi fibrele radiare, prezintă o periodicitate în lungul microtubulului.

Fig.VII.22. Imagine de microscopie optică a epiteliului pseudostratificat din trahee. Cilii (C) apar subţiri la suprafaţa celulelor, iar linia întunecată situată sub plasmalemă este reprezentată de corpusculii bazali (CB).

Fig.VII.23. Secţiune transversală prin axonema cilului a) imagine de microscopie electronică; b) schemă.

Motilitatea cilului - mişcarea ciliară Braţele de dineină au proprietate ATP-azică, ceea ce determină motilitatea

axonemei, iar nexina şi fibrele radiare au proprietatea de a transforma activitatea dineinei într-o mişcare de încovoiere a cililor. În prezenţa ATP-ului, dineina va suferi o modificare conformaţională, şi anume, braţele de dineină se eliberează de sufibra B a microtubulului din dubletul adiacent şi se leagă de aceeaşi pereche (de acelaşi dublet) dar mai jos, în lungul acestuia (fig.VII.24). Acest ciclu se reia atunci când o altă moleculă de ATP se leagă de braţele de dineină. Mişcările braţelor de dineină în lungul peretelui de microtubuli sunt suportate de braţele de nexină şi de proteinele radiare, aceste două structuri transformând alunecarea perechilor de microtubuli adiacenţi într-o mişcare de încovoiere, legănare.

Fig.VII.24. Dineina ciliară (A)modul de ataşare la microtubul; (B)imagine de microscopie electronică a unui cil în care se observă braţele de dineină dispuse la intervale regulate.

3.1.3.2. Flagelul La om, singura celulă care posedă flagel este spermatozoidul. Flagelul are o mişcare ondulatorie, sinusoidală, care determină înaintarea spermatozoidului (fig.VII.25). La maturitate, spermatozoidul are o lungime de aproximativ 60μ şi este format din trei porţiuni: cap (5μ), piesă intermediară (5μ) şi flagel (fig.VII.26). Ultrastructura În microscopie electronică se observă că flagelul are o ultrastructură asemănătoare cu cilul, dar mai complexă. Pe secţiune transversală, axonema flagelului prezintă aceeaşi ultrastructură de tip "9+2"; la nivelul piesei intermediare, axonema este înconjurată de o coroană de mitocondrii care asigură ATP-ul necesar mişcării. În cursul spermiogenezei axonema se polimerizează progresiv, pornind din corpusculul bazal aşezat la baza nucleului. La anumite specii, inclusiv la mamifere şi

om, axonema este înconjurată de 9 fibre dense formate în principal din keratină. Fibrele dense sunt rigide şi necontractile, iar rolul lor în mişcare este încă necunoscut. Mişcarea flagelului este determinată de glisarea dubletelor de microtubuli unele în raport cu altele, energia necesară fiind generată de dineină care are activitate ATPazică şi de mitocondriile de la nivelul piesei intermediare.

Fig.VII.25. Comparaţie între mişcarea ciliară (pendulatorie) şi mişcarea flagelară (ondulatorie). Numerele indică etapele succesive ale mişcării. Direcţia de mişcare este indicată de săgeţi. (după Goodman)

Fig.VII.26. Structura spermatozoidului (stg) şi ultrastructura flagelului (dr.)

Implicaţii medicale Deoarece dineina deţine rolul decisiv în mişcarea cililor şi flagelilor, absenţa ei determină apariţia "sindromului cililor imobili", denumit şi "sindrom Kartagener". Acesta este o boală genetică asociată cu afecţiuni respiratorii cronice şi inversia viscerelor şi a vaselor mari (situs inversus). Mişcarea ciliară este imperfectă sau chiar absentă, iar ca o consecinţă există un transport ciliar redus sau absent în tractul traheobronşic. Inversiunea viscerelor poate fi corelată cu absenţa activităţii ciliare în timpul embriogenezei. O altă ipoteză susţine că polaritatea microtubulilor citoplasmatici poate influenţa în mod indirect polaritatea organelor. De asemenea, inversiunea viscerelor poate apărea ca un rezultat a structurii anormale microtrabeculare. Bărbaţii cu sindrom Kartagener sunt sterili deoarece prin absenţa dineinei flagelul devine imobil. Femeile cu sindrom Kartagener pot fi fertile, în aceste cazuri mişcarea ciliară deşi imperfectă, poate fi suficientă pentru a permite

transportul ovocitului şi zigotului în lungul trompei uterine. Deoarece atât ultrastructura cât şi mişcarea cilului şi flagelului sunt dependente de continuitatea cu corpusculul bazal vom prezenta şi aceste componente celulare în cadrul capitolului. 3.1.3.3. Centriolii şi corpusculul bazal Încă din 1897, cercetătorii Henneguy şi Lenhossek au sugerat faptul că centriolii care alcătuiesc polii fusului de diviziune şi corpusculii bazali ai cililor şi flagelilor, sunt omologi. Ulterior microscopia electronică a dovedit că centriolii şi corpusculii bazali au ultrastrucură identică şi deci pot fi considerate două variante cu specialităţi diferite ale aceluiaşi organit. Ultrastructura Centriolii şi corpusculii bazali apar ca nişte structuri cilindrice cu lungime de circa 0,3 μm şi diametrul 0,1- 0,2 μm. La periferia cilindrului se află 9 triplete de microtubuli, fiecare triplet fiind inconjurat de o matrice densă. Microtubulii din triplet sunt notaţi cu A, B, C, dinspre lumenul cilindrului spre exterior. În timp ce microtubulul A este complet, fiind format din 13 protofilamente, microtubulii B şi C sunt incompleţi fiind formaţi din 10-11 protofilamente (fig.VII.27). Centriolii coordonează motilitatea celulară în special în timpul diviziunii, în timp ce corpusculii bazali coordonează mişcările cililor şi flagelului. Localizare şi rol 1. Centriolul participă la organizarea unei structuri complexe numită centrul celular sau centrozom. Microscopia electronică a demonstrat că centrul celular este alcătuit din 2 centrioli dispuşi perpendicular unul pe celălalt (fig.VII.28). În jurul perechilor de microtubuli este descris un material amorf numit material pericentriolar.

Fig.VII.27. Ultrastructura centriolului a) schema organizării centriolului; b) imagine de microscopie electronică: secţiune transversală

Fig.VII.28. Imagine de microscopie electronică a centrozomului. Dispunerea

perpendiculară a celor doi centrioli.

În interfază, centrul celular este plasat în apropierea nucleului, deseori fiind înconjurat de aparatul Golgi. De la nivelul său pleacă microtubuli în toată citoplasma. În faza S (de sinteză) a ciclului celular, când ADN-ul începe să se replice, are loc şi duplicarea centriolilor. Cei doi centrioli se separă, iar în dreptul fiecărui centriol se formează o masă mică granulară care poartă numele de procentriol. Acesta se măreşte în mod gradat, şi anume, la început apare un singur microtubul apoi 2 microtubuli şi se finalizează apărând tripletul, respectiv 9 triplete de microtubuli. Centriolul nou format se dispune perpendicular pe centriolul vechi. În acest fel, după duplicare, noile perechi de centrioli se separă formând cei 2 poli ai fusului de diviziune. Fusul de diviziune este alcătuit din mănunchiuri de microtubuli; polii fusului sunt formaţi din cele două perechi de centrioli, înconjuraţi de materialul pericentriolar. Din acest material dens pleacă microtubuli cu dispoziţie radiară care alcătuiesc asterul. Funcţia principală a centrozomului este aceea de centru organizator al microtubulilor. Experimental s-a demonstrat că această capacitate de nucleere a microtubulilor îi revine materialului pericentriolar. Nu se cunoaşte natura centrului de nucleere a microtubulilor, dar acesta trebuie să conţină componente proteice şi ARN. Acest material determină polimerizarea tubulinei şi asamblarea microtubulilor care au capătul (-) în centrozom şi capătul (+), distal. Deci, materialul pericentriolar iniţiază asamblarea microtubulilor şi o coordonează. 2. Corpusculul bazal La baza fiecărui cil, imediat sub plasmalemă se află corpusculul bazal. Acesta se formează prin replicarea repetată a centriolilor şi migrarea organitului nou format spre polul apical al celulei. Corpusculul bazal are rol de organizator al microtubulilor cilului (fig.VII.29).

Fig.VII.29. Schema corpusculului bazal şi relaţia sa cu axonema cilului (după Goodman).

3.2. SINTEZA ŞI SECREŢIA CELULARĂ 3.2.1. RIBOZOMII Structură şi ultrastructură Ribozomii sunt organite intracitoplasmatice nespecifice, nedelimitate de endomembrane, cu rol esenţial în coordonarea traducerii codului genetic prin interacţiunea lor cu ARNm şi cu celelalte molecule necesare biosintezei proteinelor. Au fost evidenţiaţi în celula animală de G.E.Palade în 1953, motiv pentru care sunt cunoscuţi şi sub denumirea de « granulele lui Palade ». Sunt prezenţi în toate celulele cu excepţia hematiei adulte circulante, dar sunt mai abundenţi în celulele

secretorii ale glandelor endocrine şi exocrine. În microscopia optică nu pot fi diferenţiaţi, dar sunt responsabili de bazofilia citoplasmei celulelor tinere aflate în plină activitate metabolică. În microscopia electronică au aspect granular, cu diametre de 20-30 nm, la care nu se pot distinge detaliile de organizare (fig.VII.30).

Fig.VII.30. Ribozomi în microscopia electronică

Fig.VII.31. Subunităţile ribozomale şi asocierea lor pe ARNm

Ribozomii sunt alcătuiţi din două subunităţi, inegale ca dimensiune şi formă, motiv pentru care sunt denumite „subunitatea mare şi subunitatea mică”. Subunitatea mare prezintă o adâncitură în formă de şa, în care se dispune subunitatea mică, alungită, reniformă. În momentul biosintezei proteice, cele două subunităţi se asociază pe o catenă de ARN mesager (fig.VII.31). În citoplasmă ribozomii se găsesc sub următoarele forme: • subunităţi libere care nu au nici o funcţie; • ataşaţi pe catena de ARNm împreună cu care alcătuiesc polizomi sau, poliribozomi, (fig.VII.32). Forma poliribozomilor depinde de flexibilitatea ARNm: liniari, rozetă, spirală. Numărul ribozomilor din cadrul poliribozomului depinde de mărimea moleculei proteice ce urmează a fi sintetizată, de exemplu 5 ribozomi în poliribozomul pentru sinteza moleculei de globină, 100 de ribozomi în poliribozomul pentru sinteza moleculei de colagen. Când procesul de biosinteză proteică se finalizează, poliribozomul se dezasamblează în părţile componente. • poliribozomi ataşaţi la membranele reticulului endoplasmic cu care formează reticulului endoplasmic rugos.

Fig.VII.32. Trei forme de prezentare ale ribozomilor în citoplasmă

(după Alberts, 1995)

Organizarea moleculară a fost elucidată prin tehnica imunologică şi prin tehnica fizică de împrăştiere a neutronilor. Tehnica imunologică constă în tratarea cu anticorpi faţă de o anumită proteină ribozomală, legarea acestor anticorpi de ribozomi şi formarea de complexe care pot fi vizualizate în microscopia elecronică. Tehnica fizică de împrăştiere a neutronilor presupune ca proteinele ribozomale să fie marcate cu deuteriu, iar după împrăştierea neutronilor se poate determina distanţa dintre două proteine, pentru obţinerea unei hărţi spaţiale a poziţionării tuturor proteinelor din ribozomi. La eucariote ribozomii conţin: 50% ARNr cu rol în activitatea catalitică a ribozomilor şi 50% proteine structurale (50 de tipuri în subunitatea mare şi 30 de tipuri în subunitatea mică) şi funcţionale. Deşi sunt implicaţi în aceeaşi funcţie (menţinerea vieţii prin producerea de proteine), ribozomii celulelor eucariote şi procariote diferă din punct de vedere al organizării moleculare şi constantelor de sedimentare (tabel VII.III şi fig.VII.33). Procariote Constanta de sedimentare

ARN r

Proteine (nr. tipuri)

Tabelul VII.III.

Eucariote

totală

70 S

80 S

subunit. mare

50 S

60 S

subunit. mică

30 S

40 S

subunit. mare

23 S + 5 S

28 S + 5 S

subunit. mică

16 S

18 S

% totală

40%

50%

subunit. mare

34 (L1-L34)

49

subunit. mică

21 (S1-S21)

33

Fig.VII.33. Organizarea moleculară a ribozomilor la PK (stg) şi EK (dr)

Originea ribozomilor Sinteza precursorilor ribozomali are loc în nucleol. Majoritatea tipurilor de ARN ribozomal provin dintr-un precursor comun, ARN 45S sintetizat pe matriţa de ADN nucleolar sub acţiunea catalitică a ARN polimerazei I; un singur tip, ARN 5S la procariote şi ARN 5,8S la eucariote este de producţie nucleară (fig.VII.34).

Fig.VII.34. Etapele formării subunităţilor ribozomale la procariote (după Berkaloff)

Asamblarea ribozomilor începe încă din nucleol unde ARNr este transcris de pe genele existente pe o anumită porţiune a cromozomilor denumită organizator nucleolar. Aceste gene sunt multiplicate prin replicări repetate, cu formarea unui ADN extracromozomial care intră în alcătuirea nucleolului. Genele ARNr sunt transcrise de ARN-

polimeraza I cu producerea aceluiaşi tip de ARN, cunoscut sub denumirea de ARN 45S. ARN 45S este maturat biochimic la ARN 41S. Acesta este clivat la ARN 32S şi 20S. Înainte să părăsească nucleul ARN 20S este transformat în ARN 18S, iar ARN 32S dă naştere la ARN 28S; acesta din urmă se asociază cu ARN 5S. În nucleu, ARNr se asociază cu proteinele ribozomale (L şi S), formează precursorii ribozomali care vor trece în citoplasmă pentru a participa la biosinteza proteică. Funcţiile ribozomilor 1. Ribozomii ataşaţi de membranele reticulului endoplasmic sintetizează proteine de "export" reprezentate de hormoni, anticorpi, enzime. 2. Ribozomii liberi intervin în sinteza proteinelor de structură care participă la diviziune, la creşterea celulară şi înlocuirea organitelor îmbătrânite (tabel VII.IV). Tipul poliribozomilor • • Poliribozomii ataşaţi de membranele reticulului endoplasmic

• • •

Poliribozomii liberi

• •

Clasa de proteine sintetizată Proteine de export Glicoproteine pentru membranele nucleare, ale RE şi aparatului Golgi Enzime lizozomale, ale RE, ale aparatului Golgi Proteine ataşate pe faţa externă a membranei celulare ca: fibronectina, laminina, colagenul Proteine ataşate pe faţa internă a membranelor celulare: actina, spectrina Proteine mitocondriale codificate de ADN nuclear Proteine peroxizomale şi citoplasmatice solubile

Tabel VII.IV. Proteinele sintetizate de diferite clase de ribozomi

3.2.2. RETICULUL ENDOPLASMIC Structură şi ultrastructură Reticulul endoplasmic este un organit intracitoplasmatic nespecific, prezent în toate celulele cu excepţia hematiei adulte, angajat în procesele de sinteză şi secreţie celulară. Din acest motiv este mai bine reprezentat în celulele secretorii ale glandelor endocrine şi exocrine şi în alte celule angajate în sinteze. În microscopia optică, prezenţa ribozomilor ataşaţi reticulului endoplasmic rugos conferă citoplasmei diferite grade de bazofilie sau pironinofilie. A fost evidenţiat sub denumiri diferite, funcţie de coloraţia utilizată şi tipul celular cercetat: "corpusculi Nissl" în neuroni, pe secţiuni colorate cu albastru de toluidină; "corpi Berg" în hepatocite folosind coloraţia cu albastru de toluidină; "ergastoplasma", o zonă bazofilă în endoplasma celulelor pancreatice; "corpi tigroizi" în neuroni, pe secţiuni colorate prin impregnare argentică.

Fig.VII.35. Ultrastructura reticulului endoplasmic

În microscopie electronică, R.K.Porter şi colaboratorii l-au denumit reticul endoplasmic. Reticulul apare ca un sistem complex de membrane organizat în canalicule şi cisterne (saci turtiţi), al căror lumen prezintă continuitate cu spaţiului perinuclear (fig.VII.35). Reticulul endoplasmic reprezintă aproximativ 10% din volumul total celular şi se extinde ca o reţea în întreg spaţiul citoplasmatic. Lumenul tubilor are un diametru variabil de 25-500 nm, cu un conţinut heterogen dependent de natura reticulului, tipul celular şi momentul funcţional. Membrana reticulului endoplasmic separă lumenul acestuia de citosol şi mediază transferul selectiv şi rapid al moleculelor între cele două compartimente (luminal şi citosolic). Din punct de vedere morfologic şi funcţional, reticulul endoplasmic este format din două tipuri de membrane care se află într-o relaţie de continuitate şi anume: • reticul endoplasmic neted (REN) format din canalicule tubulare cu diametru de 20-30 nm, fără ribozomi ataşaţi. Este mai bine reprezentat în celulele care sintetizează hormoni steroizi (glande suprarenale, ovar, testicol), în celulele care sintetizează pigmenţi (melanocite), în celulele cu conuri şi bastonaşe, celule musculare, hepatocite. • reticul endoplasmic rugos (RER) a primit această denumire din cauza existenţei pe suprafaţa externă a numeroşi ribozomi ataşaţi. Prezenţa ribozomilor conferă aspectul de “om de zăpadă” şi aspectul neregulat, rugos al membranei. Datorită prezenţei ribozomilor pe membrana externă, RER joacă un rol central în biosinteza proteinelor; lanţul polipeptidic sintetizat la nivelul ribozomilor pătrunde în lumenul RER printr-un canal realizat de proteine translocatoare şi începe să fie expus la o serie de reacţii chimice de maturare. Din acest motiv, reprezentarea membranelor RER este mai importantă în celulele specializate în sinteza heteroproteinelor: celule pancreatice, plasmocite, hepatocite, neuroni etc. Compoziţia chimică a fost stabilită prin microanalize după separarea prin ultracentrifugare diferenţială şi folosind soluţii gradient de densitate. În cursul acestor operaţii are loc fragmentarea şi fuziunea membranelor cu formarea unor vezicule numite microzomi. Acestea sunt alcătuite din resturi membranare de reticul endoplasmic, aparat Golgi şi ribozomi. a) Compoziţia chimică a membranelor. Cu ajutorul metodelor amintite mai sus endomembranele mozaicate, lipoproteice, cu o grosime de 7nm apar alcătuite din punct de vedere biochimic din proteine (60%) şi lipide (40%) după cum urmează: • proteine structurale: lipoproteine, glicoproteine cu dispoziţie asimetrică cu gruparea glucidică orientată spre lumen; proteinele caracteristice RER poartă numele de proteine translocatoare şi au fost identificate de Kreibich şi colaboratorii sub denumirea de proteine tunel sau riboforine. Proteinele translocatoare participă la ataşarea ribozomilor pe faţa externă a

membranelor şi creează canale prin intermediul cărora lanţurile polipeptidice pătrund în lumenul reticulului. Această proteină lipseşte din membranele REN. Alte proteine structurale caracteristice reticulului endoplasmic sunt componente ale unor mici lanţuri transportoare de electroni cu rol în metabolismul lipidic şi detoxifierea medicamentelor; ele caracterizează membranele reticulului neted şi sunt reprezentate de citocrom b5 şi citocrom P450. • protein-enzime: glucozo-6-fosfataze (enzima marker), hidrolaze, dezaminaze, glicoziltransferaze, nucleozid difosfataza, NADH citocrom b5 reductaza, NADPH citocrom P450 reductaza (fig.VII.36). • lipidele din structura membranelor sunt reprezentate de fosfolipide (fosfatidilcolina 45%, fosfatidiletanolamina 30%, fosfatidilserina 10%, fosfatidilinozitol 5%), colesterol cu procent mai crescut în REN şi acizi graşi nesaturaţi care conferă fluiditate membranelor. • anioni, cationi şi apă.

Fig. VII.36. Schema componentelor membranelor reticulului endoplasmic

b) Conţinutul cavităţilor reticulului este o soluţie apoasă în care domină un amestec de proteine: holo-, glico- şi lipoproteine. Produşii sintetizaţi se află într-o stare imatură, urmând a fi maturaţi biochimic în lumenul reticulului şi apoi în sacii golgieni. Conţinutul este caracteristic fiecărui tip celular: reticulul plasmocitelor conţine precursori de imunoglobuline, al fibroblastelor conţine lanţuri de procolagen şi hidroxilaze, în celulele beta ale pancreasului endocrin predomină proinsulina în timp ce în celulele pancreasului exocrin se găsesc hidrolaze şi proteine acide sulfatate. Reticulul endoplasmic al hepatocitelor conţine proalbumine şi glicoproteine din plasma sanguină.

Funcţiile reticulului endoplasmic 1. Funcţii specifice RER: 1.1. Transferul lanţurilor polipeptidice. RER participă la sinteza proteinelor destinate “exportului”, precum şi a unor proteine structurale destinate membranelor organitelor citoplasmatice. Din aceste motive RER este bine reprezentat în celulele pancreatice unde secretă enzime digestive şi hormoni, în plasmocite unde sunt sintetizate imunoglobuline, în hepatocite - albumina şi proteine serice. Sinteza lanţurilor polipeptidice se desfăşoară la nivelul polizomilor ataşaţi de membranele RER prin subunităţile mari, de unde trec în canaliculele şi cisternele reticulului. Catena de ARNm care participă la formarea poliribozomului prezintă o secvenţă de nucleotide care codifică un mic fragment proteic localizat la capătul N-terminal al lanţului polipeptidic. Acest fragment este denumit “secvenţă semnal”(“signal peptide” sau secvenţă “leader”) (fig.VII.37). După iniţierea biosintezei proteice, proteina care conţine această secvenţă va orienta ribozomul pentru ataşarea la membrana RE. Orientarea şi traversarea membranei RE de proteinele care prezintă secvenţa semnal implică existenţa a cel puţin două componente: • o particulă semnal de recunoaştere (signal-recognition particle - SRP) care face naveta între membrana RE şi citosol şi se leagă de secvenţa semnal a proteinei şi de ribozom; • receptorul pentru SRP localizat în membrana RE care recunoaşte şi leagă specific particula SRP în momentul în care ea s-a ataşat la peptidul semnal de pe lanţul polipeptidic în creştere (fig.VII.38).

Fig.VII.37. Prezentarea schematică a translocării lanţului polipeptidic prin membranele RE

Fig.VII.38. Secvenţa semnal şi SRP dirijează ataşarea ribozomului la proteina translocatoare (după Alberts, 2002)

Procesul de transport al proteinei nou sintetizate în lumenul RE se desfăşoară în următoarele etape: - SRP se leagă de secvenţa semnal a proteinei; - elongaţia e oprită pentru a permite complexului ribozomi-SRP să se lege de receptorul SRP de pe faţa citosolică a membranei RE;

- sinteza proteinei se reia; pe măsură ce este sintetizat, lanţul polipeptidic pătrunde în lumenul RE prin canalul realizat de proteina translocatoare; - secvenţa semnal este tăiată şi îndepărtată de o semnal-peptidază; - lanţul polipeptidic este eliberat în lumenul reticulului, iar ribozomul şi SRP se desprind şi vor parcurge un nou ciclu de sinteză şi ataşare. Deoarece transportul proteinelor în RE decurge simultan cu sinteza proteică, procesul a fost denumit translaţie-cotranslaţională. Acest proces diferă de cel întâlnit la mitocondrii, nuclei şi peroxizomi unde există un transport posttranslaţional care necesită alte tipuri de peptide semnal. Astfel, dacă proteina este destinată lumenului RE, peptidul semnal este tăiat de către semnal- peptidaza înainte de a se fi terminat sinteza şi astfel molecula polipeptidică nou sintetizată este eliberată în lumen. Dacă proteina este destinată membranelor reticulului, peptidul semnal nu este tăiat, fapt esenţial pentru asigurarea inserţiei în membrană a proteinelor transmembranare. 1.2. Glicozilarea proteinelor în RE Adiţia covalentă a zaharidelor la proteine este una din funcţiile importante ale RE deoarece majoritatea proteinelor din lumen sunt glicozilate înainte de a fi transportate la aparatul Golgi, la lizozomi, la membrana plasmatică sau în spaţiul extracelular. La eucariote, radicalii oligozaharidici se leagă de moleculele proteice prin două modalităţi şi anume: - oligozaharidele O-linkate (link = legătură) în care galactoza sau N-acetil

galactozamina se leagă de gruparea hidroxil (OH) a unei serine sau treonine din lanţul polipeptidic. Sunt în general radicali scurţi care conţin 1- 4 monozaharide, dar există şi situaţii când aceşti radicali sunt foarte lungi, de exemplu antigenele grupelor sanguine ABO. - oligozaharidele N-linkate care se leagă la gruparea amino (NH2) a unei asparagine din structura proteinelor. Conţin un număr minim de 5 monozaharide şi se leagă întotdeauna de asparagină prin N-acetil-glucozamină. Cele două tipuri de oligozaharide sunt ataşate de proteine în lumenul RE sau pe faţa luminală a acestuia, deosebirea esenţială dintre cele două categorii de oligozaharide este modul în care sunt sintetizate şi legate la proteine (fig.VII.39). Sinteza oligozaharidelor N-linkate începe în lumenul RE şi se continuă în aparatul Golgi pornind de la un precursor. Oligozaharidul precursor este legat la membrana RE prin intermediul unei molecule speciale lipidice denumite dolicol. Oligozaharidul este sintetizat pe acest lipid treaptă cu treaptă după care este transferat în “bloc” pe asparagina unei molecule proteice. Sinteza oligozaharidelor O-linkate începe în lumenul RE şi se continuă în aparatul Golgi prin adiţia succesivă, treaptă cu treaptă, a monozaharidelor la serina sau treonina unei proteine. Procesul e catalizat de enzime numite glicoziltransferaze, localizate pe versantul luminal al membranei. Membrana RE efectuează şi alte modificări ale lanţului polipeptidic: scindări proteolitice, modificări ale lanţurilor laterale de aminoacizi, formări de legături disulfidice.

Fig.VII.39. Glicozilarea proteinelor în RER

2. Funcţii specifice REN : 2.1. Realizează etape din metabolismul lipidelor Fiind implicat în biosinteza lipidelor, REN este foarte bine reprezentat în celulele din corticosuprarenale şi gonade care sintetizează hormoni steroizi, precum şi celulele din mucoasa intestinală cu rol în absorţie. Aceste celule absorb din lumenul intestinal amestecul de acizi graşi, monogliceride şi digliceride rezultate din scindarea lipidelor alimentare sub acţiunea lipazei pancreatice. În REN-ul celulelor intestinale, din substanţele absorbite se sintetizează trigliceride care se pot evidenţia chiar în lumenul REN sub formă de chilomicromi (fig.VII.40). Membranele reticulului posedă sisteme enzimatice care catalizează reacţii importante din cadrul metabolismului diverselor lipide: acizi graşi, fosfolipide, colesterol şi derivaţii săi. a) Sinteza fosfolipidelor are loc sub acţiunea enzimelor localizate în membrana RE, având centrul activ orientat spre citosol, de unde provin precursorii: acil-CoA şi glicerolfosfatul. Din două molecule de acizi graşi + glicerol-P rezultă o moleculă de acid fosfatidic care este încorporat pe versantul extern al membranei RE; ulterior, prin modificări biochimice, el va genera celelalte fosfolipide de membrană (fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina şi fosfatidilinozitolul).

Sinteza fosfolipidelor este asimetrică deoarece are loc în stratul extern, citosolic al membranei RE. Fig.VII.40. Absorbţia trigliceridelor la nivelul enterocitelor (după Berkaloff)

RE poate fi considerat ,,fabrica de membrane” a celulei eucariote deoarece în mod continuu membrana RE creşte prin sinteza componentelor sale (proteine şi lipide), apoi se fragmentează generând vezicule de transport pe care le expediază altor organite sau plasmalemei. În acelaşi timp, avînd în vedere modul asimetric în care se desfăşoară sinteza lipidelor cât şi glicozilarea proteinelor în RE, se înţelege de ce asimetria este transmisă tuturor membranelor celulare prin intermediul veziculelor de transport. Dintre organitele celulare, mitocondriile şi peroxizomii fac excepţie în privinţa biogenezei membranelor, prin faptul că ele primesc fosfolipide nu prin vezicule de transport, ci prin proteine de transfer a fosfolipidelor. Diferenţa se explică prin faptul că mitocondriile şi peroxizomii nu pot fuziona cu veziculele provenite din RE, de aceea ele trebuie să adopte această strategie. b) elongarea şi desaturarea acizilor graşi este catalizată de o oxidază cu funcţie mixtă, care utilizează o moleculă de oxigen şi o moleculă de NADH. Transferul electronilor la oxigen este realizat de un lanţ transportor de electroni care conţine

citocrom b5. c) biosinteza colesterolului şi a derivaţilor săi. Sinteza colesterolului cu plecare de la acetat se derulează în membranele reticulului. Transformarea colesterolului în acizi biliari şi hormoni steroizi se realizează prin hidroxilări şi necesită prezenţa oxigenului şi a NADPH-ului. La realizarea reacţiilor participă un lanţ transportor de electroni care cuprinde citocromul P450. 2.2. Detoxifierea Detoxifierea reprezintă metabolizarea substanţelor endogene sau exogene (reprezentate de medicamente, substanţe toxice, poluanţi) în vederea neutralizării efectelor nocive şi a uşurării eliminării lor. Acesta este motivul pentru care REN este mai bine reprezentat în celulele celor cinci organe care realizează detoxifierea: ficat, rinichi, plămân, intestin şi piele. Reacţiile prin care substanţele sunt detoxifiate constau în: oxidare, hidroliză, reducere sau conjugare (legarea covalentă cu acidul glucuronic). Prin aceste procese substanţele toxice îşi pierd acţiunea biologică (inactivare) sau îşi pierd proprietăţile toxice (detoxifiere), devin mai solubile şi deci se elimină mai uşor. Reacţiile de acest tip sunt importante pentru metabolizarea sărurilor biliare, a steroizilor, degradarea hemoglobinei şi în metabolismul medicamentelor (glucuronoconjugarea aspirinei sau hidroxilarea fenobarbitalului, neutralizarea morfinei, degradarea codeinei). Inactivarea se realizează de cele mai multe ori prin reacţii de oxidare şi conjugare: - oxidarea utilizează oxigenul şi NADPH şi este catalizată de NADPH-citocrom P450 reductază şi citocrom P450. - conjugarea este realizată prin legarea acidului glucuronic, fie direct de substanţa ce urmează a fi inactivată (de exemplu acid salicilic), fie indirect, după ce toxicul a fost oxidat. Cele mai multe reacţii de detoxifiere sunt oxidări efectuate de către un sistem enzimatic particular microzomial, sistem care are drept enzimă principală citocromul P450. Citocromul P450 este o hemoproteină cu maximum de absorbţie a spectrului luminos la 450 nm. Acest sistem leagă atât O2 cât şi substratul şi trece unul din atomii de O2 pe substrat (sub forma grupării OH), cel de-al doilea atom al O2 se combină cu H+ pentru a forma H2O.

Electronii folosiţi în sinteza apei sunt furnizaţi citocromului P450 de la NADPH prin lanţul transportor de electroni asociat RE. Din acest lanţ mai fac parte flavoproteinele şi citocromul b5. Flavoproteinele pot transfera electroni de la NADH sau NADPH la citocromul b5. Citocromul c poate acţiona ca un acceptor de electroni

de la citocromul b5 redus, acesta fiind stabilizat.

2.3. Alte roluri: • În hepatocite participă la: - degradarea glicogenului hepatic. Sub acţiunea fosforilazei, glicogenul eliberează glucozo-1-fosfat care este convertit la glucozo-6-fosfat; prin acţiunea enzimei glucozo-6-fosfataza, glucozo-6-fosfatul eliberează glucoza care trece în lumenul RE şi de aici în sânge. Glucozo-6-fosfataza este o enzimă caracteristică a RE. - transformarea bilirubinei indirecte (puţin solubilă) în bilirubină directă (solubilă) prin intermediul glucuroniltransferazei, o enzimă din RE. Bilirubina directă se elimină prin bilă. • În celulele musculare REN participă la formarea sistemului sarcoplasmatic cu rol în stocarea Ca++; prin aceasta intervine în cuplarea excitaţiei cu contracţia; • În celulele cu conuri şi bastonaşe din retină, REN are rol în fotorecepţie constituind suportul procesului vizual şi al declanşării influxului nervos. • În melanocite realizează sinteza melaninei. 3. Funcţiile comune RER şi REN: 1. Străbătând întreaga citoplasmă RE poate juca rol de suport mecanic al citoplasmei, dar şi de compartimentare a acesteia. 2. RE este un sistem circulator intracitoplasmatic prin care sunt vehiculate o serie de substanţe: proteine, lipide. Acest sistem circulator comunică direct cu cisterna perinucleară, spaţiul intercelular (rar), cu sacii golgieni (prin intermediul microveziculelor) permiţând transportul substanţelor ce pot fi repartizate astfel aparatului Golgi, învelişului nuclear etc. 3. Reprezintă o imensă suprafaţă de schimb selectiv între lumenul RE şi citoplasmă. Acest fenomen se realizează atât prin difuziune cât şi prin transport activ. Se consideră că există gradiente ionice transmembranare şi potenţial de membrană ce joacă un rol important în special în reticulul sarcoplasmic din celulele musculare care conduce excitaţia de la plasmalemă la miofibrile. 4. Rol în biogeneza membranelor prin sinteza unor glicoproteine şi fosfolipide membranare; mai accentuat în neuroni care trebuie să-şi întreţină o suprafaţă mai mare de membrane în prelungiri. Originea RE Ca şi alte membrane celulare, membranele reticulului endoplasmic sunt structuri aflate în echilibru dinamic, constituenţii lor fiind reînnoiţi în permanenţă. Reînnoirea se realizează cu viteză

diferită, în funcţie de tipul moleculelor; proteinele mari au un turnover scurt, de 4-5 zile, pe când cele mici se reînnoiesc la 16-28 de zile. În cursul biogenezei membranelor reticulului, asamblarea constituenţilor are loc în etape: la început, fosfolipidele şi colesterolul sintetizate la nivelul REN se dispun în bistrat molecular. Apoi are loc inclavarea proteinelor, fenomen care se realizează progresiv, pe măsura alungirii bistratului lipidic.

Implicaţii medicale O caracteristică a REN o reprezintă proliferarea sa marcată în funcţie de necesităţile crescute de metabolizare a unor substanţe străine. De exemplu, administrarea à la long a unor medicamente cum este fenobarbitalul induce proliferarea REN ce se dublează în câteva zile. În urma proliferării sunt induse şi enzimele implicate în procesele de dezintoxicare şi ca urmare va creşte capacitatea de metabolizare a REN şi pentru alte medicamente. De aceea, în cazul folosirii unui tratament cu mai multe medicamente care se metabolizează prin REN este necesară ajustarea precisă a dozelor administrate pentru a preveni ineficacitatea tratamentului. Acest proces are la bază inducţia enzimatică care se produce şi în cazul alcoolului: ingestia cronică de alcool accelerează metabolizarea medicamentelor, în timp ce ingestia acută de alcool o inhibă. De aici rezultă toleranţa crescută la sedative a alcoolicului cronic şi intoleranţa în cazul alcoolismului acut. Inducţia RE este determinată şi de contactul permanent cu anestezicele (personalul operator) sau de contactul unic dar în doză crescută (persoanele operate). Paradoxal, o serie de cercetători au arătat că în mecanismul de dezintoxicare apare un citocrom P448 ca efect a unor agenţi chimici carcinogeni (metil colantren), citocrom care se pare că activează carcinogeneza. RE prezintă aspecte diferite în raport cu starea funcţională a celulei. De exemplu, la un animal bine nutrit, hepatocitele sunt în activitate maximă şi în citoplasma lor predomină RER, în timp ce la un animal subnutrit în hepatocite predomină REN. Aceste aspecte prezintă o mare importanţă în morfopatologie. O altă importanţă practică decurge din faptul că toate leziunile toxice dintr-un organ sau ţesut conduc la dezorganizări ale RE. După cum lipsa oxigenului afectează primordial mitocondriile, tot aşa, orice substanţă toxică (otravă sau drog) modifică ultrastructura şi funcţia reticulului endoplasmic, ceea ce permite stabilirea diagnosticului de intoxicaţie în practica medico-legală.

3.2.3. APARATUL GOLGI Structură şi ultrastructură A fost descris de Camillo Golgi în 1898 ca un “aparat reticular intern” datorită aspectului de reţea perinucleară observat în ganglionul spinal de pisică, dar mult timp a rămas pentru unii un artefact. Abia în 1954, microscopia electronică a dovedit existenţa acestui organit care a mai fost denumit complexul Golgi. Aparatul Golgi este un organit intracitoplasmatic nespecific, delimitat de endomembrane, prezent în toate celulele cu excepţia hematiei adulte. Deoarece reprezintă staţia finală a procesului de sinteză intracelulară este mai bine reprezentat în celulele secretorii. În microscopia optică are aspect de reţea perinucleară (a fost observat de către Voinov la plante în 1935 şi denumit dictiozomi). Localizarea sa depinde de tipul celular şi de momentul funcţional: în neuroni este dispus perinuclear, în celulele secretorii exocrine este situat supranuclear, iar în tireocite juxtanuclear. În microscopia electronică, complexul Golgi prezintă trei compartimente distincte: • compartimentul cis reprezentat de zona dinspre reticulul endoplasmic, imatură, cu convexitatea orientată spre nucleu. La acest nivel se aglomerează veziculele de tranziţie provenite prin pensarea reticulului endoplasmic, vezicule care conţin produşii ce vor fi prelucraţi biochimic în aparatul Golgi; • compartimentul median format din cisterne aplatizate, suprapuse, numite saci golgieni ; • compartimentul trans reprezentat de zona dinspre plasmalemă, matură, concavă, de la nivelul căreia se desprind veziculele de secreţie ce vor fi vehiculate spre periferia celulei (fig.VII.41).

Fig.VII.41. Prezentarea schematică a compartimentelor golgiene

Sacii golgieni sunt delimitaţi de endomembrane cu o grosime de 6 nm, asemănătoare cu membranele reticulului endoplasmic la nivelul feţei cis, respectiv cu o grosime de 8 nm, asemănătoare plasmalemei la nivelul feţei trans. Prezintă un aspect turtit, sunt uşor curbaţi, au o dispoziţie paralelă şi sunt aşezaţi în stive de 3-12. Veziculele de tranziţie (microvezicule) au un diametru de 20-80 nm şi transportă produşii sintetizaţi la nivelul reticulului endoplasmic; membranele veziculelor fuzionează progresiv şi formează sacii golgieni. Veziculele de secreţie (macrovezicule) prezintă un diametru de 0,3-3 μm şi un conţinut amorf, fin granular, care este de fapt produsul de sinteză al reticulului endoplasmic, maturat în aparatul Golgi. Compoziţie chimică Aparatul Golgi conţine proteine de structură şi proteine enzime în proporţie de 60%, lipide în proporţie de 40%. Enzimele marker sunt tiaminopirofosfataza şi nucleoziddifosfataza. La nivelul aparatului Golgi se mai află şi alte enzime ca: glicoziltransferaze, sulfotransferaze, NADH2, NADPH2, citocrom-C-reductaza, adenilatciclaza, fosfataza acidă, ubiquinona. La nivelul complexului Golgi există o heterogenitate enzimatică, cu o polaritate distinctă (Palade, 1981): - compartimentul cis conţine manozidaze pentru îndepărtarea manozei; - compartimentul median conţine manozidaze care îndepărtează manoza pentru adăugarea N-acetilglucozaminei; - compartimentul trans conţine glicoziltransferaze (sialtransferaza, galactozil transferaza), adenilatciclaza, sulfotransferaze.

Funcţii 1. Rol central în secreţia celulară Sinteza şi secreţia enzimelor digestive de către porţiunea exocrină a pancreasului a fost primul model de secreţie celulară studiat prin metode moderne, de către Palade şi Jamieson. Autorii au injectat aminoacizi radioactivi la cobai şi după 3 minute au injectat o doză mult mai mare de aminoacizi nemarcaţi pentru a opri captarea radioactivităţii. S-au sacrificat animalele la diferite intervale de timp; după câteva minute radioactivitatea a fost găsită în reticulul endoplasmic al celulelor pancreatice; după 20 de minute s-a găsit în aparatul Golgi; după 2 ore s-a găsit în veziculele de secreţie (numite şi granule de zimogen fiindcă conţin enzime inactive). Aceste experienţe au demonstrat secvenţa prin care se deplasează proteinele secretate din reticulul endoplasmic rugos spre aparatul Golgi şi veziculele de secreţie (fig.VII.42), au elucidat calea secreţiei celulare, valabilă pentru toate procesele de secreţie, indiferent de celulă sau substanţele secretate. Etapele secreţiei celulare, numită şi “ciclul secretor” sau “ciclul lui Palade” sunt : • sinteza lanţurilor polipeptidice la nivelul poliribozomilor ataşaţi reticuluilui endoplasmic rugos; • transferul şi segregarea proteinelor de export la nivelul reticulului endoplasmic rugos; • transferul proteinelor în reticulul endoplasmic neted, care se află în relaţii de contiguitate cu reticulul endoplasmic rugos; • formarea de vezicule de tranziţie (microvezicule) de la nivelul reticulului în zone fără ribozomi ataşaţi ; • prelucrarea biochimică a proteinelor la nivelul sacilor Golgi; • desprinderea de vezicule de secreţie la nivelul zonei trans Golgi; • depozitarea veziculelor în citoplasmă 1-4 ore; • exocitoza.

Fig.VII.42. Etapele ciclului secretor

2. Prelucrarea biochimică a produşilor de secreţie implică mai multe procese, desfăşurate paralel cu avansarea proteinelor şi lipidelor prin intermediul microveziculelor în toate compartimentele. Aceste procese compartimentate sunt reprezentate de: a) Glicozilarea proteinelor În aparatul Golgi, proteinele cu oligozaharide N-linkate suferă modificări extensive la nivelul radicalilor oligozaharidici, de obicei prin adăugarea de noi monozaharide la cele preexistente. În acest sens, au fost descrise două clase de oligozaharide Nlinkate la glicoproteinele mature, adică la cele care au trecut prin aparatul Golgi: - oligozaharide bogate în manoză, sunt legate la asparagină prin 2 molecule de Nacetil-glucozamină, la care se ataşează mai multe molecule de manoză. În majoritatea cazurilor, manozele componente sunt adăugate încă în reticulul endoplasmic, iar la nivelul aparatului Golgi, extensia lanţurilor de manoză este minimă; - oligozaharidele complexe sunt prelucrate intensiv la nivelul aparatului Golgi, la cele două N-acetil-glucozamine legate la asparagină adăugându-se un număr variabil de molecule de galactoză, acid sialic şi uneori fucoză. Glicozilarea este compartimentată: în compartimentul cis se îndepărtează parţial manoza, în compartimentul median se adaugă N-acetil-glucozamină, în compartimentul trans se adaugă acid sialic la oligozaharide. În biosinteza oligozaharidelor O linkate, restul de N-acetil-galactozamină este transferat de la UDP-N-acetil-galactozamină la gruparea OH a unui rest de serină sau treonină prin intermediul unei enzime (N-acetil-galactozamină transferază). După ce proteina este transportată la nivelul compartimentului Golgi trans, restul de

galactoză este adăugat N-acetil-galactozaminei prin intermediul unei galactoziltransferaze specifice. Ulterior, se adiţionează două molecule de acid sialic. b) Glicozilarea glicolipidelor în special a cerebrozidelor şi gangliozidelor (foarte activă în creier şi rinichi ) se realizează prin glicoziltransferaze specifice. c) Sulfatarea se produce la nivelul compartimentului Golgi trans, prin intermediul sulfotransferazelor, care transferă grupări sulfat pe glicoproteine, proteoglicani, glicolipide (de exemplu din cerebrozide rezultă sulfatide). d) Clivajul proteolitic specific se realizează prin scindarea unor porţiuni din lanţul polipeptidic a moleculelor precursoare: din proalbumină rezultă albumină, din proinsulină sau proparathormon rezultă insulină şi respectiv, parathormon. 3. Concentrarea produşilor de secreţie se realizează fie la nivelul veziculelor de secreţie (în cazul pancreasului exocrin), fie, în majoritatea celulelor, la periferia sacilor golgieni. Concentrarea rezultă din formarea unor agregate prin interacţiuni electrostatice între produşii de secreţie şi complexe proteine-polizaharide cu sarcină opusă; rezultă scăderea presiunii osmotice şi ieşirea apei din compartiment. 4. Rol în biogeneza membranelor. După cum am prezentat anterior, permanenta înmugurire şi fuzionare a veziculelor de pe parcursul căii de sinteză-secreţie şi a căii de endocitoză conduce la formarea unor compartimente celulare delimitate de membrane (diferite compartimente golgiene, lizozomale şi ale reticulului endoplasmic); putem afirma astfel că aparatul Golgi intervine activ în reglarea traficului de membrane. Pe de altă parte, prin fuziunea cu membrana plasmatică, veziculele cu produşi de secreţie furnizează membranei constituenţi specifici lipo-proteici. Prin aportul de constituenţi membranari, aparatul Golgi participă la creşterea suprafeţei membranelor plasmatice, deci participă la procesul de reciclare al membranelor. Menţinerea constantă a suprafeţei membranei plasmatice este asigurată de procesul de endocitoză. 5. Rol în geneza lizozomilor (vezi cap.”Lizozomi”). Biogeneza aparatului Golgi Modul de vehiculare intracelulară a produşilor de secreţie demonstrează că reţeaua golgiană se reînnoieşte continuu. Veziculele de tranziţie care se formează din membranele reticulului, fuzionează în compartimentul cis, formând saci golgieni. Aceştia sunt în permanenţă împinşi spre faţa trans de formarea altor saci în reţeaua cis (fig.VII.43). Aparatul Golgi este o structură dinamică motiv pentru care faţa pe care se formează noi saci este denumită faţă de formare iar faţa pe care sacii cei mai vechi se fragmentează în vezicule este denumită faţă de maturare. Prin autoradiografie s-a estimat că timpul de formare a unui sac golgian este în medie de 3-4 minute. Înnoirea sacilor golgieni este un proces etapizat, care se desfăşoară în direcţia cis→trans:

• veziculele de tranziţie înmuguresc din zone ale reticulului endoplasmic fără ribozomi ataşaţi; • prin fuziune veziculele dau naştere unui sac golgian foarte fenestrat; • noul sac este împins spre compartimentul median de către alte vezicule care se aglomerează în compartimentul cis; în cursul migrării sacul îşi schimbă morfologia, se dilată şi devine din ce în ce mai puţin fenestrat; • ajuns pe faţa de maturare sacul golgian suferă o nouă fragmentare dând naştere la vezicule de secreţie.

Fig.VII.43. Biogeneza aparatului Golgi

3.2.4. TRAFICUL INTRACELULAR DE VEZICULE Toate celulele trebuie să comunice cu mediul înconjurător. În acest scop, celula eucariotă şi-a dezvoltat o reţea de endomembrane care îi permite să internalizeze macromolecule (prin endocitoză) pe care apoi le “livrează” enzimelor digestive stocate în lizozomi; de asemeni, metaboliţii rezultaţi din digestie sunt transportaţi din lizozomi în citosol pe măsură ce se produc. Pe de altă parte, sistemul de endomembrane permite celulei eucariote să controleze procesul de

exocitoză a proteinelor şi glucidelor nou sintetizate. Deoarece moleculele care sunt transportate de-alungul căii de biosintezăsecreţie traversează multiple compartimente, celula are capacitatea de a modifica aceste molecule printr-o serie de etape controlate, să le stocheze, apoi să le elibereze la nivelul unui domeniu specific al suprafeţei celulare, prin procesul de exocitoză. Lumenele compartimentelor situate pe căile biosinteză-secreţie şi endocitoză se găsesc într-o permanentă comunicare unele cu celelalte, fie direct, fie prin intermediul numeroaselor vezicule de transport care înmuguresc continuu de pe o membrană pentru a fuziona cu alta. Acest trafic este foarte bine organizat: • Calea de biosinteză-secreţie este centrifugă, cu plecare din reticulul endoplasmic, trecând prin aparatul Golgi spre suprafaţa celulei (cu o deviaţie care conduce la formarea lizozomilor); • Calea endocitozei este centripetă, cu plecare de la membrana plasmatică în direcţia endozomilor şi lizozomilor. Pentru a-şi îndeplini funcţia, fiecare veziculă de transport care înmugureşte dintr-un compartiment, nu trebuie să conţină decât anumite categorii de proteine şi să fuzioneze numai cu membrana adecvată. De exemplu, o veziculă care transportă o încărcătură de la aparatul Golgi la membrana plasmatică, trebuie să excludă proteinele destinate a rămâne în aparatul Golgi şi trebuie să fuzioneze numai cu membrana plasmatică. Cu toate că conlucrează la realizarea acestor căi de transport, fiecare compartiment trebuie să-şi menţină o identitate distinctă.

În cadrul căii de biosinteză-secreţie, aparatul Golgi reprezintă o staţie de vehiculare şi sortare (triere, segregare) a produşilor proveniţi din reticulul endoplasmic. Compartimentele cis, median şi trans ale aparatului Golgi realizează triajul, ambalarea şi vehicularea produşilor sintetizaţi, în funcţie de necesităţile celulei în sine sau de necesităţile altor celule, după cum urmează: 1. Proteinele destinate reticulului endoplasmic sunt menţinute în reticul de către un semnal specific de retenţie (peptid semnal). Există şi cazuri în care aceste proteine sunt eliberate şi transportate prin intermediul veziculelor la reţeaua cis golgiană. Membranele golgiene de la acest nivel prezintă receptori care recunosc semnalul peptidic de retenţie în reticulul endoplasmic. Membranele din compartimentul cis au astfel posibilitatea de a încorpora enzimele purtătoare a acestui semnal în vezicule de transport special şi de a le returna reticulului endoplasmic (fig.VII.44).

Fig.VII.44. Mecanismul de reţinere a proteinelor rezidente în RE

2. Proteinele destinate matricei lizozomale parcurg compartimentele golgiene în direcţia cis → trans. În reţeaua trans golgiană, enzimele lizozomale sunt separate de celelalte proteine de către un receptor proteic membranar care recunoaşte manozo6-fosfatul. 3. Veziculele de transport destinate membranei plasmatice părăsesc reţeaua trans în flux constant. Proteinele şi lipidele din membrana acestor vezicule aduc constituenţi noi pentru membrana plasmatică, pe când proteinele solubile din interiorul veziculelor sunt secretate în spaţiul extracelular. Fuziunea veziculelor cu membrana plasmatică realizează exocitoza. În acest fel, celulele produc şi secretă cea mai mare parte din proteoglicanii şi glicoproteinele matricei extracelulare. Toate celulele beneficiază de această cale de secreţie numită constitutivă (fig.VII.45). Celulele secretorii posedă şi o a doua cale, de secreţie controlată. În aceste celule, secreţia se produce ca răspuns la un semnal extracelular. Produsul de secreţie poate fi reprezentat de o moleculă mică (histamina) sau de o macromoleculă (hormon, enzimă digestivă). Proteinele destinate veziculelor de secreţie (numite frecvent şi proteine de secreţie) sunt ambalate în membrane aparţinând reţelei trans golgiene prin intermediul unui mecanism care implică agregarea selectivă a proteinelor de secreţie. Semnalul de triere care dirijează proteinele de secreţie spre aceste agregate este necunoscut. Veziculele de secreţie conţin proteine membranare particulare dintre care multe pot servi ca receptori pentru materialul agregat în reţeaua trans

golgiană.

Fig.VII.45. Secreţia constitutivă şi secreţia controlată

În momentul desprinderii din reţeaua trans, veziculele de secreţie sunt acoperite de clatrine. Ulterior, învelişul de clatrine este eliminat, iar conţinutul veziculelor devine foarte condensat (de aproximativ 200 de ori mai electronodens decât în lumenul aparatului Golgi). Condensarea se produce brusc şi este provocată de o acidifiere a lumenului veziculei, indusă de o pompă de H + cu activitate ATPazică, localizată în membrana veziculelor. Condensarea produşilor are ca scop exocitarea rapidă a unei mari cantităţi de material ca răspuns a unei stimulări externe ca de exemplu exocitarea insulinei din celulele β ale pancreasului după ingestia de glucide. După ce au fost stocate, veziculele de secreţie trebuie să-şi găsească situsul specific de legare la membrana plasmatică, acolo unde se va produce exocitoza. În unele celule, situsul de secreţie se află la mare distanţă de aparatul Golgi. Exemplul cel mai reprezentativ îl constituie celulele nervoase în care, neurotransmiţătorii peptidici ambalaţi în soma neuronală trebuiesc exocitaţi la nivelul butonului terminal al axonului. Vehicularea acestor produşi este mediată de prezenţa microtubulilor axonali care orientează circulaţia în aval. Microtubulii au un rol similar în ghidarea

veziculelor de secreţie din celulele epiteliale polarizate spre suprafaţa celulară. În cazul secreţiei controlate, fuziunea veziculelor de secreţie cu membrana plasmatică urmată de exocitoză, este un mecanism comandat de un stimul extern, care se derulează de o manieră specifică. Locul de ataşare şi fuziune al veziculelor este determinat de prezenţa la nivelul membranei plasmatice a unor receptori specifici, capabili de a recunoaşte şi cupla proteine specifice de pe membrana veziculelor. Transportul veziculelor între compartimentele citoplasmatice este extrem de selectiv. În drumul său citoplasmatic, o veziculă întâlneşte multe membrane potenţial „ţintă”, dar numai cu una trebuie să fuzioneze. Se consideră că etapa de recunoaştere este controlată de două clase de proteine: • proteinele SNARE care determină specificitatea fuzionării veziculelor cu membranele ţintă. În celulele animale au fost descrise cel puţin 20 de tipuri cu localizare specifică şi formează două grupe complementare: SNARE-v în membranele veziculelor şi SNARE-t (target) în membranele ţintă. • familia de proteine Rab care reglează stocarea iniţială şi ataşarea veziculelor la membranele ţintă. Fuziunea este un proces energodependent, realizat cu participarea proteinelor Rab care prezintă activitate GTPazică (fig.VII.46).

Fig.VII.46. Rolul proteinelor SNARE în ghidarea transportului vezicular (după Alberts, 2002)

3.3. DIGESTIA INTRACELULARĂ

LIZOZOMII

Lizozomii sunt organite implicate în digestia intracelulară. Au fost descoperiţi înainte de a fi fost vizualizaţi în microscopie electronică prin tehnica de fracţionare celulară, de către Christian de Duve în 1950. Prin studii biochimice asupra enzimelor din omogenatele hepatice s-a observat că activitatea fosfatazei acide este mult mai mare în omogenatele obţinute în apă distilată sau în cele conservate necorespunzător. De aici a rezultat o concluzie simplă şi logică: existenţa în celulă a unor vezicule membranare ce conţin o serie de enzime hidrolitice implicate în digestia celulară a macromoleculelor, vezicule care au fost numite lizozomi. Distrugerea membranelor lizozomale din extractele celulare, indusă prin liză osmotică sau prin conservare necorespunzătoare, eliberează aceste enzime. Ulterior (1956) lizozomul a fost vizualizat ca organit celular prin microscopie electronică de către Novikoff şi a fost descris ca o veziculă cu conţinut enzimatic crescut, limitată de o membrană. Structură şi ultrastructură Lizozomii sunt prezenţi în toate celulele cu excepţia hematiei adulte, dar sunt mai bine reprezentaţi în celulele implicate în mecanismele de apărare nespecifică (microfage şi macrofage). În microscopia optică se evidenţiază prin coloraţii bazice ca APT Drăgan, Azur II şi prin metode citoenzimatice de evidenţiere a fosfatazei acide (metoda Gömöri). Apar de aspect granular, cu diametre de 0,25 -1,5 μm. În microscopia electronică apar delimitaţi de o membrană simplă cu o grosime de 7-8 nm, trilaminată. Matricea lizozomală prezintă aspecte diferite: omogenă, fin granulară sau heterogenă, ceea ce conferă un polimorfism lizozomal în fiecare celulă. Organizarea biochimică a fost stabilită prin analiza lizozomilor separaţi prin ultracentrifugare diferenţială: a) membrana lizozomală este de natură lipoproteică. Proteinele membranare sunt reprezentate de: • proteine transportoare pentru produşii rezultaţi în urma digestiei macromoleculelor; • pompa de protoni care utilizează ATP pentru a pompa H+ în interiorul lizozomilor, menţinând astfel pH-ul în lumen la valoarea 5 (fig.VII.47);

• proteine membranare glicozilate orientate cu lanţurile oligozaharidice spre lumen; se presupune că ele asigură protecţia membranelor lizozomale împotriva acţiunii litice a enzimelor lizozomale.

Fig.VII.47. Menţinerea pH ului acid este realizată de o ATP ază membranară care pompează H+ în lizozomi

Grupul enzimatic Fosfataze Nucleaze Proteaze

Polizaharidaze

Sulfataze Lipaze

Tipul enzimatic fosfataza acidă fosfodiesteraza acidă ribonucleaza dezoxiribonucleaza catepsina A,B,C colagenaza peptidaza β-galactozidaze α-glucozidază β-hexozaminidaza β-glucuronidaze lizozim hialuronidază acetil-hexozaminidază Arilsulfatază condroitinsulfatază Lipaza fosfolipaza ceramidaza

Substratul pe care acţionează fosfomonoesteri oligonucleotide ARN ADN proteine colagen peptide galactozide glicogen glicolipide polizaharide şi GAG polizaharide din peretele bacterian acid hialuronic sulfaţi organici trigliceride fosfolipide ceramide

Tabel VII.V. Exemple de enzime hidrolitice conţinute de lizozomi

b) matricea se caracterizează printr-un conţinut crescut în hidrolaze acide. Au fost descrise aproximativ 40 de tipuri de enzime hidrolitice reprezentate de: proteaze, glicozidaze, lipaze, fosfolipaze, fosfataze, sulfataze şi nucleaze (tabel VII.V), care pot degrada orice component organic. În condiţii normale, enzimele se caracterizează prin latenţă devenind active la un pH de 5. Latenţa enzimelor se datorează integrităţii membranelor lizozomale şi, chiar dacă acestea sunt lezate, dependenţa acţiunii enzimatice de pH protejează componentele citosolului (care are pH 7,2) deoarece enzimele devin inactive la pH de 7,2. Originea lizozomilor Cunoştinţele actuale au demonstrat că formarea lizozomilor este un proces complex, realizat în multiple etape: 1. Producerea endozomilor tardivi este un mecanism realizat cu participarea aparatului de sinteză şi secreţie celulară (fig.VII.48): • enzimele lizozomale se sintetizează la nivelul poliribozomilor ataşaţi RE; • de aici sunt transportate în lumenul RE, unde li se ataşează oligozaharide Nlinkate; • în zona cis a aparatului Golgi, una sau mai multe manoze din aceste oligozaharide sunt fosforilate. Manoza fosforilată la atomul 6 de C reprezintă un semnal chimic care orientează aceste molecule înspre membranele de pe faţa trans a aparatului Golgi unde există o proteină receptor numită manozo-6-fosfat (M6P). Acest receptor se leagă specific de proteinele care au M6P şi care au fost transportate aici. Regiunile membranare care conţin M6P se segregă în zona trans de unde se desprind vezicule îmbrăcate în clatrină şi astfel este împiedicată acţiunea litică a enzimelor lizozomale. Receptorii pentru M6P pot realiza cuplarea cu ligandul specific (M6P), la un pH neutru, existent în aparatul Golgi. Cuplarea nu are loc la un pH acid cum este cel din veziculele de sortare. În acest fel, doar în momentul în care enzimele lizozomale ajung la nivelul veziculelor de sortare vor fi eliberate de pe receptori în lumen, devenind active. • ulterior, o fosfatază îndepărtează fosfatul de pe manoză. Astfel, veziculele care conţin enzimele lizozomale se separă de veziculele de sortare, devenind endozomi tardivi. Ca şi alţi receptori celulari, receptorii M6P vor fi reciclaţi, acest mecanism nefiind complet elucidat. • Veziculele segregate în zona trans îşi pierd învelişul de clatrine devenind endozomi tardivi. 2. Formarea lizozomilor Matricea endozomului tardiv are pH 6 şi conţine precursorii inactivi ai enzimelor (proenzime). Acestea trebuie să treacă printr-un proces de maturare pentru a deveni active, proces care constă în degradare proteolitică, prin care enzima

inactivă este scurtată devenind astfel enzimă matură, activă. Procesul are loc atunci când mediul din matricea endozomilor tardivi devine foarte acid, pH ul scade la 5. Acesta este momentul în care endozomii tardivi dau naştere la lizozomi.

Fig. VII.48. Transportul hidrolazelor lizozomale de la RE la lizozom (după Alberts)

În funcţie de provenienţă, materialele care urmează a fi degradate sunt livrate lizozomilor pe trei căi (fig.VII.49): 1. endocitoza macromoleculelor odată cu lichidul extracelular (pinocitoza) conduce la formarea de vezicule numite endozomi precoce. Aceste macromolecule vor trece apoi în endozomii tardivi unde vor lua un prim contact cu hidrolazele acide. Digestia intracelulară începe deci în endozomii tardivi, dar se va finaliza în lizozomi sub acţiunea enzimelor active la pH 5.

Fig.VII.49. Cele trei căi de aport a materialelor de degradare până la nivelul lizozomilor (după Alberts, 2002)

2. autofagia este procesul de degradare a self-ului alterat. Fiecare moleculă, macromoleculă sau organit are un turnover. De exemplu, durata de viaţă a unei mitocondrii este de aproximativ 10 zile, a peroxizomilor de 2-3 zile. Organitele îmbătrânite sunt degradate de lizozomi prin procesul de autofagie; veziculele care înglobează şi conduc componentele celulare uzate la lizozomi poartă numele de autofagozomi. 3. fagocitoza este un proces care caracterizează celulele cu rol fagocitar. Reamintim că procesul conduce la degradarea bacteriilor, virusurilor, fragmentelor celulare, celulelor îmbătrânite şi moarte. În timpul procesului de fagocitoză, materialul endocitat este învelit de un fragment de membrană celulară ceea ce conduce la formarea unei vezicule numite fagozom; fagozomul reprezintă a treia cale de aducere a materialului destinat degradării în contact cu enzimele lizozomale. Roluri şi activităţi fiziologice Datorită conţinutului enzimatic, lizozomii intervin în viaţa celulară asigurând digestia produşilor nutritivi ingeraţi de celule, degradarea sau stocajul deşeurilor provenite din metabolismul celular, cât şi distrugerea organitelor celulare a căror durată de viaţă este limitată. În funcţie de tipul celular, lizozomii prezintă o serie de activităţi particulare: Celulele sistemului fagocitar mononuclear sunt celule specializate în apărarea şi curăţirea organismului. Ele endocitează elemente celulare îmbătrânite şi microorganisme străine, care sunt apoi distruse prin acţiunea enzimelor eliberate de lizozomi. Excepţie fac microorganismele numite “infecţioase” care reuşesc să se sustragă distrucţiei lizozomale, sau care după distrucţie eliberează endotoxine. Celulele tubilor contorţi distali ai nefronului sunt celule specializate în reabsorbţia apei, aminoacizilor, glucozei şi a unei mari cantităţi de săruri minerale conţinute de filtratul glomerular (urina primară); în acest caz, lizozomii asigură degradarea proteinelor reabsorbite. Celulele secretoare ale glandelor endocrine; în acest tip celular, lizozomii realizează digestia secreţiilor hormonale excedentare. Fenomenul poartă numele de crinofagie. Spermatozoizi. În cursul procesului de spermiogeneză, lizozomii spermatidelor fuzionează şi formează acrozomul. Astfel, enzimele litice lizozomale participă la liza coroanei radiata şi a membranei pelucida, favorizâd penetrarea nucleului spermatozoidului în ovocit. Fenomene de autofagie. În afară de intervenţia în turnoverul organitelor celulare,

lizozomii sunt implicaţi în remanierea tisulară din cursul vieţii fetale cum sunt perforarea pupilei şi dispariţia membranei interdigitale. Remanierea osoasă în cursul dezvoltării oaselor, dar şi în urma unei fracturi, lizozomii osteoclastelor determină digestia matricei organominerale prin eliberarea hidrolazelor lizozomale în matricea extracelulară. Implicaţii medicale 1. Boli datorate unei activităţi scăzute a hidrolazelor a) Boli determinate genetic Până la ora actuală au fost descrise mai mult de 40 de tipuri de enzime lizozomale, fiecare dintre ele fiind responsabilă de digestia unui substrat organic. Absenţa sau malsinteza uneia dintre hidrolazele lizozomale determină imposibilitatea digestiei substratului şi acumularea acestuia până la intoxicarea funcţiilor citoplasmei şi moartea celulei. Bolile de această natură sunt determinate genetic şi sunt transmise autozomal recesiv. Cele mai afectate organe sunt ficatul, creierul, musculatura şi splina. Acumularea se produce în ani şi conduce progresiv la degenerarea celulară şi implicit la moartea individului. Maladiile fac parte dintr-un grup numit „tezaurismoze lizozomale” şi pot fi clasificate în funcţie de natura substratului după cum urmează: • Lipidoze - caracterizate de acumulări lipidice: boala Gaucher datorată absenţei glucocerebrozidazelor, boala Niemann-Pick datorată absenţei sfingomielinazei, boala Tay-Sachs datorată absenţei gangliozidazelor etc. • Glicogenoze - caracterizate de acumulări citoplasmatice de glicogen: boala Von Gierke caracterizată de deficitul în glucozo-6-fosfatază, maladia Pompe datorată absenţei α-1,4-glucozidazei etc. b) Boli dobândite în timpul vieţii Tezaurizarea se poate produce şi în cazul endocitozei excesive a unui substrat “nedigerabil” de natură anorganică sau pigmentară: • Hemosiderozele - acumularea de hemosiderină (pigment brun rezultat din degradarea hemoglobinei) în celulele sistemului fagocitar mononuclear. • Antracoza - acumulare de praf de cărbune în macrofagele pulmonare ale muncitorilor din minele de cărbune. • Sideroza - acumulare de particule de fier în macrofagele pulmonare ale muncitorilor din industria de extracţie şi prelucrare a fierului. • Argiria apare în cazul administrării în cantităţi mari a medicamentelor care conţin săruri de argint.

2. Albinismul Melanocitele produc melanina pe care o stochează în lizozomi, numiţi în acest caz melanozomi. Melanozomii îşi descarcă conţinutul în matricea extracelulară prin exocitoză. În acest fel, pigmentul este absorbit de keratinocite, ceea ce determină pigmentarea normală a pielii. În cazul în care exocitoza pigmentului este blocată apare hipopigmentarea pielii, maladie genetică cunoscută sub denumirea de „albinism”. Fiind maladii genetice, bolile lizozomale nu beneficiază la ora actuală de tratament curativ. Există doar încercări de terapie genică aflate în stadiu de experiment. Aceste încercări constau în transferul de gene terapeutice prin intermediul unui vector viral. În cazul maladiei Gaucher de tip I s-a încercat tratarea pacienţilor cu glucocerebrozidază purificată din placenta umană. Din păcate, metoda de extragere este extrem de costisitoare şi laborioasă: pentru tratamentul unui bolnav timp de un an sunt necesare 10-12 tone de placentă umană, ceea ce corespunde la 50.000 de naşteri.

3.4. ORGANITELE CONVERSIEI DE ENERGIE MITOCONDRIILE Toate vieţuitoarele necesită o mare cantitate de energie pentru asigurarea funcţiilor lor biologice: sinteze, transport de substanţe, menţinerea temperaturii corporale şi a presiunii osmotice etc. În celulele animale aproape toată energia necesară menţinerii vieţii este produsă de mitocondrii, organite citoplasmatice al căror ansamblu alcătuieşte condriomul. Mitocondriile sunt prezente în toate celulele eucariote. Lipsesc la bacterii, la celulele plantelor lignificate, la celulele cu metabolism anaerob şi la hematiile adulte. În eucariotele vegetale, cloroplastele sunt organitele care captează energia luminoasă şi o transformă în energie chimică în cursul procesului de fotosinteză. La procariote, reacţii asemănătoare celor din mitocondrii şi cloroplaste sunt catalizate de sisteme enzimatice localizate în membrana plasmatică la nivelul mezozomilor. 3.4.1. Structură şi ultrastructură Mitocondriile au fost descoperite şi descrise în celula animală de W.Fleming

(1882) şi R.Altmann (1890). Denumirea de mitocondrii a fost dată de C.Benda (1897). Microscopia optică a permis descrierea următoarelor caractere morfologice: Forma este în general alungită, dar ea variază de la un tip celular la altul. În microscopia optică, mitocondriile se evidenţiază pe preparatele proaspete cu colorantul verde Yanus iar pe preparatele fixate se colorează cu hematoxilină ferică Regaud. Studiile în MO au descris trei forme numite „statice” ale mitocondriilor (fig.VII.50): forma granulară corespunde denumirii de mitocondrii (a), şiraguri de granule numite condriomite (b) şi forma alungită sau de bastonaş care corespunde condriocontelor (c). Forma este dependentă de respiraţie şi fosforilare, observânduse modificări în anaerobioză sau la administrarea de ATP. La microscopul cu contrast de fază, pe preparatele proaspete se observă modificări continue ale formei dependente de diferenţierea celulară, starea de nutriţie, administrarea unor hormoni sau medicamente în condiţii patologice (fig.VII.51).

Fig.VII.50. Forme „statice” ale mitocondriilor in vitro pe preparatele fixate

Fig.VII.51. Modificările de formă a mitocondriilor in vivo

Dimensiunile mitocondriilor sunt variabile. Diametrul longitudinal este cuprins între 1şi 5μ iar cel transversal între 0,1 şi 0,5μ. Dacă mitocondriile au o formă filamentoasă cum este cazul celor pancreatice, diametrul longitudinal poate ajunge până la 10μ. Studiile in vivo demonstrează că dimensiunile mitocondriilor se modifică în permanenţă prin fuziuni şi fragmentări. Numărul mitocondriilor dintr-o celulă este diferit în funcţie de tipul celular, vârsta

celulei şi activitatea metabolică a acesteia. Astfel, hepatocitul, o celulă foarte activă, conţine până la 1000 de mitocondrii, nefrocitul 300 de mitocondrii iar spermatozoidul are 24 de mitocondrii dispuse în jurul axonemei piesei intermediare etc. În concluzie, cu cât activitatea celulei este mai intensă, numărul mitocondriilor este mai mare şi proporţional creşte şi suprafaţa ocupată de acestea în celulă. Dispoziţia intracelulară variază în funcţie de tipul celular şi de nevoile energetice de moment ale celulei. Pe preparatele proaspete observate la microscopul cu contrast de fază, mitocondriile prezintă mişcări generate de curenţii citoplasmatici precum şi mişcări numite "salturi" mitocondriale. La ora actuală, aceste salturi mitocondriale sunt explicate prin ataşarea lor la microtubuli; permanenta modificare de dimensiune şi direcţionare a microtubulilor are rol în poziţionarea mitocondriilor în locul de maxim consum energetic (vezi rolurile microtubulilor). În general, mitocondriile se aglomerază acolo unde nevoile energetice ale celulei o cer: - se aglomerează la polul de exocitoză: în nefrocite şi enterocite la polul bazal, iar în celulele secretorii la polul apical; - în jurul nucleului în faza S (sintetică) a ciclului celular, în vederea furnizării de energie necesară sintezei de acid dezoxiribonucleic; În funcţie de tipul celular: - în spermatozoid sunt dispuse helicoidal în jurul axonemei piesei intermediare unde generează energia necesară mişcării; - în celula musculară sunt aranjate regulat între miofibrile; - în neuroni mitocondriile se condensează în soma neuronală în jurul reticulului endoplasmic (care sintetizează în permanenţă neurotransmiţători) şi în butonul terminal (pentru a genera energia necesară exocitozei neurotransmiţătorului); - în pancreasul exocrin sunt asociate reticulului endoplasmic rugos care sintetizează enzime digestive; - în hepatocite sunt răspândite pe toată aria celulară deoarece reticulul endoplasmic hepatic este extrem de bine reprezentat pentru a asigura multiplele funcţii ale hepatocitului (vezi funcţiile RE). Microscopia electronică a demonstrat că ultrastructura mitocondriei este adaptată ideal funcţiei de producere a ATP. Descoperirea ultrastructurii mitocondriilor este una din primele achiziţii ale microscopului electronic, iar reuşita ei se datoreşte tehnicii de fixare pusă la punct de George Emil Palade (1953), cercetător de origine română, laureat al Premiului Nobel. Indiferent de formele observate în MO sau de originea lor, toate mitocondriile au aceeaşi ultrastructură, alcătuită de la exterior spre interior din: membrană externă, spaţiu perimitocondrial, membrană internă şi matrice mitocondrială (fig.VII.52).

Fig.VII.52. Elementele ultrastructurale ale mitocondriei (după Berkaloff)

3.4.2. Organizarea moleculară a componentelor ultrastructurale 3.4.2.1. Membrana externă este trilaminată, de natură lipoproteică, conţine 60% proteine şi 40% lipide, este netedă şi are o grosime de 6nm. Lipidele sunt reprezentate de fosfolipide, o mare cantitate de colesterol şi foarte puţină cardiolipină (difosfatidilglicerol), ceea ce îi conferă o permeabilitate crescută pentru moleculele hidrofobe; prin membrana externă se realizează schimburile dintre citosol şi organit. Componenta proteică majoră a membranei este o proteină integrală numită porină. Aceasta are capacitatea de a forma canale permeabile pentru molecule cu greutate moleculară sub 10.000 de daltoni. Aşadar, spaţiul perimitocondrial şi citoplasma pot fi considerate ca fiind un compartiment continuu pentru molecule mai mici de 10kD. Membrana externă conţine şi un mare număr de enzime. Dintre acestea amintim ca enzime marker: coenzima A ligaza care facilitează trecerea acizilor graşi din citosol şi monoaminoxidaza (MAO) care catalizează reacţiile de dezaminare ale mono şi diaminelor. 3.4.2.2. Spaţiul perimitocondrial are o grosime de 7-8nm, este omogen şi electronoclar în microscopia electronică. Are rol activ în transportul substanţelor din citosol în matrice şi invers. Conţinutul enzimatic este bogat în adenilatkinază, enzimă care menţine raportul ATP/ADP/AMP şi nucleoziddifosfokinază. În cazuri patologice în acest spaţiu se acumulează materiale organice de tipul sărurilor de calciu care apar electonodense în M.E.

3.4.2.3. Membrana internă are o grosime de 7,5nm este trilaminată şi lipoproteică. Spre deosebire de membrana externă care este lisă, membrana internă prezintă invaginări numite criste mitocondriale. Dacă luăm în considerare faptul că marea majoritate a funcţiilor mitocondriale sunt realizate la nivelul membranei interne, se înţelege că prezenţa cristelor mitocondriale conferă o creştere considerabilă a suprafeţei de reacţie. Din punct de vedere morfologic cristele diferă de la un tip celular la altul (fig.VII.53) şi se caracterizează prin următorii parametri:

Fig.VII. 53. Forma şi dispoziţia cristelor mitocondriale

Forma: lamelară, tubulară, veziculoasă. Pe secţiune au formă saculară, prismatică sau în zig-zag. Sunt scurte sau lungi, mai rar o cristă poate traversa mitocondria. Poziţia: perpendiculare sau paralele faţă de axul longitudinal, spiralate, radiare. Numărul cristelor este mai mare în celulele aflate în plină activitate şi mai mic în perioadele de repaus celular. În bolile mitocondriale, cristele au tendinţa la dispariţie. Deoarece raportul între componente este mult în favoarea proteinelor, membrana internă este considerată a fi cea mai funcţională endomembrană celulară. • Lipidele reprezintă 20% din structura membranei interne şi sunt reprezentate de fosfolipide cu o concentraţie crescută de cardiolipină. Absenţa colesterolului şi prezenţa cardiolipinei conferă membranei interne un grad înalt de impermeabilitate, de ,,barieră” între spaţiul perimitocondrial şi matricea mitocondrială. • Proteinele reprezintă 80% din membrana internă şi constituie o cincime din totalul proteinelor mitocondriale. Această cantitate mare de proteine conferă membranei interne o intensă activitate funcţională, deoarece la nivelul acesteia au loc mecanisme de sinteză a ATP, se desfăşoară transportul piruvatului şi al acetil coenzimei A spre matrice şi a produşilor proveniţi din fosforilarea oxidativă spre interiorul şi în afara mitocondriei. În funcţie de rolurile pe care le îndeplinesc, proteinele din membrana mitocondrială internă pot fi clasificate în trei mari clase: a) constituenţii lanţului respirator şi enzimele asociate

Constituenţii lanţului respirator sunt transportori de electroni care catalizează reacţiile de oxidoreducere (fig.VII.54). Există două categorii: unii transportă simultan electroni şi protoni cum sunt dehidrogenaza flavoproteică şi hidroquinona, alţii nu transportă decât electroni şi sunt metaloproteine de tipul citocromilor şi a proteinelor fier-sulf: - NADH dehidrogenaza catalizează transferul a 2 electroni de la NADH la un acceptor care este în acest fel redus; - ubiquinona (coenzima Q) poate primi electroni de la NADH şi de la FADH2; - citocromii care alcătuiesc lanţul respirator mitocondrial sunt b, c1, c, a şi a3. Citocromii a şi a3 sunt asociaţi într-un complex numit citocrom oxidază care transferă electronii la oxigenul molecular; - proteinele fier-sulf conţin fier şi sulf în proporţie equimoleculară. Fierul îşi poate schimba valenţa şi permite astfel transportul electronilor. În această categorie se încadrează NADH dehidrogenaza şi succindehidrogenaza; - în celulele care sintetizează hormoni steroizi, membrana internă mitocondrială prezintă încă un lanţ transportor de electroni care cuprinde citocrom P450; acesta, împreună cu cel al reticulului endoplasmic neted participă la realizarea etapelor steroidogenezei.

Fig.VII.54. Constituenţii lanţului respirator

b) ATP aza mitocondrială Prin aplicarea tehnicilor de coloraţie negativă în microscopia electronică, pe faţa matricială a membranei interne s-a descris prezenţa unor subunităţi de membrană de natură proteică, responsabile de producerea ATP şi care au fost denumite ATP-sintetază. O astfel de particulă este formată din trei piese: bază, gât şi cap. Distanţa între bazele oxizomilor este de aproximativ 10nm. Structura particulelor elementare cuprinde:

- porţiunea F0, o bază hidrofobă integrată în membrană, care traversează bistratul molecular lipidic. Această porţiune conţine 5-8 subunităţi clasificate în entităţile a, b, c. Primele două au rol în conducerea protonilor, iar subunitatea c este de natură proteolipidică. Pe lângă aceste componente, porţiunea F0 mai conţine şi 2-5 proteine accesorii. - porţiunea F1 este ataşată porţiunii F0, spre matricea mitocondrială. F1 are formă sferică şi reprezintă porţiunea catalitică a complexului, fiind alcătuită din 9 subunităţi notate în felul următor: 3 dintre ele cu , 3 cu , una cu , una  şi alta . Toate au o structură oligomerică. Subunităţile  au rol de catalizare a conversiei ADP → ATP. Subunităţile  au rol reglator al nivelului ADP/ATP. Rolul comun al subunităţilor  şi  este acela de a lega porţiunea F1 de porţiunea F0. Rolul subunităţii  este încă necunoscut (fig.VII.55). Fiecărei ATP sintetaze îi corespunde un lanţ respirator. Aşadar se poate spune că numărul ATP azelor este egal cu cel al lanţurilor respiratorii pe mitocondrie. Acest număr diferă în funcţie de tipul celular şi activitatea metabolică a celulei. De exemplu: celulele hepatice au 15.000 de astfel de subunităţi membranare per mitocondrie spre deosebire de cele cardiace care conţin între 40.000 şi 50.000.

Fig.VII.55. Structura ATP sintetazei

c) transportorii specifici După cum am prezentat anterior, membrana internă prezintă un grad crescut de impermeabilitate, motiv pentru care transporturile pasiv şi activ trebuiesc controlate de canale sau transportori specifici de natură proteică sau glicoproteică. Astfel, au fost studiaţi: - transportorul ADP-ATP, - transportorii acizilor dicarboxilici, - transportorii acizilor tricarboxilici,

-

transportorii aminoacizilor, transportori pentru acizii graşi, transportori pentru fosfat, transportori de cationi (de exemplu Ca++), transportori pentru CO2 şi O2.

3.4.2.4. Matricea mitocondrială Matricea conţine enzime implicate în oxidarea piruvatului şi a acizilor graşi, precum şi cele mai multe dintre enzimele care participă la realizarea ciclului acidului citric (ciclul Krebs sau ciclul tricarboxilic). Tot la nivelul matricei sunt localizate genomul mitocondrial, ARN-uri mitocondriale şi mitoribozomii. ADN-ul mitocondrial este bicatenar, helicoidal, circular, neconjugat cu proteine, asemănător cu cel de la procariote; el reprezintă mai puţin de 1% din totalul ADN-ului celular. Compoziţia proteică a matricei este de aproximativ 500 mg/ml sau 50% din soluţia proteică. Din această cauză ea are consistenţă de gel cu aspect vâscos. În compoziţia chimică a matricei intră substanţe anorganice, apă, ioni minerali + (K , Na+, Mg2+, Ca2+) precum şi substanţe organice. 3.4.3. Funcţiile mitocondriei Mitocondriile sunt adevărate “termocentrale celulare“ care convertesc şi eliberează energia înmagazinată în substanţe organice simple (hidraţi de carbon, acizi graşi, aminoacizi) într-un compus macroergic şi anume ATP. La nivelul membranei interne mitocondriale, pe faţa sa matricială are loc finalizarea glicolizei aerobe; fiecare moleculă de glucoză, prin oxidare completă la CO2 şi H2O, produce 36 de molecule de ATP, comparativ cu glicoliza anaerobă în care o moleculă de glucoză generează două molecule de ATP. Celulele dispun de depozite de lipide (trigliceride) şi glucide (glicogen) în ţesutul adipos, ficat şi muşchi, pentru a asigura aportul continuu de acizi graşi şi piruvat. În cazul lipsei de aport exogen, rezervele de lipide sunt suficiente pentru o lună, iar cele de glicogen pentru o zi. Procesele metabolice localizate în mitocondrie pot fi încadrate în două clase principale: procese ale metabolismului energetic şi procese biosintetice. 3.4.3.1. Fosforilarea oxidativă a) Teoria cuplajului chemi-osmotic În 1961, Mitchell a presupus că producţia mitocondrială de ATP se realizează printr-un mecanism pe care el l-a denumit cuplaj chemi-osmotic. Mecanismul

presupune cuplarea reacţiei de producere a ATP („chimio”) cu procesul de transport transmembranar de tip pasiv („osmotic”). Mecanismul se realizează în două etape succesive şi presupune participarea proteinelor membranei interne mitocondriale (fig.VII.56).

Fig.VII.56. Etapele cuplajului chemi-osmotic

Transportul electronilor acţionează pompa de protoni care sunt pompaţi în spaţiul perimitocondrial. Aceasta determină realizarea unui gradient electrochimic de protoni, gradient ce reprezintă o formă de stocare a energiei. Revenirea protonilor în matricea mitocondrială are loc prin traversarea canalului ATP sintetazei şi catalizează formarea de ATP din ADP şi fosfat anorganic (Pi), proces numit fosforilare. b) Oxidaţia de substrat Mecanismul de furnizare a energiei presupune oxidarea prin dehidrogenare a alimentelor (glucide, proteine, lipide), oxidare care se realizează în trei etape: citoplasmatică, matricială şi membranară. • Primul nivel de degradare (etapa citoplasmatică) De la nivelul celulelor adipoase, acizii graşi liberi (AGL) sunt eliberaţi în sânge, traversează membrana plasmatică şi odată ajunşi în citoplasmă sunt convertiţi la acetil-coenzima A, care poate traversa membranele mitocondriale. Glucoza este convertită la piruvat prin intermediul căii glicolitice Embden Meyerhoff conform reacţiei : glucoză + 2 NAD+ + 2 ADP2- + 2 Pi

↓ 2 molecule piruvat +2 NADH + 2 ATP4- + 2 H+

Piruvatul astfel obţinut traversează membranele mitocondriale până în matrice. • Al doilea nivel de degradare (etapa matricială) Acil-coenzima A, provenită din oxidarea acizilor graşi, suferă un ciclu de reacţii care determină scurtarea moleculei cu 2 atomi de carbon şi producerea unei molecule de acetil-CoA pe ciclu (fig.VII.57).

Fig.VII.57. Oxidarea acizilor graşi la acetil-CoA

Acidul piruvic provenit din glicoliză intră în matricea mitocondrială unde suferă o decarboxilare oxidativă şi este convertit la acetil-CoA, substratul de bază al ciclului citric (Krebs). Reacţia de decarboxilare oxidativă este catalizată de complexul piruvat-dehidrogenază. Oxidarea acetil-CoA, pe parcursul fiecărei ture a ciclului citric, determină formarea următoarelor componente : 2CO2 - ce urmează a fi eliminat din celulă, 3NADH - nicotinamid-adenin-dinucleotid, 1FADH2 - flavin-adenin-dinucleotid. În esenţă ciclul citric (Krebs) este reprezentat în fig.VII.58.

Fig. VII.58. Etapele ciclului Krebs

Cele 3 molecule de NADH şi molecula de FADH2 transferă cîte 2 electroni pe moleculele acceptor situate la nivelul membranei interne mitocondriale. Acest fapt va determina reducerea oxigenului şi producerea apei (în cadrul lanţului respirator) şi concomitent producerea de ATP (fosforilarea). • Lanţul oxidaţiei de transfer (lanţul respirator) reprezintă un lanţ transportor de electroni (fig.VII.59) localizat la nivelul membranei interne în porţiunea sa externă. Transferul electronilor de la NADH şi FADH2 la oxigen este catalizat de o serie de electroni carriers asociaţi cu patru proteine complexe şi anume:

- complexul NADH dehidrogenază cu o greutate moleculară de 800kd, alcătuit din 22 peptide, - ubiquinona sau coenzima Q, - complexul citocromilor b-c1, - citocromoxidaza cu greutate moleculară de 300kd.

Fig.VII.59. Constituenţii lanţului respirator şi ATP sintetaza

Mecanismul de reacţie decurge în 3 etape: I. Complexul NADH dehidrogenază preia electronii de la NADH şi îi transferă ubiquinonei. II. Complexul b-c1 preia electronii de la ubiquinonă şi îi transferă citocromului c. Molecula de ubiquinonă este hidrofobă şi are posibilitatea de a se mişca în planul orizontal al membranei. În acest fel ea transferă electroni complexului b-c1. Acesta conţine 8 polipeptide care formează 2 lanţuri proteice cu 3 citocromi. Citocromii conţin o grupare hemică cu un atom de Fe3+ în momentul acceptării unui electron. Astfel citocromii şi ionii de fier participă la transferul perechilor de electroni de la ubiquinonă la citocromul c, spre periferia membranei. III. Complexul citocromoxidazei acceptă 4 electoni de la citocomul c şi îi predă oxigenului conform reacţiei: O2 + 4 H+ + 4 e- → 2 H2O. Citocromoxidaza este alcătuită din cel puţin 8 polipeptide care se asociază şi formează 2 proteine ataşate. Fiecare monomer proteic conţine 2 citocromi şi atomi de cupru cu rol de carrier. Aceştia acceptă electroni de la citocromul c şi îi transferă oxigenului. Odată cu transferul electronilor de la un complex proteic la altul are loc mişcarea protonilor dinspre faţă matricială spre faţa externă a membranei interne. Pomparea protonilor dinspre matrice spre spaţiul perimitocondrial conduce la realizarea unui gradient electrochimic de protoni, cu două efecte: 1. Crearea potenţialului electric de membrană. Potenţialul de membrană internă este de 160mV şi este negativ pe faţa matricială şi pozitiv pe faţa externă.

2. Realizarea unui gradient de pH: pH-ul spaţiului perimitocondrial şi citoplasmatic este de apoximativ 7, faţă de cel matricial care este de 8. • Cuplarea oxidaţiei cu fosforilarea (realizarea fosforilării oxidative) Finalitatea acestui proces este sinteza ATP-ului. Gradientul electrochimic de protoni realizează o forţă protonmotrice care acţionează în sensul atragerii protonilor în matrice. Pasajul lor spre matrice se realizează la nivelul complexului ATPsintetază şi catalizează sinteza de ATP conform reacţiei: ADP + Pi → ATP ATP-ul nou sintetizat trece din matricea mitocondrială în spaţiul perimitocondrial şi spre citoplasmă, printr-un sistem antiport cu ADP-ul. În concluzie, procesele metabolismului energetic la nivelul mitocondrial se realizează în trei etape. a. Oxidaţia de substrat în cadrul ciclului Krebs reprezintă pe de o parte calea finală a oxidării glucozei, lipidelor şi proteinelor, iar pe de altă parte este principala sursă de electroni pentru lanţul respirator. b. Lanţul oxidaţiei de transfer (lanţul respirator) determină formarea apei şi pomparea protonilor spre spaţiul perimitocondrial. c. Fosforilarea oxidativă are loc pe faţa matricială a membranei interne. Oxidarea unei molecule de NADH furnizează 3 molecule de ATP, iar a unei molecule de FADH2 generează 2 molecule de ATP. c) Factori care influenţează fosforilarea oxidativă • Realizarea gradientului electrochimic optim Imposibilitatea realizării gradientului electrochimic optim sau abolirea lui, determină imposibilitatea fosforilării ADP; în acest caz are loc un decuplaj al fosforilării. • Integritatea membranei interne Cuplajul energetic se poate realiza numai în cazul în care membrana internă este continuă, delimitează un compartiment complet închis şi este impermeabilă pentru fluxul de protoni. Experimental s-a demonstrat că dacă membrana internă este ruptă mecanic, transportul electronilor nu se mai cuplează cu fosforilarea. Mai mult, dacă fracţiunile submitocondriale sunt tratate cu dinitrofenol (DNP) care produce permeabilizarea membranei interne la protoni, are loc decuplajul fosforilării. • Intervenţia factorilor chimici Factorii chimici care influenţează mecanismul fosforilării oxidative, au fost demonstraţi experimental; rezumativ, pot fi clasificaţi în trei categorii, în funcţie de etapa şi locul acţiunii lor :

- Inhibitorii transferului de electroni determină blocarea pasajului electronilor într-o anumită etapă a lanţului respirator. Sunt reprezentaţi de: amital şi rotenonă care acţionează între NAD şi CoQ, antimicina A între citocrom b şi c1, cianura şi CO la nivelul citocromoxidazei. Datorită efectului lor de a bloca transferul de electroni, aceste substanţe se încadrează în categoria toxicelor. - Decuplanţii fosforilării oxidative împiedică sinteza ATP fără a influenţa pasajul electronilor prin lanţul respirator. Reprezentantul clasic este 2,4-dinitrofenolul. - Inhibitorii transferului de energie (inhibitorii fosforilării oxidative) produc blocarea transferului de energie de la lanţul respirator la ATP. De exemplu oligomicina, care inhibă respiraţia cuplată cu fosforilarea, dar nu influenţează respiraţia mitocondriilor decuplate, deoarece acţionează doar asupra porţiunii F0; după cum am văzut anterior, această porţiune poartă denumirea de OSCP (factor de conferire a sensibilităţii la oligomicină). 3.4.3.2. Producerea de precursori pentru diverse biosinteze Ciclul Krebs, a cărui reacţii se desfăşoară în matricea mitocondrială, intervine nu numai în degradarea substraturilor la CO2 şi H2O, ci el reprezintă şi o sursă a precursorilor utilizaţi în diverse biosinteze. Reacţiile ciclului sunt deci importante atât în catabolismul cât şi în anabolismul celular. Deoarece cea mai mare parte a biosintezelor se realizează în hialoplasmă, pot fi utilizaţi ca precursori doar acele substanţe care pot părăsi matricea mitocondrială, deci pentru care la nivelul membranei interne există transportori specifici. Precursorii utilizaţi în biosinteze sunt di- sau tri-acizi ai ciclului, în principal reprezentaţi de acidul oxaloacetic, malic şi -cetoglutaric. 1. Precursori ai neoglucogenezei Neoglucogeneza (producţia de glucoză din precursori – alţii decât hidraţii de carbon), se produce în citosol printr-o suită de reacţii cu pornire de la acidul fosfoenolpiruvic (fig.VII.60). Neoglucogeneza se desfăşoară în cea mai mare parte în hepatocite şi într-o mică măsură în nefrocite. Ea debutează în citosol prin formarea acidului fosfoenolpiruvic cu pornire de la acidul oxaloacetic furnizat de mitocondrii şi în mică măsură prin degradarea hialoplasmatică a doi aminoacizi: acidul aspartic şi asparagina. Ca precursor al neoglucogenezei, acidul oxaloacetic se formează în matrice fie prin oxidarea diverşilor intermediari ai ciclului Krebs, fie prin decarboxilarea acidului piruvic. Acidul oxaloacetic nu poate fi exportat direct din matrice, deoarece membrana mitocondrială internă este impermeabilă pentru acest precursor. Din acest motiv, în matricea mitocondrială are loc reducerea acidului oxaloacetic la acid malic cu participarea unei malat dehidrogenaze. Prin intermediul unui transportor specific, acidul malic traversează membrana internă spre spaţiul intermembranar, de unde

difuzează spre citoplasmă.

Fig.VII.60. Reglarea neoglucogenezei

Aminoacizii a căror degradare conduce la formarea acidului piruvic sau a intermediarilor ciclului Krebs şi care pot servi neoglucogenezei, poartă denumirea de glucoformatori. Acidul lactic produs de celulele musculare în timpul contracţiei, este transportat la ficat pe cale sanguină; în hepatocite el poate fi utilizat ca precursor al neoglucogenezei. Iniţial, în citosolul hepatocitului acidul lactic este retransformat în acid piruvic apoi, prin intermediul unui transportor specific al membranei interne, acidul piruvic pătrunde în matricea mitocondrială, unde este carboxilat la acid oxaloacetic, precursor al neoglucogenezei. Sinteza citoplasmatică de acizi graşi porneşte de la acetil-CoA matricială care părăseşte matricea prin naveta citrat. În citoplasmă, acidul citric participă la regenerarea acetil-CoA; în cursul reacţiei, se formează acid oxaloacetic care se întoarce în matrice după ce a fost transformat în acid piruvic.

Acidul -cetoglutaric din cadrul ciclului Krebs, reprezintă şi el un precursor pentru sinteza aminoacizilor neesenţiali. El părăseşte matricea printr-un transportor specific al membranei interne (transportor al acizilor dicarboxilici) şi odată ajuns în citosol participă la o serie de reacţii care au ca punct final formarea alaninei şi

acidului aspartic. 2. Precursorii biosintezei acizilor graşi Sinteza acizilor graşi, care are loc în citoplasmă, are ca punct de pornire acetilCoA, precursor furnizat de mitocondrii; el este produs în matricea mitocondrială prin oxidarea a diverse substraturi: decarboxilarea oxidativă a acidului piruvic, oxidarea acizilor graşi şi degradarea oxidativă a unor aminoacizi. Deoarece membrana internă mitocondrială este impermeabilă pentru acetil-CoA, grupul acetil este transportat spre hialoplasmă sub formă de acid citric, acid tricarboxilic pentru care există un transportor specific (fig.VII.61).

Fig.VII.61. Producerea precursorilor pentru diverse biosinteze

3. Precursorii ureogenezei La animalele ureotelice (mamifere şi amfibieni adulţi), amoniacul care provine din degradarea aminoacizilor este transformat în uree. Procesul are loc la

nivelul hepatocitelor, printr-un ciclu de reacţii care se derulează succesiv în matricea mitocondrială şi citosol, reacţii care constituie “ciclul ureei” (fig.VII.62). În matrice are loc dezaminarea oxidativă a acidului glutamic cu eliberarea NH3; CO2 cu NH3 formează carbamil fosfatul, care la rândul său împreună cu ornitina, formează citrulina. Cel de-al doilea grup aminat necesar sintezei de uree provine din acidul aspartic care în hialoplasmă se combină cu citrulina. Din această reacţie se formează acidul arginosuccinic care este apoi clivat la acid fumaric şi arginină. În final, hidroliza argininei determină eliberarea ureei şi reformarea ornitinei, care reintră în mitocondrie şi ciclul reîncepe. Ornitina şi citrulina traversează membrana internă mitocondrială prin intermediul unui transportor specific capabil de cotranspot antiport: intrarea unei molecule de ornitină este condiţionată de ieşirea simultană a unei molecule de citrulină. Organizarea ultrastructurală a mitocondriilor asigură compartimentarea ciclului ureei; amoniacul eliberat în matrice prin dezaminarea acidului glutamic nu trece în sânge deoarece el este imediat încorporat în carbamil fosfat. Dacă procesul nu s-ar fi desfăşurat aşa, amoniacul ar fi părăsit hepatocitele şi ar fi ajuns pe cale sanguină la alte celule, celule ale căror mitocondrii nu conţin carbamil fosfat sintetază. În aceste condiţii, NH3 s-ar combina cu acidul -cetoglutaric, formând acid glutamic; ar apărea astfel un deficit de acid -cetoglutaric care ar conduce la inhibiţia ciclului Krebs, cu efecte toxice pentru celulă. 4. Precursorii biosintezei aminoacizilor şi porfirinelor Unii intermediari ai ciclului Krebs, care provin din degradarea aminoacizilor, reprezintă în acelaşi timp precursori pentru sinteza de noi aminoacizi. Aceşti aminoacizi sunt consideraţi neesenţiali deoarece nu este necesară furnizarea lor prin aport alimentar. Din reacţia acidului -cetoglutaric cu amoniacul, rezultă acid glutamic, glutamină şi prolină. Prin transaminarea acizilor piruvic şi oxaloacetic cu acid glutamic, se formează alanină, respectiv acid aspartic. Aceste sinteze au loc în citoplasmă după ce precursorii au fost exportaţi din matricea mitocondrială fie în mod direct prin transportori specifici (acidul -cetoglutaric şi acidul piruvic), fie indirect prin intermediari (acidul oxaloacetic prin intermediarul acid citric). Sinteza porfirinelor are loc în etape succesive care se derulează în matricea mitocondrială, citosol şi membrana internă mitocondrială. Ea debutează în matrice cu condensarea succinil-CoA cu serina şi formarea acidului -aminolevulinic; reacţiile următoare se derulează în citoplasmă. Inserţia fierului la nucleul porfirinic şi deci formarea hemului, are loc la nivelul membranei interne mitocondriale sub acţiunea unei ferochelataze situate la acest nivel. Mitocondria participă deci la prima şi la ultima etapă a biosintezei hemului, grup prostetic din componenţa a mai multor proteine şi a citocromilor lanţului respirator.

Fig.VII.62. Participarea mitocondriilor hepatice la ureogeneză

3.4.3.3. Sinteza proteică mitocondrială ADNmt este purtătorul unei informaţii genetice care codifică câteva proteine mitocondriale şi ARN-ul mitocondrial; el reprezintă deci un genom, distinct de ADN-ul nuclear al celulei eucariote. Spre deosebire de alte genomuri în care există

şi porţiuni “mute”, în genomul mitocondrial fiecare nucleotid pare să facă parte dintr-o secvenţă de codificare fie a unei proteine, fie a unuia dintre ARNt, fie a unui ARNr. Aceste secvenţe fiind foarte apropiate una de alta, nucleotidele care codifică factorii reglatori ai ADN sunt în număr foarte restrâns. Mecanismul biosintezei proteice mitocondriale este asemănător cu cel al sintezei proteice bacteriene (vezi capitolul ”Biosinteza proteică”). Mitoribozomii sintetizează 5-10% din proteinele mitocondriale, procent cantitativ scăzut dar esenţial din punct de vedere calitativ; cea mai mare parte dintre lanţurile polipeptidice sintetizate la acest nivel sunt constituenţi ai lanţului respirator şi ai ATPazei. Proteinele sintetizate de mitoribozomi sunt: 3 din cele 7 lanţuri ale citocromoxidazei, 2 lanţuri polipeptidice ale citocromului b, un lanţ polipeptidic necesar asamblării celor două lanţuri ale citocromului c1, 4 lanţuri care intră în constituţia bazei hidrofobe a ATP-sintetazei şi proteina transportoare ADP-ATP sensibilă la atractilozid (fig.VII.63).

Fig.VII.63. Genomul ADN-ului mitocondrial

Mitocondriile sintetizează deci o parte din constituenţii proteici ai membranei interne şi anume lanţuri polipeptidice foarte hidrofobe care sunt ulterior incluse în bistratul lipidic al acestei membrane. Acesta este motivul pentru care atunci când începe sinteza proteică, mitoribozomii se ataşează feţei matriciale a membranei interne; pe măsura elongării, lanţurile polipeptidice se integrează în bistratul lipidic. În afara constituenţilor proteici membranari, mitoribozomii sintetizează şi alte lanţuri polipeptidice. De asemeni, ARNm mitocondrial care este tradus de mitoribozomi în timpul sintezei este transcris de pe ADNmt. S-a demonstrat că un fragment de ADN cu o lungime de 5m corespunde la aproximativ 15.000 de perechi de nucleotide, sau la 5000 de codoni, sau la aproximativ 25 de proteine de câte 200 aminoacizi, sau unei mase moleculare de 600.000 de daltoni. Ori masa moleculară a

ansamblului care intervine în respiraţia celulară este de 2.000.000 de daltoni. Deci cea mai mare parte a proteinelor mitocondriale şi anume toate proteinele din membrana externă, proteinele matriciale şi cea mai mare parte a proteinelor membranei interne sunt sintetizate la nivelul ribozomilor citoplasmatici şi importate ulterior. 3.4.3.4. Schimburile efectuate între mitocondrie şi citosol Funcţiile mitocondriale nu pot avea loc decât cu condiţia realizării schimburilor bidirecţionale între matrice şi citosol. Este vorba despre intrarea în matrice a combustibililor care urmează a fi oxidaţi la CO 2 şi H2O, ADP care este fosforilat la ATP, aminoacizi care sunt asamblaţi în proteine de către mitoribozomi şi ieşirea în citosol a intermediarilor ciclului Krebs care servesc la sinteza a numeroase molecule, ieşirea ATP a cărui hidroliză eliberează energia necesară activităţilor celulare. Toate aceste schimburi, esenţiale metabolismului celulelor aerobe şi reglării sale, sunt controlate de membrana mitocondrială internă. Permeabilitatea selectivă a membranei interne este realizată de două tipuri de transportori specifici de natură proteică: transportori cu mecanism uniport şi transportori cu mecanism cotransport-antiport (fig.VII.64). Prima categorie transportă un singur ion (K+, Ca++) sau un metabolit (aminoacid, ornitină); transportorii din cea de a două categorie transportă simultan şi în sensuri opuse fie doi ioni de talie mică (H2PO4- şi OH- sau Na+ şi H+), fie doi metaboliţi sub formă ionizată (-cetoglutarat şi malat; malat şi citrat; glutamat şi aspartat; ADP-ATP), fie un ion şi un metabolit (piruvat şi OH-; HPO42- şi malat).

Fig.VII.64. Transportul ionilor şi metaboliţilor prin membrana internă

Atunci când oxidaţia respiratorie nu are loc, aceşti transportori realizează

transportul pasiv al ionilor şi metaboliţilor în sensul gradientului concentraţional dintre matrice şi citosol (dinspre compartimentul cu concentraţie mare spre compartimentul cu concentraţie mică). Aceeaşi transportori pot realiza şi un transport activ, în contra gradientului concentraţional, în acest caz energia necesară fiind furnizată de mecanismul de oxidoreducere din cadrul lanţului respirator. În afară de schimburile de ioni şi metaboliţi, între mitocondrie şi citosol se produc şi pasaje de macromolecule proteice; acest import-export de proteine este, după cum vom vedea, necesar biogenezei mitocondriale. 3.4.4. Biogeneza mitocondriilor Ipoteza endosimbiontului Numeroasele asemănări morfologice şi biochimice dintre mitocondrii şi celulele procariote au sugerat ipoteza că mitocondria a evoluat din bacterii care au fost endocitate cu mai mult de 1 miliard de ani în urmă. Se presupune că stabilirea unei relaţii simbiotice între celulele eucariote primitive cu metabolism anaerob şi o bacterie capabilă de a realiza fosforilarea oxidativă a devenit necesară odată cu apariţia oxigenului în atmosferă. Acest eveniment ar fi avut loc cu aproximaţie acum 1,5 x 109 ani, înainte ca regnurile animal şi vegetal să se separe. Conform teoriei endosimbiontului, bacteria endocitată şi-a pierdut peretele celular ale cărui glicoproteine erau responsabile de patogenitate, s-a “învelit” cu o a doua membrană (membrana externă) pentru a-şi asigura compartimentarea de citosol şi a început să genereze energia necesară tuturor mecanismelor metabolice ale “gazdei” sale. La rândul său, celula eucariotă furnizează mitocondriei cea mai parte a proteinelor de care aceasta are nevoie pentru a-şi îndeplini funcţiile. Deşi iniţial a fost acceptată cu entuziasm, la ora actuală această ipoteză este controversată. Contraargumentele sunt din ce în ce mai numeroase: mitoribozomii au constantă de sedimentare diferită faţă de ribozomii bacterieni; citoplasma eucariotelor nu este un sistem anaerob cum presupune teoria simbiotică, membranele reticulului endoplasmic prezentând citocromi transportori de electroni la oxigen; citosolul conţine o dismutază care catalizează formarea apei oxigenate din radicalul superoxid. La ora actuală se consideră că în cursul evoluţiei, eucariotele şi-au format capacitatea de a utiliza oxigenul, chiar înainte de apariţia mitocondriilor.

Ipoteza plasmidei (nonsimbiotică) Conform acestei ipoteze, genomul mitocondrial s-ar fi separat din genomul unei bacterii aerobe foarte evoluate, bacterie care s-ar situa ea însăşi la originea celulei eucariote. Teoria susţine de asemenea că replicarea genomului mitocondrial este independentă de cea a genomului principal, iar ADNmt este echivalentul plasmidelor din citoplasma bacteriană; acesta este motivul pentru care ipoteza poartă numele de “ipoteza plasmidei”.

Continuitatea mitocondrială Noile mitocondrii apărute în celulă se formează prin diviziunea mitocondriilor

preexistente. Din punct de vedere morfologic, ea se realizează prin două mecanisme: segmentarea şi partiţia şi este precedată de replicarea ADNmt. Segmentarea are loc prin ştrangularea progresivă la nivel median, urmată de fuziunea membranelor de o parte şi de alta a brazdei de ştrangulare. Partiţia debutează cu alungirea unei criste mitocondriale care conduce la împărţirea matricei în două compartimente distincte; apoi membrana externă se invaginează la nivelul acestei criste particulare şi formează o constricţie din ce în ce mai profundă, care sfârşeşte prin a separa mitocondria în două (fig.VII.65).

Fig.VII.65. Morfologia diviziunii mitocondriale (condrodiereza)

Sinteza şi asamblarea constituenţilor După cum am văzut, sinteza constituenţilor mitocondriali are loc, pentru o mică parte dintre ei, în matricea mitocondrială, dar cei mai mulţi sunt sintetizaţi în citoplasmă. Sinteza moleculelor de origine extramitocondrială este guvernată de informaţia nucleară, deci ADN nuclear este responsabil în cea mai mare parte de morfogeneza mitocondrială.

Cea mai mare parte a lipidelor şi proteinelor necesare biogenezei mitocondriale sunt sintetizate în citosol. Ribozomii citoplasmatici sintetizează enzimele necesare replicării şi transcripţiei ADNmt, aminoacil-ARNt transferazele, proteinele din alcătuirea mitoribozomilor şi factorii care coordonează biosinteza proteică mitocondrială, proteinele membranei externe şi cea mai mare parte din proteinele membranei interne, enzimele matricei şi spaţiului perimitocondrial. Fosfolipidele din cele două membrane şi colesterolul din constituţia membranei externe sunt sintetizate la nivelul reticulului endoplasmic, ca şi lipidele din componenţa celorlalte membrane celulare; biosinteza precursorilor acestor lipide (acizi graşi şi acetat) are loc în hialoplasmă. Marea majoritate a constituenţilor proteici mitocondriali sunt codificaţi de genomul nuclear, sintetizaţi în citoplasmă de ribozomii liberi citosolici şi ulterior importaţi în mitocondrie sub formă de lanţuri polipeptidice complete. Studiile biochimice recente au elucidat parţial mecanismele moleculare ale importului de proteine mitocondriale. Importul are loc în mai multe etape. La început are loc recunoaşterea presecvenţelor de către receptori citoplasmatici care au rolul de a le orienta spre faţa citoplasmatică a membranei externe. La nivelul la care cele două membrane mitocondriale vin în contact intim, sunt localizate două complexe transportoare distincte (complex A şi B) care direcţionează translocarea presecvenţelor spre matrice. Pentru a putea traversa membranele, proteinele adoptă o conformaţie parţial depliată. Deplierea şi menţinerea acestei conformaţii pe perioada translocării se realizează de către chaperone moleculare din familia Hsp 70 localizate pe faţa citoplasmatică a membranei externe (fig.VII.66). Pe faţa matricială a membranei interne sunt localizate alte chaperone din familia Hsp 70, care se pare că au rolul de a “tracta” lanţul polipeptidic depliat în matrice. Ulterior, lanţul polipeptidic este transferat unei chaperonine Hsp 60, care are rolul de a reface plierea caracteristică a proteinei. Translocarea proteică prin membrane este dependentă de potenţialul electric realizat în membrana internă (transportul electronilor de la NADH şi FADH2 la oxigenul molecular este cuplat cu transferul protonilor din matrice în spaţiul perimitocondrial). Potenţialul electric dirijează inserţia membranară şi translocarea presecvenţei încărcată pozitiv spre matricea care este încărcată negativ. Pe de altă parte, interacţiunile chaperonelor moleculare cu lanţurile polipeptidice sunt procese energodependente care necesită prezenţa ATP-ului pe ambele feţe ale anvelopei mitocondriale.

Importul de proteine destinate membranei externe este mediat de receptori membranari care le permit inserţia în membrană. Proteinele destinate membranei interne sau spaţiului perimitocondrial sunt iniţial importate în matrice, sortate şi apoi transportate spre compartimentul adecvat (fig.VII.67). Secvenţa semnal care orientează proteina pentru a fi orientată spre membrana internă sau exportată în spaţiul intermembranar este hidrofobă şi similară cu secvenţele semnal ale proteinelor bacteriene dirijate către reticulul endoplasmic sau destinate secreţiei celulare. Odată transporturile realizate, presecvenţele sunt degradate: presecvenţa încărcată pozitiv este supusă proteolizei după ce lanţul polipeptidic a ajuns în matrice, iar presecvenţa hidrofobă este clivată după ce proteina a fost inserată în membrana internă sau exportată în spaţiul perimitocondrial. Deoarece mecanismul este similar cu cel al proteinelor bacteriene, el a fost numit mecanism de sortare conservativă. Alte proteine destinate membranei interne şi spaţiului perimitocondrial necesită mecanisme de sortare neconservativă (fig.VII.68). Astfel, proteina poate fi transferată direct prin membrana externă în spaţiul perimitocondrial, cum este cazul citocromului c (I); unele proteine destinate membranei interne şuntează calea matricială inserându-se direct în membrana internă (II); sau după ce s-au inserat direct în membrana internă, se eliberează în spaţiul intermembranar prin clivarea secvenţelor hidrofobe de stopare a transferului (III).

Mitocondria participă la formarea membranelor sale prin sintetiza de fosfatidilserină din fosfatidiletanolamină şi catalizarea sintezei de cardiolipină. Cea mai mare parte din fosfolipidele constituente ale membranelor mitocondriale este importată din citoplasmă. Fosfatidilcolina şi fosfatidil etanolamina sintetizate în reticulul endoplasmic sunt importate prin intermediul unor proteine de interschimb lipidic (PIL). Acestea, sunt capabile să extragă fosfolipidele din membrana RE, să le transporte prin citosol şi să le elibereze în membrana mitocondrială externă.

Fig.VII.66. Etapele importului de proteine mitocondriale din citosol în matrice

Fig.VII.66. Etapele importului de proteine mitocondriale din citosol în matrice (după Cruce)

Fig.VII.67. Etapele importului de proteine mitocondriale din citosol în membrana internă şi spaţiul intermembranar. Mecanismul sortării conservative. (după Cruce)

Fig.VII.68. Mecanismul de sortare neconservativă (după Cruce)

3.4.5. Implicaţii medicale 3.4.5.1. Modificările de ultrastructură mitocondrială interesează în special: forma, talia, structura, dispoziţia cristelor, aspectul matricei, acumulări improprii în compartimentele mitocondriale. Ele nu reprezintă în mod obligatoriu fenomene patologice şi nu li se poate atribui o valoare diagnostică specifică. Cele mai frecvent întâlnite modificări ultrastructurale mitocondriale sunt:

1. Gigantismul mitocondrial. În aceste cazuri talia mitocondriilor depăşeşte 15μ; apare în stări fiziologice (când trădează o hiperactivitate), dar şi în stări patologice, ca de exemplu: hepatita virală, tumori ovariene, miopatii. Se consideră că megamitocondriile pot proveni din fuzionarea mai multor mitocondrii sau prin hiperbalonizarea unui organit normal. 2. Tumefacţia sau turgescenţa mitocondrială este caracterizată de creşterea globală a taliei, lărgirea spaţiului permitocondrial, scăderea numărului de criste până la dispariţie, matrice electronoclară sau vacuolizată. Din punct de vedere funcţional apare o perturbare a permeabilităţii membranei mitocondriale pentru apă, creşterea volumului organitului realizându-se prin imbibiţie. Aceste modificări apar în cursul hipoxiei, carenţelor proteice şi de vitamină B2, hepatita virală, febra galbenă. 3. Retracţia mitocondrială se caracterizează prin scăderea volumului, densificarea matricei. Acest fenomen este o degenerescenţă ce interesează exclusiv mitocondriile, celelalte organite având structură normală. 4. Distrugerea mitocondriilor. În acest caz mitocondriile îşi pierd cristele, membrana se fragmentează, conţinutul se răspândeşte în citoplasmă. 5. Acumulări intramitocondriale de produşi citoplasmatici. a. Glicogenul. În cardiopatii s-a observat depozitarea glicogenului în spaţiul intermembranar. Explicarea acestui fenomen este dificilă, există mai multe teorii între care, fie creşterea exagerată a permeabilităţii membranei externe, fie sinteza glicogenului chiar în spaţiul intermembranar. b. Alte incluziuni mitocondriale. Au fost identificate structuri cristaline, lamelare, filamentoase, tubulare. Acestea se acumulează în matrice; semnificaţia lor încă nu este cunoscută. 3.4.5.2. Maladiile mitocondriale Aşa cum afirma George Emil Palade, “când mitocondriile au fost aduse în primul plan al atenţiei biologilor şi chimiştilor (1950-1953) şi când a fost descoperită funcţia lor de a genera ATP, nimeni nu a bănuit că după aproximativ 20 de ani se va vorbi din ce în ce mai insistent despre o patologie mitocondrială”. Aceste boli sunt consecinţa producerii în celulă a unor defecte genetice şi a unor componenţi mitocondriali “defectivi”. La ora actuală se cunosc aproximativ 25 de maladii mitocondriale, iar numărul lor va creşte desigur, pe măsura dezvoltării metodelor de investigaţie. Maladiile mitocondriale sunt boli metabolice datorate deficienţei unei enzime localizată în unul dintre compartimentele mitocondriale. Cauzele care conduc la apariţia acestor deficienţe sunt diverse şi pot fi clasificate după cum urmează: • anomalii de transport intramitocondrial al proteinelor codificate de genomul nuclear. Ele corespund unor anomalii ale genelor care codifică receptorii

membranari, translocazele, enzimele de fixare pe transportori sau semnalpeptidazele. • anomalii de utilizare intramitocondrială a substraturilor (piruvat, ciclul Krebs,  oxidarea, ciclul ureei etc.) • anomalii ale lanţului respirator (citopatii). Acestea pun probleme dificile de rezolvare deoarece originea celor 66 de subunităţi ale lanţului respirator este dublă: mitocondrială şi nucleară. Diagnosticul acestor boli se bazează pe analiza fenotipurilor clinice, asociată cu cea a modificărilor biochimice. Aceste maladii debutează cel mai frecvent în perioada neonatală şi au o evoluţie gravă foarte rar controlabilă prin regim alimentar şi terapeutică adecvată. Ca şi în cazul altor maladii metabolice umane, tratamentul trebuie să ia în considerare noi tehnici de clonare a genelor şi de transfer al genelor normale în celulele deficitare prin intermediul unor vectori virali sau direct prin micro-injecţii. ADN-ul mitocondrial ca şi cel nuclear poate suferi frecvent mutaţii care afectează funcţia celulară, funcţia organitului şi conduc la apariţia unor boli particulare. După cum am prezentat în capitolul “Biogeneza mitocondrială”, în momentul fecundaţiei flagelul se desprinde de capul spermatozoidului, deci mitocondriile paterne situate la nivelul piesei intermediare nu participă la formarea aparatului energogen al zigotului. Mitocondriile oului fecundat provin numai de la ovul, deci eventualele alterări ale ADNmt sunt transmise generaţiei următoare strict pe cale maternă. Asemenea mutaţii au fost asociate cu numeroase maladii mitocondriale cum sunt bolile neurologice degenerative (maladiile Parkinson şi Alzheimer), neuropatia optică ereditară Leber, miopatia mitocondrială, encefalopatia şi encefalomiopatia familială mitocondrială, sindromul KearnsSayre. Mutaţiile ADNmt sunt asociate cu boala neuromusculară; astfel, în miopatia mitocondrială şi sindromul Kearns-Sayre au fost evidenţiate deleţii ale ADNmt în celulele musculare şi activităţi alterate ale enzimelor lanţului respirator. Identificarea mutaţiilor ADNmt care induc aceste boli permite diagnosticul molecular al bolii ceea ce va conduce la stabilirea diagnosticului definitiv al pacienţilor care nu provin dintro familie afectată. Mai utilă este detectarea mutaţiilor moştenite de genele nucleare; analiza moleculară a acestor mutaţii poate determina dacă un membru al familiei sau un embrion a moştenit o celulă mutantă sau o “celulă de tip sălbatic”. Terapia metabolică a acestor boli îşi propune să stimuleze fosforilarea oxidativă prin administrarea de cofactori ai căii transportoare de electroni cum ar fi succinatul sau coenzima Q. Ingineria genetică şi terapia genică reprezintă o altă posibilitate de tratament prin relocalizarea unei alele a unei gene normale în nucleu şi găsirea unui semnal adecvat pentru direcţionarea produsului acestei gene către mitocondrie; odată ajuns aici, acesta s-ar putea substitui proteinei imperfect codificate de către ADNmt.

În terapia genică somatică, progresele realizate în experienţele efectuate pe animale dau speranţa că această tehnică va putea fi utilizată cu eficacitate în unele maladii metabolice, chiar şi pentru maladiile mitocondriale; acest viitor este însă îndepărtat.

3.4.5.3. Mitocondria şi cancerul În celulele canceroase, mitocondriile prezintă variaţii numerice şi structurale, dar nici una dintre ele nu este specifică. a) Variaţii numerice. O creştere a numărului mitocondriilor a fost observată în leziunile precanceroase ale sistemului melanogen şi în celulele tumorale ale melanomului malign; în acest caz, creşterea numărului de mitocondrii sugerează nevoile energetice crescute în vederea realizării melanogenezei cât şi motilităţii celulare care asigură metastazarea. Prin spectroscopie cu rezonanţă electronică paramagnetică, s-a arătat că melanomul malign conţine concentraţii crescute de radicali liberi, anormali, care conduc la alterarea membranelor mitocondriale cu scurgerea electronilor. b) Alterări structurale. În cancerul renal cu celule clare, în unele sarcoame (oncocitoame, tumora Whartin, chistadenoame limfomatoase ale parotidei), apar anomalii de talie (2-4 lungime), de formă (mitocondrii neregulate, cu expansiuni laterale, burjonări şi constricţii), matrice cu densitate crescută, criste cu dispoziţie concentrică la periferia organitului. Există însă şi tumori în care mitocondriile nu prezintă decât alterări minore, nesemnificative, ca de exemplu în hepatoame. c) Creşterea dimensiunilor mitocondriale cu formarea mega-mitocondriilor a fost evidenţiată în tumori de tipul oligodendroglioamelor şi a limfoamelor. Studii efectuate pe ADN-ul mitocondrial din oncocitoamele umane au arătat că celulele acestei tumori, numite oncocite, conţin un număr crescut de mitocondrii cu caractere morfologice diferite faţă de cele normale: sunt mari, aproape exclusiv rotunde, cu criste dezvoltate şi aliniate strict paralel.

3.4.5.4. Mitocondria şi ischemia cardiacă Ischemia cardiacă este caracterizată de diminuarea fluxului sanguin coronarian, deci de diminuarea aportului de substraturi şi oxigen. Aceste deficite conduc în mod direct la scăderea producţiei intracelulare de ATP, energie necesară menţinerii homeostaziei şi deci contracţiei cardiace; apare deci un dezechilibru între aport şi necesităţile cordului. În mod normal, cantitatea de ATP necesară asigurării contracţiei cardiace timp

de 24 de ore este de 5 Kg; mitocondria constituie în acest fel “uzina energetică” a inimii. Se poate deci afirma că “o criză de angor = o criză de energie”. Atunci când survine ischemia, acizii graşi devin aproape în exclusivitate substratul energogen al celulei cardiace. În acest caz, acetil-CoA produs prin -oxidare se acumulează în mitocondrie şi inhibă piruvat dehidrogenaza. Calea de oxidare a glucozei este în acest caz blocată; blocajul este de două ori nefast pentru celulă: pe de o parte, pentru producerea energiei necesare celula nu poate utiliza decât calea intramitocondrială cu randament scăzut (-oxidarea acizilor graşi), pe de altă parte, ionii de H+ şi lactat rezultaţi din glicoliză nu pot fi reciclaţi, ceea ce conduce la acumularea lor în citoplasmă şi la instalarea acidozei intracitoplasmatice. Pentru ameliorarea randamentului energetic al celulei cardiace, terapia administrată în ischemia cardiacă trebuie să rezolve două aspecte: frânarea producerii acidozei citoplasmatice şi favorizarea căii de oxidare a glucozei în detrimentul -oxidării acizilor graşi; aceste două deziderate sunt realizate de o substanţă capabilă de a menţine activitatea piruvat dehidrohenazei în ciuda ischemiei – trimetazina.

3.4.5.5. Apoptoza şi metabolismul energetic Sub aspect biochimic, apoptoza (moartea fiziologică a celulei) reprezintă un proces energodependent, riguros controlat. Una dintre caracteristicile morţii celulare este diminuarea cantităţii de ATP exportate dinspre matricea mitocondrială către citosol. Până în prezent experimentele de laborator nu au precizat dacă scăderea cantităţii de ATP celular reprezintă una din cauzele morţii celulare sau este o consecinţă a acesteia. Ca urmare a experienţelor efectuate, s-a emis ipoteza conform căreia mitocondriile trebuiesc privite ca “tabloul celular de comandă” de la care se poate face comutarea spre comportamentul de “sinucidere celulară”. Alte experimente au adus în discuţie o altă faţetă a raportului dintre metabolismul energetic şi apoptoză. În câteva linii celulare a fost examinată posibilitatea ca moleculele de ATP extracelular să inducă apoptoza şi liza osmotică. Excesul de ATP ar putea determina activarea unor protein-kinaze, controlate la rândul lor de protein-fosfataze. Astfel, posibilitatea de a bloca experimental fragmentarea ADN-ului, ar putea reprezenta punctul de plecare pentru dezvoltarea unor clase noi de medicamente. În concluzie, alterările metabolismului energetic celular ar putea reprezenta un element esenţial în luarea deciziei de moarte la scară celulară. Gravitatea acestor alterări ar putea orienta spre un anumit tip de moarte celulară: apoptoză sau necroză.

3.5. DETOXIFIEREA CELULARĂ PEROXIZOMII Peroxizomii sunt organite celulare implicate în numeroase funcţii metabolice esenţiale. Au fost observaţi la microscopul electronic în 1954 de către Rhodin în celulele renale şi denumiţi “microbodies”. Cu ajutorul tehnicilor de fracţionare diferenţiată, în anul 1965 Christian de Duve şi colab., au purificat o fracţiune subcelulară bogată în enzime - uratoxidaza, catalaza şi D-aminoacidoxidaza, care reprezintă enzimele marker ale peroxizomilor. Ulterior, aceste organite au fost evidenţiate în toate celulele eucariote, dar în organismul uman sunt mai numeroşi în ficat, rinichi, sistemul nervos central şi periferic, retină. Ultrastructură, organizare moleculară şi biogeneză Peroxizomii au formă sferică sau ovalară, cu un diametru de 0,3-1,5μm, variabil de la o celulă la alta. Sunt înconjuraţi de o singură membrană de 6nm grosime, trilaminată, mozaicată. Matricea organitului este densă, are un aspect granular şi este bogată în enzime oxidative. Concentraţia enzimatică este atât de ridicată încât în unele celule matricea peroxizomală prezintă o zonă centrală densă, numită „cristaloid" cu o structură ordonată, cristalină, alcătuit din uratoxidază (fig.VII.69).

Fig.VII.69. Imagine de microscopie electronică de transmisie: peroxizomi în celula hepatică. Formaţiunea electronodensă cu localizare centrală reprezintă cristaloidul de uratoxidază (după Daniel S.Friend citat de Alberts, 2002)

Atât proteinele care participă la formarea membranei peroxizomului cât şi enzimele matriciale sunt sintetizate de poliribozomii liberi din citoplasmă şi apoi sunt importate în peroxizomi. Semnalul de import matricial este reprezentat de o secvenţă de trei aminoacizi, localizată la una dintre extremităţile C- sau N- terminale a proteinelor. Faptul a fost demonstrat experimental: dacă la o proteină citosolică care în mod normal nu este destinată peroxizomilor se ataşează această secvenţă semnal, proteina va fi importată în peroxizomi. Până la ora actuală au fost identificate 23 de proteine structurale, numite peroxine, care participă la edificarea peroxizomilor şi aproximativ 60 de enzime care participă la realizarea funcţiilor lor. Importul proteinelor este mediat de receptori situaţi pe faţa citosolică a membranei peroxizomale, capabili de a recunoaşte secvenţele semnal ale proteinelor destinate peroxizomilor. Noii peroxizomi se formează din precursorii peroxizomali, prin creşterea şi fisiunea acestora (fig.VII.70).

Fig.VII.70. Model de biogeneză a noilor peroxizomi

Funcţii Peroxizomii utilizează oxigenul molecular şi peroxidul de hidrogen pentru a realiza reacţii oxidative: 1. Producerea H2O2 cu scop de detoxifiere Peroxizomii utilizează oxigenul molecular pentru a elimina atomii de hidrogen din substanţe organice specifice (R); aceste reacţii oxidative conduc la formarea peroxidului de hidrogen (H2O2): RH2 + O2 → R+ H2O2 H2O2 generată prin aceste reacţii este folosită de catalază pentru oxidarea substraturilor: fenoli, acid formic, formaldehidă şi alcool. Reacţia de peroxidare se derulează conform formulei: H2O2 + R' H2 → R '+ 2H2O. Reacţiile oxidative se desfăşoară în special în ficat şi rinichi unde are loc procesul de detoxifiere a diferitelor molecule toxice care intră apoi în circulaţia sanguină. În acest fel, mai mult de 25% (după unii autori 50%) din etanolul băut este oxidat la acetaldehidă; peroxizomii consumă pentru aceasta 10% din oxigenul folosit de ficat.

Apa oxigenată este toxic celular deoarece formează radicali liberi care influenţează negativ proteinele şi acizii nucleici. Din această cauză, H2O2 în exces este oxidată de catalază conform reacţiei: 2 H2O2 → 2 H2O + O2. Reacţia este considerată a fi o “supapă de siguranţă” pentru inactivarea agentului oxidant (H2O2) în cazul unui aport insuficient de donori de hidrogen R'H2 reprezenat de substanţele cu grad crescut de toxicitate. 2. Oxidarea acizilor graşi Una dintre funcţiile majore ale reacţiilor oxidative realizate de peroxizomi este degradarea acizilor graşi. În procesul numit β oxidare, lanţurile alkil a acizilor graşi sunt scurtaţi secvenţial cu câte 2 atomi de carbon/ciclu şi convertiţi în acetil CoA; acesta este apoi exportat din peroxizomi în citosol pentru a fi folosit în reacţiile biosintetice. Caracteristic peroxizomilor este faptul că oxidează acizii graşi cu lanţ lung de atomi de carbon, iar când lanţul s-a scurtat la 6 atomi de carbon urmează oxidarea în mitocondrii, deci peroxizomii colaborează cu mitocondriile în oxidarea acizilor graşi. 3. Sinteza plasmalogenilor În general plasmalogenii reprezintă 10% din lipidele membranare, dar sunt cele mai abundente fosfolipide din structura tecii de mielină. Iniţierea sintezei lor are loc la nivelul peroxizomilor. Defectele de sinteză ale plasmalogenilor explică apariţia unui mare număr de boli neurologice (vezi implicaţii medicale). Implicaţii medicale • Defectele de import ale proteinelor peroxizomale conduc la o severă deficienţă de funcţie a acestui organit. Maladia poartă denumirea de sindrom hepato-cerebro-renal Zellweger şi este determinată de o mutaţie la nivelul genei care codifică o proteină intrinsecă a membranei peroxizomale (peroxizom assembly factor-1) cu rol de receptor al enzimelor peroxizomale. Bolnavii ai căror celule conţin peroxizomi “goi”, prezintă hipotonie neonatală severă, acumulări de lipide în masa cerebrală, hepatomegalie cu ciroză, chiste renale, tulburări neuro-senzoriale (cataractă, atrofie optică, surditate), criptorhidie la băieţi şi hipertrofie clitoridiană la fetiţe, anomalii scheletice şi dismorfism facial. Deoarece toate funcţiile peroxizomale sunt deficitare, maladia este letală, conducând la deces înaintea vârstei de un an. • Alterarea funcţiei peroxizomale de oxidare a acizilor graşi cu lanţ lung de atomi de carbon conduce la apariţia bolilor numite adrenoleucodistrofii (adrenoleucodistrofia X-linkată şi adrenoleucodistrofia neonatală autozomală). Sunt boli genetice grave caracterizate prin manifestări neurologice determinate de distrugerea progresivă a substanţei albe din sistemul nervos (creier, măduvă şi nervi) şi a medulosuprarenalei. Aterarea structurii mielinei determină alterarea transmiterii mesajelor neuronale la toate nivelele. Astfel, bolnavii dezvoltă progresiv paralizie totală, incapacitate de vorbire şi alimentare normală, incontinenţă sfincteriană, cecitate (orbire), surditate, pierderea simţului tactil etc. În aceeaşi categorie se încadrează maladia Refsum determinată de acumularea în sânge şi ţesuturi a acidului fitanic. Acidul fitanic este un acid gras provenit din aport alimentar; provine în principal din degradarea clorofilei, se găseşte în vegetale şi produsele animalelor erbivore (carne, lapte, unt etc.). În mod normal este degradat prin oxidare numai în peroxizomi (nu şi în mitocondrii unde are loc oxidarea majorităţii acizilor graşi) fiind catalizată de fitanoil-CoA hidroxilază. Absenţa enzimei determină imposibilitatea degradării acidului fitanic. Expresia clinică a bolii constă în principal în retinită

•

•

pigmentară, neuropatie periferică, ataxie cerebeloasă şi manifestări dermatologice (ihtioză). Acatalasemia este o altă boală genetică determinată de absenţa sintezei catalazei. După cum am prezentat anterior, catalaza catalizează reacţile de producere a H2O2 care la rândul său oxidează o serie de substraturi toxice pentru organism. Malsinteza catalazei determină imposibilitatea oxidării alcoolului şi fenolilor. Condrodisplazia punctuală rizomelică de tip I este o maladie genetică determinată de mutaţia genei care codifică peroxina 7 (receptorul citosolic al proteinei PTS2). Malsinteza acestui receptor determină deficienţa de funcţie peroxizomală în celulele sistemului osos şi sistemului nervos. Boala se manifestă prin retard mental şi încetinire a creşterii osoase a humerusului şi femurului. Maladia poate fi depistată în stadiu neonatal, iar copiii care o prezintă nu depăşesc vârsta de 10 ani.

Observaţii de laborator aflate în studiu - una dintre dintre cele mai constante trăsături biochimice ale cancerelor este activitatea catalazică scăzută în ficat la animalele cu tumori; - peroxizomii pot fi identificaţi în tumorile cu creştere lentă, dar lipsesc total în cele cu creştere rapidă; - peroxizomii apar în număr crescut şi sunt de dimensiuni mari în condiţii patologice cum sunt hepatita virală sau după administrare îndelungată de medicamente care scad lipemia.

Capitolul VIII NUCLEUL 1. CICLUL CELULAR 1.1.

Definirea conceptului Una dintre caracteristicile fundamentale ale celulelor care alcătuiesc organismele vii este reproducerea celulară. Celulele se reproduc în cadrul unui ciclu de duplicare şi divizare, numit ciclu celular. La speciile unicelulare (bacterii şi drojdii) fiecare diviziune produce un nou organism, în timp ce la speciile pluricelulare sunt necesare multe cicluri celulare pentru a forma un nou individ. Deşi unele evenimente ale ciclului celular variază de la un tip celular la altul sau în cadrul aceluiaşi tip celular în diferite perioade de viaţă, anumite caracteristici sunt universale şi celula trebuie să le realizeze pentru a-şi atinge scopul fundamental – acela de a transmite informaţia genetică la generaţiile următoare. Astfel, pentru a produce o pereche de celule fiice diploide (46 de cromozomi) identice din punct de vedere genetic, ADN-ul trebuie să se reproducă cu fidelilate, iar cromozomii reproduşi trebuiesc repartizaţi în 2 celule separate (fig.VIII.1). La fiecare ciclu celular, majoritatea celulelor îşi dublează masa şi numărul de organite citoplasmatice, altfel acestea ar deveni tot mai mici cu fiecare diviziune.

Fig.VIII.1. Schema etapelor de desfăşurare a ciclului celular (după Alberts)

1.2. Fazele ciclului celular Ciclul celular reprezintă perioada de timp cuprinsă între terminarea diviziunii ce a dat naştere unei celule până în momentul în care această celulă îşi desăvârşeşte propria diviziune. Astfel, ciclul celular are două faze distincte: diviziunea celulară notată cu M (mitoză) şi perioada dintre două diviziuni succesive numită interfază. La microscopul optic, interfaza apare în mod eronat ca un interludiu fără evenimente în care celula doar îşi măreşte dimensiunile. Odată cu introducerea metodelor biologiei celulare şi moleculare s-a evidenţiat faptul că interfaza este o perioadă foarte importantă pentru proliferarea celulei; în timpul său au loc procese biologice necesare pregătirii diviziunii, procese care se derulează într-o succesiune bine stabilită. În interfază au loc sinteze de ADN, ARN şi proteine. În timp ce sinteza ARN-ului şi a proteinelor are loc pe tot parcursul interfazei, sinteza ADN-ului se desfăşoară numai într-o anumită perioadă numită perioada sintetică, notată S; înainte de S există o periodă presintetică notată cu G1 (G-gap = pauză sau întrerupere), iar după perioada S este perioada postsintetică notată cu G2 . În concluzie, ciclul celular este alcătuit din patru faze succesive, fiecare având rolul de a o pregăti şi iniţia pe următoarea. Pe parcursul ciclului, materialul genetic suferă modificări cantitative (fig.VIII.2): • G1 este perioada cuprinsă între sfârşitul mitozei şi începutul sintezei de ADN. Se caracterizează prin sinteză de ARN şi proteine, celula pregătindu-se din punct de vedere citoplasmatic pentru dublarea materialului genetic. Materialul nuclear este 2n, iar cei 46 de cromozomi sunt unicromatidieni. Dacă celulele din G1 nu intră în procesul de replicare al ADN-ului, ele pot

trece într-o perioadă de pauză a ciclului celular - stare de odihnă specializată numită G0. Din punct de vedere genetic celulele sunt diploide (2n) şi apar în microscopia optică asemănător celor din G1, însă nu prezintă acelaşi metabolism al ARN şi proteinelor. Astfel, anumite celule sunt în stare G 0 definitiv (polimorfonuclearele şi neuronii), altele pot trece, sub acţiunea unor factori externi, din G 0 în G1 (fibroblastele din piele pot intra în faza de repaus G0, în care rămân metabolic active, dar nu mai proliferează decât dacă sunt stimulate de semnale extracelulare care le scot din G0 şi le trec în G1, limfocitele înaite de stimularea antigenică etc). • S este perioada în care se sintetizează ADN-ul prin replicare după model semiconservativ; cromozomii devin bicromatidieni şi din punct de vedere cantitativ, materialul nuclear corespunde la 4n. La sfârşitul fazei S, celula este pregătită din punct de vedere nuclear pentru mitoză. • G2 este perioada cuprinsă între sfârşitul sintezei de ADN şi începutul mitozei. Este caracterizată de transcripţia materialului genetic şi biosinteza proteinelor necesare derulării mitozei; materialul nuclear este 4n. Faza G2 pregăteşte mitoza din punct de vedere citoplasmatic. • M este perioada de diviziune sau mitoza în care materialul nuclear şi citoplasmatic este împărţit între cele două celule fiice. La finalul mitozei conţinutul în ADN devine 2n pentru fiecare celulă fiică.

Fig.VIII.2. Succesiunea fazelor ciclului celular la eucariote şi modificările cantitative ale materialului genetic.

1.3. Clasificarea tipurilor celulare în funcţie de parcurgerea ciclului celular După modul de parcurgere al ciclului celular, celulele din corpul uman se împart în trei categorii:

1. celule care şi-au pierdut capacitatea de a se divide fiind oprite în faza G0 a ciclului celular (exemplu neuronii şi celulele musculare striate). 2. celule care au o capacitate scăzută de a se divide, dar care în condiţii speciale îşi accelerează ritmul mitotic (celule din ficat, rinichi, plămâni, glande endocrine). Astfel, ţesutul hepatic îşi reface rapid celulele pierdute (în urma unui traumatism sau a unei hepatectomii parţiale) printr-o rapidă diviziune a hepatocitelor restante. 3. celule care au o capacitate mare de diviziune cum sunt celulele din epiderm, măduva hematogenă, celulele liniei spermatice, celulele epiteliale intestinale. Aceste celule se împart în două compartimente: unul proliferativ (celule cu ritm de diviziune rapid) şi un compartiment neproliferativ reprezentat de celule care nu se divid în mod normal, dar care se pot divide în anumite condiţii. Ţesuturile din această categorie pierd în mod fiziologic o parte din celulele mature: hematiile se distrug după aproximativ 120 zile, enterocitele se descuamează după 3-4 zile. Celulele pierdute sunt înlocuite prin trecerea unor celule din compartimentul neproliferativ în compartimentul proliferativ. Celulele din compartimentul neproliferativ sunt considerate de rezervă fiind numite celule "stem" sau "suşe". Acestea se află în faza G0 a ciclului celular. Prin acţiunea unor stimuli specifici, celulele din faza dormantă G0 pot să reia parcurgerea ciclului celular. Astfel de stimuli care intervin în reglarea ciclului celular, numite şi substanţe mitogene sunt: eritropoetina, factorul de creştere al nervilor, al fibroblastelor, poliamine ca putresceina, hormonii estrogeni etc. 1.4. Durata ciclului celular Perioada G1 este cea mai lungă perioadă a ciclului şi variază în funcţie de tipul celular, în timp ce faza S poate varia de la câteva minute pentru celulele embrionare până la cîteva ore la celulele somatice. Fazele G2 şi M sunt scurte (mai puţin de o oră). Durata ciclului celular este variabilă în funcţie de specie şi de tipul celular; ea poate varia de la o celulă la alta în cadrul aceluiaşi ţesut. Embrionii de muşte au cele mai scurte cicluri celulare cunoscute (fiecare durând doar 8 minute), levurile prezintă cicuri celulare de 1,5 – 3 ore, celulele epiteliale intestinale 12 ore, iar la hepatocitele mamiferelor ciclul celular durează mai mult de 1 an. Pentru o celulă umană cu proliferare rapidă, ciclul celular are o durată de 24 ore, unde faza G1 durează 11 ore, faza S dureaza 8 ore, faza G2 dureaza 4 ore, iar faza M durează 1 oră. Cu toate că durata fazelor unui ciclu celular variază într-o anumită măsură, cea mai mare variaţie la tipurile de celule uzual studiate apare la faza G1. Celulele din stadiul G0 pot rămâne în acest stadiu zile, săptămâni şi chiar ani pînă la reluarea proliferării. 1.5. Punctele de control ale ciclului celular 1.5.1. Punctul de control G1 Celulele fiice rezultate în urma diviziunii mitotice trebuie să aleagă între a rămâne în faza G1 şi a continua ciclul celular sau să părăsească ciclul, angajându-se

într-una din căile alternative: starea de latenţă G0, diferenţiere, senescenţă sau apoptoză. Această decizie a fost evidenţiată prin analize genetice efectuate pe drojdia Saccharomyces cerevisiae; punctul de tranziţie G1/S a fost denumit „punct start" şi s-a considerat că depăşirea lui depinde de disponibilitatea nutritivă a mediului. La mamifere, tranziţia G1/S este guvernată de punctul de control G1 (fig.VIII.3). Celulele răspund la semnale intracelulare şi extracelulare care-i pemit să decidă continuarea ciclului. Dacă punctul de control a fost depăşit, celula intră în faza S şi parcurge restul ciclului celular. În schimb, dacă condiţiile de depăşire a fazei G1 nu sunt îndeplinite sau factorii de creştere nu sunt disponibili, ciclul celular se opreşte în punctul de control G1 care devine un punct de restricţie. 1.5.2. Punctul de control G2 Un al doilea punct de control este situat la trecerea din faza G2 în faza M şi este numit punct de control G2. El are rolul de a împiedica iniţierea mitozei în cazul în care replicarea ADN nu a fost finalizată. Punctul de control G2 sesizează ADN-ul nereplicat şi/sau ADN-ul deteriorat, ceea ce generează un semnal care determină oprirea ciclului celular. În acest fel, punctul de control G 2 împiedică iniţierea fazei M înainte de replicarea totală şi corectă a genomului; celulele rămân în G2 până când are loc finalizarea replicării genomului sau până când sunt reparate erorile ADN. Atunci când restricţia din G2 va fi înlăturată, celula va intra în mitoză şi va fi capabilă să distribuie celulelor fiice câte un material genetic complet. 1.5.3. Punctul de control al metafazei permite finalizarea metafazei şi debutul anafazei numai în cazul în care toţi cromozomii sunt fixaţi la nivelul ecuatorului fusului de diviziune.

Fig.VIII.3. Punctele de control ale ciclului celular (după Alberts) .

1.6. Sistemul de control al ciclului celular Desfăşurarea corectă a evenimentelor ciclului celular este condusă de un sistem de control care are rolul de a activa în timp util enzimele şi proteinele responsabile de realizarea fiecărui proces, precum şi de a le dezactiva odată ce procesul s-a încheiat. Pe de altă parte, sistemul de control trebuie să se asigure că fiecare perioadă a ciclului celular a fost încheiată înaite ca faza următoare să înceapă; de exemplu el trebuie să se asigure că replicarea întregului ADN nuclear a fost finalizată înainte ca mitoza să debuteze. De asemenea trebuie să ţină cont de semnalele venite din mediul extracelular, precum cele care stimulează proliferarea atunci cînd este nevoie de un număr mai mare de celule. Sistemul de control are un rol important şi în reglarea numărului de celule în cadrul unui ţesut; alterarea controlului este considerată astăzi una dintre cauzele transformării maligne. Principala clasă de proteine aparţinând sistemului de control al ciclului celular este reprezentată de serin-treonin kinaze, notate Cdk deoarece sunt kinaze dependente de cicline (cyclin-dependent protein kinase), enzime capabile să activeze proteinele ţintă prin fosforilare. Activitatea acestor kinaze oscilează pe parcursul ciclului celular ceea ce determină variaţii ciclice ale fosforilării proteinelor care participă la iniţierea sau reglarea evenimentelor majore ale ciclului celular: replicarea ADN şi mitoza. De exemplu, creşterea activităţii Cdk la începutul mitozei conduce la accentuarea fosforilării proteinelor cu rol de control asupra condensării cromozomilor, fragmentării membranei nucleare şi asamblării fusului de diviziune. Variaţiile ciclice ale Cdk sunt controlate de un complex proteo-enzimatic care cuprinde ciclinele şi factorii modulatori ai complexului cicline-Cdk. 1.6.1. Ciclinele Principalele proteine de reglare a Cdk sunt reprezentate de cicline, proteine care se leagă de moleculele de Cdk şi le activează (fig.VIII.4). Denumirea de cicline provine de la faptul că spre deosebire de Cdk care rămân constante, aceste proteine parcurg un ciclu de sinteză-degradare pe parcursul ciclului celular; asamblarea ciclică, activarea şi dezasamblarea complexelor cicline-Cdk sunt evenimente pivot care coordonează ciclul celular. Complexele proteice cicline-Cdk sunt alcătuite din două subunităţi: o subunitate catalitică – cdk şi o subunitate cu rol reglator – ciclina.

Fig.VIII.4. Cele două componente importante ale sistemului de control a ciclului celular. Interacţiunea ciclină - Cdk are ca rezultat declanşarea evenimentelor caracteristice ciclului celular. Fără ciclină, Cdk este inactivă.

Au fost descrise 9 tipuri de proteine cdk: cdk1-cdk7 sunt implicate direct în ciclul celular, pe când cdk7, cdk8 şi cdk9 participă la procesul de transcripţie. Aceiaşi ciclină poate activa Cdk diferite, dar fiecare Cdk este activat de o singură ciclină. Există 15 tipuri de cicline grupate în patru mari clase după etapa în care se asociază la Cdk, formând complexe ciclină/Cdk (6 complexe mai importante pentru specia umană: figVIII.5). • ciclinele fazei G1 formează complexele ciclina D/Cdk4 şi ciclina D/Cdk6. Acestea fosforilează şi inactivează proteina Rb (proteina retinoblastomului) care realizează un punct de restricţie cunoscut sub denumirea de punctul R. În forma defosforilată, activitatea proteinei Rb se traduce prin legarea de factorul de transcripţie E2F. Complexul astfel format este capabil să lege ADN-ul, dar nu poate iniţia transcripţia. Inactivarea proteinei Rb prin fosforilare sub acţiunea complexelor ciclina D/Cdk4 şi ciclina D/Cdk6, determină eliberarea factorului E2F care devine astfel capabil să-şi îndeplinească rolul de factor de transcripţie. Astfel se activează transcripţia genelor ai căror produşi sunt necesari pentru trecerea în faza S a ciclului celular şi pentru realizarea în condiţii optime a replicării ADN. Se consideră că proteina Rb este factorul-cheie pentru trecerea în faza S a ciclului celular. Alterarea ADN-ului celulei aflate în faza G1 determină sinteza unei mari cantităţi de proteină p53. Aceasta induce sinteza în cantităţi crescute a proteinei p21, un inhibitor multipotent al kinazelor ciclin-dependente. Consecinţa finală este inhibarea fosforilării proteinei Rb şi oprirea ciclului celular. De asemenea, proteina p53 induce şi transcripţia unor compuşi implicaţi în procesele de reparaţie a ADN, însă dacă defectul este mult prea grav pentru a fi reparat, p53 contribuie la declanşarea apoptozei.

Fig.VIII.5. Complexele ciclină-cdk implicate în diferite perioade ale ciclului celular

• ciclina G1/S formează complexul ciclină E/Cdk2 responsabil de tranziţia G1/S. Acest complex este ţinta factorilor antiproliferanţi precum factorul TGF-β care blochează ciclul în faza G1. De asemenea, controlează transcripţia la nivelul hiperfosforilării Rb. Ciclina E este rapid degradată din momentul în care debutează replicarea. • ciclinele fazei S formează complexele ciclină A/Cdk2 şi ciclina A/Cdk1. Complexele determină fosforilarea substraturilor care declanşază şi întreţin replicarea ADN şi inactivează factorii de transcripţie ai fazei G1. La mamifere induc duplicarea centrozomului şi opresc degradarea ciclinei B. • ciclina fazei M este reprezentată de ciclina B care formează complexul ciclinaB/Cdk1 sau MPF (factor de promovare a mitozei). Faza debutează după activarea complexului cdk1-ciclinaB. Ieşirea din faza mitozei şi intrarea în stadiul G1 este marcată de distrucţia proteolitică a ciclinei B şi de inactivarea cdk1. Acest complex este responsabil de degradarea laminelor nucleare care antrenează fragmentarea anvelopei nucleare în timpul mitozei, dar intervine şi în condensarea cromatinei şi organizarea fusului de diviziune (fig. VIII.6).

1.6.2. Factorii modulatori ai complexului cicline-Cdk După fixarea ciclinelor, activarea completă a cdk necesită fosforilarea unui reziduu Thr (treonină) la capătul carboxi-terminal. Fosforilarea este realizată de enzima CAK (kinaza de activare a cdk sau ciclinaH/cdk7). Cdk pot fi inactivate prin fosforilarea a două situsuri de legare a ATP de la capătul amino-terminal (reziduul tirozină 15 şi treonină 14). Inactivarea este realizată de protein-kinaze de tipul Wee1 şi Myt1. Reactivarea cdk poate fi obţinută prin defosforilarea acestor reziduuri realizată de fosfataze care aparţin familiei Cdc25.

Fig. VIII.6. Participarea MPF şi a ciclinelor la evenimentele ciclului celular. (după Alberts)

Un alt mecanism pentru reglarea cdk implică familia de proteine numite CKI (cyclin-dependent kinase inhibitors) reprezentate de p16, p15, p18 şi p19 (familia INK4) şi p21, p27 şi p57 (familia Cip/Kip). Aceaste proteine se leagă specific la cdk inhibând legarea lor de cicline şi în acest fel impiedică declanşarea proliferării celulare. Genele care conduc la sinteza acestor proteine sunt considerate a fi gene supresoare ale tumorilor, fiind frecvent alterate în cancere (tabel VIII.I). COMPLEXUL CDK-CICLINA cdk 4-Ciclina D cdk 2-Ciclina E cdk 2-Ciclina A cdk 2-Ciclina B

KIP (inhibitori ai cdk) p21 p27 p21, p27 P21 P21

INK (inhibitori ai kinazelor) p15, p16 p18, p19 -

FAZA G1 G1/S S G2/M

Tabel VIII.I - Complexele cdk-ciclină şi inhibitorii acestora în funcţie de etapele ciclului celular

Ciclinele şi CKI sunt inactivate printr-un mecanism de proteoliză dependentă de ubicuitină, aceasta marcând proteinele ce urmează a fi distruse complet de către proteazomă.

În concluzie, numeroase evenimente intracelulare sau extracelulare pot determina oprirea parcurgerii ciclului celular: denutriţia, schimbări drastice de temperatură, factori de stres, alterarea ADN etc. Afectarea ADN-ului celular este cel mai studiat semnal de iniţiere a sistemelor de control ale ciclului celular. Detectarea de erori de copiere a genomului celular determină sechestrarea celulelor în faza G 1 sau, dacă aceasta a fost depăşită, în faza S, inhibându-se atât iniţierea replicării, cât şi elongaţia. Blocarea ciclului celular se face prin intermediul inhibitorilor kinazelor ciclin-dependente (fig.VIII.7).

Fig.VIII.7. Acţiunea factorilor extracelulari şi intracelulari asupra ciclului

2. NUCLEUL ÎN INTERFAZĂ Formarea nucleului este considerată a fi unul dintre cele mai importante salturi în evoluţia materiei vii. El este prezent în toate celulele, cu excepţia hematiei adulte circulante, îndeplinind următoarele funcţii: • Prin intermediul ADN-ului asigură sinteza, conservarea şi transmiterea informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor celulare şi totodată asigură specificitatea lumii vii;

• Prin intermediul proceselor de transcripţie şi translaţie asigură reglarea şi controlul proceselor vitale. În funcţie de etapa ciclului celular pe care o parcurge, nucleul are un mod de prezentare diferit şi o funcţie diferită: • nucleu metabolic în interfază • nucleu genetic în timpul mitozei. 2. 1. CARACTERE MORFOLOGICE Studiul celulelor vii în microscopia optică demonstrează că nucleul se găseşte într-un permanent dinamism, ca oricare altă structură din materia vie. De aceea, pe aceste preparate morfologia nucleilor prezintă mari variaţii chiar la nucleul aceleiaşi celule. Astfel forma, numărul, dimensiunile, topografia, raportul nucleocitoplasmatic şi structura nucleului variază de la un tip celular la altul. În acelaşi timp există variaţii în raport cu vârsta celulei, activitatea ei dominantă, momentul funcţional. Fiind o structură predominant acidă, evidenţierea caracterelor morfologice ale nucleului se realizează cu coloranţi bazici. Studiul acestor caractere se realizează prin coroborarea următorilor parametri: • Forma nucleului urmăreşte de obicei forma celulei, dar pot exista şi excepţii. Forma variază în funcţie de starea evolutivă a celulei şi de rolul pe care îl îndeplineşte în cadrul ţesutului. Formele nucleare frecvent întâlnite sunt: - forma rotund - ovalară apare la celulele izodiametrice (sferice, cubice poliedrice). Exemple: ovulul, limfocitul, timocitul, eritroblastul etc. - forma alungită este întâlnită la celulele înalte sau fuziforme. Exemple: celulele musculare striate scheletale şi musculare netede. - forma lobată sau polilobată întâlnită la polimorfonucleare. - nucleu înmugurit la megacariocite. - forma neregulată cu multiple incizuri şi burjonări întâlnită uneori la celula malignă. Se cunoaşte că sfera are suprafaţa minimă pentru un volum dat. În cazul nucleilor aproximativ sferici, neregularităţile de pe suprafaţa lor pot fi considerate ca mijloc de creştere a ariei nucleului, adică a suprafeţei prin care se realizează schimburile dintre nucleu şi citoplasmă.

Nucleul are un oarecare grad de plasticitate (deformabilitate). Aceasta face ca în anumite situaţii, generate de o cauză mecanică intracelulară, nucleul să aibă o altă formă în celulele în care ar fi de aşteptat să fie rotund-ovalar. Este cazul monocitelor, celule sferice cu nucleu reniform. Deformarea nucleului este cauzată de prezenţa în

imediata sa vecinătate a centrozomului care este cea mai densă formaţiune din citoplasmă. De asemenea, în prima etapă a mitozei (profaza), înaintea fragmentării anvelopei nucleare, nucleul suferă depresionări progresive datorate deplasării celor doi centrozomi în formare spre polii celulei. • Numărul. Majoritatea celulelor se caracterizează prin prezenţa unui singur nucleu - celule mononucleate. După numărul de nuclei, celulele se pot împărţi în următoarele categorii: - anucleate - hematia adultă, - mononucleate - marea majoritate a celulelor, - binucleate - 7-8% din hepatocite, - multinucleate - osteoclastele (zeci de nuclei), fibra musculară striată scheletală care are aproximativ 40 de nuclei pe fiecare centimetru. Variaţiile numerice cu creşterea numărului de nuclei se întâlnesc în condiţii fiziologice atribuite în general unei activităţi metabolice celulare intense, dar mai ales în stări patologice cum sunt degenerările maligne. • Aşezarea nucleului este în general centrală. El poate avea şi o aşezare excentrică în celulele cu polaritate funcţională (nucleul nefrocitului este dispus la polul bazal al celulei) sau o aşezare periferică la adipocitul alb, datorită acumulărilor citoplasmatice de lipide. Deplasarea nucleului în celulă poate fi consecinţa mişcărilor sau curenţilor citoplasmatici. • Dimensiunile nucleului variază de la un tip de celulă la altul, dar şi cu vârsta sau activitatea funcţională a celulei, cu ritmul nictemeral sau cu gradul de ploidie. Variaţiile dimensionale nucleare sunt cuprinse între 4μ la spermatozoid şi 20μ la nucleul ovulului; în timp ce dimensiunile celulelor sunt cuprinse între câţiva μ la trombocite şi câţiva centimetri în cazul diametrului longitudinal al fibrei musculare striate scheletale. De aici rezultă că diversitatea dimensională a celulelor din organismul uman se datorează mai ales citoplasmelor şi nu dimensiunilor nucleilor. Aceasta s-ar explica prin faptul că nucleii diferitelor tipuri celulare au aceeaşi funcţie de bază (conţin aceeaşi cantitate de ADN, genomul fiind acelaşi). Aşadar se poate spune: ,,Câte citoplasme, atâtea tipuri celulare,, sau altfel spus, expresii fenotipice diferite ale aceluiaşi genotip. Nucleii celulelor tinere sunt de dimensiuni mari, eucromatici, veziculoşi, datorită conţinutului crescut în eucromatină şi apă. Cei ai celulelor adulte, dar mai ales îmbătrânite, sunt mai mici, picnotici, intens coloraţi. Variaţii dimensionale nucleare întâlnim în interfază şi anume în etapa S, când are loc dublarea materialului genetic prin autoreplicare semiconservativă a ADN, însoţită de creşterea dimensiunii nucleului. Dimensiunile nucleului pot fi determinate prin metode cariometrice. Există numeroase situaţii patologice ce pot determina modificări ale volumelor nucleare, printre care modificările toxice celulare, boala de iradiere şi în special boala neoplazică. Nucleii celulelor maligne sunt frecvent de talie mare şi

morfologie extrem de variată în acelaşi câmp microscopic. • Raportul nucleo-citoplasmatic , R N/C se calculează după formula: VN RN/C = -------Vc –VN

unde, VN = volumul nuclear, VC= volumul celular.

Acest raport este acelaşi pentru un anumit tip celular. Raportul nucleocitoplasmatic prezintă variaţii largi cuprinse între 1/3 până la 1/20. Raportul este constant în favoarea nucleului la limfocite şi monocite. La celulele tinere (blaşti) şi la cele maligne în care activitatea metabolică este intensă, nucleul este mai mare şi citoplasma mai redusă (raport în favoarea nucleului). Celulele adulte şi îmbătrânite prezintă un raport invers, în favoarea citoplasmei. Evaluarea acestui raport permite aprecierea stării de sănătate sau patologie celulară precum şi aprecierea vârstei celulei.

2.2. ULTRASTRUCTURA NUCLEULUI INTERFAZIC În interfază, nucleul celulelor eucariote este alcătuit din: - înveliş nuclear (nucleolemă, anvelopă nucleară, membrană nucleară) - nucleoplasmă (matrice nucleară, carioplasmă, cariolimfă) - cromatină - nucleol (fig.VIII.9).

Fig.VIII.9. Ultrastructura nucleului în interfază (după Alberts)

2.2.1. Învelişul nuclear 2.2.1.1. Ultrastructură Izolarea celei mai mari părţi a ADN-ului celular în nucleu reprezintă diferenţa majoră dintre celulele eucariote şi celulele procariote. Această izolare este realizată de către învelişul nuclear sau membrana nucleară (fig.VIII.10). Învelişul nuclear determină formarea unui compartiment nuclear şi a unui compartiment citoplasmatic, realizând astfel separarea fenomenelor nucleare (autoreplicarea semiconservativă a ADN şi transcripţia ARN) de fenomenele citoplasmatice (translaţie, traducerea şi sinteza proteinelor). Studiile de microscopie elecronică au permis caracterizarea structurii fundamentale a învelişului nuclear care apare format din 2 membrane concentrice (externă şi internă) care se află în continuitate una cu cealaltă, precum şi cu reticulul endoplasmatic. Cele două membrane sunt separate între ele de un spaţiu cu o grosime de aproximativ 15 nm, denumit spaţiu perinuclear care comunică cu lumenul reticulului endoplasmatic. În locurile unde membrana externă fuzionează cu membrana internă, se formează porii nucleari.

Fig.VIII.10. Invelişul nuclear. Cele două membrane nucleare sunt penetrate de pori nucleari şi se continuă cu lumenul reticulului endoplasmatic.

Membrana nucleară externă este trilaminată, cu o grosime de 6-8 nm, prezintă ribozomi ataşaţi şi se continuă cu reticulul endoplasmatic, fiind considerată o formă particulară a acestuia. Proteinele sintetizate de ribozomii ataşaţi membranei nucleare

externe sunt destinate fie pentru membrana internă, fie pentru membrana externă, fie sunt deplasate transversal prin membrană şi depozitate în spaţiul perinuclear. Membrana nucleară internă este lipsită de ribozomi, fiind considerată membrana proprie nucleului. Ea este aderentă de nucleoplasmă. Lamina nucleară. Faţa internă a membranei nucleare este tapetată de o reţea bidimensională proteică, cu o grosime de 30-100 nm numită lamina nucleară (fig.VIII.11). Proteinele care alcătuiesc lamina nucleară sunt filamente intermediare cu o GM de 60-70 Kda numite laminele A, B şi C. Ele interacţionează cu unele proteine ancorate în membrana internă precum emerina, LAP2 sau proteina LBR. Lamina B este diferită ca structură de laminele A şi C care sunt codate de aceiaşi genă (LMNA). Dacă lamina B este întânită în toate celulele somatice nucleate, laminele B şi C nu se întâlnesc la celulele embrionare, ele se formează după naştere. Lamina nucleară participă la realizarea conformaţiei şi stabilităţii nucleului, la organizarea spaţială a porului nuclear, la ataşarea cromatinei de învelişul nuclear, precum şi la dispariţia şi refacerea învelişului nuclear în timpul diviziunii celulare.

Fig.VIII.11. Lamina nucleară a) reprezentarea schematică a localizării laminei nucleare; b) imagine de microscopie electronică a unei porţiuni din lamina nucleară.

Prin examinare la microscopul electronic, în perioada premergătoare diviziunii s-a observat că membrana nucleară se fragmentează în vezicule mici care rămân ataşate la reticulul endoplasmatic. Laminele B sunt foarte strâns legate de aceste vezicule, în timp ce laminele A şi C sunt depolimerizate şi dispersate în celulă. Această depolimerizare şi rupere consecutivă a membranei nucleare se produce datorită fosforilării tranzitorii a proteinelor laminare, fosforilare realizată de activarea kinazei lamelare. La sfârşitul diviziunii celulare (în telofază) se induce defosforilarea laminelor, permiţându-le să polimerizeze, fapt ce determină

fuzionarea micilor vezicule asociate cu laminele B şi respectiv formarea unei membrane nucleare interfazice normale (fig.VIII.12).

Fig.VIII.12. Corelaţia dintre fosforilarea proteinelor laminare şi structura învelişului nuclear în timpul mitozei

Implicaţii medicale. S-a constatat o legătură între mutaţiile genelor care codifică proteinele laminei nucleare şi o serie de maladii ereditare familiale: • Distrofia musculară Emery Dreifuss este determinată de mutaţia genei codante pentru emerină sau mutaţia genelor pentru laminele de tip A. Boala se caracterizează prin distrucţie musculară acompaniată de cardiomiopatie cu tulburări de conducere şi poate determina moartea subită cardiacă. Gena codantă pentru laminele de tip A este alterată şi în alte maladii precum: • Lipodistrofia de tip Dunningan. Boala dubutează la pubertate şi este caracterizată prin pierderea progresivă a ţesutului adipos în regiuni localizate ale corpului (trunchi, membre), concomitent cu creştere depunerilor de lipide la nivelul feţei, spatelui. Maladia se asociază cu achantozis nigricans (pigmentarea regiunii axilare), hirsutism (pilozitate corporală excesivă) şi ovar polichistic.

• Displazia acro-mandibulară este o maladie genetică cu transmitere autozomal recesivă, manifestată clinic prin malformaţii osoase, dismorfism cranio-facial, lipodistrofie parţială şi îmbătrânire precoce; • Maladia Charcot Marie Tooth este o neuropatie periferică ereditară caracterizată prin atrofie musculară şi neuropatie senzitivă progresivă cu atingere bilaterală şi simetrică a membrelor, amiotrofie şi deficit motor, abolirea reflexelor osteotendinoase. • Progeria sau sindromul prematur Hutchinson Gilford este o maladie genetică rară, determinată de mutaţiile genelor LMNA care se traduce prin diminuarea cantitativă a laminei A sau prin alterări calitative ale proteinei numită progernă. Aceste anomalii conduc la alterarea anvelopei nucleare, perturbând funcţia normală a celulelor şi diviziunea lor; repararea şi reînnoirea ţesuturilor va fi alterată, ceea ce determină o îmbătrânire patologică. Boala se manifestă de la naştere la ambele sexe, se caracterizează prin accelerarea procesului de îmbătrânire şi conduce la deces în jurul vârstei de 15 ani. • Lipodistrofia indusă medicamentos. Numeroase studii au demonstrat că administrarea triplei terapii utilizată în tratamentul infecţiei HIV alterează maturarea prolaminelor nucleare. Ca urmare, pacienţii prezintă manifestări lipodistrofice. 2.2.1.2. Porii învelişului nuclear La toate celulele eucariote de la Saccharomices caerevisiae (drojdia de bere) până la om, învelişul nuclear este perforat de pori. Fiecare por este alcătuit dintr-o structură complexă cunoscută sub numele de complexul porului nuclear (NPC) care are o masă moleculară estimată la aproximativ 125 milioane daltoni şi este alcătuit din mai mult de 100 de proteine diferite, aranjate într-o strictă simetrie octogonală. Proteinele care intră în alcătuirea NPC poartă numele de nucleoporine (NUP). Dintre acestea numai două prezintă un domeniul transmembranar, celelalte se asamblează în sub-complexe interacţionând între ele pentru a forma NPC. Unele nucleoporine prezintă o secvenţă repetitivă de Phe-Gly (FG) şi au rol predominant în transportul transmembranar. Celelalte nucleoporine au rol în menţinerea structurii porului nuclear. Dintre acestea NUP107 şi NUP133 sunt componente stabile ale nucleului în intefază şi participă la asamblarea precoce a anvelopei nucleare la sfârşitul diviziunii mitotice. Complexul porului nuclear penetrează cele 2 membrane ale învelişului nuclear şi apare în regiunile unde membrana externă se continuă cu cea internă. Conformaţia porului împiedică schimburile între cele două membrane ale învelişului nuclear, dar realizează un canal de comunicare între compartimentul nuclear şi cel citoplasmatic. În secţiune transversală, complexul porului nuclear apare alcătuit din 3 componente (fig.VIII.13): - componenta columnară care formează cea mai mare parte a peretelui porului;

- componenta anulară formată din 8 granule proteice care determină forma octogonală a porului. De la nivelul acestei componente se extind spiţe spre interiorul porului. - componenta luminală formată dintr-o glicoproteină transmembranară care se pare că participă la ancorarea complexului porului la membrana nucleară.

Fig.VIII.13. Componentele complexului porului nuclear

Spiţele sunt conectate la 2 inele situate pe suprafaţa nucleară şi respectiv pe suprafaţa citoplasmatică, iar ansamblul spiţe-inele este ancorat în învelişul nuclear la locurile de contact între membranele nucleare internă şi externă. De la cele 2 inele pornesc fibrile sau filamente proteice care pe faţa nucleară formează o structură în formă de "coş de baschet". Porii nucleari reprezintă aproximativ 5→15% din totalul suprafeţei membranei nucleare. S-a constatat că numărul porilor este corelat cu activitatea transcripţională a celulei. Astfel, anvelopa nucleară a unei celule somatice de mamifer conţine 3000 – 4000 NPC, cea a ovocitelor de broască Xenopus laenis care au o capacitate de trascripţie mai mare prezintă 60 pori/m2, însumând aproximativ 30 milioane de complexe de pori/nucleu, în timp ce proeritrocitul care este inactiv transcripţional, prezintă doar 3 pori/m2, în total aproximativ 150-300 pori/nucleu. Proprietăţile transportului prin porii nucleari au fost studiate prin injectarea de compuşi radioactivi în citosol şi examinarea ratei lor în nucleu. Astfel, experienţele au demonstrat că porii nucleari sunt permeabili pentru ioni şi molecule mici, inclusiv proteine cu un diametru mai mic de 9 nm ( 60kDa). Aceste molecule difuzează pasiv prin canalele deschise (pline cu H2O) din complexul porului nuclear. Dar, porii nucleari permit trecerea unor macromolecule sau complexe

multimoleculare importante pentru realizarea funcţiilor celulei. Astfel din citoplasmă sunt "importate" în nucleu enzime de sinteză a ADN, precum şi proteine histonice care intră în alcătuirea cromatinei. De asemenea, nucleul "exportă" în citoplasmă precursori ribozomali şi particule ribonucleoproteice formate din complexe de ARNm şi proteine. Trecerea unor asemenea ansambluri cu dimensiuni mult mai mari decât diametrul canalului porului, se face datorită unui proces activ prin care proteinele specifice şi ADN-ul sunt recunoscute şi transportate selectiv într-o singură direcţie.

Fig. VIII.14. Complexul porului. a) reconstrucţie 3D; b) şi c) imagini de microscopie electronică SEM (după J.E.Henshaw şi R.Milligan)

Rezumând, se poate spune că porii nucleari reprezintă un important canal de comunicare între interiorul compartimentului nuclear şi cel citoplasmatic. Canalul prezintă proprietăţile unui filtru molecular, fiind permeabil faţă de ioni şi molecule mici şi selectiv faţă de complexele proteice mai mari. Acest transport selectiv este foarte specific prin prezenţa secvenţelor semnal aminoacide din cadrul complexelor proteice ce se leagă de proteinele receptor din complexele porilor. În acelaşi timp este un proces energodependent responsabil de translocarea prin învelişul nuclear. Mecanismul de transport prin porii nucleari Fiecare complex al porului nuclear conţine cel puţin un canal apos cu un diametru de 9 nm şi o lungime de 15 nm care este traversat în mod pasiv de molecule hidrosolubile cu greutate moleculară mică. Moleculele cu GM mai mică de 5000d difuzează atât de rapid, încât se poate considera că pentru ele anvelopa nucleară prezintă o permeabilitate liberă. O proteină de 17000d realizează traversarea între citosol şi nucleu în 2 minute, o proteină de 44000d în 30 minute, în timp ce o proteină globulară de talie mai mare de 60000d nu poate penetra în nucleu. Proteinele cu greutăţi moleculare mari, ribozomii maturi al căror diametru este de 30 nm, ADN

polimerazele şi ARN-ul ale căror subunităţi au o greutate moleculară de 100.000200.000d, ca şi numeroase alte proteine se leagă de receptori proteici specifici localizaţi în complexele porilor şi sunt transportate în mod activ prin membrana nucleară. După cum am arătat anterior, cu cât un nucleu prezintă o activitate de transcripţie mai mare, cu atât numărul complexelor porilor nucleari este mai mare. Anvelopa nucleară a unei celule de mamifer conţine 3.000-4.000 de complexe a porilor. O celulă care sintetizează ADN trebuie să importe din citosol 10 6 molecule de histone la fiecare 3 minute; aceasta înseamnă că fiecare complex al porului trebuie să transporte în medie 100 de molecule de histone într-un minut. De asemeni, dacă celula creşte repede, fiecare complex al porului trebuie să vehiculeze spre citosol aproximativ 6 subunităţi ribozomale mari şi mici nou formate într-un minut. Transportul proteinelor nucleare este selectiv şi se realizează cu participarea unor semnale de localizare nucleară (NLS). Semnalul de localizare nucleară poate fi localizat oriunde pe secvenţa de aminoacizi, el variază de la o proteină nucleară la alta, dar în general este format dintr-o secvenţă scurtă de 4-8 aminoacizi bogaţi în lizină, arginină, prolină. Există de asemenea semnale de export nuclear sau NES (Nuclear Export Signal). Transportul nuclear activ presupune următoarele etape: a) Fixarea proteinelor NLS sau NES la NPC. Această etapă este independentă de energie şi temperatură şi se realizează prin intermediul a două mari familii proteice: proteinele RanGTP şi karioferinele α şi β. Karioferinele formează trei clase de proteine: exportine, importine şi transortine. În prezenţa Ran exportinele fixează transportorul, în rimp ce importinele îl relaxează. Transportinele sunt mai puţin influenţate de Ran. Karioferinele sunt capabile să recunoscă proteinele ce prezintă pe suprafaţa lor semnalele de localizare nucleară sau de export nuclear. Transportul presupune formarea unui complex alcătuit din cele două subunităţi ale karioferinelor şi nucleoporine: subunitatea α ataşază NLS sau NES determinând creşterea afinităţii acesteia pentru subunitatea β; unirea subunităţilor α şi β a karioferinelor permite ataşare sevenţelor repetitive FG ale nucleoporinelor şi astfel, complexul de transport odată format poate pătrunde prin porul nuclear. b) Transportul moleculelor prin porii nucleari şi disocierea complexului de transport. Importul presupune ataşarea karioferinelor, a NLS şi a nucleoporinelor FG cu formarea complexului transportor care odată ajuns în nucleu se disociază printr-un mecanism alosteric determinat de legarea RanGTP la subunitatea β a karioferinelor (fig.VIII.15.).

Fig.VIII.15. Dinamica moleculară a importului nuclear (după Nehrabass)

Formarea complexului de export se realizează prin fixarea exportinei la secvenţa NES a proteinei transportate şi la secvenţele FG a nucleoporinelor, în prezenţa RanGTP. Acesta traversează porul nuclear şi odată ajums în citoplasmă se disociază, responsabil de disociere fiind RanGDP (fig. VIII.16).

Fig. 16.Dinamica moleculară a exportului nuclear (după Nehrabass)

Transportul nuclear este deci o suită de importuri şi exporturi de proteine guvernate de gradientul RanGTP, acesta găsindu-se în concentraţie mai mare în nucleu şi mai mică în citoplasmă. Concentraţia RanGTP în nucleu este menţinută prin intervenţia unei enzime RCCI sau RanGEF care converteşte RanGDP în RanGTP, pe când în citoplasmă RanGTP este transformat în RanGDP sub acţiunea enzimei RanGAP (fig.VIII.17).

Fig.VIII.17. Distribuţia asimetrică a RanGTP la nivelul NPC (după Nehrabass)

2.2.1.3. Compoziţia chimică a învelişului nuclear.

Anvelopa nucleară face parte din ansamblul sistemelor membranare celulare şi este formată din 30% lipide, 65% proteine (majoritatea glicoproteine), 4% ARN şi 1% ADN. Proporţia crescută a proteinelor în raport cu lipidele se datorează prezenţei laminei nucleare şi a NPC. Prezenţa ADN-ului se datorează heterocromatinei care se ataşează la lamina nucleară, pe cînd ARN-ul poate fi localizat la nivelul porilor nucleari sau poate fi asociat cu proteine specifice. Arhitectura moleculară a acestor membrane este asemănătoare cu cea a reticulului endoplasmic, enzimele şi citocromii fiind plonjate în dublul strat lipidic. 2.2.1.4. Rolul fiziologic al învelişului nuclear • Schimburile nucleo-citoplasmatice Principalul rol al învelişului nuclear este reprezentat de transportul de ioni şi molecule între compartimentul nuclear şi cel citoplasmatic, transport care se desfăşoară prin intermediul porilor nucleari. Schimburile nucleo-citoplasmatice sunt esenţiale pentru viaţa celulei, deoarece: - sinteza acizilor nucleici se desfăşoară în nucleu şi necesită importul nuclear al tuturor factorilor care participă la aceste mecanisme şi care sunt sintetizaţi în citoplasmă: componente nucleotidice, enzime, factori de transcripţie, ATP, proteine histonice şi nonhistonice care intră în alcătuirea cromozomilor, complexe ribonucleoproteice care participă la formarea precursorilor ribozomali. - biosinteza proteică se desfăşoară în citoplasmă şi necesită exportul nuclear al tuturor tipurilor de ARN şi a subunităţilor ribozomale (fig.VIII.18). • Participarea la realizarea reacţiilor metabolice Fiind o formă particulară de reticul endoplasmic, membrana nucleară prezintă un echipament enzimatic asemănător cu al acestuia şi realizează reacţii metabolice

cvasiidentice: - elongarea şi desaturarea acizilor graşi, biosinteza fosfolipidelor şi colesterolului, glicozilarea lipidelor şi proteinelor, detoxifiere. - poliribozomii ataşaţi la membrana externă sintetizează lanţuri polipeptidice care vor fi apoi inserate în bistratul lipidic sau vor fi transferate în spaţiul perinuclear. - în unele tipuri celulare, membrana nucleară externă formează prin înmugurire vezicule de tranziţie prin a căror fuziune se formează saci golgieni.

2.2.1.5. Biogeneza învelişului nuclear Învelişul nuclear este o structură prezentă pe perioada interfazei. Membranele se fragmentează până la dispariţie în premetafază şi se refac progresiv pe parcursul interfazei. După cum am prezentat anterior, învelişul nuclear este o formă particulară de reticul endoplasmic, ceea ce explică fragmentarea şi refacerea sa rapidă. Ca şi în cazul celorlalte membrane, constituenţii lipidici şi proteici se află într-un echilibru dinamic; viteza de reînnoire este la fel de mare ca şi în cazul constituenţilor reticulului. Fosfolipidele membranei interne se reînnoiesc mai repede decât cele ale membranei externe. Biogeneza anvelopei nucleare are loc în telofază cu participarea reticulului, a laminei nucleare, precum şi a nucleoproteinelor NUP 107 şi NUP 133.

Fig.VIII.18. Rolul învelişului nuclear în schimburile efectuate între nucleu şi citoplasmă

2.2.2. Matricea nucleară sau nucleoplasma Reprezintă partea nucleului aparent lipsită de structură în microscopie optică şi electronică, în care plonjează cromatina şi nucleolii. Din punct de vedere biochimic, matricea nucleară este definită ca o structură care conţine 10% din totalul proteinelor nucleare, 30% din ARN-ul nuclear, 1-3% din totalul ADN-ului şi 3% din fosfolipidele nucleare. Studiul matricei nucleare în microscopie elecronică arată că ea cuprinde în principal elemente fibrilare care stabilesc legături cu proteinele din alcătuirea porilor şi laminele nucleare. Organizarea moleculară a matricei nucleare cuprinde două componente: • o componentă stabilă reprezentată de o reţea fibroasă de natură proteică care menţine forma nucleului. Se poate aprecia că aceasta este o reţea structurală

cu rol analog citoscheletului celular. Proteinele structurale ale matricei nucleare sunt reprezentate de nucleoplasmină şi proteine nonhistonice. Proteinele nonhistonice sunt heterogene ca masă moleculară (GM de 10-30 kda), dar şi din punct de vedere chimic, fiind acide, neutre sau bazice. • o componentă labilă reprezentată de apă, ioni, ATP şi enzime de tipul nucleaze, ADN şi ARN-polimeraze şi proteinkinaze. Conţinutul în ATP al nucleului este mai mare decât cel al citoplasmei. Ionii cei mai abundenţi sunt Ca2+, Mg2+, Na+, K+. Există diferenţe între concentraţiile de Na+ şi K+ în nucleu faţă de citoplasmă, Na+ se găseşte în concentraţie mai mică, iar K+ în concentraţie mai mare decât în citoplasmă. Contractilitatea matricei nucleare este dependentă de cationii bivalenţi Ca+ şi Mg2+. Prezentând contractilitate, matricea nucleară este o structură dinamică. Funcţia matricei nucleare este neclară, cu toate că a fost definită din punct de vedere structural şi biochimic. Probabil că rolul ei cel mai important ar fi să asigure organizarea şi structura compartimentului nuclear intern. ADN-ul multiplicat şi componentele enzimatice necesare sintezei ADN-ului sunt asociate cu matricea, ceea ce sugerează rolul matricei în organizarea aparatului de multiplicare al ADN. 2.2.3. Cromatina 2.2.3.1. Clasificarea cromatinei În interfază, cromatina este forma relaxată, desfăşurată a cromozomilor. În timpul diviziunii celulare, cromatina se reorganizează, se condensează luând aspectul caracteristic cromozomilor. În funcţie de starea de condensare şi rolul îndeplinit pe parcursul interfazei, cromatina se clasifică în : • eucromatina, forma relaxată, activă din punct de vedere transcripţional; gradul scăzut de spiralizare permite transcripţia informaţiei genetice pe ARN ceea ce va conduce la sinteza proteinelor. În microscopia optică se colorează slab bazofil, tinctorialitatea redusă se datorează gradului scăzut de spiralizare. Predomină în nucleii celulelor tinere cu intensă activitate metabolică, numiţi nuclei eucromatici. În microscopia electronică are aspect fin granular. Eucromatina cuprinde genele care codifică sinteza proteinelor responsabile de structura şi funcţia tipului celular respectiv în diferite perioade de activitate metabolică. Se subclasifică în : a) eucromatina activă reprezentată de zonele care codifică proteinele care asigură structura şi funcţia (viaţa bazală) celulei; b) eucromatina permisivă reprezenată de zonele care codifică proteine sintetizate ca răspuns celular la semnale modulatoare. Această fracţiune a eucromatinei nu este în permanenţă activă, dar poate fi activată de către mesageri (ex.hormoni).

• heterocromatina, cromatina înalt condensată şi inactivă din punct de vedere transcripţional. Datorită gradului ridicat de spiralizare, heterocromatina nu permite copierea mesajului pe ARN şi deci nu va conduce la sinteza proteinelor pe care le codifică. Ea reprezintă aproximativ 90% din cromatina nucleară. În microscopia optică se colorează intens bazofil datorită gradului crescut de spiralizare şi se prezintă sub formă de mase neregulate ataşate foiţei interne a membranei nucleare sau ataşate nucleolului. Se găseşte în cantitate crescută în nucleii celulelor îmbătrânite cu activitate metabolică redusă. Datorită gradului crescut de tinctorialitate, aceştia poartă numele de nuclei hipercromi sau picnotici. În microscopia electronică apare sub formă de grunji de aspect neregulat, electronodenşi. În funcţie de rolul îndeplinit în formarea cromozomilor, heterocromatina se subclasifică în: a) heterocromatina constitutivă este condensată în permanenţă pe parcursul interfazei. În mitoză intră în alcătuirea celor 22 de perechi de cromozomi autozomi şi se localizează în jurul centromerilor şi la telomere. b) heterocromatină facultativă este condensată pe perioada interfazei numai în anumite tipuri celulare şi pe perioade restrânse ale dezvoltării celulare. Genele care aparţin acestei fracţiuni de cromatină nu se exprimă decât în cazul în care are loc despiralizarea, cu transformarea heterocromatinei în eucromatină. Din heterocromatina facultativă face parte formaţiunea descrisă de Barr şi Bertram (1949) sub denumirea de cromatină sexuală sau corpuscul Barr. Cromatina sexuală este prezentă în 20% din celulele sexului feminin şi în mod normal lipseşte la sexul masculin. Ea reprezintă o heterocromatinizare interfazică a unuia din cromozomii X care devine inactiv din punct de vedere genetic; inactivarea se produce în a 14-15 zi de la fecundaţie la embrionul de sex feminin. Cromatina Barr se poate pune în evidenţă în celulele mucoasei bucale unde apare de formă lenticulară, ataşat de membrana internă a nucleului, în neuroni unde este ataşat nucleolului şi în polimorfonuclearele neutrofile, unde are forma unui "băţ de tobă" (drumstick) ataşat de unul dintre lobii nucleului (fig.VIII.19). Evidenţierea corpusculului Barr (de regulă pe frotiul de sânge) este utilizată în orientarea diagnosticului anomaliilor cromozomiale numerice gonozomale de tip sindrom Turner (45,X0), sindrom triploX (47,XXX) şi sindrom Klinefelter (47,XXY). Diagnosticul de certitudine necesită efectuarea cariotipului. Caracteristica sexului masculin o reprezintă cromozomul Y. Acesta poate fi evidenţiat prin microscopie de fluorescenţă, după colorare cu quinacrină sub forma unui corpuscul intens fluorescent numit şi corpuscul F (fluorescent). A fost descoperit de Pearson în 1970 şi este utilizat în diagnosticul anomaliilor

cromozomiale legate de cromozomul Y.

Fig.VIII.19. Evidenţierea corpusculului Barr în diferite tipuri celulare

2.2.3.2. Organizare moleculară Nucleul conţine aproape toată informaţia genetică sub formă de ADN. După cum s-a prezentat anterior, ADN este format din 4 nucleotide: 2 conţin baze purinice cu o structură inelară dublă (adenină şi guanină), iar 2 conţin baze pirimidinice cu o structură inelară simplă (timină şi citozină). Structura de bază a ADN, dedusă în 1953 de Watson şi Crick este formată din 2 lanţuri polinucleotidice care stabilesc legături de hidrogen între adenină şi timină (perechea A-T) şi între guanină şi citozina (perechea G-C). Cele 2 catene sunt antiparalele, complementare şi răsucite, formând un dublu helix cu un diametru de 2 nm. Nucleotidele nu sunt aranjate la întâmplare, ci în aşa fel încât trei litere să formeze un „cuvânt” care să semnifice un aminoacid; astfel informaţia genetică este conţinută în aranjamentul liniar specific al bazelor azotate. Fiecare „cuvânt” reprezintă o unitate informaţională a codului genetic şi poartă numele generic de codon (fig.VIII.19). ADN cromozomial asociat cu proteinele nucleare şi resturi de ARN formează cromatina. Din punct de vedere biochimic, proteinele asociate ADN se clasifică în proteine histonice şi proteine nonhistonice. Încă din 1960 se cunoaşte faptul că, în timp ce conţinutul în ARN şi proteine nonhistonice prezintă un raport variabil de la un tip celular la altul, histonele şi ADN-ul prezintă un raport fix de 1/1.

• Proteinele nonhistonice sunt o clasă heterogenă de polipeptide care cuprinde proteine structurale care intră în structura cromozomilor, proteine reglatoare implicate în reglarea genelor şi enzime de tipul ARN polimeraze şi ADN polimeraze. • Proteinele histonice se găsesc doar în celulele eucariote şi sunt cele mai numeroase proteine din nucleu. Au o greutate moleculară mică de 10-20 Kd şi sunt bogate în arginină şi lizină. Aceşti aminoacizi conferă proteinelor histonie o sarcină puternic pozitivă şi un caracter bazic şi le permite astfel realizarea de

legături strânse cu moleculele de ADN care au un caracter acid şi o sarcină negativă (tabel VIII.II). Există 5 tipuri de histone notate H1, H2A, H2B, H3 şi H4. Proteinele histonice H1 sunt diferite de la o specie la alta precum şi de la un ţesut la altul şi sunt ultimele apărute pe scara filogenetică. Histonele H2A, H2B, H3 şi H4 sunt foarte similare la specii diferite, motiv pentru care sunt considerate printre cele mai conservate proteine cunoscute. H2A şi H2B au un conţinut ridicat de lizină, iar H3 şi H4 de arginină. Histonele H2A, H2B, H3 şi H4 sunt denumite histone nucleozomale, deoarece sunt responsabile de organizarea unităţii de bază a cromatinei, numită nucleozom.

Fig.VIII.19. Relaţia dintre detaliile moleculare ale codului genetic conţinut în ADN şi cromozom

Tipul H1 H2A H2B H3 H4

Masa moleculară 20000 14000 13800 15300 11300

Număr de aminoacizi 220 129 125 135 102

Tipuri de a.a. Lizină Arginină +++ ++ ++

+++ +++

Specificitate de specie Da Nu Nu Nu Nu

Tabel VIII.II. Principalele caracteristici ale histonelor

2.2.3.3. Organizarea supramoleculară a cromatinei - Nucleozomul Nucleozomul este unitatea de bază a cromatinei şi prin repetare formează structura filamentului de cromatină, conferind aspectul de „mărgele pe sârmă” observat în microscopie electronică.

Fig.VIII.20. Schema de organizare supramoleculară a nucleozomului. Detalierea componentelor moleculare (după Alberts)

Nucleozomul este format dintr-un miez proteic numit octamer pe care se dispune o dublă spiră de ADN dublu catenar. - octamerul poartă această denumire deoarece este format din 8 molecule, câte două din fiecare din proteinele histonice H2A, H2B, H3, H4. Histona H1 este implicată în legarea nucleozomilor. - lungimea ADN-ului care înconjoară octamerul este de 146 de perechi de nucleotide, iar a filamentului total de ADN din alcătuirea nucleozomului, de aproximativ 200 perechi de nucleotide (fig.VIII.20). Microscopia electronică a demonstrat că în celulele vii, cromatina adoptă rareori forma despiralizată de „mărgele pe sârmă” cu o grosime a filamentului de 11 nm (similară cu înălţimea nucleozomului). Cea mai mare parte a filamentelor de cromatină au o grosime de 30 nm, modul de dispunere al nucleozomilor nefiind încă cunoscut. Totuşi, din multele modele propuse, modelul „în zig-zag” este considerat cel mai coerent la ora actuală (fig.VIII.21a). Mai mult, se consideră că modelul „în zig-zag” are un aspect dinamic, modificându-se în permanenţă datorită acţiunii proteinelor ataşate ADN-ului de legătură intercromozomială (fig.VIII.21.b).

Fig.VIII.21.Modelul în „zig-zag” al dispunerii nucleozomilor în cadrul fibrei de 30 nm a) diferite modele propuse ale fibrei de cromatină de 30 nm; b) localizarea proteinelor de legătură a secvenţelor de ADN care par să fie responsabile de variaţia dispunerii nucleozomilor

2.2.4. Nucleolul Nucleolul este un organit nuclear prezent în toate celulele eucariote cu excepţia primelor blastomere care nu realizează biosinteză proteică, deoarece

funcţiile vitale le sunt asigurate de proteinele vitelusului formativ asigurat de ovocit. A fost evidenţiat încă din 1836 prin tehnici de microscopie optică, dar rolul său în sinteza precursorilor ribozomali a fost dovedit abia în 1960. Nucleolul este prezent pe întreaga perioadă a interfazei; se fragmentează până la dispariţie în premetafază şi se reface în telofază ca şi component al nucleului celulelor fiice. 2.2.4.1. Morfologie

În microscopia optică, pe preparatele proaspete, nucleolul apare sub forma unui corpuscul refringent, rotund-ovalar. Pe preparatele fixate, datorită încărcăturii acide, se colorează intens bazofil (albastru de toluidină) sau intens argentofil (impregnare argentică-metoda Cajal). Numărul nucleolilor este în raport direct cu gradul de ploidie, în majoritatea celulelor umane somatice (diploide) există 1-2 nucleoli. În celulele maligne care sunt caracterizate de poliploidie numărul nucleolilor poate ajunge la 10-12. Dimensiunea nucleolului se încadrează de regulă între 1-7 (aproximativ 1/3 din volumul nucleului). Talia nucleolilor variază în funcţie de specie, tipul celular şi starea funcţională a celulei deoarece ea reflectă activitatea nucleolului, deci numărul de ribozomi produşi într-un anumit moment funcţional. Poziţionarea în nucleu este de regulă centrală, dar poate fi şi excentrică, chiar periferică în funcţie de momentul funcţional (fig.VIII.22).

Fig.12. Imagini de microscopie electronică de transmisie ale nucleului şi nucleolului unui fibroblast uman. Nucleul în interfază (stg); componentele nucleolui (dr.)

(după E.G.Jordan şi J.McGovern)

2.2.4.2. Ultrastructură Nucleolul nu rezintă o membrană proprie. Din punct de vedere ultrastructural sunt descrise 4 componente: - centru fibrilar; - componenta fibrilară densă formată din ADN cromozomial care joacă rol de organizator nucleolar. Genele ribozomale sunt grupate în regiuni cromozomiale numite organizatori nucleolari sau NOR (nucleolar organiser region). Numărul genelor ribozomale variază, fiind în jur de câteve sute la mamifere; la om există aproximativ 400 de cópii. În timpul mitozei, materialul genetic nucleolar este antrenat în spiralizarea cromozomilor şi aceste gene se dispun la nivelul constricţiilor secundare ale cromozomilor din perechile 13, 14, 15, 21, 22. Numele de „organizatori nucleolari” provine din faptul că în telofază, odată cu despiralizarea cromozomilor, ele participă la reorganizarea nucleolilor în nucleii celulelor fiice. - componenta granulară dominantă din punct de vedere cantitativ, reprezentată de precursorii ARN-urilor ribozomale, ARN-uri ribozomale mature, subunităţi proteo-ribozomale ; - componenta amorfă care umple spaţiul dintre celelalte componente. 2.2.4.3. Organizarea moleculară. Datorită concentraţiei mari de substanţă uscată, nucleolul este considerat a fi cea mai densă structură celulară. Principalele componente moleculare din greutatea uscată a nucleolului sunt reprezentate de: ADN-3%, ARN-7%, proteine-90%. ADNul este reprezentat de centrul fibrilar şi organizatorii nucleolari care pătrund ca nişte bucle în nucleol. ARN-ul este în principal reprezentat de ARN ribozomal aflat în diferite faze de maturare. Proteinele nucleolare sunt reprezentate de proteine ribozomale, precum şi de enzime care participă la sinteza şi maturarea ARN-urilor ribozomale. 2.2.4.4. Rolul nucleolului Rolul esenţial al nucleolului este biogeneza ribozomilor. În nucleol se sintetizează tipurile de ARN ribozomal care participă la formarea subunităţilor ribozomale. Aceşti precursori ribozomali se asociază cu proteinele ribozomale, trec prin porii nucleari în citoplasmă unde se maturează, formându-se ribozomii capabili de sinteza proteică. Transcripţia genelor ribozomale este iniţiată la nivelul joncţiunii dintre centrul fibrilar şi componenta fibrilară densă. Se formează precursorul ARNr 45 S de la care porneşte un proces de maturare biochimică care conduce la formarea a trei tipuri de

ARNr: ARNr 18S, ARNr 28S şi ARNr 5,8S (fig.VIII.23). La formarea ribozomilor participă şi un ARNr 5S care se sintetizează în nucleu. Moleculele de ARNr formează complexe ribonucleoproteice cu un mare număr de proteine sintetizate în citoplasmă şi importate apoi în nucleu. Maturarea ribozomilor are loc în citoplasmă pe măsură ce subunităţile ribozomale sunt transferate. La eucariote, subunitatea mare ribozomală (60S) este formată din complexele ribonucleoproteice care conţin ARNr 18 S, 28 S şi 5,8 S şi 49 de tipuri de proteine ribozomale, iar subunitatea mică (40S) din complexele ribonucleoproteice cu ARNr 18S şi 33 de tipuri de proteine ribozomale.

Fig. VIII.23. Rolul nucleolului în sinteza ribozomilor. Schema sintezei ARNr în nucleol, transportul lor în nucleu şi apoi în citoplasmă,

asamblarea subunităţilor ribozomale 60S şi 40S 2.2.4.5. Factori care influenţează activitatea nucleolului

a) substanţe inhibitoare: Substanţele inhibitoare determină inactivitatea nucleolară prin hipotrofia nucleolară, vacuolizarea şi fragmentarea acestuia. Deoarece inhibă activitatea nucleolului şi prin această inhibă funcţiile vitale celulare (biosinteza proteică), unele dintre ele sunt utilizate în tratamentul anticanceros: - agenţi fizici: căldura, razele X, UV; - agenţi chimici: actinomicina D, fluorouracilul; - toxine microbiene. b) substanţe stimulatoare: - thioacetamida, phitohemaglutinina, pilocarpina; - infecţii virale cu adenovirusuri. 2.3. FUNCŢIILE NUCLEULUI INTERFAZIC Pe parcursul interfazei, nucleul poartă denumirea de „nucleu metabolic” deoarece supraveghează şi coordonează activitatea metabolică a celulei. Pentru aceasta, el prezintă o ultrastructură adaptată funcţiei de stocare, dublare şi copiere a informaţiei genetice, precum şi funcţiei de comunicare cu citoplasma. Am prezentat în numeroase rânduri faptul că proteinele participă la organizarea tuturor structurilor celulare şi la realizarea tuturor funcţiilor celulare. Fără proteine viaţa nu poate exista. De altfel, începutul vieţii pe planetă este considerat a fi momentul apariţiei primilor aminoacizi. Pe de altă parte, ştim că „celulele” sunt acele forme de existenţă ale lumii vii capabile de metabolism, autoreglare şi diviziune. Fiecare dintre aceste funcţii se realizează cu participarea proteinelor. De aici rezultă faptul că pe perioada întregii sale vieţi, celula are două deziderate importante: producerea de proteine şi pregătirea şi realizarea diviziunii. Mecanismul care asigură realizarea acestor deziderate se realizează în etape succesive şi a fost denumit „dogma centrală a biologiei moleculare” sau simplu „calea metabolică de la ADN la proteine”. Etapele de realizare a transmiterii informaţiei sunt în ordine: replicarea (duplicarea ADN), transcripţia (sinteza ARN) şi translaţia (sinteza proteinelor) (fig.VIII.24).

Fig.VIII.24. Dogma centrală a biologiei moleculare

2.3.1. REPLICAREA (DUPLICAREA ADN) O primă abordare a mecanismului replicării ADN a fost realizată de studiile lui Chargaff în legătură cu compoziţia bazelor azotate. În procesul analizării moleculelor de ADN provenind de la o varietate largă de organisme, Chargaff a descoperit un model remarcabil: bazele adenină şi timină au fost găsite întotdeauna ca fiind în cantităţi egale, la fel ca şi bazele citozină şi guanină. Acest model a devenit cunoscut ca „regula lui Chargaff”. Deşi Chargaff a intuit că această regularitate trebuie să reflecte o proprietate fundamentală a ADN-ului, nu a descoperit importanţa sa exactă. Importanţa relaţiilor dintre adenină şi timină, citozină şi guanină a devenit evidentă în 1953 când Watson şi Crick au publicat un model bidimensional al structurii ADN. Acest model s-a bazat pe analiza ADN prin difracţie în raze X realizată de Franklin şi Wilkins; ei au sugerat lui Watson şi Crick aranjamentul molecular al ADN în spirală sau helix. Watson şi Crick au descoperit că cele două catene din helixul de ADN pot fi ţinute împreună prin legături de hidrogen între bazele azotate a celor două catene opuse. În acest ADN dublu helix capetele zaharidice fosfate ale celor două catene au polaritate

opusă, una fiind orientată în direcţia 5'→3' şi cealaltă în direcţia 3'→5'. Bazele azotate din cele două catene sunt orientate spre interiorul moleculei de ADN şi astfel pot interacţiona între ele. Cea mai remarcabilă trăsătură a acestui model a fost descoperirea că legăturile de hidrogen care stabilizează helixul se pot realiza între adenina dintr-un lanţ şi timina din celălalt sau între citozină şi guanină. Deoarece secvenţa bazelor dintr-un lanţ determină secvenţa lanţului opus, cele două lanţuri sunt complementare. Cea mai profundă implicaţie a modelului lui Watson şi Crick a fost aceea că a dovedit o explicare moleculară simplă a capacităţii celulelor de aşi duplica informaţia genetică. S-a evidenţiat că din cele două lanţuri de ADN, fiecare poate servi ca matriţă pentru copierea lanţului opus pe baza complementarităţii bazelor azotate. Deoarece fiecare moleculă de ADN sintetizată prin acest mecanism conţine o catenă veche de ADN şi una nou sintetizată, procesul a fost denumit replicare semiconservativă. Mecanismul replicării se realizează în etape succesive şi necesită prezenţa unui aparat enzimatic specializat. 1. Iniţierea sintezei are loc într-un punct specific din molecula de ADN numit origine care va conduce la sinteza unui replicon. La procariote există o singură origine şi un singur replicon, la eucariote există mii de origini şi mii de repliconi. Originea replicării este reprezentată de o secvenţă specifică de nucleotide numită secvenţă de replicare autonomă sau ARS (autonomus replication sequence). 2. Sinteza începe prin separarea catenelor ADN parental şi formarea furcii de replicare, numită astfel datorită formei în Y. Molecula de ADN este foarte subţire şi astfel separarea helixului nu va întâmpina nici o rezistenţă de frecare. În plus, legăturile de hidrogen care stabilizează molecula sunt foarte slabe astfel încât energia necesară separării este practic neglijabilă. Sinteza noilor catene are loc bidirecţional, începând dintr-o singură origine cu formarea a două furci de replicare în direcţii opuse faţă de origine. 3. Sinteza noilor catene este realizată de ADN polimerază care foloseşte ca matriţe catenele vechi. ADN polimeraza are rolul de a adauga nucleotidul la gruparea OH3' a dezoxiribozei. Sinteza noilor catene are loc într-o singură direcţie 5'→3' din acest motiv, noua catenă 5'→3' se sintetizează continuu şi este denumită catenă prioritară (leading), iar catena 3'→5' este sintetizată discontinuu şi mai încet fiind denumită catena tardivă (lagging). În cazul catenei tardive, viteza de sinteză este încetinită deoarece ADN polimeraza trebuie să sintetizeze fragmente tot în direcţia 5'→3'. Aceste fragmente sunt numite fragmentele Okazaki şi au o lungime de 2000 nucleotide la procariote şi 100-200 nucleotide la eucariote (fig.VIII.25). Aparatul replicării Replicarea ADN implică un număr mare de enzime dar şi proteine care nu

prezintă activitate enzimatică. Enzimele şi proteinele implicate în replicare formează o structură multiproteică numită replizom care se asamblează la nivelul furcii de replicare numai în momentul iniţierii sintezei ADN. 1. Primozomul este un complex enzimatic care se deplasează de-a lungul furcii, separă cele două lanţuri şi ataşează primerii de ARN pentru sinteza fragmentelor Okazaki ale catenei tardive. Este format din: - ADN helicazele separă catenele dublului helix şi continuă să se deplaseze pe o singură catenă (fig.VIII.26). Existînd două catene cu orientări diferite vor exista şi două helicaze care desfac catenele din dublul helix. - ADN primaza iniţiază sinteza de ADN prin ataşarea unor secvenţe scurte de ARN, formate din 5-8 ribonucleotide numite primeri. 2. ADN polimerazele. Enzimele cu rol în sinteza noilor catene pe catenele parentale (template) sunt ADN polimerazele. La procariote au fost denumite ADN polimeraza I, II, III, iar la eucariote α,β,γ. La eucariote ADN polimeraza α se deplasează în direcţia 5'→3' şi ataşează nucleotidele în mod continuu pe catena prioritară şi discontinuu (fragmentele Okazaki) pe catena tardivă. Pe lângă activitatea sintetică, ADN polimeraza are două subunităţi cu activitate nucleazică: a) După ce a avut loc sinteza fragmentelor Okazaki, ADN polimeraza digeră primerii de ARN şi îi înlocuieşte cu dezoxinucleotide complementare. b) ADN polimeraza are şi rolul de a corecta erorile mecanismului replicării care pot apare în molecula de ADN prin introducerea unei baze necomplementare. 3. ADN ligaza. După ce fragmentele Okazaki au fost sintetizate şi primerii lor digeraţi, ADN ligaza uneşte fragmentele şi realizează continuitatea catenei tardive. 4. Proteinele SSB (single strand DNA binding) sunt proteine care se leagă de ADN monocatenar şi au rolul de a stabiliza catenele de ADN în regiunile desfăcute şi de a împiedica refacerea structurii dublu catenare, favorizând astfel funcţia de matriţă a catenelor. Ele fac parte din categoria proteinelor auxiliare (chaperone proteins).

Fig.VIII.25. Replicarea ADN-ului în direcţia 5’-3’.

Fig.VIII.26. Enzimele şi proteinele implicate în replicarea ADN-ului

Sistemele de corectare postreplicativă Replicarea are loc cu viteză mare de polimerizare: 1000 perechi de nucleotide/s la bacterii şi 100 perechi de nucleotide/s la eucariote. Acest lucru poate conduce la apariţia a numeroase erori de replicare care, de regulă, sunt corectate de sisteme de corectare postreplicativă numite şi mecanisme care asigură fidelitatea replicării. Sistemele de corectare postreplicativă acţionează secvenţial (fig.VIII.26): a) selecţia nucleotidelor pentru formarea perechilor de baze complementare este asigurată de eficienţa ADN polimerazei; în cazul în care selecţia nucleotidelor a fost punctual alterată şi nucleotidul inserat nu este complementar, intervine următorul sistem de corectare. b) recunoaşterea bazei incorecte şi eliminarea ei de către exonucleaza 3'-5'. Înlocuirea regiunii excizate cu secvenţa corectă este realizată de ADN polimerază. c) unirea fragmentelor cu restabilirea continuităţii catenei este realizată de ADN ligază.

Fig.VIII.26. Schema generală a sistemului postreplicativ de reparare

2.3.2. TRANSCRIPŢIA (SINTEZA ARN) ADN stochează informaţia genetică a celulei, dar fiind macromolecule cu GM 10 -109 d nu pot depăşi bariera realizată de învelişul nuclear. Transmiterea informaţiei de la nivelul genei (nucleu) la sediul sintezei proteice (citoplasmă) presupune un sistem de transport al informaţiei. Transmiterea mesajului genetic de la ADN spre sinteza proteică trece prin etapele de transcripţie (transcrierea informaţiei de la ADN prin sinteza moleculelor de ARNm) şi translaţie (traducerea informaţiei de la ARNm la proteină, cu participarea ARNt). 6

La procariote, transcripţia şi translaţia sunt cuplate spaţial şi temporal (ambele se desfăşoară în citoplasmă), în timp ce la eucariote aceste procese sunt separate spaţial şi temporal (transcripţia are loc în nucleu, iar translaţia în citoplasmă) (fig.VIII.27). Transcripţia ADN-ului se desfăşoară pe toată perioada interfazei şi este blocată în mitoză.

Fig.VIII.27. Locul de derulare al transcripţiei şi translaţiei la PK (a) şi EK (b) Aparatul transcripţiei Procesul de transcripţie este realizat de enzime specifice numite ARN- polimeraze. La procariote există o singură ARN-polimerază care este responsabilă pentru sinteza celor trei tipuri

de ARN, pe când la eucariote au fost descrise trei tipuri de ARN-polimeraze implicate în transcriere: - ARN-polimeraza I se găseşte în nucleol şi catalizează sinteza ARNr; - ARN-polimeraza II se găseşte în nucleu şi participă la sinteza ARNm; - ARN-polimeraza III se găseşte în nucleu şi sintetizează ARNt şi unităţile ribozomale 5S, 18S şi 28S. Pe lângă ARN-polimeraze, în procesul transcripţiei sunt implicate numeroase proteine auxiliare (factori de transcripţie), proteine reglatoare (reglează desfăşurarea procesului), precum şi o serie de elemente de control ale transcripţiei care se găsesc în structura ADN-ului. Etapele transcripţiei Deoarece transcripţia are loc numai în direcţia 5′→3′, numai una din cele două catene de ADN va acţiona ca matriţă pentru ribonucleotidele care se vor ataşa conform principiului complementarităţii şi vor forma ARN-ul nou sintetizat. 1. Etapa de iniţiere cuprinde recunoaşterea de către ARN-polimerază a genei care trebuie transcrisă, precum şi a locului din care începe copierea informaţiei, numit situs start sau promotor. Promotorul reprezintă o secvenţă din ADN care conţine informaţia pentru iniţierea sintezei ARN şi stabileşte care din cele două catene de ADN va fi transcrisă. Secvenţa de recunoaştere a acestui promotor este regiunea „TATA box“ (secvenţă în care alternează timina cu adenina). După legarea ARN-polimerazei la promotor are loc desfacerea dublului helix al ADN, secvenţele de nucleotide fiind astfel expuse (fig.VIII.28). 2. Etapa de elongaţie în care ARN polimeraza înaintează despiralizând helixul ADN şi expunând succesiv alte baze pentru „citire”. Astfel, lanţul de ARN se extinde cu câte un nucleotid în sens 5'→3'. Ansamblul format de porţiunea de ADN aflat în transcriere şi moleculele de ARN ataşate de genă poartă numele de „unitate de transcriere” şi apare la microscopul electronic ca o frunză de ferigă (fig.VIII.29). 3. Etapa de terminare. Sinteza ARN încetează în momentul în care ARN polimeraza întâlneşte semnalul de terminare (stop). Ea se desprinde de pe ADN, eliberând în acelaşi timp şi molecula de ARN transcrisă. ADN-ul se reface sub formă de dublu helix.

Fig.VIII.28. Etapele sintezei ARN

Fig.VIII.29. Aspectul în „frunză de ferigă”: transcrierea simultană a unei gene de către mai multe ARN polimeraze Metabolismul posttranscripţional ARN nou sintetizat prin transcripţie este numit ARN transcris primar. Înainte de a părăsi nucleul, moleculele de ARN transcris primar vor suferi unele modificări: a) adiţia la capătul 5' a unui nucleotid G-metilat, proces numit “5'- capping”, cu rol important în iniţierea sintezei proteice, dar şi de a asigura protecţia moleculei de ARN care este transcrisă. b) adiţia la capătul 3' a unui lanţ poli-A, format din 100-200 nucleotide cu adenină. Secvenţa genelor din genomul procariotelor corespunde în întregime cu secvenţa aminoacizilor din proteina pe care au codificat-o. La eucariote, unitatea transcriptibilă a genei este formată din două grupuri de secvenţe: – exoni sau secvenţe informaţionale, transcrise în ARN precursor, conţinute de ARNm şi care se regăsesc în secvenţa aminoacizilor din proteină; – introni sau secvenţe non-informaţionale, transcrise în ARN precursor, dar care nu se mai regăsesc în ARNm şi nici în secvenţa aminoacizilor din proteină (fig.VIII.30). ARN transcris primar conţine toată secvenţa nucleotidelor copiată de pe ADN, atât introni cât şi exoni. Prin procesul de “RNA-splicing” (ARN-procesare), secvenţele non-informaţionale (introni) vor fi eliminate, iar secvenţele informaţionale (exoni) vor fi legate unul de celălalt. În urma acestui proces, rezultă molecula de ARNm matur care, fiind formată numai din exoni, este mult mai mică (cca. 500 – 3.000 nucleotide) decât transcriptul primar (cca. 50.000 nucleotide). Ulterior, ARNm matur trece în citoplasmă, unde participă la sinteza proteinelor.

Fig.VIII.30. Transcrierea secvenţei genelor, fenomenul de „splicing” al ARN Inhibitorii sintezei de ARN

Transcrierea ADN de către ARN-polimerază este inhibată de o serie de compuşi care acţionează diferit: • prin legarea de matriţa de ADN şi modificarea structurii acestuia. În această categorie se încadrează actinomicina D, bromura de etidiu, aflatoxina, 2-acetilaminofluorenul. • prin legarea la ARN-polimerază şi inhibiţia activităţii acesteia. În această categorie se încadrează rifampicina şi α-amanitina.

2.3.3. TRANSLAŢIA (BIOSINTEZA PROTEINELOR) Sinteza proteinelor are loc în citoplasmă la nivelul poliribozomilor, cu respectarea următoarelor reguli: - concentraţia intracitoplasmatică a ionilor de Mg++ trebuie să atingă pragul de 103 ; la o concentaţie mai mică subunităţile ribozomale nu se ataşează pe catena de ARNm, iar la o concentraţie mai mare se produce o aglomerare de subunităţi ribozomale ceea ce împiedică debutul sintezei. - ARNm este citit în direcţia 5'→3'; - sinteza se desfăşoară întotdeauna de la capătul amino spre cel carboxil al lanţului polipeptidic. - natura lanţului sintetizat este determinată exclusiv de ARNm şi nu de natura ribozomului, acelaşi ribozom poate sintetiza lanţuri polipeptidice diferite în funcţie de ARNm pe care se dispune. Mecanismul molecular al biosintezei proteice se desfăşoară în trei etape care implică evenimente biochimice distincte: faza de iniţiere, faza de elongare şi faza de terminare. a) Faza de iniţiere reprezintă formarea complexului de iniţiere, care cuprinde: ARNm, subunităţile ribozomale şi un ARNt iniţiator. Subunitatea mică ribozomală prezintă un situs specific pentru asocierea ribozomului la ARNm (fig.VIII.31). Subunitatea mare ribozomală prezintă 3 situsuri specifice: situsul A de legare a unui aminoacil-ARNt, situsul P de legare al peptidil-ARNt şi situsul E de eliberare al ARNt.

Fig.VIII.31. Reprezentarea schematică a situsurilor de ataşare pe mica şi marea subunitate ribozomală

Faza de iniţiere se realizează în etape succesive (fig.VIII.32): • La eucariote, ARNt iniţiator transportă întotdeauna metionina (la procariote, formil-metionina). În acest fel, toate lanţurile polipeptidice în formare prezintă la extremitatea N-terminală acest aminoacid. La sfârşitul sintezei lanţului polipeptidic, metionina va fi eliminată de o protează specifică, ceea ce explică faptul că nu toate proteinele încep cu metionina. • ARNt iniţiator se ataşează pe subunitatea mică ribozomală. Odată cu ARNt iniţiator are loc ataşarea unor proteine numite factori de iniţiere la eucariote (eIF) şi a unei molecule de GTP. • Subunitatea mică se ataşează pe ARNm şi începe să se deplaseze în direcţia 5’→3’ în căutarea primului codon AUG; deplasarea este energodependentă, realizându-se cu consum de ATP. • Ajunsă la nivelul AUG, subunitatea mică pierde factorii de iniţiere şi consumă GTP pentru a ataşa subunitatea mare. Ribozomul devine în acest fel complet. • Subunitatea mare se ataşează în aşa fel încât ARNt iniţiator să se plaseze pe locusul P (peptidil). Locusul A (aminoacil) este încă liber. • În citoplasmă, un alt ARNt fixează specific un aminoacid împreună cu care formează un aminoacil-ARNt. Acesta se va ataşa pe locusul A. • Subunitatea mare se deplasează spre capătul 3’ cu lungimea unui codon, fenomen numit translocare. În acest fel, ARNt iniţiator se plasează pe locusul E (eliberare), primul aminoacil-ARNt se plasează pe locusul P, iar locusul A rămâne liber pentru ataşarea unui alt aminoacil-ARNt. • Între metionină şi primul aminoacid are loc formarea primei legături peptidice, catalizată de peptidiltransferază. b) Faza de elongare constă în inserţia succesivă de aminoacizi şi formarea de legături polipeptidice între aceştia. Mecanismul se derulează în cicluri de ataşare a unui nou aminoacil-ARNt pe locusul A, translocarea subunităţii mari şi formarea legăturii polipeptidice. La sfârşitul fiecărui ciclu locusul A rămâne liber (fig.VIII.33). Aminoacidul nou inserat este dictat de codonul liber corespunzător locusului A al ARNm. Pentru inserţie mai sunt necesare o moleculă de GTP şi o proteină solubilă din citosol numită primul factor al elongării (EFтu). La legarea aminoacilARNt de locusul A se produce hidroliza GTP, iar GDP şi primul factor al elongării sunt eliminaţi. Apoi GTP se reface prin acţiunea celui de al doilea factor al elongării (EFтs) şi ca urmare se reface complexul GTP - primul factor de elongare necesar pentru a începe o nouă inserţie. Translocarea necesită energie, eliberată prin hidroliza a celei de-a treia molecule de GTP cât şi prezenţa celui de-al treilea factor al elongării numit

translocază (EFG). Ciclul elongării se poate repeta deoarece de fiecare dată la sfârşitul celor trei timpi locusul A devine vacant. În dreptul său se va afla de fiecare dată un alt codon care poate fi recunoscut de aminoacil ARNt-ul cu anticodon complementar, deci un alt aminoacid se va lega în lanţul peptidic

Fig.VIII.32. Fazele etapei de iniţiere

Fig.VIII.33. Cicluri ale etapei de elongare

c) Faza de terminare a sintezei lanţului polipeptidic se produce atunci când pe locusul A ajunge un codon pentru care în citoplasmă nu există ARNt cu anticodon complementar. Există trei codoni nonsens UAA, UAG sau UGA numiţi şi codoni stop. Codonii nonsens sunt recunoscuţi de proteine numite factori de eliberare. Acestea determină peptidil transferaza să adiţioneze o moleculă de apă în locul unui alt aminoacid. În acest fel lanţul polipeptidic este eliberat în citoplasmă, ribozomul se disociază în cele două subunităţi, iar moleculele de ARNm şi ARNt sunt puse în libertate (fig.VIII.34). Lanţul polipeptidic format nu este produsul final, el va fi supus unor procese de maturare al căror scop final este reprezentat de formarea structurii spaţiale a proteinei, structură indispensabilă activităţii biologice a proteinei.

Fig.VIII.34. Fazele etapei de terminare a biosintezei proteice

Implicaţii medico-farmaceutice: Numeroase substanţe se comportă ca inhibitori ai procesului de biosinteză a proteinelor. Inhibarea sintezei proteinelor poate fi realizată în orice moment al transferului de informaţie: replicare, transcripţie, translaţie. Cea mai mare parte din antibioticele folosite în medicină, inhibă sinteza proteică la bacterii şi prin aceasta au efect bactericid. Teoretic, ele nu sunt toxice pentru om deoarece se leagă în diferite regiuni ale ribozomilor bacterieni şi intervin astfel în diferite etape ale sintezei proteice (tabelul VIII.III). Antibioticul Eritromicina Puromicina Ciclohexamida Anizomicina Tetraciclina

Streptomicina

Cloramfenicol Mitomicina Acidul nalidixic Rifampicina, α- amanitina Neomicina, Kanamicina Toxina difterică

Mod de acţiune Blochează translocaţia pe ribozomi Determină terminarea prematură a lanţului polipeptidic Blochează reacţia de translocare pe ribozomi Inhibă activitatea peptidil transferazei Blochează legarea aminoacil-ARNt la situsul A al ribozomului Blochează trecerea de la iniţiere la elongaţia lanţului polipeptidic prin acţiunea sa pe subunitatea mică sau produce citirea greşită a ARNm Blochează activitatea peptidil transferazei (nu se mai formează lanţul polipeptidic la bacterii) Împiedică separarea catenelor complementare a AND Inhibă ADNgiraza Blochează sinteza ARN prin inhibarea ARNpolimerazei Determină erori în citirea codului genetic Inhibă translocarea

Tabel VIII.III. Efectele antibioticelor asupra biosintezei proteice

Cu toate că în marea lor majoritate antibioticele nu sunt considerate toxice pentru om, atragem atenţia că ribozomii mitocondriali (mitoribozomii) au structură şi funcţie apropiată de cele ale ribozomilor procariotici. În acest fel, anumite etape ale biosintezei proteice mitocondriale sunt sensibile la inhibitorii biosintezei proteice

la procariote. Astfel, unele antibiotice au efect nefavorabil asupra mitocondriilor din celula umană detrminând sinteza alterată a unor proteine mitocondriale răspunzătoare de producerea energiei. Efectele acestora au consecinţe cu atât mai grave dacă sunt administrate în perioade de creştere şi maturare ale organismului când celulele afectate au nevoi energetice crescute. Aceste efecte au fost observate după ani de utilizare şi la vremea respectivă au fost încadrate ca efecte adverse ale unor antibiotice administrate la copii: streptomicina poate determina surditate, cloramfenicolul poate determina aplazii medulare, fluorochinolonele determină calcificarea prematură a cartilajelor de creştere etc.

În consecinţă, în practica medicală, alegerea antibioterapiei reprezintă o sarcină complexă; ea trebuie să ţină cont de acţiunea antibioticului asupra mecanismului translaţional la om, de vârsta bolnavului şi nu în ultimul rând de antecedentele acestuia (vezi rolul reticulului endoplasmic în detoxifierea medicamentelor). 2.3.4. METABOLISMUL POSTTRANSLAŢIONAL ŞI SISTEMELE SALE DE CONTROL 2.3.4.1. Plierea proteinelor Pentru a fi utilizabil, noul lanţ polipeptidic trebuie să adopte o conformaţie tridimensională unică, să lege cofactori necesari activităţii sale, să sufere modificări biochimice (glicozilare, hidroxilare, acetilare etc.) şi să se asambleze corect cu alte subunităţi împreună cu care funcţionează. (fig.VIII.35).

Fig.VIII.35. Etapele de realizare a unei proteine funcţionale

După mai multe milioane de ani de evoluţie, secvenţa de aminoacizi a fiecărei proteine a fost selectată nu doar pentru adoptarea unei conformaţii specifice ci şi pentru capacitatea sa de a se plia rapid, încă din timpul sintezei sale. Experimentele au demonstrat că încă de la nivelul ribozomilor numeroase domenii ale lanţurilor polipeptidice adoptă o structură compactă, foarte asemănătoare cu structura secundară finală (α helix şi/sau foiţă pliată). Aceste domenii reprezintă punctul de pornire pentru procesele de ajustare a lanţului în vederea formării structurii terţiare corecte. Procesul de pliere al lanţului polipeptidic începe încă din timpul sintezei sale, se desfăşoară în câteva minute şi devine complet în momentul în care ribozomul eliberează capătul C-terminal al proteinei. 2.3.4.2. Repararea defectelor de pliere a proteinelor O mare parte dintre proteinele sintetizate suferă un proces de pliere corectă încă din timpul sintezei la nivel ribozomal. Proteinele care se pliază corect şi repede nu prezintă zone hidrofobe. O proteină care prezintă la suprafaţa sa o zonă hidrofobă este de obicei anormală; ea va eşua să se plieze corect şi în felul acesta nu va reuşi să-şi găsească subunităţile partenere pentru a forma un complex proteic normal. O astfel de proteină nu numai că este inutilă celulei, dar poate fi dăunătoare. Defectele de pliere

ale acestor proteine sunt supuse unui proces de reparare realizat de chaperone. Proteinele care prezintă defecte grave de pliere şi parte din cele care nu răspund mecanismelor de reparare vor fi degradate de proteazomă. În sfârşit, proteinele cu grave alterări de sinteză şi care scapă tuturor mecanismelor de reparare sau degradare, formează agregate proteice cu consecinţe nefaste asupra vieţii celulei şi a individului. Rolul chaperonelor în repararea defectelor de pliere a proteinelor Replierea unui procent de 30% dintre proteinele defectuoase este realizată de două clase speciale de proteine numite chaperone. Experienţele au demonstrat existenţa unei clase de proteine care se sintetizează în cantităţi crescute după expunerea de scurtă durată a celulelor la o temperatură ridicată (de exemplu expunerea celulelor care trăiesc în mod normal la 37ºC, la o temperatură de 42ºC). Datorită acestei proprietăţi, au fost denumite heat shock proteins, prescurtat hsp. Celulele eucariote prezintă cel puţin două familii majore de chaperone moleculare cunoscute sub denumirea de hsp60 şi hsp70. Membri diferiţi ale celor două familii acţionează în organite diferite. Astfel, mitocondriile conţin molecule proprii hsp60 şi hsp70 care sunt distincte de cele care operează în citosol sau în reticulul endoplasmatic. În citosol, clasele de hsp acţionează diferit în mecanismul de repliere al lanţurilor polipeptidice: • Hsp70 acţionează precoce, înainte ca proteina să părăsească ribozomul. Ele se ataşează pe lanţul polipeptidic în dreptul unor segmente hidrofobe alcătuite dintrun număr redus de aminoacizi şi determină replierea lanţului. Mecanismul are loc în cicluri de ataşare şi detaşare a hsp70 şi se realizează cu hidroliza ATP şi participarea proteinelor asociate, hsp40 (fig.VIII.36). • Hsp60 acţionează tardiv, după finalizarea sintezei proteinelor. Acest tip de chaperone formează o cameră izolată, în formă de butoi, la nivelul căreia proteinele pliate greşit sunt izolate. În acest fel se previne aglomerarea lor cu formarea de agregate proteice nocive şi în acelaşi timp li se oferă un mediu favorabil în care să încerce să se replieze (fig.VIII.37).

Fig.VIII.36. Replierea proteinelor prin acţiunea chaperonelor Hsp70

Fig.VIII.37. Structura şi funcţia chaperonelor Hsp60

Rolul proteazomei în degradarea proteinelor malsintetizate Celulele îndepărtează rapid eşecurile procesului lor translaţional. Experimente recente sugerează că mai mult de o treime din lanţurile polipeptidice nou sintetizate sunt selectate pentru a fi rapid degradate. La eucariote, aparatul final de îndepărtare a proteinelor cu defecte majore de sinteză este proteazoma, o protează ATP dependentă care constituie aproape 1% din proteinele celulare. Prezentă în mai multe cópii dispersate în citosol şi nucleu, proteazoma are ca ţintă proteinele reticulului endoplasmatic. Proteinele care fie nu au reuşit să se replieze într-un mod adecvat, fie nu au reuşit să se asambleze adecvat după ce au pătruns la nivelul reticulului endoplasmatic sunt detectate de un sistem de control al reticulului endoplasmatic care le retranslocă înapoi în citosol pentru a fi degradate. Fiecare proteazomă constă dintr-un cilindru format din multiple subunităţi proteice care se asamblează sub forma à 4 inele (fig.VIII.38). Capetele cilindrului se asociază cu complexe proteice mari, formate din aproximativ 20 de polipeptide diferite, dintre care cel puţin 6 pot hidroliza ATP. Aceste ATPaze sunt localizate lângă marginea cilindrului şi funcţionează ca „porţi” de intrare, orientare şi deplasare a proteinelor alterate în interiorul camerei. Prezenţa camerelor repetitive realizate de subunităţile care o alcătuiesc demonstrează că proteazoma este structurată ideal pentru realizarea funcţiei sale; în contrast cu o protează simplă, proteazoma păstrează substratul în totalitate legat până când acesta este degradat. În majoritatea cazurilor, proteazoma acţionează asupra proteinelor care au fost marcate specific pentru distrugere prin ataşarea covalentă de cópii multiple a unei proteine numită ubiquitină. Ubiquitina se găseşte în celule atât sub formă liberă cât şi legată covalent de o varietate imensă de proteine intracelulare. Pentru cele mai multe dintre aceste proteine, etichetarea cu ubiquitină determină distrugerea lor de către proteazomă.

Fig.VIII.38. Proteazoma a) schemă în secţiune longitudinală; b) reconstrucţie după microscopia electronică a proteazomei împreună cu extremităţile proteice care funcţionează ca „porţi” de intrare pentru proteinele alterate

2.3.4.3. Implicaţii medicale În cazul în care controlul calităţii proteinelor alterate nu reuşeşte, acestea vor forma agregate proteice mari care se vor acumula în celula afectată şi vor determina lezarea severă şi chiar moartea acesteia. Mai mult, agregatele proteice eliberate din celulele moarte au tendinţă de acumulare în matricea extracelulară, unde produc leziuni tisulare. • Deoarece creierul este alcătuit dintr-un ansamblu celular cu înaltă organizare, el este în mod special vulnerabil. Nu este surprinzător faptul că agregatele proteice cauzează la acest nivel boli neurodegenerative de tipul bolii Huntington şi Alzheimer numită şi demenţă senilă. Pentru ca un tip de agregat proteic să persiste încercărilor de degradare şi să se crească cantitativ în aşa fel încât să lezeze organismul, trebuie să fie foarte rezistent la proteoliză atât în interiorul, cât şi în exteriorul celulei. Multe dintre aceste agregate proteice formează fibrile alcătuite din lanţuri polipeptidice aşezate unul deasupra altuia sub forma unor grămezi neîntrerupte de foiţe β, numite filamentele încrucişate beta, foarte rezistente la proteoliză. Ele determină depozite matriciale observate în multe dintre bolile neurologice şi histologic poartă denumirea de amiloid. • O varietate particulară a acestor anomalii este reprezentată de bolile prionice. Spre deosebire de boala Huntington şi Alzheimer (considerate la ora actuală boli cu transmitere genetică), o boală prionică se poate răspândi de la un organism la altul cu condiţia ca cel de-al doilea organism să importe prin alimentaţie ţesutul care conţine agregate proteice. La ora actuală sunt descrise o serie de boli (dermatopatia alergică la oi, boala Creutzfeld Jacobs la om, encefalopatia spongiformă bovină) cauzate de acumularea unui agregat proteic format prin acumularea proteinei alterate PrP (proteina prionului). Funcţia sa normală nu este încă cunoscută, dar cercetările au demonstrat că PrP poate fi convertită întro conformaţie anormală; această conformaţie are un puternic caracter infecţios deoarece transformă proteinele normal conformate în proteine cu conformaţie anormală, asemănătoare PrP, numite PrP*. Această proprietate determină

propagarea PrP* din celulă în celulă la nivelul creierului, cauzând în final moartea animalului şi a omului infectat.

3. REPRODUCEREA CELULARĂ 3.1. AMITOZA Amitoza este diviziunea caracteristică celulelor procariote. Ea poate să apară şi la celulele eucariote în condiţii patologice: la celulele neoplazice şi în regenerările cu defect. Dimensiunile reduse ale bacteriilor favorizează diviziunile rapide. În condiţii optime, atunci când mediul de cultură este bogat în factori de creştere, celulele procariote au capacitatea de a se divide la fiecare 20 de minute, astfel că în mai puţin de 11 ore se poate forma o colonie de 5 miliarde de celule (număr aproximativ egal cu populaţia actuală a Terrei). Capacitatea crescută de diviziune permite bacteriilor să se adapteze rapid la modificările mediului înconjurător. Genomul celulelor procariote este reprezentat de o singură moleculă de ADN circular, format din aproximativ 4x106 perechi de baze. La unele tipuri bacteriene ADN-ul este ancorat de invaginaţiile membranei plasmatice, numite mezozomi. În timpul diviziunii nu s-au evidenţiat condensări sau decondensări ale materialului genetic.

În celulele procariote, diviziunea ADN-ului bacterian şi a citoplasmei se derulează cuplat într-o manieră directă. În timp ce ADN-ul se replică, cele două cópii ale cromozomului bacterian sunt ataşate de membrana plasmatică pe situsuri specifice. Îndepărtarea şi separarea lor are loc în mod progresiv pe măsura creşterii suprafeţei învelişului bacterian dintre situsurile de ataşare (fig.VIII.39). Membrana plasmatică situată între situsuri creşte progresiv, se invaginează şi formează un sept transversal care va conduce la separarea celulelor fiice; în acest fel, fiecare dintre ele va conţine un singur cromozom. Factorii care influenţează ritmul de desfăşurare al diviziunii directe sunt: factorii nutritivi din mediu, temperatura, pH-ul, concentraţia ionică, precum şi prezenţa oxigenului (pentru bacteriile cu metabolism aerob). Atunci când condiţiile de mediu sunt improprii supravieţuirii, unele bacterii au capacitatea de a se proteja prin convertirea metabolismului într-o stare dormantă; se formează în acest fel structuri inerte, numite spori. Procesul de formare al sporilor începe prin separarea cromozomului nou replicat şi migrarea lui spre unul din polii celulei. Are loc o învaginare asimetrică a membranei plasmatice care va conduce la separarea cromozomului şi a unei mici cantităţi citoplasmatice de restul celulei. Compartimentul nou format este ulterior înconjurat de învelişuri care vor forma un perete gros, protector (fig.VIII.40). Sporul suferă un proces de deshidratare care îi va permite supravieţuirea timp de mai mulţi ani,în condiţii nefavorabile de mediu.

Atunci când mediul devine favorabil, în câteva ore sporul devine capabil de germinare. Rehidratarea citoplasmatică şi pierderea învelişului de protecţie va determina activarea metabolismului celular.

Fig.VIII.39. Etapele diviziunii directe prin amitoză

Fig.VIII.40. Etapele formării sporului

3.2. MITOZA Mitoza este mecanismul care asigură transmiterea şi conservarea informaţiei genetice stocată în ADN-ul celular; ea este realizabilă datorită fenomenului fundamental al interfazei, autoreplicarea semiconservativă a ADN.

La eucariote, cromozomii unei celule somatice purtători ai informaţiei genetice se duplică în timpul fazei S a ciclului celular. În timpul mitozei are loc condensarea materialului genetic, cromozomii se individualizează şi devin vizibili. Fiecare dintre ei apare format din două cromatide identice, unite la nivelul unei regiuni numite constricţie primară sau centromer. După cum se ştie, o celulă diploidă este caracterizată de prezenţa a două garnituri (loturi) de cromozomi omologi (2n). Cele două garnituri de cromozomi omologi provin fiecare din gametul masculin şi respectiv din cel feminin a căror asociere realizată în timpul fecundării stă la originea individului. Cromozomii omologi sunt deci asemănători dar neidentici, în timp ce cele două cromatide care participă la formarea fiecăruia sunt identice între ele. Putem spune deci că informaţia prezentă pe fiecare dintre cromozomii omologi se găseşte în două cópii; în acest fel celula diploidă prezintă 4 cópii ale informaţiei genetice, identice două câte două. Mitoza este deci mecanismul prin care se realizează distribuirea dublei informaţii genetice la cele două celule fiice; modalitatea de partajare face ca ambele celule fiice să posede aceeaşi cantitate şi calitate a informaţiei genetice ca şi celula mamă, atunci când ea se găsea în faza G1 a ciclului celular, deci înaintea duplicării cromozomilor. La sfârşitul mitozei fiecare din celulele fiice se găseşte ea însăşi în faza G1 , deci la începutul unui nou ciclu celular.

3.2.1. Clasificarea tipurilor de mitoză a) În funcţie de modificările membranei nucleare În cea mai mare parte a celulelor animale şi în celulele vegetalelor superioare mitoza implică fragmentarea progresivă a învelişului nuclear, astfel că începând cu sfârşitul premetafazei, componentele celor două compartimente (citoplasmic şi nuclear) se amestecă. Din această cauză, acest tip de mitoză (cel mai frecvent întâlnit) este denumit mitoză deschisă. La unele organisme însă, partajarea materialului genetic are loc fără ruptura învelişului nuclear sau cu o deschidere parţială a acestuia, motiv pentru care în acest caz diviziunea poartă denumirea de mitoză închisă. b) În funcţie de participarea complexelor centriolare şi a asterilor Celulele eucariotelor animale (şi implicit ale omului) prezintă, după cum se ştie, un organit nespecific responsabil de iniţierea diviziunii, numit centrozom (centru celular, diplozom).

Complexul centriolar este ansamblul format dintr-un centrozom şi materialul pericentriolar care îl înconjoară. Ansamblul realizat de un complex centriolar şi fibrele asteriene care îl înconjoară se numeşte aster sau centrosferă, motiv pentru care acest tip de mitoză este numit mitoză astrală. La vegetalele inferioare, unele celule vegetale superioare (angiosperme), precum şi la unele protozoare care se divid prin mitoză deschisă, complexele centriolare şi deci asterii sunt absenţi, motiv pentru care diviziunea poartă denumirea de mitoză anastrală. c) În funcţie de partajarea (distribuţia) materialului genetic la cele două celule fiice. Cea mai mare parte a diviziunilor mitotice care caracterizează eucariotele somatice conduc la formarea a două celule fiice identice între ele şi identice cu celula mamă, atât din punct de vedere al materialului genetic cât şi al conţinutului citoplasmatic; în acest caz diviziunea poartă denumirea de mitoză homoplastică sau homotipică. În cazul în care în urma diviziunii, rezultă două celule care diferă din punct de vedere genetic şi citoplasmatic între ele, vorbim de o mitoză heteroplastică sau heterotipică. Dacă în urma diviziunii, una dintre celule este identică cu celula mamă, iar cealaltă este diferită, mitoza este considerată homoheteroplastică sau homoheterotipică. Există şi cazuri în care în urma diviziunii, apar celule fiice cu un grad de diferenţiere (specializare) redus faţă de celula mamă; în acest caz diviziunea poartă denumirea de mitoză de dediferenţiere sau de întinerire. 3.2.2. Aspecte morfologice Partajarea materialului genetic şi citoplasmatic la cele două celule fiice implică transformări profunde morfologice şi metabolice ale celulei mamă aflate în diviziune. Transformările celulare care afectează nucleul şi citoplasma în cursul mitozei se derulează în cinci faze succesive. A. PROFAZA înainte de fragmentarea învelişului nuclear a) Modificări citoplasmatice La sfârşitul interfazei centrul celular (format din doi centrioli cu dispoziţie perpendiculară unul în raport cu celălalt) se găseşte în imediata apropiere a nucleului. Din materialul pericentriolar se polimerizează progresiv microtubuli (microtubuli asterieni), care se dispun radiar în jurul centrozomului, formând în acest fel un aster. Între cei doi centrioli ai centrului celular începe polimerizarea unei alte categorii de microtubuli (microtubuli polari), a căror alungire progresivă determină îndepărtarea centriolilor unul în raport cu celălalt. În acest moment începe polimerizarea tubulinelor care va conduce la formarea unor noi centrioli, fiecare cu plasament perpendicular pe centriolii iniţiali (fig.VIII.41). Cei doi asteri astfel formaţi, migrează progresiv progresiv în direcţii opuse; alungirea microtubulilor plasaţi între cele două complexe centriolare se realizează cu o viteză mai mare decât alungirea microtubulilor asterieni, astfel că la sfârşitul profazei cele două complexe centriolare vor fi plasate la polii celulei. • Are loc o scădere a vâscozităţii citoplasmei. • Alungirea microtubulilor asterieni orientaţi spre membrana nucleară determină o depresionare progresivă a acesteia. • În ME se poate observa începerea dezorganizării progresive a reticulului endoplasmic şi gruparea mitocondriilor la periferia nucleului.

Fig.VIII.41. Profaza înainte de fragmentarea învelişului nuclear A. Sfârşitul interfazei; B şi C.profaza;D. Sfârşitul profazei.

b) Modificări nucleare • • • •

La debutul profazei, volumul nucleului creşte uşor. Cromozomii apar sub forma unor filamente alungite, cu spiralizare minoră, relaxată. Condensarea materialului genetic se accentuează progresiv, cromozomii apar formaţi din două cromatide unite la nivelul centromerului, cu cromomere vizibile. Începe fragmentarea învelişului nuclear. Începe fragmentarea nucleolilor, fragmentele numite “organizatori nucleolari” fiind antrenate în spiralizarea cromozomilor care aparţin perechilor 13, 14, 15, 21, 22.

B. PROFAZA după fragmentarea învelişului nuclear (Premetafaza) Cea de a două parte a profazei este marcată de fragmentarea membranei nucleare, fenomen care are loc simultan în mai multe puncte. Ruptura începe de obicei în apropierea asterilor, iar fragmentele se dispersează rapid în citoplasmă. Lamina nucleară se detaşează de foiţa internă a membranei nucleare şi se dispersează în citoplasmă. După această fragmentare a învelişului nuclear, principalele evenimente care caracterizează premetafaza sunt (fig.VIII.42):

• La nivelul cromozomilor are loc diferenţierea progresivă a cinetocorilor care devin funcţionali şi se comportă ca centri organizatori ai microtubulilor; microtubulii care se polimerizează de la acest nivel, perpendiculari pe axul longitudinal al cromozomilor, poartă denumirea de microtubuli cinetocorieni sau cromozomiali; • Cromozomii din ce în ce mai intens spiralizaţi îşi modifică poziţia în aşa fel încât cinetocorii lor să se orienteze spre cei doi poli ai fusului de diviziune. Traiectele microtubulilor polari şi cinetocorieni devin astfel paralele. • Microtubulii cinetocorieni se alungesc progresiv determinând migrarea asincronă a cromozomilor spre planul ecuatorial al fusului de diviziune. C. METAFAZA

• Atunci când cromozomii se aliniază în totalitate pe placa ecuatorială, echidistant faţă de poli, celula se află în metafază. În acest moment, spiralizarea cromozomială este maximă, mobilitatea lor este minimă, deci se găsesc într-un stadiu de echilibru static. În acest stadiu, cromozomii au forma cea mai caracteristică. • Fusul de diviziune este complet format şi simetric în raport cu planul ecuatorial. Microtubulii care participă la formarea sa sunt de trei categorii (fig.VIII.43): - microtubuli polari care pornesc dintr-un pol şi se opresc înainte sau cu puţin după placa ecuatorială, - microtubuli cinetocorieni care pornesc din cinetocorii cromozomilor şi ating polul de partea respectivă; în metafază aceştia ating lungimea maximă, - microtubuli liberi, aşezaţi în dreptul plăcii ecuatoriale, fără a avea legătură cu polii fusului sau cu cromozomii; rolul acestora nu este încă cunoscut. • Reticulul endoplasmatic este dezorganizat, iar mitocondriile se aglomerează în jurul fusului de diviziune. • Permeabilitatea membranei plasmatice scade.

Fig.VIII.42. Fenomenele care caracterizează premetafaza

Fig.VIII.43. Schema de organizare a fusului metafazic D. ANAFAZA Anafaza debutează cu clivajul longitudinal al cromozomilor la nivelul centromerului, fenomen care conduce la partajarea cromozomilor în două loturi identice. Acest stadiu este caracterizat de două evenimente distincte (fig.VIII.44): a) migrarea cromozomilor spre poli determinată de scurtarea progresivă a microtubulilor cinetocorieni; b) alungirea fusului de diviziune prin alungirea microtubulilor polari. • Cromozomii anafazici. Până la sfârşitul metafazei, cromozomii sunt formaţi din două cromatide; debutul anafazei este marcat de separarea cromatidelor la nivelul constricţiei primare. Fiecare cromatidă, devenită autonomă, conţine aceeaşi informaţie genetică pe care a prezentat-o celula-mamă în faza G1 a ciclului său celular. Deci mecanismul clivării face ca fiecare cromatidă să devină un cromozom independent; altfel spus, fiecare cromozom metafazic, bicromatidian, dă naştere la doi cromozomi anafazici, unicromatidieni. Ca urmare a depolimerizării progresive a microtubulilor cinetocorieni, fiecare cromozom “frate”, migrează spre câte un pol al fusului de diviziune; deplasarea cromozomilor este sincronă şi se realizează cu o viteză mai mare la debutul anafazei, pentru ca mai apoi, pe măsura apropierii de poli, viteza de deplasare să încetinească. Sfârşitul anafazei este marcat de ajungerea cromozomilor la polii fusului, unde fiecare “lot “ formează o reţea densă la nivelul căreia cromozomii sunt greu de recunoscut individual. • Fusul anafazic. Deplasarea cromozomilor anafazici spre poli se însoţeşte de modificarea numărului şi lungimii microtubulilor fusoriali. După cum am arătat anterior, microtubulii cinetocorieni devin din ce în ce mai scurţi, datorită depolimerizării progresive care se

derulează la capătul polar. În cea de a doua parte a anafazei, microtubulii polari se alungesc, fusul devine mai îngust, iar polii se îndepărtează.

Fig.VIII.44. Schema de organizare a fusului anafazic a) debutul anafazei: clivajul cromozomial şi începerea migrării cromozomilor pe seama depolimerizării microtubulilor cinetocorieni b) anafaza terminală: alungirea fusului concomitent cu continuarea deplasării cromozomilor spre poli

E. TELOFAZA Telofaza începe atunci când cele două garnituri cromozomiale au atins polii fusului de diviziune. Ea este marcată de două evenimente majore: reconstituirea nucleilor celor două celule fiice (care capătă în mod progresiv un aspect interfazic) şi finalizarea citodierezei.

a) Modificări nucleare • Învelişul nuclear. Anvelopa nucleară începe să se reformeze încă de la sfârşitul anafazei; reconstrucţia ei este progresivă şi se finalizează în cursul telofazei.

Refacerea membranei debutează prin ataşarea de vezicule şi lamele scurte de reticul endoplasmic la suprafaţa reţelei de cromozomi; simultan, componente ale laminei nucleare se interpun între reţeaua cromozomială şi elementele reticulului endoplasmic; unirea progresivă a acestor elemente, conduce la formarea unei membrane continue. Este posibilă şi reutilizarea unor fragmente din vechea membrană nucleară care au fost dispersate în citoplasmă în premetafază. Porii membranari apar precoce, pe măsura reedificării învelişului nuclear. Spaţiul perinuclear este la început de dimensiuni variabile, dar devine regulat la sfârşitul telofazei. • Volumul nucleului este mic la sfârşitul telofazei, conform cu valorile corespunzătoare raportului nucleo-citoplasmatic al celulelor fiice în faza G1. • Cromozomii. Concomitent cu refacerea membranei nucleare în jurul reţelei cromozomiale, materialul genetic suferă o despiralizare progresivă care va conduce la reformarea aspectului interfazic al cromatinei. Despiralizarea cromozomilor se însoţeşte de reluarea activităţii lor metabolice – începerea de noi transcrieri. • Nucleolul se reformează pe seama organizatorilor nucleolari. b) Modificări citoplasmatice • Microtubulii telofazici. La debutul telofazei, microtubulii polari se depolimerizează începând de la nivelul polilor. Microtubulii interzonali se apropie progresiv, fuzionează şi formează un fascicol unic, înconjurat de o substanţă densă (fig.VIII.45). • Vâscozitatea citoplasmei creşte. • Citodiereza. Partajarea citoplasmei în cele două celule fiice este un mecanism complex care debutează la sfârşitul anafazei şi continuă pe tot parcursul telofazei. Citodiereza debutează la sfârşitul anafazei cu apariţia unei depresiuni concentrice la nivelul ecuatorului celulei-mamă. La începutul telofazei, pe faţa citoplasmatică a citoscheletului membranar începe polimerizarea filamentelor de actină care vor forma progresiv un inel contractil; la formarea acestuia participă şi alte proteine asociate: -actinina şi miozina. Prin contracţie progresivă, inelul contractil va conduce la sfârşitul telofazei la separarea celulelor fiice. Acesta este momentul care încheie diviziunea celulară şi totodată momentul de debut al unui nou ciclu celular pentru fiecare dintre celulele nou formate.

Fig.VIII.45. Schema derulării telofazei şi a citodierezei celulelor animale a) sfârşitul anafazei; b)debutul telofazei; c) sfârşitul telofazei; d) separarea celulelor fiice.

3.2.3. Determinismul mitozei Ordinea factorilor care condiţionează derularea acestui eveniment major din viaţa celulei nu este încă pe deplin cunoscută, în ciuda numeroaselor observaţii şi studii experimentale efectuate în acest domeniu. Factorii care au fost studiaţi şi dovediţi a avea un rol în reglarea mecanismului de diviziune celulară pot fi clasificaţi în: 3.2.3.1.Factori stimulatori 1. Factori proprii celulari a) Raportul nucleo-citoplasmatic a fost mult timp considerat factorul esenţial în determinismul mitozei. În cursul ciclului celular volumul citoplasmei creşte mult mai rapid decât cel al nucleului; în acest fel, nucleul devine incapabil de a "controla" un volum de citoplasmă mult crescut, motiv pentru care celula este "obligată" să intre în diviziune. La baza teoriei conform căreia diviziunea serveşte la menţinerea echilibrului între volumul nucleului şi cel al citoplasmei stau experienţele care au demonstrat că amoebele cărora li s-a îndepărtat o parte din citoplasmă nu se mai divid. b) Semnalele citoplasmatice care stimulează replicarea ADN-ului. Existenţa acestora a fost indirect pusă în evidenţă prin experienţe de hibridare somatică, dar natura lor nu a fost încă precizată. Experienţele au demonstrat că un nucleu prelevat dintr-un neuron adult (care în vivo şi-a pierdut capacitatea de diviziune), introdus în citoplasma unui zigot care în prealabil a fost enucleat, începe să îşi

mărească volumul şi intră în faza S. În aceste condiţii este de presupus că citoplasma zigotului conţine factori capabili de a iniţia diviziunea. Existenţa semnalelor citoplasmatice care sunt responsabile de debutul condensării cromatinei cu formarea cromozomilor a fost evidenţiat şi prin experienţe de hibridare somatică a unei celule aflată în faza M a ciclului celular cu o celulă aflată în faza G1 sau G2; în acest caz, materialul genetic al acestor celule a început să se condenseze. 2. Factori extracelulari a)Reglarea proliferării celulare în sânul organismului se manifestă sub mai multe aspecte: • hepatectomia parţială stimulează proliferarea celulelor hepatice, care au în mod obişnuit un ritm scăzut de proliferare. Această proliferare accentuată se opreşte atunci când masa normală a ficatului a fost restabilită. Acelaşi control al diviziunilor se manifestă la nivelul epidermului în condiţiile cicatrizării; • localizarea celulelor asigură de asemenea un control asupra ritmului mitotic. Astfel, în epiderm care este pluristratificat, se divid doar celulele din stratul cel mai profund, care vin în contact cu lamina bazală care acoperă dermul. Celulelefiice migrează progresiv spre suprafaţa pielii şi se încarcă cu keratină. Dacă celulele din stratul profund pierd contactul cu lamina bazală, îşi pierd concomitent capacitatea de diviziune; • hormonii (hormoni de creştere, tiroidieni şi sexuali), factorii de creştere (EGF etc.), vitaminele (în special cele din grupul B), reprezintă factori ce intervin în controlul proliferării celulare in vivo. b) Factori exogeni fizici (temperatura, radiaţiile şi lumina) precum şi chimici (fitohemaglutinina, concavalina) influenţează derularea şi/sau viteza de derulare a ciclului celular. O creştere a temperaturii cu câteva grade (24˚C la 45˚C) activează ritmul mitozei, pe când absenţa luminii provoacă o încetinire a acestuia. Radiaţia X determină un blocaj al sintezei de ADN. 3.2.3.2. Factori inhibitori ai mitozei a) "Orologiul biologic" poate limita puterea de diviziune a celulelor care de altfel nu este nelimitată în timp. În condiţii optime de cultură, celulele se divid de un număr limitat de ori, determinat genetic (de exemplu de 50 până la 100 de ori), apoi mor. Aceste celule păstrează în memoria lor numărul de diviziuni pe care lau efectuat deja. În sprijinul acestei afirmaţii stau experienţele efectuate de Hayflick: el a utilizat fibrocite, celule care se divid de 50 de ori, apoi mor. Un lot de celule (lotul A) a fost lăsat să efectueze in vitro 40 de diviziuni şi un alt lot (lotul B) care a efectuat în aceleaşi condiţii 10 diviziuni, au fost congelate timp de 14 ani. După decongelare, lotul A a mai efectuat 10 diviziuni, iar celulele din lotul B au mai suferit 40 de diviziuni înainte de a părăsi ciclul celular şi a muri.

Alte experienţe, au demonstrat că celule prelevate de la un bolnav de Progeria (sindrom care imită o îmbătrânire accelerată), nu efectuează in vitro decât un număr foarte redus de diviziuni (2 până la 10), comparativ cu celulele de acelaşi tip prelevate de la un individ sănătos. b) Substanţele chimice care inhibă sau încetinesc diviziunile celulare poartă denumirea de inhibitori ai mitozei şi acţionează prin mecanisme diferite: • Inhibarea replicării. Agenţii alkilanţi stabilesc punţi suplimentare între cele două lanţuri ale moleculei de ADN. 5-bromo sau 5-fluoro-dezoxiuridina intră în competiţie cu bazele azotate ale ADN-ului. • Inhibarea transcripţiei şi/sau a traducerii, ceea ce va conduce la absenţa proteinelor indispensabile autoreplicării ADN (ADN polimeraze). • Inhibarea polimerizării aparatului mitotic. Alcaloizii de tipul Colchicină, Vincristin, Vinblastin au efect depolimerizant asupra microtubulilor fusoriali. Acesta este motivul pentru care aceste droguri sunt utilizate alături de radioterapie în tratamentul paleativ al cancerului. Se încearcă în acest fel a se micşora ritmul anarhic de proliferare al celulelor maligne. 3.2.4. Cromozomii umani În cursul procesului de diviziune materialul nuclear îşi pierde aspectul caracteristic interfazei, cel de cromatină şi se organizează sub formă de cromozomi. Termenul de cromozomi a fost introdus de Waldeyer în 1888 pentru a defini corpusculii cu afinitate pentru coloranţii bazici, vizibili la microscop în timpul diviziunii celulare. Prin metode citochimice (microcitospectrofotometria în UV) s-a determinat cantitatea de ADN conţinută în cromozomii umani. Un cromozom de mărime mijlocie -5 m lungime, conţine o moleculă de ADN de 6 x 1010 daltoni. Dublul helix de ADN corespunzător acestei mase are o lungime de 3 cm. Este clar că ADNul trebuie să fie împachetat foarte compact în cromozomi pentru ca un „fir” lung de 3 cm să încapă în 5 m (0,0005 cm). Aspectul electronomicroscopic al cromozomului metafazic este o exemplificaţie a acestei împachetări strânse, cromozomii apărând ca nişte gheme din fibre de cromatină înfăşurate foarte neregulat. De fapt, fiecare cromatidă este formată dintr-o singură fibră de cromatină încolăcită, împachetată compact. Împachetarea duplexului de ADN în nucleozom şi a acestora în fibra de cromatină de 30 nm, reduce lungimea firului de la 3 cm la aproximativ 1 mm. În concluzie, sunt necesare împachetări de ordin superior ale firului de cromatină de 30 nm (fig.VIII.46). Deşi aceste lucruri nu se cunosc precis, este admisă ipoteza că fiecare fibră de cromatină de 30 nm formează bucle de mărimi variabile prin legarea zonei

aflate la o distanţă de 20.000 – 80.000 perechi de nucleotide în lungul ADN-ului. Aceste zone sunt prinse ca într-o clamă. Formarea buclelor scade lungimea „firului” de la 1 mm la 100 m. Până la cei 5 m de lungime ai cromozomului din metafază mai trebuie să existe încă un ordin de condensare a cromatinei, probabil prin împachetarea helicoidală în spaţiu a buclelor. Împachetarea finală este însoţită de fosforilarea tuturor moleculelor de histone H1 la 5 resturi de serină. Probabil această fosforilare produce condensarea cromozomilor în cursul mitozei.

Fig.VIII.46. Schema nivelelor de împachetare ale cromatinei

Cromozomii sunt formaţiuni microscopice a căror morfologie caracteristică este observată în timpul diviziunii în cursul metafazei, numai după blocarea diviziunii celulare cu o substanţă statmokinetică (colchicină). Cromozomii sunt deţinătorii informaţiei ereditare, iar numărul şi morfologia lor sunt elemente caracteristice fiecărei specii. La om, celulele somatice conţin 46 de cromozomi, celulele somatice se numesc diploide, iar celulele sexuale mature care conţin numai 23 de cromozomi se numesc celule haploide. Setul diploid de cromozomi se notează 2n iar setul haploid se notează n. Cei 46 de cromozomi din

celulele diploide sunt dispuşi în 23 de perechi. În cadrul unei perechi cromozomii sunt identici ca mărime şi formă, dar diferiţi ca origine, unul matern, altul patern şi sunt numiţi cromozomi omologi. În celulele somatice există 22 de perechi de cromozomi autozomi şi o pereche de cromozomi sexuali (heterozomi sau gonozomi): perechea XX la sexul feminin şi XY la sexul masculin.Cromozomii X şi Y nu sunt omologi deoarece cromozomul Y este mult mai mic (aproximativ 1/3 din talia cromozomului X), iar în cursul evoluţiei filogenetice a pierdut majoritatea genelor somatice şi s-a specializat pentru procesul de sexualizare masculină. Morfologia cromozomilor metafazici Elementele structurale prezente la toţi cromozomii pot fi considerate ca elemente obligatorii (fig.VIII.47): Cromatidele sunt două subunităţi longitudinale identice ca mărime şi formă, fiecare conţinând câte o macromoleculă de ADN. Telomerele sunt extremităţile rotunjite ale cromatidelor care au rol în menţinerea structurii cromozomilor respectiv a individualităţi lor. Sunt structuri importante, deoarece sunt terminatorii bifurcaţiei replicative a ADN-ului şi deţin gene pentru sinteza ARN-urilor ribozomale şi de transport, fiind implicate şi în mecanismele care intervin în apoptoză. Centromerul reprezintă locul de unire al celor două cromatide surori la nivelul constricţiei primare. Constricţia primară este zona la nivelul căreia cromatidele sunt mai îngustate. Prin tehnici convenţionale de colorare, constricţiile primare sunt slab colorate sau acromatice. Având o poziţie constantă, centromerul reprezintă unul din markerii caracteristici care permite descrierea tipurilor morfologice de cromozomi. Centromerul împarte cromatidele în două braţe, notate convenţional cu “p” (braţul scurt) şi “q” (braţul lung). Raportat la poziţia centromerului s-au descris la om trei tipuri morfologice de cromozomi: metacentrici, submetacentrici şi acrocentrici. La cromozomii metacentrici, centromerul este situat în regiunea mediană şi p= q. La cromozomii submetacentrici, centromerul este situat submedian şi p