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Práctica 3: Determinación de coliformes en alimentos (NMP) 1

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES EN ALIMENTOS(NMP) Isabella shanaia Martínez olave, Natalia jhaidiris sabogal Giron

Universidad Santiago de Cali, Facultad de Ciencias Básicas, Laboratorio de Microbiología de Alimentos, Santiago de Cali. Abril 01 2021 [email protected] Resumen En esta practica se realizó la determinación de coliformes totales y fecales presente en un alimento de consumo regular, que en este caso fue una hortaliza llamada apiolo cual se realizó por medio de la técnica número más probable (NMP) , esta practica se dividió en tres fases que fue la prueba presuntiva , prueba confirmativa y prueba completa el cual se utilizaron medios de cultivo liquido como , VBB, EC,LST. De dichos cultivos se obtuvieron resultados NMP positivos para coliformes totales y fecales con niveles muy altos, por ello en la prueba completa que se realizó por medio de siembra en superficie en agar chromocul y EMB se evidencio la presencia de Escherichya.coli y otro tipo de coliformes donde se pudo concluir que las hortalizas tienen un alto índice de coliformes fecales y totales. Palabras claves: Recuento,Colformes,Agar,Probable,Viabilidad

Práctica 3: Determinación de coliformes en alimentos (NMP) 2

Práctica 3: Determinación de coliformes en alimentos (NMP) 2

Introducción

El número más probable es una estimación estadística basada en el hecho de que cuantas más bacterias haya en la muestra, mayor será la dilución necesaria para reducir la densidad hasta el punto en que no haya crecimiento de bacterias en el tubo de ensayo. Cuando los microorganismos que se van a contar no crecen en un medio sólido, el método de recuento más probable es el más útil. También es útil cuando se utiliza el crecimiento en medios líquidos diferenciales para identificar organismos (como en el caso de coliformes que fermentan selectivamente lactosa mediante la producción de ácido en el análisis de agua). El número más probable es solo un informe, lo que indica que existe una probabilidad del 95% de que la población bacteriana se encuentre dentro del estándar crítico, y MPN es el número más probable estadísticamente, sin embargo para este tipo de pruebas se utiliza en su gran parte para detectar coliformes totales y fecales ya que son indicadores de las condiciones en las que se han manipulado el producto, donde existe una relación directa entre su presencia y una contaminación de origen fecal directa o indirecta . Sin embargo, los coliformes son bacterias de origen entérico capaces de fermentar la lactosa a acido carbónico. Al grupo pertenecen los géneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y klebsiella, las cuales representan contaminación fecal. Se denomina coliformes fecales a las bacterias coliformes capaces de crecer a 44,5° C entre las cuales se encuentra Escherichia Coli, que es una bacteria que comúnmente se encuentra en el tracto digestivo, normalmente no patógena, sin embargo, incluye cepas que pueden ser; enterotoxicas, enterohemorrágicas, enteropatogenicas; su presencia ha sido interpretada como indicativa de encontrar posiblemente organismos enteropatógenos incluyendo a salmonella y shigella. Cuando se habla de coliformes cabe destacar que también se habla de la calidad bacteriológica del agua ya que para el consumo humano y domestico se necesita un tratamiento de potabilización convencional llamados, coagulación, floculación, sedimentación, filtración y desinfección, los cuales deben cumplir con un nivel de coliformes totales de NMP 20.000 microorganismos/100 mL y coliformes fecales NMP 2.000 microrganismos/100mL. Objetivos: 

Conocer la técnica de número más probable (NMP) de Coliformes en una muestra de alimento, a partir de la técnica de tubos múltiples, en la cual volúmenes decrecientes de la muestra (diluciones decimales consecutivas) son inoculadas en el medio de cultivo adecuado. La combinación de los resultados positivos y negativos es usada en la determinación de NMP.

Práctica 3: Determinación de coliformes en alimentos (NMP) 3 Materiales y Métodos Materiales -1 Boeco 250 mL -2 tubos tapa rosca -Asa bacteriológica -Incubadora a 35°C +/- 2 °C -Baño de agua con agitación, graduados a 44°C -Micropipeta de 10 a 100 µL -18 tubos de fermentación (Durham) -10 tubos con 9mL de caldo Lauril triptosa de sencilla concentración -10 tubos con 9 mL de caldo lactosado verde brillante bilis 2% -10 Tubos con caldo triptona -3 cjas petro -Gradillas -Mecheros -Gramera

Reactivos -Caldo Lauril sulfato triptosa de sencilla concentración -Caldo lactosado verde brillante Bilis -Caldo triptona o EC -Agar eosina azul de metileno (EMB) -Reactivo de kovacs

Preparación y dilución de los homogenizados de las muestras de alimentos Preparamos la muestra del alimento 10 gr de apio con los 90 ml de agua peptonada y a partir de ella hicimos diluciones hasta 10-3 Prueba presuntiva 1. Pipeteamos 1 mL de cada una de las diluciones del homogenizado del alimento(apio) en tubos con Caldo Lauril Sulfato Triptosa de sencilla concentración, utilizando tres tubos por cada dilución. 2. Agitamos suavemente los tubos e incubamos a 35oC +/- 2oC por 18 – 24 horas 3. Pasadas las 48 horas, anotamos los tubos que muestren producción de gas, que se observa por el desplazamiento del medio en el tubo de Durham Prueba confirmativa 1. A partir de los tubos positivos, con producción de gas de la prueba presuntiva de NMP de Coliformes, transferimos de cada tubo una asada de cultivo en: Verde Brillante Bilis al 2% con campana de Durham y Caldo Triptona o EC. 2. Mezclamos suavemente los tubos e incubarlos a 35oC +/- 2oC (Verde Brillante Bilis al 2%) y 44.5oC +/- 0.5oC (Caldo Triptona o EC) por 48 horas, en baño de agua con Rotación. 3. Al cabo de la incubación observar los tubos de Caldo Verde Brillante Bilis al 2% que presenten gas y revelar los Caldos Triptona adicionando 0.2 mL del reactivo de Kovac`s observando la formación de un anillo rojo cereza en la superficie de la capa

Práctica 3: Determinación de coliformes en alimentos (NMP) 4 de alcohol amílico indicando la presencia de indol cundo la prueba es positiva o el color original del medio cuando la prueba es negativa, para el caso del EC, observar turbidez y gas. Con el verde brillante se confirman Coliformes totales, con el triptona y EC se confirman Coliformes fecales. 4. Consideramos como Coliformes de origen fecal en triptona, los tubos que demuestren positividad en ambas pruebas: gas e indol positivos. No incluya los tubos Indol negativo, aunque el brilla haya sido positivo. 5. Confrontamos los resultados con la tabla de NMP. Prueba completa 1. De los tubos que fueron Indol positivos en la prueba confirmativa en el caldo triptona o positivos en el EC, tomamos una asada para sembrar por estría en Agar eosina azul de metileno (EMB), Agar violeta rojo neutro bilis (VRBA), agar MaConkey o Agar Endo. 2. Incubamos las placas invertidas a 35oC +/- 2oC por 24 horas, al cabo de este tiempo observe la morfología de las colonias. Si encuentra colonias aisladas y típicas se puede purificar el cultivo en agar nutritivo inclinado. 3. A partir de una colonia aislada a del agar nutritivo realizamos las pruebas bioquímicas para identificar completamente Eschechia coli.

Resultados En los resultados de la prueba presuntiva donde se realizaron diluciones seriadas hasta 10-3 por triplicado en caldo Laurin triptosa con campana de Durham donde se dejaron incubando por 24 horas a 35°C donde se evidencio gas y turbidez en los nueve tubos correspondientes dando positivo para la prueba presuntiva.

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Imagen 1: prueba confirmativa ,Caldo EC Dado a que la prueba presuntiva nos dio positiva con turbidez y gas , procedimos con la prueba confirmativa donde en el caldo Ec (imagen 1) que es un medio selectivo para E.Coli dieron positivos con turbidez para la presencia de esta bacteria , lo cual nos indica que el alimento que se escogió ( apio) contenía contaminación por esta bacteria lo cual es causante de enfermedades transmitidas por alimentos.

NMP=

NMP DE LA TABLA X 10 MAYOR VOLUMEN ESTUDIADO ¿ ¿

NMP=

110 X 10 =1100 NMP de E.Coli o coliformes fecales / gro o mL de alimento 0,1

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Imagen 2 : Prueba confirmativa, Caldo verde brillante bilis Prosiguiendo con el cultivo en caldo brillante bilis , el resultado de este fue positivo ya se me mostro acumulación de gas en las campanas de Durham y turbidez en los tubos, esto nos conlleva a que la prueba arrojo positivo tanto para coliformes totales como para coliformes fecales, donde se puede evidenciar que el apio tiene gran presencia de estos microorganismos

NMP=

NMP=

NMP DE LA TABLA X 10 MAYOR VOLUMEN ESTUDIADO ¿ ¿

110 x 10 =1100 NMP de coliforme totales / gr o ml de alimento 0,1 mL

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Imagen 3: Agar EMB 10-1, Prueba completa Para la prueba completa en agar EMB el cual es un agar selectivo se pudo evidenciar el crecimiento de E.Coli donde hubo un recuento de 152 colonias el cual se tiñeron de color blanco rosa.

UFC de E . c o li=

152 x 10 =15.200UFC de E . Coli 0,1mL =1,52X104 UFC de E.Coli

Imagen 4: Agar chromocult 103 Prueba completa

Práctica 3: Determinación de coliformes en alimentos (NMP) 8 El cultivo de chromocult se cultivo 1ml de el cultivo de alimento en caldo EC donde se escogió la dilución 103. Esta dilución en este medio no hubo ningún cambio crecimiento alguno como se puede evidenciar en la imagen 4, sin embargo se utilizo del mismo cultivo pero de diferente dilución y se sembró en diferente agar (EMB) y si se evidencio crecimiento de E.Coli lo que quiere decir que se puede demostrar la presencia de E.Coli en el agar EMB bajo una concentración más alta como 101. Con estos resultados obtenidos en la practica se puede evidenciar la presencia de E.coli y algunas otras bacterias que pueden estar presentes ya sea staphylococcus , streptococcus que están presentes ya sea en coliformes totales y fecales , esto arroja que muchas de las hortalizas vendidas en las plazas de mercado no cumplen con las medidas necesarias para la venta de estos productos Conclusiones 

Se logró aprender el fundamento y practica para realizar la técnica de NMP a pesar de que se realizo en diferentes fases, se logró una buena coordinación para terminar la practica.



Se evidencio con los resultados que la manipulación e higiene que tienen tanto los campesinos a la hora de cosechar sus productos como la persona final que los consume no utiliza unas buenas practicas de manufactura(BPM) el cual se presta para ser foco de enfermedades infecciosas gastrointestinales.

 Referencias o Bibliografía

1. Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2017). Introducción a la microbiologia. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana. 2. Prudhon, C. (2002). Evaluación y tratamiento de la desnutrición en situaciones de emergencia. Barcelona: Icaria. 3. Botello, A., & Fernández Bremauntz Adrián. (2005). Golfo de México. Campeche: Universidad Autónoma de Campeche, Centro de Ecología, Pesquerías y Oceanografía del Golfo de México. 4. superintendencia de servicios publicos domiciliarios. (2017). Calidad del agua. Bogota D.C: https://www.superservicios.gov.co/sites/default/archivos/SSPD %20Publicaciones/Publicaciones/2018/Oct/ebook_calidad_de_agua-26-12-2017-vbibiana1.pdf.

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