Metodos Cualitativos para La Determinacion de Proteinas 2017 [PDF]

Zitiervorschau

UNIVERSIDAD NACIONAL DE FRONTERA FACULTAD DE INGENIERÍA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

MÉTODOS CUALITATIVOS DE ANÁLISIS DE PROTEÍNAS EN LOS ALIMENTOS

ESTUDIO MONOGRÁFICO

AUTORES: ARANA TORRES, Nancy Maribel GUINDE LIZANA, Luis Ángel ISLA CÁRDENAS, Ariana Metis OLIVARES MENDEZ, Gianella PRIETO SEMINARIO, Katherine SUNCIÓN PANTA, Daniela VALDIVIEZO MARCELO, Jaime

DOCENTE: Blgo. BERRIOS TAUCCAYA, Oscar Julián

CÁTEDRA: QUÍMICA DE LOS ALIMENTOS/METODOS DE ANALISIS DE LOS ALIMENTOS

SULLANA - PERÚ 2017

2

DEDICATORIA

A Dios, por habernos dado la vida y permitirnos llegar hasta este momento tan importante de nuestra formación profesional. A nuestros padres, Por ser nuestros principales ejemplos de superación, por brindarnos su amor, consejos e infinita confianza y fe en nosotros, por forjarnos todos los caminos y hacer posible nuestros sueños.

TEMA

PAG

I

INTRODUCCION ............................................................................................................................................ 4

II

OBJETIVOS .................................................................................................................................................... 5 2.1 2.2

OBJETIVO GENERAL ..............................................................................................................................................5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .........................................................................................................................................5

III

METODOLOGIA ............................................................................................................................................. 6

IV

MARCO REFERENCIAL ................................................................................................................................... 7 4.1 BASES TEÓRICAS ..................................................................................................................................................7 4.1.1 Métodos químicos ..................................................................................................................................7 4.1.1.1 El método del Biuret ..........................................................................................................................7 4.1.1.1.1 El fundamento ...................................................................................................................................7 4.1.1.1.2 El procedimiento ...............................................................................................................................7 4.1.1.1.3 Las aplicaciones.................................................................................................................................8 4.1.1.2 Método "dye-binding".......................................................................................................................9 4.1.1.2.1 Principio químico ...............................................................................................................................9 4.1.1.3 Determinación de proteínas por alcohol etílico ..............................................................................10 4.1.1.3.1 Método densitométrico ...................................................................................................................10 4.2 BASES CONCEPTUALES.........................................................................................................................................10

V

APLICACIONES PRÁCTICAS .......................................................................................................................... 12 5.1 RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS EN LA LECHE ....................................................................................................12 5.1.1 Prueba de Biuret: .................................................................................................................................12 5.1.2 Resultados y discusión .........................................................................................................................12

VI

RESULTADOS .............................................................................................................................................. 14

VII

CONCLUSIONES........................................................................................................................................... 15

VIII

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................................................... 16

1

16

IX

ANEXOS Y APÉNDICE .................................................................................................................................. 18 9.1 ANEXOS............................................................................................................................................................18 9.2 APÉNDICE .........................................................................................................................................................18 9.2.1 Apéndice ..............................................................................................................................................18 9.2.2 Solubilidad ...........................................................................................................................................18

4 I

INTRODUCCION

A lo largo de este tema vamos a estudiar los distintos métodos que nos permiten analizar desde un punto de vista cualitativo el contenido proteico. Por la estructura peptídica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las proteínas pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose productos coloreados. Estas reacciones son la base para la determinación cuantitativa y cualitativa de las proteínas. Por presentarse variaciones en la composición de los aminoácidos de las diferentes proteínas, se manifiestan diferentes colores y grados de intensidad para una misma reacción, íntimamente relacionado con la naturaleza de la proteína analizada. Las proteínas se pueden clasificar según su composición, su estructura, su función biológica o sus propiedades de solubilidad. Por ejemplo, las proteínas simples (o sencillas) contienen solo aminoácidos tras la hidrolisis, mientras que las proteínas complejas (o conjugadas) contienen también componentes que no son aminoácidos. En el presente trabajo se describirá métodos para determinar la presencia de proteínas de los alimentos, basados en las características singulares de las proteínas y aminoácidos. Para seleccionar un método en concreto para una aplicación específica, hay que tener en cuenta la sensibilidad, la exactitud y la reproductibilidad, así como las propiedades físico-químicas de los materiales alimentarios. El análisis cualitativo tiene como objetivo identificar el analito presente en la muestra sometida al proceso analítico.

II

2.1

OBJETIVOS

Objetivo General



Conocer los fundamentos de los métodos cualitativos para la determinación de proteínas en los alimentos.

2.2

Objetivos Específicos



Determinar qué tipos de métodos existen para el análisis cualitativo de las proteínas en los alimentos.



Identificar cuál de los métodos cualitativos estudiados son los más utilizados en la industria alimentaria.



Conocer el fundamento de los métodos cualitativos para la determinación de proteínas en los alimentos.

6 III METODOLOGIA

El presente trabajo de investigación es de carácter bibliográfico, por la modalidad correspondiente a un proyecto de desarrollo por cuanto está encaminado en ver los métodos cualitativos para el análisis de proteínas en los alimentos, a través de libros, páginas web y proyectos de investigación. Esta investigación a través de los métodos cualitativos nos permitirá identificar la presencia de proteínas en los alimentos, basándose en los fundamentos científicos encontrados durante el desarrollo de la investigación y la interpretación en el estudio de las muestras, determinado la validez de cada método independientemente.

IV MARCO REFERENCIAL

4.1

Bases Teóricas 4.1.1 Métodos químicos Las proteínas presentan un amplio rango de comportamiento químico debido a la propiedad de los aminoácidos de tener diferentes tipos de grupos funcionales, a las reacciones químicas de estos grupos y a los enlaces peptídicos.

4.1.1.1 El método del Biuret 4.1.1.1.1 El fundamento La reacción de biuret es específica para la medición del enlace peptídico, por lo que solo se recomienda para la cualificación de proteínas, mas no de hidrolizados, a menos que se conozcan los tamaños moleculares y se adapten la proteína estándar de la curva. Se utiliza una solución diluida de sulfato cúprico en tartrato fuertemente alcalino, esta se adiciona a la solución de proteína, resultando un compuesto de color entre purpura y violeta que absorbe a 540 nm, obteniendo probablemente por el acomplejamiento del 𝐶𝑢+2 con dos enlaces peptídicos adyacentes. (Badui Dergal, 2012) 4.1.1.1.2 El procedimiento 1. Se mezclan 5 mL de un rea ctivo de biuret con una porción de 1 mL de la disolución de las proteínas (de 1 a 10 mg de proteína/mL). El reactivo contiene sulfato de cobre, NaOH y tartrato de sodio y potasio, el cual se utiliza para estabilizar el ion cúprico en la disolución alcalina. 2. Después de haber dejado reposar la mezcla de reacción a temperatura ambiente, durante 15 ó 30 minutos, se toma la lectura de la absorbancia a 540 nm, frente a un blanco del reactivo. 3. Si la mezcla de reacción no fuese transparente, sería necesaria la filtración o la centrifugación antes de la lectura de la absorbancia.

8 4. Se construye una curva de calibrado de la concentración frente a la absorbancia, haciendo uso de la albúmina de suero bovino (BSA). 4.1.1.1.3 Las aplicaciones El método del biuret ha sido utilizado para determinar las proteínas contenidas en los cereales, en la carne, las proteínas de las semillas de soja (18) y como un ensayo cualitativo para el pienso [Método 935.11 de la AOAC, (el cual hace referencia a los métodos 22.01222.013, AOAC, 10a. ed., (1965)]. El método del biuret se puede utilizar, así mismo, para medir el contenido en proteína de los extractos de proteínas. Ventajas: 1. Es menos costoso que el método de Kjeldahl; rápido (se puede completar en menos de 30 minutos); es el método más simple para el análisis de las proteínas. 2. Se encuentran desviaciones del color con menor frecuencia que en el método de Lowry, la absorción UV o los métodos turbidimétricos (los cuales se describen más abajo). 3. Muy pocas sustancias distintas de las proteínas en los alimentos interfieren con la reacción del biuret. 4. No detecta el nitrógeno procedente de fuentes que no sean peptídicas o que sean distintas de las proteínas. Inconvenientes: 1. No es demasiado sensible, en comparación con el método de Lowry; requiere, al menos, 2-4 mg de proteína para el ensayo. 2. Si estuviesen presentes, podría tener lugar cierta contribución de los pigmentos biliares a la absorbancia. 3. Una concentración alta de sales de amonio interfiere con la reacción. 4. El color varía con las diferentes proteínas; la gelatina da un color rosa púrpura. 5. Podría presentarse una opalescencia en la disolución final, si hubiese presentes niveles altos de lípidos o de hidratos de carbono. (Nielsen, 2009) 6. No es un método absoluto: el color se debe calibrar frente una proteína conocida (por ejemplo, la BSA) o frente al método de Kjeldahl para el nitrógeno.

4.1.1.2

Método "dye-binding"

4.1.1.2.1 Principio químico Se caracteriza por la formación de un coágulo de proteína coloreado e insoluble producto de la reacción de la proteína con una solución coloreada de ácido sulfónico a pH 2. El anión coloreado se une por asociaciones electrostáticas a los sitios básicos de la proteína, por ejemplo, a los grupos amino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y aminos terminales. Además, se producen atracciones intermoleculares por interacciones hidrofóbicas entre la proteína y la mitad no iónica del anión y entre el anión unido a proteína y la mitad no iónica del anión en solución. El coágulo se separa por filtración y se mide colorimétricamente el exceso de tintura en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de proteína. El método es empírico por lo que se debe buscar la concentración de tintura ideal que sature la proteína y forme el coágulo pero que no pierda sensibilidad. Ventajas: 1. Útil en análisis de rutina de muestras similares. 2. Económico y rápido. 3. Preciso como el método de Kjeldhal. 4. Usado como método de referencia. Desventajas: 1. Dificultad en encontrar tinturas puras. 2. Desuniformidad en la calidad de las tinturas de un lote de fabricación a otro, por lo que se requiere la calibración del método con cada lote. 3. No es aplicable a alimentos que varíen su contenido en grupos aminos (proteólisis, pardeamiento). (R.S.Kirk, 2011)

10 4.1.1.3 Determinación de proteínas por alcohol etílico 4.1.1.3.1 Método densitométrico Requiere de un equipo especial. Mide el peso específico de la muestra, por el cambio de frecuencia de oscilación en un tubo en U comparado con dos estándares. El peso específico se convierte a porcentaje de etanol a 15,56°C. Se aplica a destilados entre 25-79° alcohólicos. El control de la temperatura y presión son factores importantes a considerar en la determinación (FAO, 1990) 4.1.1.4 Reacción xantoproteica Es un método que se utiliza para determinar la presencia de proteínas solubles en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba es positiva en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos. 4.1.1.5 Reacción de millón Es un ensayo químico para saber si existe tirosina en la solución, si es así presenta un coagulo y por calentamiento se torna de color rojo.

4.2

Bases Conceptuales Opalescencia La opalescencia es el término dado a las sustancias que muestran propiedades similares a las de la piedra ópalo cuando se someten a la luz transmitida y reflejada. Ante la luz reflejada, un ópalo tiene un aspecto azul, ya que la mayor parte de la longitud de onda corta se refleja. Cuando se transilumina, el ópalo aparecerá naranja, dependiendo del ángulo de observación. (Muñoz, 2008) Absorbancia Medida de la cantidad de luz absorbida por una solución. Se mide con un colorímetro o con un espectrómetro. Los valores de la absorbancia se usan para detectar el crecimiento de bacterias en cultivos en suspensión y para determinar la concentración de moléculas en solución. (Tesauro, 2013) Albúmina

La albúmina es una proteína, que contiene el 55-65 % de la cantidad proteica en el plasma. Tiene un peso molecular de 66,248 Ángstrom. Sus funciones principales son de transporte en la sangre numerosas sustancias como: ácido graso libre, bilirrubina, muchas hormonas, calcio, numerosos fármacos. Otra función importante es la de regular la presión osmótica. ((SSU), 2012) Turbidimétricos Métodos turbidimétricos, sistemas ópticos, bioprocesos, cultivo celular, microbiología predictiva. La turbidez se define por la Organización Internacional de Normalización (ISO), como la reducción de la transparencia de un líquido causada por la presencia de partículas no disueltas de material distinto al propio líquido. Al ser un indicador de apariencia óptica, ocasionado por la dispersión y absorción de la energía lumínica a través del líquido, la turbidez solo puede ser medida usando técnicas ópticas. (Revista CENIC, 2013) Transilumina Transiluminación f. Paso de luz a través de un tejido para su examen. La zona que se va a observar está interpuesta entre el examinador y la fuente de luz; p. ej., la diafanoscopia. (Clinica Universidad de Navarra, 2015)

12 V

5.1

APLICACIONES PRÁCTICAS

Reconocimiento de aminoácidos en la leche 5.1.1 Prueba de Biuret Para esta prueba se usaron seis tubos de ensayo cada uno con 1 ml de agua destilada, solución de alanina al 0.5 %, leche previamente evaporada al 60 %, albumina de huevo diluida al 10 %, muestra problema y solución de harina de trigo al 10%; posteriormente se adicionó a cada uno de los tubos 1 ml de hidróxido de sodio (NaOH) al 10% y se mezcló, continuando con la adición gota a gota de sulfato cúprico ( CuSO4) al 0.5 % hasta la aparición de una coloración violeta o amarilla, finalmente se tomó nota de lo observado en cada tubo.

5.1.2 Resultados y discusión

Muestra

TUBO1

TUBO2

TUBO3

TUBO4

TUBO5

TUBO6

-

+

+

+

+

+

Prueba

Biuret

Prueba de Biuret: De acuerdo a la tabla 1 los resultados para esta prueba fueron positivos para la muestra de alanina (+), leche evaporada (++), albúmina (+++), muestra problema (++), harina de trigo diluida (+), de acuerdo a las coloraciones obtenidas en una escala violeta. (Figura 4.) (Valencia, 2009)

Figura 4. Coloraciones obtenidas en la prueba de Biuret.

14 VI RESULTADOS

Han sido descritos métodos para determinar la presencia de proteínas de los alimentos, basados en las características singulares de las proteínas y los aminoácidos. Los métodos rápidos pueden ser adecuados para los propósitos del control de la calidad, mientras que se requiere un método sensible para el trabajo con una cantidad diminuta de proteínas. Habitualmente, los métodos colorimétricos indirectos requieren el uso de un patrón de proteínas cuidadosamente seleccionado, o bien un calibrado frente a un método oficial

VII CONCLUSIONES

Los métodos para la determinación de proteínas dependerán de varios factores, unos dependen de las muestras a analizar y otros como los equipos e instrumentos con lo que se cuente. En todos los casos siempre se prefieren los métodos sencillos y rápidos. La sensibilidad del método es muy importante cuando la cantidad total de la muestra es limitada o bien cuando la concentración de proteína en ella sea muy baja. La especificidad del método es importante cuando se analizan muestras de diferente naturaleza, es decir, la respuesta del método no presentará grandes variaciones dependiendo del tipo de proteína presente en los alimentos analizados. De otra manera sería necesario la realización de varias curvas estándar, una para cada tipo de proteína a cualificar. Las interferencias al método son importantes cuando se trata de muestras no muy puras, obtenidas de medios complejos, conteniendo concentraciones elevadas de otros compuestos o a condiciones de pH o fuerza iónica especiales. A través de este estudio identificamos aquellos métodos comúnmente utilizados para la determinación de proteínas en las muestras, finalmente que sea apto para la aplicación en alimentos. Los métodos más usados en la actualidad de diversos estudios realizados en laboratorios como investigaciones fundamentadas que se llevaron a cabo en los análisis de cada método estudiado con el fin de que sean factibles y que puedan ser aplicados en la determinación de proteínas que están abalados en las muestras de estudio en el campo de los alimentos.

16 VIII REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

(SSU), S. S. (2012). CONTROL DE LA ALBUMINA. Bolivia. Obtenido de http://www.ssucbba.org/_admin/pdf/ALBUMINA.pdf Badui Dergal, S. (2012). Quimica de los Alimentos 5ta Edicion. Mexico: Pearson educación. Capilla, P. (2002). Fundamentos de Colorimetría. Valencia. Obtenido de https://books.google.com.pe/books?id=f8u6BLhkoaMC&pg=PA31&lpg=PA31&dq=defi nicion+colorim%C3%A9trico&source=bl&ots=DV6j_JLqWs&sig=npvfWV-Erz5RqJi17VaoKP3PiE&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwjVnfmYoe_WAhWJIpAKHfhTD3MQ6A EIWjAJ#v=onepage&q=definicion%20colorim%C3%A9tri Clinica Universidad de Navarra. (2015). Obtenido de http://www.cun.es/diccionariomedico/terminos/transiluminacion FAO. (1990). metodos analiticos cualitativos. Obtenido de deposito de documentos fao: http://www.fao.org/docrep/010/ah833s/ah833s16.htm Lopez, F. (2011). Transformacion del n- Heptano sobre catalizadores Ni - Mo / Al2 O3. Carabogo. Obtenido de [0:39, 14/10/2017] Prieto Seminario, Katherine Elizabeth: http://www.spq.pt/magazines/RPQ/290/article/877/pdf MALLQUI, L. A. (2014). Métodos para el análisis fisicoquímico de la leche y derivados lácteos. Huancayo. Mandal, A. (2014). Fuciones de la Glutamina. Granada. Obtenido de https://www.newsmedical.net/health/Glutamine-Functions-(Spanish).aspx Muñoz, M. d. (2008). Estudio experimental de la transludidez. Madrid. Obtenido de http://eprints.ucm.es/20258/1/M%C2%AA_Angeles_Rodr%C3%ADguez.pdf Nielsen, S. S. (2009). Análisis de los Aimentos. ZARAGOZA: ACRIBIA, S.A. Nuñez, A. P. (2010). Fuentes de donde proviene la asparagina. San José. Obtenido de http://aminoacidosnoesenciales.blogspot.pe/2010/08/asparagina.html R.J.., F. (1983). Quimica Orgánica. Mexico: Iberoamericana. R.S.Kirk. (2011). Composición y análisis de alimentos de Pearson. Mexico: GRUPO EDITORIAL PATRIA.

Revista CENIC. (2013). Obtenido de http://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/losm%C3%A9todos-turbidim%C3%A9tricos-y-sus-aplicaciones-en-las-ciencias-de-la-vida Silva, C.-d. (2011). Análisis de métodos de prevención de la reacción álcali-agregado. Pernambuco. Obtenido de https://www.google.com.pe/search?q=Pernambuco&rlz=1C1CHZL_esPE750PE750&oq =Pernambuco&aqs=chrome..69i57j69i61j0l4.463j0j1&sourceid=chrome&ie=UTF-8 Tesauro, L. (2013). Biblioteca Agricola Nacional EE.UU. Beltsville. Obtenido de https://boletinagrario.com/ap-6,absorbancia,1133.html Valencia, M. (2009). RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS EN LA LECHE, HUEVO Y HARINA DE TRIGO. Quindío. Obtenido de https://www.academia.edu/34578339/RECONOCIMIENTO_DE_AMINOACIDOS_EN_ LA_LECHE_HUEVO_Y_HARINA_DE_TRIGO._RECOGNITION_OF_AMINOACID S_IN_THE_MILK_EGG_AND_FLOUR_OF_WHEAT

18 IX ANEXOS Y APÉNDICE

9.1

Anexos

Método Biuret Fuentes: Química orgánica proteínas 1y2

9.2

Apéndice 9.2.1 Apéndice 9.2.2

Solubilidad La solubilidad de un soluto en un disolvente es la concentración que presenta una disolución saturada, o sea, que está en equilibrio con el soluto sin disolver porque siempre habrá algunas moléculas o iones que pasen a la disolución. las sustancias se clasifican en: Solubles: si su solubilidad es 0,1 M o >. Poco Solubles: si su solubilidad se sitúa entre 0,1 M y 0,001 M Insolubles: si su solubilidad no llega a 0,001 M (R.J.., 1983)