Instrumentelle analyser [4] 8200275175 [PDF]

Zitiervorschau

Marit Ingebrigtsen, Gerd Nybraaten og Jan Tuxen Thingvoll

LABORATORIE­ ARBEID 4 Instrumentelle analyser

B

" Nasjonalbiblioteket Depot biblioteket

Universitetsforlaget Oslo - Bergen - Stavanger - Tromsø

© Universitetsforlaget, Oslo 1984 ISBN 82-00-27517-5

Det må ikke kopieres fra denne boka ut over det som er tillatt etter bestemmelsene i «Lov om åndsverk», «Lov om rett til fotografi» og «Avtale mellom staten og rettighetshavernes organisasjoner om kopiering av opphavsrettslig beskyttet verk i undervisningsvirksomhet». Brudd på disse bestemmelsene vil bli anmeldt.

, 0 “i

Illustrasjoner: Tove Gjertsen Liell Omslag: Tor Berglie Papir: 100 g offset Grafisk produksjon: HS-bedriftene, Oslo 1984

Forord

Laboratoriearbeid 4 er den siste boka i en serie som er utarbeidet for bruk ved kjemilaborant- og kjemiprosesslinjen i den videregående skolen. Instrumentelt analyseutstyr er kostbart å anskaffe. Utstyret vil nok variere en del fra skole til skole. Men det er vårt håp at boka kan brukes del­ vis i teoriundervisningen og delvis i praktisk laboratoriearbeid. Boka gir en oversikt over de forskjellige analysemetodene som er i bruk. Her er det behandlet enkle metoder som for eksempel måling av smelte­ punkt og brytningsindeks, men også kompliserte metoder som MS, NMR og HPCL er behandlet. De sistnevnte er ikke i bruk i den videregående skolen. Men vi tenker oss muligheten av en teoretisk gjennomgåelse, etterfulgt av ekskursjoner der det er mulig å se instrumentene i bruk. Ellers er det tatt med praktiske opp­ gaver som er mulig å gjennomføre i den videregående skolen. Marit Ingebrigtsen Gerd Nybraaten Jan Tuxen Thingvoll

Våren 1984

Innhold

Innledning 7

Oversikt over instrumentelle analysemetoder 7 1 Spektroskopiske metoder 9 1.1 Generelt 9 1.2 Synlig (UV) spektroskopi Analyse av molekyler og ioner 13 1.3 Spektrofotometer for UV og synlig lys 15 1.4 Fremgangsmåter ved spektrofotometriske målinger 17 1.5 Øvelser 21 1.6 Emisjons- og absorpsjonsspektroskopi Analyse av grunnstoff 32 1.7 Flammefotometri 34 1.8 Øvelser 38 1.9 Atomabsorpsjon spektroskopi (AA-spektroskopi) 44 1.10 Infrarød spektrofotometri (IR) eller infrarød spektroskopi 48 1.11 NMR-spektroskopi 55 2 Kromatografiske metoder 59 2.1 Generelt 59 2.2 Gasskromatografi 60 2.3 Høytrykk væskekromatografi 66

3 Elektrokjemiske metoder 70 3.1 Generelt 70 3.2 Elektrokjemiske celler 71 3.3 Faradays lov 72 3.4 Coulometri 73 3.5 Galvaniske celler 76 3.6 Potensiometriske målinger 79 3.7 Glasselektroden (pH-elektroden) 80 3.8 loneselektive elektroder 83 3.9 Referanseelektroder 84 3.10 Potensiometri 86 3.11 Øvelser 89 3.12 Potensiometrisk titrering 91 3.13 Øvelser 92 3.14 Voltametri 93 3.15 Ledningsevnemålinger - konduktometri 94 3.16 Konduktometrisk titrering 97 3.17 Øvelser 102

PH

5

4 Diverse metoder 104 4.1 Bestemmelse av tettheten av væsker 104 4.2 Bestemmelse av brytningsindeks (refraksjon) 105 4.3 Abbe-refraktometer 107 4.4 Øvelser 109 4.5 Smeltepunkt 110 4.6 Måling av smeltepunkt 111 4.7 Øvelser 114 4.8 Viskositet 114 4.9 Elektroforese 117 4.10 Massespektrometri (MS) 121 5 Appendiks 127

6

Innledning

Kjemisk analyse er grunnleggende for all kjemisk virksomhet. En funda­ mental problemstilling for kjemikeren har alltid vært å kunne skille de en­ kelte stoffene i en blanding fra hverandre. Klassiske metoder som destilla­ sjon, krystallisasjon, fraksjonerte fellinger osv., er som oftest ikke tilstrek­ kelig når det gjelder å skille de enkelte stoffene i mer kompliserte blandin­ ger. Undersøkelser har vist at kjemikeren i gjennomsnitt bruker minst 50 % av sin tid for å finne ut hva og hvor mye som finnes av ulike stoffer i ulike systemer. Økende kjemisk aktivitet og nye problemstillinger har stadig stilt større krav til kjemisk analyse. Dette har medført at kjemisk analyse etter­ hvert har utviklet seg til en egen vitenskap innenfor kjemien. Typisk for utviklingen i kjemisk analyse er at de klassiske metodene slik som man lærer dem på laboratoriekursene i kvalitativ og kvantitativ ana­ lyse, ikke strekker til når det gjelder å møte økende krav om kapasitet, ana­ lyse av komplekse blandinger og følsomhet. I stedet benyttes i dag nesten utelukkende instrumentelle metoder. Det er vanskelig å trekke klare grenselinjer mellom klassisk kjemisk ana­ lyse og instrumentell analyse. Som det ligger i navnet, er instrumentell ana­ lyse basert på bruk av kompliserte instrumenter, der vi kan måle karakteris­ tiske størrelser ved hjelp av detektorer og ved bruk av elektroniske prinsip­ per. Vi skal imidlertid få se at en del av de metoder som vi skal stifte be­ kjentskap med, ikke forutsetter særlig avansert utstyr. I noen tilfeller kom­ binerer vi klassiske prinsipper med instrumentelt utstyr. En karakteristisk egenskap ved instrumentelle metoder er at måleresultatene sjelden er abso­ lutte i samme grad som for klassiske metoder. Derfor er vi henvist til å be­ nytte oss av analysestandarder for å kalibrere instrumentene. Analysestandardenes innhold av aktuelt stoff er i siste omgang basert på analyse ved hjelp av klassiske prinsipper som gravimetri eller titrer analyse. La det imidlertid være klart at de klassiske metodene og teoriene bak dem, fremdeles er av fundamental betydning også innenfor instrumentell analyse.

Oversikt over instrumentelle analysemetoder Spektroskopiske metoder Spektroskopiske metoder kan vi dele inn i 2 underklasser: a) Absorpsjonspektroskopiske metoder som er basert på at kjemiske stof­ fer absorberer elektromagnetisk stråling. 7

b) Emisjonspektroskopiske metoder som er basert på at kjemiske stoffer kan sende ut (emittere) elektromagnetisk stråling (røntgen, ultrafiolett, synlig, infrarød), når de tilføres riktig type energi i tilstrekkelig mengde. Den mengden og den typen stråling som en prøve absorberer, står i forhold til sammensetningen av prøven. Strålingsstyrken og bølgelengdene på strå­ lene som sendes ut ved emisjonsspektroskopi, forteller også noe om hvilke stoffer vi har og hvor mye.

Kromatografiske metoder

De kromatografiske metodene som utgjør en hel familie av metoder, gjør det i dag langt på vei mulig for kjemikeren å realisere en gammel drøm om å kunne separere, isolere og identifisere kjemiske forbindelser. Det kro­ matografiske grunnprinsippet består i at de enkelte kjemiske forbindelser i en blanding vil vandre med forskjellig hastighet, når de ved hjelp av en be­ vegelig fase (gass eller væske) transporteres gjennom en fastliggende fase (væske eller fast stoff).

Elektrokjemiske metoder Metodene er basert på å måle ulike elektriske størrelser (spenning, resistans, strømstyrke). Metodene gir både kvalitative og kvantitative infor­ masjoner om den aktuelle prøven.

Diverse metoder

Denne usystematiske «sekken» av metoder, som ikke har noen prinsipiell «fellesnevner», er nesten ubegrenset i omfang. Her skal vi bare gi noen få eksempler: bestemmelse av viskositet, densitet, refraksjon, smeltepunkt, elektroforese og massespektrometri.

8

1 Spektroskopiske metoder

1.1 Generelt Spektroskopi betyr registrering og undersøkelse av spektrer. Opprinnelig hadde vi bare mulighet til å studere det synlige spektret vi får når vi sender lys gjennom et prisme, og lyset blir spaltet. Spektroskopi er nå utvidet til å gjelde undersøkelser av all elektromagne­ tisk stråling. For å forklare bruken må vi gå inn på litt lys- og atomteori.

Figur 1. Spalting av hvitt lys ved hjelp av et prisme.

Lysteori Lys (elektromagnetisk stråling, forkortet Ems) er en form for energi som kan gå gjennom lufttomt rom, gasser, væsker og stoffer om de ikke er i for tykke lag. Lys kan vi best beskrive som en rettlinjet bevegelse av bølgenatur, sam­ tidig som det har partikkelegenskaper. Røntgenstråler og radiobølger er også elektromagnetiske bølger, og for­ skjellen ligger i hvor fort bølgene svinger. En bølge som svinger fort har en kort bølgelengde, mens en bølge som svinger langsomt har en lang bølge­ lengde. Avstanden fra en bølgetopp til en bølgetopp kaller vi en bølgelengde, forkortet Å (lambda). i-X-i

l---------

X------- 1I

I---------

X------ 1 f-

Vi måler bølgelengde i meter. Men de områdene vi er mest interessert i, har så små bølgelengder at vi bruker benevningen nanometer (1 nanometer = 1 nm = 10“9 meter). I figur 3 ser vi at synlig lys har en bølgelengde på rundt 5 • lO-6 m. Dette tilsvarer 500 nm. Synlig lys har bølgelengde fra ca. 400 nm (fiolett) til ca. 800 nm (rødt).

9

Figur 2. Elektromagne­ tiske bølger kan ha kort eller lang bølgelengde.

Bølgelengde, nanometer LU Z LU LU O LU

Figur 3. Det elektro­ magnetiske spektret. Den synlige delen er vist forstørret.

All stråling forplanter seg med samme hastighet i lufttomt rom lik lysets hastighet som er ca. 3 • 108 m/s. Sammenhengen mellom bølgelengde og energi ser vi av Plancks likning: E = h • — Å

Både h (Plancks konstant) og lyshastighetén, c, er konstanter. Altså vil energien, E, øke når bølgelengden, A, minker. Ultrafiolett stråling (UV) har kortere bølgelengde enn både synlig lys og infrarødt lys (IR, varmestrå­ ling), og er altså mer energirik enn disse.

Atomteori Vi husker fra innføringen i generell kjemi at et atom består av en kjerne med en positiv ladning og med elektroner som beveger seg i baner i visse, helt bestemte avstander fra kjernen. 10

Figur 4. Bohrs atommodell.

Hvert skall eller hovedenerginivå har elektroner i forskjellige orbitaler eller underenerginivåer. Innerste elektronbane har lavest energi. Ytterste elektronbane har høyeste energi.

Ved tilførsel av energi, ved varme eller stråling, kan et eller flere elektro­ ner ta denne energien opp i seg og på den måten løftes opp i et høyere ener­ ginivå. Vi sier at elektronet eller atomet blir eksitert. Men snart vil elektronene falle tilbake til sitt grunnivå, og da vil ned­ gangen i stillingsenergi avgis i form av stråling. Vi sier at det blir emittert

Figur 5. Absorbering og emittering av lys.

Energi

Energi i form av stråling

Av figur 5 ser vi at ved tilførsel av energi vil stoffets energi øke fra Ex til E2. Stoffet absorberer energi lik Æ. E2 er en ustabil tilstand for stoffet, og når energitilførselen stopper, vil det vende tilbake til grunntilstanden E\. Da frigjøres energimengden Æ, som emitteres. 11

Vi sier at atomet absorberer energi når atomet eller elektronet tar opp energi, og at atomet emitterer energi når det gir fra seg energi i form av stråling. Hvert atom, ion eller molekyl absorberer/emitterer bare helt karakteris­ tiske energi-pakker, det vil si stråling av en helt bestemt bølgelengde som til­ svarer de hoppene elektronene kan gjøre. Det er dette vi utnytter til kvalitative og kvantitative analyser under samlingsnavnet spektroskopiske analyser, hvor vi enten måler absorbert eller emittert energi.

Tabell 1. Absorpsjonsspektroskopi Spektroskopisk metode

Spektralområde

Analyser/studier av

Viktigste anven­ delsesområde

synlig

synlig (400-800 nm)

molekyler/ ioner

kvantitativ

UV

ultrafiolett

molekyler

kvantitativ

IR

infrarød (4000-400 cm’1)

molekyler

kvalitativ

AA (atomabsorpsjon)

UV

atomer

kvantitativ

NMR (nuclear magnetic resonance)

radiobølge 60-40 MHz

atomkjerner

kvalitativ

Tabell 2. Emisjonsspektroskopi

Spektroskopisk metode

Spektral­ område

Analyser/ studier av

Viktigste anven­ delsesområde

Røntgen-fluorescens

Røntgen 10-8-10~12m

atomer

kvalitativ og kvantitativ

Atom-fluorescens

UV/synlig

atomer

kvantitativ

Flammefotometri

UV/synlig

atomer

kvantitativ

Emisjonsspektrografi

UV/synlig

atomer

kvalitativ og kvantitativ

Molekyl-fluorescens

UV/synlig

molekyler

kvantitativ

Fosforescens

UV/synlig

molekyler

kvantitativ

12

1.2 Synlig (UV) spektroskopi Analyse av molekyler og ioner Teori Ved disse analysene sender vi elektromagnetisk stråling gjennom prøven, og måler hvilke bølgelengder som blir absorbert av prøven. Analysene baserer seg på Beers lov: Mengden av lys som absorberes (A) av en løsning, er proporsjonal med indre bredde av kuvetten, kalt lysveien (b), og med konsentrasjonen av stoffet i løsningen (c). a er en konstant kalt absorptiviteten. A = a-b-c

Figur 6. Beers lov.

Av figur 6 ser vi at når konsentrasjonen øker, vil absorpsjonen øke tilsva­ rende (proporsjonalt). Hvis vi avsetter konsentrasjonen som funksjon av absorpsjonen, skulle vi få en rett linje. Med økende konsentrasjon vil kurven ofte avvike noe fra en rett linje. Da snakker vi om avvik fra Beers lov. Beers lov gjelder bare for fortynnede løsninger med konsentrasjoner lavere enn 0,01 M. Hvis denne grensen overstiges, endres forløpet til kurven. Men avviket kan skyldes andre årsaker som:

a) instrumentelle årsaker: dårlig monokromatorsystem som ikke bare gir lys av en bølgelende (ikke monokromatisk lys).

b) kjemiske årsaker:

stoffet vi måler inngår i kjemiske likevekter, og det går over i andre former under måling.

Figur 7 viser at det ikke er noe i veien for å benytte den ikke-lineære delen av kurven, når den er blitt fastlagt på grunnlag av standarder (kjente kon­ sentrasjoner). Hvis vi bruker den rette linjen i det området der den avviker fra Beers lov, vil vi avlese for lav konsentrasjon.

13

Figur 7. Avvik fra Beers lov.

Enheter for absorpsjon Hvor mye lys som er blitt absorbert i prøven, kan vi uttrykke på flere måter. Sendes lys av intensiteten /0 inn i prøven, vil intensiteten ha sunket til I når strålen kommer ut av prøven. Vi vil da ha Io > /(likhetstegn når ingen absorpsjon har funnet sted). Forholdet I/Io uttrykker en måte å angi energiminskningen på. Dette forholdet kalles transimittansen med symbol T, og angir den brøkdel av den opprinnelige intensitet som kommer ut av prøven.

Transmittans = T = — /o Verdien av T vil ligge mellom 1 og 0. T = 1 vil si at ikke noe lys er blitt absorbert, og T = 0 vil si at alt lys er absorbert. Multipliserer vi Tmed 100, får vi prosent transmittans.

% T = 100 T = 1004)

% T vil variere mellom 100 og 0.

a) Ci

Figur 8. Transmittans.

b) c i

c) c2 = 2 - Ci

I figur 8 er det vist at det transmitterte lyset ikke minsker rettlinjet når kon­ sentrasjon og lysvei øker jevnt. En lysmengde med intensitet /0 blir sendt inn mot tre prøveløsninger som varierer i lysvei og (b) og konsentrasjon (c).

14

Ut fra dette er det hensiktsmessig å innføre begrepet absorbans (A).

A = lg 4 = - 18 T = - >8 T 1 yo

Av sammenhengen mellom A og T ser vi at når T varierer mellom 1 og 0, vil A samtidig variere mellom 0 og uendelig. % Tog/eller A benytter vi som ordinatverdi i absorpsjonsspektrer eller de inngår i beregninger. Det er derfor viktig å bli fullt fortrolig med hva disse størrelsene står for, og sam­ menhengen mellom dem. I figur 9 er skalaen for % T og A tegnet under hverandre. 20 50 100 80 —? % i1 1f 1 1 I * 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 00 0,70 0,097 0,30 Q i------- i-------- i------- 1-------H------- 1-------- H---- 1--------1-------- F------- 1 A

T

Figur 9. Sammenhen­ gen mellom transmittans og absorbans.

Av figuren ser vi at absorbansen øker når % Tavtar, og omvendt. Ska­ laen på spektrofotometeret viser både prosent transmittans (% 7) og absor­ bans (A). Oppgave: Fremstill funksjonen A = - lg Tgrafisk.

1.3 Spektrofotometer for UV og synlig lys I figur 10 er den skjematiske oppbygningen av et spektrofotometer vist. (a) Strdle kilde

(c)

(b)

(d)

(e)

lys

0-

Vi0

Skriver

Figur 10. Skjematisk oppbygning av et spektrofotometer.

(g) 15

En strålekilde (a) emitterer lys av mange bølgelengder. Strålen går gjennom en monokromator (b). Ut fra den kommer lys av en bestemt bølgelengde, monokromatisk lys. Bølgelengden kan vi variere ved å dreie monokromatoren. Strålen går så gjennom prøven (c), før den faller på en passende de­ tektor (d) som sammen med tilhørende elektronikk (e) måler intensiteten I av strålen. Et spektrofotometer består av følgende komponenter:

Lyskilde For synlig lys benyttes en wolframlampe. Lampen gir lys med bølgelengde fra 320-2500 nm. I det ultrafiolette området (UV) benytter vi som regel en hydrogen- eller deuteriumlampe, som avgir lys med bølgelengde fra 180— 350 nm.

Monokromator Monokromatorsystemets oppgave er å isolere en bestemt bølgelengde ut fra det kontinuerlige lysspektret fra lyskilden. Det kan vi gjøre ved å bruke et filter, prisme eller gitter sammen med spalter.

FAST SPALTE eller ..SLIT"

Figur 11. Prinsipp­ skisse av en monokro­ mator.

SKYVBAR UTGANGSSPALTE

Detektorer Fotoelektriske detektorer overfører strålingsenergi til elektriske signaler. Signalene kan vi lese av på en skala, som lysende siffer på en skjerm (digitalavlesning) eller som utskrifter på en skriver. Datateknikken blir også mer og mer tatt i bruk for avlesning og utregning av verdier.

16

320 nm

1000 nm SYNLIG SPEKTRUM

ULTRAFIOLETT

hbyf jell sol

FIOLETT | INDIGO | BLÅTT | GRONT | GULT | ORANSJE | RODT

500

ca. 380

600

INFRARODT

ca. 7-800 nm ca. 780

Den dominerende bruken av UV-synlig spektroskopi er for kvantitative analyser. De fleste metoder er basert på målinger i det synlige spektralområdet og ved bestemte bølgelengder. Til disse analysene er det vanligvis til­ strekkelig med enkeltstråleinstrument. Instrumenter som måler UV-absorpsjon er nesten alltid et dobbeltstråleinstrument. De vil i de aller fleste tilfellene dekke det synlige området også. Instrumentet har et monokromatisk speil som splitter det monokromatiske lyset i to stråler, den ene går gjennom prøveløsningen, den andre gjennom blindprøven. Detektoren korrigerer for blindprøvens absorbans, slik at en leser av prøveløsningens absorbans. Figur 13 viser et enkeltstråle­ instrument. En viktig forskjell mellom UV og synlig spektroskopi, er at i UV må vi bruke optiske komponenter (prisme, linser) og kyvetter som er laget av kvarts. Glass stopper UV-lys.

varmestråler

Figur 12. Skala for stråling.

monokromator

Figur 13. Skjematisk diagram av et enkeltstrålespektrofotometer. Speilet kan settes i to forskjellige stillinger slik at instrumentet kan benyttes både i det synlige og det ultrafio­ lette (UV) spektralområdet.

deuteriumlampe(UV)

1.4 Fremgangsmåter ved spektrofotometriske målinger Krav til forbindelser som skal analyseres For å kunne foreta målinger i det synlige området, må det foreligge en far­ get forbindelse. Mangan for eksempel er farget i forbindelsen Mn04“, krom i Cr2072”. Hvis stoffet som skal analyseres ikke er farget, må vi tilsette en reagens som reagerer med det aktuelle stoffet til en farget forbindelse. I UV-området måler vi ufargede forbindelser. De absorberer UV-lys for­ di de inneholder dobbeltbindinger. 2 - Laboratoriearbeid

17

Bruk av spektrofotometer a) Vi nullstiller instrumentet når alt lys fra lyskilden er sperret, °/o T = 0. b) Vi innstiller 100% T mens blindprøven står inne. Dette må vanligvis gjentas med visse mellomrom i løpet av en større måleserie på grunn av spenningsvariasjoner på lysnettet. c) Kjente og ukjente løsninger settes inn, og deres % T- eller Æverdier av­ leses.

Når vi skal utføre en ny spektrofotometrisk analyse, er det 3 kurver vi ar­ beider ut i fra og tar hensyn til:

- absorpsjonsspektrum - tidskurve - standardkurve

Figur 14. Kurve for absorpsjonsspektrum.

Absorpsjonsspektrum Ethvert stoff har sitt absorpsjonsspektrum. Det er «fingeravtrykket» til stoffet. For å ta opp det kan vi bruke nær sagt hvilken som helst konsentra­ sjon av stoffet, bare vi holder oss innen absorpsjonsskalaen. Spekteret vil vise samme bilde uansett konsentrasjon. Vi bruker absorpsjonsspektret til å finne ut ved hvilke bølgelengder vi skal gjøre målingene. Det kan være flere hensyn å ta ved valg av analytisk bølgelende. 1 Vi må ha høy nok absorbans til å bestemme lave konsentrasjoner. 2 Et stoff kan ha flere absorpsjonsmaksima (flere topper). Ikke velg sla­ visk den bølgelengden som gir høyest absorbans. Er denne toppen bratt, vil du få problemer med å innstille instrumentet likt fra dag til dag. Ør­ små variasjoner i bølgelengde gir opphav til store variasjoner i absorbansen. Velg om mulig en bred topp. 3 En avlesning nede i UV-området krever kvartskyvetter og spesiallampe. Dette utstyret koster mye mer enn det du trenger i det synlige området. Det skal du altså ikke velge dersom det ikke er nødvendig.

18

TIDSKURVE

Figur 15. Tidskurve.

Tidskurve En tidskurve setter vi opp for å finne ut hvor lang tid det tar fra vi tilsetter det reagenset som gir fargen, til vi har oppnådd maksimal fargeutvikling. Vi tilsetter reagenset, blander, overfører raskest mulig til kyvettene og leser så av absorbansen med jevné mellomrom, for eksempel hvert 2. minutt. Fargeutviklingen kan ta forskjellig tid etter hvilken konsentrasjon vi har av stoffet. Vi bør sette opp tidskurve på f.eks. laveste og høyeste standard for å finne det tidspunktet hvor alle har nådd stabil farge. Det hender også at fargen ikke er stabil, men blekner etter en stund. Da må vi passe på å lese av analysen innen et visst tidsrom. Er dette tidsrommet kort, må vi ikke sette opp flere prøver enn det er mulig å lese av på kort tid. Vi bør sette opp tidskurve på en vanlig prøve også, for å sjekke at fargeutviklingen her er lik den vi har i standardene. Det hender at prøven kan inneholde stoffer som enten kan hemme fargeutviklingen eller som gjør at fargen bare er stabil kort tid. Det vil igjen si at vi får en strammere tidsramme å arbeide med. Vanligvis er det oppgitt i analyseforskriften hvor lang tid vi må vente før vi kan gjøre avlesningen.

Standardkurve En standardkurve eller en kalibreringskurve lager vi ved å måle absorban­ sen for 3-5 løsninger med kjente konsentrasjoner, og avsetter verdiene gra­ fisk med konsentrasjon som x-akse og absorbans som y-akse. En standardkurve setter vi også opp for å finne ut hvor langt analysen følger Beers lov. Konsentrasjonen i en ukjent prøve kan vi bestemme på to måter: 1) Vi kan lese av absorbansen på prøven og finne hvilken konsentrasjon det tilsvarer på standardkurven. 2) Vi kan bruke en av standardene og regne om etter den. Mest nøyaktig blir resultatet om vi velger en standard med absorbans tilnærmet lik prøvens: 19

- absorbans A = 0,450 standard - absorbans Ax = 0,500 prøve Eksempel:

Figur 16. Krum og rett­ linjet standardkurve.

20

Konsentrasjonen av standard 4 mg/1 Konsentrasjonen av prøve X

De to måtene følger samme prinsipp. Mens det kan greie seg med 3-5 forskjellige konsentrasjoner på en lineær kurve, må vi på en krum kurve ha det mangedobbelte for å finne beliggen­ heten nøyaktig. Er du i tvil om kurven er rettlinjet, så mål absorbansen på flere konsentrasjoner. Standardkurve for bestemmelse av X I figur 17 er det tegnet en standardkurve for bestemmelse av X.

Alle punktene skal du avmerke tydelig. En enkel måling som tydelig fal­ ler utenfor en tenkt linje gjennom de andre punktene, lar vi gå ut. Deretter trekker vi kurven opp som et gjennomsnitt av punktenes absorbansverdier. Det gir ofte en kurve hvor det er like mange punkter over som under kur­ ven.

Husk: 1 Alle nødvendige opplysninger skal stå på forsiden! 2 Benytt ikke standardkurven på andre apparater enn det apparatet den er satt opp på. Alle apparater er individualister. (Bl.a. variasjoner i falsklys). 3 Avviker kurven fra Beers lov, benytter vi den bare i det rettlinjede områ­ det. (Forutsatt at det ikke er en buet standardkurve.) 4 Velg en skala som gir kurven en vinkel på 35-45 °C, og som samtidig er lett å lese av. 5 Bruk ikke den samme standardkurven over lenger tid uten å sjekke at den er i orden. Variasjoner i kjemikalier og variasjoner i f.eks. falsklys (falsklys er ikke konstant over tid) kan forandre standardkurven.

1.5 Øvelser Forsøk 1. Bestemmelse av jern som FeSCN2+ Generelt Jern har vært framstilt og brukt av menneskene fra svært lang tid tilbake (3-4000 f.Kr.). Det er det mest brukte av alle metaller fordi det foreligger i store mengder i naturen, og det er både lett og billig å framstille. Dessuten er det mulig å lage jernlegeringer og stållegeringer med helt forskjellige egenskaper ved forskjellig behandling og tilsetninger. Jern forekommer i naturen i praktisk talt alle bergarter og mineraler, i jordsmonnet, i planter og dyr. Jern er også en viktig bestanddel i blodets hemoglobin, som fungerer som bærer av oksygen til cellene i kroppen. Analyse av jern som FeSCN2+ er tilfredsstillende for bestemmelse av små mengder jern i vann fra springen, vann fra jernholdige innsjøer, og for bestemmelse av jern i forskjellige jerntabletter og jernpreparater.

21

Ved svært nøyaktig bestemmelse av spormengder av jern må andre og mer spesifikke reagenser erstatte tiocyanat. Her skal vi bare nevne de så­ kalte fenantrolinene (1,10-fenantrolin og batofenantrolin), 2,2-bipyridin og nitro-R-saltet.

De kjemiske prinsippene for analysen Treverdig jern reagerer med tiocyanat og danner et sterkt rødfarget kom­ pleks. Reaksjon: Fe3+ + SCN

FeSCN2+

Dette er av flere grunner ingen ideell analysemetode for bestemmelse av jern. Fe3+ danner en rekke forbindelser med SCN- avhengig av hvor mye reagens som brukes. Med økende mengde SCN" dannes Fe(SCN)2+, Fe(SCN)3 eller Fe(SCN)63". Men heldigvis er alle disse forbindelsene rødfargede og absorberer mest lys ved bølgelengder på omkring 470 nm. FeSCN2+ komplekset er ustabilt, og fargen avtar med tiden hvis vi ikke tar spesielle forholdsregler. Fe3 + er et lite ion med høy ladning. I vannløsninger vil ionet hydrolysere sterkt og danne Fe(OH)2+. Reaksjon: Fe3+ + H2O

Fe(OH)2+ + H+.

Dette vil resultere i at konsentrasjonen av Fe3+ minker og følgelig også konsentrasjonen av Fe(SCN)2+ og fargen på løsningen. Men ved å tilsette syre (H + ), kan vi skyve likevekten over mot venstre igjen. Fe3+ ioner vil bli frigjort, de vil reagere med SCN-, og fargeintensiteten vil øke. Fargen på løsningen vil også avta med tiden fordi SCN- er i stand til å redusere Fe3+ til Fe2+. Forbindelsen mellom Fe2+ og SCN- (FeSCN+) er fargeløs. Tilsetning av salpetersyre vil ha to gunstige virkninger. Den er i stand til å oksidere Fe2+ tilbake til Fe3 + , og samtidig inneholder den H + ioner. Dermed vil rødfargen forbli stabil så lenge som det er salpetersyre og overskudd av reagens til stede. Det er mange metallioner som danner forbindelser med SCN- (Hg2+, Cu2, Bi3+, Zn2+, Mn2+, Ni2+, Co2+),men disse forbindelsene har en annen farge enn FeSCN2+ og vil ikke forstyrre så lenge vi har overskudd av rea­ gens. En nøyaktig jernbestemmelse er også avhengig av om det er forstyrrende anioner slike som fosfat, fluorid eller oksalat til stede i prøveløsningen for­ di disse anionene danner meget stabile forbindelser med Fe3 +. Eksempel: Fe3+ + 6 F-

FeF63- (likevekten ligger langt mot høyre).

Utførelse

Lever inn en ren 100 ml målekolbe og merk den med navn og laboratorieplass. Du vil få utlevert en ukjent jernløsning i kolben. Konsentrasjonen av 22

jern (mg/I) skal du bestemme spektrofotometrisk/kolorimetrisk etter at løsningen er tilsatt destillert vann til merket. Anm.: Tiden som går med til denne øvelsen er avhengig av hvor mange reagensløsninger som er laget i stand på forhånd.

Reagenser A Reagensløsning: 3 M NH4SCN Løs 4 gram fast NH4SCN i 100 ml destillert vann i en erlenmeyerkolbe. Merk kolben.

B Stamløsning 1: 100 mg Fe pr. liter Vei inn nøyaktig 0,848 g FeC^b H2O. Hell stoffet i en 1000 ml målekolbe. Tilsett ca. 10 ml konsentrert saltsyre og fortynn med destillert vann til 1000 ml merket på målekolben. Bland godt. Anm.: FeCl3 • 6 H2O bør være av kvaliteten pro analyse (pa) som inne­ holder minimum 99% jern(III)klorid. Stoffet tar lett opp fuktighet og blir flytende om kjemikaliekrukka blir stående åpen. Den egner seg derfor dår­ lig som utgangsstoff for tillaging av standard. Vi sier at den ikke er en pri­ mær standard. En bedre og mer nøyaktig standardløsning kan en lage ved å veie inn 0,10 g av en jerntråd (blomsterbindertråd), tilsette ca 10 ml kon­ sentrert saltsyre i et begerglass, overføre løsningen til en 1000 ml målekolbe og tilsette destillert vann til merket. C Stamløsning 2: 12 mg Fe pr. liter Pipetter ut 12 ml av stamløsning 1, overfør volumet til en 100 ml målekolbe og fortynn til merket med 0,5 M HC1. D Ukjent jernprøve Hver elev får utlevert et nøyaktig volum (fra 20 ml til 40 ml) av stamløsning 2 som ukjent prøve. Bare læreren kjenner til dette volumet. Fortynn til 100 ml merket med 0,5 M HC1. Anm.: Konsentrasjonen av den ukjente prøven beregner læreren etter formelen:

mg Fe -

12mg/l • F (ml) 1000 ml/1

V - det utmålte volumet av stamløsning 2.

Spesielt interesserte kan bestemme jerninnholdet i jerntabletter som er kjøpt på apotek. (F.eks. Duroferon inneholder 100 mg Fe hver.) Løs en tablett i 10 ml konsentrert HC1 i et begerglass. Tilsett 50 ml destillert vann og filtrer fra det uløste som er fyllstoffer. Hell løsningen på 100 ml måle­ kolbe og fortynn til merket med destillert vann. Pipetter ut 10 ml av løsnin­ gen på en ny 100 ml målekolbe og fortynn til merket med 0,5 M HC1. Be­ stem jernkonsentrasjonen i løsningen ved å bruke samme framgangsmåte som for de ukjente. Beregn hvor mange mg Fe jerntabletten inneholdt. Ta hensyn til fortynningene som er gjort.

23

E Standardløsninger

Sett fram 8 reagensglass og merk dem med tall fra 0-8. Bland sammen rea­ gensene i de mengdene som er angitt i tabellen nedenfor. Bruk både pipette og byrette til utmålingene. Legg merke til at vi behandler den ukjente prø­ ven samtidig med standardene:

Reagensglass nr. ml stamløsning 2 ml ukjent prøve ml 4 M HNO3 ml dest. vann ml 3 M NH4SCN ml totalt

0 0

1

1 10 1 12 ml

1,0

2 2,0

1 9 1 i hvert

1 1 1 8 7 6 1 1 1 reagensglass

3 3,0

4 4,0

5 0 10 1

6 0 10 1

7 0 10 1

1

1

1

Spektrofotometrisk måling 1 Opptak av absorpsjonskurve. Vi stiller først apparatet på 100 % transmittans (100 % T) (tilsvarer 0 A) ved hjelp av blindprøven (reagensglass 0). Still så inn 0% T som er beskrevet i apparatets bruksanvisning. Bruk den sterkeste standarden til å ta opp en absorpsjonskurve for det rødfargede komplekset. Dette gjøres ved å måle absorbansen av løsningen ved 700 nm, ved 680 nm, 660 nm ... og så videre ned til 400 nm. Framstill resultatene i et koordinatsystem med bølgelengden (nm) som xakse og absorbansen (A) som _y-akse. Bestem bølgelengden hvor jernkomplekset absorberer mest. I litteraturen er maksimum absorbans oppgitt til 468 nm. 2 Opptak av standardkurve. Mål absorbansen av hver av løsningene i reagensglass 1-7, og før resulta­ tene inn i en lignende tabell som vist nedenfor.

Reagensglass nr. mgFe/1 Absorbans

1 1,0

2 2,0

3 3,0

4 4,0

5 x

6 x

7 x

Eksempel: konsentrasjonen av standarden i reagensglass nr. 1 beregnes slik: mgFe/1 = 12 mg/l

11111

—— = 1 mg/l

1 ml + 1 ml + 9 ml + 1 ml

Lag et koordinatsystem med konsentrasjon (mg/l) som x-akse og absor­ bans somy-akse, og merk av resultatene dine. Standardkurven er den beste rette linje som du kan trekke gjennom punktene. Bestem konsentrasjonen, Cx, av den ukjente prøven. 24

Bestem hvor mange mg jern det var i den utleverte prøven ved hjelp av formelen: mg Fe = C l2(ml) - 0 11 8

x \ 1 / 10(ml)

’

12

— = fortynningsfaktoren

0,1 1 = 100 ml = volumet av prøveløsningen.

Forsøk 2. Spektrofotometrisk bestemmelse av mangan som MnO4" Generelt Mangan finnes i naturen i malmer og bergarter og ofte sammen med jern. Anvendelsen av mangan er også nært knyttet til jern. Nesten alt mangan som vi utvinner, brukes til framstilling av stållegeringer med forskjellig manganinnhold. En nyere og hittil mer beskjeden anvendelse av mangan er som tilsetningsstoff i bensin som erstatning for bly. Manganforbindelsen, MMT (wetylsyklopentadienylznanganZrikarbonyl) har tilnærmet den samme virkningen som tetraetylbly (TEB) med hensyn til bankefastheten, men det gunstige er at manganforbindelsene som dannes ved forbrenningen er langt mindre giftige enn de tilsvarende blyforbindelsene. Mangan opptrer i svært mange oksidasjonstrinn, og de har forskjellige farger. I denne analysemetoden benytter vi oss av at mangan danner en sterkt farget (rødfiolett) oksygenforbindelse, permanganat (MnO4~) i sitt høyeste oksidasjonstrinn. Forskriften nedenfor har stor anvendelighet og kan brukes til å bestemme mangan i malmprøver, forskjellige stållegeringer og vannløsninger hvor det forekommer små mengder mangan.

De kjemiske prinsippene for analysen En sur løsning av mangan(II) lar seg oksidere til mangan(VII) permanga­ nat, ved hjelp av det meget kraftige oksidasjonsmidlet kaliumperjodat (KIO4).

Reaksjon: 2 Mn2+ + 5 IO4~ -I- 3 H2O = 2 MnO4 + 5 IO3 + 6 H+. Reaksjonen går sakte i kald oppløsning, men går mye raskere ved opp­ varming til koking. Oppvarming øker også løseligheten av KIO4. Reaksjonen ovenfor er så godt som spesifikk for mangan. På grunn av den høye fargeintensiteten på MnO4” ionene kan analysen benyttes til å be­ stemme svært små mengder mangan, helt ned til 1 mg pr. liter. Permanganationene er ustabile og lar seg spalte til brunstein (MnO2) av sollys, varme, syrer, baser og mangan(II)salter. Det kan vi forhindre ved å bruke et stort overskudd av KIO4. Permanganationene som er blitt redu-

25

sert til brunstein, vil da umiddelbart bli oksidert tilbake av overskuddet KIO4. Fargen på permanganatløsningene kan således holde seg stabile og uforandret i flere uker. Hvis analysen går ut på å bestemme mangan i malm eller stål, vil prøven inneholde store mengder jern. Det kan forstyrre analysen om vi ikke tar de nødvendige forholdsreglene. En saltsur løsning av jern(III) vil være sterkt gulfarget på grunn av ionene FeCl4‘. lonene absorberer en del lys ved den samme bølgelengden som vi benytter til bestemmelse av mangan. Denne interferensen kan vi fjerne ved å tilsette noen ml fosforsyrer. H3PO4 dan­ ner nemlig en stabil og fargeløs forbindelse med Fe3+ ionene. Vi kaller det for å maskere jern(III) ionene.

Utførelse Lever inn en ren 150 ml erlenmeyerkolbe og merk kolben med navn og laboratorieplass. I kolben vil det bli utlevert en manganløsning, og oppgaven din blir å bestemme hvor mange mg mangan den ukjente prøven innehol­ der. Prøven skal du tilsette reagenser og behandle som angitt i forskriften nedenfor (pkt. E). Prøven inneholder mangan i området 40 mg-60 mg. Reagenser A Stamløsning - 200 mg Mn pr. liter En stamløsning som inneholder 200 mg Mn pr. liter er ferdiglaget. Den er laget ved å veie inn nøyaktig 0,6152 g MnSO4H2O. Denne mengden har blitt overført til en 1000 ml målekolbe og tilsatt destillert vann opp til mer­ ket.

B Stamløsning - 50 mg Mn pr. liter Pipetter ut 25 ml av stamløsningen ovenfor og overfør den til en 150 ml erlenmeyerkolbe. Tilsett 4 ml fosforsyre og ca 0,4 g kaliumperjodat og kok løsningen i 5 minutter. Anm.: Rekkefølgen for tilsetning av reagensene er viktig. Tilsetter vi KIO4 før H3PO4, blir løsningen grumsete av brunstein, og dette vil ødeleg­ ge for den videre analyse. Brunstein kan du fjerne ved å tilsette noen dråper fortynnet natriumsulfitt og koke ut overskudd av SO2. Men dette vil ta lengre tid å gjøre enn å lage ny stamløsning. Avkjøl løsningen og hell den i en 100 ml målekolbe. Skyll erlenmeyerkolben 2-3 ganger med litt destillert vann og hell det opp i samme målekolben. Tilsett destillert vann opp til merket. Bland godt. Anm.: Vi kaller dette å overføre løsningen kvantitativt. C Standardløsninger Lag fire standardløsninger med forskjellig manganinnhold ved å pipettere ut 5 ml, 10 ml, 20 ml og 30 ml av stamløsning B i hver sin erlenmeyerkolbe. Tilsett destillert vann slik at totalvolumet i hver kolbe blir 100 ml.

Eksempel: Den svakeste standarden inneholder:

50mg/l--A?L = 2,5mgMn/l 100 ml

26

D Blindprøve En blindprøve lager vi ved å bruke samme framgangsmåte som for stamløsning B, men med 25 ml destillert vann i stedet for manganløsning. Det er til­ strekkelig nøyaktig å fortynne blindprøven på samme måte som den ster­ keste standarden, og bruke løsningen som blindprøve. Anm.: Destillert vann inneholder ubetydelige mengder mangan. Dess­ uten absorberer verken fosforsyre eller kaliumperjodat lys ved den samme bølgelengde som den vi benytter ved bestemmelse av mangan. Derfor kan vi sløyfe tillaging av blindprøven uten at det går ut over metodens nøyaktig­ het.

E Ukjent prøve Hver elev får utlevert et nøyaktig volum på mellom 20 ml og 30 ml av stamløsning A. Bare læreren kjenner volumet. Anm.: Læreren beregner antall mg mangan i den ukjente prøven etter formelen: 200 mg/l • V (ml) mg Mn = 1000 ml/1

V = volumet (ml) av manganløsningen som er utmålt.

Tilsett ca 4 ml H3PO4 og ca 0,4 g KIO4 og kok oppløsningen i 5 minut­ ter. Avkjøl og overfør løsningen kvantitativt til en 100 ml målekolbe. Til­ sett destillert vann til merket. Bland godt.

Nødvendig fortynning Den ukjente prøven har mye større konsentrasjon enn standardløsningene og må derfor fortynnes. Det er passelig å pipettere ut 25 ml av prøveløsningen, overføre den til en målekolbe og tilsette destillert vann til totalvolumet blir 100 ml. Eksempel: La oss anta at eleven har fått utlevert 24,4 ml av en ukjent prøve (stamløsning A). Den er blitt tilsatt reagenser og tilsatt destillert vann til 100 ml.

Konsentrasjonen av ukjent prøve: 200 mg/l • 24’4

(utl,evert) = 48,8 mg/l 100 ml

-------------

Konsentrasjonen av prøven etter fortynning 48,8 mg/l 25 ml (utPipettg). = 12,2 mg/l 100 ml

-------------

Vi ser at konsentrasjonen er i samme området som standardene, 2,5 mg/l-15 mg/l.

E Spektrofotometrisk måling 1 Studer absorpsjonskurven (absorpsjon som funksjon av bølgelengden) nedenfor, og velg en bølgelengde som vil egne seg til bestemmelse av man­ gan. Konferer med læreren. Still inn spektrofotometeret på bølgelenden.

27

2 Sett spektrofotometeret på 100% transmittans (100% T, tilsvarer 0 A) med destillert vann i kyvetten(e). Sett deretter apparatet på 0 % T (tilsvarer) uendelig A) slik som angitt i bruksanvisningen.

3 Mål absorbansen for blindprøven, hver av standardene og den ukjente prøven. Start med standarden som inneholder minst mangan. Anm.: Det er tilstrekkelig å skylle kyvetten en gang med den neste løsnin­ gen som vi skal måle absorbansen for. Ta tre parallelle absorbansmålinger av den ukjente prøven. Bruk ny løsning for hver måling. Før resultatene inn i en lignende tabell som nedenfor. A

mg Mn/1 4 Sammenlign fargen på den ukjente prøveløsningen med fargene på stan­ dardene, og avgjør om den målte absorbansverdien er rimelig i forhold til absorbansen for standardene.

28

5 Lag en standardkurve med konsentrasjonen av Mn (mg/1) som x-akse og absorbans som y-akse. Bestem konsentrasjonen av den ukjente prøven, Cx, ut fra standardkurven.

6 Beregn hvor mange mg mangan det var i den utleverte prøven ved hjelp av formelen: „

mg Mn = Cx

100 ml n . , -0,1 1 25 ml

100 er rfortynningen

0,1 liter er volumet av den ukjente prøven. 7 Få oppgitt den riktige verdien for manganinnholdet og beregn det pro­ sentvise avviket.

Forsøk 3. Bestemmelse av konsentrasjon av glukose i blodserum Formålet med oppgaven Formålet med oppgaven er å bestemme konsentrasjonen av glukose i blod­ serum på grunnlag av den blågrønne forbindelsen som glukose danner med ortotoluidin i iseddik. Oppgaven skal i tillegg tjene til å illustrere prinsip­ pene for spektrofotometrisk analyse.

Teori Glukose reagerer med primære aromatiske aminer i iseddik ved en kondensasjonsreaksjon mellom karbonylgruppen i glukose og aminogruppen i aminet under avspaltning av vann. Forholdsvis selektiv er reaksjonen med ortotoluidin der reaksjonsproduktet er en blågrønnfarget forbindelse: H

I

CH,

I3

C5HnO5C = 0 + h2n-(o) glukose o-toluidin (amin) (fargeløs) (fargeløs)

|

H

I

ch3

—►c5h11o5c

= N-(cT> + h2o Schiff base vann

(blågrønn)

Ved romtemperatur går reaksjonen meget langsomt. Reaksjonsblandingen blir derfor oppvarmet til ca 100 °C, og er ferdigreagert etter ca 10 minutter. Forbindelsen har absorpsjonsmaksimum ved 636 nm. Den har begrenset holdbarhet, og absorbansmålingene må derfor være avsluttet senest én time etter at løsningene er laget.

29

Utstyr

Standard glukoseløsning: ortotoluidin-løsning:

1,50 mg/ml i vann. 50 ml nydestillert o-toluidin + 3 g tiourea i 950 ml iseddik.

Destillert vann. Blodserum («Seronorm» Nyco). Målekolber, pipetter (vanlig og finn-pipetter), vannbad.

Utførelse

Prøveløsning 1,0 ml blodserum + 4 ml destillert vann i 50 ml målekolbe fortynner du til merket med o-toluidin-løsning.

Standardløsninger

4, 6, 8 og 10 ml standard glukoseløsning pipetteres ut i 50 ml målekolber og fortynnes til merket med destillert vann. Fra hver av kolbene tar du ut 5 ml 1 50 ml målekolber, og fortynner til merket med o-toluidin-løsning.

Biindprøve 5 ml destillert vann i 50 ml målekolbe fortynnes til merket med o-toluidinløsning. Plasser målekolbene (6 stykker) i et stativ, og sett det opp i et kokende vannbad. Etter 10 minutter tar du kolbene opp av vannbadet og avkjøler dem i kaldt vann. NB! Under behandlingen i vannbad oppstår det et over­ trykk i kolbene. Det lønner seg derfor å la korkene stå løst i kolbene under behandlingen i vannbadet.

Påsetting og klargjøring av spektrofotometer Se veiledning i laboratoriet.

Måling av standard- og prøveløsninger Fyll cellene ca fulle med de respektive løsningene og sett dem i prøveholderen. NB! Blindprøven skal alltid stå inne.

Bearbeidelse av eksperimentelle resultater Standardløsningenes absorbansverdier fremstiller vi grafisk på mm-papir mot konsentrasjon av glukose i løsningene. Standardkurven trekkes, og på grunnlag av den, bestemmer vi konsentrasjonen av glukose i prøveløsningen. Fra denne verdien regnes det tilbake til konsentrasjonen av glukose i blodserum. Svaret angis i mg/100 ml blodserum («milligram-prosent») og som mmol/liter blodserum. Sammenlign svarene med oppgitt verdi (kfr.

30

datablad Nyco), og beregn % avvik fra denne verdien. Undersøk hvordan standardkurven stemmer med Beers lov.

Rapport Rapporten skal inneholde alle eksperimentelle data satt opp på en oversikt­ lig måte. Du skal vise og forklare alle beregninger. Grafisk fremstilling med kommentar skal være med. Angi feilkilder, og vurder deres innflytelse på den bestemte konsentrasjonsverdien.

Forsøk 4. Spektrofotometrisk bestemmelse av salisyl­ syre Teori Salisylsyre, C6H4(OH)COOH, har en antiseptisk virkning og brukes bl.a. til konservering av matvarer og framstilling av legemidler. Acetylsalisylsyre er det aktive stoffet i mange feber- og smertestillende legemidler slik som aspirin, globoid, novid, dispril. Legemiddelforgiftninger som skyldes overdose av acetylsalisylsyre, er ikke uvanlig. Ofte har barn spist tabletter i den tro at det har vært godterier. Når det er mistanke om en forgiftning (salisylisme), kan vi konstatere det ved å analysere en prøve av blodserumet. Acetylsalisylsyre hydrolyserer i kroppen og brytes ned til eddiksyre og salisylsyre. Mengden av salisylsyre kan bestemmes spektrofotometrisk ved å tilsette treverdig jern (Fe3 +) som fargereagens og måle absorpsjonen ved 530 nm.

Fe3 + 4- C6H4(OH)COOH

Fe

+ h2o

Fe3+ kan reagere med en, to eller tre molekyler salisylsyre avhengig av pH i løsningen. Salisylsyre er et eksempel på en såkalt bidentat ligand, fordi den danner to (bi-) bindinger (dent = tann) til jern. Analysemetoden kan også brukes til å bestemme jern. Reagens Løs 100 mg vannfri jern (III) klorid i 20 ml 1M HC1. Fortynn med vann til 100 ml. Standardkurve Lag 50 ml standardløsning som inneholder 0,1 mg salisylsyre pr. ml. Løsningsmidlet er 10% etanolvann. Pipettér ut 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ml i åtte rør. Bruk byretter og vær meget

31

nøyaktig. Tilsett 10% etanolvann slik at alle rør inneholder 10 ml. Tilsett så 1 ml reagens i hvert rør. Til blindprøve utpipetteres 10 ml etanolvann og 1 ml reagens. Mål absorbansene for løsningene ved bølgelengde 530 nm.

Ukjent prøve

Spe den utleverte prøven til 50 ml med 10% etanolvann. Ta ut 3 paralleller å 10 ml. Tilsett 1 ml reagens til hvert rør. Mål ved 530 nm. Regn ut resultatet ved hjelp av standardkurven.

1.6 Emisjons- og absorpsjonsspektroskopi Analyse av grunnstoff Innledning Når vi holder forskjellige salter inn i en flamme, vil en få fram mange flotte farger. Natriumforbindelser gir en gyllen gul farge, litiumforbindelser en spesiell rødfarge, bariumforbindelser en flott grønnfarge og strontiumforbindelser gir en festlig rødfarge. Strontiumforbindelser er mye brukt i fyr­ verkeri. Disse egenskapene utnytter vi i kvalitativ uorganisk analyse. Ved hjelp av flammeprøver kan vi identifisere natrium, kalium, litium og visse andre metallforbindelser i ukjente blandinger. For øyet virker det som om lyset fra f.eks. kalium bare består av en farge. Men sender en lyset gjennom et prisme eller gitter vil det bli spaltet opp i sine enkelte farger hvor hver farge tilsvarer en bestemt bølgelengde.

/rod fiolett

Figur 18. Spredning av lyset fra kaliumforbindelse.

Spektret som kommer fram, består av en rekke lysende linjer av ulike farger. Et slikt linjespektrum er helt forskjellig fra det kontinuerlige spekt­ ret vi får når det blir sendt sollys (vanlig lys) gjennom et prisme. En kan få alle grunnstoffer til å sende ut lys om det blir tilført tilstrekke­ lig eksitasjonsenergi. Metallene er lettest å eksitere, og det er dem vi vil kon­ sentrere oss mest om i dette kapitlet. 32

Analyse av emisjonsspektre gir oss to viktige opplysninger: Beliggen­ heten av de forskjellige spektrallinjene avslører hva slags atomer eller grunnstoffer som finnes i prøven. Men analysen forteller ikke noe om hva slags kjemiske forbindelser det er. Derimot er det en direkte sammenheng mellom mengden eller konsentra­ sjonen av et stoff og intensiteten på lyset som blir sendt ut. Og vi utnytter det i flammefotometeret, når vi skal bestemme alkalimetallene natrium, ka­ lium og litium kvantitativt. Så langt har vi beskjeftiget oss bare med lysemisjon og linjespektra. Lig­ nende opplysninger får vi også om vi sender ultrafiolett eller synlig lys gjen­ nom en gass som består av frie atomer. Mesteparten av lyset vil passere uhindret gjennom gassen, men noe vil bli absorbert. Dermed framkommer det mørke linjer eller bånd i det kontinuerlige spektret. Beliggenheten av absorpsjonsbåndene gir opplysninger om hva slags grunnstoff vi har. Mengden av lys som absorberes, er direkte avhengig av hvor mange atomer som er tilstede. Det var to oppdagelser som førte fram til en større forståelse av både emisjons- og absorpsjonsspektrene. På midten av attenhundretallet opp­ daget Frauenhofer en del mørke linjer i solspekteret og lysspektrene fra for­ skjellige stjerner i verdensrommet. Senere, i 1859, oppdaget Kirchhoff at når en sendte hvitt lys, det er lys av alle bølgelengder gjennom natriumatomer i gassfase, oppstod det en mørk linje i spektret. Den befant seg på nøy­ aktig samme sted som en mørk linje i solspektret. Det var derfor nærliggen­ de å trekke konklusjonen at sollyset måtte ha passert gjennom en atmo­ sfære av natriumatomer omkring sola. Eksperimenter med andre grunnstoffer viste at hvert grunnstoff absor­ berte lys av samme bølgelengde som det som blir sendt ut når det samme grunnstoffet blir tilført energi i en flamme eller i et utladningsrør.

ultrafiolett---------- ------------- synlig -------- >| NaCI (s)

> Na * (g )

Cl (g) + e“

ioner opplost i vann

ubnskede reaksjoner

Cl-(g)

Na (g) (frie atomer)

(g) (eksitert atom )

H (g) H+ (g)

* Na

OH" (g) OH (g)

Na (g) + lysemisjon

0 (g)

A betyr tilførsel av energi

(Oppvarming)

Emisjonsspekteret fra en natriumforbindelse i en blanding av propan (C3H8) og luft er vist i figur 22. Vi ser et sammenhengende spektrum med nesten alle bølgelengder avbrutt av brede bånd (DH) og små topper (CO, C, CH, C2 osv.). Det er flammens spektrum. Brede spektrer av denne typen er typisk for kjemiske forbindelser og kalles båndspektrer. Så ser vi en smal pigg, her ved 589 nm. Det er en av natriumatomets emisjonslinjer. Til slutt ser vi en liten bred kul som kommer fra vannmolekylet, eller kan­ skje fra noe annet i prøven.

Figur 21. Fordampning av natriumklorid i en flamme. Spaltningen av stoffet i flammen er svært kompleks og bare de viktigste reak­ sjonene er illustrert.

Figur 22. Eksempel på et flammeemisjonsspektrum (ikke-lineær skala).

Om vi fjerner flammens spekter fra det totale emisjonsspektret, kommer natriumatomets karakteristiske linjespekter fram. emisjon (signal)

589 nm

330nm

200

300

400

Figur 23. Natrium­ atomets linjespekter.

819nm

1000

bdlgelengde i nm

35

Flammens spekter fjernes ved hjelp av en monokromator eller et filter. Monokromatoren består av en åpning (inn), et prisme eller et gitter og en smal utgangsåpning. Ved hjelp av monokromatoren velger vi en passende bølgelengde, oftest den sterkeste emisjonslinjen. Dersom vi ønsker å måle på et annet metall, roterer vi prismet til en annen emisjonslinje treffer utgangsåpningen. Lysemisjonen eller intensiteten fra utgangsåpningen måler vi ved hjelp av en fotodetektor (foto = lys, detektor = måler). Bakgrunnsstrålingen fra flammen er avhengig av temperaturen. Tempe­ raturen bestemmes av brennstofftype (propan, acetylen el. lign.), brenn­ stoffets trykk, lufttrykket og forholdet mellom brennstoff og luft. Det er meget viktig å holde konstant temperatur siden temperaturen avgjør hvor stor del av analysestoffet som vil bli redusert til frie metallatomer, som der­ etter kan bli eksitert til en høyere energitilstand og gi lys av den bølgeleng­ den som vi har innstilt apparatet på. Det kan være interessant å vite at ved 3000 K er det bare ett av hvert 60 000 natriumatomer som gir emisjon. Ved ca 2000 K vil bare alkali- og jordalkalimetallene gi målbare spektrer i det synlige spektralområdet. Andre metaller krever mye høyere tempera­ turer, over 3000 K. Dette kompliserer og fordyrer apparatet, og derfor eg­ ner andre analysemetoder seg vel så godt. Flammefotometere benytter vi nesten bare til kvantitative bestemmelser. Dersom vi lager flere løsninger med økende natriumkonsentrasjoner og måler lysintensiteten fra dem, kan vi sette opp en standardkurve for natri­ um (figur 24). relativ

Figur 24. Standard­ kurve for natriumbestemmelse.

En ukjent prøve som gir en emisjon på 75, vil ifølge kurven ha en natriumkonsentrasjon på 37 mg pr. liter (37 ppm).

Interferenser Flammefotometre er enkle å bruke, men en nøyaktig analyse er avhengig av om en har kjennskap til en del faktorer som kan forstyrre (interferere) målingene, og vi må kunne ta de nødvendige forholdsregler for å fjerne eller redusere dem. På figur 24 er det tegnet inn to stiplede linjer som illustrerer to slags konsentrasjonseffekter som ofte forekommer i flammefotometri. 36

1 Ved lave natriumkonsentrasjoner avviker standardkurven fra en rett linje og bøyer av frax-aksen. Dette skyldes at en stor del av prøven blir ioni­ sert i stedet for å bli atomisert. Det gjør at antallet frie natriumatomer og intensiteten på lysemisjonen avtar. En forlengelse av den rette linje vil skjære x-aksen før null konsentrasjon.

lonisasjon:

Na

Na+ 4- e“

Av likevekten ovenfor ser vi at om en tilfører flere elektroner i flammen, så vil reaksjonen forskyves mot venstre, og den nevnte konsentrasjonseffekten forsvinner. Rent praktisk gjør vi dette ved å tilsette en stor konsen­ trasjon av et annet alkalimetall, og helst et lettere ioniserbart metall. Stoffet kalles for en strålingsbuffer og tilsettes både standarder og prøver. Strålingsbufferen tilfører flammen et stort antall elektroner og trenger tilbake ioniseringen av natrium. Om litiumklorid brukes som strålingsbuffer, skjer følgende: (1) Li (2) * TZ Na"

Li+ + e’

lonisasjonen frigjør elektroner

Na+ + e' Elektronene fra (1) fordriver likevekten mot venstre.

2 Ved store natriumkonsentrasjoner vil lysemisjonen fra noen natrium­ atomer kunne bli absorbert av andre natriumatomer som befinner seg i ut­ kanten av flammen. Selvabsorpsjon vil resultere i at lysintensiteten blir lavere enn forventet, og standardkurven vil bøye av mot x-aksen. Når vi analyserer slike prøver må vi sørge for å lage standarder innen samme konsentrasjonsintervall og trekke opp en krum standardkurve, eller vi kan fortynne prøven før selve analysen.

3 lonisasjonsinterferens oppstår når prøvene inneholder varierende kon­ sentrasjon av et annet metall som lett lar seg ionisere. Prøver som innehol­ der samme mengde natrium, men varierende mengde kalium, vil f.eks. gi forskjellig lysintensitet for natrium. Den effekten har samme årsak som konsentrasjonseffekten som er beskrevet i punkt 1. Ved ionisasjon av kalium dannes det ulike konsentrasjoner av elektroner i flammen, og det har betydning for hvor mange natriumatomer som til enhver tid er i flam­ men. Na^Na+ + e~

Forskyvningen av likevekten avhenger av hvor man­ ge elektroner som tilføres fra ionisasjon av kalium.

lonisasjonsinterferQnsen eliminerer vi ved å tilsette standarder og prøver samme mengde av en strålingsbuffer som beskrevet i punkt 1. 4 Såkalt spektralinterferens oppstår når emisjonslinjene for to metaller ligger så nær hverandre at monokromatoren ikke er i stand til å skille dem fra hverandre. Lysemisjonen fra både metallet vi måler på og det forstyr­ rende metallet vil bli registrert og målt av detektoren. Analyseresultatet vil dermed bli for høyt. Spektralinterferens oppstår også når emisjonslinjer fra selve flammen

37

eller molekylbruddstykker i prøven sender ut lys med samme bølgelengde som den analytiske bølgelengde. Feil på grunn av spektralinterferens unngår vi lettest ved å innstille monokromatoren på en annen spektrallinje fra samme grunnstoff. 5 Kjemisk interferens forekommer sjelden ved analyse av alkalimetaller, men det kan være et stort problem for jordalkalimetallene. Analyse av f.eks. kalsium i nærvær av fosfat er vanskelig. Kalsium dan­ ner en termisk meget stabil forbindelse med fosfat.

3 Ca2+ + 2 PO43’ Z±Ca3(PO4)2

En prøve som inneholder fosfat og en bestemt mengde kalsium, vil gi et mindre signal (lysintensitet) enn en prøve som inneholder samme mengde kalsium uten fosfat. Vi må huske på at det bare er de frie metallatomene som bidrar med lysemisjon. Fosfat binder kalsium så sterkt at færre kalsiumioner lar seg atomisere. Kjemisk interferens kan vi eliminere på mange måter. I tilfellet med kal­ sium er det nok å tilsette en lettløselig lantanforbindelse, f.eks. La(NO3)3. Lantanionen danner en mer stabil forbindelse med fosfat enn kalsiumionene. Dermed løses mer og mer av Ca3(PO4)2, og Ca2+ ionene frigjøres. La3 + -l- PO43- ZZ LaPO4

Lantan binder fosfationene

Ca3(PO4)2 ZZ 3 Ca2+ + 2 PO43- Kalisumioner frigjøres

En annen og svært mye brukt metode for å frigjøre ioner som vanskelig lar seg atomisere, er å tilsette en 1 % EDTA-løsning. EDTA danner stabile komplekser med de fleste metaller, men de brytes lett ned av flammen. Tilsetning av et organisk løsningsmiddel vil også bidra til at konsentra­ sjonen av frie metallatomer i flammen øker, fordi flammetemperaturen øker. Tilsetning av en glukoseløsning reduserer også kjemisk interferens. Når konsentrasjonen av forstyrrende ioner er stor, er det ofte nødvendig å foreta en separasjon av de forstyrrende ionene (ved f.eks. ionebytting) før vi gjør selve analysen på flammefotometeret.

1.8 Øvelser Forsøk 1 Flammefotometri - innledende forsøk Hensikten med forsøket er å la eleven bli kjent med den praktiske bruken av flammefotometeret og en del av de faktorene som er bestemmende for en nøyaktig analyse. Forsøket består av fire deler og omfatter: 1 Kvantita­ tiv bestemmelse av kalium. 2 Virkningen av forskjellige organiske løsnings­ midler (forbrenningstemperatur og viskositet). 3 lonisasjonsinterferens. 4 Bestemmelse av følsomheten for kalium. 38

I del 1 tar vi opp en standardkurve over et stort konsentrasjonsintervall for å illustrere de to konsentrasjonseffektene som ble nevnt innledningsvis. I del 2 vil vi se hvilken effekt et organisk løsningsmiddel (alkohol) har på forbrenningen og lysutsendelsen. Samtidig demonstrerer vi hvilken effekt viskositeten har på innsugningen av løsningen i brenneren og hva det betyr for lysemisjonen (viserutslaget). I del 3 sammenligner vi emisjonssignalet med og uten bruk av strålingsbuffer, og i del 4 skal vi bestemme den laveste konsentrasjonen av kalium som er målbart på det instrumentet vi har. Målingene på instrumentet er raske å utføre, men det går mye tid med til å lage de forskjellige standardløsningene og prøveløsningene. Det er hen­ siktsmessig at flere elever (2-3) går sammen om arbeidet.

Reagenser 1 Stamløsning - 1000 ppm K Tørk litt mer enn 2 gram KC1 i et varmeskap ved 110 °C i en time. Vei så nøyaktig inn 1,907 g KCI, hell stoffet i en målekolbe og tilsett destillert vann til merket. 2 Standardløsninger - 1, 5, 10, 20, 30, 50, 80 og 100 ppm K Mål ut henholdsvis 1,2, 3, 5, 8 og 10 ml av stamløsningen i hver sin 100 ml målekolbe ved hjelp av en byrette og tilsett destillert vann opp til merket. Bland godt. Kolbene vil da inneholde 10, 20, 30, 50, 80 og 100 ppm K. Mål ut 1 ml og 5 ml av standarden på 100 ppm K ovenfor i hver sin 100 ml målekolbe, og fortynn til merket med destillert vann. Bland godt. Kol­ bene inneholder da 1 ppm og 5 ppm K.

3 10 ppm K i 10% etanol Mål ut 1 ml av stamløsningen i en 100 ml målekolbe. Tilsett ca 10 ml etanol og fortynn til merket med destillert vann. Bland godt.

4 10 ppm i 50 % glyserol (glyserin) Mål ut 1 ml av stamløsningen i en 100 ml målekolbe. Tilsett ca 50 ml glyse­ rol og fortynn til merket med destillert vann. Bland godt.

5 Strålingsbuffer - 10 000 ppm Na Vei inn 2,54 g NaCl, overfør stoffet til en 100 ml målekolbe og fortynn til merket med destillert vann.

Eksempel på utregning: 2,54 g-1000 * ¥-M Na

2,54 g- 1000^-23,0

------------- ------------ = ----------------- - ------- = 10 000 MNaCl-V

58,45-0,1 1

1

39

6 10 ppm K tilsatt strålingsbuffer

Mål ut 1 ml av stamløsningen, tilsett 10 ml strålingsbuffer i en 100 ml måle­ kolbe. Fortynn til merket med destillert vann og bland godt. Løsningen vil være 1000 ppm med hensyn på Na.

Del 1. Kvantitativ bestemmelse av kalium

a Les bruksanvisningen for instrumentet før du begynner målingene. Kon­ troller at riktig filter (her kaliumfilteret) er montert. Hvis flammefotometeret har monokromator, innstilles den på 770 nm som er kaliums sterkeste emisjonslinje. b Innstill instrumentet på null mot blindprøven, her destillert vann og på fullt utslag, 100 mot den sterkeste standarden på 100 ppm K. c Mål emisjonen for hver av standardløsningene og løsningen med den ukjente kaliumkonsentrasjonen. Sett opp resultatene i en lignende tabell som nedenfor. Start målingene med den laveste standarden.

konsentrasjonen av K (ppm K)

0

1

5

10 20 30 50 80

100 x

utslag (emisjon)

Viktig

Rett etter at en måleserie er avsluttet, må du suge destillert vann gjennom systemet for å rense det for salter. Hvis du ikke gjør det, vil innsugningssystemet raskt bli tett. Av samme grunn må du heller ikke suge inn prøveløsningene i for lang tid før hver avlesing (høyst 30 sekunder). d Konstruer standardkurven ved å avsette utslaget (y-aksen) som funk­ sjon av kaliumkonsentrasjonen (langs x-aksen). Spørsmål:

1 Bestem konsentrasjonen av den ukjente prøven. 2 Forklar hvorfor standardkurven ikke blir en rett linje over hele konsentrasjonsområdet. 3 Hvis den ukjente prøven hadde inneholdt en stor konsentra­ sjon av et annet alkalimetall, hvilken virkning ville det ha hatt på måleresultatet?

Del 2. Virkningen av forskjellige organiske løsningsmidler a Innstill instrumentet på null mot destillert vann og på halvt utslag (50) mot kaliumstandarden som inneholder 10 ppm K. b Mål emisjonen for 10 ppm K i 10% alkohol og i 10 ppm K i 50% glyserol.

40

Resultater: løsning

lOppmK (vann)

lOppmK (vann-alkohol)

lOppmK (vann-glyserol)

utslag

c Sug destillert vann gjennom systemet på samme måte som beskrevet ovenfor. Spørsmål:

Forklar hvorfor utslaget (emisjonen) er forskjellig for de tre løsningene selv om alle inneholder 10 ppm K.

Del 3. lonisasjonsinterferens a Innstill instrumentet på null mot destillert vann og på halvt utslag mot kaliumstandarden på 10 ppm K. b Mål lysemisjonen (utslaget) for løsningen som inneholder 10 ppm K tilsatt strålingsbuffer (natriumklorid). c Sug destillert vann gjennom systemet i noen minutter før du avslutter målingene. Spørsmål:

1 Forklar forskjellen i emisjonen på de to løsningene som begge inneholder 10 ppm K. 2 I alle senere målinger med flammefotometeret skal vi inn­ stille instrumentet på null mot blindprøven og ikke destillert vann. Blindprøven består oftest av destillert vann tilsatt strålingsbuffer. Kan du forklare hvorfor løsningene sann­ synligvis vil gi forskjellig utslag.

Del 4. Bestemmelse av følsomheten for kalium Følsomheten eller deteksjonsgrensen er et mål for den minste konsentrasjo­ nen vi kan ha av et bestemt metall. Men det er en del vanskeligheter forbun­ det med å bestemme grensen, fordi med små konsentrasjoner og når instru­ mentet er tøyd til maksimal følsomhet, er viserutslaget svært ustabilt pga. elektronisk støy. Av praktiske grunner er følsomheten definert som den konsentrasjonen som gir et utslag som er to ganger større enn bakgrunns­ støyen, dvs. utslaget vi måler når blindprøven suges inn. Viseren beveger seg ustanselig når instrumentet står på maksimal følsomhet, og vi må der­ for bestemme gjennomsnittsverdien for en rekke avlesninger når vi skal av­ gjøre om viserutslaget er det dobbelte av bakgrunnsutslaget. a Mål ut 1 ml av løsningen som inneholder 1 ppm K, og 10 ml av strålingsbufferen (NaCl) i en 100 ml målekolbe og fortynn opp til merket med destillert vann. Bland godt. Løsningen er 0,01 ppm m.h.t. K. b Innstill instrumentet på null mot blindprøve som er destillert vann til­ satt 10 ml strålingsbuffer til totalvolumet er 100 ml. Innstill apparatet på største følsomhet med 0,01 ppm K, samme løsningen som vi laget i punkt a. 41

Hvis utslaget blir større enn full skala, så fortynn løsningen ovenfor ved å ta ut 1 ml eller 10 ml av løsningen på 0,01 ppm (tilsvarer 10 ppb) og fortyn­ ne på nytt til 100 ml i en målekolbe. c Bestem den kaliumkonsentrasjonen som gir et gjennomsnittsutslag som er ca 2 ganger større enn utslaget for blindprøven.

Forsøk 2 Bestemmelse av natrium og kalium i urin og i drikkevann Reagenser: 1 Stamløsninger 100 ppm K. Vei inn nøyaktig 0,1907 g KC1 som på forhånd er tørket i varmeskap i en time ved ca. 110 °C. Hell stoffet i en målekolbe og fortynn til 100 ml merket med destillert vann. Bland godt. 100 ppm Na. Vei inn nøyaktig 0,2542 g NaCl og løs stoffet i destillert vann i en 100 ml målekolbe. Bland godt.

2 Strålingsbuffer - 10 000 ppm Li Vi lager strålingsbuffer ved å løse 6,1 g LiCl i destillert vann til et total­ volum på 100 ml. Bland godt. (Kontroller at mengden på 6,1 g er riktig ved å gjøre dine egne utregninger.) 3 Standardløsninger - 5, 10, 15 og 20 ppm Na og K Standardløsninger som består av begge metallene, lager vi ved å utpipettere henholdsvis 5, 10, 15 og 20 ml av hver av stamløsningen av både natrium og kalium i 4 målekolber. Tilsett 5 ml strålingsbuffer i hver kolbe, og for­ tynn til merket med destillert vann. Bland godt.

4 Blindprøve Mål ut 5 ml strålingsbuffer og fortynn med destillert vann til merket i en 100 ml målekolbe.

5 Urinprøve Urin inneholder store mengder natrium og kalium, og vi må fortynne to ganger før selve målingen på flammefotometeret. Mål ut 10 ml urin, over­ før prøven til en 100 ml målekolbe og fortynn til merket med destillert vann. Pipetter ut 1 ml av denne løsningen i en ny 100 ml målekolbe, tilsett 5 ml strålingsbuffer og fortynn til merket med destillert vann. (Fortynningsfaktoren blir: f = 42

= 1000)

Anm.: Det kan være nødvendig å gjøre andre fortynninger dersom kon­ sentrasjonen av Na og K ikke faller innenfor konsentrasjonen på standard­ løsningene.

Alternativ prøve Hvis noen elever har motvilje mot å utføre analyse på sin egen eller andres urin, kan en bruke samme analyseforskrift og utføre analyse på Na og K i blodserum (seronorm, Nyco), den samme prøven som ble benyttet i forsøk 3 i synlig spektrofotometri. Seronorm inneholder 135,8 mmol/1 og 4,54 mmol/1 av henholdsvis na­ trium og kalium. Det tilsvarer 3123 ppm Na og 177,5 ppm K. Lag fortyn­ ninger slik at konsentrasjonen av prøven faller innenfor området for stan­ dardløsningene. Husk å tilsette strålingsbuffer.

6 Springvann Mål ut 5 ml strålingsbuffer og fortynn til 100 ml i en målekolbe med spring­ vann.

Resultater og målinger a Instrumentet nullstilles mot blindprøven og stilles på fullt utslag mot den sterkeste standarden. Hvis instrumentet er utstyrt med monokromator, så sett den på 589 nm når du måler natrium og på 770 nm for kalium. Hvis du benytter et filterfotometer, så kontroller at et natriumfilter er montert ved natriummålingene og et kaliumfilter ved kaliummålingene. b Mål emisjonen for standardløsningene og urinprøven. Start med den svakeste standarden. Sug destillert vann inn i flammen mellom hver måling. c Sett resultatene opp i tabellform og konstruer standardkurvene, én for Na og én for K. Ut fra standardkurven bestemmer du konsentrasjonen av Na og K i den fortynnede urinprøven. Beregn tilslutt mengden av Na og K i de opprinne­ lige prøver. d På grunn av den lave konsentrasjonen av Na og K i springvannet, må instrumentet innstilles på fullt utslag mot en av de svakeste standardløsnin­ gene. Instrumentet nullstilles mot blindprøve. Beregn konsentrasjonen av Na og K i springvannet etter denne formelen: mg Na eller K pr. liter = Cs

viserutslag (springvann) viserutslag (standard)

Cs = konsentrasjonen av standarden du bruker.

VIKTIG! Sug destillert vann gjennom systemet før du avslutter målingene! 43

1.9 Atomabsorpsjonspektroskopi (AA-spektroskopi) AA-spektroskopi har hatt en kolossal vekst siden 1955, da den australske forskeren Dr. Allan Walsh for første gang benyttet denne teknikken til be­ stemmelse av metaller. En person innen fagfeltet har i den forbindelse be­ regnet at hvis salget av AA-instrumenter skjer med samme hastighet som i dag, så vil hele jordas overflate være dekket med AA-instrumenter i år 2000. Alle laboratorier, bedrifter, institusjoner eller skoler som utfører metallanalyser, har ett eller flere AA-instrumenter. En trenger ikke å være spå­ mann for å kunne si at alle som driver med kjemi, som laboranter, tekni­ kere, ingeniører osv., før eller senere i sin yrkeskarriere vil måtte utføre analyse på slike instrumenter. Dette kapitlet har til hensikt å gi fremtidige brukere en kort presentasjon og innføring i grunnbegrepene og prinsippene for analyseteknikken. Det som i første omgang begrenser muligheten for skoler til å anskaffe AA-instrumenter, er prisen. De billigste instrumentene koster i overkant av kr. 200 000 i dag. I tillegg trenger man penger til innkjøp av lamper for hvert metall som skal analyseres. Lampene koster ca kr. 5 000 pr. stykk. I tillegg går det med penger til brennstoff (forskjellige gasser). La oss kort nevne noen av de viktigste årsakene til at AA-instrumenter har fått slik enorm utbredelse og betydning innen alle felter av analytisk kjemi.

1 Stor følsomhet og nøyaktighet Med et moderne AA-instrument er det mulig å måle svært små metallkonsentrasjoner i nesten alle typer prøveløsninger. F.eks. kan vi oppdage 1 mg kvikksølv i en ett tonns prøve. Deteksjonsgrensene for en del vanlige metal­ ler er gitt i tabell 3.

Tabell 3. Deteksjonsgrensen for et lite utvalg metaller funnet ved hjelp av AA-spektrofotometer metall

Na K Mg Ca Cr

deteksjonsgrense (PPm)

metall

deteksjonsgrense (PPm)

0,03 0,03 0,001 0,08 0,006

Ni Cu Zn Al Pb

0,01 0,005 0,0005 0,8 0,01

Tabellen viser at flamme AA-spektroskopi har mindre følsomhet for natrium og kalium enn flammefotometri. Derimot kan vi bestemme langt lavere konsentrasjoner av kalsium og magnesium med AA-spektroskopi. De øvrige metallene som er nevnt i tabellen, lar seg ikke analysere på et flammefotometer. 44

2 Stor selektivitet Stor selektivitet betyr at vi kan analysere et metall i en blanding av mange flere metaller uten at disse forstyrrer analysen. Vi har nevnt i innledningen at et atom i grunntilstanden bare vil absor­ bere lys av helt bestemte bølgelengder. Frie kalsiumatomer vil f.eks. bare absorbere lys som stammer fra eksiterte kalsiumatomer, og blyatomer absorberer bare lys fra eksiterte blyatomer. Det betyr at når vi ønsker å ana­ lysere en ukjent prøve på et bestemt metall, må vi bruke en lampe som sen­ der ut lys som er karakteristisk for metallet. Konstruksjonen av en slik lampe, kalt hulkatodelampe, er vist på figur 25. Lampen består av en glassbeholder med et kvartsvindu (husk at mye av UV-Iyset stoppes av glass, men ikke kvarts), og inneholder en edelglass (argon) ved lavt trykk. Katoden er laget av det metallet en ønsker emisjonslys fra.

Figur 25. Skjematisk tegning av en hul­ katodelampe.

Når det er høy spenning mellom elektrodene, vil argonatomene danne positive ioner (Ar + , Ar2+). De blir trukket mot katoden (den negative polen) med stor hastighet. Ved sammenstøtet slår de løs og eksiterer metallatomene på katodeo ver flaten. Resultatet blir emisjonslys som er helt typisk for katodemetallet. Når emisjonslyset sendes gjennom en flamme som inneholder mange forskjellige metaller, så vil bare de atomene som er av det samme metallet som katoden, absorbere lys. De andre metallatomene «ser» ikke lyset, og vil la det passere uhindret. Dette forklarer den store selektiviteten som vi oppnår ved AA-spektrofotometri. Når vi skal analysere et annet metall, må vi skifte til en annen hulkatodelampe med katode som er laget av samme metall som det vi ønsker å analysere.

hulkatodelampe

brennstoff (acetylen, hydrogen)

r prove

45

Et enkelt AA-spektrofotometer er vist i figur 26. Legg merke til at det som skiller dette instrumentet fra flammefotometeret, er hulkatodelampen som er plassert foran flammen. La oss ta utgangspunkt i en blyanalyse og diskutere de forskjellige pro­ sessene som skjer fra hulkatodelampen til detektoren. Katoden i hulkatodelampen (bly-lampen) er laget av bly. Når lampen ly­ ser, sender den ut det karakteristiske bly spektret som består av lys med bøl­ gelengdene 283,3 nm, 217,0 nm, 261,4 nm og 368,4 nm. Prøven som inneholder en ukjent mengde av en blyforbindelse, suges opp i flammen og reduseres til frie blyatomer. Et lite stykke over brennerhodet er konsentrasjonen av blyatomer størst, og vi lar lysstrålen fra hul­ katodelampen passere der for å få størst mulig følsomhet. De frie blyatomene vil absorbere noe av lyset, avhengig av konsentrasjo­ nen. Andre metallatomer vil ikke «se» blylyset. Lyset som kommer ut fra flammen, har mindre intensitet pga. absorp­ sjonen, og minskningen måles ved hjelp av en detektor. Men før lyset tref­ fer detektoren, er det blitt spaltet opp i sine bølgelengder ved hjelp av pris­ me eller gitter i monokromatoren. Prismet innstiller vi slik at bare lys av f.eks. 283,3 nm (dvs. den sterkeste emisjonslinjen) slipper ut gjennom utgangsåpningen til detektoren. Monokromatoren fjerner også en del av flammens spektrum. Ved å sammenligne lysintensiteten fra prøven med lysintensiteten fra en serie med standardløsninger med kjent mengde bly, kan en bestemme kon­ sentrasjonen av bly i den ukjente prøven. På moderne AA-instrumenter er det gjort en del forbedringer i forhold til det enkle instrumentet som er vist ovenfor. Spesielle elektriske kretser gjør det mulig å lese av absorpsjonen (A = 4- log T) direkte. Når det kommer mye lys til detektoren, får vi et lite viserutslag. Når mye lys absor­ beres og lite lys treffer detektoren, får vi et stort viserutslag. Bruk av såkalte «chopper» («strålesaks») representerer også en stor for­ bedring i forhold til eldre instrumenter. En «chopper» er ofte en rund plate med en åpning i som plasseres mellom lampen og flammen (figur 27).

= lys fra lampen = lys fra flammen

på hvordan en «chopper» virker.

Når «chopperen» roterer, vil den vekselvis slippe igjennom og stoppe lyset fra hulkatodelampen. På den måten kommer bare lyset fra flammen fram til detektoren når «chopperen» er i en posisjon. Når «chopperen» er åpen, kommer både flammens lys og det lyset fra hulkatodelampen som ikke er blitt absorbert av atomene i flammen. «Chopperen» gjør det mulig å eliminere alt bakgrunnslys, slik at bare lys som stammer fra hulkatode­ lampen blir målt. «Chopperen» siler også ut lys som skyldes eksiterte ato­ mer i flammen. Uten «chopper» ville vi altså få en konsentrasjonsavhengig 46

bakgrunnstråling som hadde medført at standardkurven ville avvike fra en rett linje.

Interferenser De samme typene interferenser som er omtalt under flammefotometri, forekommer også i AA-spektroskopi. Repeter dem! Vi nevnte at en nøyak­ tig bestemmelse var avhengig av en konstant flammetemperatur, fordi bare 0,002 % av atomene bidro med emisjonslys. Flammetemperaturen er ikke så kritisk i AA, fordi mer enn 90% av prøven vil foreligge som frie atomer i grunntilstanden. Viskositeten på løsningen kan påvirke måleresultatene like dramatisk som i flammefotometri. Spektralinterferens forekommer nesten aldri i AA-spektroskopi. Spektrallinjene fra hulkatodelampen har ekstremt liten båndbredde, som gjør at emisjonslinjer fra andre metaller aldri overlapper hverandre. Kjemisk interferens er av samme slag som i flammefotometri. Vi får dan­ net termisk stabile forbindelser som binder metallene så sterkt at de ikke frigjøres og reduseres til atomer i flammen. Fosfationer forstyrrer i analy­ sen av kalsium da de danner den stabile forbindelsen Ca3(PO4)2. Dannelse av stabile oksider forstyrrer analysen av aluminium.

Sammenligning mellom AA-spektroskopi og synlig spektroskopi Skissen nedenfor illustrerer noe av likhetene og forskjellene mellom AAspektrofotometri og synlig spektrofotometri.

Selv om AA teknisk sett er mye mer komplisert, og instrumentets utfor­ ming (design) er helt forskjellig fra et synlig spektrofotometer, er det mange likhetspunkter. 47

forskjellene mellom et AA- og et synlig spektrofotometer.

Hulkatodelampen har erstattet wolframlampen, og i stedet for en vanlig kyvette som inneholder en løsning av molekylene og ionene som vi skal analysere, har vi i AA en flamme med atomene av stoffet. Når det gjelder flere likheter og forskjeller, overlates dette som øvelse for elevene å finne ut av.

Oppgave:

Studér skissen i figur 28 og noter deg forskjellene og likhetene mellom et AA-instrument og synlig spektrofotometer.

1.10 Infrarød spektrofotometri (IR) eller infrarød spektroskopi Spektrofotometre som benytter infrarøde stråler (IR), er i prinsippet svært like med spektrofotometere som benytter UV og synlig lys. Men da IR-strålene stoppes av glass, blir kravene til de optiske komponentene (cel­ ler, kyvetter, linser, prismer osv.) helt forskjellige. Analyser av kjemiske forbindelser i det infrarøde spektralområdet, krever at vi har et eget instru­ ment som er laget for dette formålet. Det krever selvsagt økonomiske res­ surser. Selv om prisene på de enkleste IR-instrumentene er blitt overkom­ melige, så finnes det knapt noen videregående skole som har slike instru­ menter i dag. Når vi likevel tar med IR-spektroskopi, er hensikten å gi kunnskap og innsikt om et meget utbredt og anvendt hjelpemiddel for analyse av orga­ niske forbindelser. Ved hjelp av IR-absorpsjonsspektrer er det ofte mulig å bestemme de ulike funksjonelle gruppene i et molekyl, f.eks. CH3-metyl, CO-karbonyl, OH-hydroksyl osv., og identifisere forbindelsen. Oppbygningen og virkemåten til et typisk IR-instrument er også tatt med. Hva skiller et slikt instrument fra tilsvarende som blir benyttet ved UV- og synlig spektrofotometri? En sammenligning vil øke forståelsen for disse instrumentene, og gjøre det lettere når en senere skal ta avgjørelser om hvilken analyseteknikk som egner seg best for en bestemt analyse.

Generelt Absorpsjonsspektroskopi i det infrarøde området blir hovedsakelig brukt for identifikasjon av rene organiske forbindelser: IR-spektret er helt unikt for hvert stoff, vi sier at det er stoffets «fingeravtrykk». Vi kan tenke oss at identifikasjonen av et stoff foregår i to trinn. Belig­ genheten av absorpsjonstoppene og størrelsen på dem vil avsløre hvilke grupper stoffet består av. Eksempel: Et stoff som har et sterkt absorpsjonsbånd ved 1650 cm1, antyder at forbindelsen inneholder en karbonylgruppe, -C = 0. Når vi har kjennskap til noen flere av gruppene som inngår i molekylet, kan vi lettere 48

foreta sammenligning av IR-spektrer av kjente forbindelser av samme type, og på den måten identifisere den ukjente forbindelsen. Det finnes store tabeller og oppslagsverk som inneholder hundrevis av IR-spektrer som vi kan benytte ved sammenligningen. På moderne forskningsinstrumenter sammenligner vi ved hjelp av store datamaskiner, som har tusenvis av IR-spektrer lagret i hukommelsen sin. Vi må understreke at IR-spektrer alene, som oftest ikke er nok til å klar­ gjøre strukturen for eller å identifisere en ukjent forbindelse. I slike tilfeller fungerer det som et verdifullt redskap sammen med massespektrometri, NMR og fysikalske målinger til å finne løsning på problemene. IR-spektrofotometri har etter hvert fått større anvendelse innen kvanti­ tativ analyse. Bestemmelse av mengden av et stoff ved hjelp av IR foregår på samme måte som ved UV- og synlig spektrofotometri: Først opptak av absorpsjonskurve og utvelgelse av en bølgelengde hvor stoffet absorberer sterkt. Deretter kommer tillaging av standarder og preparering av ukjent prøve. Tilslutt måling av absorbans, konstruksjon av standardkurve og be­ stemmelse av mengde ukjent stoff ut fra stoffets absorbans og standard­ kurven. IR-spektrofotometre benyttes også som detektorer i forbindelse med høytrykksvæskekromatografi (kalt HPLC). I HPLC kolonnen separeres de forskjellige stoffene fra hverandre, og de registreres ved utgangen av ko­ lonnen ved hjelp av UV eller IR.

IR-spektret IR-strålene er usynlige for øyet, men vi kan lett registrere dem med våre andre sanser. Du har sikkert sittet foran en peis eller en varm vedovn og kjent hvordan strålene fra ovnen har varmet. Setter du en gjenstand mel­ lom deg og ovnen, blir det med en gang kaldere. IR-strålene har mange av de samme egenskapene som vanlig lys. De kan stoppes, reflekteres, spres og brytes. Men på grunn av forskjell i energiinnhold, har de også mange ulike egenskaper. Det kan være interessant å vite at IR-strålene har den egenskapen at de kan trenge gjennom tåke også. Fotografi tatt med en IR-følsom film kan avsløre detaljer som er usynlig på en vanlig film eller for det blotte øye. IR-strålene har lengre bølgelengde enn både ultrafiolett (UV) og synlig lys. Som navnet sier, ligger IR-området over (infra) den røde (red) delen av det synlige spektret. IR-strålene er mindre energirike, og det har betydning for hva som skjer med et molekyl som absorberer IR-energi. Strålene har akkurat nok energi til å få i stand forskjellige typer vibrasjo­ ner i bindingene mellom atomene og atomgruppene i molekylet, men de har ikke nok energi til å løfte elektroner fra et lavere til et høyere energinivå innen molekylet. I figuren nedenfor er vist hvordan en metylengruppe oppfører seg ved absorpsjon av IR-energi. Bare to av de fire mulige vibrasjonene for metylengruppen er tatt med. 4 - Laboratoriearbeid

49

"nullstilling"

Figur 29. Eksempel på ulike vibrasjoner i en metylengruppe (CH2).

usymmetrisk strekkvibrasjon

symmetrisk vibrasjon (bøying) i planet

Andre grupper har tilsvarende vibrasjoner. Antallet ulike vibrasjoner avhenger av hvor mange atomer som inngår i en funksjonell gruppe. Enkel­ te vibrasjoner vil resultere i sterk absorpsjon av stråling, mens andre vibra­ sjoner bare gir svak eller ingen absorpsjon. For UV- og det synlige området er vi vant til å bruke nanometer (nm) som enhet på x-aksen på absorpsjonskurvene. I IR-området derimot, benytter vi både resiproke cm (cm1) og mikrometer (mikron). Det kan virke forvir­ rende i begynnelsen, og derfor er det tatt med en figur nedenfor som viser sammenhengen mellom de forskjellige enhetene. Hvis det likevel skulle være uforståelig og vanskelig, skal du trøste deg med at bruk av IR-spektrofotometret og identifikasjon av ukjente forbindelser fra deres absorpsjonsspektrer, ikke forutsetter at en har forstått eller kan omregne fra de forskjellige enhetene. 50nm

400nm

800nm

2500nm

4000cm’’ IIIHIIIHIIII

UV

1.000 000 nm

400cm-1 --------------------

Synlig

Figur 30. Oversikt over UV, synlig og IR-områdene. De områdene som er mest benyttet, er skravert. Inm = 0,001 gm (mikron).

25000nm

IR

Legg merke til at IR spenner over et mye større spektralområde enn både UV og synlig lys. Det mest velegnede området for strukturoppklaring og identifikasjon av organiske forbindelser er fra 2500 nm (2,5 gm) til 10 000 nm (10 gm). Det tilsvarer området fra 4000 cm-1 til 1000 cm-1. Området fra 1000 cm'1 til 400 cm'1 er mest nyttig når du studerer uorganiske for­ bindelser. IR-instrumentene som er i handelen, dekker spektralområdet fra 4000 cm'1 til 400 cm'1.

Identifikasjon av kjemiske forbindelser Et IR-spektrum kan være enkelt, men de aller fleste er meget kompliserte fordi de inneholder svært mange absorpsjonsbånd. Båndene kan være skarpe eller brede. Men samtidig kan vi dele dem inn i sterke, middels eller

50

veike (svake), alt etter hvor mye IR-energi de absorberer. Figuren nedenfor illustrerer forholdet. BØLGENUMMER CM

Figur 31. Det infrarøde spektret av toluen (C6H5CH3). Absorpsjonsbåndene som er merket S, M eller V, er av sterk, middels eller veik intensitet.

Anm.: IR-spektra er prosent transmittans (°7o T) som funksjon av bølge­ lengden (/im) eller bølgenummer (cm '). Når et stoff absorberer energi, re­ sulterer dette i en reduksjon i prosent av transmittans. Dermed kommer de såkalte absorpsjonsbåndene fram. I synlig spektroskopi er forholdet om­ vendt. Der måles absorpsjonen som funksjon av bølgelengden. Dermed oppstår absorpsjonstoppene. Identifikasjonen av en ukjent kjemisk forbindelse starter med at vi først gjør en foreløpig klassifisering av hvilken type forbindelse en har ved å sammenholde absorpsjonsbåndene med en korrelasjonstabell. Korrelasjonstabellen viser de typiske absorpsjonsbåndene for forskjellige typer organiske forbindelser. Når det er gjort, slår vi opp i et tabellverk og finner fram til et spektrum som er identisk med spektret til den ukjente forbindel­ sen. Et eksempel vil klargjøre framgangsmåten:

Steg 1: Bestem absorpsjonsbåndene for den ukjente forbindelsen med IRspektrum som vist i figur 32. Den ukjente forbindelsen i figuren har følgende absorpsjonsbånd: a) b) c) d) e)

3125 cm'1 1725 cm'1 1400 cm1 1295 cm'1 1050 cm'1

sterkt bånd, bredt sterkt bånd, skarpt middels bånd, skarpt middels bånd, skarpt svakt bånd, skarpt

Steg 2: Sammenlign absorpsjonsbåndene med dem som er gjengitt i korrelasjonstabellen (figur 33). I korrelasjonstabellen finner vi at O-H og N-H forbindelser har absorp­ sjonsbånd i området 4000-3125 cm'1 (pkt. 1). Absorpsjonsbåndet på 1725 cm'1 passer bra med karboksylsyrer som har typiske bånd i området 1755— 1640 cm'1 (pkt. 1 a). Vår forbindelse har et absorpsjonsbånd på 1295 som 51

ytterligere bekrefter at vi har en forbindelse som inneholder bindingen -O(pkt. 1 c og pkt. 8). I korrelasjonstabellen finner vi også at metylgruppen (CH3-) absorberer i området 1410-1350 cm-1. Vår forbindelse har et bånd ved 1400 cm’1. Det indikerer at karboksylsyren inneholder en metylgruppe. Steg 3: Sammenlign spektret av den ukjente med spektrer av forskjellige karboksylsyrer og identifiser forbindelsen. Svar: Den ukjente forbindelsen var eddiksyre: CH3COOH. BØLGENUMMER CM

Figur 32. IR-spektrum av en ukjent forbin­ delse.

Figur 33. Figuren hører sammen med korrela­ sjonstabellen (tabell 4), og viser eksempler på bestemmelse av bindinger og funksjonelle grupper.

Bølgelengde, mikroner Omn) 52

Tabell 4

1

a) b) c) d) 2

3

Absorpsjon 4000-3125 cm’1 (bredt bånd) 1755-1640 cm’1 1695-1493 cm1 1333-1000 cm’1 ca 667 cm-1

Grupper hydroksyl aminer syrer amider -o-forbindelser primære aminer

3125-3000 cm’1 (skarp) a) 2000-1668 cm’1 b) 1680-1640 cm’1 c) 1640-1450 cm’1

olefiner aromater benzenoid olefiner aromater (to bånd)

3003-2810 cm’1 (skarp) a) 1493-1430 cm * b) 1410-1350 cm’1 c) 732- 720 cm’1

ali fater

Formel -O-H -N-H -COOH

-conh2

-nh2 i i -c = cC6H5 1

1

-c = cCnH2n + 2

-ch2-, -ch3 -ch3 -(ch2v

4

2500-2000 cm’1

acetylener

-c=c-

5

1750-1640 cm’1 (skarp)

estere ketoner syrer

R-COOR R]R2C = O -COOH

6

1330-1000 cm’1

-o-forbindelser

7

990- 667 cm’1

aromater

c6h5-,

...

Instrumentering Figur 34 viser et skjematisk bilde av et typisk IR-instrument. De er nesten bestandig dobbeltstråleinstrumenter og består av en strålekilde, speil, rote­ rende halvspeil («Chopper»), gitter eller prisme, detektor, kontroll for lys­ intensitet og skriver.

Figur 34. Typisk IRinstrument.

53

Det er en såkalt Nernstgløder som produserer IR-strålene. Den er et fast stoff som består av oksider av lantanidmetallene. Når vi varmer opp stoffet til 1500-2000 °C ved hjelp av elektrisk strøm, sender det ut IR-stråler i alle retninger. Strålene treffer to konkave speil som reflekterer strålene slik at de blir parallelle før de passerer prøvecella og referansecella. Prøvecella er spesiell idet den er laget av natriumsalt eller liknende salter som er transparente for IR-stråler. I referansecella er det mest vanlig å ikke plassere noen ting, det betyr at vi bruker luft som referansestoff. IR-strålene fra prøve- og referansecella samles igjen ved et roterende halvspeil («chopper» betyr saks eller avkutter) (fig. 35). Det er en svært vik­ tig detalj med hensyn til å redusere og eliminere en rekke feilkilder som forekommer ved IR-målinger og andre spektrofotometriske målinger. Vi har utdypet det nærmere under AA-spektroskopi. Siden IR-strålene er varmestråler, må detektoren være et instrument som kan registrere temperaturforandringer. Mest benyttet er ulike termoelementer. Når IR-strålen fra prøvecella treffer termoelementet, resulterer det i et signal som blir lagret elektronisk. I neste øyeblikk treffer referansestrålen detektoren, og signalet fra denne sammenlignes med signalet som ble lag­ ret.

Figur 35. Roterende halvspeil («chopper», «saks»).

dreieakse

Når vi bruker IR-instrumentet til kvalitativ analyse, sveiper det over et spektralområde fra 4000 cm’1 til 400 cm”1. Det skjer ved hjelp av en motor som er koblet til gitteret. Når gitteret roterer med en jevn hastighet, vil strå­ ler av forskjellig bølgelengde treffe utgangsspalten og nå detektoren etter hvert. Som nevnt tidligere er all optikken i IR-instrumentene laget av høypolert NaCl eller salter som er IR-transparente. Også prøvecellene må være laget av samme slags materiale. Det gjør at vi må ta spesielle forholdsregler ved arbeide med slike instrumenter. Vann må ikke forekomme fordi salter er vannløselige. En bør også unngå fuktig­ het. Til vask av celler og kyvetter og for tillaging av prøveløsninger, må vi bruke tørre organiske løsningsmidler. Hvis prøven er en væske, plasserer vi en dråpe på en saltskive, og den andre saltskiven legger vi oppå slik at det blir en tynn væskefilm mellom platene (figur 36). Så plasserer vi dem i en prøveholder foran IR-strålene. en dr&pe av prdven Figur 36. Preparering av prøvecelle for opp­ tak av IR-spektrum. Prøven er plassert mel­ lom to saltplater (NaCl).

tynn væskefilm av prbven NaCl plate

54

to NaCl plater

Hvis prøven er et fast stoff, må vi først knuse stoffet til et fint pulver før vi blander og fordeler det i en organisk væske, f.eks. parafin (mineralolje). En dråpe av blandingen plasserer vi på saltplatene som beskrevet ovenfor.

1.11 NMR-spektroskopi (Kjernemagnetisk spinn resonans - «Auclear Afagnetic Ztesonance»)

Teori Når elektronene beveger seg i baner omkring atomkjernen, vil de samtidig rotere omkring sin egen akse, enten med eller mot urviseren. Atomkjernene spinner også omkring sine egne akser. Når f.eks. hydro­ genkjernen (protonet) spinner omkring sin egen akse, virker den som en liten magnet med en nordpol og sydpol. Plasserer vi magneten i et sterkt magnetfelt, vil den rette seg inn enten med eller mot feltets retning. Proto­ net er i sin laveste energitilstand når det er innrettet mot det ytre magnetfel­ tet. En sier da at det har spinnkvantetallet + Vi. Det trengs altså tilførsel av energi for å forandre protonets spinn fra + !4 (laveste energitilstand) til - !4 (høyeste energitilstand). A energi

spinn —1/2 ( hdyeste energitilstand, spinn nedyp

spinn +1/2 (laveste energitilstand, spinn opp A)

Når protonet absorberer energi (resonansenergien), resulterer det i et NMR-signal. Det er denne egenskapen ved protonet som utnyttes i NMR, og som vi da kaller PMR (Proton magnetic resonance). Hydrogen er den atomkjernen som har vært mest benyttet i NMRspektroskopien, men vi kan også bruke andre atomkjerner med et odde an­ tall kjernepartikler, slik som 13C, 19F, 31P. Når NMR-spektroskopien er blitt en så viktig teknikk for blant annet oppklaring av strukturen til organiske forbindelser, skyldes det flere for­ hold: 1 Organiske forbindelser inneholder alltid hydrogen og karbonatomer, og svært mange forbindelser inneholder oksygen i tillegg. Men heldigvis har både karbonatomet (12C) og oksygenatomet (16O) et netto spinn lik

55

Figur 37. Hydrogen­ kjernen i sine to spinntilstander.

null, og de atomene vil ikke gi opphav til noe NMR-signal. Bare hydrogen­ kjernene vil bli registrert. 2 Energien som trengs til å forandre protonets spinn fra + Yl til - Vi er ikke den samme for alle protoner. Den avhenger av omgivelsen til hvert proton. Hvis vi velger etanol (CH3CH2OH) som eksempel, så vil protonene i metylgruppen (-CH3) kreve tilførsel av mer energi enn protonene i metylengruppen (-CH2-) for å endre spinnet.

Figur 38. Eksempel på NMR-spektrum for eta­ nol. NMR-instrumentet har liten oppløsningsevne.

okende feltstyrke

3 Beliggenheten for signalene forteller oss om protonene til molekylet. En får forskjellige NMR-signaler for protonene i disse forbindelsene: -CHO,

-ch2ci, -chci2, -ch=ch-. Protoner som befinner seg i identiske omgivelser, absorberer like store mengder energi, og NMR-signalet kommer på samme sted. Ved å telle hvor mange topper som finnes i spektret, kan en bestemme hvor mange «slags» protoner molekylet består av. Spektret ovenfor viser at molekylet har tre «slags» protoner. Arealet under hver topp er proporsjonal med antallet protoner. I spekte­ ret ovenfor ser en at arealet under CH3-, -CH2- og OH- er i forholdet 3:2:1. Alt dette gir oss meget verdifull informasjon om sammensetningen av molekylet. 4 Spektret i figur 38 er tatt opp med et NMR-instrument med liten oppløsningsevne. Dette betyr at instrumentet ikke klarer å skille fra hverandre topper som ligger nær hverandre. Flere topper vil framkomme som en sum av alle toppene i nærheten. Med et høyt oppløsende NMR-instrument vil en få dette spektrum for etanol.

Figur 39. NMR-spektret for etanol med et NMRinstrument som har svært god oppløsningsevne.

56

Figuren viser at signalet for metylgruppen er splittet i tre (triplett), mens signalet fra metylengruppen (-CH2-) er splittet i fire (kvartett). Dette er eksempel på en annen viktig informasjon som kan trekkes ut av et NMR-spektrum. Det er at et NMR-signal vil bli splittet opp i et antall som er en større enn antallet identiske hydrogenatomer som er bundet til naboatomet.

Antall splittinger = N +1

N = antallet identiske hydrogenatomer på naboatomet.

NMR-signalet fra CH3-gruppen blir splittet i tre av de to identiske hydrogenatomene i CH2-gruppen. Tilsvarende vil signalet for -CH2-gruppen bli splittet i 4 av de tre identiske hydrogenatomene i CH3-gruppen.

Oppgave Studer spektret av kloroacetaldehyd (C1CH2CHO) og bestem hvor mange protoner som hvert signal tilsvarer. Prøv også å forklare oppsplittingen av signalene ved hjelp av (N + l)-regelen.

Anvendelser I dag bruker vi ofte NMR-spektroskopi sammen med andre spektroskopis­ ke teknikker (IR, massespektrometri) for å klargjøre strukturen til kje­ miske forbindelser. Det er et uvurderlig instrument for personer og bedrif­ ter som framstiller nye og hittil ukjente forbindelser (legemidler, kjemika­ lier, tilsetningsstoffer i matvarer osv.). Innen næringsmiddelindustrien er det et velegnet instrument når vi vil bestemme forholdet mellom mettede og umettede fettsyrer (fett). Det be­ nyttes også til å kontrollere om f.eks. kjøttvarer er tilsatt fremjnedproteiner (soya) eller om et bestemt kjøttprodukt inneholder kjøtt og fett av andre dyr enn det som etiketten sier. NMR instrumenter er også tatt i bruk av politiet og rettsmedisinere til identifikasjon av narkotiske stoffer eller legemidler. Vi kunne nevnt flere eksempler, men dette skulle være tilstrekkelig for å vise NMR-spektroskopiens mange mulige anvendelsesområder. 57

Sammendrag

Til slutt skal vi kort vise framgangsmåten for NMR-målinger: Prøven som vi skal analysere, må først løses i et egnet løsningsmiddel. Vi prøver da å unngå løsningsmidler som inneholder protoner fordi signalene fra dem vil komplisere NMR-spektret unødvendig. Gode løsningsmidler er CC14, CDC13, cs2, C2C14. Prøveløsningen (ca 0,3 ml) heller vi opp i et spesielt NMR-rør. Det er et avlangt rør som er forseglet i den ene enden. Røret plasserer vi mellom pole­ ne på en magnet som har et konstant magnetfelt, og prøveløsningen bestrå­ les med radiobølger med en frekvens på 60 MHz (megahertz) eller høyere. NMR-signalene registreres av en detektor, og spektret kommer ut på en skriver. Ved hjelp av spektret er det mulig å bestemme: 1 2 3 4

hva «slags» protoner vi har ut fra signalenes beliggenhet, antallet ulike protoner ut fra antallet NMR-signaler, hvor mange identiske protoner det er ut fra arealet under toppene og hvilke protoner og hvor mange protoner som er bundet til naboatomene ut fra antall deler et signal er spaltet opp i (dublett, triplett, kvartett, kvintett osv.).

Prdverbr

Magnet

Figur 40. Skissen viser plasseringen av et prø­ verør ved opptak av NMR-spektrum.

Radiofrekvens spole

58

2 Kromatografiske metoder 2.1 Generelt Den generelle teorien for kromatografi er behandlet i Laboratoriearbeid 3, Spesielle analyser. Der er det oppgaver i papirkromatografi og tynnsjiktkromatografi. For at brukere av denne boka ikke skal være avhengig av å bruke bok 3, tar vi med litt generell teori om kromatografi. Navnet kromatografi som betyr fargebeskrivelse, ble første gang brukt av russeren Tswett omkring århundreskiftet. Tswett sitt kromatografisystem bestod av et glassrør (kolonne) fylt med f.eks. SiO2 eller Al2O3-pulver. På toppen av kolonnen ble det plassert et ekstrakt av plantefargestoff. Deretter ble en organisk væske helt på kolonnen i en kontinuer­ lig strøm. Tswett fant ut at stoffene i blandingen ble mer eller mindre adskilt fordi de vandrer med forskjellig hastighet ned gjennom kolonnen, det ble altså dannet forskjellige fargebånd i kolonnen. Disse kan vi eluere (løse ut) hver for seg, ved å bruke løsningsmidler med økende polaritet. Så ble teknikken glemt inntil ca. 1940. Kromatografi er nå en fellesbetegnelse på en gruppe separasjonsmetoder innen analytisk kjemi. Både fargede og ufargede forbindelser i gass eller væskefase kan vi separere, isolere og identifisere ved de ulike metodene. All kromatografi baserer seg på prinsippet at en blanding kan adskilles i et tofasesystem; en stasjonær (stillestående) og en mobil (bevegelig) fase. Stoffene som vi skal skille fra hverandre, vil vandre med den mobile fasen inntil det punktet der den stasjonære fase har større tiltrekning enn den mo­ bile. Når stoffene i en blanding er forskjellige, er også tiltrekningen til sta­ sjonær og mobil fase forskjellig. Separasjonsteknikken har altså ikke noe med farge å gjøre, men baserer seg på stoffenes forskjellige egenskaper med hensyn til fordeling mellom to faser. Det finnes forskjellige kombinasjoner av stasjonær og mobil fase. (Se ta­ bell 5.) Tabell 5 Mobil fase

StasjoEksempel nær fase

gass gass væske væske

fast væske fast væske

gasskromatografi gasskromatografi tynnsjiktkromatografi væskekromatografi

GSC (Gas Solid Chrom) GLC (Gas Liquid Chrom) TLC (Thin Layer Chrom) HPLC (High Pressure Liquid Chrom)

59

Et stoff som vi bringer inn i et kromatografisk system, bindes til de to res­ pektive fasene med svake kjemiske bindinger som van der Waal-krefter, Hbindinger, dipol-dipol-krefter. Stoffets fordelingskoeffisient vil være av­ hengig av styrken til bindingene i de to fasene. For komponenten A kan vi sette opp likevekten for fordelingen av stof­ fet A i mobil fase (A/) og stasjonær fase (S).

^(M) 52 As) Fordelingskoeffisienten er da det samme som likevektskonstanten for denne likevekten:

K = JAsiL

Skal vi eksempelvis skille stoffene A, B, C fra hverandre i et kromatogra­ fisk system, må fordelingskoeffisientene for A, B og C være forskjellige. I papir- og tynnsjiktkromatografi bruker vi retensjonsfaktor Rf for å fortelle om stoffets oppførsel ved kromatografering. Æf-verdien for et stoff er definert som forholdet mellom de distanser som henholdsvis stoffet og den mobile fasen tilbakelegger i samme tids­ rom. Ellers brukes retensjonstid tR, som er definert som den tiden det tar stof­ fet A å bevege seg gjennom et kromatografisk system (fra start til det kan registreres). Her skal vi behandle teorien for gasskromatografi (GC) og høytrykksvæskekromatografi (HPLC).

2.2 Gasskromatografi GC er en kromatografisk metode som er mye brukt i dag. Metoden har sin begrensning da stoffene som skal skilles fra hverandre ved gasskromato­ grafi, må ha en viss minste flyktighet. I vanskelige tilfeller kan vi f.eks. framstille derivater som er mer flyktige enn stoffet selv. Som stasjonær fase kan det brukes fast stoff (GSC) eller flytende (GLC). Når det brukes flytende fase er det et fast stoff med en væskefilm på over­ flaten. I praksis har det ingen betydning for forståelsen eller utførelsen av GC hva som blir brukt. Som mobil fase blir det brukt gass og da en inert gass. Det er en ikke reaktiv gass slik som N2, He, Ar, H2. Den mobile fasen kaller vi gjerne bæregass - det er den som skal drive de stoffer vi ønsker å adskille gjennom den stasjonære fasen. 60

Termostat

Figur 41. Skjematisk tegning av en gasskromatograf.

Figur 42. Injeksjons­ sprøyte.

Prøven vi ønsker å få separert, injiseres med en spesiell sprøyte (injek­ sjonssprøyte). Se figur 42. Sprøyten blir stukket gjennom en gummimembran kalt septum og inn i den mobile fasen (bæregassen). Prøven og bæregassen strømmer så gjen­ nom den stasjonære fasen. Den stasjonære fasen er fylt i et spiralrør av glass eller metall. Spiralrøret kalles kolonne. Lengden på kolonnen er 0,5-5 m, og diameteren er 1-5 mm. Kolonnen er oppvarmet, og prøven vil fordampe når bæregassen fører den gjennom kolonnen (avhengig av stoffenes kokepunkt og flyktighet). Den fordampede prøven vil følge bæregassen gjennom kolonnen. De ulike komponentene i prøven vil bli adskilt, og de vil bruke forskjellig tid på å gå gjennom kolonnen (på samme måte som blekkfargene ble adskilt ved papir- eller tynnsjiktkromatografering). Men gassen er ikke synlig, og det må følgelig være en registreringsmekanisme - den kalles en detektor (oppdager). Ved gasskromatografering bruker vi små mengder av prøven (1-5 gl). Det betyr at detektoren må være meget følsom. Detektoren registrerer pro­ porsjonalt med konsentrasjonen av hver komponent. Detektoren er koblet til en skriver som gir resultatet i form av en kurve med topper, se figur 43.

Figur 43. Utskrift etter at en blanding som inneholder etanol, isopropanol, eddiksyreetylester og isolbutanol, er separert ved gasskromatografi.

61

Mengden av hver komponent, relativt til de andre, finnes ved å beregne arealet under hver topp. Det kan vi gjøre ved å legge inn en trekant og be­ regne arealet av trekanten, se figur 44.

Figur 44. Beregning av arealet under en topp.

På figur 43 ser vi at skriveren har registrert fire adskilte topper. Etanol har lavest kokepunkt og enklest struktur, og vil fordampe lettest og re­ gistreres først. Det betyr at etanol har lavest retensjonstid (sammenlign ved tynnsjiktkromatografi). Innholdet av en komponent A i en blanding er lik forholdet mellom arealet under toppen A og summen av arealene under alle toppene, se figur 45.

• 100

Figur 45. Beregning av prosentvis innhold til komponentene i bland­ ingen.

En gasskromatograf er utstyrt med trykk- og hastighetskontroll. Ho­ vedkravet er at trykk og gasshastighet holdes konstant under analysen. Gassflasken er utstyrt med manometer som viser trykket. Gasshastigheten måles ved hjelp av en såpeboble-gass-strømningsmåler som er koblet til kolonnens utløp etter detektoren. Vanlig gasshastighet er 10-40 cm’/ min, alt etter kolonnens størrelse. For mer avanserte gasskromatografer er det mulig å programmere en be­ stemt temperaturstigning i løpet av analysen, samtidig som gasshastigheten holdes konstant (gasshastigheten i kolonnen vil avta når temperaturen øker hvis inngangstrykket for bæregassen holdes konstant).

Detektor Flere forskjellige typer detektorer er i bruk. På større GC-instrument bru­ kes nå mest flammeionisasjonsdetektor. Her skal vi bare behandle varmeledningsevnedetektoren. 62

Prinsippet er at det ved kolonnens utløp er plassert en metall- eller halvledertråd (filament) som det går strøm gjennom. Trådens temperatur vil til enhver tid være bestemt av hvor mye varme gassen fra kolonnen transpor­ terer bort fra den pr. tidsenhet.

Figur 46. Varmeledningsdetektor.

Bæregassen som brukes, har som regel adskillig bedre varmeledningsevne enn andre gasser. Så lenge det kommer bæregass ut av kolonnen, og hastigheten av den er konstant, vil temperaturen og resistansen i tråden være konstant og ha laveste verdi. Så snart det kommer noe gass i tillegg (gass som er separert i kolonnen), vil varmetransporten bort fra tråden bli langsommere. Skriveren registrerer forskjellen i resistans (pga. tempera­ turforskjell), og resultatet kommer ut som topper, se figur 43 og 45.

Kapillarkolonne I stedet for de vanlige fylte kolonner blir det også brukt kapillarkolonner. Det er 10-100 m lange kapillarrør med indre diameter 0,1-0,2 mm. Den sta­ sjonære fasen er da påført som en tynn væskefilm på kolonnens innervegg, som er forbehandlet for å gi godt feste. Gasshastigheten her er adskillig mindre enn i de vanlige kolonnene, 1 cmVmin. Adskillelsen er også langt bedre enn i en vanlig kolonne.

Anvendelse GC kan brukes til renframstilling av små stoffmengder. Ellers har GC stor betydning innen analytisk arbeid. GC kan ikke direkte fortelle hvilke stoffer som finnes i en blanding. Identifiseringen er basert på sammenligning. Den enkleste metoden er å sammenligne retensjonstiden ZR for et ukjent stoff med ZR for kjente stoffer. Ukjent stoff og kjent stoff kjøres hver for seg og ZR sammenlignes, figur 47. Videre blandes ukjent og kjent med sam­ me tR. Hvis mistanken var berettiget, skal bare høyden av toppene øke. Det skal ikke oppstå nye topper. (Samme prinsipp brukes for papir- og tynnsj ikt kromatografi.)

63

1

UKJENT ALKOHOL

-I---------- F

36 minutter STANDARD

A Metyl alkohol B Etyl alkohol C n-propyl alkohol D n- butyl alkohol En - amyl alkohol

Figur 47. Identifikasjon av ukjent prøve (A) ved sammenligning med kjent prøve (B).

I----------- 1----------- 1----------- 1----------- 1----------- 1----------- 1----------- F

0

6

12

18

24

30

36 minutter

Vanligvis kan vi ikke stole på én slik sammenligning. Det er nødvendig å gjøre det samme forsøket med andre kolonner og/eller variere kromatograferingsbetingelser som temperatur og trykk. Figur 48 og 49 viser hvor­ dan ulike betingelser virker inn på toppens bredde, adskillelse og retensjonstid. I tillegg finnes andre mer avanserte metoder for sammenligning som er basert på bruk av datamaskin. GC har vært brukt f.eks. ved sammenligning av naturprodukter og synte­ tiske produkter. I noen tilfeller vil ørsmå variasjoner kunne påvises, mens det i andre tilfeller har vist seg umulig å påvise forskjeller. Dette har jo sam­ menheng med hvor komplisert sammensetning det naturlige stoffet har. Ved hjelp av GC kan vi også påvise ulike oljetyper. Sammenlignings­ grunnlaget er kjente oljetyper. På den måten kan vi identifisere olje i olje­ søl. Som du sikkert vet er luftforurensning et problem i store byer. GC blir brukt til regelmessig kontroll av forurensningsgraden i lufta. Ellers er det utarbeidet metoder for analysering av aminosyrer, fettsyrer, hormoner og vitaminer. Analysene har medisinsk interesse. 64

20% væskefase ved 30 C

1

2

20% væskefase ved 40 * C .M.

20% væskefase ved 50 C

20% væskefase ved 60 C Figur 48. Temperatu­ rens innvirkning på retensjonstiden.

Starttid

10% væskefase ved 50 C

5% væskefase ved 50 C

1% væskefase ved 50 C Figur 49. Væskefasens innvirkning på reten­ sjonstiden.

Starttid 5 - Laboratoriearbeid

65

Øvelse Forskjellige gasskromatografer er i bruk, så det er vanskelig å gi oppgaver som kan utføres overalt. Shandon gasskromatograf for skolebruk er svært begrenset i sin anven­ delse, men det er mulig å gi en god demonstrasjon av prinsippene. Et forslag til øvelse er at en blanding av for eksempel benzen, cyclohexan og toluen blir separert i enkeltforbindelser. Retensjonstidene for forbindel­ sene kromatografert hver for seg kan måles. Videre kan vi beregne prosent sammensetningen i blandingen. I tillegg kan kolonnens temperatur og bæregassens hastighet varieres slik at vi får se hvordan adskillelsen varierer med betingelsene. For øvrig henvises det til bruksanvisningen for de enkelte instrumentene.

2.3 Høytrykk væskekromatografi (forkortes HPLC etter den engelske betegnelsen High Pressure Liquid Chromatography eller High Performance Liquid Chromatography). Navnet forteller at separasjonsteknikken benytter seg av høyt trykk i for­ bindelse med væskekromatografi. Før vi omtaler HPLC skal vi gi en kort beskrivelse av hvordan en tidligere utførte en væskekromatisk adskillelse og deretter trekke forbindelsen fram til dagens HPLC instrumenter. I den tradisjonelle væskekromatografien, også kalt kolonnekromatografi, foregår separasjonen i et stort glassrør med diameter på 1-5 cm og lengde på 10-30 cm. Kolonnen blir pakket med et fast stoff av porøst mate­ riale (SiO2, A12O3). Partikkelstørrelsen varierer fra 50 til 250 Selve pakkingen må utføres nøye for å unngå at det blir luftlommer i væsken som omslutter det faste stoffet. Blandingen som skal separeres, blir avsatt på toppen av kolonnen, og hanen nederst åpnes slik at prøven fester seg på kolonnematerialet (den stasjonære fase). Ved å tilsette et egnet elueringsmiddel (mobil fase) og la det strømme med jevn hastighet gjennom kolonnen, får vi prøven til å bevege seg nedover kolonnen. Fordi stoffene i prøven binder seg med ulik styrke til kolonnematerialet, vil de bevege seg med forskjellig hastighet. Dermed oppnår vi at de blir adskilt. Når blandingen består av fargede forbindelser, ser vi hvordan adskillel­ sen skjer gradvis. I tillegg er det lett å se når de forskjellige komponentene strømmer ut fra kolonnen slik at vi kan samle dem opp i hvert sitt beger­ glass for videre analyse. Ufargede forbindelser kan detekteres ved å samle opp mange små frak­ sjoner i begerglass, og senere analysere dem ved hjelp av IR, eller UV spek­ troskopi, titrering eller andre teknikker. Framgangsmåten er illustrert i figur 50.1 samme figur har vi tatt med en enkel skisse av en høytrykksvæskekromatograf for sammenligning. 66

elueringsvaeske forstbrrede partikler

stasjonær fase (S1O2. AI2O3 e.l.) i en væske

d~100|jm ulike komponenter

g lassull

til videre analyse (UV, IR, titrering o.l.)

injeksjon av proven

forstbrrede partikler

pumpe reservoar av elueringsvæske

Figur 50. En sammen­ ligning mellom vanlig kolonnekromatografi (øverst) og høytrykk væskekromatografi (nederst).

‘"^stålror

Den viktigste forskjellen er partikkelstørrelsen og hvordan væsken dri­ ves gjennom kolonnen. Den stasjonære fasen (kolonnematerialet) består av faste partikler som bare er 1-4 /xm i diameter. Kolonnematerialet vil da bli så tettpakket at det ikke er mulig å få væske til å renne gjennom uten å bruke høyt trykk. Framgangsmåten er slik: Stoffblandingen som skal separeres, festes på selve kolonnen ved hjelp av en spesiell injeksjonssprøyte. Prøvevolumet er ofte svært lite, 1-15 /d. Elueringsvæsken presses eller pumpes gjennom kolonnen ved hjelp av en spesiell pumpe som er montert foran kolonnen. Trykket kan komme opp i flere hundre atmosfærer, og derfor må kolonnen være laget av et mate­ riale som tåler så høyt trykk, eksempelvis stål. Kolonnens diameter er i stør­ relsesorden 1-3 mm, og lengden 10-50 cm. Når komponentene i prøven kommer ut fra kolonnen, passerer de en fast detektor som kontinuerlig registrerer mengden av de ulike forbindelsene. Et utsnitt av røret som leder forbi detektoren, er vist på figur 51. 67

V

UV eller IR lys

UV eller IR detektor

Figur 51. Skisse av en gjennomstrømmingscelle (z-rør) i HPLC. Detektoren er vist som en firkantet boks.

V Ulike instrumenter blir brukt som detektor, alt etter hvilke forbindelser som detekteres. De kan basere seg på:

a) b) c) d)

måling av brytningsindeks (refraktometer) måling av absorpsjon i UV-området (UV/synlig spektrofotometer) måling av fluorescens (fluorescensspektrofotometer) måling av strømstyrke, potensialforskjeller eller ledningsevne (elektro­ kjemisk detektor)

Moderne HPLC-instrumenter har en utrolig god separasjonsevne. Som eksempel kan vi nevne at ved hjelp av en spesiell type HPLC har en skilt fra hverandre 175 ulike komponenter i urin fra mennesker. Et kromatogram som viser separasjonen av en blanding nukleosider, er vist i figur 52. Et UV spektrofotometer ble benyttet som detektor.

Toppene er 1. cytidin 2. uridin 3. xantosin 4. inosin 5. guanosin 6. tymidin 7. adenosin Figur 52. Kromatogram av en blanding av nukleosider.

68

Anvendelse av HPLC HPLC brukes idag til separasjon av ioniske forbindelser, ulike polymerer, komponenter i biologiske og kliniske prøver, termisk ustabile stoffer slik som eksplosiver og lignende. En svært viktig prinsipiell forskjell mellom GC og HPLC er at HPLC kan brukes for flere typer stoffer, mens GC krever flyktige forbindelser. Nesten alle stoffer som lar seg løse opp i et oppløsningsmiddel, kan analyse­ res på HPLC. HPLC gir også en skånsom behandling av prøven i og med at det ikke er noen oppvarming. Vekten av prøvemateriale kan variere fra nanogram til flere gram. Den eneste begrensningen nedad er at detektoren kan måle så små mengder. HPLC er under stadig utvikling, og en antar at det vil bli den mest benyt­ tede separasjonsmetode i framtiden. De skoler som ikke har utstyr for HPLC, bør gjennomgå teorien og om mulig arrangere ekskursjoner til institusjoner som har HPLC.

69

3 Elektrokjemiske metoder

3.1 Generelt Elektrokjemiske metoder er et fellesnavn på alle analyseteknikkene som har med sammenhengen mellom elektrisk energi og kjemiske reaksjoner å gjøre. Vi deler de elektrokjemiske metodene opp i flere grupper, alt etter hvilke elektriske størrelser (spenning, strømstyrke, motstand/ledningsevne) som blir variert og hvilke som holdes konstante under målingene. En kort oversikt over elektrokjemien er gitt nedenfor.

1

Potensiometri a Direkte potensiometri b Potensiometrisk titrering

2 Coulometri a Direkte coulometri b Coulometrisk titrering 3 Voltametri a .Polarografi b Amperometri 4 Konduktometri (ledningsevnemålinger) a Direkte konduktometri b Konduktometrisk titrering

Det vil i denne boka bli gitt en innføring i teorien bak potensiometri, cou­ lometri og konduktometri. I tillegg er det tatt med en del eksperimenter for å styrke både begrepsinnlæringen og begrepsforståelsen. For en grundigere behandling av metodene henvises til andre lærebøker. Voltametrien (polarografi og amperometri) er ikke behandlet i det hele tatt. Her er bare tatt med en kort beskrivelse av deres viktigste anvendelses­ områder. De er utelatt fordi de krever relativt dyrt og komplisert utstyr og har dessuten begrenset utbredelse i alminnelig kontroll og analyselaboratorier. 70

3.2 Elektrokjemiske celler Elektrokjemiske celler brukes som fellesnavn på to forskjellige typer celler som det er helt nødvendig å skille klart imellom. Den ene typen kalles galva­ niske celler og anvendes innen potensiometrien. De elektrolytiske cellene bruker vi mest innen coulometrien og voltametrien.

Elektrolytiske celler. Faradays lov Elektrisk energi kan omdannes til kjemisk energi ved å forbinde polene på et batteri (likestrømskilde) til to metallstaver som står nedsenket i en løs­ ning eller smelte. Batteriet «pumper» elektronene gjennom løsningen/ smelta, og får kjemiske reaksjoner i gang på elektrodene (egentlig på gren­ seflaten mellom elektrodene og løsningen).

katode (negativ elektrode)

Figur 53. Elektrolytisk celle.

Denne type celler kalles elektrolytiske celler. I cellen ovenfor er elektrolyseløsningen en natriumklorid-smelte. Den består av Na + - og Cl -ioner som er mobile og kan bevege seg forholdsvis fritt omkring. Den elektroden som er knyttet til den negative polen på batteriet, blir negativt ladet, og vil utøve en elektrostatisk tiltrekning på de positive ionene, kationene. De vil bevege seg til den negative elektrode hvor de tar opp elektroner. Katodereaksjon: Na+ + e" — Na (s) Det resulterer i at metallisk natrium avsettes på katoden. Et stoff (mole­ kyl, ion) som opptar elektroner, sier vi blir redusert. Natriumionene blir her redusert til fast natrium. På samme måte vil den positive elektrode trekke til seg de negative ionene, anionene. De vil avgi elektroner og blir dermed oksiderte.

Anodereaksjon: 2 Cl" — Cl2 (g) + 2e"

Totalreaksjon: 2 Na+ + 2 Cl" — 2 Na (s) + Cl2 (g) 71

Ved elektrolyse av vannløsninger er det mer komplisert å avgjøre hvilke reaksjoner som vil skje ved katoden eller anoden. Vannmolekylene selv kan delta i reaksjonen ved elektrodene. Ved katoden kan H3O+ i vann ta opp elektroner og bli redusert til hydrogengass:

2H2O 4- 2e —■ 2OH 4- H2 (katodisk reduksjon)

På samme måte kan oksygen i vann frigi elektroner ved anoden og bli oksidert til oksygengass: 2H2O — 4H+ 4- O2 4- 4e' (anodisk oksidasjon) Ved elektrolyse av vannløsninger har en alltid valget mellom minst to mulige katodereaksjoner og to mulige anodereaksjoner. Ut fra spenningsrekken kan vi avgjøre hvilken reaksjon som vil finne sted.

1 Ved katoden vil den reaksjonen som har største positive EP verdi fin­ ne sted. 2 Ved anoden skjer den reaksjonen som har størst negative

verdi.

Elektrodene i en elektrolytisk celle er som oftest laget av inerte stoffer slik som platina eller karbon, dvs. stoffer som ikke selv inngår i noen oksi­ dasjon eller reduksjon. Når anoden er laget av metall som lar seg oksidere, resulterer det i at elektroden forbrukes.

M — M+ 4- e“ M — M2+ + 2 e’ Ag — Ag+ 4- e~

(for enverdige metaller) (for toverdige metaller)

Når prøveløsningen/elektrolyseløsningen inneholder oksianioner som SO42 , NO3 , PO43 , C1O4 og CO32-, vil de vanligvis ikke delta i noen reaksjoner ved elektrodene. I slike løsninger vil oksidasjonen gi vann ved anoden: H2O = O2 + 4H+ 4- 4 e".

3.3 Faradays lov Stoffmengden som utskilles ved hver av elektrodene ved en elektrolyse, er proporsjonal med elektrisitetsmengden som har gått gjennom cellen. Dette er bare én av mange måter å uttrykke Faradays lov på. Elektrisi­ tetsmengden som «pumpes» gjennom cellen, kan angis som 72

antall mol elektroner antall faraday (F) antall ampere • sekund eller coulomb (C) antall ampere • timer

Sammenhengen mellom disse enheter er:

1 F = 1 mol e‘ 1 F = 6,02 • 1023e~ 1 F = 96 500 coulomb (C) = 96 500 ampere • sek = 26,8 ampere • timer

Vi finner tallene over slik: Ett elektron har ladningen 1.602 • 10'19 coulomb (C) 1 mol elektroner tilsvarer da elektrisitetsmengde (Q) Q = 1,602 • 10’19 C/e_ • 6,02 • 1023e’ = 96 487 C ~ 96 500 C

1 C = 1A• s Omgjøringen fra ampere • sekund til ampere • timer skjer ved å dividere med 60 • 60 fordi 1 time - 60 min. og 1 min. - 60 sekund. 1 F = 96 500 A • s = 96 500At = 26,8 A • t 60 • 60

—----------

Det matematiske uttrykk for Faradays lov er:

I' t. 1 F Ne

n / t F Ne

= = = =

antall mol stoff strømstyrken i ampere elektrolysetid i sekund 96 500 C = 96 500 ampere • s antall elektroner som inngår i delreaksjonen for hver elektrode

3.4 Coulometri Direkte coulometri I denne analyseteknikken blir det brukt en elektrolytisk celle for å bestem­ me metaller/metallforbindelser og organiske stoffer, og for måling av den elektrisitetsmengden som trengs til fullstendig oksidasjon eller reduksjon av en forbindelse. Elektrolyse eller elektrogravimetri kommer inn under denne metoden, selv om vi her bestemmer mengden av et metall ved veiing etter avsetning av metallet på katoden. Kobber i en løsning kan for eksempel bestemmes elektrogravimetrisk ved veiing av katoden før og etter fullstendig elektrolyse, eller ved å måle elektrisitetsmengden som trengs til fullstendig reduksjon av Cu2 + til Cu. Eksempel: Figuren viser hvordan mengden av kobber i en løsning kan bestemmes. I kobberløsningen står det to elektroder av platina. Cellen får en viss konstant spenning. I strømkretsen er det koblet inn et amperemeter

73

hvor vi avleser strømstyrken (7) og en stoppeklokke for avlesning av elektrolysetiden (Z).

Katodereaksjon: Anodereaksjon:

Cu2+ + 2e — Cu (s) 2 H2O - 4 e" — O2 (g) + 4 H +

stromkilde stoppeklokke koblet pllli-Ø___ av-P *-bryteren amperemeter

(Pt)

Figur 54. Bestemmelse av kobber ved direkte coulometri.

Katodereaksjon :

Cu2, Ag++ e" Cl —

Katode: 2 H2O + 2e —>

Prbveldsning med ukjent mengde Cl I et begerglass pipetteres ut et visst volum av den ukjente HCl-løsningen tilsatt noen dråper fenolftalein som indikator. To platinaelektroder settes ned i begerglasset. Katoden står direkte i løsningen, mens anoden er adskilt fra denne med en porøs glassmembran og omgitt av NaCl-løsning. Det skal hindre at reaksjonsproduktet ved anoden blir blandet med den løsningen som vi skal titrere. Vi kobler elektrodene til en likestrømskilde og strømstyrken holdes kon­ stant ved å regulere en innkoblet motstand. Strømmen kan kobles inn ved hjelp av en stoppeklokke for å få nøyaktig tidsmåling.

2H2