Munteanu Madalina-Acidul Glutamic [PDF]

Zitiervorschau

Universitatea Tehnică Gheorghe Asachi, Facultate de Inginerie Chimică și Protecția Mediului – Iași

BIOTEHNOLOGII INDUSTRIALE

Coordonator:

STUDENT:

Şef lucrări dr. bioing. Lenuţa Klotzer

Munteanu Madalina Grupa 2404

2015-2016 Facultate de Inginerie Chimică și Protecția Mediului

1

Acidul Glutamic

Coordonator:

STUDENT:

Şef lucrări dr. bioing. Lenuţa Klotzer

Munteanu Madalina

2015-2016 Cuprins Capitolul I....................................................................................................................................4 Memoriu tehnic........................................................................................................................4 Capitolul 2. Tehnologia de fabricaţie..........................................................................................5 2.1 Domeniile de utilizare şi proprietaţile produsului............................................................5 2.2 Variante tehnologice.........................................................................................................11 2.3 Alegerea variante optime.................................................................................................14 2

2.4 Descrierea procesului tehnologic adoptat........................................................................16 2.5 Materii prime,materii intermediare şi materii auxiluare..................................................28 2.6 Mecanismul reacţiilor chimice........................................................................................37 2.6.1 Cinetica procesului de fermentatie...........................................................................38 2.6.2 Modele cinetice pentru viteza de crestere a masei celulare......................................41 2.6.3 Modele cinetice pentru viteza de formare a produsului............................................42 2.6.4 Modelul Gaden.........................................................................................................50 2.6.5 Termodinamica proceselor de fermentație................................................................51 Capitolul 3. Controlul fabricaţiei..............................................................................................56 3.1 Controlul, reglarea şi automatizarea procesului tehnologic.............................................56 3.1.1 Reglarea automată a temperaturii.............................................................................57 3.1.2 Reglarea automată a pH-ului....................................................................................60 3.1.3Reglarea automată a concentraţiei.............................................................................64 3.1.4 Reglarea concentraţiei oxigenului............................................................................66 3.1.5 Reglarea nivelului spumei........................................................................................73 3.2 Controlul de calitate.........................................................................................................77 3.2.1 Metode de analiza a materiilor prime si a materialelor intermediare.......................77

Capitolul I Memoriu tehnic Aminoacizii sunt combinaţii organice care conţin în moleculă una sau mai multe grupări amino şi carboxilice. Aminoacizii sunt folosiţi de către organism pentru obţinerea proteinelor.

3

Acidul glutamic (abreviat Glu sau E) este un alfa monoaminoacid dicarboxilic alifatic, neesenţial (deoarece poate fi sintetizat şi de către organism). Este codificat de codonii GAA/GAG din lanţul peptidic. Are un pH de 4,1. L-aminoacizii pot fi obţinuţi, industrial, din hidrolizate proteice (ex. L-cisteină din hidrolizat de păr), dar în urma unor procese laborioase şi poluante; sinteza chimică e o altă cale de producere a aminoacizilor, dar în formă racemică (rezultă ambele forme D,L). În prezent, majoritatea aminoacizilor se produc prin biosinteză cu ajutorul bacteriilor sau al enzimelor, cu avantajul obţinerii selective numai a izomerului asimilabil de către organismul uman: L-aminoacid. Acidul glutamic a fost descoperit şi identificat pentru prima dată în gluten de dr. Karl Ritthausen (Germania, 1866). În 1883 Schultze şi Bosshard i-au descris proprietăţile, după ce l-au separat din sucul de sfeclă. Profesorul Kikunae Ikeda (1864-1936) a întreprins încă din 1907 cercetări privind corelaţia între conţinutul în acid glutamic natural al unor produse alimentare japoneze şi gustul specific al acestora. Reuşeste să identifice prezenţa unui conţinut de peste 1% glutamat în unele tipuri de combu (condiment utilizat în Japonia). Concomitent vizează aspectele practice, înregistrându-şi descoperirea ca patent industrial (14805 din 1907). Ikeda fundamentează trei aspecte: conţinutul natural de acid glutamic din alimente, determinarea unui gust specific (numit de el umami- după cuvântul japonez gustos sau delicios) şi stabilirea compusului glutamic cel mai solubil în apă, respectiv cel mai stabil, anume glutamatul de sodiu. În 1917, la iniţiativa sa, firma Ajinomoto Co. Inc. condusă de Saburosuke Suzuki asimilează şi pune la punct până în 1920 o producţie industrială de glutamat de sodiu de biosinteză obţinut prin fermentarea melasei, separat şi purificat. Până în prezent, această companie încă mai produce o treime din cele 1,5 milioane tone ale producţiei mondiale de MSG (glutamat monosodic). În anii 1920 deţinea însă monopolul absolut al acestui produs, care s-a răspândit în perioada interbelică în toată Asia şi a devenit un ingredient de bază al preparatelor culinare japoneze şi chinezeşti. După cel de-al doilea război mondial MSG este tot mai mult utilizat şi în SUA, ca urmare a răspândirii restaurantelor chinezeşti, afluxului de populaţie asiatică pe coasta de est şi deprinderilor alimentare ale militarilor americani care şi-au efectuat serviciul în Extremul Orient.

4

Începută cu acidul L-glutamic, biosinteza microbiană de Corynebacterium glutamicum a realizat, cu mutanţi ai acestei bacterii, alţi aminoacizi importanţi, ca L-lizină şi L-treonină. În prezent, utilizând tehnica RMN cu 13C, s-a reuşit descifrarea căilor metabolice ale biosintezei bacteriene, cunoscând, astfel, punctele cheie asupra cărora s-ar interveni prin recombinare genetică, supraexprimând genele relevante (inginerie metabolică). Dezvoltarea în ultimii ani a metodelor de secvenţiere completă a genomului bacterian a permis cunoaşterea genomului Corynebacterium glutamicum.

Capitolul 2. Tehnologia de fabricaţie 2.1 Domeniile de utilizare şi proprietaţile produsului Acidul glutamic se utilizează în industria alimentară fiind un potenţiator de aromă (glutamatul monosodic MSG, sarea acidului glutamic), obţinut prin biosinteză din materii prime vegetale sau animale. La nivel mondial au avut loc nenumărate discuţii în contradictoriu cu privire la efectele consumului de MSG , adăugat ca aditiv în diverse alimente. S-a afirmat că acest adaos, devenit aproape universal mai ales în conservele de carne şi peşte, sosuri, dressinguri, în unele condimente complexe ( tip Vegeta, Delikat ), are drept scop să atenueze şi să mascheze gustul natural şi adesea mai puţin savuros al unor preparate. Aceeiaşi acuzaţie s-a adus patronilor de restaurante cu profil asiatic care funcţionează pretutindeni în lume, bănuiţi că exagerează în folosirea MSG. Profesorul Ikeda a emis ideea că ansamblul de compuşi glutamici, în cantitate mai mare sau mai mică, imprimă şi conferă un gust specific distinct alimentelor în care se află. Treptat s-a confirmat că acesta este un gust distinct, la fel de relevant precum sunt celelalte patru gusturi de bază, dulce, sărat, amar şi acru, fiind considerat în prezent al cincilea gust de bază. Este totuşi un gust relativ greu de definit, mulţi caracterizându-l prin calificativele bogat, plin, corpolent, consistent, asociat cu aroma de carne, intensiv, într-un cuvânt-delicios (umami). Ikeda a făcut o paralelă între sare, care este produsul specific pentru gustul sărat şi glutamatul de sodiu- produsul specific pentru gustul delicios. În prezent s-a stabilit că doar configuraţia L a acidului glutamic liber determină proprietăţile legate de gust. 5

În urma unor studii aprofundate privind fiziologia şi biochimia intimă a formării gusturilor de bază în cavitatea bucală, continuată prin reflectarea lor la nivel cerebral, s-a confirmat că gustul umami, alături de celelalte gusturi de bază, are proprii receptori specifici. Cercetătorii Nirupa Chaudhari and Stephen Roper de la Universitatea din Miami (1997) şi-au bazat cercetările lor asupra receptorului umami pe un cunoscut receptor proteic din creier: mGluR4- special pentru glutamat, care joacă un rol important ca neuro-transmiţător. Într-adevăr, au reuşit să găsească o proteină foarte asemănătoare pe limbă, cu singura diferenţă că este mult mai puţin senzitivă decât cea din creier. Ei au numit receptorul “taste-mGluR4”. Marea sensibilitate a acestui receptor neural este explicabilă, deoarece concentraţia glutamatului în sistemul nervos este mult mai redusă decât în cavitatea bucală, atunci când consumăm un produs specific mai bogat în glutamaţi. Doi oameni de ştiinţă din SUA, dr. Ch. S. Zuker şi dr. N. J. P. Ryba, au abordat de câţiva ani un studiu mai general, de identificare a receptorilor celulari care permit recunoaşterea gustului la fiinţele umane. Zuker a stabilit că aceşti receptori pot fi deschişi (pot opera) pe baza anumitor coduri sau chei, fiecare corespunzătoare unui anumit gust. Împreună, cei doi au identificat receptorii pentru gusturile dulce şi amar. În continuare, au identificat şi un receptor numit T1 R1+3considerat că este deschis de gustul aminoacizilor. Gustul amar ne permite să recunoaştem eventuale substanţe toxice. Gustul prea acru ne pune în gardă asupra consumului de fructe încă nemature, necoapte. Gustul sărat ne ajută să recunoaştem prezenţa cationilor de Na+, care prezintă o mare importanţă pentru organism.

Gustul dulce este în mod evident asociat cu senzaţia de plăcere şi cu secreţia de endorfine în creier, situaţie care apare şi atunci când consumăm alimente cu gust “delicios”. Ambele clase de substanţe, glucidele solubile şi aminoacizii sunt deosebit de importante pentru metabolism. Bernd Lindemann, un cercetător de la Universitatea Saarland din Germania consideră că gustul umami caracteristic aminoacizilor ne călăuzeşte spre proteine, care nu au un gust propriu. Glutamatul se foloseşte cel mai mult în alimentele fabricate artificial şi în semipreparate gen: supe concentrate, sosuri, condimente, mezeluri, îngheţată, budinci. Rolul lui este de a da impresia creierului că acel aliment este foarte gustos.Acidul glutamic este

6

prezent în alimente ca:peşte,ouă,carne şi este responsabil pentru cele 5 gusturi principale ale omului.În Australia glutamatul este interzis, însă este tolerat în Statele Unite. Majoritatea persoanelor sunt sensibile la glutamat invocând simptome ca greaţă, dureri de cap, ameţeli, palpitaţii, slăbiciune şi oboseală. Toate acestea sunt cunoscute sub denumirea generică de “simptomul mâncării chinezeşti”. Acidul glutamic este un valoros medicament utilizat în tratamentul unor afectiuni ale sistemului nervos central. Acidul glutamic este necesar pentru dezvoltarea lactobacililor, amestecul acestui acid şi 'asparagin' înlocuiesc amida nicotinei în dezvoltarea Bacteriei dysenteriae şi celelalte organisme. Acidul glutamic are 10 celule diferenţiale, acestea activează metoda de 'învaţare' pentru şobolani, face parte din reacţiile de transaminare. Este benefică în tratamentul 'petit mal' şi atacuri nervoase. Sarea din acidul glutamic este unică, aroma din carne este perceptibilă în 3000 părţi higroscopice. În concluzie acidul glutamic este folosit în industria alimentară şi farmaceutică sub formă de săruri de sodiu, pentru aromatizarea supelor concentrate, stimularea secreţiei gastrice, ameliorarea activităţii sistemului nervos central şi a ficatului cirotic.

Proprietăţi fizice

Denumire chimică : - IUPAC: -acid 2-aminopentadioic ; - acid α-aminoglutaric; Denumire commercială: : acid glutamic; Formula moleculară: C5H9NO4 ; Masa molară:M= 147.13 g mol−1 ; Densitatea:ρ= 1.4601 (20 ºC); Punctul de topire: 225-227°C; Constante de disociere : pKa : 2,16

7

Acidul glutamic,ca toţi aminoacizii,este o substanţă amfoteră care dizolvată în apă poate forma anioni sau cationi alături de ioni H + sau OH- eliberaţi simultan.Grupările aminice şi carboxilice,formează ioni bipolari prin neutralizare internă,iar punctul izoelectric este la pH 3,2. Conform datelor din literatură, principalele proprietăţi ale acidului glutamic sunt:

- rotaţia specifică în apă :

[ α ]tD = 11.5;

- solubilitatea în apă( g/100ml apă): 0.864.

Solubilitatea acidului glutamic creşte odată cu deplasarea pH-ului în mediu acid sau bazic;în mediu acid este solubil în apă sub formă de clorhidrat,iar în mediu bazic este solubil sub formă de sare. Solubilitatea în alcool etilic:insolubil în alcool etilic absolut şi în eter. În stare pură acidul glutamic,se prezintă sub formă de pulbere albă, cristalină, cu gust acru şi fără miros,având următoarea structură chimică:

HO-CO-CH2-CH2-CH-COOH NH2

Proprietăţi chimice

Proprietăţile chimice ale acidului glutamic:

8

Glutamina+H2O→ Glu + NH3 NAcGlu + H2O→ Glu + Acetat Acid α-cetoglutaric + NADPH + NH4+→ Glu + NADP+ + H2O Acid α-cetoglutaric + α-amino acid→ Glu + α-oxo-acid Acid N-formimino-L-glutamic + FH4→ Glu + 5-formimino-FH4

unde:

NAcGlu – acid N-acetil glutamic (C7N11NO5); Acetat – sarea acidului acetic ([CH3COO]−); Acid α-cetoglutaric – COOH-C-CH2-CH2-COOH; Acid N-formimino-L-glutamic – (C6H10N2O4); FH4 – acidul folic (C19H19N7O6);

Proprietăţi biologice

Acidul glutamic (glutamat) este un aminoacid folosit de organism pentru a construi proteine. Glutamatul este cel mai frecvent excitator (neurotransmiţător) în sistemul nervos central. Are rol în metabolismul celular.

9

Creierul foloseşte drept combustibil glucoza. Hipoglicemia (scăderea cantităţii de glucoză din sânge) duce la utilizarea aminoacizilor ca substraturi energetice alternative. Exită peste o sută de aminoacizi cerebrali, dintre care doar trei: glutamatul, acidul γ-aminobutiric (GABA) şi glicina întrunesc criteriile necesare pentru a fi consideraţi neurotransmiţători. Glutamatul este principalul neurotransmiţător excitator, prevalent la mamifere, în timp ce GABA şi glicina sunt neurotransmiţătorii inhibitori. Acidul glutamic are capacitatea de a colecta excesul de amoniac din organism, care poate inhiba activitatea cerebrală, convertindu-l în glutamină. Dat fiind faptul că glutamina produce o sporire considerabilă a nivelului de acid glutamic, un deficit al acesteia poate determina carenţa celui de-al dolilea. Acidul glutamic este un transmiţător excitator major de la nivelul creierului. Aproape toate celulele cerebrale au receptori care îi răspund. Ca neurotransmiţător, glutamatul este sintetizat în mitocondria neuronului presinaptic cu ajutorul glutaminazei mitocondriale din glutamină. După sinteză, este stocat în vezicule sinaptice, pentru a fi eliberat în sinapsă în timpul neurotransmisiei. Acţiunea sinaptică a glutamatului este oprită prin recaptare, cu ajutorul pompelor transportoare de glutamat, care se găsesc atât presinaptic pe neuron, cât şi pe glia vecină. În glie, glutamatul este convertit în glutamină şi la nevoie, neuronul va prelua glutamina de aici şi o va reconverti în glutamat.

2.2Variante tehnologice

Obţinut în anul 1866 de către Ritthansen prin hidroliza glutenului, iar în 1890 Wolff realizează sinteza acidului d,l-glutamic din acid levulinic. Mai târziu(1908), Ikeda obţine acid l-glutamic prin hidroliza la cald a unor alge(laminaria) şi constată că acestui acid i se datorează gustul plăcut al algei. Această observaţie a constitiut punctul de plecare al cercetărilor privind dezvoltarea producţiei de acid l-glutamic în Japonia,principala producătoare a acestui acid. 10

Pentru obţinerea acidului l-glutamic se folosesc trei grupe de metode : a)extracţia din surse naturale ; b)sinteze chimice ; c)biosinteza. a)Extracţia din surse naturale foloseşte leşiile de la fabricile de zahar, deşeurile de la fabricile de amidon din grâu sau porumb şi deşeurile de origine animală ( caseina ), care se supun hidrolizei în vederea eliberării acidului glutamic şi apoi separarea lui. Hidroliza acidă a proteinelor( caseina, gluten) se realizează prin fierbere îndelungată cu acid sulfuric( H2SO4) sau clorhidric (HCl) urmată de neutralizare cu hidroxid de calciu Ca(OH)2 pentru îndepartarea acidului sulfuric sub formă de sulfat, iar după filtrarea sulfatului se îndepartează ionii de calciu cu acid oxalic. Soluţia apoasă se concentrează la vid, iar după răcire cristalizează acidul l-glutamic care se purifică prin recristalizari repetate. Un alt procedeu de fabricare care foloseşte ca materie primă deşeurile de la fabricile de zahăr prin hidroliza alcalină duce la obţinerea acestui aminoacid. Prin acest procedeu se fabrică în Franţa, anual, peste 3000 tone acid glutamic. b)Urmatoarea metodă este cea de obţinere prin sinteză a acidului l-glutamic (aminarea acidului α-clor-glutaric,adiţia esterului acetamidomalonic la acroleină,utilizarea acrilonitrilului.Prin sinteză,plecand de la acrilonitril,s-au obţinut,în anul 1963,4800 t/an,iar 1970 12 000 t/an acid l-glutamic. Schema de principiu a acestui procedeu este: Acrilonitril CH2=CH-CH

Aer+CH4+NH3

Sinteza oxo

Combustie parţială

Β-cian-OCH-CH2-CH2-CNCNNH4 Cianura de amoniu propional aldehida α-aminoglu-tarodinitril

CN-CH2-CH2-CH-CN NH2 d,l-glutamat

11

Hidroliza alcalina NH3

Acid d,l glutamic cristalizat

În metodele de sinteză rezultă totdeuna un racemic,iar separarea izomerilor ridică multe probleme tehnologice care au ca efect scumpirea produsului sintetizat. c)Procedeul de biosinteză foloseşte ca surse de carbon:glucoza,zahăr,amidon,hidrolizate de amidon,surse de azot( uree sau săruri de amoniu) şi microelemente.Pe aceste medii se cultivă microorganismul Micrococcus glutamicus, principalul producător al acidului l-glutamic. Deasemenea s-au studiat şi alte surse de carbon: acidul acetic, esteri organici şi hidrocarburi alifatice, la care se adaugă surse de azot şi săruri minerale,obţinându-se medii de cultură pe care se cultivă M. glutamicus. Cele mai bune rezultate s-au obţinut la utilizarea nparafinelor cu 12-17 atomi de carbon. S-a plecat de la acidul α-ceto-glutaric, intermediar în ciclul Krebs, produs prin conversia zaharului şi s-a supus procesului de transaminare. Enzima care catalizează aceastăreacţie este mult răspândită în ţesuturile animale, vegetale şi microorganisme [Corneliu Oniscu,1978]. Fermentaţia este procesul de creştere a microorganismelor pe medii de cultură,cu scopul de a biosintetiza diverşi produşi . Adoptarea unui anumit procedeu de fermentaţie este condiţionată de asigurarea celor mai bune condiţii de dezvoltare a microorganismelor,fără a fi neglijate caracteristicile tipurilor de microorganisme cultivate (aerobe sau anaerobe,cultivabile în sistem septic sau aseptic). Procedeele de fermentaţie pot fi clasificate în funcţie de: 1. modul de realizare a culturilor microbiene: -culturi în suprafaţă -culturi în profunzime 2. necesarul de oxigen: -sisteme de fermentaţie aerobe -sisteme de fermentaţie anaerobe 3. modul de funcţionare a instalaţiei de fermantaţie:

12

-fermentaţii discontinue -fermentaţii continue. 1) Procedeul culturii în suprafaţă a fost folosit la începutul fabricării pe scară industrială a producţiei de antibiotice.El s-a realizat prin cultivarea microorganismelor la suprafaţa unui mediu nutritiv lichid cu grosimea stratului de 1-2 cm într-un mare număr de aparate cu mărimi şi forme diferite.Procedeul are productivitate mică,motiv pentru care cultura în suprafaţă a fost abandonată în practica industrială[Corneliu Oniscu,1978].Fermentaţiile în suprafaţă se practică mai rar şi,de obicei,pentru microorganisme anaerobe[Corneliu Oniscu şi Dan Caşcaval,2002]. Procedeul culturii în profunzime constă în cultivarea microorganismelor în fermentatoare din oţel V2A,în care mediul supus unei aeratii şi agitări continue.În aceste condiţii,procedeul culturii în profunzime oferă o serie de avantaje, faţă de cultura în suprafaţă,printre care : randament mai mare,produs omogen,economie de spaţiu,economie de muncă[Corneliu Oniscu,1978].Fermentaţia în profunzime se utilizează în majoritatea proceselor de creştere a ,microorganismelor.Industrial,acest tip de fermentaţie poate fi realizat prin procedee de fermentaţie discontinuă şi procedee de fermentaţie continuă[Corneliu Oniscu și Dan Cașcaval,2002]. 2) Fermentaţia discontinuă, este întalnită în literatura de specialitate şi sub denumirea de “ sistem de cultivare batch”,se caracterizează prin aceea că microorganismele parcurg întrun singur bioreactor toate etapele de dezvoltare ,după care procesul se reia de la capăt.Acest mod de operare conduce la consumuri sporite de utilităţi,deoarece de fiecare dată este necesară stabilirea întregii înstalaţii. Fermentaţia continuă oferă o serie de avantaje comparative cu procedeul discontinuu:    

utilizarea bioreactoarelor de capacitate mai redusă realizarea mai eficientă a proceselor de transfer de masă,căldură,impuls productivitate sporită epuizare mai avansată a componentelor mediului de cultură.

Procesul de fermentaţie continuă poate fi realizat într-un bioreactor sau într-o baterie de bioreactoare,cu un debit constant(viteza de diluţie constantă) ,caz în care acest sistem mai este

13

întalnit în literatura sub denumirea”cultivare continuă tip turbidistat sau chemostat” în funcţie de stadiul de dezvoltare al microorganismului[Corneliu Oniscu și Dan Cașcaval,2002l].

2.3 Alegerea variante optime Se alege procedeul discontinuu de fermentaţie în profunzime deoarece prezintă următoarele avantaje: -costuri reduse; -flexibilitate ridicată; -un pericol de contaminare al culturii redus; -volumul bioreactorului relativ mare oferă posibilitatea obţinerii unor randamente ridicate; -puritatea produsului finit cât şi activitatea biologică ridicată. Comparativ cu celelalte procedee cel mai economic procedeu de obţinere a acidului lglutamic este procedeul de biosinteză care permite obţinerea produsului la un preţ de cost mult mai mic fiind deosebit de rentabil. Producţia acidului l-glutamic prin procedeul de biosinteză a crescut mereu, ajungând în anul 1966 să reprezinte 84% din producţia totală,iar în anul 1970 peste 88 %.Odată cu creşterea acestei producţii au scăzut costurile acidului l-glutamic cu peste 60 % faţă de anul 1952 considerat ca bază. Dintre cele două procedee care au fost propuse plecând de la mecanismuldebiosinteză ,fermentaţia directă este aplicată la scară industrială,iar mediul de cultură utilizat trebuie să conţină surse de carbon,surse de azot,săruri minerale,factori de creştere.Randamentele obţinute în procesele de fermentaţie directă variază între 24 si 54% faţă de conţinutul de zahăr,iar concenraţia finală a acidului l-glutamic în biomasă este cuprinsă între 5 şi 80 g/l ,funcţie de compoziţia mediului de cultură utilizat şi parametrii procesului de biosinteză. Deasemenea sursele de azot necesare în procesul de fermentaţie(etapă de obţinere a acidului glutamic) sunt asigurate prin adăugarea de uree şi sulfat de amoniu.Utilizarea numai a sulfatului de amoniu are un efect nefavorabil şi se manifestă prin productivitate mică în acid.Folosirea sulfatului de amoniu sau a amoniacului ca agent de corectare a pH-ului la 14

valoarea 7,6-8,5 ,pH optim pentru fermentaţia acidului l-glutamic ,conduce la randamente mai mici.Folosind ureea ca sursa de azot şi ca agent de corectare a pH-ului se obţin randamente mari în acid l-glutamic. Creşterea se explică prin faptul că ureea este descompusă uşor, în prezenţa bacteriilor , în CO2 şi NH3 care sunt utilizate apoi în formarea moleculei de acid lglutamic. Celelalte două metode nu sunt economice deoarece prima metodă(extracţia din surse naturale ) prezintă un randament scăzut(se consumă 12 t de gluten din grâu sau 18 t gluten din soia pentru 1 t acid) utilizează intalaţii mari care fac acest procedeu scump şi puţin utilizat,cea de-a doua metodă pare a fi cea mai economică întrucăt foloseşte ca materie primă acrilonitrilul. Pe plan mondial se produc, prin cele trei metode,peste 100 000 t/an acid l-glutamic ,din care 65 800 t/an se produc în Japonia[Corneliu Oniscu,1978].

15

2.4 Descrierea procesului tehnologic adoptat Schema tehnologică de obţinere a acidului glutamic

16

Glucoză Extract deporumb

Uree

Fosfaţi

Sulfaţi Apă

Mediu de cultură

Sterilizarea mediului de cultură

Aer

Inocul Micrococcus glutamicus Inocularea mediului de cultură H2SO4

Sterilizare aer

Fermentaţia

Aer steril

Filtrare biomasă

Concentrare

Substanţă tensioactivă

Apă NaOH

Cristalizare

Cărbune activ

Biomasă celulară

Apă

HCl

Centrifugare primară

Soluţie impură

Dizolvare

Cărbune activ

Filtrare

Reziduu

Cristalizare avansată Apă

Spălare Uscare Ambalare

17

Acid glutamic, pulbere pură

Apă evaporată

*Pregătirea mediului de cultură şi selecţionarea microorganismelor Mediile de cultură sunt formate din soluţii apoase care conţin componentele necesare creşterii microorganismelor şi elaborării produselor dorite pentru metabolismul celulei, si anume: -surse de carbon; -azot; -substanţe minerale; -factori de creştere; -la o concentraţie a substanţelor dizolvate corespunzatoare presiunii osmotice celulare; -cu valori de pH optime creşterii şi multiplicării microorganismelor de cultivat. Mediu de cultură standardizat, special pentru sinteza acidului glutamic, format din : -glucoză 10-12%; -extract de porumb 0,3% ca substanţă uscată; -uree 2-3%; -fosfat mono- şi bipotasic câte 0,1 respectiv 0,15%; -sulfat de Mg 0,05%; -apă 84,5-87,55%. Mediile se folosesc pentru izolarea, multiplicarea şi conservarea microorganismelor sau pentru obţinerea prin cultivare a produselor de biosinteză microbiană. Mediile pot fi procurate de la firme producătoare sau pot fi preparate în laborator. Cultura microorganismelor este utilizată pentru a creşte numărul de celule care se doreşte a fi studiate. Microorganismele sunt adăugate în mediul de cultură care conţine nutrienţi pentru creştere. Cultura este incubată una sau mai multe zile, la temperatura optimă a fiecărui organism. În multe cazuri microorganismele sunt crescute pe plăci cu agar. Microorganismele

18

se multiplică formând colonii. O colonie creşte în locul în care o singură celulă a fost inoculată. O colonie este ca o clonă. Ea poate fi pură dacă nu există în jurul ei alte tipuri de microorganisme în colonii care o pot contamina. În funcţie de natura şi sursa componentelor care intră în alcătuirea lor ,mediile de cultură sunt:sintetice,semisintetice si naturale. Mediile de cultură selective sunt medii definite sau complexe, cu o compoziţie chimică bine definită, care permit dezvoltarea unui număr restrâns de microorganisme sau chiar a unei specii. Aceste medii conţin pe lângă substanţe nutritive şi inhibitori ai altor microorganisme însoţitoare din microbiota din care se face izolarea culturii care se doreşte a fi selecţionată. În prezent, în locul glucozei tehnice se foloseşte melasa ca sursă de carbon sau un amestec deglucoză şi zaharoză, care dau rezultate mai bune decât glucoza pură. Aceasta se datorează prezenţei în melasă a acizilor organici. Pentru sinteza acidului L-glutamic se vor utiliza bacterii aparţinând genului Brevibacterium lactofermentum. *Sterilizarea mediului de cultură Procesele de creştere a biomasei microbiene impun, în marea lor majoritate, absenţa totală a sporilor de microorganisme străine, provenite din apă, aer sau materii prime, care s-ar putea dezvolta în faza de fermentaţie, infectând cultura unică a microorganismului util. Această cerinţă tehnologică se poate realiza prin sterilizare şi, mai rar, prin pasteurizare. Sterilizarea este,procesul prin care are loc distrugerea sau îndepărtarea microorganismelor patogene sau apatogene (atât a formelor vegetative, cât şi a sporilor) din substanţe, preparate, spaţii închise, obiecte[Corneliu Oniscu și Dan Cașcaval2002].. Sterilizarea termică prezintă o serie de inconveniente generate în special, de reacţiile secundare de degradare care au loc în timpul procesului de sterilizare: - denaturarea proteinelor şi inactivarea lor; - denaturarea vitaminelor şi a unor factori de creştere;

19

- supraîncălziri care iniţiază reacţii de oxidare a fenolilor şi a acidului ascorbic, de polimerizare a aldehidelor nesaturate, de caramelizare a hidraţilor de carbon şi brunificare a mediului. De asemenea, în timpul sterilizării termice, se produc reacţii de condensare a grupărilor aldehidice, din zaharuri reducătoare, cu grupările aminice libere, din aminoacizi sau proteine, cu formare de produşi asemănători bazelor Schiff (reacţia Maillard), produşi toxici pentru majoritatea microorganismelor. Pentru a fi evitată apariţia acestor compuşi, este recomandată sterilizarea separată a hidraţilor de carbon şi a compuşilor cu azot. *Sterilizarea la 120ºC Sterilizarea directă în fermentator ,prin procedeu discontinuu la 120°C, necesită un timp mai mare,iar degradarea mediului este mai avansată. Pentru sterilizarea unor cantităţi mari de medii de cultură se recomandă utilizarea proceselor continue de sterilizare care prezintă o serie de avantaje,printre care: -conservarea mai bună a proprietăţilor nutritive ale mediului,ca rezultat al expunerii limitate la temperaturi ridicate; -controlul superior al calităţii; -utilizarea mai raţională şi nivelarea consumului de abur; -productivitate şi eficacitate sporită; -control automat. Realizarea în condiţii optime a procesului de sterilizare prin procedeu continuu impune un control riguros al spumării mediului şi o vascozitate mică a acestuia. Pentru sterilizarea continuă a mediilor de cultură se folosec instalaţii industriale care lucrează la 120°C instalaţii care lucrează la temperaturi mai mari ( 140°C ),dar care permit o răcire rapidă mediului supraincălzit.

20

Fig.2.4.2 Instalația de sterilizare la 120ºC 1-coloană de sterilizare; 2-menținător; 3-răcitor țeavă în teavă

Instalaţia pentru sterilizarea continuă a mediului de cultură la 120°C ,este compusă din trei parţi distincte: coloana de sterilizare,mentinator si racitor. Coloana de sterilizare 1 este formată din două ţevi concentrice: prin ţeava interioară circulă aburul de 5 ata,iar prin spaţiul inelar circulămediul supus sterilizării.În coloana de sterilizare are loc încălzirea mediului până la 120°C,după care acesta este trecut prin menţinătorul 2 şi răcitorul ţeavă în ţeavă 3,pentru desăvârşirea procesului de sterilizare şi răcire până la 35-40°C. Din diagrama timp-temperatură pentru sterilizarea continuă la 120°C rezultă că încălzirea mediului cu abur direct de 5 ata în coloana de sterilizare se face în 4-5 s,iar timpul de menţinere (de 15-20 min) permite o distrugere a tuturor microorgamismelor patogene capabile de multiplicare în condiţiile din fermentator.În acest procedeu ,contribuţia perioadei de încălzire şi răcire fiind mai mică (5-6 %) decât în sterilizarea discontinuă ,se poate considera că procesul de sterilizare are loc numai în menţinător.

21

Fig.2.4.3 Diagrama timp-timp temperatură pentru sterilizarea continuă la 120°C

*Sterilizarea aerului Sterilizarea aerului tehnologic necesar în fermentația aerobă constitue una din problemele de importanță majoră în industria biochimică,de rezolvarea căreia depinde buna desfășurare a procesului de biosinteza.Dificultățile de sterilizare a aerului sunt generate de varietatea mare de microorganisme conținute (bacterii,spori bacterieni,fungi,viruși), de rezistența lor la temperaturi uscateși de limitele largi ale dimensiunilor acestora. Pentru sterilizarea aerului au fost propuse urmatoarele metode: -sterilizarea termica -sterilizarea cu raze ionizate sau ultra-violete -sterilizare cu agenți chimici -sterilizare prin filtare. La sterilizarea aerului prin utilizarea procesului termic se cer temperaturi ridicate deoarece microorganismele au rezistență mare la temperaturi uscate.Astfel ,dupa Decker,sporii din aer sunt distruși în 24 s la 218-220°C.Această temperatură poate fi obținută fie prin încălzirea aerului într- un schimbător de caldură,fie prin comprimarea aerului în compresor adiabatic.

22

Sterilizarea aerului prin metoda filtrării se realizează pe filtre mecanice prevăzute cu un strat de material fibros.La început s-au folosit fibre din bumbc,dar,odată cu dezvoltarea producției industriale de antibiotice,fibrele de bumbac au fost înlocuite cu fibre de sticlă.

Fig.2.4.4 Filtru cu fibre de sticlă pentru sterilizarea aerlui Pentru sterilizarea aerului prin filtrare, în principiu, există trei tipuri de filtre cu aplicabilitate practică. Filtrul cu fibre de sticlă este alcătuit dintr-un strat de material filtrant fixat între două site, susţinute de două plăci perforate (diametrul perforaţiilor este de 0,7 – 0,8 cm). Filtrul este prevazut cu manta de încalzire, care permite uscarea materilului filtrant sterilizat cu abur direct. Acest tip de filtru, indicat pentru industria de biosinteză, oferă posibilitatea sterilizarii unor debite ridicate de aer, realizarea unui grad avansat de purificare şi durata îndelungată de funcţionare. Dezavantajele filtrului cu fibre sunt ;operaţii complicate la schimbarea fibrelor de sticlă (durata 2,5 – 3 ore), manipularea neplacută a fibrelor de sticlă şi anularea efectului de sterilizare după umezirea materialului filtrant fibros.

23

Studiind procesul de purificare a aerului de microorganisme,prin filtrare pe fibre de sticlă,Gaden și Humphrey au stabilit eficacitatea separării sporilor de Bacillus subtilisfuncție de viteza aerului,iar Aiba a măsurat distribuția microorganismului Serroria marcescens. Cea mai largă utilizare în industria de sinteză microbiologică o are procedeul de strerilizare a aerulului bazat pe principiul combinat cu efectul termic. După acest procedeu,aerul tehnologic,supus procesului de sterilizare,trece prin filtru cu saci pentru separarea particulelor solide,apoi este încălzit,în schimbator de căldură sau în compressor,la 150º-160ºC.Aerul încălzit este trecut în continuare printr-un răcitor de aer,separator de picături,filtrul principal cu material fibros (prima treapta de filtrare),filtrul individual cu material fibros (treapta a doua de purificare),după care pătrunde în fermentator. Schema de principiu a liniei de purificare si sterilizare a aerului tehnologic este redată în figura 2.4.5

Fig.2.4.5Schema de purificare şi sterilizare a aerului 1-filtru; 2-compresor;3-răcitor;4-separator picături;5-filtru principal;6-filtru individual;7fermentator.

Conform acestei scheme, aerul, separat de impurităţi în filtrul (1), trece prin compresorul (2), unde este comprimat adiabatic la 3 - 3,5 at, temperatura crescând la 150 160°C. După răcire în (3), aerul este introdus în separatorul de picături (4), filtrul principal cu

24

material fibros (5) (prima treaptă de sterilizare), filtrul individual cu material fibros (a doua treaptă de sterilizare), după care pătrunde în fermentator. Răcirea aerului în răcitorul (3) se face până la apariţia condensului, iar, după separarea lui, aerul saturat se preîncălzeşte cu aer fierbinte până când temperatura de ieşire din filtrul individual (6) depăşeşte cu cel puţin 12°C temperatura punctului de rouă. Stabilirea parametrilor de funcţionare ai instalaţiei de sterilizare se face numai în funcţie de parametrii termodinamici ai aerului. Pentru explicarea mecanismului de sterilizare a aerului prin filtrare pe material fibros și stabilirea ecuațiilor de proiectare a filtrelor,este necesar să se cunoască modelul de curgere a aerului în jurul unei fibre cilindrice și modul de separerea particulelor solide.

Fig.2.4.6 Modelul de curgere a aerului prin filtru cu matrial fibros Modelul curgerii aerului prin filtru cu material fibros se analizează în următoarele ipoteze:1) fibra individuală este perpendiculară pe direcția de curgere;2) curgerea aerului este laminară;3) particulele ce se separă au formă sferică[Corneliu Oniscu,1978]. După sterilizare mediul de cultură este supus răcirii în vederea inoculării cu bacteriile producătoare de acid glutamic. Răcirea mediului se face până la temperatura de 29-31 0C, temperatura optimă la care are loc şi însămânţarea. Procesul de inoculare are loc în inoculator, durata acestui proces fiind de 10-15h. Mediul de cultură se inoculează într-un raport de 5-10% inocul faţă de cantitatea mediului.

25

În cursul desfăşurării procesului, temperatura se menţine la 30 0C, cu o bună aerare, iar pH-ul se menţine între 6,0-7,5 cu NH4OH.

* Fermentaţia Bioreactorul pentru producerea acidului glutamic este de tipul, acelaşi cu inoculatorul. Fermentaţia are loc în două etape: în prima etapă are loc multiplicarea microorganismului şi durează între 18 şi 24 ore, în inoculator; iar în cea dea doua etapă are loc acumularea acidului L-glutamic şi are loc în intermediar. Durata fazei finale este de 12-16 ore, procesul fiind încheiat în 30-40 ore. În ambele faze fermentaţia se consideră terminată atunci când conţinutul de zahăr este consumat până la aproximativ 0,8-0,9% din valoarea iniţială. pH-ul se menţine constant la valoarea de 7,5-8,5, iar temperatura trebuie să fie de 29-310C. Aeraţia bună reprezintă un factor foarte important în desfăşurarea procesului cu randament de transformare ridicat. Debitul de aer steril administrat este de aproximativ 1 litru aer/litru mediu de cultură/minut, sub o intensă agitare. Procesele industriale de fermentaţie sunt, aproape în totalitate, procese aerobe şi, în marea lor majoritate, aseptice. Necesarul orar de aer steril variază între 60 şi 120 m 3 aer/m3 mediu de cultură. În sterilizarea acestor debite mari de aer apar dificultăţi generate, pe de o parte, de varietatea microorganismelor prezente (viruşi, bacterii, spori bacterieni, fungi), iar pe de altă parte, de rezistenţa lor la temperaturi uscate. *Filtrarea biomasei În procesul de biosinteză ,procesul de sterilizare a masei celulare este legat ,în majoritatea cazurilor ,de dificultăţi tehnologice considerabile,datorită naturii miceliului care poate fi fibros ,mucilaginos sau sub formă de pastă.Alegerea utilajului pentru filtare este determinată de următorii factori :caracterul suspensiei,productivitate,rezultatele cerute şi materialul de construcţie.

26

Fig 2.4.7 Filtru rotativ cu strat adjucvant 1-tambur; 2-capul distribuitorului; 3-cuţit micrometric; 4-buncăr; 5-cuvă suspensie; 6-duză de spălare; 7-strat depus; 8-strat filtrant; I-zona filtrării; II-IV-zone de uscare; III-zonă de spălare;V-zonă de îndepartare a stratului depus. Amestecul obţinut în urma fermentării trebuie filtrat pentru recuperarea produsului important- acidul glutamic şi îndepărtarea biomasei. *Concentrarea soluţiei Lichidul filtrat ajunge în evaporator, unde se concentrează, în vedereaeliminării apei, sub vid. Temperatura la care are loc procesul este de 50-550C, iar pH-ul se menţine la valoarea de 6,5. Procesul este terminat când se atinge o densitate a mediului de cultură de 1,20 g/cm 3, în urma acestuia rezultă o soluţie concentrată de acid glutamic. Apa evaporată este preluată de un condensator şi răcită. *Cristalizarea soluţiei Soluţia concentrată ajunge în cristalizator, unde se acidulează cu HCl, până la punctul izoelectric al acidului glutamic şi se adaugă o substanţă tensioactivă care favorizează cristalizarea. Apoi soluţia se răceşte lent la 10-120C. *Filtrarea cristalelor de acid Masa cristalină obţinută se filtrează pe centrifugă şi se îndepărtează soluţia impură. În urma cristalizării şi filtrării acidul glutamic, sub formă de cristale, nu are puritatea necesară utilizării în scop farmaceutic sau alimentar. De aceea cristalele obţinute sunt supuse unor noi metode de purificare. 27

*Dizolvarea cristalelor şi refiltrarea acestora Cristalele obţinute se dizolvă în apă, se adaugă o soluţie de NaOH până la pH de 6,5 şi cărbune activ. Soluţia se încălzeşte ulerior la 70 0C. Masa cristalină purificată se filtrează pe filtru de presă. Soluţia purificată rezultată se trimite în cristalizator. *Recristalizarea, filtarea şi spălarea noilor cristale de acid Soluţia purificată este acidulată până la pH de 3,2 (punctul izoelectric al acidul glutamic) şi se răceşte la 10-120C timp de 24 h. Cristalele de acid L-glutamic pur se separă prin centrifugare şi se spală cu apă rece, pentru îndepărtarea totală a ionilor de Cl-. *Uscarea şi ambalarea Cristalele pure de acid gluamic, fiind ude, trebuiesc uscate foarte bine, apa trebuia îndepărtată în totalitate. Uscarea se poate face în uscător dulap sau uscător în pat fluidizat. Temperatura aerului la intrarea în uscător este cuprinsă între 100 şi1050C [Corneliu Oniscu , 1978]. 2.5 Materii prime,materii intermediare şi materii auxiluare Materiile prime care sunt introduse în procesul tehnologic sunt:

Glucoza este o sursa excelentă de carbon şi energie ,foarte mult utilizată pentru stimularea creşterii microbiene,uneori constituind chiar precursorul în biosinteză (obţinerea glicozidelor ,a macrolidelor şi glicoproteinelor) [ Dan Caşcaval şi Corneliu Oniscu,2002]. Aspect : este o substanţă solidă, cristalizată, incoloră şi solubilă în apă. Are un gust dulce. Punctul său de topire este foarte ridicat, deoarece între numeroasele sale grupărihidroxil se formează multe legături de hidrogen. Când sunt încălzite, toate monozaharidele (nu numai glucoza) se descompun înainte de a se topi, în carbon şi apă, reacţie numită carbonizare. Glucoza are 75% din puterea de îndulcire a fructozei (care este luată ca unitate) [https://ro.wikipedia.org/wiki/Glucoz%C4%83].

28

Extract de porumb Se obţine din apele de înmuiere a cerealelor (mai ales porumb) din procesul de obţinere a amidonului industrial şi a fungilor de porumb, prin concentrare la cald, filtrare şi sterilizare cu bioxid de sulf. Este o sursă foarte echilibrată de C,N,S, săruri minerale. Utilizarea sa a produs o spectaculoasă mărire de randament în biosinteza penicilinei (1943) şi s-a impus apoi în întreaga industrie de biosinteză, ca ingredient principal al mediilor de cultură. Este un lichid vâscos, brun, cu un conţinut de circa 4% azot aminic, corespunde unei cantităţi de 40-42% proteine, formată din 25% alanină, arginină şi acid glutamic, fiecare cu câte 8%, leucină 6%, fenil-alanina 2%, prolina 5%, izoleucina, valina si treonina cate 3,5% metionina si cistina cate 1%. Mai conţine 15-30% acid lactic, 3% fosfor, 1% calciu şi 15% potasiu, vitaminele B 2, B6, biotina, gume polizaharidice. Prezintă aspect lichid cremos de culoare galben închis.Mirosul este caracteristic unei fermentaţii lactice. Sedimentarea are loc după 24 ore într-un cilindru de 100 ml de 100 %.În frotiu colorat prezintă o masă bacteriană tipică bacililor lactici,în proporţie de peste 90 %.Substanţa uscată este de minim 50 %.Extractul de porumb prezintă un pH de 3,54.Conţinutul în acid lactic este de minim 20 g la 100g substanţă uscată.Cantitatea de zahăr conţinută este de maxim 2,5 %.

Uree Ureea este acel compusul organic cu formula moleculară CO(NH2)2. De fap ureea este, diamida acidului carbonic, deci o amidă. Se numeşte aşa deoarece se obţine din acidul carbonic (sifon), printr-o dublă reacţie a acidului cu amoniacul. Aspect:este o substanţă solidă, cristalizată, solubilă în H2O. Chimic vorbind, ea se comportă ca amidele.Ureea prezintă culoare albă având :umiditate maximă: 0,2 % şi masa moleculară relativă: 60,05. Se foloseşte, de obicei, ca îngrăşământ agricol, datorită conţinutului ridicat de N, în industria medicamentelor şi la obţinerea de produşi macromoleculari de policondensare cu aldehida formic [https://ro.wikipedia.org/wiki/Uree].

29

Micrococcus glutamicus-face parte din categoria bacteriilor. Bacteriile sunt organisme unicelulare cu o structură complexă care au un metobolism propriu datorită unui aparat enzimatic complex ce le asigură desfăşurarea proceselor vitale. Structura celulei bacteriene Celula bacteriană este o entitate morfologică şi funcţională echivalentă cu celulele organismelor superioare, cu o structură complexă formată din urmatoarele componente, de la exterior catre interior, luând ca reper peretele celular: Structura extraparietală formată din: capsula; cilii sau flagelii; aparatul fimbrial şi pilii de sex. Peretele celular. Structura intraparietală compusă din: membrana citoplasmatică, mezozomii, citoplasma, aparatul nuclear, incluziunile, ribozomii, vacuolele, sporul bacterian. Capsula este o secreţie care apare la unele bacterii, ce se fixează la exteriorul celulei şi constituie un înveliş în jurul acesteia. În funcţie de raportul faţă de celula bacteriană capsula este de mai multe feluri: -microcapsula, cu grosimea fină de 0,2 mm, ce se pune în evidenţă prin metode imunologice; -capsula propriu-zisă, cu grosimea cuprinsă intre 0,2-2 mm; -stratul mucos caracterizat prin prezenţa unei mase amorfe neorganizate în jurul celulei; -zooglea ce se prezintă ca un strat mucos neorganizat care înglobează mai multe celule microbiene. Compoziţia chimică a capsulei diferă în funcţie de specia bacteriană la care apare şi de condiţiile de mediu, fiind formată din 98 % apă, alţi constituienţi ca polizaharidele şi polipeptide. Funcţiile biologice ale capsulei sunt urmatoarele: - funcţia de protecţie împotriva fagocitelor la bacteriile patogene;

30

- funcţia de virulenţă; - funcţia de protecţie împotriva desicaţiei. Cilii sau flagelii Cilii sau flagelii sunt formaţiuni filamentoase, cilindrice, lungi, subţiri, situate la suprafaţa celulei bacteriene şi reprezintă organite de mişcare ale acesteia. Prezenţa cililor este caracteristică numai anumitor specii de bacterii, mobile. Numărul cililor este variabil, funcţie de specie, de la unu pana la o suta. În funcţie de inserţia pe corpul bacteriei cilii pot avea urmatoarele poziţii: - monotriha, un cil la un singur pol; - amfitricha, cu cate un cil la ambii poli ai celulei; - peritricha, cu cili dispuşi în jurul bacteriei; - lophotricha, cu cili dispuşi la un pol sub forma de mănunchi. Cilii sunt organite lungi de 16-18 mm şi subţiri, cu diametrul de 0,01-0,02 mm pe toata lungimea, de obicei ondulaţi. Implantarea lor se face în citoplasma printr-un corp bazal situat între peretele celular şi membrana citoplasmatica. La bacteriile Gram-pozitive corpusculul bazal este format din douădiscuri (inele), angrenate împreună sub forma butonilor de manseta. Lungimea cililor depaşeste pe cea a celulei, în mod excepţional până la de 10 ori. Cu ajutorul cililor, bacteriile se pot deplasa linear sau se pot rostogoli. Viteza de înaintare este mare, parcurgând într-o secundă o distanţă de la 10 până la 40 ori mai mare decât diametrul longitudinal al bacteriei. Aparatul fimbrial. Fimbriile sunt formatiuni filamentoase prezente pe suprafaţa bacteriilor imobile sau mobile, în numar mare, de ordinul sutelor (100-400). Ele au o poziţie radială şi sunt mai scurte ca cilii; nu servesc la mişcare ci au rol de fixare pe diferite substrate solide sau pe hematii, pe care le aglutinează. Fimbriile sunt de natura intracelulara deoarece după îndepărtarea peretelui celular, rămân fixate pe protoplaşti. 31

Pilii sunt, dupa Ottow, apendice filamentoase care au un canal prin care se face transferul cromozomului bacterian de la celula mascula (F+) la celula femela (F-), fiind denumite si 'pili de sex'. Peretele celular Este invizibil sau foarte greu vizibil la microscopul fotonic şi reprezintă aproximativ 20 % din greutatea uscată a celulei si 25 % din volumul ei. Peretele celular are rol: - de sustinere mecanica; - asigura individualitatea morfologica; - ofera protectie fata de socul osmotic; - participa la procesul de diviziune celulara; - contine receptori de virus; - mediaza schimbul de substante cu mediu. Peretele celular este absent la micoplasmatale. Membrana citoplasmatica, acopera citoplasma bacteriilor si o separa de fata interna a peretelui celular. Are o grosime de 7,5 nm si este constituita din doua straturi fosfolipidice. Analiza chimica a membranei evidentiaza trei tipuri de molecule: lipide, proteine si glucide. Proteinele reprezinta peste 50 % din total. Membrana citoplasmatica este o bariera osmotica de permeabilitate care regleaza patrunderea in celula si eliminarea selectiva a diferitelor substante. Ea mentine in celula o concentratie ridicata de macromolecule, molecule mici si chiar ioni impedicandu-le difuzarea in mediu desi concentratia extracelulara este mai mica. Contine permeazele care asigura transportul activ in interiorul celulei a unor substante organice polare din mediu. Membrana citoplasmatica are rol in cresterea si diviziunea celulara; la nivelul sau ia nastere semnalul care declanseaza initierea replicarii cromozomului bacterian.

32

In sfarsit, membrana citoplasmatica este suportul enzimelor care participa la sinteza ATP (la eucariote aceste enzime se afla in mitocondrii). Mezozomii sunt formatiuni care deriva din membrana citoplasmatica sub forma unor invaginari, legate de ADN celular. Aceste organite celulare joaca un rol important in diviziunea nucleului si in formarea septului care separa cele doua celule fiice. La bacteriile purpurii mezozomii contin pigmenti clorofilieni. La bacteriile fixatoare de N2, nitrogenaza care este inhibata de O2, este protejata de mezozomi. La bacteriile nitrificatoare numeroasele invaginari ale membranei citoplasmatice maresc suprafata de schimb enzimatic. Citoplasma, este un sistem coloidal constituit din saruri minerale, compusi solubili de natura lipoproteica, nucleoproteine, lipide si apa. Are un pH cuprins intre 7-7,2. Citoplasma poate fi caracterizata ca un complex de stari fizice intr-o continua transformare, in functie de starea fiziologica si varsta celulei. Ribozomii sunt formatiuni citoplasmatice, sferice. O celula bacteriana contine in medie 18.000 ribozomi de tip 70 S, cu un diametru de 10-30 nm. Fiecare ribozom se disociaza in doua subunitati, 30 S si 50 S. Fiecare subunitate 50 S este legata de o subunitate 30 S prin intermediul legaturilor ARN - proteina si proteina-proteina. Ribozomii 70 S joaca un rol precis in cursul traducerii lanturilor de ARN in proteine. Materialul nuclear ('nucleul') este constituit dintr-un cromozom format de o bucla de ADN aflat in suspensie, in citoplasma. Lungimea acestuia este mare, ajungand la Escherichia coli la 1 mm, ceea ce implica o rasucire foarte accentuata. Plasmidele sunt considerate material genetic extracromozomial, fiind independente de nucleu. Plasmidele nu sunt indispensabile pentru viata celulara dar pot aduce un avantaj selectiv. Ele poarta informatia pentru degradarea unor substraturi si pentru rezistenta la antibiotice.

33

Replicarea plasmidelor se produce in doua momente diferite: atunci cand celula se divide si atunci cand se produce procesul de conjugare. Bacteriile pot contine mai multe plasmide. Escherichia coli, de exemplu, poseda pe cromozom 1 sau 2 plasmide conjugate si 10-15 plasmide neconjugate. Vacuolele sunt formatiuni sferice care apar in citoplasma in faza de crestere activa a celulelor bacteriene. In interiorul lor se gaseste apa sau gaz. Cele cu apa au rol in mentinerea presiunii osmotice in raport cu mediul extern, iar cele cu gaz au rol de flotatie. Incluziunile sunt formatiuni inerte care apar in citoplasma la sfarsitul periodei exponentiale de crestere a celulei. Ele pot fi formate din glicogen, amidon, carbonat de calciu si fosfat anorganic. Sporul bacterian este o formatiune care deriva din celula vegetativa a bacteriilor, in anumite conditii de viata. Sporul este o forma de conservare a speciei la conditiile nefavorabile de mediu si concentreaza intr-un volum redus toate componentele esentiale ale celulei din care provine. Practic toate microorganismele produc acid glutamic, dar puţine în cantităţi suficient de mari şi în condiţii selective. Mai productive sunt Brevibacterium amynophylum, diverse varietăţi de Micrococcus glutamicus şi Carynebacteryum glutamicum, dar şi Esteria Coli, Bacillus subtilis. Cultivarea Micrococcus glutamicus pe un mediu de glucoză 10% necesită o concentraţie optimă de biotină de 2,53%. Mărirea şi reducerea acestei concentraţii face ca raportul între cantitatea de aminoacizi conţinuţi intra şi extra celular să varieze de la 12 la 0,3. Pe medii naturale sărace în biotină cantitatea de aminoacizi trecuţi în mediu este şi de 200 de ori mai mare decât cele bogate în această vitamină. Componentele naturale şi vegetale ale mediilor de cultură conţin mari cantităţi de biotină. Se impune folosirea unui mediu de cultură sintetic şi folosirea inhibitorului natural al biotinei-alcoolul palmitic.

34

MICROCOCCUS GLUTAMICUS

Săruri minerale KH2 P04-solubil în apă, insolubil în acool. (NH4)2 S04-se prezintă sub formă de cristale de culoare alb-gălbuie până la portocaliu. ZnCl2-este o sare a zincului cu acidului clorhidric cu formula chimică ZnCl2. Substanţa este incoloră sau albă şi este foarte solubilă în apă.Totodată, ea este higroscopică, şi delicvescentă.Prezintă masa molară: 136,315 g/mol şi densitate: 2,91 g/cm³. Acidul sulfuric Acidul sulfuric (H2SO4) este un lichid vâscos şi incolor ce se solidifică la o temperatură de 3 °C atunci când este de concentraţie 100%. În rest, punctul de îngheţare depinde de concentraţie: la 93% acesta este de -32 °C, la 78% este -38 °C şi la 65% este de -64 °C. Acidul sulfuric tehnic poate avea adesea o culoare maronie datorată impurităţilor organice. Încălzit deasupra punctului de fierbere de 279,6 °C, acidul sulfuric se vaporizează, iar în forma acesta de vapori există trioxid de sulf în exces. La o temperatură de 338 °C, vaporii au un conţinut de 98,3% acid şi corespund unui amestec azeotropic de apă şi acid sulfuric. Încălzit mai mult, la 450 °C, acidul sulfuric se disociază în apă şi trioxid de sulf complet.Căldura specifică a soluţiilor apoase de acid sulfuric scade odată cu creşterea conţinutului de mare de acid şi se măreşte odată cu ridicarea temperaturii. Vâscozitatea acidului este de 24,6 mPa·S[https://ro.wikipedia.org/wiki/Acid_sulfuric].

35

Acidul sulfuric se utilizează după terminarea fermentaţiei,biomasa este acidulată cu acid sulfuric la un pH de 6,5 adăugându-se cărbune activ şi un adjucvant pentru mărirea vitezei de filtrare[Corneliu Oniscu,1978].

Carbunele activ este folosit ca material de umplutură pentru a reţine mai uşor catalizatorul de filtrare.Se obţine din mangal sau turbă prin tratarea la cald cu vapori de apă sau rumegus de lemn prin impregnare cu ZnCl 2 sau H2 P04 si calcinare ulterioara [Corneliu Oniscu,1978]. Acidul clorhidric Acidul clorhidric este un gaz incolor, cu miros puternic, iritant. Densitatea sa relativă este de 1,12601 şi greutatea unui litru de 1,6394 g. Gazul fumegă la aer cu formare de picături hidratate de HCl. Răcit la 10 °C şi la o presiune de 40 atm se condensează sub forma unui lichid incolor. Punctul de fierbere este de -83,7 °C, iar cel de topire este de -112 °C. În stare solidă se prezintă ca o masă albă cristalină. Cristalizează într-o reţea cubică moleculară. Temperatura şi presiunea critică au valorile 51,46 °C şi, respectiv, 81,6 atm. În stare lichidă nu conduce curentul electric[https://ro.wikipedia.org/wiki/Acid_clorhidric]. Solutia care este trecută în cristalizator se acidulează cu HCl până la punctul izoelectic al acidului L-glutamic ,apoi se adaugă o substanţă tensioactivă ce are rolul de a favoriza cristalizarea[Corneliu Oniscu,1978]. NaOH Hidroxidul de sodiu, cunoscut şi drept sodă caustică sau leşie, are formula chimică NaOH. Ca formă de agregare este un corp solid, higroscopic, de culoare albă.Este un puternic elctrolit favorizând electroliza apei.Se dizolvă în substanţele polare degajându-se căldură de diluare.Neutralizează acizii formând sărurile corespunzătoare radicalului nemetalic şi apă.Proprietăţi:masa molară 39,997 g/mol, densitate 2,130 g/cm3, punct de topire 322°C, punct de fierbere 1.388°C.Masa cristalină care se obţine se filtrează pe centrifugă ,după care se dizolvă în apă ,se adaugă o soluţie de NaOH până la pH 6,5 şi carbune activ[Corneliu Oniscu 1978].

36

2.6 Mecanismul reacţiilor chimice

Pentru elucidarea mecanismului de biosinteză a acidului l-glutamic s-a plecat de la αceto-glutaric ,intermediar în ciclul Krebs ,produs prin conversia zahărului în proporţie de 5060 % şi s-a supus procesului de transaminare. Enzima care catalizează această recţie (transaminoza) este mult răspândită în ţesuturile animale, vegetale şi microorganism.Procesul de transaminare poate fi reprezentat astfel:

HOCO-CHl-2Transaminaza glutamica NH3

HOCO-CH2-CH2-C-COOH

NH3

O HOCO-CH2-CH2-CH-COOH NH2

Dehidrataza lglutamica

Acidul glutamic este unul dintre cei mai importanţi donori de grupe aminice în procesul de transaminare la nivel celular, favorizând apariţia altor aminoacizi. În mecanismul de biosinteză rolul biotinei este stabilit şi constă în orietarea metabolismului microorganismelor M.glutamicus pe calea acumulării anormale a acidului glutamic, favorizând deci creşterea randamentului în faza de biosinteză. Plecând de la mecanismul de biosinteză au fost propuse două procedee de biosinteză: 1) procedeul într-un singur stadiu, în care acidulglutamic este produs direct în biomasă de către un singur tip de microorganism. 2) procedeul în doua stadii, în care se obţine mai întâi acidul α-ceto-glutaric care este mai apoi tramsformat în acid glutamic, fie cu ajutorul altui microorganism, fie prin metode enzimatice[ Cornelui Oniscu,1978].

2.6.1 Cinetica procesului de fermentatie

37

Studiul mecanismului reacţiilor enzimatice, a proceselor metabolice şi a vitezei de trasformare a substratului în produs se face prin metoda cinetică. Metodă reprezintă singura posibilitate de studio a proceselor enzimatice, deoarece numărul de enzime pure separate până în present este redus. În tratarea problemelor de cinetică enzimatică privind viteza de formare a produsului sau de creştere a masei celulare, se vor folosi definiţiile date de Gaden pentru viteza de fermentaţie ,viteză volumetrică şi viteză specific Gaden defineşteviteza de fermentaţie ca fiind variaţia momentană a concentraţiei produsului, a intensităţii respiraţiei sau a concentraţiei masei celulare, iar viteza volumetrică este definită prin unitatea de produs obţinută,cantitatea de zahăr utilizată,cantitatea de celule produsesau prin consumul de oxigen, toate fiind raportate la litru mediu de cultură şi la oră. Viteza specifică se defineşte prin raportul dintre viteza volumetrică şi densitatea bacteriană şi se exprimă în grame de produs obţinut pe oră şi gram masă celulară. Procesele metabolice ce au loc în interiorul celulelor vii sunt reacţiifizico-chimice foarte complexe care se petrec cu viteze mari şi sunt catalizate de enzime.Gaden defineşte fermentaţia ca reprezentând “reacţiile chimice catalizate de sisteme enzimatice care, la rândul lor, sunt produse de către microorganisme în timpul creşterii”. Enzimele sunt macromolecule organice care catalizează procesele biochimice.Din punct de vedere structural, enzimele sunt compuşi de natură heteroproteică cu sensibilitate deosebită la toţi factorii care afectează proteinele. Activitatea enzimelor este influenţată de temperatură (intervalul optim de temperatură este între 10 şi 70°C ),Ph, presiune osmotică, concentraţia substratului, concentraţia produşilor rezultaţi în reacţie.Activitatea enzimatică este inhibată de anumiţi agenţi specifici printre care:sulfamide,antibiotice,narcitice,coloranţi,H2O,CO2,dezinfectante. Substanţa asupra căreia se exercită reacţiile chimice, datorită acţiunii enzimelor, se numeşte substrat.Prezenţa enzimelor permite transformarea substratului la temperatura normală a materiei vii, oferind în acest fel energia necesară desfăşurării procesului de biosinteză. Funcţiunea esenţială a enzimelor constă în accelerarea vitezei reacţiilor metabolice la temperatura normală a organismelor.Având activitate catalitică foarte mare,enzimele reduc

38

considerabil barierele de potenţial ale reacţiilor de transformare a substratului şi facilitează în acest fel deplasarea echilibrului spre formarea de produs. Mecanismul prin care enzimele transformă substratul în produs poate fi explicat prin teoria stării de tranziţie.Această teorie presupune că substratul se combină cu enzime formând un complex activat, instabil, care se descompune apoi în produs şi enzimă.Enzima eliberată este utilizată într-un nou proces de transformare a substratului după schema : k2

k+1 E+S

E+S

*

P+E

k-1 În care: E-este enzima liberă; E-S*-complexul activat enzimă-substrat; S-substrat; P-produs; k+1-constanta de viteză la formarea produsului; k-1-constanta de viteză la formarea enzimei şi a substratului din complexul enzimă-substrat; k2-constanta de viteză la formarea produsului din complexul enzimă-substrat. Procesul de creştere a microorganismelor se urmăreşte prin determinarea masei celulare sau a densităţii celulare şi prin determinarea numărului de microorganisme sau a concentraţiei celulare.Măsurarea creşterii se face prin metoda turbidimetrică sau cu analizor continuu infraroşu (prin determinarea CO2 din gazele care părăsesc cultura aerată). În practică, este foarte comod să se urmărească ciclul de creştere prin determinarea numărului de miroorganisme sau a acumulării acestora în timp.Dacă se reprezintă grafic creşterea în timp a numărului de microorganisme se obţin curbe,alura acestora fiind influenţată de metoda de măsurare utilizată.

39

Fig. 2.6.1.1Curba de creştere a microorganismelor Curba de creştere a microorganismelor cuprinde mai multe faze corespunzătoare diferitelor viteze de creştere din ciclu.Astfel , după Stell, curba de creştere cuprinde patru faze , şi anume:faza de inoculare sau de adaptare la mediu (de la a la b), faza creşterii logaritmice a numărului de microorganisme (de la b la c), faza creşterii încetinite (de la c la d ) şi faza de descreştere a numărului de microorganisme (de la d la e ).După Monod, curba de creştere cuprinde următoarele faze: faza lag sau faza creşterii staţionare, faza de creştere accelerată, faza de creştere logaritmică sau faza exponenţială, faza de retardare, faza staţionară, faza distrucţiei accelerate a microorganismelor prin liză şi faza distrucţiei logaritmice. Faza lag corespunde perioadei de timp în care are loc aclimatizarea microorganismelor la noile condiţii oferite de cultivarea la scară industrială.Durata fazei lag este determinată de compoziţia mediului folosit pentru cultivare la scară industrială şi de specia microorganismului.După perioada de aclimatizare urmează o accelerare a creşterii, caracterizată prin faptul că multiplele reacţii ale metabolismului microorganismelor se deşfăsoară cu viteză ridicată.În faza creşterii logaritmice are loc un intens proces de diviziune celulară,iar numărul microorganismelor viabile în această fază este de peste 99 %. Creşterea logaritmică se caracterizează şi printr-un consum intens al elementelor nutitive din mediu.Pe măsură ce mediul se epuizează , viteza procesului de creştere începe să scadă, iar acest fenomen este tradus, pe curba propusă de Monod, prin apariţia fazei de retardare.Această etapă se caracterizează prin acumularea de produşi metabolici, scăderea vitezei de creştere a biomasei şi a viabilităţii microorgamismelor.Urmează o perioadă relativ scurtă în care 40

populaţia microbiană pare să rămână constantă, după care apare o pronunţată tendinţă de reducere a viabilităţii, etapă care corespunde fazelor morţii accelerate şi a morţii logaritmice[Corneliu Oniscu şi Dan Caşcaval,2002].

2.6.2 Modele cinetice pentru viteza de crestere a masei celulare

Cinetica proceselor de biosinteză poate fi studiată şi sub aspectul creşterii masei celulare funcţie de concentraţia substratului. Astfel, Monod, analizand procesul de creştere bacteriană în corelatie cu variaţia concentraţiei unui singur substrat, a stabilit pentru faza de crestere logaritmică a masei celulare urmatoarea expresie de calcul a vitezei specifice: μ=

μmax∗C S K S +C S

(1)

μ−¿ viteza specifică de creştere a masei celulare când substratul este limitat;

μmax

-viteza maximă de creştere a masei celulare când substratul nu este limitat;

KS-constanta de saturatie (corespunde concentraţiei substratului la care viteza specifică de creştere este jumătate din viteza maximă). Dependenţa dintre viteza specifică de creştere a masei celulare şi concentraţia substratului limitativ este redata în figura, din care se constată că viteza specifică de creştere tinde asimptotic către valoarea maximă.

41

Figura 2.6.2.1 Dependenţa dintre viteza specifică de creştere şi concentraţia substratului limitativ Substratul limitativ poate fi sursă de carbon şi energie, un aminoacid essential, oxigenul, fosforul sau azotul anorganic. Ţinând cont de faptul că viteza specifică de creştere este definită prin relaţia: 1 ∗dC x Cx μ= dτ

(2)

Şi combinănd această relaţie cu expresia de mai sus , se obţine ecuaţia de creştere a masei celulare în funcţie de concentraţia substratului limitativ, CS : dC x μmax∗C s C = dτ K s +C s * x

(3)

Ultima relaţie este cunoscută în literatura de specialitate sub denumirea de ecuaţia Monod. Prezintă omare importanţă, pentru industrie faptul că primele două faze din modelul Monod, respectiv prima fază din modelul Stell, să dureze puţin.În acest scop, se recomandă folosirea unei culturi care creşte activ, folosirea în inocul a unui mediu de aceeaşi compoziţie cu cel folosit în industrie şi utilizarea de inocule mari[Corneliu Oniscu şi Dan Caşcaval,2002].

2.6.3 Modele cinetice pentru viteza de formare a produsului

Michaelis şi Menten dezvoltă modelul cinetic al vitezei de formare a produsului în funcţie de concentraţia substratului şi a enzimei.Reacţia dintre enzimă şi substrat se desfăşoară 42

în două etape.În prima etapă, viteza de reacţie este dependentă direct cantitatea de substrat, iar în a doua, în care are loc formarea produsului şi eliberarea enzimei, care este capabilă să reia +1 ciclul descris de sistemul de reacţie,viteza kdepinde de concentraţia complexului enzimăsubstrat: E+S

E-S k-1 k2

E-S

P+E

Viteza de formare în procesul enzimatic descries de sistemul de mai sus este: Vp

¿

dCp =k 2∗C c (4) dτ

Pentru determinarea concentraţiei complexului enzimă-substrat,Cc, se utilizează expresia vitezei de formare a acestuia, pentru cazul în care CS >>CE:

dCc =k +1∗( C E −Cc )∗C s−k −1∗Cc −k 2∗C c dτ

(5)

În regim staţionar , concentraţia complexului nu variază în timp, iar expresia anterioară devine: k +1∗( C E−C c )∗C s −k −1∗C c −k 2∗C c =0 Prin explicitarea ecuaţiei de mai sus funcţie de CC , se obţine:

43

(6)

C c=

C E∗C s k −1 +k 2 +C s k +1

(7)

Combinând ultimele două ecuaţii obţinem: v p=

În care : V

d CP k ∗C ∗C V ∗Cs =k 2∗C c = 2 E s = dτ k −1 +k 2 k +C s K s + 2 +C s k +1 k +1

¿ k 2∗C E

(9)

–viteza maximă de formare a produsului şi corespunde stadiului

în care întreaga cantitate de enzimă formează complexul enzimă-substrat Ks=

k−1 k +1 -constanta de echilibru la disocierea complexului enzimă- substrat

K M =K s +

k2 k +1

-constanta Michaelis-Menten.

Constanta KM este egala cu constanta de echilibru Ks numai atunci când k2CE .Creşterea concentraţiei enzimei în mediul de fermentaţie peste o anumită limită atrage după sine anularea acestei ipoteze şi, în consecinţă, viteza recţiei enzimatice nu va mai fi direct proporţională cu concentraţia enzimei.

44

KM Fig. 2.6.3.1Reprezentarea grafică a ecuaţiei Michaelis-Menten Din reprezentarea grafică se observă că KM este acea valoare a concentraţiei substratului CS pentru care reacţia porneşte cu jumătate din viteza maximă ,V. Pentru determinarea constantei KM şi a vitezei maxime V, se utilizează metodele de liniarizare. Una dintre acestea este metoda Lineweaver-Burk, care foloseăte inversul ecuatiei (10): 1 KM = vp V

1 1 + * CS V

(11)

Prin reprezentarea grafică a ecuaţiei (11) în coordinatele

1 v p şi

1 Cs

se obţine dia-

grama Lineweaver-Burk (figura 2.6.3.1 ), care permite determinarea constantelor V şi KM în funcţie de variaţia concentraţiei substratului şi de valorile experimentale ale vitezei de formare a produsului.

45

Figura 2.6.3.1.2 Reprezentarea grafică a ecuaţiei Lineweaver-Burk. În literartura de specialitate se întâlnesc şi alte reprezentări ale ecuaţiei MichaelisMenten. Astfel, Eadie-Hofsee obţin prin împărţirea ecuaţiei (10) la Cs: v

p=

V KM +1 Cs

sau

v p=V −K

M∗v p Cs

(12)

Reprezentarea grafică a acestei ecuaţii în coordinate VP şi

VP CS

este o dreaptă,

redată în figura 2.6.3.1.3

Figura 2.6.3.1.4 Reprezentarea grafică a vitezei reacţiei enzimatice după metoda EadieHofsee. O altă reprezentare a ecuaţieie Michaelis-Menten a fost propusă de Woolf. Autorul porneşte de la ecuaţia Lineweaver-Burk pe care o înmulţeşte cu C S,obţinând ecuaţia (13), redată în figura 2.6.3.1.4 Cs K M 1 = + ∗C s vp V V

(13)

46

Figura 2.6.3.1.5 Reprezentarea grafică a ecuaţiei Michaelis-Menten după metoda lui Woolf. Modelul Michaelis-Menten a fost conceput ca un model ideal şi descrie viteza de formare a produselor în procese de fermentatie perfecte. Însă, acest model, care abordează cinetica enzimatică în regim staţionar, poate fi extins şi la procesele în care, alături de transformarea enzimatică a substratului în produs, intervin reacţii de inhibiţie competitivă sau necompetitivă a enzimelor. Prezenţa inhibitorilor nu se poate evita, deoarece ei apar ca urmare a degradării mediului nutritiv în timpul sterilizării, a unor reacţii secundare şi nu numai. Principalele tipuri de inhibiţii întâlnite curent în procesele fermentative sunt: - inhibiţia competitivă; - inhibiţia necompetitivă; - inhibiţie de substrat; - inhibiţie de produs. Procesul de transformare enzimatică a substratului în produs însoţit de inhibiţie competitive este descries prin reacţiile:

(14) Caracteristic pentru procesul de transformare enzimatică însoţit de inhibiţie competitivă este faptul că enzima pusă în libertate prin disocierea complexului enzimăinhibitor, E-I, îsi pierde capacitatea de a cataliza transformarea substratului în produs.

47

Viteza de formare a produsului este proporţională cu concentraţia complexului enzimăsubstrat, de aceea este necesară cunoaşterea valorii acesteia, în regim staţionar. În acest scop, se scriu constantele de echilibru, pentru situaţia în care : C ¿ ¿E ¿ (¿−C c−C ¿ ¿C c ¿ )∗C s ¿ ¿ s=¿ K¿

(15)

D

C ¿ E−C c−C ¿ ¿∗C I ¿ ¿ K I =¿

D

(16)

unde: CI - concentraţia inhibitorului; CD- concentraţia complexului enzimă-inhibitor. Se reduce termenul CD din ecuaţiile (15) şi (16) şi se explicitează în funcţie de Cc, obţinându-se: C

C=

CE× C s × K I KI × Ks + Ks × C +K I

I×C s

(17)

Ecuaţia vitezei de formare a produsului devenind: v

p=k 2 × C c =

k 2 × C E× C × K I V × Cs = Ks × KI +K × C × Cs K K s

s

I +K

I

M + C s+

M

KI

×C I

(18)

în care: KM=KS deoarece k2CE şi CI>>CD*CF constantele de echilibru ale sistemului (18) se calculează cu expresiile urmatoare: E−¿C C −C D −C F C ¿ ×C s ¿ ¿ K s=¿

(19),

D−¿ C F E−¿C c −C ¿ C ¿∗C I (20), ¿ ¿ K I =¿

KI=

Cc × CI CF

(21), K

s=

C D ×C s CF

(22)

în care : CF- concentraţia complexului enzimă-substrat-inhibitor. Admiţându-se că KS=KS’ şi KI=KI’ prin combinarea ecuaţiilor anterioare se obţine concentraţia complexului enzimă-substrat: K (¿ ¿ s+C s )×(K I + C I ) C × Cs× K I C c= E ¿

(23)

50

Iar ecuaţia vitezei de formare a produsului devine: K k 2 × C E ×C × K I

p=k 2 × Cc =

s

V × Cs

( ¿ ¿ s+ Cs )×( K I +C I )=

(24)

C

( K M + Cs ) × 1+ K I

I

v¿ în care: KM=KS deoarece k2