Produccion de Penicilina (Ingeniería de Procesos) [PDF]

Zitiervorschau

[ E s c r i Instituto b a

Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

e l n oProducción industrial de penicilina a partir m de hongo Penicilium. chrysogenum b r e d e

-Contreras Flores José Caín l -Gonzales Bernal Javier a -Reyes Baca Guadalupe -Segundo Ramírez Jesús Alberto c o -Tello Alvarado Bibiana m p a ñ í a ]

Contenido

Resumen....................................................................................................................3 1. INTRODUCCION...................................................................................................3 1.1 Penicilina..........................................................................................................3 1.2 Biosíntesis de penicilinas.................................................................................4 1.3 PRODUCCION INDUSTRIAL..........................................................................8 1.3.1 Desarrollo en tanques de sembrado.........................................................9 1.3.2 Medio de cultivo para la fermentación......................................................9 1.3.3 Etapa II. Biorreacción..............................................................................10 1.3.4 Etapa III. Purificación...............................................................................11 1.4 IMPORTANCIA ECONÓMICA.......................................................................12 1.5 Penicillium chrysogenum...............................................................................13 1.5.1 Clasificación taxonómica de Penicillium chrysogenum...........................13 1.6 Mejora de cepas productoras de penicilina..................................................14 1.7 MEDIO............................................................................................................15 1.7.1 Diseño de medios de cultivo...................................................................15 2.

ANTECEDENTES............................................................................................17

3.

Estrategia experimental....................................................................................19

4.

BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................21

Resumen Se realiza una estrategia experimental basándose en investigaciones anteriores para la producción industrial de penicilina, donde se hace los cálculos necesarios para los balances de materia y energía con la finalidad de optimizar la producción de este metabolito secundario, utilizando métodos de ingeniería de procesos, tomando en cuenta los distintos parámetros.

1. INTRODUCCION 1.1 Penicilina La penicilina fue el primer antibiótico empleado en medicina y su descubrimiento es atribuido a Alexander Fleming, quien junto a otros científicos médicos obtuvieron el premio Nóbel de medicina en 1945, mención más que merecida tras semejante aporte. El descubrimiento de la penicilina ocurrió de una forma un tanto casual y fue relatada por el propio Fleming, quien en la mañana del 28 de septiembre de 1928 se encontraba estudiando cultivos de bacterias en el sótano del laboratorio del Hospital St. Mary, en Londres. Fleming se encontraba estudiando bacterias de estafilococo para entonces, pero, luego de ausentarse casi por un mes de la ciudad de Londres, olvidó una placa de Petri en la que se contenían bacterias cerca de una ventana abierta. Al regresar a sus experimentos, se encontró con que su experimento se había estropeado pues las muestras se habían contaminado con una especie de moho que había entrado con el viento.[ CITATION Nol03 \l 2058 ] La curiosidad de Fleming hizo que el científico en lugar de tirar su experimento arruinado a la basura, colocase su placa de Petri al microscopio. Lo que observó fue que no solo el moho había contaminado todo el contenido de la placa, sino que alrededor de éste, había un claro, una zona limpia en la que el moho había matado a las bacterias. Luego de identificar el moho como hongos de Penicillium, Fleming fue optimista acerca de los claros resultados: el Penicillium eliminaba las mortales bacterias Staphylococcus de una vez por todas[ CITATION Nol03 \l 2058 ]. Aunque, al poco tiempo, perdió un poco la confianza al cuestionarse acerca de cuánto posible era utilizar este hongo como antibiótico en realidad y cuál seguro era para el cuerpo humano, sus numerosas investigaciones, pruebas y ensayos clínicos le dieron la seguridad necesaria para desarrollar y completar el descubrimiento. En este punto, mucho tuvieron que ver sus colegas universitarios, entre ellos, Sir Howard Florey y Ernst Chain, ambos de la Universidad de Oxford y con quienes comparte el premio Nobel.

Finalmente, luego de que los colegas de Fleming demostraran que la penicilina podía utilizarse perfectamente en los humanos como un antibiótico, se probó por primera vez en humanos. Orvan Hess y Bumstead Juan fueron las primeras personas en utilizar la penicilina como antibiótico y los resultados fueron un completo éxito. Desde entonces, los antibióticos de penicilinas han salvado una enorme cantidad de vidas en el mundo entero[ CITATION Jor09 \l 2058 ].

La penicilina es un elemento antibiótico que se emplea para el tratamiento de las infecciones y enfermedades derivadas. Su nombre proviene del término inglés penicillin, que, del mismo modo, deriva de la voz en latín Penicillium notatum. En su conjunto, las penicilinas son un tipo de antibióticos que tienen la facultad de combatir y eliminar las bacterias o microbios que originan infecciones en el cuerpo humano. Por tanto, forman parte del grupo de los antibióticos[ CITATION Jua11 \l 2058 ]. La penicilina es uno de los primeros antibióticos que fueron empleados en la historia de la medicina para el tratamiento de enfermedades mortales producidas por infecciones. Tan efectiva es que, en la actualidad, se sigue empleando en la medicina moderna. La penicilina se obtiene a partir de una especie de hongo concreta conocida como Penicillium. Del mismo modo, la penicilina sirve para la prevención y el tratamiento de diversas infecciones bacterianas. Principalmente las originadas por los microorganismos Gram positivos, como los estafilococos y los estreptococos, pero también por las bacterias Gram negativas como los gonococos y los meningococos. La penicilina es un antibiótico ß-lactámico que puede ser producido por muchos hongos. Es uno de los antibióticos que tiene mayor importancia clínica debido a su función como inhibidor específico de la síntesis de peptidoglicano. Aproximadamente el 38% de las penicilinas naturales producidas comercialmente se utilizan en medicina humana, el 12% en veterinaria y el 43% como material de partida para la producción de penicilinas semisintéticas[ CITATION Jor09 \l 2058 ]

1.2 Biosíntesis de penicilinas Las rutas de biosíntesis de penicilinas han sido estudiadas en detalle a nivel molecular y bioquímico, habiéndose conseguido conocer los pasos implicados. En la Figura1 se muestra un esquema de la vía biosintética de penicilinas con las actividades enzimáticas implicadas en cada paso.

Los dos primeros pasos de la vía biosintética de penicilinas son comunes. El primer paso consiste en la formación del tripéptido ACV: δ-(L-α-aminoadipil)Lcisteinil-D-valina por condensación no ribosómica de los tres aminoácidos que lo conforman (ácido L-α-aminoadípico, L-cisteína y L-valina), llevada a cabo por la enzima ACV sintetasa (ACVS). El segundo paso de la vía biosintética es la ciclación oxidativa del tripéptido ACV para dar lugar al compuesto isopenicilina N ya con una débil actividad antibiótica. La enzima responsable de la ciclación es la isopenicilina N sintasa (IPNS), también denominada ciclasa. El paso final de la biosíntesis de penicilinas consiste en la sustitución de la cadena lateral de L-α-aminoadípico por un ácido orgánico activado mediante coenzima A (CoA)[ CITATION Jor10 \l 2058 ].

Figura 1: Ruta de biosíntesis de penicilina por el hongo P. chrysogenum En hongos filamentosos y actinomicetos productores de cefalosporinas, la ruta prosigue con la epimerización de la isopenicilina N a penicilina N. Se ha propuesto que esta reacción transcurre en dos etapas: en primer lugar la isopenicilina N es activada por la enzima que codifica el gen cefD1 a su derivado de CoA y después

es epimerizada por la epimerasa que codifica el gen cefD2. Posteriormente, se produce la expansión del anillo tiazolidínico de la penicilina N dando lugar a la desacetoxicefalosporina C (DAOC). La enzima DAOC sintasa (expandasa) es quien lleva a cabo esta reacción. La DAOC es hidroxilada y oxidada por la enzima desacetilcefalosporina C sintetasa (hidroxilasa), sintetizando desacetilcefalosporina C (DAC). El último paso es llevado a cabo por la DAC acetiltransferasa, que acetila DAC mediante la transferencia de acetil-CoA al grupo hidroxilo, obteniéndose cefalosporina C.

En la Figura 2 se muestra un esquema de la localización de las enzimas de la ruta biosintética de penicilinas y de los procesos de transporte necesarios para que se lleve a cabo. Una evidencia clara de la importancia de estos microcuerpos en la biosíntesis de penicilina ha sido subrayada a través de la alteración del número y forma de estos orgánulos como resultado de la sobreexpresión de la proteína PcPex11p (una peroxina que está involucrada en la abundancia de peroxisomas). La sobreexpresión de esta proteína se traduce en un incremento en la biosíntesis de penicilina. Este efecto positivo viene a estar relacionado con un aumento en el transporte de penicilina y/o de los precursores a través de los peroxisomas, (Kiel y col., 2005), lo cual evidencia que el transporte a través de membrana en los orgánulos es muy importante[ CITATION Jor10 \l 2058 ].

Figura 2: Compartimentalización de la ruta biosintética de penicilina. Representación esquemática mostrando los pasos enzimáticos y los orgánulos involucrados en la ruta biosintética de penicilina. (1)ACV sintetasa. (2)IPN sintasa.

(3)IPN aciltransferasa. (4) fenilacetil-CoA (aryl-CoA) ligasa. PAA-CoA, (fenilacetilCoA). αAA, (L-α-aminoadípico). Cys, (L-cisteína). Val, (L-valina). PAA, (ácido fenilacético (AFA)). PenG, (bencilpenicina).

1.3 PRODUCCION INDUSTRIAL Un antibiótico es un producto del metabolismo secundario de muchos seres vivos que inhibe el crecimiento de otros organismos o induce la muerte. Son moléculas que actúan sobre las membranas y paredes microbianas, la replicación y la transcripción del DNA, la síntesis de proteínas y, en general, sobre el metabolismo de los microorganismos a diferentes niveles. La observación de Alexander Fleming en 1929 de que los penicillum notatum inhibían el crecimiento de los estafilococos condujo al desarrollo del procese de producción de la penicilina, iniciándose la era de los antibióticos. Las penicilinas son antibióticos del grupo de los betalactámicos empleados profusamente en el tratamiento de infecciones provocadas por bacterias sensibles. Distintas penicilinas son producidas a partir de Penicillum chrysogeizuin por adición de una apropiada cadena carboxílica en cantidad adecuada en el medio de cultivo, pero solamente tienen valor terapéutico la penicilina G y la V [ CITATION Lid08 \l 2058 ]. Hay dos tipos de procesos para la producción microbiología de antibióticos: 1. El proceso superficial, mediante el cual el microorganismo productor de antibiótico se desarrolla en forma de un almohadilla sobre la superficie de un medio líquido, en bandejas o frascos, o en la superficie de un sustrato solido húmedo finamente fragmentado; por ejemplo, virutas de madera o salvado de trigo. 2. El proceso de inmersión, mediante el cual el microorganismo se desarrolla en un medio líquidomantenido bajo agitación mecánica y aireación continuas, de modo que el microorganismo se desarrolla de manera uniforme y homogénea en la forma de una suspensión de células aisladas o pequeños agregados o colonias en todas áreas del líquido de cultivo [ CITATION Alf00 \l 2058 ]. Producción de penicilina por inmersión: Acelera en forma notoria el desarrollo y facilita la manipulación de cantidades importantes de microorganismos. Este proceso es mucho más eficiente que los procesos superficiales y, por lo tanto, es el único procedimiento factible para la producción comercial en gran escala.

Etapa I. Preparación de la materia prima Etapa de desarrollo en el laboratorio

Normalmente la cepa de producción es mantenida como esporos liofilizados o en nitrógeno líquido. Otra alternativa es mantener el desarrollo vegetativo en nitrógeno líquido o congelado a -70 °C. El desarrollo del inóculo se lleva a cabo a 25 °C en agares inclinados y matraces erlenmeyers, para inocular los tanques de sembrado (etapa de proliferación o propagacion) es necesario disponer de un gran númerode esporos (conidios). Usando un medio para esporulación (semillas de cereales, afrecho de trigo humedecido, pan integral, etc.) se preparan los conidios de la cepa utilizada. La concentración de esporas (óptima 5x103/ ml) y la formación de agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente. Luego de 6-10 días los cultivos están bien esporulados y puede inocularse un tanque de sembrado donde los conidios germinan y generan en 1-2 días un micelio activo, suficiente para inocular un fermentador [ CITATION And08 \l 2058 ].

1.3.1 Desarrollo en tanques de sembrado El inoculo para el fermentador se obtiene incrementando en forma progresiva la magnitud del crecimiento a través de una serie de tanques de sembrado; se pasa de un tanque a otro trasfiriendo el producto bajo presión de aire a través de cañerías estériles. En general este inoculo masivo equivale a un 510% de la partida principal; por lo tanto, los tanques de siembra equivalen a alrededor de 1/10 del volumen del tanque de gran tamaño subsiguiente. La transferencia vegetativa continua del hongo en medios artificiales conduce a una pérdida de la capacidad productora de penicilina (degeneración fisiológica), en consecuencia, es necesario minimizar la cantidad de transferencias intermedias entre el cultivo madre y la partida final [ CITATION Alf00 \l 2058 ].

1.3.2 Medio de cultivo para la fermentación En la fermentación el medio de cultivo es diferente al de proliferación, ya que ahora se trata de favorecer la elaboración del antibiótico por sobre el desarrollo del micelio. Los antibióticos, así como los pigmentos, son metabolitos secundarios. Medio de producción típico Licos de maíz (solidos).....................2% a 5% Lactosa bruta................................2% a 3% Carbonato de calcio........................0.5% a 1% El medio de cultivo utilizado para la producción comercial de penicilina por lo general contiene material nitrogenado natural, nitrato, ácido α-aminoadípico, harina de semillas de algodón o alcohol de maíz (un producto intermedio de la industria de la molienda del maíz), lactosa, precursor de la cadena lateral, un agente tensioactivo y sales minerales (incluido el sulfuro), también

se adicionan compuestos inorgánicos conteniendo hidrogeno, oxigeno, fósforo, azufre, potasio, magnesio, nitrógeno y trazas de hierro, cobre y zinc. Después de ajustar el pH a 4,5-5,0, el medio de cultivo se pasa al fermentador [ CITATION Alf00 \l 2058 ].

1.3.3 Etapa II. Biorreacción

Fermentadores Para la fabricación de penicilina se utilizan tanques cerrados estacionarios, conocidos como tanques fermentadores, con una capacidad de 20000 a 115000 litros. La mayoría de estos tanques esta provista de mezcladores a hélice o turbina y un dispositivo mecánico para distribuir aire estéril, el cual se encuentra acoplado en la regio del mezclador para alcanzar un máximo efecto de dispersión. Los tanques tienen una compuerta de acceso desarmable en la parte superior, visores y salidas para líneas de muestreo a válvula y cámaras de alimentación accesorias, lo que la inoculación manual si fuera necesaria (sobre todo en el caso de tanques de sembrado pequeño) y el agregado de otros materiales (estériles), como agentes anti-espuma, durante la fermentación. Todas las salidas de los tanques están constantemente expuestas a un chorro de vapor para minimizar el riesgo de contaminación [ CITATION Alf00 \l 2058 ]. El medio de cultivo se esteriliza mediante vapor a alta presión con enfriamiento ulterior-. Durante el desarrollo del hongo la temperatura se mantienen automáticamente entre 23°C y 25°C. El aire comprimido introducido en los fermentadores es esterilizado por filtración a través de cartuchos de tamaño adecuado esterilizados al vapor y rellenados, por ejemplo, con lana de vidrio. El aire estéril permite el crecimiento del hongo aerobio, y la agitación facilita su uniforme distribución en el seno del líquido. La fermentación de penicilina es un proceso aeróbico con una velocidad de absorción volumétrica de oxígeno de 0,4-0,8 mM/l min. La aireación presenta un problema especial en esta fermentación, debido a que al incrementarse la biomasa, y por consiguiente la demanda de O2, aumenta también la viscosidad del medio, lo cual crea una resistencia importante para la transferencia de oxígeno. La velocidad de aireación requerida está entre 0,5-1,0 volúmenes de aire (volumen de líquido)-1min-1dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de impulsor [ CITATION Alf00 \l 2058 ]. Se debe cuidar en esta fase no tener un exceso de glucosa debido a que el mismo puede ocasionar una inhibición de la actividad o de la síntesis de enzimas involucradas en la biosíntesis de penicilina. Al cabo de unas 50 a 90 horas el crecimiento se va haciendo más lento, lo que indica que el hongo se ha desarrollado por completo.

Condiciones especiales del fermentador Características específicas de cuando se intenta fermentación:

penicilina

que

debe

ser

considerado

•La mayoría de las penicilinas constituyen caldos filamentosos que son pseudoplástico(no Newtoniano) en la naturaleza. Esto significa que pueden ser difíciles de mezclar, debido a su alta (Y no constante) viscosidad. Asimismo, el aumento de la viscosidad del caldo puede obstaculizar la transferencia de oxígeno. Lo que nos lleva al siguiente punto. •La penicilina es un organismo aeróbico, por lo tanto la tasa de suministro de oxígeno es crítico a la fermentación. Así, el reactor debe tener un suministro de oxígeno eficiente sistema. •El pH óptimo para el crecimiento de la penicilina es de 6,5. Así, el reactor debe mantener pH eficientemente (esto se hace con frecuencia mediante la adición de NaOH). •Los problemas de estabilidad de deformación no existen y el mantenimiento de lacepa cuidado es obligatorio. •Duplicaciónde la biomasa es de aproximadamente 6 horas.

1.3.4 Etapa III. Purificación Actualmente la extracción con solventes es la base para la separación y purificación de la penicilina. El primer paso consiste en separar el micelio del medio de cultivo empleando un filtro rotatorio a vacío tipo cilíndrico. El filtrado rico en penicilina es luego enfriado en un intercambiador de calor a 0 -4 °C con el objeto de disminuir la degradación enzimática y química durante las etapas de extracción posteriores [ CITATION Alf00 \l 2058 ]. Las penicilinas G y V son ácidos fuertes (pKa entre 2.5 -3.1). Las formas ácidas son solubles en muchos solventes orgánicos y se pueden extraer con un alto rendimiento en acetato de amilo o de butilo a pH 2.5 -3.0. La extracción se puede realizar en operaciones continuas, a contracorriente en extractores centrífugos en etapas múltiples, a temperaturas de 0 -3 °C. Otra posibilidad es el empleo de mezcladores estáticos o decantadores, los cuales tienen en menor costo de inversión. Se debe tener en cuenta que tanto la penicilina G como la V se degradan en medio ácido con una cinética de primer orden a una velocidad proporcional a la temperatura y recíproca con respecto al pH. Esto hace que la vida media en condiciones de eficiente extracción en medio ácido sea muy reducida. Sin embargo como la forma V en tales condiciones es más estable que la G, si el objetivo es obtener 6-amino penicilánico (6-APA) la producción de penicilina V es más aconsejable.

La extracción de penicilina se puede realizar en una o más etapas sucesivas, con una acidificación del caldo filtrado con H2SO4 o H3PO4 al 10% P/V y con el agregado de un agente surfactante (0,003 -0,1% P/P, en el solvente), realizándose la extracción y concentración en extractores centrífugos. Dependiendo de las especificaciones de uso final, el solvente conteniendo penicilina se puede tratar con carbón para separar pigmentos y otras impurezas. Esta etapa actualmente no se realiza debido a las bajas impurezas de los caldos y a los altos rendimientos obtenidos. La cristalización se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo los valores críticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la concentración de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalización a partir de un solvente se requiere también un exceso de Na+o K+, siendo los cristales recuperados en un filtro rotatorio a vacío. Estos cristales son lavados y pre secados con un solvente volátil que también separa impurezas coloreadas. El secado definitivo se puede realizar con aire caliente, vacío o calor radiante [ CITATION Alf00 \l 2058 ].

1.4 IMPORTANCIA ECONÓMICA Siendo el descubrimiento de la penicilina desde la 1920, las enzimas presentes en la lisozima que poseían efectos antibacterianos, no fue hasta en 1941 y en 1943 cuando comenzó la producción comercial en Estados Unidos [ CITATION ARG07 \l 2058 ]. De modo que, en 1980 la producción mundial de penicilina alcanzó las 17.000 toneladas con un valor estimativo de 380 millones de dólares. Por lo tanto, estos dos valores son mayores que los de cualquier otro antibiótico y no son fijos, sino que la producción tiene una significativa velocidad de crecimiento anual [ CITATION Mar08 \l 2058 ]. La producción industrial de antibióticos β-lactámicos que son derivados de la penicilina, cefalosporina, básicamente cualquier agente antibiótico que contenga un anillo β-lactámico en su estructura molecular. Hoy en día, la producción industrial particularmente las penicilinas y las cefalosporinas, representan los principales productos biotecnológicos del mundo, con ventas en forma de dosis en todo el mundo de ~ 15,000 millones de dólares o ~ 65% del mercado mundial total de antibióticos [ CITATION Ela03 \l 2058 ]. Las penicilinas semisintéticas han llegado a ser extremadamente utilizadas en distintos tipos de tratamiento, debido a su amplio campo de acción. Aproximadamente el 38% de las penicilinas producidas comercialmente se utilizan en medicina humana, el 12% medicina veterinaria y un 43% se utiliza como material de partida para la producción de penicilinas semisintéticas [ CITATION Mar08 \l 2058 ].

Cabe mencionar, que uso y consumo masivo de antibióticos ha provocado el aumento de bacterias resistentes en un 30% al 50%, haciéndose muchas de ellas, intratables. Como consecuencia de esta situación se observan un aumento tanto de las enfermedades [ CITATION Kas16 \l 2058 ].

1.5 Penicillium chrysogenum Aunque la penicilina es producida por diversas especies del género Penicillium y Aspergillus, la producción industrial de penicilina está basada en el hongo P. chrysogenum. Los hongos productores de antibióticos β-lactámicos, como es el caso del hongo P. chrysogenum (Figura…) pertenecen al phylum Ascomycota, el cual agrupa aproximadamente al 75 % de todos los hongos descritos, y dentro de éste al subphylum Pezizomycotina [ CITATION Jor11 \l 2058 ]. P. chrysogenum es un hongo filamentoso que presenta conidióforos tabicados de pared lisa (200-300 µm), ramificado al final, con métulas (de 8-12 µm) y fiálides en forma de botella (de 7-12 µm), donde nacen conidios lisos, elipsoidales (de 2,5-4 µm) azules o verde-azulados en cadenas, sin ramificar, con un penacho o pincel característico. Forma colonias en poco tiempo, con un aspecto velloso, aterciopelado, un leve color verdoso, con una corona radial ancha y blanca. Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la colonia, y presenta un reverso habitualmente amarillento o cremoso, su esporulación es abundante y tiene un olor aromático, especiado o afrutado a manzana o a piña [ CITATION Ber10 \l 2058 ]. Está ampliamente distribuido en la naturaleza, suele formar colonias verdeazuladas sobre el pan duro y los cítricos, y sus esporas se encuentran frecuentemente en el polvo doméstico. No muestra una notable variación estacional. Las máximas concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las áreas urbanas que en las rurales). Su temperatura óptima de crecimiento es de 23 °C, pero crece entre 5 y 37 °C [ CITATION Car06 \l 2058 ].

1.5.1 Clasificación taxonómica de Penicillium chrysogenum. Reino: Fungi. Phylum: Ascomycota. Subphylum: Pezizomycotina. Clase: Eurotiomycetes. Orden: Eurotiales.

Familia: Trichocomaceae.; mitosporic Trichocomaceae. Género: Penicillium. Fig.. Hongo productor de penicilina, P. chrysogenum se pueden observar las esporas y las hifas

NCBI Taxonomy ID: 5076.

1.6 Mejora de cepas productoras de penicilina. La cepa original de Penicillium aislada por Fleming y que fue designada como P. notatum NRRL-1249 producía alrededor de 3-6 µg/ml de penicilina. En la búsqueda por conseguir cepas con un incremento en los títulos de penicilina se enviaron muestras de tierra de todas partes del mundo al Northern Regional Research Laboratory (NRRL) de Peoria, Illinois, donde fueron analizadas consiguiéndose cepas que incrementaban la producción de penicilina en cultivos sumergidos. A partir de la cepa P. chrysogenum NRRL-1951 y por mutagénesis al azar, utilizando mutágenos tanto físicos (luz UV, rayos X) como químicos (nitrosoguanidina) se fueron obteniendo sucesivas cepas que se seleccionaron según su mayor producción. Tras varios pasos de mutación se consiguió aislar la cepa Wis Q-176 con un título en penicilina de 2500 µg/ml. Esta cepa fue adoptada por la mayor parte de los fabricantes de penicilina y fue la original de la conocida línea Wisconsin en los distintos programas de mejora de cepas. Dichos programas han conseguido aumentar la productividad más de 1000 veces (Lein,1986; Elander, 2003). No solo ha sido importante el aumento del rendimiento en el desarrollo de las cepas, sino que también han sido optimizados otros factores que tienen un efecto muy importante sobre la recuperación del producto, como, por ejemplo, la eliminación de pigmentos que se purificaban junto con la penicilina. Sin embargo, estos métodos se han empleado para la obtención de un solo tipo de penicilina, actualmente existen muchos tipos de penicilinas que son usadas para diferentes enfermedades y en los procesos de obtención se han encontrado pérdidas. La producción de penicilina es un proceso relativamente ineficiente ya que sólo un 20 % de la fuente de carbono consumida durante la fermentación termina incorporándose a la molécula de penicilina, aunque los análisis de flujos metabólicos en las cepas de alta producción estiman un rendimiento teórico de la conversión hasta valores del 50 % (Jorgensen y col., 1995). La mejora en la

producción y en el porcentaje de rendimiento de las cepas que actualmente se emplean se ha conseguido, en mayor medida, mediante la utilización de técnicas clásicas de mutación y selección.

1.7 MEDIO 1.7.1 Diseño de medios de cultivo Para el cultivo de microorganismos, se necesita un medio de cultivo que contenga los elementos bioquímicos necesarios para el crecimiento, el cual, a su vez dependerá de tres factores: 1) la composición del medio debe reflejar la composición elemental del microorganismo. 2) los elementos del medio deben encontrarse o estar disponibles en moléculas que puedan ser absorbidas y metabolizadas por el organismo. 3)Para la preparación en el laboratorio el número de componentes y combinaciones debe ser lo más sencillo posible. Con base en lo anterior, cuando se tiene por objetivo el cultivo y el crecimiento exitoso de un microorganismo es necesario tener en cuenta el tipo de microorganismo que se tiene, las fuentes más apropiadas para su crecimiento y el contexto al que será aplicado en la industria, esto con el fin de preservar las características de interés que tiene durante su cultivo (expresiones enzimáticas, metabolitos, tipo de sustratos que es capaz de degradar etc).Para esto los medios de cultivo juegan un papel fundamental, pues van a permitir obtener la mayor concentración de biomasa o la mejor actividad degradadora de polímeros, lo que traerá como resultados tratamientos exitosos como la degradación de sustratos específicos u otras aplicaciones biotecnológicas con cepas específicas [ CITATION Jor04 \l 2058 ]. La penicilina G es producida utilizando procesos sumergidos en fermentadores de 40000-200000 litros. Debido a las dificultades en el suministro de oxigeno no puede ser empleados tanques mayores. La fermentación de la penicilina es un proceso aerobio con una velocidad de absorción volumétrica de oxigeno 0.4-0.8 mM/l.min. la velocidad de aireación requerida esta entre 0.5-1.0 volúmenes de aire (volumen de líquido)-1 min-1 dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de impulsor. Para el mezclador se suelen utilizar varios impulsores de tipo Rushton (120-150 rpm) el rango de temperatura optima es de 25-27 °C. El caldo de cultivo para la fermentación se obtiene por infusión acuosa de maíz, añadiendo de un 2 a un 3 % de lactosa, y también se adicionan compuestos inorgánicos conteniendo hidrogeno, oxigeno, fósforo, azufre, potasio, magnesio, nitrógeno y trazas de hierro, cobre y zinc.

La concentración de esporas (optima 5*103/ml) y la formación de agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente la penicilina G es un ácido fuerte (pKa entre 2.5-3.1). La extracción de penicilina se puede realizar en una o más etapas sucesivas, con una acidificación del ácido filtrado con H2SO4 O H3PO4 al 10% p/v y con el agregado de un agente surfactante (0.003-0.1 % p/p, en el solvente) realizándose la extracción y concentraciones en extractores centrífugos. La cristalización se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo los valores críticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la concentración de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalización a partir de un solvente se requiere un exceso de Na+ o K+, siendo los cristales recuperados en un filtro rotatorio de vacío. Estos cristales son lavados y presecados con un solvente volátil que también separa impurezas coloreadas. El medio de cultivo típico alimentado puede variar dependiendo de la cepa y generalmente consiste en:     

Liquido de maceración de maíz (4-5 % peso seco) Una fuente de nitrógeno adicional, harina de soya, extracto de levadura o suero Una fuente de carbono, lactosa El pH se mantiene constante a 6.5 El ácido fenilacético o el fenoxiacético se alimenta continuamente como precursores (0.5-0.8 % del total).

Los procesos con alimentación de glucosa o melazas también tienen éxito. En estos casos las velocidades de alimentación son de 1.0-2.5 kg/m3h con una concentración de glucosa de 500 kg/m3. Aproximadamente el 65% de la fuente de carbono metabolizada se utiliza para el mantenimiento energético, el 25% para el crecimiento y solo el 10% para la producción de penicilina [ CITATION Man07 \l 2058 ].

2. ANTECEDENTES [ CITATION Har09 \l 2058 ] demostraron un estudio sobre la producción de βlactama por P. chrysogenum, la adición y omisión de un precursor de cadena lateral que se usa comúnmente para generar penicilina a G. observaron los

efectos del precursor de la cadena lateral ácido fenilacético (PAA). De modo que, en una cepa modificaron una cepa la cual no tenía el grupo funcional del gen de biosíntesis de la penicilina G, en medios de quimiostato con glucosa limitada, cultivadas en presencia y ausencia de PAA causó una pequeña reducción del rendimiento de biomasa. Por lo tanto, el PAA que actúa como desacoplador de ácido orgánico débil, siendo este un ácido débil lo que probable que sea tóxico para las células dependiendo de su concentración y del pH del cultivo. Demostrando que, la ausencia de un grupo de genes de penicilina G dio como resultado una regulación positiva transcripcional de un grupo de genes supuestamente implicado en la producción del metabolito secundario. Mientas que en la suplementación de PAA varios genes implicados en el metabolismo del nitrógeno y azufre se regularon positivamente bajo condiciones de producción de penicilina. Además, el número de genes para los transportadores de penicilina se redujo fuertemente. Este estudio demuestra la utilidad del análisis de transcriptoma combinatorio en cultivos de quimiostato, permitiendo una comprensión de la energía la producción de penicilina G. Así mismo, la corroboración de genes que estaban que se encuentran implicados cuando la cepa se somete a estrés, los efectos de los parámetros biológicos y de proceso en la regulación de la expresión génica.

Stefan S. Weber y Arnold J. M. Driessen (2012) demostraron que la producción de penicilina en cepas de alto rendimiento puede mejorarse aún más mediante la sobreexpresión de isopenicilina N aciltransferasa (IAT), mientras que a niveles muy altos de IAT se acumula el ácido 6-aminopenicílico precursor (6-APA). La sobreproducción de ligasa de ácido fenilacético (PCL) solo estimula marginalmente la producción de penicilina. Estos datos demuestraron que en cepas de alto rendimiento IAT es el factor limitante y que esta limitación se puede aliviar mediante una sobreproducción equilibrada de esta enzima. Niveles de proteína IAT en cepas de P. chrysogenum de alto rendimiento. Los niveles de proteína IAT en las cepas que sobreexpresan penDE (5 días de crecimiento) se analizaron mediante inmunotransferencia usando anticuerpo policlonal específico de IAT. Las células se lisaron y las proteínas se recogieron usando precipitación con ácido tricloroacético (TCA) y se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia de Western. Con todas las cepas huésped (DS47274, DS47273 y DS17690), hubo un aumento casi lineal en el nivel de proteína IAT en el menor número de copias de penDE (1 a 3), pero los niveles saturados en los números de copia muy altos (15 a 30 ) (Fig. 1).

Figura 1. Niveles de proteína IAT en cepas que contienen copias adicionales de penDE. (A) Los niveles de proteína de IAT como se determina por análisis de Western blot. Carriles: 1, DS47274 (un grupo); 2, DS47274penDE2; 3, DS47274penDE15-16; 4, DS47274penDE4; 5, DS47273 (tres agrupaciones); 6, DS47273penDE24; 7, DS47273penDE4; 8, DS47273penDE5; 9, DS17690 (siete u ocho agrupaciones); 10, DS17690penDE30; 11, DS17690penDE10; y 12, DS17690penDE10 -11. (B) Cuantificación de los niveles de IAT en función del número de copia del gen de penDE. Los círculos cerrados corresponden a las cepas DS47274 (un grupo), DS47274penDE2, DS47274penDE4 y DS47274penDE15-16. Los círculos abiertos muestran las cepas DS47273 (tres clústeres), DS47273penDE4, DS47273penDE5 y DS47273penDE24, y los triángulos cerrados muestran DS17690 (siete u ocho clústeres), DS17690penDE10, DS17690penDE10 -11 y DS17690penDE30. Este estudio proporciona un enfoque racional para aumentar los niveles de producción de penicilina en cepas industriales.

En el año 2000 los investigadores van Gulik WM, de Laat WT y Vinke JL, Heijnen JJ. desarrollaron un modelo estequiométrico detallado para el crecimiento y la producción de penicilina-G en Penicillium chrysogenum. A partir de un análisis de flujo metabólico a priori utilizando este modelo, pareció que la producción de penicilina requiere cambios significativos en los flujos a través de las vías metabólicas primarias. Esto es provocado por la biosíntesis de precursores de carbono para el núcleo beta-lactano y una mayor demanda de NADPH, principalmente para la reducción de sulfato. Como resultado, ocurren cambios significativos en el reparto de flujo alrededor de cuatro nodos principales en el metabolismo primario. Estos se encuentran en: (1) glucosa-6-fosfato; (2) 3fosfoglicerato; (3) piruvato mitocondrial; y (4) isocitrato mitocondrial. Estos nodos deben considerarse como posibles cuellos de botella para aumentar la

productividad. La flexibilidad de estos nodos principales se investigó mediante la manipulación experimental de los flujos a través de las vías metabólicas centrales utilizando una cepa de P. chrysogenum de alta producción. Los flujos metabólicos se manipularon mediante el crecimiento de las células en diferentes sustratos en el cultivo de quimiostato de carbono limitado. El análisis del flujo metabólico, basado en los flujos de entrada y salida medidos, se utilizó para calcular los flujos alrededor de los nodos principales. Se encontró que, para el crecimiento en glucosa, etanol y acetato, la distribución del flujo alrededor de estos nodos difería significativamente. Sin embargo, esto apenas tuvo ningún efecto sobre la productividad de la penicilina, lo que demuestra que es poco probable que el metabolismo primario del carbono contenga posibles cuellos de botella. Se realizaron experimentos adicionales para manipular la demanda metabólica total del cofactor nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH). La demanda de NADPH se incrementó paso a paso al cultivar las células con glucosa o xilosa como fuente de carbono combinada con amoníaco o nitrato como fuente de nitrógeno, lo que dio como resultado una disminución escalonada de la producción de penicilina. Esto muestra claramente que, en la fermentación de la penicilina, las posibles limitaciones en el metabolismo primario residen en el suministro / regeneración de los cofactores (NADPH) más que en el suministro de precursores de carbono.

3. Estrategia experimental

Cuadro 1: diagrama de flujo de la estrategia experimental

Esporas liofilizadas: la cepa de producción es mantenida como esporos liofilizados o en nitrógeno líquido, posteriormente se activara en agar. –Agar inclinado: se prepara 100 ml de agar y se inoculara una muestra liofilizada. –cultivo vegetativo: se realiza el crecimiento en un medio vegetativo. –inóculos: una vez crecido en los diferentes medios, se procede a obtener los inóculos a utilizar en la fermentación. –fermentación: se lleva a cabo la fermentación típica de penicilina en un tanque de 1000 litros donde se agregó 100 gramos de glucosa por litro, 30 gramos de lactosa por litro, 20 gramos de sulfato de amonio por litro, caldo de maíz. Se mantendrá a un pH de 5.5 y con una temperatura de 26 grados centígrados, durante 40 horas. Filtración: pasado el tiempo se filtrara, con la finalidad de retirar el micelio. Enfriador: una vez retirado el micelio se pasará a enfriar en un intercambiador de calor rotatorio.-almacenamiento: se llevara a almacenar a -5 grados centígrados durante 5 días. –filtración: se realiza nuevamente una filtración para retirar partículas no deseadas que se pudieran formar durante el periodo de almacenamiento. –cristalización: se llevará a cabo con sodio o potasio. – separación de cristales: se lleva a cabo la separación de cristales al vacío. – secado: se realiza un secado a 80 grados centifrados.

4. BIBLIOGRAFÍA ARGENBIO. (13 de Junio de 2007). Consejo Argentino para la información y el Desarrollo de la Biotecnología. Obtenido de Historia y producción de la penicilina : http://www.argenbio.org/index.php?action=novedades¬e=234 Carlier MJ, W. S. (2006). The fungi as mayor group of organisms. Elsevier Ltd. Elander, R. (2003). Industrial production of beta-lactam antibiotics. Applied Microbiology and Biotechnology, 385-392. Freyre, L. B. (2008). Introduccion al estudio de micología. Universidad Nacional. Harris, D. M., Krogt, Z. A., & Klaassen, P. (2009). Exploring and dissecting genome-wide gene expression responses of Penicillium chrysogenum to phenylacetic acid consumption and penicillinG production. BMC Genomis. Illanes, A. (2008). Springer Enzyme biocatalysis (principles and applications). Jorge L Martínez, O. H. (2009). estudio de la potencialidad de produccion de penicilina acilasa de 9 hongod filamentosos. ciudad de la Habana. Jorgensen H, M. A. (2004). Growth and enzyme ´production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology 2004. Jorgensen H, M. A. (2011). Growth and enzyme ´production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. Juan Manuel, D. V. (2011). DISEÑO DE UN MEDIO DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA Y CONIDOS DE Penicillium sp. AISLADO DE SUELOS DE ARROZ DEL TOLIMA . Bogotá. Kasper, D., Fauci, A., Hauser, S., & Longo, D. (2016). Harrison. Principios de Medicina Interna, 19e. McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, S.A. de C.V. León, J. M. (2010). Un autoinductor de la biosíntesis de penicilina en Penicillium chrysogenum: Caracterización molecular y estudio de la respuesta del proteoma a la adición de inductor. León: Instituto de Biotecnología (INBIOTEC). Mannan S, F.-R. A. (Mannan S, Fakhru’l-Razi A, Alam MdZ. Optimization of process parameters for the bioconversion of activated2007). Optimization of process parameters for the bioconversion of activated sludge by Penicillium

corylophilum, using response Environmental Sciences 2007.

surface

methodology.

Journal

of

Marengo, C. (6 de octubre de 2008). Producción de Penicilinas y Tetraciclinas. Obtenido de Demanda mundial de la penicilina y la tetraciclina sito Web: http://penicilinatetraciclina.blogspot.mx/2008/10/demanda-mundial-de-lapenicilina-y-la.html R.Genaro, A. (2000). produccion de penicilina. Remington. RA., B. (2010). The long-term carbón cycle, fossil fuels and atmospheric composition. Nature. Yair, N. T. (2003). mejoramiento en la producción de penicilina. ciuda de México.