ngải cứu hutech [PDF]

Zitiervorschau

ĐOÀN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP. HỒ CHÍ MINH ----------------------

CÔNG TRÌNH DỰ THI

GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA LẦN THỨ XX NĂM 2018

TÊN CÔNG TRÌNH: NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU TỪ LÁ NGẢI CỨU (ARTEMISIA VULGARIS L.), XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC, KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ BƯỚC ĐẦU TẠO CAO XOA

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU

: Công nghệ Hóa - Dược

CHUYÊN NGÀNH

: Dược liệu

Mã số công trình: ……………………………. (Phần này do BTC Giải thưởng ghi)

i

MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................... i TÓM TẮT .................................................................................................................... v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................ vii DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... ix MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................... 8 1.1. Giới thiệu về Ngải cứu ......................................................................................... 8 1.1.1 Vị trí phân loại ..................................................................................................... 8 1.1.2. Giới thiệu về họ Cúc (Asteraceae) và chi ngải (Artemisia) ................................ 8 1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố .............................................................................. 9 1.1.4. Công dụng và dược lý của Ngải cứu ................................................................... 11 1.2. Giới thiệu về tinh dầu .......................................................................................... 12 1.2.1. Khái niệm về tinh dầu ......................................................................................... 12 1.2.2. Phân bố tinh dầu trong thiên nhiên ..................................................................... 13 1.2.3. Quá trình tích luỹ tinh dầu .................................................................................. 13 1.2.4. Tính chất vật lý của tinh dầu ............................................................................... 14 1.2.5. Tính chất hoá học của tinh dầu Ngải cứu............................................................ 15 1.2.6. Ảnh hưởng của những nhân tố khác nhau đến thành phần và tính chất của tinh dầu Ngải cứu ........................................................................................... 17 1.2.7. Ứng dụng tinh dầu Ngải cứu trong các ngành công nghiệp................................ 19 1.2.8. Nguyên tắc sản xuất tinh dầu .............................................................................. 19 1.2.9. Nguyên tắc trích ly tinh dầu ................................................................................ 19 1.2.10.Các phương pháp trích ly tinh dầu ..................................................................... 20 1.3. Giới thiệu về phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ................................. 25 1.3.1. Nguyên lý hoạt động của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ................ 26 1.3.2. Giới thiệu về ảnh hưởng các yếu tố đến hàm lượng của tinh dầu Ngải cứu ........................................................................................................................ 27 1.4. Khả năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật ................................................................. 28

ii

1.4.1. Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ..................................................... 28 1.4.2. Các cơ chế kháng khuẩn ..................................................................................... 28 1.4.3. Một số nhóm hợp chất alkaloid ở thực vật.......................................................... 30 1.4.4. Một số nhóm hợp chất glycoside ở thực vật ....................................................... 32 1.4.5. Nhóm tinh dầu ..................................................................................................... .34 1.5. Giới thiệu về các chủng vi khuẩn gây bệnh ........................................................ 35 1.5.1. Staphyllococcus aureus ........................................................................................ 36 1.5.2. Escherichia coli (E.coli) ...................................................................................... 38 1.5.3. Shigella ................................................................................................................. 39 1.5.4. Salmonella ............................................................................................................ 41 1.6. Giới thiệu về tình hình nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu và các loại tinh dầu khác từ thực vật ......................................... 43 1.6.1. Khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu Ngải cứu ............................................. 43 1.6.2. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu tần dày lá .............................. 43 1.7. Sắc ký khí ghép khối phổ và một số ứng dụng (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry) ............................................................... 44 1.8. Giới thiệu về cao xoa ............................................................................................. 49 1.8.1. Cao xoa................................................................................................................. 49 1.8.2. Thành phần ........................................................................................................... 50 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 52 2.1. Vật liệu ................................................................................................................... 52 2.1.1 Nguyên liệu ........................................................................................................... 52 2.1.2 Dụng cụ, thiết bị .................................................................................................... 52 2.1.3. Hóa chất .............................................................................................................. 54 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 55 2.2.1. Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ............................. 56 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................... 57 2.2.3. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu ........................................ 62 2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn ...................................................... 66

iii

2.3. Quy trình sản xuất cao xoa tinh dầu Ngải cứu ở quy mô phòng thí nghiệm .................................................................................................................. 68 2.4. Thống kê và xử lý số liệu ...................................................................................... 72 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 73 3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................... 73 3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................................................................. 73 3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá già) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ........... 75 3.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ............................................................................................. 76 3.1.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian ngâm dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ........... 78 3.1.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ............. 79 3.1.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ............. 82 3.1.7. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ....................................................................................................................... 83 3.2. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu ...................................... 85 3.2.1. Đánh giá cảm quan ............................................................................................... 85 3.2.2. Định lượng tinh dầu Ngải cứu.............................................................................. 85 3.2.3. Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu .................................................................................. 86 3.2.4. Chỉ số hóa học của tinh dầu Ngải cứu ................................................................. 87 3.2.5. Độ hòa tan trong ethanol ...................................................................................... 87 3.3. Kết quả xác định thành phần hóa học của tinh dầu .......................................... 88

iv

3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................... 91 3.4.1. Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ................................................... 91 3.4.2. Hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................................................................. 93 3.4.3. Kết quả hoạt tính kháng Salmonella typhimurium của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................... 95 3.4.4. Hoạt tính kháng Shigella boydii của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ............................................................ 97 3.5. Kết quả sản xuất cao xoa ở quy mô phòng thí nghiệm ...................................... 99 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................. 101 4.1. Kết luận .................................................................................................................. 101 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................ 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 103 PHỤ LỤC

v

TÓM TẮT Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành các hướng sau đây: Đầu tiên là nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ( kích thước nguyên liệu, tuổi nguyên liệu, nồng độ dung dịch NaCl, thời gian ngâm nguyên liệu trong dung dịch NaCl, thời gian chưng cất, độ héo của nguyên liệu, lượng nước chưng cất ) đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước: Kết quả cho thấy nguyên liệu lá già, cắt nhỏ 1 cm, nồng độ dung dịch NaCl 10%, thời gian ngâm nguyên liệu trong dung dịch NaCl là 30 phút, thời gian chưng cất là 180 phút, thời gian để héo của nguyên liệu là 5 ngày, lượng nước chưng cất là 450 mL ( tương đương tỷ lệ Ngải cứu : nước là 1 : 3) thích hợp cho thu nhận tinh dầu từ lá Ngải cứu. Kết quả xác định số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu cho thấy về cảm quan tinh dầu Ngải cứu thu được có màu vàng sáng, nhẹ hơn nước, mùi nồng đặc trưng, vị cay the…. Hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước là 0,446%; tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu là 0,881. Thứ hai là phân tích thành phần hóa học của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp GC-MS. Kết quả cho thấy tinh dầu Ngải cứu thu được ở huyện Củ Chi, Tp.HCM có các thành phần chính D-camphor (31,78%) và cineole (15,80%), ngoài ra còn có các chất α-Pinene (3,09%), β-Pinene (1,743%). Thứ ba là đánh giá khả năng kháng các chủng vi khuẩn (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Shigella boydii), kết quả cho thấy tinh dầu Ngải cứu có khả năng kháng các loại vi khuẩn gram (+), gram (-). Tinh dầu nguyên chất có khả năng kháng vi sinh vật mạnh nhất.

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO:

Dimethyl sulfoxyde

DNA :

Deoxyribonucleic Acid

E.Coli :

Escherichia coli

GC

:

Gas chromatography

MS

:

Mass spectrometry

NA

:

Nutrient Agar

NB

:

Nutrient Broth

PABA :

4-Aminobenzoic acid

RNA :

Ribonucleic Acid

SAS :

Statistical Analysis Systems

TCVN :

Tiêu chuẩn Việt Nam

TCVS :

Tiêu chuẩn vi sinh

TSA :

Trypticase Soy Agar

TSB :

Trypticase Soy Broth

vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình ảnh cây Ngải cứu (Artemisia Vulgaris) ......................................... 8 Hình 1.2. Một số cây thuộc chi Ngải ..................................................................... 9 Hình 1.3. Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) ................................................. 10 Hình 1.4. Cấu trúc 3D phân tử camphor ............................................................. 15 Hình 1.5. Cấu trúc 3D phân tử eucalyptol ........................................................... 16 Hình 1.6. Cấu trúc phân tử β-eudesmol............................................................... 16 Hình 1.7. Cấu trúc 3D phân tử α-pinene ............................................................. 17 Hình 1.8. Cấu trúc 3D phân tử Terpene-4-ol ...................................................... 17 Hình 1.9. Máy ép tinh dầu ................................................................................... 20 Hình 1.10. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước .............................................. 21 Hình 1.11. Hệ thống chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng ................. 24 Hình 1.12. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước và nguyên lý hoạt động........ 26 Hình 1.13. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật...... 28 Hình 1.14. Cấu trúc Morphine ............................................................................. 30 Hình 1.15. Cấu trúc Quinine ............................................................................... 31 Hình 1.16. Sơ đồ phân loại saponin ................................................................... 33 Hình 1.17. Staphyllococcus aureus ..................................................................... 36 Hình 1.18. Vi khuẩn E.coli .................................................................................. 38 Hình 1.19. Vi khuẩn Shigella .............................................................................. 41 Hình 1.20. Vi khuẩn Salmonella ......................................................................... 39 Hình 1.21. Sắc đồ của sắc ký khí ........................................................................ 46 Hình 1.22. Mô hình khối phổ .............................................................................. 47 Hình 1.23. Mass-spectrum................................................................................... 48 Hình 1.24. Một số loại cao xoa phổ biến ở Việt Nam ......................................... 50 Hình 2.1. Vườn Ngải cứu và nhánh Ngải cứu khô .............................................. 52 Hình 2.2. Bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước Clevenger ......................................... 54 Hình 2.3. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ........................................................... 55 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình chưng cất và thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương

viii

pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ........................................................................ 56 Hình 2.5. Quy trình sản xuất cao xoa .................................................................. 69 Hình 3.1. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ..... 74 Hình 3.2. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ............ 75 Hình 3.3. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .... 77 Hình 3.4. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ............................ 79 Hình 3.5. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ............ 81 Hình 3.6. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian để héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .......... 83 Hình 3.7. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .......... 84 Hình 3.8. Tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ...................................................................................................................... 85 Hình 3.9. Kết quả kháng Staphylococcus aureus ................................................ 93 Hình 3.10. Kết quả kháng E.coli ......................................................................... 95 Hình 3.11. Kết quả kháng Salmonella ................................................................. 97 Hình 3.12. Kết quả kháng Shigella boydii........................................................... 99 Hình 3.13. Cao xoa thành phẩm ........................................................................ 100

ix

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. ...................................................................... 73 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được ................................................................................................ 75 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. ...................................................................... 76 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu trong dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. ............................. 78 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. ................................................................................. 80 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. ................................................................................. 82 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. ................................................................................. 84 Bảng 3.8. Kết quả định lượng tinh dầu Ngải cứu ................................................ 86 Bảng 3.9. Kết quả xác định tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu ...................................... 86 Bảng 3.10. Kết quả xác định chỉ số hóa học của tinh dầu Ngải cứu ................... 87 Bảng 3.11. Kết quả xác định độ hòa tan của tinh dầu Ngải cứu trong ethanol ... 88 Bảng 3.12. Kết quả xác định thành phần hóa học và hàm lượng tương đối các hợp chất trong mẫu tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp GC – MS.................. 88 Bảng 3.13 Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu Ngải cứu .......... 91 Bảng 3.14. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu Ngải cứu ..................................... 93 Bảng 3.15. Kết quả kháng Salmonella typhimurium của tinh dầu Ngải cứu....... 96 Bảng 3.16 Kết quả kháng Shigella boydii của tinh dầu Ngải cứu ....................... 98

1

MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài 1.1. Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp tổng hợp hữu cơ, trong đó thuốc tổng hợp đã và đang có nhiều đóng góp hữu ích trong việc cung cấp thuốc trị bệnh, giá thành rẻ và được mọi người ưa chuộng. Tuy nhiên, cái gì cũng có mặt xấu song song với nó, vì do có quá nhiều tác dụng phụ trong quá trình sử dụng thuốc tổng hợp, có thể thấy rõ là hiện tượng kháng kháng sinh đang là vấn đề nóng của nền y học hiện đại. Vì lẽ đó trên thế giới hiện nay đang có xu hướng quay về sử dụng các bài thuốc có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Nền y học dân gian dùng cây cỏ để trị bệnh là hình thức chữa bệnh cổ xưa nhất của nhân loại, đã có từ hàng ngàn năm về trước. Việt Nam cũng là một trong những nước có nền y học cổ truyền sử dụng nguồn nguyên liệu từ thiên nhiên để chữa bệnh từ rất lâu và được nhiều bạn bè các nước biết đến. Do điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng của Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên hệ thực vật phong phú và đa dạng, đó là nguyên nhân tạo nên nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được với nhiều cây thuốc quý đầy đủ chủng loại và số lượng. Nhưng nhiều năm trở lại đây, có một số nhận định từ một số nhà khoa học, bác sĩ: “Người Việt ra ngõ gặp cây thuốc, nhưng lại chết trên đống thuốc”, phải chăng nhận định này đang ám chỉ cho chúng ta: “Tại sao không chịu tìm hiểu và học cách sử dụng những cây thảo dược để chữa bệnh?” Trong quá trình nghiên cứu kháng sinh thực vật, người ta đặc biệt quan tâm đến tinh dầu. Tinh dầu có nhiều đặc tính sinh học và dược học cao, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và được sử dụng trong việc tạo ra một số loại chế phẩm để làm thuốc. Một trong những ứng dụng tuyệt vời của tinh dầu thiên nhiên đó là khả năng giúp giảm tress, giảm căng thẳng, rũ bỏ lo âu như những liệu pháp mang tính chất an thần, tạo cảm giác bình tĩnh, yên bình, thư giãn,… Các loại tinh chất tốt có thể kể tên như một số loại tinh dầu: Oải hương, Cúc la mã, Cam Bergamot

2

(Cam đắng), Ngọc lan tây (Ylang Ylang), Cam, Hoa hồng, Trầm hương, Ngải cứu, Cỏ hương bài (Vetiver essential oil). Do đó tinh dầu thường được sử dụng ở dạng nguyên chất và xông hơi tạo không khí dễ chịu, hoặc bổ sung vào các sản phẩm cao xoa (dầu cù là). Trong rất nhiều loài thực vật có thể chiết xuất tinh dầu như chanh, sả, quế, bạc hà,… thì Ngải cứu cũng là một nguyên liệu rất được quan tâm và cần phải đề cập đến. 1.2. Tầm quan trọng của đề tài Ngải cứu còn có tên thuốc cứu, ngải diệp, nhả ngải, quá sú, cỏ linh li, tên khoa học Artemisia vulgaris, là một loài thực vật thuộc họ Cúc có sẵn, dễ tìm, thu hoạch quanh năm và có tiềm năng to lớn để sản xuất tinh dầu và kháng sinh tự nhiên. Từ lâu, Ngải cứu được biết đến qua nhiều bài thuốc trong dân gian với các công dụng đặc trưng như bổ huyết, điều kinh hay trong cuộc sống thường ngày Ngải cứu được dùng để nấu canh, làm rau sống ăn kèm để tăng thêm khẩu vị. Đặc biệt việc nghiên cứu tách chiết các hợp chất có dược tính từ tinh dầu Ngải cứu và thử hoạt tính sinh học là vấn đề mới mẻ, chưa được quan tâm và nghiên cứu nhiều. Tinh dầu được sản xuất từ thân, lá cây bằng nhiều phương pháp: phương pháp cơ học, phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi và không bay hơi, phương pháp trích ly bằng CO2, phương pháp vi sóng, phương pháp sinh học,... Ngoài ra, còn một phương pháp trích ly tinh dầu khá phổ biến là phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Ưu điểm của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước là quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản, thiết bị gọn, dễ chế tạo, không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ, thời gian tương đối nhanh, thu được tinh dầu ít bị lẫn tạp chất, giữ nguyên được mùi vị thiên nhiên ban đầu và thành phần trong tinh dầu ít bị biến đổi. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu từ cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, xác định thành phần hóa học, khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu tạo cao xoa” nhằm bước đầu tìm hiểu, khảo sát

3

thành phần hóa học và những ứng dụng của cây Ngải cứu từ đó nâng cao hiệu quả sử dụng loại cây này. 1.3. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa về mặt kinh tế của đề tài Tạo ra được nhiều sản phẩm từ tinh dầu Ngải cứu thiên nhiên. Có giá thành rẻ, mà lại có ứng dụng nhiều trong đời sống và an toàn. Nâng cao giá trị kinh tế của cây Ngải cứu, có thể tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị cao từ tinh dầu Ngải cứu, đáp ứng được nhiều lĩnh vực trong đời sống, an toàn, giúp cải thiện nguồn kinh tế cho người dân. Ý nghĩa về mặt xã hội Tạo ra nhiều sản phẩm có chứa tinh dầu trên thị trường chưa từng có. Tinh dầu Ngải cứu sẽ thay thế phần nào các loại hóa chất độc hại và các loại kháng sinh thương mại trên thị trường. Ý nghĩa về mặt sức khỏe Đối với Tây Y Ngải cứu là dược liệu sử dụng rộng rãi với thành phần hóa học cũng khá đa dạng tập trung ở các bộ phận khác nhau của cây như cụm hoa, lá và cây chứa tinh dầu, flavonoid, phenolic,… Bên cạnh đó, Ngải cứu có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, gây độc tế bào ung thư, dùng trong bệnh lý về huyết áp, hen suyễn và có tác dụng bảo vệ gan. Trong y học hiện đại, Ngải cứu được sử dụng trong hỗ trợ cân bằng hệ probiotic trong đường ruột, giúp làm giảm táo bón, loại bỏ giun và ký sinh trùng đường ruột. Ngoài ra một số hoạt chất trong Ngải cứu còn giúp kháng viêm và đặc biệt qua nhiều nghiên cứu đã chỉ ra trong Ngải cứu có chứa hoạt chất artemisinin có tác dụng chữa sốt rét.

4

Đối với Đông Y Trong Đông y Ngải cứu có tính hơi hàn, vị cay, dùng làm thuốc ôn khí huyết, trục hàn thấp, điều kinh, an thai, dùng chữa đau bụng do hàn, kinh nguyệt không đều, thai động không yên, thổ huyết, máu cam. Ý nghĩa trong thực phẩm - mỹ phẩm Xay nhuyễn thành bột để làm bột gia vị như ngũ vị hương, hồi, quế… Làm se da, sáng da, tẩy tế bào chết và kháng khuẩn, kháng nấm, giảm thâm nám. Được sử dụng như nguyên liệu của một số món ăn phổ biến ở miền Bắc Việt Nam như: Trứng rán Ngải cứu, bánh ngải,… 2. Tình hình nghiên cứu Hiện nay, các nghiên cứu về tinh dầu Ngải cứu còn ít, chủ yếu tập trung vào phân tích thành phần hóa học, dược tính, hoạt tính trong dịch chiết Ngải cứu hoặc phối chế với các loại dược liệu, thực vật khác. Theo Đỗ Tất Lợi (2004), trong ngải cứu có tinh dầu, ít tannin, thành phần chủ yếu trong tinh dầu ngải cứu là cineole và α-thujone. Tinh dầu Ngải cứu có tính chất làm kích thích cho say do α-thujone có tác dụng hưng phấn, nhưng lại có tác động mạnh đến hệ thần kinh, dùng quá liều có thể gây nguy hiểm đến hệ thần kinh. Năm 1979, những nghiên cứu ở Trung Quốc đã cho thấy tác dụng chữa bệnh sốt rét của loài Thanh cao hoa vàng (Artemisia annua L.), từ đó nghiên cứu của Đinh Huỳnh Kiệt, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (1989; 1990) trên cây Thanh cao hoa vàng dại cho kết quả như sau:  Có khoảng 0,6 % tinh dầu  Tỷ trọng d25 là 0,9011  Tinh dầu màu vàng nhạt, gồm 35 thành phần trong đó nhận dạng được khoảng 20 chất với 12 cấu tử chính chiếm trên 73% tổng hàm lượng tinh dầu. Tinh dầu Ngải cứu còn có hoạt tính kháng khuẩn, cụ thể ở vi khuẩn Staplylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis đường kính vòng kháng lần lượt là 23 mm và 13 mm. Ở chủng Salmonella typhimurium đường kính vòng

5

kháng là 8 mm và ở chủng E.coli vòng kháng có đường kính là 11 mm (Erel et al., 2012). Mới đây nhất tác giả Lê Thị Thanh Thảo và cộng sự (2018) đã chỉ ra tinh dầu Ngải cứu có tính kháng mạnh với chủng Staphylococcus aureus với đường kính vòng kháng là 23 mm, ngoài ra tinh dầu còn có hoạt tính kháng đối với các chủng nấm men Candida. Điều này đã chứng tỏ tiềm năng của tinh dầu Ngải cứu trong tìm kiếm chất có hoạt tính kháng nấm. Nghiên cứu cũng chỉ ra khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH của tinh dầu là có, tuy nhiên lại yếu hơn rất nhiều so với cao chiết. 3. Mục đích nghiên cứu  So sánh hàm lượng tinh dầu của 2 loại lá Ngải cứu: lá già, lá non.  Xác định được các điều kiện tối ưu của việc trích ly tinh dầu, và xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến việc trích ly tinh dầu.  Xác định được thành phần hóa học của tinh dầu Ngải cứu ở TP HCM.  Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu đối với các chủng vi sinh vật (Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, E.coli, Shigella boydii).  Bước đầu sử dụng tinh dầu Ngải cứu bổ sung vào sản phẩm cao xoa ở quy mô phòng thí nghiệm. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu  Nghiên cứu cơ sở lý luận và thực tiễn của đề tài.  Tiến hành thực nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.  Định danh và định lượng các thành phần hóa học của tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).  Kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp khuyết tán trên đĩa thạch. 5. Phương pháp nghiên cứu  Nghiên cứu lý thuyết: thu thập, phân tích, tổng hợp tài liệu.  Phương pháp tách chiết tinh dầu: phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp sử dụng bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger.

6

 Phương pháp sinh hóa: thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu trên các chủng vi khuẩn: Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, E.coli, Shigella boydii.  Xử lý số liệu bằng phần mềm SAS 9.1 và Excel 2016 ®. 6. Các kết quả đạt được của đề tài  Tối ưu hóa quy trình trích ly tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.  Định danh và định lượng thành phần hóa học có trong tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS.  Thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu trên các chủng vi khuẩn: Salmonella typhimuirium, Staphylococcus aureus, E.coli, Shigella boydii. 7. Kết cấu nghiên cứu Nghiên cứu gồm 4 chương:  Chương 1: Tổng quan tài liệu Tổng quan về Ngải cứu, các khái niệm về tinh dầu, nguyên tắc sản xuất và ly trích tinh dầu. Giới thiệu về các chủng vi khuẩn và khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu  Chương 2: Vật liệu và phương pháp Giới thiệu nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị sử dụng. Thiết kế thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Các phương pháp xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu và đánh giá hoạt lực kháng khuẩn của tinh dầu.  Chương 3: Kết quả và thảo luận  Chương 4: Kết luận và kiến nghị

7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về Ngải cứu 1.1.1. Vị trí phân loại Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) thuộc: Giới (regnum)

:

Plantae

Ngành (division)

:

Angiospermae

Lớp (class)

:

Eudicot

Phân lớp (subclass) :

Asterids

Bộ (ordo)

:

Asterales

Họ (familia)

:

Asteraceae

Chi (genus)

:

Artemisia

Loài (species)

:

Artemisia vulgaris

Ngải cứu có tên khoa học là: Artemisia vulgaris L., Mugwort Tên thông thường là: thuốc cứu, ngải diệp, nhả ngải, quá sú, cỏ linh li.

Hình 1.1: Hình ảnh cây Ngải cứu (Artemisia Vulgaris) 1.1.2. Giới thiệu về họ Cúc (Asteraceae) và chi ngải (Artemisia) Họ Cúc (Asteraceae) gồm 115 chi với khoảng 325 loài, phần lớn ở dạng thân cỏ, lá đơn, mọc cách hoặc mọc đối. Hoa lưỡng tính hay đơn tính, mọc đều, đối xứng 2 bên. Họ Cúc có nhiều giá trị kinh tế hơn. Nhiều loại được trồng rộng rãi làm cây cảnh như thược dược (Dahlia pinnata), các loại cúc vàng, cúc trắng thuộc chi Chrysanthenum làm thuốc trừ sâu. Một số được dùng làm rau như rau diếp (Lactuca indica), rau khúc tẻ (Gnaphalium affine), rau khúc nếp (G. polycaulon), cây có dầu như hướng dương (Helianthus annuus), cây làm thuốc

8

như Ngải cứu (Artemisia vulgaris), cây chữa bệnh sốt rét như thanh hao hoa vàng (A. annua). Chi ngải (Artemisia) là một chi lớn của họ Cúc với khoảng 185 loài, thường là cây thân thảo hay cây bụi , có mùi tinh dầu đặc trưng. Môi trường sinh sống khô hay bán khô thường là các khu vực nhiệt đới và ôn đới bắc bán cầu. Lá ngải tương tự lá dương xỉ, thường có nhiều lông trắng nhỏ bao phủ. Ở Việt Nam, có bốn loài thuộc chi ngải là ngải thanh cao (A. carvifolia), ngải hoa vàng (A. annua), ngải đắng (A. absinthium) và Ngải cứu (A. vulgaris).

Hình 1.2. Một số cây thuộc chi Ngải a. Ngải Thanh Cao (A. carvifolia) b. Ngải Hoa Vàng (A. annua) c. Ngải Đắng (A. absinthium) d. Ngải cứu (A. vulgaris) 1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố Ngải cứu còn gọi là cây thuốc cứu, cây thuốc cao, ngải điệp. Tên khoa học: Artemisia vulgaris L., thuộc họ Cúc (Asteraceae).

9

Hình 1.3. Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) Thân: là cây thân cỏ, sống lâu năm, cao khoảng 1 m. Thân thẳng có rãnh dọc màu tía nhạt, cành non có lông. Lá: lá xẻ nhiều kiểu từ xẻ lông chim đến xẻ thùy theo đường gân lá, mặt trên nhẵn màu nâu đậm, mặt dưới trắng xanh do có nhiều lông màu trắng, lá mọc so le, không có cuống (nhưng phía dưới thường có cuống), vò nát có mùi hắc, vị đắng. Hoa: thường có vào tháng 7 – 9, hoa có màu vàng lục nhạt hoặc màu đỏ nhạt, mọc thành chùy kép, dài từ 2 – 10 cm, đứng ở nách lá, mỗi hoa hình đầu rộng từ 3 – 4 mm bao gồm 2 loại hoa hình ống: hoa cái và hoa lưỡng tính. Quả bế không có mào lông. Ngải cứu là cây của miền Âu, Á ôn đới. Cây phát triển trên vùng có nhiều cỏ dại, ở những vùng đất giàu nitơ như vùng bỏ hoang nơi có nhiều ánh nắng, vùng đất không canh tác, ven đường và trên các bờ dậu. Mọc hoang ở nhiều nơi trong nước ta và cũng mọc ở nhiều nước khác. Cây cũng được trồng nhiều nơi trên quy mô nhỏ ở các vườn thuốc vườn gia đình từ vùng thấp đến vùng cao.

10

1.1.4. Công dụng và dược lý của Ngải cứu Ở một vài nước phương Đông, người ta sử dụng một lượng lớn Ngải cứu trong thực phẩm như sử dụng trong trà, tạo mùi vị dễ chịu cho một số loại bánh. Ở phương Tây, người ta sử dụng để nấu các món từ gia cầm, thịt heo, cũng được sử dụng để ủ bia. Phổ biến hơn, Ngải cứu còn được dùng trong châm cứu bấm huyệt giúp lưu thông huyết mạch, thư giãn xóa tan căng thẳng mệt mỏi. Trước đây, người ta sử dụng Ngải cứu như một phương thuốc chống sự mệt mỏi cho đôi chân và khớp gối, ngoài ra còn giúp khử mùi cho đôi giày giống như quế. Người dân ở các nước phương tây còn dùng Ngải cứu như 1 loại trà tăng lực, khoảng 2 – 3 tách trà mỗi ngày gồm 150 mL nước nóng và từ 2 đến 3 g lá Ngải cứu khô ngâm ngập trong nước khoảng 5 phút và dùng trước bữa ăn để tăng khẩu vị chống đầy hơi. Rễ cây Ngải cứu được sử dụng để bổ huyết, an thần, trị chứng mất ngủ và ứng dụng làm thuốc ngừa thai. Người Ấn Độ cũng sử dụng Ngải cứu làm trà tăng lực. Bên cạnh đó Ngải cứu còn được dùng để làm thuốc trị co thắt, long đờm, ho gà và các chứng bệnh về đường ruột và tiết niệu. Đông y coi Ngải cứu là một vị thuốc có tính hàn thấp, điều kinh, an thai, dùng chữa đau bụng do hàn, kinh nguyệt không đều, khí hư, động thai, ngăn chặn sảy thai, băng huyết, chảy máu cam, lỵ ra máu, nôn mửa, đau dây thần kinh, thấp khớp, ghẻ lở, thổ huyết. Ngoài ra nó cũng giúp tiêu hóa, trị giun, kháng sinh, sốt rét, chữa rối loạn kinh nguyệt, dùng ngoài trị lạnh bụng, đau dạ dày, đau khớp, eczema, ngứa. Một số bài thuốc từ Ngải cứu Mùa hè, nhất là từ sau ngày hạ chí, thời tiết bắt đầu có những thay đổi thất thường, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe. Đây cũng là thời điểm bùng phát nhiều loại bệnh, tấn công cơ thể và gây phiền phức cho nhiều nhóm người. Đông y có câu nói nổi tiếng "Mùa hè chữa bệnh mùa Đông", với ý rằng, mùa nóng không chỉ cần chăm sóc sức khỏe tốt để vượt qua thời tiết, mà còn phải chăm chỉ dưỡng sinh để chuẩn bị sức khỏe cho mùa đông lạnh giá, khắc nghiệt hơn

11

Một trong những giải pháp phòng chữa bệnh nổi tiếng của Đông y đó chính là ngâm chân. Có lẽ không cần nhấn mạnh thì hầu như chúng ta đều biết tác dụng của việc ngâm chân đối với sức khỏe. Quan trọng hơn, việc ngâm chân với lá Ngải cứu – thứ lá quen thuộc, phổ biến và dễ dàng mua được còn mang lại nhiều tác dụng hơn những gì xưa nay chúng ta vẫn nghĩ. Lá Ngải cứu còn được Đông y gọi là Ngải khao, vốn chỉ là một loài rau dại nhưng sau đó được nghiên cứu và sử dụng như một loại dược liệu quý, được gọi là "rau của bậc Danh y". Ngải cứu được người dân Châu Á sử dụng phổ biến trong đời sống hàng ngày. Theo Đông y, Ngải cứu có vị đắng, cay, ấm, khi ăn sẽ tác động chính vào 3 kinh mạch là tỳ, gan và thận. Nghiên cứu cho thấy lá Ngải cứu có thể làm giảm hàn trừ ẩm, ấm kinh và cầm máu. Rất phù hợp dùng cho những người hay bị mất máu, đau bụng, đau bụng kinh, tử cung chảy máu, các bệnh phụ khoa khác. 1.2. Giới thiệu về tinh dầu 1.2.1. Khái niệm về tinh dầu Tinh dầu là hỗn hợp các chất hữu cơ tan lẫn vào nhau, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu. Cần phân biệt rõ tinh dầu với dầu béo (hỗn hợp các triglicerid) và dầu mỏ (hỗn hợp các hydrocarbon). Rất khó khăn khi có một định nghĩa tuyệt đối chính xác cho tinh dầu. Về mặt thực hành, tinh dầu có thể như “một hỗn hợp thiên nhiên có mùi, phần lớn có nguồn gốc từ thực vật”. Tinh dầu thường là thể lỏng ở nhiệt độ phòng, bay hơi hoàn toàn mà không bị phân hủy. Trong thiên nhiên, rất nhiều tinh dầu ở trạng thái tự do, chỉ có một số ít trạng thái tiềm tàng. Ở trạng thái tiềm tàng, tinh dầu không có sẵn trong nguyên liệu mà chỉ xuất hiện trong những điều kiện gia công nhất định trước khi tiến hành ly trích. Còn ở trạng thái tự do, tinh dầu hiện sẵn trong nguyên liệu có thể thu trực tiếp dưới những điều kiện ly trích bình thường (Abegaz et al., 1983).

12

1.2.2. Phân bố tinh dầu trong thiên nhiên Các loại cây có tinh dầu được phân bố rộng trong thiên nhiên. Kết quả thống kê cho thấy có khoảng 2.500 loài cây có chứa tinh dầu. Trữ lượng tinh dầu trong cây phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng. Cây mọc ở vùng nhiệt đới có trữ lượng tinh dầu cao hơn ở vùng ôn đới. Ngay trong một cây, thành phần và lượng tinh dầu trong các bộ phận khác nhau cũng khác nhau. Ngoài ra lượng tinh dầu thu được còn phụ thuộc vào điều kiện, phương pháp thu hoạch, bảo quản, tách chiết,... Hàm lượng tinh dầu trong những cây khác nhau cũng rất khác nhau: Hoa hồng hàm lượng tinh dầu vào khoảng 0,25%; bạc hà hàm lượng khoảng 1%; quả hồi và nụ Đinh hương thì hàm lượng tinh dầu tương ứng có thể đạt giá trị 5% và 15% (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014). 1.2.3. Quá trình tích luỹ tinh dầu Trong thực vật, tinh dầu được tạo ra và tích trữ trong các mô. Hình thành các mô này thay đổi tùy theo vị trí của chúng trong cây. Những mô này có thể hiện ở tất cả mọi nơi trong cây như rễ, thân, lá, hoa và quả,... dưới những tên gọi khác nhau như: Tế bào tiết: tế bào tiết ra tinh dầu rồi giữ luôn trong tế bào (mô tiết) như trong cánh Hoa hồng, trong củ Gừng,... Lông tiết: cũng là tế bào tiết nhưng nằm nhô ra ngoài bề mặt thực vật, thường bắt gặp ở lá các họ Hoa môi, Cúc, Cà,... Túi tiết: tế bào tiết ra tinh dầu nhưng không chứa lại bên trong mà dồn chung chứa vào một xoang trống, tạo ra bởi cơ chế ly bào hay tiêu bào. Túi tiết thường năm bên dưới biểu bì. Thường có ở vỏ quả các giống Citrus, Eucalyptus,... Ống tiết: cách tạo ra tinh dầu cũng như túi tiết nhưng nằm sâu bên trong phần gỗ và chạy dài theo sớ gỗ, bắt gặp trong các giống Dipterocarpi, Artemisia,... Về phần phân bố lượng tinh dầu, đặc biệt có nhiều trong họ Long não, họ Hoa môi, Họ Cam, Họ Sim, họ Hoa tán. Tinh dầu có trong các bộ phận khác nhau của cây: như ở hoa (hoa hồng, hoa nhài, cam, chanh,...); ở lá (Bạch đàn, Bạc hà, Hương nhu, Tần dầy lá,...); ở

13

vỏ cây (Quế); ở thân cây (Hương đàn, Peru, Sả,...); ở rễ (Hương bài, Gừng, Nghệ, Xuyên khung,...) (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014). 1.2.4. Tính chất vật lý của tinh dầu Ở nhiệt độ thường, tinh dầu ở thể lỏng, trừ một số trường hợp như menthol, camphor,... là ở thể rắn. Tinh dầu gần như không tan trong nước và dễ bay hơi, do vậy có thể tách thu tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Tinh dầu rất ít tan trong nước, tan tốt trong cồn và các dung môi hữu cơ, các loại dầu mỡ, có thể tan một phần trong dung dịch kiềm,... Đa số tinh dầu không có màu hoặc màu vàng nhạt, một số tinh dầu có màu như: tinh dầu Quế có màu nâu sẫm, tinh dầu Xạ hương màu đỏ, tinh dầu Ngải cứu màu vàng lục. Tinh dầu thường có vị cay và hắc. Tỷ trọng của tinh dầu thường vào khoảng 0,85 – 0,95; có một số tinh dầu nặng hơn nước như tinh dầu Đinh hương, tinh dầu Quế. Tỷ trọng thay đổi theo thành phần hóa học. Nếu tinh dầu có thành phần chủ yếu là hydrocarbon terpenic thì tỷ trọng thấp, tinh dầu có hợp chất chứa oxy hoặc nhân thơm thì tỷ trọng cao hơn. Tinh dầu thường có chỉ số khúc xạ vào khoảng 1,45 – 1,56. Chỉ số khúc xạ cao hay thấp tùy theo thành phần các chất chứa trong tinh dầu là no, không no hoặc có nhân thơm. Nếu tinh dầu có nhiều thành phần có nhiều dây nối đôi thì có chỉ số khúc xạ cao. Vì tinh dầu là một hỗn hợp nên không có nhiệt độ sôi nhất định. Điểm sôi của tinh dầu thay đổi tùy theo thành phần hợp chất. Ví dụ, hợp chất terpen có điểm sôi là 150 – 160oC, hợp chất sesquiterpen có điểm sôi cao hơn, khoảng 250 – 280oC, còn các hợp chất polyterpene có điểm sôi trên 300oC. Từ đó, ta có thể tách riêng các thành phần khác nhau trong tinh dầu bằng phương pháp chưng cất phân đoạn. Khi hạ nhiệt độ một số tinh dầu có thể kết tinh như tinh dầu Hồi, tinh dầu Bạc hà, tinh dầu Xá xị,... (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 1.2.5. Tính chất hoá học của tinh dầu Ngải cứu

14

Năm 2008, Govindaraj và cộng sự đã khảo sát tinh dầu Ngải cứu, kết quả cho thấy tinh dầu chứa các chất camphene, camphor, 1,8-cineole, p-cymene, βeudesmol, α-pinene, terpene-4-ol Camphor: Camphor (Long não hay băng phiến) là một chất rắn kết tinh, có màu trắng hoặc trong suốt giống với sáp, mùi hăng mạnh đặc trưng. Camphor là một monoterpenoid với công thức hóa học C10H16O. Camphor có tác dụng xua đuổi côn trùng, đồng thời là hoạt chất được sử dụng trong một số loại thuốc chống côn trùng, chống ngứa. Tuy nhiên khi sử dụng một lượng lớn camphor có thể dẫn đến ngộ độc, gây ra tai biến, rối loạn tương tự chất kích thích. Năm 1980, FDA Hoa Kỳ đã đặt giới hạn 11% camphor được phép sử dụng trong các sản phẩm tiêu dùng và cấm toàn bộ các sản phẩm chứa các chiết xuất camphor.

Hình 1.4. Cấu trúc 3D phân tử camphor 1,8-cineole 1,8-cineole hay còn được biết đến dưới tên gọi eucalyptol là một hợp chất hữu cơ tự nhiên, trong điều kiện nhiệt độ phòng là một chất lỏng không màu. Đây là thành phần chủ đạo của tinh dầu bạch đàn Eucalyptus globulus, chiếm tới 90% trong dầu bạch đàn. Ngoài ra Eucalyptol còn được tìm thấy trong Long não, Ngải cứu, Húng quế, Hương thảo và một số loài thực vật lá có hương thơm khác. Eucalyptol được ứng dụng trong nhiều loại nước súc miệng và thuốc ho, ngoài ra còn được sử dụng như là thuốc trừ sâu và thuốc xua đuổi côn trùng. Ở liều lượng cao thì eucalyptol gây nguy hiểm khi tiếp xúc qua da, đường miệng hay đường hô hấp và hệ thần kinh.

15

Hình 1.5. Cấu trúc 3D phân tử eucalytol β-eudesmol Hợp chất này thuộc nhóm sesquiterpene và được tìm thấy nhiều trong tinh dầu tràm, gỗ Siam và thương truật (một loài thảo mộc Trung Quốc). Theo một số nghiên cứu cho thấy đây là chất có tác dụng trong điều trị một số bệnh liên quan đến thần kinh cụ thể là chống viêm thần kinh và chống động kinh. Ngoài ra chất này còn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của khối u ung thư và là thuốc giải độc chống ngộ độc organophosphate.

Hình 1.6. Cấu trúc phân tử β-eudesmol α-pinene Ở mức độ sử dụng thấp, α-pinene được coi như thuốc điều trị các bệnh liên quan đến phế quản đặc biệt là hen suyễn, ngoài ra đây còn là chất chống viêm và kháng khuẩn. Một số nghiên cứu còn chỉ ra khả năng hỗ trợ trí nhớ và cũng như khả năng hoạt động như một chất ức chế acetylcholinesterase của chất này.

16

Hình 1.7. Cấu trúc 3D phân tử α-pinene Terpene-4-ol Đây là thành phần chính trong tinh dầu nhục đậu khấu. Hiện vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về chất này mặc dù khả năng kháng nấm và kháng khuẩn của hợp chất này tương đối nổi trội.

Hình 1.8. Cấu trúc 3D phân tử Terpene-4-ol 1.2.6. Ảnh hưởng của những nhân tố khác nhau đến thành phần và tính chất của tinh dầu Ngải cứu Tinh dầu chứa trong thực vật có thành phần không cố định mà luôn thay đổi theo hướng phát triển của cây cũng như ảnh hưởng của những yếu tố khác. Nguyên liệu chế biến và bộ phận dùng để chế biến Mỗi loại cây tinh dầu, ở mỗi bộ phận chứa tinh dầu, có thành phần nhất định trong những điều kiện nhất định, các giống khác nhau thì thành phần tinh dầu cũng khác nhau. Trong cùng 1 cây nhưng lượng tinh dầu ở các bộ phận khác nhau, hàm lượng và thành phần cũng khác nhau (Lê Ngọc Thạch, 2003).

17

Phương pháp chế biến Tùy thuộc vào phương pháp chế biến mà hàm lượng và thành phần cũng khác nhau. Tinh dầu nhận được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ít bị tạp hơn so với tinh dầu trích ly bằng dung môi bay hơi vì các thành phần tạp khác sẽ hòa tan vào nước (Lê Ngọc Thạch, 2003). Hướng phát triển của cây Trong thời gian cây sinh trưởng thành phần tinh dầu chịu hàng loạt các biến đổi và những chuyển hóa này có thể xác định thời kỳ mà cây tích tụ được nhiều tinh dầu nhất và có chất lượng cao nhất để thu hoạch và chế biến. Tinh dầu tạo thành trong cây không phải có 1 lượng cố định mà biến đổi liên tục theo hướng phát triển của cây. Sự biến đổi này có xu hướng là càng ngày càng tích tụ nhiều những hợp chất có chứa oxy. Trong các bộ phận khác nhau của cây, tinh dầu tạo thành và tích lũy không giống nhau mà luôn luôn chuyển hóa lẫn nhau (Lê Ngọc Thạch, 2003). Độ tươi Nguyên liệu bị khô, dập, úng cũng ảnh hưởng đến hàm lượng và chất lượng tinh dầu. Nên tránh để dồn đống nguyên liệu đưa đến sự phát nhiệt bên trong làm thối rữa nguyên liệu. Cần phơi héo nguyên liệu thích hợp, tốt nhất phơi héo trong bóng mát vì nếu nhiệt độ lên quá 40oC một số cấu phần trong tinh dầu sẽ bay hơi. Nhưng độ héo cũng ảnh hưởng đến hàm lượng và chất lượng tinh dầu. Do đó, nếu để nguyên liệu héo trong một thời gian dài sẽ đưa đến giảm khối lượng tinh dầu chứa trong nguyên liệu. Mặt khác, việc này cũng sẽ dẫn đến một số cấu phần không bền trong tinh dầu bị phân hủy làm cho tinh dầu thu được không còn chất lượng tự nhiên. Do đó, trước khi ly trích tinh dầu, nguyên liệu cần được phơi héo, cần phải khảo sát hiệu suất và thành phần hóa học của tinh dầu theo thời gian để héo để biết cần để héo trong thời gian bao nhiêu lâu là thích hợp nhất (Phùng Thị Ái Hữu, 2012).

18

Độ sạch Nguyên liệu càng sạch thì chất lượng tinh dầu thu được càng cao. Do đó khi ly trích cần phải làm sạch, loại bỏ bẩn, các đối tượng không phải nguyên liệu cần ly trích ra khỏi nguyên liệu, không được để lẫn vào (Phùng Thị Ái Hữu, 2012). 1.2.7. Ứng dụng tinh dầu Ngải cứu trong các ngành công nghiệp Tinh dầu Ngải cứu đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm không chỉ từ giới khoa học mà cả trong sản xuất công nghiệp hiện đại khi mà xu hướng đang dần quay trở về sử dụng các hợp chất thiên nhiên. Trong bảo quản thực phẩm, tinh dầu Ngải cứu được sử dụng như một chất ức chế sự phát triển cũng như xua đuổi côn trùng, các loại vi khuẩn từ đó có thể giữ thực phẩm không bị xâm hại bởi các loại côn trùng, vi khuẩn khác nhau (Judzentinene và Buzelyte, 2006). Ở thời điểm mà ung thư đang là một trong những nỗi ám ảnh với con người thì các nghiên cứu đã chỉ ra khả năng chống ung thư của tinh dầu Ngải cứu xuất phát từ hoạt chất Artemisin (Sun et al., 1992). Đây cũng là một tín hiệu cho thấy khả năng ứng dụng cao của tinh dầu Ngải cứu trong ngành công nghiệp Dược phẩm. Với thành phần chính gồm có camphor, tinh dầu Ngải cứu đã được chứng minh là có thể sử dụng trong bảo quản dược phẩm và mỹ phẩm. 1.2.8. Nguyên tắc sản xuất tinh dầu Theo Mai Thị Anh Tú (2009), nguyên tắc để sản xuất tinh dầu từ nguyên liệu thiên nhiên như sau:  Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu.  Quy trình khai thác phải phù hợp với nguyên liệu.  Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp nhất.  Đơn giản, thuận tiện và nhanh chóng. 1.2.9. Nguyên tắc trích ly tinh dầu Theo Phùng Thị Ái Hữu (2012), nguyên tắc ly trích của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những đặc tính của tinh dầu như:  Dễ bay hơi.

19

 Lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 100oC.  Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ.  Dễ bị hấp thu ngay ở thể khí. 1.2.10.Các phương pháp trích ly tinh dầu Do những yêu cầu về nguyên tắc trích ly nên khi khai thác hợp chất thơm từ thực vật, động vật, người ta thường dùng một trong các phương pháp sau đây: Phương pháp cơ học

Hình 1.9. Máy ép tinh dầu Đây là phương pháp tương đối đơn giản dùng để tách tinh dầu ở dạng tự do bằng cách tác dụng lực cơ học lên nguyên liệu (thường là ép). Phương pháp này được dùng phổ biến đối với các loại vỏ quả họ Citrus như cam, chanh, quýt, bưởi,... Vì ở những loại nguyên liệu này tinh dầu thường phân bố chủ yếu ở lớp tế bào mỏng trong biểu bì. Khi có lực tác dụng lên vỏ quả, các tế bào có chứa tinh dầu bị vỡ ra giải phóng tinh dầu. Phương pháp ép có nhiều ưu điểm như: tinh dầu giữ nguyên được mùi vị thiên nhiên ban đầu, các thành phần trong tinh dầu ít bị biến đổi. Nhược điểm của phương pháp ép tinh dầu bị lẫn nhiều tạp chất, chủ yếu là các hợp chất hữu cơ hòa tan vật liệu đem ép (Lê Ngọc Thạch, 2003).

20

Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hình 1.10. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước 1. Bình cấp hơi nước 2. Bình chứa nguyên liệu chưng cất 3. Lớp tinh dầu 4. Lớp nước Hơi nước tạo ra từ nồi hơi, thường có áp suất cao hơn không khí, được đưa thẳng vào bình chưng cất. Ngày nay thường dùng phương pháp này để chung cất tinh đầu từ các nguyên liệu thực vật. Điểm ưu việt của phương pháp này là người ta có thể điều chỉnh áp suất, nhiệt độ như mong muốn để tận thu sản phẩm nhưng phải giữ nhiệt độ ở mức giới hạn để tinh dầu không bị phân hủy. Việc sử dụng phương pháp cũng lệ thuộc vào những điều kiện hạn chế, yêu cầu hơi nước không quá nóng và quá ẩm. Nếu quá nóng nó có thể phân hủy nhưng cấu phần có độ sôi thấp, hoặc làm chất nạp khô quăn khiến hiện tượng thẩm thấu không xảy ra. Nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại sớm quá, người ta phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong một thời gian cho đến khi sự khuếch tán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới tiếp tục dùng lại hơi nước quá nhiệt. Nếu hơi nước quá ẩm sẽ dẫn đến hiện tượng hơi nước ngưng tụ, phần chất nạp phía dưới sẽ bị ướt, trong trường hợp này người ta phải tháo nước ra bằng một van xả dưới đáy nồi. Trong công nghiệp, hơi nước trước khi vào bình chưng cất phải đi ngang một bộ phận tách nước.

21

Với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng, nên tốt nhất là bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết thúc. Không có một quy tắc chung nào cho mọi nguyên liệu vì mỗi chất nạp đòi hỏi một kinh nghiệm và yêu cầu khác nhau. Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ vào đặc tính của tinh dầu và cách chọn phương pháp chưng cất. Trong phòng thí nghiệm, để chưng cất hơi nước tinh dầu người ta thường dùng bộ dụng cụ thủy tinh Clevenger. Theo Lã Đình Mỡi (2001), phương pháp chưng cất lôi cứu hơi nước bằng bộ chưng cất Clevenger có những ưu, nhược điểm như sau: Ưu điểm  Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản.  Thiết bị gọn, dễ chế tạo.  Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ.  Thời gian tương đối nhanh. Nhược điểm  Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp.  Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy.  Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn.  Những tinh dầu có độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém. Phương pháp trích bằng dung môi dễ bay hơi Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng thích hợp ở nhiệt độ phòng. Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong với dung môi bên ngoài do chênh lệch nồng độ. Sau khi trích ly phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu (Mai Thị Anh Tú, 2009). Trích ly bằng dung môi không bay hơi Dựa vào tính chất có thể hòa tan trong chất béo động vật và thực vật của tinh dầu, người ta ngâm nguyên liệu vào dầu động vật hoặc thực vật, tinh dầu sẽ

22

khuếch tán qua màng tế bào, hòa tan vào dầu, sau đó tách riêng dầu để thu tinh dầu. Phương pháp ngâm bằng dung môi không bay hơi có nhiều ưu điểm hơn phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi ở chỗ thu dầu được dầu ít tạp chất hơn. Tuy nhiên, phương pháp này rất thủ công, khó cơ giới hóa và có nhược điểm lớn là chất béo dùng làm dung môi rất khó bảo quản và chế biến, giá thành cao. Chính vì vậy hiện nay phương pháp này rất ít được sử dụng (Mai Thị Anh Tú, 2009). Phương pháp trích ly bằng CO2 Lợi dụng tính chất khí CO2 có thể hóa lỏng ở áp suất cao, dùng CO2 lỏng chiết tinh dầu ra khỏi nguyên liệu. Phương pháp trích ly dùng CO2 lỏng được sử dụng nhiều trong công nghiệp trong thời gian gần đây do có nhiều ưu điểm như: Dung môi CO2 có tính chọn lựa tốt. CO2 không có tác dụng độc hại đối với con người như các loại dung môi khác. Dễ loại và không để lại vết dung môi. Khi loại dung môi không cần sử dụng nhiệt, vì vậy giữ được mùi thơm của tinh dầu mà không sợ tinh dầu bị phân hủy. Quá trình kín ít bị hao tốn. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp chịu áp lực cao, chi phí cho CO2 còn đắt, nên chưa được phổ biến (Mai Thị Anh Tú, 2009).

23

Phương pháp vi sóng

Hình 1.11. Hệ thống chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng Phương pháp vi sóng có đặc điểm: vi sóng (micro – onde, microwave) là sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng. Sóng điện từ này được đặc trưng bởi:  Tần số f, tính bằng Hertz (Hz = cycles/s ), là chu kỳ của trường điện từ trong một giây, nằm giữa 300 Hz và 30 GHz  Vận tốc c là 300.000 km/giây.  Độ dài sóng 𝜆 (cm) là đoạn đường đi của vi sóng trong một chu kỳ, liên hệ với tần số theo công thức 𝜆 = c/f.  Hầu hết các lò vi sóng gia dụng đều sử dụng tần số 2450 MHz, ở tần số này 𝜆 = 12,24 cm. Một số phân tử, thí dụ như nước, phân chia điện tích trong phân tử một cách bất đối xứng. Như vậy các phân tử này là những lưỡng cực có tính định hướng trong nhiều điện trường. Dưới tác dụng của điện trường một chiều, các phân tử lưỡng cực có khuynh sắp xếp theo chiều điện trường này. Nếu điện trường là một điện trường xoay chiều, sự định hướng của các lưỡng cực sẽ thay đổi theo chiều xoay đó. Cơ sở của hiện tượng phát hiện do vi sóng là sự tương tác giữa điện trường và các phân tử phân cực bên trong vật chất. Trong điện trường xoay chiều

24

có tần số rất cao 2,45 x 109 Hz, điện trường này sẽ gây ra một sự xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử, đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất. Với một cơ cấu có bất đối xứng cao, phân tử nước có độ phân cực rất lớn, do đó nước là một chất rất lý tưởng để đun nóng bằng vi sóng. Ngoài ra, các nhóm định chức phân cực như: - OH, - COOH, - NH2,... trong các hợp chất hữa cơ cũng là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ. Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu xạ của vi sóng. Việc này liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó. Tóm lại, sự đun nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Phương pháp sinh học Phương pháp này được ứng dụng cho các nguồn nguyên liệu có tinh dầu ở trạng thái kết hợp (glucosid). Để phân lập tinh dầu, người ta phải xử lý bằng cách lên men hoặc dùng enzyme, sau đó kết hợp với chưng cất hay trích ly để thu tinh dầu giống như các loại vật liệu chứa hợp chất thơm khác (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 1.3. Giới thiệu về phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Phương pháp này dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định. Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo thì phải dùng nhiều hơi nước hơn và sự chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn (Phùng Thị Ái Hữu, 2013).

25

1.3.1. Nguyên lý hoạt động của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Phương pháp chưng cất lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nước được dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu. Khi hỗn hợp này được gia nhiệt, cả hai chất đều bay hơi. Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng với áp suất môi trường thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước (Phùng Thị Ái Hữu, 2012). Chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp Nguyên liệu và nước được cho vào cùng một thiết bị, đun sôi, hơi nước bay ra sẽ lôi cuốn theo hơi tinh dầu, sau đó làm lạnh ngưng tụ hơi, ta sẽ thu được tinh dầu sau khi phân ly tách nước ra. Thiết bị sử dụng tương đối đơn giản, rẻ tiền, phù hợp với sản xuất nhỏ ở địa phương, nhất là ở những nơi mới bắt đầu khai thác tinh dầu, bước đầu chưa có điều kiện đầu tư vào sản xuất. Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm:  Chất lượng tinh dầu sản phẩm không cao.  Nguyên liệu dễ bị cháy khét, do bị thiếu nước, bị dính vào thành thiết bị.  Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật (nhiệt độ, áp suất), thời gian chưng cất kéo dài.  Tiêu tốn nhiều năng lượng.

Hình 1.12. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước và nguyên lý hoạt động

26

Chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp Phương pháp chưng cất gián tiếp sử dụng nồi bốc hơi nước riêng hoặc sử dụng chung hệ thống hơi nước từ một lò hơi chung cho các thiết bị khác nhau. Do bộ phận chưng cất không bị gia nhiệt trực tiếp nên phương pháp khắc phục được tình trạng nguyên liệu bị khê khét, màu sắc và phẩm chất của tinh dầu thu được tốt hơn. Do hơi nước cấp từ bên ngoài nên dễ dàng khống chế và điều chỉnh các yếu tố như lưu lượng, áp suất cho phù hợp với từng loại nguyên liệu, giúp nâng cao hiệu suất cũng như chất lượng tinh dầu thu được (Phùng Thị Ái Hữu, 2012). 1.3.2. Giới thiệu về ảnh hưởng các yếu tố đến hàm lượng của tinh dầu Ngải cứu Ảnh hưởng của thời gian chiết đến lượng tinh dầu thu được Đối với yếu tố khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến lượng tinh dầu thu được, tác giả Nguyễn Thị Hồng thực hiện chưng cất lôi cuốn hơi nước với 100 g lá Ngải cứu già trong vòng 7 giờ, sau khoảng thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ đọc thể tích tinh dầu thu được bên nhánh hứng. Kết quả khảo sát cho thấy thời gian chưng cất tối ưu là 5 giờ, sau khoảng thời gian đó lượng tinh dầu tăng không đáng kể. Thể tích tinh dầu thu được ở 5 giờ là 1,4 mL. Từ đó, tác giả đã nhận xét để lượng tinh dầu thu được là tối ưu thì ta tiến hành chưng cất trong khoảng thời gian là 5 giờ với nguyên liệu lá Ngải cứu già (Nguyễn Thị Hồng, 2011). Ảnh hưởng của lượng dung môi trích ly Ở thực nghiệm khảo sát yếu tố lượng dung môi trích ly, tác giả Nguyễn Thị Hồng đã tiến hành khảo sát trên 100 g mẫu lá Ngải cứu già với thể tích nước lần lượt là 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL đun trong 5 giờ bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Kết quả khảo sát cho thấy khi tăng thể tích dung môi dùng để ly trích thì lượng tinh dầu càng tăng. Do đó, thể tích dung môi dùng để ly trích tỷ lệ thuận với hàm lượng tinh dầu ly trích được. Hàm lượng tinh dầu thu được cao nhất là 1,2% ở thể tích nước cất là 300 mL. Khi tăng lượng dung môi, lượng tinh dầu có xu hướng không tăng thêm. Vì vậy tác giả đã nhận xét bổ sung 300 mL nước tương đương tỷ lệ nguyên liệu / thể

27

tích nước là 1:3 là tỷ lệ dung môi tối ưu khi ly trích tinh dầu với lượng mẫu như trên (Nguyễn Thị Hồng, 2011). Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu làm mẫu Tác giả Nguyễn Thị Hồng đã khảo sát yếu tố mẫu nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. Kết quả cho thấy tại các điều kiện ly trích tối ưu, khối lượng tinh dầu lá Ngải cứu già thu được nhiều hơn so với lá Ngải cứu non là 1,23 lần. Điều này chứng tỏ hàm lượng tinh dầu trên lá Ngải cứu già nhiều hơn so với lá Ngải cứu non (Nguyễn Thị Hồng, 2011) 1.4. Khả năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật 1.4.1. Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật Hợp chất kháng khuẩn ở thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt sự phát triển của vi sinh vật. Các hợp chất kháng khuẩn thường có khả năng tác dụng đặc hiệu lên vi sinh vật với một nồng độ rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010). Các hợp chất này thường thuộc nhiều nhóm hợp chất khác nhau như alkaloid, glucoside, phenolic và tinh dầu. 1.4.2. Các cơ chế kháng khuẩn

Hình 1.13. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn:

28

Gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin. Tác động lên quá trình tổng hợp vách tế bào làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu. Ức chế chức năng của màng tế bào: Gồm colistin, polymycin, gentamicin và amphoterricin. Cơ chế sẽ làm mất chức năng của màng, làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc các acid amin mới vào chuỗi polypeptide. Nhóm macrolide và lincoxinamide gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA. Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho 2 mạch đơn DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotide. Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic (Tôn Nữ Minh Nguyệt và cộng sự, 2010).

29

1.4.3. Một số nhóm hợp chất alkaloid ở thực vật Morphine Morphine là alkaloid chủ yếu trong nhựa của cây anh túc còn xanh (Papaver somniferum). Morphine tinh sạch được thu được lần đầu vào năm 1806 và xác định cấu trúc hóa học vào năm 1927. Morphine có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, gây nghiện . Morphine có khả năng giảm đau, tạo cảm giác lâng lâng dễ chịu. Hiện nay rất nhiều hợp chất tổng hợp giống morphine nhưng ít độc hơn được sử dụng trong y tế như linol, lerit hay phenazone,…

Hình 1.14. Cấu trúc Morphine Quinine Từ rất lâu, quinine đã được sử dụng làm thuốc trị sốt rét. Quinine có trong cây Cinchona officinalis có nguồn gốc từ Peru, Bolivia. Cấu trúc hóa học của quinine được xác định vào năm 1907 và tổng hợp hóa học từ năm 1945. Quinine ức chế quá trình sao chép DNA và phiên mã tạo RNA của tác nhân gây sốt rét.

30

Hình 1.15. Cấu trúc Quinine Glucoalkoloid Đại diện là latisolin hoạt chất trích ly từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) thuộc họ Amaryllidaceae. Vào năm 1986, Ghosal công bố tách được một số dẫn xuất alkaloid từ cây Trinh nữ hoàng cung có khả năng chống ung thư. Nhiều nghiên cứu về sinh học phân tử từ cây Trinh nữ hoàng cung và trong họ Amaryllidaceae đã chứng minh rằng các alkaloid trong họ này có khả năng chống ung bứu, chống vi khuẩn và kích thích miễn dịch. Nhóm glucoside Glycoside là một phân tử đường liên kết với một nhóm chức bằng liên kết glycosidic. Trong cơ thể sống glycoside đóng rất nhiều vai trò quan trọng như dự trữ năng lượng, cấu trúc tạo hình (cellulose,..), bảo vệ (Mucopolysaccharide), chống tạo thể cetone gây độc cho cơ thể, đồng thời rất nhiều glycose từ thực vật được sử dụng làm thuốc (Marco, 2007). Glycoside thường ở dạng rắn, kết tinh một số ít ở dạng lỏng hoặc vô định hình. Các hợp chất glycoside thường không màu, tan trong nước và cồn, ít hoặc không tan trong dung môi hữu cơ như ether hoặc chloroform.

31

Phân loại Nhóm glycoside thường được phân loại theo tính chất hóa học của aglycone bao gồm các nhóm:  Nhóm alcoholic glycoside: salicin.  Nhóm anthraquinone glycoside.  Nhóm coumarin glycoside: apterin.  Nhóm chromone glycoside: benzo- gamma-pyrone.  Nhóm cyanogenic glycoside: amygdalin, dhurrin, linamarin, lotaustralin và prunasin.  Nhóm flavonoid glycoside: hesperidin, naringin, rutin, quercitrin.  Nhóm phenolic glycoside.  Nhóm saponin.  Nhóm cardiac glycoside.  Nhóm steviol glycoside.  Nhóm thioglycosides: sinigrin, sinalbin. 1.4.4. Một số nhóm hợp chất glycoside ở thực vật: Tannin Tannin là một polyphenol tan trong nước có trong cây Sồi. Gồm 2 nhóm chính là tannin tan và tannin phức không tan. Tannin tan trong nước là những dẫn xuất đơn của benzoic acid như gallic acid và hexahydroxydiphenic acid liên kết với đường đơn. Tannin phức là các đại phân tử tạo thành từ một số gốc hydroxyflavanol. Tannin thường không gắn với vách tế bào như các phenol khác mà nằm ở không bào. Một trong những chức năng sinh học quan trọng nhất của tannin là làm chất xua đuổi dinh dưỡng (chất làm ngán ăn). Tannin có thể gây độc cho nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Saponin Saponin là một glucoside tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật đặc biệt là nhân sâm. Saponin có một tính chất chung đó là khi bị hòa tan vào nước, saponin có khả năng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch, tạo nhiều bọt, có độc đối với động vật máu lạnh đặc biệt là đối với cá. Tạo phức với

32

cholesterol, có vị hắc và làm hắc hơi mạnh. Một vài loài động vật cũng có saponin như hải sâm, cá sao. Ngày nay, saponin được công nhân là thành phần chính giúp tạo ra những công dụng của nhân sâm. Sâm càng nhiều saponin thì càng tốt, dựa trên tiêu chí đó để đánh giá chất lượng của các loại sâm. Saponin được chia làm 2 nhóm chính dựa trên cấu trúc phần sapogenins là saponin trung tính dẫn xuất steroid và các saponin có tính acid chứa gốc triterpenoid. Nhóm spirostan

Saponin

Nhóm olenan

Nhóm furostan Saponin steroid

Saponin triterpenoid

Nhóm aminofurostan

Nhóm ursan

Nhóm lupan

Nhóm hopan

Saponin triterpenoid pentacylic

Saponin triterpenoid tetracylic Nhóm spirosolan

Nhóm dammara

Nhóm lanostan

Nhóm cucurbitan

Nhóm solanidan

Hình 1.16. Sơ đồ phân loại saponin (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013)

33

Flavonoid Flavonoid là nhóm hợp chất thứ cấp gồm khoảng hơn 5000 chất có bộ khung cấu tạo C15 và thường được cải biến bằng cách gắn thêm các gốc (-OH) và (-OCH3). Thông thường flavonoid thường tồn tại ở dạng phức với glucose và acid hữu cơ. Trong số này có những nhóm chất phổ biến như flavonone và flavonol, authocyacin, roteno. Một số nhóm đại diện chính của flavonoid là isoflavone, flavanonem, flavonol và leucoanthocyanidin (Nguyễn Tiến Thắng, 2012). Flavonoid chủ yếu tập trung ở các cây ngành hạt kín, lớp 2 lá mầm. Trong thực vật bậc cao flavonoid là nhóm sắc tố phổ biến nhất tạo màu cánh hoa từ da cam, đỏ đến xanh dương. Trong lớp 1 lá mầm chỉ có khoảng 10 họ được tìm thấy có chứa flavonoid. Ngoài ra hàm lượng của flavonoid còn phụ thuộc vào nơi mọc, cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì có hàm lượng flavonoid cao hơn những nơi thiếu ánh sáng (Ngô Văn Thu, 2011). 1.4.5. Nhóm tinh dầu Tinh dầu thường là một hỗn hợp gồm nhiều thành phần, có mùi thơm, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi ở nhiệt độ thường và có thể tách chiết từ thực vật bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Thông thường tinh dầu đa số là chất lỏng chỉ có một số ít ở thể rắn như: menthol, borneol, vanilin, heliotropin. Không màu hoặc màu vàng nhạt và có thể sẫm màu vì oxi hóa. Tinh dầu có mặt rộng rãi trong các họ cây như: họ Cúc (Asteraceae), họ Hoa Tán (Apiaceae), họ Hoa Môi (Lamiaceae), họ Long Nhãn (Lauraceae), họ Sim (Myrtaceae), họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae) Tinh dầu được sử dụng như một vị thuốc, trong đông y tinh dầu được sử dụng để trị sán (Thymol), diệt ký sinh trùng sốt rét (Artermisinin) ngoài ra còn chống viêm, làm lành vết thương, kháng khuẩn và diệt khuẩn,… (Ngô Văn Thu, 2011).

34

Phân loại Thành phần hóa học và cấu tạo của tinh dầu khá phức tạp nhưng có thể chia thành 4 nhóm sau:  Nhóm dẫn xuất monoterpene.  Nhóm dẫn xuất sesquiterpene.  Nhóm dẫn xuất các dẫn xuất nhân thơm.  Nhóm các hợp chất chứa nitrogen và lưu huỳnh. Một số nhóm hợp chất tinh dầu ở thực vật Monoterpene Monoterpene chủ yếu có mặt trong tinh dầu, có mùi thơm và thường được tách chiết bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. một vài đại diện tiêu biểu của monoterpene là menthol, geraniol và citral được sử dụng rất rộng rãi trong y học, mỹ phẩm và thực phẩm. Sesquiterpene Sesquiterpene có cấu tạo từ pharnesylpyrophosphate thường có mặt trong tinh dầu và nhựa thực vật. Một số loại serquiterpene là hormone ảnh hưởng đến quá trình lột xác của sâu bọ, chất thơm và chất gây ngán ăn ở thực vật. Farnesol, abscisic acid và phaseic acid là một số hợp chất sesquiterpene thường thấy. 1.5. Giới thiệu về các chủng vi khuẩn gây bệnh Một số vi khuẩn hay gặp là Propionibacterium acnes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Staphylococcus aureus, E.coli, Bacillus suptilis, Corynebacterium acnes,... Các loại vi khuẩn này thường xuất hiện trên da, nếu muỗi chích và da để lại vết thương nhỏ mà mắt thường không thấy được, các loài vi khuẩn trên sẽ phát huy tác dụng tức là làm vết thương sưng đỏ, tạo cảm giác ngứa, dị ứng và nhiễm trùng.

35

1.5.1. Staphyllococcus aureus Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878, sau khi thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt. Năm 1880, Louis Pasteur cũng đã thực hiện tiến hành phân lập và nghiên cứu về Staphylococcus aureus.

Hình 1.17. Staphyllococcus aureus Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 – 1,5 µm, có thể đứng riêng lẻ nhưng thường tạo từng chùm giống chùm nho, không di động, không sinh bào tử. Staphylococcus aureus thường cư trú trên da, niêm mạc, đường ruột các động vật máu nóng . Staphylococcus aureus là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường. Phát triển được ở nhiệt độ 10 – 45°C, mọc tốt ở 37°C, pH thích hợp là 7,0 – 7,5. Ở môi trường canh thang thì sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ thì làm đục rõ, để lâu có thể lắng cặn. Ở môi trường thạch, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, đường kính khoảng 1 – 2 mm, có thể màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng. Ở môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, làm tan máu hoàn toàn. Tụ cầu vàng tiết ra năm loại dung huyết tố (hemolysin): α, β, γ, δ, ε.

36

Coagulase do S. aureus sinh ra có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi đã được chống đông. Đây là tiêu chuẩn quan trọng nhất để phân biệt tụ cầu vàng với các tụ cầu khác. Coagulase có ở tất cả các tụ cầu vàng. Coagulase có hai loại: một loại tiết ra môi trường (coagulase tự do), một loại bám vào vách tế bào (coagulase cố định). Staphylococcus aureus cho phản ứng catalase dương tính, lên men được nhiều loại đường như: mannitol, glucose, lactose, mannose, sucrose, levulose, manit. Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không sinh bào tử khác. Nó bị tiêu diệt ở 80°C trong 1 giờ, 100°C trong 1 – 2 phút, có thể sống ở môi trường có nồng độ NaCl cao (15%), có thể tồn tại ngoài môi trường khô ráo 4 – 5 tháng. Vi khuẩn tụ cầu vàng gây bệnh bằng cách gây tổn thương trực tiếp lên các cơ quan như:  Da: nhọt da, áp xe, viêm mô tế bào.  Hô hấp: viêm khí quản, viêm phổi hoại tử, áp xe phổi biến chứng tràn khí màng phổi, tràn khí trung thất, tràn khí dưới da, tràn mủ màng phổi  Tim: viêm nội tâm mạc, tràn mủ màng tim.  Màng não: viêm màng não mủ.  Xương: cốt tủy viêm, viêm khớp  Máu: nhiễm trùng máu hoặc gây bệnh bằng cách gián tiếp tiết ra các độc tố gây viêm da tróc vẫy hoặc hội chứng sốc độc tố (Đại học Y Thái Bình, 2012).

37

1.5.2. Escherichia coli (E.coli)

Hình 1.18. Vi khuẩn E.coli E. coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước trung bình 0,5 µm x 1 – 3 µm, di động bằng tiêm mao, không sinh bào tử, thường được tìm thấy trong đường ruột của người và các động vật máu nóng. E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có thể sống ở nhiệt độ 10 – 46°C, pH 5,5 – 8. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37°C, pH thích hợp là 7 – 7,2. Môi trường canh thang: Nuôi cấy sau 3 – 4 giờ vi khuẩn phát triển làm đục nhẹ môi trường, sau 2 ngày trên mặt môi trường có váng mỏng, những ngày sau vi khuẩn lắng xuống đáy ống. Môi trường thạch thường: Nuôi cấy sau 8 – 10 giờ có thể nhìn thấy khuẩn lạc riêng rẽ, qua kính phóng đại, khuẩn lạc to dần, tròn lồi, hơi phồng, mặt nhẵn, bờ đều, đường kính khoảng 1,5 mm. Những ngày sau, khuẩn lạc chuyển thành màu xám xanh, giữa đục xám. Có thể thấy khuẩn lạc dạng R (xù xì) và M (nhầy) Môi trường thạch EMB: E. coli có khuẩn lạc tròn, hơi lồi, bóng, có ánh kim tím. E. coli lên men nhiều loại đường như glucose, galactose, lactose, xylose, ramnose,… sinh acid và sinh hơi; indol dương tính, methyl đỏ dương tính, Voges Proskauer âm tính, citrat âm tính, urease âm tính, H2S âm tính. E. coli đề kháng yếu, bị tiêu diệt bởi nhiệt độ 55°C trong 1 giờ, 60°C trong 30 phút và chết ngay ở 100°C. Tuy nhiên, ở môi trường bên ngoài các chủng E. coli độc có thể tồn tại tới 4 tháng.

38

Bình thường E. coli sống trong ruột người không gây bệnh. Khi cơ thể suy yếu một số chủng trở nên gây bệnh. E. coli không những gây bệnh đường ruột như tiêu chảy, kiết lỵ mà còn có thể gây một số bệnh khác như viêm đường tiết niệu, viêm gan, viêm phế quản, viêm màng phổi,… E. coli O157: H7 là chủng vi khuẩn gây tiêu chảy phổ biến. Ở vài bệnh nhân vi khuẩn này có thể gây rối loạn máu và suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong. Chúng ta có thể bị nhiễm E. coli qua tiếp xúc hay phơi nhiễm với phân người và phân động vật, kể cả gia cầm vì thỉnh thoảng phân người và động vật xâm nhập vào ao, hồ, sông hay nói chung là nguồn nước sinh hoạt. Vi khuẩn có thể lan truyền từ người sang người, thông thường qua người không rửa tay sau khi đi vệ sinh. E. coli cũng có thể lan truyền từ tay đến các vật dụng trong nhà (Chi cục thú y TP. Hồ Chí Minh, 2012). 1.5.3. Shigella Theo y học, Shigella là tên gọi của một loại vi khuẩn không lông, thuộc nhóm trực khuẩn Gram âm tính. Vi khuẩn Shigella không có khả năng di động và không có vỏ cũng như sinh nhà bào.Vi khuẩn Shigella được hình thành do men Glucose không sinh hơn, lên men Manitol. Hầu hết các vi khuẩn Shigella đều không lên men Lactose, chỉ có loại Sonnie có khả năng lên men nhưng chậm.

Hình 1.19. Vi khuẩn Shigella

39

Shigella là trực khuẩn Gram âm tính, không có lông, vì vậy không có khả năng di động, không có vỏ không sinh nha bào. Shigella có kháng nguyên thân O, không có kháng nguyên H. Căn cứ vào kháng nguyên O và tính chất sinh hóa, người ta chia Shigella ra làm 4 nhóm: A, B, C và D. Ở Việt Nam, Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn thường gặp nhất là nhóm B (Shigella flexneri) và nhóm A (Shigella dysenteriae). Sau khi xâm nhập vào cơ thể vi khuẩn Shigella có thể gây kiết lị, nặng hơn là bệnh viêm đại tràng và trực tràng. 1.5.4. Salmonella Năm 1874, nhà nghiên cứu bệnh học Ba Lan Tadeusz Browicz mô tả một loại vi khuẩn là nguyên nhân gây ra bệnh thương hàn. Năm 1880, Karl Joseph Eberth và Robert Koch phát hiện tác nhân gây bệnh sốt thương hàn ở người. Năm1884, Georg Gaffky thành công trong việc cấy mầm bệnh trong môi trường nuôi cấy thuần khiết. Năm 1889, nhóm nghiên cứu dưới quyền bác sĩ thú y Daniel Elmer Salmon tìm thấy vi khuẩn gây ra bệnh "dịch tả cho heo" và tên vi khuẩn được đặt theo tên của ông.

Hình 1.20. Vi khuẩn Salmonella Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi không tạo bào

40

tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi. Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới trong cả động vật máu lạnh và động vật máu nóng, và trong môi trường. Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các bệnh như thương hàn (do Salmonella typhi), phó thương hàn, nhiễm trùng máu (do Salmonella choleraesuis) và ngộ độc thực phẩm (Salmonellosis). Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 – 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu chứng thường kéo dài từ 2 – 7 ngày. Trong môi trường canh thang, mọc nhanh, sau 10 giờ và làm đục môi trường. Môi trường thạch thường, Salmonella phát triển tốt sau 24 giờ, tạo khuẩn lạc màu trắng xám. Salmonella được phân loại dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên. Hiện nay có khoảng 1.500 typ huyết thanh (còn gọi là loài) Salmonella. Đặt tên cho mỗi loài Salmonella mới tìm ra có thể lấy tên động vật mang mầm bệnh hoặc tên địa phương đã phân lập ra chúng lần đầu tiên. Sau đây là một số loài Salmonella đáng được chú ý nhất: S.typhi: chỉ gây bệnh cho người. Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu do S.typhi gây ra. S.paratyphi A: cũng chỉ gây bệnh thương hàn cho người. Ở nước ta cũng hay gặp loài này sau S.typhi. S.paratyphi В: gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi ở cả súc vật. Bệnh thường gặp ở các nước Châu Âu. S.paratyphi С: vừa có khả năng gây bệnh thương hàn, vừa có khả năng gây viêm dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết thường gặp ở các nước đông nam Châu Á. S.typhimurium và S. enteritidis gây bệnh cho người và súc vật. Hai loài này là nguyên nhân chủ yếu của nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn do Salmonella. S.choleraesuis: là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do Salmonella ở nước ta. (Khailid et al., 1990)

41

1.6. Giới thiệu về tình hình nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu và các loại tinh dầu khác từ thực vật 1.6.1. Khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu Ngải cứu Nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Ngải cứu thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Ege, Thổ Nhĩ Kỳ của tác giả Baykan Erel (2012) cho kết quả như sau: Staphylococcus aureus: đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu là 23 mm. Pseudomonas aeruginosa: đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu là 23 mm. Escherichia coli: đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu là 11 mm Salmonella typhimurium: đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu là 10 mm. Candida albicans: đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu là 20 mm. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật trên cho thấy tinh dầu Ngải cứu có hoạt tính kháng vi sinh vật tốt, ở nồng độ nguyên chất đều thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên tất cả mẫu thí nghiệm. Tinh dầu lá Ngải cứu có tác dụng diệt khuẩn rất mạnh đối với các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, và đối với chủng vi nấm: Candida albicans. 1.6.2. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu tần dày lá Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Tần dày lá thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước được thực hiện tại phòng thí nghiệm khoa Khoa học tự nhiên, Đại học Cần Thơ. Tác giả Mai Thị Anh Tú (2009) đã khảo sát hoạt tính sinh học của mẫu tinh dầu tần dày lá thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Tần dày lá: Staphylococcus aureus: đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu nguyên chất trích ly từ lá Tần dày lá là 30 mm, đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu pha loãng 4 lần trích ly từ lá Tần dày lá là 20 mm.

42

Escherichia coli: đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu nguyên chất trích ly từ lá Tần dày lá là: 30 mm, đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu pha loãng 4 lần trích ly từ lá Tần dày lá là 19 mm. Candida albicans: đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu nguyên chất trích ly từ lá Tần dày lá là: 30 mm, đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu pha loãng 4 lần trích ly từ lá Tần dày lá là 17 mm. Salmonella: đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu nguyên chất trích ly từ lá Tần dày lá là: 30 mm, đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu pha loãng 4 lần trích ly từ lá Tần dày lá là 20 mm. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật trên hai mẫu tinh dầu Ngải cứu cho thấy các mẫu tinh dầu đều có hoạt tính kháng vi sinh vật tốt, ở nồng độ nguyên chất đều thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên tất cả mẫu thí nghiệm. Tinh dầu Tần dày lá có tác dụng diệt khuẩn rất mạnh đối với các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella và đối với chủng vi nấm: Candida albicans (Mai Thị Anh Tú, 2009). 1.7. Sắc ký khí ghép khối phổ và một số ứng dụng (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry) Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị GC-MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry), các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC-MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm,… Sắc ký khí (GC - Gas Chromatography) Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt. Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất

43

hiện khi mẫu bơm vào pha động. Trong sắc ký lỏng (LC) pha động là một dung môi hữu cơ, còn trong GC pha động là một khí trơ gống như helium. Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu. Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau. Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động. Cột trong GC được làm bằng thủy tinh, inox hoặc thép không rỉ có kích thước, kích cỡ rất đa dạng. Cột của GC dài có thể là 25m, 30m, 50m, 100m và có đường kính rất nhỏ, bên trong đường kính được tránh bằng một lớp polimer đặc biệt nhưphenyl 5% + dimetylsiloxane polymer 95%), đường kính cột thường rất nhỏ giống như là một ống mao dẫn. Thông thường cột được sử dụng là semivolatile, hợp chất hữu cơ không phân cực như PAHs, các chất trong hỗn hợp được phân tích bằng cách chạy dọc theo cột này. Một chất chia tách, rửa giải phóng đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò. Đầu dò có khả năng tạo ra một tín hiệu bất kỳ lúc nào, khi phát hiện ra chất cần phân tích. Tín hiệu này phát ra từ máy tính, thời gian từ khi bơm mẫu đến khi rửa giải gọi là thời gian lưu (TR). Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ từ các tín hiệu. Đây gọi là sắc đồ, mỗi một peak trong sắc đồ sẽ miêu tả một tín hiệu tạo nên khi chất giải hấp từ cột sắc ký và đi vào đầu dò detector, trục hoành biểu diễn thời gian lưu và trục tung biểu diễn cường độ của tín hiệu, trong hình mỗi đỉnh (peak) biểu diễn một chất riêng lẻ, chất này được tách từ hỗn hợp mẫu phân tích, peak có thời gian lưu (TR) 4,97 phút là dodecane, 6,36 phút là biphenyl, 7,64 phút là chlolobiphenyl, 9,41 phút là hexadecanoic acid methyl ester. Nếu trong cùng điều kiện sắc ký như nhiệt độ, loại cột… gống nhau thì cùng chất luôn có thời gian lưu giống nhau, khi biết thời gian lưu của hợp chất thì chúng ta có thể chấp nhận được độ nhạy của nó. Tuy nhiên, chất có tính chất giống nhau thì thường có thời gian lưu giống nhau.

44

Hình 1.21. Sắc ký đồ của sắc ký khí

Khối phổ: Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó. Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa (mass spectrometry). Khi đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng, do chúng bị bỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc nhỏ; Những mảnh vụn thực tế là các vật mang điện hay còn gọi là iôn, điều này là quan trọng bởi vì các hạt cần ở trạng thái tích điện thì mới đi qua được bộ lọc. Các khối nhỏ chắc chắn, khối của mảnh vỡ được chia bởi các vật mang gọi là tỷ lệ vật mang khối (M/Z); Hầu hết các mảnh vụn có điện tích là +1, M/Z thường miêu tả các phân tử nặng của mảnh vụn. Nhóm gồm có 4 nam châm điện gọi là tứ cực (quadrapole), tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên qua các khe hở và đi vào đầu dò detector, tứ cự được thành lập bởi phần mền chương trình và hướng các mảnh vụn đi vào các khe của khối phổ. Phân tích kết quả Máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét. Trục hoành biểu diễn tỷ lệ M/Z còn trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn được quét bởi đầu dò detector. Đây là đồ thị của số khối. Làm thế nào để phân tích các kết quả từ máy tính? Dưới đây là một hình khối phổ. Trục X là khối lượng còn trục

45

Y là số lượng. Mỗi hóa chất chỉ tạo ra một mô hình duy nhất, nói cách khác mỗi chất có một “dấu vân tay” để nhận dạng, dựa trên mô hình ion của nó. Trên hình ta thấy phân tử ban đầu có khối lượng là 5. Trên sơ đồ khối phổ hạt lớn nhất này được gọi là ion phân tử (molecular ion). Các hạt nhỏ hơn có khối lượng 1, 2, 3 và 4 được gọi là các ion phân mảnh (fragment ions). Trong trường hợp ví dụ trên ta thấy các phân tử của chất này có xu hướng bị phá vỡ thành các tổ hợp 1 – 4 hơn là 2 – 3. Các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được trong thí nghiệm của họ với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác đinh trước. Việc này có thể giúp họ định danh được chất đó (nếu phép so sánh tìm được kết quả tương ứng) hoặc là cơ sở để đăng ký một chất mới (nếu phép so sánh không tìm được kết quả tương ứng).

Hình 1.22. Mô hình khối phổ Trong hình 1.23, hình ảnh khối cao nhất là dodecane, phần nềm của GCMS nó giống như là một thư viện hình ảnh dùng để nhận ra các chất chưa biết tồn tại trong hỗn hợp mẫu. Thư viện này có thể so sánh hình ảnh khối từ thành phần của mẫu với hình ảnh khối trong thư viện của máy.

46

Hình 1.23. Mass-spectrum Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS / Gas Chromatography Mass Spectometry) Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp như không khí, nước…Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu vân tay). Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết. Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên cứu, có thể dựa trên cấu trúc mới tìm được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc hóa học. Nói cách khác, nhà nghiên cứu thu được 1 dữ liệu mới và có thể đóng góp vào thư viện cấu trúc nói trên, sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định chính xác loại hợp chất mới này. Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các nhà nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ, tách chiết và bơm vào máy để nhận dạng chúng, hơn nữa các nhà nghiên cứu cũng xác định nồng độ của mỗi thành phần hóa chất. Một số ứng dụng của sắc ký khí ghép khối phổ Khác với các máy phân tích dư lượng kháng sinh như sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS/MS), thì sắc ký khí ghép khối phổ độ phận giải cao

47

(HRGC/HRMS), GC/MSN sắc ký ghép khối phổ có ứng dụng phân tích các độc chất trong nước tương, nước mắm (3 MCPD,...); Nghiên cứu chiết xuất và xác định thành phần các chất hóa học, độc chất, kháng sinh, đánh giá độ tồn lưu của hóa chất diệt côn trùng khác nhau trong các vật liệu hoặc hợp chất khác nhau. 1.8. Giới thiệu về cao xoa 1.8.1. Cao xoa Cao xoa, dầu xoa hay dầu cù là là tên gọi thông dụng của một dạng thuốc bôi ngoài da dạng sệt, đều màu, mịn, có mùi thơm đặc trưng của nguyên liệu, mà thành phần nguyên liệu chính trong đó là những chất hoặc hoạt chất thiên nhiên (tinh dầu) có tác dụng chính là giảm đau. Cao xoa được cho là có tác dụng giảm đau nhức khi bôi vào vị trí cần thiết ngoài da. Tuy nhiên khác với các loại thuốc giảm đau như ibuprofen hoặc aspirin, cao xoa không trực tiếp tấn công vào nguồn gốc cơn đau. Nó tạo ra cái gọi là kích thích giảm đau (counterirritants): dùng các hóa chất thiên nhiên tạo cảm giác nóng nhưng không bỏng và mát mẻ luân phiên trên da để làm phân tán sự chú ý của não bộ. Nói cách khác, cao xoa không trực tiếp dập tắt cơn đau mà thay vào đó, nó tạo nên sự nhầm lẫn, đồng thời là sự thỏa mãn cho não bộ bằng hỗn hợp nhiều thành phần. (Nguyễn Ðức Ðoàn, 2002)

48

Hình 1.24. Một số loại cao xoa phổ biến ở Việt Nam 1.8.2. Thành phần Cao xoa hay dầu cù là có 2 thành phần chủ yếu là tá dược và dược chất là các tinh dầu với công thức tùy thuộc công thức riêng của nhà sản xuất. Nhiều công thức làm cao xoa được xem là bí mật thương mại cũng như là công thức gia truyền nhiều đời không được công bố cho người ngoài. Tá dược: là các chất không hoạt tính (dược lý hoặc sinh học) được lựa chọn để xây dựng công thức bào chế cùng với các thành phần hoạt chất khác của thuốc, nhằm mục đích xây dựng công thức bào chế thuốc. Công thức bào chế thuốc có chứa các thành phần hoạt hoạt chất có tác dụng dược lý mạnh (hoạt lực mạnh), cần phải có các chất độn hay pha loãng là một trong các vai trò của tá dược. Tính chất này cho phép thực hiện thuận tiện và chính xác phân tán thuốc (các hoạt chất) khi sản xuất một dạng bào chế. Tá dược cũng có thể ảnh hưởng tới khả năng giải phóng và hấp thu của dược chất trong cơ thể tức là ảnh hưởng đến đáp ứng lâm sàng của thuốc (các quá trình dược động học của thuốc trong cơ thể). Tá dược cũng có ích cho các quá trình sản xuất, pha chế thuốc như làm tăng độ hòa tan của thuốc, làm tăng tính chất trơn chảy của hạt thuốc (dập viên, đóng nang), tá dược còn đóng vai trò quan trọng trong độ ổn định của thuốc (dược chất, dạng bào chế) giúp thuốc đạt được tuổi thọ như mong muốn. Dược chất: dược chất (còn gọi là hoạt chất) là chất hoặc hỗn hợp các chất dùng để sản xuất thuốc, có tác dụng dược lý hoặc có tác dụng trực tiếp trong phòng bệnh, chẩn đoán bệnh, chữa bệnh, Điều trị bệnh, giảm nhẹ bệnh, Điều chỉnh chức năng sinh lý cơ thể người.

49

Khảo sát nhiều loại cao xoa tại Việt Nam, hai thành phần thường bắt gặp nhất là menthol và methyl salicylate, hai chất này có trong tinh dầu Bạc Hà. Ngoài ra còn có khuynh diệp, quế, tràm, long não, hương nhu, thông, cineole,...tá dược như vaselin, novalin, paraffin,… (Nguyễn Ðức Ðoàn, 2002)

50

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Nguyên liệu Lá Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) thu mua ở ấp Chợ, xã Tân Phú Trung, huyện Củ Chi, Tp HCM. Các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Shigella boydii, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium.

Hình 2.1. Ngải cứu được sử dụng làm nguyên liệu trong nghiên cứu. a. Vườn Ngải cứu b. Nhánh Ngải cứu để héo 5 ngày 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị Thiết bị:  Bộ chưng cất tinh dầu Clevenger  Autoclave (Đức).  Cân phân tích, cân kỹ thuật.  Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức).  Bếp điện  Máy xay khô  Bể điều nhiệt Dụng cụ:  Bao PE

51

 Bông thấm nước, bông không thấm nước.  Pipetman 100 µl, 1000 µl.  Becher 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL  Erlen 250 m.  Đĩa Petri  Que cấy tăm bông  Đèn cồn  Ống đong.  Pipette.  Lọ thủy tinh.  Đũa thủy tinh.  Ống nghiệm.  Phễu thủy tinh.  Phễu chiết.  Giấy lọc.

Hình 2.2. Bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước Clevenger

52

2.1.3. Hóa chất Các hóa chất để pha môi trường NA, NB  Na2SO4  NaCl  Nước cất  KOH 0,1N  HCl 0,1N  Thuốc thử phenolphthalein  Ethanol 96o, ethanol 80o và ethanol 70o  Môi trường nuôi cấy vi khuẩn là: môi trường Nutrient agar và môi trường Nutrient Broth.

53

2.2. Phương pháp nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm với các nội dung: Nguyên liệu Ngải cứu

Nồng độ dung dịch NaCl

Xác định ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Thời gian ngâm nguyên liệu trong dung dịch NaCl

Kích thước nguyên liệu

Thời gian để héo nguyên liệu

Tỷ lệ rắn/lỏng

Thời gian chưng cất Chỉ số hóa học tinh dầu Ngải cứu

Độ hòa tan trong ethanol Định lượng tinh dầu Ngải cứu

Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu

Đánh giá cảm quan

Mùi Xác định chỉ tiêu hóa lý của tinh dầu Ngải cứu

Vị

Xác định thành phần hóa học tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp GC-MS Escherichia Coli

Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus

Màu sắc

Đánh giá hoạt lực kháng khuẩn

Shigella boydii

Hình 2.3. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

54

2.2.1. Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng Nguyên liệu (lá Ngải cứu)

+ Loại bỏ tạp chất + Cắt bỏ lá héo, già, bỏ rễ Ngâm trong dung dịch nước + NaCl

Ly trích bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

Hỗn hợp tinh dầu với nước

Bình lóng (phễu chiết)

Nước

Tinh dầu thô (tinh dầu + nước)

Làm khan bằng Na2SO4

Tinh dầu Ngải cứu Hình 2.4. Sơ đồ quy trình chưng cất và thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

55

Thuyết minh quy trình: Lắp đặt hệ thống chưng cất hơi nước và chưng trong khoảng từ 30’ đến 180 phút để lấy tinh dầu Ngải cứu ở dạng thô. Sau quá trình chưng cất là quá trình lắng và làm sạch tinh dầu. Để cho việc tách tinh dầu ra dễ dàng, phân lớp rõ ràng của lớp nước và tinh dầu. Sau khi tách tinh dầu ra khỏi hỗn hợp nước chưng thì tiếp tục cho khoảng 5 g Na2SO4 khan để làm khan triệt để những hạt nước còn nằm trong lớp tinh dầu. Lấy phần nước chưng còn lẫn ít tinh dầu trữ lại và đen chưng lại để thu tinh dầu triệt để hơn. Thu tinh dầu đã được làm sạch và bảo quản. Tính toán kết quả và so sánh lượng tịnh dầu của lá Ngải cứu. Đem tinh dầu Ngải cứu đi bảo quản và thử hoạt tính sinh học. 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Tiến hành khảo sát yếu tố: nguyên liệu tươi và để héo, 2 loại mẫu lá Ngải cứu (lá non, lá già), nguyên liệu để nguyên, cắt nhỏ và xay nhuyễn, thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất và nồng độ muối. Nguyên tắc: cố định 6 yếu tố và thay đổi một yếu tố để chọn được mức tối ưu cho yếu tố đó. Sau đó cố định yếu tố này và tiếp tục thay đổi một yếu tố khác, cứ tiến hành như vậy cho đến khi chọn được mức yếu tố tối ưu cho quá trình ly trích. 2.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cố định 6 yếu tố: nguyên liệu mẫu lá già, để héo, thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nồng độ muối. Sau đó tiến hành trích ly thu tinh dầu và so sánh để tìm ra được kích thước nguyên liệu tối ưu.

56

Kích Nghiệm Nguyên thức

liệu

thước nguyên liệu

A1

Lá già

A2

Lá già

A3

Lá già

Để nguyên Cắt nhỏ Xay nhuyễn

Khối

Nồng

Thời

Thời

lượng

độ

gian

gian

mẫu

muối

ngâm

để héo

(g)

(%)

(phút) (ngày)

450

150

10

30

5

3

450

150

10

30

5

3

450

150

10

30

5

Thời

Lượng

gian

nước

(giờ)

(mL)

3

2.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá già) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cố định các yếu tố: thời gian chưng cất, nồng độ muối, thời gian ngâm mẫu, lượng nước chưng cất, nguyên liệu được cắt nhỏ, để héo và thay đổi 2 loại lá Ngải cứu: lá già và lá non. Sau khi ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu được ở những thời gian khác nhau, từ đó chọn loại nguyên liệu lá Ngải cứu làm nguyên liệu trích ly tinh dầu Ngải cứu thích hợp. Kích Nghiệm Nguyên thức

liệu

thước nguyên liệu

B1

Lá non

B2

Lá già

Cắt nhỏ Cắt nhỏ

Thời Lượng gian

nước

(giờ)

(mL)

Khối

Nồng

Thời

lượng

độ

gian

mẫu

muối

ngâm

(g)

(%)

(phút)

Thời gian để héo (ngày)

3

450

150

10

30

5

3

450

150

10

30

5

57

2.2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cố định thời gian chưng cất, thời gian ngâm mẫu, nguyên liệu lá già, để héo, lượng nước chưng cất, nguyên liệu được cắt nhỏ, ta thay đổi nồng độ dung dịch NaCl chưng cất như sau: 0% (0g/450mL nước cất), 5% (22,5 g/450 mL nước cất), 10% (45 g/450 mL nước cất), 15% (67,5 g/450 mL nước cất). Khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước thành hệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợp chưng cất để tránh thất thoát tinh dầu dưới dạng nhũ, làm giảm độ tan của một số thành phần không phân cực có trong tinh dầu vào nước. Đồng thời sẽ tạo thành dung dịch điện ly dẫn đến tăng nhiệt độ sôi (tăng áp suất hơi) của nước. Lượng tinh dầu thu được có thể giảm theo sự tăng nồng độ của muối do khi ở nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngoài chứa tinh dầu co lại, ngăn cản sự thoát tinh dầu ra ngoài. Kích Nghiệm Nguyên thức

liệu

thước nguyên liệu

C1

Lá già

C2

Lá già

C3

Lá già

C4

Lá già

Cắt nhỏ Cắt nhỏ Cắt nhỏ Cắt nhỏ

Thời Lượng gian

nước

(giờ)

(mL)

Khối

Nồng

Thời

lượng

độ

gian

mẫu

muối

ngâm

(g)

(%)

(phút)

Thời gian để héo (ngày)

3

450

150

0

30

5

3

450

150

5

30

5

3

450

150

10

30

5

3

450

150

15

30

5

58

2.2.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu trong dung dịch NaCl hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Thời gian ngâm nguyên liệu với dung dịch nước muối trước khi chưng cất có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu được. Do có thời gian để tạo sự thẩm thấu cho tinh dầu thoát ra môi trường bên ngoài nên khi chưng cất tinh dầu thu được nhiều ngay từ đầu và thể tích tăng đáng kể. Đồng thời muối sẽ làm tăng tỷ trọng của nước phá vỡ hệ nhũ tương tinh dầu – nước và tinh dầu bị hơi nước cuốn đi dễ dàng hơn khi chưng cất. Thời gian ngâm khảo sát 0 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, cố định các yếu tố đã tối ưu. Kích Nghiệm Nguyên thức

liệu

thước nguyên liệu

D1

Lá già

D2

Lá già

D3

Lá già

Cắt nhỏ Cắt nhỏ Cắt nhỏ

Thời Lượng gian

nước

(giờ)

(mL)

Khối

Nồng

Thời

lượng

độ

gian

mẫu

muối

ngâm

(g)

(%)

(phút)

Thời gian để héo (ngày)

3

450

150

10

0

5

3

450

150

10

30

5

3

450

150

10

60

5

2.2.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Với các mức tối ưu đã chọn, tiếp tục cố định các yếu tố còn lại và thay đổi các mức thời gian chưng cất như sau: 30 phút, 1 giờ, 1 giờ 30 phút, 2 giờ, 2 giờ 30 phút, 3 giờ, 3 giờ 30 phút, 4 giờ. Thời gian chưng cất càng lâu lượng tinh dầu thu được càng nhiều. Tuy nhiên, đến một thời điểm nào đó thì lượng tinh dầu thu được không tăng lên theo thời gian. Mặt khác, kéo dài thời gian chưng cất còn

59

ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu do nguyên liệu bị cháy khét làm mất mùi thơm tự nhiên của tinh dầu. Thời gian chưng cất

Nghiệm thức

(phút)

E1

30

E2

60

E3

90

E4

120

E5

150

E6

180

E7

210

E8

240

2.2.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cố định các yếu tố đã tối ưu, nguyên liệu được làm héo ở 45 – 50οC ở các mức thời gian 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày. Sau đó tiến hành trích ly và so sánh lượng tinh dầu thu được để chọn ra độ héo tối ưu. Nghiệm thức

Thời gian để héo (ngày)

F1

0

F2

3

F3

5

F4

7

60

2.2.2.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Với các mức tối ưu của các yếu tố đã chọn, ta thay đổi lượng nước chưng cất như sau: 300 mL, 450 mL và 600 mL. Ghi nhận lượng tinh dầu thu được ở mỗi nghiệm thức, từ đó xác định lượng nước chưng cất tối ưu. Tỷ lệ nguyên liệu/nước chưng ảnh hượng mạnh đến hiệu suất thu hồi tinh dầu. Lượng nước quá nhiều, một số thành phần tinh dầu có tính phân cực sẽ tan vào nước. Nếu lượng nước quá ít thì không đủ hòa tan các chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu. Nghiệm thức

Thể tích nước chưng (mL)

G1

300

G2

450

G3

600

2.2.3. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu Phân tích sơ bộ chất lượng của tinh dầu bằng cảm quan phương pháp thực hiện dựa theo tác giả Tôn Long Dày (2013). Nghĩa là nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài như mùi, vị, màu sắc, độ trong suốt,... Qua nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài này có thể phán đoán và đánh giá sơ

bộ về chất lượng của tinh dầu và mục đích sử dụng tinh dầu.

Màu sắc và độ trong suốt: Xác định màu sắc và độ trong suốt của tinh dầu bằng cách cho tinh dầu vào một ống thủy tinh trong suốt không có màu có dung tích 20 mL, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cường độ của màu và độ trong suốt (ví dụ: vàng nhạt, nâu sẫm,...). Nếu tinh dầu còn vẩn đục và không trong suốt chứng tỏ còn tạp chất và nước.

61

Mùi: Mùi là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại tinh dầu có một mùi đặc trưng. Dựa vào mùi có thể biết được chất lượng và mục đích sử dụng của nó. Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy lọc hoặc bôi một ít vào mu bàn tay rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20 – 30 mm, cứ 15 phút ngửi 1 lần trong một giờ. Ghi nhận xét về bản chất và cường độ mùi (thơm dịu, hăng, xốc,...). Vị: Vị cũng là một biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại tinh dầu có mùi vị riêng. Để xác định vị, dùng phương pháp nếm, nếm xong ghi nhận xét bản chất (ngọt, đắng,…) và cường độ của vị (dịu, thoảng,…) (Tôn Long Dày, 2013) 2.2.3.1 Xác định chỉ số vật lý a. Định lượng tinh dầu Theo (TCVN 8444:2010) hàm lượng tinh dầu được tính theo công thức: % tinh dầu =

số mL tinh dầu thu được sau chưng cất số gam nguyên liệu tươi hoặc khô

× 100%

b. Tỷ trọng Tỷ trọng của tinh dầu tại 20oC là tỷ số khối lượng tinh dầu ở 20oC trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20oC. Do hàm lượng tinh dầu thu được ở mỗi lần chưng cất rất thấp, các phương pháp bảo quản chưa được tối ưu dẫn đến việc tinh dầu bị quang hóa, oxy hóa có thể ảnh hưởng đến kết quả đo tỷ trọng. Vì vậy việc sử dụng bình tỷ trọng 10 mL không phù hợp, thay vào đó việc đo tỷ trọng được thực hiện theo phương pháp thủ công. Dùng một ống tiêm y tế (loại 1 mL), trên thân ống tiêm được vạch một đường làm dấu. Cách xác định: Ban đầu, đem cân ống tiêm không và ghi số liệu lại (m0).

62

Tiếp theo: hút nước cất đến vạch (lưu ý trong ống tiêm không có bong bóng khí), đem cân và ghi lại số liệu (m1). Rồi xả bỏ nước trong ống tiêm, vẩy cho khô nước. Cuối cùng: hút tinh dầu khan đến vạch (lưu ý không để cho có bong bóng khí trong ống tiêm) đem cân và ghi lại số liệu (m2). Tỷ trọng d20 20

m2 - m0 m1 -m0

(TCVN 189:1993) Với: m0: khối lượng của ống tiêm không, tính bằng gam (g) m1: khối lượng của ống tiêm và nước cất, tính bằng gam (g) m2: khối lượng của ống tiêm và tinh dầu, tính bằng gam (g) Cứ như thế lặp lại nghiệm thức 3 lần: d(tb) = (d1 + d2 + d3)/3 c. Độ hòa tan của tinh dầu trong ethanol Pha ethanol 90o, 80o, 70o từ cồn tuyệt đối. Dùng pipette chuẩn hút 1 mL tinh dầu Ngải cứu cho vào bình tam giác có nút mài. Từ buret nhỏ dần ethanol vào bình đựng tinh dầu. Sau mỗi lần nhỏ khoảng 0,2 mL vào đậy nút và lắc đều cho đến khi tan hết tinh dầu. Tiếp tục nhỏ ethanol vào và lắc cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất trong suốt, ghi lượng ethanol đã dùng. Lặp lại thao tác 3 lần. 2.2.3.2. Xác định chỉ số hóa học Chỉ số acid (Index Acid) Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hoà các acid tự do có trong 1 g tinh dầu. KOH trung hoà các acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng RCOOH + KOH  RCOOK + H2O Cách xác định: Cho vào erlen 100 mL: 10 mL ethanol, thêm vào 5 giọt dung dịch phenolphthalein. Cho tiếp vào 1 g tinh dầu, lắc đều cho dầu tan hoàn toàn. Tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng dung dịch KOH 0,1 N đến khi xuất hiện màu hồng

63

bên trong 30 giây. Ta thực hiện phép đo 3 lần, ghi lại thể tích dung dịch KOH 0,1 N (VKOH) dùng chuẩn độ, lấy kết quả trung bình. Chỉ số acid được tính theo công thức IA =

5,61⋅V g

Trong đó: (TCVN 8444:2010) VKOH: số mL dung dịch KOH 0,1 N dùng chuẩn độ. 5,61: số mg KOH có trong 1 mL dung dịch KOH 0,1 N g: số g tinh dầu dùng để chuẩn độ Chỉ số ester (Index Ester) Chỉ số ester hoá của tinh dầu là số mg KOH cần thiết để trung hoà lượng acid béo nằm ở dạng ester có trong 1 g tinh dầu. Cách xác định: Sử dụng mẫu thử đã xác định ở trên, thêm chính xác 10 mL KOH 0,095 N trong ethanol. Lắp ống sinh hàn ngược vào bình đun cách thủy trong 1 giờ đến khi phản ứng xà phòng hóa kết thúc (lúc đó dung dịch trong bình màu hồng, đồng thời xuất hiện tinh thể nhỏ màu vàng nâu). Đồng thời làm một mẫu đối chứng với 10 mL KOH 0,095 N trong ethanol và 10mL ethanol 96o, tiến hành trong cùng điều kiện như trên. Đun xong để nguội, chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1 N. Hiệu số giữa số mL dung dịch HCl 0,1N đã dùng trong mẫu đối chứng và số mL dung dịch HCl 0,1 N đã dùng trong mẫu thử là số mL HCl đã dùng để trung hòa lượng KOH dùng cho phản ứng este hóa. Chỉ số ester được tính theo công thức: IE=

5,61.(V1 -V0) g

Trong đó: (TCVN 8444:2010) V0: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu trắng (mL) V1: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu tinh dầu (mL) g: số g tinh dầu ngải cứu Chỉ số savon hóa (Index Savon)

64

Chỉ số savon hoá là số mg KOH cần thiết để tác dụng với tất cả các acid tự do và acid kết hợp dưới dạng ester có trong 1 g tinh dầu. Quá trình savon hoá tinh dầu bao gồm: KOH trung hoà các acid tự do: KOH + RCOOH  RCOOK + H2O KOH xà phòng hoá các ester: KOH + R1COOK +R2OH Chỉ số savon hoá của tinh dầu bằng tổng số giữa chỉ số ester hoá và chỉ số acid: IS = IE + IA Trong đó: (TCVN 8444:2010) IS: chỉ số savon hoá. IE: chỉ số ester hoá. IA: chỉ số acid hoá. 2.2.3.3. Xác định thành phần hóa học của tinh dầu Thành phần hoá học của tinh dầu Ngải cứu được xác định bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS với các điều kiện như sau:  Máy sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS:HP6890  Cột mao quản: dài 30 m, đường kính trong 250 µm, lớp phim dày 250 µm.  Nhiệt độ phần bơm mẫu (injector): 250oC  Tỷ lệ dòng (splitless)  Đầu do khối phổ tứ cụ (MSD)  Tốc độ dòng khí mang (He) 0,9 mL/phút, áp suất 6.9 psi Chương trình nhiệt phân tích: bắt đầu ở 60oC, giữ trong 4 phút. Sau đó tăng lên 100oC, với tốc độ tăng 10oC/phút. Tiếp tục tăng đến 280oC với tốc độ tăng 30oC/phút và giữ trong 15 phút. 2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị tinh dầu nguyên chất của Ngải cứu ở ấp Chợ, xã Tân Phú Trung, huyện Củ Chi, Tp HCM Chuẩn bị 4 loại vi khuẩn: Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, E.coli, Shigella boydii. Chuẩn bị mẫu thuốc kháng sinh Ampicillin để đối chứng.

65

Cân chính xác 100 mg thuốc kháng sinh Ampicillin cần thử, hoà tan vào 10 mL nước cất, nếu thuốc không tan trong nước thì hòa tan với DMSO, ta sẽ được nồng độ dung dịch mẹ 10 mg/mL. Dung dịch để bảo quản trong tủ lạnh. Chuẩn bị môi trường Thạch nền: sử dụng môi trường NA, pha NA vào nước cất sau đó hấp khử trùng 121oC, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến khoảng 50oC đến 60oC sau đó đổ vào các đĩa petri đã tiệt trùng. Để nguội sau đó úp ngược đĩa petri lại. Môi trường lỏng: sử dụng môi trường NB, pha 4 g NB vào 500 mL nước cất sau đó chia ra làm 5 lọ để hấp khử trùng 121oC, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng sau đó cấy E.coli vào lọ số (1), Staphylococcus aureus vào lọ số (2), cấy Shigella vào lọ số 3, cấy Salmonella vào lọ số 4, còn lọ số (5) dùng để set máy. Sau đó mang đi lắc. Chuẩn bị 20 ống nước muối sinh lý 0,9% hấp khử trùng 121 oC, 1 atm, 15 phút. Nguyên tắc Các hợp chất kháng khuẩn có trong tinh dầu sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu tinh dầu có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy kháng sinh. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng đường kính vòng kháng khuẩn (mm). Tiến hành Lấy sinh khối vi khuẩn hòa vào ống nghiệm chứa 9 mL nước muối sinh lý vô trùng (NaCl 0,9%), lắc đều. Lấy tăm bông vô khuẩn thấm vào huyền dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa và đạt mật độ 106 CFU/mL lên mặt thạch NA và tiến hành cấy ria đều bằng tăm bông vô khuẩn. Sau đó nhúng 3 đĩa giấy kháng sinh có đường kính 6 mm vào từng nồng độ tinh dầu và đặt vào đĩa petri, làm tương tự với các đĩa petri còn lại theo từng độ pha loãng tinh dầu, nhúng đĩa kháng sinh Ampicillin ĐC vào đĩa petri ĐC, giữ yên trong vòng 1 giờ để tinh dầu và kháng sinh Ampicillin ĐC có thể khuếch tán vào môi trường thạch. Cuối cùng, các đĩa được đem ủ trong tủ ấm

66

37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả thông qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm). Phương pháp thu thập và xử lý số liệu Đối với thạch đặt đĩa giấy kháng sinh: dùng thước đo vòng vô khuẩn (tính bằng mm) và chụp hình. So sánh đường kính vòng vô khuẩn của tinh dầu với kháng sinh. Phương pháp tính toán Kết quả đường kính vòng vô khuẩn thu được qua 3 lần thí nghiệm lặp lại tính trung bình Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết được phân loại dựa theo đường kính vòng vô khuẩn: (Celikel và Kavas, 2008)  Đường kính vòng vô khuẩn < 8 mm: không nhạy  Đường kính vòng vô khuẩn từ 9 – 14 mm: nhạy  Đường kính vòng vô khuẩn 15 – 19 mm: rất nhạy  Đường kính vòng vô khuẩn > 20 mm: cực nhạy 2.3. Quy trình sản xuất cao xoa tinh dầu Ngải cứu ở quy mô phòng thí nghiệm Quy trình sản xuất được dựa theo công thức được công bố trong Bào chế và Sinh hóa dược của Trường Đại Học Y Dược Tp.HCM xuất bản năm 2005.

67

Cân nguyên liệu

Tá dược (paraffin, Vaseline, sáp ong, lanolin)

Dược chất (menthol + long não)

Đun tan chảy nguyên liệu

Phối trộn chung với tinh dầu Ngải cứu

Khuấy đều đồng nhất nguyên liệu

Đổ hộp / khuôn

Để nguội

Cao xoa thành phẩm Hình 2.5. Quy trình sản xuất cao xoa

68

Thuyết minh quy trình: Cân nguyên liệu Việc cân nguyên liệu trong việc bào chế cao xoa là một việc rất quan trọng. Nó giúp cân chia đúng tỷ lệ của các nguyên liệu tránh sai xót trong các giai đoạn về sau. Khi đổ hộp/ khuôn sẽ tránh cho việc thất thoát nguyên liệu thành phẩm. Nếu nói việc phối chế các nguyện liệu là chính thì giai đoạn cân nguyên liệu cũng là một quá trình không thể thiếu. Nhờ cân nguyên liệu mà ta biết được tình trạng và trạng thái trước khi được đưa vào sản xuất để có đề xuất giải pháp kịp thời cho nguyên liệu. Cân tá dược trước vì các tá dược là các hợp chất cao phân tử, khó tan nên việc lựa chọn cân tá dược trước là việc làm được ưu tiên. Các dược chất như menthol, long não rất dễ tan khi nhiệt độ môi trường thay đổi nên được chọn cân sau khi cân hoàn tất các loại tá dược. Sau khi cân tá dược rồi thì đen đi đun cho tan chảy hết các thành phần có trong đó. Rồi mới tiến hành cân các dược chất sau. Khi cân tránh việc đê nguyên liệu tiếp xúc quá nhiều với bề mặt của vật đựng nó. Vì có thể khi đun nguyên liệu dính trên thành vật liệu sẽ tiếp xúc nhiệt chậm hơn, lâu tan hơn. Đun tan chảy nguyên liệu Thành phần của cao xoa là những nguyên liệu dễ tan chảy nên phải cân nhắc việc đun thành phần nào trước để việc phối chế diễn ra một cách dễ dàng nhất. Đun không được quá lâu chỉ tầm thừ 3 đến 5 phút đối với sản xuất vừa và nhỏ, còn khối lượng nguyên liệu lớn sẽ tùy thuộc vào công thức phối chể của nhà sản xuất. Không đun nguyên liệu quá lâu vì sẽ dẫn đến tình trạng “già hóa” hoặc “chín lố” nguyên liệu, làm cho thành phẩm cao sau khi sản xuất có mùi hăng khó chịu bởi các hợp chất cao phân tử bị oxy hóa. Mục đích của việc đun nhằm làm tan chảy nguyên liệu ngoài ra còn khử bớt nước trong các thành phần tá dược làm cho sản phẩm sẽ bảo quản được lâu. Đun có 2 hình thức là đun cách thủy và đun trực tiếp trên bếp điện.

69

Phối trộn nguyên liệu, đồng nhất nguyên liệu Khi hai thành phần nguyên liệu đã tan (tá dược, long não với menthol) thì ta tiến hành phối trộn chung với nhau và phối cùng các dược chất như tinh dầu Ngải cứu, Bạc hà,… Quy trình phối chế phải diễn ra nhanh chóng tránh sự bay hơi của các loại tinh dầu và sự đông lại của sáp ong. Khi hòa các nguyên liệu lại với nhau thì dùng đũa thủy tinh (quy mô phòng thí nghiệm) khuấy cho đồng nhất nguyên liệu. Thao tác cũng phải thật nhanh chóng. Đổ thành phẩm vào hộp Thực hiện đồng nhất nguyên liệu xong cũng là lúc đổ vào hộp thiết có khối lượng tịnh từ 3 đến 5 g. Khi vừa đông thì cao có màu vàng hơi đục do màu của sáp ong tạo thành. Nếu muốn màu khác thì có thể sử dụng màu thực phẩm để tạo cao có màu như người bào chết mong muốn. Lúc này cao xoa vẫn chưa có thể sử dụng mà phải đợi từ 2 đến 3 phút cho cao đông lại hoàn toàn thì có thể sử dụng. Màu sắc của cao lúc này chuyển thành màu vàng nhạt, đục. Đánh giá cảm quan sản phẩm Phân tích sơ bộ chất lượng của cao xoa tinh dầu bằng cảm quan phương pháp thực hiện dựa theo tác giả Trần Vi Ngân (2017). Nghĩa là nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài như mùi, vị, màu sắc, độ trong suốt,... Qua nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài này có thể phán đoán và đánh giá sơ bộ về chất lượng của cao tinh dầu và mục đích sử dụng cao tinh dầu.  Màu sắc và độ trong suốt: Xác định màu sắc và độ trong suốt của cao tinh dầu bằng cách cho cao tinh dầu vào một cốc ống thủy tinh trong suốt không có màu có dung tích 20 mL, đun cho tan chảy, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cường độ của màu và độ trong suốt (ví dụ: vàng nhạt, nâu sẫm,...). Nếu cao tinh dầu còn lợn cợn và không trong suốt chứng tỏ còn tạp chất và nước.  Mùi:

70

Mùi là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của cao tinh dầu. Mỗi một loại cao tinh dầu có một mùi đặc trưng. Dựa vào mùi có thể biết được chất lượng và mục đích sử dụng của nó. Để xác định mùi, dùng đũa thủy tinh, lấy mẫu cao cho tờ giấy lọc hoặc bôi một ít vào mu bàn tay rồi ngửi cách chỗ có cao tinh dầu 20 – 30 mm, cứ 15 phút ngửi 1 lần trong một giờ.  Độ nóng: Độ nóng là một biểu hiện bên ngoài đặc trưng quan trọng của cao tinh dầu. Mỗi một loại cao tinh dầu có độ nóng riêng. Để xác định độ nóng, dùng phương pháp bôi một ít vào mu bàn tay, để cảm nhận độ nóng. So sánh kết quả với cao đối chứng trong cùng 1 khoảng thời gian nhất định. 2.4. Thống kê và xử lý số liệu Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Xử lý số liệu thu được, vẽ biểu đồ, đồ thị bằng phần mềm Excel 2016® và dữ liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm Statistical Analysis Systems 9.1. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b,... thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

71

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Tiến hành khảo sát kích thước nguyên liệu lá Ngải cứu ở 3 kích thước để nguyên, cắt nhỏ 1 cm và xay nhuyễn thu được kết quả như sau: Bảng 3.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. Thể tích Nghiệm thức

Kích thước nguyên liệu

tinh dầu

Hàm lượng

thu được

tinh dầu (%)

(mL) A1

Để nguyên

0,142

0,094c

A2

Cắt nhỏ

0,668

0,446a

A3

Xay nhuyễn

0,472

0,315b (Phụ lục 2)

*Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

72

0,500 0,450 0,446

0,400 0,350 0,300

0,315 Hàm lượng tinh dầu thu được%

0,250 0,200 0,150 0,100 0,050

0,094

0,000 Để nguyên

Cắt nhỏ

Xay nhuyễn

Hình 3.1. Đồ thị ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Theo hình 3.1, nguyên liệu được cắt nhỏ sẽ cho thể tích tinh dầu là 0,668 mL và hàm lượng tinh dầu tối ưu là: 0,446%. Theo các tài liệu nghiên cứu, việc trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước với các nguyên liệu xay sẽ cho hàm lượng tinh dầu cao hơn. Tuy nhiên qua thực nghiệm lại cho thấy hàm lượng tinh dầu thu được ở nguyên liệu cắt nhỏ nhiều hơn so với nguyên liệu xay nhuyễn. Khi xay nhuyễn, các tế bào chứa tinh dầu bị vỡ, dễ thẩm thấu vào các túi dầu, tinh dầu dễ thoát ra môi trường. Trong quá trình xay lại tạo ra một lượng nhiệt nhất định nên dẫn đến việc tinh dầu bị thất thoát ngay trong quá trình xay nhuyễn. Đối với nguyên liệu xay nhuyễn, tinh dầu thu được có màu vàng sáng, mùi tự nhiên so với nguyên liệu cắt nhỏ, tinh dầu đôi khi xuất hiện màu vàng sậm do tiếp xúc nhiệt quá lâu. 3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá già) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cố định các yếu tố: thời gian chưng cất, nồng độ muối, thời gian ngâm mẫu, lượng nước chưng cất, nguyên liệu được cắt nhỏ và thay đổi 2 loại lá Ngải cứu: lá già và là non. Sau khi ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu được ở những

73

thời gian khác nhau, từ đó chọn loại nguyên liệu lá Ngải cứu làm nguyên liệu trích ly tinh dầu Ngải cứu thích hợp. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. Thể tích tinh dầu

Hàm lượng tinh dầu

thu được (mL)

(%)

B1

0,411

0,274b

B2

0,668

0,446a

Nghiệm thức

(Phụ lục 2) *Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. 0,500

0,450 0,400

0,446

0,350 0,300 0,250

0,274

Hàm lượng tinh dầu %

0,200 0,150 0,100 0,050

0,000 Lá già

Lá non

Hình 3.2. Đồ thị ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Căn cứ vào hình 3.2 ghi nhận hàm lượng tinh dầu thu được ở nguyên liệu lá già là tốt nhất 0,446%. Qua đó nhận định tuổi nguyên liệu có ảnh hưởng đến lượng tích lũy tinh dầu trong nguyên liệu. 3.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cố định thời gian chưng cất, thời gian ngâm mẫu, nguyên liệu lá già, lượng nước chưng cất, nguyên liệu được cắt nhỏ, ta thay đổi nồng độ dung dịch

74

NaCl chưng cất như sau: 0% (0g/450 mL nước cất), 5% (22,5 g/450 mL nước cất), 10% (45 g/450 mL nước cất), 15% (67,5 g/450 mL nước cất). Khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước thành hệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợp chưng cất để tránh thất thoát tinh dầu dưới dạng nhũ, làm giảm độ tan của một số thành phần không phân cực có trong tinh dầu vào nước. Đồng thời sẽ tạo thành dung dịch điện ly dẫn đến tăng nhiệt độ sôi (tăng áp suất hơi) của nước. Lượng tinh dầu thu được có thể giảm theo sự tăng nồng độ của muối do khi ở nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngoài chứa tinh dầu co lại, ngăn cản sự thoát tinh dầu ra ngoài. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. Nồng độ muối

Nghiệm thức

(%)

Thể tích tinh dầu thu được (mL)

Hàm lượng tinh dầu (%)

C1

0

0,231

0,153c

C2

5

0,345

0,230b

C3

10

0,668

0,446a

C4

15

0,416

0,281b (Phụ lục 2)

*Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. 0,500

10; 0,446

Hàm lượng tinh dầu (%)

0,450 0,400 0,350

15; 0,281

0,300 5; 0,230

0,250 0,200

0; 0,153

0,150 0,100 0,050

0,000 0

5 10 15 Nồng độ dung dịch NaCl (%)

Hàm lượng tinh dầu (%)

75

Hình 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước thành hệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợp chưng cất để tránh thất thoát tinh dầu dưới dạng nhũ, làm giảm độ tan của một số thành phần không phân cực có trong tinh dầu vào nước. Đồng thời sẽ tạo thành dung dịch điện ly dẫn đến tăng nhiệt độ sôi (tăng áp suất hơi) của nước (W.F.Furter and R.A.Cook, 1967). Lượng tinh dầu thu được có thể giảm theo sự tăng nồng độ của muối do khi ở nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngoài chứa tinh dầu co lại, ngăn cản sự thoát tinh dầu ra ngoài. Mặt khác, do làm tăng nhiệt độ sôi của nước nên việc thêm muối NaCl vào quá trình chưng cất không thể áp dụng cho những tinh dầu có nhiệt độ sôi thấp hoặc kém bền với nhiệt. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng (2011) khảo sát trên mẫu lá Ngải cứu già thu thập tại Quảng Nam đã cho kết quả thể tích tinh dầu thu được là 1,6 mL ở nồng độ NaCl là 10%, ở các mức nồng độ 15 và 20% lượng tinh dầu thu được không tăng thêm. Dựa vào bảng 3.3, nhận xét ở nồng độ muối là 10% là nồng độ tối ưu nhất để trích ly tinh dầu Ngải cứu. 3.1.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian ngâm dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Thời gian ngâm nguyên liệu với dung dịch nước muối trước khi chưng cất có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu được. Do có thời gian để tạo sự thẩm thấu cho tinh dầu thoát ra môi trường bên ngoài nên khi chưng cất tinh dầu thu được nhiều ngay từ đầu và thể tích tăng đáng kể. Đồng thời muối sẽ làm tăng tỷ trọng của nước phá vỡ hệ nhũ tương tinh dầu – nước và tinh dầu bị hơi nước cuốn đi dễ dàng hơn khi chưng cất. Thời gian ngâm khảo sát 0 phút, 30 phút, 60 phút Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu trong dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. Nghiệm thức

Thời gian ngâm

Thể tích tinh

Hàm lượng tinh

(phút)

dầu thu được

dầu (%)

76

(mL)

D1

0

0,200

0,133c

D2

30

0,668

0,446a

D3

60

0,350

0,233b (Phụ lục 2)

*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. 0,500

30; 0,446

Hàm lượng tinh dầu (%)

0,450

0,400 0,350 0,300

60; 0,233

0,250 0,200 0,150

0; 0,133

Hàm lượng tinh dầu (%)

0,100 0,050 0,000 0 30 60 Thời gian ngâm mẫu (phút)

Hình 3.4. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Hiện nay chưa có nghiên cứu nào về tinh dầu Ngải cứu khảo sát về thời gian ngâm nguyên liệu trước khi chưng cất. Tuy nhiên dựa vào kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết tỏi Lý Sơn của nhóm tác giả Nguyễn Minh Chính và cộng sự đã cho thấy thời gian ngâm nguyên liệu trước khi chưng cất tối ưu là 1 giờ. Tác giả kết luận việc ngâm tỏi trong dung dịch muối NaCl trước khi chưng cất có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước (Nguyễn Minh Chính và cộng sự, 2011). Dựa vào hình 3.5., chúng tôi nhận xét ở mức thời gian ngâm mẫu 30 phút, lượng tinh dầu thu được là cao nhất: 0,668 mL, hàm lượng tinh dầu tối ưu là

77

0,446%. Vì vậy, kết luận ở mức thời gian 30 phút là thời gian ngâm tối ưu nhất để trích ly tinh dầu Ngải cứu. 3.1.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cố định các yếu tố nguyên liệu lá già, cắt nhỏ, nồng độ dung dịch NaCl, thời gian ngâm mẫu, lượng nước. Khảo sát thời gian chưng từ 30 phút đến 240 phút và so sánh để tìm ra thời gian tối ưu ly trích tinh dầu Ngải cứu. Lá Ngải cứu được cắt nhỏ, cho 150 g ± 0,001 g lá Ngải cứu vào bình cầu, chưng cất lôi cuốn theo hơi nước thu lấy tinh dầu Ngải cứu. Tinh dầu này được làm khan với bột Na2SO4 khan. Kết quả thu được trình bày ở bảng Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. Thời gian chưng

Thể tích tinh dầu

Hàm lượng tinh

cất (phút)

(mL)

dầu thu được (%)

E1

30

0,220

0,147c

E2

60

0,268

0,179c

E3

90

0,377

0,251bc

E4

120

0,509

0,339ab

E5

150

0,584

0,389a

E6

180

0,668

0,446a

E7

210

0,653

0,435a

E8

240

0,648

0,432a

Nghiệm thức

(Phụ lục 2) *Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05..

78

0,500 0,450 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000

30 Hàm lượng tinh dầu (%) 0,147

60 0,179

90 0,251

120 0,339

150 0,389

180 0,446

210 0,435

240 0,432

Hình 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Dựa vào hình 3.5, thời gian từ 30 phút đến 1 giờ, tinh dầu tiết ra khá chậm. Từ 1 giờ 30 phút đến 2 giờ, tinh dầu tăng nhanh và bắt đầu chậm giờ sau 2 giờ 30 phút. Hàm lượng tinh dầu thu được ở thời điểm 3 giờ là 0,446% và bắt đầu bị hao hụt bớt còn 0,432% sau 4 giờ. Thời gian chưng cất càng lâu lượng tinh dầu thu được càng nhiều. Tuy nhiên đến một thời điểm nhất định lượng tinh dầu không tăng thêm và có thể bị hao hụt bớt. Mặt khác việc kéo dài thời gian chưng cất còn ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu do nguyên liệu bị cháy, khét làm mất mùi thơm tự nhiên của tinh dầu. So sánh với kết quả của tác giả Nguyễn Thị Hồng (2011), với 100g nguyên liệu lá Ngải cứu già, ngâm trong 300 mL dung dịch NaCl 10%, kết quả thu được lượng tinh dầu là 1,4 mL sau 5 giờ chưng cất. Tuy nhiên vì mẫu nguyên liệu thuộc các vùng khác nhau nên các kết quả có sự chênh lệch. Từ đó, nhận xét đối với mẫu Ngải cứu trong bài nghiên cứu này, ghi nhận thời gian chưng cất tối ưu là 3 giờ.

79

3.1.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cố định các yếu tố đã tối ưu, nguyên liệu được làm héo ở 45 – 50οC ở các mức thời gian 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày. Sau đó tiến hành ly trích và so sánh lượng tinh dầu thu được để chọn ra độ héo tối ưu. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. Thời gian để héo

Thể tích tinh dầu

Hàm lượng tinh

(ngày)

(mL)

dầu thu được (%)

F1

0

0,142

0,094c

F2

3

0,370

0,247b

F3

5

0,668

0,446a

F4

7

0,228

0,152c

Nghiệm thức

(Phụ lục 2) *Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. 0,500

0,450

5; 0,446

Hàm lượng tinh dầu (%)

0,400 0,350 0,300 0,250

3; 0,247

Hàm lượng tinh dầu (%)

0,200

7; 0,152

0,150 0,100

0; 0,094

0,050

0,000 0

2

4 6 Thời gian để héo (ngày)

8

Hình 3.6. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian để héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

80

3.1.7. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Với các mức tối ưu của các yếu tố đã chọn, ta thay đổi lượng nước chưng cất như sau: 300 mL, 450 mL, 600 mL. Ghi nhận lượng tinh dầu thu được ở mỗi nghiệm thức, từ đó xác định lượng nước chưng cất tối ưu. Tỷ lệ nguyên liệu / nước chưng ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất thu hồi tinh dầu. Lượng nước quá nhiều, một số thành phần tinh dầu có tính phân cực sẽ tan vào nước. Nếu lượng quá ít thì không đủ hòa tan các chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu.

81

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của lượng nước chưng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. Thể tích nước

Thể tích tinh dầu

Hàm lượng tinh

chưng (mL)

(mL)

dầu thu được (%)

G1

300

0,360

0,271b

G2

450

0,668

0,446a

G3

600

0,407

0,240b

Nghiệm thức

(Phụ lục 2) *Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. 0,500 0,450 0,446

0,400 0,350 0,300 0,250

0,271 0,240

0,200

Hàm lượng tinh dầu (%)

0,150 0,100 0,050

0,000 300

450

600

Hình 3.7. Đồ thị ảnh hưởng của hàm lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Với các yếu tố đã cố định, tiến hành khảo sát lượng nước chưng cất. Dựa vào hình 3.3 với các mức nước 300 mL, 450 mL, 600 mL, lượng tinh dầu thu được thay đổi khá đáng kể. Tỷ lệ lá Ngải cứu/nước chưng ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất thu hồi tinh dầu. Lượng nước quá nhiều, một số thành phần tinh dầu có tính phân cực sẽ tan vào nước. Nếu lượng nước quá ít thì không đủ hòa tan các chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu dẫn đến nguyên liệu dễ bị cháy, khét, ảnh hưởng xấu đến chất lượng và hiệu suất thu được của tinh dầu.

82

So sánh kết quả khảo sát của tác giả Nguyễn Thị Hồng. Khi giữ nguyên các yếu tố khác và thay đổi lượng nước chưng cất, kết quả cho thấy lượng nước tối ưu để trích ly là 500 mL tương đương tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1:3. Dựa vào hình 3.7, kết quả khảo sát của thí nghiệm cho thấy hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được ở lượng nước chưng cất 450 mL là cao nhất (0,446%) tương đương với tỷ lệ nguyên liệu/nước cũng là 1:3. Khi tăng lượng nước chưng cất, hàm lượng tinh dầu giảm. Từ đó rút ra kết luận ở mức 450 mL tương đương tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1:3, tinh dầu thu nhận được nhiều nhất và tối ưu nhất. Kết quả trên phù hợp với mẫu nguyên liệu được khảo sát trong nghiên cứu này. 3.2. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu 3.2.1. Đánh giá cảm quan Tinh dầu Ngải cứu ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước thu được có tính chất sau:  Màu: trong suốt màu vàng sáng.  Mùi: có mùi hơi hắc, nồng 

Vị: có vị đắng nhẹ, the và cay.

Hình 3.8. Tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 3.2.2. Định lượng tinh dầu Ngải cứu Tiến hành định lượng tinh dầu Ngải cứu, lấy 150 g Ngải cứu cắt nhỏ 0,5 – 1 cm chưng cất ở các điều kiện tối ưu trong thực nghiệm, kết quả thu được như sau:

83

Bảng 3.8. Kết quả định lượng tinh dầu Ngải cứu Hàm lượng tinh

Khối lượng

Thể tích tinh dầu

nguyên liệu (g)

thu được (mL)

1

150

0,624

0,416

2

150

0,730

0,487

3

150

0,651

0,434

Số lần

Hàm lượng trung

dầu thu được (%)

0,446

bình (%) Nhận xét và thảo luận:

Hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được ở các điều kiện tối ưu là 0,446%. Hàm lượng tinh dầu thu được trong thực nghiệm mang tính tương đối so với các loại tinh dầu thuộc chi Artemisia. Hàm lượng tinh dầu thu được của thực nghiệm tuy nhỏ hơn hàm lượng tinh dầu thu được ở điều kiện tối ưu cảu tác giả Nguyễn Thị Hồng nhưng thời gian trích ly tối ưu của thực nghiệm là 3 giờ, nhanh hơn thời gian trích ly của tác giả là 5 giờ. 3.2.3. Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu Tiến hành thí nghiệm xác định tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu ta thu được kết quả như sau: Bảng 3.9. Kết quả xác định tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu Số lần

m0

m1

m2

D

1

2,696

3,748

3,610

0,869

2

2,680

3,745

3,632

0,893

3

2,713

3,750

3,628

0,882

Trung bình

2,696

3,748

3,623

0,881

Nhận xét và thảo luận: Trong tinh dầu Ngải cứu thu được chứa hàm lượng lớn D-camphor có tỷ trọng khoảng 0,910 – 0,950 và cineole tỷ trọng khoảng 0,868 – 0,930. Do vậy, tỷ trọng trung bình của tinh dầu Ngải cứu thu được là: 0,881 là có cơ sở. Hiện nay vẫn chưa có tài liệu nghiên cứu công bố về tỷ trọng của tinh dầu

84

Ngải cứu, so sánh với kết quả thu được trên loài Ngải thanh cao hoa vàng (Đinh Huỳnh Kiệt và cộng sự, 1990) với d25 là 0,9011 có sự tương đồng với kết quả nghiên cứu của chúng tôi. So với tỷ trọng của nước là 1, tỷ trọng của tinh dầu Ngải cứu chắc chắn sẽ nhẹ hơn nước, vì vậy khi chưng cất tinh dầu Ngải cứu thu được nằm ở trên, nước nằm ở dưới 3.2.4. Chỉ số hóa học của tinh dầu Ngải cứu Tiến hành xác định chỉ số lý hóa của tinh dầu Ngải cứu thu được kết quả như sau: Bảng 3.10. Kết quả xác định chỉ số hóa học của tinh dầu Ngải cứu Số lần

IA

IE

IS

1

3,366

36,465

39,831

2

3,927

37,857

41,514

3

3,366

37,026

40,392

Trung bình

3,533

37,026

40,559

Kết luận:  Chỉ số acid của tinh dầu Ngải cứu là: IA = 3,533  Chỉ số ester hóa của tinh dầu Ngải cứu là: IE = 37,026  Chỉ số savon hóa của tinh dầu Ngải cứu là: IS = 40,559 3.2.5. Độ hòa tan trong ethanol Tiến hành xác định độ hòa tan của tinh dầu trong ethanol 96o, 90o, 80o thu được kết quả như sau:

85

Bảng 3.11. Kết quả xác định độ hòa tan của tinh dầu Ngải cứu trong ethanol Thể tích ethanol

Số lần

tuyệt đối (mL)

Thể tích

Thể tích

Thể tích

ethanol 90o

ethanol 80o

ethanol 70o

(mL)

(mL)

(mL)

1

10,3

14

23,6

48

2

10,5

14,2

24,3

48,7

3

10,5

14,5

24

47,5

10,43

14,23

23,97

48,07

1:10,43

1:14,23

1:23,97

1:48,07

Thể tích trung bình Tỷ lệ hòa tan tinh dầu

Nhận xét và thảo luận: Dựa vào tính chất vật lý của tinh dầu, tinh dầu Ngải cứu gần như không tan trong nước và dễ bay hơi nhưng lại tan tốt trong cồn và các dung môi hữu cơ, các loại dầu mỡ, có thể tan một phần trong dung dịch kiềm,... Vì vậy, khi tăng nồng độ ethanol sẽ tỷ lệ thuận với độ hòa tan của tinh dầu. Nồng độ ethanol càng cao, tinh dầu càng tan tốt. 3.3. Kết quả xác định thành phần hóa học của tinh dầu Bảng 3.12. Kết quả xác định thành phần hóa học và hàm lượng tương đối các hợp chất trong mẫu tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp GC – MS Hàm TT

Rt

Tên chất

lượng

Độ tương Mass

hợp khổi phổ

(%) 1

5,082

1R-α-Pinene

3,090

136

950

2

5,344

Camphene

6,463

136

950

3

5,725

1-Octen-3-ol

2,357

128

820

4

5,826

β-Pinene

1,743

136

931

5

5,971

β-Myrcene

0,985

136

951

6

6,035

2,3-Dehydro-1,8-cineole

0,379

152

832

86

7

6,295

α-Phellandrene

0,535

136

929

8

6,528

γ-Terpinene

0,730

136

933

9

6,680

o-Cymene

0,778

134

943

10

6,849

Eucalyptol (Cineole)

16,80

154

951

11

7,376

Pinocamphyl tiglate, iso-

1,840

236

793

12

8,393

Filifolone

0,919

150

873

13

8,814

p-Menth-2-en-1-ol

2,679

154

905

14

8,902

Chrysanthenone

2,996

150

944

15

9,245

Cis-2-Menthenol

2,361

154

900

16

9,435

D-(+)-Camphor

31,78

152

945

17

9,831

Pinocarvone

1,124

150

918

18

9,908

Camphol

5,707

154

937

19

10,168

Terpinen-4-ol

1,464

154

906

20

10,474

α-Terpinol

0,812

154

919

21

10,644

(-)-Myrtenol

2,048

152

873

22

10,879

Trans-Piperitol

1,160

154

898

23

10,965

Levoverbenone

0,457

150

894

24

11,144

Cis-Carveol

0,432

152

935

25

15,562

β-Elemene

0,825

204

909

26

16,314

Caryophyllene

3,240

204

952

27

17,144

Humulene

1,508

204

947

28

17,799

D-Germacrene

2,016

204

943

29

18,172

Bicyclogermacren

0.715

204

908

30

18,751

Cadina-1(10),4-diene

0,370

204

912

31

20,226

Caryophyllene oxide

0,805

220

902

32

20,424

Viridiflorol

0,508

222

909

33

21,817

Neointermedeol

0,410

222

879 (Phụ lục 4)

87

Nhận xét và thảo luận: Dựa vào bảng 3.12 cho thấy thành phần hóa học chiếm hàm lượng lớn trong tinh dầu Ngải cứu là D-camphor (31,78%) và cineole (15,80%), ngoài ra còn có các chất α-Pinene (3,09%), β-Pinene (1,743%). Kết quả thu nhận được có sự tương đồng với các chất có mặt trong thành phần tinh dầu Ngải cứu thu thập ở miền Bắc Việt Nam (Thao et al., 2004), tuy nhiên do vị trí địa lí, thổ nhưỡng khác nhau dẫn đến hàm lượng các chất có sự khác biệt, cụ thể ở nghiên cứu của tác giả ghi nhận hàm lượng cineole là 21,7% cao hơn kết quả ở bảng 3.12 5,9%; hàm lượng camphor là 14,7% thấp hơn kết quả ở bảng 3.12 17,08%; hàm lượng α-Pinene là 4%; β-Pinene là 9,8%. Camphor hay long não được ứng dụng nhiều trong việc xua đuổi côn trùng, thực tế sử dụng long não dạng rắn đặt ở tủ quần áo giúp xua đuổi gián, bọ. Người Ấn Độ cổ đại còn sử dụng long não như một loại thuốc điều trị sốt. Ngày nay long não được sử dụng dưới dạng lỏng như một loại thuốc ho và thuốc thông mũi. Tuy nhiên liều lượng sử dụng phải được thông qua bởi bác sĩ. Thông qua bảng kết quả 3.12 còn cho thấy sự xuất hiện của camphene và camphol là tiền chất của camphor. Điều này có thể kết luận được hàm lượng camphor trong tinh dầu Ngải cứu của nghiên cứu này là tương đối cao. Cineole được sử dụng làm hương liệu, nước hoa và mỹ phẩm ở mức thấp (0,002%) trong các sản phẩm khác nhau. Cineole còn là thành phần trong một số loại nước súc miệng, thuốc ho. Ngoài ra hoạt chất này còn được sử dụng trong thuốc trừ sâu và thuốc chống côn trùng. Vì vậy, tinh dầu Ngải cứu có tiềm năng to lớn trong vai trò là chất phụ gia bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm, ức chế một số vi sinh vật gây hại như Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis, Escheichia coli (Erel et al.,2012). Ức chế mạnh đối với các chủng nấm Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata ND31, Candida tropicalis PNT20 (Lê Thị Thanh Thảo, 2018); Aspergillus niger (Blagojevic et al., 2006)

88

3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 3.4.1. Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Kết quả hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu Ngải cứu được thể hiện trong bảng 3.13 qua đường kính vùng ức chế Bảng 3.13 Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu Ngải cứu Nghiệm thức

A0

Độ pha loãng tinh dầu

Đường kính vòng

Ngải cứu

kháng khuẩn (mm)

Kháng sinh Ampicillin (ĐC)

14

A1

Tinh dầu nguyên chất

21,333a

A2

10-1

16,333b

A3

10-2

12,667c

A4

10-3

10,333d

A5

10-4

8,667d (Phụ lục 3)

*Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Nhận xét và thảo luận Sau 3 lần thực hiện kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu đối với chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ở nồng độ vi khuẩn 106 CFU/mL, chúng tôi ghi nhận kết quả như sau: Ở nồng độ tinh dầu pha loãng tinh dầu nguyên chất: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 21,333 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng ≥ 20 mm. Đánh giá: cực nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-1: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 16,333 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng 15 – 19 mm. Đánh giá: rất nhạy (Celikel và Kavas, 2008).

89

Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-2: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 12,667 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng từ 9 – 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-3: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 10,333 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng từ 9 – 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-4: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 8,667 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng từ < 8 mm. Đánh giá: không nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của kháng sinh Ampicillin đối chứng là 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Dựa vào bảng 3.13., kết quả nghiệm thức A1 có đường kính vòng kháng khuẩn rất lớn, đạt mức cực nhạy. Nghiệm thức A1 có vòng kháng nhạy hơn cả kháng sinh Ampicillin đối chứng được xét là có kết quả kháng khuẩn rất tốt. Ở các nồng độ pha loãng tinh dầu còn lại, kết quả cho thấy ở các nghiệm thức, đường kính vòng kháng khuẩn vẫn nằm ở mức rất nhạy và nhạy. Nhìn chung, tinh dầu Ngải cứu trích ly từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cho kết quả kháng Staphylococcus aureus là rất tốt và tốt hơn cả kháng sinh đối chứng trên cả 4 nồng độ pha loãng.

90

Hình 3.9. Kết quả kháng Staphylococcus aureus a. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu Ngải cứu b. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của đối chứng kháng sinh Ampicilin 3.4.2. Hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Kết quả hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu Ngải cứu được thể hiện trong bảng 3.14 qua đường kính vùng ức chế. Bảng 3.14. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu Ngải cứu Nghiệm thức

B0

Độ pha loãng tinh dầu

Đường kính vòng

Ngải cứu

kháng khuẩn (mm)

Kháng sinh Ampicillin (ĐC)

17

B1

Tinh dầu nguyên chất

18,333a

B2

10-1

14,667b

B3

10-2

10,333c

B4

10-3

9,000c

B5

10-4

6,000d (Phụ lục 3)

*Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Nhận xét và thảo luận

91

Sau 3 lần thực hiện kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu đối với chủng vi khuẩn E.coli ở nồng độ vi khuẩn 106 CFU/mL, chúng tôi ghi nhận kết quả như sau: Ở nồng độ tinh dầu pha loãng tinh dầu nguyên chất: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 18,333 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng 15 – 19 mm. Đánh giá: rất nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-1: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 14,667 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng 9 - 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-2: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 10,333 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng 9 – 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-3: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 9,000 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng từ 9 – 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-4: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 6,000 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng < 8 mm. Đánh giá: không nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng là 17 mm. Đánh giá: rất nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của kháng sinh Ampicillin đối chứng là 17 mm. Đánh giá: rất nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Dựa vào bảng 3.13., kết quả nghiệm thức A1 có đường kính vòng kháng khuẩn lớn, đạt mức rất nhạy. Nghiệm thức A1 có vòng kháng nhạy hơn cả kháng sinh Ampicillin đối chứng được xét là có kết quả kháng khuẩn rất tốt. Ở các nồng độ pha loãng tinh dầu còn lại, kết quả cho thấy ở các nghiệm thức, đường kính vòng kháng khuẩn vẫn nằm ở mức rất nhạy và nhạy trừ nồng độ pha loãng 10-4 không nhạy. Nhìn chung tinh dầu Ngải cứu trích ly từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cho kết quả kháng E.coli tốt. Theo kết quả khảo sát hoạt lực kháng

92

khuẩn của tinh dầu Ngải cứu do Erel và cộng sự tiến hành vào năm 2012, vòng kháng khuẩn đo được ở nồng độ tinh dầu nguyên chất là 11 mm.

Hình 3.10. Kết quả kháng E.coli a. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu Ngải cứu b. Kết quả kháng E.coli của đối chứng kháng sinh 3.4.3. Kết quả hoạt tính kháng Salmonella typhimurium của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Kết quả hoạt tính kháng Salmonella typhimurium của tinh dầu Ngải cứu được thể hiện trong bảng 3.15 qua đường kính vùng ức chế

93

Bảng 3.15. Kết quả kháng Samonella typhimurium của tinh dầu Ngải cứu Nghiệm thức

C0

Độ pha loãng tinh dầu

Đường kính vòng

Ngải cứu

kháng khuẩn (mm)

Kháng sinh Ampicillin

15

(ĐC)

C1

Tinh dầu nguyên chất

14,667a

C2

10-1

12,000b

C3

10-2

10,333c

C4

10-3

9,000d

C5

10-4

7,333e (Phụ lục 3)

*Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Nhận xét và thảo luận Sau 3 lần thực hiện kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu đối với chủng vi khuẩn Salmonella ở nồng độ vi khuẩn 106 CFU/mL, chúng tôi ghi nhận kết quả như sau: Ở nồng độ nguyên chất: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 14,667 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng 9 – 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-1: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 12,000 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng 9 – 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-2: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 10,333 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng 9 – 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-3: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 9,000 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng từ 9 – 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008).

94

Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-4: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 7,333 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình < 8 mm. Đánh giá: không nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của kháng sinh Ampicillin đối chứng là 15 mm. Đánh giá: rất nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Dựa vào bảng 3.15., kết quả các nghiệm thức từ A1 đến A3 có đường kính vòng kháng khuẩn trung bình, đạt mức nhạy. Tuy các nghiệm thức này có vòng kháng không nhạy bằng kháng sinh Ampicillin đối chứng nhưng vẫn được xét là có kết quả kháng khuẩn tốt. Kết quả ở nghiệm thức A5, đường kính vòng kháng khuẩn nằm ở mức không nhạy. Từ đó cho thấy tinh dầu Ngải cứu trích ly từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cho kết quả có khả năng kháng Salmonella typhimurium.

Hình 3.11. Kết quả kháng Salmonella typhimurium a. Kết quả kháng Salmonella typhimurium của tinh dầu Ngải cứu b. Kết quả kháng Salmonella typhimurium của đối chứng kháng sinh 3.4.4. Hoạt tính kháng Shigella boydii của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Kết quả hoạt tính kháng Shigella boydii của tinh dầu Ngải cứu được thể hiện trong bảng 3.16 qua đường kính vùng ức chế. Bảng 3.16 Kết quả kháng Shigella boydii của tinh dầu Ngải cứu

95

Nghiệm thức

D0

Độ pha loãng tinh dầu

Đường kính vòng

Ngải cứu

kháng khuẩn (mm)

Kháng sinh Ampicillin (ĐC)

17

D1

Tinh dầu nguyên chất

20,667a

D2

10-1

20,333a

D3

10-2

16,667b

D4

10-3

10,333c

D5

10-4

9,3333c (Phụ lục 3)

*Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Nhận xét và thảo luận Sau 3 lần thực hiện kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu đối với chủng vi khuẩn Shigella boydii ở nồng độ vi khuẩn 106 CFU/mL, chúng tôi ghi nhận kết quả như sau: Ở nồng độ nguyên chất: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 20,667 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng > 20 mm. Đánh giá: cực nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-1: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 20,333 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng > 20 mm. Đánh giá: cực nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-2: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 16,667 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng 15 - 19 mm. Đánh giá: rất nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-3: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 10,333 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm trong khoảng từ 9 – 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-4: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 9,3333 mm. Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình trong khoảng từ 9 – 14 mm. Đánh giá: nhạy (Celikel và Kavas, 2008).

96

Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của kháng sinh Ampicillin đối chứng là 17 mm. Đánh giá: rất nhạy (Celikel và Kavas, 2008). Dựa vào bảng 3.16., kết quả các nghiệm thức D1 và D2 có đường kính vòng kháng khuẩn trung bình đạt mức cực nhạy, tốt hơn so với kháng sinh Ampicilin. Từ đó cho thấy tinh dầu Ngải cứu trích ly từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cho kết quả kháng Shigella boydii rất tốt.

Hình 3.12. Kết quả kháng Shigella boydii a. Kết quả kháng Shigella boydii của tinh dầu Ngải cứu b. Kết quả kháng Shigella boydii của đối chứng kháng sinh 3.5. Kết quả sản xuất cao xoa ở quy mô phòng thí nghiệm Cao đã hoàn thiện sẽ có mùi thơm đặc trưng của các loại tinh dầu cho vào đó. Đối với cao Ngải cứu này thì mùi đặc trưng phải có mùi thơm nhẹ của Ngải cứu, không để các mùi của các loại tinh dầu khác lấn át. Phân tích sơ bộ chất lượng của cao xoa tinh dầu bằng cảm quan: Màu: vàng nhạt hơi đục Mùi: mùi đặc trưng của tinh dầu Ngải cứu, the mát của menthol, tinh dầu bạc hà.

97

Độ nóng: đánh giá sơ bộ độ nóng cao Tinh dầu Ngải cứu từ 4 đến 10 phút.

Hình 3.13. Cao xoa thành phẩm

98

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Từ quá trình nghiên cứu ta thu được các thông số kỹ thuật cho quá trình trích ly tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ở quy mô phòng thí nghiệm:  Nguyên liệu lá già, để héo 5 ngày, cắt nhỏ: 1 cm  Tỷ lệ Ngải cứu/nước: 1:3  Nồng độ dung dịch NaCl: 10%  Thời gian ngâm nguyên liệu: 30 phút  Thời gian chưng cất: 180 phút kể từ khi giọt tinh dầu đầu tiên ngưng tụ nhỏ xuống ống hứng tinh dầu. Tinh dầu Ngải cứu thu được có màu vàng sáng, nhẹ hơn nước, có mùi nồng đặc trưng, vị cay the. Đã xác định được các chỉ số vật lý và hóa học của tinh dầu Ngải cứu như sau:  Hàm lượng tinh dầu Ngải cứu: 0,446%  Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu: 0,881  Chỉ số acid (IA): 3,533  Chỉ số savon hóa (IS): 40,559  Chỉ số ester hóa (IE): 37,026  Chỉ số ethanol:

Tỷ lệ tinh dầu/cồn tuyệt đối = 1:10,43 Tỷ lệ tinh dầu/cồn 96o = 1:14,23 Tỷ lệ tinh dầu/cồn 80o = 1:23,97 Tỷ lệ tinh dầu/cồn 70o = 1:48,07

Thành phần hóa học trong tinh dầu Ngải cứu là D-camphor (31,78%) và cineole (15,80%), ngoài ra còn có các chất α-Pinene (3,09%), β-Pinene (1,743%). Kết quả kháng khuẩn khảo sát ở 4 loại vi khuẩn: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Shigella boydii cho thấy tinh dầu Ngải cứu có khả năng kháng các loại vi khuẩn gram (+), gram (-). Tinh dầu nguyên chất có khả năng kháng vi sinh vật mạnh nhất và có hoạt lực kháng khuẩn mạnh hơn cả kháng sinh Ampicillin đối chứng. Khả năng kháng khuẩn

99

của tinh dầu Ngải cứu giảm dần theo nồng độ pha loãng tinh dầu. Kết quả cho thấy dù nồng độ pha loãng tinh dầu Ngải cứu thấp nhất 10-4 nhưng vẫn cho kết quả nhạy ở các chủng Salmonella typhimurium, Escherichia coli. Bước đầu ứng dụng tinh dầu Ngải cứu trong sản xuất cao xoa ghi nhận thành phẩm có màu sắc, kết cấu tương tự các loại cao xoa đang lưu hành trên thị trường. Độ nóng cao xoa thành phẩm từ 4 đến 10 phút. 4.2. Kiến nghị Đề tài cần nghiên cứu thêm:  Các loại Ngải cứu phân bố trên lãnh thỗ Việt Nam và điều kiện canh tác, độ tươi, héo của Ngải cứu ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất.  Ứng dụng các phương pháp mới vào quá trình chưng cất như: chưng cất bằng nước có hỗ trợ của vi sóng, sóng siêu âm,…  Xác định tính chất vật lý khác của tinh dầu thu được như: chỉ số chiết quang, chỉ số khúc xạ, nhiệt độ kết tinh tinh dầu,…  Xác định các chỉ số hóa học như: chỉ số iod,…  Nghiên cứu thêm các quy trình sản xuất cao xoa từ đó ứng dụng trong sản xuất công nghiệp, tạo nên sự đa dạng cho các sản phẩm từ tinh dầu Ngải cứu.

100

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tài liệu Tiếng Việt [1]. Dược điển Việt Nam IV (2004), Nhà xuất bản Y học. [2]. Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kỹ Thuật. [3]. Lã Đình Mỡi (2001). Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam, NXB Nông Nghiệp. [4]. Lê Ngọc Thạch (2003). Tinh Dầu, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. [5]. Mai Thị Anh Tú, 2009. Khảo sát tinh dầu tần dầy lá, Đại học Cần Thơ. [6]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. [7]. Nguyễn Quốc Châu Thanh (2013). Ly trích và khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu sả chanh (Cymbopogon citratus stapf), Trường Đại học Cần Thơ. [8]. Nguyễn Tấn Thịnh, 2013. Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây lược vàng Callisia fragrans (lindl) Wood, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Công nghệ Kỹ thuật, Tp.HCM. [9]. Nguyễn Tiến Thắng, 2012. Công nghệ sản xuất sinh phẩm. Nhà xuất bản Bộ giáo dục và đào tạo – Trường đại học công nghệ kỹ thuật. Tp.HCM. [10]. Nguyễn Thị Hồng Liên (2014). Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá lốt được ly trích từ phương pháp lôi cuốn hơi nước và phương pháp vi sóng, Trường Đại học Cần Thơ. [11]. Nguyễn Thị Hồng, 2011. Nghiên cứu xác định thành phần và cấu tạo một số hợp chất hóa học trong tinh dầu từ cây Ngải cứu ở Quảng Nam. Đại học Đà Nẵng, Luận văn Thạc sĩ khoa học. [12]. Phùng Thị Ái Hữu (2012). Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hoá học tinh dầu cây sả chanh Cẩm Lệ - Đà Nẵng, Trường Đại học sư phạm – Đại học Đà Nẵng. [13]. Tiêu chuẩn Việt Nam 189:1993. Tinh dầu và phương pháp thử. Năm ban hành 1993-09-07.430/QĐ-TĐC.

101

[14]. Tôn Long Dày (2013). Ly trích và khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu Bạc Hà. Đại học Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp. [15]. Tôn Nữ Minh Nguyệt và cộng sự, 2010. Chất kháng khuẩn thực vật, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh. [16]. Nguyễn Đức Đoàn, 2002. Thuốc Đông y, cách sử dụng – bào chế - bảo quản, NXB Y học. 2.Tài liệu tiếng Anh [17]. Juvatkar PV, Kale MK., Jalalpure SS, Waghulde Sandeep, Naik Pravin, Jain Vishal, Antimicrobial activity of Leaves of Artemisia vulgaris L, USC.ES. [18]. Sujatha Govindaraj and Bollipo D. RanjithaKumari, Composition and Larvicidal Activity of Artemisia vulgaris L. Stem Essential Oil Against Aedes aegypti, Jordan Journal of Biological Sciences, Volume 6, Number 1, March .2013, Pages 11 – 16 [19]. Garza I, Swanson J W. Prophylaxis of migraine. Neuropsychiatr Dis Treat. 2006 September; 2(3): 281–291. [20]. Asakura K, Kanemasa T, Minagawa K, et al. 2000. Alpha-eudesmol, a P/Q-type Ca2+ channel blocker, inhibits neurogenic vasodilation and extravasation following electrical stimulation of trigeminal ganglion. Brain Res, 873:94–101. [21]. Tsuneki H, Ma EL, Kobayashi S, Sekizaki N, Maekawa K, Sasaoka T, Wang MW, Kimura I. Antiangiogenic activity of beta-eudesmol in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 2005 Apr 11;512(2-3):105-15. [22]. Ma EL, Li YC, Tsuneki H, Xiao JF, Xia MY, Wang MW, Kimura I. Beta-eudesmol suppresses tumour growth through inhibition of tumour neovascularisation and tumour cell proliferation. J Asian Nat Prod Res. 2008 Jan-Feb;10(1-2):159-67. [23]. Chiou L. C., Chang C. C. Antagonism by β-eudesmol of neostigmineinduced neuromuscular failure in mouse diaphragms. European journal of pharmacology ISSN 0014-2999. 1992, vol. 216, no2, pp. 199-206.

102

[24]. Chiou LC, Ling JY, Chang CC. beta-Eudesmol as an antidote for intoxication from organophosphorus anticholinesterase agents. Eur J Pharmacol. 1995 Jan 13;292(2):151-6 [25]. Mugwort (Artemisia vulgaris) Oils Chapter | 65 579 Essential Oils in Food Preservation, Flavor and Safety, First Edition, 2016, 573-579 [26]. Alizade M., Aghaei M., Saadatian M., Sharifian I. Chemical composition of essential oil of Artemisia vulgaris from West Azerbaijan, Iran. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 2012. [27]. Asta, J., Juste, B., 2006. Chemical composition of essential oils of Artemisia vulgaris L. (Mugwort) from North Lithuania. Chemistry 1, 12– 15. [28]. Bamoniri, A., Mirjalili, B.B.F., Mazoochi, A., Batooli, H., 2010. Chemical composition of Artemisia vulgaris L. from Kashan area isolated by nano scale injection. Iran. J. Org. Chem. 2 (4), 533–536 [29]. Barney, J.N., Hay, A.G., Weston, L.A., 2005. Isolation and characterization of allelopathic volatiles from Mugwort (Artemisia vulgaris). J. Chem. Ecol. 31 (2), 247–265. [30]. Bhatt, L.R., Lee, J.S., Baek, S.H., 2007. Evalution of antioxidant activity of essential oil from Artemisia vulgaris. Korean J. Orient. Physiol. Pathol. 21 (2), 528–531. [31]. Blagojevic, P., Radulovic, N., Palic, R., Stojanovic, G.J., 2006. Chemical composition of the essential oil of Serbian wild-growing Artemisia absinthium and Artemisia vulgaris. J. Agric. Food Chem. 54, 470–478. [32]. Erel, S.B., Reznicek, G., Senol, S.G., Yavasogulu, N.U.K., Konyalioglu, S., Zeybek, A.U., 2012. Antimicrobial and antioxidant properties of Artemisia L. species from western Anatolia. Turk. J. Biol. 36, 75–84. [33]. Gilani,

A.H.,

Yaeesh,

S.,

Jamal,

Q.,

Ghayur,

M.N.,

2005.

Hepatoprotective activity of aqueous-methanol extract of Artemisia vulgaris. Phytother. Res. 19, 170–172.

103

[34]. Govindaraj, S.P., Kumari, B.D.R., 2013. Composition and larvicidal activity of Artemisia vulgaris L. stem essential oil against Aedesaegypti. Jordan J. Biol. Sci. 6 (1), 11–16. [35]. Gruenwald, J., Brendler, T., Jaenicke, C., 2008. PDR of Herbal Medicine, fourth ed. Medical Economics Company. [36]. Haider, F., Dwivedi, P.D., Naqvi, A.A., Bagchi, G.D., 2003. Essential oil composition of Artemisia vulgaris harvested at different growth periods under Indo-Gangetic plain conditions. J. Essent. Oil Res. 15, 376–378. [37]. Harimath, S.K., Kolume, D.G., Muddapur, U.M., 2011. Antimicrobial activity of Artemisia vulgaris Linn. (Damanaka). Int. J. Res. Ayurveda Pharm. 2 (6), 1674–1675. [38]. Hussain, A.I., Anwar, F., Sherazi, S.T.H., Przybylski, R., 2008. Chemical composition, antioxidant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depend on seasonal variations. Food Chem. 108, 986–995. [39]. Jerkovic, I., Mastelic, J., Milos, M., Juteau, F., Masotti, V., Viano, J., 2003. Chemical variability of Artemisia vulgaris L. essential oils originated from the Mediterranean area of France and Croatia. Flavour Fragr. J. 18, 436–440. [40]. Judzentiene, A., Buzelyte, J., 2006. Chemical composition of essential oils of Artemisia vulgaris L. (Mugwort) from plants grown in North Lithuania. Chemistry 17 (1), 12–15. [41]. Mucciarelli, M., Caramiello, R., Maffei, M., 1995. Essential oils from some Artemisia species growing spontaneously in North-West Italy. Flavour Frag. J. 10, 25–32. [42]. Pino, J.A., Rohlado, A., Fuentcs, V., 1999. Composition of the essential oil of Artemisia vulgaris L. herb from Cuba. J. Essent. Res. 11, 477–478. [43]. Sharifian, I., Hashemi, S.M., Darvishzadeh, A., 2013. Fumigant toxicity of essential oil of Mugwort (Artemisia vulgaris L.) against three major stored product beetles. Arch. Phytopathol. PFL 46 (4), 445–450.

104

[44]. Silva, T.D.J.A., 2004. Mining the essential oils of the Anthemideae. Afr. J. Biotechnol. 3 (12), 706–720. [45]. Sun, W.C., Han, J.X., Yang, W.Y., Deng, D.A., Yue, X.F., 1992. Antitumor activities of 4 derivatives of artemisic acid and artemisinin B in vitro. Acta Pharm. Sin. 13, 541–543. [46]. Surburg, H., Panten, J., 2006. Common Fragrance and Flavor Materials. Preparation, Properties and Uses, fifth ed. Wiley-VCH, Weinheim. ISBN: 978-3-527-31315-0. [47]. Tang, W., Eisenbrand, G., 2011. Handbook of Chinese Medicinal Plants: Chemistry, Pharmacology, Toxicology, vol. 1. Wiley VCH, Weinheim. ISBN: 978-3-527-32226-8. [48]. Thao, N.T.P., Thuy, N.T., Hoi, T.M., Muselli, T.H.T.A., Bighelli, A., Castola, V., Casanova, J., 2004. Artemisia vulgaris L. from Vietnam: chemical variability and composition of the oil along the vegetative life of the plant. J. Essent. Oil Res. 16, 358–361. [49]. Tigno, X.T., Guzman, F.D., Flora, A.M.T.V., 2000. Phytochemical analysis and hemodynamic actions of Artemisia vulgaris L. Clin. Hemorheol. Micro-circ. 23, 167–175. [50]. Tobyn, G., Denham, A., Whitelegg, M., 2011. The Western Herbal Tradition: 2000 Years of Medicinal Plant Knowledge. Elsevier Churchil Livingstone. ISBN: 978-0-443-10344-5. pp. 123. [51]. Walter, H.L., Memory, P.F.E.L., 2003. Medical Botany: Plants Affecting Human Health, second ed. John Wiley and Sons, New York. ISBN: 978-0-471-62882-8. pp. 345. [52]. Wang, J., Zhu, F., Zhou, X.M., Niu, C.Y., Lei, C.L., 2005. Repellent and fumigant activity of essential oil from Artemisia vulgaris to Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae). J. Stored Prod. Res. 42, 339–347. [53]. Willcox, M., 2009. Artemisia species: from traditional medicines to modern antimalarial and back again. J. Altern. Complem. Med. 15, 101– 109.

105

[54]. Wright, C.W., 2002. Artemisia: Medicinal and Aromatic Plantsindustrial Profiles. Taylor and Francis, New York. ISBN: 978-0-41527212-4. [55]. Yoshikawa, M., Shimada, H., Matsuda, H., Yamahara, J., Murakami, N., 1996. Bioactive constituents of Chinese natural medicines. Chem. Pharm. Bull. 44 (9), 1656–1662. [56]. Govindaraj S, Kumari BD, Cioni PL, Flamini G. Mass propagation and essential oil analysis of Artemisia vulgaris. J Biosci Bioeng, 2008 Mar; 105 (3): 176-83. 3. Tài liệu Internet [57]. Chi cục thú y TP. Hồ Chí Minh, Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E. coli, 6/2012, http://chicucthuyhcm.org.vn/new/2005/09/23/Ngo-doc-thuc-pham-do-vikhuan-Ecoli.aspx [58]. Đại Học Y Thái Bình, Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp, 5/2012, http://thuvien.yhvn.vn/node/1030 http://thuvien.yhvn.vn/node/1029 http://thuvien.yhvn.vn/node/1012 [59]. https://vi.wikipedia.org/wiki/Ngải_cứu

1

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần các chất môi trường và cách pha 1 số dung dịch thử Dung dịch chuẩn độ KOH 0,1 N Cân khoảng 0,56 g KOH rắn, hòa tan trong 100 mL ethanol 96o, ta được dung dịch KOH trong cồn nồng độ khoảng 0,1 N. Môi trường tăng sinh NB Cân chính xác 5 g môi trường Peptone, 3 g môi trường Beef extract (có thể thay thế bằng 3 g môi trường Meat extract), 15 g muối NaCl. Hòa 23 g môi trường Nutrient Broth trong 1000 mL nước cất vô trùng. Đun sôi, khuấy đều và khử trùng bằng nồi hấp ở 121°C trong 15 phút. PH cuối 7,0 ± 0,2. Môi trường cấy kháng khuẩn NA Cân chính xác 5 g môi trường Peptone, 3 g môi trường Beef extract (có thể thay thế bằng 3 g môi trường Meat extract), 15 g muối NaCl và 15 g Agar. Hòa 38 g môi trường Nutrient Agar trong 1000 mL nước cất vô trùng. Đun sôi, khuấy đều và khử trùng bằng nồi hấp ở 121°C trong 15 phút. PH cuối 7,0 ± 0,2. Phụ lục 2: Xử lý thống kê các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu trong quá trình chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kích cỡ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu nhận được sau 3h chưng cất Sum of Source

DF

Model

2

Error

6

Corrected Total

Squares

Mean Square

F Value

Pr > F

0.09460133

124.49

F F

30.24

0.0053

0.04420417 0.00146167

0.05005083

R-Square

Coeff Var

Root MSE

Mean

0.883185

10.62485

0.038232

0.359833

Source

DF

NT

1

Anova SS 0.04420417

Mean Square 0.04420417

F Value 30.24

Pr > F

0.0053

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom Error Mean Square

4

0.001462

Critical Value of t

2.77645

Least Significant Difference 0.0867 t Grouping

Mean

N NT

A

0.44567

3 B1

B

0.27400

3

B2

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu nhận được sau 3h chưng cất Sum of Source

DF

Model

3

Error

8

Corrected Total

Squares

Mean Square

0.13765667 0.00388400 11

Mean

0.972559

7.935437

0.022034

0.277667

3

F

0.04588556

R-Square

Source

F Value

Anova SS 0.13765667

Mean Square

F Value

0.04588556

94.51

Pr > F

F

0.07631878

112.29

F F

15.75

F

F

0.07119222

131.23

F F

45.32

0.0002

0.03688411 0.00081378

0.07865089

R-Square

Source

Mean Square

Anova SS 0.07376822

Mean 0.318889

Mean Square

F Value

0.03688411

45.32

Pr > F

0.0002

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom Error Mean Square

6

0.000814

Critical Value of t

2.44691

Least Significant Difference t Grouping

Mean

0.057

N NT

A

0.44567

3

G2

B

0.27100

3

G3

3

G1

B B

0.24000

Phụ lục 3: Xử lý thống kê kết quả mức độ kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu trên các nhóm vi sinh vật chỉ thị 1. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu Ngải cứu Sum of Source

DF

Model

4

Error

Squares 308.4000000

10

Corrected Total

Mean Square

7.3333333 14

F Value

77.1000000

Pr > F

105.14

F F

177.08

F F

119.17

97.33333333

R-Square

Source

F Value

Anova SS 95.33333333

Mean Square

F Value

23.83333333

119.17

Alpha

Pr > F