5 Tehnici Bio Molec [PDF]

Zitiervorschau

Biologie Celulara si Histologie

Curs 5 – Tehnici de biologie moleculara si inginerie genetica

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Cuprins ⇨

The Human Genome project

⇨

Tehnici de genetica moleculara

⇨



Secventierea acizilor nucleici



PCR



Clonarea unor gene



Vectori



Transfectii



Animale transgenice; linii knock-out

Aplicatii ale ingineriei genetice

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

The human genome project

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

The human genome project

⇨

Proiect desfasurat pe durata a 13 ani: 1990 – 2003

⇨

Initiat de U.S. Dept. of Energy + National Institute of Health 

Partener major: Wellcome Trust (UK)



Alte contributii: Japonia, Franta, Germania, China etc

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

The Human Genome Project Obiective

⇨ Identificarea

25000)

tuturor genelor din ADN-ul uman (in total 20-

⇨ Determinarea

intregii secvente de nucleotide din ADN-ul uman (aprox. 3 miliarde)

⇨ Crearea

unor baze de date cu aceste informatii

⇨ Perfectionarea ⇨ Transferul

de instrumente pentru analiza and

tehnologiilor catre sectorul privat

⇨ Identificarea

problemelor legale si etice care pot aparea si propunerea de solutii

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Continutul informational al genomului uman

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Probleme speciale legate de identificarea si localizarea genelor ⇨

Centromerii – contin secvente cu grad inalt de repetitivitate, dificil de mapat cu tehnicile actuale

⇨

Telomerele – contin la randul lor secvente repetitive, de multe ori sunt incomplete / se pierd partial la replicarea ADN-ului

⇨

Existenta multigenelor – locusuri cromozomiale care contin gene multiple, corelate functional si intricate, dificil de identificat individual

⇨

Aprox. 93% din ADN a fost efectiv cartografiat in prezent; studiul telomerelor si centromerilor ramane limitat de tehnologia actuala

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Cromozomul 1 ⇨

Cel mai mare dintre cromozomii umani; contine aprox. 8% din informatia genetica

⇨

Boli genetice:

⇨

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

▶

Parkinson

▶

Alzheimer

▶

Charcot-Marie Tooth (neuropatie ereditara)

In cancer apar frecvent modificari ale regiunilor sale terminale

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Cromozomii 2 si 4

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

⇨

Au cea mai mica rata de recombinare dintre cromozomii umani

⇨

Cromozomul 2 – unic prin provenienta (fuziunea a 2 cromozomi ancestrali)

⇨

Cromozomul 4: ▶

Boala Huntington

▶

Boala polichistica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Cromozomii 3, 5, 6 ⇨

⇨

⇨

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Cromozomul 3 ▶

Cea mai scazuta rata de duplicare segmentala

▶

Zone implicate in diferite cancere

Cromozomul 5 ▶

Redundanta informationala mare, continut genetic scazut

▶

Implicat in atrofia musculara spinala

Cromozomul 6 ▶

Contine cea mai mare secventa de codificare a ARN-t (activitate transcriptionala)

▶

Gene implicate in cancer, schizofrenie, autoimunitate Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Cromozomii 7, 8, 9 ⇨

Cromozomul 7 ▶

⇨

Cromozomul 8 ▶

⇨

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Gena CFTR - implicata in fibroza chistica

Contine o gena implicata in cresterea dimensiunii creierului la primatele mari

Cromozomul 9 ▶

Gene implicate in transsexualitate spontana (reversie de sex mascul → femela)

▶

Gene tumorale: leucemii, melanoame familiale etc Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Cromozomii 10, 11, 12, 13 ⇨

Cromozomul 10 ▶

⇨

Tumori, boli neurologice

Cromozomul 12 ▶

Leucemii, limfoame, alte cancere

▶

2 gene asociate diabetului

▶

⇨

Gene implicate in tulburari psihiatrice

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

⇨

Cromozomul 11 ▶

Unul dintre cei mai bogati in gene

▶

Numarul cel mai mare de gene ptr receptori olfactivi

Cromozomul 13 ▶

Contine gena cancerului de san (de tip II)

▶

Contine gena asociata retinoblastomului

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Cromozomii 14, 15, 16, 17 ⇨

Cromozomul 14 ▶

⇨

⇨

Gene pentru ARNr in bratul scurt

Cromozomul 16 ▶

Duplicare segmentala mare

▶

Gene implicate in boala polichistica renala, leucemii acute

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Cromozomul 15 ▶

⇨

Unul din cromozomii cu rata mare de duplicare segmentala

Cromozomul 17 ▶

Cea mai mare diferenta de structura dintre un cromozom uman si cromozomi similari mamalieni

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Cromozomii 18, 19, 20, 21 ⇨

Cromozomul 18 ▶

⇨

Translocarea 14-18 este una din cele mai comune cauze genetice de cancer la oameni

Cromozomul 20 ▶

▶

⇨

Contine gene prionice (boala Creutzfeld-Jacob) Implicat in diabetul zaharat de tip II, obezitate, cataracta, boala Graves

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Cromozomul 19 ▶

⇨

Gene implicate in hipercolesterolemia familiala si diabetul insulino-rezistent

Cromozomul 21 ▶

Cel mai mic cromozom

▶

O copie suplimentara (trisomie) determina sindromul Down

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Cromozomii 22, X, Y ⇨

Cromozomul 22 ▶

⇨

Cromozomul X ▶

⇨

Cromozomul sexual feminin

Cromozomul Y ▶

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Implicat in schizofrenie, alte boli psihiatrice

Cromozomul sexual masculin

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Exemplu – cromozomul 21

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/chooser.shtml

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Baze de date ⇨

NCBI Human Genome Sequencing Progress ▶

⇨

University of California (Santa Cruz) ▶

⇨

http://genome.ucsc.edu/

Ensembl Genome Browser (Wellcome Trust Sanger Institute & EMBL-European Bioinformatics Institute ▶

⇨

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/

http://www.ensembl.org/

EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory's Nucleotide Sequence Database) ▶

http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Aplicatii, beneficii din urma HGP ⇨

⇨

Medicina moleculara: 

Diagnostic timpuriu al bolilor / predispozitiilor la o boala



Design rational de medicamente



Terapie genica



Farmacogenomica

Aplicatii energetice si de ingineria mediului 

Aplicatii de genomica microbiana pentru a obtine biocombustibili, sisteme de detectare a poluantilor, tehnici de purificare a mediului

⇨

Bioarheologie si antropologie

⇨

Medicina legala

⇨

Agricultura 

Genetically modified foods (GMF)

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Patentarea genelor, secventelor genetice ⇨

Se poate face atunci cand: 

Este identificata o noua secventa genetica



Este specificat produsul (proteina) secventei genetice respective



Este specificata functia produsului respectiv



Este dezvoltata o metoda de valorificare a produsului genei, care poate fi utilizata de specialisti din domeniu

⇨

Patentele sunt pe o perioada de 20 de ani

⇨

Patentarea prespune si punerea la dispozitie a intregii informatii referitoare la produsul patentat

⇨

Informatii suplimentare (argumente pro/contra, situatia legala in USA etc): http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/patents.shtml

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Tehnici de genetica moleculara

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Secventierea ADN ⇨

Reprezinta succesiunea de proceduri utilizate pentru identificarea secventei de nucleotide intr-un lant de and

⇨

Metode de baza: ▶

▶

Secventierea chimica (Maxam – Gilbert) 

Bazata pe inducerea unor modificari chimice ale ADN-ului si apoi clivarea lantului la nivelula cestor modificari



Utilizata in prezent doar in domenii restranse (studiul interactiunilor ADNproteine etc)

Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger) 

Necesita: un lant simplu de ADN (single-stranded), un primer (secventa de ADN care serveste ca punct de plecare a polimerizarii), ADN-polimeraza si nucleotide marcate radioactiv sau fluorescent



Fragmentele sintetizate sunt denaturate termic si separate prin electroforeza pe gel si autoradiografie / fotografie UV

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Alte metode de secventiere

Electroforeza capilara

Dye-termination method DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Clonare in vectori bacterieni Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Secventierea ADN Metoda shotgun ⇨

Cromozomii sunt taiati in fragmente mai mici

⇨

Fiecare fragment este folosit ca matrita pentru crearea unor fragmente noi, care difera de original printr-o singura baza (care urmeaza a fi identificata intr-o etapa ulterioara)

⇨

Fragmentele dintr-un set sunt separate prin electroforeza pe gel

⇨

Markeri fluorescenti de generatie noua permit separarea fragmentelor din cadrul aceleiasi benzi de migrare in gel

⇨

Se identifica ultima baza azotata din fiecare fragment – se recreaza astfel secventa originala de A – T – C – G pentru fiecare fragment

⇨

Rezultatele sunt analizate de sisteme de secventiere automate, obtinandu-se o cromatograma in 4 culori, cu varfuri corespunzatoare celor patru baze azotate

⇨

Dupa “citirea” bazelor, secventele scurte sunt reconstituite pe calculator si este analizata structura lor din punctul de vedere al tipului de informatie genetica stocata.

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Exemplu (principiu de baza)

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

PCR = polymerase chain reaction ⇨

Reactie de copiere si amplificare a informatiei ADN

⇨

Necesita:

⇨



Fragmentul de ADN-ul care se doreste a fi amplificat



Primeri = secvente de nucleotide complementare celor doua capete ale lantului de ADN



ADN-polimeraza



Nucleotide



Buffer, ioni divalenti

Utilizare: 

Secventializarea ADN-ului (“citirea” informatiei genetice)



Clonari



Scopuri diagnostice



Crearea de plasmide, vectori pentru utilizarea in ingineria genetica



Scopuri criminalistice

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

PCR

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Clonari de gene

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Clonari de gene ⇨

Clonare moleculara = izolarea unei anumite portiuni de ADN si realizarea de copii multiple ale acesteia

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro10.swf DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Vectori ⇨ Sunt

molecule de ADN utilizate pentru transferarea de material genetic strain intr-o celula

⇨ Tipuri   

de vectori:

Plasmide Bacteriofagi, alte virusuri Cromozomi artificiali

⇨ Transferul

de material genetic intr-o celula = Transfectie

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Plasmide ⇨

Fragmente de ADN dublu spiralat, de obicei circulare

⇨

Capabile de autoreplicare

⇨

Se pot integra sau nu in genomul celulei gazda

⇨

Origine bacteriana / sinteza in vitro

⇨

Utilizare in transfectii, terapie genica Wikimedia Commons

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120082/bio35.swf DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Vectori virali ⇨

Bacteriofagi – virusuri care infecteaza bacterii

⇨

Retrovirusuri – se integreaza in genom, se replica o data cu celula gazda

⇨

Lentivirusuri (subclasa a Retrovirusurilor)

⇨

Adenovirusuri – nu se integreaza in genom, nu se replica o data cu celula gazda (utilizare limitata; genereaza un raspuns imun puternic → utilizare in crearea de vaccinuri)

CONDITII DE UTILIZARE: Nepatogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene ● Toxicitate redusa pentru celulele pe care le infecteaza ● Stabilitate – sa nu prezinte mutatii frecvente ● Specificitate pentru o anumita linie celulara ●

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Vectori virali Bacteriofag

Vector lentiviral Wikimedia Commons Wikimedia Commons

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Cromozomi artificiali ⇨ Cromozomi

de drojdie (YAC – yeast artificial chromosome)

⇨ Cromozomi

bacterieni (BAC)

⇨ Cromozomi

umani (HAC) – functioneaza ca un cromozom suplimentar (47), sunt multiplicati la diviziunea celulara; pot fi utilizati pentru introducerea in celula de gene noi

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Transfectii ⇨

Reprezinta transferul intr-o celula de material genetic strain, cu ajutorul unui vector

⇨

Metode: ✗

Utilizarea unor plasmide + a unei modalitati de destabilizare temporara a membranei celulare, pentru a permite intrarea ADN-ului plasmidic in celula ➔

➔

➔

➔

✗

Metoda fosfatului de calciu (istorica; functioneaza!) Utilizare de lipozomi in care este inclus plasmidul, si care fuzioneaza cu membranele celulare Utilizare de polimeri cationici de care se ataseaza ADN-ul, care ulterior sunt introdusi in celule prin endocitoza Electroporare, ultrasonoporare, magnetoporare, soc termic etc.

Utilizarea de vectori virali: ➔

Transfer mai simplu; are loc infectia celulelor care vin in contact cu virusul modificat genetic, infectie care se propaga rapid in toata cultura de celule

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Animale transgenice ⇨

Crearea, in scopuri de cercetare, a unor linii de animale de laborator (soareci, sobolani etc), ce prezinta o anumita mutatie a unei gene

⇨

Utilitate: ➔

➔

Modele pentru anumite boli Studierea implicarii anumitor gene in anumite lanturi de control, in aparitia anumitor maladii

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Expert Reviews in Molecular Medicine, Vol. 5; 7 April 2003 Generation of YAC-transgenic mice Kenneth R. Peterson

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Linii knock-out ⇨

Linii de organisme modificate genetic (de obicei soareci), la care una sau mai multe gene au fost blocate de la expresie

⇨

Utilizate in studiul patogeniei unor boli

Wikimedia Commons

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Wikimedia Commons Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Aplicatii ale ingineriei genetice

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Aplicatii ale ingineriei genetice

⇨

Screening genetic

⇨

Vaccinuri

⇨

Sinteza de proteine in vitro (ex: insulina!)

⇨

Terapie genica

⇨

GMF/O

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Screening genetic ⇨

Analiza informatiei genetice din ADN-ul unei persoane

⇨

Aplicatii: 

Screening al purtatorilor (identificarea persoanelor care poseda o gena din doua necesare transmiterii unei boli genetice)



Diagnostic prenatal



Teste in perioada presimptomatica la persoanele cu risc pentru boli genetice (Coree Huntington, Alzheimer, cancer de san, etc)



Medicina legala

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Terapie genica ⇨

Introducerea in genom a unei gene normale (clonata), care sa inlocuiasca gena cu defect cauzatoare a unei boli genetice

⇨

Cum se introduce gena? 

Vectori:   

Retrovirusuri Adenovirusuri Virusuri herpes simplex

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Terapia genica ⇨

Probleme actuale de rezolvat: 

Durata scurta a efectului – in prezent, integrarea genei in genom este de scurta durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie



Controlul raspunsului imun – declansat de prima sedinta de terapie, accentuat la repetarea sedintei



Probleme speciale legate de vectorii virali – efecte adverse nedorite (raspuns inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun, posibilitatea redobandirii virulentei odata incorporat in genomul gazdei)



Bolile multigenice – dificultati in identificarea tuturor genelor implicate, ale tipului de intricare functionala; dificultati in inlocuirea tuturor regiunilor de genom implicate

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Terapia genica ⇨

Rezultate semnificative in prezent: ▶

2008: UCL Institute of Ophthalmology and Moorfields Eye Hospital NIHR Biomedical Research Centre – ameliorarea vederii in urma terapiei genice a unei forme ereditare de cecitate

▶

2007: University of Texas M. D. Anderson Cancer Center and the University of Texas Southwestern Medical Center - un studiu pe soareci, cu o combinatie de terapie genica + tehnici nanotehnologice de introducere a genelor au indus scaderea semnificativa a volumului unor tumori pulmonare

▶

2006: National Cancer Institute (NCI) – au obtinut limfocite modificate genetic care ataca cu succes celule tumorale de melanom malign

▶

2006: tratarea cu succes prin terapie genica a unor pacienti suferind de sindroame mieloide

▶

2005: tratata cu succes surditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la hamsteri, prin introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule cohleare

▶

Alte rezultate promitatoare – deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de laborator sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie etc

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Farmacogenomica ⇨

Studiul felului in care bagajul genetic al unui individ afecteaza raspunsul organismului la medicamente

http://www.freewebs.com/pharmacogenomics/impactonyou.htm

⇨

Informatii suplimentare: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara