Spesielle analyser [3] 8200269469 [PDF]

Zitiervorschau

Sverre Hopen m.fl.

LABORATORIE­ ARBEID 3. Spesielle analyser

Bokmål

U ni ver sitet sforlaget

Rana Dspotbiblioteket

0 Universitetsforlaget, Oslo 1980 ISBN 82-00-26946-9

Det må ikke kopieres fra denne boka ut over det som er tillatt etter bestemmelsene i «Lov om opphavsrett til åndsverk», «Lov om rett til fotografi» og «Avtale mellom staten og rettighets­ havernes organisasjoner om kopiering av opphavsrettslig beskyttet verk i undervisningsvirk­ somhet». Brudd på disse bestemmelsene vil bli meldt til politiet.

Omslag: Tor Berglie Trykk: Aktiv Trykk a.s., Oslo 1980.

Forord

Dette heftet er beregnet på grunnkurs ved kjemiprosess- og kjemilaborantlinjene i den videregående skolen. I dette heftet er det samlet en del analyser og spesielle forsøk som vi vet det er interesse for, selv om ikke alle står på emnelista i fagplanen. Hoveddelen i heftet - mikrobiologi og næringsmiddelanalyser - er skrevet av Sverre Hopen. De andre oppgavene har vi fått fra andre lærere. Vi oppfordrer brukerne av heftet til å sende oss kommentarer til forsøkene og stoffvalget, slik at vi kan rette opp feil og mangler når heftet skal revideres. Oslo, august 1980 Universitetsforlaget I den industrialiserte del av verden har industrien stadig overtatt mer av den rollen hjemmene tidligere hadde med å tilberede den maten vi spiser. I de siste tiår har det vokst opp en betydelig næringsmiddelindustri som framstiller matvarer i store mengder. For å gjøre produktene holdbare og innbydende er det blitt tatt i bruk mange forskjellige tilsetningsstoffer. Noen av disse kjenner man lite til når det gjelder den langsiktige virkningen på menneskekroppen. Våre myndigheter har derfor redusert bruken av tilsetningsstoffer så langt som mulig ved hjelp av lover og regler. I landbruket er det tatt i bruk kjemiske hjelpemidler for å bekjempe insekter og sykdom på plantene. Disse plantevernmidlene kan være helse­ skadelige for mennesker, selv i små mengder, dersom de finnes i den maten vi spiser.

For å kunne kontrollere våre næringsmidler, kjemisk og bakteriologisk, har en nordisk komité som oppgave å utarbeide nødvendige analysemeto­ der. Disse er utgitt dels på svensk, dels på dansk og dels på norsk. En del av analyseoppskriftene i denne boka er hentet fra standardforskriftene til Nordisk metodik-komité for levnedsmidler.

Bergen, august 1980 Sverre Hopen

Innhold

MIKROBIOLOGI — NÆRINGSMIDDELANALYSER..........................................................

A. GENERELL DEL..................................................................................................................... Innføring i mikrobiologi...................................................................................... Kvantitativ bestemmelse av bakterieinnholdet inæringsmidler............................................. B. ANALYSER................................................................................................................................ 1. Kvantitativ bestemmelse av kimtall i melk, vann og kjøttdeig................................... 2. Mikroskopering.................................................................................................................... 3. Bestemmelse av vann i kjøttvarer..................................................................................... 4. Proteinbestemmelse etter Kjeldahl.................................................................................... 5. Bestemmelse av fett i sildemjøl. Soxhlets ekstraksjon................................................... 6. Bestemmelse av stivelse i kjøttvarer.................................................................................. 7. Kjemisk undersøkelse av vann.......................................................................................... KROMATOGRAFI........................................................................................

A. GENERELL DEL..................................................................................................................... Teori.......................................... Papirkromatografi og tynnsjiktkromatografi......................................................................... B. ANALYSER................................................................................................................................ 1. Atskillelse av fargekomponenter i handelsblekk............................................................ 2. Påvisning av konserveringsmidler i matvarer................ ................................................ 3. Identifisering av vannløselige kunstige fargestoff i næringsmidler.............................. 4. Atskillelse av fargestoffer i tusj-filt-penner .....................................

7 8 8 14 16 16 18 19 20 22 23 25

28 29 29 30 33 33 35 36 41

IONEBYTTING.................. .................................................................................................................... 42

A. GENRELL DEL........................................................................................................................ Teori................................. Bruk av ionebyttere.................................................................................................................... B. FORSØK..................................................................................................................................... 1. Preparering av ionebytterkolonne.................................................................................... 2. Kationbytter......................................................................................................................... 3. Anionbytter............................................................................................................................

43 43 44 46 46 47 48

DIVERSE FORSØK.............................................................................................................................. 50

1. Orsatapparat — Gassanalyse............................................................................................ 2. Luftanalyse med Drågerapparat........................................................................................ 3. Jodklokke.............................................................................................................................. 4. Oscillerende reaksjon...........................................................................................................

51 53 54 55

TILLEGG.................................................................................................................................................. 56

1. 2. 3.

Mikroskopet.................................................. ....................................................................... 57 Framkalling og kopiering av film.................................................................................... 59 Standardforskrifter fra Nordisk metodik-komité for levnedsmidler.......................... 60

Mikrobiologi Næringsmiddel analyser

A. Generell del

Innføring i mikrobiologi Mikrobiologi er læren om de mikroskopiske organismer. Den omfatter vesentlig encellete dyr (protozoologi), alger, sopp (mykologi), bakterier (bakteriologi) og virus (virologi). I norsk industri finnes det en rekke bedrifter der det blir foretatt mikrobielle undersøkelser. Dette gjelder særlig næringsmiddelindustrien. Dessuten utføres det mikrobielt arbeid ved sykehuslaboratorier, helseråd, legesentrer, veterinærlaboratorier m.m. Innenfor disse områdene er det vesentlig bakteriologien som har interesse og som derfor denne innføringen handler om. I tillegg blir det gitt en kort orientering om sopp. Bakterienes størrelsesorden er fra 0,5 -5 /im (1 /zm = 0,001 mm). Deres utseende (morfologi) varierer sterkt. Ved å studere formen på organismen kan man si noe om hva slags bakterietype det er, men dersom arten skal bestemmes fullstendig må det utføres en omfattende undersøkelse. Bakteriene kan deles inn i fem hovedformer som vist på fig. 1. Kokker (kuleformede) Staver (bacillus = liten stav) Spiriller

Spirochæter

Vibrioner (kommaformede)

Karakteristisk for sopp er lange trådformede utløpere som kalles hyfer. En samling av hyfer kan få et ull-lignende utseende. Den kalles et mycel. Når bakteriene formerer seg ved deling, kan de atskille seg fullstendig, eller de blir liggende i mindre eller større ansamlinger. Det dannes et delingsmønster som er karakteristisk for de forskjellige typer bakterier og som kan være til hjelp når bakterien skal bestemmes (fig. 2). Bakterienes anatomi er vist skjematisk på fig. 3. Noen bakterietyper danner kapsler som vist på figuren. Når slike bakterier formerer seg på et næringsmiddel og danner synlige kolonier, vil 8

Fig. 1. Forskjellige former for bakterier

°o°

Monokokker

Diplokokker

Streptokokker

Mikrokokker, deling i ett plan Sarcina, deling i to plan Stafylokokker, tilfeldig deling

Fig. 2. Eksempel på delings­ mønster for bakterier.

Kapsel, slimet lag Cellevegg

Fl age II

Protoplasmamembran

Bevegelsesorgan

Diffus kjerneregion (nucleær sone, inneholder arvestoffene DNA)

Fig. 3. Bakterienes anato­ mi

Cytoplasma

disse få et glinsede eller slimaktig utseende. Noen bakterier har ikke kapsel. De danner «tørre» kolonier. Bevegelsesorganene kan være forskjellig plassert hos de forskjellige typer organismer, se fig. 4.

Monotrikk flagellert

Amplitrikk flagellert

Lopotrikk flagellert Lopotrikk flagellert Fig. 4. Bevegelsesorganenes plassering.

Peritrikk flagelert

9

Enkelte organismer mangler bevegelsesorganer og kan derfor ikke beve­ ge seg aktivt, men de beveges passivt ved strømninger i det mediet de befinner seg i. Clostridium - med terminal spore Bacillus - med terminal spore Bacillus - med sentral spore

Fig. 5. Bakterier med spo­ rer

Noen organismer utvikler sporer. Disse opptrer som små korn i bakteriekroppen. Sporene kan utvikle seg til selvstendige celler. Sporer dannes når bakteriene utsettes for farer som uttørking, næringsmangel, oppvarming m.m. Mens bakterien selv lett går til grunne ved slike påkjenninger, kan sporene tåle både oppvarming og uttørking. De tåler f.eks. koking ved 100°C i flere timer. Enkelte kan tåle temperaturer over 100°C. Sporene kan beholde sin spiredyktighet i mange år. Det er påvist spiredyktighet hos 50 år gamle sporer. Vekst

Dersom man poder en bakterie på et egnet næringsmedium, deler den seg i to etter en stund. De to delene vil igjen dele seg i to og bli til fire nye deler. Delingsforløpet vil skje slik: 1, 2, 4, 8, 16, 32............ celler. Etter hvert som bakterieantallet øker, kommer det et stadium da det inntrer næringsmangel. Videre kan det oppstå forgiftninger fordi det hoper seg opp avfallstoffer i mediet. Bakteriene vil da slutte å dele seg. De begynner litt etter litt å dø ut. Vekstforløpet kan illustreres ved et diagram. Log. antall celler

Fig. 6. Vekstforløpet for bakterier

Temperaturen har avgjørende betydning for bakterienes vekst. De enkelte bakterietyper deler seg ikke like fort ved alle temperaturer. Hver type har sitt optimale temperaturområde.

10

Vekst hastighet

Fig. 7. Bakterievekst som funksjon av temperatur.

Bakterier som vokser ved temperaturer under 20 °C, kalles psykrofile (kuldeelskende), mellom 20 og 45 °C kalles mesofile (som trives ved middels forhold), og over 45 °C kalles termofile (varmeelskende) bakterier. De fleste bakterier har et optimalt pH-område mellom 6 og 8. Noen vokser ved pH 0 til 1 (Tiobacillus). Dyrking

Fig. 8. Petriskål med vekstmedium.

Når bakteriene skal dyrkes, må dette skje på et sterilt vekstmedium. Mediet må inneholde vann og næringsstoffer. Næringskravene varierer sterkt. Enkelte bakterier kan leve av enkle uorganiske forbindelser som NO.f, NH4+, S~, CO2 og noen sporstoffer. Andre stiller store krav til nærings­ stoffene, f.eks. ferdigproduserte aminosyrer, vitaminer m.m. Hit hører også patogene (sykdomsframkallende) bakterier. Vekstmediet blir framstilt etter oppskrift og må være tilpasset den bakterietypen som skal dyrkes. Mediet kan være fast eller flytende. Ved tilsetting av gelatin eller agar blir mediet gjort fast. Et medium som er tilsatt agar, er flytende når det er varmt, men stivner ved nedkjøling til ca. 40 °C. Bakteriene kan dyrkes på overflaten eller «støpes» inn i mediet. Når bakterier dyrkes på faste medier, er det vanlig å nytte petriskåler. Ved overflatedyrking helles mediet på skåla i flytende tilstand. Etter at det er nedkjølt og stivnet, spres bakteriesuspensjonen på overflaten. Dersom bakteriene skal støpes inn i mediet, må dette først nedkjøles til 45 °C i vannbad. Deretter blandes bakteriesuspensjonen med mediet. Dyrking i flytende medier foregår i erlenmeyerkolber eller reagensglass. For å hindre infeksjon dekker man munningen med et lokk eller en bomullsdott. Bomullsdotten dekkes ytterligere med et lag ulimt papir. Se fig- 9.

Fig. 9. Dyrking i flytende medier.

11

Matforgiftning

Ved vekst i proteinholdige matvarer kan enkelte bakterier produsere sterke giftstoffer. De vanligste matforgiftningsbakterier er forskjellige typer stafylokokker, salmonella, bacillus cerus og clostridium perfringens. De to siste er sporedannende. Den mest fryktede matforgiftning er botulisme, som skyldes den sporedannende bakterien clostridium botulinum. Den finnes i jord. Botulisme har forekommet i forbindelse med rakefisk. Matforgiftning kan inntre når matvarer som kjøtt, fisk, eggprodukter m.m. oppbevares varmt, dvs. ved 20-35 °C over litt lengre tid, fra noen timer til et par dager, alt etter betingelsene. De fleste giftstoffene brytes ned ved koking. Matvarer kan gjøres holdbare mot bakterievirksomhet ved hermetisering, salting, tørking, røyking og frysing og ved hjelp av forskjellige typer konserveringsmidler. Den eldste og mest kjente konserveringsmåten er salting. Ved salting tørkes bakteriene ut (jf. osmose). Samme virkning har sukker, f.eks. konservering av frukt i sukkerlake, syltetøy osv. Røyk virker konserverende fordi den utvikler formalin, som er bakteriehemmende. I nyere tid har man tatt i bruk kjemiske midler som benzoesyre og derivater av den. Man nytter forskjellige kjemiske konserveringsmidler alt etter hvilket produkt som skal konserveres, et karbohydratholdig produkt, fisk, kjøtt, et eggprodukt osv. Hvis man ijemer vann, kan bakteriene ikke utvikle seg. Fisk, kjøtt og «posevarer» blir gjort holdbare ved tørking. Sopp

Sopp er uten unntak heterotrof (dvs. den trenger organisk materiale for å leve, i likhet med dyr). De fleste sopper er aerobe. De lever på døde planteog dyrerester. Soppcellene er større enn bakteriecellene. Noen er enecellete og kulerunde, f.eks. gjær. Sopp danner som nevnt hyfer (se s. 8 og fig. 11). Fig. 10. Eksempel på hyfe.

Soppene vokser ved deling i spissen av hyfen. Hver celle er atskilt ved en cellevegg. Biter av hyfer kan vokse ut til nye hyfer. Formering skjer ved sporer. Sopp omfatter en stor gruppe, fra bakergjær og mugg til forskjellige sopparter i skog og mark.

Antibiotika

Enkelte sopper produserer stoffer som hemmer bakterier. Stoffene kalles antibiotika. De ble oppdaget på den måten at når sopp og bakterier vokste på samme mediet, la man merke til at det dannet seg bakteriefrie soner omkring soppen. Se fig. 12. I dag dyrkes forskjellige sopparter for framstilling av antibiotika.

12

Fig. 11. Sopp, sterkt for­ størret.

Fig. 12. Petriskål med antibiotikaproduserende sopp.

13

Kvantitativ bestemmelse av bakterieinnholdet i næ­ ringsmidler De fleste næringsmidler gir god grobunn for en mengde forskjellige bakterier. Disse kan være vanlige forråtnelsesbakterier som finnes overalt i naturen, men også patogene bakterier kan spres via forskjellige matvarer og vann. Bakteriene kan forringe et produkt ved dårlig lukt og smak. Noen kan produsere sterke toksiner (giftstoffer), slik at det kan oppstå sykdom hos dem som spiser varen. Dette gjelder særlig proteinholdige varer. Ved koking blir de fleste bakterier drept, og toksinene uskadeliggjort. En kvantitativ bestemmelse av det totale bakterieinnhold pr. gram (kimtall) kan gi et godt grunnlag for å vurdere kvaliteten av en vare. I praksis utføres en slik bestemmelse ved at en liten del av det som skal undersøkes blir overført til et sterilt vekstmedium, f.eks. på en petriskål. Skåla plasseres i inkubator (varmeskap) ved 30 °C i to døgn. De levende bakteriene vil da vokse opp til synlige kolonier som kan telles. Som regel er bakterietallet svært høyt. Det er ikke uvanlig med 106 bakterier i ett gram kjøttdeig. Før utsåing på petriskåla må derfor materialet fortynnes med fysiologisk saltvann (0,9% NaCl i vann) slik at man får et passende antall kolonier på skåla. Antallet bør være mellom 10 og 300 dersom man skal få et brukbart resultat. Da både en enkelt bakterie og en bakterieklump vokser opp til en koloni, er det ikke riktig å angi tallet med antall bakterier pr. gram. Man bruker derfor betegnelsen kimtall. Aerobe bakterier trenger oksygen. Anaerobe bakterier vokser bare i oksygenfritt miljø. For disse må derfor oksygen utelukkes, f.eks. ved at man dyrker den i vakuum (anaerobkolbe) eller dekker mediet med parafin (voks). Sterilisering

Alt utstyr som brukes ved dyrking, må være sterilt. Glassvarer, apparater osv. tørrsteriliseres i varmeskap ved 130 °C i 3 timer, eller autoklaveres ved 120 °C i en halv time. Da drepes alt organisk liv, også sporene. Flytende medier autoklaveres. Noen medier tåler ikke autoklavering. Da må man bruke en annen teknikk, f.eks. tyndalisering (brutt sterilisering) eller filtrering.

Farging

For lettere å kunne studere bakteriene i mikroskopet kan man farge dem. Det finnes flere fargemetoder. Den viktigste er gramfarging. Med denne metoden kan vi diagnostisere bakterier i gr+ og gr~. Syrefast farging brukes til tuberkelbasillen. En enkel metode er farging med metylenblått. Farging utføres ved at en liten del av en bakteriekoloni eller suspensjon strykes jevnt utover en glassplate (et objektglass). Preparatet lufttørkes og fikseres, dvs. objektglasset trekkes gjennom en gassflamme, slik at bakteriene «svir» fast i

14

glasset. Fargen som skal nyttes, helles over preparatet og får virke ca. 1 minutt. Deretter spyles overflødig farge forsiktig vekk. Så tørker man objektglasset forsiktig ved å klemme det mellom to filterpapir. Preparatet er nå klart for mikroskopering.

15

B. Analyser

1. Kvantitativ bestemmelse av kimtall i melk, vann og kjøttdeig Klargjøring av utstyr, vekstmedium og fysiologisk saltvann

Utstyr Alt utstyr må være omhyggelig reingjort og tørket før sterilisering. Reagensglass må forsynes med bomullsdott og pakkes inn i silkepapir eller vanlig hvitt innpakningspapir, helst ulimt, da dette tåler oppvarming bedre, ca. 10 glass i hver pakke. 1 ml og 10 ml målepipetter forsynes med bomullsdott og pakkes inn én og én. Utstyret steriliseres i varmeskap ved 130 °C i 3 timer. Petriskåler Det nyttes plast, engangsskåler ferdig sterilisert fra fabrikk.

Vekstmedium Mediet tilberedes i 250 ml erlenmeyerkolber. I hver kolbe veies det inn 4,7 gram Difco, «Plate count Agar» (kimtallsmedium). Tilsett 200 ml destillert vann. Mediet løses opp ved koking på vannbad. Juster pH til 7,0. Når substratet er oppløst, forsynes kolben med bomullsdott og papir. For å hindre at bomullsdotten går ut av kolben fester man papiret med hyssing rundt halsen på kolben. Mediet autoklaveres ved 120 C (dvs. 10- N/m— overtrykk) i en halv time. Dersom mediet skal brukes straks, plasseres kolbene etter autoklavering i vannbad ved ca. 60 °C og kjøles langsomt ned til 45 °C før mediet helles på skåler ved innstøping. (Ved overflatedyrking helles mediet på skåler mens det ennå er 60—90 °C.) Mediet oppbevares ellers i kjøleskap.

Fysiologisk saltvann (0,9 °/o NaCl) 1,8 g NaCl og 200 ml vann tilsettes kolber å 250 ml. Kolbene forsynes med bomull og papir. Autoklavering som for mediet. Bestemmelse av kimtall i melk

Til hver prøve trengs 3 reagensglass. Hvert glass tilsettes 9 ml fysiologisk saltvann. 1 ml melk overføres til glass nr. 1. Blandes ved forsiktig risting, eller ved omrøring med pipetten. På samme måten overføres 1 ml fra glass nr. 1 til nr. 2 og fra nr. 2 til nr. 3. Melken er altså fortynnet 10“ 1, 10“2 og 10“3 ganger i henholdsvis glass nr. 1,2 og 3. Fra hvert av glassene overføres 16

1 ml til hver sin petriskål som på forhånd er merket med prøvenummer, fortynningsgrad og dato. Hver skål fylles ca. halvfull med medium som har temperatur 42-45 °C. Blandes ved forsiktig rotering. Skålene får stå til mediet er stivnet. De plasseres deretter med bunnen opp, i inkubator. Temperaturen innstilles til 30 °C. Etter to døgn tas skålene ut av inkubatoren. Koloniene telles og ut fra fortynningen beregner man antall kimer pr. ml melk. Normalt kan det være inntil 100 000 kimer pr. ml i pasteurisert melk og noe mer i upasteurisert. Bestemmelse av kimtall i vann

Man sår ut 1 ml direkte fra vannprøven og fra fortynningen 10"1. Framgangsmåten videre er som for melk. Normalt kan det være 50—200 kim pr. ml i reint vann. Bestemmelse av kimtall i kjøttdeig

10 gram kjøttdeig finfordeles i en steril morter. Deigen overføres til en kolbe og blandes med fysiologisk saltvann til 100 ml. Man sår ut fra fortynningene 10“ 4 10“6 og 10“8. Dyrkingen er som for melk. Bakterieinnholdet i kjøttdeig varierer sterkt etter alder og lagringstemperatur m.m.

17

2. Mikroskopering Generelt

Man bør unngå å berøre bakteriekoloniene med fingrene. Skåler med bakterier og objektglass med bakteriepreparat bør pakkes inn i plastposer før det kastes. Alt mikrobiologisk arbeid krever høy grad av reinslighet. Levende preparat

En dråpe fysiologisk saltvann plasseres på et objektglass. Litt av en bakteriekoloni blandes med dråpen på glasset. Deretter dekkes preparatet med dekkglass. Man kan nå studere bakteriene i mikroskopet ved 1000 ganger forstørrelse. Man vil som regel se at en del bakterier er bevegelige, de har flageller, mens andre driver passivt i væsken. Dersom man vil studere anaerobe bakterier, kan man lage en «høykultur». Litt høy has i en 500 ml erlenmeyerkolbe. Deretter tilsettes en teskje pepton, en knivspiss NaCl og vann til kolben er full. Dette gir gode ernæringsbetingelser for bakterier. Etter et par uker ved 28 °C tas en prøve fra bunn-nivået og mikroskoperes. Legg merke til om det finnes bakterier av typen clostridium. Farging

Ved farging blir preparatet bedre synlig. Objektglasset må være helt reint, eventuelt ved rensing med sprit. En liten dråpe fysiologisk saltvann eller destillert vann plasseres på glasset. Litt av en bakteriekoloni overføres til glasset og blandes med vanndråpen til et jevnt utstryk, ca. en kvadratcenti­ meter. Preparatet tørkes ved vifting over et gassbluss. Etter tørking «fikseres» preparatet ved at objektglasset, med preparatet vendt opp, trekkes tre ganger gjennom et gassbluss. Bakteriene blir da festet til glasset slik at de ikke forsvinner ved seinere skylling. Etter nedkjøling tilsettes metylenblått-oppløsning til preparatet er helt dekket. Fargen får virke i ett minutt. Deretter helles den av, og objektglasset etterskylles med vann til all fargen er fjernet. Preparatet tørkes ved at man trykker det mellom to lag filtrerpapir. En dråpe vann og et dekkglass plasseres på preparatet, som nå er klart for mikroskopering. Studer hvilke bakteriegrupper som finnes på preparatet - staver, kokker etc. Legg merke til om noen av bakteriene er samlet i spesielle mønstre stafylokokker, diplokokker m.m. Lag tegninger av bakterietypene og even­ tuelle delingsmønstre. Dersom man ønsker å oppbevare noen av preparatene, f.eks. i lab.joumalen, kan man istedenfor vann nytte et plastlim (eukitt) mellom objektglass og dekkglass.

18

3. Bestemmelse av vann i kjøttvarer 2 g finfordelt kjøtt veies inn på en porselensskål med diameter 6—8 cm. Prøven tørkes i varmeskap ved 105 °C til konstant vekt, ca. 3-5 timer. Plasseres i eksikator for nedkjøling og veiing.

Vekt utørket kjøtt + porselensskål -Vekt tørket kjøtt + porselensskål = Vanninnhold i 2 g kjøtt

Vanninnhold x 50 = prosent vann i prøven

19

4. Proteinbestemmelse etter Kjeldahl NB: Dette er en makrometode som kan være farlig (eksplosjon)! Det tørkede kjøttproduktet fra vannundersøkelsen nyttes for bestemmel­ sen av protein. Prinsipp

Prøven oppsluttes (ca. 370°C) med konsentrert svovelsyre. Nitroge­ net i proteinet blir da overført til ammoniumsulfat. Ammoniakken frigjøres med overskudd av base (NaOH) etter ligningen NH/ 4OH" NH3 4- H^O. Ammoniakken destilleres over i en gitt mengde 0.5 N H2SO4. Tilbaketitrering med 0,1 N NaOH. Nitrogenmengden kan nå beregnes.

Utstyr

Kombinert oppslutning- og destillasjonsapparat Kjeldahls apparat Kjeldahlskolber 500 ml Erlenmeyerkolber 300 ml Pipetter 1 ml og 10 ml Byrette 50 ml Reagenser:

Konsentrert H2SO4 spesifikk vekt 1,84 NaOH, 40 % Katalysator, kobberoksyd (CuO) K2SO4 (vannfri) 0,1 N H2SO4 0,1 N NaOH Metylrødt 0,1 % Målesylinder 25 ml og 100 ml Glass-spatler Glasstrakter (for å dekke åpningen av kjeldahlskolben under oppslutnin­ gen) Porselensskåler, diam. 6-8 cm

Utførelse

Den tørkede prøven fra vannbestemmelsen overføres til kjeldahlskolben ved hjelp av en glasspatel. 25 ml kons. H2SO4 måles av i en 25 ml målesylinder. Rester fra kjøttproduktet som delvis er festet til porselensskåla, skrapes løs og spyles over i kjeldahlskolben i 3 porsjoner ved hjelp av den avmålte H0SO4-mengden. En knivspiss kobberoksyd, ca. 0,5 g, tilset­ tes. For å unngå tap av materiale under oppslutningen plasserer man en 20

langhalset trakt i munningen av kolben. Reaksjonsblandingen varmes opp i 15 minutter. Derved utvikles SCh-gass (husk avtrekk!). En toppet teskje, ca. 3 g, vannfri K2SO4 tilsettes. Oppslutningen fortset­ ter inntil innholdet i kolben er blitt grønt og helt klart, ca. 1 -2 timer. Etter avkjøling tilsettes 150 ml vann forsiktig langs kanten av kolben, og kolben kjøles ned på ny under rennende vann. For å hindre støtkoking, må kolben inneholde kokstein. I en erlenmeyerkolbe, 300 ml, tilsettes 10 ml vann, 0,1 ml metylrødt og 10 ml 0,5 N H2SO4. Erlenmeyerkolben nyttes som forlag ved destillasjonen. 80 ml 40% NaOH tilsettes i kjeldahlskolben langs halsen på denne, og kolben kombineres hurtigst mulig til destillasjonssystemet. Destillasjonen pågår inntil ca. 100 ml er destillert over. Om destillasjonen er ferdig, kan man kontrollere med fuktet indikatorpapir i munningen av kjeldahlskolben (NH3 gass). Etter avsluttende destillasjon titreres overskytende H,SO4 i forlaget med 0,1 N NaOH. Beregning

Forbruk 0,1 N NaOH for titrering av 10 ml 0,5 N H2SO4 = a ml. Forbruk 0,1 N NaOH ved titrering av overskytende H2SO4 i forlaget = b ml. Forbruk 0,1 N H2SO4 = a - b. Faktor for 0,1 N NaOH = f. 0,4375 • (a - b) • f = prosent protein.

21

5. Bestemmelse av fett i sildemjøl Soxhlets ekstraksjon Vei inn 5 gram sildemjøl. Mjølet overføres til en ekstraksjonshylse. Fett­ stoffet ekstraheres med dietyleter (brannfarlig) eller trikloretylen (husk avtrekk) i Soxhlets apparat. Rundkolben veies før apparatet monteres. Når alt fettstoffet er ekstrahert fra mjølet, avkjøles og demonteres apparatet (husk avtrekk). Dietyleter (eller trikloretylen) skilles fra fettstoffet ved destillasjon. Destillasjonen avbrytes når det er ca. 1 ml dietyleter (eller trikloretylen) tilbake i rundkolben. Resten destilleres i vannbad i avtrekkskap. Til slutt tørkes kolben med innhold i varmeskap ved ca. 100 C, inntil all dietyleter (eller trikloretylen) er fordampet. Kolben avkjøles og veies.

Prosent fett i mjølet beregnes:

Vekt fett • 100

Vekt mjøl Kolben reingjøres ved at man først løser fettet i litt white spirit, deretter i varmt såpevann. De andre delene av apparatet skal ikke vaskes med vann, men eventuelt bare skylles med litt dietyleter (eller trikloretylen). Brukt dietyleter (trikloretylen) samles på egen flaske for seinere å bli renset ved fornyet destillasjon.

22

Fig. 13. Soxhletapparat.

6. Bestemmelse av stivelse i kjøttvarer Prinsipp

Prøven behandles med etanolisk kaliumhydroksydoppløsning. Da oppløses kjøtt og fett, mens stivelse og cellulose forblir uoppløst. Stivelsen skilles fra cellulosen ved oppløsning i en vånding kaliumhyd­ roksydoppløsning, og isoleres deretter ved utfelling med eddiksur etanol og bestemmes ved veiing.

Utstyr

Porselensfilter digel A3 Begerglass, 400 ml Målekolber, 100 ml Filtrerpapir, 9 cm, f.eks. Munktell nr. 00 M. Reagenser

1. Kaliumhydroksydoppløsning, etanolisk. 50 g kaliumhydroksyd (KOH purum) oppløses i, 95 v/v% etanol til 1 liter. 2. Kaliumhydroksydoppløsning, vandig, 2 N 28 g kaliumhydroksyd (KOH purum) oppløses i vann til 250 ml. 3. Etanol, 90 v/v%. 920 ml 95 v/v% etanol blandes med 80 ml vann. 4. Etanol, eddiksurt, 1000 ml 90% etanol (3) blandes med 5 ml iseddiksyre. 5. Etyleter. Utførelse

10 g av den fmfordelte og omhyggelig blandede prøven veies inn i et 400 ml begerglass. Tilsett 150 ml etanolisk kaliumhydroksydoppløsning (1) og varm prøven på kokende vannbad under jevnlig omrøring med en glassspatel. Sørg for at eventuelle klumper findeles. Når man ikke rører om, holder man begerglasset dekket med et urglass. Når alt kjøtt er oppløst, vanligvis i løpet av 30 minutter, filtreres væsken. Den dekanteres gjennom et filterpapir. Bunnfall og filter vaskes ut 3 ganger, hver gang med 20—25 ml varme, etanolisk kaliumhydroksydoppløsning (1). Filtratet kastes bort, og filteret bringes tilbake i begerglasset. Tilsettes 10 ml vånding kaliumhy­ droksydoppløsning (2) og 60 ml vann, og varmes opp til stivelsen er oppløst. Oppløsningen filtreres gjennom en liten vattdott ned i en 100 ml målekolbe. Begerglasset med innhold vaskes med vann, som helles gjennom vattdotten ned i målekolben; etter avkjøling fylles det opp til merket med vann. Avpipetter 10 ml (hvis analysen viser at prøven inneholder mindre enn 2 % mjøl, må den gjentas med 20 ml filtrat) i et 400 ml begerglass, som i forveien inneholder 75 ml (ved prøver med mindre enn 2% mjøl 150 ml)

23

30-40 °C varm, eddiksur etanol (4). Rør om, og konstater at oppløsningen er svakt sur overfor lakmuspapir. Deretter skal begerglasset stå til neste dag dekket med et urglass. Bunnfallet filtreres fra på en porselensfilterdigel (a) og vaskes med eddiksurt etanol. Digelen med innhold vaskes med etyleter (5) og tørkes til konstant vekt ved 100°C. Deretter foraskes bunnfallet i digelen ved gløding til konstant vekt ved 550 °C. Beregning

(a _ b) . 10000

Prosent stivelse =-------------------- der A ■ u = vekt i g av digelen med innhold etter tørking, men før gløding, = vekt i g av digelen med innhold etter gløding, = vekt i g av den innveide prøven = antall ml, uttatt av målekolben Resultatet oppgis med én desimal. Hvis det ved mikroskopi er konstatert at stivelsen kommer fra potetmjøl eller hvetemjøl, kan melinnholdet beregnes slik:

a b A u

Prosent potetmjøl =

% stivelse

0,8 Prosent hvetemjøl =

% stivelse 0,7

NB: Hvis det mjølinnholdet som er funnet, er mindre enn 0,5 % og det ved mikroskopi ikke kan påvises en av de kjente stivelsesarter, kan man anta at stivelsesinnholdet som er funnet, stammer fra krydderier. Resultatet kan da eventuelt anføres som 0,0 % av henholdsvis stivelse og tilsatt mjøl. I Norge er det tillatt å tilsette 3,5 % stivelse til pølsevarer.

24

7. Kjemisk undersøkelse av vann Vi skal bestemme følgende: pH, farge, ammonium, nitritt, nitrat, KMnO4-tall (organisk stoff), klorid, fosfat, jern, kobber, hardhet, klor. Utførelse

(For detaljert framgangsmåte og oppskrift på framstilling av reagenser, viser vi til «Die Untersuchung von Wasser», E. Merk, Darmstadt.) Tabell 1 viser hvordan resultatene kan føres på et skjema. pH måles med pH-meter. Farge måles i komparator. Verdien angis som mg Pt pr. liter vann.

Ammonium 10 ml av vannprøven tilsettes 0,2 ml seignette saltløsning. Deretter tilsettes 0,4 ml Nesslers reagens. Rist om. Les av etter 5 minutters henstand. Gul til brun farge viser NH4+ innhold. Ved kvantitativ bestemmelse må man på forhånd tilberede en standardserie på 10 glass å 10 ml (tilsvarende 0,1 til 1,0 ppm). Standardserien behandles likt med vannprøven. Ved å sammenligne fargen på vannprøven med standardseriens kan man bestemme konsentra­ sjonen i vannprøven.

Nitritt En vannprøve på 10 ml tilsettes en spatelspiss av et spesialframstilt reagens (nitrittreagens). Henstand 10 minutter. Rosa til rød farge viser NO2 innhold. Konsentrasjonen angis som ( + ) + ++ + + + etter graden av fargen.

Nitrat En vannprøve på 2 ml tilsettes forsiktig 5 ml kons. H2SO4. Etter avkjøling tilsettes en spatelspiss brucin. Rist om. Hvis NO_f er til stede, kommer det fram rød farge som går over i gult. Konsentrasjonen angis som for nitritt.

KMnO4.-tall er et mål for oppløst organisk stoff, f.eks. humus fra planterester. Reaksjonen utføres i en 250 ml erlenmeyerkolbe, tilsatt kokstein. En vannprøve på 100 ml tilsettes 5 ml H2SO4 (fortynnes 1 til 4). Deretter tilsettes 10 ml 1/100 N KMnCL. Kokes i 10 minutter, så tilsettes 10 ml 1/100 N oksalsyre. Mens løsningen ennå er varm, titreres med 1/100 N KMn04 til svak rosa farge. KMnCL-tallet får man ved å multiplisere antall ml forbrukt KMnCL med 3,161. Tallet angir antall mg KMnC>4 som forbrukes pr. liter vann.

25

Klorid En vannprøve på 100 ml tilsettes 1 ml K2CrO4 (5 % K2CrO4-løsning). Titreres med 1/35,5 N AgNO3 til svak gulbrun farge. 1 ml forbrukt AgNO? tilsvarer 10 mg CFpr. liter vannprøve. Fosfat En vannprøve på 10 ml tilsettes først 0,2 ml ammoniummolybdatløsning. Deretter tilsettes 0,1 ml SnCL-løsning. Blå farge viser PO4 -innhold. Tilbered en standardserie på fem glass med konsentrasjon 0,1 - 0,5 - 1 5 og 10 mg PO4 pr. liter. Fosfatinnholdet i vannprøven måles kvantitativt.

Jern En vannprøve på 100 ml tilsettes 3 ml 25 % HC1 og 0,3 ml 3 % H2O0løsning. Dampes inn i begerglass til ca 50 ml (husk avtrekk!). Avkjøles og helles over på en 100 ml målekolbe. Fylles opp til merket med destillert vann. Tilbered en standardserie på 10 glass med kons. 0,1 til 1 mg Fe+++ pr. liter, 10 ml i hvert glass. Ta ut 10 ml fra vannprøven i målekolben. Til denne vannprøven og til hvert av glassene i standardserien tilsettes først 0,1 ml 4 NHC1, deretter 0,3 ml 10 % KSCN. Les av straks.

Kopper En vannprøve på 10 ml tilsettes 0,1 ml sitronsyreløsning (20 g sitronsyre til 100 ml vann) og 0,2 ml 10% NH3. (40 ml kons. NH3 til 100 ml vann.) Deretter tilsettes 0,1 ml natrium-dietylditiokarbaminatløsning. (1 g av saltet løses til 100 ml vann.) Lag 8 glass standardløsning å 10 ml og med konsentrasjonene 0,1 -0,2 -0,3 -0,5 -1,0 -1,5 - 2 og 5 mg Cu++ pr. liter. Natrium-dietylditiokarbaminat gir gul til brun farge med Cu++-ioner, avhengig av konsentrasjonen. Maksimalt akseptabelt Cu++ i drikkevann er 1,5 mg pr. liter vann. Karbonathardhet (CaCO3-innhold) = dKH En vannprøve på 100 ml tilsettes 0,1 ml metyloransjeløsning, og titreres med 0,1 N HC1 til brungul farge. 1 ml 0,1 N HCl/100 ml = 28 mg CaO/1 = 2,8° dKH. Karbonathardhet i noen vannforsyninger: Bergen 0,14°, Stavanger 2°, Oslo 0,5°. Det er svært sjelden at vann inneholder så mye som 20° dKH. Klor (Cf) En 50 ml vannprøve tilsettes 0,5 ml ortotolidinløsning. Les av i komparator innen 10 sek. Klor gir gul til brun farge med reagensen. Drikkevannsforsy26

ningene tilsettes klor til kons. 0,3 - 0,6 mg Cl0 pr. liter vann. Dette er nok til å drepe de patogene bakteriene. Den samme konsentrasjonen eller noe høyere nyttes i svømmebasseng. Tabell 1 Kjemisk analyse av vann. Der analyseresultatet er angitt med tall, svarer disse til mg/1 eller ppm. un

w

o

oc

oo

o z o z

+

z bJO

Q O

W &

£ Q

27

Kromatografi

A. Generell del

Teori' Ut fra den erfaring vi har med kjemiforsøk, vet vi at det er viktig å kunne skille ut stoffer fra en blanding. I kjemi og biologi er det ofte nødvendig å separere, isolere, rense og identifisere små mengder av komponenter i komplekse blandinger. Kromatografi er en mye brukt metode i slike tilfeller. I korthet kan vi si at kromatografi er en separasjonsmetode som i mange varianter (papirkromatografi, tynnsjiktkromatografi, søylekromatografi, gasskromatografi) brukes til å atskille slike små mengder og til å identifisere dem. Uansett hvilken kromatografisk teknikk som brukes, kan vi si at metoden benytter seg av stoffers ulike løselighet og av likevektsfordelingen mellom to ikke-blandbare faser. Den ene av disse fasene er stasjonær (ubevegelig), den kan være et fast stoff eller en væske. Den andre fasen er mobil (bevegelig), den kan være en væske eller en gass. I papirkromatografi er papiret den stasjonære fasen, mens vann eller andre løsningsmidler er den mobile fasen som «suger» seg utover i papiret. I tynnsjiktkromatografi består den stabile fasen av et tynt lag av f.eks. S1O2, som er festet til en tynn aluminiumsfolie, mens den mobile fasen er som for papirkromatografi. I søylekromatografi pakker man et glassrør med pas­ sende høyde og diameter med et fast stoff, f.eks. cellulosefibrer eller magnesiumoksyd, som representerer den stasjonære fasen, mens den mobile fasen er et løsningsmiddel som helles ned gjennom røret med passende hastighet. I gasskromatografi nyttes et langt rør av f.eks. metall eller glass som innvendig er belagt med fast stoff (eller med en væske som er adsorbert i et fast stoff) som den stasjonære fasen. Den mobile fasen er en gass, ofte H, eller He, som hele tiden strømmer gjennom kolonnen. Den mobile fasen vandrer gjennom den stasjonære fasen og trekker de forskjellige kompo­ nenter i analysebehandlingen med seg med ulik hastighet. Komponentene vil til dels løse seg i den mobile fasen og løpe sammen med den, dels blir de adsorbert i den stasjonære fasen og holdt igjen. Vi får en fordeling av de forskjellige komponentene mellom de to fasene. Løseligheten, adsorpsjonen og derved fordelingen mellom de to fasene vil oftest være forskjellig for de ulike komponentene i blandingen. Derved vil noen komponenter vandre raskere enn andre, og de enkelte stoffene skilles fra hverandre. Har vi en blanding der komponentene vandrer omtrent like fort gjennom den stasjonære fasen, kan disse ikke atskilles ved kromatografi. Vi må 29

imidlertid være oppmerksom på at om to komponenter oppfører seg likt ved bruk av én stasjonær fase, kan det tenkes at vi likevel kan atskille stoffene ved å bruke en annen kjemisk forbindelse i den stasjonære fasen. Foruten å atskille og rense komponentene i en analyseblanding, ønsker en kjemiker også å identifisere hver enkelt komponent. I mange tilfeller vil vi ha en viss anelse om hvilke forbindelser det er i blandingen. For å få bekreftet om denne anelsen er riktig, kan vi gjøre en blindprøve (referanseprøve) ved å gjøre nøyaktig det samme forsøket om igjen med en prøve av det stoffet vi tror det er i analyseblandingen. Hvis denne oppfører seg slik som den i analyseblandingen og løper like langt på like lang tid, kan vi med temmelig stor sikkerhet fastslå hvilke komponenter det var i analysen. Dette viser en viktig egenskap ved kromatografi: En kjemisk forbindelse beveger seg i et kromatografisk system alltid like fort/like langt i forhold til et gitt løsningsmiddel (mobil fase). Dette er en karakteristisk og reproduserbar egenskap for stoffet i et bestemt løsningsmiddel. Det blir nærmere forklart i neste avsnitt om papirkromatografi. Foruten å identifisere forbindelsen (kvalitativt) kan man også nytte kromatografi til kvantitative bestemmelser. Det foregår i prinsippet ved at man nytter et nøyaktig kjent volum av blandingen og etter at kromatograferingen er ferdig, «vasker ut» hver enkelt komponent av den stabile fasen (eluering) med et egnet løsningsmiddel. Så bestemmes konsentrasjonen og mengden av komponentene i blandingen.

Papirkromatografi og tynnsjiktkromatografi Papirkromatografi og tynnsjiktkromatografi er mye brukt i biokjemi og organisk kjemi. Som den skjematiske figuren av papirkromatografi viser, løper den mobile fasen (væsken) oppover den stasjonære fasen (papiret). Papiret er porøst filtrerpapir eller kromatografipapir. Stikkes enden av et

Mobil fase

30

Fig. 14. Den mobile fasen (væske) trekker analysesubstanser med seg. Den stasjonære fasen (papiret) «holder igjen».

slikt papir ned i en væske (den mobile fasen), vil væsken løpe oppover papirstrimmelen på grunn av kapillareffekten. Avsetter man så en dråpe av analyseløsningen på papiret, vil stoffene i blandingen delvis bli trukket med av den mobile fasen, delvis bli holdt igjen av den stasjonære fasen (papiret). På denne måten vil de forskjellige stoffene i blandingen etter en tid ha vandret ulike langt, avhengig av sine egenskaper overfor de to fasene. Hvis de enkelte stoffene i tillegg er fargete forbindelser, kan man tydelig se stoffene som forskjelligfargete flekker i ulik avstand fra utgangspunktet på papiret. Teknikken i tynnsjiktkromatografi er temmelig lik den som brukes i papirkromatografi. Men i stedet for å bruke papir som den stasjonære fasen, nyttes et tynt lag av f.eks. silikagel, festet til en glassplate, alumi­ niumsfolie eller lignende. Fordelen med tynnsjiktkromatografi er at det i en del tilfeller gir bedre atskillelse enn papir og at man kan bruke løsningsmid­ ler som ville ødelegge cellulosefibrene i papir.

Fig. 15. Rf(A) = ±

R i(B) -

c

Prøvesubstans

Som nevnt kan vi identifisere en komponent etter hvor langt den løper i forhold til et gitt løsningsmiddel. Se fig. 15. Blandingen som skal separeres, er avsatt midt på grunnlinjen. Etter en viss tid har komponent A vandret en avstand a, komponent B en avstand b og den mobile fasen en avstand c. Forholdet mellom avstanden a for komponent A og c for den mobile fasen er konstant og karakteristisk for forbindelsen A i et bestemt løsningsmid­ del. Dette forholdet betegnes Rf. En Rrverdi er gitt ved:

Rf(A) = | og R,(B) = |

Som navnet sier, er kromatografi (av gresk khroma = farge, grafein — risse, tegne) opprinnelig en metode som ble brukt til å atskille fargede forbindelser ved at hvert farget stoff etter en viss kromatograferingstid stod igjen på papiret eller i kolonnemassen som en farget flekk i en viss avstand fra startpunktet. Metoden egner seg imidlertid også godt til å atskille et utall ikke-fargete forbindelser. Man må da nytte spesielle metoder til å

31

«observere» eller «fremkalle» de forskjellige komponentene. En del forbin­ delser som atskilles godt ved papir- eller tynnsjiktkromatografi, kan «sees» ved at papiret blir bestrålet med UV-lampe (lys i det ultrafiolette bølgeområdet, f.eks. en høyfjellssollampe), idet komponentene i analysen adsorberer lys med denne bølgelengden og derved blir «synlige». En annen metode som også kan brukes til fremkalling av papir- og tynnsjiktkromatogram­ mer, er å spraye papiret med en egnet forbindelse som reagerer kjemisk med de enkelte komponentene på papiret og gir forbindelser som er fargede eller som adsorberer UF-lys.

32

B. Analyser

1. Atskillelse av fargekomponenter i handelsblekk Prinsipp

Blekkfarger består av en blanding av farger. Komponentene i en blekkfarge atskilles av kromatografi. Prinsippet for atskillelsen er at de forskjellige komponentene har ulik løselighet og adsorberes forskjellig av papiret.

Utførelse

Kjøretid: 1 - 11/2 t Brun Blekk: M200 Kongeblått 201 Høyrødt 202 Grønt 203 Svart 204

Numrene refererer til Shandon kromatograferingssett. Vanlig blekk av forskjellig farge kan også nyttes.

Oppløsningsmiddel: z?-butanol-etanol-2M NHj (60 : 20 : 20) Oppløsningsmidlet has i bunnen av kromatograferingskaret (ca | cm høyt). Lokket settes på slik at atmosfæren i karet mettes med damp fra oppløsningsmidlet. Papiret klippes til slik at det passer i karet (ca. 1| cm mindre i omkrets og 2-3 mm mindre i høyden). Trekk en svak blyantstrek ca. 1,2 cm fra bunnen av papiret, og sett 6 kryss med samme avstand. Kryssene representerer de 6 utgangspunktene (5 forskjellige farger og en blanding av alle 5 i det 6. krysset).

Påsetting Blekkfargene settes på papiret med et tynt kapillarrør. Husk å merke hva som er de forskjellige fargene! I det 6. krysset settes en dråpe av hver farge. Bruk et tynnere kapillar slik at det blir noe mindre konsentrasjon her. Hver fargeflekk må tørke før den neste settes på.

Kromatografering Papiret lages til en sylinder som festes sammen med tape. Tapen må ikke komme ned i oppløsningsmidlet! Sett papiret i kromatograferingskaret. Pass på at papiret ikke berører veggene! Sett på lokk. Følg med papiret, men rør ikke lokket!

33

Når væskefronten er kommet nesten helt opp, tas papiret ut av tanken, og væskefronten merkes (med blyant). Papiret tørkes i luft. Resultat Rf-verdiene for de enkelte komponenter måles. Mål avstand fra krysset der stoffet ble påsatt, til midt i fargeflekken. Det samme forsøket kan gjøres med tynnsjiktkromatografi.

34

2. Påvisning av konserveringsmidler i matvarer Prinsipp

Etter forbehandling av prøven (forskjellig etter om undersøkelsen gjelder fettholdige, proteinholdige. stivelsesholdige eller sukkerholdige produkter) ekstraheres konserveringsmidiene med dietyleter (brannfarlig!) eller kloroform (avtrekk). Ekstraksjonsvæsken dampes inn til et lite volum og undersøkes ved papirkromatografi. Konserveringsmidiene, som alle er svake syrer, kan identifiseres med syre-baseindikator. Videre undersøkes flekkene med UF-lys.

Undersøkelse av sukkerholdige produkter

Fortynn 10 ml av prøven (ev. 10 g) med 40 ml vann. Tilsett 2N H,SO4 til sur reaksjon, overfør væsken til en skilletrakt og ekstraher med 15 ml dietyleter (kloroform) to ganger. De to ekstraktene samles og filtreres gjennom vannfri Na2SO4 for å fjerne rester av vann. Dietyleteren (klorofor­ men) dampes inn i avtrekk i værelsestemperatur til ca. 1 ml. Deretter overføres den til et lite reagensglass og kromatograferes, ca. 50 mikroliter pr. flekk. I tillegg til de ukjente prøvene påføres også benzoesyre på papiret. (Benzoesyra tjener som kontroll.)

Kroma tografivæske Bland i skilletrakt 70 ml butanol, 20 ml 25% NH3 og 10 ml vann. Ristes, står deretter til klaring. Vannfasen tappes fra og kastes. Til butanolfasen tilsettes 3 ml etanol for at rester av vann skal bli absorbert. Kromatografivæsken filtreres gjennom vannfri Na2S04 og overføres til kromatografitank. Kromatografipapiret plasseres i tanken. Kromatograferingen pågår i 6 timer. Papiret tørkes i avtrekk. Identifisering Kromatogrammet undersøkes 1 UF-lys. Impregner deretter papiret med kinin løst i etanol (0,25 g kinin i 25 ml etanol). Impregneringsvæsken påføres ved hjelp av forstøver. Papiret tørkes ved værelsestemperatur. Undersøkes i UF-lys. Impregneres med en syre-baseindikator (120 mg bromfenolblått løses i 100 ml vann. Deretter løses 60 mg metylrødt i 100 ml etanol (96 %). De to løsningene blandes. Titreres forsiktig med 0,1 N NaOH til svak blå farge. Indikatoren er blå i base og rød i syre.) Kromatogrammet undersøkes i dagslys og i UF-lys. Prosedyren er for­ enklet i forhold til originalen. Ikke alle konserveringsmidler kan derfor undersøkes etter den angitte metoden. Den kan likevel brukes til å undersøke benzoesyre, som er det mest brukte konserveringsmiddel i saft og syltetøy.

35

Identifikasjon av benzoesyrer UF-lys direkte Behandlet med kinin og UF-lys Syre-baseindikator og UF-lys Syre-baseindikator og dagslys

36

mørk fiolett fiolett fluorescerende lyst fluorescerende purpur (rødt)

3. Identifisering av vannløselige kunstige fargestoffer i næringsmidler Fra 1. januar 1978 er det i Norge ikke tillatt å markedsføre nærings- og nytelsesmidler som er tilsatt kunstig farge. Prinsipp

Fargestoffene isoleres fra prøven ved at de adsorberes på ullgarn. De elueres (løses ut) fra ullgarnet, og eluatet overføres til kromatografipapir der fargestoffene separeres kromatografisk.

Reagenser og utstyr

5 % ammoniakk: 215 ml 25 % ammoniakk (d = 0,91) fortynnes med vann til 1 liter. Kaliumhydrogensulfatoppløsning: 10 g KHSO4 løses i vann til 100 ml. Kromatograferingsvæske: 2 g tertiært natriumsitrat løses i 100 ml 5% ammoniakk (20 ml kons. NH3, 80 ml vann). 2 N natrium hydroksyd 7 N saltsyre Kons. svovelsyre Kromatografitank. Her brukes en glassylinder (ca. 18 x 35 cm) med tettsluttende lokk. Hårtørkeapparat Kromatografipapir: Schleicher & Schull 2040 a eller Whatman nr. 1 Mikropipetter, 25 pl Ullgarn: Hvitt ullgarn, avfettes med petroleter i soxhletapparatur (25 -30 ekst r aksjoner). Garnet tørkes i lufta, petroleteren skal ikke vris ut. Så plasseres gamet i 5% ammoniakk i 1 time ved 80 °C under omrøring. Deretter skylles garnet grundig med vann og tørkes natten over, hengende på glasstaver. Oppbevares i tett lukket glassbeholder. Ultrafiolett lampe. Isolering av fargestoffene

A 1. Fargestoffer i pulverform Reine, konsentrerte fargestoffer kromatograferes direkte etter oppløsning i vann (passende konsentrasjon ca. 0,3 %). For å lette bruken er fargene ofte tilsatt sukker eller andre stoffer, derfor er det sikrest å fiksere dem på ulltråd før kromatograferingen. I et 50 ml begerglass løses en knivsodd farge i 25 ml vann og surgjøres ved 1 ml kaliumhydrogensulfatoppløsning (pH ca. 2). Prøven dekkes med urglass og varmes opp i en halv time på kokende vannbad sammen med en 10 cm lang ulltråd. Deretter tas ulltråden opp og skylles i rennende vann. For å eluere fargestoffene anbringer man ulltråden i et begerglass som inneholder 10 ml vann og noen dråper 5% ammoniakk (tydelig alkalisk

37

reaksjon). Dette varmes på vannbad i en halv time. Ulltråden tas opp. Hvis den fremdeles er farget, gjentas elueringen med ny ammoniakkoppløsning. Er det fremdeles farge igjen på tråden, tas det ikke hensyn til dette. Eluatet slås sammen og dampes inn til ca. 1 ml. Konsentratet brukes til kromatografering. A 2. Fargestoffer løst i vann Om oppløsningen bare inneholder fargestoffer, kan disse kromatograferes direkte. Er også andre stoffer til stede, må fargestoffene først fikseres på ulltråd. Ca. 1 ml fargeoppløsning fortynnes med 25 ml vann og surgjøres med 1 ml kaliumhydrogensulfat (pH ca. 2). Fortsett som A 1. B. Fargestoffer i næringsmidler Når et næringsmiddel skal undersøkes med hensyn til fargestoffer, må man skjelne mellom tre tilfeller: sukkerrike produkter, stivelsesrike produkter og eggehviterike produkter. Ekstraksjonsmåten varierer noe i de tre tilfellene.

B 1. Sukkerrike produkter (saft, brus, karameller, sukkertøy, kakepynt osv.) 10 ml saft blandes (eller 10 g fast produkt) oppløses i et 150 begerglass med 20 (30) ml vann. Dette gjøres surt med 1 ml kaliumhydrogensulfat, dekkes med urglass og varmes opp 1 time på kokende vannbad sammen med en 10 cm lang ulltråd. Deretter tas gamet opp, og om det viser seg å være farget, behandles det videre ifølge A 1. B 2. Stivelsesrike produkter (kakemiks, puddingpulver osv.) 10 g findelt prøve ristes med 50 ml 70% etanol av værelsestemperatur (ikke varm!) og filtreres gjennom foldefilter. Etter behov gjentas prosedyren etter at man har tilsatt noen dråper 5 % ammoniakk (tydelig alkalisk reaksjon). Filtratet fortynnes med 25 ml vann og dampes inn til 25 ml på vannbad, gjøres surt med 1 ml kaliumhydrogensulfatoppløsning, dekkes med urglass og varmes opp 1 time på kokende vannbad sammen med en 10 cm lang ulltråd. Deretter tas ulltråden opp og om den viser seg farget, behandles den videre som i A 1. B 3. Eggehviterike produkter (fisk, fiskeprodukter, kjøtt, kjøttprodukter) 10 20 g findelt (malt) prøve tilsettes 50 ml 70% etanol og varmes opp på kokende vannbad i en halv time. Volumet holdes konstant med 70 % etanol. Prøven filtreres så gjennom foldefilter. Etter behov gjentas prosedy­ ren etter tilsetting av noen dråper 5 % ammoniakk (tydelig alkalisk reaksjon). Filtratet fortynnes med 25 ml vann og dampes inn til 25 ml. Om dette inneholder fett, nedkjøles væsken slik at fettet stivner. Så filtreres den gjennom et fuktet filter. Væsken inndampes til 25 ml, gjøres sur med 1 ml kaliumhydrogensulfatoppløsning, og varmes opp sammen med en 10 cm lang ulltråd i en time på kokende vannbad. Begeret dekkes med urglass.

38

Deretter tas garnet opp, og om det viser seg farget, behandles det videre som beskrevet i A 1. Kromatografering

På et ark kromatografipapir (29 x 30 cm) tegner man med blyant to linjer, én 2 cm og én 22 cm fra den nedre kanten på papiret. På linjen nærmest nedre kant plasseres flekkene av konsentratet med 3 cm mellomrom, og 5 cm fra hver ytterkant. Flekkene bør ikke være større enn 10 mm i diameter, og derfor settes prøven om nødvendig på i flere omganger med tørking (hårtørker) etter hver gang. Arket formes som en sylinder der ytterkantene festes til hverandre med rustfrie kromatografiklips. Papirsylinderen anbringes så i kromatografitanken, der man på forhånd har helt oppi kromatograferingsvæske. Papirsy­ linderen skal stå ca. 1 cm ned i væsken. Kromatograferingsvæsken trekker seg nå oppover i papiret, og når øvre blyantlinje etter ca. 2 timer. Arket tas ut og henges til tørk ved værelsestemperatur (avtrekk!). Deretter undersøkes kromatogrammet i ultrafiolett lys, og væskefronten markeres med blyant. Samtidig kontrolleres eventuelle fluorescensflekker, som markeres med styrke, farge osv. Fargeflekkenes utseende (farge) og posisjon på arket (R-verdien) sammenliknes med kromatogram for typeprøver av godkjente fargestoffer. Dessuten kan man undersøke flekkenes reaksjoner med syrer og baser.

39

Tabell 2 Fortegnelse over vannløselige kunstige fargestoffer som før har vært godkjent i Norge, deres Rf-verdi og farge etter kromatografi i ammoniakk og natriumsitrat.

Farge Index

Navn

Farge

73015 69800 42045 42085

Indigotin Mellomblått Nyblått Guineagrønt

Blå Blå Blå Grønn

42053

13015 19140 15980 15985 16185 45430 14720 16045 16255 16290 14700 14815 28440 42650 42540

Hovedflekkenes Rrverdi og farge

0,2, blå (D), blå (UF) 0,0, blå (D) 0,86, blå (D), mørkeblå (UF) 0,70, grønn (D), forsvinner ofte, mør­ keblå (UF) Patentgrønt Grønn 0,87, grønn, vandrer blått (D), mør­ keblå (UF) Syregult Gul 0,63, grønngul (D), olivenbrun (UF) Tartrazin Gul 0,78, gul (D), gul (UF) Meta-oransje Oransje 0,57, oransje (D), svak oransje (UF) Para-oransje Oransje 0,57, oransje (D), sv. oransje (UF) Amarant Rød 0,57, rødfiolett (D), mørkerødt (UF) Erytosin 0,10, rød (D), oransje (UF) Rød Karmosin Rød 0,29, rød (D), svakt rød (UF) Naftolrød Rød 0,41, rød (D), mørkerød (UF) Nykorkin Rød 0,71, rød (D), mørkerød (UF) Pnceau 6 R Rød 0,80, rød (D), mørkerød (UF) 0,50, rød (D), oransje (UF) Ponceau SX Rød Skarlagensrødt Rød 0,86, rød, vandrer oransje (D), mørke­ rød (UF) Blåsvart Mørke­ 0,25, mørkeblå (D), blåsvart (UF) blå Fiolett 0,70, fiolett (D), fiolett (UF) Formylfilett Syrefiolett Fiolett 0,73, fiolett (D), fiolett (UF)

Tegnforklaring: D = dagslys, UF = ultrafiolett lys R-verdiene i tabellen er bare veiledende. R-verdiene kan forandre seg fra gang til gang, men flekkenes innbyrdes avstand er konstant. Man må alltid kjøre kjente fargeoppløsninger som referanse. Kromatografivæsken bør skiftes relativt ofte, da ammoniakk fordamper fra oppløsningen, og dette fører til større feil i R-verdiene.

40

4. Atskillelse av fargestoffer i tusj-filtpenner Utstyr og kjemikalier

- Kromatografikar - Kromatografipapir Whatman nr. 1 - Analyseblanding (tusj-filtpenn): Penol 300 - svart Pelikan (mine 134) - grønn Pilot - blått - Kromatografivæske (mobil fase) n-butanol Eddiksyre

Slik lages kromatografivæsken: 4 deler n-butanol 1 del eddiksyre 5 deler vann Væsken blandes i skilletrakt og ristes godt. De to væskefasene skilles, og den øvre nyttes til kromatografivæske. Utførelse

a) Hell kromatografivæske i kromatografikaret slik at løsningen står 1015 mm over bunnen. Pass på at det ikke er løsning på veggene av karet. b) Avsett en fargeflekk med en av tusj-filtpennene 15—20 mm over den nedre kanten av papiret. c) Heng papiret ned i kromatografikaret. Pass på at tusjflekken avsettes over nivået for kromatografivæsken (fig. 14 og 15). d) Når kromatografivæsken har nådd nesten opp til kromatografipapirets øvre kant, avbrytes kromatograferingen. Papiret tas ut og tørkes. e) Hva ser du på papiret? f) Gjør det samme med de andre tusj-filtpennene.

41

lonebytting

A. Generell del

Teori Ved ionebytting blir ioner i et fast stoff skiftet ut med ioner fra en oppløsning i kontakt med det faste stoffet. Se fig. 16—20. De ionebyttere som er av interesse for analytiske formål, består av høypolymere organiske

O

lonebyttermasse (negativt ladde makroioner) Positive ioner (H + ) som er festet til de negative makroionene. Positive ioner (M + ) som bytter ut de positive ioner som er festet til ionebytteren.

Ureint vann (M + )

Fig. 16. Prinsippet for ionebytteren.

Renset vann

43

stoffer med «aktive» punkter der det sitter utskiftbare H+ ioner (kationbyttere) eller OH -ioner (anionbyttere). 1) Kation bytter HR(s) + M+MR(s) + H+ 2) Anion bytter ROH(s) + A RA(s) + OH“ Hvis likevekten er sterkt forskjøvet mot høyre, kan vi få M+ kvantitativt byttet ut mot H+ og A“ mot OH-. For å framstille reint vann ved ionebytting, brukes en kombinasjon av kation bytter og anionbytter. Når en ionebytter har vært i bruk en tid, vil H+ på de fleste aktive punkter være erstattet med M+ (eller OH erstattet med A-). lonebytteren er da ikke lenger effektiv. En kationbytter kan regenereres med HC1. Likevekten forskyves da mot venstre. Etter vasking med reint vann til negativ reaksjon på klorioner er da lonebytteren igjen klar til bruk. På tilsvarende måte kan en anionbytter regenereres med NaOH. Utvekslingen av ioner kan vi illustrere slik:

Fig. 17. Natriumionet (M+) nærmer seg hydrogenionet som er festet til kationbytteren.

Fig. 18. Natriumionet lei­ rer seg til kationbytteren på det stedet hvor hydrogenionet er festet.

Fig. 19. Natriumionet har tatt hydrogenionets plass.

Fig. 20. Hydrogenionet vandrer nedover i kolon­ nen sammen med vannet.

44

Bruk av ionebyttere

lonebyttere har et stort virkefelt, f.eks.: Demineralisering av andre produkter Fjerning av salter fra et stort antall vannløselige forbindelser som ikke leder elektrisk strøm, f.eks. sukker, formaldehyd, glyserol, glykol.

Gjenvinning av metaller fra løsninger Små mengder av metaller i løsning kan konsentreres i kationbyttere. Mange sjeldne metaller kan reinframstilles på denne måten. Gjenvinning av andre typer ioner fra løsninger Brukes industrielt for å gjenvinne dyre kjemikalier som inngår i prosessene. Framstilling av ionefritt vann (destillert vann) Med kationbytter og anionbytter kan positive og negative ioner i vann

fjernes. Biokjemisk og farmasøytisk bruk Brukes i stor utstrekning i separasjon og rensing av produkter, for eksempel ekstraksjon av antibiotika, reinframstilling av B12.

45

B. Forsøk

1. Å lage ionebytterkolonne lonebytterkolonne

røra

Glassvatt lonebyttermasse

Glassvatt

Hane for regulering av gjennom stemnings hastighet

lonebytterkolonnen kan bestå av et glassrør med diameter 1 —1,5 cm og lengde ca. 45 cm. (En 50 ml byrette kan med fordel nyttes.) Det vil gå med ca. 30 cm3 (22 g) av ionebytter type Dowex 50 W XI 50/100 mesh eller liknende for forsøk 2 (Na+), og ca. 30 cm3 (22 g) av ionebytter type Dowex WX4 50/100 mesh eller liknende for forsøk 3 (Fe3+, Co24", Ni24"). Utførelse

1. Pakk sammen en liten mengde glassvatt nederst i kolonnen. 2. Hell destillert vann i kolonnen, og la det renne gjennom glassvatten så alle luftblærer forsvinner. La det stå ca. 5 cm3 destillert vann igjen i kolonnen. 3. Hell 30 cm3 av ionebytteren opp i et begerglass på 100 ml, og tilsett 50 ml vann. Rør om så luftblærer fjernes. For forsøk 3 brukes 50 ml 4 M saltsyre istedenfor 50 ml vann. 4. Hell deretter denne blandingen forsiktig over i kolonnen mens du lar noe av væsken renne ut av kolonnen. 5. Etter at all ionebyttermassen er overført til kolonnen, pakkes litt glassvatt øverst. Unngå luftblærer! 6. Under pakkingen må du passe på at ikke væskestanden i kolonnen synker under ionebyttermassen. 46

Fig. 21. Ionebytterkolonne.

1. Kationbytter: Å bestemme mengden av natriumioner i en løsning. Prinsipp

Natrium er et av de grunnstoffer som det er vanskelig å bestemme kvantitativt etter vanlige metoder. Men hvis natriumionene i en natrfumionløsning av ukjent styrke byttes ut med hydrogenioner, som jo lett lar seg bestemme, blir det mulig å utføre en slik kvantitativ analyse av natriumioner. Utførelse:

Kationbytteren må først mettes med hydrogenioner. Dette gjøres slik: a) 30 cm3 4 M saltsyre helles i små porsjoner opp i kolonnen og får passere ionebytteren. Passende gjennomstrømningshastighet er 3 cm3 pr. mi­ nutt. (lonebyttermassen minker i volum ca. 14 cm3 etter gjennomskylling med HC1.) b) Overskudd av hydrogenioner skylles ut med destillert vann som helles i små porsjoner opp i kolonnen. Man fortsetter til eluatet (det som renner ut av ionebytteren) ikke lenger viser sur reaksjon (pH-verdi større enn 5). Surhetsgraden kontrolleres med pH-papir. lonebyttermassen øker i volum igjen til begynnelsesnivå. (Forbruk ca. 50 cm3 destillert vann.) NB: Det er viktig at væskenivået i ionebytteren aldri får synke så mye at det kommer luft inn i lonebyttermassen. På den andre siden er det best å vente med å fylle på ny løsning til væskenivået har sunket nær til lonebyttermassen hvis man ønsker en mest mulig effektiv ionebytter. c) En 250 cm3 erlenmeyerkolbe settes under ionebytteren for å samle opp eluatet. d) 25 cm3 av prøveløsningen som inneholder natriumioner, konsentra­ sjon ca. 0,1 M, får passere den hydrogenionmettede ionebytteren. e) Det etterskylles 3-4 ganger med destillert vann i porsjoner på ca. 10 cm3, eller til eluatet er nøytralt. Kontroller etter tredje porsjon. f) Natriumionene har nå trengt ut en ekvivalent mengde hydrogenioner ■ som kan bestemmes kvantitativt ved titrering med 0,1 M natriumhydroksydløsning. Indikator: BTB (bromtymolblått) eller fenolftalein. For at resultatet skal være pålitelig, må det gjøres flere paralleller. Vi regner vanligvis med at ionebytteren tåler 3 prøver før det er nødvendig å regenerere.

47

3. Anionbytter: Atskillelse av Fe3+, Co2+ og Ni2+ Prinsipp

Fe3*, Co2* og Ni24 som finnes i vannløsning, kan skilles fra hverandre ved hjelp av en anionbytter ved at man gjør bruk av de tre ionenes ulike tendens til å danne kompleks med kloridioner. I ca. 9 M saltsyre foreligger Fe3* hovedsakelig i form av negativt ladde kompeksioner. f.eks. FeClF. Co2* danner også negativt ladde kompleksioner, f.eks. CoCl42 . Disse er imidlertid svakere, det vil si at de har lettere for å spaltes enn anionkomplekset mellom Fe3* og kloridioner. Ni2* danner ikke anionkompleks med kloridioner. Til å atskille disse ionene nyttes en kloridionmettet anionbytter. Til den løsningen som inneholder de tre ioneslagene, settes konsentrert saltsyre, slik at løsningens kloridionkonsentrasjon blir ca. 9 M. Ved denne store kloridionkonsentrasjon foreligger jern og kobolt praktisk talt bare som negative kompleksioner, mens nikkel bare foreligger som positive ioner. Noen cm3 av løsningen helles ned i ionebytterkolonnen. Etterpå heller man et visst volum 9 M saltsyre opp i kolonnen. Det viser seg at den løsningen som renner ut av kolonnen, foruten saltsyre bare inneholder nikkelklorid. Løsningen er grønnfarget av nikkelionene. Da nikkel bare foreligger som positive ioner, vil den ikke bli fanget opp av anionbyttere. Deretter tilsetter man 5 M saltsyre. Når kloridionkonsentrasjonen minker, spaltes CoCIT etter hvert ved at det dannes CoCly, CoCfi, CoCl* og Co2*:

h2o

CoC13(H2OF + CT coC12(hoo)2 + cr

CoCL,(H2O)o + H2o CoC1(H2O)/ + H2o

CoCl(H9b)3* + CT Co(H2O)X + CT

CoCl/ + H2O

coci,(H2oy +

I en løsning som er 5 M med hensyn på kloridioner, finnes størstedelen av koboltmengden som nøytrale eller positivt ladde klorid kompleksioner. Kobolten frigjøres derfor fra ionebytteren. Til slutt frigjøres jernioner med 0,01 M saltsyre. Ved en så lav kloridionkonsentrasjon foreligger jernet praktisk talt bare som positi­ ve ioner. Det skilles ut gult FeCfiHjO)2*.

Utførelse:

1. Reagens på metallionene. Lag løsninger av jem(III)nitrat, nikkel(Il)nitrat og kobolt(II)nitrat i vann og i 9 M HC1. Fargene på løsningene noteres. (Fe3* er svakt gul i vann og sterkere gul i saltsyre, Ni2* er lysegrønn i vann og gulgrønn i saltsyre, Co2* er svakt rosa i vann og blå i saltsyre.) 48

2. 3.

4.

5.

6.

7. 8.

Til noen cm3 jem(III)nitratløsning i et reagensrør tilsettes noen dråper kaliumtiocyanatløsning (KSCN). Det dannes en mørkerød løsning enten man bruker jem(III)nitratløsningen i vann eller i saltsyre: Reaksjon: Fe3+ + SCbT Fe(SCN)T En løsning av Ni(II)nitrat gjøres basisk med natriumhydroksydløsning. Noen dråper dimetylglyoksin tilsettes. En sterk rød løsning viser Ni2+_. Til noen cm3 kobolt(II)nitratløsning i et reagensrør tilsettes ca. 1 g fast ammoniumrodanid og 1 ml 2-metyl-l-butanol (amylalkohol). Løs­ ningene ristes. Blå farge i det organiske sjiktet viser Co2*. Pakk en anionbytterkolonne. Beskrivelse, se side 46. Mett anionbytteren med kloridioner ved å la ca. 40 cm3 4 M saltsyre passere gjennom den. Tilsett syra i små porsjoner. Pass på at væskeoverfiaten aldri synker så mye at luft kan komme inn i ionebyttermassen. Passe gjennomstrømningshastighet er 3 cm3 pr. minutt. Tilsett prøveløsningen: 6 cm3 av en løsning som er 9 M med hensyn på HC1, 0,1 M med hensyn på Ni2^-ioner og 0,005 M med hensyn på Co2" og Fe3+. Bruk nitrater og vær oppmerksom på at alle disse nitratene inneholder krystallvann. La løsningen renne gjennom ionebytteren. Tilsett 40 cm3 9 M saltsyre i små porsjoner. Eluatet samles opp i reagensrør i porsjoner på 10 cm3. Rørene merkes så de kan identifiseres siden. Eluer deretter med 60 cm3 5 M saltsyre. Samle opp eluatet i porsjoner på 10 cm3. Merk rørene! Eluer til slutt med 40 cm3 0,01 M saltsyre. Eluatet samles opp som beskrevet før. Undersøk innholdet av eluatene: Iaktta fargen på dem og forsøk å trekke slutninger. Eluatet fra 5 gjøres basisk med 10 M NaOH. FORSIKTIG! Etter avkjøling tilsettes reagens for nikkelioner. Eluatet fra 6 testes for koboltioner og eluatet fra 7 for jemioner.

49

Diverse forsøk

1. Orsatapparat — gassanalyse Prinsipp

Dette apparatet blir mye brukt til kvantitativ analyse av CO2, CO og i forbrenningsgasser. Metoden bygger på at disse tre gassene absorberes i tre forskjellige medier: CO2 absorberes i en kaliumhydroksydløsning CO2 + 2K0H

= K2CO3 + H,O

CO absorberes i en kopper(II)kloridløsning 2CO + Cu2Cl2 — Cu2Cl2. 2CO O2 absorberes i en pyrogallolløsning. Fordi kopperkloridløsningen absorberer både CO og O2 er det viktig at O^ blir absorbert før CO. Se prinsippskisse av apparaturen på fig. 22. Gassen som skal analyseres, tas inn forbi hanen A. Absorpsjonsbeholderen B inneholder KOH-løsning, pyrogalloløsning og kopperkloridløsnmg. Gassbyretten C rommer 100 ml og har 0-merke både oppe og nede. Vannmantelen. D, er en sylindrisk glasskappe fylt med vann. Vanntemperaturen skal holdes konstant gjennom hele forsøket. Nivåflaska E er festet til byretten med en gummislange. Den inneholder en sperrevæske som i liten grad oppløser gasser. Absorpsjonsbeholderne, B, består av to beholdere som er forbun­ det nedentil (se fig.). Den fremste beholderen er forbundet med gassrøret ved en hane, den bakerste hanen er forsynt med en gummiball øverst.

51

Klargjøring av apparaturen

Absorpsj onsvæsker: KOH-løsning: 400 g KOH pr. liter destillert vann Pyrogallolløsning: 250 g pyrogallussyre + 750 ml destillert vann. Dette blandes med 1200 g KOH + 800 ml destillert vann. Kopperkloridløsning: 200 g CuCl + 250 g NH4CI, 750 ml destillert vann. Tre deler av denne løsningen blandes med én del 20 %NH3-løsning. Deretter fylles løsningene over i absorpsj onsbeholderne slik at disse er fylt til merket på deri forreste beholderen. Den bakerste vil da være ca. halvt fylt med væske. Lukk ventilen. Sperrevæsken lages slik: 20 % NaCl-løsning tilsettes 1 ml 1 N HC1 og 1 ml metylrødt pr. liter. Hell sperrevæske i nivåflaska E, og hold den slik at sperrevæsken fylles opp til nullmerket på byretten, C (se fig.). Nå skal apparatet spyles med gass. Gassinntaket koples til ventilen A. Nivåflaska senkes slik at gassen suges over i byretten. Når byretten er fylt med gass, åpnes hanen A mot luft, og nivåflaska heves igjen slik at gassen presses ut av apparaturen. Skyll apparaturen to-tre ganger med gass på denne måten. Utførelse

Nivåflaska holdes slik at byretten er fylt til 0-merket med sperrevæske. Ventilen A åpnes mot gassinntaket, og nøyaktig 100 ml gass suges inn i byretten ved å senke nivåflaska. Steng hanen A.

Husk: Ved avlesing av byretten skal væsken i nivåflaska og i byretten være i samme nivå.

Først analyseres gassen med hensyn til CO9. Hanen til absorpsjonsbeholderen med KOH-løsning åpnes. Nivåflaska heves slik at væsken i byretten og nivåflaska er i høyde med det øverste nullmerket. Vent et øyblikk, og før gassen tilbake til byretten. Absorpsjonsvæsken skal da stå opp til merket i absorpsjonsbeholderen. Trykk om nødvendig på gummiballen. Les av volumet i gassbyretten. Gjenta forsøket til avlesningen i byretten er konstant. Steng hanen til absorpsjonsbeholderen med KOH. Åpne hanen til absorpsjonsbeholderen med pyrogallolløsning, og analy­ ser på samme måten for O0. Noter avlesningen i byretten. Husk å stenge ventilen til absorpsjonsbeholderen når avlesingen er ferdig. Til slutt analyserer du på samme måten med hensyn til CO ved å åpne hanen til absorpsjonsbeholderen med kobberkloridløsning. Noter avlesnin­ gen i gassbyretten. Regn ut hvor mange volumprosent CO2, O, og CO gassen inneholdt.

52

2. Luftanalyse med drågerapparat Apparatur

D

6

8

£

10 12

14

16 18

20

F n=10

H2S 1/C

Drågerapparatet brukes når en raskt vil finne ut størrelsesordenen av en luftforurensing. Ofte dreier det seg om så små mengder forurensende stoffer at det er vanskelig å måle gassvolumet etter absorpsjon slik som i orsatapparatet. I drågerapparatet brukes et absorpsjonsrør som inneholder et stoff som gir en fargereaksjon med den forurensende gassen. Fargens utstrekning i absorpsjonsmidlet er et mål for den mengden som er absorbert. Drågerapparatet kan f.eks. brukes til å bestemme hydrogensulfid, svovel­ dioksyd, tetraklormetan eller kvikksølvdamp i lufta på laboratoriet. Absorpsjonsrøret er vist på figur 23. Røret er ca. 12 cm langt og tilsmeltet i begge ender (A og B). Disse rørendene skjæres av like før apparatet skal brukes. C er et matt felt der man kan skrive på analysens nr., navn, dato o.l. D er et metallnett og en glassvattdott som skal gi jevn fordeling av gassen over hele rørets tverrsnitt. E er absorpsjonslaget. Dette er selvsagt forskjel­ lig alt etter hvilket stoff man skal analysere på. Langs E er det en tallskala som brukes ved avlesing av apparatet. Denne tallskalaen angir ofte konsentrasjonen i ppm (parts per million, volum). Bestemmelse av ILS

Fig. 23. Absorpsjonsrør for drågerapparatet.

Ved bestemmelse av H?S består absorpsjonslaget av et blysalt som er absorbert på kiselgel. Reaksjonen med H0S blir da: H2S + Pb++ PbS + 2H+ PbS vil danne et lysebrunt lag i absorpsjonsmaterialet. Apparaturen plasseres der analysen skal foretas. Når du er helt klar til å foreta analysen, åpner du begge endene av absorpsjonsrøret ved hjelp av fila som hører til apparatet. Absorpsjonsrøret settes så på plass i pumpa. Pass på at lufta passerer røret i pilens retning, og se etter at røret og pumpa slutter tett sammen slik at det ikke suges inn falsk luft. Trykk pumpa sammen, og la den deretter utvide seg. Pump så mange ganger som det er angitt på prøverøret. Hver gang suges det 100 ml gass gjennom røret. Ta vekk prøverøret, og pump et par ganger etterpå for å fjerne eventuell kjemikaliedamp fra apparaturen. Les av analyseresultatet og noter det. Husk at noen fargereaksjoner bare er holdbare kort tid, mens andre er permanente. Angi H2S-mengden i gassen i ppm. Regn ut H2S-innholdet i mg pr. md luft. Finn også ut hvor mange ppm som tilsvarer 0,1 volumprosent H0S i lufta.

53

3. Jod-klokke Prinsipp

Jodat reduseres til jodid ved hjelp av sulfitt som reduksjonsmiddel (1). Videre vil jodid oksyderes og jodat reduseres til jod (2). Med stivelse gir jod blå farge.

4-5 4-4 IOf + 3S?Z

5r 4-IOf 4- 6H+

—1 4" 6 F 4-3SO/

3I2 4- 3H2O

I? 4- stivelseblått kompleks.

Red. F+ + 6e Oks. S-*+ - 2e

Oks. F - e-*- I Red. I5+ 4- 5e~*~ I

F (1) S6+

(2)

(3)

Så lenge det er sulfitt til stede, vil jodat reagere etter ligning (1). dvs. det dannes ikke I2 og heller ikke blåfarge. I det øyeblikk da sulfitt er brukt opp, vil jodat reagere med det jodidet (2) som er dannet og blåfargen vil straks komme fram (3). Da det tar en viss tid før blåfargen vises, må vi anta at (1) er en langsom reaksjon.

Utførelse

Løsning A. Løs 0,25 g kaliumjodat (KIO3) i 150 ml vann. Løsning B. Løs 0,1 g natriumsulfitt (NaoSOj), 0,5 ml 3 M H2S04 og 8 ml 1 % stivelse i 142 ml varmt vann. De to løsningene tempereres til samme temperatur, og blandes. Tiden før omslag noteres. Økning eller minking av konsentrasjonene vil gi endret reaksjonstid.

Det kan lages større porsjoner av løsning A og B, og det kan undersøkes hvordan forandring i konsentrasjon og/eller temperatur virker inn. Husk å forandre bare en konsentrasjon om gangen.

54

4. Oscillerende reaksjon (farge kommer og går) Prinsipp

De to hovedreaksjoner som inngår er følgende: 10 50,0, + L

+5 -2 2HIO, + 4H O

O i + e O 21° - 10e^ 2F+

(\^

Jod oksyderes til jodat, og hydrogenperoksyd reduseres.

5H,O2 A 2H1O, ^±5O2 4~ I, + 6H,0

O 1 -- e 4-^- O (2) 15+ + 5e 1°

Jod reduseres, og hydrogenperoksyd oksyderes. I den ene reaksjonen produseres jod, det vil si at reaksjonsblandingen blir blåfarget. 1 den andre reaksjonen forbrukes jod, det vil si at blåfargen forsvinner. Den totale reaksjon er man ikke sikker på, men det antas at det er ganske kompliserte reaksjoner som inngår.

Utførelse

Løsning A. Løsning B.

H2O0 4,5 M KIO3 (42,8 g) + H2SO4 (160 ml, 1 M) til 1 liter løsning. Løsning C. Malonsyre (CH2(COOH))2 15,6 g + mangansulfat 0,02 mol til 1 1. Løsning D. 3 % stivelse 25 ml vann tilsettes 10 ml A, B, C og 0,5 ml D.

Noter hvor mange ganger fargen kommer og går.

55

Tillegg

1. Mikroskopet Hensikt: å lære å bruke mikroskopet Utstyr: mikroskop, objektglass, dekkglass, dråpeteller, hår, ferdig preparat. Mikroskopet er et meget viktig hjelpemiddel i undervisningen. Det kan få det objektet du undersøker, til å se flere hundre ganger større ut enn det virkelig er.

Fig. 24. Mikroskopet.

1. Undersøk mikroskopet. Finn okular (1), tubus (2), grov- og fminnstillingsskrue (3) og (4), objektiv (5), revolver (6), objektbord (7), preparatklemmer (8), kondensor (9), blender (10), lampe m/bryter (11). 2. BRUK ALDRI MAKT PÅ MIKROSKOPET. Linsene er det mest kostbare på mikroskopet. De må behandles svært forsiktig. TA ALDRI PÅ LINSENE. Linsene må bare rein gjøres med linsepair. Overlat dette til læreren. 3. Plasser det ferdige preparat på objektbordet under preparatklemmene. 4. Drei revolveren til minste forstørrelse (minste objektiv). Du hører et klikk når det er på plass. 5. Plugg inn støpselet og tenn lampen (11). 6. Påse at objektet ligger i lysstrålen som kommer opp gjennom konden­ seren. 7. Innstill med grovinnstillingsskruen til du får objektet i fokus (skarpt bilde). Juster så med fminnstillingsskruen til du får et helt klart bilde av objektet. 8. Når du skal skifte til sterkere forstørrelse, dreier du på revolveren slik at et nytt objektiv kommer på plass. Det skal nå bare være nødvendig med en mindre finjustering for å få et helt skarpt bilde. 57

9. Når du dreier revolveren til største forstørrelse, må du være meget forsiktig. Det er nå meget liten avstand mellom objektiv og preparat. 10. BEGYNN ALLTID MED MINSTE FORSTØRRELSE. 11. Studer preparatet. Tegn det du ser.

Fig. 25. Bruk pinsett når du plasserer dekkglasset.

Vanndråpe

12. Lag et VANNPREPARAT av et hår. Legg et reint objektglass på arbeidsbenken. Ved hjelp av dråpetelleren avsetter du en dråpe vann på midten av glasset. Legg håret ned i vannet. 13. Berør vanndråpen med den ene kanten av dekkglasset. Senk så forsiktig den andre kanten ned mot vannet slik at håret blir liggende i vann mellom de to glassene. 14. I begynnelsen vil det lett komme luftblærer mellom glassene. Dette må du prøve å unngå. 15. Plasser objektglasset på objektbordet, og fest det med preparatklemmene. 16. Gå så fram som forklart ovenfor. Studer det du ser. Lag tegning. 17. Du kan regulere lysmengden med blenderen. Hvordan virker det inn på det du ser?

58

2. Framkalling og kopiering av svart/hvitt-film Framkalling av film

1. Den eksponerte filmen tres på spole og plasseres i tank. 2. Etter fortynning (se bruksanvisning) helles framkallervæsken i tanken. Virkningstiden finner man i tabellen som følger med framkallervæsken. For.å fjerne luftblærer fra filmen må man vende tanken med film kontinuerlig de tre første minuttene, deretter hvert 30. sekund. Når framkallingstiden er ute, helles væsken av, og filmen skylles to ganger med vann. 3. Tanken lukkes, fikseringsvæsken helles på. Tanken vendes av og til. Fikseringstiden er det dobbelte av klaringstiden for filmflippen, eller som angitt på Fix-pakken. Når fikseringstiden er ute, helles fikserings­ væsken tilbake på flaska. Inntil fikseringsprosessen er over, må filmen oppbevares i totalt mørke. 4. Filmen skylles 20-30 minutter i rennende vann. Til slutt behandles filmen 30 sekunder med vann tilsatt «foto-flo», fortynnet 1 til 200. 5. Vannet strykes av filmen, som henges til tørk i støvfritt rom. Filmen er tørr når den ikke lenger kleber. Kopiering

(Det brukes plastkopieringspapir, f.eks. Veribrom F2 9 x 13). 1. Filmen plasseres med blanksiden opp i forstørrelsesapparatet. Bruk full linseåpning ved skarpinnstilling, og still deretter linsen to hakk tilbake. I mørkeromsbelysning plasseres kopipapir med blanksiden opp under forstørrelsesapparatet og eksponeres. Ved tildekning eksponeres et prøvebilde 5-10-15 og 20 sekunder. 2. Kopipapiret plasseres i framkallerbadet med glattsiden ned. Glattsiden vendes opp etter ca. 30 sek. Hold papiret i bevegelse. Framkallingstid ett minutt, eller til framkallingen stopper. Framkallervæsken: Se bruksanvis­ ningen. 3. Det framkalte bildet overføres til stoppbad, 30 sek. Stoppbadet: iseddik fortynnet 1 til 20. 4. Fiksering i 1-2 min. Se bruksanvisning som følger pakken med plastkopipapir. (Tiden som er angitt på Fix-pakken gjelder papirfilm.) 5. Skylling, sirkulerende vann 2—4 min. 6. Det ferdige bildet tørkes, først ved avstryking og deretter ved plassering på bord. NB. Alle væsker tilberedes før man begynner på henholdsvis framkalling og kopiering. Samtlige væsker inkludert skyllevann skal ha temperatur 18-20 °C.

59

3. Standardforskrifter for Nordisk metodik-komité for levnedsmidler’ Nr. 1. Bestemmelseaf borsyre (H3BO3) 2. Bestemmelse af benzoesyre(C6H5COOH) 3. Bestemmelse af salicylsyre (CgH4OH COOH 1,2) 4. Kjemiske undersøkelsesmetoder til påvis­ ning av mangelfull mekanisk rengjøring av servise. 5. Bakteriologiske undersøkelsesmetoder til påvisning av mangelfull rengjøring av service og bestikk 6. Kvælstofbestemmelse efter Kjeldahl-metoden 7. Standardmetode for bestemmelse av aske i kom og mel 8. Bestemmelse af myresyre. Kvalitativ påvisning. 9. Reduktoseprøver for melk 10. Vægtanalytisk bestemmelse af fedt i mælk, fløde og mælkekonserves 11. Bestemmelse af tørstof, aske, chlorid og surhedstilstand i mælk, fløde og mælkekonserves 12. Bestemmelse af vægtfylde, frysepunkt og brydningstal i mælk og fløde 13. Beståmning av vattenhalten i spanmål och i vissa spanmålsprodukter 14. Bestemmelse av vanninnholdet i brød 15. Kemiska analysmetoder for maltdrycker 16. Bestemmelse af phosphor i cerealier 17. Bestemmelse af phytinsyre i cerealier 18. Bestemmelse af svovelsyrling 19. Bestemmelse af flour i kalkpræparater og i cerealier tilsat kalkpræparater 20. Metoder for bakteriologisk undersøkning av srndr 21. Bestemmelse af calcium i cerealier 22. Bestemmelse af jern i cerealier 23. Kemiska analysmetoder for kott och charkuterivaror 24. Metoder til undersøgelse af mælk og mælkeprodukter for patogene, hæmolytiske streptokokker

60

Nr. 25. Bestemmelse af flourindholdet i drikkevand 26. Analysmetod for kontroll av pastorisering av mjolk, grådde og vassle 27. Bestemmelse av totalt kiminnhold i melk, fløte og iskrem ved hjelp av platespredningsmetoden 28. Viktanalystisk beståmning av totala torrsubstansen i tomatpuré 29. Beståmning af drånerad vikt i grdnsaks- og fruktkonserves dår lagen omedelbart kan silas bort 30. Beståmning av koppar i livsmedel 31. Isolering och identifiering av vattenldsliga syntetiska fargåmnen Isolering og identifiering af fettoppløselige 32. kunstige fargestoffer 33. Identifiering av sockerater med papperskromatogram 34. Riktlinjer for provtagning av spanmål och spanmålsprodukter 35. Bestemmelse af arsen i levnedsmidler og i tilsætninger i levnedsmidler 36. Forberedelse til Analys av Prov på Spanmål och Spanmålsprodukter 37. Gæringsprøve til uspecifik kvalitativ påvis­ ning af konserveringsstoffer i levnedsmid­ ler 38. Bestemmelse af fedtstoffers aciditetsgrad 39. Bestemmelse af fedtstoffers iodtal 40. Bestemmelse af fedtindhold i sødmælk efter Gerber 41. Bestemmelse af organisk bundet halogen i læskedrikke, frugtsafter og marmelade 42. Beståmning av cyklamat 43. Bestemmelser af mono- og disaccharider i rene, vandige opløsninger (efter Potterat & Eschmann) 44. Bestemmelse av innhold av koliforme bak­ terier i næringsmidler 45. Bestemmelse af peroxidtal i rene fedtstoffer samt smør og margarine 46. Beståmning i bly i livsmedel

47. Metode til holdbarhedsprøvning af helkonserves 48. Bestemmelse af p-hydroxybenzoesyreestere 49. Bestemmelse af nitrit. I. Uspecifik titrimetrisk rutinemetode til bestemmelse af nitrit i nitritsalt og nitritsalpeter. II. Bestemmelse af nitrit i nitritsalt og nitritsalpeter samt i kød, fisk og saltlage. 50. Kvantitativ bestemmelse af antioxidanteme BHA (3-tert-butyl-4-hyrdoxyanisol) og BHT (3,5 ditert-butul-4-hydroxytoluen) i fedtstoffer 51. Beståmning av kadmium i livsmedel 52. Bestemmelse af stivelse i charcuterivarer 53. Fremstilling og klaring af extrakt til sukkerbestemmelse 54. Påvisning og bestemmelse af formaldehyd i levnedsmidler 55. Bestemmelse af den totale nettovægt i frugtog grøntsager (konserves) samt drænet vægt i samme, hvor lagen umiddelbart kan drænes af 56. Bestemmelse av innhold av sulfitreduserende clostridier i næringsmidler

57. Bestemmelse af det totale indhold af phosphor i levnedsmidler 58. Bestemmelse av zink i levnedsmidler 59. Bakteriologisk undersøgelse af helkonserves 60. Chromatografisk påvisning af konserve­ ringsmidler 61. Beståmning av sorbinsyre 62. Bestemmelse af indhold af termotolerante, coliforme bakterier i levnedsmidler 63. Bestemmelse af oxalsyre 64. Bestemmelse af tørstof i konserveret grøntkål og spinat 65. Bestemmelse af diastatisk aktivitet i hvedemel 66. Kvantitativ bestemmelse af staphylococcus aureus (koagulaseproducerende stafylokokker) 67. Bestemmelse af bacillus cereus i nærings­ midler Forskriftene kan bestilles fra: Teknisk Forlag, Skelbækgade 4, 1717 Kbhvn.v. Telefon (01)*21 68 01

i

61