Replicarea ADN-ului [PDF]

Zitiervorschau

REPLICAREA = procesul de duplicare al unei molecule de ADN, realizat prin sintetizarea unei catene complementare fiecarei catene din cadrul moleculei de ADN initiala - se copiaza si se transmite info genetica de la celula-mama la celulele-fiice, de la parinti la copii Caracteristici : 1 - model semi-conservativ - fiecare catena de adn d.c. este matrita pentru formarea unei noi molecule adn dc 2 - replicarea incepe de la un situs specific numit originea replicarii 3 - se desfasoara in directia 5'-3' : sinteza celor doua molecule se desf simultan, dar in directii opuse pe cele doua catene 4 - este semi-discontinua : catena noua 5-3' ce foloseste ca matrita catena 3'-5' (catena leading) este sintetizata continuu in directia furcii de replicare; catena noua 3'-5' ce foloseste ca matrita catena 5'-3'(catena lagging) este sintetizata discontinuu, in opusul directiei furcii de replicare se formeaza scurte segmente prin sinteze discontinue, numite fragmente Okazaki Principalele etape ale replicarii sunt : 1 - initierea - recunoasterea regiunii de la care se incepe replicarea 2 - elongatia - procesul efectiv de duplicare 3 - terminarea - etapa de sfarsit, dupa sintetizarea catenelor complementare - secvente ter

PK Componente pt PK : 1 - matrita ADN 2 - substrat nucleotide 3 - enzime si alte proteine : 1. Topoizomeraze – I – fara ATP, incizii monocatenare, induce relaxare actionand asupra suprarasucirilor positive II –; Giraza – incizii dublucatenare : fara atp – relaxare; cu atp suprarasuciri

2. Complex primozom - actioneaza la nivelul originii:  DNA A – ATP-aza –  DNA B – helicaza (asociata cu C si A) – despiralizeaza helixul – formeaza 2 catene  DNA C  DNA G – primaza – sintetizeaza primeri ce repr situs de pornire a sintezei mediate de AND polimeraza 3. Proteine ssb (single-strand binding) previn reasocierea catenelor prin atasarea la scheletul pentozofosfat 4. ADN-polimeraze : Tip Gena Actiune I poIA - Polimerizatoare 667/min - Exonucleazica : 1 –proofreading 3’-5’; 2 -reparatorie II

poIB

-

Polimerizatoare Proofreading III poIC Polimerizatoare – 60 000 -100 000/s - Proofreading 5. ADN-ligaza – uneste fragmentele Okazaki prin refacerea legaturilor fosfodiesterice ADN polimeraza III : -

Actioneaza ca un dimer, fiecare monomer pe cate o catena Este o holoenzima formata din 10 subunitati

Denumirea subunitatii (litere mici grecesti) α (alpha) ε (epsilon) θ (theta) τ (tau) γ (gamma) δ (delta) δ' (delta) χ (chi)

Masa moleculara

Functii

130

ADN polimeraza Exonucleaza 5’->3’ Exonucleaza 3’->5’ Rol structural Dimerizarea miezului enzimei

27 10 71 47 35 33 15

Subansamblu

ATPaze

Miezul enzimei(Core) Complexul τ Complexul γ(clamp loader) Favorizeaza tranferul

ϕ (phi)

12

β (beta)

40

subunitatii β la matrita ADN Leaga miezul enzimei la ADN si il recicleaza

Complexul β(cleme)

Initierea la PK : Presupune - recunoasterea regiunii de la care se incepe replicarea, regiune numita origine de replicare (oriC). Sunt situsuri cromozomiale specifice, continand unitati repetitive scurte, bogate in A-T, recunoscute de proteine multimere "origin-binding proteins". Secventa oriC a molecule de ADN de la E.Coli prezinta 3 secvente repetitive de 13 pb si 4 secvente de 9 pb. ~ 20 molecule DNA-A, fiecare legand cate o molecula de ATP, se atasaza celor 4 secvente, ce determina denaturarea celor 3 secvente. Apoi, hexameri DNA-B helicazei, cu ajutorul DNA-C, se atasazeaza secventei oriC si desface legaturile dintre cele doua catene. Elongatia la PK ADN helicazele implicate in furca de replicare de la E. coli se deplaseaza in directia 5'-->3' direction. Holoenzima ADN Pol III interactioneaza cu ADN helicaza prin intermediul subunitatii  (tau) care se leaga la ambele core ADN polimeraze. Una dintre “core” ADN Pol III replica catena directa in timp ce cealata catena inversa. SSB acopera regiunile monocatenare ale ADN ( pentru simplificare SSB de pe catena intarziata/antisens sunt prezentate numai partial Avem cele doua catene : pe Leading – se atasaza proteinele ssb pentru a preveni

reanelarea. Periodic, ADN primaza se asociaza cu ADN helicaza si sintetizeaza un nou primer pe catena matrita inversa/intarziata . intervine apoi ADN-polimeraza III care continua sinteza noii catene pornind de la capatul 3’OH liber al ultimei nucleotide din structura primerului. După încorporarea unui nou dNTP este eliberată a grupare PPi care funcţionează ca donor de energie. Pasul urmator este realizat de ADN polim I care realizeaza proofreading.

Pe Lagging – analog ssb si DNA-G primaza. Sinteza ADN continua cu ajutorul ADN polim III pana ce fragmentele extinse ajung la nivelul primerului anterior (al fragmentului Okazaki anterior). ) In momentul in care ADN polimeraza finalizeaza un fragment Okazaki, de pe catena intarziata, aceasta este eliberata prin alunecarea ea este eliberata prin alunecarea clemei (clamp) la nivelul ADN.Primerul recent amorsat de pe catena intarziata devine tinta pentru clema (clamp) care se pozitioneaza la nivelul primerului asambland un nou complex care realizeaza sinteza unui nou fragment Okasaki. In fata, un nou primer este sintetizat si procesul continua. Pentru unirea fragmentelor intervin ADN polimeraza

I cu functia exonucleazica 3’-5’ (proofreading) si 5’-3’ care degradeaza primerii, si cu functia polimerazica se extinde noua catena, de la o taietura – leg fosfodiester. rupta, proces numit translatia taieturii. Aceasta taietura este translatata pana cand and polim I disociaza. Ea este sudata ulterior de AND ligaza. Terminarea : - in dreptul secventelor Ter, la nivelul carora helicaza este blocata de activitatea proteinei Tus.

EK Caracteristici : -

Are loc in faza S a ciclului celular (6-8 h la mamifere) Exista mai multe furci de replicare – cromozomi multirepliconi ADN polimeraza nu actioneaza si la nivelul telomerelor cromozomilor. La acest nivel intervine o enzima specifica, numita telomeraza.

Componente pt EK: 1 - matrita ADN 2 - substrat - deoxinucleotide 3 - enzime sau alte tipuri de proteine : a – complexul ORC(echivalent DNA-A) - se leaga de originea de replicare, initiind replicarea b - complexul Mcm2-7 (echivalent DNA B helicaza-) desface catenele la nivelul furcii de replicare c – RF-A (echivalent protein ssb) - se atasaza la scheletul pentozofosfat ale fiecarei catene ADN pentru a preveni recuplarea

d - ADN-giraza - este topoizomeraza II - merge inainte de furca de replicare, inducand suprarasuciri negative pentru inlaturarea superrasucirilor pozitive, ce relaxeaza molecula e - ADN-polimeraza alfa - sintizeaza scurti primeri ARN pentru a oferi secventa cu capatul 3'OH liber pentru atasarea nucleotidelor f - ADN-polimeraza delta sau epsilon - continua sinteza noii catene, atasand nucleotide la gruparea 3'OH libera oferita de primer g - ADN-polimeraza beta - indeparteaza primerii ARN si ii inlocuieste cu ADN h - ADN-ligaza - uneste fragmentele Okazaki prin refacearea legaturilor fosfodiesterice ADN polimerazele  SINTEZA REPLICATIVA A ADN: - implica intreaga molecula de ADN - realizata in vederea reduplicarii genetice si continuitatii ereditare.  SINTEZA REPARATORIE A ADN: - se realizeaza la nivelul unor regiuni scurte - are loc destramarea catenei afectate Clasificare :  ADN polimeraza α (echivalent DNA G primaza)- initierea replicarii ADN - 4 subunitati distincte: cea mai mare – 180 KDa cea mai mica ~ 50-60 KDa - primaza capabila sa sintetizeze mici transcripti de ARN ce servesc ca primeri pt elongarea catenei ADN, asigurata de subunitatea catalitica. < 100 nucleotide / eveniment de legare  nu e inalt procesiva  ADN polimeraza β (echivalent polimeraza I)- repararea leziunilor ADN si recombinare

 ADN polimeraza γ - replicarea ADN mitocondrial  ADN polimeraza δ (echivalent adn polimeraza III) - replicaza nucleara - pe leading  in prezenta PCNA (antigenul nuclear din celulele proliferative) devine mai procesiva (>1000 nucleotide / eveniment de legare)  ADN polimeraza ε (echivalent polimeraza III)- repararea leziunilor ADN - activitate exonucleozica 3`-5` - active polim pe lagging Initierea : Secventele ori la eucariote sunt grupate in unitati replicative. Acestea grupeaza secventele ori care vor fi activate in acelasi timp. Echivalentul functional al proteinei dnaA este complexul ORC. Se formeaza complexul pre-replicativ compus din : proteina ORC, la care se atasaza cel putin 2 proteine aditionale si o helicaza mcm2-7. Activarea acestui complex duce la formarea furcii de replicare. Este activat prin fosforilarea proteinelor de catre cdk si ddk, fapt ce determina recrutarea multiplilor factori de replicare, printre care si ADN polimeraza alfa ce incepe sinteza primerilor. Elongatia Dupa ce primerii au fost sintetizati, intervine adn polim delta sau epsilon. DNA Pol δ recunoaste primerii si incepe sinteza catenei directe. Dupa o perioada de relaxare a ADN, ADN pol alfa sintetizeaza alti primeri, care permit initierea catenei intarziate si sinteza ADN la nivelul acestei catene prin interactionea ADN Pol ε si a altor polimeraze. Terminarea La nivelul telomerelor, cu ajutorul enzimei telomeraza, specifica acestui nivel.

Comparatie replicare PK cu EK : 1 - pk - CRS unireplicon - o singura secventa de la care incepe replicarea

ek - CRS multireplicon - mai multe secvente de la care se incepe replicarea 2 – PK – CRS circular EK – CRS linear 3 – viteza : 1000pb/s la PK →rata de mutatii mai mare 50 pb/s la EK -> procese de incetinire pentru a castiga acuratete : 4 – rata de mutatii : mai mare la PK 5 – marimea fragm okazaki : pk – 1000 pb; ek – 100 pb 6 – prezenta telomerelor la ek 7 – echivalenti : DNA A –> complexul ORC DNA G- primaza -> ADN polimeraza alfa ADN polimeraza I -> AND polimeraza beta ADN polimeraza III -> ADN polimeraze delta, epsilon