Taschenlehrbuch Biologie: Biochemie - Zellbiologie 3131448318, 9783131448316 [PDF]

Zitiervorschau

Auf einen Blick 1 Die Zelle

1

2 Biophysikalische Grundlagen

2

3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

3

4 Proteine

4

5 Enzymbiochemie

5

6 Coenzyme

6

7 Stoffwechsel

7

8 Membranen

8

9 Die eukaryotischen Zellkompartimente

9

10 Cytoskelett

10

11 Zelloberflächen

11

12 Zellteilung

12

13 Anhang

13

Aus Munk, Katharina: Taschenlehrbuch Biochemie-Zellbiologie (ISBN 978-313-144831-6) © 2008 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart Dieses Dokument ist nur für den persönlichen Gebrauch bestimmt und darf in keiner Form an Dritte weitergegeben werden!

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Taschenlehrbuch Biologie

Biochemie · Zellbiologie Herausgegeben von Katharina Munk Unter Mitarbeit von

Constanze Abröll Thomas Kurth Thomas Langer Regina Nethe-Jaenchen Harald Schlatter Beate Schultze Klaus Wolf

432 Abbildungen 39 Tabellen

Georg Thieme Verlag Stuttgart · New York

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Bibliografische Information Der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen National-bibliographie; detaillierte bibliographische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar

Geschützte Warennamen (Warenzeichen) werden nicht besonders kenntlich gemacht. Aus dem Fehlen eines solchen Hinweises kann also nicht geschlossen werden, dass es sich um einen freien Warennamen handele. Das Werk, einschließlich aller seiner Teile, ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Verlages unzulässig und strafbar. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen.

c 2008 Georg Thieme Verlag KG Rüdigerstraße 14, D-70469 Stuttgart Unsere Homepage: http://www.thieme.de Printed in Germany Umschlaggestaltung: Thieme Verlagsgruppe Titelbild: Ausschnitt aus der Struktur der Proteinkinase A mit Substratpeptid und einem gebundenen Molekül ADP. Erzeugt von Dr. Thomas Langer, Sulzbach/ Taunus, mit PyMOL (http://sourceforge.net/projects/pymol/) Zeichnungen: H. Bernstädt-Neubert, Berlin; Ch. von Solodkoff, Neckargemünd Satz: Hagedorn Kommunikation, Viernheim Gesetzt auf 3B2 Druck: Offizin Andersen Nexö, Leipzig ISBN 978-3-13-144831-6

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Vorwort

V

Vorwort Für die Studierenden wird es immer schwieriger bei dem wachsenden Informationsangebot und der Flut an täglich neu hinzukommenden Forschungsergebnissen, im Rahmen des kurzen Bachelor-Studiums der Biologie ein Verständnis für biologische Zusammenhänge und Prinzipien zu entwickeln. Die verschiedenen biologischen Fachbücher als Reihe herauszubringen, bietet die Möglichkeit, die Zusammenhänge zwischen den Fachgebieten herauszuarbeiten. Vier Bände enthalten das relevante Grundwissen der Zoologie, Botanik, Mikrobiologie und Genetik. Um die Gemeinsamkeiten der Organismen herauszustellen und gleichzeitig die Überschneidungen zwischen den Bänden möglichst gering zu halten, haben wir diesen „klassischen“ Fächern zwei übergreifende Bände zur Seite gestellt: Den hier vorliegenden Band Biochemie · Zellbiologie, der sich mit der Zelle als der kleinsten Lebenseinheit beschäftigt, und den Band Evolution · Ökologie, der sich mit Interaktionen befasst, die über den einzelnen Organismus hinausgehen und ganze Lebensgemeinschaften und Ökosysteme betreffen. Die an der Buchreihe beteiligten über 40 Autoren sind in Lehre und Forschung erfahrene Dozenten ihrer Fachgebiete. Ihre Erfahrungen mit den seit einigen Jahren laufenden Bachelor-Studiengängen haben sie in diese Taschenbücher eingebracht, die Stofffülle auf ein überschaubares Basiswissen reduziert und durch eine fächerübergreifende, vergleichende Darstellung und viele Verweise Querverbindungen zwischen den einzelnen biologischen Disziplinen hergestellt. So vermitteln die Bände einen zusammenhängenden Überblick über die Basisinhalte der Biologie. Der Band Biochemie · Zellbiologie umfasst alle relevanten Grundlagen zur Struktur und Funktion der Zelle als Grundeinheit des Lebens. Die in einer Zelle stattfindenden biochemischen Prozesse, die diesen zugrundeliegende Energetik, der Aufbau und die Organisation der Zellbestandteile sowie die Rolle der Zelloberflächen bei der Signalerkennung und Weiterleitung werden fächerübergreifend, vergleichend dargestellt. Auf diese Weise werden Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen einer prokaryotischen, pflanzlichen, tierischen Zelle und einer Pilzzelle erkennbar. Die Ursprünge dieser Taschenlehrbuch-Reihe zur Biologie gehen auf eine Initiative des Gustav Fischer Verlages im Sommer 1997 zurück. An dieser Stelle möchte ich ganz besonders Herrn Dr. Arne Schäffler danken, der damals das Zustandekommen der Reihe ermöglichte und mit seinen vielen wertvollen Ratschlägen ihren Werdegang begleitet hat. Ermutigt durch den Erfolg der ersten Auflage, die 2000 und 2001 unter dem Namen Grundstudium Biologie im Spektrum-Verlag erschien, und die starke positive Resonanz von Studenten und Dozenten, haben wir eine neue Auflage in Angriff genommen, die mittlerweile durch zahlreiche neue Autoren unterstützt wird.

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VI

Vorwort

Mein besonderer Dank gilt dem Georg Thieme Verlag für die neue Herausgabe der Reihe in ihrer jetzigen Taschenbuchform und der großzügigen farbigen Gestaltung. Frau Marianne Mauch als verantwortliche Programmplanerin danke ich für ihre Begeisterung für das Projekt, die effiziente Hilfe und ihre wertvolle Unterstützung bei der Weiterführung des Konzepts. Die Zusammenarbeit macht mir sehr viel Spaß. Frau Elsbeth Elwing hat mit ihrer fröhlichen Ruhe stets alle noch so aussichtslosen Terminprobleme bei der Herstellung gelöst. Auch allen anderen Mitarbeitern des Verlages, die mit ihrer Arbeit zum Gelingen der Bände beigetragen haben, sei gedankt. Besonders auch Michael Zepf, der alle meine technischen Anfragen immer rasch und zuverlässig beantwortet hat. Besonders bedanke ich mich auch bei Frau Christiane von Solodkoff sowie bei Frau Henny Bernstädt-Neubert für die sehr persönliche Zusammenarbeit und die kreative und professionelle Umsetzung – zeitweilig im Dauereinsatz – der teilweise chaotischen Vorlagen in die nun hier vorliegenden, hervorragend gelungenen Abbildungen. Dr. Karin Hauser (Stuttgart), Dr. habil. Maria Mulisch (Kiel), PD Dr. Andrea Maisner (Marburg), Dr. Hella Hartmann (Dresden), Prof. Dr. Christian Bardele (Tübingen), Prof. Dr. Peter Traub (Ladenburg), Dr. Denis Chrétien, (Rennes), Prof. Dr. Manfred Hauser (Bochum) danke ich für die zur Verfügung gestellten Abbildungen und Originale. Einige fotografische Abbildungen wurden aus anderen Lehrbüchern des Thieme-Verlags übernommen. Für die freundliche Genehmigung und Überlassung bedanke ich mich ganz herzlich bei den jeweiligen Autoren und Urhebern. Für die geniale Unterstützung im Hintergrund danke ich meiner Mutter, die für unser leibliches Wohlergehen sorgte, meiner Tochter, die mich daran erinnerte, dass auch die Familie interessant sein kann, meinen beiden Söhnen für die kompetente und permanente Computerbetreuung ohne jegliche Pannen und Abstürze und meinem Ehemann PD Dr. Matthias Munk für die vielen fachlichen Diskussionen und Ermutigungen. Das hier vorliegende Werk ist eine Gemeinschaftsleistung aller an der Buchreihe beteiligten Autoren. Mit großem Einsatz haben sie nicht nur die eigenen Kapitel geschrieben, die anderen Kapitel korrigiert, sondern auch mit vielen konstruktiven Anregungen zu den Inhalten der anderen Bände fachübergreifende Zusammenhänge hergestellt. Wir hoffen, dass dadurch ein Gesamtwerk entstanden ist, dessen Lektüre Ihnen nicht nur gute Voraussetzungen für das Bestehen Ihrer Prüfungen vermittelt, sondern auch Ihre Begeisterung für das Fach Biologie weckt. Wir wünschen Ihnen viel Erfolg in Ihrem Studium! Dr. Katharina Munk E-Mail: [email protected] Juli 2008

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Hinweise zur Benutzung

VII

So arbeiten Sie effektiv mit der Taschenlehrbuch-Reihe Die Bücher bieten Ihnen vielfältige didaktische Hilfen, sowohl für die Phase, in der Sie die Grundlagen erarbeiten, als auch für die schnelle und effiziente Stoffwiederholung kurz vor einer Ihrer Prüfungen.

Einführende Abschnitte geben Ihnen einen ersten Überblick und nehmen die wichtigsten Schlüsselbegriffe vorweg. Hier erhalten Sie den „Rahmen“, in den Sie den folgenden Inhalt einordnen können. Um Ihnen trotz der Stofffülle alle relevanten Inhalte im handlichen Taschenbuch-Format bieten zu können, sind die Texte möglichst kurz gefasst, aber dennoch verständlich formuliert – mit vielen Hervorhebungen für eine optimale Orientierung und einen raschen Informationszugriff. Kleingedruckte Abschnitte mit zusätzlichen Details, Beispielen oder weiterführenden Informationen ermöglichen Ihnen einen „Blick über den Tellerrand“.

Zahlreiche farbige Abbildungen und eindrucksvolle mikroskopische oder elektronenmikroskopische Aufnahmen helfen Ihnen, sich komplexe Sachverhalte zu erschließen.

n In grün markierten Abschnitten finden Sie Informationen über Anwendungsmöglichkeiten, die sich aus den beschriebenen biologischen Prinzipien ergeben. m n Orange gekennzeichnete Abschnitte erläutern konkrete Methoden, die Sie entweder in Ihrer experimentellen Arbeit selbst beherrschen müssen, oder die für Anwendungen z.B. in großtechnischem Maßstab von Bedeutung sind. m Repetitorien am Ende der Abschnitte greifen die wichtigsten neuen Begriffe nochmals auf. Sie sind ideal zur Rekapitulation beim Lernen und Nachschlagen! Außerdem erfüllen sie die Funktion eines Glossars, da die Definitionen anhand der farbigen Seitenzahl im Sachverzeichnis leicht nachgeschlagen werden können. Das Zusatzangebot im Internet: www.thieme.de/go/taschenlehrbuch-biologie Anhand zahlreicher Prüfungsfragen zu jedem Kapitel und den ausführlichen Antworten können Sie Ihr Wissen selbst überprüfen. Die Zahl der Internet-Seiten, die sich mit biologischen Themen befassen, ist groß und steigt stetig. Aus dem unübersichtlichen Angebot haben wir für Sie neben einer Auswahl der wichtigsten weiterführenden Literatur einige Internet-Adressen zusammengestellt, die Ihnen als nützlichen Einstieg für weiterführende Recherchen dienen sollen. Wie bei einem Werk diesen Umfanges zu erwarten, ist auch diese TaschenlehrbuchReihe sicher nicht frei von Fehlern. Wir sind daher dankbar für Hinweise. Anregungen und Verbesserungsvorschläge können Sie uns jederzeit mailen. Die uns bekannten Korrekturen werden wir auf der oben genannten Internetseite zusammenfassen und aktualisieren.

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Adressen

Adressen Constanze Abröll Friedrichsfelder Straße 16 69123 Heidelberg

Dr. Regina Nethe-Jaenchen Bickenbacher Weg 9 64673 Zwingenberg

Dr. Thomas Kurth Electron Microscopy Facility DFG-Center for Regenerative Therapies (CRTD) Cluster of Excellence/TU Dresden Tatzberg 47–49 01307 Dresden

Dr. Harald Schlatter Hugenottenallee 35 63263 Neu-Isenburg

Dr. Thomas Langer Keltenweg 10 65843 Sulzbach Dr. Katharina Munk Untere Beltz 12 65510 Idstein

Dr. Beate Schultze Kirchstraße 9 34519 Diemelsee Dr. rer. nat. habil. Klaus W. Wolf The University of the West Indies (Mona Campus) Electron Microscopy Unit Kingston 7 Jamaica, West Indies

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IX

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1

2

Die Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4

Kleinste Lebenseinheit Zelle . . . . . . . . . . . . . Die verschiedenen Organisationsformen der Die Zelle der Bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Zelle der Archaea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Zelle der Eukarya . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Das Lichtmikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Das Elektronenmikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . Herstellung mikroskopischer Präparate . . . . . In vivo-Betrachtungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

..... Zelle ..... ..... ..... ..... ..... ..... ..... .....

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1 4 5 9 10 14 15 21 23 28

Biophysikalische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 2.2.1 2.2.2 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.4.5 2.4.6 2.4.7 2.4.8 2.5 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4 2.5.5

Die besondere Rolle des Wassers . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Struktur des Wassers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Wasser als Lösungsmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gleichgewichte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Das Massenwirkungsgesetz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Das Löslichkeitsprodukt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Säuren, Basen und Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Dissoziation des Wassers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der pH-Wert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biologische Puffersysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Physikalische Faktoren für den Stofftransport . . . . . . Diffusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ficksche Diffusionsgesetze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diffusion und Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Osmotische Erscheinungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Osmose und Tonizität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Donnan-Verteilung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Viskosität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Strömung in Kapillaren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Thermodynamische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der Erste Hauptsatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Enthalpie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der Zweite Hauptsatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chemisches Potential . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Freie Standard-Bildungsenthalpie und Standardzustände

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30 30 32 36 36 37 38 39 40 45 46 48 48 49 51 52 54 55 57 58 60 61 62 63 65 65

Inhaltsverzeichnis

X

2.5.6 2.5.7 2.6 2.6.1 2.6.2 2.6.3 2.6.4 2.6.5 2.6.6 2.6.7 2.6.8 2.7 2.7.1 2.7.2 2.7.3

3

. . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . .

67 68 69 69 70 73 74 75 76 77 78 80 81 82 85

Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle 87 3.1 3.1.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 3.5 3.5.1 3.5.2

4

Die Änderung der freien Enthalpie unter Nicht-Standardbedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gekoppelte Reaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Elektrochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Redoxreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Redoxpotentiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Arbeitsleistung bei Redoxreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Nernst-Gleichung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Einfluss des pH-Wertes auf das Redoxpotential . . . . . . . . Elektrochemisches Potential und Membranpotential . . . . Goldman-Gleichung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chemiosmotische Theorie und protonenmotorische Kraft Licht und Leben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Natur des Lichts: elektromagnetische Wellen . . . . . . . Lichtabsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Messung der Lichtabsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Aufbau und Zusammenhalt von Makromolekülen . . . . . Verschiedene Bindungstypen bestimmen die Raumstruktur biologischer Makromoleküle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kohlenhydrate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Monosaccharide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Oligo- und Polysaccharide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nucleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Bausteine der Nucleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Lipide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Struktur der Fette . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Struktur der Wachse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Struktur der komplexen Lipide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Struktur der Isoprenoide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Isomerie bei Biomolekülen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Konstitutionsisomere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Stereoisomere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. 87 . . . .

88 92 92 97 103 105 108 109 111 111 112 114 115 115

Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 4.1 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4

Die Funktion von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Aminosäuren – Bausteine der Proteine . . . . . . . . . . . Eigenschaften von Aminosäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die 20 Standardaminosäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weitere proteinogene Aminosäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nicht proteinogene Aminosäuren und Aminosäurederivate

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120 121 122 123 126 128

4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4 4.4.5 4.4.6

5

Inhaltsverzeichnis

XI

Die Struktur von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die verschiedenen Sekundärstrukturen von Proteinen Von der Sekundär – über die Supersekundär – zur Tertiärstruktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Stabilisierung von Proteinstrukturen . . . . . . . . . . Der rätselhafte Faltungscode der Proteine . . . . . . . . . Die Quartärstruktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Methoden der Proteinchemie . . . . . . . . . . . . . . . Proteinnachweis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Elektrophoretische Techniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . Proteinreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Analyse der Proteinstruktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Recherche im Internet und Proteindatenbanken . . . . . Protein-Engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . 129 . . . . 131 . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

138 141 143 145 147 147 149 151 154 161 163

Enzymbiochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.3.6 5.3.7 5.3.8 5.3.9

Was sind Enzyme? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Enzymspezifitäten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Rolle der Coenzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Einteilung der Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Isoenzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Strategien der Enzymkatalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . Reaktionskinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Reaktionsgeschwindigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Übergangszustand und Temperaturabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Katalyse durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie . Das aktive Zentrum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Enzymaktivitäten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Einfluss des pH-Werts auf die Enzymaktivität . . . . . . Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität . . . . . Enzymkinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Michaelis-Menten-Gleichung . . . . . . . . . . . . . . . . Die Michaelis-Konstante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Das Verhältnis Michaelis-Konstante/Wechselzahl . . . . Linearisierung der Michaelis-Menten-Gleichung . . . . . Hemmung der enzymatischen Aktivität . . . . . . . . . . . Irreversible Hemmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Reversible Hemmtypen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Substrat- und Produkthemmung . . . . . . . . . . . . . . . . . Mehrsubstratreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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166 166 169 169 170 172 172 173

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174 176 177 179 181 181 182 183 186 187 189 190 191 191 196 196

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XII

Inhaltsverzeichnis 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 5.4.6 5.5 5.5.1 5.5.2 5.5.3 5.6 5.6.1 5.6.2

6

Regulation der enzymatischen Aktivität Keine Wirkung ohne Enzym . . . . . . . . . . . Zymogenaktivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . Schlüsselenzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Regulation durch kovalente Modifikation . Allosterische Effekte und Kooperativität . . Kooperativität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mechanismen der Enzymkatalyse . . . . . . Serinproteasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Metallionen-Katalyse . . . . . . . . . . . . . . . . Lysozym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ribozyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Spleißen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Viroide und Hammerhead-Ribozyme . . . .

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198 199 200 200 201 202 203 205 207 211 214 215 216 216

Coenzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219 6.1 6.2 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6 6.2.7 6.2.8 6.2.9 6.2.10 6.2.11 6.3 6.3.1 6.3.2 6.3.3 6.4 6.4.1 6.5 6.5.1 6.5.2 6.6 6.6.1 6.6.2 6.6.3

Cofaktor, Coenzym oder prosthetische Gruppe? . . . . . . . Cofaktoren der Oxidoreductasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nicotinamidnucleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Flavinnucleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Faktor 420 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chinone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glutathion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tetrahydrobiopterin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Liponsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Metallionen als Cofaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Eisen-Schwefel-Cluster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Molybdopterin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Metallporphyrine als Cofaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Coenzyme für den Transfer von C1-Fragmenten . . . . . . . S-Adenosylmethionin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tetrahydrofolat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biotin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Coenzyme für den Transfer von C2- und größeren Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Coenzym A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Energiereiche Phosphorverbindungen als Cofaktoren . . . Nucleotide als Cofaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Andereenergiereiche Phosphor-Verbindungen als Cofaktoren Coenzyme der Lyasen, Isomerasen und Ligasen . . . . . . . . Thiamindiphosphat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pyridoxalphosphat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cobalamin (Coenzym B12) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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219 223 223 225 227 228 230 231 231 233 234 235 236 241 241 241 244 247 248 250 250 254 255 255 256 259

XIII

Inhaltsverzeichnis

7

Stoffwechsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262 7.1 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.2.6 7.2.7 7.2.8 7.3 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.3.4 7.3.5 7.3.6 7.3.7 7.4 7.4.1 7.4.2 7.4.3 7.5 7.5.1 7.5.2 7.5.3 7.5.4 7.5.5 7.6 7.6.1 7.6.2 7.6.3 7.6.4

Grundprinzipien des Stoffwechsels . . . . . . . . . . . . . ATP und weitere energiereiche Verbindungen . . . . . Mechanismen der ATP-Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . Ein Überblick über die Reaktionen des Stoffwechsels Der Kohlenhydratstoffwechsel . . . . . . . . . . . . . . . . Die Glykolyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Polysaccharide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Gluconeogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der Pentosephosphatweg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Anaerober Glucoseabbau: Verschiedene Gärungen . . Oxidative Decarboxylierung des Pyruvats . . . . . . . . Der Citratzyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der Glyoxylatzyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Atmungskette . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Komponenten der Atmungskette . . . . . . . . . . . . Aufbau der protonenmotorischen Kraft . . . . . . . . . . . Kopplung von Oxidation und Phosphorylierung . . . . Struktur und Funktion der ATP-Synthase . . . . . . . . . Energiebilanz der Atmungskette . . . . . . . . . . . . . . . . Der respiratorische Quotient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Regulation der Atmungskette . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der Lipidstoffwechsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die b-Oxidation der Fettsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Fettsäurebiosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Biosynthese von Lipiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der Stickstoffstoffwechsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Stickstoff-Assimilation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aminosäuresynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nucleotidsynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aminosäureabbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ausscheidung von Stickstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Photosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Oxygene Photosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Anoxygene Photosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . CO2-Fixierung: Der Calvin-Zyklus . . . . . . . . . . . . . . Regulation des Calvin-Zyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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262 265 268 270 273 274 280 285 288 290 292 293 298 300 301 303 305 307 309 311 311 313 314 321 325 330 331 331 334 335 336 339 340 343 345 347

XIV

8

Inhaltsverzeichnis

Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 348 8.1 8.2 8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.2.5 8.2.6 8.2.7 8.2.8 8.2.9 8.3 8.3.1 8.3.2 8.4 8.4.1 8.4.2 8.4.3 8.4.4 8.4.5 8.4.6 8.4.7 8.4.8 8.4.9

9

Die Lipiddoppelschicht als universeller Bauplan aller zellulären Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Lipidkomponente der Membranen . . . . . . . . . . . . . . Phospholipide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glykolipide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sterine und Hopanoide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Etherlipide und Isoprenoidlipide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Lipopolysaccharide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bewegungen innerhalb der Membran . . . . . . . . . . . . . . . . . Strukturelle Organisation biologischer Membranen . . . . . . Funktionen einzelner Lipide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bildung neuer Membranen – intrazelluläre Lipidverteilung Die Proteinkomponente der Membranen . . . . . . . . . . . . Periphere Membranproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Integrale Membranproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Transportvorgänge an Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . . Kanalbildende Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Carrier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ionophore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Porine und kanalbildende bakterielle Toxine . . . . . . . . . . . Aquaporine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Liganden-gesteuerte Ionenkanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATP-getriebene Transporter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Na+-K+-ATPase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ABC-Transporter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

348 350 354 356 357 359 360 360 362 364 365 367 368 368 371 373 373 376 376 377 379 379 381 383

Die eukaryotischen Zellkompartimente . . . . . . . . . . . . . . 387 9.1 9.2 9.2.1 9.2.2 9.2.3 9.2.4 9.2.5 9.3 9.3.1 9.3.2 9.3.3 9.3.4

Die Kompartimentierung der eukaryotischen Zelle Der Zellkern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Das Chromatin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der Nucleolus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kernlamina und Kernmatrix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der Kernporenkomplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kerntransportprozesse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Endoplasmatisches Retikulum . . . . . . . . . . . . . . . . . Translokation von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Proteinmodifikationen im ER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Lipidsynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Proteintransport zwischen ER und Golgi . . . . . . . . . . .

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387 389 391 392 393 394 395 399

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401 404 406 406

XV

Inhaltsverzeichnis

9.4 9.4.1 9.5 9.6 9.6.1 9.6.2 9.6.3 9.6.4 9.7 9.8 9.8.1 9.8.2 9.9 9.10 9.10.1 9.10.2 9.10.3 9.11 9.11.1 9.11.2

10

Golgi-Apparat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Processing-Reaktionen im Golgi-Apparat . . . . . . . . . . . . . . Vesikelknospung, Proteintargeting und Membranfusion Exocytose, Endocytose, Transcytose, Phagocytose . . . . . . Exocytose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Endocytose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Transcytose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phagocytose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Microbodies: Peroxisomen, Glyoxysomen, Glykosomen . Lysosomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der enzymatische Abbau in Lysosomen . . . . . . . . . . . . . . . Mannose-6-phosphat: Das Sortierungssignal für lysosomale Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vakuolen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mitochondrien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Energieliefernde Prozesse in den Mitochondrien . . . . . . . . Austausch mit dem Cytosol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mitochondrialer Import . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Plastiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Syntheseprozesse in den Chloroplasten . . . . . . . . . . . . . . . Proteintransport in Chloroplasten . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

408 410 412 415 416 417 422 424 425 427 429 430 431 433 435 436 436 438 440 440

Cytoskelett . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443 10.1 10.2 10.2.1 10.2.2 10.2.3 10.2.4 10.2.5 10.2.6 10.3 10.3.1 10.3.2 10.3.3 10.3.4 10.3.5 10.4 10.4.1 10.4.2 10.5

Einführung in das Cytoskelett . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mikrotubuli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tubulin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bau der Mikrotubuli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Dynamische Instabilität der Mikrotubuli . . . . . . . . . . . Funktionen der Mikrotubuli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mikrotubuli-abhängige Motorproteine . . . . . . . . . . . . . Cilien und Flagellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mikrofilamente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Actin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bau der Mikrofilamente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Actinbindende Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Myosine, die Mikrofilament-abhängigen Motorproteine Funktionen der Mikrofilamente . . . . . . . . . . . . . . . . . . Intermediäre Filamente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bau der intermediären Filamente . . . . . . . . . . . . . . . . . Funktion der intermediären Filamente . . . . . . . . . . . . . Amöboide Bewegung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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443 446 446 447 449 452 454 456 461 461 461 463 463 465 466 467 468 470

XVI

11

Inhaltsverzeichnis

Zelloberflächen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 472 11.1 11.1.1 11.1.2 11.1.3 11.1.4 11.1.5 11.2 11.2.1 11.1.2 11.2.3 11.3 11.3.1 11.3.2 11.3.3 11.3.4 11.3.5 11.3.6

Oberflächenstrukturen und extrazelluläres Material Oberflächenstrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glykokalyx . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Extrazelluläre Matrix der Tiere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zellwände der Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zellwände der Prokaryoten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Oberflächenrezeptoren und Signaltransduktion . . . . Rezeptortypen und Signaltransduktionswege . . . . . . . . Signaltransduktion bei Pflanzen und Prokaryoten . . . . . Regulation der Signalübertragung und Integration der Signale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zell-Zell-Kontakte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tight Junctions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Adherens Junctions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Desmosomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Septate Junctions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gap Junctions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Plasmodesmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

12 Zellteilung 12.1 12.2 12.3 12.3.1 12.3.2 12.3.3 12.3.4 12.3.5

..................... Funktionen der Zellteilung . . . Prokaryoten . . . . . . . . . . . . . . . Zellteilung bei Eukaryoten . . . Die Stadien der Interphase . . . . Stadien der Mitose . . . . . . . . . . Cytokinese . . . . . . . . . . . . . . . . Mitose bei niederen Eukaryoten Mitose höherer Pflanzen . . . . . .

13 Anhang

......... Maße und Einheiten Bildquellen . . . . . . . . Sachverzeichnis . . . .

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472 472 473 474 481 482 483 485 494

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495 497 498 500 501 504 504 506

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508 508 508 510 512 515 525 526 528

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1.1 Kleinste Lebenseinheit Zelle

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Die Zelle

Thomas Kurth, Katharina Munk

1.1

Kleinste Lebenseinheit Zelle

Zellen sind die kleinste lebende Einheit. Sie treten sowohl als einzellige selbständige Lebewesen auf, als auch als Bauelement von Geweben und Organen in vielzelligen Organismen. Zellen sind in unterschiedlichsten Lebensräumen zu finden und entsprechend mit unterschiedlichen Fähigkeiten und Strukturen ausgestattet. Dennoch enthalten alle Zellen strukturelle Gemeinsamkeiten. Im Zellinnenraum finden zahlreiche hochkonservierte Stoffwechselvorgänge statt, Ribosomen sind Orte der Proteinsynthese und zahlreiche Reservestoffe werden in Form von Einschlüssen gelagert. Nach außen ist die Zelle von einer selektiven Barriere, der Cytoplasmamembran, umgeben. Zusätzlich können Zellwände oder eine extrazelluläre Matrix vorhanden sein. Alle Zellen enthalten genetische Information in Form von Nucleinsäuren. Die Zelle ist die kleinste Struktur- und Funktionseinheit aller Lebewesen. Sie Ökologie, Evolution): Stoffbesitzt bereits alle Merkmale des Lebendigen ( wechsel zu betreiben, zu wachsen und sich selbst zu vermehren, Information zu speichern und auf Signale von außen zu reagieren. Zellen variieren in Anpassung an ihre unterschiedlichen und teilweise extremen Lebensräume stark in Form und Größe und übernehmen hoch spezialisierte Aufgaben (Abb. 1.1). Viren besitzen keinen eigenen Stoffwechsel und sind zur Vermehrung auf die Wirtszelle angewiesen. Sie werden daher nicht als Lebewesen im engeren Sinn verstanden ( Mikrobiologie). Trotz großer Unterschiede stimmen Zellen in den Grundzügen ihrer Organisation überein. Der Innenraum der Zelle, das Cytoplasma, besteht aus einer wässrigen Lösung, die wegen der hohen Konzentration an Proteinen und anderen Makromolekülen bzw. niedermolekularen Verbindungen eine hohe Viskosität (Zähflüssigkeit) aufweist (S. 57). In diesem zentralen Reaktionsraum laufen zahlreiche Stoffwechselvorgänge ab. Im Cytoplasma sind außerdem in großen Mengen Ribosomen vorhanden, an denen die Proteinbiosynthese stattfindet. Ribosomen bestehen aus zwei unterschiedlich großen Untereinheiten, die jeweils aus zahlreichen Proteinen und 1–3 rRNA-Molekülen zusammengesetzt sind. Eine menschliche Leberparenchymzelle enthält ca. 107, eine Bakterienzelle wie Escherichia coli je nach Wachstumsrate, ca. 7000–70 000 Ribosomen. Lebende Zellen enthalten eine Reihe von großen Molekülkomplexen. Sie können als kleine Reaktionsräume aufgefasst werden, in denen die Reaktionen eines Stoffwechselweges zusammengefasst sind, um die Diffusionswege zu ver-

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1 Die Zelle

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Abb. 1.1 Größenordnungen in der Zellbiologie. Für eine Analyse von Zellen und Zellbestandteilen ist eine optische Vergrößerung notwendig wie durch Licht- und Elektronenmikroskop. Bei diesen Beispielen wurden die eukaryotischen Zellen einige 100x, die Bakterienzellen einige 1000x und das Masernvirus 150 000x vergrößert. (Pollen: M. Mulisch, zentrale Mikroskopie, Kiel; fluoreszenzmarkierte Pyramidenzelle: R. Galuske, Darmstadt; Hefezellen: K. Hauser, Stuttgart; Pseudomonaden: D. Jahn, Braunschweig; Masernvirus: A. Maisner, Marburg)

kürzen und eine präzise Regulation zu ermöglichen. Dazu gehören neben den Ribosomen die Chaperone (Proteinfaltung) und Proteasomen (Proteinabbau); in den eukaryotischen Zellen zusätzlich die Splicosomen für die mRNA-Reifung, der Multienzymkomplex der Fettsäuresynthase und die Centriolen als Organisationszentren der Mikrotubuli.

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1.1 Kleinste Lebenseinheit Zelle

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Reservesubstanzen werden osmotisch unwirksam als Makromoleküle in Form von Granula gespeichert, wasserunlösliche Neutralfette aggregieren zu Oleosomen. Sie sind die Fettspeicher zahlreicher tierischer Zellen und fettreicher Pflanzensamen. Für den gezielten Transport von Zellbestandteilen innerhalb des Cytoplasmas, aber auch als Stütze für die größer werdenden Zellen, entwickelte sich sehr früh in der Evolution ein aus Proteinfilamenten bestehendes Cytoskelett (Kap. 10). Nach außen wird das Cytoplasma durch eine Membran, die Cytoplasmamembran, begrenzt, die in allen Zellen sehr ähnlich aufgebaut ist, deren Zusammensetzung sich aber bei den verschiedenen Organismen unterscheidet (S. 353). Sie besteht in der Regel aus einer etwa 5 nm dicken Lipiddoppelschicht, einer dynamischen, fluiden Struktur, die für die meisten Moleküle eine selektive Barriere darstellt. Ihre flexible Struktur erlaubt das Größenwachstum der Zellen und ihre Teilung, ohne dass der geschlossene Strukturzusammenhalt insgesamt verloren geht. Die Phospholipide machen den größten Anteil der verschiedenen Membranlipide aus. In der Membran eingebettete Proteinmoleküle übernehmen zahlreiche Funktionen. Transportproteine kontrollieren, welche Moleküle in die Zelle hinein bzw. aus der Zelle heraus gelangen (Kap. 8.4). Andere Membranproteine sind Rezeptoren, die Signale aus der Umgebung erkennen und an das Zellinnere weitergeben. Sie vermitteln den Informationsaustausch zwischen verschiedenen Zellen (Kap. 11.5). Viele Zellen sind zusätzlich von extrazellulärem Material umgeben, das von den Zellen selbst sezerniert und bei den Tieren als extrazelluläre Matrix bezeichnet wird. Bei Pflanzen, Pilzen und Bakterien besteht sie in erster Linie aus der Zellwand (Kap. 11.1). Neben den bislang aufgeführten Elementen enthält jede Zelle die für ihre Entwicklung und ihre spezifischen Eigenschaften notwendigen Informationen. Diese Informationen sind als Gene in der Basensequenz der Nucleinsäuren enthalten. Dabei dient die DNA vorwiegend als Informationsspeicher und wird als Erbgut bei der Teilung der Zelle auf die Tochterzellen weitergegeben, während die RNA vorwiegend an der Umsetzung und Realisierung der genetischen Information, der Genexpression, beteiligt ist ( Genetik). Größenbereiche in der Biologie: Atome 0,1 nm, Ribosomen 30 nm, Viren 20–200 nm, prokaryotische Zelle 0,3–10 mm, Hefezelle 5 mm, tierische Zelle 8–20 mm, pflanzliche Zelle 20 mm–0,3 mm. Zelle: Kleinste Struktur- und Funktionseinheit aller Lebewesen. Cytoplasma ist zentraler Reaktionsraum, enthält die Ribosomen, an denen die Proteinsynthese stattfindet, Reservesubstanzen und die genetische Information in Form der DNA und RNA, nach außen von der Cytoplasmamembran begrenzt und ggf. von extrazellulärem Material umgeben.

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1 Die Zelle

1.2

Die verschiedenen Organisationsformen der Zelle

Unterschiede in der Größe der Zellen, der Zusammensetzung der Zellmembranen und Zellwände, der Organisation des Zellinnenraums oder des genetischen Materials haben zur Einteilung aller Organismen in drei Domänen geführt: Bacteria, Archaea und Eukarya. Die Schätzungen des globalen Artenreichtums schwanken zwischen 3 und 30 Millionen Arten. Phylogenetisch lassen sich alle lebenden Organismen drei Domänen zuordnen: Bacteria, Archaea oder Eukarya. Zu den Eukarya gehören die einzelligen Eukaryoten (Protisten), Pflanzen, Pilze und Tiere. Gemeinsames Namen gebendes Merkmal der Eukarya ist, dass ihre Zellen einen echten Zellkern (griech. eu: wahr, echt, griech. karyon: Kern) enthalten, der von zwei Membranen, der Kernhülle, umgeben ist und die chromosomale DNA enthält. Bei den Bacteria liegt die chromosomale DNA in einer kernähnlichen als Nucleoid bezeichneten Struktur im Cytoplasma. Sie enthalten keinen echten Zellkern und entsprechen daher dem prokaryotischen Zelltyp (lat. pro: vor, anstatt). Ebenfalls prokaryotisch sind die Archaea. Viele Gemeinsamkeiten besonders im genetischen Apparat (Tab. 1.1) zeigen aber eine nähere Verwandtschaft der Archaea zu den Eukarya. Von daher besitzt die noch häufig zu findende Einteilung der lebenden Organismen in Prokaryoten und Eukaryoten keine phylogenetische Bedeutung. Dessen ungeachtet haben die einzelligen Bacteria und Archaea einige Gemeinsamkeiten, sie besitzen eine außerordentliche Stoffwechselvielfalt und sind in nahezu allen Bereichen unserer Umwelt zu finden. Sie bilden fast drei Viertel der Biomasse der Erde. Die Zelle der Bacteria und Archaea ist insgesamt einfacher organisiert als die eukaryotische Zelle und der DNA-Gehalt ist geringer. Die Grundformen sind kugelige oder zylinderförmige Zellen, die als Kokken bzw. Stäbchen bezeichnet werden. Spirillen sind schraubenförmige, Vibrionen gekrümmte Stäbchen. Einige Bakterien bilden charakteristische Zusammenlagerungen der Einzelzellen z. B. Trauben bei Staphylokokken, oder Filamente bei Streptokokken oder fädigen Cyanobakterien, fädige Actinomyceten wachsen häufig als Mycel. Im Unterschied zu den echten Geweben der eukaryotischen Vielzeller (s. u.) bleibt in diesen Zellverbänden jede Einzelzelle selbstständig. Bereits in der einfacher organisierten prokaryotischen Zelle existiert eine Form der Arbeitsteilung. Die Zellwand bietet Schutz nach außen und gibt der Zelle ihre Form. Die Cytoplasmamembran ist entscheidend am Energiestoffwechsel beteiligt, sie enthält die Komponenten des Elektronentransports und der oxidativen Phosphorylierung bzw. der Photoreduktion und Photophosphorylierung. An ihr werden Lipide, Glykoside und Proteine zusammengebaut, die extrazellulär z. B. für den Aufbau der Zellwand, benötigt werden. Bei den eukaryotischen

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1.2 Die verschiedenen Organisationsformen der Zelle

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Zellen, besitzt die Cytoplasmamembran solche Funktionen nicht. Sie hat diese Aufgaben an die inneren Membranen weitergegeben. Die Vermehrung erfolgt bei Bacteria und Archaea in der Regel durch Zweiteilung ( Mikrobiologie), und ein direkter genetischer Austausch zwischen den Zellen bleibt auf Mechanismen wie die Konjugation ( Mikrobiologie) beschränkt. Bei den Eukarya entwickelt sich die sexuelle Fortpflanzung. Die Entstehung der sexuellen Fortpflanzung war für die Evolution von enormer Bedeutung: Die Durchmischung des Erbguts durch die Verschmelzung von nicht identischen Gameten (Syngamie) und die Rekombination im Rahmen der Meiose ( Genetik) führten innerhalb eines kurzen Zeitraumes zu einer unglaublichen Artenvielfalt. Über 1,5 Millionen verschiedene Eukarya-Arten sind bislang beschrieben worden: 69 000 Pilzarten, 248 000 Pflanzenarten und 1,2 Millionen Tierarten.

1.2.1

Die Zelle der Bacteria

Bacteria (Abb. 1.2) werden entsprechend ihrem Zellwandaufbau in grampositive und gramnegative Bakterien unterteilt ( Mikrobiologie). Grampositive Bakterien besitzen eine dicke Peptidoglykanschicht, auch als Mureinschicht bezeichnet, die die Cytoplasmamembran umgibt. Bei gramnegativen Bakterien ist die Peptidoglykanschicht dünner und zusätzlich von einer äußeren Membran umgeben, die aus Lipopolysacchariden und Phospholipiden aufgebaut ist ( Mikrobiologie). Durch diese äußere Membran entsteht ein zusätzliches Kompartiment, der periplasmatische Raum. Er ist nicht völlig abgeschlossen, sondern steht durch kanalbildende Proteine in der äußeren Membran, die Porine, mit der Außenwelt in Verbindung (S. 376 und Mikrobiologie). Die Cytoplas-

Abb. 1.2 Zellorganisation der Bacteria-Zelle. Eine einzelne Bakterienzelle enthält bis zu 70 000 Ribosomen. Im Cytoplasma sind häufig Speicherstoffe in Form von Lipidtropfen oder Granula zu finden.

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Prokaryoten

Bacteria

0,3–10 mm

0,3–10 mm, bis 600 mm

Eukaryoten Protisten

Pflanzen

Tiere

Pilze

10–100 mm

20–300 mm, bis mehrere Meter

8–20 mm, bis mehrere Meter

5 mm–20 cm

mehrzellig

mehrzellig

mehrzellig

Zellorganisation Zellgröße Organisationsform

einzellig

einzellig

einzellig

Zusammensetzung der Membran

Etherlipide

Esterlipide, Hopanoide

Esterlipide, Sterole Esterlipide, Sterole Esterlipide, Sterole Esterlipide, Sterole

Zellwände

Pseudopeptidogly- Peptidoglykan, kan, Polysacchari- Polysaccharide, de, Glykoproteine, Proteine Proteine

Polysaccharide

Polysaccharide, v. a. Cellulose

keine

Polysaccharide, v. a. Chitin

Bewegung

archaeelle Flagellen

Flagellen, Typ IV-Pili

Geißeln, Cilien, Pseudopodien

Geißeln, Cilien, Pseudopodien

Geißeln, Cilien, Pseudopodien

Geißeln, Cilien, Pseudopodien

Struktur und Funktion des Cytoplasmas intrazelluläre Membranen, Kompartimentierung

selten, Proteinmembranen

selten, Membraneinstülpungen oder Chlorosomen bei phototrophen Bacteria

vorhanden, ER, Golgi-Apparat, Lysosomen, Microbodies

vorhanden, ER, Golgi-Apparat, Lysosomen, Microbodies, Vakuole

vorhanden, ER, Golgi-Apparat, Lysosomen, Microbodies

vorhanden, ER, Golgi-Apparat, Lysosomen, Microbodies, Vakuole

Organellen mit Doppelmembran

keine

keine

Mitochondrien, Plastiden

Mitochondrien, Plastiden

Mitochondrien

Mitochondrien

Ribosomen

70S

70S

80S (Mitochondrien und Plastiden 70S)

80S (Mitochondrien und Plastiden 70S)

80S (Mitochondrien 70S)

80S (Mitochondrien 70S)

Start der Translation

Methionin

Formyl-Methionin

Methionin

Methionin

Methionin

Methionin

1 Die Zelle

Archaea

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Tab. 1.1 Pro- und Eukaryoten im Vergleich. Manche Merkmale gelten nicht für alle Mitglieder, z. B. sind nicht alle prokaryotischen bzw. eukaryotischen Zellen beweglich.

Kernstruktur

kernähnliche Struktur (Nucleoid)

kernähnliche Struktur (Nucleoid)

Zellkern (Nucleus) umgeben von Kernhülle

Zellkern (Nucleus) umgeben von Kernhülle

Zellkern (Nucleus) umgeben von Kernhülle

Zellkern (Nucleus) umgeben von Kernhülle

chromosomale DNA

meist ringförmig meist ein Chromosom Histone in nucleosomenähnlichen Strukturen monoploid oder polyploid Transkription und Translation gleichzeitig

meist ringförmig meist ein Chromosom histonähnliche Proteine

linear mehrere Chromosomen Histone meist in Nucleosomen

linear mehrere Chromosomen Histone Nucleosomen

linear mehrere Chromosomen Histone Nucleosomen

linear mehrere Chromosomen Histone meist in Nucleosomen

monoploid oder polyploid Transkription und Translation gleichzeitig

diploid oder polyploid Transkription (Zellkern) und Translation (Cytoplasma) getrennt

diploid oder polyploid Transkription (Zellkern) und Translation (Cytoplasma) getrennt

diploid oder polyploid Transkription (Zellkern) und Translation (Cytoplasma) getrennt

diploid oder polyploid Transkription (Zellkern) und Translation (Cytoplasma) getrennt

Plasmide, häufig ringförmig

Plasmide, meist ringförmig

Mitochondrien und Plastiden

Mitochondrien und Plastiden

Mitochondrien

Mitochondrien, bei einigen auch Plasmide

extrachromosomale DNA Introns

in tRNA-Genen

selten

verbreitet

verbreitet

verbreitet

verbreitet

nicht codierende Sequenzen im Genom

selten

selten

häufig

häufig

häufig

häufig

genetische Rekombination

konjugationsähnlicher Prozess

Konjugation

Meiose, Syngamie

Meiose, Syngamie

Meiose, Syngamie

Meiose, Syngamie

1.2 Die verschiedenen Organisationsformen der Zelle

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Lokalisation und Struktur der Erbinformation

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1 Die Zelle

mamembran der Bacteria enthält Esterlipide, in denen Fettsäuren mit Glycerin verestert sind, und Hopanoide zur Stabilisierung. Das Nucleoid mit der DNA der Bacteria umfasst typischerweise ein Drittel des Zellvolumens. Das meist zirkuläre, manchmal auch lineare DNA-Molekül ist mit histonähnlichen Proteinen assoziiert ( Mikrobiologie) und in schleifenförmigen Strukturen organisiert. Das Chromosom besteht aus 80 % DNA und ca. 20 % Proteinen. Neben der chromosomalen DNA im Nucleoid enthält das Cytoplasma häufig noch kleinere extrachromosomale Elemente. Dazu gehören Viren (Bakteriophagen) und kleine, meist ringförmige DNA-Moleküle, die Plasmide. Die Virus-DNA kann in das bakterielle Chromosom integriert werden oder als extrachromosomale DNA vorliegen und wird von der Zelle mitrepliziert. Plasmide codieren für zusätzliche Proteine, die beispielsweise Antibiotikaresistenz oder die Toxinbildung bei pathogenen Bakterien bedingen. Die Replikation der Plasmide erfolgt unabhängig von der des Chromosoms. Plasmide haben große Bedeutung in der molekularbiologischen Forschung, Medizin und Biotechnologie ( Genetik). Das Cytoskelett beinhaltet drei Klassen von Proteinfilamenten, die strukturell den Elementen der eukaryotischen Zellen entsprechen, funktionell jedoch z. T. Mikrobiologie). FtsZ (benannt nach der filaandere Aufgaben übernehmen ( mentösen Temperatur-sensitiven Mutante Z) wurde sowohl in Bacteria als auch in Archaea nachgewiesen, es ist für die Zellteilung essentiell. Proteine der MreB-Familie bilden helikale Filamente unterhalb der Cytoplasmamembran und bestimmen bei stäbchenförmigen Bakterien die gestreckte Zellform. Den intermediären Filamenten der Eukaryoten entspricht sowohl strukturell als auch funktionell das Crescentin, das für die Aufrechterhaltung der gekrümmten Zellform von Caulobacter crescentus sorgt. Zur Fortbewegung besitzen einige Bacteria eine oder mehrere Flagellen (Bakteriengeißeln). Diese schraubenförmige extrazelluläre Struktur wird durch einen Haken und einen Basalkörper in der Zellwand bzw. in der Cytoplasmamembran verankert ( Mikrobiologie). Die rotierende Bewegung des an sich starren Flagellenfilamentes wird durch Motorproteine vermittelt, die um den Basalkörper angeordnet sind. Die Energie für die Bewegung liefert ein über der Membran liegender Protonengradient. Ähnliche Strukturen gibt es in den Axialfilamenten der Spirochäten; allerdings rotieren hier die Fibrillen nicht außen, sondern unter einer Hüllschicht entlang der Bakterienzelle, was zu einer typischen schlängelnden Bewegung führt. Eine andere Form der Fortbewegung ist das Gleiten der Myxobakterien und Cyanobakterien auf einem Schleimfilm. Dabei spielen vermutlich Typ IV-Pili eine Rolle, die sich an benachbarte Zellen anheften, zurückziehen und damit die Zelle voranziehen, während am hinteren Ende aktiv Elektrolytschleim ausgestoßen wird, der das Bakterium gleichzeitig anschiebt (twitching motility). Neben den Flagellen und Pili, die der Fortbewegung dienen, besitzen Bacteria noch andere extrazelluläre fädige Zellanhänge: Die starren Fimbrien (Typ-I-Pili) dienen der Anheftung an Oberflächen oder bei einigen

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1.2 Die verschiedenen Organisationsformen der Zelle

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pathogenen Bakterien an Wirtszellen; andere Pili sorgen bei gramnegativen Bacteria für den spezifischen Kontakt zwischen den Zellen bei der Konjugation ( Mikrobiologie). Charakteristisch für viele Bakterien sind größere Reservegranula aus Polyhydroxybuttersäure (PHB). Schwefelgranula sind typisch für Schwefelbakterien Mikrobiologie). Auch Polyphosphate werden in Form von Granula gespei( chert. Einige Bacteria bilden bei ungünstigen Umweltbedingungen Dauerformen in Form von Sporen oder Cysten. Endosporen entstehen im Inneren der Zelle, dabei werden ein Teil des Cytoplasmas und das Chromosom von mehreren Hüllen umgeben, so dass eine feste, widerstandsfähige Wand entsteht. Reife Sporen sind sehr resistent gegenüber der Einwirkung von Hitze, Kälte, Trockenheit, Strahlung und Chemikalien. Die wohl am besten untersuchte prokaryotische Zelle und Standardobjekt der Molekularbiologie und Genetik ist das zur Darmflora gehörende Bakterium E. coli ( Mikrobiologie), dessen Nucleotidsequenz seit 1997 bekannt ist. Die meisten Kenntnisse über Replikation und Entschlüsselung der genetischen Information stammen von Untersuchungen an E. coli. Die sich rasch vermehrenden Zellen sind etwa 2 mm lang und haben einen Durchmesser von knapp 1 mm.

1.2.2

Die Zelle der Archaea

Archaea sind auch an extremen Standorten zu finden mit Temperaturen von mehr als 100 hC, sehr hohen NaCl-Konzentrationen oder extrem sauren pH-Werten bis zu pH 2. Methanogene Archaea reduzieren in ihrem Energiestoffwechsel CO2 zu Methan oder bilden Methan und CO2 aus Acetat. Dieser strikt anaerobe Prozess stellt eine einzigartige biochemische Fähigkeit dar, die einen großen Anteil an der Methanbildung auf der Erde hat ( Mikrobiologie). Die Cytoplasmamembran der Archaea weist einige Besonderheiten auf (S. 359). Sie enthält z. B. weder Hopanoide noch Sterole und anstelle der Fettsäuren sind in den Lipiden der Archaea verzweigte Kohlenwasserstoffe enthalten, die aus Isopreneinheiten bestehen und über Etherbindungen mit Glycerin verbunden sind (Etherlipide). Bei hyperthermophilen Archaea sind die Kohlenwasserstoffketten der beiden Phospholipidschichten kovalent miteinander verbunden, sodass die Membran nicht in der üblichen Lipiddoppelschicht (Bilayer), sondern als einfache Schicht (Monolayer) vorliegt. Die Zellwände der Archaea sind sehr heterogen aufgebaut. Einige Archaea besitzen Pseudopeptidoglykan, das dem Peptidoglykan der Bacteria sehr ähnlich ist. Weit verbreitet unter den Archaea sind Zellwände aus Glykoproteinen. Die meist einlagige aus einer Protein„spezies“ gebildete Schicht wird als Surface (S)-layer bezeichnet. S-layer als zusätzliche Zellwandkomponente kommen auch in allen Hauptgruppen der Bacteria vor ( Mikrobiologie).

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Einige Archaea besitzen Flagellen, die oberflächlich den bakteriellen Flagellen ähneln, aber im Aufbau und Bewegungsmechanismus einige Gemeinsamkeiten mit den Typ IV-Pili der Bacteria aufweisen (s. o., Mikrobiologie). Die Chromosomen der Archaea sind mit Histonen und weiteren kleinen basischen Proteinen assoziiert, die am Aufbau nucleosomenähnlicher Strukturen Mikrobiologie). beteiligt sind ( Auch andere Strukturen des genetischen Apparates der Archaea lassen Parallelen zu dem der Eukarya erkennen: Archaea besitzen eine aus 12 Untereinheiten aufgebaute RNA-Polymerase; Promotoren zeigen eukaryotische Strukturmerkmale. Die Prozessierung archaealer tRNA und rRNA erfolgt nach einem Mechanismus, ähnlich dem Spleißen eukaryotischer tRNA. Bei der Translation ist die Initiator-tRNA wie die der eukaryotischen mit einem normalen Methionin beladen, bei Bacteria beginnt die Translation dagegen mit einem N-Formyl-Methionin (fMet). Die Initiationsfaktoren weisen eine sehr große Homologie zu den eukaryotischen Initiationsfaktoren auf.

1.2.3

Die Zelle der Eukarya

Die Zellen der Eukarya sind größer als die der Bacteria und Archaea. Eine Größenzunahme in lebenden Systemen bietet Vorteile, doch sind dem Wachstum von Einzelzellen Grenzen gesetzt. Kleine Zellen haben im Verhältnis zum Volumen eine große Oberfläche. Bei ihnen ist sowohl die Aufnahme von Nährstoffen aus der Umgebung der Zelle als auch die Ausscheidung von Abfallprodukten über die Cytoplasmamembran in ausreichendem Maße gewährleistet. Mit einer Vergrößerung der Zelle nimmt das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen ab. Bei größeren Zellen bilden sich deshalb häufig Einstülpungen, Falten und Spalten, die zu einer Oberflächenvergrößerung führen. Daraus entstanden bei Eukaryoten innere, von Membranen umschlossene Hohlräume, die Kompartimente (Abb. 1.3), die über Verschmelzen und Abschnüren von Vesikeln sowohl untereinander als auch mit der Cytoplasmamembran in einem regen Austausch stehen. Zusammen mit der Cytoplasmamembran bildet das gesamte innere Membransystem einer Eukaryotenzelle eine Einheit, die eine mindestens fünfzigfache Oberflächenvergrößerung ausmacht und für die nötigen Austauschprozesse mit der Umwelt sorgt. Bei Bacteria und Archaea sind intrazelluläre Membranen selten, sie kommen z. B. bei einigen phototrophen Bakterien vor ( Mikrobiologie). Neben dem Oberflächen/Volumenverhältnis ist die Diffusionsgeschwindigkeit für die Größe einer Zelle limitierend. Bei kleinem Zellvolumen reicht die Diffusionsgeschwindigkeit aus, um den Stofftransport im Cytoplasma zu gewährleisten und Stoffwechselprozesse in ausreichender Geschwindigkeit durchzuführen (Beispiel, S. 51). In den größeren eukaryotischen Zellen bilden die Kompartimente geschlossene Reaktionsräume, in denen die Reaktionsbedingungen für bestimmte Stoffwechselprozesse optimiert sind: kurze Diffusionswege, die Anreicherung der Intermediate in ausreichenden

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1.2 Die verschiedenen Organisationsformen der Zelle

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Abb. 1.3 Zellorganisation. a Schema einer tierischen Zelle. b Die Mehrzahl der Pflanzenzellen unterscheidet sich von den eukaryotischen tierischen Zellen durch den Besitz von Plastiden, typischerweise von Chloroplasten zur Photosynthese, durch die Bildung einer zentralen Vakuole, die das Cytoplasma auf einen dünnen Schlauch zusammendrängt, und durch die Zellwand, die der Pflanzenzelle eine feste Form verleiht.

Konzentrationen und pH-Werte, die sich von dem pH-Wert der restlichen Zelle unterscheiden. Neben der Formgebung besonders bei zellwandlosen Zellen spielt das Cytoskelett sowohl bei intracytoplasmatischen Bewegungen, z. B. dem Transport bestimmter Zellbestandteile oder Organellen, als auch bei der Bewegung der ganzen Zellen eine Rolle. Es setzt sich hauptsächlich aus drei Filamenttypen zusammen, Mikrotubuli, Mikrofilamenten und in tierischen Zellen den intermediären Filamenten (Kap. 10). An diesen Cytoskelettelementen wandern Motorproteine entlang, die die chemische Energie aus der Spaltung von ATP in Bewegung umsetzen. Mikrofilamente, auch als Actinfilamente bezeichnet, sind unter Beteiligung des Motorproteins Myosin an zahlreichen intrazellulären Bewegungen und an der Muskelkontraktion beteiligt. Die intermediären Filamente haben eher strukturgebende Funktion. Die aus Tubulin aufgebauten Mikrotubuli und die an sie assoziierten Motorproteine Dynein und Kinesin spielen eine bedeutende Rolle für die Orientierung verschiedenster Zellkompartimente in der Zelle sowie den Vesikelverkehr in der Zelle. Sie sind auch an der Ausbildung des Spindelapparates beteiligt und sorgen für die gleichmäßige Verteilung der

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Chromosomen auf die Tochterzellen. Schließlich sind Mikrotubuli wichtige Bestandteile der eukaryotischen Geißeln. Diese sind im Gegensatz zu den prokaryotischen Flagellen von der Cytoplasmamembran umgeben und haben einen grundsätzlich anderen Aufbau (9+2-Muster). Dyneine bewegen sich durch zyklisches Binden und Lösen unter ATP-Verbrauch entlang den Tubuli. Es kommt zu einer Gleitbewegung der Mikrotubuli aneinander und damit zu einer Krümmung der Geißel (S. 457). Unter den einzelligen Eukarya gibt es räuberische, photosynthetisch aktive, Ökologie, Evolution). Sie stellen eine bewegliche und sessile Formen ( genetisch außerordentlich diverse Gruppe von Organismen dar (Protisten, Botanik, Zoologie). Erst im letzten Fünftel der Erdgeschichte, gegen Ende des Präkambriums entstand die Vielzelligkeit. Die Kompartimentierung der eukaryotischen Zelle in Reaktionsräume, in denen nebeneinander verschiedene Stoffwechselvorgänge ungestört ablaufen und reguliert werden können, ist ein großer Evolutionsvorteil. Das Prinzip dieser Arbeitsteilung ist in einem Vielzeller perfektioniert, in dem nicht nur bestimmte Kompartimente einer Zelle, sondern ganze Zellen bestimmte Funktionen übernehmen. Viele Zellen mit gleichartiger Spezialisierung bilden ein Gewebe, verschiedene Gewebe bilden ihrerseits die Organe und diese bilden in ihrer Gesamtheit den vollständigen Organismus. Von einigen losen Zusammenlagerungen abgesehen (z. B. Streptokokken, fädige Cyanobakterien, Zellkolonien), entstand Vielzelligkeit nur innerhalb der Eukarya und die Bildung von echten Geweben nur innerhalb der Tiere und Pflanzen. Die Fruchtkörper höherer Pilze entstehen durch Verflechtung von verzweigten Hyphen, in denen jede Zelle ihre Eigenständigkeit behält. Diese Pseudogewebe werden als Plektenchyme bezeichnet und von den echten Geweben unterschieden, die aus einer gemeinsamen Ursprungszelle hervorgehen. Allein Wirbeltiere weisen über 200 verschiedene Zellarten aus, die in unterschiedlichen Strukturebenen organisiert sind. Nach ihrer Struktur und Funktion unterscheidet man im tierischen Organismus verschiedene Gewebearten: Epithelien kleiden die Körperoberflächen aus, sie bestehen aus zusammenhängenden Epithelzellschichten. Binde- und Stützgewebe, zu denen die Knorpel und Knochen gehören, sind entscheidend an Formgebung und Erhaltung des Körpers beteiligt. Muskelgewebe, dazu gehören glatte Muskulatur, Skelettmuskulatur und Herzmuskulatur sorgen für die unterschiedlichen Bewegungsformen. Im Nervengewebe, die menschliche Großhirnrinde besteht schon aus mindestens 1011 Zellen, sind die Neurone auf die Signalübertragung spezialisiert, Gliazellen haben stützende bzw. ernährende Funktion. In höheren Pflanzen bilden die verschiedenen Gewebe mit über 40 verschiedenen Zelltypen zusammen die pflanzlichen Organe, wie Wurzel, Sprossachse, Blatt und Blüte. Zu den Grundgeweben mit unterschiedlichsten Funktionen gehören Photosynthese-, Speicher-, Durchlüftungsgewebe; Abschlussgewebe schützen oberirdische Organe vor Verdunstung und mechanischer Beschädigung bzw. grenzen innere Gewebe voneinander ab; Festigungsgewebe verleihen mechanische Stabilität. Die Aufgabe der Absorptionsgewebe ist die Aufnahme von Wasser und der darin gelösten Stoffe, der Weitertransport

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1.2 Die verschiedenen Organisationsformen der Zelle

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aber auch der Transport der Assimilate aus den photosynthetisch aktiven Organen zurück erfolgt über die Leitgewebe. Reproduktive Gewebe dienen der Fortpflanzung.

Die Entwicklung von ursprünglich gleichartigen Zellen zu Zellen unterschiedlicher Struktur und Funktion wird als Differenzierung bezeichnet. Zu dieser Differenzierung kommt es durch differentielle Expression zelltypspezifischer Gene Genetik). Da differentielle Genexpression von bestimmten regulatorischen ( Proteinen, den Transkriptionsfaktoren, gesteuert wird, ist deren Anzahl und Diversität in Vielzellern deutlich erhöht. Es gibt eine Reihe von Transkriptionsfaktorfamilien in Eukaryonten, die sich jeweils durch charakteristische Strukturelemente auszeichnen, z. B. die Homöobox, der Zinkfinger, die T-Box oder ein Motiv aus „Helix Loop Helix“ ( Genetik). Die Hefe als Einzeller besitzt z. B. 7 verschiedene Basic-Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren, die Taufliege dagegen deren 84 und der Mensch gar 131. Ähnlich verhält es sich mit vielen anderen genregulatorischen Proteinen. Die Möglichkeiten zur Differenzierung spiegeln sich auch in den unterschiedlichen Genomgrößen. So enthält das Genom von E. coli etwa 4300 Gene, das einer Hefezelle 6300, einer Fruchtfliege 14 000 und das des Menschen ca. 30 000. Die Differenzierung, die Aktivität, aber auch die Vermehrung der einzelnen Zellen in einem Vielzeller ist vielfältigen Steuersystemen unterworfen. Die Zellen müssen zusammenhalten und miteinander kommunizieren. Wichtige Voraussetzung dafür sind Zellkontakte sowie Signalmoleküle und deren Rezeptoren (Kap. 11). So codieren z. B. mehr als 2000 der 19 000 Gene des Nematoden Caenorhabditis elegans für Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle und Kanäle. Je nach Aufgabe haben die eukaryotischen Zellen in einem Vielzeller sehr unterschiedliche Lebensdauern, eine Dünndarmepithelzelle 1,4, Knochenzellen 27, rote Blutkörperchen 120 Tage, während Nieren- und Nervenzellen lebenslang erhalten bleiben. Manche tierische Zellen büßen ihre Teilungsfähigkeit während der Zelldifferenzierung nicht ein und sorgen selbst für ihren Ersatz, andere werden über die Aktivität sogenannter Stammzellen erneuert. Pflanzen besitzen eine stärkere Regenerationsfähigkeit durch die verloren gegangene oder funktionsuntüchtig gewordene Gewebeelemente oder ganze Organe wieder ersetzt werden. Diese Fähigkeit nutzt man z. B. bei der Stecklingsvermehrung ( Botanik). Im Interesse des gesamten Organismus werden einzelne Zellen auch gezielt getötet. Dem gezielten Zelltod, der Apoptose, liegt ein genetisches Programm zugrunde, das entweder durch äußere Faktoren wie UV-Strahlung oder chemische Signalstoffe oder durch zellinterne Faktoren ausgelöst wird ( Zoologie, Botanik, Genetik). Von den unteren Epidermisschichten wandern Zellen an die Oberfläche, sterben dort ab und bilden als verhornte, tote Zellen die oberste Hautschicht (Hornhaut, Stratum corneum). Auch bei pflanzlichen Korkzellen führen von innen auf die Zellwand aufgelagerte Wachs- und Suberinschichten allmählich zum Absterben der Zelle, womit gleichzeitig ein wasserundurchlässiger Wundverschluss der Epidermis erfolgt.

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Der genetisch gesteuerte Selbstmord spielt während der Individualentwicklung der Organismen eine wichtige Rolle. Dabei werden Zellen, die ihre Aufgabe erfüllt haben und im nächsten Entwicklungsstadium nicht mehr gebraucht werden, gezielt durch Apoptose getötet. Beim Frosch sind das z. B. die Zellen des Schwanzes während der Metamorphose von der Kaulquappe zum Frosch. In der Embryonalentwicklung des Menschen die Zellen zwischen den Fingern.

Domänen: Alle Organismen werden einer von drei Domänen zugeordnet: Bacteria, Archaea, Eukarya. Bacteria und Archaea werden als Prokaryoten bezeichnet; die Eukarya umfassen die einzelligen Protisten sowie die vielzelligen Pflanzen, Pilze und Tiere. Bacteria: Zellwand aus Peptidoglykan, vielschichtig bei grampositiven, einschichtig und von einer äußeren Membran umgeben bei gramnegativen Bacteria; Plasmide (= extrachromosomale, meist ringförmige DNA-Moleküle); Cytoskelett aus Proteinfilamenten; Flagellen (= Bakteriengeißel), Pili und Fimbrien dienen der Fortbewegung, Reservegranula als Speicher; Bildung von Dauerformen. Archaea: Zellwände mit Pseudopeptidoglykan; genetischer Apparat enthält Elemente der Bacteria und der Eukarya; Chromosomen mit nukleosomenähnlichen Strukturen; archaeelle Flagellen haben Ähnlichkeit zu bakteriellen Typ IV-Pili. Eukarya: Artenzahlen: Mindestens 69 000 Pilzarten, 248 000 Pflanzenarten und über 1,2 Millionen Tierarten; Zellwände aus Cellulose (Pflanzen), Chitin (Pilze) oder abwesend (Tiere); größere Zellen mit Kompartimentierung des Cytoplasmas (Tab. 1.1; Kap. 9); Cytoskelett aus Mikrofilamenten, intermediären Filamenten und Mikrotubuli; eukaryotische Geißeln (aus Mikrotubuli, 9+2-Muster); Gewebebildung bei vielzelligen Pflanzen und Tieren; Vielzelligkeit einhergehend mit Zellkommunikation, Differenzierung von bestimmten Zelltypen, begrenzter Lebensdauer von Zellen und Apoptose (programmierter Zelltod).

1.3

Mikroskopie

Für eine Analyse der Organisation von Geweben, Zellen und Zellbestandteilen ist eine optische Vergrößerung notwendig (Abb. 1.1). Als technische Hilfsmittel stehen Lupen, Stereo- und eine Vielzahl von Lichtmikroskopen, die verschiedenen Varianten der Elektronenmikroskope sowie Rastertunnelund Rasterkraftmikroskope zur Verfügung. Der Zuwachs an Informationen über die Struktur von Geweben, Zellen und Zellbestandteilen ist eng gekoppelt an die Einführung und technische Weiterentwicklung von optischen Geräten zur Darstellung kleiner und kleinster Zellbestandteile. Der Vielzahl an Mikroskopen steht eine Vielzahl an Präparationsmöglichkeiten für das biologische Untersuchungsmaterial zur Seite. Mit Hilfe von rekombinanten fluoreszenzmarkierten Proteinen rückt in jüngster Zeit die In-vivo-Untersuchung biologischen Materials immer mehr in den Vordergrund.

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1.3 Mikroskopie

1.3.1

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Das Lichtmikroskop

Die wesentlichen Elemente des Lichtmikroskops sind die Lichtquelle und die Linsensysteme von Kondensor, Objektiv und Okular (Abb. 1.4a). Die von der Lichtquelle ausgehenden Strahlen können durch eine Leuchtfeldblende eingegrenzt werden. Hierzu wird das Mikroskop am besten so eingestellt, dass sowohl die Beleuchtungsquelle (bzw. die Leuchtfeldblende) als auch das Präparat scharf abgebildet werden und das Blickfeld gerade ausgeleuchtet ist (Köhlersches Beleuchtungsprinzip). Aus dieser Einstellung ergibt sich die bestmögliche Auflösung, weil das Präparat von vornehmlich parallel verlaufenden Lichtstrahlen durchleuchtet wird. Neben der Beleuchtung sind für die Qualität der optischen Abbildung die Linsensysteme von enormer Bedeutung. Bei Objektiven und Okularen werden meist Kombinationen mehrerer Linsen verwendet, weil so die Fehler der Einzellinsen kompensiert werden können. Unter dem maximal erreichbaren Auflösungsvermögen eines Mikroskops versteht man den Abstand zwischen zwei Punkten, die gerade noch als getrennt wahrgenommen werden können. Das Auflösungsvermögen des Auges beträgt 0,2 mm. Es ist letztlich durch den Abstand der Photorezeptorzellen auf der Netzhaut begrenzt ( Zoologie). Das Auflösungsvermögen des Lichtmikroskops ist von der Wellenlänge des verwendeten Lichtes direkt, von der numerischen Apertur (NA) umgekehrt proportional abhängig (Abb. 1.5a). Unter der numerischen Apertur versteht man das Produkt aus dem Brechungsindex des Mediums zwischen Präparat und Objektiv (n) und dem Sinus des halben Öffnungswinkels (a) zwischen Präparat und Objektiv. Je höher die numerische Apertur, desto besser die Auflösung (Abb. 1.5b). Die Abbildung von Präparatstrukturen beruht auf Absorption, Brechung, Reflektion und Beugung von Lichtwellen. Im Grenzbereich der Auflösung wird die Beugung zum wichtigsten Faktor. Wenn z. B. ein feines Strichgitter durchleuchtet wird, entstehen charakteristische Beugungsmuster mit Maxima und Minima 0., 1., 2., n. Ordnung. Sie sind das Resultat der Interferenz der am Gitter gestreuten Lichtwellen. Um ein Objektdetail aufzulösen, müssen in dessen Beugungsbild neben dem Maximum 0. Ordnung mindestens noch die Maxima der 1. Ordnung erscheinen. Ob diese Bedingung erfüllt werden kann, hängt nicht zuletzt von der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs ab. Die Lichtstrahlen werden beim Eintritt in die Luft zwischen Deckglas und Objektiv gemäß dem Brechungsgesetz vom Lot weg gebrochen. Stärker geneigte Lichtstrahlen gelangen nicht mehr in das Objektiv und tragen nicht zur Auflösung bei. Daher versucht man, den Arbeitsabstand der Objektive möglichst gering zu halten, da sich dadurch der Winkel a erhöht, und, wenn möglich, an Stelle von Luft, Medien mit höherem Brechungsindex (z. B. Immersionsöl) zu verwenden, damit auch stärker geneigte Lichtstrahlen in das Objektiv (Abb. 1.5) gelangen.

Da sichtbares Licht als Beleuchtungsquelle dient, ist der Auflösung des Lichtmikroskops aber eine entscheidende obere Grenze gesetzt, die mit der Wellennatur des Lichtes zusammenhängt: Strukturen, die kleiner als die halbe Wellenlänge des verwendeten Lichtes sind, können nicht mehr aufgelöst werden (Abbesche Beugungsgrenze). Durch Verwendung von UV-Lichtquellen in Ver-

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Abb. 1.4 Aufbau der verschiedenen Mikroskope im Vergleich. a Strahlengang im Lichtmikroskop. Die Abbildungsvergrößerung im Lichtmikroskop erfolgt in zwei Stufen. Das Objektiv erzeugt ein reelles Zwischenbild, das durch das wie eine Lupe wirkende Okular erneut vergrößert wird. b Strahlengang im Transmissionselektronenmikroskop. Die Elektronenquelle besteht aus einer Glühkathode und einer Anode. Mit den elektromagnetischen Linsensystemen Kondensor, Objektiv und Projektiv entspricht der Aufbau des Transmissionselektronenmikroskops dem eines umgekehrten Lichtmikroskops. c Beim Rasterelektronenmikroskop ist der Elektronenstrahl nicht fixiert, sondern tastet das dreidimen-

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1.3 Mikroskopie

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sionale Relief des Präparates ab. Die Bewegung wird durch den vom Rastergenerator gesteuerten Strahldeflektor erzeugt. Zur Bildentstehung werden Sekundärelektronen benützt, die durch die auf das Präparat auftreffenden Primärelektronen aus dem Präparat herausgeschleudert werden. Die Sekundärelektronen werden von einem Detektor erfasst und zu einem Bild verarbeitet. d Lichtmikroskopische Aufnahme eines mit Toluidinblau gefärbten 1 mm dicken Kunststoffschnittes durch die Trachea der Maus. Zu sehen sind das mehrreihige Tracheaepithel, das darunter gelegene Bindegewebe (Lamina propria) und Anschnitte von Trachealdrüsen. e Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Cilienzelle in der Epidermis eines Schwanzknospenembryos von Xenopus. f Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Schwanzknospenembryos von Xenopus. Zu beachten sind die gleichmäßig angeordneten Cilienzellen in der Epidermis. (Aufnahmen: T. Kurth)

bindung mit hochsensiblen Kameras kann die Auflösung noch ein wenig verbessert werden. Unter optimalen Bedingungen liegt die Auflösungsgrenze eines Lichtmikroskops bei ungefähr 0,2 mm, d. h. Strukturen wie Zellen, Zellkerne oder größere Organellen können mit Hilfe des Lichtmikroskops erkannt werden. Außer dem normalen Durchlichtmikroskop gibt es noch einige andere Varianten des Lichtmikroskops. Die meisten Lebendpräparate besitzen im Hellfeld (bei Standardbeleuchtung) nur einen geringen Eigenkontrast. Das sie durchstrahlende Licht wird kaum absorbiert und es ergeben sich daher auch kaum Unterschiede in den Amplituden der Lichtwellen, welche vom Auge wahrgenommen werden könnten. Die verschiedenen

Abb. 1.5 Auflösungsvermögen. a Der Strahlengang von der Lichtquelle über Kondensor und Präparat zum Objektiv. a bezeichnet den halben Öffnungswinkel zwischen Präparat und Objektiv. Das Auflösungsvermögen des Lichtmikroskops ist im Wesentlichen abhängig von der Wellenlänge des verwendeten Lichtes und dem Winkel a. b Eine Veränderung des Arbeitsabstandes vergrößert den Öffnungswinkel. Für eine optimale Auflösung sollte der Winkel a so groß wie möglich sein (im besten Fall ungefähr 70h). Immersionsöl erhöht den Brechungsindex n zwischen Objekt und Objektiv.

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Abb. 1.6 Vergleich von Phasenkontrast und Differentialinterferenzkontrast. Aufgrund unterschiedlicher Brechungsindizes verschiedener Strukturen in Lebendpräparaten entstehen Phasenunterschiede der sie durchdringenden Lichtwellen. a Eine zusätzliche Ringblende wandelt beim Phasenkontrast diese Phasenunterschiede zwischen Lichtwellen, die durch verschiedene Präparatdetails gelaufen sind, in einen Amplitudenunterschied um und macht sie dadurch sichtbar. b Beim Differentialinterferenzkontrast erscheinen optisch dichtere Strukturen des Präparats plastisch vorgewölbt. (HeLa-Zellen; Aufnahmen: Hella Hartmann, Dresden) Strukturen in Lebendpräparaten weisen lediglich unterschiedliche Brechungsindizes (n) auf, was zu Phasenverschiebungen der die Objektstrukturen durchdringenden Lichtwellen führt. Diese Phasenunterschiede können allerdings vom Auge kaum wahrgenommen werden. Beim Phasenkontrast wird durch eine zusätzliche Ringblende dieser Phasenunterschied in einen Amplitudenunterschied umgewandelt, wodurch letztlich der Kontrast erhöht wird. Beim Differentialinterferenzkontrast nach Nomarski werden dagegen Dichteunterschiede im Präparat in ein plastisches Relief übersetzt. Es entsteht ein scheinbar dreidimensionales Bild, bei dem optisch dichtere Strukturen wie unter seitlicher Beleuchtung vorgewölbt erscheinen (Abb. 1.6). Weitere Formen der Lichtmikroskopie sind die Dunkelfeldmikroskopie und die Polarisationsmikroskopie. Bei der Dunkelfeldbeleuchtung wird nur gebeugtes Licht durch das Präparat geführt. Die Strukturen erscheinen dann hell vor dunklem Hintergrund. Man kann mit dieser Art der Beleuchtung z. T. sehr feine Details auflösen, die bei konventioneller Beleuchtung nicht zu erkennen wären (z. B. einzelne Mikrotubuli). Bei der Polarisationsmikroskopie verwendet man Filter, die nur polarisiertes Licht, d. h. Licht, das nur in einer Ebene schwingt, durchlassen. Kristalle und andere hochgeordnete Molekülaggregate (Stärkekörner, Zellwände, Actin-Myosin-Komplexe in Muskelzellen usw.) verändern in charakteristischer Weise die Schwingungsrichtung des sie durchdringenden Lichtes, was Aussagen über Orientierung und Ordnungsgrad der entsprechenden Molekülaggregate ermöglicht. Der In-vivoNachweis von Mikrofilamenten in Muskelzellen oder von Mikrotubuli in Teilungsspindeln erfolgte mit Hilfe der Polarisationsmikroskopie lange bevor Elektronenmikroskope diese subzellulären Strukturen direkt sichtbar machen konnten.

Das Fluoreszenzmikroskop Etwa 80 % aller mikroskopischen Untersuchungen in der zellbiologischen Forschung entfallen auf die Fluoreszenzmikroskopie, durch die fluoreszenzmarkierte Moleküle wie Proteine, Polysaccharide (z. B. Lektine) oder Nucleinsäuren innerhalb der Zelle lokalisiert werden können. Für die Markierung der Moleküle

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1.3 Mikroskopie

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steht eine Reihe von Verfahren zur Verfügung (S. 24). Die wichtigsten Formen sind die Epifluoreszenz- und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM). Bei der Epifluoreszenz wird von einer Quecksilberdampflampe ausgestrahltes UV-Licht durch die Optik des Mikroskops auf das Präparat gelenkt. Dabei dient das Objektiv zugleich auch als Kondensor. Der fluoreszierende Farbstoff im Präparat wird angeregt und gibt eine Strahlung charakteristischer Wellenlänge ab. Ein Strahlungsteiler (Spiegel) im Strahlengang sorgt für die Trennung von kurzwelliger Anregungsstrahlung und langwelliger spezifischer Fluoreszenz. Dies wird durch zusätzliche spezifische Filter, die jeweils nur Strahlen bestimmter Wellenlängen durchlassen, unterstützt (Abb. 1.7a). Sie dienen auch der Trennung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale bei Mehrfachmarkierungen (s. u.). Die Epifluoreszenzmikroskopie eignet sich gut für die Analyse von dünnen oder ultradünnen Schnittpräparaten.

Abb. 1.7 Fluoreszenzmikroskope. a Vereinfachtes Schema eines Epifluoreszenzmikroskops. Das von einer UV-Lampe erzeugte Anregungslicht wird durch die Mikroskopoptik mit Hilfe eines Spiegels auf die Probe gelenkt. Die dort angeregte Fluoreszenz gelangt durch Objektiv und Okular zum Beobachter. Spezifische Sperrfilter erlauben die Trennung verschiedener Fluoreszenzsignale. b Prinzip der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie. Das vom Laser erzeugte Anregungslicht wird über eine Beleuchtungsblende und einen Spiegel auf eine bestimmte Ebene in der Probe gelenkt (Brennebene) und regt dort Fluoreszenz an. Die Fluoreszenz gelangt durch eine Detektorblende und wird registriert. Da Beleuchtungs- und Detektorblende konfokal sind, gelangt nur Fluoreszenz aus der Brennebene zur Abbildung.

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Dagegen ist die Untersuchung von größeren dreidimensionalen Präparaten aufgrund des massiv auftretenden Streulichtes durch nicht im Fokus befindliche Präparatteile nur mit Hilfe zusätzlicher Einrichtungen und spezieller Software (Deconvolution, Apotom) möglich. Die Methode eignet sich daher nur bedingt zur Aufklärung von komplexen 3D-Strukturen. Hier liegt u. a. das Anwendungsgebiet des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopes (CLSM) (Abb. 1.7b). Mit dem CLSM können größere ungeschnittene fluoreszenzmarkierte Präparate analysiert werden. Das CLSM erstellt dabei Ebene für Ebene optische Schnitte. Das besondere ist, dass jeweils nur die optische Information verarbeitet wird, die sich im Fokus der verwendeten Mikroskopoptik befindet. Hierzu wird das Licht eines Lasers (Anregungslicht) durch eine feine Lochblende und über spezielle Spiegel auf eine bestimmte optische Ebene des Präparates fokussiert. Ein geeigneter Lichtdetektor registriert die aus dieser Ebene abgestrahlte spezifische Fluoreszenz. Vor diesem Detektor ist eine zweite Blende angebracht. Die beiden Blenden sind konfokal, d. h. der Detektor registriert nur die Fluoreszenz, die aus der vom fokussierten Laserstrahl angeregten optischen Ebene abgestrahlt wird. Streulicht aus den darunter- oder darüber liegenden Ebenen wird von der Detektorblende abgeschirmt. Jeder Punkt des optischen Schnittes wird nun abgetastet und ein zweidimensionales Bild erscheint schließlich auf einem Bildschirm. Viele optische Schnitte aus verschiedenen Ebenen werden dann in einem Computer zu einem dreidimensionalen Bild rekonstruiert. Das CLSM liefert somit eine hohe Auflösung ohne Streulicht und ist für Rekonstruktionen komplexer dreidimensionaler Strukturen das Gerät der Wahl. Für größere Proben eignet sich das Zwei-Photonen-Mikroskop. Fluoreszenz wird auch durch längerwelliges Licht angeregt, wenn zwei Photonen (oder mehr, dann Multi-Photonen-Mikroskop) gleichzeitig am Fluorochrom ankommen und sich ihre Anregungsenergien addieren. Beim Zwei-Photonen-Mikroskop wird eine Anregungswellenlänge verwendet, die in etwa der doppelten zu beobachtenden Emissionswellenlänge entspricht. Auch hier wird die Probe mit dem Anregungsstrahl abgetastet, der auf eine bestimmte Probenebene fokussiert ist. Nur in dieser Ebene ist die Wahrscheinlichkeit für ein gleichzeitiges Auftreffen von Photonen auf den Fluorochromen hoch genug, sodass detektierbare Fluoreszenz nur aus der Fokusebene stammt. Damit ist das Prinzip dem der CLSM durchaus vergleichbar. Durch die Verwendung längerwelligen Lichts erhält man allerdings eine bessere Durchdringung, und die Probe kann wesentlich schonender mikroskopiert werden. Eine weitere Variante des CLSM, mit der auch die Abbe’sche Beugungsgrenze durchbrochen werden kann, ist das STED (stimulated emission depletion)-Mikroskop. Hierbei wird ein Fluoreszenzmarker zunächst mit einem Lichtstrahl bestimmter Wellenlänge (z. B. 470 nm) bestrahlt (Anregung) und direkt anschließend mit Licht einer anderen Wellenlänge (z. B. 620 nm) erneut bestrahlt (Abregung). Die durch die Anregung erhaltene Energie wird als Licht der Abregungswellenlänge abgegeben. Das nennt man stimulierte Emission. Die Anregungswellenlänge ist niedriger als die des Abregungslichts und regt in unserem Beispiel grüne Fluoreszenz an, das stimulierte Abregungslicht wäre rot. Salopp formuliert schaltet man mit der Anregungswellenlänge ein grünes Lämpchen an. Bevor das aber richtig angeht, wird die grüne Fluoreszenz durch die Abregungswellenlänge in rote Fluoreszenz „umgewandelt“. Jetzt kommt das Wesentliche: der Abregungs-

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strahl hat eine Nullstelle in der Mitte, d. h. ein „Loch“. Die angeregte Fluoreszenz wird also durch einen „ringförmigen“ Lichtstrahl abgeregt. In der Mitte kann die Fluoreszenz jedoch durchscheinen, wie durch eine Lochblende. Je höher die Intensität des Abregungsstrahls ist, desto kleiner sind das Loch und die noch durchgelassene Fluoreszenz. Ein Fluoreszenzpunkt an der Auflösungsgrenze von ca. 200 nm lässt sich dadurch noch einmal deutlich verkleinern, im Prinzip auf bis zu ca. 20 nm. Wird die fluoreszenzmarkierte Probe abgetastet, entstehen Bilder mit einer Auflösung deutlich jenseits der Abbe’schen Beugungsgrenze. Obwohl sich die Auflösung bei den meisten biologischen Anwendungen zur Zeit im Bereich von 40–50 nm bewegt, lassen sich damit bereits eindrucksvolle zelluläre Details, z. B. synaptische Vesikel (ca. 40 nm) darstellen. In Verbindung mit GFPmarkierten Proteinen lassen sich mit dem STED-Mikroskop zelluläre Prozesse in vivo in bislang ungeahnter Auflösung studieren. Damit ist man dem schlichten und doch schwer erreichbaren Ziel: zu sehen, was passiert, ein deutliches Stück näher gekommen.

1.3.2

Das Elektronenmikroskop

Das Auflösungsvermögen des normalen Durchlichtmikroskops ist durch die Verwendung von sichtbarem Licht begrenzt. In Elektronenmikroskopen wird zur Beleuchtung des Präparates ein Elektronenstrahl mit deutlich geringerer Wellenlänge verwendet. Mit Elektronenmikroskopen wurde erstmals der Aufbau von Zellen und insbesondere von einzelnen Zellorganellen ultrastrukturell aufgeklärt. Auch heute stellen Elektronenmikroskope noch wichtige Instrumente in der zellbiologischen Forschung dar. Man unterscheidet zwei verschiedene Varianten, das Transmissionselektronenmikroskop und das Rasterelektronenmikroskop. Das Transmissionselektronenmikroskop (TEM) erinnert in seinem Aufbau an ein umgekehrtes Lichtmikroskop (Abb. 1.4b, e). An der Spitze der Hauptsäule befindet sich die Elektronenquelle. Diese besteht aus einer Glühkathode und einer darunter angebrachten Anode. Die Glühkathode wird erhitzt, bis sich Elektronen aus ihrer Oberfläche lösen. Diese werden durch die zwischen Kathode und Anode angelegte Hochspannung – in der Regel zwischen 50 000–100 000 V – in Richtung Anode beschleunigt. Ein aus zwei magnetischen Linsen bestehendes Kondensorsystem fokussiert den Elektronenstrahl auf das Präparat. Dabei wird nur ein sehr kleiner Teil des Präparates beleuchtet. Durch Bewegen des Präparates kann eine gewünschte Position eingestellt werden. Durch weitere magnetische Linsensysteme (Objektiv und Projektiv) werden die das Präparat durchdringenden Elektronen schließlich auf einen Leuchtschirm gelenkt. Für Aufnahmen kann der Leuchtschirm hochgeklappt und die Elektronenstrahlen auf Photoplatten oder eine digitale Kamera gelenkt werden. Da die Elektronen sehr energiearm sind und durch Gasmoleküle leicht abgelenkt werden könnten, muss in der Mikroskopsäule ein Hochvakuum herrschen. Photoplatten und Präparate müssen daher über Luftschleusen in die Mikroskopsäule gebracht werden, und die Präparate darüber hinaus vollständig entwässert sein. Da Elektronen Materie nur sehr schlecht durchdringen, müssen die mikroskopierten Präparate außerordentlich dünn sein. Für histologische Untersuchungen werden

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ultradünne (30–50 nm) Schnitte mikroskopiert. Der Kontrast entsteht im Elektronenmikroskop nicht wie beim Hellfeldmikroskop durch unterschiedliche Absorption, sondern durch unterschiedliche Beugung der Elektronenstrahlen. Schwermetalle wie Blei oder Uran erzeugen die stärkste Beugung. Sie werden daher häufig in Kontrastierungsmitteln verwendet. Ähnlich wie beim Lichtmikroskop ist die Auflösung des Elektronenmikroskops abhängig von der Wellenlänge des Elektronenstrahls, die wiederum von der Beschleunigung der Elektronen abhängt. So beträgt die Wellenlänge eines Elektronenstrahls bei einer Beschleunigungsspannung von 100 000 V ungefähr 0,004 nm. Damit lassen sich Auflösungsvermögen von 0,1 nm erreichen und man befindet sich in den Größenbereichen einzelner Atome. Bei den meisten biologischen Anwendungen werden allerdings deutlich geringere Werte erreicht (1–2 nm). Durch Verwendung von Hochspannungs-Transmissionselektronenmikroskopen mit Beschleunigungsspannungen von bis zu 1 000 000 V kann die Auflösung noch erhöht werden. Gleichzeitig verringert sich allerdings der Kontrast, da die Beugung der Elektronen umgekehrt proportional zur Geschwindigkeit des Elektronenstrahls ist. Die Elektronen-Tomographie (ET) ist eine Methode zur 3-D-Rekonstruktion kleinster Strukturen. Im TEM wird ein bis zu 200 nm dicker Schnitt einer entlang einer oder zwei Achsen (single und double axis ET) geneigten Probe aus verschiedenen Winkeln aufgenommen. Am Rechner wird dann eine Rückprojektion der einzelnen Bilder vorgenommen, wodurch ein 3-D-Modell (Tomogramm) eines Zielobjekts innerhalb des Schnittes (z. B. Organell, Proteinkomplex) erstellt wird. Als Probe werden sowohl Kunststoff- als auch Gefrierschnitte (Cryo-ET) verwendet. Die 3-D-Rekonstruktion wird auch mit einer Immunmarkierung (s. u.) kombiniert (Immuno-ET). Mit Hilfe dieser Methode konnten z. B. Tomogramme von Mitochondrien, Kernporenkomplexen und dem ActinMyosin-System im Muskel erstellt werden.

Mit dem Rasterelektronenmikroskop (REM) lassen sich Oberflächenstrukturen darstellen (Abb. 1.4c, f). Es unterscheidet sich fundamental vom TEM. Zwar wird auch hier ein Elektronenstrahl über magnetische Linsen (Kondensor und Objektiv) zum Präparat gelenkt; der Elektronenstrahl ist allerdings nicht wie beim TEM fixiert, sondern tastet das dreidimensionale Relief des Präparates ab. Die Bewegung des Elektronenstrahls wird durch einen Strahldeflektor erzeugt, welcher wiederum von einem Rastergenerator gesteuert wird. Die auf das Präparat treffenden primären Elektronen führen dazu, dass sich Elektronen aus der Präparatoberfläche lösen (Sekundärelektronen). Diese werden von einem Sekundärelektronendetektor erfasst und elektronisch zu einem Bild verarbeitet, welches aufgrund der Geschwindigkeit des Rastervorganges fast in Echtzeit auf einem Bildschirm verfolgt werden kann. Die Auflösung des REM entspricht ungefähr der Größe des Rasterpunktes, auf den der Elektronenstrahl gebündelt werden kann. Er beträgt bei den meisten REM zwischen 1 und 10 nm im Durchmesser. Damit ist das Auflösungsvermögen deutlich geringer als beim TEM, dafür liefert das REM dreidimensionale Informationen, die im TEM nur durch aufwendige

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1.3 Mikroskopie

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Serienschnittanalysen oder hintereinander gekoppelte EM-Tomogramme zu erlangen sind. Ein völlig anderes Prinzip als bei Licht- und Elektronenmikroskopen liegt dem Rastertunnel- und dem daraus weiter entwickelten Rasterkraftmikroskop (atomic force microscope) zugrunde. Beim Rasterkraftmikroskop tastet eine extrem feine pyramidenförmige Spitze, ähnlich wie beim Tonabnehmer eines Schallplattenspielers, die Oberfläche der zu untersuchenden Probe ab. Die mit der Objektoberfläche interagierende eigentliche Rasterspitze besteht dabei nur aus wenigen Siliciumatomen, so dass eine sehr hohe Auflösung erreicht wird und sogar die Oberfläche von Atomen erfasst werden kann. Die Pyramide ist an einem Federbügel angebracht, der schon bei äußerst geringen Kräften in der z-Richtung ausgelenkt wird. Da die für den Ausschlag des Federbügels benötigten Federkräfte geringer sind als die interatomaren Bindungskräfte in den meisten Molekülen, wird so ein Abtasten der Präparatoberfläche ermöglicht, ohne dass dabei Atome aus ihrem molekularen Verband herausgestoßen werden. Die Rasterbewegung erfolgt durch den Präparatehalter, welcher durch piezoelektrische Elemente in der x- und y-Achse bewegt werden kann. Der Federbügel mit der Rasterpyramide ist fixiert. Ein Laserstrahl, der auf den Federbügel gerichtet ist, wird durch dessen Ausschläge beim Abrastern der Präparatoberfläche abgelenkt und von einer Photodiode registriert. Die von der Photodiode aufgenommenen Informationen werden elektronisch zu einem dreidimensionalen Bild der Präparatoberfläche verarbeitet. Da die Abrasterung auch in wässrigem Milieu erfolgen kann und sehr schonend ist, können mit Hilfe des Rasterkraftmikroskopes Lebensvorgänge an Zellen bei sehr hoher Auflösung beobachtet werden. Dies stellt einen Vorteil gegenüber der Elektronenmikroskopie dar, bei der nur fixierte und entwässerte Präparate mikroskopiert werden können. Mit dem Rasterkraftmikroskop kann man beispielsweise Enzymen bei der Arbeit zusehen und den Membranumbau einer wandernden Zelle beobachten.

1.3.3

Herstellung mikroskopischer Präparate

Nur sehr kleine und mehr oder weniger durchsichtige Organismen oder Gewebestücke sind einer direkten mikroskopischen Beobachtung zugänglich. Größere Objekte müssen vor der mikroskopischen Analyse fixiert, in ein schneidbares Material eingebettet und schließlich in mikroskopierbare Scheiben geschnitten werden. Die Fixierung soll Strukturen möglichst in ihren natürlichen Lagebeziehungen zueinander erhalten und das Präparat stabilisieren, sie erfolgt chemisch oder durch möglichst schnelles Einfrieren. Zur chemischen Fixierung werden Alkohole (z. B. 70 % Ethanol als Standardfixativ für viele Anwendungen) oder quervernetzende Moleküle wie Formaldehyd oder Glutardialdehyd verwendet. Man muss allerdings berücksichtigen, dass die fixierenden Chemikalien mit Molekülen des zu untersuchenden Gewebes interagieren und dort unter Umständen zu Veränderungen führen. Die chemische Fixierung erzeugt somit kein getreues Lebensabbild einer biologischen Probe sondern ein im besten Fall reproduzierbares Äquivalentbild. Aus diesem Grund kann es durch die chemische Fixierung auch zu Veränderungen der antigenen Eigenschaften von Proteinen kommen, was für Immunmarkierungen (s. u.) von Bedeutung ist. Das Einfrieren (Kryofixierung) andererseits muss äußerst schnell erfolgen, da es sonst zur Kristallbildung

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und somit zur Schädigung des Gewebes oder der Zellen kommt. Das Schockgefrieren erfolgt meist in flüssigem Stickstoff oder flüssigem Propan. Häufig werden zusätzlich noch Gefrierschutzmittel verwendet. Um den Gefriervorgang noch weiter zu beschleunigen, werden die Präparate in aufwendigen Anlagen unter Hochdruck in flüssigem Stickstoff gefroren. Da das Präparat von außen nach innen gefriert, verlangsamt sich die Gefriergeschwindigkeit im Inneren der Probe beträchtlich. Daher ist die Kryofixierung insbesondere für ultrastrukturelle Untersuchungen nur bei relativ kleinen Objekten (je nach Zusammensetzung bis 200 mm) sinnvoll. Nach der Fixierung werden die Präparate in schneidbares Material eingebettet. Hierzu eignen sich verschiedene Materialien wie Paraffin, Kunststoffe oder Harze, die in flüssigem Zustand die fixierten Präparate infiltrieren und durch Abkühlung oder Polymerisation aushärten. Zumeist werden für die Einbettung nicht wasserlösliche Materialien verwendet, so dass die Präparate vor der Infiltration entwässert werden müssen. Für das Lichtmikroskop werden in der Regel 1–10 mm dicke Schnitte an einem Mikrotom mit Hilfe von Stahl- oder Glasmessern hergestellt. Für die hochauflösende Lichtmikroskopie werden auch Semidünnschnitte (100–500 nm), und bei Schnittfluoreszenzmarkierungen sogar Ultradünnschnitte (30–50 nm, Abb. 11.13) angefertigt. Letztere entsprechen auch der Schnittdicke für elektronenmikroskopische Untersuchungen. Ultradünnschnitte werden mit Hilfe von Glas- oder Diamantmessern an Ultramikrotomen erstellt. Kryofixierte Proben werden bei niedrigen Temperaturen in Kunststoff überführt (Gefriersubstitution) und anschließend mit Mikrotomen oder Ultramikrotomen geschnitten. Sie können aber auch in gefrorenem Zustand, eingebettet in Gelatine oder Äquivalentes mit Hilfe von Kryotomen (für die Lichtmikroskopie) oder Ultrakryotomen (für TEM) geschnitten werden.

Histologische Färbungen Mikroskopische Schnittpräparate besitzen nur einen geringen Eigenkontrast. Um Strukturen besser darzustellen, wird eine Vielzahl von Farbstoffen verwendet. Einige häufig verwendete histologische Farbstoffe färben verschiedene Zellbestandteile ihren chemischen Eigenschaften entsprechend, so dass ein differenziertes Bild von Zellen und Geweben entsteht. Haematoxylin-Eosin (H. E.) färbt das Cytoplasma und Kollagen rot, die Kerne blauviolett (Abb. 9.1b), Azan dagegen das Cytoplasma blassrosa bis schwach bläulich, die Kerne rot und Kollagen blau, und Toluidinblau färbt das Cytoplasma rot-violett bis bläulich sowie die Kerne blau (Abb. 1.4d). Außerdem gibt es eine Reihe von Farbstoffen, die selektiv bestimmte Zellkomponenten markieren: DNA-bindende fluoreszierende Farbstoffe wie 4,6-Diamino-2-Phenylindol (DAPI, blaue Fluoreszenz) und Acridinorange; Sudanschwarz zur Darstellung von Lipiden; Alcianblau zum Nachweis von sauren Proteoglykanen in Knorpel und Knochen.

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1.3 Mikroskopie

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In der Elektronenmikroskopie werden Lösungen von Uranylacetat und Bleicitrat als Kontrastierungsmittel verwendet. Im TEM können auch Oberflächenstrukturen von Makromolekülen dargestellt werden. Dazu werden diese mit Metall (meist Platin) bedampft. Viren, Zellwände oder größere Proteine erscheinen so dreidimensional. Eine andere Methode zur Darstellung von Makromolekülen ist die Negativkontrastierung. Hier werden die Makromoleküle auf einen Kohlefilm gebracht und dann mit einer Uranylacetatlösung behandelt. Nach der Trocknung des Präparates, hat sich das Uranylacetat überall auf dem Kohlefilm niedergeschlagen. Nur die Makromoleküle sind frei geblieben, die dadurch hell erscheinen. Bei der Gefrierbruchtechnik wird ein Gewebeblöckchen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Der gefrorene Block wird in eine Vakuumkammer gebracht und mit Hilfe eines Messers gebrochen. Der Gefrierbruch erfolgt bevorzugt entlang den hydrophoben Innenanteilen der Membranen, dabei werden durch Bruchvorgänge unterschiedliche Ebenen an den Zellkompartimenten freigelegt. Die Bruchoberfläche wird zunächst metall- und schließlich kohlebedampft. Diese Kohleschicht unterstützt die Metallschicht und ist für Elektronen durchlässig. Das Präparat wird schließlich mit Säure behandelt, um das Gewebe wegzulösen. Übrig bleiben lediglich Metall- und Kohleschicht, welche einen Abdruck (Replika) der Bruchoberfläche darstellen. Diese Replika wird im TEM mikroskopiert (Abb. 1.8). Eine Abwandlung dieser Methode stellt die Gefrierätzung dar. Hier wird nach dem Gefrierbruch und vor der Metallbedampfung im Vakuum ein Teil des Eises absublimiert und dadurch das Oberflächenrelief verstärkt. Die Gefrierätzung dient vor allem der Darstellung intrazellulärer Strukturen.

Abb. 1.8 Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie. Durch den Gefrierbruch entlang der hydrophoben Innenteile der Membran werden unterschiedliche Ebenen an den intrazellulären Kompartimenten eines Enterocyten freigelegt. (EM-Aufnahme aus Kühnel W., Thieme 2002)

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Die Immunmarkierung Um bestimmte Proteine, Polysaccharide oder andere Zellbestandteile innerhalb von Zellen oder Geweben zu lokalisieren, werden sie auch mit spezifischen Antikörpern markiert: Dazu werden monoklonale Antikörper, die genau ein Epitop binden, und polyklonale Antikörper, die als Antikörpergemisch verschiedene Epitope eines Antigens binden, verwendet. Die primären Antikörper stammen meist aus Maus, Hase oder Ratte. Zum Nachweis der primären Antikörper werden verschiedene sekundäre Antikörper aus Ziege, Esel oder Pferd verwendet. Diese binden den konstanten Teil der Primärantikörper und sind entweder an einen fluoreszierenden Farbstoff, Enzyme (alkalische Phosphatase, Peroxidase) oder sonstige Marker (Goldpartikel, Ferritin) gekoppelt. Für manche Anwendungen sind bakterielle Proteine wie Protein A oder Protein G als sekundäre Nachweissysteme geeignet. Diese Proteine binden an die Primärantikörper und können ebenfalls mit Markern wie Goldpartikeln versehen werden. Fluoreszenzmarkierte Präparate werden an einem Epifluoreszenzmikroskop oder an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop untersucht. Mit unterschiedlichen Farbstoffen können auch 2- oder 3-fach-Markierungen durchgeführt werden (bei Fluoreszenzmarkierungen blau-grün-rot, Abb. 1.9), wobei die Primärantikörper nach Möglichkeit jeweils aus unterschiedlichen Spezies (z. B. Maus und Kaninchen) stammen sollten. Sie können dann mit verschieden markierten Sekundärantikörpern gegen die konstanten Bereiche aus Mausbzw. Kaninchen-Antikörpern detektiert werden. Enzymgekoppelte Sekundärantikörper sind oft in der Lage auch geringe Mengen an Antigen zu detektieren. Die Peroxidase setzt beispielsweise Diaminobenzidin (DAB) um, wobei sich ein brauner Niederschlag bildet, der im Lichtmikroskop erkennbar ist. Da dieser Niederschlag elektronendicht ist, findet die DAB-Peroxidase-Methode auch in der Elektronenmikroskopie Anwendung. Enzymgekoppelte sekundäre Antikörper spielen auch bei der nicht-radioaktiven In-situ-Hybridisierung (Nachweis von mRNA durch markierte Antisense-RNA) eine wichtige Rolle. Goldmarkiertes Protein A/G oder goldmarkierte sekundäre Antikörper werden vor allem in der Elektronenmikroskopie verwendet (Abb. 11.13–11.15). Dabei können Goldpartikel unterschiedlicher Größe an die sekundären Antikörper gekoppelt werden, so dass auch hier Mehrfachmarkierungen möglich sind. Ektopisch, d. h. nicht an ihrem physiologischen Ort, exprimierte Proteine, die z. B. durch Transfektion oder Elektroporation von DNA oder Mikroinjektion von DNA/RNA in Zellen „eingebracht“ wurden, können durch „Tags“ (engl. tag: Zeichen, Markierung) markiert werden, z. B. myc-Tag, His-Tag, FLAG-Tag (S. 247). Die DNA, die für diese Tag-Epitope codiert, kann mit fast jedem beliebigen Gen rekombiniert werden. Das myc-Tag beispielsweise ist ein aus 13 Aminosäuren bestehendes Epitop aus dem C-Myc-Onkoprotein. Mit Hilfe spezifischer, kommerziell erhältlicher Antikörper lassen sich die Tags und damit die markier-

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1.3 Mikroskopie

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Abb. 1.9 Immunfluoreszenzmarkierung. a Indirekte Immunfluoreszenz von a-Tubulin in der Epidermis von Xenopus Schwanzknospenembryonen. Tubulinreiche Strukturen wie Cilienzellen (s. auch Abb. 1.4e, f) und Nervenzellfortsätze sind zu erkennen. Ganzkeimpräparat, Oberflächenbetrachtung. b Immunfluoreszenzmarkierung Actin (rot) im Schwanz einer Xenopus-Kaulquappe. Die Zellkerne sind mit dem DNA-bindenden fluoreszierenden Farbstoff 4,6-Diamino-2 Phenylindol (DAPI, blau) markiert. Kunststoffschnitt, frontal, Markierung vor der Einbettung. c Frontalschnitt durch den Kopf einer Xenopus-Kaulquappe. Immunfluoreszenzmarkierung von b-Catenin (rot) und b1-Integrin (grün). Kunststoffschnitt, frontal, Markierung vor der Einbettung. (Aufnahmen: T. Kurth)

ten Proteine effektiv nachweisen. Damit ist man nicht auf spezifische Antikörper gegen die Zielproteine selbst angewiesen.

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1 Die Zelle

1.3.4

In vivo-Betrachtungen

Die bisher angesprochenen Präparationsmethoden basieren auf der Verarbeitung fixierten Materials. Eine fixierte biologische Probe hat aber einen entscheidenden Nachteil: sie ist tot! Eines der Hauptziele in der modernen Biologie ist daher, Prozesse möglichst in vivo zu untersuchen. Eine Möglichkeit bestimmte Proteine in vivo darzustellen, offeriert das aus der Qualle Aequorea victioria stammende GFP (green fluorescent protein). Dabei handelt es sich um ein natürlich fluoreszierendes Protein. Das gfp-Gen kann ähnlich wie die verschiedenen Tags (s. o.) an nahezu jedes Gen angekoppelt werden, sodass Zellen, die dieses Konstrukt exprimieren, eine Chimäre aus dem zu untersuchenden Protein und GFP produzieren. Auf diese Weise lassen sich dynamische Vorgänge im Cytoskelett (Actin-GFP, Tubulin-GFP, etc.), Vesikeltransport (Rab-GFP) und viele andere Prozesse im wahrsten Sinn des Wortes „live und in Farbe“ verfolgen. Durch Mutagenese ist es inzwischen gelungen viele farbliche Varianten des GFP zu „erzeugen“ (YFP: yellow fluorescent protein, CFP: cyan fluorescent protein, RFP: red fluorescent protein, etc.). Dadurch lassen sich mehrere Proteine gleichzeitig verfolgen. Die Methode FRET (Fluoreszenz-Resonanzenergie-Transfer) basiert auf der Tatsache, dass die Anregungsenergie von einem fluoreszierenden Molekül (z. B. GFP) auf ein anderes (z. B. RFP) übertragen werden kann. Dieser Energietransfer benötigt die enge räumliche Nähe der beiden Fluorophore (1–10 nm). Dabei wird die Fluoreszenz des Donors (in unserem Beispiel GFP) schwächer, während die des Akzeptors (RFP) zunimmt: Ein Licht geht aus, das andere geht an. Mit dieser Methode lassen sich geringfügige Veränderungen im Abstand zweier Fluorophore verfolgen. FRET eignet sich daher gut zur Untersuchung von Faltungsprozessen, von Proteinmodifikationen, die mit größeren Konformationsänderungen einhergehen, oder von Protein-Protein-Interaktionen. Biochemie wird sichtbar!

Auflösungsvermögen: Abstand zwischen zwei Punkten, die gerade noch als getrennt wahrgenommen werden können, abhängig von der Wellenlänge des Lichts und der numerischen Apertur des Linsensystems, unbewaffnetes Auge 0,2 mm. Lichtmikroskop: Lichtquelle, Kondensor, Objektiv und Okular, Auflösungsvermögen 0,2 mm. Prinzipien lichtmikroskopischer Verfahren: – Hellfeld: geeignet für gefärbte Präparate, ein Lebendpräparat bietet kaum Kontrast. – Phasenkontrast: macht Unterschiede im Brechungsindex sichtbar. – Differentialinterferenzkontrast: Strukturen mit geringen Dichteunterschieden erscheinen verstärkt hervorgehoben. – Dunkelfeld: nur an Präparatstrukturen gebeugtes Licht wird durchgeführt. Sie erscheinen hell vor dunklem Hintergrund. – Polarisationsmikroskopie: lichtdrehende Objekte verändern die Schwingungsrichtung des polarisierten Lichtes. – Fluoreszenzmikroskopie: Epifluoreszenzmikroskopie und konfokale LaserScanning-Mikroskopie mit den Varianten Zwei-Photonen und STED-Mikroskopie.

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1.3 Mikroskopie

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Elektronenmikroskop: Elektronenstrahlquelle (Glühkathode, Anode), magnetische Linsensysteme. – Transmissionselektronenmikroskop, TEM: Auflösungsvermögen (0,1–2 nm), Darstellung kleinster Strukturen; 3D-Darstellung durch Elektronentomographie. – Rasterelektronenmikroskop, REM: Auflösungsvermögen (5–10 nm), Darstellung von Oberflächenstrukturen. Fixierung von Zellmaterial für mikroskopische Untersuchungen: – Chemische Fixierung: Alkohol, quervernetzende Moleküle (Formaldehyd, Glutardialdehyd). – Kryofixierung: Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff oder Propan. Mikrotom: Gerät zur Herstellung von Dünnschnitten für die mikroskopische Untersuchung von Zellpräparaten. Dünnschnitte 1–10 mm; Semidünnschnitte 100–500 nm; Ultradünnschnitte 30–50 nm. Kryotom: Gerät zur Herstellung von Gefrierschnitten (10–20 mm Kryotom; bis 50 nm Ultrakryotom). Histologische Farbstoffe: z. B. Haematoxylin-Eosin, Azan, Toluidinblau, DAPI. Immunmarkierung: Nachweis der In-situ-Expression von Proteinen mit Hilfe von markierten Antikörpern.

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2 Biophysikalische Grundlagen

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Biophysikalische Grundlagen

Thomas Langer „Contra principia negantem non est disputandum” (Mit jemandem, der die Grundlagen nicht begreift, lässt sich nicht diskutieren) Horaz Ziel der modernen Biologie ist das Verständnis der elementaren Lebensvorgänge auf molekularer Ebene. Die Biophysik untersucht strukturelle und funktionelle Erscheinungen lebender Systeme und versucht, durch Anwendung physikalischer Prinzipien auf biologische Fragestellungen Lebensprozesse erklärbar zu machen. Die von Aristoteles begründete Lehre des Vitalismus, die besagt, dass belebte (organische) Stoffe nur von lebenden Systemen erzeugt werden können und sich somit der analytischen Erfassung entziehen, hat sich bis in das 19. Jahrhundert halten können. Erst durch Experimente von Scheele, Döbereiner und Wöhler, denen es bis 1828 gelungen war organische Stoffe aus „unbelebten“ (anorganischen) Stoffen herzustellen, setzte sich zögernd die Erkenntnis durch, dass auch die Biologie physikalischen und chemischen Gesetzen folgt.

2.1

Die besondere Rolle des Wassers

Zu den ungewöhnlichen Eigenschaften, in denen sich Wasser von anderen Molekülen unterscheidet, gehören der relativ hohe Schmelz- und Siedepunkt, eine hohe Wärmekapazität und Verdampfungsenthalpie, die elektrische Leitfähigkeit, eine hohe Dielektrizitätskonstante, eine hohe Oberflächenspannung und die hohe Viskosität. All diese Eigenschaften liegen in der Struktur des Wassermoleküls begründet. Leben entwickelte sich erst, nachdem Wasserdampf der Erdatmosphäre dauerhaft zu Wasser kondensierte. Leben und Wasser sind aufs Engste miteinander verbunden: In vielen afrikanischen Sprachen gibt es nur ein Wort für „Leben“ und „Wasser“. Wasser ist mit einem Anteil von 70 % und mehr die in lebenden Organismen am häufigsten vorkommende Substanz. Wasser spielt eine ganz entscheidende Rolle bei der Organisation zellulärer Strukturen und ist als Reaktionspartner an zahlreichen chemischen Umsetzungen in der Zelle beteiligt.

2.1.1

Die Struktur des Wassers

Die elektrischen Ladungsverhältnisse in einem Wassermolekül sind asymmetrisch (Abb. 2.1). Der elektronegativere Sauerstoff zieht die Elektronen stärker an als der Wasserstoff, so dass die O-H-Bindung zu 33 % ionischen Charakter auf-

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2.1 Die besondere Rolle des Wassers

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weist. Es resultiert ein permanenter Dipol. Zwischen dem Sauerstoff mit negativer Partialladung und dem positiv polarisierten Wasserstoff eines benachbarten Wassermoleküls bilden sich Wasserstoffbrücken-Bindungen aus (S. 90). Jedes Wassermolekül kann maximal vier Wasserstoffbrücken-Bindungen mit benachbarten Wassermolekülen eingehen. Dies ist im Eis der Fall (Abb. 2.1). Im Eis sind die Wassermoleküle tetraedrisch angeordnet. Auf dieser regelmäßigen Anordnung beruht die Volumenvergrößerung bei der Ausbildung der Eisstruktur gegenüber flüssigem Wasser. Im Eiskristall sind die Wassermoleküle räumlich fixiert. Beim Schmelzen beginnen die Wassermoleküle sich heftiger gegeneinander zu bewegen und gelangen dadurch auch in die Zwischengitterplätze: Es kommt zur bekannten Volumenkontraktion. Beim Schmelzen werden aber nicht alle Wasserstoffbrücken-Bindungen aufgebrochen. Im flüssigen Wasser bildet jedes Molekül im Durchschnitt ca. 3,4 Wasserstoffbrücken-Bindungen aus. Diese Bindungen sind sehr kurzlebig, die Lebensdauer der so gebildeten Aggregate, die als „Cluster“ bezeichnet werden, beträgt weniger als 10–9 Sekunden. Trotz der geringen Stärke einzelner Wasserstoffbrücken-Bindungen wird durch diesen Zusammenhalt die Gesamtenergie erhöht, die benötigt wird, um einzelne Moleküle aus dem Verband herauszulösen. Dies ist die Erklärung für die hohen Schmelz- und Siedepunkte bzw. die hohe Verdampfungsenthalpie. Auch die Phänomene der hohen Oberflächenspannung und der Kohäsion beruhen auf den zahlreichen Wasserstoffbrücken-Bindungen. Als Kohäsion bezeichnet man den Zusammenhalt eines Stoffes, der auf den zwischenmolekularen Anziehungskräften in dessen Innerem beruht. Im Gegensatz hierzu sind bei der Adhäsion die Anziehungskräfte haupt-

Abb. 2.1 Wasser und Eis. Struktur des Wassermoleküls als a Kugel-Stab-Modell und b Kalottenmodell. Der Sauerstoff besitzt eine negative Teilladung (2d–), die Wasserstoffatome eine positive (d+). Der Winkel zwischen den beiden O-H-Bindungen beträgt 104,5h und weicht damit etwas vom idealen Tetraederwinkel (109,5h) ab. Diese Abweichung beruht darauf, dass die bindenden Orbitale der OH-Bindung durch die nichtbindenden Orbitale des Sauerstoffs zusammengedrückt werden. c Struktur des Eises. Zu beachten ist die offene Struktur im Eiskristall.

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2 Biophysikalische Grundlagen

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sächlich in den Grenzschichten wirksam und sorgen so für das „Zusammenkleben“ zweier unterschiedlicher Stoffe.

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2.1.2

Wasser als Lösungsmittel

Wasser ist ein ausgezeichnetes Lösungsmittel für polare Stoffe. In Wasser lösliche Substanzen werden als hydrophil (wasserliebend) bezeichnet; unpolare, in Wasser unlösliche, entsprechend als hydrophob (wasserabweisend). In Wasser lösliche Stoffe bilden Wasserstoffbrücken-Bindungen mit Wassermolekülen aus, die gegenüber den Wasserstoffbrücken-Bindungen zwischen den Wassermolekülen energetisch begünstigt sind. Polare Stoffe bilden WasserstoffbrückenBindungen mit Wasser, aber auch untereinander aus. Für die Löslichkeit hydrophiler Substanzen ist die Anzahl der gebildeten Wasserstoffbrücken-Bindungen zum Lösungsmittel entscheidend. Wasser eignet sich als Lösungsmittel besonders gut, da es pro Molekül vier Wasserstoffbrücken-Bindungen ausbilden kann. Es kann sowohl zweimal als Wasserstoffakzeptor als auch zweimal als Wasserstoffdonor fungieren. Bei der Auflösung eines Salzkristalls in Wasser lagern sich Wassermoleküle über Wasserstoffbrücken-Bindungen an die Ionen und bilden eine Wasserhülle, die Ionen werden hydratisiert (Abb. 2.2). Durch die Wasserhülle bzw. Hydratation (hydration) wird die zwischen den Ionen wirkende elektrostatische Wechselwirkung vermindert. Für die Abschirmung der Ionenladungen ist die Dielektrizitätskonstante e (Tab. 2.1) des Wassers entscheidend. Die Kraft F, die zwischen zwei Ionen wirkt, errechnet sich wie folgt: F¼

q1 q2 e r2

(2.1)

Dabei sind q1 und q2 die Ladungen des betrachteten Ionenpaars, r der Abstand der Ionen zueinander. Je höher die Dielektrizitätskonstante eines Lösungsmittels ist, umso besser können ionische Wechselwirkungen gegeneinander abgeschirmt werden. Mit der Hydratation von Ionen ist stets ein Wärmeumsatz

Abb. 2.2 Hydratation. Die Anziehungskräfte der Ionen untereinander werden durch die Wasserhülle soweit vermindert, dass die erneute Ausbildung eines Kristallgitters unterbleibt.

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2.1 Die besondere Rolle des Wassers

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Tab. 2.1 Physikalische Eigenschaften einiger häufig verwendeter Flüssigkeiten. Substanz

Dielektrizitätskonstante

Dipolmoment [Cm · 10–30]

Schmelzpunkt [hC]

Siedepunkt [hC]

Formamid (CHO-NH2)

109,8

11,24

2,6

210 (Zersetzung)

Wasser

78,5

6,18

0

100

Dimethylsulfoxid (DMSO, H3C-SO-CH3)

46,7

13,20

18,6

189

Methanol (CH3OH)

32,6

5,68

–97,8

64,7

Ethanol (C2H5OH)

24,3

5,66

–117,3

78,5

Aceton (H3C-CO-CH3)

20,7

9,62

–95

56,5

Propanol (CH3CH2CH2OH)

20,1

5,56

–127

97,2

Chloroform (CHCl3)

4,81

3,4

–63,5

61,3

Diethylether (C2H5-O-C2H5)

4,3

3,83

–116,3

34,6

Benzol (C6H6)

2,27

0

5,51

80,1

Butan (CH3(CH2)2CH3)

1,003

0

–135

–0,4

(Enthalpieänderung) verbunden: Die Hydratation ist ein exothermer Vorgang (S. 62). Unpolare bzw. hydrophobe Substanzen können keine oder nicht genügend Wasserstoffbrücken-Bindungen mit Wassermolekülen ausbilden. Hier sind die Wechselwirkungen der Wassermoleküle untereinander gegenüber den Wechselwirkungen mit der unpolaren Substanz bevorzugt. Diese Moleküle werden von einem geordneten „Wasserkäfig“ umgeben, der die Wechselwirkungen mit der Substanz minimiert. Kommen zwei so „ausgestoßene“ Moleküle sich nahe genug, treten sie direkt miteinander in Wechselwirkung und werden von einer gemeinsamen Wasserhülle, die aus weniger Wassermolekülen besteht, umgeben. Dies führt schließlich zur Phasentrennung bzw. bei Makromolekülen zur Aggregation. Die bei der Entstehung der gemeinsamen Wasserhülle freigesetzten Wassermoleküle weisen eine höhere Beweglichkeit (Unordnung) auf, als dies in dem fixiertem Wasserkäfig der Fall wäre. Dieser Entropie-Effekt (S. 63) ist die treibende Kraft für die als hydrophobe Wechselwirkungen bezeichneten Phänomene. Sie sind z. B. an der Bindung von Substraten/Liganden an Enzyme/Rezeptoren und an der Aufrechterhaltung der Tertiär- bzw. Quartärstruktur von Proteinen (S. 129) beteiligt. Moleküle, die sowohl polare als auch unpolare Bereiche besitzen, heißen amphiphil oder amphipathisch („beidesliebend“). Viele biologische Moleküle sind amphiphil, darunter Proteine, Steroide, einige Vitamine, bestimmte Pigmente und Fettsäuren. In wässriger Lösung liegen die polaren Gruppen hydrati-

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2 Biophysikalische Grundlagen

siert vor, die unpolaren Gruppen der amphiphilen Substanzen lagern sich zusammen, um die dem Wasser ausgesetzte hydrophobe Fläche zu minimieren. Es kommt zur Ausbildung von Micellen (Abb. 2.3) oder Doppelschichten, die kugelförmige Strukturen ausbilden können (Liposomen). Dies ist das Prinzip der biologischen Lipidmembranen (S. 350). Für die Ausbildung funktioneller und stabiler Strukturen von Proteinen (S. 141) und Nucleinsäuren (S. 106) ist Wasser ebenfalls maßgeblich beteiligt. Auch Proteinkristalle bestehen bis zu 70 % aus Wasser. Durch seine Eigenschaft zahlreiche Wasserstoffbrücken-Bindungen auszubilden, wird Wasser als „dynamischer“ Baustein in die Struktur miteinbezogen (Abb. 2.4). Ein gut untersuchtes Beispiel für den Einfluss von Wasser auf die Struktur von Biomolekülen ist die Konformationsänderung der DNA. Abhängig vom Wassergehalt bildet sich eine sogenannte A- oder B-DNA Struktur aus ( Genetik). Bedeutung der Eigenschaften des Wassers für das Leben: Wasser kann aufgrund seiner Eigenschaften von keiner anderen Substanz ersetzt werden. Bei sinkender Außentemperatur ermöglicht die Tatsache, dass Eis leichter als Wasser ist und deshalb auf der Wasseroberfläche schwimmt, das Überleben der Organismen in den tieferen Schichten größerer Gewässer. Da die Eisschicht als Wärmeisolator wirkt, frieren diese Gewässer nicht bis in die Tiefe zu, und so ist flüssiges Wasser für die Lebensprozesse der dort lebenden Organismen weiterhin verfügbar. Würde sich Wasser wie eine „normale“ Flüssigkeit verhalten und beim Erstarren zu Boden sinken, hätte dies grundlegende ökologiÖkologie, Evolution): In den Ozeanen wären ständig Eisablagesche Konsequenzen ( rungen vorhanden. Das warme, leichtere Wasser befände sich stets an der Oberfläche

Abb. 2.3 Micellenbildung. a Durch Zusammenlagerung der hydrophoben Bereiche wird die Zahl der an einer strukturierten Wasserhülle beteiligten Wassermoleküle verkleinert. b Die maximale Freisetzung von Wassermolekülen wird durch die Bildung von Micellen oder Vesikeln (Liposomen) erreicht.

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2.1 Die besondere Rolle des Wassers

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Abb. 2.4 Wasser in der Komplexstruktur. Gezeigt ist die Bindung des l-Repressors Genetik) an ( die DNA. Eine optimale Bindung des Proteins an die DNA wird erst durch die Einbeziehung von Wassermolekülen erreicht. Man kann die Funktion von Wasser bei diesen Interaktionen am besten mit einer „Schmierfunktion“ beschreiben. Einige Wassermoleküle stehen sowohl mit dem Protein als auch der DNA in Kontakt, andere vermitteln Kontakte zwischen den Proteinuntereinheiten, und manche Wassermoleküle stehen nur mit der DNA oder einer Proteinuntereinheit in Kontakt (pdb: 1LMB). und es käme nicht zu einer Vermischung der unterschiedlichen Wasserschichten durch Konvektion. Eis absorbiert beim Schmelzen eine große Wärmemenge und gibt diese beim Erstarren auch wieder ab (hohe Schmelzenthalpie). Die großen Wasserreservoire der Erde dienen deshalb und aufgrund der hohen Wärmekapazität von Wasser als „Thermostat“. So kommt es zumindest in Küstenbereichen nicht zu extremen Temperaturwechseln. Die hohe Wärmekapazität des Körperwassers nutzen viele Organismen, um eine annähernd konstante Körpertemperatur aufrecht zu halten. Blut dient daher auch zum Wärmetransport. Die hohe Verdampfungsenthalpie des Wassers wird zum Kühlen genutzt: Bei hoher Außentemperatur oder großer körperlicher Anstrengung wird Wasser über große Oberflächen (Haut) ausgeschwitzt und die dazu erforderliche VerdunstungsenerZoologie). gie dem Organismus entzogen ( Die starke Kohäsion der Wassermoleküle untereinander ermöglicht bei Pflanzen in den Xylemelementen einen kontinuierlichen „Wasserfaden“ bis zu den Spaltöffnungen. Durch den Transpirationssog werden so Wasser und gelöste Nährstoffe in die Blätter transportiert ( Botanik).

Struktur des Wassermoleküls: Bedingt die ungewöhnlichen physikalischen Eigenschaften des Wassers: Hohe Schmelz- und Verdampfungstemperatur, hohe Wärmekapazität, hohe Dielektrizitätskonstante, Volumenausdehnung beim Erstarren, hohe Oberflächenspannung. Adhäsion: Zusammenhalt zweier unterschiedlicher Stoffe aufgrund der Anziehungskräfte zwischen ihren Grenzschichten. Kohäsion: Zusammenhalt innerhalb eines Stoffes aufgrund der internen zwischenmolekularen Anziehungskräfte. Hydrophil (wasserliebend): Polare, in Wasser lösliche Stoffe, Ausbildung von Wasserstoffbrücken-Bindungen zu Wasser.

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2 Biophysikalische Grundlagen

Hydrophob (wassermeidend): Unpolare in Wasser unlösliche Stoffe, keine Ausbildung von Wasserstoffbrücken-Bindungen zu Wasser. Dielektrizitätskonstante: Maßgebliche Stoffkonstante von Lösungsmitteln für die Abschirmung von Ionenladungen. Gute Lösungsmittel (für polare Stoffe) besitzen eine hohe Dielektrizitätskonstante. Hydrophobe Wechselwirkungen: Bewirken Zusammenlagerung unpolarer Moleküle bzw. Molekülbereiche in wässriger Lösung durch Verdrängung von Wassermolekülen. Antriebskraft ist die erhöhte Entropie der verdrängten Wassermoleküle. Amphiphil (beidesliebend): Moleküle mit polaren und unpolaren Bereichen.

2.2

Gleichgewichte

Biochemische und chemische Reaktionen laufen scheinbar vollständig und eindeutig ab. Bei genauer Analyse sind aber stets Ausgangsstoffe (Edukte) und Produkte vorhanden. Jede Reaktion verläuft nur soweit, bis sich ein Gleichgewichtszustand einstellt. Die Verhältnisse im Gleichgewichtszustand werden durch das Massenwirkungsgesetz beschrieben. Das Massenwirkungsgesetz gilt auch für die Dissoziation schwerlöslicher Salze. Für die Löslichkeit dieser Salze kann gemäß dem Massenwirkungsgesetz das Löslichkeitsprodukt formuliert werden.

2.2.1

Das Massenwirkungsgesetz

Bei der allgemeinen chemischen Reaktion a [A] þ b [B] Ð c [C] þ d [D]

(2.2)

wird sich immer derselbe Gleichgewichtszustand einstellen, unabhängig davon, ob zu Beginn der Reaktion nur die Stoffe A und B oder die Stoffe C und D vorhanden sind (a, b, c und d sind die jeweiligen stöchiometrischen Koeffizienten). Der Gleichgewichtszustand ist für jede Reaktion durch eine jeweils charakteristische Konstante, die Gleichgewichts- oder Massenwirkungskonstante K, gekennzeichnet. K ist abhängig von den jeweiligen Reaktionsgeschwindigkeiten. Im Gleichgewicht gilt: a

b

c

vhin ¼ khin [A] [B] ¼ vru€ck ¼ kru€ ck [C] [D]

d

(2.3)

khin und krück sind die Reaktionskonstanten für die Hin- bzw. Rückreaktion, vhin und vrück die entsprechenden Reaktionsgeschwindigkeiten. Es handelt sich hierbei um ein dynamisches Gleichgewicht. Die Konzentrationen der Stoffe ändern sich nicht mehr; es reagieren pro Zeiteinheit gleichviel A und B zu C und D wie C

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2.2 Gleichgewichte

37

und D zu A und B. Dieser Sachverhalt wird durch das Massenwirkungsgesetz (MWG) beschrieben: c

K¼

d

vhin k [C] [D] ¼ hin ¼ vru€ck kru€ ck [A]a [B]b

(2.4)

Der Gleichgewichtszustand ist unabhängig von der Anwesenheit von Katalysatoren und Enzymen. Diese beschleunigen lediglich das Erreichen des Gleichgewichtszustandes. Die Einstellung des thermodynamischen Gleichgewichts in lebenden Zellen würde den biologischen Tod bedeuten. Innerhalb der Zelle wird die Einstellung des Gleichgewichts dadurch vermieden, dass die bei einer bestimmten Reaktion entstehenden Produkte gleich weiter verwendet werden, d. h. dem Gleichgewicht entzogen werden. Es wird ein Konzentrationsgradient zwischen Edukten und Produkten aufrechterhalten. Dieser Zustand wird als Fließgleichgewicht bezeichnet.

2.2.2

Das Löslichkeitsprodukt

In einer gesättigten Lösung stehen gelöste Ionen im Gleichgewicht mit dem ungelösten Bodenkörper. Für ein Salz AB2 gilt folgende Gleichung: AB2

fest

Ð A2þ þ 2 B


(2.5)

Somit kann das Massenwirkungsgesetz formuliert werden zu: K¼

[A2þ ] [B
] [AB2 ]

2

(2.6)

Bei einer gesättigten Lösung spielt es keine Rolle, ob 0,2 g oder 20 kg eines Salzes als Bodenkörper vorhanden sind. Die Konzentration des Bodenkörpers kann daher in die Gleichgewichtskonstante einbezogen werden. Es ergibt sich nun: 2

K [AB2 ] ¼ [A2þ ] [B
] ¼ LAB2

(2.7)

LAB wird als das Löslichkeitsprodukt bezeichnet. Eine Lösung wird als gesättigt bezeichnet, wenn das Löslichkeitsprodukt erreicht ist. Weitere Zugabe von A oder B (gleichgültig in welcher Form) führt zur Bildung eines Niederschlags. Ist die Lösung ungesättigt, so geht bei Zugabe von festem AB2 dieses solange in Lösung, bis das Löslichkeitsprodukt erreicht ist. Unter gewissen Umständen kann das Löslichkeitsprodukt auch überschritten werden, es handelt sich dann um eine übersättigte Lösung. Ist ein Kristallisationskeim vorhanden, fällt solange festes AB2 aus, bis das Löslichkeitsprodukt erreicht ist. Das Löslichkeitsprodukt spielt in der Biologie eine große Rolle: Die Konzentration der Harnsäure im Blut liegt dicht unterhalb der Löslichkeitsgrenze. Kommt es zu einer Erhöhung der Harnsäurekonzentration (Hyperurikämie, z. B. durch purinreiche Nahrung)

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2

38

2

2 Biophysikalische Grundlagen

bzw. zu einer Erniedrigung des pH-Wertes des Blutes (Acidose), kann das Löslichkeitsprodukt der Harnsäure leicht überschritten werden: Harnsäure fällt aus, der Patient erleidet einen Gichtanfall. Die Knochen der Wirbeltiere bestehen überwiegend aus Calcium- und Phosphationen, die in Form von Hydroxylapatit kristallin vorliegen. Die Calciumkonzentration im Blut wird durch das Zusammenspiel von Parathormon, Calcitonin und Calciferol (Vitamin D) präzise reguliert ( Zoologie). Hier stehen Calciumionen sowohl mit Carbonat- als auch Phosphationen im Gleichgewicht. Die intrazelluläre Ca2+-Konzentration liegt –7 –1 unter 1 · 10 mol l (hohe Phosphatkonzentration!) und wird streng reguliert. Die Gehäuse von Schnecken und Muscheln sowie Eierschalen bestehen aus Calciumcarbonat (Kalk). Bei einigen Pflanzenzellen kommt es zur Bildung von Calciumoxalaten innerhalb der Vakuolen. Die Bildung der Calciumoxalatkristalle ist jedoch als eine „Notlösung“ zu betrachten, da die Pflanzenzellen keine andere Möglichkeit haben, sich des überschüssigen Calciums zu entledigen. In jedem Fall aber sind die Bedingungen der Kristallisation regulierte Prozesse, da eine Kristallisation im Cytoplasma unbedingt verhindert werden muss.

Massenwirkungsgesetz: Beschreibt eine Reaktion im Gleichgewichtszustand. Der Gleichgewichtszustand ist unabhängig von den Ausgangskonzentrationen der Reaktionspartner. Gleichgewichtskonstante (Massenwirkungskonstante): Beschreibt den Gleichgewichtszustand einer Reaktion. Quotient aus dem Produkt der Konzentrationen der Endprodukte und dem Produkt der Konzentrationen der Ausgangsstoffe. Dynamisches Gleichgewicht: Bei gleicher Geschwindigkeit der Hin- und Rückreaktion bleiben die Konzentrationen der Edukte und Produkte konstant. Fließgleichgewicht: Aufrechterhaltung eines Konzentrationsgradienten zwischen Edukten und Produkten, durch Verhinderung der Gleichgewichtseinstellung aufgrund des Entzuges von Produkten aus dem System. Löslichkeitsprodukt: Produkt aus den Konzentrationen der Ionen eines Salzes in einer gesättigten Lösung.

2.3

Säuren, Basen und Puffer

Viele Lösungsmitteleigenschaften können mit der Struktur des ungeladenen Wassermoleküls beschrieben werden. Einige Eigenschaften wässriger Lösungen werden aber von den Dissoziationsprodukten des Wassers, H+ und OH–, dominiert. Die Konzentration der H+-Ionen einer Lösung wird als pH-Wert angegeben. Fast alle biologisch bedeutenden Verbindungen besitzen funktionelle Gruppen, die an Säure-Base-Reaktionen beteiligt sind. Schließlich hängt die Funktion biologischer Makromoleküle entscheidend von der Acidität der Umgebung ab. Als Puffer werden Lösungen bezeichnet, bei denen sich der pH-Wert bei Zugabe von Säuren oder Laugen minimal ändert.

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2.3 Säuren, Basen und Puffer

2.3.1

39

Dissoziation des Wassers

Auch in reinem Wasser dissoziieren Wassermoleküle nach der Gleichung H2 O Ð Hþ þ OH


(2.8)

Da ein freies Proton nicht beständig ist, lagert es sich mit einem weiteren Wassermolekül zu H3O+ zusammen. Auch H3O+ und OH–-Ionen liegen in wässriger Lösung hydratisiert vor; es wäre eigentlich genauer, von H9O4+ (hydratisiertes H+) und H7O4– (hydratisiertes OH–) zu sprechen. Im weiteren Verlauf wird jedoch die einfachere Schreibweise H+ bzw. H3O+ und OH– verwendet. Die Dissoziation des Wassers ist eine Gleichgewichtsreaktion, die nach dem Massenwirkungsgesetz (s. o.) wie folgt formuliert werden kann: K¼

[Hþ ] [OH
] [H2 O]

(2.9)

Genaugenommen sind anstelle der Konzentrationen die Aktivitäten der Substanzen einzusetzen. Die Aktivität einer Substanz erhält man durch Multiplikation der Konzentration mit dem Aktivitätskoeffizienten g. Aktivitäten sind im Vergleich zu den Konzentrationen reduzierte Wirkungen, bei unendlicher Verdünnung erhält g den Wert 1. Bei stark verdünnten Lösungen (II 10–3 mol l–1), dies ist bei biochemischen Reaktionen meistens der Fall, kann mit ausreichender Genauigkeit mit den Konzentrationen anstelle der Aktivitäten gerechnet werden. Die Dissoziation des Wassers erfolgt nur in sehr geringem Ausmaß, so dass die Konzentration von Wasser mit 55,5 mol l–1 (1 Mol Wasser wiegt 18 g; 1 l Wasser wiegt 1 kg) als konstant angesehen und in die Gleichgewichtskonstante einbezogen werden kann: K¼

[Hþ ] [OH
] bzw. K  (55,5 mol l
1 ) ¼ [Hþ ] [OH] ¼ Kw 55,5 mol l
1

(2.10)

Kw wird als das Ionenprodukt des Wassers bezeichnet. Bei Leitfähigkeitsmessungen an reinem Wasser konnte K bei 25 hC zu 1,8 · 10–16 mol l–1 bestimmt werden. Wegen der Stöchiometrie der Dissoziation kann somit die Konzentration von H+ berechnet werden: 2

K [H2 O] ¼ [Hþ ] [OH
] ¼ [Hþ ] ¼ Kw

(2.11)

Auflösung nach [H+] ergibt: pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi [Hþ ] ¼ K [H2 O] ¼ 1,8 p 10
16 mol l
1  55,5 mol l
1 ¼ 1 p 10
7 mol l
1

(2.12)

Nur ein Wassermolekül unter 10 Millionen Wassermolekülen ist in reinem Wasser dissoziiert, dies entspricht einem Mol (18 g) in 1 800 Tonnen Wasser!! Kw lässt sich berechnen zu:

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2

40

2 Biophysikalische Grundlagen 2

2

Kw ¼ [Hþ ] [OH
] ¼ [Hþ ] ¼ (1 p 10
7 mol l
1 ) ¼ 1 p 10
14 mol2 l
2

2

(2.13)

Das Ionenprodukt Kw ist eine Konstante. Wird die Konzentration an H+ erhöht, (z. B. durch Zugabe einer Säure), muss sich die Konzentration der Hydroxidionen entsprechend verringern. Rechenbeispiel: In einer HCl-Lösung (Salzsäure) der Konzentration 0,5 mol l–1 ist [H+] ebenfalls 0,5 mol l–1, da HCl eine starke Säure ist und vollständig dissoziiert vorliegt. Die OH–-Konzentration kann nach Gleichung 2.10 berechnet werden: [OH
] ¼

2.3.2

Kw 1 p 10
14 mol2 l
2 ¼ ¼ 2 p 10
14 mol l
1 [Hþ ] 0,5 mol l
1

Der pH-Wert

Da das Rechnen mit sehr kleinen Potenzen umständlich ist, wurde 1909 von Sørensen eine bequemere Ausdrucksweise für die H+-Konzentration eingeführt: der pH-Wert (von. lat.: pondus Hydrogenii). Der pH-Wert ist der negative dekadische Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration: pH ¼
log10 [Hþ ] ¼ log10

1 bzw. [Hþ ] ¼ 10
pH [Hþ ]

(2.14)

Analog zum pH kann auch ein pOH-Wert definiert werden. In reinem Wasser ist [H+] = 1 · 10–7 mol l–1 und somit pH = 7. Zwischen pH und pOH besteht folgender Zusammenhang: pH þ pOH ¼ 14

(2.15)

Eine Lösung mit einem pH = 7 wird als neutral bezeichnet. Beim Lösen einer Säure in Wasser erhöht sich [H+] und der pH-Wert sinkt. Bei einer Lösung mit einem pH-Wert I 7 spricht man von einer sauren Lösung. Umgekehrt führt das Auflösen einer Base zu einem Anstieg von [OH–] und damit auch des pHWertes. Lösungen mit einem pH-Wert i 7 heißen alkalische oder basische Lösungen. In Tab. 2.2 sind die pH-Werte einiger wässriger Lösungen aufgeführt. Rechenbeispiel: Die pH-Skala ist eine logarithmische Skala. Erhöht sich der pH-Wert um eine Einheit, so hat sich die [H+] um den Faktor 10 erhöht. Im Magensaft beträgt der pHWert ca. 1,5, daraus ergibt sich für [H+] ein Wert von 3,16 · 10–2 mol l–1. Die H+-Konzentration ist gegenüber reinem Wasser um den Faktor 316 000 vergrößert. In reinem Wasser ist der Quotient [H+] / [OH–] = 1. Im Magensaft beträgt er: 3,16 p 10
2 mol l
1 ¼ 1 p 1011 3,16 p 10
13 mol l
1

Nach der Säure-Base-Theorie von Brønsted und Lowry ist eine Säure eine Substanz, die H+ abgeben (Protonendonor), und eine Base eine Substanz, welche H+ anlagern kann (Protonenakzeptor).

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41

2.3 Säuren, Basen und Puffer Tab. 2.2 pH-Werte einiger wässriger Flüssigkeiten. Lösung

pH-Wert

Lösung

pH-Wert

konzentrierte Salzsäure (37 %)

ca. –1,1

Schweiß

4–6,8

Salzsäure, [HCl] = 1 mol l–1

0,0

Magensaft

0,9–2,3

Zitronensaft

2,1

Wein

3,5

Milch, Speichel

6,4–6,7

reines Wasser, 24 hC

7,0

Blut, Tränen (Mensch)

7,4

Meerwasser

7,8–8,2

Backpulverlösung (NaHCO3)

8,5

Tomatensaft

4,1

Bier

4,3

Haushaltsammoniak (Salmiakgeist)

11,9

schwarzer Kaffee

5,0

Natronlauge [NaOH] = 1mol l–1

14

Urin

6,0

gesättigte Natronlauge

ca. 15

Regenwasser

6,5

Eine Säure (HA) steht in wässriger Lösung in folgendem Gleichgewicht: HA þ H2 O Ð A
þ H3 Oþ

(2.16)

Eine Protonenabgabe ist immer auch von einer Protonenaufnahme begleitet. Protonendonor und Protonenakzeptor bilden zusammen ein konjugiertes SäureBase-Paar. HA (Protonendonor) ist die konjugierte Säure zu der Base A– (Protonenakzeptor); ebenso ist H3O+ die konjugierte Säure zu der Base H2O. Substanzen, die sowohl als Protonendonor als auch als Akzeptor fungieren können, werden als Ampholyte bezeichnet. Neben Wasser sind in der Biologie vor allem die Aminosäuren (S. 123) von Bedeutung. Der Ausdruck für die Gleichgewichtskonstante der Säuredissoziation lautet: K¼

[A
] [H3 Oþ ] [HA] [H2 O]

(2.17)

Die Konzentration des Wassers kann als konstant angesehen und in die Gleichgewichtskonstante einbezogen werden: K [H2 O] ¼

[A
] [H3 Oþ ] ¼ KS [HA]

(2.18)

KS ist die Dissoziationskonstante einer Säure. Sie erlaubt eine Aussage über die Stärke einer Säure, d. h. ihr Bestreben, Protonen abzugeben. Die konjugierte Base einer starken Säure zeigt nur eine schwache Tendenz, ein Proton anzulagern. Je stärker die Säure, umso schwächer ist die konjugierte Base und umgekehrt. Anstelle des KS-Wertes wird, analog zum pH-Wert, häufig der pKS angegeben: pKS ¼
log10 KS ¼ log10

1 bzw. KS ¼ 10
pKS KS

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(2.19)

2

2 Biophysikalische Grundlagen

42

2

Je niedriger der pKS-Wert ist, desto stärker ist die Säure, und umso saurer reagiert eine Lösung. In Tab. 2.3 sind einige Säuren und deren KS bzw. pKS-Werte aufgeführt. Starke und schwache Säuren: Starke Säuren und Laugen dissoziieren in Wasser vollständig. Starke Säuren sind z. B. Salzsäure (HCl), Schwefelsäure (H2SO4, das in der ersten Dissoziationsstufe entstehende HSO4–-Anion ist eine schwache Säure), Salpetersäure (HNO3) und Perchlorsäure (HClO4). Starke Basen sind z. B. Kalilauge (KOH) und Natronlauge (NaOH). Schwache Säuren sind in Wasser nur unvollständig dissoziiert. Eine Lösung einer schwachen Säure enthält neben H+ und A– stets noch undissoziierte Säuremoleküle HA. Zu den schwachen Säuren gehören alle organischen Säuren, beispielsweise die Carbonsäuren. Bei der pH-Wert-Berechnung einer schwachen Säure muss berücksichtigt werden, dass neben dissoziierten Säuremolekülen auch noch undissoziierte Säuremoleküle vorhanden sind. Bei der Dissoziation eines Säuremoleküls HA entstehen jeweils in gleicher Menge die Dissoziationsprodukte A– und H3O+, so dass in der Lösung gilt: [H3 Oþ ] ¼ [A
]

(2.20)

Tab. 2.3 Dissoziationskonstanten. KS und pKS-Werte einiger biologisch wichtiger Substanzen bei 25 hC. Substanz

KS

Oxalsäure (COOH)2

5,37 · 10–2

1,27 (pKS1)

Phosphorsäure (H3PO4)

7,08 · 10–3

2,15 (pKS1)

Citronensäure (dissoziierte Form: Citrat)

7,41 · 10–4

3,13 (pKS1)

Ameisensäure (HCOOH)

1,78 · 10–4

3,75

Bernsteinsäure (HOOC-(CH2)2-COOH, dissoziierte Form: Succinat)

6,17 · 10–5

4,21 (pKS1)

Oxalat– (HOOC-COO–)

5,37 ·10–5

4,27 (pKS2)

Essigsäure CH3COOH

1,74 · 10–5

4,76

Citrat–

1,74 · 10–5

4,76 (pKS2)

Succinat– (HCOO-(CH2)2-COO–)

2,29 · 10–6

5,64 (pKS2)

Kohlensäure (H2CO3)

4,47 · 10–7

6,35 (pKS1)

–7

2–

pKS

Citrat

3,98 · 10

6,40 (pKS3)

Dihydrogenphosphat (H2PO4–)

6,31 · 10–8

7,2 (pKS2)

Glycylglycin

5,50 · 10–9

8,26

Ammoniumionen (NH4+)

5,62 · 10–10

9,25

Glycin (HOOC-CH2-NH3)

1,66 · 10–10

9,78

Hydrogencarbonat (HCO3–)

4,68 · 10–11

10,33 (pKS2)

–13

12,38 (pKS3)

Hydrogenphosphat

(HPO42–)

4,17 · 10

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2.3 Säuren, Basen und Puffer

43

Ersetzt man nun [A–] in Gleichung 2.18 durch [H3O+] und löst nach [H3O+] auf, erhält man: pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi 2 [H3 Oþ ] ¼ KS [HA] bzw. [H3 Oþ ] ¼ KS [HA] (2.21)

Gleichung 2.21 entspricht jedoch nur einer Annäherung, da für [HA] die insgesamt vorhandene Säuremenge eingesetzt wurde und der zu H3O+ und A– dissoziierte Anteil hierbei vernachlässigt wurde. Für die Laborpraxis liefert Gleichung 2.21 jedoch ausreichend genaue Werte.

Rechenbeispiel: Der pH-Wert schwacher Basen kann analog den Verhältnissen für schwache Säuren berechnet werden. Für Basen wird anstelle des pKS-Wertes häufig ein pKB-Wert angegeben. Zwischen dem pKS- und dem pKB-Wert einer Säure und deren konjugierter Base besteht folgender Zusammenhang: pKS + pKB = 14. Für die pHWert-Berechnung muss hier zunächst der pOH-Wert über die OH-Konzentration berechnet werden: pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi [OH
] ¼ KB [B] [B] ist die Konzentration der unprotonierten Base. Die schwache Base Ammoniak NH3 reagiert in Wasser teilweise zu: NH3 þ H2 O Ð NH4 þ þ OH
Für eine Ammoniaklösung der Konzentration 0,2 mol l–1 ergibt sich somit: pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi [OH
] ¼ KB [NH3 ] Der KB-Wert lässt sich aus dem pKS-Wert (Tab. 2.3) berechnen:

pKB ¼ 14
pKS ¼ 14
9,25 ¼ 4,75

KB ¼ 10
pKB ¼ 1,78 p 10
5

Für die Hydroxidionenkonzentration ergibt sich: pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi [OH
] ¼ 0,2 mol l
1 p 1,78 p 10
5 ¼ 1,89 p 10
3 mol l
1 Der pOH berechnet sich somit zu: pOH ¼
log (1,89 p 10
3 ) ¼ 2,72 Daraus resultiert: pH ¼ 14
pOH ¼ 14
2,72 ¼ 11,28

Wenn eine Säure mehrere Protonen abspalten kann, spricht man von einer mehrprotonigen Säure. Für jedes abgespaltene Proton lässt sich ein eigener pKSWert angeben. Abb. 2.5 zeigt die Titrationskurve von Glycin, der einfachsten Aminosäure. Bei niedrigem pH-Wert liegt Glycin als Kation vor. Es kann somit als zweiprotonige Säure aufgefasst werden. Nach Dissoziation der Carboxylgruppe beträgt die Nettoladung des Moleküls null. Eine Struktur, bei der ein Molekül zwei entgegengesetzt geladene Gruppen enthält, bezeichnet man als Zwitterion. Die zwitterionische Struktur ist die unter physiologischen Bedingungen bzw. in kristallinem Zustand vorliegende Form der Aminosäuren.

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2

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2 Biophysikalische Grundlagen

2

Abb. 2.5 Titrationskurve von Glycin. Bei niedrigem pH-Wert liegt Glycin als Kation vor, bzw. bei hohem pH-Wert als Anion. Am isoelektrischen Punkt (pI) ist das Zwitterion die vorherrschende Form. Die Titrationskurven anderer Aminosäuren mit neutraler Seitengruppe zeigen einen ähnlichen Verlauf.

Hierdurch erklären sich z. B. deren gute Wasserlöslichkeit und der hohe Schmelzpunkt im Vergleich zu anderen strukturell ähnlichen, aber nicht ionischen Substanzen. Den pH-Wert, bei dem das Zwitterion die vorherrschende Form ist, bezeichnet man als isoelektrischen Punkt (pI). Da am pI die Nettoladung null ist, wandern Zwitterionen bei diesem pH-Wert in einem elektrischen Feld, z. B. einer Elektrophorese, nicht. Der isoelektrische Punkt einer Aminosäure mit neutraler Seitenkette berechnet sich wie folgt: pK ¼ pI ¼

1 (pKS1 þ pKS2 ) 2

(2.22)

pKS1 und pKS2 sind die negativen dekadischen Logarithmen der Dissoziationskonstanten für das erste bzw. zweite Proton. Für Glycin berechnet sich der pI nach Gleichung 2.22 zu 6,07 (pKS1 = 2,35, pKS2 = 9,78). Durch die unmittelbare Nähe der beiden funktionellen Gruppen in den Aminosäuren beeinflussen sich diese gegenseitig in ihrer Acidität. Im Vergleich zu den aliphatischen Carbonsäuren bzw. Aminen sind die pKS-Werte der a-ständigen Carboxyl- bzw. Aminogruppen um 2 bis 3 Einheiten vermindert, d. h. deren Acidität ist erhöht. Erst wenn die funktionellen Gruppen einen gewissen Abstand voneinander haben, etwa bei einer Trennung durch fünf Kohlenstoffatome, erfolgen deren Ionisierungen

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2.3 Säuren, Basen und Puffer

45

2

Abb. 2.6 Lysin bei unterschiedlichen pH-Werten. Die Aminosäure Lysin besitzt eine zweite Aminogruppe. Bei niedrigem pH-Wert resultieren daraus zwei positive Nettoladungen. Für die Berechnung des pI sind hier pKS2 = 9,0 und pKS3 = 10,5 maßgeblich. Daraus ergibt sich ein pI von 9,75.

unabhängig voneinander. Dies ist z. B. bei Lysin der Fall. Lysin besitzt eine zusätzliche Aminogruppe am e-Kohlenstoffatom (S. 126, Abb. 4.2). Diese Aminogruppe ist jedoch von den a-ständigen Gruppen so weit entfernt, dass deren Ionisierungen keinen Einfluss mehr auf die e-Aminogruppe haben. Die Titrationskurve von Lysin weist somit drei Äquivalenzpunkte auf. Der pI kann analog zu einer Aminosäure mit neutraler Seitenkette berechnet werden (Abb. 2.6). Da Proteine aus Aminosäuren aufgebaut sind, können auch für diese pI-Werte bestimmt werden.

2.3.3

Puffer

Puffer sind Lösungen, deren pH-Wert sich bei Zugabe geringer Mengen Säure (H+) oder Base (OH–) kaum ändert. Puffer sind ein Gemisch aus einer undissoziierten Säure (schwache Säure, z. B. Essigsäure CH3COOH) und deren konjugierter Base in Form eines Salzes (z. B. Natriumacetat, Na+CH3COO–). Bei der Zugabe weiterer Säure wird das zugesetzte H+ durch die Reaktion mit der Base (A–) zur undissoziierten Säure (AH) neutralisiert. Umgekehrt dient die Dissoziation der Säure zur Neutralisation zugesetzter Basen. Die Pufferkapazität, d. h. die Fähigkeit, den pH-Wert konstant zu halten, ist der Menge der Puffersubstanzen (Säure und Base) direkt proportional. Sie ist am größten, wenn konjugierte Base und undissoziierte Säure in gleicher Konzentration vorliegen (s. u.). Das Verhältnis der undissoziierten Säure zu ihrer konjugierten Base, und damit auch die Pufferkapazität, sind vom pH-Wert und dem pKS-Wert des entsprechenden Säure-Base-Paares abhängig. Dieser Zusammenhang wird durch eine einfache Gleichung beschrieben: Auflösung von Gleichung 2.18 nach H+ (als vereinfachte Schreibweise für H3O+) ergibt: [Hþ ] ¼ KS

[HA] [A
]

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(2.23)

46

2 Biophysikalische Grundlagen

Durch Logarithmieren und Multiplikation mit (–1) ergibt sich:

2


log [Hþ ] ¼
log KS
log

[HA] [A
]

(2.24)

Die Ausdrücke –log [H+] und –log KS werden nun durch pH bzw. pKS (2.14 bzw. 2.19) ersetzt und man erhält die Henderson-Hasselbalch-Gleichung: [HA] [A
] oder pH ¼ pKS þ log [A
] [HA]

pH ¼ pKS
log

(2.25)

Mit dieser Gleichung kann bei bekanntem pH und pKS das Verhältnis von undissoziierter Säure zu konjugierter Base berechnet werden. Wenn die Konzentration undissoziierter Säure gleich der Konzentration der konjugierten Base ist ([HA] = [A–] und damit + log ([A–] / [HA]) = 0), ist auch pH gleich pKS. Dies ist am Wendepunkt der Titrationskurven der Fall. Auch Aminosäuren bzw. Proteine besitzen Puffereigenschaften im Bereich der jeweiligen pKS-Werte (s. Abb. 2.5).

2.3.4

Biologische Puffersysteme

Für viele biologische Prozesse ist der pH-Wert von entscheidender Bedeutung und unterliegt daher einer sehr präzisen Kontrolle. Das Blut höherer Tiere wird in einem engen Bereich um pH 7,4 gepuffert. Als Puffersubstanzen dienen hier Hämoglobin, Serumproteine, Hydrogencarbonat und Phosphat ( Zoologie). Der intrazelluläre pH-Wert liegt im Bereich von 6–7. Das wichtigste intrazelluläre Puffersystem ist das Phosphat-Puffersystem. Neben diesem tragen auch die Proteine und – in untergeordnetem Maße – die Nucleinsäuren und Lipide zur Pufferkapazität bei. Rechenbeispiel: Die Aminosäure Histidin kommt in wässriger Lösung in vier Formen vor: a) in der zweifach protonierten Form (His2+), b) in der einfach protonierten Form (His+), c) als nach außen hin neutrales Zwitterion (Hise) und d) in der deprotonierten Form (His–). Die entsprechenden pKS-Werte sind: pKS1 = 1,80 (Carboxylgruppe), pKS2 = 6,04 (Seitenkette) und pKS3 = 9,33 (Aminogruppe). Alle Formen stehen miteinander im Gleichgewicht. Diese Gleichgewichtsverhältnisse können mit der Henderson-Hasselbalch-Gleichung berechnet werden. Bei pH = pKS2 = 6,04 gilt nach Gleichung 2.25 für die Dissoziation der Carboxylgruppe: pH ¼ pKS1 þ log

[Hisþ ] [Hisþ ] bzw. pH
pKS1 ¼ log [His2þ ] [His2þ ]

Einsetzen der Werte liefert: 6,04
1,80 ¼ log

[Hisþ ] [Hisþ ] bzw. 104,24 ¼ ¼ 17378 [His2þ ] [His2þ ]

für die Dissoziation der Seitenkette und der Aminogruppe gilt entsprechend: pH ¼ pKS2 þ log

[His ] [His ] bzw. 100 ¼ ¼ 1 und [Hisþ ] [Hisþ ]

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2.3 Säuren, Basen und Puffer pH ¼ pKS3 þ log

47

[His
] [His
] bzw. 10
3,29 ¼ ¼ 5,13 p 10
4 [His ] [His ]

Somit bestehen zwischen den unterschiedlichen Formen die Verhältnisse: [His2þ ] : [Hisþ ] : [His ] : [His
]

1 : 17378 : 17378 : 9

Welche Verhältnisse bestehen bei den pH-Werten 1,5 und 13? Bei pH 1,5 gilt: 4,69 p 1012 : 2,34 p 1012 : 6,76 p 107 : 1 Bei pH 13 gilt: 1 : 1,58 p 1011 : 1,44 p 1018 : 6,74 p 1021 Die Seitenkette des Histidins trägt maßgeblich zur Pufferwirkung der Proteine im physiologischen pH-Bereich bei. Histidin wird im Labor gelegentlich als Puffersubstanz verwendet. Folgendes Beispiel soll die Pufferwirkung demonstrieren: Bei Zugabe einer NaOH-Lösung der Konzentration 1 mol l–1 zu 1 l reinem Wasser (pH = 7) ändert sich der pH-Wert folgendermaßen: Natronlauge ist eine starke Base und dissoziiert vollständig. In 0,1 ml der Natronlauge sind 0,1 mmol NaOH, folglich ist die OH–-Konzentration im Wasser 0,1 mol l–1 und der pOH-Wert beträgt pOH = – log (0,00 01) = 4 bzw. pH = 10. Verwendet man jedoch eine Histidinlösung (20 mmol l–1, pH 6,04), so liegt folgender Sachverhalt vor: Bei diesem pH-Wert ist [His+] = [Hise] = 10 mmol l–1. Durch Zugabe von OH– bildet sich [Hise] aus [His+]. Das freigesetzte Proton reagiert mit OH– zu Wasser. Der pH-Wert kann nun mit Hilfe der Henderson-Hasselbalch-Gleichung berechnet werden (die Konzentrationen von His2+ bzw. His– können vernachlässigt werden): pH ¼ pKS2 þ log

[His ] 0,01 mol l
1 þ 0,0001 mol l
1 ¼ 6,04 þ log ¼ 6,05 [Hisþ ] 0,01 mol l
1
0,0001 mol l
1

Bei Zugabe der Lauge zu dem Puffer ändert sich der pH-Wert nur sehr geringfügig (0,01 pH-Einheiten), während sich der pH-Wert bei reinem Wasser um 3 pH-Einheiten ändert.

Ionenprodukt des Wassers: Gleichgewichtskonstante für die Dissoziation von reinem Wasser. Entspricht dem Produkt aus der H+- und der OH–-Konzentration. pH-Wert: Der negative dekadische Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration. Neutrale Lösungen haben einen pH-Wert von 7, saure (alkalische/basische) Lösungen einen pH-Wert kleiner (größer) als 7. Konjugiertes Säure-Base-Paar: Protonendonor und Protonenakzeptor einer Säure bzw. Base in wässriger Lösung. Ampholyte: Substanzen, die als Protonendonor und als Protonenakzeptor fungieren können. Dissoziationskonstante (Ks): Gleichgewichtskonstante für die Dissoziation einer Säure, Quotient aus dem Produkt der Ionenkonzentrationen und der Konzentration der undissoziierten Säure. pKS-Wert (pKB-Wert): Negativer dekadischer Logarithmus der Dissoziationskonstanten, Maß für das Bestreben einer Säure (Base), Protonen abzugeben (anzulagern). Zwitterion: Molekül mit zwei entgegengesetzt geladenen Gruppen. Isoelektrischer Punkt: pH-Wert, bei dem die Nettoladung eines Polyelektrolyten gleich null ist. Puffer: Lösungen, deren pH-Wert sich bei Zugabe geringer Mengen an H+- oder OH–-Ionen nur geringfügig ändert.

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2

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2

2 Biophysikalische Grundlagen

Pufferkapazität: Fähigkeit einer Lösung, den pH-Wert in einem bestimmten Bereich konstant zu halten. Henderson-Hasselbalch-Gleichung: Definiert den pH-Wert einer Lösung als Differenz aus dem pKS und dem Logarithmus des Verhältnisses von undissoziierter Säure zu konjugierter Base. Bei zwei gegebenen Größen kann jeweils die dritte berechnet werden.

2.4

Physikalische Faktoren für den Stofftransport

Eine Zelle kann nicht mehr Substanzen aufnehmen, als sich in ihrer unmittelbaren Umgebung befinden. Diese Stoffe gelangen durch Diffusion bis zu den Zellen und können dann, meist über aktive Prozesse, von der Zelle aufgenommen werden. Zellen sind von ihrer Umgebung durch die Zellmembran abgegrenzt. Diese stellt für verschiedene Stoffe eine unterschiedlich starke Diffusionsbarriere dar, welche auch als Semipermeabilität bezeichnet wird. Diffusionsprozesse durch solch semipermeable Membranen werden als Osmose bezeichnet. In einer Zelle gibt es neben gelösten Salzionen auch Polyelektrolyte (z. B. Proteine). Das Gleichgewicht der Ionenverteilung an einer semipermeablen Membran wird durch die Donnan-Verteilung beschrieben. Beim Stofftransport über längere Strecken kommen zwischenmolekularen Kräften eine entscheidende Rolle zu. Diese unter dem Begriff Viskosität zusammengefassten Eigenschaften bestimmen maßgeblich das Verhalten von Gasen und Lösungen über längere Strecken in den verschiedenen Transportsystemen.

2.4.1

Diffusion

Bei Betrachtung sehr feiner Suspensionen beobachtet man eine unregelmäßige Zitterbewegung der suspendierten Partikel. Diese Zitterbewegung, die sich auch in Aerosolen (Rauch, Nebel) beobachten lässt, wird als Brownsche Molekularbewegung bezeichnet. Die Brownsche Molekularbewegung resultiert aus den Zusammenstößen der suspendierten Partikel mit den Lösungsmittelmolekülen. Beim Zusammenstoß übertragen die Lösungsmittelmoleküle jeweils einen Impuls auf das suspendierte Partikel, die Summe aller Impulse bestimmt schließlich Richtung und Geschwindigkeit der Bewegung. Je kleiner das suspendierte Teilchen ist, umso heftiger sind die Zitterbewegungen. Ab einem Teilchendurchmesser von etwa 4 · 10-6 m kann die Teilchenbewegung nicht mehr beobachtet werden. Da die Brownsche Molekularbewegung auf den Wärmebewegungen der Lösungsmittelmoleküle beruht, verstärkt sie sich bei steigender Temperatur.

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2.4 Physikalische Faktoren für den Stofftransport

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Diese zufälligen Wärmebewegungen führen zu einer Durchmischung von direkt miteinander in Verbindung stehenden gasförmigen, flüssigen oder festen Stoffen. Die Triebkraft für diesen als Diffusion bezeichneten Vorgang ist ein unterschiedliches chemisches Potential m (S. 65) der Substanz zwischen den angrenzenden Medien. Meistens beruht der Unterschied im chemischen Potential auf einem Konzentrationsgefälle. Die Teilchen mit einem höheren chemischen Potential diffundieren aufgrund der Brownschen Molekularbewegung so lange in den Bereich mit einem niedrigeren chemischen Potential, bis das chemische Potential der betreffenden Substanz an jeder Stelle gleich ist. Die Diffusionsrate steigt mit zunehmender Temperatur; am absoluten Nullpunkt (T = –273 hC) kommt sie zum Erliegen. Der Transport von Stoffen zwischen den Versorgungsbahnen und den Zellen unterliegt den Gesetzen der Diffusion ebenso wie der Transport innerhalb der Zellen. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit einiger Stoffwechselvorgänge wird nur durch das Zusammentreffen des Substrats mit dem Enzym limitiert (diffusionskontrollierte Reaktionen). Dies hat schließlich zur Entstehung von Multienzymkomplexen geführt, bei denen das Substrat nicht freigesetzt, sondern von einem aktiven Zentrum zum nächsten „weitergereicht“ wird. Frei bewegliche Zellen können durch Ortsveränderungen optimale Umweltbedingungen aufsuchen. Höhere Organismen haben zur Versorgung der unbeweglichen Körperzellen leistungsfähige Versorgungssysteme wie das Blutkreislaufsystem, das Tracheensystem und die Leitbündel entwickelt.

2.4.2

Ficksche Diffusionsgesetze

Wird z. B. eine Farbstofflösung mit reinem Lösungsmittel überschichtet, diffundieren die Farbstoffmoleküle in das Lösungsmittel ein. Der Teilchenfluss Jx entlang der x-Richtung ist der betrachteten Fläche A und dem Konzentrationsgradienten – Dc/Dx direkt proportional. Diesen Zusammenhang beschreibt das 1. Ficksche Diffusionsgesetz:   Dc (2.26) Jx ¼
D A Dx D ist der Diffusionskoeffizient, eine stoffspezifische Konstante. Das Vorzeichen des Konzentrationsgradienten ist negativ, da der Teilchenfluss in Richtung des kleineren chemischen Potentials verläuft. Die Werte für D liegen für Gase in der Größenordnung 10–4 bis 10–5 m2 s–1, bei Flüssigkeiten im Bereich von 10–9 bis 10–10 m2 s–1und bei Festkörpern etwa bei 10–14 m2 s–1. In Tab. 2.4 sind einige Zahlenwerte für Diffusionskoeffizienten verschiedener Stoffe in Wasser aufgeführt. Die Diffusion erfolgt in Gasen aufgrund der geringen Dichte viel schneller als in Flüssigkeiten oder in Festkörpern. Biologische Membranen sind fluide Strukturen. Membranständige Proteine können ebenso wie die Lipidmoleküle in der Membran diffundieren. Man spricht

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2 Biophysikalische Grundlagen

Tab. 2.4 Diffusionskoeffizienten einiger biologisch bedeutender Verbindungen in Wasser.

2

Substanz

Molmasse [g mol–1]

Diffusionskoeffizient · 10–10 [m2 s–1]

Temperatur [hC]

Harnstoff

60

13,83

25

Glucose

180

6,78

25

Saccharose

342

4,59

25

Adenosintriphosphat

507

3,0

20

Flavinmononucleotid

995

2,86

20

Ribonuclease

13 683

1,19

25

Lysozym

14 100

1,04

25

Serumalbumin

65 000

0,594

25

Hämoglobin

68 000

0,69

25

Kollagen

345 000

0,069

25

Urease

480 000

0,346

25

Myosin

493 000

0,116

25

hier von einer lateralen Diffusion. Die Diffusionskonstanten für Lipide liegen im Bereich von 10–11 bis 10–12 m2 s–1 und für Proteine bei etwa 10–13 m2 s–1 (S. 371). Bedeutung der Diffusion für Pflanzen und Tiere: Bei Pflanzen diffundiert das zur Photosynthese benötigte CO2 über die Spaltöffnungen (Stomata) in den Interzellularraum. Da der Konzentrationsgradient zwischen Außenluft (0,03 Vol.-%) und Interzellularraum (0 %) sehr gering ist, kann CO2 bei geschlossenen Stomata nicht über Cuticula und Epidermis zu den Orten der Photosynthese gelangen. Die Pflanze steuert somit die Photosyntheserate aufgrund des Diffusionswiderstandes des CO2 über die Stomata. Bei dem für die Atmung benötigtem Sauerstoff ist dies anders: Hier ist der Konzentrationsgradient zwischen Außenluft (20 Vol.-%) und den atmenden Mitochondrien (0 %) so groß, dass Sauerstoff auch bei geschlossenen Stomata über Cuticula und Epidermis in ausreichenden Botanik). Auch bei Tieren Mengen zu den Orten des Verbrauchs vordringen kann ( geschieht der Gasaustausch stets passiv über Diffusion: Bei Fischen über Kiemen, bei landlebenden Tieren über Lungen. Da die Diffusionsrate von der Fläche, über der die Diffusion erfolgt, abhängt, besitzen die Atmungsorgane eine möglichst große Oberfläche ( Zoologie). Neben den Atemgasen erfolgt auch die Wasseraufnahme bei Pflanzen durch die Wurzeln ebenso wie die Nährstoffaufnahme aus tierischen Verdauungstrakten über Diffusion. Daher besitzen auch diese Organe eine möglichst große Oberfläche.

Betrachtet man den Konzentrationsausgleich in einer Lösung in Abhängigkeit von der Zeit, so reicht zur Beschreibung das 1. Ficksche Diffusionsgesetz nicht mehr aus. Bei dieser realistischeren Betrachtungsweise wird sowohl der Teil-

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2.4 Physikalische Faktoren für den Stofftransport

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chenzustrom in ein bestimmtes Volumen, als auch der Teilchenefflux aus diesem Volumen berücksichtigt. Dieser Zusammenhang wird vom 2. Fickschen Diffusionsgesetz beschrieben. Das 2. Ficksche Diffusionsgesetz ist eine partielle Differentialgleichung zweiter Ordnung und soll an dieser Stelle nicht weiter behandelt werden (siehe hierzu die Lehrbücher der Physikalischen Chemie). Eine aus dem 2. Fickschen Diffusionsgesetz abgeleitete Beziehung lautet: x2 ¼ 2 D t

(2.27)

x ist die von einer Substanz in der Zeit t zurückgelegte Strecke. D ist der Diffusionskoeffizient. Mit Gleichung 2.27 lässt sich die Diffusionsgeschwindigkeit berechnen. Rechenbeispiel: Betrachtet man z. B. eine Bakterienzelle mit einem Durchmesser von 1 mm, so würde ein durchschnittlich großes, kugelförmiges Protein mit einem angenommen Wert für D von 0,8 · 10–10 m2 s–1 (dies korreliert etwa mit einer Molekularmasse von 50 000 Da) bei freier Diffusion in wässriger Lösung gemäß Gleichung 2.27 die Zeit 2

t¼

x2 (1 p 10
6 m) ¼ ¼ 6,3 p 10
3 s 2 D 2 p 0,8 p 10
10 m2 s
1

benötigen, um per Diffusion einmal die Zelle zu durchqueren. Für ein Bakterium ist dies ausreichend schnell. Wie lange würde dieses Protein benötigen, um per Diffusion vom Zellsoma über das Axon (diese können beträchtliche Längen annehmen) bis zur Synapse einer Nervenzelle zu gelangen? Nimmt man für die Axonlänge 1 m an, so errechnet sich ein Wert von ca. 198 Jahren. Dieser Unterschied demonstriert die Erfordernisse von Transportsystemen innerhalb größerer Zellen. Könnte ein Baum den Nährstofftransport von den Blättern in die Wurzeln durch Diffusion bewerkstelligen? (Die Diffusion von z. B. Saccharose von den Blättern eines 30 m hohen Baumes bis zu den Wurzeln würde etwa 31 000 Jahre, die des oben erwähnten Proteins beachtliche 178 000 Jahre dauern und damit die Lebensdauer des Baumes weit übertreffen). Anhand dieser Beispiele wird verständlich, dass die Diffusion bei kleinen Strecken (z. B. zwischen benachbarten Zellen) ein leistungsfähiger Vorgang ist, aber mit zunehmender Entfernung (ab einigen Millimetern) immer ineffektiver wird. Insekten besitzen ein Tracheensystem zur Versorgung ihrer Körperzellen mit Sauerstoff. Der Austausch der Atemgase erfolgt passiv durch Diffusion. Dieses Atmungssystem ist der limitierende Faktor für das Größenwachstums der Insekten. Ab einer bestimmten Größe dauert es einfach zu lange, bis die Gase durch das Tracheensystem diffundiert sind, um die Zellen ausreichend zu versorgen. 290 Millionen Jahre alte Fossilien aus dem Oberkarbon weisen eine Flügelspannweite bis zu 70 cm auf, diese Libellenarten waren die größtmöglichen Insekten.

2.4.3

Diffusion und Membranen

Biologische Membranen bestehen aus einer Lipiddoppelschicht mit darin eingelagerten Proteinen (S. 348). Der Lipidanteil verleiht der Membran ein hydrophobes Inneres. Hierin liegt die maßgebliche Diffusionsbarriere zwischen den zwei Kompartimenten. Kleine hydrophile Substanzen (bis zu einer Molekularmasse von etwa 80 Da, z. B. Wasser oder Harnstoff) können die Membranen gut durch-

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2

2 Biophysikalische Grundlagen

dringen. Dies geschieht vermutlich über kurzlebige Poren, deren Zustandekommen auf der Fluktuation der Lipide beruht. Hydrophobe Moleküle lösen sich gemäß ihren Verteilungskoeffizienten in der Membran und können sich auf diese Weise durch die Membran „durchlösen “. Für größere polare Moleküle sowie Ionen ist die Membran praktisch dicht, da sie nicht in der Lage sind, die Energiebarriere, die für die Abstreifung ihrer Hydrathülle aufzuwenden ist, zu überwinden. Diese Stoffe müssen spezifisch über die aus Proteinen bestehenden Transporter transloziert werden. Da kleine hydrophile Substanzen biologische Membranen ungehindert durchqueren können, größere aber nicht, bezeichnet man biologische Membranen als semipermeabel (halbdurchlässig). Werden zwei Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen einer ungeladenen Substanz durch eine Membran getrennt, die für diese Substanz permeabel ist, so findet ein Fluss der Substanz von der Lösung höherer Konzentration (cI) zur niedrig konzentrierten Lösung (cII) statt. Der Fluss J der Substanz ist der Konzentrationsdifferenz cI – cII = Dc direkt proportional: J ¼ P Dc

(2.28)

Die Proportionalitätskonstante P wird als Permeabilitätskoeffizient (Einheit: cm s–1) bezeichnet. Der Permeabilitätskoeffizient ist ein Maß für die Geschwindigkeit, mit der ein gelöstes Teilchen von der wässrigen Phase in eine hydrophobe Phase (z. B. das Innere einer biologischen Membran) eintritt.

2.4.4

Osmotische Erscheinungen

Als Osmose bezeichnet man die Diffusion von Lösungsmittelmolekülen durch eine semipermeable Membran, die zwei Lösungen unterschiedlicher Konzentration trennt. Die semipermeable Membran ist nur für das Lösungsmittel durchlässig (permeabel), nicht aber für die Moleküle der gelösten Substanz. Es kommt zu einer Diffusion von Lösungsmittelmolekülen aus der niedriger konzentrierten Lösung I (die Konzentration der gelösten Substanz sei cI) in die höher konzentrierte Lösung II mit der Konzentration cII der gelösten Substanz. Die Triebkraft für das „Verdünnungsbestreben“ der konzentrierten Lösung ist das chemische Potential des Lösungsmittels (S. 65). Das chemische Potential ist von der Konzentration der betreffenden Substanz abhängig. Je höher die Konzentration, umso höher ist das chemische Potential. Jede Substanz zeigt ein thermodynamisches Bestreben, den Zustand mit dem geringsten chemischen Potential einzunehmen. In der Lösung I ist die Konzentration des Lösungsmittels größer (höheres chemisches Potential) als in der Lösung II (niedrigeres chemisches Potential). Die Lösungsmittelmoleküle folgen dem Gefälle des chemischen Potentials, indem sie von der Lösung I in die Lösung II einströmen und dabei einen Druck, den osmotischen Druck P, aufbauen. Die experimentelle Bestimmung des osmotischen Druckes erfolgt mit einem Osmometer (Abb. 2.7). Der osmotische Druck ist der Anzahl gelöster Teilchen

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2.4 Physikalische Faktoren für den Stofftransport

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2

Abb. 2.7 Osmometer (Pfeffersche Zelle). Die Niederschlagsmembran aus Kupfer(II)hexacyanoferrat (Cu2[Fe(CN)6]) ist für Wasser, nicht aber für die gelösten Saccharosemoleküle permeabel. Wird der Tonzylinder mit einer Saccharoselösung gefüllt und in ein Gefäß mit reinem Wasser gestellt, so dringt, dem Gefälle des chemischen Potentials folgend, Wasser in den Tonzylinder ein. Innerhalb des Tonzylinders entsteht ein Überdruck, der die Saccharoselösung solange in das Steigrohr drückt, bis der entstehende hydrostatische Druck dem osmotischen Druck P der Lösung entspricht. Es gilt: P = r g Dh (r ist die Dichte der Flüssigkeit im Steigrohr, g die Erdbeschleunigung und Dh die Steighöhe). Der osmotische Druck entspricht allgemein dem Druck, der auf eine Lösung ausgeübt werden muss, um einen Nettoübertritt von Lösungsmittelmolekülen aus dem reinen Lösungsmittel in die Lösung zu verhindern, wenn beide Lösungen durch eine semipermeable Membran getrennt sind.

direkt proportional. Hierbei ist es unerheblich, ob es sich um Elektrolyte (Salze) oder Nichtelektrolyte (z. B. Glucose, Glycerin, Harnstoff) handelt. Zu beachten ist aber, dass Salze in Lösung dissoziiert vorliegen und jedes Ion zum osmotischen Druck beiträgt. So hat eine CaCl2-Lösung der Konzentration 1 mol l–1 einen dreimal so großen osmotischen Druck wie eine Glucose- oder Harnstofflösung der Konzentration 1 mol l–1. Eigenschaften einer Lösung, die nur von der Anzahl und nicht von der Art und Struktur der gelösten Teilchen abhängen, werden nach van’t Hoff als kolligative Eigenschaften bezeichnet. Neben dem osmotischen Druck sind dies die Phänomene der Gefrierpunktserniedrigung, Dampfdruckerniedrigung und Siedepunktserhöhung. Die kolligativen Eigenschaften können zur Bestimmung der Molekülmasse ausgenutzt werden.

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2 Biophysikalische Grundlagen

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Der osmotische Druck P einer ideal verdünnten Lösung kann mit der Van’t-Hoff-Gleichung wie folgt berechnet werden:

2

PV¼nRT

(2.29)

V ist das Volumen der Lösung, n die Anzahl der Mole der gelösten Substanz, R die allgemeine Gaskonstante (8,314 J K–1 mol–1) und T die absolute Temperatur in Kelvin. (Beachte die rein formale Ähnlichkeit der Van’t-Hoff-Gleichung für den osmotischen Druck mit dem idealen Gasgesetz [p V = n R T]). Der Quotient n/V ist gleich der Konzentration c (in mol l–1) der gelösten Substanz. Die Anzahl der Mole einer Substanz entspricht dem Quotienten aus der Masse m (in g) und dem Molekulargewicht M (in g mol–1). Berücksichtigt man diese Verhältnisse, so ergibt sich aus Gleichung 2.29: P ¼ c R T bzw. M ¼

RT m  P V

(2.30)

Mit dieser Beziehung kann das Molekulargewicht einer gelösten Substanz anhand des osmotischen Druckes der Lösung bestimmt werden. Rechenbeispiel: Cellulose, das auf der Erde am häufigsten vorkommende Biopolymer, ist ein aus Glucose aufgebautes Polysaccharid mit der Bruttoformel (C6H10O5)n, wobei n bei etwa 500 bis 5000 liegt. Durch Cellulase bzw. durch Zugabe von starken Säuren kann die b-1,4-glykosidische Bindung gespalten werden. Bei vollständigem Abbau erhält man schließlich Glucose. Stoppt man aber den Verdauungsvorgang vorher, so erhält man ein Gemisch aus Polysacchariden mit statistisch verteilter Kettenlänge. Die mittlere Molekülmasse kann durch Messung des osmotischen Druckes bestimmt werden. Nach dem Trocknen der Lösung werden z. B. 20 mg aus der erhaltenen Masse abgewogen, in 10 ml Wasser gelöst und der osmotische Druck bestimmt: Bei T = 298 K wurde P zu 2,02 kPa bestimmt. Durch Einsetzen der Werte in Gleichung 2.30 ergibt sich: M¼

8,314 J mol
1 K
1 298 K 2 p 10
5 kg  ¼ 2,453 kg mol
1 ¼ 2453 g mol
1 2,02 p 103 Pa 1 p 10
5 m3

Hieraus ergibt sich eine mittlere Kettenlänge von ca. 15 Glucosebausteinen. Die Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen kann auch über die Bestimmung des osmotischen Druckes durchgeführt werden, aber hierbei müssen folgende Tatsachen berücksichtigt werden: Proteine sind Polyelektrolyte. In einer Proteinlösung befinden sich immer auch anorganische Salze, die ebenfalls zum osmotischen Druck beitragen. Die Messung muss ferner am isoelektrischen Punkt durchgeführt werden, da sonst der Donnan-Effekt (s. u.) die Messung beeinträchtigt. In der Praxis wird das (ungefähre) Molekulargewicht von Proteinen durch Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt (S. 149).

2.4.5

Osmose und Tonizität

Der osmotische Druck ist der Osmolarität, der Summe der Konzentrationen aller gelösten Teilchen einer Lösung, direkt proportional. Besitzen zwei Lösungen die gleiche Anzahl gelöster Teilchen, weisen sie bei einer perfekt semipermeablen

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2.4 Physikalische Faktoren für den Stofftransport

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Membran gegenüber dem Lösungsmittel den gleichen osmotischen Druck auf. Solche Lösungen werden als isoosmotisch bezeichnet. Beispielsweise ist eine Lösung mit 0,5 mol l–1 Glycerin und 0,5 mol l–1 Glucose isoosmotisch zu einer Glucoselösung der Konzentration 1 mol l–1. Werden diese beiden Lösungen von einer für Glycerin durchlässigen, für Glucose aber undurchlässigen Membran getrennt, so tritt Wasser aus der Glycerin/Glucoselösung in die Glucoselösung über, weil diese gegenüber der Glycerin/Glucoselösung einen höheren osmotischen Druck aufweist. Der Anteil des osmotischen Druckes, der durch die Substanz verursacht wird, für die die Membran impermeabel ist (in diesem Beispiel Glucose), wird als Tonizität bezeichnet. Man bezeichnet die Glycerin/Glucoselösung als hypoton gegenüber der Glucoselösung bzw. die Glucoselösung ist hyperton gegenüber der Glycerin/Glucoselösung. Gegenüber einer Glucoselösung der Konzentration 0,5 mol l–1 ist die Glycerin/Glucoselösung isoton, obwohl (zunächst) hyperosmotisch. Zwischen diesen Lösungen baut sich keine Druckdifferenz auf, da die Konzentration der für die Membran impermeablen Substanz auf beiden Seiten gleich groß ist. Da Glycerin die Membran passieren kann, stellt sich nach einiger Zeit ein Zustand ein, bei der auch die Glycerinkonzentration auf beiden Seiten gleich groß ist.

2.4.6

Donnan-Verteilung

Wird eine Salzlösung von einer für Salzionen und Wassermoleküle permeablen, aber für einen Polyelektrolyten (z. B. ein Protein) nichtpermeablen Membran getrennt, kommt es bei Zusatz des Polyelektrolyten in ein Kompartiment zu einer ungleichmäßigen Verteilung der diffusiblen Ionen. Das neue Gleichgewicht, das sich hierbei einstellt, wird Donnan-Gleichgewicht oder Donnan-Verteilung genannt. Abb. 2.8 verdeutlicht die Entstehung der Donnan-Verteilung. Für die Konzentrationsverhältnisse der diffusiblen Ionen im Donnan-Gleichgewicht gilt hier: [Na+]links · [Cl–]links = [Na+]rechts · [Cl–]rechts 18 · 8 = 12 · 12 Die allgemeine Donnan-Gleichung lautet: cþI c
I ¼ cþII c
II

(2.31)

c+ ist die Konzentration der diffusiblen Kationen, c– die der Anionen. Das polyelektrolythaltige Kompartiment erhält den Index I, das andere den Index II. Nun ist die Teilchenzahl bzw. die Osmolarität (s. o.) auf der linken Seite (27) höher als auf der rechten Seite (24). Hierdurch entsteht eine osmotische Druckdifferenz zwischen beiden Kompartimenten. Die osmotische Druckdifferenz ist wegen der ungleichmäßigen Ionenverteilung größer, als sie aufgrund der Anzahl zugesetzter Teilchen (1, dem Protein) zu vermuten wäre. Die zusätzliche Druck-

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2 Biophysikalische Grundlagen

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Abb. 2.8 Donnan-Gleichgewicht. Zwei NaCl-Lösungen sind durch eine semipermeable Membran getrennt. Die Membran ist für Ionen und Wasser, nicht aber für Polyelektrolyte (z. B. Proteine) durchlässig. a Der osmotische Druck ist auf beiden Seiten gleich groß. Es besteht kein Membranpotential. b Dem linken Kompartiment wird nun ein 10fach negativ geladenes Protein zugesetzt. Aus Gründen der Elektroneutralität werden auch 10 Na+-Ionen zugegeben. Da auf der linken Seite nun die Na+-Konzentration größer ist als auf der rechten Seite, diffundieren Na+-Ionen in das rechte Kompartiment. Diesen folgen nun Cl–Ionen, um die Elektroneutralität zu wahren. c Es stellt sich ein neues Gleichgewicht ein: das Donnan-Gleichgewicht. Auf beiden Seiten halten sich jeweils die Summen der positiven und negativen Ladungen die Waage.

differenz wird, da sie von makromolekularen Substanzen (Kolloide) verursacht wird, als kolloidosmotischer Druck D2 bezeichnet. Der osmotische Gesamtdruck einer polyelektrolythaltigen Lösung setzt sich somit aus dem osmotischen Druck (direkt durch Salze bedingt) und dem kolloidosmotischen Druck (ungleichmäßige Ionenverteilung bedingt durch Polyelektrolyte, bei biologischen Systemen vor allem Proteine) zusammen. Zudem entsteht ein Membranpotential, das Donnan-Potential, das sich wie folgt berechnet: D2 ¼ 2II
2I ¼

RT cþI RT c
I ln ln ¼
F F cII cII

(2.32)

cII ist die Ionenkonzentration einer Ionensorte (c+II = c–II = cII) im polyelektrolytfreien Kompartiment. Bedeutung des kolloidosmotischen Drucks für den Organismus: Im Organismus kommt es an folgenden Grenzen zur Ausbildung einer Donnan-Verteilung: Gewebezellen/interstitielle Flüssigkeit, interstitielle Flüssigkeit/Blutplasma und Blutplasma/Erythrocyten. Ist der kolloidosmotische Druck des Blutplasmas durch Eiweißmangel (z. B. bei Unterernährung oder verminderter Proteinsynthese bei einer Lebererkrankung) vermindert, bilden sich Wasseransammlungen (Ödeme) im Interstitium. Das Interstitium besitzt nun einen höheren osmotischen Gesamtdruck als das Blutplasma, folglich geht Wasser vom Blut in das Interstitium über. Dieses Phänomen erklärt die aufgedunsenen Bäuche

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2.4 Physikalische Faktoren für den Stofftransport

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(Hungerödeme) unterernährter Kinder in Afrika. Bei ausreichender Eiweißzufuhr normalisiert sich der kolloidosmotische Druck des Blutes wieder und die von den Einwohnern Kwashiorkor genannte Krankheit heilt aus, sofern keine weiteren Mangelerscheinungen bzw. Sekundärkrankheiten vorliegen. Auch bei der Bildung des Primärharns in den Glomeruli der Niere spielt der kolloidosmotische Druck des Blutes eine wichtige Rolle ( Zoologie).

2.4.7

Viskosität

Die Viskosität oder Zähigkeit einer Flüssigkeit oder eines Gases, die auch als innere Reibung bezeichnet wird, ist ein Maß für die Kraft die aufgewendet werden muss, um die Moleküle gegeneinander zu verschieben. Die Ursache der Viskosität beruht auf den zwischenmolekularen Kräften. Die Viskosität einer Substanz ist sowohl für die Diffusion der darin gelösten Teilchen als auch für deren Fließeigenschaften, den rheologische Eigenschaften, entscheidend. Eine Flüssigkeit, die sich wie in Abb. 2.9 dargestellt verhält, wird als laminare oder Newtonsche Flüssigkeit bezeichnet. Liegt bei der Beschreibung von Fließvorgängen dieses Anschauungsmodell zugrunde, spricht man von laminarer Strömung. In der Realität kommt es aber bei strömenden Flüssigkeiten häufig zu Wirbelbildungen, dieses Fließverhalten wird entsprechend als turbulente Strömung (s. u.) bezeichnet. Bei der laminaren Strömung bewegt sich die der bewegten Platte am nächsten stehende Schicht mit der höchsten Geschwindigkeit, während die der stehenden Platte anliegende Flüssigkeitsschicht nahezu unbeweglich ist. Nach Newton ist die Kraft F, die Kraft, die aufgewendet werden muss, um die Platte gegenüber der anliegenden Flüssigkeitsschicht zu verschieben, proportional zur Fläche A und dem Geschwindigkeitsgradienten (auch als Schergradient G bezeichnet):

Abb. 2.9 Dynamische Viskosität einer laminaren Flüssigkeit. Eine Flüssigkeit sei zwischen zwei parallelen Platten eingeschlossen, von denen die eine fest ist und die andere in x-Richtung mit der Geschwindigkeit v bewegt wird. Die Flüssigkeit zwischen diesen Platten setzt der Bewegung einen Widerstand entgegen. Stellt man sich die Flüssigkeit in sehr viele Schichten oder Blätter (lat.: laminae) unterteilt vor, die gegeneinander verschoben werden, so entsteht zwischen den Schichten ein Geschwindigkeitsgradient.

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2 Biophysikalische Grundlagen

Tab. 2.5 Dynamische Viskositäten einiger biologischer Substanzen bei unterschiedlichen Temperaturen.

2

Substanz

Temperatur [hC]

Dynamische Viskosität · 10–3 [Pa s]

Wasser

0

1,8

Wasser

20

1,0

Cytoplasma

20

2,0–3,0

Blut

18

4,8

Biomembranen

20

ca. 100

F¼hA

dv ¼hAG dy

(2.33)

Die Proportionalitätskonstante h (eta, SI-Einheit Pa s [Pascalsekunde] = kg m–1s–1) wird als dynamische Viskosität bezeichnet. Bei gegebener Temperatur ist sie eine stoffspezifische Konstante. Die Viskosität ist temperaturabhängig, bei steigender Temperatur nimmt die Viskosität in der Regel ab (Tab. 2.5).

2.4.8

Strömung in Kapillaren

Der Fluss einer laminaren Flüssigkeit durch eine Kapillare wird durch das HagenPoiseuillesche-Gesetz beschrieben: dV p DP R4 ¼ dt 8hl

(2.34)

Diese Gleichung beschreibt den Fluss einer Flüssigkeitsmenge dV (die Flüssigkeit besitzt die Viskosität h) in der Zeit dt durch eine Kapillare mit dem Radius R und der Länge l. DP ist die Druckdifferenz zwischen Anfang und Ende der Kapillare. Das Strömungsprofil bei laminarer bzw. turbulenter Strömung ist in Abb. 2.10 abgebildet. Bei laminarer Strömung ergibt sich ein parabolisches Geschwindigkeitsprofil. Die laminare Strömung ist ein Grenzfall, eignet sich aber sehr gut zur Beschreibung des Blutflusses in feinen Blutkapillaren ( Zoologie) und des Wasserflusses in den Xylemgefäßen ( Botanik). Das Hagen-PoiseuillescheGesetz zeigt, dass die Stromstärke sehr stark (mit der 4. Potenz) vom Radius abhängt. Für die Strömungen in feinsten Kapillaren bedeutet dies eine beträchtliche Zunahme der Durchblutung schon bei geringfügigen Gefäßerweiterungen, die z. B. durch bestimmte Medikamente hervorgerufen werden können. In den meisten Fällen z. B. bei höheren Strömungsgeschwindigkeiten liegt jedoch eine turbulente Strömung vor. Bei einer turbulenten Strömung ist die mittlere Strömungsgeschwindigkeit niedriger als bei der laminaren Strömung. Entscheidend hierfür ist die sogenannte Reynolds-Zahl Re:

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2.4 Physikalische Faktoren für den Stofftransport

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2 Abb. 2.10 Strömungsprofile bei laminarer und turbulenter Strömung in einer Kapillare.

Re ¼

2Rvr h

(2.35)

R ist der Radius der durchströmten Kapillare, n die mittlere Strömungsgeschwindigkeit, r die Dichte und h die dynamische Viskosität der interessierenden Flüssigkeit. Überschreitet die Reynolds-Zahl einen kritischen Wert, entstehen Turbulenzen.

Brownsche Molekularbewegung: Ständige und unregelmäßige Bewegung kleinster in Lösungen/Aerosolen suspendierter Partikel, beruht auf dauernden Zusammenstößen zwischen den suspendierten Partikeln und den Lösungsmittelmolekülen aufgrund der Wärmebewegung. Diffusion: Durchmischung von miteinander in Kontakt stehenden Stoffen aufgrund der Brownschen Molekularbewegung. 1. Ficksches Diffusionsgesetz: Der Teilchenfluss von Partikeln zwischen zwei benachbarten Lösungen ist der betrachteten Kontaktfläche und dem Konzentrationsgradienten proportional. Diffusionskoeffizient (D): Stoffspezifische Konstante im 1. Fickschen Diffusionsgesetz (Einheit: m2·s–1) 2. Ficksches Diffusionsgesetz: Betrachtet die Diffusion von Teilchen in Abhängigkeit von Zeit und zurückgelegter Wegstrecke. Permeabilitätskoeffizient: Maß für die Geschwindigkeit, mit der ein gelöstes Teilchen von einer wässrigen in eine hydrophobe Phase eintritt (Einheit cm·s–1). Osmose: Diffusion von Lösungsmittelmolekülen durch eine semipermeable Membran. Osmotischer Druck: Durch Osmose verursachte Druckdifferenz zwischen zwei unterschiedlich konzentrierten Lösungen. Bedingt durch das höhere chemische Potential der Lösungsmittelmoleküle in der verdünnten Lösung. Kolligative Eigenschaften: Eigenschaften einer Lösung, die ausschließlich von der Teilchenzahl der gelösten Stoffe bestimmt werden. Van’t-Hoff-Gleichung: Der osmotische Druck einer ideal verdünnten Lösung ist der Konzentration der gelösten Substanz proportional. Osmolarität: Summe der Konzentrationen aller gelösten Teilchen in einer Lösung. Isoosmotisch: Lösungen mit gleichem osmotischen Druck. Tonizität: Anteil des osmotischen Druckes, der durch die Undurchlässigkeit der Membran für eine der gelösten Substanzen verursacht wird.

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2 Biophysikalische Grundlagen

– Hypoton: Lösung mit geringerer Tonizität gegenüber einer anderen. – Hyperton: Lösung mit höherer Tonizität gegenüber einer anderen. – Isoton: Lösungen mit identischer Tonizität. Donnan-Gleichgewicht (Donnan-Verteilung): Konzentrationsverhältnis der diffusiblen Ionen zweier Salzlösungen, die durch eine Membran getrennt sind. Das Produkt aus Anionen- und Kationenkonzentration ist in beiden Kompartimenten identisch. Kolloidosmotischer Druck: Durch Zusatz von Makromolekülen (Kolloiden) verursachte osmotische Druckdifferenz zwischen zwei Lösungen. Donnan-Potential: Durch ungleichmäßige Ionenverteilung zwischen zwei Kompartimenten verursachtes Membranpotential. Viskosität: Maß für die Kraft, die nötig ist, um die Moleküle einer Flüssigkeit bzw. eines Gases gegeneinander zu verschieben. Laminare Flüssigkeit (Newtonsche Flüssigkeit): Flüssigkeit, bei der eine laminare Strömung vorliegt, Strömungsgeschwindigkeit steigt mit dem Radius der durchströmten Kapillare. Dynamische Viskosität: Temperaturabhängige stoffspezifische Proportionalitätskonstante (Einheit: Pa·s). Hagen-Poiseuillesche-Gesetz: Beschreibt den Volumendurchsatz einer laminaren Flüssigkeit pro Zeit durch eine kreisförmige Kapillare. Die Stromstärke ist proportional zur Druckdifferenz und umgekehrt proportional zum Reibungswiderstand.

2.5

Thermodynamische Grundlagen

Die Thermodynamik befasst sich mit dem Zusammenhang von Wärmeumsätzen bei Arbeitsprozessen. Sie macht eine Aussage darüber, ob eine Reaktion überhaupt ablaufen kann oder nicht. Die zentralen Aussagen der Thermodynamik werden in zwei Hauptsätzen zusammengefasst. Der Erste Hauptsatz ist der Energieerhaltungssatz. Eine wichtige Größe in der Thermodynamik ist die Enthalpie, durch welche der Energieumsatz bei konstantem Druck beschrieben werden kann. Der Zweite Hauptsatz der Thermodynamik legt eine Richtung fest: die dauernde Vergrößerung der Unordnung eines Systems. Zur Beschreibung des Ordnungszustandes wird die Entropie verwendet. Durch die Gibbs-Helmholtz-Gleichung wird der Erste mit dem Zweiten Hauptsatz verbunden. Die Beschreibung der Arbeitsleistung einer bestimmten Substanz erfolgt mit dem chemischen Potential. Bei der Beschreibung chemischer Reaktionen werden Standardbedingungen, bestimmte Konzentrationen und Temperatur, angenommen. Die meisten Reaktionen finden jedoch nicht unter diesen Standardbedingungen statt. Die Beschreibung von Energieumsätzen unter vorliegenden Bedingungen, etwa innerhalb einer Zelle, erfolgt durch Angabe der Änderungen der freien Enthalpie.

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2.5 Thermodynamische Grundlagen

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Die Thermodynamik macht keine Aussage über die Reaktionsgeschwindigkeit. Mit dieser Fragestellung befasst sich die Kinetik (S. 182). So ist ein Gemisch aus Wasserstoff und Sauerstoff (Knallgas) in Abwesenheit von Katalysatoren bzw. eines Zündfunken unbegrenzt haltbar. Die Thermodynamik sagt lediglich voraus, dass Wasserstoff und Sauerstoff unter Freisetzung einer bestimmten Energiemenge zu Wasser reagieren können.

2.5.1

Der Erste Hauptsatz

Der Erste Hauptsatz der Thermodynamik ist der Energieerhaltungssatz. Als Energie wird in diesem Zusammenhang die Fähigkeit eines Systems zur Verrichtung von Arbeit verstanden. Die Aussage des Ersten Hauptsatzes lautet: Die Gesamtenergie eines Systems ist konstant. Dies bedeutet, dass Energie weder erschaffen noch vernichtet werden kann. Daraus folgt, dass alle Energiearten, mechanische, chemische, elektrische Energie und Wärmeenergie, ineinander überführbar sind. Der erste Hauptsatz macht keine Aussage darüber, in welcher Richtung und mit welcher Effizienz diese Umwandlungen ablaufen. Bei jedem Arbeitsvorgang wird zwangsläufig ein Teil der aufgewendeten Energie in Wärme umgesetzt. Dieser Energiebetrag wird freigesetzt und steht somit zur Arbeitsleistung nicht zur Verfügung. Den Quotienten aus geleisteter Arbeit und zugeführter Energie bezeichnet man als Wirkungsgrad. Wegen des nicht vermeidbaren Wärmeverlustes liegt der Wirkungsgrad eines jeden Prozesses stets unter 100 %. Arbeit und Energie: Energie wird durch unterschiedliche Arbeitsformen repräsentiert. Die Einheit der Energie bzw. der Arbeit ist das Joule (J). Mechanisch verrichtete Arbeit ist definiert als das Produkt aus dem zurückgelegten Weg und einer Kraft, die der Bewegung längs des Weges entgegenwirkt: mechanische Arbeit = entgegenwirkende Kraft · Weg Die Ausdehnung gegen einen äußeren Druck p wird als Volumen- oder Expansionsarbeit bezeichnet. Der äußere Druck ist hier die der Bewegung (Ausdehnung DV) entgegenwirkende Kraft: Expansionsarbeit = äußerer Druck · Ausdehnungsvolumen = p DV Als Stromarbeit wird die Energiemenge bezeichnet, die aufgewendet werden muss, um die beweglichen Ladungsträger (Elektronen) durch einen elektrischen Leiter zu bewegen. Es gilt: Stromarbeit = Spannung · Stromstärke · Zeit = U I t Für die Umrechnung der Energieeinheiten gilt: 1 J = 1 N m = 1 Pa m3 = 1 V A s

In der angelsächsischen Literatur hat sich die Bezeichnung „calorie“ (cal) gehalten. Die Einheit cal wurde definiert, als die Energiemenge, die aufgewendet wer-

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2 Biophysikalische Grundlagen

den muss, um 1 g Wasser von 14,5 hC auf 15,5 hC zu erwärmen. Für den Zusammenhang zwischen J und cal gilt: 1 J = 0,239 cal bzw. 1 cal = 4,187 J. Die Energie, die ein Körper besitzt, wird als dessen innere Energie bezeichnet. Eine Zelle oder ein lebender Organismus stellt in thermodynamischer Betrachtungsweise ein offenes System dar: Es tauscht mit der Umgebung Materie und Energie aus. Wird einem System Energie zugeführt, vergrößert sich auch dessen innere Energie. Die innere Energie eines Systems hängt nur von diesem selbst (bei konstanten Werten für Druck und Temperatur) ab, sie ist eine sogenannte Zustandsfunktion. Beispielsweise hat ein Liter Kohlendioxid bei bestimmtem Druck und bestimmter Temperatur immer die gleiche innere Energie, unabhängig davon, wo er sich im Weltall befindet und unabhängig davon, auf welche Weise, z. B. durch Atmung oder chemische Synthese, er entstanden ist. Gemäß allgemeiner Vereinbarung werden Energiebeträge, die einem System zugeführt werden, mit positivem Vorzeichen angegeben. Von einem System abgegebene Energien werden durch ein negatives Vorzeichen dargestellt. Hat ein System 15 J in Form von Wärme (Formelzeichen q) an die Umgebung abgegeben, so schreibt man q = – 15 J. Hat sich die innere Energie (Formelzeichen U) eines Systems bei einer Reaktion um 30 J erhöht, so schreibt man DU = + 30 J. Reaktionen, bei denen Wärme freigesetzt wird (q I 0), werden als exotherm bezeichnet. Reaktionen, bei denen das System Wärme aus der Umgebung aufnimmt (q i 0), als endotherm.

2.5.2

Die Enthalpie

Bei der Bestimmung der inneren Energie wird ein konstantes Volumen vorausgesetzt und die experimentelle Bestimmung in einem Bombenkalorimeter durchgeführt. Biologisch bedeutende Reaktionen finden jedoch bei konstantem Druck, dem umgebenden Atmosphärendruck, statt. Da es in der Biologie und der Chemie umständlich ist, Energieinhalte bei konstantem Volumen zu bestimmen, wurde eine neue Größe definiert, die diesem Sachverhalt (konstanter Druck, Berücksichtigung der Volumenarbeit) Rechnung tragen soll, die Enthalpie H. Gleichung 2.36 beschreibt den Zusammenhang zwischen Enthalpie und innerer Energie: H¼Uþp V

(2.36)

p V beinhaltet den Anteil der Volumenarbeit. Die Enthalpie gibt den maximalen Wärmebetrag an, der von einer Reaktion unter konstantem Druck umgesetzt werden kann. Rechenbeispiel: Unter Standardbedingungen (s. u.) und bei konstantem Druck wurde der Wärmeumsatz bei der Oxidation von Glucose zu 2808 kJ mol–1 bestimmt. Glucose wird nach folgender Gleichung oxidiert: C6H12O6 + 6 O2 Ð 6 CO2 + 6 H2O

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2.5 Thermodynamische Grundlagen

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Die bei einer Oxidation unter konstantem Druck umgesetzte Wärmemenge wird als Verbrennungsenthalpie DHhV bezeichnet. Die Verbrennungsenthalpie gibt die maximale Wärmemenge an, die bei der Umsetzung mit Sauerstoff frei werden kann. In diesem Beispiel wird die Verbrennungsenthalpie vom System freigesetzt, d. h.: DHhV = –2808 kJ mol–1. Bei der Verbrennung entstehen pro Formelumsatz aus 7 Teilen Edukten 12 Teile Produkte (CO2 und H2O liegen nach der Reaktion gasförmig vor). Durch die Erhöhung der Teilchenzahl wird Expansionsarbeit an der Umgebung verrichtet. Unter Verwendung der Zustandsgleichung für ideale Gase p V = n R T (p ist der umgebende Druck, V das Volumen der Gasmischung, n gibt die Gasmenge in mol an, R ist die allgemeine Gaskonstante [8,314 J mol–1 K–1] und T die absolute Temperatur in K) kann die Verbrennungsenergie DUhV nach Gleichung 2.36 berechnet werden: DUhV = DHhV – D(pV) = DHhV – D(n R T) Findet die Reaktion bei 298 K statt, so resultiert: DUhV = – 2 808 kJ mol–1 – (5 · 8,314 J mol–1 K–1 · 298 K) = – 2 820 kJ mol–1 Der Energiebetrag, der zur Expansion gegen den äußeren Luftdruck aufgewendet wird (in diesem Beispiel 12 kJ mol–1), steht für andere Arbeitsleistungen nicht mehr zur Verfügung.

2.5.3

Der Zweite Hauptsatz

Der Zweite Hauptsatz macht eine Aussage darüber, ob eine Reaktion spontan, d. h. in eine bestimmte Richtung, ablaufen kann oder nicht. Das heißt aber nicht, dass diese Reaktion schnell abläuft. Die Knallgasreaktion ist zwar eine spontane Reaktion, sie wird aber erst dann ablaufen, wenn sie durch einen Funken gezündet wurde. Was unterscheidet eine spontane Reaktion von einer nicht spontanen? Die Triebfeder aller spontanen Reaktionen ist die Zunahme der Unordnung im Universum (dem betrachteten System und der Umgebung). In der Thermodynamik wurde die Bezeichnung Entropie S eingeführt, um den Ordnungszustand eines Systems zu beschreiben. Die Aussage des Zweiten Hauptsatzes lautet:

Die Entropie („Unordnung“) strebt einem Maximum zu. Diese Aussage hat weitreichende Konsequenzen: Sie sagt den Wärmetod des Weltalls voraus. Lebende Organismen stellen komplexe, organisierte Strukturen dar. Wie lässt sich deren Existenz im Sinne des zweiten Hauptsatzes erklären? Bei spontan ablaufenden Reaktionen, zu denen auch alle Lebensprozesse gehören, kann die Ordnung in einem System, z. B. einer Zelle, zunehmen. Dafür muss aber die Unordnung in der Umgebung in so großem Maße zunehmen, dass für das Universum insgesamt eine Zunahme der Unordnung resultiert. Eine Möglichkeit, die Entropie der Umgebung zu erhöhen, besteht in der Übertragung von Wärme: Die Temperatur der Atemgase und anderer Stoffwechselendprodukte liegt in der Regel höher als die Umgebungstemperatur. Durch die Erhöhung der Umgebungstemperatur erhöht sich auch deren Unordnungszustand, da die ungerichteten Bewegungen der Moleküle verstärkt werden.

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2 Biophysikalische Grundlagen

Rechenbeispiel: Im folgenden Beispiel soll demonstriert werden, dass eine Reaktion spontan (exergon) sein kann, obwohl sich der Ordnungszustand des Systems erhöht. Bei der Knallgasreaktion ist die Teilchenzahl der Produkte geringer (höherer Ordnungszustand) als die Teilchenzahl der Edukte. Für die Knallgasreaktion (die Reaktion soll bei 298 K stattfinden) 2 H 2 + O 2 Ð 2 H 2O beträgt die Standard-Reaktionsentropie DSh = –327 J K–1. Das System nimmt also an Entropie ab bzw. an Ordnung zu. Die Standard-Reaktionsenthalpie beträgt DHh = –572 kJ. Es werden 572 kJ in Form von Wärme vom System an die Umgebung abgegeben. Die thermodynamische Formulierung für die Entropie lautet: DS = q/T (q ist die Wärmemenge, die das System aufnimmt, wenn der Prozess bei der Temperatur T reversibel abläuft). Die Entropiezunahme des Universums ist die Summe der Entropieänderungen des Systems und der Umgebung: DSUniversum = DSUmgebung + DSSystem Für die Knallgasreaktion ergibt sich somit: DHh 572 kJ ¼ = 1 919 J K–1 DSUmgebung = – T 298 K Die Entropiezunahme des Universums ist folglich: DSUniversum = DSUmgebung + DSh = 1 919 J K–1 – 327 J K–1 = 1 592 J K–1 Die Gesamtentropie hat zugenommen und das entspricht gemäß dem zweiten Hauptsatz dem Kriterium für eine spontane Reaktion.

Um entscheiden zu können, ob ein Vorgang spontan abläuft oder nicht, muss sowohl die Entropieänderung des Systems als auch die Entropieänderung der Umgebung bestimmt werden. Dies ist in der Praxis jedoch sehr umständlich. Zur Vereinfachung wurde eine Größe eingeführt, die ein Maß für die Entropiezunahme des Universums ist, aber nur Änderungen des Systems berücksichtigt und somit leicht zu bestimmen ist: die freie Enthalpie G. Diese Größe ist wie folgt definiert: G¼H
TS

(2.37)

Dies ist die nach ihren geistigen Vätern benannte Gibbs-Helmholtz-Gleichung (zum Merken: Gibbs-HelmholTS). Sie ist eine fundamentale Gleichung der physikalischen Chemie, da sie den Ersten mit dem Zweiten Hauptsatz der Thermodynamik verknüpft. Wie die Entropie und die Enthalpie ist auch die freie Enthalpie eine Zustandsfunktion. Die Änderung der freien Enthalpie errechnet sich bei konstanter Temperatur zu: DG ¼ DH
T DS

(2.38)

Welche Aussage erlaubt die Änderung der freien Enthalpie? Die Änderung der freien Enthalpie beinhaltet die bei einer Reaktion entstehende Enthalpieänderung und berücksichtigt die Gesamtentropieänderung. Sie erlaubt somit die Aussage, ob es sich bei einer betrachteten Reaktion um eine spontane Reaktion

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2.5 Thermodynamische Grundlagen

handelt oder nicht. Ein negativer Wert für die Änderung der freien Enthalpie bedeutet zugleich auch eine Zunahme der Gesamtentropie. Reaktionen mit einer negativen freien Enthalpieänderung (DG I 0) sind spontane Reaktionen, sie führen zu einer Entropievergrößerung des Universums. Diese Reaktionen werden als exergone Reaktionen bezeichnet. Im Gegensatz hierzu werden nichtspontane Reaktionen als endergone Reaktionen bezeichnet. Hier hat die Änderung der freien Enthalpie einen positiven Wert (DG i 0), die Reaktion zeigt keine Tendenz abzulaufen. Die Änderung der freien Enthalpie gibt ferner den maximalen Energiebetrag an, der bei konstantem Druck und konstanter Temperatur zusätzlich zur notwendigen Volumenarbeit zur Verfügung steht.

2.5.4

Chemisches Potential

Die Arbeitsleistung, die von einem System verrichtet werden kann, entspricht der freien Enthalpie G. Die auf 1 Mol einer Substanz bezogene freie Enthalpie (partielle molare freie Enthalpie) wird als das chemische Potential m bezeichnet: m¼

G n

(2.39)

n ist die Anzahl der Mole der betrachteten Substanz. Das chemische Potential ist ein Maß für die Arbeitsleistung, zu der 1 Mol einer Substanz fähig ist. Die Bedeutung des chemischen Potentials wird deutlich, wenn Stoffgemische, dies ist bei biologischen Systemen praktisch immer der Fall, betrachtet werden. Die Summe der chemischen Potentiale der einzelnen Komponenten entspricht der gesamten freien Enthalpie des betrachteten Systems. Das chemische Potential ist von der Konzentration c der Substanz (genauer: der Aktivität) und der Temperatur abhängig: m ¼ mh þ R T ln c

(2.40)

mh ist das chemische Potential unter Standardbedingungen, R die allgemeine Gaskonstante (8,314 J K–1 mol–1), T die absolute Temperatur in K und c die Konzentration. Liegt die Substanz in der Standardkonzentration von 1 mol l–1 vor, so ist m = mh.

2.5.5

Freie Standard-Bildungsenthalpie und Standardzustände

Da in der Praxis nicht mit absoluten Werten gearbeitet wird, sondern nur mit Änderungen der Enthalpie bzw. freien Enthalpie ist es notwendig, ein Bezugssystem anzugeben. Hierzu dienen die Standard-Bildungsenthalpien DGBhl: Die freie Standard-Bildungsenthalpie einer Reaktion gibt die Änderung der freien Enthalpie an, die bei der Bildung einer Substanz aus ihren Elementen im Standardzustand resultiert. Als Standardbedingungen gelten in der physikalischen Chemie: T = 298 K, p = 100 kPa. Substanzen in Lösung liegen in einer Konzentra-

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2 Biophysikalische Grundlagen

tion von 1 mol l–1 vor. Die freie Enthalpie der Elemente ist im Standardzustand als Null definiert. Die Elemente liegen in ihrer stabilsten Konfiguration vor (Kohlenstoff beispielsweise als Graphit und nicht als Diamant). Wenn Aussagen sich auf Standardbedingungen beziehen, wird dies mit „h “ gekennzeichnet, Bildungsenthalpien entsprechend mit „B “. Die Änderung der freien Enthalpie einer beliebigen Reaktion kann aus den freien Standard-Bildungsenthalpien wie folgt berechnet werden: X X (2.41) DGhB (Edukte) DGh ¼ DGhB (Produkte)
Für biologische Bedingungen sind die definierten Standardzustände der physikalischen Chemie ungeeignet, daher wurden folgende Modifikationen eingeführt: Der Standardzustand für pH-abhängige Reaktionen ist auf pH = 7 bezogen, die Konzentration von H+ beträgt also 10–7 mol l–1; Wasser soll in reiner Form vorliegen, sodass die Konzentration 55,5 mol l–1 beträgt. Ist bei Reaktionen Wasser als Reaktionspartner beteiligt, so wird dies durch Einbeziehung der Wasserkonzentration in die Gleichgewichtskonstante berücksichtigt. Bezieht man sich auf biologische Standardzustände, so wird dies durch „hl “ gekennzeichnet. In Tab. 2.6 sind einige freie Bildungsenthalpien biologisch wichtiger Verbindungen aufgeführt. Tab. 2.6 Freie Bildungsenthalpien biologisch wichtiger Verbindungen. *Bildung aus den Elementen und freiem Acetyl-CoA. Verbindung

–DGBh [kJ mol–1]

Verbindung

Acetaldehyd

139,7

Glycerinaldehyd-3-phosphat

1285,6

Acetat

369,2

H+

0,0

–DGBh [kJ mol–1]

Acetyl-CoA*

374,1

H2 (g)

0,0

cis-Aconitat

902,9

H2O (l)

237,2 1160,0

CO2 (g)

394,4

Isocitrat

CO2 (aq)

386,2

a-Ketoglutarat

798,0

HCO3–

587,1

Lactat

516,6

Citrat

1166,6

L-Malat

845,1

Dihydroxyacetonphosphat

1293,2

OH–

157,3

Ethanol

181,5

Oxalacetat

797,2

Fructose

915,4

Phosphoenolpyruvat

1269,5

Fructose-6-phosphat

1758,3

2-Phosphoglycerat

1285,6

Fructose-1,6-bisphosphat

2600,8

3-Phosphoglycerat

1515,7

Fumarat

604,2

Pyruvat

474,5

a-D-Glucose

917,2

Succinat

690,2

Glucose-6-phosphat

1760,3

Succinyl-CoA*

686,7

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2.5 Thermodynamische Grundlagen

2.5.6

Die Änderung der freien Enthalpie unter Nicht-Standardbedingungen

Chemische Reaktionen laufen in der Umwelt nicht unter Standardbedingungen ab. Die einzelnen Reaktionspartner liegen normalerweise in Konzentrationen vor, die weit unterhalb der Standardkonzentration von 1 mol l–1 liegen. Des Weiteren finden diese Reaktionen nicht bei der Standard-Temperatur von 298 K statt. Diesem Sachverhalt muss bei der Berechnung der freien Enthalpie einer interessierenden Reaktion Rechnung getragen werden. Der Wert der freien Enthalpie hängt von den Konzentrationen der Reaktionspartner und der Temperatur ab. Die Gleichgewichtskonstante K (S. 36) ist mit der freien Enthalpie einer Reaktion unter Standardbedingungen über folgende Beziehung verknüpft: DGh ¼
R T ln K

(2.42)

R ist die allgemeine Gaskonstante, T die absolute Temperatur in Kelvin und DGh die Änderung der freien Enthalpie bei der Temperatur T. Für die allgemeine Reaktion a A + b B Ð c C + d D lässt sich DG aus DGh über folgende Gleichung berechnen: DG ¼ DGh þ R T ln

c

d

a

b

[C] [D] [A] [B]

(2.43)

DG ist die Änderung der freien Enthalpie, wenn die Reaktanden in den Konzentrationen [A], [B], [C] und [D] vorliegen. So kann eine Reaktion unter Standardbedingungen endergon sein, aber unter physiologischen Bedingungen dennoch spontan ablaufen. Rechenbeispiel: In der Glykolyse wird Fructose-1,6-bisphosphat (FBP) von der Aldolase in Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) gespalten. DGhl wurde zu +22,8 kJ mol–1 bestimmt. Unter biologischen Standardbedingungen ist dies keine spontane Reaktion. Da aber in der Zelle die Spaltprodukte unmittelbar weiter umgesetzt werden, kommt es nicht zur Einstellung der Gleichgewichtsbedingungen. In Erythrocyten wurden folgende Konzentrationen gemessen: [FBP] = 31 · 10–6 mol l–1, [DHAP] = 138 · 10–6 mol l–1 und [GAP] = 19 · 10–6 mol l–1. Unter Berücksichtigung der physiologischen Bedingungen ergibt sich für die FBP-Spaltung: DG = DGhl + R T ln

[GAP] [DHAP] = [FBP]

22 800 J mol–1 + 8,314 J mol– 1 K–1 · 310 K ln – 1 370 J mol–1

19 p 10
6 mol l
1 138 p 10
6 mol l
1 = 31 p 10
6 mol l
1

Die Reaktion zeigt unter physiologischen Bedingungen eine negative Änderung der freien Enthalpie und somit die Tendenz, in Richtung der Spaltprodukte abzulaufen.

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2 Biophysikalische Grundlagen

2.5.7

Gekoppelte Reaktionen

Einige Reaktionen haben unter physiologischen Bedingungen einen positiven Wert für DG (endergone Reaktion). Wie gelingt es einer Zelle, diese Reaktionen dennoch in der gewünschten Richtung ablaufen zu lassen? Da Gleichgewichtsverschiebungen hier nicht zum Ziel führen, muss die Zelle Energie in Form von „energiereichen“ Verbindungen (S. 265), meist ATP, aufwenden. Die Umsetzung energiereicher Verbindungen ist mit einer negativen Änderung der freien Enthalpie verbunden. Wenn diese stark exergone Reaktion mit einer endergonen gekoppelt wird, so resultiert gemäß dem Hessschen Satz eine exergone Gesamtreaktion. Rechenbeispiel: Freier Ammoniak, der z. B. beim Aminosäurestoffwechsel oder bei der Stickstofffixierung entsteht, steht in wässriger Lösung mit dem Ammoniumion im Gleichgewicht. Da freier Ammoniak aber stark cytotoxisch ist, muss er sehr schnell entfernt werden. Eine Möglichkeit neben der Exkretion ist der Einbau in eine andere Verbindung. Als Akzeptormolekül dient der Zelle die Aminosäure Glutamat. Glutamat + NH4+ + Ð Glutamin DGhl = + 16 kJ mol–1 Diese Reaktion ist auch unter physiologischen Bedingungen endergon. Für die Entfernung des Ammoniaks muss die Zelle Energie in Form von ATP aufwenden. Die Reaktion wird in der Zelle durch das Enzym Glutamin-Synthetase (zur Nomenklatur der Enzyme S. 169) katalysiert. Die Reaktionsgleichung lautet: Glutamat + NH4+ + ATP Ð Glutamin + ADP + Pi DG = – 16 kJ mol–1 Die Reaktion der Glutamin-Synthetase lässt sich formal in zwei Reaktionen aufteilen: 1) Glutamat + NH4+ Ð Glutamin DGhl = + 16 kJ mol–1 2) ATP Ð ADP + Pi DGhl = – 32 kJ mol–1 Die Summe der beiden Teilreaktionen ergibt einen negativen Wert für DGhl und somit läuft die Gesamtreaktion in Richtung der Glutaminbildung. Die beiden Teilreaktionen laufen aber nicht unabhängig voneinander ab. Es entsteht intermediär ein Glutamylg-phosphat, welches dann mit dem Ammoniumion reagiert. Alle gekoppelten Reaktionen müssen über eine gemeinsame Zwischenverbindung (hier das Glutamyl-g-phosphat) verlaufen. Die Kopplung einer endergonen Reaktion mit der (formalen) Hydrolyse von ATP ist eine in der Natur sehr häufig genutzte Möglichkeit, den Ablauf einer an sich endergonen Reaktion dennoch zu ermöglichen.

1. Hauptsatz der Thermodynamik (Energieerhaltungssatz): Die Gesamtenergie eines Systems ist konstant. Alle Energieformen sind ineinander umwandelbar. Wirkungsgrad: Maß für die Effizienz einer Energieumwandlung, Quotient aus geleisteter Arbeit und zugeführter Energie. Exotherme Reaktion: Reaktion, in deren Verlauf Wärme freigesetzt wird. Endotherme Reaktion: Reaktion, bei der Wärme aus der Umgebung aufgenommen wird. Enthalpie H: Wärmeumsatz einer Reaktion unter konstantem Druck. Entropie S: Maß für den Ordnungszustand eines Systems. Je größer die Entropie, umso höher ist die Unordnung eines Systems.

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2.6 Elektrochemie

69

2. Hauptsatz der Thermodynamik: Die Entropie strebt einem Maximum zu. Freie Enthalpie G: Maß für die Entropiezunahme des Universums. Wird nach der Gibbs-Helmholtz-Gleichung aus Enthalpie, Entropie und Temperatur eines Systems bestimmt. Gibbs-Helmholtz-Gleichung: Verbindet die freie Enthalpie mit der Enthalpie und Entropie eines Systems bei konstanter Temperatur und verknüpft somit den Ersten mit dem Zweiten Hauptsatz der Thermodynamik. Exergone Reaktion: Spontan ablaufende Reaktionen. Endergone Reaktion: Nicht spontan ablaufende Reaktionen. Zum Ablauf der Reaktion ist Zufuhr von freier Enthalpie notwendig. Chemisches Potential: Freie Enthalpie einer Substanz bezogen auf ein Mol. Standard-Bildungsenthalpie: Änderung der freien Enthalpie bei der Bildung einer Substanz aus ihren Elementen unter Standardbedingungen.

2.6

Elektrochemie

Bei vielen chemischen Reaktionen kommt es zu Übertragungen von Ladungen. Bei diesen elektrochemischen Reaktionen wird chemische und elektrische Energie ineinander umgewandelt. Werden im Verlauf einer Reaktion Elektronen von einem Reaktionspartner auf einen anderen übertragen, wird dies als Redoxreaktion bezeichnet. Unterschiedliche Substanzen unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, Elektronen zu übertragen. Diese Eigenschaft wird als das Redoxpotential einer Substanz angegeben. Substanzen mit unterschiedlichen Redoxpotentialen können miteinander reagieren. Die bei diesen Reaktionen möglichen Arbeitsleistungen werden durch die Nernst-Gleichung berechnet. In lebenden Zellen existiert ein Potential über den Membranen. Dieses kann mithilfe der Goldman-Gleichung, eine Erweiterung der Nernst-Gleichung, angegeben werden.

2.6.1

Redoxreaktionen

Eine Reaktion, bei der Elektronen von einer Substanz auf eine andere übertragen werden, wird als Redoxreaktion bezeichnet. Die Substanz, die Elektronen abgibt, wird oxidiert, die elektronenaufnehmende Substanz wird reduziert:

Reduktion + Oxidation = Redoxreaktion Reduktions- und Oxidationsreaktionen sind strikt miteinander gekoppelt: In Analogie zur Protonenübertragung von einer Säure auf deren konjugierte Base spricht man auch von konjugierten Redoxpaaren. Eine Redoxreaktion kann formal in zwei Halbreaktionen, die eigentliche Oxidation bzw. Reduktion, zerlegt werden. Die Lactat-Dehydrogenase beispielsweise katalysiert folgende Reaktion:

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2

70

2 Biophysikalische Grundlagen

Lactat þ NADþ Ð Pyruvat þ NADH þ Hþ

2

(2.44)

Bei dieser Reaktion werden Elektronen vom Lactat auf NAD+ übertragen. Lactat wird oxidiert, während NAD+ zu NADH reduziert wird. Die Teilreaktionen lauten: Oxidation: Lactat Ð Pyruvat þ 2 Hþ þ 2 e
Reduktion:

NADþ

þ2

Hþ

þ2

e


Ð NADH þ

(2.45) Hþ

(2.46)

Die Summe dieser beiden Halbreaktionen ergibt Gleichung 2.44. Reaktionen, bei denen Elektronen übertragen werden, sind für die Biologie von grundlegender Bedeutung: Der Fluss der Elektronen, der bei den Reaktionen der Photosynthese beginnt und über viele Stationen (reduzierte Verbindungen) schließlich zum Ziel (den terminalen Elektronenakzeptoren der Atmungsketten) führt, zieht sich wie ein roter Faden durch den gesamten Stoffwechsel (Kap. 7). Photosynthetisch aktive Pflanzenzellen und Cyanobakterien nutzen die Energie der einfallenden Sonnenstrahlung, um Elektronen aus Wasser auf ein energetisch höheres Niveau (negativeres Redoxpotential) zu bringen. Bei der anoxygenen Photosynthese der grünen Bakterien und der Purpurbakterien dient nicht Wasser, sondern H2 bzw. eine reduzierte Schwefelverbindung, z. B. H2S, oder eine organische Verbindung als Elektronendonor. Nachdem die Elektronen mithilfe der Lichtenergie auf ein höheres Energieniveau angehoben worden sind, durchlaufen sie die photosynthetische Elektronentransportkette, die aus energetisch nebeneinanderliegenden Redoxsystemen besteht, in welchen die Elektronen schrittweise übertragen werden. Schließlich erfolgt die Übertragung der Elektronen auf NADP+. Durch Bildung reduzierter Verbindungen (Kohlenhydrate) wird die Reduktionskraft der Elektronen fixiert. Tierische Organismen nutzen diese reduzierten Verbindungen für eine weitere Elektronentransportkette, die Atmungskette. Diese verläuft ebenso über benachbarte Redoxsysteme in Richtung eines energetisch niedrigeren Niveaus (positiveres Redoxpotential). Im letzten Schritt werden die Elektronen schließlich auf molekularen Sauerstoff übertragen. Bei dieser energetischen „Bergabfahrt“ der Elektronen kann deren Energie in Form von ATP gespeichert werden, das dann für energieverbrauchende Leistungen, etwa zur Muskelarbeit, zur Erzeugung eines elektrochemischen Membranpotentials (s. u.), zur Wärmeproduktion oder zum Aufbau anderer Verbindungen genutzt werden kann.

2.6.2

Redoxpotentiale

Die Elektronenaffinität jeder Substanz bzw. jedes Redoxpaares ist unterschiedlich. Um die Elektronenaffinitäten verschiedener Redoxpaare vergleichen zu können, werden diese auf ein Referenzsystem bezogen. Das Redoxpotential E ist ein Maß für die Elektronenaffinität einer Substanz. Redoxpotentiale werden in einer elektrischen Zelle gemessen. In dieser Anordnung sind zwei Redoxhalbzellen über einen Draht und eine Salzbrücke leitend miteinander verbunden (Abb. 2.11). Von der Halbzelle mit dem höheren Redoxpotential (stärker reduzierend) fließen die Elektronen zu der Halbzelle mit dem niedrigeren Redoxpotential. Zwischen den beiden Halbzellen entsteht eine Potentialdifferenz DE. Die Potentialdifferenz DE zwischen zwei Halbzellen im stromlosen Zustand wird auch als deren elektromotorische Kraft EMK bezeichnet.

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2.6 Elektrochemie

71

2

Abb. 2.11 Elektrochemische Zelle zur Bestimmung des Standard-Redoxpotentials am Beispiel des konjugierten Redoxpaares Fe2+/Fe3+. Elektrische Zellen werden vereinbarungsgemäß so dargestellt, dass die Elektronen von der linken Halbzelle (niedriges Potential; an der Elektrode findet die Oxidation statt, hier H2 p 2 H+ + 2 e–) spontan zur rechten Halbzelle (hohes Potential; an der Elektrode erfolgt die Reduktion, hier Fe3+ + e– p Fe2+) fließen. Die Elektrode, an der die Oxidation stattfindet heißt Anode, die Elektrode, an der die Reduktion erfolgt, Kathode. Zur Berechnung der Potentialdifferenz werden die Halbzellenreaktionen als Reduktion geschrieben. Alle Reaktanden (H+, Fe2+ und Fe3+ liegen in den Standardkonzentrationen [1 mol l–1] vor). Die Salzbrücke erlaubt eine Ionenwanderung zwischen den Halbzellen zur Wahrung der Elektroneutralität.

Die Maßeinheit der EMK ist das Volt (V). Als Bezugssystem wurde die NormalWasserstoffelektrode gewählt. Die Normal-Wasserstoffelektrode besteht aus einem mit Platinmohr (fein verteiltes Platin zur Oberflächenvergrößerung) überzogenen Platindraht, der in eine wässrige Lösung mit einer H+-Konzentration von 1 mol l–1 eintaucht und von Wasserstoffgas mit einem Druck von 101,3 kPa umspült wird. Die Halbreaktion an der Normal-Wasserstoffelektrode lautet: 2 Hþ þ 2 e
Ð H2

(2.47)

Das Potential der Normal-Wasserstoffelektrode ist per definitionem bei allen Temperaturen gleich Null. Die unter Standardbedingungen gegenüber der Normal-Wasserstoffelektrode gemessene Potentialdifferenz eines interessierenden Redoxpaares wird als Standard-Redoxpotential Eh bezeichnet. Bei biologisch bedeutenden Reaktionen bezieht man sich auf pH 7 und kennzeichnet dies mit einem „l“ (vgl. biologischer Standardzustand der freien Enthalpie). Auch zwischen der Normal-Wasserstoffelektrode ([H+] = 1 mol l–1) und einer Wasserstoffelektrode unter biologischen Standardbedingungen ([H+] = 10–7 mol l–1) kommt

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2 Biophysikalische Grundlagen

72

2

es zur Ausbildung einer Potentialdifferenz. Ist das Elektrodenpotential der untersuchten Redoxhalbzelle stärker reduzierend als das der Normal-Wasserstoffelektrode, wird ihr ein negatives Standard-Redoxpotential (Eh I 0) zugeordnet. Findet an der Elektrode des interessierenden Redoxpaares die Oxidation statt, flieTab. 2.7 Standard-Redoxpotentiale einiger biologisch wichtiger Halbreaktionen unter biologischen Standardbedingungen (25 hC, pH 7). Halbreaktion

Ehl [V]

/ O2 + 2H+ + 2e– p H2O

0,816

1 2

Fe

3+

–

2+

+ e p Fe

0,771

NO3– + 2H+ + 2e– p NO2– + H2O

0,421

Cytochrom a3 (Fe3+) + e– p Cytochrom a3 (Fe2+)

0,385

Cytochrom f (Fe3+) + e– p Cytochrom f (Fe2+)

0,365

O2 + 2H+ + 2e– p H2O2

0,295

3+

–

2+

Cytochrom a (Fe ) + e p Cytochrom a (Fe )

0,290

Cytochrom c (Fe3+) + e– p Cytochrom c (Fe2+)

0,254

Cytochrom c1 (Fe3+) + e– p Cytochrom c1 (Fe2+)

0,220

Ubichinon + 2H+ + 2e– p Ubichinol + H2

0,113

Cytochrom b (Fe3+) + e– p Cytochrom b (Fe2+)

0,077

Fumarat2– + 2H+ + 2e– p Succinat2–

0,031

+

–

2H + 2e p H2 (unter Standardbedingungen, pH 0) Crotonyl-CoA + 2H+ + 2e– p Buturyl-CoA

0,000 –0,015

Menachinon + 2H+ + 2e– p Menachinol + H+

–0,075

Oxalacetat2– + 2H+ + 2e– p Malat2–

–0,166

Pyruvat– + 2H+ + 2e– p Lactat–

–0,185

+

–

Acetaldehyd + 2H + 2e p Ethanol

–0,197

FMN + 2H+ + 2e–p FMNH2

–0,19

FAD + 2H+ + 2e– p FADH2

–0,219

Glutathion + 2H+ + 2e– p 2 reduzierte Glutathion

–0,230

S0 + 2H+ + 2e– p H2S

–0,27

Liponsäure + 2H+ + 2e– p Dihydroliponsäure

–0,290

NAD+ + H+ + 2e– p NADH

–0,320

NADP+ + H+ + 2e– p NADPH

–0,324

Acetoacetat + 2H+ + 2e– p b-Hydroxybutyrat

–0,346

a-Ketoglutarat2– + CO2 + H+ + 2e– p Isocitrat3–

–0,380

Ferredoxin (Fe3+) + e– p Ferredoxin (Fe2+)

–0,39

2H+ + 2e– p H2 (bei pH 7)

–0,414

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2.6 Elektrochemie

73

ßen die Elektronen zur Normal-Wasserstoffelektrode, an der die Reduktion der Wasserstoffionen gemäß Gleichung 2.47 stattfindet. Die Normal-Wasserstoffelektrode hat in diesem Fall eine höhere Elektronenaffinität als die entsprechende Redoxhalbzelle. Ein positives Standard-Redoxpotential (Eh i 0) entspricht einer höheren Elektronenaffinität gegenüber der Normal-Wasserstoffelektrode. Standard-Redoxpotentiale von Halbreaktionen können nun direkt miteinander verglichen werden (Tab. 2.7). Für die elektrische Zelle in Abb. 2.11 ergibt sich nach Einsetzen der entsprechenden Standard-Redoxpotentiale aus Tab. 2.7: DE = E (rechte Seite) – E (linke Seite) Rechte Seite: Fe3+ + e– p Fe2+ EhFe3S /Fe2S = 0,771 V Linke Seite: h H+ + e– p 1⁄2 H2 EHS /H2 = 0,000 V Gesamtreaktion: Fe3+ + 1⁄2 H2 p Fe2+ + H+ DEh = (+ 0,771 V) – (0,000 V) = + 0,771 V Da das Redoxpotential der Normal-Wasserstoffelektrode gleich Null ist, entspricht das gemessene Potential bei Standardbedingungen dem Standard-Redoxpotential des konjugierten Redoxpaares Fe3+/Fe2+.

2.6.3

Arbeitsleistung bei Redoxreaktionen

Die Bedeutung von DE liegt vor allem in der direkten Beziehung zur freien Enthalpie. Wenn bei einer Redoxreaktion ein Mol Elektronen übertragen wird, wird eine Ladungsmenge von 6,022 · 1023 mol–1 (Avogadro-Konstante, NA) · 1,60 219 · 10–19 C (Elementarladung des Elektrons, 1 C = 1 Coulomb = 1 J V–1) = 96 484 C mol–1 von einem Mol Reduktionsmittel auf ein Mol Oxidationsmittel übertragen. Die hierbei geleistete elektrische Arbeit wel beträgt: wel ¼ n F DE

(2.48)

Die molare Elektrizitätsmenge von 96 484 C mol–1 ist die Faraday-Konstante F; n ist die Anzahl der Mole Elektronen, die bei der Reaktion übertragen werden. Wenn bei der Redoxreaktion keine anderen Arbeitsleistungen verrichtet werden und diese bei konstantem Druck und konstanter Temperatur abläuft, entspricht wel der Abnahme der freien Enthalpie des Systems. Für Standardbedingungen gilt:
DGh ¼ n F DEh bzw. DGh ¼
n F DEh

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(2.49)

2

74

2

2 Biophysikalische Grundlagen

Zu beachten ist hierbei: Spontan ablaufende Vorgänge weisen eine negative Änderung der freien Enthalpie auf (DG I 0), dies entspricht bei Redoxreaktionen einem positiven Wert für die EMK (DE i 0). Durch Kombination der Gleichungen 2.42 (DGh = – R T ln K) und 2.49 (DGh = – n F DEh) erhält man eine Beziehung zwischen der EMK und der Gleichgewichtskonstante:
R T ln K ¼
n F DEh bzw. DEh ¼

RT ln K nF

(2.50)

Rechenbeispiel: In den Mitochondrien läuft die „biologische Knallgasreaktion“ unter Konservierung der freigesetzten Energie ab. Bei dieser Reaktion wird molekularer Sauerstoff mit NADH zu Wasser reduziert. Aus den Daten der Tab. 2.7 kann die Standard-EMK DEhl der Reaktion berechnet werden: DEhl = EO2/H2O – ENAD+/NADH = (0,816 V) – (– 0,320 V) = 1,136 V Unter biologischen Standardbedingungen entspricht dies einer Änderung der freien Enthalpie von: DGhl = – n F DEhl = – 2 · 96 484 J V–1 mol–1 · 1,136 V = – 219,2 kJ mol–1 Dieser Energiebetrag wird zunächst als elektrochemischer Protonengradient (DmHS, s. u.) über der inneren Mitochondrienmembran gespeichert und dann für die Synthese von ATP genutzt (S. 306).

2.6.4

Die Nernst-Gleichung

Um DE auch unter Nicht-Standardbedingungen berechnen zu können, werden die Beziehungen DG = – n F DE bzw. DGh = – n F DEh (2.49) in Gleichung 2.42 und 2.43 eingesetzt:
n F DE ¼
n F DEh þ R T ln

c

d

a

b

[C] [D] [A] [B]

(2.51)

Division durch – n F liefert eine Form der Nernst-Gleichung: c

DE ¼ DEh


d

RT [C] [D] ln a b nF [A] [B]

(2.52)

Liegen die Reaktanden unter Standardbedingungen vor ([A] = [B] = [C] = [D] = 1 mol l–1), so wird wegen ln 1 = 0 DE = DEh. Die Nernst-Gleichung erlaubt die Berechnung des Redoxpotentials eines Redoxpaares in Abhängigkeit von dessen Oxidationsgrad. Bei der allgemeinen Redox-Halbreaktion 1 n H2 + Ox Ð Red þ n Hþ (2.53) 2 erhält man mit Gleichung 2.52

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2.6 Elektrochemie

75

n

DE ¼ DEh


RT [Hþ ] [Red] ln n nF [H2 ]2 [Ox]

(2.54)

Unter Standardbedingungen ist [H+] bzw. [H2] gleich 1, somit vereinfacht sich Gleichung 2.54 zu: DE ¼ DEh


RT [Red] RT [Ox] ln bzw. DE ¼ DEh þ ln nF [Ox] nF [Red]

(2.55)

Dies ist eine andere Ausdrucksform der Nernst-Gleichung. Liegen von einer Substanz reduzierte und oxidierte Form in gleicher Konzentration vor, so wird DE = DEh. Je höher die Konzentration der oxidierten Form ist, umso höher wird das Redoxpotential. Rechenbeispiel: Aus Tab. 2.7 kann man entnehmen, dass sich die Standard-Redoxpotentiale der beiden Redoxpaare NAD+/NADH und NADP+/NADPH nur unwesentlich voneinander unterscheiden. Im Cytosol von Leberzellen beträgt das Verhältnis [NAD+] : [NADH] ca. 700 : 1 und das Verhältnis [NADP+] : [NADPH] ca. 1 : 70. Daraus ergibt sich für DENAD+/NADH bzw. DENADP+/NADPH: DENADþ /NADH

¼ DEhNADþ /NADH þ

RT [Ox] ln nF [Red]

¼ (
0,320 V) þ

8,314 J mol
1 K
1 p 298 K 700 ln ¼
0,236 V 1 2 p 96484 J V
1 mol
1

DENADPþ /NADPH ¼ (
0,324 V) þ

8,314 J mol
1 K
1 p 298 K 1 ln ¼
0,378 V 70 2 p 96484 J V
1 mol
1

Das Redoxpotential des Redoxpaares NADP+/NADPH ist unter physiologischen Bedingungen negativer (stärker reduzierend) als das des Redoxpaares NAD+/NADH. In der Zelle werden sowohl Oxidationen als auch Reduktionen durchgeführt. NADPH wird als Elektronendonor für Reduktionen, z. B. bei der Synthese von Fettsäuren verwendet, NAD+ als Elektronenakzeptor bei Oxidationen, vor allem in der Glykolyse und im Citratzyklus. Die Phosphatgruppe von NADP+ dient der Zelle zur Unterscheidung des Oxidationsmittel-Pools (NAD+/NADH) von dem des Reduktionsmittel-Pools (NADP+/NADPH, S. 272). Zu Struktur und Mechanismus der Elektronenübertragung von NAD+ bzw. NADP+ S. 223).

2.6.5

Einfluss des pH-Wertes auf das Redoxpotential

Bei vielen biochemischen Reaktionen sind Protonen beteiligt. Bei der allgemeinen Redox-Halbreaktion 1 n H2 + Ox Ð Red þ n Hþ (2.53) 2 werden n H+ freigesetzt. Da in der Gleichgewichtsbeziehung H+ erscheint, ist diese Reaktion pH-abhängig. Gleichung 2.54 lässt sich umstellen zu: DE ¼ DEh


RT [Red] RT ln ln [Hþ ] n þ nF [Ox] [H2 ]2 n F

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(2.56)

2

76

2 Biophysikalische Grundlagen

Da die Beziehung ln = 2,303 log gilt, kann anstelle von [H+] der pH (pH = –log [H+]) eingesetzt werden:

2

DE ¼ DEh


RT [Red] RT ln pH n
2,303 2 nF nF [Ox] [H2 ]

(2.57)

Bei Standardbedingungen ([Red] = [Ox] = [H2] = 1, T = 298 K) ergibt sich: DE ¼ DEh


0,059 V n pH

(2.58)

Eine Erniedrigung des pH-Wertes (Erhöhung von [H+]) führt zu einer Erniedrigung des Redoxpotentials um 0,059 V pro Mol übertragener Elektronen. Das Redoxpotential unter chemischen Bedingungen und das Redoxpotential unter biologischen Standardbedingungen sind wie folgt miteinander verknüpft: DEhl ¼ DEh


2.6.6

0,059 V np7

(2.59)

Elektrochemisches Potential und Membranpotential

Werden zwei unterschiedlich konzentrierte NaCl-Lösungen durch eine Membran getrennt, die nur für Na+-Ionen permeabel ist, so entsteht im Gleichgewichtszustand eine Potentialdifferenz über der Membran. Na+-Ionen aus der höher konzentrierten Lösung ([Na+]I) diffundieren in die verdünnte Lösung ([Na+]II). Da aber die Cl–-Ionen nicht folgen können, erhält die höher konzentrierte Seite eine negative Ladung (hier überwiegen nun die Cl–-Ionen), die verdünnte Lösung eine positive Ladung (durch den Übertritt der Na+-Ionen). Die Diffusion der Na+-Ionen aus der höher konzentrierten Lösung in die verdünnte Lösung erfolgt so lange, bis die entstehende Potentialdifferenz die Konzentrationsdifferenz ausgleicht. Zur Beschreibung von Gleichgewichten bei der Verteilung von Ionen reicht die Definition des chemischen Potentials nicht mehr aus, da hier das elektrische Potential unberücksichtigt bleibt. Daher wurde eine neue Größe definiert, die diesem Sachverhalt Rechnung trägt: das elektrochemische Potential m*. m* ¼ m þ n F 2

(2.60)

Es ist m das chemische Potential des betrachteten Ions, 2 ist das elektrische Potential der Stelle, an der sich das betrachtete Ion befindet, n ist die Wertigkeit des Ions. In Abwesenheit eines elektrischen Potentials ist m* = m. Im Gleichgewichtszustand gilt für das betrachtete Beispiel: m*Naþ I ¼ m*Naþ II

(2.61)

m*Na+I bzw. m*Na+II ist das elektrochemische Potential in der Lösung mit [Na+]I bzw. [Na+]II. Unter Berücksichtigung von Gleichung 2.40 (m = mh + R T ln c) erhält man:

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2.6 Elektrochemie

mhNaþ þ R T ln [Naþ ]I þ F 2I ¼ mNaþ þ R T ln [Naþ ]II þ F 2II

77 (2.62)

Dies lässt sich umformen zu: 2I
2II ¼ D2 ¼

RT RT ln [Naþ ]II
ln [Naþ ]I F F

2 (2.63)

und wegen ln [Na+]II – ln [Na+]I = ln ([Na+]II / [Na+]I) D2 ¼

RT [Naþ ]II ln [Naþ ]I F

(2.64)

Allgemein gilt für ein selektiv permeables Ion der Wertigkeit n: D2 ¼

RT cII ln cI nF

(2.65)

Im Gleichgewicht wird die Potentialdifferenz über einer Membran als das Membranpotential D2 bezeichnet. Auch Gleichung 2.65 stellt eine Ausdrucksform für die Nernst-Gleichung dar. Ionengradienten als Energiewährung: Erzeugung und Aufrechterhaltung von Ladungsbzw. Ionengradienten über biologische Membranen sind in der Biologie nicht minder bedeutend als die Redoxreaktionen. Eine ungleichmäßige Ladungsverteilung über einer biologischen Membran führt zur Ausbildung eines elektrochemischen Membranpotentials: Mitochondrien, Chloroplasten und Bakterien nutzen dies zur Synthese von ATP. Nervenzellen und einige pflanzliche Parenchymzellen verwenden ein elektrochemisches Membranpotential zur Informationsweiterleitung. Auch für viele Transportvorgänge über biologische Membranen ist ein elektrochemisches Membranpotential unerlässlich. Schließlich werden die Flagellen der Bakterien direkt durch ein elektrochemisches Membranpotential angetrieben. Die Ionengradienten stehen der Bedeutung des ATPs als „Energiewährung“ in nichts nach. Bei den Ionengradienten handelt es sich vielmehr um eine andere „Zahlungsart“.

2.6.7

Goldman-Gleichung

In einer eukaryotischen Zelle sind vor allem Na+, K+ und Cl–-Ionen an der Ausbildung eines Membranpotentials beteiligt. Die Zellmembranen besitzen eine ATPgetriebene, elektrogene (d. h. ein Membranpotential erzeugende) Na+/K+-Pumpe. Für Na+-Ionen ist die Membran wenig permeabel; K+-Ionen können die Membran jedoch über sogenannte K+-Sickerkanäle gut passieren. Innerhalb der Zelle ist die K+-Ionenkonzentration größer als außen, hingegen ist die Na+-Ionenkonzentration außerhalb der Zelle größer als innen. Ein echter Gleichgewichtszustand kann sich aufgrund der unterschiedlichen Permeabilitätskoeffizienten (S. 52) für die einzelnen Ionenarten und der aktiven Ionentransporte nicht mehr einstellen. Das vorhandene Membranpotential liegt zwischen den Potentialen, die für die einzelnen Ionenarten berechnet werden können.

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2 Biophysikalische Grundlagen

78

2

Die Goldman-Gleichung berücksichtigt die unterschiedlichen Permeabilitäten der einzelnen Ionenarten, sie lautet in der allgemeinen Form: P P RT Pþ cþa þ P
c
i P D2 ¼ 2i
2a ¼ ln P (2.66) F Pþ cþi þ P
c
a

Es bedeuten: i Zellinnenseite, a Zellaußenseite. P sind die entsprechenden Permeabilitätskoeffizienten für die Kationen (+) bzw. Anionen (–). Werden nur Na+, K+, und Cl–-Ionen berücksichtigt, ergibt sich: RT PKþ [Kþ ]a þ PNaþ [Naþ ]a þ PCl
[Cl
]i ln nF PKþ [Kþ ]i þ PNaþ [Naþ ]i þ PCl
[Cl
]a

D2 ¼

(2.67)

Die Permeabilität für K+-Ionen ist sehr viel größer als für alle anderen Ionen, sodass sich Gleichung 2.67 weiter vereinfachen lässt, zu: RT [Kþ ]a ln F [Kþ ]i

D2 ¼

(2.68)

Dies entspricht der bereits bekannten Nernst-Gleichung. Die Goldmann- bzw. die Nernst-Gleichung bilden die Grundlage für die Berechnung von Membranpotentialen und den Verhältnissen bei der Ausbildung und Weiterleitung von Aktionspotentialen (S. 352 und Zoologie). Auch für die Beschreibung von Transportvorgängen über Membranen (S. 374) ist die Nernst-Gleichung unentbehrlich.

2.6.8

Chemiosmotische Theorie und protonenmotorische Kraft

Die Erzeugung von ATP steht bei allen Lebensformen im Zentrum des Energiestoffwechsels. Dies ist auf zwei prinzipiell verschiedenen Wegen möglich: durch Kopplung der Substratoxidation mit der Bildung energiereicher Verbindungen (Substratkettenphosphorylierung, S. 269) oder Nutzung eines elektrochemischen Protonengradienten über einer Membran. Beide Mechanismen kommen nahezu universell vor. Ein solcher Protonengradient wird durch die Reaktionen der Photosynthese bzw. der Atmungskette generiert. Die Kopplung des elektrochemischen Protonengradienten mit der ATP-Synthese wurde 1961 von Peter Mitchell vorgeschlagen und wird als chemiosmotische Theorie bezeichnet (S. 305). Spätere Experimente bestätigten diese Vorstellung. Der elektrochemische Protonengradient DmH+ setzt sich aus zwei Termen zusammen: Dem Konzentrationsgradienten DpH und, da das Proton ein geladenes Teilchen ist, dem elektrischen Membranpotential D2. Das Arbeitspotential des Protonengradienten wurde von Mitchell, in Anlehnung an die elektromotorische Kraft EMK, als protonenmotorische Kraft PMK (proton motive force) bezeichnet und mit Dp abgekürzt. Die PMK ist wie folgt definiert: Dp ¼

DmHþ F

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(2.69)

2.6 Elektrochemie

79

Durch die Definition von Dp in Gleichung 2.69 wird ein direkter thermodynamischer Vergleich zur elektromotorischen Kraft bei Redoxreaktionen erleichtert (PMK und EMK stellen Potentialdifferenzen dar und werden in der Einheit Volt gemessen). Für den elektrochemischen Protonengradient DmH+ über einer Membran gilt: (2.70)

DmHþ ¼ m*Hþ i
m*Hþ a

Es sind m*H+i bzw. m*H+a die elektrochemischen Potentiale der Protonen an der Membraninnen- bzw. Membranaußenseite. Durch Einsetzen der Definitionsgleichung für das elektrochemische Potential (2.60) erhält man: DmHþ ¼ (mHþ i þ F2i )
(mHþ a þ F2a )

(2.71)

Für das chemische Potential einer Substanz gilt m = mh + RT ln c (2.40). Setzt man diesen Ausdruck in Gleichung 2.71 ein, so ergibt sich: DmHþ ¼ (mhHþ þ R T ln [Hþ ]i þ F2i )
(mhHþ þ R T ln [Hþ ]a þ F2a )

(2.72)

Durch Kürzen und Umstellung lässt sich dies vereinfachen zu: DmHþ ¼ F (2i
2a ) þ R T ln

[Hþ ]i [Hþ ]a

(2.73)

Unter Berücksichtigung von ln = 2,303 log erhält man durch Verwendung des pH-Wertes anstelle der Protonenkonzentration (2.14): DmHþ ¼ F D2
2,303 R T (pHi
pHa ) bzw. DmHþ ¼ F D2
2,303 R T DpH (2.74) Für die PMK ergibt sich somit gemäß Gleichung 2.69: Dp ¼ D2
2,303

RT DpH F

(2.75)

Variation eines Themas „der elektrochemische Na+-Gradient“: Ionengradienten werden auch direkt zum Transport von Metaboliten in die Zellen verwendet (Co-Transport bzw. aktiver Transport). Einige Bakterien benutzen zusätzlich zu den Protonen-getriebenen Mechanismen einen elektrochemischen Na+-Gradienten DmNa+ zur ATP-Synthese, zum gekoppelten Metaboliten-Import und zum Flagellenantrieb. Bei dem strikt anaeroben Bakterium Propionigenium modestum kommt beispielsweise nur ein elektrochemischer Na+-Gradient vor; ein elektrochemischer Protonengradient existiert hier nicht Mikrobiologie). Eukaryotische Zellen benutzen ebenfalls einen Na+-Gradienten; die( ser muss aber zuvor unter ATP-Verbrauch durch die Na+/K+-ATPase aufgebaut werden (S. 382). In den Zellen gibt es damit drei ineinander umwandelbare Energieübertragungsformen („Energiewährungen“): ATP, DmH+ und DmNa+.

Redoxreaktion: Reaktion, bei der Elektronen übertragen werden. Hierbei ist eine Oxidation (Elektronenabgabe) stets mit einer Reduktion (Elektronenaufnahme) verbunden. Konjugiertes Redoxpaar: Bezeichnung für Elektronen abgebende und aufnehmende Substanzen bei einer Redoxreaktion.

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2

2 Biophysikalische Grundlagen

Redoxpotential: Maß für die Elektronenaffinität einer Substanz. Elektronen fließen in Richtung des positiveren Redoxpotentials. Elektromotorische Kraft (EMK): Potentialdifferenz zwischen zwei Redoxpaaren mit unterschiedlichem Redoxpotential. Nernst-Gleichung: Berechnung des Redoxpotentials eines Redoxpaares mit bekanntem Standard-Redoxpotential unter Nicht-Standardbedingungen aus den Konzentrationen von oxidierter und reduzierter Substanz. Das Redoxpotential eines Redoxpaares steigt mit der Konzentration der oxidierten Form. Elektrochemisches Potential: Potentialdifferenz über einer Membran, verursacht durch Konzentrations- und Ladungsunterschiede. Setzt sich zusammen aus dem chemischen und dem elektrischen Potential. Membranpotential: Potentialdifferenz über einer Membran im Gleichgewichtszustand. Goldman-Gleichung: Modifizierte Form der Nernst-Gleichung, zusätzliche Berücksichtigung der unterschiedlichen Permeabilitätskoeffizienten.

2.7

Licht und Leben

Als Licht werden elektromagnetische Wellen bezeichnet, die für das menschliche Auge sichtbar sind. Diese bestehen aus einer elektrischen und magnetischen Komponente. Für die „Lichterscheinungen“ ist die elektrische Komponente maßgeblich. Licht kann mit Materie wechselwirken. Solche Wechselwirkungen können zur Drehung der Schwingungsebene führen (Lichtdrehung) oder auch die Anhebung von Elektronen in Niveaus mit höherer Energie bewirken (Lichtabsorption). Absorbierte Lichtenergie ist zur Arbeitsleistung fähig und bildet die Grundlage für die Reaktionen der Photosynthese. Durch die Fixierung der Lichtenergie in „chemische“ Energie steht diese somit auch allen anderen Lebewesen – direkt oder indirekt – als Energiequelle zur Verfügung. Licht spielt aber nicht nur als Energielieferant eine wichtige Rolle: Viele Organismen können Licht in speziellen Strukturen perzipieren und entsprechend reagieren. Licht dient somit auch der Kommunikation. Meilensteine in der Erforschungsgeschichte des Lichts: Aristoteles erkannte bereits um 350 v. Chr., dass Licht für das Pflanzenwachstum unentbehrlich ist. Isaac Newton (1643–1727) zerlegte Licht erstmals mit einem Glasprisma in die Spektralfarben, er deutete Licht als einen Teilchenstrom. Noch zu Lebzeiten Newtons postulierte 1677 Christiaan Huygens die Wellennatur des Lichtes. Newton und Huygens sollten schließlich beide recht behalten. Das Medium, von dem man annahm, dass es zur Lichtausbreitung notwendig war, wurde Äther genannt. Joseph Priestley entdeckte 1771, dass Pflanzen „schlechte Luft“ (Luft, in der Sauerstoff durch Atmung verbraucht wurde) in „gute Luft“ (Luft mit Sauerstoff) umwandeln können. 1779 erkannte Jan Ingenhouz, dass bei der „Luftreinigung“ die Einstrahlung von Licht auf grüne Pflanzenteile entscheidend

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2.7 Licht und Leben

81

ist. Um 1800 bestimmte Thomas Young erstmals die Wellenlänge von Licht. Robert Mayer formulierte 1842 den Energieerhaltungssatz, er erkannte, dass Pflanzen eine Energieform (Licht) in eine andere Energieform („chemische Differenz“) umwandeln. Louis Pasteur beschrieb 1848 die optische Aktivität bei asymmetrischen Verbindungen. Die Natur des Lichtes als elektromagnetische Welle wurde vor allem von James Clark Maxwell 1861 theoretisch begründet und u. a. von Hendrik A. Lorentz und Hermann von Helmholtz weiterentwickelt. Helmholtz stellte 1867 die Dreifarben-Theorie zur Erklärung des Farbsehens auf. Max Planck formulierte 1900 seine Quantentheorie des Lichtes, mit der ein Ausweg aus der „UV-Katastrophe“ gefunden wurde. Die Quantentheorie konnte schließlich durch Albert Einsteins Entdeckung und Deutung des photoelektrischen Effektes bewiesen werden. Für diese Leistung wurde Einstein 1921 mit dem Nobelpreis geehrt.

2.7.1

Die Natur des Lichts: elektromagnetische Wellen

Bei elektromagnetischen Wellen handelt es sich um transversale Wellen, d. h. die Schwingungsrichtung der elektrischen (E) bzw. magnetischen (H) Komponente erfolgt senkrecht zur Ausbreitungsrichtung (Abb. 2.12). Im Gegensatz dazu handelt es sich bei Schallwellen um longitudinale Wellen. Hier erfolgen die Schwingungen in Ausbreitungsrichtung der Welle. Während Schallwellen ein schwingendes Trägermedium (Luft, Wasser etc.) benötigen, können sich elektromagnetische Wellen auch im Vakuum ausbreiten. Als Licht wird der (für Menschen) sichtbare Bereich elektromagnetischer Wellen mit Wellenlängen von 380 bis 780 nm bezeichnet. Das Licht, das auf die Erde gelangt, entsteht in der Sonne bei der Fusion von Wasserstoff zu Helium. Die Sonne strahlt eine Energiemenge von ca. 2,3 · 1028 kJ min–1 ab, davon gelangen nur etwa 1019 kJ min–1 auf die Erde. Nimmt man eine gleichmäßige Verteilung auf der Oberfläche an und berücksichtigt Verluste durch Streuung und Absorption in der Atmosphäre, so berechnet sich die auf die Erdoberfläche eingestrahlte Energiemenge zu ca. 565 kJ cm–1 a–1 (zur spektralen Intensitätsverteilung der Sonnenstrahlung Ökologie, Evolution). Zur Beschreibung elektromagnetischer Wellen werden zwei Modelle herangezogen: das Wellen- oder das Teilchen (Photonen)-Modell. Beide Auffassungen widersprechen sich nicht; sie unterstreichen vielmehr jeweils eine Eigenschaft

Abb. 2.12 Licht. Bei elektromagnetischen Wellen schwingt die elektrische (E) und die magnetische Komponente (H) in Phase senkrecht zur Ausbreitungsrichtung. Der Energiefluss wird durch den Poynting-Vektor S = E q H beschrieben. Die elektromagnetischen Wellen, die vom Menschen als Licht wahrgenommen werden, haben Wellenlängen l von 380 bis 780 nm.

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2 Biophysikalische Grundlagen

2

Abb. 2.13 Spektrum elektromagnetischer Strahlen. Dieses umfasst mehrere Größenordnungen. Der für die Biologie hauptsächlich interessierende Strahlungsbereich umfasst Wellenlängen von etwa 100 bis 800 nm.

des Lichtes (Welle-Teilchen-Dualismus). Das Spektrum der elektromagnetischen Wellen umfasst viele Größenordnungen (Abb. 2.13). Die Energie des Lichtes wird in diskreten Quanten (Photonen) abgegeben, und ist der Frequenz direkt proportional: E ¼ hn

(2.76)

E ist die Energie des Lichtes, n ist die Frequenz der Strahlung und h ist der Proportionalitätsfaktor, die Planck-Konstante (Plancksches Wirkungsquantum, h = 6,6261 · 10–34 J s). Die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Lichtes im Vakuum ist eine Konstante (c = 2,997 925 · 108 m s–) und entspricht dem Produkt aus Frequenz und Wellenlänge l: c ¼ ln

(2.77)

Häufig ist es von Vorteil, die Energie elektromagnetischer Strahlung auf ein Mol Photonen (photochemisches Äquivalent) zu beziehen. Hierfür wird die Einheit Einstein (E) verwendet. Beispielsweise besitzen „rote“ Photonen der Wellenlänge 750 nm gemäß Gleichungen 2.76 und 2.77 eine Energie von E = (h c)/n = 2,65 · 10–19 J. Bezogen auf ein Mol (6,023 · 1023) Photonen ergibt sich ein Energiebetrag von 160 kJ bzw. 160 Einstein.

2.7.2

Lichtabsorption

Damit Licht einen Effekt bewirken kann, muss es mit der Materie in Wechselwirkung treten. Optisch aktive Verbindungen drehen die Schwingungsebene

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2.7 Licht und Leben

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(die Ebene der elektrischen Schwingung bezeichnet man als Schwingungsebene, die der magnetischen als Polarisationsebene) von linear polarisiertem Licht (S. 115). Für die Biologie ist vor allem die Lichtabsorption von Bedeutung. Licht wird von Molekülen absorbiert, indem es deren Elektronen vom Grundzustand auf ein energetisch höheres Niveau bringt. Man spricht dann von einem angeregten Zustand. Die lichtabsorbierenden Strukturen werden als Chromophore bezeichnet. Als Chromophore im sichtbaren Wellenlängenbereich dienen vor allem Moleküle mit delokalisierten p-Elektronensystemen. Hierbei handelt es sich um Moleküle mit aromatischen Systemen, z. B. die pflanzlichen Flavanderivate oder Flavonoide (z. B. die Anthocyane), und/oder ausgedehnten Bereichen konjugierter Doppelbindungen. Zu letztgenannten gehören z. B. die Chlorophylle und Carotinoide der Pflanzen. Eine Anregung kann nur erfolgen, wenn die Energie des Lichtes genau der Energiedifferenz zwischen den beiden elektronischen Zuständen, dem Grund- und dem angeregten Zustand, entspricht. Beim Übergang vom angeregten Zustand zurück in den Grundzustand emittieren Atome Licht, dessen Wellenlänge dem absorbierten Licht entspricht. Absorptions- und Emissionsspektrum von Atomen komplementieren sich zu einem kontinuierlichen Spektrum. Bei der Lichtabsorption von Molekülen ist dies anders. Da ein Molekül aus mehreren Atomen besteht, und diese gegeneinander schwingen können, werden zusätzlich Schwingungszustände mit angeregt. Jeder elektronische Zustand ist in mehrere Schwingungszustände unterteilt. Die Schwingungszustände sind wiederum in Rotationszustände unterteilt. Im Gegensatz zu den Linienspektren bei Atomen erhält man für Moleküle daher Bandenspektren. Aber auch für Moleküle gilt: Die Energie des absorbierten Lichtes muss genau der Energiedifferenz zweier elektronischer Zustände entsprechen. Ein Molekül im angeregten Zustand kann die absorbierte Energie auf verschiedene Weise wieder abgeben und damit in den Grundzustand zurückkehren, der meist ein Singulettzustand ist (Ausnahme: O2): Interne Konversion (IC). Bei der internen Konversion wird die absorbierte Energie in kinetische Energie (Schwingung und Rotation des Moleküls, d. h. Wärme) umgewandelt. Die Übergänge erfolgen strahlungslos. Fluoreszenz. Der Übergang vom ersten Singulettzustand in den Grundzustand kann auch unter Abstrahlung eines Photons erfolgen. Die Wellenlänge der abgestrahlten Photonen ist größer (energieärmer) als die der absorbierten Photonen. Fluoreszenz kommt z. B. bei dem Pflanzenpigment Chlorophyll vor. Etwa 3 % der absorbierten Strahlung werden als Fluoreszenzstrahlung emittiert. Dieser Energiebetrag steht somit für die Photosynthese nicht mehr zur Verfügung. Inzwischen sind zahlreiche Moleküle bekannt deren Hauptfunktion im Rahmen der Biolumineszenz die Emission von Fluoreszenzstrahlung ist, z. B. GFP (green fluorescent protein). GFP wird häufig zur Markierung von Biomolekülen verwendet (S. 28). Systemübergang (intersystem crossing). Beim Systemübergang erfolgt ein Übergang vom ersten Singulettzustand in den ersten Triplettzustand. Da es hier-

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2

2 Biophysikalische Grundlagen

bei zu einer Spinumkehr des Elektrons kommt, ist dies ein quantenmechanisch „verbotener“ Übergang, d. h., dieser Vorgang hat eine niedrige Eintrittswahrscheinlichkeit. Phosphoreszenz. Beim Übergang vom ersten Triplettzustand in den Grundzustand wird ein Photon abgestrahlt. Die Phosphoreszenzstrahlung ist energieärmer als die Fluoreszenzstrahlung; zudem ist die Abstrahlung zeitlich verzögert, da der erste Triplettzustand ein metastabiler Zustand ist. Phosphoreszenzstrahlung kann z. B. beim Chlorophyll beobachtet werden. Im Rahmen der Photosynthese bedeutet die Phosphoreszenzstrahlung ebenso wie die Fluoreszenzstrahlung einen Energieverlust. Resonanzenergie-Transfer (Excitonentransfer). Ein Molekül im angeregten Zustand kann die Anregungsenergie (Exciton) auf ein räumlich benachbartes Molekül mit ähnlichen elektronischen Eigenschaften übertragen. Der Übergang erfolgt vom ersten Singulettzustand aus. Hierbei müssen sich das Fluoreszenzspektrum des Spendermoleküls und das Absorptionsspektrum des Akzeptormoleküls überlappen. Die Übertragung erfolgt ähnlich der Schwingungsübertragung bei einem gekoppelten Pendel. Dieser Energietransfer ist in den Lichtsammelkomplexen und Antennenpigmenten der Photosysteme I und II von großer Bedeutung (S. 340 und Botanik). Cyanobakterien und Rotalgen (Rhodophyceae) besitzen Phycobilisomen, welche ebenfalls als Lichtsammler dienen und die absorbierte Lichtenergie dem photosynthetischen Reaktionszentrum zuführen. Photochemische Reaktion. Durch die Anregung kann sich das Elektron weiter vom Molekül entfernen und schließlich ganz abgespalten werden (Photooxidation). Das angeregte Molekül wird oxidiert. Dieser Vorgang ist der zentrale Prozess in der Photosynthese, bei dem ein Elektron eines speziellen Chlorophyllmoleküls aus dem Molekül entfernt wird und somit die photosynthetische Elektronentransportkette antreibt (S. 340 und Botanik, Mikrobiologie). Eine weitere Möglichkeit, in den elektronischen Grundzustand zurückzukehren, besteht in der Umorientierung chemischer Bindungen (Isomerisierung). Dieser Vorgang findet in den Photorezeptoren der Tiere und der lichtgetriebenen Protonenpumpe einiger Halobakterien statt. Die photochemische Reaktion besteht in der Isomerisierung von all-trans-Retinal zu 11-cis- bzw. 13-cis-Retinal ( Zoologie, Mikrobiologie). Die Übergänge zwischen den Energieniveaus werden in einem JablonskiDiagramm dargestellt (Abb. 2.14). Spin und Multiplizität: Ein Orbital kann maximal von zwei Elektronen besetzt werden. Diese Elektronen müssen nach den Regeln der Quantenmechanik einen entgegengesetzten Spin s aufweisen (s = + 1⁄2 bzw. s = – 1⁄2). Bei der Anregung wird ein Elektron in ein energetisch höheres Orbital gehoben. Bleibt der Spin des Elektrons erhalten, so bleibt auch der Gesamtspin S = (+ 12 ) + (– 12 ) = 0 erhalten. Kommt es hingegen zu einer Spinumkehr, weisen beide Elektronen die gleiche Spinrichtung (+ 12 ) auf (dies ist nur möglich, da sich die Elektronen in verschiedenen Orbitalen befinden). Der Gesamtspin S beträgt hier

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2.7 Licht und Leben

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2

Abb. 2.14 Jablonski-Diagramm. Die Unterteilung der elektronischen Niveaus in Schwingungs- und Rotationszustände resultiert in die für Makromoleküle charakteristischen Absorptionsbanden. (+ 12 ) + (+ 12 ) = 1. Die Multiplizität M eines Zustandes berechnet sich nach: M = 2 S + 1. Die Multiplizität gibt die Anzahl verschiedener Zustände an, welche sich auf dem gleichen Energieniveau befinden. Beträgt der Gesamtspin S = 0, so ergibt sich für die Multiplizität der Wert 1. Dies bezeichnet man als den Singulettzustand. Für S = 1 ist M = 3, diese Konstellation wird als Triplettzustand bezeichnet. Triplettzustände liegen energetisch stets unter den entsprechenden Singulettzuständen. Der interessierte Leser sei hier auf die Lehrbücher der Spektroskopie verwiesen.

2.7.3

Messung der Lichtabsorption

Die Bestimmung der Lichtabsorption ist eine wichtige Methode zur Charakterisierung bzw. Bestimmung der Konzentrationen von Biomolekülen, wie Nucleinsäuren ( Genetik), Aminosäuren und Proteinen (S. 148) oder NAD+ und dessen reduzierter Form NADH (S. 225). Die Messungen erfolgen in einem Spektralphotometer oder kurz Photometer. Jedes Molekül besitzt ein charakteristisches Absorptionsspektrum. Als Spektrum bezeichnet man allgemein die Auftragung der absorbierten bzw. emittierten Strahlungsmenge gegen einen elektromagnetischen Parameter (z. B. die Wellenlänge). Die Menge des absorbierten Lichtes ist der Konzentration des Stoffes und der Schichtdicke direkt proportional. Das Ausmaß der Strahlungsabsorption bei der Wellenlänge l wird als Extinktion El bezeichnet. Die Extinktion berechnet sich nach dem Lambert-Beer-Gesetz wie folgt:

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2 Biophysikalische Grundlagen

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El ¼ log

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I0 ¼ el c d I

(2.78)

I0 ist die Intensität des einfallenden Lichtes, I ist die Lichtintensität des Lichtes nach Durchlaufen einer Lösung der Konzentration c (in mol l–1) und der Schichtdicke d (in cm). e ist der molare Extinktionskoeffizient (Einheit: l mol–1cm–1) bei der Wellenlänge l und für jede Substanz eine spezifische Konstante. Als Transmission (Durchlässigkeit) T bezeichnet man den Anteil des Lichtes, der die Probe durchdringen kann: Tl ¼

I ¼ e
e I0

c d

(2.79)

Transmission und Extinktion sind durch die Beziehung El ¼ log

l bzw. Tl ¼ e
E l Tl

(2.80)

miteinander verknüpft.

Chromophor: Lichtabsorbierende Struktur in Molekülen, z. B. konjugierte Doppelbindungen in Chlorophyllen und Carotinoiden. Interne Konversion: Vorgang bei der Umwandlung von absorbierter Lichtenergie in Wärme. Fluoreszenz: Abstrahlung von Photonen aus einem durch Lichtabsorption angeregten Molekül. Die emittierte Strahlung ist energieärmer als die absorbierte. Systemübergang: Bezeichnung für die Änderung des elektronischen Zustandes in einem Molekül. Phosphoreszenz: Abstrahlung von Photonen aus einem durch Lichtabsorption angeregten Molekül, die emittierte Strahlung ist energieärmer als Fluoreszenzstrahlung und zeitlich verzögert. Resonanzenergie-Transfer: Übertragung der Anregungsenergie auf ein räumlich benachbartes Molekül, wichtig bei Antennenpigmenten und Lichtsammelkomplexen der Photosynthese. Photochemische Reaktion: Chemische Reaktion, welche durch Licht angetrieben wird, z. B. Photooxidation, Photoisomerisierung. Spektrum: Auftragung der von einer Substanz absorbierten bzw. emittierten Strahlungsmenge gegen einen elektromagnetischen Parameter. Extinktion: Ausmaß der Strahlungsabsorption durch ein Molekül bei einer bestimmten Wellenlänge. Lambert-Beer-Gesetz: Beschreibt die Abhängigkeit der Extinktion von der Konzentration einer absorbierenden Substanz und der Schichtdicke der Messküvette. Die Extinktion ist der Konzentration und der Schichtdicke direkt proportional, Proportionalitätskonstante ist der molare Extinktionskoeffizient. Molarer Extinktionskoeffizient: Stoffspezifische Konstante für die Extinktion (Einheit: mol · l–1) Transmission: Anteil des Lichtes, der eine Probe durchdringt.

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3.1 Aufbau und Zusammenhalt von Makromolekülen

3

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Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

Constanze Abröll, Katharina Munk

3.1

Aufbau und Zusammenhalt von Makromolekülen

Die organische Substanz aller Zellen sind Kohlenstoffverbindungen, dazu gehören die Aminosäuren, Monosaccharide, Nucleotide und Fettsäuren. Sie sind sowohl Zwischenprodukte des Stoffwechsels als auch Bausteine von großen Molekülen und Makromolekülen, wie den Proteinen, Polysacchariden, Nucleinsäuren und Lipiden. Unterschiedliche Bindungstypen sorgen für die Ausbildung der funktionell wichtigen Raumstrukturen. Dazu gehören die stabilen kovalenten Bindungen als Hauptvalenz-Bindungen und die schwächeren aber ebenso wichtigen Wasserstoffbrücken-Bindungen, Van-der-WaalsKräfte und ionischen Bindungen als Nebenvalenz-Bindungen. Lebende Organismen bestehen zu 99 % aus Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Kohlenstoff. Die herausragende Bedeutung unter diesen Elementen kommt jedoch dem Kohlenstoff zu: Vom Wasser abgesehen sind mit sehr wenigen Ausnahmen alle Moleküle, aus denen lebende Organismen bestehen, Kohlenstoffverbindungen. Sie werden entsprechend als organische Verbindungen bezeichnet. Das Kohlenstoffatom zeichnet sich durch viele Eigenschaften aus, die es zu dieser Rolle befähigen. Das Kohlenstoffatom hat einen kleinen Umfang und besitzt vier Valenzelektronen, mit denen es mit anderen Kohlenstoffatomen Einfach-, Doppel- und Dreifachbindungen eingehen und stabile lange und auch verzweigte Ketten sowie Ringe bilden kann. Die Kettenbildung und die Möglichkeit der Isomerie sind die wesentlichen Voraussetzungen für die Bildung einer unbegrenzten Zahl verschiedener Kohlenstoffmakromoleküle. Da auch Sauerstoff- und Stickstoffatome stabile Doppel- bzw. Dreifachbindungen eingehen können, erhöht sich die Möglichkeit der Bildung von Molekülstrukturen um ein Vielfaches. Bindungen des Kohlenstoffatoms mit anderen Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Wasserstoffatomen sind sehr beständig. Die am Zellaufbau beteiligten Kohlenstoffverbindungen lassen sich in vier Familien unterteilen: Aminosäuren, einfache Zuckermoleküle, Nucleotide und Fettsäuren. Zu einem geringen Teil kommen sie als Zwischenprodukte des Stoffwechsels in gelöster Form im Cytoplasma vor, der wesentlich größere Anteil ist aber als Bausteine in großen Molekülen oder Makromolekülen zu finden, die den Hauptteil der festen Zellsubstanz ausmachen (Tab. 3.1). Die Aminosäuren sind die Bausteine der Proteine (Kap. 4). Zu langen Sacchariden aneinandergereihte Zuckermoleküle sind zum einen wichtige Energiespeicher, zum anderen Struk-

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3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

Tab. 3.1 Ungefähre chemische Zusammensetzung einer Bakterien- und einer Säugetierzelle. Prozent des Zellgesamtgewichts E. coli-Zelle

Säugetierzelle

Wasser

70

70

Proteine

15

18

Polysaccharide

2

2

DNA

1

0,25

RNA

6

1,1

Lipide

2

5

3

monomere Untereinheiten

3

3

anorganische Ionen

1

1

turelemente z. B. in den Zellwänden der verschiedensten Organismen. Nucleotide sind die Bausteine der Nucleinsäuren, DNA und RNA, sie speichern die genetische Information und sind an Transkription und Translation beteiligt. Fettsäuren sind Bestandteile der Lipide. Makromoleküle sind hochmolekulare Verbindungen, sie bestehen aus einigen Tausend dieser Bausteinen, den Monomeren, und werden daher auch als Polymere bezeichnet. Ihre Molekularmassen betragen einige Tausend bis zu einigen Milliarden Dalton. Dalton (Da) ist die in der Biochemie gebräuchliche Einheit der relativen Atom- bzw. Molekülmasse. Es ist ein anderer Name für die atomare Masseneinheit u (unified atomic mass unit): 1 Da = 1 u. Seit 1961 gilt der Wert 1, das entspricht 1/12 der Masse des Kohlenstoffisotops 12C (1 Da = 1,6 605 655 10–27 kg).

Die Lipide werden nicht zu den Makromolekülen gezählt, da ihre Molekularmassen (750–1500 Da) wesentlich geringer sind. Allerdings lagern sich viele Lipidmoleküle nicht kovalent zusammen und bilden so Strukturen wie die Zellmembran. Ebenso lagern sich auch andere Makromoleküle zu noch größeren, supramolekularen Strukturen zusammen, beispielsweise Ribosomen oder Enzymkomplexen.

3.1.1

Verschiedene Bindungstypen bestimmen die Raumstruktur biologischer Makromoleküle

Makromoleküle haben einerseits eine sehr stabile, definierte Raumstruktur, andererseits benötigen sie zur Ausübung ihrer Funktionen eine gewisse Flexibilität und Dynamik. Diese Eigenschaften beruhen auf unterschiedlichen Bindungstypen. Das Rückgrat der organischen Verbindungen besteht aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor und/oder

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3.1 Aufbau und Zusammenhalt von Makromolekülen

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Tab. 3.2 Bindungstypen und deren Bindungsenergie. Bindungstyp

Bindungsenergie [kJmol–1]

Länge [nm]

Proportionalität der Anziehungsenergie U zum Abstand r

Kovalent

250–500

0,1–0,15

U Z r–1

Ionisch

300–700 in wässriger Lösung: I 20

0,2–0,25

U Z r–1

Wasserstoffbrücken

10–30

0,2–0,30

U Z r–2

Van-der-Waals-Kräfte

0,8–8

0,3–0,35

U Z r–4 bis r–7

Schwefel in kovalenter Bindung. Die kovalenten Bindungen sind aufgrund der unterschiedlichen Elektronegativitäten teilweise polar, haben aber keinen Ionencharakter. Kovalente Bindungen auch als Elektronenpaarbindung bezeichnet sind sehr stabil (Tab. 3.2). Eine kovalente Bindung entsteht, wenn sich zwei Atome so nahe kommen, dass sich deren Elektronenorbitale überlappen und es zur Ausbildung eines gemeinsamen Molekülorbitals kommt. Bei einer Doppeloder Dreifachbindung sind die benachbarten Atome über zwei bzw. drei Elektronenpaare verbunden. Bei einer Einfachbindung ist eine freie Drehung der Molekülgruppen längs der Bindung möglich, bei einer Mehrfachbindung nicht bzw. nur sehr begrenzt. Die Bindungsenergie ist die Energiemenge, die aufgewendet werden muss, um die jeweilige Bindung zu lösen. Bei Kristallen wird sie auch Gitterenergie genannt. Bindungen mit einer Bindungsenergie i 50 kJmol–1 werden auch als Hauptvalenz-Bindungen bezeichnet. Hierzu gehören die kovalenten und ionischen Bindungen in Abwesenheit von Wasser. Bei Bindungen mit einer Bindungsenergie I 50 kJmol–1 spricht man häufig von Nebenvalenz-Bindung. Hierzu gehören die Wasserstoffbrücken-Bindungen, Vander-Waals-Kräfte und die ionischen Bindungen.

Für die Raumstruktur von Makromolekülen in der Zelle spielen nicht kovalente Bindungen die dominierende Rolle. Dazu gehören ionische Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Kräfte und Wasserstoffbrücken-Bindungen. Der Einzelbeitrag einer solchen Bindung ist sehr gering. Letztlich beruht die Wirkung der nicht kovalenten Bindungen auf der Vielzahl solcher Bindungen. Nicht kovalente Bindungen bilden sich zwischen verschiedenen Bereichen des gleichen Makromoleküls, aber auch zwischen verschieden Makromolekülen aus. Lokal können sie leicht gelöst werden, d. h. einerseits bestimmen sie die Struktur der Moleküle, sorgen andererseits aber auch für eine ausreichende Flexibilität, die für die verschiedensten Wechselwirkungen und damit Funktionen der Moleküle nötig ist. Übersteigt die Differenz der Elektronegativität zwischen zwei Atomen einen bestimmten Wert, so wird ein Elektron vollständig von einem Atom auf das andere Atom übertragen. Das negativ geladene Atom wird als Anion bezeichnet, das positiv geladene als Kation. Das Produkt, die Ionenverbindung, wird als Salz

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3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

bezeichnet. Es kommt zur Ausbildung der sehr stabilen Kristall- bzw. Ionengitter. In Wasser wird die elektrostatische Anziehung der Ionen untereinander durch die Moleküle des Lösungsmittels vermindert (S. 32, Tab. 3.2). Obwohl sie in wässrigen Lösungen verhältnismäßig schwach sind, sind ionische Wechselwirkungen in biologischen Systemen außerordentlich wichtig. Sie spielen z. B. bei Enzymreaktionen eine Rolle (S. 205). Im Unterschied zu den Verhältnissen in einem Salzkristall besteht in einem Protein eine mehr oder weniger gerichtete Wechselwirkung zwischen den ionisierten Gruppen. Man spricht hier auch von einer Salzbrücke. Unter der Bezeichnung Van-der-Waals-Kräfte werden Wechselwirkungen zwischen ungeladenen Molekülen zusammengefasst. Bei den Molekülen kann es sich um polare oder unpolare Verbindungen handeln. Polare Moleküle besitzen ein permanentes Dipolmoment. Bei der Wechselwirkung zweier Dipole spricht man auch von Dipol-Dipol-Wechselwirkung. Diese Anziehungskräfte sind elektrostatischer Natur. Ein permanenter Dipol kann in einem unpolaren Molekül durch Verschiebung von dessen Elektronenwolke ein Dipolmoment induzieren; die Moleküle orientieren sich dann entsprechend ihrer Polarisierung. Auch zwischen unpolaren Molekülen bzw. Atomen bestehen Anziehungskräfte. Durch Fluktuationen in der Elektronenwolke entstehen bei unpolaren Molekülen kurzlebige, sogenannte momentane Dipole. Diese momentanen Dipole sind in der Lage, in einem räumlich benachbarten Molekül ein entsprechendes Dipolmoment zu induzieren. Diese Art der Wechselwirkung wird auch als Dispersionsoder London-Wechselwirkung bezeichnet. Häufig wird der Begriff Van-derWaals-Kräfte nur für die Dispersions-Wechselwirkungen verwendet. Ein Molekül tritt über die gesamte Oberfläche mit anderen Molekülen in Wechselwirkung. Die insgesamt für ein Molekül resultierenden Van-der-Waals-Kräfte sind daher von dessen Oberfläche abhängig; bei Makromolekülen werden diese dominierend. Unterschreiten aber benachbarte Moleküle einen bestimmten Mindestabstand, so kommt es aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen zu einer Abstoßung. Der optimale Abstand ist abhängig von den jeweiligen Atomen und wird durch deren Van-der-Waals-Radius bestimmt (Abb. 3.1). Zwei Atome können sich daher praktisch nicht überlappen; eine Tatsache, die z. B. die Bindungswinkel in einer Polypeptidkette begrenzt. Der Van-der-WaalsRadius wird bei der Darstellung von Molekülen durch das Kalottenmodell anschaulich. Wasserstoffbrücken-Bindungen bilden sich sowohl innerhalb eines Moleküls als auch zwischen verschiedenen Molekülen aus. Hierbei kommt es zur Anziehung zwischen einem Atom mit mindestens einem freien Elektronenpaar und einem Wasserstoffatom, das kovalent an ein elektronegatives Atom gebunden ist und dadurch polarisiert vorliegt (Tab. 3.3). Das Atom bzw. die Molekülgruppe mit dem freien Elektronenpaar wird als Wasserstoffakzeptor, die wasserstofftragende Gruppe als Wasserstoffdonor bezeichnet. Die Stärke der Wasserstoffbrücken-Bindung ist abhängig von der Orientierung der beiden Gruppen (Tab.

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3.1 Aufbau und Zusammenhalt von Makromolekülen

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Abb. 3.1 Van-der-Waals-Radius. Dargestellt ist die Energie als Funktion des Abstandes zweier Atome: Bis zu ihrem optimalen Van-der-Waals-Abstand ziehen sich die Atome an. Bei dichterer Packung nimmt die Abstoßung wieder zu.

3.2). Sie erreicht ein Maximum, wenn Wasserstoffakzeptor und Wasserstoffdonor linear angeordnet sind. Eine besondere Rolle spielen die Wasserstoffbrücken-Bindungen bei der Ausbildung der Wasserstruktur (S. 30). Viele Proteine enthalten Metallionen, die ebenfalls kovalent gebunden sind. Eine solche Komplex- bzw. Koordinationsverbindung besteht aus dem zentralen Metallatom oder -ion, das von mehreren Molekülen oder Ionen, den sogenannten Liganden, umlagert wird. Der Ligand stellt beide Elektronen, häufig aus einem nicht bindenden Elektronenpaar, für die gemeinsame kovalente Bindung zur Verfügung. Einige Liganden gehen mehrere Koordinationsverbindungen mit einem Zentralatom ein. Diese Komplexe werden als Chelate (lat. chelae: Krebsscheren) bezeichnet. Somit können auch Metallproteine als Chelate aufgefasst werden. Die bekanntesten Chelate in der Biologie sind die Metall-Porphyrin-Komplexe Häm und Chlorophyll (S. 236). Pflanzenfarbstoffe, wie Anthocyane, ( Botanik), bilden ebenfalls Chelate, bevorzugt mit Eisen, Aluminium und Kupfer, aus. Tab. 3.3 Reaktive Gruppen, die WasserstoffbrückenBindungen ausbilden. reaktive Gruppe

Donor

Akzeptor

Hydroxyl- –OH

+

+

Thiol- –SH

+

+

Carbonyl- A C==O

–

+

Amino- –NH2

+

+

Imino- ==NH

+

+

O || Amido- –C–NH2

+

+

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3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

Makromoleküle: Moleküle, mit einer Molekularmasse von mindestens einigen Tausend Dalton. Dazu gehören Proteine, Polysaccharide oder Nucleinsäuren, die aus den Bausteinen Aminosäuren, Einfachzucker und Nucleotide zusammengesetzt sind. Dalton (Da): Einheit der relativen Atom- bzw. Molekülmasse, entspricht 1/12 der Masse des Kohlenstoffisotops 12C. Kovalente Bindung: Stabile Bindung zwischen zwei Atomen durch Ausbildung eines gemeinsamen Molekülorbitals. Richtgröße für die Bindungsenergie 400 kJ/mol. Wasserstoffbrücken-Bindungen: Anziehung zwischen einem Atom mit einem freien Elektronenpaar und einem H-Atom, das durch kovalente Bindung an ein elektronegatives Atom polarisiert ist. Richtgröße für die Bindungsenergie 40 kJ/mol. Ionische Wechselwirkungen: Anziehung zwischen zwei Atomen mit stark unterschiedlicher Elektronegativität, bei der es zur Übertragung eines oder mehrerer Elektronen kommt. Richtgröße für die Bindungsenergie in wässriger Lösung 20 kJ/mol. Van-der-Waals-Kräfte: Wechselwirkungen zwischen ungeladenen Molekülen. Richtgröße für die Bindungsenergie 5 kJ/mol.

3.2

Kohlenhydrate

Kohlenhydrate sind die häufigsten Biomoleküle auf der Erde. Entsprechend vielfältig sind ihre Funktionen in Lebewesen: Sie werden als Energiespeicher und -lieferanten verwendet; sind Bestandteile der Nucleinsäuren; dienen als Gerüst- und Stützsubstanzen in Zellwänden von Bakterien, Pilzen und Pflanzen, im Außenskelett von Arthropoden oder im Bindegewebe der tierischen Organismen. Sie sind Bestandteil der Zellmembranen und an Zellerkennungsvorgängen beteiligt. Die einfachsten Kohlenhydrate sind die Monosaccharide, die über a- oder b-glykosidische Bindungen miteinander verknüpft werden können. Nach der Anzahl der miteinander verknüpften Zuckermoleküle unterscheidet man Disaccharide (2 Einheiten), Oligosaccharide (3 – max. 50 Einheiten) oder Polysaccharide (mehr als 50 Einheiten).

3.2.1

Monosaccharide

Hinter dem Begriff Kohlenhydrate (Saccharide) verbirgt sich die Naturstoffklasse der Zucker und Zuckerderivate (z. B. Aminozucker). Einfachzucker oder Monosaccharide sind chemisch Polyhydroxyaldehyde oder -ketone mit der allgemeinen Summenformel Cn (H2O)n, daher auch die Bezeichnung „Kohlen(stoff)Hydrat“ (Abb. 3.2). Nach der Anzahl der Kohlenstoffatome werden die Aldosen oder Ketosen (Abb. 3.2) auch als Triosen (3), Tetrosen (4), Pentosen (5), Hexosen (6) und Heptosen (7) bezeichnet.

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3.2 Kohlenhydrate

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Die kleinsten Monosaccharide sind die Triosen: Glycerinaldehyd und Dihydroxyaceton. Glycerinaldehyd besitzt ein asymmetrisches C-Atom. Daher gibt es zwei Enantiomere, die eine Rechts- bzw. Linksdrehung von polarisiertem Licht verursachen (S. 115). Die beiden Stereoisomere werden nach der FischerProjektionsformel als D- und L-Form bezeichnet. Wird das Kohlenstoffgerüst um jeweils eine HCOH-Einheit verlängert, so lassen sich Zuckerstammbäume für die Aldosen bzw. Ketosen aufstellen (Abb. 3.3). Die meisten natürlich vorkommenden Zucker gehören zur D-Reihe (S. 115). In wässriger Lösung können bei Aldopentosen, Aldo- oder Ketohexosen und höheren Zuckern die funktionellen Gruppen innerhalb eines Moleküls reagieren. Dabei erfolgt durch nucleophile Addition einer Hydroxylgruppe an die Carbonylbzw. Ketogruppe eine intramolekulare Ringbildung unter Ausbildung eines Hemiacetals bzw. Hemiketals. Reagiert die C1-Aldehydgruppe mit der Hydroxylgruppe am C5, bildet sich ein 6er-Ring aus. Solche Zucker nennt man Pyranosen. Reagiert die Aldehydgruppe am C1 mit der Hydroxylgruppe am Kohlenstoff in Position 4, kommt es zur Bildung eines 5er-Ringes, einer Furanose (Abb. 3.5). In die Gruppe der Furanosen gehören die beiden Pentosen, Ribose und Desoxyribose, ebenso wie die Hexose Fructose bei der der Ringschluss zwischen der Ketogruppe an C2 und der Hydroxylgruppe am C5 erfolgt. Thermodynamisch sind die zyklischen Hemiacetale stabiler als die entsprechenden azyklischen Moleküle. Bei der Hemiacetalbildung entsteht durch den Ringschluss ein weiteres chirales Zentrum, das als anomeres Kohlenstoffatom bezeichnet wird. Es können zwei Ringformen entstehen, die a- und die b-Form. In der a-Form steht die Hydroxylgruppe am anomeren Kohlenstoffatom unterhalb der Ringebene, in der b-Form oberhalb (Abb. 3.5). In wässrigen Lösungen wandeln sich die Hemiacetale über die offene Kettenform in einem als Mutarotation bezeichneten Prozess ineinander um. Beispielsweise liegen im Gleichgewichtszustand 34 % a-D-Glucose, 63 % b-D-Glucose und 3 % in offener Kettenform vor. Die b-Form ist thermodynamisch stabiler, da sämtliche Hydroxylgruppen äquatorial liegen. Äquatoriale Hydroxylgruppen haben den größtmöglichen Abstand voneinander, wodurch die Abstoßungskräfte untereinander minimiert werden. Die offene Kettenform ist verantwortlich für die positiven Nachweisreaktionen der Glucose.

Abb. 3.2 Aldosen und Ketosen. Kohlenhydrate lassen sich von Polyalkoholen ableiten, wobei eine Hydroxylgruppe zu einer Carbonylgruppe oxidiert wird. Wird eine primäre Hydroxylgruppe oxidiert, so erhält man ein Aldehyd; die Oxidation einer sekundären Hydroxylgruppe führt zur Bildung eines Ketons.

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3.2 Kohlenhydrate

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m Abb. 3.3 Stammbaum der Aldosen. Das am weitesten von der Aldehydgruppe entfernte asymmetrische *C-Atom (rot) besitzt die gleiche Konfiguration wie D-Glycerinaldehyd und bestimmt die Zuordnung zur D-Reihe. Die biologisch wichtigsten D-Aldosen sind unterlegt. Über den Merkspruch lassen sich die acht Aldosen mit sechs C-Atomen leicht einprägen.

3

Abb. 3.4 Stammbaum der biologisch wichtigsten Ketosen. Dihydroxyaceton, der einfachste Zucker der Ketosen, ist optisch inaktiv. Da Ketosen ein asymmetrisches Zentrum weniger besitzen als Aldosen mit der gleichen Anzahl an C-Atomen, gibt es erst bei C4-Ketosen D- und L-Isomere.

Abb. 3.5 Hemiacetale und -ketale. a Bildung einer Pyranose unter Ausbildung eines Hemiacetals. b Bildung einer Furanose am Beispiel einer intramolekularen Anlagerung der Hydroxylgruppe an eine Ketogruppe (Hemiketal).

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3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

n Zucker mit einer freien Aldehydgruppe werden im stark alkalischen Milieu durch leichte Oxidationsmittel zu einer Carbonsäure oxidiert. Ebenso Zucker mit einer freien Ketogruppe, die aufgrund intramolekularer Protonenwanderung im alkalischen Medium auch in Aldehydform vorliegt. Da die Oxidationsmittel bei der Nachweisreaktion reduziert werden, nennt man diese Saccharide auch reduzierende Zucker. Als Oxidationsmittel werden zweiwertige Kupferionen (FehlingsReagenz) verwendet. Bei der Umsetzung fällt aus der blauen Kupfer(II)-Salzlösung rotes Kupfer(I)oxid aus (Abb. 3.6). Die Fehling-Reaktion wurde früher zum Nachweis von Diabetes verwendet. Ein anderes Oxidationsmittel ist ammoniakalische Silber(I)-Salzlösung (Tollens-Reagenz). Aus der farblosen Silber(I)-Salzlösung fällt bei der Reduktion durch Aldehyde elementares Silber aus, das sich im Reagenzglas als Silberspiegel absetzt. Heute kommt die Glucose-OxidaseMethode für den spezifischen Nachweis von Glucose am häufigsten zur Anwendung. Das Enzym oxidiert Glucose zur Gluconsäure. Das dabei entstehende H2O2 wird in einer Farbreaktion nachgewiesen. Auf dieser Reaktion beruhen z. B. die Teststreifen zur Selbstkontrolle des Blutzuckerspiegels bei Diabetikern oder zur Messung der Glucosekonzentration im Urin. Beim optisch enzymatischen Test wird die Glucose zunächst zu Glucose-6-phosphat phosphoryliert und erst in einem zweiten Schritt zu Gluconolacton oxidiert, wobei gleichzeitig NADP(H) entsteht, dessen Konzentration ebenfalls photometrisch bestimmt werden kann (Abb. 6.3). m Ein zyklisches Monosaccharid ist nicht planar, sondern es nimmt im Falle eines sechsgliedrigen Ringes eine stabile Wannen- oder Sesselkonformation ein (Abb. 3.18, Abb. 3.7). Die Sesselkonformation von Pyranoseringen ist energetisch begünstigt. In dieser Konformation haben alle C–C-Bindungen den spannungsfreien Tetraederwinkel. Je nach Stellung zum Ringgerüst unterscheidet man äquatoriale und axiale Bindungspartner. Die äquatorialen Bindungen liegen in der Ebene (= Ringebene), die senkrecht zu einer gedachten Ringachse steht. Die axialen Bindungen liegen parallel zur Ringachse, sie liegen also über oder unter der Ringebene. Eine Sesselkonformation kann in eine andere überführt werden, wobei die äquatorialen zu axialen Bindungspartnern und die axialen zu äquatorialen werden. Auch Furanoseringe liegen nicht planar vor. Sie nehmen eine stabile

Abb. 3.6 Fehling-Reaktion.

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3 Abb. 3.7 Fischer-, Haworth- und Sesselform.

Konformation ein, bei der vier Atome nahezu in einer Ebene liegen und das Fünfte sich außerhalb der Ringebene befindet (Briefumschlagform). Zyklische Monosaccharide werden unterschiedlich dargestellt. Eine Möglichkeit ist die Fischer-Projektionsformel (S. 117). Übersichtlicher ist die Haworth-Projektionsformel. Hier wird der Ring planar dargestellt. Die Bindungspartner, die in der Fischer-Projektion rechts liegen, werden in der Haworth-Projektionsformel unter die Ringebene geschrieben; alle Bindungspartner, die in der Fischer-Projektion links liegen, werden in der Haworth-Projektion über die Ringebene geschrieben. Die Beschreibung einer zyklischen Verbindung in Sesselkonformation ist relativ wirklichkeitsgetreu.

3.2.2

Oligo- und Polysaccharide

Bei der Reaktion eines Hemiacetals mit einer Hydroxylgruppe entsteht unter Wasserabspaltung ein Vollacetal. Solche Verbindungen werden als Glykoside bezeichnet (Abb. 3.8) und die Bindung als O-glykosidische Bindung. Hierbei zu beachten ist, dass die halbacetalische Hydroxylgruppe a- oder b-konfiguriert sein kann, wodurch eine a- oder b-glykosidische Bindung zu unterscheiden ist. Eine N-glykosidische Bindung entsteht, wenn die Wasserabspaltung zwischen der Hydroxylgruppe des Halbacetals und einer NH-Gruppe erfolgt. N-glykosidische Bindungen finden sich z. B. in den Nucleotiden (S. 105).

Reagiert die besonders reaktionsfreudige Hydroxylgruppe am anomeren C-Atom eines Zuckers mit einer Hydroxylgruppe eines anderen Zuckers, entsteht ein Disaccharid (Abb. 3.8). Da mehrere Hydroxylgruppen für die Bindung in Frage kommen, bestehen bei der Bildung eines Disaccharids mehrere Möglichkeiten. Reagieren die Hydroxylgruppen der beiden anomeren C-Atome miteinander, entstehen Disaccharide vom Trehalose-Typ. Diese Disaccharide, der wichtigste Vertreter ist die Saccharose, wirken nicht reduzierend. Vom Maltose-Typ spricht man, wenn die Hydroxylgruppe am anomeren C-Atom des einen Zuckermoleküls mit einer der anderen zahlreichen Hydroxylgruppen z. B. am C2, C4, C6 des zweiten Zuckermoleküls reagiert. Diese entstehenden Verbindungen behalten eine freie Halbacetalgruppe und damit ihre reduzierende Wirkung. Sie können eine weitere Glykosidbindung eingehen. Setzt sich die Reaktion mit einem weiteren Zuckermolekül fort, entstehen Trisaccharide und schließlich die entsprechenden

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Abb. 3.8 Häufig vorkommende Disaccharide. In diesem Fall reagieren zwei Glucosemoleküle unter Wasserabspaltung zu Maltose. Die Halbacetalgruppe des zweiten Glucosemoleküls bleibt frei und könnte eine weitere glykosidische Bindung eingehen. In der Saccharose sind beide anomeren C-Atome an der Reaktion beteiligt. Saccharose ist daher im Gegensatz zu Maltose kein reduzierender Zucker.

höheren Oligosaccharide mit vier bis maximal fünfzig Einheiten oder Polysaccharide. Polysaccharide bestehen aus mehr als 50, meist aber mehreren Hundert bis mehreren Tausend Zuckerresten, die je nach der Art der glykosidischen Bindungen als verzweigte oder unverzweigte Ketten vorliegen. Nach ihrer Zusammensetzung lassen sich drei Gruppen unterscheiden: Homoglykane enthalten nur eine Sorte eines Monosaccharids als Baustein; Heteroglykane setzen sich aus verschiedenen Zuckern zusammen. Zu den Glykokonjugaten werden Verbindungen gezählt, die aus Polysacchariden und einer anderen chemischen Komponente, wie Lipiden oder Proteinen bestehen. Polysaccharide haben verschiedene Funktionen: Die wichtigsten Reservestoffe in der Natur sind die Homoglykane Stärke und Glykogen (Abb. 3.9a), die beide aus Glucose bestehen. In der Zelle tragen sie aufgrund ihrer Molekülgröße im Gegensatz zu dem Monosaccharid kaum zum osmotischen Druck bei.

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3.2 Kohlenhydrate

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Abb. 3.9 Die Struktur von Reserve- und Strukturpolysacchariden. a Stärke besteht aus unverzweigter Amylose und der verzweigten Form, Amylopektin. Glykogen hat eine ähnliche Struktur wie Amylopektin, ist jedoch stärker verzweigt und kompakter. Die zellulären Glykogengranula (ca. 0,1 mm) sind im Vergleich zu den Stärkegranula (ca. 1 mm) wesentlich kleiner. b Die wichtigsten Gerüstpolysaccharide.

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3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

Stärke ist der pflanzliche Reservestoff. Hohe Konzentrationen an Stärke sind vor allem in Speicherorganen wie Knollen oder Samen zu finden. Stärke liegt in Form von zwei verschiedenen Polymeren vor: Amylose und Amylopektin. Amylose besteht aus 250–1000 Glucoseeinheiten, die zu einer langen Kette verknüpft sind. Die a-glykosidischen Bindungen bewirken eine schraubenförmige Anordnung. Amylopektin besteht aus bis zu 5000 Glucoseeinheiten. Das Polymer ist stark verzweigt: An die über a1p4-Bindungen verknüpften Hauptketten sind nach jeweils 20–30 Glucoseeinheiten unterschiedlich lange Seitenketten a1p6-glykosidisch gebunden. Glykogen ist der Reservestoff der Tiere. Es ist ähnlich wie Amylopektin aufgebaut, besitzt jedoch einen höheren Verzweigungsgrad, da jede achte bis zwölfte Glucoseeinheit eine Seitenkette trägt. Glykogen enthält bis zu 100 000 Glucoseeinheiten. Auch verschiedene Mikroorganismen sind in der Lage, Stärke (photosynthetische Algen wie Chlamydomonas) und Glykogen (Bakterien) als Energiespeicher zu synthetisieren; sie verwenden jedoch auch andere Polymere aus Kohlenhydrateinheiten oder anderen Monomeren als Energiespeicher. Die wichtigsten strukturbildenden Polysaccharide sind Cellulose, Chitin und Murein (Abb. 3.9b). Die Verknüpfung der Bausteine über b1p4-Glykosidbindungen führt zu lang gestreckten Polymeren: Cellulose ist der Hauptbestandteil der pflanzlichen Zellwände. Das Homoglykan besteht wie Glykogen und Stärke aus Glucose. Durch die b-Verknüpfung der Glucoseeinheiten sind die Makromoleküle langgestreckt. Cellulose ist die häufigste organische Verbindung auf der Erde, es werden pro Jahr ca. 1015 kg Cellulose von Pflanzen synthetisiert. Chitin. In diesem linearen Molekül sind N-Acetylglucosamin-Einheiten miteinander verknüpft. Chitin ist in der Zellwand von Pilzen sowie manchen Algen enthalten und ist der Hauptbestandteil des Exoskeletts der Arthropoda (Gliedertiere) ( Mikrobiologie, Zoologie). Murein (Peptidoglykan) ist der Hauptbestandteil der Bakterienzellwand. Murein ist analog zu Chitin aufgebaut und wird wie Chitin z. B. von Lysozym gespalten (S. 214). Im Gegensatz zu Chitin ist Murein ein Heteroglykan und besteht aus alternierenden N-Acetylglucosamin- und N-Acetylmuraminsäureeinheiten. Quervernetzungen erfolgen durch kurze Peptide, deren Zusammensetzung von der Bakterienart abhängig ist ( Mikrobiologie). Wichtige Glykokonjugate sind die Glykoproteine und die Proteoglykane. Bei eukaryotischen Zellen sind praktisch alle sekretorischen Proteine glykosyliert. Die Synthese der Glykoproteine beginnt mit der Bildung der Polypeptidkette am rauen Endoplasmatischen Retikulum. Im ER-Lumen werden kurze, häufig verzweigte Oligosaccharid-Seitenketten, die aus verschiedenen Komponenten bestehen, O-glykosidisch mit der Hydroxylgruppe eines Serin- oder Threoninrests oder N-glykosidisch an die Amidgruppe eines Asparaginrests der Polypeptidkette gebunden (S. 404). Die weiteren Modifikationen der Zuckerseitenketten

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3.2 Kohlenhydrate

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erfolgen im Golgi-Apparat. Glykoproteine haben wichtige Funktionen im Zellstoffwechsel, bei Erkennungsvorgängen und als Bestandteile von Membranen (S. 473). Bei tierischen Organismen kommen Glykoproteine in Form der Mucine in Körperschleimen oder z. B. als Plasmaproteine im Blut vor. Als Immunglobuline spielen sie eine wichtige Rolle im Immunsystem ( Zoologie). Auch Zoologie) gehören zu dieser Gruppe. Hormone der Hypophyse ( Proteoglykane sind vor allem Gerüstsubstanzen in tierischen Organismen, sie enthalten lange sich vielfach wiederholende Disaccharideinheiten, die entweder direkt oder bei längeren Ketten über sogenannte Core-Kohlenhydratstrukturen an das Protein gebunden sind. Proteoglykane sind – häufig mit Hyaluronsäure assoziiert – Bestandteil der extrazellulären Matrix tierischer Gewebe (S. 478). Glykoproteine und Proteoglykane sind nicht die einzigen Zellbestandteile mit komplexen Polysaccharidketten. Auch manche Lipide enthalten kovalent gebundene Oligosaccharidketten. Die schon erwähnten Glykolipide sind wichtige Membranbestandteile. Lipopolysaccharide in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien sind die Hauptangriffsorte der Immunabwehr bei einer bakteriellen Infektion. Viele membranständige Proteine und Lipide sind glykosyliert. Die teilweise sehr großen und komplexen Kohlenhydratstrukturen spielen z. B. eine Rolle bei der Zell-Zell-Erkennung und inzwischen sind zahlreiche Rezeptoren bekannt, die mit hoher Affinität an bestimmte Kohlenhydratstrukturen binden. Solche kohlenhydratbindenden Proteine wurden schon vor über 100 Jahren aus Pflanzen isoliert. Aufgrund ihrer Eigenschaften, Erythrocyten zu agglutinieren und zwischen Erythrocyten verschiedener Blutgruppen zu selektieren, wurden sie zunächst als Phytoagglutinine und in den 50er Jahren dann allgemein als Lektine (lat. legere: auswählen) bezeichnet. In Pflanzen haben Lektine u. a. eine Schutzfunktion gegenüber Parasiten, z. B. Pilzen oder Bakterien. Sie sind am schnellen Wundverschluss der Siebröhren beteiligt, um die Ausbreitung von Pathogenen Botanik). In der Wirkung wären Lektine damit über das Gefäßsystem zu verhindern ( den Antikörpern der Wirbeltiere vergleichbar. Im Unterschied zu den Antikörpern ist das Erkennungsrepertoire der Lektine, mit meist zwei oder mehr Kohlenhydrat-Bindungsstellen, aber genetisch festgelegt und damit eingeschränkt. Für einige Leguminosen ist eine lektinabhängige Bindung der Knöllchenbakterien an die Wurzelhaarzellen nachgewiesen worden. Mittlerweile sind mehr als 100 verschiedene Lektine und deren Erkennungsstrukturen bekannt. Beispielsweise bindet Concanavalin A, ein Protein welches im Samen der Schwertbohne (Canavalia ensiformis) in relativ hoher Konzentration vorkommt, spezifisch an nicht reduzierende, endständige a-Mannosereste. Ein weiteres gut charakterisiertes Lektin ist das Weizenkeimagglutinin (WGA, wheat germ agglutinine). Dieses tetramere Lektin bindet an N-Acetylglucosaminreste. Ein gut untersuchtes Beispiel bei Tieren ist der Galactose/N-Acetyl-Galactose (Gal/ GalNAc)-Rezeptor. Dieses membranständige Lektin kommt auf der Oberfläche von Hepatocyten vor und bindet endständige Gal- bzw. GalNAc-Reste, was zur rezeptorvermittelten Endocytose führt. Dieser Mechanismus ist Teil der Reinigungsfunktion der Leber, indem gealterte Glykoproteine oder auch Erythrocyten mit freistehenden Gal- bzw. GalNAc-Resten aus dem Blut herausgefiltert und abgebaut werden. Normalerweise ist Gal/GalNAc nicht der endständige Kohlenhydratrest, sondern der vorletzte. Erst nach Hydrolyse des endständigen Kohlenhydratrestes, meist N-Acetylneuraminsäure, wird der Gal/GalNAc-Rest zugänglich. Auch viele Zelladhäsionsmoleküle gehören zu den Lek-

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tinen, da sie spezifisch an die Kohlenhydratstrukturen der extrazellulären Proteoglykane binden (S. 479). Innerhalb der Zellen sind Lektine am Sortierungsmechanismus für Vesikel bzw. Proteine vom Golgi-Apparat beteiligt. Beispielsweise ist ein endständiger Mannose-6-phosphat-Rest ein Sortierungssignal für Lysosomen (S. 430). Auf der spezifischen Erkennung von Kohlenhydratstrukturen durch Lektine beruht auch die Befruchtung der Eizelle durch Spermien. Aus der Zona pellucida konnte ein Glykoprotein isoliert werden, welches für die Spermienbindung notwendig ist. Bei diesem Glykoprotein stellt der Kohlenhydratanteil die Bindungsstelle für das Spermium dar, der Proteinanteil alleine ist hierzu nicht in der Lage. Lektine sind auch im Labor ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung zellulärer Strukturen bzw. Mechanismen. Beispielsweise werden mit unterschiedlichen Lektinen bestimmte Kohlenhydratstrukturen auf Membranoberflächen markiert. Durch Kopplung der Lektine mit elektronendichten Markern, etwa Ferritin, kann mithilfe elektronenmikroskopischer Aufnahmen auf die Lokalisation der Kohlenhydratstrukturen geschlossen werden. Diese Technik ist im Prinzip eine Weiterentwicklung der oben erwähnten Erythrocyten-Agglutinations-Experimente. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von WGA zur Untersuchung von Transportvorgängen am Zellkern. Viele Proteine der Kernpore besitzen O-glykosidisch gebundene N-Acetylglucosaminreste. Die Bindung von WGA an diese Strukturen führt zum Erliegen der meisten Kerntransportvorgänge (S. 394).

Monosaccharide, Einfachzucker: Polyhydroxyaldehyde oder Polyhydroxyketone, die kleinsten Monosaccharide sind Glycerinaldehyd und Dihydroxyaceton mit 3 C-Atomen. Bausteine der Gerüst- und Speicherpolysaccharide. Reduzierende Zucker: Besitzen eine freie Aldehydgruppe, lassen sich mit Fehlings- oder Tollensreagenz nachweisen. Hemiacetal und Hemiketale: intramolekulare Ringbildung durch nucleophile Addition einer Hydroxylgruppe an die Carbonyl- bzw. Ketogruppe bei Aldopentosen, Aldo- oder Ketohexosen und höheren Zuckern. Bei der Ringbildung entsteht ein weiteres anomeres C-Atom. – Pyranosen: Reagiert die C1-Aldehydgruppe mit der Hydroxylgruppe am C5, bildet sich ein 6er-Ring aus. – Furanosen: Reagiert die Aldehydgruppe am C1 mit der Hydroxylgruppe am Kohlenstoff in Position 4, oder die Ketogruppe am C2 mit der Hydroxylgruppe am C5 kommt es zur Bildung eines 5er-Ringes. O-glykosidische Bindung: Reaktion einer halbacetalischen oder halbketalischen Hydroxylgruppe mit der Hydroxylgruppe eines anderen Zuckers unter Wasserabspaltung. Reservepolysaccharide: a1p4- und a1p6-Bindung, schraubenförmige Anordnung: – Stärke: Gemisch aus Amylose (250–1000 Glucosereste, unverzweigt) und Amylopektin (–100 000 Glucosereste), Verzweigungen nach 20–30 Glucoseresten. – Glykogen: (–100 000 Glucosereste), Verzweigungen nach 8–12 Glucoseresten. Strukturbildende Polysaccharide: b1p4-Bindung, lineare Anordnung: – Cellulose: Homoglykan aus Glucose. – Chitin: Homoglykan aus N-Acetylglucosamin. – Murein: Heteroglykan aus N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure.

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3.3 Nucleinsäuren

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Nucleinsäuren

Die Nucleinsäuren, DNA und RNA, sind als Träger bzw. Übermittler der genetischen Information an Transkription und Translation beteiligt. Bausteine der Nucleinsäuren sind die Nucleotide, die aus einer Pentose (RNA: Ribose, DNA: Desoxyribose), einem Phosphatrest und einer von vier bzw. fünf verschiedenen Basen bestehen. Adenin und Guanin sind Purinbasen, Thymin, Uracil und Cytosin Pyrimidinbasen. Thymin kommt ausschließlich in DNA vor, Uracil stattdessen in der RNA. Die Nucleotide sind über Phosphodiesterbrücken verknüpft. Das kovalente Rückgrat der Nucleinsäuren wird von den Phosphat- und Pentoseresten gebildet, die genetische Information ist in der Abfolge der Basen codiert. Nucleotide sind nicht nur Bausteine der Nucleinsäuren, sondern auch als Energieträger an Stoffwechselreaktionen beteiligt, sie wirken als sekundäre Botenstoffe und sind Bestandteile zahlreicher anderer Verbindungen, z. B. der Cofaktoren. Bei allen Organismen lassen sich zwei Klassen von Nucleinsäuren unterscheiden: DNA (deoxyribonucleic acid) und RNA (ribonucleic acid). Sowohl in Proals auch in Eukaryoten sind sowohl DNA als auch RNA vorhanden, wobei die Genetik) dient, DNA überwiegend als Speicher der genetischen Information ( während die RNA vorwiegend für die Übertragung der genetischen Information verantwortlich ist. Dagegen besitzen Viren immer nur eine Art von Nucleinsäuren, entweder DNA oder RNA ( Mikrobiologie). Die gesamte DNA einer Zelle wird als Genom bezeichnet. Die Genomgrößen sind bei den verschiedenen Organismen sehr unterschiedlich (Tab. 3.4). Die DNA kommt bis auf wenige Ausnahmen immer als Doppelhelix vor. Die Helix ist normalerweise rechtsgängig. Sie besitzt eine große und eine kleine Furche. Es existieren zwei isomere Helixformen, die A- und die B-Form, wobei in vivo die DNA hauptsächlich in der flexibleren B-Form vorliegt (Abb. 3.10, Tab. 3.4). Unter besonderen Bedingungen entsteht die linksgängige Z-DNA ( Genetik). In den Zellen ist die DNA mit Proteinen assoziiert, die die z. B. in einer menschlichen Zelle bis zu 2 m langen DNA-Stränge so kondensieren und zu übergeordneten Strukturen aufwickeln, dass sie in die nicht einmal 10 mm großen Zellkerne passen. Die RNA ist mit Ausnahme einiger viraler Genome einzelsträngig. Einzelne Bereiche innerhalb der RNA-Moleküle sind zu kurzen Doppelsträngen zusammengelagert und bilden definierte, für die jeweilige Funktion wichtige Raumbzw. Sekundärstrukturen aus. Die verschiedenen RNA-Moleküle werden nach ihren biologischen Funktionen eingeteilt: x Boten- oder Messenger-RNA (mRNA). Abschrift der DNA (Matrize) für die Proteinsynthese.

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104

3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

ribosomale RNA (rRNA). Struktureller und katalytischer Bestandteil der Ribosomen. x Transfer-RNA (tRNA). Adaptermolekül zwischen mRNA und Aminosäure. Daneben gibt es noch weitere kleine RNA-Moleküle mit regulatorischen oder katalytischen Funktionen. Hierzu gehören z. B. die siRNA (small interfering-RNA, Genetik) oder die snRNA (small nuclear-RNA), die am RNA-Splicing beteiligt sind (S. 216). x

3

Tab. 3.4 Genomgrößen und Chromosomenzahlen. Die angegebenen Werte gelten bei den Eukaryoten für das haploide Genom. Die Beziehung zwischen der Zahl der Basenpaare und der Konturlänge der DNA basiert auf dem Verhältnis von 10,5 Basenpaaren auf 3,4 nm der DNA-Doppelhelix. Basenpaare

Konturlänge

Chromosomenzahl und Form der DNA

Simian Virus (SV40)

5243

1,7 mm

1 · zirkulär

Darmbakterium (Escherichia coli)

ca. 4,7 · 106

1,52 mm

1 · zirkulär

Sprosshefe (Saccharomyces cerevisiae)

ca. 14 · 106

4,5 mm

16 · linear

Fadenwurm (Caenorhabditis elegans)

ca. 80 · 106

2,5 cm

4 · linear

Taufliege (Drosophila melanogaster)

ca. 165 · 106

5,3 cm

4 · linear

Krallenfrosch (Xenopus laevis)

6

ca. 3000 · 10

97,1 cm

18 · linear

Hausmaus (Mus musculus)

ca. 3000 · 106

97,1 cm

20 · linear

Mensch (Homo sapiens)

ca. 3000 · 106

97,1 cm

23 · linear

Mais (Zea mays)

ca. 5000 · 106

160,2 cm

10 · linear

Zwiebel (Allium cepa)

ca. 15 000 · 106

485,7 cm

8 · linear

Abb. 3.10 Ein Abschnitt der rechtsgängigen DNA-Doppelhelix. Die Dimensionen gelten für die B-DNA. Die große und die kleine Furche sind deutlich zu unterscheiden. Die beiden Ketten laufen in entgegengesetzten Richtungen. Sie werden durch Wasserstoffbrücken zwischen den zum Inneren der Helix gerichteten Basenpaaren zusammengehalten.

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3.3 Nucleinsäuren

3.3.1

105

Die Bausteine der Nucleinsäuren

Die Nucleinsäuren (DNA und RNA) sind polymere Strukturen und werden entsprechend als Polynucleotide bezeichnet. Die monomeren Bausteine der Nucleinsäuren sind die Nucleotide. Sie bestehen aus einem Zucker (Pentose), einem basischen Heterozyklus (Base) und einer Phosphatgruppe (Abb. 3.11). Die Verbindung aus Zucker, Base und Phosphatrest wird als Nucleotid, die Verbindung aus Zucker und Base (ohne Phosphat) als Nucleosid bezeichnet.

Ein wichtiger Unterschied zwischen DNA und RNA, der sich auch im Namen widerspiegelt, ist die Struktur der Pentose. Die Ribose trägt im Falle der RNA eine Hydroxylgruppe am C2-Kohlenstoffatom. Dagegen ist bei DNA die Hydroxylgruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt, daher der Name „Desoxy“ribonucleinsäure. Dieser Unterschied hat strukturelle und funktionelle Auswirkungen. RNA nimmt keine der B-DNA ähnlichen Strukturen an und ist instabiler. Ribonucleotide werden über die Ausbildung zyklischer Diester leichter gespalten. Mit dem C1l des Zuckermoleküls sind über eine N-glykosidische Bindung (S. 97) die Basen verknüpft (s. Abb. 3.11). Die Nucleotide unterscheiden sich in ihrem Basenanteil: Es gibt fünf verschiedene Basen, die zwei Gruppen angehören (Abb. 3.12). Adenin und Guanin sind Purinderivate. Thymin, Uracil und Cytosin gehören zu den Pyrimidinderivaten. In den Nucleinsäuren sind aber nur jeweils vier verschiedene Nucleinsäuren vorhanden, Thymin kommt nur in DNA vor, in der RNA ist stattdessen Uracil vorhanden.

Abb. 3.11 Bausteine der Nucleinsäuren. a Nucleotide und Nucleoside. Die N-glykosidische Bindung erfolgt zwischen dem C1 der Pentose und einem Stickstoff der heterozyklischen Base. b Die Positionsnummern der Kohlenstoffatome im Zuckeranteil der Nucleotide werden mit einem Apostroph (l) gekennzeichnet, um sie von den Positionsnummern der Stickstoff- und Kohlenstoffatome in den Basen zu unterscheiden.

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3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

3

Abb. 3.12 Basen. Die Nucleinsäuren enthalten vier verschiedene heterozyklische Basen, die sich entweder von Purin oder Pyrimidin ableiten lassen. Heterozyklisch bedeutet, dass ein oder mehrere C-Atome eines Kohlenstoffringes durch andere Atome, z. B. Stickstoff, ersetzt sind. Die Pyrimidinbase Thymin ist nur in DNA, Uracil nur in RNA zu finden.

Zusätzlich kommen abgewandelte Basen, sogenannte seltene Basen, vor. Die Modifizierungen, dazu gehören Methylierungen, Desaminierungen oder Reduktionen, erfolgen erst nach dem Einbau der Nucleotide in die Nucleinsäuren durch spezielle Enzyme. Bei Mikroorganismen kommt sowohl in DNA als auch in RNA in geringer Menge N6-Methyladenin vor, bei Tieren und Pflanzen 5-Methylcytosin. tRNA-Moleküle enthalten an den funktionell wichtigen Stellen besonders viele seltene Basen, darunter Inosin oder Pseudouridin. Die Modifikationen spielen hier eine Rolle bei der Codonerkennung.

Die Nucleotide werden über Phosphodiesterbrücken zu polymeren Strukturen verknüpft. Es entsteht das kovalente Rückgrat der Nucleinsäuren über die Phosphat- und Pentosereste, wobei die Bindung über die 5l-Hydroxylgruppe eines Nucleotids über eine Phosphodiesterbindung mit der 3l-Hydroxylgruppe des nächsten Nucleotids erfolgt. Durch die Art der Bindungen erhält die polymere Kette zwei unterschiedliche Enden. Das 5l-Ende trägt einen Phosphorsäurerest, am 3l-Ende ist die Hydroxylgruppe der Pentose vorhanden (Abb. 3.13). Aus dem Rückgrat ragen die vier verschiedenen Basen heraus. Die Abfolge oder Sequenz der Basen in den Nucleinsäuren stellt die genetische Information dar. Die Umsetzung der Basensequenz in eine Aminosäuresequenz, d. h. die Umwandlung des Vierbuchstabenalphabets der Nucleinsäuren in das 20-Buchstabenalphabet der Proteine, erfolgt nach dem genetischen Code ( Genetik). Die Basen bilden untereinander Wasserstoffbrücken-Bindungen aus (Abb. 3.13). Sie sind für den Zusammenhalt der DNA-Doppelhelix ( Genetik) bzw. die Ausbildung von Sekundärstrukturen in der RNA ( Genetik) verantwortlich. Aus sterischen Gründen steht in einem Doppelstrang immer eine Purinbase einer Pyrimidinbase gegenüber, und zwar einem Guanin ein Cytosin und einem Adenin ein Thymin bzw. Uracil. Die Basenpaare Adenin-Thymin bzw. Adenin-Uracil werden mit zwei Wasserstoffbrücken zusammengehalten, in dem Basenpaar

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3.3 Nucleinsäuren

107

3

Abb. 3.13 DNA. a Ausschnitt einer DNA-Sequenz. Die einzelnen Nucleotide sind über Phosphodiesterbrücken miteinander verbunden. Bei der Schreibweise der Nucleinsäuren ist darauf zu achten, dass das 5l-Ende (ein Phosphorsäurerest) links und das 3l-Ende (die Hydroxylgruppe der Pentose) rechts geschrieben wird. b Basenpaarung. Im Doppelstrang kommt es zwischen Adenin und Thymin bzw. Uracil zur Ausbildung von zwei Wasserstoffbrücken-Bindungen und zwischen Guanin und Cytosin zur Ausbildung von drei Wasserstoffbrücken-Bindungen.

Guanin-Cytosin sind drei Wasserstoffbrücken ausgebildet. Durch diese spezifische Basenpaarung legt ein Strang die Sequenz und dadurch die genetische Information des anderen Stranges fest. Die beiden Polynucleotidstränge sind aufgrund dieser Anordnung der Basen zueinander komplementär. Die Basenpaarung ist die Grundlage für fast alle Funktionen der Nucleinsäuren. Sie ermöglicht Replikation, Transkription und Translation, sie ist aber auch für das Splicen verantwortlich (S. 216 und Genetik). Die Synthese der Nucleotide kann auf zwei unterschiedlichen Reaktionswegen erfolgen. Nucleotide können prinzipiell von jedem Organismus neu synthetisiert werden, man spricht hier von der De-novo-Synthese. Purine und Pyrimidine werden bei den meisten Organismen auf die gleiche Weise synthetisiert. Der Ribosephosphatanteil der Purin- und Pyrimidinnucleotide stammt aus 5-Phosphoribosyl-1-phosphat (PRPP), das hauptsächlich im Pentosephosphatweg aus ATP und Ribose-5-phosphat synthetisiert wird. Der Purinring wird aus verschiedenen Verbindungen (Abb. 3.14) am Ribosephosphat aufgebaut. Dagegen wird der Pyrimidinring zuerst zusammengebaut und anschließend mit Ribo-

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3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

3 Abb. 3.14 Herkunft der Atome in den Nucleotiden. Der Pyrimidinring wird aus Carbamoylphosphat (N3, C2) und Aspartat (C4, C5, C6, N1) gebildet. Für die Synthese des Purinringes wird Glycin (C4, C5, N7), Aspartat (N1), Glutamin (N3, N9), ein Derivat des Formyltetrahydrofolats (C2, C8) und CO2 (C6) benötigt.

se-5-phosphat zu einem Nucleotid verknüpft. Der andere Weg Nucleotide zu gewinnen, ist ein Recycling der beim Abbau von Nucleinsäuren anfallenden freien Basen und Nucleosiden (salvage pathway). Nucleotide sind nicht nur als Bausteine der Nucleinsäuren von großer Bedeutung, sie erfüllen auch zahlreiche andere zelluläre Funktionen. Nucleotide sind als Energieträger an Stoffwechselreaktionen beteiligt (S. 265). Außerdem können sie als intrazelluläre und sekundäre Botenstoffe wirken (S. 478) und sind Strukturbestandteile zahlreicher Verbindungen, z. B. der Cofaktoren (Kap. 5).

Nucleinsäuren (DNA und RNA): Polynucleotide, Speicher bzw. Überträger der genetischen Information. Nucleosid: Base (Purin- oder Pyrimidinbase) und Zucker (Ribose oder Desoxyribose). Nucleotid: Base (Purin- oder Pyrimidinbase) und Zucker (Ribose oder Desoxyribose) und Phosphat. Purinbasen: Adenin und Guanin. Pyrimidinbasen: Thymin, Cytosin und Uracil.

3.4

Lipide

Lipide bilden keine Makromoleküle, können aber aufgrund nicht kovalenter Wechselwirkungen Strukturen bilden, z. B. die größtenteils aus Phospho- und Glykolipiden bestehende Zellmembran. Neben ihrer Funktion als Zellmembranbestandteil dienen sie in vielen Organismen als Energielieferanten bzw. -speicher und als Signalmoleküle. Unter dem Begriff Lipide wird eine sehr heterogene Gruppe von Verbindungen zusammengefasst. Als Kriterium zur Klassifizierung wird nicht die Molekülstruktur der Verbindungen zugrunde gelegt, sondern ihre hydrophobe Eigenschaft: Lipide sind in Wasser unlöslich, gut löslich dagegen in organischen Lösungsmitteln (lipophil). Aus diesem Grund sind in dieser Stoffklasse verschiedenartige Ver-

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3.4 Lipide

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bindungen vertreten, wie einfache Lipide, dazu gehören die Fettsäuren, Fette und Wachse, die komplexen (Membran)-Lipide und Isoprenoide (Terpenoide).

3.4.1

Die Struktur der Fette

Fette sind chemisch gesehen Glycerinester (Abb. 3.15a). Sie setzen sich aus zwei Komponenten zusammen: der Alkoholkomponente Glycerin (engl. Glycerol) und einer Säurekomponente, den Fettsäuren. Glycerin ist ein dreiwertiger Alkohol, es gibt also drei Möglichkeiten der Esterbindung: Ist nur eine OH-Gruppe eines Glycerinmoleküls mit einer Fettsäure verestert, spricht man von Monoglyceriden. Bilden zwei Fettsäuren mit zwei OH-Gruppen eines Glycerinmoleküls

Abb. 3.15 Esterbildung und Verseifung. a Eine Säure reagiert mit einem Alkohol unter Bildung eines Esters und Wasser. Dabei stammt der Sauerstoff im gebildeten Wasser aus der Hydroxylgruppe der Säure. b Die Veresterung ist reversibel. Unter katalytischer Wirkung von Säuren oder Basen werden Ester leicht hydrolytisch gespalten (Verseifung). Von Bedeutung ist die Esterspaltung in wässriger Lösung mit Basen, z. B. Alkalilauge. Als Reaktionsprodukt erhält man die Alkalisalze der Fettsäuren (= Seife) und Glycerin. Die Natriumsalze werden als harte Seifen (Kernseife) bezeichnet, die Kaliumsalze als „Schmierseifen“.

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3

3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

Ester aus, erhält man Diglyceride; bei drei Fettsäuren entsprechend Triglyceride. Die in der Natur vorkommenden Triglyceride enthalten meist verschiedene Fettsäuren. Sie werden daher auch als gemischte Triglyceride bezeichnet. Die Begriffe Mono-, Di- und Triglyceride werden heute zwar noch häufig verwendet, nach neuer Nomenklatur spricht man allerdings von Monoacyl-, Diacyl- und Triacylglycerin. Am häufigsten kommen Fettsäuren mit 16 und 18 Kohlenstoffatomen vor (Tab. 3.5). Die Zahl der Kohlenstoffatome ist in den natürlichen Fettsäuren gewöhnlich geradzahlig. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Fettsäuresynthese (S. 321) von Acetyl-CoA (C2-Einheiten) ausgeht. Innerhalb der Fettsäuren unterscheidet man zwischen gesättigten und ungesättigten Fettsäuren. Gesättigte Fettsäuren enthalten nur Einfachbindungen. In den Fetten werden die einzelnen Acylreste durch Van-der-Waals-Kräfte zusammengehalten. Die Anziehungskräfte sind dafür verantwortlich, dass solche Fette bei Raumtemperatur im festen Zustand vorliegen. Viele tierische Fette enthalten ausschließlich gesättigte Fettsäuren. Gesättigte Fettsäuren werden in der Zickzack-Konformation dargestellt (Abb. 3.15a). Dagegen enthalten ungesättigte Fettsäuren mindestens eine Doppelbindung und werden entsprechend als einfach oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren bezeichnet. Die Doppelbindungen der ungesättigten Fettsäuren liegen fast immer in der cis-Konfiguration vor (Abb. 3.18). Eine Doppelbindung hat zur Folge, dass das stabförmige Fettsäuremolekül „abknickt“. Fette mit ungesättigten Fettsäuren können also nicht so dicht gepackt werden wie Fette mit gesättigten Fettsäuren entsprechender Molekülgröße. Es können nicht mehr so viele intermolekulare Bindungen ausgebildet werden, was zu einer Absenkung des Schmelzpunktes führt. Solche Fette sind bei Raumtemperatur flüssig oder ölig. Hierzu gehören z. B. pflanzliche Öle oder Lebertran.

Tab. 3.5 Gesättigte und ungesättigte Fettsäuren. Trivialname

Summenformel

Zahl der C-Atome: Vorkommen Zahl der Doppelbindungen

Palmitinsäure

C16 H32 O2

C16:0

Palmöl, Baumwollsaatöl, tierische und pflanzliche Fette

Stearinsäure

C18 H36 O2

C18:0

tierische und pflanzliche Fette

Ölsäure

C18 H34 O2

C18:1

Olivenöl, Haselöl, Palmöl

Linolsäure

C18 H32 O2

C18:2

Sojaöl, Baumwollsaatöl, Sonnenblumenöl, Sesamöl

Linolensäure

C18 H30 O2

C18:3

Leinöl

Arachidonsäure

C20 H32 O2

C20:4

tierische Fette

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3.4 Lipide

111

Linol- und Linolensäure sind für Säugetiere essentiell. Sie können nicht synthetisiert werden, da die Enzyme fehlen, um Doppelbindungen distal von C9 einzuführen. Die Fettsäuren müssen daher mit der Nahrung aufgenommen werden. Aus ihnen werden weitere ungesättigte Fettsäuren wie Arachidonsäure gebildet. Bei Wirbeltieren ist die Arachidonsäure Vorstufe wichtiger Gruppe von lokalen Hormonen: den Prostaglandinen, Prostacyclinen, Thromboxanen und Leukotrienen ( Zoologie).

Fettsäuren dienen sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren als Brennstoffmoleküle, die Speicherform sind die Triacylglycerine (= Neutralfette). Triacylglycerine sind hoch konzentrierte Energiespeicher. Die vollständige Oxidation von Fettsäuren liefert ca. 37 kJ/g, die von Kohlenhydraten oder Proteinen ca. 17 kJ/g. Die unterschiedliche Energieausbeute ist darauf zurückzuführen, dass Fettsäuren im Gegensatz zu Kohlenhydraten und Proteinen in einer höher reduzierten Form vorliegen. Zudem sind Fettsäuren aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften kaum hydratisiert, sie können also nahezu wasserfrei gespeichert werden. Das braune Fettgewebe mancher Säuger kann unter bestimmten physiologiZoologie). schen Bedingungen auch zur Wärmeproduktion genutzt werden ( Bei diesem als Thermogenese bezeichneten Vorgang wird in den Mitochondrien des braunen Fettgewebes die oxidative Phosphorylierung entkoppelt und Wärme freigesetzt (S. 307).

3.4.2

Die Struktur der Wachse

Wachse sind Ester langkettiger, einwertiger Alkohole mit höheren Fettsäuren. Sie haben in Organismen vielfältige Funktionen, die mit ihren wasserabstoßenden Eigenschaften und der Konsistenz zusammenhängen. Die Blätter vieler Pflanzen werden von einer Wachsschicht überzogen, um die Transpiration herabzusetzen. ( Botanik). Wirbeltiere besitzen Hautdrüsen, die Wachse ausscheiden, um Haut und Haare zu schützen; Vögel scheiden über die Bürzeldrüse Wachse aus, um ihr Gefieder wasserdicht zu machen.

3.4.3

Die Struktur der komplexen Lipide

Zu den komplexen Lipiden zählen die Membranlipide (S. 350). Phospholipide und Glykolipide sind zusammen mit Cholesterin oder Hopanoiden die Hauptbestandteile der biologischen Membranen. Die Membranlipide sind amphiphatische Moleküle, d. h., sie haben einen hydrophilen Teil, die polare Kopfregion, und eine hydrophobe Region, die aus den langen Kohlenstoffschwänzen der Fettsäuren besteht. Phospholipide und Glykolipide leiten sich entweder vom Glycerin bzw. vom Aminoalkohol Sphingosin ab. Sie enthalten gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren. Die Anzahl der Doppelbindungen sowie die Länge der Fettsäure beeinflussen die Fluidität der Membran (S. 361).

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3

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3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

3.4.4

Die Struktur der Isoprenoide

Die Isoprenoide (Terpenoide) spielen sowohl bei Mikroorganismen als auch bei Pflanzen und Tieren eine bedeutende Rolle. Zu den Isoprenoiden gehören Steroide und Hopanoide sowie zahlreiche sekundäre Pflanzenstoffe, z. B. Polyterpene wie Kautschuk und die Carotinoide ( Botanik). Zu den für tierische Organismen wichtigen Isoprenoiden gehören auch die Vitamine A, E und K und z. B. das Juvenilhormon der Insekten ( Zoologie). Dolichol fungiert als Carriermolekül bei der bakteriellen Zellwandsynthese oder bei der Synthese der komplexen Polysaccharidseitenketten der Proteine im ER und Golgi-Apparat in eukaryotischen Zellen. All diesen Stoffen ist das Isoprengrundgerüst gemeinsam, ein ungesättigter Kohlenwasserstoff mit fünf C-Atomen und einer MethylVerzweigung, der nach entsprechender Aktivierung über eine Kettenreaktion zu den teilweise hochmolekularen Verbindungen polymerisiert (Abb. 3.16). Auch die Seitenketten der Chinone, ein ubiquitärer Bestandteil von Elektronentransportketten, lassen sich von diesem Grundkörper ableiten (S. 228). Durch Kondensation von drei Molekülen Acetyl-CoA entsteht die verzweigte Verbindung 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA. Es schließt sich eine Reduktion mit zwei NADPH unter Abspaltung von HSCoA an; das Produkt dieser Reaktion ist Mevalonat. Aus Mevalonat entsteht nach Decarboxylierung und Phosphorylierung Isopentenyldiphosphat, das aktive Isopren. Bei den Kondensationsreaktionen der aktivierten Isopreneinheiten ist zwischen einer Kopf-Kopf- (KK) und einer Kopf-Schwanz-Anlagerung (KS) zu unterscheiden. Aus drei Isopentenyldiphosphat-Molekülen entsteht Farnesyldiphosphat. Zwei Farnesyldiphosphat-Moleküle werden zu Squalen kondensiert. Vor der Zyklisierung wird Squalen zu Squalen-2,3-Epoxid oxidiert. In einer sehr komplexen Reaktion erfolgt im tierischen Organismus (Ausnahme: Insekten) die Zyklisierung von Squalen-2,3-Epoxid zu Lanosterol, das in über 20 Reaktionen zum Cholesterin umgebaut wird. Das Produkt der Zyklisierung von Squalen-2,3-Epoxid bei höheren Pflanzen ist Cycloartenol. Bei Prokaryoten und Pflanzen gibt es auch eine andere Möglichkeit der Umsetzung von Squalen: die Zyklisierung zu Hopanoiden. Diese Reaktion verläuft, im Gegensatz zur Bildung von Lanosterol, ohne eine oxidative Aktivierung von Squalen. Vermutlich entstand dieser Stoffwechselweg sehr früh in der Evolution, als die Erdatmosphäre noch sauerstofffrei war.

Steroide sind starre, planare Moleküle, da die kondensierte Ringstruktur keine Rotation um die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung zulässt. Cholesterin ist wichtiger Bestandteil eukaryotischer Membranen. Aufgrund der starren Struktur beeinflusst es die Fluidität der Membranen (S. 361). Als evolutionärer Vorläufer der Sterine gelten die Hopanoide, die bei Bakterien weit verbreitet sind und ebenfalls zur Stabilisierung der Membranen beitragen. Im Tierreich wichtige Steroide sind die Sexualhormone, Mineralcorticoide und die Gallensäuren, Abbauprodukte des Cholesterins, die eine wichtige Rolle bei der Verdauung und Resorption von Fetten spielen ( Zoologie). Steroide der Pflanzen sind sekundäre Pflanzenstoffe, sie sind von pharmakologischem Interesse. Dazu gehören die Saponine, wie Digitonin oder die Alkaloidsteroide wie Solanin.

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3.4 Lipide

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3

Abb. 3.16 Synthese und Struktur der Isoprenoide. (Mit freundlicher Genehmigung nach Ch. Bardele)

Der Stoffwechsel der Isoprenoide ist ein eindrucksvolles Beispiel dafür, wie aus dem Grundbaustein, Acetyl-CoA, das auch in vielen anderen Stoffwechselprozessen eine zentrale Rolle spielt (S. 270) über ähnliche Stoffwechselwege eine Vielzahl an Substanzen entstehen kann (Abb. 3.16).

Lipide: Gruppe von Substanzen, die in Wasser unlöslich und in organischen Lösungsmitteln löslich sind. Z. B. einfache Lipide (Fettsäuren, Fette und Wachse), die komplexen (Membran)-Lipide und Isoprenoide.

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114

3

3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

Fette: Mono-, Di- oder Triester höherer geradzahliger Fettsäuren mit Glycerin als Alkoholkomponente. Natürliche Fette sind Gemische verschiedener Triacylglycerine. Triacylglycerine sind energiereiche Speichermoleküle. Wachse: Ester langkettiger, einwertiger Alkohole mit höheren Fettsäuren. Isoprenoide (Terpenoide): Aufgebaut aus Isopreneinheiten. Weit verbreitete Stoffklasse, z. B. Pigmente, sekundäre Pflanzenstoffe, Sehfarbstoff, Hormone, Membranbestandteile.

3.5

Isomerie bei Biomolekülen

Die räumliche Anordnung der Atome in Biomolekülen ist für ihre Funktion entscheidend. Die meisten organischen Moleküle sind asymmetrisch und fast alle Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen sind stereospezifisch. Die räumliche Anordnung der Atome in Biomolekülen ist bei der Bindung eines Substrats an ein Enzym oder bei der Bindung eines Hormons an ein Rezeptormolekül entscheidend. Die Aufklärung der Raumstruktur von Biomolekülen, in erster Linie durch Verfahren wie die Röntgenstrukturanalyse und die KernmagnetResonanz-Spektroskopie, ist heute eine wichtige Forschungsrichtung (S. 160). Die Summenfomel gibt Auskunft darüber welche und wie viele Atome in einem Molekül vorhanden sind. Sie sagt aber nichts über die Anordnung der Atome in dem Molekül aus. Zwei Moleküle mit gleicher Summenformel können sich aber in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften unterscheiden, solche Verbindungen werden als isomere Verbindungen bezeichnet. Sie lassen sich weiter in zwei Gruppen unterteilen, in Konstitutionsisomere und Stereoisomere.

Abb. 3.17 Konstitution, Konformation, Konfiguration.

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3.5 Isomerie bei Biomolekülen

3.5.1

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Konstitutionsisomere

Konstitutionsisomere (Strukturisomere) unterscheiden sich durch die Reihenfolge ihrer Atome oder ganzer Atomgruppen. Die Konstitution eines Moleküls wird durch die Strukturformel wiedergegeben. Gleiche Summenformel aber unterschiedlicher Strukturformel haben z. B. Propanol und Isopropanol (Abb. 3.18a) und Substanzen die der Keto-Enol-Tautomerie unterliegen (Abb. 3.18b).

3.5.2

Stereoisomere

Stereoisomere (optische Isomere) haben die gleiche Konstitution, unterscheiden sich aber in der unterschiedlichen räumlichen Anordnung, der Konformation bzw. Konfiguration, ihrer Atome (Abb. 3.17). Dementsprechend lassen sich Stereoisomere weiter unterteilen in Konformationsisomere und Konfigurationsisomere, die sich nach der Art der Umwandlung unterscheiden. Konformationsisomere können relativ leicht durch Drehung um eine Einfachbindung ineinander umgewandelt werden, wobei sich die Konformeren in ihrem Energiegehalt unterscheiden. Ein Beispiel sind die verschiedenen Ringformen der 6er-Zucker: Die Wannenform kommt häufiger vor, weil sie die energetisch günstigere Form ist. Konfigurationsisomere lassen sich nur durch Bruch und Wiederverknüpfung einer oder mehrerer kovalenter Bindungen ineinander überführen. Zur Konfigurationsisomerie gehören die cis-trans-Isomerie, die Enantiomerie und die Diastereomerie. Die cis-trans-Isomerie tritt bei Ringschlüssen, wie bei der Hemiacetalbildung der Kohlenhydrate, oder bei C-C-Doppelbindungen der Fettsäuren auf. Bei der cis-Form zeigen beide Gruppen um eine Doppelbindung in die gleiche Richtung, bei der trans-Form in unterschiedliche Richtungen. Konfigurationsisomere werden auch nach den Symmetrieverhältnissen im Molekül unterschieden. Zwei Moleküle, die sich wie Bild und Spiegelbild zueinander verhalten, bezeichnet man als Enantiomere. Enantiomere stimmen in den meisten chemischen und physikalischen, häufig aber nicht in ihren biologischen Eigenschaften überein. Sie unterscheiden sich in der Fähigkeit, die Schwingungsebene von linear polarisiertem Licht zu drehen. Solche Substanzen sind optisch aktiv. Die Enantiomere, darunter viele Zucker und Aminosäuren, weisen ein Asymmetriezentrum (Chiralitätszentrum) in der Molekülstruktur auf. Ein solches Asymmetriezentrum besteht meist aus einem Kohlenstoffatom mit vier unterschiedlichen Substituenten. Sie lassen sich durch Drehung nicht mit ihrem Spiegelbild in Deckung bringen. Sie verhalten sich zu ihrem Spiegelbild wie die rechte Hand zur linken, daher auch der Begriff Chiralität oder Händigkeit (gr. cheiros: Hand). Dreht eine optisch aktive Substanz die Schwingungsebene von linear polarisiertem Licht nach links (Abb. 3.19), so bezeichnet man diese Verbindung als linksdrehend und kennzeichnet dies mit (–). Das entsprechende Enantiomer

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3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

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Abb. 3.18 Isomerie. a Konstitutionsisomerie. Die unterschiedliche Atomanordnung findet sich bei der Sequenzisomerie und der Tautomerie. b Stereoisomere unterscheiden sich hinsichtlich der Konformation und der Konfiguration.

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3.5 Isomerie bei Biomolekülen

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Abb. 3.19 Polarimeter zur Bestimmung des optischen Drehvermögens einer Substanz. Beim Durchlaufen der Probe wird die Schwingungsebene des linear polarisierten Lichts um einen bestimmten Betrag gedreht. Ein Polarisator lässt nur Licht einer Schwingungsebene passieren. Der Analysator ist ein drehbarer Polarisator, der um einen bestimmten Betrag gedreht werden muss, um einen Lichtdurchsatz zu erzielen.

zu dieser Verbindung dreht die Schwingungsebene um den gleichen Betrag nach rechts und ist damit rechtsdrehend (+). Eine äquimolare Mischung zweier zueinander enantiomerer Verbindungen bezeichnet man als Racemat. Diese Lösung ist optisch inaktiv. Hier heben sich die entgegengesetzten Drehvermögen auf. Das Drehvermögen einer Substanz ist eine stoffspezifische Konstante, die von der Temperatur T und der Wellenlänge l abhängt und als spezifische Drehung [a]Tl bezeichnet wird. Die spezifische Drehung berechnet sich wie folgt: [a]Tl = aobs / l · c Oft findet man den Index „D“ anstelle der Wellenlänge. D steht für die D-Linie des Natriumspektrums (589,3 nm). aobs ist der im Experiment erhaltene Drehwert, l die Länge der Messküvette (in dm) und c die Konzentration (gml–1, die unüblichen Einheiten sind historisch begründet) der betreffenden Substanz. Der organische Chemiker Emil Fischer (1852–1919) entwickelte ein System, um die dreidimensionale Struktur einer chiralen Verbindung zu beschreiben. Bei der Fischer-Projektionsformel wird das Kohlenstoffatom mit der höchsten Oxidationsstufe nach oben geschrieben. Das chirale Zentrum liegt in der Papierebene. Horizontale Bindungslinien liegen über der Papierebene und sind auf den Betrachter gerichtet. Vertikale Bindungslinien dagegen weisen vom Betrachter weg, sie liegen unterhalb der Papierebene. Man unterscheidet zwei sterische Konfigurationen: die D- und die L-Form (Abb. 3.3). Eine D-Konfiguration liegt dann vor, wenn die OH-Gruppe nach rechts zeigt (lat. dexter: rechts), Moleküle mit links angeordneter OH-Gruppe werden als L-Form bezeichnet (lat. laevus: links). Die Bezeichnungen D- und L- geben die absolute Konfiguration am chiralen C-Atom an. Sie sagen nichts über den jeweiligen Drehsinn aus. Die Drehrichtung (+) oder (-) lässt keinerlei Aussagen über die wirkliche Struktur eines optisch aktiven Moleküls zu. So dreht D-Glycerinaldehyd das Licht nach rechts, die D-Milchsäure dagegen dreht trotz gleicher absoluter Konfiguration das Licht nach links, es heißt D-(+)Glycerinaldehyd und D-(-)-Milchsäure. Die Fischer-Projektionsformel kann z. B. auf Monosaccharide oder Aminosäuren angewendet werden. Für beide Gruppen ist das C-Atom der Carbonylgruppe das Kohlenstoffatom mit der höchsten Oxidationsstufe. Als Bezugsmolekül der D- und L-Reihe der Monosaccharide dient Glycerinaldehyd, bei den Aminosäuren ist Alanin das Bezugs-

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3 Aufbau und Eigenschaften biologischer Makromoleküle

molekül. Die Zugehörigkeit zur D- oder L-Reihe richtet sich nach der Anordnung an jenem Kohlenstoffatom, das am weitesten von dem am höchsten oxidierten Kohlenstoffatom entfernt ist. Hat dieses chirale C-Atom die gleiche Konfiguration wie D-Glycerinaldehyd (befindet sich in der Fischer-Projektionsformel die Hydroxylgruppe rechts), so liegt ein D-Monosaccharid vor. Ist die Konfiguration dagegen wie die von L-Glycerinaldehyd, so handelt es sich um ein L-Monosaccharid.

Auch wenn sich zwei chirale Verbindungen nicht anhand ihrer chemischen Eigenschaften sondern nur durch die physikalische Eigenschaft der optischen Drehung unterscheiden lassen, ist fast immer nur eine der beiden Verbindungen biologisch aktiv. Biologische Systeme arbeiten stereospezifisch, d. h., sie können zwischen verschiedenen Stereoisomeren unterscheiden. Ein Beispiel sind enzymatische Reaktionen (S. 167). Bei der Proteinbiosynthese aller Organismen werden nur L-Aminosäuren verwendet, da die beteiligten zellulären Elemente wie Ribosomen, tRNAs und die Aminoacyl-tRNA-Synthetase, die die jeweiligen tRNAs mit der dazugehörigen Aminosäure belädt, selektiv L-Aminosäuren binden. Als Diastereoisomere werden Stereoisomere bezeichnet, welche zueinander nicht enantiomer sind. Diese Verbindungen haben mehrere Chiralitätszentren. Eine Verbindung mit n Asymmetriezentren hat 2n stereoisomere Formen, wenn die asymmetrischen Moleküle voneinander verschieden substituiert sind. Unterscheiden sich zwei stereoisomere Moleküle mit mehreren Asymmetriezentren nur in der Konfiguration an einem chiralen Kohlenstoffatom, so spricht man von Epimeren. Der Begriff Anomere ist auf Zucker beschränkt. Er dient zur Beschreibung der Konfiguration des bei der Ringbildung neu entstehenden Chiralitätszentrums, das anomere C-Atom. Dabei können die epimeren (anomeren) a- und b-Formen unterschieden werden.

Isomere Verbindungen: Gleiche Summenformel, aber unterschiedliche physikalische Eigenschaften. – Konstitutionsisomere (Strukturisomere): Unterschiedliche Stellung der Atome oder Atomgruppen im Molekül. – Stereoisomere (optische Isomere): Gleiche Konstitution, aber unterschiedliche räumliche Anordnung. Man unterscheidet Konfigurationsisomere und Konformationsisomere. Konformationsisomere: Umwandlung ineinander durch freie Rotation um Einfachbindung möglich, Beispiel: Sessel-, Wannenform der 6er-Zucker.

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3.5 Isomerie bei Biomolekülen

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Konfigurationsisomere: Umwandlung nur durch Spalten und Knüpfen mindestens einer Bindung möglich. – cis-trans-Isomere: Bei der cis-Form zeigen beide Gruppen um eine Doppelbindung in die gleiche Richtung, bei der trans-Form in unterschiedliche. – Enantiomere: Chirale Moleküle, die sich wie Bild und Spiegelbild verhalten. Optisch aktiv. – Diastereoisomere: Chirale, optisch aktive Moleküle, die aber keine Enantiomere sind. Epimere unterscheiden sich nur in der Konfiguration an einem chiralen Kohlenstoffatom; Anomere sind ein Spezialfall bei Zuckern, treten durch die intramolekulare Ringbildung auf (a- und b-Form). Chirales C-Atom: Kohlenstoffatom mit vier unterschiedlichen Substituenten. Racemat: Äquimolare Mischung zweier Enantiomere, optisch inaktiv. Optische Aktivität: Eigenschaft von Substanzen, die ein Chiralitätszentrum (Asymmetriezentrum) aufweisen. Schwingungsebene des polarisierten Lichtes wird gedreht: linksdrehende Substanzen (–), rechtsdrehende Substanzen (+).

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4 Proteine

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Proteine

Harald Schlatter (4.1–4.3), Thomas Langer (4.4)

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„Wenn irgendeine Molekülklasse als Grundbausteine lebender Organismen betrachtet werden kann, so sind es sicher die Proteine. Sie sind von allen Molekülen die vielseitigsten.“ Richard E. Dickerson, Irving Geis, Chemistry, Matter and the Universe

4.1

Die Funktion von Proteinen

Proteine sind als Strukturproteine am Aufbau der einzelnen Zellen und Gewebe und damit des gesamten Organismus beteiligt; als Enzyme katalysieren Proteine nahezu alle chemischen Stoffwechselreaktionen; Transport- und Motorproteine ermöglichen sämtliche Transport- und Bewegungsvorgänge sowohl innerhalb einer Zelle als auch auf der Ebene des Gesamtorganismus z. B. bei Muskelbewegungen oder dem Sauerstofftransport; als Antikörper sind sie ein wichtiger Bestandteil unseres Immunsystems; als Rezeptoren, aber auch selber als Signal- und Botenstoffe regulieren sie zahlreiche Prozesse. Proteine („Proteuo“, griech: den ersten Platz einnehmend, überlegen sein) auch Eiweiße genannt, sind die häufigsten Makromoleküle in lebenden Organismen und an allen lebenswichtigen Funktionen beteiligt: Strukturproteine sind verantwortlich für die Ausbildung von dreidimensionalen Strukturen und sorgen für mechanische Stabilität, z. B. Laminaproteine (S. 393) im Zellkern oder die Proteine des Cytoskeletts innerhalb des Cytoplasmas (Kap. 10). Das extrazelluläre Kollagen (S. 135, S. 475) hingegen ist verantwortlich für die Form des Bindegewebes und die in ihm eingebetteten Zellen. Auch Haare, Hörner und Nägel bestehen aus Proteinen. Enzyme sind sicherlich die vielfältigste Proteingruppe. Mehrere tausend verschiedene Enzyme katalysieren die unterschiedlichsten biochemische Reaktionen einer Zelle. Mittlerweile ist die Struktur vieler dieser Enzyme bekannt. Sehr viele Enzyme werden durch regulatorische Proteine beeinflusst. Auch die Expression von Genen wird über Regulatorproteine, z. B. der Lambda-Repressor, gesteuert. Proteine regulieren so die Entwicklung, Differenzierung und das Wachstum von Zellen bzw. ganzer Organismen. Proteine spielen eine Rolle bei Bewegungen, sowohl auf zellulärer als auch auf der Ebene des Gesamtorganismus. Das Motorprotein Myosin ist im Zusammenspiel mit anderen Proteinen sowohl an vielfältigen intrazellulären Bewegungen als auch an der Muskelkontraktion beteiligt. Das Transportprotein Hämoglobin versorgt den Körper mit Sauerstoff aus der Lunge, bzw. sorgt für den

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4.2 Die Aminosäuren – Bausteine der Proteine

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Abtransport des Kohlendioxids. Membranintegrale Transportproteine vermitteln den Transport von Ionen oder Molekülen über die sonst unüberwindlichen zellulären Membranen. Damit sind sie z. B. verantwortlich für den Ionenhaushalt einer Zelle oder aber für die Übertragung und Weiterleitung von Impulsen entlang von Nervenzellen. Membranintegrale Proteine auf Zelloberflächen wirken auch als Rezeptoren für Signale oder Botenstoffe und initiieren entsprechende Reaktionen im Zellinneren. Einige Botenstoffe (z. B. Hormone) selbst wiederum sind kurze Proteine, z. B. das Insulin. Im Verlauf einer immunologischen Abwehrreaktion bildet unser Immunsystem spezielle Proteine, die Immunglobuline. Diese hochspezifischen Antikörper binden an organismusfremde, möglicherweise krankheitsauslösende Strukturen, sogenannte Antigene, die auch Proteine sein können. Viele Erbkrankheiten beruhen auf der Ausbildung fehlerhafter Proteine und mit den durch BSE gewonnenen Erkenntnissen ist bekannt, dass bestimmte Proteine Infektionskrankheiten auslösen, so wie die Prionen die spongiformen Encephalopathien. Viele Gifte sind Proteine oder Polypeptide, darunter auch die nach derzeitigem Kenntnisstand giftigste Substanz, das schon in geringen Mengen (wenige Nanogramm) tödlich wirkende Botulinustoxin aus dem Bakterium Chlostridium botulinum. Auch die Ribosomen, an denen die Proteinsynthese stattfindet, bestehen neben RNA zu einem Großteil aus einzelnen Polypeptiden und Proteinen. Proteine bewerkstelligen als Enzyme die DNA-Replikation, Transkription, bzw. in Form des Spindelapparates auch die Zellteilung. Damit ergibt sich die faszinierende Vorstellung, dass Proteine ihre eigene Produktion und Vermehrung steuern. Letztlich sind Proteinen als Proteasomen sogar mit ihrem eigenen Abbau betraut.

Funktionen der Proteine: mechanische Stütz- und Strukturfunktion, Transport, Bewegung, enzymatische Katalyse, Regulation, Immunabwehr, Botenstoffe, Gifte.

4.2

Die Aminosäuren – Bausteine der Proteine

Bausteine der Proteine sind Aminosäuren. Sie sind über Peptidbindungen zu Ketten verbunden. Die Länge der Ketten variiert von einigen wenigen Aminosäuren bis zu mehreren Tausend Aminosäuren in großen Proteinen. Die Standardaminosäuren werden bei der Proteinbiosynthese direkt in die Proteine eingebaut und teilweise anschließend modifiziert. Die unterschiedlichen Seitenketten der Aminosäuren nehmen Einfluss auf die räumliche Struktur und damit auf die Funktion des Proteins. Neben diesen proteinogenen Aminosäuren existieren über 250 nicht proteinogene Aminosäuren mit unterschiedlichsten Funktionen im Stoffwechsel.

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4 Proteine

Proteine sind aus Aminosäuren aufgebaut, die über Peptidbindungen zu Ketten unterschiedlicher Länge verknüpft sind. Manche dieser Ketten bestehen nur aus wenigen Aminosäuren und werden entsprechend als Dipeptide, Tripeptide bzw. als Polypeptide (bis 100 Aminosäuren) bezeichnet. Das Protein Titin, auch Connectin genannt, dagegen besteht aus einer ca. 27 000 Aminosäuren langen Kette und weist eine Molmasse von ca. 30 Millionen Dalton auf. Lagern sich mehrere Ketten zusammen entstehen Proteinkomplexe. Sie können aus über 100 verschiedenen Proteinen bestehen und Molmassen von bis zu 120 000 kDa (120 MDa), etwa bei dem Kernporenkomplex des Zellkerns, annehmen. Viele Proteine enthalten Bestandteile, die nicht aus Aminosäuren aufgebaut sind. Solche Bestandteile werden zusammenfassend als Co-Faktoren bezeichnet, dazu gehören die Coenzyme aber auch Metallionen (Kap. 6). Regulär gibt es 20 verschiedene Aminosäuren, die während der Proteinbiosynthese ( Genetik) direkt in die wachsende Peptidkette eingebaut werden. Man nennt sie Standardaminosäuren oder auch kanonische Aminosäuren. Für jede Standardaminosäure existiert mindestens ein entsprechendes Codon, das den 4-Buchstabencode der Gene in den 20-Buchstabencode der Proteine übersetzt. Folglich existiert für jede Standardaminosäure mindestens jeweils eine spezifische tRNA, die das Codon der mRNA erkennt und dann die passende Aminosäure an der entsprechenden Stelle in die wachsende Polypeptidkette einbaut. Darüber hinaus sind zur Zeit noch drei weitere Aminosäuren bekannt, die ebenfalls über eine eigene tRNA bei der Proteinbiosynthese als Bausteine verwendet werden. Sie kommen aber nur sehr vereinzelt und in wenigen Proteinen vor oder aber besitzen spezielle Funktionen (s. u.). Teilweise werden die Aminosäuren nach Abschluss der Proteinbiosynthese noch modifiziert. Neben diesen Aminosäuren, die am Aufbau der Proteine beteiligt sind – sie werden auch als proteinogene Aminosäuren bezeichnet – wurden inzwischen über 250 nicht proteinogene Aminosäuren identifiziert. Sie sind meist Derivate der Standardaminosäuren und übernehmen eine Vielzahl unterschiedlicher biologischer Funktionen (s. u.).

4.2.1

Eigenschaften von Aminosäuren

Allen Aminosäuren gemeinsam sind charakteristische Molekülgruppen und Eigenschaften (Abb. 4.1a). Aminosäuren zeichnen sich – wie der Name schon sagt – durch eine Aminogruppe (-NH2) und eine Säure-, eine Carboxylgruppe (-COOH), aus. Die beiden Gruppen sowie ein Wasserstoffatom und eine, je nach Aminosäure, unterschiedliche Seitenkette sind um ein zentrales Kohlenstoffatom C2 gruppiert, das aufgrund seiner unmittelbaren Nachbarschaft zur Carboxylgruppe auch als a-C-Atom bezeichnet wird. Der Dissoziationsgrad einer Aminosäure ist abhängig vom pH-Wert der Lösung. Bei neutralem pH-Wert bindet das freie Elektronenpaar der Aminogruppe ein positiv geladenes Proton und wird positiv geladen. Das Proton der Carboxylgruppe dissoziiert, so dass eine negativ geladene COO–-Gruppe zurück-

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4.2 Die Aminosäuren – Bausteine der Proteine

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Abb. 4.1 Aminosäuregrundgerüst. a Die Seitenkette (R) besteht im einfachsten Falle aus einem H-Atom (Glycin), sonst aus einer unterschiedlich langen, verzweigten oder unverzweigten Kohlenstoffkette oder einem aromatischen Rest. b Eine Aminosäure bei unterschiedlichen pH-Werten. Bei neutralem pH liegt ein Zwitterion vor.

bleibt (Abb. 4.1b). Eine Aminosäure mit einer positiven und einer negativen Ladung in einem Molekül wird als Zwitterion bezeichnet, d. h. die Aminosäure trägt insgesamt keine Ladung. Bei niedrigem pH-Wert sind die Carboxylgruppen ungeladen und die Aminogruppen geladen. Bei hohem pH-Wert verhält es sich genau umgekehrt. Der durchschnittliche pK-Wert der Aminogruppen liegt im Bereich von 10, der der Carboxylgruppe im Bereich von 2 (S. 44). In den Proteinen sind die Carboxyl- und Aminogruppen durch die Peptidbindungen nicht mehr ionisierbar. Nur die endständigen Carboxyl- bzw. Aminogruppen eines Polypeptids sind polarisierbar. Fünf der zwanzig Aminosäuren haben zudem polarisierbare Seitenketten. Der pH-Wert, bei dem die Konzentration der sauren und basischen Reste in einer Aminosäure bzw. in einem Protein gleich groß sind, wird als isoelektrischer Punkt bezeichnet (S. 44). Im elektrischen Feld tritt keine Ionenwanderung ein, da die Aminosäure bzw. das Protein keine Nettoladung trägt. Diese Eigenschaft der Proteine wird zur Proteintrennung bei der isoelektrischen Fokussierung (s. u.) ausgenutzt. An dem zentralen C2-Kohlenstoffatom sind vier verschiedene Liganden gebunden. Dadurch existieren zwei Stereoisomere jeder Aminosäure, die Dund die L-Aminosäuren (S. 117, Abb. 3.18). Eine Ausnahme bildet die Aminosäure Glycin; ihr Rest besteht aus einem zweiten H-Atom und damit ist ihr a-Kohlenstoff nicht chiral. Bei der Proteinbiosynthese werden nur L-Aminosäuren verwendet, da die beteiligten zellulären Elemente wie Ribosomen, tRNAs und die Aminoacyl-tRNA-Synthetase, die die jeweiligen tRNAs mit der dazugehörigen Aminosäure belädt, selektiv L-Aminosäuren binden.

4.2.2

Die 20 Standardaminosäuren

Bei der Proteinbiosynthese werden üblicherweise 20 verschiedene Standardaminosäuren eingebaut. Ihre jeweiligen Eigenschaften, die die räumliche Struktur

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4 Proteine

Abb. 4.2 Struktur der 20 Standard-Aminosäuren. Die Aminosäuren sind nach der n Polarität ihrer Seitenketten geordnet. Angegeben ist die freie Enthalpie (DG [kJ/mol]) bei der Überführung einer Aminosäure von Ethanol (relativ unpolar) in Wasser (polar) und die molare Masse (Da). Je negativer DG, desto polarer ist die Seitenkette. Für jede Aminosäure gibt es einen Dreibuchstaben-Code und einen Einbuchstaben-Code.

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und Funktion des fertigen Proteins bestimmen, hängen von den speziellen Eigenschaften der unterschiedlichen Seitenketten ab (Abb. 4.2). Bei der kleinsten Aminosäure Glycin besteht die Seitenkette nur aus einem H-Atom. Die nächstgrößere Aminosäure ist Alanin mit einer Methylgruppe -CH3 als Seitenkette, gefolgt von Serin mit -CH2OH. Die Aminosäureseitenketten unterscheiden sich aber nicht nur durch ihre Größe. Für die Struktur und Funktion von Proteinen besonders entscheidend ist ihre Polarität und Ladung. Die unpolaren, aliphatischen Aminosäuren wie Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin stabilisieren die Proteinstruktur über die Ausbildung hydrophober Wechselwirkungen. In wässriger Umgebung sind sie bestrebt, sich dem Kontakt mit Wasser zu entziehen, sie schaffen im Inneren eines Proteins wasserfreie Bereiche, die manche Reaktionen erst ermöglichen. In membranintegralen Proteinen oder mit Membranen assoziierten Proteinen findet man eine entgegengesetzte Orientierung. Hier orientieren sich unpolare Aminosäuren in Richtung der hydrophoben Fettsäureketten der Phospholipide und verankern so das Protein in der lipophilen Umgebung. Die hydrophoben Wechselwirkungen der aromatischen Seitenketten Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan sind besonders stark, wenn die aromatischen Gruppen übereinandergestapelt vorliegen. Methionin und Cystein enthalten Schwefel. Dem Cystein mit seiner terminalen Sulfhydrylgruppe (-SH) kommt eine besondere Bedeutung bei der Stabilisierung von Proteinstrukturen zu. Die freie SH-Gruppe kann mit einer zweiten Cystein-SH-Gruppe eine sehr stabile, kovalente Disulfidbrücke ausbilden. Diese kommen allerdings vorwiegend in extrazellulären Proteinen vor, da innerhalb der Zelle reduzierende Bedingungen vorherrschen, die eine Disulfidbrücke sofort zu zwei Sulfhydrylgruppen reduzieren würde. Die Aminosäuren Serin oder Threonin tragen eine Hydroxylgruppe und sind damit polar. Threonin besitzt ebenso wie Isoleucin neben dem a-Kohlenstoffatom noch ein weiteres asymmetrisches C-Atom. Die polaren funktionellen Gruppen von Serin, Threonin, Cystein, Asparagin und Glutamin, die aber unter physiologischen Bedingungen praktisch nicht ionisierbar sind, bilden intramolekulare Wasserstoffbrücken aus. Sie sind für die Stabilisierung von Proteinen sehr wichtig. Die nichtionischen Seitenreste von Glutamin und Asparagin sind als Carbonsäureamid-Gruppen relativ stark polarisiert. Eine Besonderheit stellt die Aminosäure Prolin dar: Die Seitenkette vollzieht einen Ringschluss mit dem Stickstoffatom der Aminogruppe. Somit besitzt Prolin eine sekundäre Aminogruppe und ist demnach keine Amino-, sondern eine Imi-

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4.2 Die Aminosäuren – Bausteine der Proteine

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4 Proteine

nosäure. Trotzdem wird Prolin vereinfachend stets zu den 19 anderen Aminosäuren mit hinzugerechnet. Der gebildete Fünferring fixiert die Bindungsebene zwischen dem a-Kohlenstoffatom und der Aminogruppe. Prolin hat damit Auswirkung auf den Strukturverlauf eines Proteins: Das Rückgrat des Proteins wird leicht abgeknickt, außerdem ist die Polypeptidkette hier nicht frei drehbar. Die beiden sauren Aminosäuren Glutaminsäure und Asparaginsäure sind aufgrund ihrer terminalen Carboxylgruppe sehr polar. Unter physiologischen Bedingungen bei etwa pH 7,4 liegen sie immer dissoziiert vor und werden entsprechend als Glutamat und Aspartat bezeichnet. Noch polarer sind die basischen Aminosäuren Lysin mit endständiger Aminogruppe und vor allem Arginin mit positiv geladener Guanidinogruppe, die bei pH 7,4 protoniert vorliegen. Der Imidazolring des Histidins ist meist protoniert, kann aber auch deprotoniert vorliegen. Im Gegensatz zu den unpolaren Aminosäuren orientieren sich die polaren Aminosäuren in wässriger Umgebung meist nach außen, im Proteininneren z. B. bei Enzymen sind sie häufig am Katalysemechanismus beteiligt (S. 205). In Membranproteinen sind sie nach innen gerichtet und kleiden beispielsweise Poren aus, über die hydrophile Moleküle die lipophile Membran durchqueren. Acht Aminosäuren kann der menschliche Körper selbst nicht synthetisieren, diese Aminosäuren werden als essentiell bezeichnet, d. h. ihre Aufnahme oder die der Vorstufen über die Nahrung ist lebensnotwendig: Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan, Lysin, Methionin und Threonin.

4.2.3

Weitere proteinogene Aminosäuren

Neben den bisher genannten 20 Aminosäuren gelten folgende drei Aminosäuren ebenfalls als Standardaminosäuren: Selenocystein, Pyrrolysin und Formylmethionin (Abb. 4.3a). Im Selenocystein ist das Schwefelatom des Cysteins durch das Spurenelement Selen ersetzt. Selen liegt negativ geladen vor, das Proton ist dissoziiert. Die Selenocystein-tRNA trägt das Anticodon ACU und bindet an UGA-Codons der mRNA, die üblicherweise als Stopcodons fungieren. Bestimmte mRNA-Haarnadelstrukturen (stem-loops) in der Nähe von UGACodons legen fest, dass Ribosomen ein Selenocystein einbauen, anstatt die Translation durch ein Stopcodon zu beenden ( Genetik). Selenocystein kommt sowohl in pro- als auch in eukaryotischen Proteinen vor, z. B. in der Glycinreductase bei Clostridien ( Mikrobiologie). Auch das Pyrrolysin, das sich von Lysin ableitet, wird von einem Codon kodiert, das üblicherweise als Stopsignal für die Translation fungiert: dem UAG. Pyrrolysin kommt z. B. in einigen prokaryotischen Enzymen des Methanstoffwechsels vor. Der Austausch des H-Atoms an der Aminogruppe des Methionins gegen einen Formylrest unter Bildung von Formylmethionin geschieht bei Bacteria erst, nachdem Methionin an die t-RNA gebunden ist. Der Formylrest blockiert die

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4.2 Die Aminosäuren – Bausteine der Proteine

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Abb. 4.3 Weitere proteinogene und modifizierte Aminosäuren. a Selenocystein, Pyrrolysin und Formylmethionin. b Hydroxyprolin, Allysin, O-Phosphotyrosin sind posttranslational modifizierte Aminosäuren in Proteinen.

Aminogruppe, so dass die Verlängerung der Peptidkette nur in Richtung des Carboxylrests und nicht umgekehrt erfolgen kann. Die spezifische Formylmethionin-tRNA bindet stets nur das erste Startcodon AUG bei der Transkription, d. h. die erste Aminosäure in einem neu translatierten Protein ist bei Bacteria ein Formylmethionin ( Genetik). Die Standardaminosäuren werden zum Teil am fertigen Protein modifiziert (Abb. 4.3b). Zu den posttranslationalen Modifikationen gehören Glykosylierungen, Acylierungen, Phosphorylierungen oder Sulfatierungen (S. 404). Phosphoserin, Phosphotyrosin und Phosphothreonin entstehen z. B. durch Übertragung von Phosphatgruppen auf die Hydroxylgruppen der Aminosäuren Serin, Tyrosin und Threonin. Donor dieser Phosphatgruppen ist meist das endständige g-Phosphat des ATPs. Diese Modifikation ist reversibel und dient häufig der Regulation. Eine besondere Aminosäure ist das Hydroxyprolin: Es entsteht posttranslational durch Hydroxylierung von Prolin und kommt ausschließlich in den Kollagenen vor. Allysine sind desaminierte Lysine; sie kommen ebenfalls nur in Kollagenen sowie dem Elastin vor. Sie sind nur ein Zwischenprodukt, bevor zwei Allysine eine Aldolkondensation eingehen und damit eine kovalente Bindung zwischen zwei Allysin-Seitenketten ausbilden. Mittlerweile sind eine Reihe kurzer Peptide beschrieben worden, die mittels nicht ribosomaler Peptidsynthetasen gebildet werden. Das bekannteste ist Gluthathion oder einige Antibiotika wie Valinomycin. Die Peptide enthalten Standardaminosäuren oder aber – wie in den Zellwänden von Bakterien – z. B. auch D-Enantiomere anstelle der normalen L-Aminosäuren.

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4 Proteine

4.2.4

Nicht proteinogene Aminosäuren und Aminosäurederivate

Aminosäuren nehmen aber nicht nur als integrale Bestandteile größerer Polymerstrukturen wie Proteinen, Peptiden oder Zellwänden wichtige Funktionen wahr. Einige Aminosäure und deren Derivate fungieren selber z. B. als chemische Botenstoffe zwischen Zellen (Abb. 4.4). Glutaminsäure und Glycin gehören zu den Neurotransmittern; g-Aminobuttersäure (GABA), aus Glutaminsäure durch Decarboxylierung gebildet, ist ebenfalls ein Neurotransmitter, ebenso wie Dopamin, das durch Hydroxylierung von Tyrosin zu L-Dopa (für 3,4-Dihydroxyphenylalanin) und anschließende Decarboxylierung zu 3,4-Dihydroxyphenylethylamin (Dopamin) entsteht ( Zoologie). Aus Tyrosin wird auch das Schilddrüsenhormon Thyroxin gebildet. Das Decarboxylierungsprodukt des Histidins, das Histamin, spielt als Gewebshormon oder Mediator ( Zoologie) eine Rolle bei allergischen Reaktionen. Aminosäurederivate haben noch andere Funktionen: S-Adenosylmethionin z. B. ist ein stark aktivierter Methylgruppendonor. Es entsteht aus Methionin und ATP, wobei alle Phosphatgruppen des ATPs gespalten werden. Melanin, das schwarze Pigment von Haaren und Haut, besteht aus polymerisierten Tyrosinderivaten. Auch das Lignin, ein Polymer, das dem Holz der Pflanzen seine Stabilität verleiht, leitet sich vom Tyrosin ab. Schließlich existieren noch einige Aminosäuren, die bei der Proteinbiosynthese nicht von den Standardaminosäuren unterschieden werden können. Ein Beispiel einer solchen toxischen Aminosäure, die zu Fehlfaltung und Dysfunktion des betroffenen Proteins führt, ist die Azetidin-2-Carbonsäure des Maiglöckchens, die Prolin imitiert. Während sich die Pflanze selbst durch eine hochspezifische Prolyl-tRNA-Synthetase vor dem Einbau in eigene Proteine schützt, kann die menschliche Prolyl-tRNA-Synthetase Azetidin2-Carbonsäure nicht vom eigentlichen Prolin unterscheiden.

Abb. 4.4 Nicht proteinogene Aminosäuren. Die Neurotransmitter GABA und Dopamin sind Derivate der Aminosäuren Glutamat bzw. Phenylalanin. Das Schilddrüsenhormon Thyroxin entsteht aus zwei Tyrosinen.

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4.3 Die Struktur von Proteinen

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Protein: Makromolekül, aus Aminosäuren aufgebaut, die über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Aminosäuren: Bausteine der Proteine und Polypeptide, enthalten eine Säuregruppe (-COOH), eine basische Aminogruppe (-NH2), ein Wasserstoffatom und eine variable Seitenkette, gebunden an ein zentrales C-Atom. – unpolare Seitenketten: Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin. – geladene polare Seitenketten: Glutaminsäure, Asparaginsäure, Histidin, Lysin, Arginin. – ungeladene polare Seitenketten: Cystein, Methionin, Threonin, Serin, Prolin, Glutamin, Asparagin. – aromatische Seitenketten: Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin.

4.3

Die Struktur von Proteinen

Die Primärstruktur eines Proteins beschreibt die Abfolge der einzelnen Aminosäuren in der Polypeptidkette. Die teilweise starre Peptidbindung erlaubt nur die Ausbildung bestimmter übergeordneter Sekundärstrukturen, dazu gehören die a-Helix und das b-Faltblatt, die in den meisten Proteinen zu finden sind. Verschiedene Bindungstypen zwischen den Seitenketten stabilisieren diese Strukturen innerhalb eines Moleküls aber auch zwischen zwei benachbarten Polypeptidketten. Es entstehen übergeordnete räumliche Strukturen, die Tertiär- bzw. Quartärstruktur, die die speziellen Funktionen von Proteinen ermöglichen, z. B. die eines DNA-bindenden Proteins oder eines Enzyms. Proteine liegen nicht als lineare Polypeptidketten vor, sondern bilden komplexe dreidimensionale Strukturen, die durch verschiedene Organisationsebenen beschrieben werden: Die Reihenfolge der Aminosäuren, d. h. die Aminosäuresequenz der Polypeptidkette wird als Primärstruktur bezeichnet. Aus dieser linearen, zweidimensionalen Primärstruktur entstehen zunächst einzelne typische dreidimensionale Strukturelemente, die Sekundärstrukturen, die sich dann zur vollständigen räumlichen Gestalt eines Proteins, der Tertiärstruktur, arrangieren. Darüber hinaus können sich Einzelproteine zu einem funktionellen Protein und übergeordneten Proteinkomplex zusammenlagern, der dann als Quartärstruktur bezeichnet wird (Abb. 4.5). Die Peptidbindung wird an den Ribosomen geknüpft. Unter Wasserabspaltung verbindet sich die negativ geladene Carboxylgruppe mit der positiv geladenen Aminogruppe der zweiten Aminosäure (Abb. 4.6). Durch Bindung weiterer Aminosäuren entsteht das kovalente Rückgrat der Proteine aus der sich wiederholenden Folge N-C-C. Aus dem Peptidrückgrat ragen die verschiedenen Seitenketten der Aminosäuren heraus, deren Eigenschaften für die weitere Faltung des Proteins entscheidend sind. Dabei lässt das Peptidrückgrat nur sehr eingeschränkte Konformationen zu.

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4 Proteine

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Abb. 4.5 Proteinstrukturen. Die Aminosäuresequenz entspricht der Primärstruktur eines Proteins. Die a-Helix stellt eine mögliche Sekundärstruktur der gebildeten Polypeptide dar. Am Beispiel des Hämoglobins wird gezeigt, dass die a-Helix Teil der Tertiärstruktur der b-Polypeptidkette ist (nicht zu verwechseln mit dem b-Faltblatt). Die höchste Strukturebene stellt die Quartärstruktur dar, die die räumliche Anordnung der Untereinheiten im Hämoglobin wiedergibt.

Abb. 4.6 Peptidbindung. a Bildung der Peptidbindung. b Das Tetrapeptid besteht aus vier Aminosäuren. In einem Polypeptid bzw. Protein ergibt sich ein Ende mit einer freien Aminogruppe (Aminoterminus, N-Terminus) und ein Ende mit einer freien Carboxylgruppe (Carboxyterminus, C-Terminus).

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4.3 Die Struktur von Proteinen

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4

Abb. 4.7 Mesomere Grenzstrukturen der Peptidbindung. a Bis auf wenige Ausnahmen liegt das Wasserstoffatom der substituierten Aminogruppe in der trans-Position zum Sauerstoff der Carbonylgruppe. Im Gegensatz dazu sind die Bindungen zwischen dem a-Kohlenstoffatom und dem Carbonylkohlenstoffatom sowie die Bindung zwischen dem a-Kohlenstoffatom und dem Stickstoffatom Einfachbindungen und damit nicht fixiert. b Rotationen im Peptidrückgrat sind so nur an der N-Ca und der C-Ca-Bindung möglich. c Die Drehungen um diese Bindungen werden durch die Winkel 2 (phi: N-Ca-Bindung) und c (psi: Ca-C-Bindung) erfasst.

Als Säureamidbindung ist die C-N-Peptidbindung mesomerie- bzw. resonanzstabilisiert, und hat zu ca. 40 % Doppelbindungscharakter (Abb. 4.7). Mit Hilfe röntgenkristallographischer Untersuchungen gelang den Wissenschaftlern Linus Pauling und Robert Corey bereits Ende der 30er Jahre der Nachweis, dass die Peptidebene starr ist. Im Peptidrückgrat sind nur Rotationen an der Bindung zwischen a-Kohlenstoffatom und Carbonylatom sowie a-Kohlenstoffatom und Stickstoffatom möglich. Die Drehungen um diese Bindungen werden durch die Winkel 2 und c beschrieben. Diese sehr eingeschränkte Flexibilität der Polypeptidkette ist bereits entscheidend verantwortlich für die Ausprägung höherer, sekundärer Strukturmerkmale eines Proteins. Letztlich sind nur einige sehr wenige, definierte Winkelkombinationen von 2 und c zulässig, ohne dass sich einzelne Substituenten des Polypeptids sterisch behindern. Dies wird in dem sogenannten Ramachandran-Plot deutlich, in dem die zulässigen Winkelgrade von 2 und c gegeneinander aufgetragen sind. Die dort als zulässig ausgewiesenen Flächen repräsentieren die in Proteinen vorkommenden übergeordneten Sekundärstrukturen, wie die verschiedenen Formen der a-Helix und des b-Faltblattes.

4.3.1

Die verschiedenen Sekundärstrukturen von Proteinen

In allen Proteinen kommen nur wenige verschiedene sekundäre Strukturen vor: Die a-Helix, das b-Faltblatt – beide 1951 von Pauling und Corey postuliert – und die b-Schleife (b-turn). Außerdem existiert noch die linksgängige Kollagenhelix,

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4 Proteine

die aber bislang ausschließlich in den Kollagen (s. u.) des Bindegewebes nachgewiesen werden konnte. Bei der rechtsgängigen a-Helix windet sich das Proteinrückgrat eng schraubenförmig wie eine rechtsgängige Wendeltreppe, wobei das Polypeptidrückgrat innen liegt und die Seitenreste der Aminosäure nach außen zeigen (Abb. 4.8). 3,6 Aminosäuren sind für eine Helixwindung erforderlich. Die Ausbildung einer a-Helix wird von verschiedenen Aminosäuren begünstigt, von anderen Aminosäuren eher behindert. Alanin gilt als a-Helix-fördernd, kommt aber auch sehr häufig in einer speziellen Form des b-Faltblattes im Seidenfibroin vor (s. u.). Tab. 4.1 gibt die Häufigkeit an, in der die verschiedenen Aminosäuren in einer a-Helix sowie in dem noch zu besprechenden b-Faltblatt und in der b-Schleife vorkommen.

Abb. 4.8 Die a-Helix. In der Sekundärstruktur der a-Helix zeigen die Aminosäurereste nach außen. Der Kern der a-Helix (ohne abstehende Reste) hat einen Durchmesser von ca. 0,5 nm. Nach einem Anstieg der Helix um jeweils 0,15 nm folgt nach 100h Drehung die nächste Aminosäure; ca. 3,6 Aminosäuren sind für eine volle Helixumdrehung erforderlich, was einer Ganghöhe von ca. 0,54 nm entspricht. Die a-Helix wird durch Wasserstoffbrücken zwischen der NH-Gruppe und der CO-Gruppe der drittnächsten Aminosäure stabilisiert. In Proteinabbildungen werden a-Helices häufig als Helix oder Zylinder dargestellt.

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4.3 Die Struktur von Proteinen

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Tab. 4.1 Relative Häufigkeit des Vorkommens von Aminosäuren in den drei Sekundärstrukturen von Proteinen. Aminosäure

a-Helix

b-Faltblatt

b-Schleife

Met

1,47

0,97

0,39

Glu

1,44

0,75

1,00

Leu

1,30

1,02

0,59

Ala

1,29

0,90

0,78

Gln

1,27

0,80

0,97

Lys

1,23

0,77

0,96

His

1,22

1,08

0,69

Cys

1,11

0,74

0,80

Val

0,91

1,49

0,47

Ile

0,97

1,45

0,51

Phe

1,07

1,32

0,58

Tyr

0,72

1,25

1,05

Thr

0,82

1,21

1,03

Trp

0,99

1,14

0,75

Pro

0,52

0,64

1,91

Gly

0,56

0,92

1,64

Asp

1,04

0,72

1,41

Ser

0,82

0,95

1,33

Asn

0,90

0,76

1,28

Arg

0,96

0,99

0,88

Stabilisiert wird die a-Helix durch Wasserstoffbrücken zwischen der NHGruppe und der CO-Gruppe der drittnächsten Aminosäure. Der Kerndurchmesser einer a-Helix (also ohne die nach außen zeigenden Reste) beträgt ca. 0,5 nm. Normalerweise ist die Länge der a-Helices auf ca. 40 nm begrenzt. Entsprechend bilden a-Helices in Proteinen häufig nur kurze, zylinderförmige Abschnitte. Danach werden sie von einer anderen Struktur abgelöst. Helix-terminierend wirken einige typische Aminosäuren, wie der „Peptidbieger“ Prolin (S. 146). Sehr viel längere a-Helices bilden Proteine wie das Myosin und Tropomyosin des Muskels oder das Keratin der Haare (Abb. 4.9a). Hier verdrillen sich zwei bis vier parallel verlaufende rechtsgängige a-Helices zu einer superspiralisierten (coiled-coil) linksgängigen „Superhelix“. Die Anordnung aber auch die Länge dieser Superhelix kommt außer im Keratin so gut wie nicht vor. Weit häufiger sind a-Helices in Proteinen als isolierte Zylinder limitierter Länge zu finden.

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4 Proteine

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Abb. 4.9 Keratin und Kollagen. a Rechtsgängige a-Helix, superspiralisiert am Beispiel des Keratins. In einer Superhelix können die einzelnen a-Helices über 100 nm lang sein. b Linksgängige Kollagenhelix. Die linksgängige Kollagenhelix ist steiler und schmaler als die rechtsgängige a-Helix. Drei linksgängige Kollagenhelices bilden eine superspiralisierte, rechtsgängige Tripelhelix. Jede dritte Aminosäure ist ein Glycin (blau).

a-Helices sind eine vielseitig verwendbare Sekundärstruktur. Einige Proteine wie der Sauerstoff- und Kohlendioxid-Transporter Hämoglobin oder das sauerstoffbindende Muskelprotein Myoglobin bestehen nahezu ausschließlich aus a-Helices. Häufig sind es a-Helices, die in membranintegralen Proteinen die Lipiddoppelschicht der Zellmembran durchdringen, um damit das Protein zu verankern (S. 370). Zum Aufbau solcher membranintegraler a-Helices werden vorwiegend Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten, wie Ile, Leu, Val, Ala und Phe, verwendet, die nach außen orientiert in die Lipidphase der Membran hinein ragen. Transmembranproteine durchspannen die Lipiddoppelschicht vollständig. In ihnen besteht die membranintegrale a-Helix, entsprechend als Transmembranhelix bezeichnet, aus ca. 20–30 Aminosäuren und reicht in ihrer Länge aus, um den unpolaren Teil einer Membran ganz zu durchspannen. Manche Proteine durchspannen die Membran nur einmal, sie werden entsprechend als Single-pass-Proteine bezeichnet. Multi-pass-Proteine durchspannen die Membran mehrmals und haben mehrere solcher Transmembranhelices. So besteht der nicotinische Acetylcholinrezeptor, der nach Bindung von Acetylcholin Natriumionen passieren lässt, aus fünf einzelnen Polypeptiden, von dem jedes vier Transmembranhelices generiert: zusammen 20 Transmembranhelices. Bei dem spannungsabhängigen Natriumkanal, der entlang von Axonen in Nervenzellen für die Reizweiterleitung verantwortlich ist, bildet eine einzige Polypeptidkette 24 Transmembranhelices! Viele Membranrezeptoren sind Siebentransmembranhelix-Proteine (7TM-Motiv). Sie binden auf der Außenseite einer Zelle Hormone oder Neurotransmitter und sind auf der

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4.3 Die Struktur von Proteinen

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cytoplasmatischen Seite mit einem G-Protein gekoppelt, das das extrazelluläre Hormonsignal in der Zelle weiterleitet (S. 486). Das gleiche 7TM-Motiv liegt auch dem Opsin zugrunde, dem Proteinbestandteil, der in unseren Augen Lichtreize in Nervenimpulse umwandelt. Ein weiteres Beispiel für ein Siebentransmembranhelix-Protein ist das Bakteriorhodopsin mit sieben dicht gepackten a-Helices, bestehend aus jeweils 25 Aminosäuren. Mit einer Breite von 4,5 nm stehen die a-Helices fast senkrecht zur Membranebene (Abb. 4.10a). Die Räume zwischen den Proteinmolekülen werden von Lipidmolekülen ausgefüllt.

Die faserigen Kollagene sind außerordentlich zugstabile Komponenten der extrazellulären Matrix. Sie sind mit einem Gewichtsanteil von 25 % die häufigste

Abb. 4.10 Membranproteine. a Bakteriorhodopsin durchspannt die Membran mit sieben Transmembranhelices. Bakteriorhodopsin ist eine lichtgetriebene Protonenpumpe halophiler (salzliebender) Bakterien. (pdb 1C3W) b Struktur des a-Hämolysins von Staphylococcus aureus. Hier ist das sogenannte b-Barrel, das das Protein in der Membran verankert (S. 137) (pdb: 7AHL)

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4 Proteine

Proteinfamilie in Säugetieren. Kollagene weisen eine sehr typische Aminosäuresequenz auf: Fast jede dritte Aminosäure ist ein Glycin. Ebenfalls sehr regelmäßig sind die Aminosäuren Prolin sowie Hydroxyprolin, die beide durch ihren Ringschluss einen Knick in der Polypeptidkette erzeugen. Diese ungewöhnliche Aminosäuresequenz generiert in Kollagenen linksgängige, sehr steile Helices: drei Aminosäuren pro Helixwindung bei einer Ganghöhe von 0,96 nm (Abb. 4.9b). Drei dieser linksgängigen Helices lagern sich dann zu einer superspiralisierten, rechtsgängigen Tripelhelix zusammen. Dies ist der Grund, warum nahezu jede dritte Aminosäure ein Glycin ist: Ihr Wasserstoffrest ist stets zur Mitte der Tripelhelix orientiert, da er als einziger klein genug ist, die Bildung dieser Tripelhelix nicht zu behindern. Eine Stabilisierung innerhalb der einzelnen Helices über Wasserstoffbrücken-Bindungen ist nicht mehr möglich. Die Stabilität wird nur durch die Zusammenlagerung zur Tripelhelix gewährleistet, bei der die Helices untereinander intermolekulare Wasserstoffbrücken ausbilden. Zusätzlich wird die Tripelhelix noch über kovalente Disulfidbrücken stabilisiert. Daneben bilden sich zwischen zwei Lysinen kollagentypische kovalente Bindungen aus: Hierfür werden zwei Lysinreste über die Lysin-Oxidase oxidativ desaminiert. Die resultierenden Aldehydderivate (Allysine) bilden dann eine Aldolquerbrücke aus. Eine weitere Besonderheit sind Hydroxyproline (Abb. 4.3b). Wie Hydroxyproline zur Stabilisierung der Tripelhelix beitragen, ist noch unbekannt. Möglicherweise werden intramolekulare Wasserstoffbrücken ausgebildet, in die Wassermoleküle als Überbrückung involviert sind. Warum das Strukturmotiv der linksgängigen, steilen Helix außer in den Kollagenen in keinen anderen Proteinen Verwendung findet, ist unbekannt. Möglicherweise wird diese höchst zugbelastbare Proteinstruktur anderweitig einfach nicht benötigt. Verschiedene Krankheiten haben ihre molekularen Ursachen in einer unzureichenden Kollagenstabilität z. B. Skorbut (S. 475). Beim b-Faltblatt stapeln sich einzelne, nahezu vollständig gestreckte Peptidketten regelmäßig gefaltet, wellblechartig übereinander. Die Aminosäureseitenketten ragen oben bzw. unten aus dem Faltblatt heraus (Abb. 4.11). Die übereinander liegenden Polypeptide können in die gleiche Richtung laufen (bp-Faltblatt; Index p = parallel) oder entgegengesetzt (antiparalleles ba-Faltblatt) orientiert sein, wobei letzteres energetisch sehr viel günstiger ist (Abb. 4.11b). Antiparallele b-Faltblätter finden sich z. B. im Seidenfibroin, dem fibrillären Proteinbestandteil von Seide, die von vielen Insekten und Spinnen zum Bau von Kokons und Netzen benutzt wird. Im Fibroin wechseln sich die Aminosäuren Glycin und Alanin regelmäßig ab: Es kommt zu einer Stapelung, in der jeweils die kleinen Wasserstoffreste von Glycin zweier übereinander liegender Faltblätter ineinander verzahnt vorliegen und bei den beiden darüber liegenden Faltblätter die etwas größeren Methylseitenketten von Alanin reißverschlussartig ineinander ragen. So sind zwei verschiedene Abstände zwischen den b-Faltblättern möglich: Sind die H-Reste der Glycine die Reißverschlusszähne, beträgt der

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4.3 Die Struktur von Proteinen

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Abb. 4.11 Das b-Faltblatt. a Im b-Faltblatt ist die Peptidkette nahezu völlig gestreckt. Sie wird durch Wasserstoffbrücken zwischen zwei übereinander liegenden Blättern stabilisiert; Wasserstoffbrücken innerhalb eines Faltblattes sind nicht möglich. In Proteinabbildungen werden b-Faltblätter meist als flache, bänderartige Pfeile dargestellt. b Die übereinander liegenden Polypeptide können in die gleiche Richtung laufen (paralleles bp-Faltblatt), oder entgegengesetzt (antiparalleles ba-Faltblatt) orientiert sein. Wasserstoffbrücken verbinden benachbarte Peptidketten. Sie sind bei antiparallelem Kettenverlauf gerade und bei parallelem gebogen. Die antiparallele Anordnung ist daher energetisch begünstigt.

Abstand 0,35 nm; sind die Methylgruppen der Alanine ineinander verzahnt, beträgt der Abstand 0,57 nm. Die enge und regelmäßige Stapelung von b-Faltblättern ist eher die Ausnahme. In den meisten Proteinen treten b-Faltblätter als isolierte, bänderartige Strukturen auf, wobei mehrere von ihnen durchaus in einem Bereich eng benachbart sein können, dann aber meist leicht versetzt und verdreht zueinander stehen. Immunglobuline sind ein weiteres Beispiel für Proteine, die vorwiegend aus b-Faltblättern aufgebaut sind. b-Faltblätter können auch DNABindungsproteine dominieren. Ein Beispiel ist das TATA-Box-Bindungsprotein ( Genetik). Eine weitere übergeordnete b-Faltblattstruktur ist das b-Barrel (barrel: Fass), neben den a-Transmembranhelices eine weitere Möglichkeit für eine Polypep-

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4 Proteine

tidkette eine zelluläre Membran zu durchspannen: Beim b-Barrel besitzen mehrere Transmembranstränge eine b-Faltblattstruktur und bilden eine fassförmige Struktur aus. Zehn und weniger Aminosäurereste sind ausreichend, um die Lipiddoppelschicht als gestrecktes b-Faltblatt zu durchspannen. Die am besten untersuchten Proteine, die als b-Barrel die Membran durchdringen, sind die Porine in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien bzw. Mitochondrien und einige bakterielle Toxine (S. 377). Die Primärstrukur b-Barrel bildender Transmembranproteine ähnelt der von löslichen Proteinen; nichts deutet zunächst auf ein membranständiges Protein hin. Im Gegensatz zu den a-helikalen Transmembransequenzen bestehen die b-Barrels nicht aus einer Abfolge hydrophober Aminosäuren und können deshalb auch nicht anhand der Primärstruktur vorhergesagt werden. Dies hat zu einigen Irritationen geführt, die erst mit der Strukturaufklärung des Porins aus Rhodobacter capsulatus geklärt wurden. Bei den Porinen wird ein b-Barrel von einer Polypeptidkette gebildet. Aber auch mehrere Polypeptidketten können ein gemeinsames b-Barrel ausbilden, etwa bei dem a-Hämolysin von Staphylococcus aureus (Abb. 4.10b). Bei einer b-Schleife vollziehen vier Aminosäuren eine fast vollständige 180h Kehrtwende des Peptidrückgrats. Die b-Schleife wird durch eine Wasserstoffbrücke zwischen der CO-Gruppe der ersten und der NH-Gruppe der vierten Aminosäure stabilisiert. Es gibt zwei verschiedene Typen der b-Schleife (I und II). Sie unterscheiden sich in der Orientierung der Peptidbindungsebene zwischen der zweiten und der dritten Aminosäure. Häufig treten b-Schleifen am Ende einer a-Helix auf. In einem Protein liegen die oben beschriebenen Sekundärstrukturen aber nicht unmittelbar nebeneinander. Vielmehr weist das Polypeptidrückgrat zwischen den a-Helices, b-Faltblättern oder b-Schleifen über ausgedehnte Strecken keine erkennbaren Sekundärstrukturen auf. Diese als Random Coil (random: zufällig, beliebig; coil: Knäuel) bezeichneten Elemente machen einen Großteil der Proteine aus. Sie sind für die Proteinfunktion von entscheidender Bedeutung in dem sie z. B. als bewegliche Glieder die Verschiebung einzelner Sekundärstrukturen gegeneinander zulassen.

4.3.2

Von der Sekundär – über die Supersekundär – zur Tertiärstruktur

Alle Sekundärstrukturen zusammen ergeben die Tertiärstruktur eines Proteins oder einer Polypeptidkette. Zwischen der Organisationsebene der Sekundärund der Tertiärstruktur lassen sich einzelne Sekundärstrukturen sowie die sie verbindenden Polypeptidketten räumlich und funktionell zu Gruppen oder funktionellen Bereichen zusammenfassen. Solche Bereiche, die für verschiedene Funktionen eines Proteins verantwortlich sind, werden als Proteinmotive oder auch als Supersekundärstrukturen bezeichnet. Ein weiterer Begriff im Zusammenhang mit Supersekundärstrukturen ist die Proteindomäne. Er bezieht sich

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4.3 Die Struktur von Proteinen

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auf eine sehr kompakte, globuläre Einheit, die zwischen 100 und 400 Aminosäuren umfasst und sich meist auf eine exponierte Oberfläche eines Proteins bezieht. Zwischenzeitlich ist der Begriff der Domäne teilweise durch den des Proteinmotivs ersetzt worden. Er wird aber häufig noch im Zusammenhang mit bereits seit längerem bekannten Proteinstrukturen wie den Immunglobulinen verwendet ( Zoologie). Proteinmotive und -strukturen, die eine bestimmte Funktion wahrnehmen, kommen häufig in vielen verschieden Proteinen vor und sind dort dann sehr ähnlich aufgebaut. Einem Baukastenprinzip gleich wurde so eine einmal erfolgreiche Struktur kopiert und bei Bedarf an anderer Stelle erneut verwendet. Ein solch typisches Proteinmotiv ergibt sich z. B. bei DNA-bindenden Proteinen: Bei dem Helix-turn-Helix-Motiv sind zwei a-Helices durch eine „Kurve“ oder „Schleife“ (turn) getrennt und stehen in einem scharfen Winkel zueinander (Abb. 4.12a). Diese Schleife muss keinesfalls die namensverwandte b-Schleife

Abb. 4.12 Verschiedene Proteinmotive. a Das Helix-turn-Helix-Motiv wird durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den beiden a-Helices stabilisiert. Für die Bindung der Erkennungshelix an die DNA sind Wasserstoffbrücken-Bindungen (H-Brücken) zwischen Aminosäureresten der Helix und den DNA-Basen verantwortlich. b Beim Leucin-Zipper tragen zwei eng benachbarte, antiparallel laufende a-Helices an jeder siebten Aminosäure ein Leucin, deren Reste jeweils nur auf einer Seite der Helix auftauchen. Die einseitig orientierten, hydrophoben Leucinreste beider a-Helices verzahnen sich sehr stabil ineinander, ähnlich wie die Zähne eines Reißverschlusses. c calciumbindende EF-Hand. Zwei im Winkel zueinander stehende a-Helices bilden eine Bindungstasche für Ca2+-Ionen.

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4 Proteine

(s. o.) sein; vielmehr reicht hier oft schon die helixterminierende Aminosäure Prolin, die einen Knick im Polypeptidrückgrat erzeugt. Eine der beiden Helices ist eine DNA-Erkennungshelix. Häufig sind solche DNA-Bindungsproteine Dimere. Mit Hilfe der im Partnermolekül ebenfalls vorhandenen DNA-Erkennungshelix des Helix-Turn-Helix-Motivs kann das dimere Bindungsprotein die DNA von zwei Seiten gezielt in die Zange nehmen. Ebenfalls ein häufiges a-Helix-Motiv ist der Leucin-Reißverschluss (LeucinZipper) (Abb. 4.12b). Im Gegensatz zu den parallel verlaufenden a-Helices, verdrillen sich diese antiparallelen Helices nicht zu „coiled-coils“, sondern bilden sehr markante Proteinstrukturen, die wahrscheinlich nicht nur DNA-Spezifität haben. a-Helices werden auch zur Konstruktion von Calciumbindungsmotiven herangezogen (Abb. 4.12c). Hierbei sind zwei Helices von einer größeren Peptidschleife voneinander getrennt und stehen zueinander, wie der Zeigefinger und der Daumen einer Hand. Zusammen mit der sie verbindenden Peptidschleife koordinieren sie die Bindung des Ca2+-Ions. Calcium ist ein sekundärer Botenstoff (S. 488), das calciumbindende Calmodulin spielt eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion. Das Bindungs-Motiv wurde erstmals in Parvalbumin nachgewiesen. Da die dort fortlaufenden a-Helices E und F für die Calciumbindung verantwortlich sind, wurde das gesamte Motiv auf den Namen EF-Hand getauft. Das Motiv des Zinkfingers (Abb. 4.13) ist ein Beispiel für die enge Nachbarschaft von a-Helices und b-Faltblättern. Bei diesem Motiv wird ein Zinkion zwischen zwei Cysteinen und zwei Histidinen koordiniert. Die eine Seite des Zinkfingers bildet eine a-Helix, die andere ein b-Faltblatt. Zinkfinger sind sehr effektive DNA-Bindungsmotive. Die Bindung erfolgt über die a-Helices an die großen Furchen der DNA.

Abb. 4.13 Zinkfinger. a Die dreidimensionale Struktur zeigt, dass Zinkfinger auf der einen Seite der Zink-Koordinierungsstelle ein b-Faltblatt und auf der anderen Seite eine a-Helix bilden (pdb: 1ZAA). b In der zweidimensionalen Darstellung verläuft das Polypeptidrückgrat zwischen diesen Koordinierungsstellen in einer Art Schlaufe, die einem Finger gleicht. Viele solcher Zinkfinger hintereinander angeordnet bilden eine Art Kamm.

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4.3 Die Struktur von Proteinen

4.3.3

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Die Stabilisierung von Proteinstrukturen

Sekundärstrukturen lagern sich zu bestimmten funktionellen Motiven zusammen. Sowohl diese erste Assoziation, als auch die Verankerung der einzelnen Sekundärstrukturen und Motive an den richtigen Positionen des Proteins, geschieht über kovalente und nicht kovalente Bindungen (S. 89). Dabei tragen die nicht kovalenten Bindungen aufgrund ihrer Häufigkeit am meisten zur Strukturstabilisierung von Proteinen bei, obgleich ihre einzelne Bindungsenergie vergleichsweise gering ist. Nichtkovalente Bindungen sind noch aus einem weiteren Grund sehr wichtig: Sie sind die Bindungstypen, die für die Faltung der Polypeptidkette und die erste Stabilisierung von Sekundärstrukturen verantwortlich sind. Die sehr viel stabileren kovalenten Bindungen sind weitaus seltener und stabilisieren die Proteinstruktur erst dann, wenn die Proteinfaltung nahezu vollständig abgeschlossen ist. Ionenbindungen sorgen in Proteinen für außerordentlich starke Wechselwirkungen zwischen zwei gegensätzlich geladenen Seitenketten, z. B. zwischen den positiv geladenen Resten Lysin, Arginin oder Histidin mit den negativ geladenen Resten Glutamat oder Aspartat. Wasserstoffbrücken-Bindungen fixieren einzelne Sekundärstrukturen untereinander und damit auch die gesamte Tertiärstruktur. Die Struktur vieler Proteine wird über Metallionen fixiert. So wird das Ca2+-Ion in der bereits besprochenen EF-Hand von verschiedenen Sauerstoffatomen komplexiert, die vorwiegend von Aspartat- und Glutamatseitenketten stammen. Die Komplexbildung eines Metallions fixiert dabei nicht nur das Ion selbst, sondern es stabilisiert die gesamte dazu gehörende dreidimensionale Struktur. Kovalente Bindungen sind zwar thermodynamisch stabiler, kommen in Proteinen aber zwischen den Seitenketten selten vor. Die häufigsten kovalenten Bindungen unter Proteinseitenketten sind die bereits bekannten Disulfidbrücken (Abb. 4.14) zwischen zwei Cysteinen. Keineswegs alle sondern nur wenige bestimmte Cysteine sind für die Ausbildung einer Disulfidbrücke vorgesehen. Disulfidbrücken kommen weit häufiger in extrazellulären Proteinen als in intrazellulären vor. Die Disulfidbrücke ist die stabilste Fixierung einer Tertiärstruktur. In den Kollagenen und dem Elastin tragen, wie oben schon erwähnt, Lysinreste

Abb. 4.14 Disulfidbrücke. Die freien Sulfhydrylgruppen zweier Cysteine bilden unter Oxidation eine Disulfidbrücke aus. Es entsteht Cystin. Disulfidbrücken sind sehr stabil und nur unter Enzymeinwirkung oder starken Reduktionsmitteln (b-Mercaptoethanol) wieder zu öffnen. Sie kommen vorwiegend in extrazellulären Proteinen vor.

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4 Proteine

zur kovalenten Verknüpfung innerhalb eines Polypeptids und zwischen verschiedenen Polypeptiden bei. Zwei für das Protein Elastin charakteristische kovalente Querverbindungen leiten sich ebenfalls von Lysinresten ab. Die kovalente Peptidbindung der Aminosäureketten ist sehr stabil, sowohl aggressiven Chemikalien als auch hohen Temperaturen gegenüber. In der Zelle spalten spezialisierte Proteasen diese Bindungen. Dagegen sind die nichtkovalente, bzw. wenigen kovalenten Bindungen zwischen den Aminosäureseitenketten, die zu den Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen führen, empfindlich: Proteine geraten leicht „aus der Form“ und verlieren damit ihre biologische Funktion. Der Proteinchemiker spricht dann von denaturierten Proteinen. Säuren, Basen, viele Lösungsmittel, Detergenzien, erhöhte Salzkonzentrationen können die Struktur eines Proteins verändern, ebenso wie leichter Temperaturanstieg. So kommt es bereits bei starkem Fieber von über 42hC zu irreparablen Strukturschäden von Proteinen. Proteindenaturierung ist auch der Grund für das Einlaufen eines zu heiß gewaschenen Wollpullovers oder für das Gerinnen von Hühnereiweiß nach Erhitzen. Sind Proteine erst einmal denaturiert, sind sie meist nicht mehr in ihren nativen, funktionsfähigen Originalzustand zurück zu formen. Lediglich sogenannte Chaperone, ebenfalls Proteine, sind in der Lage, denaturierte und schwach geschädigte Proteine wieder zu rekonstituieren (S. 145). Ein Beispiel für Proteine, denen selbst extrem hohe Temperaturen nichts anhaben können, ist die Taq-Polymerase. Die thermoresistente DNA-Polymerase des in heißen Quellen lebenden Bakteriums Thermus aquaticus hat eine außergewöhnliche Karriere gemacht: Das Enzym wird heute weltweit in der Polymerasekettenreaktion PCR (polymerase chain reaction) eingesetzt, eine Methode zur Vervielfältigung selbst geringster

Abb. 4.15 Die RNase, gereinigt aus Rinderpankreas. Versetzt man die RNase mit b-Mercaptoethanol, werden die Disulfidbrücken gelöst und zu Sulfhydrylgruppen reduziert. Durch zugesetzten Harnstoff, der nicht kovalente Wechselwirkungen vermindert, wird das Protein denaturiert. Wird im Anschluss daran das b-Mercaptoethanol und der Harnstoff der Lösung durch Dialyse wieder entzogen, werden die Sulfhydrylgruppen durch Luftsauerstoff oxidiert und bilden Disulfidbrücken aus, die die native, dreidimensionale Struktur der RNase rekonstruieren.

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4.3 Die Struktur von Proteinen

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DNA-Mengen ( Genetik). Welche molekularen Mechanismen die außergewöhnliche Hitzestabilität dieser Proteine ausmachen, ist noch immer nicht zweifelsfrei geklärt. Ein weiteres Beispiel für eine außergewöhnliche Strukturstabilität sind Ribonucleasen (RNasen). Im Gegensatz zur Taq-Polymerase lassen sich RNasen leicht denaturieren, finden allerdings schnell nach Beendigen der denaturierenden Bedingungen ihre native Form wieder (Abb. 4.15). Dieser hohe Renaturierungserfolg von RNasen erschwert das Arbeiten mit isolierter RNA: RNasen sind nur sehr schwer zu inaktivieren. Die RNase aus Rind besteht aus einem einzigen Polypeptid von 124 Aminosäuren. Ihre Tertiärstruktur wird u. a. über vier Disulfidbrücken stabilisiert. Die korrekte Rückfaltung ist insofern außergewöhnlich als bei acht zur Verfügung stehenden Cysteinen theoretisch 105 verschiedene Disulfidbrücken möglich sind, tatsächlich aber nur eine Tertiärstruktur thermodynamisch bevorzugt ist. Die Arbeiten zur Rückfaltung der RNAse gelten als Beweis, dass für die dreidimensionale Struktur der Proteine nur die Aminosäuresequenz ausreichend ist. Christian B. Anfinsen erhielt hierfür 1972 den Nobelpreis, zusammen mit Stanford Moore und William Howard Stein.

4.3.4

Der rätselhafte Faltungscode der Proteine

Tatsächlich ist es bis heute noch immer nicht endgültig geklärt, wie ein Protein innerhalb kurzer Zeit nach der Proteinbiosynthese aus der linearen Polypeptidkette seine stets gleiche und spezifische dreidimensionale Struktur findet. Zwar ist unbestritten, dass die Eigenschaften des Peptidrückgrats und bestimmte Aminosäuren die Ausbildung entsprechender Sekundärstrukturen begünstigen oder behindern und durch dieselben Kräfte und Bindungen auch später die gesamte Tertiärstruktur stabilisiert wird. Doch trotz dieser nachgewiesenen Korrelation zwischen Sequenz und Sekundärstruktur ist es bislang nur sehr bedingt möglich, von der primären Aminosäuresequenz eines Proteins auf dessen Tertiärstruktur zu schließen. Wie heute bekannt ist, sind nur ungefähr 25 % aller Aminosäurereste letztendlich für die Festlegung der Faltungsstruktur verantwortlich. Meist orientieren sich Strukturprognosen an homologen Primärsequenzen, deren dreidimensionale Faltung in anderen Proteinen bereits bekannt ist. Strukturaussagen de novo, also Strukturprognosen zu einer neu entdeckten Sequenz, für die keine Referenzstruktur bekannt ist, sind sehr schwierig. Nicht selten zeigt sich, dass eine aufgrund der Sequenz in silico (also per Computermodell) vorhergesagte Sekundärstruktur im Protein gar nicht ausgebildet ist. Noch ungleich viel schwieriger ist die Voraussage der gesamten Tertiärstruktur. Zusätzlich erschwerend kommt hinzu, dass vollkommen unterschiedliche Aminosäuresequenzen nahezu identische Tertiärstrukturen generieren z. B. bei den sauerstofftransportierenden Proteinen. Gleiches gilt für a- und b-Tubulin, jene Proteinmonomere, die durch Polymerisierung im Cytoplasma die langen, röhrenförmigen Mikrotubuli ausbilden. Die Aminosäuresequenz von a- und b-Tubulin stimmt nur zu 40 % überein. Die Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse beider Monomere offenbarte überraschend, dass a- und b-Tubulin trotz ihrer sehr geringen Sequenzhomologie nahezu identische räumliche Proteinstrukturen ausbilden.

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Der umgekehrte Fall – also eine gleiche Aminosäuresequenz, die zu unterschiedlichen Proteinstrukturen führt – zeigt sich bei Prionen (protein infectious agent). Diese Proteine gelten als Erreger der übertragbaren Hirnschwammerkrankungen (spongiforme Enzephalopathien). Prionen sind Strukturvarianten eines membranständigen Glykoproteins, das alle Säuger in bestimmten Nervenzellen exprimieren. Beide Proteine haben eine identische Aminosäuresequenz, sie unterscheiden sich lediglich in ihrer Sekundär- und Tertiärstruktur. Während das gesunde Prionprotein (PrPC, c: cellular) vorwiegend a-Helices aufweist, schnappen diese beim infektiösen Prionprotein (PrPSc, sc: scrapie) zu b-Faltblättern um (Abb. 4.16). Die so veränderten Prionen lagern sich zu Aggregaten zusammen, die von Proteasen nicht mehr abgebaut werden und sich in der Nervenzelle anhäufen. In der Folge stirbt die Nervenzelle ab. Es scheint, als ob die infektiösen den gesunden Prionproteinen durch die Induktion irreversibler Konformationsänderungen die eigene, krankmachende Struktur aufzwingen. So kann sich das infektiöse Prion – einer Kettenreaktion gleichend – vermehren. Stanley B. Prusiner erhielt für seine Arbeiten zum Nachweis der Prionen als Ursache der spongiformen Enzephalopathien 1997 den Medizin-Nobelpreis. Revolutionär an Prusiners Idee war, dass er erstmals einen „Nur-Eiweiß-Erreger“ ohne genetischen Datenträger in Form von DNA oder RNA nachwies – eine Hypothese, die bereits 1967 von dem britischen Biologen John S. Griffith formuliert wurde, bis dato aber für unmöglich gehalten wurde.

Trotz der Kenntnis über die Faltungsanomalien bei Prionen geht man nach wie vor davon aus, dass die korrekte Faltung eines Proteins üblicherweise die energetisch günstigste, also die mit der geringsten freien Enthalpie ist. Doch selbst für ein vergleichsweise kleines Protein existieren theoretisch astronomisch viele unterschiedliche Faltungsoptionen, dass ein zufälliges „Ausprobieren“ aller bis zum Aufspüren der energetisch günstigsten Variante eine Zeit in Anspruch nehmen würde, die das Alter des Universums um Größenordnungen überschreiten würde – ein Problem, das als Levinthal-Paradoxon bezeichnet

Abb. 4.16 Prionen. a Während das normale PrPC vorwiegend aus a-Helices aufgebaut ist, sind in dem infektiösen PrPSc eine oder zwei dieser a-Helices in vier antiparallele b-Faltblätter umgelagert. b PrPSc lagert sich an normales PrPC an und induziert damit die irreversible Konformationsänderung.

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4.3 Die Struktur von Proteinen

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wird. Es wird daher davon ausgegangen, dass die Faltung des Proteins über Zwischenstufen verläuft: Kleinere, eng begrenzte Polypeptidbereiche finden relativ schnell ihr energetisches Faltungsoptimum und bilden eine Art Faltungskern oder -keim, der die möglichen Faltungszustände benachbarter Peptidabschnitte energetisch stark einschränkt, um diese dann in ihr Energieminimum praktisch „mit hinein zu ziehen“. Von Bedeutung sind bei der korrekten Faltung bestimmte Proteine sogenannte Chaperone (engl. Anstandsdamen). Bereits bei der Translation, sobald das wachsende Polypeptid auf der Außenseite aus der großen ribosomalen Untereinheit heraustritt, wird es von diesen molekularen Kindermädchen flankiert und erste Faltungsvorgänge unterstützt. Dabei orientieren sich Chaperone an der Aminosäuresequenz. Einige Chaperone sind Peptidyl-Prolyl-Isomerasen, d. h. sie lösen die an der Stelle eines Prolins fixierte 2N-Ca-Bindung und verändern damit die Struktur des Peptidrückgrats. Teilweise verzögern Chaperone aber auch Strukturausbildungen, z. B. bis das Protein seinen endgültigen Zielort in der Zelle erreicht. Chaperone beeinflussen aber nicht nur während oder kurz nach der Proteinbiosynthese die Faltung, sondern greifen strukturkorrigierend während des gesamten „Proteinlebens“ ein. Häufig kommt es beispielsweise nach einem Hitzestress aber auch nach anderen Stresssituationen einer Zelle zu einer Denaturierung von Proteinen. Spezielle Chaperone, die Hitzeschockproteine (heat shock proteins, HSP) sind dann in der Lage, die native Proteinform wiederherzustellen oder aber sie verhindern durch direkte Bindung an das Protein dessen vollständige Denaturierung und damit Inaktivierung.

4.3.5

Die Quartärstruktur

Lagern sich bereits zu einer Tertiärstruktur ausgebildete Proteine zu übergeordneten Proteinkomplexen zusammen, werden sie als Quartärstruktur bezeichnet. DNA-Bindungsproteine binden den DNA-Strang z. B. paarweise als Dimere. Ab einer gewissen Größe ist eine Polypeptidkette als Ganzes schwer handhabbar. Hier ist es sinnvoll, funktionell abgegrenzte Bereiche auf unterschiedliche Proteine zu verteilen und in einem Proteinkomplex zu assoziieren. Dieses Baukastenprinzip eröffnet zudem die Möglichkeit, erfolgreiche Unterstrukturen in anderen Proteinkomplexen erneut zur Anwendung zu bringen. Ist z. B. einmal eine funktionstüchtige Transmembranhelix gebildet worden, kann diese als Gen kopiert und bei Bedarf leicht modifiziert anderweitig verwendet werden. Bei besonders komplexen chemischen Reaktionen ist es überdies sinnvoll, die beteiligten Enzyme zu einem Komplex zusammenzufassen, innerhalb dessen das Substrat von Enzymabschnitt zu Enzymabschnitt „weitergereicht“ werden kann. Damit unterbleibt die unkontrollierte Diffusion eines Substrates von einem isolierten Enzym zum nächsten. Ein Beispiel hierfür ist der Pyruvat-DehydrogenaseKomplex der eukaryotischen Mitochondrienmembran. Dieser riesige Komplex hat ein Gesamtmolekulargewicht von ca. 7 Millionen und besteht aus über 80

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4 Proteine

einzelnen Polypeptiden, die zusammen die drei Einzelreaktionen katalysieren (S. 292). Mehrere identische Polypeptide, die in einem Komplex assoziiert sind, können sich gegenseitig in ihrer Funktion beeinflussen. Dieses Prinzip wird als Kooperativität bezeichnet (S. 203). Ein bekanntes Beispiel ist das Hämoglobin: Das O2 und CO2 transportierende Tetramer besteht aus je zwei identischen a- und je zwei b-Polypeptidketten, die untereinander in Verbindung stehen. Alle vier Polypeptidketten binden je ein Sauerstoffmolekül, wobei die Sauerstoffbindung als Tetramer effektiver ( Zoologie) und das Hämoglobintetramer besser den physiologischen Bedingungen anzupassen ist als vier einzelne unabhängige Moleküle. Proteine, deren Funktion einer präzisen Regulation unterliegen, bestehen fast ausnahmslos aus mehreren Untereinheiten.

Primärstruktur: Protein-Organisationsebene, Aminosäuresequenz, bestimmt die Konformation des Proteins. Sekundärstruktur: Protein-Organisationsebene, erste regelmäßig wiederkehrende Strukturorganisation der Polypeptidkette. – a-Helix: Rechtsgängige, schraubenförmige Anordnung der Polypeptidkette (ca. 3,6 Aminosäuren/Windung), die durch Wasserstoffbrücken-Bindungen stabilisiert wird. Beispiele: Myosin, Hämoglobin, Transmembranproteine, DNAbindende Proteine, Leucin-Zipper, calciumbindende Proteine. – b-Faltblatt: gefaltete Nebeneinanderlagerung mehrerer Kettenteile des gleichen Proteinmoleküls. Beispiele: Seidenfibroin, Immunglobuline. – b-Schleife: 180h-Kehrtwende im Peptidrückgrat. Beispiele: häufig am Ende einer a-Helix. – Kollagenhelix: linksgängige, schraubenförmige Anordnung der Polypeptidkette und stets mit zwei weiteren Kollagenhelices zu einer rechtsgängigen Tripelhelix verdrillt. Tertiärstruktur: Protein-Organisationsebene, dreidimensionale Form einer Polypeptidkette bzw. eines Proteins. Setzt sich aus allen Strukturmotiven zusammen. Quartärstruktur: Protein-Organisationsebene, bei der mehrere einzelne Polypeptidketten oder Proteine als Untereinheiten zu einem funktionellen und strukturellen Komplex zusammentreten. Vorteile dieser Strukturen: schnelle und effektive Substratübertragung, Kooperativität und Untereinheiten können in mehreren Proteinen verwendet werden. Proteinmotiv: Spezifisches Arrangement einzelner Sekundärstrukturen zu funktionellen Einheiten eines Proteins. Disulfidbrücken: Kovalente Bindungen zwischen zwei Cysteinen. Stabilisieren die Tertiärstruktur. Kommen in erster Linie bei extrazellulären Proteinen vor. Proteindenaturierung: Drastische Konformationsänderung eines Proteins durch Erhitzen oder Chemikalien, führt meist zu Funktionsverlust.

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4.4 Die Methoden der Proteinchemie

4.4

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Die Methoden der Proteinchemie

Das Methodenarsenal der Proteinchemie ist sehr umfangreich. Proteine werden durch unterschiedliche Färbemethoden nachgewiesen und quantifiziert. Der Nachweis bestimmter Proteine erfolgt mit spezifischen Antikörpern. Die Isolierung eines Proteins erfolgt meist durch eine Kombination von Zentrifugation, chromatographischen und elektrophoretischen Techniken. Die dreidimensionale Struktur eines Proteins wird mit der Röntgenstrukturanalyse oder der magnetischen Kern-Resonanz-Spektroskopie untersucht. Eine empfindliche Methode zur Analyse bzw. Identifizierung auch geringer Proteinmengen ist die Massenspektrometrie. Bevor ein Protein eingehender analysiert werden kann, muss es meistens in gereinigter (isolierter) Form vorliegen. Für jedes Protein muss dabei eine individuelle Reinigungsstrategie entwickelt werden Das beinhaltet den Nachweis des gesuchten Proteins, um eine geeignete Quelle ausfindig zu machen, bei intrazellulären Proteinen einen Zellaufschluss, die Anreicherung und dann die Aufreinigung in ausreichender Menge und Reinheit, die die jeweiligen Untersuchungen erlaubt. Für die Analysen sind Eigenschaften des Proteins von Interesse wie isoelektrischer Punkt, Molekulargewicht (physikochemische Parameter), katalytische Eigenschaften, Aminosäuresequenz, posttranslationale Modifikationen und schließlich die räumliche Struktur. Die Identifizierung, Reinigung oder gar die Strukturbestimmung eines Proteins kann ein sehr langwieriges und aufwendiges Vorhaben sein, kann letztlich aber dennoch erfolglos bleiben. Meist sind es membranständige Proteine, deren Reinigung und Analytik erhebliche Schwierigkeiten bereiten. Ist die Aminosäuresequenz eines Proteins erst einmal bekannt, können mit Hilfe gentechnischer Methoden das komplette Protein – oder auch nur einzelne Domänen – in großen Mengen rekombinant hergestellt oder bestimmte Eigenschaften, etwa Stabilität oder Substratspezifität, gezielt verändert werden (protein engineering). Dies ist besonders bei industriell (z. B. Proteasen als Waschmittelzusatz) oder therapeutisch eingesetzten Proteinen (z. B. Insulin) von Bedeutung.

4.4.1

Proteinnachweis

Die am häufigsten verwendeten Nachweisverfahren sind Protein-spezifische Färbemethoden. Die Intensität der Farbänderung ist von der Proteinkonzentration abhängig und kann im Photometer gemessen werden (kolorimetrisches Verfahren). Durch den Vergleich mit Eichkurven bekannter Proteinkonzentrationen kann dann auf die Konzentration in der Probe geschlossen werden. Auch eine direkte spektroskopische Analyse ist möglich. Diese Verfahren sind quantitativ, sie unterscheiden nicht zwischen unterschiedlichen Proteinen.

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n Eine charakteristische Struktur aller Proteine sind die Peptidbindungen. Bei der Biuret-Methode erfolgt in alkalischem Milieu eine Komplexbildung von Cu2+-Ionen mit den Peptidbindungen des Proteins. Diese Komplexe haben ein Absorptionsmaximum bei 550 nm. Der Name der Methode bezieht sich auf Biuret (Carbamoylharnstoff), welcher ebenfalls einen farbigen Komplex mit Kupferionen bildet. Die von Oliver H. Lowry 1951 vorgestellte Methode ist eine Weiterentwicklung der Biuret-Methode. Komplexierte Cu2+-Ionen werden zu Cu+ reduziert, welche wiederum mit dem sogenannten Folin-Ciocalteau-Reagenz reagieren. Hierbei entsteht ein tiefblauer Komplex, dessen Extinktion bei 540 oder 650 nm gemessen wird. Die Reduzierung der Kupferionen im Komplex mit Peptidbindungen zu Cu+ nutzt auch der Bicinchoninsäure (BCA)-Test, welcher 1985 entwickelt wurde. BCA bildet stöchiometrische Farbkomplexe mit Cu+-Ionen, welche bei 562 nm gemessen werden. Der für die Quantifizierung von Proteinen in Lösung am häufigsten eingesetzte Farbstoff ist das Coomassie-Brilliant-Blau. Die Verwendung von Coomassie-Brilliant-Blau zum Proteinnachweis wurde 1976 von Marion Bradford vorgestellt; die Methode ist daher als Bradford-Test bekannt. Der Farbstoff lagert sich bevorzugt an Reste basischer Aminosäuren (Lysin, Arginin) an. Hierbei verschiebt sich dessen Absorptionsmaximum von 450 auf 595 nm. Die Seitenketten der aromatischen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin, in geringem Masse auch Phenylalanin, absorbieren Licht bei 280 nm. Somit kann der Proteingehalt auch durch eine Absorptionsbestimmung bei 280 nm gemessen werden. Ist die Aminosäurekomposition des Proteins bekannt wird der spezifische molare Extinktionskoeffizient (e280) berechnet, der eine genauere Quantifizierung erlaubt. m

Abb. 4.17 Prinzip des ELISA. Alternativ kann auch ein Antigen an die Testplatte gekoppelt werden, welches dann mit Antikörpern aus der Probe reagiert. Der zweite Antikörper, gerichtet gegen die konstanten Regionen des ersten Antikörpers, ist mit einem Enzym gekoppelt. Häufig wird hierfür alkalische Phosphatase verwendet. Die entsprechende Nachweisreaktion ist die Umsetzung des farblosen Substrats 5-Brom-4-Chlor-3-Indoxylphosphat (BCIP) zu dem blauen Farbstoff Indigo. Die Farbintensität ist proportional zu der Menge an Antigen oder Antikörpern in der Lösung. Mit Hilfe des ELISA kann so ein bestimmtes Protein in einer Probe quantifiziert werden.

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4.4 Die Methoden der Proteinchemie

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Der Nachweis eines bestimmten Proteins erfolgt mit Hilfe von Antikörpern im ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, Abb. 4.17), dem Western-Blot (Abb. 4.19) oder – sofern es sich um ein aktives Enzym handelt – über die enzymatische Aktivität.

n Der ELISA ist in Form des „Schwangerschaftstests“ weit verbreitet. Der Schwangerschaftstest beruht auf dem Nachweis des humanen Schwangerschaftshormon Choriongonadotropin (hCG). hCG wird in der Plazenta vor allem zu Beginn einer Schwangerschaft gebildet ( Zoologie) und mit dem Urin ausgeschieden. Auf entsprechenden Teststreifen immobilisierte Antikörper binden vorhandenes hCG aus der Urinprobe. Ein zweiter Antikörper, welcher ebenfalls hCG erkennt, ist mit einem Enzym für die entsprechende Farbreaktion gekoppelt. m

4.4.2

Elektrophoretische Techniken

Als Elektrophorese wird die Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld bezeichnet. Unterscheiden sich Moleküle in Größe bzw. Ladung, können sie durch Elektrophorese voneinander getrennt werden. Der Trennungsvorgang wird meistens in einem Trägermaterial (Matrix) durchgeführt, für Proteine sind dies vorwiegend Polyacrylamid-Gele. Entsprechend wird die Methode als Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) bezeichnet. Während der Gelelektrophorese werden die geladenen Moleküle aufgrund der angelegten Spannung durch das Gel gezogen. Kleine und mehrfach geladene Moleküle durchdringen die Gelmatrix schneller als große bzw. weniger stark geladene Moleküle. In der nativen PAGE werden Proteine ohne weitere Zusätze untersucht. Proteine sind abhängig von der Gesamtladung der Aminosäureseitenketten unter den gegebenen Bedingungen positiv oder negativ geladen; sie wandern im elektrischen Feld entsprechend zur Anode bzw. Kathode. Ist der pI (S. 44) eines Proteins unbekannt, besteht bei der nativen PAGE die Möglichkeit, dass das Protein unter Verwendung eines falschen Puffers (pH-Wert) in die „falsche“ Richtung wandert. Um die Trennung von Proteinen weitgehend unabhängig von deren Nettoladung und damit unter standardisierten Bedingungen durchzuführen, werden die Proteine mit Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate, SDS) denaturiert. Die Trennung über die Gelmatrix bei der sogenannten SDS-PAGE (Abb. 4.18) ist nur von der Molekülgröße abhängig, so dass ein ungefähres Molekulargewicht angegeben werden kann. Bei der Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) erfolgt die elektrophoretische Trennung in einer Kapillare, meist aus Quarz („fused silica“) mit Durchmessern zwischen 25 und 100 mm und Längen bis zu 100 cm. Zwischen den Enden der Kapillare wird eine Hochspannung bis zu 30 kV angelegt. Da die Trennung in einem wässrigen Medium erfolgt, ist die Wahl der Pufferbedingungen wichtig. Die Detektion der getrennten Proteine erfolgt anhand der Absorptionsmessung bei 280 nm. Insbesondere in Kombination mit der Massenspektrometrie ist die Kapillarelektrophorese eine sehr empfindliche Methode zur Analyse von Proteingemischen. Bereits wenige nL einer Probe sind für eine Analyse ausreichend. Eine Variation der CE verwendet eine mit einer Gelmatrix

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4 Proteine

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Abb. 4.18 SDS-PAGE. a SDS entfaltet Proteine und lagert sich an die Proteinkette an. Hierdurch erhalten die Proteine eine auf die Molekülmasse bezogene gleichmäßige negative Ladung. Disulfidbrücken werden durch Zugabe von z. B. b-Mercaptoethanol reduziert. Kleine Moleküle durchdringen das Polyacrylamidgel (eine polymerisierte Mischung aus Acrylamid und N,Nl-Methylen-Bisacrylamid) schneller als große. Eine Erhöhung der Trennschärfe wird durch den Einsatz eines sogenannten Sammelgels mit geringerem Polymerisationsgrad und niedrigerem pH-Wert erreicht. Hierdurch werden die Proteine zu Beginn der Elektrophorese an der Grenze zwischen Sammel- und Trenngel konzentriert. b Mit Coomassie-Blau gefärbte Proteine im Polyacrylamidgel. Markerproteine (M) bekannter Größe geben einen Hinweis auf die Proteingröße. gefüllte Kapillare, entsprechend heißt die Methode Kapillar-Gelelektrophorese (capillary gel electrophoresis, CGE). Diese Methode ist besonders gut zur Miniaturisierung und Automatisierung geeignet. Entsprechende Trenneinheiten sind wenige cm groß und werden auf Chips platziert.

Western-Blot. In der Polyacrylamidmatrix sind aufgetrennte Proteine schwer zugänglich für die Identifikation z. B. via Antikörper. Darum müssen die Proteine, die durch SDS-PAGE aufgetrennt wurden, zunächst auf eine spezielle Membran (meist aus Nitrozellulose oder Polyvinyldifluorid, PVDF) übertragen werden (Abb. 4.19). Da die Proteine durch das SDS eine negative Ladung besitzen, lassen sie sich mittels eines angelegten elektrischen Feld aus der Gelmatrix heraus auf die Membran transferieren (blotting). Aufgrund starker hydrophober Interaktionen haften die Proteine auf der Membran und sind nun z. B. für Antikörper gut zugänglich. Für diese Technik hat sich der Begriff „Western-Blot“ eingebürgert - eine Anspielung auf eine früher von Ed M. Southern entwickelte, analoge Übertragungstechnik für DNA-Moleküle (der entsprechende Transfer von RNA-Molekülen wird Northern-Blot genannt). Isoelektrischen Fokussierung (IEF). Bei der IEF werden die Proteine in einem elektrischen Feld aufgrund ihres unterschiedlichen pIs getrennt. Die Trennung erfolgt in einem angelegten pH-Gradienten, der durch den Einsatz unterschiedlicher Ampholyte (Substanzen mit positiv und negativ ionisierbaren Gruppen) generiert wird. An dem pH-Wert, der dem pI des Proteins entspricht, ist dessen Nettoladung null und das Protein wandert im elektrischen Feld nicht mehr; es

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4.4 Die Methoden der Proteinchemie

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4 Abb. 4.19 WesternBlot. Der Western-Blot wird häufig nach einer SDS-PAGE zur Proteinidentifizierung durchgeführt.

wird an dieser Stelle fokussiert. Mit der Methode lassen sich entsprechend auch die pIs von Proteinen bestimmen. Zweidimensionale Elektrophorese (2D-Elektrophorese). Durch Kombination zweier Analysetechniken, die auf unterschiedlichen Parametern basieren, lässt sich die Empfindlichkeit beträchtlich steigern, z. B. die IEF zusammen mit der SDS-PAGE zur 2D-Elektrophorese. 2D-Gelelektrophoresen sind die Techniken mit dem höchsten Auflösevermögen für Proteingemische: Über 1000 Proteine können so auf einem einzigen Gel aufgetrennt werden. In Kombination mit den empfindlichen Methoden der Massenspektrometrie (S. 154) kann das Proteinmuster ganzer Zellen (das sogenannte Proteom) untersucht werden. Ein Nachteil der 2D-Elektrophorese ist, dass verschiedene 2D-Gelelektropherogramme oft nur schlecht oder gar nicht vergleichbar sind.

4.4.3

Proteinreinigung

Handelt es sich bei dem interessierenden Protein um ein intrazelluläres Protein, ist der erste Schritt bei der Reinigung der Zellaufschluss. Je nach Ausgangsmaterial, d. h. zellwandhaltige oder zellwandlose Bakterien-, Pilz- oder Pflanzenzellen oder tierisches Gewebe kommen zum Zellaufschluss unterschiedliche Methoden zur Anwendung: Dazu gehören Ultraschall, French-Presse, Elvehjem-PotterHomogenisator oder eine Kugelmühle. Nach erfolgtem Zellaufschluss liegt das Zelllysat oder Homogenisat vor. Zentrifugation. Die Kombination unterschiedlicher Zentrifugationsschritte, als differentielle Zentrifugation bezeichnet, ist eine wichtige Methode bei der Proteinreinigung. Beispielsweise lassen sich nach dem Zellaufschluss durch eine kurze, niedrigtourige Zentrifugation Zelltrümmer und Gewebereste als Sediment (pellet) entfernen. Im Überstand (supernatant) befinden sich die kleineren Zellorganellen, die in einer anschließenden hochtourigen Zentrifugation von löslichen zellulären Bestandteilen abgetrennt werden. Die verschiedenen Zell-

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4 Proteine

organellen können in einem nächsten Zentrifugationsschritt durch unterschiedliche Pufferdichten, z. B. durch Verwendung unterschiedlich konzentrierter Saccharoselösungen, differenziert werden. Anwendung finden diskontinuierliche bzw. Stufen-Dichtegradienten und kontinuierliche Dichtegradienten.

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Die Trennung verschiedener Teilchen durch Zentrifugation beruht auf deren unterschiedlicher Dichte. Dies gilt auch für verschiedene Moleküle in einer Lösung. Eine Trennung erfolgt jedoch erst, wenn diese Lösungen sehr hohen Zentrifugalbeschleunigungen ausgesetzt werden. Diese werden in Ultrazentrifugen erzeugt, welche Zentrifugalbeschleunigungen bis 1 000 000 g erreichen. Mit Hilfe der Ultrazentrifugation ist auch eine Bestimmung der Partikel- bzw. Molekularmasse möglich. Die erste Ultrazentrifuge wurde 1923 von Theodor Svedberg konstruiert. Zudem entwickelte Svedberg die theoretischen Grundlagen zur Sedimentation eines Teilchens im Zentrifugalfeld. Ein gelöstes Teilchen erfährt hier eine nach außen wirkende, d. h. von der Rotationsachse wegzeigende Kraft; die Zentrifugalkraft. Hierbei verdrängen die Teilchen eine entsprechende Menge Lösungsmittel. Die hierbei entstehende Auftriebskraft wirkt der Zentrifugalkraft entgegen. Die aus diesen Kräften resultierende Kraft wirkt auf das Teilchen ein und bewirkt dessen Sedimentation. Zu berücksichtigen ist ferner die zwischen dem Teilchen und dem Lösungsmittel wirkende Reibungskraft. Es lässt sich folgender Zusammenhang herstellen: s = (dr/dt) · 1/(v2 r) = 2 (rP – rL) / f Hierbei ist dr/dt die Sedimentationsgeschwindigkeit, v die Winkelgeschwindigkeit, r der Abstand des Teilchens zur Rotationsachse, 2 das Volumen des Partikels, rP und rL die Dichten des gelösten Teilchens bzw. des Lösungsmittels, f ist der Reibungskoeffizient und s ist der Sedimentationskoeffizent. Dieser wird in Svedberg-Einheiten wiedergegeben. 1 S entspricht 10–13 s. Der Sedimentationskoeffizient ist ein Maß für die Sedimentationsgeschwindigkeit eines Teilchens in einem bestimmten Zentrifugalfeld. Zwischen Sedimentationskoeffizient und Molekulargewicht besteht kein linearer Zusammenhang. Die Angabe der Svedberg-Einheit ist vor allem zur Beschreibung größerer Partikel gebräuchlich, z. B. 60 S ribosomale Untereinheit oder 28 S Proteasom. Für diese grundlegenden Arbeiten erhielt Svedberg 1926 den Nobelpreis für Chemie.

Chromatographische Trennmethoden. Die chromatographische Trennung erfolgt aufgrund unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften der Proteine: Dies sind Größe, Ladung, der Anteil exponierter hydrophober Oberfläche oder die Fähigkeit zur Bindung bestimmter Stoffe. Die Methoden werden entsprechend der genutzten Eigenschaften als Gelfiltration, Ionenaustausch-, hydrophobe Interaktions- oder Affinitätschromatographie bezeichnet. Alle chromatographischen Trennverfahren beruhen auf einer unterschiedlichen Verteilung der zu trennenden Substanzen zwischen einer stationären- und einer mobilen Phase. Die stationäre Phase wird auch als Matrix bezeichnet. In der Praxis wird die stationäre Phase in einen Säulenkörper gepackt und die mobile Phase, d. h. die proteinhaltige Lösung, auf die Säule aufgetragen. Entsprechend wird das Verfahren als Säulenchromatographie bezeichnet (Abb. 4.20).

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Abb. 4.20 Säulenchromatographie. a Gelfiltration. b Ionenaustauschchromatographie; bei dem abgebildeten Fall handelt es sich um eine Anionenaustauschchromatographie. c Affinitätschromatographie. Hierbei können auch an die Säulenmatrix gekoppelte Antiköper verwendet werden. Bei der Gelfiltration (auch als Gelpermeations-, Ausschluss- oder Molekularsiebchromatographie bezeichnet) besteht die stationäre Matrix aus porösen Kügelchen (beads) aus Polydextran, Agarose oder auch Polyacrylamid. Die Poren in den Kügelchen erhöhen das Verteilungsvolumen innerhalb der Säule. Dieses Volumen steht allerdings nur solchen Molekülen zur Verfügung, welche klein genug sind um in diese Poren eindringen zu können. Größere Moleküle können weniger gut oder gar nicht in diese Poren eindringen. Aufgrund der Retardierung verlassen (eluieren) kleine Moleküle später die Säule als große Moleküle. Bei der Gelfiltration wird für Probenauftrag und Elution nur ein Puffer verwendet, ein Verfahren welches isokratische Elution genannt wird. Bei der Ionenaustauschchromatographie befinden sich an der stationären Phase ionisierbare Gruppen. Handelt es sich um positiv ionisierbare Gruppen, kann das Gegenion hierzu (ein Anion)

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ausgetauscht werden. In diesem Fall handelt es sich um eine Anionenaustauschchromatographie. Für Anionenaustauscher werden häufig quartäre Ammoniumgruppen als ionisierbare Gruppen verwendet. Das Gegenion ist meist Chlorid. Ein unter gegebenen Bedingungen negativ geladenes Protein verdrängt die Chloridionen und bindet an die stationäre Phase. Erst durch Erhöhung der Chloridkonzentration kann das Protein von der Matrix verdrängt und damit eluiert werden. Entsprechendes gilt für einen KationenAustauscher. Bei der hydrophoben-Interaktions-Chromatographie (HIC) sind stark hydrophobe Reste, z. B. aliphatische Ketten oder aromatische Gruppen an die stationäre Phase gekoppelt. Die Bindung zwischen stationärer Phase und dem Protein erfolgt durch hydrophobe Wechselwirkungen. Die Bindung wird durch hohe Salzkonzentrationen begünstigt; eluiert wird mit einem abnehmenden Salzgradienten. Bei der Affinitätschromatographie wird die spezifische Bindung eines Proteins an einen immobilisierten Liganden bzw. Bindungspartner (dies kann ein entsprechender Antikörper sein, Abb. 4.20) ausgenutzt. Eluiert werden die entsprechenden Proteine durch steigende Konzentrationen des freien Liganden. Das Protein kann häufig auch durch Erhöhung der Ionenstärke von der stationären Phase abgetrennt werden. Häufig wird die Affinitätschromatographie zur Isolierung von rekombinant hergestellten Proteinen verwendet, die mit bestimmten Affinitäts-Tags (Abb. 6.20) hergestellt wurden.

4.4.4

Analyse der Proteinstruktur

Zur Bestimmung der Primär-, Sekundär- und Tertiärstrukturen von Proteinen werden z. T. sehr aufwendige Geräte eingesetzt, die daher nicht in jedem Laboratorium zu finden sind. Meist liefert auch hier erst die Kombination verschiedener Methoden das gewünschte Resultat. N-terminale Proteinsequenzierung. Bei der von Pehr Edman entwickelten Methode wird das Protein von dem N-terminalen Ende her sukzessiv abgebaut, die abgespaltenen Aminosäuren derivatisiert und anschließend analysiert (Abb. 4.21). Für die Reaktionen muss das Protein zuvor auf einen Träger, z. B. einer PVDF-Membran, fixiert werden. Die weitere Umsetzung erfolgt heutzutage vollautomatisiert. Die maximale Länge einer Proteinsequenz, die mit dieser Methode bestimmt werden kann, ist begrenzt und liegt bei etwa 70 Aminosäuren. Dies liegt daran, dass die chemischen Umsetzungen nie zu 100 % ablaufen. Somit kommt es im Laufe weiterer Zyklen zu Verschleppungen, welche eine eindeutige Identifizierung zunehmend erschweren. Meist reichen aber schon Sequenzen von 10–20 Aminosäuren aus, um ein Protein zweifelsfrei, z. B. in einer Datenbank, identifizieren zu können. Soll die Sequenz größerer Abschnitte bestimmt werden, wird das Protein enzymatisch, z. B. mit Trypsin oder chemisch mit Bromcyan, gespalten und die entstehenden Peptide dann jeweils gesondert sequenziert. Problematisch wird die Edman-Sequenzierung, wenn die N-terminale Aminosäure derivatisiert, z. B. acetyliert, vorliegt. Das Protein ist für die Sequenzierung „blockiert“ und muss vorher entsprechend gespalten werden. Massenspektrometrie (MS). Mit der Methode werden Molekülmassen bestimmt. Für die Messungen werden die Moleküle ionisiert, anschließend aufgrund unterschiedlicher Masse-Ladungsverhältnisse (m/z-Quotient) getrennt und nachgewiesen. Jedes Massenspektrometer besteht daher aus drei prinzipiel-

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Abb. 4.21 Edman-Abbau. Durch Kopplung der N-terminalen Aminosäure mit PITC entsteht ein Phenylthiocarbamoyl (PTC)-Protein. Unter sauren Bedingungen wird die N-terminale Aminosäure abgespalten. Die Umsetzung des instabilen Anilinothiazolinon (ATZ)Derivats erfolgt in einer zweistufigen Reaktion zu dem stabilen Phenylthiohydantoin (PTH)Derivat. Dieses wird mittels der Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC) identifiziert.

len Bestandteilen: einer Ionenquelle, einem Massenanalysator und einem Detektor (Abb. 4.22). Mit massenspektrometrischen Untersuchungen können Proteinmodifikationen (z. B. Phosphorylierungen, Glykosylierungen) erfasst werden.

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n Die Ionisierung ganzer Moleküle mit einem Molekulargewicht i1000 Da gelang erst mit Entwicklung entsprechender schonender Ionisierungsverfahren zu Beginn der 80iger Jahre (Abb. 4.22a), bis dahin übliche Verfahren führten zu einer Molekülfragmentierung und waren für die Proteinanalytik nur bedingt nutzbar: Bei der Elektronenspray-Ionisation (ESI) wird die Proteinlösung durch eine Kapillare in die Ionisationskammer eingespritzt. Zwischen der Kapillare und der Wand der

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m Abb. 4.22 Massenspektrometer. a Als Ionenquellen für Proteine wird die MALDI- oder ESI-Technik eingesetzt. b Ein häufig verwendeter Analysator ist der Flugzeitanalysator (ToF). Die Ionen werden durch ein Hochspannungsfeld in Abhängigkeit von deren m/z-Verhältnisse unterschiedlich stark beschleunigt und dadurch getrennt. Neben dem ToF-Analysator gibt es noch weitere Geräte mit unterschiedlichen Mechanismen zur Ionentrennung. c Der Detektor ist meist ein Photomultiplier. Durch die eintreffenden Ionen werden in der Photokathode Sekundärelektronen freigesetzt. Diese werden durch die Parallelelektroden kaskadenartig verstärkt schließlich detektiert. d Massenspektrum eines tryptischen Proteinverdaus. Die Massen können einzelnen Peptiden zugeordnet und so das Protein identifiziert werden. In diesem Beispiel handelt es sich um Casein (Swiss-Prot P02662).

Ionisationskammer ist eine Hochspannung angelegt, die die erzeugten Ionen in den Analysator beschleunigen. In dem hierbei erzeugten Spray werden die Analytmoleküle vollständig von Lösungsmittelmolekülen befreit und reproduzierbar ionisiert. Die ESI ist zur Ionisierung von Molekülen mit einem Molekulargewicht bis etwa 80000 Da geeignet. Größere Moleküle oder auch Proteinkomplexe werden mit der Laser-Desorptionsmethode (MALDI-Technik) ionisiert. Bei dieser von Michael Karas und Franz Hillenkamp 1987 vorgestellten Methode werden die Analytmoleküle zunächst in einer festen, kristallinen Matrix eingeschlossen. Durch einen kurzen Laserpuls, die Längenwelle des Lasers liegt hierbei im Absorptionsbereich der verwendeten Matrix, werden neben Matrixmoleküle auch Analytmoleküle in die Gasphase freigesetzt. m Mit Hilfe der Massenspektrometrie können Proteine direkt identifiziert werden. Die entsprechende Methode hierzu wird als Peptidmassen-Fingerabdruck (peptide mass fingerprint, PMF) bezeichnet (Abb. 4.22d). Die Proteine, z. B. aus einem 2D-Gel, werden proteolytisch gespalten und anschließend die Massen der erzeugten Peptide massenspektrometrisch bestimmt. Jedes Protein liefert ein individuelles Muster an Peptidfragmenten, welche jeweils unterschiedliche Massen besitzen. Eine Identifizierung erfolgt über den Vergleich entsprechender Peptidfragmente bzw. deren Massen in Proteindatenbanken. Neuere MS-Techniken erlauben auch eine Protein-Sequenzbestimmung. Eine Möglichkeit hierzu besteht in der Generierung von sogenannten Proteinleitern. Bei diesen Proteinleitern handelt es sich um eine Mischung von Peptiden, welche sich jeweils um eine Aminosäure voneinander unterscheiden. Diese Mischung wird massenspektrometrisch untersucht. Eine andere Möglichkeit ist die sogenannte Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS). Zunächst wird das Protein gespalten. In einem ersten Massenanalysator wird ein Peptid selektiert und anschließend fragmentiert. Die entstandenen Bruchstücke werden in einem weiteren Analysator erfasst. Anhand der jeweils aufgenommenen Massenspektren kann dann die Sequenz berechnet werden. Röntgenstrukturanalyse. Mit Hilfe der Methode ist prinzipiell die dreidimensionale Darstellung aller biologischer Moleküle und Molekülassoziationen, bis hin zum kompletten Virus, möglich. Die wichtigste Voraussetzung hierzu ist, dass die entsprechenden Objekte homogen vorliegen und Kristalle bilden. Die Herstellung entsprechender Kristalle ist schwierig und kann sich über Monate

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hinziehen, häufig müssen viele (bis zu mehreren 1000) Kristallisationsbedingungen getestet werden. Eine häufig verwendete Methode ist der sogenannte „hängende Tropfen “ (Abb. 4.23). Die Grundlage der Röntgenstrukturanalyse beruht auf der Beugung von Röntgenstrahlen durch die Elektronenwolken kristallisierter Moleküle. Die Beugungsstrahlung wird z. B. auf einer photographischen Platte aufgenommen (Abb. 4.23b); das sogenannte Röntgenbeugungsmuster erlaubt ein Abbild der Elektronenwolkedichte der entsprechenden Moleküle. Anhand der Elektronendichteverteilung kann die dreidimensionale Anordnung der Atome rekonstruiert werden (Abb. 4.24). Die Intensität der gebeugten Röntgenstrahlung ist sehr gering und abhängig von der Elektronendichte. Eine Hilfe bei der Auswertung der Beugungsdaten ist der gezielte Einbau von Atomen mit hoher Elektronendichte in den Kristall. Dies kann z. B. durch Zugabe von Schwermetallsalzen zu dem Kristallisationsansatz geschehen oder aber – bei rekombinant hergestellten Proteinen – durch den Einbau von Selenomethionin anstelle von Methionin. Der Einbau von Atomen mit hoher Elektronendichte erleichtert die Orientierung innerhalb der erhaltenen Elektronendichteverteilung; dies ist besonders dann notwendig, wenn keine bereits bekannten Strukturen homologer Proteine bekannt sind (s. u.).

Abb. 4.23 Experimente zur Protein-Strukturbestimmung. a Prinzip des „hängenden Tropfens“. Der hängende Tropfen enthält ein Präzipitanz, Salze oder organische Verbindungen z. B. Polyethylenglykole, das mit dem Protein um die Wassermoleküle konkurriert. Aus der zunehmend übersättigten Proteinlösung können schließlich Kristalle entstehen, wenn Wassermoleküle ihrem Konzentrationsgefälle folgend nach und nach in das hochkonzentrierte Präzipitanzreservoir diffundieren. b Schematische Darstellung eines Experiments zur Erzeugung von Röntgenbeugungsbildern.

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Abb. 4.24 Protein-Kristallstruktur. Ausgehend von der Elektronenwolkendichte kann die Proteinstruktur abgeleitet werden. Bei dem abgebildeten Protein handelt es sich um Lysozym; ein Rest (Trp108) ist hervorgehoben (pdb: 4LZT; Auflösung: 0.95 Å).

Proteinkristalle sind ein „nobles“ Arbeitsfeld. Für den Nachweis, dass auch Proteine kristallisiert werden können, erhielt James Sumner 1946 den Nobelpreis. Die Lösung der ersten Raumstruktur eines Proteins (Myoglobin) mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse wurde 1962 mit dem Nobelpreis für Max Perutz und John Kendrew gewürdigt. Dass auch membranständige Proteine erfolgreich kristallisieren können, zeigten Johann Deisenhofer, Robert Huber und Hartmut Michel am photosynthetischen Reaktionszentrum von Rhodopseudomonas viridis (Nobelpreis 1982). Roderick MacKinnon erhielt 2003 den Nobelpreis für seine Arbeiten zur Struktur und Funktion des K+-Kanals; welcher mit Hilfe monoklonaler Antikörperfragmente kristallisiert werden konnte. 2006 wurde der Nobelpreis an Roger Kornberg für die Aufklärung der Transkriptionsmechanismen auf molekularer Ebene vergeben. Die Grundlage hierzu war die Erzeugung einer Kristallstruktur der RNA-Polymerase II im Komplex mit DNA und RNA.

Sind dreidimensionale Strukturen homologer Proteine bekannt, wird zunächst versucht die Sequenz des neu kristallisierten Proteins entsprechend den bekannten Strukturen anzupassen. Diese Vorgehensweise wird als molekularer Ersatz (molecular replacement) bezeichnet. Ein wichtiges Qualitätskriterium einer Struktur ist deren Auflösung, basierend auf der Auflösung der erhaltenen Beugungsdaten. Diese hängt von der Qualität des vermessenen Kristalls ab. Strukturen mit einer niedrigen Auflösung i 5 Å erlauben in der Regel eine grobe Abschätzung des Verlaufs von a-Helices und b-Faltblättern. Eine klare Verfolgung der Proteinkette ist bei einer Auflösung von ca. 2–3 Å möglich. Um atomare Einzelheiten, z. B. die Orientierung von Seitenketten oder die genaue Lage gebundener Liganden, aufzulösen, ist eine Auflösung I 1.5 Å erforderlich.

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n Die Kenntnis der räumlichen Proteinstruktur ist bei krankheitsauslösenden Proteinen von großer Bedeutung und kann entscheidend zur Entwicklung neuer Medikamente beitragen. Als Molecular Modelling wird das Generieren spezifischer, auf eine bekannte Proteinstruktur hin ausgerichteter Substanzen bezeichnet. Proteasen sind bei zahlreichen intrazellulären und extrazellulären Vorgängen beteiligt. Auch bei vielen pathogenen Organismen und Viren sind Proteasen am Krankheitsverlauf entscheidend beteiligt. Von vielen Proteasen sind die dreidimensionalen Strukturen bekannt. Anhand dieser Kristallstrukturen können Molekülstrukturen in das aktive Zentrum hinein modelliert werden, welche diesem komplementär sind und entsprechend mit hoher Affinität binden sollen (structure based drug design). Beispiele hierfür sind die Protease des humanen Immunodefizienz (HI)-Virus, welche bei der Prozessierung von viralen Proteinen benötigt wird oder die Blutgerinnungsfaktoren Xa und VIIa, deren Hemmung durch Verhinderung der Blutgerinnung Thrombosen entgegenwirken. m

Kernmagnet-Resonanz-Spektroskopie (nuclear magnetic resonance-, NMRspectroscopy): Die Grundlage der Methode beruht darauf, dass Atomkerne einen bestimmten Drehimpuls (Spin) und ein magnetisches Moment besitzen. In einem angelegtem Magnetfeld orientieren sich die Spins entweder parallel oder antiparallel zu dem äußeren Magnetfeld. Diese beiden Zustände besitzen jeweils unterschiedliche Energieniveaus. Durch Absorption von Strahlung der entsprechenden Energiedifferenz, diese liegt im Radiowellenbereich, finden Übergange vom energieärmeren Zustand (parallele Orientierung) zum energiehöheren Zustand (antiparallele Orientierung) statt. Dieses Phänomen wird als Resonanzabsorption bezeichnet. In einem Molekül hat jeder Atomkern eine distinkte elektronische Umgebung. Diese ist von der Elektronegativität benachbarter Atome abhängig. Die Elektronen bewirken eine gewisse Abschirmung des Atomkerns gegenüber dem angelegten Magnetfeld. Somit unterscheiden sich auch für gleiche Atome die Resonanzfrequenzen innerhalb eines Moleküls wenn diese von unterschiedlichen Atomen umgeben sind. Dies gilt sowohl für kleine als auch für große Moleküle. Biologische Makromoleküle können sehr gut mit Hilfe der NMR-Spektroskopie untersucht werden. Ein großer Vorteil der NMR-Spektroskopie besteht darin, dass sich die Proteine bei den Messungen in wässriger Lösung befinden, d. h. die Versuchsbedingungen sind näher an den physiologischen Bedingungen als in einem Proteinkristall. Mit der NMR-Spektroskopie können sehr gut starre Molekülbereiche von flexiblen Bereichen unterschieden werden (Abb. 4.25). Im Gegensatz zur Röntgenstrukturanalyse ist die NMR-Spektroskopie bei der Strukturauflösung von der Größe her limitiert. Die Grenze liegt z. Zt. bei etwa 50 kDa. Das heißt jedoch nicht, dass größere Strukturen nicht NMR-spektroskopisch untersucht werden können: Gut untersuchen lassen sich mögliche Protein-Ligand-Interaktion oder auch eine Protein-Protein- bzw. Protein-DNA/RNA-Interaktion in Lösung. Hierfür ist die Kenntnis der Proteinstruktur nicht notwendig. Membranständige Proteine in Lipidvesikeln können ebenfalls untersucht werden.

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Abb. 4.25 Protein-NMRStruktur. Trp108 befindet sich im Inneren von Lysozym und ist daher in der Beweglichkeit eingeschränkt. Arg45 befindet sich an exponierter Stelle und hat zahlreiche räumliche Orientierungsmöglichkeiten (pdb: 1E8L).

Eine Voraussetzung für NMR-Experimente ist, dass die untersuchten Atome „magnetisch aktiv“ sind. Für biologische Moleküle sind dies die Atomkerne 1H, 13C, 15N und 31 P, welche einen Kernspin von 1⁄2 aufweisen und somit magnetisch aktiv sind. 1H ist das mit 99,98 % am häufigsten vorkommende Wasserstoff-Isotop. Anders liegen die Verhältnisse bei 13C (1,1 % Anteil) und 15N (0,36 % Anteil). Um die Sensitivität bestimmter NMR-Experimente auf der Basis von 13 C bzw. 15N Resonanzen zu erhöhen oder überhaupt durchführbar zu machen, muss der Anteil dieser Isotope in den Proteinen erhöht werden. Unter Verwendung entsprechender isotopenmarkierter Nährstoffe werden die gewünschten Proteine rekombinant hergestellt. Entgegengesetzt verhält es sich bei 1 H. Da die Messungen in wässriger Lösung stattfinden, ist die 1H-Konzentration extrem hoch. Manchmal ist eine Verringerung der 1H Menge – auch in den Proteinen selbst – erforderlich. Dies kann durch Verwendung von 2H (Deuterium, Kernspin = 1), einem magnetisch inaktiven Wasserstoffisotop in analoger Weise erreicht werden. Für die Entwicklung von NMR-Techniken zur Untersuchungen von Dynamik und Struktur von Proteinen wurde Kurt Wüthrich 2002 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.

4.4.5

Recherche im Internet und Proteindatenbanken

Sowohl Nucleotid- als auch Proteinsequenzen werden in verschiedenen Datenbanken zusammengefasst. Sie sind über das Internet abrufbar und geben neben den eigentlichen Sequenzinformationen z. B. Angaben zur Funktion, Struktur, Spleißvarianten, Genlocus oder posttranslationale Modifikationen. Die zurzeit wichtigste Internet-Seite über Proteininformationen und Analyse ist die ExPASy-(Expert Protein Analysis System)-Seite (http://expasy.org/). Von

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hieraus gibt es zahlreiche Verknüpfungen zu Datenbanken und Hilfsmitteln zur Berechnung physikochemischer Parameter (pI, MW), Vorhersage von Transmembranabschnitten, Suche nach bestimmten Domänen und Sequenzmotiven oder Sequenzvergleichen. Die umfangreichste Datenbank ist die NCBI (National Center for Biotechnology Information) Genbank, welche über das Zugangssystem Entrez zugänglich ist (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html). Über Entrez können verschiedene Datenbanken abgefragt werden. In der Genbank sind über 61 Millionen Nucleotidsequenzen enthalten (Stand Aug. 2006). Sowohl die aus den entsprechenden Nucleotidsequenzen abgeleiteten Proteinsequenzen als auch Einträge aus anderen Proteindaten sind hier enthalten. Eine weitere Proteindatenbank ist die Swiss-Prot-Datenbank (http://expasy.org/sprot/). Hervorzuheben sind hier bei den Einträgen weiter führende Verknüpfungen, z. B. zu homologen Proteinsequenzen anderer Spezies oder zu den entsprechenden Proteinstrukturen. In der Protein Data Bank (PDB) sind die bekannten dreidimensionalen Strukturen von Proteinen abgelegt (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Für jeden Datenbankeintrag gibt es einen individuellen und eindeutigen Zugangscode (accession number), dessen Nomenklatur bei den Datenbanken aber unterschiedlich ist. Beispielsweise ist die der Abb. 4.25 zu Grunde liegende Datei einer Lysozymstruktur in der PDB-Datenbank unter dem Zugangscode 1E8L abgelegt. Das gebräuchlichste Datei-Format in der Bioinformatik zur Angabe einer Proteinsequenz ist das FASTA-Format. Dieses Format besteht aus einer mit einem „i“ beginnenden Kommentarzeile, gefolgt von der beliebig langen Sequenz. Die Angabe der Aminosäuren erfolgt im Ein-Buchstaben-Code. Die Sequenz von Hühner-Lysozym (Zugangscode GenBank NP_001001470) im FASTA-Format sieht folgendermaßen aus: igi|47 825 389|ref|NP_001001470.1| lysozyme [Gallus gallus] MLGKNDPMCLVLVLLGLTALLGICQGGTGCYGSVSRIDTTGASCRTAKPEGLSY CGVRASRTIAERDLGS MNKYKVLIKRVGEALCIEPAVIAGIISRESHAGKILKNGWGDRGNGFGLMQVDK RYHKIEGTWNGEAHIR QGTRILIDMVKKIQRKFPRWTRDQQLKGGISAYNAGVGNVRSYERMDIGTLHDD YSNDVVARAQYFKQHG Y Die Daten in der PDB sind im sogenannten pdb- oder mmCIF-Format abgelegt. Zum Betrachten der Strukturen müssen diese Dateien mit entsprechenden Programmen geöffnet werden. Solche Programme, etwa RasMol, Pymol oder der Swiss-pdb-Viewer sind über das Internet, z. B. über ExPASy, frei zugänglich.

Durch die Genomsequenzierungs-Projekte, z. B. das Human-Genom-Projekt, HGP, können auch die Primärstrukturen vieler bislang unbekannter Proteine abgeleitet werden. Durch Sequenzvergleich solcher Proteine mit den in den Datenbanken abgelegten Proteinsequenzen lässt sich das Protein oft schon einer bestimmten Proteinfamilie zuordnen. Wichtige Anhaltspunkte liefern bekannte Proteinstrukturabschnitte (Domänen) und konservierte Signalsequenzen. Beispielsweise sind zahlreiche G-gekoppelte Rezeptoren (G-protein coupled receptors, GPCRs) mit ihren charakteristischen sieben Transmembranhelices auf diese Weise identifiziert worden. Die Klassifizierung eines unbekannten

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4.4 Die Methoden der Proteinchemie

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Proteins ist schwierig, wenn sich keine Sequenzhomologien mit bereits bekannten Proteinen finden lassen. Aussagen über die dreidimensionale Struktur sind ebenfalls nur möglich, wenn schon entsprechende Strukturen verwandter Proteine bekannt sind bzw. in der PDB-Datenbank abgelegt sind. Das am meisten verwendete Programm zur Sequenzsuche (query) in Datenbanken ist BLAST (basic local alignment search tool). Dieses Programm sucht mit kurzen Abschnitten (3 Aminosäuren bei Proteinen, 11 Nucleotide bei DNA/RNA) aus der Such-Sequenz (query sequence) in den Datenbanken nach entsprechenden Sequenzen mit hoher Übereinstimmung. Von solchen Abschnitten wird dann der Sequenzvergleich auf beiden Seiten fortgesetzt, bis ein bestimmter Bewertungswert (score) unterschritten wird. Als Ergebnis erhält man ein Sequenzvergleich der Such-Sequenz (welche häufig nur eine experimentell bestimmte Teilsequenz ist) mit möglichen Treffern aus der Datenbank.

4.4.6

Protein-Engineering

Als Protein-Engineering wird die gezielte Veränderung eines Proteins bezeichnet. Durch Mutationen im entsprechenden Gen sollen bestimmte Eigenschaften eines Proteins verändert werden, häufig eine höhere Stabilität des Proteins oder katalytische Fähigkeiten. Beispiele hierfür sind Waschmittelzusätze. Bei diesen Proteasen ist eine möglichst hohe Stabilität bei unterschiedlichen Temperaturen und Anwesenheit von Seifen wichtig. Ist die dreidimensionale Struktur eines Proteins bekannt, werden aufgrund rationaler Überlegungen entsprechende Mutationen in das Gen eingeführt. Die gezielte Veränderung von Proteinen ist ein schwieriger Prozess, da die Auswirkungen der Mutationen nicht immer vorhergesagt werden können. Eine Alternative zum gezielten Eingriff in die Proteinstruktur ist die sogenannte „gerichtete Evolution “ (directed evolution). Hier werden z. B. durch PCR zufällige Mutationen (error prone PCR) in das Gen eingeführt und die unterschiedlichen Proteine hinsichtlich der gewünschten Eigenschaften untersucht. Einzelne Proteinmutanten werden herausgesucht und in die dazugehörigen Gene erneut zufällige Mutationen eingeführt. Durch dieses Verfahren ist es möglich, Proteine mit den gewünschten Eigenschaften zu „züchten“.

Therapeutische Proteine. Die Proteine, die zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, stammen teilweise aus tierischen oder menschlichen Quellen, z. B. Blutgerinnungsfaktoren oder Antikörper aus Blut. Neben ethischen Aspekten, besonders problematisch ist die Isolierung von Proteinen aus Organen verstorbener Personen, sind die Übertragung von Krankheiten kritische Punkte. Beispielsweise wurde bis 1985 das Wachstumshormon Somatotropin aus humanen Hirnanhangsdrüsen isoliert und zur Behandlung des Zwergenwuches eingesetzt. Hierbei kam es zu Übertragungen der Creutzfeld-Jakob-Krankheit und damit zum Verbot der Gewinnung von Somatotropin aus humanen Gewebe. Bei tierischen Proteinen sind allergische Reaktionen häufig. Ein Beispiel hierfür ist das zur Behandlung des Diabetes mellitus (Zuckerkrankheit) eingesetzte Insulin, das in großen Mengen aus dem Pankreas von Schweinen oder Rindern isoliert wird. Schweine-Insulin unterscheidet sich in der B-Kette an Position 30 (Ala) vom humanen Insulin (B30 Thr). Um das Schweine-Insulin besser

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4 Proteine

verträglich zu machen, wurde es durch entsprechende chemische Umsetzungen der humanen Sequenz angepasst.

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Die Herstellung therapeutischer Proteine auf rekombinantem Weg löst mehrere der oben genannten Probleme: Das Material ist frei von potentiellen Krankheitserregern, zudem entfällt der Bedarf an natürlichem Ausgangsmaterial und die Proteine können bei Bedarf spezifisch verändert werden.

n Insulin reguliert als Peptidhormon den Blutzuckerspiegel. Der Insulinspiegel im Blut schwankt im Tagesverlauf, abhängig von der Nahrungsaufnahme ( Zoologie). Diabetes-Patienten bilden kein oder nicht genügend Insulin, sie sind auf eine externe Insulingabe mehrmals täglich in bestimmten Abständen zur Nahrungsaufnahme angewiesen. Um die Lebensqualität von Diabetes-Patienten zu verbessern wäre ein langwirksames Insulin wünschenswert, dass nur einmal täglich verabreicht werden müsste, bzw. ein schnellwirksameres das flexiblere Mahlzeiten zulassen würde. Gereinigtes Insulin bildet überwiegend Hexamere oder höhere Aggregate. Biologisch wirksam ist jedoch das Monomer. Somit ist die Stabilität des Hexamers ein wichtiger Parameter für die biologische Verfügbarkeit. Ausgehend von der Kristallstruktur des Insulinhexamers wurden gezielt Insulinderivate entwickelt. Insulin-Glargine enthält in der B-Kette zwei zusätzliche Arg-Reste und in der A-Kette ist Aspartat an Position 21 gegen Glycin ausgetauscht, mit seiner reduzierten Löslichkeit hat es eine längere Wirkungsdauer. Bei Insulin-Lispro ist die Reihenfolge von Lysin und Prolin an Position 28 und 29 in der B-Kette invertiert; die Bildung von Dimeren und Hexameren ist deutlich reduziert. Bei Insulin-Glusine sind an Position 3 der B-Kette Asp gegen Lys und an Position 29 Lys gegen Glu ausgetauscht; hierdurch wird eine bessere Löslichkeit erreicht. Insulin-Lispro und Insulin-Glusine sind schnellwirksame Insulinderivate. m Proteinnachweis: Quantitativer Nachweis mit kolorimetrischen (Färbemethoden) oder qualitativer Nachweis mit dem Enzym-gekoppelten Immunosorbent-Test (ELISA) oder Western-Blot. Elektrophorese: Trennung von geladenen Teilchen im elektrischen Feld. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE): Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen in einem Polyacrylamidgel. Aufgrund des SDS erhalten unterschiedliche Proteine ein vergleichbares Ladungs-Masse-Verhältnis. Die Trennung erfolgt daher überwiegend aufgrund der unterschiedlichen Größe. Die am meisten verwendete Methode zur Proteintrennung. Isoelektrische Fokussierung: Technik, welche Proteine aufgrund der unterschiedlichen isoelektrischen Punkte (pIs) in einem pH-Gradienten trennt. 2D-Gelelektrophorese: Kombination von isoelektrischer Fokussierung mit einer PAGE. Hohe Trennleistung. Gelfiltration: Säulen-chromatographisches Verfahren zur Trennung von Proteinen aufgrund deren Größe. Ionenaustauschchromatographie: Trennverfahren zur Trennung von Proteinen aufgrund der unterschiedlichen Eigenladung durch Bindung an eine gegensätzlich geladene Matrix.

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4.4 Die Methoden der Proteinchemie

165

Affinitätschromatographie: Trennverfahren, welches auf der unterschiedlichen Fähigkeit von Proteinen zur Bindung an verschiedene Liganden beruht. Hydrophobe-Interaktions-Chromatographie (HIC): Trennverfahren, welches die unterschiedlichen Anteile hydrophober Oberflächen der Proteine ausnutzt. Bindung an eine hydrophobe Matrix. Edman-Sequenzierung: Proteinchemische Methode zur Proteinsequenzierung. Das Protein wird N-terminal um jeweils eine Aminosäure verkürzt. Massenspektrometrie: Analysenmethode zur Bestimmung der Molekülmasse. Auch zur Identifizierung von Proteinen, nach deren Spaltung in Peptide, geeignet (Peptidmassen-Fingerabdruck, PMF) Peptidmassen-Fingerabdruck (PMF): Massenspektrometrische Methode zur Proteinidentifizierung. Das Protein wird hierbei enzymatisch gespalten und die Massen der entstandenen Peptide bestimmt. Proteinstrukturen: Können von Proteinkristallen mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse oder in Lösung durch Kernmagnet-Resonanz-Spektroskopie (NMR) bestimmt werden. Proteindatenbanken: Enthalten Struktur- bzw. Sequenzinformationen bestimmter Proteine; z. T. aus DNA-Sequenzen abgeleitet. Protein-Engineering: Zielgerichtete Veränderung von Proteineigenschaften.

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4

166

5 Enzymbiochemie

5

Enzymbiochemie

Thomas Langer „Without enzymes life could not exist and yet enzymes themselves are not living.” John Northrop

5

5.1

Was sind Enzyme?

Enzyme sind katalytisch aktive Proteine, d. h. sie beschleunigen die Gleichgewichtseinstellung einer Reaktion in einer Zelle. Im Gegensatz zu chemischen Katalysatoren sind Enzyme sowohl bezüglich der Substrate als auch der Reaktionsart sehr spezifisch. Zudem können sie in ihrer Aktivität reguliert werden. Einige Enzyme benötigen für ihre Funktion zusätzliche Coenzyme bzw. Cofaktoren. Die systematische Einteilung der Enzyme erfolgt aufgrund der Art der katalysierten Reaktion. Enzyme wurden auch als „Katalysatoren des Lebens“ bezeichnet, da sie bei allen Reaktionen, die in einem lebenden Organismus ablaufen, beteiligt sind. Enzyme sind überwiegend hoch spezialisierte Proteine; erst in letzter Zeit wurde erkannt, dass auch RNA katalytisch aktiv ist (S. 215). Enzyme beschleunigen chemische Reaktionen so, dass sie in einem Zeitraum ablaufen, der den Erfordernissen eines lebenden Organismus entspricht, z. B. in Sekundenbruchteilen bei der Katalase oder einigen Sekunden bei der Proteinbiosynthese an den Ribosomen. Einige Enzyme steigern die Reaktionsgeschwindigkeit chemischer Reaktionen um einen Faktor bis zu 1022 (dies entspricht einer Verkürzung der Reaktionszeit von z. B. 3,17 · 104 Jahren auf 10–10 Sekunden). Wie chemische Katalysatoren gehen Enzyme aus den Reaktionen, die sie katalysieren, unverändert wieder hervor, und stehen somit für weitere Reaktionszyklen zur Verfügung. Enzymatische Umsetzungen weisen immer ein Temperaturoptimum auf (Abb. 5.1) und laufen unter relativ milden Bedingungen ab, d. h. in einem Temperaturbereich von etwa 0 hC, z. B. Tiere im Eismeer, bis 110 hC, z. B. thermophile Bakterien in siedenden Quellen. Der optimale pH-Wert für die meisten Enzyme liegt bei etwa 7. Chemische Katalysatoren funktionieren erst bei sehr viel höheren Temperaturen und z. T. extremen Drücken und pH-Werten. Im Gegensatz zu chemischen Katalysatoren können Enzyme in ihrer Aktivität reguliert werden.

5.1.1

Enzymspezifitäten

Die meisten Enzyme setzen sehr spezifisch nur eine Verbindung um (Substratspezifität), und katalysieren nur eine Reaktion (Wirkungsspezifität). Bei der

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5.1 Was sind Enzyme?

167

Abb. 5.1 Temperaturabhängigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion im Vergleich zu einer durch einen chemischen Katalysator beschleunigten Reaktion. Die Umsatzgeschwindigkeit enzymkatalysierter Reaktionen kann durch Temperaturerhöhung nicht beliebig gesteigert werden, da es bei höheren Temperaturen zu einer Denaturierung des Enzyms kommt.

Umsetzung kommt es nicht zur Bildung von Nebenprodukten. Beschränkt sich die Spezifität nur auf eine bestimmte Molekülgruppe ansonsten unterschiedlicher Substrate, spricht man auch von Gruppenspezifität (Tab. 5.1). Einige Enzyme sind bezüglich des Substrats nur wenig spezifisch, z. B. Hexokinase, oder gar unspezifisch, z. B. saure und alkalische Phosphatase. Enzyme können zwischen Enantiomeren (S. 115) unterscheiden (Stereoselektivität), auch die katalysierten Reaktionen sind dann stereospezifisch. Die Stereoselektivität beruht auf dem Aufbau der Enzyme. Ihre Bausteine sind selber asymmetrische Verbindungen, die L-Aminosäuren (S. 123). Durch die räumliche Anordnung der Aminosäuren bzw. deren Seitenketten bilden sich entsprechend auch asymmetrische aktive Zentren (S. 177). Chemische Katalysatoren sind in der Regel nicht stereoselektiv. Diese Tatsache ist von herausragender Bedeutung, weil die Substanzen, die durch konventioTab. 5.1 Enzymspezifitäten. Spezifität

Beispiel

Substrat

Absolute Spezifität

Kreatinkinase

Kreatin

Glutamat-Dehydrogenase

Glutamat

Urease

Harnstoff

D-Lactat-Dehydrogenase

D-Lactat

Stereospezifität Gruppenspezifität

L-Lactat-Dehydrogenase

L-Lactat

b-Fructosidase

b-D-Fructofuranoside (z. B. Saccharose, Raffinose)

Nucleasen

Nucleinsäuren

Lipasen

Triglyceride

Proteasen

Proteine, Peptide

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168

5 Enzymbiochemie

nelle chemische Syntheseverfahren hergestellt werden und eine biologische Wirkung besitzen (Arzneimittel, Antibiotika, Pestizide) meist als Racemate (S. 117) vorliegen. Da jeweils nur ein Enantiomer die gewünschte biologische Wirkung besitzt, müssen die Enantiomere entweder getrennt werden oder das Produkt enthält entsprechend einen unwirksamen Anteil von 50 %. Besteht die Möglichkeit, eine Substanz in biologischen Systemen, z. B. Antibiotika von Mikroorganismen, produzieren zu lassen, so erhält man nur das gewünschte Enantiomer.

5

n Im Alltag begegnet man zahlreichen Produkten, die Enzyme enthalten oder mit deren Hilfe hergestellt wurden und die biotechnologische Herstellung von Enzympräparaten ist ein bedeutender Wirtschaftszweig. Amylasen, Proteasen und Lipasen sind Waschmittelzusätze. In der Lebensmittelindustrie wird Amylase beim Brauen oder Rennin (Chymosin) bei der Käseherstellung verwendet, Fruchtsäfte werden mit Hilfe von Pektinasen geklärt. Einige Enzyme werden auch therapeutisch eingesetzt: Das bekannteste Beispiel ist Lysozym als lokal wirkendes Antibiotikum. Bei der Hämophilie B ist die Blutgerinnung durch fehlende oder unzureichende Bildung des Blutgerinnungsfaktors IX gestört, der im Verlauf der Blutgerinnungskaskade aktiviert wird. Der aktivierte Faktor IXa ist eine Serinprotease, die inzwischen rekombinant hergestellt wird, so dass für die Patienten das Infektionsrisiko gegenüber Präparaten, die aus Spenderblut gewonnen werden, wegfällt ( Zoologie). Trotz ihres geringen Anteils an der Gesamtmenge der verwendeten Enzyme sind auch die in Forschung, Medizin und Lebensmittelanalytik eingesetzten Enzyme, etwa die Restriktionsenzyme, von großer Bedeutung. Bei den genannten Beispielen kommen Enzyme direkt zum Einsatz, daneben werden viele Produkte mit Hilfe von Enzymen bzw. ganzen Mikroorganismen hergestellt. Dieser Wirtschaftszweig der industriellen Biotechnologie wird auch als „weiße Biotechnologie“ bezeichnet. Zurzeit werden etwa 5 % der chemischen Produkte unter Verwendung biotechnologischer Verfahren hergestellt. Ein weiterer Anstieg auf 10–20 % wird bis 2010 erwartet. Durch Ausnutzung mikrobieller Stoffwechselleistungen können komplexe Reaktionsfolgen unter Verwendung billiger und nachwachsender Ausgangmaterialien (z. B. Melasse, Sojamehl, Cellulose, Stärke) anstelle fossiler umweltfreundlich und effektiv durchgeführt werden. Die Vorteile liegen auf der Hand. Die Produkte der weißen Biotechnologie finden vor allem als Energielieferant (Biogas, Biodiesel, Bio-Ethanol) und in der Lebensmittel-, Textil-, Papier-, Kosmetikindustrie Verwendung. Weltweit werden z. Zt. jährlich etwa 38 000 000 t Bio-Ethanol, 1 500 000 t L-Glutamat, 80 000 t Vitamin C, 35 000 t Antibiotika und 20 000 t Xanthan hergestellt. Durch Umstellung auf biotechnologische Verfahren zur Herstellung von Vitamin B2 konnten die Kosten um 40 % gesenkt werden; zudem werden die Ressourcen besser genutzt und die Abfallmenge drastisch reduziert. Vitamin B12 lässt sich im industriellen Maßstab (ca. 10 t jährlich) überhaupt nur biotechnologisch herstellen. Ein rasch wachsender Zweig ist die Herstellung von Kunststoffen mit Hilfe der Biotechnik: Ein Beispiel ist Poly-Milchsäure (poly lactic acid, PLA). Als Ausgangsmaterial dient Glucose, welche zu Milchsäure fermentiert und anschließend polymerisiert wird. Der Bio-Kunststoff hat dem Polyethylen vergleichbare Eigenschaften, kann im Unterschied zu diesem aber mikrobiologisch abgebaut (kompostiert) werden. Die Produktion von PLA lag im Jahr 2002 bei 140 000 t. m

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5.1 Was sind Enzyme?

5.1.2

169

Die Rolle der Coenzyme

Einige Enzyme benötigen für ihre Funktion noch zusätzliche Faktoren, insbesondere, wenn sie Redoxreaktionen und bestimmte Gruppenübertragungsreaktionen katalysieren. Solche Faktoren werden zusammenfassend als Cofaktoren bezeichnet (Kap. 6). Den Proteinanteil eines Enzyms bezeichnet man als Apoenzym, zusammen mit dem Cofaktor bildet es das aktive Holoenzym: Apoenzym (inaktiv) + Cofaktor = Holoenzym (aktiv)

5.1.3

Einteilung der Enzyme

Um bei der stets wachsenden Zahl bekannter Enzyme (bisher wurden mehr als 4000 Enzyme charakterisiert) Doppelbenennungen und unklare Bezeichnungen zu vermeiden, wurde von der Enzymkommission der internationalen Union für Biochemie (Commission on Enzymes of the IUB) eine Nomenklatur eingeführt, die jedem Enzym neben seinem Trivialnamen einen streng systematischen Namen und eine vierstellige EC (enzyme commission)-Nummer zuordnet. Die Klassifizierung erfolgt nach dem katalysierten Reaktionstyp in sechs Hauptklassen, die weiter in Unterklassen und Subunterklassen unterteilt werden. Die erste Ziffer bezieht sich auf die Hauptklasse, die zweite und dritte auf die Unterklasse bzw. Subunterklasse, die vierte Ziffer ist die Seriennummer des Enzyms innerhalb der Subunterklasse. Der systematische Name leitet sich von der Art der Reaktion und den beteiligten Substanzen ab und endet stets auf „ase“. Beispiel: Der systematische Name für Glucose-Oxidase lautet: b-D-Glucose-O2-1-Oxidoreductase und die Systemnummer EC 1.1.3.4. Es bedeutet: EC: Enzyme Commission 1. Hauptklasse: Oxidoreductase 1. Unterklasse: auf CH(OH)-Gruppen wirkend 3. Subunterklasse: O2 als Akzeptor 4. Enzymnummer innerhalb der Subunterklasse. Einen Überblick über die systematische Einteilung der Enzyme gibt Tab. 5.2. In der 1. Hauptklasse werden Enzyme, die Redoxreaktionen katalysieren, als Oxidoreductasen zusammengefasst. Zu diesen gehören die Dehydrogenasen, Reductasen, Oxidasen und Oxygenasen. Als Dehydrogenasen bezeichnet man speziell wasserstoffübertragende Enzyme. Als Reductasen werden solche Enzyme bezeichnet, bei denen die Reduktion des Substrats die physiologische Funktion darstellt (z. B. Dihydrofolat-Reductase). Oxidasen verwenden molekularen Sauerstoff direkt als Elektronenakzeptor; hierbei entsteht Wasserstoffperoxid (H2O2). Oxygenasen übertragen molekularen Sauerstoff auf ein Substrat. Wird dabei nur ein Sauerstoffatom aus dem O2-Molekül in das Substrat eingebaut, spricht man von einer Monooxygenase, während Dioxygenasen in der Lage sind, beide Sauerstoffatome von O2 unter Bildung eines Peroxids in das Substrat einzubauen. Die Enzyme der 2. Hauptklasse sind die gruppenübertragenden Transferasen. Die prominenteste Enzymfamilie der Transferasen stellen die Proteinkinasen (Übertragung von Phosphorylgruppen) dar. In dem mittlerweile vollständig sequenzierten Genom der Hefe

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170

5 Enzymbiochemie

Tab. 5.2 Enzym-Klassifikation. Hauptklasse

Reaktionstyp

wichtige Unterklassen

1. Oxidoreductasen

Redoxreaktion

Dehydrogenasen Oxidasen Oxygenasen Reductasen

2. Transferasen

Gruppenübertragung

Phosphotransferasen (Proteinkinasen) Aminotransferasen (Transaminasen) C1-Transferasen

3. Hydrolasen

Hydrolytische Spaltung

Esterasen (Lipasen) Phosphatasen Glykosidasen Peptidasen (Proteasen)

4. Lyasen Synthasen

Gruppeneliminierung unter Bildung von Doppelbindungen Bildung einer chemischen Bindung unter Auflösung von Doppelbindungen

C-C-Lyasen C-O-Lyasen C-N-Lyasen

5. Isomerasen

Isomerisierungen

Isomerasen Mutasen Epimerasen

6. Ligasen („Synthetasen“)

Bildung kovalenter Bindungen unter Verbrauch von Nucleosidtriphosphaten

C-C-Ligasen C-O-Ligasen C-N-Ligasen

5

Saccharomyces cerevisiae wurden 113 Gene für Proteinkinasen identifiziert, was ca. 2 % des gesamten Genoms entspricht. Phosphorylgruppen-Donor ist in den meisten Fällen ATP. Zur 3. Hauptklasse gehören die Hydrolasen. Diese Enzyme spalten Verbindungen unter Einbau eines Wassermoleküls (Hydrolyse). Erfolgt die Spaltung auf nicht hydrolytische Weise, so werden die Enzyme als Lyasen (4. Hauptklasse) bezeichnet. Der Begriff „Synthasen“ betont die umgekehrte Reaktion, die Bildung einer chemischen Bindung zwischen zwei Substraten unter Auflösung einer vorhandenen Doppelbindung, (z. B. Citrat-Synthase). Isomerasen sind die Vertreter der 5. Hauptklasse, sie katalysieren intramolekulare Umlagerungen. Zur 6. Hauptklasse werden die Ligasen, gelegentlich auch als Synthetasen bezeichnet, gezählt. Ligasen katalysieren die Verknüpfung zweier Verbindungen bei gleichzeitiger Spaltung einer Phosphosäureanhydrid-Bindung eines Nucleosidtriphosphates, meist von ATP.

5.1.4

Isoenzyme

Isoenzyme oder Isozyme sind Enzyme, welche die gleiche Reaktion katalysieren, aber eine mehr oder weniger unterschiedliche Struktur aufweisen. Isoenzyme werden entweder durch mehrere Genorte (Genloci) innerhalb eines Genoms oder durch verschiedene Allele eines einzigen Genlocus innerhalb einer Organismenart codiert. Sie unterscheiden sich entsprechend mehr oder

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5.1 Was sind Enzyme?

171

weniger stark in ihren physikalischen Eigenschaften (z. B. isoelektrischer Punkt, Hitzestabilität, pH-Optimum), den regulatorischen Eigenschaften sowie in den kinetischen Parametern. Innerhalb eines Organismus kommen Isoenzyme meist in unterschiedlichen Organen bzw. Zellkompartimenten vor. Manche Isoenzyme haben den gleichen intrazellulären Bestimmungsort; die entsprechenden Isoenzyme werden aber dann meist nicht gleichzeitig, sondern nacheinander aufgrund veränderter Umgebungsbedingungen gebildet. Regulation der Glucose-Homöostase mit Hilfe von Isoenzymen: Die Aufrechterhaltung einer konstanten Blutglucosekonzentration ist für die meisten Säugetiere lebenswichtig: Beim Menschen liegt sie im Bereich von 4–5 · 10–3 mol l–1. Der Transport von Glucose über die Zellmembranen wird von unterschiedlichen Transportern, als GLUT 1–5 bezeichnet, katalysiert. Die verschiedenen GLUT-Proteine werden in unterschiedlichen Organen exprimiert und unterscheiden sich stark bezüglich ihrer Affinität für Glucose. GLUT 1 und 3 (KM z 1 · 10–3 mol l–1) kommen in nahezu allen Zellen des Organismus vor. Die Funktion dieser Transporter ist es, die Grundversorgung der Zellen mit Glucose sicher zu stellen. In der Leber und den b-Zellen des Pankreas wird GLUT 2 exprimiert. GLUT 2 besitzt einen KM-Wert von etwa 2 · 10–2 mol l–1, der weit über der durchschnittlichen Glucosekonzentration im Blut liegt. Erst bei erhöhter Glucosekonzentration im Blut, z. B. nach einer kohlenhydratreichen Nahrung, wird Glucose in merklichem Ausmaß über GLUT 2 aus dem Blut in die Leber bzw. die b-Zellen des Pankreas transportiert. Die b-Zellen des Pankreas sezernieren daraufhin Insulin in das Blut. GLUT 4 (KM z 8 · 10–3 mol–l) kommt in den Muskeln und im Fettgewebe vor. Der Einbau von GLUT 4 in die Zellmembran wird durch Insulin stimuliert. In den Epithelzellen des Darms kommt GLUT 5 vor. Die Funktion von GLUT 5 besteht darin, Glucose aus den Epithelzellen in das Blut zu transportieren. Nach Aufnahme in die Zellen, wird Glucose durch Hexokinase zu Glucose-6-phosphat phosphoryliert. Auch von diesem Enzym gibt es unterschiedliche Isoformen, die sich bezüglich der Affinität für Glucose und der Regulation unterscheiden (S. 276). Weitere Beispiele für Isoenzyme sind die Carboanhydrase und die Phenylalanin-AmmoniakLyase (PAL, Botanik).

Enzymspezifität: Enzyme weisen unterschiedliche Spezifitäten auf. Diese können sich auf bestimmte Verbindungen (Substratspezifität), Molekülgruppen (Gruppenspezifität), Reaktionen (Wirkungsspezifität) oder auch auf ein Enantiomer (Stereoselektivität) beziehen. Apoenzym: Proteinanteil eines Enzyms. Holoenzym: Aktives Enzym bestehend aus Apoenzym und Coenzym bzw. prosthetischer Gruppe. Enzym-Klassifizierung: Systematische Einteilung der Enzyme anhand der Art der katalysierten Reaktion. Sechs Hauptklassen: Oxidoreductasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen (Synthasen), Isomerasen und Ligasen (Synthetasen). Isoenzyme (Isozyme): Enzyme von unterschiedlicher Struktur, die die gleiche Reaktion katalysieren.

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5

5

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5 Enzymbiochemie

5.2

Strategien der Enzymkatalyse

Auch Enzym-katalysierte Reaktionen sind chemische Reaktionen, welche mit den entsprechenden Formalismen beschrieben werden können. Das Teilgebiet der Chemie, welches zeitabhängige Prozesse behandelt, ist die Reaktionskinetik. Die zeitabhängige Umsetzung einer Substratmenge wird durch die Reaktionsgeschwindigkeit der betrachteten Reaktion festgelegt. Für jede Reaktion kann ein entsprechendes Geschwindigkeitsgesetz formuliert werden. Im Verlauf einer Reaktion wird ein energetisch ungünstiger Zustand durchlaufen, welcher als Übergangszustand bezeichnet wird. Um diesen zu erreichen, muss die Aktivierungsenergie aufgewendet werden. Enzyme beschleunigen chemische Reaktionen, indem sie die hierfür nötige Aktivierungsenergie herabsetzten. Einen Zusammenhang zwischen Aktivierungsenergie und Reaktionsgeschwindigkeit stellt die Arrhenius-Gleichung her. Die Stelle im Enzym, an der die eigentliche Reaktion stattfindet ist das aktive Zentrum. Das aktive Zentrum wird erst im Verlauf der Reaktion optimal ausgerichtet. Diese Betrachtungsweise wird als Induced Fit-Modell bezeichnet. Temperatur und pH-Wert haben in der Regel einen deutlichen Einfluss auf die jeweiligen Enzymaktivitäten. Enzyme erhöhen Reaktionsgeschwindigkeiten um viele Größenordnungen und lassen Reaktionen sehr spezifisch, ohne Entstehen von Nebenprodukten, ablaufen. Auch Enzyme sind dabei den Gesetzen der Thermodynamik unterworfen. Wie kann das funktionieren? Enzyme können nur solche Reaktionen katalysieren, die auch ein thermodynamisches Bestreben haben, abzulaufen (exergone Reaktionen, DGhl I 0). Zwei Moleküle in einer Lösung haben folgende „Probleme“, wenn sie miteinander reagieren wollen: Sie müssen zunächst in einer bestimmten Ausrichtung aufeinander treffen und sie müssen einen bestimmten Energiebetrag, die Aktivierungsenergie, überwinden. An diesen Punkten hilft das Enzym: Es sorgt für eine optimale Umgebung bzw. Orientierung der Substratmoleküle und damit für eine Reduzierung der erforderlichen Aktivierungsenergie.

5.2.1

Reaktionskinetik

Im Gegensatz zur Thermodynamik, die keine zeitabhängigen Prozesse kennt und sich nur mit der Beschreibung von Zuständen befasst, beschreibt die Kinetik die Dynamik der betrachteten Systeme. Die Reaktionskinetik beschreibt den zeitlichen Verlauf chemischer Reaktionen und untersucht die Geschwindigkeiten, mit denen sich ein betrachtetes System dem Gleichgewichtszustand nähert. In Kap. 3.5 wurden energetische Betrachtungen bei chemischen Reaktionen erörtert. So mag die Reaktion S p P zwar eine starke negative Änderung der

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5.2 Strategien der Enzymkatalyse

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freien Enthalpie aufweisen, aber über die Geschwindigkeit der Umsetzung bzw. den Zeitpunkt der Gleichgewichtseinstellung sagt die Gleichung nichts aus. Die Thermodynamik beschreibt lediglich Anfangs- und Endzustände, sie macht eine Aussage darüber, ob ein bestimmter Zustand bei gegebenen Ausgangsbedingungen erreicht werden kann oder nicht.

5.2.2

Die Reaktionsgeschwindigkeit

Die Reaktionsgeschwindigkeit gibt an, wie schnell aus einem oder mehreren Substraten ein oder mehrere Produkte gebildet werden und kann entweder durch die Messung der entstehenden Produkte oder des Verbrauchs der Substrate bestimmt werden. Die Reaktionsgeschwindigkeiten sind von den Konzentrationen der beteiligten Stoffe, dem Druck und der Temperatur abhängig und werden in der Einheit mol l–1 s–1 angegeben. Die Beschreibung der Reaktionsgeschwindigkeit erfolgt durch eine mathematische Gleichung, das Geschwindigkeitsgesetz. Die allgemeine Beziehung für die Reaktionsgeschwindigkeit lautet: Reaktionsgeschwindigkeit = Konstante [Reaktanden]n Für die einfache Reaktion S p P folgt daraus: v ¼ k [S]

n

(5.1)

v ist die Reaktionsgeschwindigkeit, [S] die Konzentration der Substanz S und n die Reaktionsordnung (s. u.). Es leuchtet unmittelbar ein, dass eine Erhöhung der Stoffkonzentration zu einer Erhöhung der Zusammenstöße zwischen den Reaktanden und damit zu einer Erhöhung der Bildung von P führt. Der Proportionalitätsfaktor k, die Geschwindigkeitskonstante, ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit, die bei einem Zusammentreffen der Reaktanden tatsächlich zur Reaktion führt. Je größer k ist, umso höher ist die Reaktionsgeschwindigkeit. Zu Beginn einer Reaktion ist die Geschwindigkeit am größten, da hier die Reaktanden in den höchsten Konzentrationen vorliegen. Die Abnahme der Konzentration von S in der Zeit t, entspricht wegen der stöchiometrischen Verhältnisse der Zunahme von P und wird durch ein negatives Vorzeichen ausgedrückt. In infinitesimaler Schreibweise ergibt sich für die Reaktionsgeschwindigkeit folgende Gleichung: v¼


d[S] d[P] ¼ dt dt

(5.2)

Die Angabe der Reaktionsgeschwindigkeit erfolgt am besten so, dass v einen positiven Wert erhält. Die Reaktionsordnung: Die Reaktionsordnung wird durch die Summe der Exponenten aller Konzentrationsparameter im Geschwindigkeitsgesetz angegeben. Bei einfachen Reaktionen ist die Reaktionsordnung n meist eine kleine, ganze Zahl. n kann aber auch gebrochene Zahlenwerte annehmen. Die Bestimmung des Geschwindigkeitsgesetzes und damit der Reaktionsordnung muss immer durch das Experiment erfolgen, da die

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5 Enzymbiochemie

174

5

Reaktionsordnung auch von den gewählten Reaktionsbedingungen abhängig ist. Folgende Reaktionstypen sind von Bedeutung: Reaktionen nullter Ordnung: v = k Die Reaktion verläuft mit einer von der Substratkonzentration unabhängigen Geschwindigkeit. Eine Reaktion nullter Ordnung liegt z. B. bei enzymkatalysierten Umsetzungen vor, wenn das Enzym gesättigt ist ([S] ii KM, S. 183). Reaktionen erster Ordnung: v = k [S] Die Reaktionsgeschwindigkeit ist der Konzentration einer einzelnen Substanz direkt proportional. Bei niedrigen Substratkonzentrationen (KM ii [S]) beschreibt die Michaelis-Menten-Gleichung eine Reaktion erster Ordnung (S. 184, Gl. 5.7, 5.8). Reaktionen zweiter Ordnung: v = k [S]2 oder v = k [S1] [S2] Die Reaktionsgeschwindigkeit ist dem Quadrat der Konzentration einer Substanz oder dem Produkt der Konzentration zweier Substanzen direkt proportional. Im zweiten Fall ist die Reaktion erster Ordnung bezüglich der einzelnen Substanzen, insgesamt aber zweiter Ordnung. Enzymkatalysierte Reaktionen können bei geringen Substratkonzentrationen als Reaktionen zweiter Ordnung aufgefasst werden (S. 187, Gl. 5.14). Weitere Beispiele sind die Antigen-Antikörper-Reaktionen im Rahmen der Immunantwort oder die Reassoziation komplementärer DNA-Stränge, z. B. nach thermischer Denaturierung. Reaktionen höherer Ordnung spielen in der (biologischen) Praxis keine Rolle.

5.2.3

Übergangszustand und Temperaturabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit

Damit zwei Substanzen miteinander reagieren können, müssen sie sich so nahe kommen, dass sie miteinander in Wechselwirkung treten können. Die Kräfte, die zwischen den Teilchen wirksam sind, sind elektrostatische Kräfte. Damit z. B. zwei ungeladene Moleküle miteinander reagieren können, muss Energie aufgebracht werden, um die durch die Elektronenwolke bedingte gegenseitige Abstoßung zu überwinden. Zudem müssen die Teilchen im Hinblick auf die zu knüpfende (oder zu spaltende) Bindung optimal ausgerichtet sein. Die Energie, die benötigt wird, um die Teilchen für die Reaktion auszurichten, wird Aktivierungsenergie EA genannt. Die Reaktanden durchlaufen einen energiereicheren Zwischenzustand, der als Übergangszustand bezeichnet wird. In Abb. 5.2 ist ein Energieprofil für die allgemeine Reaktion S Ð S‡ * P

(5.3)

dargestellt. Der Weg vom Übergangszustand S‡ zu den Produkten bzw. zurück zum Substrat ist gleich wahrscheinlich. Da die Konzentration des Übergangskomplexes im Vergleich zu den Ausgangsstoffen sehr niedrig ist, ist der Zerfall des Übergangskomplexes in die Produkte der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Reaktion. Die Arrhenius-Gleichung, eine empirisch gefundene, d. h. aus experimentellen Daten abgeleitete Gleichung, beschreibt die Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten k: EA

k ¼ A e
RT

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(5.4)

5.2 Strategien der Enzymkatalyse

175

Abb. 5.2 Reaktionsprofil für die exergone Reaktion S p P. Der Übergangszustand (S‡) ist der Zustand mit dem höchsten Energiegehalt. Dieser ist nur sehr schwach besetzt. Die Differenz der Aktivierungsenergie zwischen der Bildung des Übergangszustandes aus dem Edukt (DG‡ S p S‡) und dem Produkt (DG‡ P p S‡) entspricht der freien Reaktionsenthalpie DGhl der Gesamtreaktion S p P.

EA ist die Aktivierungsenergie der Reaktion, R die Gaskonstante, T die absolute Temperatur und A eine für die jeweilige Reaktion charakteristische Konstante. In E einer Lösung besitzen nicht alle Moleküle die gleiche Energie. Der Faktor A e
RT entspricht dem Bruchteil der Moleküle, deren Energie groß genug ist, um die Energiebarriere zur Bildung des Übergangszustandes zu überwinden. Die Konstante A berücksichtigt weitere Faktoren, die den Anteil der produktiven Zusammenstöße beschreibt (nicht jedes Zusammentreffen zweier Moleküle, deren Energie mindestens der Aktivierungsenergie entspricht, wird zu einer Reaktion führen). Die Aktivierungsenergie EA und die Konstante A werden auch als Arrhenius-Parameter bezeichnet. Die Aktivierungsenergie kann z. B. durch Temperaturerhöhung (Erhöhung der Molekularbewegung und damit Erhöhung der Wahrscheinlichkeit des Zusammenstoßes) oder durch optimale räumliche Ausrichtung der Reaktanden und Polarisierung bestimmter Bindungen erreicht werden (s. u.). Aus der Arrhenius-Gleichung (5.4) wird ersichtlich, dass eine niedrige Aktivierungsenergie einer hohen Geschwindigkeitskonstante entspricht. Je niedriger die Geschwindigkeitskonstante, umso langsamer läuft die Reaktion ab. Aus dem reziproken exponentiellen Zusammenhang zwischen der Geschwindigkeitskonstanten und der Temperatur folgt ferner, dass eine Temperaturerhöhung immer auch eine Vergrößerung von k und damit eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit zur Folge hat. Bei enzymkatalysierten Reaktionen wird die Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit allerdings durch Denaturierung des Enzyms bei Erreichen entsprechender Temperaturen begrenzt. Eine alte Faustregel besagt, dass sich bei einer Temperaturerhöhung um 10 hC die Geschwindigkeit chemischer Reaktionen verdoppelt bis verdreifacht. Mathematisch ausgedrückt wird dieser Zusammenhang in der Van’t Hoff- oder RGT (Reaktionsgeschwindigkeits-Temperatur)-Regel. In der angelsächsischen Literatur wird das Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten bei einem Temperaturunterschied von 10 hC als Q10 bezeichnet: Q10 ¼

vðT þ 10Þ vðTÞ

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(5.5)

5

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5

5 Enzymbiochemie

v ist die Reaktionsgeschwindigkeit, T die Temperatur. Führt eine Temperaturerhöhung um 10 hC zu einer Verdopplung der Reaktionsgeschwindigkeit, so resultiert daraus ein Q10 von 2. Enzyme beschleunigen, wie chemische Katalysatoren auch, lediglich die Einstellung des Gleichgewichts einer Reaktion. Sie haben aber keinerlei Einfluss auf die Lage des Gleichgewichts d. h. die Gleichgewichtskonstante ändert sich nicht. Eine endergone Reaktion kann auch in Anwesenheit eines Enzyms nicht ablaufen, es sei denn, dass diese mit einer exergonen Reaktion gekoppelt wird, sodass die Summe der Reaktionen wieder exergon ist (S. 65). Da Enzyme die Gleichgewichtseinstellung einer Reaktion beschleunigen, katalysieren sie sowohl die Hin- als auch die Rückreaktion. Dass bei einer Reaktion innerhalb der Zelle ein „Nettofluss“ in eine Richtung resultiert, liegt daran, dass eine Einstellung des thermodynamischen Gleichgewichts nie erreicht wird, da die Produkte sofort weiter umgesetzt werden. Diesen Zustand bezeichnet man als Fließgleichgewicht (S. 37). Bei vielen Reaktionen ist die Aktivierungsenergie so hoch, dass die Reaktion in Abwesenheit von Enzymen praktisch nicht stattfindet bzw. nicht messbar langsam abläuft, obwohl die Reaktanden sich nicht im Gleichgewichtszustand befinden. Das thermodynamische Gleichgewicht für die meisten organischen Verbindungen und Sauerstoff liegt auf der Seite der Oxidationsprodukte CO2 und H2O. Glucose reagiert z. B. nur dann mit O2 zu CO2 und H2O, wenn eine beträchtliche Aktivierungsenergie aufgebracht wird. Substanzen, die sich nicht im Gleichgewichtszustand befinden, deren Gleichgewichtszustand aber durch eine exergone Reaktion erreicht werden kann, und die trotzdem keine Tendenz zeigen, zu reagieren, werden als metastabil bezeichnet; die Reaktion ist kinetisch gehemmt. Metastabile Verbindungen sind beispielsweise die energiereichen, organischen Phosphorverbindungen (S. 265). Reaktionen dieser Stoffe (z. B. ATP) weisen eine große Änderung der freien Enthalpie auf; die spontane Hydrolyse ist aber gehemmt, da die Aktivierungsenergie in Abwesenheit entsprechender Enzyme nicht überwunden werden kann.

5.2.4

Katalyse durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie

Enzyme katalysieren Reaktionen dadurch, dass sie die Aktivierungsenergie einer Reaktion herabsetzen. Der Reaktionsschritt mit der höchsten Aktivierungsenergie ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Gesamtreaktion. Dies ist die Bildung des Übergangszustandes. Im Übergangszustand sind die „alten“ Bindungen noch nicht ganz gelöst und die „neuen“ Bindungen noch nicht vollständig ausgebildet. Dieser Zustand lässt sich in etwa mit einem Regenschirm im Moment des Umklappens vergleichen. Das Enzym stabilisiert nun diesen Übergangszustand durch zahlreiche Wechselwirkungen und vermindert so den Energiebetrag, der zu dessen Bildung notwendig ist. Zu beachten ist, dass sich die freie Standard-Bildungsenthalpie DGhl der Reaktion durch die Katalyse nicht

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5.2 Strategien der Enzymkatalyse

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Abb. 5.3 Reaktionsprofile für die katalysierte und unkatalysierte Reaktion S p P. In der katalysierten Reaktion (blaue Kurve) ist die Aktivierungsenergie (DG‡kat) zur Bildung des Übergangszustandes (ES‡) gegenüber der Aktivierungsenergie (DG‡unkat) zur Bildung des Übergangszustandes (S‡) der unkatalysierten Reaktion (schwarze Linie) herabgesetzt. Die freie Reaktionsenthalpie DGhl für die Gesamtreaktion hat sich durch die Katalyse nicht verändert.

ändert (Abb. 5.3). Der gegenüber der unkatalysierten Reaktion „fehlende“ Enthalpiebetrag wird überwiegend durch die Substratbindungsenergie kompensiert. Dieser Energiebetrag wird bei der Bindung des Substrats an das Enzym freigesetzt. Zur Substratbindungsenergie tragen die Kräfte bei, die auch zur Aufrechterhaltung der Sekundärstruktur bei Proteinen beitragen: Van-der-WaalsKräfte, hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken-Bindungen und ionische Wechselwirkungen (S. 89). Die Aktivierungsenergie enzymkatalysierter Reaktionen kann leicht durch die thermische Energie erreicht werden.

5.2.5

Das aktive Zentrum

Die Umsetzung der Substrate erfolgt an einer ganz bestimmten Stelle des Enzyms, dem aktiven Zentrum (active site). Das aktive Zentrum bindet die Substrate sehr spezifisch. Für die Bindung eines Enzyms an das aktive Zentrum wurde 1894 von Emil Fischer das Schlüssel-Schloss-Modell vorgeschlagen (Abb. 5.4a). Dieses Modell, welches für das Verständnis der Enzymkatalyse sehr hilfreich war, ist aber unzureichend. Ein Substrat, das genau komplementär zur Bindungsstelle ist, bindet, reagiert aber nicht. Das entsprechende Enzym wäre wirkungslos. Das 1958 von Daniel Koshland entwickelte Induced-Fit-Modell versucht, diesen Widerspruch aufzulösen (Abb. 5.4b). Wesentlicher Unterschied zum Schlüssel-Schloss-Modell ist hierbei, dass sowohl das Enzym als auch das Substrat eine Konformationsänderung erfahren. Man kann sich die Konformationsänderungen des Enzyms am besten so vorstellen, dass es die Reaktanden bei der Umsetzung dauernd begleitet, ähnlich wie ein Handschuh der Hand folgt. Im aktiven Zentrum werden die Substrate für die anstehende Reaktion optimal ausgerichtet. Das aktive Zentrum bildet eine zum Übergangszustand komplementäre Struktur aus und stabilisiert diesen durch zahlreiche Wechselwirkungen. Einige Enzymhemmstoffe wirken dadurch, dass sie eine Struktur ähnlich

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5 Enzymbiochemie

Abb. 5.4 Substratbindung. a Schlüssel-SchlossModell. Aktives Zentrum und Substrat sind schon vor der Substratbindung komplementär zueinander. b Induced-Fit-Modell. Sowohl Substrat als auch Enzym erfahren eine Konformationsänderung. Erst im gebundenen Zustand sind Substrat und aktives Zentrum komplementär zueinander.

dem Übergangszustand aufweisen und dadurch mit einer höheren Affinität an das aktive Zentrum gebunden werden (S. 192). Die Energie, die für die Konformationsänderungen bei der Substratbindung sowie zur Entfernung der Hydrathülle des Substrats aufgebracht werden müssen, entstammt der Substratbindungsenergie; zudem resultiert bei der Substratbindung ein Entropiegewinn, da die Zahl der ungeordneten Wassermoleküle in der Umgebung erhöht wird (vgl. hydrophobe Wechselwirkung, S. 33).

n Antikörper binden mit einer hohen Affinität an das entsprechende Antigen (Bindungskonstanten im Bereich von 104 bis 1014 mol l–1). Hier ist, und das unterscheidet Antikörper von Enzymen, die komplementäre Struktur zum Liganden schon weitgehend vorgefertigt. Schon Linus Pauling, einer der großen Proteinchemiker dieses Jahrhunderts, wies vor rund 50 Jahren auf ein grundlegendes Unterscheidungsmerkmal zwischen Enzymen und Antikörpern hin: Antikörper binden Moleküle im Grundzustand, während Enzyme diese im Übergangszustand binden. Stellt man nun Antikörper her, die dem Übergangszustand einer Substanz in einer bestimmten Reaktion strukturell ähneln, so sind diese Antikörper auch in der Lage, die entsprechende Reaktion zu katalysieren. Diese Antikörper bezeichnet man als katalytische Antikörper oder Abzyme (von antibody enzyme). Die katalytische Potenz katalytischer Antikörper liegt in der Regel unterhalb der von Enzymen. Sie beschleunigen Reaktionen um etwa das 103- bis 106-fache gegenüber der unkatalysierten Reaktion. Bisher sind etwa 100 katalytische Antikörper generiert bzw. beschrieben worden; die Zahl wächst stetig. Katalytische Antikörper können gezielt auf eine zu katalysierende Reaktion hin erzeugt werden. Die meisten der bisher hergestellten katalytischen Antikörper hydrolysieren Esterbindungen. Chemisch stabile Analoga der entsprechenden Übergangszustände können relativ leicht hergestellt werden. Diese Substanzen dienen dann als Immunogen zur Generierung der katalytischen Antikörper. Mit Hilfe dieser Antikörper können stereoselektive Reaktionen unter milden chemischen Be-

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5.2 Strategien der Enzymkatalyse

179

dingungen durchgeführt werden. Gibt es auch praktische Anwendungen für katalytische Antikörper? Ein Beispiel hierfür ist der Antikörper „CAb15A10“ der zur Behandlung von Kokainmissbrauch erprobt wird. CAb15A10 spaltet die BenzoylEsterbindung des Kokains und inaktiviert dieses damit. Ein schnellerer Abbau der Droge im Körper wird damit erreicht. Ähnliche Strategien werden auch zur Behandlung anderer Krankheiten erprobt: Die Spaltung des HIV-Oberflächenproteins gp120 (Verhinderung der Virus-Anheftung) oder etwa der Abbau von b-Amyloidablagerungen bei der Alzheimerschen Krankheit. m Das aktive Zentrum liegt meist in einer wasserfreien, hydrophoben Tasche im Enzym. Der Ausschluss von Wasser ist, sofern dieses nicht selbst an der Reaktion beteiligt ist, von Bedeutung, da hierdurch eine optimale elektrostatische Wechselwirkung zwischen den Reaktanden ermöglicht wird (Wasser besitzt eine hohe Dielektrizitätskonstante und vermag elektrostatische Anziehungskräfte zwischen polaren oder geladenen Teilchen besonders gut abzuschirmen; S. 32). Im aktiven Zentrum herrschen somit völlig andere Umweltbedingungen als in wässriger Lösung. Wie aber werden die kleinen Wassermoleküle aus dem aktiven Zentrum fern gehalten, solange kein Substrat gebunden ist? Zum einen bildet sich die Substratbindungstasche erst mit der Bindung des Substrats richtig aus (induced fit), zum anderen ist es für einzelne Wassermoleküle energetisch äußerst ungünstig, aus dem Verband mit anderen Wassermolekülen auszutreten und in eine hydrophobe Umgebung überzugehen, in der kaum Wasserstoffbrücken-Bindungen ausgebildet werden können (S. 33).

5.2.6

Enzymaktivitäten

Die Mengenbestimmung eines Enzyms in einer Präparation erfolgt meist anhand der durch das Enzym katalysierten Reaktion. Die Enzymaktivität wird durch den Verbrauch eines Substrats oder durch das Entstehen des Produkts bestimmt. Kann das Substrat oder ein entstehendes Produkt nicht unmittelbar, z. B. spektroskopisch, nachgewiesen werden, so besteht die Möglichkeit, einen weiteren Reaktionsschritt, der spezifisch für das Produkt ist und auch enzymkatalysiert sein kann, anzuschließen (Abb. 5.5). Nach Möglichkeit wird versucht, die Reaktion mit einer NAD(P)+ bzw. NAD(P)H umsetzenden Reaktion zu koppeln, da der Verbrauch von NAD(P)+ bzw. NAD(P)H leicht im optischen Test (S. 225) verfolgt werden kann. Die SI-Einheit der Enzymaktivität ist das Katal (kat, mol s–1). Ein Katal entspricht der Umsetzung von einem Mol Substrat pro Sekunde. Häufig erfolgt die Angabe der Enzymaktivität in internationalen Enzymeinheiten (Units, U, mmol min–1). Ein Unit entspricht der Enzymmenge, die ein mmol Substrat in einer Minute umsetzt. Die Aktivitätsbestimmungen werden unter definierten Bedingungen durchgeführt; dies sind normalerweise 25 hC und der für das jeweilige Enzym optimale pH-Wert. Für die Umrechnung von Units in Katal gilt: 1 U = 16,67 · 10–9 kat.

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5 Enzymbiochemie

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Abb. 5.5 Indirekte Bestimmung der Aktivität von Phosphofructokinase mit Hilfe gekoppelter Reaktionen. Da eine direkte Messung der Aktivität nicht möglich ist, wird die Reaktion mit weiteren Umsetzungen gekoppelt, die schließlich zu einem Umsatz von NAD+ zu NADH führen. In dem Versuchsansatz müssen die anderen Enzyme sowie ATP, Fructose6-phosphat, NAD+ und Pi im Überschuss vorliegen. Sie stellt somit wegen der strengen Kopplung der Reaktionen ein direktes Maß für die Aktivität der PFK dar. Der Indikatorreaktion, katalysiert durch Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, ist eine weitere Hilfsreaktion, die Aldolasereaktion, vorgeschaltet.

In der Biochemie wird die Aktivitätsbestimmung zur Kontrolle bei der Reinigung von Enzymen eingesetzt. Hier setzt man die gemessene katalytische Aktivität zur Gesamtproteinmenge ins Verhältnis und erhält die spezifische Aktivität: €t = spezifische Aktivita

€t (Units) katalytische Aktivita Protein (mg)

Je höher die spezifische Aktivität einer Fraktion, umso reiner ist die Enzympräparation. Die Messung von Enzymaktivitäten hat eine große Bedeutung in der medizinischen Diagnostik.

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5.2 Strategien der Enzymkatalyse

5.2.7

181

Einfluss des pH-Werts auf die Enzymaktivität

Die pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität liegt in einer pH-abhängigen Dissoziation funktioneller Gruppen im aktiven Zentrum des Enzyms oder des Substrats begründet. Bei extremen pH-Werten kommt es schließlich zur Denaturierung des Enzyms. Nicht alle Enzyme weisen ein pH-Optimum auf, viele sind in ihrer Funktion über einen weiten Bereich vom pH-Wert unabhängig. Besitzt die Aktivitätskurve ein Maximum, kann man von seiner Lage auf die Beteiligung bestimmter funktioneller Gruppen schließen. Ein Maximum im Bereich von pH 6–7 deutet auf einen Histidinrest hin, während Maxima im Bereich von pH 2–3 auf die Carboxylgruppe eines Aspartat- oder Glutamatrestes hinweisen (Abb. 5.6a). Maßgeblich hierfür sind die pKS-Werte der an der Katalyse beteiligten Aminosäurereste.

5.2.8

Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität

Wie andere chemische Reaktionen, sind auch enzymkatalysierte Reaktionen temperaturabhängig. Bei einer Temperaturerhöhung um 10 hC verdoppelt sich in etwa die Geschwindigkeit der katalytischen Umsetzung (RGT-Regel, s. o.). Die Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit wird schließlich durch die thermische Denaturierung des Enzyms bei steigender Temperatur limitiert. Bei den meisten Enzymen beginnt die Denaturierung in einem Bereich von 55–60 hC (S. 142).

Abb. 5.6 Abhängigkeiten der Enzymaktivität. a Aktivitätskurven von Pepsin und Trypsin in Abhängigkeit vom pH-Wert. Pepsin besitzt im aktiven Zentrum zwei Aspartatreste. Das pH-Optimum resultiert aus der Tatsache, dass für die Katalyse ein Rest protoniert, der andere deprotoniert vorliegen muss. Beim Trypsin basiert das pH-Optimum auf der Teilnahme eines Histidinrestes an der Reaktion. Dieser muss zu Beginn der Reaktion in ungeladenem Zustand vorliegen. Die pH-Optima sind den jeweiligen Wirkungsorten der Enzyme (Pepsin im Magen bei pH 2–3, Trypsin im Dünndarm bei pH 7–8) angepasst. b Aktivitätskurven zweier typischer Stoffwechselenzyme des Menschen und der TaqPolymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus in Abhängigkeit von der Temperatur. Die unterschiedlichen Temperaturoptima sind den gegebenen Umgebungsbedingungen angepasst.

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5 Enzymbiochemie

Aktives Zentrum: Stelle des Enzyms, an der die Reaktion stattfindet. Geschwindigkeitsgesetz: Beschreibt den Zusammenhang zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Konzentration der Reaktanden. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist der Konzentration der Reaktanden proportional. Enzyme: Biologische Katalysatoren, die eine chemische Reaktion beschleunigen, setzen die Aktivierungsenergie der Hin- als auch der Rückreaktion herab, sie haben aber keinen Einfluss auf die Gleichgewichtslage. Im Unterschied zu chemischen Katalysatoren laufen enzymkatalysierte Reaktionen unter vergleichsweise milden Bedingungen ab. Die Aktivität von Enzymen kann reguliert werden. Geschwindigkeitskonstante (k): Proportionalitätskonstante im Geschwindigkeitsgesetz, Maß für die Wahrscheinlichkeit der Reaktion. Aktivierungsenergie (EA): Energiebetrag, der zur Durchführung einer Reaktion von zwei Molekülen überwunden werden muss. Übergangszustand: Energiereicher Zwischenzustand einer chemischen Reaktion. Arrhenius-Gleichung: Beschreibt die Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten k. Kinetische Hemmung: Extrem zeitlich verzögerter Reaktionsverlauf einer exergonen Reaktion von metastabilen Verbindungen aufgrund zu hoher Aktivierungsenergie. Substratbindungsenergie: Energiebetrag, der bei der Bindung eines Substrates an ein Enzym freigesetzt wird. Schlüssel-Schloss-Modell: Modell zur Beschreibung der Bindung zwischen Enzym und Substrat. Enzyme und Substrat sind bereits vor der Bindung zueinander komplementär. Induced-Fit-Modell: Modell zur Beschreibung der Bindung zwischen Substrat und Enzym. Ausbildung komplementärer Formen auf Grund Konformationsänderungen von Enzym und Substrat erst durch die Bindung. Enzymaktivität: Maß für die Umsatzgeschwindigkeit enzymkatalysierter Reaktionen. Einheit: Katal (kat) = mol s–1, häufig auch in Units (U), 1 U = 1 · 10–6 kat. Spezifische Aktivität: Katalytische Aktivität bezogen auf die eingesetzte Gesamtproteinmenge.

5.3

Enzymkinetik

Die Enzymkinetik befasst sich mit den Umsatzgeschwindigkeiten enzymkatalysierter Reaktionen. Die Michaelis-Menten-Gleichung ist eine wichtige Gleichung und erlaubt die Berechnung des Substratumsatzes solcher Umsetzungen. Wichtige kinetische Parameter zur Beschreibung enzymkatalysierter Reaktionen sind die Michaelis-Konstante (KM), die Wechselzahl (kkat) und die maximale Umsatzgeschwindigkeit (vmax). Die doppelt reziproke Umformung der Michaelis-Menten-Gleichung nach Lineweaver-Burk ist eine häufig verwendete Umformung zur linearen graphischen Darstellung. Enzyme können durch Inhibitoren gehemmt werden. Aufgrund der Wechselwirkung des Inhibitors mit dem Enzym wird zwischen verschiedenen Hemmtypen un-

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5.3 Enzymkinetik

183

terschieden. Inhibitoren können reversibel oder irreversibel an ein Enzym binden. Die Analyse der Reaktionsgeschwindigkeit ist die älteste Methode zur Untersuchung enzymkatalysierter Reaktionen. Bis heute hat diese Methode nicht an Bedeutung verloren. Sie liefert wichtige Hinweise zum Verständnis der Mechanismen der Enzymkatalyse (allosterische Effekte, Kooperativität, Reihenfolge der Bindung bei mehreren Substraten). Durch die kinetischen Parameter können die katalytischen Eigenschaften eines Enzyms quantitativ beschrieben werden. Die Hemmung bestimmter Enzyme ist das grundlegende Prinzip der meisten Medikamente und Antibiotika.

5.3.1

Die Michaelis-Menten-Gleichung

Zur Beschreibung der enzymatischen Katalyse werden Annahmen gemacht, die auf den Arbeiten von Adrian Brown (1902), Michaelis und Menten (1913) und Briggs und Haldane (1925) beruhen: Der erste Schritt einer enzymkatalysierten Reaktion ist die Bindung des Substrats S an das Enzym E. Es bildet sich der Enzym-Substrat-Komplex ES; der auch als Michaelis-Komplex bezeichnet wird. Der Michaelis-Komplex kann entweder wieder zu E und S dissoziieren, oder es kommt zur Reaktion und damit zur Bildung des Produkts P. Die Reaktion kann somit formuliert werden als: k1

k2

E þ S Ð ES * E þ P k–1

(5.6)

k1, k–1 und k2 sind die jeweiligen Geschwindigkeitskonstanten. Nach der schnellen und reversiblen Substratbindung an das Enzym kommt es in einem langsamen und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt zur Produktbildung. Dieses Reaktionsschema ist allerdings eine sehr grobe Vereinfachung. Enzymkatalysierte Reaktionen setzen sich aus mehreren Zwischenschritten zusammen. Der Michaelis-Menten-Kinetik liegt das Reaktionsschema aus Gleichung 5.6 zu Grunde. Weitere Annahmen sind: x Es stellt sich ein Gleichgewichtszustand bei der Bindung des Substrats an das Enzym ein: KS = k–1 /k1 = [E] [S] / [ES] (KS ist die Dissoziationskonstante) x Das Gleichgewicht der Reaktion liegt auf der Seite der Produkte (Substratüberschuss) x [ES] ändert sich während der Reaktion nicht, die Reaktion befindet sich im Fließgleichgewicht (steady state) x Die Geschwindigkeit der Reaktion ist proportional zu [ES] x Die Rückreaktion ist vernachlässigbar, d. h. k –1 II k2 x Die Reaktion ist exergon x Das Enzym zeigt keine kooperativen und allosterischen Effekte (S. 146)

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5

5 Enzymbiochemie

Abb. 5.7 zeigt den zeitlichen Verlauf der Konzentrationsänderungen der einzelnen Komponenten bei einer nach Gleichung 5.6 verlaufenden Reaktion. Da sich die Reaktionsgeschwindigkeit mit der Substratkonzentration ändert, wird in der Praxis nur die Anfangsgeschwindigkeit v0, bei der [S] als konstant angesehen werden kann, bestimmt. Somit werden auch Hemmeffekte, die von dem Produkt auf das Enzym ausgeübt werden können (Feedback-Hemmung, S. 202), ausgeschlossen. Die Anfangsgeschwindigkeiten, die bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen ermittelt werden, werden dann gegen die entsprechenden Substratkonzentrationen aufgetragen. Der Verlauf dieser Kurve wird durch die Michaelis-Menten-Gleichung (5.7) beschrieben (Abb. 5.8): v¼

vmax [S] (KM þ [S])

(5.7)

v ist die Reaktionsgeschwindigkeit bei der Substratkonzentration [S], vmax ist die maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung. KM ist die MichaelisKonstante. Bei hohen Substratkonzentrationen ([S] ii KM) wird KM im Nenner vernachlässigbar gegenüber [S]. Unter diesen Bedingungen ist v unabhängig von [S] (Reaktion nullter Ordnung, S. 174). Bei niedrigen Substratkonzentrationen, wenn KM ii [S] ist, ist [S] im Nenner vernachlässigbar gegenüber KM und es ergibt sich folgende Gleichung: v¼

vmax KM [S]

(5.8)

Abb. 5.7 Konzentrationsänderungen der an einer enzymkatalysierten Reaktion beteiligten Komponenten. Die Michaelis-Menten-Gleichung gilt nur für den Steady-StateBereich. In diesem Bereich bleiben die Konzentrationen von ES und E praktisch unverändert. [S]0 bezeichnet die Ausgangskonzentration des Substrats, Etot die gesamte Enzymkonzentration aus freiem und an das Substrat gebundenem Enzym.

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5.3 Enzymkinetik

185

Abb. 5.8 Nicht lineare Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung bei Auftragung der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit v0 gegen die Substratkonzentration [S]. Bei niedriger Substratkonzentration liegt eine Reaktion erster Ordnung vor, bei hoher Substratkonzentration wird die Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration unabhängig (Reaktion nullter Ordnung).

Es handelt sich hier um eine Reaktion erster Ordnung bezüglich des Substrats mit der Geschwindigkeitskonstanten vmax / KM. Die Geschwindigkeit der Substratumsetzung ist der Substratkonzentration linear proportional. vmax und KM sind unter gegebenen Bedingungen enzymspezifische Konstanten und von der Enzymkonzentration unabhängig. Ableitung der Michaelis-Menten-Gleichung: Der folgenden Ableitung liegt die Gleichung 5.6 zu Grunde. Für die Geschwindigkeit der Gesamtreaktion v folgt daraus: v = k2 [ES]

(I)

Da [ES] während der Reaktion konstant sein soll, müssen Bildung und Zerfall von [ES] mit gleicher Geschwindigkeit erfolgen. Bildung bzw. Zerfall von [ES] werden durch folgende Gleichungen beschrieben: Bildung von [ES]:

d[ES] = k1 [E] [S] dt

Zerfall von [ES]: –

d[ES] = k–1 [ES] + k2 [ES] = (k–1 + k2) [ES] dt

(II) (III)

Durch Gleichsetzen von II und III erhält man: k1 [E] [S] = (k–1 + k2) [ES] bzw.

[E] [S] (k–1 þ k2 ) ¼ [ES] k1

(IV)

Der Ausdruck mit den Geschwindigkeitskonstanten wird zur Michaelis-Konstanten KM zusammengefasst: KM =

(k–1 þ k2 ) k1

(V)

Für [ES] ergibt sich nun: [ES] =

[E] [S] KM

(VI)

Die freie Enzymkonzentration [E] ist in der Praxis sehr schwierig zu bestimmen. Die totale Enzymkonzentration [E]tot ist die Summe der freien Enzymkonzentration [E] und der des Enzym-Substrat-Komplexes [ES] und entspricht der in dem Versuch insgesamt eingesetzten Menge (diese kann leicht bestimmt werden): [E]tot = [E] + [ES] bzw. [E] = [E]tot – [ES]

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(VII)

5

5 Enzymbiochemie

186

Durch Einsetzen der Beziehung für [E] aus Gleichung VII in VI erhält man: ([E]tot
[ES]) [S] [E]tot [S]
[ES] [S] ¼ KM KM

[ES] =

(VIII)

Umstellung nach KM ergibt: KM =

[E]tot [S]
[ES] [S] [E]tot [S] [ES] [S] ¼
[ES] [ES] [ES]

(IX)

Für [ES] ergibt sich daraus:

5

[E]tot [S] (KM þ [S])

[ES] =

(X)

Durch Einsetzen von X in die Ausgangsbedingung I erhält man: v=

k2 [E]tot [S] KM þ [S]

(XI)

Wenn bei hoher Substratkonzentration ([S] ii KM) alle Enzyme gesättigt sind, hat der Ausdruck [S] / (KM + [S]) nahezu den Wert 1 und es gilt: v = vmax = k2 [E]tot

(XII)

Durch Kombination der Gleichungen XI und XII erhält man schließlich die MichaelisMenten-Gleichung: v=

vmax [S] KM þ [S]

5.3.2

(XIII)

Die Michaelis-Konstante

Bei einer Substratkonzentration von [S] = KM (Einheit: mol l–1) ist die halbmaximale Umsatzgeschwindigkeit erreicht (v = 1⁄2 vmax). Bei einem niedrigen KM-Wert erreicht ein Enzym schon bei geringen Substratkonzentrationen die maximale Umsatzgeschwindigkeit. Der Wert von KM ist von der Temperatur, der Ionenstärke und dem pH-Wert abhängig. Enzymatische Untersuchungen erfordern daher genau definierte Versuchsbedingungen. Zwischen KM und den Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten herrscht die Beziehung: KM ¼

k–1 þ k2 k1

(5.9)

Wenn nun k–1 ii k2, d. h. die Dissoziation des Michaelis-Komplex in E und S die Produktbildung bei weitem überwiegt, kann k2 gegenüber k–1 vernachlässigt werden und man erhält: KM ¼

k–1 k1

(5.10)

KM ist nun formal in die Dissoziationskonstante KS für den Michaelis-Komplex übergegangen. Für die Dissoziation von ES gemäß [ES] Ð [E] þ [S]

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(5.11)

5.3 Enzymkinetik

187

ergibt sich für die Dissoziationskonstante: KS ¼

[E] [S] k–1 ¼ [ES] k1

(5.12)

(Es sei nochmals darauf hingewiesen, dass KM nur unter der Bedingung k–1 ii k2 als Dissoziationskonstante angesehen werden kann). KM stellt unter diesen Bedingungen ein Maß für die Stabilität des ES-Komplexes dar. Ein niedriger Wert für KM bedeutet daher eine hohe Substrataffinität. Eine bemerkenswerte Tatsache ist, dass die meisten Enzyme des Grundstoffwechsels KM-Werte in einem Bereich, der in etwa der Metabolitenkonzentration in vivo entspricht, aufweisen. Bei einem erhöhten Substratangebot wird auch die Umsatzgeschwindigkeit gesteigert, sodass sich bald der ursprüngliche Zustand wieder einstellt. Dieser Sachverhalt erlaubt bereits eine gewisse Regulation des Substratumsatzes.

5.3.3

Das Verhältnis Michaelis-Konstante/Wechselzahl

Die Wechselzahl kkat (turnover number, Einheit: s–1) gibt die Anzahl der von einem Enzym umgesetzten Substratmoleküle pro Zeiteinheit an. Bei hoher Substratkonzentration [S] ii KM, d. h. wenn das Enzym gesättigt ist, entspricht die Wechselzahl kkat bei Gültigkeit der Michaelis-Menten-Kinetik der Geschwindigkeitskonstanten k2 (vgl. Ableitung der Michaelis-Menten-Gleichung, XII): vmax ¼ kkat [E]tot

(5.13)

Da die meisten Enzyme unter physiologischen Bedingungen bei weitem nicht gesättigt sind, wird die durch die Geschwindigkeitskonstante kkat bzw. k2 beschriebene Umsatzgeschwindigkeit (5.13) nicht erreicht. Bei niedriger Substratkonzentration, wenn KM ii [S] ist, entspricht die Menge an freiem Enzym [E] annähernd der totalen Enzymmenge [E]tot. Durch Einsetzen von [ES] = [E] [S] / KM in v = k2 [ES] (VI bzw. I, S. 185) und unter der Annahme [E] = [E]tot erhält man: v¼

k2 [E]tot [S] KM

(5.14)

Dies ist eine Reaktion zweiter Ordnung mit der Geschwindigkeitskonstanten k2 / KM. Das Verhältnis k2 / KM ist somit ein Maß für die Produktivität bei einem Zusammentreffen von Enzym und Substrat. Wodurch wird nun die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen limitiert? KM stellt eine Beziehung zwischen den Geschwindigkeitskonstanten k1, k–1 und k2 dar. Durch Einsetzen der Gleichung 5.9 in 5.14 ergibt sich: v¼

k2 k1 [E]tot [S] k–1 þ k2

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(5.15)

5

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5 Enzymbiochemie

Wenn die Umsetzung des Substrats in das Produkt schneller verläuft, als die Dissoziation des Michaelis-Komplexes, d. h. k2 ii k–1 ist, geht Gleichung 5.15 über in v ¼ k1 [E]tot [S]

5

(5.16)

Die Gesamtgeschwindigkeit der Reaktion vges wird nun nur durch das Zusammentreffen von Enzym und Substrat limitiert. k1 ist die Geschwindigkeitskonstante für die Bildung des Michaelis-Komplexes ES. Das Verhältnis k2 / KM kann also nicht größer sein als k1 (vgl. 5.14 und 5.16). Die Geschwindigkeitskonstante k1 wird wiederum nur durch das diffusionskontrollierte Zusammentreffen von Enzym und Substrat begrenzt. Solche Reaktionen werden daher als diffusionskontrollierte Reaktionen bezeichnet. Die Geschwindigkeitskonstanten für diffusionskontrollierte Prozesse liegen im Bereich von 108 bis 109 mol l–1 s–1. Enzyme, die in diesem Bereich („am Limit“) arbeiten, nennt man kinetisch perfekt. Hier führt (fast) jedes Zusammentreffen von Enzym und Substrat zu einer Umsetzung. Beispiele kinetisch perfekter Enzyme sind Katalase, Fumarase, b-Lactamase, Acetylcholinesterase und Carboanhydrase (Tab. 5.3). Eine Erhöhung der Gesamtgeschwindigkeit mehrstufiger Reaktionen kann nur erreicht werden, wenn die Diffusionszeit zwischen den entsprechenden Enzymen minimiert wird. Hierzu haben sich Multienzymkomplexe entwickelt, bei denen das Substrat von einem aktiven Zentrum zum nächsten „weitergereicht“ wird. Das Substrat wird nicht nach jedem Reaktionsschritt in das umliegende Milieu entlassen; damit entfällt die „Suche“ nach dem nächsten Enzym. Beispiele für solche Multienzymkomplexe sind die Fettsäuresynthase eukaryotischer

Tab. 5.3 KM und kkat-Werte einiger Enzyme. Enzym

Substrat

kkat [s–1]

KM [mol l–1]

Acetylcholinesterase

Acetylcholin

1,4 · 104

9,5 ·10–5

6

1,2 ·10–2

5

2,6 · 10–2

7

Carboanhydrase

CO2 HCO3–

1,0 · 10 4,0 · 10

Katalase

H2O2

1,0 · 10

2,5 · 10–2

Urease

Harnstoff

1,0 · 104

2,5 · 10–2

3

4,7 · 10–4

2

5,0 · 10–6

2

2,5 · 10–5

3

2,0 · 10–5

Triosephosphat-Isomerase Fumarase

Glycerinaldeyd-3-phosphat Fumarat Malat

b-Lactamase

Benzylpenicillin

4,3 · 10 8,0 · 10 9,0 · 10

2,0 · 10

Lysozym

Hexa-N-acetylglucosamin

0,5

6,0 · 10–6

F0F1-ATPase (E. coli)

ATP

3,0 · 102

6,0 · 10–4

Cytochrom c-Oxidase

Cytochrom c

1,1 · 102

1,0 · 10–5

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5.3 Enzymkinetik

189

Zellen (bei prokaryotischen Zellen werden die einzelnen Reaktionen von unabhängigen Enzymen katalysiert, S. 322) und der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (S. 292).

5.3.4

Linearisierung der Michaelis-Menten-Gleichung

Bei der direkten Auftragung der Reaktionsgeschwindigkeit gegen die Substratkonzentration, erhält man gemäß der Michaelis-Menten-Gleichung eine Kurve mit hyperbolischem Kurvenverlauf. Aus diesem Kurvenverlauf lassen sich die kinetischen Parameter vmax und KM nur ungenau ablesen (bei einem hyperbolischen Kurvenverlauf wird häufig ein zu niedriger Wert für die Asymptote angenommen). Daher wurden verschiedene Linearisierungsverfahren für die Michaelis-Menten-Gleichung eingeführt. Bei einer linearen Auftragung können die kinetischen Parameter als Geradensteigung oder Achsenschnittpunkte abgelesen werden. Ein weiterer Vorteil linearer Diagramme liegt darin, dass unterschiedliche Bindungsstellen für verschiedene Substrate, aber auch Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität für ein und dasselbe Substrat identifiziert werden können. Die Art der Abweichung vom idealen linearen Verlauf gibt einen Hinweis auf den Reaktionsablauf (Kooperativität oder Mehrsubstratreaktionen). Bei einem hyperbolischen Kurvenverlauf sind diese Abweichungen häufig nicht sofort ersichtlich, aber auch bei einer linearisierten Auftragung kann aus dem Diagramm nur die Information entnommen werden, die auch in den Messdaten enthalten ist. Das am häufigsten angewendete Linearisierungsverfahren ist die doppeltreziproke Auftragung nach Lineweaver-Burk. Die reziproke Form der Michaelis-Menten-Gleichung (5.7) lautet: 1 [S] þ KM 1 KM 1 ¼ ¼  þ v vmax [S] vmax vmax [S]

(5.17)

Dies entspricht einer Geradengleichung der allgemeinen Form y = mx + b, in der m die Steigung und b den Schnittpunkt mit der Ordinate angibt. Durch Auftragung von 1 / v gegen 1 / [S] erhält man eine Gerade mit der Steigung KM / vmax, dem Ordinaten-Schnittpunkt 1 / vmax und dem Abszissen-Schnittpunkt –1 / KM (Abb. 5.9a). Ein Nachteil bei der Auftragung nach Lineweaver-Burk besteht darin, dass schon kleine Fehler bei niedrigen Substratkonzentrationen (je kleiner die Substratkonzentration, umso schwieriger ist eine genaue Konzentrationsbestimmung) den Kurvenverlauf erheblich beeinflussen können. Dies kann durch andere Linearisierungsverfahren, etwa nach Eadie-Hofstee oder nach Hanes, umgangen werden. Die Bestimmung von vmax und KM ist am Beispiel der Lactat-Dehydrogenase in Abb. 5.9b dargestellt.

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5 Enzymbiochemie

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Abb. 5.9 Lineare Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung nach Lineweaver-Burk (1 / v0 gegen 1 / [S]). a Allgemeine Darstellung. b Lineweaver-Burk-Diagramm zur Bestimmung von KM und vmax am Beispiel der Lactat-Dehydrogenase. Die Lactat-Dehydrogenase katalysiert folgende Reaktion: Pyruvat + NADH + H+ p Lactat + NAD+. Die Anfangsgeschwindigkeiten v0 bei unterschiedlichen Pyruvatkonzentrationen [S] können z. B. durch Verbrauch von NADH bei 340 nm spektroskopisch verfolgt werden (optischer Test, S. 225). Die Extinktionsabnahme bei 340 nm (DE / min) ist ein direktes Maß für die Reaktionsgeschwindigkeit. Zur Bestimmung des KM-Wertes für Pyruvat muss NADH im Überschuss vorliegen. Die experimentell erhaltenen Daten werden in einem Lineweaver-Burk-Diagramm (1 / v gegen 1 / [S]) aufgetragen. Aus dem Diagramm können nun durch Extrapolation des Kurvenverlaufs die Schnittpunkte mit den Achsen des Koordinatensystems entnommen werden. Für den Schnittpunkt mit der Abszisse ergibt sich ein Wert von –6,6 · 103 l mol–1, daraus folgt KM = 1,5 · 104 mol l–1. Aus dem Ordinaten-Schnittpunkt erhält man für 1 / vmax = 1,45 · 102 s mol–1 und damit für vmax = 6,90 · 10–3 mol s–1.

5.3.5

Hemmung der enzymatischen Aktivität

Die Aktivität der Enzyme kann durch verschiedene Substanzen, die man als Inhibitoren bezeichnet, gehemmt werden. Die Hemmung ist nicht zu verwechseln mit einer Verminderung der Reaktionsgeschwindigkeit durch Denaturierung des Enzyms, z. B. durch extreme pH-Werte oder Ionenstärken. Der Effekt auf das Enzym ist in diesen Fällen unspezifisch. In-vitro-Experimente mit Inhibitoren haben viel zum Verständnis des Mechanismus der enzymatischen Katalyse beigetragen. Die hierbei verwendeten Inhibitoren spielen aber für die lebende Zelle, wenn überhaupt, nur eine untergeordnete Rolle. Die von lebenden Zellen verwendeten, stets reversiblen Regulationsmechanismen werden in Kap. 5.4 ausführlich beschrieben. Inhibitorisch wirksame Substanzen binden stets an einer definierten, aber je nach Hemmtyp unterschiedlichen Stelle. Grundsätzlich wird zwischen irreversibler und reversibler Hemmung unterschieden.

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5.3 Enzymkinetik

5.3.6

191

Irreversible Hemmung

Die Hemmstoffe, häufig Quecksilber- oder organische Phosphorverbindungen, bilden kovalente Bindungen mit reaktiven Gruppen (z. B. Carboxyl-, Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppen) im aktiven Zentrum des Enzyms aus. Das Enzym ist irreversibel zerstört und steht für eine Katalyse nicht mehr zur Verfügung. Substratanaloga, die im aktiven Zentrum gebunden werden und dort im Verlauf der katalytischen Umsetzung irreversibel mit dem Enzym reagieren, werden als Suizid-Inhibitoren bezeichnet. Bei niedriger Hemmstoffkonzentration kann die Zelle bzw. der Organismus durch vermehrte Synthese des Enzyms den Verlust wieder ausgleichen, werden aber zu viele Enzyme außer Gefecht gesetzt, so bedeutet dies den Zelltod. Beispiele für Suizid-Inhibitoren sind die Serinprotease-Inhibitoren Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF, Abb. 5.10a) und Diisopropylfluorophosphat (DFP, ein Phosphorsäureester, Abb. 5.10b). Ein weiteres Beispiel ist das Penicillin, das irreversibel die Transpeptidase hemmt (Abb. 5.11, Mikrobiologie).

5.3.7

Reversible Hemmtypen

Im Gegensatz zu den irreversiblen Hemmstoffen binden reversible Hemmstoffe nicht kovalent an das Enzym. Der Inhibitor kann mit physikalischen Methoden, z. B. durch Dialyse, wieder vom Enzym entfernt werden. Abhängig vom Ort der Bindungsstelle am Enzym wird zwischen kompetitiver, nicht kompetitiver

Abb. 5.10 Proteaseinhibitoren. a PMSF und b DFP. DFP bindet irreversibel an OH-Gruppen im aktiven Zentrum des an der Katalyse beteiligten Serinrests. Der Inhibitor hat eine sehr hohe Affinität für das aktive Zentrum, da er dem Übergangszustand der Reaktion ähnelt (das Phosphoratom besitzt ebenfalls eine tetraedrische Konfiguration). Eine Reaktion mit den leicht zugänglichen Hydoxylgruppen an der Außenseite des Enzyms findet nicht statt. Durch die Bindung von DFP an Ser195 im aktiven Zentrum von Chymotrypsin wurde die bedeutende Funktion des Serins bei der Katalyse erkannt. Der Reaktionsmechanismus von PMSF ist analog dem von DFP. PMSF und DFP reagieren auch mit dem Serinrest der Acetylcholinesterase und zeigen daher neurotoxische Wirkung. Proteaseinhibitoren werden in der Laborpraxis häufig bei Arbeiten mit Zellextrakten zugesetzt, um den unerwünschten Abbau von Proteinen, z. B. während einer Proteinreinigung, zu verhindern.

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5 Enzymbiochemie

5

Abb. 5.11 Penicillin. a Im reaktiven Bereich ähnelt Penicillin dem Übergangszustand von R-D-Ala-D-Ala bei der Transpeptidierung. Auf Grund dieser Strukturhomologie bindet Penicillin mit hoher Affinität im aktiven Zentrum des Enzyms. b Die Peptidbindung des b-Lactamrings ist sehr reaktiv, da diese in einen viergliedrigen Ring „gezwängt“ wird (vergleichbar mit einer gespannten Feder). Die Transpeptidase wird durch die Addition des Penicilloylrestes an einen Serinrest im aktiven Zentrum irreversibel gehemmt.

und unkompetitiver Hemmung unterschieden. Manche Enzyme zeigen das Phänomen einer Substrat- oder Produkthemmung. Bei der kompetitiven Hemmung konkurriert der Inhibitor (Kompetitor) mit dem Substrat um die Bindungsstelle am aktiven Zentrum des Enzyms, wird aber dort nicht umgesetzt. Kompetitive Hemmstoffe weisen eine strukturelle Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat auf und werden daher als Substratanaloga oder Strukturanaloga, gelegentlich auch als Antimetabolite, bezeichnet. Abb. 5.12a zeigt einen Vergleich der Strukturen des Substrats und kompetitiver Inhibitoren am Beispiel der Succinat-Dehydrogenase. Durch Erhöhung der Substratkonzentration kann der Inhibitor wieder vom Enzym verdrängt werden. Beim Vorliegen einer kompetitiven Hemmung gelten folgende Gleichungen: E þ S Ð ES * E þ P

(5.18)

E þ I Ð EI

(5.19)

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5.3 Enzymkinetik

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5

Abb. 5.12 Kompetitive Hemmung. a Strukturelle Ähnlichkeit zwischen dem Substrat der Succinat-Dehydrogenase, Succinat, und den kompetitiven Inhibitoren Malonat und Oxalacetat. b Der Inhibitor bindet nur im aktiven Zentrum des Enzyms. vmax bleibt unverändert, während KM erhöht wird.

Für die Bindung des Inhibitors I an das Enzym kann die Dissoziationskonstante (Inhibitionskonstante oder Hemmkonstante) KI, die wie KM die Dimension einer Konzentration besitzt, definiert werden: KI ¼

[E] [I] [EI]

(5.20)

KI entspricht der Inhibitorkonzentration, die den KM-Wert der ungehemmten Reaktion scheinbar verdoppelt. Wie aus Abb. 5.12 ersichtlich ist, ändert sich vmax bei einer kompetitiven Hemmung nicht, wird aber erst bei höheren Substratkonzentrationen erreicht. Anders formuliert: Ein kompetitiver Inhibitor hat keinen Einfluss auf die Umsatzgeschwindigkeit des Michaelis-Komplexes ES in das Produkt, sondern er verringert den Anteil von ES durch die konkurrierende Bildung des Enzym-Inhibitor-Komplexes EI. In Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors wird ein höherer KM-Wert gemessen, da die Affinität für das eigentliche Substrat vermindert zu sein scheint (man spricht daher auch vom apparenten KlM-Wert). Bindet ein Inhibitor mit sehr hoher Affinität (KI i 1010) an das aktive Zentrum (dies sind häufig Analoga des Übergangszustandes) kann eine kompetitive Hemmung durch eine kinetische Analyse nicht von einer kovalenten, irreversiblen Hemmung (s. o.) unterschieden werden. Man spricht daher auch von einer quasiirreversiblen Hemmung. Einige Substratanaloga haben als Therapeutika Eingang in die medizinische Praxis gefunden (Abb. 5.13).

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5 Enzymbiochemie

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Abb. 5.13 Substratanaloga als Therapeutika. a Reaktion der Dihydrofolat-Reductase (DHFR). b Strukturen kompetitiver Inhibitoren. Tetrahydrofolat wird als Reduktionsmittel für die Thymidinsynthese benötigt. Thymidin, als Baustein der DNA, wird besonders von schnell wachsenden Zellen mit einer hohen Teilungsrate, z. B. Krebszellen, benötigt. Bei der Behandlung einiger Krebsarten werden die Folsäure-Antagonisten Aminopterin oder Methotrexat (Amethopterin) eingesetzt. Diese binden mit einer ca. 1000fach höheren Affinität an die DHFR und hemmen diese (KI I 1 · 10–9 mol l–1) und damit eine weitere Thymidinsynthese sehr effektiv. Die Krebszellen werden an der Replikation ihres genetischen Materials gehindert und sterben ab. Trimethoprim bindet stärker an bakterielle DHFR und wird daher als bakteriostatisch wirkendes Antibiotikum eingesetzt.

Bei der unkompetitiven Hemmung bindet der Inhibitor nur an den MichaelisKomplex ES, nicht aber an das freie Enzym. Die Bindungsstelle für den Inhibitor muss hierbei keineswegs im Bereich des aktiven Zentrums liegen. Es kommt zur Reduktion der Anzahl „produktiver“ Michaelis-Komplexe und damit verkleinert sich vmax. Der KM-Wert, der ein Maß für die Affinität des Enzyms für sein Substrat ist, wird ebenfalls verringert (Abb. 5.14a), da das Substrat durch die zusätzliche Bindung des Inhibitors an den ES-Komplex gebunden bleibt und daraus eine scheinbar höhere Affinität resultiert. Das Enzym wird während der Katalyse als Michaelis-Komplex „arretiert“. Der Einfluss des Inhibitors auf vmax und KM kann durch ein erhöhtes Substratangebot nicht aufgehoben werden. Das Verhältnis KM / vmax bleibt unverändert. Es gilt somit: E þ S Ð ES p E þ P

(5.21)

ES þ I Ð ESI

(5.22)

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5.3 Enzymkinetik

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5

Abb. 5.14 Unkompetitive und nicht kompetitive Hemmung. a Bei der unkompetitiven Hemmung bindet der Inhibitor nur an den Enzym-Substrat-Komplex. Sowohl KM als auch vmax werden vermindert. b Bei der nicht kompetitiven Hemmung kann der Inhibitor sowohl an das freie Enzym als auch an den Enzym-Substrat-Komplex binden. KM bleibt unverändert, während vmax reduziert wird.

Die Inhibitor-Konstante ergibt sich zu KI ¼

[ES] [I] [ESI]

(5.23)

Bei einer nicht kompetitiven Hemmung bindet der Inhibitor an einer anderen Stelle des Enzyms als das Substrat, d. h. die Substratbindung wird nicht blockiert. Die Bindung des Inhibitors führt zu einer Inaktivierung des Enzyms bzw. des ESKomplexes. Die Anzahl der aktiven Enzymmoleküle wird reduziert, folglich verringert sich auch vmax. KM bleibt bei einer nicht kompetitiven Hemmung unverändert, da die Bindung des Substrats an das Enzym nicht beeinträchtigt wird (Abb. 5.14b). Da der Inhibitor die Umsetzung des gebundenen Substrats verhindert, kann der Inhibitor-Effekt auf vmax durch hohe Substratkonzentrationen nicht überspielt werden. Für die nicht kompetitive Hemmung lassen sich folgende Gleichungen formulieren: E þ I Ð EI

(5.24)

ES þ I Ð ESI

(5.25)

entsprechend gibt es auch zwei Inhibitorkonstanten: KEI I ¼

[E] [I] [EI]

KESI ¼ I

[ES] [I] [ESI]

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(5.26) (5.27)

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5 Enzymbiochemie

Setzt ein Enzym im Verlauf der Reaktion zwei Substrate um und wird eine Substratbindungsstelle kompetitiv inhibiert, so wirkt dieser kompetitive Inhibitor als nicht kompetitiver Inhibitor auf den Reaktionsumsatz des zweiten Substrats. Beispiel: Die Alkohol-Dehydrogenase katalysiert die Umsetzung von Ethanol (1. Substrat) mit NAD+ (2. Substrat) zu den Produkten Acetaldehyd und NADH. Eine hohe Acetaldehydkonzentration hemmt die Bildung von Acetaldehyd aus Ethanol kompetitiv (Produkthemmung, s. u.). Gleichzeitig wirkt Acetaldehyd als nicht kompetitiver Inhibitor bezüglich der Umsetzung von NAD+ zu NADH.

5.3.8

Substrat- und Produkthemmung

Kommt es bei hohen Substratkonzentrationen zu einer Hemmung der Enzymaktivität statt zur Annäherung der Reaktionsgeschwindigkeit an vmax, spricht man von einer Substrathemmung. Das Vorliegen einer Substrathemmung deutet auf eine zusätzliche, vom aktiven Zentrum unabhängige, Bindungsstelle hin. Das regulatorisch wirkende, in diesem Fall hemmende, zweite Substratmolekül kann formal als unkompetitiver Inhibitor aufgefasst werden. Enzyme katalysieren die Gleichgewichtseinstellung einer Reaktion, d. h. sowohl die Hin- als auch die Rückreaktion. Bei der Ableitung der Michaelis-Menten-Gleichung wurde die Rückreaktion jedoch vernachlässigt (Gl. 5.6) und Substratüberschuss angenommen. Im Verlauf einer Reaktion steigt auch die Produktkonzentration. Bei einer hohen Produktkonzentration kann das aktive Zentrum schließlich nicht mehr schnell genug für das Substrat „frei gemacht“ werden. Man spricht auch von einer kompetitiven Produkthemmung, da das Produkt mit dem Substrat um die gleiche Stelle am Enzym konkurriert: um das aktive Zentrum. Die Abweichung bei Produkthemmung von der ungehemmten Reaktion ist in der Darstellung im Lineweaver-Burk-Diagramm mit der einer kompetitiven Hemmung identisch. An Stelle [I] und KI werden hier [P] und KP eingesetzt.

5.3.9

Mehrsubstratreaktionen

Enzymatische Reaktionen sind meist nicht auf ein einziges Substrat beschränkt. Bei vielen Reaktionen, meist Gruppenübertragungen, werden mehrere Substrate in unterschiedlicher Reihenfolge an das Enzym gebunden. Aufgrund der Anzahl der während der Katalyse gebundenen Substrate spricht man von Uno- (Ein-), Bi- (Zwei-) oder Tri- (Drei-) Substratreaktionen. Weiterhin unterscheidet man in der Reihenfolge der Substratbindung bzw. der Ablösung der Produkte. Substrate können in einer willkürlichen (random) oder in einer festgelegten (ordered) Reihenfolge an das Enzym binden. Für den Fall einer Bi-Substratreaktion, in deren Verlauf beide Substrate gleichzeitig an das Enzym gebunden werden, bezeichnet man den hierbei entstehenden Komplex (ES1S2) als ternären Komplex. Reaktionen, in deren Verlauf ein Produkt bereits abgelöst wird, bevor alle

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5.3 Enzymkinetik

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Abb. 5.15 Ping-Pong-Mechanismus. Nach diesem Mechanismus arbeiten häufig gruppenübertragende Enzyme, z. B. die Aspartat-Aminotransferase. Im ersten Reaktionsschritt („Ping“) wird das Enzym mit einer Gruppe, in diesem Fall mit einer Aminogruppe, beladen und das erste Produkt, hier Oxalacetat, freigesetzt. Erst nach der Freisetzung des ersten Produkts erfolgt im zweiten Schritt („Pong“) die Anlagerung des zweiten Substrats (hier a-Ketoglutarat) und dessen Umsetzung. (PLP: Pyridoxalphosphat)

Substrate gebunden sind, laufen nach dem sogenannten Ping-Pong-Mechanismus ab (Abb. 5.15). Mehrsubstratreaktionen können mit der Michaelis-MentenGleichung untersucht werden; hierbei wird das interessierende Substrat in limitierender Menge zugesetzt. Für jedes Substrat kann ein eigener KM-Wert bestimmt werden.

Michaelis-Komplex: Komplex aus einem Enzym und seinem Substrat (EnzymSubstrat-Komplex, ES). Michaelis-Menten-Gleichung: Mathematische Gleichung zur Beschreibung der Kinetik enzymatischer Umsetzungen. Maximale Umsatzgeschwindigkeit vmax: Reaktionsgeschwindigkeit bei Enzymsättigung. Michaelis-Konstante KM: Enzym-spezifische Konstante mit der Einheit mol l–1, beinhaltet mehrere Geschwindigkeitskonstanten, entspricht der Substratkonzentration bei halbmaximaler Umsatzgeschwindigkeit. Wechselzahl kkat (turnover number): Anzahl der von einem Enzym pro Zeiteinheit umgesetzten Moleküle (Einheit: s–1). Diffusionskontrollierte Reaktion: Reaktion, deren Geschwindigkeit nur durch das Zusammentreffen von Enzym und Substrat limitiert wird. Lineweaver-Burk-Auftragung: Doppelt reziproke grafische Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung. Auftragung von 1 / v gegen 1 / [S] ergibt eine Gerade mit der Steigung KM / vmax, einem Ordinatenschnittpunkt 1 / vmax und einem Abszissenschnittpunkt –1 / KM.

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5 Enzymbiochemie

Inhibitor: Substanz, die reversibel oder irreversibel an definierte Bereiche eines Enzyms bindet und so deren Aktivität hemmt. Suizid-Inhibitor: Substratanalogon, das an das aktive Zentrum eines Enzyms bindet und mit diesem irreversibel reagiert (z. B. Penicillin). Substratanaloga (Strukturanaloga, Antimetabolite): Hemmstoffe, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat aufweisen. Kompetitive Hemmung: Substrat und Inhibitor konkurrieren um die Bindung im aktiven Zentrum. Quasi-irreversible Hemmung: Kompetitive Hemmung einer Reaktion durch einen Inhibitor mit sehr hoher Affinität für das Enzym. Kinetisch von einer irreversiblen kovalenten Hemmung nicht zu unterscheiden. Unkompetitive Hemmung: Inhibitor bindet an den Michaelis-Komplex (ES), nicht aber an freies Enzym. Nicht kompetitive Hemmung: Inhibitor bindet an einer vom aktiven Zentrum verschiedenen Stelle an das Enzym. Substrathemmung: Hemmung der Enzymaktivität durch hohe Substratkonzentrationen. Produkthemmung: Kompetitive Hemmung eines Enzyms durch das Produkt. Ternärer Komplex: Gleichzeitige Bindung zweier Substrate an ein Enzym im Verlauf einer Mehrsubstratreaktion. Ping-Pong-Mechanismus: Freisetzung eines Produktes bei einer Mehrsubstratreaktion bevor alle Substrate gebunden sind.

5.4

Regulation der enzymatischen Aktivität

Eine der grundlegenden Voraussetzungen für die Funktion der Enzyme ist deren Regulierbarkeit. Die richtige Menge am richtigen Ort mit der richtigen Aktivität. Entsprechend wird die Synthese der Enzyme reguliert, aber auch die Aktivierung aus den inaktiven Zymogenen und schließlich das fertige Enzym selbst. Bei vielen Stoffwechselwegen werden nur bestimmte, an wichtigen Punkten wirkende Enzyme stringent reguliert: Dies sind die sogenannten Schlüsselenzyme. Es gibt zwei prinzipiell unterschiedliche Regulationsmechanismen: Regulation durch kovalente Modifikation oder durch Bindung eines Molekül an das Enzym. Letztgenannte Mechanismen werden als allosterische Effekte zusammengefasst. Eine Besonderheit mancher Enzyme ist die Kooperativität, eine aufgrund der Bindung eines Substratmoleküls veränderte Bindungsaffinität für weitere Substratmoleküle. Um auch unter wechselnden Umweltbedingungen, die meistens auch eine Änderung des inneren Milieus bewirken, optimal funktionieren zu können, muss ein Organismus bzw. eine Zelle in der Lage sein, auf Veränderungen der Umgebung, z. B. das Nährstoffangebot, zu reagieren. Jeder Reaktion eines Organismus liegen enzymatische Umsetzungen zu Grunde. Ohne regulierbare Enzyme hätte die

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5.4 Regulation der enzymatischen Aktivität

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Zelle keine Kontrolle über ihren physiologischen Zustand, unregulierte Enzyme würden lediglich den Gleichgewichtszustand einstellen. Ein System im thermodynamischen Gleichgewicht ist aber nicht zu Arbeitsleistungen fähig.

5.4.1

Keine Wirkung ohne Enzym

Enzyme werden in einem Organismus in der Regel nur in den Organen oder Zellen exprimiert, in denen sie auch benötigt werden. Innerhalb der Zellen werden die Enzyme an den Ort ihrer Wirkungsstätte transportiert. In eukaryotischen Zellen werden z. B. die abbauenden Enzyme saure Phosphatase, a-Glucosidase und b-Glucuronidase in die Lysosomen transportiert, auf die DNA einwirkende Enzyme befinden sich im Zellkern. Bei gramnegativen Bakterien werden bestimmte Proteine, z. B. die Transpeptidase, in den periplasmatischen Raum ( Mikrobiologie) transportiert. Enzyme, die für einen Ort charakteristisch sind und nur dort vorkommen, werden als Leitenzyme bezeichnet. Beispiele für Leitenzyme sind die Katalase der Peroxisomen, die Succinat-Dehydrogenase, die Cytochrom-c-Oxidase und die Fumarase der Mitochondrien sowie die Isocitrat-Lyase und die Malat-Synthase der Glyoxysomen. Anhand der gebildeten Menge des Enzyms erfolgt bereits eine gewisse Regulation. Bei einigen Genen wird die Transkriptionsrate auf einen Stimulus hin erhöht (Induktion, Genetik). Gut untersucht sind die Verhältnisse bei den nuklearen HormonRezeptoren ( Zoologie). Beispielsweise führen Glucocorticoide zu einer Erhöhung der Enzyme für die Gluconeogenese sowie des Aminosäurestoffwechsels in der Leber. Im Gegensatz zu den induzierbaren Enzymen, die nur bei Bedarf synthetisiert werden, erfolgt die Produktion anderer Enzyme kontinuierlich. Die Syntheserate ist unabhängig von den Umweltbedingungen und bedarf keines besonderen Induktors. Solche Enzyme bezeichnet man als konstitutive Enzyme, die entsprechenden Gene als Housekeeping Genes. Zu den konstitutiven Enzymen gehören die Enzyme des Grundstoffwechsels z. B. die der Glykolyse, des Citratzyklus oder der b-Oxidation der Fettsäuren. Auch die Repression der Genaktivität ( Genetik), die eine Verringerung der Enzymmenge zur Folge hat, ist möglich. Bei anabolen Stoffwechselwegen, z. B. der Synthese von Bausteinen wie den Aminosäuren, kommt es in Anwesenheit größerer Mengen der jeweiligen Aminosäure zu einer Repression der Enzyme des entsprechenden Stoffwechselweges. Diese Art der Regulation bezeichnet man als Endprodukt-Repression. Das wohl am besten verstandene System zur Regulation der Enzymsynthese ist das lac-Operon von E. coli (als Operon werden hintereinander liegende Gene bezeichnet, die gemeinsam reguliert und transkribiert werden, diese Organisationsform von Genen in Operons kommt nur bei Prokaryoten vor). Jedes Gen bzw. Operon besitzt jedoch einzigartige Regulationsmechanismen ( Mikrobiologie, Genetik). So werden z. B. die Gene zur Synthese von Tryptophan (trp-Operon) oder Histidin (his-Operon) durch völlig unterschiedliche Mechanismen gesteuert.

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5 Enzymbiochemie

5.4.2

Zymogenaktivierung

Eine Möglichkeit der Regulation besteht in der Bildung inaktiver Vorstufen (Zymogene), welche erst an den entsprechenden Wirkungsorten aktiviert werden. Ein gut bekanntes Beispiel ist das Verdauungsenzym Chymotrypsin Zoologie). Chymotrypsin ist eine Serinprotease (S. 207) und wird als Chymo( trypsinogen vom Pankreas synthetisiert und in das Duodenum (Zwölffingerdarm) sezerniert. Chymotrypsinogen wird durch eine trypsinkatalysierte Spaltung einer Peptidbindung zwischen den Aminosäuren Arginin (Arg15) und Isoleucin (Ile16) aktiviert. Es entsteht das p-Chymotrypsin, welches bereits aktiv ist. Durch Autolyse werden zwei Dipeptide (Ser14-Arg15 und Thr147-Asn148) abgespalten. Das entstandene Produkt, d-Chymotrypsin, wandelt sich in das stabilere und voll aktive a-Chymotrypsin um. Die Synthese des Enzyms in Form einer inaktiven Vorstufe verhindert, dass eine katalytische Aktivität innerhalb der Zellen des Pankreas bzw. des Pankreasgangs stattfindet, die schließlich zur Selbstverdauung führen würde. Weitere Beispiele für die bedarfsorientierte Aktivierung von Enzymen aus Zymogenen finden sich bei den Komponenten der Blutgerinnungskaskade ( Zoologie) oder dem Komplement-System Zoologie). (

5.4.3

Schlüsselenzyme

Gegenläufige Stoffwechselwege werden so gesteuert, dass die Gesamtreaktion jeweils nur in einer Richtung abläuft. Als Schlüsselenzyme bezeichnet man die Enzyme, die an Verzweigungspunkten des Stoffwechsels stehen. Häufig sind diese Reaktionen auch mit einer hohen Änderung der freien Enthalpie verbunden, sodass sie unter physiologischen Bedingungen irreversibel verlaufen. Diese Reaktionen werden durch die Schlüsselenzyme präzise reguliert. Durch die Regulation wird die entsprechende Reaktion zu der Schrittmacherreaktion (geschwindigkeitsbestimmender Schritt, committed step) der gesamten Reaktionskaskade. Schlüsselenzyme werden in der Zelle streng in ihrer Aktivität reguliert (von 0–100 %). Die Enzyme, welche die nachfolgenden Reaktionen bis zum Endprodukt bzw. bis zu einem weiteren Verzweigungspunkt katalysieren, werden nicht reguliert; ihre katalytische Kapazität ist i. d. R. so groß, dass sie für den Reaktionsweg nicht limitierend sind. Bei den Schlüsselenzymen handelt es sich oft um allosterische Enzyme (s. u.). Wird z. B. Glucose über die Reaktionen der Glykolyse abgebaut, so werden die Schlüsselenzyme der gegenläufigen Reaktionskaskade, der Gluconeogenese, abgeschaltet und umgekehrt (S. 287). Die Reaktionen, die von beiden Stoffwechselwegen genutzt werden, weisen eine niedrige Änderung der freien Enthalpie auf. Sie sind unter physiologischen Bedingungen reversibel, und die sie katalysierenden Enzyme werden normalerweise nicht reguliert (Beispiel: Triosephosphat-Isomerase).

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5.4 Regulation der enzymatischen Aktivität

5.4.4

201

Regulation durch kovalente Modifikation

Einige Enzyme werden durch kovalente Modifikation (auch als Interkonversion bezeichnet) reguliert. Hierunter versteht man die Übertragung einer Gruppe auf ein Enzym unter Ausbildung einer kovalenten Bindung. Solche kovalenten Modifikationen sind nicht auf die Regulation von Enzymen beschränkt. In der Tat werden viele Proteine, RNA und auch DNA nachträglich modifiziert. Die kovalenten Modifikationen sind reversibel. Die am häufigsten vorkommende Modifizierung zur Regulation der enzymatischen Aktivität ist die Phosphorylierung, d. h. die Übertragung einer Phosphorylgruppe auf das Enzym (Abb. 5.16). Einige Enzyme werden durch Phosphorylierung aktiviert. Hierzu gehört z. B. die Glykogen-Phosphorylase, welche den Abbau von Glykogen durch phosphorolytische Spaltung zu Glucose-1-phosphat katalysiert. Im Gegensatz hierzu wird die glykogenbildende Glykogen-Synthase durch Phosphorylierung gehemmt (S. 284). Sukzessive Phosphorylierungen durch Proteinkinasen stellen einen wichtigen Mechanismus bei der intrazellulären Signaltransduktion dar (S. 487). Weitere Möglichkeiten zur Regulation von Proteinen durch kovalente Modifikation bestehen in der Übertragung von Methyl- und Acetylgruppen sowie Adenyl- (AMP), Uridyl- (UMP) oder ADP-Ribosylgruppen. Die kovalenten Modifikationen führen zu einer Konformationsänderung des Enzyms, sodass nun das aktive Zentrum für das Substrat zugänglich (Aktivierung) oder unzugänglich wird (Inaktivierung). Bei der Interkonversion wird zwischen den beiden Zuständen hin- und hergeschaltet (aktiv und inaktiv, entsprechend folgt die Funktion dem „Alles oder Nichts“-Prinzip). Im aktiven Zustand („an“) folgen so regulierte Enzyme der Michaelis-Menten-Kinetik, sofern sie nicht noch durch weitere Effektoren reguliert werden (s. u.). Abb. 5.16 Proteinphosphorylierung. Eine Proteinkinase katalysiert die Phosphorylierung des Enzyms an der Hydroxylgruppe eines Serin-, Threoninoder Tyrosinrestes. Auch der Imidazolring eines Histidinrestes kann phosphoryliert werden. Der Phosphatgruppendonor ist ATP. Die Rückreaktion, die Abspaltung der Phosphatgruppe unter Freisetzung von anorganischem Phosphat, wird von einer Phosphatase katalysiert. Kinase und Phosphatase, die auf dasselbe Protein wirken, werden selbst ebenfalls reguliert.

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5 Enzymbiochemie

5.4.5

Allosterische Effekte und Kooperativität

Als allosterische Enzyme (nach griech. allos: ein anderer und stereos: starr, hart) bezeichnet man solche Enzyme, die neben dem aktiven Zentrum eine weitere Bindungsstelle für ein Molekül aufweisen. Dieses wird allerdings nicht umgesetzt, sondern dient der Regulation der enzymatischen Aktivität, man bezeichnet die Bindungsstelle für den Regulator (Effektor oder Modulator) daher auch als regulatorisches oder allosterisches Zentrum (effector site). Die Bindung des Effektors ist nicht kovalent. Die gebundene Form des Effektors steht mit der freien Form im Gleichgewicht. Bei der Bindung allosterischer Effektoren kommt es zu weit reichenden Konformationsänderungen im Enzym. Allosterische Regulationsmechanismen können aktivierend oder inhibierend sein. Bei einer allosterischen Aktivierung erhöht sich die Reaktionsgeschwindigkeit, das Substrat kann besser gebunden werden. Ein allosterischer Inhibitor erschwert dagegen die Substratbindung bzw. vermag diese vollständig zu verhindern. Wenn das Substrat selbst einen modulatorischen Effekt hat, bezeichnet man das Enzym als homotrop. Sind hingegen Substrat und Modulator unterschiedliche Substanzen, spricht man von einem heterotropen Enzym. Wenn ein Enzym am Anfang eines Stoffwechselweges durch das Endprodukt dieses Stoffwechselweges gehemmt wird, spricht man von einer Rückkopplungshemmung (Feedback-Hemmung, Abb. 5.17). Der gegenteilige Effekt, die Stimulierung eines nachfolgenden Enzyms, wird als Feedforward-Stimulierung bezeichnet. Dies ist beispielsweise im Verlauf der Glykolyse bei der Aktivierung der Pyruvat-Kinase durch Fructose-1,6-bisphosphat der Fall (S. 278). Allosterische Effekte und kovalente Modifikationen schließen sich nicht gegenseitig aus. Ein Beispiel ist die Glykogen-Phosphorylase, bei der die enzymatische Aktivität sowohl über allosterische Effektoren als auch durch Phosphorylierung reguliert wird (S. 284).

Abb. 5.17 Rückkopplungshemmung eines Stoffwechselweges am Beispiel der Methioninsynthese. Der Syntheseweg verläuft über drei Zwischenprodukte (Z1–3). Das Endprodukt, hier Methionin, hemmt das erste Enzym (E1) dieses Stoffwechselweges.

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5.4 Regulation der enzymatischen Aktivität

5.4.6

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Kooperativität

Ein Spezialfall allosterischer Wechselwirkung ist die kooperative Bindung. Unter Kooperativität versteht man die aufeinander folgende Bindung von Substraten oder Liganden an ein Enzym bzw. Protein, wobei die Bindungen nicht unabhängig voneinander sind. Wenn nach der Bindung eines Substrats die Affinität für ein weiteres Substratmolekül erhöht wird, spricht man von positiver Kooperativität. Verringert sich die Affinität nach der ersten Substratbindung, bezeichnet man dies als negative Kooperativität. Ein Maß für die Kooperativität ist der HillZoologie). Koeffizient, dem die Hill-Gleichung zu Grunde liegt ( Kooperativität und Allosterie sind nicht prinzipiell miteinander gekoppelte Phänomene, die deshalb auch unabhängig voneinander vorkommen können. Meistens treten sie jedoch gemeinsam auf und leisten somit Gewähr für eine optimale Regulation. Ein Beispiel ist Hämoglobin mit den kooperativen Bindungen der Sauerstoffmoleküle und der allosterischen Regulation durch 2,3-Bisphosphoglycerat ( Zoologie). Allosterische bzw. kooperative Enzyme gehorchen nicht der Michaelis-Menten-Kinetik. Kooperative Enzyme zeigen einen sigmoiden oder S-förmigen Verlauf der Sättigungs- bzw. Substratbindungskurve im v / [S]-Diagramm (Abb. 5.18a). Der entscheidende Vorteil kooperativer Wechselwirkung liegt in der Steilheit der sigmoiden Sättigungskurve. Der physiologische „Arbeitsbereich“ kooperativer Enzyme liegt genau in diesem steilen Anstieg. Geringe Konzentrationsschwankungen bewirken bereits eine erhebliche Aktivitätsänderung. Zudem kann durch allosterische Regulation die Steilheit der Kurve stark beeinflusst werden (Abb. 5.18b). Die Zelle ist somit in

Abb. 5.18 Kooperative Wechselwirkung in der nicht linearen Darstellung (v-[S]-Diagramm). a Vergleich von kooperativer Wechselwirkung mit dem nicht kooperativen Verhalten nach Michaelis-Menten. b Effekt der allosterischen Wechselwirkungen im „Arbeitsbereich“ kooperativer Enzyme. (1) negative Kooperativität, (2) Verhalten nach MichaelisMenten, (3) positive Kooperativität bei Anwesenheit eines allosterischen Aktivators, (4) positive Kooperativität in Abwesenheit von Modulatoren, (5) positive Kooperativität bei Anwesenheit eines allosterischen Inhibitors.

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5 Enzymbiochemie

der Lage, sehr empfindlich auf kleine Konzentrationsänderungen zu reagieren. Dies ist besonders bei den Rezeptoren wichtig. In der Tat weisen zahlreiche Oberflächenrezeptoren, z. B. der Acetylcholin-Rezeptor, der bei der synaptischen Informationsübertragung von entscheidender Bedeutung ist (S. 379, Zoologie), kooperatives Verhalten auf. Allosterische Proteine bzw. Enzyme mit kooperativem Verhalten bestehen aus mehreren Untereinheiten. Zur Beschreibung der Verhältnisse bei der kooperativen Substratbindung wurden zwei Modelle entwickelt. Das erste Modell wurde 1965 von Jaques Monod, Jeffries Wyman und Jean-Pierre Changeux (daher gelegentlich auch als MWC-Modell bezeichnet) vorgestellt und ist als Symmetrie-Modell bekannt. Bei dieser Modellvorstellung können die einzelnen Untereinheiten und damit auch das gesamte Enzym in zwei verschiedenen Konformationszuständen vorliegen: Einer für das Substrat hochaffinen und einer weniger affinen Form. Die hochaffine Form wird als R-Form (relaxed: entspannt), die niederaffine, inaktive Form als T-Form (tensed: gespannt) bezeichnet. Die Untereinheiten des Enzyms liegen stets in der gleichen Konformation vor. Beim Übergang zwischen den beiden Formen bleibt die Symmetrie des multimeren Enzyms erhalten, d. h. der Konformationswechsel aller Untereinheiten erfolgt zeitgleich. In Abwesenheit des Substrats überwiegt die T-Form die R-Form bei weitem. Durch die Bindung eines Substrats an die R-Form wird diese Konformation stabilisiert und damit die Bindung weiterer Substratmoleküle erleichtert. Eine alternative Vorstellung wurde 1966 von Daniel Koshland entwickelt, der hierbei das Konzept des Induced Fit auf allosterische Enzyme ausweitete. In diesem Modell können gleichzeitig unterschiedliche Konformationszustände der Untereinheiten vorkommen. Aufgrund der nacheinander erfolgenden Konformationswechsel wird dieses Modell als sequentielles Modell bezeichnet. Nach diesem Modell können die Untereinheiten ebenfalls in zwei unterschiedlich affinen Konformationszuständen vorliegen. Im Unterschied zum Symmetrie-Modell können diese auch gleichzeitig auftreten. Die Bindung eines Substrats an die niederaffine Form bewirkt einen Konformationswechsel einer benachbarten Untereinheit zur hochaffinen Form. Hierdurch wird die Bindung weiterer Substratmoleküle erleichtert. Beide Modelle beschreiben die bekannten Phänomene in etwa gleich gut.

Leitenzyme: Für bestimmte Zellen, Zellbereiche oder Gewebe charakteristische Enzyme. Induzierbare Enzyme: Synthese erfolgt nur unter bestimmten Bedingungen. Konstitutive Enzyme: Kontinuierlich gebildete Enzyme, codiert von sogenannten „Housekeeping Genes“. Endprodukt-Repression: Hemmung der Enzymsynthese durch Endprodukte des entsprechenden Stoffwechselweges. Zymogene: Inaktive Enzym-Vorstufen, die erst an ihrem Wirkungsort aktiviert werden (z. B. Chymotrypsin).

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5.5 Mechanismen der Enzymkatalyse

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Schrittmacherreaktion: Geschwindigkeitsbestimmender Schritt einer Reaktionsfolge. Kovalente Modifikation (Interkonversion): Reversible Übertragung einer Gruppe auf ein Enzym unter Ausbildung einer kovalenten Bindung (z. B. Phosphorylierung). Kann zur Aktivierung oder Inaktivierung des Enzyms führen. Allosterische Enzyme: Enzyme, die neben dem aktiven Zentrum eine weitere Bindungsstelle (allosterisches Zentrum) für ein regulatorisches Molekül (Regulator) besitzen. Homotrope Enzyme: Substrat selbst wirkt regulierend auf das Enzym. Heterotrope Enzyme: Regulator und Substrat des Enzyms sind nicht identisch. Rückkopplungshemmung (Feedback-Hemmung): Hemmung eines Enzyms am Anfang eines Stoffwechselweges durch das Endprodukt dieses Weges. Feedforward-Stimulierung: Stimulierung eines nachfolgenden Enzyms durch das Produkt einer vorgeschalteten Reaktion. Kooperativität: Voneinander abhängige, aufeinander folgende Bindung von Substraten an ein Enzym. – Positive Kooperativität: Erhöhung der Affinität für ein weiteres Substratmolekül. – Negative Kooperativität: Verringerung der Affinität für ein weiteres Substratmolekül.

5.5

Mechanismen der Enzymkatalyse

Im Verlauf einer Katalyse werden oft kovalente Bindungen zwischen Enzym und Substrat geknüpft (kovalente Katalyse). Ein gut untersuchtes Beispiel für diesen Katalysetyp sind die Serinproteasen. Häufig sind Metallionen an der Katalyse beteiligt (Metallionen-Katalyse). Diese dienen der Stabilisierung geladener Übergangszustände. Metallionen können aber auch als Elektronenüberträger bei Redoxreaktionen fungieren. Bei einem anderen Katalysemechanismus, der Säure-Base-Katalyse, werden Protonen auf das Substrat übertragen bzw. von diesem abgezogen. Die Wirkungsweise von Lysozym etwa basiert auf diesem Prinzip. Neben Proteinen kann auch RNA katalytisch aktiv sein. Diese RNA-Moleküle werden als Ribozyme bezeichnet. Die zentrale Frage ist, wie eine enzymkatalysierte Reaktion auf molekularer Ebene verläuft. Die Reaktion findet im aktiven Zentrum statt. Die Aminosäurereste, die das aktive Zentrum bilden, liegen in enger räumlicher Nähe. Dies bedeutet aber nicht, dass die Aminosäuren auch in der Primärstruktur dicht beieinander liegen. In der Tat liegen die entscheidenden Aminosäuren in der Primärstruktur an völlig unterschiedlichen Stellen und kommen erst durch die Faltung der Polypeptidkette zu einer dreidimensionalen Struktur (Tertiärstruktur) in Nachbarschaft zueinander. Häufig sind hierbei die Reste der sauren Ami-

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5 Enzymbiochemie

nosäuren Glutamat und Aspartat und die der basischen Aminosäure Lysin und Arginin beteiligt. Aber auch die Hydroxylgruppe des Serins, die Sulfhydrylgruppe des Cysteins und der Imidazolring des Histidins spielen bei enzymatischen Katalysen häufig essentielle Rollen.

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n Ein Wunschtraum der Enzymologen ist, den Katalysemechanismus eines Enzyms während einer laufenden Reaktion zu verfolgen. Das Auflösungsvermögen der Lichtmikroskope (ca. 200 nm) ist hierzu viel zu gering. Elektronenmikroskope besitzen zwar ein maximales Auflösungsvermögen im atomaren Bereich, aber die Probenbehandlung schließt jegliche Lebendbeobachtungen bzw. Untersuchungen zu Konformationsänderungen bei Proteinen aus. Gute Ergebnisse wurden jedoch, z. T. in Kombination mit immunochemischen Methoden, bei sehr großen Komplexen erzielt. Hervorzuheben hierbei sind die Untersuchungen zu den Transportvorgängen über die Kernmembran durch den Kernporenkomplex sowie über die Struktur des Kernporenkomplexes selbst. Auch für das Verständnis der Ribosomenstruktur bzw. deren Funktion lieferte die Elektronenmikroskopie wertvolle Hinweise. Die Bilder, die hierbei erhalten werden, sind allerdings nur Momentaufnahmen, quasi Standbilder. Wie andere Proteine können Enzyme kristallisiert werden. Aus dem Kristall kann durch Röntgenstrukturanalyse die dreidimensionale Struktur des Enzyms berechnet werden (S. 157). Analog den Verhältnissen bei der Elektronenmikroskopie erhält man nur statische Bilder. Der Katalysemechanismus muss anhand zahlreicher Untersuchungen (Enzymkristall mit Inhibitor, Übergangszustandsanalogon etc. in Kombination mit kinetischen Experimenten) rekonstruiert werden. Enzymkristalle sind enzymatisch aktiv. Die Konformationsänderungen bei der Katalyse bewirken teilweise ein makroskopisch erkennbares „Schmelzen“ der Kristalle. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Versuche unternommen, Enzymkristalle während der Katalyse direkt zu beobachten. Hierbei besteht folgende Problematik: Ein typisches Enzym benötigt für eine Reaktion etwa 10–4 Sekunden, die Kristallisation eines Proteins kann Tage bis Wochen in Anspruch nehmen; allein die Datensammlung mit monochromatischer Röntgenstrahlung kann mehrere Stunden dauern. Das Substrat wäre längst umgesetzt, bevor der Enzym-Substrat-Komplex kristallisieren könnte. Die Zeit der Datensammlung konnte durch die Verwendung polychromatischer („weißer“) Röntgenstrahlung (das Prinzip ähnelt dem der Fourier-Transformation bei NMR-Hochfrequenzpulsen) und leistungsfähiger Rechner extrem verkürzt werden. Wie aber erhält man einen Enzym-Substrat-Kristall? Durch Modifizierung der Substrate, Coenzyme oder bestimmter Reste des Enzyms mit photolytisch abtrennbaren Schutzgruppen. Substanzen mit solchen Schutzgruppen, die am häufigsten verwendete ist 1-(2-Nitrophenyl)ethanol, werden als „caged“-Verbindungen bezeichnet. Mit einem caged-Substrat kann das Enzym einen Cokristall bilden, die Reaktion wird durch einen Lichtblitz gestartet. Diese Methode wurde erstmals bei Untersuchungen zur GTP-Hydrolyse des kleinen G-Proteins Ras angewendet. Eine weitere Strategie, direkte Einblicke in den dynamischen Ablauf der Umsetzung zu bekommen, bieten die Möglichkeiten der Kernmagnet-Resonanz-Spektroskopie (NMR, S. 160). Ein entscheidender Vorteil der NMR-Spektroskopie ist, dass man hierbei die Struktur des gelösten Proteins erhält. Flexible Bereiche eines Makromoleküls können klar von rigiden Strukturelementen unterschieden werden und deu-

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5.5 Mechanismen der Enzymkatalyse

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ten auf das aktive Zentrum hin. Eine sehr junge Technik ist die Rasterkraftmikroskopie (S. 23). Mit dieser Technik konnten erfolgreich Konformationsänderungen des Enzyms Lysozym während der Katalyse direkt beobachtet werden. m Auf molekularer Ebene lassen sich verschiedene Mechanismen enzymkatalysierter Reaktionen unterscheiden: Bei der Serinprotease Chymotrypsin verläuft die Katalyse über eine kovalente Bindung des Substrats an das Enzym (ein weiteres Beispiel ist die Reaktion der Pyruvat-Dehydrogenase, S. 292), Metalloproteasen sind Beispiele für eine Metallionen-Katalyse und Lysozym katalysiert über einen Mechanismus, dem das Prinzip der Säure-Base-Katalyse zu Grunde liegt.

5.5.1

Serinproteasen

Serinproteasen sind eine umfangreiche Gruppe von proteolytischen (Peptidbindungen spaltenden) Enzymen, den Proteasen. Das Charakteristikum der Serinproteasen ist ein Serinrest mit ungewöhnlichen chemischen Eigenschaften im aktiven Zentrum. Serinproteasen sind weit verbreitet und kommen sowohl bei Eukaryoten als auch bei Bakterien und Viren vor (Tab. 5.4). Ein sehr gut untersuchtes Beispiel ist das Chymotrypsin, ein etwa 25 kDa großes Verdauungsenzym, welches bei Säugern im Pankreas als inaktive Vorstufe (Zymogen) synthetisiert und in das Duodenum sezerniert wird ( Zoologie). Chymotrypsin spaltet Peptidbindungen auf der Carboxyseite von aromatischen Aminosäuren (Phe, Tyr, Trp) und von Aminosäuren mit großen, hydrophoben Seitenketten, z. B. Ile, Leu, und Met. Aber auch Esterbindungen können von Chymotrypsin hydrolysiert werden. Im Unterschied zu den Exopeptidasen, die Peptidbindungen am Ende einer Polypeptidkette spalten, gehört Chymotrypsin zu den Endopeptidasen, die Peptidbindungen innerhalb einer Polypeptidkette spalten. Für den Reaktionsmechanismus sind drei Aminosäuren essenziell: His57, Ser195 und Asp102. Sie bilden die sogenannte katalytische Triade (Abb. 5.19). Die Substratspezifität von Chymotrypsin wird durch die Ausbildung einer hydrophoben Tasche erzielt, in der nur große, hydrophobe Aminosäurereste gebunden werden. In der katalytischen Triade besteht bei neutralem pH-Wert (pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität!) eine Wasserstoffbrücken-Bindung zwischen der Hydroxylgruppe von Ser195 und dem räumlich benachbarten, unprotonierten His57: Hierdurch wird die Bindung zwischen dem Wasserstoff und dem Sauerstoff der Hydroxylgruppe geschwächt und die Nucleophilie des Sauerstoffatoms erhöht. Der Hydroxylsauerstoff von Ser195 greift den Carbonylkohlenstoff der zu spaltenden Bindung nucleophil an; hierbei geht der Hydroxylwasserstoff auf His57 über. Der Carbonylkohlenstoff der zu spaltenden Bindung besitzt nun eine tetraedrische Konformation. Der negativ geladene Sauerstoff wird durch zahlreiche Wechselwirkungen in der sogenannten Oxyanion-Tasche stabilisiert (Katalyse durch Stabilisierung des Übergangszustandes). His57 trägt nun eine positive Ladung. Dieser Zustand wird durch die benachbarte Carboxylgruppe von Asp102 stabilisiert. Es folgt die Lösung der Peptid-Bindung und die Übertragung des Wasserstoffs von His57 auf die neue N-terminale Aminogruppe des ersten Spaltproduktes. Nach der Freisetzung dieses Spaltprodukts gelangt ein Wassermolekül in das aktive Zentrum. Das andere Spaltprodukt ist intermediär mit dem Enzym über Ser195 kovalent verbunden.

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5 Enzymbiochemie

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Abb. 5.19 Chymotrypsin. Die von Chymotrypsin katalysierte Reaktion ist auch ein Beispiel für eine Säure-Base-Katalyse. a Unbesetztes Enzym. b Bildung des Enzym-SubstratKomplexes und Acylierung des Enzyms. c 1. Übergangszustand. d An Ser195 acyliertes Enzym. e Freisetzung des ersten Spaltprodukts. f 2. Übergangszustand. Die Deacylierung ist der limitierende Schritt der Gesamtreaktion.

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5.5 Mechanismen der Enzymkatalyse

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5 Enzymbiochemie

Tab. 5.4 Einige Serinproteasen.

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Enzym

Herkunft

Funktion

Chymotrypsin Trypsin Elastase

Pankreas

Proteinverdauung

Acrosin

Akrosom (Spermium)

Durchdringen der Eihaut bei der Befruchtung

Kallikrein

Blut/Gewebe

Spaltung von Kininogenen zu aktiven Kininen

Plasmin

Blutserum

Spaltung von Fibrin, Auflösung von Blutgerinnseln (Fibrinolyse)

Thrombin

Blutserum

Spaltung von Fibrinogen, Blutgerinnung

Lysosomale Protease

Lysosomen

intrazelluläre Proteinverdauung

a-lytische Endopeptidase

Lysobacter

Verdauung von Zellwänden anderer Bodenbakterien

Subtilisin

Bacillus subtilis

Proteinverdauung

IgA-spezifische Protease

Neisseria gonorrhoeae Haemophilus influenzae

Spaltung und Inaktivierung von IgA in der Gelenkregion der schweren Kette

Repressor LexA

Escherichia coli

Transkriptionsrepression der SOS-Gene. Aktivierung durch RecA führt zur Autolyse und Derepression

NS3-Endopeptidase

Gelbfieber-Virus

Reifung des Viruspartikels

Auch in Abwesenheit eines Substrats bildet Asp102 eine Wasserstoffbrücken-Bindung mit His57 aus. Durch die Ausbildung dieser Wasserstoffbrücken-Bindung wird die Nucleophilie des Sauerstoffatoms des nun im aktiven Zentrum befindlichen Wasser-Moleküls erhöht. Es folgt ein nucleophiler Angriff auf den Carbonylkohlenstoff. Bei der Deacylierung (Hydrolyse der Esterbindung) wird wieder ein tetraedrischer Übergangszustand durchlaufen. Nach der Freisetzung des zweiten Spaltprodukts steht das Enzym für eine weitere Katalyse zur Verfügung. Bei dem Zusammenspiel der Aminosäurereste der katalytischen Triade kommt es im Verlauf der Katalyse zu Ladungsverschiebungen; daher wird dieses System auch als charge relay system (Ladungsübertragungssystem) bezeichnet.

Katalytische Triaden kommen bei Proteasen bzw. Peptidasen häufig vor. Anhand von Sequenzhomologien können die Serinproteasen in verschiedene Familien eingeteilt werden. Mitglieder einer Familie weisen deutliche Sequenzhomologie untereinander auf und unterscheiden sich vor allem bezüglich der Substratspezifität. Vermutlich besitzen sie einen gemeinsamen urzeitlichen Vorgänger. Chymotrypsin, Trypsin und Elastase besitzen in ihrer Aminosäuresequenz eine Übereinstimmung von ca. 40 %, in einigen Bereichen sogar bis zu 60 %. Die Tertiärstrukturen ähneln sich sehr stark und die Reaktionen verlaufen nach dem gleichen Mechanismus. Chymotrypsin besitzt eine Präferenz für die Spaltung auf

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5.5 Mechanismen der Enzymkatalyse

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der Carboxyseite von hydrophoben Aminosäuren. Trypsin spaltet Peptidbindungen auf der Carboxyseite von Aminosäuren mit positiv geladenen Seitenketten (Arg und Lys). In der Substratbindungstasche von Trypsin befindet sich ein negativ geladener Aspartatrest, der eine optimale Wechselwirkung mit diesen Resten ermöglicht. Elastase hat eine Substratbindungsstelle, in der nur kleine, hydrophobe Seitenketten, etwa von Glycin, Valin oder Alanin, Platz haben. Bevorzugtes Substrat der Elastase ist das Elastin, einem Hauptbestandteil elastischer Fasern des Bindegewebes. Eine katalytische Triade hat sich außer bei den Serinproteasen der Chymotrypsinfamilie auch bei dem aus Bacillus subtilis isolierten Subtilisin entwickelt. Subtilisin besitzt ebenso eine katalytische Triade aus Aspartat, Histidin und Serin wie die Serinproteasen der Chymotrypsinfamilie, weist aber eine völlig unterschiedliche Aminosäuresequenz und damit eine andere Tertiärstruktur auf. Das Prinzip der katalytischen Triade wurde während der Evolution (mindestens) zwei Mal „erfunden“. Man spricht daher auch von einer konvergenten Evolution auf molekularer Ebene.

5.5.2

Metallionen-Katalyse

Viele Enzyme enthalten Metallionen im aktiven Zentrum. Teilweise dienen diese zur Stabilisierung von geladenen Übergangszuständen (man spricht in diesem Fall besser von einer elektrostatischen Katalyse), meistens werden sie jedoch zur Stabilisierung oder Ausrichtung bzw. zur Aktivierung der Substrate benötigt. Eine wichtige Rolle spielen Metallionen auch bei der Elektronenübertragung, z. B. in der Atmungskette (S. 300, Mikrobiologie) und der Photosynthese (S. 339, Botanik, Mikrobiologie). Ein elektronenübertragendes Enzym von fundamentaler Bedeutung ist die Nitrogenase (Abb. 5.20). Sie kommt ausschließlich in Bakterien vor ( Mikrobiologie) und katalysiert die Reduktion von molekularem Stickstoff (N2) zu Ammoniak (NH3). Bei dieser Reaktion werden 8 Elektronen unter ATP-Verbrauch auf das N2-Molekül übertragen.

Abb. 5.20 Nitrogenase-Cofaktor. Die Nitrogenase enthält als Cofaktor ein Molybdänion in einem Komplex mit Eisen und Schwefel (FeMo-Cofaktor). In diesem FeMo-Cofaktor wird das Stickstoffmolekül während der Reaktion vermutlich „gefangen gehalten“.

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5 Enzymbiochemie

Metalloproteasen benutzen eine andere Strategie als etwa die Serinproteasen, um Peptidbindungen zu hydrolysieren. Hier dient ein zentrales Metallion, meist Zn2+, zur Aktivierung eines Wassermoleküls. Ein gut untersuchtes Beispiel ist die Carboxypeptidase A, ein 34,4 kDa großes Verdauungsenzym der Säugetiere. Wie Chymotrypsin wird es als Zymogen im Pankreas synthetisiert und in das Duodenum sezerniert. Es hydrolysiert Peptidbindungen bevorzugt nach Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten. Im Unterschied zu Chymotrypsin ist Carboxypeptidase A eine Exopeptidase d. h. sie spaltet nur die carboxyterminale Aminosäure von einer Polypeptidkette ab (Abb. 5.21). Proteasen als biologische Gifte: Einige Enzyme können stark toxische Substanzen sein. Hierzu gehören das Botulinum- und das Tetanustoxin (BTX bzw. TTX). Bei beiden Toxinen handelt es sich um hochspezifische Zinkproteasen. BTX bzw. TTX sind die Substanzen mit den höchsten Toxizitäten, die bekannt sind (bei der Maus ist die letale Dosis I 0,1 ng kg–1; 28 mg wären theoretisch ausreichend um 1000 Menschen zu töten!). Wie können diese Proteasen solch enorme toxikologischen Effekte bewirken? BTX und TTX werden von Clostridien, grampositiven, anaeroben Endosporenbildnern produziert ( Mikrobiologie). Diese gelangen z. B. bei Verletzungen in die Wunden. BTX bzw. TTX besteht aus einer einzigen etwa 150 kDa großen Polypeptidkette, die in zwei Teile gespalten wird. Das 100-kDa-Fragment schleust das für die biologische Wirkung verantwortliche 50-kDa-Fragment in die Zielzellen (Nervenzellen) ein. Bei der synaptischen Übertragung lagern sich die mit den Neurotransmittern gefüllten synaptischen Vesikel an die präsynaptische Membran an. Dieser Kontakt kommt durch die Rezeptoren VAMP (synaptische Vesikelmembran) und Syntaxin (präsynaptische Membran) zu Stande. Ein Kontakt zwischen beiden Rezeptoren wird durch die SNAP-Proteine hergestellt (S. 413). Die 50-kDa-Fragmente sind Zinkproteasen, die VAMP spalten (BTX und TTX hydrolysieren unterschiedliche Bindungen) und somit die synaptischen Vesikel von der präsynaptischen Membran ablösen. Eine Transmitterausschüttung ist nicht mehr möglich ( Zoologie). Die hohe Spezifität von BTX für acetylcholinerge neuromuskuläre Verbindungen kann aber auch therapeutisch genutzt werden. Ein BTX-haltiges Präparat wird gegen altersbedingte Hautfalten eingesetzt. Weitere, medizinisch indizierte, Einsatzgebiete sind die Behandlung verschiedener Krampfarten (Lidkrampf, Scheidenkrampf, spastische Anfällen), bestimmte Formen des Schielens (paralytischer Strabismus) oder bei extremer Überfunktion von schweißproduzierenden Drüsen. In allen Fällen wird BTX lokal und in sehr geringen Mengen verabreicht. Sehr treffend bemerkte Paracelsus bereits im 16. Jahrhundert: „Alle Ding’ sind Gift und nichts ohn’ Gift, allein die Dosis dass ein Ding Gift ist.“ Abb. 5.21 Carboxypeptidase A. a Im aktiven Zentrum ist ein Zinkion durch zwei Histidin- n und ein Glutamatrest koordinativ gebunden. Der vierte Ligand ist ein Wassermolekül, welches über Glu270 zusätzlich gebunden ist. Das Zinkion erhöht die Nucleophilie des Sauerstoffatoms aus dem Wassermolekül. Es erfolgt ein nucleophiler Angriff des Sauerstoffatoms auf den Carbonylkohlenstoff der endständigen Peptidbindung des Substrats. b Im Verlauf der Reaktion wird ein tetraedrischer Übergangszustand durchlaufen, der durch das Zinkion zusätzlich stabilisiert wird. Glu270 dient vorübergehend als Protonenakzeptor. Durch den Induced Fit wird die Substrat-Bindungstasche während der Reaktion verschlossen. c Nach Verlauf der Reaktion werden die Spaltprodukte, die endständige Aminosäure und das um eine Aminosäure verkürzte Peptid freigesetzt.

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5.5 Mechanismen der Enzymkatalyse

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5 Enzymbiochemie

5.5.3

Lysozym

Die Wirkung von Lysozym wurde 1922 zuerst von Alexander Fleming beschrieben. Er entdeckte, dass einige Sekrete eine bakterienlysierende Substanz enthalten und nannte diese Substanz Lysozym. Lysozym ist bei Vertebraten weit ver-

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Abb. 5.22 Lysozym-Katalysemechanismus. Für die Katalyse sind zwei Carboxylgruppen essentiell: Bei dem pH-Optimum der Enzymkatalyse (pH 5,5) ist der Glutamatrest (Glu35) protoniert, der Aspartatrest (Asp52) unprotoniert. Von dem Substrat (hier: Chitin) sind nur drei Einheiten eingezeichnet. a Ein Proton von Glu35 wird auf den Sauerstoff der zu spaltenden Bindung übertragen, der linke Ring liegt in der energetisch ungünstigen Halbsesselkonformation vor. b Das Carbenium-Ion des Übergangszustandes wird durch die Carboxylgruppe von Asp52 stabilisiert. c Diffundiert das erste Spaltprodukt ab, gelangt ein Wassermolekül in das aktive Zentrum. Eine Hydroxylgruppe aus dem Wassermolekül wird an das Carbenium-Ion addiert, das Proton wird von Glu35 übernommen. Lysozym ist ein weiteres Beispiel für eine Säure-Base-Katalyse.

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5.6 Ribozyme

215

breitet. Es kommt z. B. in den Sekreten der Nasenschleimhaut, der Tränenflüssigkeit, in der Milch aber auch in den Zellen selbst (z. B. Milz oder Plazenta) vor und dient dem Schutz der Organismen vor Bakterien. Eine besonders reichhaltige Quelle für Lysozym ist das Hühnereiklar; dieses enthält etwa 3,5–5 % Lysozym. Dieses Lysozym war das erste Enzym, dessen genaue Raumstruktur aufgeklärt werden konnte (David Phillips, 1965). Lysozym besteht aus einer Polypeptidkette von 129 Aminosäuren, die durch vier Disulfidbrücken stabilisiert ist; die Molekularmasse beträgt etwa 14,4 kDa. Lysozym ist eine Hydrolase und spaltet glykosidische Bindungen im Murein der Bakterienzellwände ( Mikrobiologie) und Chitin, einen bei Arthropoden und Pilzen weit verbreiteten Baustoff (S. 100). Die Bausteine der Murein-Polysaccharidketten sind die Aminozucker N-Acetylmuraminsäure (MurNAc) und N-Acetyl-D-glucosamin (GlcNAc), welche alternierend über eine b-1,4-glykosidische Bindung miteinander verknüpft sind. Chitin ist ein Homopolymer von GlcNAc (Abb. 5.22). Die langen Polysaccharidketten werden in einem Spalt, der quer über das Enzym verläuft, gebunden. Eine optimale Bindung bzw. eine maximale Umsatzgeschwindigkeit wird erst erreicht, wenn mindestens sechs Zuckerreste in dem Spalt gebunden werden. Dimere und Trimere aus GlcNAc wirken als kompetitive Inhibitoren. Wie ist dieser Sachverhalt zu verstehen? In dem Spalt können sechs Zuckerreste gebunden werden (die Bindungsplätze im Enzym werden mit A bis E bezeichnet). Bei der Bindung wird der Zuckerrest in Position D aus einer energetisch günstigen Konformation (Sesselform, S. 96) in eine energetisch ungünstige (Halbsesselform) gezwängt. Hierdurch wird die glykosidische Bindung für die Spaltung vorbereitet. Für die Bindung der übrigen Zuckerreste ergibt sich eine negative Änderung der Bindungsenthalpie. Erst wenn die Summe dieser Bindungsenthalpien den Energiebetrag übersteigt, der zur Konformationsänderung des Zuckerrestes in Position D notwendig ist, verläuft die Umsetzung in messbarem Ausmaß.

5.6

Ribozyme

Proteine sind nicht die einzigen enzymatisch aktiven Biomoleküle. Anfang der Achtzigerjahre wurden erstmals katalytische Eigenschaften bei RNA-Molekülen beschrieben. Katalytisch aktive RNAs werden als Ribozyme bezeichnet. Der Begriff Ribozym erstreckt sich auch auf Ribonucleoprotein-Partikel, bei denen die RNA für die katalytische Aktivität verantwortlich ist. Inzwischen sind ein Reihe solcher Reaktionen bekannt, die von RNA katalysiert werden: Spleißen, Prozessieren von tRNA durch das Ribonucleoprotein RNAse P oder die Transpeptidierung bei der Proteinbiosynthese am Ribosom. Zudem gibt es zahlreiche Reaktionen bei denen die RNA zwar nicht unmittelbar an der Katalyse beteiligt ist, die aber dennoch auf die Beteiligung von RNA angewiesen sind. Hierzu gehört das Proteintargeting zu den Membranen (7S-RNA im signal recognition particle

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5.6 Ribozyme

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breitet. Es kommt z. B. in den Sekreten der Nasenschleimhaut, der Tränenflüssigkeit, in der Milch aber auch in den Zellen selbst (z. B. Milz oder Plazenta) vor und dient dem Schutz der Organismen vor Bakterien. Eine besonders reichhaltige Quelle für Lysozym ist das Hühnereiklar; dieses enthält etwa 3,5–5 % Lysozym. Dieses Lysozym war das erste Enzym, dessen genaue Raumstruktur aufgeklärt werden konnte (David Phillips, 1965). Lysozym besteht aus einer Polypeptidkette von 129 Aminosäuren, die durch vier Disulfidbrücken stabilisiert ist; die Molekularmasse beträgt etwa 14,4 kDa. Lysozym ist eine Hydrolase und spaltet glykosidische Bindungen im Murein der Bakterienzellwände ( Mikrobiologie) und Chitin, einen bei Arthropoden und Pilzen weit verbreiteten Baustoff (S. 100). Die Bausteine der Murein-Polysaccharidketten sind die Aminozucker N-Acetylmuraminsäure (MurNAc) und N-Acetyl-D-glucosamin (GlcNAc), welche alternierend über eine b-1,4-glykosidische Bindung miteinander verknüpft sind. Chitin ist ein Homopolymer von GlcNAc (Abb. 5.22). Die langen Polysaccharidketten werden in einem Spalt, der quer über das Enzym verläuft, gebunden. Eine optimale Bindung bzw. eine maximale Umsatzgeschwindigkeit wird erst erreicht, wenn mindestens sechs Zuckerreste in dem Spalt gebunden werden. Dimere und Trimere aus GlcNAc wirken als kompetitive Inhibitoren. Wie ist dieser Sachverhalt zu verstehen? In dem Spalt können sechs Zuckerreste gebunden werden (die Bindungsplätze im Enzym werden mit A bis E bezeichnet). Bei der Bindung wird der Zuckerrest in Position D aus einer energetisch günstigen Konformation (Sesselform, S. 96) in eine energetisch ungünstige (Halbsesselform) gezwängt. Hierdurch wird die glykosidische Bindung für die Spaltung vorbereitet. Für die Bindung der übrigen Zuckerreste ergibt sich eine negative Änderung der Bindungsenthalpie. Erst wenn die Summe dieser Bindungsenthalpien den Energiebetrag übersteigt, der zur Konformationsänderung des Zuckerrestes in Position D notwendig ist, verläuft die Umsetzung in messbarem Ausmaß.

5.6

Ribozyme

Proteine sind nicht die einzigen enzymatisch aktiven Biomoleküle. Anfang der Achtzigerjahre wurden erstmals katalytische Eigenschaften bei RNA-Molekülen beschrieben. Katalytisch aktive RNAs werden als Ribozyme bezeichnet. Der Begriff Ribozym erstreckt sich auch auf Ribonucleoprotein-Partikel, bei denen die RNA für die katalytische Aktivität verantwortlich ist. Inzwischen sind ein Reihe solcher Reaktionen bekannt, die von RNA katalysiert werden: Spleißen, Prozessieren von tRNA durch das Ribonucleoprotein RNAse P oder die Transpeptidierung bei der Proteinbiosynthese am Ribosom. Zudem gibt es zahlreiche Reaktionen bei denen die RNA zwar nicht unmittelbar an der Katalyse beteiligt ist, die aber dennoch auf die Beteiligung von RNA angewiesen sind. Hierzu gehört das Proteintargeting zu den Membranen (7S-RNA im signal recognition particle

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5 Enzymbiochemie

[Signalerkennungspartikel, SRP], S. 401), die Replikation der Chromosomenenden mit Hilfe der RNA-haltigen Telomerase ( Genetik), eine Form des Editing, die posttranslationale Änderung der Nucleotidsequenz von mRNA ( Genetik) und vor allem die Proteinbiosynthese (mRNA, tRNA, rRNA der Ribosomen, Genetik). Wie Proteine bilden auch RNA-Moleküle eine geordnete räumliche Struktur aus. Die dreidimensionale Struktur korreliert streng mit der katalytischen Aktivität. Die Zerstörung der dreidimensionalen Struktur, etwa durch Erhitzen oder durch hohe Ionenstärken, unterbindet auch die katalytische Aktivität. Bei der Umsetzung kommt es, analog zu den Verhältnissen bei Proteinen, zu weit reichenden Konformationsänderungen.

5.6.1

Spleißen

Bei Untersuchungen zum Spleißen von ribosomaler RNA (die ungespleißte Form wird als „precursor“-rRNA, pre-rRNA, bezeichnet) des Ciliaten Tetrahymena wurde festgestellt, dass diese Reaktion in Abwesenheit jeglicher Proteine abläuft. Es waren nur Guanosin oder Guanosinphosphate (GMP, GDP bzw. GTP) und zweiwertige Metallionen, vorzugsweise Mg2+ oder Mn2+, notwendig. Guanosin bzw. die Guanosinphosphate werden in einer speziellen Tasche der RNA gebunden. Beim Spleißen werden Phosphodiesterbindungen gespalten und wieder neu geknüpft. Zu beachten ist hierbei, dass bei diesen Transphosphorylierungen keine Energie benötigt wird, da die „neuen“ und die „alten“ Bindungen energetisch auf dem gleichen Niveau liegen. Da es sich bei dieser Art des Spleißens um einen autokatalytischen Prozess handelt, wird dieser Vorgang auch als Selbstspleißen (self splicing) bezeichnet. Bei Tetrahymena vollzieht das ausgeschnittene Intron noch zwei weitere Spleiß-Schritte an sich selbst. Das fertig prozessierte Intron, als L–19 IVS (von linear minus 19 intervening sequence) bezeichnet, ist allein katalytisch aktiv und vermag weitere pre-rRNA-Moleküle zu spalten. Bei diesen Reaktionen erfüllt es alle Kriterien, die ein „echtes“ Enzym erfüllen muss: Es arbeitet sehr spezifisch, die Bindung des Cofaktors Guanosin ist sättigbar (KB z 21 mmol l–1) und kann durch 3l-Desoxyguanosin kompetitiv verdrängt werden. Die Reaktion ist gegenüber der unkatalysierten Reaktion um etwa das 1012–1013fache beschleunigt und folgt der Michaelis-Menten-Kinetik. Auch die Rückreaktion, die Ligation von RNA-Molekülen ist möglich. Die Erkennung des Substrats erfolgt über die BasenSequenz. Im Labor synthetisierte RNA-Moleküle, die diese Erkennungssequenz besitzen, sind in der Lage, die Spleiß-Reaktion kompetitiv zu inhibieren.

5.6.2

Viroide und Hammerhead-Ribozyme

Viroide sind infektiöse pflanzenpathogene zirkuläre RNA-Moleküle mit einer Größe von 246 bis etwa 400 Nucleotiden ( Botanik, Mikrobiologie). Bisher wurden 21 Viroide identifiziert. Im Unterschied zu Viren liegt die RNA nicht mit

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5.6 Ribozyme

217

Proteinen assoziiert vor. Bei der Vermehrung der RNA durch Enzyme der infizierten Wirtszelle bilden sich zunächst lange aneinanderhängende Stränge, sogenannte Concatemere. Die Vermehrung der RNA erfolgt nach dem Rolling CircleMechanismus ( Genetik). DNA-Zwischenstufen sind, im Gegensatz zu den Retroviren, bisher nicht bekannt. Die Viroid-RNA codiert nicht für Proteine, auch besitzt die Wirtszelle keine Enzyme, um die Concatemere in die infektiösen Viroide zu spalten. Wie aber erfolgt diese spezifische Spaltung? Durch die RNA selbst! Viroide sind ein weiteres Beispiel für autokatalytisch aktive RNA. Bestimmte Abschnitte in der Nucleotidsequenz bilden eine Tertiärstruktur aus, die in der Lage ist, das Viroid-Concatemer an spezifischen Stellen zu schneiden. Bisher wurden zwei katalytisch aktive RNA-Tertiärstrukturen beschrieben. Diese werden auf Grund ihrer dreidimensionalen Struktur als Hammerhead- (Hammerkopf-) bzw. Hairpin- (Haarnadel-) Struktur bezeichnet. Für das 246–251 Nucleotide „große“ Avocado-Sonnenflecken-Viroid (avocado sunblotch viroid, ASBV) wurde 1986 erstmals die Selbstspaltung durch Ausbildung der Hammerkopf-Struktur nachgewiesen. Für die Ausbildung einer katalytisch aktiven Hammerkopf-Struktur zur Hydrolyse der Phosphodiesterbindung sind nur wenige Nucleotide notwendig (Abb. 6.23a, b). Solche kurzen RNA-Moleküle können leicht im Labor synthetisiert werden. Diese künstlichen Ribozyme sind in der Lage, andere RNA-Moleküle spezifisch zu spalten. Hammerhead-RNAs sind ein reizvolles Forschungsgebiet. Durch In-vitro-Synthesen verschiedener Hammerhead-RNAs und gezielte Modifikationen wurden auch solche gefunden, die so komplexe Reaktionen wie die Insertion von Metallionen in Porphyrine, die Übertragung von Aminosäureresten zwischen verschiedenen RNAs oder RNAPhosphorylierungen katalysieren können. Tatsächlich sind einige HammerheadRibozyme länger und komplexer als die entsprechende Minimal-HammerheadStrukturen (Abb. 6.23c). Interessanterweise scheint die Reaktion dieses Volllängen-Hammerhead-Ribozyms unabhängig von Metallionen abzulaufen.

Kovalente Katalyse: Ausbildung von kovalenten Bindungen zwischen Enzym und Substrat. Metall-Ionen-Katalyse: Beteiligung von Metallionen bei der Katalyse dienen zur Stabilisierung geladener Übergangszustände oder Elektronenübertragung bei Redoxreaktionen Säure-Base-Katalyse: Übertragung bzw. Entfernung von Protonen am Substrat. Endopeptidasen: Spalten Peptidbindungen innerhalb einer Polypeptidkette. Exopeptidasen: Spalten Peptidbindungen am Ende einer Peptidkette. Serinproteasen: Proteinspaltende Enzyme, deren aktives Zentrum einen essentiellen Serinrest enthält. Katalytische Triade: Für den Reaktionsmechanismus essentielle Funktionseinheit aus drei Aminosäuren. Metalloproteasen: Proteasen mit einem Metallion im aktiven Zentrum zur Aktivierung eines Wassermoleküls (z. B. Carboxypeptidase A). Ribozyme: Katalytisch aktive Ribonucleinsäure (RNA).

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5 Enzymbiochemie

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Abb. 5.23 Hammerhead-RNA. a Die Hammerhead-Grundstruktur besteht aus drei Stämmen, welche Doppel-Helices mit Watson-Crick-Basenpaarungen ausbilden und am aktiven Zentrum zusammentreffen. Das Substrat (grün) wird über komplementäre Basenpaarung gebunden. Die für eine effiziente Katalyse notwendigen und daher konservierten Basen sind hervorgehoben. Die mit N bezeichneten Basen sind nicht konserviert. X steht für A, U, oder C. b Mechanismus der Selbstspaltung. Ein zweiwertiges Metallion (M2+) ist für die Katalyse essentiell. An dieses Metallion ist vermutlich ein Hydroxidion gebunden. Das Hydroxidion bildet eine Bindung zu dem 2l-Wasserstoff aus und erhöht somit die Nucleophilie des 2l-Sauerstoffs, der das Phosphoratom der Phosphodiesterbindung nucleophil angreift. Die Spaltprodukte besitzen eine freie 5l-OH-Gruppe bzw. einen 2l,3l-zyklischen Phosphorsäurediester. c Im Gegensatz zu der Minimal-Struktur ist hier besonders der Stamm I-Bereich verlängert. Die an der Katalyse unmittelbar beteiligten Nucleotide sind hervorgehoben. Diese richten das Substrat optimal für die anstehende Spaltung aus. (pdb: 2GOZ)

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6.1 Cofaktor, Coenzym oder prosthetische Gruppe?

6

219

Coenzyme

Thomas Langer

6.1

Cofaktor, Coenzym oder prosthetische Gruppe?

Coenzyme bzw. Cofaktoren sind verhältnismäßig niedermolekulare Verbindungen, sie spielen bei zahlreichen enzymatischen Reaktionen, meist Übertragungen, eine wichtige Rolle oder ermöglichen sie erst aufgrund ihrer besonderen chemischen Eigenschaften. Ihre „Frachtgröße“ bei intrazellulären Transporten bzw. Übertragungen reicht von einzelnen Elektronen bis hin zu komplexen Molekülen. Analog zum genetischen Code, finden die Coenzyme bei allen Organismen fast universelle Verwendung. Viele Coenzyme sind Nucleotidderivate. Insgesamt bilden die Coenzyme jedoch eine sehr heterogene Substanzgruppe und werden anhand der Reaktionen, an denen sie beteiligt sind, verschiedenen Gruppen zugeordnet. Als Cofaktoren werden Stoffe bezeichnet, die neben dem Apoenzym und dem Substrat zum Ablauf einer enzymkatalysierten Reaktion notwendig sind. Dies können Coenzyme oder auch Metallionen sein. Coenzyme werden im Verlauf der katalysierten Reaktion vom Enzym in stöchiometrischem Verhältnis zum Substrat gebunden und chemisch verändert. Daher wäre der Begriff „Cosubstrat “ angebrachter. Die Bezeichnung Coenzym ist jedoch geläufiger und soll deshalb auch hier verwendet werden. Meist haben Coenzyme eine Überträgerfunktion. Im Unterschied zum eigentlichen Substrat werden die Coenzyme in einem kurzen Zyklus, an dem in der Regel ein weiteres Enzym beteiligt ist, wieder regeneriert (Abb. 6.1a). Ist der Cofaktor über eine kovalente Bindung mit dem Apoenzym verbunden, so spricht man von einer prosthetischen Gruppe. Unter dem Oberbegriff prosthetische Gruppe werden allgemein Gruppen zusammengefasst, die kovalent an ein Protein gebunden sind. Hierbei muss es sich nicht immer um eine an der Katalyse beteiligte Gruppe handeln (z. B. Kohlenhydrat- oder Lipidanteil bei Glyko- bzw. Lipoproteinen). In diesem Kapitel soll der Begriff prosthetische Gruppe jedoch auf einen kovalent an ein Enzym gebundenen Cofaktor beschränkt bleiben. Die Regeneration einer prosthetischen Gruppe erfolgt im Gegensatz zu der eines Coenzyms durch Reaktion mit einem zweiten Substrat (Abb. 6.1b). Viele Organismen benötigen für die Bildung bestimmter Coenzyme Vorstufen, zu deren Synthese sie selbst nicht in der Lage sind. Diese Substanzen stellen dann sogenannte Wachstumsfaktoren oder Vitamine ( Zoologie) für die jeweiligen Organismen dar. Nach Art der Reaktion, an der sie beteiligt sind, werden die Coenzyme unterschiedlichen Gruppen zugeordnet. Die Coenzyme der Oxidoreductasen (S. 223)

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6 Coenzyme

6 Abb. 6.1 Coenzym und prosthetische Gruppe. a Die Reaktion ist ein Beispiel für eine Dehydrierung mit NAD+ als Coenzym (Cosubstrat). Das veränderte Coenzym wird durch Reaktion mit einem zweiten Enzym regeneriert. b Besitzt das Enzym eine prosthetische Gruppe (Reaktion am Beispiel einer FAD-haltigen Aminosäure-Oxidase), so wird diese am Enzym verändert und durch Reaktion mit einem zweiten Substrat regeneriert.

sind speziell für die Elektronenübertragung bei Redoxreaktionen konzipiert. Bei diesen Reaktionen werden entweder einzelne Elektronen oder Elektronen gemeinsam mit einem Proton übertragen. Coenzyme, die bei den letztgenannten Reaktionen beteiligt sind, werden häufig auch als „wasserstoffübertragend “, die entsprechenden Enzyme als Dehydrogenasen bezeichnet. Der von den Substraten abgezogene Wasserstoff wird meist auf NAD(P)+, FMN oder FAD (s. u.) übertragen. Die Bezeichnung „Reduktionsäquivalent “ ist ein synonymer Begriff für ein Elektron, welches im Verlauf einer Redoxreaktion übertragen wird. Bei gruppenübertragenden Coenzymen wird zusätzlich noch nach der Art der übertragenen Gruppe differenziert. Es gibt Coenzyme, die speziell Fragmente mit nur einem Kohlenstoffatom (C1-Fragmente) übertragen (S. 241), wobei die Oxidationsstufe des Kohlenstoffs unterschiedlich sein kann. Im Stoffwechsel werden aber auch größere Bausteine benötigt: Hierfür gibt es Coenzyme, die speziell Fragmente mit zwei oder mehr Kohlenstoffatomen übertragen (S. 247). Energiereiche Phosphorverbindungen spielen nicht nur im Energiestoffwechsel eine wichtige Rolle, sondern dienen der Zelle auch als Coenzyme, z. B. bei der Übertragung von Phosphoryl- und Sulfatgruppen, aber auch von größeren Gruppen wie Zuckermolekülen (S. 250). Auch bei den Reaktionen einiger Isomerasen, Lyasen und Ligasen sind gruppenübertragende Coenzyme beteiligt (S. 255). Eine Isomerase kann als gruppenübertragendes Enzym betrachtet werden, das eine Gruppe innerhalb eines Substrats überträgt. Tab. 6.1 gibt einen Überblick über die funktionelle Einteilung von Coenzymen und prosthetischen Gruppen.

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6.1 Cofaktor, Coenzym oder prosthetische Gruppe?

221

Cofaktoren: Neben dem Apoenzym und dem Substrat notwendige Stoffe (Coenzyme, prosthetische Gruppen, Metallionen), die für den Ablauf einer enzymatischen Reaktion essentiell sind. Coenzym: Niedermolekulare Verbindung mit der Funktion eines zweiten Substrats (Cosubstrat); übertragen Reduktionsäquivalente oder verschiedene Atomgruppen. Prosthetische Gruppe: Kovalent an ein Protein gebundener Cofaktor.

Tab. 6.1 Einteilung der Coenzyme bzw. prosthetischen Gruppen nach deren überwiegender Funktion. Coenzym bzw. prosthetische Gruppe

Übertragung von bzw. beteiligt bei

Vorstufe mit Vitamincharakter für den Menschen

1. Cofaktoren der Oxidoreductasen Nicotinamidadenindinucleotid (NAD), Wasserstoff Nicotinamidadenindinucleotid-phosphat (NADP)

Nicotinsäure bzw. Nicotinsäureamid

Flavinmononucleotid (FMN), Flavinadenindinucleotid (FAD)

Wasserstoff

Riboflavin (Vitamin B2)

Faktor 420

Wasserstoff

–

Membranständige Chinone: Ubichinon, Plastochinon, Menachinon, Phyllochinon

Wasserstoff

Proteingebundene Chinone: Pyrrolochinolinchinon (PQQ), Topachinon (TPQ), Tryptophan-TryptophylChinon (TTQ), Lysin-Tyrosyl-Chinon (LTQ)

Wasserstoff

Mena- und Phyllochinon besitzen Vitamin K-Charakter, bei Ubichinon und LTQ ist Eigensynthese möglich

Glutathion

Wasserstoff

Tetrahydrobiopterin

Wasserstoff

Eigensynthese möglich

Liponsäure

Wasserstoff, Acylgruppen

Eigensynthese möglich

FeS-Proteine

Elektronen

Eigensynthese möglich

Porphyrine: Häm, Chlorophyll, Sirohäm, Faktor430

Elektronen

Häm: Eigensynthese möglich

Eigensynthese möglich

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6 Coenzyme

Tab. 6.1 Fortsetzung. Coenzym bzw. prosthetische Gruppe

Übertragung von bzw. beteiligt bei

Vorstufe mit Vitamincharakter für den Menschen

2. Gruppenübertragende Coenzyme C1-Fragmente

6

S-Adenosylmethionin (SAM)

Methylgruppen

Eigensynthese möglich

Tetrahydrofolat (THF)

Methyl-, Formyl-, Formiminogruppen

Folat

Biotin

Carboxylgruppen

Biotin

Tetrahydromethanopterin (H4MPT)

Methyl-, Formyl-, Formiminogruppen

–

Methanofurane (MFR)

Formylgruppen

–

Cobalamin (CoB12)

Methylgruppen

Cobalamine (Vitamin B12)

Coenzym M (CoM), Coenzym B (CoB, HS-HPT)

Methylgruppen

–

Coenzym A (HS-CoA)

C2- und größere Fragmente Acylreste, meist Acetylreste

Pantothensäure

Thiamindiphosphat (TDP)

C2-Aldehydgruppen

Thiamin (Vitamin B1)

Carnitin

Acylreste

Eigensynthese möglich

andere Gruppen Adenosindiphosphat (ADP)

Phosphorylgruppe, Adenyl(AMP)-Rest, Zucker (bei Pflanzen)

Eigensynthese möglich

Phospho-Adenosin-5-phosphosulfat (PAPS)

Sulfatrest

Eigensynthese möglich

Uridindiphosphat (UDP)

Zucker und Zuckerderivate (Aminozucker, Uronsäuren)

Eigensynthese möglich

Cytidindiphosphat (CDP)

Ethanolamin, Cholin, Phosphatidsäure

Eigensynthese möglich

Pyridoxalphosphat (PLP)

Aminogruppe

Pyridoxin (Vitamin B6)

3. Coenzyme der Lyasen, Isomerasen und Ligasen Thiamindiphosphat (TDP)

Decarboxylierung

Thiamin (Vitamin B1)

Pyridoxalphosphat (PLP)

Eliminierungen am a-C-Atom von Aminosäuren

Pyridoxin (Vitamin B6)

Cobalamin (CoB12)

Isomerisierungen

Cobalamine (Vitamin B12)

Uridindiphosphat (UDP)

Isomerisierung (Zucker)

Eigensynthese möglich

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6.2 Cofaktoren der Oxidoreductasen

6.2

223

Cofaktoren der Oxidoreductasen

Oxidoreductasen sind elektronen- bzw. wasserstoffübertragende Enzyme, die für ihre Funktion Coenzyme mit jeweils speziellen Eigenschaften benötigen. Bei biologischen Redoxreaktionen gibt es neben Ein- auch Zwei-ElektronenÜbertragungen. Die Nicotinamidnucleotid-Coenzyme übertragen stets in einem Schritt zwei Elektronen gemeinsam mit einem Proton. Dies entspricht dem Transfer eines Hydrid (H–)-Ions. Im Gegensatz hierzu können die Flavinnucleotide und Chinone zwei Elektronen auch nacheinander übertragen. Zu den wasserstoffübertragenden Coenzymen zählen ferner das Glutathion, das Tetrahydrobiopterin und die Liponsäure. Die Übertragung einzelner Elektronen erfolgt durch Metalloproteine. Diese Proteine besitzen Strukturen mit Metallionen, welche bei der Elektronenübertragung die Oxidationsstufe ändern. Zu den Metalloproteinen gehören die Eisen-Schwefel-Proteine und Proteine mit Metallporphyrinen. Oxidationen sind meist mit einer großen negativen Änderung der freien Enthalpie verbunden, welche von den Organismen zur Energiegewinnung genutzt wird. Dabei wird entweder direkt ATP synthetisiert („Substratkettenphosphorylierung“, z. B. Reaktion der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, S. 277) oder indirekt durch Übertragung der Elektronen auf NAD bzw. FAD, die ihrerseits die Elektronen in die Atmungskette einspeisen (oxidative Phosphorylierung, S. 301), Energie gespeichert.

6.2.1

Nicotinamidnucleotide

Viele Oxidoreductasen verwenden als Wasserstoff-Überträger die Coenzyme Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) oder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP). NADP unterscheidet sich von NAD nur durch eine zusätzliche Phosphorylgruppe an der 2l-Stellung des Adenosins (Abb. 6.2). In der angelsächsischen Literatur werden Nicotinsäure und Nicotinsäureamid (Nicotinamid) als Niacin bzw. Niacinamid oder auch zusammenfassend als Niacin bezeichnet. In der oxidierten Form trägt der Pyridinring des Nicotinamids eine positive Ladung, weshalb häufig auch NAD+ bzw. NADP+ geschrieben wird (zu beachten ist aber, dass die Moleküle wegen der Phosphatreste insgesamt negativ geladen sind). Wenn sowohl NAD+ als auch NADP+ verwendet werden kann, schreibt man NAD(P)+. Bei Reaktionen, an denen NAD(P)+ als Elektronenüberträger beteiligt ist, handelt es sich stets um Zwei-Elektronen-Übergänge. Die Elektronenübertragung erfolgt durch den Transfer eines Hydridions vom Substrat auf das C4-Atom des Pyridinrings. Hierbei kommt es zu deutlichen Änderungen der spektroskopischen Eigenschaften (Abb. 6.3). Durch die gemeinsame Übertragung zweier Elek-

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6 Coenzyme

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Abb. 6.2 NAD+ und NADP+. Sowohl der Pyridinring des Nicotinamids als auch das Adenin sind jeweils über eine N-b-glykosidische Bindung mit der Ribose verbunden. Der quartäre Pyrimidin-Stickstoff des Nicotinamids erhält hierbei eine positive Ladung.

tronen als Hydridion wird das Entstehen radikalischer Zwischenstufen vermieden. Die Nicotinsäure und das Nicotinsäureamid (Nicotinamid) werden zu den B-Vitaminen gezählt. Für den Menschen stellen Nicotinsäure und Nicotinsäureamid aber keine eigentlichen Vitamine dar, da sie beim Abbau der Aminosäure Tryptophan gebildet werden können. Da Tryptophan aber eine essentielle Aminosäure ist, ist eine Zufuhr von Nicotinsäure bzw. Nicotinsäureamid bei tryptophanarmer Ernährung notwendig. Ein Nicotinsäureamid-Mangel äußert sich in dem Krankheitsbild der Pellagra ( Zoologie). Die De-novo-Synthese von Nicotinsäure bei Pflanzen und Bakterien geht von Aspartat und Dihydroxyacetonphosphat aus.

Die Hauptfunktion von NAD+ bzw. NADP+ liegt in der Übertragung von Elektronen innerhalb der Zellen. Als Wasserstoffdonoren dienen überwiegend primäre und sekundäre Alkohole. NAD+ fungiert vor allem im katabolen Stoffwechsel als Wasserstoffüberträger und transportiert die Elektronen zu den Enzymen der Atmungskette. Hier erfolgt schließlich die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser unter Ausbildung eines Protonengradienten über der inneren Mitochondrienmembran, dem Sitz der Atmungskette (S. 306), bzw. der Cytoplasmamembran bei Bakterien. NADPH liefert vor allem bei reduktiven Biosynthesen Elektronen (z. B. Fettsäuresynthese, Reduktion von CO2 auf die Stufe der Kohlenhydrate in der Photosynthese, S. 345, Botanik). Da das Redoxpotential für die Redox-

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6.2 Cofaktoren der Oxidoreductasen

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Abb. 6.3 Optischer Test. Die Reduktion von NAD(P)+ zu NAD(P)H ist mit einer deutlichen Änderung der spektroskopischen Eigenschaften verbunden. Es entsteht ein weiteres Absorptionsmaximum bei 340 nm. Da der Umsatz von NAD(P)+ stöchiometrisch mit dem Substratumsatz gekoppelt ist, kann die Umsatzgeschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion durch Messung der Extinktionsänderung bei 340 nm optisch direkt erfasst werden.

paare NAD+/NADH und NADP+/NADH gleich groß ist (–0,32 V), muss das Verhältnis NADP+/NADPH I 1 sein, um reduzierend zu wirken (S. 73)

6.2.2

Flavinnucleotide

Enzyme, deren Coenzyme bzw. prosthetischen Gruppen aus Riboflavin (Vitamin B2) als Vorstufe hervorgehen, werden als Flavoproteine bezeichnet. Die meisten Flavoproteine sind gelb, daher wurden die Flavoproteine auch als „gelbe Fermente“ bezeichnet, es gibt aber auch grüne, rote und braune Flavoproteine. Es werden zwei Riboflavin enthaltende Coenzyme unterschieden: das Flavinmononucleotid (FMN) und das Flavinadenindinucleotid (FAD) (Abb. 6.4). Das Grundgerüst des aromatischen Ringsystems ist das Isoalloxazin. Alloxazin besteht aus einem Pteridingerüst mit einem ankondensierten Benzolring. Pteridine sind eine im Tierreich weitverbreitete Stoffklasse. Sie kommen als Farbpigmente vor allem in den Flügeln der Schmetterlinge und in den Augen von Fischen, Amphibien und Reptilien vor. Ferner bilden sie das Grundgerüst der Coenzyme Tetrahydropteridin, Molybdopterin (s. u.) und Tetrahydrofolat (S. 241). Riboflavin wird von höheren Tieren und vom Menschen nicht selbst gebildet und muss daher mit der Nahrung aufgenommen werden ( Zoologie). Die Biosynthese von Riboflavin bei Bakterien und Pflanzen geht von GTP und Ribulose-5-phosphat aus. Sie beginnt mit der Öffnung des Imidazolrings unter Abspaltung von Formiat; der Ribitylrest entsteht durch Reduktion der Ribose. Über mehrere Reaktionen wird das Pyrimidin-Ringsystem unter Verwendung von zwei Molekülen Ribulose-5-phosphat zum Isoalloxazin-System umgebaut. Die Phosphorylierung von Riboflavin zum FMN und die anschließende Adenylierung zum FAD kann auch von höheren Tieren bzw. dem Menschen durchgeführt werden.

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6 Coenzyme

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Abb. 6.4 FMN und FAD. Der Isoalloxazinring bildet mit dem Ribitylrest das Riboflavin (Vitamin B2). Durch eine Kinase wird dieses zum FMN phosphoryliert. FMN ist kein Nucleotid im eigentlichen Sinne (S. 105), da hier anstelle eines Zuckerrestes ein Zucker-Alkohol, das Ribit, verwendet wird. Die Bezeichnung wurde wegen der offensichtlichen Ähnlichkeit jedoch beibehalten. Im Gegensatz zu FMN ist das FAD ein „echtes“ Nucleotid. Es entsteht aus FMN und ATP unter Abspaltung von Pyrophosphat (PPi) durch die FAD-Pyrophosphatase.

Im Gegensatz zu den Nicotinamidnucleotiden werden die Flavinnucleotide fest von den Enzymen gebunden. Bei einigen Flavoenzymen ist die Bindung kovalent. So ist z. B. in der Succinat-Dehydrogenase das FAD über eine Methylgruppe des Isoalloxazins mit einem Histidinrest verbunden. Die Flavinnucleotide sind die Coenzyme vieler Dehydrogenasen und Oxidasen. Sie übertragen ebenfalls zwei Elektronen. Diese werden aber meist nacheinander, unter Ausbildung einer radikalischen Semichinon-Struktur, auf das Isoalloxazin übertragen bzw. von diesem abgezogen (Abb. 6.5). Aber auch ein Hydridionen-Transfer ist möglich. Bei den Flavoproteinen hat das Apoenzym einen entscheidenden Einfluss auf die Reaktivität der gebundenen Flavinnucleotide. Viele Flavoproteine enthalten zusätzlich noch Metallionen; häufig Kupfer, Eisen oder Mangan, die vermutlich am Elektronentransport beteiligt sind. Durch den Einfluss des Apoenzyms kann das Redoxpotential der Flavinnucleotide erheblich variieren und den Anforderungen des Stoffwechsels angepasst werden:

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6.2 Cofaktoren der Oxidoreductasen

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6

Abb. 6.5 Flavinnucleotide. Mechanismus der sukzessiven Übertragung von zwei Elektronen durch Flavinnucleotide.

E0l kann Werte zwischen –0,49 und +0,08 V annehmen. Im Gegensatz hierzu beträgt das Redoxpotential des freien FAD etwa –0,22 V. Flavinnucleotide weisen ein Absorptionsmaximum bei 450 nm auf. In der reduzierten Form (FMNH2 bzw. FADH2) verschwindet diese Absorptionsbande. Die Enzymaktivität flavinhaltiger Enzyme kann, analog zu NAD(P)+, durch Messung der Absorption bei 450 nm spektroskopisch verfolgt werden.

Flavoproteine sind an zahlreichen Reaktionen beteiligt. Sie spielen eine wichtige Rolle als Elektronenüberträger in der Atmungskette (S. 300) sowie bei der Einführung von Doppelbindungen in gesättigte Kohlenwasserstoffe (z. B. bei der b-Oxidation der Fettsäuren, S. 314). Flavinnucleotide und Chinone (s. u.) können aufgrund ihrer Fähigkeit, zwei Elektronen nacheinander zu übertragen, zwischen Zwei-Elektronen-Übertragungen, z. B. von NAD(P)H, und Ein-Elektronen-Übertragungen, etwa auf Eisen-Schwefel-Proteine oder Cytochrome (z. B. in der Atmungskette), vermitteln (s. u.). Auch bei Dehydrierungen von Thiolgruppen spielen Flavinnucleotide eine wichtige Rolle (z. B. von Liponsäure im Pyruvatbzw. a-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplex, S. 292). Flavinnucleotide werden auch von zahlreichen Oxidasen (z. B. Xanthin-Oxidase, Aldehyd-Oxidase, Aminosäure-Oxidase) als Coenzyme verwendet.

6.2.3

Faktor 420

Bei dem ausschließlich bei methanogenen Archaea vorkommenden Faktor 420 (F420) handelt es sich ebenfalls um ein Flavinderivat. F420 ist in den Zellen reichlich vorhanden. Das Standard-Redoxpotential des Redoxpaares F420H2 / F420 liegt bei –0,35 V. Analog zu NAD(P)+ (E0l = –0,32 V) handelt es sich bei F420 um einen

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obligaten Hydridionen-Überträger. Methanogene Bakterien sind in der Lage, molekularen Wasserstoff (H2) direkt als Elektronendonor zu verwenden. Die Spaltung von H2 (E0l= –0,414 V) und die Übertragung der Elektronen auf einen Akzeptor wird von Hydrogenasen katalysiert. Bei einigen Hydrogenasen dient F420 als Elektronenakzeptor. Aufgrund des gegenüber NAD(P)+niedrigeren Redoxpotentials ist F420 in der Lage, die Elektronen aus der H2-Spaltung auf NAD(P)+ zu übertragen. F420 ist bei zahlreichen Elektronenübertragungen beteiligt und ist vermutlich der wichtigste Elektronenüberträger der methanogenen Bakterien ( Mikrobiologie).

6

6.2.4

Chinone

Die frei in der Membran beweglichen Chinone spielen beim Elektronentransport in der Atmungskette und bei der Photosynthese eine wichtige Rolle. In der Atmungskette dient Ubichinon (Coenzym Q, Abb. 6.6a) als Elektronenüberträger (E0l = +0,03 bis +0,06 V), während bei der Photosynthese das Plastochinon (Abb. 6.6b) eine entsprechende Funktion übernimmt ( Botanik). Ubichinone kommen in fast allen Organismen vor (lat. ubique: überall); Ausnahmen bilden lediglich grampositive Bakterien und Cyanobakterien. Einige Bakterien z. B. Rhodopseudomonas viridis verwenden neben dem Ubichinon Naphthochinone (2-Methyl-1,4-naphtochinone, Menachinone) (Abb. 6.6c). Über den Isoprenylrest, der

Abb. 6.6 Membranständige Chinone. Die Anzahl der Isopreneinheiten wird hinter dem Chinon angegeben. a Ubichinon, b Plastochinon und c Menachinon. Die Elektronenübertragung ist am Beispiel von Ubichinon-6 dargestellt. Die Bezeichnung Chinol für die reduzierte Form (Hydrochinon) deutet auf die Hydroxylgruppen hin. d Struktur der Baueinheit der Isoprenylseitenkette, dem Isopren bzw. dem Prenylrest.

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6.2 Cofaktoren der Oxidoreductasen

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von Spezies zu Spezies unterschiedlich lang sein kann, werden die Chinone in der Membran verankert und bilden dort einen Pool von Reduktionsäquivalenten. Membranständige Chinone wie Ubichinon oder Menachinon kommen bei methanogenen Bakterien nicht vor. Bei diesen Organismen übernimmt Methanophenazin den Transport von Elektronen zwischen membrangebundenen Enzymen ( Mikrobiologie). Im Photosystem I der Chloroplasten dient vermutlich ein Phyllochinon (2-Methyl-3-phytyl-1,4-naphtochinon, Vitamin K, Zoologie) als zweiter ElektroBotanik). Im Unterschied nenüberträger nach der Photooxidation von P700 ( zu den Menachinonen besitzt Phyllochinon einen Phytyl- anstelle eines Isoprenrestes. Menachinone und Phyllochinone sind für den Menschen als Vitamin K von Bedeutung. Neben den membranständigen Chinonen gibt es auch Cofaktoren mit Chinonstruktur, welche sehr fest bzw. kovalent an die entsprechenden Enzyme gebunden sind. Diese Proteine werden zusammenfassend auch als Chinoproteine (quinoproteins) bezeichnet (Abb. 6.7).

Abb. 6.7 Nicht membranständige Chinone. a Pyrrolochinolon-Chinon (PQQ) ist das einzige nicht kovalent gebundene Chinon. Das Vorkommen von PQQ ist auf Prokaryoten beschränkt. b Topachinon (TPQ) leitet sich von der Aminosäure Tyrosin ab. Es kommt in den kupferhaltigen Amin-Oxidasen bei Bakterien, Hefen, Pflanzen und Tieren vor. c Tryptophan-Tryptophyl-Chinon (TTQ) entsteht durch Konjugation von zwei Tryptophanresten und kommt bei bakteriellen Dehydrogenasen vor. d Lysin-Tyrosyl-Chinon (LTQ) leitet sich von den Aminosäuren Lysin und Tyrosin ab und wurde bei der kupferhaltigen Lysyl-Oxidase beschrieben. LTQ scheint der einzige Cofaktor bei Säugern zu sein, der durch das Crosslinking zweier Aminosäurereste entsteht. Die Chinonstrukturen sind hervorgehoben.

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Alle Organismen, in denen Ubichinone vorkommen, sind zu deren Synthese fähig. Bei Bakterien geht der Reaktionsweg von Phosphoenolpyruvat und Erythrose-4-phosphat aus und verläuft über Chorismat. Chorismat ist ein wichtiges Stoffwechselintermediat; auch die Bildung der aromatischen Aminosäuren bzw. von 4-Aminobenzoat (S. 243) verlaufen über diese Verbindung. Bei Pflanzen und Tieren beginnt der Reaktionsweg bei 4-Hydroxyphenylpyruvat, dem Desaminierungsprodukt von Tyrosin. Die Menachinonund Phyllochinonsynthese geht ebenfalls von Chorismat aus; zusätzlich wird a-Ketoglutarat zur Bildung des Naphtolringes benötigt. Plastochinon wird bei Pflanzen ausgehend von Homogentisat, einem Abbauprodukt von Tyrosin, synthetisiert.

6

6.2.5

Glutathion

Glutathion (g-L-Glutamyl-L-cysteinylglycin, E0l = –0,23 V) ist ein Tripeptid mit einer freien SH-Gruppe und wird nicht an den Ribosomen, sondern von zwei speziellen Synthetasen aus den Aminosäuren Glutamat, Cystein und Glycin gebildet. Glutathion übernimmt in der Zelle vielfältige Aufgaben. Eine Funktion besteht darin, Cysteinreste cytosolischer Proteine im reduzierten Zustand zu halten. Die reduzierte Form des Glutathions (GSH) wird hierbei zu Glutathiondisulfid (GSSG) oxidiert (Abb. 6.8). Innerhalb der Zellen beträgt das Verhältnis GSH : GSSG etwa 100 : 1. GSH verleiht den Zellen ferner Schutz gegenüber Peroxiden. Diese Reaktion wird durch die selenhaltige Glutathion-Peroxidase katalysiert. Glutathion-Peroxidase besitzt eine recht breite Substratspezifität und vermag zahlreiche Peroxide nach der Gleichung 2 GSH + R-OOH p GSSG + R-OH + H2O umzusetzen. Durch diese Reaktion werden auch Hydroperoxide mehrfach ungesättigter Fettsäuren (diese können besonders leicht durch H2O2 bzw. Hyperoxid oder Perhydroxid oxidiert werden) und der Nucleinsäuren reduziert. Glutathion und Glutathion-Peroxidase kommen besonders reichlich in den Erythrocyten vor

Abb. 6.8 Glutathion. Oxidiertes Glutathiondisulfid (GSSG) entsteht bei der Oxidation von zwei reduzierten Glutathion (GSH).

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6.2 Cofaktoren der Oxidoreductasen

231

und dienen hier der Aufrechterhaltung der Integrität der Erythrocytenmembran ( Zoologie). GSSG wird durch die Glutathion-Reductase mit NADPH als Reduktionsmittel wieder zu GSH reduziert: GSSG + NADPH + H+ p 2 GSH + NADP+ In eukaryotischen Zellen werden durch Glutathion-Transferasen, die ebenfalls eine breite Substratspezifität aufweisen, zahlreiche Substanzen über die freie SH-Gruppe unter Ausbildung einer Thioetherbindung an Glutathion gekoppelt und die GlutathionS-Konjugate durch spezielle Transporter aus den Zellen ausgeschleust. Diese Reaktionen spielen in der Leber eine wichtige Rolle bei der Entgiftung des Organismus. Aber auch unkonjugiertes GSH wird von der Leber in die Galle und das Blut abgegeben. GSH fungiert hier als Transport- und Speicherverbindung für die Aminosäure Cystein. Extrazelluläres GSH dient ebenfalls dem Schutz der Zellen gegenüber Peroxiden und freien Radikalen.

6.2.6

Tetrahydrobiopterin

Tetrahydrobiopterin (BH4) dient als wasserstoffübertragendes Coenzym bei der Hydroxylierung z. B. der Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan. Phenylalanin wird durch die Monooxygenase Phenylalanin-Hydroxylase zu Tyrosin umgesetzt (Abb. 6.9). Eine verminderte Synthese bzw. Regenerierung von Tetrahydrobiopterin führt ebenso wie ein Defekt in dem Gen für die Phenylalanin-Hydroxylase zum Krankheitsbild der Phenylketonurie (PKU). Zusätzlich bedingt ein Tetrahydrobiopterinmangel neurologische Störungen, da auch die Synthese der Neurotransmitter Serotonin und Dopamin sowie der Hormone Adrenalin und Noradrenalin vermindert ist. Tryptophan ist die Vorstufe von Serotonin; Adrenalin bzw. Noradrenalin werden über Dopamin aus Tyrosin gebildet ( Zoologie). Die Synthese von Tetrahydrobiopterin ist vermutlich nur auf Tiere beschränkt und verläuft von GTP ausgehend über drei enzymatische Umsetzungen.

6.2.7

Liponsäure

Die Liponsäure (Thioctansäure, E0l = –0,29 V) wurde ursprünglich als Wachstumsfaktor für verschiedene Mikroorganismen entdeckt, kann aber von den meisten Organismen selbst gebildet werden. Ausgangsstoffe für die Biosynthese von Liponsäure sind die Caprylsäure (Octansäure), ein Intermediärprodukt im Fettsäurestoffwechsel, und Cystein, aus dem der Schwefel stammt. In den Zellen kommt die Liponsäure jedoch nicht frei vor, sondern sie ist durch eine Amidbindung über einen Lysinrest an das jeweilige Protein gebunden (Liponamid) (Abb. 6.10). Liponamid ist z. B. die prosthetische Gruppe des Pyruvat-Dehydrogenasebzw. des a-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes (S. 292). Bei den Reaktionen dieser Enzyme handelt es sich um oxidative Decarboxylierungen. Die Oxidation ist mit einer Gruppenübertragung gekoppelt. Hierbei wird das Substrat auf Liponamid übertragen, innerhalb des Enzymkomplexes weitergereicht und schließ-

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Abb. 6.9 Tetrahydrobiopterin. Reaktionszyklus von Tetrahydrobiopterin (BH4) am Beispiel der Hydroxylierung von Phenylalanin. Tetrahydrobiopterin entsteht aus Dihydrobiopterin, die Reduktion wird von der NADPH-abhängigen Dihydrofolat-Reductase katalysiert. Die bei der Hydroxylierung von Phenylalanin entstehende chinoide Form wird anschließend durch die NADH-abhängige Dihydropterin-Reductase zu Tetrahydrobiopterin regeneriert. Bei der Hydroxylierung von Tyrosin und Tryptophan wird ebenfalls BH4 benötigt.

Abb. 6.10 Liponamid und Dihydroliponamid.

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6.2 Cofaktoren der Oxidoreductasen

233

lich auf Coenzym A (S. 248) übertragen. Bei der Reaktion wird das Liponamid zum Dihydroliponamid reduziert. Die Oxidation zum zyklischen Disulfid erfolgt durch ein Flavoprotein, die Dihydrolipoyl-Dehydrogenase.

6.2.8

Metallionen als Cofaktoren

Auch einzelne Metallionen können als Cofaktoren dienen, z. B. Cu2+ in der Cytochrom c-Oxidase oder Zn2+ in der Carboanhydrase. Häufig sind die Metallionen jedoch mit einer weiteren Verbindungen assoziiert, etwa Fe2+ im Komplex mit einem Porphyrin bei den Cytochromen oder Molybdän mit Molybdopterin (s. u.). In Tab. 6.2 sind einige Beispiele für Enzyme aufgeführt, die Metallionen für ihre Aktivität benötigen.

Tab. 6.2 Enzyme mit Metallionen als Bestandteil bzw. Cofaktor im aktiven Zentrum. Element

Enzym

Reaktionstyp

Co

Methylmalonyl-CoA-Mutase Tetrahydrofolat-Dehydrogenase

Isomerisierung Redoxreaktion

Cu

Cytochrom c-Oxidase Amin-Oxidase

Redoxreaktion Redoxreaktion

Fe

Aconitase Katalase Cytochrom c-Oxidase

Elimination von H2O Redoxreaktion Redoxreaktion

Mn

Pyruvat-Carboxylase

Carboxylgruppen-Übertragung Redoxreaktion

Photosystem II Mo

Nitrogenase (Mo-abhängig) Xanthin-Oxidase

Redoxreaktion Redoxreaktion

Ni

Urease Hydrogenase Kohlenmonoxid-Dehydrogenase

Hydrolyse von Harnstoff Redoxreaktion Redoxreaktion

V

Nitrogenase (V-abhängig) Bromoperoxidase

Redoxreaktion Redoxreaktion

W

Aldehyd-Oxidoreductase Formiat-Dehydrogenase

Redoxreaktion Redoxreaktion

Zn

alkalische Phosphatase Alkohol-Dehydrogenase Carboanhydrase

Hydrolytische Spaltung Redoxreaktion Elimination von H2O

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6.2.9

Eisen-Schwefel-Cluster

In allen lebenden Zellen kommen Proteine mit Eisen-Schwefel-Gruppen (FeSCluster, Abb. 6.11) als Cofaktoren vor. In diesen Clustern sind Eisenionen mit anorganischem Schwefel (Sulfidionen, S2-) zu käfigartigen Strukturen verbunden. Die Eisenionen sind mit dem Protein über organischen Schwefel (Cysteinreste) verbunden. Proteine mit FeS-Cluster werden auch als Eisen-SchwefelProteine bezeichnet. FeS-Cluster haben unterschiedliche Funktionen; meist dienen sie jedoch der Elektronenübertragung: Hierbei wechseln die Eisenionen zwischen den Oxidationsstufen +2 (Eisen [II], Ferro-Form) und +3 (Eisen [III], Ferri-Form). Bei der Oxidation bzw. Reduktion der Cluster ändert sich jeweils nur deren Formalladung, nicht aber ihre Struktur. Einige Eisen-Schwefel-Proteine sind speziell für die Elektronenübertragung „maßgeschneidert“. Bei diesen als Ferredoxine bezeichneten Proteinen handelt es sich um relativ kleine Proteine mit einer Molekularmasse zwischen 6 und 30 kDa. Auch bei den Ferredoxinen ist das Redoxpotential stark von der Proteinkomponente abhängig (vgl. Flavoproteine). Die meisten Ferredoxine weisen ein starkes negatives Redoxpotential auf (zwischen –0,2 und –0,6 V), jedoch wurden in einigen Bakterien auch Eisen-Schwefel-Proteine mit einem Redoxpotential von +0,35 V (high potential ironsulfur protein, HiPIP) beschrieben. Ferredoxine sind bei zahlreichen Redoxreaktionen in Bakterien ( Mikrobiologie), den Reaktionen der Photosynthese ( Botanik) ) sowie bei den Cytochrom P450-abhängigen Hydroxylierungen (s. u.) beteiligt. Durch Sauerstoff werden FeS-Cluster leicht oxidiert und damit die entsprechenden Enzyme inaktiviert. Die Oxidation eines FeS-Clusters kann aber auch eine Aktivierung bedeuten. Beispielsweise ist die Oxidation von [Fe2S2]1+ p [Fe2S2]2+ durch Sauerstoff an

Abb. 6.11 Verschiedene FeS-Cluster. a, b FeS-Cluster kommen meist in der Stöchiometrie Fe2S2 oder Fe4S4 vor. c Bei Bakterien sind auch Cluster vom Typ Fe1S0 und Fe3S4 identifiziert worden. Bei Fe1S0 ist das Eisenion nur mit dem Cystein-Schwefel koordiniert; das Fe3S4-Cluster entspricht bis auf ein fehlendes Eisenion in der Struktur dem Fe4S4-Cluster. Beachte die negative Ladung des anorganischen (Disulfid-) Schwefels.

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6.2 Cofaktoren der Oxidoreductasen

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dem Protein SoxR von E. coli der Auslöser für die Aktivierung von Schutzmechanismen gegenüber Hyperoxid (O2–). In solchen Fällen spricht man auch von einer Sensorfunktion der FeS-Cluster. Eisen-Schwefel-Cluster dienen auch als Sensoren für Eisen, Hyperoxid und auch für Stickstoffmonoxid (NO). Die intrazelluläre Eisenkonzentration eukaryotischer Zellen wird durch das Protein IRP (iron regulatory protein) reguliert. Bei ausreichender Eisenversorgung bildet IRP ein Fe4S4-Cluster aus. Bei Eisenmangel bzw. oxidativem Stress kann der Fe4S4-Cluster nicht gebildet werden. In diesem Zustand bindet IRP jedoch an zwei mRNA und sorgt damit für einen Eisennachschub aus dem Blut in die Zellen: Die mRNA für Ferritin, ein eisenspeicherndes Protein, und die mRNA für den Transferrin-Rezeptor (TR, Transferrin ist ein eisentransportierendes Protein im Blut). Die Bindung von IRP stabilisiert die TR-mRNA, sodass einerseits verstärkt Transferrin-Rezeptoren gebildet werden, während andererseits die Bindung von IRP an die Ferritin-mRNA die Translation Genetik). IRP wurde als die Apoform der cytosolischen Aconivon Ferritin verhindert ( tase identifiziert. Aconitase katalysiert die Isomerisierung von Citrat zu cis-Aconitat bzw. Isocitrat. Für diese Reaktion ist ein FeS-Cluster zur Substratbindung notwendig, eine Änderung der Oxidationszustände kommt hierbei nicht vor. Der Aconitase-FeS-Cluster ist sehr sensitiv gegenüber Oxidation (z. B. durch Sauerstoffradikale). Dies führt zur Inaktivierung der enzymatischen Funktion und gleichzeitig zur Aktivierung der RNA-Bindungseigenschaft. Durch den reversiblen Funktionswechsel besteht eine direkte Regulationsmöglichkeit des Eisenhaushalts in Abhängigkeit von der aktuellen Stoffwechsellage ohne die Notwendigkeit einer Genaktivierung bzw. Proteinsynthese. Eisen-Schwefel-Proteine sind aus evolutionärer Hinsicht vermutlich sehr alte Proteine. Für diese Annahmen spricht z. B. das Vorkommen von anorganischem Schwefel, der in der Erdatmosphäre mit Sicherheit reichlich vorhanden war ( Ökologie, Evolution). Eine Theorie zur Evolution des Stoffwechsels (Wächtershäuser, 1988) nimmt an, dass erste „Stoffwechsel“-Reaktionen an Pyrit (FeS2)-Oberflächen stattgefunden haben. Die Elektronen zur Reduktion von Kohlenstoff (als CO2 oder CO) könnten aus der Reaktion Fe2+ + 2 H2S p FeS2 + 4 H+ + 2 e– stammen. Durch die Bildung von unlöslichem Pyrit wird das Gleichgewicht auf die Seite der Produkte verschoben. Auch aus thermodynamischer Sicht scheint dies plausibel. Ein weiterer Hinweis auf das Alter der EisenSchwefel-Proteine ergibt sich aus deren Vorkommen in der Natur: Sie sind ausschließlich auf Prokaryoten sowie Mitochondrien und Chloroplasten beschränkt. Nach der Endosymbionten-Theorie haben sich die Mitochondrien und Chloroplasten aus Purpurbzw. Cyanobakterien entwickelt, die mit einer eukaryotischen Vorläuferzelle eine SymÖkologie, Evolution). biose eingegangen sind (

6.2.10

Molybdopterin

Bei fast allen molybdänhaltigen Proteinen (Ausnahme: Nitrogenase) liegt das Molybdänion assoziiert mit einem Cofaktor, dem Molybdopterin (MPT, Abb. 6.12), vor. Molybdopterin besitzt ein Pteridin-Ringsystem, welches auch bei Tetrahydrobiopterin (s. o.) und Tetrahydrofolat (S. 241) vorkommt. Als Molybdän-Cofaktor (Mo-Co) bezeichnet man den Komplex zwischen Molybdän und MPT. In dieser Form wird der Mo-Co in das Enzym eingebaut. Bei den von diesen Enzymen katalysierten Reaktionen handelt es sich meist um Sauerstoff-Übertragungen vom allgemeinen Typ: RH + H2O m ROH + 2 H+ + 2 e–. MPT-haltige Enzyme sind weit verbreitet. Beispiele für MPT-haltige Enzyme in Säugetieren sind die Xanthin-Oxidase, die Aldehyd-Oxidase und die Sulfit-Oxidase. Bei eini-

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Abb. 6.12 Molybdän-Cofaktor. Molybdopterin (MPT) und Molybdän bilden zusammen den Molybdän-Cofaktor. X steht für ein Schwefel- bzw. Sauerstoffatom oder ein zweites MPT. Bei Bakterien ist das Molybdän häufig mit zwei MPT verbunden, außerdem bilden Bakterien häufig Dinucleotide mit MPT. Hierbei wird meist ein Guanyl(GMP)- oder Adenyl(AMP)-Rest von GTP bzw. ATP unter Abspaltung von PPi auf die Phosphorylgruppe des MPTs übertragen.

gen thermophilen Mikroorganismen ist das Molybdän durch Wolfram ersetzt, z. B. bei der Aldehyd-Ferredoxin-Oxidoreductase aus Pyrococcus furiosus. Die Synthese von MPT geht von GTP aus und kann von den entsprechenden Organismen selbst durchgeführt werden.

6.2.11

Metallporphyrine als Cofaktoren

Das Porphyrin-System ist in der Natur weit verbreitet. Das Grundgerüst der Porphyrine ist das zyklische Tetrapyrrol Porphin. In der belebten Welt kommen die Porphyrine in unterschiedlich reduzierter Form, mit variablen Seitenketten (z. B. Methyl-, Acetyl-, Propionyl-, Formyl-, Vinylreste) sowie verschiedenen Zentralatomen vor (Abb. 6.13). Bei der Porphyrin-Biosynthese kann die Bildung des Zwischenproduktes 5-Aminolävulinat über zwei verschiedene Synthesewege erfolgen: Bei Pflanzen, Archaea und den meisten Bacteria geht die Reaktion von Glutamat aus, während bei Säugetieren, Vögeln und einigen Mitgliedern der Bacteria Succinyl-CoA und Glycin als Ausgangssubstanzen dienen. Im weiteren Verlauf werden zwei Moleküle 5-Aminolävulinat zu Porphobilinogen, das einen Pyrrolring enthält, kondensiert. Die Kondensation von vier Molekülen Porphobilinogen ergibt das zyklische Tetrapyrrol Uroporphyrinogen III. Ab diesem Punkt trennen sich die Synthesewege für Häm bzw. Cytochrome und Chlorophylle von dem Syntheseweg für Sirohäm, Cobalamin und F430 (s. u.). Die Reaktionsschritte der Chlorophyllsynthese verlaufen bei Pflanzen und Bakterien ähnlich.

Als Häm (griech. haima: Blut) werden allgemein Komplexe von Porphyrinen mit Eisenionen bezeichnet. Hämproteine sind Proteine mit einem Häm als prosthetischer Gruppe. Zwei für Säugetiere wichtige Hämproteine sind das Hämoglobin und das Myoglobin (S. 146). Bei den sauerstofftransportierenden Hämproteinen kommt es im Rahmen ihrer physiologischen Funktion nicht zu einem Wechsel der Oxidationsstufe des Eisens; eine Oxidation zur dreiwertigen Form führt zum Funktionsverlust.

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6.2 Cofaktoren der Oxidoreductasen

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Abb. 6.13 Zyklische Tetrapyrrole. a Nomenklatur des Porphin-Grundgerüsts. Die alte Bezeichnung geht auf Hans Fischer zurück, der in den 20er- und 30er-Jahren die Strukturen von Häm und Chlorophyll aufklärte. b Die Grundstrukturen der Porphyrine unterscheiden sich vor allem im Hydrierungsgrad. Bereiche konjugierter Doppelbindungen sind hervorgehoben.

Bei den Cytochromen (griech. chroma: Farbe; viele Cytochrome absorbieren im sichtbaren Wellenlängenbereich und erscheinen farbig) ist der Wechsel der Oxidationsstufe des Eisenions eine Voraussetzung für deren Funktion, den Elektronentransport. Sie kommen vor allem in der Atmungskette und in den Komplexen des Photosyntheseapparates vor (S. 301, Botanik, Mikrobiologie). Das Redoxpotential der Hämgruppen in den Cytochromen wird stark durch den Proteinanteil bestimmt. Besonders hervorzuheben ist das Cytochrom c. Nahezu alle Organismen, die eine Atmungskette besitzen, verfügen über Cytochrom c. Es dient in der Atmungskette dem Elektronentransport (E0 = +0,254 V). Das Cytochrom c des Menschen besteht aus 104 Aminosäuren mit einer Molekularmasse von 12,4 kDa. Ein Vergleich der Sequenzen und räumlichen Strukturen von über 100 verschiedenen Organismen hat ergeben, dass sich Cytochrom c im Verlauf von 1,5 Milliarden Jahren Evolution nur wenig geändert hat. Die Hämgruppe in Cytochrom c ist über zwei Cysteine kovalent mit dem Proteingerüst verknüpft (Abb. 6.14). Cytochrome kommen nicht nur in den Elektronentransportketten der Atmungskette vor. Eine bedeutende Familie von Hämproteinen sind die Cytochrome P450. Bei diesen bei Eukaryoten weitverbreiteten Proteinen besitzt das Eisen der Hämgruppe ein Thiolat als 5. Liganden. Im Komplex mit Kohlenmonoxid weisen die Cytochrome P450 eine cha-

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6 Coenzyme

Abb. 6.14 Cytochrom c. Häm c ist über zwei Cysteine kovalent mit dem Proteingerüst verbunden. His18 und der Schwefel von Met80 besetzen die verbleibenden Koordinationsstellen des Eisenions. Eine Anlagerung weiterer Liganden, z. B. O2 oder von Stoffwechselgiften wie CN– oder CO ist somit nicht möglich. (pdb: 5CYT) rakteristische Absorptionsbande bei 450 nm auf, die für die Proteinfamilie namensgebend wurde. Cytochrome P450 sind membranständige Proteine. Sie wirken als Monooxygenasen und katalysieren Reaktionen vom allgemeinen Typ: RH + O2 + NAD(P)H + H+ p ROH + H2O + NAD(P)+. Bei R handelt es sich meist um einen lipophilen Rest. In den eukaryotischen Zellen befinden sich diese Cytochrome vor allem in den Membranen des endoplasmatischen Retikulums. Als Elektronendonor dient hier ein Flavoprotein (NADP-Ferrihämoprotein-Reductase), welches die Elektronen von NAD(P)H übernimmt und nacheinander auf die Hämgruppe bzw. das Substrat überträgt. Cytochrom P450-Hydroxylasen sind in der Leber der Säugetiere an zahlreichen Entgiftungsreaktionen, vor allem bei den sogenannten Phase-I-Reaktionen, beteiligt. Bei den Phase-I-Reaktionen werden Substanzen oxidativ, reduktiv oder hydrolytisch verändert. Diese Umwandlungsreaktionen werden auch als Biotransformation bezeichnet. Aufgrund der durch die Cytochrom P450-Hydoxylasen eingeführten Hydroxylgruppen wird das Substrat hydrophiler und kann in den sogenannten Phase-II-Reaktionen mit hydrophilen Stoffen, z. B. Glucuronat, Acetat oder Sulfat, gekoppelt werden. Bei den Phase-II-Konjugaten ist die Hydrophilie gegenüber dem Ausgangsstoff stark erhöht, sodass diese über die Niere ausgeschieden werden können. In einigen Fällen werden die Substanzen durch die Phase-Iund Phase-II-Reaktionen überhaupt erst aktiviert (Giftungsreaktion). Bei Pflanzen und einigen Mikroorganismen spielen die Enzyme der Cytochrom P450-Familie eine wichtige Botanik). Rolle im Sekundärstoffwechsel (

Chlorophylle (griech. chloros: grün, phyllon: Blatt) sind die Blattpigmente höherer Pflanzen, Grünalgen und einiger Bakterien (Bakteriochlorophylle, Abb. 6.15). Das Porphyringerüst unterscheidet sich in einigen Punkten gegenüber dem Porphyringerüst des Häms: Chlorophylle besitzen als Zentralion ein Magnesiumion, ihre Porphyrinstruktur ist gegenüber dem Häm weiter reduziert und sie tragen am Pyrrolring II zudem einen Cyclopentanonring. Chlorophylle sind an Ring IV mit einem langkettigen Diterpenalkohol verestert. Das Porphyringerüst ohne das zentrale Magnesiumion wird als Phäophytin bezeichnet. Chlorophylle und Phäophytine sind die lichtabsorbierenden Komponenten des Photosyntheseapparates.

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Abb. 6.15 Chlorophylle. Für die Chlorophylle ist das zentrale Mg2+-Ion sowie der reduzierte Ring D charakteristisch.

Bei der Photosynthese ( Botanik, Mikrobiologie, S. 339) werden bestimmte Chlorophyllmoleküle so stark angeregt, dass sie ein Elektron abgeben. Diese Elektronen werden über eine Redoxkette letztlich auf NADP+ übertragen, das zu NADPH reduziert wird. Bei Pflanzen und Cyanobakterien wird das Elektronendefizit des Chlorophylls durch die Oxidation von Wasser und die Übertragung der Elektronen auf das Chlorophyll ausgeglichen. Sirohäme kommen als prosthetische Gruppen in den pflanzlichen und bakteriellen Nitrit- und Sulfit-Reductasen vor. Sirohäme unterscheiden sich vom Häm vor allem durch die teilweise gesättigten Ringe C und D (Abb. 6.13). Bei der assimilatorischen Nitrit-Reduktion wird Nitrit (NO2–) zu Ammoniak (NH3) reduziert, der dann für den Einbau in Aminosäuren zur Verfügung steht. Die Sulfit-Reductase katalysiert die Reduktion von Sulfit (SO32–) zu Schwefelwasserstoff (H2S). In dieser Form kann der Schwefel zur Synthese der Aminosäure Cystein verwendet werden. Diese Reaktionen sind für die Stickstoff- bzw. Schwefelassimilation von großer Bedeutung ( Mikrobiologie). Faktor 430 (F430) kommt nur in methanbildenden (methanogenen) Bakterien als prosthetische Gruppe der Methyl-Coenzym-M-Reductase vor. F430 ist ein Porphyrinoid mit einem Nickelion als Zentralion. An der Methanbildung sind zwei weitere Coenzyme unmittelbar beteiligt, die ebenfalls nur bei methanogenen Bakterien vorkommen: Coenzym M und Coenzym B (zur Struktur der Coenzyme Mikrobiologie). Im Verlauf der Methanbildung erfolgt ein nucleophiler Angriff des Nickelions auf die an CoM gebundene Methylgruppe. Hierbei entsteht eine metallorganische Verbindung zwischen der Methylgruppe und dem Nickelion (S. 259, Reaktion von Cobalamin).

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6 Coenzyme

Nicotinamidnucleotide: Enthalten Nicotinsäureamid, übertragen ein Hydridion, nicht enzymgebunden. Reduzierte und oxidierte Form besitzen unterschiedliche Absorptionsspektren. NAD dient überwiegend als Elektronenüberträger im katabolen Stoffwechsel. NADP dient überwiegend als Elektronenüberträger im anabolen Stoffwechsel. Redoxpotential beider Formen –0,32 V. Flavinnucleotide: Flavinadenindinucleotid (FAD) und Flavinmononucleotid (FMN), enthalten Riboflavin (Vitamin B2), fest, aber nicht immer kovalent, an ein Enzym gebunden. Übertragung von zwei Reduktionsäquivalenten (Hydridionen-Transfer möglich). Können zwischen Ein- und Zwei-Elektronen-Übergängen vermitteln, reduzierte und oxidierte Form besitzen unterschiedliche Absorptionsspektren. Redoxpotential durch Apoenzyme beeinflussbar. Faktor 420: Flavinderivat der methanogenen Archaea, Hydridionen-Überträger, Redoxpotential –0,35 V. Chinone: Sukzessive Übertragung von zwei Reduktionsäquivalenten. – Ubichinon und Menachinon: Elektronenüberträger in der Atmungskette; in der Membran frei beweglich. – Plastochinon und Phyllochinon: Elektronenüberträger bei der Photosynthese; in der Membran frei beweglich. Chinoproteine: Enzymgebundene Chinon-Cofaktoren. Glutathion (GSH): Tripeptid mit freier SH-Gruppe, beteiligt an der Aufrechterhaltung des reduzierenden Milieus in der Zelle. Coenzym der Glutathion-Peroxidase (Schutz gegenüber Peroxiden). Kopplung verschiedener Substanzen an Glutathion zum Zwecke des Austransportes aus der Zelle bei Eukaryoten. Tetrahydrobiopterin (BH4): Wasserstoffüberträger bei Hydroxylierungen von aromatischen Aminosäuren. Liponsäure: Über einen Lysinrest an ein Protein gebunden (Liponamid). Fungiert als Coenzym bei oxidativen Decarboxylierungen. Eisen-Schwefel-Cluster (FeS-Cluster): Charakteristischer Bestandteile der EisenSchwefel-Proteine. Käfigartige Strukturen aus Eisen- und Sulfidionen. Als Cofaktor bei Redoxreaktionen Übertragung eines Elektrons. Teilweise Sensorfunktion für bestimmte Substanzen, evolutiv sehr alte Strukturen. Molybdopterin: Bildet zusammen mit einem Molybdänion den Molybdän-Cofaktor (Mo-Co). Cofaktor verschiedener Oxidasen. Metallporphyrine: Cofaktoren aus einem Porphinderivat mit einem zentralen Metallion. Häm: Komplex von Porphyrin mit Eisenion. Hämproteine: Proteine mit Hämgruppen. Bei sauerstofftransportierenden Hämproteinen erfolgt keine Änderung der Oxidationsstufe des Eisens. Cytochrome: Hämproteine, bei deren Reaktionsverlauf eine Änderung der Oxidationsstufe des Eisens erfolgt. Funktion: Elektronentransport. Chlorophylle: Komplexe von Porphyrinen mit Magnesiumionen. Funktion: Lichtabsorption bei der Photosynthese. Phäophytin: Porphyringerüst der Chlorophylle ohne zentrales Magnesiumion. Sirohäme: Komplexe von teilweise gesättigten Porphyrinen mit Eisenionen. Funktion: Cofaktoren der Nitrit- und Sulfit-Reductasen bei Pflanzen und Bakterien. Faktor 430: Komplex eines Porphyrinoids mit einem Nickelion. Funktion: Cofaktor der Methyl-Coenzym-M-Reductase in methanogenen Archaea.

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6.3 Coenzyme für den Transfer von C1-Fragmenten

6.3

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Coenzyme für den Transfer von C1-Fragmenten

Die Übertragung von Molekülfragmenten spielt im Stoffwechsel eine zentrale Rolle. Jedes Nahrungsmolekül, das von einer Zelle aufgenommen wurde, wird zunächst in „handlichere“ Fragmente zerlegt. Aus diesen „standardisierten“ Fragmenten werden dann wieder neue Moleküle aufgebaut. Für die Übertragung von Molekülgruppen mit einem Kohlenstoffatom (C1-Fragmente) werden S-Adenosylmethionin, Tetrahydrofolat, Biotin und Cobalamin verwendet. Im Verlauf des Stoffwechsels werden ständig neue Verbindungen auf- und abgebaut. Je nach der Oxidationsstufe des Kohlenstoffatoms können folgende Coenzyme zur Übertragung verwendet werden: x CH (Methylgruppe). Übertragung durch S-Adenosylmethionin, Tetrahydro3 folat und Cobalamin (S. 259). x CH OH (Hydroxymethylgruppe). Übertragung durch Tetrahydrofolat. 2 x CHO (Formylgruppe). Übertragung durch Tetrahydrofolat. x COOH (Carboxylgruppe). Übertragung meist durch Biotin.

6.3.1

S-Adenosylmethionin

S-Adenosylmethionin (SAM) ist der meistverwendete Überträger von Methylgruppen im Stoffwechsel. SAM entsteht durch Übertragung der Aminosäure Methionin auf ATP (s. Abb. 6.23b). Die Methylgruppe ist in SAM über eine reaktive Sulfoniumstruktur gebunden. Die hierdurch aktivierte Methylgruppe besitzt gegenüber der Thioetherstruktur im Methionin ein beträchtlich höheres Gruppenübertragungspotential. Als Akzeptoren der Methylgruppe von SAM dienen vor allem Aminogruppen. Weitere Beispiele für Methylierungen durch SAM sind die Umwandlung von Phosphatidylethanolamin in Phosphatidylcholin, die Synthese von Kreatin aus Guanidinoessigsäure sowie die Methylierungen bestimmter Nucleotide in der DNA zur Abgrenzung zelleigener gegenüber zellfremder DNA (Abb. 6.16).

6.3.2

Tetrahydrofolat

Tetrahydrofolat (5,6,7,8-Tetrahydropteroyl-L-glutamat, THF, FH4, H4Folat) ist Überträger zahlreicher C1-Fragmente unterschiedlicher Oxidationsstufen im Stoffwechsel. Tetrahydrofolat ist die reduzierte Form des Folats (N-Pteroyl-l-glutamat, PteGlu, Abb. 6.17a), einer Verbindung, die von Säugetieren nicht synthetisiert werden kann und daher als Vitamin über die Nahrung aufgenommen werden muss. Folat besteht aus einem Pterin, welches über 4-Aminobenzoesäure mit einem oder mehreren (bei Säugern bis zu 6) Glutamatresten verbunden ist. Die weiteren Glutamatreste sind durch Peptidbindungen über die g-Carboxylgruppe des Glutamats an das THF konjugiert. Die Gluta-

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6 Coenzyme

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Abb. 6.16 S-Adenosylmethionin (SAM). Die Methylgruppe wird als CH3+ übertragen. Adenosylhomocystein wird anschließend zu Adenosin und Homocystein hydrolysiert. Durch Übertragung einer Methylgruppe von N5-Methyl-THF auf Homocystein wird das Methionin wieder regeneriert. matreste verhindern eine unkontrollierte Diffusion über Membranen. Zur Resorption von Folat im Darm müssen die Glutamatreste zuvor abgespalten werden. Im Organismus wird Folat zunächst zu Dihydrofolat (DHF, FH2, H2Folat) und weiter zu THF reduziert. Die zweistufige Reaktion wird von der Dihydrofolat-Reductase (DHFR) katalysiert. THF unterscheidet sich von Folat durch die Hydrierung in der 5,6 bzw. 7,8-Stellung.

Die an THF gebundenen C1-Fragmente können leicht ineinander übergeführt werden. Die C1-Fragmente stammen überwiegend aus der Umwandlung von Serin zu Glycin und aus dem Abbau von Glycin. Die von THF übertragenen C1-Fragmente werden für die Purin-Biosynthese, beim Stoffwechsel des Histidins, bei der Synthese von dTMP durch die Thymidylat-Synthase und zur Bildung von Methionin aus Homocystein benötigt. Prokaryoten verwenden für die Initiation der Proteinbiosynthese formyliertes Methionin ( Genetik). Die Formylgruppe hierzu stammt aus dem von THF übertragenen „C1-FragmentePool“. Abb. 6.17b gibt einen Überblick über die verschiedenen Oxidationsstufen der von THF übertragenen C1-Fragmente. Methanogene Bakterien besitzen anstelle von Folat bzw. THF die strukturell ähnlichen Verbindungen Methanopterin bzw. Tetrahydromethanopterin. Tetrahydromethanopterin besitzt zu THF analoge Funktion ( Mikrobiologie).

n Mit der Entdeckung der Übertragbarkeit des Kindbettfiebers durch Ignaz Phillip Semmelweis im Jahre 1861 begann die systematische, auf wissenschaftlichen Überlegungen und Experimenten beruhende Forschung zur Therapie von Infek-

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6.3 Coenzyme für den Transfer von C1-Fragmenten

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6

Abb. 6.17 Tetrahydrofolat (THF). a Struktur von THF. b THF-Derivate. Methyl-THF („aktives Methyl“) dient bei der Methioninsynthese aus Homocystein als Methylgruppen-Donor. Die wichtigste Quelle für C1-Fragmente ist die Bildung von Methylen-THF („aktivierter Formaldehyd“) bei der Umwandlung von Serin zu Glycin durch die Serin-Hydroxymethyltransferase. Methylen-THF kann auch durch die Glycin-Synthase aus Glycin und NAD+ unter Bildung von CO2, NH4+ und NADH gebildet werden. Methylen-THF wird als Donor bei der Methylierung von Uridylat zu Thymidylat bei der DNA-Synthese benötigt. Beachte, dass bei dieser Reaktion Dihydrofolat (DHF) entsteht, welches durch DihydrofolatReductase erst wieder zu THF reduziert werden muss. Formyl-THF ist Donor der Formylgruppe bei der Synthese von N-Formyl-Methionin. Das C2 des Puringerüstes stammt ebenfalls von Formyl-THF. Formimino-THF entsteht beim Abbau von Histidin. Methenyl-THF liefert C8 des Purinringes im Verlauf der Purinsynthese.

tionskrankheiten. Gerhard Domagk testete 1932 eine Substanz, die sich als sehr potentes Mittel zur Heilung von mit Streptokokken infizierten Mäusen erwies. Die Substanz, ein Sulfonamidderivat (chemisch korrekt: Sulfanilamidderivat; die Bezeichnung „Sulfonamid“ hat sich jedoch gehalten), gelangte schließlich unter dem Namen „Prontosil“ auf den Markt. Bakterien sind in der Lage, Folat selbst zu synthetisieren; ein hierbei verwendeter Baustein ist die p-Aminobenzoesäure (4Aminobenzoesäure, Abb. 6.18), die von vielen Bakterien als Vitamin benötigt wird. Sulfonamide verdrängen p-Aminobenzoesäure kompetitiv an der Dihydropteroinsäure-Synthetase; eine Neusynthese von Folat ist nicht mehr möglich und die Bakterien werden im Wachstum gehemmt (bakteriostatische Wirkung). Da Tiere und Menschen Folat nicht selbst synthetisieren, sprechen sie nicht bzw. nur

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6 Coenzyme

Abb. 6.18 4-Aminobenzoesäure. Ein wichtiger Baustein für die Synthese von Folat. Durch Derivate des strukturanalogen Sulfanilamids kann die Synthese von Folat kompetitiv gehemmt werden.

6

unspezifisch auf Sulfonamide an. Die Einführung der Sulfonamide in die medizinische Therapie durch Domagk kann nicht hoch genug eingeschätzt werden. Alexander Fleming, der Entdecker des Lysozyms und des Penicillins, verdeutlichte dies mit dem Ausspruch: „Ohne Domagk keine Sulfonamide, ohne Sulfonamide kein Penicillin, ohne Penicillin keine Antibiotika“. m

6.3.3

Biotin

Biotin ist die prosthetische Gruppe einiger Carboxylasen, Decarboxylasen und der Transcarboxylase und kann als ein zyklisches Harnstoffderivat aufgefasst werden. An dem Imidazolin-2-on-Ring ist formal ein Tetrahydrothiophen-Ring ankondensiert, der die Valeriatseitenkette trägt. Deren Carboxylgruppe verbindet Biotin über eine Amidbindung mit einem Lysinrest des Enzyms. Hierbei entsteht, ähnlich den Verhältnissen bei Liponamid (S. 231), ein langer, flexibler Arm. Dieser ermöglicht den Transfer der Carboxylgruppe innerhalb des Enzyms. Das mit dem Lysin konjugierte Biotin (e-Biotinyllysin) wird gelegentlich auch als Biocytin bezeichnet (Abb. 6.19).

Biotin wurde ursprünglich als Wachstumsfaktor für Hefe identifiziert. Tiere und Menschen sind nicht in der Lage, Biotin selbst zu synthetisieren. Es ist daher zu den Vitaminen zu zählen. Der Syntheseweg bei Bakterien und Pflanzen verläuft gleich. Er beginnt mit einer Kondensation von drei Malonyl-CoA; ferner wird Alanin und ein Cystein als S-Donor benötigt. Carboxylierungen sind im Stoffwechsel weit verbreitet: Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Fettsäuresynthese (Carboxylierung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA) sowie beim Abbau ungeradzahliger oder methylverzweigter Fettsäuren (Carboxylierung von Propionyl-CoA zu Methylmalonyl-CoA, S. 230). Weitere Beispiele für Carboxylierungen sind die Bildung von Oxalacetat aus Pyruvat (Abb. 6.19), einer anaplerotischen Reaktion, und die Synthese von 3-Methylglutaconyl-CoA aus 3-Methylcrotonyl-CoA beim Abbau von Leucin. Die biotinhaltigen Carboxylasen werden in drei Klassen eingeteilt: Carboxylasen der ersten Klasse (Klasse-I-Carboxylasen) katalysieren die Einführung einer Carboxylgruppe in eine Verbindung unter ATP-Verbrauch. Die Klasse-IICarboxylasen kommen nur bei einigen anaerob lebenden Bakterien vor. Diese Enzyme koppeln die bei der Decarboxylierung von b-Ketosäuren bzw. deren Thioestern freiwerdende Energie mit dem Transport von Na+-Ionen aus der

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6.3 Coenzyme für den Transfer von C1-Fragmenten

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Abb. 6.19 Biotin. Struktur und Ablauf einer Biotin-katalysierten Reaktion. Die Beladung des Biotins zum Carboxybiotin verläuft unter Verbrauch von ATP und Bildung eines gemischten Säureanhydrids.

Zelle heraus. Hierbei entsteht ein elektrochemischer Na+-Gradient über der Cytoplasmamembran ( Mikrobiologie). Die dritte Klasse enthält nur einen Vertreter: die Transcarboxylase. Dieses Enzym vermag Carboxylgruppen von einer Verbindung auf eine andere zu übertragen. Die Transcarboxylase ist Bestandteil des Acetyl-CoA-Carboxylase-Komplexes, der den entscheidenden Schritt bei der Fettsäuresynthese katalysiert (S. 321). Carboxylierungen sind stets endergone Vorgänge. Durch Kopplung dieser Reaktion mit einer stark exergonen Reaktion, der ATP-Hydrolyse, wird das Gleichgewicht auf die Seite des carboxylierten Produktes verschoben (S. 68). Der energieverbrauchende Schritt ist die „Beladung“ des Biotins mit der Carboxylgruppe. Die Carboxylgruppe stammt von Hydrogencarbonat (HCO3–), gelöstes Kohlendioxid (CO2) wird von Biotin-haltigen Carboxylasen nicht verwendet. Die Konzentration von Hydrogencarbonat ist bei physiologischen pH- und Temperatur-Werten etwa 20-mal größer als die des physikalisch gelösten Kohlendioxids. Es gibt Enzyme, welche für Carboxylierungen Kohlendioxid verwenden, z. B. die Ribulose-bisphosphat-Carboxylase (Rubisco); diese besitzt kein Biotin ( Botanik).

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6 Coenzyme

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Abb. 6.20 „Strep-tag“. Der „Strep-tag“ bindet an die Biotin-Bindungsstelle von Streptavidin (und Avidin). Andere Proteine, welche diese Aminosäuresequenz nicht besitzen, binden nicht an Streptavidin und werden entsprechend nicht an dem Säulenmaterial zurückgehalten. Im Hühnereiklar wurde bereits in den 20er-Jahren ein Faktor beschrieben, der mit einer bemerkenswerten Affinität an Biotin bindet (KD = 10–15 mol l–1, dies korrespondiert mit einer Bindungsenthalpie DGhl von etwa –88 kJ mol–1). Dieses Protein, Avidin genannt, ist in zahlreichen Eiern von Vögeln und Invertebraten zu finden. Es dient zusammen mit Lysozym und anderen Substanzen vermutlich zum Schutz des Eis gegenüber bakteriellen Infektionen. Während Lysozym Bakterien direkt schädigt, verhindert Avidin das Wachstum biotinbedürftiger Bakterien dadurch, dass es Biotin sehr fest bindet und damit den Bakterien „vorenthält“. Als in den 50er-Jahren die Rolle des Biotins als Cofaktor entdeckt wurde, begannen die Forscher, sich verstärkt für Avidin zu interessieren. Mit der hohen Affinität von Avidin für Biotin sollte es gelingen, biotinhaltige Enzyme gezielt zu isolieren. Streptomyces avidinii ist ebenfalls in der Lage, ein Protein zu produzieren, das eine vergleichbare Affinität zu Biotin aufweist wie Avidin: das Streptavidin.

n Die hohe Affinität von Avidin und Streptavidin zu Biotin macht man sich heute in der Molekularbiologie zunutze. Viele Substanzen lassen sich leicht biotinylieren und können dann mit Avidin bzw. Streptavidin detektiert werden. Hierzu wird an Avidin ein Marker, z. B. kolloidales Gold, Enzyme, fluoreszierende oder radioaktive Substanzen usw. gekoppelt. Kann das Substrat nicht direkt biotinyliert werden, wird ein biotinylierter Antikörper gegen das Substrat verwendet. Eine bequeme Methode, bestimmte PCR-Produkte nachzuweisen, besteht darin, biotinylierte

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6.4 Coenzyme für den Transfer von C2- und größeren Fragmenten

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Primer zu verwenden ( Genetik). Nur die gewünschte DNA bindet dann an Avidin. Eine Weiterentwicklung des Biotin-Avidin-Systems war die Entdeckung, dass eine bestimmte Aminosäuresequenz, Ser-Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-GlyGly, an der Biotin-Bindungsstelle von Avidin bzw. Streptavidin gebunden wird. Mit gentechnologischen Methoden ist es ein Leichtes, die für diese Aminosäuresequenz codierende DNA an eine für ein bestimmtes Protein codierende DNA zu koppeln. Das entstehende Fusionsprotein mit der zusätzlichen Aminosäuresequenz, diese wird im Laborjargon als „Strep-tag“ bezeichnet, kann durch Affinitätschromatografie über einer Avidin- oder Streptavidinsäule gereinigt werden. Die Elution des Proteins erfolgt mit Biotin oder Diaminobiotin (Abb. 6.20). Für analoge Zwecke wird häufig der Einbau aufeinanderfolgender Histidine („Histag“) verwendet. Der Imidazol-Ring des Histidins geht Komplexbindungen mit immobilisierten Metallionen ein (Immobilisierte Metall-Ionen Affinitäts-Chromatografie; IMAC). Eluiert werden die Proteine mit freiem Imidazol (Abb. 4.20). m S-Adenosylmethionin (SAM): Meist verwendeter Methylgruppen-Überträger. Tetrahydrofolat (THF): Überträger verschiedener C1-Fragmente. Die Vorstufe Folat ist für Säuger essentiell. Methanogene Archaea besitzen Tetrahydromethanopterin bzw. Methanopterin als C1-Überträger. Biotin: Überträger von Carboxylgruppen, Vitamin für Menschen und Tiere, prosthetische Gruppe vieler Carboxylasen, Decarboxylasen und Transcarboxylasen.

6.4

Coenzyme für den Transfer von C2- und größeren Fragmenten

Neben Fragmenten mit nur einem Kohlenstoffatom werden im Stoffwechsel auch Fragmente mit zwei oder mehr Kohlenstoffatomen übertragen. Coenzym A ist der Hauptüberträger von Acetylresten und anderen Carbonsäureresten im Stoffwechsel. Diesem bzw. den acylierten Derivaten kommt eine zentrale Rolle besonders im Lipid-Stoffwechsel zu, da sie an der Schnittstelle zwischen katabolen und anabolen Stoffwechselwegen stehen. Von einigen Enzymen werden Liponsäure und Thiamindiphosphat bei der oxidativen Decarboxylierung von a-Ketosäuren (z. B. Pyruvat, a-Ketoglutarat) als Überträger der hierbei entstehenden Aldehyde auf Coenzym A (s. o.) verwendet. Im Verlauf dieser Reaktionen, bei denen es sich um Redoxreaktionen handelt, kommt es auch zum Gruppentransfer. Liponsäure wurde daher bereits als Coenzym der Oxidoreductasen behandelt (S. 231). Die Funktion des Thiamindiphosphats wird auf S. 255 genauer betrachtet. Acylgruppen werden während des Transportes über die innere Mitochondrienmembran mit Carnitin konjugiert (Abb. 7.22). Auch einige Nucleotide werden für die Übertragung größerer Fragmente verwendet (S. 251).

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6 Coenzyme

6.4.1

Coenzym A

Coenzym A ist aus den Bausteinen Cysteamin, b-Alanin, Pantoinsäure (Dihydroxydimethylbuttersäure) und einem in 3l-Stellung phosphorylierten ADP aufgebaut (Abb. 6.21). b-Alanin und Pantoinsäure bilden zusammen die Pantothensäure. Viele Organismen, darunter auch der Mensch, sind nicht in der Lage, Pantothensäure zu synthetisieren und müssen diese als Vitamin mit der Nahrung zu sich nehmen. Die reaktive Gruppe von Coenzym A ist die Sulfhydrylgruppe des Cysteamins. Soll diese Struktur betont werden, kürzt man Coenzym A mit CoASH, ansonsten nur mit CoA ab. Über die Sulfhydrylgruppe werden Carbonsäuren als Thioester gebunden; allgemein bezeichnet man diese Verbindungen als AcylCoA. Die Hydrolyse der Thioester ist mit einer stark negativen Änderung der freien Enthalpie (DGhl = –43 kJ mol–1) verbunden. Die Bildung der Thioester ist ein endergoner Vorgang und muss daher mit einer exergonen Reaktion gekoppelt werden. Als energieliefernde Reaktion dient eine oxidative Decarboxylierung (z. B. beim Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex), eine thioklastische Spaltung oder eine Aktivierung mit ATP (S. 266). Bei Bakterien geht die Pantothensäuresynthese von Pyruvat und Valin aus, im weiteren Verlauf wird b-Alanin ankondensiert, welches durch Decarboxylierung aus Aspartat entsteht. Pantothensäure wird im Organismus durch Kondensation mit Cystein weiter zu 4-Phosphopantethein umgebaut, das auch die prosthetische Gruppe des Acyl-CarrierProteins (ACP) der Fettsäuresynthase (S. 322) darstellt.

Abb. 6.21 Coenzym A (CoA) (a) und Acetyl-CoA (b). Die Acetylgruppe ist über einen Thioester gebunden. Acetyl-CoA hat ein hohes Acetylgruppenübertragungspotential, um dieses zu verdeutlichen, wird die Bindung durch Z dargestellt.

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6.4 Coenzyme für den Transfer von C2- und größeren Fragmenten

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Die wichtigste Acyl-CoA-Verbindung ist das Acetyl-CoA („aktivierte Essigsäure“), das zentrale Zwischenprodukt im Bau- und Energiestoffwechsel. Die Zellen besitzen einen regelrechten Acetyl-CoA -„Pool“. Viele Verbindungen werden zu Acetyl-CoA abgebaut, das dann als Ausgangsmaterial für neue Verbindungen dient. Das Acetyl-CoA stammt aus der b-Oxidation der Fettsäuren sowie der Decarboxylierung des Pyruvats, dem Endprodukt der Glykolyse, und aus dem Abbau einiger Aminosäuren. Acetyl-CoA wird in den Citratzyklus eingespeist oder direkt für Neusynthesen, z. B. von Fettsäuren oder Isoprenoiden, verwendet (Abb. 7.4). Acetyl-CoA besitzt zwei prinzipielle Reaktionsmöglichkeiten (Abb. 6.21): x Reaktionen an der Methylgruppe (bei längerkettigen Alkylresten am b-C-Atom): Bei diesen Reaktionen fungiert die C-H-acide Verbindung als Nucleophil. Im Verlauf dieser Reaktion werden neue C-C-Bindungen geknüpft. Ein Beispiel für diesen Reaktionstyp ist die Übertragung des Acetylrestes auf Oxalacetat, dem einleitendem Schritt bei der Einspeisung von Acetyl-CoA in den Citratzyklus (s. Kap. 8.2). x Reaktionen am Carbonyl-Kohlenstoff. Bei diesen Reaktionen wird der Carbonyl-Kohlenstoff von einer nucleophilen Verbindung angegriffen. Als nucleophile Verbindungen kommen hier vor allem Amide und Alkohole in Frage. Auf diese Weise entstehen Säureamide (z. B. Aminozucker wie N-Acetyl-Glucosamin) und Ester (z. B. der Neurotransmitter Acetylcholin, Zoologie). Neben der Funktion als Baustofflieferant dient Acetyl-CoA auch als Donor von Acetylgruppen bei der posttranslationalen Proteinmodifikation. Bei Eukaryoten liegt die DNA im kondensierten Zustand im Komplex mit Histonen als Chromatin vor. In diesem dicht gepackten Zustand ist die DNA für Transkription and andere chromatinmodifizierende Prozesse nicht zugänglich. Dies ist erst nach Acetylierung der e-Aminogruppen bestimmter Lysinreste von Kernhistonen möglich. Die entsprechenden Enzyme hierfür sind die HistonAcetyltransferasen (HATs). Durch die Acetylierung der e-Aminogruppen wird deren positive Ladungen neutralisiert, dadurch die Affinität zur DNA verringert und die Chromatinstruktur gelockert. In diesem Zustand erst kann die genetische Information der DNA ausgelesen werden. Die gegenläufigen Reaktionen, die Histon-Deacetylierungen werden von den Histon-Deacetylasen (HDACs) katalysiert. Die Aktivitäten von HATs und HDACs haben eine grundlegende Funktion bei der Genexpression. Entsprechend stringent werden deren Aktivitäten reguliert. Fehlfunktionen können zu Differenzierungs- bzw. Entwicklungsfehlern und auch zur Krebsentstehung beitragen. HATs bzw. HDACs werden aufgrund Genetik). ihrer Funktion auch den Transkriptions-Coaktivatoren zugeordnet (

Coenzym A (CoA-SH, CoA): Überträger von Acylresten, die als Thioester gebunden werden. Die Vorstufe Pantothensäure ist für Menschen ein Vitamin. Acetyl-CoA („aktivierte Essigsäure“): Thioester aus Essigsäure und Coenzym A. Zentrales Zwischenprodukt des Bau- und Energiestoffwechsels.

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6 Coenzyme

6.5

Energiereiche Phosphorverbindungen als Cofaktoren

Energiereiche Phosphorverbindungen werden im Stoffwechsel häufig als Cofaktoren verwendet. Die bedeutendste dieser Verbindungen ist das Adenosintriphosphat (ATP), welches hauptsächlich bei der Übertragung von Phosphorylgruppen als Donor verwendet wird. Auch die Nucleotide Uridintriphosphat (UTP), Cytidintriphosphat (CTP) und Guanosintriphosphat (GTP) dienen im Stoffwechsel als Cofaktor, meist bei der Übertragung ganzer Moleküle oder größerer Bausteine im Rahmen des Baustoffwechsels. Aber nicht nur Nucleotide, sondern auch andere energiereiche Phosphorverbindungen werden als Cofaktoren verwendet.

6.5.1

Nucleotide als Cofaktoren

Das Adenosintriphosphat (ATP, Abb. 6.22) steht als energiereiche Verbindung im Mittelpunkt des Energie- und Baustoffwechsels (S. 265). Die Übertragung der endständigen Phosphorylgruppe wird durch Kinasen katalysiert. Als Akzeptor der Phosphorylgruppe dienen Hydroxyl-, Carboxy- oder Amidino- bzw. Guanidinogruppen. Durch die Phosphorylierungen werden zelluläre „Brennstoffe“ (z. B. Glucose) für den weiteren Abbau aktiviert. Bei Proteinen dienen die Phosphorylierungen vor allem der Regulation ihrer enzymatischen Aktivität (S. 201). Die Übertragung der endständigen Phosphorylgruppe auf Wasser entspricht einer Hydrolyse. Enzyme, die diese Reaktion katalysieren, werden als Adenosintriphosphatasen, kurz ATPasen bezeichnet. Diese Reaktionen sind in der lebenden Zelle mit besonderen Arbeits- oder Syntheseleistungen gekoppelt, um die Änderung der freien Enthalpie bei der Hydrolyse (DGhl = –30,5 kJ mol–1) zu nut-

Abb. 6.22 Adenosintriphosphat (ATP). Die Verbindung aus Zucker und Base wird allgemein als Nucleosid (hier Adenosin) bezeichnet. Die Phosphorsäureester der Nucleoside werden als Nucleotide (hier AMP, ADP und ATP) bezeichnet. Die Bezeichnung der anderen Nucleotide ist entsprechend.

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6.5 Energiereiche Phosphorverbindungen als Cofaktoren

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zen. Bei einigen Reaktionen mit ATP wird Pyrophosphat (PPi) abgespalten. Dies wird durch die anorganische Pyrophosphatase zu zwei Pi hydrolysiert (DGhl = –33,5 kJ mol–1). Somit müssen insgesamt zwei energiereiche Phosphorsäureanhydridbindungen für diese Reaktionen aufgewendet werden. Die bei der Spaltung der Phosphorsäureanhydridbindung zwischen der a- und b-Phosphorylgruppe erzielte Änderung der freien Enthalpie reicht allein nicht aus, um das Gleichge-

6

Abb. 6.23 Reaktionen mit ATP. Die Übertragung der Phosphorylgruppe auf eine Hydroxylgruppe findet z. B. zur Glucoseaktivierung statt. Bei der Bildung von SAM werden sämtliche Phosphorylgruppen abgespalten. Bei dem Transfer von Nucleotiden bzw. Desoxynucleotiden im Verlauf der Transkription bzw. Replikation werden diese an die 3l-OH-Gruppe der Ribose des vorangehenden Bausteins angefügt. Bei der Übertragung von Adenylresten (AMP) auf Carboxylgruppen entstehen gemischte Säureanhydride, die ein der Phosphorsäureanhydridbindung vergleichbares Gruppenübertragungspotential besitzen. Eine Übertragung von Pyrophosphat kommt vergleichsweise selten vor.

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6 Coenzyme

wicht so weit auf die Seite der Produkte zu verschieben, dass eine Rückreaktion ausgeschlossen ist. Erst durch die Spaltung des Pyrophosphats liegt das Gleichgewicht der Reaktion „endgültig“ auf der Seite der Produkte. Eine Rückreaktion unter In-vivo-Bedingungen ist nicht möglich, da durch die Aktivität der anorganischen Pyrophosphatase die Konzentration von PPi nahezu null ist. Die Abspaltung von PPi und dessen anschließende Hydrolyse kommen im Stoffwechsel häufig vor, um Reaktionen unidirektional ablaufen zu lassen. Abb. 6.23 gibt einen Überblick über Reaktionen mit ATP als Gruppendonor.

6

Eine in der Natur sehr wichtige Verbindung mit – auf den ersten Blick – unterschiedlichen Funktionen ist das zyklische Adenosin-3l,5l-monophosphat (cyclo-AMP, cAMP). cAMP spielt bei Eukaryoten als Second Messenger bei der intrazellulären Signalübertragung (S. 487) eine wichtige Rolle. Einzelne Amöben des Schleimpilzes Dictyostelium discoideum beginnen im Hungerzustand mit der Produktion und Ausscheidung von cAMP. Das ausgeschiedene cAMP dient der Anlockung weiterer Amöben, die sich zu einem Fruchtkörper zusammenschließen und widerstandsfähige Sporen bilden. In diesem Fall dient das cAMP als extrazellulärer Signalstoff ( Mikrobiologie). In Bakterien spielt cAMP eine wichtige Rolle bei der Transkriptionskontrolle ( Genetik).

Alle Organismen benötigen schwefelhaltige Aminosäuren (Cystein, Methionin) als Proteinbausteine. Der Schwefel stammt aus anorganischen Verbindungen, z. B. Sulfat. Pflanzen und Mikroorganismen bilden aus Sulfat zunächst Adenosin5-phosphosulfat (APS), durch Phosphorylierung an C3 der Ribose entsteht Phospho-APS (PAPS) („aktiviertes Sulfat“, Abb. 6.24). In dieser Form kann das Sulfat auf die Stufe des Thiols reduziert werden ( Botanik). In der Leber der Säugetiere dient PAPS als Sulfatgruppen-übertragendes Coenzym. Sulfat kann mit Hydroxylgruppen oder aromatischen Aminen konjugiert werden, z. B. bei Biotransformations- und Entgiftungsreaktionen. Die hierbei entstehenden Schwefelsäureester werden über die Niere ausgeschieden. Des Weiteren ist PAPS Cosubstrat bei der Synthese der Glucosaminoglykane der extrazellulären Matrix, z. B. Heparin. Uridintriphosphat (UTP) spielt im Kohlenhydratstoffwechsel eine bedeutende Rolle. Glucose-1-phosphat wird mit UTP zu Uridindiphosphat-Glucose (UDPGlc) umgesetzt (Abb. 6.25). UDP-Glc kann als „aktivierte Glucose“ aufgefasst und in dieser Form auf zahlreiche nucleophile Akzeptoren übertragen werden; z. B. bei der Glykosylierung von Proteinen und Lipiden (Glykolipide, S. 356) oder bei der Glykogensynthese (beachte: Pflanzen verwenden für die Synthese ihrer Speicherpolysaccharide Amylopektin bzw. Amylose ADP-Glc anstelle von UDP-Glc). An UDP-Glc selbst finden ebenfalls zahlreiche Umsetzungen statt: Glucose kann z. B. zur Glucuronsäure (an C6) oxidiert werden. Pflanzen und Mikroorganismen verfügen über besonders vielfältige Möglichkeiten zur Überführung des Glucose-Bausteins in andere Zucker bzw. deren Derivate. Pflanzen verwenden diese vor allem zur Synthese von Gerüstpolysacchariden. Zu den Gerüstpolysacchariden gehören neben Cellulose die Hemicellulosen (D-Glucane, D-Xylane, D-Galaktane und D-Mannane), Pektine und Kallose. Einige Algen bilden weitere Gerüstpolysaccharide, z. B. Agar-Agar.

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6.5 Energiereiche Phosphorverbindungen als Cofaktoren

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Abb. 6.24 Adenosin-5-phosphosulfat und Phospho-APS. Die Sulfatgruppe ist über eine energiereiche Säureanhydridbindung mit der Phosphorylgruppe verbunden.

Abb. 6.25 „Aktivierte Glucose“. Bildung aus Glucose-1-phosphat und dem Pyrimidinnucleotid UTP. Bei dieser Reaktion wird Pyrophosphat abgespalten. Bakterien verwenden ebenfalls UDP als Überträger einzelner Bausteine bei der SynMikrobiologie). these des Mureins, einem Bestandteil bakterieller Zellwände (

Cytidintriphosphat (CTP) wird bei der Synthese einiger Phospholipide als Überträger für Ethanolamin und Cholin verwendet (Abb. 7.28). Durch Übertragung von Ethanolamin bzw. Cholin auf 1,2-Diacylglycerin entstehen die Phospholipide Phosphatidylethanolamin respektive Phosphatidylcholin (Lecithin). Bei der Bildung der Phospholipide Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin wird eine aktivierte „Kopfgruppe“ auf einen hydrophoben, membranverankerten Rest übertragen. Aber auch die Aktivierung der hydrophoben Phosphatidsäure mit CTP (CDP-1,2-Diacylglycerin) ist verwirklicht: beispielsweise bei der Synthese

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6 Coenzyme

von Cardiolipin, Phosphatidylserin und Phosphatidylinositol. Die Synthese der verschiedenen Phospho- und Glykolipide wird in Kap. 9 ausführlich behandelt. Guanosintriphosphat (GTP) wird von einigen Proteinen gebunden und – unter dem Einfluss stimulierender oder hemmender Proteine – wieder hydrolysiert. Diese GTP-bindenden Proteine werden als G-Proteine bezeichnet. Es werden zwei Klassen von G-Proteinen unterschieden: „große“ G-Proteine und „kleine“ G-Proteine. G-Proteine beider Klassen sind an zahlreichen Prozessen bei der Signalweiterleitung innerhalb der Zellen beteiligt (S. 486). Neben dem zyklischen AMP gibt es auch zyklisches Guanosin-3l,5l-monophosphat (cGMP). cGMP spielt beim Sehvorgang in den Sehzellen (Stäbchen) der Retina eine wichtige Rolle ( Zoologie).

6.5.2

Andere energiereiche Phosphor-Verbindungen als Cofaktoren

Bei der reversiblen Überführung von Glucose-1-phosphat (Glc-1-P) in Glucose6-phosphat (Glc-6-P), katalysiert durch Phosphoglucomutase, entsteht als intermediäres Zwischenprodukt Glucose-1,6-bisphosphat (Glc-1,6-P2). Ein Glc1,6-P2-Molekül bleibt ständig an das Enzym gebunden. Von dem gebundenen Glc-1,6-P2 wird eine Phosphorylgruppe auf Glc-1-P bzw. Glc-6-P übertragen. Der „ausgediente“ Cofaktor wird als Produkt entlassen, das Substrat übernimmt nun die Rolle des Cofaktors (S. 276). Nach dem gleichen Prinzip verläuft die Umsetzung von 3-Phosphoglycerat zu 2-Phosphoglycerat im Verlauf der Glykolyse. Cofaktor der Phosphoglyceratmutase ist das 2,3-Bisphosphoglycerat. 2,3-Bisphosphoglycerat kommt besonders häufig in Erythrocyten vor: Hier dient es als allosterischer Effektor des Hämoglobins.

Adenosintriphosphat (ATP): Wichtigster Phosphorylgruppen-Überträger zyklisches Adenosin 3l,5l-monophosphat (cAMP): In Eukaryoten Botenstoff bei der intrazellulären Signalübertragung, Funktion bei der Transkriptionskontrolle in Bakterien. Phospho-Adenosin-5-phosphosulfat (PAPS): „Aktiviertes Sulfat“, wichtigster Sulfatgruppenüberträger. Uridintriphosphat (UTP): Aktivierung von Glucose im Kohlenhydratstoffwechsel. Cytidintriphosphat (CTP): Überträger von Ethanolamin und Cholin bei der Synthese von Phospholipiden. Guanosintriphosphat (GTP): Funktion bei der Signalweiterleitung durch G-Proteine innerhalb von Zellen.

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6.6 Coenzyme der Lyasen, Isomerasen und Ligasen

6.6

255

Coenzyme der Lyasen, Isomerasen und Ligasen

Lyasen, Isomerasen und Ligasen sind Enzyme, die von einer Zelle zum Ab-, Um- oder Aufbau der verschiedensten Verbindungen verwendet werden (Tab. 6.1). Zu den überwiegend von Lyasen, Ligasen und Isomerasen verwendeten Coenzymen gehören Thiamindiphosphat, Pyridoxalphosphat und Cobalamin (Coenzym B12). Einige Lyasen, Isomerasen und Ligasen verwenden aber auch Coenzyme, welche von gruppenübertragenden Enzymen benutzt werden.

6 6.6.1

Thiamindiphosphat

Thiamindiphosphat (TDP, Thiaminpyrophosphat, TPP) besteht aus einem Thiazol- und einem Pyrimidinring, die gemeinsam das Thiamin bilden, an das zwei Phosphorylreste gebunden sind (Abb. 6.26). Tierische Organismen sind nicht zur Thiaminsynthese befähigt. Für diese Organismen ist eine Thiaminzufuhr (Vitamin B1) mit der Nahrung erforderlich. Die Phosphorylierung von Thiamin wird durch die Thiamin-Phosphokinase katalysiert. Thiamin wird von Pflanzen und Bakterien auf unterschiedliche Weise gebildet. Der Pyrimidin- und der Thiazolring werden jeweils auf getrennten Wegen synthetisiert und schließlich zum Thiaminphosphat zusammengefügt. Thiamindiphosphat ist das Coenzym der a-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexe. Zu diesen gehören der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, der die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA katalysiert, der a-Ketoglutarat-

Abb. 6.26 Thiamindiphosphat (TDP). Der Stickstoff des Thiazol besitzt eine positive Ladung (quartärer Stickstoff). Die hierdurch bedingte hohe Elektronenaffinität des Stickstoffs ist für die Katalyse wichtig. b Der saure Kohlenstoff des Thiazolrings (C2, pKS z 8) kann ein Proton abgeben und trägt dann eine negative Ladung. Diese Struktur bezeichnet man als Ylid, da die C-N-Bindung sowohl Eigenschaften einer kovalenten Bindung (...yl) als auch ionischen (...id) Charakter besitzt.

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6 Coenzyme

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Abb. 6.27 Reaktionsmechanismus unter Beteiligung von Thiamindiphosphat. Zunächst erfolgt eine Addition des Pyruvats an TDP. Das Elektronendefizit des quartären Stickstoffs bewirkt die Abspaltung von CO2. Der gebundene, ionisierte Hydroxyethylrest ist resonanzstabilisiert und wird im Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex auf Liponamid übertragen.

Dehydrogenase-Komplex (Bildung von Succinyl-CoA aus a-Ketoglutarat) und der Verzweigtketten-a-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplex. Dieser Komplex katalysiert die oxidative Decarboxylierung der nach der Desaminierung der Aminosäuren Valin, Leucin und Isoleucin entstehenden verzweigten Carbonsäuren zu Methylacryloyl-CoA, 3-Methylcrotonyl-CoA bzw. 2-Methylcrotonyl-CoA. Außerdem ist TDP Coenzym der Transketolase, die im Rahmen des Pentosephosphatzyklus als Überträger von „aktiviertem Glykolaldehyd“ dient (S. 288). Die Beladung des TDP bei der Transketolase und bei den a-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexen verläuft nach dem gleichen Mechanismus (Abb. 6.27). Bei den a-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexen erfolgt die Übertragung der Decarboxylierungsprodukte auf Liponamid, die Transketolase überträgt das C2-Fragment auf eine Aldose, wobei eine Ketose gebildet wird.

6.6.2

Pyridoxalphosphat

Pyridoxalphosphat (PLP) ist die aktive Form des Vitamin B6 im Aminosäurestoffwechsel. Viele Bakterien, Pflanzen und Hefen sind zur Pyridoxalsynthese in der Lage. Die Reaktionsfolge beginnt mit der Kondensation von Pyruvat und Glycerinaldehyd; zusätzlich wird Erythrose-4-phosphat benötigt. PLP reagiert mit einer Aminogruppe zu einer Schiff-Base (chemisch korrekt ausgedrückt handelt es sich bei den Schiff-Basen um substituierte Imine (Abb. 6.28).

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6.6 Coenzyme der Lyasen, Isomerasen und Ligasen

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6 Abb. 6.28 Schiff-Base. a Die Schiff-Base entsteht bei der Reaktion der Aldehydgruppe des Pyridoxalphosphats mit der Aminogruppe einer Aminosäure. b Durch das Elektronendefizit des Pyrimidin-Stickstoffs entsteht ein Elektronensog, der sich bis zum a-Kohlenstoffatom der gebundenen Aminosäure fortsetzt. In Abhängigkeit von der Struktur der entsprechenden Enzyme kann nun eine der markierten Bindungen mit dem a-Kohlenstoffatom gelöst werden.

PLP ist das Coenzym zahlreicher Enzyme im Aminosäurestoffwechsel: z. B. der Aminotransferasen, Aminosäuredecarboxylasen sowie verschiedener Ligasen und Lyasen. Bei den Aminotransferasen dient PLP als Überträger von Aminogruppen. Abb. 6.29 zeigt verschiedene Möglichkeiten PLP-katalysierter Reaktionen. PLP-katalysierte Reaktionen sind nicht auf Umsetzungen am a-Kohlenstoffatom beschränkt. Threonin, Serin und Cystein besitzen in b-Stellung zur Carboxylgruppe eine OH- bzw. SH-Gruppe. Die entsprechenden Dehydratasen (Serin, Threonin) bzw. Desulfhydrasen (Cystein) katalysieren die Elimination dieser Gruppe als H2O bzw. H2S. Hierbei entsteht eine Doppelbindung zwischen dem a- und b-C-Atom. Eine analoge Reaktion ist die b,g-Elimination von H2O bzw. H2S aus Homoserin respektive Homocystein. Aminosäure-Ammoniak-Lyasen katalysieren die oxidative Elimination von Ammoniak (NH3); beispielsweise entsteht beim Abbau von Histidin durch die Histidin-Ammoniak-Lyase Urocaninat. Ein Enzym von überragender Bedeutung im Sekundärstoffwechsel der Pflanzen ist die Phenylalanin-Ammoniak-Lyase. Dieses streng regulierte Enzym katalysiert die oxidative Desaminierung von Phenylalanin zu Zimtsäure. Die Zimtsäure ist Ausgangsstoff der pflanzlichen Phenole. Zu diesen gehören die Lignine, Cumarine, Gerbstoffe (z. B. 4Hydroxybenzoesäure, Gallussäure), Polyprenylchinone (z. B. Plastochinon, Ubichinon, Botanik). Tocopherole), Anthrachinone, Flavonoide und Stilben-Abkömmlinge (

Pyridoxalphosphat dient auch der Glykogen-Phosphorylase als prosthetische Gruppe. An die Glykogen-Phosphorylase ist PLP über eine Schiff-Base mit einem Lysinrest des Enzyms kovalent gebunden. Die Glykogen-Phosphorylase katalysiert die phosphorolytische Spaltung von Glykogen. Hierbei entsteht direkt

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6 Coenzyme

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Abb. 6.29 Pyridoxalphosphat (PLP)-abhängige Reaktionen im Aminosäurestoffwechsel. a Die Eliminierung von R kommt verhältnismäßig selten vor. Ein Beispiel ist die Spaltung von Threonin in Glycin und Acetaldehyd. b Decarboxylierung führt zur Bildung sogenannter biogener Amine. Viele biogene Amine besitzen selbst starke biologische Wirkungen (z. B. Histamin), andere sind Vorstufen für die Synthese weiterer Substanzen, von Neurotransmittern wie Serotonin und g-Aminobuttersäure. c Bei Transaminierungen wird die Aminogruppe auf PLP übertragen. Die Aminosäure wird hierbei zur entsprechenden a-Ketosäure desaminiert. Als Akzeptor der Aminogruppe dienen meist a-Ketoglutarat oder Oxalacetat, die zu Glutamat bzw. Aspartat aminiert werden. Die Reaktionen der Transaminasen sind vollständig reversibel.

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6.6 Coenzyme der Lyasen, Isomerasen und Ligasen

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a-D-Glucose-1-phosphat; die Konfiguration an C1 bleibt also erhalten. Welche Rolle spielt hier das PLP? Im Gegensatz zu den Reaktionen im Aminosäurestoffwechsel, bei denen die Aldehydgruppe des PLPs für die Katalyse entscheidend ist, spielt bei der Glykogen-Phosphorylase die Phosphorylgruppe des PLPs die entscheidende Rolle. Diese dient hier als Säure-Base-Katalysator.

6.6.3

Cobalamin (Coenzym B12)

Cobalamin (Coenzym B12, CoB12) kommt im Stoffwechsel in zwei aktiven Formen vor: als Methyl-Cobalamin (Met-CoB12) oder als 5l-Desoxyadenosyl-Cobalamin (Ade-CoB12) (Abb. 6.30). Alle Tiere und viele Mikroorganismen sind nicht in der Lage, CoB12 zu synthetisieren und müssen dies mit der Nahrung aufnehmen (Vitamin B12). CoB12 wird nur von anaerob lebenden Prokaryoten gebildet. In Pflanzen und Pilzen finden – nach jetzigem Kenntnisstand – keine CoB12-abhängigen Reaktionen statt. Die Lichtempfindlichkeit der C-Co-Bindung mag der Selektionsdruck für Pflanzen gewesen sein, CoB12-unabhängige Alternativen zu etablieren. Cyano-Cobalamin kommt in der Natur nicht vor, kann jedoch von

Abb. 6.30 Cobalamin. Die Struktur von Cobalamin, der das Corrin-Ringsystem zugrunde liegt, wurde 1961 von P. G. Lehnert und D. Hodgkin aufgeklärt. Das Zentralion im Cobalamin ist ein Cobaltion. Vier der sechs Ligandenbindungsstellen werden von den Stickstoffatomen der Pyrrolringe besetzt. Als fünfter Ligand dient 5,7-Dimethylbenzimidazol. Bei der Methylmalonyl-CoA-Mutase (s. u.), wird die sechste Ligandenbindungsstelle von einem Histidinrest eingenommen; dies scheint auch bei anderen CoB12-haltigen Enzymen der Fall zu sein. Als sechster Ligand können neben den bereits erwähnten Resten auch OH– bzw. H2O (diese stehen miteinander im Gleichgewicht) gebunden sein. Diese Hydroxybzw. Aquo-CoB12-Form wird im Organismus in die aktiven Formen (Met-CoB12, Ade-CoB12) umgewandelt.

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6 Coenzyme

den CoB12-bedürftigen Organismen entsprechend verwendet werden. CyanoCobalamin wird ausschließlich therapeutisch eingesetzt. Die chemische Besonderheit des Cobalamins besteht in der Ausbildung einer kovalenten Atombindung (keine Koordinationsbindung) zwischen dem Cobaltion (Co3+) und dem Adenosyl- bzw. Methylrest. Solche metallorganischen Bindungen kommen in der Natur äußerst selten vor. Außer im Cobalamin wurde eine metallorganische Bindung nur bei der F430-abhängigen Methanbildung beschrieben (S. 239). Während es bei Bakterien noch zahlreiche Cobalamin-abhängige Reaktionen gibt, z. B. bei der Reduktion von Ribonucleotiden (s. u.), der Synthese von AcetylCoA, der Methanbildung und beim Abbau kleiner organischer Moleküle, gibt es bei Säugern nur zwei: die Isomerisierung von Methylmalonyl-CoA zu SuccinylCoA durch die Methylmalonyl-CoA-Mutase und die Bildung von Methionin aus Homocystein durch die 5-Methyl-THF-Homocystein-Methyltransferase (Methionin-Synthase). Dieses Enzym verwendet während der Reaktion alle drei Methylgruppen übertragenden Coenzyme. Die Isomerisierung von Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA (Abb. 6.31) spielt beim Abbau ungeradzahliger oder methylverzweigter Fettsäuren eine wichtige Rolle (S. 320). Eine verminderte Aktivität der Methylmalonyl-CoA-Mutase hat eine Erhöhung der Methylmalonat-Konzentration im Blut zur Folge. Methylmalonyl-CoA-Mutase weist eine bemerkenswerte Sensibilität gegenüber Bleiionen aus. Durch Kontrolle des Methylmalonat-Spiegels im Blut kann einer bevorstehenden Bleivergiftung entgegengewirkt werden. Eine weitere, nach einem radikalischen Mechanismus verlaufende Reaktion, bei der CoB12 als Radikalquelle dient, ist die Reduktion von Ribonucleotiden zu Desoxyribonucleotiden für die DNA-Synthese bei Lactobacillus leichmannii. Interessanterweise verlaufen auch CoB12-unabhängige Ribonucleotid-Reduktionen stets radikalisch; diese Reaktion scheint überhaupt nur in dieser Form durchführbar zu sein. Bei dem Methylgruppen-Transfer zur Methioninsynthese dient Methyl-CoB12 als Cofaktor. Bei dieser Reaktion wird die metallorganische C-Co-Bindung heterolytisch gespalten; das bindende Elektronenpaar verbleibt beim Cobalt, das somit in der Oxidationsstufe +1 vorliegt. Die Übertragung der Methylgruppe

Abb. 6.31 Isomerisierung von Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA. Im Verlauf dieser Reaktion wechseln zwei über benachbarte Kohlenstoffatome gebundene Reste ihre Plätze. In dieser Reaktion dient CoB12 als Quelle für Radikale. Die C-Co-Bindung wird durch das Enzym so weit geschwächt, dass diese leicht gespalten wird.

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6.6 Coenzyme der Lyasen, Isomerasen und Ligasen

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erfolgt als Kation (CH3+). Die Methylgruppe zur Regenerierung von Methyl-CoB12 stammt von N5-Methyl-THF. CoB12 ist der wohl in jeder Hinsicht bemerkenswerteste Cofaktor, den die Natur hervorgebracht hat. Vermutlich ist CoB12 abiotisch in der Uratmosphäre entstanden und wurde von den in der „RNA-Welt“ lebenden „Organismen“ als willkommene Hilfe zur Etablierung eines Stoffwechsels angenommen. Einige Befunde stützen diese Theorie: Die Zahl der CoB12-abhängigen Enzyme ist bei anaerob lebenden Bacteria und Archaea relativ hoch. CoB12 wird nur unter anaeroben Bedingungen synthetisiert. Die Synthese ist zudem recht kompliziert: Mindestens 25 Enzyme sind zur Synthese von CoB12 nötig. Bemerkenswert an diesem Syntheseweg ist, dass dieser bei einigen Bakterien mit einer Aminoacyl-tRNA beginnt, und im weiteren Verlauf RNA eine Rolle bei der Genregulation übernimmt. CoB12 diente im anaeroben Stoffwechsel vermutlich als interne „Elektronensenke“, mit deren Hilfe die Verwertung kleiner Moleküle erfolgen konnte. Solche Reaktionen werden in der Tat von einigen Bakterien durchgeführt; z. B. die Dehydratation von 1,2-Propandiol zum Propionaldehyd oder die Desaminierung von Ethanolamin zu Acetaldehyd. Später brachte die Evolution Sirohäm hervor, das die Verwendung anorganischer Moleküle wie Sulfit oder Nitrit als terminale Elektronenakzeptoren ermöglichte. Mit dem Aufkommen von Chlorophyll und Häm begann die Freisetzung von O2 in die Atmosphäre. Einigen Organismen gelang es, den atmosphärischen Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor im Energiestoffwechsel zu nutzen. Mit der „Umstellung“ auf einen aeroben Stoffwechsel schwand der Bedarf für Enzyme zum Umbau kleiner, organischer Moleküle zum Zweck der Energiegewinnung unter anaeroben Verhältnissen. Die meisten CoB12-abhängigen Reaktionen wurden von den aufkommenden aeroben Organismen ersatzlos „aus dem Programm gestrichen“. Für viele Organismen ist CoB12 jedoch immer noch essentiell; die Zahl der CoB12-abhängigen Reaktionen ist beim Menschen auf zwei reduziert worden (s. o.). Pflanzen und Pilze haben es anscheinend geschafft, völlig auf CoB12-abhängige Reaktionen zu verzichten.

Thiamindiphosphat (TDP): Die Vorstufe Thiamin ist für Tiere essentiell (Vitamin B1). Coenzym der a-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexe und der Transketolase. Pyridoxalphosphat (PLP): Wichtigstes Coenzym im Aminosäurestoffwechsel, Bildung von Schiff-Basen mit Aminogruppen. Cobalamin (Coenzym B12): Physiologische Formen sind Methyl-Cobalamin (Met-CoB12) und 5l-Desoxyadenosyl-Cobalamin (Ade-CoB12). Für Tiere und viele Mikroorganismen ist Cobalamin essentiell (Vitamin B12). Synthese ausschließlich durch anaerob lebende Prokaryoten. Nur zwei B12-abhängige Reaktionen bei Säugern: Isomerisierung von Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA und Bildung von Methionin aus Homoserin. Keine B12-abhängigen Reaktionen bei Pilzen und Pflanzen bekannt.

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7 Stoffwechsel

7

Stoffwechsel

Regina Nethe-Jaenchen

7.1

7

Grundprinzipien des Stoffwechsels

Als Energiewandler nutzen Organismen Energie und Materie aus der Umwelt für ihren Stoffwechsel. Die im Energiestoffwechsel in Form von Reduktionsäquivalenten, elektrochemischen Membranpotentialen und ATP konservierte Energie wird für die Energie verbrauchenden Prozesse des Leistungsstoffwechsels, Baustoffwechsel, Transport, Bewegung und Wahrnehmung, bereitgestellt. Als Energiequelle nutzen phototrophe Organismen Sonnenlicht, chemoorganotrophe Organismen organische und chemolithotrophe Organismen anorganische Verbindungen. Die Oxidation organischer Verbindungen im Energiestoffwechsel wird als Katabolismus, der Aufbau von organischem Zellmaterial als Anabolismus bezeichnet. Autotrophe Organismen synthetisieren ihr Zellmaterial überwiegend aus CO2, heterotrophe sind auf organische Biosynthesevorstufen angewiesen. ATP, der universelle Energieüberträger, aktiviert aufgrund seines hohen Gruppenübertragungspotentials zahlreiche Verbindungen durch Übertragung einer Phosphorylgruppe. In den katabolen Stoffwechselwegen werden energiereiche Zwischenprodukte wie Phosphoenolpyruvat oder 1,3-Bisphosphoglycerat gebildet, deren Phosphorylierungspotential ausreichend hoch für die Phosphorylierung von ADP zu ATP ist (Substratstufenphosphorylierung). Die Reoxidation der im Energiestoffwechsel reduzierten Coenzyme ist mit der Synthese von ATP aus ADP und Pi über eine membrangebundene ATP-Synthase verknüpft (Elektronentransportphosphorylierung). Die Energieladung beschreibt das Verhältnis der Konzentrationen von ATP plus 1/2 ADP zur Gesamtkonzentration der Adeninnucleotide und ist ein Maß für den Energiezustand einer Zelle. Lebende Organismen sind Energiewandler. Sie nehmen Energie und Materie aus der Umgebung auf und nutzen sie für den Aufbau ihrer Zellstrukturen (Abb. 7.1). Die Gesamtheit der in einer Zelle stattfindenden Prozesse, der Stoffwechsel oder Metabolismus (griech. metabolé: Veränderung, Wechsel), besteht aus den Energie konservierenden Reaktionen des Energiestoffwechsels und den Energie verbrauchenden des Leistungsstoffwechsels. Der Energiestoffwechsel stellt ATP, ein elektrochemisches Membranpotential und Reduktionsäquivalente in Form von Nicotinamidadenindinucleotid[phosphat] (NAD[P]H) für den Leistungsstoffwechsel bereit. Im Energiestoffwechsel konservieren Organismen die Energie des Sonnenlichtes bzw. die bei einer Redoxreaktion frei werdende Energie durch den Abbau relativ energiereicher chemischer Verbindungen zu energieärmeren. Der Abbau organischer Verbindungen im Energiestoffwechsel wird

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7.1 Grundprinzipien des Stoffwechsels

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7 Abb. 7.1 Fließgleichgewicht. Lebende Organismen stehen mit ihrer Umgebung in einem Fließgleichgewicht. Energie wird aus der Umgebung in Form von Lichtenergie (phototrophe Organismen) oder als chemische Energie (chemotrophe Organismen) aufgenommen und in Form von elektrochemischen Membranpotentialen, ATP und NAD(P)H gespeichert. Die gespeicherte Energie wird für Arbeitsleistungen der Zelle (Biosynthesen, Transport, Bewegung und Wahrnehmung) verwendet. Der Wirkungsgrad des Energiestoffwechsels liegt bei ca. 60–70 %, der Rest der Energie wird als Wärme freigesetzt. Im Leistungsstoffwechsel geht erneut ein Teil der für die ATP-Synthese aufgewendeten Energie als Wärme verloren. Der gesamte Leistungsstoffwechsel hat einen Wirkungsgrad von ca. 40 %. Die aufgenommenen Substrate werden z. T. auch als Biosynthesevorstufen genutzt, Abfallstoffe an die Umgebung abgegeben.

als Katabolismus bezeichnet. Bestimmte Prokaryoten nutzen die Oxidation anorganischer Verbindungen zur Energiekonservierung. Der Aufbau von Zellstrukturen findet im Baustoffwechsel oder Anabolismus (griech. anabolé: Hinaufgehen) statt. Weitere energieverbrauchende Stoffwechselleistungen sind aktiver Transport, Bewegung und Wahrnehmung. Während bei Prokaryoten sämtliche Stoffwechselprozesse im Cytoplasma oder in der Cytoplasmamembran stattfinden, sind katabole und anabole Wege bei Eukaryoten häufig in unterschiedlichen Zellkompartimenten lokalisiert (Tab. 7.1). Sie besitzen daher zahlreiche Transportsysteme für hydrophile oder große Moleküle. Pflanzen und bestimmte Prokaryoten sind phototroph, sie nutzen die Strahlungsenergie der Sonne zur Synthese von ATP als mobilem Energiespeicher, zum Aufbau eines elektrochemischen Membranpotentials und zur Erzeugung von Reduktionsäquivalenten in Form von NAD(P)H. Chemotrophe Organismen nutzen die bei der Oxidation chemischer Verbindungen frei werdende Energie. Lithotrophe Organismen verwenden für die Reduktion von NAD(P)+ einen anorganischen Elektronendonor, organotrophe einen organischen. Autotrophe Organismen synthetisieren ihr Zellmaterial im Baustoffwechsel überwiegend aus Kohlendioxid (CO2) als einziger Kohlenstoffquelle, heterotrophe nutzen vorwiegend von den autotrophen Primärproduzenten synthetisierte organische

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7 Stoffwechsel

Tab. 7.1 Lokalisation der anabolen und katabolen Stoffwechselwege in eukaryotischen und prokaryotischen Zellen.

7

Stoffwechselweg

Eukaryoten: tierische Zelle

Eukaryoten: pflanzliche Zelle

Prokaryoten

Glykolyse

Cytoplasma

Cytoplasma; z. T. auch in Plastiden

Cytoplasma

Speicherkohlenhydrate

Cytoplasma (Glykogen)

Plastiden (Stärke)

Cytoplasma

Gärung

Cytoplasma

Cytoplasma

Cytoplasma

Citratzyklus

Mitochondrien

Mitochondrien

Cytoplasma

Gluconeogenese

Cytoplasma

Cytoplasma, auch in Plastiden

Cytoplasma

Pentosephosphatweg

Cytoplasma

Cytoplasma; modifiziert auch in Chloroplasten

Cytoplasma

b-Oxidation der Fettsäuren

Mitochondrien, auch Microbodies

Glyoxysomen, Peroxisomen

Cytoplasma

Fettsäuresynthese

Cytoplasma

Plastiden

Cytoplasma

Glyoxylatzyklus

–

Glyoxysomen

Cytoplasma

Endoxidation

Mitochondrienmembran

Mitochondrienmembran

Cytoplasmamembran

Photosynthese

–

Thylakoidmembran der Chloroplasten

Cytoplasmamembran und intracytoplasmatische Membranen

Tab. 7.2 Einteilung der Organismen anhand ihrer Energie- und Kohlenstoffquelle. Typ

Energiequelle

Elektronendonor

KohlenOrganismen (Beispiele) stoffquelle

Photolithoautotroph

Licht

anorganisch

CO2

Cyanobacteria, Chromatiaceae, Chlorobiaceae, Algen, grüne Pflanzen

Photoorganoheterotroph

Licht

organisch

organisch

Rhodospirillaceae

Chemolithoautotroph

Oxidation anorgachemischer nisch Verbindungen

CO2

Ammonium- und Nitritoxidierer, viele Wasserstoffoxidierer, Eisenoxidierer u. farblose Schwefeloxidierer, sulfidogene Bakterien

Chemolithoheterotroph

Oxidation anorgachemischer nisch Verbindungen

organisch

einige Schwefeloxidierer, z. B. Beggiatoa

organisch

die meisten Prokaryoten, Pilze, Pflanzen (im Dunkeln), Tiere

Chemoorgano- Oxidation organisch heterotroph chemischer Verbindungen

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7.1 Grundprinzipien des Stoffwechsels

265

Verbindungen als Vorstufen. Die verschiedenen Stoffwechseltypen der Organismen sind in Tab. 7.2 zusammengefasst.

7.1.1

ATP und weitere energiereiche Verbindungen

Die Zelle speichert Energie aus den exergonen Redoxreaktionen des Energiestoffwechsels in Form von elektrochemischen Membranpotentialen, NAD(P)H und ATP. Diese intrazellulären Energiespeicher sind ineinander umwandelbar und stehen den endergonen Prozessen des Leistungsstoffwechsels, Baustoffwechsel, Transport, Bewegung und Wahrnehmung, zur Verfügung (Abb. 7.2). Der universelle Überträger chemischer Energie ist in allen Zellen ATP (Abb. 7.3a), eines der ältesten Moleküle in lebenden Systemen mit zahlreichen weiteren Funktionen, z. B. als Quelle für cAMP, als Phosphorylgruppendonor für Proteinkinasen (S. 486), als Baustein für zahlreiche Biomoleküle (S. 105) und als Cofaktor (S. 251). In der Zelle liegt ATP stets im Komplex mit Magnesiumionen vor. Als energiereiche Verbindung besitzt ATP ein hohes Gruppenübertragungspotential, es enthält zwei Phosphorsäureanhydridbindungen, bei deren Hydrolyse unter Standardbedingungen jeweils ca. –32 kJ mol–1 (DGh) frei werden. Unter physiologischen Bedingungen und den zellulären Konzentrationen von ATP, ADP und Pi beträgt DGhl –50 kJ mol–1. Der gleiche Energiebetrag ist entsprechend für die Synthese von ATP aus ADP und Pi erforderlich und muss von den Redoxreaktionen des Energiestoffwechsels geliefert werden. Im Unterschied zu anderen Verbindungen, bei deren Hydrolyse ein ähnlich hoher Energiebetrag frei wird, z. B. Essigsäureanhydrid (DGhl = –48 kJ mol–1), ist ATP unter physiologischen Bedingungen sehr stabil, die unkontrollierte Hydrolyse ist kinetisch gehemmt. ATP eignet sich deshalb besonders gut als Energiespeicher, weil die Übertragung der Phosphorylgruppe nur dann erfolgt, wenn sie durch entsprechende Enzyme katalysiert wird. Zahlreiche Stoffwechselreaktionen werden erst durch die Aktivierung einer energiearmen Verbindung über ihre gezielte Phosphorylierung mit ATP ermöglicht. ATP überträgt Phosphorylgruppen auf

Abb. 7.2 Verknüpfung von Energie- und Leistungsstoffwechsel. Die Energiespeicher sind ineinander umwandelbar; elektrochemische Potentialdifferenzen von Ionen an einer Membran können durch Reoxidation von NADH aufgebaut und zur Synthese von ATP genutzt oder umgekehrt durch Hydrolyse von ATP zu ADP aufgebaut und für die Reduktion von NAD+ zu NADH genutzt werden.

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7

266

7 Stoffwechsel

Tab. 7.3 Freie Energie der Hydrolyse einiger Verbindungen mit unterschiedlich hohem Gruppenübertragungspotential.

7

Verbindung

DGhl der Hydrolyse (kJ mol–1)

Verbindung

DGhl der Hydrolyse (kJ mol–1)

Phosphoenolpyruvat

–62

Glucose-1-phosphat

–21

1,3-Bisphosphoglycerat

–49

PPi

–9

Acetylphosphat

–44

Glucose-6-phosphat

–16

Phosphokreatin

–44

Acetacetyl-CoA

–43

ATP

–32

Acetyl-CoA

–43

Uridindiphosphat-Glucose

–31

Succinyl-CoA

–43

Verbindungen mit geringerem Gruppenübertragungspotential, umgekehrt wird ADP nur von Verbindungen mit höherem Gruppenübertragungspotential zu ATP phosphoryliert (Tab. 7.3). Ein besonders hohes Phosphorylgruppenübertragungspotential besitzt das Phosphoenolpyruvat (Abb. 7.3b). Pyruvat kann in einer Enol- und in einer Ketokonformation vorliegen, wobei das Gleichgewicht stark auf der Seite der Ketoform liegt. Im Phosphoenolpyruvat ist die Verbindung durch die Phosphorylgruppe in der Enolkonformation arretiert. Nach der hydrolytischen Abspaltung der Phosphorylgruppe von Phosphoenolpyruvat lagert sich die Enol- in die Ketoform um (Keto-Enol-Tautomerisierung). Gemischte Säureanhydride aus einer Carbonsäure und Phosphorsäure, z. B. Acetylphosphat oder 1,3-Bisphosphoglycerat (Abb. 7.3c), besitzen ebenfalls ein höheres Gruppenübertragungspotential als ATP und treten häufig als energiereiche Zwischenprodukte des Energiestoffwechsels auf, von denen eine Phosphorylgruppe auf ADP übertragen wird. Phosphokreatin fungiert als intrazellulärer Energiespeicher, aus dem bei kurzfristig gesteigertem Bedarf ATP über die Phosphorylierung von ADP durch die Phosphokreatin-Kinase regeneriert werden kann. Eine bedeutende Rolle im Stoffwechsel spielen auch energiereiche Thioester wie Coenzym A (CoA) als Überträger von Acylgruppen (S. 248), z. B. in Acetyl-CoA (Abb. 7.3d). Die Acylgruppe ist über eine SH-Gruppe an CoA gebunden, wodurch eine energiereiche Thioesterbindung entsteht. Weil die freien Elektronenpaare des Schwefels aufgrund der Größe des Schwefelatoms nicht zur Mesomerie und damit zur Stabilisierung der Verbindung in der Lage sind, gibt es bei Thioestern keine Resonanzstabilisierung wie bei Sauerstoffestern. Daher ist DGhl bei Thioestern deutlich größer als bei vergleichbaren Sauerstoffestern und die Gruppenübertragung wird begünstigt. Wie bei den Phosphorsäureestern ist die spontane Hydrolyse kinetisch gehemmt.

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7.1 Grundprinzipien des Stoffwechsels

267

7

Abb. 7.3 Energiereiche Verbindungen. a ATP besteht aus Adenosin und drei Phosphorylgruppen, von denen die beiden äußeren über Phosphoanhydridbindungen miteinander verknüpft sind. b Das sehr hohe Gruppenübertragungspotential von Phosphoenolpyruvat ist durch die Keto-Enol-Tautomerisierung bedingt, da die bevorzugte Ketoform erst nach Abgabe der Phosphorylgruppe erreicht werden kann. c 1,3-Bisphosphoglycerat ist ein gemischtes Säureanhydrid aus einer Carbonsäure und einer Phosphorsäure. d Thioester fungieren häufig als Überträger von Acylgruppen.

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7 Stoffwechsel

Innerhalb der Zellen steht ATP mit den anderen Nucleosidtriphosphaten (NTP) im Gleichgewicht: Die reversible Reaktion ATP + NDP m NTP + ADP wird von der relativ unspezifischen Nucleosiddiphosphat-Kinase katalysiert. Die ATP-Konzentration ist ein Maß für die Verfügbarkeit von Energie in der Zelle und wird streng reguliert. Das Verhältnis der Menge an ATP plus ADP zur Gesamtmenge der Adeninnucleotide entspricht der Energieladung: Energieladung = ([ATP] + 1⁄2 [ADP]) / ([ATP] + [ADP] + [AMP])

7

Dass ATP im Unterschied zu ADP zwei energiereiche Anhydridbindungen enthält, wird in der Gleichung durch die Werte [ATP] bzw. 1⁄2 [ADP] ausgedrückt. Die Energieladung kann Werte zwischen 0 (nur AMP) und 1 (nur ATP) annehmen, aufgrund der exakten Regulation des Stoffwechsels liegt der Wert für die meisten Zellen zwischen 0,80 und 0,95. ATP-erzeugende Stoffwechselwege werden in der Regel durch eine hohe Energieladung gehemmt, ATP-verbrauchende aktiviert. Ein anderer Index für den Energiezustand einer Zelle ist das Phosphorylierungspotential, das im Unterschied zur Energieladung von der Pi-Konzentration abhängt: Phosphorylierungspotential = [ATP] / [ADP] [Pi]

7.1.2

Mechanismen der ATP-Synthese

Der stufenweise Abbau von energiereichen Substraten wird als Dissimilation bezeichnet, der Aufbau körpereigener Substanz aus einfachen Vorstufen entsprechend als Assimilation. Die Konservierung der Energie erfolgt bei der Dissimilation durch Redoxreaktionen, bei denen die in den Substraten enthaltene Energie für die ATP-Synthese genutzt wird. Dabei gibt es einen oxidativen und einen reduktiven Teil des Energiestoffwechsels, in denen jeweils eine ATP-Synthese stattfinden kann. Im oxidativen Teil fungiert das Energiesubstrat als Elektronendonor und wird oxidiert, die abgegebenen Reduktionsäquivalente werden dabei in der Regel auf Nicotinamidnucleotide (NAD+) oder Flavinnucleotide (enzymgebundenes FAD) übertragen. Abhängig vom terminalen Akzeptor der Reduktionsäquivalente unterscheidet man im reduktiven Teil der Dissimilation zwei Haupttypen. Bei der Nutzung eines externen Elektronenakzeptors erfolgt eine vollständige Oxidation des energiereichen Substrates zu energiearmen Endprodukten. Die im Verlauf des Oxidationsprozesses gewonnenen Reduktionsäquivalente werden dabei auf einen terminalen Elektronenakzeptor wie O2, NO3–, SO42– oder Fumarat übertragen. Je nach Elektronenakzeptor wird dieser Prozess als aerobe bzw. anaerobe Atmung bezeichnet. Wenn kein externer Elektronenakzeptor zur Verfügung steht, können die Elektronen auf ein organisches Molekül übertragen werden, das im oxidativen Teil des Abbauprozesses entstanden ist (interner Elektronenakzeptor). Diese unvollständige Oxidation eines Energiesubstrates

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7.1 Grundprinzipien des Stoffwechsels

269

wird als Gärung (Fermentation) bezeichnet. Als Gärungsendprodukte entstehen Verbindungen, die höher oxidiert sind als das Ausgangssubstrat und solche, die stärker reduziert sind, z. B. CO2 und Ethanol bei der Vergärung von Glucose. Die eigentliche ATP-Synthese erfolgt über zwei grundsätzlich verschiedene Mechanismen. Im Verlauf der Oxidation eines organischen Ausgangssubstrates entstehen verschiedene phosphorylierte energiereiche Zwischenprodukte (s. o.), deren Phosphorylierungspotential hoch genug für die Übertragung einer Phosphorylgruppe auf ADP ist. Diese Art der ATP-Synthese wird als Substratstufenphosphorylierung (SSP) bezeichnet. Ein typisches Beispiel ist die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Reaktion in der Glykolyse (S. 277). Der zweite Mechanismus wird als Elektronentransportphosphorylierung (ETP) bezeichnet. Er findet bei Organismen, die über eine entsprechende Elektronentransportkette verfügen, und damit zu einer Endoxidation des Substrates in der Lage sind, im reduktiven Teil der Dissimilation statt. Die im Verlauf des Oxidationsprozesses reduzierten Coenzyme (NADH und [FADH2] bzw. QH2) dienen dabei als Elektronendonoren. Die Elektronen werden in Richtung steigender Elektronenaffinität über eine Kette von Elektronencarriern, die bei Eukaryoten in der inneren Mitochondrienmembran und bei Prokaryoten in der Cytoplasmamembran lokalisiert sind, zu einem Elektronenakzeptor transportiert. Dieser Elektronenfluss ist mit einer Protonentranslokation über die Membran gekoppelt, wodurch sowohl ein Protonengradient als auch ein elektrisches Membranpotential erzeugt wird. Hieraus resultiert eine protonenmotorische Kraft (S. 305), die für die ATP-Synthese über eine membrangebundene ATP-Synthase genutzt wird (chemiosmotische Kopplung). Die reoxidierten Coenzyme stehen wieder für den oxidativen Teil der Dissimilation zur Verfügung. Der Mechanismus der ATP-Synthese bei photoautotrophen Organismen entspricht einer Elektronentransportphosphorylierung. Im Unterschied zur Atmung stammen die benötigten Elektronen jedoch nicht aus der Oxidation eines organischen Substrates, sondern werden einem primären Elektronendonor durch die Energie des Sonnenlichtes entzogen und anschließend über eine Kette von Elektronencarriern zu einem terminalen Akzeptor transportiert. Wie bei der Elektronentransportkette der Atmung werden auch hier gleichzeitig Protonen transloziert, sodass eine protonenmotorische Kraft aufgebaut wird, die für die ATP-Synthese genutzt werden kann. Als externer Elektronendonor für die dem System entzogenen Elektronen fungiert bei Pflanzen und Cyanobakterien Wasser (oxygene Photosynthese), bei den übrigen phototrophen Bakterien (anoxygene Photosynthese) ein anderer externer Elektronendonor (S. 339 und Botanik).

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7

270

7 Stoffwechsel

7.1.3

Ein Überblick über die Reaktionen des Stoffwechsels

In lebenden Zellen läuft eine Vielzahl von chemischen Reaktionen ab (Abb. 7.4), denen jedoch nur wenige unterschiedliche Reaktionstypen zugrunde liegen, an denen meist bestimmte funktionelle Gruppen beteiligt sind (Tab. 7.4). Ein zentraler Abbauweg in vielen Organismen ist die Glykolyse; in einigen Prokaryoten existieren alternative Wege wie der Entner-Doudoroff-Weg oder Mikrobiologie). In der Glykolyse (griech. glykys: der Phosphoketolase-Weg ( süß, lysis: Auflösung) wird Glucose über eine Kette von Reaktionsschritten bis zum C3-Körper Pyruvat abgebaut. Dabei wird ATP über Substratstufenphosphorylierung synthetisiert und Reduktionsäquivalente werden in Form von NADH

7

Abb. 7.4 Anabole und katabole Stoffwechselwege, unterteilt in drei Stufen. Im Katabolismus werden die Polymere zunächst zu Monomeren und anschließend zu zentralen Stoffwechselintermediaten wie Pyruvat, Acetyl-CoA oder Intermediaten des Citratzyklus abgebaut. In Stufe III erfolgt über Citratzyklus und Endoxidation die vollständige Oxidation zu H2O und CO2. In Stufe II wird ATP über Substratstufenphosphorylierung synthetisiert, in Stufe III über Substratstufen- und vor allem über Elektronentransportphosphorylierung. Ausgehend von Intermediaten der Glykolyse bzw. des Citratzyklus werden im Anabolismus unter ATP-Verbrauch Monomere und die benötigten Polymere synthetisiert.

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7.1 Grundprinzipien des Stoffwechsels

271

Tab. 7.4 Wichtige funktionelle Gruppen und ihre Verbindungen. Funktionelle Gruppe bzw. Bindung

Benennung

Vorkommen/Eigenschaften

7

bereitgestellt. In aeroben Organismen reagiert Pyruvat mit Coenzym A zu AcetylCoA, das anschließend in den Citratzyklus eingeschleust wird. Neben der Synthese weiterer energiereicher Nucleotide (GTP oder ATP) über Substratstufenphosphorylierung besteht eine wichtige Funktion des Citratzyklus in der Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten. Die Reoxidation von NADH erfolgt im Verlauf einer Elektronentransportkette, deren Komponenten entweder nur Elektronen oder Elektronen und Protonen über die Membran transportieren. Das dadurch aufgebaute elektrochemische Membranpotential stellt einen Energiespeicher dar, der zur Synthese von ATP über eine ATP-Synthase genutzt werden kann (Elektronentransportphosphorylierung).

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272

7

7 Stoffwechsel

Anabole Stoffwechselwege sind meist endergon und erfordern daher die Zufuhr von Energie in Form von ATP. Ausgangssubstrate für Biosynthesen sind oft Intermediate der zentralen Abbauwege des Energiestoffwechsels, sodass unterschiedliche Stoffwechselwege um diese Zwischenprodukte konkurrieren. Die Biosynthesewege für die verschiedenen Zellbestandteile sind in den meisten Organismen identisch oder sehr ähnlich. Essentielle Aminosäuren und Vitamine, die ein Organismus nicht selbst synthetisieren kann, müssen mit der Nahrung aufgenommen werden. Da Biosynthesen in der Regel auf dem Wege chemischer Reduktionen stattfinden, werden für den Aufbau organischer Zellsubstanz auch Reduktionsmittel benötigt. Während NAD+/NADH als Elektronenakzeptor bzw. -donor im Energiestoffwechsel fungiert, wird NADPH als Elektronendonor im Baustoffwechsel verwendet. Dabei dient der Phosphatrest von NADP+ der Zelle als Unterscheidungsmerkmal zwischen Oxidationsmittel-Pool (NAD+/NADH) und ReduktionsmittelPool (NADP+/NADPH) (S. 224). Stoffwechsel (Metabolismus): Gesamtheit der Stoffumsetzungen. Energiestoffwechsel: Stoffwechselwege, die der Energiebereitstellung der Zelle dienen. Chemotroph: Energiequelle sind organische oder anorganische chemische Verbindungen. Phototroph: Energiequelle ist Sonnenlicht. Leistungsstoffwechsel: Baustoffwechsel, Transport, Bewegung, Wahrnehmung. Katabolismus: Abbau organischer Verbindungen im Energiestoffwechsel. Anabolismus (Baustoffwechsel): Aufbau von organischem Zellmaterial. Autotroph: Synthese vorwiegend aus CO2. Heterotroph: Organische Biosynthesevorstufe erforderlich. Gruppenübertragungspotential: DG0l-Wert der hydrolytischen Abspaltung eines Molekülteils (meist Phosphatgruppe); charakterisiert die Fähigkeit einer Verbindung, die Gruppe auf andere Moleküle zu übertragen. Energieladung: Verhältnis der Konzentrationen von ATP plus 1/2 ADP zur Konzentration der Gesamtnucleotide. Maß für den Energiezustand einer Zelle. Wert liegt zwischen 0 (nur AMP) und 1 (nur ATP). Energiereiche Verbindungen: Verbindungen mit hohem Gruppenübertragungspotential. ATP: universeller Energieüberträger der Zelle. Energiereiche Stoffwechselintermediate: Acylphosphate (Acetylphosphat, 1,3-Bisphosphoglycerat), Phosphoenolpyruvat, Thioester (Acetyl-Coenzym A). Atmung: Vollständige Oxidation eines Energiesubstrates gekoppelt mit der Reduktion eines externen Elektronenakzeptors. ATP-Synthese über SSP, aber in erster Linie über ETP. – Aerobe Atmung: Übertragung der Elektronen auf O2 als terminalen Elektronenakzeptor. Vorkommen: alle Eukaryoten und viele Prokaryoten. – Anaerobe Atmung: Übertragung der Elektronen auf externe Elektronenakzeptoren wie NO3–, NO2–, SO42– oder Fumarat. Vorkommen: einige Prokaryoten.

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

273

Gärung (Fermentation): Unvollständige Oxidation eines Energiesubstrates bei Fehlen eines externen Elektronenakzeptors oder einer vollständigen Elektronentransportkette. Übertragung der Elektronen auf einen internen Elektronenakzeptor (meist ein Abbauprodukt der Oxidation). ATP-Synthese erfolgt in der Regel über SSP. Substratstufenphosphorylierung (SSP): Direkte Verknüpfung einer stark exergonen Reaktion mit der Synthese von ATP. Übertragung der Phosphorylgruppe auf ADP erfolgt über ein energiereiches Stoffwechselintermediat. Beispiel: GAP-DHReaktion der Glykolyse. Elektronentransportphosphorylierung (ETP): Gerichteter Elektronentransport in einer Membran ist mit der Translokation von Protonen über die Membran verbunden. Die resultierende protonenmotorische Kraft treibt die ATP-Synthese an.

7.2

Der Kohlenhydratstoffwechsel

Kohlenhydrate dienen in vielen Organismen als Energielieferanten und sind Bestandteile von Strukturelementen. Zentraler Abbauweg für Kohlenhydrate ist die Glykolyse, über die Glucose zu Pyruvat oxidiert wird. Dabei entstehen ATP und Reduktionsäquivalente. Andere Mono- und Disaccharide werden mithilfe zusätzlicher Enzyme in die Glykolyse eingeschleust. In Abwesenheit eines externen Elektronenakzeptors werden die dem Ausgangssubstrat entzogenen Elektronen auf einen internen Elektronenakzeptor, z. B. Pyruvat, übertragen (Gärung). In Anwesenheit eines externen Elektronenakzeptors wird Pyruvat durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex oxidativ zu Acetyl-CoA decarboxyliert, das über den Citratzyklus vollständig zu CO2 oxidiert wird. Dabei entstehen GTP bzw. ATP und weitere Reduktionsäquivalente, die in der Atmungskette als Elektronendonor fungieren (Atmung). Die Synthese von Polysacchariden geht von Nucleosiddiphosphat-Zuckern aus. Die Monomere werden unter Freisetzung des Nucleosiddiphosphates a-glykosidisch (Speicherpolysaccharide, z. B. Stärke, Glykogen) oder b-glykosidisch (Strukturpolysaccharide, z. B. Cellulose, Chitin, Peptidoglykan) verknüpft. Der Abbau von Polysacchariden erfolgt phosphorolytisch oder hydrolytisch. Über die Gluconeogenese werden Glucose-6-phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat aus Pyruvat und Intermediaten des Citratzyklus synthetisiert. Im Unterschied zu Tieren können Pflanzen und viele Prokaryoten über den Glyoxylatzyklus Glucose aus Acetyl-CoA bilden. Der oxidative Pentosephosphatweg liefert Pentosen und NADPH für Biosynthesen. Kohlenhydrate sind die häufigsten organischen Verbindungen auf der Erde. Sowohl in Prokaryoten als auch in eukaryotischen Organismen erfüllen Kohlenhydrate in Form von Mono- oder Disacchariden und als Polymere zahlreiche Funktionen (S. 280). Auch als Bestandteile von Glykolipiden oder Glykoproteinen

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7

274

7

7 Stoffwechsel

spielen Zucker eine wichtige Rolle. Hexosen dienen den meisten Organismen als wichtige Energielieferanten, insbesondere Glucose als Ausgangssubstrat der Glykolyse. Außer Glucose können auch andere Mono- und Disaccharide durch wenige zusätzliche Schritte in die Glykolyse eingeschleust werden. Viele Organismen synthetisieren aus überschüssiger Glucose Speicherpolysaccharide wie Glykogen oder Stärke als Energiereserve. Cellulose, Hauptbestandteil pflanzlicher Zellwände, ist ein weiteres Polysaccharid aus Glucoseeinheiten. Über die Reaktionen der Gluconeogenese kann Glucose aus Nichtkohlenhydraten gebildet werden. Dabei wird die verwendete Vorstufe zunächst in Pyruvat überführt und anschließend in die Gluconeogenese eingeschleust. Die meisten autotrophen Organismen synthetisieren Zuckermonomere aus CO2 über den CalvinZyklus (S. 345), in einigen Prokaryoten existieren andere CO2-Fixierungswege ( Mikrobiologie). Einen zentralen Knotenpunkt im Stoffwechsel bildet Glucose-6-phosphat als Intermediat verschiedener Stoffwechselwege, z. B. Glykolyse, Pentosephosphatweg, Gluconeogenese und Synthese bzw. Abbau von Glykogen oder Stärke. Vielfältige Regulationsmechanismen sorgen dafür, dass der Ablauf der verschiedenen Synthese- und Abbauwege den jeweiligen Lebensbedingungen optimal angepasst ist, sodass eine Zelle Glucose sowohl als Brennstoff nutzen als auch für Biosynthesen verwenden kann. Neben den Hexosen benötigen alle Organismen auch Pentosen, die Bestandteil der Nucleotide und vieler Coenzyme sind. Im Verlauf des oxidativen Pentosephosphatweges wird neben diesen C5-Zuckern auch NADPH erzeugt, das als Reduktionsmittel für zahlreiche Biosynthesen dient.

7.2.1

Die Glykolyse

Die Glykolyse, auch Embden-Meyerhof-Parnas-Weg, besteht in allen Organismen aus der Abfolge von zehn enzymatischen Reaktionen (Abb. 7.5). Dabei wird der C6-Körper Glucose in zwei C3-Einheiten (Pyruvat) überführt. Die zwischen Glucose und Pyruvat ablaufenden enzymatischen Reaktionen dienen der Synthese energiereicher Zwischenverbindungen, deren Phosphorylierungspotential hoch genug ist, um ihre Phosphorylgruppe auf ADP zu übertragen. Pro Mol Glucose werden zwei Mol ATP und zwei Mol Reduktionsäquivalente erzeugt: Glucose + 2 Pi + 2 ADP + 2 NAD+ p 2 Pyruvat + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O

Die einzelnen Reaktionen und ihre Enzyme In der Eingangsreaktion katalysiert das Enzym Hexokinase die Aktivierung von Glucose zu Glucose-6-phosphat durch den Transfer eines Phosphatrestes von ATP auf die C6-Position (Abb. 7.5). Die in allen Zellen vorkommende Hexokinase ist relativ unspezifisch und überträgt Phosphatgruppen von ATP auf eine Reihe von Hexosen wie Glucose, Mannose, Galactose, Glucosamin und Fructose.

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

275

7

Abb. 7.5 Die Glykolyse. Glucose wird schrittweise zu Pyruvat abgebaut. Alle Zwischenprodukte sind phosphorylierte C6- und C3-Körper. Durch Übertragung einer Phosphorylgruppe von 1,3-Bisphosphoglycerat bzw. Phosphoenolpyruvat auf ADP wird jeweils ATP gebildet. Bei der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Reaktion fungiert NAD+ als Elektronenakzeptor.

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7 Stoffwechsel

In Zellen von Leber und Pankreas erfolgt die Phosphorylierung von Glucose hauptsächlich durch die für Glucose spezifische Glucokinase, eine spezielle Isoform der Hexokinase, deren KM-Wert mit 10–2 mol l–1 das Hundertfache des KM-Wertes der Hexokinase (10–4 mol l–1) beträgt. Ihre Aufgabe ist vor allem die Senkung eines hohen Blutglucosespiegels, z. B. nach einer kohlenhydratreichen Mahlzeit. Überschüssige Glucose wird dann aus dem Blut in die Leberzellen transportiert, durch die Glucokinase zu Glucose6-phosphat umgesetzt und anschließend zu Glykogen polymerisiert (s. u.). Der hohe KMWert der Glucokinase stellt sicher, dass nicht zu viel Glucose aus dem Blut entfernt wird, sodass die Glucoseversorgung des Gehirns und der Muskulatur gesichert bleibt.

7

Die Aldose Glucose-6-phosphat wird im nächsten Schritt durch die Phosphogluco-Isomerase (PGI, auch Glucosephosphat-Isomerase, HexosephosphatIsomerase) zur Ketose Fructose-6-phosphat (F6P) isomerisiert, das anschließend durch die Phosphofructokinase an C1 phosphoryliert wird. Da Glucose-6-phosphat auch das Startmolekül für andere Stoffwechselwege wie Pentosephosphatweg und Glykogensynthese ist, stellt erst die irreversible PhosphofructokinaseReaktion die Schrittmacherreaktion der Glykolyse dar (S. 278). Die Fructosebisphosphat-Aldolase katalysiert die Spaltung von Fructose1,6-bisphosphat in die beiden Triosen Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP). DHAP und GAP sind Ketose-Aldose-Isomere, die in einer reversiblen enzymatischen Reaktion ineinander umgewandelt werden können. Diese Reaktion ist analog zur Glucosephosphat-Isomerase-Reaktion und wird von der Triosephosphat-Isomerase (TIM) katalysiert. Im Gleichgewicht liegen nur etwa 4 % der Triosephosphate als GAP und 96 % als DHAP vor. Weil die nachfolgende Reaktion das gebildete GAP jedoch sofort weiter umsetzt und damit dem System entzieht, wird ständig weiteres DHAP zu GAP isomerisiert. Dihydroxyacetonphosphat dient außerdem als Baustein für die TriglyceridSynthese (S. 325). Die Oxidation von Glycerinaldehyd-3-phosphat zu 1,3-Bisphosphoglycerat (1,3-BPG; Glycerat-1,3-bisphosphat) durch die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAP-DH) stellt Reduktionsäquivalente (NADH) bereit und schafft durch die Bildung eines energiereichen Thioesters als Zwischenprodukt die Voraussetzung für die Konservierung von Energie in Form von ATP (Abb. 7.6). Das hohe Gruppenübertragungspotential des gemischten Säureanhydrids 1,3-Bisphosphoglycerat ermöglicht in der anschließenden PhosphoglyceratKinase-Reaktion unter Bildung von 3-Phosphoglycerat (3-PG) die Phosphorylierung von ADP zu ATP. Durch die von der Phosphoglycerat-Mutase (PGM) katalysierte intramolekulare Umlagerung der Phosphatgruppe entsteht aus 3-Phosphoglycerat 2-Phospho-D-glycerat (2-PG). Diese Umlagerung ermöglicht in der nachfolgenden Enolase-Reaktion unter Wasserabspaltung die Bildung von Phosphoenolpyruvat (PEP), in dem die Phosphorylgruppe als energiereiche Bindung vorliegt. Die Freie Standardenthalpie der Hydrolyse von PEP reicht mit –61,9 kJ mol-1 für die ATP-Synthese durch Übertragung der Phosphorylgruppe auf ADP aus. Diese Reaktion, bei der neben ATP auch Pyruvat entsteht, wird von der Pyru-

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

277

Abb. 7.6 Mechanismus der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Reaktion (GAP-DH). Durch die Bildung eines Thioesters zwischen der Aldehydgruppe von Glycerinaldehyd-3-phosphat und der Sulfhydrylgruppe eines Cysteinrestes der GAP-DH entsteht eine energiereiche Zwischenverbindung mit hohem Gruppenübertragungspotential. Coenzym der Reaktion ist NAD+, das zu NADH reduziert wird. Anschließend reagiert der noch an die GAP-DH gebundene Thioester mit Orthophosphat zu 1,3-Bisphosphoglycerat.

vat-Kinase katalysiert und ist unter physiologischen Bedingungen irreversibel. Die ATP-Synthese wird erst durch die vorangehende Enolase-Reaktion möglich, denn die Freie Standardenthalpie der Hydrolyse von 2-PG würde mit nur –17,6 kJ mol–1 nicht ausreichen (S. 266, Keto-Enol-Tautomerisierung). Bei den von Hexokinase und Phosphofructokinase katalysierten Reaktionen werden pro Mol Glucose insgesamt zwei Mol ATP verbraucht. Jeweils ein Mol ATP entsteht pro Mol umgesetzter Triose bei den Reaktionen der Phosphoglycerat-Kinase und der Pyruvat-Kinase, insgesamt vier Mol ATP pro Mol Glucose. Die Netto-ATP-Ausbeute der Glykolyse beträgt daher zwei Mol ATP pro Mol Glucose. Sämtliche Reaktionen der Glykolyse finden im Cytosol statt. Die beteiligten Enzyme liegen, insbesondere in Muskel- und Lebergewebe, als Multienzymkomplex vor, sodass die Zwischenprodukte von einem Enzym direkt an das nächste weitergegeben werden (Kanaleffekt). In eukaryotischen Zellen werden einige Glykolyseenzyme durch Mikrotubuli (S. 453) in bestimmten Cytosolbereichen fixiert.

Regulation der Glykolyse Die Glykolyse hat zwei Funktionen: Die ATP-Synthese durch Abbau von Glucose und die Lieferung von Bausteinen für Biosynthesen. Die Regulation dieser beiden Funktionen entsprechend den jeweiligen Bedürfnissen der Zelle erfolgt durch allosterische Effektoren, kovalente Modifikationen oder auf Transkriptionsebene. Regulierte Enzyme der Glykolyse sind die drei Kinasen, die alle stark exergone Schlüsselreaktionen katalysieren. Die Phosphofructokinase (PFK) stellt die wichtigste Kontrollstelle der Glykolyse dar, weil sie den ersten irreversiblen

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7 Stoffwechsel

Schritt katalysiert, der ausschließlich in der Glykolyse stattfindet. Neben den Substratbindungsstellen für Fructose-6-phosphat und ATP besitzt die PFK mehrere Bindungsstellen für allosterische Effektoren (S. 202). ATP ist nicht nur Substrat der PFK, sondern auch ein Produkt der Glykolyse. Ein hoher ATP-Spiegel führt zu einer allosterischen Hemmung der PFK durch ATP (Feedback-Kontrolle, S. 202) und damit der Glykolyse. Steigende Konzentrationen von ADP und AMP bewirken eine allosterische Aufhebung der durch ATP verursachten Hemmung, sodass letztlich die Energieladung der Zelle (S. 268) über die Aktivität der PFK und damit über die Substratzufuhr für die gesamte Glykolyse entscheidet: Eine hohe Energieladung der Zelle bewirkt eine Hemmung, eine niedrige die Aktivierung der PFK. Da die Glykolyse neben ATP auch Bausteine für Biosynthesen bereitstellt, existiert ein weiterer Regulationsmechanismus für die PFK, der vom Baustoffwechsel ausgeht. Eine hohe Konzentration von Citrat, dem ersten Zwischenprodukt des Citratzyklus, zeigt die ausreichende Verfügbarkeit von Bausteinen für Biosynthesen an und wirkt daher ebenfalls hemmend auf die PFK. Dabei wird die durch ATP verursachte Hemmung verstärkt, sodass der Verbrauch von Glucose durch die Glykolyse noch weiter verringert wird. Eine Hemmung der PFK führt zu einer Anhäufung ihres Substrates Fructose6-phosphat. Da Fructose-6-phosphat über die Isomerase-Reaktion mit Glucose6-phosphat im Gleichgewicht steht, steigt auch dessen Konzentration an, sodass durch den erhöhten Glucose-6-phosphat-Spiegel auch die Hexokinase allosterisch gehemmt wird, die außerdem direkt durch ihr Endprodukt ADP gehemmt wird. Die Glucokinase der Leber wird nicht durch Glucose-6-phosphat gehemmt, sondern durch Fructose-6-phosphat, das Produkt des zweiten Schrittes der Glykolyse. Dieser Unterschied in der Regulation bewirkt, dass die Glucokinase auch bei einer hohen Glucose-6-phosphat-Konzentration überschüssige Glucose aus dem Blut phosphorylieren und so den Blutglucosespiegel senken kann. Die Pyruvat-Kinase kontrolliert die Menge der gebildeten Endprodukte ATP und Pyruvat. Durch ATP, d. h. eine hohe Energieladung, wird die Pyruvatkinase allosterisch gehemmt, indem die Affinität des Enzyms zu seinem Substrat Phosphoenolpyruvat (PEP) gesenkt wird. Auch Alanin, eine Aminosäure, die durch Transaminierung aus Pyruvat entsteht (S. 332) und daher einen Überfluss an Bausteinen signalisiert, hemmt das Enzym allosterisch. Fructose-1,6-bisphosphat aktiviert die Pyruvat-Kinase und bewirkt dadurch, dass sie mit der Anlieferung der Zwischenprodukte Schritt halten kann (Feedforward-Stimulierung). Außerdem wird die Pyruvat-Kinase durch Acetyl-CoA und durch langkettige Fettsäuren gehemmt, die aus Acetyl-CoA synthetisiert werden (S. 321). Säugetiere besitzen drei Isoenyzme der Pyruvat-Kinase: Der L-Typ kommt vorwiegend in der Leber vor, der M-Typ in Muskel und Gehirn und der A-Typ in anderen Geweben. Die verschiedenen Isoenzyme unterscheiden sich vor allem in der Art ihrer Regulation, beispielsweise wird das L-Isozym zusätzlich hormonell durch Glucagon reguliert ( Zoologie).

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

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In Pflanzen findet die Glykolyse im Cytoplasma und zusätzlich in manchen Plastiden statt. In Chloroplasten fehlen die Phosphofructo-Kinase und die PhosphoglyceratMutase. Für den Stoffaustausch zwischen den Kompartimenten sorgen selektive Transporter in der inneren Plastidenmembran. Für die Regulation der Glykolyse spielen bei Pflanzen Adeninnucleotide – und damit die Energieladung – keine große Rolle, weil im pflanzlichen Cytoplasma häufig PPi als Energiequelle fungiert und in vielen pflanzlichen Geweben die Funktion der Glykolyse eher in der Versorgung der Biosynthesen mit Vorstufen liegt als in der ATP-Produktion. Wichtige Effektoren der pflanzlichen Glykolyseregulation sind PEP, Pi, Fructose2,6-bisphosphat und Intermediate des Citrat- und des Glyoxylatzyklus. Nahezu alle cytosolischen (PFKc) und plastidären (PFKp) Phosphofructokinasen, die bisher untersucht wurden, zeigen eine starke Inhibierung durch PEP, die durch den Aktivator Pi aufgehoben wird, sodass in Pflanzen das Verhältnis der Konzentrationen von Pi zu PEP die PFK-Aktivität reguliert. Die Intermediate des Citratzyklus a-Ketoglutarat, Succinat oder Malat sind effektive Feedback-Inhibitoren vieler cytosolischer pflanzlicher Pyruvatkinasen; ebenso die Aminosäuren Aspartat und/oder Glutamat. Ein bemerkenswerter Unterschied in der Feinkontrolle der pflanzlichen gegenüber der nicht pflanzlichen Glykolyse ist, dass die generelle Regulation der jeweiligen Enzyme des Fructose-6-phosphat- und des PEPMetabolismus offenbar in umgekehrter Reihenfolge stattfindet. In der Leber der Säugetiere wird die primäre Kontrolle der Glykolyse über die PFK ausgeübt, die sekundäre durch die PK. Die Aktivierung der PFK erhöht die Konzentration ihres Produktes Fructose-1,6-bisphosphat, das ein starker allosterischer Feedforward-Aktivator der meisten bisher untersuchten nicht pflanzlichen PKs ist. Die pflanzliche Glykolyse wird dagegen von unten nach oben reguliert; die primäre Regulation geht von der verarbeiteten Menge an PEP, die sekundäre von der verarbeiteten Menge an Fructose-6-phosphat aus. Viele pflanzliche PFKps und PFKcs werden durch PEP stark allosterisch inhibiert. Eine Erhöhung der Aktivität der PK oder anderer Enzyme, die PEP metabolisieren, hebt die durch PEP ausgelöste Inhibierung der PFK auf und erlaubt dadurch ein Fortschreiten der Glykolyse. Sinkt die cytoplasmatische PEP-Konzentration, nimmt auch die Menge an 3-Phosphoglycerat ab, das ein starker Inhibitor der 6-Phosphofructo-2-Kinase ist. Ein Absinken der 3-Phosphoglycerat-Konzentration hebt diese Hemmung auf und Fructose2,6-bisphosphat wird gebildet. Im Gegensatz zu nicht pflanzlichen PKs wird keine bekannte pflanzliche PK durch Fructose-1,6-bisphosphat aktiviert. Ein entscheidender Vorteil der Von-unten-nach-oben-Regulation der pflanzlichen Glykolyse ist ihre Unabhängigkeit von verwandten metabolischen Prozessen wie dem Calvin-Zyklus (S. 345) und der Saccharose/Trioseposphat/Stärkeumwandlung.

Einschleusung anderer Zucker in die Glykolyse Viele Mono- und Disaccharide werden über vorgeschaltete Reaktionen zu einem Zwischenprodukt der Glykolyse umgesetzt und dann in die Glykolyse eingeschleust (Abb. 7.7). Die wichtigsten Disaccharide sind Maltose, Lactose, Saccharose und Trehalose, die hydrolytisch in Glucose und Fructose, Galactose oder Mannose gespalten werden. Bei Vertebraten werden mit der Nahrung aufgenommene Disaccharide wie Lactose zunächst durch Enzyme am Dünndarmepithel gespalten, und die gebildeten Monosaccharide in die Dünndarmepithelzellen transportiert, von wo aus sie ins Blut gelangen. Bei vielen Menschen (Ausnahme: Nordeuropäer und einige afrikanische Völker) tritt im Erwachsenenalter eine Lactose-Intoleranz auf. Dabei führen lactosehaltige Nahrungsmittel wie Milch zu Bauchkrämpfen und Durchfall. Ursache ist das Absinken oder völlige

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7 Stoffwechsel

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Abb. 7.7 Die Einschleusung anderer Monosaccharide in die Glykolyse. a Fructose wird durch die Fructokinase zu Fructose-1-phosphat phosphoryliert, das von einer Aldolase in Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehyd gespalten wird. Glycerinaldehyd wird anschließend durch die Triosekinase zu Glycerinaldehyd-3-phosphat phosphoryliert. Alternativ kann Fructose auch durch die Hexokinase zu Fructose-6-phosphat phosphoryliert werden (s. c), das Enzym besitzt jedoch nur eine geringe Affinität zu Fructose. b Galactose wird durch die Galactokinase zu Galactose-1-phosphat phosphoryliert, das nachfolgend mit UDP-Glucose zu UDP-Galactose und Glucose-1-phosphat reagiert. Diese Reaktion wird von der Galactose-1-phosphat-Uridyltransferase katalysiert. Glucose-1-phosphat wird nach Isomerisierung zu Glucose-6-phosphat in die Glykolyse eingeschleust, UDP-Galactose zu UDP-Glucose epimerisiert und so der Kreislauf geschlossen. c Mannose wird durch die Hexokinase zu Mannose-6-phosphat umgesetzt und anschließend zum Glykolyse-Intermediat Fructose-6-phosphat isomerisiert. Verschwinden der Lactase-Aktivität in den Darmzellen, sodass Lactose nicht mehr vollständig verdaut und absorbiert werden kann. Im Dünndarm führt die osmotische Wirkung der nicht absorbierten Lactose zum Einstrom von Flüssigkeit; im Dickdarm wird die Lactose von Bakterien zu H2, CO2 und organischen Säuren umgesetzt.

Speicherpolysaccharide wie Glykogen und Stärke werden auf der Stufe von Glucose-6-phosphat in die Glykolyse eingeschleust (s. u.).

7.2.2

Polysaccharide

Polysaccharide sind Makromoleküle aus zahlreichen identischen oder unterschiedlichen Zuckermonomeren und ihren Derivaten, die über glykosidische Bindungen miteinander verknüpft sind (S. 97). Die wichtigsten Speicherpolysaccharide besitzen a-glykosidische Bindungen: Glykogen bei Pilzen, Wirbeltieren und Bakterien, Stärke bei Pflanzen und vielen Bakterien, Dextrane bei Hefen

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

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und Bakterien. Neben ihrer Funktion als Energiereserve dienen sie auch als Speicher für Bausubstrate. Strukturpolysaccharide besitzen meist b-glykosidische Bindungen: Peptidoglykan bei Bacteria und Pseudopeptidoglykan bei einigen Archaea ( Mikrobiologie), Cellulose bei Pflanzen und einigen Bakterien (z. B. Acetobacter xylinum), Chitin bei Pilzen und im Exoskelett von Arthropoden (S. 100). Eine Ausnahme ist Pektin, das aus a-glykosidisch verknüpften Galacturonsäure-Monomeren besteht.

Synthese von Polysacchariden Die Polysaccharidsynthese startet mit der Aktivierung der Monomere durch ihre Bindung an ein Nucleosiddiphosphat, meist UDP, z. B. bei der Glykogensynthese (Abb. 7.8a), aber auch ADP, GDP oder CDP. Das hohe Gruppenübertragungspotential der Nucleosiddiphosphat-Zucker (Tab. 7.3) begünstigt die Übertragung der Zuckereinheit auf die Hydroxylguppe eines Reaktionspartners. An Nucleosiddiphosphate gebundene Zucker werden bei zahlreichen Polysaccharid-Biosynthesen als Glykosylgruppendonor genutzt, während die Aktivierung für den Abbau eines Polysaccharides durch die Anlagerung einer Phosphorylgruppe erfolgt (s. u.). Stärke ist ein Gemisch aus unverzweigter a1p4-verknüpfter Amylose und dem verzweigten Amylopektin, das neben den a1p4-Bindungen zusätzlich im Abstand von 24 bis 30 Resten a1p6-Bindungen aufweist. Die Stärkesynthese findet bei Pflanzen in den Chloroplasten statt und geht von Fructose-6-phosphat aus, das über den Calvin-Zyklus bereit gestellt wird (Abb. 7.8b), oder in den Amyloplasten von Speicherzellen nach Import von Hexosephosphaten über die Hüllmembran. Cellulose besteht aus b1p4-verknüpften Glucoseresten. In Pflanzen wird als Ausgangssubstanz für die Cellulosesynthese meist Saccharose verwendet, die Transportform der in der Dunkelreaktion der Photosynthese gebildeten Hexosen (Abb. 7.8c).

Abbau von Polysacchariden Der Abbau von Polysacchariden erfolgt entweder phosphorolytisch oder hydrolytisch. Vorteil der Phosphorolyse ist die Bildung von Glucose-1-phosphat, das nicht mehr aktiviert werden muss, sodass die für den Aufbau des Polymers aufgewendete Energie beim Abbau nicht verloren geht. Die Spaltung der Polysaccharide durch Glucan-Phosphorylasen erfolgt nach der Gleichung: (Glucose)n + HPO42– m (Glucose)n–1 + Glucose-1-phosphat (DGhl = +3,1 kJ mol–1) Diese Phosphorylasen sind bei Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen weit verbreitet und katalysieren den Abbau von Glykogen (Abb. 7.9a) und Stärke. Stärke wird entweder analog zum Glykogenabbau durch die Stärke-Phosphorylase in Glucose-1-phosphat zerlegt, wobei die Seitenkettenfragmente

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7 Stoffwechsel

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Abb. 7.8 Die Synthese der wichtigsten Polysaccharide. a Glykogensynthese: Glucose6-phosphat wird reversibel zu Glucose-1-phosphat umgesetzt, das mit UTP zu UDP-Glucose reagiert. Bei einigen Bakterien wird Glucose-1-phosphat auch mit ATP zu ADP-Glucose umgesetzt. Das dabei entstehende Pyrophosphat wird von der anorganischen Pyrophosphatase sofort hydrolysiert und so das Reaktionsgleichgewicht in Richtung der Bildung von UDP-Glucose bzw. ADP-Glucose verschoben. Weil die Glykogen-Synthase Glykogen nicht aus Glucosemonomeren synthetisieren, sondern nur eine aus mindestens vier Glucoseresten bestehende a1p4-Glucankette verlängern kann, wird die Polymerisierung von UDP-Glucose bis zu einer Länge von acht Glucoseresten durch das Protein Glykogenin katalysiert, das zugleich als Starter fungiert. Die weitere Verlängerung wird von der Glykogen-Synthase katalysiert, deren Produkt unverzweigtes Glykogen ist. Das Enzym ist fest an Glykogenin gebunden und nur in dieser Form katalytisch aktiv, sodass die beiden Syntheseschritte optimal aufeinander abgestimmt sind. Zuletzt werden die a1p6-Verzweigungen durch ein spezielles Verzweigungsenzym, die Amylo-(1,4p1,6)-Transglykosylase eingeführt. b Stärkesynthese: Fructose-6-phosphat wird durch die nacheinander stattfindenden Reaktionen einer Isomerase und einer Mutase in Glucose-6-phosphat und dann in Glucose-1-phosphat umgewandelt. Nach Aktivierung zu ADP-Glucose katalysiert die StärkeSynthase mit Hilfe eines Primers die Bildung der unverzweigten Amylose. Ein Verzweigungsenzym führt die a1p6-Verzweigungen ein und erzeugt so Amylopektin. c Cellulosesynthese: Saccharose wird von der Saccharose-Synthase mit UDP oder GDP zu UDP- bzw. GDP-Glucose umgesetzt und dabei Fructose freigesetzt. Die Polymerisierung der UDPoder GDP-Glucose zu Cellulose wird von der Cellulose-Synthase katalysiert, die wie die anderen Polymerasen einen Primer benötigt.

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

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Abb. 7.9 Abbau von Polysacchariden. a Glykogen wird durch die Glykogen-Phosphorylase zu Glucose-1-phosphat abgebaut, das von der Phosphoglucomutase zu Glucose-6-phosphat umgelagert und über die Glykolyse abgebaut wird. Da die Glykogen-Phosphorylase die Verzweigungen nicht angreifen kann, werden sie durch zwei spezielle Enzyme entfernt: Wenn die Phosphorylase auf eine Stelle trifft, die noch vier Glucosereste von einer a1p6-Verzweigung entfernt liegt, überträgt zunächst die Oligo-a1,6pa1,4-Glucan-Transferase einen Block von drei Glucoseeinheiten auf einen anderen äußeren Zweig. Anschließend hydrolysiert die Amylo-1,6-Glucosidase (debranching enzyme) die jetzt frei zugängliche 1,6-Bindung. Der weitere Glykogen-Abbau erfolgt dann wieder durch die GlykogenPhosphorylase. b Stärke wird durch Endo- oder Exoamylasen hydrolysiert. Als Endoamylase hydrolysiert a-Amylase innere a1p4-Bindungen von Amylopektin und Amylose; dabei entstehen aus Amylose Maltose und Maltotriose, aus Amylopektin zusätzlich a-Dextrine, die a1p6-Bindungen enthalten. Maltose und Maltotriose werden durch Maltase zu Glucose abgebaut, a-Dextrine durch a-Dextrinase, die auch a1p6-Bindungen spaltet. Die in Pflanzen vorkommende b-Amylase spaltet als Exoamylase vom nichtreduzierenden Ende der Molekülkette Maltoseeinheiten ab. c Cellulose wird im ersten Schritt durch Endo- und Exocellulasen zu Cellobiose hydrolysiert, die dann entweder durch b-Glucosidase zu Glucose hydrolysiert oder durch eine Phosphorylase zu Glucose-1-phosphat abgebaut wird.

entsprechend durch eine Transferase und eine Glucosidase (R-Enzym) entfernt werden, oder durch Amylasen hydrolysiert (Abb. 7.9b). Cellulose wird durch Cellulasen von Pilzen, einigen Protozoen und Prokaryoten abgebaut (Abb. 7.9c). Tierische a-Amylasen können die b-1,4-glykosidischen Bindungen der Cellulose nicht hydrolysieren, daher können die meisten Tiere Cellulose nicht direkt als Energiequelle nutzen. Eine seltene Ausnahme sind die Silberfischchen (Lepisma saccharina), die eine eigene Cellulase besitzen. Dagegen verwerten Termiten Cellulose nur mithilfe von Cellulase bildenden symbiontischen Protozoen (Trichonympha) in ihrem Darmtrakt. Im Pansen von Wiederkäuern, z. B. Rindern, leben symbiontische Bakterien, die Cellulase produzieren.

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7 Stoffwechsel

Regulation des Abbaus und der Synthese von Glykogen und Stärke

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Die Glykogen- bzw. Stärke-Phosphorylase nimmt eine zentrale Stellung ein, da sie die Nährstoffspeicher (Glykogen und Stärke) mit der Glykolyse (s. o.) verbindet. Sowohl Synthese als auch Abbau von Glykogen in tierischen Zellen sind unter den gleichen physiologischen Bedingungen exergon; die Synthese durch die Hydrolyse des Pyrophosphates aus der UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Reaktion, der Abbau durch die Spaltung der glykosidischen Bindungen im Glykogen. Bei gleichzeitigem Ablauf würde lediglich UTP verbraucht. Die Aktivität der gegenläufig arbeitenden Enzyme Glykogen-Phosphorylase und GlykogenSynthase im Muskel und in der Leber unterliegt daher einer komplexen Regulation. Glykogen muss abgebaut werden, wenn der Energiespiegel niedrig ist, daher wird die Glykogen-Phosphorylase im Muskel durch AMP allosterisch aktiviert und durch ATP und Glucose-6-phosphat gehemmt. Die Glykogen-Synthase wird genau umgekehrt reguliert. Diese allosterischen Wechselwirkungen überlagern sich mit einem weiteren Kontrollsystem, der posttranslationalen Modifikation. Beide Enzyme kommen in phosphorylierter und dephosphorylierter Form vor, die über Proteinkinasen und Phosphoproteinphosphatasen ineinander umgewandelt werden (S. 487). Die an der kovalenten Modifikation beteiligten Reaktionen werden hormonell gesteuert ( Zoologie). Die Stärkesynthese in Chloroplasten wird auf dem Niveau der Bildung von ADP-Glucose reguliert. Das wichtigste regulatorische Enzym ist die ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, die durch Phosphat inhibiert und durch 3-Phosphoglycerat und Thioredoxin aktiviert wird. Über die Phosphatkonzentration ist die ADP-Glucose-Pyrophosphorylase auch von der Rate der Saccharosesynthese im Cytoplasma abhängig. Saccharose ist die Transportform der Glucose in Pflanzen. Die Enzyme Saccharose-6-phosphat-Synthase und Saccharosephosphat-Phosphatase werden durch einen Anstieg der Saccharosekonzentration gehemmt, was zu einer Vergrößerung des Hexosephosphat-Pools im Cytoplasma führt. Auf diese Weise wird ein großer Teil des verfügbaren Phosphates in einer Form gebunden, in der es nicht zurück in die Chloroplasten transportiert werden kann. Die sinkende Konzentration an freiem Pi im Cytoplasma und die daraus resultierende Abnahme der Aktivität des Pi/Triosephosphat-Antiporters führen dazu, dass auch in den Chloroplasten die Konzentration von Pi sinkt und die von C3-Verbindungen steigt. Eine Folge der ansteigenden Saccharosekonzentrationen im Cytoplasma ist daher die Zunahme der Stärkesynthese in den Chloroplasten. Im Fließgleichgewicht sind alle diese Aktivitäten so aufeinander abgestimmt, dass die Saccharose- und die Stärkesynthese gemittelt über die Lichtphase je etwa 50 % des Triosephosphates verbrauchen, das bei der CO2Fixierung (S. 345) gebildet wurde. Allerdings schwanken die Verhältnisse im Tageslauf mit meist erhöhter Saccharosesynthese in den Morgenstunden und erhöhter Stärkesynthese in den späten Phasen der Lichtphase.

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

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Im kontrahierenden Skelettmuskel wird bei starker Anstrengung mehr Pyruvat durch die Glykolyse erzeugt als nachfolgend im Citratzyklus oxidiert wird. Gleichzeitig übersteigt auch die Geschwindigkeit der NADH-Bildung in der Glykolyse aufgrund des Sauerstoffmangels die Rate der NADH-Oxidation in der Atmungskette. Um unter diesen Bedingungen den weiteren Ablauf der Glykolyse, der von der Verfügbarkeit ausreichender Mengen an NAD+ abhängt, und damit die weitere Synthese von ATP zu ermöglichen, wird überschüssiges Pyruvat mit NADH zu Lactat reduziert und NAD+ für die Glykolyse regeneriert. Zur Reoxidation wird Lactat aus dem Skelettmuskel über das Blut in die Leber transportiert und dort zu Pyruvat oxidiert. Diese Reaktion wird durch das niedrige NADH/NAD+-Verhältnis im Cytoplasma der Leber begünstigt. Anschließend wird aus Pyruvat über die Gluconeogenese (s. u.) Glucose regeneriert, die über das Blut wieder zum Skelettmuskel transportiert wird. Auf diese Weise versorgt die Leber den kontrahierenden Skelettmuskel mit Glucose. Die Lactatbildung aus Pyruvat im Muskel und die anschließende Rückgewinnung von Glucose aus Lactat in der Leber ermöglichen also gleichzeitig die Entfernung überschüssiger Reduktionsäquivalente aus dem Muskel und seine ausreichende Versorgung mit ATP. Man bezeichnet diesen Stoffwechselweg zwischen Leber und Muskel nach Carl und Gerti Cori als Cori-Zyklus.

7.2.3

Die Gluconeogenese

Die Gluconeogenese (= Neubildung von Zucker) ist ein universeller Stoffwechselweg in den meisten Lebewesen, über den Glycerinaldehyd-3-phosphat und Glucose-6-phosphat aus Substraten synthetisiert werden, die über Pyruvat oder Zwischenprodukte des Citratzyklus in den Zentralstoffwechsel eingeschleust werden (Abb. 7.10). Bei höheren Tieren findet die Gluconeogenese hauptsächlich in der Leber statt und sichert bei Kohlenhydratmangel die lebensnotwendige Versorgung des Gehirns und der Erythrocyten mit Glucose. Pflanzen, Pilze und Bakterien besitzen im Unterschied zu Tieren zusätzlich zur Gluconeogenese den Glyoxylatzyklus (s. u.) und können daher Kohlenhydrate auch aus Lipiden und anderen Substraten regenerieren, die zu Acetyl-CoA abgebaut werden.

Die einzelnen Reaktionen und ihre Enzyme Die meisten Schritte der Gluconeogenese werden von den entsprechenden Enzymen der Glykolyse in umgekehrter Richtung katalysiert (Abb. 7.10). Nur die aus thermodynamischen Gründen irreversiblen Reaktionen der Phosphofructokinase und der Pyruvat-Kinase müssen durch alternative Enzyme umgangen werden. Die Bildung von PEP aus Pyruvat erfolgt in den meisten Organismen in zwei Schritten: Zunächst wird Pyruvat durch die Pyruvat-Carboxylase zu Oxalacetat carboxyliert, das dann von der PEP-Carboxykinase zu PEP umgesetzt wird. Beide Reaktionen erfordern die Zufuhr von Energie in Form von ATP bzw. GTP. In einigen Bakterien, die keine Pyruvat-Carboxylase besitzen, wird PEP aus Pyruvat durch eine ATP-abhängige PEP-Synthetase ( Mikrobiologie) gebildet.

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7 Abb. 7.10 Die Gluconeogenese. Pyruvat wird in zwei Schritten zu Phosphoenolpyruvat (PEP) umgesetzt. Zunächst erfolgt eine Carboxylierung durch die Pyruvat-Carboxylase, deren Produkt Oxalacetat anschließend phosphoryliert und gleichzeitig decarboxyliert wird. Dieser Schritt wird von der PEPCarboxykinase katalysiert. Beide Reaktionen benötigen die Zufuhr von Energie in Form von ATP bzw. GTP. Die Umsetzung von Fructose-1,6-bisphosphat zu Fructose-6-phosphat wird von einer spezifischen Phosphatase durchgeführt.

Die Bildung von Fructose-6-phosphat aus Fructose-1,6-bisphosphat wird von der Fructose-1,6-bisphosphatase katalysiert. Um den Glucosetransport über die Blutbahn zu den Organen zu ermöglichen, existiert in der Leber, der Nierenrinde und dem Dünndarmepithel von Tieren die Glucose-6-Phosphatase, die die Phosphatgruppe von Glucose-6-phosphat hydrolytisch abspaltet. Insgesamt sind sechs energiereiche Phosphatverbindungen und zwei NADH für die Bildung von einem Mol Glucose erforderlich.

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

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Regulation der Gluconeogenese Gepaarte anabole und katabole Stoffwechselwege wie Gluconeogenese und Glykolyse werden reziprok (= entgegengesetzt) über die Enzyme reguliert, die jeweils nur in einem der beiden Wege katalytisch wirksam sind (Abb. 7.11). Die erste Regulationsstelle stellen die Pyruvat-Kinase der Glykolyse und die in der Gluconeogenese entgegengesetzt wirkenden Enzyme Pyruvat-Carboxylase und Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase dar. Während die Pyruvat-Kinase durch Fructose-1,6-bisphosphat stimuliert und durch ATP bzw. Alanin gehemmt wird, wird die Pyruvat-Carboxylase in den meisten Organismen durch AcetylCoA aktiviert. Infolgedessen wird die Biosynthese von Glucose aus Pyruvat nur dann gefördert, wenn sich in den Mitochondrien bzw. in der Zelle bei Prokaryoten mehr Acetyl-CoA anreichert als die Zelle unmittelbar für den Citratzyklus benötigt. Der Anstieg der Acetyl-CoA-Konzentration hemmt gleichzeitig den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex und verlangsamt so die Bildung von AcetylCoA aus Pyruvat. Das ist insbesondere für Tiere wichtig, da sie wegen des fehlenden Glyoxylatzyklus (s. u.) Pyruvat nicht aus Acetyl-CoA bilden und daher auch keine Kohlenhydrate durch den Abbau von Fetten regenerieren können. Zur Aufrechterhaltung des Blutglucosespiegels während einer Hungerperiode bzw. einer kohlenhydratarmen Diät müssen tierische Organismen Proteine (Muskeln) abbauen, um aus deren Abbauprodukten über die Gluconeogenese Glucose zu synthetisieren. Sowohl die Pyruvat-Carboxylase als auch die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase werden durch ADP gehemmt. Eine erhöhte ADP-Konzentration signalisiert Energiebedarf und damit die Notwendigkeit, bevorzugt den katabolen Stoffwechselweg, die Glykolyse, ablaufen zu lassen. Der zweite Regulationspunkt der Gluconeogenese ist die Fructose1,6-bisphosphatase, die durch AMP allosterisch gehemmt wird; die Phosphofructokinase der Glykolyse wird dagegen durch AMP stimuliert. Dadurch

Abb. 7.11 Regulation von Glykolyse und Gluconeogenese.

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7 Stoffwechsel

kommt es zur Gluconeogenese, wenn die Energieladung hoch ist, während bei leerem Energiespeicher der katabole Weg dominiert. Steigt die Konzentration von Fructose-6-phosphat im Cytoplasma, wird ein Teil durch die Phosphofructokinase-2 zu Fructose-2,6-bisphosphat phosphoryliert (S. 279), das die Fructose1,6-bisphosphatase hemmt. Das entsprechende Glykolyseenzym, die Phosphofructokinase-1, wird durch AMP und Fructose-2,6-bisphosphat stimuliert, durch Citrat und ATP dagegen gehemmt, sodass diese gegenläufigen Reaktionen entgegengesetzt reguliert werden. Sind Acetyl-CoA oder Citrat in ausreichender Konzentration vorhanden oder liegt das Adenylat in der Zelle zu einem großen Teil in Form von ATP vor, wird die Gluconeogenese und somit die Bildung und Speicherung von Glucose begünstigt.

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Obwohl der gleichzeitige Ablauf von entgegengesetzten anabolen und katabolen Stoffwechselwegen wie Gluconeogenese und Glykolyse einen Nettoverlust von Energie zur Folge hat, sind diese Substrat- oder Leerlaufzyklen in begrenzter Rate keineswegs sinnlos. Eine biologische Bedeutung besteht wahrscheinlich darin, Stoffwechselsignale zu verstärken, indem die Wirkung eines allosterischen Effektors gleichzeitig die Reaktionsgeschwindigkeit in der einen Richtung erhöht und in der anderen vermindert, sodass die Nettoproduktionsrate erheblich ansteigt: Wenn ein Substrat S mit der Geschwindigkeit, die einem Wert von 100 entspricht, zum Produkt P umgesetzt wird und die Rückreaktion von P nach S mit einer Geschwindigkeit von 80 erfolgt, ergibt sich für P eine Nettoproduktionsrate von 20. Bewirkt ein allosterischer Effektor eine Steigerung der Geschwindigkeit von S nach P und entsprechend eine Verminderung der Rückreaktion um jeweils 20 %, läuft die Reaktion von S nach P mit einer Geschwindigkeit von 120, die von P nach S mit einer Geschwindigkeit von 64 ab. Daraus errechnet sich eine neue Nettoproduktionsrate für P von 56, was einer Steigerung von 180 % entspricht, während die Reaktionsgeschwindigkeit nur um 20 % erhöht wurde. Eine andere Funktion von Leerlaufzyklen ist die Wärmeproduktion: Bei kalter Witterung können Hummeln erst dann fliegen, wenn sie ihre Muskeln mit Hilfe eines Leerlaufzyklus von Fructose-6-phosphat und Fructose-1,6-bisphosphat und der dadurch verursachten wärmeerzeugenden ATP-Hydrolyse auf etwa 30hC erwärmt haben.

7.2.4

Der Pentosephosphatweg

Der oxidative Pentosephosphatweg (auch Phosphogluconatweg oder Hexosemonophosphat-Shunt) hat in Eukaryoten und Prokaryoten im Wesentlichen zwei Funktionen: Er liefert durch den Abbau von Glucose Pentosen für aromatische Aminosäuren, Nucleinsäuren und Coenzyme wie ATP, CoA, NAD(P)H oder FAD sowie NADPH für Biosynthesen, z. B. die Fettsäuresynthese. Bei Säugetieren enthalten Gewebe, die den Großteil der Fettsäure- (S. 321) und der CholesterinBiosynthese leisten (Leber, Milchdrüsen, Fettgewebe und Nebennierenrinde), große Mengen an Enzymen des Pentosephosphatweges. In der Leber werden etwa 30 % der Glucose über den Pentosephosphatweg oxidiert, während er im Skelettmuskel fast völlig fehlt. Der Pentosephosphatweg lässt sich in einen irreversiblen oxidativen und einen reversiblen nicht oxidativen Abschnitt unterteilen:

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

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Abb. 7.12 Der Pentosephosphatweg. a Im oxidativen Teil wird aus Glucose-6-phosphat über zwei Oxidationsschritte, bei denen die Elektronen jeweils auf NADP+ übertragen werden, Ribulose5-phosphat gebildet. Die drei dazu notwendigen Reaktionen werden von der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, der Lactonase und der Gluconat-6-phosphat-Dehydrogenase katalysiert. b Nicht oxidativer Teil des Pentosephosphatweges.

Im oxidativen Abschnitt werden NADPH und Ribulose-5-phosphat erzeugt (Abb. 7.12a): 3 Glucose-6-phosphat + 6 NADP+ p 6 NADPH + 6 H+ + 3 CO2 + 3 Ribulose-5-phosphat Durch anschließende Isomerisierungs- und Epimerisierungsreaktionen wird Ribulose-5-phosphat entweder in Ribose-5-phosphat oder in Xylulose-5-phosphat umgewandelt: 3 Ribulose-5-phosphat m Ribose-5-phosphat + 2 Xylulose-5-phosphat Im nicht oxidativen Abschnitt entstehen durch hintereinander geschaltete Umlagerungen von C2- und C3-Einheiten aus drei Pentosen zwei Hexosen und eine Triose (Abb. 7.12b): Ribulose-5-phosphat + 2 Xylulose-5-phosphat m 2 Fructose-6-phosphat + Glycerinaldehyd-3-phosphat. Katalysierende Enzyme sind Transaldolasen, die C3-Einheiten, und Transketolasen, die C2-Einheiten jeweils von einer Ketose auf eine Aldose übertragen. Transketolasen benötigen als Coenzym Thiaminpyrophosphat (TPP). Diese Umlagerungen laufen in umgekehrter Richtung im Calvin-Zyklus (S. 345) ab. Da Fructose-6-phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat Zwischenprodukte der Glykolyse sind, verbindet der reversible nicht oxidative Teil des Pentosephosphatweges die beiden Stoffwechselwege und ermöglicht der Zelle entspre-

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7 Stoffwechsel

chend ihren jeweiligen Bedürfnissen aus Glucose ATP, Reduktionsäquivalente oder Bausteine für Biosynthesen zu erzeugen. Die Gesamtreaktion des Pentosephosphatweges lautet: 3 Glucose-6-phosphat + 6 NADP+ m 6 NADPH + 6 H+ + 3 CO2 + 2 Fructose-6-phosphat + Glycerinaldehyd-3-phosphat Der Umsatz des Pentosephosphatweges und damit die Geschwindigkeit der NADPH-Produktion werden durch die Geschwindigkeit der Glucose-6-phosphatDehydrogenase-Reaktion reguliert, die den einleitenden Schritt des Pentosephosphatweges katalysiert. Die Aktivität dieses Enzyms wird durch die Konzentration seines Substrates NADP+ bestimmt.

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7.2.5

Anaerober Glucoseabbau: Verschiedene Gärungen

Wenn kein externer Elektronenakzeptor verfügbar ist, erfolgt eine unvollständige Oxidation des aus Glucose gebildeten Pyruvats durch Gärung. Als interner Elektronenakzeptor zur Reoxidation von NADH wird dabei Pyruvat oder ein aus Pyruvat gebildetes Zwischenprodukt wie Acetaldehyd oder Acetat genutzt. ATP wird bei einer Gärung in der Regel nur über die Substratstufenphosphorylierungen (S. 269) der Glykolyse bzw. entsprechende alternative Abbauwege bei Mikrobiologie) gebildet. einigen Prokaryoten ( Gärungssubstrate können neben Zuckern zahlreiche andere organische Verbindungen sein, Gärungsprodukte sind vor allem organische Säuren und Alkohole. Pyruvat wird meist zu Lactat oder Ethanol reduziert (Abb. 7.13),

Abb. 7.13 Milchsäuregärung und alkoholische Gärung. Bei der Milchsäuregärung wird Pyruvat durch die Lactat-Dehydrogenase zu Lactat reduziert, als Elektronendonor dient NADH. Bei der alkoholischen Gärung werden zwei Enzyme benötigt: Im ersten Schritt wird Pyruvat durch die Pyruvat-Decarboxylase zu Acetaldehyd decarboxyliert, das dann von der Alkohol-Dehydrogenase zu Ethanol reduziert wird. Als Elektronendonor dient auch hier NADH.

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

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beide Gärprozesse werden industriell für die Produktion von alkoholhaltigen Getränken bzw. von Sauermilchprodukten genutzt ( Mikrobiologie). Die Vergärung von Glucose zu Lactat ist charakteristisch für Milchsäurebakterien Mikrobiologie), kommt aber auch bei Eukaryoten, z. B. im kontrahierenden ( Skelettmuskel unter hoher Belastung oder bei manchen höheren Pflanzen, z. B. Kartoffeln, vor. Ethanol wird vor allem von Stämmen der Hefe Saccharomyces cerevisiae und einigen Bakterien, z. B. Zymomonas, gebildet ( Mikrobiologie) und ist in höheren Konzentrationen toxisch. Wegen seiner hohen Membranpermeabilität kann Ethanol nicht in einem Speicherkompartiment gelagert werden, sondern wird nach außen abgegeben. Auch bei Pflanzen und vielen Pilzen kommt es unter anaeroben Bedingungen zur Anhäufung von Ethanol. Verschiedene Prokaryoten-Species bilden jeweils typische Gärungsprodukte wie Acetat, Propionat, Butyrat, Butanol, Formiat oder Succinat, oft auch CO2 und H2 ( Mikrobiologie). Die traditionellerweise als „Essigsäuregärung“ bezeichnete Oxidation von Ethanol zu Acetat (Essigsäure) ist keine Gärung, sondern eine unvollständige Oxidation, bei der O2 als externer Elektronenakzeptor dient und ATP durch Elektronentransportphosphorylierung (S. 269) erzeugt wird ( Mikrobiologie). Die ATP-Ausbeute pro Mol Glucose beim Abbau durch Gärung beträgt nur einen Bruchteil der ATP-Ausbeute einer vollständigen Oxidation: Bei der Vergärung von Glucose zu Lactat bzw. Ethanol wird nur ein Energiebetrag von –219 kJ mol–1 bzw. von –234 kJ mol-1 freigesetzt im Vergleich zu –2877 kJ mol–1 bei vollständiger Oxidation zu CO2. Ein strikt gärender Organismus muss daher sehr große Mengen Substrat umsetzen, um seinen Energiebedarf zu decken. Bei Hefen wurde nachgewiesen, dass unter aeroben Bedingungen die Geschwindigkeit der Glykolyse und auch der Glucoseverbrauch wesentlich niedriger sind als unter anaeroben. Ursache des nach seinem Entdecker benannten Pasteur-Effektes ist vor allem die allosterische Hemmung der Phosphofructokinase durch ATP und Citrat. Da unter aeroben Bedingungen pro Mol Glucose wesentlich mehr ATP gebildet wird als unter anaeroben (s. o.), wird die Phosphofructokinase und damit die Glykolyse durch den hohen ATP-Spiegel gehemmt und so der Glucoseverbrauch vermindert. Unter anaeroben Bedingungen ist die ATP-Produktion sehr viel geringer, sodass die Konzentration von ADP, einem positiven allosterischen Effektor der Phosphofructokinase, ansteigt. Durch die Aktivierung des Enzyms erhöhen sich die Geschwindigkeit der Glykolyse und damit der Glucoseverbrauch. Steigt die Sauerstoffkonzentration, steigt auch der ATPSpiegel an, weil wieder mehr ATP pro Mol Glucose gebildet wird. Der erhöhte ATPSpiegel drosselt die Durchsatzgeschwindigkeit der Glykolyse und unterdrückt damit die Gärung. Mit diesem Kontrollmechanismus kann schnell auf den wesentlich effektiveren aeroben Weg der Energieproduktion umgeschaltet werden. Viele Bakterien zeigen keinen Pasteur-Effekt.

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7 Stoffwechsel

7.2.6

Oxidative Decarboxylierung des Pyruvats

Unter aeroben Bedingungen wird das aus Glucose gebildete Pyruvat von Organismen mit einer vollständigen Elektronentransportkette über Citratzyklus und Atmungskette (s. u.) vollständig zu CO2 und H2O oxidiert, wobei O2 als externer Elektronenakzeptor dient. Einleitender Schritt ist die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA, die vom Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (Abb. 7.14) katalysiert wird, einem Multienzymkomplex, der bei Prokaryoten im Cytoplasma, bei Eukaryoten in der Mitochondrienmatrix lokalisiert ist. Die Zusammenfassung der drei beteiligten Enzymkomponenten zu einem Komplex sorgt für eine effektive Koordination der Einzelreaktionen, weil die Zwischen-

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Abb. 7.14 Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex. Der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex besteht aus drei Enzymen mit ihren jeweiligen Cofaktoren: Pyruvat-Dehydrogenase (PD) mit Thiaminpyrophosphat (TPP), Dihydrolipoyl-Transacetylase (DTA) mit Liponamid und Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (DD) mit FAD. Substrate sind neben Pyruvat Coenzym A (CoA) und NAD+. Im ersten Schritt wird Pyruvat an TPP gebunden und decarboxyliert, sodass eine Hydroxyethylgruppe an TPP gebunden bleibt. Diese wird im nächsten Schritt zur Acetylgruppe oxidiert und auf Liponamid übertragen. Liponamid transferiert die Acetylgruppe auf Coenzym A, dabei entstehen die energiereiche Verbindung Acetyl-CoA und Dihydroliponamid. Im letzten Schritt wird Dihydroliponamid wieder zu Liponamid oxidiert, wobei zunächst enzymgebundenes FAD und anschließend freies NAD+ als Elektronenakzeptor fungieren.

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

293

produkte direkt an das jeweils nächste katalytische Zentrum weitergereicht werden. Die Gesamtreaktion lautet: Pyruvat + NAD+ + CoA-SH p Acetyl-CoA + NADH + H+ + CO2 (DGhl = –33,5 kJ mol–1) In tierischen Zellen ist die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA ein irreversibler Schritt, weil ihnen die Enzyme für eine Synthese von Glucose aus Acetyl-CoA fehlen (s. u.). Acetyl-CoA kann entweder als Baustein für Biosynthesen verwendet werden oder in den Citratzyklus eintreten.

Regulation des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes Der Komplex der Pyruvat-Dehydrogenase markiert einen Knotenpunkt im Stoffwechsel, seine Aktivität wird daher durch mehrere Effektoren kontrolliert (Abb. 7.14). Die Untereinheiten DTA und DD (Dihydrolipoyl-Dehydrogenase) werden durch ihre Produkte Acetyl-CoA und NADH kompetitiv gehemmt, sodass die Aktivität des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes sowohl über die Energieladung als auch über die Menge an Biosynthese-Zwischenstufen gesteuert wird. Eine Erhöhung der Konzentrationen von Acetyl-CoA, NADH oder ATP führt bei Eukaryoten zu einer reversiblen Phosphorylierung der Komponente PD (PyruvatDehydrogenase) des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes durch eine spezifische Kinase. Dadurch wird der Komplex inaktiviert. Die Aufhebung dieser Hemmung wird durch eine spezifische Phosphatase bewirkt, die durch Ca2+-Ionen stimuliert wird. Beide Kontroll-Enzyme sind an die DTA-Untereinheit (DihydrolipoylTransacetylase) des eukaryotischen Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes gebunden. Eine hohe Pyruvat-Konzentration hemmt die Kinase und fördert so die Aktivität des Komplexes.

7.2.7

Der Citratzyklus

Der Citratzyklus (Tricarbonsäurezyklus, Krebs-Zyklus) findet bei Prokaryoten im Cytoplasma, bei Eukaryoten in der Mitochondrienmatrix statt. Er dient der vollständigen Oxidation der in der Pyruvat-Dehydrogenase-Reaktion gebildeten Acetylgruppe und stellt Vorstufen für Biosynthesen zur Verfügung. Die einleitende Reaktion ist die Kondensation von Acetyl-CoA mit dem C4-Akzeptormolekül Oxalacetat unter Bildung von Citrat. Durch zwei Decarboxylierungsschritte werden im ersten Abschnitt des Zyklus zwei Moleküle CO2 freigesetzt. Die restlichen Reaktionen des Citratzyklus dienen der Energiekonservierung über Substratstufenphosphorylierung und der Regeneration des C4-Akzeptormoleküls. Neben CO2 und einem Nucleosidtriphosphat, GTP bei Tieren und ATP bei Pflanzen und Prokaryoten, entstehen Reduktionsäquivalente in Form von NADH und QH2.

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7 Stoffwechsel

Die einzelnen Reaktionen und ihre Enzyme

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Der Citratzyklus besteht aus neun Reaktionen (Abb. 7.15). Das erste Enzym, die Citratsynthase, katalysiert die Kondensation von Oxalacetat mit Acetyl-CoA. Diese Aldolkondensation, bei der zunächst Citryl-CoA entsteht, wird durch dessen nachfolgende Hydrolyse in Richtung der Citrat-Bildung verschoben. Um aus Citrat eine Carboxylgruppe durch oxidative Decarboxylierung entfernen zu können, wird die Hydroxylgruppe intramolekular umgelagert, sodass Isocitrat entsteht. Das katalysierende Enzym wird nach dem Zwischenprodukt cis-Aconitat als Aconitase bezeichnet. Isocitrat wird anschließend von der Isocitrat-Dehydrogenase mit NAD+, bei vielen Bakterien mit NADP+, als Coenzym oxidiert. Dabei entsteht als enzymgebundenes instabiles Zwischenprodukt eine b-Ketosäure, die spontan zu a-Ketoglutarat decarboxyliert. Bei dessen nachfolgender oxidativer Decarboxylierung entsteht Succinyl-CoA. Auch diese Reaktion beinhaltet gleichzeitig einen Oxidationsschritt, bei dem NAD+ als Coenzym fungiert und reduziert wird. Das katalysierende Enzym, die a-Ketoglutarat-Dehydrogenase, ist ein Multienzymkomplex, der in Aufbau und Funktion dem Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex ähnelt. Das Produkt ist in beiden Fällen ein Acylrest, der über eine energiereiche Thioesterbindung an Coenzym A gebunden ist. Diese Thioesterbindung wird im nächsten Reaktionsschritt des Zyklus von der Succinyl-CoA-Synthetase (auch Succinat-Thiokinase) für die Bildung einer energiereichen Phosphatbindung (GTP oder ATP) genutzt. Coenzym A und Succinat werden dabei freigesetzt. Aus Succinat wird anschließend in drei Schritten das Akzeptormolekül Oxalacetat regeneriert. Dazu wird Succinat zunächst zu Fumarat oxidiert, wobei die Elektronen auf enzymgebundenes FAD übertragen werden, weil die Änderung der freien Enthalpie für die Reduktion von NAD+ nicht ausreicht. Das katalysierende Enzym, die Succinat-Dehydrogenase, ist im Unterschied zu allen anderen Enzymen des Citratzyklus membrangebunden und kann so die bei der Reaktion anfallenden Elektronen über den Chinonpool direkt in die Elektronentransportkette der Endoxidation einbringen (S. 302), dabei entsteht die Chinolform (QH2). Katalysiert von der Fumarase wird Fumarat durch Wasseranlagerung zu Malat umgesetzt, das im letzten Schritt von der Malat-Dehydrogenase mit NAD+ zu Oxalacetat oxidiert wird. Die letzten drei Reaktionen des Citratzyklus folgen dem gleichen Prinzip wie die einleitenden Reaktionen der b-Oxidation der Fettsäuren: Auch dort folgt auf eine Oxidation mit FAD als prosthetischer Gruppe eine Wasseranlagerung und anschließend eine zweite Oxidation mit NAD+ als Coenzym (S. 314). Die Gesamtreaktion des Citratzyklus lautet: Acetyl-CoA + 3NAD+ + Q + GDP + Pi + 3 H2O p 2CO2 + 3 NADH + QH2 + GTP + 3H+ + HS-CoA. Die beiden in einer Runde als CO2 freigesetzten Kohlenstoffatome stammen nicht aus der Acetylgruppe des Acetyl-CoA, sondern aus den beiden Carboxylgruppen des Oxalacetats. Die beiden über Acetyl-CoA in den Zyklus eingebrachten

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

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Abb. 7.15 Der Citratzyklus. Über den Citratzyklus erfolgt die vollständige Oxidation der Acetyl-Gruppe (C2) zu zwei Molekülen CO2. Oxalacetat, der Akzeptor der Acetyl-Gruppe, wird im weiteren Verlauf des Zyklus regeneriert. Voraussetzung für den Ablauf des Citratzyklus ist die Verfügbarkeit eines Akzeptors für die bei den Dehydrogenierungsschritten anfallenden Reduktionsäquivalente.

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7 Stoffwechsel

Kohlenstoffatome erscheinen am Ende einer Zyklusrunde im regenerierten Akzeptormolekül Oxalacetat. Bei Eukaryoten sind die Enzyme des Citratzyklus in einem Komplex zusammengefasst, der der Matrixseite der inneren Mitochondrienmembran angelagert ist, wobei die Succinat-Dehydrogenase am stabilsten in der Membran verankert ist.

Regulation des Citratzyklus

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Der erste Kontrollpunkt des Citratzyklus ist die von der Citratsynthase katalysierte Kondensation von Acetyl-CoA und Oxalacetat zu Citrat. Die Citratsynthase wird durch ATP (= hohe Energieladung) allosterisch gehemmt, wodurch sich der KM-Wert für Acetyl-CoA erhöht. Bei Prokaryoten wirkt auch NADH inhibierend. Den nächsten Kontrollpunkt stellt die Isocitrat-Dehydrogenase dar, deren Reaktion geschwindigkeitsbestimmend für den Zyklus ist. Auch sie wird durch ATP allosterisch gehemmt, während ADP als allosterischer Aktivator wirkt. NADH hemmt die Isocitrat-Dehydrogenase durch direkte Verdrängung von NAD+ (Produkthemmung, S. 202). Bei Prokaryoten, z. B. E. coli, wird die Isocitrat-Dehydrogenase durch die reversible Phosphorylierung einer Aminosäure im aktiven Zentrum des Enzyms inaktiviert. Dritter Kontrollpunkt des Citratzyklus ist die a-Ketoglutarat-Dehydrogenase. Wie die strukturell ähnliche Pyruvat-Dehydrogenase wird dieser Enzymkomplex durch die Produkte der von ihm katalysierten Reaktion, hier Succinyl-CoA und NADH, gehemmt. Auch eine hohe Energieladung hemmt die Aktivität des Enzyms. Die Succinat-Dehydrogenase wird durch Oxalacetat allosterisch gehemmt.

Anaplerotische Reaktionen Neben seiner Funktion im Energiestoffwechsel liefert der Citratzyklus auch Vorstufen für zahlreiche Biosynthesen. Dafür werden Zwischenprodukte aus dem Zyklus abgezogen, z. B. sind Oxalacetat und a-Ketoglutarat Ausgangssubstrate für viele Aminosäuren (S. 331) und Succinyl-CoA für Porphyrine. Der Citratzyklus ist daher ein amphiboler Weg und wird als „Drehscheibe des Stoffwechsels“ bezeichnet. Durch die Entnahme von Intermediaten aus dem Zyklus steht Oxalacetat als Akzeptor für Acetyl-CoA nicht mehr in ausreichender Menge zur Verfügung. Um den Ablauf des Citratzyklus trotzdem zu sichern, besitzen die verschiedenen Organismen unterschiedliche anaplerotische Reaktionen (griech. ana und pleres: bis oben voll auffüllen; Abb. 7.16) für die Regeneration von Oxalacetat aus Pyruvat oder PEP. Die Pyruvat-Carboxylase katalysiert in vielen Bakterien und Hefen, aber auch in Pilzen, Pflanzen, Invertebraten und Vertebraten die ATP-abhängige Carboxylierung von Pyruvat zu Oxalacetat. Das Enzym enthält Biotin als prosthetische Gruppe. Die Reaktionsgleichung lautet: Pyruvat + HCO3– + ATP p Oxalacetat + ADP + Pi (DGhl = –2,1 kJ mol–1)

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

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7 Abb. 7.16 Anaplerotische Reaktionen zur Regeneration von Oxalacetat aus Pyruvat oder PEP. Der Glycoxylatzyklus kommt bei Pflanzen, Pilzen und vielen Bakterien vor.

Die Pyruvat-Carboxylase wird in vielen Organismen nur in Gegenwart von Acetyl-CoA als allosterischem Effektor aktiviert. In Pflanzen und vielen Bakterien, z. B. E. coli, katalysiert die PEP-Carboxylase die Carboxylierung von PEP zu Oxalacetat: PEP + HCO3– p Oxalacetat + Pi In dieser Reaktion wird aus der schwachen Säure HCO3— die Carboxylgruppe der Dicarbonsäure mit einem wesentlich niedrigeren pK-Wert. Dadurch kann diese Reaktion auch zur Regulation des cytosolischen pH-Werts genutzt werden. Darüber hinaus spielt die PEP-Carboxylase die zentrale Rolle in der C4-Photosynthese und im Crassulaceen-Säurestoffwechsel. Bakterien, die keine Pyruvat-Carboxylase besitzen, synthetisieren bei Wachstum auf Pyruvat oder Lactat mithilfe spezieller, ATP-abhängiger Enzyme aus Pyruvat PEP, das anschließend von der PEP-Carboxylase zu Oxalacetat carboxyliert wird ( Mikrobiologie). Die PEP-Carboxykinase katalysiert in der Gluconeogenese die Bildung von PEP aus Oxalacetat (S. 285). Da diese Reaktion reversibel ist, katalysiert das Enzym in Herz- und Skelettmuskeln sowie bei einigen strikt anaeroben Bakterien und Würmern, die in einem Milieu mit hoher Kohlendioxidkonzentration leben, umgekehrt die Synthese von Oxalacetat aus PEP und HCO3–, als Coenzym fungiert entweder ADP oder GDP. PEP + HCO3– + ADP (GDP) p Oxalacetat + ATP (GTP)

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7 Stoffwechsel

7.2.8

Der Glyoxylatzyklus

Pflanzen, Pilze und viele Bakterien synthetisieren über den Glyoxylatzyklus aus zwei C2- Einheiten (Acetyl-CoA) eine C4-Einheit (Succinat bzw. Malat) (Abb. 7.16); bei Tieren kommt er mit Ausnahme einiger Egel nicht vor. Bis zum Isocitrat ist der Glyoxylatzyklus identisch mit dem Citratzyklus. Durch zwei zusätzliche Enzyme werden jedoch die Decarboxylierungsreaktionen umgangen: Isocitrat wird durch die Isocitrat-Lyase in Succinat und Glyoxylat gespalten. Das entstandene Succinat durchläuft anschließend die weiteren Reaktionen des Citratzyklus, Glyoxylat und ein weiteres Molekül Acetyl-CoA werden durch die Malat-Synthase zu Malat kondensiert, eine Reaktion, die der Citratsynthase-Reaktion zu Beginn des Citratzyklus ähnelt. Wie im Citratzyklus wird Malat anschließend zu Oxalacetat oxidiert. Über die Gluconeogenese können dann Hexosephosphate für Biosynthesen gebildet werden. Die Summe der Reaktionen des Glyoxylatzyklus lautet: 2 Acetyl-CoA + NAD+ + 2 H2O p Succinat + 2 CoA + NADH + 2 H+ Da Wirbeltiere keinen Glyoxylatzyklus besitzen, können sie im Gegensatz zu Pflanzen, Pilzen und Bakterien, aber auch einigen Wirbellosen, Glucose nicht aus Verbindungen synthetisieren, die zu Acetyl-CoA abgebaut werden, beispielsweise aus Lipiden. Viele Bakterien, z. B. E. coli, enthalten sämtliche Enzyme für den Glyoxylat- und den Citratzyklus und können daher Acetat als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen. Bei der Samenkeimung bestimmter Pflanzen stehen als Energie- und Kohlenstoffquelle ausschließlich Fette zur Verfügung. Entsprechend enthalten die Glyoxysomen neben Enzymen für den Fettabbau (S. 314) auch die für den Glyoxylatzyklus. Von den Enzymen, die sowohl am Citrat- als auch am Glyoxylatzyklus beteiligt sind, existieren jeweils zwei Isoenzyme, ein mitochondrienspezifisches und ein glyoxysomenspezifisches. Wegen der Verwendung von gemeinsamen Zwischenprodukten müssen der Abbau von Fettsäuren zu Acetyl-CoA und der Glyoxylatzyklus in den Glyoxysomen, der Citratzyklus in den Mitochondrien und die Gluconeogenese im Cytoplasma den Bedürfnissen der Zelle entsprechend reguliert und koordiniert werden. Bei pflanzlichen Zellen befinden sich die Enzyme dieser Stoffwechselwege in unterschiedlichen Kompartimenten, sodass der Transport von Substraten und Produkten zwischen diesen Kompartimenten einen Kontrollmechanismus darstellt. In Prokaryoten dagegen konkurrieren Enzyme wie die Isocitrat-Dehydrogenase des Citratzyklus und die Isocitrat-Lyase des Glyoxylatzyklus im Cytoplasma um die Substrate, sodass eine Regulation auf der Ebene der Enzyme erforderlich ist. Die Aktivität der Isocitrat-Dehydrogenase wird durch ihre reversible Phosphorylierung über ein bifunktionales Proteinkinase/PhosphataseSystem reguliert. Die Funktion als Kinase bzw. Phosphatase wird jeweils durch Zwischenprodukte des Citratzyklus allosterisch aktiviert bzw. inhibiert, die ent-

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7.2 Der Kohlenhydratstoffwechsel

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sprechend in umgekehrter Richtung die Aktivität der Isocitrat-Lyase steuern. Auch ein hoher ATP-Spiegel stimuliert die Kinase und führt so zur Deaktivierung der Isocitrat-Dehydrogenase, während AMP die Dephosphorylierung fördert. Auf diese Weise bestimmt der Energiezustand der Zelle, ob Isocitrat in den katabolen Citratzyklus oder in den anabolen Glyoxylatzyklus fließt.

Glykolyse: Kataboler Stoffwechselweg, Oxidation von Glucose zu Pyruvat. Funktion: Erzeugung von ATP und Reduktionsäquivalenten, Bereitstellung von Biosynthesevorstufen, Regulation: Energieladung (ATP hemmt; Bausteine aktivieren). Regulierte Enzyme: Hexokinase, Phosphofructokinase, Pyruvatkinase. Polysaccharidsynthese: Aktivierung der Monomere zu NucleosiddiphosphatZuckern, z. B. UDP-Glucose. Übertragung der Glykosylgruppe auf die wachsende Polysaccharidkette durch eine Synthase. Neusynthese erfordert ein Oligosaccharid als Primer. Verknüpfung erfolgt a-glykosidisch (Glykogen, Stärke) oder b-glykosidisch (Cellulose). Verzweigungen (Glykogen, Amylopektin) durch spezielles Verzweigungsenzym. Polysaccharidabbau: Phosphorolytisch (Produkt phosphoryliert) oder hydrolytisch. Glykogen, Stärke: Abspaltung von Monomeren, Stärke, Cellulose: Abspaltung von Disacchariden, nachfolgende Spaltung in Monomere. Verzweigungen erfordern spezielle Enzyme (debranching enzyme). Gluconeogenese: Anaboler Stoffwechselweg. Funktion: Synthese von Glucose6-phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat aus Pyruvat. Umgehung der irreversiblen Glykolyse-Reaktionen durch Pyruvat-Carboxylase, PEP-Carboxykinase, Fructose-1,6-bisphosphat-Phosphatase. Regulation dieser Enzyme reziprok zur Glykolyse. Reziproke (entgegengesetzte) Regulierung: Regulierung von entgegengesetzten katabolen und anabolen Stoffwechselwegen (z. B. Glykolyse und Gluconeogenese). Regulationsstellen sind jeweils die Enzyme für die irreversiblen Reaktionsschritte. Anaboler Weg: hohe Energieladung, Überschuss an Biosynthesevorstufen aktivieren, kataboler Weg: niedrige Energieladung, Mangel an Biosynthesevorstufen aktivieren. (Oxidativer) Pentosephosphatweg (Phosphogluconatweg): Funktion: Bereitstellung von NADPH und Pentosen für Biosynthesen. Kopplung zwischen Glykolyse und Pentosephosphatweg durch Transaldolasen und Transketolasen, die Pentosen zu Zwischenprodukten der Glykolyse umsetzen. Schrittmacherreaktion: einleitende Oxidation von Glucose-6-phosphat. Reguliertes Enzym: Glucose-6phosphat-Dehydrogenase. Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex: Enzymkomplex aus drei Enzymen. Prosthetische Gruppen: TPP, Liponamid und FAD. Katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA. Regulation: Hemmung über reversible Phosphorylierung durch Energieladung (ATP, NADH) und Biosynthesevorstufen (AcetylCoA). Citratzyklus: Kataboler zyklischer Stoffwechselweg, der nur unter aeroben Bedingungen abläuft. Funktion: Erzeugung von ATP (GTP), Reduktionsäquivalenten und Biosynthesevorstufen. Regulation: hohe Energieladung (ATP, NADH) hemmt; niedrige Energieladung (ADP) aktiviert.

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300

7 Stoffwechsel

Anaplerotische Reaktionen: Auffüllende Synthesewege für Zwischenprodukte des Citratzyklus, die als Vorstufen für Biosynthesen genutzt werden. Unterschiedliche Enzyme bei Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen. Glyoxylatzyklus: Anaplerotischer Stoffwechselweg in Pflanzen, Pilzen und Prokaryoten. Funktion: Neu-Synthese eines C4-Körpers aus zwei C2-Einheiten (AcetylCoA), Synthese von Kohlenhydraten aus Fetten (über Gluconeogenese). Umgeht durch einen Kurzschluss zwischen Isocitrat und Malat die beiden Decarboxylierungen des Citratzyklus. Zusätzliche Enzyme: Isocitrat-Lyase und Malat-Synthase.

7.3 7

Die Atmungskette

In der Atmungskette werden die in den oxidativen Abbauwegen reduzierten Coenzyme reoxidiert und dabei über Elektronentransportphosphorylierung ATP synthetisiert. Zwischen ATP-Synthese und Redoxreaktion besteht eine chemiosmotische Kopplung. Über mehrere hintereinander geschaltete Oxidoreductasen, ihre redoxaktiven prosthetischen Gruppen und Coenzyme sowie mobile Elektronencarrier in der Cytoplasmamembran von Prokaryoten bzw. der innreren Mitochondrienmembran von Eukaryoten werden die Elektronen in Richtung des positiveren Redoxpotentials auf einen externen Elektronenakzeptor übertragen. Durch die gleichzeitige Translokation von Protonen über die Membran wird ein elektrochemisches Membranpotential aufgebaut. Die resultierende protonenmotorische Kraft ist Antrieb der Synthese von ATP aus ADP und Pi über eine membrangebundene ATP-Synthase (oxidative Phosphorylierung). Die ATP-Ausbeute ist abhängig von der Potentialdifferenz zwischen dem primären Elektronendonor und dem terminalen Elektronenakzepor, den verwendeten Elektronencarriern und bei Eukaryoten vom Energieverbrauch der Shuttle-Systeme für cytosolisches NADH und ADP. In der Atmungskette, dem letzten Abschnitt des oxidativen Abbaus von Kohlenhydraten, Fetten und Aminosäuren bei chemoorganotrophen Organismen, werden die den organischen Substraten durch lösliche Dehydrogenasen entzogenen und auf NAD+ übertragenen Elektronen über eine membrangebundene Elektronentransportkette auf einen externen Elektronenakzeptor, z. B. O2, übertragen. Dieser Elektronentransport ist mit der Translokation von Protonen über die Membran verbunden, was zum Aufbau der protonenmotorischen Kraft (PMK, S. 303) führt. Im Unterschied zur Substratstufenphosphorylierung treten keine phosphorylierten energiereichen Zwischenprodukte auf, sondern die durch die protonenmotorische Kraft energetisierte Membran selbst stellt den Speicher für die Freie Energie der oxidierten Substrate dar, der zur Synthese von ATP genutzt wird. Die membrangebundene ATP-Synthase koppelt den kontrollierten Rückstrom von Protonen über die Membran mit der Phosphorylierung von ADP

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7.3 Die Atmungskette

301

zu ATP, die als Elektronentransportphosphorylierung (ETP) bezeichnet wird. Die Kopplung zwischen ATP-Synthese und Elektronentransport ist in der Regel so eng, dass bei einer Erschöpfung des Substrates ADP auch der Elektronentransport zum Stillstand kommt. Die Elektronentransportphosphorylierung, bei chemoorganotrophen Organismen auch als oxidative Phosphorylierung bezeichnet, liefert den größten Teil des von aeroben Organismen synthetisierten ATP. Einige Prokaryoten können als terminalen Elektronenakzeptor an Stelle von O2 auch NO3–, SO42– oder Fumarat verwenden (anaerobe Atmung, Mikrobiologie). Bei strikt phototrophen (Photophosphorylierung, S. 343) und strikt chemolithotrophen ( Mikrobiologie) Organismen erfolgt die ATP-Synthese ausschließlich über Elektronentransportphosphorylierung.

7.3.1

Die Komponenten der Atmungskette

Die Atmungskette ist bei Prokaryoten in der Cytoplasmamembran, bei Eukaryoten in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert (Tab. 7.1). Sie ist aus hintereinander geschalteten Oxidoreductasen aufgebaut, die jeweils aus mehreren Untereinheiten bestehen. Über Coenzyme oder prosthetische Gruppen, die im Wechsel reduziert und oxidiert werden, können diese Oxidoreductasen Elektronen oder Reduktionsäquivalente ([H] =Elektronen plus Protonen) aufnehmen bzw. abgeben. In einer Elektronentransportkette sind die einzelnen Komponenten abhängig von ihrem Redoxpotential so angeordnet, dass der Elektronentransport immer in Richtung des positiveren Redoxpotentials erfolgt (Tab. 7.6). Die Atmungskette in den Mitochondrien besteht aus vier Oxidoreductasen, von denen drei gleichzeitig Protonenpumpen sind, die während des Elektronentransportes Protonen über die Membran pumpen und so die protonenmotorische Kraft erzeugen, die zur ATP-Synthese genutzt wird (Abb. 7.17). Innerhalb der Komplexe werden die Elektronen über eine Reihe von prosthetischen Gruppen, Flavinnucleotide (FMN oder FAD), Eisen-Schwefel-Zentren, Häm-Gruppen und Kupferionen (S. 302), weitergeleitet (Tab. 7.5). Zwischen den einzelnen Komplexen vermitteln kleine, mobile Elektronencarrier, Chinone oder Cytochrome, die ein oder zwei Elektronen aufnehmen und auf eine prosthetische Gruppe des nachfolgenden Komplexes übertragen. Chinone wie Ubichinon (UQ) können zwei Elektronen nacheinander aufnehmen, dabei entsteht im ersten Schritt das Semichinon-Radikal (UQHx) und bei Aufnahme des zweiten Elektrons das Hydrochinon Ubichinol (UQH2). Chinone können ebenso wie die Flavoprotein-Carrier als Schalter zwischen Ein- und Zwei-Elektronen-Übergängen fungieren. Bei der Reduktion des Chinons mit zwei Elektronen werden auf der Membraninnenseite zwei Protonen aufgenommen, die bei der Oxidation auf der Membranaußenseite wieder abgegeben werden. Wird QH2 durch einen Elektronencarrier oxidiert, der nur eines der beiden Elektronen aufnimmt (Cytochrom c bzw. Plastocyanin), wird das zweite Elektron in den Chinonpool zurückgeführt, wo es ein fest gebundenes Chinon zum Semichinon-Radikal QHx reduziert. Bei der Oxidation eines

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7

302

7 Stoffwechsel

7 Abb. 7.17 Atmungskette: Verknüpfung von Elektronentransport und Protonentranslokation über die Membran. Bei Prokaryoten kann die Elektronentransportkette speziesabhängig auch weniger als vier Komplexe umfassen, die Zusammensetzung variiert abhängig von der O2-Konzentration. Durch spezielle Inhibitoren wird die Elektronenübertragung innerhalb der Atmungskette blockiert, z. B. werden verschiedene Komponenten der Cytochrom c-O2-Oxidoreductase durch Cyanid (CN–), Azid (N3–) und Kohlenmonoxid (CO) gehemmt. Außen: bei Mitochondrien Intermembranraum, bei Prokaryoten der Extrazellularraum; innen: bei Mitochondrien der Matrixraum, bei Prokaryoten das Cytoplasma. Tab. 7.5 Komponenten der Atmungskette und ihre Elektronen übertragenden Gruppen in Mitochondrien und in E. coli. Als Redoxmediatoren fungieren Ubichinon und Cytochrom c in Mitochondrien und Ubichinon in E. coli. Bei hoher O2-Konzentration werden in E. coli die Elektronen des Hydrochinons (= Chinol) auf den Cytochrom bo-Komplex übertragen, bei niedriger O2-Konzentration auf den Cytochrom bd-Komplex. Mitochondrien (Säuger)

E. coli

Komplex

Bezeichnung

Elektronen übertragende Gruppen

Bezeichnung

Elektronen übertragende Gruppen

I

NADH-Q-Oxidoreductase

FMN, Fe2S2- und Fe4S4-Zentren, Ubichinon

NADH-Q-Oxidoreductase

FMN, Fe2S2- und Fe4S4-Zentren

II

Succinat-Q-Oxidoreductase

FAD, Fe2S2- und Fe4S4-Zentren, Cytochrom b558

Succinat-Q-Oxidoreductase

FAD, 1 FeS-Zentrum, Cytochrom b556

III

Hydrochinon-Cytochrom c-Oxidoreductase

Cytochrom b566, Cytochrom b560, Cytochrom c1, 1 Fe2S2-Zentrum, Ubichinon

Cytochrom bd-Komplex

Cytochrom b558, Cytochrom b595, Cytochrom d

IV

Cytochrom c-O2Oxidoreductase

Cytochrom a, Cytochrom a3, 2 CuA, CuB

Cytochrom bo-Komplex

Cytochrom b562, Cytochrom o (Cytochrom b555), CuB

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7.3 Die Atmungskette

303

weiteren QH2 wird erneut ein Elektron auf den nachfolgenden Elektronencarrier übertragen, das andere reduziert das gebundene QHx zu QH2. Insgesamt werden so in einem kompletten Q-Zyklus zwei QH2 zu Q oxidiert, ein gebundenes Q zu QH2 reduziert und dabei zwei Elektronen und vier Protonen transportiert. An den Elektronentransportketten der verschiedenen Organismen sind unterschiedliche Chinone beteiligt: Ubichinon bei der mitochondrialen Atmungskette und bei aeroben gramnegativen Bakterien, Menachinon bei aeroben grampositiven Bakterien und Plastochinon bei photosynthetischen Elektronentransportketten.

7.3.2

Aufbau der protonenmotorischen Kraft

+

NAD fungiert bei den meisten Redoxreaktionen der Glykolyse und des Citratzyklus als Elektronenakzeptor und wird zu NADH reduziert. Über den Komplex I der Atmungskette, die NADH-Q-Oxidoreductase (NADH-Dehydrogenase), speist NADH die den Energiesubstraten entzogenen Elektronen in die Elektronentransportkette ein und wird dabei zu NAD+ reoxidiert (Abb. 7.17). Dieser Vorgang ist mit einer Translokation von Protonen durch die innere Mitochondrienmembran verbunden: Pro Elektronenpaar werden dabei vier Protonen durch die Membran gepumpt. Ein Chinon (Ubichinon) übernimmt anschließend die Elektronen von der NADH-Q-Oxidoreductase und wird durch die Aufnahme von zwei cytosolischen Protonen zum Chinol reduziert. Das Chinol überträgt die Elektronen dann auf Komplex III, die Hydrochinon-Cytochrom c-Oxidoreductase (Cytochrom bc1-Komplex), dabei gibt es zwei Protonen auf der Membranaußenseite ab und wird wieder zum Chinon oxidiert. Die Elektronen aus der Succinat-Dehydrogenase-Reaktion werden über Komplex II, die Succinat-Q-Oxidoreductase, ohne Translokation von Protonen in die Elektronentransportkette eingeschleust und auf Ubichinon übertragen. Die Succinat-Dehydrogenase ist Bestandteil von Komplex II und das einzige membrangebunde Enzym des Citratzyklus. Auch andere Dehydrogenasen, deren prosthetische Gruppe FAD ist, z. B. die Acetyl-CoA-Dehydrogenase der Fettsäureoxidation und die Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase im Glycerinphosphat-Shuttle (s. u.), übertragen Elektronen über Komplex II auf Ubichinon. Von Komplex III werden die Elektronen auf membranassoziiertes Cytochrom c an der Außenseite der inneren Mitochondrienmembran transferiert, pro Elektronenpaar werden auch zwei Protonen transloziert. Cytochrom c überträgt die Elektronen auf Komplex IV, die Cytochrom c-O2-Oxidoreductase (CytochromOxidase). Komplex IV überträgt die Elektronen auf den externen Elektronenakzeptor O2, wobei für jedes Elektronenpaar weitere zwei Protonen transloziert werden. Insgesamt werden in der mitochondrialen Atmungskette pro Elektronenpaar aus NADH zehn Protonen von der Matrixseite der Membran auf die cytosolische Seite gepumpt und sechs Protonen für jedes Elektronenpaar, das über Komplex II eingeschleust wird. Die Anzahl der pro Elektronenpaar translozierten Protonen hängt von den Redoxpotentialen des Elektronendonors, der

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7

304

7 Stoffwechsel

7

Abb. 7.18 Transportsysteme (Shuttle) für cytosolisches NADH in die Mitochondrien. a Glycerinphosphat-Shuttle, b Malat-Aspartat-Shuttle.

jeweiligen Elektronencarrier und des terminalen Akzeptors ab und kann sich daher bei Prokaryoten von den mitochondrialen Werten unterscheiden (s. u. und Mikrobiologie). Bei Eukaryoten übernimmt die NADH-Q-Oxidoreductase die Elektronen von NADH auf der Matrixseite der inneren Mitochondrienmembran. Da die innere Membran für cytoplasmatisches NADH undurchlässig ist, wird cytosolisches NADH über spezielle Shuttle-Systeme in die Mitochondrien transportiert (Abb. 7.18). Der Glycerinphosphat-Shuttle nutzt zum Transport der Elektronen des cytosolischen NADH Glycerin-3-phosphat, das durch die innere Mitochondrienmembran diffundieren kann. Im Cytosol wird Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) von der NADH-abhängigen Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase zu Glycerin-3-phosphat (G-3-P) reduziert, das in die Mitochondrien diffundiert. Dort oxidiert eine zweite Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase G-3-P wieder zu DHAP und überträgt die Elektronen auf ihre prosthetische Gruppe FAD, DHAP diffundiert zurück ins Cytosol. Da die Elektronen vom enzymgebundenen FADH2 nur über Komplex II in die Elektronentransportkette eingeschleust werden können, werden beim Transport eines Elektronenpaars insgesamt nur sechs Protonen transloziert statt zehn bei einer direkten Einspeisung aus NADH über Komplex I. Entsprechend verringert sich die aufgebaute protonenmotorische Kraft und damit die ATPAusbeute bei Verwendung dieses Transportsystems um 2 ATP pro Mol oxidierte Glucose. Vorteil des Glycerinphosphat-Transportsystems ist seine Funktionsfähigkeit auch gegen ein Konzentrationsgefälle von cytosolischem zu mitochondrialem NADH. Der Glycerinphosphat-Shuttle ist für die Flugmuskulatur von Insekten wichtig, beim Menschen kommt er im Gehirn und in der Skelettmuskulatur vor.

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7.3 Die Atmungskette

305

Beim Malat-Aspartat-Shuttle werden die Elektronen des NADH im Cytosol auf Oxalacetat übertragen, wobei Malat entsteht, das über die innere Mitochondrienmembran diffundieren kann. In der Mitochondrienmatrix wird Malat wieder zu Oxalacetat oxidiert und die Elektronen auf mitochondriales NAD+ übertragen. Da Oxalacetat nicht ins Cytosol zurück diffundieren kann, sind zusätzliche Reaktionen erforderlich: Oxalacetat wird in der Mitochondrienmatrix mit Glutamat als Aminogruppendonor zu Aspartat transaminiert, das die Membran überwinden kann. Im Cytosol erfolgt anschließend die umgekehrte Reaktion, um Oxalacetat zu regenerieren. Dieses Transportsystem verbraucht keine Energie, da die Elektronen in der Mitochondrienmatrix wieder auf NAD+ übertragen werden. Es funktioniert jedoch nur unter der Voraussetzung, dass die NADH-Konzentration im Cytosol höher ist als in den Mitochondrien. Der Malat-Aspartat-Shuttle ist vor allem in der Leber und im Herzmuskel aktiv.

7.3.3

Kopplung von Oxidation und Phosphorylierung

Die ursprüngliche Antriebskraft für die oxidative Phosphorylierung ist das hohe Elektronenübertragungspotential des primären Elektronendonors in Bezug auf den Elektronenakzeptor, in der mitochondrialen Atmungskette O2. Für das Redoxpaar NAD+/NADH beträgt das Standard-Redoxpotential –0,32 V, für das Paar 1⁄2 O2/H2O +0,82 V (Tab. 7.6), daraus errechnet sich eine Redoxpotentialdifferenz DE0l von 1,14 V. Die Freie Energie der Redoxreaktion

⁄2 O2 + NADH + H+ m H2O + NAD+

1

lässt sich damit nach der Gleichung DGhl = –n F DE0l zu –220 kJ mol–1 berechnen (n = 2, Anzahl der übertragenen Elektronen; F = 96,5 kJ V–1 mol–1). Dieser Wert der Freien Energie ist für die Synthese von ATP bei weitem ausreichend (s. u.). Zwischen Redoxreaktion und ATP-Synthese besteht eine chemiosmotische Kopplung. Durch die Wirkung der drei Protonenpumpen der Atmungskette wird parallel zum Elektronentransport ein Protonengradient aufgebaut, aus

Tab. 7.6 Standard-Redoxpotentiale der Elektronencarrier in der Atmungskette. Redoxpaar

Eol (Volt)

Redoxpaar

Eol (Volt)

2H+/H2

–0,42

Ubichinon ox/red

+0,113

Ferredoxin

–0,39

Cytochrom b ox/red

+0,035

NAD+/NADH + H+

–0,32

Cytochrom c1 ox/red

+0,22

FAD/FADH2

–0,22

Cytochrom c ox/red

+0,23 bis +0,26

FMN/FMNH2

–0,19

Cytochrom a ox/red

+0,29

Menachinon ox/red

–0,075

Cytochrom a3 ox/red

+0,385

Plastochonin ox/red

–0,25 bis +0,11

1 2

/ O2 + 2 H+/H2O

+0,82

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7

306

7

7 Stoffwechsel Abb. 7.19 Elektrochemischer Protonengradient. Über der inneren Mitochondrienmembran bzw. der Cytoplasmamembran bei Prokaryoten wird durch die Wirkung der drei Komplexe der Atmungskette, die neben ihrer Funktion als Elektronentransportsysteme Protonen pumpen, ein elektrochemischer Protonengradient aufgebaut. Die resultierende protonenmotorische Kraft wird zur ATP-Synthese durch die membrangebundene ATP-Synthase verwendet.

dem eine pH-Differenz zwischen Matrixraum (basisch) und Intermembranraum (sauer) resultiert. Die gleichzeitige Ladungsverschiebung bewirkt eine elektrische Potentialdifferenz, die Innenseite der Membran ist negativ, die Außenseite positiv geladen (Abb. 7.19). Der pH-Gradient und das Membranpotential energetisieren die Membran und erzeugen die protonenmotorische Kraft (PMK, DmH+), in der ein Teil der Freien Energie der Redoxreaktion gespeichert ist. Durch den kontrollierten Rückfluss der Protonen über die membrangebundene ATP-Synthase in die Mitochondrienmatrix kann die in der protonenmotorischen Kraft konservierte Freie Energie der Redoxreaktion für die Synthese von ATP genutzt werden. Als ATPase kann das Enzym umgekehrt ATP zu ADP hydrolysieren und die Freie Energie der Hydrolyse für den Aufbau eines Protonengradienten nutzen. Auf diese Weise können strikt gärende Bakterien, die keine Elektronentransportkette besitzen, die protonenmotorische Kraft für die Geißelbewegung ( MikroMikrobiologie) oder für Transportprozesse erzeugen. Die Kopplung eines Protonengradienten mit der Synthese bzw. Hydrolyse von ATP spielt auch bei vielen anderen biologischen Prozessen eine Rolle, z. B. bei der Photophosphorylierung ( Botanik), bei der Wärmeerzeugung oder bei der Erzeugung von NADPH für Biosynthesen. Bestimmte lipidlösliche Verbindungen wie 2,4-Dinitrophenol wirken als Entkoppler, indem sie zum Zusammenbruch des Protonengradienten und damit der protonenmotorischen Kraft führen. Natürliche Entkoppler sind Ammoniak (NH3), das protoniert wird, und Antibiotika wie Valinomycin (Ionophor für K+-Ionen) und Nigericin (H+/K+-Austauscher) ( Mikrobiologie). Obwohl der Elektronentransport nicht beeinträchtigt wird, ist keine ATP-Synthese mehr möglich, stattdessen wird Wärme frei.

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7.3 Die Atmungskette

307

Entkopplung wird von einigen tierischen Geweben unter bestimmten physiologischen Bedingungen zur Wärmeproduktion eingesetzt. Chemische Thermogenese findet im braunen Fettgewebe der Neugeborenen vieler Säugetiere einschließlich des Menschen statt. In diesem Gewebe, dessen braune Farbe durch die große Menge an Mitochondrien und die darin enthaltenen Cytochrome verursacht wird, wird ein großer Teil des Protonengradienten zur Erzeugung von Wärme genutzt. Auch Winterschlaf haltende Säugetiere besitzen viel braunes Fettgewebe. Bei der Oxidation von Brennstoffen (insbesondere Fettsäuren) in den Mitochondrien des braunen Fettgewebes werden zwar die Elektronen über die Atmungskette auf O2 übertragen und von einer Protonentranslokation aus der Matrix heraus wie in den anderen Mitochondrien begleitet, die Mitochondrien des braunen Fettgewebes enthalten jedoch in ihrer inneren Membran integrale Membranproteine wie das Thermogenin, die als Entkopplungsproteine (UCP, uncoupling protein) wirken, weil sie den Protonen einen Rückweg in die Matrix zur Verfügung stellen, der die ATP-Synthase umgeht. Als Ergebnis dieses Protonenkurzschlusses wird die Energie der Oxidation nicht in ATP gespeichert, sondern in Form von Wärme freigesetzt. Diese dient der Aufrechterhaltung der Körpertemperatur.

7.3.4

Struktur und Funktion der ATP-Synthase

Die ATP-Synthase nutzt die protonenmotorische Kraft, um den kontrollierten, passiven Rückstrom von Protonen ins Cytoplasma von Prokaryoten bzw. in die Mitochondrienmatrix oder den Chloroplasteninnenraum bei Eukaryoten an die Phosphorylierung von ADP zu ATP zu koppeln und so die Freie Energie des Protonengradienten zu konservieren. Die ATP-Synthasen von Prokaryoten und Eukaryoten zeigen einen übereinstimmenden Aufbau und gehen auf einen gemeinsamen evolutionären Ursprung zurück. Obwohl die meisten ATP-Synthasen H+-abhängig sind, exisitieren auch Na+-abhängige, z. B. in dem anaeroben Bakterium Propionigenium modestum. Die ATP-Synthase, auch FoF1-ATPase, besteht aus dem hydrophilen, der Membraninnenseite aufsitzenden Kopfteil F1 und dem hydrophoben, aufgrund seiner Oligomycin-Sensitivität benannten Fo-Teil, der die Membran durchspannt (Abb. 7.20). Der Fo-Teil stellt den Protonenkanal dar und ist aus mindestens drei verschiedenen Polypeptiden (a, b, c) der Stöchiometrie ab2c9–12 zusammengesetzt. Die Untereinheit c trägt eine für die Funktion wichtige saure Aminosäure (Glu bzw. Asp), die zur Ionenleitung beiträgt. Der lösliche F1-Teil enthält die drei katalytischen Zentren der ATP-Synthese und besteht aus fünf Polypeptiden der Stöchiometrie a3b3gde. Die N-Termini der großen a- und b-Untereinheiten bilden eine a3b3-Krone. Sie stellt den membranfernen Teil des F1-Kopfes dar. Im Zentrum dieses hexameren a3b3-Komplexes steht die lang gestreckte g-Untereinheit als eine Art Achse, die sich nach unten (membranwärts) weiter ausdehnt und einen wesentlichen Teil des zentralen Stiels bildet, der F1 und Fo miteinander verbindet. Zusätzlich ist der membranverankerte Teil über die b2-Proteine als peripheren Stiel mit dem hexameren Kopf verbunden, wodurch das Holoenzym stabilisiert wird. Der F1-Teil kann relativ leicht mechanisch vom Komplex und damit vom Protonenkanal abgetrennt werden und fungiert dann als ATP hydrolysierende

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308

7

7 Stoffwechsel Abb. 7.20 Struktur der ATPSynthase. Die ATP-Synthase besteht aus dem Fo-Teil, der als Protonenkanal fungiert, und dem F1-Teil, der die ATP-Synthese durchführt. Der Fo-Teil des Enzyms ist in der Membran verankert und über einen zentralen und einen peripheren Stiel mit der F1-Einheit verbunden, die in die Mitochondrienmatrix hineinragt. Beide Teile des Enzyms bestehen jeweils aus mehreren Polypeptiden, von denen eine oder mehrere Kopien vorhanden sind. Die Untereinheiten des F1-Teils bilden eine Krone, in ihr sind die Nucleotidbindungsstellen lokalisiert.

F1-ATPase. Die sechs Nucleotidbindungsstellen befinden sich jeweils an den Grenzflächen zwischen a und b-Untereinheiten; die drei katalytischen werden vorwiegend von Aminosäureresten der b-Untereinheit gebildet, während die drei nicht katalytischen hauptsächlich der a-Untereinheit zuzuordnen sind. Jedes der ab-Paare befindet sich jeweils in einem von drei definierten Konformationszuständen im Bereich der katalytischen Nucleotidbindungsstellen: Ein katalytisches Zentrum ist mit ATP besetzt, eines mit ADP und Pi, das dritte ist unbesetzt. Die Reaktionen der drei katalytischen Zentren werden miteinander koordiniert, indem die Spannung, die durch die Nucleotidbindung entsteht, an die beiden anderen Zentren übermittelt wird. Zusätzlich existieren mindestens zwei „Schalterpunkte“ auf g, die mit spezifischen Stellen auf dem a3b3-Hexamer interagieren. Daher wird die katalytische Aktivität jedes Zentrums vom Status der beiden anderen Zentren und der Position der g-Untereinheit beeinflusst. Die hohe Effizienz der ATP-Synthase von nahezu 100 % wird dadurch möglich, dass keine Wärme freigesetzt wird, sondern die Energieübermittlung fast ausschließlich durch die Erzeugung elastischer Spannungen geschieht. Durch die Freisetzung eines ATP-Moleküls von seinem katalytischen Zentrum werden die Synthese eines weiteren ATP-Moleküls aus ADP und Pi am zweiten katalytischen Zentrum sowie die Bindung von ADP und Pi an das dritte, zuvor unbesetzte Zentrum begünstigt. Der Umlauf von g öffnet und schließt die katalytischen Bindungstaschen, das erforderliche Drehmoment wird, wie bei der Flagellenbewegung in Archaea und Bacteria ( Mikrobiologie), auf Kosten der protonenmotorischen Kraft erzeugt. Die gesamte Struktur der ATP-Synthase kann in zwei gegeneinander rotierende Einheiten unterteilt werden. Dabei kann die Gesamtheit der Untereinheiten ab2(ab)3d als Stator des Enzyms, die der Untereinheiten gec9–12 als Rotor betrachtet werden. Zwischen den a- und den c-Untereinheiten befindet sich

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7.3 Die Atmungskette

309

ein Kanal, in den aus dem Intermembranraum, bei Prokaryoten aus dem extrazellulären Raum, Protonen einströmen. Der Stator besitzt eine hydrophobe und eine hydrophile Domäne. In der a-Untereinheit des Stators befindet sich eine einzige Kopie eines Argininrestes, der für dessen Funktion essentiell ist. Er ist immer positiv geladen (protoniert) und verhindert so durch elektrische Abstoßung ein zufälliges Durchsickern der ebenfalls positiv geladenen Protonen. Die negativ geladenen unprotonierten Bindungsstellen des Rotors werden dagegen angezogen. Durch das aufgebaute Membranpotential wird diese Anziehung vermindert und so die Bewegung der Bindungsstelle in Richtung des Statorkanals ermöglicht. Dort nimmt der negativ geladene Aspartatrest einer der 9 bis 12 Bindungsstellen der c-Untereinheit des Rotors ein Proton auf und erhält dadurch die Eigenschaften eines Dipols (insgesamt neutral). Die mit einem Proton beladene Bindungsstelle kann jetzt den hydrophoben Bereich des Stators überwinden, anschließend erfolgt die Dissoziation des Protons ins Cytoplasma. Der jetzt wieder negativ geladene Aspartatrest der Bindungsstelle verhindert eine Rückwärtsbewegung in den hydrophoben Statorbereich; dadurch ist die Drehung gerichtet. Die Funktion des Protonengradienten liegt in der Freisetzung des gebildeten ATP-Moleküls. Pro ATP müssen drei bis vier Protonen durch den Protonenkanal zurück in die Mitochondrienmatrix fließen. Wenn die ATP-Synthese blockiert wird, z. B.durch Oligomycin, können die Protonen nicht mehr durch den FoF1-Komplex in die Matrix zurückfließen. Da durch die Aktivität der Atmungskette aber weiter Protonen auf die Außenseite der Membran geschleust werden, baut sich ein hoher Protonengradient und damit eine große PMK auf. Wenn die freie Enthalpie, die notwendig ist, um noch ein weiteres Proton gegen diesen Gradienten aus der Matrix zu pumpen, genau der Energie entspricht, die durch die Elektronentransferreaktionen der Elektronentransportkette von NADH auf O2 erzeugt wird oder sie übersteigt, stoppt der Elektronentransport.

7.3.5

Energiebilanz der Atmungskette

Der Hauptteil der Freien Energie aus der Oxidation organischer Substrate wird über Elektronentransportphosphorylierung konserviert. Die Änderung der Freien Energie von –220 kJ mol–1 für die Oxidation von NADH mit O2 wäre unter physiologischen Bedingungen, d. h. einem Bedarf von ca. 50 kJ pro Mol ATP, ausreichend für die Synthese von ca. vier Mol ATP. Die tatsächliche ATP-Ausbeute hängt jedoch nicht nur von der verfügbaren Freien Energie ab, sondern auch vom Mechanismus der Energiekonservierung. Da pro Mol ATP, das synthetisiert und freigesetzt wird, mindestens drei bis vier Protonen durch die ATP-Synthase fließen müssen (s. o.), hängt die tatsächliche ATP-Menge vom Verhältnis Protonen/Elektronen ab, die bei der Oxidation von NADH mit O2 transportiert werden. Entscheidend für die Zahl der jeweils translozierten Protonen sind die Komponenten der Atmungskette. In der mitochondrialen Atmungskette und in der aeroben Elektronentransportkette von Paracoc-

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7

310

7

7 Stoffwechsel

cus denitrificans werden 10 Protonen/2 e– aus NADH und 6 Protonen /2 e– aus QH2 transloziert, während die Stöchiometrie in der aeroben Elektronentransportkette von E. coli 8 Protonen/2 e– für NADH und 4 Protonen/2 e– für QH2 beträgt. Ein weiterer Faktor, der die ATP-Ausbeute beeinflusst, ist die Kompartimentierung der eukaryotischen Zelle. Cytoplasmatisches NADH, ADP und ATP müssen die innere Mitochondrienmembran mithilfe von Transportsystemen passieren, die einen Teil der im Protonengradienten gespeicherten Energie verbrauchen. Beispiele sind der Glycerinphosphat-Shuttle für NADH (Abb. 7.18a) und die ATP/ ADP-Translokase, die beim Antiport ADP aus dem Intermembranraum gegen ATP aus dem Matrixraum jeweils ein Proton zum Ausgleich der zusätzlichen negativen Ladung von ATP verbraucht. Synthese und Export von einem ATP erfordern daher in den Mitochondrien insgesamt mindestens vier Protonen. Bei einer Protonen/Elektronen-Stöchiometrie von 10 für NADH und 6 für QH2 ergibt sich daraus eine Ausbeute von 2,5 ATP pro oxidiertes NADH und von 1,5 ATP pro oxidiertes QH2. Für cytosolisches NADH, das über den Glycerinphosphat-Shuttle in die Mitochondrien eingeschleust wird, reduziert sich der Wert auf 1,5 ATP, weil hier die Elektronen des NADH auf [FAD] und von da auf Q übertragen werden. Für die vollständige Oxidation von einem Mol Glucose über die mitochondriale Atmungskette errechnet sich eine maximale Energieausbeute von 30 ATP, bei Verwendung des Malat-Aspartat-Shuttles (Abb. 7.18b) 32 ATP (Tab. 7.7). Für Tab. 7.7 Abhängigkeit der ATP-Ausbeute pro Mol oxidierte Glucose von der Protonen/Elektronen-Stöchiometrie in der Elektronentransportkette der Endoxidation verschiedener Organismen. Bei Eukaryoten beeinflussen zusätzlich die verwendeten Transportsysteme für cytosolisches NADH und für Nucleotide die ATP-Werte. Reaktionsabschnitt

Gebildete ReduktionsMitoE. coli äquivalente pro Glucose chondrien

Glykolyse

2 NADH

Decarboxylierung von Pyruvat

2 NADH

Citratzyklus

6 NADH + 2 QH2

P. denitrificans

Atmungskette H+/2e– Stöchiometrie pro NADH

10

8

10

ATP-Ausbeute pro oxidiertes NADH

2,5

2

3

H+/2e– Stöchiometrie pro QH2

6

4

6

ATP-Ausbeute pro oxidiertes QH2

1,5

1

2

ATP-Ausbeute der Atmungskette

28

22

34

ATP-Ausbeute der SSP in Glykolyse u. Citratzyklus

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Gesamtbilanz ATP-Ausbeute pro Glucose

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7.3 Die Atmungskette

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P. denitrificans, das keine Energie aus dem Protonengradienten für NADH- oder ATP/ADP-Transportsysteme abzweigen muss, ergibt sich eine Ausbeute von 38 ATP pro Mol Glucose, für E. coli wegen der ungünstigeren Protonen/ElektronenStöchiometrie nur 26 ATP pro Mol Glucose. Für Prokaryoten, die an Stelle von O2 (E0l = +0,82 V) einen terminalen Elektronenakzeptor mit negativerem RedoxMikrobiologie), potential, z. B. NO3– (E0l = +0,42 V) nutzen (anaerobe Atmung, verringert sich die Redoxpotentialdifferenz zu NAD+/NADH und infolgedessen auch die ATP-Ausbeute.

7.3.6

Der respiratorische Quotient

Das Volumenverhältnis von erzeugtem CO2 zu verbrauchtem O2 bei der vollständigen Oxidation eines Substates wird als respiratorischer Quotient (RQ) bezeichnet. RQ = Volumen CO2/Volumen O2 Da nach dem Avogadro-Satz gleiche Molzahlen aller Gase gleiche Volumina besitzen, kann der RQ-Wert für den Abbau eines bestimmten Substrates anhand der Stöchiometrie der Reaktion berechnet werden. Für die Veratmung von Glucose ergibt sich ein RQ-Wert von 1, da für jedes verbrauchte Mol O2 ein Mol CO2 erzeugt wird. Beim Abbau von stärker reduzierten Molekülen wie Fetten und Proteinen liegt der RQ-Wert unter 1 (Fette ca. 0,7; Proteine ca. 0,8), bei der Oxidation höher oxidierter Säuren über 1: C16H32O2 + 23 O2 p 16 CO2 + 16 H2O (Palmitinsäure, RQ = 0,7) HOOC-COOH + 1⁄2 O2 p 2 CO2 + H2O (Oxalsäure, RQ = 4,0) Fett oxidierende Keimlinge haben dementsprechend RQ-Werte um 0,7. Werden Fette über die Gluconeogenese (s. o.) zuerst in Kohlenhydrate umgewandelt, so wird ein RQ I 1 gemessen, weil mehr O2 verbraucht wird als CO2 entsteht. Umgekehrt ergibt sich bei Umwandlung von Kohlenhydraten in Fette, die anschließend vollständig oxidiert werden, ein RQ i 1. An diesen Beispielen wird deutlich, dass der respiratorische Quotient nicht allein von der Natur des ursprünglich aufgenommenen Nährsubstrates abhängt, sondern insbesondere davon, in welcher Form dieser Brennstoff letztlich in die Abbauprozesse eingeschleust wird.

7.3.7

Regulation der Atmungskette

Die Geschwindigkeit der Atmung (= O2-Verbrauch) in den Mitochondrien bestimmt die gebildete ATP-Menge und wird daher streng reguliert. ADP ist Substrat der ATP-Synthase und die ADP-Konzentration ein Maß für die Energieladung einer Zelle, sodass die entscheidende Kontrolle der Atmungsgeschwindigkeit über die ADP-Konzentration erfolgt (Atmungskontrolle). Wenn durch ener-

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7 Stoffwechsel

gieverbrauchende Prozesse die Geschwindigkeit der ATP-Hydrolyse zunimmt, steigt der ADP-Spiegel und die Energieladung sinkt (S. 268). Dadurch steht mehr ADP für die oxidative Phosphorylierung zur Verfügung, sodass die Atmungsgeschwindigkeit erhöht und ATP regeneriert wird. In einigen tierischen Geweben wird die Atmungsgeschwindigkeit durch ADP-Zugabe verzehnfacht. Gleichzeitig werden durch einen erhöhten ADP-Spiegel auch Glykolyse, oxidative Decarboxylierung und Citratzyklus beschleunigt und so die Menge der Reduktionsäquivalente für die Atmungskette erhöht. Umgekehrt werden durch die Hemmung des Citratzyklus, z. B. durch eine hohe NADH-Konzentration, weniger Reduktionsäquivalente für die Atmungskette angeliefert, sodass sich deren Geschwindigkeit verlangsamt. Die Regulierung dieser Prozesse ist so genau, dass die Energieladung in den meisten Geweben auch bei starker Schwankung des Energiebedarfs nur geringfügig variiert. Wegen der chemiosmotischen Kopplung von Elektronentransport und oxidativer Phosphorylierung wird durch die Hemmung des Elektronentransportes auch die oxidative Phosphorylierung gehemmt und umgekehrt.

Elektronentransportkette: In einer Membran lokalisierte Reihe von Oxidoreductasen mit redoxaktiven prosthetischen Gruppen und Coenzymen, zwischen denen mobile Elektronencarrier vermitteln. Transport von Elektronen oder Elektronen und Protonen in Richtung des positiveren Redoxpotentials entweder zyklisch zurück zum Elektronendonor oder linear auf einen externen Elektronenakzeptor. Atmungskette: Elektronentransportkette aus vier Oxidoreductasen in der inneren Mitochondrienmembran, Transport von Elektronen und Protonen durch die Komplexe I, III und IV, Transport von Elektronen durch Komplex II. O2 als terminaler Elektronenakzeptor. Spezifische Inhibitoren hemmen die einzelnen Komplexe. Protonenmotorische Kraft (PMK): DmH+, elektrochemische Potentialdifferenz (Ionengradient (H+ oder Na+) und elektrisches Membranpotential) an Membranen. Treibende Kraft für die ATP-Synthese bei der ETP. Nutzung für aktive Transportprozesse, bakterielle Geißelbewegung und die Erzeugung von NADPH. Chemiosmotische Kopplung: Verknüpfung zwischen exergoner Redoxreaktion und endergoner ATP-Synthese über die protonenmotorische Kraft DmH+ an einer Membran. Entkoppler: Schleusen Protonen (oder andere einwertige Ionen) über die Membran, was zum Zusammenbruch der PMK führt. Hemmung der ATP-Synthese, keine Beeinträchtigung des Elektronentransportes, Freisetzung von Wärme. ATP-Synthase (FoF1-ATPase): Reversibel arbeitendes, membranständiges Enzym; nutzt DmH+ zur Synthese von ATP bzw. ATP zum Aufbau von DmH+. Besteht aus zwei Domänen: Ionenkanal (Fo) und ATP-Synthese-Einheit (F1) Glycerinphosphat-Shuttle: Transportsystem für Elektronen aus cytosolischem NADH auf mitochondriales [FAD] über Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinphosphat.

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7.4 Der Lipidstoffwechsel

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ATP/ADP-Translokase: Transportprotein in der inneren Mitochondrienmembran, Antiport von cytosolischem ADP und mitochondrialem ATP unter Verbrauch eines Protons pro ATP. Malat-Aspartat-Shuttle: Transportsystem für Elektronen aus cytosolischem NADH auf mitochondriales NAD+ über Oxalacetat, Malat, und Aspartat. Respiratorischer Quotient: Volumenverhältnis von erzeugtem CO2 zu verbrauchtem O2 für die Veratmung eines Energiesubstrates. Atmungskontrolle: Kontrolle der Atmungsgeschwindigkeit über die ADP-Konzentration: Hohe ADP-Konzentration erhöht die Atmungsgeschwindigkeit.

7.4

Der Lipidstoffwechsel

Lipide kommen in allen Organismen als Speicherstoffe und Membrankomponenten vor. Triacylglyceride, Dreifachester von Glycerin mit langkettigen Fettsäuren, dienen hauptsächlich Tieren als Energiespeicher. Membranlipide sind Phospholipide oder Glykolipide, die neben zwei Fettsäureresten einen Phosphatrest oder mindestens eine glykosidisch gebundene oder mit einem Phosphatrest veresterte Glykosylgruppe tragen. Grundgerüst von Membranlipiden ist Glycerin oder Sphingosin. Ausgangssubstrate der Lipidsynthese sind Dihydroxyacetonphosphat und langkettige Fettsäuren, aus dem Zwischenprodukt Phosphatidat werden die verschiedenen Lipide gebildet. Der Abbau von Lipiden erfolgt mithilfe von Lipasen, die freigesetzten langkettigen Fettsäuren werden nach Aktivierung zu Acyl-CoA im Cytosol über die b-Oxidation zu Acetyl-CoA abgebaut. Bei Eukaryoten werden die aktivierten Fettsäuren mithilfe von Carnitin zur b-Oxidation in die Mitochondrienmatrix transportiert. Die Fettsäurebiosynthese findet im Cytosol am Fettsäure-Synthase-Komplex statt. Isoprenoide sind aus Isopreneinheiten aufgebaut. Beispiele sind Carotinoide, Steroide und Hopanoide. Lipide spielen in allen Organismen eine wichtige Rolle als Speicherstoffe und Membrankomponenten, in höheren Eukaryoten auch als Signalmoleküle. Einfache Lipide wie Triacylglyceride (Neutralfette) dienen vor allem in Tieren als Energiespeicher und sind außerdem an der Aufnahme fettlöslicher Vitamine beteiligt. Triacylglyceride sind Dreifachester des C3-Alkohols Glycerin mit langkettigen Fettsäuren und besonders gut als Energiespeicher geeignet, da die langen Alkylketten ihres Fettsäureanteils reduziert vorliegen und im Unterschied zu Polysacchariden nicht hydratisiert sind. Auch viele Pflanzen speichern Lipide in ihren Samen, die bei der Keimung Energie und Ausgangssubstrate für zahlreiche Biosynthesen liefern. Prokaryoten nutzen speziesabhängig unterschiedliche Lipide oder Polyhydroxyalkanoate als Speicherstoffe ( Mikrobiologie).

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7 Stoffwechsel

Membranlipide sind komplexe Lipide, deren Grundgerüst Glycerin oder der Aminoalkohol Sphingosin ist. Neben langen hydrophoben Fettsäureketten enthalten Membranlipide auch eine hydrophile Kopfgruppe: Phospholipide einen Phosphatrest, Glykolipide einen oder mehrere Zuckerreste. Dieser amphipatische Charakter bewirkt die Zusammenlagerung der Membranlipide zur charakteristischen Lipiddoppelschicht. Während in den Lipiden der Eukarya und der meisten Bacteria Fettsäuren mit einem Alkohol verestert sind (Esterlipide), besitzen Archaea und einige hyperthermophile Bacteria Etherlipide (S. 359). Isoprenoide (Terpenoide) sind aus Isopreneinheiten aufgebaut. Zu ihnen zählen die Elektronencarrier Ubichinon und Plastochinon, Carotinoide wie die Vitamine A, E und K und die Steroide. Zu den Steroiden gehören zahlreiche Hormone und das Cholesterin, das in Eukaryoten zur Stabilisierung von Membranen beiträgt; in Prokaryoten übernehmen diese Funktion die strukturell verwandten Hopanoide ( Mikrobiologie). In Säugern gehen die Biosynthesen von Gallensäuren, Steroidhormonen und herzwirksamen Glykosiden von Cholesterin aus. Eine zentrale Verbindung des Lipidstoffwechsels ist Acetyl-CoA, das als Ausgangspunkt bzw. Abbauprodukt anabole und katabole Reaktionswege verknüpft.

7.4.1

Die b-Oxidation der Fettsäuren

Die Hydrolyse von Triglyceriden erfolgt mithilfe von Lipasen (Abb. 7.21). Abbauprodukte sind Glycerin, das nach Phosphorylierung zu Glycerin-3-phosphat in die Glykolyse eingeschleust wird (Abb. 7.21a), und langkettige Fettsäuren, die über die b-Oxidation abgebaut werden. Der einleitende Schritt für die Oxidation einer Fettsäure ist ihre Aktivierung mit Coenzym A, er wird von Acyl-CoA-Synthetasen katalysiert und findet im Cytosol statt, bei Eukaryoten an der äußeren Mitochondrienmembran. Dabei wird der Acylrest unter Abspaltung von Pyrophosphat zunächst auf AMP und nachfolgend auf Coenzym A übertragen. AcylCoA-Synthetasen existieren als Isoenzyme mit unterschiedlicher Spezifität für Fettsäuren mit kurzen (C4–C6), intermediären (C4–C14) und langen Kohlenstoffketten (C12–C18). Die sofortige Hydrolyse des Pyrophosphats durch die anorganische Pyrophosphatase verlagert das Reaktionsgleichgewicht in Richtung AcylCoA-Bildung. (Abb. 7.21b): FS + ATP + CoA m FS-Acyl-CoA + AMP +PPi PPi p 2 Pi In Pflanzen, Pilzen und einigen Protozoen wird die Energie des Pyrophosphats durch die vakuoläre transmembranale H+-Pyrophosphatase auch zum Transport von Protonen über Endomembranen genutzt. Bei Prokaryoten findet die b-Oxidation im Cytoplasma statt, bei Eukaryoten in der Mitochondrienmatrix, in Pflanzenzellen auch in Glyoxysomen. Da die einleitende Aktivierungsreaktion im Cytosol erfolgt und die innere Mitochondrienmembran für Acyl-CoA nicht permeabel ist, wird die Acylgruppe auf die

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7.4 Der Lipidstoffwechsel

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Abb. 7.21 Abbau von Fetten. Triacylglyceride werden mithilfe von Lipasen hydrolytisch in Glycerin und Fettsäuren zerlegt. a Glycerin wird von der Glycerinkinase zu Glycerin-3-phosphat (G-3-P) phosphoryliert. G-3-P wird anschließend von der Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase zu Dihydroxyacetonphosphat oxidiert und dann über die Glykolyse abgebaut. b Die freien Fettsäuren werden durch die Acyl-CoA-Synthetase aktiviert.

Hydroxylgruppe von Carnitin übertragen. Diese Reaktion wird von der auf der äußeren Oberfläche der inneren Mitochondrienmembran lokalisierten CarnitinAcyltransferase I katalysiert. Das Acyl-Carnitin wird dann von der Carnitin-Acylcarnitin-Translokase gegen ein unbeladenes Carnitin-Molekül aus der Mitochondrienmatrix durch die innere Mitochondrienmembran transportiert. Dort wird der Fettsäurerest durch die auf der inneren Oberfläche der inneren Mitochon-

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7 Stoffwechsel

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Abb. 7.22 Transport von Fettsäuren über den Carnitin-Shuttle in die Mitochondrienmatrix.

drienmembran lokalisierte Carnitin-Acyltransferase II wieder auf Coenzym A übertragen (Abb. 7.22). Die b-Oxidation einer an CoA gebundenen gesättigten Fettsäure verläuft in vier Reaktionsschritten (Abb. 7.23): - Oxidation mit [FAD] als Elektronenakzeptor, - Wasseraddition an die resultierende Doppelbindung (Hydratisierung), - Oxidation des b-Hydroxyacyl-CoA mit NAD+ als Elektronenakzeptor, - Thiolyse. Weil die Änderung der Freien Energie für die Reduktion von NAD+ nicht ausreicht, werden die Elektronen bei der ersten Oxidation auf FAD, die prosthetische Gruppe der Acyl-CoA-Dehydrogenase, übertragen und anschließend wie bei der Succinat-Dehydrogenase-Reaktion des Citratzyklus (S. 294) an Ubichinon weiter gegeben. Das entstandene Enoyl-CoA wird durch die Enoyl-CoA-Hydratase zu L-b-Hydroxyacyl-CoA hydratisiert, das nachfolgend durch die L-b-HydroxyacylCoA-Dehydrogenase mit NAD+ zu einem Ketoacyl-CoA reduziert wird. Durch die Verknüpfung des a-Kohlenstoffatoms (C2) mit zwei Carbonylkohlenstoffen ist diese Verbindung nicht sehr stabil. Die ersten drei Reaktionen der Fettsäureoxidation entsprechen den letzten drei Schritten des Citratzyklus: Oxidation von Succinat zu Fumarat mit [FAD], Hydratisierung von Fumarat zu Malat, Oxidation von Malat zu Oxalacetat mit NAD+ (S. 295). Die Keto-Funktion des b-Kohlenstoffs (C3) von Ketoacyl-CoA begünstigt einen nucleophilen Angriff durch die SH-Gruppe von Coenzym A, diese Reaktion wird durch die Thiolase katalysiert. Die Acidität des a-Kohlenstoffs macht aus dem endständigen -CH2-CO-S-CoA eine gute Abgangsgruppe, was die Spaltung der a-b-Bindung erleichtert. Bei einem Durchgang der

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7.4 Der Lipidstoffwechsel

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Abb. 7.23 Die b-Oxidation der Fettsäuren. Langkettige Fettsäuren werden stufenweise oxidiert, wobei in jeder Runde eine C2-Einheit als Acetyl-CoA abgespalten wird. Jede Runde besteht aus vier Reaktionen.

b-Oxidation entsteht ein Molekül Acetyl-CoA und ein um zwei Kohlenstoffatome verkürztes Fettsäureacyl-CoA-Molekül, z. B. entsteht aus Palmityl-CoA (C16) Myristyl-CoA (C14). Dabei werden zwei Elektronenpaare und vier H+-Ionen auf [FAD] bzw. Q und NAD+ übertragen. Die Gleichung für einen Durchgang lautet dann: Palmityl-CoA + CoA + Q + NAD+ + H2O p Myristyl-CoA + Acetyl-CoA + QH2 + NADH + H+ Myristyl-CoA kann nun die Reaktionsfolge der b-Oxidation ein weiteres Mal durchlaufen, wobei ein zweites Molekül Acetyl-CoA und der Coenzym-A-Thioester von Laurat (C12) entstehen. Insgesamt sind sieben Durchgänge erforderlich, um ein Molekül Palmityl-CoA zu acht Molekülen Acetyl-CoA zu oxidieren. Die Gesamtgleichung für den Abbau der C16-Fettsäure Palmitinsäure lautet: Palmityl-CoA + 7 CoA + 7 Q + 7 NAD+ + 7 H2O p 8 Acetyl-CoA + 7 QH2 + 7 NADH + 7 H+ In der Atmungskette der Mitochondrien werden pro QH2 1,5 ATP und pro NADH 2,5 ATP erzeugt (S. 310), das ergibt für 7 QH2 plus 7 NADH 28 ATP. Für jedes der 8 Acetyl-CoA, die über Citratzyklus und Atmungskette vollständig oxidiert

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7 Stoffwechsel

werden, kommen weitere 10 ATP hinzu, sodass die vollständige Oxidation von Palmityl-CoA zu CO2 und H2O insgesamt 108 ATP liefert. Da die Aktivierung von Palmitat zu Palmityl-CoA zwei ATP-Äquivalente verbraucht, beträgt die Netto-Ausbeute pro oxidiertes Palmitat in Eukaryoten 106 ATP. Für Prokaryoten ergibt sich, abhängig von der Protonen/Elektronen-Stöchiometrie ihrer Elektronentransportkette, ein anderer Wert.

7

Wenn während einer Hungerperoide überschüssiges Acetyl-CoA aus der Fettsäureoxidation nicht weiter oxidiert werden kann, werden daraus in den Mitochondrien der Leber Ketonkörper gebildet, vor allem Acetacetat und b-Hydroxybutyrat. Auf diese Weise wird Acetyl-CoA in eine wasserlösliche Transportform überführt, die ins Blut diffundieren und zu allen peripheren Organen gebracht werden kann. Dort werden die Ketonkörper wieder zu Acetyl-CoA abgebaut, das dann als Energielieferant dient. Für Tiere, die in extrem trockenen Lebensräumen oder während des Winterschlafs längere Zeit ohne Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme auskommen müssen, liefert die Fettsäureoxidation neben Energie und Wärme auch das lebensnotwendige Wasser, das bei der ATP-Synthese und bei der Reduktion von O2 im letzten Schritt der Atmungskette gebildet wird. Während kurz- und langkettige Fettsäuren in der Mitochondrienmatrix oxidiert werden, findet die Oxidation von überlangen Fettsäuren in den Peroxisomen statt: Die Fettsäuren diffundieren in die Peroxisomen und werden erst dort zum Acyl-CoA aktiviert. Bei der b-Oxidation in Peroxisomen werden die Reduktionsäquivalente nicht in die Atmungskette eingeschleust, sondern unter Bildung von H2O2 direkt auf O2 übertragen, sodass kein ATP gebildet wird. H2O2 wird anschließend durch das Enzym Katalase zu H2O und O2 disproportioniert. Die Freie Energie der Reaktion wird dabei als Wärme freigesetzt. In tierischen Peroxisomen dient die b-Oxidation nur der Verkürzung von Fettsäuren mit mehr als 22 C-Atomen, die vollständige Oxidation findet in der Mitochondrienmatrix statt. Bei Pflanzen läuft die Fettsäureoxidation ausschließlich in den Peroxisomen des Blattgewebes und in den Glyoxysomen der keimenden Samen ab. Glyoxysomen stellen eine Sonderform von Peroxisomen dar, die insbesondere während der Samenkeimung aktiv sind. Beide Organellen enthalten die Enzyme Peroxidase und Katalase, Glyoxysomen zusätzlich die des Glyoxylatzyklus, sodass aus den gespeicherten Lipiden über b-Oxidation, Glyoxylatzyklus und Gluconeogenese Glucose synthetisiert werden und alle benötigten Biosynthesevorstufen bereitgestellt werden können. Der Abbau ungesättigter Fettsäuren mit Doppelbindungen in cis-Konfiguration über die b-Oxidation erfordet zusätzliche Enzyme, weil die Enoyl-CoA-Hydratase spezifisch für trans-Doppelbindungen ist. C18-Oleat, das eine cis-Doppelbindung zwischen C9 und C10 (D9) enthält, kann zunächst drei Oxidationszyklen absolvieren. Dabei entstehen drei Moleküle Acetyl-CoA und cis-D3-Dodecanoyl-CoA (C12), das die Enoyl-CoA-Hydratase nicht umsetzen kann. Erst die Isomerisierung zu trans-D2-Enoyl-CoA (trans-D2Dodecanoyl-CoA) durch die Enoyl-CoA-Isomerase ermöglicht den weiteren Ablauf der b-Oxidation (Abb. 7.24a).

Abb. 7.24 Die Oxidation ungesättigter, ungeradzahliger und verzweigter Fettsäu- n ren. a Die Oxidation einfach ungesättigter Fettsäuren erfordert als zusätzliches Enzym die Enoyl-CoA-Isomerase. Für mehrfach ungesättigte Fettsäuren werden die Enoyl-CoA-Isomerase und die 2,4-Dienoyl-CoA-Reductase benötigt. b Bei der b-Oxidation ungeradzahliger Fettsäuren entsteht Propionyl-CoA, das zu D-Methylmalonyl-CoA carboxyliert wird. Nach Epimerisierung in die L-Form wird es durch eine Mutase zu Succinyl-CoA umgelagert. c Verzweigte Fettsäuren werden über die a-Oxidation abgebaut. Anschließend wird die entstandene Fettsäure ohne Verzweigung an Cb über die b-Oxidation weiter abgebaut.

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C18-Linoleat weist eine cis-D9, cis-D12-Konfiguration auf. Nach drei Durchgängen der b-Oxidationssequenz sind drei Moleküle Acetyl-CoA und der Coenzym-A-Thioester einer ungesättigten C12-Fettsäure mit einer cis-D3- und einer cis-D6-Doppelbindung entstanden. Die cis-D3-Doppelbindung kann durch die Isomerase in die trans-Konfiguration überführt werden, nicht jedoch die cis-D6-Doppelbindung. Das entstandene 2,4-DienoylCoA wird daher zunächst von der 2,4-Dienoyl-CoA-Reductase reduziert, wobei eine cisD3-Doppelbindung entsteht, die durch die Enoyl-CoA-Isomerase zu einem trans-EnoylCoA isomerisiert wird. Bei der Oxidation ungeradzahliger Fettsäuren entstehen als Produkte der letzten Reaktionsfolge Acetyl-CoA und Propionyl-CoA (Abb. 7.24b). Propionyl-CoA wird in den Mitochondrien von Tieren, Pflanzen und in einigen Mikroorganismen durch die Propionyl-CoA-Carboxylase, die den Cofaktor Biotin enthält, unter ATP-Verbrauch zu D-Methylmalonyl-CoA carboxyliert. D-Methylmalonyl-CoA wird durch die Methylmalonyl-CoA-Epimerase zu L-Methylmalonyl-CoA epimerisiert und dann durch die Vitamin B12-abhängige Methylmalonyl-CoA-Mutase zu Succinyl-CoA umgelagert, das anschließend in den Citratzyklus eintreten kann. Diese Reaktion ist eine von zwei bei Säugern vorkommenden Reaktionen, die als Coenzym Vitamin B12 benötigen. Der Abbau verzweiger Fettsäuren erfolgt über die a-Oxidation (Abb. 7.24c), deren physiologische Bedeutung jedoch gering ist. Phytansäure, ein Abbauprodukt von Chlorophyll, kommt in Milchprodukten und tierischen Fetten vor und enthält Verzweigungen an ungeradzahligen C-Atomen (Cb), die die b-Oxidation blockieren. Bei der a-Oxidation wird das Cb-Atom hydroxyliert und die verzweigte Fettsäure anschließend oxidativ decarboxyliert. So wird das ursprüngliche Ca zur neuen Carboxylgruppe und es entsteht eine Fettsäure mit unsubstituiertem Cb, die über die b-Oxidation abgebaut werden kann. Die a-Oxidation kommt in keimenden Pflanzensamen, in grünen Blättern und in tierischen Geweben in der Mikrosomen-Fraktion vor. Beim Refsum-Syndrom, einer seltenen Erbkrankheit mit vorwiegend neurologischen Symptomen, ist der Phytansäureabbau durch einen Phytansäure-Oxidase-Mangel gestört. Bei Betroffenen enthalten Blutserum (10–20 % der Gesamtfettsäuren) und Organe (in der Leber bis i50 % der Gesamtfettsäuren) große Mengen an Phytansäure, die normalerweise nur in Spuren vorhanden ist. Durch eine strenge Diät ohne Gemüse, Obst und Butter sowie wenig tierische Fette können sich die Symptome zurückbilden.

Regulation der Fettsäureoxidation Eine im Cytosol aktivierte Fettsäure (Acyl-CoA) kann abhängig vom Energiezustand des Organismus entweder in den Mitochondrien über die b-Oxidation oxidiert oder im Cytosol als Baustein für die Biosynthese von Triacylglyceriden und Membranlipiden genutzt werden. Welcher Weg eingeschlagen wird, hängt von der Geschwindigkeit des Acyl-CoA-Transportes in die Mitochondrien ab, da alle einmal in die Mitochondrienmatrix transportierten Fettsäureester dort auch zu Acetyl-CoA oxidiert werden. Die entscheidende Regulation der b-Oxidation betrifft die Carnitin-Acyltransferase I (s. o.), die durch Malonyl-CoA, das erste Zwischenprodukt der Fettsäuresynthese (s. u.) im Cytosol, gehemmt wird. Die Malonyl-CoA-Konzentration steigt immer dann, wenn der Energiebedarf ausreichend durch Kohlenhydratabbau gedeckt werden kann und überschüssiges Acetyl-CoA zur Fettsäuresynthese verwendet wird. Die Hemmung der Carnitin-Acyltransferase I durch Malo-

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7.4 Der Lipidstoffwechsel

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nyl-CoA stellt sicher, dass die Oxidation von Fettsäuren verhindert wird, wenn in der Leber große Mengen Glucose als Brennstoff vorliegen. Zwei Enzyme der b-Oxidation werden durch ihre Stoffwechselprodukte reguliert: Wenn das NADH/NAD+-Verhältnis hoch ist, wird die b-Hydroxyacyl-CoADehydrogenase gehemmt, hohe Konzentrationen an Acetyl-CoA hemmen die Thiolase.

7.4.2

Die Fettsäurebiosynthese

Die Fettsäurebiosynthese geht von Acetyl-CoA aus und findet im Cytoplasma statt, bei photosynthetisch aktiven Pflanzenzellen im Chloroplastenstroma. Bei chemotrophen Eukaryoten stammt das Acetyl-CoA fast ausschließlich aus der oxidativen Decarboxylierung von Pyruvat in den Mitochondrien und aus dem Abbau von Aminosäuren. Da die innere Mitochondrienmembran für Acetyl-CoA undurchlässig ist, wird Acetyl-CoA über den Citrat-Pyruvat-Shuttle ins Cytosol transportiert (Abb. 7.25). Alle Reaktionen der Fettsäurebiosynthese werden durch die Fettsäure-Synthase katalysiert, die bei Prokaryoten und Chloroplasten aus sieben eng assoziierten einzelnen Enzymen besteht, in Eukaryoten liegt die

Abb. 7.25 Citrat-Pyruvat-Shuttle. In der Mitochondrienmatrix wird Acetyl-CoA mit Oxalacetat durch die Citrat-Synthase zu Citrat kondensiert, das anschließend über den CitratPyruvat-Shuttle ins Cytosol diffundiert. Dort wird Citrat unter ATP-Verbrauch von der ATPCitrat-Lyase in Oxalacetat und Acetyl-CoA gespalten, das nun für die Fettsäuresynthese zur Verfügung steht. Oxalacetat wird durch die NADH-abhängige Malat-Dehydrogenase zu Malat reduziert, das dann über den Malat-Shuttle (Abb. 7.18b) zurück in die Mitochondrienmatrix transportiert werden kann. Alternativ kann Malat auch im Cytosol durch das Malatenzym zu Pyruvat decarboxyliert werden, das dann über den Pyruvat/H+-Symporter in die Mitochondrienmatrix gelangt. Als Elektronenakzeptor der Malatenzym-Reaktion fungiert NADP+, sodass gleichzeitig Reduktionsäquivalente für die Fettsäurebiosynthese bereitgestellt werden. In der Mitochondrienmatrix wird Pyruvat wieder zu Oxalacetat carboxyliert.

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7 Stoffwechsel

Fettsäuresynthase als Multienzymkomplex vor. Bei Hefen sind sieben aktive Zentren auf zwei getrennten Polypeptiden angeordnet, bei Tieren bildet die Fettsäure-Synthase ein Homodimer, in dem beide Polypeptidketten jeweils alle Enzymaktivitäten enthalten. Die Reaktionsfolge ist jedoch bei allen Organismen identisch. Während des gesamten Syntheseprozesses bleiben die Zwischenprodukte kovalent an eine von zwei Thiolgruppen des Komplexes gebunden: die periphere SH-Gruppe der b-Ketoacyl-ACP-Synthase und die zentrale SH-Gruppe des Acyl-Carrier-Proteins (ACP), an dem die einzelnen Reaktionen ablaufen. Die grundlegende Reaktionssequenz der Fettsäuresynthese besteht aus vier Schritten (Abb. 7.26). Ausgangssubstrate sind Acetyl-CoA und Malonyl-CoA, das durch die biotinhaltige Acetyl-CoA-Carboxylase aus Acetyl-CoA und HCO3– gebildet wird. Acetyl-CoA + HCO3– + ATP p Malonyl-CoA + ADP + Pi + H+ Zu Beginn der Fettsäurebiosynthese werden die Acetylgruppe von Acetyl-CoA auf eine SH-Gruppe des kondensierenden Enzyms und die Malonylgruppe von Malonyl-CoA auf die SH-Gruppe am flexiblen Phosphopanthethein-Arm des ACP übertragen. Diese Reaktionen werden von der Acetyl-CoA-ACP-Transacetylase bzw. der Malonyl-CoA-ACP-Transferase katalysiert. Die anschließende Kondensation der an ACP gebundenen Acylreste wird von der b-Ketoacyl-Synthase (auch AcylMalonyl-ACP-kondensierendes Enzym) katalysiert und führt unter Freisetzung von CO2 zur Bildung von Acetacetyl-ACP. Die Decarboxylierung liefert die für die Kondensation notwendige Energie, dabei wird das in der Eingangsreaktion gebundene HCO3– wieder freigesetzt. Der an ACP gebundene Acetacetylrest wird nachfolgend reduziert, dehydratisiert und erneut reduziert. Als Reduktionsmittel dient dabei NADPH. Als Produkt dieser Reaktionen entsteht Butyryl-ACP. Nach Translokation des Butyrylrestes auf die SH-Gruppe der b-Ketoacyl-Synthase beginnt mit der Übertragung eines Malonylrestes auf die jetzt wieder freie SH-Gruppe des ACP und der anschließenden Kondensation mit dem Butyrylrest eine weitere Verlängerungsrunde. Wie im Coenzym A wird die Acylverbindung über den energiereichen Thioester an Pantethein aktiviert, sodass keine weitere Energiezufuhr erforderlich ist. Bei jedem Durchlauf der Reaktionsfolge wird die Kette um zwei Kohlenstoffatome verlängert. Sieben Kondensations- und Reduktionszyklen liefern die gesättigte C16-Palmitylgruppe, die noch an ACP gebunden ist. Im Allgemeinen stoppt die Kettenverlängerung an diesem Punkt und die Fettsäure wird durch eine Thioesterase, deren aktives Zentrum bei Tieren zum Protein des Fettsäure-Synthase-Komplexes gehört, freigesetzt. Kleine Mengen längerkettiger Fettsäuren, beispielsweise Stearat (18:0), werden ebenfalls gebildet. Die Gesamtreaktion zur Synthese von Palmitat aus Acetyl-CoA lautet: 8 Acetyl-CoA + 7 ATP + 14 NADPH + 14 H+ p Palmitat + 8 CoA + 6 H2O + 7 ADP + 7 Pi + 14 NADP+

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7.4 Der Lipidstoffwechsel

323

7

Abb. 7.26 Fettsäurebiosynthese. Die einleitende Reaktion der Fettsäuresynthese ist die biotinabhängige Carboxylierung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA. Malonyl-CoA wird anschließend auf die SH-Gruppe von ACP übertragen, ein weiteres Acetyl-CoA auf die SHGruppe des kondensierenden Enzyms (CE). Die Kondensation der beiden Acylreste zu Acetacetyl-ACP wird durch die Decarboxylierung des Malonylrestes energetisch angetrieben. Die folgenden drei Reaktionen, Reduktion, Dehydratisierung, erneute Reduktion, werden am ACP-gebundenen Acylrest durchgeführt, Elektronendonor ist NADPH. Als Produkt des ersten Durchlaufs entsteht Butyryl-ACP, das nach Translokation an das kondensierende Enzym in die nächste Verlängerungsrunde eintritt.

Palmitat ist die Vorstufe für andere langkettige Fettsäuren. Die weitere Verlängerung zu Stearat (18:0) oder noch längeren gesättigten Fettsäuren wird durch das Fettsäure-Verlängerungssystem durchgeführt, das bei Eukaryoten im glatten endoplasmatischen Retikulum und in den Mitochondrien lokalisiert ist. Trotz unterschiedlicher Enzymsysteme, und obwohl Coenzym A an Stelle von ACP

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324

7 Stoffwechsel

als Acyl-Carrier direkt an der Reaktion beteiligt ist, entspricht der Verlängerungsmechanismus ansonsten dem der Palmitatsynthese. Palmitat und Stearat dienen auch als Vorstufen für die beiden häufigsten einfach ungesättigten Fettsäuren in tierischen Geweben, Palmitoleat (16:1) und Oleat (18:1) mit je einer cis-Doppelbindung in D9-Position, die von der Fettsäure-Acyl-CoA-Desaturase eingeführt wird. Die Desaturase kann nur Doppelbindungen bis D9 einführen, daher können mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Linoleat, 18:2 (D9,12) und Linolenat, 18:3 (D9,12,15) von Säugern nicht de novo synthetisiert werden, wohl aber von Pflanzen und vielen Prokaryoten. Zweifach ungesättigte Fettsäuren sind für Säuger essentiell und müssen über die Nahrung aufgenommen werden. In eine vorhandene Linolsäure kann die Desaturase jedoch nach entsprechender Kettenverlängerung weitere Doppelbindungen einführen und so mehrfach ungesättigte Fettsäuren synthetisieren.

7

Die Regulation der Fettsäurebiosynthese Die Regulation der Fettsäurebiosynthese erfolgt über das Schrittmacherenzym Acetyl-CoA-Carboxylase. Palmityl-CoA, das Hauptprodukt der Fettsäurebiosynthese, wirkt als Rückkopplungsinhibitor des Enzyms. Wenn sich bei hoher Energieladung die Konzentration von Acetyl-CoA und ATP in den Mitochondrien erhöht, steigt auch die Citratkonzentration. Citrat wird ins Cytoplasma transportiert (Citrat-Pyruvat-Shuttle, S. 321), wo es als Vorstufe von cytosolischem Acetyl-CoA dient und bei Tieren als allosterischer Aktivator der Acetyl-CoA-Carboxylase wirkt. AMP als Indikator für eine niedrige Energieladung hemmt das Enzym. Bei Wirbeltieren hemmen die katabolen Hormone Glucagon und Adrenalin, die bei niedriger Blutglucosekonzentration ausgeschüttet werden ( Zoologie), das Enzym über eine Erhöhung des cAMP-Spiegels, Insulin wirkt aktivierend durch Senkung des cAMP-Spiegels. Auf Transkriptionsebene aktiviert Insulin die Fettsäurebiosynthese durch Induktion einer gesteigerten Synthese der Fettsäure-Synthase. Auch Enzyme, die Vorstufen für die Fettsäurebiosynthese liefern, werden in tierischen Organismen hormonell reguliert: PyruvatDehydrogenase und Citrat-Lyase, die beide Acetyl-CoA erzeugen, werden über eine Kaskade von Proteinphosphorylierungen durch Insulin aktiviert. Bei Pflanzen und Prokaryoten wird die Acetyl-CoA-Carboxylase nicht durch Citrat oder ein Phosphorylierungs-Dephosphorylierungs-System reguliert. Das Enyzm der Pflanzen wird nach Belichtung durch eine Erhöhung des pH-Wertes und der Mg2+-Konzentration sowie über das Thioredoxin-System durch Thiolreduktion im Chloroplastenstroma aktiviert ( Botanik). Prokaryoten verwenden als Energiespeicher vor allem Polyhydroxybutyrat oder Speicherpolysaccharide wie Glykogen und Stärke, sodass die Hauptfunktion der Fettsäurebiosynthese hier nicht die Synthese von Speicherlipiden, sondern die Bereitstellung von Vorstufen für Membranlipide ist. An der Regulation dieser komplexen Synthesen sind Guaninnucleotide wie ppGpp (Guanosin-3l,5l-Bispyrophosphat) beteiligt, die das Zellwachstum mit der Membransynthese koordinieren ( Mikrobiologie).

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7.4 Der Lipidstoffwechsel

7.4.3

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Die Biosynthese von Lipiden

Die meisten von einem Organismus synthetisierten oder mit der Nahrung aufgenommenen Fettsäuren werden in Lipide eingebaut, die bei Eukaryoten hauptsächlich an den Membranen des glatten ER synthetisiert werden. Die Enzyme der Phospholipidsynthese befinden sich auf der cytoplasmatischen Seite. Mithilfe von Phospholipid-Translokasen („Flippasen“, S. 362) werden die gebildeten Phospholipide anschließend auf die luminale Seite des ER transferiert. Daneben findet auch im Golgi-Apparat eine de novo Lipidsynthese statt, die jedoch nur ca. 1 % der gebildeten Lipidmenge ausmacht. Cardiolipin und Phosphatidylglycerol kommen in eukaryotischen Zellen ausschließlich in der inneren Mitochondrienmembran vor und werden auch in den Mitochondrien gebildet. Auch Plastiden sind zur Synthese bestimmter Lipide in der Lage. Bei Prokaryoten findet die Lipidsynthese an der Cytoplasmamembran statt. Die Biosynthese der Glycerolipide geht in Eukarya und Bacteria von Acyl-CoA und sn-Glycerin-3-phosphat aus (Abb. 7.27). sn-Glycerin-3-phosphat entsteht in der Regel durch die Reduktion von Dihydroxyacetonphosphat, bei Säugern in

Abb. 7.27 Glycerolipidsynthese. Dihydroxyacetonphosphat wird in Eukarya und Bacteria durch die sn-Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase zu sn-Glycerin-3-phosphat reduziert, Elektronendonor ist NADH. Nacheinander übertragen Acyltransferasen die Fettsäurereste aus Acyl-CoA auf C1 und C2 von sn-Glycerin-3-phosphat. Dabei entsteht Phosphatidat, ein zentrales Zwischenprodukt der Lipidsynthese. Für die Synthese eines Triacylglycerids wird anschließend die Phosphatgruppe am C3 abgespalten und durch einen weiteren Fettsäurerest ersetzt. Phospholipide werden ausgehend von Phosphatidat in Eukaryoten und Prokaryoten auf unterschiedlichen Wegen synthetisiert (Abb. 7.28). In Archaea wird die Eingangsreaktion von der sn-Glycerin-1-phosphat-Dehydrogenase katalysiert, das Produkt ist dementsprechend sn-Glycerin-1-phosphat, das Stereoisomer von sn-Glycerin-3-phosphat.

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7 Stoffwechsel

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7.4 Der Lipidstoffwechsel

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7

Abb. 7.28 Phospholipidsynthese. a Bei Prokaryoten wird Phosphatidat durch Übertragung eines Cytidyl-Restes (CMP) von CTP auf die Phosphorylgruppe unter Abspaltung von PPi aktiviert. Durch Austausch des Cytidylrestes gegen Serin oder Glycerin-3-phosphat entstehen Phosphatidylserin bzw. 3-Phosphatidylglycerin-1-phosphat, aus dem durch Dephosphorylierung Phosphatidylglycerin gebildet wird. Durch Kondensation von zwei Molekülen Phosphatidylglycerin entsteht unter Abspaltung von Glycerin Cardiolipin. Phosphatidylserin kommt bei E. coli nur in geringen Mengen vor, da es sofort zu Phosphatidylethanolamin decarboxyliert wird. b Bei Eukaryoten erfolgt die Synthese von Phosphatidylinositol und Cardiolipin durch Aktivierung von Phosphatidat durch CTP und den nachfolgenden Austausch des Cytidylrestes gegen Inositol bzw. Phosphatidylglycerin. Die Synthese von Phosphatidylcholin (auch: Lecithin), Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin geht ebenfalls von Phosphatidat aus, das jedoch im ersten Schritt zu Diacylglycerin dephosphoryliert wird. Diacylglycerin reagiert dann mit der durch CTP aktivierten Kopfgruppe, CDP-Cholin bzw. CDP-Ethanolamin. Unter Abspaltung von CMP entsteht Phosphatidylcholin bzw. Phosphatidylethanolamin. Aus beiden kann durch Austausch der Kopfgruppe gegen Serin Phosphatidylserin gebildet werden. Vor allem in der Leber wird Phosphatidylcholin durch Methylierung aus Phosphatidylethanolamin gebildet.

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7 Stoffwechsel

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Abb. 7.29 Sphingolipidsynthese. Im ersten Schritt kondensieren in einer Pyridoxalphosphat-abhängigen Reaktion Palmityl-CoA und Serin zu 3-Dehydrosphinganin, das zu Sphinganin reduziert wird. Durch Acylierung der Aminogruppe und anschließende Desaturierung entsteht das zentrale Zwischenprodukt Ceramid, aus dem die verschiedenen Sphingolipide gebildet werden: Durch Übertragung von Phosphorylcholin aus Phosphatidylcholin entsteht Sphingomyelin, Cerebroside tragen einen Glucose- oder einen Galactoserest, der aus UDP-Glucose bzw. UDP-Galactose stammt, in Gangliosiden ist ein Oligosaccharid über einen Glucoserest an Ceramid gebunden. Die Zuckerreste werden im GolgiApparat von Glykosyltransferasen auf Ceramid übertragen. Sphingolipide werden in Lysosomen durch Abspaltung der Substituenten zu Ceramid abgebaut, das dann unter Freisetzung einer Fettsäure zu Sphingosin hydrolysiert wird. Sphingosin wird anschließend weiter abgebaut.

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7.4 Der Lipidstoffwechsel

329

geringerer Menge auch aus Glycerin durch die in Leber, Nieren, Darmschleimhaut und Milchdrüsen vorhandene Glycerinkinase. Nach Veresterung der beiden freien Hydroxylgruppen mit Fettsäureresten entsteht Phosphatidat, von dem aus Triacylglyceride und Glycerophospholipide synthetisiert werden. In Glyceroglykolipiden sind ein oder mehrere Zucker entweder O-glykosidisch an Glycerin gebunden oder mit dem Phosphatrest verestert. Die Synthese von Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin verläuft bei Prokaryoten über eine Aktivierung des Glycerinrestes von Phosphatidat (Abb. 7.28a), während bei Eukaryoten für deren Synthese die einzubringende Kopfgruppe aktiviert wird (Abb. 7.28b). Neben der Neusynthese ist auch ein Umbau vorhandener Lipide möglich. Einen Überblick über die Synthese der Sphingolipide gibt Abb. 7.29. Ausgangssubstrat der Cholesterin-Biosynthese (S. 112) ist Acetyl-CoA, das alle 27 Kohlenstoffatome des Cholesterins liefert. Über Mevalonat und Isopentenylpyrophosphat (IPP, aktives Isopren) wird der C30-Körper Squalen aufgebaut. Unter Mitwirkung einer Monooxygenase zyklisiert Squalen zu Lanosterin, aus dem letztlich Cholesterin entsteht. Cholesterin konnte wegen der Sauerstoffabhängigkeit seiner Synthese erst unter einer aeroben Erdatmosphäre entstehen. Daher besitzen fast nur Eukaryoten Cholesterin, Prokaryoten die strukturähnlichen Hopanoide ( Mikrobiologie), bei deren Synthese kein Sauerstoff-abhängiger Schritt erfolgt.

Lipide: Ester der Alkohole Glycerin oder Sphingosin mit langkettigen Fettsäuren. Funktion als Speicherstoffe oder Membrankomponenten. Einfache und komplexe Lipide, Tepenoide. – Einfache Lipide: Triacylglyceride und Wachse, Funktion als Energiespeicher. – Komplexe Lipide: Membranbildende Lipide, besitzen eine hydrophile Kopfgruppe und ein hydrophobes Ende. Phospholipide und Glykolipide. Isoprenoide (Terpenoide): Besitzen Grundgerüst aus Isopreneinheiten, Synthese geht von Acetyl-CoA aus. Steroide, Hopanoide und Carotinoide. Lipidsynthese: Ausgangssubstrate sind Dihydroxyacetonphosphat und Acyl-CoA. Zentrales Zwischenprodukt ist Phosphatidat. Die Synthese der Phospho- und Glykolipide erfolgt durch Aktivierung von Phosphatidat oder der einzubringenden Kopfgruppe mit CTP. Carnitin-Shuttle: Transportsystem für Acyl-CoA vom Cytosol in die Mitochondrienmatrix: Übertragung des Acylrestes auf Carnitin durch die Carnitin-Acyltransferase I im Cytosol, Antiport gegen unbeladenes Carnitin, Übertragung des Acylrestes auf mitochondriales Coenzym A.

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7

7 Stoffwechsel

b-Oxidation: Kataboler Stoffwechselweg in der Mitochondrienmatrix (Eukaryoten) und in Glyoxysomen (pflanzliche Zellen) bzw. im Cytoplasma (Prokaryoten). Funktion: Abbau von Fettsäuren zu Acetyl-CoA, Erzeugung von Reduktionsäquivalenten. Aktivierung der Fettsäure zu Acyl-CoA unter ATP-Verbrauch. Oxidative Entfernung von C2-Einheiten als Acetyl-CoA vom Carboxylende der Fettsäure durch hintereinander geschaltete Oxidation, Hydratisierung, Oxidation und Thiolyse. Regulation: Produkthemmung der beiden letzten Enzyme der Reaktionsfolge durch NADH bzw. Acetyl-CoA, Hemmung der Carnitin-Acyltransferase I durch Malonyl-CoA. Fettsäurebiosynthese: Anaboler Stoffwechselweg im Cytoplasma von Eukaryoten und Prokaryoten. Fettsäure-Synthase: bei Prokaryoten, Chloroplasten aus sieben Untereinheiten, bei Pilzen und Tieren Multienzymkomplex. Funktion: Synthese langkettiger Fettsäuren (bis C16) aus Acetyl-CoA unter Verbrauch von NADPH. Eingangsreaktion: Carboxylierung (Biotin-Enzym) von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA unter ATP-Verbrauch. Übertragung der Acylreste von Acetyl-CoA und MalonylCoA auf ACP. Verlängerungszyklus besteht aus Kondensation, Reduktion, Dehydratisierung und Reduktion. Regulation: Schrittmacherreaktion ist die Carboxylierung von Acetyl-CoA.

7.5

Der Stickstoffstoffwechsel

Molekularer Stickstoff (N2) kann nur von Prokaryoten direkt als Stickstoffquelle genutzt werden, die den Nitrogenase-Komplex besitzen. Viele andere Prokaryoten und Pflanzen reduzieren Nitrat mithilfe löslicher Reductasen zu Ammonium, Tiere sind auf Ammonium als anorganische Stickstoffquelle oder reduzierte organische Stickstoffverbindungen angewiesen. Ausgehend von Ammonium wird mithilfe spezifischer Enzyme aus a-Ketoglutarat Glutamat synthetisiert, das als Aminogruppendonor für viele Biosynthesen fungiert. Die Aminosäuresynthese geht von Intermediaten der zentralen Stoffwechselwege aus, die Aminogruppe wird meist über Transaminasen aus Glutamat eingeführt. Der Abbau von Aminosäuren erfolgt durch Desaminierung und Einschleusung der Kohlenstoffskelette in die katabolen Abbauwege. Nucleotide werden über Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP) synthetisiert, als Aminogruppendonor dient hier Glutamin. Die Ausscheidung von toxischem Ammoniak (NH3) erfolgt bei Tieren entweder direkt (ammonotelisch), in Form von Harnsäure (uricotelisch) oder Harnstoff (ureotelisch). Der Harnstoffzyklus läuft bei Säugern in der Leber teils im Cytoplasma und teils in der Mitochondrienmatrix ab. Molekularer Stickstoff (N2) stellt mit ca. 80 % der Erdatmosphäre die größte Stickstoffquelle für lebende Organismen dar, allerdings muss N2 für Biosynthesen auf die Stufe von NH4+ reduziert werden. Die Fähigkeit zur Stickstofffixierung ist auf

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7.5 Der Stickstoffstoffwechsel

331

bestimmte frei lebende und symbiontische Prokaryonten beschränkt und erfordert wegen der äußerst stabilen Bindung zwischen den beiden Stickstoffatomen ein spezielles Enzym, den Nitrogenase-Komplex ( Mikrobiologie). Der Nitrogenase-Komplex, der einen Eisen-Molybdän-Cofaktor enthält, ist sehr Sauerstoffempfindlich und wird daher in aeroben Stickstofffixierern durch Kompartimentierung (Heterocysten) oder durch hohe O2-Respirationsraten geschützt. In Leguminosen-Wurzelknöllchen schützt von der Pflanze synthetisiertes Leghämoglobin, ein O2 bindendes eisenhaltiges Protein, die Nitrogenase der symbiontischen Stickstofffixierer. In der Landwirtschaft wird die symbiontische Stickstoff-Fixierung genutzt, um durch Vorkulturen von Leguminosen die Stickstoffversorgung der nachfolgenden Kulturpflanzen zu sichern (Gründüngung). Die N2-Fixierung durch Prokaryoten, die Oxidation von Ammoniak zu Nitrat durch bestimmte Bodenbakterien (Nitrifizierung), die Umsetzung von Nitrat zu Ammoniak durch Pflanzen und Prokaryoten, die Synthese von Aminosäuren durch Pflanzen, Tiere und Prokaryoten sowie die Umwandlung von Nitrat in N2 durch bestimmte Bodenbakterien (Denitrifikation) bilden zusammen den Stickstoffkreislauf ( Mikrobiologie).

7.5.1

Stickstoff-Assimilation

Für den Einbau in organische Verbindungen wird Nitrat (NO3–) in Pflanzen und Prokaryoten zu Ammonium (NH4+) reduziert (assimilatorische Nitratreduktion). Im ersten Schritt wird NO3– durch die Nitrat-Reductase mit NADH als Elektronendonor zu Nitrit (NO2–) reduziert. Anschließend wird NO2– unter ATP-Verbrauch durch die Nitrit-Reductase zu NH4+ reduziert. Bei Pflanzen findet dieser Schritt im Chloroplastenstroma statt, wo das Enzym eng mit dem Photosyntheseapparat verbunden ist. Elektronendonor ist reduziertes Ferredoxin aus dem linearen Elektronentransport der Photosynthese (S. 342 und Botanik). Tiere sind auf Ammonium als anorganische Stickstoffquelle angewiesen oder nehmen bereits reduzierte organische Stickstoffverbindungen wie Aminosäuren oder Nucleotide auf. Die dissimilatorische Nitratreduktion, deren Enzyme membrangebunden sind, dient der Energiekonservierung und ist auf Prokaryoten beschränkt (NitratMikrobiologie), die Reaktionsprodukte werden ausgeschieden. atmung,

7.5.2

Aminosäuresynthese

Abhängig von der NH4+-Konzentration wird reduzierter Stickstoff mithilfe unterschiedlicher Enzyme in organische Moleküle eingebaut. Der erste Akzeptor für anorganischen reduzierten Stickstoff ist häufig a-Ketoglutarat: Durch die von der Glutamat-Dehydrogenase katalysierte Reduktion mit NAD(P)H, bei der gleichzeitig die Ketogruppe durch eine Aminogruppe ersetzt wird, entsteht Glutamat (Abb. 7.30a). a-Ketoglutarat + NAD(P)H + H+ + NH4+ m Glutamat + NAD(P)+

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7 Stoffwechsel

In Lebermitochondrien wird über diese Reaktion toxischer Ammoniak beseitigt und gleichzeitig Glutamat synthetisiert. Fast alle anderen Aminosäuren können durch Transaminierung (Abb. 7.30b) gebildet werden, wenn die korrespondierende a-Ketosäure verfügbar ist, wobei Glutamat den Aminogruppenpool für a-Aminogruppen bereitstellt. Aminotransferasen (Transaminasen), deren prosthetische Gruppe Pyridoxalphosphat (Vitamin B6) ist, übertragen die Aminogruppe auf die entsprechende a-Ketosäure, beispielsweise entsteht aus Oxalacetat Aspartat und aus Pyruvat Alanin. Die allgemeine Reaktion lautet: Glutamat + a-Ketosäure p a-Ketoglutarat + Aminosäure

7

Abb. 7.30 Wichtige Enzyme für die Aminosäuresynthese. a Bei hoher NH4+-Konzentration überträgt die Glutamat-Dehydrogenase Ammonium (NH4+) auf a-Ketoglutarat. b Transaminierung einer a-Ketosäure (Oxalacetat) durch eine Transaminase, Aminogruppendonor ist Glutamat. Es entsteht eine Aminosäure (Aspartat) und a-Ketoglutarat als Aminogruppenakzeptor der Glutamat-Dehydrogenase-Reaktion wird regeneriert. c Bei niedriger NH4+-Konzentration überträgt die ATP-abhängige Glutamin-Synthetase NH4+ auf Glutamat, Produkt ist Glutamin. d Die Glutamat-Synthase überträgt die Amidgruppe von Glutamin die auf a-Ketoglutarat, dabei entstehen zwei Glutamat.

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7.5 Der Stickstoffstoffwechsel

333

Alternativ können Transaminasen auch die Aminogruppe von Alanin auf eine a-Ketosäure übertragen. Da der KM-Wert der Glutamat-Dehydrogenase für NH4+ relativ hoch ist, besitzen die meisten Organismen einen alternativen Assimilationsweg für sehr niedrige Ammoniumkonzentrationen. Unter ATP-Verbrauch kann Glutamat durch die Glutamin-Synthetase, die einen niedrigen KM-Wert und damit eine hohe Affinität für NH4+ hat, zu Glutamin amidiert werden (Abb. 7.30c): Glutamat + ATP + NH4+ p Glutamin + ADP + Pi Die Glutamin-Synthetase ist ein regulatorisches Enzym, das im Stickstoffmetabolismus eine Schlüsselstellung einnimmt und Ziel des Kontaktherbizids Phosphinotricin (PPT, Markenname: Basta) ist ( Botanik). Die Übertragung der Amidgruppe von Glutamin auf a-Ketoglutarat katalysiert in Chloroplasten und vielen Prokaryoten die Glutamat-Synthase (früher GOGAT: Glutamin-OxoGlutarat-Amino-Transferase) (Abb. 7.30d): a-Ketoglutarat + Glutamin + NAD(P)H + H+ p 2 Glutamat + NAD(P)+ Durch die aufeinander folgenden Reaktionen von Glutamin-Synthetase und Glutamat-Synthase kann auch bei sehr niedrigen NH4+-Konzentrationen ausreichend Glutamat als Aminogruppendonor synthetisiert werden. Die Nettoreaktion, die typisch ist für die Weiterleitung des reduzierten Stickstoffs bei der symbiontischen Stickstofffixierung in Wurzelknöllchen, ist irreversibel und lautet: a-Ketoglutarat + ATP + NH4++ NAD(P)H+H+ p Glutamat + ADP + Pi + NAD(P)+ Die Kohlenstoffskelette der Aminosäuren leiten sich von Zwischenprodukten der Glykolyse, des Citratzyklus oder des Pentosephosphatweges ab. Aminosäuren, deren Biosynthesewege von einem gemeinsamen Startpunkt ausgehen, werden als Familien zusammengefasst (Abb. 7.31). Essentielle Aminosäuren, die der Mensch nicht selbst herstellen kann, sind die verzweigten Aminosäuren Valin, Leucin und Isoleucin, die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin und Tryptophan sowie Lysin, Methionin, Histidin und Threonin. Sie werden jedoch von Pflanzen und Bakterien synthetisiert und können daher aus der Nahrung oder nach Synthese durch Darmbakterien aufgenommen werden. Während Glutamat bei den meisten Aminosäure-Biosynthesen als Aminogruppendonor fungiert, liefert Glutamin häufig Aminogruppen für andere stickstoffhaltige Moleküle, z. B. für Purine.

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7 Stoffwechsel

7

Abb. 7.31 Die Kohlenstoffskelette der Aminosäuren leiten sich von Zwischenprodukten der Glykolyse, des Pentosephosphatweges und des Citratzyklus ab. Ausgehend von den Aminosäuren werden zahlreiche wichtige Biomoleküle synthetisiert. Zum Abbau werden die Aminosäuren durch Transaminasen desaminiert und die Kohlenstoffgerüste über Intermediate des Citratzyklus abgebaut. In Tieren erfolgt der Aminosäureabbau vorwiegend in den Mitochondrien der Leber.

7.5.3

Nucleotidsynthese

Nucleotide (S. 105) bestehen aus einer Base (Purin oder Pyrimidin) und einem phosphorylierten C5-Zucker (Ribose oder Desoxyribose) und sind in Nucleinsäuren ( Genetik), Vitaminen, Coenzymen und in energiereichen Verbindungen wie ATP enthalten. Purine sind Adenin und Guanin, Pyrimidine Thymin, Cytosin und Uracil. Bei der Synthese von Purin- und Pyrimidinnucleotiden fungiert Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP), ein Ribosemolekül, das insgesamt drei Phosphatgruppen trägt, als Überträger der Ribosephosphat-Einheit ( Mikrobiologie). Die Synthese des heterozyklischen Purinringsystems erfolgt schrittweise am bereits gebundenen Ribosephosphat. Dabei werden Formylgruppen durch Tetrahydrofolsäure (THF) und Aminogruppen von Aminosäuren übertragen, Glycin liefert in einem Schritt zwei Kohlenstoffatome und ein Stickstoffatom, ein Kohlenstoffatom stammt aus CO2. Aus dem gebildeten Inositolmonophosphat (IMP) entstehen AMP und GMP.

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7.5 Der Stickstoffstoffwechsel

335

Bei der Pyrimidinsynthese wird zuerst aus Carbamoylphosphat und Aspartat das freie Pyrimidin Orotat gebildet, das anschließend mit PRPP zum Pyrimidinnucleotid Orotidylat reagiert. Durch weitere Modifikationen entstehen daraus Uracil, Cytosin und Thymin.

7.5.4

Aminosäureabbau

Synthese und Abbau der Aminosäuren werden von den gleichen Enzymen katalysiert, die durch allosterische Effektoren entgegengesetzt reguliert werden. Bei den meisten Aminosäuren wird die a-Aminogruppe durch Aminotransferasen auf a-Ketoglutarat übertragen und das entstehende Glutamat anschließend durch die Glutamat-Dehydrogenase oxidativ desaminiert. Die Gesamtreaktion lautet: a-Aminosäure + NAD+ + H2O m a-Ketosäure + NH4+ + NADH + H+

Glucogene Aminosäuren, aus denen über die Gluconeogenese Glucose gebildet werden kann, werden zu Pyruvat oder Zwischenprodukten des Citratzyklus abgebaut. Ketogene Aminosäuren werden zu Acetyl-CoA oder Acetacetyl-CoA abgebaut. Wegen des fehlenden Glyoxylatzyklus können sie in Tieren nicht zu Glucose umgesetzt werden. Aminosäuren, die am b-Kohlenstoff eine Hydroxylgruppe tragen (Serin, Threonin), werden durch spezielle Dehydratasen direkt zu der entsprechenden a-Ketosäure und NH4+ desaminiert, beispielsweise entstehen aus Serin Pyruvat und NH4+. Anschließend werden die Kohlenstoffskelette der Aminosäuren in Pyruvat, Acetacetyl-CoA, Acetyl-CoA, a-Ketoglutarat, Succinyl-CoA, Fumarat oder Oxalacetat überführt und über den Citratzyklus oxidiert. Alternativ können die gebildeten a-Ketosäuren zu Aldehyden decarboxyliert und diese anschließend zu Fettsäuren oxidiert werden. Die verzweigten Aminosäuren Leucin, Isoleucin und Valin werden beim Menschen in den extrahepatischen Geweben abgebaut. Für den Abbau ihrer Kohlenstoffgerüste sind, ebenso wie für die der aromatischen Aminosäuren, einige spezifische Enzyme erforderlich. Stoffwechselkrankheiten wie Phenylketonurie oder die Ahornsirupkrankheit werden durch mutierte Gene für Enzyme des Abbaus von Phenylalanin bzw. von verzweigten Aminosäuren verursacht. Durch Aminosäure-Decarboxylasen, die meist spezifisch das L-Stereoisomer einer Aminosäure decarboxylieren, entstehen biogene Amine, z. B. Methylamin aus Glycin: H2N-CH2-COOH p H2N-CH3 + CO2 Viele Amine haben starke pharmakologische Wirkungen, andere sind Vorstufen von Hormonen oder Bausteine von Coenzymen und anderen wichtigen Biomolekülen. Cadaverin (aus Lysin) und Putrescin (aus Ornithin) wurden in den Ribosomen nachgewiesen. Samenflüssigkeit, Ribosomen und manche Viren enthalten Spermidin und Spermin, die aus Putrescin durch Alkylierung mit Aminopropyl-Gruppen entstehen. Durch Decarboxylierung von Serin entsteht Ethanolamin (Colamin), ein Bestandteil der Phospholipide.

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7

336

7 Stoffwechsel

Cysteamin, das aus Cystein entsteht, ist Träger der reaktiven SH-Gruppe von Coenzym A. Im Pantothensäure-Anteil von Coenzym A ist b-Alanin (aus Aspartat) enthalten und in Vitamin B12 Aminopropanol (aus Threonin). g-Aminobuttersäure (GABA) aus Glutaminsäure spielt eine Rolle als Neurotransmitter in Vertebraten, Crustaceen und Insekten. Histamin aus Histidin wirkt als Vasodilator und spielt eine Rolle bei Allergien. Serotonin aus Tryptophan sowie Adrenalin und Noradrenalin, die sich von Tyrosin ableiten, wirken als Neurotransmitter.

7.5.5

7

Ausscheidung von Stickstoff

Als starkes Zellgift wird das beim Aminosäureabbau freigesetzte Ammoniak sofort ausgeschieden. Wasserlebende ammonotelische Tiere (Knochenfische, Kaulquappen) scheiden Ammoniak direkt über ihre Kiemen aus. Ureotelische Tiere (Selachier, Säuger, terrestrische Amphibien, einige Schildkröten) scheiden über die Niere nicht toxischen Harnstoff aus, der leicht durch biologische Membranen diffundieren kann. Harnstoff wird im Harnstoffzyklus ( Zoologie) in der Leber über fünf Reaktionen gebildet, von denen zwei in der Mitochondrienmatrix und drei im Cytosol ablaufen (Abb. 7.32). Dabei werden zwei Stickstoffatome in Harnstoff fixiert. Die Gesamtreaktion der Harnstoffsynthese nach der Gleichung CO2 + NH4+ + 3 ATP + Aspartat + 2H2O p H4N2CO + 2 ADP + AMP +PPi + Fumarat ist stark endergon und erfordert die Spaltung von vier energiereichen Bindungen. Durch die Hydrolyse des gebildeten PPi wird das Gleichgewicht in Richtung der Harnstoffsynthese verlagert und die Reaktion irreversibel. Neben seiner Funktion als Aminogruppendonor für Biosynthesen (s. o.) ist Glutamin auch eine Transportform für Ammoniak im Organismus. In der Niere wird Glutamin durch die Glutaminase zu Glutamat und NH4+ hydrolysiert. Die Ammonium-Salze des Harns entstehen zum erheblichen Teil durch diese Reaktion. Abb. 7.32 Der Harnstoffzyklus. In der Mitochondrienmatrix katalysiert die Carbamoyl- n phosphat-Synthetase I die Bildung von Carbamoylphosphat aus NH4+ (aus Glutamat), CO2 und ATP. Die Carbamoylphosphat-Synthetase I ist das Schrittmacherenzym des Harnstoffzyklus und wird durch N-Acetyl-Glutamat aktiviert, das bei hoher Glutamatkonzentration von der Acetyl-Glutamat-Synthase aus Glutamat und Acetyl-CoA gebildet wird. Im zweiten Schritt überträgt die Ornithin-Carbamoyl-Transferase die Carbamoylgruppe auf Ornithin, dabei entsteht Citrullin, das ins Cytosol transportiert wird. Im Cytosol wird Citrullin unter ATP-Verbrauch von der Argininosuccinat-Synthetase mit Aspartat zu Argininosuccinat kondensiert, dabei entstehen AMP und PPi, das sofort hydrolysiert wird. Argininosuccinat wird von der Argininosuccinat-Lyase in Arginin und Fumarat gespalten. Aus Fumarat wird, entsprechend den Reaktionen des Citratzyklus, über Malat und Oxalacetat Aspartat regeneriert. Arginin kann in Proteine eingebaut werden und ist Ausgangspunkt für die Synthese von Stickstoffmonoxid (NO) und Kreatin. Wenn der Arginin-Bedarf dieser Biosynthesen abgedeckt ist, wird Arginin im letzten Schritt des Harnstoffzyklus durch die Arginase zu Harnstoff und Ornithin hydrolysiert. Während der Harnstoff, in dem zwei NH4+ gebunden sind, ausgeschieden wird, gelangt Ornithin zurück in die Mitochondrienmatrix und steht dort für die nächste Runde des Zyklus zur Verfügung.

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7.5 Der Stickstoffstoffwechsel

337

Uricotelische Tiere (Insekten, Vögel und Reptilien) synthetisieren aus überschüssigem Aminostickstoff Purine, die sie zu Harnsäure (Urat) abbauen. Harnsäure ist kaum wasserlöslich und wird daher fast ohne Wasserverlust in kristalliner Form ausgeschieden. Auch beim Menschen entsteht beim Purinabbau Harnsäure, die normalerweise mit dem Urin ausgeschieden wird. Eine Überpro-

7

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338

7 Stoffwechsel

duktion von Harnsäure bei bestimmten Stoffwechselstörungen, z. B. Gicht, verursacht durch die Auskristallisation starke Schmerzen.

7

Stickstofffixierung: Reduktion von molekularem Stickstoff (N2) zu NH4+. Vorkommen ausschließlich in einigen Prokaryoten. Nitrogenase: Sauerstoff-empfindlicher Enzym-Komplex in N2-fixierenden Prokaryoten. Enthält Eisen-Molybdän-Cofaktor. Stickstoff-Assimilation: Reduktion von NO3– zu NO2– und NO2– zu NH4+ mithilfe von Nitrat- bzw. Nitrit-Reductasen in Pflanzen und Prokaryoten und Einbau in organische Verbindungen. Aminosäuresynthese: Anaboler Stoffwechselweg. Aminosäurefamilien leiten sich von gemeinsamen Vorläufern ab, Vorläufer sind Zwischenprodukte der Glykolyse, des Citratzyklus und des Pentosephosphatzyklus, die Aminogruppe stammt aus NH4+ oder wird von Transaminasen übertragen. Glutamat-Dehydrogenase: Katalysiert die NAD(P)H-abhängige reversible Synthese von Glutamat aus a-Ketoglutarat und NH4+ bei hoher .NH4+-Konzentration. (Amino)transaminasen: Katalysieren die Übertragung der Aminogruppe von Glutamat oder Alanin auf eine a-Ketosäure. Glutamin-Synthetase: Katalysiert die ATP-abhängige Synthese von Glutamin aus Glutamat und NH4+ bei niedriger NH4+-Konzentration. Glutamat-Synthase: Katalysiert die NADPH-abhängige Synthese von zwei Glutamat aus a-Ketoglutarat und Glutamin, Synonym: GOGAT (Glutamin-2-Oxo-Glutarat-Amino-Transferase). Nucleotide: Bestehen aus einer Pentose (Ribose oder Desoxyribose), einer Purinoder Pyrimidinbase und einem Phosphatrest, Synthese verläuft über PRPP. Purine: Adenin und Guanin, Pyrimidine: Cytosin, Thymin und Uracil. Essentielle Aminosäuren: Aminosäuren, die ein Organismus nicht selbst synthetisieren kann und die von außen aufgenommen werden müssen. Aminosäureabbau: Kataboler Stoffwechselweg, Umkehr der Biosynthesereaktionen. Übertragung der a-Aminogruppe auf a-Ketoglutarat durch Transaminasen. Desaminierung des entstandenen Glutamates durch die Glutamat-Dehydrogenase. Einschleusung der Kohlenstoffskelette in vorhandene Abbauwege. Glucogene Aminosäuren: Werden zu Pyruvat oder Zwischenstufen des Citratzyklus abgebaut. können in Glucose umgewandelt werden. Ketogene Aminosäuren: Werden zu Ketonkörpern (Acetyl-CoA, Acetacetyl-CoA) abgebaut. Können in Tieren wegen des fehlenden Glyoxylatzyklus nicht in Glucose umgewandelt werden. Stickstoffausscheidung bei Tieren: In Form von Ammoniak durch ammonotelische Tiere, als Harnsäure durch uricotelische Tiere, als Harnstoff durch ureotelische Tiere. Harnstoffzyklus: Energie verbrauchende Synthese von Harnstoff im Cytosol und in der Mitochondrienmatrix der Leber, Funktion: Entfernung von toxischem NH4+, Zwischenprodukt Arginin dient auch als Biosynthesevorstufe.

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7.6 Die Photosynthese

7.6

339

Die Photosynthese

Pflanzen und phototrophe Prokaryoten konservieren in der Photosynthese mithilfe von Pigmenten ([Bakterio]chlorophylle, Carotinoide, Phycobiline) in ihren photosynthetischen Membranen die Energie des Sonnenlichts und nutzen sie für Energie verbrauchende Prozesse. Ein durch Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregtes (Bakterio)chlorophyll im Reaktionszentrum des Photosystems überträgt ein Elektron über eine membrangebundene Elektronentransportkette auf einen Elektronenakzeptor. Beim zyklischen Elektronentransport kehrt das Elektron zum Reaktionszentrum zurück, beim linearen wird es auf NAD(P)+ übertragen. Durch die gleichzeitige Translokation von Protonen wird eine protonenmotorische Kraft erzeugt, die eine membrangebundene ATP-Synthase antreibt (Photophosphorylierung). Phototrophe Prokaryoten enthalten mit Ausnahme der Cyanobacteria nur ein Photosystem mit einem Typ I-(FeS)-Reaktionszentrum bei Grünen Schwefelbakterien und Heliobacteria und einem Typ II-(Chinon)-Reaktionszentrum bei Schwefelfreien Grünen Bakterien und Purpurbakterien. Ihr Elektronentransport ist vorwiegend zyklisch, für die Reduktion von NAD(P)+ abgezogene Elektronen werden aus einem organischen oder anorganischen externen Elektronendonor ersetzt, jedoch nie aus Wasser, daher ist ihre Photosynthese anoxygen. In Chloroplasten und Cyanobacteria sind zwei Photosysteme mit einem Typ IIbzw. einem Typ I-Reaktionszentrum hintereinander geschaltet, der Elektronentransport verläuft linear auf NAD(P)+. Als externer Elektronendonor fungiert Wasser, bei dessen Oxidation molekularer Sauerstoff gebildet wird; die Photosynthese ist oxygen. Bei autotrophem Wachstum fixieren Pflanzen und die meisten phototrophen Prokaryoten CO2 über den Calvin-Zyklus. Phototrophe Organismen (Pflanzen und phototrophe Prokaryoten) nutzen in der Photosynthese ( Botanik und Mikrobiologie) die Energie des Sonnenlichtes zum Aufbau ihrer Biomasse aus anorganischen Verbindungen. Die Photosynthese besteht aus zwei Abschnitten: In der Lichtreaktion, an der ein oder zwei Photosysteme beteiligt sind, werden Reduktionsäquivalente und ATP gebildet und für die Synthese von organischen Verbindungen aus CO2 in der lichtunabhängigen Dunkelreaktion (s. u.) bereitgestellt. Pigmente in den Membranen von Chloroplasten und photosynthetischen Bakterien werden durch die Absorption von Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt. Zur optimalen Lichtausnutzung wird das absorbierte Licht über ein Antennensystem aus proteingebundenen Pigmenten an das eigentliche Reaktionszentrum weitergegeben. Bei Typ I (Fe-S)-Reaktionszentren ist der erste stabile Elektronenakzeptor ein EisenSchwefel-Zentrum, bei Typ II (Chinon)-Reaktionszentren ein proteingebundenes Chinon. Durch die Anregung sinkt das Redoxpotential des zentralen Pigmentes stark ab, sodass es ein Elektron an eine benachbarte prosthetische Gruppe im

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340

7

7 Stoffwechsel

Reaktionszentrum abgibt. Über eine Kette von Elektronencarriern wird das abgegebene Elektron in Richtung des positiveren Redoxpotentials weitergeleitet und dabei durch die Translokation von Protonen eine protonenmotorische Kraft aufgebaut, die wie in der Atmungskette die ATP-Synthese durch eine membrangebundene ATP-Synthase antreibt (Photophosphorylierung). Das abgegebene Elektron kann entweder zum Reaktionszentrum zurückkehren (zyklischer Elektronentransport) oder auf NAD(P)+ übertragen werden (linearer Elektronentransport). Die beim linearen Transport dem System entzogenen Elektronen werden durch die Oxidation eines externen Elektronendonors ersetzt. Halorhodopsin, die lichtgetriebene Protonenpumpe der Haloarchaea, baut die protonenmotorische Kraft ohne Beteiligung von Redoxreaktionen auf ( Mikrobiologie).

7.6.1

Oxygene Photosynthese

An der Photosynthese in Cyanobacteria und Chloroplasten ( Botanik) sind zwei hintereinander geschaltete Photosysteme beteiligt. Die Komponenten des Photosyntheseapparates sind in Thylakoidmembranen lokalisiert, die gestapelt sein können (Abb. 7.33) und sich aus Einstülpungen der inneren Chloroplastenmembran und durch Vesikelfluss bilden. Thylakoidmembranen sind impermeabel für viele, insbesondere geladene Moleküle, sodass der Aufbau der protonenmotorischen Kraft nicht durch unkontrollierte Diffusionsprozesse gestört wird. Die beiden Photosysteme sind durch weitere Komponenten der photosynthetischen Elektronentransportkette verbunden (Abb. 7.34). Das Sonnenlicht wird vom Lichtsammelkomplex (LHC, light harvesting complex) absorbiert, der zahlreiche Moleküle des Porphyrins Chlorophyll enthält, in dessen Zentrum ein Magnesiumion gebunden ist. Grüne Pflanzen und Algen enthalten die Chlorophylle a und b, deren Struktur und Absorptionsspektren sich nur geringfügig unterscheiden, Cyanobacteria mit Ausnahme der Prochlorales ( Mikrobiologie) nur Chlorophyll a. Die in den Lichtsammelkomplexen absorbierte Lichtenergie wird durch Excitonentransfer an die Reaktionszentren weitergeleitet. Aufgrund der photochemischen Eigenschaften der Chlorophylle in den Lichtsammelkomplexen erreicht bei grünen Pflanzen nur Rotlicht der Wellenlängen 680 nm (Photosystem II) und 700 nm (Photosystem I) die Reaktionszentren, die daher als P680 und P700 bezeichnet werden. Rotalgen und Cyanobacteria, die in ihrem Lebensraum von mehr als einem Meter Wassertiefe nur geringe Mengen Rotlicht absorbieren können, besitzen zusätzlich Phycobiline (proteingebundenes Phycoerythrin, Phycocyanin und Allophycocyanin), die in Phycobilisomen auf den Thylakoidmembranen lokalisiert sind und auch das von Chlorophyllen kaum genutzte grüne und gelbe Licht absorbieren. Innerhalb der Lichtsammelkomplexe wird die Anregungsenergie zum „Special Pair“, dem zentralen Pigment aus einem Paar von Chlorophyll a im Typ-II-Reaktionszentrum von Photosystem II weitergeleitet. Durch die Anregung sinkt dessen Redoxpotential stark ab und es gibt ein Elektron an eine benachbarte redoxaktive prosthetische Gruppe ab (Pho-

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7.6 Die Photosynthese

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Abb. 7.33 Membransysteme in den Chloroplasten. Chloroplasten sind durch eine Doppelmembran vom Cytoplasma abgegrenzt. Die innere Membran kann von den meisten Verbindungen nur mithilfe von Transportsystemen passiert werden. Der Chloroplasteninnenraum, das Stroma, enthält ein komplex aufgebautes Membransystem aus Thylakoidstapeln (Grana) und Stromathylakoiden, in denen die photosynthetischen Pigmente lokalisiert sind. Die einzelnen Thylakoide sind abgeflachte geschlossene Räume, deren Innenraum (Lumen) von der Thylakoidmembran (Abb. 7.34) umgeben ist. Stromalamellen verbinden die einzelnen Grana.

Abb. 7.34 Elektronentransportkette in der Thylakoidmembran. Die Lichtenergie wird über Antennenpigmente (AP) und den LHC zum Reaktionszentrum P680 des Photosystem II weitergeleitet. Das vom angeregten P*680 abgegebene Elektron wird über den Chinonpool und den Cytochrom-b6f-Komplex zum Photosystem I transportiert. Dessen Reaktionszentrum P700 wird ebenfalls durch Lichtenergie angeregt und gibt nachfolgend ein Elektron ab, das über die Ferredoxin/NAD(P)+-Reductase auf NAD(P)+ übertragen wird. Die parallel zum Elektronentransport aufgebaute protonenmotorische Kraft treibt die ATP-Synthese an.

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7

7 Stoffwechsel

tooxidation, 1. Ladungstrennung). Die Elektronen fließen über Pheophytin (Chlorophyllmolekül ohne zentrales Magnesiumion) und mehrere Chinone, von denen das Plastochinon in der Thylakoide mobil ist, zum Cytochrom-b6f-Komplex, der ihre Übertragung auf Plastocyanin in Chloroplasten bzw. Cytochrom c bei Cyanobacteria katalysiert. Dadurch und durch den Q-Zyklus werden Protonen über die Thylakoidmembran nach innen transportiert und so ein Protonengradient aufgebaut. Cytochrom c bzw. Plastocyanin nutzen die Elektronen, um das ebenfalls durch Lichtenergie angeregte und oxidierte Chl a-Paar (2. Ladungstrennung) des Typ I-Reaktionszentrums (P700) von Photosystem I zu reduzieren. Über eine Elektronentransportkette, an der Eisen-Schwefel-Zentren und ein Flavoprotein beteiligt sind, werden die von P*700 abgegebenen Elektronen auf NAD(P)+ übertragen (linearer Elektronentransport). Alternativ können bei einem Überschuss an Reduktionsäquivalenten die Elektronen zum Cytochrom-b6f-Komplex zurückflie-

Abb. 7.35 Elektronentransport der oxygenen Photosynthese. Durch linearen Elektronentransport wird sowohl die protonenmotorische Kraft aufgebaut als auch NADP+ reduziert. Die Elektronen werden aus Wasser ersetzt, dabei entsteht O2. Beim zyklischen Elektronentransport, der ohne Beteiligung von Photosystem II über Photosystem I und Cytochrom b6f verläuft, wird nur durch Aufbau der protonenmotorischen Kraft Energie konserviert, jedoch kein NADP+ reduziert. Als Elektronenüberträger zwischen dem b6f-Komplex und P700 fungiert bei Chloroplasten Plastocyanin (PC,) bei Cyanobakterien Cytochrom c. PS: Photosystem, P: zentrales Pigment des Reaktionszentrums, Bakteriochlorophyllpaar, P*: Pigment in angeregtem Zustand, P+: Pigment in oxidiertem Zustand, Q: Chinon, Cyt c: Cytochrom c, FNR: Ferredoxin-NADP+-Oxidoreductase, DmH+: protonenmotorische Kraft.

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343

7.6 Die Photosynthese

ßen (Abb. 7.35). Dieser zyklische Elektronentransport führt zum Aufbau eines Protonengradienten ohne Bildung von NAD(P)H. Die für die NAD(P)+-Reduktion abgezweigten Elektronen werden aus Wasser als externem Elektronendonor ersetzt, da das Standardredoxpotential von P680 mit +1,15 V hoch genug für die Oxidation von Wasser (E0l = +0,82 V) ist. Um die Entstehung freier Sauerstoffradikale zu vermeiden, wird an einem speziellen Zentrum aus Manganionen molekularer Sauerstoff gebildet und freigesetzt (oxygene Photosynthese). Analog zur oxidativen Phosphorylierung (S. 301) fungiert der zwischen Lumen und Stroma aufgebaute transmembranale Protonengradient als Antrieb für die Synthese von ATP aus ADP und anorganischem Phosphat Pi durch die in der Thylakoidmembran verankerte ATP-Synthase (Photophosphorylierung, Botanik).

7.6.2

7

Anoxygene Photosynthese

Bei Prokaryoten sind die photosynthetischen Pigmente in verschiedene intrazelluläre Membransysteme integriert (Tab. 7.8). Purpurbakterien, Grüne Bakterien und Heliobacteria besitzen spezielle Bakteriochlorophylle, die sich in ihrer Struktur von Chlorophyllen unterscheiden. Ihre Absorptionsmaxima liegen zwischen 700 und über 1000 nm, sodass auch langwelliges Infrarotlicht genutzt wird. Als Antennenpigmente fungieren Carotinoide. Im Unterschied zu grünen Pflanzen und Cyanobacteria enthalten Purpurbakterien, Grüne Bakterien und Heliobacteria nur ein Photosystem: Purpurbakterien und Schwefelfreie Grüne Bakterien beTab. 7.8 Charakteristische Eigenschaften der oxygenen und anoxygenen Photosynthese in Pflanzen und Prokaryoten (Chl = Chlorophyll, Bchl = Bakteriochlorophyll).

Eukaryoten

Gruppe

Photopigmente

Pflanzen (Algen, Moose, Farne, Samenpflanzen)

Chl a u. min- Thylakoidmembradestens ein nen in den Chloroweiteres Chl plasten

I und II

ja

Chl a u. Phycobiline

Thylakoide mit angelagerten Phycobilisomen

I und II

ja

Invaginationen der Cytoplasmamembran als Lamellen o. Vesikel

II

nein

Bchl c, d, e u. CytoplasmamemI wenig a bran mit angelagerten Chlorosomen

nein

Prokaryoten Cyanobakterien

Purpurbakterien Bchl a u. b (Rhodospirillaceae, Chromatiaceae) Grüne Schwefelbakterien (Chlorobiaceae)

Photosynthetische Membranen

PhotoO2-Prosystemtyp duktion

Schwefelfreie Bchl a u. c Grüne Bakterien (Chloroflexaceae)

CytoplasmamemII bran mit angelagerten Chlorosomen

nein

Heliobacteria

Cytoplasmamembran

nein

Bchl g

I

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344

7 Stoffwechsel

7

Abb. 7.36 Elektronentransport der anoxygenen Photosynthese. Zur Energiekonservierung verläuft der Elektronentransport zyklisch. Für die Reduktion von NAD(P)+ abgezweigte Elektronen werden aus externen Elektronendonoren ersetzt und in der Regel über den Chinonpool in den Zyklus eingespeist. a Bei Beteiligung eines Typ II(Chinon)-Reaktionszentrums (Purpurbakterien und Schwefelfreie Grüne Bakterien) erfolgt die NAD(P)+-Reduktion durch revertierten Elektronentransport über eine NADH-Chinon-Oxidoreductase. b Bei Beteiligung eines Typ I(Fe-S)-Reaktionszentrums (Grüne Schwefelbakterien und Heliobacteria) wird NADP+ ohne weiteren Energieaufwand über Ferredoxin und die FerredoxinNADP-Reductase (FNR) reduziert. PS: Photosystem, P: zentrales Pigment des Reaktionszentrums, Bakteriochlorophyllpaar, P*: Pigment in angeregtem Zustand, P+: Pigment in oxidiertem Zustand, Q: Chinon, DmH+: protonenmotorische Kraft.

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7.6 Die Photosynthese

345

sitzen ein Typ II-Reaktionszentrum, Grüne Schwefelbakterien und Heliobacteria ein Typ I-Reaktionszentrum (Abb. 7.36). Durch Lichtenergie wird ein Bakteriochlorophyllpaar im Reaktionszentrum angeregt und gibt ein Elektron ab, das über die jeweiligen prosthetischen Gruppen des Reaktionszentrums und verschiedene mobile Chinone zum Cytochrom bc1-Komplex transportiert wird. Verstärkt durch den Q-Zyklus werden dabei Protonen über die Membran transloziert und so die protonenmotorische Kraft aufgebaut. Über ein c-Typ Cytochrom werden die Elektronen schließlich zum Reaktionszentrum zurückgeführt (zyklischer Elektronentransport). Für die Reduktion von NAD(P)+ werden dem System Elektronen entzogen, die aus externen Elektronendonoren, z. B. H2S, S0, S2O32-, H2, Fe2+ oder organischen Verbindungen, wieder aufgefüllt werden, jedoch nicht aus Wasser, da die Redoxpotentiale der zentralen Pigmente in den Reaktionszentren zu negativ sind, um Wasser (E0l = +0,82 V) Elektronen zu entziehen. Daher ist ihre Photosynthese nie mit der Bildung von O2 verbunden (anoxygene Photosynthese). H2 wird von Bakterien mit einer löslichen Hydrogenase als Elektronendonor genutzt und besitzt mit –0,42 V ein ausreichend negatives Redoxpotential, um seine Elektronen direkt auf NAD(P)+ (E0l = –0,32 V) zu übertragen. Wird ein externer Elektronendonor mit einem positiverem Potential als NAD(P)+ genutzt, z. B. H2S (E0l = –0,22 V), können die Elektronen nicht direkt auf NAD(P)+ übertragen werden, sondern treten auf der Stufe des c-Typ-Cytochroms in die Elektronentransportkette ein. Von dort werden sie über den Chinonpool durch revertierten Elektronentransport (reverse electron flow) zum NAD(P)+ gepumpt. In Grünen Schwefelbakterien und Heliobacteria mit einem Typ I-Reaktionszentrum ist das Redoxpotential des Eisen-Schwefel-Zentrums als erstem stabilen Elektronenakzeptor mit etwa –0,5 V negativ genug, um die Elektronen über Ferredoxin (E0l = –0,39 V) auf NAD(P)+ übertragen zu können. Beim Typ II-Reaktionszentrum von Purpurbakterien und Schwefelfreien Grünen Bakterien hat der erste stabile Elektronenakzeptor, ein an das Reaktionszentrum gebundenes Chinon, mit etwa 0,0 V ein positiveres Redoxpotential als NAD(P)+, sodass die Elektronen unter Energieaufwand über einen revertierten Elektronentransport zum NAD(P)+ gepumpt werden müssen.

7.6.3

CO2-Fixierung: Der Calvin-Zyklus

Alle phototrophen Eukaryoten (grüne Pflanzen und Algen, Botanik) und viele aerobe und fakultativ anaerobe Bacteria, darunter auch die phototrophen Cyanobacteria, fixieren bei autotrophem Wachstum CO2 über den Calvin-Zyklus (Abb. 7.37). In einigen Gruppen der Prokaryoten existieren alternative CO2-Fixierungswege: der reduktive Citratzyklus bei Chlorobiaceae, weiteren anaeroben und mikroaerophilen Bacteria und dem Archeaon Thermoproteus neutrophilus, der Hydroxypropionatzyklus bei Chloroflexus und einigen thermophilen Archaea, der reduktive Acetyl-CoA-Weg bei homoacetogenen und vielen sulfatreduzierenden Bacteria, sowie methanogenen und sulfatreduzierenden Archaea ( Mikrobiologie).

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7

346

7 Stoffwechsel

7

Abb. 7.37 CO2-Fixierung über den Calvin-Zyklus. Der Ablauf des Calvin-Zyklus gliedert sich in die drei Bereiche Fixierung, Reduktion und Regeneration. Für die Fixierung eines Moleküls CO2 werden jeweils drei ATP und zwei NADPH benötigt.

Im ersten Reaktionsschritt katalysiert die Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase (Rubisco), als erstes Schlüsselenzym die Carboxylierung des Akzeptormoleküls Ribulose-1,5-bisphosphat. In einigen anoxygenen photosynthetischen Bakterien und in Cyanobacteria liegt das Enzym semikristallin in Form von Carboxysomen vor. Dies erhöht durch Minimierung der konkurrierenden Oxygenierungsreaktion der Rubisco die CO2-Fixierungsrate. Der entstehende C6-Körper bleibt enzymgebunden und wird unter Wasseranlagerung sofort in zwei Moleküle 3-Phosphoglycerinsäure gespalten, die anschließend über die gleichen Reaktionen wie in der Gluconeogenese (S. 285) zu Fructose-6-phosphat umgesetzt werden, das Ausgangssubstrat für die Stärkesynthese. Damit ist das erste Ziel des Reaktionsweges, der Einbau von CO2 in Kohlenhydrate, erreicht. Zur Vervollständigung des Zyklus muss Ribulose1,5-bisphosphat regeneriert werden. Katalysiert von Transketolase und Aldolase finden dabei wie im nicht oxidativen Teil des Pentosephosphatweges (S. 289) Umlagerungen von C2- und C3-Einheiten statt, wobei insgesamt aus drei C3- und einem C6-Körper drei C5-Zucker entstehen. Mithilfe von Epimerisierungs- und Isomerisierungsreaktionen werden alle C5-Zucker in die Ketose Ribulose-1,5bisphosphat umgewandelt. Im letzten Schritt katalysiert die PhosphoribuloseKinase, das zweite Schlüsselenzym des Calvin-Zyklus, die Phosphorylierung von Ribulose-5-phosphat zu Ribulose-1,5-bisphosphat. Für die Synthese einer Hexose sind insgesamt sechs Zyklen erforderlich: 6 CO2 + 12 H2O + 12 NADPH +18 ATP p C6H12O6 + 18 ADP + 18 Pi + 12 NADP+ + 6 H+

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7.6 Die Photosynthese

347

Aufgrund der Ähnlichkeiten mit dem Pentosephosphatweg wird der CalvinZyklus auch als reduktiver Pentosephosphatweg bezeichnet.

7.6.4

Regulation des Calvin-Zyklus

Als Teil des Baustoffwechsels benötigt der Calvin-Zyklus ATP und NADPH, die in phototrophen Organismen von den lichtinduzierten Reaktionen bereitgestellt werden. Aus diesem Grund findet die Assimilation von CO2 am Tage statt, während die Dissimilation von Kohlenhydraten nachts erfolgt. Die Enzyme dieser beiden Prozesse werden gegenläufig reguliert. Die Ribulose-1,5-bisphosphatCarboxylase, ein Schlüsselenzym des Calvin-Zyklus, wird durch Licht aktiviert. Ein wichtiger Regulator ist Thioredoxin, das bei Belichtung in seiner reduzierten Form vorliegt, die als Aktivator der Biosynthese-Enzyme und als Inhibitor der abbauenden Enzyme wirkt. Bei Dunkelheit entsteht vorwiegend die oxidierte Form mit umgekehrter Wirkung. Auf diese Weise können nicht nur Synthese und Abbau von Kohlenhydraten, sondern auch Licht- und Dunkelreaktion der Photosynthese aufeinander abgestimmt werden.

Photosynthese: Konservierung der Energie des Sonnenlichtes in Form von ATP und Reduktionsäquivalenten. Voraussetzung: photosynthetische Membranen, Licht absorbierende Pigmente, membrangebundene Elektronentransportkette, membrangebundene ATP-Synthase. Photophosphorylierung: ATP-Synthese über ETP bei phototrophen Organismen. Oxygene Photosynthese: Zwei Photosysteme und zwei Lichtreaktionen. Photosystem I enthält ein Typ I (FeS)-Reaktionszentrum, Photosystem II enthält ein Typ II-(Chinon)-Reaktionszentrum. Elektronentransport ist linear (Erzeugung von ATP und NADPH) oder zyklisch (nur ATP-Erzeugung). Durch lichtinduzierte Spaltung des externen Elektronendonors H2O (Photolyse) wird O2 gebildet. Vorkommen: Alle phototrophen Eukaryoten und Cyanobacteria. Photopigmente: Chlorophylle a und b bei grünen Pflanzen und Algen; Chlorophyll a bei Cyanobacteria; zusätzlich Phycobiline (auch bei Rotalgen). Anoxygene Photosynthese: Ein Photosystem und eine Lichtreaktion. Typ I (FeS)Reaktionszentrum bei Grünen Schwefelbakterien und Heliobacteria; Typ II-(Chinon)-Reaktionszentrum bei Schwefelfreien Grünen und Purpurbakterien. Elektronentransport ist zyklisch (Erzeugung von ATP und NADPH). Externe Elektronendonoren sind reduzierte Schwefelverbindungen, H2, Fe2+ oder organische Verbindungen. Photopigmente: Bacteriochlorophylle, Carotinoide. Keine O2-Bildung. Revertierter Elektronentransport: Elektronentransport in Richtung eines negativeren Redoxpotentials. Benötigt Energiezufuhr. Calvin-Zyklus (reduktiver Pentosephosphatzyklus): Anabol, zyklischer CO2Fixierungsweg in phototrophen Eukaryoten und vielen phototrophen und chemolithotrophen Prokaryoten. Primärer CO2-Akzeptor: Ribulose-1,5-bisphosphat. Regulation: Schlüsselenzym Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase), in phototrophen Organismen durch reduziertes Thioredoxin (im Licht) aktiviert, durch oxidierte Form (im Dunkeln) inhibiert.

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7

348

8 Membranen

8

Membranen

Thomas Langer

8.1

8

Die Lipiddoppelschicht als universeller Bauplan aller zellulären Membranen

Biologische Membranen verleihen Zellen durch Abgrenzung Individualität und unterteilen den Innenraum der Eukaryotenzelle in diskrete Kompartimente. Membranen bestehen hauptsächlich aus Lipiden und Proteinen, deren Zusammensetzung zwischen verschiedenen Spezies und Zell- bzw. Membrantypen variiert. Ihrem Aufbau liegt ein einheitlicher Bauplan zu Grunde, die Lipiddoppelschicht. Die Lipidkomponenten der Membranen ermöglichen durch ihre Anordnung Stabilität und strukturelle Flexibilität. Proteine üben die meisten membranspezifischen Funktionen wie Transport, Kommunikation oder Energieübertragung aus. Biologische Membranen haben für die Zellen zentrale Funktionen. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften bilden sie widerstandsfähige, aber flexible; selbstdichtende, jedoch keine unpassierbaren, sondern hoch selektive Barrieren. Sie garantieren das intrazelluläre Milieu bzw. das Milieu innerhalb der Kompartimente einer Eukaryotenzelle und sind Ort komplexer Reaktionsfolgen wie oxidative Phosphorylierung, Photosynthese und Energiespeicherung. Sie sorgen für Kommunikation der Zellen untereinander, Formveränderungen, amöboide Bewegung und Zellteilung. Trotz der vielfältigen Aufgaben liegt allen zellulären Membranen ein einheitlicher, universeller Bauplan zu Grunde, die Lipiddoppelschicht (Abb. 8.1). Die Lipidmoleküle sind in einer durchgehenden Doppelschicht von 5–8 nm Stärke angeordnet, die als zweidimensionale Flüssigkeit aufgefasst werden kann. In diesen flüssigen Film sind, je nach Membrantyp und Funktion, unterschiedliche Proteine in unterschiedlicher Menge eingelagert sind (Tab. 8.1). Die einzelnen Lipid- und Proteinmoleküle sind in der Membran nicht statisch sondern beweglich, sie bilden nach dem von S. J. Singer und G. L. Nicolson 1972 vorgestellten Modell ein „flüssiges Mosaik“ (fluid mosaic, Abb. 8.2). Die Lipiddoppelschicht ist die Grundstruktur aller Membranen. Aber es sind Proteine, die die meisten membranspezifischen Funktionen wie Transport, Kommunikation oder Energieübertragung ausüben. Aus diesem Grund sind Art und Menge dieser Moleküle in einer Membran stark variabel. So besitzt die Myelinscheide, die die Axone der Nervenzellen umgibt und als Isolator dient, einen relativ geringen Proteinanteil von etwa 18 %. Hauptbestandteil sind hier Lipide, die eine gute elektrische Isolierung bieten. Im Gegensatz hierzu haben die inneren Membranen von Mitochondrien und Chloroplasten einen

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349

8.1 Die Lipiddoppelschicht als universeller Bauplan

8 Abb. 8.1 Biologische Membran. Elektronenmikroskopische Aufnahme einer biologischen Membran, der Cytoplasmamembran einer äußeren Epithelzelle einer Blastula von Xenopus laevis. Die Membran erscheint dreischichtig. Die beiden äußeren, dunklen Schichten repräsentieren die polaren Kopfgruppen, die innere, helle Schicht entspricht dem Bereich der Kohlenwasserstoffketten (EM-Aufnahme von Th. Kurth). Tab. 8.1 Unterschiedliche Protein : Lipid-Massenverhältnisse in verschiedenen Membranen. Membrantyp

Protein : Membrantyp Lipid

Myelin (Cytoplasmamembran)

0,25

E. coli (Cytoplasmamembran)

2,5

Disc-Membran der Sehstäbchen

1,0

Äußere Mitochondrienmembran

1,1

Leberzelle (Cytoplasmamembran) 0,8

Chloroplast (Thylakoidmembran)

2,3

Humane Erythrocyten (Cytoplasmamembran)

1,3

Innere Mitochondrienmembran

2,9

Sarkoplasmatisches Retikulum

1,4

Purpurmembran von Halobacterium spec.

5,0

Protein : Lipid

Proteinanteil von etwa 75 %. Einige Bereiche der Cytoplasmamembran von Halobacterium halobium bestehen fast vollständig aus Proteinen (Purpurmembran).

Fluid-mosaic-Modell: Einfaches Membranmodell welches die Membran als fluide Lipiddoppelschicht mit darin eingelagerten Proteinen beschreibt.

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350

8 Membranen

8 Abb. 8.2 Fluid-mosaic-Modell. Die biologische Membran besteht aus zwei Lipidschichten (Membranblätter). Mit der Membran sind auf unterschiedliche Weise Proteine verbunden. Proteine und Lipide sind asymmetrisch in den zwei Membranblättern verteilt, wodurch die Membran eine funktionelle Asymmetrie erhält. Zuckerreste sind stets auf die Zellaußenseite beschränkt.

8.2

Die Lipidkomponente der Membranen

Lipide bestehen aus einem hydrophoben und einem hydrophilen Anteil. In wässriger Umgebung lagern sich Lipide spontan zu Micellen oder Doppelschichten zusammen. Bei den meisten Lipiden besteht der hydrophobe Bereich aus langkettigen Fettsäure- oder Phytylreste, es gibt aber auch solche mit cyclischen Kohlenwasserstoff-Strukturen. Phospholipide und Glykolipide bilden die Hauptbestandteile biologischer Membranen. Sterole, eukaryotische Membranbestandteile, und Hopanoide, prokaryotische Membranbestandteile, beeinflussen die Fluidität der Membran. Etherlipide kommen fast ausschließlich in den Membranen der Archaea vor. Die Lipidzusammensetzung der beiden Membranblätter ist unterschiedlich. Diese Asymmetrie ist lebenswichtig und wird durch verschiedene Proteine, den Flippasen, generiert und aufrechterhalten. Innerhalb einer Membran können sich Bereiche bestimmter Lipide zu Lipid-Rafts zusammenlagern. In diesen Bereichen kommen bestimmte Proteine bevorzugt vor. Die Membranlipide zählen zu den komplexen Lipiden. Die meisten dieser Lipidmoleküle sind amphiphil mit einem hydrophilen, polaren Ende aus Phosphorsäureestern oder Zuckerresten und einem hydrophoben, unpolaren Ende aus aliphatischen Kohlenwasserstoffen. Der hydrophile Anteil wird auch als Kopfgruppe bezeichnet. Von Wasser umgeben, lagern sich Lipide so zusammen, dass ihre hydrophoben Enden im Innern verborgen und die hydrophilen Enden

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8 Membranen

8 Abb. 8.2 Fluid-mosaic-Modell. Die biologische Membran besteht aus zwei Lipidschichten (Membranblätter). Mit der Membran sind auf unterschiedliche Weise Proteine verbunden. Proteine und Lipide sind asymmetrisch in den zwei Membranblättern verteilt, wodurch die Membran eine funktionelle Asymmetrie erhält. Zuckerreste sind stets auf die Zellaußenseite beschränkt.

8.2

Die Lipidkomponente der Membranen

Lipide bestehen aus einem hydrophoben und einem hydrophilen Anteil. In wässriger Umgebung lagern sich Lipide spontan zu Micellen oder Doppelschichten zusammen. Bei den meisten Lipiden besteht der hydrophobe Bereich aus langkettigen Fettsäure- oder Phytylreste, es gibt aber auch solche mit cyclischen Kohlenwasserstoff-Strukturen. Phospholipide und Glykolipide bilden die Hauptbestandteile biologischer Membranen. Sterole, eukaryotische Membranbestandteile, und Hopanoide, prokaryotische Membranbestandteile, beeinflussen die Fluidität der Membran. Etherlipide kommen fast ausschließlich in den Membranen der Archaea vor. Die Lipidzusammensetzung der beiden Membranblätter ist unterschiedlich. Diese Asymmetrie ist lebenswichtig und wird durch verschiedene Proteine, den Flippasen, generiert und aufrechterhalten. Innerhalb einer Membran können sich Bereiche bestimmter Lipide zu Lipid-Rafts zusammenlagern. In diesen Bereichen kommen bestimmte Proteine bevorzugt vor. Die Membranlipide zählen zu den komplexen Lipiden. Die meisten dieser Lipidmoleküle sind amphiphil mit einem hydrophilen, polaren Ende aus Phosphorsäureestern oder Zuckerresten und einem hydrophoben, unpolaren Ende aus aliphatischen Kohlenwasserstoffen. Der hydrophile Anteil wird auch als Kopfgruppe bezeichnet. Von Wasser umgeben, lagern sich Lipide so zusammen, dass ihre hydrophoben Enden im Innern verborgen und die hydrophilen Enden

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8.2 Die Lipidkomponente der Membranen

351

8

Abb. 8.3 Amphipathische Aggregate. Moleküle mit einer hydrophoben Kette haben meist einen konischen Van-der-Waals-Umriss und lagern sich zu Micellen zusammen. Phospholipide besitzen zwei hydrophobe Ketten und weisen daher einen in etwa rechteckigen Van-der-Waals-Umriss auf. Sie lagern sich bevorzugt zu Doppelschichten bzw. flüssigkeitsgefüllten Liposomen zusammen. In der Medizin werden künstliche Liposomen als Vehikel für Therapeutika eingesetzt, die dann über die Blutbahn ihr Zielorgan erreichen sollen. Bei entsprechender Molekülgeometrie bilden Lipide invertierte Vesikel.

dem Wasser zugewandt sind. Treibende Kraft für den Zusammenhalt sind hydrophobe Wechselwirkungen (S. 33). Es gibt zwei Varianten, die dieser Ausrichtung entgegenkommen: Die Micelle, eine kugelförmige Anordnung, die vor allem von einschwänzigen Molekülen bevorzugt wird, und eine Lipiddoppelschicht, die von Molekülen mit raumfüllenden hydrophoben Seitenketten, etwa Glycerophospholipiden und Sphingolipiden, gebildet wird. Die Lipiddoppelschicht kann sich zu einer Hohlkugel zusammenschließen, dem Liposom (Abb. 8.3). Bei der Ausbildung von Liposomen, in deren Innerem ein separates wässriges Kompartiment entsteht, wird die größte Stabilität erreicht. Neben den hydrophoben Wechselwirkungen sind die Van-der-Waals-Kräfte für den Zusammenhalt der Membran verantwortlich. Van-der-Waals-Kräfte wirken direkt zwischen den hydrophoben Ketten. Die genannten energetischen Faktoren sind von großer Bedeutung für die Biologie von Membranen: x Lipiddoppelschichten bevorzugen eine große Ausdehnung. x Sie neigen zum Zusammenschluss mit sich selbst, sodass keine Ränder mit freien Kohlenwasserstoffketten entstehen, sondern in sich geschlossene Hohlräume und Kompartimente. x Sie sind selbstreparierend, da ein Loch in der Doppelschicht energetisch ungünstig ist.

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352

8 Membranen

8

Abb. 8.4 Membranlipidgruppen.

Phospholipide und Glykolipide bilden zusammen mit Cholesterin oder Hopanoiden die Hauptbestandteile der biologischen Membranen. Phospholipide oder Glykolipide leiten sich entweder vom dreiwertigen Alkohol Glycerin oder vom Aminoalkohol Sphingosin ab. Sie können gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren enthalten. Handelt es sich um ungesättigte Fettsäuren, liegt in den meisten Fällen die cis-Konfiguration vor. Die Anzahl der Doppelbindungen sowie die Länge der Fettsäuren haben einen großen Einfluss auf die Fluidität der Membran. Die häufigsten in den Membranlipiden vorkommenden Fettsäurereste enthalten 16, 18 oder 20 Kohlenstoffatome. Sie stammen von einigen wenigen Fettsäuren ab: Der gesättigten Palmitinsäure, der gesättigten Stearinsäure, der einfach ungesättigten Ölsäure, der zweifach ungesättigten Linolsäure, der dreifach ungesättigten a-Linolensäure, der g-Linolensäure und der vierfach ungesättigten Arachidonsäure. Während bakterielle Membranen mit zum Teil nur drei unterschiedlichen Lipidarten einfach aufgebaut sind, enthält z. B. die Myelinscheide menschlicher Nerven mindestens acht, die Erythrocytenmembran ungefähr 400 verschiedene Lipide (Tab. 8.2). Auch innerhalb einer Zelle unterscheidet sich die Lipidzusammensetzung der verschiedenen Membranen z. T. erheblich: Die Membranen des endoplasmatischen Retikulums und der Mitochondrien enthalten kaum Cholesterin; bei Epithelzellen weist der apikale Membranbereich eine andere Lipidzusammensetzung auf als die basolaterale Membran. Eine Durchmischung beider Bereiche wird hier durch die Tight Junctions (S. 498) verhindert.

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Lipid

E. coli

Hepatocyt (Ratte)

Plasmamembran

Plasmamembran

ER

Mitochondrien

Mensch

Chloroplast (Spinat)

Cyanobakterium (Synechococcus)

Myelin

Hüllmembran

Plasmamembran

Thylakoide

Phosphatidylcholin (PC)

–

38

63

41

11

22

3

–

Phosphatidylethanolamin (PE)

75

15

18

39

14

–

–

–

Phosphatidylserin (PS)

–

8

2

–

5

–

–

–

Phosphatidylinositol (PI)

–

6

9

2

1

1

1

–

Phosphatidylglycerol (PG)

20

–

–

–

–

9

9

18

Cardiolipin (CL)

5

–

–

17

–

–

–

–

Monogalactosyldiacylglycerol

–

–

–

–

–

22

53

63

Digalactosyldiacylglycerol

–

–

–

–

–

39

27

12

Sulfolipide

–

–

–

–

–

7

7

7

Sphingomyelin

–

16

4

–

6

–

–

–

Sphingoglykolipide

–

–

–

–

26

–

–

–

Plasmalogene

–

–

–

–

12

–

–

–

Cholesterin

–

17

4

–

25

–

–

–

8.2 Die Lipidkomponente der Membranen

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Tab. 8.2 Lipidzusammensetzung unterschiedlicher Membranen. Angaben in mol% (nach Kleinig, H., Maier, U. (1999) Zellbiologie, Gustav Fischer Verlag).

353

8

354

8 Membranen

8.2.1

Phospholipide

Die Phospholipide machen den größten Anteil der Membranlipide aus. Es werden zwei Gruppen unterschieden: Die Glycerophospholipide (Glycerophosphatide), zu denen auch die Plasmalogene gehören, und die Sphingophosphatide. Die Glycerophospholipide sind Derivate des Glycerins. Die Hydroxylgruppe an C1 und C2 ist jeweils mit der Carboxylgruppe einer Fettsäure, die Hydroxylgruppe an C3 mit Phosphorsäure verestert. In der Regel handelt es sich bei der Fettsäure an C1 um eine gesättigte C16–C18 Fettsäure, an C2 um eine ungesättigte C16–C20 Fettsäure. Das einfachste Glycerophospholipid ist Phosphatidat (oder Diacylglycerin-3-phosphat). Es kommt selbst nur selten in der Membran vor, ist aber die Ausgangsverbindung für die Biosynthese der anderen Glycerophospholipide.

8

Weitere Glycerophospholipidderivate entstehen durch Veresterung der Phosphorylgruppe mit einer Alkoholkomponente, meist Serin, Ethanolamin, Cholin, Glycerin oder Inositol. Einige Glycerophospholipide besitzen Trivialnamen: Phosphatidylcholine (PC) werden als Lecithin bezeichnet; eine frühere Sammelbezeichnung für Phosphatidylethanolamine (PE) und Phosphatidylserine (PS) lautet Cephaline. Durch Veresterung zweier Phosphatidatmoleküle mit den beiden endständigen Hydroxylgruppen von Glycerin entsteht das Cardiolipin (CL). Cardiolipin wurden erstmals aus dem Herzmuskel isoliert und kommt in eukaryotischen Zellen ausschließlich in der inneren Mitochondrienmembran vor.

Bei den Plasmalogenen befindet sich an C1 keine Fettsäure, sondern ein langkettiger Alkohol (meist C16 oder C18), der über eine Enoletherstruktur mit dem Glycerinrest verknüpft ist. Durch eine spezifische Desaturase wird im letzten Schritt der Plasmalogensynthese im 1-Alkylrest eine cis-Doppelbindung zwischen C1 und C2 eingeführt. Ähnlich aufgebaute Verbindungen sind die Plasmen- und Plasmansäuren. Bei den Plasmensäuren ist an C1 ebenfalls ein langkettiger Alkohol über eine Enoletherstruktur mit dem Glycerinrest verbunden. An C2 befindet sich ein weiterer Kohlenwasserstoffrest. An C3 des Glycerins können über eine Phosphorylgruppe andere Verbindungen, meist Ethanolamin, Cholin oder Serin gebunden sein. Plasmansäuren unterscheiden sich von den Plasmensäuren nur dadurch, dass diese an C1 einen über eine Etherbindung gebundenen gesättigten Fettsäurerest tragen. Eine Plasmansäure mit weit reichender physiologischer Bedeutung ist das 1-Octadecyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholin oder wegen seiner Wirkung auch als PAF (Plättchen [Thrombocyten]-aktivierender Faktor, platelet activating factor) bezeichnet. PAF ist unter anderem an der Thrombocytenaggregation im Rahmen der Blutgerinnung beteiligt ( Zoologie).

Abb. 8.5 Phospholipide. a Die Glycerophospholipide leiten sich vom Glycerin ab. Hierzu n gehören neben den verschiedenen Derivaten des Phosphatidats auch die Plasmalogene. Die für Plasmalogene charakteristische Enoletherstruktur ist hervorgehoben. Der Plättchen-aktivierende Faktor (PAF) ist ein Vertreter der Plasmansäuren. b Den Sphingophosphatiden liegt der Aminoalkohol Sphingosin zu Grunde. Bei Pflanzen und Hefen kommt auch Phytosphingosin vor.

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8.2 Die Lipidkomponente der Membranen

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8 Membranen

Im Gegensatz zu den Glycerophospholipiden enthalten die zu den Sphingolipiden gehörenden Sphingophosphatide den langkettigen Aminoalkohol Sphingosin. Durch Veresterung der Aminogruppe mit einer langkettigen Fettsäure entsteht zunächst das Ceramid, welches nur in sehr geringen Mengen frei vorliegt. Als Sphingomyeline werden die mit Phosphocholin oder Ethanolamin an der endständigen Hydroxylgruppe des Ceramids verknüpften Verbindungen bezeichnet. Die meisten Sphingomyeline enthalten die Reste der gesättigten Fettsäuren Palmitinsäure (C16) oder Stearinsäure (C18). Sphingomyeline kommen besonders reichlich im Gehirn und in der Myelinscheide, die die Axone myelinisierter Neuronen umgibt, vor. Bei Hefen und höheren Pflanzen wird neben Sphingosin auch das 4-Hydroxydihydrosphingosin (Phytosphingosin) zur Bildung von Sphingolipiden verwendet. Einen Überblick über die wichtigsten Phospholipide gibt Abb. 8.5.

8 8.2.2

Glykolipide

Glykolipide enthalten als hydrophilen Anteil eine Kohlenhydratstruktur von unterschiedlicher Größe. Phosphatreste kommen bei diesen Substanzen nicht vor. In bakteriellen Membranen und den Thylakoidmembranen der Chloroplasten sind die Glykoglycerolipide in großer Zahl vorhanden, in den Membranen von Säugetieren hingegen nur in sehr geringen Mengen. Sie enthalten 1,2-Diacylglycerin und ein Mono- oder Disaccharid an C3 des Glycerins gebunden. Wichtigste Vertreter sind die Monogalactosyldiacylglycerine. Vielen Glykolipiden liegt das Ceramid als Baustein zu Grunde. Innerhalb dieser Glykosphingolipide wird zwischen den neutralen Glykosphingolipiden, den Sulfatiden, den Sulfolipiden und den Gangliosiden unterschieden. Zu den einfachsten neutralen Glykosphingolipiden gehören die Cerebroside. Bei ihnen ist die endständige OH-Gruppe des Ceramids mit einem Monosaccharid, entweder Glucose oder Galactose, verestert. Galactocerebroside kommen besonders reichlich im Gehirn vor, während in anderen Organen meist Glucocerebroside vorhanden sind. Bei höheren Pflanzen kommen auch auf Phytosphingosin basierende Cerebroside vor. Im Unterschied zu den Cerebrosiden sind die Sulfatide an ihrem Zuckeranteil mit Schwefelsäure verestert und enthalten somit eine negative Ladung. Sulfolipide kommen ausschließlich bei Pflanzen vor ( Botanik). Die sauren Ganglioside sind komplexere Glykosphingolipide. Die endständige OH-Gruppe des Ceramids ist mit einem neutralen Oligosaccharid (meist zwei bis vier Zuckerreste: Glucose, Galactose und N-Acetylgalactosamin) verestert, der ein oder mehrere Sialinsäuren (Sammelname für N-Acetyl- und N-GlykosylNeuraminsäuren) enthält. Ganglioside kommen vor allem in Nervenzellen (Ganglion = Nervenknoten), besonders häufig aber in der grauen Substanz des Gehirns vor. Die Strukturen einiger Glykolipide zeigt Abb. 8.6.

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8.2 Die Lipidkomponente der Membranen

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8

Abb. 8.6 Glykolipide. a Die Glykoglycerolipide leiten sich vom Glycerin ab. b Den Glykosphingolipiden liegt das Sphingosin bzw. das Ceramid zu Grunde.

8.2.3

Sterine und Hopanoide

Sterine (syn. Sterole, die Bezeichnung „ol“ betont die Hydroxylgruppe) sind eine Untergruppe der Steroide. Sie sind charakteristische Membranbestandteile fast aller eukaryotischen Zellen und machen je nach Zelltyp, bis zu 50 % des Lipidanteils in der Cytoplasmamembran aus. Mitochondrien sowie die Membranen des endoplasmatischen Retikulums enthalten nur sehr geringe Mengen an Sterinen. Das bedeutendste Membransterin der Wirbeltiere ist das Cholesterin. Cholesterin ist ein amphipathisches Molekül (Abb. 8.7). In Membranen treten Cholesterinmoleküle miteinander sowie mit den hydrophoben Ketten der Fettsäuren in Wechselwirkung. Sterine alleine sind aber nicht zur Bildung von Membranen

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8 Membranen

8

Abb. 8.7 Sterine und Hopan. a Cholesterin, das wichtigste tierische Steroid. b Stigmasterin ist ein typischer Vertreter pflanzlicher Sterine (Phytosterine). b-Sitosterin, ein weiteres pflanzliches Sterin, unterscheidet sich von Stigmasterin nur durch die gesättigte Bindung zwischen C22 und C23. c Ergosterin wird von vielen Pilzen und Flechten gebildet. Durch Belichtung kann Ergosterin zu Prävitamin D2 und weiter zu Vitamin D2 umgewandelt werden. Vitamin D2 ist genauso wirksam wie das aus Cholesterin gebildete Vitamin D ( Zoologie). d Struktur von Hopan. Hydroxylierte Hopanderivate kommen auch in Pflanzen vor. Archaea enthalten keine Hopanoide.

in der Lage. Innerhalb einer Membran hat der Steringehalt einen entscheidenden Einfluss auf die Fluidität der Membran (s. u.). Neben der Funktion als Membranbaustein dient Cholesterin als Ausgangssubstanz zur Synthese der Steroidhormone sowie von Vitamin D (Abb. 3.16). Dem Cholesterin ähnliche Sterine findet man auch bei Pflanzen z. B. Stigmasterin oder bei den Pilzen Ergosterin. In der Zellmembran von Prokaryoten kommen Sterine nur selten vor, etwa bei den zellwandlosen Mycoplasmen (s. u.). Bei vielen Bacteria, z. B. Cyanobakterien und Bacillus-Arten, kommen stattdessen Hopanoide vor. Grundstruktur der Hopanoide ist das Hopan. Hopanoide haben eine den Sterinen vergleichbaren Einfluss auf die Membranintegrität.

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8.2 Die Lipidkomponente der Membranen

8.2.4

359

Etherlipide und Isoprenoidlipide

Etherlipide kommen fast ausschließlich in den Membranen der Archaea vor. Bei Etherlipiden (Abb. 8.8) sind im Unterschied zu den Membranlipiden bei Eukaryoten und Bacteria lange Kohlenwasserstoff-Ketten über Etherbindungen mit C1 und C2 des Glycerinrests (Glycerin-Diether) verbunden. Im Unterschied zu allen anderen enthalten die Etherlipide der Archaea auch kein D-Glycerin, sondern L-Glycerin. Etherlipide bilden wie Esterlipide Membranen mit einem hydrophoben Innenteil und einem hydrophilen Außenteil. Einige Archaea, z. B. bestimmte methanogene und extrem thermophile Arten, enthalten fast ausschließlich Glycerin-Tetraether. Diese Moleküle bilden eine Lipid-MonolayerMembran (Abb. 8.8c). Warum benutzen Archaea Etherbindungen an Stelle der Esterbindungen? Archaea leben unter teilweise sehr extremen Bedingungen: Pyrolobus fumarii wächst noch bei 113 hC; unterhalb 80 hC fällt dieser Organismus in „Kältestarre“; Picrophilus spec., die acidophilsten der bisher bekannten Archaea, besitzen ein pH-Optimum von 0,7! Unter solchen Bedingungen würden Esterbindungen rasch hydrolysieren. Auch bei einigen hyperthermophilen Bacteria wurden Etherlipide nachgewiesen. Im Gegensatz zu den Archaea enthalten diese aber stets auch Esterlipide.

Abb. 8.8 Etherlipide. a Glycerin-Diether; die Polyprenylseitenkette stammt aus der Phytansäure. b Beim Glycerin-Tetraether sind zwei Glycerinmoleküle durch zwei lange Kohlenwasserstoffketten miteinander verbunden. Die Glycerin-Struktur ist hervorgehoben. c Bildung eines Lipid-Monolayers durch Glycerin-Tetraether.

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360

8 Membranen

Zu den Isoprenoidlipiden gehören das Squalen und weitere Polyprenylderivate, etwa b-Carotin oder Geranylgeraniol. Squalen ist bei Prokaryoten weit verbreitet; bei Archaea kommen auch teilweise bzw. vollständig gesättigte Squalenund Polyprenylderivate vor.

8.2.5

8

Lipopolysaccharide

Lipopolysaccharide sind komplexe Moleküle mit einem Lipid- und einem Polysaccharid-Anteil. Sie kommen ausschließlich in den äußeren Membranen gramnegativer Bakterien vor und bestehen aus drei Komponenten, dem Lipid A, einer Kernzone und den O-spezifischen Seitenketten. Im Zuge einer Infektion zeigen die Lipopolysaccharide im tierischen Organismus eine stark pyrogene, d. h. Fieber erzeugende Wirkung, und können zu einem lebensbedrohlichen septischen Schock führen. Aufgrund dieser Eigenschaften werden die Lipopolysaccharide als Endotoxine bezeichnet ( Mikrobiologie).

8.2.6

Bewegungen innerhalb der Membran

Die Fluidität („Fließvermögen“) biologischer Membranen ist Voraussetzung für die Membranfunktionen wie Transportprozesse über die Membran, die Abtrennung von Membranbereichen, etwa bei der Zellteilung oder dem Abschnüren von Vesikeln, und der umgekehrte Prozess, die Fusion zweier Membranen. Die Veränderung der Zellform, z. B. von Erythrocyten oder bei amöboider Bewegung, setzt ebenfalls eine fluide Membran voraus. In einer synthetischen Lipiddoppelschicht diffundieren Lipidmoleküle frei, in biologischen Membranen ist dies hingegen nur eingeschränkt möglich (Abb. 8.9). Innerhalb eines Membranblattes wechseln benachbarte Moleküle ständig ihren Platz (laterale Diffusion); ein Lipidmolekül legt etwa 2 mm pro Sekunde zurück. Der spontane Wechsel einzelner Lipide von einer Einzelschicht zur anderen ist dahingegen ein seltenes Ereignis (Stunden bis Tage). Diese transversale Diffusion, auch „Flip-Flop“ genannt, wird durch bestimmte Proteine gesteuert (s. u.). Eine andere Form der Bewegung ist die Rotation der Lipidmoleküle um

Abb. 8.9 Bewegungsmöglichkeiten von Lipidmolekülen innerhalb einer Membran.

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8.2 Die Lipidkomponente der Membranen

361

ihre eigene Längsachse. Die Beweglichkeit der Kohlenwasserstoffkette innerhalb eines Membranblattes wird als Flexion bezeichnet. Die Fluidität und damit auch die Permeabilität einer Membran sind von der Temperatur und der Lipidzusammensetzung abhängig. Bei niedrigen Temperaturen ist die Bewegung der Lipidmoleküle vermindert und die Lipiddoppelschicht geht in einen parakristallinen Zustand, auch als Gelphase bezeichnet, über. Für jede Membran existiert ein charakteristischer Schmelzpunkt. Gesättigte Fettsäurereste begünstigen die parakristalline Anordnung, d. h. je größer der Anteil gesättigter Fettsäuren in einer Membran, desto höher liegt die Temperatur für den Übergang von parakristallin zu flüssig. Bei ungesättigten Fettsäuren verursachen die cis-Doppelbindungen einen Knick in den aliphatischen Ketten, sie stören den geordneten Zustand, die Membran wird flüssiger. Der flüssige Zustand wird auch als liquid disordered („flüssig-ungeordnet“) bezeichnet. Durch den Einbau von Sterolen wird die Beweglichkeit der Fettsäurereste in unmittelbarer Nachbarschaft des starren Sterinringsystems eingeschränkt. Die Membran bleibt flüssig, die Fettsäureseitenketten sind nun aber stärker geordnet. Diese Phase wird als liquid ordered („flüssig-geordnet“) bezeichnet. Durch die eingeschränkte Bewegungsfreiheit der Kohlenwasserstoffketten wird die Ausbildung kurzlebiger Poren vermindert, und damit die Membran weniger permeabel für kleine Moleküle. Beim Abkühlen einer Membran verhindern Sterine die parakristalline Ausrichtung der Fettsäureketten und führen somit zur Herabsetzung des Schmelzpunktes der Membran im Vergleich zu einer sterinfreien Membran ansonsten gleicher Zusammensetzung. Oberhalb des Schmelzpunktes vermindern Sterine die Flexion der Fettsäureketten um ihre C-C-Bindungen und verringern so die Fluidität innerhalb der Doppelschicht. Die Sterine verhindern einen abrupten Phasenübergang und bewirken somit eine annähernd konstante Fluidität der Membran bei verschiedenen Temperaturen. Der Einbau von Cholesterin verleiht den Membranen auch eine erhöhte mechanische Stabilität. Ein Beispiel sind die Mycoplasmen ( Mikrobiologie). Sie besitzen keine Zellwand, sondern stabilisieren ihre Zellmembran durch den Einbau von Cholesterin, eine sonst bei Prokaryoten ungewöhnliche Erscheinung. Auf diese Weise überleben Mycoplasmen in einer hypoosmotischen Umgebung, ohne dass es zur Zelllyse kommt.

Für alle Organismen ist eine konstante Fluidität ihrer zellulären Membranen auch unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen essentiell. Sie erreichen dies durch eine Regulation der Lipidzusammensetzung. So synthetisieren Bakterien bei niedrigen Temperaturen mehr ungesättigte und weniger gesättigte Fettsäuren als bei höheren Temperaturen. Eine weitere Möglichkeit zur Regulation der Membranfluidität besteht in der reversiblen Verkürzung des hydrophoben Bereichs der Membranlipide. Dieser Mechanismus wird von einigen Archaea angewendet. In die Polyprenylseitenketten der Lipide werden pentazyklische Ringe eingeführt, entsprechend verkürzt sich der hydrophobe Bereich und die Membranfluidität nimmt zu.

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8 Membranen

8.2.7

Strukturelle Organisation biologischer Membranen

Untersuchungen der Lipidzusammensetzung beider Blätter einer biologischen Membran ergaben erstaunliche Unterschiede. Während Sterine in beiden Schichten etwa gleichmäßig verteilt sind, da sie aufgrund der kleinen hydrophilen Kopfgruppe zwischen den beiden Membranblättern frei hin- und her-„flippen“ können, sind Glycerophospholipide und Sphingolipide asymmetrisch verteilt. Die Sphingolipide befinden sich in der äußeren Seite, während Glycerolipide, z. B. PE und PS, in der cytoplasmatischen Seite dominieren. Für ihre asymmetrische Verteilung sind bestimmte Enzyme, die „Flippasen “ (Transport zur cytoplasmatischen Seite) und „Floppasen “ (Transport zur exoplasmatischen Seite), verantwortlich, die z. T. unter ATP-Verbrauch den Übertritt bestimmter Lipide von einem Membranblatt in das andere katalysieren. Unspezifische Translokasen, die „Scramblasen“ (engl. scramble: verquirlen), bewirken eine gleichmäßige Verteilung der Phospholipide innerhalb der Membran und wirken somit den Flippasen und Floppasen entgegen (Abb. 8.10). Kohlenhydrate, diese können an Lipide oder Proteine gebunden sein, befinden sich ausschließlich auf der Außenseite der Lipiddoppelschicht. An der Cytoplasmamembran liegen die Kohlenhydratgruppen frei auf der Zelloberfläche. Dieser Besatz an Kohlenhydraten kann, besonders bei zellwandlosen Zellen, sehr dicht sein und eine regelrechte Hülle um die Zellen bilden, die Glykokalyx (S. 473). Die asymmetrische Verteilung der Glykolipide bei eukaryotischen Zellen beruht darauf, dass die Anheftung von Zuckergruppen an Lipidmoleküle im Lumen des Golgi-Apparates, das topologisch dem Zelläußeren entspricht, erfolgt.

Abb. 8.10 Lipid-Translokasen. Schematische Darstellung der Funktion von Lipid-Translokasen. Es gibt verschiedene Transporterproteine der jeweiligen Klassen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten. Einige Scramblasen benötigen Ca2+-Ionen als Cofaktor.

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8.2 Die Lipidkomponente der Membranen

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Abb. 8.11 Lipidverteilung in einer Membran. Die Lipidverteilung zwischen den beiden Membranblättern ist asymmetrisch. Die dicht gepackten Sphingolipid-Cholesterin-Assoziationen der Membran-Rafts sind verhältnismäßig stabil und widerstehen selbst dem Auflösen durch Zugabe von Detergentien. Im Gegensatz zur umliegenden Membran („flüssigungeordnet“) weisen die Lipide in den Rafts einen höheren Ordnungsgrad („flüssig-geordnet“) auf. Die Lipide unterscheiden sich auch hinsichtlich ihrer Molekülgeometrie. Anreicherungen von invertiert-kegelförmigen Lipiden auf dem äußeren Membranblatt erleichtert die Ausbildung von Poren bzw. das Abschnüren von Membranvesikeln.

Aber auch innerhalb eines Membranblattes sind die vorhandenen Lipidmoleküle nicht homogen verteilt, vielmehr sammeln sich bestimmte Lipidmoleküle zu Clustern oder Mikrodomänen. Besonders starke Assoziationen gibt es zwischen Glykosphingolipiden und Cholesterin. Die Cluster werden auch als LipidRafts (engl. raft: Floß) bezeichnet. Rafts sind dynamische Strukturen, sie sind innerhalb der Membran beweglich, und ihre Zusammensetzung und ihr Umfang ändern sich mit der Zeit. Auch innerhalb der Rafts ist die Zusammensetzung beider Membranblätter asymmetrisch (Abb. 8.11). Durch die Segregation der Membran-Rafts entstehen Membranbereiche mit unterschiedlichen Eigenschaften. Zu diesen gehören z. B. die Caveolae, Invaginationen der Cytoplasmamembran, in denen das cholesterinbindende Protein Caveolin vorkommt. Caveolae sind an Endo- und Exocytose bzw. am intrazellulären Vesikel- bzw. Membranverkehr beteiligt. Der zugrunde liegende Mechanismus unterscheidet sich deutlich von dem Coated Pit-Weg, sodass in einer

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8 Membranen

Zelle (mindestens) zwei Mechanismen für die Endo- bzw. Exocytose existieren (S. 418). Bevorzugt, vielleicht sogar ausschließlich, befinden sich in den MembranRafts Proteine, die über einen GPI-Anker (S. 405) oder über kovalent gebundene Fettsäurereste mit der Membran verbunden sind, während Proteine, die mit einer Geranylkette in der Membran verankert sind, von den Membran-Rafts ausgeschlossen sind. Interessanterweise ist eine Vielzahl der Caveolae bzw. Raft-ständigen Proteine an der Signaltransduktion beteiligt. Zu diesen Proteinen gehören etwa Proteine der Src-Familie und heterotrimere G-Proteine (Verankerung mit der Membran über Fettsäurereste), Ras (Polyprenylseitenkette), Tyrosin-Kinasen (Assoziation mit GPI-verankerten Proteinen) oder auch der PDGF-Rezeptor, MAP-Kinase oder Proteinkinase (s. u.).

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8.2.8

Funktionen einzelner Lipide

Einige Membranlipide sind direkt an der Signaltransduktion beteiligt, indem sie selbst bzw. ihre Spaltprodukte als Second Messenger dienen. Die am besten untersuchten Beispiele hierzu sind Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat und Diacylglycerol (S. 487). Auch Sphingolipide dienen als Second Messenger. Die Bindung des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF a) an den entsprechenden Rezeptor führt z. B. zur Hydrolyse bestimmter Sphingolipide. Ein Spaltprodukt hierbei ist Ceramid. Durch Ceramid werden verschiedene intrazelluläre Signaltransduktionswege aktiviert. Diese führen, in Abhängigkeit von Zelltyp und Art der Ceramidbildung, z. B. zu einem Stillstand im Zellzyklus oder zur Apoptose (S. 13 und Zoologie). Ein weiteres Beispiel ist Sphingosin, ein Inhibitor der Proteinkinase C. Die Signaltransduktion der Proteinkinase C (PKC, S. 488) erfolgt über membranständige Rezeptoren, die nach der Bindung entsprechender extrazellulärer Signale zunächst Phospholipase C (PLC) aktivieren, welche aus Glycerophospholipiden bzw. Glycerolipiden Diacylglycerol (DAG) freisetzt. DAG bindet sehr spezifisch an PKC, wodurch PKC nicht nur aktiviert, sondern auch räumlich an die Membran umorientiert wird. DAG dient hier nicht nur als Second Messenger, sondern ist auch für die Funktion des Enzyms unerlässlich. In der Membran befinden sich die entsprechenden Substratproteine von PKC. Ein weiteres Beispiel ist der ADP/ATP-Austauscher, das häufigste Protein der inneren Mitochondrienmembran. Es hat sechs Cardiolipinmoleküle fest gebunden, die für die Funktion des Carriers notwendig sind. Die Lactose-Permease von E. coli katalysiert den aktiven Eintransport von Lactose in die Zelle. Für diese Funktion ist eine Assoziation mit PE notwendig. Versuche an rekonstituierten Vesikeln mit definierter Lipidzusammensetzung haben gezeigt, dass Lactose-Permease in Anwesenheit von Phosphatidylglycerin und CL nur zu einem erleichterten Transport von Lactose in der Lage ist. Es scheint, dass jedes membranständige Protein zur optimalen Funktion eine bestimmte Lipidumgebung benötigt.

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8.2 Die Lipidkomponente der Membranen

8.2.9

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Bildung neuer Membranen - intrazelluläre Lipidverteilung

Membranen sind dynamische Strukturen. Dies beinhaltet auch ihren ständigen Auf- und Abbau sowie die Ausbildung und Erweiterung intrazellulärer Kompartimente in eukaryotischen Zellen. Membranen wachsen durch Expansion bereits bestehender Membranen, neu synthetisierte Proteine und Lipide werden in bereits existierende membranöse Elemente eingefügt. Bei Bakterien findet die Synthese der Membranlipide an der Cytoplasmamembran statt. In eukaryotischen Zellen kann die Lipidsynthese über mehrere Kompartimente verteilt sein, und viele Lipide müssen dabei für die erforderlichen Reaktionen z. T. mehrmals die Seite des Membranblattes wechseln. Hauptsächlich werden die Membranlipide in eukaryotischen Zellen jedoch in den Membranen des glatten ERs gebildet. Die meisten Enzyme zur Phospholipidsynthese im ER befinden sich auf der cytosolischen Seite. Trotzdem sind z. B. Glycerophospholipide in den Membranen des ERs – im Gegensatz zur Cytoplasmamembran – gleichmäßig zwischen den beiden Membranblättern verteilt. Der Grund hierfür ist folgender: Durch Einbau neuer Lipide in nur ein Membranblatt würde das Membransystem kollabieren. Durch die Aktivität der Scramblasen werden daher neu synthetisierte Lipide zunächst gleichmäßig zwischen den Membranblättern verteilt und somit die Membran „entspannt“.

Obwohl die Stoffwechselreaktionen zur Synthese der Lipide gut bekannt sind, weiß man über Transportwege bzw. Verteilungsmechanismen innerhalb der Zelle noch recht wenig. Der intrazelluläre Transport bzw. die Verteilung der Lipide zwischen den verschiedenen Kompartimenten erfolgt sowohl durch vesikulären Transport (S. 415) als auch durch spezifische Lipid-Transfer-Proteine. Mitochondrien und Chloroplasten sind nicht in das ineinander übergehende Membransystem zwischen ER, Golgi-Apparat und Cytoplasmamembran eingebunden. Der Einbau von im ER gebildeten Lipiden in die Mitochondrien bzw. Chloroplasten verläuft ausschließlich über Lipid-Transfer-Proteine. Eine wichtige Rolle beim intrazellulären Lipidtransport hat der Golgi-Apparat. Dieser ist nicht nur eine Sortier- und Modifizierungs-Station für Proteine, auch die asymmetrische Verteilung der Lipide (nicht nur zwischen den Membranblättern) findet hier in umfangreichem Maße statt. Die Bildung von Sphingolipiden beginnt im ER auf der cytosolischen Seite ausgehend von Serin und Acyl- (meist Palmitoyl-) CoA. Hierbei entsteht durch die Serin : PalmitoylTransferase zunächst 3-Ketosphinganin, welches in zwei aufeinanderfolgenden Schritten zu Ceramid umgebaut wird. Die entsprechenden Enzyme sind integrale Membranproteine, das aktive Zentrum liegt auf der cytoplasmatischen Seite. Im ER wird Ceramid zu Galactosylceramid umgebaut. Den Transfer von Galactose auf Ceramid katalysiert die UDP-Galactose : Ceramid-Galactosyltransferase, er findet auf der luminalen Seite des ERs statt. Zur Bildung von Sphingomyelin bzw. Glycosylceramid muss Ceramid in die Membran des Golgi-Apparates gelangen. Dies kann durch vesikulären Transport oder aber durch das für Ceramid spezifische Lipid-Transfer-Protein CERT (Ceramid Transport Protein) erfolgen. Interessanterweise wird CERT nur für die Synthese von Sphingomyelin

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8 Membranen

benötigt; die Anlieferung von Ceramid zur Glycosylceramid-Synthese verläuft über einen anderen Weg. Im Golgi-Apparat erfolgen die weiteren Modifizierungen zum Sphingomyelin durch die Sphingomyelin-Synthase (SMS) bzw. zum Glycosylceramid durch die Glycosylceramid-Synthase (GCS) auf der luminalen Seite. Entsprechende Flippasen sorgen für den Wechsel in das andere Membranblatt.

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Amphipathische Aggregate: Amphiphile Lipide lagern sich zu höher geordneten Strukturen zusammen: Micellen, Lipiddoppelschichten und Liposomen. Phospholipide: Stellen den größten Anteil innerhalb der Membranlipide dar, besitzen Phosphorylgruppen als hydrophile Kopfgruppe. Zwei Gruppen: Glycerophospholipide und Sphingophosphatide. Glykolipide: Besitzen Kohlenhydrate als hydrophile Kopfgruppe, teilweise mit Schwefelsäure verestert. Zwei Gruppen: Glykoglycerolipide und Glykosphingolipide. Sterine/Hopanoide: Einfache Lipide mit entscheidendem Einfluss auf die Membranintegrität, Einlagerung in die Membran stabilisiert und dichtet diese ab. Die Einlagerung verhindert einen abrupten Phasenübergang. Durch Sterineinlagerung resultiert ein höherer Ordnungszustand (liquid ordered). Sterine sind charakteristisch für eukaryotische Membranen, Hopanoide kommen nur bei Prokaryoten vor. Etherlipide: Besitzen Etherbindungen anstatt Esterbindungen, lange Kohlenwasserstoffketten aus Isopreneinheiten und bei Archaea L-Glycerin. Kommen nur bei Archaea und einigen thermophilen Eubakterien vor. Lipopolysaccharide: Bestandteil der äußeren Membran gramnegativer Bakterien mit Endotoxinwirkung. Membranfluidität: Abhängig von Lipidzusammensetzung und Temperatur. Je länger die Kohlenwasserstoff- bzw. Fettsäureketten und je höher der Anteil gesättigter Bindungen, umso geringer ist die Fluidität. Laterale Diffusion: Seitliche Beweglichkeit von Membranlipiden und -proteinen innerhalb der Membranebene. Transversale Diffusion (Flip-Flop): Übergang eines Lipids von einem Membranblatt in das andere. Bei Proteinen bisher nicht nachgewiesen. Rotation: Bewegung von Lipid- und Proteinmolekülen um deren Längsachse. Flexion: Bewegungen der Kohlenwasserstoffketten innerhalb der Membran. Asymmetrische Membran: Die verschiedenen Membranblätter besitzen eine unterschiedliche Lipidzusammensetzung: Glykolipide kommen ausschließlich im äußeren Membranblatt vor. Die unterschiedliche Lipidverteilung wird durch Phospholipid-Translokasen (Flippasen und Floppasen) aufrechterhalten. Membran-Rafts: Zusammenlagerungen bestimmter Lipide innerhalb einer Membran. Höherer Ordnungsgrad; bevorzugter Ort für bestimmte membranständige Proteine, daher mit besonderen biologischen Funktionen. Lipidtransport: Erfolgt intrazellulär über Vesikel oder über spezifische LipidTransfer-Proteine.

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8.3 Die Proteinkomponente der Membranen

8.3

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Die Proteinkomponente der Membranen

Neben Lipiden sind Proteine Bestandteil biologischer Membranen. Integrale, fest mit der Membran verbundene Membranproteine, werden von peripheren, durch elektrostatische Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken an die Membranoberfläche gebundenen Membranproteinen unterschieden. Periphere Proteine können leicht von der Membran abgelöst werden. Integrale Proteine sind entweder mit einem lipophilen Membrananker in der Membran befestigt oder die Proteinkette selbst durchspannt die Membran. Bei diesen Transmembran-Proteinen ist der die Membran durchspannende Teil eine a-Helix oder ein b-Barrel. Membranproteine sind zuständig für den Stoff- und Signalaustausch einer Zelle mit deren Umgebung; zudem stellen sie Verankerungspunkte für das Cytoskelett dar. Die Proteine sind in unterschiedlicher Art und Weise mit der Lipiddoppelschicht assoziiert (Abb. 8.12): Einige Proteine sind über einen lipophilen Anker in der Membran befestigt oder an integrale Membranproteine gebunden, andere Proteine durchspannen die Lipiddoppelschicht einmal oder mehrmals. Nach ihrer unterschiedlichen Ablösbarkeit von der Membran unterscheidet man periphere und integrale Membranproteine.

Abb. 8.12 Membranproteine. Integrale Membranproteine sind in die Lipiddoppelschicht integriert. Proteine mit GPI-Anker sind stets extrazellulär; Proteine mit einer Verankerung durch eine Kohlenwasserstoffkette stets intrazellulär lokalisiert. Intrazelluläre periphere Proteine sind über entsprechende Wechselwirkungen ebenfalls mit der Membran assoziiert.

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8 Membranen

8.3.1

Periphere Membranproteine

Periphere Proteine werden an den freien Ribosomen im Cytoplasma synthetisiert und gelangen posttranslational an die Membran. Sie sind über nicht kovalente Bindungen mit bestimmten Lipiden oder mit einem integralen Membranprotein assoziiert. Eine Abtrennung peripherer Proteine von der Membran erfolgt bereits unter milden chemischen Bedingungen, etwa durch Erhöhung der Ionenstärke (z. B. 1 mol l–1 NaCl) oder eine Veränderung des pH-Wertes. Die Membranstruktur bleibt hierbei intakt. Zu den peripheren Proteinen gehören z. B. die elektronenübertragenden Proteine Cytochrom c und Plastocyanin der inneren Mitochondrienmembran bzw. Thylakoidmembran oder die F1-Untereinheit der F1F0-ATPase. In diesen Fällen erfolgt die Assoziation mit der Membran über integrale Membranproteine. Zu den peripheren Proteinen, die über nicht kovalente Bindungen direkt an Lipide gebunden sind, gehören Phospholipase A2, die Annexine oder einige Vitamin-K-haltige Proteine. Bei einigen dieser Proteine erfolgt die Bindung an die Kopfgruppen der Phospholipide in Abhängigkeit von Ca2+. Solche Proteine werden durch Chelatisierung von Ca2+, etwa mit EDTA, von der Membran abgelöst.

8.3.2

Integrale Membranproteine

Integrale Membranproteine sind Bestandteil der Membran und können nur unter Zerstörung der Membranstruktur, z. B. mit Detergentien, aus der Membran herausgelöst (solubilisiert) werden. Die Strukturen häufig eingesetzter Detergentien sind in Abb. 8.13 gezeigt. Integrale Membranproteine sind entweder über einen lipophilen Membrananker in der Membran verankert oder das Protein selbst durchspannt die Membran. Letztgenannte Proteine werden daher auch als Transmembranproteine bezeichnet. n Detergentien bilden oberhalb der kritischen Micellbildungskonzentration (KMK) (critical micellization concentration, cmc) Micellen aus. Bis zu dieser Konzentration sind die Detergensmoleküle frei in Lösung. Oberhalb der KMK ändert sich die Konzentration freier Detergensmoleküle nicht mehr. Um integrale Membranproteine aus einer Membran solubilisieren zu können, muss die Detergenskonzentration oberhalb der KMK liegen. Das Solubilisieren ist eine Voraussetzung für die Reinigung von Membranproteinen. Solubilisierte Membranproteine können auch wieder in Vesikel definierter Zusammensetzung eingebaut werden (rekonstituierte Vesikel). Mit solchen Präparationen können bestimmte Funktionen, etwa Transportvorgänge über die Membran, genauer untersucht werden. Beim Solubilisieren von Membranproteinen wird die Lipiddoppelschicht zerstört und es bilden sich auch Micellen, die aus Detergens- und Lipidmolekülen bestehen. Diese werden als gemischte Micellen bezeichnet. m

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8.3 Die Proteinkomponente der Membranen

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Abb. 8.13 Detergentien. Als amphiphile Moleküle besitzen Detergentien sowohl einen polaren als auch einen unpolaren Bereich. a Bei den Gallensäuren sind die Ringe A und B im Gegensatz zum Cholesterin in cis-Stellung miteinander verknüpft. Die Hydroxylgruppen liegen hier auf einer Seite. b Der hydrophile Bereich besteht bei Triton X-100 aus einer Polyether-Struktur. Bei einem solubilisierten Protein decken die Detergentien mit ihrem hydrophoben Bereich den der Proteine ab. Die polaren Gruppen stehen mit der wässrigen Umgebung in Kontakt.

Über einen lipophilen Membrananker mit der Membran verbundene Proteine werden z. T. wie die peripheren Membranproteine an freien Ribosomen im Cytoplasma synthetisiert. Erst durch die Anbindung der verschiedenen lipophilen Gruppen erfolgt eine dauerhafte Assoziation mit der Membran: Verankerung über eine Fettsäurekette: Das Protein ist hierbei über einen Myristylsäure- (gesättigte C14-Kohlenwasserstoff-Kette), einen Stearinsäure- (gesättigte C16-Kohlenwasserstoff-Kette) oder über einen Palmitinsäurerest (gesättigte C18-KohlenwasserstoffKette) mit der Membran verbunden. Der Myristylsäurerest ist meist über eine Amidbindung an die freie Aminogruppe eines N-terminalen Glycins gebunden (dies erfordert die vorherige Abspaltung des ursprünglichen N-terminalen Methionins). Beispiele hierfür sind die a-Untereinheiten trimerer G-Proteine. Einige myristylisierte Proteine befinden sich jedoch im Cytosol, z. B. die cAMP-abhängige Proteinkinase. Palmitinsäurereste sind meist über eine Thioesterbindung an einen internen Cysteinrest des Proteins gebunden; aber auch Esterbindungen mit internen Serin- oder Threo-

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8 Membranen

ninresten kommen vor. Beispiele sind Ras (S. 490), aber auch Transmembranproteine, z. B. Rhodopsin oder die Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums (beide Proteine durchspannen die Lipiddoppelschicht mehrfach). Die Fettsäurereste haben vermutlich regulatorische Funktionen bei Protein-Protein-Wechselwirkungen; auch eine Funktion als intrazelluläres Sortierungssignal, etwa die Einbindung in Membran-Rafts, kommt in Betracht. Verankerung über eine Polyprenylseitenkette: Als Membrananker dient meist ein Farnesylrest (C15; aufgebaut aus drei Isopentenyl-Bausteinen) oder ein Geranylgeranylrest (C20; aufgebaut aus vier Isopentenyl-Bausteinen). Die Polyprenylseitenkette wird auf einen Cysteinrest am C-terminalen Ende des Proteins unter Ausbildung eines Thioethers übertragen. Das entsprechende Cystein hierzu muss innerhalb der Consensus-Sequenz Cys-A-A-X (A: aliphatische Aminosäure, X: beliebige Aminosäure) vorkommen. Nach der Übertragung der Polyprenylseitenkette werden die drei endständigen Aminosäuren abgespalten. Die freie Carboxylgruppe des terminalen Cysteins wird anschließend meist noch methyliert. Beispiele für Proteine mit einer Polyprenylseitenkette sind Ras – es kann zusätzlich an einem anderen Cysteinrest noch einen Palmitinsäurerest gebunden haben (s. o.); hierfür ist jedoch die Anwesenheit der Polyprenylseitenkette eine Voraussetzung – und Ras-ähnliche Proteine, die g-Untereinheiten trimerer G-Proteine sowie das Lamin B an der inneren Kernmembran. Verankerung über einen Glykosyl-Phosphatidylinositol-Anker: Der GPI-Anker besteht aus einem Phosphatidylinositol (PI) das an ein Tetrasaccharid (Man-a1 p2-Man-a1p6-Man-a1p4-GlcN) gebunden ist. Der endständige Mannoserest ist über eine Phosphorylgruppe mit Ethanolamin verestert, das wiederum mit der C-terminalen Carboxylgruppe des Proteins über eine Amidbindung verknüpft ist. An dieser Grundstruktur können, je nach Organismenart, noch weitere Zucker- oder Alkylgruppen vorhanden sein. Der GPI-Anker wird im ER gebildet und dann en bloc auf das Protein übertragen. GPI-verankerte Proteine sind stets extrazellulär. Sie sind weit verbreitet und kommen bei Prokaryoten, eukaryotischen Einzellern, Pilzen und Tieren vor, nicht jedoch bei Pflanzen. Beispiele GPI-verankerter Proteine sind alkalische Phosphatase, Acetylcholinesterase, der Fibronektinrezeptor oder das Scrapie-Prion-Protein.

Transmembranproteine durchspannen die Lipiddoppelschicht mit ihrer Polypeptidkette mindestens einmal. Die Sequenzen, die die Membran durchspannen, sind reich an hydrophoben Aminosäuren wie Ile, Leu, Val, Ala und Phe. Innerhalb der Transmembranabschnitte sind die Reste der hydrophoben Aminosäuren zur Proteinoberfläche hin orientiert und können so mit den Lipiden im Inneren der Membran in Kontakt treten. Die Transmembranabschnitte bilden meist eine a-Helix als Sekundärstruktur aus und werden daher als Transmembranhelices bezeichnet. Eine Transmembranhelix besteht aus ca. 20–30 Aminosäuren und reicht in ihrer Länge aus, um den unpolaren Teil einer Membran ganz zu durchspannen. Das Vorkommen von Transmembranhelices kann aufgrund der gehäuften Abfolge hydrophober Aminosäuren aus der Primärstruktur vorhergesagt werden. Manche Proteine durchspannen die Membran nur einmal, sie werden entsprechend als single pass-Proteine bezeichnet. Multi pass-Proteine durchspannen die Membran mehrmals und haben mehrere Transmembranhelices. Neben den a-Transmembranhelices können auch bestimmte b-Faltblattstrukturen den membrandurchspannenden Teil bilden (S. 138). Zum Mechanismus der Insertion von Transmembranproteinen in die Membran Abb. 9.5.

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8.4 Transportvorgänge an Membranen

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Die laterale Beweglichkeit von Membranproteinen ist sehr unterschiedlich. Einige sind fast so beweglich wie Lipide, andere praktisch immobil, da sie mit dem Cytoskelett verankert sind. Die für die Lipide beschriebene transversale Diffusion, das Flip-Flop, wurde für Proteinmoleküle bisher nicht beobachtet.

n Der Diffusionskoeffizient membranständiger Proteine kann mit der als FRAP (fluorescence recovery after photobleaching: Fluoreszenz-Rückgewinnung nach Lichtbleichung) bezeichneten Methode bestimmt werden. Hierbei wird ein membranständiges Protein mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper spezifisch markiert. Die Fluoreszenz verteilt sich schließlich gleichmäßig über die Zelloberfläche. Mit einem Laserstrahl wird ein kleiner, kreisförmiger Bereich gebleicht. Nicht ausgebleichte Proteine aus den umliegenden Membranbereichen diffundieren nun in den ausgebleichten Bereich herein. Die Zeit, die benötigt wird, bis die Fluoreszenzintensität der gebleichten Stelle wieder der Fluoreszenzintensität der Umgebung entspricht, ist ein Maß für den Diffusionskoeffizienten des Proteins. m Periphere Membranproteine: Über nicht kovalente Bindungen mit integralen Proteinen oder Phospholipiden assoziierte Membranproteine. Integrale Membranproteine: Fest in der Membran verankerte Membranproteine, lipophiler Membrananker (Fettsäure, Polyprenylrest, GPI-Anker). Protein selbst durchspannt die Membran als Transmembranhelix (a-Helix; single-pass oder multi-pass) oder b-Faltblatt (b-Barrel).

8.4

Transportvorgänge an Membranen

Kleine, unpolare Substanzen können eine Lipiddoppelschicht frei passieren. Der Durchtritt polarer Substanzen wie Ionen, Zucker, Aminosäuren erfolgt stets mithilfe spezifischer, membranständiger Proteine, den Kanälen bzw. Transportern (Carrier). Einige dieser Proteine befördern die gebundenen Substanzen passiv entlang ihres elektrochemischen Gradienten. Auch ein aktiver Transport gegen den elektrochemischen Gradienten ist möglich. Die dazu benötigte Energie stammt meist aus der ATP-Hydrolyse oder der Beförderung eines anderen Moleküls entlang seines elektrochemischen Gradienten. Der Transport erfolgt stets in stöchiometrischen Verhältnissen. Die Transporter bzw. Kanäle werden auf unterschiedliche Weise, z. B. durch Ligandenbindung oder spannungsabhängig, präzise reguliert. Unkontrollierte membrandurchspannende Kanäle führen zum Zelltod; einige solcher Proteine werden von Mikroorganismen gebildet und sind starke Toxine. In lebenden Zellen wird der Prozess der einfachen Diffusion (S. 48) durch die Membranen unterbunden. Kleine hydrophile Substanzen bis zu einer Molekülmasse von etwa 80 Da, z. B. Wasser oder Harnstoff, können eine Phospholipiddoppelschicht frei passieren. Dies geschieht vermutlich über kurzlebige

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8 Membranen

Abb. 8.14 Relative Permeabilitäten verschiedener Substanzen gegenüber einer künstlichen Lipiddoppelschicht.

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Poren, deren Zustandekommen auf der Fluktuation der Lipide beruht. Hydrophobe Substanzen lösen sich gemäß dem Verteilungskoeffizienten in der Membran und können sich auf diese Weise durch die Membran „durchlösen“. Für größere polare Moleküle sowie Ionen ist die Membran praktisch dicht, da die Moleküle nicht in der Lage sind, die Energiebarriere zu überwinden, die für die Abstreifung der Hydrathülle aufzuwenden ist. Weil biologische Membranen nur für bestimmte Substanzen durchlässig sind, werden sie als semipermeable (halbdurchlässige) Membranen bezeichnet. In Abb. 8.14 ist die Diffusionsfähigkeit einiger Stoffe durch eine synthetische Lipiddoppelschicht dargestellt. Biologische Membranen müssen aber die Passage von verschiedenen polaren Molekülen wie Ionen, Zucker, Aminosäuren, Nucleotiden und verschiedenen Zellmetaboliten ermöglichen. Für die meisten Stoffe gibt es spezifische Mechanismen, die ihren Durchtritt durch Membranen ermöglichen. Hierdurch ist eine Zelle in der Lage, das intrazelluläre Milieu genau zu kontrollieren. Auch die Aufnahme verschiedener endocytotisch aufgenommener Substanzen in das Cytosol erfolgt über spezifische membranständige Proteine in den Lysosomen. Kompliziertere Mechanismen für den Membrantransfer sind die Proteinmaschinerien zur Translokation ganzer Polypeptidketten. Auch hierbei gibt es unterschiedliche Mechanismen: Der Transfer von Polypeptidketten über die Membranen des ERs bzw. der bakteriellen Cytoplasmamembran erfolgt cotranslational (S. 401, Genetik). Der Transport von Proteinen in andere Organellen z. B. in Mitochondrien, Plastiden oder Peroxisomen, erfordert die Auffaltung der Proteine, die dann durch die Membran gefädelt werden (S. 426, 436, 440). Der komplexeste Apparat zum Membrantransfer ist der Kernporenkomplex. Im Unterschied zu den anderen Translokationsmechanismen erlaubt der Kernporenkomplex den Transfer gefalteter Proteine bzw. Proteinkomplexe bis hin zu ganzen ribosomalen Untereinheiten (S. 395). Im Folgenden soll die Darstellung auf die Proteine beschränkt werden, die die Passage von Ionen und kleinen Molekülen über Membranen ermöglichen. Hierbei handelt es sich stets um multi pass-Proteine. Innerhalb dieser membran-

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8.4 Transportvorgänge an Membranen

373

ständigen Proteine wird zwischen zwei Klassen unterschieden: kanalbildenden Proteinen und Carriern (Transportern).

8.4.1

Kanalbildende Proteine

Kanalbildende Proteine kommen in allen lebenden Zellen vor und bilden eine wassergefüllte Pore in der Membran aus, die bestimmten Substanzen den Durchtritt durch die Membran erlaubt. Kanäle sind meist sehr spezifisch für eine Substanz bzw. Ionenart, aber auch unspezifische Kanäle kommen vor, etwa die Porine (S. 376) oder die Gap Junctions (S. 504). Die Kanäle werden bezüglich der Porenöffnung streng reguliert. Bei einigen Kanälen ist die Öffnung der Pore abhängig vom herrschenden Membranpotential (spannungsabhängige Kanäle), andere Kanäle reagieren auf mechanische Beanspruchung und wiederum andere Kanäle werden durch Bindung bestimmter Stoffe geöffnet (Liganden-gesteuerte Kanäle). Die Regulation Liganden-gesteuerter Kanäle kann durch Ionen, Nucleotide oder andere Stoffe erfolgen. Ein Beispiel für einen Liganden-gesteuerten Kanal ist der Acetylcholin-Rezeptor der postsynaptischen Membran (s. u.). Viele Kanäle können zusätzlich durch Phosphorylierung reguliert werden. Kanäle arbeiten stets passiv, d. h. sie sind nicht an Energiequellen gekoppelt. Die auf den Transport kleiner, anorganischer Ionen spezialisierten Kanäle werden auch als Ionenkanäle bezeichnet. In ihrer Transporteffektivität übertreffen sie die Carrier (s. u.) bei Weitem. In einer Sekunde können mehr als 106 Ionen einen Ionenkanal passieren. Aufgabe der Ionenkanäle ist es, einen schnellen Übertritt von Ionen, hauptsächlich Na+, K+, Ca2+oder Cl–, gemäß dem elektrochemischen Gradienten zu ermöglichen. In den Zellen sind die Ionenkanäle an der Ausbildung des Membranpotentials bzw. bei Nervenzellen an der Ausbildung und Weiterleitung von Aktionspotentialen beteiligt. Hierzu gehören etwa der spannungsabhängige Na+-Kanal oder die K+-Sickerkanäle. Die Leitfähigkeit einzelner Ionenkanäle in der Membran kann mithilfe der Patch-clamp-Technik untersucht werden ( Zoologie).

8.4.2

Carrier

Carrier (auch Transportproteine oder Translokatoren) binden stöchiometrisch und spezifisch eine Substanz und befördern diese in nachfolgenden Schritten über die Membran. Hierbei kommt es meist zu weitreichenden Konformationsänderungen. Bei den Substanzen kann es sich um Ionen oder um größere Moleküle, etwa Peptide, handeln (z. B. einige ABC-Transporter, s. u.). Carrier können als membranständige Enzyme aufgefasst werden. Jeder Carrier besitzt eine oder mehrere spezifische Bindungsstellen für sein zu transportierendes Molekül; sind alle Bindungsstellen besetzt, erreicht die Transportgeschwindigkeit ihr Maximum, vmax. Diese Art des Transports kann mit den Gesetzen der Enzymkinetik nach Michaelis-Menten beschrieben werden (S. 183). Ähnlich einer Enzym-

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8 Membranen

Abb. 8.15 Transportmechanismen über eine Membran.

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reaktion ist der Transport durch Carrier spezifisch hemmbar, etwa durch Substratanaloga. Viele Carrier können in ihrer Aktivität reguliert werden. Einige Carrier transportieren nur eine Substanz über eine Membran. Diese Art des Transports wird als Uniport bezeichnet. Viele Carrier transportieren aber zusätzlich zu dem Substrat noch ein weiteres Molekül (Cotransport). Wird der zweite Stoff in die gleiche Richtung transportiert, handelt es sich um einen Symport; erfolgt der Transport, entweder gleichzeitig oder nacheinander, in entgegen gesetzter Richtung, spricht man von einem Antiport (Abb. 8.15). Unterschiedliche Carrier transportieren eine Substanz entweder passiv oder aktiv über die Membran. Der passive Transport durch Carrier oder Kanäle erfolgt entlang des elektrochemischen Gradienten, er wird deshalb auch als erleichterte Diffusion bezeichnet. Ein Beispiel ist die Glucose-Permease der Erythrocyten. Im Unterschied zur freien Diffusion, bei der die Diffusionsgeschwindigkeit stets proportional zur Konzentration des zu transportierenden Substrats ist, ist die erleichterte Diffusion ein sättigbarer Vorgang. Beim aktiven Transport wird eine Substanz unter Energieverbrauch gegen ihren elektrochemischen Gradienten transportiert. Carrier, die unter Energieverbrauch anorganische Ionen transportieren, werden auch als Ionenpumpen bezeichnet. Nach dem Transportvorgang erhöht sich beim aktiven Transport die freie Enthalpie DG des transportierten Stoffes. DG kann wie folgt berechnet werden (S. 65): DG = RT ln (cII / cI) + n F Df R ist die allgemeine Gaskonstante (8,314 J mol–1K–1), T die absolute Temperatur in K, cI und cII sind die Konzentrationen der Substanz an den Orten I und II; n ist die Zahl der elektrischen Ladungen, F ist die Faraday-Konstante (96 494 C mol–1) und Df das Membranpotential.

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8.4 Transportvorgänge an Membranen

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Rechenbeispiel. Eine Substanz soll vom Ort I, an dem ihre Konzentration cI = 10 mmol l–1 beträgt, zu dem Ort II mit der Konzentration cII = 100 mmol l–1 transportiert werden. Die beiden Orte werden von einer Membran getrennt, über der ein Membranpotential von 70 mV besteht (II negativ gegenüber I). Für einen neutralen Stoff ergibt sich bei einer Temperatur von 298 K nach der Gleichung: DG = RT ln (cII / cI) = 8,314 J mol–1K–1 · 298 K · ln (100 mmol l–1 / 10 mmol l–1) = 5705 J mol–1 Der Wert von DG ist positiv; der Transport der Substanz gegen das Konzentrationsgefälle benötigt Energie (aktiver Transport). Handelt es sich bei der Substanz um ein Kation mit einer Ladung, so muss der elektrische Term in der Gleichung berücksichtigt werden und man erhält: DG = RT ln (cII / cI) + n F Df = 5705 J mol–1 + 1 · 96 494 C mol–1 · (–0,07 V) = –1050 J mol–1 DG ist negativ, d. h. in diesem Fall kann die Substanz die Membran, dem elektrochemischen Gradienten folgend, ohne weitere Zuführung von Energie überqueren (passiver Transport). Trägt die Substanz eine negative Ladung, resultiert für DG: DG = RT ln (cII / cI) + n F Df = 5705 J mol–1 + (–1) · 96 494 C mol–1 · (–0,07 V) = 12 460 J mol–1 In diesem Fall erfolgt der Transport sowohl gegen den Konzentrationsgradienten als auch gegen das Membranpotential; entsprechend mehr Energie muss für den Transport aufgewendet werden.

Der aktive Transport ist strikt an einen energieverbrauchenden Prozess gekoppelt. Es werden je nach Energiequelle verschiedene Formen unterschieden: Primär aktiver Transport. Beim primär aktiven Transport wird eine Energiequelle direkt zum Transport einer Substanz über die Membran verwendet. Dies kann Lichtenergie sein, die z. B. in der Purpurmembran von Halobakterien vom Bakteriorhodopsin zum Austransport von H+ verwendet wird. Meist wird jedoch die bei chemischen Reaktionen freigesetzte Energie an den Transportprozess gekoppelt. Hierzu gehören die Redoxreaktionen in der Atmungskette bzw. der Photosynthese, welche insgesamt einen Austransport von H+ bewirken, oder die Decarboxylierung von S-Methylmalonyl-CoA bei dem Bakterium Propionigenium modestum, die mit der Translokation von zwei Na+ über die Membran gekoppelt ist. Die meisten aktiven Carrier verwenden als Energiequelle jedoch die Hydrolyse von ATP, wie etwa die Ionenpumpen oder die ABC-Transporter (s. u.). Sekundär aktiver Transport. Beim sekundär aktiven Transport ist der Transport des Substrats mit dem Transport eines zweiten Stoffes gekoppelt (Cotransport), für den ein steiler elektrochemischer Gradient über der Membran vorliegt, der die treibende Kraft für den Transport ist. So verbraucht der sekundär aktive Transport zwar unmittelbar keine Energie, aber der elektrochemische Gradient für den zweiten Stoff wird über primär aktive Transportprozesse aufrechterhalten. In tierischen Zellen werden Na+-Gradienten, in Pflanzenzellen H+-Gradienten und in Prokaryoten H+-Gradienten oder Na+-Gradienten genutzt. Beispiele für sekundär aktive Transportprozesse sind der Symport von Zuckern und Aminosäuren mit Na+ über die Cytoplasmamembran der Mukosazellen in

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8 Membranen

der Darmwand und der Epithelzellen der Nieren oder der Symport von Lactose mit H+ bei Bakterien durch die Lactose-Permease. Gruppentranslokation. Diese besondere Transportform kommt nur beim Zuckereintransport bei Bakterien vor. Während des Transportes durch das Phosphotransferase-System (PTS) wird der Zucker chemisch modifiziert (phosphoryliert), sodass sich das auf der Innenseite freigesetzte Substrat von dem außerhalb der Zelle vorliegenden Substrat chemisch unterscheidet und dadurch der Konzentrationsgradient des unmodifizierten Zuckers aufrechterhalten wird ( Mikrobiologie).

8.4.3

8

Ionophore

Als Ionophore werden Substanzen mit kleiner Molekularmasse (I 2000 Da) bezeichnet, durch die Ionen biologische Membranen passieren. Die meisten Ionophore sind natürlich vorkommende Antibiotika. Es gibt zwei grundsätzliche Wirkungsmechanismen: Einige fungieren als Ionen-Carrier, die Ionen durch die Membran transportieren; andere Ionophore bilden Känale innerhalb der Membran aus. Valinomycin aus Streptomyces fulvissimus ist eine zyklische Verbindung der Struktur (D-Valin-L-Lactat-L-Valin-D-Hydroxyisovaleriat)3. Die einzelnen Bausteine sind alternierend über Ester- und Peptidbindungen miteinander verknüpft. Valinomycin komplexiert spezifisch K+. Ein weiteres Beispiel für ein zyklisches, als Carrier fungierendes Ionophor ist das synthetisch hergestellte A23 187, das spezifisch Ca2+ bindet. Ein kanalbildendes Ionophor ist Gramicidin A aus Bacillus brevis. Gramicidin A ist ein Peptid aus 15 hydrophoben Aminosäuren. Hierbei sind D- und L-Aminosäuren alternierend miteinander verknüpft. Innerhalb eines Membranblattes bildet Gramicidin A eine Helix; ein funktionsfähiger Kanal entsteht durch Assoziation von zwei Gramicidin A-Molekülen innerhalb der Membran. Die Kanäle besitzen einen effektiven Porendurchmesser von etwa 4,5 nm und sind wenig spezifisch. Sie erlauben vor allem einwertigen anorganischen Kationen den Durchtritt. Innerhalb einer Sekunde können bis zu 107 Kationen den Kanal passieren. Aufgrund ihrer Eigenschaften, Membranen für Ionen permeabel zu machen, bewirken Ionophore bei Zellen einen Zusammenbruch des Membranpotentials und führen damit zum Zelltod ( Mikrobiologie).

8.4.4

Porine und kanalbildende bakterielle Toxine

Porine sind kanalbildende Proteine in den äußeren Membranen gramnegativer Bakterien und Mitochondrien, durch die eine freie bzw. erleichterte Diffusion durch die Membran ermöglicht wird. Der Porendurchmesser beträgt etwa 1 nm. Während selektive Porine nur bestimmte Substanzen passieren lassen, ermöglichen unselektive Porine die freie Diffusion und damit einen ungehinderten

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8.4 Transportvorgänge an Membranen

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Austausch von kleinen hydrophilen Molekülen (Masse I ca. 600 Da) zwischen Zelle und Umgebung. Gleichzeitig wirken sie wie ein molekulares Sieb, sodass größere periplasmatische Proteine nicht abdiffundieren können bzw. größere toxische Umgebungsproteine nicht in das Zellinnere gelangen. Die unselektiven Porine sind Homotrimere, wobei jedes Monomer einen aus 16 antiparallelen b-Faltblättern (bei den selektiven Porinen sind es 18) bestehenden Kanal, in der Form eines sog. b-Barrel ausbildet ( Mikrobiologie). Eine interessante Eigenschaft der Porine, vielleicht sogar aller b–Barrel-Kanäle, ist die Abhängigkeit der Öffnung vom Membranpotential. Die Porine gehören somit zu den spannungsabhängigen Kanälen; ober- und unterhalb bestimmter Werte ist die Pore verschlossen. Die physiologische Bedeutung dieser Eigenschaft ist jedoch unklar. Einige bakterielle Toxine, z. B. das a-Hämolysin von Staphylococcus aureus (Abb. 4.10b), bilden ebenfalls b-Barrel-Strukturen aus. Auch hier ist das b-Barrel der membrandurchspannende Teil und bildet einen Kanal. Wie gelangt das Protein aber in die Membranen der Zielzelle, wo es seine toxische Funktion ausübt? Die a-Hämolysin-Untereinheiten werden als lösliche Proteine von den Bakterien sezerniert. Einzelne Monomere binden spezifisch an Erythrocyten und lagern sich in die Membran ein. Erst in einem zweiten Schritt assoziieren die Monomere zum vollständigen Protein und bilden einen gemeinsamen Kanal aus. Die ungehinderte Diffusion verschiedener kleiner Ionen und Metaboliten über die Erythrocytenmembran führt anschließend zum Absterben der Erythrocyten bzw. zur Zelllyse.

8.4.5

Aquaporine

Wasser ist der Hauptbestandteil lebender Zellen; die Bedeutung des Wasserhaushaltes einer Zelle liegt somit auf der Hand. Obwohl Wasser eine polare Verbindung ist, weisen Lipiddoppelschichten eine bemerkenswert hohe Permeabilität für Wasser auf. Bei den meisten Zellen verläuft der gesamte Wassereintritt und -austritt durch Diffusion über die Membran. Dennoch gibt es ubiquitär, sowohl bei Eukaryoten als auch bei Prokaryoten, Kanäle für Wasser: die Aquaporine. Aquaporine kommen meist als Homotetramere vor, wobei jede Untereinheit einen funktionsfähigen Kanal ausbildet. Die Selektivität der Aquaporine ist bemerkenswert: Aquaporine sind selektiv für Wasser, kleine Ionen wie Na+, NH4+ und sogar H3O+ können den Kanal nicht passieren (kein Ausgleich eines transmembranen pH-Gradienten durch Aquaporine!). Einige dieser Kanäle sind auch für Glycerin permeabel und werden daher als Aquaglyceroporine bezeichnet. Die Erklärung für die Selektivität liefert die Proteinstruktur (Abb. 8.16). Für die Entdeckung und den Nachweis der Aquaporine als Wasserkanäle in der Membran erhielt Peter C. Agre 2003 den Nobelpreis für Chemie. Beim Menschen wurden bisher 11 unterschiedliche Aquaporine identifiziert, sie unterscheiden sich vor allem in der Gewebe- bzw. subzellulären Verteilung. Die Bedeutung der Aquaporine liegt vor allem darin, die Wasserpermeabilität der Membranen, etwa in den Nieren, um ein Vielfaches zu erhöhen ( Zoologie).

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8 Membranen

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Abb. 8.16 Aquaporin. a Struktur eines Monomers. Eine strukturelle Besonderheit besteht in zwei in die Membran eindringende Schleifen „B“ und „E“, die kurze a-Helices ausbilden. An exponierter Stelle der Schleifen stehen sich zwei Asparaginreste (Asn76 und Asn192) gegenüber. Beide kommen in der für Aquaporine konservierten Sequenz AsnProAla vor. b Nahansicht auf die engste Stelle in der Pore. Der Durchmesser beträgt hier 2,8 Å. Am Eingang der Pore verhindern Arg195 und His180 den Zutritt größerer Moleküle bzw. Ionen. Die Pore ist sonst überwiegend hydrophob ausgekleidet. Die Peptidbindungen der Aminosäuren Gly188 bis Ile191 können Wasserstoffbrücken mit den Wassermolekülen ausbilden und geleiten diese quasi durch die Pore. Cys189 ist verantwortlich für die Empfindlichkeit gegenüber Hg-Ionen. Um die engste Stelle zu passieren, muss ein Wassermolekül gleichzeitig zwei Wasserstoffbrücken mit den Seitenketten von Asn76 und 192 eingehen; somit kann das Wassermolekül keine weiteren Wasserstoffbrücken-Bindungen eingehen. Mit diesem Trick wird eine Selektivität gegenüber den H3O+ und OH--Ionen erreicht (pdb:1AQP).

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8.4 Transportvorgänge an Membranen

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Erythrocytenmembranen weisen gegenüber synthetischen Lipiddoppelschichten eine etwa 100fach höhere Permeabilität für Wasser auf. Die erhöhte Wasserpermeabilität lässt sich durch Hg-Ionen, die irreversibel an SH-Gruppen von Proteinen binden, inhibieren. Dieser Befund weist auf einen Protein-vermittelten Prozess hin. Der Nachweis der spezifischen Wasserkanäle gelang durch Klonierung der cDNA und anschließender Injektion der entsprechenden mRNA in Xenopus-Oocyten. In den Zellen werden die mRNA translatiert und das gebildete Protein in die Cytoplasmamembran eingebaut. Werden solche Oocyten in ein hypoosmotisches Medium überführt, beginnen diese deutlich schneller und stärker anzuschwellen als unbehandelte Oocyten. Ein weiterer Beweis für die Existenz der Wasserkanäle ist deren Einbau in rekonstituierte Lipidvesikel und anschließender Messung des Wassereinstroms.

8.4.6

Liganden-gesteuerte Ionenkanäle

Liganden-gesteuerte Ionenkanäle sind für die Signalübertragung an der neuronalen bzw. neuromuskulären Synapse zuständig ( Zoologie). Durch Bindung eines Neurotransmitters, den Liganden der Ionenkanäle, erfolgen Konformationsänderungen, die zu einer kurzzeitigen Öffnung des Ionenkanals führen. Liganden-gesteuerte Ionenkänale können somit als Rezeptoren für Neurotransmitter aufgefasst werden: Sie wandeln das extrazelluläre Signal, die Präsenz des Neurotransmitters, in ein intrazelluläres Signal, eine veränderte Ionenzusammensetzung bzw. eine Änderung des Membranpotentials um. Die Öffnungszeiten liegen im Bereich von Millisekunden; in dieser Zeitspanne können mehrere Tausend Ionen den Kanal passieren. Ein Beispiel ist der nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor der neuromuskulären Synapse (nicht zu verwechseln mit dem ebenfalls durch Acetylcholin aktivierten muskarinergen Rezeptor, der aber kein Ionenkanal ist). Gut untersucht ist der Acetylcholin-Rezeptor aus den elektrischen Organen vom Zitterrochen; diese leiten sich evolutionär vom Muskel ab (Abb. 8.17). Elektrische Organe weisen eine besonders hohe AcetylcholinRezeptoren-Dichte auf. Weitere Beispiele für Liganden-gesteuerte Ionenkanäle sind der 5HT3 (5-Hydroxytryptophan = Serotonin)-Rezeptor, der GABAA (g-Aminobuttersäure)- oder der Glycin-Rezeptor. Die beiden letztgenannten Kanäle weisen eine Präferenz für Anionen auf. Glutamat-Rezeptoren sind im Nervensystem weit verbreitet. Auch ATP-Rezeptor-Ionenkanäle sind bekannt. Viele Rezeptoren, darunter auch Liganden-gesteuerte Ionenkanäle, sind die Wirkungsorte pharmakologisch aktiver Substanzen bzw. Medikamente. Die Blockade nikotinerger Acetylcholin-Rezeptoren durch das Pfeilgift Curare führt zur Muskellähmung. Strychnin bewirkt schwere Krämpfe durch die Blockade postsynaptischer Glycin-Rezeptoren inhibitorischer Neurone im Rückenmark.

8.4.7

ATP-getriebene Transporter

Die Verwendung von ATP als Energiequelle zum Transport verschiedener Ionen, z. B. H+, K+, Ca2+, ist ubiquitär verbreitet. Nach Struktur und Funktion wird innerhalb der ATP-getriebenen Ionenpumpen zwischen drei Typen unterschieden.

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Abb. 8.17 Acetylcholin-Rezeptor. a Der Acetylcholin-Rezeptor besteht aus fünf Untereinheiten der Zusammensetzung a2bgd. Jede Untereinheit besitzt vier Transmembranhelices (M1-M4). Die Bindungsstellen für Acetylcholin (ACh) befinden sich zwischen der aund g- bzw. a- und d-Untereinheit. b Die M2-Helix jeder Untereinheit trägt zur Bildung des Kanals bei. Hierbei bilden die Seitenketten bestimmter Valin- und Leucin- bzw. Isoleucinreste eine hydrophobe Schleuse. Im geschlossenen Zustand des Kanals sind diese Seitenketten (als Kugelmodell hervorgehoben) zum Lumen des Kanals hin orientiert. c Die hydrophobe Schleuse besteht aus zwei Ringen. Die g-Untereinheit ist zur Vereinfachung nicht gezeigt. Die Bindung der Liganden bewirkt eine Rotation der M2-Helices, wodurch die hydrophoben Seitenketten vom Kanallumen weg bewegt werden. Die Pore ist nun vorrangig mit hydrophilen Gruppen ausgekleidet und für Na+-Ionen geöffnet. Die Selektivität für Na+-Ionen wird durch die Anordnung negativ-geladener Glutamat-Seitenketten oberund unterhalb der Pore erreicht. Nach Entfernung des Acetylcholins, – dieses wird durch die Acetylcholinesterase im synaptischen Spalt sehr schnell gespalten –, schließt sich der Kanal wieder (Quelle: pdb: 2BG9).

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8.4 Transportvorgänge an Membranen

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Von den bisher mehr als 100 beschriebenen P-Typ-ATPasen (P für Phosphorylierung) ist die Na+-K+-ATPase (s. u.) die am besten untersuchte. P-Typ-ATPasen kommen sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten vor. Sie transportieren Kationen unter ATP-Verbrauch über die Membran. P-Typ-ATPasen sind dadurch charakterisiert, dass sie durch das Phosphat-Analogon Vanadat gehemmt werden und dass im Verlauf des Transportzyklus ein Aspartatrest in der hochkonservierten Sequenz AspLysThrGly phosphoryliert wird. Eine weitverbreitete Gruppe der P-Typ-ATPasen transportiert selektiv Schwermetallionen, z. B. Cadmium- oder Kupferionen, aus den Zellen. Diese P-Typ-ATPasen besitzen einige Besonderheiten und werden nach einem kurzen, aber charakteristischen Transmembran-Motiv auch als CPx-ATPasen bezeichnet. CPx-ATPasen sind bei Säugern z. B. am Kupferionenstoffwechsel beteiligt.

Die V-Typ-ATPasen kommen nur in eukaryotischen Zellen vor. Ihre Bezeichnung kommt daher, dass sie zunächst in pflanzlichen Vakuolen beschrieben wurden. V-Typ-ATPasen sind Protonenpumpen, die mit den F-Typ-ATPasen (s. u.) verwandt sind. Die Funktion der V-Typ-ATPasen liegt in der Ansäuerung intrazellulärer Kompartimente, etwa der Vakuolen oder der Lysosomen. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass V-Typ-ATPasen auch einen Protonengradienten über die Cytoplasmamembran erzeugen können, der – neben den bei tierischen Zellen dominierenden Na+-Gradienten – anderen Mechanismen als Energiequelle dient. F-Typ-ATPasen finden sich in der Cytoplasmamembran der Prokaryoten sowie den Energie konservierenden Membranen der Mitochondrien und Chloroplasten. Der Prototyp der F-Typ-ATPasen ist die F1Fo-ATPase der Mitochondrien, die analoge Form in den Chloroplasten wird entsprechend als CF1CFo-ATPase bezeichnet. Die physiologische Funktion der F-Typ-ATPasen liegt in der Synthese von ATP; sie werden daher auch als ATP-Synthasen bezeichnet. Untersuchungen zur ATPSynthese zu Beginn der 60er-Jahre führten zu dem Ergebnis, dass die ATP-bildende Struktur in zwei Fraktionen zerlegt werden kann: einer löslichen und einer membranständigen Fraktion. Die lösliche Fraktion zeigt eine ATP-hydrolysierende Aktivität. Die Wiederherstellung der ATP-synthetisierenden Eigenschaften der membranständigen Fraktion erfordert die Zugabe eines löslichen Faktors, des Kopplungsfaktor F1 (für Faktor 1). Dieser Kopplungsfaktor ist mit der löslichen Fraktion identisch. Die membranständige Fraktion wurde als Fo-Faktor bezeichnet (S. 307). Spätere Untersuchungen ergaben, dass der Fo-Teil für die Protonentranslokation verantwortlich ist. Heute sind sowohl die Struktur als auch der Mechanismus der F1Fo-ATPase aufgeklärt (S. 308).

8.4.8

Die Na+-K+-ATPase

Die Na+-K+-ATPase, häufig als Na+-K+-Pumpe bezeichnet, ist eine P-Typ-ATPase. Sie kommt in den Cytoplasmamembranen nahezu aller tierischen Zellen vor. Sie besteht aus einer etwa 110 kDa großen a-Untereinheit mit 10 Transmembranhelices, einer etwa 40 kDa großen b-Untereinheit und einer kleinen etwa

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10 kDa großen g-Untereinheit mit jeweils einer Transmembranhelix. Die b-Untereinheit besitzt eine große, stark glykosylierte extrazelluläre Domäne. Die b-Untereinheit ist an dem eigentlichen Transport nicht beteiligt, sie wird jedoch für die Assemblierung der a-Untereinheit und deren Stabilisierung benötigt. Die Funktion der g-Untereinheit ist unbekannt. Die Na+-K+-ATPase transportiert 3 Na+ unter ATP-Verbrauch im Austausch gegen 2 K+ aus der Zelle (Abb. 8.18). Dieser Vorgang ist ein energieverbrauchender Prozess, da die Ionen jeweils gegen einen steilen elektrochemischen Gradienten transportiert werden müssen ([Na+]innen = 10 mmol l–1, [K+]innen = 140 mmol l–1, [Na+]außen =145 mmol l–1, [K+]außen = 5 mmol l–1). Die ATP-Hydrolyse ist strikt an den Transport der Ionen gekoppelt; d. h. in Abwesenheit von Na+ oder K+ erfolgt keine ATP-Spaltung. In einer „durchschnittlichen“ tierischen Zelle dient fast ein Drittel der gebildeten ATP-Menge zum Antrieb der Na+-K+-Pumpe; bei spezialisierten Zellen, etwa Nervenzellen, bis zu 70 %. Die physiologische Bedeutung der Na+-K+-ATPase

Abb. 8.18 Na+-K+-ATPase. Im Verlauf eines Reaktionszyklus wechselt das Enzym zwischen zwei Konformationszuständen. Die beiden Konformationszustände, als E1 und E2 bezeichnet, können sowohl phosphoryliert als auch dephosphoryliert vorliegen, unterscheiden sich aber hinsichtlich der Affinität für Na+ bzw. K+. Die E1-Konformation weist selektive Bindungseigenschaften für Na+ auf; während die E2-Konformation K+ spezifisch bindet. Die maximale Wechselzahl (S. 187) kkat der Na+-K+-ATPase liegt bei etwa 150 s–1.

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8.4 Transportvorgänge an Membranen

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besteht darin, die unterschiedlichen Na+- bzw. K+-Konzentrationen im Cytosol bzw. der extrazellulären Umgebung zu erzeugen bzw. aufrecht zu halten. Die Energie, die bei der ATP-Spaltung frei wird, wird in einen Ionengradienten über die Membran umgewandelt, der dann für andere Transporte verwendet wird (sekundär aktiver Transport). Eine weitere wesentliche Funktion der Na+-K+-ATPase ist die Regulation des Zellvolumens. Ohne die Funktion der Na+-K+-ATPase würde aufgrund des Donnan-Effekts (S. 55) verstärkt Wasser in die Zellen gelangen, bis diese schließlich platzen würden. Durch den ständigen Austransport anorganischer Ionen, z. B. Na+, wird die Konzentration an anorganischen Ionen im extrazellulären Milieu gegenüber dem Zellinneren erhöht. Hiermit wird erreicht, dass das Zellinnere gegenüber der Umgebung in etwa isoton ist. Pflanzen und viele Bakterien besitzen keine Na+-K+-ATPase; hier sind die Zellen von einer Zellwand umgeben, die ein Platzen der – gegenüber der Umgebung – hypertonen Zellen verhindert. Ein anderer Mechanismus existiert bei einigen Einzellern: Diese Einzeller pumpen eingedrungenes, überschüssiges Wasser über kontraktile Vakuolen nach außen. Dadurch, dass im Verlauf eines Reaktionszyklus der Na+-K+-ATPase drei Na+ aus der Zelle heraus befördert und zwei K+ hinein transportiert werden, entsteht ein NettoStromfluss. Man sagt daher, die Na+-K+-ATPase ist elektrogen. Der elektrogene Effekt trägt mit zum elektrischen Membranpotential bei, bei dem das Zellinnere gegenüber dem Zelläußeren negativ geladen ist.

n Eine eingeschränkte Leistungsfähigkeit des Herzens (Herzinsuffizienz) wird mit herzwirksamen Glykosiden (Herzglykoside) therapiert. Die Wirkungen dieser Substanzen aus dem Fingerhut Digitalis purpurea oder verschiedenen StrophanthusArten sind schon seit über 200 Jahren bekannt. Die Herzglykoside bestehen aus einem Steroid-Grundkörper (Genin), welcher mit verschiedenen Zuckern konjugiert ist. Das bekannteste Herzglykosid ist das Digitoxin. Die Effekte der Herzglykoside sind vielfältig: Steigerung der Herzleistung (positiv inotrop), Verlangsamung der Schlagfrequenz (negativ chronotrop), Verlangsamung der Erregungsleitung (negativ dromotrop) und Erniedrigung der Reizschwelle (positiv bathmotrop). Die Wirkung erfolgt durch Inhibierung der Na+-K+-ATPase. Hierdurch steigt die intrazelluläre Na+-Konzentration; die K+-Konzentration sinkt. Da der elektrochemische Na+-Gradient als Antriebsquelle für den Ca2+-Na+-Antiporter der Cytoplasmamembran dient, resultiert indirekt ein verringerter Austransport von Ca2+; die intrazelluläre Ca2+-Konzentration steigt. Während der Diastole kann vermehrt Ca2+ im sarkoplasmatischen Retikulum gespeichert und dann entsprechend wieder freigesetzt werden. Durch die Abnahme der intrazellulären K+-Konzentration sinkt das Membran-Ruhepotential mit den oben erwähnten Folgen. m

8.4.9

ABC-Transporter

Die ABC-Transporter stellen die umfangreichste Familie membranständiger Transportproteine dar. Sie kommen sowohl bei Prokaryoten und Eukaryoten als auch Archaea vor. Bisher sind weit mehr als 1000 ABC-Transporter unterschiedlicher Spezifität bekannt. Im Genom von E. coli wurden 80; beim Menschen 48 ABC-Transporter identifiziert (Abb. 8.19). Charakteristisch für diese Proteinfamilie ist eine konservierte ATP-Bindungs-Kassette (ATP binding cas-

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8 Membranen

Abb. 8.19 ABC-Transporter. Diese bestehen in der Regel aus vier Domänen: zwei Transmembrandomänen (TMD) mit meistens jeweils sechs Transmembranhelices und zwei cytoplasmatischen ATP-bindenden Domänen (ATP binding cassette, ABC). Die Quartärstruktur der ABC-Transporter kann unterschiedlich sein und ist für verschiedene Beispiele gezeigt. a Jede Domäne wird von einer Polypeptidkette gebildet. b Die cytoplasmatischen Domänen liegen beide auf einer Polypeptidkette. c Jeweils eine membranständige und eine ATP-bindende Domäne befinden sich auf einer Polypeptidkette oder d alle vier Domänen werden von einer einzigen Polypeptidkette gebildet. e CFTR besitzt noch eine zusätzliche, regulatorische Domäne (R). ABC-Transporter der Struktur a und b kommen überwiegend bei Prokaryoten vor; bei Eukaryoten hängen ABC- und Transmembrandomäne meist zusammen.

sette). ABC-Transporter sind für eine Vielzahl von Transportprozessen zuständig; die Größe der transportierten Substanzen reicht von anorganischen Ionen bis hin zu großen Proteinen. Bei Bakterien befinden sich die ABC-Transporter in der Cytoplasmamembran. Hier arbeiten die Transporter mit einem jeweils spezifischen periplasmatischen Bindeprotein (BP) oder einem spezifischen Kanal in der äußeren Membran zusammen. Über Porine gelangen z. B. kleine Nährstoffmoleküle in den periplasmatischen Raum. Hier werden sie von den spezifischen Bindeproteinen (BPs) gebunden. Die BPs binden mit sehr hoher Affinität an die jeweiligen Substrate und anschließend an die entsprechenden ABC-Transporter. Von diesen wird das Substrat übernommen und unter ATP-Verbrauch über die Membran transportiert. Erst nach Bindung der beladenen BPs an die ABC-Transporter erfolgt die ATP-Hydrolyse. Ein ATP-Verbrauch erfolgt somit nur bei Anwesenheit entsprechender Substrate. Solche Importmechanismen gibt es bei Bakterien für verschiede Zucker und Aminosäuren, z. B. Maltose, Ribose, Galactose, Histidin, aber auch für Vitamin B12 und verschiedene Eisenkomplexe. ABC-Transporter können auch Substanzen aus den Zellen ausschleusen. Beispiele hierfür sind die Toxine Hämolysin oder Colicin V sowie einige Proteasen. Einer der ersten ABC-Transporter, der bei Eukaryoten beschrieben wurde, ist das MDR1-Protein (multi drug resistance). Dieses Protein transportiert verschie-

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8.4 Transportvorgänge an Membranen

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dene Moleküle, darunter auch Arzneimittel, aus der Zelle. In einigen Krebszellen wird MDR1 stärker exprimiert, Wirkstoffe werden in diesen Zellen verstärkt ausgeschieden und bleiben wirkungslos. In den letzten Jahren sind viele ABC-Transporter identifiziert worden, die einen Signalpeptid-unabhängigen Transport von Peptiden oder Proteinen in verschiedene Organellen ermöglichen, etwa Lysosomen, Peroxisomen oder Mitochondrien. Beispielsweise transportiert das TAP1/TAP2-Heterodimer (transporter associated with antigen presentation) Peptide, die beim Abbau von Proteinen entstehen (z. B. in den Proteasomen) über die Membranen des ER. Im Lumen des ER werden die Peptide vom MHCI-Komplex (major histocompatibility complex class I, Zoologie) gebunden. Sowohl bei Hefe als auch bei Säugerzellen wird der Transport verschiedener Proteine bzw. Peptide über die Cytoplasmamembran von ABC-Transportern bewerkstelligt: Beispielsweise sezernieren Säugerzellen Interleukin-1b oder das Protein Thioredoxin mit Hilfe von ABC-Transportern. Über die physiologische Funktion dieser Sezernierungsmechanismen ist wenig bekannt. Es könnte sich bei diesen Transportern um eine Einrichtung zur Entfernung toxischer oder funktionsunfähiger („gealterter“) Proteine handeln oder die Transporter dienen als eine Art „Überlaufventil“ zur Kontrolle des cytoplasmatischen Proteinspiegels. Die Mukoviszidose (wörtlich übersetzt: „voll mit zähem (viscidus) Schleim (muco)“; auch als cystische Fibrose bezeichnet) ist eine der häufigsten Erbkrankheiten in Deutschland (etwa 1 : 2500). Bei den Patienten sezernieren die exokrinen Drüsen, betroffen sind vor allem Lunge, Bronchien und Verdauungstrakt, aufgrund eines gestörten Elektrolythaushalts ein wasserarmes Sekret. Die Schleimhäute sind entsprechend sehr infektanfällig, die Atemfunktion und die Nahrungsverwertung stark eingeschränkt. 1989 wurde das der Krankheit zugrunde liegende Gen identifiziert. Das Genprodukt, als CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) bezeichnet, ist ein regulierter Chloridkanal aus der Familie der ABC-Transporter. Bei Mukoviszidose-Patienten ist Phe508 häufig deletiert. Diese Mutation führt zu einem instabilen Protein, das gleich wieder im Proteasom degradiert wird, sodass kein funktionstüchtiger Cl-Kanal in die Zellmembran gelangt. Die Viskosität des gebildeten, wasserarmen Sekrets wird durch absterbende Zellen bzw. der hierbei freigesetzten DNA noch verstärkt. Bislang kann den Mukoviszidose-Patienten nur durch Linderung der Symptome geholfen werden. In einigen Fällen ist die Einschleusung eines intakten Gens (Gentherapie) gelungen, die entsprechenden Zellen wurden durch das Immunsystem jedoch wieder eliminiert.

Passage der Membran durch Diffusion: Lipophile Substanzen, kleine hydrophile Substanzen, z. B. Wasser oder Harnstoff. Passage der Membran durch Transportproteine: Stark polare Moleküle sowie größere Moleküle. Ionenkanäle: Wassergefüllte Membranporen, die auf den passiven, dem elektrochemischen Gradienten folgenden Transport von anorganischen Ionen spezialisiert sind, Ionenkanäle können durch Liganden gesteuert werden. Carrier (Translokator): Transportproteine, binden stöchiometrisch an die zu transportierende Substanz, Transport kann passiv oder aktiv sein.

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8 Membranen

Uniport: Carrier-vermittelter Transport einer Substanz über die Membran. Beispiel: Glucose-Permease. Cotransport: Gleichzeitiger Transport zweier Substanzen. Symport: Carrier-Transport bei dem zwei unterschiedliche Substanzen in der gleichen Richtung über die Membran transportiert werden. Beispiel: LactosePermease. Antiport: Carrier-Transport, bei dem zwei unterschiedliche Stoffe in entgegen gesetzter Richtung über die Membran transportiert werden. Beispiel: Na+-K+ATPase. Erleichterte Diffusion: Passiver Transport durch Carrier oder Kanäle, im Unterschied zur freien Diffusion ein sättigbarer Vorgang. Aktiver Transport: Resultiert in einer Erhöhung der freien Enthalpie der transportierten Substanz nach dem Transport. Benötigt stets eine Energiequelle, prinzipiell drei unterschiedliche Mechanismen: Primär aktiver Transport, sekundär aktiver Transport und Gruppentranslokation. – Primär aktiver Transport: Der energieliefernde Schritt (ATP, Licht) ist direkt mit dem Transportvorgang verbunden (z. B. Na+-K+-ATPase; ABC-Transporter, lichtgetriebene Protonentranslokation durch Bakteriorhodopsin). – Sekundär aktiver Transport: Nutzt den von einem primär aktiven Transporter generierten elektrochemischen Gradienten einer Substanz, um eine andere Substanz entgegen deren elektrochemischen Gradienten zu transportieren (Beispiel: Na+-Glucose-Symporter, Gradient durch Na+-K+-ATPase). Ionophore: Antibiotika, die zum Zusammenbruch des Membranpotentials führen, indem sie die Membranpassage von Ionen ermöglichen. Aquaporine: Spezifische Wasserkänale in der Membran. Ionenpumpen: Transportproteine, die auf den aktiven Transport von anorganischen Ionen spezialisiert sind, verwenden ATP als Energiequelle, Unterteilung in drei Gruppen hauptsächlich aufgrund des Katalysemechanismus: P-Typ-ATPasen, V-Typ-ATPasen, F-Typ-ATPasen. Na+-K+-ATPase (Na+-K+-Pumpe): P-Typ-ATPase, wichtigste Ionenpumpe tierischer Organismen, transportiert unter ATP-Verbrauch 3 Na+ im Austausch gegen 2 K+ aus der Zelle heraus. ABC-Transporter: Umfangreiche Gruppe ATP-getriebener Membrantransporter mit weitem Substratspektrum.

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9.1 Die Kompartimentierung der eukaryotischen Zelle

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Die eukaryotischen Zellkompartimente

Thomas Kurth, Beate Schultze

9.1

Die Kompartimentierung der eukaryotischen Zelle

Das Cytoplasma der Eucyte ist in verschiedene Kompartimente unterteilt, in denen verschiedene Reaktionen ablaufen, ohne sich gegenseitig zu beeinträchtigen. Die Kompartimente sind mit Ausnahme der Mitochondrien, Plastiden und Microbodies durch Membranfluss untereinander verbunden. In den Kompartimenten in denen membrangebundene Reaktionen stattfinden sind die Membranoberflächen durch Einstülpungen oder innere Membranen stark vergrößert.

9 Eukaryotische Zellen sind durch innere Membranen in mehrere funktionell unterscheidbare Reaktionsräume, sogenannte Zellorganellen oder Kompartimente unterteilt (Abb. 1.3; Tab. 9.1). Dazu gehören als größter Reaktionsraum das Cytosol selbst, in dem eine Vielzahl an metabolischen Stoffwechselwegen, die Proteinbiosynthese und die Elemente des Cytoskeletts lokalisiert sind, sowie die anderen Kompartimente: Mitochondrien, Plastiden, Microbodies, raues bzw. glattes endoplasmatisches Retikulum (ER), Golgi-Apparat, Lysosomen, Transportvesikel und der Zellkern. In diesen membranumhüllten Reaktionsräumen laufen Stoffwechselprozesse getrennt und ungestört voneinander ab (Tab. 9.1). Die Kompartimentierung ist dynamisch, d. h. die verschiedenen membranumgebenen Strukturen stehen direkt oder indirekt über Transportvesikel miteinander oder mit der Cytoplasmamembran in Verbindung. So werden z. B. Vesikel vom Golgi-Apparat abgeschnürt und zu anderen Kompartimenten oder zur Cytoplasmamembran transportiert. Von der Cytoplasmamembran wiederum wird durch Endo- bzw. Pinocytose ständig Membranmaterial internalisiert. Es entsteht ein kontinuierlicher Membranfluss innerhalb der Zelle. Bei einem Fibroblasten z. B. wird die gesamte Cytoplasmamembran innerhalb von ca. drei Stunden vollständig ausgetauscht. Der Membranfluss sorgt für den kontinuierlichen Austausch von Substanzen sowohl zwischen den Kompartimenten untereinander als auch zwischen der Zelle und ihrer Umgebung. Mitochondrien, Plastiden und Microbodies sind nicht am Membranfluss beteiligt. Mitochondrien und Plastiden sind von zwei Membranen umgeben und stehen weder untereinander noch mit den anderen Kompartimenten in dauerhafter Verbindung. Der Stoffaustausch erfolgt ausschließlich durch die Membranen hindurch.

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9 Die eukaryotischen Zellkompartimente

Tab. 9.1 Kompartimente der eukaryotischen Zelle und ihre wichtigsten Funktionen. Lysosomen kommen nur in tierischen, Glyoxysomen und Plastiden nur in pflanzlichen Zellen vor, Vakuolen in Pflanzen- und Pilzzellen. Kompartiment

Wichtigste Funktion

Cytoplasma

zahlreiche Stoffwechselwege; Ribosomen (Proteinsynthese), intrazelluläre Bewegung

Endoplasmatisches Retikulum (ER)

Synthese von Membran-, Export- und Lysosomenproteinen, Lipidsynthese, Calciumspeicher

Golgi-Apparat

Modifizieren, Sortieren und Verpacken der Proteine und Lipide für die Sekretion oder den Transport zu anderen Organellen, Oligo- und Polysaccharidsynthese

Endosomen

Sortieren des endocytierten Materials

Microbodies (Peroxysomen, Spezialaufgaben (Oxidation toxischer Verbindungen, Glyoxysomen, Glykosomen) Glyoxylatzyklus)

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Lysosomen

intrazelluläre Verdauung

Vakuolen

intrazelluläre Verdauung, Speicherung, Deponie, Turgor

Mitochondrien

Atmung, b-Oxidation, Citratzyklus

Plastiden

Photosynthese, Lipidsynthese, Speicherung (Stärke, Pigmente)

Form und Größe der Kompartimente in einer Zelle können sehr unterschiedlich sein. Konstant ist jedoch die spezifische Oberfläche, d. h. das Verhältnis von Volumen zu Kompartimentoberfläche. Transportvesikel und Speichervesikel haben eine relativ kleine spezifische Oberfläche, ebenso Lysosomen, Microbodies und Zellkern, da in diesen Kompartimenten die Funktionen und Stoffwechselvorgänge im löslichen Anteil ablaufen. Andere Kompartimente haben ihre spezifische Oberfläche durch röhrenförmige oder flächige Ausdehnungen oder durch Einstülpungen der Membranen stark vergrößert. Bei diesen Kompartimenten sind die Funktionen membrangebunden. Beispiele hierfür sind die inneren Membranen der Mitochondrien und Chloroplasten. Sie enthalten die Enzyme der Atmungskette bzw. die der Photosynthese.

Kompartiment: Durch eine Membran vom übrigen Raum abgetrennter Bereich einer Zelle. Kompartimente der eukaryotischen Zelle: Cytosol; Nucleus (zwei Membranen); raues bzw. glattes endoplasmatisches Retikulum (ER); Golgi-Apparat; Lysosomen; Mitochondrien (zwei Membranen); Microbodies; Plastiden (pflanzliche Zellen, zwei Membranen); Vakuole (pflanzliche Zellen und Pilze).

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9.2 Der Zellkern

9.2

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Der Zellkern

Der Zellkern, Nucleus, ist von einer Doppelmembran umgeben, die äußere der beiden Kernmembranen geht in die Membranen des ERs über. Im Zellkern ist bis auf wenige Ausnahmen die gesamte genetische Information der Zelle lokalisiert: Die DNA ist mit Proteinen und RNA assoziiert und füllt als Chromatin das gesamte Nucleoplasma aus. Darin liegen als kugelige Strukturen die Nucleoli, an denen die Ribosomen synthetisiert werden. Der nucleoplasmatischen Seite der inneren Kernmembran liegt die Lamina an. Das Proteinnetzwerk hat stützende Funktionen und spielt vermutlich eine Rolle bei der Chromatinorganisation. Der Transport von Makromolekülen aus dem Cytosol in den Zellkern und umgekehrt erfolgt über die Kernporenkomplex. Der gerichtete GTP-abhängige Kerntransport ist abhängig von Signalsequenzen in den zu transportierenden Molekülen (Kernlokalisationssignal, nucleäre Exportsignale) und Transportrezeptoren (Importin, Exportin). Auffälligstes Strukturmerkmal der eukaryotischen Zelle ist der Zellkern (Nucleus). Er ist das logistische Zentrum einer jeden eukaryotischen Zelle. Mit Ausnahme einiger weniger Gene, die auf der DNA von Mitochondrien und Chloroplasten lokalisiert sind, enthält der Zellkern die gesamte genetische Information einer Zelle, das Genom. Der Zellkern ist häufig kugelförmig mit einem Durchmesser von 8 bis 10 mm, kann aber auch sehr vielgestaltig und durchaus unterschiedlich groß sein (Abb. 9.1). In den meisten tierischen Zellen ist er das größte Kompartiment und nimmt dabei durchschnittlich 10 % des Gesamtvolumens ein. Üblicherweise besitzen eukaryotische Zellen nur einen Zellkern. Ausnahmen bilden z. B. Ciliaten, einzellige Eukaryoten, die einen großen Makronucleus besitzen, der als somatischer Zellkern den Zellmetabolismus steuert, und einen kleinen Mikronucleus, der als generativer Zellkern ausschließlich Genspeicherfunktion hat. Verbreitet ist auch die Bildung sogenannter Syncytien (mehrere Kerne in einem gemeinsamen cytoplasmatischen Raum, Zoologie), etwa bei adulten Skelettmuskelzellen, den Osteoklasten des Knochens oder bei der Larvenentwicklung der Fruchtfliege Drosophila. Es gibt aber auch eukaryotische Zellen, die gar keinen Zellkern haben. Säugererythrocyten z. B. verlieren im Laufe ihrer Differenzierung ihren Zellkern, damit der durch sein innen aufliegendes Lamina-Proteingerüst starre Zellkern sie nicht bei ihrer Passage durch sehr enge Kapillaren behindert. Eine Doppelmembran, die innere und die äußere Kernmembran (INM, inner nuclear membrane und ONM, outer nuclear membrane), trennt das Nucleoplasma vom Cytoplasma. Bei dieser Doppelmembran, auch als Kernmembran oder Kernhülle bezeichnet, handelt es sich nicht, wie bei anderen mit einer Doppelmembran ausgestatteten Organellen, um ein isoliertes Membransystem. Die Kernhülle stellt vielmehr eine Art Ausläufer des ER dar. Dabei „umlappen“

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9 Die eukaryotischen Zellkompartimente

Teile der ER-Membran das Nucleoplasma und schaffen damit ein separates Zellkompartiment (Abb. 9.1). Die äußere Kernmembran geht kontinuierlich in die Membranen des ERs über, auch der bis zu 60 nm breite Raum zwischen beiden Kernmembranen, als perinucleärer Spalt oder Perinuclearzisterne bezeichnet, steht mit dem Lumen des ERs in Verbindung. Die Kernmembran kann wie das ER auf der Außenseite mit Ribosomen, auf der Innenseite – d. h. zum Lumen des perinucleären Spaltes hin – mit Signalpeptidasen und Glykosyltransferasen besetzt sein. Die Kernmembran ist regelmäßig von sehr großen Poren durchsetzt.

9

Abb. 9.1 Zellkern. a Schematischer Querschnitt durch einen Zellkern. Die Kernhülle besteht aus zwei Membranen, die an den Kernporen zusammentreffen. Die äußere Membran geht kontinuierlich in das ER über. b Histologischer Schnitt durch eine Duftdrüse der Haut. Die Kerne der Epithelzellen sind rund, mit deutlich sichtbarem Nucleolus (Pfeile), während die Kerne der Myoepithelzellen (My, unterstützen den Sekretionsvorgang) kleiner und flacher sind (Pfeilspitzen). Lu, Lumen. c Der segmentierte Kern eines reifen, neutrophilen Granulocyten im Blutausstrich. Ery, Erythrocyt. d Nucleoplasmin-Antikörpermarkierung (grün) in den Zellen eines Xenopus-Embryos. Das Protein ist in der Interphase nucleär und während der Mitose cytoplasmatisch lokalisiert. Das erfordert den Reimport in den Kern nach jeder Zellteilung. Zellgrenzen sind rot markiert (Antikörperfärbung von b-Catenin, S. 26). In den beiden mitotischen Zellen sind die Chromosomen blau markiert (DAPIFluoreszenz, S. 24). e Darmepithelzellen (En, Enterocyt) einer Kaulquappe. Zellkerne (Nu) sind blau (DAPI), Zellgrenzen rot (b-Catenin) markiert. (B–E, Originale, T. Kurth)

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9.2 Der Zellkern

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An dieser Stelle berühren sich innere und äußere Kernmembran. Die riesigen Strukturen werden als Kernporenkomplexe bezeichnet und haben einen Durchmesser von bis zu 120 nm. Der Zellkern ist kein dauerhaftes Kompartiment (S. 518). Bei den meisten eukaryotischen Zellen löst er sich vor der eigentlichen Zellteilung in der Prometaphase vollständig auf, die Kernhülle fragmentiert in eine Vielzahl kleiner Membranvesikel, die sich zum Teil mit anderen Vesikelchargen der Zelle vermengen. Die Auflösung des Zellkerns vereinfacht eine reibungslose Trennung der homologen Chromosomen und somit die identische Aufteilung des Genoms auf die beiden Tochterzellen. Nach der Teilung der Zelle und der Bildung der Tochterzellen in der späten Anaphase bildet sich die Kernmembran dann wieder neu und rekrutiert hierfür auch jene aus dem Zellkern der Mutterzelle hervorgegangenen Kernmembranvesikel. Auch dieser Vorgang verdeutlicht den Membranfluss innerhalb einer Zelle. Der entscheidende Vorteil eines Zellkerns ist die räumliche und zeitliche Trennung der RNA-Synthese (Transkription) von der Proteinbiosynthese (Translation). In prokaryotischen Zellen sind beide Vorgänge nicht voneinander getrennt: Während die bakterielle RNA-Polymerase das RNA-Transkript von der DNA abliest, besetzen bereits erste Ribosomen das 5l-Ende der noch unfertigen mRNA und beginnen mit der Proteinbiosynthese. Zwar erlaubt auch diese schnelle Abfolge beider Vorgänge spezielle Regulationen (Attenuation, Genetik, Mikrobiologie), für das Editieren und Variieren der mRNA bleibt aber keine Zeit mehr. Die prokaryotische Zelle benutzt also gleich die erste „Blaupause“ als unmittelbare Proteinbauanleitung, oder, umgekehrt formuliert, die Bauanleitungen für alle Genprodukte, alle Proteine und alle Enzyme müssen bereits auf DNA-Ebene exakt so abgespeichert sein, wie sie später als Genprodukt gebraucht werden. In eukaryotischen Zellen wird eine transkribierte mRNA vielfältig modifiziert, bevor sie den Zellkern zur Proteinbiosynthese im Cytoplasma verlässt. Zu den posttranskriptionalen Modifikationen gehört das Spleißen: Eukaryotische Gene enthalten codierende Bereiche (Exons) und nicht codierende Bereiche (Introns). Diese zerstückelten Gene resultieren wahrscheinlich daraus, dass im Laufe der Evolution die Vervielfältigung und Neukombination von Exons zu Proteinen mit neukombinierten Proteindomänen und –strukturen führte, was erheblich zur Bildung der genetischen Vielfalt eukaryotischer Zellen beitrug. Die Introns werden zwar mit transkribiert, aber noch im Zellkern Genetik). aus der mRNA herausgeschnitten (Spleißen,

9.2.1

Das Chromatin

Die DNA als Träger der genetischen Information liegt im Zellkern nicht alleine als riesiges, fädiges Molekül vor; vielmehr ist sie mit Proteinen und in kleineren Mengen mit RNA assoziiert. Die Gesamtheit dieses Riesenkomplexes wird als Chromatin bezeichnet. Der Inhalt des Zellkerns, das Nucleo- oder Karyoplasma, besteht im Wesentlichen aus dem Chromatin. Während der Interphase einer Zelle erscheint das Chromatin eher unstrukturiert. Unterschieden wird lediglich zwischen dem dichten Euchromatin und dem lichteren Heterochromatin, Orte besonders intensiver Transkription, deren lockere Packung das Ablesen und Bearbeiten von Genen gestattet. Die im Lichtmikroskop sichtbaren Chromoso-

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9 Die eukaryotischen Zellkompartimente

men stellen eine besonders straff kondensierte Verpackungs- und Transportform des Chromatins dar. Sie ist nur kurz vor und während der Mitose existent, um die DNA gleichmäßig und reibungslos auf die beiden Tochterzellen verteilen zu können. Während dieser Zeit ist die DNA funktionell inaktiv; es findet keine Transkription oder Replikation statt ( Genetik). Den überwiegenden Proteinanteil des Chromatins stellen die einheitlichen Histone. Diese haben eine wichtige Funktion bei der räumlichen Organisation der DNA und bei der Regulation der Transkription ( Genetik). Ihnen steht die sehr heterogene Gruppe der Nicht-Histon-Proteine gegenüber, zu denen z. B. die Enzyme der DNA-Vervielfältigung, der DNA-Reparatur, der Transkription und die Transkriptionsfaktoren gehören.

9.2.2

9

Der Nucleolus

Im Karyoplasma sind eine oder mehrere kugelförmige Strukturen, die Nucleoli, auch Kernkörperchen genannt, zu erkennen. (Abb. 9.1b). Sie sind Orte der Ribosomen-Biogenese. Elektronenmikroskopisch lassen sich die Bereiche unterscheiden, in denen die unterschiedlichen Phasen beim Aufbau der aus zwei Untereinheiten bestehenden Protein-RNA-Komplexe ablaufen: – das fibrilläre Zentrum, das vermutlich inaktive DNA-Bereiche darstellt; – eine fibrilläre Komponente, an der gerade ribosomale RNAs gebildet werden, und – eine granuläre Komponente, an der der „Selbstzusammenbau“ (self-assembly) der Komponenten zu den Untereinheiten stattfindet. In den Nucleolus reichen große, schleifenartige DNA-Abschnitte hinein, auf denen die Gene für die ribosomalen RNAs (rRNA) in vielen Kopien tandemartig hintereinander angeordnet sind. An diesem Abschnitt, als Nucleolus-Organisator-Region (NOR) bezeichnet, bildet die RNA-Polymerase I (bei Eukaryoten existieren drei verschiedene RNA-Polymerasen) ein 45S-Primärtranskript, aus dem durch Prozessierung die 18S-rRNA der kleineren 40S-Untereinheit sowie die 5,8S-rRNA und die 28S-rRNA der größeren 60S-Untereinheit entstehen. Die 5S-rRNA der 60S-Untereinheit wird außerhalb der Nucleoli von der RNA-Polymerase III transkribiert und dann zu den Kernkörperchen transportiert. Die ribosomalen Proteine werden nach ihrer Synthese im Cytoplasma in den Zellkern importiert und zum Nucleolus dirigiert. Der Zusammenbau der einzelnen Proteine und RNAs zu ribosomalen Untereinheiten geschieht dann in einem Self Assembly-Prozess und in streng geordneter Reihenfolge. Die vollständig zusammengebauten 40S- und 60S-ribosomalen Untereinheiten werden anschließend ins Cytoplasma exportiert. Die Existenz der Nucleoli ist ebenso wie der Zellkern selbst vom Zellzyklus (S. 515) abhängig. Zu Beginn der Mitose, in der Prophase, lösen sich die Nucleoli vollständig auf. Zu diesem Zeitpunkt kommt mit der dichten Verpackung der DNA in die Chromosomen die RNA-Synthese und damit auch die der rRNA

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9.2 Der Zellkern

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zum Erliegen. Nach der Zellteilung erscheinen in den Tochterzellen zu Beginn der G1-Phase zunächst viele kleinere Nucleoli, die dann zu einem Nucleolus oder sehr wenigen größeren Nucleoli zusammentreten.

9.2.3

Kernlamina und Kernmatrix

Auf der Außenseite ist die Kernmembran mit Elementen des Cytoskeletts verankert. Der inneren Kernmembran ist auf der nucleoplasmatischen Seite die Lamina, ein dichtes Proteinnetzwerk, aufgelagert. Dieses Geflecht besteht aus den drei unterschiedlichen Laminproteintypen A, B und C (70, 67 und 62 kDa). Sie sind verwandt mit den Proteinen des Cytoskeletts, die die intermediären Filamente formen (S. 466). Die Lamina ist über membranintegrale laminbindende Proteine wie den Lamin-B-Rezeptor in der inneren Kernmembran verankert (Abb. 9.2). Sie stützt die Kernhülle von innen und verschafft ihr mechanische Stabilität. Wahrscheinlich spielen die Laminae auch eine Rolle bei der strukturellen Organisation des Chromatins. Während der Auflösung der Kernhülle in der Prometaphase dissoziiert auch die Lamina in ihre einzelnen Proteinbestandteile. Eingeleitet wird diese Dissoziation durch eine starke Phosphorylierung der Laminae durch spezielle Kinasen (cdc2-Kinase, auch Cdk1 genannt sowie die Proteinkinase C). Beide Kinasen werden zellzyklusabhängig aktiviert und deaktiviert (S. 514). Nach der Phosphorylierung liegen die Laminae A und C dann frei im Cytoplasma gelöst vor, die Laminae des B-Typs bleiben mit den aus der Kernhülle hervorgehenden Membranvesikeln assoziiert. Die Dephosphorylierung der Laminae in der späten Anaphase initiiert dann die Rekonstruktion des Laminanetzwerks und damit den Wiederaufbau der Kernhülle. Das Innere eines Zellkerns ist keine homogene Mixtur bestehend aus DNA, RNA und Proteinen. Vielmehr ist das Nucleoplasma straff organisiert. Dies wirft die Frage nach einem strukturgebenden, stützenden Kernskelett im Nucleoplasma auf. Die komplexen Prozesse im Zellkern wie DNA-Replikation und -Reparatur, RNA-Transkription, -Prozessierung und RNA-Transport wären ohne ein solches Kernskelett wahrscheinlich nicht möglich. Tatsächlich gibt es eine Reihe von experimentellen Indizien, die auf die Existenz einer Kernmatrix hindeuten. So bleiben z. B. nach verschiedenen Extraktionsmethoden stets einige unlösliche Matrixproteine in Zellkernhüllen zurück. Allerdings wurden viele dieser Eiweißmoleküle als Lamine oder als Proteine identifiziert, die die Organisation der DNA oder die Verpackung der RNA bewerkstelligen, so z. B. die heterogenen nucleären Ribonucleoproteine (hnRNP), die an noch ungespleißte RNA binden. Auch wurden Proteine identifiziert, die an sogenannte Matrix-assoziierte Regionen (MARs) der DNA binden. Die weitere Proteinzusammensetzung dieser „Kernmatrix“ ist sehr uneinheitlich und hängt stark vom Organismus und dem Zelltyp ab. Bis heute konnte keine In-vivo-Struktur dieser Matrixproteine in Form eines Kernskeletts sicher nachgewiesen werden. Die Untersuchung

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9 Die eukaryotischen Zellkompartimente

dieser Fragestellung ist aufgrund der dichten DNA-Packung außerordentlich schwierig. Die Entfernung der DNA stellt einen so entscheidenden Eingriff in die innere Organisation des Zellkerns dar, dass eine eventuell vorhandene Kernmatrix dadurch in Mitleidenschaft gezogen wird.

9.2.4

9

Der Kernporenkomplex

Die Kernmembran schafft zwar die für einen Eukaryoten erforderliche Trennung von Kern und Cytoplasma, macht damit aber auch einen intensiven Stoff- und Informationsaustausch über die Kernmembran nötig. Diese Aufgabe übernehmen spezielle Poren, ihre Anzahl schwankt erheblich und liegt, je nach Zelltyp und -zyklus, zwischen 2 und 60 pro mm2. Die Poren sind mit ca. 30 unterschiedlichen Proteinen, den Nucleoporinen (Nups), ausgekleidet. Sie bilden zusammen den wohl größten und kompliziertesten Proteinkomplex in der Natur, den Kernporenkomplex (NPC, nuclear pore complex). Seine molare Masse reicht von 65 MDa bei Saccharomyces cerevisiae bis zu 120 MDa bei Oocyten des Krallenfrosches Xenopus laevis. Die meisten Kenntnisse über die Struktur des NPCs stammen aus elektronenmikroskopischen Untersuchungen an Xenopus-Oocyten. Der NPC hat eine zylindrische Grundstruktur mit einem Durchmesser von ca. 125 nm bei einer Gesamthöhe von ca. 70 nm. Er weist eine achtfache Symmetrie auf. Ein Ringsystem auf der nucleoplasmatischen Seite und eine weitere Ringstruktur auf der cytoplasmatischen Seite sind über ein Achtspeichensystem miteinander verbunden und bilden eine Art Grundgerüst. Der etwas größere cytoplasmatische Ring (Durchmesser ca. 120 nm, ca. 32 MDa) trägt acht Fibrillen, die weit in das Cytoplasma reichen. Diese Fibrillen sind die ersten Kontaktstellen z. B. für kernständige Proteine, die in den Zellkern importiert werden und hierfür den NPC passieren müssen. Von dem kleineren nucleoplasmatischen Ring (Durchmesser 60–80 nm, ca. 21 MDa) reichen ebenfalls acht Fasern in Richtung Kern, die dort aber nicht blind enden, sondern in einen kleineren Ring münden. Dieser die Fasern verbindende Ring und die Fasern selbst werden unter dem Begriff „nucleoplasmatischer Korb “ zusammengefasst. Dieser Korb scheint Transportmoleküle, die exportiert werden müssen, erstmals zu binden. Das zentrale Speichensystem der Kernpore bildet acht kleinere Seitenkanäle und einen großen zentralen Transportkanal. Auf einigen elektronenmikroskopischen Bildern ist noch ein zentrales Partikel zu erkennen. Ob dieser Zentralkörper ein regulärer Bestandteil des NPCs ist, oder ob es sich um ein gerade transportiertes Makromolekül handelt, ist noch unklar (Abb. 9.2).

Die Vielzahl an Proteinen und die Komplexität und Größe der Kernpore selbst machen die biochemische Charakterisierung der einzelnen Bestandteile des NPCs sehr schwierig. Viele Proteine sind glykosyliert (O-glykosidisch gebundene N-Acetylglucosaminreste). Dies ist möglicherweise der Grund dafür, warum Weizenkeimagglutinin, ein tetrameres Lektin, das an N-Acetylglucosaminreste bindet, fast alle Kerntransportprozesse zum Erliegen bringt. Nucleoporine tragen häufig charakteristische Proteinmotive wie Zinkfinger und Leucin-Reißverschlüsse (Leucin-Zipper) (S. 140, Abb. 4.12), die für die Protein-Protein- oder Protein-DNA-Wechselwirkungen verantwortlich sind. Charakteristisch für eine

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9.2 Der Zellkern

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Vielzahl von Nucleoporinen sind die häufig wiederkehrenden Aminosäureabfolgen von Phenylalanin, Glycin und auch von Leucin.

9.2.5

Kerntransportprozesse

Eine mögliche Antwort auf die Frage nach der außergewöhnlichen Größe und Komplexität der Kernpore ist, dass über die Zellkernmembran auch sehr große Makromoleküle transportiert werden müssen. Im Zellkern gebildete mRNA-Moleküle werden in das Cytoplasma exportiert, wo sie als Matrize für die Proteinbiosynthese fungieren. Diese mRNA-Moleküle von zum Teil beträchtlicher Länge sind zudem noch mit einer Vielzahl an mRNA-bindenden Proteinen assoziiert, sie werden in dieser Form auch als Ribonucleoprotein-Partikel bezeichnet. Sie werden linearisiert durch den Transportkanal der Kernpore geschleust. Die im Zellkern zusammengebauten ribosomalen Untereinheiten aber müssen als globuläre Makromoleküle die Kernpore passieren. Zu diesem Zeitpunkt hat die große 60S-ribosomale Untereinheit bereits eine molare Masse von 2,8 MDa und einen Durchmesser von ca. 20–30 nm. Um ein solches Molekül passieren zu lassen, bedarf es eines außergewöhnlich großen Transportkanals. Diese Pore kann aber nicht „nackt“ bleiben – sie wäre instabil und nicht lange von Bestand – sie muss mit entsprechend vielen Proteinen ausgekleidet sein. Diese notwendige umfangreiche Proteinausstattung ist möglicherweise auch der Grund dafür, dass der Zellkern die Kernpore als Transportkanal für viele unterschiedliche Moleküle, sowohl für die großen Ribonucleoprotein-Partikel, als auch für einzelne Proteine, Nucleotide und sogar Ionen, nutzt. Kleine, lösliche Moleküle bis zu einer Größe von 5 kDa scheinen die Kernpore passiv zu durchqueren. Man vermutet eine effektive Porengröße von ca. 9 nm. Größere Moleküle werden aktiv transportiert. Neuere Patch-clamp-Untersuchungen ( Zoologie) belegen, dass die Kernpore darüber hinaus Ionenkanaleigenschaften aufweist, sie z. B. einzelne Calciumionen hochselektiv und reguliert transportiert. Auch die ATP-Konzentration des Nucleoplasmas ist etwas höher als die des Cytoplasmas. Während vorwiegend RNPs (s. u.) aus dem Zellkern exportiert werden, sind es im Wesentlichen Proteine, die in großem Umfang in den Zellkern importiert werden. Mit einigen Ausnahmen: So gibt es eine Reihe spezieller Proteine, die aus dem Zellkern reexportiert werden oder die zwischen Nucleo- und Cytoplasma pendeln. Umgekehrt gilt für einige spezielle RNATypen, dass sie auch in den Zellkern reimportiert werden können oder auch zwischen Nucleo- und Cytoplasma pendeln.

Der Kernimport Der Import vieler kernständiger Proteine ist vom Vorhandensein einer nucleären Lokalisationssequenz, kurz NLS (nuclear localization signal), auch Kernlokalisationssignal genannt, abhängig. Im Gegensatz zu anderen Proteinzielsteuerungssignalen wird die NLS nach Erreichen des Zellkerns nicht abgespalten, sondern

Aus Munk, Katharina: Taschenlehrbuch Biochemie-Zellbiologie (ISBN 978-313-144831-6) © 2008 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart Dieses Dokument ist nur für den persönlichen Gebrauch bestimmt und darf in keiner Form an Dritte weitergegeben werden!

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bleibt dem Protein erhalten. Daher muss die NLS nicht an den Enden eines Proteins lokalisiert sein, sondern kann sich an jeder beliebigen Position in dem zu importierenden Protein befinden. Der Grund, warum die NLS des karyophilen Proteins nicht entfernt werden darf, liegt in der zellzyklusabhängigen Auflösung des Zellkerns. Hierbei werden auch die kernständigen Proteine in das Cytoplasma freigesetzt (Abb. 9.1d). Nach der Rekonstitution der Kernmembran müssen die nucleoplasmatischen Proteine dann wieder in den Zellkern reimportiert werden; sie werden also häufiger als nur ein einziges Mal in den Kern transportiert.

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Die zuerst charakterisierte NLS ist die des großen T-Antigens des SV40-Virus. Dieses virale 92-kDa-Protein reguliert die Replikation und Transkription der Virus-DNA und muss hierfür in den Kern der Wirtszelle geschleust werden. Ein kurzer Abschnitt, der vorwiegend die basische Aminosäure Lysin aufweist, konnte als essentielles Signal identifiziert werden (Tab. 9.2). Dies ist aber nur einer von zwei NLS-Prototypen. Die NLS kann auch zweigeteilt vorliegen, erstmals identifiziert in dem kernständigen Nucleoplasmin, einem 21-kDa-Protein, das stets als 105-kDa-Pentamer vorliegt und am Neuaufbau der Nucleosomen beteiligt ist (Abb. 9.1d). Auch hier sind es im Wesentlichen die basischen Lysine, die essentiell für den Kernimport sind. Mittlerweile sind in einer Vielzahl von Proteinen Kernsignalsequenzen identifiziert worden, die immer auf diese beiden Prototypen zurückgehen. Insgesamt aber sind die NLS-Motive etwas inhomogener als andere Zielsteuerungssignale, die meist recht präzise und einheitlich sind. Zusammenfassend lässt sich lediglich festhalten, dass eine NLS aus „karyophilen Clustern“ besteht, aus vorwiegend basischen Aminosäuren in einer nicht streng diktierten Reihenfolge, meist von den helixterminierenden Aminosäuren Prolin und Glycin flankiert.

Zwischenzeitlich konnten auch die betreffenden NLS-Rezeptoren isoliert werden, also jene Proteine, die die NLS eines zu importierenden Proteins erkennen. Es handelt sich hierbei nicht, wie ursprünglich vermutet, um membranintegrale Rezeptoren in der Kernhülle, sondern um frei lösliche Proteine des Cytoplasmas: Importin a und b (Xenopus) bzw. Karyopherin a und b (Saccharomyces cerevisiae). Importin a (ca. 60 kDa) bindet an die NLS, während Importin b (ca. 90–95 kDa) an die Proteine der Kernpore bindet. An der Kernpore selbst ist noch ein drittes Protein – ein kleines G-Protein namens Ran – an dem Translokationsprozess des NLS-Importin-Komplexes über die Kernmembran beteiligt (Abb. 9.2). Wahrscheinlich dienen unterschiedliche Ran-GTP/GDP-Konzentrationen zwischen Cyto- und Nucleoplasma als treibende Kraft für Import und Export. Im Cytoplasma gibt es überwiegend Ran-GDP, im Kern dagegen hauptsächlich Ran-GTP. Dieser nucleocytoplasmatische Ran-GTP-Gradient wird durch zwei Proteine aufrechterhalten, die entsprechend lokalisiert sind: Ran-GAP und RCC1. Ran-Gap stimuliert im Cytoplasma die Hydrolyse von Ran-GTP zu RanGDP, während RCC1 im Kern die Umwandlung von Ran-GDP in Ran-GTP stimuliert. Letztlich wird die Energie aus der GTP-Hydrolyse also für die Aufrechterhaltung dieses Gradienten investiert und treibt so den gerichteten Kerntransport an. Zunächst bindet der NLS-Importin-Komplex an die cytoplasmatische Seite der Kernpore, löst eine Konformationsänderung des NPC aus und wird in die Pore

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Abb. 9.2 Kernporenkomplex und Kerntransport. Der Kernporenkomplex besteht aus ca. 30 Proteinen. Acht Fibrillen reichen vom äußeren cytoplasmatischen Ring weit ins Cytoplasma. Ebenfalls acht Fasern reichen vom nucleoplasmatischen Ring in den Kerninnenraum. Sie bilden zusammen mit einem kleinen Ring den nucleoplasmatischen Käfig. Die Struktur in der Mitte der Pore, die auf einigen elektronenmikroskopischen Aufnahmen zu erkennen ist, stellt möglicherweise ein Transportpartikel dar. Die Abbildung zeigt den Import eines NLS-haltigen Proteins in den Zellkern. Importin a bindet an das NLS, während Importin b an die Proteine der Kernpore bindet. An dem Transport des NLS-Importin-Komplexes an der Kernpore ist Ran beteiligt. Darüber, welches Guanylnucleotid gebunden ist, bestimmen auf der cytoplasmatischen Seite pp15 und Ran-Gap, bzw. auf der nucleoplasmatischen Seite der Nucleotidaustauscher RCC1. Das GTP-beladene Ran steht dann im Kern für Exportprozesse zur Verfügung.

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„gestopft“. Dadurch ist der Komplex nun in der Lage nucleäres Ran-GTP zu binden, was bewirkt, dass der Komplex dissoziiert und das zu transportierende Protein sowie Importin a freigesetzt werden. Ran-GTP steht dann für Exportprozesse zur Verfügung.

Der Kernexport

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Über die Exportprozesse aus dem Zellkern ist vergleichsweise wenig bekannt. Es wird ein dem Importin-NLS-System entsprechender Transportmechanismus vermutet. Für den Export einiger spezieller Proteine wurden sogenannte nucleäre Exportsignale (NES, nuclear export signal) identifiziert; zunächst bei dem Rev-Protein des Humanen Immundefizienz-Virus, HIV, aber auch in einem zelleigenen Protein, dem Proteinkinase-Inhibitor. Entsprechende Rezeptorproteine (Exportine) gehören der gleichen Proteinfamilie wie die Importine an. Das Frachtmolekül bildet einen Komplex mit Ran-GTP und einem Exportin, bindet an den nucleoplasmatischen Teil der Pore und wird hindurchtransportiert. Importin a wird auf diese Weise z. B. wieder ins Cytoplasma geschafft. Importin b taucht während des Kernimports zwar auch auf der nucleoplasmatischen Seite des Zellkerns auf, bleibt aber wahrscheinlich an den NPC gebunden. Auf diese Weise sorgt der Ran-GTP-Gradient für den gerichteten Kerntransport in beide Richtungen. Motorproteine oder ATPasen scheinen nicht beteiligt zu sein. Es sind vorwiegend RNPs, die die Kernpore in Richtung Cytoplasma passieren. Auch auf RNA-Ebene existieren spezielle Transportsignale. Bei mRNA gelten bis zu 200 Adenylreste als so genannter Poly(A)-Schwanz am 3l-Ende als Exportsignal, ebenso wie die (monomethylierte) Cap-Struktur am 5l-Ende des Moleküls, die auch bei anderen RNA-Sorten als Exportsignal fungiert (snRNA). Es gibt auch Ausnahmen: So tragen Histon-mRNAs keinen Poly(A)-Schwanz, werden aber dennoch effektiv aus dem Zellkern in das Cytoplasma entlassen. Der Export der rRNA in Form der ribosomalen Untereinheiten sowie der tRNAs ist noch vollkommen ungeklärt. Zwischenzeitlich wurden auch alternative, Importin-NLS-unabhängige, Importmechanismen entdeckt. HnRNP-Proteine, die an hnRNA binden und mit der RNA in das Cytoplasma coexportiert werden, müssen nach dem Exportgeschehen wieder in den Kern reimportiert werden. Für diese, zwischen beiden Kompartimenten hin